(57)【要約】【課題】  生物活性物質をさらなる機能性を付与できる形態でＰＥＧ化できるＰＥＧ誘導体の提供【構成】  一末端がジホルミル基を末端基とし、他の末端がホルミル基と異なる官能基を末端基とするポリエチレングリコールが提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される多官能基を末端基とするポリエチレングリコールまたはその保護形態物。
【化１】
2015024980.tif 000005
式中、Ａ１はＸ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２Ｙを表し、
Ａ２はＣ（＝Ｏ）Ａ１を表すか、または水素もしくはＣＨ３を表し、かつ、
Ｘは−ＮＨ−または−Ｏ−を表し、
ＹはＯＨ、ＣＨ３、ＳＨ、Ｎ３、ＣＯＯＨまたはマレイミド基を表し、
ｎは５〜５０００の整数を表し、Ａ２がＣ（＝Ｏ）Ａ１を表すとき各ｎは同一または異なることができる。
【請求項２】
少なくとも１つの反応しうるアミノ基を分子中に有する生物活性物質と反応しうる請求項１に記載の多官能基を末端基とするポリエチレングリコールを反応体とする生物活性物質を修飾するためのポリエチレングリコール化作用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多官能基をα、ω−末端基とするポリエチレングリコールに関し、より具体的には、一方の官能基を保持したままタンパク質等の生物活性物質をポリエチレングリコールで効果的に修飾できるポリエチレングリコール誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品候補となるタンパク質の生体内での動態を改善する技術としてポリエチレングリコール化（ＰＥＧ化：ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）が有用であり、これまでにいくつものＰＥＧ化タンパク質が医薬品として上市されてきた。なかでもタンパク質に結合した際に分岐型となる枝分かれＰＥＧは近年特に注目され新規の医薬品開発が困難な昨今の状況においても新規のＰＥＧ化医薬品開発に貢献している（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、ＰＥＧ化に伴いタンパク質の活性が大きく損なわれ開発に至らなかったタンパク質も多い。
【０００３】
現在広く用いられているＰＥＧ化の技術は、活性エステルを末端基とするＰＥＧをタンパク質のアミノ基と反応させ、アシル化によりＰＥＧ化タンパクを調製する方法である。このＰＥＧ化の技術では、アミド結合によりアミノ基の塩基性は大きく変化してしまうため、しばしばタンパク質活性の大幅な減少を招いてしまう。そのため、アミノ基の塩基性を維持したままＰＥＧ化タンパク質を調製する技術の確立が望まれている。これまでにアルデヒド末端の還元アミノ化などによりアミノ基を残存させる研究が行われているが、反応条件の厳しさ、反応効率の悪さ及び副生成物の問題などから、医薬品としての効果が期待されながらも現状のＰＥＧ化技術では開発に至らなかったタンパク質も数多く存在する。そこで本発明者等は中性付近の温和な条件で効率よく反応し、これまでとは全く異なる結合様式にてタンパク質、その他の生物活性物質のアミノ基をアルキル化によってＰＥＧ化する技術の開発し、その技術内容を特許文献１で開示した。かようなアルキル化は、２本のＰＥＧ鎖を分子中の置換基とし、２つのホルミル基を両末端基とするアルキル基を用いることにより効果的な分岐型となる枝分かれＰＥＧ化可能にする。
【０００４】
他方、ドラッグデリバリーシステムやバイオセンサー表面の開発にこれまで広く利用しうるＰＥＧ化作用剤として下記に示すに官能基を末端基とするポリエチレングリコールも開発され、市販されているものもある。これらは、例えば、バイオセンサー等の表面を一方の官能基を利用してＰＥＧ化し、もう一方の官能基を利用して当該表面をさらに修飾することが可能である。
【０００５】
【化１】
2015024980.tif 000002
【０００６】
しかし、これらの二官能基を末端基とするポリエチレングリコールも、それらを用いるＰＥＧ化により多くのタンパク質が活性を失う結果をもたらす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／０８９１８２
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９５，Ｖｏｌ．６，ｐ．６２−６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、タンパク質、また、その他の生物活性物質を効果的にＰＥＧ化できると同時に、ＰＥＧ化薬物等のさらなる修飾を可能にする手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
２つのホルミル基を両末端基とするアルキル基を形成しうる化合物に、予め、２つ異なる官能基を末端基とするＰＥＧ鎖をその一方の官能基を介して結合せしめ、その後、当該化合物のホルミル化処理等を実施することにより、当該ホルミル基の反応性に悪影響を及ぼすことなく、ＰＥＧ鎖の他方の官能基を利用可能な状態で保持した当該アルキル基が製造できることを見出した。
【００１１】
したがって、本発明は前記課題を解決するための手段として、こうして製造される化合物を提供する。具体的には、下記式（Ｉ）で表される多官能基を末端基とするポリエチレングリコールまたはその保護形態物を提供する。
【００１２】
【化２】
2015024980.tif 000003
【００１３】
式中、Ａ１はＸ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２Ｙを表し、
Ａ２はＣ（＝Ｏ）Ａ１を表すか、または水素もしくはＣＨ３を表し、かつ、
Ｘは−ＮＨ−または−Ｏ−を表し、
ＹはＯＨ、ＣＨ３、ＳＨ、Ｎ３、ＣＯＯＨまたはマレイミド基を表し、
ｎは５〜５０００の整数を表し、Ａ２がＣ（＝Ｏ）Ａ１を表すとき各ｎは同一または異なることができる。
【００１４】
式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコールは、分子中の２つのホルミル基を介して少なくとも１個のアミノ基を有するタンパク質をはじめとする生物活性物質、バイオセンサー表面を穏和、かつ、選択的にＰＥＧ化できる効果を奏する。
【００１５】
したがって、本発明は別の態様として、タンパク質をはじめとする生物活性物質、バイオセンサー表面を修飾するための式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコールまたは化合物の使用も提供する。
【００１６】
以下、本発明をより具体的に説明する。
【００１７】
本発明にいう、「保護形態物」とは、式（Ｉ）における官能基Ｙが、必要により、保護または活性化された形態にある物質を意味する。かような保護または活性化された形態は、ＯＨにあっては、アセチル、クロロアセチル、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、トリチル基により保護された形態、ＳＨにあっては、ピリジルジスルフィド体、ＣＯＯＨにあっては、ハロゲン化されていてもよいＣ１−Ｃ６アルカノール、ハロゲンとのエステル形態、スクシンイミド体、酸無水物であることができる。
【００１８】
本願発明に関して、ＰＥＧ化とは、タンパク質、ペプチドまたは非ペプチド分子の１以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の共有結合を介する修飾を意味する。かようＰＥＧ化は、理論に拘束されるものではないが、前記式（Ｉ）で表される多官能基を末端基とするポリエチレングリコールにおける分子中の２つのホルミル基（またはアルデヒド基）が一緒になって、少なくとも１つの反応しうるアミノ基を有する化合物、例えば、生物活性物質である、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、その他の低分子有機化合物の１つのアミノ基と反応して環構造を有するアミン化合物を形成するように進行するものと理解されている。反応しうるアミノ基とは、かような２つのアルデヒド基と反応できる状態にあるアミノ基を意味し、該当する生理活性物質の分子の如何なる位置またはバイオセンサー表面に存在するものであっても制限することなく包含される。このようなアミノ基は、該当する分子中、或は、当該表面上に固定ないし共有結合された状態にあることができる。また、生物活性物質は、医療用、例えば、治療用または診断用タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、アプタマー等）であることができる。タンパク質は、糖タンパク質、リポタンパク質を包含する概念として使用しており、それらには、天然由来のもの、遺伝子操作による組換え由来のもの、融合タンパク質が包含される。
【００１９】
生理活性物質としては、医療用、例えば、治療用または診断用タンパク質またはペプチドが好ましく、酵素（例えば、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ等）、サイトカイン（例えば、インターロイキン１、２、６、等、インターフェロンα、β、γ、腫瘍壊死因子、リンホトキシン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、等）、可溶性受容体タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子受容体、各種インターロイキン受容体、チロシンキナーゼ受容体等由来）、ホルモン（例えば、インスリン、ヒト成長ホルモン等）、抗体（例えば、抗癌用、抗アレルギー用および抗感染症用抗体）ならびにこれらの活性フラグメント等を挙げることができる。
【００２０】
式（Ｉ）における各ｎは、一般的に、本発明の目的に沿う限りいかなる整数であることもでき、限定されるものでないが、一般に、５〜５０００、好ましくは８〜３０００、より好ましくは１２〜１００、特に好ましくは２０〜７００であることができる。
【００２１】
式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコールは、典型的には、後述する実施例に示され反応スキームに従う方法またはそれに準じる方法により製造できる。また、そこに記載される中間体（例えば、反応スキーム中のジカルボン酸：化合物２またはモノカルボン酸：化合物３）の、式（Ｉ）におけるＸ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２Ｙに対応する、式Ｈ−Ｘ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２Ｙ（式中、ＸおよびＹは式（Ｉ）で定義したのと同義である）で表される化合物またはＹが保護された形態にある化合物のアミド化またはエステル化反応により製造できる。かようなアミド化またはエステル化には、一般的なアミド化またはエステル化に常用されている反応条件が使用できる。
【００２２】
こうして製造された式（Ｉ）の多官能基を末端基とするポリエチレングリコールは、そのジホルミル基を介して、アミノ基を分子内に有する遊離化合物または材料表面上もしくは材料チップ等に固定化されたアミノ基と反応して当該分子または表面をホルミル基以外の一定の官能基を末端基とするＰＥＧにより修飾できる。このような反応は、例えば、水、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の如き反応溶媒中で、必要があれば、緩衝化された溶液中、冷却温度（例えば、４℃）〜１００℃、好ましくは、４〜３７℃の温度で、目的の反応が完了するまで反応せしめることにより、達成することができる。具体的な当該反応条件は、特許文献１の例２または例５に記載の条件を参照できる（特許文献１は、ここに引用することによって、その内容のすべてが本明細書に取り込まれる）。
【００２３】
したがって、本発明の多官能基を末端基とするポリエチレングリコールは、ジホルミル基以外の官能基に、悪影響を及ぼすことのない、穏和な反応条件によりタンパク質等のアミノ基を選択的、かつ効果的に修飾することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、限定されるものでないが、本発明関して、具体例を挙げながらさらに具体的に説明する。
【実施例】
【００２５】
例１：製造例
本発明に従う、多官能基を末端基とするポリエチレングリコールは次の反応スキームにより製造した。
【００２６】
【化３】
2015024980.tif 000004
【００２７】
（１）化合物３は（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２６（２），  ４５１−２；  １９８９）に記載の方法に従い合成した。化合物３（６７．２ｍｇ）に塩化チオニル１ｍｌ，塩化メチレン０．５ｍｌを加え６０℃で２時間反応させた。反応液をエバポレーターで濃縮し、残留物を塩化メチレン（１ｍｌ）に溶解させ塩化メチレン（１ｍｌ）とピリジン（１ｍｌ）に溶解させたＮＨ２Ｃ３Ｈ６Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）１０５Ｃ２Ｈ４ＳＨ（ＳＨ−０５０−ＰＡ）（３００ｍｇ）に氷冷下で加えた。その後室温で二日間反応させた。反応ご溶媒をエバポレーションで除き、残留物をイソプロパノールで再沈し、ベンゼンにより凍結乾燥し化合物４を得た。（収率７５％）
ＧＰＣ：Ｍｎ＝４１８４；Ｍｗ＝４９９８：Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１９０
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：理論値［Ｍ＋Ｈ］＋  ４９９４．０２１；実験値  ４９９４．８３５
ＮＭＲ  １Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）  ５．６６（４Ｈ），３．８３‐３．４５（３７２Ｈ  ｍ），３．３８（２Ｈ），３．３５（２Ｈ），３．１０（２Ｈ），２．６５（８Ｈ），１．５８（２Ｈ）。
【００２８】
（２）化合物４（２００ｍｇ）をアセトン（２．５ｍＬ）、水（２．５ｍＬ）、アセト二トリル（２ｍＬ）に溶解させ、Ｎ−メチルモルホリンＮ−オキシド（７２ｍｇ）、マイクロカプセル化四酸化オスミウム（１４ｍｇ）を加えた。室温にて４８時間振とうさせた。反応後、ろ過により四酸化オスミウムを取り除き、エバポレートし反応物を濃縮した。続いて、冷凍庫で冷した２−プロパノール（２００ｍＬ）で再沈殿を行った。遠心分離により反応物を分離させ、上澄み液を除いた。反応物をメタノールに溶かし２００ｍＬナスフラスコに回収し、エバポレーターにて反応物を濃縮させ、再び再沈殿を行った。再沈殿は３回行った。３回目のエバポレーターが終了後、１，４−ジオキサン５ｍＬに反応物を溶解させ、凍結乾燥を行った。得られ化合物５（１２０ｍｇ）を水（５００μＬ）とメタノール（２０００μＬ）に溶解させ過ヨウ素酸ナトリウム（１４ｍｇ）を加え、２５分間攪拌した。反応後、ジクロロメタンを用いて抽出し、硫酸ナトリウムにより脱水し、エバポレーターにより反応物を濃縮した。１，４−ジオキサン５ｍＬに反応物を溶解させ、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、化合物６を得た。化合物４からの収率３０％
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ：理論値［Ｍ＋Ｈ］＋  ５０５８．０２１；実験値  ５０５５．１２２
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）  ９．７３（４Ｈ），３．８３‐３．５６（３７２Ｈ，ｍ），３．４４（２Ｈ），３．３２（２Ｈ），３．１０（２Ｈ），２．９２（４Ｈ），２．７２（４Ｈ），１．５８（２Ｈ）。
【００２９】
（３）化合物６（２５ｍｇ）を０．１５Ｍの炭酸カリウム水溶液中で１５分間撹拌し反応させた後１Ｍ塩酸水溶液によりｐＨ１にした。その後、ジクロロメタンを用いて抽出し、硫酸ナトリウムにより脱水し、エバポレーターにより反応物を濃縮した。１，４−ジオキサン５ｍＬに反応物を溶解させ、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、化合物７を収率５８％
で得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ），９．７９（２Ｈ），３．８３−３．５３（３７２Ｈ，ｍ），３．３０（２Ｈ），３．１０（１Ｈ），２．７０（２Ｈ），２．６７（２Ｈ），２．３２（２Ｈ），１．５８（２Ｈ）。
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ：理論値［Ｍ＋Ｎａ］＋  ４９５３．８９３；実験値  ４９５４．８０１
ＩＲ  １６４６．９１ｃｍ−１にアルデヒド  ３４６２．５６ｃｍ−１にアミドのピークを確認した。またエルマン試験によりチオールの存在を確認した。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明の多官能基を末端基とするポリエチレングリコールは、一方の官能基であるジホルミル基を介して生物活性物質のアミノ基をＰＥＧ化でき、もう一方の官能基はその後利用できる形態にあるので、生物活性物質をさらなる機能性を付与できる形態でＰＥＧ化するのに利用できる。したがって、医薬製造業等で利用できる。