(57)【要約】【課題】サリチル酸を有効成分として含む多剤耐性真菌に有効な抗真菌剤、およびサリチル酸の抗真菌作用を増強する方法を提供すること。【解決手段】本発明は、サリチル酸を有効成分として含み、さらにＮ−アセチルシステインを含む、多剤耐性真菌用抗真菌剤、および農薬、ならびにサリチル酸と共にＮ−アセチルシステインを用いることを特徴とする、サリチル酸の抗真菌作用を増強する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サリチル酸を有効成分として含み、さらにＮ−アセチルシステインを含む、多剤耐性真菌用抗真菌剤。
【請求項２】
多剤耐性真菌がアゾール系抗真菌剤を含む抗真菌剤に対して耐性がある、請求項１記載の多剤耐性真菌用抗真菌剤。
【請求項３】
多剤耐性真菌がサリチル酸を含む抗真菌剤に対して耐性がある、請求項１または２記載の多剤耐性真菌用抗真菌剤。
【請求項４】
サリチル酸を有効成分として含み、さらにＮ−アセチルシステインを含む、抗真菌作用を有する農薬。
【請求項５】
サリチル酸と共にＮ−アセチルシステインを用いることを特徴とする、サリチル酸の抗真菌作用を増強する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サリチル酸を有効成分として含む多剤耐性真菌に有効な抗真菌剤、およびサリチル酸の抗真菌作用を増強する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌類は、ヒト、動物および植物に感染して、様々な疾患をもたらすことが知られている。真菌の感染による真菌症としては、例えば、アスペルギルス症、カンジダ症、クリプトコックス症、白癬（水虫、たむし、およびしらくも等）、マラセチア症、スポロトリコーシス、黒色真菌感染症、接合菌症、コクシジオイデス症、ヒストプラスマ症などが知られており、その病巣部位または組織によって、表在性真菌症、深部皮膚真菌症および深在性真菌症に大別される（非特許文献１参照）。このうち最も発生頻度が高い疾患は白癬である。一方、深在性真菌症の発生頻度はそれほど高くないが、重篤なものが多く、近年、その発生率が増加している。
【０００３】
真菌類は、ウイルスや細菌と異なり、進化学的にヒトなどの高等真核生物と近縁であり、真菌が備える生命機構やそれに関与する蛋白質がかなり共通する。そのため、創薬のターゲットとなりうる部位が少なく、抗真菌剤の開発は困難を極める。現在上市される抗真菌剤も、細胞壁や細胞膜のごく限られた違いをターゲットとして、限られた数があるにすぎない（非特許文献２〜３参照）。
【０００４】
サリチル酸は、角質軟化作用や抗真菌作用を有することが知られ、白癬、皮膚カンジダ症、癜風等の治療薬として、主に外皮用薬として使用されている。また、植物の胴枯れ病の病原菌Ｅｕｔｙｐａ  ｌａｔａに対して抗真菌作用を示すことが知られている（非特許文献４）。しかしながら、サリチル酸の抗真菌効果は弱く、アゾール系、アリルアミン系、ベンジルアミン系等の他の抗真菌剤の方がより有効である。現在、白癬治療薬の薬効成分としては、塩酸テルビナフィン、塩酸ブテナフィン、塩酸アモロルフィン、またはアゾール系成分（ラノコラゾール、ミコナゾール、ネチコゾール、クロトリマゾール等）が主に用いられている。
【０００５】
抗菌剤、抗ウイルス剤、抗原虫剤等の化学療法剤を用いる治療においては、化学療法剤の多用により耐性病原体が出現し、その薬剤を用いて治療を継続することができなくなることが知られている（非特許文献２〜３参照）。特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）等の多剤耐性菌の出現は、深刻な問題となっている。真菌症治療においては、個々の薬剤に対する耐性菌出現の報告は頻繁にあるが（例えば、非特許文献５）、現在のところ重大な多剤耐性真菌出現の報告はない。しかし、近年、糖尿病、エイズ、臓器移植、抗癌剤治療に係る免疫低下した患者が増加したことにより、真菌症に罹患する患者が増加の一途をたどっている。したがって、抗真菌剤の使用が増加することにより、病原性真菌が薬剤耐性を獲得する確率も飛躍的に高まっている。今後出現が予測される多剤耐性真菌は、限られた抗真菌薬しかない現状で、人類にとって大変な脅威となるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】化学と生物  Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．１２，２００４
【非特許文献２】モダンメディア  ５６巻６号２０１０［真菌］１１９
【非特許文献３】医学のあゆみ  Ｖｏｌ．２０９，Ｎｏ．９，２００４．５．２９
【非特許文献４】Plant Physiol. Biochem. 40 (200), 1051-1060
【非特許文献５】日本化学療法学会雑誌  ２０１３，Ｖｏｌ．６１，Ｎｏ．２，ｐｐ．１４９−１５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、新規な抗真菌剤の開発が求められるだけでなく、多剤耐性真菌にも対応することができる抗真菌剤を開発する必要がある。しかしながら、上記のとおり、新薬の開発は極めて困難であるので、今後将来にわたり、上市された既存の抗真菌剤を有効に使用することも必要である。また、多剤耐性真菌の出現を防ぐためにも、同一の抗真菌剤の多用を回避することが重要である。そのため、本発明は、サリチル酸のような薬効の弱い既存の抗真菌剤の有効利用を目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、サリチル酸とＮ−アセチルシステインを添加した培地で真菌類を培養したところ、全く意外なことに、Ｎ−アセチルシステインの添加量を上げるにしたがって、真菌類のサリチル酸に対する感受性が高まることを見出した。さらに、驚くべきことに、サリチル酸とＮ−アセチルシステインを混合した抗真菌剤が、発明者が作成した多剤耐性変異株においても抗真菌効果を示すことを見出した。かくして、本発明が完成された。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）サリチル酸を有効成分として含み、さらにＮ−アセチルシステインを含む、多剤耐性真菌用抗真菌剤、
（２）多剤耐性真菌がアゾール系抗真菌剤を含む抗真菌剤に対して耐性がある、上記（１）記載の多剤耐性真菌用抗真菌剤、
（３）多剤耐性真菌がサリチル酸を含む抗真菌剤に対して耐性がある、上記（１）または（２）記載の多剤耐性真菌用抗真菌剤、
（４）サリチル酸を有効成分として含み、さらにＮ−アセチルシステインを含む、抗真菌作用を有する農薬、および
（５）サリチル酸と共にＮ−アセチルシステインを用いることを特徴とする、サリチル酸の抗真菌作用を増強する方法
を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、サリチル酸にＮ−アセチルシステインを加えるだけという非常に簡便な方法によって、サリチル酸の抗真菌作用を増強することができる。本発明によれば、サリチル酸の抗真菌作用を高めることができるので、本発明の抗真菌剤は、今までサリチル酸によって十分な治療効果が得られなかった真菌症に対しても使用することができる。さらに、本発明によれば、サリチル酸の利用を増やすことにより、他の抗真菌剤の使用を減らすことができ、それらの薬剤に対する耐性真菌の出現または多剤耐性真菌の出現を抑えることが期待できる。また、本発明の抗真菌剤は、驚くべきことに、多剤耐性真菌に対しても抗真菌効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】サリチル酸およびＮ−アセチル−Ｌ−システイン含有培地中における出芽酵母の増殖結果を示す図である。図中、ＮＡＣはＮ−アセチル−Ｌ−システインを示す。
【図２】サリチル酸およびＮ−アセチル−Ｌ−システイン含有培地中における出芽酵母の増殖結果を示す図である。図中、ＮＡＣはＮ−アセチル−Ｌ−システインを示し、ＳＡはサリチル酸を示す。
【図３】サリチル酸およびＮ−アセチル−Ｌ−システイン含有培地中におけるカンジダの増殖結果を示す図である。図中、ＮＡＣはＮ−アセチル−Ｌ−システインを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
サリチル酸は、古来から鎮痛薬として使用されており、抗真菌剤としては、白癬の治療薬として、主に外皮用薬として使用されている。サリチル酸は、医薬品としてすでに認可されている安価な化合物であり、重篤な副作用も報告されていない。本発明において使用されるサリチル酸としては、サリチル酸、ならびにサリチル酸の塩、エステル、誘導体、および類似体が含まれる。サリチル酸の塩またはエステルとしては、好ましくは、医薬上許容される塩またはエステル、獣医学上許容される塩またはエステル、あるいは農業上許容される塩またはエステルが使用され、例えば、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸メチル、サリチル酸エチル等が挙げられる。サリチル酸の誘導体としては、例えば、アセチルサリチル酸、クロロサリチル酸、例えば、３−クロロサリチル酸、４−クロロサリチル酸、３，５−ジクロロサリチル酸等が挙げられる。サリチル酸の類似体としては、安息香酸、クロロ安息香酸、例えば、３−クロロ安息香酸、４−クロロ安息香酸、３，４−ジクロロ安息香酸、３，５−ジクロロ安息香酸、メトキシ安息香酸、例えば、２−メトキシ安息香酸、３−メトキシ安息香酸、４−メトキシ安息香酸、アミノ安息香酸、例えば、２−アミノ安息香酸、ブロモ安息香酸、例えば、２−ブロモ安息香酸、ヨード安息香酸、例えば、２−ヨード安息香酸、サリチルアルデヒド、２−ヒドロキシ−５−メトキシベンズアルデヒド等が挙げられる。本発明において、好ましくはサリチル酸が使用される。
【００１３】
本発明において、Ｎ−アセチルシステインとしては、Ｌ型またはＤ型のいずれを使用してもよい。Ｎ−アセチル−Ｌ−システインは、主に、去痰剤や高カロリー輸液成分として使用されている。Ｎ−アセチル−Ｌ−システインは、医薬品としてすでに認可されている安価な化合物であり、重篤な副作用も報告されていない。
【００１４】
本発明の抗真菌剤は、有効成分としてのサリチル酸と、Ｎ−アセチルシステインとを混合することによって製造することができる。例えば、本発明の抗真菌剤は、常法にしたがい、適当な基剤に、サリチル酸およびＮ−アセチルシステインを混合することによって製造する。基剤としては、所望の剤形に適当な当該分野で通常使用されるものを使用すればよく、例えば、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、エタノール等のアルコール類、マクロゴール類、アジピン酸ジイソプロピル、セタノール、スクワラン、中鎖トリグリセライド、カルボキシビニルポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ワセリン、パラフィン、シリコン、植物油等の油脂、ミツロウ、ラノリン等が挙げられる。本発明の抗真菌剤は、さらに、適宜、賦形剤、抗酸化剤、界面活性剤、安定化剤等の添加剤を含んでいてもよい。
【００１５】
本発明の抗真菌剤の剤形としては、特に限定されないが、例えば、液剤、ローション剤、乳剤、チンキ剤、軟膏剤、クリーム剤、水性ゲル剤、油性ゲル剤、エアゾール剤、パウダー剤等の外用製剤、注射剤、および錠剤、液剤、粉末剤等の内服製剤が挙げられる。治療対象となる真菌症の種類にもよるが、本発明の抗真菌剤は、好ましくは外用製剤として製剤化される。
【００１６】
本発明の抗真菌剤中のサリチル酸の含有量は、特に限定されず、所望の抗真菌効果が達成されるように適宜決定することができる。例えば、本発明の抗真菌剤は、サリチル酸を０．１重量％〜１０重量％、好ましくは０．２重量％〜１０重量％、より好ましくは０．５重量％〜１０重量％含んでいてもよい。
【００１７】
本発明の抗真菌剤中のＮ−アセチルシステインの含有量は、特に限定されず、所望の抗真菌効果が達成されるように適宜決定することができる。例えば、本発明の抗真菌剤は、Ｎ−アセチルシステインを０．１重量％〜３０重量％、好ましくは０．２重量％〜３０重量％、より好ましくは０．５重量％〜３０重量％含んでいてもよい。
【００１８】
本発明の抗真菌剤中に含まれるサリチル酸およびとＮ−アセチルシステインの配合比は、特に限定されず、所望の抗真菌効果が達成されるように適宜決定することができる。例えば、本発明の抗真菌剤中に含まれるサリチル酸およびＮ−アセチルシステインの配合比は、１：１〜１：２００、例えば１：１〜１：１００、好ましくは１：２〜１：５０、より好ましくは１：２〜１：１０、さらに好ましくは１：２〜１：５のモル比であってもよい。Ｎ−アセチルシステインの配合量を増やすことにより、サリチル酸の薬効がより増強した抗真菌剤を得ることができる。
【００１９】
また、本発明の抗真菌剤は、有効成分としてサリチル酸を含む既存の薬剤に、Ｎ−アセチルシステインを混合することによって製造することもできる。かかる既存のサリチル酸含有薬剤としては、例えば、サリチル酸配合ワセリン、例えば、１０％サリチル酸ワセリン軟膏、イオウ・サリチル酸チアントール軟膏等が挙げられる。既存のサリチル酸含有薬剤に添加するＮ−アセチルシステインの量は、特に限定されず、所望の抗真菌効果が達成されるように適宜決定すればよい。
【００２０】
かくして製造された本発明の抗真菌剤は、Ｎ−アセチルシステインを含まない場合と比べて、サリチル酸の抗真菌作用が増強される。本発明の抗真菌剤の投与量は、投与対象となる個体、対象疾患、対象真菌等によって異なり、所望の抗真菌効果が達成されるように当業者により適宜決定することができる。
【００２１】
本発明の抗真菌剤が効果を奏する真菌としては、例えば、ツボカビ門；クモノスカビ属、ケカビ属などの接合菌門；子嚢菌門；クリプトコッカス属（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ等）、マラセチア属（例えば、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒ等）、さび病菌などの担子菌門；白癬菌（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ等）、スポロトリックス属、黒色真菌などの不完全菌；酵母などが挙げられる。子嚢菌門としては、白癬菌（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ等）、スポロトリックス属（例えば、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｋｉｉ等）、アスペルギルス属、ニューモシスチス属（例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ等）；カンジダ属（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｒａｂｒａｔａ等）、サッカロマイセス属（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等）などの出芽酵母、シゾサッカロマイセス属などの分裂酵母などの酵母；アオカビ、コウジカビ、アカパンカビなどのカビ；アミガサタケ、トリュフなどのキノコ、ユーティパ（Ｅｕｔｙｐａ）属、いもち病菌、うどんこ病菌などが挙げられる。本発明の抗真菌剤は、好ましくは、子嚢菌門の真菌、担子菌門の真菌、および不完全菌に有効である。本発明の抗真菌剤は、多剤耐性真菌だけでなく、単剤耐性真菌、および野生株（各種薬剤感受性真菌）に対しても抗真菌効果がある。
【００２２】
本発明において、「抗真菌効果」（本明細書において、「抗真菌作用」ともいう）は、真菌の増殖を抑制する静菌的作用または真菌を死滅させる殺菌的作用を有することをいう。静菌とは、一定濃度のある薬剤下で、真菌が生存はしているが増殖できない状態を指す。殺菌とは、一定濃度のある薬剤下で、真菌が完全に死滅する状態を指す。抗真菌効果を示す薬剤を抗真菌剤という。薬剤の抗真菌効果は、その薬剤を菌に投与したときの菌の増殖度を測定することによって確認することができる。
【００２３】
「耐性」とは、菌がある薬剤に対して抵抗力を示すことをいう。たとえば、ある菌の変異株および野生株に対して抗真菌剤を投与したとき、変異株の増殖度が野生株に比して高い場合に、その変異株はその抗真菌剤に対して「耐性」を有するといえる。
【００２４】
菌の増殖度の測定は、後述の実施例において記載するスポット・アッセイによって行うことができる。あるいは、日本医真菌学会の「酵母の抗真菌薬感受性試験法」（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｙｃｏｌ．，Ｖｏｌ．５１，１５３−１６３，２０１０）、またはＣｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）のＭ３８−Ａ２法（National Committee for Clinical Laboratory Standards: Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi: Approved standard M38-A2. CLSI, Wayne, PA, USA, 2002）に基づいて行ってもよい。
【００２５】
本発明において、「多剤耐性」とは、複数の抗真菌剤に対して耐性を示すことをいう。かかる複数の抗真菌剤は、同じ系に分類される薬剤であってもよいし、異なる系に分類される薬剤であってもよい。抗真菌剤としては、アムホテリシンＢ（ＡＭＰＨ−Ｂ）、オリゴマイシン、ナイスタチンなどのポリエン系の抗真菌剤；フルシトシン（５−ＦＣ）などのピリミジン誘導体の抗真菌剤；アゾール系およびその他のエルゴステロール合成阻害薬である抗真菌剤；ミカファンギン、カスポファンギン、アニデュラファンギンなどのキャンディン系の抗真菌剤；サリチル酸、ヨードチンキ、エキサラミドなどのサリチル酸系の抗真菌剤などが挙げられる。エルゴステロール合成阻害薬である抗真菌剤としては、例えば、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロミダゾール、クロトリマゾール、クロコナゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、ケトコナゾール、イソコナゾール、ミコナゾール、ネチコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、ラノコナゾール、フルコナゾール、テルコナゾール、ヘキサコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾールイトラコナゾール、ボリコナゾールなどのアゾール系の抗真菌剤、およびアモロルフィン、ブテナフィン、テルビナフィンなどが挙げられる。また、抗真菌剤としては、４−ニトロキノリン１−オキシド（４−ＮＱＯ）などの化学発癌剤、リベロマイシンＡ、セルレニン、アルテスネート、シクロヘキシミドなどの抗生物質なども挙げられる。さらに、抗真菌剤としては、２−フェニルフェノール、マンコゼブ、チアベンダゾール、ベノミル、イマザリルなどの農薬または動物用抗真菌剤も挙げられる。このうち、アムホテリシンＢ、フルシトシン、ミコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、ボリコナゾール、およびミカファンギンは、日本で深在性真菌症治療薬として使用されている。なお、ポリエン系、およびエルゴステロール合成阻害薬の抗真菌剤は、細胞膜構成成分であるエルゴステロールを創薬のターゲットとする。また、キャンディン系の抗真菌剤は、細胞壁を創薬のターゲットとする。
【００２６】
菌類が単剤耐性を獲得する原因としては、例えば、その薬剤の創薬のターゲットとなる因子の突然変異が考えられる。突然変異によっては、同じ因子をターゲットとする全ての薬剤に対して耐性を付与する場合と、一部の薬剤に対して耐性を付与する場合がある。さらに、菌類が薬剤耐性を獲得する原因の一つとして、薬剤排出ポンプと呼ばれるタンパク質が変異導入によって菌類内で過剰に発現し、抗菌剤が菌類内部から外部に排出される現象が知られている（例えば、ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＲＥＶＩＥＷＳ，Ｓｅｐｔ．２００６，ｐ．５８３-６０４、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．４００  ｐｈａｓｅ  ｉｉ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍｓ）。薬剤排出ポンプは、生物において高度に保存された膜輸送体であり、その発現量を制御する一連の転写因子が存在することが知られている。これらの薬剤排出ポンプは基質特異性がゆるく、同一ポンプにおいても複数の薬剤が排出される。出芽酵母の薬剤排出ポンプとしては、Ａｚｒ１ｐ、Ｓｎｇ１ｐ、Ｆｌｒ１ｐ、Ｓｎｑ２ｐ、Ｙｏｒ１ｐ、Ｐｄｒ１０ｐ、Ｐｄｒ５ｐ、Ｐｄｒ１５ｐ、Ｐｄｒ１２ｐなどが挙げられる。薬剤排出ポンプをコードする遺伝子の発現を制御する転写因子に機能獲得性突然変異（優性の形質）が生じると、発現制御している薬剤排出ポンプ群を恒常的に強発現する。薬剤排出ポンプ群が強発現することで、細胞内に侵入した多種類の薬剤が速やかに細胞外へ排出されて多剤耐性形質を示すこととなる。出芽酵母の場合、この転写因子としては、たとえば、Ｙｒｍ１ｐ、Ｙｒｒ１ｐ、Ｐｄｒ１ｐ、Ｐｄｒ３ｐなどが挙げられる。転写因子Ｙｒｍ１ｐは、薬剤排出ポンプＡｚｒ１ｐ、Ｓｎｇ１ｐ、Ｆｌｒ１ｐ、Ｓｎｑ２ｐ、Ｙｏｒ１ｐの発現を制御する。転写因子Ｙｒｒ１ｐは、薬剤排出ポンプＡｚｒ１ｐ、Ｓｎｇ１ｐ、Ｆｌｒ１ｐ、Ｓｎｑ２ｐ、Ｙｏｒ１ｐの発現を制御する。転写因子Ｐｄｒ１ｐは、薬剤排出ポンプＳｎｑ２ｐ、Ｙｏｒ１ｐ、Ｐｄｒ５ｐ、Ｐｄｒ１５ｐの発現を制御する。転写因子Ｐｄｒ３ｐは、薬剤排出ポンプＳｎｑ２ｐ、Ｙｏｒ１ｐ、Ｐｄｒ５ｐ、Ｐｄｒ１５ｐの発現を制御する。個々の詳細な遺伝子情報、ＤＮＡ配列、アミノ酸配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＧＥＮＯＭＥ  ＤＡＴＡＢＡＳＥ（ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ）などの公知のデータベースにより得ることができる。
【００２７】
本発明の抗真菌剤は、例えば、エルゴステロール合成阻害薬である抗真菌剤、ポリエン系の抗真菌剤、キャンディン系の抗真菌剤、ベノミルおよびイマザリルなどの農薬または動物用抗真菌剤、４−ＮＱＯなどの化学発癌剤、あるいはリベロマイシンＡ、セルレニン、アルテスネート、シクロヘキシミドなどの抗生物質に対して耐性がある真菌に対して抗真菌効果を示す。例えば、本発明の抗真菌剤は、ミコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、イソコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、ボリコナゾール、ブテナフィン、テルビナフィン、イマザリル、セルレニン、アルテスネート、シクロヘキシミド、アムホテリシンＢ、カスポファンギン、４−ＮＱＯ、ベノミル、またはリベロマイシンＡに対して耐性がある真菌に対して抗真菌効果を示す。また、本発明の抗真菌剤は、サリチル酸に対して耐性がある真菌に対して抗真菌効果を示す。
【００２８】
さらに、本発明の抗真菌剤は、エルゴステロール合成阻害薬である抗真菌剤、ポリエン系の抗真菌剤、キャンディン系の抗真菌剤、ベノミルおよびイマザリルなどの農薬または動物用抗真菌剤、４−ＮＱＯなどの化学発癌剤、およびリベロマイシンＡ、セルレニン、アルテスネート、シクロヘキシミドなどの抗生物質から選択される１以上、好ましくは２以上を含む抗真菌剤に対して耐性がある多剤耐性真菌に対して、抗真菌効果を示す。また、本発明の抗真菌剤は、例えば、Ｙｒｒ１ｐ、Ｐｄｒ１ｐ、Ｐｄｒ３ｐなどの転写因子の機能獲得性突然変異による多剤耐性真菌に対して抗真菌効果を示す。例えば、本発明の抗真菌剤は、転写因子Ｐｄｒ１ｐおよび／またはＰｄｒ３ｐの機能獲得性突然変異による多剤耐性真菌に対して抗真菌効果を示す。本発明の抗真菌剤は、例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、イソコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、ボリコナゾール、ブテナフィン、およびテルビナフィン、イマザリル、セルレニン、アルテスネート、シクロヘキシミド、アムホテリシンＢ、カスポファンギン、４−ＮＱＯ、ベノミル、およびリベロマイシンＡから選択される１以上、好ましくは２以上を含む抗真菌剤に対して耐性がある多剤耐性真菌に対して抗真菌効果を示す。例えば、本発明の抗真菌剤は、２以上のアゾール系抗真菌剤に対して耐性がある多剤耐性真菌に対して、抗真菌効果を示す。さらに、本発明の抗真菌剤は、サリチル酸を含む抗真菌剤に対して耐性がある多剤耐性真菌に対しても、抗真菌効果を示す。
【００２９】
本発明の抗真菌剤は、上記の本発明の抗真菌剤が効果を奏する真菌が原因となる真菌症の治療において効果を奏する。かかる真菌症としては、限定するものではないが、例えば、ムコール症、クリプトコッカス症、スポロトリックス症、アスペルギルス症、ニューモシスチス肺炎、白癬（例えば、足白癬、手白癬、体部白癬、股部白癬、水虫、たむし、およびしらくも等）、カンジダ症（例えば、皮膚カンジダ症）、癜風等が挙げられる。また、立ち枯れ病、いもち病、うどんこ病、さび病などの植物の真菌症も挙げられる。
【００３０】
本発明の抗真菌剤は、ヒトおよび動物の真菌症の治療のための医薬または動物薬として用いることができる。さらに、本発明の抗真菌剤は、植物の真菌感染に対して農薬として使用することができる。また、本発明の抗真菌剤は、洗剤、医療用洗剤、化粧品、シャンプー、ボディーソープ、洗顔料、ニキビ肌用の化粧品または洗顔料等の成分として使用することができる。
【００３１】
さらに、本発明は、本発明の抗真菌剤を対象に投与することを特徴とする、真菌症、特に上記の真菌症を治療する方法を提供する。また、本発明においては、サリチル酸を有効成分として含む抗真菌剤とＮ−アセチルシステインを含む剤とを別々に製剤化し、これらの製剤を真菌症の治療において併用することもできる。したがって、本発明は、さらに、サリチル酸を有効成分として含む抗真菌剤とＮ−アセチルシステインとを対象に投与することを特徴とする、真菌症、特に上記の真菌症を治療する方法を提供する。またさらに、本発明は、真菌症、特に上記の真菌症の治療における、サリチル酸とＮ−アセチルシステインとの組み合わせの使用を提供する。
【００３２】
さらに、本発明は、サリチル酸と共にＮ−アセチルシステインを用いることを特徴とする、サリチル酸の抗真菌作用を増強する方法を提供する。例えば、本発明は、既存のサリチル酸含有抗真菌剤に適量のＮ−アセチルシステインを添加することによる、サリチル酸の抗真菌作用を増強する方法を提供する。さらに、本発明は、サリチル酸の抗真菌作用を増強するための、Ｎ−アセチルシステインの使用を提供する。この場合、サリチル酸およびＮ−アセチルシステインの使用量は、特に限定されず、所望の抗真菌効果が達成されるように適宜決定することができる。例えば、サリチル酸およびＮ−アセチルシステインは、１：１〜１：２００、例えば１：１〜１：１００、好ましくは１：２〜１：５０、より好ましくは１：２〜１：１０、さらに好ましくは１：２〜１：５のモル比で使用してもよい。サリチル酸に対するＮ−アセチルシステインの使用量を増やすにしたがって、サリチル酸の抗真菌作用に対する増強効果が高くなる。
【００３３】
さらに、本発明は、抗真菌剤の製造のための、サリチル酸およびＮ−アセチルシステインの使用を提供する。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００３５】
実験手法：
以下の実施例において、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の野生株（ＢＹ４７４２株）、その派生株であるｓｎｇ１欠損株および３種類の多剤耐性変異株（ｙｒｒ１−５２株、ｐｄｒ１−３株、ｐｄｒ３−１１株）、ならびびカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、およびＣａｎｄｉｄａ  ｇｒａｂｒａｔａ）を、サリチル酸およびＮ−アセチル−Ｌ−システインを含有するＹＰＤ培地中で培養し、スポット・アッセイ法により感受性試験を行った。
【００３６】
下記の試験例１にしたがって、ｙｒｒ１−５２株、ｐｄｒ１−３株、およびｐｄｒ３−１１株を作成した。ｙｒｒ１−５２株、ｐｄｒ１−３株、およびｐｄｒ３−１１株は、各々、転写因子Ｙｒｒ１ｐの遺伝子を変異させた株、転写因子Ｐｄｒ１ｐの遺伝子を変異させた株、および転写因子Ｐｄｒ３ｐの遺伝子を変異させた株である。変異の詳細は、下記の表に示すとおりである。これらの変異株は各々、その転写因子が制御する種々の遺伝子の発現が亢進することにより、その遺伝子産物である薬剤排出ポンプ群を強発現し、複数の抗真菌剤に対して耐性を示す多剤耐性株であることが分かった。転写因子Ｙｒｒ１ｐが制御している薬剤排出ポンプ群にはＳｎｇ１ｐが含まれ、Ｓｎｇ１ｐは、サリチル酸の細胞外排出を担う薬剤排出ポンプであることが分かった。
【表１】
2015199682.tif 000002
【００３７】
ｓｎｇ１欠損株は、薬剤排出ポンプＳｎｇ１ｐをコードする遺伝子を欠損させた変異株であり、この薬剤排出ポンプを発現しない株である。
【００３８】
なお、以下の試験例および実施例において、出芽酵母の分子遺伝学的実験手法は、以下の実験書に基づいて行った。
・Ｄ．Ｃ．Ａｍｂｅｒｇ，Ｄ．Ｊ．Ｂｕｒｋｅ，ａｎｄ  Ｊ．Ｎ．Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｕｒｓｅ  ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００５．
・水野貴之、バイオ実験イラストレイテッド７  使おう酵母  できるＴｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ、秀潤社．
また、分子生物学実験の各種方法は、以下のマニュアルを用いて行った。
・Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９．
【００３９】
試験例１．出芽酵母変異株の入手：
（１）ＢＹ４７４２株：
ＢＹ４７４２株は、文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクト［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏ−Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＮＢＲＰ）］「酵母」より購入した。
【００４０】
（２）ｓｎｇ１欠損株：
ｓｎｇ１欠損株は、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）より購入した。
【００４１】
（３）ｙｒｒ１−５２株、ｐｄｒ１−３株、ｐｄｒ３−１１株：
ＹＣｐｌａｃ１１１（ＮＢＲＰより購入）プラスミドに各々の突然変異型遺伝子を連結した各構築物を、各遺伝子欠損酵母株（ｙｒｒ１欠損株、ｐｄｒ１欠損株、ｐｄｒ３欠損株）に導入して、上記の突然変異株を得た。なお、ｙｒｒ１欠損株、ｐｄｒ１欠損株、ｐｄｒ３欠損株は、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）より購入した（これらは全てＢＹ４７４２派生株である）。変異導入用の各構築物の構築方法を以下に記す。
【００４２】
ａ．ＹＣｐｌａｃ１１１にｙｒｒ１−５２突然変異遺伝子を連結した構築物（ＹＣｐ−ｙｒｒ１−５２）：
「バイオ実験イラストレイテッド７  使おう酵母  できるＴｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ」に記すガラス・ビーズを用いたゲノムＤＮＡ抽出法により、突然変異を有するＫｉｎＳａｌ０５２株（論文未発表）からゲノムＤＮＡを抽出した。なお、ＫｉｎＳａｌ０５２株は、Ｙｒｒ１ｐの６１６番目のＳｅｒがＰｈｅに置換する変異を有する。このＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲを行うことにより、突然変異ｙｒｒ１コード領域とその上流・下流を含むＤＮＡを増幅した。使用したプライマーは、５’−ＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＡＣＴＧＧＣＡＧＡＡＡＴＣＡＴＡＧＴＧ−３’（配列番号１）と５’−ＡＡＣＧＧＡＴＣＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＴＣＴ−３’（配列番号２）である。これらのプライマーの５’末端側には制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加した。東洋紡のＫＯＤ−ＦＸ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、その添付文書に記す通りにＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ反応溶液を作製した。ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズのＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００を用いた。ＰＣＲプログラムは、９５℃２分に続き、９５℃３０秒と５５℃３０秒と６８℃３分を３０サイクル行った。反応終了後、反応溶液をキアゲン社の「ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」を用いて増幅断片の精製を行った。増幅断片とベクターは制限酵素ＢａｍＨＩで消化を行い、実験マニュアルに記すようにライゲーションと大腸菌に形質転換を行うことにより、構築物（ＹＣｐ−ｙｒｒ１−５２）を得た。本構築物のｙｒｒ１欠損株への導入は、実験書に記す酢酸リチウム法により行った。そして、ＹＣｐｌａｃ１１１プラスミドのロイシン要求性マーカーを指標にして組換え体を選択し、ｙｒｒ１−５２株を取得した。
【００４３】
ｂ．ＹＣｐｌａｃ１１１にｐｄｒ１−３突然変異遺伝子を連結した構築物（ＹＣｐ−ｐｄｒ１−３）：
本構築物もＹＣｐ−ｙｒｒ１−５２の場合と同様の方法によって取得した。ｐｄｒ１−３株は、Ｐｄｒ１ｐの８１５番目のアミノ酸がＰｈｅからＳｅｒに置換した変異株である。以下、ＹＣｐ−ｙｒｒ１−５２の場合との変更点を記す。ＰＣＲに使用したゲノムＤＮＡは、ＢＹ４７４２株から取得した。このＤＮＡを鋳型にして、まず野生型ＰＤＲ１遺伝子を増幅した。使用したプライマーは、フォワード・プライマーが５’−ＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＡＴＣＡＧＣＡＴＡＣ−３’（配列番号３）であり、この５’末端側には制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を新たに付加した。そして、リバース・プライマーは５’−ＡＴＴＴＡＧＴＣＧＡＣＧＴＴＴＣＧＧＡＧＣＣＡＡＴＧＡＴＴＣＴ−３’（配列番号４）であり、これも５’末端側に制限酵素ＳａｌＩの認識配列を新たに付加した。ＰＣＲ反応は上記と同様に行い精製を行った。プラスミドへの連結も使用した制限酵素以外は同様に行い、大腸菌に形質転換を行うことにより、野生型ＰＤＲ１構築物を作製した（ＹＣｐ−ｐｄｒ１）。つづいて突然変異型ｐｄｒ１遺伝子を作製するために、上記構築物ＹＣｐ−ＰＤＲ１を鋳型にしてＰＣＲを行った。それに用いたリン酸基を付加したプライマーは、フォワード・プライマーが５’−ＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＧＴＣＡＣＴＣＧＴＡ−３’（配列番号５）であり、リバース・プライマーが５’−ＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＴＣＴＴＧＴＡＴＡ−３’（配列番号６）である。ＰＣＲ条件も上記と基本的に同様であるが、プログラムを以下の通りとした。すなわち、９４℃で２分のあと、９４℃３０秒と５５℃３０秒と６８℃１１分を３０サイクル行った。反応溶液を精製後、増幅産物のみを用いてセルフ・ライゲーション（自己環状化）を行って、大腸菌に形質転換を行うことで、構築物（ＹＣｐ−ｐｄｒ１−３）を得た。
【００４４】
ｃ．ＹＣｐｌａｃ１１１にｐｄｒ３−１１突然変異遺伝子を連結した構築物（ＹＣｐ−ｐｄｒ３−１１）：
本構築物はＹＣｐ−ｐｄｒ１−３と同様に、２段階のＰＣＲにより作製した。ｐｄｒ３−１１株は、Ｐｄｒ３ｐの９５７番目のアミノ酸がＧｌｙからＡｓｐに置換した変異株である。一回目のＰＣＲは、ＢＹ４７４２株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、フォワード・プライマー（５’−ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＴＧＧＣＡＣＡＴＡＡＣＴＧ−３’［配列番号７］）とリバース・プライマー（５’−ＡＡＡＴＴＧＴＣＧＡＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＣＣＧＴＴＴＴＡＴＡＴ−３’［配列番号８］）を用いて増幅を行った。これらのプライマーにも制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩの認識配列を新たに付加した。二回目のＰＣＲには、一回目のＰＣＲに基づき構築されたＹＣｐ−ｐｄｒ３を鋳型に、フォワード・プライマー（５’−ＴＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＡＴＴＴＡＴＡＴＣ−３’［配列番号９］）とリバース・プライマー（５’−ＴＣＡＣＴＧＣＴＧＡＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣ−３’［配列番号１０］）を用いて増幅を行った。この増幅産物をセルフ・ライゲーションし、大腸菌に形質転換することにより、構築物（ＹＣｐ−ｐｄｒ３−１１）を得た。
【００４５】
実施例１．出芽酵母の薬剤感受性試験（スポット・アッセイ法）：
試験例１によって入手した酵母を用いて、以下のようにして薬剤感受性試験を行った。
（１）酵母終夜培養希釈液の調製：
ａ．  出芽酵母ＢＹ４７４２野生株と試験例１で得たその派生変異株を、クリーンベンチ内でＹＰＤ固形培地に植菌した。培地を３０℃に設定した培養器内で３日程度保温して、コロニーを形成させた。次に、クリーンベンチ内で、各々の株のコロニー１つを滅菌した竹串でかきとり、試験管内の１ｍｌのＹＰＤ液体培地に移植した。その試験管を同様に３０℃の培養器内で２４時間以上振とう培養を行った。
ｂ．  培養が終了した試験管を用いて、クリーンベンチ内で以下の操作を行った。まず、滅菌したサンプルチューブに０．９ｍｌのＰＢＳを加え、それを一株につき５本用意した。良く撹拌した液体培養から０．１ｍｌをマイクロピペットで取り出し、用意した一本のチューブに加えて混合した。この操作により、１０倍希釈液を作製した。さらに、この希釈液から０．１ｍｌ取り出し、新しいチューブへ移し混合することで、さらに原液の１００倍希釈液を作製した。この操作を繰り返して、最終的に５本の希釈系列（１０倍、１００倍、・・・）を各株で作製した。
【００４６】
（２）各薬剤を含有するＹＰＤ固形培地の作製：
種々の濃度のサリチル酸（以下、ＳＡともいう）およびＮ−アセチル−Ｌ−システイン（以下、ＮＡＣともいう）を含有する試験用固形培地は、以下のようにして作製した。サリチル酸およびＮ−アセチル−Ｌ−システインは、和光純薬工業株式会社より購入した。各々の薬剤をＤＭＳＯで溶解したストック溶液を作製した。メディウム瓶にＹＰＤと最終濃度２％になるように寒天末を加えて、オートクレーブ滅菌を行った。終了後、培地はウォーター・バスで６５℃に保温した。クリーンベンチ内で、３０ｍｌの培地を滅菌ピペットで取り出し、滅菌済のカップへ移した。そこへ、目的の最終濃度（サリチル酸０ｍＭ、２．５ｍＭ、３．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、および１５ｍＭ、ならびにＮ−アセチル−Ｌ−システイン０ｍＭ、１５ｍＭ、および３０ｍＭからなる計２４通りの組み合わせ）となるように、各薬剤のストック溶液をマイクロピペットを用いて加えて、十分に混合を行った。そして、滅菌シャーレに本液体を注ぎ、クリーンベンチ内で固化させると共に十分に乾燥を行った。
【００４７】
（３）スポット・アッセイの実施：
各種薬剤を含む固形培地をクリーンベンチ内に並べて、各株の液体培養の希釈系列をスポットした。スポットする際は、液体培養の入ったチューブを十分に攪拌したのち、マイクロピペットで１０μｌずつ固形培地の数ミリ上方から培地上に滴下を行った。全ての培養希釈系列を滴下して乾燥を行い、シャーレのふたをして、３０℃の培養器で２日間培養を行った。コロニー形成したシャーレは、野生株、多剤耐性株、排出ポンプ遺伝子欠損株の生育状況を観察するとともに、写真撮影を行った。
【００４８】
（４）結果
結果を図１および図２に示す。
図１から明らかなように、野生株では、サリチル酸単独の場合、１５ｍＭサリチル酸で完全に死滅したが、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを併用すると、１５ｍＭ ＮＡＣ＋１０ｍＭ ＳＡおよび３０ｍＭ ＮＡＣ＋５ｍＭ ＳＡで完全に死滅した。したがって、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを併用することにより、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの濃度依存的に出芽酵母のサリチル酸感受性が高まることが分かった。また、サリチル酸を含む薬剤に対する多剤耐性株であるＳＮＧ１強発現株（ｙｒｒ１−５２株）では、サリチル酸単独の場合、１５ｍＭサリチル酸下でも増殖したが、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを併用すると、１５ｍＭ ＮＡＣ＋１２．５ｍＭ ＳＡおよび３０ｍＭ ＮＡＣ＋７．５ｍＭ ＳＡで完全に死滅した。したがって、多剤耐性菌においても、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを併用することにより、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの濃度依存的にサリチル酸感受性が高まることが分かった。また、図１から明らかなように、ｓｎｇ１欠損株は野生株と比べてサリチル酸感受性が高いが、その感受性は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの併用によりさらに高まった。
【００４９】
さらに、図２から明らかなように、ｐｄｒ１−３株およびｐｄｒ３−１１株においても、同様に、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを併用することにより、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの濃度依存的に、そのサリチル酸感受性が高まることが分かった。
【００５０】
発明者の研究において、転写因子Ｐｄｒ１ｐまたはＰｄｒ３ｐが発現制御している薬剤排出ポンプは、少なくとも、リベロマイシンＡ、ベノミル、４−ＮＱＯ、カスポファンギン、アムホテリシンＢ、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、イソコナゾール、ボリコナゾール、ブテナフィン、テルビナフィン、イマザリル、セルレニン、アルテスネート、およびシクロヘキシミドの細胞外排出に関与することが分かった。したがって、サリチル酸の抗真菌作用は、少なくとも、リベロマイシンＡ、ベノミル、４−ＮＱＯ、カスポファンギン、アムホテリシンＢ、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、イソコナゾール、ボリコナゾール、ブテナフィン、テルビナフィン、イマザリル、セルレニン、アルテスネート、およびシクロヘキシミドのうち１以上の薬剤に対して耐性のある真菌または多剤耐性真菌に対して有効であることが分かる。さらに、かかるサリチル酸の抗真菌作用は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの併用により増強される。
【００５１】
実施例２．カンジダの薬剤感受性試験（スポット・アッセイ法）：
カンジダ株Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（ＮＢＲＣ１３９３）（以下、「Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ」という）およびＣａｎｄｉｄａ  ｇｒａｂｒａｔａ（ＮＢＲＣ０６２２）（以下、「Ｃ．ｇｒａｂｒａｔａ」という）を独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）より入手した。これらのカンジダ株を実施例１と同様に培養し、終夜培養希釈液を調製した。さらに、実施例１と同様の方法で、サリチル酸およびＮ−アセチル−Ｌ−システインを含有するＹＰＤ固形培地を作製した。但し、サリチル酸の最終濃度は、０ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５０ｍＭ、０．７５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭおよび３ｍＭとし、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの最終濃度は、０ｍＭ、１５ｍＭおよび３０ｍＭとした。これらの希釈液および培地を用いて、実施例１と同様の方法で、スポット・アッセイを行った。
【００５２】
結果を図３に示す。いずれの株も５ｍＭサリチル酸で死滅した（データを示さず）。図３から明らかなように、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、１５ｍＭ  ＮＡＣ＋２ｍＭ  ＳＡおよび３０ｍＭ  ＮＡＣ＋０．７５ｍＭ  ＳＡで完全に死滅した。Ｃ．ｇｒａｂｒａｔａは、１５ｍＭ  ＮＡＣ＋３ｍＭ  ＳＡおよび３０ｍＭ  ＮＡＣ＋２ｍＭ  ＳＡで完全に死滅した。したがって、カンジダでも、出芽酵母と同様、サリチル酸とＮ−アセチル−Ｌ−システインとの併用による抗真菌作用の増強効果が示された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、サリチル酸の抗真菌作用を高めることができるので、本発明の抗真菌剤は、今までサリチル酸によって十分な治療効果が得られなかった真菌症に対しても使用することができる。また、本発明の抗真菌剤は、サリチル酸以外の抗真菌剤に対して耐性を有する真菌または多剤耐性真菌に対して有効に使用することができる。また、本発明の抗真菌剤は、サリチル酸を含む抗真菌剤に対する多剤耐性真菌に対しても、有効に使用することができる。さらに、本発明によれば、サリチル酸の利用を増やすことにより、他の抗真菌剤の使用を減らすことができ、それらの薬剤に対する耐性真菌の出現または多剤耐性真菌の出現を抑えることが期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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