(57)【要約】【課題】非転移性又は弱転移性のヒト癌細胞株から強転移性ヒト癌細胞株を作製する方法及びその方法により得られる強転移性ヒト癌細胞株を提供することにある。【解決手段】非転移性又は弱転移性のヒト癌細胞と癌内線維芽細胞とを免疫不全非ヒト動物に共移植し、当該免疫不全非ヒト動物体内で増殖させることにより得られる強転移性ヒト癌細胞株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非転移性又は弱転移性のヒト癌細胞と癌内線維芽細胞とを免疫不全非ヒト動物に共移植し、当該免疫不全非ヒト動物体内で増殖させることにより得られる強転移性ヒト癌細胞株。
【請求項２】
免疫不全非ヒト動物体内で増殖したヒト癌細胞を採取し、当該ヒト癌細胞と癌内線維芽細胞とを免疫不全非ヒト動物に再度共移植し、当該免疫不全非ヒト動物体内で増殖させる工程を繰り返すことにより得られる請求項１記載の強転移性ヒト癌細胞株。
【請求項３】
免疫不全非ヒト動物が、免疫不全マウスである請求項１又は２記載の強転移性ヒト癌細胞株。
【請求項４】
免疫不全非ヒト動物が、ＮＯＧマウスである請求項１〜３のいずれかに記載の強転移性ヒト癌細胞株。
【請求項５】
共移植部位が、皮下である請求項１〜４のいずれかに記載の強転移性ヒト癌細胞株。
【請求項６】
非転移性又は弱転移性のヒト癌細胞と癌内線維芽細胞とを免疫不全非ヒト動物に共移植し、当該免疫不全非ヒト動物体内で増殖させることを特徴とする強転移性ヒト癌細胞株の製造法。
【請求項７】
免疫不全非ヒト動物体内で増殖したヒト癌細胞を採取し、当該ヒト癌細胞と癌内線維芽細胞とを免疫不全非ヒト動物に再度共移植し、当該免疫不全非ヒト動物体内で増殖させる工程を繰り返すことを特徴とする請求項６記載の強転移性ヒト癌細胞株の製造法。
【請求項８】
免疫不全非ヒト動物が、免疫不全マウスである請求項６又は７記載の強転移性ヒト癌細胞株の製造法。
【請求項９】
免疫不全非ヒト動物が、ＮＯＧマウスである請求項６〜８のいずれかに記載の強転移性ヒト癌細胞株の製造法。
【請求項１０】
共移植部位が、皮下である請求項６〜９のいずれかに記載の強転移性ヒト癌細胞株の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強い転移性を有するヒト癌細胞株及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌患者の死因の９０％は転移に起因するが、癌転移の分子機構は未だ明らかにされてない。転移の早期診断法や有効な治療法も乏しい。従来の多くの研究は、ヒト癌転移巣より転移性癌細胞株を樹立し、免疫不全マウスに移植後、遠隔臓器に誘導される転移を調査するものである。またトランスジェニックマウスに特定な癌遺伝子を強制発現することにより生じた癌より自発的に誘導される転移が調査された。
【０００３】
従来、癌転移は癌細胞内のゲノムの変異により起こる稀な悪性癌細胞の増殖により生じると推測されていた。しかしながら、癌化と転移化の表現型の違いを説明する遺伝子変異や分子機構は未だ明確ではない。最近の研究により、癌間質よりのパラクラインのシグナルを受けた癌細胞が上皮間葉移行などのｎｏｎ−ｇｅｎｏｍｉｃな変化を呈し、癌浸潤、転移のプログラムを活性化することが示唆されている（非特許文献１）。本発明者は、以前患者乳癌塊より癌内線維芽細胞（ＣＡＦｓ）を抽出し、この細胞が非癌部に存在する線維芽細胞と比較して、癌塊中でｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  １  （ＳＤＦ−１）ケモカインを高発現し、癌血管新生や癌細胞の増殖を顕著に促進することを明らかにした（非特許文献２、３）。加えて、癌化の過程において、ＳＤＦ−１とＴＧＦ−ｂｅｔａの  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  の獲得が、ＣＡＦｓの癌の進展促進能の誘導と維持に必須であることを示した（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．６：３，１９３−２０２（２０１２）
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ，１２１，３３５−３４８（２００５）
【非特許文献３】Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ，５，１６０２−１６０６（２００６）
【非特許文献４】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１０７，２０００９−２００１４（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、非転移性又は弱転移性のヒト癌細胞株から強転移性ヒト癌細胞株を作製する方法及びその方法により得られる強転移性ヒト癌細胞株を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、癌微小環境中に多数存在し癌の進展に重要であることが知られているＣＡＦｓに着目し、非転移性又は弱転移性のヒト癌細胞とＣＡＦｓとを免疫不全非ヒト動物に共移植し、そこでヒト癌細胞を増殖させることにより、癌内で強転移性のヒト癌細胞株に変化することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１０〕を提供するものである。
【０００８】
〔１〕非転移性又は弱転移性のヒト癌細胞と癌内線維芽細胞とを免疫不全非ヒト動物に共移植し、当該免疫不全非ヒト動物体内で増殖させることにより得られる強転移性ヒト癌細胞株。
〔２〕免疫不全非ヒト動物体内で増殖したヒト癌細胞を採取し、当該ヒト癌細胞と癌内線維芽細胞とを免疫不全非ヒト動物に再度共移植し、当該免疫不全非ヒト動物体内で増殖させる工程を繰り返すことにより得られる〔１〕記載の強転移性ヒト癌細胞株。
〔３〕免疫不全非ヒト動物が、免疫不全マウスである〔１〕又は〔２〕記載の強転移性ヒト癌細胞株。
〔４〕免疫不全非ヒト動物が、ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ receptorγnull）マウスである〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の強転移性ヒト癌細胞株。
〔５〕共移植部位が、皮下である〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の強転移性ヒト癌細胞株。
〔６〕非転移性又は弱転移性のヒト癌細胞と癌内線維芽細胞とを免疫不全非ヒト動物に共移植し、当該免疫不全非ヒト動物体内で増殖させることを特徴とする強転移性ヒト癌細胞株の製造法。
〔７〕免疫不全非ヒト動物体内で増殖したヒト癌細胞を採取し、当該ヒト癌細胞と癌内線維芽細胞とを免疫不全非ヒト動物に再度共移植し、当該免疫不全非ヒト動物体内で増殖させる工程を繰り返すことを特徴とする〔６〕記載の強転移性ヒト癌細胞株の製造法。
〔８〕免疫不全非ヒト動物が、免疫不全マウスである〔６〕又は〔７〕記載の強転移性ヒト癌細胞株の製造法。
〔９〕免疫不全非ヒト動物が、ＮＯＧマウスである〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の強転移性ヒト癌細胞株の製造法。
〔１０〕共移植部位が、皮下である〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載の強転移性ヒト癌細胞株の製造法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の強転移性ヒト癌細胞株は、非転移性又は弱転移性のヒト癌細胞が変異したものであるから、この細胞株を用いれば癌細胞の転移性獲得のメカニズムが判明するとともに、癌転移抑制剤のスクリーニングが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＣＡＦｓを利用した転移性乳癌細胞株の樹立方法例を示す。
【図２】マウスの皮下に移植されたＤＣＩＳCAFsの肺転移能の亢進を示す図である。線維芽細胞と共移植することなしに、１×１０5ＤＣＩＳCAFs及び１×１０5ＤＣＩＳCntFsをＮＯＧマウスの皮下に移植した。１ヶ月後皮下の原発巣が切除された。さらに転移を増殖させるために１ヶ月間マウスを飼育した後に肺を摘出した。。ＤＣＩＳCntFsと比較してＤＣＩＳCntFsにより形成された顕著なtomato蛍光タンパク陽性の転移巣(矢印で示されている)の存在が示されている。
【図３】マウスの尾静脈に注射されたＤＣＩＳCAFsの肺転移能の亢進を示す図である。４×１０4ＤＣＩＳCAFs及び４×１０4ＤＣＩＳCntFsをＮＯＧマウスの尾静脈より注射した。1か月後にマウスより切除された肺の転移巣の写真、tomato蛍光タンパクの陽性所見および組織標本のH-E染色が示されている。ＤＣＩＳCntFsと比較して、ＤＣＩＳCAFsで誘導された肺転移巣の顕著な増大が観察された。また１×１０4あるいは４×１０4ＤＣＩＳ癌細胞を尾静脈より注射し、その１ヶ月後に形成される肺転移巣の容積を定量化した。ＤＣＩＳCntFsと比較して、ＤＣＩＳCAFsで誘導された転移巣の容量が顕著に増加していることが示された。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の強転移性ヒト癌細胞は、非転移性又は弱転移性ヒト癌細胞とＣＡＦｓとを免疫不全非ヒト動物に共移植し、当該免疫不全非ヒト動物体内で増殖させることによって得られる。
【００１２】
原料である非転移性又は弱転移性のヒト癌細胞としては、株化されたヒト由来の癌細胞が挙げられ；非浸潤性のヒト由来癌細胞が好ましい。癌の種類は限定されず、例えば上顎洞癌、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、食道癌、胃癌、直腸癌、結腸癌、肝臓癌、胆管癌、胆のう癌、すい臓癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、外陰癌、皮膚癌、甲状腺癌などが挙げられる。これらのヒト癌細胞としては、市販されているヒト癌細胞株を用いることができる。
【００１３】
本発明においては、ヒト癌細胞を強転移性に変換するためＣＡＦｓを共移植する。ＣＡＦｓとしては、ヒト乳癌より抽出され、不死化された細胞株が好ましい（Kojima， Y. et al. Autocrine TGF-b and SDF-1 signaling drives evolution of mammary stromal fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 107, 20009-20014, 2010)。
【００１４】
これらの細胞を共移植する免疫不全非ヒト動物としては、非ヒト動物であってヒト由来の細胞を移植しても拒絶反応を示さない動物であればよいが、免疫不全マウスが好ましい。また、免疫不全マウスとしては、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、Ｒａｇ欠損（Ｒａｇnull）マウス、ＮＯＧマウス等が挙げられる。このうち、ＮＯＧマウスがより好ましい。ＮＯＧマウスは、ＷＯ２００２／０４３４７７に記載のマウスであり、ＮＯＤ／ＳｈｉマウスにＣ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄマウスを戻し交配したマウスに、インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウスを戻し交配して得られたマウスであり、異種細胞の生着に適している。
【００１５】
前記細胞の皮下移植量は、動物あたり１×１０4〜１×１０6細胞数、より好ましくは１×１０5細胞数程度でよい。またＣＡＦｓの移植量は、動物あたり３×１０4〜３×１０6細胞数、より好ましくは３×１０5細胞数程度でよい。
【００１６】
前記ヒト癌細胞とＣＡＦｓとの共移植は、これらの細胞を同じ部位に同時に移植すればよく、これらの細胞を混合してから移植する。
【００１７】
共移植の部位は、免疫不全非ヒト動物の体内であればどこでもよいが、共移植された部位で同時に増殖し、非転移性又は弱転移性のヒト癌細胞がＣＡＦｓの作用を受けやすい点から、皮下が好ましい。
【００１８】
共移植後、１ヶ月〜２ヶ月増殖させることにより、非転移性又は弱転移性ヒト癌細胞は、強転移性ヒト癌細胞株に変換される。
【００１９】
また、本発明においては、免疫不全非ヒト動物体内で増殖した前記ヒト癌細胞を採取し、当該採取した細胞とＣＡＦｓとを免疫不全非ヒト動物に再度共移植し、当該免疫不全非ヒト動物体内で増殖させる工程を、繰り返すことにより、当該ヒト癌細胞の強転移性をさらに強くすることができる。この共移植は、合計で２回行うのが好ましい。
【００２０】
このようにして得られた強転移性ヒト癌細胞株は、免疫不全非ヒト動物から採取し、培養して維持することができる。培養条件は、原料として用いたヒト癌細胞株と同様である。
得られた強転移性ヒト癌細胞株は、強力な転移能力を保持しているので、免疫不全動物に移植すれば、移植部位から肺組織に容易に転移する。従って、本発明の強転移性ヒト癌細胞株を用いれば、癌転移抑制剤のスクリーニング、癌転移のメカニズムの解明などが可能である。
【実施例】
【００２１】
次に実施例を挙げて本発明を詳細説明する。
【００２２】
実施例１
ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ耐性遺伝子が導入されたｄｓ−ｔｏｍａｔｏ蛍光タンパク陽性の弱転移性ＤＣＩＳヒト乳癌細胞は、ＧＦＰ陽性のＣＡＦｓとＮＯＧマウスの皮下に共移植された。１ヶ月後に切除された癌塊を酵素処理により消化し、ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ存在下で５日間培養しｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ耐性の培養ＤＣＩＳ細胞（ＤＣＩＳ−１  ｃｙｃｌｅ）を抽出した（図１）。この条件では、ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ非耐性のＣＡＦｓやマウスの間質細胞は生存不可能である。さらにＣＡＦｓによる教育を施す為に、ＤＣＩＳ−１  ｃｙｃｌｅ細胞は再度ＣＡＦｓとＮＯＧマウスに共移植された。１ヶ月後に切除された癌塊を消化後、抽出されたｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ耐性の培養ＤＣＩＳ細胞（ＤＣＩＳ−２ｃｙｃｌｅ）をＤＣＩＳCAFsと名付けた。また非癌部より抽出された対照線維芽細胞で同様に教育されたＤＣＩＳ−２ｃｙｃｌｅはＤＣＩＳCntFsと名付けられた。
【００２３】
ＤＣＩＳCAFsあるいはＤＣＩＳCntFsを線維芽細胞の非存在下でＮＯＧマウスに皮下移植した。１ヶ月後に原発癌を切除し、転移巣の増大を促すために、さらに１ヶ月間マウスを生存させた後に肺を切除し顕微鏡下で観察した（図２）。ＤＣＩＳCntFsと比較して、ＤＣＩＳCAFsにより肺に形成された転移（ｔｏｍｏｔｏ陽性）の亢進が観察された（図２）。また、ＤＣＩＳCAFsがＮＯＧマウスの尾静脈に注入された場合でも、ＤＣＩＳCntFsと比較して、移植後１ヶ月後の肺により著明な転移（ｔｏｍｏｔｏ陽性）が観察された（図３）。以上よりＤＣＩＳCAFsの肺転移能の亢進が示唆された。
【図１】
2015047078.tif 000002
【図２】
2015047078.tif 000003
【図３】
2015047078.tif 000004