(57)【要約】【課題】新規微生物キチノファーガ  ｓｐ．１０１１−１４株（受領番号  ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１８２９）および鉄シアノ錯体を含みうる廃水、土壌等から有効に金属シアノ錯体を分解除去できる金属シアノ錯体分解方法を提供すること。【解決手段】鉄シアノ錯体分解能力を有する新規微生物を、好気性環境下で金属シアノ錯体を含有する土壌に適用して前記金属シアノ錯体を分解する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属シアノ錯体分解能力を有する新規微生物キチノファーガ  ｓｐ．１０１１−１４株（受領番号  ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１８２９）。
【請求項２】
請求項１に記載の新規微生物を好気性環境下で金属シアノ錯体を含有する土壌に適用して前記金属シアノ錯体を分解する金属シアノ錯体の分解方法。
【請求項３】
前記金属シアノ錯体が鉄シアノ錯体である請求項２に記載の金属シアノ錯体の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規微生物および金属シアノ錯体分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シアン化合物は、炭素と窒素からなる無機物質であり、土壌汚染対策法（以下、土対法という）においては重金属類として第二種特定有害物質に分類されている。シアン化合物には、シアン化物と金属シアノ錯体と称される化合物群がある。前記シアン化物は、「遊離シアン」とも呼ばれているもので、一般式Ａｎ（ＣＮ）ｘで表され、Ａには水素（Ｈ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、アンモニウム（ＮＨ4）、カルシウム（Ｃａ）
などがあり、シアン化合物の中で最も毒性の高い形態である。また、前記金属シアノ錯体は、シアン化水素の金属塩と金属とが過剰のシアン化物イオン（ＣＮ-）と化合したもの
で、一般式Ａｎ［Ｍ（ＣＮ）ｘ］で表される。ここで、Ｍには銀（Ａｇ）、金（Ａｕ）、カドミウム（Ｃｄ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、鉄（Ｆｅ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）などの金属が該当し、溶液中に溶存、あるいは懸濁状で存在している。
【０００３】
前記シアン化合物は、産業排水等に含まれていることがあり、浄化処理で取り除かれるべき性質の物質である。シアン化合物を排出する工場としては、メッキ工場、選鉱精錬所、鉄鋼熱処理工場、コークス製造工場等がある。これら工場では、シアン化合物を銅、亜鉛、ニッケル、金等の建浴過程や、製品製造過程でシアン化合物が副生されるため、工場内にシアン排水処理設備を設置している。「平成２０年度土壌汚染対策法の施行状況および土壌汚染調査・対策事例等に関する調査結果：平成２２年２月：環境省」（以下、「土対法事例結果」という）によれば、シアン化合物による土壌環境基準超過の業種区分は、金属製品製造業、ガス業、化学工業の順となっている。日本では、中小規模のメッキ工場が多く、全国で約２，０００社以上存在する。その多くは戦後の高度経済成長期に都市部周辺に建設されており、操業時のシアン化合物の漏出や設備の経年劣化によるメッキ浴槽や配管からの漏えいにより、潜在的に調査結果以上の工場敷地内で土壌がシアン化合物によって汚染されていることが予想される。
【０００４】
溶液（排水）中でのシアン化合物の存在形態に関しては、排水処理分野で多くの研究が行なわれており、その形態は大部分が前記遊離シアンと前記金属シアノ錯体であることが報告されている。これらのシアン化合物を含有する排水の処理方法としては、アルカリ塩素法、オゾン酸化法、電解酸化法、紺青法（難溶性錯化合物沈殿法）、酸分解燃焼法、煮詰法（煮詰高温燃焼法）、湿式加熱分解法、および、吸着法などが知られている。しかし、これらの処理方法においては、安定性の高い金属シアノ錯体、たとえば鉄、コバルト、銀、金のシアノ錯体については適用されなかったり、反応条件が過酷で大規模な設備が必要であったり、生成物の処理がさらに必要であったりするという問題があった。そこで、生物機能を利用して環境を修復する技術、所謂、バイオレメディエーション（ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）が注目されており、前記シアン化合物分解能力を有する微生物の検索が行なわれている。
【０００５】
現在、シアン化カリウム、シアン化ナトリウムなどの前記遊離シアンの微生物分解に関しては、遊離シアン分解菌としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．などの微生物が単離、同定されたという報告がある。
【０００６】
そして、前記金属シアノ錯体に関しては、ニッケルシアノ錯体（［Ｋ2Ｎｉ（ＣＮ）4］）を分解する金属シアノ錯体分解微生物として、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｕｍ  ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍ  が報告されている。また、鉄シアノ錯体であるフェロシアン化カリウム（［Ｋ4Ｆｅ（ＣＮ）6］）の分解菌としては、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｉｃｚｙｎｓｋｉが報告されている（いずれも非特許文献１）。また、本願出願人においても、鉄シアノ錯体を分解する種々の金属シアノ錯体分解微生物を単離、同定している（たとえば特許文献１、２等、本願出願人以外の同定例として特許文献３等）。
【０００７】
しかし、前記鉄シアノ錯体を分解する場合に、上記金属シアノ錯体分解微生物は、いずれも好気性条件下で働くものであるため、その金属シアノ錯体分解微生物の施用形態が限られ、ほとんど酸素供給のない土壌中で鉄シアノ錯体を分解することができないなど、実際に用いるうえで、技術的に種々の問題を抱えているため、実用化には至っていない。なお、前記特許文献３に記載されている金属シアノ錯体分解微生物は、嫌気条件下で鉄シアノ錯体を分解する可能性のあるものであるが、分解菌のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｎｕｍｏｎｉａｅ  はＢＳＬ２の病原菌であり、原位置処理法のオーグメンテーション法による嫌気性条件における鉄シアノ錯体分解処理には適さず、やはり、技術的に種々の問題を抱えているため、実用化には至っていない。
【０００８】
また、上述のような事情を鑑みれば、鉄シアノ錯体の浄化は土壌中、特に飽和層まで達した汚染土壌に対して適用されることが望まれる。
汚染土壌の処理の実態としては、土地所有者の心理的要因や、不動産取引における経済的側面を考慮して、完全浄化を目的とした掘削除去を選択することが多い。特に重金属類は、鉛やカドミウム等のようにそれ以上の分解は不可能であり、掘削除去による対策費用は５万円／ｍ3以上の高コストであるにも関わらず、第二種特定有害物質の超過事例の８
３％で掘削除去が採用されている（「土対法事例結果」による）。掘削除去の比率が、８３％と非常に高いのは、原位置浄化技術が確立されていないことも大きな理由である。特に、シアン化合物については、原位置浄化技術が適用できる範囲が限られている。不溶化処理は、長期的なモニタリングを必要とし、開発の際には土地造成が制限される。薬剤添加処理（フェントン法）やオゾン注入処理は、安定なフェロシアン（鉄とシアンの錯体）には適用できないなど、一部の金属シアノ錯体化合物に限られる。掘削除去の場合は、別途掘削土壌の無害化処理が必要であり、セメント原料化を代表とする熱処理や、化学処理である不溶化処理、薬剤添加処理、オゾン分解処理、物理処理である分級洗浄処理がある。前述のように、金属シアノ錯体は分解が容易でなく、熱処理が採用されることが多い。また、その熱処理についても、セメント原料化の場合での受入基準は厳しいものとなっており、専用の熱処理施設に処理を委ねるしか手段がない。したがって、金属シアノ錯体の処理費は、通常の重金属処理費に比べても高価なものになっており、より低コストな処理方法として原位置浄化技術の適用が求められている。
【０００９】
特許文献４には、弱アルカリ性の生育条件下で、鉄シアノ錯体分解能力を有する嫌気性鉄シアノ錯体分解微生物について記載されているが、これらは病原菌または日和見菌であり、開放系の土壌浄化には適さない問題があった。
【００１０】
現状のシアン化合物汚染土壌のバイオレメディエーションは、栄養剤、溶存酸素水および空気を土壌中に注入して微生物活性を促す「注入工法」が行なわれている。しかし、「注入工法」適用には条件があり、汚染サイトが、
＜１＞比較的分解の容易な遊離シアンや銅シアノ錯体の汚染土壌である、なおかつ、
＜２＞注入工法に適した地層条件（透水性が良く、注入物質の移動が容易に行なわれる飽和層）
といった場合において浄化を確認した実証研究段階にとどまっている。
シアン化合物はその形態が多岐にわたり、特に鉄シアノ錯体は非常に安定な物質である。製鉄業やガス事業で問題になっている石炭ガス由来のシアン化合物汚染土壌に含まれるシアン化合物は、ほとんどが鉄シアノ錯体であることが知られている。また、メッキ工場でのシアン汚染土壌は、メッキ浴に使用した重金属による銅シアノ錯体であるが、土壌中には鉄が多く含まれるため、地中に浸透拡散したシアン化合物は鉄シアノ錯体としても存在しており、環境基準達成のためには難分解な鉄シアノ錯体の分解が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０００−２７０８４７号公報
【特許文献２】特開２００２−０８７３０９号公報
【特許文献３】特開２００５−１０２６７１号公報
【特許文献４】特開２００１−２６９１６６号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｃ．Ｊ．  ｅｔ．  ａｌ，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  ＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２：２２３−２３１，（１９９８）
【００１３】
また、このような地中に浸透拡散したシアン化合物を分解除去するために、本発明者らは、新規微生物クロストリジウムクロモレダクタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｈｒｏｍｏｒｅｄｕｃｔａｎｓ）ＥＲ−ＣＬ−１株（寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１４３４）が有用に用いられることを見出している。
【００１４】
しかし、上記微生物は嫌気性において鉄シアノ錯体を分解する性質を有しており、実際の土壌に対して上記微生物を適用するためには、環境を嫌気性に維持するための工夫が別途必要になるため、現実的には取り扱いが困難になる傾向があり、鉄シアノ錯体を分解する性質を有し、かつ、取り扱い容易な微生物が求められていた。
【００１５】
そこで、本発明の目的は、上記実情に鑑み、新規微生物キチノファーガ  ｓｐ．１０１１−１４株（受領番号  ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１８２９）（以下１０１１−１４株と称する）および鉄シアノ錯体を含みうる廃水、土壌等から有効に金属シアノ錯体を分解除去できる金属シアノ錯体分解方法を提供することにある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
〔構成１〕
上記目的を解決するために本発明は、金属シアノ錯体分解能力を有する新規微生物キチノファーガ  ｓｐ．１０１１−１４株（受領番号  ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１８２９）を提供するものである。
【００１７】
〔作用効果１〕
本発明者らは、フェロシアンを唯一の窒素源、グルコースを炭素源として、一般土壌またはシアン汚染土壌を分離源として中性領域のｐＨで好気的に集積培養を行い、フェロシアンを好気的に分解する好気性フェロシアン分解コンソーシアムを得た。
得られた好気性フェロシアン分解コンソーシアムを通常の栄養寒天培地上に展開して得られるコロニーについて、フェロシアンを窒素源とする液体培養を行うことで、フェロシアンを分解して増殖する菌株を得た。この株を解析した結果、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列解析および形態観察、生理・生化学試験の結果から、新規な菌株１０１１−１４株であることが明らかになった。この菌株はＢＳＬ−１のレベルであり、安全に汚染土壌の浄化プログラムに使用できる。
【００１８】
〔構成２〕
また、本発明の金属シアノ錯体の分解方法の特徴構成は、１０１１−１４株を好気性環境下で金属シアノ錯体を含有する土壌に適用して前記金属シアノ錯体を分解する点にある。
【００１９】
１０１１−１４株は、好気性環境下で鉄シアノ錯体を分解する能力を有するので、好気性環境下で金属シアノ錯体を含有する土壌に適用することによって前記金属シアノ錯体を分解することができ、土壌を浄化して無害化できる。ここで、１０１１−１４株は、好気性菌であるから、菌や栄養源の供給路となる部分や土壌自体を嫌気性環境下に維持する必要はなく、取り扱い性よく土壌に適用することができる。
【００２０】
〔構成３〕
尚、前記金属シアノ錯体が鉄シアノ錯体であってもよい。
【００２１】
１０１１−１４株は、鉄シアノ錯体を分解することができるから、土壌中で鉄シアノ錯体として安定化した金属シアノ錯体であっても分解浄化できるものと期待できる。
【発明の効果】
【００２２】
したがって、本発明によると、難分解性の鉄シアノ錯体を含有するシアン錯体廃液や、シアン化合物汚染土壌であっても好適に浄化することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】金属シアノ錯体分解微生物の集積培養結果を示すグラフ
【図２】１０１１−１４株の金属シアノ錯体分解能力を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明者らは、以下のようにして、フェロシアンを唯一の窒素源、グルコースを炭素源として、一般土壌またはシアン汚染土壌を分離源として中性領域のｐＨで好気的に集積培養を行い、フェロシアンを好気的に分解する好気性フェロシアン分解コンソーシアムを得た。得られた好気性フェロシアン分解コンソーシアムを通常の栄養寒天培地上に展開して得られるコロニーについて、フェロシアンを窒素源とする液体培養を行うことで、フェロシアンを分解して増殖する株を得た。以下に新規微生物キチノファーガ  ｓｐ．１０１１−１４株のスクリーニング方法について具体的に示す。
【００２５】
＜実験方法＞
シアン汚染土壌から下記手順にて金属シアノ錯体分解微生物の集積培養を行った。
【００２６】
（１）採取した土壌各１ｇおよび基本合成培地４９ｍＬ、５０ｍＭフェロシアン水溶液１ｍＬをバイアルビンに加え、グルコースを１Ｍとなるように加えたのち、アルゴンガス置換後密栓する。さらに、アルゴン置換した気層からガスタイトシリンジで２０  ｍＬ気体を抜いて酸素を２０  ｍＬ加える。
（３）３０℃で振とう培養１週間する。
（３）１週間培養後の培養液０．５ｍＬを、第二合成培地５０ｍＬに加え３０℃で培養する。（さらに１週間）
（４）さらに１週間培養後の培養液０．５ｍＬをフェロシアン培地５０ｍＬに加え室温で培養する。
【００２７】
（１）〜（４）の工程を行い、（４）の工程におけるフェロシアン濃度の変化を測定した。また、（１）の工程における栄養源にグルコースを加えなかったもの、および、土壌を加えなかったものについても、（１）〜（４）の工程を行い、（４）の工程におけるフェロシアン濃度の変化を測定した。その結果図１のようになった。（それぞれ、グルコースあり、グルコースなし、コントロールと記載）
【００２８】
基本合成（ｓｙｎ）培地
Ｎａ2ＨＰＯ4・・・  ０．１    ％
ＫＨ2ＰＯ4  ・・・  ０．０５  ％
ＮａＣｌ  ・・・・  ０．０５  ％
ＭｇＳＯ4    ・・・  １      ｍＭ
ＣａＣｌ2    ・・・  ０．１  ｍＭ
グルコース・・・・１０      ｍＭ
微量元素溶液・・・１／１０００量
ｐＨ  ７．０
【００２９】
第二合成培地
基本合成培地
生育因子溶液・・・１／１０００量
【００３０】
フェロシアン培地
第二合成培地
フェロシアン化カリ・・・０．５ｍＭ
【００３１】
その結果、グルコースありの場合にフェロシアン分解能力の高いコンソーシアムが形成されていることが分かった。このコンソーシアムを培養後、菌相を解析したところ、ノカルディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ），ブレバンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）が多くみられた。そこで、これらを標的として鉄シアノ錯体分解能力を有する菌の単離を行うこととした。
【００３２】
上記コンソーシアムを寒天培地にて３０℃、３日間培養し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子用プライマーを用いてコロニーＰＣＲを行って塩基配列解析し、菌株を推定した。さらに菌株それぞれを、前記第二合成培地にて１４日間３０℃で培養し、各菌株のシアン分解能力を、１４日培養後の第二合成培地中の残存シアン濃度により求め（図２）、シアン分解能の高い菌株を４株抽出した。これらについては、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列解析および形態観察、生理・生化学試験を実施した。
【００３３】
その結果、各菌株のうち、１０１１−１４株は、キチノファーガ（Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ）属の新種を形成する可能性が考えられ、新規キチノファーガｓｐ．であることが分かった。
【００３４】
＜キチノファーガ属微生物との相同性＞
アポロンＤＢ、ＢＡ９．０に対するＢＬＡＳＴ相同性検索の結果、１０１１−１４株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列はキチノファーガ属の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列に対し高い相同性を示し、キチノファーガ属に含まれるものの、検体に  ９８．７％以上の相同性を示す既知種の基準株に由来する  １６ＳｒＤＮＡ  塩基配列は検索されず、キチノファーガ属の新種を構成する可能性が高いと考えられる。
従って、単離した微生物は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ解析の結果、キチノファーガｓｐ．に帰属する新規な菌株であることが確認された。この新規微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、キチノファーガｓｐ．１０１１−１４株（受領番号  ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１８２９）として寄託されている。
【００３５】
この新規微生物の菌学的性質は、以下の通りである。
（以下の記載で、＋は陽性、−は陰性を示す）
【００３６】
細胞形態：桿菌、
グラム染色性：−、
胞子の有無：−、
運動性：＋
【００３７】
コロニー形態
色調：黄色、
形：円形、
隆起状態：レンズ状、
周縁：全縁、
表面の形状など：スムーズ、
透明度：不透明、
粘稠度：バター様
【００３８】
生育温度試験
３７℃：−、
４５℃：−
【００３９】
カタラーゼ反応：＋、
オキシダーゼ反応：＋、
グルコースからの酸／ガス産生：−／−、
Ｏ／Ｆテスト：−／−
硝酸塩還元：＋、
インドール産生：−、
ブドウ糖酸性化：−、
アルギニンジヒドロラーゼ：−、
ウレアーゼ：−、
エスクリン加水分解：＋、
ゼラチン加水分解：−、
β−ガラクトシダーゼ：＋、
ブドウ糖資化性：＋、
Ｌ−アラビノース資化性：−、
Ｄ−マンノース資化性：＋、
Ｄ−マンニトール資化性：−、
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性：＋、
マルトース資化性：＋、
グルコン酸カリウム資化性：−、
ｎ−カプリン酸資化性：−、
アジピン酸資化性：−、
ｄ１−リンゴ酸資化性：−、
クエン酸ナトリウム資化性：−、
酢酸フェニル資化性：−、
チトクロームオキシダーゼ：＋
【００４０】
嫌気条件下での生育：−、
２％ＮａＣｌでの生育：＋、
マッコンキー寒天での生育：−、
カゼインの加水分解：−、
デンプンの加水分解：−、
リパーゼ活性：−
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の新規微生物および金属シアノ錯体分解方法は、シアン化合物がプルシアンブルーやフェロシアンなど化学的に安定で難分解性の鉄シアノ錯体として存在している工場廃水や工場跡地のシアン化合物汚染土壌の浄化に利用することができる。
【図１】
2015188417.tif 000002
【図２】
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