(57)【要約】【課題】  Ｆｃγレセプターを凝集させずに長期間安定的に保存可能な溶液、およびＦｃγレセプターを凝集させずに長期間安定的に保存する方法を提供すること。【解決の手段】  Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液中のハロゲン化物イオンの濃度を２００ｍＭ未満とすることにより、前記課題を解決する。【選択図】  図２
2015178468.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液であって、前記水溶液中に含まれるハロゲン化物イオンの濃度が２００ｍＭ未満である、前記水溶液。
【請求項２】
Ｆｃ結合性タンパク質をハロゲン化物イオンの濃度が２００ｍＭ未満の水溶液で保存する、Ｆｃ結合性タンパク質の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆｃレセプターを水溶液中で長期間保存可能な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
Ｆｃγレセプターの一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。
【０００４】
ヒトＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）、および遺伝子配列はＥｘＰＡＳｙ（Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１４）などの公的データベースに公表されている。また、ＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。ヒトＦｃγＲＩのα鎖は図１に示す構造をとり、Ｎ末端側から１５アミノ酸からなるシグナルペプチド領域（ＳＳ：配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目から１５番目までの領域）、２７７アミノ酸からなる細胞外領域（ＥＣ：配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目から２９２番目までの領域）、２１アミノ酸からなる細胞膜貫通領域（ＴＭ：配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２９３番目から３１３番目までの領域）、６１アミノ酸からなる細胞内領域（Ｃ：配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１４番目から３７４番目までの領域）から構成される。
【０００５】
前述した通りＦｃγＲＩの細胞外領域を構成するタンパク質は、高度な親和性のもと、ヒト抗体に対する優れた識別機能を有している。この高度な親和性に基づいて、診断試薬、抗体医薬品の研究用ツールまたはＩｇＧなどの抗体医薬品の製造工程で利用されるアフィニティークロマトグラフィーのリガンドとして活用する方法が報告されている（特許文献１）。また近年になり、予想外の免疫抑制的な生物学的特性があることが見出されてより、自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。
【０００６】
遺伝子組換え技術を利用したＦｃγレセプターの発現に関しては、これまで、大腸菌（特許文献１）、動物細胞（非特許文献３）、バチルス属細菌（特許文献２）、酵母（特許文献３）、麹菌（特許文献４）を宿主とした発現が報告されている。中でも大腸菌を宿主として用いた系では、高密度培養によるＦｃγレセプターの製造法（特許文献５）、疎水クロマトグラフィー（特許文献６）や陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたＦｃγレセプターの精製法も報告されている。さらにはＦｃγレセプター構造遺伝子の改変によりＦｃγレセプターの安定化や生産性が向上する（特許文献７）など、Ｆｃγレセプターの産業利用への関心が高まっている。
【０００７】
一方でＦｃγレセプターは精製後に溶液状態で保存すると凝集しやすいことが問題となっており、産業利用において重大な欠点となっていた。すなわち、精製したＦｃγレセプターを使用するまでの間放置しておくと、凝集し析出する問題があった。さらに凝集したＦｃγレセプターをそのまま放置しておくと変性し再溶解できなくなる問題もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−２４５５８０号公報
【特許文献２】特開２００９−２０１４０３号公報
【特許文献３】特開２０１１−０７２２４６号公報
【特許文献４】特開２０１１−２００２０３号公報
【特許文献５】特開２０１２−０３４５９１号公報
【特許文献６】特開２０１１−１２６８２７号公報
【特許文献７】特開２０１１−２０６０４６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ  Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５
【非特許文献３】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、Ｆｃγレセプターを凝集させずに長期間安定的に保存可能な溶液、およびＦｃγレセプターを凝集させずに長期間安定的に保存する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｆｃγレセプターの凝集がハロゲン化物イオンによるものであることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１２】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する： 
（ｉ）Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液であって、当該水溶液中に含まれるハロゲン化物イオンの濃度が２００ｍＭ未満である、前記水溶液。
【００１３】
（ｉｉ）Ｆｃ結合性タンパク質をハロゲン化物イオンの濃度が２００ｍＭ未満の水溶液で保存する、Ｆｃ結合性タンパク質の保存方法。
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明においてＦｃ結合性タンパク質とは、Ｆｃγレセプターの細胞外領域を構成するタンパク質のことをいう。一例として、Ｆｃγレセプターが天然型ヒトＦｃγＲＩの場合は配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの領域がＦｃ結合性タンパク質に相当する。ただし必ずしもＦｃγレセプターの細胞外領域の全領域でなくてもよく、Ｆｃγレセプターの細胞外領域を構成するタンパク質（ポリペプチド）のうち、少なくとも抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。当該Ｆｃ結合性タンパク質の一例として、
（Ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。
【００１６】
前記（ＩＩ）の具体例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報や特開２０１４−０２７９１６号公報に開示のＦｃ結合性タンパク質があげられる。
【００１７】
本発明はＦｃ結合性タンパク質を含む水溶液を保存する際、当該水溶液に含まれるハロゲン化物イオンの濃度を２００ｍＭ未満とすることを特徴としている。ここでいうハロゲン化物イオンとは、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオンのことをいう。Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液から前述の濃度以下になるまでハロゲン化物イオンを除去する方法に特に限定はなく、透析による方法、限外ろ過による方法、ハロゲン化物イオンが２００ｍＭ未満にまで希釈する方法、イオン交換膜、イオン交換樹脂やイオン交換クロマトグラフィー担体に通過させることでハロゲン化物イオンを吸着除去する方法、硝酸銀などを添加して生成した沈殿を除去する方法、硫安などのハロゲン化物イオンを含まない塩やアセトン、エタノールなどの水と任意の容量比で混和する有機溶媒を加えて沈殿物として回収した後に２００ｍＭ未満のハロゲン化物イオンを含む水または緩衝液に再溶解する方法、が例示できる。中でも処理の簡便性から、透析や限外ろ過による方法が工業的には好ましく用いられる。なおＦｃ結合性タンパク質水溶液に含まれるハロゲン化物イオンの濃度は少ないほどよく、好ましくは１５０ｍＭ未満、より好ましくは８０ｍＭ未満、さらに好ましくは５０ｍＭ未満である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明はＦｃ結合性タンパク質を含む水溶液を保存する際、当該水溶液に含まれるハロゲン化物イオンの濃度を２００ｍＭ未満とすることを特徴としている。これにより、精製したＦｃ結合性タンパク質を、他の用途（例えばアフィニティクロマトグラフィ用リガンド）に用いるまでの間に、凝集により生じる、Ｆｃ結合性タンパク質のロスが防止され、Ｆｃ結合性タンパク質の利用効率を大幅に向上させることできる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ヒト型ＦｃγＲＩの構造を示す図。
【図２】Ｆｃ結合性タンパク質水溶液に含まれる塩化ナトリウム濃度による、Ｆｃ結合性タンパク質の保存安定性への影響を示す図。
【図３】２００ｍＭ  硫酸ナトリウム存在下でのＦｃ結合性タンパク質水溶液に含まれる塩化ナトリウム濃度による、Ｆｃ結合性タンパク質の保存安定性への影響を示す図。
【図４】Ｆｃ結合性タンパク質水溶液に含まれるアニオン種による、Ｆｃ結合性タンパク質の保存安定性への影響を示す図。
【図５】本発明のＦｃ結合性タンパク質水溶液（タンパク質濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）の長期保存安定性を示す図。
【図６】本発明のＦｃ結合性タンパク質水溶液（タンパク質濃度：３０ｍｇ／ｍＬ）の長期保存安定性を示す図。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は前記例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１  Ｆｃ結合性タンパク質水溶液の調製
（１）Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌を、特開２０１２−０３４５９１号公報に記載の方法で培養することで、前記タンパク質を発現させた。
（２）組換え大腸菌の培養液より菌体を回収後、抽出液（６５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、６ｍＭ  硫酸マグネシウム、２５０Ｕ／Ｌ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商品名）、０．０５ｇ／Ｌ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、０．４％（ｖ／ｖ）  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）および５０ｍＭ  塩化カルシウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を添加して菌体を懸濁させ、その後臭化セチルトリメチルアンモニウム塩（ＣＴＡＢ）を終濃度で０．５％（ｗ／ｖ）添加し撹拌することで、菌体内に発現した前記タンパク質を抽出した。
（３）（２）で得られた菌体抽出液に、酢酸を、液のｐＨが３．５となるよう、撹拌しながら滴下することで酸処理を行ない、遠心分離により上清（酸処理液）を回収した。
（４）酸処理液に尿素を終濃度１Ｍとなるよう添加後、あらかじめ平衡化緩衝液Ａ（１Ｍ  尿素を含む２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ６．０））で平衡化した、陽イオン交換クロマトグラフィー用ゲル（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０、東ソー製）を充填したカラムに添加し、平衡化緩衝液Ａで十分洗浄後、１Ｍ  塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝液ＡでＦｃ結合性タンパク質を溶出した。
（５）（４）の溶出液を、特開２０１１−１２６８２７号に記載の疎水クロマトグラフィーを用いた方法によりヒトＦｃ結合性タンパク質を精製した。
（６）あらかじめ平衡化緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０））で平衡化した、陽イオン交換クロマトグラフィー用ゲル（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０、東ソー製）を充填したカラムに、（５）で精製したＦｃ結合性タンパク質水溶液を添加した。
（７）平衡化緩衝液Ｂで十分量洗浄後、１Ｍ  塩化ナトリウムを含む平衡化緩衝液Ｂで溶出することで、高度に精製したＦｃ結合性タンパク質を含む水溶液を得た。
（８）（７）で得られた水溶液１０ｍＬを、１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  ＭＥＳ（２−モルフォリノエタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ５．０）１Ｌに対し、３回透析することで脱塩し、水溶液中に含まれる塩化ナトリウムを完全に除去した。透析後のＦｃ結合性タンパク質濃度は６ｍｇ／ｍＬだった。
（９）（８）で得られた脱塩後の溶液を４℃で２０日間静置保存した。
【００２２】
結果を図２に示す。２０日間の保存で沈殿物の析出は認められず、上清中のタンパク質濃度にも変化は認められなかった（ＮａＣｌ  ０ｍＭの結果）。
【００２３】
実施例２  Ｆｃ結合性タンパク質水溶液中に含まれる塩化ナトリウムの影響（その１）
実施例１（８）で得られた脱塩後の水溶液に４Ｍ  塩化ナトリウム水溶液を添加することで、塩化ナトリウムを７８ｍＭ、１５４ｍＭ、２６２ｍＭ、３６４ｍＭまたは５２５ｍＭ含むＦｃ結合性タンパク質水溶液をそれぞれ調製した後、４℃で２０日間静置保存し、溶液中のタンパク質濃度を測定した。
【００２４】
結果を図２に示す。塩化ナトリウムを７８ｍＭ含んだＦｃ結合性タンパク質水溶液は、２４時間までの保存では沈殿物の析出や溶液中のタンパク質濃度に変化は認められなかったものの、５日間の保存では沈殿物が生じ溶液中のタンパク質濃度も４．８ｍｇ／ｍＬに低下した。ＮａＣｌを１５４ｍＭ含んだＦｃ結合性タンパク質水溶液は、２４時間の保存で沈殿物が生じ溶液中のタンパク質濃度も１．２ｍｇ／ｍＬに低下した。塩化ナトリウムを２６２ｍＭ以上含んだＦｃ結合性タンパク質水溶液は、２４時間の保存で溶液中のタンパク質濃度がほぼ０にまで低下した。
【００２５】
以上の結果から、Ｆｃ結合性タンパク質水溶液に塩化ナトリウム（塩化物イオン）が含まれると、Ｆｃ結合性タンパク質の凝集が促進され、塩化ナトリウム（塩化物イオン）濃度が２００ｍＭ以上になるとＦｃ結合性タンパク質が速やかに（２４時間以内に）凝集されることがわかる。
【００２６】
実施例３  Ｆｃ結合性タンパク質水溶液中に含まれる硫酸ナトリウムの影響（その２）
（１）実施例１（７）で得られたＦｃ結合性タンパク質水溶液１０ｍＬを、１ｍＭのＥＤＴＡと０．２Ｍの硫酸ナトリウムを含む２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）に対して３回透析することで脱塩し、溶液中に含まれる塩化ナトリウムを完全に除去した。透析後のＦｃ結合性タンパク質濃度は６ｍｇ／ｍＬだった。
（２）（１）で得られた溶液を４℃で２０日間静置保存した。
【００２７】
結果を図３に示す。保存中に沈殿物の析出は認められず、上清中のＦｃ結合性タンパク質濃度にも変化は認められなかった（ＮａＣｌ  ０ｍＭでの結果）。この結果より、硫酸ナトリウム（硫酸イオン）を添加しても、Ｆｃ結合性タンパク質水溶液の保存安定性には影響を受けないことがわかる。
【００２８】
実施例４  Ｆｃ結合性タンパク質水溶液中に含まれる塩化ナトリウムの影響（その３）
実施例３（１）で得られた脱塩後の水溶液に４Ｍ  塩化ナトリウム水溶液を添加することで、ＮａＣｌを７８ｍＭ、１５４ｍＭ、２６２ｍＭ、３６４ｍＭまたは５２５ｍＭ含むＦｃ結合性タンパク質水溶液をそれぞれ調製した後、４℃で２０日間静置保存し、溶液中のタンパク質濃度を測定した。
【００２９】
結果を図３に示す。塩化ナトリウムを７８ｍＭ含んだＦｃ結合性タンパク質水溶液は、塩化ナトリウムを含まないときと同様、保存中に沈殿物の析出は認められず、上清中のＦｃ結合性タンパク質濃度にも変化は認められなかった。塩化ナトリウムを１５４ｍＭ含んだＦｃ結合性タンパク質水溶液は、５日間までの保存では沈殿物の析出や溶液中のタンパク質濃度に変化は認められなかったものの、２０日間の保存では沈殿物が生じ溶液中のタンパク質濃度は４．２ｍｇ／ｍＬに低下した。塩化ナトリウムを２６２ｍＭ以上含んだＦｃ結合性タンパク質水溶液は、２４時間までの保存では沈殿物の析出や溶液中のタンパク質濃度にほぼ変化は認められなかったものの、５日間の保存では上清中のタンパク質濃度はそれぞれ４．７ｍｇ／ｍＬ（２６２ｍＭ）、１．４ｍｇ／ｍＬ（３６４ｍＭ）及び０．７ｍｇ／ｍＬ（５２５ｍＭ）まで減少し、２０日間の保存では上清中のタンパク質濃度がほぼ０となった。
【００３０】
すなわち、Ｆｃ結合性タンパク質水溶液に硫酸ナトリウム（硫酸イオン、すなわちハロゲン化物以外のイオン）を含むと、塩化ナトリウム（塩化物イオン）による凝集促進が抑えられるものの、塩化ナトリウム（塩化物イオン）が２００ｍＭ以上になるとＦｃ結合性タンパク質の凝集が促進され、保存安定性が低下することがわかる。
【００３１】
実施例５  陰イオンの影響
（１）実施例１（８）で得られた脱塩後の水溶液に、純水、２Ｍ  塩化ナトリウム水溶液、２Ｍ  臭化ナトリウム水溶液、２Ｍ  ヨウ化ナトリウム水溶液、２Ｍ  リン酸二水素一ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．３）、シュウ酸ナトリウム粉末、２Ｍ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）、または２Ｍ  硫酸ナトリウム水溶液を加えることで、各陰イオン（アニオン）が２００ｍＭ含まれる水溶液となるよう調製した。この際、タンパク質濃度が一定になるように純水にて５ｍｇ／ｍＬに調整した。
（２）（１）で調整した溶液を４℃で２２日間静置保存した。
【００３２】
結果を図４に示す。純水（なし）、リン酸二水素一ナトリウム（ＰＯ４）、シュウ酸ナトリウム（シュウ酸）、クエン酸ナトリウム（クエン酸）、および硫酸ナトリウム（ＳＯ４）を添加した水溶液では、保存中に沈殿物の析出は認められず、上清中のＦｃ結合性タンパク質濃度にも変化は認められなかった。一方、塩化ナトリウム（Ｃｌ）、臭化ナトリウム（Ｂｒ）およびヨウ化ナトリウム（Ｉ）を添加した水溶液では、保存中に沈殿物の析出が進み、２２日間の保存で上清中のタンパク質濃度がほぼ０となった。特に臭化ナトリウム（Ｂｒ）およびヨウ化ナトリウム（Ｉ）を添加した液では添加直後より沈殿物が析出し、上清中のタンパク質濃度も低下した。
【００３３】
以上の結果から、Ｆｃ結合性タンパク質はハロゲン化物イオンにより凝集沈殿が促進される一方、その他の陰イオン（アニオン）には凝集促進効果はないことが判明した。
【００３４】
実施例６  長期保存安定性試験
（１）実施例１（１）から（７）と同様にＦｃ結合性タンパク質を調製し、限外ろ過膜で約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した後、純水を加えながら限外ろ過を行なうことで電気伝導度が２ｍＳ／ｃｍになるまで脱塩した。なお純水の添加速度と限外ろ過によるろ過速度が一致するよう、母液重量を電子天びんで測定して、その重量が一定になるように制御している。
（２）脱塩後、Ｆｃ結合性タンパク質が３０ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。
（３）濃縮液の一部を採取し、純水を加えることで１０ｍｇ／ｍＬのＦｃ結合性タンパク質水溶液を調製した。
（４）（２）で得られた３０ｍｇ／ｍＬのＦｃ結合性タンパク質水溶液および（３）で調製した１０ｍｇ／ｍＬのＦｃ結合性タンパク質水溶液を、０．２μｍの除菌フィルターでろ過し、滅菌済みの密閉容器に小分けした後、−２０℃、４℃、２５℃または３７℃で保存した。
（５）一ヶ月ごとに各水溶液の沈殿物生成の観察および水溶液中のタンパク質濃度の測定を行なった。
【００３５】
タンパク質濃度の推移を図５（タンパク質濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）および図６（タンパク質濃度：３０ｍｇ／ｍＬ）に示す。いずれの条件においても、５ヶ月間の保存期間中に沈殿の析出もなく、上清中のタンパク質濃度の減少も観察されなかった。
【００３６】
以上のことから本発明の保存方法により、Ｆｃ結合性タンパク質は溶液状態で長期間安定に保存できることが確認された。
【図１】
2015178468.tif 000003
【図２】
2015178468.tif 000004
【図３】
2015178468.tif 000005
【図４】
2015178468.tif 000006
【図５】
2015178468.tif 000007
【図６】
2015178468.tif 000008
【配列表】
2015178468000001.app