(57)【要約】【課題】  アユ冷水病の原因菌（フラボバクテリウム  サイクロフィラム）が産生する毒素を特定すると同時に、その毒素を取得すること。その遺伝子配列を決定し、遺伝子工学的手法を用いて当該毒素を生産するための技術を構築すること。【解決手段】  アユに対して病原性を示す株と示さない株を分離し、それらの比較から毒素を特定する。その毒素の各種特徴を明らかにすることにより、製造方法を検討する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列又はコラゲナーゼ活性を有するその一部を含むコラゲナーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載のコラゲナーゼからなるアユ冷水病の原因毒素。
【請求項３】
下記の(a)〜(c)を含む、コラゲナーゼをコードする遺伝子
(a) 配列番号１で示されるアミノ酸配列又はコラゲナーゼ活性を有するその一部をコードするDNA
(b) 配列番号２で表されるDNA
(c) 上記(a)又は(b)の相補鎖。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、コラゲナーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアユ冷水病菌フラボバクテリウム  サイクロフィラムに由来する毒素（コラゲナーゼ）及びコラゲナーゼ遺伝子、当該遺伝子が組み込まれた組換えベクター、当該ベクターにより形質転換された宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
アユは日本の代表的な淡水魚であり、重要な産業対象魚である。養魚場等においてはアユの大量死亡を引き起こす冷水病が問題となっている。冷水病はフラボバクテリウム  サイクロフィラム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ）を原因とする細菌性疾病であり、穴あきや非溶血性の貧血等の症状を呈する。アユ冷水病が発生すると高い死亡率のために生産効率が低下するとともに、穴あき等の外傷のために商品価値が著しく損なわれる。内水面漁業においてアユ冷水病対策は重要な課題である。
【０００３】
一般的に細菌性疾病に対しては、抗菌剤の投与が有効である。アユ冷水病に効果がある抗菌剤としてスルフィソゾールが動物用医薬品としての承認を受けており、冷水病の発生時に使用されている（特許文献１）。しかし、上記治療薬を投与しても死亡が収まらない事例が多く、既に穴あき等の外観症状を呈している個体については痕跡を残すことなく完治させることは困難である。また、アユ飼育水を昇温処理してフラボバクテリウム  サイクロフィラムを除菌する方法も開発されている（特許文献２、３）。しかし、殆どの養殖場において数１００トンの飼育水を数日間加温し続けることは技術的に不可能であるので、当該方法が実施できる場面は限られている。これまでに開発された手法では、冷水病対策として完全とは言い難い状況である。
【０００４】
一方、フラボバクテリウム  サイクロフィラムを原因とする冷水病はアマゴやニジマス等のマス類にも発生し、その菌株毎に致死性の高い魚種が異なることが明らかにされている。アユから分離されるＡ型株と、マス類等から分離されるＢ型株は、同じフラボバクテリウム  サイクロフィラム属の細菌であるもののアユに対する致死性は互いに異なる。アユに対して致死性を示すのはＡ型株であり、Ｂ型株は一部を除きアユに直接注射したとしてもアユを死亡させない。Ａ型株とＢ型株はＰｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｃ（ＰＰＩＣ）遺伝子を対象としたＰＣＲ−ＲＦＬＰにより判別することができる（非特許文献１）。
【０００５】
これまでにニジマスから分離されたＢ型株から２種類のプロテアーゼ（ＦＰＰ１及びＦＰＰ２）が同定されている（非特許文献２，３）。これらのプロテアーゼは魚の筋肉等を溶解する作用があることから、冷水病の発症に関与する毒素と考えられてきた。そして、アユから分離されたＡ型株からも当該プロテアーゼが見出されており、アユ冷水病の発症においても重要な役割を果たすと考えられてきた（非特許文献４）。但し、アユに対して病原性を示すＡ型株と、アユに対して病原性を示さないＢ型株との間で、どのような相違点があるかについては未解明なままであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−１９１５５１
【特許文献２】特開２００５−２８７３０３
【特許文献３】特開２００５−２４５３１８
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】吉浦ら、魚病研究、４１（２００６）６７−７１
【非特許文献２】Ｓｅｃａｄｅｓら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６７（２００１）２４３６−２４４４
【非特許文献３】Ｓｅｃａｄｅｓら、ＦＥＭＳ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、  ２２６（２００３）２７３−２７９
【非特許文献４】岡村、滋賀県水産試験場報告、（２０１０）７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アユ冷水病を引き起こすフラボバクテリウム  サイクロフィラムが産生する毒素を明らかにする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
冷水病菌が産生するアユに対する致死的毒素を見出すために、本発明者がアユから分離したフラボバクテリウム  サイクロフィラム  ＷＡ−１株（ＮＢＲＣ１０８９５１）、及びアマゴから分離したフラボバクテリウム  サイクロフィラム  ＷＢ−１株（ＮＢＲＣ１０８９５２）を用い様々な比較を行った。そして、ＷＡ−１株は高いゼラチン分解能力を有し、ＷＢ−１株は殆どゼラチン分解能力を有していないことを見出した（図１）。
【００１０】
なお、本発明者がアユから分離したフラボバクテリウム  サイクロフィラム  ＷＡ−１株（NBRC番号：NBRC 108951）及びフラボバクテリウム  サイクロフィラム  ＷＢ−１株（NBRC番号：NBRC 108952）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターに２０１２年４月２０日に寄託してある。
【００１１】
ＷＡ−１株及びＷＢ−１株を液体培養に供してその上清を回収し、ＦＩＴＣ−コラーゲンに対する酵素活性を調べた。ＷＡ−1株の培養上清はコラゲナーゼ活性を示し、ＷＢ−１株の培養上清はコラゲナーゼ活性を示さなかった（図２）。各株のゼラチン分解活性は、コラゲナーゼ酵素活性と関連していることが明らかになった。
【００１２】
ＷＡ−1株及びＷＢ−1株の培養上清を部分精製し、コラゲナーゼを含む画分をアユに皮下注射した。ＷＡ−1株に由来する上清のみが、アユに病原性の冷水病菌を皮下注射したときに生じるような病斑を生じさせた（図３）。これらのことから、フラボバクテリウム  サイクロフィラムが分泌するコラゲナーゼがアユに対する毒素の一つであることが明らかになった。
【００１３】
ＷＡ−1株とＷＢ−1株から抽出したゲノムＤＮＡを対象として、コラゲナーゼ遺伝子を探索した。ＷＡ−１株では活性型と思われるコラゲナーゼ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が見出された（図４）。ＷＢ−１株でも類似する遺伝子配列は見出されたものの、当該遺伝子内部に１塩基の欠失があるために、コラゲナーゼ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のうちＮ末端部分が失われていた。この結果は、フラボバクテリウム  サイクロフィラムのゲノム上に存在するコラゲナーゼ遺伝子は１コピーであり、当該遺伝子産物（コラゲナーゼ）がコラーゲン又はゼラチンの分解活性に関与することを示唆している。興味深いことに、Ｂ型株の一つであるＪＩＰ０２／８６株のコラゲナーゼ様遺伝子（ＦＰ１７７６とＦＰ１７７７）にはトランスポゾンが介在しており、当該コラゲナーゼ遺伝子は不活性型であった（Duchaudら、Nat. Biotechnol.、25（2007）763-769）。また、ＷＡ−１株以外の複数のＡ型株については全て活性型のコラゲナーゼ遺伝子を有していた（データ非表示）。これらのことから、Ａ型株はコラゲナーゼ活性を有し、Ｂ型株ではコラゲナーゼ活性を示さないという傾向が明確になった。コラゲナーゼがアユにとって毒素であることを強く示唆する知見である。
【００１４】
フラボバクテリウム  サイクロフィラムに属する菌株由来の毒素（コラゲナーゼ）及びその遺伝子を取得し、本発明を完成した。これにより、遺伝子工学的手法を用いた当該コラゲナーゼの産生系を構築することが可能となり、ブレビバチルス  チョウシネンシスを用いたコラゲナーゼ発現系も併せて構築した。本発明の概略は以下の通りである。
項１．  配列番号１で示されるアミノ酸配列又はコラゲナーゼ活性を有するその一部を含むコラゲナーゼ。
項２．  項１に記載のコラゲナーゼからなるアユ冷水病の原因毒素。
項３．  下記の(a)〜(c)を含む、コラゲナーゼをコードする遺伝子
(a) 配列番号１で示されるアミノ酸配列又はコラゲナーゼ活性を有するその一部をコードするDNA
(b) 配列番号２で表されるDNA
(c) 上記(a)又は(b)の相補鎖。
項４．  項３に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
項５．  項４に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体。
項６．  項５に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、コラゲナーゼの製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によりフラボバクテリウム  サイクロフィラムが産生する毒素（コラゲナーゼ）及びその遺伝子が明らかになり、物質としての新規性を証明することができた。また本発明により、当該コラゲナーゼを例えば適当な宿主を用いて大量に製造することや、遺伝子工学的手法により改良する等の手段を講じることができるようになった。
【００１６】
フラボバクテリウム  サイクロフィラム由来のコラゲナーゼはアユ冷水病対策（例えば、コラゲナーゼの活性を抑制する薬等の開発）に応用できるものであり、当該コラゲナーゼ、その遺伝子配列及び当該コラゲナーゼの製造方法は産業上の利用価値を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】１％ゼラチンを添加したＭＣＹ固形培地に冷水病菌を接種してゼラチンの液化が起こるかを調べた。左：ＷＡ−１株、右：ＷＢ−１株。ＷＡ−１株だけがゼラチンを液化した。
【図２】ＷＡ−１株及びＷＢ−１株を液体培養した後、遠心分離により菌体を除去した上清を得た。当該上清に含まれるコラゲナーゼ活性をＦＩＴＣラベルコラーゲンに対する活性を調べた（２０℃×４０ｈ）。ＷＡ−１株由来上清だけがＦＩＴＣラベルコラーゲンに対する分解活性を示した。
【図３】ＷＡ−１株の培養上清から部分精製したコラゲナーゼ溶液をアユに皮下注射した。溶液が浸潤した部位には出血斑が生じた。
【図４−１】ＷＡ−１株由来コラゲナーゼ遺伝子を示す。上段に塩基配列、下段にアミノ酸配列を示す。小文字はＯＲＦの上流及び下流の塩基配列を示す。下線で示された配列(caaaaa)はプロモーター配列、波線で示された配列(aacaaa)はリボソーム結合配列、垂直の矢印はシグナルペプチドの切断部位、四角で囲まれた配列は触媒活性モチーフ、＊は終止コドンを示す。水平の矢印は転写終了配列を示す。
【図４−２】ＷＡ−１株由来コラゲナーゼ遺伝子を示す。上段に塩基配列、下段にアミノ酸配列を示す。小文字はＯＲＦの上流及び下流の塩基配列を示す。下線で示された配列(caaaaa)はプロモーター配列、波線で示された配列(aacaaa)はリボソーム結合配列、垂直の矢印はシグナルペプチドの切断部位、四角で囲まれた配列は触媒活性モチーフ、＊は終止コドンを示す。水平の矢印は転写終了配列を示す。
【図４−３】ＷＡ−１株由来コラゲナーゼ遺伝子を示す。上段に塩基配列、下段にアミノ酸配列を示す。小文字はＯＲＦの上流及び下流の塩基配列を示す。下線で示された配列(caaaaa)はプロモーター配列、波線で示された配列(aacaaa)はリボソーム結合配列、垂直の矢印はシグナルペプチドの切断部位、四角で囲まれた配列は触媒活性モチーフ、＊は終止コドンを示す。水平の矢印は転写終了配列を示す。
【図５】（Ａ）ＷＡ−１株の増殖曲線とコラゲナーゼ遺伝子発現量の推移○：ハウスキーピング遺伝子（ｈｋｇ）に対するコラゲナーゼ遺伝子（ｃｏｌ）発現量、●：ＯＤ６２０値（Ｂ）ＷＡ−１株の後期対数増殖期におけるコラゲナーゼ遺伝子発現量の比較  ＋Ｃａ及び＋ｇｅｌは、通常培地に５ｍＭ塩化カルシウム及び０．１％ゼラチンをそれぞれ添加して培養した時のコラゲナーゼ発現量を示す。
【図６−１】コラゲナーゼ遺伝子の比較サイトファーガｓｐ．Ｌ４３−１株及びフラボバクテリウム  サイクロフィラム  ＷＡ−１株に由来する由来コラゲナーゼのアミノ酸配列（Cytophaga及びFpsＷＡ−１株）をClustal Wを用いて多重整列した。一致するアミノ酸の下には＊を付した。両者の触媒活性モチーフ（ＨＥｘｘＨ）部分（Cytophagaで231-235；FpsWA-1で236-240）を太字で表記した。
【図６−２】コラゲナーゼ遺伝子の比較サイトファーガｓｐ．Ｌ４３−１株及びフラボバクテリウム  サイクロフィラム  ＷＡ−１株に由来する由来コラゲナーゼのアミノ酸配列（Cytophaga及びFpsＷＡ−１株）をClustal Wを用いて多重整列した。一致するアミノ酸の下には＊を付した。両者の触媒活性モチーフ（ＨＥｘｘＨ）部分（Cytophagaで231-235；FpsWA-1で236-240）を太字で表記した。
【図７】（Ａ）１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥＭ：分子量マーカー（フナコシ）、col：精製コラゲナーゼ、▲：コラゲナーゼ由来のバンド（Ｂ）ゼラチンザイモグラフィー（１０％アクリルアミド、１％ゼラチン）Ｍ：分子量マーカー（フナコシ）、col：精製コラゲナーゼ、▲：コラゲナーゼ由来のバンド
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書中では、フラボバクテリウム  サイクロフィラム由来コラゲナーゼのことを「当該コラゲナーゼ」と称することがある。「当該コラゲナーゼ」の意味するところには、以下に記載の方法でフラボバクテリウム  サイクロフィラムに属する微生物を培養して得られるものと、遺伝子工学的手法で得られるものの両方が含まれる。
【００１９】
フラボバクテリウム  サイクロフィラムに属する微生物は独立行政法人 製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）に寄託された株の分与を受けることができる。フラボバクテリウム  サイクロフィラムの培養は１Ｌ中にペプトン２g、イーストエクストラクト０．５g、酢酸ナトリウム０．２gを含む固形又は液体培地で行うことができる。これに適宜、１Ｌ当たり肉エキス０．５ｇ、塩化カルシウム０．２ｇ、馬胎児血清１０％（ｖ／ｖ）を添加しても良い。また、フラボバクテリウム  サイクロフィラムの培養液からコラゲナーゼを得る場合は、アユ由来株を用いなければならない（図２）。アユ以外の魚種から分離されたフラボバクテリウム  サイクロフィラムにおいては、これまでのところコラゲナーゼを分泌する株は見つかっていない。
【００２０】
フラボバクテリウム  サイクロフィラムの培養液からコラゲナーゼを得る場合は、コラゲナーゼは培地中に分泌されるので、その培養液から以下の方法により回収できる。フラボバクテリウム  サイクロフィラムの後期対数増殖期を過ぎた後、５日程度、望ましくは約４８時間経過した時に遠心分離（６，０００ｒｐｍ×１０分）等によって菌体を除去する（図５）。また、培地中に塩化カルシウム又はゼラチンが含まれる場合、コラゲナーゼの発現量が低下するため、これらを培地に含めないことが望ましい（図５）。
【００２１】
培養液中のコラゲナーゼは以下の方法により精製及び濃縮することが可能である。遠心分離等により菌体を除去した培養液に５０％硫酸アンモニウムを添加し、４℃で２時間程度混和した後に、遠心分離（２０，０００ｇ×３０分）によって、コラゲナーゼを沈殿させることができる。一方、当該コラゲナーゼは硫酸アンモニウム濃度が２０％では、遠心分離（６，０００ｇ×１５分）によって沈殿しないことを確認している。必要に応じて５０％硫酸アンモニウム分画を実施する前に、２０％硫酸アンモニウム分画を実施しコラゲナーゼ以外の夾雑蛋白質を沈殿させ、コラゲナーゼが含まれる上清画分を回収することで夾雑蛋白質を除去することができる。更には、５０％硫酸アンモニウム分画後の沈殿画分を適切なバッファー（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、５ｍＭ塩化カルシウム）に懸濁した後に、カラムクロマトグラフィーにより精製することができる。またコラゲナーゼ画分は限外濾過（１０ｋＤａカットオフ）によって濃縮することができる。
【００２２】
当該コラゲナーゼは液体クロマトグラフィー装置を用いて、ＤＥＡＥセファロース（ＧＥヘルスケア）分画によって精製することができる。スタートバッファーには５０ｍＭトリスｐＨ８．０、５ｍＭ塩化カルシウムを用い、溶出バッファーには５０ｍＭトリスｐＨ８．０、５ｍＭ塩化カルシウム、１Ｍ塩化ナトリウムを用い、リニアグラジエントで溶出させることができる。コラゲナーゼは活性等を指標として、含まれている画分を判別する。
【００２３】
当該コラゲナーゼは液体クロマトグラフィー装置を用いて、ゼラチンセファロース（ＧＥヘルスケア）分画によって精製することができる。スタートバッファーには５０ｍＭトリスｐＨ８．０、５ｍＭ塩化カルシウムを用い、溶出バッファーには５０ｍＭトリスｐＨ８．０、５ｍＭ塩化カルシウム、１Ｍ塩化ナトリウムを用い、リニアグラジエントで溶出させることができる。コラゲナーゼは活性等を指標として、含まれている画分を判別する。
【００２４】
本発明のコラゲナーゼは、配列番号１で示され、そのＮ末端又はＣ末端の一部の配列は欠失していてもよい。「コラゲナーゼ活性を有するその一部」とは、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端の配列が、各々の末端から１、２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９、２０、２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９又は５０個欠失し、かつ、コラゲナーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。従って、Ｎ末端から５０個、Ｃ末端から５０個の合計１００個のアミノ酸が欠失したポリペプチドは、「コラゲナーゼ活性を有するその一部」に包含される。なお、コラゲナーゼのＮ末端は、シグナルペプチドが切断されたＮ末端とシグナルペプチドを含むＮ末端の両方を意味する。配列番号１で示される１位〜７５位のアミノ酸(垂直方向の矢印のＮ末端側)がシグナルペプチドであり、このペプチドは任意の長さで切断されてもよく、さらに７６位から１２５位の５０個のアミノ酸が任意の個数で欠失してもよい。
【００２５】
本発明のコラゲナーゼ遺伝子は、フラボバクテリウム  サイクロフィラム由来のコラゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。好ましい遺伝子は、(a) 配列番号１で示されるアミノ酸配列又はコラゲナーゼ活性を有するその一部をコードするDNA、(b) 配列番号２で表されるDNA、(c) 上記(a)又は(b)の相補鎖である。
【００２６】
本発明のコラゲナーゼ遺伝子の一態様は、フラボバクテリウム  サイクロフィラムのうちアユから分離された株のゲノムＤＮＡ由来の天然型の遺伝子をクローニングすることにより得られる。
【００２７】
本発明者らが実際に行った手順は次の通りである。アユから分離されたフラボバクテリウム  サイクロフィラムの培養細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。全ゲノム情報が明らかになっているＪＩＰ０２／８６株のコラゲナーゼ様遺伝子配列に基づき、コラゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅できるプライマーを合成した。当該プライマーを用いてＰＣＲ反応を行いコラゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。次いで、この断片のＤＮＡ塩基配列をダイレクトシーケンスにより決定し、それに含まれるコラゲナーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
【００２８】
当該コラゲナーゼに対応するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は２，８８３塩基対からなる９６０アミノ酸をコードする配列であり、分子量約１０２ＫＤａのコラゲナーゼタンパク質を構成することが明らかとなった。（図５）。
【００２９】
本発明のコラゲナーゼ遺伝子の別の一態様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものである。
【００３０】
フラボバクテリウム  サイクロフィラムはサイトファーガｓｐ．  Ｌ４３−１株（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐ．  Ｌ４３−１）とは近縁種であるが、今回明らかにしたコラゲナーゼ遺伝子配列から両者のコラゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列を比較した結果、両者の一致性は４６%であった(図６)。このことは、両者は機能の類似する酵素遺伝子であることを示すものであるが、両者の酵素としての機能が完全に一致することを示すものではない。実際、宿主生物の性質が異なることから、両者のコラゲナーゼが機能する条件は互いに異なる。サイトファーガｓｐ．  Ｌ４３−１株は土壌細菌であり、２５℃の温度条件下でも生育可能である。それに対し、フラボバクテリウム  サイクロフィラム  ＷＡ−１株は水棲細菌であり、２３℃以上の条件下では生育できない。そして、サイトファーガｓｐ．  Ｌ４３−１株由来コラゲナーゼの至適反応温度は３０℃であるのに対して、フラボバクテリウム  サイクロフィラム由来コラゲナーゼの至適反応温度は２５℃である。これらのことから、本発明のコラゲナーゼ及びその遺伝子は新規であると考えられる。
【００３１】
一般的に、ペプチドないしタンパク質は、そのアミノ酸配列中の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されていても同じ活性を有することが知られている。本発明において、「数個」のアミノ酸とは、コラゲナーゼタンパク質の構造におけるアミノ酸残基の位置又は種類によっても異なるが、通常、例えば、２〜１０個を意味する。ＷＡ−１株由来のコラゲナーゼと同時期に取得した他の株由来のコラゲナーゼ遺伝子とは互いに９９％以上のアミノ酸が一致し、１〜６個のアミノ酸が互いに異なっていた。また、一般的に、同じペプチドないしタンパク質をコードする遺伝子でもコドンの縮重により塩基配列が相違することが知られている。本明細書においては、これらの欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列や、コドンの縮重により相違する塩基配列も含めて「生物学的に同等」とする。Ｎ末端(シグナルペプチドを含むもしくは含まないコラゲナーゼのＮ末端)、Ｃ末端以外の１〜１０個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加されたコラゲナーゼ活性を有するポリペプチドも本発明の「コラゲナーゼ活性を有するその一部」に包含される。
【００３２】
このような生物学的に同等な塩基配列を有する遺伝子も、発現産物であるタンパク質がコラゲナーゼ活性を有する限り、フラボバクテリウム  サイクロフィラム由来のコラゲナーゼ遺伝子と等価なものとして本発明のコラゲナーゼ遺伝子の範囲内に包含される。
【００３３】
本発明のコラゲナーゼ遺伝子を用いると、遺伝子組み換え技術によって当該コラゲナーゼを大量に製造することが可能である。
【００３４】
すなわち、本発明のコラゲナーゼ遺伝子を適当なベクターに組み込むことにより、宿主細胞を形質転換することができる。これらのベクターに適当なプロモーターや形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において本発明のコラゲナーゼ遺伝子を発現することが可能である。宿主細胞としては、エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）やバチルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）やブレビバチルス  チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｉｎｅｎｓｉｓ）を用いることができ、ベクターとしては、エシェリヒア  コリ内で複製できるｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＥＭ３、ｐＧＥＭ４など、バチルス  ズブチリス内で複製できるｐＵＣ１１０、ｐＥ１９４、ｐＣ１９４など、ブレビバチルス  チョウシネンシス内で複製できるｐＮＣＭＯ２、ｐＮＹ３２６等のプラスミドが使用できる。
【００３５】
本発明のコラゲナーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、培養物からコラゲナーゼを採取することにより、当該コラゲナーゼを製造することができる。宿主細胞の培養は、適当な炭素源、窒素源および微量の金属元素を含む培地中で液体培養することで行なえる（Lecroiseyら、FEBS Lett.、59 (1975) 167−172）。得られた培養物を回収し、例えば、培養上清や可溶化菌体上清を硫安沈澱（５０％飽和）処理し、種々のカラムクロマトグラフィー（例えば、ＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィー、ゼラチンセファロースカラムクロマトグラフィー、セファデックスＧ−１００カラムクロマトグラフィー、又はキレートアフィニティクロマトグラフィーなど）を用いて精製することにより、所望のコラゲナーゼが得られる。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
[フラボバクテリウム  サイクロフィラムの分離・培養]
養殖場において冷水病により死亡したアユ及びアマゴを解剖し、それらの腎臓に滅菌済みの白金線を押し付けた後に、ＭＣＹ寒天培地（１Ｌ当たりペプトン２g、イーストエクストラクト０．５g、酢酸ナトリウム０．２g、塩化カルシウム０．２g、寒天１５ｇ）に塗布した。１８℃で約３日間静置培養すると、やや透明な黄色のコロニーを生じるので、各コロニーを滅菌した白金線でピックアップし、更にＭＣＹ寒天培地に塗布して培養することで純粋であることを確認した。このようにして、アユからＷＡ−１株、アマゴからＷＢ−１株を分離した。ＷＡ−１株及びＷＢ−１株のコロニーを、更にＭＣＹ液体培地に植菌し、１８℃で約３日間旋回培養（１２０ｒｐｍ）すると濁りを生じるので、その培養液を遠心分離（６，０００ｒｐｍ×１５分）に供し、菌体を沈殿させた。当該菌体を用いて、ＤＮＡ抽出に供した。なお、フラボバクテリウム  サイクロフィラムをＭＣＹ寒天培地上で培養した物を白金線で取り、１０％グリセロールを含むＭＣＹ液体培地に入れることで長期間の凍結保存（−８０℃）が可能となる。ＷＡ−１株及びＷＢ−１株については、グリセロールストックを作成した後、ＮＩＴＥの微生物寄託センター（ＮＢＲＣ）に寄託した（ＮＢＲＣ１０８９５１、ＮＢＲＣ１０８９５２）。
【実施例２】
【００３８】
[ゲノムＤＮＡの抽出]
上記実施例１で得たフラボバクテリウム  サイクロフィラム  ＷＡ−１株及びＷＢ−１株の菌体から常法により全ゲノムＤＮＡを単離した。微生物ＤＮＡの単離法としては、例えば、サイトウ・ミウラ法等が挙げられる（Saitoら、Biochem. Biophys. Acta、72 (1963) 619-629）。
【実施例３】
【００３９】
[菌株の１６Ｓリボゾーム遺伝子のＰＣＲ増幅]
真正細菌の１６Ｓリボゾーム遺伝子を増幅可能なユニバーサルプライマー８Ｆ及び１５４１Ｒを用いた（配列番号３、４）。上記プライマーの組合せで、上記実施例２にて抽出したＷＡ−１株及びＷＢ−１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  Ｄａｓｈ、ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲ増幅を行った（熱変性：９６℃×３０秒、アニーリング：５０℃×１５秒、伸張：７２℃×１分）。反応後の溶液の一部を１％アガロースゲル電気泳動に供し、電気泳動後のゲルを０．１％エチジウムブロマイド溶液に浸して染色し、ＵＶプレパレータにて紫外線を照射することで、それぞれ約１．５ｋｂのＰＣＲ産物が増幅されていることを確認した。
【００４０】
[コラゲナーゼ遺伝子断片のＰＣＲ増幅]
全ゲノム情報が得られているＪＩＰ０２／８６株の推定コラゲナーゼ遺伝子配列から以下のプライマーを設計した（配列番号５、６）。当該プライマーの組合せで、上記実施例２にて抽出したＷＡ−１株及びＷＢ−１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  Ｄａｓｈ、ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲ増幅を行った（熱変性：９６℃×３０秒、アニーリング：５０℃×１５秒、伸張：７２℃×３分）。上記[菌株の１６Ｓリボゾーム遺伝子のＰＣＲ増幅]と同じ方法で、約６．０ｋｂのＰＣＲ産物が増幅されていることを確認した。
【実施例４】
【００４１】
[ＤＮＡ塩基配列の決定]
上記ＰＣＲ産物のうち電気泳動に供した残りの溶液にＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＧＥヘルスケア）を添加し、余分なプライマーの消化を行った（３７℃×１５分、８０℃×１５分）。この溶液を鋳型として用い、ジデオキシ法（F.Sangerら、Proc.Nat,Acad,Sci,USA、74 (1977) 5963-5967）により塩基配列を決定した。このとき解析にはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００−Ａｖａｎｔを用いた。１６Ｓリボゾーム遺伝子配列の決定の際は、配列番号３及び４のプライマーを用いた。コラゲナーゼ遺伝子配列の決定の際は、配列番号５及び６のプライマーを用いた。最初の解析により得られた塩基配列を元に新たなプライマーを合成し、それらのプライマーを用いて当該ＰＣＲ産物の全ての塩基配列を決定した（プライマーウォーク法）。
【００４２】
[菌種の決定]
ＷＡ−１株由来１６Ｓリボゾーム遺伝子の塩基配列は配列番号７の通りであった。この塩基配列をＢＬＡＳＴ検索に供し、ＷＡ−１株がフラボバクテリウム  サイクロフィラムであることを確認した。ＷＢ−１株についても同様にしてフラボバクテリウム  サイクロフィラムであることを確認した。
【００４３】
[コラゲナーゼ遺伝子の決定]
ＷＡ−１株に由来するコラゲナーゼ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、２，８８３塩基対であった（図４、配列番号２）。それに対して、ＷＢ−１株に由来するコラゲナーゼ様遺伝子のＯＲＦは、ＷＡ−１株由来遺伝子の塩基配列と比べて約９９％一致しており、相同な位置に開始コドンも見られた。しかし、ＯＲＦ内部に１塩基の欠失が生じていたことにより、最初のＯＲＦが極めて短くなっていた。そして後半のＯＲＦの方が長く（２，２６５塩基対）、触媒活性モチーフ（ＨＥｘｘＨ）も見られた。
【実施例５】
【００４４】
[フラボバクテリウム  サイクロフィラムからのコラゲナーゼ溶液の獲得]
ＷＡ−１株を上記実施例１に記載したＭＣＹ液体培地に植菌し、３日間培養した後に、遠心分離（６，０００ｒｐｍ×１５分）により菌体を除去した。当該培養上清を用いて以下のコラゲナーゼ活性測定に用いた。なお、比較対象として、ＷＢ−１株からも同様の方法により培養上清を得た。
【００４５】
[フラボバクテリウム  サイクロフィラム由来コラゲナーゼ溶液の部分精製]
ＷＡ−１株を上記実施例１に記載したＭＣＹ液体培地（１Ｌ）に植菌し、５日間培養した後に、遠心分離（６，０００ｒｐｍ×１５分）により菌体を除去した。当該培養上清に終濃度２０％になるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃で２時間攪拌した後に遠心分離（６，０００ｒｐｍ×１５分）に供した。この上清にコラゲナーゼ活性が見られたので、上清に更に終濃度５０％になるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃で２時間攪拌した後に遠心分離（２０，０００ｇ×３０分）に供した。その沈殿画分を５０ｍＬのバッファー（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、５ｍＭ塩化カルシウム）に懸濁した。当該懸濁液を、透析膜を用いてこれと同じバッファーに４℃で１晩透析した。透析後の溶液にコラゲナーゼ活性が確認できた。
【実施例６】
【００４６】
[コラゲナーゼ活性測定]
コラゲナーゼ活性は、蛍光標識したコラーゲン溶液を用いて測定した。測定法は細胞外マトリックス研究法、第２巻、７７−８５頁、コラーゲン技術研修会（１９９８）に記載の方法を用いた。詳しくは、ＦＩＴＣラベルコラーゲン（牛皮由来Ｉ型コラーゲン１ｍｇ／ｍＬ、岩井化学）５０μＬを当量の中和液（１００ｍＭトリスｐＨ８．０、１０ｍＭ塩化カルシウム、０．４Ｍ塩化ナトリウム）と混合した後、酵素溶液１００μＬ（溶媒は５０ｍＭトリスｐＨ８．０、５ｍＭ塩化カルシウム）を添加して反応させた（２０℃×４０ｈ）。このとき、酵素溶液として上記実施例５において調整したＷＡ−１株由来の上清を用いた。なお、比較対象として、ＷＢ−１株由来の上清を用いた。
【００４７】
反応後、１０μＬの停止液（２００ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．５）を添加し、更に氷冷した２００μＬの抽出液（５０ｍＭトリスｐＨ９．５、２００ｍＭ塩化ナトリウム、７０％エタノール）を添加した。この溶液を遠心分離（１０，０００ｇ×１０分）に供した後、蛍光マイクロプレートリーダー（インフィニットＦ−５００、テカンジャパン）で励起光（４８５ｎｍ）及び蛍光（５３０ｎｍ）を測定した。ＷＡ−１株由来の上清のみがコラゲナーゼ活性を示し、ＷＢ−１株由来の上清は活性を示さなかった（図２）。ＷＢ−１株由来のコラゲナーゼ様遺伝子は、ＷＡ−１株由来遺伝子と比べＮ末端が２０６残基短かったものの、触媒活性モチーフ（ＨＥｘｘＨ）は見られた。それにも関わらず、ＷＢ−１株においてはコラゲナーゼが機能していない事実は、ＷＢ−１株由来遺伝子において欠失していたＮ末端部分が細胞外においてコラゲナーゼが機能するために必要であることを示唆する。
【実施例７】
【００４８】
[コラゲナーゼ発現条件の検討]
ＷＡ−１株においてコラゲナーゼが盛んに分泌される条件を検討するため、定量ＰＣＲを応用しコラゲナーゼ遺伝子のｍＲＮＡ量を経時的に定量した。まずＷＡ−１株を簡易液体培地（１Ｌ当たりペプトン２g、イーストエクストラクト０．５g、酢酸ナトリウム０．２g）に植菌し、１８℃で旋回培養（１２０ｒｐｍ）し、経時的に培養液を採取した。採取した培養液の吸光度（６２０ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（ＮＪ−２３００、ヌンク）を用いて測定し、増殖曲線を描いた（図５）。また、培地条件がコラゲナーゼ発現量に及ぼす影響を検討するために、上記簡易培地に、５ｍＭ塩化カルシウム又は０．１％ゼラチンを添加した培地も作成し、それにＷＡ−１株を植菌し、吸光度をモニターすることで後期対数増殖期の培養液を得た。
【００４９】
次に、上記[コラゲナーゼ発現条件の検討]で経時的に採取した培養液を遠心分離（６，０００ｒｐｍ×１５分）に供し、上清を除去することでＷＡ−１株の菌体ペレットを得た。当該菌体ペレットからＲＮＡ抽出試薬（ＩＳＯＧＥＮ、ニッポンジーン）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。当該トータルＲＮＡを鋳型として、配列番号８及び９のプライマーセットで、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてコラゲナーゼ部分配列を含むｃＤＮＡを得た。併せて比較対象とするために、同じ鋳型ＲＮＡを用い、ハウスキーピング遺伝子（ＰＰＩＣ）の部分配列を含むｃＤＮＡを配列番号１０及び１１のプライマーセットを用いて得た。
【００５０】
定量ＰＣＲの検量線を描くために、ＷＡ−１株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号８及び９、１０及び１１のプライマーで、ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  Ｄａｓｈ、ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、コラゲナーゼ遺伝子及びＰＰＩＣ遺伝子の部分配列を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ後の溶液をエタノール沈殿により精製した後に、吸光度（２６０ｎｍ）を測定することによりＤＮＡ量を定量した。当該ＤＮＡ溶液を適切な濃度に段階希釈することにより検量線を描くためのサンプルとした。
【００５１】
上記で得たｃＤＮＡ、及び検量線用のＤＮＡ断片を鋳型として用い、試薬（ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ、ＴＡＫＡＲＡ）を用い定量ＰＣＲを行った。蛍光の検出には、リアルタイムＰＣＲ装置（７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ、ＡＢＩ）を用いた（熱変性：９６℃×１５秒、アニーリング：５５℃×３０秒、伸張：６８℃×３０秒）。それによりＰＣＲ増副産物がある一定量に達したときのサイクル数（Ｃｔ値）を求め、検量線に当てはめることにより、ＷＡ−１株の増殖段階におけるコラゲナーゼ及びＰＰＩＣ遺伝子のｍＲＮＡ量を定量した（検量線法）。
【実施例８】
【００５２】
[コラゲナーゼ組換えタンパク質の発現株の構築]
ＷＡ−１株由来のコラゲナーゼ遺伝子をブレビバチルス  チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｉｎｅｎｓｉｓ）で大量に生産させるための組換えプラスミドを作製した。ＷＡ−１株のコラゲナーゼ遺伝子をＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  Ｄａｓｈ，  ＴＯＹＯＢＯ）により、配列番号１２及び１３のプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、上記実施例３と同様の方法で１％アガロースゲル電気泳動に供した後に、切り出し精製キット（ＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、キアゲン）を用いて、末端がＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたコラゲナーゼ遺伝子断片を得た。一方、発現ベクターｐＮＹ３２６を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、上記と同じ方法で精製した。ライゲーションキット（ＭｉｇｈｔｙＭｉｘ、タカラ）を用いて、上記コラゲナーゼ遺伝子断片をｐＮＹ３２６ベクターに連結した。得られたライゲーション産物を所定の方法により、ブレビバチルス  チョウシネンシスのコンピテントセル（タカラバイオ）に導入した。得られた形質転換体はＴＭ培地（１％ポリペプトンＮ、０．２％酵母エキス、０．５％肉エキス、１％グルコース、０．００１％硫酸鉄、０．００１％硫酸マンガン、０．０００１％硫酸亜鉛、０．４％硫酸マグネシウム、１．５％寒天、ネオマイシン１０μｇ／ｍＬ）で２日間、３７℃で静置培養した後に、複数のコロニーを得た。これらのコロニーを液体ＴＭ培地に植菌し、２日間、３７℃で旋回培養（１２０ｒｐｍ）した後に、プラスミド抽出キット（ＭｉｎｉＰｒｅｐ、キアゲン）を用いてプラスミドの抽出を行った。抽出したプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化した後に、上記実施例３と同様の方法で１％アガロースゲル電気泳動に供し、インサートの確認を行った。当該方法により高い効率でインサートが挿入されたプラスミドを得ることができた。
【実施例９】
【００５３】
[コラゲナーゼ発現株の選別（ゼラチンザイモグラフィー法）]
実施例８で得られた形質転換体を上記実施例８に記載したＴＭ液体培地に植菌し、２５℃で７２時間、旋回培養（１２０ｒｐｍ）した。遠心分離（６，０００ｒｐｍ×１５分）により、菌体を除去し、その上清中に分泌されたコラゲナーゼ組換えタンパク質をゼラチンザイモグラフィー法によって解析した。ゼラチンザイモグラフィー法は服部らの方法（Hattori, S., Anal. Biochem., 301,27-34,(2002)）で行った。詳しくは、１０％アクリルアミドゲル（１％ゼラチン、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む）に、上記培養上清を１０μＬアプライし、氷水中で冷却しながら電気泳動を行い、ＣＢＢ染色に供した。コラゲナーゼ活性が強い形質転換体由来の上清はクリアゾーンが強く形成されることから、それを指標としてコラゲナーゼ発現量が多い形質転換体を選別した。ブレビバチルスにおいては、株毎に性質が異なる場合があるので、なるべく多くの株を培養し、望ましい形質を有している株を選別する作業が必須である。また、コラゲナーゼ遺伝子を含まない発現プラスミドを保有するブレビバチルス菌株の上清（対照）は当該ゼラチンザイモグラフィーにおいてゼラチン分解活性を示さなかった。このことから、当該方法で確認されたゼラチン分解活性は発現した組換えコラゲナーゼの活性に起因することが明らかである。なお、ゼラチンザイモグラフィーの結果において、コラゲナーゼ発現株由来の上清では複数の異なる分子量のバンドが確認された（３０〜７０ｋＤａ）。このことは、ブレビバチルスを培養する過程で分泌されたコラゲナーゼが自己消化等により低分子化したことを示唆している（図７）。この低分子化は、ブレビバチルスの培養液に１〜１０ｍＭの塩化カルシウムを添加することで、ある程度抑えることができる。
【実施例１０】
【００５４】
[組換えコラゲナーゼの精製]
実施例９で得られた形質転換体を実施例８に記載したＴＭ液体培地に植菌し、３０℃で４８時間、旋回培養（１２０ｒｐｍ）した。その前培養液を１Ｌの２ＳＹ培地（４％ソイトン、０．５％酵母エキス、２％グルコース、０．０１５％塩化カルシウム、ネオマイシン５０μｇ／ｍＬ）に植菌し、２５℃で７２時間、旋回培養（１２０ｒｐｍ）した。その培養液を遠心分離（６，０００ｒｐｍ×１５分）し、その上清を回収した。当該上清に終濃度２０％になるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃で２時間攪拌した後に遠心分離（６，０００ｒｐｍ×１５分）に供した。この上清に更に終濃度５０％になるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃で２時間攪拌した後に遠心分離（２０，０００ｇ×３０分）に供した。その沈殿画分を５０ｍＬのバッファー（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、５ｍＭ塩化カルシウム）に懸濁した。当該懸濁液を、透析膜を用いてこれと同じバッファーに４℃で１晩透析した。透析後の溶液にコラゲナーゼ活性があることを上記実施例６に記載の方法で確認した。更に、透析後の溶液を陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥセファロース、ＧＥヘルスケア）に供して精製した。詳しくは、液体クロマトグラフィー装置を用いて、スタートバッファーには５０ｍＭトリスｐＨ８．０、５ｍＭ塩化カルシウムを用い、ＤＥＡＥセファロースを充填したカラムにコラゲナーゼを吸着させた後に、溶出バッファーとして５０ｍＭトリスｐＨ８．０、５ｍＭ塩化カルシウム、１Ｍ塩化ナトリウムを用い、リニアグラジエントで溶出させた。コラゲナーゼが含まれる画分は、先に記載したＦＩＴＣ−コラーゲンに対する分解活性が高いことを指標として選択した。
【実施例１１】
【００５５】
[組換えコラゲナーゼの精製度の確認]
上記実施例１０で得た精製酵素をＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ）に供し、ＣＢＢ染色に供した。図７に精製酵素のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動像を示した。３つの異なる分子量のバンドが観察された（約５７、５３及び４０ｋＤａ）。同一サンプルを上記実施例９と同様の方法でゼラチンザイモグラフィーに供した結果、ゼラチン分解活性を意味するクリアゾーンが複数観察された（約９０，７０，５７，５３ｋＤａ）。このうち５７，５３ｋＤａのクリアゾーンはＳＤＳ―ＰＡＧＥにおいて観察されたバンドと同一と思われる。一方、ＳＤＳ―ＰＡＧＥにおいて観察された約４０ｋＤａの低分子化したバンドは、低分子化し過ぎたことによって酵素活性を失っていると考えられる。
【図２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図１】
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【図３】
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【図７】
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【配列表】
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