(57)【要約】【課題】細胞を複数の培養容器に順に移し替えて培養する場合に、コンタミネーションのリスクを低減すると共に、培養容器内における細胞の残存を減少させ、培地の加温機構を省略することを可能とする。【解決手段】複数の培養容器２ａ，２ｂ，２ｃが、他の容器との内容物移送用ポートを一つ備え、第一容器２ａに細胞懸濁液を収容し、培地を供給する培地容器１と培養容器とをチューブ３を用いて接続して細胞の培養を開始し、第一容器での培養終了後、当該容器に接続された第二容器２ｂに細胞懸濁液を移送し、第一容器に培地容器から培地を供給し、所定時間経過後、第二容器に第一容器から培地を供給し、第二容器において細胞の培養を行い、次の培養容器がある場合、次の培養容器への細胞懸濁液の移送、当該培養容器への培地の供給、次の培養容器への当該培養容器からの培地の供給、及び次の培養容器における細胞の培養を、残りの培養容器について繰り返して行う。【選択図】  図１
2015188392.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の培養容器を用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、
前記複数の培養容器が、それぞれ他の容器との内容物の移送用のポートを一つ備え、
前記複数の培養容器における第一の培養容器に細胞及び培地を含む細胞懸濁液を収容し、
前記複数の培養容器に培地を供給する培地供給容器と前記第一の培養容器とをチューブを用いて接続すると共に、前記第一の培養容器に前記複数の培養容器におけるその他の培養容器を順次チューブを用いて接続して、
前記第一の培養容器において細胞の培養を開始し、
前記第一の培養容器での培養が終了した後、前記第一の培養容器に接続された第二の培養容器に前記第一の培養容器から培養された細胞を含む細胞懸濁液を移送し、次いで前記第一の培養容器に前記培地供給容器から培地を供給して、所定時間経過後、前記第二の培養容器に前記第一の培養容器から培地を供給して、前記第二の培養容器において細胞の培養を行い、
前記第二の培養容器での培養が終了した後、培養が終了した培養容器に接続された次の培養容器がある場合、前記次の培養容器への細胞懸濁液の移送、前記培養が終了した培養容器への培地の供給、前記次の培養容器への前記培養が終了した培養容器からの培地の供給、及び前記次の培養容器における細胞の培養を、前記培養が終了した培養容器に接続された前記次の培養容器がなくなるまで、繰り返して行う
ことを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２】
培養する細胞が浮遊系の細胞である場合に、前記複数の培養容器として、
ダメージを受けた細胞の機能を回復させるための細胞培養に用いる養生培養容器、
細胞を活性化させるための細胞培養に用いる活性化培養容器、及び、
細胞を増殖させるための細胞培養に用いる増幅培養容器を用い、
前記養生培養容器に細胞及び培地を含む細胞懸濁液を収容して、前記培地供給容器と、前記養生培養容器と、前記活性化培養容器と、前記増幅培養容器とを、この順番で接続し、
前記養生培養容器においてダメージを受けた細胞の機能を回復させた後、前記活性化培養容器に、前記養生培養容器から培養された細胞を含む細胞懸濁液を移送し、前記養生培養容器に前記培地供給容器から培地を供給して、所定時間経過後、培地の温度が所定の値以上に上昇した後に、前記活性化培養容器に前記養生培養容器から培地を供給して、前記活性化培養容器において細胞の培養を行い、
前記活性化培養容器において細胞を活性化させた後、前記増幅培養容器に、前記活性化培養容器から活性化された細胞を含む細胞懸濁液を移送し、前記養生培養容器及び／又は前記活性化培養容器に前記培地供給容器から培地を供給して、所定時間経過後、培地の温度が所定の値以上に上昇した後に、前記増幅培養容器に前記養生培養容器及び／又は前記活性化培養容器から培地を供給して、前記増幅培養容器において細胞の培養を行い、細胞を増殖させる
ことを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
前記活性化培養容器において細胞を活性化させた後、前記増幅培養養容器に、前記活性化培養容器から活性化された細胞を含む細胞懸濁液を移送し、前記養生培養容器に前記培地供給容器から培地を供給して、所定時間経過後、前記活性化培養容器に前記養生培養容器から培地を供給して、所定時間経過後、前記増幅培養容器に前記活性化培養容器から培地を供給して、前記増幅培養容器において細胞の培養を行い、細胞を増殖させる
ことを特徴とする請求項２に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
培養する細胞が浮遊系の細胞である場合に、前記複数の培養容器として、
細胞を活性化させるための細胞培養に用いる活性化培養容器、及び、
細胞を増殖させるための細胞培養に用いる増幅培養容器を用い、
前記活性化培養容器に細胞及び培地を含む細胞懸濁液を収容して、前記培地供給容器と、前記活性化培養容器と、前記増幅培養容器とを、この順番で接続し、
前記活性化培養容器において細胞を活性化させた後、前記増幅培養容器に、前記活性化培養容器から活性化された細胞を含む細胞懸濁液を移送し、前記活性化培養容器に前記培地供給容器から培地を供給して、所定時間経過後、培地の温度が所定の値以上に上昇した後に、前記増幅培養容器に前記活性化培養容器から培地を供給して、前記増幅培養容器において細胞の培養を行い、細胞を増殖させる
ことを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項５】
培養する細胞が接着系の細胞である場合に、前記複数の培養容器として、培養面積の異なる培養容器を用い、
前記複数の培養容器における培養面積の最も小さい第一の培養容器に細胞及び培地を含む細胞懸濁液を収容し、前記複数の培養容器に培地を供給する培地供給容器に前記複数の培養容器を培養面積の小さい順に接続して、前記第一の培養容器において細胞の培養を開始する
ことを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項６】
培養された細胞を前記培養容器内の底面から剥離するための酵素溶液を前記培養容器に供給する酵素溶液供給容器を、前記培地供給容器と前記第一の培養容器の間にチューブを用いて接続し、
前記酵素溶液供給容器から前記培養容器に酵素溶液を送流し、培養された細胞を前記培養容器内の底面から剥離して、培養された細胞を含む細胞懸濁液の移送を行う
ことを特徴とする請求項５に記載の細胞培養方法。
【請求項７】
前記培地供給容器に接続された第一の培養容器と、
前記第一の培養容器に接続された第二の培養容器と、その他に接続された培養容器がある場合は、これらのその他の培養容器とを、前記培地供給容器により近く接続されたものほど相対的に高い位置に配置し、
それぞれの前記培養容器を傾けることで、前記培養容器から次に接続された培養容器への細胞懸濁液の移送を行う
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項８】
一端縁に設けられた回動軸を基台に軸支した平板状の一又は二以上の保持板を有する積載部に前記複数の培養容器を別個に又は一括して保持し、
前記回動軸を中心に前記保持板を上方に回動させることにより、前記複数の培養容器を別個に又は同時に傾けつつ初期位置よりも上方に移動させ、
次いで、前記回動軸を中心に前記保持板を下方に回動させて、前記複数の培養容器が別個に又は同時に初期位置に戻る際に前記保持板を前記基台に当接させることによって、前記複数の培養容器に加える振動を生じさせる請求項１〜７のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項９】
浮遊系の細胞を培養するための複数の培養容器を備えた細胞培養システムであって、
前記複数の培養容器に培地を供給する培地供給容器と、
前記複数の培養容器として、
ダメージを受けた細胞の機能を回復させるための細胞培養に用いる養生培養容器と、
細胞を活性化させるための細胞培養に用いる活性化培養容器と、
細胞を増殖させるための細胞培養に用いる一又は二以上の増幅培養容器を備え、
前記養生培養容器と、前記活性化培養容器と、前記増幅培養容器とが、それぞれ他の容器との内容物の移送用のポートを一つ備え、
前記培地供給容器と、前記養生培養容器と、前記活性化培養容器と、前記増幅培養容器とが、この順番でチューブを用いて接続された
ことを特徴とする細胞培養システム。
【請求項１０】
接着系の細胞を培養するための複数の培養容器を備えた細胞培養システムであって、
前記複数の培養容器に培地を供給する培地供給容器と、
前記複数の培養容器として、培養面積の異なる培養容器を備え、
前記複数の培養容器が、それぞれ他の容器との内容物の移送用のポートを一つ備え、
前記培地供給容器に前記複数の培養容器が培養面積の小さい順にチューブを用いて接続された
ことを特徴とする細胞培養システム。
【請求項１１】
一端縁に設けられた回動軸を基台に軸支した平板状の一又は二以上の保持板を有する積載部と、
前記保持板をフォロワとするカム機構と、を備え、
前記複数の培養容器が別個に又は一括して前記積載部に保持されて、
前記カム機構により前記回動軸を中心に前記保持板を上下に繰り返し回動させるとともに、前記保持板が下動して前記基台に当接したときに生じる振動を前記複数の培養容器に別個に又は同時に加えることにより前記複数の培養容器の内容液を撹拌する
ことを特徴とする請求項９又は１０に記載の細胞培養システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で培養する細胞培養方法、及び細胞培養システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。このような細胞培養にあっては、培地内の細胞密度が高くなるにつれて、増殖に必要な成分の枯渇、細胞自身の代謝産物の蓄積が起こり、増殖速度が低下し細胞密度は飽和に達してしまう。このため、細胞をある程度の規模で培養する場合には、通常、細胞密度が適性に維持されるよう継代を繰り返しながら培養を行っている。
【０００３】
この継代の際に、容量の小さい培養容器から、容量のより大きい培養容器に細胞を移し替える場合がある。例えば、細胞培養ウェルプレートを用いて培養の初期段階に適した細胞密度となるように、培地と共に細胞を個々のウェルに加えて培養を開始し、ウェル内で細胞を十分に増殖させてから細胞培養フラスコに移し替え、細胞増殖に合わせて培地を追加して培養することが行われていた。また、細胞が一定量に増殖した時点で、さらに容量の大きいバックなどに移し替え、培地の補給と継代を繰り返し行って、細胞が大量培養されていた（例えば、特許文献１［００２７］段落等参照）。
また、凍結保存された細胞を使用する際に、融解して復元した後に、細胞本来の機能を回復するためにウェルプレートを用いて数日間の培養を行い（以下、養生培養と称する場合がある）、細胞の機能を本来の状態に回復させた後にフラスコに移し替えて培養し（以下、拡大培養と称する場合がある）、その後、活性化培養を行う方法もあった（例えば、特許文献２［００５７］段落等参照）。
【０００４】
しかしながら、このような細胞培養においては、ウェルプレートからフラスコに移し替える際にピペッティング作業を何回も繰り返す必要があり、継代のたびに新たなフラスコやバックなどの培養容器に細胞を移さなければならず、作業が煩雑になるだけでなく、細胞にダメージを与える可能性があった。また、コンタミネーションのリスクが高いという問題もあった。
【０００５】
一方、コンタミネーションのリスクを低減し得る細胞培養装置等が、特許文献３及び特許文献４に記載されている。
すなわち、特許文献３には、インキュベータ内に気密に形成された細胞の培養器を設置し、培養器に気密に接続された送液管を介して培地容器と洗浄液容器と骨髄液容器の液を選択的に培養器に注入する送液手段と、培養器内の液を排液管を介して排出する排液手段とを備えた自動培養装置が開示されている。そして、この構成により、培養器に接着した幹細胞を選択的に分離した後、培地を培養器に注入して幹細胞を培養し、次いで、分化培養用の培地を培養器に注入して目的の組織細胞に分化させる技術が開示されている。
また、特許文献４には、複数の培養容器を用いて、密閉系で付着細胞の継代培養を行うことが可能な自動継代培養装置が開示されている。具体的には、複数の培養容器に、培地が収容された培地供給タンクと、洗浄液が収容された洗浄液供給タンクと、剥離液が収容された剥離液供給タンクと、処理容器とが接続され、処理容器内に細胞の通過を阻止するためのフィルタが設けられ、フィルタの表面に細胞を集めた後に、フィルタの外側から培地を供給して、細胞を培地により押し流して移送する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−２４１１５９号公報
【特許文献２】特開２０１３−２１５１４１号公報
【特許文献３】特開２００７−３１２６６８号公報
【特許文献４】特開２００５−１９８６２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、これらの細胞培養装置等は、複数の培養容器を用いて細胞を大量に培養する場合に、最適なものであるとは言えなかった。
すなわち、特許文献３の細胞培養装置によれば、一つの培養器で幹細胞を培養し、かつ目的の組織細胞に分化させることはできるが、細胞を大量に培養するために必要となる継代などに好適に利用し得るものではなかった。
また、特許文献４の自動継代培養装置では、複数の培養容器を用いて細胞の継代培養が行われるが、最初に一つの培養容器で培養した細胞をフィルタの表面に集めた後、フィルタの外側から培地を供給して細胞を三つの培養容器に移送して再度培養し、この再度培養した細胞をフィルタの表面に集めた後、フィルタの外側から培地を供給して細胞の一部又は全部を回収する構成となっている。この培養装置では、再度培養した細胞の一部を継代培養することはできるが、全部は行えないことから細胞の大量培養に最適なものとは言えず、また操作手順が煩雑であるという問題があった。さらに細胞を培地や洗浄液と共に送流してフィルタで堰き止めた後に、培養容器への移送や細胞の取出しを行うものであるため、細胞にダメージを与えるおそれがあった。
【０００８】
また、複数の培養容器を用いて細胞培養を行う場合、従来は、細胞の移送に際して、培養容器内に細胞が残存してしまうという問題があった。このような培養容器内における細胞の残存が生じると、全ての細胞を利用することができず、細胞の一部廃棄につながるため、細胞の増殖効率が低減することから重大な問題となっていた。
【０００９】
さらに、細胞培養において用いる培地は、低温で保存しなければ品質が劣化するため、使用するまでは冷却して保存されている。ところが、細胞培養は３７℃程度で行われるため、この冷却された培地を細胞と培地が封入された培養容器にそのまま供給すると、細胞の増殖効率が低下してしまうという問題があった。
そこで、従来は、例えば特許文献３の段落００１８に記載されているように、ヒータなどの加温機構により培地を加温してから培養容器に供給することで、このような問題を解決していた。
しかしながら、細胞培養システムにおいて加温機構を設けると、構成が煩雑かつ大型化するため、加温機構は設けないことが望ましい。
【００１０】
本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであり、複数の培養容器を用いて細胞培養を行う場合に、コンタミネーションのリスクを低減すると共に、細胞の移送に際して、培養容器内における細胞の残存を減少させ、さらに培地の加温機構を省略することの可能な細胞培養方法、及び細胞培養システムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る細胞培養方法は、複数の培養容器を用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、前記複数の培養容器が、それぞれ他の容器との内容物の移送用のポートを一つ備え、前記複数の培養容器における第一の培養容器に細胞及び培地を含む細胞懸濁液を収容し、前記複数の培養容器に培地を供給する培地供給容器と前記第一の培養容器とをチューブを用いて接続すると共に、前記第一の培養容器に前記複数の培養容器におけるその他の培養容器を順次チューブを用いて接続して、前記第一の培養容器において細胞の培養を開始し、前記第一の培養容器での培養が終了した後、前記第一の培養容器に接続された第二の培養容器に前記第一の培養容器から培養された細胞を含む細胞懸濁液を移送し、次いで前記第一の培養容器に前記培地供給容器から培地を供給して、所定時間経過後、前記第二の培養容器に前記第一の培養容器から培地を供給して、前記第二の培養容器において細胞の培養を行い、前記第二の培養容器での培養が終了した後、培養が終了した培養容器に接続された次の培養容器がある場合、前記次の培養容器への細胞懸濁液の移送、前記培養が終了した培養容器への培地の供給、前記次の培養容器への前記培養が終了した培養容器からの培地の供給、及び前記次の培養容器における細胞の培養を、前記培養が終了した培養容器に接続された前記次の培養容器がなくなるまで、繰り返して行う方法としてある。
【００１２】
また、本発明に係る細胞培養システムは、浮遊系の細胞を培養するための複数の培養容器を備えた細胞培養システムであって、前記複数の培養容器に培地を供給する培地供給容器と、前記複数の培養容器として、ダメージを受けた細胞の機能を回復させるための細胞培養に用いる養生培養容器と、細胞を活性化させるための細胞培養に用いる活性化培養容器と、細胞を増殖させるための細胞培養に用いる一又は二以上の増幅培養容器を備え、前記養生培養容器と、前記活性化培養容器と、前記増幅培養容器とが、それぞれ他の容器との内容物の移送用のポートを一つ備え、前記培地供給容器と、前記養生培養容器と、前記活性化培養容器と、前記増幅培養容器とが、この順番でチューブを用いて接続された構成としてある。
【００１３】
さらに、本発明に係る細胞培養システムは、接着系の細胞を培養するための複数の培養容器を備えた細胞培養システムであって、前記複数の培養容器に培地を供給する培地供給容器と、前記複数の培養容器として、培養面積の異なる培養容器を備え、前記複数の培養容器が、それぞれ他の容器との内容物の移送用のポートを一つ備え、前記培地供給容器に前記複数の培養容器が培養面積の小さい順にチューブを用いて接続された構成としてある。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、複数の培養容器を用いて細胞培養を行う場合に、コンタミネーションのリスクを低減すると共に、細胞の移送に際して、培養容器内における細胞の残存を減少させ、さらに培地の加温機構を省略することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の第一実施形態に係る細胞培養システムの概略を示す説明図である。
【図２】本発明の第一実施形態に係る細胞培養システムにおける攪拌手段の概略を示す説明図である。
【図３】本発明の第一実施形態に係る細胞培養方法における一次培養工程を示す斜視図である。
【図４】本発明の第一実施形態に係る細胞培養方法における細胞移送工程を示す斜視図である。
【図５】本発明の第二実施形態に係る細胞培養システムの概略を示す説明図である。
【図６】本発明の第二実施形態に係る細胞培養システムにおける養生容器及び保持具の概略を示す斜視図である。
【図７】本発明の第三実施形態に係る細胞培養システムの概略を示す説明図である。
【図８】本発明の第四実施形態に係る細胞培養システムの概略を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態に係る細胞培養方法、及び細胞培養システムの好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
【００１７】
（第一実施形態）
まず、本発明の第一実施形態に係る細胞培養方法、及び細胞培養システムについて、図１及び図２を参照して説明する。
【００１８】
［細胞培養システム］
本実施形態に係る細胞培養システムは、図１に示すように、培地供給容器１（以下、培地容器１と称する場合がある）と、複数の培養容器２（一次培養容器２ａ，二次培養容器２ｂ，三次培養容器２ｃ）と、移送チューブ３（以下、単にチューブ（導管）と称する場合がある）とを備えている。
複数の培養容器２には、それぞれ他の容器との内容物の移送を行うためのポートが一つ備えられており、培地容器１と複数の培養容器２とが、チューブを用いて接続されている。
【００１９】
本実施形態に係る細胞培養システムによれば、これら複数の培養容器２を用いて、閉鎖系で細胞の継代培養を行うことができるため、コンタミネーションのリスクを低減することが可能になっている。
また、本実施形態に係る細胞培養システムを用いて、ある培養容器２における培養が終了し、次の培養容器２で培養を行うにあたり、当該次の培養容器２に培地を注入する前に、既に培養が終了した培養容器２に培地を注入して所定時間待った後、次に培養を行う培養容器２へ培地を移送することで、培養が終了した培養容器２に残存する細胞を低減でき、かつ次に培養を行う培養容器２へ移送する培地の温度を上昇させることができる。このため、細胞の増殖効率をより向上させることが可能になっている。
これらの効果は、以降の実施形態においても同様に得ることが可能である。
【００２０】
［培地供給容器］
培地容器１は、細胞を培養するための培地を培養容器に供給する容器であり、複数の培養容器２に供給する培地を格納する。この培地容器１は、同一の又は異なる培地を供給するために、複数の容器を用いて構成しても良い。
培地容器１は、格納している培地のｐＨが培養期間中に大きく変化しないように、酸素及び二酸化炭素に対するガスバリア性を有することが好ましい。これは、培地中に含まれている高濃度の炭酸ガスが空気中に抜け、培地中の炭酸ガス濃度が低下し、結果としてｐＨが上昇することを回避するために、培地容器１の内部から二酸化炭素が外部に漏れ出るのをできるだけ少なくすることが望ましいからである。また培地の酸化を防ぐことが望ましいからである。
【００２１】
培地容器１には、一つのポートが備えられ、このポートに移送チューブ３が接続され、この移送チューブ３を介して複数の培養容器２に接続されている。この培地容器１から培地を、培養細胞の増殖等に合わせて、ポンプを用いて培養容器２に供給することができる。
【００２２】
なお、培地容器１は、培養が完了して空になった後に、廃液回収容器（以下、廃液容器と称する場合がある）として用いることができる。そして、培養容器２から細胞懸濁液の上澄みを廃液容器としての培地容器１に送流することで、培養容器２における細胞懸濁液を濃縮することが可能になっている。さらに、二以上の培地容器１を接続して、一方を廃液容器として使用すると共に、他方を細胞回収容器として使用し、濃縮された細胞懸濁液を培養容器２から培地容器１に送流して、細胞を回収することなども可能である。
【００２３】
［培養容器］
培養容器２は、細胞を継代培養などにより増殖させるための容器であり、複数の容器からなる。図１の例では、培養容器２として、一次培養容器２ａ、二次培養容器２ｂ、三次培養容器２ｃが備えられており、この順番に細胞培養を行うことを想定している。なお、培養容器２の個数は、三個に限定されるものではなく、例えば二個としても良く、四個や五個、又はそれ以上にしても良い。
【００２４】
培養容器２の容量及び培養面積は、継代培養などを効率的に行えるように、後に接続されるものほど大きくすることが好ましい。例えば、二次培養容器２ｂとして、一次培養容器２ａの容量の２倍以上のものを好適に用いることができ、一次培養容器２ａの培養面積の１．５倍以上のものを好適に用いることができる。また、三次培養容器２ｃとして、二次培養容器２ｂの容量の１０倍程度のものを好適に用いることができ、二次培養容器２ｂの培養面積の６倍以上のものを好適に用いることができる。なお、一次培養容器２ａ、二次培養容器２ｂ、三次培養容器２ｃの容量及び培養容器の比率は、これらに限定されない。
【００２５】
本実施形態に係る細胞培養システムでは、まず一次培養容器２ａで細胞培養を行った後、培養された細胞を一次培養容器２ａから二次培養容器２ｂに移送する。次いで培地を培地容器１から一次培養容器２ａに流加する。そして、一次培養容器２ａに培地が収容された状態で、所定時間が経過するのを待つことにより、培地温度を上昇させる。この待ち時間としては、培地量と培養温度によるが例えば５分間から１０分間程度とすることができる。次いで培地を一次培養容器２ａから二次培養容器２ｂに移送する。
また、培地容器１から一次培養容器２ａへの培地の移送にあたり、移送速度を通常よりも遅くすることが好ましい。この移送速度としては、例えば通常の移送速度の５％〜５０％程度とすることが好ましい。具体的には、例えば５ｍL／min〜５０ｍL／minとすることが好ましく、１０ｍL／min〜３０ｍL／minとすることがより好ましい。このように、培地の移送速度を通常よりも遅くすることにより、次の培養を行う培養容器２（二次培養容器２ｂ）に移送する前に、培地の温度を上昇させることが可能になっている。
また、培地を一次培養容器２ａに移送してから二次培養容器２ｂに移送するため、一次培養容器２ａに残存していた細胞を、培地と共に二次培養容器２ｂに移送することができる。このため、培養が終了した培養容器２（一次培養容器２ａ）における残存細胞を低減することが可能になっている。
【００２６】
また、二次培養容器２ｂで細胞培養を行った後についても同様に、培養された細胞を二次培養容器２ｂから三次培養容器２ｃに移送し、次いで培地を培地容器１から一次培養容器２ａに流加する。そして、一次培養容器２ａに培地が収容された状態で、そのまま所定時間が経過するのを待って培地温度を上昇させ、次いで培地を一次培養容器２ａから二次培養容器２ｂに移送する。そして、二次培養容器２ｂに培地が収容された状態で、所定時間が経過するのを待って培地温度を上昇させ、次いで培地を二次培養容器２ｂから三次培養容器２ｃに移送する。
このとき、培地を一次培養容器２ａと二次培養容器２ｂに移送してから三次培養容器２ｃに移送するため、一次培養容器２ａと二次培養容器２ｂに残存していた細胞を、培地と共に三次培養容器２ｃに移送することができる。
【００２７】
なお、二次培養容器２ｂで細胞培養を行った後に、一次培養容器２ａのみに培地を流加して培地温度を上昇させた後、この培地を三次培養容器２ｃに移送しても良く、二次培養容器２ｂのみに培地を移送させて培地温度を上昇させた後、この培地を三次培養容器２ｃに移送しても良い。また、一次培養容器２ａ及び二次培養容器２ｂ両者に培地を流加して培地温度を上昇させた後、これらの培地を三次培養容器２ｃに移送しても良い。
このように、本実施形態に係る細胞培養システムによれば、培養容器内における細胞の残存を顕著に減少させることができると共に、培地の温度を上昇させてから培養容器に移送することができ、細胞の増殖効率を一層向上させることが可能になっている。
【００２８】
これらの培養容器２は、軟包材を材料として袋状（バッグ型）に形成されており、内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有している。
また、培養容器２は、細胞の培養に必要なガス透過性（酸素及び二酸化炭素透過性）を有していることが必要であり、３７℃、５％二酸化炭素濃度の培養環境下で使用することが好ましい。さらに、培養容器２は、高い細胞増殖効率を実現するために、低細胞毒性、低溶出性、及び放射線滅菌適性を有することが好ましい。
【００２９】
このような条件を満たす培養容器２の材料としては、ポリエチレン系樹脂が好ましい。このポリエチレン系樹脂としては、ポリエチレン、エチレンとα−オレフィンの共重合体、エチレンと酢酸ビニルの共重合体、エチレンとアクリル酸やメタクリル酸共重合体と金属イオンを用いたアイオノマー等が挙げられる。また、ポリオレフィン、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーン樹脂等を用いることもできる。
【００３０】
培養容器２の形状は、特に限定されないが、図１に示すように、長方形状とすることができ、他の容器との内容物の移送用のポートを一つ備えている。この内容物の移送用のポートには、移送チューブ３が接続され、この移送チューブ３を介して、培地容器１から培養容器２への培地の注入、及び培養容器２から次の培養容器２への培地や細胞懸濁液の移送を行う構成になっている。
この移送用ポートは、培養容器２を傾斜させることで、内容物を次の培養容器２に自然送流することができるように、培養容器２を傾斜させたときに下側になる位置に配置させることが望ましい。
【００３１】
また、最後に培養が行われる培養容器２（通常、最後に接続される培養容器２、図１では三次培養容器２ｃ）は、サンプリング用のポートを備えており、このポートにサンプリングチューブ２ｃ−１が接続されている。サンプリングチューブ２ｃ−１は、培養された細胞の状態を確認することなどを目的として、培養容器２から培養された細胞の一部を取り出すために用いられる。サンプリングチューブ２ｃ−１における培養容器２のポートと反対側の自由端の先端部には、二段シールが施されており、サンプリングチューブ２ｃ−１をしごくことによって、培養容器２からサンプリングチューブ２ｃ−１内に細胞懸濁液を充填させることができる。そして、サンプリングチューブ２ｃ−１をヒートシール（熱溶着）した後に切断することで、細胞培養システムの閉鎖系を維持した状態で、細胞をサンプリングすることが可能になっている。
なお、サンプリング用のポートを中間の培養容器２（図１では二次培養容器２ｂ）に備え、このポートにサンプリングチューブを接続して細胞のサンプリングを行えるようにすることも好ましい。
【００３２】
培養容器２の四辺はヒートシールにより密封されている。培養容器２の収容部の形状は、長方形状としてもよく、また図１に示すように、ポートに向かって次第に狭くなるように構成することも好ましい。なお、培養容器２は、ブロー成形による一体成型バッグでもよい。
【００３３】
［移送チューブ］
移送チューブ３は、培地容器１と複数の培養容器２とを接続し、これによって、培地容器１から培養容器２への培地の注入、及び複数の培養容器２間における培地や細胞懸濁液の移送を行うことを可能にしている。
移送チューブ３の流路には流路開閉手段とポンプを適宜配置し、流路開閉手段によって送液流路を制御している。流路開閉手段としては、例えばピンチバルブや二方活栓、三方活栓等を用いることができ、特に限定されない。図１では、三方活栓を用いて培地容器１と複数の培養容器２とが接続され、ポンプにより培地容器１から培養容器２への培地の移送が行われる。また、同図では、培養容器２（一次培養容器２ａ，二次培養容器２ｂ）と移送チューブ３の接続や移送チューブ３同士の接続を、ルアーコネクターを用いて行っているが、その他の方法で接続しても良い。
【００３４】
移送チューブ３の材料は、使用環境に合わせて適宜選択すれば良いが、ガス透過性に優れるものが望ましい。例えば、シリコーンゴム、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー等を用いることができる。また、スチレン系エラストマーとしては、例えば、ＳＢＳ（スチレン・ブタジエン・スチレン）、ＳＩＳ（スチレン・イソプレン・スチレン）、ＳＥＢＳ（スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン）、ＳＥＰＳ（スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン）等を用いることができる。
図１では、移送チューブ３におけるポンプを取り付ける部分にはシリコーンチューブが用いられ、その他の部分には軟質塩化ビニル樹脂チューブが用いられている。
【００３５】
［攪拌手段］
培養容器２を用いて細胞培養を行うにあたり、培養容器２の内容液中の細胞の分布や培地の成分濃度を均一にして良好な培養環境を維持して細胞の増殖を促進するために、培養開始および培地供給時などに培養容器２の内容液を撹拌する攪拌手段を設けることが好ましい。なお、攪拌手段は、以降の実施形態においても培養容器の内容液を攪拌することなどを目的として用いることができる。
【００３６】
このとき、攪拌手段により、培養容器２を初期位置よりも上方に移動させる上動工程と、培養容器２を初期位置まで戻すとともに、初期位置に戻った培養容器２に振動を加える下動工程とを繰り返すことによって培養容器２の内容液を撹拌することができる。
なお、上動工程と下動工程とを繰り返すにあたり、培養容器２の内容液の撹拌が確実になされるように、必要に応じて下動工程後にインターバルをおいて、所定の時間が経過してから上動工程が繰り返されるようにしてもよい。
【００３７】
このようにすることで、培養容器２の上下動による内容液の撹拌に加えて、下動工程において培養容器２に加わる振動によって細胞が内容液中を舞い上がるように拡散する。これにより、培養容器２の内容液が上下方向にも効率よく攪拌され、細胞が培養容器２の培養面を転がり落ちる際のずり応力を軽減して、細胞に与えるダメージを少なくしつつ、培養容器２の内容液中の細胞の分布や培地の成分濃度を均一にして良好な培養環境を維持するとともに、細胞が容器内壁に付着したり、過度に凝集したりするのを抑制して、細胞の増殖を促進することができる。さらに、培養する細胞が接着系の細胞である場合には、下動工程において培養容器２に加わる振動により、培養容器２の培養面からの細胞の剥離を促すことも可能である。
【００３８】
上記のようにして培養容器２の内容液を撹拌するために、攪拌手段として、例えば図２に示すように、一端縁に設けられた回動軸４２を基台６に軸支した平板状の保持板４１を有する積載部４と、保持板４１をフォロワとするカム機構とを備え、培養容器２が積載部４に保持されて、カム機構により回動軸４２を中心に保持板４１を上下に繰り返し回動させるとともに、保持板４１が下動して基台６に当接したときに生じる振動を培養容器２に加えることにより培養容器２の内容液を撹拌する装置を用いるのが好ましい。複数の培養容器２は、それぞれ別個の保持板４１に保持させるようにしても良く、一つの保持板４１に一括して保持させるようにしても良い。
【００３９】
このような装置において、上動工程では、積載部４に保持された培養容器２は、カム機構によって保持板４１が上方に回動するに伴って、初期位置よりも上方に移動しながら傾いていき、これによって軟包材を用いて形成された培養容器２が撓み変形しつつ、その内容液が回動軸４２側に偏るように流動する（図２（ａ）〜（ｅ）参照）。下動工程では、保持板４１は、最大傾斜角度θｍａｘに達した後、下方に回動し、これに伴って培養容器２は初期位置に戻るが（図２（ｆ），（ｇ）参照）、その際に培養容器２の内容液に揺り戻しが生じ、これとともに、保持板４１が基台６に当接したときの衝撃によって生じた振動で細胞が内容液中を舞い上がるように拡散し、これによって培養容器２の内容液が撹拌される。
【００４０】
このようにして培養容器２の内容液を撹拌するにあたり、細胞に与えるダメージをより少なくして、培養容器２の内容液をより効率よく撹拌するためには、基台６に水平に支持した保持板４１を緩やかに上方に回動させ、保持板４１が最大傾斜角度θｍａｘに達した後に、保持板４１を落下により下方に回動させて、落下する保持板４１を基台６が受けたときに生じる衝撃によって、培養容器２に振動が加わるようにするのが好ましい。特に図示しないが、保持板４１が基台６に当接したときの衝撃によって生じた振動を培養容器２に加えるに際しては、培養容器２の内容液をより効率よく撹拌する上で培養容器２に振動を加えるのに好適な位置に応じて、保持板４１に当接する凸部を基台６に設けておくことができる。
【００４１】
また、保持板４１を落下により下方に回動させるには、例えば、輪郭が円弧状の第一カム面５１と、輪郭が直線状の第二カム面５２とを有する板カム５によってカム機構を構成し、カム面５１，５２の曲率、板カム５を回転させる駆動軸５３の位置及び回転速度を適宜設定し、第一カム面５１によって保持板４１を上方に回動させ、第二カム面５２に切り替わる際に板カム５が保持板４１から離れるようにすることで（図２（ｆ）参照）、保持板４１を落下により下方に回動させることができる。
また、第二カム面５２に切り替わる際に板カム６が保持板４１に接したままになるようにすると共に、カム面５１，５２の曲率、駆動軸５３の位置及び回転速度を適宜設定することにより、培養容器２に衝撃を加えることなく、培養容器２を揺動して、培養容器２の内容液をゆるやかに攪拌することも可能である。
【００４２】
なお、前述したように、培養容器２の形状は、長方形状とすることができ、保持板４１の形状も培養容器２の形状に合わせて設計するが、保持板４１を長方形状とした場合、回動軸４２を設ける一端縁は、短辺側であっても、長辺側であってもよい。
また、このような培養容器２の内容液の攪拌手段を、浮遊系の細胞を活性化させた後に細胞を培養面から剥離する場合や、前述したように接着系の細胞を培養面から剥離する場合に、細胞剥離手段として用いることも可能である。
【００４３】
なお、図示しないが、細胞培養システムには、各培養容器２内の細胞や培地の状態を観察するための観察装置を備えることが好ましい。観察装置としては、例えばＣＣＤカメラ、対物レンズ、照明、及び情報処理装置等からなるものを用いることができる。この場合、観察孔を有する積載台に水平に載置された培養容器２の上方から光を照らし、観察孔の下方からＣＣＤカメラと対物レンズにより培養容器２内の細胞などを所定のタイミングで自動的に撮影することができる。そして、得られた画像データを情報処理装置に送信し、情報処理装置において画像データを解析して、培養容器２内の細胞数や細胞密度などを算出することができる。これは以降の実施形態についても同様である。
【００４４】
［細胞培養方法］
次に、本実施形態に係る細胞培養方法について図１〜図４を参照して詳細に説明する。
本実施形態に係る細胞培養方法は、複数の培養容器を用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、複数の培養容器が、それぞれ他の容器との内容物の移送用のポートを一つ備え、複数の培養容器における第一の培養容器に細胞及び培地を含む細胞懸濁液を収容し、複数の培養容器に培地を供給する培地供給容器と第一の培養容器とをチューブを用いて接続すると共に、第一の培養容器に複数の培養容器におけるその他の培養容器を順次チューブを用いて接続して、第一の培養容器において細胞の培養を開始し、第一の培養容器での培養が終了した後、第一の培養容器に接続された第二の培養容器に第一の培養容器から培養された細胞を含む細胞懸濁液を移送し、次いで第一の培養容器に培地供給容器から培地を供給して、所定時間経過後、第二の培養容器に第一の培養容器から培地を供給して、第二の培養容器において細胞の培養を行い、第二の培養容器での培養が終了した後、培養が終了した培養容器に接続された次の培養容器がある場合、次の培養容器への細胞懸濁液の移送、培養が終了した培養容器への培地の供給、次の培養容器への培養が終了した培養容器からの培地の供給、及び次の培養容器における細胞の培養を、培養が終了した培養容器に接続された次の培養容器がなくなるまで、繰り返して行うことを特徴とする。
【００４５】
具体的には、本実施形態に係る細胞培養方法は、（１）容器接続工程と、（２）一次培養工程と、（３）細胞移送工程１と、（４）培地流加工程１と、（５）二次培養工程と、（６）細胞移送工程２と、（７）培地流加工程２と、（８）三次培養工程と、（９）サンプリング工程と、（１０）濃縮工程とを有するものとすることができる。
なお、細胞培養システムにおける培養容器２の個数が二個の場合は、（６）〜（８）を省略すると共に、二次培養容器２ｂにサンプリングチューブを備えて（９）〜（１０）を行うことができる。また、細胞培養システムにおける培養容器２の個数が四個以上の場合は、四個以上の分について（６）〜（８）を繰り返し行う。さらに、（９）及び（１０）を省略することもできる。
【００４６】
（１）容器接続工程
まず、本実施形態に係る細胞培養方法において用いる培地容器１と複数の培養容器２を、図１に示すように接続して、閉鎖系の細胞培養システムを構成する。
すなわち、培地容器１と、一次培養容器２ａと、二次培養容器２ｂと、三次培養容器２ｃとを、この順番で移送チューブ３を用いて接続する。
このとき、一次培養容器２ａには、培養を行う細胞と培地を含む細胞懸濁液を収容して接続する。また、培地容器１には培養容器２に供給するための培地を充填して接続する。二次培養容器２ｂと三次培養容器２ｃは、空のまま接続する。培地容器１と培養容器２の間の移送チューブ３上にはポンプが備えられ、このポンプにより培地の移送等が行われる。また、移送チューブ３上には適宜三方活栓が備えられており、これらによって送液流路を制御できるようになっている。
【００４７】
また、図３に示すように、複数の培養容器２は、培地容器１により近く接続されたものほど相対的に高い位置になるように配置される。すなわち、一次培養容器２ａが最も高い位置に配置され、二次培養容器２ｂが次に高い位置に配置され、三次培養容器２ｃが最も低い位置に配置される。培養容器２をこのように配置して、一次培養容器２ａを図４に示すように傾けることで、一次培養容器２ａの内容液を、一次培養容器２ａの下側のポートと移送チューブ３を経由して、二次培養容器２ｂに自然送流によって移送することが可能になっている。また、図示しないが、同様にして二次培養容器２ｂを傾けることで、二次培養容器２ｂの内容液を、二次培養容器２ｂの下側のポートと移送チューブ３を経由して、三次培養容器２ｃに自然送流によって移送することが可能になっている。なお、図３，図４において、攪拌手段は省略してある。
また、図示しないが、培地容器１は、培養容器２よりも相対的に低い位置に配置することが好ましく、例えば培養容器を配置している積載台１３の下側に配置することができる。これによって、培地が培養系に意図せず流入することを防止することが可能になる。
このような複数の培養容器２と培地容器１の配置は、以下の実施形態においても同様に採ることが好ましい。
【００４８】
さらに、本実施形態に係る細胞培養システムにおいて、培養容器２を載置した基台６の重量を計測するための計測手段を備えることも好ましい。このような計測手段を用いて、培養容器２を載置した基台６の重量の減少をモニターすることによって、培養容器２から液漏れが生じた場合に、これを検出することが可能になる。
【００４９】
（２）一次培養工程
このように細胞培養システムを構成すると、まず一次培養容器２ａにおいて細胞培養が行われる。また、培養細胞の増殖等に合わせて、培地が培地容器１からポンプを用いて一次培養容器２ａに供給される。このとき、培地の移送速度を通常よりも遅くして、培地の温度を上昇させつつ、移送することが好ましい。この移送速度としては、例えば通常の移送速度の５％〜５０％程度とすることが好ましく、具体的には５ｍL／min〜５０ｍL／minとすることが好ましく、１０ｍL／min〜３０ｍL／minとすることがより好ましい。
また、この一次培養工程において、一次培養容器２ａ内における細胞を分散させるために、前述した攪拌手段を用いて、一次培養容器２ａに繰り返し振動を加えて、一次培養容器２ａの内容液を撹拌することが好ましい。このような内容液の攪拌は、その他の培養容器２についても同様に行うことが好ましい。
【００５０】
（３）細胞移送工程１
一次培養容器２ａ内の細胞密度が所定の細胞密度になり、一次培養工程が完了すると、次に一次培養容器２ａから二次培養容器２ｂに培養細胞の移送が行われる。
このとき、図４に示すように、一次培養容器２ａを、二次培養容器２ｂへ接続するためのポートが下側になるように傾斜させて、一次培養容器２ａ内の内容液（細胞懸濁液）を二次培養容器２ｂに送流する。これによって、一次培養容器２ａで培養された細胞が、二次培養容器２ｂに移送される。このように、一次培養容器２ａで培養された細胞は、二次培養容器２ｂに自然送流されるが、この送流が完了した時点では、通常、一次培養容器２ａには、細胞が残存している。
【００５１】
（４）培地流加工程１
次に、培地を培地容器１から一次培養容器２ａに流加する。このとき、前述した一次培養工程において培地を供給する場合と同様に、培地の移送速度を通常よりも遅くして、培地の温度を上昇させつつ、移送することが好ましい。
そして、一次培養容器２ａに培地が収容された状態で、所定時間が経過するのを待つことにより、培地温度を上昇させる。この待ち時間としては、例えば２分間から２０分間程度とすることが好ましく、５分間から１０分間程度とすることがより好ましい。
次いで、前述した攪拌手段によって、一次培養容器２ａ内の培地を攪拌する。そして、培地を一次培養容器２ａから二次培養容器２ｂに移送する。
これにより、例えば培地容器１において１５℃以下であった培地の温度を、２０℃以上にしてから二次培養容器２ｂに移送することができる。このため、低温の培地がそのまま二次培養容器２ｂに移送されることがなく、低温の培地によって細胞の増殖効率が低下することを抑止することが可能になっている。その後、培地の温度は、室温（例えば３７℃）まで自然に上昇する。
また、このように培地を一次培養容器２ａに移送してから二次培養容器２ｂに移送することにより、一次培養容器２ａに残存していた細胞を培地と共に二次培養容器２ｂに移送することができ、細胞培養における残存細胞を低減することが可能になっている。
【００５２】
（５）二次培養工程
二次培養容器２ｂに培養細胞及び培地が移送されると、二次培養容器２ｂにおいて、引き続き細胞の培養が行われる。また、培養細胞の増殖等に合わせて、培地を培地容器１から供給することができるが、このときも培地流加工程１と同様にして行うことができる。
【００５３】
（６）細胞移送工程２
二次培養容器２ｂ内の細胞密度が所定の細胞密度になり、二次培養工程が完了すると、次に二次培養容器２ｂから三次培養容器２ｃに培養細胞の移送が行われる。
このとき、二次培養容器２ｂを、三次培養容器２ｃへ接続するためのポートが下側になるように傾斜させて、二次培養容器２ｂ内の内容液（細胞懸濁液）を三次培養容器２ｃに送流する。これによって、二次培養容器２ｂで培養された細胞が、三次培養容器２ｃに移送される。このように、二次培養容器２ｂで培養された細胞は、三次培養容器２ｃに自然送流されるが、この送流が完了した時点では、通常、二次培養容器２ｂには、細胞が残存している。
【００５４】
（７）培地流加工程２
次に、培地を培地容器１から一次培養容器２ａに流加する。このとき、培地流加工程１と同様に、培地の移送速度を通常よりも遅くして、培地の温度を上昇させつつ移送しても良い。そして、培地流加工程１と同様に、一次培養容器２ａに培地が収容された状態で、所定時間が経過するのを待つことにより、培地温度を上昇させる。
次いで、攪拌手段により一次培養容器２ａ内の培地を攪拌した後、培地を一次培養容器２ａから二次培養容器２ｂに移送する。そして、二次培養容器２ｂに培地が収容された状態で、所定時間が経過するのを待って培地温度を上昇させ、次いで攪拌手段により二次培養容器２ｂ内の培地を攪拌した後、培地を二次培養容器２ｂから三次培養容器２ｃに移送する。
このとき、培地を一次培養容器２ａと二次培養容器２ｂに移送してから三次培養容器２ｃに移送するため、一次培養容器２ａと二次培養容器２ｂに残存していた細胞を、培地と共に三次培養容器２ｃに移送することができ、細胞培養における残存細胞を顕著に低減することが可能になっている。
【００５５】
（８）三次培養工程
三次培養容器２ｃに培養細胞及び培地が移送されると、三次培養容器２ｃにおいて、引き続き細胞の培養が行われる。また、培養細胞の増殖等に合わせて、培地を培地容器１から供給することができるが、このときも培地流加工程２と同様にして行っても良い。
なお、三次培養容器２ｃにおける培地量は、一次培養容器２ａや二次培養容器２ｂに比べて大きく、冷えた培地による影響が比較的小さいため、三次培養容器２ｃへの培地の移送速度は、通常の移送速度とすることができ、例えば１００ｍL／min程度にすることができる。
培地容器１における全ての培地が培養容器２に供給され、培地容器１が空になると、空になった培地容器１は、廃液容器又は細胞回収容器として用いることができる。
【００５６】
（９）サンプリング工程
三次培養容器２ｃにおける細胞が、所定の細胞数又は細胞密度になると、細胞のサンプリングが行われる。なお、このサンプリング工程は、増幅培養工程の途中において、行っても良い。
このとき、細胞のサンプリングは、サンプリングチューブ２ｃ−１をしごくことによって、サンプリングチューブ２ｃ−１内に三次培養容器２ｃから内容液を充填し、サンプリングチューブ２ｃ−１を熱溶着した後に切断して行うことができる。このようにすれば、細胞培養システムにおける閉鎖系を維持したまま無菌的に細胞のサンプリングを行うことができる。
【００５７】
（１０）濃縮工程
次に、三次培養容器２ｃから内容液の上澄みを、廃液容器としての培地容器１にポンプを用いて送流する。これによって、三次培養容器２ｃ内の内容液における細胞密度を高めることができ、高濃度の細胞懸濁液を得ることが可能となる。そして、このようにして得られた高濃度の細胞懸濁液を収容する三次培養容器２ｃから細胞を回収することができる。
【００５８】
このように本実施形態に係る細胞培養方法、及び細胞培養システムでは、培養容器に培地を供給するにあたり、既に培養が終了した培養容器に培地を注入して所定時間経過した後に、培養容器に培地を移送するようにしてある。このため、培養が終了した培養容器に残存する細胞を低減できると共に、培地の温度を上昇させてから培養容器に培地を移送することができ、細胞の増殖効率をより向上させることが可能になっている。
【００５９】
（第二実施形態）
次に、本発明の第二実施形態に係る細胞培養方法、及び細胞培養システムについて、図５を参照して説明する。
【００６０】
［細胞培養システム］
本実施形態に係る細胞培養システムは、主として、リンパ球などの浮遊系の細胞をより効率的に培養するためのものであり、図５に示すように、複数の培地容器１と、機能の異なる複数の培養容器が、移送チューブ３により接続された構成となっている。これら複数の培養容器は、他の容器との内容物の移送を行うためのポートが一つ備えられており、培地容器１と複数の培養容器２とが、チューブを用いて接続されている。
【００６１】
具体的には、本実施形態に係る細胞培養システムは、培地容器１として、培地Ａ供給容器１ａと培地Ｂ供給容器１ｂを備えると共に、複数の培養容器として、養生拡大培養容器２０ａ（以下、養生培養容器、又は養生容器２０ａと称する場合がある）、活性化培養容器２０ｂ（以下、活性化容器２０ｂと称する場合がある）、及び増幅培養容器２０ｃ（以下、増幅容器２０ｃと称する場合がある）を備え、これらの容器を、移送チューブ３を用いて接続した構成となっている。
なお、複数の培養容器は、これら三個に限定されるものではなく、例えば養生容器２０ａを除いて活性化容器２０ｂと増幅容器２０ｃの二個としても良く、またその他の培養容器等を用いて四個や五個、又はそれ以上にしても良い。
【００６２】
本実施形態に係る細胞培養システムによれば、養生容器２０ａにおける培養が終了し、活性化容器２０ｂで培養を行うにあたり、活性化容器２０ｂに培地を注入する前に、まず養生容器２０ａに培地を注入して所定時間待った後、活性化容器２０ｂへ培地を移送することで、養生容器２０ａに残存する細胞を低減でき、かつ活性化容器２０ｂへ移送する培地の温度を上昇させることができる。また、増幅容器２０ｃで培養を行うにあたり、増幅容器２０ｃに培地を注入する前に、養生容器２０ａ及び／又は活性化容器２０ｂに培地を注入して所定時間待った後、増幅容器２０ｃへ培地を移送することで、養生容器２０ａ及び／又は活性化容器２０ｂに残存する細胞を低減でき、かつ増幅容器２０ｃへ移送する培地の温度をさらに上昇させることができる。このため、細胞の増殖効率をより向上させることが可能になっている。
【００６３】
［培地供給容器］
培地容器１は、細胞を培養するための培地を培養容器に供給する容器であり、養生容器２０ａ、活性化容器２０ｂ、及び増幅容器２０ｃに供給する培地を格納する。
培地容器１は、図５において、養生容器２０ａと活性化容器２０ｂに培地Ａを供給するための培地Ａ供給容器１ａと、増幅容器２０ｃに培地Ｂを供給するための培地Ｂ供給容器１ｂとから構成されている点で第一実施形態と相違している。その他の点については第一実施形態におけるものと同様の構成とすることができる。
【００６４】
［養生拡大培養容器］
養生容器２０ａは、ダメージを受けた細胞の機能を回復させるための細胞培養に用いる容器である。すなわち、患者から採取したばかりの細胞や、凍結保存後に解凍されたばかりの細胞のような、ダメージを受けて機能が衰えた細胞は、そのままの状態では活性化させようとしても十分に行うことができず、細胞の大量培養に用いることができない。そこで、このような細胞を増殖させるため、細胞本来の機能が回復するように、細胞培養の初期の段階において当該細胞を養生しつつ培養する培養工程（養生培養工程）が行われる。そして、細胞本来の機能が回復し、細胞の増殖がある程度進んでから培養面積を拡大して、所定の細胞密度となるまで細胞の培養を継続する培養工程（拡大培養工程）が行われる。
養生容器２０ａは、このような養生培養工程と拡大培養工程において用いられる培養容器であり、図６に示すように、養生容器２０ａを保持する保持具７と共に用いられる。
【００６５】
養生容器２０ａは、軟包材を材料として袋状（バッグ型）に形成されている。軟包材とは、可撓性及び柔軟性を包装体に与える包装材料をいう。
また、養生容器２０ａは、細胞培養に必要なガス透過性（酸素及び二酸化炭素透過性）を有している。これにより、細胞培養を閉鎖系（密閉系）で行うことができる。養生容器２は、３７℃、５％二酸化炭素濃度の培養環境下で使用することが好ましい。これは、活性化容器２０ｂ、及び増幅容器２０ｃについても同様である。
【００６６】
さらに、養生容器２０ａは、内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有している。また、養生容器２０ａは、低細胞毒性、低溶出性、及び放射線滅菌適性を有することが好ましい。
このような条件を満たす養生容器２０ａの材料としては、ポリエチレン系樹脂が好ましい。このポリエチレン系樹脂としては、ポリエチレン、エチレンとα−オレフィンの共重合体、エチレンと酢酸ビニルの共重合体、エチレンとアクリル酸やメタクリル酸共重合体と金属イオンを用いたアイオノマー等が挙げられる。また、ポリオレフィン、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーン樹脂等を用いることもできる。
【００６７】
このような養生容器２０ａの形状は、特に限定されないが、例えば長方形状とすることができ、短辺側の一辺に一つのポートが備えられ、これに移送チューブ３が接続されている。そして、この移送チューブ３を介して、活性化容器２０ｂへの細胞懸濁液の移送、培地Ａ供給容器１ａから養生容器２０ａへの培地の流加、及び養生容器２０ａから活性化容器２０ｂへの培地の移送が行われる。
また、養生容器２０ａの四辺はヒートシールにより密封されると共に、養生容器２０ａ内の収容部が移送チューブ３の取り付け部分に向かって次第に狭くなるようにするのが好ましい。なお、養生容器２０ａは、ブロー成形による一体成型バッグでもよい。
【００６８】
養生容器２０ａを保持する保持具７には、複数の凹部７０１が設けられ、養生容器２０ａの幅方向中央部を保持する底板７０と、底板７０の両側端縁に沿って設けられて養生容器２０ａの幅方向側縁部を保持し、鉛直又は斜め方向に立ち上った状態と、底板７０と水平に倒れた状態とに可変となるように、その下端側を軸に回動可能な側板７１とを有している。図６は、側板７１を底板７０と水平に倒した状態を示している。なお、複数の凹部７０１を貫通孔として構成することもできる。
【００６９】
養生容器２０ａを保持具７に取り付けて保持するために、保持具７の側板７１には、止め部材が立設されている。これと共に、養生容器２０ａの四隅には、止め部材に係止される孔が穿設されている。これにより、止め部材のそれぞれに養生容器２０ａの各孔を係止することで、養生容器２０ａが保持具７に取り付けられて、図６に示すように、側板７１が底板７０と水平に倒れた状態の保持具７のほぼ全面で養生容器２０ａが保持されるようになっている。そして、側板７１が立ち上った状態から、底板７０と水平に倒れた状態となるように回動するのに伴って、養生容器２０ａの四隅が引っ張られて、養生容器２０ａに張力が加わるようにしてある。
【００７０】
すなわち、側板７１が立ち上った状態にあるときには、底板７０上に保持された養生容器２０ａが、内容物の重さで凹部７０１内に部分的に落ち込むように撓むことによって、養生容器２０ａの底面に窪み２０ａ−１が形成されるようになっている。そして、側板７１が回動して底板７０と水平に倒れた状態になると、養生容器２０ａの幅方向端縁部も側板７１と一緒に倒れ、これに伴って、止め部材によって養生容器２０ａの四隅が引っ張られて張力が加わり、養生容器２０ａの撓みが解消されて、養生容器２０ａの底面に形成された窪み２０ａ−１が消失するようになっている。
【００７１】
このような養生容器２０ａによれば、細胞培養の開始にあたって、養生容器２０ａに細胞と培地を含む細胞懸濁液を収容すると、細胞は養生容器２０ａの底面に沈降するが、このとき側板７１を立ち上がった状態にしておくと、沈降した細胞が養生容器２０ａの底面に形成された窪み２０ａ−１に集まって、細胞密度が高められる。
このため、細胞培養の開始時に細胞密度を高めた状態で培養を行うことができ、細胞本来の機能をより効率的に回復させることができるようになっている。具体的には、例えば、リンパ球などの浮遊系細胞を培養する場合には、養生容器２０ａの底面に形成された窪み２０ａ−１に細胞が集まることにより、細胞が生成するサイトカインなどの活性化物質の濃度が局所的に高まり、また、細胞間の相互作用が生じることにより、細胞活性を高めた状態で培養することが可能になっている。
そして、養生容器２０ａに張力を加えて撓みを解消することによって、養生容器２０ａの底面に形成された窪み２０ａ−１を消失させつつ、養生容器２０ａ内の培養面積を拡大することができる。このため、容器の移し替えを行うことなく、養生培養工程から拡大培養工程に移行することができ、細胞へのダメージの低減、コンタミネーションのリスクの低減が可能になっている。
【００７２】
また、細胞の増殖がある程度進んでから養生容器２０ａ内の培養面積を拡大させることで、同一容器内で適正な細胞密度を維持しながら、効率的に細胞を培養することができる。
このため、本実施形態における養生容器２０ａは、患者から採取したばかりの細胞や、凍結保存後に解凍されたばかりの細胞のようなダメージを受けて機能が衰えた細胞を養生して、細胞本来の機能を回復しつつ、効率よく培養するのに特に好適に利用することができるものとなっている。
【００７３】
［活性化培養容器］
活性化容器２０ｂは、細胞を活性化させるための細胞培養に用いる容器である。活性化容器２０ｂ内の底面上には、抗ＣＤ３抗体などの、細胞を活性化させる物質が固相化されており、活性化容器２０ｂに収容された細胞は、当該物質に結合して活性化される。抗ＣＤ３抗体は、リンパ球を活性化させるために好適に用いられる。
【００７４】
活性化容器２０ｂは、養生容器と同様に、軟包材を材料として袋状（バッグ型）に形成されており、内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有している。また、活性化容器２０ｂは、養生容器２０ａと同様に、細胞培養に必要なガス透過性（酸素及び二酸化炭素透過性）を有し、低細胞毒性、低溶出性、及び放射線滅菌適性を有することが好ましい。活性化容器２０ｂの材料としては、養生容器２０ａと同様のものを用いることができる。
活性化容器２０ｂの形状は、特に限定されないが、例えば長方形状とすることができ、短辺側の一辺に一つのポートが備えられ、これに移送チューブ３が接続されている。そして、この移送チューブ３を介して、増幅容器２０ｃへの細胞懸濁液の移送、培地Ａ供給容器１ａ又は養生容器２０ａから活性化容器２０ｂへの培地の流加、及び活性化容器２０ｂから増幅容器２０ｃへの培地の移送が行われる。
【００７５】
また、活性化容器２０ｂの四辺はヒートシールにより密封されると共に、活性化容器２０ｂ内の収容部が移送チューブ３の取り付け部分に向かって次第に狭くなるようにするのが好ましい。なお、活性化容器２０ｂは、ブロー成形による一体成型バッグでもよい。
活性化容器２０ｂの容量は、養生容器２０ａの容量よりも大きくすることが好ましく、例えば養生容器２０ａの容量の２倍以上のものを好適に用いることができる。
【００７６】
［増幅培養容器］
増幅容器２０ｃは、細胞を大量に増殖させるための細胞培養に用いる容器である。
増幅容器２０ｃの形状は、特に限定されないが、例えば長方形状とすることができ、その一辺に他の容器との内容物の移送を行うためのポートが一つ備えられ、これに移送チューブ３が接続されている。そして、この移送チューブ３を介して、廃液容器としての培地容器１への上澄みの移送、回収容器としての培地容器１への細胞懸濁液の移送、培地Ｂ供給容器１ｂ又は養生容器２０ａ又は活性化容器２０ｂから増幅容器２０ｃへの培地の流加が行われる。またサンプリングチューブ２０ｃ−１を接続するためのポートも備えられている。
【００７７】
増幅容器２０ｃは、細胞を大量に増殖させるために用いるため、容量の大きなものを用いることが好ましく、例えば活性化容器２０ｂの容量の１０倍程度のものを好適に用いることが可能である。
本実施形態に係る細胞培養システムにおける増幅容器２０ｃについてのその他の点は、第一実施形態における培養容器２（三次培養容器２ｃ）と同様の構成とすることができる。また、移送チューブ３も第一実施形態と同様のものとすることができる。
【００７８】
［細胞培養方法］
次に、本実施形態に係る細胞培養方法について、図５及び図６を参照して詳細に説明する。
本実施形態に係る細胞培養方法は、培養する細胞が浮遊系の細胞である場合に、複数の培養容器として、ダメージを受けた細胞の機能を回復させるための細胞培養に用いる養生培養容器、細胞を活性化させるための細胞培養に用いる活性化培養容器、及び、細胞を増殖させるための細胞培養に用いる増幅培養容器を用い、養生培養容器に細胞及び培地を含む細胞懸濁液を収容して、培地供給容器と、養生培養容器と、活性化培養容器と、増幅培養容器とを、この順番で接続し、養生培養容器においてダメージを受けた細胞の機能を回復させた後、活性化培養容器に、養生培養容器から培養された細胞を含む細胞懸濁液を移送し、養生培養容器に培地供給容器から培地を供給して、所定時間経過後、培地の温度が所定の値以上に上昇した後に、活性化培養容器に養生培養容器から培地を供給して、活性化培養容器において細胞の培養を行い、活性化培養容器において細胞を活性化させた後、増幅培養容器に、活性化培養容器から活性化された細胞を含む細胞懸濁液を移送し、養生培養容器及び／又は活性化培養容器に培地供給容器から培地を供給して、所定時間経過後、培地の温度が所定の値以上に上昇した後に、増幅培養容器に養生培養容器及び／又は活性化培養容器から培地を供給して、増幅培養容器において細胞の培養を行い、細胞を増殖させることを特徴とする。
【００７９】
具体的には、本実施形態に係る細胞培養方法は、（１）容器接続工程と、（２）養生培養工程と、（３）拡大培養工程と、（４）細胞移送工程１と、（５）培地流加工程１と、（６）活性化培養工程と、（７）細胞移送工程２と、（８）培地流加工程２と、（９）増幅培養工程と、（１０）サンプリング工程と、（１１）濃縮工程とを有するものとすることができる。
なお、増幅容器２０ｃを二個以上接続して用いる場合には、各増幅容器２０ｃ毎に（７）〜（９）を繰り返し行う。また、（１０）と（１１）を省略することもできる。本実施形態では、（１０）と（１１）を第一実施形態と同様に行うことができるため、以下においてこれらの説明は省略する。
【００８０】
（１）容器接続工程
まず、本実施形態に係る細胞培養方法において用いる培地容器１と複数の培養容器２を、図５に示すように接続して、閉鎖系の細胞培養システムを構成する。
すなわち、培地容器１と、養生容器２０ａと、活性化容器２０ｂと、増幅容器２０ｃとをこの順番で移送チューブ３を用いて接続する。
このとき、養生容器２０ａには、培養を行う細胞と培地を含む細胞懸濁液を収容して接続する。また、培地容器１のうち、培地Ａ供給容器１ａには養生容器２０ａ及び活性化容器２０ｂに供給するための培地Ａを、培地Ｂ供給容器１ｂには増幅容器２０ｃに供給するための培地Ｂを充填して接続する。活性化容器２０ｂと増幅容器２０ｃは、空のまま接続する。培地容器１と養生容器２０ａの間の移送チューブ３上にはポンプが備えられ、このポンプにより培地の移送等が行われる。また、移送チューブ３上には適宜三方活栓が備えられており、これらによって送液流路を制御できるようになっている。
【００８１】
（２）養生培養工程
このように細胞培養システムを構成すると、まず養生容器２０ａにおいて細胞培養が行われ、ダメージを受けた細胞の機能回復が行われる。
このとき、養生容器２０ａを保持する保持具７は、側板を立ち上げた状態にして用いられる。養生容器２０ａ内の底面は、内容物の重さで部分的に撓んで、窪みが形成されている。そして、この窪みに細胞が集められて、細胞培養の開始時に好適な細胞密度で培養が行われる。
また、培養細胞の増殖等に合わせて、培地Ａが培地Ａ供給容器１ａからポンプを用いて養生容器２０ａに供給される。このとき、第一実施形態と同様に、培地の移送速度を通常よりも遅くして、培地の温度を上昇させつつ、移送することが好ましい。
【００８２】
養生培養工程において、養生容器２０ａ内における細胞を分散させるために、第一実施形態において前述した攪拌手段を用いて、養生容器２０ａの内容液を撹拌することが好ましい。また、このような培養容器の内容液の攪拌を、後述する活性化培養工程において活性化容器２０ｂに対して行っても良く、増幅培養工程において増幅容器２０ｃに対して行うことが好ましい。なお、後述する活性化培養工程と増幅培養工程の説明において、このような培養容器の内容液の攪拌の説明は省略する。
【００８３】
（３）拡大培養工程
ダメージを受けた細胞の機能が回復して、細胞の増殖がある程度進んで養生培養工程が完了すると、次に拡大培養工程が行われる。
この工程では、図６に示すように、保持具７の側板を水平に倒れた状態に展開して、養生容器２０ａにおける培養面積を拡大して培養を行う。
このとき、保持具７に保持された養生容器２０ａは、その四隅が引っ張られて、張力が加えられて撓みが解消し、養生容器２０ａ内の底面に形成されていた窪みは消失する。このため、養生容器２０ａにおいて細胞を底面全体に分散させて、所定の細胞密度になるまで培養することが可能になる。
この工程においても、培養細胞の増殖等に合わせて、培地Ａが培地Ａ供給容器１ａからポンプを用いて養生容器２０ａに供給される。また、このときも第一実施形態と同様に、培地の移送速度を通常よりも遅くして、培地の温度を上昇させつつ、移送することが好ましい。
【００８４】
（４）細胞移送工程１
養生容器２０ａ内の細胞密度が所定の細胞密度になり、養生培養工程が完了すると、次に養生容器２０ａから活性化容器２０ｂに培養細胞の移送が行われる。
このとき、養生容器２０ａを、活性化容器２０ｂへ接続するためのポートが下側になるように傾斜させて、養生容器２０ａ内の内容液を活性化容器２０ｂに送流する。これによって、養生容器２０ａで培養された細胞が、活性化容器２０ｂに移送される。このように、養生容器２０ａで培養された細胞は、活性化容器２０ｂに自然送流されるが、この送流が完了した時点では、通常、養生容器２０ａには、細胞が残存している。
【００８５】
（５）培地流加工程１
次に、培地を培地Ａ供給容器１ａから養生容器２０ａに流加する。このとき、第一実施形態と同様に、培地の移送速度を通常よりも遅くして、培地の温度を上昇させつつ、移送することが好ましい。
そして、養生容器２０ａに培地が収容された状態で、第一実施形態と同様に、そのまま所定時間が経過するのを待つことにより、培地温度を上昇させる。
次いで、前述した攪拌手段によって、養生容器２０ａの内容液を攪拌する。そして、培地を養生容器２０ａから活性化容器２０ｂに移送する。
このように培地を養生容器２０ａに移送してから活性化容器２０ｂに移送することにより、養生容器２０ａに残存していた細胞を培地と共に活性化容器２０ｂに移送することができ、細胞培養における残存細胞を低減することが可能になっている。
【００８６】
（６）活性化培養工程
活性化容器２０ｂへの培養細胞と培地の移送が完了すると、活性化容器２０ｂにおいて、細胞の活性化が行われる。リンパ球を培養する場合には、活性化容器２０ｂ内の底面に抗ＣＤ３抗体が固相化されており、リンパ球はこの抗ＣＤ３抗体に結合することで活性化される。
活性化培養工程においても、培養細胞の増殖等に合わせて、培地を活性化容器２０ｂに供給することができる。このときも培地流加工程１と同様にして培地の流加を行うことが好ましい。
【００８７】
（７）細胞移送工程２
活性化容器２０ｂにおいて細胞が十分に活性化されて、活性化培養工程が完了すると、次に活性化容器２０ｂから増幅容器２０ｃに培養細胞の移送が行われる。
このとき、前述した攪拌手段を細胞剥離手段として用い、活性化容器２０ｂに比較的強い振動を与えて、培養面に固相化された抗体に結合している細胞を、培養面から剥離することができる。
そして、活性化容器２０ｂを、増幅容器２０ｃへ接続するためのポートが下側になるように傾斜させて、活性化容器２０ｂ内の内容液を増幅容器２０ｃに送流する。これによって、活性化容器２０ｂで培養された細胞が、増幅容器２０ｃに移送される。このように、活性化容器２０ｂで活性化された細胞は、増幅容器２０ｃに自然送流されるが、この送流が完了した時点では、通常、活性化容器２０ｂには、細胞が残存している。
【００８８】
（８）培地流加工程２
次に、培地を培地Ｂ供給容器１ｂから養生容器２０ａに流加する。このときも培地流加工程１と同様に、培地の移送速度を通常よりも遅くして、培地の温度を上昇させつつ移送することができる。そして、培地流加工程１と同様に、養生容器２０ａに培地が収容された状態で、所定時間が経過するのを待つことにより、培地温度を上昇させる。
次いで、攪拌手段により養生容器２０ａの内容液を攪拌した後、培地を養生容器２０ａａから活性化容器２０ｂに移送する。そして、活性化容器２０ｂに培地が収容された状態で、所定時間が経過するのを待って培地温度を上昇させ、次いで攪拌手段により活性化容器２０ｂの内容液を攪拌した後、培地を活性化容器２０ｂから増幅容器２０ｃに移送する。
このとき、培地を養生容器２０ａと活性化容器２０ｂに移送してから増幅容器２０ｃに移送するため、養生容器２０ａと活性化容器２０ｂに残存していた細胞を、培地と共に増幅容器２０ｃに移送することができ、細胞培養における残存細胞を顕著に低減することが可能になっている。
【００８９】
（９）増幅培養工程
増幅容器２０ｃへの培養細胞と培地の移送が完了すると、増幅容器２０ｃにおいて、細胞の大量増殖が行われる。細胞の増殖は、増幅容器２０ｃにおける細胞数又は細胞密度が所定の大きさになるまで行われる。
培養細胞の増殖等に合わせて、培地Ｂが培地Ｂ供給容器１ｂからポンプを用いて増幅容器２０ｃに供給される。このときも培地流加工程２と同様にして培地の流加を行っても良い。
培地Ｂ供給容器１ｂにおける全ての培地が増幅容器２０ｃに供給され、培地Ｂ供給容器１ｂが空になると、空になった培地Ｂ供給容器１ｂは、廃液容器又は細胞回収容器として用いることができる。
【００９０】
このように本実施形態に係る細胞培養方法、及び細胞培養システムによれば、浮遊系の細胞を培養する場合において、培養が終了した培養容器に残存する細胞を低減できると共に、培地の温度を上昇させてから培養容器に培地を移送することができる。このため、細胞の増殖効率をより向上させることが可能になっている。
【００９１】
（第三実施形態）
次に、本発明の第三実施形態に係る細胞培養方法、及び細胞培養システムについて、図７を参照して説明する。
本実施形態は第二実施形態の変形例であり、本実施形態に係る細胞培養システムは、図７に示すように、培地容器１と、活性化容器２０ｂと、増幅容器２０ｃと、回収容器８とが、移送チューブ３により接続された構成となっている。
【００９２】
すなわち、本実施形態に係る細胞培養システムは、第二実施形態の細胞培養システムから養生容器２０ａと培地Ａ供給容器１ａが省略され、回収容器８が追加された構成となっている。なお、本実施形態において、回収容器８を複数備えることもできる。
本実施形態に係る細胞培養方法では、養生培養工程は行われず、細胞培養は活性化培養工程から開始される。そして、回収容器８によって、増幅容器２０ｃの上澄みを回収したり、増幅容器２０ｃから細胞懸濁液を回収したりすることが可能になっている。
その他の点については、第二実施形態と同様のものとすることができる。
【００９３】
このように本実施形態に係る細胞培養方法、及び細胞培養システムによれば、養生培養を行う必要のない浮遊系の細胞を培養する場合などにおいて、培養が終了した培養容器に残存する細胞を低減できると共に、培地の温度を上昇させてから培養容器に培地を移送することができる。このため、細胞の増殖効率をより向上させることが可能になっている。
【００９４】
（第四実施形態）
次に、本発明の第四実施形態に係る細胞培養方法、及び細胞培養システムについて、図８を参照して説明する。
【００９５】
［細胞培養システム］
本実施形態に係る細胞培養システムは、主として、繊維芽細胞などの接着系の細胞をより効率的に培養するためのものであり、図８に示すように、廃液回収容器１２（以下、廃液容器１２と称する場合がある）と、培地容器１と、洗浄液供給容器９（以下、洗浄液容器９と称する場合がある）と、酵素溶液供給容器１０（以下、酵素容器１０と称する場合がある）と、阻害剤溶液供給容器１１（以下、阻害剤容器１１と称する場合がある）と、培養面積の異なる複数の培養容器２（一次培養容器２ａ，二次培養容器２ｂ，三次培養容器２ｃ）とが、移送チューブ３を用いて接続された構成となっている。以下、第一実施形態と同様の構成については、説明を省略する。
【００９６】
［洗浄液供給容器］
洗浄液容器９は、洗浄液を培養容器２に供給する容器であり、図８に示すように、培地容器１と一次培養容器２ａの間にチューブを用いて接続される。
洗浄液は、培養容器２内に酵素溶液を供給するのに先立って、培養容器２内に残存する培地を洗い流すために用いられる。
この洗浄液としては、生理食塩水やＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）など、一般的に使用されているものを用いることができる。
【００９７】
［酵素溶液供給容器］
酵素容器１０は、培養された細胞を培養容器２内の底面から剥離するための酵素溶液を、培養容器２に供給する容器である。
酵素溶液は、培養容器２の培養面全体に細胞が増殖して当該培養容器２における細胞培養が完了すると、培養された細胞を次の培養容器２へ移送するのに先だって、細胞を培養容器２内の底面から剥離するために用いられる。この酵素溶液としては、接着系の細胞を容器内の底面から剥離する際に通常使用可能なものを用いることができ、例えばトリプシンなどのプロテアーゼを用いることができる。
【００９８】
［阻害剤溶液供給容器］
阻害剤容器１１は、上記酵素溶液における酵素の活性を阻害するための阻害剤溶液を、培養容器２に供給する容器である。
阻害剤溶液は、細胞を培養容器２内の底面から剥離するために用いられた酵素の活性を阻害させるために用いられる。この阻害剤溶液としては、上記酵素を活性阻害させる際に通常使用可能なものを用いることができ、例えばトリプシンインヒビターなどのプロテアーゼインヒビターを用いることができる。なお、酵素を培地によって活性阻害させることができる場合には、本実施形態に係る細胞培養システムにおいて阻害剤容器１１を省略しても良い。
【００９９】
［廃液回収容器］
廃液容器１２は、培養容器２から洗浄液、酵素溶液、阻害剤溶液、及び培地等の廃液を回収する容器であり、これらをポンプにより移送チューブ３を介して回収することができる。
【０１００】
［細胞培養方法］
次に、本実施形態に係る細胞培養方法について、図８を参照して詳細に説明する。
本実施形態に係る細胞培養方法は、培養する細胞が接着系の細胞である場合に、複数の培養容器として、培養面積の異なる培養容器を用い、複数の培養容器における培養面積の最も小さい第一の培養容器に細胞及び培地を含む細胞懸濁液を収容し、複数の培養容器に培地を供給する培地供給容器に複数の培養容器を培養面積の小さい順に接続して、第一の培養容器において細胞の培養を開始し、第一の培養容器での培養が終了した後、第一の培養容器に接続された第二の培養容器に第一の培養容器から培養された細胞を含む細胞懸濁液を移送し、次いで第一の培養容器に培地供給容器から培地を供給して、所定時間経過後、第二の培養容器に第一の培養容器から培地を供給して、第二の培養容器において細胞の培養を行い、第二の培養容器での培養が終了した後、培養が終了した培養容器に接続された次の培養容器がある場合、次の培養容器への細胞懸濁液の移送、培養が終了した培養容器への培地の供給、次の培養容器への培養が終了した培養容器からの培地の供給、及び次の培養容器における細胞の培養を、培養が終了した培養容器に接続された次の培養容器がなくなるまで、繰り返して行うことを特徴とする。
【０１０１】
具体的には、本実施形態に係る細胞培養方法は、（１）容器接続工程と、（２）一次培養工程と、（３）培地排出工程１と、（４）洗浄工程１と、（５）細胞剥離工程１と、（６）酵素活性阻害工程１と、（７）細胞移送工程１と、（８）培地流加工程１と、（９）酵素等排出工程１と、（１０）培地流加工程２と、（１１）二次培養工程と、（１２）培地排出工程２と、（１３）洗浄工程２と、（１４）細胞剥離工程２と、（１５）酵素活性阻害工程２と、（１６）細胞移送工程２と、（１７）培地流加工程３と、（１８）酵素等排出工程２と、（１９）培地流加工程４と、（２０）三次培養工程とを有するものとすることができる。なお、培養容器２を４個以上接続して用いる場合には、四次培養以降の工程として、各培養容器２について（１２）〜（２０）の工程をさらに繰り返し行う。
【０１０２】
（１）容器接続工程
まず、本実施形態に係る細胞培養方法において用いる培地容器１と複数の培養容器２等を、図８に示すように接続して、閉鎖系の細胞培養システムを構成する。
具体的には、廃液容器１２と、培地容器１と、洗浄液容器９と、酵素容器１０と、阻害剤容器１１と、一次培養容器２ａと、二次培養容器２ｂと、三次培養容器２ｃとを移送チューブ３を用いて接続する。また、培地容器１には培養容器２に供給するための培地を、洗浄液容器９には洗浄液を、酵素容器１０には酵素溶液を、阻害剤容器１１には阻害剤溶液をそれぞれ充填して接続する。二次培養容器２ｂ、三次培養容器２ｃ、及び廃液容器１２は空のまま接続する。培地容器１と培養容器２の間の移送チューブ３上にはポンプが備えられ、このポンプにより培地の移送等が行われる。また、移送チューブ３上には適宜三方活栓が備えられており、これらによって送液流路を制御できるようになっている。
【０１０３】
（２）一次培養工程
このように細胞培養システムを構成すると、まず培養面積の最も小さい一次培養容器２ａにおいて、細胞培養が開始する。一次培養容器２ａでは、細胞の一次培養が行われる。また、培養細胞の増殖等に合わせて、培地が培地容器１からポンプを用いて一次培養容器２ａに供給される。このとき、第一実施形態と同様に、培地の移送速度を通常よりも遅くして、培地の温度を上昇させつつ、移送することが好ましい。
【０１０４】
（３）培地排出工程１
一次培養容器２ａの培養面全体に細胞が増殖すると、一次培養は完了である。そして、培養に使用された培地を、ポンプを用いて一次培養容器２ａから廃液容器１２に移送して排出する。
【０１０５】
（４）洗浄工程１
次に、洗浄液容器９から洗浄液を一次培養容器２ａに送流し、前述した攪拌手段を用いて一次培養容器２ａ内の洗浄液を攪拌してから排出する。
これによって、一次培養容器２ａに残存する培地を除去することができ、次の細胞剥離工程１において一次培養容器２ａに酵素溶液を送流するに際し、酵素の活性が培地により阻害されることを防止することが可能となる。
【０１０６】
（５）細胞剥離工程１
次に、酵素容器１０から酵素溶液を一次培養容器２ａに送流して、一次培養容器２ａ内の底面に接着している細胞を剥離する。
このとき、細胞の剥離を、前述した攪拌手段を用いて、一次培養容器２ａの内容液を攪拌することによって促進することが好ましい。このような攪拌手段を用いた細胞の剥離促進は、二次培養容器２ｂ及びこれ以降に接続されるその他の培養容器についても同様に適用することができる。
【０１０７】
（６）酵素活性阻害工程１
次に、阻害剤容器１１から阻害剤溶液を一次培養容器２ａに送流して、一次培養容器２ａ内の酵素を活性阻害させる。
【０１０８】
（７）細胞移送工程１
次に、剥離された細胞を、一次培養容器２ａから二次培養容器２ｂへ移送する。
このとき、一次培養容器２ａを、二次培養容器２ｂへ接続するためのポートが下側になるように傾斜させることで、剥離された細胞を含む内容液を一次培養容器２ａから二次培養容器２ｂに自然送流することができる。
なお、剥離された細胞を、二次培養容器２ｂから三次培養容器２ｃへ移送する場合も同様に、二次培養容器２ｂを、三次培養容器２ｃへ接続するためのポートが下側になるように傾斜させて行うことができる。
【０１０９】
（８）培地流加工程１
次に、培地を培地容器１から一次培養容器２ａに流加する。このとき、第一実施形態と同様に、培地の移送速度を通常よりも遅くして、培地の温度を上昇させつつ移送することが好ましい。そして、一次培養容器２ａに培地が収容された状態で、所定時間が経過するのを待つことにより、培地温度を上昇させる。
次いで、攪拌手段により一次培養容器２ａの内容液を攪拌した後、培地を一次培養容器２ａから二次培養容器２ｂに移送する。
このように培地を一次培養容器２ａに移送してから二次培養容器２ｂに移送することにより、培地の温度を上昇させてから二次培養容器２ｂに供給でき、かつ一次培養容器２ａにおける残存細胞を低減することもできるため、細胞の増殖効率をより向上させることが可能になっている。
【０１１０】
（９）酵素等排出工程１
二次培養容器２ｂ内において、細胞が底面に接着したら、二次培養容器２ｂから酵素溶液、阻害剤溶液、及び培地を、ポンプを用いて廃液容器１２に排出する。
【０１１１】
（１０）培地流加工程２
次に、二次培養容器２ｂに再度培地を供給するが、このときも培地流加工程１と同様に、培地を培地容器１から一次培養容器２ａに流加して、培地の温度を上昇させてから二次培養容器２ｂに移送することが好ましい。
これにより、培地の温度を上昇させてから二次培養容器２ｂに供給できると共に、一次培養容器２ａにおける残存細胞をさらに低減することができ、細胞の増殖効率をより向上させることが可能になっている。
【０１１２】
（１１）二次培養工程
以上の工程によって、培養面積のより大きい二次培養容器２ｂにおいて、細胞培養が行われる。また、培養細胞の増殖等に合わせて、培地が培地容器１からポンプを用いて二次培養容器２ｂに供給される。このときも培地流加工程１と同様にして培地の流加を行うことが好ましい。
【０１１３】
そして、（１２）培地排出工程２〜（１９）培地流加工程４の工程として、前述した（３）培地排出工程１〜（１０）培地流加工程２と同様の工程が行われる。このとき、培地の流加は、第一実施形態における培地流加工程２と同様に行うことが好ましい。
次に、（２０）三次培養工程で、培養面積のさらに大きい三次培養容器２ｃにおいて細胞培養が行われ、培養細胞の増殖等に合わせて、培地が培地容器１からポンプを用いて三次培養容器２ｃに供給される。このときも第一実施形態における培地流加工程２と同様にして培地の流加を行っても良い。
そして、三次培養容器２ｃの培養面全体に細胞が増殖すると、三次培養が完了し、三次培養容器２ｃから大量に増殖した培養細胞を回収することが可能となる。
【０１１４】
このように本実施形態に係る細胞培養方法、及び細胞培養システムによれば、接着系の細胞を培養する場合において、培養が終了した培養容器に残存する細胞を低減できると共に、培地の温度を上昇させてから培養容器に培地を移送することができる。このため、細胞の増殖効率をより向上させることが可能になっている。
【０１１５】
以上、本発明について、好ましい実施形態を示して説明したが、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲で種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、前述した第二実施形態では、養生容器２０ａ、活性化容器２０ｂ、及び増幅容器２０ｃを用いる例について説明したが、機能が異なるその他の複数の容器を用いて、本発明の実施形態に係る細胞培養システムを構成したり、あるいは上記各実施形態における構成を組み合わせたりするなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明は、細胞の培養容器を用いて、閉鎖系で細胞を大量に培養する再生医療や抗体医薬生産などにおいて好適に利用することが可能である。
【符号の説明】
【０１１７】
１        培地供給容器（培地容器）
１ａ        培地Ａ供給容器
１ｂ        培地Ｂ供給容器
２        培養容器
２ａ        一次培養容器
２０ａ      養生拡大培養容器（養生培養容器，養生容器）
２０ａ−１    窪み
２ｂ        二次培養容器
２０ｂ      活性化培養容器（活性化容器）
２ｃ        三次培養容器
２ｃ−１    サンプリングチューブ
２０ｃ      増幅培養容器（増幅容器）
２０ｃ−１  サンプリングチューブ
３        移送チューブ
４        積載部
４１        保持板
４２        回動軸
５        板カム
５１        第一カム面
５２        第二カム面
５３        駆動軸
６        基台
７      保持具
７０      底板
７０１      凹部
７１      側板
８        回収容器
９        洗浄液供給容器（洗浄液容器）
１０      酵素溶液供給容器（酵素容器）
１１      阻害剤溶液供給容器（阻害剤容器）
１２      廃液回収容器（廃液容器）
１３      積載台
【図１】
2015188392.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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