(57)【要約】【課題】酪酸産生菌を保有する非ヒト動物モデル及びその作製方法の提供。【解決手段】酪酸産生菌が腸内で優勢となった非ヒト動物モデル及びその作製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酪酸産生菌が腸内で優勢となった非ヒト動物モデル。
【請求項２】
動物がマウスである、請求項１記載の非ヒト動物モデル。
【請求項３】
酪酸産生菌が腸内で１０％以上の占有率を示す請求項１又は２記載の非ヒト動物モデル。
【請求項４】
酪酸産生菌がＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）に属する細菌である請求項１〜３のいずれかに記載の非ヒト動物モデル。
【請求項５】
Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）に属する細菌が、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）ＹＩＴ１２３５４（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８３１）又はＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）ＹＩＴ１２３５５（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８３２）である請求項４記載の非ヒト動物モデル。
【請求項６】
難消化性糖類と酪酸産生菌を含有する組成物を動物に投与することを特徴とする酪酸産生菌が腸内で優勢となった非ヒト動物モデルの作製方法。
【請求項７】
難消化性糖類が、イソマルト、イソマルチュロース、Ｄ−ガラクチトール、Ｄ−キシリトール、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、マルチトール、Ｄ−マンニトール、ラクチトール及びガラクトオリゴ糖から選ばれる１種以上である請求項６記載の非ヒト動物モデルの作製方法。
【請求項８】
酪酸産生菌が、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）に属する細菌である請求項６又は７記載の非ヒト動物モデルの作製方法。
【請求項９】
Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）に属する細菌が、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）  ＹＩＴ１２３５４（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８３１）又はＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）ＹＩＴ１２３５５（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８３２）である請求項８記載の非ヒト動物モデルの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酪酸産生菌保有非ヒト動物モデル、その作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酢酸、プロピオン酸、酪酸などの短鎖脂肪酸は、下部消化管において主に食物由来の難消化性糖質が腸内細菌により発酵を受けて産生される。短鎖脂肪酸は大腸粘膜上皮細胞の主要なエネルギー源として利用されるだけでなく、多くの生理作用を示す。特に酪酸は、上皮細胞の増殖促進作用、抗炎症作用、腸管の運動亢進作用など多彩な生理活性を示すと考えられている（非特許文献１及び非特許文献２）。また、酪酸が大腸癌や潰瘍性大腸炎の予防に重要であることが示唆されている（特許文献１）。近年では、下部消化管からの消化管ホルモンの分泌を促進すること（非特許文献３）、経口投与で末梢組織でのエネルギー消費を亢進して肥満を抑制するとともにインスリン抵抗性を改善すること（非特許文献４）等が報告されている。
【０００３】
腸内の酪酸濃度上昇促進剤として、ある種のラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属細菌が知られている（特許文献１）。また、酪酸を産生する細菌としてはＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓに属する細菌、特に、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）（以下、Ａ．ｈａｄｒｕｓ）  ＤＳＭ ３１１９T、Ｂｕｔｙｒａｔｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＳＳＣ／２、Ｂｕｔｙｒａｔｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＳＳ２／１などが知られている（非特許文献５、非特許文献６及び非特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−０８４９０９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hamwe HM et al. Review article: the role of butyrate on colonic function. Aliment Pharmacol Ther. 27:104-119 (2008).
【非特許文献２】Roy CC et al. Short-chain fatty acids: ready for prime time? Nutr Clin Pract. 21:351-366 (2006).
【非特許文献３】Zhou J et al. Peptide YY and proglucagon mRNA expression patterns and regulation in the gut. Obesity. 14:683-689 (2006).
【非特許文献４】Gao Z et al. Butyrate improves insulin sensitivity and increases energy expenditure in mice. Diabetes. 58:1509-1517 (2009).
【非特許文献５】Allen-Vercoe et al. Anaerobe 18 (2012) 523-529
【非特許文献６】Applied and Environmental Microbilogy (2004) p5810-5817
【非特許文献７】J. Bacteriology 2004, 186 (7):2099-2106
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記菌株の酪酸産生量は十分でなく、より酪酸産生能が高い菌が望まれていた。
また、腸内で産生された酪酸が生体にどのような作用を示すかについては、ｉｎ  ｖｉｖｏでの適切な評価系、つまり腸内で酪酸を特異的に増やす系が確立していないため、未だ明らかとなっていない部分が多い。
従って、本発明の課題は、酪酸産生菌を保有する非ヒト動物モデル、その作製方法及びその非ヒト動物モデルの利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、難消化性糖類を添加してヒト糞便を培養すると酪酸の産生量が増大することを見出し、さらに難消化性糖類としてＬ−ソルボース及びＤ−キシリトールを用いてヒト糞便の培養をしてスクリーニングしたところ、Ｌ−ソルボースを基質とした際に、Ａ．ｈａｄｒｕｓの基準株であるＹＩＴ １００９２T（ＤＳＭ ３１１９T）と比較して１．５倍以上の酪酸産生能を有する新たな酪酸産生菌を見出した。また、当該酪酸産生菌と難消化性糖類とを含有する組成物を非ヒト動物に投与すれば、腸内の酪酸産生菌が増加し、酪酸産生菌が腸内で優勢となった非ヒト動物モデルが作製できることも見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔９〕を提供するものである。
【０００９】
〔１〕酪酸産生菌が腸内で優勢となった非ヒト動物モデル。
〔２〕動物がマウスである、〔１〕記載の非ヒト動物モデル。
〔３〕酪酸産生菌が腸内で１０％以上の占有率を示す〔１〕又は〔２〕記載の非ヒト動物モデル。
〔４〕酪酸産生菌がＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）に属する細菌である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の非ヒト動物モデル。
〔５〕Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）に属する細菌が、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）ＹＩＴ １２３５４（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８３１）又はＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）ＹＩＴ １２３５５（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８３２）である〔４〕記載の非ヒト動物モデル。
〔６〕難消化性糖類と酪酸産生菌を含有する組成物を動物に投与することを特徴とする酪酸産生菌が腸内で優勢となった非ヒト動物モデルの作製方法。
〔７〕難消化性糖類が、イソマルト、イソマルチュロース、Ｄ−ガラクチトール、Ｄ−キシリトール、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、マルチトール、Ｄ−マンニトール、ラクチトール及びガラクトオリゴ糖から選ばれる１種以上である〔６〕記載の非ヒト動物モデルの作製方法。
〔８〕酪酸産生菌が、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）に属する細菌である〔６〕又は〔７〕記載の非ヒト動物モデルの作製方法。
〔９〕Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）に属する細菌が、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）  ＹＩＴ １２３５４（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８３１）又はＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）ＹＩＴ １２３５５（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８３２）である〔８〕記載の非ヒト動物モデルの作製方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の非ヒト動物モデルを用いれば、腸内での酪酸の作用が明確になり、酪酸の関与した疾病等の研究に役立てることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】各種難消化性糖類をヒト糞便に添加したときの酪酸産生量を示す。
【図２】１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を基にした分離株の系統解析結果を示す。分離株２株（ＹＩＴ １２３５４及びＹＩＴ １２３５５）を太字で示した。系統樹は近隣接合法で作成し、Bootstrap値が５０％以上（１，０００回反復）であった箇所に数字を記載した。スケールバーはその座位で、０．０１回の塩基置換が起こったことを示す。
【図３】難消化性糖類を基質とした培地で酪酸産生菌を培養したときの酪酸産生量を示す。
【図４】難消化性糖類を基質とした培地で酪酸産生菌を培養したときの総短鎖脂肪酸に占める酪酸の比率を示す。
【図５】マウス糞便中に難消化性糖類及びＡ．ｈａｄｒｕｓ  ＹＩＴ １２３５５を添加した際の酪酸濃度を示す。
【図６】マウス糞便中に難消化性糖類及びＡ．ｈａｄｒｕｓ  ＹＩＴ １２３５５を添加した際の総短鎖脂肪酸に占める酪酸の比率を示す。
【図７】マウスに難消化性糖類及びＡ．ｈａｄｒｕｓ  ＹＩＴ １２３５５を投与後の盲腸内容物中の細菌由来１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＧＧＥプロファイルを示す。
【図８】マウス糞便培養系におけるマルチトール及びＡ．ｈａｄｒｕｓ  ＹＩＴ １２３５５の併用効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の非ヒト動物モデルは、酪酸産生菌が腸内で優勢になった動物である。ここで動物としては、非ヒト動物であればよいが、げっ歯類であるのが好ましく、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等がより好ましく、マウスがさらに好ましい。
【００１３】
酪酸産生菌が腸内で優勢になった状態は、腸内細菌叢における酪酸産生菌の占有率が高くなった状態をいうが、酪酸産生菌の占有率が腸内で１０％以上であるのが好ましく、当該占有率が２０％以上であるのがより好ましい。
【００１４】
本発明の非ヒト動物モデルの腸内で優勢になった酪酸産生菌としては、酪酸を産生する細菌であれば限定されないが、Ａ．ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）に属する細菌が好ましい。
【００１５】
また、前記酪酸産生菌は、Ａ．ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）に属する細菌の中でも、Ｌ−ソルボースを基質とした際の酪酸産生量がＡ．ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）の基準株であるＡ．ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）ＹＩＴ １００９２Tと比較して１．５倍以上の菌であるのがより好ましい。なお、前記酪酸産生菌のＬ−ソルボースを基質とした際の酪酸産生量は、ＹＩＴ １００９２Tの１．５〜２．５倍であるのが好ましく、１．５〜２．０倍であるのがより好ましく、１．５〜１．７倍であるのがさらに好ましい。
さらに、前記酪酸産生菌は、Ｄ−キシリトールを基質として酪酸を産生することができるものが好ましい。
ここで、Ｌ−ソルボース又はＤ−キシリトールを基質とした際の酪酸産生量とは、糖類としてＬ−ソルボース又はＤ−キシリトールのみを添加した培地で培養したときの酪酸産生量である。なお、培地組成及び培養条件は、通常の酪酸産生菌の培養に適した条件であればよいが、例えば菌株の凍結保存液（菌体を１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク−２％グルタミン酸ナトリウム溶液に懸濁した溶液）（菌数：２．０〜５．５×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を融解し、その一部を３３ ｍＭの酢酸ナトリウム及び０．５（ｗ／ｖ）％のグルコースを添加したＰＹ（ｐｅｐｔｏｎｅ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）液体培地（ＰＹＧＡ培地）４ｍＬに１％接種し、３７℃で２４時間嫌気培養した後に、培養液をＰＹＧＡ培地に１％接種し、３７℃で２４時間嫌気培養した後、培養液の一部を、３３ ｍＭの酢酸ナトリウム及び０．５（ｗ／ｖ）％のＬ−ソルボース又はＤ−キシリトールを含むＰＹ培地に１％接種し、３７℃で２４時間嫌気培養した後、培養液中の酪酸濃度を測定すればよい。
なお、培養後の菌数を確認するために、ＰＹＧＡ培地及び／又は３３ ｍＭの酢酸ナトリウム及び０．５（ｗ／ｖ）％のＬ−ソルボース又はＤ−キシリトールを含むＰＹ培地での培養後に濁度（ＯＤ660）を測定することが好ましい。
培養液中の酪酸濃度の測定は、酪酸濃度が測定可能な方法であれば特に限定されないが、例えばイオン排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定することができる。
また、前記酪酸産生菌は、短鎖脂肪酸の種類を多く含む培地（例えば、酢酸、プロピオン酸、イソブチル酸、イソ吉草酸、吉草酸を含むＹＣＦＡ培地）でない、短鎖脂肪酸として酢酸（又はその塩）のみを含有する培地でも酪酸を産生できる性質を有するものが好ましい。
【００１６】
前記酪酸産生菌の具体例としては、Ａ．ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）ＹＩＴ １２３５４（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８３１）（以下、ＹＩＴ １２３５４）、Ａ．ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）ＹＩＴ １２３５５（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８３２）（以下、ＹＩＴ １２３５５）が挙げられる。
【００１７】
前記酪酸産生菌は、例えば難消化性糖類を唯一の糖源として添加した液体培地にヒト糞便の一部を接種して培養した後、培養液を平板培地に播種し、生育したコロニーを釣菌して酪酸産生能力を測定することによりヒト糞便から単離することができる。より具体的には、難消化性糖類を唯一の糖源として添加した液体培地にヒト糞便の希釈液を接種して培養し、一方には難消化性糖類を添加しない液体培地に接種して培養する。培養後、難消化性糖類を唯一の糖源として添加した寒天平板培地に各培養液の一部を播種し、生育したコロニーを観察する。難消化性糖類を添加した液体培地から得られたコロニーを、難消化性糖類を添加しない液体培地から得られたコロニーと比較し、形態が明らかに異なるものを釣菌する。釣菌した菌株を、ＰＹ培地に３３ｍＭの酢酸ナトリウムを添加したＰＹＡ液体培地にＬ−ソルボース等の難消化性糖類を唯一の糖源として添加した液体培地で嫌気培養し、培養液中の酪酸濃度を測定すればよい。ここで、難消化性糖類の添加濃度は０．１〜５．０（ｗ／ｖ）％が好ましく、さらに０．２〜１．０（ｗ／ｖ）％がより好ましく、０．４〜０．６（ｗ／ｖ）％がさらに好ましい。また、培養は３０〜４０℃で１２〜４８時間の嫌気培養を行うのが好ましく、３７℃で２４時間の嫌気培養がさらに好ましい。
【００１８】
前記酪酸産生菌は、幅広い種類の糖質を利用できるが、他の菌が利用しにくいＬ−ソルボース、Ｄ−キシリトール等の難消化性糖類を基質として培養した場合においても酪酸を産生する能力を有する。また、後記実施例のように１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を基に系統解析を行った結果、Ａ．ｈａｄｒｕｓに分類される。基準株Ａ．ｈａｄｒｕｓ  ＹＩＴ １００９２Tと生化学的性状を比較したところ、酵素活性や糖資化性に違いがあることから基準株と相違し、新菌株と同定した。ＹＩＴ １２３５４及びＹＩＴ １２３５５を独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに、それぞれ受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８３１及びＮＩＴＥ  Ｐ−０１８３２として寄託した。
【００１９】
本発明の非ヒト動物モデルは、難消化性糖類と酪酸産生菌を含有する組成物を動物に投与することによって作製することができる。
【００２０】
用いられる難消化性糖類としては、Ｌ−ソルボース、Ｄ−キシロース、イソマルチュロース、ラクチュロース、Ｄ−トレハロース等の単糖、二糖；イソマルト、Ｄ−ガラクチトール、Ｄ−キシリトール、Ｄ−ソルビトール、マルチトール、Ｄ−マンニトール、エリスリトール、ラクチトール等の糖アルコール；ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、ニゲロオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ペクチンオリゴ糖、シクロデキストリン等のオリゴ糖；発芽大麦；イヌリン；難消化性デキストリン；レジスタントスターチ等が挙げられる。このうち、特にイソマルト、イソマルチュロース、Ｄ−ガラクチトール、Ｄ−キシリトール、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、マルチトール、Ｄ−マンニトール、ラクチトール及びガラクトオリゴ糖から選ばれる１種以上が好ましい。
【００２１】
非ヒト動物モデルの作製に用いる酪酸産生菌としては、前記の酪酸産生菌が好ましい。
【００２２】
前記組成物中には、酪酸産生菌を生菌として１０4ｃｆｕ〜１０14ｃｆｕ含有するのが好ましい。また難消化性糖類は、０．０１（ｗ／ｖ）％〜９０（ｗ／ｖ）％、好ましくは、０．０５（ｗ／ｖ）％〜５０（ｗ／ｖ）％含有するのが好ましい。
【００２３】
前記組成物は、酪酸産生菌及び難消化性糖類の他、固体又は液体の動物用医薬用無毒性担体を含有させることができ、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等の形態とすることができる。これらの形態は常套手段により調製することができる。上記の動物用医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
また、前記組成物は、動物用の飼料として使用可能な成分、添加剤を含有することができ、慣用の手段を用いて飼料に適した固体状、液体等の形態とすることができる。これらの形態としては、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等が挙げられる。
【００２４】
前記組成物の投与は、経口、非経口のいずれの方法でも行うことができるが、経口的に行うのが好ましく、その投与量は１日あたり酪酸産生菌として生菌数で１．０×１０4ｃｆｕ以上が好ましく、さらに１．０×１０8ｃｆｕ〜１．０×１０12ｃｆｕがより好ましい。また投与は１回でもよいが、１回／週以上の頻度で２回以上行うのが好ましく、２回／週の頻度で２回（計４回）行うのがより好ましい。
【実施例】
【００２５】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００２６】
実施例１（酪酸産生菌の分離）
（１）ヒト糞便培養による各種難消化性糖類の酪酸産生促進効果
健常成人男性５名（Ａ〜Ｅ）の新鮮排泄糞便をグローブボックス内に搬入し、糞便２０ｇをフィルター付きホモジナイズバッグＰＹＸＯＮ−３０（エルメックス社製）に移した。そこに糞便の９倍量の嫌気置換済０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて１０倍希釈した後、フィルターろ過して残渣を除いて糞便希釈液を調製した。糞便希釈液９．５ ｍＬに、発芽大麦（ＧＢＦ）、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラクチトール、ガラクトオリゴ糖、Ｄ−キシリトール、Ｄ−キシロース、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、マルチトール、Ｄ−マンニトール、フラクトオリゴ糖の各糖類の１０（ｗ／ｖ）％溶液を０．５ｍＬ（糖類の最終濃度０．５（ｗ／ｖ）％）添加し、３７℃で２４時間嫌気培養した。
その結果を図１に示す。図１から、ヒト糞便に難消化性糖類を添加して培養すると、酪酸産生量が増加し、ヒト健常成人糞便中に酪酸産生菌が存在することを確認した。
【００２７】
（２）ＹＩＴ １２３５４及びＹＩＴ １２３５５の分離
健常成人男性２名（Ｃ：３０歳，Ｅ：２９歳）から糞便を採取し、グローブボックス内に搬入した。糞便を十分に均質化した後、一部をフィルター付きホモジナイズバッグＰＹＸＯＮ−３０（エルメックス社製）に移した。そこに糞便の９倍量の嫌気置換済０．１Ｍリン酸Ｎａバッファー（ｐＨ６．８）を加えてホモジナイズし、残渣を除いた。糞便希釈液の一部をＰＹ（表１）、０．５（ｗ／ｖ）％Ｌ−ソルボース添加ＰＹ（ＰＹＳ）、及び０．５（ｗ／ｖ）％Ｄ−キシリトール添加ＰＹ（ＰＹＸ）液体培地に０．５％接種し、３７℃のもと２４時間嫌気培養した。培養後、培養液を嫌気置換したＰＢＳで１０6-7倍希釈し、ＰＹ、ＰＹＳ、及びＰＹＸ寒天平板培地に播種し、３７℃で７２時間嫌気培養した。ＰＹＳ及びＰＹＸ平板培地に生育したコロニーのうち、ＰＹ平板培地上のそれと比較して形態が異なるコロニーを釣菌し、ＰＹＳ及びＰＹＸ液体培地に接種して３７℃で２４時間嫌気培養した。これらの分離株のうち、培養液中に酪酸を産生した株を選抜した。その結果、分離株２株（ＹＩＴ １２３５４及びＹＩＴ １２３５５）を選抜した。
【００２８】
【表１】
2015188368.tif 000002
【００２９】
実施例２（ＹＩＴ １２３５４及びＹＩＴ １２３５５の特徴１）
（１）酪酸産生量
１）各種菌株によるＬ−ソルボース及びＤ−キシリトールからの酪酸の産生
各菌株の凍結保存液（菌体を１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク−２％グルタミン酸ナトリウム溶液に懸濁した溶液）（菌数：２．０〜５．５×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を融解し、その一部を３３ｍＭの酢酸ナトリウム及び０．５（ｗ／ｖ）％のグルコースを添加したＰＹ液体培地（ＰＹＧＡ培地）４ｍＬに１％接種し、３７℃で２４時間嫌気培養した。培養後、培養液の一部を新しいＰＹＧＡ培地に１％接種し、３７℃で２４時間嫌気培養した。培養後、培養液の濁度（ＯＤ660）を測定した。その後、培養液の一部を、ＰＹ培地に０．５（ｗ／ｖ）％のＬ−ソルボース又はＤ−キシリトールと３３ｍＭの酢酸ナトリウムを含む培地（Ｌ−ソルボースを含む培地：ＰＹＳＡ、Ｄ−キシリトールを含む培地：ＰＹＸＡ）に１％接種し、３７℃で２４時間嫌気培養した後、濁度（ＯＤ660）を測定した。培養終了後の培養液中の有機酸濃度はイオン排除ＨＰＬＣで定量した。このとき、酢酸ナトリウムは添加しているがＬ−ソルボース又はＤ−キシリトールは添加しないＰＹ培地（ＰＹＡ培地）で培養したものをブランクとした。
【００３０】
【表２】
2015188368.tif 000003
【００３１】
（ＨＰＬＣ分析条件）
溶離液：１５ ｍＭ過塩素酸−７％アセトニトリル
ｐＨ調整剤：１５ ｍＭ過塩素酸−６０ ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−７％アセトニトリル
分離カラム：有機酸分析用カラムＲＳｐａｋ ＫＣ−８１１×２（昭和電工社製）
カラム温度：４２℃
注入試料量：１０μＬ
流速：１．０ ｍＬ/ｍｉｎ
分析時間：３５分
検出器：Ｗａｔｅｒｓ４３２電気伝導度検出器
セル温度：４５℃
なお、酪酸産生量は（数１）に従って算出した。
【００３２】
【数１】
2015188368.tif 000004
【００３３】
結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
2015188368.tif 000005
【００３５】
表３から、分離株２株のＬ−ソルボース添加時の酪酸産生量はいずれも基準株の１．５倍以上を示した。また、基準株はＤ−キシリトールを資化して酪酸を産生することができない一方で、分離株２株はＤ−キシリトールを基質とした場合に酪酸を産生した。
【００３６】
２）酢酸塩及び乳酸塩を加えた培地で培養した際の酪酸産生量
前記１）に記載した条件と同条件でＰＹＧＡ液体培地にて培養した菌液の一部を、３３ｍＭの酢酸ナトリウムを含むＰＹＡ培地にさらに４０ｍＭの乳酸ナトリウムを加えた培地に１％接種し、３７℃で２４時間嫌気培養した。培養終了後の培養液中の有機酸濃度をイオン排除ＨＰＬＣで分析した。分析条件は前記１）と同じ条件で行った。なお、酪酸産生量は、（数２）に従って算出した。
【００３７】
【数２】
2015188368.tif 000006
【００３８】
結果を表４に示す。
【００３９】
【表４】
2015188368.tif 000007
【００４０】
非特許文献６には、ＹＣＦＡ（３３ｍＭ酢酸＋９ｍＭプロピオン酸＋１．２ｍＭイソブチル酸＋１．０ｍＭイソ吉草酸＋１．０ｍＭ吉草酸）培地に３５ｍＭの乳酸塩を加えた培地で３７℃、２４時間培養した際の既知酪酸産生菌ＳＳ２／１及びＳＳＣ／２の酪酸産生量がそれぞれ１２．９８ｍＭ、１３．４９ｍＭであったことが記載されている。
上記酪酸産生菌は、ＹＣＦＡのような短鎖脂肪酸の種類を多く含む培地でない、短鎖脂肪酸として酢酸（又はその塩）のみを含有する培地でも酪酸を産生できる性質を有することが分かった。また、酪酸産生量自体もＳＳ２／１及びＳＳＣ／２に比べ高かった。
【００４１】
（２）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を基にした分離株の系統解析結果
各菌株の培養液からビーズフェノール法によりＤＮＡを抽出し、１６ＳｒＤＮＡの全長をＰＣＲで増幅した後、配列のほぼ全長をシークエンスした。得られた配列は日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のＦＡＳＴＡ検索に供し、既知菌種の配列データベースと照合した。さらに、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘを用いた近隣結合（ＮＪ）法で分離株の配列を系統解析し、Ｔｒｅｅ−Ｖｉｅｗプログラムを用いて系統樹を作成した。
結果を図２に示す。
【００４２】
ＹＩＴ １２３５４及びＹＩＴ １２３５５の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列（約１，４５０ｂｐ）を基に系統解析を行った結果、いずれもＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｌクラスターXIVａ中のＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ属のサブクラスターに位置し、さらにＡ．ｈａｄｒｕｓ（＝Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ）の基準株であるＡ．ｈａｄｒｕｓ  ＹＩＴ １００９２Tの配列とそれぞれ９９．７％及び９９．８％の相同性を示した。この結果から、ＹＩＴ １２３５４及びＹＩＴ １２３５５は、いずれもＡ．ｈａｄｒｕｓに分類されることがわかった。
【００４３】
（３）各種菌株の生化学性状の比較
各種菌株の生化学性状検査には、市販のアピＺＹＭ、ラピッドＩＤ３２Ａアピ、及びアピケンキ２０Ａ（シスメックス・ビオメリュー(株)）を用いた。検査方法は製品マニュアルに従った。
結果を表５に示す。
【００４４】
【表５】
2015188368.tif 000008
【００４５】
表５から、これら３菌株は類似した性質を示すものの、同一の性質でなく、互いに株レベルで異なることがわかった。なお、３菌株はいずれもグラム陽性の桿菌であった。
これらの結果から、ＹＩＴ １２３５４及びＹＩＴ １２３５５は新規な菌株と判定し、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターにそれぞれ受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８３１及びＮＩＴＥ  Ｐ−０１８３２として寄託した。
【００４６】
実施例３（ＹＩＴ１２３５４及びＹＩＴ１２３５５の特徴２）
ａ）難消化性糖類
難消化性糖類として、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マルチトール、Ｄ−マンニトール、ラクチトール、イソマルト、イソマルチュロース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−ソルビトールを用いた。なお、ＧＯＳ以外は試薬グレードのものを使用した。ＧＯＳは市販のオリゴメイト５５Ｎ（ヤクルト薬品工業）から、活性炭カラムを用いて単糖及び乳糖画分（上部消化管で消化吸収される画分）を除去したものを使用した。具体的には、精製水で膨潤させた活性炭（和光純薬社製）を詰めたカラムに、精製水で希釈した糖液を添加し、２％エタノール溶液でカラムを洗浄した後、５０％エタノール溶液で難消化性画分を溶出し、溶出液を減圧乾燥して得たＧＯＳ糖液を使用した。
ｂ）使用菌株
代表的なヒト腸内酪酸産生菌であるＡ．ｈａｄｒｕｓの基準株であるＡ．ｈａｄｒｕｓ  ＹＩＴ １００９２T（ＤＳＭ ３１１９T）及び分離株２株を使用した。
ｃ）酪酸産生能力の評価
上記の菌株を０．５％Ｄ−グルコースを添加した３３ｍＭの酢酸ナトリウムを含むＰＹＡ培地（ＰＹＧＡ培地）で３７℃２４時間嫌気培養した。培養液の一部を、０．５（ｗ／ｖ）％の各難消化性糖類を含むＰＹＡ培地（試験培地）に１％接種し、３７℃２４時間嫌気培養した。培養終了後、培養液中の有機酸濃度をイオン排除ＨＰＬＣで分析した。分析条件は前記実施例２と同じ条件で行った。有機酸濃度の定量後、各難消化性糖類からの酪酸産生量及び総短鎖脂肪酸に占める酪酸の比率を以下の式に従って算出した。
【００４７】
【数３】
2015188368.tif 000009
【００４８】
結果を図３及び図４に示す。図３及び図４より、ＹＩＴ １２３５４及びＹＩＴ １２３５５は、基準株ＹＩＴ １００９２Tと比較して多くの難消化性糖類を資化することができ、かつ、酪酸産生量も多いことがわかる。また、分離株２株のＬ−ソルボース添加時の酪酸産生量はいずれも基準株の１．５倍以上を示している。さらに、総短鎖脂肪酸に占める酪酸の比率も、基準株ＹＩＴ １００９２Tと比較して酪酸の比率が高いことがわかる。
【００４９】
実施例４（マウス糞便中に各難消化性糖類及びＹＩＴ １２３５５を添加した際の酪酸及び総短鎖脂肪酸に対する酪酸の比率）
マウスの糞便０．８ｇをＰＢＳで１２．５倍希釈し、各種難消化性糖類（ラクチトール、マルチトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｄ−キシリトール）を０．５％、ＰＹＧＡ培地で前培養したＹＩＴ １２３５５を１．０％添加した後、３７℃で２４時間嫌気培養した。また、各種消化性糖類を添加しない培地も同様に培養した。培養終了後、培養液中の有機酸濃度をイオン排除ＨＰＬＣで分析した。分析条件は前記実施例２と同じ条件で行った。有機酸濃度の定量後、（数３）と同様の式に従って酪酸産生量と酪酸の比率を算出した。
その結果を図５及び図６に示す。図５及び図６に示すように、難消化性糖類の単独添加時及び本発明の酪酸産生菌単独添加時に比べて、酪酸産生菌と難消化性糖類を組み合わせることで、酪酸産生が大きく亢進される。また、総短鎖脂肪酸に対する酪酸の比率も同様に、難消化性糖類の単独添加時及び本発明の酪酸産生菌の単独添加時に比べて、これらを組み合わせることで大きく高まる。
【００５０】
実施例５（難消化性糖類を摂取させたマウスへのＹＩＴ １２３５５の反復経口投与試験）
１）試験設計
全体の試験スケジュールを表６に示した。マウスは１週間Ｆ２飼料（フナバシファーム社製）で馴化飼育した後、各群の平均体重がほぼ等しくなるように６群に分けた。その後、１週間対照食（表７）を投与し、難消化性素材を含む精製飼料に切り替えて２週間投与した。ＹＩＴ １２３５５の生菌懸濁液は２回／週、計４回経口ゾンデ投与した。試験最終日に解剖し、盲腸及び結腸内容物を回収して有機酸濃度を調べた。また、腸管内容物中のＹＩＴ １２３５５の菌数を定量ＰＣＲ法にて測定するとともに、腸内菌叢全体の変化をＰＣＲ−ＤＧＧＥ（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法を用いて調べた。
【００５１】
＜試験系＞
使用動物  ：  マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ（４週齢：日本クレア）
試験期間  ：  ３週間
使用した難消化性糖類  ：  ラクチトール、マルチトール
難消化性糖類の投与量：  ５％（ｗ／ｗ）
投与菌株  ：  ＹＩＴ １２３５５
菌投与量  ：生菌投与量  ３．９〜６．９×１０8ｃｆｕ／マウス（生食懸濁液のゾンデ投与）。死菌を含めた総菌数では、３．６〜４．６×１０9ｃｆｕ／マウス。
群構成    ：  ６群（５匹／群）
−／−群,  対照
ＡＨ／−群，  ＹＩＴ １２３５５単独投与
−／ＬＡＣ群，ラクチトール単独投与
−／ＭＡＬ群，マルチトール単独投与
ＡＨ／ＬＡＣ群，  ＹＩＴ １２３５５及びラクチトール共投与
ＡＨ／ＭＡＬ群，  ＹＩＴ １２３５５及びマルチトール共投与
飼料組成  ：  ＡＩＮ−９３Ｇをベースとする精製飼料（表７）
測定項目  ：  盲腸内菌叢解析（定量ＰＣＲ法による投与菌の菌数測定、ＤＡＰＩカウント法による総菌数測定、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法による菌叢変化観察）
【００５２】
【表６】
2015188368.tif 000010
【００５３】
【表７】
2015188368.tif 000011
【００５４】
２）投与菌（ＹＩＴ １２３５５）の調製及び菌数測定
ＹＩＴ １２３５５は、ＰＹＧＡ培地により３７℃で２４時間培養した後、遠心ペレットを１０％スキムミルク−２％グルタミン酸ナトリウム溶液に懸濁し、−８０℃で凍結したものを凍結保存ストックとした。ＹＩＴ １２３５５の投与菌液の調製は、この凍結保存ストックを用いて以下のように行った。
ＹＩＴ １２３５５の凍結保存ストック液を融解し、４ｍＬのＰＹＧＡ培地に１％接種し、３７℃で２４時間嫌気培養した。培養液の一部を、同じ組成の培地５６ｍＬに１％植菌し、３７℃で２４時間嫌気培養した。菌液を４℃のもと、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除いた。予め嫌気置換しておいた冷生理食塩水３０ｍＬを加えてペレットを再懸濁し、遠心して上清を除いた。ペレットを６ｍＬの冷生理食塩水で再懸濁して投与菌液とした。なお、菌体の懸濁はグローブボックス内で行った。
菌液を嫌気置換した生理食塩水で段階希釈し、ＰＹＧＡ平板培地に播種して３７℃で２４時間嫌気培養した後、コロニーをカウントして生菌数を算出した。総菌数は、菌液の一部を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液で固定した後、ＤＡＰＩカウント法により測定した。
【００５５】
３）腸管内容物の採取
被験飼料の投与２週目にマウスをジエチルエーテルで麻酔し、頸椎脱臼にて安楽死させた。開腹して盲腸組織及び結腸組織を摘出し、内容物を回収した。盲腸及び結腸内容物はＰＢＳにより１０倍希釈し、ＤＮＡの抽出に供した。
【００５６】
４）腸管内容物中の菌叢解析
ａ）定量ＰＣＲ法によるＹＩＴ １２３５５の菌数測定
腸管内容物の１０倍希釈液からビーズフェノール法によりＤＮＡを抽出した。すなわち、腸管内容物の希釈液２００μＬに０．３ｇのガラスビーズ（直径０．１ｍｍ）と３００μＬのＴｒｉs−ＳＤＳ溶液（２５０ｍＬの２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ８０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ９．０と５０ｍＬの１０％ＳＤＳを混合した溶液）、及び５００μＬのＴＥ飽和フェノールを加えてＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０（パワーレベル５．０）により３０秒間激しく振とうした。１５，０００ｒｐｍで５分間遠心した後、４００μＬの上清にフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液４００μＬを加え、ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０（パワーレベル４．０）により４５秒間振とうした。１５，０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清２５０μＬに２５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）及び２５０μＬのイソプロパノールを加えて混合した。１５，０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を除き、５００μＬの７０％エタノールを加えて再度１５，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を除いてペレットを乾燥させ、１．０ｍＬのＴＥバッファーに溶解した。得られたＤＮＡ溶液を精製水で１０倍希釈し、鋳型ＤＮＡ溶液とした。定量ＰＣＲには、７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いた。反応液は、総量を２０ μＬとし、１．０ μＭの各プライマーを含むＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（タカラバイオ(株)）と鋳型ＤＮＡ溶液を混合した後、定量ＰＣＲに供した。反応条件は、９５℃で２分間加熱した後、９５℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で５０秒間の反応を１サイクルとしてこれを４０サイクル繰り返し、７２℃で３分間反応させた。さらに、これに引き続きＴｍ値解析のため、６０℃で１分間反応させた後、０．２℃/秒の温度勾配で９５℃まで温度を上昇させ、このときのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光を測定して増幅産物の２本鎖が解離するときの温度（Ｔｍ）を測定した。定量ＰＣＲに使用したＡ．ｈａｄｒｕｓ特異的プライマーの配列を表８に示した。なお、Ａ．ｈａｄｒｕｓの定量に使用する検量線は、一定菌数に調製したＡ．ｈａｄｒｕｓ  ＹＩＴ１２３５５の菌体から抽出したＤＮＡを鋳型に用いて作製した。
【００５７】
【表８】
2015188368.tif 000012
【００５８】
腸管内容物の１０倍希釈液の一部を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液で固定した後、ＤＡＰＩカウント法により総菌数を測定した。上記のＹＩＴ １２３５５の菌数を総菌数で除して占有率（％）を算出した。
【００５９】
【数４】
2015188368.tif 000013
【００６０】
ｃ）ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法による盲腸内容物中の菌叢解析
上記４）−ａで抽出したＤＮＡを群ごとにプールし、これを鋳型にしてＧＣクランプを付与したプライマー（表９）により細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子断片（Ｖ３，Ｖ４領域含む）をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ条件は５０μＬの反応液中に５μＬの１０×ＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、１μＬのＢＳＡ（２０ｍｇ／ｍＬ）溶液、２μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＬの２５  ｐｍｏｌ／μＬプライマー溶液、１．２５ｕｎｉｔｓの  Ｅｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＨＳ（タカラバイオ社）、０．１ｎｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡで行った。温度条件は９４℃５分、（９４℃２０秒、５５℃４５秒、７２℃１分）×３０サイクル、７２℃７分で行った。増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した後、１ｗｅｌｌあたり２００ｎｇのＤＮＡをゲルにアプライした。Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｆｏｒｍｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で３５−５０％の変性剤の濃度勾配（ここでは１００％変性剤とは７Ｍのｕｒｅａと４０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅの混合物）をつけた８％アクリルアミドゲル（８％Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ／Ｂｉｓ（３７：５：１）、１×ＴＡＥ（ｐＨ８．０）、０．１％ＴＥＭＥＤ、０．１％Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）を用いて６０℃、１３０Ｖで５分間泳動した後、７０Ｖで１６時間泳動した。泳動後、ＧｅｌＲｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）で染色し、ＵＶランプ下でバンドを確認撮影した。なお、Ａ．ｈａｄｒｕｓ  ＹＩＴ １２３５５に由来するバンドを特定するため、本菌株の純粋培養菌体から抽出したＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、泳動サンプルとした。
【００６１】
【表９】
2015188368.tif 000014
【００６２】
腸内の総菌数及びＹＩＴ １２３５５の菌数、ならびにＹＩＴ １２３５５の占有率の測定結果を表１０に、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法による盲腸内容物中の菌叢解析結果を図７に示す。
【００６３】
【表１０】
2015188368.tif 000015
【００６４】
表１０より、ＹＩＴ １２３５５のみ、又は難消化性糖類のみの投与では、腸内のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数及び占有率ともに大きな変化はないが、酪酸産生菌と難消化性糖類とを組み合わせて投与することで、Ａ．ｈａｄｒｕｓの菌数及び占有率が大幅に上昇することが分かった。
【００６５】
また、図７より、ＡＨ／ＬＡＣ群及びＡＨ／ＭＡＬ群でＹＩＴ １２３５５に由来するバンド（図７の枠部分）が増加したため、酪酸産生菌と難消化性糖類とを組み合せて投与することで、腸内の菌叢全体の変化で観察した際にも本発明の酪酸産生菌が特異的増加することが確認できた。
【００６６】
実施例６（難消化性糖類を摂取させたマウスへのＹＩＴ １２３５５の単回経口投与試験）
１）試験設計
表１１に群構成と試験スケジュールを示した。マウスは１週間Ｆ２飼料で馴化飼育した後、各群の平均体重がほぼ等しくなるように４群に分けた。対照食（表１２）を１週間投与した後、対照群（−／−群）及びＡＨ／−群には対照食を、−／ＭＡＬ群及びＡＨ／ＭＡＬ群にはマルチトールを含む精製飼料（ＭＡＬ含有食）を２週間投与した。ＹＩＴ １２３５５の生菌懸濁液は１週間の対照食を投与した後に単回ゾンデ投与した。試験最終日に解剖し、盲腸内容物を回収した。盲腸内容物はＹＩＴ １２３５５の菌数測定に供した。
【００６７】
＜試験系＞
被験素材：マルチトール（５％混餌投与）
投与菌株：ＹＩＴ １２３５５
動物種  ：マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ（４週齢：日本クレア）
群構成  ：７匹×４群
−／−群,  対照
ＡＨ／−群,  ＹＩＴ １２３５５単独投与
−／ＭＡＬ群,  マルチトール単独投与
ＡＨ／ＭＡＬ群,  ＹＩＴ １２３５５及びマルチトール共投与（表１１参照）
試験期間：３週間（対照食１週間  ＋  試験食もしくは対照食２週間）
菌投与法：生菌の生食懸濁液の単回ゾンデ投与
飼料組成：ＡＩＮ−９３Ｇをベースとする精製固形飼料（表１２）
測定項目：盲腸内菌叢（投与菌の菌数及び占有率）
【００６８】
【表１１】
2015188368.tif 000016
【００６９】
【表１２】
2015188368.tif 000017
【００７０】
２）投与菌（ＹＩＴ １２３５５）の調製及び菌数測定
投与菌であるＹＩＴ １２３５５の生菌懸濁液は前記実施例５、２）と同様に行った。
【００７１】
３）ＹＩＴ １２３５５の投与
上記２）で調製した菌液（生菌数３．１×１０9ｃｆｕ／ｍＬ，総菌数１．９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をマウスに０．２ｍＬ（生菌数６．２×１０8ｃｆｕ／マウス，総菌数３．８×１０9ｃｅｌｌｓ／マウス）単回経口ゾンデ投与した。対照群及び−／ＭＡＬ群には菌液の代わりに０．２ｍＬの生理食塩水を投与した。
【００７２】
４）検体採取
試験開始３週目（菌液ゾンデ投与２週目）に、ソムノペンチル麻酔下で開腹して下大静脈から全採血し、安楽死させた。その後、盲腸内容物を回収した。盲腸内容物はＰＢＳで１０倍希釈し、ＤＮＡ抽出に供した。
【００７３】
５）盲腸内容物中のＹＩＴ １２３５５の菌数測定
５）−１  定量ＰＣＲ法によるＹＩＴ １２３５５の菌数測定
腸管内容物の１０倍希釈液から前記実施例５、４）ａ）に記載のビーズフェノール法によりＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを鋳型にして、前記実施例５、４）ａ）に記載の菌種特異的プライマーを用いた定量ＰＣＲ法によりＹＩＴ １２３５５の菌数を測定した。
５）−２  腸内の総菌数に対するＹＩＴ １２３５５の占有率の測定
腸管内容物の１０倍希釈液の一部を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液で固定した後、ＤＡＰＩカウント法により総菌数を測定した。上記のＹＩＴ１２３５５の菌数を総菌数で除して占有率（％）を算出した。
【００７４】
【数５】
2015188368.tif 000018
【００７５】
腸内の総菌数ならびにＹＩＴ １２３５５の菌数及びＹＩＴ １２３５５の占有率の測定結果を表１３に示す。表１３より、単回投与で行った場合も反復投与と同様に、ＡＨのみ、又は難消化性糖類のみでは、菌数、占有率は大きな変化はないが、酪酸産生菌と難消化性糖類とを組み合わせて投与することで、菌数、占有率が大幅に上昇する。
【００７６】
【表１３】
2015188368.tif 000019
【００７７】
実施例７（Ａ．ｈａｄｒｕｓの菌数増加と酪酸濃度との対応に関する試験）
実施例６の単回投与試験における試験開始１週間後のマウス新鮮糞便０．８ｇをサンプルチューブに採取し、低温・嫌気状態を保ったままグローブボックス内に搬入した。予め嫌気置換したＰＢＳで希釈し（最終１２．５倍希釈）、マルチトール溶液（最終濃度０．５％）及び／又はＹＩＴ １２３５５の培養菌液（１％接種）を添加した後、３７℃で２４時間嫌気培養した。培養後の酪酸濃度は、電気伝導度検出器を用いたイオン排除ＨＰＬＣを用いて測定した。
【００７８】
結果を図８に示す。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、酪酸産生菌と難消化性糖類とを併用すると、菌数増加とともに、酪酸濃度が増加する。
【００７９】
実施例５〜７の結果より、難消化性糖類の単独添加では、ＹＩＴ １２３５５の菌数は１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ未満であり、酪酸濃度も増加しなかった。一方、ＹＩＴ １２３５５の単独投与では、ＹＩＴ １２３５５の菌数が増加し、それに伴い、酪酸濃度も増加した。さらに、難消化性糖類とＹＩＴ １２３５５を組み合わせると、Ａ．ｈａｄｒｕｓの菌数は、ＹＩＴ １２３５５の単独投与時と比べ１００倍程度増加し、菌数の増加に伴い酪酸濃度も上昇した。これにより、酪酸産生菌と難消化性糖類とを併用すると、菌数増加とともに、酪酸濃度も増加することがわかった。
【図１】
2015188368.tif 000020
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2015188368.tif 000025
【図７】
2015188368.tif 000026
【図８】
2015188368.tif 000027
【配列表】
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