(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物の感染症を治療、抑制又は軽減するための有効成分としてTLR9アゴニスト及びTLR2/6アゴニストを含む医薬組成物、及び該組成物を用いた治療方法。【解決手段】TLR9アゴニストが、ODN2395又はODN M362又はODN10101であるC型オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）であり、TLR2/6アゴニストがPAM2CSK4である該医薬組成物、噴霧化製剤である該組成物、及び該組成物を用いた治療方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物感染症を有するかまたは発症もしくは獲得する危険性がある個体へ、有効量のTLR9アゴニストおよびTLR2/6アゴニストを投与する工程を含む、微生物感染症を治療、抑制または軽減する方法。
【請求項２】
TLR2/6アゴニストがPAM2CSK4である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
TLR9アゴニストがC型オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
C型ODNがODN2395またはODN M362またはODN10101である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
被験体が病原性微生物へ曝露されている、請求項1記載の方法。
【請求項６】
微生物が、ウイルス、細菌、または真菌である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
ウイルスが、アデノウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス亜科、ニューモウイルス亜科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（Poxyiridae）、レトロウイルス科、トガウイルス科、パラインフルエンザ、インフルエンザ、H5N1、マールブルグ、エボラ、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、黄熱、ヒト呼吸器合胞体、ハンタウイルス、またはワクシニアウイルスである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
細菌が、炭疽菌（Bacillus anthracis）、ペスト菌（Yersinia pestis）、野兎病菌（Francisella tularensis）、緑膿菌（Pseudomonas aerugenosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureas）、スタフィロコッカス・ニューモニア（Staphylococcus pneumonia）、スタフィロコッカス・マルトフィリア（Staphlyococcus maltophilia）、バークホルデリア種（Burholderia spp.）またはモラクセラ種（Moraxella spp）である、請求項6記載の方法。
【請求項９】
真菌が、アスペルギルス属、カンジダ属、クリプトコッカス属、ヒストプラズマ属、コクシジオイデス属、ブラストミセス属、接合菌類（Zygometes）、またはニューモシスティス属である、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
TLR9アゴニストおよびTLR2/6アゴニストを噴霧化製剤で投与する、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
有効量のTLR9アゴニストおよびTLR2/6アゴニストを個体の肺内に沈着(deposit)させる、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
TLR9アゴニストおよびTLR2/6アゴニストを、約0.1 mg／個体体重のkg〜約100 mg／個体体重のkgの量で投与する、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
TLR9アゴニストおよびTLR2/6アゴニスト、抗炎症剤、ならびに1つまたは複数の薬学的賦形剤を含む薬学的に許容される組成物であって、無菌でありかつ病原性微生物を本質的に含まない、前記組成物。
【請求項１４】
組成物が、噴霧療法用に処方されている、請求項13記載の組成物。
【請求項１５】
TLR2/6アゴニストがPAM2CSK4である、請求項13記載の組成物。
【請求項１６】
TLR9アゴニストがC型オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）である、請求項13記載の組成物。
【請求項１７】
C型ODNがODN2395またはODN M362またはODN10101である、請求項13記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2009年3月25日に出願された米国仮特許出願第61/163,137号、および2009年5月18日に出願された米国仮特許出願第61/179,246号の優先権を主張し、これらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
I．本発明の分野
本発明は、一般的に、微生物学、免疫学および抗微生物薬物療法の分野に関する。より詳細には、本発明の組成物および方法は、小分子組成物を使用しての微生物感染症または侵入の治療または軽減のための個体の肺内の先天性免疫の調節に関する。
【背景技術】
【０００３】
II．背景
感染症に対する肺の感受性は、ガス交換の構造的要件から生じる。換気を支援するために、ヒトは、100 m2の肺表面積を外部環境へ絶えず曝している。肺は、空気だけでなく、その中に浮遊されている粒子、飛沫、および病原体へも曝される。不浸透性の皮膚に覆われている皮膚表面または粘液の厚い吸着性のブランケットを有する胃腸管とは異なり、肺は、最小限のバリア防御を有する大きな環境界面を示す。より実質的なバリアは、スムーズなガス拡散の要求によって排除される。
【０００４】
それらの構造的な脆弱性にもかかわらず、肺は、一般的に、様々な機械的、体液性、および細胞性機構によって感染症からそれら自体を防御することに成功している（Knowles et al., 2002；Martin and Frevert, 2005；Rogan, et al., 2006；Travis, et al., 2001）；（Mizgerd, 2008；Bals and Hiemstra, 2004；Bartlett et al., 2008；Hiemstra, 2007；Hippenstiel et al., 2006；Schutte and McCray, 2002）。大抵の吸入された微生物病原体は、気道壁への固着に起因して肺胞に浸透せず、ここで、それらは粘液によって捕えられ、次いで粘膜線毛のエスカレーターシステムによって吐き出される（Knowles et al., 2002）。この運命を回避する病原体については、気道内流体中の抗微生物性ペプチドの構成的存在が、それらの増殖を制限する（Rogan, et al., 2006；Travis, et al., 2001）。大抵の末端気腔に存在する肺胞マクロファージは、これらの生物を摂取し、それによって肺から潜在的な感染を取り除くことができる。
【０００５】
受動的ガス交換バリアとして見なされることが多いが、気道および肺胞上皮は、病原性刺激に遭遇した場合に著しい局所的構造および機能変化を受けることによって、基準の肺防御を補う。ウイルス性、真菌性、またはアレルギー性炎症に応答して、気道分泌細胞は、急速にそれらの高さを増加させ、それらの先端の細胞質を分泌顆粒で満たし、これは炎症性化生と呼ばれるプロセスである（Evans et al., 2004；Williams et al., 2006）。病原体の存在下で、肺胞上皮は、それらの原形質膜システムおよび分泌機構を活性化させ、それによって肺保護に白血球を従事させる（Evans et al., 2005）。恐らく最も重要なことには、呼吸器上皮パターン認識受容体との微生物相互作用は、デフェンシン、カテリシジン、リゾチーム、および活性酸素を含む、多数の殺菌性産物を気道内流体中へ発現させる。（Rogan et al., 2006；Forteza et al., 2005；Akinbi et al., 2000；Bals and Hiemstra, 2004；Bals and Hiemstra, 2006）。肺炎（細菌性またはウイルス性）は、世界における感染症による主要な死亡原因であることが注意される。
【０００６】
微生物感染症を抑制および／または治療するためのさらなる方法および組成物についての必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、先天的抵抗性を刺激する（刺激性先天的抵抗性（Stimulated Innate Resistance）（StIR））組成物、およびStIRを刺激するためのこのような組成物の使用方法を提供する。ある態様において、StIRは肺StIRである。本発明の一局面は、より高い治療／毒性比率または指数を提供する。本発明の態様は、哺乳類の、例えばヒトの、被験体の感染症に対する生体防御、例えば被験体の感染症に対する免疫、の増強のための組成物、製剤、および方法を含む。ある局面において、本発明の組成物は、個体の肺内に有効量で投与される。本発明の局面は、微生物感染症に対する生体防御の迅速かつ一時的な増強または増大を提供する。被験体の免疫の増強は、微生物感染症を軽減する。軽減は、感染症または微生物増殖もしくは生存を抑制、治療、または予防することによってであり得る。本発明の局面は、被験体の肺および気道の防御を増強する。
【０００８】
ある局面において、1つまたは複数の先天的受容体についての1つまたは複数のリガンドを含む有効量のStIR組成物を投与する工程を含む、このような感染症を有するかまたは発症する危険性がある個体における微生物感染症を治療、抑制、または軽減する方法が意図される。Toll様受容体（TLR）、C型レクチン受容体（CLR）、およびヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン様受容体（Nod様受容体またはNLR）を含むが、これらに限定されない、多数の先天的受容体が同定された。TLRは、先天性免疫系において重要な役割を果たすあるクラスのタンパク質である。それらは、微生物由来の構造的に保存された分子を認識する1回膜貫通型非触媒性受容体である。いったんこれらの微生物が皮膚もしくは腸管、肺、および尿生殖器粘膜（genitorurinary mucosa）上または内に存在するようになると、それらはTLRによって認識され、免疫細胞応答が活性化される。興味深いことには、これらのTLRアゴニストの多くは、単独で投与される場合、顕著なStIRを誘導しない。典型的に、本明細書に記載される方法を使用して治療される個体または被験体は、病原性微生物へ曝露されたか、またはこのような曝露の危険性がある。
【０００９】
ある態様は、1、2、3、4、またはそれ以上のTLRアゴニストを含む気道へ投与され得る組成物、ならびにこのような組成物を使用する方法に関する。TLRアゴニストは、TLR2/1、TLR2/6、TLR3、TLR4、TLR5、TLR9、またはTLR7アゴニストより選択される。ある局面において、TLRアゴニストは、TLR9およびTLR2/6アゴニストより選択される。さらなる局面において、TLRアゴニストは、TLR5アゴニストより選択される。なおさらなる局面において、TLR5アゴニストは、TLR2/6、TLR4、TLR9、またはTLR7アゴニストと組み合わせて使用され得る。ある局面において、TLR9アゴニストは、TLR2/6、TLR4、TLR5、またはTLR7と組み合わせて使用され得る。別の局面において、TLR2/6アゴニストは、TLR4、TLR5、TLR9、またはTLR7アゴニストと組み合わせて使用され得る。ある局面において、TLR4アゴニストは、TLR2/6、TLR5、TLR9、またはTLR7アゴニストと組み合わせて使用され得る。さらなる局面において、TLR7アゴニストは、TLR2/6、TLR4、TLR5、またはTLR9アゴニストと組み合わせて使用され得る。なおさらなる局面において、これらの二重の組み合わせのいずれもが、TLR2/6、TLR4、TLR5、TLR9、またはTLR7アゴニストより選択される第3または第4または第5のTLRアゴニストを含み得る。
【００１０】
ある態様は、微生物感染症を有するかまたは発症もしくは獲得する危険性がある個体へ有効量のTLR9アゴニストおよびTLR2/6アゴニストを投与する工程を含む、微生物感染症を治療、抑制または軽減する方法に関する。ある局面において、TLR2/6アゴニストはPAM2CSK4である。さらなる局面において、TLR9アゴニストは、C型オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）である。C型ODNとしては、ODN2395またはODN M362またはODN10101または別のC型ODNまたはそれらのアナログが挙げられ得るが、これらに限定されない。ある局面において、被験体は、病原性微生物へ曝露されたか、または病原性微生物の曝露の危険性がある。微生物は、ウイルス、細菌、または真菌であり得る。
【００１１】
他の局面において、TLR9アゴニストおよびTLR2/6アゴニストは、噴霧化製剤で投与される。TLR9アゴニストおよび／またはTLR2/6アゴニストは、その間の全ての値及び範囲を含む、約0.1、1、5、10、50μg／個体体重のkgまたはmg／個体体重のkg〜約5、10、50、100μg／個体体重のkgまたはmg／個体体重のkgまでの量で投与され得る。
【００１２】
ある態様は、TLR9アゴニストおよびTLR2/6アゴニスト、抗炎症剤、ならびに1つまたは複数の薬学的賦形剤を含む薬学的に許容される組成物に関し、ここで、該組成物は、無菌でありかつ病原性微生物を本質的に含まない。ある局面において、TLR2/6アゴニストはPAM2CSK4である。さらなる局面において、TLR9アゴニストは、C型オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）である。C型ODNとしては、ODN2395またはODN M362またはODN10101が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００１３】
ある局面において、StIR組成物は、TLR5アゴニストとして公知である、ペプチド
2015199747.tif 000002
の10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22連続アミノ酸を含むフラジェリンポリペプチド、またはそのセグメントもしくは誘導体を含む。本発明のポリペプチドはまた、配列番号2と少なくとも70、80、または90％（その間の全ての値及び範囲を含む）同一であるアミノ酸配列を含み得る。他の局面において、フラジェリンは、合成されたおよび／または精製または単離されたフラジェリンポリペプチドまたはペプチドである。用語「精製された」または「単離された」は、成分が他のタンパク質または合成試薬または副生成物から以前に単離または精製されたこと、および成分が組成物に処方される前は少なくとも約95％純粋であることを意味する。ある態様において、精製または単離された成分は、約または少なくとも約80、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5％またはそれ以上純粋であり、またはそこにおいて誘導可能な任意の範囲だけ純粋である。次いで、このような精製された成分は、本明細書に記載される組成物を形成するために他の成分と混合され得る。
【００１４】
組換えフラジェリンタンパク質またはそのフラグメントもしくはセグメントは、配列番号2または他のフラジェリンポリペプチドの、その間の全ての値及び範囲を含む、5、10、15、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、または400連続アミノ酸を含む。これらのフラグメントまたはセグメントは、配列番号2または他のフラジェリンポリペプチド（falgellin polypetide）と少なくとも、多くとも、または約70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％同一である。ある局面において、フラジェリンポリペプチドまたはセグメントは、配列番号2の配列と少なくとも75％同一である。別の局面において、フラジェリンポリペプチドまたはセグメントは、配列番号2の配列と少なくとも80％同一である。別の局面において、フラジェリンポリペプチドまたはセグメントは、配列番号2の配列と少なくとも85％同一である。別の局面において、フラジェリンポリペプチドまたはセグメントは、配列番号2の配列と少なくとも90％同一である。別の局面において、フラジェリンポリペプチドまたはセグメントは、配列番号2の配列と少なくとも95％同一である。フラジェリンまたはそのセグメントの誘導体または変異体は、配列番号2の挿入、欠失および点突然変異を含む。特定の挿入突然変異は、カルボキシまたはアミノ末端で、フラジェリンに対して外因性のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質である。多数のフラジェリンタンパク質が当技術分野において公知であり、これらとしては、以下のアクセッション番号を有するフラジェリンが挙げられるがこれらに限定されない：
2015199747.tif 000003
これらの各々は、本出願の優先日の時点で、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００１５】
本発明の態様は、気道を介して投与され得る。本発明の方法は、吸入によるまたは上および／または下気道への他の投与方法による、組成物の投与を含む。ある局面において、投与は吸入による。ある局面において、StIR組成物は、噴霧化またはエアロゾル化製剤で投与される。さらなる局面において、組成物は、エアロゾル化または噴霧化されるか、または被験体によって吸入されるか被験体中に滴下され得る形態のものである。組成物は、吸入または吸息によって投与され得る。TLRアゴニストを個々にまたは全体として含む、StIR組成物は、約0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70μgまたはmg／個体体重のkgから約55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200μgまたはmg／個体体重のkgまでの量で投与され得る。他の局面において、被験体に、約0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200μgまたはmgのStIRがまたはTLRアゴニストが個々にまたは全てのTLRアゴニストが全体として、投与され得る。被験体は、吸入されたウイルス、細菌、または真菌への曝露の危険性があり得るかまたは暴露され得る。なおさらなる態様は、組成物が、生物への曝露または疑わしい曝露または曝露の高い危険性の、前；後；間；前および後；前および間；間および後；前、後および間に投与される、方法を含む。被験体は、生物兵器または日和見病原体へ曝され得る。特定の局面において、被験体は、免疫無防備状態であり、例えば、癌患者またはAIDS患者である。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、1つまたは複数のTLRアゴニスト；抗炎症剤；抗微生物剤；および／または1つまたは複数の薬学的賦形剤を含む、薬学的に許容される組成物に関する。典型的に、このような組成物は、無菌でありかつ病原性微生物を本質的に含まない。
【００１７】
ある局面において、治療または防護される病原性または潜在的病原性微生物は、ウイルス、細菌、および／または真菌である。ある局面において、微生物はウイルスである。ウイルスは、アデノウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス亜科、ニューモウイルス亜科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（Poxyiridae）、レトロウイルス科、またはトガウイルス科のウイルス；および／またはパラインフルエンザ、インフルエンザ、H5N1、マールブルグ、エボラ、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、黄熱ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ハンタウイルス、またはワクシニアウイルスに由来し得る。
【００１８】
なおさらなる局面において、治療または防護される病原性または潜在的病原性微生物は、細菌である。細菌は、細胞内、グラム陽性、またはグラム陰性細菌であり得る。さらなる局面において、細菌としては、スタフィロコッカス属、バシラス属、フランシセラ属、またはエルシニア属の細菌が挙げられるが、これらに限定されない。なおさらなる局面において、細菌は、炭疽菌（Bacillus anthracis）、ペスト菌（Yersinia pestis）、野兎病菌（Francisella tularensis）、緑膿菌（Pseudomonas aerugenosa）、または黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureas）である。ある態様において、細菌は、炭疽菌および／または黄色ブドウ球菌である。なおさらなる局面において、細菌は、薬剤耐性細菌、例えば、多剤耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）である。代表的な医学的に関連するグラム陰性桿菌としては、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Hemophilus influenzae）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸菌（Escherichia coli）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、サルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis）、およびサルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）が挙げられる。代表的なグラム陽性細菌としては、これらの形態から誘導される細菌を含む、細胞壁を欠いておりグラム染色され得ない、バシラス属、リステリア属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、アクチノバクテリアおよびクロストリジウム属  マイコプラズマ属が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
さらに別の局面において、治療されるまたは防護される病原性または潜在的病原性微生物は、真菌、例えば、以下の科のメンバーである：アスペルギルス、カンジダ、クリプトコッカス（Crytpococus）、ヒストプラズマ、コクシジオイデス、ブラストミセス、ニューモシスティス、または接合菌類（Zygomyces）。なおさらなる態様において、真菌としては、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、またはニューモシスティス・カリニ（Pneumocystis carinii）が挙げられるが、これらに限定されない。接合菌類の科は、バシジオボラレス（Basidiobolales）（バシジオボラセアエ（Basidiobolaceae））、ジマルガリタレス（Dimargaritales）（ジマルガリタセアエ（Dimargaritaceae））、アツギケカビ目（Endogonales）（アツギケカビ科（Endogonaceae））、エントモフソラレス（Entomophthorales）（アンシリスタセアエ（Ancylistaceae）、コンプレトリアセアエ（Completoriaceae）、エントモフソラセアエ（Entomophthoraceae）、メリスタクラセアエ（Meristacraceae）、ネオジギタセアエ（Neozygitaceae））、キックキセラレス（Kickxellales）（キックキセラセアエ（Kickxellaceae））、モルチエレラレス（Mortierellales）（モルチエレラセアエ（Mortierellaceae））、ムコール目（Mucorales）、およびトリモチカビ目（Zoopagales）を含む。アスペルギルス科は、アスペルギルス・カエシエルス（Aspergillus caesiellus）、A.キャンディダス（A. candidus）、A.カルネウス（A. carneus）、A.クラバツス（A. clavatus）、A.デフレクツス（A. deflectus）、A.フラブス（A.flavus）、A.フミガツス（A. fumigatus）、A.グラウクス（A. glaucus）、A.ニヅランス（A. nidulans）、A.ニゲル（A. niger）、A.オクラセウス（A. ochraceus）、A.オリガエ（A. oryzae）、A.パラシチクス（A. parasiticus）、A.ペニシロイデス（A. penicilloides）、A.レストリクツス（A. restrictus）、A.ソジャエ（A. sojae）、A.シドヴィ（A. sydowi）、A.タマリ（A. tamari）、A.テレウス（A. terreus）、A.ウスツス（A. ustus）、A.ベルシコロル（A. versicolor）などを含むが、これらに限定されない。カンジダ科は、カンジダ・アルビカンス、C.ダブリニエンシス（C. dubliniensis）、C.グラブラタ（C. glabrata）、C.グイリエルモンディイ（C. guilliermondii）、C.ケフィル（C. kefyr）、C.クルセイ（C. krusei）、C.ルシタニアエ（C. lusitaniae）、C.ミレリ（C. milleri）、C.オレオフィラ（C. oleophila）、C.パラプシロシス（C. parapsilosis）、C.トロピカリス（C. tropicalis）、C.ウチリス（C. utilis）などを含むが、これらに限定されない。
【００２０】
ある局面において、病原性細菌は、細胞内、グラム陽性、またはグラム陰性細菌である。ある態様において、細菌は、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、バシラス属、フランシセラ属、またはエルシニア属である。なおさらなる局面において、細菌は、炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pnemoniae）、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、および／またはバークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）である。
【００２１】
用語「軽減」、「抑制」、「減少」または「予防」、またはこれらの用語の変形物は、特許請求の範囲および／または本明細書において使用される場合、所望の結果、例えば、曝露後の微生物の負荷または増殖の減少を達成するための、任意の測定可能な低下または完全な抑制を含む。
【００２２】
単語「1つ（a）」または「1つ（an）」の使用は、特許請求の範囲および／または本明細書において用語「含む」と組み合わせて使用される場合、「1つ（one）」を意味し得るが、それはまた、「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」、および「1つまたは1つを超える」という意味と一致する。
【００２３】
本明細書において議論される態様は、本発明の方法または組成物に関して実施され得、その逆も同様であることが、意図される。さらに、本発明の組成物およびキットは、本発明の方法を達成するために使用され得る。
【００２４】
本出願の全体にわたって、用語「約」は、値が、値を測定するために用いられる装置または方法についての誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。
【００２５】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、開示は代替物のみおよび「および／または」を指す定義を支持するが、代替物のみを指すように明示的に示されないかまたは代替物が互いに排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用される。「および／または」、「または」、または「および」を含むあるリストにおいて、列挙されるメンバーのうちの1つまたは複数が、そのリストから具体的には排除され得る。
【００２６】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単語「含む（comprising）」（および「含む（comprising）」の任意の形態、例えば、「含む（comprise）」および「含む（comprises））、「有する（having）」（および「有する（having）」の任意の形態、例えば、「有する（have）」および「有する（has）」）、「包含する（including）」（および「包含する（including）」の任意の形態、例えば、「包含する（includes）」および「包含する（include）」）、または「含有する（containing）」（および「含有する（containing）」の任意の形態、例えば、「含有する（contains）」および「含有する（contain））は、内包的またはオープンエンドであり、追加の記載されていない要素または方法工程を排除しない。
【００２７】
本発明の他の目的、特徴および利点は、下記の詳細な説明から明らかとなる。しかし、詳細な説明および具体例は、本発明の具体的な態様を示す一方、例示のためにのみ提供されることが理解されるべきであり、何故ならば、本発明の精神および範囲内の様々な変更および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるためである。
【００２８】
[本発明1001]
微生物感染症を有するかまたは発症もしくは獲得する危険性がある個体へ、有効量のTLR9アゴニストおよびTLR2/6アゴニストを投与する工程を含む、微生物感染症を治療、抑制または軽減する方法。
[本発明1002]
TLR2/6アゴニストがPAM2CSK4である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
TLR9アゴニストがC型オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
C型ODNがODN2395またはODN M362またはODN10101である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
被験体が病原性微生物へ曝露されている、本発明1001の方法。
[本発明1006]
微生物が、ウイルス、細菌、または真菌である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
ウイルスが、アデノウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス亜科、ニューモウイルス亜科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（Poxyiridae）、レトロウイルス科、トガウイルス科、パラインフルエンザ、インフルエンザ、H5N1、マールブルグ、エボラ、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、黄熱、ヒト呼吸器合胞体、ハンタウイルス、またはワクシニアウイルスである、本発明1006の方法。
[本発明1008]
細菌が、炭疽菌（Bacillus anthracis）、ペスト菌（Yersinia pestis）、野兎病菌（Francisella tularensis）、緑膿菌（Pseudomonas aerugenosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureas）、スタフィロコッカス・ニューモニア（Staphylococcus pneumonia）、スタフィロコッカス・マルトフィリア（Staphlyococcus maltophilia）、バークホルデリア種（Burholderia spp.）またはモラクセラ種（Moraxella spp）である、本発明1006の方法。
[本発明1009]
真菌が、アスペルギルス属、カンジダ属、クリプトコッカス属、ヒストプラズマ属、コクシジオイデス属、ブラストミセス属、接合菌類（Zygometes）、またはニューモシスティス属である、本発明1006の方法。
[本発明1010]
TLR9アゴニストおよびTLR2/6アゴニストを噴霧化製剤で投与する、本発明1001の方法。
[本発明1011]
有効量のTLR9アゴニストおよびTLR2/6アゴニストを個体の肺内に沈着(deposit)させる、本発明1001の方法。
[本発明1012]
TLR9アゴニストおよびTLR2/6アゴニストを、約0.1 mg／個体体重のkg〜約100 mg／個体体重のkgの量で投与する、本発明1001の方法。
[本発明1013]
TLR9アゴニストおよびTLR2/6アゴニスト、抗炎症剤、ならびに1つまたは複数の薬学的賦形剤を含む薬学的に許容される組成物であって、無菌でありかつ病原性微生物を本質的に含まない、前記組成物。
[本発明1014]
組成物が、噴霧療法用に処方されている、本発明1013の組成物。
[本発明1015]
TLR2/6アゴニストがPAM2CSK4である、本発明1013の組成物。
[本発明1016]
TLR9アゴニストがC型オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）である、本発明1013の組成物。
[本発明1017]
C型ODNがODN2395またはODN M362またはODN10101である、本発明1013の組成物。
下記の図面は、本明細書の一部分を形成し、本発明のある局面をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書に示される具体的な態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つまたは複数を参照することによって、よりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】天然内毒素（TLR4アゴニスト）はいくらかのStIRを誘導する。NTHI溶解物（「NTHi sup」）、NTHi溶解物中にあると推定される濃度のLPS（「内毒素 1x」）、溶解物中にあると考えられる10倍のLPS（「内毒素 10x」）での処置または処置無しの24時間後に、野生型Swiss-Websterマウス（10／群）に肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）（5 x 1010 CFU/ml）をチャレンジした。
【図２】合成ヘキサアシル化（hexacylated）リピドA（TLR4アゴニスト）はStIRを誘導しない。緑膿菌（P. aeruginosa）でのチャレンジの24時間前に、野生型Swiss-Websterマウス（8／群）を合成リピドA懸濁液またはPBSで処置した。
【図３】緑膿菌でのチャレンジ感染の24時間前に高用量もしくは低用量イミキモド（TLR7アゴニスト）またはPBSで処置したSwiss-Websterマウス（8／群）の代表的な実験が示される。
【図４】TLR9刺激は単独で最小限の保護を誘導する。吸入された緑膿菌での感染の24時間前に、野生型Swiss-Websterマウス（8／群）をPBSまたはODN2395で処置した。
【図５】TLR2/6アゴニストでの高用量処置はStIRを誘導する。緑膿菌での感染の24時間前に、野生型Swiss-Websterマウスを高用量もしくは低用量Pam2CSK4またはPBSで処置した。
【図６】TLRアゴニストの組み合わせは、いずれか単独よりも大きなStIRを誘導する。野生型Swiss-Websterマウスを、ODN2395（20μg/ml、8マウス）、Pam2CSK4（20μg/ml、8マウス）、両方のアゴニスト（10マウス）、またはPBS（10マウス）で処置した。
【図７】フラジェリンの合成フラグメント（TLR5アゴニスト）はStIRを誘導する。緑膿菌の感染の24時間前に、フラジェリンの22アミノ酸の高度に保存されたセグメントまたはPBSのみを、野生型Swiss-Websterに対してエアロゾル化した。
【図８】体重に対するインフルエンザA/HK肺プール11-29-05エアロゾル感染の効果：1回の30分エアロゾル処置；インフルエンザウイルス用量：約100 TCID50／マウス。体重は、病気の重篤度を反映して、感染症が進行するにつれて最初は減少し、次いで回復の間に上昇する。
【図９】生存に対するインフルエンザA/HK肺プール11-29-05エアロゾル感染の効果：1回の30分エアロゾル処置；インフルエンザウイルス用量：約100 TCID50／マウス。
【図１０】インフルエンザA/HKエアロゾルに感染したマウスの生存に対する、ODN／PAM2／ポリICでの1回の30分エアロゾル前処置の効果を示す；ウイルス用量  約130 TCID50／マウス。
【図１１】体重に対するインフルエンザA/HK肺プール11-29-05エアロゾル感染の効果：1回の30分エアロゾル処置；インフルエンザウイルス用量：約100 TCID50／マウス。体重は、病気の重篤度を反映して、感染症が進行するにつれて最初は減少し、次いで回復の間に上昇する。
【図１２】TRIFではなく、MyD88シグナル伝達が、肺炎に対する細菌溶解物誘導抵抗性のために必要とされる。図12A．無莢膜型インフルエンザ菌（NTHi）のエアロゾル化溶解物での24時間前の前処置有りまたは無しで、Myd88-/-および野生型マウスに緑膿菌を吸入によってチャレンジした。左、生存（N＝10マウス／群、*p＜0.0001）。右、感染直後の細菌肺負荷量（右、N＝3マウス／群、**p＜0.004、野生型コントロールに対して†p＝0.39）。図12B．細菌溶解物での前処置有りまたは無しでの、Trif-/-マウスの緑膿菌チャレンジ。左、生存（N＝10マウス／群、*p＜0.0001）。右、感染直後の細菌肺負荷量（N＝3マウス／群、*p＜0.0001）。
【図１３】誘導病原体殺滅はインターロイキン-1受容体欠損マウスにおいて損なわれない。緑膿菌でのチャレンジの24時間前に、Il1r-/-および野生型マウスを、エアロゾル化PBSまたは無莢膜型インフルエンザ菌（NTHi）の溶解物で処置した。感染直後の肺ホモジネートの細菌負荷量が示される（N＝3マウス／群、野生型 + PBSに対して*p＝0.001、Il1r-/-に対して**p＝0.01、野生型 + PBSに対して†p＝0.66、野生型 + NTHiに対して‡p＝0.89）。
【図１４】単一の合成TLRリガンドでの処置後の気管支肺胞洗浄液中の白血球カウント。PBSまたは以下のTLRリガンドのうちの1つでの処置の24時間後に、マウスをBALへ提出した：Pam3CSK4（TLR2/1アゴニスト、1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml）、Pam2CSK4（TLR2/6アゴニスト、1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml）、ポリ(I:C)（TLR3アゴニスト、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml）、合成リピドA（MPLA、TLR4アゴニスト、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml）、Flg22（フラジェリンの合成22-mer、TLR5アゴニスト、10μg/ml、100μg/ml、1000μg/ml）、イミキモド（TLR7およびTLR8、100μg/ml、300μg/ml、1000μg/ml）、またはODN2395（TLR9アゴニスト、2μg/ml、20μg/ml）。BAL液中の好中球（黒色バー）およびマクロファージ（灰色バー）カウントが示される。
【図１５】個々の合成TLRリガンドでのエアロゾル化処置は、肺炎に対して高レベルの抵抗性を誘導しない。24時間前にPBSまたは以下の合成TLRリガンドで処置した（20分間にわたって8 ml噴霧化）後に、野生型マウスに緑膿菌をチャレンジした：図15 A．TLR2/1アゴニスト Pam3CSK4 100μg/ml、図15B．TLR2/6アゴニスト Pam2CSK4 10μg/ml、図15C．TLR3アゴニスト ポリ(I:C) 100μg/ml、図15D．TLR4アゴニスト MPLA 100μg/ml、図15E．TLR5アゴニスト Flg22 100μg/ml、図15F．TLR7およびTLR8アゴニスト イミキモド 1 mg/ml、または図15G．TLR9アゴニスト ODN2395 20μg/ml。生存曲線は、処置および未処置マウスについての少なくとも3回の異なる実験の代表例である（N＝8マウス／群、*p＝0.5、**p＝1.0、†p＝0.47、‡p＝0.2）。
【図１６】TLR2/6およびTLR9アゴニストは細菌性肺炎に対する抵抗性を誘導するように協力する。図16A．左：PBS、Pam2CSK4 10μg/ml、ODN2395 20μg/ml、組み合わせ、または2倍用量での組み合わせでの処置の24時間後に緑膿菌がチャレンジされたマウスの生存（N＝6マウス／群、PBSに対して‡p＝0.008）。右：緑膿菌の感染直後の肺ホモジネートの細菌負荷量（N＝3マウス／群、PBSに対して#p＝0.045、PBSに対して##p＝0.030）。図16B．左：PBS、Pam2CSK4 10μg/ml、ODN2395 20μg/ml、組み合わせ、または2倍用量での組み合わせでの処置の24時間後に肺炎連鎖球菌がチャレンジされたマウスの生存（N＝10マウス／群、PBS処置に対して‡p＜0.0001）。右：肺炎連鎖球菌感染2 x 1010直後の肺ホモジネートの細菌負荷量（N＝3マウス／群、†p＜0.001、‡p＜0.0001）。図16C．PBS、Pam2CSK4 10μg/ml、ODN2395 20μg/ml、またはPam2CSK4およびODN2395の組み合わせでの処置の4または24時間後のマウスからのBAL細胞カウント（N＝3マウス／群、PBSに対して*p＝0.016、PBSに対して**p＜0.0001、Pam2単独に対して†p＝0.041）。
【図１７】全てのTLRアゴニスト組み合わせが肺炎に対して顕著な保護を提供するわけではない。24時間前にPBSまたは以下のTLRアゴニスト組み合わせで処置した後に、野生型マウスに緑膿菌をチャレンジした：図17A．Pam2CSK4およびポリ(I:C)、図17B．Pam2CSK4およびFlg22、図17C．Pam2CSK4およびイミキモド、図17D．ODN2395およびポリ(I:C)、図17E．ODN2395およびFlg22、図17F．ODN2395およびPam3CSK4。生存曲線は、少なくとも3回の異なる実験の代表例である（N＝8マウス／群、*p＝0.20、**p＝0.08、†p＝1.0、‡p＝0.5）。
【図１８】TLR2は保護的なPam2CSK4およびODN2395相乗効果を促進するには十分であるが、誘導抵抗性のためには必要ではない。図18A．左：24時間前のODN2395およびPam2CSK4での処置有りまたは無しで緑膿菌をチャレンジしたTlr2-/-および野生型マウスの生存（N＝8マウス／群、*p＜0.0002）。右：緑膿菌の感染直後の肺ホモジネーの細菌負荷量（N＝4マウス／群、野生型 + PBSに対して**p＜0.0001、Tlr2-/- + PBSに対して†p＝0.59）。図18B．左：無莢膜型インフルエンザ菌（NTHi）のエアロゾル化溶解物での24時間前の処置有りまたは無しで緑膿菌をチャレンジしたTlr2-/-および野生型マウスの生存（N＝10マウス／群、*p＜0.0002）。右：緑膿菌の感染直後の肺ホモジネーの細菌負荷量（N＝3マウス／群、野生型 + PBSに対して‡p＝0.03、Tlr2-/- + PBSに対して#p＝0.002）。
【図１９】クラスAまたはBではなく、TLR9結合性クラスCのCpG ODNは、Pam2CSK4と相乗的に相互作用し、細菌性肺炎に対する抵抗性を誘導する。図19A．緑膿菌チャレンジの24時間前にPam2CSK4およびODN2395またはPam2CSK4およびスクランブルコントロールODNで処置した野生型マウスの生存（N＝10マウス／群、*p＜0.0001）。図19B．PBSでの、またはクラスA CpG ODN（ODN1585またはODN2216）、クラスB CpG ODN（ODN 2006-G5）またはクラスC CpG ODN（M362またはODN2395）と組み合わされたPam2CSK4での処置の24時間後に緑膿菌をチャレンジした野生型マウスの生存（N＝10マウス／群、PBSに対して*p＝0.01、PBSに対して**p＝0.0001；Pam2 + ODN2395に対して†p＝0.3）。
【図２０】TLR2/6およびTLR9アゴニストは、インビトロでマウスおよびヒト呼吸器上皮細胞による細菌殺滅を誘導するように協力する。図20A．炭疽菌（B. anthracis）（1000胞子）の感染前に4時間、MLE-15細胞をPam2CSK4（10μg/ml）および／またはODN2395（20μg/ml）で処理した。感染の4時間後の細菌CFUが示される（PBSに対して*p＝0.05、PBSに対して**p＝0.016、いずれか単一のアゴニストに対して#p＞0.05）。図20B．MLE培養培地（細胞無し）をODN2395およびPam2CSK4で処理し、炭疽菌（1000 胞子）を感染させ、4時間後に培養した（†p＝1.0）。図20C．緑膿菌（2700 CFU）の感染前に4時間、A549細胞をODN2395およびPam2CSK4で処理した。感染の4時間後の細菌CFUが示される（PBSに対して*p＝0.01、PBSに対して**p＝0.003、PBSに対して***p＝0.001、いずれか単一のアゴニストに対して#p＝＞0.05）。図20D．MLE培養培地（細胞無し）をODN2395およびPam2CSK4で処理し、緑膿菌（4000 CFU）を感染させ、4時間後に培養した（‡p＝0.58）。
【図２１】種々の合成TLRアゴニストで免疫化し、5 LD50の炭疽菌Ames胞子（MD-10-013）を鼻腔内にチャレンジした、Swiss-Websterマウスの生存。炭疽でのチャレンジの24時間前に、示されるように、マウスをエアロゾル化TLRアゴニストで処置した。ALIIS＝NTHi細菌溶解物、2395＝ODN2395、10101＝ODN10101、M362＝ODN-M362。1x＝ODN 40μg/mlおよびPam2 20μg/ml。
【図２２】インフルエンザA/HK感染マウスの生存に対するODN/Pam2またはNTHi溶解物でのエアロゾル前処置の効果。1回の30分エアロゾル処置；インフルエンザウイルス用量：約100 TCID50／マウス。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
免疫系は、外部の生物学的影響から生物を保護する特殊な細胞および器官のシステムである。免疫系が適切に機能している場合、それは、微生物感染症から身体を保護し、癌細胞および外来物質を破壊する。免疫系が弱まると、身体を防御するその能力も弱まり、病原体が身体内で増殖することが可能となる。
【００３１】
免疫系は、（a）病原体を絶えず回避するための防御の即時の「第一線」を提供する成分から構成される先天性免疫、および（b）特定の病原体を標的化するように特異的に設計された抗体の製造およびT細胞の産生または刺激を含む適応（獲得）免疫にしばしば分類される。適応免疫を使用して、身体は、特定の病原体に対する特異的免疫を徐々に発達させることができる。この応答は、発達するために数日かかり、従って、最初の侵入の防止に有効でないが、それは、通常、続いての感染症を予防し、より長く持続する感染症を解決するに役立つ。
【００３２】
ある炎症性刺激に対する応答において、マウスおよびヒトの気道上皮の分泌細胞は、炎症性化生と呼ばれる顕著な構造変化を急速に受ける。大抵の構造変化は、分泌ゲル形成性ムチンの産生の増加に起因し得、一方、ムチン分泌、微生物殺滅、または炎症性シグナル伝達における機能を有するさらなる高分子もまたアップレギュレートされる。この応答の生理学的機能は、微生物病原体に対する局所防御の増大であると思われるが、その仮説は限定的な形式的試験を受けただけである。逆説的に、ゲル形成性ムチンの過剰な産生および分泌は、喘息、嚢胞性線維症、および慢性閉塞性肺疾患（COPD）などの気道の一般的な炎症性疾患における気流閉塞の主な原因である。ムチンを産生することなく先天性免疫を刺激することは、被験体を予防および／または治療することによる気道の感染症のさらなる軽減方法を提供する。
【００３３】
本発明の態様は、そのセグメントまたは誘導体またはアナログを含む、1、2、3、4、またはそれ以上のTLRアゴニストを含む組成物での、被験体の気道の刺激を含む。本発明の組成物が投与された被験体は、潜在的に感染性の生物に対する治療的、予防的、または治療的かつ予防的な応答が与えられる。特定の局面において、組成物は、エアロゾル化され、気道を介して投与される。組成物は、例えば肺の先天性免疫を活性化するまたは増大させることによって、保護護効果を誘導するまたはそうでなければ誘発するために使用される。
【００３４】
本発明のある局面は、様々な微生物から誘導されるかまたはヒトによって合成された小分子および／またはTLRアゴニストを含む。典型的に、小分子および／またはTLRアゴニストは、分泌ムチンの産生を増加させない。本発明の態様は、例えば生物兵器、新しい毒性の（neo-virulent）微生物、または日和見微生物に対する、予防的および先制的治療として使用され得る。
【００３５】
I．StIR組成物
A．異種化合物および部分
多数の非宿主または異種分子が、免疫反応の発生を刺激、増強し得るか、またはこれに寄与し得る。これらの部分としては、先天的受容体の様々なアゴニストおよび／または微生物成分が挙げられる。
【００３６】
1．先天的受容体リガンド
パターン認識受容体、またはPRR（先天的受容体）は、微生物病原体もしくは細胞ストレスに関連する、病原体関連分子パターン、即ちPAMPを確認するために先天性免疫系の細胞によって発現されるタンパク質である。PAMPとしては、細菌の炭水化物（例えば、リポ多糖またはLPS、マンノース）、核酸（例えば、細菌またはウイルスDNAまたはRNA）、ペプチドグリカンおよびリポテイコ酸（lipotechoic acid）（グラム陽性細菌由来）、N-ホルミルメチオニン、リポタンパク質、真菌グルカンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
PRRは、典型的に、それらのリガンド特異性、機能、局在および／または進化的関係に従って分類される。機能に基づいて、PRRは、エンドサイトーシスPRRまたはシグナル伝達PRRに分類され得る。シグナル伝達PRRとしては、膜結合型Toll様受容体および細胞質NOD様受容体の大きなファミリーが挙げられる。エンドサイトーシスPRRは、細胞内シグナルを中継することなく、貪食細胞による微生物の付着、貪食および破壊を促進する。これらのPRRは炭水化物を認識し、これらとしては、マクロファージのマンノース受容体、全ての貪食細胞上に存在するグルカン受容体、および荷電リガンドを認識し、全ての貪食細胞上において見られ、アポトーシス細胞の除去を媒介するスカベンジャー受容体が挙げられる。
【００３８】
Toll様受容体（TLR）、C型レクチン受容体（CLR）、およびヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン様受容体（Nod様受容体またはNLR）を含むが、これらに限定されない、多数の先天的受容体が同定された。TLRは、先天性免疫系において重要な役割を果たすあるクラスのタンパク質である。それらは、微生物由来の構造的に保存された分子を認識する1回膜貫通型非触媒性受容体である。いったんこれらの微生物が皮膚または腸管粘膜上または内に存在するようになると、それらはTLRによって認識され、免疫細胞応答が活性化される。興味深いことには、これらのTLRアゴニストの多くは、単独で投与される場合、顕著なStIRを誘導しない。典型的に、本明細書に記載される方法を使用して治療される個体または被験体は、病原性微生物へ曝露されたか、またはこのような曝露の危険性がある。
【００３９】
a．Toll様受容体（TLR）アゴニスト
Toll様受容体（TLR）は、PRRのうちで最もよく特徴付けられている（Ishii et al., 2008）。それらは、パターン認識のための多数のロイシンリッチリピートを有するエクトドメイン、膜貫通αヘリックス、および細胞内シグナル伝達のためのToll／インターロイキン-1受容体（TIR）ドメインからなる、高度に保存された膜貫通タンパク質である。少なくとも13個の哺乳類TLRが同定され、各々は、形質膜またはエンドソーム膜のいずれかへ特異的に局在化し、各々は、PAMPの特有の補体を検出する（Akira et al., 2006；Shi et al., 2006）。PAMPが認識されると、シグナル伝達が、細胞質ゾルTIRアダプタータンパク質組み合わせのTLR特異的動員によって生じる。4個の他のアダプターのうちの1つまたは複数と協力して、TIRアダプタータンパク質MyD88は、大抵のTLRからのシグナル伝達のために必要とされる。TLR3およびTLR4から観察されるMyD88非依存性シグナル伝達事象は、TRAMの関与有りまたは無しで、TIRアダプターTRIF（TICAM-1としても公知）を必要とする（Yamamoto et al., 2003）。TLR特異的TIRアダプターシグナル伝達カスケードは、受容体特異的転写因子、例えばNF-κB、活性化タンパク質-1およびインターフェロン調節因子（IRF）を活性化し、炎症性および抗微生物遺伝子が発現される（Akira et al., 2006；O'Neill, L.A., and Bowie, 2007；Takeda, K., and Akira, 2004）。
【００４０】
TLRアゴニストは、TLRを活性化するように、例えば、TLRシグナル伝達経路によって媒介されるシグナル伝達事象を誘導するように、機能する任意の化合物または物質である。好適なTLRアゴニストとしては、TLR1アゴニスト、TLR2アゴニスト、TLR3アゴニスト、TLR4アゴニスト、TLR5アゴニスト、TLR6アゴニスト、TLR7アゴニスト、TLR8アゴニスト、およびTLR9アゴニストが挙げられる。
【００４１】
保護的な免疫の発生は、抗原への曝露だけでなく、抗原に遭遇する状況にも依存することが、現在、広く認識されている。炎症状況での宿主中への新規抗原の導入が、長期免疫ではなく免疫寛容を発生させ、一方、催炎物質（アジュバント）の存在下での抗原への曝露が免疫を誘導する、多数の例が存在する（Mondino et al., 1996；Pulendran et al., 1998；Jenkins et al., 1994；およびKearney et al.,）。それは寛容と免疫との差異を意味し得るので、抗原提示の適切な免疫原性状況の作製に関与する分子経路を刺激する感染因子内に存在する「アジュバント」を発見することに多くの努力が注がれてきた。アジュバント活性の大部分が、微生物およびウイルス産物と、免疫細胞上に発現されるToll様受容体（TLR）の種々のメンバーとの相互作用に起因することが、現在、公知である（Beutler et al., 2004；Kaisho, 2002；Akira et al., 2003；およびTakeda and Akira, 2004）。TLRは、その発達において機能し抗微生物免疫に関与する、Tollと呼ばれる、ショウジョウバエ中における分子とのそれらの相同性のために命名されている（Lernaitre et al., 1996；およびHashimoto et al., 1988）。
【００４２】
初期の研究は、TollおよびToll経路分子に対する哺乳類相同体が、微生物チャレンジおよび微生物副産物に応答する先天性免疫系の細胞の能力にとって重要であることを示した（Medzhitov et al., 1997；Medzhitov et al., 1998；Medzhitov et al., 2000；およびJaneway et al., 2002）。TLR4アゴニストとしてLPSが同定されて以来（Poltorak et al., 1998）、多数の他のTLRアゴニスト、例えば、トリアシルマルチタイプHPVポリペプチド（TLR1）、ペプチドグリカン、リポテイコ酸およびPam3Cys（TLR2）、dsRNA（TLM）、フラジェリン（TLR5）、ジアシルマルチタイプHPVポリペプチド、例えばMalp-2（TLR6）、イミダゾキノリンおよび一本鎖RNA（TLR7、8）、細菌DNA、非メチル化CpG DNA配列、およびさらにヒトゲノムDNA抗体複合体（TLR9）が記載された（Takeuchi et al., 2001；Edwards et al., 2002；Hayashi et al., 2003；Nagase et al., 2003）。
【００４３】
用語「アゴニスト」は、本明細書において使用される場合、受容体（例えば、TLR）と結合し細胞活性を生じさせ得る化合物を指す。アゴニストは、受容体へ直接結合するリガンドであり得る。あるいは、アゴニストは、例えば、（a）受容体へ直接結合する別の分子と複合体を形成することによって、または（b）そうでなければ、別の化合物を修飾し、その結果、他の化合物が受容体へ直接結合することによって、間接的に受容体と結合し得る。アゴニストは、特定のTLR（例えば、TLR7アゴニスト）またはTLRの特定の組み合わせ（例えば、TLR7/8アゴニスト−TLR7およびTLR8の両方のアゴニスト）のアゴニストを指し得る。
【００４４】
本明細書において交換可能に使用される用語「CpG-ODN」、「CpG核酸」、「CpGポリヌクレオチド」および「CpGオリゴヌクレオチド」は、少なくとも1つの5'-CG-3'部分を含み、多くの態様において、非メチル化5'-CG-3'部分を含む、ポリヌクレオチドを指す。一般的に、CpG核酸は、修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオシドの配列を含み得るかまたはからなり得る少なくとも6個のヌクレオチド塩基を有する一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAポリヌクレオチドである。ある態様において、CpG核酸の5'-CG-3'部分は、パリンドロームヌクレオチド配列の一部分である。ある態様において、CpG核酸の5'-CG-3'部分は、非パリンドロームヌクレオチド配列の一部分である。
【００４５】
好適なTLRアゴニストとしては、単離された天然のTLRアゴニスト；および合成TLRアゴニストが挙げられる。TLRアゴニストの天然の供給源から単離されたTLRアゴニストは、一般的に精製され、例えば、精製されたTLRアゴニストは、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％純粋、または99％を超えて純粋である。合成TLRアゴニストは、標準方法によって作製され、一般的に、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％純粋、または99％を超えて純粋である。
【００４６】
好適なTLRアゴニストとしては、他の化合物へ結合されていないTLRアゴニストが挙げられる。好適なTLRアゴニストとしては、第2の化合物へ共有結合的にまたは非共有結合的に結合されているTLRアゴニストが挙げられる。ある態様において、TLRアゴニストは、別の化合物へ直接結合されている。他の態様において、TLRアゴニストは、リンカーを介して別の化合物へ結合されている。TLRアゴニストが結合される化合物としては、担体、足場、不溶性支持体、マイクロ粒子、マイクロスフェアなどが挙げられる。担体としては、治療用ポリペプチド；増加した溶解性を提供するポリペプチド；生理学的媒体（例えば、血清または他の体液）中におけるTLRアゴニストの半減期を増加させるポリペプチドなどが挙げられる。ある態様において、TLRアゴニストは、第2のTLRアゴニストへ、直接的にまたはリンカーを介して、結合される。
【００４７】
ある態様において、TLRアゴニストは、TLRアゴニストのプロドラッグ型である。プロドラッグは、活性治療剤へ共有結合されたプロドラッグ部分から構成されている。プロドラッグは、それらの構造のある化学的または酵素的修飾によってインビボで薬物（活性治療剤）へ変換されることができる。プロドラッグ部分の例は当技術分野において周知であり、以下の参考文献において見られ得る：Biological Approaches to the Controlled Delivery of Drugs, R. L. Juliano, New York Academy of Sciences, (1988)；Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism: Chemistry, Biochemistry, and Enzymology, Bernard Testa, Vch Verlagsgesellschaft Mbh, (2003)；およびProdrugs: Topical and Ocular Drug Delivery, Kenneth Sloan, Marcel Dekker; (1992)。プロドラッグ部分の例は、ペプチド、例えば、作用部位へTLRリガンドを向けるペプチド、およびそのアミノ末端で2個またはそれ以上の遊離したカップリングされていないカルボン酸を有するペプチドである。他の例示的な切断可能なプロドラッグ部分としては、エステル基、エーテル基、アシル基、アルキル基、リン酸基、スルホン酸基、N-オキシド、およびtert-ブトキシカルボニル基が挙げられる。
【００４８】
ある態様において、TLRアゴニストは単量体TLRアゴニストである。他の態様において、TLRアゴニストは多量体化され、例えば、TLRアゴニストはポリマーである。ある態様において、多量体化TLRアゴニストは、ホモ官能性であり、例えば、1タイプのTLRアゴニストから構成される。他の態様において、多量体化TLRアゴニストは、ヘテロ官能性TLRアゴニストである。
【００４９】
ある態様において、TLRリガンドは、キメラTLRリガンド（本明細書において「ヘテロ官能性」TLRリガンドとも呼ばれる）である。ある態様において、キメラTLRアゴニストは、TLR9アゴニスト部分およびTLR2アゴニスト部分を含む。以下は、ヘテロ官能性TLRアゴニストの非限定的な例である。
【００５０】
ある態様において、キメラTLRリガンドは、以下の式：(X)n-(Y)mを有し、式中、Xは、TLR1アゴニスト、TLR2アゴニスト、TLR3アゴニスト、TLR4アゴニスト、TLR5アゴニスト、TLR6アゴニスト、TLR7アゴニスト、TLR8アゴニスト、およびTLR9アゴニストであり、Yは、TLR2アゴニスト、TLR3アゴニスト、TLR4アゴニスト、TLR5アゴニスト、TLR6アゴニスト、TLR7アゴニスト、TLR8アゴニスト、およびTLR9アゴニストであり、nおよびmは独立して、その間の全ての値及び範囲を含む、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の整数である。ある態様において、XまたはYはTLR9であり、XまたはYはTLR2/6である。
【００５１】
TLR2アゴニスト
TLR2アゴニストとしては、単離された天然のTLR2アゴニスト；および合成TLR2アゴニストが挙げられる。TLR2アゴニストの天然の供給源から単離されたTLR2アゴニストは、一般的に精製され、例えば、精製されたTLR2アゴニストは、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％純粋、または99％を超えて純粋である。合成TLR2アゴニストは、標準方法によって作製され、一般的に、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％純粋、または99％を超えて純粋である。
【００５２】
TLR2アゴニストとしては、他の化合物へ結合されていないTLR2アゴニストが挙げられる。TLR2アゴニストとしては、第2の化合物へ共有結合的にまたは非共有結合的に結合されているTLR2アゴニストが挙げられる。ある態様において、TLR2アゴニストは、別の化合物へ直接結合されている。他の態様において、TLR2アゴニストは、リンカーを介して別の化合物へ結合されている。
【００５３】
TLR2アゴニストとしては、合成トリアシル化およびジアシル化リポペプチドが挙げられる。TLR2リガンドの非限定的な例は、FSL-1（マイコプラズマ・サリバリウム1（Mycoplasma salivarium 1）に由来する合成リポタンパク質）、Pam3Cys（トリパルミトイル-S-グリセリルシステイン）またはS-[2,3-ビス(パルミトイルオキシ)-(2RS)-プロピル]-N-パルミトイル-(R)-システインであり、ここで、「Pam3」は「トリパルミトイル-S-グリセリル」である（Aliprantis et al., 1999）。Pam3Cysの誘導体もまた、好適なTLR2アゴニストであり、ここで、誘導体としては、S-[2,3-ビス(パルミトイルオキシ)-(2-R,S)-プロピル]-N-パルミトイル-(R)-Cys-(S)-Ser-(Lys)4-ヒドロキシ三塩酸塩；Pam3Cys-Ser-Ser-Asn-Ala；PaM3Cys-Ser-(Lys)4；Pam3Cys-Ala-Gly；Pam3Cys-Ser-Gly；Pam3Cys-Ser；PaM3Cys-OMe；Pam3Cys-OH；PamCAG、パルミトイル-Cys((RS)-2,3-ジ(パルミトイルオキシ)-プロピル)-Ala-Gly-OHなどが挙げられるが、これらに限定されない。好適なTLR2アゴニストの別の非限定的な例は、Pam2CSK4PaM2CSK4（ジパルミトイル-S-グリセリルシステイン-セリン-(リジン)4であり；またはPam2Cys-Ser-(Lys)4）は、合成ジアシル化リポペプチドである。合成TLRアゴニストは文献に記載されている。例えば、Kellner et al. (1992)；Seifer et al. (1990)；Lee et al. (2003)を参照のこと。
【００５４】
TLR3アゴニスト
TLR3アゴニストとしては、単離された天然のTLR3アゴニスト；および合成TLR3アゴニストが挙げられる。TLR3アゴニストの天然の供給源から単離されたTLR3アゴニストは、一般的に精製され、例えば、精製されたTLR3アゴニストは、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％純粋、または99％を超えて純粋である。合成TLR3アゴニストは、標準方法によって作製され、一般的に、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％純粋、または99％を超えて純粋である。
【００５５】
TLR3アゴニストとしては、他の化合物へ結合されていないTLR3アゴニストが挙げられる。TLR3アゴニストとしては、第2の化合物へ共有結合的にまたは非共有結合的に結合されているTLR3アゴニストが挙げられる。ある態様において、TLR3アゴニストは、別の化合物へ直接結合されている。他の態様において、TLR3アゴニストは、リンカーを介して別の化合物へ結合されている。
【００５６】
TLR3アゴニストとしては、天然の二本鎖RNA（dsRNA）；合成ds RNA；および合成dsRNAアナログなどが挙げられる（Alexopoulou et al., 2001）。合成dsRNAアナログの例示的な非限定的な例は、ポリ(I:C)である。
【００５７】
TLR4アゴニスト
好適なTLR4アゴニストとしては、単離された天然のTLR4アゴニスト；および合成TLR4アゴニストが挙げられる。TLR4アゴニストの天然の供給源から単離されたTLR4アゴニストは、一般的に精製され、例えば、精製されたTLR4アゴニストは、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％純粋、または99％を超えて純粋である。合成TLR4アゴニストは、標準方法によって作製され、一般的に、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％純粋、または99％を超えて純粋である。
【００５８】
TLR4アゴニストとしては、他の化合物へ結合されていないTLR4アゴニストが挙げられる。好適なTLR4アゴニストとしては、第2の化合物へ共有結合的にまたは非共有結合的に結合されているTLR4アゴニストが挙げられる。ある態様において、TLR4アゴニストは、別の化合物へ直接結合されている。他の態様において、TLR4アゴニストは、リンカーを介して別の化合物へ結合されている。TLR4アゴニストが結合される好適な化合物としては、担体、足場などが挙げられる。
【００５９】
TLR4アゴニストとしては、天然のリポ多糖（LPS）、例えば、多種多様のグラム陰性細菌由来のLPS；天然LPSの誘導体；合成LPS；細菌熱ショックタンパク質-60（Hsp60）；マンヌロン酸ポリマー；フラボリピン；テイクロン酸；肺炎連鎖球菌のニューモリシン；細菌線毛、呼吸器合胞体ウイルスコートタンパク質などが挙げられる。TLR4アゴニストとしてはまた、モノホスホリルリピドA合成物（MPLA、Invivogen）およびリン酸化ヘキサアシルジサッカライド（PHAD、Avanti Polar Lipids）、ならびに他の合成TLR4アゴニストが挙げられる。
【００６０】
TLR5アゴニスト
好適なTLR5アゴニストとしては、単離された天然のTLR5アゴニスト；および合成TLR5アゴニストが挙げられる。TLR5アゴニストの天然の供給源から単離されたTLR5アゴニストは、一般的に精製され、例えば、精製されたTLR4アゴニストは、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％純粋、または99％を超えて純粋である。合成TLR5アゴニストは、標準方法によって作製され、一般的に、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％純粋、または99％を超えて純粋である。
【００６１】
TLR5アゴニストとしては、他の化合物へ結合されていないTLR5アゴニストが挙げられる。好適なTLR5アゴニストとしては、第2の化合物へ共有結合的にまたは非共有結合的に結合されているTLR5アゴニストが挙げられる。ある態様において、TLR5アゴニストは、別の化合物へ直接結合されている。他の態様において、TLR5アゴニストは、リンカーを介して別の化合物へ結合されている。TLR5アゴニスが結合される好適な化合物としては、担体、足場などが挙げられる。
【００６２】
TLR5アゴニストとしては、フラジェリンの高度に保存された22アミノ酸セグメント、ならびに全長フラジェリンおよびその他のセグメントが挙げられる。
【００６３】
TLR7アゴニスト
好適なTLR7アゴニストとしては、単離された天然のTLR7アゴニスト；および合成TLR7アゴニストが挙げられる。TLR7アゴニストの天然の供給源から単離されたTLR7アゴニストは、一般的に精製され、例えば、精製されたTLR7アゴニストは、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％純粋、または99％を超えて純粋である。合成TLR7アゴニストは、標準方法によって作製され、一般的に、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％純粋、または99％を超えて純粋である。
【００６４】
好適なTLR7アゴニストとしては、他の化合物へ結合されていないTLR7アゴニストが挙げられる。好適なTLR7アゴニストとしては、第2の化合物へ共有結合的にまたは非共有結合的に結合されているTLR7アゴニストが挙げられる。ある態様において、TLR7アゴニストは、別の化合物へ直接結合されている。他の態様において、TLR7アゴニストは、リンカーを介して別の化合物へ結合されている。
【００６５】
TLR7リガンドとしては、イミダゾキノリン化合物；グアノシンアナログ；ピリミジノン化合物、例えば、ブロピリミンおよびブロピリミンアナログなどが挙げられる。TLR7リガンドとして機能するイミダゾキノリン化合物としては、イミキモド（アルダラ、R-837、S-26308としても公知）、およびR-848（レシキモド、S-28463としても公知；化学構造：4-アミノ-2-エトキシメチル-α,α-ジメチル-1H-イミダゾール[4,5-c]キノリン-1-エタノールを有する）が挙げられるが、これらに限定されない。好適なイミダゾキノリン薬剤としては、イミダゾキノリンアミン、イミダゾピリジンアミン、6,7-縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン、および1,2架橋イミダゾキノリンアミンが挙げられる。これらの化合物は、米国特許第4,689,338号、第4,929,624号、第5,238,944号、第5,266,575号、第5,268,376号、第5,346,905号、第5,352,784号、第5,389,640号、第5,395,937号、第5,494,916号、第5,482,936号、第5,525,612号、第6,039,969号、および第6,110,929号に記載された。本方法における使用に適しているイミダゾキノリン薬剤の特定の種類としては、R-848（S-28463）；4-アミノ-2エトキシメチル-α,α-ジメチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-s-i-エタノール；および1-(2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン（R-837またはイミキモド）が挙げられる。化合物4-アミノ-2-(エトキシメチル)-α,α-ジメチル-6,7,8,9-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-エタノール水和物も使用に適している（例えば、Gorden et al. (2005) のBM-003を参照のこと）。
【００６６】
好適な化合物としては、五員窒素含有ヘテロ環式環へ縮合された2-アミノピリジンを有するものが挙げられる。このような化合物としては、例えば、イミダゾキノリンアミン、例えばしかしこれらに限定されないが、置換イミダゾキノリンアミン、例えば、アミド置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換イミダゾキノリンアミン、ヘテロ環式エーテル置換イミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンエーテル、チオエーテル置換イミダゾキノリンアミン、および6-、7-、8-または9-アリールまたはヘテロアリール置換イミダゾキノリンアミン；テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、例えばしかしこれらに限定されないが、アミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、ヘテロ環式エーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンエーテル、およびチオエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン；イミダゾピリジンアミン、例えばしかしこれらに限定されないが、アミド置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミド置換イミダゾピリジンアミン、尿素置換イミダゾピリジンアミン、アリールエーテル置換イミダゾピリジンアミン、ヘテロ環式エーテル置換イミダゾピリジンアミン、アミドエーテル置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾピリジンアミン、尿素置換イミダゾピリジンエーテル、およびチオエーテル置換イミダゾピリジンアミン；1,2-架橋イミダゾキノリンアミン；6,7-縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン；イミダゾナフチリジンアミン；テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン；オキサゾロキノリンアミン；チアゾロキノリンアミン；オキサゾロピリジンアミン；チアゾロピリジンアミン；オキサゾロナフチリジンアミン；チアゾロナフチリジンアミン；ならびに、ピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミンおよびテトラヒドロナフチリジンアミンへ縮合された1H-イミダゾダイマーが挙げられる。
【００６７】
化合物としては、置換イミダゾキノリンアミン、テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、イミダゾピリジンアミン、1,2-架橋イミダゾキノリンアミン、6,7-縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン、イミダゾナフチリジンアミン、テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン、オキサゾロキノリンアミン、チアゾロキノリンアミン、オキサゾロピリジンアミン、チアゾロピリジンアミン、オキサゾロナフチリジンアミン、およびチアゾロナフチリジンアミンが挙げられる。
【００６８】
本明細書において使用される場合、置換イミダゾキノリンアミンは、アミド置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換イミダゾキノリンアミン、ヘテロ環式エーテル置換イミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンエーテル、チオエーテル置換イミダゾキノリンアミン、または6-、7-、8-もしくは9-アリールもしくはヘテロアリール置換イミダゾキノリンアミンを指す。
【００６９】
TLR7リガンドとして機能するグアノシンアナログとしては、ある特定の（certain）C8-置換およびN7,C8-二置換グアニンリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドが挙げられ、これらとしては、ロキソリビン（7-アリル-8-オキソグアノシン）、7-チア-8-オキソ-グアノシン（TOG）、7-デアザグアノシン、および7-デアザデオキシグアノシンが挙げられるが、これらに限定されない（Lee et al., 2003）。5-ハロ-6-フェニル-ピリミジノンである、ブロピリミン（PNU-54461）、およびブロピリミンアナログは、文献に記載されており、また使用に適している。例えば、Vroegop et al. (1999) を参照のこと。好適なC8-置換グアノシンのさらなる例としては、8-メルカプトグアノシン、8-ブロモグアノシン、8-メチルグアノシン、8-オキソ-7,8-ジヒドログアノシン、C8-アリールアミノ-2'-デオキシグアノシン、C8-プロピニル-グアノシン、C8-およびN7-置換グアニンリボヌクレオシド、例えば、7-アリル-8-オキソグアノシン（ロキソリビン）および7-メチル-8-オキソグアノシン、8-アミノグアノシン、8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン、ならびに8-ヒドロキシグアノシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
ある態様において、置換グアニンTLR7リガンドは単量体である。他の態様において、置換グアニンTLR7リガンドは多量体である。従って、ある態様において、TLR7リガンドは式：(B)qを有し、式中、Bは置換グアニンTLR7リガンドであり、qは1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。多量体TLR7リガンド中の個々のTLR7リガンドモノマーは、互いに直接的にまたはリンカーを介して、共有結合的にまたは非共有結合的に、連結されている。好適なTLR7アゴニストとしては、米国特許出願公開第2004/0162309号に記載されるTLR7リガンドが挙げられる。
【００７１】
ある態様において、TLR7アゴニストは、選択的TLR7アゴニストであり、例えば、アゴニストは、TLR7を介して細胞活性を調節するが、TLR8を介しては細胞活性を調節しない。TLR7選択的アゴニストとしては、米国特許出願公開第2004/0171086号に示されるものが挙げられる。このようなTLR7選択的アゴニスト化合物としては、N1-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-6,7,8,9-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-4-フルオロ-1-ベンゼンスルホンアミド、N1-[4-(4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル]-4-フルオロ-1-ベンゼンスルホンアミド、N-[4-(4-アミノ-2-プロピル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル]メタンスルホンアミド、N-{3-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]-2,2-ジメチルプロピル}ベンズアミド、N-(2-{2-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]エトキシ}エチル)-N-メチルメタンスルホンアミド、N-(2-{2-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-6,7,8,9-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]エトキシ}エチル)ベンズアミド、N-[4-(4-アミノ-2-メチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル]シクロペンタンカルボキサミド、1-[4-(1,1-ジオキシドイソチアゾリジン-2-イル)ブチル]-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン、2-メチル-1-[5-メチルスルホニル)ペンチル-6,7,8,9-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン、N-{2-[4-アミノ-2-(エトキシメチル)-6,7-ジメチル-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-1-イル]-1,1-ジメチルエチル}-N-シクロヘキシル尿素、N-[2-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)-1,1-ジメチルエチル]ベンズアミド、N-[3-(4-アミノ-2-ブチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)-2,2-ジメチルプロピル]メタンスルホンアミド、1-[6-(メタンスルホニル)ヘキシル]-6,7-ジメチル-2-プロピル-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-4-アミン、6-(6-アミノ-2-プロピル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)-N-メトキシ-N-メチルヘキサミド、1-[2,2-ジメチル-3-(メチルスルホニル)プロピル]-2-(エトキシメチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン、N-[4-(4-アミノ-2-メチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル]-N-メチル-N-フェニル尿素、1-{3-[4-アミノ-1-(2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-8-イル]フェニル}エタノン、7-(4-アミノ-2-プロピル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)-2-メチルヘプタン-2-オール、N-メチル-4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブタン-1-スルホンアミド、N-(4-メトキシベンジル)-4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブタン-1-スルホンアミド、N-{2-[4-アミノ-3-(エトキシメチル)-6,7-ジメチル-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-1-イル]-1,1-ジメチルエチル}メタンスルホンアミド、2-エトキシメチル-1-(3-メトキシプロピル)-7-(5-ヒドロキシメチルピリジン-3-イル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン、1-[(2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-イル)メチル]-2-(エトキシメチル)-7-(ピリジン-3-イル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン、4-[3-(4-アミノ-6,7-ジメチル-2-プロピル-1H-イミチゾ（imithizo）[4,5-c]ピリジン-1-イル)プロパン-1-スルホニル]-安息香酸エチルエステル、2-ブチル-1-{2-[2-(メチルスルホニル)エトキシ]エチル}-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン、N-(2-{4-アミノ-2-エトキシメチル-7-[6-(メタンスルホニルアミノ)ヘキシルオキシ]-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル}-1,1-ジメチルエチル)メタンスルホンアミド、N-(6-{[4-アミノ-2-エトキシメチル-1-(2-メタンスルホニルアミノ-2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-7-イル]オキシ}ヘキシル)アセトアミド、1-[4-(1,1-ジオキシドイソチアゾリジン-2-イル)ブチル]-2-エトキシメチル-7-(ピリジン-3-イル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン、1-[4-(1,1-ジオキシドイソチアゾリジン-2-イル)ブチル]-2-エトキシメチル-7-(ピリジン-4-イル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン、1-[4-(1,1-ジオキシドイソチアゾリジン-2-イル)ブチル]-2-エトキシメチル-7-フェニル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン、2-(エトキシメチル)-1-{[1-(メチルスルホニル)ピペリジン-4-イル]メチル}-7-(ピリジン-3-イル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン、2-(エトキシメチル)-1-[(1-イソブチリルピペリジン-4-イル)メチル]-7-(ピリジン-3-イル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン、2-(エトキシメチル)-1-{[1-(モルホリック（morpholic）-4-イルカルボニル)ピペリジン-4-イル]メチル}-7-(ピリジン-3-イル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン、シクロプロパンカルボン酸[3-(4-アミノ-2-プロピル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)プロポキシ]アミド、イソプロピルカルバミン酸4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1-プロピル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-7-イルエステル、エチル4-(4-アミノ-2-プロピル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチラート、1-[4-アミノ-2-エチル-7-(ピリジン-3-イル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]-2-メチルプロパン-2-オール、1-(4-アミノ-2-エチル-7-[5-{ヒドロキシメチル)ピリジン-3-イル]-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル}-2-メチルプロパン-2-オール、1-(3-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-8-(ピリジン-3-イル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]プロピル]ピロリジン-2-オン、N-(2-{4-アミノ-2-エトキシメチル-7-[6-(メタンスルホニルアミノ)ヘキシルオキシ]-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル}-1,1-ジメチルエチル)アセトアミド、1-{3-[4-アミノ-7-(3-ヒドロキシメチルフェニル)-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]プロピル}ピロリジン-2-オン、N-{4-[4-アミノ-2-エトキシメチル-7-(ピリジン-3-イル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}-N'-プロピル尿素、N-{4-[4-アミノ-2-エトキシメチル-7-(ピリジン-3-イル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}ブチルアミド、5-(4-アミノ-2-プロピル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)-4,4-ジメチルペンタン-2-オン、1-シクロヘキシルメチル-2-エトキシメチル-7-(5-ヒドロキシメチルピリジン-3-イル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン、N,N-ジメチル-5-(4-アミノ-2-エトキシメチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ペンタン-1-スルホンアミド、N-{3-[(4-アミノ-2-エトキシメチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)アミノ]プロピル}メタンスルホンアミド、および／またはN,N-ジメチル-4-(4-アミノ-2-エトキシメチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブタン-1-スルホンアミドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
さらなる好適なTLR7選択的アゴニストとしては、2-(エトキシメチル)-1-(2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン（米国特許第5,389,640号）；2-メチル-1-[2-(3-ピリジン-3-イルプロポキシ)エチル]-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン（WO 02/46193）；N-(2-{2-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]エトキシ}エチル)-N-メチルシクロヘキサンカルボキサミド（米国特許出願公開第2004/0171086号）；1-[2-(ベンジルオキシ)エチル]-2-メチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン（WO 02/46189）；N-{8-[4-アミノ-2-(2-メチオキシエチル（methyoxyethyl）)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]オクチル}-N-フェニル尿素（米国特許出願公開第2004/0171086号（IRM5））；2-ブチル-1-[5-(メチルスルホニル)ペンチル]-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン（WO 02/46192）；N-{3-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]プロピル}-4-メチルベンゼンスルホンアミド（米国特許第6,331,539号）；およびN-[4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル]シクロヘキサンカルボキサミド（米国特許出願公開第2004/0171086号（IRM8））が挙げられるが、これらに限定されない。TLR7選択的アゴニストN-[4-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル-]メタンスルホン-アミドも使用に適している（Gorden et al., 2005）。
【００７３】
TLR8アゴニスト
好適なTLR8アゴニストとしては、単離された天然のTLR8アゴニスト；および合成TLR8アゴニストが挙げられる。TLR8アゴニストの天然の供給源から単離されたTLR8アゴニストは、一般的に精製され、例えば、精製されたTLR8アゴニストは、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％純粋、または99％を超えて純粋である。合成TLR8アゴニストは、標準方法によって作製され、一般的に、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％純粋、または99％を超えて純粋である。
【００７４】
TLR8アゴニストとしては、他の化合物へ結合されていないTLR8アゴニストが挙げられる。TLR8アゴニストとしては、第2の化合物へ共有結合的にまたは非共有結合的に結合されているTLR8アゴニストが挙げられる。ある態様において、TLR8アゴニストは、別の化合物へ直接結合されている。他の態様において、TLR8アゴニストは、リンカーを介して別の化合物へ結合されている。
【００７５】
TLR8アゴニストとしては、R-848、ならびにその誘導体およびアナログなどの化合物が挙げられるが、これらに限定されない。好適なTLR8アゴニストとしては、五員窒素含有ヘテロ環式環へ縮合された2-アミノピリジンを有する化合物が挙げられる。このような化合物としては、例えば、イミダゾキノリンアミン、例えばしかしこれらに限定されないが、置換イミダゾキノリンアミン、例えば、アミド置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換イミダゾキノリンアミン、ヘテロ環式エーテル置換イミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンエーテル、チオエーテル置換イミダゾキノリンアミン、および6-、7-、8-または9-アリールまたはヘテロアリール置換イミダゾキノリンアミン；テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、例えばしかしこれらに限定されないが、アミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、ヘテロ環式エーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンエーテル、およびチオエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン；イミダゾピリジンアミン、例えばしかしこれらに限定されないが、アミド置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミド置換イミダゾピリジンアミン、尿素置換イミダゾピリジンアミン、アリールエーテル置換イミダゾピリジンアミン、ヘテロ環式エーテル置換イミダゾピリジンアミン、アミドエーテル置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾピリジンアミン、尿素置換イミダゾピリジンエーテル、およびチオエーテル置換イミダゾピリジンアミン；1,2-架橋イミダゾキノリンアミン；6,7-縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン；イミダゾナフチリジンアミン；テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン；オキサゾロキノリンアミン；チアゾロキノリンアミン；オキサゾロピリジンアミン；チアゾロピリジンアミン；オキサゾロナフチリジンアミン；チアゾロナフチリジンアミン；ならびに、ピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミンまたはテトラヒドロナフチリジンアミンへ縮合された1H-イミダゾダイマーが挙げられる。
【００７６】
1つの特定の態様において、TLR8アゴニストは、アミド置換イミダゾキノリンアミンである。代替の態様において、TLR8アゴニストは、スルホンアミド置換イミダゾキノリンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、尿素置換イミダゾキノリンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、アリールエーテル置換イミダゾキノリンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、ヘテロ環式エーテル置換イミダゾキノリンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、アミドエーテル置換イミダゾキノリンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、スルホンアミドエーテル置換イミダゾキノリンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、尿素置換イミダゾキノリンエーテルである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、チオエーテル置換イミダゾキノリンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、6-、7-、8-または9-アリールまたはヘテロアリール置換イミダゾキノリンアミンである。
【００７７】
別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、アミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、スルホンアミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンである。
【００７８】
別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、アリールエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、ヘテロ環式エーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、アミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、スルホンアミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンエーテルである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、チオエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミンである。
【００７９】
別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、アミド置換イミダゾピリジンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、スルホンアミド置換イミダゾピリジンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、尿素置換イミダゾピリジンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、アリールエーテル置換イミダゾピリジンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、ヘテロ環式エーテル置換イミダゾピリジンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、アミドエーテル置換イミダゾピリジンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、スルホンアミドエーテル置換イミダゾピリジンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、尿素置換イミダゾピリジンエーテルである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、チオエーテル置換イミダゾピリジンアミンである。
【００８０】
別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、1,2-架橋イミダゾキノリンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、6,7-縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミンである。
【００８１】
別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、イミダゾナフチリジンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、オキサゾロキノリンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、チアゾロキノリンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、オキサゾロピリジンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、チアゾロピリジンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、オキサゾロナフチリジンアミンである。別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、チアゾロナフチリジンアミンである。
【００８２】
さらに別の代替の態様において、TLR8アゴニストは、ピリジンアミン、キノリンアミン、テトラヒドロキノリンアミン、ナフチリジンアミンまたはテトラヒドロナフチリジンアミンへ縮合された1H-イミダゾダイマーである。
【００８３】
ある態様において、TLR8アゴニストは、選択的TLR8アゴニストであり、例えば、アゴニストは、TLR8を介して細胞活性を調節するが、TLR7を介しては細胞活性を調節しない。TLR8選択的アゴニストとしては、米国特許出願公開第2004/0171086号におけるものが挙げられる。このようなTLR8選択的アゴニスト化合物としては、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}キノリン-3-カルボキサミド、N-{4-[4-アミノ-2-(2-メトキシエチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]ブチル}キノキソリン（quinoxoline）-2-カルボキサミド、およびN-[4-(4-アミノ-2-プロピル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル]モルホリン-4-カルボキサミドを含む、米国特許出願公開第2004/0171086号に示される化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
他の好適なTLR8選択的アゴニストとしては、2-プロピルチアゾロ[4,5-c]キノリン-4-アミン（米国特許第6,110,929号）；N1-[2-(4-アミノ-2-ブチル-1H-イミダゾ[4,5-c][1,5]ナフトリジン（naphthridin）-1-イル)エチル]-2-アミノ-4-メチルペンタンアミド（米国特許第6,194,425号）；N1-[4-(4-アミノ-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)ブチル]-2-フェノキシ-ベンズアミド（米国特許第6,451,810号）；N1-[2-(4-アミノ-2-ブチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)エチル]-1-プロパンスルホンアミド（米国特許第6,331,539号）；N-{2-[2-(4-アミノ-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル)エチオキシ（ethyoxy）]エチル}-N'-フェニル尿素（米国特許出願公開第2004/0171086号）；1-{4-[3,5-ジクロロフェニル)チオ]ブチル}-2-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン（米国特許出願公開第2004/0171086号）；N-{2-[4-アミノ-2-(エトキシメチル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]エチル}-N'-(3-シアノフェニル)尿素（WO 00/76518および米国特許出願公開第2004/0171086号）；および4-アミノ-α,α-ジメチル-2-メトキシエチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-エタノール（米国特許第5,389,640号）が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許出願公開第2004/0171086号における化合物が、TLR8選択的アゴニストとしての使用について含まれる。化合物2-プロピルチアゾロ-4,5-c]キノリン-4-アミンも使用に適している（Gorden et al., 2005上記）。
【００８５】
TLR9アゴニスト
好適なTLR9アゴニストとしては、単離された天然のTLR9アゴニスト；および合成TLR9アゴニストが挙げられる。TLR9アゴニストの天然の供給源から単離されたTLR9アゴニストは、一般的に精製され、例えば、精製されたTLR9アゴニストは、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％純粋、または99％を超えて純粋である。合成TLR9アゴニストは、標準方法によって作製され、一般的に、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％純粋、または99％を超えて純粋である。
【００８６】
TLR9アゴニストとしては、他の化合物へ結合されていないTLR9アゴニストが挙げられる。TLR9アゴニストとしては、第2の化合物へ共有結合的にまたは非共有結合的に結合されているTLR9アゴニストが挙げられる。ある態様において、TLR9アゴニストは、別の化合物へ直接結合されている。他の態様において、TLR9アゴニストは、リンカーを介して別の化合物へ結合されている。
【００８７】
TLR9アゴニスト（本明細書において「TLR9リガンド」とも呼ばれる）の例としては、配列5'-CG-3'を含む核酸（「CpG核酸」）が挙げられ、ある局面において、Cはメチル化されていない。TLR9リガンド分子の文脈において本明細書において交換可能に使用される、用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、任意の長さのポリヌクレオチドを指し、特に、一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または両方を含む）、修飾オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオシドを、単独でまたはより大きな核酸構築物の一部分として、またはポリペプチドなどの非核酸分子との結合体の一部分として、含む。従って、TLR9リガンドは、例えば、一本鎖DNA（ssDNA）、二本鎖DNA（dsDNA）、一本鎖RNA（ssRNA）、または二本鎖RNA（dsRNA）であり得る。TLR9リガンドはまた、粗製の解毒された細菌（例えば、ミコバクテリア）RNAまたはDNA、ならびにTLR9リガンドについて濃縮された濃縮プラスミドを包含する。ある態様において、「TLR9リガンド濃縮プラスミド」は、哺乳類DNAにおいて通常見られるよりも多い数のCpGモチーフを含むかまたは含むように遺伝子操作されている線形または環状プラスミドを指す。
【００８８】
非限定的なTLR9リガンド富化プラスミドの例は、Roman et al. (1997) に記載されている。オリゴヌクレオチドの修飾としては、3'OHまたは5'OH基の修飾、ヌクレオチド塩基の修飾、糖成分の修飾、およびリン酸基の修飾が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
TLR9リガンドは、L糖を含む少なくとも1つのヌクレオシドを含み得る。L糖は、デオキシリボース、リボース、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、ガラクトース、アラビノース、キシロース、リキソース、または糖「アナログ」シクロペンチル基であり得る。L糖は、ピラノシルまたはフラノシル形態であり得る。
【００９０】
TLR9リガンドは、一般的に、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列の発現を提供しないし、提供する要件も存在せず、従って、TLR9リガンドの配列は、非コーディングであり得、一般的に非コーディングである。TLR9リガンドは、線形二本鎖または一本鎖分子、環状分子を含み得、または線形セグメントおよび環状セグメントの両方を含み得る。TLR9リガンドは、一本鎖であり得、または完全にまたは部分的に二本鎖であり得る。
【００９１】
ある態様において、本方法における使用のためのTLR9リガンドは、オリゴヌクレオチドであり、例えば、約5ヌクレオチド〜約200ヌクレオチド、約10ヌクレオチド〜約100ヌクレオチド、約12ヌクレオチド〜約50ヌクレオチド、約15ヌクレオチド〜約25ヌクレオチド、20ヌクレオチド〜約30ヌクレオチド、約5ヌクレオチド〜約15ヌクレオチド、約5ヌクレオチド〜約10ヌクレオチド、または約5ヌクレオチド〜約7ヌクレオチドの長さの配列からなる。ある態様において、長さが約15ヌクレオチド未満、約12ヌクレオチド未満、約10ヌクレオチド未満、または約8ヌクレオチド未満であるTLR9リガンドは、より大きな分子と結合されている。
【００９２】
ある態様において、TLR9リガンドは、真核細胞中におけるペプチドまたはポリペプチドの発現を提供せず、例えば、真核細胞中へのTLR9リガンドの導入は、ペプチドまたはポリペプチドを産生させず、何故ならば、TLR9リガンドは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするmRNAの転写を提供しないためである。これらの態様において、TLR9リガンドは、真核細胞中における転写に必要なプロモーター領域および他の制御エレメントを欠いている。
【００９３】
TLR9リガンドは、細菌から単離され得、例えば、細菌供給源から分離され得；合成法によって作製され得（例えば、ポリヌクレオチドの化学合成についての標準方法によって作製され得）；標準的な組換え法によって作製され、次いで、細菌供給源から単離され得；または上述のものの組み合わせであり得る。多くの態様において、TLR9リガンドは精製され、例えば、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、少なくとも約99％またはそれ以上、例えば99.5％、99.9％またはそれ以上純粋である。多くの態様において、TLR9リガンドは、化学的に合成され、次いで精製される。
【００９４】
他の態様において、TLR9リガンドは、より大きなヌクレオチド構築物（例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、または他のこのような構築物）の一部分である。多種多様のプラスミドおよびウイルスベクターが、当技術分野において公知であり、本明細書において詳述される必要はない。多数のこのようなベクターが、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, (1987, および最新版)を含む、様々な刊行物に記載されている。
【００９５】
一般的に、本組成物において使用されるTLR9リガンドは、少なくとも1つの非メチル化CpGモチーフを含む。ある特定の哺乳類種（例えば、齧歯動物）におけるポリヌクレオチド中のCpG配列の相対位置は、5'-CG-3'である（即ち、Cは3'位のGに対して5'位にある）。
【００９６】
ある態様において、TLR9リガンドは、少なくとも1つのCpG配列を含む中央パリンドロームコア配列を含み、ここで、中央パリンドロームコア配列はホスホジエステル骨格を含有し、中央パリンドロームコア配列は、ホスホロチオアート骨格を含有するポリグアノシン配列によって片側または両側においてフランキングされている
【００９７】
他の態様において、TLR9リガンドは、核酸の5'末端にまたは5'末端付近に1つまたは複数のTCG配列；および少なくとも2つのさらなるCGジヌクレオチドを含む。これらの態様のいくつかにおいて、少なくとも2つのさらなるCGジヌクレオチドは、3ヌクレオチド、2ヌクレオチド、または1ヌクレオチド離れて配置されている。これらの態様のいくつかにおいて、少なくとも2つのさらなるCGジヌクレオチドは、互いに隣接している。これらの態様のいくつかにおいて、TLR9リガンドは、核酸の5'末端に(TCG)nを含み、ここで、n＝1〜3である。他の態様において、TLR9リガンドは、(TCG)nを含み、ここで、n＝1〜3であり、(TCG)n配列は、(TCG)n配列の5'末端において、1ヌクレオチド、2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、または5ヌクレオチドによってフランキングされている。
【００９８】
本発明に有用なTLR9リガンドの例示的なコンセンサスCpGモチーフとしては、以下が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない：5'-プリン-プリン-(C)-(G)-ピリミジン-ピリミジン-3'、ここで、TLR9リガンドは、少なくとも2つのプリンヌクレオチド（例えば、GG、GA、AG、AA、IIなど）および少なくとも2つのピリミジンヌクレオチド（CC、TT、CT、TC、UUなど）によってフランキングされたCpGモチーフを含む；5'-プリン-TCG-ピリミジン-ピリミジン-3'；5'-TCG-N-N-3'；ここで、Nは任意の塩基である；5'-Nx(CG)nNy、ここで、Nは任意の塩基であり、xおよびyは、独立して、0〜200の任意の整数、例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11〜15、16〜20、21〜25、25〜30、30〜50、50〜75、75〜100、100〜150、または150〜200であり；nは、1またはそれ以上である任意の整数、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上である。5'-Nx(TCG)nNy、ここで、Nは任意の塩基であり、xおよびyは、独立して、0〜200の任意の整数、例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11〜15、16〜20、21〜25、25〜30、30〜50、50〜75、75〜100、100〜150、または150〜200であり；nは、1またはそれ以上である任意の整数、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上である。5'-(TCG)n-3'、ここで、nは、1またはそれ以上である任意の整数であり、例えば、TCGベースのTLR9リガンドを提供する（例えば、ここでn＝3であり、ポリヌクレオチドは、配列5'-TCGNNTCGNNTCG-3'；配列番号3）を含む；5'Nm-(TCG)n-Np-3'、ここで、Nは任意のヌクレオチドであり、mは0、1、2、または3であり、nは、1またはそれ以上である任意の整数であり、pは1、2、3、または4であり；5'Nm-(TCG)n-Np-3'、Nは任意のヌクレオチドであり、mは0〜5であり、nは1またはそれ以上である任意の整数であり、pは4またはそれ以上であり、配列N-N-N-Nは、互いに隣接しているかまたは1ヌクレオチド、2ヌクレオチドもしくは3ヌクレオチドだけ離れている、少なくとも2つのCGジヌクレオチドを含む；ならびに5'-プリン-プリン-CG-ピリミジン-TCG-3'。
【００９９】
核酸TLR9リガンドが式：5'-Nm-(TCG)n-Np-3'の配列を含み、式中、Nは任意のヌクレオチドであり、mは0〜5であり、nは1またはそれ以上の任意の整数であり、pは4またはそれ以上であり、配列N-N-N-Nは、互いに隣接しているかまたは1ヌクレオチド、2ヌクレオチドもしくは3ヌクレオチドだけ離れている、少なくとも2つのCGジヌクレオチドを含む場合、本発明において有用な例示的なTLR9リガンドとしては、以下が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない：（1）n＝2であり、NpがNNCGNNCGである、前記式の配列；（2）n＝2であり、NpがAACGTTCGである、前記式の配列；（3）n＝2であり、NpがTTCGAACGである、前記式の配列；（4）n＝2であり、NpがTACGTACGである、前記式の配列；（5）n＝2であり、NpがATCGATCGである、前記式の配列；（6）n＝2であり、NpがCGCGCGCGである、前記式の配列；（7）n＝2であり、NpがGCCGGCCGである、前記式の配列；（8）n＝2であり、NpがCCCGGGCGである、前記式の配列；（9）n＝2であり、NpがGGCGCCCGである、前記式の配列；（10）n＝2であり、NpがCCCGTTCGである、前記式の配列；（11）n＝2であり、NpがGGCGTTCGである、前記式の配列；（12）n＝2であり、NpがTTCGCCCGである、前記式の配列；（13）n＝2であり、NpがTTCGGGCGである、前記式の配列；（14）n＝2であり、NpがAACGCCCGである、前記式の配列；（15）n＝2であり、NpがAACGGGCGである、前記式の配列；（16）n＝2であり、NpがCCCGAACGである、前記式の配列；および（17）n＝2であり、NpがGGCGAACGである、前記式の配列；ここで、1〜17のいずれにおいても、m＝0、1、2、または3である。
【０１００】
核酸TLR9リガンドが式：5'Nm-(TCG)n-Np-3'の配列を含み、式中、Nは任意のヌクレオチドであり、mは0、1、2、または3であり、nは1またはそれ以上の任意の整数であり、pは1、2、3、または4である場合、本発明において有用な例示的なTLR9リガンドとしては、以下が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない：（1）m＝0であり、n＝1であり、NpがT-T-Tである、前記式の配列；（2）m＝0であり、n＝1であり、NpがT-T-T-Tであり、前記式の配列；（3）m＝0であり、n＝1であり、NpがC-C-C-Cである、前記式の配列；（4）m＝0であり、n＝1であり、NpがA-A-A-Aである、前記式の配列；（5）m＝0であり、n＝1であり、NpがA-G-A-T、前記式の配列；（6）NmがTであり、n＝1であり、NpがT-T-Tである、前記式の配列；（7）NmがAであり、n＝1であり、NpがT-T-Tである、前記式の配列；（8）NmがCであり、n＝1であり、NpがT-T-Tである、前記式の配列；（9）NmがGであり、n＝1であり、NpがT-T-Tである、前記式の配列；（10）NmがTであり、n＝1であり、NpがA-T-Tである、前記式の配列；（11）NmがAであり、n＝1であり、NpがA-T-Tである、前記式の配列；および（12）NmがCであり、n＝1であり、NpがA-T-Tである、前記式の配列。
【０１０１】
本発明に有用なTLR9リガンドのコア構造は、任意の数または組成のヌクレオチドまたはヌクレオシドによって上流および／または下流でフランキングされている場合がある。ある態様において、TLR9リガンドのコア配列は、少なくとも6塩基または8塩基の長さであり、完全なTLR9リガンド（コア配列＋フランキング配列  5'、3'または両方）は、通常、6塩基または8塩基と約200塩基までとの間の長さである。
【０１０２】
本発明に有用なDNAベースのTLR9リガンドとしては、以下のヌクレオチド配列の1つまたは複数を含むポリヌクレオチドが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない：
2015199747.tif 000004
【０１０３】
本発明に有用なさらなるTLR9リガンドとしては、以下のヌクレオチド配列の1つまたは複数を含むポリヌクレオチドが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない：
2015199747.tif 000005
（式中、「X」は任意のヌクレオチドである）。
【０１０４】
本発明に有用なDNAベースのTLR9リガンドとしては、以下のオクタマーヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない：
2015199747.tif 000006
【０１０５】
本方法の実施において有用なTLR9リガンドは、上記CpGモチーフのいずれかの1つまたは複数を含み得る。例えば、本発明において有用なTLR9リガンドは、同一のCpGモチーフを単数または多数（例えば、2、3、4、5またはそれ以上）含み得る。あるいは、TLR9リガンドは、多数のCpGモチーフ（例えば、2、3、4、5またはそれ以上）を含み得、ここで、多数のCpGモチーフのうちの少なくとも2つが、異なるコンセンサス配列を有するか、またはTLR9リガンド中の全てのCpGモチーフが、異なるコンセンサス配列を有する。
【０１０６】
本発明において有用なTLR9リガンドは、パリンドローム領域を含んでも含まなくてもよい。存在する場合、パリンドロームは、存在する場合、コアヘキサマーまたはオクタマー配列中における、CpGモチーフのみに広がり得るか、または、より多くのヘキサマーまたはオクタマー配列およびフランキングヌクレオチド配列を含み得る。
【０１０７】
多量体TLR9リガンド
ある態様において、TLR9リガンドは多量体である。多量体TLR9リガンドは、非共有結合を介して連結された、共有結合を介して連結された、互いに直接連結された、または1つまたは複数のスペーサーを介して連結された、上述のような、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の個々の（単量体）核酸TLR9リガンドを含む。好適なスペーサーは、それらが生体適合性である限り、核酸および非核酸分子を含む。ある態様において、多量体TLR9リガンドは、単量体TLR9リガンドの線形配列を含む。他の態様において、多量体TLR9リガンドは、単量体TLR9リガンドの分岐した、またはデンドリマー状の配列である。
【０１０８】
ある態様において、多量体TLR9リガンドは、一般構造(X1)n(X2)nを有し、式中、Xは、約6ヌクレオチド〜約200ヌクレオチド、例えば、約6ヌクレオチド〜約8ヌクレオチド、約8ヌクレオチド〜約10ヌクレオチド、約10ヌクレオチド〜約12ヌクレオチド、約12ヌクレオチド〜約15ヌクレオチド、約15ヌクレオチド〜約20ヌクレオチド、約20ヌクレオチド〜約25ヌクレオチド、約25ヌクレオチド〜約30ヌクレオチド、約30ヌクレオチド〜約40ヌクレオチド、約40ヌクレオチド〜約50ヌクレオチド、約50ヌクレオチド〜約60ヌクレオチド、約60ヌクレオチド〜約70ヌクレオチド、約70ヌクレオチド〜約80ヌクレオチド、約80ヌクレオチド〜約90ヌクレオチド、約90ヌクレオチド〜約100ヌクレオチド、約100ヌクレオチド〜約125ヌクレオチド、約125ヌクレオチド〜約150ヌクレオチド、約150ヌクレオチド〜約175ヌクレオチド、または約175ヌクレオチド〜約200ヌクレオチドの長さを有する、上述のような核酸TLR9リガンドであり；ここで、nは、1〜約100の任意の数字、例えば、n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10〜約15、15〜約20、20〜約25、25〜約30、30〜約40、40〜約50、50〜約60、60〜約70、70〜約80、80〜約90、または90〜約100である。これらの態様において、XおよびX2は、少なくとも1つのヌクレオチドだけ互いにヌクレオチド配列が相違し、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の塩基だけ互いにヌクレオチド配列が相違し得る。
【０１０９】
上述したように、ある態様において、本発明の多量体TLR9リガンドは、隣接するTLR9リガンドからスペーサーによって離されたTLR9リガンドを含む。ある態様において、スペーサーは、非TLR9リガンド核酸である。他の態様において、スペーサーは、非核酸部分である。好適なスペーサーとしては、米国特許出願公開第20030225016号に記載されるものが挙げられる。TLR9リガンドは、任意の公知の方法を使用して多量体化される。
【０１１０】
TLR9リガンド修飾
本組成物における使用に適したTLR9リガンドは、様々な方法で修飾され得る。例えば、TLR9リガンドは、骨格リン酸基修飾（例えば、メチルホスホナート、ホスホロチオアート、ホスホロアミダートおよびホスホロジチオアートヌクレオチド間結合）を含み得、この修飾は、例えば、インビボでのそれらの安定性を増強し得、それらを治療適用において特に有用にする。特に有用なリン酸基修飾は、核酸TLR9リガンドのホスホロチオアートまたはホスホロジチオアート形態への変換である。ホスホロチオアートおよびホスホロジチオアートは、それらの未修飾オリゴヌクレオチド相当物よりもインビボでの分解に対してより抵抗性であり、TLR9リガンドの半減期を増加させ、それらを治療される被験体に対してより利用可能にする。
【０１１１】
本発明によって包含される他の修飾TLR9リガンドとしては、5'末端に、3'末端に、または5'末端および3'末端の両方に修飾を有するTLR9リガンドが挙げられる。例えば、5'および／または3'末端は、例えば、TLR9リガンドのバイオアベイラビリティーを増加させる、望ましい場合は取り込み効率を増加させる、関心対象の細胞への送達を促進するなどのために、分子（核酸、非核酸、または両方のいずれか）と共有または非共有結合され得る。TLR9リガンドへの結合のための分子としては、コレステロール、リン脂質、脂肪酸、ステロール、オリゴ糖、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン）、ペプチド、抗原（例えば、ペプチド、小分子など）、線形または環状核酸分子（例えば、プラスミド）、不溶性支持体、治療用ポリペプチドなどが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。TLR9アゴニストへの結合に適している治療用ポリペプチドとしては、樹状細胞増殖因子（例えば、GM-CSF）；サイトカイン；インターフェロン（例えば、IFN-α、IFN-βなど）；TNF-αアンタゴニストなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
TLR9リガンドは、ある態様において、不溶性支持体上へ連結される（例えば、結合、共有結合、非共有結合、または吸着される）。不溶性支持体の例示的な非限定的な例は、カチオン性ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)である。
【０１１３】
さらなるTLR9リガンド結合体、およびこれらの製造方法は、当技術分野において公知であり、例えば、WO 98/16427およびWO 98/55495に記載されている。従って、用語「TLR9リガンド」は、核酸TLR9リガンドを含む結合体を含む。
【０１１４】
ポリペプチド、例えば、治療用ポリペプチドは、TLR9リガンドへ、直接的にまたは間接的に、例えばリンカー分子を介して、結合され得る。多種多様のリンカー分子が、当技術分野において公知であり、結合体において使用され得る。ペプチドからオリゴヌクレオチドへの連結は、ペプチド反応性側鎖、またはペプチドのNもしくはC末端を介してであり得る。オリゴヌクレオチドからペプチドへの連結は、3'もしくは5'末端、または内部においてであり得る。リンカーは、有機、無機、または半有機分子であり得、有機分子、無機分子のポリマー、または無機分子および有機分子の両方を含むコポリマーであり得る。
【０１１５】
存在する場合、リンカー分子は、一般的に、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドならびに連結されたポリペプチドが、オリゴヌクレオチドおよびポリペプチドの間でのいくらかのフレキシブルな運動を可能にするに十分な長さのものである。リンカー分子は、一般的に、約6〜50原子長である。リンカー分子はまた、例えば、アリールアセチレン、2〜10のモノマー単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであり得る。オリゴヌクレオチドへ結合し得る他のリンカー分子が、本開示を考慮して使用され得る。
【０１１６】
b．NOD様受容体（NLR）アゴニスト
NOD様受容体（NLR）は、炎症およびアポトーシス反応の調節において様々な機能を有し得る細胞質タンパク質である。およそ20のこれらのタンパク質が、哺乳類ゲノムにおいて発見され、これらには、NODおよびNALPと呼ばれる2つの主要なサブファミリー、MHCクラスIIトランス活性化因子（CIITA）、ならびにいくつかの他の分子（例えば、IPAFおよびBIRC1）が含まれる。現在の理解によって、これらのタンパク質のうちのいくつかは、内因性もしくは微生物分子またはストレス反応を認識し、炎症性カスパーゼ（例えば、カスパーゼ1）を活性化するオリゴマーを形成してIL-1などの重要な炎症性サイトカインの切断および活性化を引き起こし、および／またはNF-κBシグナル伝達経路を活性化して炎症性分子の産生を誘導することが示唆されている。NLRファミリーは、CATERPILLER（またはCLR）またはNOD-LRRファミリーを含む、いくつかの異なる名称で公知である。
【０１１７】
リガンドは、現在、NOD1およびNOD2について公知である。NOD1は、グラム陰性細菌のみのペプチドグリカン成分である、meso-DAPと呼ばれる分子を認識する。NOD2タンパク質は、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方のペプチドグリカン成分である、細胞内MDP（ムラミルジペプチド）を認識する。NODは、RIP2と呼ばれるセリン-トレオニンキナーゼを介してNF-κBおよびMAPキナーゼの経路においてシグナルを伝達する。NODタンパク質は、ヌクレオチド三リン酸に結合するヌクレオチド結合オリゴマー化ドメインを含むために、そのように命名されている。NODは、N末端CARDドメインを介してシグナル伝達し、下流遺伝子誘導事象を活性化し、C末端ロイシンリッチリピート（LRR）領域によって微生物分子と相互作用する。
【０１１８】
NODと同様に、NALPタンパク質は、調節ドメインとして作用するようであり微生物病原体の認識に関与し得る、C末端LRRを含有する。さらにNODと同様に、これらのタンパク質もまた、ヌクレオチド三リン酸についてのヌクレオチド結合部位（NBS）を含有する。他のタンパク質（例えば、アダプター分子ASC）との相互作用は、N末端ピリン（PYD）ドメインを介して媒介される。ヒトにおいて、このサブファミリーの14のメンバーが存在する（NALP1〜NALP14と呼ばれる）。NALP3の突然変異は、自己炎症性疾患、家族性感冒自己炎症性症候群、マックル-ウェルズ症候群、および新生児期発症多臓器性炎症性疾患の原因である。NALP3の活性化因子としては、ムラミルジペプチド、細菌DNA、ATP、毒素、二本鎖RNA、パラミクソウイルス、および尿酸結晶が挙げられる。
【０１１９】
他のNLR、例えば、IPAFおよびNAIP5/Bircleもまた、サルモネラおよびレジオネラに応答してカスパーゼ-1を活性化することが示された。
【０１２０】
NLRアゴニストとしては、GM-トリペプチド（シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri））、Meso-ランチオニン（ヘリコバクター・ピロリ）、meso-DAP、γ-D-Glu-DAP（iEDAP）（腸侵入性大腸菌（Enteroinvasive Escherichia coli））、D-ラクチル-L-ala-γ-Glu-meso-DAP-Gly（FK156）（シュードモナス属）、ヘプタノリル-γ-Glu-meso-DAP-D-ala（FK565）（クラミジア属、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocyotgenes））、MDP（リステリア・モノサイトゲネス）、MurNAc-L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys （M-TRILys）（肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・フレックスネリ（Salmonella flexneri））、フラジェリン、細菌RNA、ATP、ニゲリシン、マイトトキシン、尿酸結晶、アエロリジン、および炭疽致死毒素が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
c．RIG様受容体（RLR）アゴニスト
体内の様々な細胞が、感染性ウイルスを感知し、抗ウイルス先天性反応として集合的に公知の反応を開始させることができる。これらの反応は、I型インターフェロン（IFN）などの抗ウイルスサイトカインの産生、および抗ウイルス酵素の続いての合成を含み、これらは、ウイルス複製の損傷および適応免疫反応の促進を担う。RIG（レチノイン酸誘導性遺伝子）様受容体は、先天性免疫系の成分を誘発するウイルスRNA分子を感知する。RLRについてのリガンドとしては、ssRNA、dsRNA、ポリイノシン-ポリシチジル酸（「ポリ(rI:rC)」、二本鎖RNA（dsRNA）の合成アナログ、ならびに他のウイルス核酸−RNAウイルスゲノム部分を含む（例えば、日本脳炎ウイルス（JEV）、水疱性口内炎ウイルス（VSV）、インフルエンザウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、レオウイルス、および脳心筋炎ウイルス（EMCV））−およびそれらのアナログが挙げられるが、これらに限定されない。RNAセグメントまたはアナログは、少なくとも20、25、30、35、40またはそれ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド対または等価物であり得る。ある局面において、RNAは5'三リン酸RNAである。
【０１２２】
d．白血球免疫グロブリン様受容体（LIR）アゴニスト
LIR-1に対して63〜84％アミノ酸同一性を有する、8個のLIR-1関連分子のクローニング（Fanger et al., 1999、およびその中の参考文献を参照のこと）が、免疫受容体の新規のファミリー（LIR）を確立した。LIRは、それらの構造に従って分類され得る。5つのLIR（1、2、3、5、および8）は、2、3または4つの免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ITIM）様配列を含有する細胞質ドメインを有する。2つのチロシンモチーフ（モチーフ番号2および3；I/VxYxxL/V）はオリジナルのITIMコンセンサス配列と一致するが、これらのLIRのいくつかは、チロシンの2アミノ酸上流にアスパラギン残基（モチーフ番号1；NxYxxL/V）またはセリン残基（モチーフ番号4；SxYxxL/V）が配置されたチロシモチーフを含有する。ITIM含有LIRとは対照的に、3つのLIR（6a、6b、および7）は、短い細胞質領域、および膜貫通ドメイン中に正電荷のアルギニン残基を含有する。
【０１２３】
LIRファミリーのメンバーは、MHCクラスI分子に結合する。LIR-1およびLIR-2は、HLA-A（A0101、A0301）、HLA-B（B0702、B0802、B1501、B2702）、およびHLA-C（C0304）対立遺伝子ならびに非古典的クラスI分子HLA-G1を認識する。従って、LIR-1およびLIR-2の結合特異性は、MHCクラスI対立遺伝子の比較的制限されたサブセットならびにCD94/NKG2Aを認識する、KIRのそれとは異なる。後者の分子は、特異的MHCクラスI抗原のシグナル配列に由来するペプチドによってその結合ポケットが占められるHLA-Eを認識する。
【０１２４】
2．微生物成分
a．EF2505
ある局面において、このような感染症を有するかまたは発症する危険性がある個体における微生物感染症を治療、抑制または軽減する方法が意図され、該方法は、有効量のStIRペプチド、例えば、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）タンパク質EF2505（配列番号1）、またはそのフラグメントもしくは誘導体を前記個体へ投与する工程を含む。典型的に、個体または被験体は、病原性微生物へ曝露されたか、またはこのような曝露の危険性がある。ある局面において、StIRペプチドは、精製または単離されたポリペプチドまたはペプチドである。用語「精製された」または「単離された」は、成分が他のタンパク質から以前に単離または精製されたこと、および成分が組成物に処方される前は少なくとも約70、75、80、90、95、97、または99％純粋であることを意味する。ある態様において、精製または単離された成分は、約または少なくとも約95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5％またはそれ以上純粋であり、またはそこにおいて誘導可能な任意の範囲だけ純粋である。次いで、このような精製された成分は、本明細書に記載される組成物を形成するために他の成分と混合され得る。
【０１２５】
組換えStIRタンパク質、例えばEF2505、またはそのフラグメントもしくはセグメントまたはそのアナログは、配列番号1の、少なくとも、多くとも、または約5、10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、1600または1651連続アミノ酸（その間の全ての値及び範囲を含む）を含む。ある局面において、そのフラグメントまたはアナログは、配列番号1の、アミノ酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120からアミノ酸100、150、200、250、300、350、355、360、365、370、375、380、390、395、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450までのアミノ酸配列（その間の全ての値及び範囲を含む）を少なくともまたは多くともまたはおよそ含む。さらなる局面において、そのポリペプチドフラグメントまたはアナログとしては、配列番号1の、少なくとも、多くとも、または約アミノ酸20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30からアミノ酸440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450までを含む、アミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。ある局面において、そのポリペプチドセグメントもしくはフラグメントまたはアナログとしては、配列番号1の、少なくともまたは多くともまたは約アミノ酸28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、200、250からアミノ酸440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450までを含む、アミノ酸配列（その間の全ての値及び範囲を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。なおさらなる局面において、そのポリペプチドフラグメントまたはアナログは、その間の全ての値及び範囲を含む、配列番号1のアミノ酸28〜449、28〜442、111〜449、111〜442、223〜449、または223〜442と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％同一であるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む。StIRタンパク質またはそのセグメントの誘導体または変異体は、挿入、欠失および点突然変異を含む。特定の挿入突然変異は、カルボキシまたはアミノ末端で、EF2505タンパク質に対して外因性のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質である。
【０１２６】
ある局面において、StIRタンパク質またはそのフラグメントもしくはセグメントもしくは誘導体は、噴霧化またはエアロゾル化製剤で投与される。組成物は、吸入または吸息によって投与され得る。StIRまたはそのフラグメントもしくは誘導体は、約0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70μgまたはmg／個体体重のkgから約55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200μgまたはmg／個体体重のkgまでの量で投与され得る。他の局面において、被験体に、約0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200μgまたはmgのStIRポリペプチドまたはペプチドまたはその変異体もしくは誘導体もしくはアナログが投与され得る。下記の開示に基づいて、当業者は、StIRポリペプチド、例えば、エンテロコッカス・フェカリスタンパク質EF2505の有用なセグメント、フラグメント、または誘導体を容易に決定することができる。1つの好ましい局面において、フラグメント、セグメント、または誘導体は、配列番号1の配列と少なくとも75％同一である。別の局面において、フラグメント、セグメント、または誘導体は、配列番号1の配列と少なくとも80％同一である。別の局面において、フラグメント、セグメント、または誘導体は、配列番号1の配列と少なくとも85％同一である。別の局面において、フラグメント、セグメント、または誘導体は、配列番号1の配列と少なくとも90％同一である。別の局面において、フラグメント、セグメント、または誘導体は、配列番号1の配列と少なくとも95％同一である。
【０１２７】
さらに別の態様において、本発明は、1つまたは複数のStIRポリペプチド（例えば、エンテロコッカス・フェカリスタンパク質EF2505）またはそのフラグメントもしくはセグメントもしくは誘導体もしくはアナログ；抗炎症剤；抗微生物剤；および／または1つまたは複数の薬学的賦形剤を含む、薬学的に許容される組成物に関する。典型的に、このような組成物は、無菌でありかつ病原性微生物を本質的に含まない。
【０１２８】
b．フラジェリン
ある局面において、StIR組成物は、TLR5アゴニストとして公知であるペプチド
2015199747.tif 000007
の10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22連続アミノ酸を含むフラジェリンポリペプチド、またはそのセグメントもしくは誘導体を含む。本発明のポリペプチドはまた、配列番号2と少なくとも70、80、または90％（その間の全ての値及び範囲を含む）同一であるアミノ酸配列を含み得る。他の局面において、フラジェリンは、合成されたおよび／または精製または単離されたフラジェリンポリペプチドまたはペプチドである。用語「精製された」または「単離された」は、成分が他のタンパク質または合成試薬または副生成物から以前に単離または精製されたこと、および成分が組成物に処方される前は少なくとも約95％純粋であることを意味する。ある態様において、精製または単離された成分は、約または少なくとも約80、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5％またはそれ以上純粋であり、またはそこにおいて誘導可能な任意の範囲だけ純粋である。次いで、このような精製された成分は、本明細書に記載される組成物を形成するために他の成分と混合され得る。
【０１２９】
組換えフラジェリンタンパク質またはそのフラグメントもしくはセグメントは、配列番号2または他のフラジェリンポリペプチドの、その間の全ての値及び範囲を含む、5、10、15、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、または400連続アミノ酸を含む。これらのフラグメントまたはセグメントは、配列番号2または他のフラジェリンポリペプチド（falgellin polypetide）と少なくとも、多くとも、または約70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％同一である。ある局面において、フラジェリンポリペプチドまたはセグメントは、配列番号2の配列と少なくとも75％同一である。別の局面において、フラジェリンポリペプチドまたはセグメントは、配列番号2の配列と少なくとも80％同一である。別の局面において、フラジェリンポリペプチドまたはセグメントは、配列番号2の配列と少なくとも85％同一である。別の局面において、フラジェリンポリペプチドまたはセグメントは、配列番号2の配列と少なくとも90％同一である。別の局面において、フラジェリンポリペプチドまたはセグメントは、配列番号2の配列と少なくとも95％同一である。フラジェリンまたはそのセグメントの誘導体または変異体は、配列番号2の挿入、欠失および点突然変異を含む。特定の挿入突然変異は、カルボキシまたはアミノ末端で、フラジェリンに対して外因性のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質である。多数のフラジェリンタンパク質が当技術分野において公知であり、これらとしては、以下のアクセッション番号を有するフラジェリンが挙げられるがこれらに限定されない：
2015199747.tif 000008
これらの各々は、本出願の優先日の時点で、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１３０】
c．微生物溶解物
本発明の態様はまた、本質的に非病原性の微生物の溶解物、抗炎症剤、および1つまたは複数の薬学的賦形剤を含む薬学的に許容される組成物であって、該組成物が、無菌でありかつ病原性微生物を本質的に含まない組成物を含む。微生物溶解物は、典型的に、超音波処理され；ホモジナイズされ；放射線照射され；気圧的、気体的、界面活性剤、または酵素的方法およびそれらの組み合わせによって溶解される。特定の局面において、微生物溶解物は、溶解の前、間、または後に、UV照射される。微生物溶解物としては、細菌、真菌またはウイルス溶解物が挙げられ得るが、これらに限定されない。ある態様において、微生物溶解物は、細菌溶解物である。溶解物が調製される微生物は、有毒な微生物である必要はなく、典型的に、有毒な微生物ではない。本発明の局面は、被験体の健康に対して限定的な影響を有する細菌から誘導された溶解物を含む。限定的な影響は、少なくとも、多くとも、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10日の期間にわたって、被験体の組織、器官、または系の機能において最小限の有害反応および僅かな損傷を引き起こすことを指す。
【０１３１】
本発明の組成物は、保護または治療が求められる有毒な生物から直接誘導される必要はない。細菌は、ヘモフィルス属に由来し得るが、ヘモフィルス属に限定されない。被験体において有害効果の最小限の脅威を引き起こす細菌が、確認され得る。ある局面において、細菌は、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、特に、無莢膜型インフルエンザ菌（non-typeable Haemophilus influenzae）（NTHi）である（Clement et al., 2008；Clement et al., 2009；Evans et al., 2010；Tuvim et al., 2009）。
【０１３２】
微生物溶解物は、その間の全ての値及び範囲を含む、少なくとも約、約、または多くとも約0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5または10 mg/mlのタンパク質濃度を有し得る。ある局面において、微生物溶解物は、少なくとも約、約、または多くとも約10 mg/mlのタンパク質濃度を有し得る。
【０１３３】
本発明の態様は、気道を介して投与され得る微生物溶解物を含む。ある局面において、投与は吸入による。さらなる局面において、組成物は、エアロゾル化されるか、または被験体によって吸入され得る形態である。ある態様において、溶解物組成物は、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）を含む、抗炎症剤を含む。さらなる詳細については、米国特許出願第11/830,622号 "Compositions and methods for simulation of lung innate immunity" Dickey et al.を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１３４】
B．宿主または自己由来（autolgous）成分
被験体または宿主の細胞および組織に由来する多数の分子が、免疫反応の発生を刺激、増強し得るか、またはこれに寄与し得る。これらの部分は、宿主または自己由来部分または成分と呼ばれ、これらとしては、損傷した、ストレスを受けた、または瀕死の細胞から放出される小分子；微生物の（microcroial）殺滅または中和に関与する成分；サイトカイン；および細胞または組織から放出される高分子が挙げられる。
【０１３５】
1．小分子宿主化合物
損傷した、ストレスを受けた、または瀕死の細胞に関連するまたはこれから放出される小分子、例えば、アデノシン5'-三リン酸（ATP）、尿酸（尿酸塩）、およびアデノシン。これらの分子の多くについての受容体およびそれらが炎症を調節する経路は、十分に規定されている。炎症は、感染または刺激に対する免疫系の最初の反応の1つである。炎症は、損傷細胞によって放出される化学因子によって刺激され、感染症の広がりに対する物理的バリアを確立し、病原体の排除後の損傷組織の治癒を促進するに役立つ。炎症の間に産生される化学因子（ヒスタミン、ブラジキニン、セロトニン、ロイコトリエン、さらにプロスタグランジン）は、痛覚受容体を過敏にし、現場で血管拡張を引き起こし、貪食細胞、特に好中球を引き付ける。次いで、好中球は、他の白血球およびリンパ球を召集する因子を放出することによって、免疫系の他の部分を誘発する。
【０１３６】
本発明のStIR組成物中に含まれ得る小分子宿主成分としては、ATP、アデノシン、ヒスタミン、ブラジキニン、セロトニン、ロイコトリエン、プロスタグランジンが挙げられる。
【０１３７】
2．細胞外宿主部分
直接的な微生物殺滅および／またはシグナル伝達において役割を有する細胞外宿主タンパク質、例えば、補体、ペントラキシン、デフェンシン、およびカテリシジン。これらの分子は、しばしば、構成的に存在するが、微生物産物への結合、またはタンパク分解性切断、またはなんらかの他の活性化機構によってそれらが活性化されるまで、シグナル伝達しない。さらに、それらの産生は増加され得る。ある局面において、これらのタンパク質は、活性化形態である（インビトロ活性化またはプロセッシング、またはタンパク質の操作のいずれかによって）。
【０１３８】
補体系は、生物から病原体を排除するのを助ける生化学的カスケードである。それは、適応可能ではなく個体の寿命にわたって変化しない、より大きな免疫系の一部分であり；従って、それは先天性免疫系に属する。しかし、それは、適応免疫系によって動員および作動され得る。
【０１３９】
補体系は、血液中において見られ、通常は不活性チモーゲンとして循環している、多数の小さなタンパク質からなる。いくつかのトリガーの1つによって刺激されると、前記系中のプロテアーゼは、特定のタンパク質を切断し、サイトカインを放出し、さらなる切断の増幅カスケードを開始する。この活性化カスケードの最終結果は、反応の大規模な増幅および細胞を殺滅する膜侵襲複合体の活性化である。20を超えるタンパク質およびタンパク質フラグメントが、補体系を構成しており、これらには、血清タンパク質、漿膜タンパク質、および細胞膜受容体が含まれる。これらのタンパク質は、主に肝臓において合成され、それらは、血清のグロブリン分画の約5％を占める。
【０１４０】
StIR組成物に含まれ得る補体系の成分としては、C1複合体（C1q、C1r、C1sおよびC1qr2s2）、C1r2s2、C4、C2、C4a、C4b、C2a、C2b  C3転換酵素（C4b2a複合体）、C3a、C3b；C5転換酵素（C4bC2aC3b複合体）、崩壊促進因子（DAF）、B因子、C3bB、D因子、Ba、Bb、C3bBb、C3bBbC3b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、および膜侵襲複合体（MAC）（C5b6789）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
ペントラキシンは、カルシウム依存性リガンド結合、およびマメ科レクチンのそれと同様の特徴的な平らなβゼリーロール構造を典型的に有する、タンパク質のファミリーである。「短い」ペントラキシンとしては、血清アミロイドP成分（SAP）およびC反応性タンパク質（CRP）が挙げられる。「長い」ペントラキシンとしては、PTX3（サイトカイン調節分子）およびいくつかのニューロンペントラキシンが挙げられる。
【０１４２】
デフェンシンは、脊椎動物および無脊椎動物の両方において見られる小さいシステインリッチなカチオン性タンパク質である。それらは、細菌、真菌、ならびに多くのエンベロープおよび非エンベロープウイルスに対して活性である。それらは、6個（脊椎動物において）から8個の保存システイン残基を含む、18〜45個のアミノ酸からなる。免疫系の細胞は、例えば好中性顆粒球（neutrophil granulocyte）およびほとんど全ての上皮細胞において、貪食された細菌を殺滅するのを助けるために、これらのペプチドを含有する。大抵のデフェンシンは、微生物細胞膜へ結合し、いったん埋め込まれると、必須のイオンおよび栄養素の流出を可能にする細孔様膜欠損を形成することによって、機能する。
【０１４３】
本発明のStIR組成物中に含められ得るデフェンシンとしては、α-デフェンシン（DEFA1、DEFA1A3、DEFA3、および／またはDEFA4）、β-デフェンシン（DEFB1、DEFB4、DEFB103A/DEFB103B〜DEFB107A/DEFB107B、DEFB110〜DEFB133）、および／またはθ-デフェンシン（DEFT1P）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
カテリシジン抗微生物性ペプチドは、多形核白血球（PMN）中のリソソームにおいて見られるポリペプチドのファミリーである。抗微生物性ポリペプチドのカテリシジンファミリーのメンバーは、高度に保存された領域（カテリンドメイン）および高度に可変性のカテリシジンペプチドドメインを特徴とする。カテリシジンペプチドは、哺乳動物の多くの異なる種から単離された。カテリシジンは、初めは好中球において発見されたが、それ以来、細菌、ウイルス、真菌またはホルモン1,25-Dによって活性化される上皮細胞およびマクロファージを含む多くの他の細胞において発見された。カテリシジンファミリーは、システインプロテイナーゼ阻害剤のカテプシンファミリーと一次配列相同性を共有するが、このようなプロテアーゼ阻害において重要であると考えられるアミノ酸残基は、通常、欠けている。
【０１４５】
3．サイトカイン
サイトカインは、細胞伝達において広範囲に使用されるシグナル伝達分子のカテゴリーである。それらは、タンパク質、ペプチドまたは糖タンパク質である。用語、サイトカインは、多様な発生学的起源の細胞によって体内にわたって広く産生される、ポリペプチド調節因子の大きく多様なファミリーを包含する。サイトカインの作用は、オートクリン、パラクリン、およびエンドクリンであり得る。サイトカインは、免疫系だけに限定されないが、先天および適応免疫反応の両方の発達および機能に重要である。それらは、病原体と遭遇した免疫細胞によってしばしば分泌され、それによって、さらなる免疫細胞を活性化および動員し、病原体に対する前記系の反応を増加させる。
【０１４６】
先天性免疫細胞、特に上皮細胞の、抗微生物防御を刺激するサイトカイン、例えば、IL-17、IL-22、IFN-y。ある場合において、これは、IL-17がTh17細胞によって産生される（prodnced）場合のように、適応先天性免疫系による先天炎症の増幅を示す。他の場合において、サイトカインは、適応免疫系の一部分ではない細胞によって、例えば、上皮細胞、間葉細胞、または樹状細胞によって、放出される。
【０１４７】
本発明のStIR組成物中に含まれ得るサイトカインとしては、IL-1スーパーファミリー1（(IL-1Ra)、IL-18、IL-33）；IL-6様/gp130利用ファミリー（IL-6、IL-11、IL-27、IL-30、IL-31、オンコスタチンM、白血病抑制因子、毛様体神経栄養因子、カルジオトロフィン1）；IL-10ファミリー（IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24、IL-26）；III型インターフェロン（IL-28、IL-29）；共通γ鎖ファミリー（IL-2/15、IL-3、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-21）；IL-12ファミリー（IL-12、IL-23、IL-27、IL-35）、IL-5；IL-8；IL-14；IL-16；IL-17/25；IL-32；CCLケモカイン（CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28）；CXCLケモカイン（CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17）；CX3CL-1；XCL1；XCL2；TNF（リガンド）スーパーファミリー（4-1BBリガンド、B細胞活性化因子、FASリガンド、リンホトキシン、OX40L、RANKL、TRAIL）；分化サイトカインのクラスター（CD70、CD153、CD154）；インターフェロン（IFN-Iα（ペグ化2a、ペグ化2b）、IFN-Iβ（Ia、Ib））、IFN-IIγ、およびIFN-IIIが挙げられる。
【０１４８】
4．高分子宿主部分
細胞外基質、細胞表面、または細胞内部から放出され得、先天性免疫（innate inmmme）シグナル伝達を活性化し得る、高分子またはそのフラグメント、例えば、デクチン、バーシカン、HMGB-I、DNAおよびRNA。典型的に、これらの高分子は、通常、細胞内部に、標的受容体から隠されているか、または分子内または分子間相互作用によってマスクされている。それらは、細胞破壊後に、またはシグナル伝達部分を露出するための基質の細胞表面のタンパク質分解後に、またはなんらかの同様の機構の後に、放出され、標的受容体と相互作用する。
【０１４９】
II．ポリペプチドおよびペプチド組成物
ある態様において、本発明は、少なくとも1つのポリペプチドまたはペプチド（例えば、ポリペプチドセグメント）またはその誘導体もしくは変異体に関する。本明細書において使用される場合、「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「ポリペプチドまたはペプチド組成物」または「ポリペプチドまたはペプチド化合物」は、一般的に、少なくとも5個のアミノ酸またはアミノ酸アナログ（集合的にアミノ分子、下記を参照のこと）のタンパク質またはポリペプチドを指すが、これに限定されない。上述の「ポリペプチドまたはペプチド」という用語は全て、本明細書において交換可能に使用され得る。
【０１５０】
ある態様において、少なくとも1つのポリペプチドまたはペプチド分子のサイズは、少なくとも、多くとも、または約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、100、500、1000から約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、100、500、またはそれ以上のアミノ分子残基を有する分子、およびそこにおいて誘導可能な任意の値及び範囲を含み得るが、これに限定されない。本発明は、本明細書に記載される任意の配列の連続アミノ酸またはそのアナログの長さを含む。
【０１５１】
ポリペプチドまたはペプチドのセグメントまたはフラグメントは、その間の全ての値及び範囲を含む、本明細書において開示または参照される配列の、アミノ酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、350、400、450からアミノ酸10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600までのアミノ酸を含む。
【０１５２】
本明細書において使用される場合、「アミノ分子」は、当業者に公知の任意のアミノ酸、アミノ酸誘導体またはアミノ酸模倣物を指す。ある態様において、非アミノ分子がアミノ分子残基の配列を中断することなく、ポリペプチドまたはペプチド分子の残基は連続している。他の態様において、配列は、1つまたは複数の非アミノ分子部分を含み得る。ある態様において、ポリペプチドまたはペプチド分子の残基の配列は、1つまたは複数の非アミノ分子部分によって中断されている場合がある。
【０１５３】
従って、用語「ポリペプチドまたはペプチド組成物」は、天然に合成されるタンパク質中の20個の通常のアミノ酸のうちの少なくとも1つ、または少なくとも1つの修飾されたもしくは異常なアミノ酸を含む、アミノ分子配列を含む。
【０１５４】
ある態様において、ポリペプチドまたはペプチド組成物は、少なくとも1つのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む。TLRアゴニスト組成物を伴う方法において、ポリペプチドまたはペプチドは、配列番号2または相同のポリペプチドなどの、フラジェリンポリペプチドのアミノ酸配列の全部または一部分を有し得る。ある態様において、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド含有組成物は、一般的に、各々が毒素、病原体、および有害な免疫原を本質的に含まない、タンパク質もしくはペプチドまたは合成タンパク質もしくはペプチドである。ある局面において、ポリペプチドは、組換えまたは合成アミノ酸配列である。
【０１５５】
ポリペプチドまたはペプチド組成物は、標準の分子生物学的技術によるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現、天然供給源からのポリペプチドまたはペプチドの単離、またはポリペプチドまたはペプチド物質の化学合成を含む、当業者に公知の任意の技術によって作製され得る。これらのポリペプチドまたはペプチドについてのコード領域は、本明細書に開示されるかまたは当業者に公知である技術を使用して、増幅および／または発現され得る。あるいは、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの様々な商業的調製物が、当業者に公知である。
【０１５６】
ある態様において、ポリペプチドまたはペプチド化合物は精製され得る。一般的に、精製された」は、様々な他のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ならびに他の分子および化合物を除去するために分別へ供された、特定のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド組成物に言及し、この組成物は、特定のまたは所望のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドについて当業者に公知であるような、例えばタンパク質アッセイによって、評価され得るように、その活性を実質的に保持している。
【０１５７】
実質的に任意のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド含有成分が、本明細書に開示される組成物および方法において使用され得ることが、意図される。ある態様において、エアロゾルのもしくは噴霧化されたまたはエアロゾル化可能なもしくは噴霧化可能な組成物の形成は、組成物が吸入、吸息などによって呼吸器系へより正確にまたは容易に適用されることを可能にし得ることが、予想される。
【０１５８】
A．ポリペプチドまたはペプチド変異体および誘導体
本発明のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドのアミノ酸配列変異体または誘導体は、置換、挿入または欠失変異体、ならびにアミノ酸アナログまたは誘導体の挿入物であり得る。欠失変異体は、機能または免疫原活性に必須でない、天然タンパク質の1つまたは複数の残基を欠いている。別の一般的なタイプの欠失変異体は、分泌シグナル配列、または細胞の特定の一部分もしくは膜貫通領域へ結合するようにタンパク質を向けるシグナル配列、または求められるインビボ活性のためには必要とされない他の機能配列を欠いているものである。挿入突然変異体は、典型的に、ポリペプチド中の非末端ポイントでの物質の付加を含む。これは、免疫反応性エピトープまたは単に単一の残基の挿入を含み得る。融合タンパク質と呼ばれる末端付加を下記において議論する。
【０１５９】
置換変異体は、典型的に、ポリペプチドまたはペプチド内の1つまたは複数の部位におけるあるアミノ酸の別のものでの交換を含み、他の機能または特性を失うことなく、タンパク質分解的切断に対する安定性などの、1つまたは複数の特性を調節するように設計されている場合がある。この種の置換は、好ましくは保存的であり、即ち、あるアミノ酸が、同様の形状および電荷のもので置き換えられる。保存的置換は、当技術分野において周知であり、これには、例えば、アラニンからセリンへ；アルギニンからリジンへ；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへ；アスパルテートからグルタメートへ；システインからセリンへ；グルタミンからアスパラギンへ；グルタメートからアスパルテートへ；グリシンからプロリンへ；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへ；イソロイシンからロイシンまたはバリンへ；ロイシンからバリンまたはイソロイシンへ；リジンからアルギニンへ；メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへ；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニンへ；セリンからトレオニンへ；トレオニンからセリンへ；トリプトファンからチロシンへ；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへ；およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変更が含まれる。
【０１６０】
用語「生物学的機能等価物」は、当技術分野において十分に理解され、本明細書においてさらに詳細に定義される。従って、生物学的機能等価物は、ポリペプチドもしくはペプチドまたはその変異体もしくはアナログもしくは誘導体のアミノ酸と同一または機能的に等価であるアミノ酸の約70、75、80、85、90、95、96、97、98、99％の配列を有し、フラジェリンまたは他のTLRアゴニストと同様の生物活性／応答を提供する。
【０１６１】
下記は、等価の、または改善さえされた、二代目の分子を作製するための、ポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸の変更に基づく議論である。例えば、あるアミノ酸は、免疫反応の増強などの、特定の活性をかなり失うことなく、ポリペプチドまたはペプチド内の他のアミノ酸の代わりに用いられ得る。典型的にタンパク質の機能活性を規定するのは、ポリペプチドまたはペプチドの相互作用能力および性質であるので、ある特定のアミノ酸置換が、ポリペプチドまたはペプチド配列において、およびその基礎のDNAコード配列において、行われ得、にもかかわらず、同様の特性を有するタンパク質を生じさせる。従って、様々な変更が、以下に議論されるように、それらの生物学的有用性または活性をかなり失うことなく、本発明のポリペプチドまたはペプチドをコードするDNA配列において行われ得ることが、本発明者らによって意図される。
【０１６２】
このような変更において、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を与える際におけるヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野において一般的に理解されている（Kyte & Doolittle, 1982）。アミノ酸の相対的なヒドロパシー特徴は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これは、次に、他の分子、細胞、組織など、例えば、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原、免疫細胞およびシステムなどとのタンパク質の相互作用を規定することが、受け入れられている。
【０１６３】
同様のアミノ酸の置換は、ヒドロパシーに基づいて効果的に行われ得ることがまた、当技術分野において理解される。参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,554,101号には、その隣接したアミノ酸のヒドロパシーによって左右されるような、タンパク質の最大局所平均ヒドロパシーは、タンパク質の生物学的特性に関連することが記載されている。米国特許第4,554,101号において詳述されるように、以下のヒドロパシー値が、アミノ酸残基へ割り当てられた：アルギニン（+3.0）；リジン（+3.0）；アスパルテート（+3.0 ± 1）；グルタメート（+3.0 ± 1）；セリン（+0.3）；アスパラギン（+0.2）；グルタミン（+0.2）；グリシン（0）；トレオニン（-0.4）；プロリン（-0.5 ± 1）；アラニン（-0.5）；ヒスチジン*-0.5）；システイン（-1.0）；メチオニン（-1.3）；バリン（-1.5）；ロイシン（-1.8）；イソロイシン（-1.8）；チロシン（-2.3）；フェニルアラニン（-2.5）；トリプトファン（-3.4）。
【０１６４】
あるアミノ酸が、同様のヒドロパシー値を有する別のものの代わりに用いられ得、生物学的に等価かつ免疫学的に等価なタンパク質を依然として生じさせることがまた、理解される。このような変更において、ヒドロパシー値が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内であるものが特に好ましく、±0.5以内であるものがさらに一層好ましい。
【０１６５】
上記に概説したように、アミノ酸置換は、一般的に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、ヒドロパシー、電荷、サイズなどに基づく。様々な上述の特徴を考慮する例示的な置換は、当業者に周知であり、これらとしては、アルギニンおよびリジン；グルタメートおよびアスパルテート；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
【０１６６】
本発明の他の化合物、即ち、ポリペプチドまたはペプチド誘導体を作製するために、本発明のポリペプチドまたはペプチド化合物の、内部アミノ酸、および／またはアミノおよび／またはカルボキシ末端を修飾することもできる。アミノ末端修飾としては、メチル化（例えば、-NHCH3または-N(CH3)2）、アセチル化（例えば、酢酸またはそのハロゲン化誘導体、例えば、α-クロロ酢酸、α-ブロモ酢酸、またはα-ヨード酢酸を用いる）、ベンジルオキシカルボニル（Cbz）基の付加、またはRCOO-によって定義されるカルボン酸官能性またはR-SO2-によって定義されるスルホニル官能性を含むブロッキング基でのアミノ末端のブロッキングが挙げられ、式中、Rは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールなど、および同様の基より選択される。プロテアーゼに対する感受性を低下させるためまたはポリペプチドまたはペプチド化合物の構造を制限するために、N-末端でデスアミノ酸（desamino acid）を組み入れることもできる（従って、N末端アミノ基は存在しない）。
【０１６７】
カルボキシ末端修飾には、遊離酸をカルボキサミド基で置き換えること、またはカルボキシ末端で環状ラクタムを形成し構造を制約することが含まれる。プロテアーゼに対する感受性を低下させるためまたはペプチドの構造を制限するために、本発明のペプチドを環化するか、またはペプチド末端にデスアミノ（desamino）またはデスカルボキシ（descarboxy）残基を組み入れ、末端アミノまたはカルボキシル基をなくすこともできる。本発明の化合物のC末端官能基としては、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ(低級アルキル)、低級アルコキシ、ヒドロキシ、およびカルボキシ、ならびにその低級エステル誘導体、ならびにその薬学的に許容される塩が挙げられる。
【０１６８】
20個の遺伝的にコードされるアミノ酸（または立体異性Dアミノ酸）の天然の側鎖を、他の側鎖で、例えば、アルキル、低級アルキル、環式4-、5-、6-から7-員のアルキル、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ(低級アルキル)、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびその低級エステル誘導体などの基で、ならびに4-、5-、6-から7-員のヘテロ環式で、置き換えることができる。特に、プロリン残基の環サイズが5員から4、6または7員へ変更されているプロリンアナログが、用いられ得る。環式基は、飽和または不飽和であり得、不飽和である場合、芳香族または非芳香族であり得る。ヘテロ環式基は、好ましくは、1つまたは複数の窒素、酸素および／または硫黄ヘテロ原子を含有する。このような基の例としては、フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、モルホリニル（例えば、モルホリノ）、オキサゾリル、ピペラジニル（例えば、1-ピペラジニル）、ピペリジル（例えば、1-ピペリジル、ピペリジノ）、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル（例えば、1-ピロリジニル）、ピロリニル、ピロリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、チオモルホリニル（例えば、チオモルホリノ）、およびトリアゾリルが挙げられる。これらのヘテロ環式基は、置換されていてもまたは非置換であってもよい。基が置換される場合、置換基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素、または置換もしくは非置換フェニルであり得る。
【０１６９】
リン酸化および他の方法によって、ポリペプチドまたはペプチドを容易に修飾することもできる（例えば、Hruby et al. (1990) に記載される通り）。
【０１７０】
本発明のペプチド化合物はまた、同様の生物活性を有する非ペプチド化合物についての構造モデルとしても役立つ。当業者は、様々な技術が、リードペプチド化合物と同一のまたは同様の所望の生物活性を有し、しかし、溶解性、安定性、ならびに加水分解およびタンパク質分解に対する感受性に関してリードよりも好都合な活性を有する、化合物を構築するために利用可能であることを認識する（Morgan and Gainor, 1989を参照のこと）。これらの技術には、ホスホナート、アミダート、カルバマート、スルホンアミド、第2級アミン、およびN-メチルアミノ酸から構成される骨格でペプチド骨格を置き換えることが含まれる。
【０１７１】
さらに、本発明の化合物は、は、1つまたは複数の分子内ジスルフィド結合を含有し得る。一態様において、ペプチド単量体または二量体は、少なくとも1つの分子内ジスルフィド結合を含む。好ましい態様において、ペプチド二量体は、2つの分子内ジスルフィド結合を含む。このようなジスルフィド結合は、ペプチドコア配列のシステイン残基の酸化によって形成され得る。一態様において、システイン結合形成の制御は、所望の異性体の形成を最適化するに有効な種類および濃度の酸化剤を選択することによって行われる。例えば、2つの分子内ジスルフィド結合（各ペプチド鎖上に1つ）を形成するためのペプチド二量体の酸化が、酸化剤がDMSOである場合、（分子間ジスルフィド結合の形成よりも）優先的に達成される。ある態様において、システイン結合の形成は、ペプチド合成の間のチオール保護基の選択的使用によって制御される。
【０１７２】
本発明の他の態様は、硫黄の1つがCH2基によってまたは硫黄についての他の同配体（isotere）によって置き換えられている、これらのジスルフィド誘導体のアナログを提供する。これらのアナログは、当技術分野において公知の方法（例えば、Barker et al., 1992およびOr et al., 1991を参照のこと）を使用する、分子内または分子間置換によって、本発明の化合物から作製され得、ここで、各コア配列は、少なくとも1つのCys（C）またはホモシステイン残基、および第2のC残基の代わりにα-アミノ-γ-酪酸を含有する。当業者は、この置換はまた、α-アミノ-γ-酪酸およびホモシステインの他の同族体を使用しても生じ得ることを容易に認識する。
【０１７３】
前述の環化戦略に加えて、他の非ジスルフィドペプチド環化戦略が用いられ得る。このような代替の環化戦略には、例えば、アミド環化戦略、ならびにチオエーテル結合の形成を伴うものが含まれる。従って、本発明の化合物は、分子内アミド結合または分子内チオエーテル結合を有する環化形態で存在し得る。例えば、コア配列の1つのシステインがリジンで置き換えられており、第2のシステインがグルタミン酸で置き換えられている、ペプチドが合成され得る。その後、環状モノマーが、これらの2つの残基の側鎖間のアミド結合によって形成され得る。あるいは、コア配列の1つのシステインがリジンで置き換えられているペプチドが合成され得る。次いで、環状モノマーが、コア配列のリジン残基および第2システイン残基の側鎖間のチオエーテル結合によって形成され得る。従って、ジスルフィド環化戦略に加えて、アミド環化戦略およびチオエーテル環化戦略が両方とも、本発明の化合物を環化するために容易に使用され得る。あるいは、ペプチドのアミノ末端は、α-置換酢酸でキャップされ得、ここで、α-置換基は、脱離基、例えば、α-ハロ酢酸、例えば、α-クロロ酢酸、α-ブロモ酢酸、またはα-ヨード酢酸である。
【０１７４】
2004年5月12日に出願された米国特許出願第10/844,933号が、以下の説明で含まれ、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）が、治療に重要なポリペプチドまたはペプチドの共有結合修飾のために使用され得る。このようなポリマーの結合は、生物活性を増強し、水溶解度を増加させ、プロテアーゼ消化に対する抵抗性を増強すると考えられている。例えば、インターロイキン（Knauf, et al., 1988；15064；Tsutsumi et al., 1995、インターフェロン（Kita et al., 1990）、カタラーゼ（Abuchowski et al., 1977、スーパーオキシドジスムターゼ（Beauchamp et al., 1983、およびアデノシンデアミナーゼ（Chen et al., 1981）などの治療用ポリペプチドへのPEGの共有結合は、インビボにおいてそれらの半減期を延ばす、および／またはそれらの免疫原性および抗原性を減らすことが報告された。
【０１７５】
本発明の化合物は、1つまたは複数の水溶性ポリマー部分をさらに含み得る。好ましくは、これらのポリマーは、化合物へ共有結合される。水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、およびポリオキシエチル化ポリオールであり得る。
【０１７６】
本発明の化合物は、分子の受容体結合部分（例えば、ペプチド＋スペーサー）へ水溶性ポリマーを連結するための様々な化学のいずれかを使用して、水溶性ポリマー（例えば、PEG）へ結合され得る。典型的な態様は、受容体結合部分への水溶性ポリマーの共有結合のために単一の結合ジャンクションを用い、しかし、代替の態様においては、多数の結合ジャンクションが使用され得、異なる種類の水溶性ポリマーが、スペーサーへのおよび／または一方もしくは両方のペプチド鎖への共有結合ジャンクションを含み得る、異なる結合ジャンクションで受容体結合部分へ結合される、さらなるバリエーションが含まれる。
【０１７７】
PEG試薬としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：mPEG2-NHS、mPEG2-ALD、multi-Arm PEG、mPEG(MAL)2、mPEG2(MAL)、mPEG-NH2、mPEG-SPA、mPEG-SBA、mPEG-チオエステル、mPEG-ダブルエステル、mPEG-BTC、mPEG-ButyrALD、mPEG-ACET、ヘテロ官能性PEG（NH2-PEG-COOH、Boc-PEG-NHS、Fmoc-PEG-NHS、NHS-PEG-VS、NHS-PEG-MAL）、PEGアクリレート（ACRL-PEG-NHS）、PEG-リン脂質（例えば、mPEG-DSPE）、SUNBRITEシリーズのマルチアームPEG（当業者によって選択される化学によって活性化されるグリセリンベースのPEGのGLシリーズを含む）、SUNBRITE活性化PEGのいずれか（カルボキシル-PEG、p-NP-PEG、トレシル-PEG、アルデヒドPEG、アセタール-PEG、アミノ-PEG、チオール-PEG、マレイミド-PEG、ヒドロキシル-PEG-アミン、アミノ-PEG-COOH、ヒドロキシル-PEG-アルデヒド、カルボン酸無水物型PEG、官能基化PEG-リン脂質、並びに特定の適用及び用途のために当業者によって選択される他の類似のおよび／または適切な反応性のPEGを含むが、これらに限定されない）。
【０１７８】
結合されるポリマー分子の数は変わることがある；例えば、1、2、3、またはそれ以上のポリマーが、本発明のポリペプチドまたはペプチドへ結合され得る。多数の結合されるポリマーは、同一のまたは異なる化学部分（例えば、異なる分子量のPEG）であり得る。ある場合において、ポリマー結合の程度（ペプチドへ結合されるポリマー部分の数および／またはポリマーが結合されるペプチドの総数）は、結合反応におけるポリマー分子対ペプチド分子の割合によって、ならびに反応混合物中の各々の総濃度によって、影響され得る。一般的に、最適なポリマー対ペプチド比（過剰な未反応ペプチドおよび／またはポリマー部分を提供しないための反応効率の観点から）は、所望のポリマー結合程度（例えば、モノ、ジ、トリなど）、選択されるポリマーの分子量、ポリマーが分岐または非分岐であるかどうか、および特定の結合方法についての反応条件などの因子によって決定される。
【０１７９】
他の局面において、本発明の化合物は、不水溶性ポリマーの添加によって誘導体化され得る。代表的な不水溶性ポリマーとしては、ポリホスファジン、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ(メタクリル酸メチル)、ポリ(メタクリル酸エチル)、ポリ(メタクリル酸ブチル)、ポリ(メタクリル酸イソブチル)、ポリ(メタクリル酸ヘキシル)、ポリ(メタクリル酸イソデシル)、ポリ(メタクリル酸ラウリル)、ポリ(メタクリル酸フェニル)、ポリ(アクリル酸メチル)、ポリ(アクリル酸イソプロピル)、ポリ(アクリル酸イソブチル)、ポリ(アクリル酸オクタデシル)  ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリ(酢酸ビニル)、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニックおよびポリビニルフェノール、ならびにそれらのコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８０】
本発明の誘導体において使用される合成的に修飾された天然ポリマーとしては、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、およびニトロセルロースが挙げられるが、これらに限定されない。合成的に修飾された天然ポリマーの広いクラスのメンバーとしては、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、三酢酸セルロース、硫酸セルロースナトリウム塩、ならびにアクリルおよびメタクリル酸エステルおよびアルギン酸のポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８１】
ある局面において、本発明のポリペプチドまたはペプチドは、サッカライド基または修飾糖の添加によって、修飾または誘導体化され得る。本発明は、修飾糖、修飾糖ヌクレオチド、および修飾糖の結合体を含む、ポリペプチドおよびペプチド誘導体を提供する。本発明の修飾糖化合物において、糖部分は、好ましくは、サッカライド、デオキシサッカライド、アミノサッカライド、またはN-アシルサッカライドである。用語「サッカライド」ならびにその等価物、「サッカリル」、「糖」および「グリコシル」は、モノマー、ダイマー、オリゴマーおよびポリマーに言及する。糖部分はままた、修飾基で官能化され得る。修飾基は、典型的に、糖上の、アミン、スルフヒドリルまたはヒドロキシル、例えば第1級ヒドロキシル、部分との結合によって、糖部分へ結合される。一態様において、修飾基は、糖上のアミン部分を介して、例えば、アミンと修飾基の反応性誘導体との反応によって形成されるアミド、ウレタンまたは尿素を介して、結合される。
【０１８２】
任意の糖が、本発明の結合体についての糖として利用され得る。このような糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、およびシアル酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の有用な糖としては、アミノ糖、例えば、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、シアル酸の5-アミンアナログなどが挙げられる。糖は、自然において見られる構造であり得るか、またはそれは、さらなる修飾基に結合するための部位を提供するように修飾され得る。
【０１８３】
当業者は、記載される構造および組成物は、サッカライド基、修飾サッカライド基、活性化修飾サッカライド基、および修飾サッカライド基の結合体の種類にわたって一般的に適用可能であることを認識する。
【０１８４】
III．肺防御の刺激
本発明者らは、肺の微生物感染症についてのモデルとしてマウスを使用した。ある研究において、未処置マウスは100％の死亡率を有し、しかし処置マウスは非常に保護される。いかなる特定の機構または理論にも拘束されないが、保護は局所防御または先天性免疫の活性化に起因すると考えられる。本発明の組成物への被験体の単回および反復曝露の効果を測定し、早死、体重減少、または行動変化などの明白な全体の病態は観察されなかった。
【０１８５】
本発明の1つの非限定的な利点は、それが迅速かつ容易に送達され効果を有し得ることである。さらに、組成物は、経済的に大量に製造され得、容易に保存され得、ならびに病院環境外で人によって容易に輸送され得る。典型的に、本発明の組成物の投与および本発明の方法は、細胞侵入の前にさえ侵入病原体の少なくともいくらかの殺滅または阻害をもたらす。細胞外殺滅を回避することによって、または組成物が病原体曝露前（予防的に）の代わりに病原体曝露後（先制的に）に投与されるために、ある病原体が肺内の細胞に侵入する場合、組成物および関連方法が、肺における増強または増大された局所応答から生じる細胞内殺滅を促進することが、考えられる。組成物および関連方法は、様々な呼吸器病原体に対して防護的または治療的応答を有するかまたは生じさせると考えられる。
【０１８６】
StIR組成物によって個体に与えられる保護または治療は、気道の抗微生物機構の広い活性のために、グラム陰性細菌、細胞内細菌、真菌、およびウイルスを含むさらなるクラスの微生物病原体へ拡大され得る。本出願に記載されるものなどの薬剤は、備蓄および配備対策を簡単にする。さらに、本発明の組成物および方法は、生物兵器攻撃または他の曝露または潜在的な曝露事象の間に特定の病原体を迅速に同定するという困難性を排除する。
【０１８７】
さらに、多数の非軍事的および生物テロ防御設定における適用可能性を有する薬剤を製造および購入する経済的利点は、重要である。局所的上皮機構を増大させることは、好中球減少症または適応免疫機能障害をしばしば有する被験体、例えば、免疫不全被験体において、特に魅力的である。方法は、典型的に、全身的にではなく局所的に作用し、多様な病原体に対して広範囲の効果を提供する。効果は、迅速であり、生物テロ防御、医療、および流行病設定において魅力的である。
【０１８８】
正常な宿主における肺の先天防御能力の増大は、適応免疫ワクチンが利用可能でないインフルエンザまたは新型呼吸器ウイルス流行の間、価値がある。新型または薬剤耐性生物を含む細菌の急激な発生はまた、先天肺防御のブースティングが役立ち得る状況であり得る。同様に、流行の間の介護者の保護は、蔓延を制限しながら、病人の介護を容易にする。
【０１８９】
地域社会の多くの人々、例えば、糖尿病を有する患者、および自己免疫疾患のためにまたは移植片拒絶を予防するために免疫抑制剤を摂取する患者は、感染症に対して慢性的に損なわれた防御を伴って生きている。これらの人々は、流行または微生物への曝露の可能性が高まっている時の間、肺防御の増大から特に利益を得る場合がある。なおより著しくは、一過性のしかし非常に損なわれた免疫防御を有する化学療法を受けている癌患者は、一過性の保護から利益を得る場合がある。肺炎は、これらの患者において一般的に発生し、感染性の死の主要原因である。多くの化学療法薬、例えば、アルキル化剤およびヌクレオシドアナログは、重篤な一過性好中球減少症を引き起こす。最初は、好中球減少症の患者は、正常な宿主において見られる生物、ならびに低毒性の細菌、例えばステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）に由来する細菌性肺炎に敏感である。好中球減少症が長引くと、患者はまた、低毒性の真菌、特にアスペルギルス種、での感染症に敏感となる。
【０１９０】
肺の防御は、長期間の好中球減少症の間、一過性の保護を提供するように、刺激され得る。他の癌患者、例えば、フルダラビンまたは抗リンパ球抗体を受容するもの、または造血幹細胞移植後にカルシニューリン阻害剤およびステロイドを受容するものは、適応免疫障害を有する。これらの患者もまた、気道にコロニー形成した真菌および細菌による侵入から保護するために、または流行性のウイルスから保護するために、肺免疫の一時的な刺激から利益を受ける場合がある。季節性呼吸器「風邪」ウイルス、例えば、パラインフルエンザおよびRSVの地域発生は、これらの障害を有する患者において致命的な肺炎を引き起こし得、これらのウイルスの多くでの感染症は、鼻洗浄液から迅速に同定され得る。
【０１９１】
感染すると、微生物の認識は、パターン認識受容体（PRR）と呼ばれる先天性免疫細胞上の一連の生殖細胞系にコードされた分子によって主に媒介される（Medzhitov and Janeway, 1997）。これらのパターン認識受容体は、病原体関連分子パターン（PAMP）と呼ばれる、不変の分子構造を認識する膜結合型または可溶性タンパク質として発現される（Janeway and Medzhitov, 2002）。病原体関連分子パターンは、宿主分子とは構造的に異なる、特有の、保存された、必須の微生物成分、例えばLPSである（Medzhitov and Janeway, 1997；Janeway and Medzhitov, 2002）。
【０１９２】
大抵の多細胞生物は、生物の寿命の間に変化しない「先天性免疫系」を有する。対照的に、適応免疫は、個体の寿命の間に変化および発達する、病原体に対する反応である。適応免疫を有する生物は先天性免疫も有し、これらの系の機構の多くは共通しており、作用の明確な差異にもかかわらず、各々に関与する個々の成分間に確実で固定した境界線を引くことは、必ずしも可能ではない。高等脊椎動物および全ての哺乳動物は、先天性免疫系および適応免疫系の両方を有する。
【０１９３】
A．先天性免疫系
適応免疫系は、効果を有するには、初感染後、数日または数週間かかることがある。しかし、大抵の生物は、病原体からの一定の攻撃下にあり、これらは、より迅速に作用する先天性免疫系によって阻止されなければならない。先天性免疫は、広範囲の保存された病原性成分を認識する「先天」機構を介して調整される迅速な応答によって、病原体から防御する。大抵の先天性免疫研究は、白血球、例えば、好中球、マクロファージ、およびナチュラルキラー細胞に焦点を置いてきた。しかし、上皮細胞は、微生物の侵入に対する機械的なバリアの提供、白血球へのシグナル伝達、および病原体の直接的な殺滅を含む、先天防御において、重要な役割を果たす。重要なことには、これらの防御の全ては、微生物および宿主産物の感知に応答して非常に誘導性である。健康な肺において、先天性免疫上皮機能のレベルは、ベースラインで低い。これは、低レベルの自然の微生物殺滅およびサイトカイン放出によって示され、これは、粘液線毛クリアランス機構が効果的に機能している場合のほぼ無菌の下気道における低い構成的刺激を反映している。これは結腸と対照的であり、ここでは、細菌が常に存在し、上皮細胞が構成的に活性化されている。肺の表面積は、微生物侵入についての大きな標的を示すが、沈着した（deposited）病原体に対して近接して並置された活性化された肺上皮細胞は、微生物の殺滅について理想的に配置されている（Evans et al., 2010を参照のこと）。植物および多くの下等動物は、適応免疫系を有さず、その代わりとしてそれらの先天性免疫に依存する。微生物供給源および非微生物供給源の両方の物質が、先天性免疫反応を刺激することができる。
【０１９４】
先天性免疫系は、活性化されると、幅広いエフェクター細胞および機構を有する。いくつかの異なるタイプの貪食細胞が存在し、これらは、侵入病原体を摂取し、破壊する。最も一般的な貪食細胞は、好中球、マクロファージ、および樹状細胞である。別の細胞型である、ナチュラルキラー細胞は、ウイルスに感染された細胞の破壊に熟達している。先天性免疫系の別の成分は、補体系として公知である。補体タンパク質は、血液の通常は不活性の成分である。しかし、抗体または病原体の認識によって活性化されると、様々なタンパク質が活性化され、炎症細胞を動員し、病原体をコーティングしてそれらをより容易に貪食されるようにし、病原体の表面に破壊的な細孔を作製する。
【０１９５】
「第一線の」防御は、宿主と病原体との相互作用を物理的に妨げる、感染症に対する物理的および化学的バリア、例えば、皮膚ならびに腸および気道の粘液コーティングを含む。これらのバリアに突破する病原体は、感染症を制限する構成的に発現される抗微生物性分子（例えば、リゾチーム）に遭遇する。「第二線の」防御は、外来物質を飲み込む（貪食する）ことができる貪食細胞（マクロファージおよび好中性顆粒球）を含む。
【０１９６】
貪食は、化学走性を含み、ここで、貪食細胞は、微生物産物、補体、損傷細胞および白血球断片などの、化学走性化学物質によって微生物へ引き付けられる。化学走性に続いて付着が起こり、ここで、貪食細胞が微生物へ固着する。付着は、オプソニン化によって増強され、ここで、オプソニンのようなタンパク質が、細菌の表面上にコーティングされる。これに続いて摂取が起こり、ここで、貪食細胞は、突出部を広げ、偽足を形成し、これは外来生物を飲み込む。最後に、病原体は、活性酸素およびプロテアーゼを含む、酵素によってリソソーム中において消化される。
【０１９７】
さらに、病原体が物理的バリアを通過する場合、抗微生物性タンパク質が活性化され得る。いくつかのクラスの抗微生物性タンパク質、例えば、急性期タンパク質（例えば、肺炎連鎖球菌のC-タンパク質に結合すると、貪食を増強しかつ補体を活性化する、C反応性タンパク質）、リゾチーム、および補体系がある。
【０１９８】
補体系は、カスケード様式で活性化される、血清タンパク質の非常に複雑なグループである。3つの異なる経路が、補体活性化に関与する：（a）抗原-抗体複合体を認識する古典的経路、（b）病原性細胞表面に接触すると自然に活性化する代替経路、および（c）病原性細胞表面上にのみ現れる傾向にあるマンノース糖を認識する、マンノース結合レクチン経路。タンパク質活性のカスケードが、補体活性化に続く；このカスケードは、病原体のオプソニン化、膜侵襲複合体の形成および活性化による病原体の破壊、ならびに炎症を含む、様々な効果をもたらし得る。
【０１９９】
インターフェロンもまた、抗微生物性タンパク質である。これらの分子は、ウイルス感染細胞によって分泌されるタンパク質である。次いで、これらのタンパク質は、近隣の細胞へ迅速に拡散し、ウイルス感染症の蔓延を阻害するように細胞を誘導する。本質的に、これらの抗微生物性タンパク質は、ウイルスの細胞間増殖を予防するように作用する。
【０２００】
B．適応免疫系
「獲得免疫系」とも呼ばれる、適応免疫系は、病原体による初感染を生き延びる大抵の哺乳動物が、その同一の病原体によって引き起こされるさらなる病気に対して全般的に免疫を有することを確実にする。適応免疫系は、骨髄中の幹細胞によって産生され、胸腺および／またはリンパ節において成熟する、白血球（leukocyte）（白血球（white blood cell））と呼ばれる専用の免疫細胞に基づく。哺乳動物を含む多くの種において、適応免疫系は、以下に分類され得る：（a）B細胞によって産生される、免疫グロブリン（抗体としても公知）と呼ばれるタンパク質によって、体液（例えば、血液）中の細菌およびウイルスに対して作用する体液性免疫系；および（b）T細胞（「Tリンパ球」とも呼ばれる；「T」はそれらが胸腺で発達することを意味する）で（他の義務の中でも特に）ウイルス感染細胞を破壊する、細胞性免疫系。適応免疫系は、典型的に、特定の病原体へ向けられる；例えば、ワクチン接種。
【０２０１】
IV．微生物生物
本発明の態様は、様々な病原体または潜在的病原体（例えば、NIAIDカテゴリーA、B、およびC優先病原体）に対する広い防護のための組成物および関連方法を含む。例えば、正常な宿主における細菌性肺炎は、大抵は高齢者および幼児において、1/100人/年の割合で生じ、様々な生物によって引き起こされ得る。それは、最も一般的には、肺炎連鎖球菌によって、頻度で続いては、有莢膜型インフルエンザ菌（encapsulated Hemophilus influenzae）によって引き起こされる。腸内グラム陰性菌、嫌気性菌、および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）などの他の細菌は、医療施設などの、特定の設定において、肺炎の著しい原因である。ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis）は、感染性が高く、歴史的には、世界的な死亡率の重要な原因であった。それは先進国において抗生物質で大抵は制御されてきたが、多剤耐性株が、問題を起こし続けており、カテゴリーC生物兵器剤として分類されている。レジオネラ・ニューモフィラは、1978年のフィラデルフィアでの発生の間に最初に同定されたが、現在では、環境供給源に関連する低い地方病率で広く生じると認識されている。さらに、肺の真菌感染症は、正常な宿主において症候性疾患を引き起こし得る。ヒストプラズマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミチス（Coccidiodes immitis）、ブラストミセス・デルマチチジス（Blastomyces dermatitidis）、およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Crytococcus neoformans）は全て、高い環境的濃度への局所曝露に関連する肺炎を引き起こし得る。これらの病原性真菌に起因する肺炎は、通常、正常な宿主において自己限定的である。いくつかのさらなる「非定型の」微生物、例えば、マイコプラズマは、正常な宿主におけるさらなる肺炎の実質的な割合を占める。本発明の組成物は、例えば肺炎または他の疾患状態を引き起こし得る様々な因子に対して迅速で一時的な保護を提供し得ると考えられる。ある局面において、本発明は、1つまたは複数の病原性または潜在的病原性生物へ曝露され得るかまたは曝露される被験体へさらなる保護を提供するために、ワクチン接種法と組み合わせて使用され得る。
【０２０２】
本発明の特定の局面において、本発明の組成物および方法は、生物兵器／日和見微生物への感染もしくは曝露、または吸入された感染因子への被験体の曝露の危険性を防止、低減するかまたはこれを治療するために使用され得る。現代においてテロリスト兵器として使用された唯一の微生物病原体は炭疽菌であり、これは、呼吸器経路によって感染が生じる場合、適切な抗生物質を使用したとしても、75％の致死率を有する。野兎病菌は、通性細胞内病原体である、好気性のグラム陰性球杆菌である。それは、感染性が高く、病原性が高く、苛酷な環境条件下で生存し、このため、人から人への伝染性が低いとしても、重大なバイオテロ脅威である（Dennis, 2001）。ワクチンは利用可能であるが、部分的な保護にすぎない。世界保健機関は、5百万人の住民を有する大都市圏にわたっての50 kgの有毒な野兎病菌のエアロゾル散布は、19,000人の死者を含む、250,000人の身体の自由を失った死傷者を生じさせると推定し；疾病対策センター（CDC）は、このような攻撃の経済的コストは、曝露された100,000人当たり54億ドルであると推定した（Dennis, 2001）。
【０２０３】
エアロゾルによって感染され得る他のクラスAバイオテロ剤は、ペスト菌、痘瘡ウイルス、および出血熱ウイルスである。さらに、多数のクラスBおよびC薬剤が、呼吸器経路によって効果的に送達され得る。まとめると、これらの生物は、グラム陽性、グラム陰性、細胞内、および細胞外細菌、ならびに様々なウイルスのクラスを含む。特定のバイオテロ剤を最初に同定することの潜在的困難性、特定の薬剤に向けられた適応免疫ワクチンおよび抗生物質を局所的に備蓄する複雑性、および適切な処置にもかかわらず炭疽菌などの生物の著しい毒性に起因して、肺の先天防御能力の刺激は、呼吸器経路によって送達されるバイオテロ剤での感染症を予防または先制または軽減し得；このような効果は、大きな公衆衛生的価値を有し得る。
【０２０４】
A．病原性または潜在的病原性微生物
特定の条件下で病原性または潜在的病原性と考えられる多数の微生物が存在する（即ち、日和見病原体／微生物）。ある局面において、病原性は、肺を介しての感染症に対して決定される。細菌微生物としては、細菌のバシラス属、エルシニア属、フランシセラ属（Franscisella）、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、シュードモナス属、ミコバクテリウム属、バークホルデリア属の細菌の様々な種が挙げられるが、これらに限定されない。被験体が保護され得る細菌の特定の種としては、炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、シュードモナス・エルギノーサ、バークホルデリア・セパシア、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、クロストリジウム種（Clostridia spp）、シゲラ種（shigella spp.）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）、M.イントラセルラレ（M. intracellulare）、M.カンサシ（M. kansasii）、M.パラツベルクローシス（M. paratuberculosis）、M.スクロフラシウム（M. scrofulaceum）、M.シミエ（M. simiae）、M.ハバナ（M. habana）、M.インテルジェクツム（M. interjectum）、M.ゼノピ（M. xenopi）、M.ヘッケスホルネンス（M. heckeshornense）、M.ツルガイ（M. szulgai）、M.フォーチュイタム（M. fortuitum）、M.イムノゲヌム（M. immunogenum）、M.ケローネ（M. chelonae）、M.マリヌム（M. marinum）、M.ゲナベンセ（M. genavense）、M.ヘモフィルム（M. haemophilum）、M.セラツム（M. celatum）、M.コンスピキュウム（M. conspicuum）、M.マルモエンス（M. malmoense）、M.ウルセランス（M. ulcerans）、M.セメグマティス（M. smegmatis）、M.ウォリンスキイ（M. wolinskyi）、M.グッディイ（M. goodii）、M.サーモレジスタブル（M. thermoresistible）、M.ネオオーラム（M. neoaurum）、M.バッカエ（M. vaccae）、M.パルストレ（M.palustre）、M.エレファンティス（M. elephantis）、M.ボヘミカム（M. bohemicam）およびM.セプティカム（M. septicum）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０５】
B．ウイルス
特定の条件下で病原性または潜在的病原性と考えられる多数のウイルスおよびウイルス株が存在する。ウイルスは、7つの以下の群の1つに分類され得る：第I群：二本鎖DNAウイルス、第II群：一本鎖DNAウイルス、第III群：二本鎖RNAウイルス、第IV群：ポジティブセンス一本鎖RNAウイルス、第V群：ネガティブセンス一本鎖RNAウイルス、第VI群：逆転写二倍体一本鎖RNAウイルス、第VII群：逆転写環状二本鎖DNAウイルス。ウイルスとしては、以下の科が挙げられる：アデノウイルス科、アレナウイルス科、カリシウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科（アルファヘルペスウイルス亜科、ベータヘルペスウイルス亜科、ガンマヘルペスウイルス亜科）、ニドウイルス目、パピローマウイルス科、パラミクソウイルス科（パラミクソウイルス亜科、ニューモウイルス亜科）、パルボウイルス科（パルボウイルス亜科、ピコルナウイルス科）、ポックスウイルス科（コードポックスウイルス亜科）、レオウイルス科、レトロウイルス科（オルソレトロウイルス亜科）、および／またはトガウイルス科。これらのウイルスとしては、様々なインフルエンザ株、例えば、鳥インフルエンザ（例えば、H5N1）が挙げられるが、これらに限定されない。被験体が保護され得る特定のウイルスとしては、サイトメガロウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０６】
病原性ウイルスの例としては、インフルエンザA型、H5N1、マールブルグ、エボラ、デング、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、黄熱ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ワクシニアウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０７】
C．真菌
特定の条件下で病原性または潜在的病原性と考えられる多数の真菌種が存在する。保護が、アスペルギルス・フミガーツス、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミチス、またはニューモシスティス・カリニ、および／またはブラストミセス・デルマチチジスに対して提供され得るが、これらに限定されない。
【０２０８】
V．製剤および投与
本明細書に開示される薬学的組成物は、被験体の呼吸器系を介して投与され得る。ある局面において、組成物は、当技術分野において公知の方法およびデバイスによって肺内に投与される。StIR組成物は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中において作製され得る。ディスパージョンもまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中において、ならびに油中において作製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含有する。吸入に適した薬学的形態としては、無菌液剤またはディスパージョン、および無菌の吸入可能な液剤またはディスパージョンの即席調製用の無菌散剤が挙げられる。全ての場合において、形態は、典型的に無菌であり、直接またはなんらかの媒介方法もしくは装置を介して吸入することができる。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および／または植物油を含有する、溶媒または分散媒であり得る。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。
【０２０９】
治療される被験体の状態および曝露または潜在的曝露を伴う（nvolving）特定の状況に応じて、投薬量のいくらかの変動が必ず生じる。投与に対して責任がある人は、いかなる場合も、個々の被験体についての適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与については、調製物は、FDA Office of Biologics基準または他の同様の組織によって要求されるような、無菌性、発熱性、全体的な安全性、および純度基準を満たすべきである。
【０２１０】
無菌組成物は、上記に列挙された様々な他の成分と共に好適な溶媒中に必要とされる量で活性成分を混合することによって、必要に応じて、続いて例えば濾過滅菌によって、調製される。一般的に、ディスパージョンは、様々な殺菌した有効成分を、上記に列挙されたものからの基本分散媒と必要とされる他の成分とを含有する無菌ビヒクル中へ混合することによって調製される。無菌組成物の調製用の無菌散剤の場合、ある調製方法は、前もって滅菌濾過された溶液から有効成分と任意の追加の所望の成分との粉末を作製する、真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０２１１】
肺／呼吸器薬物送達は、液体ネブライザー、エアロゾルベースの定量吸入器（MDI）、スプレー、乾燥粉末分散装置などを含む、異なるアプローチによって実行され得る。このような方法および組成物は、米国特許第6,797,258号、第6,794,357号、第6,737,045号、および第6,488,953号に示されるように、当業者に周知であり、これらの全ては参照により組み入れられる。本発明によれば、少なくとも1つの薬学的組成物は、吸入による治療剤の投与についての分野において公知の様々な吸入または経鼻装置のいずれかによって送達され得る。経肺または経鼻投与を指示するために好適な他の装置もまた、当技術分野において公知である。典型的に、経肺投与について、少なくとも1つの薬学的組成物が、肺または洞の下気道に到達するに有効な粒度で送達される。本発明の実施に適した市販の吸入装置のいくつかの具体例は、Turbohaler（商標）（Astra）、Rotahaler（登録商標）（Glaxo）、Diskus（登録商標）（Glaxo）、Spiros（商標）吸入器（Dura）、Inhale Therapeuticsによって販売される装置、AERx（商標）（Aradigm）、Ultravent（登録商標）ネブライザー（Mallinckrodt）、Acorn II（登録商標）ネブライザー（Marquest Medical Products）、Ventolin（登録商標）定量吸入器（Glaxo）、Spinhaler（登録商標）粉末吸入器（Fisons）などである。
【０２１２】
全てのこのような吸入装置は、エアロゾルでの薬学的組成物の投与について使用され得る。このようなエアロゾルは、溶液（水溶液および非水溶液の両方）または固体粒子のいずれかを含み得る。定量吸入器は、典型的に、噴射剤ガスを使用し、吸息の間に作動を必要とする。例えば、WO 98/35888；WO 94/16970を参照のこと。粉末吸入器は、混合粉末の呼吸作動を使用する。米国特許第5,458,135号；第4,668,218号；PCT公開公報WO 97/25086；WO 94/08552；WO 94/06498；および欧州出願第EP 0237507号を参照のこと；これらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。ネブライザーは、溶液からエアロゾルを作製し、一方、定量吸入器、粉末吸入器などは、小さな粒子エアロゾルを発生させる。投与に好適な製剤としては、点鼻スプレーまたは点鼻液が挙げられるが、これらに限定されず、これは、StIR組成物の水溶液または油性溶液を含み得る。
【０２１３】
本発明の薬学的組成物を含むスプレーは、圧力下でノズルを通って組成物の懸濁液または溶液を押し出すことによって作られ得る。ノズルサイズおよび形状、加えられる圧力、ならびに液体供給量は、所望の出力および粒度を達成するように選択され得る。エレクトロスプレーは、例えば、キャピラリーまたはノズル供給と関連した電場によって、作られ得る。
【０２１４】
本発明の薬学的組成物は、ジェットネブライザーまたは超音波ネブライザーなどのネブライザーによって投与され得る。典型的に、ジェットネブライザーにおいては、圧縮空気源が、開口部を通って高速度エアジェットを作り出すために使用される。ガスがノズルを超えて広がるにつれて、低圧領域が作られ、これは、液体リザーバへ連結されたキャピラリーチューブを通って組成物を引き寄せる。キャピラリーチューブからの液体流は、それがチューブから出る際に、不安定なフィラメントおよび飛沫へ剪断され、エアロゾルが作られる。様々な機器構成、流量、およびバッフルタイプが、所定のジェットネブライザーから所望の性能特性を達成するために用いられ得る。超音波ネブライザーにおいては、高周波電気エネルギーが、圧電変換器を典型的に用いて、振動力学的エネルギーを作るために使用される。このエネルギーは組成物へ伝えられ、エアロゾルが作られる。
【０２１５】
定量吸入器（MDI）においては、噴射剤、組成物、および任意の賦形剤または他の添加剤が、圧縮ガスとの混合物としてキャニスター中に含有される。メーターリングバルブの作動は、エアロゾルとして混合物を放出する。
【０２１６】
定量吸入器デバイスとの使用のための薬学的組成物は、例えば、界面活性剤の助けを借りて噴射剤中に懸濁された、非水性媒体中の懸濁液として、本発明の組成物を含有する、微細粉末を一般的に含む。噴射剤は、この目的のために用いられる任意の従来の物質、例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素、例えば、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび1,1,1,2-テトラフルオロエタン、HFA-134a（ヒドロフルロアルカン（hydrofluroalkane）-134a）、HFA-227（ヒドロフルロアルカン-227）などであり得る。
【０２１７】
本明細書において使用される場合、「担体」は、あらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。従来の媒体または薬剤が有効成分と不適合性である場合を除いて、治療組成物におけるその使用が意図される。補助的な有効成分もまた、組成物中へ混合され得る。
【０２１８】
句「薬学的に許容される」は、被験体へ投与された場合にアレルギーまたは同様の好ましくない反応を生じさせない分子成分（molecular entity)および組成物に言及する。有効成分としてポリペプチドまたはペプチドを含有する水性組成物の調製は、当技術分野において十分に理解されている。
【０２１９】
VI．併用療法
本発明の組成物および方法は、多数の治療または予防適用の状況において使用され得る。本発明の組成物での治療の有効性を高めるために、または別の療法（二次療法）、例えば、ワクチン接種または抗菌療法の保護を増大させるために、これらの組成物および方法と、感染症の治療、感染症の危険性の低減、または疾患および病的状態の予防、例えば、抗細菌、抗ウイルス、および／または抗真菌治療に有効な他の薬剤および方法とを組み合わせることが望ましい場合がある。
【０２２０】
様々な組み合わせが用いられ；例えば、StIR組成物は「A」であり、二次療法は「B」である：
2015199747.tif 000009
【０２２１】
被験体への本発明の組成物の投与は、呼吸器系を介しての投与についての一般的なプロトコルに従い、もしあれば、治療の毒性を考慮して、特定の二次療法の適用についての一般的なプロトコルにも従う。治療サイクルが必要であれば繰り返されることが予想される。様々な標準療法、およびワクチン接種が、記載の療法と組み合わせて適用され得ることも考えられる。
【０２２２】
A．抗ウイルス剤
本発明のある局面において、抗ウイルス剤が、StIR組成物と組み合わせて使用され得る。抗ウイルス薬は、ウイルス感染症の治療に特に使用されるあるクラスの医薬であり、それらは、身体の外部でウイルス粒子を積極的に不活性化する、殺ウイルス剤とは区別されるべきである。現在入手可能な抗ウイルス剤の大部分は、HIV、ヘルペスウイルス、B型およびC型肝炎ウイルス、ならびにインフルエンザA型およびB型ウイルスに対処するのを助けるように設計されている。本発明において有用な抗ウイルス剤としては、免疫グロブリン、アマンタジン、インターフェロン、ヌクレオチドアナログ、およびプロテアーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２３】
1つの抗ウイルス戦略は、標的細胞に侵入するウイルスの能力を妨害することである。ウイルス複製のこの段階は、ウイルス関連タンパク質（VAP）を模倣し細胞受容体へ結合する薬剤を使用することによって、または細胞受容体を模倣しVAPへ結合する薬剤を使用することによって、阻害され得る。これとしては、抗VAP抗体、受容体抗イディオタイプ抗体、外来受容体および合成受容体模倣物が挙げられる。2つのこのような「侵入ブロッカー」、アマンタジンおよびリマンタジンが、インフルエンザを阻止するために導入された。
【０２２４】
抗ウイルス療法への第2のアプローチは、ウイルスが細胞に侵入した後にウイルス成分を合成するプロセスを標的にすることである。これを行う1つの方法は、RNAまたはDNAの構築ブロックのように見えるが、アナログが組み入れられるとRNAまたはDNAを合成する酵素を不活性化する、ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログを開発することである。ヌクレオチドアナログとしては、リバビリン、ビダラビン、アシクロビル、ガングシクロビル（gangcyclovir）、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、およびラミブジンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２５】
さらに別の抗ウイルス技術は、選択部位でウイルスRNAまたはDNAを切断する酵素である、リボザイムに基づく薬物のセットである。それらの自然な過程において、リボザイムは、ウイルス作製配列の一部分として使用されるが、これらの合成リボザイムは、それらを無能にする部位でRNAおよびDNAを切断するように設計されている。
【０２２６】
あるウイルスは、それらの最終形状にアセンブルされ得るようにウイルスタンパク質鎖を切断するプロテアーゼとして公知の酵素を含む。HIVはプロテアーゼを含み、従って、そのライフサイクルのその期でHIVを攻撃するための「プロテアーゼ阻害剤」を見出すために、相当な研究が行われてきた。プロテアーゼ阻害剤は、1990年代に利用可能になり、有効であることがわかったが、それらは、異常な副作用、例えば、異常な場所での脂肪の構築を有し得る。改善されたプロテアーゼ阻害剤が、現在、開発中である。
【０２２７】
ウイルスのライフサイクルの最終段階は宿主細胞からの完全なウイルスの放出であり、この段階もまた抗ウイルス薬開発業者によって標的化されてきた。インフルエンザを治療するために導入されたザナミビル（リレンザ（商標））およびオセルタミビル（タミフル（商標））という名の2つの薬物は、インフルエンザウイルスの表面上において見られ、また広範囲のインフルエンザ株にわたって一定であるようである、ノイラミニダーゼという名の分子を遮断することによってウイルス粒子の放出を妨げる。
【０２２８】
抗ウイルス剤としては、アバカビル；アセマンナン；アシクロビル；アシクロビルナトリウム；アデフォビル；アロブジン；アルビルセプト・スドトクス（alvircept sudotox）；塩酸アマンタジン；アンプレナビル；アラノチン；アリルドン；メシル酸アテビルジン；アブリジン；シドフォビル；シパムフィリン；塩酸シタラビン；メシル酸デラビルジン；デスシクロビル；ジダノシン；ジソキサリル；エドクスジン；エファビレンツ；エンビラデン；エンビロキシム；ファムシクロビル；塩酸ファモチン；フィアシタビン；フィアルリジン；ホサリラート；ホスホノギ酸三ナトリウム；ホスホネットナトリウム（fosfonet sodium）；ガンシクロビル；ガンシクロビルナトリウム；イドキシウリジン；インジナビル；ケトキサール；ラミブジン；ロブカビル；塩酸メモチン；メチサゾン；ネルフィナビル；ネビラピン；ペンシクロビル；ピロダビル；リバビリン；塩酸リマンタジン；リトナビル；メシル酸サキナビル；塩酸ソマンタジン；ソリブジン；スタトロン；スタブジン；塩酸チロロン；トリフルリジン；塩酸バラシクロビル；ビダラビン；リン酸ビダラビン；リン酸ビダラビンナトリウム；ビロキシム；ザルシタビン；ジドブジン；ジンビロキシム、インターフェロン、シクロビル、α-インターフェロン、および／またはβグロブリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２９】
ある態様において、抗ウイルス剤は、リバビリンおよび高用量リバビリンである。リバビリンは、多数のDNAおよびRNAウイルスに対して活性である抗ウイルス薬である。それは、ウイルス遺伝物質の複製を妨害するヌクレオシド代謝拮抗薬のメンバーである。全てのウイルスに対して有効であるわけではないが、リバビリンは、インフルエンザ、フラビウイルス、および多くのウイルス性出血熱の因子に対する重要な活性を含む、広範囲の活性を有する。
【０２３０】
典型的に、リバビリンの経口形態が、ペグ化インターフェロン薬と組み合わせて、C型肝炎の治療において使用される。エアロゾル形態は、小児における呼吸器合胞体ウイルス関連疾患を治療するために過去に使用されていた。しかし、その効能は、多数の研究によって問題とされ、ほとんどの機関はもはやそれを使用していない。
【０２３１】
B．抗細菌剤
抗細菌剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：β-ラクタム抗生物質、ペニシリン（例えば、天然ペニシリン、アミノペニシリン、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン、カルボキシペニシリン、ウレイドペニシリン）、セファロスポリン（第一世代、第二世代、および第三世代セファロスポリン）、ならびに他のβ-ラクタム（例えば、イミペネム、モノバクタム）、β-ラクタマーゼ阻害剤、バンコマイシン、アミノグリコシドおよびスペクチノマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、メトロニダゾール、ポリミキシン、スルホンアミドおよびトリメトプリム、およびキノリン。抗細菌剤としてはまた、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アセダプソン、アセトスルホンナトリウム、アラメシン（Alamecin）、アレキシジン、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アミシクリン、アミフロキサシン、メシル酸アミフロキサシン、アミカシン、硫酸アミカシン、アミノサリチル酸、アミノサリチル酸ナトリウム、アモキシシリン、アンホマイシン、アンピシリン、アンピシリンナトリウム、アパルシリンナトリウム、アプラマイシン、アスパルトシン、硫酸アストロマイシン、アビラマイシン、アボパルシン、アジスロマイシン、アズロシリン、アズロシリンナトリウム、塩酸バカンピシリン、バシトラシン、バシトラシンメチレンジサリチラート、バシトラシン亜鉛、バンベルマイシン、ベンゾイルパスカルシウム、ベリスロマイシン、硫酸ベタマイシン、ビアペネム、ビニラマイシン（Biniramycin）、塩酸ビフェナミン、ビスピリチオンマグスルフェクス（Bispyrithione Magsulfex）、ブチカシン、硫酸ブチロシン、硫酸カプレオマイシン、カルバドクス、カルベニシリン二ナトリウム、カルベニシリンインダニルナトリウム、カルベニシリンフェニルナトリウム、カルベニシリンカリウム、カルモナムナトリウム、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファマンドールナフェート（Cefamandole Nafate）、セファマンドールナトリウム、セファパロール、セファトリジン、セファザフルナトリウム、セファゾリン、セファゾリンナトリウム、セフブペラゾン、セフジニル、セフェピム、塩酸セフェピム、セフェテコール、セフィキシム、塩酸セフィネノキシム（Cefinenoxime Hydrochloride）、セフィネタゾール（Cefinetazole）、セフィネタゾールナトリウム、セフォニシド一ナトリウム、セフォニシドナトリウム、セフォペラゾンナトリウム、セフォラニド、セフォタキシムナトリウム、セフォテタン、セフォテタン二ナトリウム、塩酸セフォチアム、セフォキシチン、セフォキシチンナトリウム、セフピミゾール、セフピミゾールナトリウム、セフピラミド、セフピラミドナトリウム、硫酸セフピロム、セフポドキシムプロキセチル、セフプロジル、セフロキサジン、セフスロジンナトリウム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシムナトリウム、セフトリアキソンナトリウム、セフロキシム、セフロキシムアキセチル、セフロキシムピボキセチル、セフロキシムナトリウム、セファセトリルナトリウム、セファレキシン、塩酸セファレキシ（Cephalexii Hydrochloride）、セファログリシニ（Cephaloglycini）、セフ��ロリジン、セファロチンナトリウム、セファピリンナトリウム、セフラジン、塩酸セトサイクリン、セトフェニコール、クロラムフェニコール、パルミチン酸クロラムフェニコール（Cliloramphenicol Palmitate）、パントテン酸クロラムフェニコール複合体（Chloramphenicol Pantotheniate Complex）、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、クロルヘキシジンホスファニラート、クロロキシレノール、重硫酸クロルテトラサイクリン、塩酸クロルテトラサイクリン、シノキサシン、シプロフロキサシン、塩酸シプロフロキサシン、シロレマイシン（Cirolemycin）、クラリスロマイシン、塩酸クリナフロキサシン、クリンダマイシン（Clildamycin）、塩酸クリンダマイシン、塩酸パルミチン酸クリンダマイシン、リン酸クリンダマイシン、クロファジミン、クロキサシリンベンザチン、クロキサシリンナトリウム、クロキシキン、コリスチンメタナトリウム（Colistimethate sodium）、硫酸コリスチン、クーママイシン、クーママイシンナトリウム、シクラシリン、サイクロセリン、ダルフォプリスチン、ダプソン、ダプトマイシン、デメクロサイシン（Demeclocycine）、塩酸デメクロサイシン、デメサイクリン、デノフンギン（Denofungin）、ジアベリジン、ジクロキサシリン、ジクロキサシリンナトリウム、硫酸ジヒドロストレプトマイシン、ジピリチオン、ジリスロマイシン、ドキシサイクリン、ドキシサイクリンカルシウム、ドキシサイクリンホスファテックス（Doxycycline Fosfatex）、ドキシサイクリンヒクラート、ドロキサシンナトリウム、エノキサシン、エピシリン、塩酸エピテトラサイクリン、エリスロマイシン、エリスロマイシンアシストラート（Erythromycin Acistrate）、エリスロマイシンエストレート（Erythromycin Estolate）、エチルコハク酸エリスロマイシン、エリスロマイシングルセプタート（Erythromycin Gluceptate）、ラクトビオン酸エリスロマイシン、プロピオン酸エリスロマイシン、ステアリン酸エリスロマイシン、塩酸エタンブトール、エチオナミド、フレロキサシン、フロキサシリン、フルダラニン、フルメキン、ホスホマイシン、ホスホマイシントロメタミン、フモキシシリン、塩化フラゾリウム、酒石酸フラゾリウム、フシジン酸ナトリウム、フシジン酸、硫酸ゲンタマイシン、グロキシモナム（Gloximonam）、グラミシジン、ハロプロジン、ヘタシリン、ヘタシリンカリウム、ヘキセジン、イバフロキサシン、イミペネム、イソコナゾール、イセパマイシン、イソニアジド、ジョサマイシン、硫酸カナマイシン、キタサマイシン、レボフラルタドン、レボプロピルシリンカリウム、レキシスロマイシン、リンコマイシン、塩酸リンコマイシン、ロメフロキサシン、塩酸ロメフロキサシン、メシル酸ロメフロキサシン、ロラカルベフ、マフェナイド、メクロサイクリン、スルホサリチル酸メクロサイクリン、リン酸メガロマイシンカリウム、メキドクス、メロペネム、メタサイクリン、塩酸メタサイクリン、メテナミン、馬尿酸メテナミン、マンデル酸メテナミン、メチシリンナトリウム、メチオプリム、塩酸メトロニダゾール、リン酸メトロニダゾール、メズロシリン、メズロシリンナトリウム、ミノサイクリン、塩酸ミノサイクリン、塩酸ミリンカマイシン、モネンシン、モネンシンナトリウム、ナフシリンナトリウム、ナリジクス酸ナトリウ��、ナリジクス酸、ナタマイシン、ネブラマイシン、パルミチン酸ネオマイシン、硫酸ネオマイシン、ウンデシレン酸ネオマイシン、硫酸ネチルマイシン、ニュートラマイシン、ニフラデン、ニフラルデゾン、ニフラテル、ニフラトロン、ニフルダジル、ニフリミド（Nifurimide）、ニフイルピリノール（Nifuirpirinol）、ニフルキナゾール、ニフルチアゾール、ニトロサイクリン、ニトロフラントイン、ニトロミド、ノルフロキサシン、ノボビオシンナトリウム、オフロキサシン、オルメトプリム、オキサシリンナトリウム、オキシモナム、オキシモナムナトリウム、オキソリン酸、オキシテトラサイクリン、オキシテトラサイクリンカルシウム、塩酸オキシテトラサイクリン、パルジマイシン、パラクロロフェノール、パウロマイシン、ペフロキサシン、メシル酸ペフロキサシン、ペナメシリン、ペニシリンGベンザチン、ペニシリンGカリウム、ペニシリンGプロカイン、ペニシリンGナトリウム、ペニシリンV、ペニシリンVベンザチン、ペニシリンVヒドラバミン、ペニシリンVカリウム、ペンチジドンナトリウム、アミノサリチル酸フェニル、ピペラシリンナトリウム、ピルベニシリンナトリウム、ピリジシリンナトリウム、塩酸ピルリマイシン、塩酸ピバンピシリン、パモ酸ピバンピシリン、ピバンピシリンプロベナート（Pivampicillin Probenate）、硫酸ポリミキシンB、ポルフィロマイシン、プロピカシン、ピラジナミド、ピリチオン亜鉛、酢酸キンデカミン、キヌプリスチン、ラセフェニコール、ラモプラニン、ラニマイシン（Ranimycin）、レロマイシン、レプロマイシン、リファブチン、リファメタン、リファメキシル、リファミド、リファンピン、リファペンチン、リファキシミン、ロリテトラサイクリン、硝酸ロリテトラサイクリン、ロサラマイシン、酪酸ロサラマイシン、プロピオン酸ロサラマイシン、リン酸ロサラマイシンナトリウム、ステアリン酸ロサラマイシン、ロソキサシン、ロキサルソン、ロキシスロマイシン、サンサイクリン、サンフェトリネムナトリウム、サルモキシシリン、サルピシリン、スコパフンギン、シソマイシン、硫酸シソマイシン、スパルフロキサシン、塩酸スペクチノマイシン、スピラマイシン、塩酸スタリマイシン、ステフィマイシン、硫酸ストレプトマイシン、ストレプトニコジド（Streptonicozid）、スルファベンズ（Sulfabenz）、スルファベンザミド、スルファセタミド、スルファセタミドナトリウム、スルファシチン、スルファジアジン、スルファジアジンナトリウム、スルファドキシン、スルファレン、スルファメラジン、スルファメータ、スルファメタジン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファモノメトキシン、スルファモキソール、スルファニラート亜鉛、スルファニトラン、スルファサラジン、スルファソミゾール、スルファチアゾール、スルファザメト、スルフイソキサゾール、スルフイソキサゾールアセチル、スルフイソキサゾールジオールアミン、スルホミキシン、スロペネム、スルタミシリン、スンシリンナトリウム、塩酸タランピシリン、テイコプラニン、塩酸テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、塩酸テトラサイクリン、リン酸テトラサイクリン複合体、テトロキソプリム、チアンフェニコール、チフェンシリンカリウム、チカルシリンク��シルナトリウム、チカルシリン二ナトリウム、チカルシリン一ナトリウム、チクラトン、塩化チオドニウム、トブラマイシン、硫酸トブラマイシン、トスフロキサシン、トリメトプリム、硫酸トリメトプリム、トリスルファピリミジン、トロレアンドマイシン、硫酸トロスペクトマイシン、チロスリシン、バンコマイシン、塩酸バンコマイシン、バージニアマイシン、および／またはゾルバマイシン。
【０２３２】
B．抗真菌剤
抗真菌剤としては、アゾール、イミダゾール、ポリエン、ポサコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、アムホテリシンB、5-フルオロシトシン、ミコナゾール、ケトコナゾール、ミアムブトール（Myambutol）（塩酸エタンブトール）、ダプソン（4,4'-ジアミノジフェニルスルホン）、パーゼル（Paser）顆粒剤（アミノサリチル酸顆粒剤）、リファペンチン、ピラジナミド、イソニアジド、リファジンIV、リファンピン、ピラジナミド、硫酸ストレプトマイシンおよびトレカトール-SC（Trecator-SC）（エチオナミド）および／またはボリコナゾール（ブイフェンド（商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３３】
C．他の薬剤
本発明のある局面において、抗炎症剤が、StIR組成物と組み合わせて使用され得る。
【０２３４】
本明細書における使用のためのステロイド性抗炎症薬としては、フルチカゾン、ベクロメタゾン、それらの任意の薬学的に許容される誘導体、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において使用される場合、薬学的に許容される誘導体としては、それらの任意の塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、酸、塩基、溶媒和物または水和物が挙げられる。このような誘導体は、このような誘導体化のための公知の方法を使用して当業者によって作製され得る。
【０２３５】
フルチカゾン−  プロピオン酸フルチカゾンは、合成コルチコステロイドであり、実験式C25H31F3O5Sを有する。それは、化学名S-(フルロメチル)6α,9-ジフルオロ-11β-17-ジヒドロキシ-16α-メチル-3-オキソアンドロスタ-1,4-ジエン-17β-カルボチオアート,17-プロピオナートを有する。プロピオン酸フルチカゾンは、分子量500.6の白色〜オフホワイト色の粉末であり、特に、水に不溶性であり、ジメチルスルホキシドおよびジメチルホルムアミドに非常に可溶性であり、メエタノールおよび95％エタノールに僅かに可溶性である。
【０２３６】
ある態様において、本発明の製剤は、ステロイド性抗炎症薬（例えば、プロピオン酸フルチカゾン）を含み得る。
【０２３７】
ベクロメタゾン−  ある局面において、ステロイド性抗炎症薬は、ジプロピオン酸ベクロメタゾンまたはその一水和物であり得る。ジプロピオン酸ベクロメタゾンは、化学名9-クロロ-11b,17,21-トリヒドロキシ-16b-メチルプレグナ-1,4-ジエン-3,20-ドイン（doine）17,21-ジプロピオナートを有する。化合物は、分子量521.25を有する白色粉末であり得；水に非常に僅かに可溶性であり（Physicians' Desk Reference）、クロロホルムに非常に可溶性であり、アセトンおよびアルコールに非常に可溶性である。
【０２３８】
本発明に従うステロイド性抗炎症薬を提供することは、例えば、望まれない炎症を軽減することによって、本発明の組成物および方法を増強し得る。本明細書における使用のための他のステロイド性抗炎症薬の例としては、ベタメタゾン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、モメタゾン、フルニソリドおよびブデソニドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３９】
本発明のさらに別の局面によれば、非ステロイド性抗炎症剤としては、アスピリン、サリチル酸ナトリウム、アセトアミノフェン、フェナセチン、イブプロフェン、ケトプロフェン、インドメタシン、フルルビプロフェン、ジクロフェナク、ナプロキセン、ピロキシカム、テブフェロン、エトドラク、ナブメトン、テニダップ、アルコフェナク（alcofenac）、アンチピリン、アミモピリン（amimopyrine）、ジピロン、アニモピロン（animopyrone）、フェニルブタゾン、クロフェゾン、オキシフェンブタゾン、プレキサゾン（prexazone）、アパゾン、ベンジダミン、ブコローム、シンコペン（cinchopen）、クロニキシン、ジトラゾール（ditrazol）、エピリゾール、フェノプロフェン、フロクタフェニンル（floctafeninl）、フルフェナム酸、グラフェニン、インドプロフェン、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルム酸、サリジファミド（salidifamide）、スリンダク、スプロフェン、トルメチン、ナブメトン、チアラミド、プロカゾン、ブフェキサマク、フルミゾール、チノリジン、チメガジン、ダプソン、ジフルニサル、ベノリラート、ホスホサール、フェンクロフェナック、エトドラク、フェンチアザック、チロミソール、カルプロフェン、フェンブフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、ピルプロフェン、フェプラゾン、ピロキシカム、スドキシカム、イソキシカム、セレコキシブ、バイオックス（登録商標）、および／またはテノキシカムが挙げられ得る。
【０２４０】
VII．キット
本明細書に記載される組成物はいずれも、キットに含まれ得る。非限定的な例において、StIR組成物の製造および／または送達のための試薬は、キットに含まれる。ある局面において、キットは携帯可能であり、喘息吸入器が携帯されるように、人に携帯され得る。キットは、病原体検出器をさらに含み得る。キットはまた、本発明の組成物用のガスまたは機械的噴射剤を含有し得る。
【０２４１】
キットの成分は、水性、粉末、または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージされ得る。キットの容器手段は、成分が配置され得、好ましくは適切に等分され得る、少なくとも1つの吸入器、キャニスター、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器または他の容器手段を一般的に含む。キット中に1を超える成分（第2薬剤など）が存在する場合、キットはまた、追加の成分が別々に配置され得る、第2、第3または他の追加の容器を一般的に含有する。しかし、成分の様々な組み合わせが、バイアル、キャニスターまたは吸入器中に含まれ得る。本発明の容器としては、ベルト上に着用され得るかまたはポケット、バックパックもしくは他の保管容器中において容易に携帯され得る、キャニスターまたは吸入器が挙げられ得る。本発明のキットはまた、記載の組成物またはそれらの変形物のための容器、および販売のための厳重な管理下にある任意の他の試薬容器を典型的に含む。このような容器としては、所望のバイアルが保持される射出またはブロー成形プラスチック容器が挙げられ得る。
【０２４２】
キットの成分が1つおよび／またそれ以上の液体溶液で提供される場合、例えば、液体溶液は水溶液であり、無菌水溶液が特に好ましいが、必要ではない。しかし、キットの成分は、乾燥粉末として提供され得る。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、好適な溶媒の添加によって再構成され得るか、または粉末形態で投与され得る。溶媒はまた別の容器手段で提供され得ることが予想される。
【０２４３】
キットはまた、キット成分の使用ならびにキットに含まれない任意の他の試薬の使用のための説明書を含む。説明書は、実施され得る変形物を含み得る。
【０２４４】
このような試薬が本発明のキットの態様であることが考えられる。しかし、このようなキットは、上述の特定のアイテムに限定されず、病原性微生物の検出または本発明のStIR組成物の投与において直接的にまたは間接的に使用される任意の試薬を含み得る。
【実施例】
【０２４５】
VIII．実施例
以下の実施例は、本発明の様々な態様を説明する目的で提供され、決して本発明を限定するようには意図されない。当業者は、本発明が、対象を実施し記載の目的および利点を得るように十分に適応されること、ならびにここに固有のそれらの対象、目的および利点を容易に認識する。本実施例は、ここに記載の方法と共に、現在、ある態様を代表し、本発明の範囲に対する限定として意図されるものではない。特許請求の範囲によって定義される本発明の精神内に包含されるその変更および他の使用は、当業者によって考えられる。
【０２４６】
実施例1
緑膿菌チャレンジ
PA103株をATCCから得、LB培地（Bio 101 Systems）中の20％グリセロール中において凍結ストック（1 x 108 CFU/ml）として保存した。ストック1 mlを100 ml LB培地中において37℃にて5％CO2中で16時間インキュベートし、次いで、1Lの新鮮なブロスで希釈し、0.3のOD600まで37℃で6〜7時間増殖させ、約3 x 1010 CFUが得られた。懸濁液を遠心分離し、洗浄し、再懸濁し、チャンレンジをエアロゾル化し、トリプシン大豆寒天プレート（Becton Dickinson）上へ連続希釈物を平板培養することによって細菌濃度を測定した。エアロゾル投与のために、10 mlの懸濁液を、深い換気を促進するために空気中5% CO2の10 L/分で作動するAeroMist CA-209ネブライザー（CIS-US）中に配置した。30分後、別の5 mlを添加し、合計10 mlの懸濁液を全60分の間エアロゾル化した。
【０２４７】
TLRリガンド処置
チャレンジ感染の前に、マウスを、単独でまたは組み合わせてTLRリガンドのエアロゾルで、またはPBS（ネガティブコントロール）で処置した。全ての処置を、換気を促進するために5％CO2が補われた10 L/分で作動するAeroMist CA-209ネブライザーを使用して、チャレンジ感染の18時間前に行った。各処置について、10 mlのTLRリガンド懸濁液またはPBSをネブライザー中に配置し、20分間にわたって投与した。TLRリガンドの組み合わせを使用しての実験のために、両方のリガンドを、同一の10 ml懸濁液に懸濁し、同時に送達した。各リガンドについて、処置の24時間後での気管支肺胞洗浄液中の総計の白血球および好中球カウントによって測定されるような、肺の好中球浸潤が誘導された、最小懸濁液濃度によって、最初のエアロゾル投薬を決定した。
【０２４８】
TLR4リガンド
5、6、および7個のアシル基の混合物を含有する天然のリピドAとは異なり、モノホスホリルリピドA合成物（MPLA、Invivogen）は、6個の脂肪アシル基を含有する純粋な合成物である。MPLAの懸濁液を100μg/mlで送達した。6個の脂肪アシル基を有する別の合成リピドAである、リン酸化ヘキサアシルジサッカライド（PHAD、Avanti Polar Lipids）を100μg/mlで送達した。
【０２４９】
TLR2/6リガンド
Pam2CSK4およびFSL-1（両方ともInvivogen製）は、TLR2およびTLR6のヘテロダイマーを介してシグナル伝達することが公知の合成ジアシル化（diacylayed）リポペプチドである。Pam2CSK4を、示されるように、6または20μg/mlで送達し、FSL-1を20μg/mlで送達した。
【０２５０】
TLR9リガンド
ODN2395（Invivogen）は、ヒトおよびマウスTLR9について高親和性を有するC型CpGオリゴヌクレオチドである。ODN2395を20μg/mlでエアロゾル化した。
【０２５１】
TLR7リガンド
イミキモド（R837、Invivogen）は、TLR7、および恐らくTLR8を刺激するイミダゾキノリンアミングアノシンアナログである。イミキモドを、示されるように、1または300μg/mlでエアロゾルによって送達した。
【０２５２】
TLR5リガンド
TLR5の公知のリガンドである、フラジェリンの高度に保存された22アミノ酸セグメントを同定した。このアミノ酸セグメントを、Cell Essentials, Inc., Boston, MAでの合成のために提出した。ペプチドがHPLCおよびMaldi-TOF質量分析に基づいて＞95％純粋であることを確認し、PBS中におけるその溶解性を確認した。Flg22の合成フラグメントを100μg/mlで送達した。
【０２５３】
実施例2
材料および方法
動物および試薬
示す場合を除いて、全ての一般的な試薬をSigma (St Louis, MO)から得た。テキサス大学M. D. Anderson Cancer CenterのInstitutional Animal Care and Use Committeeの方針に従って、全てのマウスを扱った。野生型5〜8週齢の雌性Swiss-Websterマウス（Charles River, Wilmington, MA）を、ほとんどの保護および細胞カウント実験のために使用した。示されるように、Shizuo Akira (1998)によって提供された5〜8週齢の雌性MyD88-/-マウス、Trif-/-マウス（The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）およびTLR2-/-マウス（Jackson）を、野生型マウスC57BL/6J（Jackson）との比較において使用した。
【０２５４】
エアロゾル化処置
無莢膜型インフルエンザ菌（NTHi）の凍結ストックを、記載されたように（Clement et al., 2008；Evans et al., 2010；Moghaddam et al., 2008）、チョコレート寒天（Remel, Lenexa, KS）上で増殖させ、3.5μg/ml NADが補われたブレインハートインフュージョン培地（Acumedia, Baltimore, MD）中において拡大させ、EmulsiFlex C5（Avestin, Mannheim, Germany）で破壊した。タンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイ（Pierce, Rockford, IL）によって食塩水中の2.5 mg/mlへ調節し、溶解物を-80℃にて10 mlアリコートで凍結させた。処置のために、解凍されたアリコートを、20分間、（深い呼吸を促進するために）5％CO2が補われた10 L/分空気によって作動されるAeroMist CA-209ネブライザー（CIS-US）中に配置した。ネブライザーをポリエチレンチューブ（30 cm x 22 mm）によって10リットルポリエチレン曝露チャンバへ連結し、これは、その末端でバイオセイフティーフードへ放出される低抵抗微生物フィルター（BB50T, Pall, East Hills, NY）を備える同一の流出チューブを有した。
【０２５５】
Pam3CSK4、Pam2CSK4、ポリ(I:C)、MPLA、イミキモド、およびODN2395をInvivoGen（San Diego, California）から購入した。フラジェリンの最も保存されたドメインである、Flg22の22-mer
2015199747.tif 000010
は、Cell Essentials (Boston, MA)によって合成された。動物を処置するために、合成TLRアゴニストを、内毒素を含まない水の中に再構成し、示される濃度で8 ml無菌PBS中に再懸濁し、NTHi溶解物処置のために使用したのと同一の技術を使用して20分間動物へエアロゾル化した。
【０２５６】
インビボチャレンジ感染
以前に記載されたように（Clement et al., 2008；Clement et al., 2009；Evans et al., 2010）、マウスに、LD80〜LD100へ向けられた細菌接種物を吸入によってチャレンジした。緑膿菌株PA103をATCCから得、LB培地（Bio 101 Systems）中の20％グリセロール中の凍結ストック（1 x 108 CFU/ml）として保存した。1 mlのストックを、100 ml LB培地中において37℃にて5％CO2中で16時間インキュベートし、次いで、1Lの新鮮なブロスで希釈し、0.3のOD600まで37℃で6〜7時間増殖させ、1〜4 x 1010 CFU/mlが得られた。肺炎連鎖球菌血清型4を、Todd-Hewettブロス（Becton Dickinson）中の20％グリセロール中の凍結ストック（1 x 109 CFU）として保存した。解凍ストック1 mlを、5％CO2中37℃で150 ml Todd-Hewittブロス中において16時間インキュベートし、次いで、1.5 Lの新鮮なブロスで希釈し、0.3のOD600まで6〜7時間対数期において増殖させ、2〜6 x 1011 CFU/mlが得られた。細菌懸濁液を遠心分離し、洗浄し、10 ml PBS中に再懸濁し、処置について使用したものと同一のシステムを使用して60分間にわたってエアロゾル化した。トリプシン大豆寒天プレート（Becton Dickinson）上へ連続希釈物を平板培養することによって、細菌濃度を測定した。
【０２５７】
肺病原体負荷の定量化
以前に記載されたように（Clement et al., 2008；Clement et al., 2009；Evans et al., 2010）、細菌病原体での感染の直後に、マウスを麻酔し、それらの肺を採取し、2 ml組織グラインダー（Kontes, Vineland, NJ）を使用して1 mlのPBS中においてホモジナイズした。ホモジネートの連続希釈物を、トリプシン大豆寒天（TSA）プレート上に平板培養し、37℃で16時間インキュベートし、細菌コロニーをカウントした。
【０２５８】
気管支肺胞洗浄液分析
以前に記載されたように（Clement et al., 2008；Clement et al., 2009；Evans et al., 2010）、気管支肺胞洗浄（BAL）液を、示される時点で、曝露された気管の輪を通って挿入されたルアースタブアダプターカニューレ（luer stub adapter cannula）（Becton Dickinson）を介して各1 mlのPBSの2アリコートを滴下および収集することによって得た。総白血球カウントを血球計（Hauser Scientific, Horsham, PA）によって測定し、2,000 rpmで5分間300μlのBAL液の細胞遠心分離によるディファレンシャルカウント、および続いてWright-Giemsa染色を行った。
【０２５９】
インビトロ殺滅アッセイ
以前に記載されたように（Clement et al., 2008；Clement et al., 2009；Evans et al., 2010）、MLE-15細胞およびA549細胞を、10％加熱不活性化FCSおよび1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen）が補われたRPMI-1640中において6-ウェルプレート上で培養した。約80％コンフルエンスまで増殖させ、細胞をPBSで洗浄し、10％加熱不活性化FCSを含む新鮮な抗生物質フリー培地を供給し、10％加熱不活性化FCS含有RPMI-1640中の20μl体積のODN2395（20μg/ml）、Pam2CSK4（10μg/ml）もしくは両方または20μl PBSで処理した。4時間後、1000胞子の炭疽菌Sterne株または2000 CFU 緑膿菌株PA103を次いで全てのウェルへ添加した。感染から4時間後、各ウェル由来の20μlの上澄みを吸引し、連続希釈し、TSA寒天プレート上に平板培養し、37℃で16時間インキュベートし、CFUをカウントした。
【０２６０】
免疫蛍光顕微鏡検査
A549細胞を、48時間、10％加熱不活性化FCSおよび1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen）が補われたRPMI-1640中のLab-Tek IIチャンバスライド（Nunc, Rochester, NY）上において培養し、次いで、10％加熱不活性化FCSを含有するRPMI-1640中の20μl体積のTexas Red標識ODN2395（20μg/ml、Invivogen）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識Pam2CSK4（10μg/ml、Invivogen）、または両方で処理した。2時間後、培地を吸引し、チャンバを取り外し、細胞を氷冷PBSで3回洗浄した。次いで、細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、グリシンでクエンチし、PBSで3回洗浄し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI；0.1μg/ml）で核対比染色し、適切な光学（Texas Red：励起＝540 nm；発光＝620 nm；FITC：励起＝495 nm、発光＝520 nm；DAPI：励起＝360 nm；発光＝460 nm）を使用して蛍光顕微鏡（Olympus BX-60顕微鏡、Melville, NY）を用いて調べた。画像をコンピューター制御Spot RTカメラ（Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI）で連続的に収集し、Photoshop CS3（Adobe, San Jose, CA）においてアセンブルした。重複する赤および緑蛍光は黄色に見えた。
【０２６１】
統計分析
SAS/STATソフトウェア（バージョン8.2、SAS Institute）を使用して、統計分析を行った。Studentのt検定を使用し、グループ間で肺細菌またはウイルス力価を比較した。病原体チャレンジを生き延びたマウスのパーセンテージを、Fisherの直接確率検定を使用して比較し、ログランク検定を使用して、Kaplan-Meier法によって評価した生存分布を比較した。Dunnettのポストホック検定を用いるOne-way ANOVAを使用して、処置動物および未処置動物間のBAL液ディファレンシャルカウントを比較した。
【０２６２】
結果
TRIFではなく、MyD88が、エアロゾル化された細菌溶解物による肺炎に対する抵抗性の誘導のために必要とされる。
NTHiのエアロゾル化溶解物による肺上皮の刺激は、広範囲の微生物病原体9に対する高レベルの抵抗性を誘導する（Clement et al., 2008；Clement et al., 2009；Evans et al., 2010；Tuvim et al., 2009）。TLRシグナル伝達が溶解物誘導保護のために必要であるかどうかを試験するために、TIRアダプターを介してのTLRシグナル伝達を欠いているマウスに、緑膿菌を吸入によってチャレンジした。野生型およびTRIF欠損（Trif-/-）マウスは、エアロゾル化細菌溶解物での前処置によって致死的な緑膿菌チャレンジに対して完全に保護され、一方、MyD88を欠いているマウスにおいて抵抗性は誘導され得なかった（Myd88-/-；図12Aおよび12B、左パネル）。保護は、肺における迅速な病原体殺滅の誘導と密接に相関した（図12Aおよび12B、右パネル）。IL-1受容体もまた、MyD88を介してシグナル伝達するが（Adachi et al., 1998；Medzhitov et al., 1998）、直接的に微生物産物に対してではなく、宿主サイトカインシグナル伝達に対して反応する。病原体殺滅は、エアロゾル化細菌溶解物によって刺激されたIL-1受容体欠損マウスにおいて完全に保存された（Il1r-/-；図13）。この知見は、MyD88を介しての全ての受容体シグナル伝達が、溶解物誘導保護のために必要であるわけではないことを示しており、TLRを介しての直接的な微生物シグナル伝達は、誘導性上皮抵抗性について、宿主サイトカインを介しての間接的なシグナル伝達よりも重要であることを示唆している。
【０２６３】
個々のTLRアゴニストは肺炎に対して低レベルの抵抗性を誘導する。
MyD88シグナル伝達のための要件を考慮して、本発明者らは、個々の合成TLRアゴニストが、エアロゾル化細菌溶解物によって与えられたものと同様の抵抗性を誘導し得るかどうかを試験した。TLR1およびTLR6はTLR2とのヘテロダイマーとして発現され、TLR7およびTLR8は両方ともイミキモドを認識するので、マウスTLR1〜9は全て、以下の7個の合成リガンドで刺激され得た：Pam3CSK4（TLR2/1アゴニスト）、Pam2CSK4（TLR2/6アゴニスト）、ポリ(I:C)（TLR3アゴニスト）、合成リピドA（MPLA、TLR4アゴニスト）、Flg22（フラジェリンの合成22-mer、TLR5アゴニスト）、イミキモド（TLR7およびTLR8）、またはODN2395（TLR9アゴニスト）。
【０２６４】
これらのアゴニストの好適なエアロゾル化用量は公知ではなく、従って、第2種（β）の過誤を回避するために肺への送達についての適切な用量を定めるために、戦略を考えた。使用した合成TLRアゴニストの各々は、最大のサイトカイン分泌が樹状細胞から刺激される報告濃度（[DCmax]）を有する（Yamamoto et al., 2003；Aliprantis et al., 1999；Buwitt-Beckmann et al., 2005；Hayashi et al., 2001；Krug et al., 2001；Lee et al., 2003；Martin et al., 2003）。エアロゾル化化合物の有効な気道送達の計算に基づいて（Clement et al., 2009；Evans et al., 2004）、本発明者らは、気道上皮表面で[DCmax]を達成するために必要とされるネブライザー流体濃度を決定した。エアロゾル化溶解物誘導抵抗性は白血球流入に依存しないが、保護現象は、誘導される肺好中球増加のタイミングおよび大きさと密接に相関する（Clement et al., 2008）。従って、試験に十分なTLRアゴニスト用量を定めるために、本発明者らは、各リガンドについての報告された[DCmax]で開始し、白血球浸潤が達成されるまで対数的に噴霧化濃度を増加させた。
【０２６５】
図14に示されるように、PBS処置マウスにおいて、BAL液中の好中球の数は0.1 x 103 ± 0.2細胞/mlである。Pam2CSK4のみが、DCmaxで好中球の顕著な増加を示したが、ポリ(I:C)およびFlg22を除いて全てが、DCmaxを1〜2 log超える濃度で好中球レベルの顕著な増加を示した。他方では、ポリ(I:C)およびFlg22の両方が、処置の24時間後、BALに対するマクロファージの顕著な流入を誘導した。Flg22およびイミキモドは各々、それを超えると好中球浸潤が減少するリガンド濃度を有した。Pam2CSK4は、Pam3CSK4よりもほぼ5倍高く、任意の他のリガンドよりも15倍高く、好中球増加のレベルを誘導した。
【０２６６】
各リガンドについて選択された濃度は、好中球／mlの10倍増加を誘導するかまたはマクロファージの倍増を誘導するための最も低い用量であった（いずれも両方ともを誘導しなかった）。リガンドのうちのいくつかが強力な細胞浸潤を誘導した一方、合成アゴニストのいずれも致死的な緑膿菌肺炎に対して強力な保護を提供しなかった（図15）。Pam2CSK4、Flg22、およびイミキモドで保護の傾向があったが、これらは、個々の実験でまたは多数の実験の平均において統計学的有意に達しなかった。MPLA処置マウスは病原体チャレンジ後に死亡率増加の有意でない傾向を示した。
【０２６７】
TLR2/6およびTLR9アゴニストの組み合わせは肺炎に対して高レベルの抵抗性を誘導する。
単一の合成TLRアゴニストは中程度の保護しか提供しなかったが、多数のPRRの同時刺激が、高レベルの抵抗性を誘導するために必要であるという可能性がある（Clement et al., 2008；Evans et al., 2010）。TLRアゴニストの組み合わせが抵抗性を誘導し得るかどうかを測定するために、本発明者らは、7個の合成リガンドの対の順列を試験した。
【０２６８】
驚くべきことに、Pam2CSK4およびODN2395での同時処置（ODN＋Pam2）は、グラム陰性緑膿菌での別の致死的なチャレンジからのマウスの100％の生存（図16A、左）、およびグラム陽性肺炎連鎖球菌での致死的チャレンジからの80％の生存（図16B、左）をもたらした。エアロゾル処置における両方のリガンドの濃度を倍増させることによって、肺炎連鎖球菌でのチャレンジからの90％の生存がもたらされた（図16B）。致死的チャレンジ感染からのマウスの保護は、肺内での病原体の相乗的な殺滅に関連し（図16Aおよび16B、右）、リガンドの濃度を倍増させることは、より大きな病原体殺滅への傾向と関連した。Pam2CSK4とODN2395との相乗的な相互作用はまた、4および24時間での肺への白血球動員において観察された（図16C）。これらの結果は、TLR2/6およびTLR9についてのリガンドは、病原体殺滅および白血球動員についてのものを含む、抗微生物性エフェクター応答の相乗的活性化を誘導し、これは肺炎に対して相乗的なレベルの保護をもたらすことを示している。NTHi溶解物誘導抵抗性の動態と同様に、保護が処置の4時間後までに現れた。
【０２６９】
TLRアゴニスト組み合わせの全てが感染症に対して強力な保護を生じさせるわけではない。
本発明者らは、TLRアゴニストの以下の組み合わせを試験した：Pam2＋ポリ(I:C)、Pam2＋Flg22、Pam2＋イミキモド、ODN＋ポリ(I:C)、ODN＋Flg22、およびODN＋Pam3。本発明者らは、これらの組み合わせが、Pam2-ODN組み合わせ（図16）と比較して、緑膿菌チャレンジに対する保護の点であまり有効でないことを見出した（図17A〜F）。これらの結果は、TLRアゴニスト組み合わせの全てが、Pam2-ODNと同一の免疫刺激を与えるわけではないことを示唆している。
【０２７０】
TLR2は保護的なPam2CSK4およびODN2395相乗効果を促進するには十分であるが、誘導抵抗性のためには必要ではない。
十分に規定された受容体特異性を有する、TLRリガンドであるPam2CSK4およびODN2395の相乗効果の検出は、TLR2/6およびTLR9の関与の推定証拠を提供する。本発明者らは、ノックアウトマウスおよび追加のリガンドを使用してさらなる証拠を求めた。
【０２７１】
本発明者らは、緑膿菌でのチャレンジの前にPam2-ODNまたはPBSで前処置した野生型およびTLR2欠損マウスの生存を比較した。野生型マウスはPam2-ODNによって完全に保護された一方、偽処置した野生型群またはいずれのTlr2-/-群においても生存は存在せず（図18A、左パネル）、このことは、Pam2-ODN誘導保護におけるTLR2についての要件を確認する。Tlr2-/-マウスにおける保護の喪失は、Pam2-ODN誘導される肺内病原体殺滅と密接に相関した（図18A、右パネル）。
【０２７２】
Pam2CSK4およびPam3CSK4はTLR2/6とTLR2/1とを識別し、Pam3CSK4ではなくPam2CSK4が、ODN2395と組み合わされると、強力な相乗的防護効果をもたらすので、TLR2/6ヘテロダイマーは、肺上皮抵抗性を誘導するために必要であり得る。本発明者らはまた、NTHi溶解物での処置後にTlr2-/-および野生型マウスにチャレンジし、保護の喪失（図18B、左パネル）も溶解物誘導細菌殺滅の欠如（図18B、右パネル）も見られなかった。総合すると、これらの結果は、TLR2/6は、TLR9と相乗的に相互作用するに十分であるが、全ての誘導される肺上皮抵抗性について必要ではないことを示唆している。
【０２７３】
クラスAまたはBではなくクラスCのCpG ODNが、Pam2CSK4と相乗的に相互作用し、細菌性肺炎に対する抵抗性を誘導する。
本発明者らは、TLR9がPam2-ODNの相乗的な相互作用のために必要であるかどうかをさらに評価しようとした。Tlr9-/-マウスは入手できなかったので、本発明者らは、TLR9へ結合しないことが公知のスクランブルODNを使用してTLR9関与を試験した。Pam2-ODNでの前処置は緑膿菌がチャレンジされたマウスの90％生存をもたらした一方、Pam2CSK4およびコントロールODNで前処置した場合は生存したものはおらず（図19A）、これは、ODNによるTLR9結合が相乗的な保護のために必要であることを示している。
【０２７４】
Pam2-ODN相互作用の特異性をさらに探求するために、本発明者らは、緑膿菌のチャレンジの前に、Pam2CSK4および異なるクラスのCpG ODNで野生型マウスを処置した。クラスA ODN（ODN 1585またはODN 2216）またはクラスB ODN（ODN 2006-G5）とPam2SCK4との組み合わせは保護を与えず、一方、Pam2CSK4とクラスC ODN（ODN M362またはODN 2395）との組み合わせは、そうでなければ致死的な肺炎に対して顕著な抵抗性を促進した（図19B）。これらの結果は、TLR2/6およびTLR9リガンドが相乗作用することだけでなく、他のものよりも有利に相互作用する特異的リガンドが存在することを示している。
【０２７５】
Pam2CSK4およびODN2395はインビトロで上皮細胞による細菌殺滅を誘導する。
肺上皮細胞は、NTHi溶解物で刺激されると、インビトロで細菌を殺滅するように誘導される（Clement et al., 2009；Evans et al., 2010）。Pam2-ODNはインビボで細菌溶解物の免疫刺激効果を示すので、本発明者らは、組み合わせが、単離された肺上皮細胞によってインビトロでも病原体殺滅を誘導し得るかどうかを試験した。Pam2-ODNでの4時間のマウスMLE-15呼吸器上皮細胞の前処理は、炭疽菌の接種後の細胞培養培地中における細菌CFUを顕著に低下させた（図20A）。同様に、Pam2-ODNでのヒトA549細胞の処理は、感染の4時間後に緑膿菌CFUの顕著な減少をもたらした（図20C）。病原体殺滅がPam2-ODNの直接的な抗生物質効果によってではなく上皮細胞の刺激によって生じることを実証しているが、細菌は、それらがPam2-ODNまたはPBSで処理されるかどうかにかかわらず、上皮細胞を含有しないウェル中において等しい数まで増殖した（図20Bおよび20D）。
【０２７６】
従って、抗微生物効果が、マウスおよびヒトの両方の上皮細胞において誘導され、グラム陽性およびグラム陰性細菌病原体の両方の殺滅をもたらす。これらのデータは、Pam2-ODN処置後にインビボにおいて見られる細菌殺滅を類似している。ここに示されるよりも32倍高くまでのPam2-ODN投薬量の連続増加は、病原体殺滅を有意には増加させなかった。
【０２７７】
Pam2CSK4およびODN2395はインビトロで細胞内に共局在する。
Pam2CSK4およびODN2395が相互作用して相乗効果を誘導する機構は、未解明のままである。TLR2/6は形質膜へ局在すると報告されており、TLR9はエンドソームへ局在すると報告されているので（Beutler, 2009；Dostert et al., 2008）、これらのリガンドの物理的相互作用を予想しないだろう。しかし、TLR4はシグナル伝達をするためにインターナリゼーションを必要とし得るので（Kagan et al., 2008）、本発明者らは、2つのリガンドが上皮細胞によってインターナリゼーションされるかどうかを調べた。A549細胞を細胞培養スライド上で単層に増殖させ、次いで、病原体殺滅実験において使用したのと同一の濃度でFITC標識Pam2CSK4（10μg/ml）およびTexas Red標識ODN2395（20μg/ml）で処理した。2時間後、細胞を洗浄し、核をDAPIで標識し、スライドを蛍光顕微鏡へ提出した。Pam2CSK4およびODN2395の両方が、上皮細胞によってインターナリゼーションされた。さらに、Pam2CSK4およびODN2395は、細胞質区画中に、恐らくエンドソーム内に、共局在する。これらの結果は、Pam2CSK4およびODN2395はエンドソーム内に共局在し得ることを示唆している。
【０２７８】
TLR2/6アゴニストであるPam2CSK4とTLR9アゴニストであるクラスC ODN（2395、10101またはM362）との組み合わせでの前処置は、炭疽菌およびインフルエンザウイルスでの肺感染症に対して高レベルの抵抗性を誘導する。炭疽菌胞子での鼻腔内チャレンジまたはインフルエンザウイルスでのエアロゾルチャレンジの1日前に、示される通りに、マウスをエアロゾル化TLRリガンドで前処置した。マウスの生存をモニタリングした。
【０２７９】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載のものを補う例示的な手順のまたは他の詳細を提供する程度に、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年7月3日(2015.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物感染症を有するかまたは発症もしくは獲得する危険性がある個体へ、有効量のTLR9アゴニストおよびTLR2/6アゴニストを投与する工程を含む、微生物感染症を治療、抑制または軽減する方法。