(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸増幅反応用容器内の核酸増幅反応用試薬の活性を阻害しないように構成された核酸増幅反応用カートリッジの提供。【解決手段】長手方向を有し、オイルと相分離し核酸が結合した微粒子から前記核酸を溶出する溶出液からなる溶出液プラグと、オイル及び第１の添加剤からなる第１の液体のプラグと、を内部に備えたチューブと、前記チューブに連通する核酸増幅反応用容器と、を備え、前記核酸増幅反応用容器は、オイル及び第２の添加剤からなる第２の液体を含み、前記第１、第２の添加剤は、カルビノール変性シリコーンレジン、カルボキシル変性シリコーンレジン、アミノ変性シリコーンレジン、ポリエーテル変性シリコーンレジン、シラノール変性シリコーンレジン、及びフルオロ変性シリコーンレジンからなる群から選択され、第１の添加剤濃度は第２の添加剤の濃度より高い、核酸増幅反応用カートリッジ、及び当該カートリッジが装着された核酸増幅装置。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
長手方向を有し、オイルと相分離し核酸が結合した微粒子から前記核酸を溶出する溶出液からなる溶出液プラグと、オイル及び第１の添加剤からなる第１の液体のプラグと、を内部に備えたチューブと、
前記チューブに連通する核酸増幅反応用容器と、を備え、
前記核酸増幅反応用容器は、オイル及び第２の添加剤からなる第２の液体を含み、
前記第１の添加剤は、カルビノール変性シリコーンレジン、カルボキシル変性シリコーンレジン、アミノ変性シリコーンレジン、ポリエーテル変性シリコーンレジン、シラノール変性シリコーンレジン、及びフルオロ変性シリコーンレジンからなる群から選択され、
前記第２の添加剤は、カルビノール変性シリコーンレジン、カルボキシル変性シリコーンレジン、アミノ変性シリコーンレジン、ポリエーテル変性シリコーンレジン、シラノール変性シリコーンレジン、及びフルオロ変性シリコーンレジンからなる群から選択され、
前記第１の液体に含まれる第１の添加剤濃度は、前記第２の液体に含まれる第２の添加剤の濃度より高い、核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項２】
前記添加剤は、X-22-160AS、X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、KF-6017、KF-8005（以上、信越シリコーン社）、SR1000、SS4230、SS4267、YR3370、XS66-C1191、TSF4703、TSF4708、XF42-C5196、XF42-C5197（以上、Momentive社）のいずれかである、請求項１に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項３】
前記第１の添加剤と前記第２の添加剤とは同じシリコーンレジンである、請求項１または２に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項４】
前記第１の液体のプラグを前記核酸増幅反応用容器に吐出した時の、前記核酸増幅反応用容器内における前記第１の液体の体積に前記第２の液体の体積を加算した体積に対する、前記第１の添加剤の体積に前記第２の添加剤の体積を加算した体積の割合は、１％（ｖ/ｖ）以上２０％（ｖ/ｖ）以下である、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項５】
前記核酸増幅反応用容器が、核酸増幅反応試薬を含む、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項６】
前記核酸増幅反応試薬は、前記第２の液体中に保持されている、請求項５に記載の核酸増幅反応装置。
【請求項７】
前記核酸増幅反応試薬が、凍結乾燥されている、請求項５または６に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項８】
前記核酸増幅反応試薬が、界面活性剤を含有する、請求項６または７に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項９】
前記界面活性剤が、NP40、Triton-X100、またはTween20である、請求項８に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項１０】
前記容器が、ポリプロピレン製である、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の核酸増幅反応用カートリッジが装着された核酸増幅装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応用カートリッジ及び核酸増幅装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されてきている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの核酸増幅技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は、生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
ＰＣＲ法では、チューブやチップ（以下、バイオチップという）と称する、生化学反応を行うための容器を用いて反応を行う手法が一般的である。しかしながら、従来の手法においては、必要な試薬等の量が多く、また反応に必要な熱サイクルを実現するために装置が複雑化したり、反応に時間がかかったりするという問題があった。そのため微少量の試薬や検体を用いてＰＣＲを短時間で行うためのバイオチップや反応装置が必要とされていた。
このような問題を解決するために、特許文献１には、反応液と混和せず反応液とは比重が異なる液体（ミネラルオイル等）を充填したチューブの中で、液滴の状態で含まれる反応液を往復移動させることによって熱サイクルをかけて反応を行うバイオチップ及び装置が開示されている。
しかしながら、特許文献１に開示されたバイオチップを、容器外部から蛍光測定を行って増幅産物を検出するような用途に用いる場合は、容器を透明な材料で形成する必要があった。透明な材料としては、樹脂や耐熱ガラスが挙げられるが、これらの材料は摩擦などによって帯電しやすい。容器の内表面に親水処理を施せば帯電を抑制することは可能であるが、水溶液である反応液が容器に付着して移動が妨げられてしまうため、親水処理をバイオチップに採用することは困難であった。
一方、反応液と混和せず反応液とは比重が異なる液体としては、熱や反応液に対する安定性の観点から、シリコーンオイルやミネラルオイルを用いることができるが、これらのオイルは一般に絶縁体であるため、オイル中に導入された反応液の液滴が容易に分極する。そのため、透明な材料の容器にオイルを充填し、反応液を導入すると、反応液と容器との間に電場が生じて、反応液が容器の内壁に引き寄せられて付着したり、反発によってオイル中に浮遊したりすることがある。このような状態で、特許文献１に記載のような、バイオチップ中で反応液を重力によって移動させる方式（以下、本明細書において、この方式を「昇降型」と称する。）のＰＣＲを行うと、反応液が適切に移動せず、所望の熱サイクルを施すことができなくなる場合があった。
特許文献２には、バイオチップに生じた電荷を解消し、反応液に安定した熱サイクルを施すために、反応液とは混和しない液体が充填された容器を用いる際、前記液体の体積固有抵抗を０Ω・ｃｍよりも大きく５×１０13Ω・ｃｍ以下とするバイオチップが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−１３６２５０号公報
【特許文献２】特開２０１２−１２５１６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、特許文献２のようにして帯電を防止しても、まだ液滴が容器に付着し、重力で液滴がオイル中を移動できないことが起き、核酸増幅反応用容器内のオイルに、添加剤を加えることが検討されたが、添加剤によっては、核酸増幅反応用容器内の核酸増幅反応用試薬の活性を阻害した。そこで、本発明は、核酸増幅反応用容器内の核酸増幅反応用試薬の活性を阻害しないように構成された核酸増幅反応用カートリッジを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一実施形態は、長手方向を有し、オイルと相分離し核酸が結合した微粒子から前記核酸を溶出する溶出液からなる溶出液プラグと、オイル及び第１の添加剤からなる第１の液体のプラグと、を内部に備えたチューブと、前記チューブに連通する核酸増幅反応用容器と、を備え、前記核酸増幅反応用容器は、オイル及び第２の添加剤からなる第２の液体を含み、前記第１の添加剤は、カルビノール変性シリコーンレジン、カルボキシル変性シリコーンレジン、アミノ変性シリコーンレジン、ポリエーテル変性シリコーンレジン、シラノール変性シリコーンレジン、及びフルオロ変性シリコーンレジンからなる群から選択され、前記第２の添加剤は、カルビノール変性シリコーンレジン、カルボキシル変性シリコーンレジン、アミノ変性シリコーンレジン、ポリエーテル変性シリコーンレジン、シラノール変性シリコーンレジン、及びフルオロ変性シリコーンレジンからなる群から選択され、前記第１の液体に含まれる第１の添加剤濃度は、前記第２の液体に含まれる第２の添加剤の濃度より高い、核酸増幅反応用カートリッジである。前記添加剤は、X-22-160AS、X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、KF-6017、KF-8005（以上、信越シリコーン社）、SR1000、SS4230、SS4267、YR3370、XS66-C1191、TSF4703、TSF4708、XF42-C5196、XF42-C5197（以上、Momentive社）のいずれかであってもよい。前記第１の添加剤と前記第２の添加剤とは同じシリコーンレジンであってもよい。また、前記第１の液体プラグを前記核酸増幅反応用容器に吐出した時の、前記核酸増幅反応用容器内における前記第１の液体の体積に前記第２の液体の体積を加算した体積に対する、前記第１の添加剤の体積に前記第２の添加剤の体積を加算した体積の割合は、１％（ｖ/ｖ）以上２０％（ｖ/ｖ）以下であってもよい。前記核酸増幅反応用容器が、核酸増幅反応試薬を含んでもよい。前記核酸増幅反応試薬は、前記第２の液体中に保持されていてもよい。前記核酸増幅反応試薬が、凍結乾燥されていてもよい。前記核酸増幅反応試薬が、界面活性剤を含有してもよく、前記界面活性剤が、NP40、Triton-X100、またはTween20であってもよい。前記容器が、ポリプロピレン製であってもよい。
本発明の他の実施形態は、上記いずれかの核酸増幅反応用カートリッジが装着された核酸増幅装置である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１Ａ及び図１Ｂは、カートリッジ１の説明図である。
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは、カートリッジ１の動作説明図である。
【図３】図３Ａ〜図３Ｄは、タンク３の説明図である。
【図４】図４は、固定爪２５及びガイド板２６と装着部６２の説明図である。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、ＰＣＲ容器３０の周辺の説明図である。
【図６】図６Ａは、ＰＣＲ装置５０の内部構成の斜視図である。図６Ｂは、ＰＣＲ装置５０の主要構成の側面図である。
【図７】図７は、ＰＣＲ装置５０のブロック図である。
【図８】図８Ａは、回転体６１の説明図である。図８Ｂは、回転体６１の装着部６２にカートリッジ１を装着した状態の説明図である。
【図９】図９Ａ〜図９Ｄは、カートリッジ１の装着時のＰＣＲ装置５０の状態の説明図である。
【図１０】図１０は、磁石７１を下方向に移動させたときの磁気ビーズ７の挙動の概念図である。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｃは、核酸溶出処理の説明図である。
【図１２】図１２は、磁石７１を揺動させたときの磁気ビーズ７の挙動の概念図である。
【図１３】図１３は、磁石７１の揺動の有無を示す表である。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｃは、液滴形成処理の説明図である。
【図１５】図１５Ａ及び図１５Ｂは、熱サイクル処理の説明図である。
【図１６】一実施例において用いた核酸抽出用キット及びその組み立て後の装置を示す図である。
【図１７】一実施例におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図１８】一実施例における核酸増幅溶液の保存安定性能の比較の結果を示すグラフである。
【図１９】一実施例において、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明の実施の形態を、詳細に説明する。なお、本発明の目的、特徴、利点、および、そのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【０００８】
本発明の一実施形態は、長手方向を有し、オイルと相分離し核酸が結合した微粒子から核酸を溶出する溶出液からなる溶出液プラグと、オイル及び第１の添加剤からなる第１の液体のプラグと、を内部に備えたチューブと、チューブに連通する核酸増幅反応用容器と、を備え、核酸増幅反応用容器は、オイル及び第２の添加剤からなる第２の液体を含み、第１の添加剤は、カルビノール変性シリコーンレジン、カルボキシル変性シリコーンレジン、アミノ変性シリコーンレジン、ポリエーテル変性シリコーンレジン、シラノール変性シリコーンレジン、及びフルオロ変性シリコーンレジンからなる群から選択され、第２の添加剤は、カルビノール変性シリコーンレジン、カルボキシル変性シリコーンレジン、アミノ変性シリコーンレジン、ポリエーテル変性シリコーンレジン、シラノール変性シリコーンレジン、及びフルオロ変性シリコーンレジンからなる群から選択され、第１の液体に含まれる第１の添加剤濃度は、第２の液体に含まれる第２の添加剤の濃度より高い、核酸増幅反応用カートリッジである。
以下、核酸増幅反応用カートリッジの構成を詳述する。一般的な構成を説明する際には、チューブ内の第１の液体のプラグも、オイルプラグとして説明するが、本発明では、チューブ内のいずれか一つ以上のオイルプラグが第１の液体のプラグになっているものである。
【０００９】
＜カートリッジ＞
図１Ａ及び図１Ｂは、カートリッジ１の説明図である。図２Ａ〜図２Ｃは、カートリッジ１の動作説明図である。図２Ａは、カートリッジ１の初期状態の説明図である。図２Ｂは、図２Ａの状態からプランジャー１０を押して、シール１２Ａが下シリンジ２２に接触したときの側面図である。図２Ｃは、プランジャー１０を押した後のカートリッジ１の説明図である。まず、このカートリッジの使用方法を概観する。
【００１０】
カートリッジ１は、タンク３と、ＰＣＲ容器３０を含むカートリッジ本体９とから構成される。カートリッジ１を構成するキットには、タンク３及びカートリッジ本体９とともにアダプター５が予め用意されている。アダプター５を介してタンク３とカートリッジ本体９とを接続することによって、カートリッジ１を組み立てることができる。但し、タンク３をカートリッジ本体９に直接取り付けるように構成することも可能である。
【００１１】
タンク３では、核酸抽出処理が行われ、核酸が磁気ビーズ７に結合する。チューブ２０は、洗浄液プラグ４５、溶出液プラグ４７及びオイルプラグを有している。タンク３からチューブ２０に入った磁気ビーズ７は、チューブ２０に沿って外部で磁石を移動させることにより、チューブ２０内を移動し、洗浄液プラグ４５を通って、溶出液プラグ４７に到達する。磁気ビーズ７に結合した核酸は、洗浄液プラグ４５で洗浄液により洗浄され、溶出液プラグ４７で溶出される。
【００１２】
チューブ２０と連通したＰＣＲ容器３０では、熱サイクル処理が行われる。ＰＣＲ容器３０は、第２の液体で満たされている。溶出液プラグ４７がチューブ２０からＰＣＲ容器３０中に押し出されると液滴状になり、液滴状になった溶出液４７は沈降する。ＰＣＲ容器３０内を沈降した溶出液４７は、ＰＣＲ容器３０にある凍結乾燥した核酸増幅反応試薬を溶解させ、PCR溶液となる。ＰＣＲ容器３０には、外部のヒーターによって高温領域３６Ａと低温領域３６Ｂが形成されており、カートリッジ１全体をヒーターとともに上下反転させることを繰り返すことにより、高温領域３６Ａと低温領域３６Ｂとの間で液滴状のPCR溶液が交互に移動して、２段階の温度処理が施され、ＤＮＡが増幅する。
【００１３】
以下のカートリッジ１の詳細な構成要素の説明では、図２Ａに示すように、長尺のカートリッジ１に沿った方向を「長手方向」とし、タンク３側を「上流側」とし、ＰＣＲ容器３０側を「下流側」とする。なお、上流側のことを単に「上」、下流側のことを「下」と表現することもある。
【００１４】
（１）タンク
図３Ａ〜図３Ｄは、タンク３の説明図である。
【００１５】
キットに予め用意されているタンク３には、溶解液４１と磁気ビーズ７が収容されている。タンク３の開口には、取り外し可能な蓋３Ａが取り付けられている（図３Ａ参照）。溶解液４１としては、５Ｍグアニジンチオシアン酸塩、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を用いる。作業者は、蓋３Ａを外してタンク３の開口を開放し（図３Ｂ参照）、ウイルスの付着した綿棒をタンク３内の溶解液４１に浸し、ウイルスを溶解液４１に採取する（図３Ｃ参照）。タンク３内の液体を攪拌するとき、図３Ｃの状態でタンク３を振とうしてもよいが、これでは溶解液４１が溢れやすいので、図３Ｄに示すように、蓋５Ａの付いたアダプター５をタンク３の開口に取り付けてからタンク３を振とうするのが好ましい。これによりタンク３内の物質が攪拌され、溶解液４１によりウイルス粒子が溶解し、核酸が遊離するとともに、磁気ビーズ７にコーティングされたシリカが核酸を吸着する。磁気ビーズ７は、核酸結合性固相担体に相当する。その後、作業者は、タンク３の開口に取り付けたアダプター５の蓋５Ａを外し、アダプター５を介してタンク３をカートリッジ本体９に取り付ける（図２Ａ参照）。
【００１６】
タンク３は、可塑性があり、膨張可能である容器が好ましく、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、シクロオレフィンポリマー（例えば、ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）４８０Ｒ）などの樹脂が例示できる。プランジャー１０がスライドして図２Ａの状態から図２Ｂの状態になるとき、タンク３が膨張することによって、チューブ２０内の液体の圧力が上昇し過ぎることが抑制され、チューブ２０内の液体が下流側に押し出されることが抑制される。タンク３が膨張しやすいように、タンク３に変形部３Ｂを形成することが望ましい。
【００１７】
なお、核酸を抽出・増幅する試料はウイルスに限らず、細胞であってもよい。細胞の由来も、特に限定されず、微生物であってもよく、高等生物の組織片や血液などであっても構わない。
【００１８】
なお、溶解液４１は、核酸結合性固相担体である微粒子（例えば磁性粒子Ｍ）に核酸を吸着させる液体のことをいう。溶解液４１は、カオトロピック物質を含有すれば特に限定されないが、細胞膜の破壊あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で界面活性剤を含有させてもよい。この界面活性剤としては、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであれば特に限定されないが、具体的には、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘなどのトリトン系界面活性剤やＴｗｅｅｎ２０などのツイーン系界面活性剤のような非イオン性界面活性剤、Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウム（ＳＤＳ）等の陰イオン性界面活性剤が挙げられるが、特に非イオン性界面活性剤を、０．１〜２％の範囲となるように使用するのが好ましい。さらに、溶解液には、２−メルカプトエタノールあるいはジチオスレイトール等の還元剤を含有させることが好ましい。溶解液４１は、緩衝液であってもよいが、ｐＨ６〜８の中性であることが好ましい。これらのことを考慮し、具体的には、３〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤などを含有することが好ましい。
【００１９】
カオトロピック物質は、水溶液中でカオトロピックイオン（イオン半径の大きな１価の陰イオン）を生じ、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有しており、核酸の固相担体への吸着に寄与するものであれば、特に限定されない。具体的には、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム等が挙げられるが、これらのうち、タンパク質変成作用の強いグアニジンチオシアン酸塩またはグアニジン塩酸塩が好ましい。これらのカオトロピック物質の使用濃度は、各物質により異なり、例えば、グアニジンチオシアン酸塩を使用する場合には、３〜５．５Ｍの範囲で、グアニジン塩酸塩を使用する場合は、５Ｍ以上で使用するのが好ましい。
【００２０】
この溶解液４１は、アルコール、又はアセトニトリルを含むことが好ましい。この場合、アルコール等の濃度は、特に限定されないが、下限については、１０％以上であってもよく、２０％以上であってもよく、３０％以上であってもよいが、４０％以上であることが最も好ましい。上限については、８０％以下であってもよく、７０％以下であってもよく、６０％以下であってもよいが、５０％以下であることが最も好ましい。アルコールの種類は特に限定されないが、メタノール、エタノール、プロパノールなどが例示できる。溶解液にアルコール等を添加することにより、粒子等に核酸を吸着する効果を高め、核酸抽出用デバイスとしてみた場合には核酸の抽出効率を高めることが可能になる。
【００２１】
また、試料を採取する器具は特に限定されず、綿棒の代わりに、スパチュラ、棒、スクレイパーなど、用途に合わせて選択すればよい。
【００２２】
タンク３の内容積は、特に限定されないが、例えば、０．１ｍＬ以上１００ｍＬ以下とすることができる。タンク３の材質は、特に限定されないが、例えば、ガラス、プラスティックなどの樹脂、金属などとすることができる。特に、タンクの材質として透明なガラスや樹脂を選択すると、タンク３の外部から内部を観察することができるので、より好ましい。なお、タンク３と各チューブ２０は、一体成形されていても、着脱可能になっていても構わない。タンク３の材質にゴム、エラストマー、高分子等の可とう性を有するものを利用すると、タンク３に蓋を装着した状態で、タンク３を変形させることにより、タンク３の内部を加圧することができる。それにより、チューブの内部から外部へと、チューブの先端側からチューブ２０の内容物を押し出すことができる。
【００２３】
（２）カートリッジ本体
カートリッジ本体９は、プランジャー１０と、チューブ２０と、ＰＣＲ容器３０とを有する。
【００２４】
（２−１）プランジャー
以下、図２Ａ〜図２Ｃを参照しながら、プランジャー１０について説明する。
【００２５】
プランジャー１０は、シリンジとして機能するチューブ２０の下流側から液体を押し出す可動式の押子である。プランジャー１０は、チューブ２０内の所定量の液体をチューブ２０の末端からＰＣＲ容器３０へ押し出す機能を有する。また、プランジャー１０は、アダプター５を介してタンク３を取り付ける機能も有する。
【００２６】
プランジャー１０は、筒状部１１及び棒状部１２を有する。筒状部１１はタンク３側（上流側）に設けられ、棒状部１２はチューブ２０側（下流側）に設けられている。棒状部１２は、筒状部１１の下流側の内壁から板状の２つのリブ１３によって支持されている。棒状部１２の下流側は、筒状部１１から下流側に突出している。
【００２７】
筒状部１１は上流側及び下流側に開口しており、筒状部１１の内壁は液体の通路となる。筒状部１１の上流側（タンク３側）の開口にはアダプター５が嵌合する。キットに予め用意されているカートリッジ本体９のプランジャー１０には、筒状部１１の上流側の開口に取り外し可能な蓋が取り付けられていても良い。筒状部１１の下流側の開口は、チューブ２０の上シリンジ２１の内部に位置する。筒状部１１の上流側の開口から導入される磁気ビーズ７は、筒状部１１の内部を通り、リブ１３の表裏を抜けて筒状部１１の下流側の開口から出て、チューブ２０の上シリンジ２１に導入されることになる。
【００２８】
筒状部１１の下流側は、チューブ２０の上シリンジ２１の内壁に嵌合している。筒状部１１はチューブ２０の上シリンジ２１に内接しながら、上シリンジ２１に対して長手方向にスライドできる。
【００２９】
筒状部１１の上流側の開口の周囲には、アダプター５を取り付ける取付台１１Ａが形成されている。また、取付台１１Ａは、プランジャー１０を押すときに押される部位でもある。取付台１１Ａが押されることによって、プランジャー１０がチューブ２０に対してスライドし、図２Ａの状態から図２Ｃの状態になる。プランジャー１０が下流側に移動すると、取付台１１Ａがチューブ２０の上縁に接触する（図２Ｃ参照）。つまり、プランジャー１０の取付台１１Ａとチューブ２０の上縁との間隔が、プランジャー１０のスライド長になる。
【００３０】
棒状部１２は、初期状態では、チューブ２０の上シリンジ２１の内部に位置し、下シリンジ２２から離れている（図２Ａ参照）。プランジャー１０がチューブ２０に対してスライドすると、棒状部１２がチューブ２０の下シリンジ２２に挿入され、棒状部１２が下シリンジ２２に内接しながら、下シリンジ２２に対して下流方向にスライドする（図２Ｂ及び図２Ｃ参照）。
【００３１】
棒状部１２の長手方向に直交する断面の形状は、円形状である。但し、棒状部１２の断面形状は、チューブ２０の下シリンジ２２の内壁に嵌合できるかぎり、円、楕円、多角形とすることができ、特に限定されない。
【００３２】
棒状部１２の下流側の端部には、シール１２Ａが形成されている。シール１２Ａが下シリンジ２２に嵌合すると、下流側のチューブ２０内の液体が上シリンジ２１へ逆流することが防止される。そして、図２Ｂの状態から図２Ｃの状態までプランジャー１０が押されると、その間にシール１２Ａが下シリンジ２２内でスライドした体積相当分だけ、チューブ２０内の液体が下流側から押し出されることになる。
【００３３】
なお、シール１２Ａが下シリンジ２２内でスライドする体積（チューブ２０内の液体が下流側から押し出される量）は、チューブ２０内の溶出液プラグ４７及び第３オイルプラグ４８の合計よりも多い。これにより、チューブ２０に溶出液４７が残らないように、チューブ２０内の液体を押し出すことができる。
【００３４】
プランジャー１０の材質は特に限定されないが、例えば、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、シクロオレフィンポリマー（例えば、ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）４８０Ｒ）、耐熱ガラス（例えばＰＹＲＥＸ（登録商標）ガラス）等やこれらの複合材料であってもよい。プランジャー１０の材質は、タンク３の材質と同じにしても構わない。また、プランジャー１０の筒状部１１及び棒状部１２は、同じ材質で一体的に形成されても良いし、別の材質で形成されても良い。ここでは、筒状部１１及び棒状部１２を樹脂で別々に成型し、リブ１３を介して筒状部１１と棒状部１２を接合することによって、プランジャー１０が形成されている。
【００３５】
プランジャー１０の内部には、オイル４２と第１洗浄液４３とが予め収容されている。プランジャー１０内のオイル４２は第１洗浄液４３よりも比重が小さいため、カートリッジ本体９にタンク３を取り付けるときにプランジャー１０の取付台１１Ａを上にしてカートリッジ本体９を立てると、図２Ａに示すように、タンク３内の液体とカートリッジ本体９の第１洗浄液４３との間にオイル４２が配置されることになる。なお、オイル４２としては、２ＣＳシリコーンオイルを用い、第１洗浄液４３としては、８Ｍグアニジン塩酸塩、０．７％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いる。
【００３６】
なお、第１洗浄液４３は、オイル４２及びオイル４４のいずれとも、混ぜた時に相分離する液体であればよい。第１洗浄液４３は、水または低塩濃度水溶液であることが好ましく、低塩濃度水溶液の場合、緩衝液であることが好ましい。低塩濃度水溶液の塩濃度は、１００ｍＭ以下が好ましく、５０ｍＭ以下がより好ましく、１０ｍＭ以下が最も好ましい。また、低塩濃度水溶液の下限は特に無いが、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、０．５ｍＭ以上であることがさらに好ましく、１ｍＭ以上であることが最も好ましい。また、この溶液はＴｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳなどの界面活性剤を含有しても良く、ｐＨは特に限定されない。緩衝液にするための塩は特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。さらに、この洗浄液は、アルコールを、核酸の担体への吸着、逆転写反応、ＰＣＲ反応などを阻害しない量だけ含むことが好ましい。この場合、アルコール濃度は、特に限定されないが、下限については、５０％以上であってもよく、６０％以上であってもよいが、７０％以上であることが最も好ましい。アルコール濃度の上限については、９０％以下であってもよく、８０％以下であってもよいが、７０％以下であることが最も好ましい。アルコールの種類は特に限定されないが、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトニトリルなどが例示できる。なお、核酸、及び核酸が吸着した粒子等の洗浄という観点では、溶解液、又は第１洗浄液の少なくとも一方がアルコールを含めば、洗浄効果を高めることができるが、溶解液と第１洗浄液の双方がアルコールを含むと、さらに洗浄効果を高めることができるので好ましい。
【００３７】
なお、第１洗浄液４３にカオトロピック剤を含有させてもよい。例えば、第１洗浄液４３にグアニジン塩酸塩を含有させると、粒子等に吸着した核酸の吸着を維持又は強化しつつ粒子等を洗浄することができる。グアニジン塩酸塩を含有させる場合の濃度としては、例えば、３ｍｏｌ／Ｌ以上１０ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは５ｍｏｌ／Ｌ以上８ｍｏｌ／Ｌ以下とすることができる。グアニジン塩酸塩の濃度がこの範囲であれば、粒子等に吸着された核酸をより安定に吸着させつつ、他の夾雑物等を洗浄することができる。
【００３８】
（２−２）チューブ
以下、図２Ａ〜図２Ｃを参照しながら、チューブ２０について説明する。
【００３９】
チューブ２０の材質は、特に限定されないが、透明なガラスや樹脂を選択すると、内部を観察することができるので、より好ましい。また、チューブ２０の材質に、磁力を透過する物質や非磁性体を選択すると、チューブ２０に磁性粒子を通過させる場合などに、チューブ２０の外部から磁力を与えることによって、磁性粒子を移動させることが容易化されるため好ましい。また、チューブの材質は、付近にヒーター（後述する溶出用ヒーター６５Ａや高温側ヒーター６５Ｂ）が配置されるため、少なくとも１００℃以上の耐熱性を有することが好ましい。これらの条件を満たす材質としては、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、シクロオレフィンポリマー（例えば、ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）４８０Ｒ）、耐熱ガラス（例えばＰＹＲＥＸ（登録商標）ガラス）等やこれらの複合材料であってもよいが、ポリプロピレンが好ましい。なお、チューブ２０の材質は、タンク３やプランジャー１０の材質と同じにしても構わない。
【００４０】
チューブ２０は、液体を長手方向に流通させることのできる筒状の形状である。チューブ２０は、上シリンジ２１、下シリンジ２２及びキャピラリー２３を有しており、各部の内径が段階的に異なっている。
【００４１】
上シリンジ２１は、液体を長手方向に流通させることのできる筒状の形状である。上シリンジ２１の内壁には、プランジャー１０の筒状部１１がスライド可能に内接しており、上シリンジ２１は、プランジャー１０の筒状部１１に対するシリンジとして機能する。
【００４２】
下シリンジ２２は、液体を長手方向に流通させることのできる筒状の形状である。下シリンジ２２の内壁は、プランジャー１０の棒状部１２のシール１２Ａがスライド可能に嵌合でき、下シリンジ２２は、プランジャー１０の棒状部１２に対するシリンジとして機能する。
【００４３】
キャピラリー２３は、液体を長手方向に流通させることのできる細管状の形状である。キャピラリー２３の内径は、液体がプラグの形状を維持できる大きさであり、ここでは１．０ｍｍである。キャピラリー２３の末端（チューブ２０の下流側の端）では、これより内径が小さくなっており、ここでは０．５ｍｍである。キャピラリー２３の末端の内径は、後述する液滴状の溶出液の直径（１．５〜２．０ｍｍ）よりも小さく設定されている。これにより、溶出液プラグ４７がキャピラリー２３の末端から押し出されたときに、液滴状の溶出液がキャピラリー２３の末端に付着したり、キャピラリー２３内に逆入したりすることを回避できる。
【００４４】
なお、キャピラリー２３は、内部に空洞を有し、液体を長手方向に流通させることのできる筒状の形状を有するものであればよく、長手方向に、屈曲してもよいが、直線状であるのが好ましい。チューブの内部の空洞は、液体がチューブ内でプラグの形状を維持できれば、大きさ、形状ともに特に限定されない。また、チューブ内の空洞の大きさや、長手方向に対して垂直な断面の形状は、チューブの長手方向に沿って変化してもよい。
チューブの外形の長手方向に垂直な断面の形状も限定されない。さらにチューブの肉厚（内部の空洞の側面から外部の表面までの寸法）も特に限定されない。チューブが円筒状の場合、その内径（内部の空洞の長手方向に垂直な断面における円の直径）は、例えば、０．５ｍｍ以上２ｍｍ以下とすることができる。チューブの内径がこの範囲であると、チューブの材質、液体の種類において広範な範囲で液体のプラグを形成しやすい。先端はよりテーパー状に細くなっていることが好ましく、０．２ｍｍ以上１ｍｍ以下とすることができる。そして、キャピラリー２３の末端の内径（キャピラリー２３の開口径）を小さくすることによって、ＰＣＲ容器３０内で液滴化した溶出液４７がキャピラリー２３の開口に吸着して離れなくなることを抑制できる。但し、キャピラリー２３の末端の内径を小さくし過ぎると、多数の小さな液滴の溶出液４７が形成されてしまう。なお、キャピラリー２３の末端以外の部分まで末端と同様に細径化すると、各プラグの体積を確保する必要性からカートリッジ１が長くなってしまい、望ましくない。
【００４５】
キャピラリー２３は、上流側から順に、第１オイルプラグ４４、洗浄液プラグ４５、第２オイルプラグ４６、溶出液プラグ４７、第３オイルプラグ４８を内部に備えている。つまり、水溶性のプラグ（洗浄液プラグ４５又は溶出液プラグ４７）の両側にオイルプラグが配置されている。
【００４６】
ここで、「プラグ」とは、チューブ内において、特定の液体が一区画を占める場合の液体を意味する。例えば、図２Ａ〜図２Ｃにおいてキャピラリー２３内で柱状に保持されている液体を「プラグ」と呼ぶ。なお、オイルは、その他の溶液とは相分離し（その他の溶液とは混和せず）、従って、オイルからなるプラグは、その両側の水溶性のプラグが互いに混合することを防止する機能を有する。プラグの中やプラグの間には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、磁気ビーズ７がプラグを通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在しても良い。
【００４７】
なお、第１オイルプラグ４４よりも上流側の上シリンジ２１及び下シリンジ２２には、オイル４２及び洗浄液４３が予め収容されている（図２Ａ参照）。上シリンジ２１及び下シリンジ２２の内径はキャピラリー２３の内径よりも大きく、上シリンジ２１及び下シリンジ２２では液体（オイル４２及び洗浄液４３）をプラグのような柱状に維持できないが、第１オイルプラグ４４はキャピラリー２３によってプラグの形状で保持されているため、第１オイルプラグ４４を構成するオイルが上流側に移動することが抑制されている。
【００４８】
ここで使用されるオイルの種類は、特に限定されず、ミネラルオイル、シリコーンオイル（２ＣＳシリコーンオイルなど）、植物油などが例示できるが、より高粘度なオイルにすることによって、上側のプラグとの界面で、核酸結合性固相担体を移動させる場合に、オイルによる「ぬぐい効果」を高めることができる。これにより、上側のプラグから、オイルからなるプラグに核酸結合性固相担体を移動させた場合に、核酸結合性固相担体に付着した水溶性の成分をオイル内に、より持ち込まれにくくすることができる。
【００４９】
本発明では、チューブ内のオイルプラグのうち、少なくとも一つは、第１の液体のプラグとなり、オイルと、カルビノール変性シリコーンレジン、カルボキシル変性シリコーンレジン、アミノ変性シリコーンレジン、ポリエーテル変性シリコーンレジン、シラノール変性シリコーンレジン、及びフルオロ変性シリコーンレジンからなる群から選択された第１の添加剤を含む。特に、X-22-160AS、X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、KF-6017、KF-8005（以上、信越シリコーン社）、SS4230、SS4267、XF42-C5196、XF42-C5197、XS66-C1191（以上、Momentive社）からなる群から選択されることが好ましい。そして、第１の添加剤の濃度は、ＰＣＲ容器３０内の第２の液体に含まれている第２の添加剤より高濃度である。ここで、第１の添加剤と第２の添加剤とは、同じであっても異なっていても構わない。なお、溶出液プラグ４７からＰＣＲ容器３０側にあるオイルプラグの一つ以上、が第１の液体のプラグになることが好ましいが、その場合、第１の液体のプラグがＰＣＲ容器３０内の第２の液体と混じらないように、純水などからなり、オイルを混じらせないようにするためのプラグや、キャピラリー２３の下流端の逆流防止のための弁などのオイル混合防止手段を設けるのが好ましい。
【００５０】
後述するように、第１の添加剤を含む第１の液体のプラグをＰＣＲ容器３０に吐出された後のＰＣＲ容器３０内の添加剤の濃度、すなわち、第１の液体のプラグをＰＣＲ容器３０に吐出した時の、ＰＣＲ容器３０内における第１の液体の体積に第２の液体の体積を加算した体積に対する、第１の添加剤の体積に第２の添加剤の体積を加算した体積の割合が、１％（ｖ/ｖ）以上５０％（ｖ/ｖ）以下であることが好ましく、２％（ｖ/ｖ）以上２０％（ｖ/ｖ）以下であることがより好ましく、５％（ｖ/ｖ）であることがさらに好ましく、そのような濃度になるように、チューブ２０のプラグ内の第１の液体及びＰＣＲ容器３０内の第２の液体に含有させる添加剤の濃度を決定すればよい。
【００５１】
洗浄液プラグ４５は、第２洗浄液である５ｍＭトリス塩酸緩衝液からなってもよいが、酸性溶液であることが好ましく、特に酸性水溶液であることが好ましい。含有する酸は特に限定されないが、クエン酸、酢酸、グリシン塩酸塩などの水溶液が好ましい。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）や、界面活性剤（Triton、Tween、SDSなど）等を含有してもよいが、カオトロピック物質を事実上含まない溶液であるほうが好ましい。ｐＨは、下限については、１以上であることが好ましく、２以上であることがより好ましく、３以上であることがさらに好ましく、４以上であることが最も好ましく、上限については、６以下であることが好ましく、５以下であることがさらに好ましく、４以下であることが最も好ましい。このような第１洗浄液を採用することにより、第２洗浄液の上流側で、核酸や核酸が吸着した粒子がアルコールを含む溶液と接しても、すなわちアルコールを含む溶解液で核酸を抽出する場合や、アルコールを含む洗浄液で核酸が吸着した粒子を洗浄する場合であっても、第２洗浄液により核酸が吸着した粒子等を効率よく洗浄することができ、かつ下流へのアルコールの持ち込み、いわゆるアルコールのキャリーオーバーを防ぐことができ、アルコールによる酵素反応の阻害を防ぐことができる。
【００５２】
洗浄液プラグ４５は、オイルのプラグによって分断された複数のプラグから構成されてもよい。洗浄液プラグ４５が複数のプラグからなる場合、各プラグの液体は、同じであっても異なっていても構わない。その中に、少なくとも１つの洗浄液のプラグがあれば、他のプラグの液体は特に限定されないが、全てのプラグが洗浄液であることが好ましい。洗浄液プラグ４５が分割される数は、例えば、チューブ２０の長さや洗浄の対象等を考慮して適宜設定すれることができる。その際、最も溶出液側の洗浄液は、洗浄液プラグ４５で述べたような酸性溶液であることが好ましく、他の洗浄液は、第１洗浄液４３で述べたようにアルコールを含有することが好ましい。
【００５３】
溶出液４７とは、核酸結合性固相担体に吸着した核酸を、担体から液中に溶出させ、その後、逆転写反応およびポリメラーゼ反応を行う液体のことをいう。従って、溶出液４７は、水やバッファーでもよく、核酸の溶出後の溶出液４７がそのまま逆転写反応およびポリメラーゼ反応に用いられるバッファー溶液となるように、予め調製されていてもよい。緩衝液にするための塩は、酵素反応を阻害しない限り、特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。また、逆転写反応のために、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写酵素用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含んでいてもよい。さらに、反応阻害防止剤として、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはゼラチンを含有することが好ましい。溶媒は、水であることが好ましく、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まないものがより好ましい。
【００５４】
溶出液に含まれる塩やｄＮＴＰや塩の濃度は、凍結乾燥した核酸増幅反応試薬中のｄＮＴＰや塩の濃度を考慮し、最終的に、用いる酵素について適した濃度になるようにすれば良いが、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、Ｍｇ２＋を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ−を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。ＢＳＡまたはゼラチンの濃度は、１ｍｇ／ｍＬ以下では、反応阻害防止効果が少なく、１０ｍｇ／ｍＬ以上だと、逆転写反応やその後の酵素反応を阻害する可能性があるため、１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましい。ゼラチンを用いる場合、その由来は、牛皮、豚皮、牛骨が例示できるが、特に限定されない。ゼラチンが溶解にしくいときは、加温して溶解させても良い。
溶出液プラグ４７の体積は、特に限定されず、核酸を吸着させた粒子等の量などを指標として適宜設定することができる。例えば、粒子等の体積が、０．５μＬである場合には、溶出液プラグ４７の体積は、０．５μＬ以上であれば十分であり、０．８μＬ以上５μＬ以下とすることが好ましく、１μＬ以上３μＬ以下とすることがさらに好ましい。溶出液プラグ４７の体積がこれらの範囲であれば、例えば、核酸結合性固相担体の体積を０．５μＬにしても、担体から核酸を十分溶出することができる。
【００５５】
キャピラリー２３の下流部は、ＰＣＲ容器３０に挿入されている。これにより、チューブ２０内の溶出液プラグ４７をチューブ２０から押し出すことによって、溶出液４７をＰＣＲ容器３０に導入することができる。
【００５６】
キャピラリー２３の外壁の環状の凸部がＰＣＲ容器３０の内壁と接触することによって、上シール部が形成される。また、上シール部よりも下流側のキャピラリー２３の外壁がＰＣＲ容器３０の内壁と接触することによって、下シール部が形成される。上シール部と下シール部については、後述する。
【００５７】
チューブ２０は、更に、固定爪２５及びガイド板２６を有する。図４は、固定爪２５及びガイド板２６と装着部６２の説明図である。
【００５８】
固定爪２５は、装着部６２にカートリッジ１を固定する部材である。固定爪２５が引っ掛かるまでカートリッジ１が装着部６２に挿入されると、カートリッジ１が装着部６２に対して正常な位置に固定されることになる。言い換えると、カートリッジ１が装着部６２に対して異常な位置にあるときには、固定爪２５は装着部６２に引っ掛からない。
【００５９】
ガイド板２６は、カートリッジ１をＰＣＲ装置５０の装着部６２に装着するときにカートリッジ１を案内する部材である。ＰＣＲ装置５０の装着部６２にガイドレール６３Ａが形成されており、チューブ２０のガイド板２６がガイドレール６３Ａに沿って案内しながら、カートリッジ１が装着部６２に挿入されて固定される。カートリッジ１は長尺の形状であるが、ガイド板２６で案内しながらカートリッジ１が装着部６２に挿入されるので、カートリッジ１を装着部６２に対して正常な位置に固定することが容易になる。
【００６０】
固定爪２５及びガイド板２６は、キャピラリー２３の左右から突出した板状の部材である。チューブ２０内の磁気ビーズ７を磁石で移動させるとき、板状の固定爪２５やガイド板２６の垂直な方向から磁石を近接させる。これにより、磁石とチューブ２０内の磁気ビーズ７との距離を近接させることができる。但し、磁石とチューブ２０内の磁気ビーズ７との距離を近接させられるのであれば、固定爪２５及びガイド板２６は他の形状でも良い。
【００６１】
（２−３）核酸増幅反応用容器
図５Ａ及び図５Ｂは、核酸増幅反応用容器を構成するＰＣＲ容器３０の周辺の説明図である。図５Ａは、初期状態の説明図である。図５Ｂは、プランジャー１０が押された後の状態の説明図である。以下、図２Ａ〜図２Ｃも参照しながら、ＰＣＲ容器３０について説明する。
【００６２】
ＰＣＲ容器３０の種類は特に限定されないが、例えば、ＰＣＲ装置などの核酸増幅機に直接用いることができる、０．２ｍＬから１．５ｍＬの小型チューブであることが好ましい。
【００６３】
ＰＣＲ容器３０の材質は特に限定されないが、核酸やタンパク質の吸着が少なく、ポリメラーゼ等による酵素反応を阻害しない材質であることが好ましい。また、ＰＣＲ容器３０の材質は、付近に高温側ヒーター６５Ｂがあるため、少なくとも１００℃以上の耐熱性を有することが好ましい。ＰＣＲ容器３０の材質は透明又は半透明な材質を選択すると、蛍光測定（蛍光強度測定）が容易になるので好ましい。但し、ＰＣＲ容器３０の全ての領域で透明又は半透明である必要はなく、少なくとも蛍光測定器５５と対向する部位（例えばＰＣＲ容器３０の底３５Ａ）が透明又は半透明であればよい。これらの条件を満たす材質としては、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、シクロオレフィンポリマー（例えば、ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）４８０Ｒ）、耐熱ガラス（例えばＰＹＲＥＸ（登録商標）ガラス）等やこれらの複合材料であってもよいが、ポリプロピレンが好ましい。なお、ＰＣＲ容器３０の材質は、タンク３やプランジャー１０の材質と同じにしても構わない。チューブ２０に連通する側とは反対側の端部はテーパー状であることが好ましく、例えば、先端に近づくに従って断面積が小さくなる形状であることが好ましい。それによって、液滴状になった溶出液４７が沈降する際、確実に凍結乾燥した核酸増幅反応試薬に到達することができる。
【００６４】
ＰＣＲ容器３０は、第２の液体で満たされており、チューブの第５プラグの配置された側の先端が、ＰＣＲ容器３０中に保持された第２の液体に接していることが好ましい。第２の液体に含まれるオイルの種類は、特に限定されず、ミネラルオイル、シリコーンオイル（２ＣＳシリコーンオイルなど）、植物油などを用いることができるが、チューブ２０内のオイルと同じ種類であることが好ましい。ここで、オイルの粘性は特に限定されないが、９０ｃｓ以下であることが好ましく、７０ｃｓ以下であることがより好ましく、５０ｃｓ以下であることがさらに好ましく、３０ｃｓ以下であることがさらに好ましい、というように、小さい方が好ましく、それによって、後述するように溶解液が沈降するとき、よりスムーズに沈降できるようになる。このオイルは、カルビノール変性シリコーンレジン、カルボキシル変性シリコーンレジン、アミノ変性シリコーンレジン、ポリエーテル変性シリコーンレジン、シラノール変性シリコーンレジン、及びフルオロ変性シリコーンレジンからなる群から選択された第２の添加剤を含んでもよい。特に、X-22-160AS、X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、KF-6017、KF-8005（以上、信越シリコーン社）、SS4230、SS4267、XF42-C5196、XF42-C5197、XS66-C1191（以上、Momentive社）からなる群から選択されることが好ましい。第２の添加剤は、チューブ２０内の第１の液体が含む第１の添加剤より低濃度であるが、濃度が低いほど好ましく、第２の液体が添加剤を含まないのが最も好ましい。つまり、第２の添加剤の濃度は０であってもよい。第２の添加剤の濃度が低いほど好ましい理由は、第２の添加剤が、核酸増幅反応用容器内の核酸増幅反応用試薬の活性を阻害することがあり、特に後述するように、ＰＣＲ容器３０内に凍結乾燥された核酸増幅反応試薬が保持されている場合、カートリッジの保管時に、第２の添加剤が核酸増幅反応試薬を失活させる場合があるからである。なお、この第２の添加剤も、チューブ２０内の第１の液体が含む第１の添加剤と同じ種類であることが好ましい。
【００６５】
この容器中で、核酸増幅反応試薬が第２の液体中に保持されているのが好ましい。核酸増幅反応試薬は、液体状で保持されていてもよいが、保管時の安定性の面で、凍結乾燥させた状態で保持されているのが好ましい。凍結乾燥された核酸増幅反応試薬は第２の液体に溶解しないことが好ましい。核酸増幅反応試薬は、少なくともＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰを含むが、核酸増幅反応用プライマー及び／又は核酸増幅反応用プローブを含んでいることが好ましい。また、凍結乾燥した核酸増幅反応試薬は、逆転写酵素を含んでいてもよい。その場合、逆転写用プライマーは、核酸増幅反応用プライマーと別に含んでいてもよく、核酸増幅反応用プライマーと共用してもよい。
【００６６】
核酸増幅反応試薬はまた、界面活性剤を含むのが好ましい。界面活性剤は特に限定されないが、NP40、Triton-X100、Tween20などが例示できる。界面活性剤の濃度は特に限定されないが、核酸増幅反応を阻害しない濃度が好ましく、０．００１％〜０．１％以下であってもよく、０．００２％〜０．０２％であることが好ましく、０．００５％〜０．０１％であることが最も好ましい。界面活性剤は、ＤＮＡポリメラーゼのストック溶液からの持ち込みであってもよいが、それとは独立に界面活性剤溶液を核酸増幅反応試薬に添加してもよい。
【００６７】
ＤＮＡポリメラーゼは特に限定されないが、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。また、逆転写酵素も特に限定されず、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素などが使用できるが、耐熱性の酵素が好ましい。
【００６８】
ｄＮＴＰや塩の濃度は、用いる酵素について適した濃度にすれば良いが、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、Ｍｇ2+を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ-を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。
【００６９】
核酸増幅反応試薬の凍結乾燥は、通常行われる方法で行えばよく、例えば、ＰＣＲ容器３０に、核酸増幅反応用バッファーの中に１反応分の核酸増幅反応試薬を入れ、急速凍結させ、低圧にして、所定時間放置する。核酸増幅反応用バッファーの量は特に限定されないが、５μＬでもよく、２．５μＬが好ましく、１．６μＬがより好ましく、バッファーの量が少ないほど，核酸増幅反応試薬が容器の底に小さく硬く固着するようになる。急速凍結の際の温度は特に限定されず、−１０℃から−１６０℃が好ましいが、約−８０℃であることが最も好ましい。凍結乾燥した核酸増幅反応試薬はスポンジ状もしくはケーキ状で、中に気泡がたまっている微細孔（気孔）が沢山ある多孔質であることが好ましく、それによって、溶解性が良くなる。そして、急速に凍結させた方が、微細孔がさらに小さくなり、保存性がさらに良くなる。孔の平均空隙径（例えば、断面の孔の径を顕微鏡下で一定回数計測し、その平均値をとったもの）が２０μｍ以下であることが好ましい。低圧時の圧力は特に限定されず、１００ｍｍＨｇ以下であることが好ましいが、２０ｍｍＨｇ以下であることが最も好ましい。低圧に保つ時間も特に限定されず、２−２４時間であることが好ましいが、８時間程度であることが最も好ましい。なお、核酸増幅反応試薬を凍結乾燥させるための核酸増幅反応試薬溶液の量は、核酸増幅反応試薬を溶解させる水溶液の量より少ないことが好ましい。
【００７０】
このようにしてＰＣＲ容器３０中で核酸増幅反応試薬を凍結乾燥することにより、核酸増幅反応試薬をＰＣＲ容器３０の底に固着させる。その後で第２の液体を添加するが、容器を満たすように添加するのが好ましい。凍結乾燥した核酸増幅反応試薬は水分に弱く、水分がある状態では、長期間安定して保存できないので、第２の液体は予めシリカゲルなどで脱水しておくことが好ましく、第２の液体の添加はグローブボックス内などで行うことが好ましい。また、第２の液体を加えた後、容器を軽く遠心して、気泡を除去しておくのが好ましい。
【００７１】
凍結乾燥した核酸増幅反応試薬に第２の液体を加える前に、溶解したワックスを加え、ワックスが固形化した後で第２の液体を加えることによって、凍結乾燥した核酸増幅反応試薬が第２の液体中で拡散するのを防ぐことができる。ここで、ワックスとは、室温で固体であって、加熱すると液体となる有機物のことであるが、本発明に使用できるワックスは、３１℃以上、好ましくは３６℃以上、より好ましくは４１℃以上、さらに好ましくは４６℃以上であって、かつ１００℃以下、好ましくは９０℃以下、より好ましくは８０℃以下、さらに好ましくは７０℃以下の融点を有し、中性脂肪、高級脂肪酸、炭化水素などからなることが好ましい。ワックスとしては、特に限定されず、例えば、パラフィン、マイクロクリスタリンなどの石油由来のワックス、蜜蝋、ウールワックス、鯨蝋などの動物由来のワックス、カルナバ、ロジン、キャンデリラワックス、木蝋などの植物由来のワックスのほか、エルクリスタ（登録商標、出光興産）、ニッサンエレクトール（登録商標、日油株式会社）、ポエム（登録商標、理研ビタミン）、リケマール（登録商標、理研ビタミン）、ネオワックス（登録商標、ヤスハラケミカ（株））、ハイワックス（登録商標、三井化学）、シリコンワックス（登録商標、東レ・ダウコーニング）などを用いることができる。
【００７２】
このように凍結乾燥した核酸増幅反応試薬を有するＰＣＲ容器３０は、チューブ２０から押し出される液体を受け入れる容器であるとともに、熱サイクル処理時に溶出液４７を収容する容器である。以下、ＰＣＲ容器３０の構造例を説明する。
【００７３】
ＰＣＲ容器３０は、シール形成部３１及び流路形成部３５を有する。シール形成部３１は、チューブ２０が挿入されている部分であり、流路形成部３５から溢れる第２の液体が外部に漏洩することを抑制する部位である。流路形成部３５は、シール形成部３１よりも下流側の部分であり、液滴状の溶出液４７の移動する流路を形成する部位である。ＰＣＲ容器３０は、シール形成部３１の上シール部３４Ａと下シール部３４Ｂの２箇所でチューブ２０に対して固定される。
【００７４】
シール形成部３１は、オイル受容部３２及び段差部３３を有する。
【００７５】
オイル受容部３２は、筒状の部位であり、流路形成部３５から溢れ出る第２の液体を受容するリザーバーとして機能する。オイル受容部３２の内壁と、チューブ２０のキャピラリー２３の外壁との間には隙間があり、この隙間が、流路形成部３５から溢れる第２の液体を受容するオイル受容空間３２Ａとなる。オイル受容空間３２Ａの体積は、プランジャー１０のシール１２Ａがチューブ２０の下シリンジ２２でスライドする体積よりも大きい。
【００７６】
オイル受容部３２の上流側の内壁がチューブ２０の環状の凸部と接触することによって、上シール部３４Ａが形成される。上シール部３４Ａは、空気の通過は許容しつつ、オイル受容空間３２Ａの第２の液体が外部に漏洩することを抑制するシールである。上シール部３４Ａは、第２の液体の表面張力によって第２の液体が漏洩しない程度に、通気口が形成されている。上シール部３４Ａの通気口は、チューブ２０の凸部とオイル受容部３２の内壁との間の隙間でも良いし、チューブ２０の凸部に形成した穴、溝又は切欠でも良い。また、オイルを吸収するオイル吸収材によって上シール部３４Ａを形成しても良い。
【００７７】
段差部３３は、オイル受容部３２の下流側に設けられた段差のある部位である。段差部３３の下流部の内径は、オイル受容部３２の内径よりも小さい。段差部３３の内壁は、チューブ２０のキャピラリー２３の下流側の外壁と接触している。段差部３３の内壁とチューブ２０の外壁が接触することによって、下シール部３４Ｂが形成される。下シール部３４Ｂは、流路形成部３５の第２の液体がオイル受容空間３２Ａへ流れることを許容しつつ、その流れに抵抗するシールである。下シール部３４Ｂでの圧力損失によって、流路形成部３５の圧力が外気圧よりも高くなるので、熱サイクル処理時に流路形成部３５の液体が加熱されても、流路形成部３５の液体に気泡が発生しにくい。
【００７８】
流路形成部３５は、管状の部位であり、液滴状の溶出液４７の移動する流路を形成する容器となる。流路形成部３５には第２の液体が充填されている。流路形成部３５の上流側はチューブ２０の末端によって閉じられており、流路形成部３５に向かってチューブ２０の末端が開口している。流路形成部３５の内径は、チューブ２０のキャピラリー２３の内径よりも大きく、溶出液プラグ４７の容量の液体が球状になったときの外径よりも大きい。流路形成部３５の内壁は、水溶性の溶出液４７が付着しない程度の撥水性を有することが望ましい。
【００７９】
なお、流路形成部３５の上流側は、外部の高温側ヒーター６５Ｂによって相対的に高温（例えば約９５℃）に加熱され、高温領域３６Ａを形成することになる。流路形成部３５の下流側は、外部の低温側ヒーター６５Ｃによって相対的に低温（例えば約６０℃）に加熱され、低温領域３６Ｂを形成することになる。ＰＣＲ容器３０の底３５Ａ（下流側の端部）は、低温領域３６Ｂに含まれる。これにより、流路形成部３５内の液体に温度勾配が形成されることになる。
【００８０】
図５Ａに示すように、初期状態では、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５に第２の液体が充填されている。第２の液体の界面は、第２の液体受容空間３２Ａの比較的下流側に位置している。オイル受容空間３２Ａにおける第２の液体の界面よりも上流側の体積は、プランジャー１０のシール１２Ａがチューブ２０の下シリンジ２２でスライドする体積よりも大きい。
【００８１】
図５Ｂに示すように、プランジャー１０が押されると、チューブ２０内の液体が流路形成部３５に押し出されることになる。流路形成部３５には予め第２の液体が充填されており、その中にチューブ２０内の液体が押し出されるので、流路形成部３５に気体は流入しない。
【００８２】
プランジャー１０が押されると、まず、チューブ２０の第３オイルプラグ４８が流路形成部３５に流入し、流入分のオイルが流路形成部３５からオイル受容空間３２Ａに流れ込み、オイル受容空間３２Ａのオイル界面が上昇する。このとき、下シール部３４Ｂの圧力損失によって、流路形成部３５の液体の圧力が高くなる。第３オイルプラグ４８がチューブ２０から押し出された後、溶出液プラグ４７がチューブ２０から流路形成部３５に流入する。流路形成部３５の内径がキャピラリー２３の内径よりも大きく、溶出液４７はオイルよりも比重が大きいため、チューブ２０内でプラグ状だった溶出液４７は、流路形成部３５の第２の液体中で液滴状になり、第２の液体内を沈降する。なお、オイル受容空間３２Ａにおける初期状態での第２の液体の界面よりも上流側の体積は、プランジャー１０のシール１２Ａがチューブ２０の下シリンジ２２でスライドする体積よりも大きいので、オイル受容空間３２Ａから第２の液体が溢れずに済む。沈降した液滴状の溶出液４７は、ＰＣＲ容器３０内で凍結乾燥した核酸増幅反応試薬を溶解し、ＲＴ−ＰＣＲ反応液またはＰＣＲ反応液となる。
【００８３】
＜ＰＣＲ装置５０＞
図６Ａは、ＰＣＲ装置５０の内部構成の斜視図である。図６Ｂは、ＰＣＲ装置５０の主要構成の側面図である。図７は、ＰＣＲ装置５０のブロック図である。ＰＣＲ装置５０は、カートリッジ１を用いて、核酸溶出処理及び熱サイクル処理を行うものである。
【００８４】
以下のＰＣＲ装置５０の説明では、図に示すように、上下、前後、左右を定義する。すなわち、ＰＣＲ装置５０のベース５１を水平に設置したときの鉛直方向を「上下方向」とし、重力方向に従って「上」と「下」とを定義する。また、カートリッジ１の回転軸の軸方向を「左右方向」とし、上下方向及び左右方向に垂直な方向を「前後方向」とする。カートリッジ１の回転軸からみてカートリッジ挿入口５３Ａの側を「後」とし、逆側を「前」とする。前側からみたときの左右方向の右側を「右」、左側を「左」とする。
【００８５】
ＰＣＲ装置５０は、回転機構６０と、磁石移動機構７０と、押圧機構８０と、蛍光測定器５５と、コントローラー９０とを有する。
【００８６】
（１）回転機構６０
回転機構６０は、カートリッジ１及びヒーターを回転させる機構である。回転機構６０がカートリッジ１及びヒーターを上下反転させることによって、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５内において液滴状の溶出液４７が移動し、熱サイクル処理が行われることになる。
【００８７】
回転機構６０は、回転体６１と、回転用モーター６６とを有する。図８Ａは、回転体６１の説明図である。図８Ｂは、回転体６１の装着部６２にカートリッジ１を装着した状態の説明図である。
【００８８】
回転体６１は、回転軸を中心に回転可能な部材である。回転体６１の回転軸は、ベース５１に固定された支持台５２に支持されている。回転体６１には、カートリッジ１を装着する装着部６２と、ヒーター（溶出用ヒーター６５Ａ、高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃ）が設けられている。回転体６１が回転すると、カートリッジ１とヒーターとの位置関係を維持したまま、カートリッジ１を上下反転させることができる。回転用モーター６６は、回転体６１を回転させる動力源である。回転用モーター６６は、コントローラー９０からの指示に従って、所定の位置に回転体６１を回転させる。回転用モーター６６と回転体６１との間にギヤなどの伝達機構が介在しても良い。
【００８９】
なお、回転体６１の回転軸は、カートリッジ１のＰＣＲ容器３０よりもチューブ２０の近くに位置している。言い換えると、回転体６１の回転軸の高さは、装着部６２に装着されたカートリッジ１のチューブ２０の高さに位置している。チューブ２０がＰＣＲ容器３０よりも長いため、仮にＰＣＲ容器３０の中心を回転軸にすると（仮に回転体６１の回転軸の高さがＰＣＲ容器の高さに位置していると）、回転体６１が大型化してしまうからである。
【００９０】
装着部６２は、カートリッジ１を装着する部位である。装着部６２は、ノッチの形成された固定部６３を有する。また、ヒーター（溶出用ヒーター６５Ａ、高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃ）に形成された挿入穴６４Ａも装着部６２として機能する。挿入穴６４ＡにＰＣＲ容器３０が挿入された状態で固定部６３のノッチにカートリッジ１の固定爪２５が引っ掛かることによって、カートリッジ１が回転体６１に装着される（図４参照）。ここでは、ヒーターの一部が装着部６２を兼ねていることになるが、装着部６２とヒーターが別々であっても良い。また、装着部６２は、溶出用ヒーター６５Ａを介して回転体６１に間接的に固定されているが、回転体６１に直接設けられても良い。また、装着部６２が装着可能なカートリッジ１の数は、１つに限られず、複数でも良い。
【００９１】
なお、装着部６２の固定部６３は、カートリッジ１のチューブ２０を固定するチューブ固定部として機能し、挿入穴６４Ａは、ＰＣＲ容器３０を固定するＰＣＲ容器固定部として機能する。これにより、チューブ２０及びＰＣＲ容器３０からなる長尺なカートリッジ１が、装着部６２に安定して固定される。
【００９２】
固定部６３には、上下方向に沿ってガイドレール６３Ａが形成されている（図４参照）。ガイドレール６３Ａは、カートリッジ１のガイド板２６を前後方向に拘束しながら挿入方向に案内する。ガイドレール６３Ａによってガイド板２６が案内されながらカートリッジ１が装着部６２に挿入されるため、カートリッジ１のＰＣＲ容器３０が挿入穴６４Ａに誘導され、カートリッジ１が装着部６２に対して正常な位置に固定される。
【００９３】
ＰＣＲ装置５０は、溶出用ヒーター６５Ａと、ＰＣＲ用ヒーターとして高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃとを備えている。各ヒーターは、不図示の発熱源と、ヒートブロックとから構成されている。発熱源は、例えばカートリッジヒーターであり、ヒートブロックに挿入されている。ヒートブロックは、例えば熱伝導率の高いアルミニウムなどの金属であり、熱ムラを抑制して発熱源からの熱でカートリッジ１内の液体を加熱する。また、ヒートブロックは、磁気ビーズ７を移動させる磁石７１が吸着しないように、非磁性体であることが望ましい。
【００９４】
溶出用ヒーター６５Ａは、カートリッジ１の溶出液プラグ４７を加熱するヒーターである。溶出用ヒーター６５Ａは、カートリッジ１が正常な位置に固定されると、チューブ２０の溶出液プラグ４７と対向する。例えば、溶出用ヒーター６５Ａが溶出液プラグ４７を約５０℃に加熱することによって、核酸の磁気ビーズからの遊離が促進される。
【００９５】
高温側ヒーター６５Ｂは、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の上流側を加熱するヒーターである。高温側ヒーター６５Ｂは、カートリッジ１が正常な位置に固定されると、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の上流側（高温領域３６Ａ）と対向する。例えば、高温側ヒーター６５Ｂは、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の上流側の液体を約９０〜１００℃に加熱する。
【００９６】
低温側ヒーター６５Ｃは、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の底３５Ａを加熱するヒーターである。低温側ヒーター６５Ｃは、カートリッジ１が正常な位置に固定されると、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の下流側（低温領域３６Ｂ）と対向する。例えば、低温側ヒーター６５Ｃは、ＰＣＲ容器３０の低温領域３６Ｂの液体を約５０〜７５℃に加熱する。
【００９７】
高温側ヒーター６５Ｂと低温側ヒーター６５Ｃとの間にはスペーサー６５Ｄが配置されている。スペーサー６５Ｄは、高温側ヒーター６５Ｂと低温側ヒーター６５Ｃとの間の熱伝導を抑制する。また、スペーサー６５Ｄは、高温側ヒーター６５Ｂと低温側ヒーター６５Ｃとの間の距離を正確に定めるのにも用いられている。これにより、高温側ヒーター６５Ｂと低温側ヒーター６５Ｃによって、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５内の液体に温度勾配が形成される。
【００９８】
溶出用ヒーター６５Ａ、高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃをそれぞれ構成するヒートブロックには、挿入穴６４Ａを構成する貫通穴がそれぞれ形成されている。低温側ヒーター６５Ｃの挿入穴６４Ａの下側開口からＰＣＲ容器３０の底３５Ａの外壁が露出する。蛍光測定器５５は、挿入穴６４Ａの下側の開口から溶出液４７の輝度を測定することになる。
【００９９】
なお、高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃには、それぞれ温度制御装置が設けられ、それぞれのポリメラーゼ反応に適した温度に設定できる。
【０１００】
（２）磁石移動機構７０
磁石移動機構７０は、磁石７１を移動させる機構である。磁石移動機構７０は、カートリッジ１内の磁気ビーズ７を磁石７１に引き寄せるとともに、磁石７１を移動させることによって磁気ビーズ７をカートリッジ１内で移動させる。磁石移動機構７０は、一対の磁石７１と、昇降機構７３と、揺動機構７５とを有する。
【０１０１】
磁石７１は、磁気ビーズ７を引き寄せる部材である。磁石７１として永久磁石、電磁石などを用いることができるが、ここでは発熱等を生じない永久磁石を用いている。一対の磁石７１は、前後方向に対向するように、上下方向の位置がほぼ同じになるように、アーム７２に保持されている。各磁石７１は、装着部６２に装着されたカートリッジ１の前側又は後側から対向することができる。一対の磁石７１は、装着部６２に装着されたカートリッジ１を前後方向から挟むことができる。カートリッジ１の固定爪２５又はガイド板２６の設けられた方向（ここでは左右方向）と直交する方向（ここでは前後方向）から磁石７１を対向させることによって、カートリッジ１内の磁気ビーズ７と磁石７１との距離を近接させることができる。
【０１０２】
昇降機構７３は、磁石７１を上下方向に移動させる機構である。磁石７１が磁気ビーズ７を引き寄せるため、磁気ビーズ７の移動に合わせて磁石７１を上下方向に移動させれば、カートリッジ１内の磁気ビーズ７を上下方向に誘引することができる。
【０１０３】
昇降機構７３は、上下方向に移動するキャリッジ７３Ａと、昇降用モーター７３Ｂとを有する。キャリッジ７３Ａは、上下方向に移動可能な部材であり、カートリッジ挿入口５３Ａのある側壁５３に設けられたキャリッジガイド７３Ｃによって上下方向に移動可能に案内されている。キャリッジ７３Ａには、一対の磁石７１を保持するアーム７２が取り付けられているので、キャリッジ７３Ａが上下方向に移動すると、磁石７１が上下方向に移動することになる。昇降用モーター７３Ｂは、キャリッジ７３Ａを上下方向に移動させる動力源である。昇降用モーター７３Ｂは、コントローラー９０からの指示に従って、上下方向の所定の位置にキャリッジ７３Ａを移動させる。昇降用モーター７３Ｂは、ベルト７３Ｄ及びプーリー７３Ｅを用いてキャリッジ７３Ａを上下方向に移動させているが、他の伝達機構によってキャリッジ７３Ａを上下方向に移動させても良い。
【０１０４】
キャリッジ７３Ａが一番上の位置（退避位置）にあるとき、磁石７１はカートリッジ１よりも上側に位置する。キャリッジ７３Ａが退避位置にあるときには、カートリッジ１が回転しても、昇降機構７３はカートリッジ１と接触しない。また、昇降機構７３は、磁石７１が反応プラグと対向する位置までキャリッジ７３Ａの位置を下げることができる。これにより、昇降機構７３は、タンク３内の磁気ビーズ７を反応プラグの位置まで移動させるように、磁石７１を移動させることが可能になる。
【０１０５】
揺動機構７５は、一対の磁石７１を前後方向に揺動させる機構である。一対の磁石７１を前後方向に揺動させると、各磁石７１とカートリッジ１との間隔が互い違いに変化する。距離の近い磁石７１の方に磁気ビーズ７が引き寄せられるため、一対の磁石７１を前後方向に揺動させることによって、カートリッジ１内の磁気ビーズ７が前後方向に移動する。
【０１０６】
揺動機構７５は、揺動用モーター７５Ａ及びギヤを有する。揺動用モーター７５Ａ及びギヤは、キャリッジ７３Ａに設けられており、キャリッジ７３Ａとともに上下方向に移動可能である。揺動用モーター７５Ａの動力がギヤを介してアーム７２に伝達されることによって、磁石７１を保持するアーム７２が、キャリッジ７３Ａに対して、揺動回転軸７５Ｂを中心に回転する。揺動機構７５は、磁石７１がカートリッジ１に接触してカートリッジ１を損傷させることを防止するため、磁石７１とカートリッジ１が接触しない範囲で磁石７１を揺動させる。
【０１０７】
揺動回転軸７５Ｂは、アーム７２の回転軸である。揺動回転軸７５Ｂは、磁石７１を前後方向に揺動できるように、左右方向に平行である。揺動回転軸７５Ｂを右又は左から見たとき、揺動回転軸７５Ｂは、カートリッジ１よりも前側又は後側にずれて配置されている。これにより、キャリッジ７３Ａが下に移動したときに、カートリッジ１とアーム７２との接触を回避できる。なお、磁石７１を前後方向に揺動できるのであれば、揺動回転軸７５Ｂが上下方向に平行な軸でも良い。
【０１０８】
（３）押圧機構８０
押圧機構８０は、カートリッジ１のプランジャー１０を押す機構である。プランジャー１０が押圧機構８０によって押されることによって、カートリッジ１の溶出液プラグ４７及びオイルプラグがＰＣＲ容器３０に押し出され、ＰＣＲ容器３０の第２の液体中に液滴状の溶出液４７が形成される。
【０１０９】
押圧機構８０は、プランジャー用モーター８１と、ロッド８２とを有する。プランジャー用モーター８１は、ロッド８２を移動させる動力源である。ロッド８２は、カートリッジ１のプランジャー１０の取付台１１Ａを押す部材である。カートリッジ１のタンク３ではなく取付台１１Ａを押す理由は、タンク３が膨張可能に可撓性のある樹脂で構成されているためである。タンク３が変形しない場合には、押圧機構８０がタンク３を押すことによってプランジャー１０を押しても良い。
【０１１０】
ロッド８２がプランジャー１０を押す方向は、上下方向ではなく、上下方向に対して４５度傾いている。このため、押圧機構８０によってプランジャー１０を押すとき、ＰＣＲ装置５０は、回転体６１を４５度回転させて、カートリッジ１の長手方向をロッド８２の移動方向に合わせてから、ロッド８２を移動させることになる。ロッド８２がプランジャー１０を押す方向が上下方向に対して４５度傾いているため、昇降機構７３と干渉しないように押圧機構８０を配置することが容易になる。また、ロッド８２がプランジャー１０を押す方向が上下方向に対して４５度傾いているため、ＰＣＲ装置５０の上下方向の寸法を小さくできる。
【０１１１】
（４）蛍光測定器５５
蛍光測定器５５は、ＰＣＲ容器３０の溶出液４７に励起光を照射する励起光源と、溶出液４７から放出される蛍光の強度を測定する蛍光光度計を有する。蛍光測定器５５は、カートリッジ１のＰＣＲ容器３０の底３５Ａと対向するように、回転体６１よりも下側に配置されている。蛍光測定器５５は、低温側ヒーター６５Ｃの挿入穴６４Ａの下側開口から、ＰＣＲ容器３０の底３５Ａにある溶出液４７から放出される蛍光の強度を測定することになる。
【０１１２】
（５）コントローラー９０
コントローラー９０は、ＰＣＲ装置５０の制御を行う制御装置である。コントローラー９０は、例えばＣＰＵなどのプロセッサーと、ＲＯＭやＲＡＭなどの記憶装置とを有する。記憶装置には各種プログラム及びデータが記憶されている。また、記憶装置は、プログラムを展開する領域を提供する。プロセッサーが記憶装置に記憶されたプログラムを実行することによって、各種の処理が実現される。
【０１１３】
例えば、コントローラー９０は、回転用モーター６６を制御して、回転体６１を所定の回転位置まで回転させる。回転機構６０には不図示の回転位置センサーが設けられており、コントローラー９０は、回転位置センサーの検出結果に応じて回転用モーター６６を駆動・停止させる。
【０１１４】
また、コントローラー９０は、ヒーター（溶出用ヒーター６５Ａ、高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃ）を制御して、各ヒーターを発熱させる。ヒーターを構成するヒートブロックには不図示の温度センサーが設けられており、コントローラー９０は、温度センサーの検出結果に応じて、カートリッジヒーターのオン・オフを制御する。
【０１１５】
また、コントローラー９０は、昇降用モーター７３Ｂを制御して、磁石７１を上下方向に移動させる。ＰＣＲ装置５０にはキャリッジ７３Ａの位置を検出する不図示の位置センサーが設けられており、コントローラー９０は、位置センサーの検出結果に応じて昇降用モーター７３Ｂを駆動・停止させる。
【０１１６】
また、コントローラー９０は、揺動用モーター７５Ａを制御して、磁石７１を前後方向に揺動させる。ＰＣＲ装置５０には、磁石７１を保持するアーム７２の位置を検出する位置センサーが設けられており、コントローラー９０は、位置センサーの検出結果に応じて揺動用モーター７５Ａを駆動・停止させる。
【０１１７】
また、コントローラー９０は、蛍光測定器５５を制御して、ＰＣＲ容器３０の溶出液４７の蛍光強度を測定する。コントローラー９０は、蛍光測定器５５がカートリッジ１のＰＣＲ容器３０の底３５Ａと対向しているときに、蛍光測定器５５に測定を行わせる。測定結果は、記憶装置に保存される。
【０１１８】
＜動作説明＞
（１）カートリッジ１の装着動作
図９Ａ〜図９Ｄは、カートリッジ１の装着時のＰＣＲ装置５０の状態の説明図である。図９Ａは、カートリッジ１の装着前の初期状態の説明図である。図９Ｂは、待機状態の説明図である。図９Ｃは、カートリッジ１の装着直後の説明図である。図９Ｄは、カートリッジ１の装着状態での初期状態の説明図である。
【０１１９】
図９Ａに示すように、カートリッジ１の装着前の初期状態では、装着部６２の装着方向が上下方向になっている。以下の説明では、この状態の回転体６１の回転位置を基準（０度）とし、右から見て反時計回りを正の方向として回転体６１の回転位置を示すものとする。
【０１２０】
図９Ｂに示すように、コントローラー９０は、回転用モーター６６を駆動して、回転体６１を−３０度に回転させる。この状態で、作業者は、カートリッジ１をカートリッジ挿入口５３Ａから装着部６２に挿入する。このとき、ガイドレール６３Ａによってガイド板２６が案内されながらカートリッジ１が装着部６２に挿入されるため、カートリッジ１のＰＣＲ容器３０が装着部６２の挿入穴６４Ａに誘導される。作業者は、カートリッジ１の固定爪２５が固定部６３のノッチに引っ掛かるまで、カートリッジ１を挿入する。これにより、カートリッジ１が装着部６２に対して正常な位置に固定される。仮にＰＣＲ容器３０が挿入穴６４Ａに挿入されず、カートリッジ１が装着部６２に対して異常な位置にある場合には、カートリッジ１の固定爪２５が固定部６３のノッチに引っ掛からないため、カートリッジ１が異常な位置にあることを作業者が認識できる。
【０１２１】
図９Ｃに示すように、カートリッジ１が装着部６２に対して正常な位置に固定されると、チューブ２０の溶出液プラグ４７が溶出用ヒーター６５Ａと対向し、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の上流側（高温領域３６Ａ）が高温側ヒーター６５Ｂと対向し、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の下流側（低温領域３６Ｂ）が低温側ヒーター６５Ｃと対向する。回転体６１に装着部６２及びヒーターが設けられているので、回転体６１が回転しても、カートリッジ１とヒーターとの位置関係はこのまま維持されることになる。
【０１２２】
カートリッジ１が装着部６２に装着された後、図９Ｄに示すように、コントローラー９０は、回転体６１を３０度回転させて、回転体６１の位置を基準に戻す。なお、コントローラー９０は、カートリッジ１が装着部６２に装着されたことを、不図示のセンサーによって検出しても良いし、作業者からの入力操作によって検出しても良い。
【０１２３】
（２）核酸溶出処理
・磁石７１の上下動
図１０は、磁石７１を下方向に移動させたときの磁気ビーズ７の挙動の概念図である。カートリッジ１内の磁気ビーズ７は、磁石７１に引き寄せられる。このため、カートリッジ１の外部で磁石７１が移動すると、カートリッジ１内の磁気ビーズ７が磁石７１とともに移動する。
【０１２４】
図１１Ａ〜図１１Ｃは、核酸溶出処理の説明図である。図１１Ａは、核酸溶出処理前のＰＣＲ装置５０の状態の説明図である。図１１Ｂは、磁石７１を溶出液プラグ４７まで移動させたときのＰＣＲ装置５０の状態の説明図である。図１１Ｃは、磁石７１を引き上げたときのＰＣＲ装置５０の状態の説明図である。
【０１２５】
図１１Ａに示すように、初期状態のカートリッジ１は、タンク３を上側にして、長手方向が鉛直方向と平行になる。この状態では、図２Ａに示すように、カートリッジ１は、上から順に、磁気ビーズ７を含む溶解液４１（タンク３）、オイル４２（プランジャー１０）、洗浄液４３（チューブ２０の上流側）、第１オイルプラグ４４（キャピラリー２３）、洗浄液プラグ４５（キャピラリー２３）、第２オイルプラグ４６（キャピラリー２３）、溶出液プラグ４７（キャピラリー２３）、第３オイルプラグ４８（キャピラリー２３）、第２の液体（ＰＣＲ容器３０）を備えている。
【０１２６】
図１１Ａに示すように、初期状態では、キャリッジ７３Ａが一番上の位置（退避位置）にあり、磁石７１がカートリッジ１よりも上側に位置している。この状態から、コントローラー９０は、昇降用モーター７３Ｂを駆動させて、キャリッジ７３Ａを徐々に下方向に移動させ、磁石７１を徐々に下方向に移動させる。なお、カートリッジ１の長手方向が鉛直方向と平行なので、磁石７１はカートリッジ１に沿って移動することになる。
【０１２７】
磁石７１が下方向に移動すると、磁石７１がタンク３と対向するようになり、タンク３内の磁気ビーズ７が磁石７１に引き寄せられる。コントローラー９０は、磁気ビーズ７が磁石７１とともに移動できる程度の速度で、キャリッジ７３Ａを下方向に移動させる。
【０１２８】
磁石７１がタンク３と対向する位置（タンク３の高さ）からプランジャー１０と対向する位置（プランジャー１０の高さ）まで移動すると、磁気ビーズ７が、プランジャー１０の筒状部１１の上流側の開口を通過し、タンク３内の溶解液４１とカートリッジ本体９の上流側のオイル４２との界面を通過する。これにより、核酸の結合した磁気ビーズ７がカートリッジ本体９に導入される。磁気ビーズ７がオイル４２との界面を通過するとき、オイル４２によって溶解液４１がぬぐわれるため、溶解液４１の成分はオイル４２に持ち込まれにくい。これにより、溶解液４１の成分が洗浄液や溶出液４７に混入することを抑制できる。
【０１２９】
磁石７１がプランジャー１０に対向した状態で下方向に移動すると、磁気ビーズ７は、筒状部１１の内部を通り、リブ１３の表裏を抜けて筒状部１１の下流側の開口から出て、チューブ２０の上シリンジ２１に導入される。この間に、磁気ビーズ７は、プランジャー１０内でオイル４２と洗浄液４３との界面を通過する。磁気ビーズ７が洗浄液４３に導入されると、磁気ビーズ７に結合した核酸が洗浄液４３によって洗浄される。
【０１３０】
この段階ではプランジャー１０の棒状部１２がチューブ２０の下シリンジ２２に挿入されていないため、磁石７１が上シリンジ２１と対向する位置（上シリンジ２１の高さ）からキャピラリー２３と対向する位置（キャピラリー２３の高さ）まで移動すると、磁気ビーズ７が上シリンジ２１から下シリンジ２２へ移動し、下シリンジ２２からキャピラリー２３に移動する。キャピラリー２３の上流側には第１オイルプラグ４４があり、磁気ビーズ７が下シリンジ２２からキャピラリー２３に移動するときに、磁気ビーズ７が洗浄液４３とオイルとの界面を通過する。このとき、オイルによって洗浄液４３がぬぐわれるため、洗浄液４３の成分はオイルに持ち込まれにくい。これにより、洗浄液４３の成分が、洗浄液プラグ４５や溶出液プラグ４７に混入することを抑制できる。
【０１３１】
磁石７１が第１オイルプラグ４４と対向する位置（第１オイルプラグ４４の高さ）から洗浄液プラグ４５と対向する位置（洗浄液プラグ４５の高さ）まで移動すると、磁気ビーズ７が、オイルと洗浄液との界面を通過する。磁気ビーズ７が洗浄液プラグ４５に導入されると、磁気ビーズ７に結合している核酸が洗浄液によって洗浄される。
【０１３２】
磁石７１が洗浄液プラグ４５と対向する位置（洗浄液プラグ４５の高さ）から第２オイルプラグ４６と対向する位置（第２オイルプラグ４６の高さ）まで移動すると、磁気ビーズ７が、洗浄液と磁気ビーズ７が洗浄液とオイルとの界面を通過する。このとき、オイルによって洗浄液がぬぐわれるため、洗浄液の成分はオイルに持ち込まれにくい。これにより、洗浄液の成分が、溶出液プラグ４７に混入することを抑制できる。
【０１３３】
磁石７１が第２オイルプラグ４６と対向する位置（第２オイルプラグ４６の高さ）から溶出液プラグ４７と対向する位置（溶出液プラグ４７の高さ）まで移動すると、磁気ビーズ７が、オイルと溶出液４７との界面を通過する。
【０１３４】
コントローラー９０は、磁気ビーズ７が溶出液プラグ４７に導入される前に、溶出用ヒーター６５Ａを制御して溶出液プラグ４７を約５０℃に加熱しておく。また、磁気ビーズ７が導入される前に溶出液４７を加熱しておくことで、磁気ビーズ７が溶出液４７に導入されてから核酸の溶出が終了するまでの時間を短縮できる。
【０１３５】
図１１Ｂに示すように、磁石７１が溶出液プラグ４７と対向する位置（溶出液プラグ４７の高さ）まで移動した後、コントローラー９０は、昇降用モーター７３Ｂを停止させて、磁石７１の上下方向の移動を停止させ、３０秒間、５０℃で処理すると、磁気ビーズ７に結合した核酸が溶出液プラグ４７の液中に遊離し、逆転写反応が進行する。溶出液４７を加熱することによって、磁気ビーズ７からの核酸の溶出及び逆転写反応が促進される。
【０１３６】
溶出液プラグ４７で核酸を溶出させた後、コントローラー９０は、昇降用モーター７３Ｂをこれまでとは逆方向に駆動させて、キャリッジ７３Ａを徐々に上方向に移動させ、磁石７１を徐々に上方向に移動させる。コントローラー９０は、磁気ビーズ７が磁石７１とともに移動できる程度の速度で、キャリッジ７３Ａを上方向に移動させる。
【０１３７】
図１１Ｂに示す状態から磁石７１が上方向に移動すると、磁気ビーズ７が溶出液プラグ４７から第２オイルプラグ４６に移動し、溶出液プラグ４７から磁気ビーズ７が除去される。
【０１３８】
磁石７１が上シリンジ２１と対向する位置まで徐々に移動すると、磁気ビーズ７も上シリンジ２１まで移動し、磁気ビーズ７が下シリンジ２２よりも上側になる。この位置まで磁気ビーズ７を移動させれば、プランジャー１０を押したときに磁気ビーズ７がＰＣＲ容器３０に導入されることはない。このため、コントローラー９０は、この状態から図１１Ｃに示す状態までの間、磁気ビーズ７が磁石７１の移動に追従できない程度の速度でキャリッジ７３Ａを上方向に移動させても良い。なお、プランジャー１０を押したときに磁気ビーズ７がＰＣＲ容器３０に導入されないのであれば、もっと早い段階でキャリッジ７３Ａの移動速度を速くしても良い。
【０１３９】
コントローラー９０の記憶装置には、磁石７１の移動速度に関する情報が記憶されており、コントローラー９０は、この情報に従って、上記の動作（磁石７１を上下移動させる動作）を実行する。
【０１４０】
・磁石７１の揺動
磁石７１を上下方向に移動させている間、コントローラー９０は、揺動用モーター７５Ａを駆動させて、カートリッジ１を挟む一対の磁石７１を前後方向に揺動させても良い。
【０１４１】
図１２は、磁石７１を揺動させたときの磁気ビーズ７の挙動の概念図である。
【０１４２】
磁石７１が上下方向に移動する間、チューブ２０は、前後方向から一対の磁石７１に挟まれている。一対の磁石７１はアーム７２に保持されているため、一対の磁石７１の前後方向の距離はほぼ一定である。このため、一対の磁石７１のうちの一方がチューブ２０に接近すると、他方はチューブ２０から離間する。
【０１４３】
磁気ビーズ７は、距離の近い磁石７１の方に引き寄せられるため、一方の磁石７１がチューブ２０に近接していると、その磁石７１の側に磁気ビーズ７が引き寄せられる。その後、その磁石７１がチューブ２０から離れ、逆側の磁石７１がチューブ２０に近接すると、今度は逆側の磁石７１に磁気ビーズ７が引き寄せられる。これにより、磁気ビーズ７が前後方向に移動する。一対の磁石７１を前後方向に揺動させると、磁気ビーズ７が前後方向に往復移動することになる。
【０１４４】
磁気ビーズ７が前後方向に往復移動すると、磁気ビーズ７に液体が接しやすくなる。特に、キャピラリー２３内の液体は流動性をほとんど有していないので、キャピラリー２３内の液体を磁気ビーズ７にできるだけ接しさせたい場合には、磁気ビーズ７が前後方向に往復移動することは有効となる。
【０１４５】
図１３は、磁石７１の揺動の有無を示す表である。
【０１４６】
磁気ビーズ７がオイルプラグ（第１オイルプラグ４４又は第２オイルプラグ４６）を下方向に移動するとき、コントローラー９０は、揺動モーターを停止させて、磁石７１を揺動させない。このとき、コントローラー９０は、一対の磁石７１のうちの一方をチューブ２０に接近させた状態で、磁石７１を下方向に移動させる。これは、各磁石７１とチューブ２０との距離を均等にした場合と比べて、磁気ビーズ７が磁石７１の移動に追従しやすいからである。
【０１４７】
磁気ビーズ７が洗浄液プラグ４５を下方向に移動するとき、コントローラー９０は、揺動モーターを駆動させて、磁石７１を前後方向に揺動させる。これにより、磁気ビーズ７が洗浄液プラグ４５内を前後方向に揺動しながら下方向に移動するため、磁気ビーズ７の洗浄効率を高めることができる。また、洗浄効率が高められるので、洗浄液プラグ４５の量を抑制でき、カートリッジ１の小型化を図ることができる。
【０１４８】
磁気ビーズ７が洗浄液とオイル（第２オイルプラグ４６）の界面を通過するとき、コントローラー９０は、揺動モーターを停止させて、磁石７１を揺動させない。これにより、磁気ビーズ７が揺動せずに界面を通過するので、洗浄液の成分がオイルに持ち込まれにくくなる。なお、コントローラー９０は、一対の磁石７１のうちの一方をチューブ２０に接近させた状態で、磁石７１を下方向に移動させる。これにより、距離の近い磁石７１に磁気ビーズ７が引き寄せられて凝集し、磁気ビーズ７に付着した洗浄液が絞られるため、洗浄液の成分がオイルに持ち込まれにくくなる。
【０１４９】
磁気ビーズ７が溶出液プラグ４７にあるとき、コントローラー９０は、揺動モーターを駆動させて、磁石７１を前後方向に揺動させる。これにより、磁気ビーズ７が溶出液プラグ４７内を前後方向に揺動するため、磁気ビーズ７に結合した核酸の溶出効率を高めることができる。また、溶出効率が高められるので、磁気ビーズ７が溶出液４７に導入されてから核酸の溶出を終了させるまでの時間を短縮できる。
【０１５０】
なお、溶出液プラグ４７で核酸を溶出させた後、磁石７１を上方向に移動させて磁気ビーズ７を引き上げるとき、コントローラー９０は、揺動モーターを停止させて、磁石７１を揺動させない。このとき、コントローラー９０は、一対の磁石７１のうちの一方をチューブ２０に接近させた状態で、磁石７１を下方向に移動させる。これにより、磁気ビーズ７が磁石７１の移動に追従しやすくなり、磁石７１の移動速度を速くすることができる。
【０１５１】
コントローラー９０の記憶装置には、キャピラリー２３の各プラグの位置に関する情報と、図１３に示すような揺動情報とが記憶されており、コントローラー９０は、この情報に従って、上記の動作（磁石７１を揺動させる動作）を実行する。
【０１５２】
（３）液滴形成処理
図１４Ａ〜図１４Ｃは、液滴形成処理の説明図である。図１４Ａは、磁石７１を引き上げたときのＰＣＲ装置５０の状態の説明図である。図１４Ｂは、回転体６１を４５度回転させた状態の説明図である。図１４Ｃは、押圧機構８０のロッド８２がプランジャー１０を押した状態の説明図である。
【０１５３】
図１４Ａに示すように、キャリッジ７３Ａが退避位置にあるときには、カートリッジ１が回転しても、昇降機構７３はカートリッジ１と接触しない。このような状態にしてから、コントローラー９０は、回転体６１を４５度回転させる。
【０１５４】
図１４Ｂに示すように、回転体６１が４５度回転すると、カートリッジ１の長手方向が、押圧機構８０のロッド８２の移動方向と平行になる。コントローラー９０は、プランジャー用モーター８１を駆動し、ロッド８２を移動させる。ロッド８２がカートリッジ１のプランジャー１０の取付台１１Ａに接触してから更にロッド８２が移動すると、プランジャー１０がチューブ２０側に押し込まれる。コントローラー９０は、図１４Ｃに示す状態までロッド８２を移動させ、プランジャー１０の取付台１１Ａがチューブ２０の上縁に接触するまでプランジャー１０を押す。
【０１５５】
プランジャー１０がチューブ２０側に押し込まれると、プランジャー１０の棒状部１２のシール１２Ａがチューブ２０の下シリンジ２２に嵌合する（図２Ｂ参照）。そして、更にプランジャー１０が押し込まれると、シール１２Ａが下シリンジ２２内をスライドする。これにより、シール１２Ａが下シリンジ２２内でスライドした体積相当分だけ、チューブ２０の下流側の液体（第３オイルプラグ４８、溶出液プラグ４７など）がＰＣＲ容器３０の流路形成部３５に押し出される。
【０１５６】
まず、チューブ２０の第３オイルプラグ４８が流路形成部３５に流入する。流路形成部３５にはオイルが充填されているため、流入分のオイルが流路形成部３５からオイル受容空間３２Ａに流れ込み、オイル受容空間３２Ａのオイル界面が上昇する。このとき、下シール部３４Ｂでの圧力損失によって、流路形成部３５の液体の圧力は、外気圧（オイル受容空間３２Ａの圧力）よりも高くなる。第３オイルプラグ４８がチューブ２０から押し出された後、溶出液プラグ４７がチューブ２０から流路形成部３５に流入する。流路形成部３５の内径がキャピラリー２３の内径よりも大きいため、チューブ２０内でプラグ状だった溶出液４７は、流路形成部３５のオイル中で液滴状になる。
【０１５７】
ここで、シール１２Ａが下シリンジ２２内でスライドし、チューブ２０内の液体が下流側から押し出される量は、チューブ２０内の溶出液プラグ４７及び第３オイルプラグ４８の合計よりも多いので、溶出液プラグ４７がチューブ２０から押し出された後に第２オイルプラグ４６の一部も流路形成部３５に押し出される。これにより、チューブ２０には溶出液４７は残らずに、溶出液プラグ４７の液量の全てが液滴状になる。また、第２オイルプラグ４６の一部がチューブ２０の下流側から押し出されてもよく、それによって、液滴状の溶出液４７がキャピラリー２３の開口に吸着しにくくなり、チューブ２０から離れやすくなる。
【０１５８】
キャピラリー２３の末端の内径（キャピラリー２３の開口径）は比較的小さく設計されているため、ＰＣＲ容器３０内で液滴化した溶出液４７がキャピラリー２３の開口に吸着しにくくなっている。また、溶出液４７は、ＰＣＲ容器３０の第２の液体よりも比重が大きい。このため、液滴状の溶出液４７は、キャピラリー２３の末端から離れて、流路形成部３５を流路にして底３５Ａに向かって沈降する。そして、ＰＣＲ容器３０の底３５Ａに到達し、そこで沈降を終えて凍結乾燥した核酸増幅反応試薬に接触し、核酸増幅反応試薬を溶解させる。但し、この段階では、流路形成部３５の流路が４５度に傾いているため、液滴状の溶出液４７が流路形成部３５の内壁に付着しやすい。このため、流路形成部３５の流路を鉛直方向に戻す必要がある。
【０１５９】
プランジャー１０が押され、液滴状の溶出液４７が形成された後、コントローラー９０は、プランジャー用モーター８１をそれまでとは逆方向に駆動し、ロッド８２を元の位置に戻す。この状態では、カートリッジ１が回転しても、押圧機構８０のロッド８２がカートリッジ１と接触しない。このような状態にしてから、コントローラー９０は、回転体６１を基準位置に戻す。回転体６１が基準位置になると、流路形成部３５の流路が鉛直方向になるため、液滴状の溶出液４７が流路形成部３５の内壁に付着しにくくなる。
【０１６０】
このように、核酸を含んだプラグがＰＣＲ容器３０に吐出されるのに伴い、キャピラリー２３内の１つ以上のオイルプラグがＰＣＲ容器３０に吐出される。上述したように、それらオイルプラグのうち１つ以上に、第１の添加剤が含まれている。キャピラリー２３内の第１の液体は、ＰＣＲ容器３０内の第２の液体より、高濃度の添加剤を含有するため、キャピラリー２３内の第１の液体に含有される第１の添加剤は、ＰＣＲ容器３０内で希釈される。その結果、ＰＣＲ容器３０内の添加剤の濃度は、１％（ｖ/ｖ）以上５０％（ｖ/ｖ）以下になる。
【０１６１】
（４）熱サイクル処理
図１５Ａ及び図１５Ｂは、熱サイクル処理の説明図である。図１５Ａは、溶出液４７に低温側の温度処理を施す状態の説明図である。図１５Ｂは、溶出液４７に高温側の温度処理を施す状態の説明図である。各図の左側にはＰＣＲ装置５０の状態が示されており、各図の右側にはＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の内部の状態が示されている。
【０１６２】
カートリッジ１が装着部６２に対して正常な位置に固定されると、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の上流側（高温領域３６Ａ）が高温側ヒーター６５Ｂと対向し、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の下流側（低温領域３６Ｂ）が低温側ヒーター６５Ｃと対向する。熱サイクル処理の間、コントローラー９０は、回転体６１に設けられた高温側ヒーター６５Ｂにより、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の上流側の高温領域３６Ａの液体を約９０〜１００℃に加熱する。また、コントローラー９０は、回転体６１に設けられた低温側ヒーター６５Ｃにより、流路形成部３５の下流側の低温領域３６Ｂの液体を約５０〜７５℃に加熱する。これにより、熱サイクル処理の間、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５内の液体に温度勾配が形成される。回転体６１に装着部６２及びヒーターが設けられているので、回転体６１が回転しても、カートリッジ１とヒーターとの位置関係はこのまま維持される。なお、ＰＣＲ容器３０内で、ＲＴ−ＰＣＲを行う場合は、熱サイクル処理の前に、核酸増幅反応試薬が溶解した溶出液４７に対して、低温側ヒーター６５Ｃによって、約４２〜５５℃で処理することにより、逆転写反応を行えばよい。
【０１６３】
熱サイクル処理の間、ＰＣＲ容器３０内の液体が加熱されることになる。仮にＰＣＲ容器３０の液体が加熱されることによって気泡が発生すると、流路形成部３５内の液体の温度にばらつきが生じたり、流路形成部３５における液滴状の溶出液４７の移動（沈降）が阻害されたりするおそれがある。但し、本実施形態では、下シール部３４Ｂでの圧力損失によって流路形成部３５の液体の圧力が外気圧よりも高いため、ＰＣＲ容器３０の液体に気泡が発生しにくくなっている。
【０１６４】
図１５Ａに示すように、回転体６１が基準位置にあるとき、低温側ヒーター６５Ｃが高温側ヒーター６５Ｂの下側に位置し、カートリッジ１のＰＣＲ容器３０の底３５Ａが下になる。液滴状の溶出液４７は第２の液体よりも比重が大きいため、液滴状の溶出液４７が流路形成部３５内を沈降する。液滴状の溶出液４７は、流路形成部３５内を沈降すると、ＰＣＲ容器３０の底３５Ａに到達し、そこで沈降を終えて低温領域３６Ｂに留まる。これにより、液滴状の溶出液４７が低温領域３６Ｂに移動する。コントローラー９０は、図１５Ａの状態を所定時間にて保持し、液滴状の溶出液４７を低温領域３６Ｂで約５０〜７５℃に加熱すると、低温側の温度処理が施され、ポリメラーゼ反応の伸張反応が起きる。
【０１６５】
図１５Ａの状態からコントローラー９０が回転用モーター６６を駆動して回転体６１を１８０度回転させると、図１５Ｂに示す状態になる。回転体６１が基準位置から１８０度回転すると、カートリッジ１が上下反転するとともに、高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃも上下反転する。つまり、高温側ヒーター６５Ｂが低温側ヒーター６５Ｃの下側に位置し、カートリッジ１のＰＣＲ容器３０の底３５Ａが上になる。液滴状の溶出液４７は、流路形成部３５内を沈降すると、チューブ２０の末端に到達し、そこで沈降を終えて高温領域３６Ａに留まる。これにより、液滴状の溶出液４７が高温領域３６Ａに移動する。コントローラー９０は、図１５Ｂの状態を所定時間にて保持し、液滴状の溶出液４７を高温領域３６Ａで約９０〜１００℃に加熱すると、高温側の温度処理が施され、核酸が変性する。
【０１６６】
図１５Ｂの状態からコントローラー９０が回転用モーター６６を駆動して回転体６１を−１８０度回転させると、図１５Ａの状態に戻る。この状態では、液滴状の溶出液４７が流路形成部３５内を沈降すると、液滴状の溶出液４７は、低温領域３６Ｂに移動し、低温領域３６Ｂで再び約５０〜７５℃に加熱され、低温側の温度処理が施される。なお、キャピラリー２３の末端の内径すなわちキャピラリー２３の開口径は比較的小さく設計されているため、溶出液４７がキャピラリー２３の開口に吸着しにくくなっているので、図１５Ｂの状態から回転体６１が−１８０度回転すると、液滴状の溶出液４７は、キャピラリー２３の開口に吸着することなく、チューブ２０を離れてＰＣＲ容器３０の底３５Ａに向かって沈降する。
【０１６７】
コントローラー９０は、回転用モーター６６を駆動して、回転体６１の回転位置を図１５Ａの状態にすることと図１５Ｂの状態にすることを、所定サイクル数にて繰り返す。これにより、ＰＣＲ装置５０が、溶出液４７に対してＰＣＲの熱サイクル処理を施すことができる。
【０１６８】
コントローラー９０の記憶装置には、高温側ヒーター６５Ｂの温度、低温側ヒーター６５Ｃの温度、図１５Ａの状態で保持する時間、図１５Ｂの状態で保持する時間、サイクル数（図１５Ａの状態と図１５Ｂの状態の繰り返し回数）の熱サイクル情報が記憶されており、コントローラー９０は、この熱サイクル情報に従って、上記の処理を実行する。
【０１６９】
（５）リアルタイムＰＣＲにおける蛍光測定
図１５Ａに示すように、回転体６１が基準位置にあるとき、蛍光測定器５５がカートリッジ１のＰＣＲ容器３０の底３５Ａと対向する。そのため、溶出液４７の蛍光測定時には、コントローラー９０は、回転体６１を基準位置にした状態で、低温側ヒーター６５Ｃの挿入穴６４Ａの下側開口からＰＣＲ容器３０の底３５Ａにある溶出液４７の蛍光強度を蛍光測定器５５に測定させる。
【０１７０】
回転体６１が１８０度回転して基準位置になった直後では、液滴状の溶出液４７がＰＣＲ容器３０の流路形成部３５を沈降しており、液滴状の溶出液４７がＰＣＲ容器３０の底３５Ａに到達していないことがある。このため、コントローラー９０は、回転体６１の回転位置が図１５Ａの状態になってから所定時間経過した後（図１５Ａの状態から回転体６１を回転させる直前）に、蛍光強度を測定するのが望ましい。若しくは、コントローラー９０は、回転体６１を基準位置にしたときから所定時間の間、蛍光測定器５５に蛍光強度を測定させて、蛍光強度の時間履歴を記憶するようにしても良い。
＝＝＝その他＝＝＝
上記の実施形態は、本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明を限定して解釈するためのものではない。本発明は、その趣旨を逸脱することなく、変更、改良され得ると共に、本発明にはその等価物が含まれることは言うまでもない。
【０１７１】
＜ＰＣＲ装置について＞
前述のＰＣＲ装置５０は、熱サイクル処理として所定サイクル数にてカートリッジ１の姿勢を変化させて、ＰＣＲ容器３０を上下反転させていた。但し、カートリッジ１の姿勢を変化させる回数は、複数回に限られるものではなく、１回でも良い。
【０１７２】
前述のＰＣＲ装置では、回転体の回転軸がＰＣＲ容器よりもチューブの近くに位置しているが、回転体を回転させてカートリッジの姿勢が変化したときにＰＣＲ容器の内部において液滴が移動できるのであれば、回転体の回転軸の位置は、これに限られるものではない。
【０１７３】
前述のＰＣＲ装置では、ノッチの形成された固定部６３と、挿入穴６４Ａをカートリッジの装着部としているが、カートリッジを回転体に装着できれば、この構成に限られるものではない。また、装着部が、チューブ側のみを固定することによってカートリッジを回転体に固定する構造であっても良いし、ＰＣＲ容器側のみを固定することによってカートリッジを回転体に固定する構造であっても良い。但し、装着部は、回転体が回転してカートリッジの姿勢が変化しても、カートリッジが回転体に安定して固定される構造である必要がある。
【０１７４】
前述のＰＣＲ装置５０は、ＰＣＲ用ヒーターとして高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃを備えているが、核酸増幅反応用容器であるＰＣＲ容器の内部に温度勾配を形成できるのであれば、この構成に限られるものではない。例えば、高温側のみにヒーターを設けても良い。若しくは、高温側にヒーターを設け、低温側に冷却器を設けても良い。
【０１７５】
また、前述のＰＣＲ装置５０は、回転体にＰＣＲ用ヒーター（高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃ）が設けられているが、核酸増幅反応用容器であるＰＣＲ容器の内部に温度勾配を形成できるのであれば、回転体の外部にＰＣＲ用ヒーターを設けても良い。例えば、ＰＣＲ装置が、図１５Ａに示すように回転体６１が基準位置にあるときにＰＣＲ容器と対向する第１のＰＣＲ用ヒーターと、図１５Ｂに示すように回転体を１８０度回転させたときにＰＣＲ容器と対向する第２のＰＣＲ用ヒーターとを、回転体の外部に備えていても良い。このようにしても、核酸増幅反応用容器であるＰＣＲ容器の内部に温度勾配を形成可能である。但し、ＰＣＲ用ヒーターが回転体に設けられていれば、回転体の回転位置に関わらず、カートリッジのＰＣＲ容器とヒーターとの位置関係を維持されるので、望ましい。
【０１７６】
ＰＣＲ装置５０は、溶出用ヒーター６５Ａを備えずに、ＰＣＲ用ヒーター（例えば高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃ）を備えるだけでも良い。但し、ＰＣＲ装置５０が溶出用ヒーター６５Ａを備えていれば、核酸の磁気ビーズからの遊離が促進されるので望ましい。
【０１７７】
ＰＣＲ装置５０は、チューブに沿って磁石を移動させる磁石移動機構を備えていなくても良い。この場合、例えば、作業者が磁石を持ち、チューブに沿って磁石を移動させると良い。但し、作業者によって核酸結合性固相担体である磁気ビーズの移動速度等が異なるおそれがあるため、ＰＣＲ装置５０が磁石移動機構を備えることが望ましい。
【０１７８】
また、ＰＣＲ装置５０の磁石移動機構７０が揺動機構７５を備えていなくても良い。この場合、磁石を揺動させることはできないものの、チューブに沿って磁石を移動させることはできるので、核酸の結合した磁気ビーズを、溶出液を含むプラグまで移動させることができる。
【０１７９】
ＰＣＲ装置５０は、押圧機構８０を備えていなくても、代わりの押出手段を備えていれば良い。この場合、例えば、プランジャーやタンクが、押出手段となりうる。すなわち、作業者がカートリッジのプランジャーを手で押すと良い。カートリッジにプランジャーが設けられていない場合には、上述のような変形可能な材質で作ったタンクを作業者が変形させることにより、タンクの内部を加圧して、チューブからＰＣＲ容器に液体を押し出しても良い。
【実施例】
【０１８０】
［実験例１］上記ＰＣＲ装置を用いたＰＣＲ
本実験例では、図１６に示すように、上述の核酸抽出用キットのうち、チューブ２００の内部に、第１プラグ２１０から第７プラグ２７０を有する構成を使用した。
まず、容量３ｍＬのポリエチレン製容器１３０に、３７５μＬの溶解液、及び１μＬの磁性ビーズ分散液を収容した。溶解液は、７６質量％のグアニジン塩酸塩、１．７質量％のエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物、及び１０質量％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの水溶液（東洋紡製、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−、ＮＰＫ−１）を用いた。また、磁性ビーズ原液としては、５０体積％の磁性シリカ粒子及び２０質量％の塩化リチウムが含有されたものを用いた。
ヒトから採取した血液を、ピペットを用いて容器１３０の口１２１から５０μＬ入れ、容器１３０に蓋１２２をして手で３０秒間振って撹拌した。その後、容器１３０の蓋１２２を外してチューブ２００に接続した。なお、チューブ２００には両端に栓１１０が為されており、第１プラグ２１０側の栓１１０を外してチューブ２００に容器１３０を接続した。
ここで、第１プラグ２１０、第３プラグ２３０、第７プラグ２７０、第５プラグ２５０は、シリコーンオイルとした。第２プラグ２２０の第１洗浄液は、７６質量％のグアニジン塩酸塩の水溶液とした。また、第４プラグ２４０の第２洗浄液は、ｐＨが８．０のトリス−塩酸緩衝液（溶質濃度５ｍＭ）とした。第６プラグ２６０の溶出液は、滅菌水とした。
そして、永久磁石４１０を動かして、容器１３０内の磁性ビーズ１２５をチューブ２００内に導入した。そして、磁性ビーズ１２５を第６プラグ２６０まで移動させた。磁性ビーズ１２５がチューブ２００内の各プラグに存在した時間はおよそ以下の通りであった。第１、３、７プラグ：各３秒、第２プラグ：２０秒、第４プラグ：２０秒、第６プラグ：３０秒。なお、第２プラグ２２０及び第４プラグ２４０においては、磁性ビーズを振動させる等の操作は行わなかった。また、第２プラグ２２０、第４プラグ２４０、及び第６プラグ２６０の体積は、それぞれ、２５μＬ、２５μＬ、及び１μＬとした。
次いで、チューブの第７プラグ側の栓１１０を取り外し、容器１２０を手で変形させて、第７プラグ２７０及び第６プラグ２６０をＰＣＲの反応容器に吐出させた。この操作は、磁性ビーズを永久磁石によって動かして、第２プラグ２２０まで退避させた上でおこなった。
そして、その抽出液に１９μＬのＰＣＲの反応試薬を加え、リアルタイムＰＣＲを定法に従って行った。ＰＣＲの反応試薬の内訳は、ライトサイクラー４８０ジェノタイピングマスター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製４  ７０７  ５２４）４μＬ、滅菌水で１０００倍希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（ライフテクノロジーズ社製Ｓ７５６３）０．４μＬ、１００μＭのβアクチン検出用プライマー（Ｆ／Ｒ）各０．０６μＬ、滅菌水１４．４８μＬである。実験例１のＰＣＲの増幅曲線を図２０に示す。なお、図１７の縦軸は、蛍光強度であり、横軸はＰＣＲのサイクル数である。
【０１８１】
＜比較例＞
本比較例では、一般的な核酸抽出法により核酸の抽出を行った。
まず、容量１．５ｍＬのポリエチレン製容器（エッペンドルフチューブ）に、３７５μＬの溶解液、及び２０μＬの磁性ビーズ分散液を収容した。溶解液、磁性ビーズ分散液の組成としては、上記実験例と同様である。
次にヒトから採取した血液を容器の口からピペットを用いて５０μＬ導入し、容器に蓋をして、ボルテックスミキサーで１０分間撹拌し、磁気スタンド及びピペットを操作してＢ／Ｆ分離操作を行った。この状態では、容器内には磁性ビーズ及び少量の溶解液が残存していた。
次いで容器に上記ＰＣＲ装置を用いた場合と同じ組成の第１洗浄液を４５０μＬ導入し、蓋をして５秒間ボルテックスミキサーにより撹拌し、磁気スタンド及びピペットを操作して第１洗浄液を除去した。この操作を２回繰り返した。この状態では、容器内には磁性ビーズ及び少量の第１洗浄液が残存していた。
次いで容器に上記ＰＣＲ装置を用いた場合と同じ組成の第２洗浄液を４５０μＬ導入し、蓋をして５秒間ボルテックスミキサーにより撹拌し、磁気スタンド及びピペットを操作して第１洗浄液を除去した。この操作を２回繰り返した。この状態では、容器内には磁性ビーズ及び少量の第２洗浄液が残存していた。
そして、滅菌水（溶出液）５０μＬを容器に加え、蓋をして１０分間ボルテックスミキサーにより撹拌し、磁気スタンド及びピペットを操作して上澄み液を回収した。この上澄み液が標的核酸を含んでいる。
そしてその抽出液から１μＬを分注し、さらに１９μＬのＰＣＲの反応試薬を加え、リアルタイムＰＣＲを定法に従って行った。ＰＣＲの反応試薬の内訳は、ライトサイクラー４８０ジェノタイピングマスター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製４  ７０７  ５２４）４μＬ、滅菌水で１０００倍希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（ライフテクノロジーズ社製Ｓ７５６３）０．４μＬ、１００μＭのβアクチン検出用プライマー（Ｆ／Ｒ）各０．０６μＬ、滅菌水１４．４８μＬである。このときの増幅曲線を図１７に示す。
【０１８２】
＜実験結果＞
本実験例から、以下のことが理解できる。
【０１８３】
（１）ＰＣＲの前処理である核酸の抽出処理に要した時間を比較すると、検体を容器に挿入してから、ＰＣＲの反応容器に標的核酸を導入するまでの時間は、上記ＰＣＲ装置を用いた場合ではおよそ２分であった。比較例ではおよそ３０分であった。これにより上記ＰＣＲ装置を用いた場合の核酸抽出方法は、比較例の核酸抽出方法よりも、核酸抽出に要する時間が大幅に短い。
【０１８４】
（２）各洗浄液は、上記ＰＣＲ装置を用いた場合では比較例の約１８分の１の量であった。さらに、溶出液の量も上記ＰＣＲ装置を用いた場合は比較例の約５０分の１であった。従って、上記ＰＣＲ装置を用いた場合では、洗浄液と溶出液の量が非常に少量で十分である。
【０１８５】
（３）溶出液における標的核酸の濃度を、溶解液及び溶出液の量において比較すると、理想的には上記ＰＣＲ装置を用いた場合のほうが、比較例よりも５０倍の濃度となると考えられる。但し、今回の実験例では、血液サンプルに含まれる核酸量が多く、１μＬの磁性ビーズの吸着可能量を超えており、血液サンプルに含まれる核酸を全量回収することができないため、上記ＰＣＲ装置を用いた場合では比較例の５０倍濃度が得られていない。核酸含有量が少なく１μＬの磁性ビーズの吸着可能量を超えない検体の場合には、上記ＰＣＲ装置を用いた場合には比較例の５０倍濃度が得られる。
【０１８６】
（４）図１７のグラフをみると、核酸の含有量が多い全血サンプルにおいても、核酸の増幅率の立ち上がりが、上記ＰＣＲ装置を用いた場合のほうが比較例よりも約０．６サイクル早い。すなわち、上記ＰＣＲ装置を用いた場合のＰＣＲの反応液は、比較例で用いたＰＣＲの反応液よりも、標的核酸の濃度が高い。すなわち、溶出液における標的核酸の濃度は、上記ＰＣＲ装置を用いた場合のほうが、比較例よりも高い。
【０１８７】
［実験例２］凍結乾燥試薬の保存安定性
本実施例では、核酸増幅用試薬が溶液の状態のときと、凍結乾燥のときとでの保存安定性能の比較を行った。
まず、２００μＬのエッペンドルフＰＣＲチューブ（核酸増幅反応用容器）内に調整した核酸増幅溶液を１０μＬ入れ、一方は溶液のまま、もう一方はトレハロース（100mg/mL）を加えて凍結乾燥にかけた。なお、核酸増幅溶液は、以下の通りである。
０．８μＭ  Primer F：GAC CAA TCC TGT CAC CTC TGA C（配列番号１）
０．８μＭ  Primer R：AGG GCA TTT TGG ACA AAG CGT CTA（配列番号２）
０．２μＭプローブ
TaqMan probe: FAM- TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG -TAMRA（配列番号３）
１ｘＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  ＲＴ／Ｐｌａｔｉｍｕｎ  Ｔａｑ  Ｍｉｘ
１ｘＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ
凍結乾燥した核酸増幅用試薬は、第２の液体を重層し、それぞれ室温（２５℃）で保存し、数日〜１ヵ月後に１０μＬのＲＮＡテンプレートで核酸増幅用試薬を溶解し、ＲＴ−ＰＣＲの反応を調べた。なお、ＲＴ−ＰＣＲの条件は、以下の通りである。
逆転写  ５０℃  ６０秒
酵素不活性化  ９５℃  １０秒
変性  ９５℃  ５秒
アニーリング・伸張  ５７℃  ２０秒
（５０サイクル）
図１８（Ａ）に示すように、溶液状態では、一日の保存もできない。一方、図１８（Ｂ）に示すように、凍結乾燥状態では、1ヶ月以上保存可能であった。
このように、核酸増幅用試薬が凍結乾燥状態であれば、室温で１ヶ月以上保存後のサンプルでも、調製直後と変わらず反応が起きる。さらに、凍結乾燥物が第２の液体で覆われていても、第２の液体からの阻害を受けることなく反応が起きる。
〔実験例３〕ＰＣＲ溶液中の界面活性剤による液滴付着効果
本実験例では、市販の酵素（DNA polymerase）中に含まれる界面活性剤の濃度を参考にし、様々な濃度の界面活性剤溶液を作成し、その溶液のチューブへの付着を観察した。
まず、昇降式ＰＣＲ装置用ポリプロピレンチューブに第２の液体を充填し、１.６μLの界面活性剤溶液を添加して界面活性剤溶液の液滴を作り、５分間静置した。その後、チューブを傾けて界面活性剤溶液をチューブの底から離し、再度チューブを立てて、界面活性剤溶液を底に落としてから１分後、チューブを逆さにして、界面活性剤溶液のチューブ底への付着を評価した。すぐに落ちたものを○、振ると落ちるものや振っても落ちないものまで、少しでも付着の気配があれば×とした。なお、オイルとして、高純度のジメチルシリコーンオイルであるＫＦ−９６Ｌ−２ｃｓを用いた。
その結果、界面活性剤が、ある一定以上の濃度になった時、チューブ底への付着が生じた。表１に、用いたチューブに対し、チューブ底への付着が発生しない最大の濃度を記した。即ち、界面活性剤の濃度が、表１に記載の濃度以下の場合、反応液の内壁への付着はなかったが、この濃度より高い場合、反応液の内壁への付着が観察された。
【表１】
2015188377.tif 000002
このように、反応液中に、一定濃度以上の界面活性剤を含有させると、反応液がチューブの内壁に付着し、チューブを逆さにしても反応液が落ちないという現象を引き起こす。
〔実験例４〕第２の液体中の添加剤による液滴付着防止効果
本実験例では、高純度の2ｃｓのジメチルシリコーンオイルに対し、表２に示したような添加剤を５％（ｖ/ｖ）になるように加えて混合し、第２の液体として用いることで、添加剤の効果を確認した。また、反応液は、以下のように準備した。
Takara Ex Taq HS (x50)          0.4
10xbuffer                       1.0
dNTP(10mM)                      0.2
InfA forward primer (5uM)       1.0
InfA reverse primer (5uM)       0.3
InfA probe (2uM)                0.25
plasmid                         1.0
DW                              up to 10.0（単位はμＬ）
市販のTakara Ex Taq HSには、０．５％のNP40と０．５％のTween20が含まれているため、この反応液中には、０．０２％のNP40と０．０２％のTween20が含まれていることになる。
これらの第２の液体と反応液を用い、実験例４と同様に、反応液のチューブへの付着を観察した。チューブへの付着は、（１）と同様に評価した。
【表２】
2015188377.tif 000003
このように、表２で示される添加剤を５％（ｖ/ｖ）程度添加することによって、反応液のチューブへの付着が防止できる。
〔実験例５〕添加剤による核酸増幅用試薬の不安定化
実験例２と同様にして、昇降式ＰＣＲ装置用ポリプロピレンチューブに核酸増幅用試薬を凍結乾燥させた。１％、５％、１０％、２０％の添加剤ＳＳ４２３０を加えた第２の液体で、凍結乾燥させた核酸増幅用試薬の入ったチューブを満たし、チューブを密閉して３０℃で保管した。そして、１ヶ月ごとに、特開２００９−１３６２５０号公報に記載の昇降式ＰＣＲ装置で、ＰＣＲを行った。そして、Ctが２サイクル以上遅れた場合または輝度が５０％以下に低下した場合、反応阻害が生じたと判定した。
その結果、チューブを作製した直後はいずれの添加量でも反応阻害が生じず、添加量１％では４ヶ月後でも反応阻害は生じないが、５％では４ヶ月後、１０％では３ヶ月後、２０％では１ヶ月後の実験で、反応阻害が生じた。このように、第２の液体の添加剤は、凍結乾燥させた核酸増幅用試薬を不活性化する。
〔実験例６〕溶出液に対する添加剤の影響
実験例２と同様にして、昇降式ＰＣＲ装置用ポリプロピレンチューブに核酸増幅用試薬を凍結乾燥させた。一方、６０％の添加剤ＳＳ４２３０を加えた第２の液体に、純水１．４μＬを滴下して４℃で保存し、１２ヶ月後にテンプレートとなるＲＮＡ０．２μＬを加え、凍結乾燥させた核酸増幅用試薬の入ったチューブに滴下し、特開２００９−１３６２５０号公報に記載の昇降式ＰＣＲ装置で、ＰＣＲを行った（５０℃６０秒、９８℃１０秒で処理後、９８℃５秒−６０℃２０秒を５０サイクル）。なお、このＰＣＲチューブ内のオイルにも５％の添加剤ＳＳ４２３０が添加されている。
その結果、図１９に示すように、６０％の添加剤ＳＳ４２３０を加えた第２の液体に長期間接触させた水を用いてＰＣＲを行っても、反応阻害が見られず、正常に反応が進んだ。このように、第２の液体の添加剤は、接触している水には影響を与えず、従って、溶出液に高濃度に添加剤を含有させても、希釈後にＰＣＲを行う限り、ＰＣＲには、影響しないと考えられる。
【符号の説明】
【０１８８】
１  カートリッジ、
３  タンク、３Ａ  蓋、３Ｂ  変形部、
５  アダプター、５Ａ蓋、７  磁気ビーズ、
９  カートリッジ本体、
１０  プランジャー、１１  筒状部、１１Ａ  取付台、
１２  棒状部、１２Ａ  シール、１３  リブ、
２０  チューブ、２１  上シリンジ、２２  下シリンジ、
２３  キャピラリー、２５  固定爪、２６  ガイド板、
３０  ＰＣＲ容器、３１  シール形成部、
３２  オイル受容部、３２Ａ  オイル受容空間、
３３  段差部、３４Ａ  上シール部、３４Ｂ  下シール部、
３５  流路形成部、３５Ａ  底、
３６Ａ  高温領域、３６Ｂ  低温領域、
４１    溶解液、４２  オイル、４３  洗浄液、
４４    第１オイルプラグ、４５  洗浄液プラグ、４６  第２オイルプラグ、
４７    溶出液（ＰＣＲ溶液）、
４７Ａ  溶解液、４７Ｂ  オイルプラグ、４７Ｃ  核酸増幅反応液、
４８    第３オイルプラグ、
５０    ＰＣＲ装置、５１  ベース、５２  支持台、５３  側壁、
５３Ａ  カートリッジ挿入口、５５  蛍光測定器、
６０    回転機構、６１  回転体、
６２    装着部、６３  固定部、
６３Ａ  ガイドレール、６４Ａ  挿入穴、
６５    ヒーター、６５Ａ  溶出用ヒーター、
６５Ｂ  高温側ヒーター、６５Ｃ  低温側ヒーター、
６５Ｄ  スペーサー、６６  回転用モーター、
７０    磁石移動機構、７１  磁石、７２  アーム、
７３    昇降機構、７３Ａ  キャリッジ、
７３Ｂ  昇降用モーター、７３Ｃ  キャリッジガイド、
７３Ｄ  ベルト、７３Ｅ  プーリー、
７５    揺動機構、７５Ａ  揺動用モーター、７５Ｂ  揺動回転軸、
８０    押圧機構、８１  プランジャー用モーター、８２  ロッド、
９０    コントローラー
１１０  栓
１２０  （装着後の）タンク
１２１  開口部
１２２  蓋
１２３  空間
１２４  溶解液
１２５  磁気ビーズ
１３０  （装着前の）タンク
２００  キャピラリー
２１０〜２７０  第１〜第７プラグ
３００  凍結乾燥した核酸増幅用試薬
３０１  チューブ
３０２  肉厚部
３０３  泡
３１１  オイル
【図１】
2015188377.tif 000004
【図２】
2015188377.tif 000005
【図３】
2015188377.tif 000006
【図４】
2015188377.tif 000007
【図５】
2015188377.tif 000008
【図６】
2015188377.tif 000009
【図７】
2015188377.tif 000010
【図８】
2015188377.tif 000011
【図９】
2015188377.tif 000012
【図１０】
2015188377.tif 000013
【図１１】
2015188377.tif 000014
【図１２】
2015188377.tif 000015
【図１３】
2015188377.tif 000016
【図１４】
2015188377.tif 000017
【図１５】
2015188377.tif 000018
【図１９】
2015188377.tif 000019
【図１６】
2015188377.tif 000020
【図１７】
2015188377.tif 000021
【図１８】
2015188377.tif 000022
【配列表】
2015188377000001.app