(57)【要約】【課題】標本に対する光毒性の影響を低減しつつ、タイムラプス撮影の成功率を高める。【解決手段】顕微鏡システム１００は、対物レンズと試料３との間の距離を変えながら試料３を撮影して複数の画像を取得し、各画像を取得したときの対物レンズの光軸方向におけるＺ位置を示す位置データとを関連付けて記憶する。顕微鏡システム１００は、複数の画像のそれぞれにおいて試料３に対する合焦状態を示す合焦値を決定し、合焦値に基づき複数の画像から１つの画像を決定し、当該画像に関連付けられている位置データに基づき、試料３について再度撮影をする際の対物レンズの基準位置を決定する。そして、顕微鏡システム１００は、基準位置を含む所定の移動範囲内で対物レンズを移動させることで対物レンズと試料３との間の距離を変えさせながら顕微鏡１に試料３を再度撮影させる。【選択図】図１
2015082096.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡を制御する制御装置であって、
前記顕微鏡において対物レンズと試料との間の距離を変えながら当該試料を撮影して取得された複数の画像と、各画像を取得したときの前記対物レンズの光軸方向における位置を示す位置データとを関連付けて記憶する記憶手段と、
前記複数の画像のそれぞれにおいて前記試料に対する合焦状態を示す合焦値を決定する合焦値決定手段と、
前記合焦値に基づき前記複数の画像から１つの画像を決定し、当該画像に関連付けられている位置データに基づき、前記試料について再度撮影をする際の前記対物レンズの基準位置を決定する決定手段と、
前記基準位置を含む所定の移動範囲内で前記対物レンズを移動させることで前記対物レンズと前記試料との間の距離を変えさせながら前記顕微鏡に前記試料を撮影させる撮影制御手段と
を有することを特徴とする制御装置。
【請求項２】
前記撮影制御手段は、タイムラプス撮影を実行するために一定時間ごとに到来する各撮影タイミングで前記顕微鏡にＺスタックを実行させ、
前記決定手段は、前記一定の時間間隔で並んだ複数の撮影タイミングのうちｎ番目の撮影タイミングで前記Ｚスタックを実行するときはｎ−１番目の撮影タイミングで取得されたＺスタック画像を構成する複数の画像のうちで前記試料に対して最もピントが合っている画像に関連付けられている位置データが示す位置を基準位置として決定することを特徴とする請求項１に記載の制御装置。
【請求項３】
前記移動範囲の上限位置と下限位置とを指定する範囲指定手段をさらに有することを特徴とする請求項１または２に記載の制御装置。
【請求項４】
前記範囲指定手段は、前記基準位置が前記移動範囲の中央となるように当該移動範囲の上限位置と下限位置とを指定することを特徴とする請求項３に記載の制御装置。
【請求項５】
前記範囲指定手段は、前記基準位置に対して非対称となるように前記上限位置と前記下限位置とを指定することを特徴とする請求項３に記載の制御装置。
【請求項６】
前記範囲指定手段は、予め設定された最大範囲を超えないように前記上限位置と前記下限位置を指定することを特徴とする請求項３ないし５のいずれか１項に記載の制御装置。
【請求項７】
各撮影タイミングで実行されるＺスタックによって取得される画像の数であるＺスタック数を指定するＺスタック数指定手段と、
前記移動範囲と前記Ｚスタック数とに基づいて前記対物レンズの移動ピッチを決定する移動ピッチ決定手段と
をさらに有し、
前記撮影制御手段は、１回の撮影タイミング中において、前記移動ピッチずつ前記対物レンズを移動させるたびに１回の撮影を前記顕微鏡に実行させることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の制御装置。
【請求項８】
１番目の撮影タイミングで使用される基準位置と前記移動範囲は操作者によって指定されることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の制御装置。
【請求項９】
前記顕微鏡は、蛍光試薬を添加された前記試料に対して励起光を照射し、前記試料から発する蛍光を撮影する蛍光顕微鏡であることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の制御装置。
【請求項１０】
顕微鏡と、当該顕微鏡を制御する制御装置とを有する顕微鏡システムであって、
前記顕微鏡は、
試料が載置される載置手段と、
対物レンズと、
前記対物レンズを移動させて前記対物レンズと前記試料との間の距離を変更する移動手段と、
前記試料からの光を結像する結像レンズと、
前記試料からの光が結像される撮影手段と
を有し、
前記制御装置は、
顕微鏡において対物レンズと試料との間の距離を変えながら当該試料を撮影して取得された複数の画像と、各画像を取得したときの前記対物レンズの光軸方向における位置を示す位置データとを関連付けて記憶する記憶手段と、
前記複数の画像のそれぞれにおいて前記試料に対する合焦状態を示す合焦値を決定する合焦値決定手段と、
前記合焦値に基づき前記複数の画像から１つの画像を決定し、当該画像に関連付けられている位置データに基づき、前記試料について再度撮影をする際の前記対物レンズの基準位置を決定する決定手段と、
前記基準位置を含む所定の移動範囲内で前記対物レンズを移動させることで前記対物レンズと前記試料との間の距離を変えさせながら前記顕微鏡に前記試料を撮影させる撮影制御手段と
を有することを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項１１】
顕微鏡を制御するコンピュータを、
顕微鏡において対物レンズと試料との間の距離を変えながら当該試料を撮影して取得された複数の画像と、各画像を取得したときの前記対物レンズの光軸方向における位置を示す位置データとを関連付けて記憶する記憶手段と、
前記複数の画像のそれぞれにおいて前記試料に対する合焦状態を示す合焦値を決定する合焦値決定手段と、
前記合焦値に基づき前記複数の画像から１つの画像を決定し、当該画像に関連付けられている位置データに基づき、前記試料について再度撮影をする際の前記対物レンズの基準位置を決定する決定手段と、
前記基準位置を含む所定の移動範囲内で前記対物レンズを移動させることで前記対物レンズと前記試料との間の距離を変えさせながら前記顕微鏡に前記試料を撮影させる撮影制御手段として機能させるプログラム。
【請求項１２】
顕微鏡を制御する制御方法であって、
前記顕微鏡において対物レンズと試料との間の距離を変えながら当該試料を撮影して取得された複数の画像と、各画像を取得したときの前記対物レンズの光軸方向における位置を示す位置データとを関連付けて記憶手段に記憶する記憶工程と、
前記複数の画像のそれぞれにおいて前記試料に対する合焦状態を示す合焦値を決定する合焦値決定工程と、
前記合焦値に基づき前記複数の画像から１つの画像を決定し、当該画像に関連付けられている位置データに基づき、前記試料について再度撮影をする際の前記対物レンズの基準位置を決定する決定工程と、
前記基準位置を含む所定の移動範囲内で前記対物レンズを移動させることで前記対物レンズと前記試料との間の距離を変えさせながら前記顕微鏡に前記試料を撮影させる撮影制御工程と
を有することを特徴とする制御方法。
【請求項１３】
顕微鏡を制御する制御装置であって、
顕微鏡において対物レンズと試料との間の距離を変えながら撮影された複数の画像と、各画像を撮影したときの前記対物レンズと前記試料との間の距離を示す距離データとを関連付けて記憶する記憶手段と、
前記複数の画像のそれぞれにおいて前記試料にピントが合っているかどうかを判定する合焦判定手段と、
前記試料について再度撮影をする際に、前記試料に対して最もピントが合っている画像に関連付けられている距離データが示す距離を基準距離として前記顕微鏡に設定する設定手段と、
前記基準距離を含む所定範囲内で前記対物レンズと前記試料との間の距離を変えさせながら前記顕微鏡に前記試料を撮影させる撮影制御手段と
を有することを特徴とする制御装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タイムラプス撮影を実行している際のフォーカス追尾に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞が分裂・成長する様子などを捉えるために、ある撮影間隔を置いて撮影することをタイムラプス撮影と言う（特許文献１、２）。撮影時には電動制御の顕微鏡システムと、細胞の温度や湿度、ＣＯ２濃度（酸性・アルカリ性を示すＰＨを一定に保つため）などを制御するチャンバーが用いられることがある。タイムラプス撮影の撮影間隔は数分から数時間であり、予定された複数枚を撮影するのによう必要となるトータルの撮影期間は数時間から数日に及ぶこともある。このように、トータルの撮影期間は長くなるため、光毒性や経時的な合焦位置（ピント位置）の変化が問題となる。
【０００３】
（ｉ）光毒性
細胞を撮影する際には光を細胞に照射する必要があるが、特に蛍光観察を行う場合には強力な励起光を細胞に照射する必要がある。タイムラプス撮影では何度も光を細胞に照射することになるため、細胞にダメージが及ぶことがある。このように、光による標本への悪影響を総じて光毒性と呼ぶ。光毒性は細胞に有毒であると言われる紫外線が用いられるケースでは更に悪影響が大きくなるため注意が必要となる。そのため、一般的なタイムラプス撮影顕微鏡では観察対象である細胞に極力ダメージを与えないようにするために撮影中のみ励起光を照射し、ある撮影タイミングから次の撮影タイミングまでの時間である待ち時間中は励起光を照射しないように制御されてもよい。特許文献３ではオートフォーカス中に励起光とは異なる光源を使ってオートフォーカスを行い、撮影時にのみ励起光を照射する技術が開示されている。
【０００４】
（ｉｉ）経時的なピント位置の変化
タイムラプス撮影中には、温度変化によってステージなど構造部材が膨張・収縮する現象（温度ドリフト）が発生し、ピント位置が変化する。ドリフト量は数μｍ〜数十μｍ程度であるが、高倍率には問題が顕在化しやすい。高倍率の対物レンズの中にはピントが合う範囲、すなわち被写界深度はたとえば１μｍ程度のものもあるからである。その他にも細胞そのものがＸＹＺ方向に移動することによってピント位置が変化することもある。
【０００５】
従来技術としては、撮影前にオートフォーカスによる合焦動作を行う技術が開示されている（特許文献４、５）。特許文献４では、オートフォーカス時には、撮影に使用する光学系と同一の光学系を用いて画像のコントラストから合焦位置を求めるパッシブ型と、赤外線レーザーなどを照射して標本が置かれているガラス表面位置を測定し、表面とサンプルとのオフセット量を一定とするアクティブ型に言及している。特許文献５では、アクティブ型で大まかな位置を求めてパッシブ型で詳細位置を求める技術を提案している。しかし、パッシブ型では合焦動作を撮影前に一度行う必要があり、光毒性の問題が発生する。一方、アクティブ型では撮影系と合焦系とで２つの光学系が必要となるため、顕微鏡のコストが増加する。さらに、アクティブ型では、ガラス表面と標本が置かれている面との距離に変動があった場合にピントずれが発生してしまう。
【０００６】
ところで、顕微鏡の撮影技法としてＺスタックと呼ばれる技術が存在する。これは標本とレンズとの間における光軸方向（Ｚ軸方向）の距離を変化させながら標本を撮影して複数枚の画像（Ｚスタック画像）を取得する技術である。１枚の画像では標本の平面的な構造しか判別できないが、Ｚスタック画像からは標本の立体的な構造を判別できる。Ｚスタック画像から疑似的に３次元画像も作成できる。さらに、標本に対して部分的に合焦位置の異なるＺスタック画像から合焦とされるＺ位置の画素を抜き出して合成した全合焦合成画像を作ることもできる。特許文献６では、所定距離ずつステージを移動しながら撮影を繰り返すＺスタックを用いることで、手動での合焦動作を実行しない技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−２７７７５４号公報
【特許文献２】特開２００６−１７８０４４号公報
【特許文献３】特開２０１２−１５９８５４号公報
【特許文献４】特開２０１０−１５２４０７号公報
【特許文献５】特開２００１−０９１８２１号公報
【特許文献６】特開２００３−２１７９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献６はタイムラプス撮影を考慮していない。タイムラプス撮影においても、光軸方向における標本の予想移動範囲を全てカバーするようにＺスタックすることでピント位置のあった画像を取得できると考えられる。しかし、タイムラプス撮影の実行中にどれだけ合焦位置が変化するかを事前に正しく予想することは困難である。さらに、ステージの移動範囲が広大となり撮影枚数も増加してしまうと、光毒性の影響が大きくなりやすい。
【０００９】
そこで、本発明は、標本に対する光毒性の影響を低減しつつ、タイムラプス撮影の成功率を高めることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、たとえば、顕微鏡を制御する制御装置であって、
前記顕微鏡において対物レンズと試料との間の距離を変えながら当該試料を撮影して取得された複数の画像と、各画像を取得したときの前記対物レンズの光軸方向における位置を示す位置データとを関連付けて記憶する記憶手段と、
前記複数の画像のそれぞれにおいて前記試料に対する合焦状態を示す合焦値を決定する合焦値決定手段と、
前記合焦値に基づき前記複数の画像から１つの画像を決定し、当該画像に関連付けられている位置データに基づき、前記試料について再度撮影をする際の前記対物レンズの基準位置を決定する決定手段と、
前記基準位置を含む所定の移動範囲内で前記対物レンズを移動させることで前記対物レンズと前記試料との間の距離を変えさせながら前記顕微鏡に前記試料を撮影させる撮影制御手段と
を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、標本に対する光毒性の影響を低減しつつ、タイムラプス撮影の成功率を高めることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は顕微鏡システムの中核をなす顕微鏡の斜視図である。
【図２】図２は顕微鏡システムを構成する主要部を示すブロック図である。
【図３】図３はＺスタック画像の一例を示す図である。
【図４】図４は制御プログラムを実行することにより実現される機能を示すブロック図である。
【図５】図５はタイムラプス撮影においてＺスタックを実行する処理を示すフローチャートである。
【図６】図６はＳ５０６を詳細に示したフローチャートである。
【図７】図７はＺスタック画像の概要を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に本発明の一実施形態を示す。以下で説明される個別の実施形態は、本発明の上位概念、中位概念および下位概念など種々の概念を理解するために役立つであろう。また、本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲によって確定されるのであって、以下の個別の実施形態によって限定されるわけではない。
【００１４】
図１（Ａ）および図１（Ｂ）は顕微鏡システムの中核をなす顕微鏡１の斜視図である。図１（Ａ）が示すように顕微鏡１は、筐体自体を暗室として利用するため、ユーザーが暗室を用意する必要がない。ユーザー（操作者）は、上面カバー１９０を開けると、透過照明光学系５の下方に配置されたＸＹステージ６にアクセス可能となる。ＸＹステージ６は試料が載置される載置手段の一例である。上面カバー１９０を閉じることで、暗室が形成される。ユーザーは前面カバー１９１を開けることでフィルタターレット１４に搭載されたフィルタキューブ（カラーフィルタなど）を交換できる。
【００１５】
図２は、顕微鏡システム１００を構成する主要部を示すブロック図である。顕微鏡１は図２に示す制御装置２によって制御される。制御装置２は、たとえば、制御プログラムをインストールされた情報処理装置（パーソナルコンピュータ：ＰＣ）である。つまりＰＣが顕微鏡１の制御装置２として機能する。このように顕微鏡システム１００は、顕微鏡１と制御装置２とを有している。
【００１６】
顕微鏡１は、試料３のモノクロ画像、カラー画像および蛍光画像を取得することができる顕微鏡であるが、このうち１つの画像のみを取得する顕微鏡であってもよい。ＸＹステージ６には試料３を保持するための容器ユニット７が固定される。試料３は標本、サンプル、検体またはワークと呼ばれることもある。容器ユニット７は、プレパラート、ディッシュまたはウェル等の容器とこの容器を支持するホルダーとを有している。透過照明光源４が出力された照明光はコンデンサレンズなどを含む透過照明光学系５を介して試料３に照射される。透過照明光学系５には遮光用のメカシャッターが設けられていてもよい。透過照明光源４からの照明光は、試料３のモノクロ画像やカラー画像を取得する際に使用される。試料３について蛍光観察を実行する際は、蛍光落射照明光源８から励起光が出力される。励起光は、蛍光落射照明光学系９および励起フィルタ１０を通過する。蛍光落射照明光学系９には遮光用のメカシャッターが設けられていてもよい。励起フィルタ１０は、蛍光落射照明光源８から出力された光のうち励起光となる波長成分のみを透過させる波長選択性フィルタである。励起光はさらにダイクロックミラー１１で反射され、対物レンズユニット１２の対物レンズを通過して試料３に照射される。ダイクロックミラー１１も波長選択性のミラーであり、励起光を反射するが、試料３に添加された蛍光試薬（蛍光染料や蛍光色素とも呼ばれる）が発光する蛍光については透過する。対物レンズユニット１２は、モータ１３によって回転する電動レボルバと、電動レボルバに搭載された複数の対物レンズとを有している。フィルタターレット１４は、４つの開口を有し、そのうち３つの開口には励起フィルタ１０、ダイクロイックミラー１１、吸収フィルタ１６を有するそれぞれ異なるフィルタキューブが取り付けられているが、残りの１つの開口は何も取り付けられていない。フィルタの取り付けられていない開口は、明視野画像を取得する際に使用される。フィルタターレット１４は、モータ１５によって回転する。吸収フィルタ１６は、試料３からの光のうち必要な波長成分のみを透過させる波長選択性フィルタである。結像光学系１７は、試料３を撮影装置１８の撮影面に結像させる結像レンズを含む。カラーフィルタ２４は、たとえば、液晶チューナブルフィルタであり、透過波長を切り替えることにより順にＲ、Ｇ、Ｂの画像を取得、これらを画像処理部１９で合成することでカラー画像を作成する。なお、カラーフィルタとしては上述した液晶チューナブルフィルタに限られず、異なる透過波長のフィルタを機械的に切り替えるカラーフィルタターレットを配置してもよい。画像処理部１９は、撮影装置１８から出力される画像信号を増幅してＡ／Ｄ変換し、さらにシェーディング補正を行ったりするなど、様々な画像処理を行う。制御部２０は、制御装置２からの指示にしたがって顕微鏡１の各部を制御する。たとえば、制御部２０は、モータ群２１を制御してＸＹステージ６をＸ軸方向またはＹ軸方向へ移動させたり、モータ２２を制御してＺステージと呼ばれることもある対物レンズユニット１２をＺ軸方向に移動させたりする。対物レンズユニット１２をＺ軸方向に移動させることで合焦位置が変化し、オートフォーカスが実行される。ＸＹステージ６およびＺステージは手動調整機構を有していてもよい。ここで、Ｚ軸方向は対物レンズの光軸方向であり、Ｘ軸方向およびＹ軸方向はＺ軸方向に直交した方向である。通信部２３は、制御装置２からの指示を受信したり、制御部２０からの情報や画像データを制御装置２へ送信したりするユニットである。制御部２０は、たとえば、マイクロプロセッサやＣＰＵ、ＬＳＩ、ＦＰＧＡ、ＡＳＩＣなどで構成される。つまり、制御部２０はソフトウエアとその実行手段で実現されてもよいし、ハードウエアのみで実現されてもよいし、前者と後者との混在によって実現されてもよい。
【００１７】
制御装置２においてＣＰＵ３０は、記憶装置３１に記憶された制御プログラムを実行して顕微鏡１を制御したり、通信インタフェース３２を通じて受信した画像データを表示部３４に表示させたりする。通信部２３および通信インタフェース３２は、ＵＳＢやＩＥＥＥ１３９４、ＬＡＮなどの一般的な通信プロトコルで接続されていてもよいし、専用の通信プロトコルで接続されていてもよい。記憶装置３１は、ＲＯＭ、ＲＡＭなどのメモリやハードディスク記憶装置などを含んでいる。操作部３３は、キーボードやポインティングデバイスなどの入力装置である。表示部３４は、顕微鏡１を制御するための制御パラメータを設定するユーザーインタフェース（ＵＩ）や観察結果（静止画または動画）を表示するＵＩを提供する。
【００１８】
顕微鏡システム１００はＺスタック画像の撮影やタイムラプス撮影を実行できる。Ｚスタック画像とは、Ｚステージを少しずつ移動させることで合焦位置をずらしながら各合焦位置において取得された試料３の複数の画像（レイヤー画像／スライス画像）をいう。微生物などの試料３は観察中にＸ軸方向やＹ軸方向だけでなくＺ軸方向にも移動する。よって、Ｚ軸方向に少量ずつ合焦位置をずらして複数の画像を取得することで、試料３に合焦した画像を取得しやすくなる。なお、１回のＺスタックによって取得される画像の枚数をＺスタック数またはＺスタック枚数と呼ぶことにする。つまり、Ｚスタック数Ｎｚは、Ｚスタック画像を構成している画像の枚数を示している。タイムラプス撮影とは、一定時間ごとに１枚または複数枚の画像を取得する撮影方法をいう。微生物などの試料３は観察中に成長したり変化したりする。そのため、その経過を知る上でタイムラプス撮影は有効である。本実施形態は、基本的に、Ｚスタックとタイムラプス撮影とを組み合わせて実行する。つまり、顕微鏡１は、一定時間ごとに到来する各撮影タイミングでＺスタックを実行する。なお、タイムラプス撮影の開始から終了までの全工程において取得された画像の枚数をトータル撮影枚数Ｎｔと呼ぶことにする。
【００１９】
［Ｚスタック画像］
操作部３３を通じてＺスタック画像の取得（つまりＺスタックの実行）が指示されると、ＣＰＵ３０は、Ｚスタックの実行を顕微鏡１の制御部２０に指示する。この際に、ＣＰＵ３０は、操作部３３を通じてユーザーにより設定された制御パラメータ（たとえば、露光時間、Ｚスタック数Ｎｚ、トータル撮影枚数Ｎｔ、撮影開始時刻、光源の種類、フィルタ、対物レンズの倍率、Ｚステージの移動範囲Ｗなど）も制御部２０に送信される。制御部２０は、制御パラメータにしたがって露光時間などを撮影装置１８に設定するとともに、Ｚステージ（対物レンズユニット１２）を撮影開始位置に移動させるためにモータ１３を制御する。制御部２０は、撮影開始時刻になると光源を点灯させて撮影を開始する。制御部２０は、移動範囲ＷをＺスタック数Ｎｚ撮影枚数で除算して一回の移動距離である移動ピッチＰを求め、それに応じてモータ１３を駆動してＺステージを移動させる。つまり、１枚の画像を取得するたびに移動ピッチＰだけＺステージが移動する。撮影枚数がＺスタック数Ｎｚに一致するまでＺステージの移動と撮影とが繰り返し実行される。これにより、指定された枚数（Ｚスタック数Ｎｚ）の画像が取得される。制御部２０は、各画像を撮影したときの制御パラメータ（撮影時刻、対物レンズ、ＺステージのＺ位置）を含むメタデータを作成して各画像に添付する。ＺステージのＺ位置は、実質的に、対物レンズと試料３との間の距離を示しており、Ｚ位置を示す位置データは距離を示す距離データに相当する。制御部２０は、画像を取得するたびに通信部２３を通じて当該画像を制御装置２に送信してもよいし、または、Ｚスタック数Ｎｚ分の複数の画像の取得が完了するたびにこれらの画像を一括して制御装置２に送信してもよい。なお、制御部２０は、メタデータとしてＺ位置を示す位置データ（距離データ）を各画像に付与してもよいが、制御パラメータに基づいてＣＰＵ３０がこのようなメタデータを作成してもよい。顕微鏡１に設定した制御パラメータには移動範囲および移動ピッチの情報が含まれているため、ＣＰＵ３０は移動範囲を移動ピッチで除算することによって各画像のＺ位置を求めることができる。ＣＰＵ３０は、通信インタフェース３２を通じて受信した複数のレイヤー画像を記憶装置３１に記憶する。このように、記憶装置３１は、顕微鏡１において対物レンズと試料３との間の距離を変えながら当該試料を撮影して取得された複数の画像と、各画像を取得したときの対物レンズの光軸方向における位置を示す位置データとを関連付けて記憶する記憶手段として機能する。この複数のレイヤー画像がＺスタック画像である。ＣＰＵ３０は、操作部３３からの指示に応じてＺスタック画像から３次元画像を構築して表示部３４に表示してもよい。
【００２０】
図３はＺスタック画像の一例を示す図である。このＺスタック画像は、６枚のレイヤー画像から構成されている。各レイヤー画像のメタデータにはＺステージのＺ位置が書き込まれている。
【００２１】
［合焦位置の制御］
本実施形態では、Ｚスタックを伴うタイムラプス撮影において、過去の撮影タイミングにおいて取得されたＺスタック画像から合焦位置が判定され、合焦位置を基準位置として次回の撮影が実行される。基準位置は、ＺスタックにおけるＺステージの移動範囲Ｗを決定するための基準となる位置である。たとえば、基準位置が移動範囲Ｗにおいて中央の位置となるように移動範囲Ｗの上限位置と下限位置とが決定される。移動範囲Ｗは一回のＺスタックにおけるＺステージの移動距離である。この移動距離を２Ｌと仮定すると、基準位置から＋ＬとなるＺ位置がＺスタックの開始位置（または終了位置）となり、基準位置から−ＬとなるＺ位置がＺスタックの終了位置（または開始位置）となる。もちろんこれは一例にすぎず、試料３の移動方向が予測可能であれば、移動方向をカバーするようにＺステージの移動範囲を決定すればよい。たとえば、試料３が基準位置から＋方向に移動（成長）することがわかっていれば、基準位置を開始位置に決定してもよい。なお、制御部２０およびＣＰＵ３０は、基準位置にＺステージを移動した後に合焦動作（オートフォーカス）を実行して合焦位置を探索し、見つかった合焦位置が中央となるように移動範囲をシフトしてもよい。
【００２２】
このように、過去または直前に取得されたＺスタック画像を用いて合焦位置を追跡することで、別途の合焦動作が不要となるか、または合焦動作に必要となる時間を短縮できる。その結果、試料３に光が照射される時間も短縮されるため、光毒性を低減できる。
【００２３】
なお、Ｚスタックではタイムラプス撮影の開始から終了までの全期間においてＺステージの移動しうる全範囲（最大範囲Ｗｍａｘ）を各撮影タイミングにおけるＺステージの移動範囲Ｗに設定することも考えられる。しかし、これは、１回の撮影タイミングにおけるＺスタック数が増加し、光の照射時間も長時間となってしまう。一方で、本実施形態では、１回の撮影タイミングにおける撮影開始から撮影終了までの間におけるＺステージの移動しうる範囲のみを実際の移動範囲Ｗに設定すればよい。そのため、移動範囲Ｗは、試料３の厚みであるたとえば数μｍの範囲内に十分収まるだろう。よって、Ｚスタック以外のための余分な撮影（フォーカス追尾のための撮影）は基本的に不要である。その結果、光毒性の低減と撮影時間の短縮を図ることができる。
【００２４】
図４は、ＣＰＵ３０が記憶装置３１に記憶されている制御プログラムを実行することにより制御装置２によって実現される機能を示すブロック図である。撮影制御部４０１は顕微鏡１に対して制御信号を送信して制御し、顕微鏡１から送信される画像信号を受信して画像データを作成して画像保存部４０７に記憶する。顕微鏡１ですでに画像データが作成されていれば、ＣＰＵ３０はメタデータを作成してこの画像データに付与し、画像保存部４０７に記憶することになる。撮影制御部４０１は、タイムラプス撮影を実行するために顕微鏡に一定時間ごとに撮影を実行させる。また、Ｚスタックを実行する際には、撮影制御部４０１が顕微鏡１を制御することで、基準位置を含む所定の移動範囲内（基準距離を含む所定範囲内）で対物レンズと試料３との間の距離を変えさせながら顕微鏡１に試料３を撮影させる。この場合、画像保存部４０７は、顕微鏡１において対物レンズと試料３との間の距離を変えながら試料３を撮影して取得された複数の画像と、各画像を取得したときの対物レンズの光軸方向におけるＺ位置を示す位置データ（距離データ）とを関連付けて記憶する。なお、画像とＺ位置との関連付けを示すデータについてはデータベース化されてデータ保存部４０３に記憶されてもよい。このように、対物レンズと試料３との間の距離はＺステージのＺ軸方向における位置（Ｚ位置）によって表現可能である。
【００２５】
合焦判定部４０４は、複数の画像のそれぞれにおいて試料３にピントが合っているかどうかを判定する。これによって試料３に対して最もピントが合っている１つの画像が特定される。たとえば、合焦判定部４０４は、複数の画像のそれぞれにおいて試料３に対する合焦状態を示す合焦値を決定する合焦値決定手段として機能してもよい。
【００２６】
設定部４０２は、合焦値に基づき複数の画像から１つの画像を決定し、当該画像に関連付けられている位置データに基づき、試料３について再度撮影を実行する際の対物レンズの基準位置を決定する。たとえば、設定部４０２は、一定の時間間隔で並んだ複数の撮影タイミングのうちｎ番目の撮影タイミングでＺスタックを実行するときはｎ−１番目の撮影タイミングで取得されたＺスタック画像を構成する複数の画像のうちで試料３に対して最もピントが合っている画像に関連付けられている位置データが示すＺ位置を基準位置として決定してもよい。なお、設定部４０２は、Ｚ位置に代えて距離を用いてもよい。設定部４０２は、試料３について再度撮影を実行する際に、試料３にピントが合っている画像に関連付けられている距離データが示す距離を基準距離として顕微鏡１に設定してもよい。このように、設定部４０２は、一定の時間間隔で並んだ複数の撮影タイミングのうちｎ番目の撮影タイミングで撮影を実行するときはｎ−１番目の撮影タイミングでの撮影において取得された複数の画像のうちで試料にピントが合っている画像に関連付けられている距離データが示す距離を基準距離として顕微鏡１に設定する。
【００２７】
設定部４０２は、さらに移動範囲指定部４０５や移動ピッチ決定部４０６、撮影回数指定部４０８などを有していてもよい。移動範囲指定部４０５は、各Ｚスタックにおける移動範囲の上限位置Ｚｈｉと下限位置Ｚｌｏとを指定する機能である。基本的に、移動範囲指定部４０５は、基準位置Ｚｒが移動範囲Ｗの中央となるように移動範囲Ｗの上限位置Ｚｈｉと下限位置Ｚｌｏとを指定する。なお、移動範囲指定部４０５は、基準位置Ｚｒに対して非対称となるように上限位置Ｚｈｉと下限位置Ｚｌｏとを決定してもよい。また、移動範囲指定部４０５は、予め設定された最大範囲を超えないように上限位置Ｚｈｉと下限位置Ｚｌｏとを指定してもよい。たとえば、最大範囲は、対物レンズが試料３を保持している容器に接触しないように決定される。データ保存部４０３には、対物レンズの倍率と関連付けて最大範囲Ｗｍａｘが保存されている。移動範囲指定部４０５は、制御パラメータにおいて設定されている倍率を特定し、特定した倍率に対応する最大範囲Ｗｍａｘをデータ保存部４０３から読み出してもよい。撮影回数指定部４０８は、１回の撮影タイミングで撮影する撮影回数（Ｚスタック数Ｎｚ）を顕微鏡１に指定する機能である。つまり、撮影回数指定部４０８は、各撮影タイミングで実行されるＺスタックによって取得される画像の数であるＺスタック数を指定するＺスタック数指定手段として機能する。撮影回数指定部４０８は、操作部３３からのユーザーの指示に応じてトータル撮影枚数Ｎｔを指定してもよい。移動ピッチ決定部４０６は、移動範囲ＷとＺスタック数Ｎｚとに基づいて対物レンズの移動ピッチＰ（対物レンズユニット１２の移動距離）を決定する機能である。撮影制御部４０１は、１回の撮影タイミング中において、移動ピッチＰずつ対物レンズユニット１２を移動させるたびに１回の撮影を顕微鏡１に実行させる。
【００２８】
図５は、タイムラプス撮影においてＺスタックを実行する処理を示すフローチャートである。
【００２９】
Ｓ５０１で、設定部４０２は操作部３３を通じてユーザーにより入力される指示にしたがって撮影の設定を行う。たとえば、ユーザーは、対物レンズの倍率、撮影に用いる検鏡法（明視野・暗視野・位相差・微分干渉・偏光・蛍光など）、撮影装置１８の設定（露光時間、各撮影タイミングにおけるレイヤー画像間の撮影時間間隔（各撮影タイミングで１枚の画像だけを取得するときはこの間隔は無視される）、タイムラプス撮影時の撮影タイミング間の時間間隔）、撮影の実行されるＸＹ位置（ＸＹステージの座標など）、光源４や光源８の強度や絞りを設定し、撮影制御部４０１を通じて顕微鏡１に設定する。さらに、移動範囲指定部４０５は、Ｚスタックを実行する際のＺステージの上限位置Ｚｈｉや下限位置Ｚｌｏとその移動ピッチＰを指定してもよい。撮影回数指定部４０８は、各撮影タイミングでの撮影回数（Ｚスタック数Ｎｚ）やタイムラプス撮影におけるトータル撮影回数Ｎｔなどを指定してもよい。なお、各撮影タイミングにおいて複数のＸＹ位置で撮影を実行する多点タイムラプス撮影や、異なる蛍光波長や検鏡法を用いて同一視野でかつ同一Ｚ位置で複数枚の画像を取得するマルチカラー撮影、異なるＸＹ視野を撮影して１枚の広視野画像を得る画像連結撮影も設定部４０２が顕微鏡１に設定してもよい。設定が完了するとＳ５０２に進む。
【００３０】
Ｓ５０２で、撮影制御部４０１は、顕微鏡１に撮影を開始させるための制御信号を送信する。顕微鏡１の制御部２０は制御信号を受信すると、顕微鏡１の制御部２０は撮影準備を実行する。たとえば、制御部２０は、設定部４０２などにより設定された制御パラメータにしたがってＸＹステージ６を移動させたり、Ｚステージを移動させたり、対物レンズを選択したり、フィルタを選択したりする。
【００３１】
Ｓ５０３で、撮影制御部４０１は、次の撮影タイミングまで待機する。たとえば、撮影制御部４０１は、設定部４０２により設定された撮影開始時刻が到来したかどうかを、タイマーを用いて判定する。撮影タイミングが到来すると、Ｓ５０４に進む。
【００３２】
Ｓ５０４で、撮影制御部４０１は撮影タイミングが到来したことを示す制御信号を顕微鏡１の制御部２０に送信し、Ｚスタックを開始させる。制御部２０は、設定部４０２により設定された制御パラメータにしたがって光源８を制御して励起光の照射を開始させ、撮影装置１８にＺスタックを開始させる。光源８がメタルハライドランプや水銀といった点灯開始から光量が安定するまでに時間を要する光源であれば、制御部２０は、予め光源８を点灯しておき、撮影タイミングが到来すると、光源８の光軸に設けられたメカシャッターを開いて励起光の照射を開始してもよい。なお、メカシャッターに代えて高速にＯＮ・ＯＦＦ可能な光変調素子による遮光制御が採用されてもよい。光源８がＬＥＤのように点灯直後から光量が安定している光源であれば、制御部２０は、光源８への印加電圧の制御によって点灯・消灯を制御してもよい。制御部２０は、設定部４０２により設定された移動開始位置から１ピッチずつＺステージを移動させる。これにより、対物レンズと試料３との間の距離が１ピッチずつ変化する。また、制御部２０は、Ｚステージを移動させるごとに撮影装置１８に撮影を実行させる。制御部２０またはＣＰＵ３０は、撮影回数（撮影枚数）をカウントし、設定部４０２により設定されたＺスタック数Ｎｚにカウント値が一致したかどうかを判定する。これにより、１つの撮影タイミングにおけるＺスタック画像の取得が完了したかどうかを判定してもよい。制御部２０は、画像処理部１９から出力されたＺスタック画像に関する画像信号を、通信部２３を通じて制御装置２に送信する。撮影制御部４０１は、顕微鏡１から受信したＺスタック画像に関する画像信号（画像データ）を画像保存部４０７に保存する。Ｚスタック画像は複数の画像から構成されているが、１つの画像が取得されるたびに顕微鏡１から制御装置２に転送されてもよいし、複数の画像がまとめて顕微鏡１から制御装置２に転送されてもよい。
【００３３】
撮影制御部４０１は、Ｚスタック画像を構成する複数の画像をそれぞれ画像保存部４０７に保存する際に、各画像を撮影したときに使用された制御パラメータ（特にＺ位置など）をメタデータとして各画像に付加してもよい。あるいは、撮影制御部４０１は、データベースを作成し、各画像のファイル名と制御パラメータとを関連付けてデータベースに登録してもよい。これにより画像とＺ位置とが関連付けて管理される。
【００３４】
Ｓ５０５で、撮影制御部４０１は、タイムラプス撮影が完了したかどうかを判定する。たとえば、撮影制御部４０１は、タイムラプス撮影における撮影枚数をカウントして行き、カウント値がトータル撮影枚数Ｎｔに達したかどうかを判定してもよい。タイムラプス撮影の終了時刻が予め設定されているときは、撮影制御部４０１がリアルタイムクロックを監視し、終了時刻が到来したかどうかを判定してもよい。タイムラプス撮影を終了すべき条件が満たされると、撮影制御部４０１は、タイムラプス撮影を終了する。一方で、タイムラプス撮影を終了すべき条件が満たされていなければ、Ｓ５０６に進む。
【００３５】
Ｓ５０６で、設定部４０２は、次回の撮影タイミングで使用されることになる設定を決定する。たとえば、合焦判定部４０４に今回の撮影タイミングで取得されたＺスタック画像を構成する複数の画像のうちで試料３に対して最も合焦している画像を判別し、その画像を撮像したときの設定（特にＺ位置など）をデータ保存部４０３に保存する。設定部４０２は、合焦判定部４０４に特定された画像に関連付けられている制御パラメータに基づき次回の撮影タイミングで使用される制御パラメータを決定する。
【００３６】
図６は、Ｓ５０６を詳細に示したフローチャートである。ここでは、ｎ−１回目の撮影タイミングで取得されたＺスタック画像からｎ回目の撮影で使用される制御パラメータが決定される。
【００３７】
Ｓ６０１で、合焦判定部４０４は、ｎ−１回目の撮影タイミングで取得されたＺスタック画像を構成する複数の画像のそれぞれについて合焦値を求める（ｎは２以上の自然数）。合焦値はどのように求められてもよいが、たとえば、画像のコントラストから計算されてもよい。あるいは、ラプラシアンフィルタやアンシャープマスクといった一般的な高周波フィルタを用いて合焦値が算出されてもよい。画像の分散値を合焦値としてもよい。たとえば、合焦判定部４０４は、画像を１６個ｘ１６個の画素グループに区切って各画素グループの分散値を求めてその和（局所分散値）を計算し、その和を合焦値として使用してもよい。
【００３８】
Ｓ６０２で、合焦判定部４０４は、Ｚスタック画像を構成する各画像の合焦値を比較して最大値を決定し、合焦値が最大値となった画像を決定する。合焦値が最大値となった画像は、試料３に対して最もピントが合っている画像である。合焦判定部４０４は、試料３に対して最もピントが合っている画像の識別情報（例：ファイル名など）を設定部４０２に通知する。
【００３９】
Ｓ６０３で、設定部４０２は、試料３に対して最もピントが合っている画像を撮像したときのＺ位置をｎ回目の撮影タイミングで使用されるＺスタックの基準位置Ｚｒに決定する。たとえば、設定部４０２は、試料３に対して最もピントが合っている画像のメタデータからＺ位置を読み出し、読み出したＺ位置を基準位置Ｚｒに決定する。
【００４０】
Ｓ６０４で、設定部４０２は、基準位置Ｚｒを基にｎ回目の撮影タイミングで使用されるＺステージの上限位置Ｚｈｉと下限位置Ｚｌｏとを決定する。上述したように基準位置を中心として上限位置Ｚｈｉと下限位置Ｚｌｏとが設定されてもよい。また、合焦位置から上に観察対象が伸びているなど非対称な観察対象に対しては、基準位置Ｚｒから上限位置Ｚｈｉまでの距離と基準位置Ｚｒから下限位置Ｚｌｏまでの距離とを非対称に設定してもよい。たとえば、ユーザーが基準位置Ｚｒから上側で５枚の画像を取得し、基準位置Ｚｒの下側で２枚の画像を取得するよう設定すると、設定部４０２は、基準位置Ｚｒに対して５ピッチを加算したＺ位置を上限位置Ｚｈｉに決定し、基準位置Ｚｒに対して２ピッチを減算したＺ位置を下限位置Ｚｌｏに決定する。この場合に、基準位置Ｚｒにおいても撮影が実行されてもよい。これにより、非対称なＺスタック設定が実現される。
【００４１】
なお、上述したＳ５０１では、上限位置Ｚｈｉの初期値、下限位置Ｚｈｉの初期値、基準位置Ｚｒの初期値および移動ピッチがユーザーによって指定されてもよい。初期値は１番目の撮影タイミングで使用される値である。
【００４２】
移動範囲指定部４０５は操作部３３を通じたユーザーの指定よって事前に最大範囲Ｗｍａｘを設定してもよい。この場合、設定部４０２は、最大範囲Ｗｍａｘを逸脱しない範囲で上限位置Ｚｈｉと下限位置Ｚｌｏを決定する。たとえば、設定部４０２は、上限位置が最大範囲Ｗｍａｘを逸脱する場合、上限位置を最大範囲Ｗｍａｘの端部に設定する。なお、設定部４０２は、上限位置Ｚｈｉをずらした分だけＺステージの移動範囲Ｗを下限側にシフトしてもよいし、移動範囲Ｗを狭くしてもよい。移動範囲Ｗを狭くすることで、Ｚスタック画像を構成する画像の枚数が減少することになる。
【００４３】
Ｓ６０５で、設定部４０２は、決定した移動範囲Ｗ（上限位置Ｚｈｉと下限位置Ｚｌｏ）を、撮影制御部４０１を通じて顕微鏡１に設定する。
【００４４】
なお、本実施形態の合焦判定部４０４はコントラスト値の最大値を基に合焦位置（基準位置）を決定したが、画像の平均輝度の最大値を基準に合焦位置を決定してもよい。合焦判定部４０４は、Ｚスタック画像を構成する複数の画像のうちでコントラスト値または平均輝度値がある一定値を上回る画像を決定してもよい。このような画像は、経験的に、試料３の存在する画像と考えられる。このような画像が複数存在する場合、設定部４０２は、各画像のＺ位置をメタデータから読み出し、Ｚ位置を比較し、上限となるＺ位置、下限となるＺ位置または中央となるＺ位置を決定する。設定部４０２は、これらのＺ位置を基準位置として使用する。上限となるＺ位置、下限となるＺ位置または中央となるＺ位置のいずれを基準位置に設定するかは、試料３の特徴に依存するため、ユーザーがいずれかを選択または指定してもよい。
【００４５】
図７を用いて本実施形態で撮影されるＺスタック画像の概要を説明する。ここでは、ユーザーにより、５枚の画像がＺスタック画像として撮影されること、および、ピント追尾範囲の下限Ｚｌｏと上限Ｚｈｉが設定されている。５枚の画像の各Ｚ位置はＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５である。タイムラプス撮影の撮影タイミングは４回とする。
【００４６】
第１回目の撮影タイミング（Ｔ＝０）ではＺ１−Ｚ５の各Ｚ位置で順に撮影が事項される。合焦判定部４０４は、斜線で強調した画像を合焦位置の画像と判定したと仮定する。ここでは、Ｚ４が第２回目の撮影タイミング（Ｔ＝１）における基準位置として決定される。
【００４７】
第２回目の撮影タイミング（Ｔ＝１）ではＺ４を基準位置とし、ここを中心としてＺステージの移動範囲が決定され、Ｚスタック画像が取得される。合焦判定部４０４は、Ｚスタック画像を解析し、Ｚ位置がＺ６に設定されていたときに取得された画像が最もピントが合っていると判定する。よって、設定部４０２は、Ｚ６を第３回目の撮影タイミング（Ｔ＝２）における基準位置として決定する。
【００４８】
第３回目の撮影タイミング（Ｔ＝２）ではＺ６を基準位置とし、ここを中心としてＺステージの移動範囲を決定しようとするが、Ｚ６が中心となるように移動範囲を決定すると、移動範囲の上限値が、ピント追尾範囲の上限Ｚｈｉを超えてしまう。そこで、設定部４０２は、移動範囲の上限値をピント追尾範囲の上限Ｚｈｉに設定することで、ピント追尾範囲を逸脱しないようにＺスタックが実行される。本実施形態では、設定部４０２は、画像の撮影枚数とピッチを変更せずに、下側に移動範囲を拡張している。合焦判定部４０４は、Ｚスタック画像を解析し、Ｚ位置がＺ５に設定されていたときに取得された画像が最もピントが合っていると判定する。よって、設定部４０２は、Ｚ５を第４回目の撮影タイミング（Ｔ＝３）における基準位置として決定する。
【００４９】
第４回目の撮影タイミング（Ｔ＝３）ではＺ５を基準位置とし、ここを中心としてＺステージの移動範囲が決定され、Ｚスタック画像が取得される。これにより、４回の撮影タイミングにより構成されたタイムラプス撮影が終了する。
【００５０】
なお、異なる複数の検鏡法で撮影するマルチカラー撮影の場合、Ｚスタック範囲（Ｚステージの移動範囲Ｗ）を各検鏡法で個別に設定することで基準位置を個別に追尾してもよい。あるいは、複数の検鏡法のうちでどれか一つの検鏡法で撮影した画像を用いて共通の基準位置と撮影範囲が決定されてもよい。
【００５１】
［撮影画像の編集・解析］
ＣＰＵ３０は、画像を編集したり解析したりする際に、撮影地点ごとや検鏡法ごと区別して読み込む。この区別を実現するには、たとえば、画像を保存するフォルダ構成やファイルの命名規則、画像ファイルリストデータベース等が使用されてもよい。Ｚスタック画像を構成している個々の画像はＺ位置が異なる画像であり、３次元的に存在する画像と観念できる。そこで、ＣＰＵ３０は、Ｚスタック画像から３次元動画や全焦点動画を作成してもよいし、画像連結を用いて広視野３次元／全焦点動画を作成してもよい。また、ＣＰＵ３０は、３次元動画を作成する際に各画像のＺ位置の変化を反映させ、３次元的に変化していく様を可視化してもよい。
【００５２】
ＣＰＵ３０は、あるＺ位置の画像、たとえば基準位置の画像のみで動画を作成してもよい。さらに、ＣＰＵ３０は、基準位置以上または以下のＺ位置で取得された画像であって基準位置から見てｎ枚上または下に存在する画像のみから動画を作成してもよい。これにより、ある合焦位置にのみ着目した動画を作成することができる。
【００５３】
ＣＰＵ３０は、座標Ａ、Ｂ、Ｃの３点など多点で試料３を撮影して取得した画像について動画を作成してもよい。たとえば、ＣＰＵ３０は、Ａ１→Ｂ１→Ｃ１→Ａ２→Ｂ２→Ｃ２→Ａ３→…という順で取得された静止画をＡ１，Ａ２，Ａ３，…と並び替えて動画を生成してもよい。この場合、Ａ１→Ｂ１→Ｃ１→Ａ２と座標を移動する際のＸＹステージの繰り返し精度によって微小に振動したような安定しない動画が生成されてしまうことがある。これを抑制するためには、Ａ１，Ａ２，Ａ３間での微小なズレを画像間のパターンマッチングによって検出して位置合わせを行って動画を作成すればよい。
【００５４】
上述した実施形態ではＺステージを移動させることで対物レンズと試料３との間の距離を変えているが、ＸＹステージ６をＺ軸方向に移動させることで対物レンズと試料３との間の距離を変えてもよい。前者の場合はＺステージのＺ位置が対物レンズと試料３との間の距離を示す距離データに相当し、後者の場合はＸＹステージ６のＺ位置が対物レンズと試料３との間の距離を示す距離データに相当する。このように、対物レンズと試料３との間の距離は、対物レンズを移動するか試料３を移動することで、変更される。なお、上述したＺ軸方向の基準位置は基準距離と呼ばれてもよい。
【００５５】
以上説明したように本実施形態の顕微鏡システム１００は、顕微鏡１において対物レンズと試料３との間の距離を変えながら試料３を撮影して取得された複数の画像と、各画像を取得したときの対物レンズの光軸方向におけるＺ位置を示す位置データとを関連付けて記憶する。顕微鏡システム１００は、複数の画像のそれぞれにおいて試料３に対する合焦状態を示す合焦値を決定し、合焦値に基づき複数の画像から１つの画像を決定し、当該画像に関連付けられている位置データに基づき、試料３について再度撮影をする際の対物レンズの基準位置を決定する。そして、顕微鏡システム１００は、基準位置を含む所定の移動範囲内で対物レンズを移動させることで対物レンズと試料３との間の距離を変えさせながら顕微鏡１に試料３を再度撮影させる。このように、本実施形態の顕微鏡システム１００は、過去に取得した複数の画像から将来に取得することになる画像の制御パラメータを決定する。とりわけ、過去に取得した複数の画像の合焦値から将来の撮影における対物レンズの基準位置を決定することで、次回に撮影される複数の画像についても試料３に合焦している可能性が高まる。これは、対物レンズについてのオートフォーカスを不要にできるか、オートフォーカスを短時間で終了できることを間接的に意味している。その結果、試料３に対する照明光の照射時間も削減される。よって、試料３に対する光毒性の影響を低減しつつ、タイムラプス撮影の成功率も向上すると考えられる。
【００５６】
より具体的に、顕微鏡システム１００は、タイムラプス撮影を実行するために一定時間ごとに到来する各撮影タイミングで顕微鏡１にＺスタックを実行させてもよい。つまり、複数の画像はいわゆるＺスタック画像であってもよい。顕微鏡システム１００は、一定の時間間隔で並んだ複数の撮影タイミングのうちｎ番目の撮影タイミングでＺスタックを実行するときはｎ−１番目の撮影タイミングで取得されたＺスタック画像を構成する複数の画像のうちで試料３に対して最もピントが合っている画像に関連付けられている位置データが示す位置を基準位置として決定してもよい。Ｚスタック画像は一般に一定の移動ピッチずつＺステージを移動させることで対物レンズと試料３との間の距離を変化させる。これは合焦位置を移動させることを間接的には意味している。このようなＺスタックにおけるＺステージの動作はフォーカス制御における動作と似ている。それゆえに、Ｚスタック画像には試料３に対して合焦している画像が含まれている可能性が高いため、その画像を取得したときのＺ位置を次回のＺスタックにおけるＺステージの移動範囲の基準位置として利用できる。
【００５７】
顕微鏡システム１００は、移動範囲の上限位置と下限位置とを指定してもよい。移動範囲をＺスタックステージが機構的に移動可能な全範囲に指定してもよいが、これではＺタック数が非常に多くなり、かつ、１回のＺスタックに必要となる処理時間も膨大となってしまう。また、試料３が移動可能な全範囲にわたって移動することはほとんど考えられない。よって、全範囲よりも狭い範囲となるように移動範囲の上限位置と下限位置とを指定してもよい。これにより、Ｚタック数を削減でき、処理時間も短縮できるようになろう。とりわけ、試料３がｎ−１回目の撮影タイミングからｎ回目の撮影タイミングまでにＺスタック軸方向においてどの程度にわたり移動するかは経験的な知識が必要となる。よって、ユーザーが経験的な知識に基づいて適切に移動範囲を設定すれば、より効率的にタイムラプス撮影を実行できるようになろう。
【００５８】
顕微鏡システム１００は、基準位置が移動範囲の中央となるように移動範囲の上限位置と下限位置を設定してもよいし、基準位置に対して非対称となるように上限位置と下限位置を指定してもよい。試料３がＺ軸方向において下方にも上方にもほぼ等しい確率で移動する場合は、基準位置が次回の移動範囲の中央に位置するように移動範囲の上限位置と下限位置を設定してもよい。また、試料３がＺ軸方向において下方または上方の一方にのみ移動する確率が高ければ、試料３が移動する可能性のある方向のＺ位置で多くの撮影が実行されるように、基準位置に対して非対称となるように上限位置と下限位置を指定してもよい。これにより、試料３にピントの合った画像を取得できる確率が高まるであろう。
【００５９】
上述したように、Ｚステージには機構的に移動可能な範囲が存在する。また、機構的に移動可能な範囲であってもあるＺ位置よりもＺステージが移動すると対物レンズが容器に接触してしまう可能性もある。よって、このような問題が生じないように予めＺステージの移動する最大範囲を設定することが望ましい。そこで、顕微鏡システム１００は、最大範囲を超えないように上限位置と下限位置を指定してもよい。
【００６０】
移動ピッチについては直接ユーザーによって指定されてもよいし、他の制御パラメータに基づいて決定されてもよい。たとえば、顕微鏡システム１００は、各撮影タイミングで実行されるＺスタックによって取得される画像の数であるＺスタック数と、移動範囲とに基づいて対物レンズの移動ピッチを決定してもよい。移動ピッチに関しても専門的な知識がなくても、移動ピッチを設定できるようになる。
【００６１】
１番目の撮影タイミングで使用される基準位置と移動範囲は操作者によって指定されてもよい。本実施形態では、２番目の以降の撮影タイミングで使用される基準位置は、直前の撮影タイミングで取得された画像から基準位置を決定できる。これは、１番目の撮影タイミングで使用される基準位置については別の方法で決定できる必要がある。よって、１番目の撮影タイミングで使用される基準位置についてはユーザーが指定できるようにしてもよい。あるいは、１番目の撮影タイミングで使用される基準位置についてはオートフォーカスを実行して決定してもよい。つまり、オートフォーカスにより決定された合焦位置が移動範囲を決定する基準位置となる。この場合であってもタイムラプス撮影の全期間におけるオートフォーカスの実行時間は、各撮影タイミングのすべてでオートフォーカスを実行する場合と比較して、短縮される。
【００６２】
顕微鏡１は、蛍光試薬を添加された試料に対して励起光を照射し、試料３から発する蛍光を撮影する蛍光顕微鏡であってもよい。とりわけ、励起光は生物に対して有害となる波長の光であるため、本実施形態に係る発明は蛍光顕微鏡において有効であろう。もちろん、通常の顕微鏡であっても照明光によって標本の退色などが発生することがあるため、やはり照明光の照射時間を短縮可能な本実施形態は有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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