(57)【要約】【課題】ケージド化合物を提供する。【解決手段】下記式（I）又は(II)で表される化合物：【化１】2015017047.tif 000005(式中、Ｚは同一又は異なってビオチニル基又はマレイミド基を示し、Ｙは二価のリンカー基を示し、Ａｒは置換されていてもよいアリーレン基または置換されていてもよいヘテロアリーレン基を示す。Ａｒ１は置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいヘテロアリール基を示す)【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（I）又は(II)で表される化合物：
【化１】
2015017047.tif 000004
(式中、Ｚは同一又は異なってビオチニル基又はマレイミド基を示し、Ｙは二価のリンカー基を示し、Ａｒは置換されていてもよいアリーレン基または置換されていてもよいヘテロアリーレン基を示す。Ａｒ１は置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいヘテロアリール基を示す)
【請求項２】
請求項1の式(I)で表される化合物とアビジン化標識物質及びアビジン化機能性物質を結合してなる複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケージド化合物及び該ケージド化合物で標識を連結された複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
多様な及び多機能なナノ粒子はin vitro及びin vivo.での多重検出のような応用範囲の広がりのために近年注目を集めている(非特許文献1)。
【０００３】
単一のナノメートルスケールのプローブにおける蛍光及び磁性手段の組み合わせは、生体イメージング、光熱療法及び光力学療法、多様な腫瘍の検出及び単離などの多様な用途に有用である。
【０００４】
量子ドット（QD）は広い吸収範囲、大きなモル吸光係数、狭い発光バンド幅、高い光安定性などの特性のためバイオイメージングで注目されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Cheon, J.; Lee, J. H. Synergistically Integrated Nanoparticles as Multimodal Probes for Nanobiotechnology. Acc. Chem. Res. 2008, 41, 1630-1640.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、イメージング又は治療の後に生体内で分解されて体外に容易に排出される標識物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の化合物及び複合体を提供するものである。
項１．  下記式（I）又は(II)で表される化合物：
【０００８】
【化１】
2015017047.tif 000002
【０００９】
(式中、Ｚは同一又は異なってビオチニル基又はマレイミド基を示し、Ｙは二価のリンカー基を示し、Ａｒは置換されていてもよいアリーレン基または置換されていてもよいヘテロアリーレン基を示す。Ａｒ１は置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいヘテロアリール基を示す)
項２．  項1の式(I)で表される化合物とアビジン化標識物質及びアビジン化機能性物質を結合してなる複合体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、光によりケージド化合物部分が分解し、それにより複合体のサイズが小さくなり、生体内に複合体を導入した場合でも体外への排出が促進され、安全性が高くなる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】PUNPの合成及び特徴付け。(a) PCB, PCBB 及び (b) PUNPの合成スキーム。(i) PBS, (ii) QD, (iii) Fe3O4 NP 及び (iv) PUNPの溶液の(c) 光学画像、(d) 光発光画像、(e) T1 強調 MRI 及び (f) T2 強調MRI。(g) サイズ 及び 形が均一な分布を示すPUNPsのFESEM画像。差込図: 拡大及びスキャンされたFESEM画像及びPUNPsの略図である。‘g’におけるPUNPsの凝集はSEM イメージング用のサンプル調製中における溶媒の乾燥のためである。
【図２】光脱ケージ化。 (a) 397 nm励起下でのSN1 光脱ケージ化 反応スキーム, (b,c) (b) 397 nmでの光活性化又は(c)暗所での PCB のUV-Vis 吸収 スペクトルの時間的進化. 差し込み図：光脱ケージ化反応の速度論、(d, e) 光脱ケージ化の前(d)及び後(e)におけるPCB のMALDI-TOF 質量スペクトル、(f)397 nmでの光活性化におけるDMSO-d6に溶解したPCB の1H NMR スペクトルの時間的発達、(g, h) (g) アリルプロトン 及び (h) クマリニルメチル プロトンの拡大した1H NMRスペクトル、 及び (i) 異なるバンドパスフィルターにより集めた脱ケージ化生成物の蛍光イメージ。
【図３】細胞内送達及び細胞毒性アッセイ。 (a-c) PUNP-アラトスタチン複合体 及びsyto 21で処理されたB16細胞及び(d-f) QD-EGF複合体及びsyto 21で処理されたH1650細胞の蛍光イメージ及びオーバーレイイメージ。(g-i) (g) Fe3O4 NP, (h) CdSe/ZnS QD及び(i) PUNPについてのMTTアッセイヒストグラム。PUNP-アラトスタチン複合体を用いた(i)標識有り又は(ii)標識無しのB16細胞の(j)光透過及び(k)蛍光イメージ。(i) Fe3O4NP, (ii)PBS, (iii)PUNP-アラトスタチン複合体で標識したB16細胞及び(iv)非標識細胞の(l)T1強調MRI及び(m) T2強調MRI
【図４】In vivo 蛍光イメージング及びMRI。 (a) 蛍光イメージ, 及び(b) PBS, QD, Fe3O4 NP, 及びPUNPを皮下注射したB6マウスのT1強調MRI、(c-f)T1 強調MRI, (g, h) 明視野光学イメージ及び(i, j)10nM PUNP溶液(250 μL)を静脈注射したB6マウスの蛍光イメージ。
【図５】PCB, PCBB, Fe3O4, QD 及び PUNPのUV-Vis 吸収及びPLスペクトル;
【図６】Xe ランプからの340 nm 光照射下でのPCBBの光脱ケージ化;
【図７】光脱ケージ化後のPUNPのSEMイメージ;
【図８】PUNP-アラトスタチン 複合体で処理したB16 細胞の蛍光イメージ;
【図９】PCB, PCBB 及び 光生成物のMTTアッセイ;
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、二つの機能を有する二機能性標識複合体及びこのような標識化合物を得るための化合物を提供するものである。
【００１３】
本発明で使用する化合物を以下の式（Ｉ）又は式（II）に示す。
【００１４】
【化１】
2015017047.tif 000003
【００１５】
(式中、Ｚは同一又は異なってビオチニル基又はマレイミド基を示し、Ｙは二価のリンカー基を示し、Ａｒは置換されていてもよいアリーレン基または置換されていてもよいヘテロアリーレン基を示す。Ａｒ１は置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいヘテロアリール基を示す)
【００１６】
式(II)の化合物は、式(I)の化合物を得るための製造中間体として有用である。
【００１７】
「アリール基」は、５又は６員の芳香族炭化水素環からなる単環又は多環系の基を意味し、具体例としては、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アントリル、ビフェニリル、テトラヒドロナフチル、クロマニル、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニル、インダニル及びフェナントリルが挙げられる。
【００１８】
「アリーレン基」は、５又は６員の芳香族炭化水素環からなる単環又は多環系の２価の基を意味し、具体例としては、フェニレン、ナフチレン、フルオレニレン、アントリレン、ビフェニリレン、テトラヒドロナフチレン、クロマニレン、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニレン、インダニレン及びフェナントリレンが挙げられる。
【００１９】
「ヘテロアリール基」は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む、５又は６員の芳香環からなる単環又は多環系の基を意味し、多環系の場合には少なくとも１つの環が芳香環であればよい。具体例としては、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、キノリル、イソキノリル、ベンゾ［ｂ］チエニル及びベンズイミダゾリル、クマリル、ベンゾピラニル、ベンゾフラニルが挙げられる。
【００２０】
「ヘテロアリーレン基」は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む、５又は６員の芳香環からなる単環又は多環系の２価の基を意味し、多環系の場合には少なくとも１つの環が芳香環であればよい。具体例としては、フリレン、チエニレン、ピロリレン、イミダゾリレン、ピラゾリレン、オキサゾリレン、チアゾリレン、イソオキサゾリレン、イソチアゾリレン、ピリジレン、ピラジニレン、ピリミジニレン、ピリダジニレン、インドリレン、キノリレン、イソキノリレン、ベンゾ［ｂ］チエニレン及びベンズイミダゾリレン、クマリレン、ベンゾピラニレン、ベンゾフラニレンが挙げられる。
【００２１】
Ｚがビオチニル基のとき、Ｚ-OHはビオチンである。
【００２２】
ビオチニル基はアビジン物質と結合することができ、マレイミド基はＳＨ基と結合することができる。
【００２３】
Ｙで表される二価のリンカー基としては、炭素数１以上のアルキレン基、シクロアルキレン基、−ＣＯ−、−（アリーレン）-（炭素数１以上のアルキレン）−基、アリーレン基が挙げられる。
【００２４】
炭素数１以上のアルキレン基としては、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、-CH2CH(CH3)-、-CH(CH3) CH2-などの直鎖又は分枝を有するアルキレン基が挙げられる。
【００２５】
シクロアルキレン基としては、シクロペンチレン基、シクロヘキシレン基などの炭素数３〜８のシクロアルキレン基が挙げられる。
【００２６】
−（アリーレン）-（炭素数１以上のアルキレン）−基としては、上記のアリーレン基と炭素数１以上のアルキレン基（好ましくは炭素数１〜４のアルキレン基、より好ましくは炭素数１〜２のアルキレン基）を組み合わせた基が挙げられる。
【００２７】
アリーレン基、ヘテロアリーレン基、アリール基、ヘテロアリール基の置換基としては、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノＣ１−６アルキル置換アミノ、ジＣ１−６アルキル置換アミノ、カルバモイル、スルファモイル、メチレンジオキシが挙げられ、置換基の数は、１〜３個、好ましくは１〜２個である。
【００２８】
「Ｃ１−６アルキル」としては、直鎖状又は分枝鎖状のいずれでもよく。例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ヘキシルが挙げられる。
【００２９】
ハロゲンとしては、塩素、臭素、フッ素、ヨウ素が挙げられる。
【００３０】
Ｃ１−６アルコキシの具体例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、tert−ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ及びヘキシルオキシが挙げられる。
【００３１】
モノＣ１−６アルキル置換アミノとしては、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、イソブチルアミノ、tert−ブチルアミノ、ｎ−ペンチルアミノ、イソペンチルアミノ、ヘキシルアミノが挙げられる。
【００３２】
ジＣ１−６アルキル置換アミノ基としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジｎ−プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジｎ−ブチルアミノ、ジイソブチルアミノ、ジtert−ブチルアミノ、ジｎ−ペンチルアミノ、ジイソペンチルアミノ、ジヘキシルアミノが挙げられる。
【００３３】
標識物質としては、量子ドット(QD)、蛍光物質、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰなど）、発光酵素（例えば、ルシフェラーゼなど）、酵素、金コロイド、ユーロピウム錯体、テルビウム錯体などが挙げられる。
【００３４】
蛍光物質としては、例えば、ｃｙ５、ｃｙ７、ｃｙ３Ｂ、ｃｙ３．５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０、フルオレセイン−４−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などが挙げられる。
【００３５】
酵素としては、β−ガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。
【００３６】
ユーロピウム錯体、テルビウム錯体は公知の配位子が配位した錯体が制限なく使用できる。ユーロピウムイオン、テルビウムイオンの配位子としては、例えばβ−ジケトン構造を有する配位子、β−ジスルフォニル構造を有する配位子、カルボニルイミド構造を有する配位子、スルホンイミド構造を有する配位子などが挙げられ、これらの配位子は形成した錯体の発光効率が良好な点で好ましい。
【００３７】
これらの標識物質は、アビジン物質と結合されてアビジン化標識物質となる。ここで標識物質と結合されるアビジン物質としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンなどが挙げられる。アビジン物質と結合した標識物質（アビジン化標識物質）は、市販品を使用するか、常法に従い製造することができる。アビジン物質と標識物質の結合は直接結合であってもよく、適当なリンカーを介して結合してもよい。
【００３８】
アビジン化機能性物質は、上記アビジン物質と機能性物質が直接あるいは適当なリンカーを介して結合した材料である。機能性物質としては、磁性材料、抗体、薬物、ホルモン、サイトカイン、アプタマー、葉酸、RGDペプチドなどの受容体のリガンド分子などが挙げられる。
【００３９】
前記磁性材料は、ＭＲＩ検査用造影剤として有用である。例えばガドリニウム錯体、鉄酸化物、マンガン酸化物、コバルト錯体、ニオジウム錯体などの磁性材料をＭＲＩ検査用造影剤として使用することができる。これらの磁性材料と標識を含む本発明の複合体は、静脈注射や観察する器官又は組織に注射し、これを造影剤として利用することができる。
【００４０】
好ましい実施形態において、本発明は光脱ケージ化かつ二機能性の標識ナノ粒子からなる複合体を提供する。「二機能性」とは、機能性物質（磁性材料）と標識物質を含むことを意味し、本発明の好ましい複合体は磁性材料と標識物質を式(I)又は(II)の化合物で連結する。標識物質はイメージングあるいは治療の後に除かれ、体外への排出を促進する。
【００４１】
本明細書において、標識物質及び機能性物質が光脱ケージ化リガンドによりケージ化された複合体を（PUNP）と記載することがある。本発明の複合体は、化学試薬を使用せず光を適用することで容易に分解され得る。本発明の複合体は、空間的及び時間的に制御された薬物及び生体分子の送達のような生物化学の異なる側面における興味深い用途が見出されている。現在までに知られている種々の光脱ケージ化分子の中で、クマリニルメチルエステルはその有効な光分解性のために詳細に研究されている。クマリニルメチルエステルを用いて調製したビオチン誘導体又はマレイミド誘導体は磁性 NPの表面への多数のフルオロフォアの結合及び高い蛍光及び磁性を有する複合体を得ることを可能にした。
【００４２】
以下、本発明を量子ドットを蛍光物質、磁性ナノ粒子を機能性物質、光脱ケージ化ビオチン誘導体または光脱ケージ化マレイミド誘導体としてクマリニルメチルビオチンエステル(PCB、3)及びクマリニルメチルビス-ビオチンエステル(PCBB、5)を用いた例を中心に説明するが、本発明はこれらに限定されず、特許請求の範囲の全ての実施形態を含むものである。
【００４３】
本発明者は２つの新規な光脱ケージ化ビオチン誘導体、すなわちクマリニルメチルビオチンエステル(PCB、化合物3)及びクマリニルメチルビス-ビオチンエステル(PCBB、化合物5)を合成し、PCBBを用いてCdSe/ZnS QD及びFe3O4 NPから構成されるPUNPの作製を行い、これはFESEMイメージングにより特徴付けられる。さらに、PUNPはペプチドホルモンアラトスタチン Iと複合体化され、これによりPUNPの細胞内送達を可能にした。PCB, PCBB及びPUNPの脱ケージ化は時間依存性のUV-Vis吸収スペクトル、NMRスペクトル、MALDI-TOFマススペクトル及びSEMを用いて詳細に研究した。PCB又はPCBBの光活性化におけるクマリニルメチルアルコール誘導体の形成は、光脱ケージ化を強力にサポートする。MTTアッセイを用いたヒト肺上皮腺がん細胞(H1650)及びマウスメラノーマ細胞(B16)でのPCB、PCBB、ペプチド-コートされたPUNP及び光脱ケージ化した生成物の細胞毒性は90%を超える細胞生存度を示し、PUNP及びその成分の非毒性の性質を示唆する。最後に、本発明者はペプチド-複合体化PUNPをB16細胞及びC57BL/6(B6)マウスのMRI及び蛍光イメージングの有効な造影剤として使用した。ペプチド-複合体化PUNPで処理された細胞サンプル又はペプチド-複合体化PUNPを注入されたマウスから集められた増強された磁性及び蛍光コントラストは、その二峰性特性を確認した。
【００４４】
図1a及び図１bはPCB, PCBB,及びPUNPの合成ステップを示す。PCB及びPCBBの調製についての有機化学反応の詳細及びそれらの特徴付けは実施例で与えられる。PUNPの作製中、Fe3O4 NP及びPCBBの濃度は1:100の比であり、その結果Fe3O4 NP上のストレプトアビジンポケットはPCBB分子により完全に占められ、光脱ケージ化ビオチン官能化Fe3O4 NPを提供する。Fe3O4 NPをPCBBに過剰に添加することで、Fe3O4 NPのPCBB-介在凝集を防止できる。これは、SEMイメージングにより確認することができる。遊離のPCBB分子は2KDaの膜に対して透析することにより連続的に除去される。次いで、ビオチン化Fe3O4 NPをストレプトアビジン官能化QDに５分割で1:10比で加えられ、光脱ケージ化ビオチンリガンドによりFe3O4 NP上に約10QDが連結される。棒磁石を用いた繰り返しの磁性分離を終夜行い、反応混合物中における遊離のQDをすべて除去した。PUNP調製の詳細は、実験セクションに示される。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液(i), CdSe/ZnS QD(ii), Fe3O4 NP (iii) 及び PUNP (iv)についての明視野光画像(c), 蛍光画像(d)及びT1強調MRI(e)及びT2(f)強調MRIは図1c-fに示される。光吸収及び光発光スペクトル(図５)におけるQD、PCBB及びFe3O4NPの総合的な特徴に加えてPUNPからの強い磁性及び蛍光コントラストは、PUNPの二機能性を示唆している。MR及び蛍光コントラストは遊離のFe3O4及びQDの存在に起因するものではなく、これはSEMを用いたPUNPの形態を得ることにより確認される。PUNPのサイズ分布及び形状は、SEMイメージ(図1g)に示される。さらにPUNPの形態を理解するために、本発明者は拡大及びスキャンしたFESEMイメージを得(図1g)、これはFe3O4 NP上での多数のQDの結合を示唆する。他方、本発明者はサンプル中のFe3O4, QD又はこれらの混合物の特徴的な形態を観察できなかった。したがって、QD及びFe3O4 NPの非特異的凝集は除外された。他方、図1gに示されるPUNPの凝集は、SEMイメージング用のサンプル調製中の減圧下での溶媒の蒸発のためである。
【００４５】
PCB, PCBB及びPUNPの光脱ケージ化を評価するために、本発明者らは、時間依存性のUV-Vis吸収分光法,1H NMR分光法及びMALDI-TOF質量分析法を用いて光脱ケージ化の速度論を研究した。第1に、DMF:水(10:1)混合液中の1μM PCB溶液にXeランプからの397nmの光又は400 nmのレーザ光(7 mW)を照射し、溶液のUV-Vis吸収スペクトルを一定の時間間隔で記録した。図2bに示されるように、約410 nmの吸光度の連続的な低下と等吸収点による約275nmの新しいバンドの発生は、光脱ケージ化反応を示唆する。逆に言えば、暗所におけるコントロールサンプルの吸収スペクトルは本質的に変化しなかった(図2c)。410nm及び275nmにおける光脱ケージ化経過中での吸光度vs時間のプロットは、図2bに示され、これは,一次速度則に従う。モル吸光係数及び差吸収スペクトルから計算された反応分子数及び励起レーザ強度及び光子エネルギーから計算された吸収された光子数を用いて、本発明者は光脱ケージ化反応の量子効率を約4.8%と評価した。光脱ケージ化反応をさらに評価するために、本発明者は標準α-シアノ-4-ヒドロキシケイヒ酸マトリクスに負荷されたPCBサンプルのMALDI-TOFマススペクトルを記録及び評価した。光活性化の前後のPCBのMALDI-TOF質量スペクトルが図2d及び2eに示される。予期されるように、光活性化サンプルにおけるPCB(m/z=453)の分子ピークは完全に消失し、これは図2aに示される光脱ケージ化生成物の形成に伴うもの質量スペクトルのこの変化は、吸収スペクトル(図2b)において見られる光脱ケージ化プロセスとよく一致する。アリルエステルの光脱ケージ化特性及び1級アルコールの形成は、重水素化DMSOに溶解されかつ397nmの光を照射されたPCBの時間依存性1H NMRスペクトルによる光脱ケージ化反応のさらなる評価を可能にする(図2f)。クマリニルメチルプロトンのブロードダブレットのダウンフィールドシフト(図2g)及びアリルプロトンと新たに形成されたヒドロキシメチル基の空間的カップリングによるトリプレットの出現(図2h)は、光脱ケージ化反応を確認する。より興味深いことに、NMRチューブでUV光を照射した光脱ケージ化サンプルは白色光の発光を示し、これは図2iに示すようにバンドパスフィルターを用いて個々の色に分解することができる。PCBと比較すると白色光の発光はその単純な分子構造により促進されるヒドロキシメチルクマリンのH-型凝集物及びエキシマーの形成に起因する。同様に、PCBBの光脱ケージ化は時間依存性のUV-Vis吸収スペクトルを用いて特徴付けできる(図６)。しかしながら、PCBB光脱ケージ化の速度論は、PCBのそれよりも遅いと思われ、これは光SN1反応中に形成されたカルボカチオンの安定性の相違のためである(図2a)。換言すると、最初のPCBの光脱ケージ化は、PCBBの光脱ケージ化中に形成されたカルボカチオンよりも安定である7-ヒドロキシ-クマリニルメチルカルボカチオンの形成の原因となる。PUNPの光脱ケージ化を評価するために,本発明者はXeランプから340nmの光を照射した後でPUNPのSEMイメージを記録及び分析した。興味深いことに、本発明者は大部分のSEMサンプルにおいて大きなスフェロイドナノ構造というよりむしろ断片化されたナノ粒子を観察した(図７)。PCB及びPCBBの光脱ケージ化特性及び光照射したPUNPサンプルのSEMイメージにおける小さいナノ構造の形成は、PUNPの光脱ケージ化を示唆する。MR及び蛍光造影剤の組み合わせは、in vivo 及びin vitroでのMRI及び蛍光イメージを得ることを可能にする。最初に、本発明者はin vivo.で適用する前に培養ヒト細胞及びマウス細胞におけるPUNPの二峰性特性及び細胞毒性効果を試験した。本発明者はアラトスタチン I（昆虫に存在するペプチドホルモン）及びcrustaceanをエンドサイトーシス機序として使用した。アラトスタチンはビオチンの3-スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いてビオチン化し、次いで1:5のモル比(PUNP:アラトスタチン)でPUNPのストレプトアビジン部分と複合体化した。アラトスタチンのビオチン化及びPUNPの生物複合体化の詳細な手順が実施例に示される。60%コンフルエンスまで培養されたマウスメラノーマ細胞(B16)はフェノールレッド又はウシ胎児血清(FBS)を含まないダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)に5nM PUNP-アラトスタチン複合体を含む溶液で1時間4℃でインキュベートされ、PBSで３回洗浄され、5 nMの核染色色素syto 21の溶液で１０分間処理された。処理後、細胞をPBSで３回洗浄し、培地を10% FBSを添加したDMEMと交換した。B16細胞におけるPUNPの細胞内送達は蛍光顕微鏡を用いて詳細に研究した。イメージングに用いた励起光源はsyto 21及びQDについて400 nm fsレーザであり、QD単独の場合532 nm cwレーザであった。図3aは400nmで励起して得られたB16細胞の蛍光イメージ及び580nmロングパスフィルターで集めた蛍光シグナルを示す。細胞の核は緑色蛍光syto 21の蛍光テーリングのためにオレンジに見え、細胞質の赤色蛍光は細胞内PUNPのためである。図3bは400nmで励起し、syto21について510-550nmの光学バンドパスフィルター及びPUNPについて580nmロングパスフィルターで蛍光シグナルを集めることにより得られたイメージのオーバーレイ・イメージを示す。図3cは光透過及び蛍光イメージのオーバーレイを示し、これはB16細胞におけるPUNPのエンドサイトーシスを明瞭に示す。細胞の広い領域の蛍光イメージが図８a-cに示されている。本発明者はさらにPUNPのアラトスタチン介在エンドサイトーシスとQDのEGF-介在エンドサイトーシスの効率を比較した。図3dはQD-EGF複合体で処理されたヒト肺上皮腺がん細胞(H1650)のオーバーレイ蛍光イメージを示す。図3dにおいて、核はsyto21のために緑色に見え(図3e)及び細胞質の赤色蛍光は細胞内QDに起因する。図3fは光透過及び蛍光イメージのオーバーレイを示し、これはH1650細胞における有効な細胞内送達を示す。他方、QD又はPUNPのEGF複合体はB16細胞のEGFR受容体の発現が低いので効果的に送達されない。ナノ材料の毒性は生物学的適用に決定的に重要である。QD-ベースの蛍光マーカーは、バイオイメージングで汎用されているが、QDの細胞毒性は問題なしとはされていない。最近の研究では、非保護CdSe QDの空気酸化及び光に暴露されたときのカドミウムイオンの浸出を示し、これはZnS及びポリマーシェルを用いた表面保護により抑制されることが示された。ポリエチレングリコール(PEG)-及びZnS-被覆されたCdSe QD及びPEG-被覆されたFe3O4 NPはPUNPに含まれるが、本発明者はMTTアッセイを用いて細胞増殖の抑制を測定することによりQD, Fe3O4 NP,PUNP及び光脱ケージ化生成物の細胞毒性をさらに評価した。
【００４６】
MTTアッセイにおいて、細胞により取り込まれる黄色のテトラゾリウム塩は、代謝的に生存している細胞の細胞質中のNADP/H-依存性酸化還元酵素による還元の結果として紫色のホルマザンに変換される。このように、細胞内ホルマザンの光学密度は細胞増殖又は細胞生存度を直接測定する。MTTアッセイの詳細な手順は実施例に記載される。ここで、Fe3O4 NP(図3g), CdSe/ZnS QD(図3h),PUNP(図3i),PCB(図9a),PCBB(図9b)及び光生成物(図9c)の細胞毒性アッセイは、ナノモルからマイクロモルの濃度範囲での90%を超える細胞生存度を示し、これはPUNP及びその成分と光生成物の非毒性の性質を示唆する。二峰性イメージングプローブであるPUNPの可能性を評価するために、本発明者はPUNP-アラトスタチン複合体で処理された細胞のMRI及び蛍光イメージを記録した。90%コンフルエンスのB16細胞をフェノールレッド又はFBSを含まないDMEMに5nMの複合体溶液で1時間4℃でインキュベートされる。細胞は、PBSで３回洗浄され、トリプシンを用いて収穫され、FEBを補足したDMEM培地で３回洗浄され、次いで遠心分離された。図3j及び3kはPUNP-アラトスタチン複合体を用いた(i)標識無し及び(ii)標識有りのB16細胞ペレットの明視野及び蛍光イメージを示す。
【００４７】
個々の細胞(図3a)及び細胞ペレット(図3k)の蛍光イメージは、PUNPにより提供される蛍光手段が有効であることを示す。さらに,図3l及び3mはFe3O4 NP(i),PBS(ii),PUNPで標識された(iii)及び標識されていない(iv)T1及びT2強調MRIを示す。T2強調MRIにおける標識細胞の暗いコントラストは、より長いエコー時間(TE)及び繰り返し時間(TR)におけるPUNPのコントラスト増強に起因する。図1f及び3mに示されるPUNPにより提供されるMRIコントラストは、T2強調MRIで輝いて見える脂質/水/脂肪分子から標識細胞を区別する。
【００４８】
PUNPの二峰性特性をさらに評価するために、本発明者はPUNP.を皮下投与又は静脈内投与したC57BL/6(B6)マウスのin vivo MRI及び蛍光イメージを得た。最初に、麻酔はペントバルビタールナトリウム(40mg kg-1)を腹腔内投与することで行った。麻酔に続いて、QD, Fe3O4 NP, PUNP及びPBSの10nM溶液を図4a-bに示すようにB6マウスの異なる場所に皮下投与した。バンドパスフィルター光(Xeランプからの黄緑光)で励起することで注射直後にIn vivo蛍光イメージを集めた。580nmロングパスフィルターで集めたマウスの写真は、QD(コントロール)又はPUNPが注射された場所から高いS/N比で蛍光シグナルを示す(図4a)。同様に,マウスのT1強調MRIは、Fe3O4NP(コントロール)又はPUNP(図4b)を注射した領域における皮下コントラスト増強を示す。さらに、肝臓のような深部臓器におけるPUNPの蛍光及びMRIコントラスト検出の可能性を試験するために、本発明者はPUNP(10nM,250μL)を上記と異なるC57BL/6(B6)マウスの静脈内に注射し、注射後の種々の時間でMRI及び蛍光イメージを得た。図4c-fに示されるように、t=0からt=24hで得られるマウスのT1強調MRIは肝臓でのコントラスト増強を示す。興味深いことに、PUNPは注射後30分以内に肝臓に蓄積する。注射後30分で580nmロングパスフィルターにより集めたマウスの蛍光イメージは肝臓領域からのかすかな赤色蛍光(図4i)を示し、これはQDにより提供されるPUNPの蛍光撮影方法による。興味深いことに、図4d-fに示すように、PUNPは徐々に明瞭に肝臓に蓄積し24時間以内の完全に消失する。また、肝臓領域からの赤色蛍光の強度は、時間とともに弱まり、図4jに示されるように24時間以内に完全に消失する。これは図4e及び4fに示されるMRIコントラストの減少及び消失と一致する。
【００４９】
皮下領域からの明るい蛍光と比較して肝臓領域からのPUNPの低い蛍光強度(図4a)は、肝臓のような深部臓器への励起光の低い透過率に起因する。QDの大きな吸収断面と強い蛍光並びにPUNPにおけるFe3O4ナノ粒子の存在は、肝臓からの蛍光及びMRIコントラストの両方の検出を可能にする。にもかかわらず、外部から適用した励起光の内部臓器への低い透過率は注意すべきである。
【００５０】
要約すると、新規光脱ケージ化リガンドを用いて調製した最初の首尾よい光脱ケージ化蛍光-磁性の二峰性ナノ粒子が報告された。ここで、本発明者は粒子の磁性成分及び蛍光成分の両方に結合するリガンドの断片化のための革新的なツールとして光を用いる単純な方法を導入した。光脱ケージ化プロセスは光脱ケージ化リガンドの吸収スペクトル,質量スペクトル及びNMRスペクトルの規則的な変化並びに粒子のSEMイメージを観察することにより明らかにされる。ペプチドホルモンの二峰性ナノ粒子への複合体化により調製されたナノ粒子又はその成分又は光生成物は、MTTアッセイにより毒性を示さなかった。光脱ケージ化ナノ粒子はメラノーマ細胞及びB6マウスのMRI及び蛍光イメージングを組み合わせた二峰性造影剤として応用できる。皮下又は静脈内の光脱ケージ化ナノ粒子を注射したB6マウスのIn vivo蛍光イメージング及びMRIは、皮下及び肝臓での蛍光及び磁性コントラスト増強を示した。光脱ケージ化ナノ粒子は多様なバイオイメージングプローブだけでなくバイオイメージング又は治療後に生物系に残されたナノ材料のオンデマンドクリアランスに興味深く、評価する価値のあるものである。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
【００５２】
材料及び方法:
全ての試薬及び溶媒は分析グレードのものを使用し、さらに精製することなく使用した。CdSe/ZnS QD(PL 最大約605 nm)はインビトロジェン社から購入した。Fe3O4ナノ粒子はNANOCS社から購入した。4-クロロレゾルシノール,エチル-4-クロロアセトアセテート,メタンスルホン酸,ビオチン及び1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)はSigma Aldrich社から購入した。K2CO3及び1,3-ジブロモプロパンは東京化成工業から購入した。
【００５３】
1H及び13C NMR測定はJEOL 400MHz spectrometerで行った。MALDI/LDI-TOF質量測定はα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸をマトリクスとして用いてBRUKER Microflexにより行った。標識細胞の蛍光イメージは40X対物レンズ(Olympus-LUCPlanFl),a2.5X望遠レンズ,PUNP及びsyto21色素用のバンドパス／ロングパスフィルター,及び電子増倍型CCD(EMCCD, Andor Technology)又はCCDカメラ(Olympus)を備えた倒立光学顕微鏡(Olympus IX70)を用いて行った。蛍光イメージングに使用される励起光源は400又は532nmレーザであった。FESEMイメージは10μA及び15kVで作動するJSM-6700FZ(JEOL)顕微鏡を用いて得た。MRIデータは小動物イメージングMRI装置(MR Technology, Inc., Tsukuba, Japan)を用いて得た。B16細胞ペレット及びB6マウスの蛍光イメージはMaestero小動物イメージングシステム(Perkin Elmer)を用いて記録した。細胞ペレット及びマウスのMRI及び蛍光イメージはMaestroソフトウェア(Cambridge Research & Instrumentation, Inc.)及びImage-Pro Plusソフトウェア(Roper Industries, Inc., Sarasota, FL, USA)を用いて解析した。
【００５４】
化合物1の合成:
4-クロロレゾルシノール(14.4g,100mmol)及びエチル-4-クロロアセトアセテート(19.9g,120mmol)をメタンスルホン酸(160mL)に溶解した混合物を室温で4h撹拌し、次いで氷冷水に注いで一定の撹拌を1h行った。沈殿物を濾過し、氷冷水で洗浄し、減圧下に乾燥して所望の生成物(22g,90%)を得た。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=4.99 (s, 2H), 6.49 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 7.8 (s, 1H), 11.5 (s, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ= 59.70, 104.30, 108, 111.90, 112.30, 117.30, 126, 153.89, 156.84, 160.63; FT-IR, (νmax)= 3297, 1702, 1611, 1553, 1504, 1430, 1399, 1342, 1291, 1170, 1138, 1068, 1036, 941, 891, 738, 643, 534 cm-1; MALDI-TOF (C10H6Cl2O3), m/z=245. 15 
【００５５】
化合物2の合成:
1,3-ジブロモプロパン(10mL,98.95mmol)中で超音波照射しながら調製された化合物1(2.4g,9.8mmol)の懸濁液にDBU(1.5mL,10.05mmol)を加え、150℃で30分間加熱した。生成物をジクロロメタン(DCM)を用いて抽出し、抽出液を希HClで洗浄してDBUを除去した。粗生成物を溶出液としてDCMを用いるシリカゲル(200-400mesh)カラムクロマトグラフィーにより精製し、収率65%で化合物2を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ= 2.40 (m, 2H), 3.62 (t, 2H), 4.20 (t, 2H), 4.56 (s, 2H), 6.40 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 7.6 (s, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ= 29.80, 31.90, 41.10, 67.50, 102.30, 111.34, 113.68, 120, 125, 149.00, 154, 157, 160; FT-IR, (νmax)= 1731, 1607, 1552, 1505, 1464, 1416, 1369, 1288, 1208, 1152, 1206, 1152, 1036, 909, 871, 771, 724, 602, 534 cm-1; MALDI-TOF (C13H11BrCl2O3), m/z=365. 
【００５６】
化合物3の合成:
化合物1(1.5g,6.25mmol)のエタノール懸濁液に乾燥エタノール中のビオチン(1g, 4.08 mmol)とDBU (700 μL, 4.69 mmol)の混合物を加え、反応混合物を4h加熱撹拌した。ヘキサンを添加して化合物3を沈殿させた。粗生成物は酢酸エチル中の2%メタノールを溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー(200-400mesh)により精製し、収率50%で化合物3を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ= 1.36 (m, 2H), 1.60 (m, 4H), 2.46 (t, 2H), 2.80 (d, 1H), 2.84 (d, 1H), 3.08 (m, 1H), 4.13 (m, 1H), 4.29 (m, 1H), 5.36 (s, 2H), 6.23 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.93 (s, 1H), 7.75 (s, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ= 25, 28.54, 33.45, 43.33, 55.20, 59.42, 62.22, 74.20, 92.88, 104.32, 110.60, 117.66, 125.38, 150.64, 154.15, 157.66, 161.87, 163.98, 173.80; FT-IR, (νmax)= 3230, 3059, 2932, 1714, 1600, 1405, 1316, 1260, 1162, 1032, 952, 876, 838, 700, 554 cm-1; MALDI-TOF (C20H21ClN2O6S), m/z= 453. 
【００５７】
化合物 4の合成: 
ビオチン (1 g, 4.08 mmol), 1,3-ジブロモプロパン (1.3 mL, 12.86 mmol) 及び DBU (1.85 mL, 12.40 mmol)をアセトニトリル (100 mL)に溶解した混合物を3時間加熱撹拌した。ヘキサンを添加することにより化合物 4を沈殿させた。粗生成物はDCM を溶出液として用いたシリカ ゲル (200-400 mesh)カラム クロマトグラフィーにより精製し、収率80%で化合物 4を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ= 1. 46 (m, 2H), 1.70 (m, 4H), 2.18 (m, 2H), 2.35 (t, 2H), 2.74 (m, 1H), 2.94 (m, 1H), 3.16 (m, 1H), 3.47 (t, 2H), 4.21 (t, 2H), 4.34 (m, 1H), 4.56 (m, 1H), 5.16 (s, 1H), 5.56 (s, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ= 29, 32.5, 34, 36, 38, 45, 53, 59, 64.5, 66.5, 101, 167, 178; FT-IR, (νmax)= 3241, 2941, 2843, 1736, 1474, 1418, 1362, 1324, 1262, 1223, 1195, 1115, 994, 859, 752, 728, 662, 624, 569, 544 cm-1; MALDI-TOF (C13H21BrN2O3S), m/z= 365. 16
【００５８】
化合物 2から化合物 5の合成: 
化合物 2 (1g, 2.75 mmol), ビオチン (2 g, 8.2 mmol) 及び K2CO3 (1.2 g, 8 28mmol)の混合物をDMFに懸濁し、1時間還流した。反応混合物にクロロホルムを添加することにより未反応のビオチン及びK2CO3 を沈殿させて除去した。次いで、氷冷水を添加することにより化合物 5を沈殿させた。粗生成物は、水で徹底的に洗浄し、減圧下デシケータで乾燥して収率約30%で所望の生成物を得た。
【００５９】
化合物 3 及び 4からの化合物 5の合成: 
化合物 3 (1 g, 2.20 mmol), 化合物 4 (0.9 g, 2.47 mmol) 及び K2CO3 (1g, 7.7 mmol)の混合物をDMFに懸濁し、6時間還流した。固体を濾過により除き、氷冷水をろ液に加えることにより、生成物を沈殿させた。粗生成物を徹底的に水で洗浄し、減圧下デシケータで乾燥して収率約50%で所望の生成物を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ= 1.36 (m, 4H), 1.63, (m, 8H), 2.11 (m, 2H), 2.31 (t, 2H), 2.46 (m, 2H), 2.59 (m, 2H), 2.81 (m, 2H), 3.07 (m, 2H), 3.30 (t, 2H), 4.13 (m, 2H), 4.23 (t, 2H), 4.3 (m, 2H), 5.36 (s, 2H), 6.32 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 6.40 (s, 1H), 6.43 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 8.23 (s, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ= 25, 28, 33.6, 56, 60, 61.6, 67, 103, 118.7, 126, 144, 150.1, 154, 157, 160, 163, 173, 177; FT-IR, (νmax)= 3248, 3091, 2920, 2848, 2365, 3091, 1737, 1694, 1612, 1550, 1507, 1464, 1414, 1386, 1336, 1279, 1205, 1165, 1065, 887, 772, 734, 689, 602, 545; MALDI-TOF (C33H41ClN4O9S2), m/z= 737。
【００６０】
PUNPの作製: 
PUNPの作製は、2工程で行った。第1の工程では、ストレプトアビジン-複合体化Fe3O4 NPの200 nM水溶液(50 μL)とPCBB の20μM DMSO溶液 (50 μL)を混合することによりPCBBの末端に存在するビオチン部分をストレプトアビジン官能化Fe3O4 NPと複合体化させた。この混合物を37 ℃で2時間インキュベートし、未反応のPCBBを2 KDaの透析膜を用いて透析により除去した。第2の工程では、50μLの Fe3O4 NP のPCBB 誘導体をQD 溶液(50μL, 100 nM)に5回に分けて添加し、次いで 37℃で2時間インキュベートすることで、第1工程で調製されたFe3O4 NPのビオチン誘導体をストレプトアビジンでコーティングされたCdSe/ZnS QDと複合体化した。この複合体化は光脱ケージ化 PCBB 分子により架橋されたPUNPを生じた。
【００６１】
PUNP-アラトスタチン 複合体の調製: 
凍結乾燥したアラトスタチン (Genscript Corporation)を滅菌 水中で0.75 mM 溶液に再構成し、ビオチン-3-スルホ-NHS エステルの15 mM 水溶液を用いて25℃で1時間ビオチン化した。ビオチン化 アラトスタチンをsephadex G-25 カラム(Sigma)上のゲル濾過により精製し、滅菌濾過水で250 nM (100 mL) 溶液に希釈し、PUNPの50 nM水溶液 (100 μL)と25 ℃で30分間反応させて、PUNP-アラトスタチン複合体を得た。
【００６２】
細胞毒性 アッセイ: 
CdSe/ZnS QD, Fe3O4 NP, PCB, PCBB, PUNP 及び 光脱ケージ化生成物の細胞毒性は、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムクロリド（MTT）細胞増殖キット(Roche Diagnostics)を用いた MTTアッセイにより評価した。ここで、約1x106ヒト上皮肺腺がん細胞(H1650)を10%FBSを補足したDMEMを含む96-ウェル組織培養プレート(FALCON)に接種し、48時間37℃で培養した。次いで、細胞をPBSで十分に洗浄し、培地を種々の濃度のクマリニルメチルアルコール(0.1 μM to 10 μM), PCB (0.01μM to 1 μM), PCBB (0.01μM to 1 μM), Fe3O4 NP (1 nM to 100 nM), CdSe/ZnS QD (0.1 nM to 10 nM), 又は PUNP (0.1 nM to 10 nM)を含むDMEMと交換した。24時間の培養後、細胞をPBSで3回洗浄し、MTT溶液(10 μL, 5 mg/mL)で4時間処理した。処理された細胞を0.01M HCl(100 μL/well)中の10%SDSを添加して溶解し、終夜インキュベートした。MTTから形成したホルマザンの吸光度をマイクロプレートリーダーで550nmで測定し、細胞生存度を処理細胞で生成したホルマザンの吸光度をコントロール細胞の吸光度と比較することにより決定した。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の複合体は、PET、CT、MRIなどの造影剤として有用である。この造影剤は、抗腫瘍抗体、疾患マーカーなどとして生体に適用した後、光切断されて除去される。
【００６４】
抗EGFR抗体、抗-PSMA抗体, trastuzumab, rituximabなどのようながん特異的抗体を結合したイメージングプローブと薬物の複合体化は、リンパ腫、乳癌、前立腺がんなどのがん治療に有用である。このようなイメージングプローブと薬物の複合体の適用後に薬物の放出、イメージングプローブの除去が可能である。
【００６５】
薬物は、金、ポリマーリポソームなどのナノ粒子に本発明の化合物を介して結合させることができる。このナノ粒子は局所的に濃縮でき、光開裂により局所的に放出させることが可能である。
【００６６】
アプタマー、Bortezomib, RGDペプチド, 葉酸などは本発明の化合物を介して複合体に結合されて、部位特異的に放出され得る。
【００６７】
光力学的及び光熱的治療薬は、複合体化され、異なる励起光(400/800 nm)により開裂、除去される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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