(57)【要約】【課題】CXCR4の活性を抑制又は阻害し、CXCL12及びCXCL14の両者の活性を抑制又は阻害し得るペプチド等を提供する。【解決手段】本発明に係るペプチド等は、ヒトCXCL14ケモカインタンパク質のC末端側のαへリックス構造を有する領域を含むペプチド若しくはその変異体ペプチドを、リンカー結合を介して二量体化させてなる、ダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトCXCL14ケモカインタンパク質のC末端側のαへリックス構造を有する領域を含むペプチド若しくはその変異体ペプチドを、リンカー結合を介して二量体化させてなる、ダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
【請求項２】
以下の(a)又は(b)のペプチドを、リンカー結合を介して二量体化させてなる、ダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
(a) 配列番号２〜５で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
(b) 配列番号２〜５で表されるいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、二量体化させたダイマーペプチドとしたときにCXCR4活性の抑制又は阻害活性を有するペプチド
【請求項３】
以下の(a)又は(b)のペプチドを、リンカー結合を介して二量体化させてなる、ダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
(a) 配列番号２〜５で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド
(b) 配列番号２〜５で表されるいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、二量体化させたダイマーペプチドとしたときにCXCR4活性の抑制又は阻害活性を有するペプチド
【請求項４】
リンカー結合が、ジスルフィド結合又はオキシム結合である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
【請求項５】
ダイマーペプチドが、下記式(I)又は式(II)で表されるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
【化７】
2015024960.tif 000008
【化８】
2015024960.tif 000009
【請求項６】
CXCR4に対するアンタゴニスト活性を有するものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含む、CXCR4活性の抑制又は阻害剤。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含む、細胞走化性の抑制剤。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含む、糖尿病の治療又は予防用医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含む、癌の治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CXCL12ケモカインの受容体であるCXCR4の活性を阻害し得るペプチド、及びその用途に関する。詳しくは、CXCR4の活性を阻害することにより、CXCL12ケモカイン及びCXCL14ケモカインの両者の活性を阻害し得るペプチド、及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
CXCL14は上皮性癌組織で発現消失するCXCタイプのケモカインとして1999年に発見された。CXCL14は、組織マクロファージ、未成熟樹状細胞、及びNK細胞を誘引する活性を有するが、組織の損傷修復過程で発現誘導されないことから、一群の炎症性ケモカインとは異なる役割を担っていると推察されている（非特許文献１）。数あるケモカインの中で、CXCL14及びその近縁のCXCL12のアミノ酸配列だけは、魚類からヒトまでよく保存されている。2006年、CXCL12とその受容体CXCR4が造血幹細胞を骨髄ニッチに定着させるのに必須であることが証明された。CXCL12特異的な阻害剤であるAMD3100（モゾビル）は、造血幹細胞採取剤としてFDAで承認され、多発性骨髄腫等の治療に使用されている。その後の研究により、CXCL12・CXCR4システムは様々な組織由来の癌細胞の悪性化と転移にも必須な役割を果たすことが明らかにされた。
【０００３】
他方、研究が進んでいるCXCL12と比べて、CXCL14に関する研究はまだ始まったばかりである。本発明者は、CXCL14が肥満や２型糖尿病の発症と関連する重要な代謝調節因子であることを証明し、既に報告した（非特許文献２、３）。CXCL14ノックアウトマウス（CXCL14-KOマウス）を高脂肪食飼育すると、野生型マウス（対照）と同程度に内蔵白色脂肪が蓄積し、個々の脂肪細胞の肥大化が観察された。しかし、高脂肪食飼育したCXCL14-KOマウスでは内蔵脂肪に浸潤したマクロファージ数が野生型マウスと比べて減少しており、慢性炎症反応が緩和されていた。結果として、高脂肪食飼育したCXCL14-KOマウスでは脂肪肝が改善され、個体のインスリン感受性が保持されていた。CXCL14は視床下部にも発現し、絶食時の食欲促進ペプチドNPY・AgRPの発現誘導に関与していた。CXCL14-KOマウスは摂食量減少による低体重を示し、これはob/obやAy肥満マウスとの二重変異マウスにおいて、より顕著に観察された。したがって、CXCL14は末梢組織と中枢神経の両者において、エネルギーを備蓄する（肥満を助長する）方向に働くユニークなケモカインであると推察された。興味深いことに、CXCL14は急性の炎症反応では発現高進されないものの、肥満個体の内蔵脂肪や自己免疫性関節リウマチの患部では発現レベルが上昇し、インスリン抵抗性と関節炎の発症促進にそれぞれ寄与することが明らかにされている。このことは、CXCL14が肥満性糖尿病だけでなく、慢性炎症に起因する様々な疾患の悪化因子である可能性を示唆する。
【０００４】
上記の現象と対照的に、口腔癌や胃癌由来の上皮性癌細胞株にCXCL14を強制発現させてヌードマウスに移植すると、固形癌の形成率が減少することが報告されている。また、CXCL14トランスジェニックマウスでは、皮下に移植した癌細胞の腫瘍形成率が顕著に低下した。CXCL14はGefitinib（イレッサ）やErlotinib（ターセバ）などのEGF受容体キナーゼ阻害剤投与によって強く転写誘導されることから、これらの抗癌剤のエフェクターとして働いている可能性がある。しかし、CXCL14の示す抗癌活性の分子メカニズムはまだ解明されていない。
CXCL12とCXCL14は、癌や糖尿病の発症と密接に関わっている重要なケモカインである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】T. Hara and Y. Nakayama. CXCL14 and insulin action. Vitamins and Hormones, 80: 107-123, 2009.
【非特許文献２】N. Nara, Y. Nakayama, S. Okamoto, H. Tamura, M. Kiyono, M. Muraoka, K. Tanaka, C. Taya, H. Shitara, R. Ishii, H. Yonekawa, Y. Minokoshi, and T. Hara. Disruption of CXC motif chemokine ligand-14 in mice ameliorates obesity-induced insulin resistance. J. Biol. Chem., 282: 30794-30803, 2007.
【非特許文献３】K. Tanegashima, S. Okamoto, Y. Nakayama, C. Taya, H. Shitara, R. Ishii, H. Yonekawa, Y. Minokoshi, and T. Hara. CXCL14 deficiency in mice attenuates obesity and inhibits feeding behavior in a novel environment. PLoS ONE, 5: e10321, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような状況下において、CXCL14の受容体構成分子を同定し、それに基づく新しいタイプのCXCR4活性モジュレーターの開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、ダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩、並びに、CXCR4活性の阻害剤、細胞走化性の抑制剤、糖尿病の治療又は予防用医薬組成物、及び癌の治療用医薬組成物等を提供するものである。
【０００８】
（１）ヒトCXCL14ケモカインタンパク質のC末端側のαへリックス構造を有する領域を含むペプチド若しくはその変異体ペプチドを、リンカー結合を介して二量体化させてなる、ダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
【０００９】
（２）以下の(a)又は(b)のペプチドを、リンカー結合を介して二量体化させてなる、ダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
(a) 配列番号２〜５で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
(b) 配列番号２〜５で表されるいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、二量体化させたダイマーペプチドとしたときにCXCR4活性の抑制又は阻害活性を有するペプチド
【００１０】
（３）以下の(a)又は(b)のペプチドを、リンカー結合を介して二量体化させてなる、ダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
(a) 配列番号２〜５で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド
(b) 配列番号２〜５で表されるいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、二量体化させたダイマーペプチドとしたときにCXCR4活性の抑制又は阻害活性を有するペプチド
【００１１】
上記(1)〜(3)のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩において、リンカー結合は、例えば、ジスルフィド結合又はオキシム結合が挙げられる。
上記(1)〜(3)のダイマーペプチドは、例えば、下記式(I)又は式(II)で表されるものが挙げられる。
【００１２】
【化１】
2015024960.tif 000002
【００１３】
【化２】
2015024960.tif 000003
【００１４】
上記(1)〜(3)のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩は、例えば、CXCR4に対するアンタゴニスト活性を有するものが挙げられる。
【００１５】
（４）上記(1)〜(3)のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含む、CXCR4活性の抑制又は阻害剤。
（５）上記(1)〜(3)のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含む、細胞走化性の抑制剤。
（６）上記(1)〜(3)のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含む、糖尿病の治療又は予防用医薬組成物。
（７）上記(1)〜(3)のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含む、癌の治療用医薬組成物。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、CXCR4の活性を阻害することにより、CXCL12及びCXCL14の両者の活性を阻害し得るペプチド（ダイマーペプチド）等を提供することができる。
本発明のペプチド等は、細胞走化性の抑制剤、糖尿病の治療又は予防用医薬組成物、及び癌の治療用医薬組成物等の有効成分として用いることができる点で、極めて有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】CXCL12及びCXCL14の生物活性を担う受容体の構造及び構成因子を示す模式図である。
【図２】CXCL14がTHP-1細胞のCXCL12走化性を阻害することを示す図である。
【図３】CXCL14がCXCL12の活性と受容体結合を濃度依存的に阻害すること（ひいてはCXCL14はCXCL12の天然アンタゴニストであること）を示す図である。
【図４】CXCL14の立体構造と、CXCL14に由来する各ダイマーペプチド（N2C、CG2O）の構造を示す模式図である。
【図５】N2C及びCG2OがCXCL14の受容体への結合を濃度依存的に阻害することを示す図である。
【図６】N2C及びCG2OがTHP-1細胞のCXCL12/CXCL14走化性を阻害することを示す図である。
【図７】N2C及びCG2Oを投与した高脂肪食肥満マウスの体重変化を示す図である。
【図８】N2C及びCG2Oを投与した高脂肪食肥満マウスのインスリン感受性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１９】
１．本発明の概要
CXCL14は組織マクロファージや未成熟樹状細胞を皮下や臓器周囲に常在させる非炎症性のケモカインであるが、肥満性糖尿病の悪化、関節リウマチの発症、そして上皮性癌細胞の悪性増殖抑制にも関与していることが近年明らかとなった。
これに対し、本発明者は、CXCL14受容体には、CXCL12受容体であるCXCR4と機能未知の７回膜貫通型タンパク質Lphn2とが含まれていることを見出した（論文投稿中）。さらに、CXCL14はCXCR4に結合することでCXCL12のケモカイン活性を濃度依存的に抑制することを明らかにした（論文投稿中）。CXCL12は造血幹細胞を骨髄ニッチに呼び寄せる一方で、様々な組織由来の癌細胞の悪性増殖や転移を促進するケモカインでもある。CXCL14はCXCR4-Lphn2を含む受容体の活性化によって、CXCL14特異的な細胞内シグナルを伝えると同時に、CXCL12の天然アンタゴニストとして正常組織の構築及び維持にも重要な働きをしているものと推察される。
【００２０】
今回、本発明者は、CXCR4アンタゴニストやアゴニストが、糖尿病や癌の新規治療薬になることを期待し、分子構造予測に基づくCXCL14の構造改変を行った。その結果、CXCL14ケモカインタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）におけるC末端側の27アミノ酸残基（配列番号１で表されるアミノ酸配列の第51〜77番目のアミノ酸残基）を含むペプチドあるいはその変異体ペプチド（アミノ酸置換体）を、互いにN末端側でリンカー結合を介して二量体化させたダイマーペプチド（具体的には、N2CとCG2O（後述する式(I)及び式(II)参照））が、CXCL12及びCXCL14の両者の活性を有意に阻害することを発見した。なお、二量体化していないモノマー体のペプチドやC末端側でのリンカー結合（リンカーに使われる化学結合）を介して二量体化させたダイマーペプチドには、上述のような阻害活性は認められなかった。
【００２１】
２．CXCR4活性阻害ペプチド
本発明のペプチドは、CXCR4活性を阻害し得るペプチドであり、具体的には、ヒトCXCL14ケモカインタンパク質のC末端側のαへリックス構造を有する領域を含むペプチド若しくはその変異体ペプチドを、リンカー結合を介して二量体化させてなる、ダイマーペプチドである。
本発明において、「阻害」とは、「抑制」の概念も包含し、活性を完全に無くす（すなわち不活性化させる）ことのほか、活性を低下させることも含む意味である。
【００２２】
また本発明において、「ペプチド」とは、限定はされず、少なくとも２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合して構成されたものであればよく、オリゴペプチド、ポリペプチドなどが含まれる。さらに、ポリペプチドが一定の立体構造を形成したものはタンパク質と呼ばれるが、本発明においては、このようなタンパク質も上記「ペプチド」に含まれるものとする。従って、本発明のダイマーペプチドに使用されるペプチドは、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質のいずれをも意味し得るものである。
【００２３】
ここで、ヒトCXCL14ケモカインタンパク質（単にCXCL14とも表記する）のアミノ酸配列は、下記のとおり、配列番号１で表されるアミノ酸配列（７７アミノ酸残基）であり、そのうちC末端側のαへリックス構造を有する領域とは、好ましくは、当該アミノ酸配列のうち第５１番目〜第７７番目のアミノ酸を含む領域（下線部）であり、より好ましくは、当該アミノ酸配列のうち第５１番目〜第７７番目のアミノ酸からなる領域、及び第５０番目〜第７７番目のアミノ酸からなる領域である。
【００２４】
CXCL14のアミノ酸配列（配列番号１）：
SKCKCSRKGPKIRYSDVKKLEMKPKYPHCEEKMVIITTKSVSRYRGQEHCLHPKLQSTKRFIKWYNAWNEKRRVYEE
【００２５】
なお、上記αへリックス構造を有する領域を含むペプチドの変異体ペプチドとしては、限定はされないが、例えば、αへリックス構造を安定化させるために適宜アミノ酸置換をしたペプチド（具体的には、配列番号３及び５で表されるアミノ酸配列を含むペプチド等）等が好ましく挙げられる。
本発明のペプチドは、上記αへリックス構造を有する領域を含むペプチド若しくはその変異体ペプチドを二量体化させてなるダイマーペプチド（好ましくはホモダイマーペプチド）であるが、互いのペプチドは、リンカー結合を介して二量体化されたものである。ここで、リンカー結合としては、限定はされないが、ジスルフィド結合やオキシム結合等が挙げられる。また、リンカー結合は、各々のペプチド鎖のN末端側どうしで結合されていることが好ましい。
【００２６】
本発明のペプチドとしては、より具体的には、先に述べたとおり、下記(a)のペプチドを、リンカー結合を介して二量体化させてなる、ダイマーペプチドが好ましく挙げられる。
(a) 下記の配列番号２〜５で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
配列番号２： LHPKLQSTKRFIKWYNAWNEKRRVYEE
配列番号３： LHPKLESTKKFIEWYNKWNEKRRKYEE
配列番号４： CLHPKLQSTKRFIKWYNAWNEKRRVYEE
配列番号５： CLHPKLESTKKFIEWYNKWNEKRRKYEE
【００２７】
上記(a)のペプチドとしては、より好ましくは、配列番号２〜５で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである。
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表されるCXCL14のアミノ酸配列中、第５１番目〜第７７番目のアミノ酸からなる配列であり、配列番号３で表されるアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第６、１０、１３、１７及び２４番目のアミノ酸をグルタミン酸(E)又はリジン(K)に置換したものである（配列番号３で表されるアミノ酸配列中の下線を付したアミノ酸残基を参照）。
【００２８】
また配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表されるCXCL14のアミノ酸配列中、第５０番目〜第７７番目のアミノ酸からなる配列であり、配列番号５で表されるアミノ酸配列は、配列番号４で表されるアミノ酸配列の第７、１１、１４、１８及び２５番目のアミノ酸をグルタミン酸(E)又はリジン(K)に置換したものである（配列番号５で表されるアミノ酸配列中の下線を付したアミノ酸残基を参照）。
【００２９】
また本発明のペプチドとしては、先に述べたとおり、下記(b)のペプチドを、リンカー結合を介して二量体化させてなる、ダイマーペプチドであってもよい。
(b) 配列番号２〜５で表されるいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、二量体化させたダイマーペプチドとしたときにCXCR4活性の阻害活性を有するペプチド
【００３０】
上記(b)のペプチドとしては、より好ましくは、配列番号２〜５で表されるいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、二量体化させたダイマーペプチドとしたときにCXCR4活性の阻害活性を有するペプチドである。
【００３１】
ここで、上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、１個〜５個程度、好ましくは１個〜３個程度、より好ましくは１個〜２個程度のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列が挙げられ、限定はされない。上記欠失、置換、付加等の変異の導入は、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えば、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社）、及びTaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、上記欠失、置換又は付加の変異が導入されたペプチドであるかどうかは、各種アミノ酸配列決定法、並びにX線及びNMR等による構造解析法などを用いて確認することができる。
【００３２】
さらに、上記配列番号２〜５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのほか、上記アミノ酸配列に対して、約80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、二量体化させたダイマーペプチドとしたときにCXCR4活性の阻害活性を有するペプチドも挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
本発明において、「二量体化させたダイマーペプチドとしたときにCXCR4活性の阻害活性を有する」とは、具体的には、CXCR4受容体へのCXCL14及びCXCL12の結合を阻害する活性を有する意味であり、当該活性は、例えば、125Iで標識したCXCL14あるいはCXCL12を用いたバイディングアッセイ等により測定することができる。
【００３３】
上記(a)又は(b)のペプチドは、配列番号２〜５で表されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、又は前記欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドである限り、その構成アミノ酸の残基数は限定されず、22残基以上であってもよいし（前記欠失されたアミノ酸の場合等）、27残基以上であってもよく、例えば27〜100残基であってもよいし、27〜50残基であってもよいし、27〜40残基であってもよいし、27〜30残基であってもよい。
上記(a)又は(b)のペプチドを二量体化させてなるダイマーペプチドも、前述と同様、リンカー結合を介して二量体化させたものであり、当該リンカー結合としては、ジスルフィド結合及びオキシム結合等が好ましく挙げられる。また、リンカー結合は、各々のペプチド鎖のN末端側どうしで結合されていることが好ましい。
【００３４】
本発明のペプチドとしては、さらに具体的には、下記式(I)又は式(II)で表されるダイマーペプチドが好ましく挙げられる。式(I)のダイマーペプチドは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを、N末端のシステイン(C)残基どうしでジスルフィド結合（S-S結合）させたものである。また、式(II)で表されるダイマーペプチドは、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが、N末端のロイシン(L)残基どうしでオキシム結合により結合させたものである。
【００３５】
【化３】
2015024960.tif 000004
【００３６】
【化４】
2015024960.tif 000005
【００３７】
上記(a)又は(b)のペプチドは、天然物由来のペプチドであってもよいし、人工的に化学合成して得られたものであってもよく、限定はされない。人工的に化学合成して得られるペプチドである場合は、生産が容易であり、コストを安価に抑えて大量調製することができるため好ましい。天然物由来のペプチドである場合は、細胞毒性等の悪影響がない場合が多いため好ましい。
【００３８】
化学合成ペプチドは、公知のペプチド合成方法を用いて得ることができる。合成方法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、カルボイミダゾール法及び酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置を使用してもよい。合成反応後は、クロマトグラフィー等の公知の精製法を組み合わせてペプチドを精製することができる。
【００３９】
また、天然物由来のペプチドとしては、天然に存在するオリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質、又はこれらを断片化した状態のもの等が挙げられる。天然物由来のペプチドは、天然物から公知の回収法及び精製法により直接得てもよいし、又は、公知の遺伝子組換え技術により、当該ペプチドをコードする遺伝子を各種発現ベクター等に組込んで細胞に導入し、発現させた後、公知の回収法及び精製法により得てもよい。あるいは、市販のキット、例えば、試薬キットPROTEIOSTM（東洋紡）、TNTTM System（プロメガ）、合成装置のPG-MateTM（東洋紡）及びRTS（ロシュ・ダイアグノスティクス）等を用いた無細胞タンパク質合成系により当該ペプチドを産生し、公知の回収法及び精製法により得てもよく、限定はされない。
【００４０】
本発明においては、CXCR4活性阻害ペプチドとして、前述した各種ダイマーペプチドとともに又はそれに代えて、当該ペプチドの誘導体を含むことができる。当該誘導体とは、当該ダイマーペプチド（又は当該ダイマーペプチドに使用する各種モノマーペプチド）に由来して調製され得るものをすべて含む意味であり、例えば、構成アミノ酸の一部が非天然のアミノ酸に置換されたものや、構成アミノ酸（主にその側鎖）の一部に化学修飾が施されたもの等が挙げられる。
【００４１】
さらに、本発明においては、CXCR4活性阻害ペプチドとして、前述した各種ダイマーペプチド、及びその誘導体とともに又はそれに代えて、当該ダイマーペプチド及び／又は当該誘導体の塩を含むことができる。当該塩としては、生理学的に許容される酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
【００４２】
塩は、塩酸などの適切な酸、又は水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用いて調製することができる。例えば、水中、又はメタノール、エタノール若しくはジオキサンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、標準的なプロトコルを用いて処理することにより調製することができる。
上述した本発明のダイマーペプチド、その誘導体及びこれらの塩は、いずれもCXCR4活性を阻害し得るペプチドであるが、より具体的には、CXCR4に対するアンタゴニスト活性を有するものであることが好ましい。
【００４３】
３．CXCR4活性の阻害剤、及び、細胞走化性の抑制剤
本発明は、上述した本発明のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含む、CXCR4活性の阻害剤を提供するものである。
また本発明は、上述した本発明のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含む、細胞走化性の抑制剤を提供するものでもある。
【００４４】
上記CXCR4活性の阻害剤、及び細胞走化性の抑制剤は、上述した本発明のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩からなるものであってもよいし、当該ダイマーペプチド等と他の成分とを含むものであってもよく、限定はされない。他の成分としては、限定はされないが、例えば、PBS及びTris-HCl等の緩衝液、並びにアジ化ナトリウム及びグリセロール等の添加剤などが挙げられる。他の成分を含む場合、その含有割合は、当該ダイマーペプチド等によるCXCR4活性の阻害活性、及び細胞走化性の抑制活性が著しく妨げられない範囲で、適宜設定することができる。具体的には、上記ペプチドの溶液で用いる場合、ペプチド濃度は、限定はされないが、10nM以上であることが好ましく、より好ましくは50〜1000nM、さらに好ましくは100〜1000nMである。
【００４５】
また、本発明においては、構成成分として前記本発明のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、CXCR4活性の阻害用キット、及び細胞走化性の抑制用キットも提供される。
【００４６】
４．医薬組成物
前述した本発明のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩は、医薬組成物に含まれる有効成分として有用である。特に、糖尿病の治療又は予防用医薬組成物、及び癌の治療用医薬組成物の有効成分として有用である。
本発明の医薬組成物は、本発明の阻害剤を有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。
【００４７】
「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、１つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。また、前述した本発明のダイマーペプチド等を生体内に投与する場合は、コロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、当該ペプチドの生体内の安定性を高めたり、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであればよく限定はされないが、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げることができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、リポソームや人工膜の小胞である。
【００４８】
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される本発明のダイマーペプチド等の種類などにより異なっていてもよい。通常、成人一人あたり、一回につき100μg〜5000mgの範囲で投与することができるが、限定はされない。
【００４９】
例えば注射剤により投与する場合は、ヒト患者に対し、１回の投与において１kg体重あたり、100μg〜100mgの量を、１日平均あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。すなわち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００５０】
なお、本発明は、糖尿病を治療及び／又は予防する医薬（薬剤）を製造するための、前記本発明のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩の使用を提供するものでもある。また、本発明は、糖尿病の治療用及び／又は予防用の前記本発明のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩を提供するものでもある。
さらに、本発明は、前記本発明のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩を用いること（すなわち患者に投与すること）を特徴とする、糖尿病の治療及び／又は予防方法を提供するものであり、また、糖尿病を治療及び／又は予防するための、前記本発明のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩の使用を提供するものでもある。
【００５１】
ここで、本発明において、糖尿病としては、肥満に密接に関連して発症する糖尿病、特にインスリン抵抗性を示す「２型糖尿病」が対象疾患として好ましい。
また、本発明は、癌を治療する医薬（薬剤）を製造するための、前記本発明のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩の使用を提供するものでもある。また、本発明は、癌の治療用の前記本発明のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩を提供するものでもある。
【００５２】
さらに、本発明は、前記本発明のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩を用いること（すなわち患者に投与すること）を特徴とする、癌の治療方法を提供するものであり、また、癌を治療するための、前記本発明のダイマーペプチド、その誘導体又はこれらの塩の使用を提供するものでもある。
ここで、本発明において、治療対象となる癌としては、例えば、肺癌、口腔癌及び乳癌などが挙げられるが、特に限定はされない。
【００５３】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
＜方法＞
CXCL14とCXCL12のin vitro活性評価法
CXCL12とCXCL14のin vitroバイオアッセイには、ヒト単球系白血病細胞株THP-1を用いた走化性試験、並びに125I標識リガンドによるBinding assayを用いた。CXCL14は抗CXCL14モノクローナル抗体MAB730（R&D）共存下でのみ強いTHP-1細胞誘引活性を示すため（Tanegashima, K. Suzuki, Y. Nakayama, and T. Hara. Antibody-assisted enhancement of biological activities of CXCL14 in human monocytic leukemia-derived THP-1 cells and high fat diet-induced obese mice. Exp. Cell Res., 316: 1263-1270, 2010.）、CXCL14走化性試験には100 nM human CXCL14（ペプロテック）+MAB730 (10μg/ml)を、CXCL12走化性試験には10 nM human CXCL12（ペプロテック）をそれぞれ24well-plate（lower chamber）に入れた。THP-1細胞 (2 x 105)をクラボウ製5μ Chemotaxicellチャンバー内（upper chamber）に入れ、２時間37℃で反応させた後、膜孔を通過した細胞をDiff-quick染色し、その後カウントした。各種のCXCL14変異ペプチド (1〜1000 nM)は、Chemotaxicellチャンバー内（upper chamber）にのみ添加して、細胞移動を阻害する効果を定量した。
【００５５】
Binding assayでは、10 nM 125I標識CXCL14、あるいは10 nM 125I標識CXCL12とTHP-1細胞とを混合し、4℃で2時間反応後、遠心によって細胞を分離してγカウンターを用いて放射線量を測定した。100倍量の非標識CXCL14あるいは各種のCXCL14変異ペプチドを上記のアッセイ系に添加して反応させた後、細胞の放射線量を測定して、リガンド結合阻害率を算出した。
【００５６】
＜結果＞
CXCL14受容体の構造は長らく未解明であったが、本発明者は最近、当該受容体にはCXCR4と機能未知の7回膜貫通タンパク質Lphn2とが含まれることを発見した（図１）。CXCL14はCXCR4と高親和性で結合するが、単独ではシグナルを伝えない。CXCL14刺激による細胞内シグナルはLphn2を通して伝達されると推察される。Lphn2の発現場所は、脳、肺、骨格筋、マクロファージ、味蕾等で、リガンドであるCXCL14の発現パターンとほぼ一致していた。興味深いことに、CXCL14は、CXCR4のnon-signaling ligandであるために、CXCL12を介したTHP-1細胞株の走化性移動をほぼ完全にブロックした（図２）。したがって、個体におけるCXCL14の生理的役割は、それ単独の直接的なものとCXCL12の機能抑制による間接的なものとに区別できた（図１）。CXCL14によるCXCL12の活性抑制が、受容体への結合阻害よりも低い濃度で観察されたことから（図３）、CXCL14はCXCR4に結合することでアロステリックな構造変化をもたらすものと推察された。
【実施例２】
【００５７】
＜方法＞
CXCL14変異ペプチドの合成法
CXCL14は77アミノ酸残基から成るが（配列番号１）、C末端側は典型的なαヘリックス構造を有する。このヘリックス領域は、77アミノ酸残基中の第51〜77番目のアミノ酸残基の範囲に存在し、本発明者はこのヘリックス構造が受容体との相互作用において極めて重要な役割を果たしているものと推察した。そこで、CXCL14のアミノ酸配列中のC末端側(第51〜77番目のアミノ酸残基)を含むペプチドをFmoc型固相合成法により合成し、その活性について検討を加えることにした。なお、モノマーペプチドの合成は、公知の方法（具体的には、本発明者らのCXCL14全合成の論文（K. Tsuji, A. Shigenaga, Y. Sumikawa, K. Tanegashima, K. Sato, K. Aihara, T. Hara, and A. Otaka. Application of N to C- or C to N-directed sequential native chemical ligation to the preparation of CXCL14 analogs and their biological evaluation. Bioorg. Med. Chem., 19: 4014-4020, 2011.）に記載の方法）に従って行った。ダイマーペプチドについては第51番目のアミノ酸のN端側にシステイン(Cys:天然型配列に相当)あるいはオキシアミノ酢酸(H2N-O-CH2COOH)を縮合し、Cys導入体についてはジスルフィド(S-S)結合、オキシアミノ酢酸導入体についてはアルデヒドリンカーを利用し、オキシム結合を形成させることで二量体化を行った。また、オキシム結合形成を利用したホモダイマーについては、そのαヘリックス構造の安定化を図る目的でアミノ酸置換を行っている。このアミノ酸置換は、αヘリックスペプチドの機能面区別化戦略に基づくものであり、当該アミノ酸置換の有用性は抗HIVペプチドの創製を通じて実証済みである（A. Otaka, M. Nakamura, D. Nameki, E. Kodama, S. Uchiyama, S. Nakamura, H. Nakano, H. Tamamura, Y. Kobayashi, M. Masuoka, and N. Fujii. Remodeling of gp41-C34 Peptide Leads to Highly Effective Inhibitors of the Fusion of HIV-1 with Target Cells. Angew. Chem. Int. Ed., 41: 2937-2940, 2002.）。上記ジスルフィド結合によるダイマーペプチドをN2C、オキシム結合によるダイマーペプチドをCG2Oと命名し、それらダイマーペプチドの構造を、それぞれ下記式(I)（N2C）及び下記式(II)（CG2O）、並びに図４に示した。各々のダイマーペプチドは、合成後、HPLCで精製し、生理活性検証実験に供した。なお、HPLC分析及びHPLC分取にはCosmosil 5C18-AR-II 分析カラム (Nacalai Tesque, 4.6×250 mm, flow rate 1.0 mL/min)、a 5C18-AR-II セミ分取カラム(Nacalai Tesque, 10×250 mm, flow rate 3.0 mL/min)又はa 5C18-AR-II 分取カラム (Nacalai Tesque, 20×250 mm, flow rate 10 mL/min)を利用した。この際、溶出液としては、0.1% TFA aqueous solution (v/v, solvent A)と 0.1% TFA in MeCN (v/v, solvent B)からなる混合溶媒系を利用し、220nmのUV測定によりペプチドの検出を行った。また、精密質量分析はWaters MICROMASS(登録商標) LCT PREMIERによる測定により行った。
【００５８】
・N2C (CXCL14 (50-77) S-S dimmer)
【化５】
2015024960.tif 000006
Analytical HPLC condition: linear gradient of solvent B in solvent A, 5-45% over 30 min, retention time = 22.0 min. 
Preparative HPLC condition: linear gradient of solvent B in solvent A, 20-30% over 30 min. 
MS (ESI-TOF) m/z calcd for ([M+8H]8+) 906.2, found 906.3.
【００５９】
・CG2O (CXCL14 (51-77, 56Glu, 60Lys, 63Glu, 67Lys, 74Lys) Oxime dimer)
【化６】
2015024960.tif 000007
Analytical HPLC condition: linear gradient of solvent B in solvent A, 5-45% over 30 min, retention time = 23.6 min. 
Preparative HPLC condition: linear gradient of solvent B in solvent A, 20-30% over 30 min. 
MS (ESI-TOF) m/z calcd for ([M+8H]8+) 970.0, found 969.8.
【００６０】
＜結果＞
前述のとおり、CXCL14のC末端側は特徴的なαヘリックス構造をとっており、ここが特異的阻害剤の標的部位となる可能性があった。そこで、ヒトCXCL14のC末端側を構造改変した様々なペプチドを合成し、THP-1細胞を用いた走化性試験にかけることで、CXCL14の活性阻害効果を検討した。その結果、ヒトCXCL14のC末端側の第51〜77番目の27アミノ酸残基を含むペプチドをS-S結合で二量体化させたダイマーペプチド(N2C)、およびオキシム結合で二量体化させたダイマーペプチド(CG2O)の両者において、125I標識CXCL14の受容体結合を特異的にブロックする活性が検出された（図５）。さらに、これらの化合物をTHP-1細胞を用いた走化性試験にかけたところ、両者とも100 nMの濃度でCXCL12とCXCL14によるTHP-1細胞の走化性移動を有意に抑制した（図６）。以上の結果から、N2CとCG2Oは、CXCL12及びCXCL14の両者に対して有効な阻害剤であることを示すことが分かった。
【実施例３】
【００６１】
＜方法＞
肥満マウスへのin vivo投与実験
６週齢のC57BL/6雌マウス（日本SLC）にHigh fat diet-32（日本クレア製高脂肪食）を与えて20週間飼育した。体重が46g前後に達した肥満マウス９頭を個別ケージに移し一週間慣らした後、実施例２で作製したN2C (1μg/g体重)又はCG2O (1μg/g体重)、及び溶媒コントロールとしてPBSを、各３頭ずつ腹腔注射した。注射は７日間にわたり毎日18時に行った。この間、各マウスの体重を毎日測定した。ペプチド投与最終日の晩に絶食させ、翌日午前10時に空腹時血糖値をグルテストエースR（三和化学研究所）を用いて測定した。次に、それぞれのマウスにヒトインスリン(0.75 mU/g体重)を腹腔注射し、30分、60分、90分、120分後の血糖値を継時的に測定した。
【００６２】
＜結果＞
CXCL14が肥満性糖尿病の悪化因子であることから、その活性を阻害する化合物はその新規治療薬になる可能性が期待される。そこで、in vitroアッセイにてCXCL14阻害活性が検出されたN2C及びCG2Oを肥満マウスへ投与し、体重変化とインスリン感受性をコントロールマウスと比較した。その結果、CG2O投与マウス群では体重が減少傾向にあり（図７）、インスリン感受性が有意に改善できることが示された（図８）。一方、N2Cを投与したマウス群の体重変化とインスリン感受性は、PBS投与コントロールマウス群とほぼ同じであった（図７、８）。よって、CG2Oは肥満性糖尿病の病態を改善する効果を有する化合物であることが示された。
【００６３】
＜本実施例に関する考察＞
CXCR4は、ケモカインCXCL12の受容体として造血幹細胞の骨髄ホーミングや癌細胞の悪性増殖及び転移に重要な働きをしているが、T細胞感染性HIVのエントリー受容体としても利用される。したがって、世界各所でCXCR4を分子標的とした阻害剤の開発が進められている。本実施例おいては、CXCR4とそのリガンドであるCXCL12、及びその天然アンタゴニストであるCXCL14の構造情報に基いて、新しいタイプのCXCR4活性阻害剤（CXCR4アンタゴニスト）の創出を試みた。その結果、CXCL14及びCXCL12の両者による走化性細胞移動を抑制する、新規ペプチド化合物N2C及びCG2Oの開発に成功した。その中でもCG2Oは、肥満マウスのインスリン抵抗性を改善するin vivo効果を示す極めて有用なものであった。CG2Oは天然には存在しないオキシム結合によって二量体化されているため、体内安定度が高いものと推測された。
CXCL14は肥満性糖尿病の悪化因子であるが、扁平上皮癌の悪性増殖を抑制するという活性を併せ持つ。したがって、本発明のCXCR4活性阻害ペプチドは、世界中に膨大な数の患者がいる癌やメタボリックシンドロームを克服する新しい治療薬へと発展するポテンシャルを有するものである。
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号３：組換えペプチド
配列番号５：組換えペプチド
【図１】
2015024960.tif 000010
【図２】
2015024960.tif 000011
【図３】
2015024960.tif 000012
【図４】
2015024960.tif 000013
【図５】
2015024960.tif 000014
【図６】
2015024960.tif 000015
【図７】
2015024960.tif 000016
【図８】
2015024960.tif 000017
【配列表】
2015024960000001.app