(57)【要約】【課題】肝線維症の病変部位へのターゲティングを可能にし、肝線維症のイメージング、診断、治療に有用な糖鎖含有ポリマー、および、該ポリマーを治療等に有用なアニオン性物質のキャリアーとする糖鎖含有ポリマー複合体を提供する。【解決手段】アミンを含むカチオン性のポリマーであって、Ｎ−アセチルグルコサミンが結合したことを特徴とする糖鎖含有ポリマーである。ジスルフィド結合を有することが好ましい。ポリエチレンイミンがジスルフィド結合を介して連結した構造を有することが好ましい。【選択図】図１
2015105230.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミンを含むカチオン性のポリマーであって、Ｎ−アセチルグルコサミンが結合したことを特徴とする糖鎖含有ポリマー。
【請求項２】
ジスルフィド結合を有する請求項１記載の糖鎖含有ポリマー。
【請求項３】
ポリエチレンイミンがジスルフィド結合を介して連結した構造を有する請求項１または２記載の糖鎖含有ポリマー。
【請求項４】
さらに、蛍光色素が結合した請求項１〜３のいずれか一項記載の糖鎖含有ポリマー。
【請求項５】
前記蛍光色素が、インドシアニングリーンである請求項４記載の糖鎖含有ポリマー。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項記載の糖鎖含有ポリマーと、アニオン性物質から構成されることを特徴とする糖鎖含有ポリマー複合体。
【請求項７】
前記糖鎖含有ポリマーと、前記アニオン性物質が、静電相互作用によって複合体を形成する請求項６記載の糖鎖含有ポリマー複合体。
【請求項８】
前記アニオン性物質が、核酸である請求項６または７記載の糖鎖含有ポリマー複合体。
【請求項９】
前記核酸が、ＲＮＡである請求項８記載の糖鎖含有ポリマー複合体。
【請求項１０】
前記ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡである請求項９記載の糖鎖含有ポリマー複合体。
【請求項１１】
前記ｓｉＲＮＡが、ＴＧＦβ１のｓｉＲＮＡである請求項１０記載の糖鎖含有ポリマー複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖含有ポリマー、および、糖鎖含有ポリマー複合体に関し、詳しくは、肝線維症の肝臓に特異的に相互作用し、肝線維症の病変部位のイメージング、診断、治療に有用な糖鎖含有ポリマー、および、該ポリマーをアニオン性物質のキャリアーとする糖鎖含有ポリマー複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝線維症は、肝臓がんや肝硬変などの致命的な肝臓疾患と関連性がある。一般的な肝臓病を避けるために、肝線維症の早期段階における診断および治療は肝要である。活性化された肝星細胞（HSCs）は、肝線維症において重要な役割を果たす。損傷した肝臓において、HSCsは、静止状態から活性状態へとその形質を変え、肝細胞や他の非実質細胞によるサイトカインおよび成長因子の分泌を誘導する。活性化HSCsは、肝線維症に寄与するコラーゲンなどの細胞外マトリックス(ECM)構成要素も産生する。そこで、活性化HSCsのターゲティングと遺伝子や薬剤の活性化HSCへの輸送が、肝線維症治療のキーポイントとなる。
【０００３】
最近、本発明者等は、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）を保持するポリマーが、細胞表面のビメンチンやデスミンに対して、強い結合性を有することを見出した（非特許文献１、２）。また、本発明者等は、Ｎ−アセチルグルコサミン保持ポリマー（PVGlcNAc）が、ビメンチンおよびデスミン陽性細胞を肝臓細胞集団の中から特定しうることを報告した。Ｎ−アセチルグルコサミン保持ポリマーは、類洞内皮細胞、クッパ−細胞およびHSCsといったビメンチン陽性細胞と相互作用する。特に、活性化HSCsは、静止状態のHSCsやその他の非実質細胞よりも、ビメンチンおよびデスミンを強く発現する。PVGlcNAcはポリスチレン骨格にＮ−アセチルグルコサミンが結合した構造を有するポリマーであり、疎水性のポリスチレン鎖が、同じく疎水性のポリスチレン培養皿に強固に吸着する。この性質を利用して、PVGlcNAcコート培養皿を作製し、特定の肝臓細胞を選択的に培養することが可能となった。
【０００４】
インドシアニングリーン蛍光色素(ICG)はFDAの認可を受けており、疾病のイメージングや治療に広く用いられている。ICGは、その血中保持割合を測定することにより肝機能を評価することにも使用されてきた。しかしながら、ICG単独で注入された場合には、ICG蛍光シグナルは血中から素早く消失する。長期に渡り持続可能なICGイメージングを実現するために、ナノ材料との結合が必要である。ポリマーおよびリン脂質が、血中でのICG安定化のために用いられてきた。
【０００５】
低分子干渉リボ核酸(siRNA)の輸送は、特定の疾患関連遺伝子およびタンパク質のノックダウンによる疾病の治療法として有望である。しかしながら、酵素による分解に加えて、siRNAが細胞膜を通過できないという問題がある。これらの問題を解決するために、多くの研究者が、siRNAの細胞や組織への安定な輸送システムについて、ウィルスベクター（例えば、アデノウィルス、レンチウィルス）を用いた方法や、ウィルスベクターを用いない（例えば、リポソーム、カチオンポリマー、デンドリマー）方法を探求してきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ise H., et al., Glycobiology 2010;20:843-64
【非特許文献２】Komura K., Ise H., Akaike T., Glycobiology2012; 22: 1741-59
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、肝臓疾患の治療において、肝線維症の早期発見、治療は重要であり、肝線維症治療のキーポイントとなる活性化HSCsへの、薬剤、試薬、治療用遺伝子等のターゲティングと輸送手段、キャリアーの開発が求められている。
【０００８】
そこで本発明の目的は、肝線維症の病変部位へのターゲティングを可能にし、肝線維症のイメージング、診断、治療に有用な糖鎖含有ポリマー、および、該ポリマーを治療等に有用なアニオン性物質のキャリアーとする糖鎖含有ポリマー複合体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、アミンを含むカチオン性のポリマーに、Ｎ−アセチルグルコサミンを結合させることで、上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明の糖鎖含有ポリマーは、アミンを含むカチオン性のポリマーであって、Ｎ−アセチルグルコサミンが結合したことを特徴とするものである。
【００１１】
本発明の糖鎖含有ポリマーは、ジスルフィド結合を有することが好ましい。
【００１２】
また、本発明の糖鎖含有ポリマーは、ポリエチレンイミンがジスルフィド結合を介して連結した構造を有することが好ましい。
【００１３】
また、本発明の糖鎖含有ポリマーは、さらに、蛍光色素が結合したものであることが好ましい。
【００１４】
また、本発明の糖鎖含有ポリマーは、前記蛍光色素が、インドシアニングリーンであることが好ましい。
【００１５】
本発明の糖鎖含有ポリマー複合体は、上記本発明の糖鎖含有ポリマーと、アニオン性物質から構成されることを特徴とするものである。
【００１６】
本発明の糖鎖含有ポリマー複合体は、前記糖鎖含有ポリマーと、前記アニオン性物質が、静電相互作用によって複合体を形成するものであることが好ましい。
【００１７】
また、本発明の糖鎖含有ポリマー複合体は、前記アニオン性物質が、核酸であることが好ましい。
【００１８】
また、本発明の糖鎖含有ポリマー複合体は、前記核酸が、ＲＮＡであることが好ましい。
【００１９】
また、本発明の糖鎖含有ポリマー複合体は、前記ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡであることが好ましい。
【００２０】
また、本発明の糖鎖含有ポリマー複合体は、前記ｓｉＲＮＡが、ＴＧＦβ１のｓｉＲＮＡであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、肝線維症の病変部位へのターゲティングを可能にし、肝線維症のイメージング、診断、治療に有用な糖鎖含有ポリマー、および、該ポリマーを治療等に有用なアニオン性物質のキャリアーとする糖鎖含有ポリマー複合体を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】（Ａ）実施例で用いたPEI-D-GlcNAc-ICGの構造を表す化学式である。（Ｂ）実施例で合成したポリマーのFT-IRスペクトル図である。（Ｃ）PEI-DおよびPEI-D-GlcNAcの1H-NMRスペクトルである。１．９ｐｐｍがGlcNAcのCOCH3で、２．２−３．０ｐｐｍがPEIのNHCH2CH2である。（Ｄ）PEI-D-GlcNAcとPEI-D-GlcNAc-ICGのＵＶスペクトル図である。
【図２】（Ａ）PEI-D-GlcNAc-ICGとsiRNAを用いた複合体（nanocomplex）の形成を表す模式図である。（Ｂ）DTT存在下（右）および非存在下（左）での、複合体のアガロース電気泳動によるゲルシフトアッセイの結果を示す写真である。
【図３】（Ａ）TEMによるPEI-D-GlcNAc-siRNAの形態とサイズを観察した写真である。（Ｂ）DLS計算により得られた各複合体(PEI-D-GlcNAc-siRNAおよびPEI-D-GlcNAc-ICG-siRNA)のサイズとサイズ分布を示すグラフである。（Ｃ）DTT添加による複合体のサイズ変化を示すグラフである。（Ｄ）DTT添加による蛍光強度の変化を示すグラフである。
【図４】HSCsに対する合成したポリマーの細胞毒性の有無を確認するために、細胞生存率をMTTアッセイにより調べた結果を示すグラフである。データは平均±標準偏差（n=3）として示す。
【図５】細胞によるFITC結合siRNA／ポリマー複合体の取り込みを確認するために、共焦点顕微鏡により細胞を蛍光観察した写真である。（Ａ）複合体と細胞内デスミンの相互作用を示す共焦点顕微鏡の蛍光観察写真である。（Ｂ）複合体とHSCs細胞表面のデスミンとの相互作用を示す共焦点顕微鏡の蛍光観察写真である。なお、蛍光観察写真（Ａ）および（Ｂ）中の赤色はデスミン、緑色はFITC結合SiRNA、青色はDAPIである。（Ｃ）（左）複合体によるsiTGFβ1のトランスフェクション後のα−SMAおよびTGFβ1のウェスタンブロット法による分析結果を示す写真である（スケールバー：５０μｍ）。（右）β−アクチンバンドに対するα−SMAおよびTGFβ1それぞれの相対的強度のデンシメータ分析の結果を示すグラフである（p<0.05）。
【図６】ICG蛍光のInvivoイメージングの結果を示す写真である。（Ａ）PEI-D-GlcNAc-ICGを投与した後の、肝線維症マウス（Fibrosis）と健常マウス(Normal)の光学イメージ写真である。（Ｂ）PEI-D-ICGおよびPEI-D-GlcNAc-ICG注射後の肝線維症マウスのイメージ写真である。（Ｃ）臓器（肝臓、膵臓および腎臓）のEx vivo 蛍光イメージ写真である。左がPEI-D-GlcNAc-ICG投与６日後、右がICG単独投与６日後である。
【図７】（Ａ）PEI-D-GlcNAc-ICG、PEI-D-ICGまたはPEI-D-HA-ICG投与後の共焦点顕微鏡を用いた肝臓低温切片の免疫組織化学分析の結果を示す写真である。写真中の緑色はデスミン、赤色はICG、青色はDAPIである。（Ｂ）デスミン陽性細胞のICG導入細胞に対する割合を示すグラフである。平均±標準偏差。各サンプルについて独立に１０箇所観察したものである。
【図８】（Ａ）（左）複合体を用いてsiTGFβ1を投与した後の肝組織中のα−SMAおよびTGFβ1のウェスタンブロット法の結果を示す写真である。（右）β−アクチンバンドに対するα−SMAおよびTGFβ1それぞれの相対的バンド強度のデンシメータ分析の結果を示すグラフである。（Ｂ）PEI-D-GlcNAcを用いたsiTGFβ1投与後の肝臓切片のH&E染色写真である(p<0.05)。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の糖鎖含有ポリマーは、アミンを含むカチオン性のポリマーであって、Ｎ−アセチルグルコサミンが結合したことを特徴とするものである。アミンは、１級、２級、３級のいずれでもよく、１〜３級の全てのアミンを含んでいるものでもよい。カチオン性であることにより、アニオン性の有用な物質、高分子と静電相互作用し、複合体を形成することができる。
Ｎ−アセチルグルコサミンは、好ましくは共有結合によりポリマーに結合する。Ｎ−アセチルグルコサミンの結合の方法は特に限定されない。例えば、ポリマーの側鎖のアミンと、Ｎ−アセチルグルコサミンを末端に有する糖鎖とを反応させて結合を形成する、といったものが挙げられる。下記式で表される構造により、ポリマー側鎖の末端にＮ−アセチルグルコサミンを有することが好ましい。
2015105230.tif 000003
【００２４】
本発明の糖鎖含有ポリマーの主鎖は、好ましくはポリエチレンイミンである。ポリエチレンイミンは、エチレンイミンを重合してなるカチオン性をもつ水溶性ポリマーである。分子式[-(CH2CH2NH-]nで表される構造を有し、直鎖状のものや分岐鎖状のものがある。好ましくは直鎖状のポリエチレンイミンである。
【００２５】
本発明の糖鎖含有ポリマーは、ジスルフィド結合を有することが好ましく、ジスルフィド結合を介して、複数のポリマーが結合している構造を有することが好ましい。ジスルフィド結合は、還元されると切断される。そして、ジスルフィド結合は、高濃度のグルタチオンを保持する細胞内環境において容易に還元される。そこで、糖鎖含有ポリマー内、好ましくは主鎖内に、ジスルフィド結合が存在すると、糖鎖含有ポリマーが、細胞外空間においては、優れた安定性を示し、細胞内では還元により分解するため、有用物質と複合体を形成している場合に、細胞内において効率的に有用物質を放出することができる。
【００２６】
本発明の糖鎖含有ポリマーは、蛍光色素が結合していることが好ましい。蛍光色素を含むことで、特定の細胞を蛍光により検出、観察することが可能となる。蛍光色素としては、生体内で用いることができるものであれば特に限定されない。例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）などのフルオレセイン誘導体、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（株式会社同人化学研究所）、インドシアニングリーン、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰなどの蛍光タンパク質、サイバーグリーンなどが挙げられる。好ましくはインドシアニングリーンである。
【００２７】
本発明の糖鎖含有ポリマーの分子量は、好ましくは３０００以上である。
【００２８】
本発明の糖鎖含有ポリマー複合体は、上記の糖鎖含有ポリマーと、アニオン性物質から構成されることを特徴とするものである。本発明の糖鎖含有ポリマーは、カチオン性であり、アニオン性物質と静電相互作用により複合体を形成することが可能である。例えば、図２（Ａ）、図３（Ａ）に示すように、アニオン性のsiRNAを取り込んで、ナノ粒子状の糖鎖含有ポリマー複合体を形成することができる。アニオン性物質は、静電相互作用により本発明の糖鎖含有ポリマーと相互作用し、複合体を形成しうるものであることが好ましく、病変の治療や、イメージングに有用な物質であることが好ましい。糖鎖含有ポリマー複合体がジスルフィド結合を有する場合、細胞内で複合体が還元により分解し、含まれていたアニオン性物質が細胞内に放出される。また、本発明の糖鎖含有ポリマーは、活性化した肝星細胞（HSCs）に多く発現する、デスミンやビメンチンと相互作用するＮ−アセチルグルコサミンを含むことから、活性化星細胞に特異的にターゲティングすることができる。このように、本発明の糖鎖含有ポリマーおよびその複合体は、肝蔵、特に、肝線維症の肝星細胞へのドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）として有用である。
【００２９】
アニオン性物質としては、核酸が好ましく、ＲＮＡがより好ましく、ｓｉＲＮＡ、特にＴＧＦβ１のＳｉＲＮＡが好ましい。ｓｉＲＮＡを特定の細胞内へと届けることは一般的に困難であるが、本発明の糖鎖含有ポリマー複合体であれば、効率的に肝星細胞（HSCs）内へとｓｉＲＮＡを輸送することができる。
【００３０】
本発明の糖鎖含有ポリマー複合体の大きさとして、好ましくは直径５〜２００ｎｍ程度である。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明する。本発明は以下の実施例によって制限されるものではない。
【００３２】
（材料および方法）
（材料）
ポリエチレンイミン(PEI)(0.8KDa)をシグマアルドリッチ社から購入した。Ｎ，Ｎ’−シスタミンビスアクリルアミド(CBA)をPolyscience社から購入した。キトビオースをMegazyme社から購入した。３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)、水溶性カルボジイミド、［１−エチル−３，３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド(EDC)］、および、１，４−ジチオスレイトール(DTT)をシグマアルドリッチ社から購入した。モノクローナルマウス抗TGFβ1抗体をR&D system社から購入した。モノクローナルマウス抗βアクチン抗体、モノクローナルマウス抗デスミン抗体、および、モノクローナルマウス抗α-smooth muscleアクチン抗体をシグマアルドリッチ社から購入した。Horseradish ペルオキシダーゼ(HRP)結合マウス第２抗体をAbcam社から購入した。２−［７−［１，３−ジヒドロ−１，１−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−２Ｈ−ベンゾ［e］インドール−２−イルジエン］−１，３，５−ヘプタトリエニル］−１，１−ジメチル−３−［５−（３−スルホスクシニミジル）オキシカルボニルペンチル］−１Ｈ−ベンゾ［e］インドリウム(ICG-Osu)をDojindo Molecular Technologies社から購入した。星細胞培地をSciencell Research Laboratories社から購入した。
【００３３】
（ジスルフィド結合、GlcNacおよびICGの PEIへの固定化(PEI-D-GlcNAc-ICG)）
ジスルフィド結合付加ポリエチレンイミン(PEI-D)を、CBAを用いたマイケル付加により得た。０．８ＫＤａのPEI（１０％水性メタノール）およびCBA（CBAの反応基とPEIのアミノ基とのモル比１：２）を５５℃、窒素雰囲気下で２４時間混合した。未反応のCBAを過剰のPEIにより消失させた。生成物の精製を、透析膜(MWCO3500)を用いて行った。GlcNAcのPEI-Dへの固定化(PEI-D-GlcNAc)は、公知のEDCカップリング法により行った（Kim SJ., et al., Biomaterials 2011; 32: 3471-80）。
ICGをPEI-D-GlcNAcへ結合させるために(PEI-D-GlcNAc-ICG)、ICG-Osuをジメチルスルホキシドに溶解させた（１ｍｇ／ｍｌ）。等量のポリマー（２ｍｇ／ｍｌ in PBS）とICG-Osuを室温で２時間混合した。未反応のICG-Osuを１５０００ｒｐｍの遠心分離により除去した。ジスルフィド結合とGlcNAcとの固定化は、FT-IR(Bruker Optics IF66、Billerica社製)および1H-NMR（DU-800、Beckman Coulter社製）により確認した。
【００３４】
（複合体の調製およびキャラクタリゼーション）
様々な割合のsiRNAとPEI-D-GlcNacを混合し、複合体を形成した。ジスルフィド結合の存在を確認するため、５０ｎＭ  DTTを複合体溶液に混合し、１０分間室温で保持した。複合体の形成は、ゲルシフトアッセイにより確認した。複合体のサンプルをTris塩基、酢酸およびエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)(TAE)溶液中、０．１％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲル１００Ｖで１５分間電気泳動した。サイズとゼータ電位を測定するため、ポリマー（PEI-D-GlcNAc, PEI-D-GlcNAc-ICG）とsiRNA（２０倍量）を、蒸留水中で混合し、室温で２０分間放置した。複合体のサイズとゼータ電位を動的光散乱法(DLS)により測定した。DTT点火後の複合体中のICGの蛍光強度をマイクロプレートリーダー(SpectraMax M2、MolecularDevices社製)により、８０５ｎｍおよび８２０ｎｍでそれぞれ測定した。
【００３５】
（細胞毒性）
約1×104個（細胞／ウェル）のラット肝星細胞（Sciencell Research Labratories社）を、１０％FBSとペニシリン、ストレプトマイシンを含有する星細胞培地が入った９６ウェルの細胞培養プレート上で２４時間培養した。細胞生存率を算定するためにMTTアッセイを行った。様々の濃度のポリマーを細胞とともに２４時間インキュベートした。細胞培養培地を交換し、１０μｌのMTT（５ｍｇ／ｍｌ in PBS）溶液を加え、４時間培養した。その後、細胞を洗浄し、形成されたホルマザン色素を１００μｌのジメチルスルホキシドに１５分間溶解した。５７０ｎｍにおける吸収をマイクロプレートリーダーによって測定した。
【００３６】
（複合体の細胞による取り込みとデスミンを介した結合）
複合体の細胞による取り込みとデスミンを介した結合を共焦点顕微鏡により観察した。密度が1×104（細胞／ウェル）のラットのHSCsを、８ウェルチャンバー付きスライドにて２４時間培養した。FITC結合siRNAと合成ポリマー（PEI-D、PEI-D-GlcNAc）を星細胞培地中で室温下３０分インキュベートした。その後、複合体を細胞とともに４時間インキュベートし、細胞をPBSで３回洗浄した。細胞を４％パラホルムアミドで１０分間固定した。細胞内のデスミンを染色するために、細胞を０．１％  TritonX-100で透過処理した。これらの細胞を１％ウシ血清アルブミン(BSA)にて３０分間ブロッキング処理し、ラビットポリクローナルデスミン抗体（シグマアルドリッチ社製）とともに２時間インキュベートし、その後、Cy3結合ヤギ抗マウスIgG抗体（Jackson Immune Research Laboratory社）を２次抗体として２時間室温でインキュベートした。細胞核は４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール(DAPI)溶液で染色した。
【００３７】
（肝線維症マウスの誘導）
四塩化炭素(CCl4)を、マウスにおいて肝線維症を誘導するために用いた。CCl4をオリーブオイルに溶解し（１：５）、１μｌ／μｇのCCl4溶液を５〜６週の雌マウス（Balbc/nu）に、１週間に１回計５週間に渡り腹腔内注射した。全ての動物実験は、Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology (KRIBB)に承認されている。
【００３８】
（肝線維症のイメージングおよび治療）
肝線維症の診断および治療のために、PEI-D-GlcNAc-ICG/TGFβ1 siRNA複合体をマウスに静脈注射し（２００μｌ）、最初の注射から３日後、PEI-D-GlcNAc /TGFβ1 siRNA複合体をマウスに静脈注射した。複合体およびICGを注射されたマウスを、１日後、２日後に、IVIS Luminaイメージングシステム(Xenogen社)にて、ICGフィルターセットを用いて観察した。PEI-D-GlcNAc-ICG/TGFβ1 siRNA複合体の治療効果を、最初のトランスフェクションから７日後に、ウェスタンブロット、Ｈ&Ｅ染色を行い確認した。Ex vivoイメージングを行うために、複合体の注射から６日後に、マウスを解剖し、肝臓、膵臓および腎臓を、上記イメージングシステムによって観察した。
【００３９】
（ウェスタンブロット法）
細胞および組織由来のタンパク質をウェスタンブロット法によって分析した。細胞および組織をRIPAバッファー(GeneDept社)により破砕し、１３０００ｒｐｍにて３０分間、４℃で遠心分離した。タンパク質濃度の定量をブラッドフォード法キット(GeneDepot社)によって行った。等量のタンパク質を、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンをBlocking one（ナカライテスク社）によって１時間ブロッキングし、１次抗体、モノクローナルマウス抗α−SMA抗体（１：２０００希釈）又は抗βアクチン抗体（１：５０００希釈）で２時間インキュベートした。メンブレンをTBSTバッファーで洗浄し、ＨＲＰ結合マウス２次抗体で２時間室温でインキュベートした。タンパク質のバンドをLAS3000（富士フィルム社）で検出した。バンド強度をImage Jソフトウェアで分析した。
【００４０】
（組織化学的および免疫蛍光染色分析）
肝臓をホルマリンで固定し、パラフィンに埋没してサンプルを作製した。ヘマトキシリン染色およびエオシン染色（H&E染色）を、標準的な方法に従って行った。サンプルを光学顕微鏡にて観察した。免疫蛍光染色を、低温切片標本を用いて行った。切片は、１％BSAで１時間ブロッキングし、ポリクローナルラビットデスミン抗体(abcam社)で２時間インキュベートし、ラビットFITC結合２次抗体で２時間室温で反応させた。切片を共焦点顕微鏡で観察した。
【００４１】
（統計学上の分析）
複数回の独立した実験を行い、データは、平均値および標準偏差にて表示した。またスチューデントtテストによって検定を行った。
【００４２】
（結果および考察）
（PEI-D-GlcNAc-ICGの調製）
肝線維症の効率的なターゲティングとイメージングのために、Ｎ−アセチルグルコサミンとインドシアニングリーンをキャリアーに固定化した（図１Ａ参照）。
シスタミンビスアクリルアミド(CBA)を用いたマイケル付加反応によりジスルフィド結合をポリエチレンイミン(PEI)に結合し、PEI-Dを合成した。フーリエ変換赤外分光分析(FR-IR)により、PEI-D中のCBAのカルボニル基が１７１０ｃｍ−１に現れた（図１Ｂ）。この結果は、ジスルフィド結合がPEIに結合したことを示すものである。GlcNAcのPEIへの結合は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(EDC)カップリング法によって行った。GlcNAcのヒドロキシル基を、カルボキシル基で置換し、PEIのアミノ基と反応させた。GlcNAcの固定化は1H-NMRによって確認した（図１Ｃ参照）。GlcNAcのPEI-Dへの固定化後のアセチル基に該当するピークが、１．９ｐｐｍに現れた。NMRのスペクトラム中のプロトンピークの積分によると、GLcNAcのPEI中の１級アミンに対するｍｏｌ％は、３．５ｍｏｌ％であった。ICGの結合は紫外光−可視光（UV-Vis）分光により分析した（図１Ｄ参照）。ICG-OsuおよびPEI-D-GlcNAcは、共有結合によって結合した。一般的に、ICGの吸収ピークは７８０ｎｍにおいて見られた。しかし、ポリマー中のICGの吸収ピークは８０５ｎｍであった。いくつかの研究では、ICGの吸収ピークは、キャリアーへの結合によって赤方偏位することが報告されており、本稿では、ICG-OsuのPEIへの結合によって吸収ピークがシフトしたと考えられる。
【００４３】
（複合体のキャラクタリゼーションおよびDITの作用）
カチオンポリマーと負に帯電したsiRNAは、静電相互作用により容易に凝集した（図２Ａ参照）。ポリマーとsiRNAとの複合体の形成はゲルシフトアッセイによって確認した（図２Ｂ参照）。PEI-D-GlcNAcは、重量比１以上で、完全にsiRNAとともに凝集した。５０ｍＭDTTによる処理により、複合体は、重量比１０以上で形成され、siRNAが還元剤存在下ジスルフィド結合の破壊により放出されることが示された。複合体(PEI-D-GlcNAc-siRNA)の形態およびサイズをTEMにより観察した（図３Ａ参照）。複合体の形態は、均一なナノ粒子状であり、サイズはおよそ５０ｎｍであった。複合体のサイズとゼータ電位をDLSによって調べた（図３Ｂ参照）。重量比２０で、複合体のサイズは、９７．６±２１．９ｎｍであり、ゼータ電位は、２８．８６±４．１３ｍＶであった。DLSにより決定されたサイズは、TEM分析によるものよりも大きかった。これは、DLSによるサイズが、流体力学的径であるのに対して、TEMによるサイズがコア単独の径によるためである。ICGおよびsiRNAの結合後、複合体(PEI-D-GlcNAc-ICG-siRNA)のサイズは、１４８±３５ｎｍまで増大した。図３Ｃに示すように、複合体のサイズはDTTの添加によっても増大した。複合体中のICGの蛍光強度を、８０５ｎｍおよび８２０ｎｍのそれぞれの波長での励起、放射を用いて、マイクロプレートリーダーにより得た（図３Ｄ参照）。蛍光強度は、DTTの濃度上昇に伴い増加した。５００ｍＭ DTT中の複合体の蛍光強度は、DTT非存在下での蛍光強度に対しておよそ２倍であった。これらの結果もまた、還元剤処理によってジスルフィド結合が破壊され、ICGおよびsiRNAが放出されることを示している。効率的な遺伝子の輸送のために、ポリマーはpDNAやsiRNAなどの遺伝子とともに細胞外において完全に凝縮し、細胞内に一旦入れば容易に分解する必要がある。合成した複合体は効率的にsiRNAを運搬し、細胞内の還元条件下で強い蛍光を発することができた。
【００４４】
（細胞毒性）
HSCsに対する複合体の細胞毒性をMTTアッセイによって調べた。様々な濃度のポリマーを、１０％FBS培地にて、HSCsとともに２４時間インキュベートした。以前、GlcNAcの２５ＫＤａのPEI(PEI 25k)への結合が細胞毒性を軽減することを報告している。しかしながら、PEI-25k-GlcNAcは、高濃度の場合に細胞毒性を示した。ジスルフィド結合およびGlcNAc結合PEIは、PEI 25kよりも細胞毒性が低かった（図４参照）。PEI-D-GlcNAcは高濃度処理であっても高い細胞生存率を示した。PEI-25kは、負に帯電した遺伝子との結合に寄与する一級アミンを多数有し、遺伝子輸送の効率的なキャリアーとして知られている。しかしながら、そのカチオン性と高分子量により、高い細胞毒性を示す。低分子量PEIへのジスルフィド結合の結合は、還元条件下でのジスルフィド結合の分解により細胞毒性を軽減する。これらの結果は、PEI-D-GlcNAcがHSCsのための安全な遺伝子キャリアーであることを確認するものである。
【００４５】
（細胞による取り込みおよびウェスタンブロット法）
FITC結合siRNA（FITC-siRNA）を、複合体の細胞による取り込みの観察のために用いた。FITC-siRNAとポリマーの重量比２０以上の複合体をHSCsとともに、１０％ウシ胎児血清(FBS)含有培地中で４時間インキュベートした。図５Ａに示すように、PEI-D-GlcNAcを用いたsiRNAのトランスフェクションによって、PEI-D単独を用いた場合より効率的な細胞への遺伝子導入がなされた。ビメンチンおよびデスミンを強く発現する活性化HSCsがカチオン性ポリマーとsiRNAの複合体(polyplex)中のGlcNAc部分と相互作用したものと考えられる。実際に、PEI-D-GlcNAc/FITC-siRNA複合体が、細胞のデスミン陽性領域に存在した。しかしながら、PEI-D/FITC-siRNA複合体はデスミンと相互作用せず、PEIのカチオン性によって細胞と相互作用するのみであった。特に、複合体のGlcNAc部分が、HSCsの表面に露出したデスミンと結合した（図５Ｂ参照）。他のグループが、ヒアルロン酸(HA)結合遺伝子キャリアーがHSCsへ効率良くターゲテイングされることを報告している（Kim KS., et al., ACS Nano 2010; 4: 3005-14、Park K., et al., Biomaterials 2011; 32: 4951-8）。今回の結果は、PEI-D-HAもまた、HSCsによって多く取り込まれることを示した。しかし、PEI-D-HA/FITC-siRNA複合体は、細胞のデスミン陽性領域だけでなく、デスミン陰性領域にも結合した。HAはCD44やヒアルロナン受容体−１と特異的に結合する。従って、HAはHSCsだけでなく、類洞内皮細胞などの他の肝臓細胞へもターゲティングされたことが考えられる。肝線維症は活性化HSCsと関連するものであり、活性化HSCsのみへターゲティングされた遺伝子輸送であれば、副作用も少ないと考えられる。GlcNAc固定化キャリアーは、ビメンチンのみを発現する他の非実質細胞と比較して、ビメンチンおよびデスミンを過剰発現したHSCsへとより特異的にターゲティングすることができる。
siRNA治療の影響を調べるために、トランスフォーミング増殖因子−１（TGFβ1）siRNAをFBSを含まない培地中のHSCsへと４時間トランスフェクションし、タンパク質ノックダウンを、トランスフェクションから４８時間後にウェスタンブロット法により測定した。PEI-D-GlcNAc/TGFβ1siRNA複合体を用いた場合、培地中のTGFβ1タンパク質レベルは、コントロールや、PEI-D /TGFβ1siRNAを用いた場合と比較して減少した。肝臓が損傷すると、肝類洞内皮細胞およびクッパ−細胞がサイトカインを分泌し、HSCsが活性化して形質を変化して筋繊維芽細胞様の細胞となり、α−SMA陽性となる。コラーゲンといったECMの構成要素も産生され、最後に、肝臓は繊維症となる。TGFβ1は、肝線維症において重要なサイトカインであり、TGFβ1のノックダウンは、α−SMAの減少をもたらす。そして、α−SMAタンパク質は、PEI-D/TGFβ1siRNA複合体よりも、PEI-D-GlcNAc/TGFβ1siRNA複合体を用いた場合に、より強く減少する（図５Ｃ参照）。これらの結果は、PEI-D /TGFβ1siRNA複合体が、効率的にHSCsへとターゲティングされ、細胞質への効率的なsiRNAの放出により治療効果を奏することを示している。
【００４６】
（ナノ複合体を用いた肝線維症のイメージング）
肝線維症を、ICG結合複合体を用いて観察した。マウスに対して、四塩化炭素を用いて線維症を誘導し、ヘマトキシリン、エオシン染色(H&E染色)による組織分析を通じて確認した。健常マウスおよび肝線維症マウスの尾静脈へのPEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体の注射の後、複合体は当初肝臓内に局在した。１日後、複合体の蛍光シグナルは、線維症マウスのみで観察され、健常マウスでは消失した（図６Ａ参照）。さらに、PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体は、２日後の肝線維症マウスにおいて、PEI-D-ICG/siRNA複合体よりも強く蛍光シグナルを発した（図６Ｂ参照）。Ex vivo実験において、健常マウスおよび肝線維症マウスを注射後６日後に解剖し、肝臓、膵臓および腎臓を単離した。図６Ｃに示されるように、PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体は、肝線維症の肝臓にのみ強く局在し、健常マウスの肝臓には蓄積していなかった。一方、ICG単独を注射した場合、健常マウス、肝線維症マウスの双方において蛍光シグナルは検出されなかった。ICGは病変の診断に一般的に用いられるが、蛍光シグナルが早期に消失してしまうことが病変状態のイメージングにおける長年の課題であった。PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体はは、肝線維症マウスにおいてのみ、ICG単独よりも長く保持された。従って、PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体の長期に渡る蛍光シグナルは、より安定な肝線維症の診断を可能にすると考えられる。肝線維症に深く関与するHSCsがPEI-D-GlcNAc-ICG/siRNA複合体と相互作用するかどうかを調べるために、免疫染色を行った。図７Ａが示すように、PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体はデスミン陽性のHSCsのほぼ全てと相互作用した。一方、PEI-D-ICG/siRNA複合体およびPEI-D-HA-ICG/siRNA複合体は、HSCsのみならず他の細胞とも共局在した。ICG蛍光細胞に対するデスミン陽性細胞の計量により、PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNAナノ複合体の注入後、全ICG陽性細胞のうち７９％がHSCsであったことが明らかとなった。これに対して、PEI-D-ICG/siRNA複合体およびPEI-D-HA-ICG/siRNA複合体の注入後では、それぞれ３０％、３２％のICG陽性細胞がHSCsであった（図７Ｂ参照）。これらの結果は、PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体が、肝繊維症に関連するHSCsとほぼ独占的に相互作用し、それによって肝臓の繊維領域に対してのみ選択的に輸送することが可能であると考えられる。ICGは１５分後の蛍光残存率による肝機能の測定に用いられてきた。PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体が、健常な肝臓と肝線維症の肝臓とで、注入後長時間を経た後でも蛍光残存率においてより大きな違いをもたらすことが期待される。従って、PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体を用いることで、より正確な肝線維症の分析が可能となる。
【００４７】
（複合体を用いた肝線維症の診断）
複合体を用いたTGFβ1siRNA治療の影響をウェスタンブロット法とH&E染色により調べた。図８Ａが示すように、TGFβ1およびα−SMAレベルが、全ての複合体の注入により減少した（PEI-D/TGFβ1siRNA、PEI-D-GlcNAc/TGFβ1 siRNA、および、PEI-D-HA/TGFβ1 siRNA）。特に、PEI-D-GlcNAc/TGFβ1 siRNAを注入した場合、他と比較して、α−SMAレベルが低かった。しかし、TGFβ1では同じような結果となった（図８Ｂ参照）。α-SMAは、肝臓でHSCsによってのみ発現する。一方、TGFβ1は全ての肝臓細胞から分泌される。GlcNAc固定化複合体は、HSCsのみに特異的にトランスフェクトされたと考えられた。それに対して、他の複合体は、HSCsと他の細胞の双方と相互作用したと考えられた。それによって、PEI-D-GlcNAc/TGFβ1 siRNAを用いた場合にα-SMAレベルが最も低くなり、TGFβ1は、全ての複合体で変わらない結果となったと考えられる。α-SMAレベルは、HSCsの活性化度合いを示唆するものである。PEI-D-GlcNAc-ICGを用いたTGFβ1siRNA処理の後、α-SMAは顕著に減少した。これは肝線維症の治療効果を示すものである。
H&E染色において、四塩化炭素誘導肝線維症マウスは、多くの炎症の兆候を示した。PEI-D-GlcNAc-ICG/TGFβ1 siRNAナノ複合体の注入後、肝組織は、小瘤の形成が見られない通常の組織と同様となった（図８Ｂ参照）。これらの結果は、PEI-D-GlcNAc-ICG/TGFβ1 siRNA複合体が、イメージングのみで無く、肝線維症の治療にも効果的であったことを示すものである。
【００４８】
上記のように、GlcNAc固定化生体還元性複合体が、肝線維症の効率的なイメージングと治療に有用であることが示された。PEIへのジスルフィド結合とGlcNAcの結合はその細胞毒性を軽減した。GlcNAc固定化ナノ複合体は、表面に露出したデスミンを介してHSCsと強く相互作用した。In vivoの試験において、PEI-D-GlcNAc-ICG/ siRNA複合体は、顕著にマウスの繊維症肝臓に蓄積した。さらに、肝臓組織の免疫染色により、複合体がHSCsと特異的に相互作用することが確認された。ウェスタンブロット法とH&E染色によって、α-SMAレベルと炎症レベルが、PEI-D-GlcNAc-ICGによるTGFβ1siRNAのトランスフェクション後に減少したことが確認された。従って、PEI-D-GlcNAc-ICG/TGFβ1 siRNA複合体は、安定で正確な肝線維症の診断および治療に有用であると考えられる。
【図１】
2015105230.tif 000004
【図２】
2015105230.tif 000005
【図３】
2015105230.tif 000006
【図４】
2015105230.tif 000007
【図５】
2015105230.tif 000008
【図６】
2015105230.tif 000009
【図７】
2015105230.tif 000010
【図８】
2015105230.tif 000011