(57)【要約】【課題】  ポリスチレンからスチレンモノマーを製造するための遺伝子、酵素を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明に係るポリスチレンからスチレンモノマーを製造する遺伝子は、常温・上圧でポリスチレン重合体の末端に結合し、末端から一つ一つスチレンモノマーを遊離させる反応により、スチレンモノマーを生成する遺伝子である。好ましくは、遺伝子はキチン結合タンパク質をコードする遺伝子とエキソ型キチナーゼ酵素をコードする遺伝子であり、これらを同時にポリスチレンに接触させて用いる。【選択図】  図１
2015156819.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のポリスチレン分解酵素活性を有した、キチナーゼ酵素をコードするDNA配列の遺伝子。
【請求項２】
前記遺伝子の遺伝子産物であるキチナーゼ酵素であって、配列番号１のアミノ酸配列の酵素。
【請求項３】
配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列のポリスチレン分解酵素活性を有した、キチンに結合性を示すタンパク質酵素をコードするDNA配列の遺伝子。
【請求項４】
前記キチン結合性を示すタンパク質酵素であって、配列番号２のアミノ酸配列の酵素。
【請求項５】
配列表の配列番号３で示される、請求項２のタンパク質にヒスチジンタグが付加された融合タンパク質をコードするDNA配列の遺伝子。
【請求項６】
配列表の配列番号４で示される、請求項４のタンパク質にヒスチジンタグが付加された融合タンパク質をコードするDNA配列の遺伝子。
【請求項７】
請求項１および請求項３のいずれかの遺伝子を微生物に導入して作製した、スチレンモノマーを製造するために用いる組換え微生物。
【請求項８】
請求項１および請求項３のいずれかの遺伝子を有する微生物。
【請求項９】
請求項２および請求項４のいずれかの酵素を同時にポリスチレンに接触させて、スチレンモノマーを製造する方法。
【請求項１０】
スチレンモノマーを製造するために請求項２および請求項４のいずれかの酵素を固定化した担体などの材料や錠剤とした薬品。
【請求項１１】
請求項１および請求項３のいずれかに記載の遺伝子を用いてスチレンモノマーを製造するスチレンモノマー製造装置。
【請求項１２】
請求項２および請求項４のいずれかに記載の酵素を用いてスチレンモノマーを製造するスチレンモノマー製造装置。
【請求項１３】
ポリスチレン分解活性を有し、またキチン結合タンパク質を有し、さらにスチレンモノマー生成活性を有する微生物。
【請求項１４】
ポリスチレン分解活性を有し、またエキソ型キチナーゼ酵素活性を有し、さらにスチレンモノマー生成活性を有する微生物。
【請求項１５】
請求項１０または請求項１１に記載の微生物一方、あるいは請求項１０および請求項１１に記載の微生物を同時を固定化した担体などの材料や微生物を粉末や錠剤とした薬品。
【請求項１６】
請求項１０または請求項１１に記載の微生物一方、あるいは請求項１０および請求項１１に記載の微生物を同時を固定化した担体などの材料や微生物を粉末や錠剤とした添加物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発泡スチロール等のスチレン重合体およびスチレン系樹脂を酵素分解し、スチレンモノマーを生成する方法に関する。また、本発明は、例えば廃棄された発泡スチロールや発泡スチロールを溶かすことによって減容させたポリスチレンビーズから、この原料となるスチレンモノマーを再生させるために用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
発泡スチロールは、ポリスチレンビーズにブタンなどのガスを吸収させた後に、100℃以上の高温水蒸気と圧力を加えることにより、発泡させて製造される。製法と用途により、ビーズ法発泡スチロール（Expanded Polystyrene； EPS）、ポリスチレンペーパー（Polystyrene Paper; PSP）、押出ボード（Extruded Polystyrene; XPS）に分類される。EPSは主に農水産容器や緩衝包装材として、PSPは主に食品トレー、XPSは主に断熱建材に使用されている。発泡スチロールは、断熱性や衝撃吸収性等に優れ、加工も容易であることから、今後もその消費が続くと考えられるが、使命を終えた後の発泡スチロールは産業および家庭で廃棄物として排出されている。このような状況において、他の化石燃料由来のプラスチック同様、原料の枯渇の問題や、CO2排出量の削減や、省エネなどの観点から発泡スチロールの廃棄物処理問題の解決は重要性を増しており、発泡スチロールリサイクル処理への取り組みが求められている。
【０００３】
発泡スチロールのリサイクルの手法には、マテリアルリサイクルとサーマルリサイクルがある。発泡スチロールのマテリアルリサイクルとは、発泡スチロールを減容剤や加熱処理によって減容し、減容剤を分離した後、精製したポリスチレン樹脂を再利用するリサイクル法である。
【０００４】
サーマルリサイクルとは、発泡スチロールを焼却処理した際に生じる燃焼熱を熱資源として利用するリサイクル法である。２０１２年度の我が国における発泡スチロールリサイクル率は、マテリアルリサイクルが56.8％、サーマルリサイクルが30.6％であり、合わせて87.4%がリサイクルされている。このうちのマテリアルリサイクルの大半が、元の発泡スチロールに戻す再利用法でなく、他の製品に生まれ変わるリサイクルである。また、ポリスチレン（ポリスチレンビーズを含む））からポリスチレンの原料であるスチレンモノマーへの材料リサイクルは、コストがかかる加熱処理により行う方法しかなく、ほとんど行われていない。
【０００５】
非特許文献１は、本発明者により、環境中からポリスチレンおよびスチレンモノマーを分解する微生物を単離し、この微生物種がBacillus thuringiensis STR-Y-O株であると同定を行った文献である。
【０００６】
特許文献１では、廃ポリスチレンから低コストで高純度のスチレンモノマーを効率よく回収する方法の提供がなされている。本提案は、廃ポリスチレンから油成分を回収するための熱分解装置と、凝縮器を組合せた油成分回収装置を互いに距離的に離れた複数の場所にそれぞれ設置し、各油成分回収装置で回収した油成分を共通の蒸留装置に輸送し、その蒸留装置で油成分を蒸留してスチレンモノマーを回収する方法の開発に関するものである。
【０００７】
特許文献２では、ポリスチレン樹脂からのスチレンモノマーの回収方法およびそれに用いられる装置の提供がなされている。ポリスチレン樹脂を主成分がスチレンモノマーである溶媒に溶解させて作った、ポリスチレン溶液を、加熱水蒸気に混合させた後、この混合気体を内部に触媒を入れた分解槽に供給し、この分解槽でポリスチレン樹脂を分解しスチレンモノマーを得る方法の開発である。
【０００８】
特許文献３では、耐衝撃性ポリスチレンからのスチレンモノマーの回収方法の提供がなされている。これは、硫酸塩及び／又は二酸化マンガン触媒を用いて、耐衝撃性ポリスチレンを加熱分解してスチレンモノマーを得る方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】及川栄作、キンチダリン、遠藤剛、及川胤昭、石橋良信、発泡スチロールゼロエミッション処理構築のためのポリスチレン分解微生物の単離と分解特性、2003年、土木学会環境工学研究論文集、第40巻、pp.373-379.
【非特許文献２】Vaaje-Kolstad, G.,Horn, J. H., van Aalten, D. M. F., Synstad, B., and A.H., EIjsink, B. G. H.:The Non-catalytic Chitin-binding Protein CBP21 from Serratia marcescens  is Essential for Chitin Degradation, The J. Biol. Chrm, Vol. 280, No. 31, Issue of Auguest 5, pp. 28492-28497,2005.
【非特許文献３】Sambrook, J., Fritsch. E. F. and Maniatis, T. : Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.
【特許文献１】特開２００３−３３５７１０
【特許文献２】特開２００１−２９４７０８
【特許文献３】特開２００１−２８８１２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ポリスチレン分解遺伝子を大腸菌などに導入して、この分解酵素を生産させ、この生産させた酵素を、常温および常圧下でポリスチレンと接触させて分解し、スチレンモノマーを製造する方法を提供すること、及び、ポリスチレンからスチレンモノマーを生成させる遺伝子、酵素、薬品、スチレンモノマー製造法、スチレンモノマー製造装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、環境中より溶媒で溶かした発泡スチロール（ポリスチレン溶液）を分解する能力を有した微生物Bacillus thuringiensis STR-Y-O株を同定した（非特許文献１）。その後、このSTR-Y-O株によるポリスチレン（PS）分解物の分子量分布をゲル浸透クロマトグラフ分析計（GPC）を用いて分析した。この結果、分子量の分布が低分子に移行する分解でなく、ピークの分子量のポリスチレン量のみが少なくなる分解が示された。分子量の分布が高分子から低分子へ移行する分解であれば、ポリスチレン鎖の内側でランダムに分解が生じることから、高分子のポリスチレンが低分子側へ移行した分布を示すと考えられる。これに対して、ポリスチレン鎖の末端で分解が生じた場合は、スチレンモノマーが一つずつ遊離する分解であることから、高分子から低分子への分布が生じにくいと考えられる。さらに、もし、末端から一つ一つスチレンモノマーを遊離する分解によるのであれば、分解生成物にスチレンモノマーが生成されるはずである。そこで、ガスクロマトグラフ質量分析計を用いて、分解物を分析した。この結果、菌を加えない培地のみのコントロールでは、スチレンモノマーは検出されなかったが、STR-Y-O株を植えた培養液では、スチレンモノマーが検出された。この結果より、分解酵素がポリスチレン鎖の内側からランダムに分解するエンド型の酵素でなく、ポリスチレン鎖の末端から分解するエキソ型の分解酵素であると推測した。
【００１２】
さらに、STR-Y-O株の培養液から、ポリスチレン分解酵素活性を指標に酵素の部分生成を行った。酵素活性の測定は蛍光物質で標識したポリスチレンを合成し、この標識体が酵素分解によって生じる蛍光偏光度の変化を蛍光偏光度測定装置により測定した。酵素精製は、硫酸アンモニウム分画、陰イオン交換膜、陽イオン交換膜を用いて行った。この精製酵素を用いて、分解活性を分析したところ、分解活性は消失していた。
【００１３】
さらにこの精製酵素をポリアクリルアミドゲル電気泳動して、分子量を見積もったところ、20Kdaの位置にタンパク質が検出された。そこで、このタンパク質をペプチダーゼ酵素を用いて断片化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列を決定し、データベースと照合した。この結果、この分子はSerratia marcescens のキチン結合タンパク質CBP21と同定された。キチンとは窒素を含む糖の重合体であり、カニやエビなどの節足動物や甲殻類の外骨格を構成する物質である。
【００１４】
CBP21タンパク質は、Vaaje-Kolstadら（非特許文献２）の研究により、キチンに結合するが、キチン分解活性はなく、別のキチン分解酵素であるキチナーゼと供に働くことにより、キチナーゼの分解酵素活性を高める働きをするタンパク質であることが示されていた。
【００１５】
精製したCBP21タンパク質のみでは、ポリスチレンの分解活性が示されなかったこと、また、CBP21はキチンの分解活性を持たず、キチナーゼの分解活性を高める働きがあることなどから、STR-Y-O株によるキチン分解は、CBP21の他にキチナーゼが必要でないかと推察した。そこで、Bacillus thuringiensis STR-Y-O株と同種でゲノムがweb上に一般に公開されているBacillus thuringiensis AI Hakam株をはじめとする3株のBacillus thuringiensis のCBP21およびキチナーゼを検索した。この結果、3株ともに、CBP21、エンド型キチナーゼ、エキソ型キチナーゼをそれぞれコードする遺伝子を有していることが示された。
【００１６】
以上の研究より、STR-Y-O株によるポリスチレン分解は、ポリスチレン鎖の末端からスチレンモノマーを遊離させる反応を触媒する、エキソ型のキチナーゼとキチン結合タンパク質の相乗効果によるものでないかと推察するに至った。
【００１７】
そこで、AI Hakam株のDNA配列情報を参考に作製したオリゴマーDNAプライマーを用いて、STR-Y-O株の染色体上のCBP21をコードするcbp21遺伝子とエキソキチナーゼChi36をコードするchi36遺伝子をPCR増幅法により増幅した。
【００１８】
次に増幅したそれぞれの遺伝子を大腸菌に導入して発現させ、酵素を生産した。さらに、生産した酵素を精製した上で、ポリスチレンを含む溶液に加えて、ポリスチレンモノマーの生成の有無をガスクロマトグラフ質量分析計により分析した。この結果、CBP21タンパク質のみ、Chi36酵素のみを添加した場合は、スチレンモノマーの生成がほとんど検出されなかったが、CBP21タンパク質とChi36酵素の両方を添加した場合に優位なスチレンモノマー生成が検出された。以上の実験結果より、キチン結合タンパク質CBP21とエキソキチナーゼChi36の両方がポリスチレンを分解して、スチレンモノマーを生成する酵素であることが結論づけられた。
【００１９】
本発明で同定したポリスチレン分解酵素遺伝子を保有する微生物Bacillus thuringiensis STR-Y-O株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構に受託番号FERM P-19582として保存されており、入手可能である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、常温および常圧下において微生物や酵素からスチレンモノマーを精製させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明によるポリスチレン残存率の実験結果を示すグラフであり、新品EPSと５年使用済みEPS、培養液上清を用いた実験の比較結果を示している。
【図２】PCRクローニングに用いたプライマーを示す表である。
【図３】本発明によるスチレンモノマー量の実験結果を示すグラフである。
【図４】スチレンモノマー生成量の比較結果を示す図である。
【図５】CBP21およびChi36の組み合わせによるPS→SM転換率を示すグラフである。
【図６】酵素１mol当たりの精製したスチレンモノマーのmol重量を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２２】
実験方法：
使用菌株：
今回の実験で使用した菌株は以下の通りである。
ポリスチレン分解酵素遺伝子を保有する微生物Bacillus thuringiensis STR-Y-O株は、山形県山形市の廃プラスチックや廃ビニール品などが長時間集積した状態で廃棄された畑土壌より単離した菌株である。本株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構に受託番号FERM P-19582として寄託しており、入手可能である。
【００２３】
使用培地：
微生物培養の培地としてはLB培地を用いた。LB培地の組成は、トリプトン10g、酵母エキス5g、NaCl 5g、グルコース1g、寒天15g(寒天培地の場合)、蒸留水1L(up to 1L)であり、これをオートクレーブ滅菌(20min、121℃、2atm)して用いた。組換え大腸菌の培養の際は各培地にアンピシリンを終濃度が50μg/mlになるように添加した。
STR-Y-O株を用いたポリスチレン分解実験は、LB培地とM9培地（非特許文献3）を用いた。
【００２４】
使用試薬および材料：
新品の発泡スチロールとしては、牡蠣いかだ養殖用のいかだの浮きとして製造された発泡スチロールを用いた。5年使用された発泡スチロールとしては、牡蠣いかだ養殖用のいかだに取り付けて5年間呉市の瀬戸内海沿岸で使用されたものを用いた。これらの発泡スチロールを手で細かくちぎり、d-リモネン（和光純薬工業）を用いて終濃度が0.3mg/mlになるように溶解した。
【００２５】
実験装置：
ゲル浸透クロマトグラフ分析は、日本分光PU-2080Plusを用いた。カラムはShodex GF-510HQを用い、移動相はテトラヒドロフランを用いた。
ガスクロマトグラフ質量分析は、日本電子JmsQ1000GC K9を用いた。カラムはスペルコequity5、内径0.25μm、長さ30mを用いた。
【００２６】
実験手順：
(1)  cbp21遺伝子のPCRクローニング
まず、STR-Y-O株を培養し、染色体調整した後、2通りのプライマーでPCR増幅を行った。cbp21遺伝子の塩基配列決定に用いるためのPCRは、cbp-F0プライマー5’-CAGCATTTGCTGGTGGAGCTGCGA-3’）とcbp-R1プライマー（5’-GTAGCCAATCTGACTACTTGTC-3’）を用いて行った。大腸菌でタンパク質の生産を行う場合のPCRは、5’末端のシグナルシークエンスをコードしているDNA配列を欠き、BamHIサイトを導入したcbp-N2プライマー (5’-CACGGATCCCATGGATACGTAGAATCACC-3’)およびcbp-R1プライマー(5’-GTAGCCAATCTGACTACTTGTC-3’)を用いて行った。また、PCRはEx-Taq DNAポリメラーゼ（タカラバイオ）または、PRIME-STAR DNAポリメラーゼ(タカラバイオ)を用いて、PCR増幅を行った。得られた塩基配列決定用のPCR産物はアガロースゲル電気泳動し、目的の大きさのDNAを回収し、回収したDNA断片をpGEM-Tベクター（プロメガ）に組み込んだ。その後、この組換えプラスミドを大腸菌に導入した。この組換え大腸菌からプラスミドを調整し、このプラスミドのインサート部位の塩基配列を決定した。大腸菌によるタンパク質生産用のPCR産物は制限酵素BamHIとScaIで切断して、得られた750bpのDNA断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動により回収した。最後に、この回収したDNA断片を発現ベクターpQE81L(キアゲン)のBamHIとSmaIサイトにライゲーションし、大腸菌DH5aに導入して、形質転換体DH5a+pQE81L+ cbp21を得た。この組換え大腸菌をCBP21の大量生産に用いた。
【００２７】
クローニングしたcbp21遺伝子の、AI Hakam株のcbp21遺伝子との相同性は、核酸レベルで87.1 %（全体:361bp）であり、アミノ酸レベルでは、C末端に4残基の差異が見られるものの94.6 %（全体:187残基）であった。
【００２８】
(2)  chi36遺伝子のPCRクローニング
まず、STR-Y-O株を培養し、染色体調整した後、chi-F1プライマー(5’-CCAGCACCYGCTGTGGCTTC-3’)およびchi-R1プライマー(5’-GAGAGTYATGTTGAAGGTATG-3’)を用いて、PCR増幅を行った。得られた2.5KbのPCR産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により回収し、クローニングベクターpGEM-T(プロメガ)に組み込み、大腸菌DH5aに導入して、形質転換体DH5α＋pGEM-T+chi36を得た。この組換え大腸菌からプラスミドを調整し、塩基配列を決定した。次に、pGEM-T+chi36を鋳型にして、chi-N2プライマー(5’-ACGGATCCGCAAACAATTTAGGTTCAAAATTACTCG-3’)およびベクター側のRVプライマー(5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’)を用いてPCR増幅を行った。このPCR産物を High Pure PCR Product Purification Kit(ロッシュ)により精製した。精製したPCR産物を制限酵素BamHIとSspIで切断した。得られた1133bpのDNA断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動により回収した。最後に、この回収したDNA断片を発現ベクターpQE81L（キアゲン）のBamHIとSmaIサイトにライゲーションし、大腸菌DH5aにトランスフォーメーションして、形質転換体DH5a+pQE81L+ chi36を得た。
【００２９】
クローニングしたchi36遺伝子の、AI Hakam株のchi36遺伝子との相同性は核酸レベルで96.3%、アミノ酸レベルで90%であった。
【００３０】
これらの結果より、今後は組換えDNA技術を応用することにより、このキチン結合タンパク質CBP21をコードする遺伝子やエキソ型キチナーゼchi36をコードする遺伝子を大腸菌等に導入して、組換え酵素の発現を高め、酵素を大量生産させ、この酵素をスチレンモノマー製造材料として用いることにより、さらに効率良いスチレンモノマー製造を行うことができると考えられる。
【００３１】
タンパク質の精製
(1)  大腸菌形質転換体の大量培養および超音波破砕
(a)  -85 ℃でグリセロール溶液に保存していた、大腸菌形質転換体(DH5a + pQE81 + cbp21)および大腸菌形質転換体(DH5a + pQE81 + chi36)をそれぞれ、100μg/mLのアンピシリン(Amp)入りの１× LB寒天培地に画線し、37℃で一晩静置培養した。
(b)  出現したシングルコロニーを20mLのAmp入りの1×LB液体培地に植菌し、37 ℃で一晩、130rpmで振とう培養した。
(c)  翌日10mLの培養液をAmp入りの1 x LB液体培地1Lに植え継ぎ、増殖度OD600 nmが0.5になるまで110rpm、30℃で振とう培養した。
(d)  終濃度が 0.3mMになるようにIPTG（タカラバイオ）を添加し、さらに2時間培養した。
(e)  培養液を高速遠心機にセットし、4 ℃、5,000 rpm、5分遠心して集菌する。その後、培地を捨て、菌体をチューブに移し、次の操作まで-85 ℃で保存した。
(f)  (a)〜(e)の操作を繰り返し行い、Amp入り1 × LB液体培地10 L分のそれぞれの菌体を集菌した。
(h)  菌体は培養液1Lの菌体当たりに、1 mLのlysis buffer(50mMM NaH2PO4、100mM Tris-HCl pH8.0、300mM NaCl、250mM Imidazol)を添加し懸濁した。
(i)  (h)を超音波破砕機で細胞を破壊した。（超音波破砕機の条件：10秒運転, 60秒 停止 を15分間繰り返す）
(j)  細胞破壊液を微量高速遠心機にセットし、4 ℃、15,000rpm、20 分遠心した。
(k)  上清を新しいチューブに移し、プロテインアッセイキットI (BIO-RAD Laboratories)を用いて定量した。
【００３２】
(2)  Ni-NTAカラムクロマトグラフィー法によるタンパク質の精製
以下の手順で行った。(a)  5 mLのNi-NTA Superflow レジン (キアゲン)を1 x 10 cmのcolumnに注いだ。(b)  columnを40 mLのlysis bufferで平衡化させた。(c)  lysis bufferに交換したタンパク質を0.5 mL/minの流速でcolumnにロードした。(d)  columnを40 mLのlysis bufferで洗った。Columnを40 mLのwash buffer（50mM NaH2PO4,100mMTrisHCl pH8.0,300mMNaCl, 20mM Imidazol）で洗浄した。(e)  columnに40 mLのelution buffer(50mM NaH2PO4,100mMTrisHCl pH8.0,300mMNaCl, 250mM Imidazol)を加えCBP21又はChi36を溶出させた。1 mLずつフラクションを回収した。(f)  吸光度により、タンパク質の吸収がえられたフラクションを、Centriplus 10 (Amicon,Inc)を用いてTris-DTT buffer （20mM Tris-HCL,0.1mMDTT）に交換および濃縮した。(g)  タンパク質はプロテインアッセイキットI (BIO-RAD Laboratories)を用いて定量した。(h)  精製した酵素は、ポリスチレン分解実験まで、4℃保存した。
【００３３】
(3)  タンパク質の電気泳動SDS-PAGEによる確認
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により、精製タンパク質の純度を確認した。
【００３４】
精製したタンパク質を用いたポリスチレンからスチレンモノマーの生成実験
(1)  反応液の調整
(a)  表に示す通りに、50mL容のガラス製遠心管に精製酵素や緩衝液を加え、これにリモネンで溶かした発泡スチロール（＝0.3mg/mlポリスチレン溶液）を添加し、水で10mLに調整した。
(b)  遠心管をアルミホイルで巻いて遮光し、37℃で4日間、穏やかに振とうしながら反応させた。
【００３５】
【表１】
2015156819.tif 000003
【００３６】
(2)  分解物の抽出
(a)  培養液にジクロロメタン2 mLを加え、2分間ボルテックスミキサーで混合する。
(b)  室温3,000 rpm、5分間遠心を行う。
(c)  ジクロロメタン層(下層)をパスツールで、無水硫酸ナトリウム0.1 gを加えた2 mL容マイクロチューブに移す。
(d)  ボルテックスでよく混合し、室温10分間放置する。
(e)  フラッシュ遠心し、上清をふた付のバイアルビンに移す。分析まで4℃で保存する
(f)  ポリスチレン分解物の分析は、ポリスチレン分解物量の定量や分子量分布の分析をゲル浸透クロマトグラフ(GPC)分析計を用いて行った。また、スチレンモノマーの定量分析は、ガスクロマトグラフ質量(GS-MS)分析計を用いて行った。
【００３７】
ポリスチレン分解菌STR-Y-O株によるポリスチレン分解能分析
(a)  STR-Y-O株を10mLの1×LB培地を入れた50mL容の三角フラスコを用いて30℃で振とう培養した。この培養液200μlを20mLのM9培地の入った100mL容共栓付き三角フラスコに植え継ぎ、さらに、3日間振とう培養した。
(b)  菌体を含む培養液を用いた分解実験の場合は、培養液に0.3mg/mlのリモネンで溶かしたEPSを200μl添加し、30℃で8日間振とうした。これに対して、培養液の上清を用いた分解実験の際は、三角フラスコの培養液を50ml容遠心管に移し、4℃、15,000rpmで15分遠心した。上清を新しい共栓付き三角フラスコへ移し、これに0.3mg/mlのリモネンで溶かしたEPSを200μl添加し、30℃で8日間振とうした。
(c)  培養液中の分解物をジクロロメタン抽出し、抽出した分解物の分析はゲル浸透クロマトグラフ（GPC）分析計およびガスクロマトグラフ質量分析計を用いて行った。
【００３８】
実験結果の考察
(1)  CBP21およびChi36の大量精製
精製したCBP21タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動した結果、発現誘導剤IPTG添加により、予測された21.9kDaの位置にバンドが検出され、顕著に発現誘導されたことが確認された。また、ニッケルカラムを通すことで6×His-tagを人工的に付加したCBP21を高純度に精製できていることを確認した。精製したCBP21の溶液中の濃度は濃縮前が0.832 (μg/μL)、濃縮後が0.360(μg/μL)であり、最終的に精製できた総量は10Lから、600μgと非上に微量であった。
精製したChi36タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動した結果、IPTG添加により、予測された37.7kDaの位置にバンドが検出され、顕著に発現誘導されたことが確認された。また、ニッケルカラムを通すことで6×His-tagを人工的に付加したChi36を高純度に精製できていることを確認した。精製できたChi36の溶液中の濃度は濃縮前が0.840 (μg /μl)、濃縮後が1.008(μg /μl)であり、最終的に精製できた総量は10Lの培養液から、2400μg (2.4 mg)と非常に微量であった。CBP21およびChi36タンパク質生産量が通常より少ない理由として、バチルス菌と大腸菌のコドン使用頻度の違いによる可能性がある。今後は大腸菌で使用される頻度の高いコドンにDNA配列を返還したうえで、タンパク質生産を行う必要があると考えられた。
【００３９】
(2)  大量精製したCBP21およびChi36を用いたポリスチレンからスチレンモノマー生成
精製したCBP21とChi36を用いてポリスチレン（PS）の分解実験を行った。実験に使用した酵素量は、CBP21が100 μgでChi36は400 μgである。
ガスクロマトグラフ質量分析の結果より算出した、スチレンモノマー（SM）生成量は酵素を添加しない資料と比べてCBP21のみを添加した場合とChi36のみを添加した場合もわずか0.1mg/L(CBP21)から0.18mg/L(chi36)が検出された。これに対して、CBP21とChi36の両方を添加した場合は、CBP21又はChi36単体で分解を行った場合に比べて、CBP21に対し約10倍(最大14倍)、Chi36に対し約6倍(最大9倍)の約1mg/LのSMが生成された。
CBP21とChi36の両方を添加した場合のPS→SM転換率は、6.5 %(最大9.1 %)と高い転換率を得ることができた。これらの結果から、CBP21とChi36の両方のタンパク質がポリスチレンPSからSMを生成させる酵素であると結論づけられた。
さらに、CBP21およびChi36がそれぞれ1 mol当たりに、生成したSMのmol重量を算出した。この結果、CBP21は、1 mol当たり4.70 molのSM生成が算出された。また、Chi36は、1 mol当たり1.88 molのSM生成が算出された。CBP21単体ではChi36単体よりもSM生成量が少ないにもかかわらず、CBP21とChi36を両方加えるた場合は、1 mol当たりに生成するSMの分子量はCBP21の方がChi36よりも増大することが示された。従って、mol比からは、CBP21の方がChi36よりPSからSM生成への貢献度が高いと言える。
これらの結果から、当初の推測通り、PSを分解してSMを生成する反応において、CBP21とChi36の両タンパク質が関係しており、STR-Y-O株におけるPSの初期分解はCBP21とChi36の両タンパク質の協同によるSMの生成反応であることが明らかになった。
【００４０】
(3)  STR-Y-O株の培養液上清を用いたポリスチレンからスチレンモノマー生成
STR-Y-O株によるリモネンで溶かした新品の発泡スチロールと5年使用済みの発泡スチロールの分解を分析したところ、劣化・損傷のある発泡スチロールにおいても新品発泡スチロールと同等の初期濃度のポリスチレンの20%分解能が確認され、劣化・損傷の有無にかかわらず分解能を発揮できることが示された。さらに、STR-Y-O株の培養液を遠心集菌し、菌体を取り除いた培養液上清を用いて同様の実験を行ったところ、その培養液上清においても、菌体を含む場合と同等の初期濃度のポリスチレンの20%分解能が確認された。さらにこの分解物にスチレンモノマーが検出された。この結果は、cbp21とchi36の塩基配列決定の結果からも言えることであるが、両遺伝子ともに5’末端にシグナルシークエンスをコードすることが示され、両遺伝子のコードするタンパク質が細胞外へ分泌され、この分泌された両タンパク質によりPSがSMへ転換されたのではないかと推察された。
このことから、分解酵素は細胞外分泌型の酵素であること考えられ、STR-Y-O株によるPS分解は取り扱いの面において、菌体を必要としないで物質(酵素)として扱うことができ、野生型のSTR-Y-O株の培養効率を最適化して、酵素の生産効率を上げることができれば、cbp21遺伝子とchi36遺伝子を導入した大腸菌組換え体による生産によらずとも、安価にスチレンモノマーを生成できるものと考えられ、取扱が簡素化されることから、より実用的なものになる可能性がある。使用済みの発泡スチロールをリモネンなどの有機溶媒で溶かした溶液を、直接STR-Y-O株の培養液上清に加えて、常温・常圧でSMを生成し、この生成されたSMを含む溶液を蒸留装置に加えて、SMを精製する方法を提供できる。
【００４１】
以上、本発明の好ましい実施の形態について詳述したが、本発明は、特定の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。
【図１】
2015156819.tif 000004
【図２】
2015156819.tif 000005
【図３】
2015156819.tif 000006
【図４】
2015156819.tif 000007
【図５】
2015156819.tif 000008
【図６】
2015156819.tif 000009
【配列表】
2015156819000001.app