(57)【要約】【課題】  患者がＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するか否かを検査する新規の方法、および、患者の急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後を予測する新規の方法を提供すること。【解決手段】  本発明のＲＵＮＸ１遺伝子の変異を検出するためのバイオマーカーおよび急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後を予測するためのバイオマーカーは、血小板のコラーゲン受容体若しくは血小板のトロンボキサンＡ２受容体のタンパク質またはｍＲＮＡからなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板のコラーゲン受容体若しくは血小板のトロンボキサンＡ２受容体のタンパク質またはｍＲＮＡからなる、ＲＵＮＸ１遺伝子の変異を検出するためのバイオマーカー。
【請求項２】
前記コラーゲン受容体はＣＤ４９ｂ又はＣＤ２９である、請求項１に記載のバイオマーカー。
【請求項３】
血小板のコラーゲン受容体若しくは血小板のトロンボキサンＡ２受容体のタンパク質またはｍＲＮＡからなる、急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後を予測するためのバイオマーカー。
【請求項４】
前記コラーゲン受容体は、ＣＤ４９ｂ又はＣＤ２９である、請求項４に記載のバイオマーカー。
【請求項５】
血液凝集率を比較する方法であって、
被検体から採取した血液にコラーゲン又はトロンボキサンＡ２を添加して測定された第１の血液凝集率を、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有さない健常体から取得した血液にコラーゲン又はトロンボキサンＡ２を添加して測定された第２の血液凝集率と比較する方法。
【請求項６】
ＲＵＮＸ１遺伝子の変異の有無を判定するための判定方法であって、
被検体から採取した血液にコラーゲン又はトロンボキサンＡ２を添加して測定された第１の血液凝集率を、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有さない健常体から取得した血液にコラーゲン又はトロンボキサンＡ２を添加して測定された第２の血液凝集率と比較する工程と、
第１の血液凝集率が第２の血液凝集率より小さい場合、前記被検体のＲＵＮＸ１遺伝子に変異が有ると判定し、
第１の血液凝集率が第２の血液凝集率より大きい場合、前記被検体のＲＵＮＸ１遺伝子に変異が無いと判定する工程と、
を含む方法。  
【請求項７】
診断対象の被検体から採取された血液または血小板中のバイオマーカーの発現レベルを取得する工程と、
健常体の血液または血小板中のバイオマーカーの発現レベルを取得し、前記被検体における発現レベルと比較する工程と、
発現レベルを比較した結果を出力する工程と、をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、前記バイオマーカーが、コラーゲン受容体またはトロンボキサンＡ２受容体のタンパク質またはｍＲＮＡであることを特徴とするプログラム。
【請求項８】
前記比較した結果に基づいて、前記被検体のＲＵＮＸ１遺伝子における変異、または急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後を判定する工程と、
判定した結果を出力する工程と、
をさらにコンピュータに実行させるための、請求項７に記載のプログラム
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＵＮＸ１遺伝子の変異を検出するための検査用バイオマーカー、および、急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後を予測するための検査用バイオマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＵＮＸ１（Runt-related transcription factor 1）遺伝子は、急性白血病・骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）などの造血器悪性腫瘍の患者に高頻度に変異が見られ、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有する急性白血病・骨髄異形成症候群の患者は、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有さない陰性の急性白血病・骨髄異形成症候群の患者に比べて治療反応性が悪く、予後不良であることが知られている。
【０００３】
従って、新規の急性白血病やＭＤＳ患者でＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するか否かをあらかじめ知ることができれば、最初からより強力な治療を行うなど、病態に即した効果的な治療戦略をとることが可能になり、ひいてはＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有さない急性白血病・ＭＤＳの治療成績向上につながるものと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Harada H, et al. Blood 103: 2316, 2004
【非特許文献２】Haferlach T, et al. Leukemia. 28: 241, 2014
【非特許文献３】Mendler JH et al. J Clin. Oncol 30:3109, 2012
【非特許文献４】Grossmann V, et al. Blood 120:2963, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、患者がＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するか否かを検査する新規の方法、および、患者の急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後を予測する新規の方法を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一実施態様は、血小板のコラーゲン受容体若しくは血小板のトロンボキサンＡ２受容体のタンパク質またはｍＲＮＡからなる、ＲＵＮＸ１遺伝子の変異を検出するためのバイオマーカーおよび急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後を予測するためのバイオマーカーである。前記コラーゲン受容体はＣＤ４９ｂ又はＣＤ２９である。
【０００７】
また、本発明の他の実施態様は、血液凝集率を比較する方法であって、被検体から採取した血液にコラーゲン又はトロンボキサンＡ２を添加して測定された第１の血液凝集率を、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有さない健常体から取得した血液にコラーゲン又はトロンボキサンＡ２を添加して測定された第２の血液凝集率と比較する方法である。
【０００８】
また、本発明のさらに他の実施態様は、ＲＵＮＸ１遺伝子の変異の有無を判定するための判定方法であって、被検体から採取した血液にコラーゲン又はトロンボキサンＡ２を添加して測定された第１の血液凝集率を、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有さない健常体から取得した血液にコラーゲン又はトロンボキサンＡ２を添加して測定された第２の血液凝集率と比較する工程と、第１の血液凝集率が第２の血液凝集率より小さい場合、前記被検体のＲＵＮＸ１遺伝子に変異が有ると判定し、第１の血液凝集率が第２の血液凝集率より大きい場合、前記被検体のＲＵＮＸ１遺伝子に変異が無いと判定する工程と、を含む方法である。
【０００９】
また、本発明のさらに他の実施態様は、診断対象の被検体から採取された血液または血小板中のバイオマーカーの発現レベルを取得する工程と、健常体の血液または血小板中のバイオマーカーの発現レベルを取得し、前記被検体における発現レベルと比較する工程と、発現レベルを比較した結果を出力する工程と、をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、前記バイオマーカーが、コラーゲン受容体またはトロンボキサンＡ２受容体のタンパク質またはｍＲＮＡであることを特徴とするプログラムである。前記比較した結果に基づいて、前記被検体のＲＵＮＸ１遺伝子における変異、または急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後を判定する工程と、判定した結果を出力する工程と、をさらにコンピュータに実行させてもよい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、患者がＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するか否かを検査する新規の方法、および、患者の急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後を予測する新規の方法を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】健常者のＲｕｎｘ１ｂタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図２】健常者のＲｕｎｘ１ｂタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【図３】ＦＰＤ１〜３の変異型Ｒｕｎｘ１ｂタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図４】ＦＰＤ１〜３の変異型Ｒｕｎｘ１ｂタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【図５】ＦＰＤ４の変異型Ｒｕｎｘ１ｂタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図６】ＦＰＤ４の変異型Ｒｕｎｘ１ｂタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【図７】ＦＰＤ５の変異型Ｒｕｎｘ１ｂタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図８】ＦＰＤ５の変異型Ｒｕｎｘ１ｂタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【図９】ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するＦＰＤ患者の、５μｇ／ｍＬのコラーゲンに対する血小板凝集率を示す図である。
【図１０】ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するＦＰＤ患者の、６．５μｇ／ｍＬのコラーゲンに対する血小板凝集率を示す図である。
【図１１】ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するＦＰＤ患者の、１０μｇ／ｍＬのコラーゲンに対する血小板凝集率を示す図である。
【図１２】ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するＦＰＤ患者の、１０μｇ／ｍＬのトロンボキサンＡ２アナログ（Ｕ４６６１９）に対する血小板凝集率を示す図である。
【図１３】ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するＦＰＤ患者の、２５μｇ／ｍＬのトロンボキサンＡ２アナログ（Ｕ４６６１９）に対する血小板凝集率を示す図である。
【図１４】ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するＦＰＤ患者のＡＤＰ（アデノシン二リン酸）に対する血小板凝集率を示す図である。
【図１５】ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するＦＰＤ患者のＴＲＡＰ（Thrombin receptor agonistic peptide）に対する血小板凝集率を示す図である。
【図１６】ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するＦＰＤ患者の血小板の表面における各種タンパク質量を示す図である。
【図１７】ＦＰＤ患者、ＲＵＮＸ１遺伝子を欠損しているＭＤＳ患者、および健常者それぞれから取得した血小板におけるＣＤ４９ｂの発現レベルを示す図である。
【図１８】ＦＰＤ患者、ＲＵＮＸ１遺伝子を欠損しているＭＤＳ患者、および健常者それぞれから取得した血小板におけるＣＤ２９の発現レベルを示す図である。
【図１９】ＦＰＤ患者、ＲＵＮＸ１遺伝子を欠損しているＭＤＳ患者、および健常者それぞれから取得した血小板におけるＣＤ４１の発現レベルを示す図である。
【図２０】ＦＰＤ患者、ＲＵＮＸ１遺伝子を欠損しているＭＤＳ患者、および健常者それぞれから取得した血小板におけるＣＤ４２ａの発現レベルを示す図である。
【図２１】ＦＰＤ患者、ＲＵＮＸ１遺伝子を欠損しているＭＤＳ患者、および健常者それぞれから取得した血小板におけるＣＤ４９ｂの発現レベルを示す図である。
【図２２】ＦＰＤ患者、ＲＵＮＸ１遺伝子を欠損しているＭＤＳ患者、および健常者それぞれから取得した血小板におけるＣＤ２９の発現レベルを示す図である。
【図２３】ＦＰＤ患者、ＲＵＮＸ１遺伝子を欠損しているＭＤＳ患者、および健常者それぞれから取得した血小板におけるＣＤ４１の発現レベルを示す図である。
【図２４】ＦＰＤ患者、ＲＵＮＸ１遺伝子を欠損しているＭＤＳ患者、および健常者それぞれから取得した血小板におけるＣＤ４２ａの発現レベルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１３】
本発明にかかるＲＵＮＸ１遺伝子の変異を検出するための検査用バイオマーカー、および、急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後を予測するための検査用バイオマーカーは、血小板のコラーゲン受容体若しくはトロンボキサンＡ２受容体のタンパク質またはｍＲＮＡである。コラーゲン受容体は、例えば、ＣＤ４９ｂ又はＣＤ２９である。
【００１４】
被検体から得た血小板におけるこれらのタンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルから、その被検体がＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するか否かを判定することができ、また、急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後を予測することができる。また、その結果に基づいて、治療戦略を練ることができる。以下に被検体がＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するか否かを判定する方法、および、急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後を予測する方法を説明する。ここで、被検体は、ヒトでも非ヒト動物でもよく、非ヒト動物は、例えば、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ハムスター、マウスおよびラットなどの哺乳動物を含む。
【００１５】
まず、被検体から採取された全血や、その全血から精製して取得した血小板について、血小板のコラーゲン受容体若しくはトロンボキサンＡ２受容体のタンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルを測定する。例えば、発現レベルを血小板自体で測定する場合、コラーゲン受容体若しくはトロンボキサンＡ２受容体の抗体を用い、ＦＡＣＳなどによって測定できる。発現レベルを血小板の抽出物で測定する場合、ＲＴ-ＰＣＲ、ノーザン・ブロッティング、ウエスタン・ブロッティング、ＥＬＩＳＡなどを用いてもよいが、これらの方法に限定されず、測定者は、使用するマーカーと系に対して適切な方法を選択することが可能である。
【００１６】
次に、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有さない健常体から採取された全血や、その全血から精製して取得した血小板について、被検体から採取された血液等において測定するのと同じ方法で、バイオマーカーの発現レベルを測定する。なお、あらかじめ測定しておいたバイオマーカーの発現レベルの測定データを使用してもよい。また、健常体のバイオマーカーの発現レベルは、閾値で表されてもよく、範囲で表されてもよい。例えば、各健常体に対する複数回の測定値の平均値に標準偏差を減じた値から平均値に標準偏差を加えた値までの範囲としてもよく、平均値の下限値から上限値までの範囲としてもよく、特に限定されるものではない。
【００１７】
次に、被検体の血小板における本発明にかかるバイオマーカーの発現レベルを、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有さない健常体の血小板における本発明にかかるバイオマーカーの発現レベルと比較する。被検体の血小板におけるバイオマーカーの発現レベルが、健常体の血小板における発現レベルと比較して低い場合は、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有し、また、急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後が悪いと判断することができる。逆に、被検体の血小板における発現レベルが、健常体の発現レベルと比較して高い場合は、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有さず、また、急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後が良いと判断することができる。例えば、健常体の血小板におけるバイオマーカーの発現量が範囲で表されている時、その上限より高い場合を、健常体の血小板におけるバイオマーカーの発現量より高いとし、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有さないと判定したり、又は、被検体の急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後が良いと予測したりすることができ、下限より低い場合を、健常体の血小板におけるバイオマーカーの発現量より低いとし、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有すると判定したり、又は、被検体の急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後が不良であると予測したりすることができる。
【００１８】
バイオマーカーの発現レベルを測定する代わりに、血小板にコラーゲン又はトロンボキサンＡ２を添加し、血小板の凝集率を測定することにより、ＲＵＮＸ１遺伝子の変異の有無を判定したり、又は、急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後を予測したりすることもできる。
【００１９】
まず、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有さない健常体の血小板の凝集率として、あらかじめ、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有さない複数のヒトの血液において、血小板の凝集率を測定する。一方、被検体から採取された血液や、その血液から精製して取得した血小板について、健常体と同様にコラーゲン又はトロンボキサンＡ２を添加した場合の血小板の凝集率を測定する。そして、両者の血小板の凝集率を比較する。なお、あらかじめ健常体の血小板の凝集率を決めるのではなく、被検体の血小板の凝集率を測定する際、対照として健常体の血小板の凝集率を測定してもよい。また、健常体の血小板の凝集率は範囲で表されてもよい。例えば、各健常体に対する複数回の測定値の平均値に標準偏差を減じた値から平均値に標準偏差を加えた値までの範囲としてもよく、平均値の下限値から上限値までの範囲としてもよく、特に限定されるものではない。
【００２０】
被検体の血小板の凝集率が健常体よりも低い場合は、ＲＵＮＸ１遺伝子の変異を有すると判定したり、又は、被検体の急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後が不良であると予測したりできる。逆に、被検体から取得した血液の血小板の凝集率の方が高い場合はＲＵＮＸ１遺伝子の変異を有さないと判定したり、又は、被検体の急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後が良いと予測したりできる。例えば、健常体の血小板の凝集率が範囲で表されている時、その上限より高い場合を、健常体の血小板の凝集率より高いとし、ＲＵＮＸ１遺伝子の変異を有さないと判定したり、又は、被検体の急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後が良いと予測したりすることができ、下限より低い場合を、健常体の血小板の凝集率より低いとし、ＲＵＮＸ１遺伝子の変異を有すると判定したり、又は、被検体の急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後が不良であると予測したりすることができる。
【００２１】
＝＝バイオマーカーを利用するためのコンピュータ＝＝
上述したように、ヒトまたは非ヒト動物個体から採取された血液あるいは血小板に含まれるバイオマーカーの発現レベルが測定された後、その結果が、コンピュータに送信され、上述の方法に従って、コンピュータが、その結果を利用してもよい。
【００２２】
例えば、医療従事者が、ヒトまたは非ヒト動物個体から血液あるいは血小板を採取し、適切に処理をして、サンプルをバイオマーカー測定装置にセットする。コンピュータは、バイオマーカー測定装置に、サンプル中のバイオマーカーの発現レベルを測定させ、測定結果を取得する。そして、コンピュータは、取得した血液あるいは血小板中のバイオマーカーの発現レベルに基づいて、診断対象の被検体がＲＵＮＸ１遺伝子の変異を有するか、被検体の急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後が不良であるか、を判定する。コンピュータは、そのようにして得られた判定結果を出力し、医療従事者は、診断対象の被検体についての情報を得ることが可能になる。
【００２３】
なお、本発明のプログラムは、コンピュータに、取得した血液あるいは血小板中のバイオマーカーの発現レベルを利用する方法を実行させるものである。また、コンピュータに、バイオマーカー測定装置にサンプル中のバイオマーカーの発現レベルを測定させる工程を実行させてもよい。
【００２４】
そして、このようなプログラムを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録することもできる。記録媒体は、ハードディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ＵＳＢメモリ、フロッピーディスクなど、特に限定されない。
【実施例】
【００２５】
＜実験例１：試料の調整＞
家族性血小板異常症（familial platelet disorder;ＦＰＤ）は、ＲＵＮＸ１遺伝子に先天的に変異を有する、急性白血病やＭＤＳに高率に進展する先天性の疾患である。急性白血病やＭＤＳは発症しておらず、かつ、ＲＵＮＸ１遺伝子以外の遺伝子に変異のないＦＰＤ患者４人から血液を採取し、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するヒトの血液試料として実験に使用した。また、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有さない健常者から血液を採取し、対照試料として実験に使用した。
【００２６】
健常者および家族性血小板異常症（familial platelet disorder;ＦＰＤ）の患者４人から採取した各全血に、抗凝固剤として、各全血量の１／９の容量の３．８％クエン酸ナトリウム水溶液を加え、室温で７０×ｇで１５分間遠心分離を行った。遠心後、上清層を多血小板血漿（ＰＲＰ：platelet rich plasma）として別のチューブに回収した。また、残った血球層はさらに室温で１０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、上清層を乏血小板血漿（ＰＰＰ：platelet poor plasma）として回収した。
【００２７】
以上のように取得したＰＲＰおよびＰＰＰを以下の実験に使用した。
＜実験例２：ＲＵＮＸ１タンパク質およびそのｍＲＮＡの変異の解析＞
本実施例では、実験に用いたＦＰＤ患者から取得した血液を用いてＲＵＮＸ１遺伝子の変異を特定する。
【００２８】
下記プライマーペアを用いたＲＴ−ＰＣＲ法によって、試料中のＲＵＮＸ１ｃＤＮＡの塩基配列を調べ、ＲＵＮＸ１タンパク質のアミノ酸配列を推定した。以下、ＦＰＤ患者４人から採取した試料をそれぞれＦＰＤ１、ＦＰＤ２、ＦＰＤ３、ＦＰＤ４と呼ぶ。
【００２９】
PCR プライマー (Forward/ Reverse primers)
(Exon 3)  5’-AGCTGTTTGCAGGGTCCTAA-3’/ 5’-GTCCTCCCACCACCCTCT-3’
(Exon 4)  5’-CATTGCTATTCCTCTGCAACC-3’/ 5’-CCATGAAACGTGTTTCAAGC-3’ 
(Exon 5b)       5’-CCACCAACCTCATTCTGTTT-3’/ 5’-AGACATGGTCCCTGAGTATA-3’
(Exon 6b)       5’-GGGGGCCCATTCTGCTGAGAGG-3’/ 5’-GAGCATCAAGGGGAAACCCC-3’
(Exon 7)  5’-AATCCCACCCCACTTTACAT-3’/ 5’-CTCAGCTGCAAAGAATGTGT-3’
(Exon 8)  5’-TCCGCTCCGTTCTCTTGC-3’/ 5’-GCTTGTCGCGAACAGGAG-3’
図１及び図２はそれぞれ健常者のＲＵＮＸ１タンパク質のアミノ酸配列およびＲＵＮＸ１タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。図３及び図４はＦＰＤ１〜３のＲＵＮＸ１タンパク質のアミノ酸配列およびこれらをコードするｃＤＮＡの各塩基配列、図５及び図６はＦＰＤ４のＲＵＮＸ１タンパク質のアミノ酸配列およびこれをコードするｃＤＮＡの各塩基配列図７及び図８はＦＰＤ５のＲＵＮＸ１タンパク質のアミノ酸配列およびこれをコードするｃＤＮＡの各塩基配列を示す。
【００３０】
ＦＰＤ１、ＦＰＤ２、ＦＰＤ３に含まれるＲＵＮＸ１ｃＤＮＡの５１５位のｇはａに変異しており、その結果、ＲＵＮＸ１タンパク質は１７２位のグリシンがグルタミン酸に置換している。ＦＰＤ４に含まれるＲＵＮＸ１ｃＤＮＡの４２７位のｇはｔに変異しており、その結果、ＲＵＮＸ１タンパク質は１４３位のグリシンがリシンに置換している。ＦＰＤ５に含まれるＲＵＮＸ１ｃＤＮＡは、６９７位のａが欠失したフレームシフト変異を有しており、その結果、ＲＵＮＸ１タンパク質は２３３位から２８３位のアミノ酸配列が欠失している。
＜実験例３：試料の凝集率の測定＞
ＲＵＮＸ１遺伝子が変異している血小板の凝集率の測定を行い、ＲＵＮＸ１遺伝子の変異と血小板の凝集率との関連性を調べた。
【００３１】
まず、健常者から回収したＰＲＰについて、血小板濃度が２０万／μＬとなるように調整した。ＦＰＤ患者はもともと血小板数が少なく２０万／μＬのＰＲＰは調整できないため、各ＰＲＰ中は、各ＰＰＰを加えて血小板濃度が１０万／μＬとなるように調整した。そして、各ＰＰＰ１９０μＬに対し、血小板凝集惹起剤として、コラーゲン、Ｕ４６６１９トロンボキサンＡ２アナログ、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）、又はＴＲＡＰ（Thrombin receptor agonistic peptide）を添加した。添加濃度は、コラーゲンは終濃度５μｇ／ｍＬ、６．５μｇ／ｍＬ、若しくは１０μｇ／ｍＬとなるように、トロンボキサンＡ２アナログ（Ｕ４６６１９）は、終濃度１０μｇ／ｍＬ若しくは２５μｇ／ｍＬとなるように、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）は終濃度２０μＭとなるように、ＴＲＡＰ（Thrombin receptor agonistic peptide）は終濃度１０μＭとなるようにそれぞれ添加した。血小板凝集計（株式会社ＬＭＳ製、ＨＥＭＡ  ＴＲＡＣＥＲ８０４）を用いて血小板の凝集率を測定し、血小板凝集惹起剤を添加したときを０分とし、経時的に凝集率をプロットした。ＦＰＤ１〜４のいずれも同じ傾向の結果となった。その代表的な結果を図９〜１４に示す。
【００３２】
図９〜１１は、健常者とＦＰＤ１のＰＲＰのコラーゲンに対する血小板凝集率を示し、図９はコラーゲンを終濃度５μｇ／ｍＬとなるように添加した場合、図１０はコラーゲンを終濃度６．５μｇ／ｍＬとなるように添加した場合、図１１はコラーゲンを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加した場合の結果を示す。
【００３３】
図１２および図１３は、健常者とＦＰＤ１のＰＲＰのＵ４６６１９トロンボキサンＡ２アナログに対する血小板凝集率を示す。図１２はＵ４６６１９トロンボキサンＡ２アナログを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加した場合、図１３はＵ４６６１９トロンボキサンＡ２アナログを終濃度２５μｇ／ｍＬとなるように添加した場合である。
【００３４】
図１４は、健常者とＦＰＤ１のＰＲＰのＡＤＰに対する血小板凝集率を示し、図１５は、健常者の血小板とＦＰＤ１の血小板のＴＲＡＰに対する血液凝集率を示す。
【００３５】
図１４及び図１５に示すように、ＡＤＰやＴＲＡＰに対する血小板凝集率については、ＦＰＤ患者のＰＲＰは健常者のＰＲＰと同等である。これに対し、図９〜１１に示すように、コラーゲンに対する血小板凝集率については、健常者のＰＲＰでは５０％前後であるところ、ＦＰＤ患者のＰＲＰは２５％以下である。また、図１２及び図１３に示すように、Ｕ４６６１９トロンボキサンＡ２アナログに対する血小板凝集率については、健常者のＰＲＰでは９０％前後であるところ、ＦＰＤ患者のＰＲＰは５０％以下である。
【００３６】
以上のように、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するヒトの血液は、コラーゲンやＵ４６６１９トロンボキサンＡ２アナログにより惹起される血小板凝集率が低い。この結果から、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するヒトの血小板における、コラーゲン受容体及びＵ４６６１９トロンボキサンＡ２アナログ受容体の発現量は、健常者の血小板よりも少ないと考えられる。
【００３７】
＜実験例４：コラーゲン受容体の発現量＞
ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有する被検体から得た血液中の血小板表面のコラーゲン受容体の量を調べ、ＲＵＮＸ１遺伝子における変異とコラーゲン受容体の発現量との関連性を調べた。
【００３８】
ＰＢＳに２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび３．８％クエン酸ナトリウム水溶液（ＰＢＳの１／９量）を加え、血小板希釈用溶液とした。ＦＰＤ患者および健常者から得たＰＲＰを血小板希釈用溶液で希釈し、血小板濃度を１００００／μＬに調整した。この血小板浮遊液８０μＬに各抗体を２０μＬずつ加え、遮光し室温で３０分間反応させた。抗体は、抗ＣＤ４１抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ：ＩＭ０６４９Ｕ）、抗ＣＤ４２ａ抗体（ＢＥＣＫＭＡＮＣＯＵＬＴＥＲ：ＩＭ１７５７）、抗ＣＤ４２ｂ抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ：ＩＭ０６４８Ｕ）、抗ＣＤ４９ｂ抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ：ＩＭ１４２５）、抗ＣＤ２９抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ：ＩＭ６６０４１０５）、マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ：Ａ０７７９５）を使用した。その後、１００μＬの４％パラホルムアルデヒドを加えて室温で１０分間固定した。そして、ＰＢＳ３００μＬを加えて希釈し、フローサイトメーターで血小板膜上のタンパク発現レベルを測定した。これにより得たデータの代表例を図１６に示す。
【００３９】
また、下記式で求めたＣＤ４９ｂ、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａの平均蛍光強度比を図１７〜２０に示す。図中のcontrol１〜１４は、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有さない健常者から採取した血小板の結果である。また、ＦＰＤ患者から取得したのと同様の方法で、ＲＵＮＸ１を欠損した骨髄異形性症候群（ＭＤＳ）患者から取得したＰＲＰについても同様にフローサイトメーターで血小板膜上のＣＤ４９ｂ、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＩｇＧのタンパク発現レベルを測定し、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａの平均蛍光強度比を求めた。
式：平均蛍光強度比＝（試料の平均蛍光強度−ＩｇＧの平均蛍光強度）／ＩｇＧの平均蛍光強度
また、下記式で求めたＣＤ４９ｂ、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａの平均蛍光強度比を図２１〜２４に示す。
式：平均蛍光強度比＝（試料の平均蛍光強度−試料のＩｇＧの平均蛍光強度）／（control-1の平均蛍光強度−control-1のＩｇＧの平均蛍光強度）
図１６〜２４によると、ＦＰＤ患者のＰＲＰを健常者のＰＲＰと比較すると、血小板特異的表現マーカーであるＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂの発現レベルは同等であるが、コラーゲン受容体を構成するＣＤ４９ｂおよびＣＤ２９については、ＦＰＤ患者の発現レベルは健常者の発現レベルと比較して低い。例えば、健常者のＣＤ４９ｂの平均蛍光強度比は１よりも大きいのに対し、ＦＰＤ１〜４のＣＤ４９ｂの平均蛍光強度比は１以下であり（図１７）、ＦＰＤ１〜４のＣＤ４９ｂの平均蛍光強度比は、control-1の２５％未満である（図２１）。このことから、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有するヒトのコラーゲン受容体は健常者よりも発現量が少ないことがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年4月1日(2014.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板のコラーゲン受容体若しくは血小板のトロンボキサンＡ２受容体のタンパク質またはｍＲＮＡからなる、ＲＵＮＸ１遺伝子の変異を検出するためのバイオマーカー。
【請求項２】
前記コラーゲン受容体はＣＤ４９ｂ又はＣＤ２９である、請求項１に記載のバイオマーカー。
【請求項３】
血小板のコラーゲン受容体若しくは血小板のトロンボキサンＡ２受容体のタンパク質またはｍＲＮＡからなる、急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後を予測するためのバイオマーカー。
【請求項４】
前記コラーゲン受容体は、ＣＤ４９ｂ又はＣＤ２９である、請求項３に記載のバイオマーカー。
【請求項５】
血液凝集率を比較する方法であって、
被検体から採取した血液にコラーゲン又はトロンボキサンＡ２を添加して測定された第１の血液凝集率を、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有さない健常体から取得した血液にコラーゲン又はトロンボキサンＡ２を添加して測定された第２の血液凝集率と比較する方法。
【請求項６】
ＲＵＮＸ１遺伝子の変異の有無を判定するための判定方法であって、
被検体から採取した血液にコラーゲン又はトロンボキサンＡ２を添加して測定された第１の血液凝集率を、ＲＵＮＸ１遺伝子に変異を有さない健常体から取得した血液にコラーゲン又はトロンボキサンＡ２を添加して測定された第２の血液凝集率と比較する工程と、
第１の血液凝集率が第２の血液凝集率より小さい場合、前記被検体のＲＵＮＸ１遺伝子に変異が有ると判定し、
第１の血液凝集率が第２の血液凝集率より大きい場合、前記被検体のＲＵＮＸ１遺伝子に変異が無いと判定する工程と、
を含む方法。
【請求項７】
診断対象の被検体から採取された血液または血小板中のバイオマーカーの発現レベルを取得する工程と、
健常体の血液または血小板中のバイオマーカーの発現レベルを取得し、前記被検体における発現レベルと比較する工程と、
発現レベルを比較した結果を出力する工程と、をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、前記バイオマーカーが、コラーゲン受容体またはトロンボキサンＡ２受容体のタンパク質またはｍＲＮＡであることを特徴とするプログラム。
【請求項８】
前記比較した結果に基づいて、前記被検体のＲＵＮＸ１遺伝子における変異、または急性白血病又は骨髄異形性症候群の予後を判定する工程と、
判定した結果を出力する工程と、
をさらにコンピュータに実行させるための、請求項７に記載のプログラム。