(57)【要約】【課題】再現性よく高効率で遺伝物質を細胞に導入できる遺伝物質導入補助基材を提供することである。【解決手段】細胞（Ｃ）への遺伝物質（Ｄ）の導入を促進する遺伝物質導入補助基材であって、タンパク質（Ａ）及び基材からなり、タンパク質（Ａ）がＲＧＤ配列及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するタンパク質（Ａ１）及び／又は下記タンパク質（Ａ２）であることを特徴とする遺伝物質導入補助基材を用いる。タンパク質（Ａ２）：カルボキシル基、スルホ基、アミノ基、アンモニオ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ｂ）によりタンパク質（Ａ１）中の反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）を化学修飾して官能基（Ｋ）を導入したタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞（Ｃ）への遺伝物質（Ｄ）の導入を促進する遺伝物質導入補助基材であって、
タンパク質（Ａ）及び基材からなり、
タンパク質（Ａ）がＲＧＤ配列及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するタンパク質（Ａ１）及び／又は下記タンパク質（Ａ２）であることを特徴とする遺伝物質導入補助基材。
タンパク質（Ａ２）：カルボキシル基、スルホ基、アミノ基、アンモニオ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ｂ）によりタンパク質（Ａ１）中の反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）を化学修飾して官能基（Ｋ）を導入したタンパク質。
【請求項２】
化合物（Ｂ）がカルボキシル基を有する化合物（Ｂ１）及びスルホ基を有する化合物（Ｂ２）からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の遺伝物質導入補助基材。
【請求項３】
化合物（Ｂ）がクロロ酢酸、２−クロロエタンスルホン酸及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１又は２に記載の遺伝物質導入補助基材。
【請求項４】
反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）が、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びトリプトファン残基からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝物質導入補助基材。
【請求項５】
タンパク質（Ａ１）が、２〜３３個のＧＡＧＡＧＳ配列（１）が連続して結合したポリペプチド鎖（Ｙ）を有するタンパク質である請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝物質導入補助基材。
【請求項６】
タンパク質（Ａ１）が、ＲＧＤ配列とポリペプチド鎖（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造を含むタンパク質である請求項５に記載の遺伝物質導入補助基材。
【請求項７】
タンパク質（Ａ２）１分子中に導入された官能基（Ｋ）の平均個数が１〜１５６個である請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝物質導入補助基材。
【請求項８】
タンパク質（Ａ１）が配列（２９）で表されるタンパク質である請求項１〜７のいずれかに記載の遺伝物質導入補助基材。
【請求項９】
タンパク質（Ａ）の含有量が遺伝物質導入補助基材の表面積に基づいて０．００１〜１０μｇ／ｃｍ２である請求項１〜８のいずれかに記載の遺伝物質導入補助基材。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の遺伝物質導入補助基材を用いて細胞（Ｃ）に遺伝物質（Ｄ）を導入した導入細胞（Ｃ’）の生産方法であって、
遺伝物質導入補助基材の表面に細胞（Ｃ）を接着させて遺伝物質（Ｄ）を含む標的物質（Ｅ）を作用させて細胞（Ｃ）に遺伝物質（Ｄ）を導入して細胞（Ｃ’）を得る工程を含むことを特徴とする導入細胞（Ｃ’）の生産方法。
【請求項１１】
遺伝物質（Ｄ）が核酸分子である請求項１０に記載の生産方法。
【請求項１２】
標的物質（Ｅ）中に遺伝子導入試薬を含む請求項１０又は１１に記載の生産方法。
【請求項１３】
遺伝子導入試薬がカチオン性高分子、カチオン性脂質及びリン酸カルシウムからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１２に記載の生産方法。
【請求項１４】
遺伝物質導入工程を培地（Ｆ）中でおこなう請求項１０〜１３のいずれかに記載の生産方法。
【請求項１５】
細胞（Ｃ）が幹細胞、上皮細胞、神経系細胞、線維芽細胞及び炎症性細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１０〜１４のいずれかに記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝物質導入補助基材及びこれを用いた細胞の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、培養細胞への遺伝物質の導入は、細胞生物学、遺伝子工学及び分子生物学等の分野で、広く使用されており、遺伝子やタンパク質の機能を調べる上で、必要不可欠な技術である。さらに、重篤な遺伝病を治療するために、体細胞遺伝子導入治療などのプロトコールの開発も進められている。
【０００３】
フィブロネクチンでコーティングした基材上で遺伝物質を細胞に作用させると、細胞への遺伝物質の導入効率が上昇することが知られている（特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２６７６０２号公報
【特許文献２】特開２００２−３２５５９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
フィブロネクチンを用いた場合、必ずしも細胞への遺伝物質の導入効率が高くなるとは限らず、再現性が悪いという問題がある。
本発明の目的は、再現性よく高効率で遺伝物質を細胞に導入できる遺伝物質導入補助基材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究を重ねてきた結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明の遺伝物質導入補助基材の特徴は、細胞（Ｃ）への遺伝物質（Ｄ）の導入を促進する遺伝物質導入補助基材であって、
タンパク質（Ａ）及び基材からなり、
タンパク質（Ａ）がＲＧＤ配列及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するタンパク質（Ａ１）及び／又は下記タンパク質（Ａ２）である点を要旨とする。
【０００７】
タンパク質（Ａ２）：カルボキシル基、スルホ基、アミノ基、アンモニオ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ｂ）によりタンパク質（Ａ１）中の反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）を化学修飾して官能基（Ｋ）を導入したタンパク質。
【０００８】
本発明の導入細胞（Ｃ’）の生産方法の特徴は、上記の遺伝物質導入補助基材を用いて細胞（Ｃ）に遺伝物質（Ｄ）を導入した細胞（Ｃ’）の生産方法であって、
遺伝物質導入補助基材に細胞（Ｃ）を接着させて遺伝物質（Ｄ）を含む標的物質（Ｅ）を作用させて細胞（Ｃ）に遺伝物質（Ｄ）を導入して細胞（Ｃ’）を得る工程を含む点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の遺伝物質導入補助基材を用いれば、再現性よく高効率で遺伝物質を細胞に導入することができる。
【００１０】
本発明の導入細胞（Ｃ’）の生産方法を適用すると、再現性よく高効率で遺伝物質を細胞に導入することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１〜７、比較例１で調製した遺伝物質導入補助基材について、ｈＭＳＣ細胞に遺伝物質を導入して得た導入細胞のルシフェラーゼ活性率を表した棒グラフである。
【図２】実施例１〜７、比較例１で調製した遺伝物質導入補助基材について、Ｅｐｈ４細胞に遺伝物質を導入して得た導入細胞のルシフェラーゼ活性率を表した棒グラフである。
【図３】実施例１〜７、比較例１で調製した遺伝物質導入補助基材について、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に遺伝物質を導入して得た導入細胞のルシフェラーゼ活性率を表した棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
タンパク質（Ａ１）は、天然物から抽出されたものでもよく、また、人工的に製造されるものでもよいが、動物由来成分を排除する観点から、人工的に製造されるタンパク質が好ましい。また、人工的な製造に用いられる方法としては、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等により製造できる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、タンパク質（Ａ１）を製造できるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【００１３】
タンパク質（Ａ１）は、タンパク質（Ａ１）の熱安定性の観点から、２個以上のＧＡＧＡＧＳ配列（１）が連続して結合したポリペプチド鎖（Ｙ）を有することが好ましい。ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の連続する個数は、タンパク質（Ａ１）の熱安定性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、２〜５０個が好ましく、さらに好ましくは２〜３３個、特に好ましくは３〜２０個、最も好ましくは３〜９個である。
【００１４】
タンパク質（Ａ１）中のＲＧＤ配列を構成するアミノ酸配列の含有量（個数％；ＲＧＤ配列の数の３倍）は、タンパク質（Ａ１）を構成する全アミノ酸配列の数に基づいて、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、１〜２０が好ましく、さらに好ましくは２〜１０、特に好ましくは３〜７である。
【００１５】
タンパク質（Ａ１）中のＧＡＧＡＧＳ配列（１）を構成するアミノ酸配列の含有量（個数％；ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数の６倍）は、タンパク質（Ａ１）を構成する全アミノ酸配列の数に基づいて、熱安定性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、４０〜９５が好ましく、さらに好ましくは７０〜９５である。
【００１６】
タンパク質（Ａ１）中のＲＧＤ配列及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を構成するアミノ酸配列の合計含有量（個数％）は、タンパク質（Ａ１）を構成する全アミノ酸の数に基づいて、熱安定性の観点、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、４１〜１００が好ましく、さらに好ましくは７１〜１００である。
【００１７】
タンパク質（Ａ１）中のＲＧＤ配列を構成するアミノ酸配列の含有量及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を構成するアミノ酸配列の含有量は、タンパク質（Ａ１）の全アミノ酸配列を決定することによって求めることができる。具体的には、下記測定法により求めることができる。
【００１８】
＜ＲＧＤ配列を構成するアミノ酸配列の含有量及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を構成するアミノ酸配列の含有量の測定方法＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ１）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ１）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてＧＡＧＡＧＳ配列（１）、ＲＧＤ配列の含有量を算出する。
【００１９】
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）を構成するアミノ酸配列の含有量（個数％）＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数｝×６］÷｛タンパク質（Ａ１）中の全アミノ酸配列数｝×１００
【００２０】
ＲＧＤ配列を構成するアミノ酸配列の含有量（個数％）＝［｛ＲＧＤ配列の数｝×３］÷｛タンパク質（Ａ１）中の全アミノ酸配列数｝×１００
【００２１】
タンパク質（Ａ１）中のＲＧＤ配列を構成するアミノ酸配列とＧＡＧＡＧＳ配列（１）を構成するアミノ酸配列との個数比率［（ＲＧＤ配列を構成するアミノ酸配列の個数）÷（ＧＡＧＡＧＳ配列（１）を構成するアミノ酸配列の個数）］は、熱安定性の観点、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、０．００５〜０．５が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜０．２である。
【００２２】
タンパク質（Ａ１）は、分岐鎖を含んでいてもよく、一部が架橋されていてもよく、環状構造を含んでいてもよい。しかし、タンパク質（Ａ１）は、細胞からの認識されやすさという観点から、架橋されていないことが好ましく、さらに好ましくは架橋されていない直鎖構造、特に好ましくは環状構造を持たず架橋されていない直鎖構造である。なお、直鎖構造には、β構造（直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。
【００２３】
タンパク質（Ａ１）は、熱安定性を高くする観点及び細胞接着性が高い構造体となりやすい観点から、ＲＧＤ配列とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）とが、必要によりＲＧＤ配列とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）との間に他のアミノ酸配列｛後述のアミノ酸配列（Ｘ）が好ましい。｝を介して、交互に化学結合してなる構造であることが好ましく、ＲＧＤ配列の片端又は両端に後述するアミノ酸配列（Ｘ）を含むアミノ酸配列とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造であることがさらに好ましい。
【００２４】
上記のように交互に化学結合してなる構造である場合、タンパク質（Ａ１）中のＲＧＤ配列とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）との繰り返し単位｛−ＲＧＤ−（ＧＡＧＡＧＳ）ｎ−｝（ｎは１以上の整数）の数（個）は、熱安定性の観点、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、１〜５０が好ましく、さらに好ましくは２〜４０、特に好ましくは３〜３０、次に特に好ましくは４〜２０、最も好ましくは１３である。
【００２５】
＜アミノ酸配列（Ｘ）＞
ＲＧＤ配列のＮ末端に結合するアミノ酸配列（Ｘ）としては、細胞接着性の観点から、（ＧＶＰＧＶ）２ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）、ＧＡＡＶＴＧ配列（４）、ＧＬＰＧＰＫＧＤ配列（５）、ＧＧＰＡＶＴＧ配列（６）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＴＧ配列（７）、ＧＡＡＶＣＥＰＧ配列（８）、ＧＡＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（９）、ＳＰＡＳＡＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（１０）、ＳＰＡＳＡＡＶＣＥＰＧ配列（１１）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＣＥＰＧ配列（１２）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（１３）、ＧＰＡＶＣＥＰＧ配列（１４）、ＧＰＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（１５）及びＧＡＡＰＧＡＳ配列（１６）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、さらに好ましくは（ＧＶＰＧＶ）２ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）、ＧＡＡＶＴＧ配列（４）、ＧＬＰＧＰＫＧＤ配列（５）、ＧＧＰＡＶＴＧ配列（６）及びＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＴＧ配列（７）からなる群より選ばれる少なくとも１種、特に好ましくは（ＧＶＰＧＶ）２ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）及びＧＡＡＶＴＧ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
【００２６】
ＲＧＤ配列のＣ末端に結合するアミノ酸配列（Ｘ）としては、細胞接着性の観点から、（ＧＶＰＧＶ）２ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）、ＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）、ＳＰＡＳＡＡＬＣＶＳ配列（１８）、ＳＰＡＳＡＡＶＣ配列（１９）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰ配列（２０）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＣ配列（２１）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＬＣＶＳ配列（２２）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰ配列（２３）、ＳＰＡＳＡＡＧＰＶＧＳＰ配列（２４）、ＣＤＡＧＹ配列（２５）、ＣＤＡＧＰＶＧＳＰ配列（２６）及びＳＡＧＰＳＡＧＹ配列（２７）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、さらに好ましくは（ＧＶＰＧＶ）２ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）、ＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）、ＳＰＡＳＡＡＬＣＶＳ配列（１８）、ＳＰＡＳＡＡＶＣ配列（１９）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰ配列（２０）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＣ配列（２１）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＬＣＶＳ配列（２２）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰ配列（２３）及びＳＰＡＳＡＡＧＰＶＧＳＰ配列（２４）からなる群より選ばれる少なくとも１種、特に好ましくは（ＧＶＰＧＶ）２ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）及びＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
【００２７】
タンパク質（Ａ１）の好適な例を以下に示す。
１３個のＲＧＤ配列と１３個の（ＧＡＧＡＧＳ）９配列（２８）（Ｙ１）とを有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する数平均分子量（以下、数平均分子量をＭｎと略する。）約１１万のポリペプチド（２９）｛「プロネクチンＦ」、プロネクチン（Ｐｒｏｎｅｃｔｉｎ）は三洋化成工業（株）の登録商標（日本及び米国）である。三洋化成工業（株）製＜以下同じ＞｝；
５個のＲＧＤ配列と５個の（ＧＡＧＡＧＳ）３配列（３０）（Ｙ２）とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約２万のポリペプチド（３１）（「プロネクチンＦ２」）；
３個のＲＧＤ配列と３個の（ＧＶＰＧＶ）２ＧＧ配列（２）と３個の（ＧＡＧＡＧＳ）３配列（３０）（Ｙ２）とを有し、これらが（ＧＶＰＧＶ）２ＧＧ配列（２）、（ＧＡＧＡＧＳ）３配列（３０）、ＲＧＤ配列の順に並んだ繰り返し単位が交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１万のポリペプチド（３２）（「プロネクチンＦ３」）等。
【００２８】
タンパク質（Ａ２）は、カルボキシル基、スルホ基、アミノ基、アンモニオ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ｂ）によりタンパク質（Ａ１）中の反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）を化学修飾して官能基（Ｋ）を導入したタンパク質である。
【００２９】
化合物（Ｂ）は、カルボキシル基、スルホ基、アミノ基、アンモニオ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物であれば制限なく使用でき、カルボキシル基を有する化合物（Ｂ１）、スルホ基を有する化合物（Ｂ２）、アミノ基を有する化合物（Ｂ３）、アンモニオ基を有する化合物（Ｂ４）及びヒドロキシル基を有する化合物（Ｂ５）が含まれる。なお、官能基（Ｋ）は、タンパク質（Ａ１）を化合物（Ｂ）により化学修飾することにより導入される官能基である。
【００３０】
カルボキシル基を有する化合物（Ｂ１）としては、炭素数２〜３０のカルボン酸のハロゲン化物｛ハロゲン化アシル（酸ハロゲン化物）ではなく、ハロゲン置換カルボン酸}、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアルコール、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するスルホン酸及び炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアミンが含まれる。
また、化合物（Ｂ１）中のカルボキシル基中のプロトンは、アルカリ金属カチオン（ナトリウムイオン及びカリウムイオン等）及びアルカリ土類金属カチオン（カルシウムイオン等）等で置換されていてもよい。
【００３１】
炭素数１〜３０のカルボン酸のハロゲン化物としては、フルオロ酢酸、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、ω−クロロオクタデカン酸、ω−ブロモエイコサン酸及びω−クロロトリコサン酸等が挙げられる。
【００３２】
炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアルコールとしては、ヒドロキシ酢酸、ヒドロキシプロピオン酸、パントテン酸、グルクロン酸、サリチル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシ基含有アミノ酸（Ｓｅｒ及びＴｈｒ）、ω−ヒドロキシオクタデカン酸、ω−ヒドロキシエイコサン酸及びω−ヒドロキシトリコサン酸等が挙げられる。
【００３３】
炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するスルホン酸としては、スルホ酢酸、スルホコハク酸、ｏ−スルホ安息香酸、ｍ−スルホ安息香酸、ｐ−スルホ安息香酸、２，４−ジスルホ安息香酸、３−スルホフタル酸、３，５−ジスルホフタル酸、４−スルホイソフタル酸、２−スルホテレフタル酸、２−メチル−４−スルホ安息香酸、２−メチル−３，５−ジスルホ安息香酸、４−プロピル−３−スルホ安息香酸、４−イソプロピル−３−スルホ安息香酸、２，４，６−トリメチル−３−スルホ安息香酸、２−メチル−５−スルホテレフタル酸、５−メチル−４−スルホイソフタル酸、５−スルホサリチル酸及び３−オキシ−４−スルホ安息香酸等が挙げられる。
【００３４】
炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアミンとしては、炭素数２〜２０のアミノカルボン酸及び炭素数４〜３０のペプチドが含まれ、２−アミノ酢酸、３−アミノプロピオン酸、ω−アミノオクタデカン酸、ω−アミノエイコサン酸、アミノ酸{アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）等｝及びアミノ酸が２〜１５個結合したペプチド等が挙げられる。
【００３５】
これらのカルボキシル基を含有する化合物（Ｂ１）のうち、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、カルボン酸のハロゲン化物が好ましく、さらに好ましくはクロロ酢酸である。
【００３６】
スルホ基を有する化合物（Ｂ２）としては、炭素数２〜３０のスルホン酸のハロゲン化物（ハロゲン置換スルホン酸）、炭素数２〜３０のスルホ基を有するアルコール、炭素数２〜３０のスルホ基を有するカルボン酸及び炭素数２〜３０のスルホ基を有するアミンが含まれる。
また、化合物（Ｂ２）中のスルホ基中のプロトンは、アルカリ金属カチオン（ナトリウムイオン及びカリウムイオン等）及びアルカリ土類金属カチオン（カルシウムイオン等）等で置換されていてもよい。
【００３７】
炭素数２〜３０のスルホン酸のハロゲン化物としては、クロロスルホン酸（ＣｌＳＯ３Ｈ）、クロロエタンスルホン酸、フルオロスルホン酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸、ω−クロロオクタデカンスルホン酸及びω−クロロトリコサンスルホン酸等が挙げられる。
【００３８】
炭素数２〜３０のスルホ基を有するアルコールとしては、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、３−ヒドロキシプロパンスルホン酸、ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、ω−ヒドロキシオクタデカンスルホン酸、ω−ヒドロキシエイコサンスルホン酸、ω−ヒドロキシトリコサンスルホン酸、スルホエチレングリコール、２−スルホプロピレングリコール、１，２−ジスルホプロピレングリコール、２−スルホブタンジオール、２−スルホヘキサンジオール、１，５−ジスルホヘキサンジオール、２，５−ジスルホヘキサンジオール、１，３，５−トリスルホヘキサンジオール、１，２，４−トリスルホヘキサンジオール、２−スルホドデカンジオール、４−スルホドデカンジオール、６−スルホドデカンジオール、２，４−ジスルホドデカンジオール及び２，６，１０−トリスルホドデカンジオール等が挙げられる。
【００３９】
炭素数２〜３０のスルホ基を有するカルボン酸としては、上記のカルボキシル基を有するスルホン酸と同様である。
【００４０】
炭素数２〜３０のスルホ基を有するアミンとしては、スルファニル酸（ｐ−アミノベンゼンスルホン酸）、２−アミノエタンスルホン酸、３−アミノプロパンスルホン酸、ω−アミノオクタデカンスルホン酸、ω−アミノエイコサンスルホン酸及びω−アミノトリコサンスルホン酸等が挙げられる。
【００４１】
これらのスルホン基を含有する化合物（Ｂ２）のうち、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、スルホン酸のハロゲン化物が好ましく、さらに好ましくはクロロエタンスルホン酸である。
【００４２】
アミノ基を有する化合物（Ｂ３）としては、炭素数２〜３０のアミノ基を有するハロゲン化物及び炭素数２〜３０のアミノ基を有するアルコールが含まれる。
【００４３】
炭素数２〜３０のアミノ基を有するハロゲン化物としては、炭素数２〜１７のハロゲン化（塩素化及び臭素化等）アルキル基を有するアミンが含まれ、アミノエチルクロリド、Ｎ−メチルアミノプロピルクロリド、ジメチルアミノエチルクロリド、ジエチルアミノエチルクロリド、ジベンジルアミノエチルブロミド、ジメチルアミノプロピルブロミド、ジエチルアミノプロピルクロリド及びジベンジルアミノプロピルクロリド等が挙げられる。
【００４４】
炭素数２〜３０のアミノ基を有するアルコールとしては、炭素数２〜１０のアルカノールアミン［モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノプロパノールアミン、ジプロパノールアミン、トリプロパノールアミン、モノブタノールアミン、ジブタノールアミン、トリブタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラキス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン等］並びにこれらのアルキル（炭素数１〜１８）置換体［Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、Ｎ−オクタデシルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ，Ｎ’−トリオクタデシル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミン等］等が挙げられる。
【００４５】
これらのアミノ基を含有する化合物（Ｂ３）のうち、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、炭素数２〜３０のアミノ基を有するハロゲン化物が好ましい。
【００４６】
アンモニオ基を有する化合物（Ｂ４）としては、アミノ基を有する化合物（Ｂ３）の４級化物が含まれ、化合物（Ｂ３）のアミノ基を４級化剤（メチルクロリド、エチルクロリド、プロピルブロミド、ベンジルクロリド、ジメチル炭酸、ジメチル硫酸及びエチレンオキシド等）によって４級化したもの等が挙げられる。
【００４７】
アンモニオ基を有する化合物（Ｂ４）のうち、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、炭素数２〜３０のアミノ基を有するハロゲン化物を４級化したものが好ましく、さらに好ましくはクロロエチルトリメチルアンモニウムクロリドである。
【００４８】
ヒドロキシル基を有する化合物（Ｂ５）としては、炭素数２〜３０のアルコールのハロゲン化物及び炭素数２〜３０のヒドロキシル基を有するカルボン酸等が挙げられる。
【００４９】
炭素数２〜３０のアルコールのハロゲン化物としては、２−フルオロエタノール、クロロエタノール、３−ブロモプロピルアルコール、ｐ−クロロフェノール、ω−クロロオクタデシルアルコール、ω−ブロモエイコシルアルコール及びω−クロロトリコシルアルコール等が挙げられる。
【００５０】
炭素数２〜３０のヒドロキシル基を有するカルボン酸としては、カルボキシル基を有するアルコールと同様である。
【００５１】
これらのヒドロキシル基を含有する化合物（Ｂ５）のうち、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、アルコールのハロゲン化物が好ましく、さらに好ましくはクロロエタノールである。
【００５２】
これらの官能基（Ｋ）を有する化合物（Ｂ）のうち、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、カルボキシル基を有する化合物（Ｂ１）及びスルホ基を有する化合物（Ｂ２）からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、さらに好ましくはカルボン酸のハロゲン化物及びスルホン酸のハロゲン化物からなる群より選ばれる少なくとも１種、特に好ましくはクロロ酢酸、クロロエタンスルホン酸、クロロスルホン酸及びこれらの塩（アルカリ金属塩等）からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、最も好ましくはクロロ酢酸、２−クロロエタンスルホン酸及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
【００５３】
タンパク質（Ａ２）において、導入される官能基（Ｋ）としては、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、カルボキシル基及び／又はスルホ基が好ましい。
【００５４】
タンパク質（Ａ１）中に含まれる反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）とは、官能基（Ｋ）を有する化合物（Ｂ）と反応する反応性基を有するアミノ酸の残基を意味する。反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）のうち、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、タンパク質（Ａ１）のＮ末端及びＣ末端以外のアミノ酸残基であるであることが好ましい。
【００５５】
反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）中の反応性基としては、ヒドロキシル基、カルボキシル基、メルカプト基及び第一級又は第二級アミノ基等が挙げられる。反応性基のうち、結合形成の容易さの観点、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、ヒドロキシル基、カルボキシル基及び第一級アミノ基が好ましく、さらに好ましくはヒドロキシル基及びカルボキシル基、特に好ましくはヒドロキシル基である。
【００５６】
反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）としては、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びトリプトファン残基等が挙げられる（バイオコンジュゲート  テクニークス、Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ発行、１９９６）。
【００５７】
これらの反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）のうち、官能基(Ｋ)を有する化合物（Ｂ）との反応性の観点から、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びトリプトファン残基からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、さらに好ましくはセリン残基、トレオニン残基、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、特に好ましくはセリン残基又はトレオニン残基である。
【００５８】
官能基（Ｋ）を有する化合物（Ｂ）によりタンパク質（Ａ１）中の反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）を化学修飾するには、タンパク質（Ａ１）と化合物（Ｂ）との化学反応によって、化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝を介して、化合物（Ｂ）を結合させることが好ましいが、化合物（Ｂ）とタンパク質（Ａ１）との物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）により化学修飾してもよい。細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、化学結合を介して化合物（Ｂ）を結合させることが好ましい。
【００５９】
官能基（Ｋ）を有する化合物（Ｂ）と、タンパク質（Ａ１）とを化学結合させる方法としては、公知の方法が適用でき、特開２００７−５１１２７号公報等に記載の方法が挙げられる。化学結合のうち、結合の強さの観点、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、共有結合が好ましい。
【００６０】
化学結合形成反応には反応溶媒を使用してもよく、反応溶媒としては公知のものが使用でき、水、臭化リチウム水溶液、過塩素酸リチウム水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ジスルフォキシド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン及びこれらの少なくとも１種類を含む混合溶媒等が挙げられる。
【００６１】
官能基（Ｋ）を有する化合物（Ｂ）とタンパク質（Ａ１）とを共有結合させる方法としては、例えば、タンパク質（Ａ１）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基が有する反応性基がヒドロキシル基の場合、化合物（Ｂ）のうち、カルボン酸のハロゲン化物、スルホン酸のハロゲン化物又はアルコールのハロゲン化物（以下、ハロゲン化物と略する）を使用してエーテル化反応（ウイリアムソン合成法）する方法、化合物（Ｂ）のうち、スルホ基を有するカルボン酸又はヒドロキシル基を有するカルボン酸（以下、カルボキシル化合物と略する）を使用してエステル化反応する方法が挙げられる。
【００６２】
タンパク質（Ａ１）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基が有する反応性基がカルボキシル基の場合、カルボキシル基を有するアミン又はスルホ基を有するアミンを使用してアミド化反応する方法、カルボキシル基を有するアルコール又はスルホ基を有するアルコールを使用して、エステル化反応する方法等が挙げられる。
【００６３】
官能基（Ｋ）を有する化合物（Ｂ）とタンパク質（Ａ１）とをイオン結合させる方法としては、例えば、タンパク質（Ａ１）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基が有する反応性基がアミノ基の場合、カルボキシル基を有するスルホン酸、スルホ基を有するカルボン酸又はヒドロキシル基を有するカルボン酸（以下、酸化合物と略する）を用いて中和反応する方法、アミノ基（反応性基）を塩酸等の酸を用いてアンモニオ基にしてから、酸化合物を使用してイオン交換反応する方法が挙げられる。
【００６４】
タンパク質（Ａ２）において、反応性基含有アミノ酸残基の化学修飾により導入された官能基（Ｋ）の平均個数（個）は、タンパク質（Ａ２）１分子あたり、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、１〜１５６が好ましく、さらに好ましくは１０〜１２０、特に好ましくは３０〜１１５、最も好ましくは３０〜７５である。
【００６５】
官能基（Ｋ）の平均個数は、ハロゲン化物を使用してエーテル化反応により化学修飾した場合、用いた化学修飾前のタンパク質（Ａ１）及び化学修飾されたタンパク質（Ａ２）について、ポストラベル法によるＨＰＬＣ測定による各アミノ酸のピーク面積から算出することができる。具体的には、ポストラベル法によるＨＰＬＣ測定による各アミノ酸のピーク面積から、下記式により求めることができる（タンパク質に塩酸等の酸を加え加熱することにより、タンパク質をアミノ酸に加水分解してからオルトフタルアルデヒド又はニンヒドリンを用いてラベル化したアミノ酸をＨＰＬＣにより、アミノ酸のピーク面積を求める方法）。なお、化学修飾されないグリシンのピークを標準として用いる。
【００６６】
官能基（Ｋ）の平均個数＝Σ｛γ−（βａ÷αａ）÷（β０÷α０）×γ｝
【００６７】
α０：タンパク質（Ａ１）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
β０：タンパク質（Ａ１）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
αａ：タンパク質（Ａ２）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
βａ：タンパク質（Ａ２）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
γ：  タンパク質（Ａ１）中の各アミノ酸の数
【００６８】
ハロゲン化物以外の化合物（Ｂ）により化学修飾した場合、官能基（Ｋ）の平均個数は、用いた化学修飾前のタンパク質（Ａ１）及び化学修飾されたタンパク質（Ａ２）について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを測定し、ｍ／ｚ値及びそのピーク強度を求め、下記式に当てはめることにより求めることができる。
【００６９】
官能基の平均個数＝｛［Σ（Ｍ２×Ｎｎ）÷１００］−Ｍ１｝÷Ｌ
【００７０】
Ｍ１：タンパク質（Ａ１）のｍ／ｚ値
Ｍ２：タンパク質（Ａ２）のｍ／ｚ値
Ｎｎ：タンパク質（Ａ２）の全ピーク強度の和を１００％とした場合の、Ｍ２のピーク強度の割合（％）
Ｌ：官能基（Ｋ）を有する化合物（Ｂ）１分子がタンパク質（Ａ１）１分子に結合した際に増加する分子量
Ｌは、例えば、化合物（Ｂ）がパントテン酸であり、パントテン酸のヒドロキシル基とタンパク質（Ａ１）に含まれるアミノ酸残基が有するカルボキシル基（反応性基）とを脱水縮合反応させた場合、下記のように計算できる。
Ｌ＝２１９（パントテン酸の分子量）−１８（水の分子量）＝２０１
したがって、この場合、Ｌは２０１である。
【００７１】
本発明の遺伝物質導入補助基材を構成する基材の材質、形状及びタンパク質（Ａ）の基材への結合方法は、特開２００５−２１０６号公報に記載されたものをそのまま適用できる。
基材の材質としては、プラスチック（ポリスチレン、ポリアルフォオレフィン、ポリプロピレン、ポリエチレン及びこれらの複合体等）及び／又は無機物（ガラス、セラミックス、金属及びこれらの複合体等）等が挙げられる。これらのうち、透明で培養中の細胞を観察（顕微鏡観察を含む。）ができるもの（プラスチック、ガラス等）が好ましい。
基材としては、従来の細胞培養（細胞集合体培養及び接着培養等）に用いる基材をそのまま使用できるが、入手が容易である観点から、細胞培養容器が好ましい。細胞培養容器としては、マルチウェルプレート（６穴プレート、２４穴プレート及び９６穴プレート等）やシャーレ（直径３５、６０及び１００ｍｍ等）、Ｔ−フラスコ（容量２５、７５、１５０及び２２５ｍｌ等）、ローラーボトル（培養面積６９０、９７０、１２００及び１３００ｃｍ２等）等が用いられる。
【００７２】
本発明の遺伝物質導入補助基材に含まれるタンパク質（Ａ）の含有量は、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、本発明の遺伝物質導入補助基材の表面積に基づいて、０．００１〜１０μｇ／ｃｍ２が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｃｍ２、特に好ましくは０．５〜４μｇ／ｃｍ２である。
【００７３】
なお、本発明において、遺伝子物質導入補助基材の表面積は、遺伝子物質導入補助基材の表面のうち、細胞が接着し得る表面の表面積を意味し、細胞が入り込まないような微小な凹凸（例えば、１μｍ以下の凹凸部）は平坦な表面として取扱うが、表面積を高める目的でリブ（畝）等が設けてあるものについてはそのリブの表面積も遺伝子物質導入補助基材の表面積に含まれる。
タンパク質（Ａ）の含有量の測定方法は特に限定されないが、例えば、免疫学的測定法が利用できる。具体的な方法としては、特開２００５−２１０６号公報に記載されたものをそのまま適用できる。
【００７４】
本発明の遺伝物質導入補助基材は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。
滅菌方法としては、特に限定されないが、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、プラズマ滅菌、γ線滅菌、アルコール滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。
【００７５】
細胞接着率（％）は、遺伝物質導入効率の観点及び細胞接着性の観点から、１００〜２００が好ましく、さらに好ましくは１０８〜１４８である。なお、細胞接着率（％）は、遺伝物質導入補助基材の表面に播種した細胞（Ｃ）のうち、遺伝子物質導入補助基材に接着した細胞（Ｃ）の割合を示すものであって、フィブロネクチンを吸着させた基材に接着した接着細胞数を１００％として算出した値を意味する。
【００７６】
細胞接着率は、遺伝子物質導入補助基材の表面へのタンパク質（Ａ）の吸着量を増やすことにより上昇し、タンパク質（Ａ）の吸着量を少なくすることにより減少する。タンパク質（Ａ）の吸着量を増やすには、（１）タンパク質の濃度がより高い溶液を用いる、（２）タンパク質をより多く用いる、（３）タンパク質と基材との処理時間を長くすることにより達成でき、逆に、タンパク質（Ａ）の吸着量を少なくするにはこれらの反対の操作により達成できる。また、タンパク質（Ａ）中のＲＧＤ配列の含有量が多いほど細胞接着率が高くなる傾向がある。また、タンパク質（Ａ２）において、導入される官能基がスルホ基であると、細胞接着率がさらに高くなる。
【００７７】
細胞接着率は、具体的には下記測定法によって測定できる。
遺伝物質導入補助基材に、タンパク質（Ａ）を吸着させた部分の面積に対して１３１．５μＬ／ｃｍ２の割合で０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、９９．５重量％塩化ナトリウムを０．８５重量％含有するリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと略記する））を加えて２回洗浄する。
次に、血清を含まないＤＭＥＭ培地（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）をタンパク質（Ａ）を吸着させた部分の面積に対して１３１．５μＬ／ｃｍ２の割合で加え、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター内で１０分間保存する。１０分後、細胞（Ｃ）を、タンパク質（Ａ）を吸着させた部分の面積に対して２万ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の割合で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養する。
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、細胞に直接当たらないように注意しながらＰＢＳをタンパク質（Ａ）を吸着させた部分の面積に対して１３１．５μＬ／ｃｍ２の割合で加えて２回洗浄する。アスピレーターを用いてＰＢＳを除去して細胞接着基材を得る。次に、血清を含まないＤＭＥＭ培地をタンパク質（Ａ）を吸着させた部分の面積に対して１３１．５μＬ／ｃｍ２の割合で細胞接着基材に加え、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター内で１０分間保存する。１０分間の保存後、Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ溶液を、加えた血清を含まないＤＭＥＭ培地に対して１０μＬ／１００μＬで加え、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％の条件下で２時間静置させた。その後、吸光度計（ＵＥＲＳＡｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４５０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸光度（それぞれ、ＯＤ４５０及びＯＤ６５０）を測定する。また、あらかじめ作製しておいた、細胞数と吸光度（ＯＤ４５０−ＯＤ６５０）の相関性がある検量線にあてはめ、接着細胞数（Ｘ）を算出する。
【００７８】
タンパク質（Ａ）の代わりにフィブロネクチンを用いた比較用の遺伝物質導入補助基材を作成し、細胞を播種し、「インキュベーター中にて２時間放置して培養」した後の操作「アスピレーターを用いて培地を除去し、細胞に直接当たらないように注意しながらＰＢＳを１００μＬをタンパク質（Ａ）を吸着させた部分の面積に対して１３１．５μＬ／ｃｍ２の割合で加えて２回洗浄する」を行わないこと以外、上記と同様にして、比較用の細胞接着基材を得る。ここで、比較用の細胞接着基材表面におけるフィブロネクチンの含有量は、０．５μｇ／ｃｍ２である。この比較用基材の接着細胞数（Ｘ０）を測定する。この細胞接着数（Ｘ０）を１００％として、（Ｘ）及び（Ｘ０）を下記式に当てはめ、細胞接着率を算出する。
【００７９】
細胞接着率（％）＝（Ｘ）÷（Ｘ０）×１００
【００８０】
遺伝物質（Ｄ）としては、遺伝情報を担う物質であれば制限なく、核酸分子（ＤＮＡ及びＲＮＡ等）、ポリペプチド、糖及びこれらの複合体が含まれる。
【００８１】
細胞（Ｃ）としては、幹細胞｛ｈＭＳＣ細胞等｝、骨芽細胞｛ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞｝、上皮細胞｛Ｅｐｈ４細胞等｝、神経系細胞、線維芽細胞及び炎症性細胞等が挙げられる。細胞（Ｃ）のうち、遺伝物質導入補助基材への細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、幹細胞、上皮細胞、神経系細胞、線維芽細胞及び炎症性細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、さらに好ましくは幹細胞、上皮細胞、神経系細胞及び炎症性細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
【００８２】
本発明の導入細胞（Ｃ’）の生産方法は、上記の遺伝物質導入補助基材と細胞（Ｃ）とが接着することにより、細胞外の物質を取り込む作用が促進され、標的物質（Ｅ）中に含まれる遺伝物質（Ｄ）の細胞質内への取り込みが促進され、効率よく導入細胞（Ｃ’）を生産することができるものと考えられる。したがって、本発明の生産方法によると、細胞（Ｃ）に遺伝物質（Ｄ）を高効率で導入できる。
【００８３】
標的物質（Ｅ）は、遺伝物質（Ｄ）を含むものであるが、遺伝物質（Ｄ）以外に、遺伝子導入試薬、その他の成分｛緩衝溶液及び培地等｝を含んでもよい。
【００８４】
遺伝子導入試薬としては、カチオン性高分子｛スペルミン・プルラン等｝、カチオン性脂質｛ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００及びＨｉｌｙ  Ｍａｘ等｝、リン酸カルシウム、ポリアミン試薬及びポリイミン試薬等が挙げられる。これらの遺伝子導入試薬のうち、細胞毒性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、カチオン性高分子、カチオン性脂質及びリン酸カルシウムからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。
高効率で遺伝物質を導入する観点から、標的物質（Ｅ）に遺伝子導入試薬が含まれていることが好ましい。
【００８５】
緩衝溶液としては、緩衝剤を含む水溶液等が挙げられる。
緩衝剤としては、溶液内のｐＨを一定に保つ緩衝作用のあるものであれば特に限定されないが、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、硫酸、塩酸、クエン酸、乳酸、ピルビン酸、蟻酸、モノエタノールアミン及びジエタノールアミン等が挙げられる。
緩衝溶液中の緩衝剤の濃度としては、緩衝効果の観点から、１〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、さらに好ましくは１０〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００８６】
培地（Ｆ）としては、無血清培地及び血清培地が含まれる。
無血清培地としては、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、Ｏｐｔｉ−ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＴＭＩ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴＴＭ培地、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。これらのうち、細胞の安定性の観点から、Ｏｐｔｉ−ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＴＭＩ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴＴＭ培地、ＤＭＥＭ培地及びこれらの混合培地が好ましく、さらに好ましくはＯｐｔｉ−ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＤＭＥＭ培地及びこれらの混合培地である。
【００８７】
血清培地としては、上記の無血清培地（ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等）に血清を加えたもの等が挙げられる。血清としては、ヒト血清及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清及びマウス血清等）等が挙げられる。
【００８８】
培地（Ｆ）のうち、細胞表面への遺伝物質の吸着性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、無血清培地及び血清培地が好ましく、さらに好ましくは無血清培地である。
【００８９】
標的物質（Ｅ）中に、遺伝導入試薬やその他の成分を含む場合、遺伝物質（Ｄ）の含有量（重量％）は、細胞毒性及び高効率で遺伝物質を導入する観点から、標的物質（Ｅ）の重量に基づいて、０．００１〜２０が好ましく、さらに好ましくは０．０５〜７である。
【００９０】
標的物質（Ｅ）に遺伝子導入試薬を含む場合、遺伝子導入試薬の含有量（重量％）は、細胞毒性及び高効率で遺伝物質を導入する観点から、標準物質（Ｅ）の重量に基づいて、０．１〜１５が好ましく、さらに好ましくは０．５〜７である。
【００９１】
標的物質（Ｅ）にその他の成分（緩衝溶液及び培地等）を含む場合、その他の成分の含有量（重量％）は、細胞毒性及び高効率で遺伝物質を導入する観点から、８０〜９９．９９９が好ましく、さらに好ましくは９３〜９９．９５である。
【００９２】
細胞（Ｃ）に標的物質（Ｅ）を作用させる際の遺伝物質導入補助基材表面に接着させる細胞（Ｃ）の数は、細胞増殖性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、遺伝物質導入補助基材の表面積に基づいて、１，０００〜５０，０００個／ｃｍ２が好ましく、さらに好ましくは２，０００〜１５，０００個／ｃｍ２である。
【００９３】
遺伝物質導入補助基材に細胞（Ｃ）を接着させる方法としては、公知の接着方法が適用でき、遺伝物質導入補助基材と細胞（Ｃ）懸濁液とを接触させる等が挙げられる。
【００９４】
細胞（Ｃ）に標的物質（Ｅ）を作用させる際の遺伝物質（Ｄ）の使用量は、細胞（Ｃ）の種類、導入細胞（Ｃ’）の使用目的に応じて適宜決定できるが、細胞毒性の観点及び安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入する観点から、細胞（Ｃ）の個数に基づいて、１０−８〜０．０１μｇ／個が好ましく、さらに好ましくは５×１０−６〜０．０１μｇ／個である。
【００９５】
遺伝物質導入補助基材に細胞（Ｃ）を接着させて遺伝物質（Ｄ）を含む標的物質（Ｅ）を作用させる際、細胞（Ｃ）が接着した遺伝物質導入補助基材に標的物質（Ｅ）を直接接触させてもよく、標的物質（Ｅ）を培地（Ｆ）で希釈してから接触させてもよく、培地（Ｆ）中に存在する遺伝物質導入補助基材（細胞（Ｃ）が接着されているもの）に対して培地（Ｆ）中で作用させてもよい。これらのうち、細胞（Ｃ）表面への遺伝物質の吸着性の観点及び高効率で遺伝物質を導入する観点から、培地（Ｆ）中で作用させることが好ましい。
【００９６】
培地（Ｆ）中で標的物質（Ｅ）を作用させる場合、遺伝物質（Ｄ）の使用量（重量％）は、高効率で遺伝物質を導入する観点から、培地（Ｆ）の重量に基づいて、０．００００１〜４が好ましく、さらに好ましくは０．００００２５〜０．０１０５である。
【００９７】
遺伝物質導入補助基材に接着させた細胞（Ｃ）と、標的物質（Ｅ）とを作用させる際の温度としては、高効率で遺伝物質を導入する観点から、２５〜４５℃が好ましく、さらに好ましくは３０〜４０℃、特に好ましくは３７℃である。
また、雰囲気については特に制限ないが、高効率で遺伝物質を導入する観点から、二酸化炭素濃度２〜８容量％の雰囲気が好ましく、さらに好ましくは同５容量％の雰囲気である。
【００９８】
タンパク質（Ａ）にはＲＧＤ配列が含まれるが、細胞（Ｃ）に遺伝物質（Ｄ）を導入する際、このＲＧＤ配列が、細胞（Ｃ）のＴｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ  ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）等を刺激し、細胞（Ｃ）に細胞外から物質を取り込む作用が促進され、遺伝物質（Ｄ）の導入が促進されるものと考えられる。そして、Ｔｏｌｌ様受容体等への刺激は、細胞（Ｃ）がタンパク質（Ａ）のＲＧＤ配列に接着することで生じると考えられる。
タンパク質（Ａ)が複数個のＲＧＤ配列を有すると、細胞（Ｃ）とＲＧＤ配列とがより接着するため、Ｔｏｌｌ様受容体等をさらに安定的に刺激できると考えられ、再現性よく高効率で遺伝子導入できると考えられる。
また、タンパク質（Ａ）｛ＲＧＤ配列｝と細胞（Ｃ）との接着力が高いほど、細胞外から物質を取り込む作用が促進し、さらに安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入することができると考えられる。さらに、本発明の基材を用いれば、従来は遺伝物質を導入することが困難な細胞に対しても、安定的に再現性よく高効率で遺伝物質を導入することができる。
【実施例】
【００９９】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１００】
＜実施例１＞
（１）タンパク質（Ａ１−１）の作製
特表平３−５０２９３５号公報に記載された実施例に準じて、１３個のＲＧＤ配列と１３個の（ＧＡＧＡＧＳ）９配列（２８）（Ｙ１）とを有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１１万のポリペプチド（２９）を遺伝子組換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製してタンパク質（Ａ１−１）を得た。
【０１０１】
（２）遺伝物質導入補助基材（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−３）の作製
タンパク質（Ａ１−１）１ｍｇを４．５ｍｏｌ過塩素酸リチウム水溶液１００μＬに溶解し、９００μＬのＰＢＳで希釈し、さらにＰＢＳでタンパク質（Ａ１−１）の濃度が０．００５μｇ／ｍＬとなるように希釈して、タンパク質（Ａ１−１）溶液（ａ１）を調製した。また、同様にして、タンパク質（Ａ１−１）の濃度が５μｇ／ｍＬのタンパク質（Ａ１−１）溶液（ａ２）を調製し、同様に、タンパク質（Ａ１−１）の濃度が５０μｇ／ｍＬのタンパク質（Ａ１−１）溶液（ａ３）を調製した。
【０１０２】
これらの溶液（ａ１）〜（ａ３）を９６穴（９６ウェル）のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）中の８穴（８ウェル）ずつにそれぞれ５０μＬ／ウェルで投入し、室温（約２５℃）で２時間放置した。ポリスチレンプレートの各穴からアスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／ウェルで２回洗浄し、さらに脱イオン水１００μＬ／ウェルで洗浄して、本発明の遺伝物質導入補助基材（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−３）を得た。遺伝物質導入補助基材（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−３）中のタンパク質（Ａ１−１）の含有量は後述の方法により測定して、表２に示した。
【０１０３】
＜実施例２＞
（１）タンパク質（Ａ２−１）の作製
タンパク質（Ａ１−１）５０ｍｇとクロロ酢酸２３０ｍｇとを４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．５ｍＬに溶解した後、この溶液を攪拌しながら、水酸化ナトリウム１００ｍｇを溶解した４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．３２５ｍＬを１ｍＬピペッターで２回に分けて滴下した。室温（約２５℃）で１時間攪拌したのち、反応液を透析、凍結乾燥して、タンパク質（Ａ２−１）を得た。
【０１０４】
（２）遺伝物質導入補助基材（Ｐ２−１）〜（Ｐ２−３）の作製
「タンパク質（Ａ１−１）」を「タンパク質（Ａ２−１）」に変更したこと、「４．５ｍｏｌ過塩素酸リチウム水溶液１００μＬに溶解し、９００μＬのＰＢＳで希釈」したことを「１ｍＬのＰＢＳに溶解」したことに変更したこと以外、実施例１の「（２）遺伝物質導入補助基材（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−３）の作製」と同様にして、遺伝物質導入補助基材（Ｐ２−１）〜（Ｐ２−３）を得た。遺伝物質導入補助基材（Ｐ２−１）〜（Ｐ２−３）中のタンパク質（Ａ２−１）の含有量は後述の方法により測定して、表２に示した。
【０１０５】
＜実施例３＞
（１）タンパク質（Ａ２−２）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「２−クロロエタンスルホン酸ナトリウム４０５ｍｇ」に変更したこと以外、実施例２と同様にして、タンパク質（Ａ２−２）を得た。
【０１０６】
（２）遺伝物質導入補助基材（Ｐ３−１）〜（Ｐ３−３）の作製
「タンパク質（Ａ１−１）」を「タンパク質（Ａ２−２）」に変更したこと、「４．５ｍｏｌ過塩素酸リチウム水溶液１００μＬに溶解し、９００μＬのＰＢＳで希釈」したことを「１ｍＬのＰＢＳに溶解」したことに変更したこと以外、実施例１の「（２）遺伝物質導入補助基材（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−３）の作製」と同様にして、遺伝物質導入補助基材（Ｐ３−１）〜（Ｐ３−３）を得た。遺伝物質導入補助基材（Ｐ３−１）〜（Ｐ３−３）中のタンパク質（Ａ２−２）の含有量は後述の方法により測定して、表２に示した。
【０１０７】
＜実施例４＞
（１）タンパク質（Ａ２−３）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「クロロエタノール９４ｍｇ」に変更したこと以外、実施例２と同様にして、タンパク質（Ａ２−３）を得た。
【０１０８】
（２）遺伝物質導入補助基材（Ｐ４−１）〜（Ｐ４−３）の作製
「タンパク質（Ａ１−１）」を「タンパク質（Ａ２−３）」に変更したこと、「４．５ｍｏｌ過塩素酸リチウム水溶液１００μＬに溶解し、９００μＬのＰＢＳで希釈」したことを「１ｍＬのＰＢＳに溶解」したことに変更したこと以外、実施例１の「（２）遺伝物質導入補助基材（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−３）の作製」と同様にして、遺伝物質導入補助基材（Ｐ４−１）〜（Ｐ４−３）を得た。遺伝物質導入補助基材（Ｐ４−１）〜（Ｐ４−３）中のタンパク質（Ａ２−３）の含有量は後述の方法により測定して、表２に示した。
【０１０９】
＜実施例５＞
（１）タンパク質（Ａ２−４）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「２−クロロエチルアミン２８０ｍｇ」に変更したこと以外、実施例２と同様にして、タンパク質（Ａ２−４）を得た。
【０１１０】
（２）遺伝物質導入補助基材（Ｐ５−１）〜（Ｐ５−３）の作製
「タンパク質（Ａ１−１）」を「タンパク質（Ａ２−４）」に変更したこと、「４．５ｍｏｌ過塩素酸リチウム水溶液１００μＬに溶解し、９００μＬのＰＢＳで希釈」したことを「１ｍＬのＰＢＳに溶解」したことに変更したこと以外、実施例１の「（２）遺伝物質導入補助基材（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−３）の作製」と同様にして、遺伝物質導入補助基材（Ｐ５−１）〜（Ｐ５−３）を得た。遺伝物質導入補助基材（Ｐ５−１）〜（Ｐ５−３）中のタンパク質（Ａ２−４）の含有量は後述の方法により測定して、表２に示した。
【０１１１】
＜実施例６＞
（１）タンパク質（Ａ２−５）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド１５０ｍｇ」に変更したこと以外、実施例２と同様にして、タンパク質（Ａ２−５）を得た。
【０１１２】
（２）遺伝物質導入補助基材（Ｐ６−１）〜（Ｐ６−３）の作製
「タンパク質（Ａ１−１）」を「タンパク質（Ａ２−５）」に変更したこと、「４．５ｍｏｌ過塩素酸リチウム水溶液１００μＬに溶解し９００μＬのＰＢＳで希釈」したことを「１ｍＬのＰＢＳに溶解」したことに変更したこと以外、実施例１の「（２）遺伝物質導入補助基材（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−３）の作製」と同様にして、遺伝物質導入補助基材（Ｐ６−１）〜（Ｐ６−３）を得た。遺伝物質導入補助基材（Ｐ６−１）〜（Ｐ６−３）中のタンパク質（Ａ２−５）の含有量は後述の方法により測定して、表２に示した。
【０１１３】
＜実施例７＞
（１）タンパク質（Ａ２−６）の作製
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「クロロエチルトリメチルアンモニウムクロリド３８０ｍｇ」に変更したこと以外、実施例２と同様にして、タンパク質（Ａ２−６）を得た。
【０１１４】
（２）遺伝物質導入補助基材（Ｐ７−１）〜（Ｐ７−３）の作製
「タンパク質（Ａ１−１）」を「タンパク質（Ａ２−６）」に変更したこと、「４．５ｍｏｌ過塩素酸リチウム水溶液１００μＬに溶解し９００μＬのＰＢＳで希釈」したことを「１ｍＬのＰＢＳに溶解」したことに変更したこと以外、実施例１の「（２）遺伝物質導入補助基材（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−３）の作製」と同様にして、遺伝物質導入補助基材（Ｐ７−１）〜（Ｐ７−３）を得た。遺伝物質導入補助基材（Ｐ７−１）〜（Ｐ７−３）中のタンパク質（Ａ２−６）の含有量は後述の方法により測定して、表２に示した。
【０１１５】
＜比較例１＞
「タンパク質（Ａ１−１）」に代えて「フィブロネクチン（和光純薬工業株式会社製）」を用いたこと以外、実施例１の「（２）遺伝物質導入補助基材（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−３）の作製」と同様にして、比較用の遺伝物質導入補助基材（ＨＰ１）〜（ＨＰ３）を得た。遺伝物質導入補助基材（ＨＰ１）〜（ＨＰ３）中のフィブロネクチンの含有量は後述の方法により測定して、表２に示した。
【０１１６】
＜化学修飾により導入された官能基（Ｋ）の平均個数の測定＞
タンパク質（Ａ２−１）１ｍｇを６Ｎ 塩酸２００μＬに加えてから泡が発生しなるまで脱気して均一溶液を得た後、この溶液を減圧（４ｋＰａ）密封下で１１０℃、２２時間の加水分解を行って反応液を得た。次に、反応液に試料希釈液（アミノ酸自動分析用試料希釈液 Ｎａ型、クエン酸ナトリウム緩衝液０．０６７ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ２．２０）２００μＬを加えエバポレーターで蒸発乾固し、さらに試料希釈液２００μＬを加えて蒸発乾固する共洗い操作を２回繰り返した後、２ｍｌになるように試料希釈液で希釈した。希釈した溶液を試料希釈液でさらに１０倍希釈し、０．２μｍのフィルターを通し測定用試料とした。また、同様に、タンパク質（Ａ１−１）について測定用試料を調製した。
【０１１７】
タンパク質（Ａ２−１）及び（Ａ１−１）について、ポストラベル法によるＨＰＬＣ測定（ラベル化試薬：オルトフタルアルデヒド、スタンダード：アミノ酸混合標準液 Ｈ型、共に和光純薬工業株式会社製）を行い、溶出時間からアミノ酸の種類を同定し、各アミノ酸のピーク面積を求め、次式からカルボキシル基｛官能基（Ｋ）｝の平均個数を算出した。
【０１１８】
官能基（Ｋ）の平均個数＝Σ｛γ−（βａ÷αａ）÷（β０÷α０）×γ｝
【０１１９】
α０：タンパク質（Ａ１−１）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
β０：タンパク質（Ａ１−１）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
αａ：タンパク質（Ａ２−１）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
βａ：タンパク質（Ａ２−１）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
γ：  タンパク質（Ａ１−１）中の各アミノ酸の数
【０１２０】
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  Ａｍｉｎｏ−Ｎａ
カラム温度：６０℃
移動相：アミノ酸分析移動相セット（Ｎａ 型）（株式会社島津製作所製）
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：励起波長３５０ｎｍ，測定波長４５０ｎｍ
【０１２１】
タンパク質（Ａ２−２）〜（Ａ２−６）について、上記と同様にして、化学修飾により導入された官能基（Ｋ）｛スルホ基、ヒドロキシル基、第一級アミノ基、第三級アミノ基、第四級アンモニオ基｝の平均個数を求めた。これらの結果を表１に示す。
【０１２２】
【表１】
2015047151.tif 000002
【０１２３】
＜遺伝物質導入補助基材に含まれるタンパク質の含有量の測定＞
Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）のＲｅａｇｅｎｔ  Ａ溶液、Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂ溶液及びＲｅａｇｅｎｔ  Ｃ溶液を重量比２５：２４：１（Ａ：Ｂ：Ｃ）で混合して混合液（Ｃ）を調製し、実施例で調製した遺伝物質導入補助基材｛ポリスチレンプレートの各ウェル｝に混合液（Ｃ）を１００μＬづつ加え、３７℃で２時間静置した。
２時間後に、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）とＣｕ＋とからなるキレートの生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＡ−３２）を用いて測定し、あらかじめウシ血清アルブミンにより作成した検量線からタンパク質の含有量を得た。これらの結果を表２に示す（これらの結果は各々８穴分（８ウェル分）の平均データである。）。
【０１２４】
実施例及び比較例で調製した遺伝物質導入補助基材｛ポリスチレンプレートの各ウェル｝を用いて、細胞接着率及び遺伝物質導入効率について以下の通り評価し、これらの評価結果を表２及び３に示した。
【０１２５】
＜評価１：ｈＭＳＣ細胞（ヒト間葉系幹細胞）の細胞接着率＞
（１）細胞培養
直径１０ｃｍの滅菌シャーレでｈＭＳＣ細胞を３７℃、二酸化炭素濃度５容量％、１０重量％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１重量％ペニシリンストプトマイシン含有ＤＭＥＭ培地の条件下で３日間培養した。サブコンフルエント状態になったｈＭＳＣ細胞を、５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した後、３ｍＬのトリプシン溶液を加えた。トリプシン溶液を除去し、血清を含まないＤＭＥＭ培地（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を２ｍＬ加え、ピペッティングを行い、細胞懸濁液を作製した。さらに、血清を含まないＤＭＥＭ培地を用いて２×１０５個／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製した。この懸濁液を遺伝子物質導入補助基材の各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、細胞に直接当たらないように注意しながらＰＢＳを１００μＬ加えて２回洗浄した。さらに、アスピレーターを用いてＰＢＳを除去して、細胞接着基材を得た。次に、この細胞接着基材に血清を含まないＤＭＥＭ培地をそれぞれ１００μＬ加え、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター内で１０分間保存した。
【０１２６】
比較例で得た遺伝物質導入補助基材（ＨＰ１）〜（ＨＰ３）について、「インキュベーター中にて２時間放置して培養」した後の操作「アスピレーターを用いて培地を除去し、細胞に直接当たらないように注意しながらＰＢＳを１００μＬを加えて２回洗浄した」を行わないこと以外、上記と同様にして、細胞接着基材を得た。
【０１２７】
（２）細胞数の測定
１０分間の保存後、細胞接着基材に、Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ溶液を１０μＬ加え、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％の条件下で２時間静置させた。その後、吸光度計（ＵＥＲＳＡｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４５０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸光度（それぞれ、ＯＤ４５０及びＯＤ６５０）を測定した。また、あらかじめ作製しておいた、細胞数と吸光度（ＯＤ４５０−ＯＤ６５０）の相関性がある検量線にあてはめ、培養液中の接着細胞数（Ｘ）を算出した。
【０１２８】
（３）細胞接着率
比較例で得た遺伝物質導入補助基材（ＨＰ１）〜（ＨＰ３）について得た接着細胞数の平均値（Ｘ０）を１００％として、遺伝物質導入補助基材（ＨＰ１）〜（ＨＰ３）以外の遺伝物質導入補助基材の接着細胞数を相対比較するために、次式により細胞接着率を算出した。
【０１２９】
細胞接着率（％）＝（Ｘ）÷（Ｘ０）×１００
【０１３０】
＜評価２：Ｅｐｈ４細胞の細胞接着率＞
「ｈＭＳＣ細胞」に代えて「Ｅｐｈ４細胞」を用いたこと以外、＜評価１＞と同様にして、Ｅｐｈ４細胞の細胞接着率を求めた。
【０１３１】
＜評価３：ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の細胞接着率＞
「ｈＭＳＣ細胞」に代えて「ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞」を用いたこと以外、＜評価１＞と同様にして、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の細胞接着率を求めた。
【０１３２】
【表２】
2015047151.tif 000003
【０１３３】
表２の細胞接着率測定の結果から、タンパク質の含有量が同程度の遺伝物質導入補助基材同士について細胞接着率を比較したとき、比較用の遺伝物質導入補助基材を用いた場合に比べて、本発明の遺伝物質導入補助基材を用いた場合は、ｈＭＳＣ細胞、Ｅｐｈ４細胞及びＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に対して細胞接着率が高いことが分かる。
【０１３４】
＜評価４：ｈＭＳＣ細胞（ヒト間葉系幹細胞）への遺伝物質導入効率解析＞
（１）遺伝子ベクター作製
サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）及びホタルルシフェラーゼをコードする配列からなる１２．５ｋｂのプラスミドＤＮＡを有する大腸菌と、ＱｉａｇｅｎＭａｘｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）とを用いて、プラスミドＤＮＡ（ＣＭＶ−ＦＬ）を作製した。
【０１３５】
（２）細胞培養
＜評価１＞の（１）と同様にして作製した細胞懸濁液を、実施例及び比較例で得た遺伝物質導入補助基材の各ウェルに１００μＬずつ添加し、１日間培養を行って細胞接着基材を得た。
【０１３６】
（３）遺伝物質導入
プラスミドＤＮＡ（ＣＭＶ−ＦＬ）を５０μｇ／ｍＬになるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）で希釈した。また、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭで等倍希釈した。これらの溶液を等重量ずつ混ぜ合わせ、室温（約２５℃）で１５分間放置し、標的物質（Ｘ）を作製した。
【０１３７】
細胞接着基材に、標的物質（Ｘ）をそれぞれ１０μＬずつ加え、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％の条件下で３時間培養した。その後、アスピレーターを用いて培地を除去し、細胞に直接当たらないように注意しながら血清含有ＤＭＥＭ培地を１００μＬ加え、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター内で２日間培養して、ｈＭＳＣ細胞（ヒト間葉系幹細胞）にプラスミドＤＮＡ（ＣＭＶ−ＦＬ）を導入し、遺伝物質を導入した細胞接着基材を得た。
【０１３８】
（４）ルシフェラーゼ活性測定
遺伝物質を導入した細胞接着基材をＰＢＳ１００μＬで２回洗浄し、ルシフェラーゼアッセイシステムの細胞可溶化液（プロメガ社製）を１００μＬ加え、細胞溶解液を得てから、細胞溶解液を４℃、１４，０００ｒｐｍの条件で２０分間遠心分離し、その遠心上清の２０μＬとルシフェラーゼアッセイシステムのルシフェラーゼアッセイ溶液（プロメガ社製）１００μＬとを混合し、この混合液の発光強度（ＲＬＵ）をルミノメーター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ｌｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０７）により測定した。また、細胞溶解液のタンパク質量（ｍｇ）をローリーキット（ナカライテスク株式会社製、Ｌ８９００）で測定した。これらのタンパク質量及び発光強度より、ルシフェラーゼ活性（発光強度÷タンパク質量）（Ｙ）を求めた。なお、一つの細胞接着基材について、それぞれ３穴（３ウェル）を用いてルシフェラーゼ活性を求めた。
【０１３９】
比較例で得た遺伝物質導入補助基材（ＨＰ３）を用いた場合のルシフェラーゼ活性の平均値（Ｙ０）を１００として、遺伝物質導入補助基材（ＨＰ３）以外の遺伝物質導入補助基材を用いた場合のルシフェラーゼ活性を相対比較するために、次式によりルシフェラーゼ活性率（％）を算出した。
【０１４０】
ルシフェラーゼ活性率（％）＝（Ｙ）÷（Ｙ０）×１００
【０１４１】
一つの細胞接着基材について得られた３つのルシフェラーゼ活性率（Ｑ１）、（Ｑ２）及び（Ｑ３）と、これらの平均値とを用いて、次式から相対標準偏差を算出した。
【０１４２】
平均値＝（Ｑ１＋Ｑ２＋Ｑ３）÷３
【０１４３】
【数１】
2015047151.tif 000004
【０１４４】
各遺伝物質導入補助基材について、ルシフェラーゼ活性率の平均値を棒グラフで図１に示した。また、次式で算出した標準偏差を棒グラフのエラーバーとして表した。なお、横軸の「Ｐ１」において、左の棒グラフから遺伝物質導入補助基材Ｐ１（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−３）に対するルシフェラーゼ活性率の平均値を表す。また、同様に、横軸の「Ｐ２」〜「ＨＰ」において、左の棒グラフから遺伝物質導入補助基材Ｐ２（Ｐ２−１）〜（Ｐ２−３）、Ｐ３（Ｐ３−１）〜（Ｐ３−３）、Ｐ４（Ｐ４−１）〜（Ｐ４−３）、Ｐ５（Ｐ５−１）〜（Ｐ５−３）、Ｐ６（Ｐ６−１）〜（Ｐ６−３）、Ｐ７（Ｐ７−１）〜（Ｐ７−３）、ＨＰ（ＨＰ１）〜（ＨＰ３）に対するルシフェラーゼ活性率の平均値を表す。同じ模様の棒同士が同程度のタンパク質の含有量についてのデータである。
【０１４５】
【数２】
2015047151.tif 000005
【０１４６】
＜評価５：Ｅｐｈ４細胞の遺伝物質導入効率解析＞
「ｈＭＳＣ細胞」に代えて「Ｅｐｈ４細胞」を用いたこと以外、評価４と同様にして、Ｅｐｈ４細胞のルシフェラーゼ活性率（％）を求めた。
【０１４７】
各遺伝物質導入補助基材について、ルシフェラーゼ活性率の平均値を棒グラフで図２に示した。また、図１と同様にして、標準偏差を棒グラフのエラーバーとして表し、左の棒グラフから遺伝物質導入補助基材Ｐ１（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−３）、Ｐ２（Ｐ２−１）〜（Ｐ２−３）、Ｐ３（Ｐ３−１）〜（Ｐ３−３）、Ｐ４（Ｐ４−１）〜（Ｐ４−３）、Ｐ５（Ｐ５−１）〜（Ｐ５−３）、Ｐ６（Ｐ６−１）〜（Ｐ６−３）、Ｐ７（Ｐ７−１）〜（Ｐ７−３）、ＨＰ（ＨＰ１）〜（ＨＰ３）に対するルシフェラーゼ活性率の平均値を表す。同じ模様の棒同士が同程度のタンパク質の含有量についてのデータである。
【０１４８】
＜評価６：ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の遺伝物質導入効率解析＞
「ｈＭＳＣ細胞」に代えて「ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞」を用いたこと以外、評価４と同様にして、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のルシフェラーゼ活性率（％）を求めた。
【０１４９】
各遺伝物質導入補助基材について、ルシフェラーゼ活性率の平均値を棒グラフで図３に示した。また、図１と同様にして、標準偏差を棒グラフのエラーバーとして表し、左の棒グラフから遺伝物質導入補助基材Ｐ１（Ｐ１−１）〜（Ｐ１−３）、Ｐ２（Ｐ２−１）〜（Ｐ２−３）、Ｐ３（Ｐ３−１）〜（Ｐ３−３）、Ｐ４（Ｐ４−１）〜（Ｐ４−３）、Ｐ５（Ｐ５−１）〜（Ｐ５−３）、Ｐ６（Ｐ６−１）〜（Ｐ６−３）、Ｐ７（Ｐ７−１）〜（Ｐ７−３）、ＨＰ（ＨＰ１）〜（ＨＰ３）に対するルシフェラーゼ活性率の平均値を表す。同じ模様の棒同士が同程度のタンパク質の含有量についてのデータである。
【０１５０】
【表３】
2015047151.tif 000006
【０１５１】
表３の結果から、タンパク質の含有量が同程度の遺伝物質導入補助基材についてルシフェラーゼ活性率を比較したとき、フィブロネクチンを含有する比較用の遺伝物質導入補助基材（ＨＰ１）〜（ＨＰ３）を用いた場合に比べて本発明の遺伝物質導入補助基材（Ｐ１−１）〜（Ｐ７−３）を用いた場合は、ｈＭＳＣ細胞、Ｅｐｈ４細胞及びＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に対して、ルシフェラーゼ活性率が極めて高く、高効率で遺伝物質を導入できたことが分かる。
【０１５２】
また、遺伝子導入が困難なｈＭＳＣ細胞及びＥｐｈ４細胞についても、再現性よく高効率で遺伝物質を導入できたことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１５３】
本発明の遺伝物質導入補助基材は、幹細胞や上皮細胞等の遺伝物質を導入することが難しい細胞に対しても安定的に再現性よく、高効率で遺伝物質を導入できるので、細胞培養基材として有効である。また、本発明の製造方法により遺伝物質を導入した細胞は、目的遺伝子が高効率で発現しており、研究や治療に用いる上で有用である。
【図１】
2015047151.tif 000007
【図２】
2015047151.tif 000008
【図３】
2015047151.tif 000009
【配列表】
2015047151000001.app