(57)【要約】      （修正有）【課題】深海エビであるオプロフォーラス（Oplophorus  gracilirostris）由来のルシフェラーゼの細胞外への分泌型の新規変異体の提供。【解決手段】オプロフォーラスルシフェラーゼにおいて発光を触媒する分子量19kDa蛋白質の既知の変異体（nanoKAZ）の変異部位について検証をおこない、変異の選択及び組合せによりセレンテラジンを発光基質としてより活性が高く、動物培養細胞内で発現したときに真核細胞生物由来の分泌シグナル配列の有無にかかわらず細胞外へ分泌するルシフェラーゼ変異体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）または（b）に記載のルシフェラーゼ変異体：
（a）配列番号：2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体；
（b）配列番号：2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換され、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
【請求項２】
前記（b）のルシフェラーゼ変異体が、以下の（c）に記載のものである、請求項1に記載のルシフェラーゼ変異体：
（c）配列番号：2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換され、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜16個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
【請求項３】
前記4番目のアミノ酸がグルタミン酸からアラニン、前記11番目のアミノ酸がアルギニンからグルタミン、前記18番目のアミノ酸がロイシンからグルタミン、および前記27番目のアミノ酸がバリンからロイシンに置換されている請求項1または2に記載のルシフェラーゼ変異体。
【請求項４】
前記（a）または（b）のルシフェラーゼ変異体が、それぞれ以下の（d）または（e）のルシフェラーゼ変異体である請求項1に記載のルシフェラーゼ変異体：
（d）配列番号：4のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体；
（e）配列番号：4のアミノ酸配列において、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
【請求項５】
前記（e）のルシフェラーゼ変異体が、以下の（f）のルシフェラーゼ変異体である請求項4に記載のルシフェラーゼ変異体：
（f）配列番号：4のアミノ酸配列において、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜16個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項6記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項7記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
【請求項９】
請求項8記載の形質転換体を培養し、請求項1〜5のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体を生成させる工程を含む、請求項1〜5のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体の製造方法。
【請求項１０】
請求項1〜5のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体、請求項6記載のポリヌクレオチド、請求項7記載の組換えベクターおよび請求項8記載の形質転換体から選択される少なくとも１つを含む、キット。
【請求項１１】
さらにルシフェリンを含む、請求項10記載のキット。
【請求項１２】
ルシフェリンがセレンテラジン類である、請求項11記載のキット。
【請求項１３】
セレンテラジン類がセレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンである、請求項12記載のキット。
【請求項１４】
請求項1〜5のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを接触させることを含む、発光反応を行う方法。
【請求項１５】
ルシフェリンがセレンテラジン類である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
セレンテラジン類がセレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
請求項6記載のポリヌクレオチドをレポーター遺伝子として用い、当該レポーター遺伝子がコードするルシフェラーゼ変異体をルシフェリンに接触させることを含む、プロモーター制御に関与する配列の活性を測定する方法。
【請求項１８】
ルシフェリンがセレンテラジン類である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
セレンテラジン類がセレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンである、請求項18記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エビルシフェラーゼの触媒ドメイン蛋白質の変異遺伝子とその使用方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
深海エビオプロフォーラス（Oplophorus gracilirostris）由来のルシフェラーゼは、体外へ放出される分泌型ルシフェラーゼであり、発光基質はセレンテラジンである（特許文献1、非特許文献1）。オプロフォーラスルシフェラーゼは分子量35 kDaの蛋白質と19 kDaの蛋白質より構成される106 kDa蛋白質である（非特許文献2）。オプロフォーラスルシフェラーゼにおいて、発光を触媒するドメインは、19 kDa蛋白質にある（非特許文献２）。オプロフォーラスルシフェラーゼと他の海洋性由来のルシフェラーゼと比較すると、基質の特異性が広く、セレンテラジン類縁体も良い発光基質になることが知られている（非特許文献3）。また、発光触媒機能をもつ19 kDa蛋白質の基質特異性も、オプロフォーラスルシフェラーゼのそれと一致している（非特許文献4）。
【０００３】
近年、19kDa蛋白質へのアミノ酸の16カ所の変異導入により、天然19kDa蛋白質より約10倍高い発光活性を示す変異19kDa蛋白質が開示され、アミノ酸コドンの異なる同一19kDa変異体をnanoKAZあるいはnanoLucと命名された。この変異体は、細胞外分泌シグナルペプチド配列を付加することにより、細胞外へ分泌発現することが示された（特許文献2、非特許文献5、6）。さらに、16ヶ所のアミノ酸変異について、詳細に検討が行なわれた結果、3カ所のアミノ酸（V44I、A54IおよびY138I）の変異導入した変異体（eKAZと命名）は、セレンテラジンが良い基質となることが示された。しかし、eKAZは 細胞外へ効率良く分泌しないことも示された（非特許文献7）。
【０００４】
一方、nanoKAZあるいはnanoLucにおいて、天然型セレンテラジンが良い基質とはならず、疎水性の高いbis-セレンテラジン、6h-f-セレンテラジン等がよい基質になることが示されている（非特許文献6）。しかし、これらの疎水性が高いセレンテラジンは、細胞膜透過性に優れているため、細胞外への分泌を可視化する場合、発光のバックグラウンドが高くなる原因になり、長時間のイメージングができない。このことから、分泌型ルシフェラーゼであり、天然型セレンテラジンがより良い基質となり、nanoKAZと同等の発光能力を持つ変異分泌型ルシフェラーゼが求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許4613441号明細書
【特許文献２】特表2012-525819号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】O. Shimomura et al. (1978) Biochemistry 17: 994-998.
【非特許文献２】S. Inouye et al. (2000) FEBS Lett. 481: 19-25.
【非特許文献３】S. Inouye & O. Shimomura (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 233: 349-353.
【非特許文献４】S. Inouye & S. Sasaki (2007) Protein Express. Purif. 56: 261-268.
【非特許文献５】M. P. Hall et al. (2012) ACS Chem. Biol. 7: 1848-1857.
【非特許文献６】S. Inouye et al. (2013) Biochem. Biophys. Res. Commun. 437: 23-28.
【非特許文献７】S. Inouye et al. (2014) Biochem. Biophys. Res. Commun. 445: 157-162.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記状況の下に、従来のものとは異なるルシフェラーゼが求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、既知の変異19kDa発光触媒蛋白質の変異部位について検証をおこない、変異の選択および組合せにより、セレンテラジンを発光基質として、既知の変異19kDa発光触媒蛋白質（nanoKAZあるいはnanoLuc）より活性が高く、動物培養細胞内で発現したときに真核細胞生物由来の分泌シグナル配列の有無にかかわらず細胞外へ分泌するルシフェラーゼ変異体などを創出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のルシフェラーゼ変異体、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、ルシフェラーゼ変異体の製造方法、キット、発光反応を行う方法などを提供する。
[1]以下の（a）または（b）に記載のルシフェラーゼ変異体：
（a）配列番号：2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体；
（b）配列番号：2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換され、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
[2]前記（b）のルシフェラーゼ変異体が、以下の（c）に記載のものである、上記[1]に記載のルシフェラーゼ変異体：
（c）配列番号：2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換され、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜16個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
[3]前記4番目のアミノ酸がグルタミン酸からアラニン、前記11番目のアミノ酸がアルギニンからグルタミン、前記18番目のアミノ酸がロイシンからグルタミン、および前記27番目のアミノ酸がバリンからロイシンに置換されている上記[1]または上記[2]に記載のルシフェラーゼ変異体。
[4]前記（a）または（b）のルシフェラーゼ変異体が、それぞれ以下の（d）または（e）のルシフェラーゼ変異体である上記[1]に記載のルシフェラーゼ変異体：
（d）配列番号：4のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体；
（e）配列番号：4のアミノ酸配列において、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
[5]前記（e）のルシフェラーゼ変異体が、以下の（f）のルシフェラーゼ変異体である上記[4]に記載のルシフェラーゼ変異体：
（f）配列番号：4のアミノ酸配列において、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜16個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
[6]上記[1]〜[5]のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
[7]上記[6]記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
[8]上記[7]記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
[9]上記[8]記載の形質転換体を培養し、上記[1]〜[5]のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体を生成させる工程を含む、上記[1]〜[5]のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体の製造方法。
[10]上記[1]〜[5]のいずれか1つに記載のルシフェラーゼ変異体、上記[6]記載のポリヌクレオチド、上記[7]記載の組換えベクターおよび上記[8]記載の形質転換体から選択される少なくとも１つを含む、キット。
[11]さらにルシフェリンを含む、上記[10]記載のキット。
[12]ルシフェリンがセレンテラジン類である、上記[11]記載のキット。
[13]セレンテラジン類がセレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンである、上記[12]記載のキット。
[14]上記[1]〜[5]のいずれか1つに記載のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを接触させることを含む、発光反応を行う方法。
[15]ルシフェリンがセレンテラジン類である、上記[14]記載の方法。
[16]セレンテラジン類がセレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンである、上記[15]記載の方法。
[17]上記[6]記載のポリヌクレオチドをレポーター遺伝子として用い、当該レポーター遺伝子がコードするルシフェラーゼ変異体をルシフェリンに接触させることを含む、プロモーター制御に関与する配列の活性を測定する方法。
[18]ルシフェリンがセレンテラジン類である、上記[17]記載の方法。
[19]セレンテラジン類がセレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンである、上記[18]記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、従来のものとは異なるルシフェラーゼ変異体を提供する。本発明の好ましい態様のルシフェラーゼ変異体は、セレンテラジン類を発光基質として天然型19 kDa蛋白質及び／又は既知の変異19kDa発光触媒蛋白質よりも高活性を示すこと、動物細胞内で発現したときに真核細胞生物由来の分泌シグナル配列の有無にかかわらず細胞外に分泌する新たなルシフェラーゼ変異体を創出し、本発明の完成に至ったこと。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】N末端領域に変異を導入したnanoKAZ遺伝子の模式図を示す図である。記載してある番号は、アミノ酸変異位置を示す。
【図２】pCold-ZZ-Pベクターを用いてnanoKAZ変異蛋白質を発現した大腸菌粗酵素液のSDS-PAGE分析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
1．本発明のルシフェラーゼ変異体
本発明のルシフェラーゼ変異体とは、オプロフォーラスルシフェラーゼの分子量19kDaの蛋白質の変異体である。具体的には、本発明のルシフェラーゼ変異体は、配列番号：2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体と実質的に同質の活性を有するルシフェラーゼ変異体を意味する。
【００１４】
「実質的に同質の活性」とは、ルシフェラーゼ活性、動物細胞内で発現したときに、真核細胞生物由来の分泌シグナル配列の有無にかかわらず細胞外に分泌する活性などから選択される少なくとも１つの活性を意味する。
【００１５】
「ルシフェラーゼ活性」とは、ルシフェリン（例えば、セレンテラジン類）を基質とする発光活性、すなわち、ルシフェリン（例えば、セレンテラジン類）が酸素分子で酸化されてオキシルシフェリンが励起状態で生成する反応を触媒する活性、を意味する。なお、励起状態で生成したオキシルシフェリンは可視光を発して基底状態となる。
【００１６】
このような活性は、例えば、Inouye, S. & Shimomura, O. (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 233,349-353に記載の方法によって測定することができる。具体的には、本発明のルシフェラーゼ変異体をルシフェリンと混合することにより発光反応を開始させ、発光測定装置を用いて発光触媒活性を測定することができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えばLuminescencer−PSN AB2200(アトー社製)、またはCentro 960 luminometer (ベルトール社製)を使用することができる。
【００１７】
本発明で用いられるルシフェリンとしては、本発明のルシフェラーゼ変異体の基質となるルシフェリンであればよい。本発明で用いられるルシフェリンとしては、具体的にはイミダゾピラジノン環を主骨格とするセレンテラジン類が挙げられる。
【００１８】
セレンテラジン類は、セレンテラジンまたはその類縁体のことを意味する。セレンテラジン類縁体としては、例えば、bis−セレンテラジン、deoxyfurane-セレンテラジン(フリマジン(furimazine))、h−セレンテラジン、hcp−セレンテラジン、cp−セレンテラジン、f−セレンテラジン、fcp−セレンテラジン、n−セレンテラジン、MeO−セレンテラジン、e−セレンテラジン、cl−セレンテラジンch−セレンテラジン、3iso-セレンテラジン、3meo-セレンテラジン、cf3-セレンテラジン、i-セレンテラジン、et-セレンテラジン、me-セレンテラジン、3me-セレンテラジン、αmeh-セレンテラジン 8-(1-naphthyl)-セレンテラジン、8-(2-naphthyl)-セレンテラジン、8-(2-thienyl)-セレンテラジン、6,8-di(2-thienyl)-セレンテラジン、8-(4-hydroxyphenyl)-セレンテラジン、8-(2-benzothienyl)-セレンテラジン、8-(b-styryl)-セレンテラジン、8-phenyl-セレンテラジン、6-deoxy-セレンテラジン、8-(3-thienyl)-セレンテラジン、および8-(3-benzo[b]thienyl)-セレンテラジンがあげられる。セレンテラジン類の中でも、本発明では、セレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンが特に好ましい。
【００１９】
これらのセレンテラジン類は、公知の方法で合成してもよく、あるいは、市販のものを入手することもできる。
【００２０】
セレンテラジン類の合成方法としては、例えば、Shimomura et al. (1988) Biochem. J. 251, 405-410、Shimomura et al. (1989) Biochem. J. 261, 913-920、Shimomura et al. (1990) Biochem. J. 270, 309-312、Nakamura et al. (1997) Tetrahedron Lett. 38:6405-6406、WO2010/090319号公報、もしくはInouye et al.(2010) Anal. Biochem.407, 247-252に記載の方法またはそれに準ずる方法が挙げられる。また、フリマジンは、Hall et al. (2012) ACS Chem. Biol. 16; 848-1857に記載の方法により製造することができる。
【００２１】
また、セレンテラジン類の市販品に関しては、例えば、JNC株式会社製のセレンテラジン、cf3-セレンテラジンおよびh−セレンテラジン；ビオチウム(Biotium)社製のhcp−セレンテラジン、cp−セレンテラジン、f−セレンテラジン、fcp−セレンテラジンおよびn−セレンテラジン；ならびにプロメガ社製のセレンテラジン、フリマジンおよびh-セレンテラジンを挙げることができる。
【００２２】
「ルシフェリンを基質とする発光触媒活性」は、好ましくは、セレンテラジン類を基質とする発光触媒活性である。「セレンテラジン類を基質とする発光触媒活性」は、好ましくは、セレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンを基質とする発光触媒活性である。
【００２３】
「動物細胞内で発現したときに真核細胞生物由来の分泌シグナル配列の有無にかかわらず細胞外へ分泌する活性」とは、動物細胞内で発現したときに、真核細胞生物由来の分泌シグナルを持たない場合、その発現蛋白質が、小胞体からトランス−ゴルジネットワークを経由せずに細胞外へ分泌することを意味する。「細胞外へ分泌する」とは、具体的には、発現蛋白質のうち、5%以上、10%以上または20%以上の量(重量)の蛋白質が細胞外へ分泌することを意味する。「動物細胞」は、具体的には、後述のものが挙げられる。
【００２４】
「配列番号：2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体」は、例えば、下記の（a）または（b）に記載のルシフェラーゼ変異体である。
【００２５】
（a）配列番号：2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体；
（b）配列番号：2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換され、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
【００２６】
上記（a）および（b）において「配列番号：2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換され」るとは、配列番号:2のアミノ酸配列中の4番目、11番目、18番目および26番目の位置から選択されるアミノ酸残基の置換があることを意味する。
【００２７】
前記配列番号：2のアミノ酸配列における4番目のグルタミン酸と置換する他のアミノ酸は、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンであり、好ましくは、アラニンである。
前記配列番号：2のアミノ酸配列における11番目のアルギニンと置換する他のアミノ酸は、例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、システイン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸であり、好ましくは、グルタミンである。
前記配列番号：2のアミノ酸配列における18番目のロイシンと置換する他のアミノ酸は、例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸であり、好ましくは、グルタミンである。
前記配列番号：2のアミノ酸配列における27番目のバリンと置換する他のアミノ酸は、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンであり、好ましくは、ロイシンである。
【００２８】
配列番号：2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換される場合、最も好ましくは、4番目がアラニン、11番目がグルタミン、18番目がグルタミン、および27番目がロイシンに置換されている。
【００２９】
上記（b）において「1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸と置換した」とは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の置換があることを意味する。
【００３０】
上記「1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸と置換した」における「1〜複数個」の範囲は、例えば、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個（1〜数個）、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個または1個である。置換したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。このような蛋白質は、“Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)”、“Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987−1997)”、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００３１】
配列番号：2のアミノ酸配列における4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外でアミノ酸の置換位置としては、特に限定されないが、例えば、1番目、2番目、3番目、13番目、14番目、15番目、25番目、30番目、36番目、70番目、83番目、106番目、128番目、153番目、156番目、157番目、159番目、162番目、163番目および169番目からなる群から選択される1〜20個、好ましくは1〜16個、より好ましくは、1〜14個、最も好ましくは、1〜12個、より最も好ましくは、1〜9個（1〜数個）の位置をあげることができる。特には、1番目、2番目、3番目、13番目、14番目、153番目、159番目、163番目および169番目からなる群から選択される1〜9個（1〜数個）、好ましくは、1〜8個、より好ましくは、1〜7個、最も好ましくは1〜6個、より最も好ましく1〜5個（5個以下）の位置をあげることができる。
【００３２】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
A群：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、2−アミノブタン酸、o−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
B群：イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸；
C群：アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸；
D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸；
E群：プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン；
F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；
G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００３３】
本発明の好ましい態様のルシフェラーゼ変異体は、配列番号:4のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体である。
【００３４】
本発明のルシフェラーゼ変異体は、さらに他のペプチド配列をN末端および／またはC末端、好ましくはN末端に含んでいてもよい。他のペプチド配列としては、精製のためのペプチド配列、本発明のルシフェラーゼ変異体を可溶性蛋白質として発現するためのペプチド配列、抗体認識可能なエピトープ配列などからなる群から選択される少なくとも1つのペプチド配列を挙げることができる。他のペプチド配列は、好ましくは、精製のためのペプチド配列である。本発明の別の好ましい態様では、他のペプチド配列は、精製のためのペプチド配列、および本発明のルシフェラーゼ変異体を可溶性蛋白質として発現するための配列からなる群から選択される少なくとも1つの配列である。
【００３５】
精製のためのペプチド配列としては、当技術分野において用いられているペプチド配列を使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、例えば、ヒスチジン残基が4残基以上、好ましくは6残基以上連続したアミノ酸配列を有するヒスチジンタグ配列、グルタチオン S−トランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインのアミノ酸配列またはプロテインAのアミノ酸配列などが挙げられる。
【００３６】
本発明のルシフェラーゼ変異体を可溶性蛋白質として発現するためのペプチドとしては、例えば式（Z）nで表されるポリペプチドを挙げることができる。式（Z）nで表されるポリペプチドのアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列は、例えば、特開2008−99669号公報に記載している。
【００３７】
抗体認識可能なエピトープ配列としては、当技術分野において用いられているペプチド配列を使用することができる。
【００３８】
本発明のいくつかの態様のルシフェラーゼ変異体は、さらに他のペプチド配列として、分泌シグナル配列を含まない。「分泌シグナル配列」としては、ガウシアルシフェラーゼの分泌配列などが挙げられる。
【００３９】
本発明のルシフェラーゼ変異体の取得方法については特に制限はない。本発明のルシフェラーゼ変異体としては、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換え蛋白質であってもよい。本発明のルシフェラーゼ変異体を化学合成する場合には、例えば、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t−ブチルオキシカルボニル法）等により合成することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。本発明のルシフェラーゼ変異体を遺伝子組換え技術により作製する場合には、通常の遺伝子組換え手法により作製することができる。より具体的には、本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド（例えば、DNA）を適当な発現系に導入することにより、本発明のルシフェラーゼ変異体を作製することができる。本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド、本発明のルシフェラーゼ変異体の発現系での発現などについては、後記する。
【００４０】
2．本発明のポリヌクレオチド
本発明は、前述した本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明のルシフェラーゼ変異体をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよいが、好ましくはDNAである。DNAとしては、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、細胞・組織由来のcDNA、細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織からtotal RNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction（以下、RT−PCR法と略称する）によって増幅することもできる。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドには、以下のポリヌクレオチドが含まれる。
（i）配列番号：2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；または
（ii）配列番号：2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換され、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００４２】
上記（i）および（ii）のルシフェラーゼ変異体は、前述の通りである。
【００４３】
あるアミノ酸配列に対して、1〜複数個のアミノ酸が置換したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、部位特異的変異導入法（例えば、Gotoh, T. et al., Gene 152, 271−275 (1995)、Zoller, M.J., and Smith, M., Methods Enzymol. 100, 468−500 (1983)、Kramer, W. et al., Nucleic Acids Res. 12, 9441−9456 (1984)、Kramer W, and Fritz H.J., Methods. Enzymol. 154, 350−367 (1987)、Kunkel,T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488−492 (1985)、Kunkel, Methods Enzymol. 85, 2763−2766 (1988)、など参照）、アンバー変異を利用する方法（例えば、Gapped duplex法、Nucleic Acids Res. 12, 9441−9456 (1984)、など参照）などを用いることにより得ることができる。
【００４４】
また目的の変異（欠失、付加、置換および／または挿入）を導入した配列をそれぞれの5’端に持つ1組のプライマーを用いたPCR（例えば、HoS. N. et al., Gene 77, 51 (1989)、など参照）によっても、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。
【００４５】
また欠失変異体の一種である蛋白質の部分断片をコードするポリヌクレオチドは、その蛋白質をコードするポリヌクレオチド中の作製したい部分断片をコードする領域の5’端の塩基配列と一致する配列を有するオリゴヌクレオチドおよび3’端の塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、その蛋白質をコードするポリヌクレオチドを鋳型にしたPCRを行うことにより取得できる。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドとして、好ましくは、配列番号:4のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
配列番号:4のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号:3の塩基配列を含有するポリヌクレオチドを挙げることができる。本発明の他の態様のポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号:3からなる塩基配列を含有するポリヌクレオチドである。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドは、さらに他のペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを、5’末端および／または3’末端、好ましくは5’末端に含んでいてもよい。他のペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、精製のためのペプチド配列、本発明のルシフェラーゼ変異体を可溶性蛋白質として発現するためのペプチド配列、抗体認識可能なエピトープ配列などからなる群から選択される少なくとも1つのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００４８】
精製のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、前記したものなどが挙げられる。
【００４９】
本発明のルシフェラーゼ変異体を可溶性蛋白質として発現するためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば式（Z）nで表わされるポリペプチドを挙げることができる。式（Z）nで表わされるポリペプチドのアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列としては、前記したものなどが挙げられる。
【００５０】
抗体認識可能なエピトープ配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている抗体認識可能なエピトープ配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。
【００５１】
本発明のいくつかの態様のポリヌクレオチドは、さらに他のペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとして、分泌シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含まない。「分泌シグナル配列」としては、前記したものなどを挙げることができる。
【００５２】
3.本発明の組換えベクターおよび形質転換体
さらに、本発明は、上述した本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび形質転換体を提供する。
【００５３】
組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチド(DNA)を連結(挿入)することにより得ることができる。より具体的には、精製されたポリヌクレオチド(DNA)を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結することにより得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウイルス等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド(例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110, pTP5等)、および酵母由来のプラスミド(例えばYEp13, YEp24, YCp50等)があげられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージがあげられる。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、および昆虫ウイルス(例えば、バキュロウイルス)があげられる。また、pCold Iベクター、pCold IIベクター、pCold IIIベクター、pCold IVベクター(以上、タカラバイオ社製)、pcDNA3ベクター、PICZ aベクター(インビトロジェン社製)なども好適に使用することができる。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドは、通常、適当なベクター中のプロモーターの下流に、発現可能なように連結される。用いられるプロモーターとしては、形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、SRαプロモーター、CMVプロモーターなどが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Trpプロモーター、T7プロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合は、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADH1プロモーター、GALプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
【００５５】
また、低温で発現誘導可能なプロモーターも好適に使用することができる。低温で発現誘導可能なプロモーターとしては、例えば、コールドショック遺伝子のプロモーター配列が挙げられる。コールドショック遺伝子としては、例えば、大腸菌コールドショック遺伝子(例えば、cspA、cspB、cspG、cspI、およびcsdA)、Bacillus caldolyticusコールドショック遺伝子(例えば、Bc−Csp)、Salmonella entericaコールドショック遺伝子(例えば、cspE)、およびErwinia carotovoraコールドショック遺伝子(例えば、cspG)が挙げられる。低温で発現誘導可能なプロモーターとしては、なかでも、cspAプロモーター、cspBプロモーター、cspGプロモーター、cspIプロモーター、csdAプロモーターなどを好適に使用することができる。
【００５６】
本発明の組換えベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列(SD配列)、選択マーカーなどを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子があげられる。
【００５７】
形質転換体の作成
このようにして得られた、本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。宿主としては、本発明のポリヌクレオチド(DNA)を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、シュードモナス属菌、リゾビウム属菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などがあげられる。エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)などがあげられる。バチルス属菌としては、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などがあげられる。シュードモナス属菌としては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などがあげられる。リゾビウム属菌としては、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などがあげられる。酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などがあげられる。動物細胞としては、COS細胞、CHO細胞、HeLa細胞などがあげられる。昆虫細胞としては、Sf9、Sf21などがあげられる。
【００５８】
組換えベクターの宿主への導入方法およびこれによる形質転換方法は、一般的な各種方法によって行うことができる。組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、リン酸カルシウム法(Virology, 52, 456−457 (1973))、リポフェクション法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987))、エレクトロポレーション法(EMBO J., 1, 841−845 (1982))などがあげられる。エシェリヒア属菌の形質転換方法としては、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、Gene, 17, 107 (1982)などに記載の方法などがあげられる。バチルス属菌の形質転換方法としては、Molecular ＆ General Genetics，168, 111 (1979)に記載の方法などがあげられる。酵母の形質転換方法としては、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)に記載の方法などがあげられる。動物細胞の形質転換方法としては、Virology,52, 456 (1973)に記載の方法などがあげられる。昆虫細胞の形質転換方法としては、Bio/Technology, 6, 47−55 (1988)に記載の方法などがあげられる。このようにして、本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド(本発明のポリヌクレオチド)を含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
【００５９】
低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターおよび形質転換体
発現ベクターとしては、なかでも低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターが好ましい。
【００６０】
低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターとは、具体的には、次のプロモーター配列、およびコード配列を含有する発現ベクターを意味する：
(1)低温で発現誘導可能なプロモーター配列；および
(2)本発明のポリヌクレオチドを含有するコード配列。
低温で発現誘導可能なプロモーター配列とは、宿主細胞を増殖させる培養条件から、温度を下げることによって蛋白質の発現を誘導可能なプロモーター配列を意味する。低温で発現誘導可能なプロモーターとしては、例えば、コールドショック蛋白質をコードする遺伝子(コールドショック遺伝子)のプロモーターが挙げられる。コールドショック遺伝子のプロモーターとしては、前記したものが挙げられる。
【００６１】
本発明で用いられる低温で発現誘導可能なプロモーターが発現誘導しうる温度としては、通常30℃以下、好ましくは25℃以下、より好ましくは20℃以下、特に好ましくは15℃以下である。ただし、より効率良く発現を誘導させるため、通常は5℃以上、好ましくは10℃以上、特に好ましくは約15℃で発現誘導させる。
【００６２】
本発明の低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターを作製する場合、本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターとしては、pCold Iベクター、pCold IIベクター、pCold IIIベクター、pCold IVベクター(以上、タカラバイオ社製)などを好適に使用することができる。これらのベクターを使用して、原核細胞を宿主として発現させた場合、蛋白質を宿主細胞の細胞質中に可溶性蛋白質として産生させることができる。
【００６３】
低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターを導入する宿主としては、原核細胞が好ましく、さらに大腸菌が好ましく、特にBL21株、JM109株が好ましく、なかでもBL21株が好ましい。
【００６４】
低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターが導入された形質転換体を細胞増殖させる培養温度は、通常25〜40℃、好ましくは30〜37℃である。発現誘導させる温度は、通常4〜25℃、好ましくは10〜20℃、より好ましくは12〜18℃、特に好ましくは15℃である。
【００６５】
4．本発明のルシフェラーゼ変異体の製造
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、本発明のルシフェラーゼ変異体を生成させる工程を含む、本発明のルシフェラーゼ変異体の製造方法を提供する。本発明のルシフェラーゼ変異体は、例えば、前記形質転換体を本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド（DNA）が発現可能な条件下で培養し、本発明のルシフェラーゼ変異体を生成・蓄積させ、分離・精製することによって製造することができる。
【００６６】
形質転換体の培養
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該培養によって、形質転換体によって本発明のルシフェラーゼ変異体が生成され、形質転換体内または培養液中などに本発明のルシフェラーゼ変異体が蓄積される。
【００６７】
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)などを、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)などを培地に添加してもよい。
【００６８】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15〜43℃で約3〜24時間行い、必要により、通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で約6〜24時間行ない、必要により通気や撹拌を加える。
【００６９】
宿主が酵母である形質転換体を培養する培地としては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)）や0.5％(w/v)カザミノ酸を含有するSD培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)）があげられる。培地のpHは約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約20℃〜35℃で約24〜72時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００７０】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する培地としては、たとえば約5〜20％(v/v)の胎児牛血清を含むMEM培地（Science, 122, 501 (1952)），DMEM培地（Virology, 8, 396 (1959)）などが用いられる。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００７１】
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する培地としては、Grace's Insect Medium（Nature,195,788(1962)）に非働化した10％(v/v)ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは約6．2〜6．4に調整するのが好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００７２】
なお、低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターが導入された形質転換体を細胞増殖させる培養温度および発現誘導させる温度は、前記した通りである。
【００７３】
本発明のルシフェラーゼ変異体の分離・精製
上記培養物から、本発明のルシフェラーゼ変異体を分離・精製することによって、本発明のルシフェラーゼ変異体を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明のルシフェラーゼ変異体の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
【００７４】
具体的には、本発明のルシフェラーゼ変異体が培養菌体内もしくは培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体もしくは細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により本発明のルシフェラーゼ変異体の粗抽出液を得ることができる。本発明のルシフェラーゼ変異体がペリプラズムスペース中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば浸透圧ショック法など）により本発明のルシフェラーゼ変異体を含む抽出液を得ることができる。本発明のルシフェラーゼ変異体が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体もしくは細胞と培養上清とを分離することにより、本発明のルシフェラーゼ変異体を含む培養上清を得ることができる。
【００７５】
このようにして得られた抽出液もしくは培養上清中に含まれる本発明のルシフェラーゼ変異体の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。本発明のルシフェラーゼ変異体が上述した精製のためのペプチド配列を含有する場合、これを用いて精製するのが好ましい。具体的には、本発明のルシフェラーゼ変異体がヒスチジンタグ配列を含有する場合にはニッケルキレートアフィニティークロマト法、S−トランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインを含有する場合にはグルタチオン結合ゲルによるアフィニティークロマト法、プロテインAのアミノ酸の配列を含有する場合には抗体アフィニティークロマト法を用いることができる。
【００７６】
5.本発明のルシフェラーゼ変異体の利用
発光による検出マーカーとしての利用
本発明のルシフェラーゼ変異体は、ルシフェリン存在下、発光による検出マーカー(以下、「本発明の検出マーカー」)として利用することができる。本発明の検出マーカーは、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。
【００７７】
本発明のルシフェラーゼ変異体は、例えば、目的蛋白質との融合蛋白質として発現させ、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入することによって、前記目的蛋白質の分布を測定するために利用することもできる。このような目的タンパク質などの分布の測定は、発光イメージング等の検出法などを利用して行うこともできる。なお、本発明のルシフェラーゼ変異体は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることもできる。
【００７８】
用いる発光基質（ルシフェリン）は、前述の通り、セレンテラジン類であるのが好ましく、セレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンであるのが特に好ましい。
【００７９】
レポーター蛋白質としての利用
本発明のルシフェラーゼ変異体は、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。この場合、本発明のポリヌクレオチドをレポーター遺伝子として用い、当該レポーター遺伝子がコードするルシフェラーゼ変異体をルシフェリンに接触させる。ここで、「接触」とは、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、本発明のルシフェラーゼ変異体を発現する細胞の培養容器にルシフェリンを添加すること、前記細胞とルシフェリンとを混合すること、前記細胞をルシフェリンの存在下で培養することが含まれる。本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド(すなわち、本発明のポリヌクレオチド)を、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列(例えば、エンハンサー)に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、ルシフェリン（発光基質）存在下、本発明のルシフェラーゼ変異体に由来する発光を検出することにより、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列の活性を測定することができる。さらに、発現したルシフェラーゼ変異体をセレンテラジン類と反応させ、生成する発光を高感度検出装置により可視化、画像化することもできる。
【００８０】
用いるルシフェリンは、前述の通り、セレンテラジン類であるのが好ましく、セレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンであるのが特に好ましい。
【００８１】
用いる細胞は、動物細胞であるのが好ましい。動物細胞の場合であっても、本発明の好ましい態様のルシフェラーゼ変異体は、細胞外に分泌する。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドは、上述のようにして、レポーター遺伝子として利用することができる。
【００８３】
アミューズメント用品の材料
本発明のルシフェラーゼ変異体は、ルシフェリンが酸素分子で酸化されてオキシルシフェリンが励起状態で生成される反応を触媒する活性を有する。励起状態のオキシルシフェリンは可視光を発して基底状態となる。よって、本発明のルシフェラーゼ変異体は、アミューズメント用品の材料の発光基材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、発光シャボン玉、発光アイス、発光飴、発光絵の具等があげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。
【００８４】
用いるルシフェリンは、前述の通り、セレンテラジン類であるのが好ましく、セレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンであるのが特に好ましい。
【００８５】
生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)法
本発明のルシフェラーゼ変異体は、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)法による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の測定等の分析方法に利用することができる。
【００８６】
例えば、本発明のルシフェラーゼ変異体をドナーとして使用し、蛍光物質(例えば、有機化合物、および蛍光蛋白質)をアクセプターとして使用して、両者の間で生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を起こすことによりドナーとアクセプターとの間の相互作用を検出することができる。
【００８７】
本発明のある態様では、アクセプターとして使用する有機化合物は、Hoechist3342、Indo−1、DAP1などである。本発明の別の態様では、アクセプターとして使用する蛍光蛋白質は、緑色蛍光蛋白質(GFP)、青色蛍光蛋白質(BFP)、変異GFP蛍光蛋白質、フィコビリンなどである。
【００８８】
本発明の好ましい態様において、解析する生理機能は、オーファン受容体(特にG蛋白質共役受容体)、アポトーシス、または遺伝子発現による転写調節などである。また、本発明の好ましい態様において、分析する酵素は、プロテアーゼ、エステラーゼまたはリン酸化酵素などである。
【００８９】
BRET法による生理機能の解析は、公知の方法で行うことができ、例えば、Biochem. J. 2005, 385, 625−637、またはExpert Opin. Ther Tarets, 2007 11: 541−556に記載の方法に準じて行うことができる。また、酵素活性の測定も、公知の方法で行うことができ、例えば、Nature Methods 2006, 3:165−174、またはBiotechnol. J. 2008, 3:311−324に記載の方法に準じて行うことができる。
【００９０】
用いる発光基質（ルシフェリン）は、前述の通り、セレンテラジン類であるのが好ましく、セレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンであるのが特に好ましい。
【００９１】
6.本発明のキット
本発明は、本発明ルシフェラーゼ変異体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組換えベクター、本発明の形質転換体から選択されるいずれかを含むキットも提供する。本発明のキットには、さらにルシフェリンを含んでいてもよい。
【００９２】
ルシフェリンは、前述の通り、セレンテラジン類であるのが好ましく、セレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンであるのが特に好ましい。
【００９３】
本発明のキットは、通常用いられる材料および方法で製造することができる。本発明のキットは、例えば、サンプルチューブ、プレート、キット使用者に対する指示書、溶液、バッファー、試薬、標準化のために好適なサンプルまたは対照サンプルを含んでもよい。本発明のキットには、さらに、ハロゲン化物イオンを含む塩などを含んでいてもよい。
本発明のキットは、上述したレポーター蛋白質もしくはレポーター遺伝子を用いた測定、発光による検出マーカー、BRET法による生理機能の解析または酵素活性の測定などに利用することができる。また、後述の発光反応方法に用いることもできる。
【００９４】
7.発光反応方法
発光活性
本発明のルシフェラーゼン変異体は、ルシフェリンを酸素分子で酸化して励起状態のオキシルシフェリンを生成させる反応を触媒する活性を有する。励起状態のオキシルシフェリンは、基底状態となる際に可視光を発する。すなわち、本発明のルシフェラーゼ変異体は、ルシフェリンを基質とする発光反応を触媒し、発光を生じさせる活性を有する。この活性を、本明細書において、「発光活性」と称することがある。
【００９５】
発光反応
本発明のルシフェラーゼ変異体を用いた、ルシフェリンを基質とする発光反応は、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを接触させることにより行うことができる。ここで、「接触」とは、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、ルシフェリンを収容した容器に本発明のルシフェラーゼ変異体を添加すること、本発明のルシフェラーゼ変異体を収容した容器にルシフェリンを添加すること、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを混合することが含まれる。反応条件としては、オプロフォーラスルシフェラーゼを用いた発光反応に通常用いられる条件またはそれに準じた条件で行うことができる。
【００９６】
具体的には、反応溶媒としては、Tris−HCl緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液、水、などが用いられる。
【００９７】
反応温度は、通常約4℃〜約40℃、好ましくは約4℃〜約25℃である。反応溶液のpHは、通常約5〜約10、好ましくは約6〜約9、より好ましくは約7〜約8、特に好ましくは約7.5である。
【００９８】
ルシフェリンとしては、前述の通り、セレンテラジン類が好ましく、セレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンであるのが特に好ましい。
【００９９】
ルシフェリンは、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホオキシド等の極性溶媒や、メタノール、エタノール、ブタノール等のアルコールの溶液として反応系に加えてもよい。
【０１００】
発光活性の活性化
本発明のルシフェラーゼ変異体の、ルシフェラーゼ活性は、ハロゲン化物イオン、非イオン性界面活性剤などにより活性化され得る。
【０１０１】
ハロゲン化物イオンとしては、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンなどがあげられ、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンが好ましい。
【０１０２】
ハロゲン化物イオンの濃度は、通常約10μM〜約100mM、好ましくは約100μM〜約50mM、特に好ましくは約1mM〜約20mMである。
【０１０３】
反応系にハロゲン化物イオンを添加する方法としては、塩として添加する方法などがあげられる。用いられる塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩などがあげられる。より具体的には、NaF、NaCl、NaBr、NaI、KF、KCl、KBr、KI、CaF2、CaCl2、CaBr2、CaI2、MgF2、MgCl2、MgBr2、MgI2などがあげられる。
【０１０４】
非イオン性界面活性剤の市販品（商品名）としては、Tween20(ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート)、Tween80(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート)、TritonX-100(ポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル)、Briji-58 (ポリオキシエチレン（20）セチルエーテル)、Nonidet P-40 (エチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）n）などがあげられ、Tween20、TritonX-100などが好ましい。
【０１０５】
非イオン性界面活性剤の濃度は、通常約0.0002%(w/v)〜約0.2%(w/v)、好ましくは約0.001%(w/v)〜約0.1%(w/v)、特に好ましくは約0.05%(w/v)〜約0.02%(w/v)である。
【０１０６】
なお、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
【０１０７】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【０１０８】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。
【０１０９】
発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【実施例】
【０１１０】
以下に実施例により本発明を説明するが、実施例は本発明を制限するものではない。
【０１１１】
実施例１：N末端領域に変異を導入したnanoKAZ遺伝子の調製法
N末端領域に変異を導入したnanoKAZ遺伝子の調製は、Ho et al., Gene (1989) 77: 51-59記載の方法に従い、PCR法により行った。具体的には、pcDNA3-GLsp-dnKAZを鋳型として、4種のPCRプライマーを用いて、PCRキット（タカラバイオ社製）にて2カ所のPCR（サイクル条件25サイクル；1分／94℃、1分／50℃、1分／72℃）を実施し、増幅した2種のDNA断片を鋳型として２回目のPCRを実施することにより、目的の変異遺伝子を調製した。
【０１１２】
鋳型となるpcDNA3-GLsp-dnKAZ構築は、以下の通りである。
まず、Inouye et al (2013) Biochem. Biophys. Res. Commun. 437: 23−28に記載のpCold−ZZ−P−nanoKAZを鋳型として以下のプライマーを用いて、PCR法により遺伝子増幅した。
【０１１３】
nanoKAZ-1N/EcoRI（5’ gcgGAATTCTTCACCCTGGAGGACTTCGTCGGC 3’： アンダーラインEcoRI 配列）（配列番号：9）
nanoKAZ-3C/XbaI（5’ gccTCTAGATTAGGCCAGGATTCTCTCGCACAGTCT 3’：アンダーラインXbaI 配列）（配列番号：10）
【０１１４】
次に、動物培養細胞での新規発現ベクターpcDNA3−GLspを構築した。構築方法は以下の通りである。具体的には、pcDNA3−GLucベクター（プロルミ社製）よりガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列を以下のプライマーを用いてPCR法により取得した。
【０１１５】
GLsp-1R/EcoRI （5' ggc GAA TTC GGT GGG CTT GGC CTC GGC CAC 3'、アンダーラインEcoRI 配列）（配列番号：11）
T7（5' TAATACG ACTCACTATAGGG 3'）（配列番号：12）
【０１１６】
PCR後のDNA断片をHindIII/EcoRIで消化し、消化後の断片を、pcDNA3ベクター(インビトロジェン社製)の制限酵素部位であるHindIII/EcoRI部位に挿入することにより、新規発現ベクターpcDNA3−GLspを構築した。新規発現ベクターは、CMVのプロモーターに制御され、その下流にコザック配列、ガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列、マルチクローニングサイト配列を有する。
【０１１７】
pCold−ZZ−P−nanoKAZを鋳型としてPCR行った後のDNA断片を常法により制限酵素EcoRI／XbaIにて消化した後、pcDNA3−GLspのEcoRI−XbaI 部位に連結することによって、発現ベクターpcDNA3−GLsp−dnKAZを構築した。なお、DNA シークエンサー（ABI社製）により塩基配列を決定することにより、インサート遺伝子配列の確認を行った。
【０１１８】
例えば、N末端領域に変異を導入したnanoKAZ-AQQL遺伝子の作製は、次のようにして行った。先ず、pcDNA3-GLsp-nanoKAZを鋳型として、以下のプライマーで増幅したDNA断片を調製した。
【０１１９】
１カ所目のDNA断片の調製に用いたプライマー：
T7（5' TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3'）（配列番号：12）
nKAZ-2R/AQQL（5' CAG GCT GCT CAA GCC GCC CTG CTC CAG GAC CTG GTC TTG GTT GTA GCC GGC GGT CTG TTG CCA GTC GCC GAC GAA GTC TGC CAG GGT GAA GAC 3'）（配列番号：13）
【０１２０】
２カ所目のDNA断片の調製に用いたプライマー：
nKAZ-1F/AQQL（5' TTC ACC CTG GCA GAC TTC GTC GGC GAC TGG CAA CAG ACC GCC GGC TAC AAC CAA GAC CAG GTC CTG GAG CAG GGC GGC TTG AGC AGC CTG TTC 3'）（配列番号：14）
BGH-R（5’ TAG AAG GCA CAG TCG AGG 3’）（配列番号：15）
【０１２１】
上記で得られた2カ所のDNA断片を用いて、２種のPCRプライマー：T7（配列番号：12）およびBGH-R（配列番号：15）にて2回目のPCRを実施した。その結果、nanoKAZ遺伝子によってコードされる配列番号2のアミノ酸配列のうち、4番目のアミノ酸をグルタミン酸からアラニンへ、11番目のアミノ酸をアルギニンからグルタミンへ、18番目のアミノ酸をロイシンからグルタミンへ、27番目のアミノ酸をバリンからロイシンへ置換したnanoKAZ-AQQL遺伝子（配列番号3の塩基配列、配列番号4のアミノ酸配列をそれぞれ示す。）を調製した。
【０１２２】
以下同様にして、表１に記載のプライマーを用いて、N末端領域に変異を導入したnanoKAZ-KVA遺伝子（配列番号5の塩基配列、配列番号6のアミノ酸配列をそれぞれ示す。）およびnanoKAZ-FLM遺伝子（配列番号7の塩基配列、配列番号8のアミノ酸配列をそれぞれ示す。）を取得した。変異導入後のnanokAZ変異体の模式図を図１に示す。
【０１２３】
表１．nanoKAZ-AQQL蛋白質、nanoKAZ-KVA蛋白質、およびnanoKAZ-FLM蛋白質の作製に使用した鋳型とPCRプライマーのリスト
【表１】
2015202096.tif 000002
2015202096.tif 000003
【０１２４】
実施例２：ZZ融合nanoKAZ変異体の大腸菌発現ベクターの構築
大腸菌内での変異体発現は、ZZ融合蛋白質として発現を行なった。具体的には、大腸菌内で、可溶性蛋白質としてnanoKAZ変異体蛋白質を発現するために、発現ベクターpCold-ZZ-P-X（Inouye & Sahara, Protein Express. Purif. (2009) 66:52-57に記載）を使用した。
【０１２５】
実施例１で得られた変異遺伝子断片をPCR精製キット（キアゲン社製）で精製し、常法により制限酵素EcoRI／XbaIにて消化した後、pCold-ZZ-P-XのEcoRI-XbaI 部位に連結することによって、以下のZZ融合nanoKAZ変異体発現ベクターを構築した：pCold-ZZ-P-nKAZ-AQQL、pCold-ZZ-P-nKAZ-KVAおよびpCold-ZZ-P-nKAZ-FLM。DNA シークエンサー（ABI社製）により塩基配列を決定することにより、インサート遺伝子配列の確認を行った。
【０１２６】
実施例３：ZZ融合nanoKAZ変異体の大腸菌内での発現
ZZ融合nanoKAZ変異体を大腸菌において発現させるため、実施例２で作製した組換えプラスミドおよびコントロールベクターとしてpCold-ZZ-P-nanoKAZを用いた。
【０１２７】
pCold-ZZ-P-nanoKAZは、実施例１で取得したDNA断片を常法により制限酵素EcoRI／XbaIにて消化した後、pCold-ZZ-P-XのEcoRI-XbaI 部位に連結することによって、pCold-ZZ-P-nanoKAZを構築した。DNA シークエンサー（ABI社製）により塩基配列を決定することにより、インサート遺伝子配列の確認を行った。
【０１２８】
宿主大腸菌株としてBL21（Novagen社製）を用いて、アンピシリン（50μg／mL）を含有する10 ｍLのLuria-Bertani培地にて37℃で18時間培養した。この種培養を、10 mLのLB培地に植菌し、３時間培養した後、氷上で１時間冷却した。冷却した培養液に、最終濃度が0.2 mMとなるようにIPTGを加えた後、15℃で20時間培養した。1 mLの培養液から遠心分離により大腸菌を回収し、10 mM EDTA（和光純薬製）を含む0.5 mLの50 ｍＭ   Tris-HCl (pH7.6)に懸濁し、ブランソン社製モデル250の超音波発生装置を用い、５秒間の超音波処理することにより大腸菌を破壊した。高速遠心分離にて、ZZ融合nanoKAZ変異体を含む可溶性画分である上清0.5 mLを回収した。この可溶性画分を5 μL用いてSDS-PAGE電気泳動法により、蛋白質の発現を確認した。その結果を図２に示す。図2中の1〜5は次の通りである: 1, 分子量サイズマーカー; 2, nanoKAZ; 3, nanoKAZ-AQQL; 4, nanoKAZ-KVA; 5, nanoKAZ-FLM。図2の結果から、それぞれのnanoKAZ変異蛋白質は、大腸菌内で可溶性蛋白質として、nanoKAZと同程度発現していることが明らかとなった。
【０１２９】
実施例４：ZZ融合nanoKAZ変異体の発光活性測法
実験例３で得られた可溶性画分溶液5 μLを、1μg のセレンテラジン（ＣＴＺ）（JNC社製）またはその類縁体を含む100μLの50 ｍＭ Tris-HCl (pH 7.6)-10 mM EDTAに加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置（アトー社製：ＡＢ2200）で、60秒間で測定し、表２に相対最大発光強度(Imax)と括弧内に60秒間の積算値を相対発光強度で表記した。
【０１３０】
実施例５：ZZ融合nanoKAZ変異体の基質特異性
基質特異性実験に使用したセレンテラジン類縁体は、それぞれ論文記載の方法で合成した。具体的には、bis-セレンテラジンはNakamura et al. (1997) Tetrahedron Lett. 38:6405-6406に記載の方法で、フリマジン(Furimazine)はHall et al. (2012) ACS Chem. Biol. 16; 848-1857に記載の方法で、h-セレンテラジンはInouye et al (2010) Anal. Biochem. 407:247-252に記載の方法で、6h-セレンテラジン及び6h-f-セレンテラジンはInouye et al (2013) Biochem. Biophys. Res. Commun. 437: 23-28 に記載の方法で合成した。f-セレンテラジンはProlume社より入手した。ZZ融合nanoKAZ変異体の発光活性は、実施例4記載の方法で測定した。
【０１３１】
その結果を表2に示す。表2の結果から、セレンテラジン（ＣＴＺ）を発光基質とした場合nanoKAZ-AQQLは、nanoKAZよりも最大発光強度が約20倍高いことが明らかとなった。さらにセレンテラジン類縁体のうちh-セレンテラジンおよびf-セレンテラジンを用いた場合、セレンテラジン（ＣＴＺ）を発光基質とした場合のnanoKAZよりも、それぞれ約30倍と約20倍の顕著な活性を示した。
【０１３２】
表２．大腸菌発現ZZ融合nanoKAZ変異体の発光基質と基質特異性
【表２】
2015202096.tif 000004
【０１３３】
実施例６：動物培養細胞でガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列を使用してnanoKAZ変異体を分泌発現するベクターの構築
ガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列を使用してnanoKAZ変異体を動物培養細胞で分泌発現するベクターの構築は以下の通りである。
実施例１で得られた変異遺伝子断片をPCR精製キット（キアゲン社製）で精製し、常法により制限酵素EcoRI／XbaIにて消化した後、pcDNA3-GLspベクターのEcoRI-XbaI 部位に連結することによって、pcDNA3-GLsp-nanoKAZ-AQQL、pcDNA3-GLsp-nanoKAZ-KVAおよびpcDNA3-GLsp-nanoKAZ-FLMを構築した。DNA シークエンサー（ABI社製）により塩基配列を決定することにより、インサート遺伝子配列の確認を行った。
【０１３４】
実施例７：動物培養細胞で分泌シグナル配列を使用しないでnanoKAZ変異体を分泌発現するベクターの構築
実施例６で得られたpcDNA3-GLsp-nanoKAZ-AQQL、pcDNA3-GLsp-nanoKAZ-KVAおよびpcDNA3-GLsp-nanoKAZ-FLMより、常法により制限酵素Asp718／XbaIにて消化し得られたDNA断片を、pcDNA3ベクター（インビトロジェン社製）のAsp718／XbaI 部位に連結することによって、pcDNA3-nanoKAZ-AQQL、pcDNA3-nanoKAZ-KVAおよびpcDNA3-nanoKAZ-FLMを構築した。DNA シークエンサー（ABI社製）により塩基配列を決定することにより、インサート遺伝子配列の確認を行った。
【０１３５】
実施例 ８：動物培養細胞へのベクターの導入および測定用酵素の調製法
（１）発現プラスミドの精製
実施例６および実施例７にて得られたプラスミドを精製するため、発現プラスミドを有する宿主大腸菌株JM83を培養し、プラスミド精製キット(QIAGEN社製)にて精製後、1μg/μLの濃度になるよう滅菌水に溶解した。同様に、内部標準のためのホタルルシフェラーゼベクター（pGL4.13 [Luc2/sv40]:プロメガ社製）を精製した。
【０１３６】
（２）トランスフェクションおよび測定用酵素の調製法
チャイニーズハムスター卵巣由来の細胞株CHO-K1株を、10％(v/v)牛胎児血清（バイオウエスト社製）を含むHam’s F-12培地（和光純薬社製）にて培養した。CHO-K1細胞を2 x 10５ 細胞/ウエル/2 mL培地にて6 ウエルプレートに播種し(n = 2)、インキュベーター中37 ℃、5 %(v/v) CO2にて培養した。24時間後、精製した組換えプラスミドをFuGene HD（プロメガ社製）トランスフェクション試薬を用いて、CHO-K1細胞にトランスフェクションし、次の実験に用いた。具体的には、100μL の培地に、組換えプラスミド1μgとpGL4.13 [Luc2/sv40]内部標準ベクター0.1μgと、FuGene HD 3.3μLを加え、室温で15分間静置した。100μLのDNA-FuGene 複合体溶液を、6ウエルの細胞に添加し、46時間培養後、培養液を回収した。
【０１３７】
実施例９：動物培養細胞で培養液中に発現したnanoKAZ変異体の発光活性測定法
実施例８で得られた培養液5μLを、１μg のセレンテラジン（JNC社製）を含む100μLの30ｍＭ Tris-HCl (pH 7.6)-10 mM EDTA（和光純薬）に加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置（アトー社製：ＡＢ2200）にて60秒間測定し、表３に最大発光強度(Imax)と括弧内に60秒間の積算値を相対発光強度で表記した。
【０１３８】
一方、トランスフェクションの効率を確認するための内部標準で使用したホタルルシフェラーゼについては、実施例７で得られた細胞抽出液5μLを、100μL の酵素アッセイ用試薬（プロメガ社）に加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置（アトー社製：ＡＢ2200）で、10秒間での最大発光強度(Imax)を測定した。その結果、トランスフェクション効率は、ほぼ同じであることを確認し、内部標準とし、相対活性算出に使用した。
【０１３９】
実施例１０：動物培養細胞で分泌シグナル配列を用いて培養液中に分泌発現したnanoKAZ変異体の発光活性と基質特異性
実施例９に記載の方法で、動物培養細胞発現分泌シグナル配列を用いて分泌発現したnanoKAZ変異体の培養液の発光活性を測定した。その結果を表３に示す。表３の結果から、nanoKAZ変異体のうちnanoKAZ-AQQLは細胞からの分泌が認められ、セレンテラジンを発光基質とした時の発光活性がnanoKAZの約20倍となる事が明らかとなった。すなわちnanoKAZ-AQQLは分泌可能な変異体であり、かつセレンテラジンを最も良い基質として利用可能である変異体である。
【０１４０】
表３．動物培養細胞発現で分泌シグナル配列を用いて培養液中に分泌発現したnanoKAZ変異体の発光活性と基質特異性
【表３】
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【０１４１】
実施例１１：動物培養細胞で分泌シグナル配列を使用しないで培養液中にnanoKAZ変異体を分泌発現
実施例９に記載の方法で、動物培養細胞で分泌シグナル配列を使用しないで発現したnanoKAZ変異体の培養養液中の発光活性を測定した。その結果を表４に示す。表４の結果から、分泌シグナル配列のないnanoKAZ変異体のうち、nanoKAZ-AQQLは細胞からの分泌が認められ、セレンテラジンを発光基質とした時の発光活性がnanoKAZの約18倍となる事が明らかとなった。この発現量は、表３記載の分泌シグナル配列を有するnanoKAZ-AQQLの発現の場合の約20倍とほぼ同じである。すなわちnanoKAZ-AQQLは発現分泌シグナル配列を使用なしでも分泌可能な変異体である。また、分泌シグナル配列の有無によらず培養液に分泌したnanoKAZ は、どちらの蛋白質も基本構造は同一と考えられことから、その基質特性も同一と推定できる。以上のことから、nanoKAZ変異体nanoKAZ-AQQLは、真核細胞生物の分泌シグナル配列の有無にかかわらず、動物培養細胞で分泌発現できる変異体であり、かつセレンテラジンを最も良い基質として利用可能である変異体である。
【０１４２】
表４．動物培養細胞で分泌シグナル配列を使用しないでnanoKAZ変異体の培養液での発光活性
【表４】
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【配列表フリーテキスト】
【０１４３】
[配列番号:1] nanoKAZの塩基配列である。
[配列番号:2] nanoKAZのアミノ酸配列である。
[配列番号:3] nanoKAZ-AQQLの塩基配列である。
[配列番号:4] nanoKAZ-AQQLのアミノ酸配列である。
[配列番号:5] nanoKAZ-KVAの塩基配列である。
[配列番号:6] nanoKAZ-KVAのアミノ酸配列である。
[配列番号:7] nanoKAZ-FLMの塩基配列である。
[配列番号:8] nanoKAZ-FLMのアミノ酸配列である。
[配列番号9] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である（nanoKAZ-1N/EcoRI）。
[配列番号10]実施例で用いたプライマーの塩基配列である（nanoKAZ-3C/XbaI）。
[配列番号11]実施例で用いたプライマーの塩基配列である（GLsp-1R/EcoRI）
[配列番号12]実施例で用いたプライマーの塩基配列である（T7）。
[配列番号13]実施例で用いたプライマーの塩基配列である（nKAZ-2R/AQQL）。
[配列番号14]実施例で用いたプライマーの塩基配列である（nKAZ-1F/AQQL）。
[配列番号15]実施例で用いたプライマーの塩基配列である（BGH-R）。
[配列番号16]実施例で用いたプライマーの塩基配列である（nKAZ-4R/KVA）。
[配列番号17]実施例で用いたプライマーの塩基配列である（nKAZ-3F/KVA）。
[配列番号18]実施例で用いたプライマーの塩基配列である（nKAZ-6R/FLM）。
[配列番号19]実施例で用いたプライマーの塩基配列である（nKAZ-5F/FLM）。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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