(57)【要約】【課題】腋臭を抑制する物質の同定。【解決手段】ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び腋臭原因物質を添加すること；該腋臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、を含む腋臭抑制剤の探索方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腋臭抑制剤の探索方法であって、以下：
ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び腋臭原因物質を添加すること；
該腋臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記ＯＲ１Ａ１が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
前記ＯＲ２Ｗ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
前記ＯＲ２Ｊ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
前記ＯＲ１０Ａ６が配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
前記ＯＲ５１Ｂ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
前記ＯＲ５１Ｅ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
前記ＯＲ５１Ｉ２が配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、
請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法であって、
前記ＯＲ１Ａ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３−メルカプト−３−メチルヘキサノール又は３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ２Ｗ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３−メルカプト−３−メチルヘキサノール又は３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ２Ｊ３とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号６で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（Ｓ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノールに応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ１０Ａ６とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸又は３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５１Ｂ２とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号１０で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５１Ｅ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号１２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
かつ
前記ＯＲ５１Ｉ２とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号１４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドである、
方法。
【請求項４】
前記嗅覚受容体ポリペプチドが、該嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現されている、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記試験物質を添加しなかった前記嗅覚受容体ポリペプチドの前記腋臭原因物質に対する応答を測定することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記試験物質を添加した前記嗅覚受容体ポリペプチドの前記腋臭原因物質に対する応答が、該試験物質を添加しなかった該嗅覚受容体ポリペプチドの該腋臭原因物質に対する応答に対して６０％以下に抑制されていたときに、該試験物質を、該腋臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する物質として同定することをさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記腋臭原因物質が、（Ｒ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノール、（Ｓ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノール、それらの混合物、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、及び３−メチル−２−ヘキセン酸からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答の測定が、ＥＬＩＳＡ若しくはレポータージーンアッセイによる細胞内ｃＡＭＰ量測定、又はカルシウムイメージングによる測定である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腋臭抑制剤の探索方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、清潔志向の高まりに伴い、体臭を気にする人が増えている。体臭は全身の各部から発生するニオイの総称であり、主要な発生部位としては頭部、口腔、腋窩部、鼠径部、足の裏等がある。その中でも、腋臭（腋窩部のニオイ）は、全身的な体臭へ与える影響が大きい。
【０００３】
腋臭は、酸っぱく蒸れたニオイと、腋窩部に特有のニオイとからなる。酸っぱく蒸れたニオイは、炭素数２〜５の低級カルボン酸に起因するものであり、低級脂肪酸臭、又は単に酸臭と呼ばれる。腋窩部特有のニオイは、アポクリン汗腺から分泌されアポクリン汗が皮膚常在菌によって分解されて発生する臭いであり、アポクリン臭又は「わきが」などと呼ばれている。
【０００４】
特許文献１には、３−ヒドロキシ−３−メチルペンタン酸や３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸等の炭素数５〜８のヒドロキシアルキニルカルボン酸、及び３−メチル−２−ペンテン酸、３−メチル−２−ヘキセン酸、３−メチル−２−ヘプテン酸等の炭素数５〜８の二重結合を１つ有するアルケニルカルボン酸によりアポクリン臭を再現できることが記載されている。特許文献２には、３−メルカプト−３−メチルヘキサン−１−オール、３−メルカプトヘキサン−１−オール、３−メルカプトペンタン−１−オール、３−メルカプト−２−メチルブタン−１−オール、３−メルカプト−２−メチルペンタン−１−オール等の３−メルカプトアルコール化合物又はそのラセミ混合物によりアポクリン臭を再現できることが記載されている。特許文献３には、揮発性硫黄化合物、３−メチル−２−ヘキセン酸等の短鎖分岐脂肪酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸等が腋窩の悪臭に関与する物質として知られていることが記載されている。特許文献４には、アポクリン臭原因物質として、３−メチル−３−ヒドロキシヘキサン酸、３−メチル−２−ヘキセン酸、３−メチル−３−スルホニルヘキサン−１−オール、および３−メルカプト−３−メチルヘキサン−１−オールが記載されている。
【０００５】
従来の香料物質や消臭物質の開発においては、匂いの評価は専門家による官能試験によって行われてきた。しかし、官能試験には、匂いを評価できる専門家の育成が必要なことや、スループット性が低いなどの問題がある。
【０００６】
ヒト等の哺乳動物においては、匂いは、鼻腔上部の嗅上皮に存在する嗅神経細胞上の嗅覚受容体に匂い分子が結合し、それに対する受容体の応答が中枢神経系へと伝達されることにより認識されている。ヒトの場合、嗅覚受容体は約４００個存在することが報告されており、これらをコードする遺伝子はヒトの全遺伝子の約２％にあたる。一般的に、嗅覚受容体と匂い分子は複数対複数の組み合わせで対応付けられている。すなわち、個々の嗅覚受容体は構造の類似した複数の匂い分子を異なる親和性で受容し、一方で、個々の匂い分子は複数の嗅覚受容体によって受容される。さらに、ある嗅覚受容体を活性化する匂い分子が、別の嗅覚受容体の活性化を阻害するアンタゴニストとして働くことも報告されている。これら複数の嗅覚受容体の応答の組み合わせが、個々の匂いの認識をもたらしている。
【０００７】
したがって、同じ匂い分子が存在する場合でも、同時に他の匂い分子が存在すると、当該他の匂い分子によって受容体応答が阻害され、最終的に認識される匂いが全く異なることがある。このような仕組みを嗅覚受容体のアンタゴニズムと呼ぶ。この受容体アンタゴニズムによる匂いの変調は、香水や芳香剤等の別の匂いを付加することによる消臭方法と異なり、特定の悪臭の認識を特異的に失くしてしまうことができ、また芳香剤の匂いによる不快感が生じることもないことから、好ましい消臭手段である。特許文献５〜６には、嗅覚受容体の活性を指標として、嗅覚受容体アンタゴニズムによりヘキサン酸やスカトール等の悪臭を抑制する物質を探索することできることが記載されている。特許文献７にも、３−メチル−２−ヘキセン酸等の汗臭原因物質存在下での嗅覚受容体の活性を指標として、汗臭を抑制する物質を探索することが記載されている。特許文献８には、イソ吉草酸やその等価体の存在下で嗅覚受容体をコードするポリペプチドの活性を測定することで、当該ポリペプチドの機能を調節する薬剤を同定する方法が記載されている。特許文献９には、嗅覚受容体をコードするポリペプチドに特異的に結合する化合物を同定することにより、嗅覚の感覚に関連する化合物について化学物質のライブラリーをスクリーニングする方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−２６３１０２号公報
【特許文献２】特開２００５−６２１５９号公報
【特許文献３】特表２００９−５０７４７７号公報
【特許文献４】特開２０１３−２４９２６３号公報
【特許文献５】特開２０１２−０５０４１１号公報
【特許文献６】特開２０１２−２４９６１４号公報
【特許文献７】米国特許公開第２０１３／０３３６９１０号
【特許文献８】国際公開公報第２００６／０９４７０４号
【特許文献９】特表２００４−５０４０１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、嗅覚受容体の応答を指標として腋臭抑制剤を効率良く探索する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、腋臭の主な原因物質である３−メルカプト−３−メチルヘキサノールのＳ体若しくはＲ体、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、又は３−メチル−２−ヘキセン酸に応答する嗅覚受容体を新たに同定することに成功した。また本発明者は、当該嗅覚受容体又はそれと同様の機能を有するポリペプチドの応答を指標とすることにより、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングによって腋臭を抑制する物質の評価及び選択が可能であることを見出した。
【００１１】
したがって本発明は、腋臭抑制剤の探索方法であって、以下：
ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び腋臭原因物質を添加すること；
該腋臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングにより腋臭を選択的に消臭することができる腋臭抑制剤を、効率よく探索することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】嗅覚受容体の（Ｒ）及び（Ｓ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノールに対する応答。横軸は個々の嗅覚受容体、縦軸は応答強度を示す（ｎ＝２）。
【図２】種々の濃度の（Ｒ）及び（Ｓ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノールに対する嗅覚受容体の応答。Ａ：ＯＲ１Ａ１、Ｂ：ＯＲ２Ｗ１、Ｃ：ＯＲ２Ｊ３。ｎ＝３〜４、エラーバー＝±ＳＥ。
【図３】嗅覚受容体の３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸に対する応答。横軸は個々の嗅覚受容体、縦軸は応答強度を示す（ｎ＝２）。
【図４】種々の濃度の３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸に対する嗅覚受容体ＯＲ１０Ａ６の応答。ｎ＝３〜４、エラーバー＝±ＳＥ。
【図５】嗅覚受容体の３−メチル−２−ヘキセン酸に対する応答。横軸は個々の嗅覚受容体、縦軸は応答強度を示す（ｎ＝２）。
【図６】種々の濃度の３−メチル−２−ヘキセン酸に対する嗅覚受容体の応答。Ａ：ＯＲ１Ａ１、Ｂ：ＯＲ２Ｗ１、Ｃ：ＯＲ１０Ａ６、Ｄ：ＯＲ５１Ｂ２、Ｅ：ＯＲ５１Ｅ１、Ｆ：ＯＲ５１Ｉ２。ｎ＝３〜４、エラーバー＝±ＳＥ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、匂いに関する用語「マスキング」とは、目的の匂いを認識させなくするか又は認識を弱めるための手段全般を指す。「マスキング」は、化学的手段、物理的手段、生物的手段、及び感覚的手段を含み得る。例えば、マスキングとしては、目的の匂いの原因となる匂い分子を環境から除去するための任意の手段（例えば、匂い分子の吸着及び化学的分解）、目的の匂いが環境に放出されないようにするための手段（例えば、封じ込め）、香料や芳香剤などの別の匂いを添加して目的の匂いを認識しにくくする方法、などが挙げられる。
【００１５】
本明細書における「嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキング」とは、上述の広義の「マスキング」の一形態であって、目的の匂い分子と他の匂い分子をともに適用することにより、当該他の匂い分子によって目的の匂い分子に対する受容体応答を阻害し、結果的に個体に認識される匂いを変化させる手段である。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングは、同様に他の匂い分子を用いる手段であっても、芳香剤等の、目的の匂いを別の強い匂いによって打ち消す手段とは区別される。嗅覚受容体アンタゴニズムによるマスキングの一例は、アンタゴニスト（拮抗剤）等の嗅覚受容体の応答を阻害する物質を使用するケースである。特定の匂いをもたらす匂い分子の受容体にその応答を阻害する物質を適用すれば、当該受容体の当該匂い分子に対する応答が抑制されるため、最終的に個体に知覚される匂いを変化させることができる。
【００１６】
本明細書において、「嗅覚受容体ポリペプチド」とは、嗅覚受容体又はそれと同等の機能を有するポリペプチドをいい、嗅覚受容体と同等の機能を有するポリペプチドとは、嗅覚受容体と同様に、細胞膜上に発現することができ、匂い分子の結合によって活性化し、かつ活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる機能を有するポリペプチドをいう（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００４，５：２６３−２７８）。
【００１７】
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１８】
図１〜６に示すとおり、本発明者は、多くの嗅覚受容体の中から、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、及びＯＲ５１Ｉ２を、各種腋臭原因物質に対して特異的に応答する嗅覚受容体として同定した。これらの嗅覚受容体はいずれも、腋臭原因物質に対して濃度依存的に応答する。したがって、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１若しくはＯＲ５１Ｉ２、又はこれらと同様の機能を有するポリペプチドの応答を抑制する物質は、嗅覚受容体アンタゴニズムに基づくマスキングにより、中枢における腋臭の認識に変化を生じさせ、結果として、腋臭を選択的に抑制することができる。
【００１９】
したがって、本発明は、腋臭抑制剤の探索方法を提供する。当該方法は、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び腋臭原因物質を添加すること；該腋臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、を含む。同定された試験物質は、腋臭抑制剤として選択される。当該本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで行われる方法であり得る。
【００２０】
上記本発明の方法において、腋臭原因物質としては、３−メルカプト−３−メチルヘキサノール（本明細書において（Ｒ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノール、（Ｓ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノール、及びそれらの混合物を包含する）、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、及び３−メチル−２−ヘキセン酸からなる群より選択される少なくとも１種が好適に使用される。
【００２１】
したがって、本発明の別の実施形態は、３−メルカプト−３−メチルヘキサノール臭抑制剤の探索方法である。当該方法は、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ３、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び３−メルカプト−３−メチルヘキサノール（ここで、該３−メルカプト−３−メチルヘキサノールは、（Ｒ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノール、（Ｓ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノール、又はそれらの混合物である）を添加すること；該３−メルカプト−３−メチルヘキサノールに対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、を含む。同定された試験物質は、３−メルカプト−３−メチルヘキサノール臭抑制剤として選択される。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態は、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸臭抑制剤の探索方法である。当該方法は、ＯＲ１０Ａ６及びこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸を添加すること；３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、を含む。同定された試験物質は、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸臭抑制剤として選択される。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態は、３−メチル−２−ヘキセン酸臭抑制剤の探索方法である。当該方法は、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び３−メチル−２−ヘキセン酸を添加すること；３−メチル−２−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、を含む。同定された試験物質は、３−メチル−２−ヘキセン酸臭抑制剤として選択される。
【００２４】
上記本発明の方法においては、上記腋臭原因物質に応答性を有する嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質と該腋臭原因物質とが添加される。
【００２５】
本発明の方法に使用される試験物質は、腋臭抑制剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的若しくは生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、又は化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。
【００２６】
本発明の方法に使用される嗅覚受容体ポリペプチドは、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００２７】
ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、及びＯＲ５１Ｉ２は、いずれもヒト嗅細胞で発現している嗅覚受容体である。ＯＲ１Ａ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：２８９５４７６２２として登録されている。ＯＲ１Ａ１は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ＯＲ２Ｗ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：１６９２３４７８８として登録されている。ＯＲ２Ｗ１は、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ＯＲ２Ｊ３は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５０７５８８２４５として登録されている。ＯＲ２Ｊ３は、配列番号５で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ＯＲ１０Ａ６は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５２２１８８３５として登録されている。ＯＲ１０Ａ６は、配列番号７で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ＯＲ５１Ｂ２は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：１５７７３８６２２として登録されている。ＯＲ５１Ｂ２は、配列番号９で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ＯＲ５１Ｅ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：２０５２７７３７７として登録されている。ＯＲ５１Ｅ１は、配列番号１１で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。ＯＲ５１Ｉ２は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：２８４１７２４３５として登録されている。ＯＲ５１Ｉ２は、配列番号１３で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００２８】
ＯＲ１Ａ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３−メルカプト−３−メチルヘキサノール又は３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００２９】
ＯＲ２Ｗ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３−メルカプト−３−メチルヘキサノール又は３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００３０】
ＯＲ２Ｊ３とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（Ｓ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノールに応答性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００３１】
ＯＲ１０Ａ６とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸又は３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００３２】
ＯＲ５１Ｂ２とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号１０で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００３３】
ＯＲ５１Ｅ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号１２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００３４】
ＯＲ５１Ｉ２とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドとしては、配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００３５】
本発明の方法では、上述した嗅覚受容体ポリペプチドから選択される少なくとも１種を使用すればよいが、いずれか２種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明の方法において、腋臭原因物質が３−メルカプト−３−メチルヘキサノールであるか又はそれを含む場合、嗅覚受容体ポリペプチドとしては、好ましくは、ＯＲ１Ａ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ２Ｊ３又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種が使用され、より好ましくはＯＲ１Ａ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドのいずれか又は両方が使用され、さらに好ましくは、ＯＲ１Ａ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ２Ｊ３又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが組み合わせて使用され、なお好ましくは、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１及びＯＲ２Ｊ３が組み合わせて使用される。
【００３６】
本発明の方法において、腋臭原因物質が３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸であるか又はそれを含む場合、嗅覚受容体ポリペプチドとしては、好ましくは、ＯＲ１０Ａ６及び／又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが使用され、より好ましくはＯＲ１０Ａ６が使用される。
【００３７】
本発明の方法において、腋臭原因物質が３−メチル−２−ヘキセン酸であるか又はそれを含む場合、嗅覚受容体ポリペプチドとしては、好ましくは、ＯＲ１Ａ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ１０Ａ６又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５１Ｂ２又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５１Ｅ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ５１Ｉ２又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種が使用される。より好ましくは、ＯＲ１Ａ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ１０Ａ６又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５１Ｂ２又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ５１Ｅ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種、さらに好ましくは少なくとも２種、さらに好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも４種、さらに好ましくは全部が組み合わせて使用される。なお好ましくは、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２及びＯＲ５１Ｅ１が組み合わせて使用される。
【００３８】
本発明の方法において、上記嗅覚受容体ポリペプチドは、上記腋臭原因物質に対する応答性を失わない限り、任意の形態で使用され得る。例えば、当該嗅覚受容体ポリペプチドは、生体から単離された嗅覚受容器若しくは嗅細胞等の、当該嗅覚受容体ポリペプチドを天然に発現する組織や細胞、又はそれらの培養物；当該嗅覚受容体ポリペプチドを担持した嗅細胞の膜；当該嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物；当該嗅覚受容体ポリペプチドを有する当該組換え細胞の膜；当該嗅覚受容体ポリペプチドを有する人工脂質二重膜、などの形態で使用され得る。これらの形態は全て、本発明で使用される嗅覚受容体ポリペプチドの範囲に含まれる。
【００３９】
好ましい態様においては、嗅覚受容体ポリペプチドとしては、嗅細胞等の上記嗅覚受容体ポリペプチドを天然に発現する細胞、又は当該嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞、あるいはそれらの培養物が使用される。当該組換え細胞は、当該嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。
【００４０】
好適には、嗅覚受容体ポリペプチドの細胞膜発現を促進するために、当該嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子とともに、ＲＴＰ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子を細胞に導入する。好ましくは、ＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子を、当該嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子とともに細胞に導入する。ＲＴＰ１Ｓの例としては、ヒトＲＴＰ１Ｓが挙げられる。ヒトＲＴＰ１Ｓは、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５０２３４９１７として登録されており、配列番号１５で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００４１】
本発明の方法によれば、上記嗅覚受容体ポリペプチドへの試験物質及び上記腋臭原因物質の添加に続いて、該腋臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答が測定される。測定は嗅覚受容体の応答を測定する方法として当該分野で知られている任意の方法、例えば、細胞内ｃＡＭＰ量測定等によって行えばよい。例えば、嗅覚受容体は、匂い分子によって活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させることが知られている（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００４，５：２６３−２７８）。したがって、匂い分子添加後の細胞内ｃＡＭＰ量を指標にすることで、上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ等が挙げられる。上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する他の方法としては、カルシウムイメージング法が挙げられる。
【００４２】
次いで、測定された上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答に基づいて、上記腋臭原因物質への応答に対して試験物質が及ぼす作用を評価し、当該応答を抑制する試験物質を同定する。試験物質による作用の評価は、試験物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチドの該腋臭原因物質に対する応答を、対照群における該腋臭原因物質に対する応答と比較することによって行うことができる。対照群としては、異なる濃度の試験物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチド、試験物質を添加しなかった該嗅覚受容体ポリペプチド、対照物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチド、試験物質を添加する前の該嗅覚受容体ポリペプチドなどを挙げることができる。
【００４３】
例えば、上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答に対して試験物質が及ぼす作用は、より高濃度の試験物質添加群とより低濃度の試験物質添加群との間、試験物質添加群と非添加群との間、試験物質添加群と対照物質添加群との間、又は試験物質添加前後で、上記腋臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を比較することによって評価することができる。試験物質添加により、又はより高濃度の試験物質の添加により該嗅覚受容体ポリペプチドの応答が抑制される場合、当該試験物質を、該嗅覚受容体ポリペプチドの該腋臭原因物質に対する応答を抑制する物質として同定することができる。
【００４４】
例えば、上記の手順で測定された試験物質添加群における嗅覚受容体ポリペプチドの応答が、対照群と比較して好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは２５％以下に抑制されていれば、当該試験物質を、上記腋臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する物質として同定することができる。あるいは、上記の手順で測定された試験物質添加群における嗅覚受容体ポリペプチドの応答が、対照群と比較して統計学的に有意に抑制されていれば、当該試験物質を、上記腋臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する物質として同定することができる。
【００４５】
上記の手順で同定された試験物質は、上記腋臭原因物質に対する嗅覚受容体の応答を抑制することによって、個体による腋臭の認識を抑制することができる物質である。したがって、上記手順で同定された試験物質は、腋臭抑制剤として選択することができる。本発明の方法によって腋臭抑制剤として選択された物質は、上記腋臭原因物質に対する嗅覚受容体の応答抑制に基づく嗅覚マスキングによって、腋臭を抑制することができる。
【００４６】
したがって、一実施形態において、本発明の方法によって選択された物質は、腋臭抑制剤の有効成分であり得る。あるいは、本発明の方法によって選択された物質は、腋臭を抑制するための化合物又は組成物に、腋臭を抑制するための有効成分として含有され得る。またあるいは、本発明の方法によって選択された物質は、腋臭の抑制剤の製造のため、又は腋臭を抑制するための化合物若しくは組成物の製造のために使用することができる。
【００４７】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、製造方法、用途あるいは方法を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００４８】
＜１＞腋臭抑制剤の探索方法であって、以下：
ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び腋臭原因物質を添加すること；
該腋臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。
【００４９】
＜２＞３−メルカプト−３−メチルヘキサノール臭抑制剤の探索方法であって、以下：
ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ３、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び３−メルカプト−３−メチルヘキサノール（ここで、該３−メルカプト−３−メチルヘキサノールは、（Ｒ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノール、（Ｓ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノール、又はそれらの混合物である）を添加すること；
該３−メルカプト−３−メチルヘキサノールに対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。
【００５０】
＜３＞３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸臭抑制剤の探索方法であって、以下：
ＯＲ１０Ａ６及びこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸を添加すること；
３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。
【００５１】
＜４＞３−メチル−２−ヘキセン酸臭抑制剤の探索方法であって、以下：
ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び３−メチル−２−ヘキセン酸を添加すること；
３−メチル−２−ヘキセン酸に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び、
測定された応答に基づいて該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、
を含む方法。
【００５２】
＜５＞上記＜１＞記載の方法であって、好ましくは、上記腋臭原因物質が、（Ｒ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノール、（Ｓ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノール、それらの混合物、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、及び３−メチル−２−ヘキセン酸からなる群より選択される少なくとも１種である、方法。
【００５３】
＜６＞上記＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の方法であって、好ましくは、
上記ＯＲ１Ａ１が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
上記ＯＲ２Ｗ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
上記ＯＲ２Ｊ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
上記ＯＲ１０Ａ６が配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
上記ＯＲ５１Ｂ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
上記ＯＲ５１Ｅ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
上記ＯＲ５１Ｉ２が配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、方法。
【００５４】
＜７＞上記＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載の方法であって、
上記ＯＲ１Ａ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは３−メルカプト−３−メチルヘキサノール又は３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
上記ＯＲ２Ｗ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号４で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは３−メルカプト−３−メチルヘキサノール又は３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
上記ＯＲ２Ｊ３とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号６で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは（Ｓ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノールに応答性を有するポリペプチドであり、
上記ＯＲ１０Ａ６とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号８で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸又は３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
上記ＯＲ５１Ｂ２とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号１０で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
上記ＯＲ５１Ｅ１とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号１２で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
上記ＯＲ５１Ｉ２とアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドが、配列番号１４で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、なおより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ好ましくは３−メチル−２−ヘキセン酸に応答性を有するポリペプチドである、
方法。
【００５５】
＜８＞上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載の方法であって、上記腋臭原因物質が３−メルカプト−３−メチルヘキサノールであるか又はそれを含む場合、上記ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドが、
好ましくは、ＯＲ１Ａ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ２Ｊ３又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、ＯＲ１Ａ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドのいずれか又は両方であり、
さらに好ましくは、ＯＲ１Ａ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ２Ｊ３又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドの組み合わせであり、
なお好ましくは、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１及びＯＲ２Ｊ３の組み合わせである、
方法。
【００５６】
＜９＞上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載の方法であって、上記腋臭原因物質が３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸であるか又はそれを含む場合、上記ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドが、
好ましくは、ＯＲ１０Ａ６及び／又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドであり、
より好ましくはＯＲ１０Ａ６である、
方法。
【００５７】
＜１０＞上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載の方法であって、上記腋臭原因物質が３−メチル−２−ヘキセン酸であるか又はそれを含む場合、上記ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドが、
好ましくは、ＯＲ１Ａ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ１０Ａ６又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５１Ｂ２又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５１Ｅ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ５１Ｉ２又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、ＯＲ１Ａ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ１０Ａ６又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５１Ｂ２又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ５１Ｅ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくは、ＯＲ１Ａ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ２Ｗ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ１０Ａ６又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、ＯＲ５１Ｂ２又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、及びＯＲ５１Ｅ１又はこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドの組み合わせであり、
なお好ましくは、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、及びＯＲ５１Ｅ１の組み合わせである、
方法。
【００５８】
＜１１＞上記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１に記載の方法であって、
好ましくは、対照群における上記腋臭原因物質に対する応答を測定することをさらに含み、かつ該対照群が、以下：
上記試験物質を添加しなかった上記嗅覚受容体ポリペプチド；
対照物質を添加した上記嗅覚受容体ポリペプチド；又は
上記試験物質添加前の上記嗅覚受容体ポリペプチド
である、方法。
【００５９】
＜１２＞上記＜１１＞記載の方法であって、好ましくは、
上記試験物質を添加した上記嗅覚受容体ポリペプチドの上記腋臭原因物質に対する応答が、上記対照群における該腋臭原因物質に対する応答と比べて統計学的に有意に抑制されていた場合に、該試験物質を該腋臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する物質として同定すること、
をさらに含む、方法。
【００６０】
＜１３＞上記＜１１＞記載の方法であって、好ましくは、
上記試験物質を添加した上記嗅覚受容体ポリペプチドの上記腋臭原因物質に対する応答が、上記対照群における該腋臭原因物質に対する応答に対して好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは２５％以下に抑制されていた場合に、該試験物質を該腋臭原因物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する物質として同定すること、
をさらに含む、方法。
【００６１】
＜１４＞上記＜１＞、＜５＞〜＜１３＞のいずれか１に記載の方法であって、好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドの上記腋臭原因物質に対する応答を抑制する試験物質を、腋臭抑制剤として選択することをさらに含む、方法。
【００６２】
＜１５＞上記＜２＞、＜６＞〜＜１３＞のいずれか１に記載の方法であって、好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドの３−メルカプト−３−メチルヘキサノールに対する応答を抑制する試験物質を、３−メルカプト−３−メチルヘキサノール臭抑制剤として選択することをさらに含む、方法。
【００６３】
＜１６＞上記＜３＞、＜６＞〜＜１３＞のいずれか１に記載の方法であって、好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドの３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸に対する応答を抑制する試験物質を、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸臭抑制剤として選択することをさらに含む、方法。
【００６４】
＜１７＞上記＜４＞、＜６＞〜＜１３＞のいずれか１に記載の方法であって、好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドの３−メチル−２−ヘキセン酸に対する応答を抑制する試験物質を、３−メチル−２−ヘキセン酸臭抑制剤として選択することをさらに含む、方法。
【００６５】
＜１８＞上記＜１＞〜＜１７＞のいずれか１に記載の方法であって、
好ましくは、上記ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドが、該嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現されている、
方法。
【００６６】
＜１９＞上記＜１８＞記載の方法であって、上記組換え細胞が、
好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子と、ＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子とを導入された細胞であり、
より好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子と、配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるヒトＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子とを導入された細胞である、
方法。
【００６７】
＜２０＞上記＜１＞〜＜１７＞のいずれか１に記載の方法であって、
好ましくは、上記ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２、及びこれらとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドとして、上記＜１８＞又は＜１９＞記載の組換え細胞又はその培養物が使用される、
方法。
【００６８】
＜２１＞上記＜１＞〜＜２０＞のいずれか１に記載の方法であって、
好ましくは、上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答の測定が、ＥＬＩＳＡ若しくはレポータージーンアッセイによる細胞内ｃＡＭＰ量測定、又はカルシウムイメージングによる測定である、方法。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００７０】
実施例１  腋臭原因物質に応答する嗅覚受容体の同定
１）ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
ヒト嗅覚受容体はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｆｅｍａｌｅ（Ｇ１５２１：Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子をｐＥＮＴＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマニュアルに従って組み込み、ｐＥＮＴＲベクター上に存在するＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトを利用して、ｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ−Ｒｈｏタグ配列の下流に作製したＮｏｔＩ、ＡｓｃＩサイトへと組換えた。
【００７１】
２）ｐＭＥ１８Ｓ−ヒトＲＴＰ１Ｓベクターの作製
ＲＴＰ１Ｓ（配列番号１６）をコードするＲＴＰ１Ｓ遺伝子（配列番号１５）をｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトへ組み込んだ。
【００７２】
３）嗅覚受容体発現細胞の作製
ヒト嗅覚受容体４１７種をそれぞれ発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表１に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で１５分静置した後、９６ウェルプレート（ＢＤ）の各ウェルに添加した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞（３×１０5細胞／ｃｍ2）を１００μＬずつ各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。
【００７３】
【表１】
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【００７４】
４）ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本研究での匂い応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃ２Ｐ−ＣＲＥ−ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。
上記３）で作製した培養物から、培地を取り除き、ＣＤ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で調製した匂い物質（（Ｒ）若しくは（Ｓ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノール３００μＭ、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸３ｍＭ、又は３−メチル−２−ヘキセン酸３ｍＭ）を含む溶液を７５μＬ添加した。細胞をＣＯ2インキュベータ内で２．５時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で十分に発現させた。ルシフェラーゼの活性測定には、Ｄｕａｌ−ＧｌｏTMｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製品の操作マニュアルに従って測定を行った。匂い物質刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値を、匂い物質刺激を行わない細胞での発光値で割った値をｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅとして算出し、応答強度の指標とした。
【００７５】
５）結果
４１７種類の嗅覚受容体について（Ｒ）又は（Ｓ）−３−メルカプト−３−メチルヘキサノール３００μＭに対する応答を測定した結果、（Ｒ）体に対してはＯＲ１Ａ１及びＯＲ２Ｗ１が、（Ｓ）体に対してはＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１及びＯＲ２Ｊ３が応答を示した（図１）。ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１及びＯＲ２Ｊ３の３−メルカプト−３−メチルヘキサノールに対する応答は、濃度依存的であった（図２）。ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１及びＯＲ２Ｊ３は、これまで３−メルカプト−３−メチルヘキサノールに応答することが見出されていない、新規の３−メルカプト−３−メチルヘキサノール受容体である。
【００７６】
同様に、４１７種類の嗅覚受容体について３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸３ｍＭに対する応答を測定した結果、ＯＲ１０Ａ６が応答し、この応答は濃度依存的であった（図３、４）。ＯＲ１０Ａ６は、これまで３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸に応答することが見出されていない、新規の３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸受容体である。
【００７７】
同様に、４１７種類の嗅覚受容体について３−メチル−２−ヘキセン酸３ｍＭに対する応答を測定した結果、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１、及びＯＲ５１Ｉ２が応答を示した（図５）。これらの嗅覚受容体の３−メチル−２−ヘキセン酸に対する応答は、濃度依存的であった（図６）。ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、及びＯＲ５１Ｅ１は、これまで３−メチル−２−ヘキセン酸に応答することが見出されていない、新規の３−メチル−２−ヘキセン酸受容体である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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