(57)【要約】【課題】哺乳類において抗原特異的な免疫応答を誘導する又は高める方法を提供すること。【解決手段】過剰増殖疾患、例えば、癌、の再発を治療または予防する方法が記載されている。方法には、哺乳動物に有効量の抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした核酸組成物を投与することにより哺乳動物を初回抗原刺激し、哺乳動物に有効量の抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした核酸を含む腫瘍退縮ウイルスを投与することにより哺乳動物を追加免役することを含むことができる。特定の実施形態では、核酸組成物はＤＮＡワクチンである。一部の実施形態では、核酸組成物は、皮内、腹腔内及び静脈内から成る群から投与される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、その内容が全体として参照によって本明細書に具体的に組み入れられる、２００９年４月２８日に出願された米国特許仮出願第６１／１７３４１３号の利益を主張する。
【０００２】
政府の支援
本発明は、米国国立癌研究所によって授与された助成金番号Ｐ５０ＣＡ０９８２５２及びＲＯ１ＣＡ１１４４２５のもとでの政府の支援によって為された。政府は本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
癌の免疫療法は、多数の腫瘍や過剰増殖性疾患の治療に展望を示してきたが、それらの有用性は、腫瘍が相対的に大きく、速く増殖している状況に限定される。たとえば、進行した段階の癌は治療するのが極めて難しく、稀にしか治癒することはない。早期発見及び進行した段階の癌の治療を改善する尽力は相対的に不首尾であった。進行した疾患の既存の治療法、たとえば、化学療法及び放射線療法は、局所に進行した又は転移性の疾患を持つ患者の全体的な生存率を改善することはなかった（早期乳癌被験者共同グループ（）。従って、特に進行段階に進んでいる場合の過剰増殖性疾患の制御のための革新的な治療方法を開発する強いニーズがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一実施形態では、本発明は少なくとも部分的に、哺乳類において抗原特異的な免疫応答を誘導する又は高める方法を指向するものであり、該方法は、（ａ）抗原又は生物学的に活性のあるそのホモログをコードする核酸組成物の有効量を哺乳類に投与することによって哺乳類を感作する工程と、（ｂ）抗原又は生物学的に活性のあるそのホモログをコードする核酸を含む腫瘍崩壊性ウイルスの有効量を哺乳類に投与することにより哺乳類を追加免疫し、それによって抗原特異的な免疫応答を高める工程を含む。一部の実施形態では、抗原は、哺乳類にとって外来性である腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり、及び／又は卵白アルブミン、ＨＰＶ、Ｅ６及びＨＰＶ  Ｅ７が含まれる。さらに別の実施形態では、抗原は、配列番号１３９のアミノ酸配列に少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含む卵白アルブミンタンパク質を含む。さらにほかの実施形態では、抗原は、ＬＳＲＨＦＭＨＱＫＲＴＡＭＦＱＤＰＱＥＲＰＲＫＬＰＱ及びＡＭＦＱＤＰＱＥＲＰＲＫＬＰＱＬＣＴＥＬＱＴＴＩＨＤＩＩＬＥＣから成る群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むＨＰＶ  Ｅ７タンパク質を含む。一実施形態では、抗原は、ＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣＹＥＱ、ＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴ、ＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤ、ＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹ、ＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹ及びＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩから成る群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を含むＨＰＶ  Ｅ７タンパク質を含む。
【０００５】
特定の実施形態では、核酸組成物はＤＮＡワクチンである。一部の実施形態では、核酸組成物は、皮内、腹腔内及び静脈内から成る群から投与される。特定の実施形態では、哺乳類は腫瘍を有するヒトであり、核酸組成物は腫瘍内又は腫瘍周辺に投与される。一部の実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルスは、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、単純性ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、インフルエンザウイルス、及びレオウイルスから成る群から選択される。さらに別の実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルスは、チミジンキナーゼ陰性である。特定の実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルスは、皮内、腹腔内及び静脈内から成る群から投与される。一部の実施形態では、哺乳類は腫瘍を有するヒトであり、腫瘍崩壊性ウイルスは、腫瘍内又は腫瘍周辺に投与される。さらにほかの実施形態では、核酸組成物は腫瘍崩壊性ウイルスの中に存在する。ほかの実施形態では、工程（ａ）の腫瘍崩壊性ウイルスは、工程（ｂ）の腫瘍崩壊性ウイルスと同一であるか、又は異なっている。さらにほかの実施形態では、工程（ａ）は、工程（ｂ）の前に実施され、工程（ａ）と工程（ｂ）は同時に実施され、又は工程（ａ）は工程（ｂ）の後に実施される。さらに別の実施形態では、工程（ａ）及び／又は工程（ｂ）は少なくとも１回繰り返される。一実施形態では、工程（ａ）及び／又は工程（ｂ）で使用される投与量は１×１０＾７ｐｆｕを含む範囲である。
【０００６】
特定の実施形態では、抗原特異的な免疫応答は、核酸組成物単独の投与によって誘導される抗原特異的な免疫応答よりも程度が大きい。ほかの実施形態では、抗原特異的な免疫応答には少なくとも部分的にＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が介在する。ほかの実施形態では、抗原特異的な免疫応答には少なくとも部分的にＣＤ８−細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及び／又は腫瘍周辺の間質細胞が介在する。さらに別の実施形態では、方法には、有効量の化学療法剤を投与することが含まれる。
【０００７】
さらにほかの実施形態では、方法には抗原に対する抗体の存在について哺乳類をスクリーニングすることが含まれる。一部の実施形態では、哺乳類はヒトである。ほかの実施形態では、哺乳類は癌に冒されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、哺乳類において進行した段階の癌を治療する又は予防する方法を指向するものであり、該方法は、（ａ）抗原又は生物学的に活性のあるそのホモログをコードする核酸組成物の有効量を哺乳類に投与することによって哺乳類を感作する工程と、（ｂ）抗原又は生物学的に活性のあるそのホモログをコードする核酸を含む腫瘍崩壊性ウイルスの有効量を哺乳類に投与することにより哺乳類を追加免疫し、それによって抗原特異的な免疫応答を高める工程を含む。一部の実施形態では、進行した段階の癌は、黒色腫又は胸腺腫を含む、本明細書で記載される癌である。
【０００９】
本発明はまた少なくとも部分的に、感作組成物及び追加免疫組成物を含むキットを指向するものであり、該キットは、（ａ）免疫原性の外来抗原をコードするＤＮＡと薬学上許容可能な担体を含む感作組成物と、（ｂ）前記外来抗原をコードするウイルスと薬学上許容可能な担体を含む追加免疫組成物を含む。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
哺乳動物の抗原特異的免疫応答を誘導または高める方法であって、
（ａ）哺乳動物に抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした有効量の核酸組成物を投与することにより哺乳動物に初回抗原刺激を行うステップと、
（ｂ）抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした核酸を含む有効量の腫瘍退縮ウイルスを哺乳動物に投与することにより哺乳動物に追加免疫を行うステップ、
を含み、それによって、抗原特異的免疫応答を誘導または高める方法。
（項目２）
抗原が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である項目１記載の方法。
（項目３）
抗原が哺乳動物に対し外来性である項目１記載の方法。
（項目４）
抗原が卵白アルブミン、ＨＰＶＥ６、およびＨＰＶＥ７からなる群より選択される項目１記載の方法。
（項目５）
抗原が、配列番号１３９のアミノ酸配列に少なくとも９０％同等であるアミノ酸配列を含む卵白アルブミンタンパク質を含む項目４記載の方法。
（項目６）
抗原が、ＬＳＲＨＦＭＨＱＫＲＴＡＭＦＱＤＰＱＥＲＰＲＫＬＰＱおよびＡＭＦＱＤＰＱＥＲＰＲＫＬＰＱＬＣＴＥＬＱＴＴＩＨＤＩＩＬＥＣからなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同等であるアミノ酸配列を含むＨＰＶ  Ｅ７タンパク質を含む項目４記載の方法。
（項目７）
抗原が、ＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣＹＥＱ、ＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴ、ＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤ、ＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹ、ＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹおよびＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩからなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同等であるアミノ酸配列を含むＨＰＶ  Ｅ７タンパク質を含む項目４記載の方法。
（項目８）
核酸組成物がＤＮＡワクチンである項目１記載の方法。
（項目９）
核酸組成物が皮内投与、腹腔内投与、および静脈内投与からなる群より選択されて投与される項目１記載の方法。
（項目１０）
哺乳動物が腫瘍を有するヒトであり、核酸組成物が腫瘍内または腫瘍周囲に投与される項目１記載の方法。
（項目１１）
腫瘍退縮ウイルスが、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、単純疱疹ウィルス、ポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、インフルエンザウイルス、およびレオウイルスからなる群より選択される項目１記載の方法。（項目１２）
腫瘍退縮ウイルスがチミジンキナーゼ陰性である項目１または１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
腫瘍退縮ウイルスが皮内投与、腹腔内投与、および静脈内投与からなる群から選択されて投与される項目１３記載の方法。
（項目１４）
哺乳動物が腫瘍を有するヒトであり、腫瘍退縮ウイルスが腫瘍内または腫瘍周辺に投与される項目１記載の方法。
（項目１５）
核酸組成物が腫瘍退縮ウイルス内に存在する項目１記載の方法。
（項目１６）
ステップ（ａ）の腫瘍退縮ウイルスがステップ（ｂ）の腫瘍退縮ウイルスと同じ、または異なる項目１５記載の方法。
（項目１７）
ステップ（ａ）がステップ（ｂ）の前に行わる、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）が同時に行われる、またはステップ（ａ）がステップ（ｂ）の後で行われる項目１または１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）が少なくとも１回繰り返される項目１または１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）で使われる投与量が１ｘ１０＾７ｐｆｕである項目１または１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
抗原特異的免疫応答が核酸組成物単独投与による抗原特異的免疫応答誘導より大きい項目１記載の方法。
（項目２１）
抗原特異的免疫応答の少なくとも一部がＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって媒介される項目１記載の方法。
（項目２２）
抗原特異的免疫応答の少なくとも一部がＣＤ８−細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって媒介される項目１記載の方法。
（項目２３）
抗原特異的免疫応答の少なくとも一部が腫瘍周囲の間質細胞によって媒介される項目１記載の方法。
（項目２４）
有効量の化学療法剤を投与することをさらに含む項目１記載の方法。
（項目２５）
抗原に対する抗体の存在の観点から哺乳動物を選別することをさらに含む項目１記載の方法。
（項目２６）
哺乳動物がヒトである項目１記載の方法。
（項目２７）
哺乳動物が癌に罹患している項目１記載の方法。 
（項目２８）
哺乳動物の進行期癌を治療または予防する方法であって、
（ａ）哺乳動物に、有効量の抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした核酸組成物を投与することにより哺乳動物を初回抗原刺激し、
（ｂ）哺乳動物に有効量の抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした核酸を含む腫瘍退縮ウイルスを投与して哺乳動物に追加免疫することにより、抗原特異的免疫応答を誘導または強化すること、
を含む方法。
（項目２９）
進行期癌が黒色腫または胸腺腫である項目２８記載の方法。
（項目３０）
初回抗原刺激組成物および追加免疫組成物を含むキットであって、
（ａ）初回抗原刺激組成物が免疫原性外来性抗原をコードしたＤＮＡおよび薬学的に許容可能な担体を含み、さらに
（ｂ）追加免疫組成物が前記外来性抗原をコードしたウイルスおよび薬学的に許容可能な担体を含む、
キット。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】マウスにおけるワクシニア感染を明らかにする発光画像化を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（群当たり５匹）を皮下にて５×１０４／マウスのＴＣ−１腫瘍細胞で感作した。腫瘍の大きさが８〜１０ｍｍに達したとき、１×１０７ｐｆｕ／マウスのＶａｃ−ｌｕｃのｉ．ｔ．又はｉ．ｐ．注射のいずれかでマウスを処理した。（Ａ）経時的な、各群についての代表的な生物発光シグナル。（Ｂ）経時的にＶａｃ−ｌｕｃで処理したマウスにおける腫瘍内（ｉ．ｔ．）と腹腔内（ｉ．ｐ．）の投与のシグナル強度の比を表す棒グラフ。
【図２】Ｂ１６腫瘍による生体内腫瘍処理実験を示す図である。（Ａ）感作−追加免疫の処理計画の説明図。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（群当たり５匹）を皮下にて５×１０４／マウスのＢ１６／Ｆ１０腫瘍細胞で感作した。腫瘍感作の５日後、遺伝子銃によって２μｇ／マウスのｐｃＤＮＡ３ＤＮＡ又は卵白アルブミンを発現しているｐｃＤＮＡ３（ｐ−ＯＶＡ）でマウスを免疫した。１２日目、１×１０７ｐｆｕ／マウスの野生型のワクシニア（Ｖａｃ−ＷＴ）又は卵白アルブミンをコードするワクシニア（Ｖａｃ−ＯＶＡ）の粘膜内注射によってマウスを追加免疫した。１×ＰＢＳで処理したＢ１６担癌マウスを対照として使用した。（Ｂ）異なった感作／追加免疫の計画で処理したＢ１６担癌マウスにおける腫瘍容積を示す線グラフ。カッコ内の数は完全な腫瘍拒絶率を示す。（Ｃ）異なった処理計画で処理したＢ１６担癌マウスのＫａｐｌａｎとＭｅｉｅｒの生存率分析。示したデータは行った２つの実験の代表である（平均値±ＳＤ）。
【図３】ＴＣ−１腫瘍による生体内の腫瘍処理実験。（Ａ）感作−追加免疫の処理計画の説明図。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（群当たり５匹）を皮下にて５×１０４／マウスのＴＣ−１腫瘍細胞で感作した。腫瘍感作の５日後、遺伝子銃によって２μｇ／マウスのｐｃＤＮＡ３ＤＮＡ又は卵白アルブミンを発現しているｐｃＤＮＡ３（ｐ−ＯＶＡ）でマウスを免疫した。１２日目、１×１０７ｐｆｕ／マウスの野生型のワクシニア（Ｖａｃ−ＷＴ）又は卵白アルブミンをコードするワクシニア（Ｖａｃ−ＯＶＡ）の粘膜内注射によってマウスを追加免疫した。１×ＰＢＳで処理したＴＣ−１担癌マウスを対照として使用した。（Ｂ）異なった感作／追加免疫の計画で処理したＴＣ−１担癌マウスにおける腫瘍容積を示す線グラフ。カッコ内の数は完全な腫瘍拒絶率を示す。（Ｃ）異なった処理計画で処理したＴＣ−１担癌マウスのＫａｐｌａｎとＭｅｉｅｒの生存率分析。示したデータは行った２つの実験の代表である（平均値±ＳＤ）。
【図４】生体内の腫瘍処理実験。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（群当たり５匹）を皮下にて５×１０４／マウスのＴＣ−１腫瘍細胞で感作した。腫瘍感作の５日後、遺伝子銃によって２μｇ／マウスのＣＲＴ／Ｅ７（ｐＣＲＴ／Ｅ７）を発現しているｐｃＤＮＡ３でマウスを免疫した。１２日目、１×１０７ｐｆｕ／マウスの野生型のワクシニア（Ｖａｃ−ＷＴ）又はＣＲＴ／Ｅ７をコードするワクシニア（Ｖａｃ−ＣＲＴ／Ｅ７）の腹腔内注射又は粘膜内注射によってマウスを追加免疫した。１×ＰＢＳで処理したＴＣ−１担癌マウスを対照として使用した。（Ａ）感作−追加免疫の処理計画の説明図。（Ｂ）異なった感作／追加免疫の計画で処理したＴＣ−１担癌マウスにおける腫瘍容積を示す線グラフ。カッコ内の数は完全な腫瘍拒絶率を示す。（Ｃ）異なった処理計画で処理したＴＣ−１感作マウスのＫａｐｌａｎとＭｅｉｅｒの生存率分析。＊はｐ＜０．００５を示す。示したデータは行った２つの実験の代表である（平均値±ＳＤ）。
【図５−１】異なった感作／追加免疫の計画で処理した担癌マウスにおけるＯＶＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数を測定するための細胞内サイトカインの染色とその後のフローサイトメトリー解析。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（群当たり５匹）を皮下にて５×１０４／マウスのＢ１６／Ｆ１０腫瘍細胞で感作した。腫瘍感作の５日後、遺伝子銃によってｐｃＤＮＡ３ＤＮＡ又はｐ−ＯＶＡＤＮＡでマウスを免疫し、図２に示すように、Ｖａｃ−ＷＴ又はＶａｃ−ＯＶＡもいずれかの粘膜内注射によって追加免疫した。ＰＢＳで処理したＴＣ−１担癌マウスを対照として使用した。ワクシニア感染の７日後、マウスの脾臓（Ａ及びＢ）及び腫瘍（Ｃ及びＤ）から細胞を回収し、ＯＶＡペプチドと共に一晩インキュベートし、細胞内ＩＦＮγ染色、その後のフローサイトメトリー解析を用いてＣＤ８と細胞内ＩＦＮγを染色し、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋細胞について分析した。ＡとＣ．異なった感作／追加免疫の計画で処理したマウスの脾臓（Ａ）及び腫瘍（Ｃ）におけるＯＶＡ特異的なＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す代表的なフローサイトメトリーデータ。ＢとＤ．処理したマウスの脾臓（Ｂ）と腫瘍（Ｄ）における２×１０５個のプールした細胞当たりのＯＶＡ特異的なＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を示す棒グラフ。示したデータは行った２つの実験の代表である（平均値±ＳＤ）。
【図５−２】異なった感作／追加免疫の計画で処理した担癌マウスにおけるＯＶＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数を測定するための細胞内サイトカインの染色とその後のフローサイトメトリー解析。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（群当たり５匹）を皮下にて５×１０４／マウスのＢ１６／Ｆ１０腫瘍細胞で感作した。腫瘍感作の５日後、遺伝子銃によってｐｃＤＮＡ３ＤＮＡ又はｐ−ＯＶＡＤＮＡでマウスを免疫し、図２に示すように、Ｖａｃ−ＷＴ又はＶａｃ−ＯＶＡもいずれかの粘膜内注射によって追加免疫した。ＰＢＳで処理したＴＣ−１担癌マウスを対照として使用した。ワクシニア感染の７日後、マウスの脾臓（Ａ及びＢ）及び腫瘍（Ｃ及びＤ）から細胞を回収し、ＯＶＡペプチドと共に一晩インキュベートし、細胞内ＩＦＮγ染色、その後のフローサイトメトリー解析を用いてＣＤ８と細胞内ＩＦＮγを染色し、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋細胞について分析した。ＡとＣ．異なった感作／追加免疫の計画で処理したマウスの脾臓（Ａ）及び腫瘍（Ｃ）におけるＯＶＡ特異的なＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す代表的なフローサイトメトリーデータ。ＢとＤ．処理したマウスの脾臓（Ｂ）と腫瘍（Ｄ）における２×１０５個のプールした細胞当たりのＯＶＡ特異的なＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を示す棒グラフ。示したデータは行った２つの実験の代表である（平均値±ＳＤ）。
【図６】異なった感作／追加免疫の計画で処理した担癌マウスにおけるＥ７特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数を測定するための細胞内サイトカインの染色とその後のフローサイトメトリー解析。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（群当たり５匹）を皮下にて５×１０４／マウスのＴＣ−１腫瘍細胞で感作した。腫瘍感作の５日後、遺伝子銃によって２μｇ／マウスのＣＲＴ／Ｅ７（ｐＣＲＴ／Ｅ７）を発現しているｐｃＤＮＡ３でマウスを免疫した。１２日目、１×１０７ｐｆｕ／マウスの野生型のワクシニア（Ｖａｃ−ＷＴ）又はＣＲＴ／Ｅ７をコードするワクシニア（Ｖａｃ−ＣＲＴ／Ｅ７）の腹腔内注射又は粘膜内注射によってマウスを追加免疫した。ＰＢＳで処理したＴＣ−１担癌マウスを対照として使用した。ワクシニア感染の７日後、マウスの脾臓（Ａ及びＢ）及び腫瘍（Ｃ及びＤ）から細胞を回収し、ＯＶＡペプチドと共に一晩インキュベートし、細胞内ＩＦＮγ染色、その後のフローサイトメトリー解析を用いてＣＤ８と細胞内ＩＦＮγを染色し、Ｅ７特異的ＣＤ８＋細胞について分析した。処理したマウスの脾臓（Ａ）と腫瘍（Ｂ）における２×１０５個のプールした細胞当たりのＯＶＡ特異的なＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を示す棒グラフ。示したデータは行った２つの実験の代表である（平均値±ＳＤ）。
【図７】異なった感作／追加免疫の計画で処理した担癌マウスにおけるＯＶＡ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の数を測定するための細胞内サイトカインの染色とその後のフローサイトメトリー解析。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（群当たり５匹）を皮下にて５×１０４／マウスのＢ１６／Ｆ１０腫瘍細胞で感作した。腫瘍感作の５日後、遺伝子銃によってｐｃＤＮＡ３ＤＮＡ又はｐ−ＯＶＡＤＮＡでマウスを免疫し、図２に示すように、Ｖａｃ−ＷＴ又はＶａｃ−ＯＶＡもいずれかの粘膜内注射によって追加免疫した。ＰＢＳで処理したＴＣ−１担癌マウスを対照として使用した。ワクシニア感染の７日後、マウスの脾臓（Ａ）及び腫瘍（Ｂ）から細胞を回収し、細胞内ＩＦＮγ染色、その後のフローサイトメトリー解析を用いてＣＤ８と細胞内ＩＦＮγを染色し、ＯＶＡ特異的ＣＤ４＋細胞について分析した。処理したマウスの脾臓（Ａ）と腫瘍（Ｄ）における２×１０５個のプールした細胞当たりのＯＶＡ特異的なＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を示す棒グラフ。示したデータは行った２つの実験の代表である（平均値±ＳＤ）。
【図８】生体内の抗体枯渇実験。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（群当たり５匹）を皮下にて５×１０４／マウスのＢ１６／Ｆ１０又はＴＣ−１腫瘍細胞で感作した。腫瘍感作の５日後、遺伝子銃によって２μｇ／マウスの卵白アルブミンを発現するｐｃＤＮＡ３（ｐ−ＯＶＡ）でマウスを免疫した。１２日目、１×１０７ｐｆｕ／マウスの卵白アルブミンをコードするワクシニア（Ｖａｃ−ＯＶＡ）の腹腔内注射によってマウスを追加免疫した。Ｄ５から隔日ごとに３回、その後実験終了まで週１回抗体を用いてマウスからＣＤ４＋細胞又はＣＤ８＋細胞を取り除いた。１×ＰＢＳで処理した担癌マウスを対照として使用した。異なった処理計画で処理したＢ１６（Ａ）又はＴＣ−１（Ｂ）担癌マウスのＫａｐｌａｎとＭｅｉｅｒの生存率分析。
【図９】試験管内の細胞傷害性アッセイ。（Ａ）細胞傷害性アッセイのための実験設定の模式図。ルシフェラーゼを発現するＴＣ−１腫瘍細胞（２×１０４／ウェル）を９６穴プレートに加えた。２４時間後、Ｖａｃ−ＷＴ又はＶａｃ−ＯＶＡ（ＭＯＩ＝０．５）を各ウェルに加えた。４８時間後、完全培地を交換し、活性化したＯＴ−１Ｔ細胞をＥ／Ｔ比１：１で各ウェルに加えた。４時間後、生物発光画像化を行った。ＩＶＩＳ発光画像化システムシリーズ２００を用いて発光活性の低下によって腫瘍細胞のＣＴＬが介在する殺傷の程度を示した。生物発光シグナルを１０秒間取得した。（Ｂ）９６穴プレートの代表的な発光画像化及び異なった処理の腫瘍細胞を含有する各ウェルにおける発光強度を示す棒グラフ。
【図１０】腫瘍におけるＣＤ３１＋細胞のワクシニア感染性の性状分析。（Ａ）ワクシニアで感染させた腫瘍におけるＣＤ３１＋細胞の比率を明らかにするフローサイトメトリーデータ。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（群当たり５匹）を皮下にて５×１０４／マウスのＴＣ−１腫瘍細胞で感作した。腫瘍の大きさが８〜１０ｍｍに達したとき、１×１０７ｐｆｕ／マウスのＶａｃ−ＧＦＰによって腫瘍内（ｉ．ｔ．）で又は腹腔内（ｉ．ｐ．）のいずれかでマウスを処理した。ウイルス注射の２４時間後、腫瘍を回収して、ＣＤ３１について染色し、フローサイトメトリー解析によって性状分析した。（Ｂ）異なった処理群における腫瘍に由来する３×１０５細胞当たりのＣＤ３１＋ＡＡＤ−細胞の数を示す代表的な棒グラフ（平均値±ＳＤ）。外植した腫瘍に由来する細胞（２×１０４／ウェル）を９６穴プレートに加えた。２４時間後、Ｖａｃ−ＷＴ又はＶａｃ−ＯＶＡ（ＭＯＩ＝０．５）を各ウェルに加え、４８時間後、活性化したＯＴ−１Ｔ細胞（Ｅ／Ｔ比１：１）を各ウェルに加えた。４時間後、ＰＥ標識した抗マウスＣＤ３１ｍＡｂ及びＦＩＴＣ標識した４−ＡＤＤで染色し、フローサイトメトリー解析によって解析した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
略記の部分的リスト
ＡＮＯＶＡ、分散分析；ＡＰＣ、抗原提示細胞；ＣＲＴ、カルレチクリン；ＣＴＬ、細胞傷害性Ｔリンパ球；ＤＣ、樹状細胞；Ｅ６ＨＰＶ、腫瘍タンパク質Ｅ６；Ｅ７ＨＰＶ、腫瘍タンパク質Ｅ７；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着アッセイ；ＨＰＶ、ヒトパピローマウイルス；ＩＦＮγ、インターフェロン−γ；ｉ．ｍ．筋肉内；ｉ．ｔ．腫瘍内；ｉ，ｖ．静脈内；ｌｕｃ、ルシフェラーゼ；ｍＡＢ、モノクローナル抗体；ＭＯＩ、感染多重度；ＯＶＡ、卵白アルブミン；ｐ−、プラスミド；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＰＣＲ、ポリメラーゼ鎖反応；ＳＤ、標準偏差；ＴＡＡ、腫瘍関連抗原；Ｖａｃ、ワクシニアウイルス；ＷＴ、野生型
本明細書で提供されるのは、たとえば、過剰増殖性疾患、たとえば、癌の再発を治療する及び／又は予防するための免疫応答を高める又は刺激する方法及び組成物である。一実施形態では、発明は、抗原又は生物学的に活性のあるそのホモログをコードする核酸組成物を含む組成物の有効量を哺乳類に投与することによって哺乳類を感作することと、抗原又は生物学的に活性のあるそのホモログをコードする核酸を含む腫瘍崩壊性ウイルスの有効量を哺乳類に投与することによって哺乳類を追加免疫することを含む。そのような方法は治療目的及び／又は予防目的で使用されてもよい。追加的に投与されてもよいそのほかの組成物には、免疫系を高めるタンパク質をコードするタンパク質及び核酸が含まれるが、抗原、たとえば、本明細書でさらに記載されるような抗原提示細胞の寿命を延ばすものを含まない。
【００１２】
ほかの方法は、化学療法剤又は化学療法薬、たとえば、核酸ワクチンではない薬剤、たとえば、癌細胞のアポトーシスを誘導する薬剤を投与することを含む。抗原をコードする核酸の１以上、抗原をコードする１以上の腫瘍崩壊性ウイルス、そのようなタンパク質をコードするタンパク質及び／又は核酸を高める１以上の免疫系、並びに１以上の薬剤、たとえば、化学療法薬の任意のそのほかの組み合わせも、哺乳類で免疫応答を刺激するのに使用してもよい。方法の少なくとも一部は、別の治療、たとえば、哺乳類において応答を高める免疫系を投与することを含む治療の効率を高めるために使用されてもよい。感作工程の投与は、１以上のほかの剤の投与、たとえば、追加免疫工程と造時に、その前に又はその後に実施されてもよい。
核酸ワクチン
哺乳類に投与してもよいワクチンには、任意のワクチン、たとえば、核酸ワクチン（たとえば、ＤＮＡワクチン）が挙げられる。本発明の一実施形態では、核酸ワクチンは、抗原、たとえば、それに対する免疫応答が望まれる抗原をコードする。使用されてもよいそのほかの核酸は、免疫応答を高める又は向上させるが、それに対する免疫応答が望まれる抗原をコードしていないものである。これらのワクチンを以下にさらに記載する。
【００１３】
例となる抗原には、病原性生物、たとえば、細菌又はウイルス又はそのほかの微生物に由来するタンパク質又はその断片、並びに細胞、たとえば、癌細胞に由来するタンパク質又はその断片が挙げられる。一実施形態では、抗原は、ウイルス、たとえば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の部類、たとえば、Ｅ７又はＥ６に由来する。これらのタンパク質はまた腫瘍形成性タンパク質であり、細胞性の形質転換の誘導及び維持に重要であり、ほとんどのＨＰＶ含有の子宮頸癌及びその前駆的病変にて同時発現される。従って、Ｅ７又はＥ６を標的とする本発明の組成物のような癌ワクチンを用いてＨＰＶ関連の腫瘍形成を制御することができる（Wu,T-C, Curr Opin Immunol. 6:746-54, 1994）。
【００１４】
しかしながら、言及されるように、本発明は例示される抗原に限定されない。むしろ、当業者は、Ｔ細胞介在性の応答が望まれる抗原（及びそのエピトープ）について同じ結果が期待されることを十分に理解するであろう。そのように生成される応答は、たとえば、病原性細胞の細胞表面抗原又は病原性ウイルスのエンベロープ若しくはそのほかの抗原、又は細菌抗原、又は病原性分子の一部として発現される抗原としてのエピトープ又は抗原決定基が関与する生物又は疾患に向けられた予防的又は治療的な、又は双方の免疫を提供することにおいて効果的である。
【００１５】
例となる抗原及びその配列を以下に示す。
ＨＰＶ−１６由来のＥ７タンパク質
ＨＰＶ−１６由来のＥ７の核酸配列（配列番号８）及びアミノ酸配列（配列番号９）を以下に示す（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１５２６）
【００１６】
【化１】
2015017117.tif 000002
一文字表記では、野生型Ｅ７のアミノ酸配列（配列番号９）は、
【００１７】
【化２】
2015017117.tif 000003
である。
【００１８】
別の実施形態では（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１２５６７３、ヌクレオチド５６２〜８５８及びＥ７アミノ酸配列を参照）、上記のＣ末端の４つのアミノ酸ＱＤＫＬ（及びそのコドン）を３つのアミノ酸ＱＫＰ（及びそのコドン、ｃａｇａａａｃｃａ）で置き換えて９８残基のタンパク質を得る。
【００１９】
腫瘍性タンパク質が免疫部分である場合、ワクチン自体の腫瘍形成リスクを低減することが好ましい。ＨＰＶＥ７タンパク質の潜在的な腫瘍原性のために、Ｅ７タンパク質は「解毒化」形態で使用され得る。
【００２０】
本発明の構築物でＥ７の腫瘍形成性を低減するには、Ｅ７の以下の位置の１以上を変異させる。
【００２１】
【表１】
2015017117.tif 000004
一実施形態では、Ｅ７（解毒）変異配列は以下の２つの変異を有する：
ＴＧＴ→ＧＧＴの変異は配列番号９の２４位にてＣｙｓ→Ｇｌｙの置換を生じ、ＧＡＧ→ＧＧＧの変異は、野生型Ｅ７の２６位にてＧｌｕ→Ｇｌｙの置換を生じる。この変異させたアミノ酸配列を、下線を引いた置換残基と共に以下に示す：
【００２２】
【化３】
2015017117.tif 000005
これらの置換によってＥ７のＲｂに結合する能力が完全に排除され、それによってその形質転換活性が無効にされる。上記Ｅ７又はＥ７（解毒）のポリペプチド又はその抗原断片又はエピトープをコードする任意のヌクレオチド配列を本組成物及び本方法で使用することができ、含まれるＥ７又はＥ７（解毒）の配列は上記に示す。
ＨＰＶ由来のＥ６タンパク質
野生型Ｅ６ヌクレオチド配列（配列番号１１）及びアミノ酸配列（配列番号１２）を以下に示す（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｋ０２７１８及びＮＣ＿００１５２６を参照）
【００２３】
【化４】
2015017117.tif 000006
このポリペプチドは１５８のアミノ酸を有し、一文字表記で以下に示す（配列番号１２）：
【００２４】
【化５】
2015017117.tif 000007
ＨＰＶ−１６のような子宮頸癌に関連するＨＰＶの種類に由来するＥ６は、Ｅ６−ＡＰとの相互作用を介してｐ５３腫瘍サプレッサータンパク質のタンパク分解を誘導する。Ｅ６によって不死化されたヒト乳腺上皮細胞（ＭＥＣ）は低レベルのｐ５３を示す。ほかの癌関連のパピローマウイルスＥ６タンパク質と同様にＨＰＶ１６のＥ６も細胞性タンパク質Ｅ６ＢＰ（ＥＲＣ−５５）に結合する。Ｅ７と同様に、以下に記載される、Ｅ６の非腫瘍原性の変異形態を使用してもよくｍ「Ｅ６（解毒）」と呼ばれる。幾つかの異なったＥ６変異及びそれらを記載する出版物を以下で議論する。
【００２５】
変異させるべきアミノ酸残基には上記Ｅ６アミノ酸配列で下線を引いてある。Ｅ６変異体の幾つかの検討は１５１核酸の短いＥ６タンパク質に基づくが、その際、Ｎ末端残基は、野生型Ｅ６の８位でのＭｅｔであるとみなされた。Ｅ６のその短縮版を（配列番号１３）として以下に示す：
【００２６】
【化６】
2015017117.tif 000008
構築物におけるＥ６の腫瘍原性の可能性を低減するために、Ｅ６の以下の位置の１以上を変異させる：
【００２７】
【表２】
2015017117.tif 000009
Ｎｇｕｙｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６：１３０３９−４８，２００２は、生体内で低減した腫瘍原性の可能性を示す、α−螺旋の相方を結合することにおけるＨＰＶ−１６Ｅ６欠損の変異体を記載した。１２８位（配列番号１３）でのＩｌｅのＴｈｒによる置換を含むこの変異体を本発明に従って使用して、腫瘍原性であるリスクの低いＥ６ＤＮＡワクチンを作製してもよい。このＥ６（１２８Ｔ）変異体は、ｐ５３タンパク質のＥ６依存性の分解に介在するユビキチンリガーゼであるＥ６ＡＰを含む、α−螺旋の相方の少なくともサブユニットを結合する能力に欠陥がある。
【００２８】
Ｃａｓｓｅｔｔｉ，ＭＣら、Ｖａｃｃｉｎｅ，２２：５２０−５２，２００４は、その腫瘍原性能を不活化するＥ６及びＥ７における４又は５のアミノ酸の位置の変異の効果を調べた。以下の変異を調べた：Ｅ６−Ｃ６３Ｇ及びＥ６−Ｃ１０６Ｇ（野生型Ｅ６に基づく位置）；Ｅ７−Ｃ２４Ｇ、Ｅ７−Ｅ２６Ｇ及びＥ７−Ｃ９１Ｇ（野生型Ｅ６に基づく位置）。変異型又は野生型のＥ６及びＥ７をコードするベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスのレプリコン粒子（ＶＲＰ）ワクチンは、幾つかのＨＰＶ１６  Ｅ６（＋）Ｅ７（＋）腫瘍感作モデルにて匹敵するＣＴＬ反応を誘発し、匹敵する抗腫瘍反応を生成し：Ｃ３又はＴＣ−１腫瘍の感作からの防御はワクチン接種マウスの１００％で認められた。Ｃ３腫瘍の撲滅はおよそ９０％のマウスで認められた。Ｅ６及びＥ７の腫瘍原性能の予測された不活化は、変異Ｅ６及びＥ７遺伝子を発現しているＶＲＰｓに感染させたヒト乳腺上皮細胞におけるｐ５３とＲｂ双方のタンパク質の正常レベルを明らかにすることによって確認した。
【００２９】
ＨＰＶ１６のＥ６タンパク質は構造と機能に重要な２つの亜鉛フィンガーを含有し；Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ（Ｘはアミノ酸）亜鉛フィンガーモチーフの各対におけるシステイン（Ｃ）アミノ酸１つをＥ６の６３位及び１０６位（野生型Ｅ６に基づく）にて変異させてもよい。たとえば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（カリフォルニア州、ラホヤ、ストラタジーン）を用いて変異体を創製する。野生型Ｅ６におけるＣｙｓ１０６（＝野生型Ｅ６におけるＣｙｓ１１３）のコドンにおける単一点突然変異を含有するＨＰＶ１６のＥ６。Ｃｙｓ１０６は、ｐ５３を結合しないし、その分解も促進しないが、ｐ５３の分解に依存した表現型である、ヒト乳腺上皮細胞（ＭＥＣ）を不死化することは不可能である。野生型Ｅ６におけるＣｙｓ６３（＝野生型Ｅ６におけるＣｙｓ７０）位での単一アミノ酸置換は、幾つかのＨＰＶ１６  Ｅ６も機能：ｐ５３の分解、Ｅ６ＴＰ−１の分解、テロメラーゼの活性化及びその結果としての一次上皮細胞の不活化を壊す。
【００３０】
これらＥ６ポリペプチド、その変異体の１つ又はその抗原断片若しくはエピトープをコードするヌクレオチド配列を本発明で使用することができる。上記Ｃａｓｓｅｔｔｉらに記載されたものを含めて本明細書で記載される方法に従って、そのほかの変異を調べ、使用することができる。コーディングＤＮＡの変異による適当な出発配列からこれらの変異を作出することができる。
【００３１】
本発明はまた、本明細書で記載される１以上の変異を用いて生体内でその腫瘍原性能に関して腫瘍タンパク質を不活化する、直列Ｅ６−Ｅ７ワクチンの使用も含む。ＶＲＰワクチン（上記Ｃａｓｓｅｔｔｉらに記載された）は、４又は５のアミノ酸の位置で変異させる、オープンリーディングフレーム１つに融合したＥ６とＥ７の遺伝子を含んだ。従って、本構築物は、Ｅ６及びＥ７の１以上のエピトープを含み、それらは、天然の順に配置されてもよいし、免疫原性形態でＥ６及びＥ７の抗原性エピトープを運ぶように発現されたタンパク質を可能にするように混ぜられてもよい。再び、形質導入された宿主細胞によってそれらが発現された後、スペーサーが免疫原性の方式でエピトープの発現又は提示を可能にするという条件で、Ｅ６とＥ７の間又はこれらタンパク質の個々のエピトープの間におけるアミノ酸スペーサーをコードするＤＮＡがベクターに導入されてもよい。
卵白アルブミン（ＯＶＡ）
代表的なＯＶＡ（配列番号１３９）をコードするアミノ酸配列を以下に示す。
【００３２】
【化７】
2015017117.tif 000010
ほかの例となる抗原
例となる抗原は、ＣＴＬ及び遅延型過敏症を含むエフェクターＴ細胞の応答によって宿主が防御される病原性微生物のエピトープである。これらには通常、ウイルス、マラリアのような細胞内寄生虫、及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ及びＬｉｓｔｅｒｉａの種のような細胞内で増殖する細菌が挙げられる。従って、本発明のワクチン組成物に含まれる抗原の種類は、腫瘍特異的抗原と同様にそのような病原体に関わるものにいずれかであってもよい。ウイルスが腫瘍における原因因子である場合、一部のウイルス抗原は腫瘍抗原でもあることは注目に値すべきである。
【００３３】
事実、世界中で最も一般的な２つの癌、肝臓癌と子宮頸癌はウイルス感染に関連している。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（Beasley, R.P. et al.,Lancet 2:1129-1133(1981）は肝臓癌の病原因子として関係するとみなされている。子宮頸癌の約８０〜９０％は、「高リスク」ヒトパピローマウイルス型：ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１及びＨＰＶ−４５の４つのうち１つからのＥ６抗原及びＥ７抗原（上記で議論し、本明細書で例示する）を発現する（参照によって本明細書に組み入れられるGissmann,L.et al., Ciba Found Symp. 120:190-207, 1986; Beaudenon,S., et al. Nature321:246-9, 1986）
。ＨＰＶのＥ６及びＥ７の抗原は、子宮頸癌におけるその独特の発現のために、免疫が保たれている個体におけるウイルス関連の癌について最も有望な標的である。治療用の癌ワクチンについての標的としてのその重要性に加えて、ウイルス関連の腫瘍抗原は、予防用ワクチンの理想的な候補でもある。実際、アジアにおける予防用ＨＢＶワクチンの導入が肝臓癌の発生を減らした（Chang,MHet al. New Engl. J. Med. 336, 1855-1859 (1997）ということは、癌の予防に対する大きな効果を代表している。
【００３４】
慢性のヒトのウイルス感染で最も重要なウイルスは、ＨＰＶ、ＨＢＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）のようなレトロウイルス、エプステインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＮＶ）、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２のようなヘルペスウイルス、並びにインフルエンザウイルスである。有用な抗原には、ＨＢＶ表面抗原若しくはＨＢＶコア抗原、ＣＭＶｐｐＵＬ８３若しくはｐｐ８９、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０、ｇｐ４１若しくはｐ２４の抗原、ＨＳＶのＩＣＰ２７、ｇＤ２、ｇＢ、又はインフルエンザの血球凝集素若しくは核タンパク質が挙げられる（Anthony,LS et al., Vaccine 1999; 17:373-83）。本明細書に記載されるように利用
することができる病原体に関連するそのほかの抗原は、マラリア、たとえば、ＮＡＮＰの反復に基づくマラリアペプチドを含む種々の寄生虫の抗原である。
【００３５】
特定の実施形態では、本発明は個体が既存のＴ細胞免疫（たとえば、インフルエンザ、破傷風、ヘルペスなど）を有してもよい外来抗原を用いる方法を含む。ほかの実施形態では、熟練者は、当該技術で利用できる周知の方法に従って対象が特定の抗原に対して既存のＴ細胞免疫を有するかどうかを容易に決定し、それに対して対象が既存のＴ細胞免疫をすでに有していない外来抗原を使用することができる。
【００３６】
代わりの実施形態では、抗原は、たとえば、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ；Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ；Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ；Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ
ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉのような細菌である病原体、又はたとえば、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓのような真菌、又はたとえば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのようなそのほかの病原体に由来する。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、用語「癌」は、固形腫瘍及び血液性腫瘍を含むが、これらに限定されない。用語、癌は、皮膚、組織、臓器、骨、軟骨、血液及び血管の疾患を含む。増殖で進行している癌を記載するのに使用され、また「後期段階の癌」又は「進行段階の癌」とも呼ばれる用語は、転移している、たとえば、元々の起源から体の別の部分に広がっている癌である。特定の実施形態では、進行した段階の癌にはステージ３及び４の癌が含まれる。癌は、その増殖と体中の広がりの程度に応じてステージにランク分けされ、ステージは重症度に相当する。所与の癌のステージを決定することによって、医師が治療を推奨すること、患者に起こりそうなことについての転帰のシナリオを作成すること、及びほかの医師と効率的に意思疎通することを助けることになる。
【００３８】
使用には複数のステージ決定の尺度がある。最も一般的なものの１つは患者を進行性に５つのさらに重度の段階：０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶにランク付けする。ステージ０の癌は、ほんのわずかな細胞が関与する始まったばかりの癌である。ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶは、さらに大きな腫瘍サイズ、さらなる腫瘍、癌が増殖し、広がる悪性度及び癌が広がって隣接する組織や体内の臓器を冒す程度を特徴とする進行性にさらに進んだ癌を表す。
【００３９】
別のよく知られたステージ化方式は、ＴＮＭ方式として知られ、癌の広範さの三次元のランク付けである。ＴＮＭ方式を用いて、医師は３つの尺度それぞれで見つける癌をランク付けし、その際、Ｔは腫瘍サイズを表し、Ｎはリンパ節の関与を表し、Ｍは転移（癌が元々の位置を越えて広がった程度）を表す。３つの尺度のそれぞれにおけるより大きなスコアはさらに進行した癌を示す。たとえば、体のほかの部分に広がっていない大きな腫瘍はＴ３Ｎ０Ｍ０とランク付けされる一方で、小さいがさらに悪性の癌はＴ２Ｎ２Ｍ１とランク付けされるということは、局所リンパ節に広がっているが、新しい臓器への局在は始まったばかりである中程度の大きさの腫瘍を示唆している。
【００４０】
本発明の方法及び組成物によって治療され得る癌には、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳腺、結腸、食道、消化器、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頚部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌又は子宮に由来する癌が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、癌は、これらに限定されないが、具体的には以下の組織学的種類であってもよい：新生物、悪性腫瘍；癌腫；未分化癌腫；巨細胞と紡錘細胞の癌腫；小細胞癌腫；乳頭癌腫；扁平上皮癌腫；リンパ上皮癌腫；基底細胞癌腫；毛母癌腫；移行細胞癌腫；乳頭移行細胞癌腫；腺癌；悪性ガストリン産生腫瘍；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌と胆管癌の合併；索状腺腫；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープにおける腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌種；カルチノイド腫瘍、悪性；気管支／肺胞腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性細胞癌腫；好酸性癌腫；好酸性腺癌；好塩基性癌腫；明細胞腺癌；顆粒細胞癌腫；濾胞腺癌；乳頭及び濾胞腺癌；非被包性硬化性癌腫；副腎皮質癌腫；子宮内膜性癌腫；皮膚付属器癌腫；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳道腺癌；粘膜表皮癌腫；嚢胞腺癌；乳頭嚢胞腺癌；乳頭漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌腫；浸潤管癌腫；髄質癌腫；小葉癌腫；炎症性癌腫；パジェット病、乳腺；腺房細胞癌腫；腺扁平上皮癌腫；腺癌ｗ／扁平上皮転移；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；及び神経節芽腫、悪性；セルトリ細胞癌腫；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳腺外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在性拡大黒色腫；巨大色素神経における悪性黒色腫；上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；肺胞横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎児性肉腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周皮細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；皮質近接部骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽腫、悪性；間質性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣細胞腫；星状細胞腫；原形質性星状膠細胞；線維性星状細胞腫；星状芽腫；膠芽細胞腫；乏突起膠腫；乏突起芽腫；原始性神経管外胚葉；脳肉腫；神経節神経芽腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅球神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維性肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性リンパ腫；小リンパ性；悪性リンパ腫；大細胞、びまん性悪性リンパ腫；濾胞性菌状息肉腫；そのほかの特定された非ホジキンリンパ腫；悪性組織球腫；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ性肉腫性細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；及びヘアリー細胞白血病。
【００４１】
ヒトの癌及び感染性疾患へのその適用性に加えて、本発明はまた、獣医学の背景における動物の疾患を治療することでの使用も意図される。従って、本明細書に記載されるアプローチは、当業者によって、ウマのヘルペスウイルス、ウシのウイルス性下痢ウイルス（たとえば、Ｅ２抗原）、ウシのヘルペスウイルスのようなウシのウイルス、ニワトリやそのほかの家禽におけるマレック病ウイルスを含む家畜のヘルペスウイルス感染；動物のレトロウイルス及びレンチウイルスの疾患（たとえば、ネコ白血病、ネコ免疫不全、サル免疫不全ウイルスなど）；偽狂犬病及び狂犬病などの治療に容易に適用されてもよい。
【００４２】
腫瘍抗原については、ＣＴＬを含むＴ細胞によって認識され得る腫瘍関連抗原又は腫瘍特異抗原（又は腫瘍由来のエピトープ）（まとめてＴＡＡ）のどんなものも使用することができる。これらには、限定しないで、変異ｐ５３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ又はそのペプチド、又はＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１−／Ｍｅｌａｎ−Ａのような多数の黒色腫関連抗原、チロシナーゼ、ｇｐ７５、ｇｐ１００、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧｎＴ−Ｖ、及びｐ１５（たとえば、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，１８７，３０６号を参照）が挙げられる。
【００４３】
核酸ワクチンに完全長の抗原を含める必要はなく；ＭＨＣクラスＩ及び／又はＩＩによって提示される断片を含めるのが十分である。核酸は、同一であってもよく、異なっていてもよい、１、２、３、４、５以上の抗原を含んでもよい。
Ｅ６、Ｅ７及びそのほかの抗原の突然変異誘発のアプローチ
たとえば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（カリフォルニア州、ラホヤ、ストラタジーン）を用いて、本明細書に記載される抗原の変異体を創製してもよい。一般に、本明細書で使用されてもよい抗原は、天然に存在するタンパク質又はペプチドとは異なるが、機能的な活性について必要なエピトープをまだ保持しているタンパク質又はペプチドであってもよい。特定の実施形態では、抗原は、天然に存在する抗原又はその断片と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく、又はそれから成ってもよい。特定の実施形態では、抗原はまた、天然に存在する抗原又はその断片をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく、又はそれから成ってもよい。特定の実施形態では、抗原はまた、天然に存在する抗原又はその断片をコードする核酸に高い厳密性条件下でハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく、又はそれから成ってもよい。ハイブリッド形成の条件は本明細書でさらに記載される。
【００４４】
一実施形態では、例となるタンパク質は、本明細書で提供されるＥ６又はＥ７の配列のような、たとえば、Ｅ６又はＥ７を含むウイルスタンパク質と少なくとも約5０％、５５
％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく、又はそれから成ってもよい。Ｅ６又はＥ７タンパク質が解毒Ｅ６又はＥ７タンパク質である場合、タンパク質のアミノ酸配列は、Ｅ６又はＥ７タンパク質と少なくとも約5０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、
９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく、又はそれから成ってもよく、その際、タンパク質を「解毒」タンパク質にするアミノ酸が存在する。
免疫原性を高めるポリペプチド（ＩＰＰ）と抗原をコードする例となるＤＮＡワクチン
一実施形態では、核酸ワクチンは、抗原と、第２のタンパク質、たとえば、ＩＰＰを含む融合タンパク質をコードする。ＩＰＰは、連結する抗原ポリペプチドのＭＨＣクラスＩ経路を介した処理又は処理を高める細胞性区画のターゲティングを促進することによって免疫応答を高めることで作用してもよい。この基本戦略は、本発明者らとその共同研究者らによって開拓された追加の戦略と組み合わせるが、それには「標的化ポリペプチド」と呼ばれる別のタンパク質をコードするＤＮＡを、抗原をコードするＤＮＡに連結することが関与する。再び、簡略化のために、そのような標的化ポリペプチドをコードするＤＮＡを本明細書では「標的化ＤＮＡ」と呼ぶ。その戦略は、抗原のみをコードするＤＮＡを運ぶベクターの能力を高めるのに有効であることが示されている。たとえば、Ｗｕらによる以下のＰＣＴ公開；ＷＯ０１／２９２３３；ＷＯ０２／００９６４５；ＷＯ０２／０６１１１３；ＷＯ０２／０７４９２０；及びＷＯ０２／１２２８１を参照のこと、それらすべてはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。ほかの戦略は、以下を促進する又は高めるポリペプチドをコードするＤＮＡの使用が含まれる：
（ａ）抗原提示細胞の発生、蓄積若しくは活性、若しくは高い抗原定時をもたらす抗原提示細胞の区画への抗原の標的化；
（ｂ）抗原の細胞間の輸送及び拡散；又は
（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組み合わせ。
（ｄ）リソソーム関連の膜タンパク質１型（Ｓｉｇ／ＬＡＭＰ−１）の選別。
【００４５】
戦略には以下の使用が挙げられる：
（ａ）単純性ヘルペスウイルス−１、ＶＰ２２タンパク質、マレック病ウイルスＵＬ４９（ＷＯ０２／０９６４５及び米国特許第７，３１８，９２８号を参照）、タンパク質又はその機能的ホモログ若しくは誘導体の群から選択されるウイルス細胞間拡散タンパク質；（ｂ）ＣＲＴ様分子、ＥＲ６０４，ＧＲＰ９４、ｇｐ９６、又はその機能的ホモログ若しくは誘導体（ＷＯ０２／１２２８１及び米国特許第７，３４４２，００２号を参照）の群から選択されるカルレチクリン及び小胞体シャペロンポリペプチド；
（ｃ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素ＥＴＡのドメインＩＩ又はその機能的ホモログ若しくは誘導体（公開された米国特許出願２２０４００８６８４５を参照）の群から選択される病原体毒素の細胞質転移ポリペプチドドメイン；
（ｄ）γ−チューブリン又はその機能的ホモログ若しくは誘導体から選択される細胞の中心体を標的とするポリペプチド；
（ｅ）ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−リガンド細胞外ドメイン又はその機能的ホモログ若しくは誘導体の群から選択される、樹状細胞前駆体を刺激する又は樹状細胞活性を活性化するポリペプチド；又は
（ｆ）Ｂ７−ＤＣ（米国特許シリアル番号０９／７９４，２１０を参照）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、可溶性ＣＤ４０などを含むＢ７ファミリータンパク質のような同時刺激シグナル；
（ｇ）（１）ＢＣＬ−ｘＬ、（２）ＢＣＬ−２。（３）ＸＩＡＰ、（４）ＦＬＩＣＥｃ−ｓ、（５）ドミナントネガティブカスパーゼ−８、（６）ドミナントネガティブカスパーゼ−９、（７）ＳＰＩ−６及び（８）（１）〜（７）の機能的ホモログ若しくは誘導体  （ＷＯ２００５／０４７５０１を参照）。
【００４６】
そのすべてはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる以下の出版物がＩＰＰを記載している：Ｋｉｍ,ＴＷら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１２：１０９−１
１７，２００３；Ｃｈｅｎｇ，ＷＦら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０８：６６９−６７８，２００１；Ｈｕｎｇ，ＣＦら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：３６９８−３７０３，２００１；Ｃｈｅｎ，ＣＨら、２０００，ｓｕｐｒａ；米国特許第６，７３４，１７３号；公開された特許出願ＷＯ０５／０８１７１６、ＷＯ０５／０４７５０１、ＷＯ０３／０８５０８５、ＷＯ０２／１２２８１、ＷＯ０２／０７４９２０、ＷＯ０２／０６１１１３、ＷＯ０２／０９６４５及びＷＯ０１／２９２３３。抗体としてＨＰＶのＥ６を用いたこれらＩＰＰの比較研究は、Ｐｅｎｇ，Ｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．１２：６８９−７００，２００５に記載されている。
【００４７】
抗原はＩＰＰのＮ末端又はＣ末端に連結されてもよい。例となるＩＰＰ及びそのようなものをコードする融合構築物は以下に記載される。
リソソーム関連の膜タンパク質（ＬＡＭＰ−１）
転位シグナル配列に融合させたＥ７タンパク質とＬＡＭＰ−１ドメインをコードするＤＮＡ配列（Ｓｉｇ−Ｅ７−ＬＡＭＰ−１）［配列番号１６］は、
【００４８】
【化８】
2015017117.tif 000011
である。
【００４９】
Ｓｉｇ／Ｅ７／ＬＡＭＰ−１）のアミノ酸配列［配列番号１７］は、
【００５０】
【化９】
2015017117.tif 000012
である。
【００５１】
小文字にて下線付きでのＳｉｇＥ７−ＬＡＭＰ−１のコーディング配列と共に、免疫原性ベクターｐｃＤＮＡ−３−Ｓいｇ／Ｅ７／ＬＡＭＰ−１のヌクレオチド配列［配列番号１８］を以下に示す。
【００５２】
【化１０−１】
2015017117.tif 000013
【００５３】
【化１０−２】
2015017117.tif 000014
【００５４】
【化１０−３】
2015017117.tif 000015
【００５５】
【化１０−４】
2015017117.tif 000016
【００５６】
【化１０−５】
2015017117.tif 000017
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＨＳＰ７０
ＨＳＰ７０をコードするヌクレオチド配列（配列番号１９）は、（ＧｅｎＢａｎｋＮＣ＿０００９６２におけるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムのヌクレオチド１０６３３〜１２５１０）である
【００５７】
【化１１】
2015017117.tif 000018
ＨＳＰ７０のアミノ酸配列［配列番号２０］は
【００５８】
【化１２】
2015017117.tif 000019
である。
【００５９】
Ｅ７−Ｈｓｐ７０キメラ／融合ポリペプチドの配列（ヌクレオチド配列、配列番号２１及びアミノ酸配列、配列番号２２）は以下に提供されるＥ７のコーディング配列は大文字にて下線付きで示す。
【００６０】
【化１３−１】
2015017117.tif 000020
【００６１】
【化１３−２】
2015017117.tif 000021
【００６２】
【化１３−３】
2015017117.tif 000022
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに由来するＥＴＡ（ｄＩＩ）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの外毒素Ａ型（ＥＴＡ）の完全なコーディング配列−配列番号２３−ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｋ０１３９７を以下に示す。
【００６３】
【化１４−１】
2015017117.tif 000023
【００６４】
【化１４−２】
2015017117.tif 000024
ＥＴＡのアミノ酸配列（配列番号２４）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｋ０１３９７は、
【００６５】
【化１５】
2015017117.tif 000025
である。
【００６６】
上記の残基１〜２５（イタリック体）はシグナルペプチドを表す。成熟ポリペプチドの最初の残基、Ａｌａは太字体で下線を引く。成熟ポリペプチドは、配列番号２４の残基２６〜６３８である。
【００６７】
ドメインＩＩ（ＥＴＡ（ＩＩ））、転位ドメイン（上記で下線を引いた）は成熟ポリペプチドの残基２４７〜４１７にわたり（配列番号２４の残基２７２〜４４２に相当する）、配列番号２５として別に以下に表す。
【００６８】
【化１６】
2015017117.tif 000026
ＥＴＡ（ｄＩＩ）がＨＰＶ−１６Ｅ７に融合する構築物を以下に示す（ヌクレオチド：配列番号２６及びアミノ酸：配列番号２７）。ＥＴＡ（ｄＩＩ）の配列は普通のフォントで表し、プラスミドｐｃＤＮＡ３に由来する余分なコドンをイタリック体で示す。ＥＴＡ（ｄＩＩ）とＥ７の間のヌクレオチドは太字体である（及びＥＴＡ（ｄＩＩ）とＥ７の間の２つのアミノ酸の介在を生じる）Ｅ７アミノ酸配列は下線で示す（２６９位にてＧｌｎで終わる）
【００６９】
【化１７−１】
2015017117.tif 000027
【００７０】
【化１７−２】
2015017117.tif 000028
Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  ＡＭＢ
Ｅ７とＨＳＰ７０をコードするｐｃＤＮＡ３ベクターのヌクレオチド配列（ｐｖＤＮＡ３−Ｅ７−ＨＳＰ７０）（配列番号３）
【００７１】
【化１８−１】
2015017117.tif 000029
【００７２】
【化１８−２】
2015017117.tif 000030
【００７３】
【化１８−３】
2015017117.tif 000031
プラスミド構築物ｐｃＤＮＡ３−ＥＴＡ（ｄＩＩ）／Ｅ７の核酸配列（配列番号４）。ＥＴＡ（ｄＩＩ）／Ｅ７をｐｃＤＮＡ３ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位に連結する。ＥＴＡ（ｄＩＩ）／Ｅ７をコードするヌクレオチドを大文字で下線付きで示す。プラスミド配列は小文字である。
カルレチクリン（ＣＲＴ）
よく調べられた約４６ｋＤａのタンパク質であるカルレチクリン（ＣＲＴ）は、多数の生物活性及び生化学活性があるので、上記で手短に記載した。本明細書で使用されるとき、「カルレチクリン」又は「ＣＲＴ」は、当該技術で周知である、本明細書で記載されるような例となるヒトのカルレチクリン、又はたとえば、ウサギ及びラットのＣＲＴのような、そのホモログと実質的に同一性を有するポリペプチド及び核酸を指す。ＣＲＴのポリペプチドは、ＣＲＴのアミノ酸配列と同一又は実質的に同一の配列を含むポリペプチドである。本組成物及び方法で使用されるＣＲＴについての例となるヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を以下に提示する。用語「カルレチクリン」又は「ＣＲＴ」は、天然のタンパク質、並びに、抗原と融合した際（ＤＮＡレベル又はタンパク質レベルで）、ＣＴＬ反応を含む免疫応答を促進し、血管新生を促進する組換えで生成した修飾タンパク質を包含する。従って、用語「カルレチクリン」又は「ＣＲＴ」は、試験管内の技法によって構築された天然のタンパク質の変異体、及び天然の供給源から単離されたタンパク質の変異体を含むヒトＣＲＴのホモログ及び対立遺伝子変異体を包含する。本発明のＣＲＴポリペプチド及びそれをコードする配列はまた、非ＣＲＴ配列、特にＭＨＣクラスＩ結合ペプチドを含む、及びさらに、そのほかのドメイン、たとえば、エピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナルなども含む融合タンパク質も含む。
【００７４】
ヒトＣＲＴのコーディング配列を以下（配列番号２８）で示す。
【００７５】
【化１９】
2015017117.tif 000032
配列番号２８によってコードされるヒトＣＲＴタンパク質のアミノ酸配列を以下（配列番号２９）に示す。このアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ００４３４３と相同性が高い。
【００７６】
【化２０】
2015017117.tif 000033
ウサギ及びラットのＣＲＴのアミノ酸配列はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ１５５３及びＮＭ０２２３９９に示されている。ヒト、ウサギ及びラットのＣＲＴの配列は、これらのタンパク質が高度に保存的であり、アミノ酸の種間の差異はほとんど天然では保存的であることを示している。変異のほとんどは、配置のおよそ３６のＣ末端残基で見られる。従って、本発明には、ヒトＣＲＴを使用してもよいと共に、必要な生物活性（ＩＰＰとしての）を有し、又はその活性のあるドメイン若しくは断片を有する任意の種からのＣＲＴのホモログをコードするＤＮＡをヒトＣＲＴ又はそのドメインの代わりに使用してもよい。
【００７７】
本発明者らとその共同研究者ら（その全体が参照によって組み入れられる上記Chengら
）は、ＨＰＶ−１６のＥ７にキメラ連結されたＣＲＴのＮ、Ｐ及びＣのドメインのそれぞれをコードするＤＮＡワクチンが、遺伝子銃投与によってｉ．ｄ．ワクチン接種したマウスにおいて強力な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答と抗腫瘍免疫を誘発することを。Ｎ−ＣＲＴ／Ｅ７、Ｐ−ＣＲＴ／Ｅ７、又はＣ−ＣＲＴ／Ｅ７のＤＮＡはそれぞれ、Ｅ７のＤＮＡ（抗原のみ）でワクチン接種したマウスに比べて有意に多数のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆細胞とＥ７を発現する腫瘍に対する目覚しい抗腫瘍効果を示した。ＣＲＴのＤＮＡ投与もまた抗血管新生抗腫瘍効果を生じた。従って、腫瘍抗原に連結されたＮ−ＣＲＴをコードするＤＮＡを用いた癌治療法は、抗原特異的免疫療法と血管新生の抑制の組み合わせを介して腫瘍を治療するのに使用されてもよい。
【００７８】
Ｅ７に連結されたＣＲＴ又はそのドメインの１つを含む構築物を以下に模式的に説明する。
【００７９】
【化２１】
2015017117.tif 000034
３つのヒトＣＲＴドメインのアミノ酸配列は完全長タンパク質（配列番号２９）の注釈として示す。Ｎドメインは残基１〜１７０（普通の文字）を含み、Ｐドメインは残基１７１〜２６９（下線）を含み、Ｃドメインは残基２７０〜４１７（太字体／イタリック体）を含む。
【００８０】
【化２２】
2015017117.tif 000035
３つのドメインの配列を別々のポリペプチドとして以下に示す。
【００８１】
【化２３】
2015017117.tif 000036
本ベクターはこれらのドメイン配列の１以上をコードするＤＮＡを含んでもよく、それらは以下の配列番号２８の注釈として示され、その際、Ｎドメイン配列は大文字であり、Ｐドメイン配列は小文字／イタリック体／下線であり、Ｃドメイン配列は小文字である。停止コドンも示されるが、カウントされない。
【００８２】
【化２４−１】
2015017117.tif 000037
【００８３】
【化２４−２】
2015017117.tif 000038
【００８４】
【化２４−３】
2015017117.tif 000039
或いは、これらのドメインをコードする任意のヌクレオチド配列を本構築物で使用してもよい。従って、ヒトにおける使用について、配列のコドンがさらに最適化されてもよい。
【００８５】
本構築物は、多数の配位のいずれかにて１以上のＣＲＴドメインの組み合わせを用いてもよい。ドメインを指定するために記号表示ＮＣＲＴ、ＰＣＲＴ及びＣＣＲＴを用いて、以下は、わずかな例ではあるが、本発明のＤＮＡワクチンベクターで使用されてもよい組合せである（ＡｇはＥ７（解毒）又はＥ６（解毒）を含む抗原であり得ることが理解される）。
【００８６】
【化２５】
2015017117.tif 000040
本発明は、そのような断片が対になる抗体への免疫応答を高めることができるという条件で、ＣＲＴ又はＣＲＴドメインのさらに短いポリペプチド断片を採用することができる。ＭＨＣクラスＩ経路を介してタンパク質の処理を促進する能力を有する上記で示されたＣＲＴ又はドメインの配列からのさらに短いペプチドも含まれ、日常の実験によって定義されてもよい。
【００８７】
本発明はまた、そのような断片が機能的である、たとえば、対になる（たとえば、連結される）抗原に対する免疫応答を高めることができるポリペプチドをコードするという条件で、ＣＲＴ又はＣＲＴドメインをコードするさらに短い核酸断片を採用してもよい。上記で示したＣＲＴ又はドメインの配列からのさらに短いペプチドをコードし、且つ機能的である、たとえば、ＭＨＣクラスＩ経路を介してタンパク質の処理を促進する能力を有する核酸も含まれ、日常の実験によって定義されてもよい。
【００８８】
ＣＲＴのポリペプチド断片は、少なくとも約５０、１００、２００、３００又は４００のアミノ酸を含んでもよい。ＣＲＴのポリペプチド断片はまた、群、Ｎ−ＣＲＴ、Ｐ−ＣＲＴ及びＣ−ＣＲＴから選択されるＣＲＴドメインからの少なくとも約２５、５０、７５、１００、２５〜５０、５０〜１００又は７５〜１２５のアミノ酸を含んでもよい。ＣＲＴのポリペプチド断片は、Ｎ−ドメイン（たとえば、配列番号３０）の残基１〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１２５、１２５〜１５０、１５０〜１７０を含んでもよい。ＣＲＴのポリペプチド断片は、Ｐ−ドメイン（たとえば、配列番号３１）の残基１〜５０、５０〜７５、７５〜１００１００〜１０９を含んでもよい。ＣＲＴのポリペプチド断片は、Ｃ−ドメイン（たとえば、配列番号３２）の残基１〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１２５、１２５〜１３８を含んでもよい。
【００８９】
ＣＲＴの核酸断片は、少なくとも約５０、１００、２００、３００又は４００のアミノ酸をコードしてもよい。ＣＲＴの核酸断片はまた、Ｎ−ＣＲＴ、Ｐ−ＣＲＴ及びＣ−ＣＲＴから選択されるＣＲＴドメインからの少なくとも約２５、５０、７５、１００、２５〜５０、５０〜１００又は７５〜１２５のアミノ酸をコードしてもよい。ＣＲＴの核酸断片は、Ｎ−ドメイン（たとえば、配列番号３０）の残基１〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１２５、１２５〜１５０、１５０〜１７０をコードしてもよい。ＣＲＴの核酸断片は、Ｐ−ドメイン（たとえば、配列番号３１）の残基１〜５０、５０〜７５、７５〜１００１００〜１０９をコードしてもよい。ＣＲＴの核酸断片は、Ｃ−ドメイン（たとえば、配列番号３２）の残基１〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１２５、１２５〜１３８をコードしてもよい。
【００９０】
本明細書で提供されるようなＣＲＴのポリペプチド「断片」は完全長のＣＲＴを含まない。同様に、本明細書で提供されるようなＣＲＴの核酸「断片」は、完全長のＣＲＴ核酸配列を含まず、完全長のＣＲＴポリペプチドをコードしない。
【００９１】
一実施形態では、本発明の完全なキメラ核酸のベクター構築物は以下に示される（配列番号３６）。配列は、プラスミド由来のヌクレオチド（小文字）、ＣＲＴ由来のヌクレオチド（大文字、太字体）、及びＨＰＶ−Ｅ７由来のヌクレオチド（小文字、イタリック体／下線）を示すように注釈が付けられる。５つのプラスミドヌクレオチドがＣＲＴとＥ７のコーディング配列の間に見い出され、Ｅ７配列の停止コドンが二重下線で示されることに留意のこと。このプラスミドはｐＮＧＶＬ４ａ−ＣＲＴ／Ｅ７（解毒）と呼ばれる。
【００９２】
【化２６−１】
2015017117.tif 000041
【００９３】
【化２６−２】
2015017117.tif 000042
【００９４】
【化２６−３】
2015017117.tif 000043
【００９５】
【化２６−４】
2015017117.tif 000044
【００９６】
【化２６−５】
2015017117.tif 000045
以下の表は上記プラスミドの構造を記載する。
【００９７】
【表３】
2015017117.tif 000046
一部の実施形態では、ＣＲＴの代替物は、ストレス誘導タンパク質のＨＳＰ９０ファミリーの代表であるよく検討されているＥＲシャペロンポリペプチド、ＥＲ６０、ＧＲＰ９４又はｇｐ９６によって例示される、別のＥＲシャペロンポリペプチドである（参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ０２／１２２８１を参照）。用語「小胞体シャペロンポリペプチド」は本明細書で使用されるとき、例となるシャペロンタンパク質、ＣＲＴ、タパシン、ＥＲ６０又はカルネキシンと実質的に同じＥＲシャペロン機能を有するポリペプチドを意味する。従って、用語には、その機能的な断片又は変異体又は模倣体すべてが含まれる。当該技術で既知のアッセイを用いてＥＲシャペロンとしてのその活性についてポリペプチド又はペプチドを日常的にスクリーニングすることができる。本発明は作用の特定のメカニズムによって限定されないが、生体内のシャペロンは、ＭＨＣクラスＩヘテロ三量体分子（重鎖（Ｈ）、β２ｍ及びペプチド）の組立を含む、ＥＲにおける多数の糖タンパク質の正確な折り畳み及びオリゴ化を促進する。それらはまた、ＥＲにおける不完全に組み立てられたＭＨＣクラスＩヘテロ三量体複合体も保持する（HauriFEBS Lett. 476:32-37, 2000）。
細胞間で拡散するタンパク質  生体内で増幅し、拡散するその能力によってネイキッドＤＮＡワクチンの能力を高めてもよい。ＶＰ２２、単純性ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）及びたとえば、鳥類のマレック病ウイルス（ＭＤＶ）のようなほかのヘルペスウイルスにおけるそのホモログは、ワクチンの能力を高めるアプローチを提供する細胞間輸送の特性を有する。本発明は、以前、抗原の拡散とＭＨＣクラスＩによる提示を高めるＤＮＡワクチンにおいてモデル抗原、ヒトのパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ−１６）のＥ７とのＶＰ２２の新規の融合を創製した。これらの特性は、ワクチン接種したマウスにおいてＥ７特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体の数の劇的な増加をもたらし（少なくとも５０倍）、あまり効果的ではないワクチンをＥ７発現腫瘍に対する有意な能力をもつものに変換した。比較すれば、非拡散変異体ＶＰ２２（１−２６７）はワクチンの能力を高めることはできなかった。その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願公開番号２００４００２８６９３（米国特許第７，３１８，９２８号）で提示された成績は、抗原の細胞間拡散とＭＨＣクラスＩによる提示の増大を介してＤＮＡワクチンの能力が劇的に改善されることを示している。
【００９８】
ＭＤＶ−１ＵＬ４９をＥ７に連結する同様の検討もワクチン接種したマウスにおけるＥ７特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞前駆細胞の数の劇的な増加とＥ７発現腫瘍に対する強力な応答をもたらした。ＭＤＶ−１ＵＬ４９ＤＮＡワクチンを接種したマウスは、ＨＳＶ−１ＶＰ２２／Ｅ７によって誘導されたレベルに匹敵するレベルでＥ７特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞前駆細胞を刺激した。従って、標的抗原の遺伝子をコードするＤＮＡへのＭＤＶ−１ＵＬ４９ＤＮＡの融合は、ＤＮＡワクチンの能力を有意に高める。
【００９９】
一実施形態では、拡散タンパク質は、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質を含むウイルス性の拡散タンパク質であってもよい。本明細書で例示されるのは、単純性ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）ＶＰ２２（ＨＶＰ２２と略記）及びＭＤＶ−ＶＰ２２又はＭＶＰ−２２と呼ばれるマレック病ウイルス（ＭＤＶ）に由来するそのホモログを含む融合構築物である。また本発明に含まれるのは、ヘルペスウイルス科のほかのメンバーに由来するＶＰ２２のホモログ、又はホモログであるとみなされ、それに融合される若しくは化学的に抱合されるポリペプチド若しくはペプチドの細胞間拡散を促進する機能的特性を共有する非ウイルス起源のポリペプチドである。
【０１００】
ＨＶＰ２２をコードするＤＮＡはさらに長い配列（ＨＶＰ２２を含むベクターの完全長ヌクレオチド配列である）配列番号１６のヌクレオチド１〜１９２としての配列、配列番号７を有する。ＭＤＶ−ＶＰ２２をコードするＤＮＡは、以下に示される概裂番号３７である：
【０１０１】
【化２７】
2015017117.tif 000047
ＨＶＰ２２ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３９（ベクターによってコードされる完全長アミノ酸）のアミノ酸残基１〜３０１としての配列番号３８である。
【０１０２】
ＭＤＶ−ＶＰ２２のアミノ酸配列、配列番号４０は以下のとおりである：
【０１０３】
【化２８】
2015017117.tif 000048
ＨＶＰ２２のコーディング配列とＨＰＶ−１６タンパク質Ｅ７（プラス幾つかの追加のベクター配列）を含むＤＮＡクローン、ｐｃＤＮＡ３ＶＰ２２／Ｅ７は、配列番号６である。
【０１０４】
Ｅ７（配列番号４１）のアミノ酸配列は配列番号３９の残基３０８〜４０３である。この特定のクローンは、Ｅ７に存在する９８残基のうち９６を有する。野生型Ｅ７のＣ末端残基、ＬｙｓとＰｒｏはこの構築物に存在しない。これは、用語が以下で記載されるように欠失変異体の例である。ほかの抗原性ポリペプチドのそのような欠失変異体（たとえば、２又は少数のアミノ酸の末端切捨て）は、本発明の融合ポリペプチドの範囲内で意図される実施形態の例である。
ＩＰＰのホモログ
それらが必要とされる生物活性を有するという条件で、本明細書に記載されるようなＩＰＰのホモログ又は変異体も使用されてもよい。これらには、アミノ酸配列又は核酸配列の置換、欠失又は付加が含まれる。コドンの縮重のために、たとえば、同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列には相当の変異があってもよい。
【０１０５】
ＩＰＰの機能的な誘導体は、クラスＩ経路による提示を促進することによってそれに融合される１以上の抗原性エピトープの免疫原性を促進することを含む、測定可能なＩＰＰ様の活性を保持する。「機能的な誘導体」は、用語が本明細書と併せて又はその代わりに使用されるかどうかにかかわりなく、「変異体」及び「断片」を包含する。
【０１０６】
用語「キメラ」の又は「融合」のポリペプチド又はタンパク質は、線形様式で第２のポリペプチド又はペプチドのドメインと化学的に結合する少なくとも１つのポリペプチド又はペプチドの配列を含む組成物を指す。本発明の一実施形態は、少なくとも２つのドメインを含む融合タンパク質をコードする単離された又は組換えの核酸分子であり、その際、第１のドメインはＩＰＰを含み、第２のドメインは抗原性エピトープ、たとえば、ＭＨＣクラスＩに結合するペプチドエピトープを含む。「融合」は、ペプチド結合、化学結合、電荷相互作用（たとえば、塩架橋、Ｈ−結合などのような静電気誘引）などによって生成される会合である。ポリペプチドが組換え性であるなら、「融合タンパク質」は共通するｍＲＮＡから翻訳され得る。或いは、ドメインの組成物は、化学的手段又は静電気的手段によって連結することができる。本発明のキメラ分子（たとえば、標的化ポリペプチド融合タンパク質）にはまた、追加の配列、たとえば、リンカー、エピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナル等が含まれ得る。
【０１０７】
或いは、ペプチドを単にキャリアに連結させて、ペプチドの操作、特定／局在化を円滑にすることができる。
【０１０８】
また、含まれるのは、ＩＰＰの「機能的な誘導体」であり、それは、アミノ酸置換変異体、タンパク質の「断片」と呼ばれる。ＩＰＰの機能的な誘導体は、それと共に融合される又は同時投与される１以上の抗原性エピトープの免疫原性を増進するとき明らかにされてもよい測定可能な活性を保持する。「機能的な誘導体」は、用語が本明細書と併せて又はその代わりに使用されるかどうかにかかわりなく、「変異体」及び「断片」を包含する。
【０１０９】
機能的なホモログは、上記の生化学的な及び生物学的な活性を持たなければならない。この機能的な性状分析の観点から、未だに発見されていないタンパク質を含むホモログタンパク質の使用は、これらのタンパク質が配列類似性を有し、言及された生化学的な及び生物学的な活性を有するならば、本発明の範囲内に入る。
【０１１０】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するには、最適な比較目的のために配列を並べる（たとえば、最適な配置のために第１及び第２のアミノ酸配列又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、比較目的で、非相同配列を無視する）。一実施形態では、配置の方法にはＣｙｓ残基の配置が含まれる。
【０１１１】
一実施形態では、比較される配列の長さは、ＩＰＰ参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。次いで、相当するアミノ酸（又はヌクレオチド）の位置でアミノ酸残基（又はヌクレオチド）を比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における相当する位置と同一のアミノ酸（ヌクレオチド）で占められている場合、分子はその位置で同一である（本明細書で使用されるとき、アミノ酸又は核酸の「同一性」はアミノ酸又は核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列の間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、２つの配列の最適な配置のために導入されることが必要なギャップの数、各ギャップの長さを説明する。
【０１１２】
数学的なアルゴリズムを用いて配列の比較及び２つの配列の間のパーセント同一性の決定を達成することができる。一実施形態では、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクス、及び１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ加重及び１、２、３、４、５又は６の長さ荷重を用いたＧＣＧソフトウエアパッケージ（http://www.gcg.comで利用可能）におけるＧＡＰプログラムに組み入れられているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ(J.Mol. Biol. 48:444-453 (1970)のアルゴリズムを用いて、２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性が決定される。さらに別の実施形態では、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクス及び４０、５０、６０、７０又は８０のギャップ荷重及び１、２、３、４、５又は６の長さ荷重を用いたＧＣＧソフトウエアパッケージ（http://www.gcg.comで利用可能）におけるＧＡＰプログラムを用いて２つのヌクレオチド配列の間のパーセント同一性が決定される。別の実施形態では、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長さペナルティ及び４のギャップペナルティを用いたＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられているＥ．ＭｅｙｅｒｓとＷ．Ｍｉｌｌｅｒ(CABIOS,4:11-17 (1989))のアルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の間のパーセント同一性が決定される。
【０１１３】
本発明の核酸配列及びタンパク質配列をさらに「クエリー配列」として用いて、公的なデータベースでの検索を行う、たとえば、ほかのファミリーメンバー又は関連する配列を特定することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴのプログラム（バージョン２．０）を用いて実施することができる。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２と共にＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を用いてＩＰＰ核酸分子に対するヌクレオチド配列のホモログを入手することができる。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３０と共にＢＬＡＳＴタンパク質検索を用いてＩＰＰタンパク質分子に対するアミノ酸配列のホモログを入手することができる。比較目的でギャップのある配置を入手するには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されたようにギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴのプログラムを利用する場合、各プログラム（たとえば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。
【０１１４】
従って、上記で記載されたＩＰＰ又はＩＰＰドメインのホモログは、（ａ）天然のＩＰＰ又はそのドメインの機能的な活性を有し、（ｂ）上記で決定されたとき、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％天然のＩＰＰタンパク質又はそのドメインに類似するアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【０１１５】
ＩＰＰの開示された配列に基づいたＤＮＡプローブを用いてそのようなタンパク質を入手し、発現させることは当該技術の技量の範囲内である。次いで、本明細書に記載されるもののような当該技術で承認されている方法、たとえば、Ｔ細胞増殖、サイトカイン分泌又は細胞傷害性アッセイ、又は腫瘍防御若しくは腫瘍治療の生体内アッセイを用いて融合タンパク質んｐ生化学的な及び生物学的な活性を容易に調べることができる。抗原特異的Ｔ細胞の反応性の刺激の生物学的なアッセイは、ホモログが必要とされる活性を有して「機能的なホモログ」として評価されるかどうかを示す。
【０１１６】
「変異体」は、完全なタンパク質又は１以上のアミノ酸残基が置換されている（置換変異体）又は１又は幾つかの欠失した（欠失変異体）又は付加された（付加変異体）残基を有する、その断片と実質的に同一である分子を指す。ＩＰＰの「断片」は完全長タンパク質の短いポリペプチドである分子のサブセットを指す。
【０１１７】
多数の方法を用いて、単離されたＤＮＡ配列の断片、突然変異体及び変異体を生成する。拡散タンパク質をコードする核酸の小さな亜領域又は断片、たとえば、１〜３０塩基の長さを標準的な化学合成によって調製することができる。さらなる合成断片の生成に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド及びプライマー。
【０１１８】
変異体の一群は、少なくとも１つのアミノ酸残基、特定の実施形態では、たった１つのアミノ酸残基が異なった残基によって置換されているものである。タンパク質の化学及び構造の詳細な記載については、参照によって本明細書に組み入れられるＳｃｈｕｌｚ，ＧＥら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８，及びＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３を参照のこと。タンパク質分子で為されてもよい置換の種類は、Ｓｃｈｕｌｚら（上記）の表１〜２及びＣｒｅｉｇｈｔｏｎ（上記）の図３〜９で提示されるもののような異なった種の相同なタンパク質間におけるアミノ酸変化の頻度の分析に基づいてもよい。そのような分析に基づいて、保存的置換は、以下の５群の１つの中での交換として本明細書で定義される。
【０１１９】
【化２９】
2015017117.tif 000049
上記括弧内の３つのアミノ酸は、タンパク質構造において特定の役割を有する。Ｇｌｙは側鎖を欠く唯一の残基なので、鎖に自由度を付与する。Ｐｒｏはその普通ではない幾何構造のために鎖をきつく制約する。Ｃｙｓはタンパク質の折り畳みに重要であるジスルフィド結合の形成に参加する。
【０１２０】
上記５群の中ではなく、その間でのあまり保存的ではない置換を選択することによって生化学的な、機能的な（又は免疫的な）特性でのさらに実質的な変化を為す。そのような変化は、（ａ）置換の領域におけるペプチド主鎖の構造、たとえば、シート状若しくは螺旋状の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩高を維持することに対するその効果でさらに有意に異なる。そのような置換の例は、（ｉ）ほかのアミノ酸によるＧｌｙ及び／又はＰｒｏの置換、又はＧｌｙ又はＰｒｏの欠失若しくは挿入；（ｉｉ）疎水性残基、たとえば、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ若しくはＡｌａについての（又はによる）親水性残基、たとえば、Ｓｅｒ若しくはＴｈｒの置換；（ｉｉｉ）ほかの残基についての（又はによる）Ｃｙｓの置換；（ｉｖ）電気的に負の電荷を有する残基、たとえば、Ｇｌｕ若しくはＡｓｐについての（又はによる）電気的に正の荷電を有する残基、たとえば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ若しくはＨｉｓの置換；又は（ｖ）嵩高な側鎖を有さない残基、たとえば、Ｇｌｙについての（又はによる）そのような側鎖を有する残基の置換である。
【０１２１】
本発明に従って最も許容できる欠失、挿入及び置換は、関連する生物活性という点で、たとえば、抗原性エピトープ又はタンパク質に融合されるエピトープに対する抗原特異的なＴ細胞の反応性を刺激する能力という点で、野生型又は天然のタンパク質の特徴に過激な変化を生じないものである。しかしながら、そのように行う前に置換、欠失又は挿入の正確な影響を予測するのが難しい場合、当業者は、過度の実験を必要とすることなく、ここで記載されるような日常のスクリーニングアッセイによって影響を評価することができることを十分に理解するであろう。
【０１２２】
本明細書で提供される例となる融合タンパク質は、ＩＰＰタンパク質又はそのホモログと抗原を含む。たとえば、融合タンパク質は、抗原に連結された、ＩＰＰ又はＩＰＰ断片、たとえば、Ｎ−ＣＲＴ、Ｐ−ＣＲＴ及び／又はＣ−ＣＲＴ、又はＩＰＰ又はＩＰＰ断片のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく又はそれから成ってもよく、その際、ＩＰＰ断片は本明細書でさらに記載されるように機能的に活性がある。融合タンパク質はまた、ＩＰＰ又はＩＰＰ断片及びＩＰＰ断片のＮ末端及び／又はＣ末端で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸又は約１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０１〜２５、１〜３０１〜５０のアミノ酸を含んでもよい。これら追加のアミノ酸は、ＩＰＰタンパク質における相当する位置でのアミノ酸配列に無関係であるアミノ酸配列を有してもよい。
【０１２３】
ＩＰＰ又はＩＰＰ断片のホモログは、付加、欠失又は置換によって、たとえば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のアミノ酸又は約１〜５、１〜１５又は１〜２０のアミノ酸の保存的置換によってＩＰＰ又はＩＰＰ断片とは異なるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく又はそれから成ってもよい。ＩＰＰ又はＩＰＰ断片のホモログは、本明細書で記載されるもののようなＩＰＰ又はＩＰＰ断片をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
【０１２４】
ＩＰＰ又はＩＰＰ断片のさらにほかのホモログは、ＩＰＰ又はＩＰＰ断片をコードする核酸とストリンジェントなハイブリッド形成の条件下でハイブリッド形成する核酸によってコードされる。たとえば、６５℃にて０．２〜１×ＳＳＣ、次いで６５℃にて０．２×ＳＳＣでの洗浄の高いストリンジェントな条件下で、本明細書に記載される配列から成る核酸とハイブリッド形成する核酸によってコードされてもよい。室温にて６×ＳＳＣ次いで室温にて２×ＳＳＣの洗浄の低いストリンジェントな条件下で、本明細書に記載される配列から成る核酸とハイブリッド形成する核酸を使用することができる。ほかのハイブリッド形成の条件には、４０又は５０℃での３×ＳＳＣ，次いで２０、３０、４０、５０、６０又は６５℃での１又は２×ＳＳＣでの洗浄が挙げられる。ハイブリッド形成は、ハイブリッド形成の厳密性をさらに高める、たとえば、１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％のホルムアルデヒドの存在下で実施することができる。核酸のハイブリッド形成の理論と実践はＳ．Ａｇｒａｗａｌ（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２０巻に記載されており；Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅｓ，  ｅ．ｇ．，  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２  “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋは核酸のハイブリッド形成への基本的な指針を提供している。
【０１２５】
核酸配列の断片は、完全長のＣＲＴポリペプチド、抗原性ポリペプチド又はその融合物をコードするヌクレオチド配列よりも少ないヌクレオチドを有するヌクレオチド配列として定義される。本発明は、融合ポリペプチドの抗原部分に特異的である、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＴ細胞の頻度又は反応性の増大を誘導する融合ポリペプチドの能力を保持するポリペプチドをコードするそのような核酸断片を含む。
【０１２６】
本発明の核酸配列は、コードされるタンパク質又は断片のクローニング、発現又は精製に関連する操作に有用であるリンカー配列、天然の又は修飾された制限エンドヌクレアーゼ部位及びそのほかの配列も含んでもよい。たとえば、融合タンパク質は、抗原とＩＰＰタンパク質の間にリンカーを含んでもよい。
【０１２７】
使用されてもよいそのほかの核酸ワクチンには、実施例及びその中で引用される参考文献にさらに記載されるような単鎖三量体（ＳＣＴ）が挙げられるが、それらのすべては参照によって特に本明細書に組み入れられる。
核酸ワクチンの主鎖
核酸ワクチン、たとえば、ＤＮＡワクチンは、「発現ベクター」又は「発現カセット」、すなわち、タンパク質のコーディング配列の発現に影響を及ぼすことが可能であるヌクレオチド配列を、そのような配列と相性が合う宿主にて含んでもよい。発現カセットは、ポリペプチドのコーディング配列と操作可能に連結され、任意で、ほかの配列、たとえば、転写停止シグナルと操作可能に連結された少なくとも１つのプロモータを含む。発現を達成するのに必要な又は役立つ追加の因子、たとえば、エンハンサが含まれてもよい。
【０１２８】
「操作可能に連結される」は、コーディング配列の発現を可能にするような方式でコーディング配列を調節性配列に連結することを意味する。既知の調節配列を選択して、適切な宿主細胞にて所望のタンパク質の発現を指向する。従って、用語「調節配列」には、プロモータ、エンハンサ及びそのほかの発現制御要素が挙げられる。そのような調節配列は、たとえば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））に記載されている。
【０１２９】
ＤＮＡ又はＲＮＡ分子のプロモータ領域がＲＮＡポリメラーゼに結合し、「操作可能に」連結された核酸配列の転写を促進する。本明細書で使用されるとき、「プロモータ配列」は、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるＤＮＡ又はＲＮＡの鎖上に見い出されるプロモータのヌクレオチド配列である。たとえば、プロモータとコーディング配列のような２つの核酸分子の配列は、双方の配列が同一のＲＮＡ転写物に転写されるのを可能にする又は一方の配列で始まったＲＮＡ転写物が第２の配列に伸びるのを可能にする方法でそれらが互いに連結される場合、「操作可能に連結される」。従って、プロモータとＤＮＡ又はＲＮＡのコーディング配列のような２つの配列は、プロモータ配列で開始する転写が操作可能に連結されたコーディング配列のＲＮＡ転写物を生じるならば、操作可能に連結されている。「操作可能に連結される」ためには、２つの配列が線状配列において互いに間近に隣接する必要はない。
【０１３０】
一実施形態では、本発明の特定のプロモータ配列は哺乳類細胞で操作可能でなければならず、真核生物のプロモータ又はウイルスのプロモータのいずれかであってもよい。特定のプロモータも実施例で記載され、有用なプロモータ及び調節性要素は以下で記載される。好適なプロモータは、誘導性、抑制性又は構成的であってもよい。「構成的な」プロモータは、細胞の環境において及び発生全体を通して遭遇されるほとんどの環境下で活性があるものである。「誘導性」のプロモータは、環境的な調節又は発生上の調節のもとにあるものである。「組織特異的な」プロモータは生物の特定の種類の組織で活性があるものである。構成的なプロモータの例は、ウイルスプロモータ、ＭＳＶ−ＬＴＲであり、それは、種々の細胞種で効率的であり、活性があり、ほかのほとんどのプロモータとは対照的に、停止した細胞及び増殖中の細胞で同様に高い活性を有する。ほかのウイルスプロモータのは、ＣＭＶ−ＬＴＲ（サイトメガロウイルスに由来）に存在するもの（Bashart,M. et al., Cell 41:521, 1985）又はＲＳＶ−ＬＴＲ（ラウス肉腫ウイルスに由来）に存在
するもの（Gorman,C.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777, 1982）が挙げられる。
有用なのはまた、マウスのメタロチオネインＩ遺伝子のプロモータ（Hamer,D, et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-88,1982）；ヘルペスウイするのＴＫプロモータ（McKnight,S, Cell 31:355-65, 1982）；ＳＶ４０早期プロモータ（Benoist,C., et al., Nature290:304-10, 1981）；及び酵母ｇａｌ４遺伝子プロモータ（Johnston, SA et al.,Proc.Natl. Acad. Sci. USA 79:6971-5, 1982); Silver, PA, et al., Proc.Natl.Acad. Sci. (USA) 81:5951-5, 1984)）である。プロモータ領域に関連する転写因子及び転写因子の別々の活性化とＤＮＡ結合のそのほかの説明的記載には、Ｋｅｅｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ２３１：６９９，１９８６；Ｆｉｅｌｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５，１９８９；Ｊｏｎｅｓ，Ｃｅｌｌ  ６１：９，１９９０；Ｌｅｗｉｎ，Ｃｅｌｌ  ６１：１１６１，１９９０；Ｐｔａｓｈｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：３２９，１９９０；Ａｄａｍｓら、Ｃｅｌｌ  ７２：３０６，１９９３が挙げられる。
【０１３１】
プロモータ領域にはさらに、特定の組織で見い出される特定のタンパク質と相互作用することによって、組織特異的なエンハンサとして機能してもよいオクタマー領域が挙げられる。本発明のＤＮＡ構築物のエンハンサドメインは、形質移入される標的細胞に特異的であるもの、又はそのような標的細胞の細胞性因子によって高度に活性化されるものである。ベクター（プラスミド又はレトロウイルス）の例は、たとえば、参照によって組み入れられるＲｏｙ−Ｂｕｒｍａｎらの米国特許第５，１１２，７６７号に記載されている。エンハンサ及び転写におけるその作用の一般的な議論については、Ｌｅｗｉｎ，ＢＭ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．５５２−５７６，１９９０（又はその後の版）を参照のこと。特に有用なのは、プロモータの上流に置かれ、それと相互作用して遺伝子の発現を刺激するレトロウイルスのエンハンサ（たとえば、ウイルスＬＴＲ）である。レトロウイルスベクターと共に使用するために、内因性のウイルスＬＴＲをエンハンサなしにして、組織特異性又は、転写効率のようなほかの所望の特性を付与するほかの所望のエンハンサ配列で置き換える。
【０１３２】
従って、発現カセットには、プラスミド、組換えウイルス、任意の形態の組換え「ネイキッドＤＮＡ」ベクターなどが含まれる。「ベクター」は、細胞に感染し、細胞を形質移入し、一時的に又は永続的に細胞に形質導入することができる核酸を含む。ベクターは、ネイキッド核酸であることができ、又はタンパク質若しくは脂質と複合体化した核酸であることができる。ベクターは任意で、ウイルス又は細菌の核酸及び／又はタンパク質、及び／又は膜（たとえば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープなど）を含む。ベクターは、ＤＮＡの断片が連結され、複製されるようになってもよいレプリコン（たとえば、ＲＮＡレプリコン）、バクテリオファージ）を含む。従って、ベクターは、ＲＮＡ、自律的な自己複製の環状又は線状のＤＮＡ又はＲＮＡ、たとえば、プラスミド、ウイルスなどを含むが、これらに限定されず（参照によって組み入れられる米国特許第５，２１７，８７９号）、発現プラスミド及び非発現プラスミドの双方を含む。組換え細胞又は培養物が「発現ベクター」を受け入れるとして記載される場合、これには、染色体外の環状又は線状のＤＮＡと宿主染色体に組み込まれているＤＮＡの双方が含まれる。ベクターが宿主細胞で維持される場合、ベクターは、自律的構造として細胞分裂の間に細胞によって安定的に複製されてもよいし、宿主のゲノムに取り込まれてもよい。
【０１３３】
使用されてもよい例となるウイルスベクターには、組換えアデノウイルス（Horowitz,MS, In: Virology, Fields, BN etal., eds, Raven Press, NY, 1990,p. 1679; Berkner,
KL, Biotechniques 6:616-29, 1988; Strauss, SE, In: TheAdenoviruses, Ginsberg,HS, ed., Plenum Press, NY, 1984, chapter 11）及び単純性ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）が挙げられる。ヒトの遺伝子送達にとってのアデノウイルスの利点には、組換えが稀であり、そのようなウイルスと関連するヒトの悪性腫瘍は知られておらず、アデノウイルスのゲノムは、７．５ｋｂのサイズまでの外来遺伝子を受け入れるように操作することができる二本鎖ＤＮＡであり、生きたアデノウイルスは安全なヒトワクチン用生物であるという事実が挙げられる。アデノ関連ウイルスも本発明に係るヒトの治療法（Samulski,RJet al., EMBO J. 10:3941, 1991）に有用である。
【０１３４】
本発明のＤＮＡ分子を発現することができ、本治療法の設定で有用である別のベクターは、ワクシニアウイルスであり、それは、非複製にすることができる（それぞれ参照によって組み入れられる米国特許第５，２２５，３３６号；同第５，２０４，２４３号；同第５，１５５，０２０号；同第４，７６９，３３０号；uerst,TR et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2549-53, 1992; Chakrabarti, S et al.,Mol Cell Biol 5 :3403-9, 1985）。組換えワクシニアウイルス及び非均質ＤＮＡを含有するほかのウイルスの説明及び免疫とＤＮＡ療法におけるその使用は、Ｍｏｓｓ，Ｂ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ３：８６−９０，１９９３；Ｍｏｓｓ，Ｂ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：３４５−６２，１９９２に概説されている。
【０１３５】
使用されてもよいそのほかのウイルス性ベクターには、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びプラスミドベクターを含むウイルス性又は非ウイルス性のベクターが挙げられる。例となる種類のウイルスには、ＨＳＶ（単純性ヘルペスウイルス）、ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルス）及びＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）が挙げられる。
【０１３６】
また、ＤＮＡワクチンには、レプリコン、例えば、自己複製型ＲＮＡベクターである、ＲＮＡレプリコンを使ってもよい。一実施形態では、レプリコンは、シンドビスウイルスＲＮＡレプリコン、例えば、ＳＩＮｒｅｐ５をベースにしたものである。本発明者等は、Ｅ７をこの様なワクチンの観点から試験し、Ｅ７に結合したＨＳＶ−１ＶＰ２２をコードしたシンドビスウイルスＲＮＡワクチンがＥ７特異的ＣＤ８Ｔ細胞の活性化を有意に高
め、Ｅ７発現腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫が得られることを示した（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ、米国特許出願第１０／３４３、７１９号参照）。これらの調査で使われたシンドビスウイルスＲＮＡレプリコンベクターのＳＩＮｒｅｐ５については、（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ、ＰＪ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６）に記載がある。
【０１３７】
一般的には、ＲＮＡレプリコンワクチン剤は、アルファウイルス、例えば、シンドビスウイルス（Ｈａｒｉｈａｒａｎ、ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：９５０−８．）、セムリキ森林ウイルス（Ｂｅｒｇｌｕｎｄ、Ｐ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７．ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １３：１４８７−９５；Ｙｉｎｇ、ＨＴ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ５：８２３−７）またはベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｐｕｓｈｋｏ、Ｐ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９：３８９−４０１）由来であってもよい。これらの自己複製および自己制御型ワクチン剤は、インビトロでまたはインビボで形質移入される細胞中に、（１）ＲＮＡとして、または（２）後でＲＮＡレプリコンに転写されるＤＮＡとして投与されてもよい（Ｂｅｒｇｌｕｎｄ、ＰＣ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：５６２−５；Ｌｅｉｔｎｅｒ、Ｗ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．、２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：５１−５）。代表的セムリキ森林ウイルスは、ｐＳＣＡ１（ＤｉＣｉｏｍｍｏ、Ｄ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８；２７３：１８０６０−６）である。
【０１３８】
プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３またはその機能的ホモログ（配列番号１）をＤＮＡワクチンとして使ってもよい。他の実施形態では、ｐＮＧＶＬ４ａ（配列番号２）が使われている。
【０１３９】
本発明の１つのプラスミドバックボーン、ｐＮＧＶＬ４ａは、元々ｐＮＧＶＬ３ベクター由来で、ヒトワクチン治験で承認された。ｐＮＧＶＬ４ａベクターには、非コード領域中に２つの免疫賦活性配列（ＣｐＧジヌクレオチドの直列反復）を含む。他方、ＤＣを含むＡＰＣ、または交差提示により抗原成分をＤＣに移送する他の細胞を形質転換できる任意の他のプラスミドＤＮＡは本発明に有用であり、ヒト治療上の使用にすでに認可されているという事実により、ｐＮＧＦＶＬＡ４ａを使ってもよい。
【０１４０】
次の文献には、基礎的な医学および獣医学のウイルス学の分野における原理と最新の情報が記述されており、これらは参照によって組み込まれる：Ｆｉｅｌｄｓウイルス学、Ｆｉｅｌｄｓ、ＢＮ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ
＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、ＮＹ、１９９６；ウイルス学原論：分子生物学、発病、および管理、Ｆｌｉｎｔ、Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ａｍｅｒ  Ｓｏｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、１９９９；臨床的ウイルス学の原理と実践、４ｔｈ
Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ．Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９９；Ｃ型肝炎、ｂｙ  Ｈａｇｅｄｏｒｎ、ＣＨ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、１９９９；Ｂ型肝炎ウイルス：分子的疾患メカニズムおよび新規治療戦略、Ｋｏｓｈｙ、Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ、Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ  Ｃｏ、１９９８；獣医学のウイルス学、Ｍｕｒｐｈｙ、Ｆ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９９；鳥ウイルス：機能と管理、Ｒｉｔｃｈｉｅ、Ｂ．Ｗ．、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｍｅｓ、２０００；ウイルス分類学：ウイルスの分類と命名法：Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、ｂｙ
Ｍ．Ｈ．Ｖ．ＶａｎＲｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ、ＭＨＶ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；ＮＹ、２０００。
【０１４１】
元のままのＤＮＡまたはウイルスベクターの他に、操作した細菌をベクターとして使ってもよい。多くの細菌株には、サルモネラ、ＢＣＧおよびリステリア菌（ＬＭ）（Ｈｏｉｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ２９１：２３８−９、１９８１；Ｐｏｉｒｉｅｒ、ＴＰ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１６８：２５−３２、１９８８）；Ｓａｄｏｆｆ、Ｊ  Ｃｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：３３６−８、１９８８；Ｓｔｏｖｅｒ、ＣＫ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４５６−６０、１９９１；Ａｌｄｏｖｉｎｉ、Ａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４７９−８２、１９９１）がある。これらの微生物はワクチンとしての使用に有望な２つの特性を示す：（１）経口ワクチン送達の可能性を与える、腸経路による感染、および（２）単球／マクロファージへの感染により、抗原をプロフェッショナルＡＰＣに向かわせる。
【０１４２】
インビボでのウイルス媒介遺伝子移入に加えて、プラスミドＤＮＡの投与を含む、当技術分野でよく知られた物理的手段をＤＮＡの直接移入に使用可能である（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０、上記）および微粒子銃介在遺伝子移入（Ｙａｎｇ、Ｎ−Ｓ、ｅｔ
ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：９５６８、１９９０；Ｗｉｌｌｉａｍｓ、ＲＳｅｔａｌ．、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８８：２７２６、１９９１；Ｚｅｌｅｎｉｎ、ＡＶ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２８０：９４、１９９１；Ｚｅｌｅｎｉｎ、ＡＶ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２４４：６５、１９８９）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、ＳＡ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏ  ｌ２７：１１、１９９１）。さらに、本発明に従って、遺伝子の細胞中へのインビトロでのよく知られた移入手段である電気穿孔をインビボでの組織へのＤＮＡ分子移入に使用可能である。（Ｔｉｔｏｍｉｒｏｖ、ＡＶ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １０８８：１３１、１９９１）。
【０１４３】
また、「担体媒介遺伝子移入」について、（Ｗｕ、ＣＨ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ  ２６４：１６９８５、１９８９；Ｗｕ、ＧＹ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ  ２６３：１４６２１、１９８８；Ｓｏｒｉａｎｏ、Ｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：７１２８、１９８３；Ｗａｎｇ、Ｃ−Ｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８  ４：７８５１、１９８２；Ｗｉｌｓｏｎ、ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：９６３、１９９２）に記載されている。一実施形態では、担体は、標的とされたリポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ、Ｃ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：１０６８、１９８３；Ｓｏｒｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、上述）、例えば、免疫リポソームで、これはアシル化ｍＡｂを脂質二重層中に組み込むことができる（Ｗａｎｇ  ｅｔ
ａｌ．、上述）．ポリカチオン、例えば、アシアロ糖タンパク質／ポリリシン（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、上述）を使ってもよく、この場合、複合体には、標的組織認識分子（例えば、肝臓に対するアシアロオロソムコイド）および損傷を起こすことなく形質移入できるようにＤＮＡに結合するＤＮＡ結合化合物、例えば、ポリリシン、が含まれる。この複合体は、次に、本発明のプラスミドＤＮＡと複合化される。
【０１４４】
形質移入または微量注入に使われるプラスミドＤＮＡは、当技術分野でよく知られた方法、例えば、Ｑｕｉａｇｅｎ法（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使い、その後、既知の本明細書に例示されてるような方法でＤＮＡ精製して調製できる。
【０１４５】
このような発現ベクターは、ＤＮＡの発現、および融合タンパク質またはペプチドを含むコード化タンパク質の産生を目的として、宿主細胞（インビトロ、エクスビボまたはインビボで）に形質移入するために使用可能である。一実施形態では、ＤＮＡワクチンは細胞、例えば、患者から入手した細胞、（例えば、抗原提示細胞）に投与され、または細胞と接触させ、そして、患者に投与されるが、ここで患者は、細胞が患者に投与される時間の前、後または同時に治療される。
【０１４６】
本明細書で使われる用語の「単離」は、分子または組成物、例えば、転座ポリペプチドまたはそれをコードした核酸、に関する場合は、分子または組成物が少なくとも１つの他の化合物（タンパク質、他の核酸、等）から、または元々随伴しているまたは処理中に随伴するようになった他の混入物から分離されていることを意味する。また、単離組成物は、実質的に純粋でありうる。単離組成物は、均質の状態および無水または水溶液であってもよい。純度と均質性は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような分析化学の技術、を使って測定できる。たとえタンパク質が単離され、ゲルパターンで均質または支配的バンドに見えても、同時に精製される痕跡の混入物がある。
【０１４７】
融合ポリペプチドまたはそのホモログもしくは機能的誘導体を発現するために形質転換または形質移入した宿主細胞は、本発明の範囲内に含まれる。例えば、融合ポリペプチドは、酵母中、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）もしくはヒト細胞のような哺乳動物細胞中で発現してもよい。一実施形態では、本発明による発現用細胞はＡＰＣまたはＤＣである。他の適切な宿主細胞は当業者には既知である。
【０１４８】
免疫応答を増強する他の核酸
化学療法剤およびワクチンを投与する方法には、さらに、１つまたは複数の他の構築物、例えば、抗原提示細胞の寿命を延長するための構築物、の投与を含んでもよい。代表的構築物は次の２つの節で記載する。このような複数の構築物を同時に、またはＤＮＡワクチンと同時に投与してもよい。あるいは、ＤＮＡワクチンまたは化学療法剤の投与の前または後で投与してもよい。
【０１４９】
アポトーシス経路を標的にしたｓｉＲＮＡを使った免疫応答の増強
ＤＮＡワクチンおよび化学療法剤の患者への投与には、１つまたは複数の他の試薬、例えば、構築物を一緒に投与してもよい。一実施形態では、ある方法は、アポトーシス経路を標的にしたｓｉＲＮＡの患者へのさらなる投与を含む（例えば、国際公開特許ＷＯ２００６／０７３９７０に記載されている。この特許は、本明細書にその全体が組み込まれる）。
【０１５０】
本発明者等は、以前、アポトーシス信号伝達経路で中心的役割を演ずるＢａｋおよびＢａｘタンパク質にハイブリダイズし、その活性化の発現を遮断するｓｉＲＮＡ配列の設計をしたことがある。本発明もまた、腫瘍または過剰増殖疾患の治療方法を対象とし、これには、ｓｉＲＮＡ分子（配列）、ｓｉＲＮＡを含むかまたはコードしたベクター、ＢａｋおよびＢａｘ核酸の配列に「特異的」なｓｉＲＮＡ配列の転写を推進する配列をコードしたｓｉＲＮＡに機能的に連結されたプロモーターを有する発現ベクターの投与が含まれる。ｓｉＲＮＡｓは、一本鎖「ヘアピン」配列を含んでもよい。理由は、それらが、安定性があり、標的ｍＲＮＡに対し結合するからである。
【０１５１】
他のデスタンパク質の中で、ＢａｋとＢａｘはＡＰＣ、特にＤＣのアポトーシスに関係するため、本ｓｉＲＮＡ配列を、抗原をコードした広範囲のＤＮＡワクチン構築物と一緒に使って、このようなＤＮＡワクチン構築物、特にＣＴＬ活性化と作用で典型的に表されるＣＤ８＋Ｔ細胞媒介免疫応答により誘導される免疫応答を強化し、促進してもよい。これは、抗原提示ＤＣの寿命延長に対するｓｉＲＮＡの効果の結果として起こると考えられている。このＤＣは、この効果がなければ、免疫応答を進めている過程でＤＣが誘導に関与する、まさに同じＣＴＬによって死滅させられる可能性がある。
【０１５２】
ＢａｋとＢａｘのほかに、類似の方式で設計されるｓｉＲＮＡの別の標的には、カスパーゼ８、カスパーゼ９およびカスパーゼ３がある。本発明は、任意の２つ以上のＢａｋ、Ｂａｘ、カスパーゼ８、カスパーゼ９およびカスパーゼ３を標的とするｓｉＲＮＡが組み合わされて使用され、任意選択で同時に（抗原をコードするＤＮＡ免疫原と一緒に）、患者に投与される組成物および方法を含む。また、このようなｓｉＲＮＡの組み合わせは、ＤＣに形質移入（抗原負荷と共に）して細胞性ワクチン剤としてアポトーシスに対する耐性を付与することによりＤＣの免疫原性を改善するために使うことができる。
【０１５３】
ｓｉＲＮＡｓは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる高度に制御された酵素媒介プロセスにより遺伝子発現を抑制する（Ｓｈａｒｐ、Ｐ．Ａ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：４８５-９０、２００１；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、Ｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９
：３６３-６６、２００１；Ｎｙｋａｎｅｎ、Ａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  １０７：３
０９-２１、２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：
１８８-２００、２００１）。ＲＮＡ干渉は、ｓｉＮＡの標的配列のｍＲＮＡ中のホモロ
グの配列特異的分解である。本明細書で使われる用語のｓｉＮＡ（小さい（ｓｍａｌｌ）、または短い（ｓｈｏｒｔ）、干渉核酸）は、配列特異的ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）、例えば、短い（または小さい）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、翻訳サイレンシング、等、を媒介することができる核酸分子を記述するのに使われる他の用語と等価であることを意図している。ＲＮＡｉは、４つの主要ステップ：ｓｉＲＮＡからＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の構築、ＲＩＳＣの活性化、標的認識および標的分割、を特徴とする複数のＲＮＡタンパク質相互作用を伴う。これらの相互作用は、ｓｉＲＮＡ−ＲＩＳＣ構築および活性化の間に鎖選択に対し一方に偏らせ全体のＲＮＡｉ効率に寄与することができる（Ｋｈｖｏｒｏｖａ、Ａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  １１５：２０９-２１６（２
００３）；Ｓｃｈｗａｒｚ、ＤＳ  ｅｔ  ａｌ．１１５：１９９-２０８（２００３））
。
【０１５４】
ＲＮＡｉ分子を設計する際に考慮すべきことには、特に、標的とする配列、ＲＮＡ標的の２次構造およびＲＮＡ結合タンパク質の結合がある。ｓｉＲＮＡ配列を最適化する方法は、熟練作業者には明らかであろう。典型的なアルゴリズムと方法は、Ｖｉｃｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ７８：７１０８−７１１８；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７；Ｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１：４４１７−４４２４；およびＲｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２：３２６−３３０、に記載されている。これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
Ｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．、上述、およびＲｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、上述、に記載された方法は、当業者なら使用可能で、関連するｍＲＮＡの転写のサイレンシングに有効な標的配列を選択し、ｓｉＲＮＡ配列を設計できる。Ｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．は、ｓｉＲＮＡの標的へのアクセシビリティーを評価し、活性ｓｉＲＮＡ構築物設計の支援をするためのオプションを提案している。この手法は高スループットになるよう適合させて自動化可能で、上記ＲＮＡｉの各ステップでの効率的な処理に寄与しやすいｓｉＲＮＡの特異的性質を特定するために、ｓｉＲＮＡの生物活性に関する追加のパラメーターを含めることができる。Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、上述、は、２つの遺伝子のｍＲＮＡを標的とする１８０ｓｉＲＮＡの系統的分析を示した。ｓｉＲＮＡの機能性に関連した８つの特性が特定された：低Ｇ／Ｃ含量、センス鎖３’−末端での低内部安定性の方向への偏り、逆方向反復の欠損、およびセンス鎖塩基選択性（位置３、１０、１３および１９）。８つの基準全てを組み込んだアルゴリズムの適用により効力のあるｓｉＲＮ選択が顕著に改善される。このことにより、機能的遺伝子ノックダウンを促進する効力のあるｓｉＲＮＡの選択のための合理的設計が有用であることが強調される。
【０１５６】
マウスとヒトＢａｘおよびＢａｋに対するｓｉＲＮＡ配列候補は、ＢａｘまたはＢａｋ（または他の任意の標的）の配列に対しＢＬＡＳＴ探索の実行、およびこれらの配列が他のいずれかの遺伝子と交差適合しないことを保障して「生き残る」配列の選択を含むプロセスを使って選択される。
【０１５７】
このような選択プロセスとアルゴリズムにより選択されたｓｉＲＮＡ配列を発現プラスミドに挿入し、適切な動物種のＢａｋ／Ｂａｘ機能細胞を抑止する活性を試験することができる。ＲＮＡｉ活性を示すこれらの配列は、粒子に向けて直接投与して使用しても、ウイルスベクター、例えば、複製欠損ヒトアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）に再挿入して使用してもよい。
【０１５８】
このウイルスベクターの利点の１つは、高い力価（１０１０のレベル）が得られ、その結果として、高い感染効率が得られることである。例えば、１００感染単位／細胞の感染では、全細胞の感染が保障される。このウイルスの別の利点は、高い感受性および感染力ならびに宿主の範囲（細胞の型に関して）である。たとえ発現が一次的であっても、細胞は生き残り、おそらく複製し、Ｂａｋ／Ｂａｘの作用より前に機能し続け、回復して細胞死に誘導するであろう。一実施形態では、構築物には下記が含まれる：
【０１５９】
Ｂａｋに対しては：
【０１６０】
【化３０】
2015017117.tif 000050
Ｂａｋタンパク質をコードしたヌクレオチド配列（停止コドンを含む）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００７５２３）を標的配列（大文字、下線）と一緒に下記に示す（配列番号４４）。
【０１６１】
【化３１】
2015017117.tif 000051
Ｂａｋの標的配列、ＴＧＣＣＴＡＣＧＡＡＣＴＣＴＴＣＡＣＣは配列番号４５である。
【０１６２】
Ｂａｘに対しては：
【０１６３】
【化３２】
2015017117.tif 000052
Ｂａｘをコードしたヌクレオチド配列（停止コドンを含む）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ２２４７２）を標的配列（大文字、下線）と一緒に下に示す（配列番号４８）
【０１６４】
【化３３】
2015017117.tif 000053
Ｂａｘの標的配列、ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧは配列番号４９である。
【０１６５】
一実施形態では、抑制分子は２本鎖核酸（すなわち、ＲＮＡ）で、ＲＮＡ干渉の方法で使われる。下記に、上で示したｓｉＲＮＡ配列の「対での」１９ヌクレオチド構造（対を記号
【化３３−２】
2015017117.tif 000054
で示す）：
【０１６６】
【化３４】
2015017117.tif 000055
標的になる他のアポトーシス促進性タンパク質
１．カスパーゼ８：ヒトカスパーゼ８のヌクレオチド配列を下に示す（配列番号５０）。
【０１６７】
ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１２２８。ＲＮＡｉに対する１つの標的配列を下線
で示した。他のものは、本明細書記載の方法によって特定できる（および本明細書に引用の文献、主に、Ｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．、前述、およびＲｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、前述、によって）。
【０１６８】
【化３５】
2015017117.tif 000056
この配列を標的とするためのセンスおよびアンチセンスsiRNA鎖配列（dTdT3’オーバーハングを含む）は：
【０１６９】
【化３６】
2015017117.tif 000057
である。
【０１７０】
２．カスパーゼ９：ヒトカスパーゼ９のヌクレオチド配列を下に示す（配列番号５３）。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１２２９を参照。下記の配列は、「変異体α」のものであり、これはスプライスされた他の２つ目の変異体βより長く、この変異体βは、下記配列の下線部が欠けている（そして抗アポトーシス性である）。下線部Ｄセグメントに入ると予測されるＲＮＡｉのための標的配列は、既知の方法、例えば、本明細書記載の方法（およびＦａｒｅｔａｌ．、前述、およびＲｅｙｎｏｌｄｓｅｔａｌ．、前述、にある方法）により特定され、この結果、ｓｉＲＮＡ等のｓｉＮＡが設計される。
【０１７１】
【化３７】
2015017117.tif 000058
３．カスパーゼ３：ヒトカスパーゼ３のヌクレオチド配列を下記に示す（配列番号５４）。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００４３４６を参照。下記配列は、「変異体α」のものであり、これはスプライスされた他の２つの変異体より長く、完全なタンパク質をコードしている。ＲＮＡｉのための標的配列は、既知の方法、例えば、本明細書記載の方法（およびＦａｒ  ｅｔ  ａｌ．、前述、やＲｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、前述、にある方法）により特定され、これによりｓｉＲＮＡ等のｓｉＮＡが設計される。
【０１７２】
【化３８】
2015017117.tif 000059
長い２本鎖干渉ＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ、は短い２本鎖ＲＮＡよりも容易にミスマッチに耐えるように思われる。さらに、本明細書では、用語のＲＮＡｉは、転写後の遺伝子サイレンシング、またはエピジェネティック現象等の配列特異的ＲＮＡ干渉を記述するために使われる他の用語と等価であることを意図している。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子は、転写後のレベルまたは転写前のレベルの両方でエピジェネティックな発現停止に使うことができる。非制限的な例であるが、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のエピジェネティック調節は、ｓｉＮＡが媒介するクロマチン構造の改変が原因であり、その結果遺伝子発現を変化させる（例えば、Ａｌｌｓｈｉｒｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１８１８−１９、２００２；Ｖｏｌｐｅｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９７：１８３３−３７、２００２；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：２２１５−１８、２００２；ａｎｄＨａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７、２２３２−２２３７、２００２．、を参照）。
【０１７３】
ｓｉＮＡは、ｍＲＮＡのコードまたは非コードの任意の領域を標的にして設計可能である。ｓｉＮＡは、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子で、アンチセンス領域は、核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは、２つの別のオリゴヌクレオチドから構築することができ、ここで１つの鎖はセンス鎖で、もう一方はアンチセンス鎖であり、アンチセンスとセンス鎖は自己相補的である。ｓｉＮＡは、単一のオリゴヌクレオチドから構築することができ、この場合、ｓｉＮＡの自己相補的なセンスとアンチセンス領域は核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーを使って結合される。ｓｉＮＡは、自己相補的なセンスとアンチセンス領域を有するヘアピン２次構造のポリヌクレオチドであってもよい。ｓｉＮＡは、２つ以上のループ構造および自己相補的なセンスとアンチセンス領域を含む基部を有する環状１本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、この場合、環状ポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロで処理されＲＮＡｉを媒介できる活性ｓｉＮＡ分子を生成することができる。また、ｓｉＮＡは、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する１本鎖ポリヌクレオチドを含んでもよい（またはｓｉＮＡ分子内に標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列の存在を必要としないｓｉＮＡ分子であってもよい）。この場合、１本鎖ポリヌクレオチドは、末端リン酸塩基、例えば、５’−リン酸塩（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１０、５６３−５７４およびＳｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １０、５３７−５６８、を参照）、または５’、３’−二リン酸塩、をさらに含むことができる。
【０１７４】
特定の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、別々のセンスとアンチセンス配列または領域を含み、センスとアンチセンス領域は、当技術分野で既知のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子により共有結合しているか、またはその代替として、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および／またはスタッキング相互作用により非共有結合をしている。
【０１７５】
本明細書に使われる、ｓｉＮＡ分子は、リボヌクレオチドのみを含む分子に限定される必要はなく、さらにデオキシリボヌクレオチド（ｄＴｄＴジヌクレオチドをそれぞれ含むｓｉＲＮＡのように）、化学的に修飾したヌクレオチド、および非ヌクレオチドを包含してもよい。特定の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）を含むヌクレオチドを欠いている。特定の実施形態では、ｓｉＮＡは、ＲＮＡｉ媒介するための２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要とせず、任意選択として、このように、本発明のｓｉＮＡは、いずれのリボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まなくてもよい。しかし、ＲＮＡｉを行うためにｓｉＮＡ分子にリボヌクレオチドの存在を必要としないこのようなｓｉＮＡ分子は、２’−ＯＨ基を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含む付着リンカー（単数、複数の）または他の付着または随伴基、成分、または鎖を有する。任意選択で、ｓｉＮＡ分子は、ヌクレオチド位置の約５、１０、２０、３０、４０、または５０％のリボヌクレオチドを含んでもよい。修飾された場合は、本発明のｓｉＮＡは「低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド」または「ｓｉＭＯＮ」とも呼ばれうる。他の化学的修飾、例えば、国際公開特許ＷＯ０３／
０７０９１８およびＷＯ０３／０７４６５４（両特許は参照によって組み込まれる）に記載のように、本発明のいずれかのｓｉＮＡ配列に適用可能である。
【０１７６】
一実施形態では、分子媒介ＲＮＡｉは、２ヌクレオチド３’オーバーハング（本明細書で開示された配列中のｄＴｄＴ）を有する。細胞中で、構築物から、例えば、所望の配列のヘアピン分子からまたは逆方向反復から、ＲＮＡｉ分子が発現した場合は、内在細胞機構がオーバーハングを作ることになる。
【０１７７】
ｓｉＲＮＡを作製する方法は通常の方法である。インビトロでの方法には、無細胞系でのポリヌクレオチド配列の処理（例えば、長いｄｓＲＮＡのＲＮＡｓｅ  ＩＩＩまたはダイサーによる消化）、組換え型二本鎖ＤＮＡのインビトロ転写、およびＢａｋまたはＢａｘ配列に相同なヌクレオチド配列の化学合成、が含まれる。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ
ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１３：３１９１−３１９７、１９９９、を参照。インビボでの方法には：
（１）基質がインビボでｓｉＲＮＡに変換されるようにＤＮＡベクターの細胞中への移入、例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：７００−０７、２００３；；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ  ｌ２０：４９７−５００、２００３；；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ  ｌ２０：５００−０５、２００２；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５３、２００２；ＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＲＮＡ  ８：８４２−５０、２００２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １６：９４８−５８、２００２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１４４３−４８、２００２；Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ  ｌ２０：５０５−０８、２００２；Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：５５１５−２０、２００２；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６０４７−５２、２００２、を参照。
（２）ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）プロモータを使ってプラスミド系からの低分子ヘアピンＲＮＡの発現、例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、前述；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、前述；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、前述；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．、前述；ＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．、前述）、Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、前述（両方）；Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、前述、Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．、前述；およびＹｕ  ｅｔ  ａｌ．、前述、を参照；および／または
（３）タンデムプロモータからの低分子ＲＮＡの発現。例えば、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、前述；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、前述）、
が含まれる。
【０１７８】
インビトロで合成する場合、典型的なマイクロモルレベルのＲＮＡ合成では、約１ｍｇのｓｉＲＮＡが得られ、２４ウエル組織培養プレート形式を使った約１０００例の移入実験を行うのに十分である。一般的には、培養細胞中でＢａｋまたはＢａｘの発現を抑制するために、１つまたは複数のｓｉＲＮＡを培地中の細胞に添加でき、通常、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０mｇｓｉＲＮＡ／ｍｌである。
【０１７９】
抑制型ＲＮＡに関する概要、またはより一般的な説明には、Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉ  Ａｍｅｒ  Ａｕｇ  ２００３：３４−４１；ＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３、７３７−４７、２００２；およびＤｙｋｘｈｏｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ  ４：４５７−４６７、２００３、を参照のこと。ｓｉＲＮＡの設計と調製、それらの有効性の試験、およびＲＮＡ干渉法における使用（インビトロとインビボの両方で）に関するさらなるガイダンスのためには、例えば、Ａｌｌｓｈｉｒｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１８１８−１９、２００２；Ｖｏｌｐｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１８３３−３７、２００２；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：２２１５−１８、２００２；Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７２２３２−３７、２００２；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：２０５６−６０、２００２；ＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ  ８：８４２−８５０、２００２；Ｒｅｉｎｈａｒｔ
ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：１６１６−２６、２００２；Ｒｅｉｎｈａｒｔｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１８３１、２００２；Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−１１、２００２；Ｍｏｓｓ、Ｃｕｒｒ
Ｂｉｏｌ  １１：Ｒ７７２−５、２００２：Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．、前述；Ｂａｓｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１  ４２８−９、２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−８；米国特許第６、５０６、５５９号；米国特許公開公報第２００３０２０６８８７号；ならびに国際公開特許ＷＯ９９／０７４０９、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ００／０１８４６、ＷＯ００／４４９１４、ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０１／３６６４６、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０１／８９３０４、ＷＯ０１／９０４０１、ＷＯ０２／１６６２０、およびＷＯ０２／２９８５８を参照のこと（これら全ては、参照によって組み込まれる）。
【０１８０】
リボザイムおよびｓｉＮＡは、修飾バージョンを含むアンチセンス核酸分子用に記述される任意の形を取ることができ、オリゴヌクレオチド（１本鎖または２本鎖の）として、または発現ベクターの形で細胞中に導入可能である。
【０１８１】
一実施形態では、アンチセンス核酸、ｓｉＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）またはリボザイムは、少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９３％、９５％、９７％、９８％または９９％）が標的セグメント（上述ＢａｋおよびＢａｘに対するもの等）またはその相補配列と同等の配列を含む１本鎖ポリヌクレオチドを含む。本明細書で使われるＤＮＡおよびそれによりコードされるＲＮＡは、ＤＮＡ中のチミンベースをＲＮＡのウラシルベースに置換したことを考慮すれば、同じ「配列」を含むと考えられる。
【０１８２】
本明細書で検討された核酸ベースの抑制剤の活性変異体（例えば、断片を含む長さ変異体および配列変異体）もまた、本発明の範囲内にある。「活性」変異体は、元の抑制剤の活性（すなわち、発現を抑制する能力）を維持している変異体である。通常の手段でその活性を測定することは、変異体を試験することになる。
【０１８３】
長さ変異体に関しては、アンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の抑制に有効な任意の長さであってよい。通常、アンチセンス核酸は、約６および約５０ヌクレオチドの間（例えば、少なくとも約１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｎｔ）であるが、約１００〜約２００ヌクレオチド以上の長さであってもよい。抑制される遺伝子またはコード配列と大略同じ長さを有するアンチセンス核酸を使ってもよい。長さについて言う場合は、用語の塩基および塩基対（ｂｐ）は、同義として使用され、１本鎖（ｓｓ）および２本鎖（ｄｓ）核酸に対応すると理解されよう。有効なｓｉＮＡの長さは、通常約１５ｂｐおよび約２９ｂｐの間、ならびに約１９および約２９ｂｐの間（例えば、約１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または２９ｂｐ）で、より短いおよびより長い配列も受容可能である。一般的に、ｓｉＮＡは、約３０塩基より短くして、インターフェロン効果の誘発をを防ぐ。例えば、鎖の１つに、本明細書中の配列番号４２、４３、４６、および４７の内のいずれかの１９ヌクレオチド配列を有するｓｉＲＮＡの活性変異体は、ｓｉＲＮＡの全体の長さが約１９ｂｐおよび約２９ｂｐの間（両端含む）にあるという条件下では、ｄｓＲＮＡのどちらかまたは両方の末端から塩基対を欠損してもよく、または追加の塩基対をｄｓＲＮＡのどちらかまたは両方の末端に含んでもよい。本発明の一実施形態は、「基本的な構成要素になる」配列が配列番号４２、４３、４６、および４７またはこれらの配列の相補配列によって表されるｓｉＲＮＡである。用語の「基本的な構成要素になる」は中間的移行句であり、この場合は、例えば、大きなインターフェロン応答を誘導するのに十分な長さの配列、を除外する。本発明のｓｉＲＮＡは、約１９および約２９ｂｐの間の長さを基本的な構成要素としてもよい。
【０１８４】
配列変異体に関しては、一実施形態では、抑制的核酸は、アンチセンス分子でも、リボザイム（認識配列）でもｓｉＮＡでも、抑制対象として設計されている遺伝子の配列に相補的（１００％同等配列）である鎖を含む。しかし、１００％配列同一性は本発明の実施には必要ではない。従って、本発明は、天然の配列変異、例えば、ヒトの遺伝子変異、遺伝子多型、または進化的分岐により起こる可能性があるｃ−メチオニン、を許容するという利点を有する。あるいは、変異体配列は、人工的に生成してもよい。標的配列に比べ少量の挿入、欠失、または１つの点変異を有する核酸配列は有効な抑制剤でありうる。
【０１８５】
配列同一性の度合は、当技術分野でよく知られた配列比較および整列アルゴリズム（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、配列解析プライマー、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１、およびその引用文献を参照）、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラムに実装されているＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによりデフォルトのパラメーターを使ってヌクレオチド配列間のパーセント差異の計算をして最適化できる（例えば、ウィスコンシン大学Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）。一実施形態では、少なくとも、約９０％の配列同一性を使用可能であり（例えば、少なくとも、約９２％、９５％、９８％または９９％）、または更に１００％の抑制性核酸と標的遺伝子の標的配列の間の配列同一性を使用可能である。
【０１８６】
あるいは、本発明の抑制性核酸の活性変異体は、高ストリンジェンシーな条件（ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下、抑制することを目的としている配列にハイブリダイズするものである。例えば、ｓｉＲＮＡの２本鎖領域は、高ストリンジェンシーな条件下（例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃、１２〜１６時間ハイブリダイゼーションし、通常は次に洗浄する）、標的遺伝子転写物の一部とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列として機能的に定義できる。
【０１８７】
所定の抗原Ｘを提示しているＤＣ−１細胞またはＢＭ−ＤＣは、本発明のｓｉＲＮＡで処理していない場合は、十分な数のＸ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬにアポトーシス細胞死で応答する。対照的に、ｓｉＲＮＡを形質移入したまたは本発明のｓｉＲＮＡ配列をコードしたウイルスベクターに感染した同じ細胞は、殺作用シグナル伝達にもかかわらずより長く生存する。
【０１８８】
本発明のｓｉＲＮＡ組成物の送達と発現により、Ｔ細胞応答の進展の過程でインビボでＤＣの死亡が抑制され、その結果、抗原をコードしたＤＮＡワクチンベクターによる免疫化により誘導される免疫応答の生成が促進および刺激される。これらの可能性は以下のことをを示すことにより実証された：
（１）ＨＰＶ−１６  Ｅ７をコードしたＤＮＡワクチン剤ならびにＢａｋおよびＢａｘを標的としたｓｉＲＮＡの同時投与が、流入領域リンパ節中の抗原提示ＤＣの寿命を延長し、結果として、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を強化し、予防接種した患者のＥ７発現腫瘍に対する強力な抗腫瘍効果を誘発する。
（２）ＢａｋおよびＢａｘを標的のｓｉＲＮＡを移入したＤＣは、Ｔ細胞による殺作用にインビボで抵抗する。ＢａｋおよびＢａｘタンパク質発現が下方制御されるようにＢａｋ／Ｂａｘ  ｓｉＲＮＡを移入したＥ７負荷ＤＣは、Ｔ細胞によるアポトーシス性死亡誘導にインビボで抵抗する。患者に投与された場合には、これらのＤＣは、より強力な抗原特異的免疫応答および有意な治療効果を生み出す（対照ｓｉＲＮＡを移入したＤＣに比べて）。
このように、ｓｉＲＮＡ構築物は、核酸ワクチン接種および本出願記載の化学療法計画の一部として有用である。
【０１８９】
抗アポトーシスタンパク質を使った免疫応答の増強
ＤＮＡワクチンおよび化学療法剤の患者への投与は、国際公開特許ＷＯ２００５／０４７５０１および米国特許出願公開第２００７００２６０７６号に記載されているように、抗アポトーシスタンパク質をコードした核酸の投与を伴ってもよい（これらの特許は参照によって組み込まれる）。
【０１９０】
本発明者等は、以前に、ＤＮＡワクチン組成物をコードした抗原とｂｃｌ−２、ｂｃ−ｌｘＬ、ＸＩＡＰ、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−９のドミナントネガティブ変異体（これらの産物はアポトーシスを抑制することがわかっている）等の抗アポトーシス遺伝子を含む追加のＤＮＡベクターと組み合わせた免疫療法戦略を計画し開示したことがある（Ｗｕ、ｅｔ  ａｌ．米国特許出願公開第２００７００２６０７６号。これらは参照により本明細書に組み込まれる）。また、グランザイムＢを抑制するセリンプロテアーゼ抑制剤６（ＳＰＩ−６）も、組成物および方法に採用して、ＤＣのアポトーシス細胞死を遅らせることができる。本発明者等は、追加の生物学的アポトーシス抑制メカニズムの利用により、抗原コード配列ならびにこのようなＩＰＰをコードした結合配列を含むＤＮＡワクチン剤に対するＴ細胞応答を著しく高められることを示した。
【０１９１】
遺伝子銃による皮内ワクチン接種は、ＤＮＡワクチンを皮膚のＤＣに効率よく送達し、抗原特異的Ｔ細胞の活性化と初回抗原刺激がインビボで得られる。しかし、ＤＣの寿命は限られており、その抗原特異的Ｔ細胞を刺激する長期にわたる能力を妨害する。本発明に従って、治療とＤＮＡ形質導入ＤＣの生存を延長する方法を組み合わせた戦略により、抗原特異的Ｔ細胞の初回抗原刺激を高め、その結果、ＤＮＡワクチン効力を強化する。アポトーシス（ＢＣＬ−ｘＬ、ＢＣＬ−２、ＸＩＡＰ、ドミナントネガティブカスパーゼ−９、またはドミナントネガティブカスパーゼ−８）の抑制剤をコードしたＤＮＡと抗原（ＨＰＶ−１６Ｅ７タンパク質として例証された）をコードしたＤＮＡを同時送達することにより、形質導入されたＤＣの生存が延長される。更に重要なことに、ワクチン接種した患者は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の有意な増強を示し、抗原発現腫瘍に対する強力は抗腫瘍効果が得られる。これらの抗アポトーシス因子の中で、ＢＣＬ−ＸＬにおいて、抗原特異的免疫応答および抗腫瘍効果の両方で最大の増強が認められた。このように、ＤＮＡワクチンと１つまたは複数の抗アポトーシスタンパク質をコードしたＤＮＡ構築物を含む組み合わせ治療の同時投与によりＤＮＡワクチン効力を高める手法が得られる。
【０１９２】
セリンプロテアーゼ抑制剤６（ＳＰＩ−６）、は、また、セルピンｂ９とも呼ばれ、グランザイムＢを抑制し、その結果、ＤＣのアポトーシス細胞死を遅らせることができる。ＳＰＩ−６をコードしたＤＮＡと種々のＩＰＰと結合したＥ７をコードしたＤＮＡ構築物の皮内同時投与は、ＳＰＩ−６なしのワクチン接種に比較して、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔｈ１細胞応答を著しく増やし、抗腫瘍効果を高めた。このようにして、特定の実施形態では、組み合わされた方法が使用され、免疫を増強するためのＳＰＩ−６の送達によりＭＨＣクラスＩおよびＩＩ抗原プロセシングが強化される。
【０１９３】
類似の手法がＤＮＡベースのアルファウイルスＲＮＡレプリコンベクターに採用され、自殺ＤＮＡベクターとも呼ばれている。抗原、例えば、ＨＰＶＥ７、ＤＮＡベースセムリキ森林ウイルスベクター、ｐＳＣＡ１、に対する免疫応答を高めるために、抗原ＤＮＡを、ＢＣＬ−２ファミリーのメンバーであるＢＣＬ−ｘＬ等の抗アポトーシスポリペプチドをコードしたＤＮＡと融合する。抗原ポリペプチドとＢＣＬ−ｘＬの融合タンパク質をコードしたｐＳＣＡ１は、形質移入したＤＣの細胞死を遅らせ、著しく高い抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介免疫を生成する。ＢＣＬ−ｘＬの抗アポートシス機能は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増強にとって重要である。このように、一実施形態では、そうでない場合は望ましい自殺ＤＮＡワクチンにより誘導される細胞死を遅らせることによりその効力が高められる。
【０１９４】
このように、本発明は、また、化学療法剤と免疫原として有用な核酸組成物の投与を含む組み合わせ治療に関し、下記の（ａ）、（ｂ）の組み合わせを含む：（ａ）抗原ポリペプチドまたはペプチドをコードした第一の配列を含む第一の核酸ベクターで、第一のベクターが任意選択で第一の配列に結合した第二の配列を含み、第二の配列が免疫原性増強ポリペプチド（ＩＰＰ）をコードする；ｂ）抗アポトーシスポリペプチドをコードした第二の核酸ベクターで、ここで、第二のベクターが第一のベクターと一緒に患者に投与される場合は、抗原ポリペプチドまたはペプチドに対するＴ細胞媒介免疫応答誘導が第一のベクター単独投与による免疫応答誘導よりも大きさが増しおよび／または持続期間が長くなる。上記第一のベクターは、第一および／または第二の配列に機能的に連結されたプロモーターを含んでもよい。
【０１９５】
上記組成物で、抗アポトーシスポリペプチドを、（ａ）ＢＣＬ−ｘＬ、（ｂ）ＢＣＬ２、（ｃ）ＸＩＡＰ、（ｄ）ＦＬＩＣＥｃ−ｓ、（ｅ）ドミナントネガティブカスパーゼ−８、（ｆ）ドミナントネガティブカスパーゼ−９、（ｇ）ＳＰＩ−６、および（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの機能的ホモログまたは誘導体、からなる群から選択してもよい。抗アポトーシスＤＮＡは、抗原をコードしたＤＮＡに物理的に結合していてもよい。この例は、主に自殺ＤＮＡワクチンベクターの形で米国特許出願公開第２００７００２６０７６号で提供されている（この特許は参照によって組み込まれる）。あるいは、抗アポトーシスＤＮＡを別々に、抗原をコードしたＤＮＡ分子と組み合わせて、投与してもよい。これらの２つの型のベクターの同時投与に関するさらなる例は、米国特許出願第１０／５４６、８１０号（出願公開番号ＵＳ２００７−００２６０７６）で提供されている。
【０１９６】
抗アポトーシス性および他のタンパク質の代表的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列リストに掲載している。これらのタンパク質と構築物の生物学的に活性なホモログも使用可能である。生物学的に活性なホモログは、本明細書記載のように、他のタンパク質、例えば、ＩＰＰとの関連で理解されるはずである。
【０１９７】
本発明のｐｃＤＮＡ３ベクター中に存在するＢＣＬ−ｘＬのコード配列は、配列番号５５である；ＢＣＬ−ｘＬのアミノ酸配列は配列番号５６である；配列ｐｃＤＮＡ３−ＢＣＬ−ｘＬは配列番号５７である（ＢＣＬ−ｘＬコード配列はヌクレオチド９８３〜１７３２に対応）；Ｅ７とＢＣＬ−ｘＬを結合させるｐｃＤＮＡ３ベクター（ｐｃＤＮＡ３−Ｅ７／ＢＣＬ−ｘＬと命名）は配列番号５８である（Ｅ７とＢＣＬ−ｘＬ配列はヌクレオチド９６０〜２００９に対応）；Ｅ７−ＢＣＬ−ｘＬキメラまたは融合ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号５９である；変異体ＢＣＬ−ｘＬ（「ｍｔＢＣＬ−ｘＬ」）ＤＮＡ配列は配列番号６０である；ｍｔＢＣＬ−ｘＬのアミノ酸配列は配列番号６１である；Ｅ７−ｍｔＢＣＬ−ｘＬキメラまたは融合ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号６２である；ｐｃＤＮＡ−ｍｔＢＣＬ−ｘＬ［配列番号６３］ベクターでは、この変異体配列がＢＣＬ−ｘＬが挿入されている配列番号５７中の同じ位置に挿入され、ｐｃＤＮＡ−Ｅ７／ｍｔＢＣＬ−ＸＬ［配列番号６４］では、ＢＣＬ−ｘＬ配列の配列番号５８中の位置と同じ位置にこの配列が挿入される；自殺ＤＮＡベクターｐＳＣＡ１−ＢＣＬ−ｘＬの配列は配列番号６５である（ＢＣＬ−ｘＬ配列はヌクレオチド７４８３〜８２３２に対応）；「組み合わされた」ベクター、ｐＳＣＡ１−Ｅ７／ＢＣＬ−ｘＬの配列は配列番号６６である（Ｅ７およびＢＣＬ−ｘＬの配列はヌクレオチド７４６１〜８５１０に対応）；ｐＳＣＡ１−ｍｔＢＣＬ−ｘＬ［配列番号６７］の配列は、ｍｔＢＣＬ−ｘＬ配列がｐＳＣＡ１−ｍｔＢＣＬ−ｘＬベクターの野性型配列と同じ位置に挿入されることを除けば、野性型ＢＣＬ−ｘＬと同じである。；配列ｐＳＣＡ１−Ｅ７／ｍｔＢＣＬ−ｘＬ［配列番号６８］は、野性型配列と同じ位置にｍｔＢＣＬ−ｘＬ配列が挿入されることを除いて、上記の野性型ｐＳＣＡ１−Ｅ７／ＢＣＬ−ｘＬと同じである。；ベクターｐＳＧ５−ＢＣＬ−ｘＬの配列は配列番号６９である（ＢＣＬ−ｘＬコード配列はヌクレオチド１０６１〜１８１０に対応する）；配列決定されたベクターｐＳＧ５−ｍｔＢＣＬ−ｘＬは変異体ＢＣＬ−ｘＬ配列を含む配列番号７０で、すぐ上に記載の野性型ベクターと同じ位置に挿入されたｍｔＢＣＬ−ｘＬを持っている；ＸＩＡＰ抗アポトーシスタンパクをコードしたＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号７１である；ＸＩＡＰ抗アポトーシスタンパク質コード配列を含むベクターのアミノ酸は配列番号７２である；ＸＩＡＰ抗アポトーシスタンパク質コード配列を含むベクター（ＰＳＧ５−ＸＩＡＰと命名）のヌクレオチド配列は配列番号７３に示す（ＸＩＡＰと共に、ヌクレオチド１０５５〜２５５３に対応）；抗アポトーシスタンパク質ＦＬＩＣＥｃ−ｓをコードしたＤＮＡの配列は配列番号７４である；抗アポトーシスタンパク質ＦＬＩＣＥｃ−ｓのアミノ酸配列は配列番号７５である；抗アポトーシスタンパク質ＦＬＩＣＥｃ−ｓをコードしたＰＳＧ５ベクター（ＰＳＧ５−ＦＬＩＣＥｃ−ｓと命名）は配列番号７６の配列を有する（ＦＬＩＣＥｃ−ｓ配列と共に、ヌクレオチド１０４９〜２４４３に対応）；抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ２をコードしたＤＮＡ配列は配列番号７７である；Ｂｃｌ２のアミノ酸配列は配列番号７８である；Ｂｃｌ２をコードしたＰＳＧ５ベクター（ＰＳＧ５−ＢＣＬ２と命名）は配列番号７９の配列を有する（Ｂｃｌ２配列と共に、ヌクレオチド１０６１〜１６７８に対応）；ｐＳＧ５−ｄｎ−カスパーゼ−８ベクターは配列番号８０である（ドミナントネガティブカスパーゼ−８のコードはヌクレオチド１０５５〜２４４９）に対応；ｄｎ−カスパーゼ−８のアミノ酸配列は配列番号８１である；ｐＳＧ５−ｄｎ−カスパーゼ−９ベクターは配列番号８２である（ドミナントネガティブカスパーゼ−９のコードはヌクレオチド１０５５〜２３０５に対応）；ｄｎ−カスパーゼ−９のアミノ酸配列は配列番号８３であある；マウスセリンプロテアーゼ抑制剤６（ＳＰＩ−６、ＧＥＮＥＢＡＮＫにＮＭ００９２５６として登録）のヌクレオチド配列は配列番号８４である；ＳＰＩ−６タンパク質のアミノ酸配列は配列番号８５である；変異体ＳＰＩ−６（ｍｔＳＰＩ６）の核酸配列は配列番号８６である；変異体ＳＰＩ−６タンパク質（ｍｔＳＰＩ−６）のアミノ酸配列は配列番号８７である；ｐｃＤＮＡ３−Ｓｐｉ６ベクターの配列は配列番号８８である（ＳＰＩ−６配列はヌクレオチド９６０〜２０８１に対応）；および変異体ベクターｐｃＤＮＡ３−ｍｔＳｐｉ６ベクター［配列番号８９］の配列は、野性型ＳＰＩ−６の位置と同じ位置にｍｔＳＰＩ−６配列が挿入されることを除けば、上述と同じである。
【０１９８】
これらの核酸やタンパク質の生物学的に活性なホモログを使用可能である。生物学的に活性なホモログは本明細書にある他のタンパク質、例えば、ＩＰＰ、との関連で記載されているように理解されるべきである。例えば、ベクターは、少なくとも、約９０％、９５％、９８％または９９％本明細書に記載の配列のタンパク質に同等である抗アポトーシスタンパク質をコードしてもよい。
【０１９９】
腫瘍退縮ウイルス
腫瘍退縮ウイルスは、抗原特異的免疫応答が期待される特定の抗原をコードおよび発現できる種類のクラスのベクターを含むのみならず、癌細胞の殺作用の媒介もする。用語の「腫瘍退縮性（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）」および「腫瘍退縮ウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓｅ）」は、癌殺作用を指し、すなわち「ｏｎｃｏ」が癌を意味し、「ｌｙｔｉｃ」が「殺作用」を意味する。本明細書で使用する場合、腫瘍退縮性（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）は「腫瘍退縮ウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓｅ）」および「ＯＶ」を指し、このウイルスは、癌細胞を殺す可能性のあるウイルスを表す。原理的には、腫瘍、新生物、細胞腫、肉腫、等を含む腫瘍性細胞中で選択的複製が可能などのウイルスでも本発明で使用可能である。腫瘍細胞中での選択的複製は、少なくとも３種の異なる非腫瘍形成性組織に比べて、異なる腫瘍から樹立された少なくとも３種の細胞株中で、少なくとも１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６、またはそれ以上効率的にウイルスが複製を行えることを意味する。
【０２００】
腫瘍退縮ウイルスは、追加または代替として、特異的組織または腫瘍組織を標的にしてもよい。このことは、例えば、ウイルス遺伝子の転写標的化によって（例えば、国際公開特許ＷＯ９６／３９８４１：本件は参照によって組み込まれる）または細胞性結合および感染過程中の取り込み機構に関与するウィルス蛋白質の改変によって（例えば、国際公開特許ＷＯ２００４０３３６３９またはＷＯ２００３０６８８０９：これらの特許は参照によって組み込まれる）、達成することができる。
【０２０１】
本発明では、広範囲のウイルスが腫瘍退縮ウイルスとして意図されており、例えば、これに限定されないが、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、インフルエンザウイルス、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューキャッスルウイルス、ワクチニアウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、シンドビスウイルス（ＳｒＮ）およびセンダイウイルス（ＳＶ）が挙げられる。下記の表１〜６には、以前に発表された腫瘍退縮ウイルスの例の概要を示す（ｗｗｗ．ｏｎｃｏｌｙｔｉｃＶｉｒｕｓ．ｏｒｇから採取した）。
【０２０２】
【表４】
2015017117.tif 000060
【０２０３】
【表５】
2015017117.tif 000061
【０２０４】
【表６】
2015017117.tif 000062
【０２０５】
【表７】
2015017117.tif 000063
【０２０６】
【表８】
2015017117.tif 000064
【０２０７】
【表９−１】
2015017117.tif 000065
【０２０８】
【表９−２】
2015017117.tif 000066
【０２０９】
【表１０】
2015017117.tif 000067
本発明に使われる腫瘍退縮ウイルスの産生と精製の方法は、下記に引用した文献に記載されている。
【０２１０】
【数１−１】
2015017117.tif 000068
【０２１１】
【数１−２】
2015017117.tif 000069
【０２１２】
【数１−３】
2015017117.tif 000070
全ての文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２１３】
一般的には、ウイルスを精製して基本的に望ましくない混入物、例えば、欠陥のある干渉性ウイルス性粒子または内毒素および他の発熱物質、を含まないようにして、ウイルスを受ける細胞、動物、または個体中でなんらかの好ましくない反応の原因にならないようにすることもできる。ウイルス精製手段には、浮力のある密度傾斜、例えば、セシウム塩化物勾配遠心分離、の使用も含まれる。
【０２１４】
一実施形態では、腫瘍退縮ウイルス、例えば、ワクチニアウイルス、は外来性ＤＮＡ、すなわち、前記ウイルス由来でないＤＮＡを更に含む。このＤＮＡは、それに対し抗原特異的免疫応答が期待される抗原をコードしていてもよい。他の実施形態では、外来性ＤＮＡは、異種のプロモーター領域、構造遺伝子、またはこのような遺伝子に機能的に連結されたプロモーターであってもよい。代表的プロモータには、これには限定されないが、ＣＭＶプロモーター、ＬａｃＺプロモーター、Ｅｇｒプロモーターまたは既知のＨＳＶプロモータが挙げられる。一実施形態では、構造遺伝子は、サイトカイン／ケモカイン、自殺遺伝子、融合タンパク質またはマーカー遺伝子の群から選ばれる。使用可能なサイトカイン／ケモカインには、これには限定されないが、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦがある。使用可能な自殺遺伝子には、これには限定されないが、ｐ４５０およびシトシンデアミナーゼが含まれる。融合タンパク質は、例えば、テナガザル白血病ウイルスエンベロープである。一般的なマーカー遺伝子は、ルシフェラーゼ、ＧＦＰまたはそれらの変異体、およびＬａｃＺである。
【０２１５】
さらなる実施形態では、腫瘍退縮ウイルスは、さらに改変され、変質宿主細胞特異性を有する。このような変異体は、例えば、国際公開特許ＷＯ２００４／０３３６３９（参照によって組み込まれる）、米国特許第２００５２７１６２０号（参照により組み込まれる）、Ｋａｍｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）およびＭｅｎｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）、による報告からＨＳＶ−１として有名である。ここで、ＨＳＶ−１の糖タンパク質、例えば、ｇＤ、ｇＣは、リガンド、特に、選んだ標的細胞に特異的に結合する１本鎖抗体、と融合する。さらに、このようなウイルスを、天然の受容体およびヘパリン硫酸プロテオグリカンから標的解除するために、欠失および／または点変異がｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤ中に形成される（国際公開特許ＷＯ２００４／０３３６３９（参照によって組み込まれる）、Ｚｈｏｕ  ａｎｄ  Ｒｏｉｚｍａｎ、２００６）。
【０２１６】
化学療法剤
さらに、薬剤を本明細書の方法と組成物に従って哺乳動物に投与してもよい。通常、免疫系に大きな影響を与えずに細胞の増殖を低下させる、または、少なくとも患者に投与されたＤＮＡワクチンのプラス効果を排除する程度には免疫系を抑制しない任意の薬剤が使われる。一実施形態では、薬剤は化学療法剤である。
ワクチン、例えば、ＤＮＡワクチンの効果を刺激するという前提であれば、広範な種々の化学療法剤を使うことができる。ある特定の実施形態では、化学療法剤は、（ａ）接触した場合、細胞、特に、癌細胞のアポトーシスを誘導する；（ｂ）腫瘍の重荷を減らす；および／または（ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介抗腫瘍免疫を強化する、薬剤であってもよい。特定の実施形態では、薬剤は、また、免疫系を阻害しない、または少なくともある濃度では阻害しないものでなければならない。
【０２１７】
一実施形態では、化学療法剤は、エピガロカテキン−３−ガリウム酸塩（ＥＧＣＧ）または化学的誘導体または薬学的に許容可能なその塩である。エピガロカテキンガリウム酸塩（ＥＧＣＧ）は、緑茶で見つかった主要ポリフェノール成分である。ＥＧＣＧは、種々のヒトと動物モデルで立証された、乳房、前立腺、胃、食道、結腸、膵臓、皮膚、肺、およびその他の部位の癌に対する抗腫瘍効果を有する。ＥＧＣＧは、異なる経路で作用し、癌細胞増殖、生存、血管形成および転移を調節することが示された。例えば、ある研究ではＥＧＣＧが細胞周期の停止を起こし、アポトーシスを誘導して癌に対して防御することが示唆されている。また、テロメラーゼ抑制がＥＧＣＧの抗腫瘍効果の根底にある主要機序の１つである可能性があるとの報告もある。通常使われるレチノイドおよびドキソルビシンを含む抗腫瘍薬と比べて、ＥＧＣＧは、相対的に低い毒性であり、その経口バイオアベイラビリティの故に、投与に都合がよい。従って、ＥＧＣＧは臨床試験で使われており、潜在的な理想的抗腫瘍薬であると思われる。
【０２１８】
ＥＧＣＧの代表的類似体または誘導体には、（−）−ＥＧＣＧ、（＋）−ＥＧＣＧ、（−）−ＥＧＣＧ−アミド、（−）−ＧＣＧ、（＋）−ＧＣＧ、（＋）−ＥＧＣＧ−アミド、（−）−ＥＣＧ、（−）−ＣＧ、ゲニステイン、ＧＴＰ−１、ＧＴＰ−２、ＧＴＰ−３、ＧＴＰ−４、ＧＴＰ−５、Ｂｎ−（＋）−エピガロカテキンガリウム酸塩（米国公開特許ＵＳ２００４／０１８６１６７（参照によって組み込まれる））、およびジデオキシエピガロカテキンガリウム酸塩（Ｆｕｒｕｔａ、ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００７、１１：３０９５−３０９８）が挙げられる。さらなる例としては、米国公開特許ＵＳ２００４／０１８６１６７（その全体が参照によって組み込まれる）；Ｗａｌｅｈ、ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００５、２５：３９７−４０２；Ｗａｉ、ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００４、１２：５５８７−５５９３；Ｓｍｉｔｈ、ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃ．Ｆｕｎｃ．＆  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．、２００３、５４：５８−７０；米国特許ＵＳ７、１０９、２３６（その全体が参照によって組み込まれる）；Ｌａｎｄｉｓ−Ｐｉｗｏｗａｒ、ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、２００５、１５：７３５−７４２；Ｌａｎｄｉｓ−Ｐｉｗｏｗａｒ、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．、２００７、２１３：２５２−２６０；Ｄａｎｉｅｌ、ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、２００６、１８：６２５−６３２；Ｔａｎａｋａ、ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｇ．Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．、２００７、４６：５９３４−５９３７、を参照のこと。
【０２１９】
別の使用可能な化学療法剤は、（ａ）５、６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）、またはその化学的誘導体もしくは類似体または薬学的に許容可能なその塩である。代表的類似体または誘導体には、キサンテノン−４−酢酸、フラボン−８−酢酸、
キサンテン−９−オン−４−酢酸、メチル（２、２−ジメチル−６−オキソ−１、２−ジヒドロ−６Ｈ−３、１１−ジオキサシクロペンタ［α］アントラセン−１０−イル）アセタート、メチル（２−メチル−６−オキソ−１、２−ジヒドロ−６Ｈ−３、１１−ジオキサシクロペンタ［α］アントラセン−１０−イル）アセタート、メチル（３、３−ジメチル−７−オキソ−３Ｈ、７Ｈ−４、１２−ジオキサベンゾ［α］アントラセン−１０−イル）アセタート、メチル−６−アルキルオキシキサンテン−９−オン−４−アセタート（Ｇｏｂｂｉ、ｅｔ  ａｌ．、２００２、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４５：４９３１）が挙げられる。さらなる例に関しては、国際公開特許ＷＯ２００７／０２３３０２Ａ１、ＷＯ２００７／０２３３０７Ａ１、米国公開特許ＵＳ２００６／９５０５、国際公開特許ＷＯ２００４／３９３６３Ａ１、ＷＯ２００３／８００４４Ａ１、オーストラリア公開特許ＡＵ２００３／２１７０３５Ａ１、およびＡＵ２００３／２８２２１５Ａ１を参照のこと（これらはそれぞれ参照によってその全体が組み込まれる）。
【０２２０】
また、化学療法剤は、シスプラチン、またはその化学的誘導体もしくは類似体または薬学的に許容可能なその塩であってもよい。代表的類似体または誘導体には、ジクロロ［４、４′−ビス（４、４、４−トリフルオロブチル）−２、２′−ビピリジン］白金（Ｋｙｌｅｒｅｔａｌ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６、１４：８６９２−８７００）、シス−［Ｒｈ２（−Ｏ２ＣＣＨ３）２（ＣＨ３ＣＮ）６］２＋（Ｌｕｔｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００６、１２８：７３８−７３９）、（＋）−シス−（１、１−シクロブタンジカルボキシラト）（（２Ｒ）−２−メチル−１、４−ブタンジアミン−Ｎ、Ｎ’）白金（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９２、５２：４１３０−４１３４）、シス−ビスネオデカノアト−トランス−Ｒ、Ｒ−１、２−ジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．ｏｆ  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２００５、２３：３４９５−３５０１）、カルボプラチン（Ｗｏｌｏｓｃｈｕｋ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｔｅｌｌ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍ．、１９８８、２２：８４３−８４９）、セブリプラチン（Ｋａｎａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅａｄ  ＆  Ｎｅｃｋ、２００６、１４：３８−４３）、サトラプラチン（Ａｍｏｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２０００、４６：４２３−４２６）、アザン（ジクロロ白金）（ＣＩＤ：１１９６１９８７）、アザニド（ＣＩＤ：６７１２９５１）、プラチノール（ＣＩＤ：５７０２１９８）、ｌｏｐａｃ−Ｐ−４３９４（ＣＩＤ：５４６００３３）、ＭＯＬＩ００１２２６（ＣＩＤ：４５０６９６）、トリクロロ白金（ＣＩＤ：４２０４７９）、プラチナート（１−）、アンミントリクロロ−、アンモニウム（ＣＩＤ：１６０９９５）、トリアンミン白金（ＣＩＤ：１１９２３２）、ビオシス白金（ＣＩＤ：８４６９１）、プラチブラスチン（ＣＩＤ：２７６７）および薬学的に許容可能なその塩がある。さらなる例は、米国特許ＵＳ５９２２６８９、ＵＳ４９９６３３７、ＵＳ４９３７３５８、ＵＳ４８０８７３０、ＵＳ６１３０２４５、ＵＳ７２３２９１９、およびＵＳ７０３８０７１、を参照のこと（これらは全て参照によってその全体が組み込まれる）。
【０２２１】
別の使用可能な化学療法剤はアピゲニン、またはその化学的誘導体もしくは類似体または薬学的に許容可能なその塩である。代表的類似体または誘導体には、アカセチン、クリシン、カンフェロール、ルテオリン、ミリセチン、ナリンゲニン、ケルセチン（Ｗａｎｇ
ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ、２００４、４８：１０６−１１４）、プエラリン（米国公開特許ＵＳ２００６／０２７６４５８（参照によってその全体が組み込まれる）および薬学的に許容可能なその塩が挙げられる。さらなる例については、米国公開特許ＵＳ２００６／１８９６８０Ａ１を参照のこと（参照によってその全体が組み込まれる）。
【０２２２】
別の使用可能な化学療法剤は、ドキソルビシン、またはその化学的誘導体もしくは類似体または薬学的に許容可能なその塩である。代表的類似体または誘導体には、アントラサイクリン、３’−デアミノ−３’−（３−シアノ−４−モルホリニル）ドキソルビシン、ＷＰ７４４（Ｆａｄｅｒｌ、ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００１、２１：３７７７−３７８４）、アンナマイシン（Ｚｏｕ、ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９３、３２：１９０−１９６）、５−イミノ−ダウノルビシン、２−ピロリノドキソルビシン、ＤＡ−１２５（Ｌｉｍ、ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９７、４０：２３−３０）、４−デメトキシ−４′−Ｏ−メチルドキソルビシン、ＰＮＵ１５２２４３および薬学的に許容可能なその塩（Ｙｕａｎ、ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ、２００４、１５：６４１−６４６）が挙げられる。さらなる例は、欧州特許ＥＰ１２４２４３８Ｂ１、米国特許ＵＳ６６３０５７９、オーストラリア公開特許ＡＵ２００１／２９０６６Ｂ２、米国特許ＵＳ４８２６９６４、ＵＳ４６７２０５７、ＵＳ４３１４０５４、オーストラリア公開特許ＡＵ２００２／３５８２９８Ａ１、および米国特許ＵＳ４３０１２７７（これらは参照によってその全体が組み込まれる）を参照のこと。
【０２２３】
他の使用可能な化学療法剤は抗細胞死受容体５抗体および結合タンパク質、ならびにその誘導体であり、抗体断片、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、アビマー、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体およびペプチド結合細胞死受容体５が含まれる。例えば、米国公開特許ＵＳ２００７／３１４１４およびＵＳ２００６／２６９５５４（参照によってその全体が組み込まれる）を参照。
【０２２４】
別の使用可能な化学療法剤は、ボルテゾミブ、またはその化学的誘導体もしくは類似体または薬学的に許容可能なその塩である。代表的類似体または誘導体には、ＭＬＮ−２７３および薬学的に許容可能なその塩（Ｗｉｔｏｌａ、ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ、２００７、ｄｏｉ：１０．１１２８／ＥＣ．００２２９−０７）が含まれる。さらなる可能性については、Ｇｒｏｌｌ、ｅｔ  ａｌ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１４：４５１を参照のこと。
【０２２５】
別の使用可能な化学療法剤は、５−アザ−２’−デオキシシチジン、またはその化学的誘導体もしくは類似体または薬学的に許容可能なその塩である。代表的類似体または誘導体には、他のデオキシシチジン誘導体および他のヌクレオチド誘導体、例えば、デオキシアデニン誘導体、デオキシグアニン誘導体、デオキシチミジン誘導体および薬学的に許容可能なその塩が含まれる。
【０２２６】
別の使用可能な化学療法剤は、ゲニステイン、またはその化学的誘導体もしくは類似体または薬学的に許容可能なその塩である。代表的類似体または誘導体には、７−Ｏ−改変ゲニステイン誘導体（Ｚｈａｎｇ、ｅｔ  ａｌ．、Ｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｄｉｖ．、２００７、４：２４８−２５５）、４’、５、７−トリ［３−（２−ヒドロキシエチルチオ）プロポキシ］イソフラボン、ゲニステイングリコシド（Ｐｏｌｋｏｗｓｋｉ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００４、２０３：５９−６９）、他のゲニステイン誘導体（Ｌｉ、ｅｔａｌ．、Ｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏｄｉｖ．、２００６、４：４６３−４７２；Ｓａｒｋａｒ、ｅｔ  ａｌ．、Ｍｉｎｉ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００６、６：４０１−４０７）または薬学的に許容可能なその塩があげられる。さらなる例は、米国特許ＵＳ６５４１６１３、ＵＳ６９５８１５６、および国際公開特許ＷＯ／２００２／０８１４９１（参照によってその全体が組み込まれる）を参照のこと。
【０２２７】
別の使用可能な化学療法剤は、セレコキシブ、またはその化学的誘導体もしくは類似体または薬学的に許容可能なその塩である。代表的類似体または誘導体には、Ｎ−（２−アミノエチル）−４−［５−（４−トリル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］ベンゼンスルホンアミド、４−［５−（４−アミノフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］ベンゼンスルホンアミド、ＯＳＵ０３０１２（Ｊｏｈｎｓｏｎ、ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、２００５、１０５：２５０４−２５０９）、ＯＳＵ０３０１３（Ｔｏｎｇ、ｅｔ．ａｌ、Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ、２００６、５２：１１７−１２４）、ジメチルセレコキシブ（Ｂａｃｋｈｕｓ、ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．、２００５、１３０：１４０６−１４１２）、および他の誘導体または薬学的に許容可能なその塩（Ｄｉｎｇ、ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００５、１１３：８０３−８１０；Ｚｈｕ、ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００４、６４：４３０９−４３１８；Ｓｏｎｇ、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、２００２、９４：５８５−５９１）が含まれる。さらなる例は、米国特許ＵＳ７０２６３４６（参照によってその全体が組み込まれる）を参照のこと。
【０２２８】
当業者ならプロテアソーム抑制剤（ボルテゾミブに追加して）およびＤＮＡメチル化抑制剤を含む他の化学療法剤が本発明で開示した方法とキットと共に使用可能であることを容易にわかるであろう。他の使用可能な薬剤には、パクリタキセル；セレン化合物；ＳＮ３８、エトポシド、５−フルオロウラシル；ＶＰ−１６、ｃｏｘ−２抑制剤、Ｖｉｏｘｘ、シクロオキシゲナーゼ−２抑制剤、クルクミン、ＭＰＣ−６８２７、タモキシフェンまたはフルタミド、エトポシド、ＰＧ４９０、２−メトキシエストラジオール、ＡＥＥ−７８８、アグリコンプロトパナキサジオール、アプリジン、ＡＲＱ−５０１、亜ヒ酸、ＢＭＳ−３８７０３２、カネルチニブ二塩酸塩、カンホスフアミド塩酸塩、コンブレタスタチンＡ−４プロドラッグ、イドロノキシル、インジスラム、ＩＮＧＮ−２０１、マパツムマブ、モテクサフィンガドリニウム、オブリメルセンナトリウム、ＯＧＸ−０１１、パツピロン、ＰＸＤ−１０１、ルビテカン、ティピファニブ、トラベクテジンＰＸＤ−１０１、メトトレザト、ゼルンボン、カンプトテシン、ＭＧ−９８、ＶＸ−６８０、Ｃｅｆｌａｔｏｎｉｎ、オブリメルセンナトリウム、モテクサフィンガドリニウム、１Ｄ０９Ｃ３、ＰＣＫ−３１４５、ＭＥ−２およびアポトーシス−誘導−リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ−２リガンド）が挙げられる。他の薬剤が、「癌治療におけるアポトーシス新薬競合動向」というタイトルで２００６年１２月にＢｉｏｓｅｅｋｅｒから出版された報告で提供されており、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｚｗｉｚ．ｂｉｏｓｅｅｋｅｒ．ｃｏｍ／ｂｗ／Ａｒｃｈｉｖｅｓ／Ｆｉｌｅｓ／ＴＯＣ＿ＢＳＧ０６１２１９３．ｐｄｆ、で入手可能である。
【０２２９】
また、一般的に、アポトーシス標的に影響を与える任意の薬剤が使用可能である。アポトーシス標的には、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、抗アポトーシスタンパク質のＢＣＬ２ファミリー（例えば、Ｂｃｌ−２）、アポトーシス（ＩＡＰ）タンパク質の抑制剤、ＭＤＭ２、ｐ５３、ＴＲＡＩＬおよびカスパーゼが含まれる。代表的標的には、Ｂ−細胞  ＣＬＬ／リンパ腫２、カスパーゼ３、ＣＤ４分子、細胞質卵巣癌抗原１、真核生物翻訳延長因子２、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＣＡＡＸｂｏｘ、アルファ；ＩｇＥのＦｃ断片；ヒストン脱アセチル化酵素１；ヒストン脱アセチル化酵素２；インターロイキン１３受容体、アルファ１；ホスホジエステラーゼ２Ａ、ｃＧＭＰ刺激ホスホジエステラーゼ５Ａ、ｃＧＭＰ−特異的；タンパク質キナーゼＣ、ベータ１ステロイド５α還元酵素、アルファポリペプチド１；８．１．１５トポイソメラーゼ（ＤＮＡ）Ｉ；トポイソメラーゼ（ＤＮＡ）ＩＩアルファ；チューブリン、ベータポリペプチド；およびｐ５３タンパク質が挙げられる。
【０２３０】
特定の実施形態では、本明細書記載の化合物、例えば、ＥＧＣＧ、は天然に存在し、例えば、自然界より単離できる。従って、特定の実施形態では、化合物は単離または精製された形で、すなわち、天然に存在する形以外の形で使われる。例えば、単離された化合物は、約５０％、３０％、１０％、１％、０．１％または０．０１％未満の自然界の化合物に関連した分子を含んでもよい。化合物の精製した調製物は、分子数または重量で、少なくとも、約５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の化合物を含むことができる。組成物は、基本的に１つまたは複数の本明細書記載の化合物を含むことができる。天然に存在する一部の化合物は、実験室で合成してもよく、この場合、「合成」と称する。これら以外の本明細書記載の化合物は非天然である。
【０２３１】
特定の実施形態で、化学療法剤は、天然ソースから、例えば、緑茶から調製される。
【０２３２】
１、２、３、４、５またはそれ以上の化学療法剤または薬学的に許容可能なその塩を含む医薬品組成物も本明細書で提供されている。医薬品組成物は薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。組成物、例えば、医薬品組成物は、また、ワクチン、例えば、ＤＮＡワクチン、を含んでもよく、さらに任意選択として１、２、３、４、５またはそれ以上のベクター、例えば、他のＤＮＡワクチン剤または他の構築物、例えば、本明細書記載のものを含んでもよい。
【０２３３】
化合物は薬学的に許容可能な塩で提供されてもよい。用語の「薬学的に許容可能な塩」は、当該分野で承認されているものであって、これに限定されないが、相対的に無毒の、治療薬、賦形剤、他の物質、等の組成物の無機、有機酸付加塩を含む。薬学的に許容可能な塩の例には、塩酸や硫酸のような鉱酸由来の塩、およびエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、等のような有機酸由来の塩が挙げられる。適切な塩形成用無機塩基の例には、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、亜鉛、等の水酸化物、炭酸塩、および重炭酸塩がある。また、塩は適切な有機塩基との間でも形成でき、この有機塩基には、無毒でこのような塩を形成するのに十分な塩基強度を有する塩基が含まれる。説明の目的で記載するが、このような有機塩基の種類には、モノ−、ジ−、およびトリアルキルアミン、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、およびトリエチルアミン；モノ−、ジ−またはトリヒドロキシアルキルアミン、例えば、モノ−、ジ−、およびトリエタノールアミン；アミノ酸、例えば、アルギニンおよびリシン；グアニジン；Ｎ−メチルグルコサミン；Ｎ−メチルグルカミン；Ｌ−グルタミン；Ｎ−メチルピペラジン；モルホリン；エチレンジアミン；Ｎ−ベンジルフェネチルアミン；（トリヒドロキシメチル）アミノエタン；等、が挙げられる。例えば、、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、６６：１−１９（１９７７）を参照。
【０２３４】
また、１つまたは複数のＤＮＡワクチン剤および１つまたは複数の化学療法剤、ならびに任意選択で１つまたは複数の他の本明細書記載の構築物を含む組成物およびキットも、本明細書で提供されている。
【０２３５】
治療組成物およびその投与
核酸および核酸またはこの核酸を発現している細胞を含む粒子を含むワクチン組成物を、哺乳類患者に投与できる。ワクチン組成物は、生物学的に有効なおよび／または、治療に有効な量を薬学的に許容可能な担体に入れて投与できる。
【０２３６】
本明細書記載のように、特定の条件が実施例では開示される。組成物は単独でも、別のタンパク質またはペプチド、例えば、免疫賦活性分子、と組み合わせて投与してもよい。治療には、任意の非特異的免疫刺激化合物、例えば、インターフェロン、を含む最も広範な意味で使われる場合のアジュバントの投与を含むことができる。本明細書で意図されているアジュバントには、レゾルシノール、非イオン界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテル、が含まれる。
【０２３７】
治療有効量とは、有効期間投与された場合、所望の免疫学的または臨床的効果が得られる投与量である。
【０２３８】
融合ポリペプチドをコードした核酸の治療有効量は、疾患状態、年齢、性別、および個体重量、およびペプチドの個体で所望の応答を誘発する能力、等の因子により変化する可能性がある。投与計画は、最適治療応答が得られるように調整できる。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与しても、または用量を治療状況の緊急性に応じて減らしてもよい。細胞結合型におけるタンパク質の治療有効量は、タンパク質または細胞等価物に換算して記載することができる。
【０２３９】
従って、ワクチンの有効量は、１キログラムのレシピエント体重当たり約１ナノグラムと約１グラムの間、約０．１mｇ／ｋｇと約１０ｍｇ／ｋｇの間、約１mｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇの間とすることができる。内服に適した剤形には、（後者の用量範囲に対し）１単位当たり約０．１mｇ〜１００mｇの有効成分を含むことができる。有効成分は、組成物の全重量に対する重量で０．５〜９５％の間で変化してもよい。あるいは、本発明のＤＮＡワクチン構築物を移入された細胞の有効量は、約１０４と１０８細胞の間である。免疫療法の専門家なら、必要以上の実験をしないでこの用量を調節できるであろう。
【０２４０】
特定の実施形態では、ＤＮＡの投与経路には、（ａ）腫瘍内、腫瘍周囲、および／または皮内「遺伝子銃」送達、この場合、有効量の金粒子被覆ＤＮＡが既知のレベル、例えば、４００ｐ．ｓ．ｉ．の発射圧力のヘリウム駆動遺伝子銃（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使って送達される；（ｂ）通常のシリンジ針を使った筋肉内（ｉ．ｍ．）注入；および（ｃ）無針注入器（ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ）、例えば、射出装置およびディスポーザブル注入器で構成される注入装置であるＢｉｏｊｅｃｔｏｒ２０００（Ｂｉｏｊｅｃｔ  Ｉｎｃ．、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）、の使用、を含んでもよい。オリフィスサイズにより浸透深さが制御される。例えば、５０mｇのＤＮＡをｎｏ．２シリンジノズルの
Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒを使って送達できる。
【０２４１】
他の投与経路には、次記のものが含まれる。用語の「全身投与」は、患者の循環系への組成物の導入を可能にする、または全身への伝搬を可能にする方法による本明細書記載の組成物またはＤＮＡワクチンのような試薬の投与を指す。「領域性（ｒｅｇｉｏｎａｌ）」投与は、特異的、および幾分限定された、解剖学的空間、例えば、腹腔内、鞘内、硬膜下、または特異的器官への投与を指す。「局所（ｌｏｃａｌ）投与」は、組成物または薬剤の限定された、または限局性、解剖学的空間への投与、例えば、腫瘍塊への腫瘍内注入、皮下注入、皮内または筋肉内注入、を指す。また、当業者なら、局所投与または領域性投与が、循環系への組成物の進入を生じる、すなわち、多かれ少なかれ、これらの投与に全身性を与える可能性があることをわかるであろう。他の投与経路には、経口、鼻腔内もしくは直腸または当技術分野で既知の他の任意の経路が含まれる。
【０２４２】
本発明の目的を達成するために、機能的に活性なＤＮＡを哺乳類体細胞組織または器官にインビボで直接移入することにより核酸治療を完成できる。ＤＮＡ移入は、下記に示す多くの手法を使って成し遂げることができる。これらの系は、選択可能マーカー（例えば、Ｇ４１８耐性）を使ってＤＮＡを発現している形質移入クローンを選択し、続いて、適切なイムノアッセイを使って産物に対する抗体を使って、発現産物を含む抗原の存在を検出（誘導系の場合は、誘導因子で処理後）することにより、インビトロでの発現の成功に関し試験できる。
【０２４３】
また、ＤＮＡ分子、例えば、融合ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、を当技術分野でよく知られている複製欠陥のあるレトロウイルスを産生するパッケージング細胞株を使ってレトロウイルスベクター中にパッケージできる（例えば、Ｃｏｎｅ、Ｒ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６３４９−５３、１９８４；Ｍａｎｎ、ＲＦ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ３３：１５３−９、１９８３；Ｍｉｌｌｅｒ、ＡＤ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ５：４３１−７、１９８５；Ｓｏｒｇｅ、Ｊ、ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４：１７３０−７、１９８４；Ｈｏｃｋ、ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：２５７、１９８６；Ｍｉｌｌｅｒ、ＡＤ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６：２８９５−２９０２（１９８６）。遺伝子移入に対し効率的で安全な新規パッケージング細胞株についても、報告がある（Ｂａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５、２７８、０５６号（参照によって組み込まれる））。
【０２４４】
上述の進め方は、レトロウイルスベクターを部位特異的に選択した組織または器官に送達する場合にも使用できる。従って、例えば、カテーテルデリバリーシステムを使用可能である（Ｎａｂｅｌ、ＥＧ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１３４２（１９８９））。レトロウイルスベクターまたはリポソームベクターを使うこのような方法は、特に、発現させたい核酸を血管壁、または腫瘍の血液循環路に送達するのに有用である。
【０２４５】
投与経路に依存して、酵素、酸および他の化合物を不活性化する可能性のある自然条件の作用から化合物を保護する材料で組成物を被覆してもよい。このように、不活性化を防ぐ材料で組成物を被覆するか、またはこのような不活化を防ぐ材料と組成物を同時投与する必要がある可能性がある。例えば、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼの酵素抑制剤（例えば、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロリン酸およびトラジロール）を使用するか、またはリポソーム（水中油中水型エマルジョンを含む）ならびに従来のリポソーム（Ｓｔｒｅｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ７：２７、１９８４）等の適切な担体に入れてもよい。
【０２４６】
他の本発明の核酸ワクチン組成物のための薬学的に許容可能な担体は、リポソームで、これは、活性タンパク質を脂質層に付着した水性の同心円状層から成る小体中に分散しているか、または多様な存在形態で含まれている医薬品組成物である。活性タンパク質の存在が、水性層および脂質層中でも、その内側でも外側でも、または、なんらかのイベント中でも、一般的にリポソーム懸濁液として知られる不均一系中であってもよい。疎水性層、または脂質層は、限定されない一般論として、リン脂質、例えば、レシチンやスフィンゴミエリン、ステロイド、例えば、コレステロール、程度の差はあるがイオン界面活性物質、例えば、ジセチルリン酸、ステアリルアミンまたはホスファチジン酸、および／または疎水性の他の物質が含まれる。当業者なら、本リポソーム製剤の他の適切な実施形態がわかるであろう。
【０２４７】
化学療法剤を、その化学療法剤が癌治療に投与される用量と同様の用量で投与してもよい。あるいは、より少ない用量、例えば、１０％、３０％、５０％、または２、５、もしくは１０倍少ない用量で使用可能である。通常、化学療法剤の用量は、ＤＮＡワクチンの有効性を高めるのに有効な量で、しかし、著しい免疫抑制または基本的にＤＮＡワクチンの効果を取り消す免疫抑制を生ずる量未満の用量である。
【０２４８】
化学療法剤の投与経路は、薬剤に依存する可能性がある。本明細書記載の方法での使用では、化学療法剤は、既知の方法で使われるように使用可能である。通常、薬剤は、経口で投与されるか、または注入されてもよい。薬剤投与計画は、既知の方法で通常使われるものと同じでもよい。例えば、特定の薬剤は一度に投与され、他の薬剤は、設定された期間の間３日毎に投与され、さらに別の薬剤は、隔日、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎または毎週投与される。実施例では、薬剤ならびにＤＮＡワクチン剤の代表的投与計画が示される。
【０２４９】
本発明の組成物は、同時に、または引き続いて投与してもよい。同時に投与する場合は、異なる構成成分を１つの組成物として投与してもよい。このように、本明細書では、組成物、例えば、１つまたは複数の試薬を含む医薬品組成物も提供される。
【０２５０】
一実施形態では、患者は最初に１つまたは複数の用量の化学療法剤の投与を受け、次に１つまたは複数の用量のＤＮＡワクチンの投与を受ける。ＤＭＸＡＡの場合には、患者に対し最初にＤＮＡワクチン用量を、次に化学療法剤の用量を投与するのが好ましい可能性がある。１、２、３、４、５またはそれ以上の用量のＤＮＡワクチン、および１、２、３、４、５それ以上の用量の化学療法剤を投与してもよい。
【０２５１】
一方法として、患者に別の癌治療、例えば、放射線療法、血管新生抑制試薬および／またはヒドロゲルベースシステム、をさらに受けさせることを含めてもよい。
【０２５２】
本明細書で使用する「薬学的に許容可能な担体」には、任意かつ全ての溶剤、分散媒、コーティング、抗菌と抗真菌試薬、等張性および吸収遅延試薬、等、が含まれる。薬学的に活性物質用のこのような媒質および試薬の使用は、当技術分野でよく知られている。いずれかの従来の媒質や試薬が活性化合物と不適合である場合を除き、治療組成物中にそれらを使用することが意図されている。補充の活性化合物も、また、組成物中に組み入れることができる。
【０２５３】
薬学的に許容可能な希釈剤には、食塩水および水性の緩衝液が含まれる。注入に適する医薬品組成物には、無菌の水溶液（水に溶解する場合は）または分散液および無菌注入可能溶液または分散液を即座に調製するための無菌粉末が含まれる。等張性試薬、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを医薬品組成物に含んでもよい。全てのケースで、組成物は無菌、また液体でなければならない。それは、製造と貯蔵の条件下安定でなければならず、また、微生物、例えば、バクテリアおよび菌類による汚染を防ぐ防腐剤を含まねばならない。また、分散液は、グリセリン、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物ならびにオイル中で調整可能である。通常の貯蔵と使用の条件下のこれらの調整で防腐剤を入れて微生物の増殖を防いでもよい。
【０２５４】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、等）、および適切なこれらの混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散の場合は所定の粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持できる。
【０２５５】
医薬品組成物中の微生物の活動の防止は、種々の抗菌および抗真菌試薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、等により達成できる。
【０２５６】
投与の容易にし、投与量を均一にするため、組成物を投与量単位形で処方してもよい。投与量単位形は、哺乳類患者用の単一用量として適した物理的に離散性の単位を指し、各単位は、必要な医薬品担体と共同して、所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活物質（例えば、核酸ワクチン）を含む。本発明の投与量単位形に対する仕様は、（ａ）活物質の独特の特性および達成されるべき詳細な治療効果、および（ｂ）個別の患者治療と感受性に対するこのような活性化合物の配合の当技術分野で固有の制約、に影響され、また直接に依存する。
【０２５７】
肺注入に対しては、エアロゾル化した溶液が使われる。スプレー可能エアロゾル調製では、活性タンパク質を固体または液体の不活性担体材料と組み合わせてもよい。これは、スクイーズボトルに入れて、または加圧された揮発性の、通常はガス状の噴霧剤と混合してパッケージ化することができる。エアロゾル調製では、溶剤、緩衝液、界面活性剤、および抗酸化剤を本発明のタンパク質のほかに含むことができる。
【０２５８】
本明細書記載の治療可能な疾患には、過剰増殖疾患、例えば、局所的であれ、転移し多ものであれ、癌が含まれる。代表的な癌には、頭頸部癌および子宮頸癌がある。特定の癌に付随する腫瘍関連抗原が存在する場合には、いずれの癌も治療可能である。他の癌には、皮膚癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、硬骨癌、脳癌、ならびに血液癌、例えば、骨髄腫、白血病およびリンパ腫が含まれる。細胞増殖に付随する抗原が存在し、その抗原またはそのホモログがＤＮＡワクチンによってコードされうる場合には、通常、いずれの細胞増殖も治療可能である。
【０２５９】
患者の治療には、患者の治癒または少なくとも１つの疾患の症状の改善、患者の再発の可能性の防止または低減が含まれる。例えば、癌に罹患している患者の治療は、患者の、例えば、約１０％、３０％、５０％、７５％、９０％またはそれ以上の腫瘍量の低減、腫瘍の除去、患者の再発の可能性の防止または低減、または部分的もしくは完全寛解であってもよい。
【０２６０】
本明細書に頻用された全ての文献は、具体的に組み込まれてもそうでなくても、全て参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に引用された、全ての出版物、特許、特許出願、ＧｅｎＢａｎｋ配列およびＡＴＣＣ登録物は、ここに明確に全ての目的のために参照によって組み込まれる。特に、本明細書で参照されている、または１人または複数の本出願の発明者が著している特許、特許出願および他の出版物に記載されている全てのヌクレオチド配列、アミノ酸配列、核酸構築物、ＤＮＡワクチン剤、投与方法、ＤＮＡワクチン剤と試薬の特定の投与順序は、具体的に参照によって本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合には、本出願にある定義が優先される。
【０２６１】
これまで本発明について十分に説明してきたので、本発明の趣旨と範囲を逸脱することなく、また必要以上の実験をすることなく、等価なパラメーター、濃度、および条件の広範な範囲内で、同じことが実行可能であることを当業者ならわかるであろう。
この記載は、下記の実施例によりさらに説明されるが、これがなんらかの制限をするものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２６２】
実施例１：実施例２〜６用材料と方法
Ａ．マウス
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ＫｂおよびＩ−Ａｂ）、５〜６週齢、をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から購入した。卵白アルブミンペプチド、ＳＩＩＮＦＥＫＬ、特異的ＴＣＲを発現するトランスジェニックマウス、ＯＴ−１、をＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。全てのマウスを特異的病原体のない条件下、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）の動物施設中で維持した。動物を研究機関の動物健康管理規則に従って使用し、全ての動物実験手続きは、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓの研究機関の動物管理と使用委員会により承認された。
Ｂ．細胞株
ＴＣ−１細胞またはＴＣ−１ルシフェラーゼを形質導入した（ＴＣ−１ｌｕｃ）細胞の産生と維持については、以前記載した（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．、５６：２１−６（１９９６）；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１８：５７５−８８（２００７））。マウス黒色腫細胞Ｂ１６／Ｆ１０および胸腺腫細胞ＥＬ４（Ｈ−２ｂ）をＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から購入した。Ｈ−２Ｋｂ−ＯＶＡ特異的ＣＴＬの生成のため、１ｘ１０７ＥＧ７細胞（卵白アルブミンｃＤＮＡを形質移入したＥＬ４細胞）を照射し（１０、０００ｒａｄ）、１ｘ１０７ＯＴ−１マウス由来脾臓細胞を添加した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中で６日間培養した。全ての細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ非必須アミノ酸、および０．４ｍｇ／ｍｌＧ４１８を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件で成長させた。
【０２６３】
Ｃ．プラスミドＤＮＡ構築物
ＣＲＴ／Ｅ７（ｐ−ＣＲＴ／Ｅ７）をコードした組換え型プラスミドｐｃＤＮＡ３または卵白アルブミン（ｐ−ＯＶＡ）をコードした組換え型ｐｃＤＮＡ３の生成については、以前に記載した（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、１１２：１０９−１７（２００３）；Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．、１２：６８９−７００（２００５））。ＤＮＡ構築物の正確さをＤＮＡシーケンシングにより確認した。遺伝子銃媒介皮内ワクチン接種のために、２mｇ／マウスの組換えプラスミドＤＮＡ
を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの剪毛した腹腔領域へ、４００ｐ．ｓ．ｉ．の発射圧力のヘリウム駆動遺伝子銃（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使って、以前記載のプロトコルに従って送達した（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６０：１０３５−４２（２０００））。
【０２６４】
Ｄ．組換え型ワクチニアウイルス
野性型ワクチニアウイルス（Ｖａｃ−ＷＴ）を以前記載のように調製した（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：１１６７１−５（１９９５））。ルシフェラーゼ発現ワクチニアウイルス（Ｖａｃ−ｌｕｃ）を、以前記載のプロトコルを使って産生した。これには、ＶＶ（ｔｋ−）のチミジンキナーゼ領域に挿入された２つのレポーター遺伝子（ｌｕｃおよびｌａｃＺ）を含む（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、２４：４６−５７（２００１）に記載されている）。完全長ニワトリＯＶＡ（Ｖａｃ−ＯＶＡ）を発現しているワクチニアウイルスを、以前記載のプロトコルを使って産生した（Ｎｏｒｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６６：４３５５−６２（２００１））。モデル腫瘍抗原ＨＰＶ−１６Ｅ７（Ｖａｃ−ＣＲＴ／Ｅ７）に結合したカルレティキュリン（ＣＲＴ）をコードした組換え型ワクチニアウイルスの産生を、前に記載したものと類似のプロトコルを使って行った（Ｅａｒｌ  ｅｔ  ａｌ．、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、９：５８９−９４（１９９３））。緑蛍光タンパク質（Ｖａｃ−ＧＦＰ）を発現している組換え型ワクチニアウイルスの産生を前に記載したものと類似のプロトコルを使って行った（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６９：２０５−１８（２００４））。
【０２６５】
Ｅ．インビボでのバイオルミネセンス画像処理
ウイルスの複製レベルを、異なる注入経路による投与の腫瘍間で定量的に比較した。ＴＣ−１マウス（腫瘍サイズ＝８〜１０ｍｍ）に、２００mＬのリン酸塩緩衝食塩水中のワク
チニア−ｌｕｃの１ｘ１０７ｐｆｕ／マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）または腫瘍内（ｉ．ｔ．）注入により投与した。バイオルミネッセンス画像処理を、極低温冷却したＩＶＩＳシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ／Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使って、ウイルス注入後１、３、および７日目に行った。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア２．５（Ｘｅｎｏｇｅｎ／Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使って関心領域（ＲＯＩ）として腫瘍を覆った領域をマニュアルで描画した。
【０２６６】
Ｆ．ワクチニア感染ＣＤ３１＋細胞のキャラクタリゼーション
ＴＣ−１含有マウス（腫瘍サイズ＝８〜１０ｍｍ）に、２００mＬのリン酸塩緩衝食塩水
中のワクチニア−ＧＦＰの１ｘ１０７ｐｆｕ／マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）または腫瘍内（ｉ．ｔ．）注入により投与した後に、ワクチニアウイルス感染ＣＤ３１＋細胞の度数を特徴付けした。腫瘍細胞をウイルス注入の２４時間後に採取して、単一の細胞懸濁液を作り、ＣＤ３１染色に供した。
【０２６７】
ＣＤ３１＋細胞の殺作用を評価するため、ＴＣ−１腫瘍をＣ５７ＢＬ／６マウス中で成長させ、腫瘍サイズが８〜１０ｍｍになった時点で採取した。腫瘍を解離させて単一細胞懸濁液とし、２４−ウエルマイクロタイタープレートを使って完全培地中で（３ｘ１０５／ウエル）で播種した。２４時間で、Ｖａｃ−ＷＴまたはＶａｃ−ＯＶＡを０．５ＭＯＩで各ウエルに添加し、４８時間で、完全培地を交換し、ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｔｏ−ｔａｒｇｅｔ比１：１（Ｅ／Ｔ＝１：１）で各ウエルに活性化したＯＴ−１Ｔ細胞を添加した。４時間後、細胞を採取しＰＥ抗マウスＣＤ３１ｍＡｂおよび７−ＡＡＤで染色後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター、とＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）を使って、フローサイトメトリーにより分析した。データは、３ｘ１０５細胞当たりのＣＤ３１＋７−ＡＡＤ−細胞の絶対数として表している。
【０２６８】
Ｇ．異種プライムブースト免疫化
マウス群（群当たり５匹）にＢ１６／Ｆ１０細胞またはＴＣ−１細胞（５ｘ１０４／マウス）をＤａｙ０に接種した。次に、ｄａｙ５に、遺伝子銃を使って、２μｇの対照ｐｃＤＮＡ３、ｐ−ＯＶＡまたはｐ−ＣＲＴ／Ｅ７ＤＮＡでマウスを刺激し、ｄａｙ１２のＶａｃ−ＷＴ、Ｖａｃ−ＯＶＡ、またはＶａｃ−ＣＲＴ／Ｅ７のｉ．ｔ．注入（１ｘ１０７ｐｆｕ／マウス、２００μＬ  ＰＢＳ）により追加免疫した。
【０２６９】
Ｈ．細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー分析によるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の度数評価
Ｅ７−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のキャラクタリゼーションのために、脾細胞および腫瘍の両方の異種移植片を、最後の免疫化の１週間後に採取した。細胞内のサイトカイン染色の前に、２ｘ１０６の各治療群由来のプールした脾細胞およびプールした腫瘍を別々にＨ−２Ｋｂ制限ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ；１．０mＭ）またはＩ−Ａｂ制限ペプチド（ＬＳ
ＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ；１．０mＭ）と共に１６時間インキュベートした。さ
らに、２ｘ１０６の各治療群由来のプールした脾細胞およびプールした腫瘍を、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆物質を検出するためのＭＨＣクラスＩエピトープを含む１μｇ／ｍｌのＥ７ペプチド（ａａ４９−５７）６と共に１６時間インキュベートした（Ｆｅｌｔｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３：２２４２−９（１９９３））。次に、細胞を採取し、以前記載した標準プロトコルを使ってＣＤ８とＩＦＮ−ｇを染色した（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０８：６６９−７８（２００１））。試料をＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使って、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。示した全ての分析をゲーティッドリンパ球集団に対し行った。
【０２７０】
Ｉ．インビトロ細胞障害性アッセイ
ルシフェラーゼ発現ＴＣ−１腫瘍細胞を９６ウエルプレートに２ｘ１０４／ウエルの用量で添加した。２４時間後、Ｖａｃ−ＷＴまたはＶａｃ−ＯＶＡ（ＭＯＩ＝０．５）を各ウエルに添加した。４９時間に、完全培地を交換し、活性化したＯＴ−１Ｔ細胞を１：１のＥ：Ｔ比で各ウエルに添加した。バイオルミネッセンス画像処理を４時間後に行った。腫瘍細胞のＣＴＬ媒介殺作用度合をＩＶＩＳ発光画像処理システムシリーズ２００を使って発光活性の減少により示した。バイオルミネッセンスシグナルは１０秒間採取した。
【０２７１】
Ｊ．統計的分析
統計的分析を、プリズム３．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を使って行った。全てのデータを平均±標準偏差（ＳＤ）として表し、また、少なくとも２つの非依存的実験の代表値である。個別データ点の間の比較は、必要に応じ、スチューデントｔ検定または反復測定ＡＮＯＶＡ（分散分析）検定を使って実施した。腫瘍サイズを、ディジタルキャリパーで週２回治療の間に測定し、腫瘍容量（ｍｍ３）を、下位の式で計算した：（腫瘍長さｘ幅ｘ高さ）／２。マウスの死亡を、２ｃｍを超える腫瘍直径として、自由裁量で定義した。実験群間の生存の差をログランク検定を使って解析した。群間の差の有意性の判定に０．０５以下のｐ値を設定した。
【０２７２】
実施例２：外来性抗原をコードしたＤＮＡで刺激し、同じ外来性抗原をコードしたワクチニアウイルスの細胞内注入で治療した担癌マウスが有意な治療上の抗腫瘍効果をもたらした
ルシフェラーゼ等のマーカー遺伝子をコードしたワクチニアの腫瘍内注入により、腫瘍内にルシフェラーゼの顕著な発現が生じることが最近証明され、ワクチニアの腫瘍内注入により腫瘍細胞を顕著なウイルス感染に導くことが可能であることが示された（図１）。これを受け、ＯＶＡ等の外来性抗原をコードしたＤＮＡで刺激し、同じ外来性抗原をコードしたワクチニアウイルスの腫瘍内注入により治療した担癌マウスに生じた抗腫瘍効果を測定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス群（群当たり５匹）を最初Ｂ１６腫瘍細胞で感作し、次に対照ｐｃＤＮＡ３のみ、または卵白アルブミン（ｐ−ＯＶＡ）をコードしたｐｃＤＮＡ３で刺激した。１週後、マウスを、野性型ワクチニア（Ｖａｃ−ＷＴ）またはＯＶＡ（Ｖａｃ−ＯＶＡ）をコードしたワクチニアの腫瘍内注入により治療した。１ＸＰＢＳで治療した担癌マウスを陰性対照として使用した。治療計画を図２Ａに図示した。図２Ｂに示すように、ｐ−ＯＶＡで刺激し、その後、腫瘍内Ｖａｃ−ＯＶＡ注入した担癌マウスは、他のプライムブースト治療計画での治療に比べ、最良の治療上の抗腫瘍効果を示した。さらに、ｐ−ＯＶＡで刺激し、その後、腫瘍内Ｖａｃ−ＯＶＡ注入した担癌マウスは、他の治療計画による治療に比べて生存の改善を示した（ｐ＜０．０１）（図２Ｃ）。このように、データは、ｐ−ＯＶＡでの治療とその後の腫瘍内Ｖａｃ−ＯＶＡ注入により、Ｂ１６担癌マウスで有意な治療上の抗腫瘍効果および長期生存がもたらされたことを示している。
【０２７３】
同じ治療の手法を別の腫瘍モデルのＴＣ−１を使ってさらに試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス群（群当たり５匹）を最初ＴＣ−１腫瘍細胞で感作し、次に、対照ｐｃＤＮＡ３またはｐ−ＯＶＡで刺激した。１週後、マウスをＶａｃ−ＷＴまたはＶａｃ−ＯＶＡの腫瘍内注入により治療した。ＰＢＳで治療した担癌マウスを陰性対照として使用した。治療計画を図３Ａに図示した。図３Ｂに示すように、ｐ−ＯＶＡでの治療とその後の腫瘍内Ｖａｃ−ＯＶＡ注入で治療した担癌マウスは、他のプライムブースト治療計画での治療に比べ、最良の治療上の抗腫瘍効果を示した。さらに、ｐ−ＯＶＡでの治療とその後の腫瘍内Ｖａｃ−ＯＶＡ注入で治療した担癌マウスは、他の治療計画の治療に比べ生存の改善を示した（ｐ＜０．０１；図３Ｃ）。このように、データは、ｐ−ＯＶＡでの治療とその後の腫瘍内Ｖａｃ−ＯＶＡ注入による治療により、ＴＣ−１担癌マウスで有意な治療上の抗腫瘍効果および長期生存がもたらされたことを示している。
【０２７４】
さらに、この治療の手法をＴＣ−１腫瘍細胞特異的抗原システムを使って、Ｅ７特異的に試験した。ＣＲＴ／Ｅ７ＤＮＡワクチンで皮内ワクチン接種し、その後、ＣＲＴ／Ｅ７をコードしたワクチニアの腫瘍内注入しても、ＴＣ−１担癌マウスで有意な治療上の抗腫瘍効果および長期生存が得られた（図４）。まとめると、データは、外来性抗原特異的ＤＮＡワクチンでの治療と、その後の同じ外来性抗原をコードしたワクチニアの腫瘍内注入により、担癌マウスの２つの異なる腫瘍モデルにおいて、有意な治療上の抗腫瘍効果および長期生存がもたらされることを示している。
【０２７５】
実施例３：外来性抗原をコードしたＤＮＡで刺激し、同じ外来性抗原をコードしたワクチニアを腫瘍内注入で治療した担癌マウスは、有意な度数の外来性抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を生じる
ＤＮＡ刺激および腫瘍内ウイルス性追加免疫モデルを使って、担癌マウス中のＯＶＡに対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を測定するために、前に図２に記載のように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス群（群当たり５匹）を最初Ｂ１６腫瘍細胞で感作し、次に、ｐｃＤＮＡ３またはｐ−ＯＶＡで治療し、その後Ｖａｃ−ＷＴまたはＶａｃ−ＯＶＡの腫瘍内注入で治療した。１ＸＰＢＳで治療した担癌マウスを陰性対照として使用した。ワクチニア注入の７日後に細胞をワクチン接種したマウスの脾臓および腫瘍から採取して、ＩＦＮ−g
の細胞内サイトカイン染色と、それに続くフローサイトメトリー分析を使って、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を調べた。図５に示すように、他の治療計画で治療した担癌マウスに比べて、ｐ−ＯＶＡと、それに続く腫瘍内Ｖａｃ−ＯＶＡ注入による治療を受けた担癌マウスで有意に高い数／パーセンテージのＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が脾臓ならびに腫瘍の両方で生じた。
【０２７６】
異なる抗原システム、Ｅ７を使用する別の腫瘍モデル、ＴＣ−１、で誘発された抗原特異的免疫応答も測定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス群（群当たり５匹）を最初ＴＣ−１腫瘍細胞で感作し、次にｐｃＤＮＡ３またはｐ−ＣＲＴ／Ｅ７ＤＮＡワクチンで皮内刺激した。１週後、マウスをＶａｃ−ＷＴまたはＶａｃ−ＣＲＴ／Ｅ７の腹腔内または腫瘍内注入によって治療した。ＰＢＳで治療した担癌マウスを陰性対照として使用した。他の治療計画で治療した担癌マウスに比べて、ｐ−ＣＲＴ／Ｅ７ＤＮＡで治療し、続けて腫瘍内Ｖａｃ−ＣＲＴ／Ｅ７注入により治療した担癌マウスは、有意に高い数のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を脾臓ならびに腫瘍で生じることが観察された（図６）。まとめると、データは、担癌マウスを外来性抗原特異的ＤＮＡワクチンで治療し、続けて同じ外来性抗原をコードしたワクチニアの腫瘍内注入により治療することにより、脾臓と腫瘍において、最強の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答がもたらされることを示している。
【０２７７】
また、ｐ−ＯＶＡとそれに続く腫瘍内Ｖａｃ−ＯＶＡ注入により治療された担癌マウスのＯＶＡ−特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答も測定した。治療マウスの脾臓中のＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答は、他の治療計画で治療された担癌マウス中のそれと有意に異ならないが、治療マウスの腫瘍内のＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答は、他の治療計画で治療した担癌マウスのものに比べ、有意に高いことが明らかになった（図７）。このように、データは、ｐ−ＯＶＡに続き腫瘍内Ｖａｃ−ＯＶＡ注入による治療が、腫瘍中のＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答の増加をもたらすが、担癌マウスの脾臓では、そうはならないことを示している。
【０２７８】
観察した抗腫瘍効果にとって重要である免疫細胞のサブセットを測定するために、インビボ抗体欠乏実験をｐ−ＯＶＡで治療後、腫瘍内Ｖａｃ−ＯＶＡ注入治療をした担癌マウスを使って行った。ＣＤ８＋Ｔ細胞を欠失したマウスは、両腫瘍モデルの欠乏のない治療マウスに比較して、有意な生存の減少を示すことが明らかになった（図８）。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞欠乏ほど有意ではないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の欠乏が、わずかな生存の減少を示した。まとめると、データは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞が、ｐ−ＯＶＡで治療後、腫瘍内Ｖａｃ−ＯＶＡ注入治療をしたマウスで観察された抗腫瘍効果に関して、重要な役割を演じていることを示している。
【０２７９】
実施例４：ワクチニアを発現しているＯＶＡでの治療は腫瘍細胞を直接死滅させるだけでなく、腫瘍細胞に対しＯＶＡ特異的Ｔ細胞による殺作用の影響をさらに受けやすくする腫瘍細胞のＶａｃ−ＯＶＡによる治療が、腫瘍細胞に対し、ウイルス性腫瘍退縮ならびにＯＶＡ特異的Ｔ細胞媒介殺作用の影響をさらに受けやすくしているかどうかを判断するために、ルシフェラーゼ発現ＴＣ−１腫瘍細胞を使って細胞障害性アッセイを行った。ＴＣ−１／ｌｕｃ腫瘍細胞をＤａｙ０に蒔き、Ｄａｙ１にＶａｃ−ＯＶＡまたはＶａｃ−ＷＴで治療した。次に、図９Ａに示すように、Ｄａｙ２にＯＶＡ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＯＴ−１Ｔ細胞）のある場合と無い場合について細胞を治療した。４時間後、バイオルミネッセンス画像処理システムを使って、各ウエル中のＴＣ−１腫瘍細胞のＣＴＬ媒介殺作用をモニターした。腫瘍細胞のＣＴＬ媒介殺作用の程度を発光活性の減少で示した。図９Ｂに示すように、Ｖａｃ−ＷＴまたはＶａｃ−ＯＶＡ単独と共にインキュベートした腫瘍細胞は、有意なルシフェラーゼ活性の減少を実証し、このことは、ウイルス性腫瘍退縮が腫瘍殺作用に寄与することを示している。さらに、ＯＴ−１Ｔ細胞に結合したＶａｃ−ＯＶＡで治療したＴＣ−１細胞において低いルシフェラーゼ活性が認められたが、Ｖａｃ−ＷＴで治療した細胞ではそれが認められなかった。データは、ＯＶＡ−特異的細胞障害性のＴ細胞媒介殺作用が腫瘍溶解の増加に寄与していることを示している。まとめると、データは、Ｖａｃ−ＯＶＡおよびＯＴ−１細胞による腫瘍細胞の治療により、ウイルス性腫瘍縮退とＯＶＡ特異的細胞障害性Ｔ細胞媒介殺作用の組み合わせによる腫瘍溶解がもたらされうることを示している。
【０２８０】
実施例５：ワクチニアの腫瘍内注入がＣＤ３１＋非腫瘍細胞のワクチニア感染をもたらす
Ｖａｃ−ＯＶＡ治療が、ＣＤ３１＋内皮および間質細胞を含む周辺の非腫瘍細胞に細胞障害性効果を及ぼすかどうかについてさらに調査した。担癌マウス中でワクチニアに感染したＣＤ３１＋非腫瘍細胞の数を測定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス群（群当たり５匹）をＴＣ−１腫瘍細胞に皮下で感作し、Ｖａｃ−ＧＦＰの腫瘍内（ｉ．ｔ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）注入で治療した。腫瘍細胞をワクチニアウイルス注入の２４時間後採取し、ＣＤ３１の染色を行って、フローサイトメトリー分析により特性解析をした。図１０Ａに示すように、Ｖａｃ−ＧＦＰ感染ＣＤ３１＋非腫瘍細胞の割合は、腹腔内注入マウスまたはＰＢＳ治療マウスに比べ、Ｖａｃ−ＧＦＰ腫瘍内注入担癌マウスで有意に高い。このように、データは、ワクチニアの腹腔内注入に比べて、腫瘍内注入によりワクチニア感染ＣＤ３１＋非腫瘍細胞の増加がもたらされることを示している。
【０２８１】
実施例６：ワクチニアＯＶＡによる治療は腫瘍微小環境中の周辺のＣＤ３１＋間質細胞を直接死滅させるだけでなく、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞による殺作用の影響をさらに受けやすくする
Ｖａｃ−ＯＶＡを注入した外植された腫瘍の治療により周辺腫瘍間質由来のＣＤ３１＋非腫瘍細胞がウイルス性腫瘍縮退およびＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介殺作用の影響をより受けやすくなるか否かについてさらに調べた。このために、ｄａｙ０に、外植ＴＣ−１腫瘍細胞を９６ウエルプレートに蒔き、ｄａｙ１にＶａｃ−ＯＶＡまたはＶａｃ−ＷＴで治療した。次に、ｄａｙ２に、細胞をＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＯＴ−１Ｔ細胞）がある場合と無い場合について治療した。４時間後、フローサイトメトリー分析により細胞のＣＤ３１および７−ＡＡＤの発現を解析した。図１０Ｂに示すように、Ｖａｃ−ＷＴまたはＶａｃ−ＯＶＡ単独と共にインキュベートしたＣＤ３１＋細胞は、有意なルシフェラーゼ活性の減少を示すことが認められ、このことは、ウイルス性腫瘍縮退が殺作用に寄与していることを示している。さらに、低いルシフェラーゼ活性がＶａｃ−ＯＶＡおよびＯＴ−１Ｔ細胞で治療したＣＤ３１＋細胞において認められたが、Ｖａｃ−ＷＴで治療した細胞ではこれが認められず、このことは、ＯＶＡ特異的細胞障害性Ｔ細胞媒介殺作用が腫瘍溶解の増加に寄与していることを示唆している。まとめると、データは、ＣＤ３１＋細胞のＶａｃ−ＯＶＡおよびＯＴ−１細胞による治療により、ウイルス性腫瘍縮退とＯＶＡ特異的細胞障害性Ｔ細胞媒介殺作用の組み合わせによる腫瘍溶解が生じることを示している。
【０２８２】
【数１１】
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【０２８３】
【数１２】
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【０２８４】
【数１３】
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【０２８５】
【数１４】
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【０２８６】
【数１５】
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【０２８７】
【数１６】
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【０２８９】
【数１８】
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【０２９０】
【数１９】
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【０２９１】
【数２０】
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【数２１】
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【０２９３】
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【０２９４】
【数２３】
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【数２６】
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【数２７】
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【０２９９】
【数２８】
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【０３００】
【数２９】
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【数４２】
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【数４３】
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【数４４】
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【０３１８】
【数４７】
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【０３１９】
【数４８】
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【０３２０】
【数４９】
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【０３２１】
【数５０】
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【数５５】
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【０３２８】
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【０３２９】
【数５８】
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【０３３０】
【数５９】
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【０３３１】
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【０３３４】
【数６３】
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【数６７】
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【数６８】
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【数７１】
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【数９９】
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【数１０１】
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【数１０２】
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【数１０６】
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【数１０７】
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【数１３３】
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【０４１０】
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【数１５５】
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【０４２７】
【数１５６】
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【０４２８】
【数１５７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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