(57)【要約】【課題】  芽胞形成菌を、菌種によらず、効率的かつ効果的に殺菌することができる殺芽方法を提供する。【解決手段】下記の工程１終了後下記の工程２を行う殺芽方法を提供する。すなわち、工程１として、芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩とをｐＨ６以下の条件にて接触させる工程、の終了後、工程２として、芽胞形成菌を殺菌する工程である。また、下記の工程１と下記の工程２Ａを同時に行う期間を有する殺芽方法を提供する。すなわち、工程１として、芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩とをｐＨ６以下の条件下で接触させる工程、及び、工程２Ａとして、芽胞形成菌を物理的に殺菌する工程である。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程１終了後下記の工程２を行う殺芽方法：
工程１：芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩とをｐＨ６以下の条件下で接触させる工程；及び
工程２：芽胞形成菌を殺菌する工程。
【請求項２】
前記工程２が、下記の工程２Aである、請求項１記載の殺芽方法。
工程２A：芽胞形成菌を物理的に殺菌する工程。
【請求項３】
前記工程２が、下記の工程２Ｂである、請求項１記載の殺芽方法。
工程２Ｂ：芽胞形成菌を化学的に殺菌する工程。
【請求項４】
前記工程２Aが、熱により殺菌する工程である、請求項２記載の殺芽方法。
【請求項５】
前記工程２Ｂが、芽胞形成菌を殺菌剤により殺菌する工程である、請求項３記載の殺芽方法。
【請求項６】
前記工程１において、芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩とを液中で接触させる、請求項１〜５のいずれか１項記載の殺芽方法。
【請求項７】
液中のジピコリン酸の含有量が０．０５ｍＭ以上３０ｍＭ以下である、請求項６記載の殺芽方法。
【請求項８】
前記工程１を１５℃以上５０℃未満で行う、請求項１〜７のいずれか１項記載の殺芽方法。
【請求項９】
前記工程１を５分以上６０分以下行う、請求項１〜８のいずれか１項記載の殺芽方法。
【請求項１０】
下記の工程１と下記の工程２Ａを同時に行う期間を有する殺芽方法：
工程１：芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩とをｐＨ６以下の条件下で接触させる工程；及び
工程２Ａ：芽胞形成菌を物理的に殺菌する工程。
【請求項１１】
前記工程２Aが、熱により殺菌する工程である、請求項１０記載の殺芽方法。
【請求項１２】
前記工程２Ａにおいて芽胞形成菌を５０℃以上２５０℃以下で殺菌する、請求項１０又は１１記載の殺芽方法。
【請求項１３】
前記工程２Ａにおいて芽胞形成菌を５０℃以上２５０℃以下で殺菌する時間が、３分以上９０分以下である、請求項１２記載の殺芽方法。
【請求項１４】
前記工程１において、芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩とを液中で接触させる、請求項１０〜１３のいずれか１項記載の殺芽方法。
【請求項１５】
液中のジピコリン酸の含有量が０．０５ｍＭ以上３０ｍＭ以下である、請求項１４記載の殺芽方法。
【請求項１６】
前記工程２Ａ開始前に、前記工程１を１５℃以上５０℃未満で行う期間を有する、請求項１０〜１５のいずれか１項記載の殺芽方法。
【請求項１７】
前記工程２Ａ開始前に、前記工程１を３０秒以上６０分以下行う、請求項１０〜１６のいずれか１項記載の殺芽方法。
【請求項１８】
前記工程１を合計で３０分以上９０分以下行う、請求項１０〜１７のいずれか１項記載の殺芽方法。
【請求項１９】
ジピコリン酸を含有し、ｐＨ６以下である、殺芽助剤組成物。
【請求項２０】
ジピコリン酸を０．０５ｍＭ以上３０ｍＭ以下含有する液体組成物である、請求項１９記載の殺芽助剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、芽胞を有する芽胞形成菌の殺芽方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バチルス属やクロストリジウム属などの菌は、強固な殻構造を作り、熱や薬剤などに極めて高い抵抗力を有する芽胞を形成する。ある種の芽胞を形成しうる菌は人体に侵入すると毒素を産生することが知られている。例えば、医療現場では、シーツや枕カバーなどのリネン製品は主に加熱消毒されるが、加熱消毒では耐熱性である芽胞を有する菌を殺菌できない。そのため、リネン製品を介した芽胞を形成しうる菌の院内感染で死者まで出る被害も発生している。
【０００３】
芽胞を有する菌を殺菌するためには、多くの場合、高圧蒸気で滅菌したり、次亜塩素酸Ｎａなどの強力な化学的殺菌剤が高濃度で用いられたりする。また、食品加工においては、芽胞対策として過酷な熱処理、もしくは低温流通方法がとられている。
【０００４】
特許文献１には、発芽可能な菌が発芽して栄養型細胞となるのに十分な時間かつ好適な条件で、水閉鎖系に発芽剤を接触させること、及び発芽した栄養型細胞を殺菌処理することを含む、水閉鎖系における芽胞の制御方法が開示されている。また、特許文献２には、液卵または卵加工品に含まれる芽胞を有する菌を、所定の温度及び圧力で加圧処理を行う発芽方法、及び、その方法で発芽させた後、発芽させた菌を殺菌する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０１／６６４７１号
【特許文献２】特開２００９−１１８７７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１で具体的に開示された、L-アラニンなどの発芽誘導剤で芽胞を有する菌を処理する技術では、殺菌効果が十分ではない。
【０００７】
高濃度の殺菌剤や高圧蒸気滅菌による殺芽方法は、病院など広範囲の環境を消毒するには適しておらず、器材損傷性や人体への毒性がある可能性もあることから、使用用途や使用環境に制約がある。また、例えば、特許文献２の開示する技術では、芽胞を有する菌の発芽に１０ＭＰａ以上の高圧を掛ける必要があり、特殊な装置を必要とする課題がある。食品等への適用による品質の劣化も懸念される。
【０００８】
食品加工においては、芽胞対策として過酷な熱処理、もしくは低温流通方法がとられているが、風味や品質の劣化、電力コストなどの課題も生じる。
【０００９】
本発明は、医療や食品分野で危害となる芽胞を有する菌を、菌種によらず、効率的かつ効果的に殺菌することができる殺芽方法に関する。さらに、本発明は、芽胞形成菌を殺菌する為に用いる殺芽助剤組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は前記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、ジピコリン酸（２，６−ピリジンジカルボン酸）又はその塩をｐＨ６以下で芽胞形成菌に接触させると、通常用いられる濃度より低濃度の殺菌剤の使用やより低温で効果的に殺芽できることを見出し、本発明に至った。
【００１１】
即ち、本発明は、下記の工程１終了後下記の工程２を行う殺芽方法に関する。
工程１：芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩とをｐＨ６以下の条件下で接触させる工程；及び
工程２：芽胞形成菌を殺菌する工程。
【００１２】
また、本発明は、下記の工程１と下記の工程２Ａを同時に行う期間を有する殺芽方法に関する。
工程１：芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩とをｐＨ６以下の条件下で接触させる工程；及び
工程２Ａ：芽胞形成菌を物理的に殺菌する工程。
【００１３】
また、本発明は、ジピコリン酸又はその塩を含有し、ｐＨ６以下である、殺芽助剤組成物に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、芽胞を有する芽胞形成菌を、殺菌することができる殺芽方法が提供される。さらに、本発明では、芽胞形成菌を殺菌する為に用いる殺芽助剤組成物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
芽胞形成菌とは、栄養不存在下で芽胞を形成したことによって、一定の熱処理や乾燥に対して抵抗性を有する細菌のことを言う。芽胞とは、細菌が形づくる、菌が形成する強固な殻構造を示し、菌自体とは区別する。本発明の殺芽対象となる「芽胞形成菌」は、医療現場や食品、飲料製品に存在する一般的な芽胞形成菌である。例えば、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）やバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）といったバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌、クロストリジウム・デフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）といったクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属の細菌、アンフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌、スポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属の細菌、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌、エアリバチルス（Ａｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌、アリサイクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌などが挙げられる。本発明の対象となる「芽胞形成菌」は、芽胞を有する菌であるため、耐熱性を有する。ここで耐熱性とは、本発明の実施例に示されるように、初期菌数１０７〜１０９ＣＦＵ／ｍＬである芽胞を有する菌を、８０℃で３０分以上加熱した場合に、１０７ＣＦＵ／ｍＬ以上の菌が生存できることをいう。
【００１６】
本発明において「殺芽」とは芽胞を有する状態の菌を発芽させて殺すことを主に意図する。発芽とは、芽胞を有する芽胞形成菌が発芽することであり、これにより通常の増殖、代謝能を有する菌体になる現象を指す。ここで、殺芽とは、芽胞を有する菌を死滅させること、及び滅菌することを含む。また、殺芽は、集団で存在する菌の全体の菌数を減少させることも含む。殺芽は、特に限定はされないが、実施例で示す殺芽効果指数として表わした場合に０．２１以上、より好ましくは０．３以上、さらに好ましくは０．５以上などの状態を示す。本発明において殺芽効果とは、殺芽効果指数で表されるコントロールとの殺菌効果の違いを示す。
【００１７】
本発明の殺芽方法が優れた殺芽効果を有する理由は、定かではないが以下のように考えられる。工程１において、芽胞を有する芽胞形成菌にｐＨ６以下の条件下でジピコリン酸（以下、ＤＰＡとも記載する）又はその塩を作用させることにより、発芽が促進され、工程２における殺菌が容易に行われる。また、ｐＨ６以下の条件下でのジピコリン酸は、菌に対して親和的であるため、菌内に入り易く、効果的に発芽が促進されるものと推定する。
【００１８】
また、ジピコリン酸又はその塩の芽胞形成菌内における作用は、菌種によって特異的な特定のレセプターを介する作用ではないので、芽胞形成菌の種類によらず殺芽効果又は殺菌効果を有すると考えられる。
【００１９】
なお、発芽は、例えば、芽胞の暗色化の有無を位相差顕微鏡で調べることによって確認することができる。すなわち、暗色化した芽胞の割合が多い程、発芽が誘起されていることを意味する。
【００２０】
＜工程１＞
【００２１】
本発明の工程１は、ｐＨが６以下の条件下において芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩とを接触させる工程である。工程１において芽胞形成菌とは芽胞を有する菌であることが望ましい。芽胞を有しない、芽胞を有しうる菌を含んでいても良い。
【００２２】
ジピコリン酸又はその塩は、液体又は固体の状態で提供される。ジピコリン酸又はその塩は、簡便性と殺芽効果のさらなる向上の観点から、好ましくは液体である。また、ジピコリン酸又はその塩は、簡便性の観点から、好ましくは後述の殺芽助剤組成物として提供される。
【００２３】
本発明の工程１におけるジピコリン酸又はその塩と芽胞形成菌との接触方法は、芽胞形成菌が液中に存在する場合には、ジピコリン酸又はその塩の高濃度溶液又はジピコリン酸又はその塩の粉末を芽胞形成菌が存在する液に混合し、混合した液を常に攪拌しながら接触させる方法、混合した後で攪拌する方法、又は混合した後で静置する方法などが挙げられる。芽胞形成菌が固体上に存在する場合には、ジピコリン酸又はその塩の溶液等、後述の液体の殺芽助剤組成物を固体上に塗布する方法が挙げられる。ジピコリン酸又はその塩の溶液を固体上に塗布する方法としては、噴霧する方法、刷毛やスポンジ等の道具を使用する方法が挙げられる。また、粉末等の固体の殺芽助剤組成物を固体に設置し水等を噴霧する方法が挙げられる。ここで、固体上とは特に限定はされないが、硬質表面などを指す。
【００２４】
本発明の工程１におけるジピコリン酸又はその塩と芽胞形成菌との接触方法は、簡便性の観点から、好ましくはジピコリン酸又はその塩を含有する液体組成物、より好ましくはジピコリン酸又はその塩の溶液、より好ましくはジピコリン酸又はその塩の水溶液を接触させる方法である。
【００２５】
工程１において、芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩とを溶液中で接触する場合、その溶液の２４℃におけるｐＨは、殺芽効果のさらなる向上の観点から、好ましくは５以下、より好ましくは４以下、より好ましくは３以下、より好ましくは２．５以下、より好ましくは１．８以下である。また、安全性の観点から、その溶液の２４℃におけるｐＨは、好ましくは１以上、より好ましくは１．２以上である。また、前記溶液の２４℃におけるｐＨは、上記の観点を総合すると、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、より好ましくは１〜４、より好ましくは1〜３、より好ましくは１〜２．５、より好ましくは１．２〜１．８である。ｐＨは、卓上型ｐＨメーター型式９６１１（ＨＯＲＩＢＡ製）を用い、２４℃で測定することができる。
【００２６】
ｐＨ調整は、ジピコリン酸又はその塩の溶液を予め調製する場合に行うことができる。あるいは、芽胞形成菌と接触させる際に芽胞形成菌を含む溶液中にジピコリン酸又はその塩を加えた後に行うこともできる。ｐＨ調整剤としては、一般に用いられる酸や塩基、例えば、塩酸や硫酸などの無機酸、乳酸やクエン酸あるいはそれらの塩などの有機酸、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの無機塩基、トリイソプロパノールアミンなどの有機塩基が挙げられる。ｐＨ調整剤としては、汎用性の観点から、酸としては塩酸や硫酸などの無機酸が好ましく、塩基としては水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの無機塩基が好ましい。
【００２７】
芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩を溶液中で接触させる場合、その溶液中のジピコリン酸の含有量は、殺芽効果のさらなる向上の観点から、好ましくは０．０５ｍＭ以上、より好ましくは０．５ｍM以上、より好ましくは３ｍＭ以上、より好ましくは４ｍＭ以上、より好ましくは６ｍＭ以上、より好ましくは８ｍＭ以上であり、そして、ジピコリン酸又はその塩の溶液の安定性及び経済性の観点から、好ましくは３０ｍＭ以下、より好ましくは２５ｍＭ以下、より好ましくは２０ｍＭ以下、より好ましくは１５ｍＭ以下、より好ましくは１２ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ以下である。また、芽胞形成菌とジピコリン酸を溶液中で接触させる場合、その溶液中のジピコリン酸の含有量は、上記の観点を総合すると、好ましくは０．０５〜３０ｍＭ、より好ましくは０．５〜３０ｍＭ、より好ましくは３〜３０ｍＭ、より好ましくは３〜２５ｍＭ、より好ましくは３〜２０ｍＭ、より好ましくは３〜１５ｍＭ、より好ましくは４〜１５ｍＭ、より好ましくは６〜１２、より好ましくは８〜１０ｍMである。ここで、ジピコリン酸の含有量は、ジピコリン酸の塩を用いた場合は、全てジピコリン酸換算の数値とする。
【００２８】
接触にあたって、初期菌数とジピコリン酸の濃度との関係は、特に限定はされない。例えば、殺芽効果のさらなる向上の観点から、初期菌数１０８ＣＦＵ／ｍＬに対するジピコリン酸の濃度は、より好ましくは０．１ｍＭ以上、より好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上、より好ましくは１００ｍＭ以上であり、そして、経済性の観点から、初期菌数１ＣＦＵ／ｍＬに対するジピコリン酸の濃度は、好ましくは１Ｍ以下、より好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは３０ｍＭ以下、より好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下である。
【００２９】
本発明の工程２開始前の工程１における芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩との接触温度は、殺芽効果のさらなる向上の観点及び経済性の観点から、好ましくは１５℃以上、より好ましくは２０℃以上であり、そして、経済性の観点から、好ましくは５０℃未満、より好ましくは４９℃以下、より好ましくは４５℃以下、より好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下である。また、工程１における芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩の溶液との接触温度は、同様の観点から、好ましくは１５℃〜５０℃未満、より好ましくは１５℃〜４９℃、より好ましくは１５℃〜４０℃、より好ましくは１５〜３０℃である。
【００３０】
本発明の工程２開始前の工程１における芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩とをｐＨ６以下で接触する接触時間は、殺芽効果のさらなる向上の観点から、好ましくは３０秒以上、より好ましくは１分以上、より好ましくは３分以上、よりこのましくは５分以上、より好ましくは８分以上、より好ましくは１０分以上、より好ましくは１５分以上、より好ましくは２０分以上、より好ましくは２５分以上であり、そして、経済性の観点から、６０分以下、より好ましくは５０分以下、より好ましくは４０分以下、より好ましくは３５分以下である。また、工程２開始前の工程１におけるジピコリン酸又はその塩の溶液と芽胞形成菌との接触時間は、上記の観点を総合すると、好ましくは３０秒〜６０分、より好ましくは１分〜６０分、より好ましくは３分〜６０分、より好ましくは５分〜６０分、より好ましくは５分〜５０分、より好ましくは５分〜４０分、より好ましくは８分〜４０分、より好ましくは８分〜３５分、より好ましくは１０分〜３５分、より好ましくは１５分〜３５分、より好ましくは２０分〜３５分、より好ましくは２５分〜３５分である。
【００３１】
本発明の工程１における芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩との接触時間の合計は、殺芽効果のさらなる向上の観点から、好ましくは５分以上、より好ましくは１０分以上、より好ましくは１５分以上、より好ましくは２０分以上、より好ましくは３０分以上、より好ましくは４５分以上であり、そして、経済性の観点から、好ましくは９０分以下、より好ましくは８０分以下、より好ましくは７０分以下である。
ここで、工程２が工程１より先に終わる場合、工程２終了から工程１終了までの工程１の時間を接触時間の合計には含めない。
【００３２】
工程１の後に工程２を行うのが基本であるが、工程１を終了させた後、工程２を行ってもよく、後述するように、工程１を終了せずに工程１と工程２を同時に行ってもよい。また、工程１と工程２を同時に開始してもよく、工程２を開始した後で工程１を開始してもよい。
【００３３】
工程１はジピコリン酸又はその塩を取り除くことにより終了することができる。工程１を終了する際のジピコリン酸又はその塩を取り除く方法としては、芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩が液中に存在する場合、遠心分離操作により上清を捨てて、ジピコリン酸又はその塩を除くことが挙げられる。
また、工程１は、ｐＨを６超に調整することにより終了することもできる。工程１を終了する際のｐＨ調整の方法としては、ｐＨ調整剤を用いることができる。ｐＨ調整剤としては、前述のものが挙げられ、汎用性の観点から、無機酸又は無機塩基が好ましく、塩酸若しくは硫酸又は水酸化ナトリウム若しくは水酸化カリウムがより好ましい。
【００３４】
＜工程２＞
本発明の工程２は、芽胞形成菌を殺菌する工程である。ここで、工程２における芽胞形成菌とは、工程１の処理により発芽が促進された状態の芽胞形成菌を指す。なお、以下に述べる条件次第によっては、発芽していない状態の菌も含む。
【００３５】
殺菌する手段は、物理的に殺菌する手段や化学的に殺菌する手段が挙げられる。
前記工程２において、物理的に殺菌する手段及び化学的に殺菌する手段は、単独で用いても、物理的手段のうちの２種以上、化学的手段のうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。さらに物理的手段と化学的手段のうちの２種以上を組合せて用いてもよい。
【００３６】
［物理的な殺菌］
＜工程２A＞
本発明の工程２Aは、芽胞形成菌、例えば、発芽が促進された芽胞形成菌を物理的に殺菌する工程である。
【００３７】
物理的に殺菌する手段は、熱、圧力、電磁波などが挙げられる。電磁波としてはＸ線やγ線等の放射線、紫外線などが挙げられる。物理的に殺菌する手段は、経済性及び簡便性の観点から、好ましくは熱である。
工程２Ａは工程１を行った芽胞形成菌に物理的手段を施すことにより開始することができる。また、工程２Ａは、物理的手段を止めることにより中止することができる。
【００３８】
本発明の工程２Ａは、殺芽効果のさらなる向上の観点及び経済性の観点から、好ましくは芽胞形成菌を熱により殺菌する工程であり、より好ましくは芽胞形成菌を５０℃以上２５０℃以下で殺菌する工程である。
【００３９】
芽胞形成菌を熱により殺菌する際の温度は、殺芽効果のさらなる向上の観点から、好ましくは５０℃以上、より好ましくは５５℃以上、より好ましくは６０℃以上、より好ましくは６５℃以上、より好ましくは７０℃以上、より好ましくは７５℃以上であり、そして、殺芽効果のさらなる向上の観点、経済性及び汎用性の観点から、好ましくは２５０℃以下、より好ましくは２００℃以下、より好ましくは１５０℃以下、より好ましくは１２０℃以下、より好ましくは１００℃以下、より好ましくは９０℃以下、より好ましくは８５℃以下である。
【００４０】
本発明の工程２において熱により殺菌する際の温度は、上記の観点から、好ましくは５０℃〜２５０℃、より好ましくは５０℃〜２００℃、より好ましくは５０℃〜１５０℃、より好ましくは５０℃〜１００℃、より好ましくは５５℃〜１００℃、より好ましくは６０℃〜１００℃、より好ましくは６５℃〜９０℃、より好ましくは７０℃〜９０℃であり、より好ましくは７５℃〜８５℃である。
【００４１】
通常、芽胞形成菌は発芽しないと１００℃以下では殺菌し難い。しかし、本発明においては、工程１により発芽が促進されるので、工程２において１００℃以下でも殺菌効果が得られる。尚、本発明においても１００℃より高い温度で殺菌することも可能であり、場合によって１００℃より高い温度で殺菌することもできる。
【００４２】
本発明の工程２Ａの熱により殺菌する時間は、殺芽効果のさらなる向上の観点から、好ましくは３分以上、より好ましくは５分以上、より好ましくは８分以上、より好ましくは１０分以上、より好ましくは２０分以上、より好ましくは２５分以上であり、そして、経済性及び汎用性の観点から、好ましくは９０分以下、より好ましくは７０分以下、より好ましくは５０分以下、より好ましくは４０分以下、より好ましくは３５分以下である。
【００４３】
本発明の工程２Ａの熱により殺菌する時間は、上記の観点から、好ましくは３分〜９０分、より好ましくは５分〜７０分、より好ましくは８分〜５０分、より好ましくは１０分〜５０分、より好ましくは２０〜４０分、より好ましくは２５〜３５分である。
【００４４】
本発明の工程２Ａの熱により殺菌する方法として、芽胞形成菌に乾熱、湿熱、煮沸、熱水、蒸気熱などを適用する方法が挙げられる。例えば、熱水に芽胞形成菌を浸す方法や、芽胞形成菌の存在する硬質表面などの固体や芽胞形成菌を含む液等を恒温槽に設置する方法、食品加工における加熱調理等の加熱処理による方法などが挙げられる。
【００４５】
工程２Ａの熱により殺菌するｐＨの条件は、特に限定はされず、ｐＨ１〜９のようないずれの条件下でも行うことが可能である。工程１と同じｐＨ６以下の条件であってもよい。
【００４６】
本発明の殺芽方法において、工程２Ａにおいて熱により殺菌した芽胞形成菌を、氷を入れた水、もしくは冷却した容器等で急冷することにより工程２Ａを終了することができる。あるいは、工程２Ａにおいて熱により殺菌した芽胞形成菌を、しばらく時間を置いて自然に熱を冷ますことにより工程２Ａを終了することができる。ここで、殺菌した芽胞形成菌は、液中に存在する状態であり得る。
【００４７】
工程１又は工程２Ａにおいて芽胞形成菌が液中に存在する場合、本発明の殺芽方法は、工程１若しくは工程２Ａ又はそれらの工程の前後において芽胞形成菌を攪拌する工程を有してもよい。工程１及び工程２を繰り返してもよい。
【００４８】
［化学的な殺菌］
＜工程２B＞
本発明の工程２Bは、芽胞形成菌を化学的に殺菌する工程である。
【００４９】
化学的に殺菌する手段は、経済性の観点から、好ましくは殺菌剤を用いることである。
【００５０】
本発明の工程２の殺菌剤により殺菌する方法で用いる殺菌剤としては、液状物として用いられる殺菌剤として、次亜塩素酸又はその塩、亜塩素酸又はその塩、ジクロロイソシアヌル酸又はその塩、トリクロロイソシアヌル酸又はその塩、二酸化塩素などの水溶液である塩素系消毒薬や、ポピドンヨードやヨードホルムなどのヨウ素系消毒薬等のハロゲン化物を含む殺菌剤；エタノール、１−プロパノール、イソプロピルアルコール、メタノール等のアルコール類；ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド等のアルデヒド類；石灰酸、クレゾール、キシレノール、イソプロビルメチルフェノール、トリクロサン等のフェノール類；過酢酸、過酸化水素、オゾン等の過酸化物が挙げられる。また、ガス状で用いられる殺菌剤として、酸化エチレン、ホルムアルデヒド、過酸化水素、オゾン、二酸化塩素等が挙げられる。
【００５１】
本発明では、工程１により芽胞を有する芽胞形成菌の発芽が促されるので、通常より少ない殺菌剤の使用量で、工程１で処理された芽胞形成菌を殺菌することができる。例えば、塩素系消毒薬、好ましくは、次亜塩素酸及びその塩、亜塩素酸及びその塩、ジクロロイソシアヌル酸及びその塩、トリクロロイソシアヌル酸及びその塩、並びに、二酸化塩素から選ばれる塩素系消毒薬、より好ましくは次亜塩素酸ナトリウムにより芽胞を有する芽胞形成菌を殺菌する場合、本発明の工程１を行わないのであれば、通常、有効塩素濃度１０００ｐｐｍ以上が必要である。それに対して、本発明の工程１を行う場合、殺芽に必要な有効塩素濃度は１０００ｐｐｍより少なくてもよい。具体的には、本発明において、有効塩素濃度は、殺芽効果のさらなる向上の観点から、好ましくは１０ｐｐｍ以上、より好ましくは５０ｐｐｍ以上、より好ましくは８０ｐｐｍ以上であり、経済性の観点から、１０００ｐｐｍ以下、より好ましくは８００ｐｐｍ以下、より好ましくは５００ｐｐｍ以下、より好ましくは３００ｐｐｍ以下、より好ましくは１５０ｐｐｍ以下である。また、次亜塩素酸ナトリウム等の塩素系消毒薬を始めとする化学的な殺菌手段で芽胞形成菌を殺菌する温度は、殺芽効果のさらなる向上の観点から、好ましくは５℃以上、より好ましくは１０℃以上、より好ましくは１５℃以上、より好ましくは２０℃以上、より好ましくは２３℃以上であり、そして、経済性の観点から、好ましくは５０℃以下、より好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下、より好ましくは２５℃以下である。
【００５２】
尚、本発明においても、通常の殺菌剤の使用量で殺菌を行うことができる。例えば、有効塩素濃度１０００ｐｐｍ以上の塩素系消毒薬、好ましくは、次亜塩素酸及びその塩、亜塩素酸及びその塩、ジクロロイソシアヌル酸及びその塩、トリクロロイソシアヌル酸及びその塩、並びに二酸化塩素から選ばれる塩素系消毒薬、より好ましくは次亜塩素酸ナトリウムにより殺菌することができる。
【００５３】
工程２は工程１を終了してから行うことができる（態様１）。
工程２が芽胞形成菌を物理的に殺菌する工程２Ａである場合、工程１と工程２Ａを同時に行う期間を有してもよい（態様２）。態様２は以下の様に分けられる。
態様２−１  工程１を先に開始する
態様２−２  工程１と工程２Ａを同時に開始する
態様２−３  工程２Ａを先に開始する
態様２の中、殺芽効果のさらなる向上の観点から、態様２−１が好ましい。
また、態様２の工程２Ａは熱により殺菌する工程であることが好ましい。
【００５４】
［態様１：工程１終了後工程２を行う態様］
本発明において、工程１の終了後に工程２を行うことができる。ここで、工程１の終了は、芽胞形成菌の発芽が促進されたことをもって終了することができる。工程２は、工程２Ａ（物理的な殺菌）であっても、工程２Ｂ（化学的な殺菌）であっても、いずれの場合でも、この態様１の工程１及び工程２の好ましい条件は前述の通りである。工程１はｐＨを６超にするか、ジピコリン酸を除去することにより終了することができる。その態様は前述の通りである。
ここで、「工程１の終了後に工程２を行う」とは、工程１の終了と共に工程２を行う、という意味であり、好ましくは、遅くとも工程１を終えて、１時間以内、より好ましくは３０分以内、さらに好ましくは１５分以内、さらに好ましくは５分以内、さらに好ましくは１分以内に工程２に移行することを言う。
【００５５】
［態様２：工程１と工程２Ａを同時に行う期間を有する態様］
本発明において、工程１と工程２Ａを同時に行う期間を有することができる。
工程１と工程２Ａを同時に行う期間における工程１と工程２Ａとが重複する時間及び温度の条件は、前記工程２Ａが熱による殺菌をする工程である場合、前記工程２Ａの条件と同様である。また、工程２Ａが熱以外の物理的な殺菌をする工程である場合、工程１と工程２Ａを同時に行うときの温度の条件は、前記工程１の条件と同様である。
工程１と工程２Ａを同時に行う期間における、時間及び温度以外の条件、例えば、ジピコリン酸の含有量及びｐＨの条件は、前記工程１の条件と同様である。
上記以外の工程１のみを行う際の好ましい条件は、前述の通りである。
【００５６】
[態様２−１：工程１を先に開始する態様] 
本発明の工程１と工程２を同時に行う期間を有する殺芽方法は、工程１を先に開始することができる。すなわち、工程１の途中から物理的手段を施して工程２Ａの殺菌を始めることができる。例えば、工程２Ａが芽胞形成菌を熱により殺菌する工程の場合、工程１でジピコリン酸又はその塩と芽胞形成菌とを接触させる工程が、溶液中で行われる場合には、そのまま工程２Ａに供し、溶液の温度を工程２Ａの温度帯へと移行させることができる。
【００５７】
各工程の終了については、工程１を先に終了する、工程１と工程２Ａを同時に終了する、工程２Ａを先に終了する、のいずれでもよい。尚、工程１及び工程２Ａの終了方法は前述した通りである。また、工程２Ａが工程１より先に終わる場合、工程２Ａ終了から工程１終了までの工程１の時間は、本明細書における「接触時間の合計」には含めない。
【００５８】
態様２−１において、工程２Ａを始める前の工程１でのジピコリン酸又はその塩と芽胞形成菌との接触時間は、殺芽効果のさらなる向上の観点から、好ましくは３０秒以上、より好ましくは１分以上、より好ましくは３分以上、より好ましくは５分以上、より好ましくは８分以上、より好ましくは１０分以上、より好ましくは１５分以上、より好ましくは２０分以上、より好ましくは２５分以上であり、そして、経済性の観点から、好ましくは６０分以下、より好ましくは５０分以下、よりこのましくは４０分以下、より好ましくは３５分以下、より好ましくは３０分以下、より好ましくは２５分以下、より好ましくは２０分以下、より好ましくは１５分以下、より好ましくは１０分以下である。また、この接触時間は、殺芽効果のさらなる向上の観点から、好ましくは３０秒〜６０分、より好ましくは１分〜６０分、より好ましくは３分〜６０分、より好ましくは５分〜６０分、より好ましくは５分〜５０分、より好ましくは５分〜４０分、より好ましくは８分〜４０分、より好ましくは１０分〜４０分、より好ましくは１５分〜４０分、より好ましくは２０分〜４０分、より好ましくは２５分〜４０分である。また、この接触時間は、殺芽効果のさらなる向上の観点及び経済性の観点から、好ましくは２５分〜３５分である。
【００５９】
態様２−１において、工程１での芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩との接触時間の合計は、殺芽効果のさらなる向上の観点から、好ましくは３０分以上、より好ましくは３５分以上、より好ましくは４０分以上、より好ましくは４５分以上、より好ましくは５０分以上、より好ましくは５５分以上、より好ましくは６０分以上であり、そして、経済性の観点から、好ましくは９０分以下、より好ましくは８０分以下、より好ましくは７０分以下、より好ましくは６５分以下である。
ここで、工程２Ａが工程１より先に終わる場合、工程２Ａ終了から工程１終了までの工程１の時間を接触時間の合計には含めない。
【００６０】
工程１又は工程２Ａを単独で行う期間の温度、ｐＨ等その他の各条件は、工程１終了後に工程２を行う態様におけるそれぞれの条件と同じである。
【００６１】
[態様２−２：工程１及び工程２Ａを同時に開始]
本発明の工程１と工程２Ａを同時に行う期間を有する殺芽方法は、工程１と工程２Ａを同時に開始することができる。すなわち、芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩とのｐＨ６以下における接触を、物理的手段を施すのと同時に開始することができる。物理的手段として熱を用いる場合、工程１及び工程２Ａを同時に行う場合の温度は、前記工程２Ａの熱により殺菌する工程の温度と同様である。すなわち、最初から、工程２Ａの熱により殺菌する工程の温度域で、ｐＨ６以下の条件下で、ジピコリン酸又はその塩と芽胞形成菌を接触させる。
【００６２】
各工程の終了については、工程１を先に終了する、工程１と工程２Ａを同時に終了する、工程２Ａを先に終了する、のいずれでもよい。尚、工程１及び工程２Ａの終了方法は前述した通りである。また、工程２Ａが工程１より先に終わる場合、工程２Ａ終了から工程１終了までの工程１の時間は、本明細書における「接触時間の合計」には含めない。
【００６３】
工程１又は工程２Ａを単独で行う期間の温度、ｐＨ等その他の各条件は、工程１終了後に工程２を行う態様におけるそれぞれの条件と同じである。
【００６４】
[態様２−３：工程２Ａを先に開始]
本発明の工程１と工程２Ａを同時に行う期間を有する殺芽方法は、工程２Ａを先に開始することができる。すなわち、先に工程２Ａの物理的手段を芽胞形成菌に施し、物理的手段を施している間に、芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩との接触を開始する。物理的手段として熱を用いる場合、予め芽胞形成菌の温度を工程２Ａの温度帯にしておいて、その温度を保ったまま、ジピコリン酸又はその塩をｐＨ６以下にて芽胞形成菌に接触させる。
【００６５】
各工程の終了については、工程１を先に終了する、工程１と工程２Ａを同時に終了する、工程２Ａを先に終了する、のいずれでもよい。尚、工程１及び工程２Ａの終了方法は前述した通りである。また、工程２Ａが工程１より先に終わる場合、工程２Ａ終了から工程１終了までの工程１の時間は、本明細書における「接触時間の合計」には含めない。
【００６６】
工程１又は工程２Ａを単独で行う期間の温度、ｐＨ等その他の各条件は、工程１終了後に工程２を行う態様におけるそれぞれの条件と同じである。
【００６７】
＜殺芽助剤組成物＞
本発明の殺芽助剤組成物は、ジピコリン酸又はその塩を含む組成物である。本発明の殺芽助剤組成物は、発芽を目的として行う処理に使用する。また、常温（２０℃〜３８℃前後）で用いて殺芽することを目的とする殺菌剤組成物とは区別される。特に、本発明の工程１の後、あるいは工程１と同時に、物理的または化学的手段により殺菌することで殺芽効果又は殺菌効果を発揮し得る組成物を指す。本発明において、殺芽助剤組成物は、工程１で使用され得る。
【００６８】
殺芽助剤組成物としては、液体組成物又は固体組成物が挙げられる。
【００６９】
液体の殺芽助剤組成物は、ジピコリン酸又はその塩及び溶媒を含む。
【００７０】
殺芽助剤組成物が液体の場合に、含まれる溶媒としては、水、又は親水性溶媒が挙げられる。親水性溶媒としてはエタノール、メタノール、イソプロパノール等のアルコール類、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類、メチルカルビトール、エチルカルビトール等のカルビトール類などが挙げられる。溶媒は、殺芽効果のさらなる向上の観点及び経済性の観点から、好ましくは水又は水と親水性溶媒の混合物であり、より好ましくは水である。
【００７１】
液体の殺芽助剤組成物としては、簡便性の観点から、好ましくはジピコリン酸又はその塩の溶液、より好ましくはジピコリン酸又はその塩の水溶液である。
【００７２】
液体の殺芽助剤組成物は、さらに、ｐＨ調整剤を含有することができる。液体の殺芽助剤組成物が含有するｐＨ調整剤としては、一般に用いられる酸や塩基、例えば、塩酸や硫酸などの無機酸、乳酸やクエン酸あるいはそれらの塩などの有機酸、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの無機塩基、トリイソプロパノールアミンなどの有機塩基が挙げられる。ｐＨ調整剤としては、汎用性の観点から、酸としては塩酸や硫酸などの無機酸が好ましく、塩基としては水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの無機塩基が好ましい。
【００７３】
液体の殺芽助剤組成物、好ましくはジピコリン酸又はその塩の溶液、より好ましくはジピコリン酸又はその塩の水溶液の２４℃におけるｐＨは、安全性の観点から、好ましくは１以上、より好ましくは１．２以上であり、そして、芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩の溶液とを接触させる場合の殺芽効果のさらなる向上の観点から、６以下であり、好ましくは５以下、より好ましくは４以下、より好ましくは３以下、より好ましくは２．５以下、より好ましくは１．８以下である。また、ジピコリン酸又はその塩の溶液の２４℃におけるｐＨは、上記の観点を総合すると、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、より好ましくは１〜４、より好ましくは1〜３、より好ましくは１〜２．５、より好ましくは１．２〜１．８である。
【００７４】
液体の殺芽助剤組成物中、好ましくはジピコリン酸又はその塩の溶液中、より好ましくはジピコリン酸又はその塩の水溶液中のジピコリン酸の含有量は、殺芽効果のさらなる向上の観点から、好ましくは０．０５ｍＭ以上、より好ましくは０．５ｍM以上、より好ましくは３ｍＭ以上、より好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは８ｍＭ以上であり、そして、ジピコリン酸又はその塩の溶液の安定性及び経済性の観点から、好ましくは３０ｍＭ以下、より好ましくは２５ｍＭ以下、より好ましくは２０ｍＭ以下、より好ましくは１５ｍＭ以下、より好ましくは１２ｍＭ以下である。また、ジピコリン酸又はその塩の溶液中のジピコリン酸の含有量は、上記の観点を総合すると、好ましくは０．０５〜３０ｍＭ、より好ましくは０．５〜３０ｍＭ、より好ましくは３〜３０ｍＭ、より好ましくは３〜２５ｍＭ、より好ましくは３〜２０ｍＭ、より好ましくは３〜１５ｍＭ、より好ましくは５〜１５ｍＭ、より好ましくは８〜１２ｍMである。
【００７５】
本発明の殺芽助剤組成物は、ジピコリン酸又はその塩およびｐＨ調整剤、水あるいは他の溶媒を含み、過酢酸、スルホペルオキシカルボン酸、またはジカルボン酸ジエステルのいずれも含まない組成物であり得る。ここで含まないとは、殺芽助剤組成物が殺芽効果を有しないことを示し、好ましくは１０００ｐｐｍ以下、より好ましくは１００ｐｐｍ以下、より好ましくは１０ｐｐｍ以下、より好ましくは１ｐｐｍ以下、より好ましくは実質的に０ｐｐｍである。ここで実質的とは検出限界以下である。
【００７６】
本発明の液体の殺芽助剤組成物は好ましくはジピコリン酸又はその塩の溶液、より好ましくはジピコリン酸又はその塩の水溶液である。その場合の殺芽助剤組成物は粉末状のジピコリン酸又はその塩を水あるいはその他の溶媒と混合することにより、好ましくは溶解することにより調製することができる。
【００７７】
固体の殺芽助剤組成物としては、ジピコリン酸又はその塩自身又はジピコリン酸又はその塩及び固形化剤を含む組成物が挙げられる。
【００７８】
固体の殺芽助剤組成物が含有する固形化剤としては、これに限定されるものではないが、数平均分子量が１，０００〜１００，０００のポリエチレングリコール；カルナウバロウ、キャンデリラロウ、ホホバ油、ミツロウ、ラノリンなどのロウ類；パラフィン、ワセリン、セレシン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭素数１５以上の炭化水素；ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸などの炭素数１２〜２２の高級脂肪酸；セチルアルコール、ステアリルアルコールなどの炭素数１４〜２２の高級アルコールが挙げられる。
【００７９】
固体の殺芽助剤組成物は、さらに、ｐＨ調整剤を含有することができる。固体の殺芽助剤組成物が含有するｐＨ調整剤としては、一般に用いられる酸や塩基、例えば、塩酸や硫酸などの無機酸、乳酸やクエン酸あるいはそれらの塩などの有機酸、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの無機塩基、トリイソプロパノールアミンなどの有機塩基が挙げられる。ｐＨ調整剤としては、汎用性の観点から、酸としては塩酸や硫酸などの無機酸が好ましく、塩基としては水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの無機塩基が好ましい。
【００８０】
固体の殺芽助剤組成物中のジピコリン酸の含有量は、殺芽効果のさらなる向上の観点から、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、より好ましくは５質量％以上、より好ましくは１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上、より好ましくは３０質量％以上、より好ましくは４０質量％以上、より好ましくは５０質量％以上であり、そして、経済性の観点から、好ましくは１００質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、より好ましくは８０質量％以下、よりこのましくは７０質量％以下、より好ましくは６０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下である。
【００８１】
固体の殺芽助剤組成物中の固形化剤の含有量は、簡便性の観点から、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上、より好ましくは３０質量％以上、より好ましくは４０質量％以上、より好ましくは５０質量％以上であり、そして、殺芽効果のさらなる向上の観点から、経済性の観点から、好ましくは９９．９質量％以下、より好ましくは９９質量％以下、より好ましくは９５質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、より好ましくは８０質量％以下、よりこのましくは７０質量％以下、より好ましくは６０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下である。
【００８２】
本発明の殺芽助剤組成物は、本発明の殺芽方法の工程１で使用する際に、芽胞形成菌と殺芽助剤組成物を含む溶液の２４℃におけるｐＨが、安全性の観点から、好ましくは１以上、より好ましくは１．２以上であり、そして、殺芽効果のさらなる向上の観点から、好ましくは５以下、より好ましくは４以下、より好ましくは３以下、より好ましくは２．５以下、より好ましくは１．８以下となるように使用することが好ましい。また、本発明の殺芽助剤組成物は、本発明の殺芽方法の工程１で使用する際に、芽胞形成菌と殺芽助剤組成物を含む溶液の２４℃におけるｐＨが、上記の観点を総合すると、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、より好ましくは１〜４、より好ましくは1〜３、より好ましくは１〜２．５、より好ましくは１．２〜１．８であるように使用することが好ましい。
【００８３】
本発明の殺芽助剤組成物は、本発明の殺芽方法の工程１で使用する際に、芽胞形成菌と殺芽助剤組成物を含む溶液中のジピコリン酸の含有量が、殺芽効果のさらなる向上の観点から、好ましくは０．０５ｍＭ以上、より好ましくは０．５ｍM以上、より好ましくは３ｍＭ以上、より好ましくは４ｍＭ以上、より好ましくは６ｍＭ以上、より好ましくは８ｍＭ以上であり、そして、ジピコリン酸又はその塩の溶液の安定性及び経済性の観点から、好ましくは３０ｍＭ以下、より好ましくは２５ｍＭ以下、より好ましくは２０ｍＭ以下、より好ましくは１５ｍＭ以下、より好ましくは１２ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ以下であるように使用することが好ましい。また、本発明の殺芽助剤組成物は、本発明の殺芽方法の工程１で使用する際に、芽胞形成菌と殺芽助剤組成物を含む溶液中のジピコリン酸の含有量が、上記の観点を総合すると、好ましくは０．０５〜３０ｍＭ、より好ましくは０．５〜３０ｍＭ、より好ましくは３〜３０ｍＭ、より好ましくは３〜２５ｍＭ、より好ましくは３〜２０ｍＭ、より好ましくは３〜１５ｍＭ、より好ましくは４〜１５ｍＭ、より好ましくは６〜１２、より好ましくは８〜１０ｍMであるように使用することが好ましい。
【００８４】
本発明のジピコリン酸又はその塩は、合成によるもの、または微生物から抽出する方法を用いる発酵法によるものの、いずれでも使用できる。
【００８５】
上述した実施の形態に関し、本発明は以下の殺芽方法及び殺芽助剤組成物を開示する。
【００８６】
＜項１＞
下記の工程１終了後下記の工程２を行う殺芽方法：
工程１：芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩とをｐＨ６以下の条件下で接触させる工程；及び
工程２：芽胞形成菌を殺菌する工程。
【００８７】
＜項２＞
前記工程２が、下記の工程２Aである、＜項１＞記載の殺芽方法。
工程２A：芽胞形成菌を物理的に殺菌する工程。
【００８８】
＜項３＞
前記工程２Aが、芽胞形成菌を熱、圧力又は電磁波により殺菌する工程である、＜項２＞記載の殺芽方法。
【００８９】
＜項４＞
前記工程２Ａにおいて芽胞形成菌を５０℃以上２５０℃以下で殺菌する、＜項２＞又は＜項３＞記載の殺芽方法。
【００９０】
＜項５＞
前記工程２Ａにおいて芽胞形成菌を、好ましくは５０℃以上、より好ましくは５５℃以上、より好ましくは６０℃以上、より好ましくは６５℃以上、より好ましくは７０℃以上、より好ましくは７５℃以上で、そして、好ましくは２５０℃以下、より好ましくは２００℃以下、より好ましくは１５０℃以下、より好ましくは１２０℃以下、より好ましくは１００℃以下、より好ましくは９０℃以下、より好ましくは８５℃以下で殺菌する、また、好ましくは５０℃〜２５０℃、より好ましくは５０℃〜２００℃、より好ましくは５０℃〜１５０℃、より好ましくは５０℃〜１００℃、より好ましくは５５℃〜１００℃、より好ましくは６０℃〜１００℃、より好ましくは６５℃〜９０℃、より好ましくは７０℃〜９０℃であり、より好ましくは７５℃〜８５℃で殺菌する、＜項２＞〜＜項４＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【００９１】
＜項６＞
前記工程２Ａにおいて芽胞形成菌を殺菌する時間が、好ましくは３分以上、より好ましくは５分以上、より好ましくは８分以上、より好ましくは１０分以上、より好ましくは２０分以上、より好ましくは２５分以上であり、そして、好ましくは９０分以下、より好ましくは７０分以下、より好ましくは５０分以下、より好ましくは４０分以下、より好ましくは３５分以下である、＜項２＞〜＜項５＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【００９２】
＜項７＞
前記工程２が、下記の工程２Ｂである、＜項１＞〜＜項６＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
工程２Ｂ：芽胞形成菌を化学的に殺菌する工程。
【００９３】
＜項８＞
前記工程２Ｂが、芽胞形成菌を殺菌剤により殺菌する工程である、＜項７＞記載の殺芽方法。
【００９４】
＜項９＞
殺菌剤が液状物として用いられる、＜項８＞記載の殺芽方法。
【００９５】
＜項１０＞
殺菌剤が、ハロゲン化物、アルコール類、アルデヒド類、フェノール類及び過酸化物から選ばれる１種以上である、また、次亜塩素酸又はその塩、亜塩素酸及びその塩、ジクロロイソシアヌル酸及びその塩、トリクロロイソシアヌル酸及びその塩、二酸化塩素、ポピドンヨード、ヨードホルム、エタノール、１−プロパノール、イソプロピルアルコール、メタノール、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、石灰酸、クレゾール、キシレノール、イソプロビルメチルフェノール、トリクロサン、過酢酸、過酸化水素、並びに、オゾンから選ばれる１種以上である、＜項８＞〜＜項９＞いずれか１項記載の殺芽方法。
【００９６】
＜項１１＞
殺菌剤が、次亜塩素酸及びその塩、亜塩素酸及びその塩、ジクロロイソシアヌル酸及びその塩、トリクロロイソシアヌル酸及びその塩、並びに、二酸化塩素から選ばれる１種以上の水溶液である、＜項８＞〜＜項１０＞いずれか１項記載の殺芽方法。
【００９７】
＜項１２＞
殺菌剤の有効塩素濃度が、好ましくは１０ｐｐｍ以上、より好ましくは５０ｐｐｍ以上、より好ましくは８０ｐｐｍ以上であり、そして、１０００ｐｐｍ以下、より好ましくは８００ｐｐｍ以下、より好ましくは５００ｐｐｍ以下、より好ましくは３００ｐｐｍ以下、より好ましくは１５０ｐｐｍ以下である、＜項８＞〜＜項１１＞いずれか１項記載の殺芽方法。
【００９８】
＜項１３＞
殺菌剤が、ガス状であり、酸化エチレン、ホルムアルデヒド、過酸化水素、オゾン及び二酸化塩素から選ばれる１種以上である＜項８＞〜＜項１２＞いずれか１項記載の殺芽方法。
【００９９】
＜項１４＞
前記工程１の接触時の２４℃におけるｐＨが、好ましくは１以上、より好ましくは１．２以上であり、そして、好ましくは５以下、より好ましくは４以下、より好ましくは３以下、より好ましくは２．５以下、より好ましくは１．８以下である、また、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、より好ましくは１〜４、より好ましくは1〜３、より好ましくは１〜２．５、より好ましくは１．２〜１．８である、＜項１＞〜＜項１３＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１００】
＜項１５＞
前記工程１において、芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩とを液中で接触させる、＜項１＞〜＜項１４＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１０１】
＜項１６＞
液中のジピコリン酸の含有量が０．０５ｍＭ以上３０ｍＭ以下である、＜項１＞〜＜項１５＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１０２】
＜項１７＞
液中のジピコリン酸の含有量が、好ましくは０．０５ｍＭ以上、より好ましくは０．５ｍM以上、より好ましくは３ｍＭ以上、より好ましくは４ｍＭ以上、より好ましくは６ｍＭ以上、より好ましくは８ｍＭ以上であり、そして、好ましくは３０ｍＭ以下、より好ましくは２５ｍＭ以下、より好ましくは２０ｍＭ以下、より好ましくは１５ｍＭ以下、より好ましくは１２ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ以下である、また、好ましくは０．０５〜３０ｍＭ、より好ましくは０．５〜３０ｍＭ、より好ましくは３〜３０ｍＭ、より好ましくは３〜２５ｍＭ、より好ましくは３〜２０ｍＭ、より好ましくは３〜１５ｍＭ、より好ましくは４〜１５ｍＭ、より好ましくは６〜１２、より好ましくは８〜１０ｍMである、＜項１＞〜＜項１６＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１０３】
＜項１８＞
前記工程１を１５℃以上５０℃未満で行う、＜項１＞〜＜項１７＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１０４】
＜項１９＞
前記工程１を、好ましくは１５℃以上、より好ましくは２０℃以上であり、そして、好ましくは５０℃未満、より好ましくは４９℃以下、より好ましくは４５℃以下、より好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下で行う、また、好ましくは１５℃〜５０℃未満、より好ましくは１５℃〜４９℃、より好ましくは１５℃〜４０℃、より好ましくは１５〜３０℃で行う、＜項１＞〜＜項１８＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１０５】
＜項２０＞
前記工程１を５分以上６０分以下行う、＜項１＞〜＜項１９＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１０６】
＜項２１＞
前記工程１を、好ましくは３０秒以上、より好ましくは１分以上、より好ましくは３分以上、より好ましくは５分以上、より好ましくは８分以上、より好ましくは１０分以上、より好ましくは１５分以上、より好ましくは２０分以上、より好ましくは２５分以上、そして、６０分以下、より好ましくは５０分以下、より好ましくは４０分以下、より好ましくは３５分以下行う、また、好ましくは３０秒〜６０分、より好ましくは１分〜６０分、より好ましくは３分〜６０分、より好ましくは５分〜６０分、より好ましくは５分〜５０分、より好ましくは５分〜４０分、より好ましくは８分〜４０分、より好ましくは８分〜３５分、より好ましくは１０分〜３５分、より好ましくは１５分〜３５分、より好ましくは２０分〜３５分、より好ましくは２５分〜３５分行う、＜項１＞〜＜項２０＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１０７】
＜項２２＞
下記の工程１と下記の工程２Ａを同時に行う期間を有する殺芽方法：
工程１：芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩とをｐＨ６以下の条件下で接触させる工程；及び
工程２Ａ：芽胞形成菌を物理的に殺菌する工程。
【０１０８】
＜項２３＞
前記工程２Aが、芽胞形成菌を熱、圧力又は電磁波により殺菌する工程である、＜項２２＞記載の殺芽方法。
【０１０９】
＜項２４＞
前記工程２Ａにおいて芽胞形成菌を５０℃以上２５０℃以下で殺菌する、＜項２２＞又は＜項２３＞記載の殺芽方法。
【０１１０】
＜項２５＞
前記工程２Ａにおいて芽胞形成菌を、好ましくは５０℃以上、より好ましくは５５℃以上、より好ましくは６０℃以上、より好ましくは６５℃以上、より好ましくは７０℃以上、より好ましくは７５℃以上で、そして、好ましくは２５０℃以下、より好ましくは２００℃以下、より好ましくは１５０℃以下、より好ましくは１２０℃以下、より好ましくは１００℃以下、より好ましくは９０℃以下、より好ましくは８５℃以下で殺菌する、また、好ましくは５０℃〜２５０℃、より好ましくは５０℃〜２００℃、より好ましくは５０℃〜１５０℃、より好ましくは５０℃〜１００℃、より好ましくは５５℃〜１００℃、より好ましくは６０℃〜１００℃、より好ましくは６５℃〜９０℃、より好ましくは７０℃〜９０℃であり、より好ましくは７５℃〜８５℃で殺菌する、＜項２２＞〜＜項２４＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１１１】
＜項２６＞
前記工程２Ａにおいて芽胞形成菌を５０℃以上２５０℃以下で殺菌する時間が、３分以上９０分以下である、＜項２２＞〜＜項２５＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１１２】
＜項２７＞
前記工程２Ａにおいて芽胞形成菌を殺菌する時間が、好ましくは３分以上、より好ましくは５分以上、より好ましくは８分以上、より好ましくは１０分以上、より好ましくは２０分以上、より好ましくは２５分以上であり、そして、好ましくは９０分以下、より好ましくは７０分以下、より好ましくは５０分以下、より好ましくは４０分以下、より好ましくは３５分以下である、＜項２２＞〜＜項２６＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１１３】
＜項２８＞
前記工程１において、芽胞形成菌とジピコリン酸又はその塩とを液中で接触させる、＜項２２＞〜＜項２７＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１１４】
＜項２９＞
前記工程１の接触時の２４℃におけるｐＨが、好ましくは１以上、より好ましくは１．２以上であり、そして、好ましくは５以下、より好ましくは４以下、より好ましくは３以下、より好ましくは２．５以下、より好ましくは１．８以下である、また、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、より好ましくは１〜４、より好ましくは1〜３、より好ましくは１〜２．５、より好ましくは１．２〜１．８である、＜項２２＞〜＜項２８＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１１５】
＜項３０＞
液中のジピコリン酸の濃度が０．０５ｍＭ以上３０ｍＭ以下である、＜項２２＞〜＜項２９＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１１６】
＜項３１＞
液中のジピコリン酸の含有量が、好ましくは０．０５ｍＭ以上、より好ましくは０．５ｍM以上、より好ましくは３ｍＭ以上、より好ましくは４ｍＭ以上、より好ましくは６ｍＭ以上、より好ましくは８ｍＭ以上であり、そして、好ましくは３０ｍＭ以下、より好ましくは２５ｍＭ以下、より好ましくは２０ｍＭ以下、より好ましくは１５ｍＭ以下、より好ましくは１２ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ以下である、また、好ましくは０．０５〜３０ｍＭ、より好ましくは０．５〜３０ｍＭ、より好ましくは３〜３０ｍＭ、より好ましくは３〜２５ｍＭ、より好ましくは３〜２０ｍＭ、より好ましくは３〜１５ｍＭ、より好ましくは４〜１５ｍＭ、より好ましくは６〜１２、より好ましくは８〜１０ｍMである、＜項２２＞〜＜項３０＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１１７】
＜項３２＞
前記工程２Ａ開始前に、前記工程１を１５℃以上５０℃未満で行う期間を有する、＜項２２＞〜＜項３１＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１１８】
＜項３３＞
前記工程２Ａ開始前に、前記工程１を、好ましくは１５℃以上、より好ましくは２０℃以上であり、そして、好ましくは５０℃未満、より好ましくは４９℃以下、より好ましくは４５℃以下、より好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下で行う、また、好ましくは１５℃〜５０℃未満、より好ましくは１５℃〜４９℃、より好ましくは１５℃〜４０℃、より好ましくは１５〜３０℃で行う、＜項２２＞〜＜項３２＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１１９】
＜項３４＞
前記工程２Ａ開始前に、前記工程１を、３０秒以上６０分以下行う、＜項２２＞〜＜項３３＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１２０】
＜項３５＞
前記工程２Ａ開始前に、前記工程１を、好ましくは３０秒以上、より好ましくは１分以上、より好ましくは３分以上、よりこのましくは５分以上、より好ましくは８分以上、より好ましくは１０分以上、より好ましくは１５分以上、より好ましくは２０分以上、より好ましくは２５分以上、そして、好ましくは６０分以下、より好ましくは５０分以下、より好ましくは４０分以下、より好ましくは３５分以下行う、また、好ましくは３０秒〜６０分、より好ましくは１分〜６０分、より好ましくは３分〜６０分、より好ましくは５分〜６０分、より好ましくは５分〜５０分、より好ましくは５分〜４０分、より好ましくは８分〜４０分、より好ましくは１０分〜４０分、より好ましくは１５分〜４０分、より好ましくは２０分〜４０分、より好ましくは２５分〜４０分、より好ましくは２５分〜３５分行う、＜項２２＞〜＜項３４＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１２１】
＜項３６＞
前記工程１を合計で３０分以上９０分以下行う、＜項２２＞〜＜項３５＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１２２】
＜項３７＞
前記工程１を合計で、好ましくは３０分以上、より好ましくは４０分以上、より好ましくは４５分以上、より好ましくは５０分以上、より好ましくは５５分以上、より好ましくは６０分以上、そして、好ましくは９０分以下、より好ましくは８０分以下、より好ましくは７０分以下、より好ましくは６５分以下行う、＜項２２＞〜＜項３６＞のいずれか１項記載の殺芽方法。
【０１２３】
＜項３８＞
ジピコリン酸又はその塩を含有し、ｐＨ６以下である、殺芽助剤組成物。
【０１２４】
＜項３９＞
２４℃におけるｐＨが、好ましくは１以上、より好ましくは１．２以上であり、そして、
好ましくは５以下、より好ましくは４以下、より好ましくは３以下、より好ましくは２．
５以下、より好ましくは１．８以下である、＜項３８＞記載の殺芽助剤組成物。
【０１２５】
＜項４０＞
ジピコリン酸を０．０５ｍＭ以上３０ｍＭ以下含有する液体組成物である、＜項３８＞又は＜項３９＞記載の殺芽助剤組成物。
【０１２６】
＜項４１＞
ジピコリン酸の含有量が、好ましくは０．０５ｍＭ以上、より好ましくは０．５ｍM以上、より好ましくは３ｍＭ以上、より好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは８ｍＭ以上であり、そして、好ましくは３０ｍＭ以下、より好ましくは２５ｍＭ以下、より好ましくは２０ｍＭ以下、より好ましくは１５ｍＭ以下、より好ましくは１２ｍＭ以下である、また、好ましくは０．０５〜３０ｍＭ、より好ましくは０．５〜３０ｍＭ、より好ましくは３〜３０ｍＭ、より好ましくは３〜２５ｍＭ、より好ましくは３〜２０ｍＭ、より好ましくは３〜１５ｍＭ、より好ましくは５〜１５ｍＭ、より好ましくは８〜１２ｍMである、＜項３８＞〜＜項４０＞のいずれか１項記載の殺芽助剤組成物。
【０１２７】
＜項４２＞
ジピコリン酸又はその塩及び溶媒を含有する液体組成物、又は、ジピコリン酸又はその塩、ｐＨ調整剤、及び溶媒からなる液体組成物である、＜項３８＞〜＜項４１＞の何れか１項記載の殺芽助剤組成
物。
【０１２８】
＜項４３＞
溶媒が、好ましくは水又は水と親水性溶媒の混合物であり、より好ましくは水である、＜項３８＞〜＜項４２＞のいずれか１項記載の殺芽助剤組成物。
【０１２９】
＜項４４＞
ｐＨ調整剤が、好ましくは塩酸や硫酸などの無機酸、乳酸やクエン酸あるいはそれらの塩などの有機酸、好ましくは水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの無機塩基、並びに、トリイソプロパノールアミンなどの有機塩基から選ばれる、＜項３８＞〜＜項４３＞のいずれか１項記載の殺芽助剤組成物。
【０１３０】
＜項４５＞
ジピコリン酸又はその塩、ｐＨ調整剤及び水あるいは他の溶媒を含み、過酢酸、スルホペルオキシカルボン酸及びジカルボン酸ジエステルの含有量が、好ましくは１０００ｐｐｍ以下、より好ましくは１００ｐｐｍ以下、より好ましくは１０ｐｐｍ以下、より好ましくは１ｐｐｍ以下、より好ましくは実質的に０ｐｐｍである、＜項３８＞〜＜項４４＞のいずれか１項記載の殺芽助剤組成物。
【０１３１】
＜項４６＞
ジピコリン酸又はその塩を含有し、ｐＨ６以下である、殺芽助剤組成物の殺芽助剤としての使用。
【実施例】
【０１３２】
試験１：実施例１−１〜１−４、比較例１−１：
殺芽試験
表１に記載されたｐＨに調整した１０ｍＭジピコリン酸水溶液（以下、ＤＰＡ溶液とも
いう）とB. cereus NBRC 13494株を供試菌株として用いて、次の手順により試験を行い、殺芽効果を評価した。評価結果を表１に示す。なお、芽胞形成菌は、以下の全ての試験において、顕微鏡観察により、９５％以上が芽胞を形成していることを確認した後に実験に用いた。
尚、下記工程１−１、工程１−２及び工程２Ａ−１において、芽胞形成菌はジピコリン酸（以下、ＤＰＡともいう）とｐＨ６以下の条件で接触しており、工程１に含まれる。また、工程２Ａは工程２に含まれる。本試験は、第００５３段落の態様２−１に相当する。
【０１３３】
ジピコリン酸水溶液：  ジピコリン酸は試薬（和光純薬工業株式会社製、製造コード１６５−０５３４２）を、水はイオン交換水を、ｐＨ調整剤は塩酸又は水酸化ナトリウムを用いた。ジピコリン酸水溶液の調製は２４℃にて行った。卓上型ｐＨメーター型式９６１１（ＨＯＲＩＢＡ製）にてジピコリン酸水溶液のｐＨを測定しながら、ｐＨ調整剤をジピコリン酸水溶液に滴下して、ジピコリン酸水溶液のｐＨを調整した。実施例において、特に断らない限り、ｐＨは、２４℃におけるｐＨである。
【０１３４】
―手順―
（１）工程１−１：芽胞を有する芽胞形成菌（Ｂ. ｃｅｒｅｕｓ ＮＢＲＣ １３４９４株）の含有量が１０８ ＣＦＵ／ｍＬである水分散液（以下、芽胞液という）１００ μＬを、表に記載したｐＨの１０ ｍＭ ＤＰＡ溶液９００ μＬと、各々混合し、試験液とした。
（２）工程１−２：上記（１）の試験液を２４℃で３０分間静置した。
（３）工程２A：上記（２）の後、試験液を８０℃で３０分間加熱処理した。
加熱工程には、Ｍａｊｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社のアルミブロック恒温槽ＭＤ−０１Ｎ−１１０を用いた。
（４）（３）で熱処理した試験液を滅菌水で段階希釈し、それぞれの希釈液をＬＢ寒天培地（ＢＤ社製）に１００μＬ塗抹し、３０℃、１６時間培養した。
（５）（４）の培養後、生えてきたコロニー数にて、生存菌数Ｘ（ＣＦＵ／ｍＬ）を求めた。
（６）下記の式により得た殺芽効果指数により殺芽効果を評価した。
ここで、殺芽効果指数が大きいほど、殺芽効果が高いことを示す。
【０１３５】
（殺芽効果指数）＝Ｌｏｇ１０〔（コントロールの生存菌数）／（生存菌数Ｘ）〕
【０１３６】
ここで、コントロールの生存菌数（ＣＦＵ／ｍＬ）は、ＤＰＡ溶液の代わりに、それぞれのｐＨに調整した滅菌水を用いて、上記（１）〜（６）を行い、求めた生存菌数である。また、表には生存菌数Ｘ及びコントロールの生存菌数についても１０を底とする対数で記載した。尚、実施例１−１の生存菌数Ｘは検出限界以下であったので、便宜上、生存菌数Ｘを１として計算した。
【０１３７】
表１に示す通り、実施例１−１〜１−４は比較例１−１との対比から、本発明の殺芽方法は優れた殺芽効果及び殺菌効果を有する。
【０１３８】
【表１】
2015199723.tif 000002
【０１３９】
試験２：実施例２−１〜２−３：
１０ｍＭジピコリン酸水溶液の代わりに、表２に記載された濃度のDPA溶液を用いた以外は、実施例１−２と同様の条件にて試験を行い、殺芽効果を評価した。評価結果を表２に示す。
【０１４０】
【表２】
2015199723.tif 000003
【０１４１】
試験３：実施例３−１：
工程１−２の静置時間を表３に記載された時間に代えたこと以外は実施例１−２と同様の試験を行い、殺芽効果を評価した。評価結果を表３に示す。ここで、工程１−２の静置時間が０とは、工程１及び２を同時に開始したことを示す。
【０１４２】
【表３】
2015199723.tif 000004
【０１４３】
試験４：実施例４−１〜４−３：
工程２Ａの加熱処理の温度を表４に記載された加熱温度とした以外は実施例１−２と同様の試験を行い、殺芽効果を評価した。評価結果を表４に示す。
【０１４４】
【表４】
2015199723.tif 000005
【０１４５】
尚、実施例４−３ではコントロールでも殺芽効果が比較的高かったので、殺菌効果指数の値が小さかった。
【０１４６】
試験５：実施例５−１〜５−２：
工程２Ａの加熱処理の時間を表５に記載された加熱時間とした以外は実施例１−２と同様の試験を行い、殺芽効果を評価した。評価結果を表５に示す。
【０１４７】
【表５】
2015199723.tif 000006
【０１４８】
試験６：比較例６−１〜６−４：
表６に記載した水溶液を用いて、試験１と同様の試験を行い、殺芽効果を評価した。具体的には、ＤＰＡに代えて表６に記載した濃度の各薬剤を用いて試験を行い、殺芽効果を評価した。評価結果を表６に示す。尚、水はイオン交換水を、ｐＨ調整剤は塩酸又は水酸化ナトリウムを用いた。また、表６記載の薬剤は下記の通りである。
【０１４９】
・ＤＰＡ−Ｃａ：ジピコリン酸Ｃａ塩、ＤＰＡ（和光純薬工業株式会社製、製造コード１６５−０５３４２）及び塩化カルシウム（和光純薬株式会社製、製造コード０３９−００４７５）を用いて調製した。
・Ｌ−アラニン：和光純薬工業株式会社製、製造コード０１０−０１０４２
・イノシン：和光純薬工業株式会社製、製造コード０９５−００２３３
【０１５０】
【表６】
2015199723.tif 000007
【０１５１】
表６に示す通り、実施例１−２及び１−４は、比較例６−１〜６−４と比べ、優れた殺芽効果を示す。すなわち、ｐＨ６以下のＤＰＡ溶液を用いる本発明の殺芽方法は、通常のＤＰＡ−Ｃａを通常のｐＨで用いる場合や、Ｌ−アラニン若しくはＬ−アラニン及びイノシンを併用して用いる場合と比べて、優れた殺芽効果を有する。
【０１５２】
試験７：実施例７−１、７−２：
殺芽試験
ｐHを２．２に調整した１０ｍＭジピコリン酸水溶液（以下、ＤＰＡ溶液ともいう）とB. cereus NBRC 13494株を供試菌株として用いて、次の手順により殺芽試験を行い、殺芽効果を評価した。評価結果を表７に示す。
【０１５３】
尚、下記工程１−１及び工程１−２において、芽胞形成菌はジピコリン酸（以下、ＤＰＡともいう）とｐＨ６以下の条件で接触しており、工程１に含まれる。また、工程２Ｂは工程２に含まれる。本試験は、第００５３段落の態様１に相当する。
【０１５４】
―手順―
（１）工程１−１：芽胞を有する芽胞形成菌（Ｂ. ｃｅｒｅｕｓ ＮＢＲＣ １３４９４株）の含有量が１０８ＣＦＵ／ｍＬである水分散液（以下、芽胞液という）１００μＬを、ｐＨが２．２の１０ｍＭＤＰＡ溶液９００μＬと、各々混合し、試験液とした。
（２）工程１−２：上記（１）の試験液を２４℃で表７に記載した時間静置した。
（３）工程１−３：工程１−２の試験液を遠心分離器（株式会社クボタ製テーブルトップマイクロ冷却遠心機３５００）で１２ｋｒｐｍ１０分間の条件で遠心分離操作を行い、上清を取り除いた。
（４）工程２B：工程１−３の後、上清を取り除いて、ただちに、表７に記載した濃度の次亜塩素酸ナトリウム水溶液を１ｍＬ加え、２４℃で１０分間静置した。
（５）工程２Bの試験液０．５ｍLに対し、０．１％チオ硫酸ナトリウム入りＬP溶液４．５ｍLを加えることにより、工程２Bの試験液を１０倍に希釈し、それを１０分間静置して次亜塩素酸ナトリウムの殺菌作用を止めた。
（６）（５）の試験液を滅菌水で段階希釈し、それぞれの希釈液をＬＢ寒天培地（ＢＤ社製）に１００μＬ塗抹し、３０℃、１６時間培養した。
（７）（６）の培養後、生えてきたコロニー数にて、生存菌数Ｘ（ＣＦＵ／ｍＬ）を求めた。
（８）下記の式により得た殺芽効果指数により殺芽効果を評価した。
ここで、殺芽効果指数が大きいほど、殺芽効果が高いことを示す。
【０１５５】
（殺芽効果指数）＝Ｌｏｇ１０〔（コントロールの生存菌数）／（生存菌数Ｘ）〕
【０１５６】
ここで、コントロールの生存菌数（ＣＦＵ／ｍＬ）は、ＤＰＡ溶液の代わりに、ｐＨを２．２に調整した滅菌水を用いて、上記（１）〜（８）を行い、求めた生存菌数である。また、表には生存菌数Ｘ及びコントロールの生存菌数についても１０を底とする対数で記載した。
【０１５７】
尚、試験７で用いた薬剤は下記の通りである。
・次亜塩素酸ナトリウム：南海化学株式会社製
・０．１％チオ硫酸ナトリウム入りＬP溶液：和光純薬工業株式会社製のLP希釈液「ダイゴ」と和光純薬工業株式会社製のチオ硫酸ナトリウムを用いて、LP希釈液「ダイゴ」のマニュアルに従って調製した。
【０１５８】
【表７】
2015199723.tif 000008
【０１５９】
通常、殺芽には１０００ｐｐｍ程度の有効塩素濃度が必要であるが、表７に示す通り、より低い濃度の次亜塩素酸ナトリウムを用いた場合でも、殺芽効果指数が高く、よって、工程１を行うことで、低濃度の次亜塩素酸ナトリウムでも殺芽効果及び殺菌効果が優れることが示された。
【０１６０】
＜発芽の確認＞  
本明細書において、「発芽」は、例えば、芽胞の暗色化を確認することによって、確認することが可能である。確認のための方法としては、工程１及び工程２の後、暗色化した芽胞の有無を確認することが挙げられる。すなわち、位相差顕微鏡で暗色化の有無を確認する。ここで、発芽していない場合、白色に見える芽胞は、発芽すると暗色化しており、暗色化したものは発芽していることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
本発明の殺芽方法は、例えば、リネン洗浄、食品腐敗防止、環境浄化などの幅広い用途に使用することができる。