(57)【要約】【課題】生理活性物質固定化粒子に用いられるポリマー粒子であって、生理活性物質を固定化した粒子を得るための反応ステップを少なくすることにより、生理活性物質固定化粒子の製造方法を簡略化することができるポリマー粒子および生理活性物質固定化粒子を提供することにある。【解決手段】生理活性物質捕捉用粒子の製造に用いられるポリマー粒子であって、カルボキシル基を有する単量体と、親水性側鎖を含む単量体、および架橋性単量体を重合して得られることを特徴とし、該ポリマー粒子は、カルボキシル基を有する単量体１ｍｏｌ％以上、９０ｍｏｌ％以下と、架橋性単量体０．０１ｍｏｌ％以上、３０ｍｏｌ％以下を重合して得られるものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質固定化粒子に用いられるポリマー粒子であって、
カルボキシル基を有する単量体と、親水性側鎖を含む単量体、および架橋性単量体を重合して得られることを特徴とするポリマー粒子。
【請求項２】
前記ポリマー粒子は、カルボキシル基を有する単量体１ｍｏｌ％以上、９０ｍｏｌ％以下と、架橋性単量体０．０１ｍｏｌ％以上、３０ｍｏｌ％以下を重合して得られるものである請求項１に記載のポリマー粒子。
【請求項３】
前記カルボキシル基を有する単量体が、下記一般式（Ｉ）で表わされる請求項１または２に記載のポリマー粒子。
【化１】
2015178581.tif 000011
[式（Ｉ）中Ｒ１は、―Ｏ―、―Ｓ―、―ＮＨ―、―ＣＯ―、及び―ＣＯＮＨ―からなる
群から選択される少なくとも１つで中断されてもよい炭素数０〜３０の炭化水素鎖を示し、Ｒ２はＨ、ＣＨ３又は炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す]
【請求項４】
前記カルボキシル基を有する単量体が、下記一般式（ＩＩ）で表わされる請求項１ないし３いずれかに記載のポリマー粒子。
【化２】
2015178581.tif 000012
[式（ＩＩ）中Ｒ２はＨ、ＣＨ３又は炭素数２〜５の炭化水素鎖、ｎは０から３０の整数を示す。]
【請求項５】
請求項１記載の親水性側鎖が、アルキレングリコール残基、またはベタイン構造を有する官能基である請求項１ないし４いずれか１項記載のポリマー粒子。
【請求項６】
前記ベタイン構造を有する官能基がホスホリルコリン基である請求項５記載のポリマー粒子。
【請求項７】
請求項１ないし６いずれか１項に記載のポリマー粒子に含まれるカルボキシル基を用いて生理活性物質を結合させたことを特徴とする生理活性物質固定化粒子。
【請求項８】
前記結合が、カルボキシル基と生理活性物質中に存在する、または生理活性物質に導入したアミノ基との間の縮合反応である請求項７に記載の生理活性物質固定化粒子。
【請求項９】
前記生理活性物質がタンパク質、抗原、抗体、ペプチド、核酸、糖、または低分子量生理活性物質のいずれかである請求項７または８記載の生理活性物質固定化粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質固定化用の粒子に用いられるポリマー粒子、および生理活性物質固定化粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
生理活性物質固定に用いるポリマー粒子は、種々開発されている。
例えば、引用文献１には強磁性酸化鉄粒子とシリカおよびシランカップリング剤とから構成されており、シランカップリング剤は、アミノ基、エポキシ基、メルカプト基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、ビニル基、アクリル基、メタクリル基等の官能基を有する生理活性物質固定化粒子が記載されている。
【０００３】
また、引用文献２には生理活性物質との結合量が多いカルボキシル基含有粒子の製造方法が記載されている。これは水酸基を有する有機ポリマー粒子の該水酸基とカルボン酸無水物とを反応させてエステル結合を生成させ、カルボキシル基含有粒子を製造する方法に関するものである。具体的には、２，３−ヒドロキシプロピル基を有する有機ポリマー粒子の該２，３−ヒドロキシプロピル基由来の水酸基とカルボン酸無水物とを反応させてエステル結合を生成させ、カルボキシル基含有粒子を作製している。
【０００４】
しかしながら、どちらの粒子も作製方法が煩雑で、また、夾雑物の非特異吸着を効率的に抑制する機能も付与されておらず、実際の使用において作業の手間を生じることになる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−３０５０５５
【特許文献２】特開２００７−２６２１１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、生理活性物質固定化粒子に用いられるポリマー粒子であって、生理活性物質を固定化した粒子を得るための反応ステップを少なくすることにより、生理活性物質固定化粒子の製造方法を簡略化することができるポリマー粒子および生理活性物質固定化粒子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は（１）〜（９）に記載の通りである。
（１）生理活性物質固定化粒子に用いられるポリマー粒子であって、カルボキシル基を有する単量体と、親水性側鎖を含む単量体、および架橋性単量体を重合して得られることを特徴とするポリマー粒子。
（２）前記ポリマー粒子は、カルボキシル基を有する単量体１ｍｏｌ％以上、９０ｍｏｌ％以下と、架橋性単量体０．０１ｍｏｌ％以上、３０ｍｏｌ％以下を重合して得られるものである（１）に記載のポリマー粒子。
（３）前記カルボキシル基を有する単量体が、下記一般式（Ｉ）で表わされる（１）または（２）に記載のポリマー粒子。
【化１】
2015178581.tif 000002
[式（Ｉ）中Ｒ１は、―Ｏ―、―Ｓ―、―ＮＨ―、―ＣＯ―、及び―ＣＯＮＨ―からなる
群から選択される少なくとも１つで中断されてもよい炭素数０〜３０の炭化水素鎖を示し、Ｒ２はＨ、ＣＨ３又は炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す]
（４）前記カルボキシル基を有する単量体が、下記一般式（ＩＩ）で表わされる（１）ないし（３）いずれかに記載のポリマー粒子。
【化２】
2015178581.tif 000003
[式（ＩＩ）中Ｒ２はＨ、ＣＨ３又は炭素数２〜５の炭化水素鎖、ｎは０から３０の整数を示す。]
（５）（１）記載の親水性側鎖が、アルキレングリコール残基、またはベタイン構造を有する官能基である（１）ないし（４）いずれか１項記載のポリマー粒子。
（６）前記ベタイン構造を有する官能基がホスホリルコリン基である（５）記載のポリマー粒子。
（７）（１）ないし（６）いずれか１項に記載のポリマー粒子に含まれるカルボキシル基を用いて生理活性物質を結合させたことを特徴とする生理活性物質固定化粒子。
（８）前記結合が、カルボキシル基と生理活性物質中に存在する、または生理活性物質に導入したアミノ基との間の縮合反応である（７）に記載の生理活性物質固定化粒子。
（９）前記生理活性物質がタンパク質、抗原、抗体、ペプチド、核酸、糖、または低分子量生理活性物質のいずれかである（７）または（８）記載の生理活性物質固定化粒子。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、生理活性物質を固定化した粒子を得るための反応ステップを少なくすることが可能となり、生理活性物質固定化粒子の製造方法を簡略化することができるポリマー粒子および生理活性物質固定化粒子を提供することができた。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明に係わるポリマー粒子は、生理活性物質固定化粒子の製造に用いられるポリマー粒子であって、カルボキシル基を有する単量体と、親水性側鎖を含む単量体、および架橋性単量体を重合して得られるものである。
【００１０】
前記重合に前記カルボキシル基を有する単量体を用いることにより、前記ポリマー粒子にカルボキシル基が導入される。導入されたカルボキシル基は、後述するように、アミノ基との反応に優れており、生理活性物質固定化粒子を容易に製造することができる。
【００１１】
また、親水性側鎖を含む単量体を用いることで、前記ポリマー粒子に親水性を付与することができる。これにより、固定化した生理活性物質で標的物質を捕捉する際に、生体物質の非特異的な吸着を抑制することが可能となる。
【００１２】
さらに前記重合に前記架橋性単量体を用いることにより、前記ポリマー粒子内において、架橋構造が形成され、前記ポリマー粒子に、高い耐溶剤性、力学的強度を付与することができる。
【００１３】
すなわち、前記重合にカルボキシル基を有する単量体と、親水性側鎖を含む単量体、および架橋性単量体を用いることにより、高い耐溶剤性、力学的強度を有する生理活性物質固定化粒子を容易に製造することができ、さらには固定化した生理活性物質で標的物質を捕捉する際に、生体物質の非特異的な吸着を抑制することが可能となる。
【００１４】
［カルボキシル基を有する単量体］
ここで、前記カルボキシル基を有する単量体（以下、「モノマー（Ａ）」ともいう」）としては、限定されない一又は複数の実施形態において、下記一般式（Ｉ）で表されるモノマーが挙げられる。
【００１５】
【化１】
2015178581.tif 000004
[式（Ｉ）中Ｒ１は、―Ｏ―、―Ｓ―、―ＮＨ―、―ＣＯ―、及び―ＣＯＮＨ―からなる
群から選択される少なくとも１つで中断されてもよい炭素数０〜３０の炭化水素鎖を示し、Ｒ２はＨ、ＣＨ３又は炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す]
【００１６】
さらに、一般式（Ｉ）の化合物としては、限定されない一又は複数の実施形態において、下記式（ＩＩ）で表されるものが挙げられる。
【００１７】
【化２】
2015178581.tif 000005
[式（ＩＩ）中Ｒ２はＨ、ＣＨ３又は炭素数２〜５の炭化水素鎖、ｎは０から３０の整数
を示す。]
【００１８】
尚、前記一般式（ＩＩ）の化合物としては、入手性から、下記式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）で表されるものが好ましい。
【００１９】
【化３】
2015178581.tif 000006
【００２０】
【化４】
2015178581.tif 000007
【００２１】
また、本発明に用いるモノマー（Ａ）のカルボキシル基は、カルボキシル基のままでも、電離していても、中和されて塩になっていてもよい。
【００２２】
［親水性側鎖を含む単量体］
親水性側鎖を含む単量体（以下、モノマー（Ｂ）ともいう）としては、モノマー（Ａ）と共重合を行うことが可能な化合物を好適に用いることができ、限定されない一又は複数の実施形態において、
（１）アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、
（２）側鎖にベタイン構造を有する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを挙げることができる。
【００２３】
まずアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、特に構造を限定しないが、式（Ｖ）で表される（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｘの連鎖からなる化合物であることが好ましい。本発明において、「アルキレングリコール残基」とは、アルキレングリコール（ＨＯ−Ｒ−ＯＨ、ここでＲはアルキレン基）の片側端末又は両端末の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残る「アルキレンオキシ基」（−Ｒ−Ｏ−、ここでＲはアルキレン基）を意味する。例えば、メチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２−ＯＨ）の「アルキレングリコール残基」はメチレンオキシ基（−ＣＨ２−Ｏ−）であり、エチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ）の「アルキレングリコール残基」はエチレンオキシ基（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）である。
【００２４】
【化５】
2015178581.tif 000008
【００２５】
式（Ｖ）において、アルキレングリコール残基Ｘの炭素数は１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、更に好ましくは２〜４であり、より更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基の繰り返し数ｐは、１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。繰り返し数２以上１００以下の場合は、鎖中で繰り返されるアルキレングリコール残基Ｘの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ３は水素原子またはメチル基、Ｒ４は水素原子、メチル基またはエチル基である。
【００２６】
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、例えばメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート；２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メ
タ）アクリレート等の水酸基の一置換エステルの（メタ）アクリレート類；グリセロールモノ（メタ）アクリレート；ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート；２−メトキシエチル（メタ）アクリレート；２−エトキシエチル（メタ）アクリレート；メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート；エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート；エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、生体物質の非特異的吸着の少なさ及び入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートまたはエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。
【００２７】
中でも、エチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００であるメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートまたはエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートが、合成時の操作性（ハンドリング）の良さの面から好ましく用いられる。なお、「（メタ）アクリレート」とは、メタクリレート又はアクリレートを意味する。
【００２８】
次に、ベタイン構造を有する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、下記式（ＶＩ）で示されるように、（メタ）アクリル基とベタイン構造を有する官能基が、−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を介して、あるいは直接結合した化合物であることが好ましい。
【００２９】
【化６】
2015178581.tif 000009
（式中Ｒ５は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ６はベタイン構造を有する官能基を示す。Ｘは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数０〜２０の炭化水素鎖を示す。）
【００３０】
カルボキシベタイン系モノマーの具体例としては、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（４−カルボキシラトブチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（４−カルボキシラトブチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム等が挙げられる。
【００３１】
スルホベタイン系モノマーの具体例としては、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（４−スルホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（４−スルホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（スルホナトメチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（スルホナトメチル）アミニウム等が挙げられる。
【００３２】
ホスホベタイン系モノマーの具体例としては、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−ホスホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−ホスホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（４−ホスホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（４−ホスホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（ホスホナトメチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（ホスホナトメチル）アミニウム等が挙げられる。
【００３３】
また、ホスホリルコリン構造を有する重合性不飽和モノマーの具体例としては、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン等が挙げられる。これらの中では、入手性から２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが最も好ましい。
【００３４】
［架橋性単量体］
架橋性単量体（以下、「モノマー（Ｃ）」ともいう」）としては、多官能の化合物であって、モノマー（Ａ）およびモノマー（Ｂ）と共重合する化合物を好適に用いることができ、限定されない一又は複数の実施形態において、
（１）ポリオールのジ又はトリ（メタ）アクリル酸エステル類、例えばポリオールがエチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチロールプロパン、グリセリン、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシプロピレングリコール、ポリグリセリン等であるもの、
（２）前記（１）において、不飽和酸が（メタ）アクリル酸以外のもの、例えばマレイン酸、フマル酸などであるもの、
（３）ビスアクリルアミド類、例えばＮ，Ｎ'−メチレンビスアクリルアミドなど、
（４）ポリエポキシドと（メタ）アクリル酸を反応させて得られるジ又はトリ（メタ）アクリル酸エステル類、
（５）ポリイソシアネートと（メタ）アクリル酸ヒドロキシエステルを反応させて得られるジ（メタ）アクリル酸カルバミルエステル類、例えばポリイソシアネートがトリレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネートなどであるもの、及び/又は、
（６）多価アリル化合物、例えばアリル化デンプン、アリル化セルロース、ジアリルフタレート、テトラアリロキシエタン、ペンタエリストールトリアリルエーテル、トリメチロールプロパントリアリルエーテル、ジエチレングリコールジアリルエーテル、トリアリルトリメリテート等、が挙げられる。
【００３５】
尚、モノマー（Ａ）、モノマー（Ｂ）およびモノマー（Ｃ）の組み合わせは、限定されない一又は複数の実施形態において、モノマー（Ａ）が前記（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、メタクリル酸、アクリル酸のいずれかであるとき、モノマー（Ｂ）はメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレートまたは２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンのいずれか、モノマー（Ｃ）はエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ'−
メチレンビスアクリルアミドのいずれかであることが好ましく、モノマー（Ａ）が前記（ＩＩＩ）、（ＩＶ）のいずれかであるとき、モノマー（Ｂ）はメトキシポリエチレングリ
コール（メタ）アクリレート；２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレートまたは２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンのいずれか、モノマー（Ｃ）がエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ'−メチレンビスアクリルアミ
ドのいずれかであることがより好ましい。
【００３６】
また、前記重合反応に用いられるモノマー（Ａ）１ｍｏｌ％以上、９０ｍｏｌ％以下と、モノマー（Ｃ）０．０１ｍｏｌ％以上、３０ｍｏｌ％以下であることが好ましい。また、モノマー（Ａ）１０ｍｏｌ％以上、９０ｍｏｌ％以下と、モノマー（Ｃ）０．１ｍｏｌ％以上、２０ｍｏｌ％以下であることがより好ましく、モノマー（Ａ）２０ｍｏｌ％以上、９０ｍｏｌ％以下と、モノマー（Ｃ）０．１ｍｏｌ％以上、１０ｍｏｌ％以下であることが最も好ましい。
なおモノマー（Ｃ）の重合反応系への添加タイミングは特に限定されず、一又は複数の実施形態において、重合前、重合中、重合後のいずれか時点で添加されうる。
【００３７】
前記重合反応に用いられるモノマー（Ａ）、モノマー（Ｂ）とモノマー（Ｃ）の割合が前記範囲内にあることにより、前記効果をより顕著に発揮することができる。
【００３８】
また、本発明に係る、重合の方法は、限定されない一又は複数の実施形態において、懸濁重合や、逆相懸濁重合等が挙げられる。
【００３９】
［懸濁重合反応］
ここで、懸濁重合とは、一又は複数の実施形態において、非水溶性モノマーまたは水に対して難溶性のモノマー、必要に応じて他のモノマー若しくは架橋性単量体、及び重合開始剤等を含有する油相を、重合に不活性な水相中に分散及び懸濁させ、水中油滴型の懸濁重合を行う方法である。したがって、本発明においては、一又は複数の実施形態において、水相に、少なくともモノマー（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び重合開始剤を含む混合物を分散させて水中油滴型エマルションを形成する。
【００４０】
一方、逆相懸濁重合とは、一又は複数の実施形態において、水溶性モノマー、必要に応じて他のモノマー若しくは架橋性単量体、及び重合開始剤等を含有する水相を、重合に不活性な疎水性有機溶媒を含む油相中に分散及び懸濁させ、油中水滴型の懸濁重合を行う方法である。したがって、本発明においては、一又は複数の実施形態において、有機溶媒に、少なくともモノマー（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び重合開始剤を含む混合物を分散させて油中水滴型エマルションを形成する。
尚、重合反応前の水中油滴型エマルションまたは油中水滴型エマルション又は前記エマルションを形成するための分散媒におけるモノマー（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の含有量としては、限定されない一又は複数の実施形態において、溶媒１００ｍＬに対し、１ｍｍｏｌ以上、８０ｍｍｏｌ以下、５ｍｍｏｌ以上、５０ｍｍｏｌ以下、又は、５ｍｍｏｌ以上、３０ｍｍｏｌ以下である。なお、本開示の製造方法に用いるモノマー（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、それぞれ一又は複数の実施形態において、１種類でもよく、複数種類であってもよい。
【００４１】
［水相］
また、通常の懸濁重合に使用しうる水相は、限定されない一又は複数の実施形態において、重合に不活性な水溶液である。必要に応じてポリビニルアルコールなど公知の分散剤を添加してもよい。
【００４２】
［有機溶媒］
さらに、逆相懸濁重合に使用しうる有機溶媒は、限定されない一又は複数の実施形態にお
いて、重合に不活性な疎水性有機溶媒である。本開示の製造方法に使用しうる有機溶媒は、限定されない一又は複数の実施形態において、脂肪族炭化水素、脂環族炭化水素、芳香族炭化水素、脂肪族アルコール、脂肪族ケトン、及び脂肪族エステル類が挙げられる。前記脂肪族炭化水素は、限定されない一又は複数の実施形態において、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン及びｎ−ヘプタン等の炭素数５以上の脂肪族炭化水素が挙げられる。前記脂環族炭化水素は、限定されない一又は複数の実施形態において、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン及びメチルシクロヘキサン等の炭素数５以上の脂環族炭化水素が挙げられる。前記芳香族炭化水素は、限定されない一又は複数の実施形態において、ベンゼン並びにトルエン及びキシレン等のベンゼン誘導体が挙げられる。前記脂肪族アルコールは、限定されない一又は複数の実施形態において、ｎ−ブチルアルコール及びｎ−アミルアルコール等の炭素数４以上又は４〜６の脂肪族アルコールが挙げられる。前記脂肪族ケトンは、限定されない一又は複数の実施形態において、メチルエチルケトン等の炭素数４以上又は４〜６の脂肪族ケトンが挙げられる。前記脂肪族エステル類は、限定されない一又は複数の実施形態において、酢酸エチル等の炭素数４以上又は４〜６の脂肪族エステル類が挙げられる。本開示の製造方法に使用しうる有機溶媒は、限定されない一又は複数の実施形態において、１種単独でもよく、２種以上の混合溶媒でもよい。本開示の製造方法に使用しうる有機溶媒は、限定されない一又は複数の実施形態において、上述の各有機溶媒１種のみでもよく、２種以上を混合してもよい。
【００４３】
前記水相および有機溶媒の使用量には特に限定はなく、全モノマーの量等に応じて適宜設定することができる。全モノマー１００質量部に対する前記水相または有機溶媒の使用量は、限定されない一又は複数の実施形態において、５００質量部以上、５０００質量部以下が好ましく、５００質量部以上、３０００質量部以下がより好ましい。
【００４４】
［重合開始剤］
また、懸濁重合に使用しうる重合開始剤は、限定されない一又は複数の実施形態において、油溶性である。本発明で用いる油溶性重合開始剤としては、例えば、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサネート、メチルエチルケトンパーオキサイドなどの有機過酸化物、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）、（１−フエニルエチル）アゾジ−フエニルメタン、２，２−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）などのアゾ化合物が挙げられる。これら重合開始剤は単独使用でもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４５】
また、逆相懸濁重合に使用しうる重合開始剤は、限定されない一又は複数の実施形態において、水溶性である。前記重合開始剤は、限定されない一又は複数の実施形態において、水溶性のラジカル重合開始剤等が挙げられる。前記重合開始剤は、限定されない一又は複数の実施形態において、（１）過酸化水素、（２）過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム、及び過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩、（３）過塩素酸カリウム及び過塩素酸ナトリウム等の過塩素酸塩、（４）塩素酸カリウム及び臭素酸カリウム等のハロゲン酸塩、（５）ｔ‐ブチルハイドロパーオキシド、クメンハイドロパーオキシド、及びジアルキルパーオキシド（ジ−ｔ−ブチルパーオキシド、ｔ−ブチルクミルパーオキシド等）等のパーオキシド類、（６）メチルエチルケトンパーオキシド及びメチルイソブチルケトンパーオキシド等のケトンパーオキシド、（７）ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、及びｔ−ブチルパーオキシピバレート等のアルキルパーオキシエステル、並びに（８）アゾビスイソブチロニトリル及び２，２’−アゾビス（Ｎ，Ｎ’−ジメチレンイソブチルアミジン）ジヒドロクロリド等のアゾ化合物等が挙げられる。
【００４６】
さらに、前記重合開始剤の使用量は、懸濁重合および逆相懸濁重合の条件に応じて適宜設定することができる。前記重合開示剤の使用量は、限定されない一又は複数の実施形態において、全モノマー１００質量部に対して０．００５質量部以上、２０質量部以下、０．
０１質量部以上、１０質量部以下、０．０２質量部以上、１０質量部以下、又は、０．０５質量部以上、５質量部以下である。なお、前記重合開始剤の添加方法には特に限定はない。
【００４７】
［分散剤］
本開示の製造方法の限定されない一又は複数の実施形態において、通常の懸濁重合を行う際は水相に、逆相懸濁重合を行う際は前記有機溶媒に、分散剤を含有させることが好ましい。通常の懸濁重合に使用可能な分散剤を例示すると、（１）高分子分散剤およびＨＬＢ値が８〜１８の非イオン性界面活性剤としては、タンパク質（例；ゼラチンなど）；レシチン；アラビアゴム、トラガントゴムなどの水溶性ゴム、；アルギン酸ナトリウム；カルボキシメチルセルロース、エトキシセルロースなどのセルロース誘導体；澱粉およびその誘導体；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリビニルアルコールなど；ソルビタンオレイン酸エステル、ソルビタンステアリン酸エステル、ソルビタンパルミチン酸エステルなどのソルビタン脂肪酸エステル；セチルアルコールなど、（２）イオン性界面活性剤としては、高級アルコール硫酸エステルナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、コハク酸ジアルキルエステルスルホン酸ナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤；アルキルピリジニウムクロライド、アルキルジメチルベンジルアンモニウムなどの陽イオン性界面活性剤；ヒドロキシエチルイミダゾリン硫酸エステルナトリウム、イミダゾリンスルホン酸ナトリウムなどの両性界面活性剤、（３）無機化合物の分散剤として、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムなどを挙げることができる。このような分散剤あるいは界面活性剤は単独であるいは組み合わせて使用することができる。
【００４８】
逆相懸濁重合の分散剤としては、限定されない一又は複数の実施形態において、ＨＬＢが３〜１０、又は３〜９の油溶性界面活性剤が挙げられる。そのような油溶性界面活性剤は、一又は複数の実施形態において、ソルビタン脂肪酸エステル（ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタン、ソルビタンモノオレート等）、ショ糖脂肪酸エステル（ショ糖と、ステアリン酸、パルミチン酸、ラウリン酸、オレイン酸などの脂肪酸とのモノ、ジまたはトリエステル等）が挙げられる。前記分散剤は１種単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４９】
前記分散剤の使用量は特に限定はなく、懸濁重合および逆相懸濁重合の条件に応じて適宜選択することができる。分散剤の使用量は、限定されない一又は複数の実施形態において、全モノマー１００質量部に対して０．１質量部以上、２０質量部以下、０．１質量部以上、１５質量部以下、又は０．１質量部以上、１０質量部以下である。
【００５０】
また、本発明の重合においては、モノマー滴に適宜溶媒を添加してもよい。
通常の懸濁重合では、油滴にモノマー（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）開始剤の他に有機溶媒を適宜添加してもよい。有機溶媒はモノマーを溶解し、かつ、分散媒である水に不溶または難溶のものが好ましい。一方、逆相懸濁重合においては、水滴にモノマー（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、開始剤の他に水を適宜添加してもよい。添加する有機溶媒または水の量は分散媒中で液滴を作製出来れば任意である。
【００５１】
通常の懸濁重合反応は、前記モノマー（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、必要に応じて有機溶媒及び前記重合開始剤を含む混合物が前記水相に分散した水中油滴型エマルションを懸濁しながら重合を行う。前記水中油滴型エマルションの形成と前記懸濁は同時であってもよく、前記水中油滴型エマルションの形成が先であってもよい。また、各成分は、全量を重合反応前に混合してもよく、一部又は全部を撹拌しながら添加混合してもよい。重合反応条件は、限定されない一又は複数の実施形態において、温度に関しては５０℃以上、９０℃以
下、好ましくは６０℃以上、８０℃以下、時間に関しては０．５時間以上、４８時間以下、好ましくは１時間以上、２４時間以下である。
【００５２】
逆相懸濁重合反応は、前記モノマー（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、必要に応じて水、及び前記重合開始剤を含む混合物が前記有機溶媒に分散した油中水滴型エマルションを懸濁しながら重合を行う。前記油中水滴型エマルションの形成と前記懸濁は同時であってもよく、前記油中水滴型エマルションの形成が先であってもよい。また、各成分は、全量を重合反応前に混合してもよく、一部又は全部を撹拌しながら添加混合してもよい。重合反応条件は、限定されない一又は複数の実施形態において、温度に関しては５０℃以上、９０℃以下、好ましくは６０℃以上、８０℃以下、時間に関しては０．５時間以上、４８時間以下、好ましくは１時間以上、２４時間以下である。
【００５３】
［生理活性物質］
本発明に記載の生理活性物質は特に限定されないが、例えば、タンパク質、抗原、抗体、ペプチド、核酸、糖、または低分子量生理活性物質を含むことを特徴としている。
具体的には、タンパク質としては、例えば、生体由来の酵素、アプタマー、受容体、癌マーカー等、抗原、および抗体は、ポリクローナル抗体や単クローン抗体、ペプチドとしては、例えばグルタチオン、ペプチドホルモン等であり、核酸としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡやアプタマー等、糖としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖類や、糖脂質、糖タンパク、糖ペプチドを挙げることができる。また、低分子量生理活性物質としては、ペプチド断片や、合成ペプチド、糖鎖断片、ホルモン類やビタミン類を挙げることができる。
【００５４】
［生理活性物質の固定］
本発明の一実施形態に係るカルボキシル基含有ポリマー粒子を実際に使用するにあたっては、水溶性カルボジイミドなどの公知の活性化剤によりカルボキシル部位を活性化し、生理活性物質と基材とを混合することで、生理活性物質に含まれるアミノ基との縮合反応によって粒子に化学的に結合させることができる。
【００５５】
ここで官能基をカルボキシル基に限定している理由は、生理活性物質を固定化する種々の方法が確立しており、簡便に固定化ができること、さらに、カルボキシル基が反応性を持ちながら比較的安定で、保存時の失活に注意を払わなくてもよいことにある。
【００５６】
粒子表面のカルボキシル基を用いて生理活性物質を固定化するためには、カルボキシル基を活性させた後、生理活性物質に含まれるアミノ基と反応させることが、最も簡便で、かつ確実な方法である。
抗体やアミノ化糖のようにアミノ基を元々有する生理活性物質は、そのまま活性化したカルボキシル部位と反応させて固定できるが、アミノ基を元々は有しない生理活性物質を固定したい場合には、当該生理活性物質にアミノ基を付与した後、カルボキシル基に固定してもよい。
例えば、アミノ基を有しない糖を固定して糖親和性物質捕捉材を得たい場合には、糖類とヒドラジンを反応させると、アミノ化体である糖ヒドラゾンとなるので、ポリマー粒子上のカルボキシル基と反応させることができる。
【００５７】
カルボキシル基を活性化する方法は、特に限定するものではないが、カルボジイミド化合物を用いて活性エステル化する方法が好ましい。
【００５８】
カルボジイミド化合物としては、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドを使用することができる。特に、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）と略される１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩は、水溶液中でカルボ
キシル基を活性化することが可能であり、基本的に水溶性である生理活性物質の固定化には最適である。
【００５９】
生理活性物質を基材の表面に結合させた後、固定化されていない生理活性物質を洗浄し、
必要に応じて反応の活性化カルボキシル部位を不活化する。
以降は、 生理活性物質を用いた通常の分析工程、例えば酵素基質反応、抗原抗体反応、
リガンドレセプター反応等に移行すればよい。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例を上げ説明する。
【００６１】
［実施例１］
［カルボキシル基を有する粒子の合成１］
ｍｏｎｏ‐２−（Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ
（シグマアルドリッチ社製）２．３ｇ（１０ｍｍｏｌ）、メトキシポリエチレングリコ
ールメタクリレート（シグマアルドリッチ社製、平均分子量４７５）４．７５ｇ（１０ｍｍｏｌ）、エチレングリコールジメタクリレート０．１ｇ（０．５ｍｍｏｌ）、クロロホルム５ｍＬを混合し、さらに２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）（東京化成工業株式会社製）６６ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）を加え完全に溶解させモノマー溶液を作製した。０．２６ｗｔ％のポリビニルアルコール水溶液１００ｍＬにモノマー溶液を添加し、撹拌しながら２０分間窒素ガスでバブリングした。撹拌とバブリングを継続しながら６０℃で１６時間加熱した後、エタノールと純水で洗浄し、カルボキシル基を有する粒子を得た。
【００６２】
［実施例２］
［カルボキシル基を有する粒子の合成２］
水酸化ナトリウムで中和したｍｏｎｏ‐２‐（Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ （シグマアルドリッチ社製）２．３ｇ（１０ｍｍｏｌ）、
りん酸２−（メタクリロイルオキシ）エチル２−（トリメチルアンモニオ）エチル（東京化成工業株式会社製）２．９５ｇ（１０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ'−メチレンビスアクリルア
ミド（和光純薬工業株式会社製）０．１ｇ（０．６５ｍｍｏｌ）、純水５ｍＬを混合し、さらにペルオキソ二硫酸カリウム（和光純薬工業株式会社製）５４ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え完全に溶解させモノマー溶液を作製した。０．２５ｗｔ％に調整したソルビタンモノステアレートのシクロヘキサン溶液１００ｍＬにモノマー溶液を添加し、撹拌しながら２０分間窒素ガスでバブリングした。撹拌とバブリングを継続しながら６０℃で１６時間加熱した後、エタノールと純水で洗浄し、カルボキシル基を有する粒子を得た。
【００６３】
評価方法
（粒子の活性化）
得られた粒子それぞれ１００ｍｇを２００ｍｇ/ｍＬのＷＳＣ（株式会社同仁化学研究所
製）のＰＢＳ（ｐＨ５．８）溶液５ｍＬに分散し、３７℃にて２時間転倒混和した。その後、遠心分離で粒子を回収し、ＰＢＳ（ｐＨ５．８）で３回洗浄した。
（１次抗体固定化）
活性化した粒子それぞれ２０ｍｇに対し、５０μｇ／ｍＬに調製したＣＲＰ抗体（Ａｂｎｏｖａ製）のりん酸水素二カリウム溶液１ｍＬを加え、室温にて１晩転倒混和した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。その後２−アミノエタノールで残存活性基の不活性化を行った。
【００６４】
（ＣＲＰとの反応）
ＣＲＰ抗体を固定化した粒子それぞれ５ｍｇに３μｇ／ｍＬに調製したＣＲＰのＰＢＳ溶液１ｍＬを加え、室温にて１時間転倒混和した。遠心分離で粒子を回収後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。
【００６５】
（２次抗体との反応）
ＣＲＰを反応させた粒子に、１μｇ／ｍＬに調製したＨＲＰ標識化ＣＲＰ抗体（Ａｂｎｏｖａ製）溶液を１ｍＬ加え、室温にて１時間転倒混和した。遠心分離で粒子を回収後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。
【００６６】
（捕捉したＣＲＰの検出）
ＨＲＰ標識化ＣＲＰ抗体を反応させた粒子を、住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ発色キットを用いて発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６７】
＜比較例＞
実施例１および２の粒子に対し、それぞれＷＳＣによる活性化を行ったのち、２−アミノエタノールで不活性化を行い、カルボキシル基を消尽させた粒子を作製し、比較例１および２とした。これらの粒子に対し、実施例と同様にＣＲＰ捕捉量測定を行った。
【００６８】
【表１】
2015178581.tif 000010
【００６９】
実施例、比較例から本発明に従ったカルボキシル基を有する粒子において、抗体固定による免疫分析が実施できることが明らかとなった。