(57)【要約】      （修正有）【課題】ラクトコッカス・ラクティスに由来する新規なエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとして発現させるベクターを構築し、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを大腸菌内で発現させることにより、効率よく生産する方法の提供。【解決手段】ラクトコッカス属に属する微生物ラクトコッカス・ラクティス由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードする遺伝子を取り出し、該遺伝子を含有する組換えベクターを作成し、該ベクターで形質転換した形質転換体を培養する事によって、新規なエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを発現させ、精製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(ａ)、(ｂ)、又は（ｃ）の組換えタンパク質。
(ａ) 配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
(ｂ) 配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列において１個又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質
(ｃ) 配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１に記載の組換えタンパク質を有する融合タンパク質
【請求項３】
ラクトコッカス属に属する微生物ラクトコッカス・ラクティスに由来するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列表配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを採取することを特徴とするエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼに関するものである。詳しくはラクトコッカス属由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼに関するものである。更に本発明は、微生物ラクトコッカス・ラクティスに由来するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えプラスミド、該プラスミドにより形質転換された生物、該形質転換体を用いた新規エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質は動植物の組織、真核微生物の細胞膜、壁などに広く存在している。近年、糖タンパク質の糖鎖が、細胞の分化、癌化、細胞間の認識などの機構に重要な役割を果たしていることが明らかになり、その機構解明のため糖鎖の構造と機能との相関について研究が進められている。その目的達成のための手段として、糖タンパク質から糖鎖を切り出す際、あるいは糖鎖の構造の同定の際に様々なグリコシダーゼが用いられている。その中でも、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、糖タンパク質に存在するアスパラギン結合型糖鎖（Ｎ−結合型糖鎖、Ｎ型糖鎖）に作用して、糖鎖中に存在するジアセチルキトビオース部分を切断し糖鎖を遊離する作用を有する。
【０００３】
エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、糖タンパク質の糖鎖部分の還元末端側のＮ-アセチルグルコサミン部分をタンパク質に残した形で切断することができるため、糖タンパク質中の糖鎖結合部位同定や糖鎖構造、糖鎖の機能の解明に役立つと考えられる。アスパラギン結合型糖鎖は、その構造から大きく高マンノース型（マンナン型糖鎖）、ハイブリッド型及びコンプレックス型の３つに分類されるが、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで切断できる糖鎖構造と出来ないものが存在する。
【０００４】
従来知られているエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとしては、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ，Ｅｎｄｏ−Ｈ，ｅｎｄｏ−Ｈ）（非特許文献１）、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＦ（Ｅｎｄｏ Ｆ）（非特許文献２）、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＡ（ＥｎｄｏＡ）（非特許文献３）、ＥｎｄｏＭ（非特許文献４、特許文献１）、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＤ（ＥｎｄｏＤ，Ｅｎｄｏ−Ｄ，ｅｎｄｏ−Ｄ）（非特許文献５）、エンドグリコシダーゼＳ（ＥｎｄｏＳ，Ｅｎｄｏ−Ｓ，ｅｎｄｏ−Ｓ）（非特許文献６）等が挙げられるが、これらの酵素は基質特異性を持っている為、特定の糖鎖構造に対して作用し、すべての糖鎖構造を網羅的に切断できるエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは報告されていない。  乳酸菌は、効率的な糖代謝を行う為に様々なグリコシダーゼを有している事が知られており、近年、β−ガラクトシダーゼやエキソ−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アミラーゼ等が発見され、クローニングされている。
【０００５】
乳酸菌の菌体を用いた従来の育種法により酵素生産性の向上を目指すことも考えられる。しかし、従来の育種方法は、主として、紫外線や変異誘発剤によって得られる変異株から選択する方法に限られていたため、安定な変異体を単離するのが困難であった。また、従来法による育種の場合、好まざる形質変化を伴うことも多い。更に、一般的に乳酸菌は様々なタンパク質分解酵素を生成するため、糖変換を目的とした酵素を生産するには好ましいものではない。従って、これらの問題点を除去するには多段の精製ステップを踏まねばならないため、作業が繁雑となり、かつ酵素の収量も少ない。例えば、乳酸菌の一種であるラクトコッカス属に属する微生物を培養し、その培養上清より酵素の精製を行っても、プロテアーゼの混入を除くことができず、かつ菌体の酵素生産性が低いため大量調製をすることが困難であり、実用上の価値は少なかった。
【０００６】
以上のことから、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを大量生産するためには、該酵素の遺伝子を取得し、遺伝子工学的にそれを生産することが望まれている。さらに、遺伝子を取得出来れば、蛋白工学の技術を用いて、耐熱性、耐ｐＨ性の向上、反応速度が増大された酵素を得ることも期待できる。
【０００７】
ラクトコッカス・ラクティスのゲノムＤＮＡの塩基配列において、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼと推定されるアミノ酸配列をコードする遺伝子は数種類知られている。既知のＥｎｄｏ−Ｍの部分アミノ酸配列と同一性が２５％であるアミノ酸配列をもつラクトコッカス・ラクティスのタンパク質をＮＣＢＩ  ｂｌａｓｔｐで検索すると、アライメントスコアの高い６つの配列が得られる。ラクティス亜種（ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）に属するＫＦ１４７株（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＹＰ００３３５４０３１．１）、Ｉｌ１４０３株（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＰ２６７６４８．１）、ＩＯ−１株（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＹＰ００７５０８７３２．１）、ＣＶ５６株（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＹＰ００５８６８７６６．１）、亜種と株が不明のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＷＰ０１７８６４７０３．１、およびクレモリス亜種（ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）に属するＣＮＣＭ  Ｉ−１６３１株（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＷＰ００３１３００９５．１）である。しかしながら、これらは塩基配列から推定されたタンパク質であり、タンパク質を発現させて酵素活性を確認した報告はこれまでにない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−３３２５６８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａ.Ｌ.Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ ａｎｄ Ｆ. Ｍａｌｅｙ，Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２４９, ８１１−８１７ (１９７４)
【非特許文献２】Ｊ．Ｈ. Ｅｌｄｅｒ, Ｓ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ.Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９, ４５４０−４５４４ (１９８２)
【非特許文献３】Ｋ. Ｔａｋｅｇａｗａ, ｅｔ ａｌ.,Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.，５５, ３１０７−３１１２ (１９８９)
【非特許文献４】Ｓ. Ｋａｄｏｗａｋｉ, ｅｔ ａｌ.,Ａｇｒｉｃ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ.，５４, ９７−１０６ (１９９０)
【非特許文献５】Ｓ. Ｉｔｏ,  ｅｔ ａｌ.,Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ.，６３, ９３８−９４４ (１９７５)
【非特許文献６】Ｃｏｌｌｉｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｏｌｓｅｎ，Ａ．,ＥＭＢＯ  Ｊ.，２０, ３０４６−３０５５ (２００１)
【非特許文献７】Ｈａｎａｈａｎ,Ｄ. Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. １６６，５５７-５８０(１９８３)
【非特許文献８】Ｃｏｈｅｎ, Ｓ.Ｎ. ｅｔ ａｌ.，Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ., ＵＳＡ, ６９，２１１０-２１１４ (１９７２)
【非特許文献９】Ｂｅｃｋｅｒ, Ｄ.Ｍ. ｅｔ ａｌ.，Ｍｅｔｈｏｄｓ. Ｅｎｚｙｍｏｌ., １９４， １８２-１８７ (１９９０)
【非特許文献１０】Ｈｉｎｎｅｎ, Ａ.ｅｔ ａｌ.：Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ, ７５， １９２９-１９３３ (１９７８)
【非特許文献１１】Ｉｔｏｈ, Ｈ.，Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ., １５３，１６３-１６８ (１９８３)
【非特許文献１２】Ｉｎｏｕｅ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ９６，  ２３−２８（１９９０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ラクトコッカス・ラクティスに由来する新規なエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、該エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及び該エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、公知エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの部分アミノ酸配列情報をもとに、当該酵素の生産菌であるラクトコッカス・ラクティス(Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ)から調製したｇＤＮＡより当該酵素をコードする新規な遺伝子を取得することに成功した。詳細には、農業生物資源研究所に受託番号ＭＡＦＦ ５１６０３２の番号のもとに寄託されているラクトコッカス・ラクティスから調製したｇＤＮＡより、当該酵素をコードする遺伝子をクローニングしたところ、公知の６つの塩基配列とは異なっており、新規な遺伝子を取得することができた。さらに当該新規な酵素の大腸菌での発現および精製にも成功し、当該酵素の基質特異性も試験して、本発明を完成するに至った。本発明で取得したエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＬＬ（ＥｎｄｏＬＬ，Ｅｎｄｏ−ＬＬ）と命名する。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の(ａ)、（ｂ）又は(ｃ)の組換えタンパク質である。
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質
(ｃ) 配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質
【００１３】
さらに、本発明は、前記タンパク質の組換えタンパク質を有する融合タンパク質である。
さらに、本発明は、ラクトコッカス属に属する微生物ラクトコッカス・ラクティスに由来するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列表配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子である。
さらに、本発明は、前記遺伝子を含有する組換えベクターである。
さらに、本発明は、前記組換えベクターを含む形質転換体である。
さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを採取することを特徴とするエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの製造方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及びエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの製造方法が提供される。本発明の遺伝子を含有するベクターを宿主に導入し、遺伝子を発現させることによってエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを効率的、大量に生産することができる。本発明の酵素は、糖鎖の分析、解析、及び糖鎖の改変を行う上で産業上重要な酵素であり、本発明によって得られた形質転換体は本酵素を大量に生産し、これら酵素を用いる産業界に大いに貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】新規エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＬＬ遺伝子の全長を含むプラスミドＥｎｄｏＬＬ／ｐＧＥＸ−６Ｐ−１のマップである。
【図２】発現したＧＳＴ−ＥｎｄｏＬＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。
【図３】ＥｎｄｏＬＬ，Ｅｎｄｏ−Ｍ，Ｅｎｄｏ−Ｄ，Ｅｎｄｏ−Ｈ，Ｅｎｄｏ−Ｓ処理又は未処理のカイコ絹糸線産生マウスＩｇＧ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。
【図４】カイコ絹糸線から産生されたマウスＩｇＧ１の糖ペプチド断片（Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ）のＭＳスペクトルである。
【図５】ＥｎｄｏＬＬ，Ｅｎｄｏ−Ｍ，Ｅｎｄｏ−Ｄ，Ｅｎｄｏ−Ｈ，Ｅｎｄｏ−Ｓ処理又は未処理のカイコ絹糸線産生マウスＩｇＧ１の糖ペプチド断片（Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ）のＭＳスペクトルである。
【図６】ＥｎｄｏＬＬ，Ｅｎｄｏ−Ｍ，Ｅｎｄｏ−Ｄ，Ｅｎｄｏ−Ｈ，Ｅｎｄｏ−Ｓ処理又は未処理のカイコ絹糸線産生マウスＩｇＧ１  １０μｇ当たりの各糖鎖構造の抗体結合糖鎖の量（ｐｍｏｌ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ＞
本発明のタンパク質であるエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、配列番号２から選択されるアミノ酸配列を含む、もしくは該アミノ酸配列と実質的に同等なアミノ配列を含んでいる。
【００１７】
本発明において「実質的に同等なアミノ酸配列」とは、例えば、１個又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入若しくは付加による改変を有するが、ポリペプチドの活性に影響を受けないアミノ酸配列や、７０％以上の同一性を有するが、ポリペプチドの活性に影響を受けないアミノ酸配列を意味する。
【００１８】
改変されるアミノ酸残基の数は、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜数個、更に好ましくは１〜８個、最も好ましくは１〜４個である。本発明でいう「活性に影響を与えない改変されるアミノ酸残基の数は、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜数個、更に好ましくは１〜８個、最も好ましくは１〜４個である。本発明でいう「活性に影響を与えない改変」の例としては、保存的置換が挙げられる。「保存的置換」とは、ポリペプチドの活性を実質的に変化しないように１若しくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性アミノ酸残基を別の疎水性アミノ酸残基によって置換する場合、ある極性アミノ酸残基を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性(中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸 としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００１９】
本明細書における「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、当該技術分野において公知の相同性検索プログラムであるＦＡＳＴＡ３［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４（１９８８）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ］においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値である。前記同一性としては、好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、更に好ましくは９５％以上の同一性、最も好ましくは９８％以上の同一性である事ができる。
【００２０】
本発明のタンパク質は、成熟タンパク質部分に対応する各アミノ酸配列、又はそれらと実質的に同等なアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端及びアミノ酸の側鎖に、酵素活性に影響を与えない範囲で、任意のポリペプチド配列を付与する事ができる。このようなポリペプチド配列としては、例えば、シグナル配列、検出用マーカー（例えば、Ｍｙｃタグ）、精製用ポリペプチド［例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴタグ）やＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ］を挙げる事が出来る。
【００２１】
＜エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子＞
本発明のポリヌクレオチドであるエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子は、前記の本発明のタンパク質をコードする塩基配列を含む事ができ、また配列番号１に記載の塩基配列、あるいは、該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列を含む事ができる。本発明において「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温度低塩濃度溶液中で行う事を意味し、例えば、ナトリウム濃度が５０〜３００ｍＭ、好ましくは１５０ｍＭであり、温度が５０〜６８℃、好ましくは６５℃での条件をいう。
【００２２】
なお、「実質的に同等なアミノ酸配列」をコードする塩基配列は、部位特異的突然変異誘発法などを利用して調製することができる。すなわち、Ｋｕｎｋｅｌ法若しくは Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ(ＴＡＫＡＲＡ社製）、Ｍｕｔａｎｔ−Ｇ(ＴＡＫＡＲＡ社製）)などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ シリーズキットを用いて変異が導入される。
【００２３】
＜エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子の取得＞
本発明のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子は、例えば、以下の方法によりラクトコッカス・ラクティス又はその変異株から単離する事ができる。また、本発明に開示するように塩基配列が明らかとなっているため、人工的に化学合成することも可能である。
【００２４】
１．エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを生産する乳酸菌の培養
エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを生産する乳酸菌としては、ラクトコッカス属(Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属)に属する菌体、好ましくはラクトコッカス・ラクティス(Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ)、より好ましくは農業生物資源研究所（茨城県つくば市観音台２丁目１−２）に寄託されているＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ（受託番号ＭＡＦＦ５１６０３２）が挙げられる。
【００２５】
これらの菌株の培養に用いる培地組成は通常の微生物の培養に用いられるものであればどのようなものでもよい。炭素源としては、例えばグルコース、シュークロース、マンノース、ガラクトース、マルトース、可溶性デンプン、デキストリン等の糖質、窒素源としては酵母エキス、トリプトン等が挙げられる。無機塩としては上記の窒素源に含有する無機塩の他に、各種ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩等の塩類が用いられ、場合によってはビタミン類などを添加してもよい。
【００２６】
培養は培地を通常の方法で滅菌し、菌株を接種後、２５〜３０℃、ｐＨ６〜８で３〜４日間静置又は嫌気撹拌培養を行う。本発明においては、温度が２７〜３０℃、ｐＨが７、培地はＧＡＭブイヨン「ニッスイ」（日本製薬株式会社）を用いた。
【００２７】
２．ｇＤＮＡの精製
ＧＡＭブイヨン「ニッスイ」培地１０ｍＬで嫌気培養したラクトコッカス・ラクティス株を９５００ｇ、３分間で遠心し、培地をデカンテーションで除去し、菌体を集めた。集めた菌体はミニプレップ用ｓｏｌＩ  ３００μｌ に懸濁し、更に３μｌの組換えライソザイム溶液（３０ｋＵ／μＬ）を加えて、室温で１時間半インキュベーションした。この溶液をー８０℃のフリーザーに移し５分静置して凍結させた後、室温に戻して融解した。次いで、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０、１％  ＳＤＳ  ３００μｌを加え、６０℃、１０分インキュベーションしてから急冷した。
【００２８】
次いで、５Ｍ  ＮａＣｌを２５分の１量加えてフェノール／クロロホルム抽出を２回、クロロホルム抽出を２回行った後に、２−Ｐｒｏｐａｎｏｌ  ６００μｌを加えて穏やかに懸濁し、室温で１０分静置した。糸状に析出したｇＤＮＡを７０％  ＥｔＯＨで洗浄し、３０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含む１００μｌのＴＥ溶液で溶解して３７℃、１時間インキュベーションした。この溶液にＰＥＧ溶液（１．６Ｍ  ＮａＣｌ、１３％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００）を等量加え、４℃で一晩静置した後に４℃、１７９００ｇで遠心し、得られたペレットを７０％  ＥｔＯＨで洗浄し、ＴＥ１００μｌに溶解させてゲノムＤＮＡ溶液を得た。
【００２９】
３．エンド-β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子の単離
このようにして得られたｇＤＮＡを鋳型として、設計したプライマーでＰＣＲを行う事により所望のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子を単離する事が出来る。
【００３０】
＜組換え発現ベクター及び形質転換された生物の作製＞
本発明においては、配列番号２に記載されるアミノ酸配列、又はその改変アミノ酸配列をコードする塩基配列を含んだＤＮＡ分子を、宿主生物内で複製可能で、かつそのＤＮＡ分子がコードするタンパク質を発現可能な状態で含む発現ベクターが提供される。本発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない。例えば、プラスミドを基本に構築する事ができる。また、本発現ベクターは、宿主生物に導入された時、その宿主生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
【００３１】
（１）組換えベクターの作製
本発明において利用されるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案しながら、ウイルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択できる。例えば、宿主細胞が大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、ｐＢＲ系（ｐＢＲ３２２, ｐＢＲ３２５等)、ｐＵＣ系(ｐＵＣ１１８, ｐＵＣ１１９等）のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド（ｐＵＢ１１０等)、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＣｐ系のベクター(例えばＹＥｐ１３, ＹＥｐ２４, ＹＣｐ５０等)が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００３２】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター ＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、形質転換体の選択マーカーを含むのが好ましく、選択マーカーとしては薬剤耐性マーカー、栄養要求マーカー遺伝子を使用することができる。さらに、本発明の発現ベクターとしてのＤＮＡ分子は、新規エンド-β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、転写開始信号、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結シグナルなどの転写調節信号、翻訳調節信号などを有しているものが好ましい。
【００３３】
（２）形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ)等のシュードモナス属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ)、キャンディダ・ボイジニイ(Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ)、ピキア・パストリス(Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ)等の酵母が挙げられる。
【００３４】
宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母以外に、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＤＨ５α、ＪＭ１０９などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ)ＭＩ １１４、２０７-２１などが挙げられる。枯草菌にはタンパク質を菌体外へ分泌する株が存在することが知られている。またプロテアーゼを殆ど分泌しない株も知られており、このような株を宿主として用いることも好ましい。
【００３５】
プロモーターとしては、挿入断片に含まれる宿主中でも機能することができるプロモーターはもちろんのこと、大腸菌においてはラクトースオペロン（ｌａｃ）、トリプトファンオペロン（ｔｒｐ）等のプロモーターが挙げられる。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法［非特許文献８］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３６】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ)、カンジダ・ウティリス(Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、酸性フォスファターゼ（ＰＨＯ）、ガラクトース遺伝子（ＧＡＬ）、グリセルアルデビド３リン酸脱水素酵素遺伝子（ＧＡＰＤＨ）等のプロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を好ましく用いることができる。
【００３７】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法[非特許文献９]、スフェロプラスト法[非特許文献１０]、酢酸リチウム法[非特許文献１１]等が挙げられる。動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ-７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。
【００３８】
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００３９】
＜エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの生産＞
本発明のタンパク質は、本発明の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するもの、または該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸に前記変異が導入されたアミノ酸配列を有し、かつエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するものである。本発明のタンパク質は、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００４０】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
【００４１】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で１２〜７２時間行う。培養期間中、ｐＨは４〜７.５に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４２】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸(ＩＡＡ)等を培地に添加してもよい。
【００４３】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２〜１０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより本発明のタンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。
【００４４】
組換え新規エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの精製は、公知の分離、精製方法を適当に組み合わせて行なうことができる。例えば、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグなどのタグを付加させて発現させた上でのアフィニティークロマトグラフィー、塩沈殿、溶媒沈殿のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過およびＳＤＳ-ポリアクリル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、さらに等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法等が挙げられる。
【００４５】
本発明においては、後記する実施例に示すように、エッシェリヒア・コリを宿主としてｌａｃプロモーターおよびｔａｃプロモーターの支配下にＮ末端側にＧＳＴタグを融合させてこの遺伝子を発現させたところ、細胞抽出液中に高い酵素活性が認められた。このことにより、組換え体において本発明の遺伝子を発現することによって活性型の新規エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを大量に生産可能であることが示された。
【００４６】
＜エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの機能＞
エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、糖タンパク質に存在するアスパラギン結合型糖鎖（Ｎ−結合型糖鎖、Ｎ型糖鎖）に作用して、糖鎖中に存在するジアセチルキトビオース部分を切断し、糖タンパク質・糖ペプチドの糖鎖部分の還元末端側のＮ-アセチルグルコサミン部分をタンパク質に残した形で切断することができるため、糖鎖結合部位の同定や糖鎖構造決定に有用である。本発明のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、カイコ絹糸線産生マウスＩｇＧ１に結合しているＭ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９の糖鎖を切断し、糖鎖の構造を改変する事ができた。
【００４７】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、操作手順は特に記載しない限りＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ: Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ (Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 Ｍａｎｉａｔｉｓら、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ(１９８９))に記載の方法に従った。
【実施例】
【００４８】
＜実施例１＞  新規エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの調製
（１）新規エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＤＮＡのクローニング
既知のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの部分アミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列をもつタンパク質を産生するラクトコッカス・ラクティスの該アミノ酸配列をＮＣＢＩ  ｂｌａｓｔｐにて検索し、相当するゲノム配列を元にプライマーを設計した。以下にセンス、アンチセンスのプライマー配列を記す。
ＥｎｄｏＬＬ−１２Ｆ（センスプライマー）
５'  ｔｔｇｇａｇｇａｔｔｔｔａｔｇａａａａａａｔｃｇ  ３'  （配列番号３）
ＥｎｄｏＬＬ  ｓｔｏｐＲ（アンチセンスプライマー）
５'  ｔｃａｇｃｔａｔｔｔｔｔｔｔｇｔｃｃｔａａｔａｃｔｔｇ  ３'  （配列番号４）
【００４９】
農業生物資源研究所に受託番号ＭＡＦＦ ５１６０３２の番号のもとに寄託されているラクトコッカス・ラクティスから抽出したｇＤＮＡをテンプレートにして上記プライマーでＰＣＲを行い、増幅された２．８ｋｂｐｓの断片を０．８％アガロースゲル電気泳動にて分離して切り出した後、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。このＤＮＡ断片をテンプレートとしてさらに以下のセンス、アンチセンスのプライマーでＰＣＲを行った。
６Ｐ１−ＥｎｄｏＬＬ−Ｆ（センスプライマー）
５'  ｇｇｇｃｃｃｃｔｇｇｇａｔｃｃａａａａａａｔｃｇａａａａａａ  ３'  （配列番号５）
６Ｐ１−ＥｎｄｏＬＬ−Ｒ（アンチセンスプライマー）
５'  ａｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔａｇｃｔａｔｔｔｔｔｔｔｇ  ３'  （配列番号６）
【００５０】
増幅された２．８ｋｂｐｓの断片を０．８％アガロースゲル電気泳動にて分離して切り出した後、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。この断片とＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断した線状のｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターでＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にてプラスミドＥｎｄｏＬＬ／ｐＧＥＸ−６Ｐ−１を構築した（図１）。
【００５１】
本手法で作成された新規エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、自動塩基配列決定機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製３７３０ｘ１  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて配列決定を行い、その配列は配列表の配列番号１に示す。
【００５２】
＜実施例２＞  新規エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの大腸菌での発現
宿主としては大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）株を用いた。形質転換は井上らの（非特許文献１２）の方法に従った。選抜はカルベニシリンを５０μｇ／ｍｌとなるよう添加したＬＢ寒天培地上で行い、生育したコロニーをカルベニシリンを５０μｇ／ｍｌとなるよう添加したＬＢ液体培地に植菌して３７℃で培養して、ＯＤ６００が０．８に達した時点で培養液を急冷しＩＰＴＧを終濃度５０μｇ／ｍｌとなるよう加えた。培養液は２０℃で一晩回転振盪培養を行った後に集菌した。
【００５３】
集菌した菌体をＮＥＴＮ緩衝液（５０ｍＭトリス緩衝液  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＮＰ−４０）に懸濁し、ＱＳｏｎｉｃａ社  Ｑ１２５（ワケンビーテック）にて超音波破砕した。破砕液を遠心分離し分離上清にＧＳＴ−Ａｃｃｅｐｔ（ナカライテスク）ゲルを加え、４℃で２時間回転振盪培養してアフィニティークロマトグラフィーによりＧＳＴ融合ＥｎｄｏＬＬを回収した。ＧＳＴ融合ＥｎｄｏＬＬが吸着したゲルをＮＥＴＮ緩衝液で洗浄した後、ＮＥＴ緩衝液（５０ｍＭトリス緩衝液  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）でさらに洗浄した。ＮＥＴ緩衝液を等量加えた洗浄後のゲルにＴｕｒｂｏ３Ｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅを添加して４℃で一晩回転振盪培養し、樹脂に吸着させたまま酵素消化を行った。酵素消化後の上清を回収して精製ＥｎｄｏＬＬとした。
【００５４】
得られたＥｎｄｏＬＬのアミノ酸配列は、配列番号２になり、同じ反応メカニズムを持つエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであるＥｎｄｏ−Ｍ，Ｅｎｄｏ−Ｄ，Ｅｎｄｏ−Ｈ，ＥｎｄｏＳとＥｎｄｏＬＬのアミノ酸配列の同一性を比較した結果、それぞれ２５％（Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ：５ｅ−３０），２９％（Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ：３ｅ−７９），０％，０％であった。
【００５５】
＜実施例３＞  ＥｎｄｏＬＬによるカイコ絹糸線産生マウスＩｇＧ１の加水分解反応とＳＤＳ−ＰＡＧＥによる確認
カイコ絹糸線産生のマウスＩｇＧ１（１ｍｇ、免疫生物研究所）とＥｎｄｏＬＬ（２μｇ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中に加え、総量５００μｌとして３７℃で１７時間静置した。この反応液に５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＡｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ（プロテノバ社）７５μｌを加えて室温で３時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。４５０μｌのＰＢＳで５分間洗浄する作業を計３回行った担体に１５０μｌの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）を加え室温で５分間振盪し、溶出させ、溶出液に１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を２．５μｌ加えて中和した。この溶出作業を計３回行い、その溶出液をまとめてアミコンウルトラ−０．５（ＮＭＷＬ３０ｋＤａ）で濃縮しＰＢＳに置換した。得られた９６５μｇのマウスＩｇＧ１のうち０．５μｇを加水分解前のマウスＩｇＧ１同量と並べて１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動して分子量を確認した。ＥｎｄｏＬＬで加水分解を行った場合は切断された物と切断されない物が存在することが確認された（図３）。
【００５６】
＜比較例１＞  Ｅｎｄｏ−Ｍ，Ｅｎｄｏ−Ｄ，Ｅｎｄｏ−Ｈ，ＥｎｄｏＳによるカイコ絹糸線産生マウスＩｇＧ１の加水分解反応とＳＤＳ−ＰＡＧＥによる確認
カイコ絹糸線から産生されるマウスＩｇＧ１（４μｇ）およびＥｎｄｏＳ、Ｒｅｍｏｖｅ−ｉＴ  Ｅｎｄｏ−Ｄ、Ｅｎｄｏ−Ｈ（ＮＥＢ）またはＥｎｄｏ−Ｍ（東京化成）単体（１μｇ）を緩衝液中に加え、総量２０μｌとして３７℃で６時間静置した。緩衝液はＥｎｄｏ−Ｓ、Ｒｅｍｏｖｅ−ｉＴ  Ｅｎｄｏ−Ｄの場合、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を、Ｅｎｄｏ−Ｈの場合５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を、Ｅｎｄｏ−Ｍの場合、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた。反応後のマウスＩｇＧ１（０．５μｇ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動して分子量を確認した（図３）。
【００５７】
＜実施例４＞  マウスＩｇＧ１糖ペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇの解析
カイコ絹糸線産生のマウスＩｇＧ１（１５μｇ）を１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（３０μＬ）に溶かし、１．０％（ｗ／ｖ）ＲａｐｉＧｅｓｔ水溶液（３μＬ）、を加え、９０℃で１５分間加熱し、室温で３０分間静置する。この溶液にシークエンスグレードのトリプシン（０．２５ｍｇ／ｍｌ，５μＬ）を加え、３７℃で１２時間反応させる。反応溶液を９０℃３０分間、加熱する事により酵素を失活させ、Ｇ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、濃縮する。これにＤＭＦ（５μＬ）を加え、６０℃５分間、加熱し、２００ｍＭ無水安息香酸−メタノール溶液（１００μＬ）を加え、超音波洗浄機を用いて３０分間超音波しながら反応を行い、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６０μＬ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。その後、水（２００μＬ）を加え、ＥｔＯＡｃ（４００μＬ）にて３回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物をＧ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、Ｃ１８  Ｓｐｉｎカラム（１０ｍｇ）にロードし、水（２ｍＬ）で十分洗浄した後に、２５％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）、５０％アセトニトリル水溶液  （６５０μＬ）で回収し、減圧濃縮を行った。この試料に水（２０μＬ）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ｗｅｔ５０μＬ）、エタノール（１００μＬ）、ｎ−ブタノール（４００μＬ）の順番で加え、室温で１時間、撹拌する。その後、溶液をエンプティカラムに移してｎ−ブタノール：エタノール：水＝８：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）（２ｍＬ）で洗浄し、エタノール：水＝１：２（ｖ／ｖ）（２ｍＬ）でマウスＩｇＧ１糖ペプチドを回収し、減圧濃縮した。
【００５８】
この試料を水（１０μＬ）に溶かし、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上に０．５μＬ添加し、ＤＨＢＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ  ｏｆ  ５０％アセトニトリル水溶液）（１μＬ）と混合し、乾固させた。島津製作所製ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳ装置（ＡＸＩＭＡ−Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いてｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅでＭＳ測定を行った。
【００５９】
結果を図４に示す。ＭＳ測定により、Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇにパウチマンノース型Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝１９９２．１９、２１５４．２８、２３１６．３６と複合型ＧＮ１、ＧＮ２の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２３５７．３９、２５６０．５１とハイマンノース型Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２４７８．４４、２６４０．５３、２８０２．６３、２９６４．７２、３１２６．８４を検出した。
【００６０】
＜実施例５＞  カイコ絹糸線産生マウスＩｇＧ１のＥｎｄｏＬＬによる消化の解析
ＥｎｄｏＬＬによって処理が施されたカイコ絹糸線産生マウスＩｇＧ１（１５μｇ）をそれぞれ１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（３０μＬ）に溶かし、１．０％（ｗ／ｖ）ＲａｐｉＧｅｓｔ水溶液（３μＬ）、を加え、９０℃で１５分間加熱し、室温で３０分間静置する。この溶液にシークエンスグレードのトリプシン（０．２５ｍｇ／ｍｌ，５μＬ）を加え、３７℃で１２時間反応させる。反応溶液を９０℃３０分間、加熱する事により酵素を失活させ、Ｇ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、濃縮する。これにＤＭＦ（５μＬ）を加え、６０℃５分間、加熱し、２００ｍＭ無水安息香酸−メタノール溶液（１００μＬ）を加え、超音波洗浄機を用いて３０分間室温で超音波しながら反応を行い、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６０μＬ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。その後、水（２００μＬ）を加え、ＥｔＯＡｃ（４００μＬ）にて３回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物をＧ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、Ｃ１８  Ｓｐｉｎカラム（１０ｍｇ）にロードし、水（２ｍＬ）で十分洗浄した後に、２５％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）、５０％アセトニトリル水溶液  （６５０μＬ）で回収し、減圧濃縮を行った。この試料に水（２０μＬ）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ｗｅｔ５０μＬ）、エタノール（１００μＬ）、ｎ−ブタノール（４００μＬ）の順番で加え、室温で１時間、撹拌する。その後、溶液をエンプティカラムに移してｎ−ブタノール：エタノール：水＝８：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）（２ｍＬ）で洗浄し、エタノール：水＝１：２（ｖ／ｖ）（２ｍＬ）でマウスＩｇＧ１糖ペプチドを回収し、減圧濃縮した。
【００６１】
この試料を水（１０μＬ）に溶かし、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上に０．５μＬ添加し、ＤＨＢＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ  ｏｆ  ５０％アセトニトリル水溶液）（１μＬ）と混合し、乾固させた。島津製作所製ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳ装置（ＡＸＩＭＡ−Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いてｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅでＭＳ測定を行った。
【００６２】
ＭＳ測定では、Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇにパウチマンノース型Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝１９９２．１９、２１５４．２８、２３１６．３６と複合型ＧＮ１、ＧＮ２の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２３５７．３９、２５６０．５１とハイマンノース型Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２４７８．４４、２６４０．５３、２８０２．６３、２９６４．７２、３１２６．８を検出した。
【００６３】
＜比較例２＞  カイコ絹糸線産生マウスＩｇＧ１のＥｎｄｏ−Ｍ，Ｅｎｄｏ−Ｄ，Ｅｎｄｏ−Ｈ，ＥｎｄｏＳによる消化の解析
Ｅｎｄｏ−Ｍ，Ｅｎｄｏ−Ｄ，Ｅｎｄｏ−Ｈ，ＥｎｄｏＳによって処理が施されたカイコ絹糸線産生マウスＩｇＧ１（１５μｇ）をそれぞれ実施例４と同じ手法を用いてＭＳ測定を行い、解析した。
【００６４】
結果を図５に示す。また、ＥｎｄｏＬＬによる消化により得られた各糖鎖の強度比をエ処理していない抗体の糖鎖の強度比と重ね合わせて棒グラフを作成し、当該ＥｎｄｏＬＬによりどの糖鎖が切断できたかを分析した。分析の結果を図６に示す。これにより、当該ＥｎｄｏＬＬは、カイコ絹糸線産生マウスＩｇＧ１のＭ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９の糖鎖を切断する基質特異性を持つ事が判明した。また、アミノ酸配列の同一性の近いエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであるＥｎｄｏ−Ｍ（２５％），Ｅｎｄｏ−Ｄ（２９％）よりも全く同一性の無いＥｎｄｏ−Ｈ（０％）と同等の基質特異性を持っている事が分かった。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明により得られた新規エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥｎｄｏＬＬ）は、糖ペプチド、糖タンパク質の糖鎖を切断、改変する製造工程に使用する事ができる。また、新規エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥｎｄｏＬＬ）の基質特異性を用いて糖ペプチド、糖タンパク質の糖鎖を解析する事が出来る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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