(57)【要約】      （修正有）【課題】十分な特異性と感度を有し、従来の技術による複雑なステップを削減して時間と労力を節約できる、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１Ｂ）とアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ２）を検出する方法及び試薬並びに、アルコール摂取後のがん罹患リスクが高い個体を検出する方法及びキットの提供。【解決手段】ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型と、ＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型とを検出することで、個体にアルコール摂取に起因するがん罹患リスクに関する情報を取得することができるプライマーセット。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型を検出するために使用され、以下のヌクレオチド配列を含む、プライマーセット。
（ａ）オリゴヌクレオチド１：ＧＴＡＧＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＡＧＡＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＴＴＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列、又は配列番号１に対し相補的な配列とストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
（ｂ）オリゴヌクレオチド２：ＡＧＴＧＣＣＴＧＡＡＴＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＴＴＧＧＧＴＣＡ（配列番号２）を含むヌクレオチド配列、又は配列番号２に対し相補的な配列とストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチド１の配列は配列番号１で示され、並びに、前記オリゴヌクレオチド２の配列は配列番号２で示される、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
ＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型を検出するために使用され、以下のヌクレオチド配列を含む、プライマーセット。
（ａ）オリゴヌクレオチド３：ＡＡＧＡＧＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＣＴＣＧＴＴＴＣ（配列番号３）を含むヌクレオチド配列、又は配列番号３に対し相補的な配列とストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
（ｂ）オリゴヌクレオチド４：ＴＴＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＧＣＣＴＣＡＡ（配列番号４）を含むヌクレオチド配列、又は配列番号４に対し相補的な配列とストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチド３の配列は配列番号３で示され、並びに、オリゴヌクレオチド４の配列は配列番号４で示される、請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項５】
請求項１と３に記載のプライマーセットを含む、プライマー組成物。
【請求項６】
請求項２と４に記載のプライマーセットを含む、請求項５に記載のプライマー組成物。
【請求項７】
被検サンプルにおけるＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型及びＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型を検出するために使用され、以下のステップを含む、方法。
（ａ）ＡＤＨ１Ｂ遺伝子増幅産物とＡＬＤＨ２遺伝子増幅産物を得るように、請求項５に記載のプライマー組成物により、被検サンプルにおけるＡＤＨ１Ｂ遺伝子とＡＬＤＨ２遺伝子をワンチューブ内で増幅させるステップ；
（ｂ）シークエンシングプライマーＧＴＡＧＧＧＡＴＴＡＧＴＡＧＣＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＡＴＡＣ（配列番号５）により、得られたＡＤＨ１Ｂ遺伝子増幅産物をシークエンシングするステップ；及び
（ｃ）シークエンシングプライマーＡＡＧＡＧＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＣＴＣＧＴＴＴＣ（配列番号６）により、得られたＡＬＤＨ２遺伝子増幅産物をシークエンシングするステップ；
これにより、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型とＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型を検出する。
【請求項８】
前記プライマー組成物が、請求項２と４に記載のプライマーセットを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記被検サンプルはヒトの細胞、血液や体液またはＤＮＡの抽出物である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法を使用することを含む、アルコール摂取後のがん罹患リスクが高い個体を検出する、方法。
【請求項１１】
前記プライマー組成物は、請求項２と４に記載のプライマーセットを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型とＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型に基づいて、がん罹患リスクが０〜２１ランクに分けられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＬＤＨ２＊１／＊２遺伝子型を有する者のがん罹患リスクが１３ランク以上であり、同時にＡＤＨ１Ｂ＊１／＊１の遺伝子型を有する者のがん罹患リスクが増加する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型とＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型と、がん罹患リスクとの関係は以下のように示されている、請求項１２に記載の方法。
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【請求項１５】
請求項５に記載のプライマー組成物、ＰＣＲ試薬やキット及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：５と６で示されるシークエンシングプライマーを含んで、且つ独立した容器に包装された、被検サンプルにおけるＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型とＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型を検出する、キット。
【請求項１６】
前記プライマー組成物は、請求項２と４に記載のプライマーセットを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
アルコール摂取後のがん罹患リスクが高い個体を検出するために使用される、請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型とＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型とがん罹患リスクに基づいて、がん罹患リスクが０〜２１ランクに分けられるマニュアルをさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１９】
前記マニュアルから、ＡＬＤＨ２＊１／＊２遺伝子型を有する者のがん罹患リスクが１３ランク以上であり、同時にＡＤＨ１Ｂ＊１／＊１の遺伝子型を有する者のがん罹患リスクが増加することが示されている、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記マニュアルに示されているＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型とＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型とがん罹患リスクの関係は下記のように示されている、請求項１８に記載のキット。
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【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール代謝遺伝子の検出分野に関する。特に、本発明は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＡＤＨ１Ｂ）とアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＡＬＤＨ２）を検出する方法および試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＡＤＨ１Ｂ）遺伝子とアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＡＬＤＨ２）の遺伝子多型性は、アルコールの摂取者（特にアジア人グループ）のがん罹患リスクを増加させることは、これまでに多くの先行技術文献によりサポートされている。ＡＤＨ１Ｂ＊１／＊１又はＡＬＤＨ２＊１／＊２遺伝子型を有しているヒト個体は、アルコールを摂取すると、上気道がん、消化管がんおよび他のがんを罹患するリスクを増加させる（Ｄｒｕｅｓｎｅ−Ｐｅｃｏｌｌｏ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００９；  １０（２）：  １７３−８０；  Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｋｅｉｏ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１０；  ５９（４）：  １１５−３０；  Ｂａａｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００７  Ａｐｒ；  ８（４）：  ２９２−３０及びＢｒｏｏｋｓ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ．  ２００９  Ｍａｒ  ２４；  ６（３）：  ｅ５０）。ＡＤＨ１ＢとＡＬＤＨ２の一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）は、アルコールの代謝における重要な役割を果たしている。染色体４ｑ２２上に位置している対立遺伝子について、ＡＤＨ１Ｂ＊１はエタノール代謝を減速するものであり、ＡＤＨ１Ｂ＊２はエタノール代謝を加速するものである。染色体１２ｑ２４上に位置している対立遺伝子について、ＡＬＤＨ２＊１はアセトアルデヒドを正常に代謝するものであり、ＡＬＤＨ２＊２はアセトアルデヒドの代謝欠陥を引き起こすものである（Ｅｄｅｎｂｅｒｇ  ＨＪ．，  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｒｅｓ  Ｈｅａｌｔｈ．  ２００７；  ３０  （１）：  ５−１３）。台湾の民族についての研究は、ＡＤＨ１Ｂ＊１／＊１を有する人は約５５％であり、表現型として、エタノール代謝が減速しており、ＡＬＤＨ２＊１／＊２を有する人は約３８％であり、表現型として、アセトアルデヒド代謝が減速していることを示している（Ｇｏｅｄｄｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．  １９９２；  ８８  （３）：  ３４４−６）。
【０００３】
当該分野の技術では、遺伝子の多型性に対する検出は、一つの遺伝子ずつを検出する必要があり、一般的に、１．ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）により個体の標的遺伝子を増幅するステップと、２．ＤＮＡゲル電気泳動によりＰＣＲの結果を確認し、適切なサイズのＰＣＲ断片を検査するステップと、３．過剰のプライマーを除去するように、カラムでＰＣＲ断片を精製するステップと、４．ＤＮＡシークエンシング（例えば、プライマー伸長法）ステップと、４つのステップを含む。しかしながら、当該方法では、一度に一つの標的遺伝子しか検出できないので、標的遺伝子ごとの多型性の結果を得るために、それぞれの標的遺伝子に対して上記のステップを繰り返す必要がある。従来の方法は、遺伝子多型性検出のためのステップが複雑で、長い時間がかかるため、検出を効率的に行うことができず、多数のスクリーニングについても困難を引き起こす。
【０００４】
したがって、当該分野では、一度に複数のアルコール代謝遺伝子を検出でき、類似の検出感度と特異度を有するとともに、時間や労力、コストも削減できる技術が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、十分な特異性と感度を有し、従来の技術に要する複雑なステップを削減して時間と労力を節約できる、ＡＤＨ１ＢとＡＬＤＨ２の一塩基多型を検出する方法およびキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、下記の配列を含む、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型を検出するためのプライマーセットを提供する。
【０００７】
（ａ）オリゴヌクレオチド１：ＧＴＡＧＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＡＧＡＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＴＴＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列、又は配列番号１に対し相補的な配列とストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
（ｂ）オリゴヌクレオチド２：ＡＧＴＧＣＣＴＧＡＡＴＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＴＴＧＧＧＴＣＡ（配列番号２）を含むヌクレオチド配列、又は配列番号２に対し相補的な配列とストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列。
【０００８】
本発明も、下記の配列を含む、ＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型を検出するためのプライマーセットを提供する。
（ｃ）オリゴヌクレオチド３：ＡＡＧＡＧＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＣＴＣＧＴＴＴＣ（配列番号３）を含むヌクレオチド配列、又は配列番号３に対し相補的な配列とストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
（ｄ）オリゴヌクレオチド４：ＴＴＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＧＣＣＴＣＡＡ（配列番号４）を含むヌクレオチド配列、又は配列番号４に対し相補的な配列とストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列。
【０００９】
本発明はまた、上記のプライマーセットを含有するプライマー組成物を提供する。
【００１０】
本発明はまた、以下のステップを含む、被検サンプルにおけるＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型と、ＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型とを検出するための方法を提供する。
（ａ）ＡＤＨ１Ｂ遺伝子増幅産物とＡＬＤＨ２遺伝子増幅産物を得るように、本発明のプライマー組成物により被検サンプルにおけるＡＤＨ１Ｂ遺伝子とＡＬＤＨ２遺伝子とをワンチューブ内で増幅させるステップ；
（ｂ）シークエンシングプライマーＧＴＡＧＧＧＡＴＴＡＧＴＡＧＣＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＡＴＡＣ（配列番号５）により、得られたＡＤＨ１Ｂ遺伝子増幅産物をシークエンシングするステップ；及び
（ｃ）シークエンシングプライマーＡＡＧＡＧＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＣＴＣＧＴＴＴＣ（配列番号６）により、得られたＡＬＤＨ２遺伝子増幅産物をシークエンシングするステップ。
【００１１】
これにより、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型とＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型とを検出する。
【００１２】
本発明は、さらに、アルコール摂取後のがん罹患リスクが高い個体を検出する方法およびキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＡＤＨ１Ｂの５０７塩基対のヌクレオチド配列（配列番号７）である。
【図２】ＡＬＤＨ２の４０５塩基対のヌクレオチド配列（配列番号８）である。
【図３】本発明の方法およびキットの一つの具体的な実施例である。
【図４】ＰＣＲ増幅産物に含まれる標的ＰＣＲ断片（ＡＤＨ１Ｂ（Ｒ４９Ｈ）とＡＬＤＨ２（Ｅ４８７Ｋ）一塩基多型の断片）のゲル電気泳動図である。
【図５】ＡＤＨ１Ｂシークエンシングプライマー（配列番号５；すなわち、シークエンシングプライマーＡ）により、シークエンシングして、ＡＤＨ１Ｂ（Ｒ４９Ｈ）一塩基多型を含む断片を検出する結果である。
【図６】ＡＬＤＨ２シークエンシングプライマー（配列番号６；すなわち、シークエンシングプライマーＢ）により、シークエンシングして、ＡＬＤＨ２（Ｅ４８７Ｋ）一塩基多型を含む断片を検出する結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、驚くべきことに、特定の複数種類のプライマーをワンチューブ内で混合してＰＣＲを行い、さらに、ＤＮＡシークエンシングと組み合わせて、２つの重要なアルコール代謝遺伝子であるＡＤＨ１ＢとＡＬＤＨ２の一塩基多型性により提供された正確なＤＮＡ情報を同時に獲得でき、個体にアルコール摂取に起因するがん罹患リスクに関する情報を取得させることが見出された。これにより、本発明は、十分な特異性と感度を有し、従来の技術に要する複雑なステップを削減し、時間と労力を節約できる、ＡＤＨ１ＢとＡＬＤＨ２の一塩基多型を検出する方法およびキットを提供する。
【００１５】
本願に使用されたように、用語「ポリヌクレオチド」は、長さが１００個のヌクレオチドよりも長い配列を含む核酸を意味する。
【００１６】
本願に使用されたように、用語「オリゴヌクレオチド」は、短いポリヌクレオチドやポリヌクレオチドの一部を意味する。オリゴヌクレオチドは、一般的に約２〜１００個のヌクレオチドの配列を含む。
【００１７】
本願に使用するように、用語「一塩基多型」（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｒ  ＳＮＰ）は、単一ヌクレオチド−Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧの変化によるＤＮＡ配列の変化を意味する。
【００１８】
本願に使用するように、用語「プライマー」は、長さが約１５〜４５のオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、ポリヌクレオチドの上に、合成のための出発点としてもよい。プライマーは、標的ポリヌクレオチド配列をコピーしようとする領域と完全にもしくは実際に相補する。必要であれば、光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段により検出された標識を取り込んで、プライマーが標識され得る。例えば、有用な標識は、３２Ｐ、蛍光色素、電子−稠密試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるもの）、ビオチン、またはハプテンおよび抗血清に利用可能なタンパク質を含む。プライマーまたはプライマー伸長産物、例えば、増幅されたＤＮＡが固相支持体上に固定化されるように、標識は、プライマーを「捕捉」することにも用いられる。
【００１９】
本願に使用するように、用語「被検サンプル」は、ヒトの細胞、血液や体液またはＤＮＡの抽出物を意味する。
【００２０】
本願に使用するように、用語「標的核酸」は、目標とする特定の核酸配列を意味する。
本願に使用するように、用語「相補」は、既知の塩基対合則（つまり、ＡはＴと、ＧはＣと、対合する。）を満たす核酸を意味する。
【００２１】
本願に使用するように、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列同士がハイブリダイズを維持するためのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を意味する。このハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９８９）；  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．  Ｙ．  （１９８６）；及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９８２），  ｐｐ．  ３８７−３８９に記載されているが、これらに限定されるものではなく、且つ当該技術分野で知られている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一つの好ましい非限定的な例として、５０〜７０℃の温度で、６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）あるいはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液で、１６時間でハイブリダイゼーションを行い、１ｘＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液で洗浄することが挙げられる。
【００２２】
本願に使用するように、用語「高度にストリンジェントなシーハイブリダイゼーション条件」は、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列同士がハイブリダイズを維持するためのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を意味する。このハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９８９）；  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．  Ｙ．  （１９８６）；及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９８２），  ｐｐ．  ３８７−３８９に記載されているが、これらに限定されるものではなく、且つ当該技術分野で知られている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一つの好ましい非限定的な例として、５０％ホルムアミド（ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、４２〜７０℃（好ましくは６０〜７０ｏＣ）でハイブリダイゼーションを行い、次に、０．１％（ＳＤＳ）で、２５〜７０℃、０．２−２ｘＳＳＣ下で洗浄することが挙げられる。
【００２３】
一方、本発明は、新規なオリゴヌクレオチドプライマー、プライマーセット及びプライマー組成物を提供する。本願に記載されている、これらのプライマー、プライマーセット及びプライマー組成物は、被検サンプルにおけるアルコール代謝遺伝子であるＡＤＨ１ＢとＡＬＤＨ２の一塩基多型を検出するための方法に用いられ、並びにキット内に組み合わされるために用いられる。
一つの具体的な実施例において、本発明は、下記の配列を含む、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型を検出するためのプライマーセットを提供する。
（ａ）オリゴヌクレオチド１：ＧＴＡＧＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＡＧＡＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＴＴＧ  （配列番号１）を含むヌクレオチド配列、又は配列番号１に対し相補的な配列とストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
（ｂ）オリゴヌクレオチド２：ＡＧＴＧＣＣＴＧＡＡＴＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＴＴＧＧＧＴＣＡ  （配列番号２）を含むヌクレオチド配列、又は配列番号２に対し相補的な配列とストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列。
【００２４】
本発明では、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型を検出するプライマーセットは、約５０７塩基対のｒｓ１２２９９８４ヌクレオチド配列が得られ、当該ＡＤＨ１Ｂ  ５０７塩基対のヌクレオチド配列（配列番号７）について、図１を参照する。
【００２５】
本発明の一つの具体的な実施例において、オリゴヌクレオチド１は、ＧＴＡＧＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＡＧＡＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＴＴＧ  （配列番号１）を含むヌクレオチド配列、又は配列番号１に対し相補的な配列とストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であり、及び、オリゴヌクレオチド２はＡＧＴＧＣＣＴＧＡＡＴＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＴＴＧＧＧＴＣＡ（配列番号２）を含むヌクレオチド配列、又は配列番号２に対し相補的な配列とストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列である。
【００２６】
別の具体的な実施例において、本発明は、下記の配列を含む、ＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型を検出するためのプライマーセットを提供する。
（ａ）オリゴヌクレオチド３：ＡＡＧＡＧＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＣＴＣＧＴＴＴＣ（配列番号３）を含むヌクレオチド配列、又は配列番号３に対し相補的な配列とストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
（ｂ）オリゴヌクレオチド４：ＴＴＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＧＣＣＴＣＡＡ  （配列番号４）を含むヌクレオチド配列、又は配列番号４に対し相補的な配列とストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列。
【００２７】
本発明では、ＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型を検出するプライマーセットは、約４０５塩基対のｒｓ６７１核酸配列が得られ、当該ＡＬＤＨ２  ４０５塩基対のヌクレオチド配列（配列番号８）について、図２を参照する。
【００２８】
本発明の一つの具体的な実施例において、オリゴヌクレオチド３は、ＡＡＧＡＧＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＣＴＣＧＴＴＴＣ（配列番号３）を含むヌクレオチド配列、又は配列番号３に対し相補的な配列とストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であり、及び、オリゴヌクレオチド４は、ＴＴＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＧＣＣＴＣＡＡ（配列番号４）を含むヌクレオチド配列、又は配列番号４に対し相補的な配列とストリンジェントなまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列である。
【００２９】
別の具体的な実施例において、本発明は、本願に記載されているＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型を検出するプライマーセットと、ＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型を検出するプライマーセットとを含む、プライマー組成物を提供する。
【００３０】
本発明のプライマーの調製は、当該分野で公知の方法を使用でき、適切な配列のクローニングと設計、および直接的な化学合成を含むが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明のプライマーの調製に使用できる化学合成方法は、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ６８：  ９０  （１９７９）に記載のリン酸トリエステル法と、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ６８：  １０９  （１９７９  ）に記載のリン酸ジエステル法と、ＵＳ  ４，  ４５８，  ０６６に記載の固相合成法とが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、自動化オリゴヌクレオチド合成機も使用できる。なお、必要に応じて、当該技術分野で既知の技術を利用して、プライマーを標識できる。
【００３２】
ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型（ＡＤＨ１Ｂ＊１／＊１）の検出またはＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型（ＡＬＤＨ２＊１／＊２）の検出を同定するように、前記本発明のオリゴヌクレオチドプライマーセットは、増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）およびその修飾法）に使用できる。ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型またはＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型を同時に検出するように、前記本発明のプライマー組成物は、ワンチューブ（ｏｎｅ−ｔｕｂｅ）増幅法に使用できる。
【００３３】
一般的に、標的配列が、ＰＣＲにおいて少なくとも一つまたは一対以上のプライマーにより増幅される。プライマーは、標的配列との相補領域にハイブリダイズされ、並びに、ＤＮＡポリメラーゼにより延長されて標的配列を増幅する。単一の標的ポリヌクレオチド配列の濃度を増加させるように、増幅サイクルが繰り返される。ゲル電気泳動、サザンブロット分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）またはＤＮＡシークエンシングのような当該技術分野で既知の技術を使用して、増幅産物を分離することができる。
【００３４】
さまざまなプライマーの組み合わせでＰＣＲを行う代替法は、当該技術分野で既知のものであり、例えば、それらは、Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９８９）の中に記載されている。これらの方法は、非対称ＰＣＲ、ミスマッチしたプライマーまたは縮重プライマーを使用するＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、ＲＡＰＤ  ＰＣＲ、ＩＭＳ−ＰＣＲ（Ｉｓｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏ．，  ３０：  ２８０１−２８０６  （１９９２））及びマルチウェルＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  ＰＣＲ）を含む。
【００３５】
一方、本発明は、下記のステップを含む、被検サンプルにおけるＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型及びＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型を検出するための方法を提供する。
（ａ）ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の増幅産物とＡＬＤＨ２遺伝子の増幅産物を得るように、本発明のプライマー組成物により被検サンプルにおけるＡＤＨ１Ｂ遺伝子とＡＬＤＨ２遺伝子をワンチューブ内で増幅するステップ；
（ｂ）シークエンシングプライマーＧＴＡＧＧＧＡＴＴＡＧＴＡＧＣＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＡＴＡＣ（配列番号５）により、得られたＡＤＨ１Ｂ遺伝子増幅産物をシークエンシングするステップ；及び
（ｃ）シークエンシングプライマーＡＡＧＡＧＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＣＴＣＧＴＴＴＣ（配列番号６）により、得られたＡＬＤＨ２遺伝子増幅産物をシークエンシングするステップ。
【００３６】
これにより、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型とＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型とを検出する。
【００３７】
本発明の方法では、さらに、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型とＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型に基づいて、がん罹患リスクが０〜２１ランクに分けられる。好ましくは、ＡＬＤＨ２＊１／＊２遺伝子型を有する者は、がん罹患リスクが１３ランク以上であり、同時にＡＤＨ１Ｂ＊１／＊１の遺伝子型を有する者は、がん罹患リスクが増加する。好ましくは、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型とＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型は、がん罹患リスクとの関係は次のように示されている。
【表１】
2015156853.tif 000003
【００３８】
被検サンプルとして、ヒトの細胞、血液や体液またはＤＮＡの抽出物であっても良い。ＤＮＡの抽出方法は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用できる。
【００３９】
ＰＣＲにより被検サンプルにおけるＡＤＨ１Ｂ遺伝子とＡＬＤＨ２遺伝子とを増幅させる場合、ヌクレオシドのソースおよび有効量の本発明のプライマー組成物として、有効量のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）、有効量のデオキシヌクレオシド三リン酸（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）またはヌクレオシド類似体（ｄＮＴＰｓ）を使用する。あるいは、予混合試薬として、バッファー、ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ予備混合物を使用できる。このような予備混合物を使用すれば、有効量の本発明のプライマー組成物を添加する必要がある。
【００４０】
ＰＣＲ反応を設定する方法は、当該技術分野で公知のものである。特に、増幅しようとするＤＮＡ基質、プライマー、Ｍｇ２＋補因子、ｄＮＴＰｓおよびＤＮＡポリメラーゼを含有する反応混合物の緩衝液を調製する。ＰＣＲサイクルを行う前に、通常、ＤＮＡ基質を変性させる。このステップは、一般的に、約９０〜９５℃下で、約２〜１０分行われる。変性ステップの後、標的配列を増幅するためのサイクリックプロセスを行う。サイクル数は、通常２５〜４０であり、各サイクルは、通常２または３ステップからなる。変性ステップの後、プライマーは、標的配列との相補領域に結合して、その後、標的核酸を合成するように、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長させる。ＰＣＲ反応を行った後、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子増幅産物とＡＬＤＨ２遺伝子増幅産物が得られる。
【００４１】
前記増幅産物を分離させた後、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型とＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型を検出するために、シークエンシングプライマーＧＴＡＧＧＧＡＴＴＡＧＴＡＧＣＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＡＴＡＣ（配列番号５）により、得られたＡＤＨ１Ｂ遺伝子増幅産物をシークエンシングし、並びにシークエンシングプライマーＡＡＧＡＧＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＣＴＣＧＴＴＴＣ  （配列番号６）により、得られたＡＬＤＨ２遺伝子増幅産物をシークエンシングする。
【００４２】
ＡＤＨ１Ｂ＊１／＊１とＡＬＤＨ２＊１／＊２遺伝子型を有する者が、アルコール摂取後のがん罹患リスクが高いことは、従来の技術では知られている。したがって、一方、本発明は、前記検出方法を含む、アルコール摂取後のがん罹患リスクが高い個体を検出する方法を提供する。
【００４３】
一方、本発明はまた、本発明のプライマー組成物、ＰＣＲ試薬やキット及び本発明のシークエンシングプライマーを含んで、且つ独立した容器に包装された、アルコール摂取後のがん罹患リスクが高い個体を検出するキットを提供する。本発明のキットはさらに、マニュアルを含む。
【００４４】
本発明のキットに使用される容器は、従来使用されていた任意の容器であり、ガラス、プラスチック、ポリマーおよびシリコーンなど製の容器を含むが、これらに限定されるものではない。
ＰＣＲ試薬またはキットは、緩衝液、ｄＮＴＰｓ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰとｄＴＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼなどを含む。
【００４５】
本発明のキットは、さらに、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型とＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型とがん罹患リスクに基づいて、がん罹患リスクが０〜２１ランクに分けられるマニュアルを含む。好ましくは、マニュアルから、ＡＬＤＨ２＊１／＊２遺伝子型を有する者は、がん罹患リスクが１３ランク以上であり、同時にＡＤＨ１Ｂ＊１／＊１の遺伝子型を有する者は、がん罹患リスクが増加することが示されている。好ましくは、マニュアルから、ＡＤＨ１Ｂ遺伝子の一塩基多型Ｒ４９Ｈの遺伝子型とＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型Ｅ４８７Ｋの遺伝子型は、がん罹患リスクとの関係が前記の表に示されている。
【００４６】
本発明によれば、ＡＤＨ１Ｂ＊１／＊１とＡＬＤＨ２＊１／＊２の増幅産物が同時に得られ、さらに、ＤＮＡによりＡＤＨ１Ｂ＊１／＊１及ＡＬＤＨ２＊１／＊２遺伝子型を有する者をシークエンシングし、並びにこれに基づいて、アルコール摂取後のがん罹患リスクが高い個体を検出できる。本発明は、２つのアルコール代謝遺伝子であるＡＤＨ１ＢおよびＡＬＤＨ２を有するＳＮＰを正確かつ直接的に同定できるので、労力、時間やコストを節約できる。前記ＳＮＰを同定することにより、本発明も、アルコール摂取後のがん罹患リスクが高い個体を迅速かつ簡単にスクリーニングする方法およびキットを提供する。本発明の方法およびキットの一つの具体的な実施例は、図３を参照する。
【実施例】
【００４７】
実施例１  ヒトのＡＤＨ１Ｂ及びＡＬＤＨ２の遺伝子型の検出
ヒト個体から、血液（２００μｌ）、唾液（２ｍｌ）、または細胞などの被検サンプルを取得する。ＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ．  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ６９５０４  ｏｒ  ６９５８１）により、ゲノムＤＮＡの精製および抽出を行う。ＡＤＨ１ＢとＡＬＤＨ２断片を得るために、次の表に記載されているプライマーをワンチューブ内に混合され、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ＰＣＲ増幅キットを用いてＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲサイクルは、９４℃、１分、（９４℃、１０秒、６２℃、２０秒、６８℃、３０秒）の条件下で、３５サイクルを実施し、７２℃、１０分で行い、並びに、４℃で維持する。
【表２】
2015156853.tif 000004
【００４８】
続いて、ゲル電気泳動により増幅産物に含まれている標的ＰＣＲ断片（ＡＤＨ１Ｂ（Ｒ４９Ｈ）とＡＬＤＨ２（Ｅ４８７Ｋ）の一塩基多型の断片）（図４を参照）を確認して、その後、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡ  ＰＣＲ精製キットにより標的ＰＣＲ断片を精製する。
【００４９】
前記標的ＰＣＲ断片、ＰＣＲプライマーセットと断片のサイズは下記の表に示されている。
【表３】
2015156853.tif 000005
【００５０】
ＡＤＨ１Ｂ（Ｒ４９Ｈ）とＡＬＤＨ２（Ｅ４８７Ｋ）一塩基多型を含む断片を検出するように、ＡＤＨ１Ｂシークエンシングプライマー（ＧＴＡＧＧＧＡＴＴＡＧＴＡＧＣＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＡＴＡＣ、配列番号５）とＡＬＤＨ２シークエンシングプライマーを使用してシークエンシングする。シークエンシングの結果は、図５（ＡＤＨ１Ｂ）と図６（ＡＬＤＨ２）に示されている。図５には、Ａの単一ピークがＡＤＨ１Ｂ＊２／＊２遺伝子型を示し、Ａ／Ｇの重複ピークがＡＤＨ１Ｂ＊１／＊２遺伝子型を示し、Ｇの単一ピークがＡＤＨ１Ｂ＊１／＊１遺伝子型を示す。図６には、Ｇの単一ピークがＡＬＤＨ２＊１／＊１遺伝子型を示し、Ｇ／Ａの重複ピークがＡＬＤＨ２＊１／＊２遺伝子型を示し、Ａの単一ピークがＡＬＤＨ２＊２／＊２遺伝子型を示す。
【００５１】
実施例２  ＡＤＨ１Ｂ（Ｒ４９Ｈ）とＡＬＤＨ２（Ｅ４８７Ｋ）一塩基多型の遺伝子型とがん罹患リスクとの関係
ＰＬｏＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｍａｒｃｈ  ２００９，  Ｖｏｌ．  ６，  Ｉｓｓｕｅ  ３，  ｐｐ．  ０２５８−０２６３及びＹｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｋｅｉｏ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１０；  ５９  （４）：  １１５−１３０に発表された文献により、本発明はＡＤＨ１ＢとＡＬＤＨ２遺伝子型を再集計して分析したところ、アルコール摂取後の赤面とがん罹患リスクとの関係は、下記の表に示されている。
【００５２】
【表４】
2015156853.tif 000006
【００５３】
上記の表から、ＡＤＨ１Ｂ＊１／＊１及ＡＬＤＨ２＊１／＊２遺伝子型を有する者は、がん罹患リスクが高いことが分かる。従って、本発明の方法およびキットは、アルコール摂取後のがん罹患リスクが高い個体のスクリーニングに用いられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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