(57)【要約】【課題】インボルクリンの発現を抑制する、インボルクリン発現抑制剤、くせ毛改善剤を提供する。【解決手段】ルテオリンを有効成分とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルテオリンを有効成分とするインボルクリン発現抑制剤。
【請求項２】
ルテオリンを有効成分とするくせ毛改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インボルクリン発現抑制剤及びくせ毛改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インボルクリンは、表皮角化細胞の分化にしたがって有棘細胞で産生されるタンパク質で、角質細胞の細胞膜を裏打ちする強靭な不溶性膜であるコーニファイドエンベロープ（角質肥厚膜、cornified envelope：以下ＣＥとも略記する）の主構成要素の１つである（非特許文献１）。ＣＥは、インボルクリンをはじめとする複数のＣＥ前駆体タンパク質が、酵素トランスグルタミナーゼにより架橋され不溶化して形成される。さらに、ＣＥを構成するインボルクリンは、その一部にセラミド等の脂質が共有結合し、疎水的な構造をとることで細胞間脂質ラメラ構造の形成にも寄与している（非特許文献２）。こうしたＣＥの形成・成熟化によって、細胞間脂質のラメラ構造が安定化して角質層のバリア機能が正常に働き、皮膚の水分保持機能や外部からの刺激に対する抵抗性を高めることができる。
【０００３】
また最近、本出願人は、毛髪形状と毛髪毛根部における各種遺伝子の遺伝子発現との関係を探索したところ、非くせ毛者の毛根部に比して、くせ毛者の毛根部において、インボルクリン（IVL）遺伝子の発現量が有意に増加しており、インボルクリンの発現を制御することにより、くせ毛を抑制したり、促進できることを報告している（特許文献１）。
【０００４】
一方、ルテオリンは、染毛剤(安定化剤)、白髪予防剤、メラニン酸性促進剤、抗酸化剤として利用できることが知られている（特許文献２〜１１）。
しかしながら、ルテオリンに、インボルクリン発現抑制作用や、くせ毛改善作用があることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０４３３３０号
【特許文献２】特表２０１１−５１８８２９号公報
【特許文献３】特開２０１２−２５７３６号公報
【特許文献４】特表２００９−５３５４１３号公報
【特許文献５】特表２００８−５０９１７３号公報
【特許文献６】特開２００７−１８６４５７号公報
【特許文献７】特開２００７−３１３０１号公報
【特許文献８】特開２００７−８９１０号公報
【特許文献９】特開２００４−２２６４号公報
【特許文献１０】特開２００３−２０１２０８号公報
【特許文献１１】特開２０００−３３６０６２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Steinert, PM. Et al., J. Biol. Chem., 270(30), p17702-17711 (1995)
【非特許文献２】Nemes, Z., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(15), p8402-8407 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、インボルクリンの発現を抑制する、インボルクリン発現抑制剤、くせ毛改善剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、インボルクリンの発現抑制について検討したところ、ルテオリンに優れたインボルクリン発現抑制作用があり、これがインボルクリン発現抑制、くせ毛の改善のための成分又は素材として有用であることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記に係るものである。
１）ルテオリンを有効成分とするインボルクリン発現抑制剤。
２）ルテオリンを有効成分とするくせ毛改善剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、インボルクリンの発現抑制作用を有し、くせ毛を改善するための化粧品、医薬品、医薬部外品、或いはこれらに使用される原料又は素材を提供できる。したがって、本発明によれば、インボルクリンの発現を抑制して、くせ毛の改善が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において用いられる「インボルクリン発現抑制」とは、インボルクリンの遺伝子レベルでの発現抑制及びタンパク質レベルでの発現抑制の何れをも包含する意味である。前記遺伝子レベルでの発現抑制はｍＲＮＡへの転写抑制を含み、前記タンパク質レベルでの発現抑制とは、例えば翻訳における抑制を含み、翻訳後に修飾される場合は、当該修飾の抑制も含むものである。
【００１２】
本発明で用いられるルテオリンは、以下の構造式で示されるフラボノイドであり、例えば３’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラボンを脱メチル化することにより得ることができる（薬学雑誌、１０４（12）、1306-1308、1984；Tetrahedron 67 (2011) 4344-4351；国際公開2013／111148号等参照）。
【００１３】
【化１】
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【００１４】
また、ルテオリンは、ルテオリン含有量の高い植物、例えばシソ、セロリ、ピーマン、カモミール等よりエタノール等の溶媒を用いて抽出して得ることや、東京化成工業、関東化学、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ等より購入することができる。
【００１５】
後記実施例で示すとおり、ルテオリンは、遺伝子レベル及びタンパク質レベルで、インボルクリンの発現を抑制する作用を有する。上述したように、くせ毛者の毛根部では、非くせ毛者の毛根部に比して、インボルクリン（IVL）遺伝子の発現量が有意に増加しているため、インボルクリンの発現を抑制することにより、くせ毛の改善に寄与すると考えられる（前記特許文献１参照）。
【００１６】
よって、上記ルテオリンは、インボルクリン発現抑制剤、又はくせ毛改善剤となり得、これらの剤を製造するために使用することができる。
【００１７】
また、ヒトに使用して、インボルクリン発現抑制、又はくせ毛改善を図ることができる。ヒトに対する使用は、治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
【００１８】
ここで、「くせ毛」とは、特に説明がなければ、直毛と対比する場合に直毛以外の形状を総括的に指し、「くせ毛を改善する」とは、くせ毛のカール半径や曲率を低減し、形質を直毛に近づけることをいう。
【００１９】
本発明のインボルクリン発現抑制剤又はくせ毛改善剤は、それ自体、インボルクリン発現抑制、くせ毛改善のための、医薬品、医薬部外品、化粧料であり得、又は当該医薬品、医薬部外品、化粧料を製造するための原料又は素材であり得る。
【００２０】
上記ルテオリンを含む、医薬品、医薬部外品、化粧料等の各種性剤組成物の形態は、例えば皮膚外用剤とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、エアゾール、乳化化粧料、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。とりわけヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアトリートメント、ヘアローション、ヘアパック、ヘアクリーム、コンディショニングムース、ヘアムース、ヘアスプレー、シャンプー、リーブオントリートメント等の形態とすることが好ましい。
【００２１】
上記製剤組成物は、それぞれ一般的な製造法により、上記ルテオリンを製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、水 、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、薬効成分、香料、樹脂、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類、ビタミン類等を適宜組み合わせることにより調製することができる。
また、これらの製剤組成物には、上記ルテオリンの他、夫々医薬品、医薬部外品、化粧料等の製剤の種類に応じて、適宜、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗炎症剤、抗菌剤、清涼剤、抗脂漏剤等を 本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
【００２２】
当該製剤組成物中のルテオリンの含有量は、特に限定されないが、製剤全質量の０．０１質量％以上、好ましくは０．１質量％以上、更に好ましくは１．０質量％以上であり、そして９０質量％以下、好ましくは５０質量％以下、更に好ましくは２０質量％以下である。また、０．０１〜９０質量％、好ましくは０．１〜５０質量％、更に好ましくは１．０質量％〜２０質量％が挙げられる。
【００２３】
ルテオリンを上記医薬品、医薬部外品として使用する場合の投与量は、本発明の効果が得られる量であれば特に限定されず、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１人当たりの１日の投与量は、通常１ｍｇ以上、好ましくは５ｍｇ以上、更に好ましくは１５ｍｇ以上であり、そして５ｇ以下、好ましくは２．５ｇ以下、更に好ましくは１ｇ以下である。
【００２４】
また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数ヶ月間継続して投与することが好ましい。
また、投与又は摂取対象としては、それを必要としていれば特に限定されないが、インボルクリン発現抑制、くせ毛改善等を必要とする若しくは希望するヒトが好ましい。
【００２５】
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞ルテオリンを有効成分とするインボルクリン発現抑制剤。
＜２＞ルテオリンを有効成分とするくせ毛改善剤。
＜３＞インボルクリン発現抑制剤又はくせ毛改善剤を製造するための、ルテオリンの使用。
＜４＞インボルクリン発現抑制又はくせ毛改善に使用するための、ルテオリン。
＜５＞ルテオリンの有効量を、投与又は摂取することを特徴とするインボルクリン発現抑制方法又はくせ毛改善方法。
＜６＞前記＜３＞において、使用は非治療的使用である。
＜７＞前記＜５＞において、方法は非治療的方法である。
＜８＞前記＜５＞において、投与又は摂取の対象は、インボルクリン発現抑制、くせ毛改善を必要とする若しくは希望するヒトである。
【実施例】
【００２６】
インボルクリン発現抑制作用
（１）細胞培養
ドイツ癌研究所（ＤＫＦＺ）より入手したヒト表皮角化細胞株ＨａＣａＴを、ＤＭＥＭ(Invitrogen)に非働化した１０％ウシ胎児血清(Invitrogen)、及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン(Invitrogen)を添加した培地で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
【００２７】
（２）定量的ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析
６穴プレートに、２×１０５個／ｗｅｌｌとなるように上記ＨａＣａＴ細胞株を播種し、２４時間培養した後に、表１に示す濃度のルテオリンを添加した。添加から２４時間後に、培地を吸引して、ＰＢＳで２回洗浄後、RNeasy Mini Kit（QIAGEN）（当該Kitの使用説明書に従う）を用いてtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNAの濃度を測定した後、当該total RNA１μｇを用いてQuantitect RT（QIAGEN）による逆転写反応を実行し、ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを４ｎｇ／μＬに希釈し、評価サンプルとした。調製したｃＤＮＡ  ８ｎｇにTaqman Universal Master mix（Applied Biosystems）を１０μＬ、Taqmanプローブ（Applied Biosystems）を１μＬ、滅菌水を７μＬ添加し、7500 リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。得られたｍＲＮＡは内部標準としてＲＰＬＰ０遺伝子の発現量を用い補正し、その値を、コントロール（ルテオリン無添加）におけるｍＲＮＡ量を１００とした時の相対的ｍＲＮＡ発現量として求め、その結果を表１に示す。
なお、TaqmanプローブはIVL：Hs00846307_s1、RPLP0：Hs9999902_m1を使用した。ルテオリンは、東京化成工業製Luteolin 純度＞98％を使用した。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
表１から明らかなように、ルテオリンの濃度に依存して、インボリクリンmRNAの発現量が低下した。
【００３０】
（３）Western Blotting
６穴プレートに１×１０５個／ウェルとなるように上記ＨａＣａＴ細胞株を播種し、２４時間培養した後に、表２に示す濃度のルテオリンを添加した。４８時間後に培地を吸引して、ＰＢＳで２回洗浄後、Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail（Thermo Scientific）を含むRIPA Buffer（Sigma）１５０μＬにて、細胞を溶解した。その後、セルスクレーパーにより、細胞を剥離・回収し、遠心して回収した上清を細胞抽出液としてとして評価に用いた。
細胞抽出液の総タンパク質濃度は、BCA Protein Assay Kit（Thermo Scientific）を用いて定量した。細胞抽出液の蛋白質量として５μｇと、０．３５Ｍ  ＤＴＴ（ｓｉｇｍａ）を含むLaemmli Sample Buffer（Bio-Rad）とを１：１で混合し、その混合液を９５℃で５分間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、７．５％ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて定法に従い実行した。ゲルを転写するメンブレンにはメタノールにより親水化したＰＶＤＦメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ブロッティングバッファーにはＴｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／メタノール転写バッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。
４℃で一晩転写後、メンブレンを５％スキムミルク溶液／ＰＢＳ−Ｔで室温、２時間ブロッキングした後、抗ＩＶＬ抗体（ＢＴＩ、ＢＴ−６５１）、抗Ａｃｔｉｎ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を０．３％スキムミルク／ＰＢＳ−Ｔで１０００倍希釈して、室温、２時間反応させた。メンブレンをＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、抗ＩＶＬ抗体に対しては抗ウサギ−ＨＲＰ抗体（ＮＡ９３４ＶＳ、ＧＥ）を、抗Ａｃｔｉｎ抗体に対しては抗ヤギ−ＨＲＰ抗体（岩井化学）を、０．３％スキムミルク／ＰＢＳ−Ｔで２０００倍希釈して、室温、１時間反応させた。反応終了後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ECL Prime Western Blotting Detection System（GE）を用いて、発光を検出した。コントロール（ルテオリン無添加）におけるインボルクリン発現量を１００とした時の発現量相対値を求め、その結果を表２に示す。各バンドの積算値の算出はMulti Gauge V3.2(FUJIFILM)ソフトウェアを用いた。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
表２から明らかなように、ルテオリンの濃度に依存して、インボリクリンタンパク質の発現量が低下した。