(57)【要約】【課題】細胞を複数の培養容器に順に移し替えて培養する場合に、コンタミネーションのリスクを低減すると共に、培養容器内における細胞の残存を減少させることを可能とする。【解決手段】他の容器との内容物移送用ポートを二つ有する培養面積の異なる複数の培養容器２ａ，２ｂ，２ｃを用い、最も培養面積の小さい第一培養容器２ａに細胞及び培地を含む細胞懸濁液を収容し、培養容器に培地を供給する培地容器１に培養容器を培養面積の小さい順にチューブでループ状に接続して細胞培養を開始し、第一培養容器での培養が終了した後、第一培養容器に接続された第二培養容器２ｂに培養された細胞を含む細胞懸濁液を移送し、第一培養容器を流路として第二培養容器に培地容器から培地を供給して第二培養容器で細胞培養を行い、上記の細胞懸濁液の移送、培地の供給、及び細胞培養を、残りの培養容器について繰り返して行う。【選択図】  図３
2015188391.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の培養容器を用いて、接着系の細胞を培養する細胞培養方法であって、
前記複数の培養容器として、それぞれ他の容器との内容物の移送用のポートを二つ有する培養面積の異なる培養容器を用い、
前記複数の培養容器における培養面積の最も小さい第一の培養容器に細胞及び培地を含む細胞懸濁液を収容し、前記複数の培養容器に培地を供給する培地供給容器に前記複数の培養容器を培養面積の小さい順にチューブを用いてループ状に接続して、前記第一の培養容器において細胞の培養を開始し、
前記第一の培養容器での培養が終了した後、前記第一の培養容器に接続された第二の培養容器に前記第一の培養容器から培養された細胞を含む細胞懸濁液を移送し、
前記第一の培養容器を流路として、前記第二の培養容器に前記培地供給容器から培地を供給して、前記第二の培養容器において細胞の培養を行い、
前記第二の培養容器での培養が終了した後、培養が終了した培養容器に接続された次の培養容器がある場合、前記次の培養容器への細胞懸濁液の移送、前記培養が終了した培養容器を流路としての前記次の培養容器への培地の供給、及び前記次の培養容器における細胞の培養を、前記培養が終了した培養容器に接続された前記次の培養容器がなくなるまで、繰り返して行う
ことを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２】
培養された細胞を前記培養容器内の底面から剥離するための酵素溶液を前記培養容器に供給する酵素溶液供給容器を、前記培地供給容器と前記第一の培養容器の間にチューブを用いて接続し、
前記酵素溶液供給容器から前記培養容器に酵素溶液を送流し、培養された細胞を前記培養容器内の底面から剥離して、培養された細胞を含む細胞懸濁液の移送を行う
ことを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
酵素の活性を阻害するための阻害剤溶液を前記培養容器に供給する阻害剤溶液供給容器を、前記培地供給容器と前記第一の培養容器の間にチューブを用いて接続し、
前記酵素溶液供給容器から前記培養容器に前記酵素溶液を送流し、細胞を前記培養容器内の底面から剥離した後に、
次いで前記阻害剤溶液供給容器から前記培養容器に前記阻害剤溶液を送流し、酵素を活性阻害させた後に、培養された細胞を含む細胞懸濁液の移送を行う
ことを特徴とする請求項２に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
前記培養容器からの廃液を回収する廃液回収容器を、前記培地供給容器と最後に接続された培養容器の間にチューブを用いて接続し、
前記第一の培養容器での培養が終了した後、前記第一の培養容器から培地を前記廃液回収容器に回収して、前記第一の培養容器から前記第二の培養容器への細胞懸濁液の移送を行い、
前記第一の培養容器を流路として、前記第二の培養容器に前記培地供給容器から培地を供給し、
細胞が前記第二の培養容器内の底面に接着した後、前記第二の培養容器から酵素溶液、阻害剤溶液及び培地を前記廃液回収容器に回収し、
前記第一の培養容器を流路として、前記第二の培養容器に前記培地供給容器から培地を再度供給し、前記第二の培養容器において細胞の培養を行い、
前記第二の培養容器での培養が終了した後、培養が終了した培養容器に接続された次の培養容器がある場合、前記培養が終了した培養容器からの培地の回収、前記次の培養容器への細胞懸濁液の移送、前記培養が終了した培養容器を流路としての前記次の培養容器への培地の供給、前記次の培養容器からの酵素溶液、阻害剤溶液及び培地の回収、前記培養が終了した培養容器を流路としての前記次の培養容器への培地の再度の供給、及び前記次の培養容器における細胞の培養を、前記培養が終了した培養容器に接続された前記次の培養容器がなくなるまで、繰り返して行う
ことを特徴とする請求項３に記載の細胞培養方法。
【請求項５】
前記複数の培養容器の間のチューブと、前記廃液回収容器と前記最後に接続された培養容器の間のチューブとを、一又は二以上の連結チューブを用いて接続し、
前記連結チューブを介して、前記複数の培養容器からの酵素溶液及び培地の回収を行う
ことを特徴とする請求項４に記載の細胞培養方法。
【請求項６】
前記培地供給容器に接続された第一の培養容器と、
前記第一の培養容器に接続された第二の培養容器と、その他に接続された培養容器がある場合は、これらのその他の培養容器とを、前記培地供給容器により近く接続されたものほど相対的に高い位置に配置し、
それぞれの前記培養容器を傾けることで、前記培養容器から次に接続された培養容器への細胞懸濁液の移送を行う
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項７】
前記培地供給容器を、前記複数の培養容器よりも相対的に低い位置に配置することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項８】
一端縁に設けられた回動軸を基台に軸支した平板状の一又は二以上の保持板を有する積載部に前記複数の培養容器を別個に又は一括して保持し、
前記回動軸を中心に前記保持板を上方に回動させることにより、前記複数の培養容器を別個に又は同時に傾けつつ初期位置よりも上方に移動させ、
次いで、前記回動軸を中心に前記保持板を下方に回動させて、前記複数の培養容器が別個に又は同時に初期位置に戻る際に前記保持板を前記基台に当接させることによって、前記複数の培養容器に加える振動を生じさせる請求項１〜７のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項９】
接着系の細胞を培養するための複数の培養容器を備えた細胞培養システムであって、
前記複数の培養容器に培地を供給する培地供給容器と、
前記複数の培養容器として、それぞれ他の容器との内容物の移送用のポートを二つ有する培養面積の異なる培養容器を備え、
前記培地供給容器に前記複数の培養容器が培養面積の小さい順にチューブを用いてループ状に接続された
ことを特徴とする細胞培養システム。
【請求項１０】
培養された細胞を前記培養容器内の底面から剥離するための酵素溶液を前記複数の培養容器に供給する酵素溶液供給容器が、前記培地供給容器と前記培地供給容器に接続された培養容器の間にチューブを用いて接続され、
酵素の活性を阻害するための阻害剤溶液を前記培養容器に供給する阻害剤溶液供給容器が、前記培地供給容器と前記培地供給容器に接続された培養容器の間にチューブを用いて接続された
ことを特徴とする請求項９に記載の細胞培養システム。
【請求項１１】
一端縁に設けられた回動軸を基台に軸支した平板状の一又は二以上の保持板を有する積載部と、
前記保持板をフォロワとするカム機構と、を備え、
前記複数の培養容器が別個に又は一括して前記積載部に保持されて、
前記カム機構により前記回動軸を中心に前記保持板を上下に繰り返し回動させるとともに、前記保持板が下動して前記基台に当接したときに生じる振動を前記複数の培養容器に別個に又は同時に加えることにより前記複数の培養容器の内容液を撹拌する
ことを特徴とする請求項９又は１０に記載の細胞培養システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で培養する細胞培養方法、及び細胞培養システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。このような細胞培養にあっては、培地内の細胞密度が高くなるにつれて、増殖に必要な成分の枯渇、細胞自身の代謝産物の蓄積が起こり、増殖速度が低下し細胞密度は飽和に達してしまう。このため、細胞をある程度の規模で培養する場合には、通常、細胞密度が適性に維持されるよう継代を繰り返しながら培養を行っている。
【０００３】
この継代の際に、容量の小さい培養容器から、容量のより大きい培養容器に細胞を移し替える場合がある。例えば、細胞培養ウェルプレートを用いて培養の初期段階に適した細胞密度となるように、培地と共に細胞を個々のウェルに加えて培養を開始し、ウェル内で細胞を十分に増殖させてから細胞培養フラスコに移し替え、細胞増殖に合わせて培地を追加して培養することが行われていた。また、細胞が一定量に増殖した時点で、さらに容量の大きいバックなどに移し替え、培地の補給と継代を繰り返し行って、細胞が大量培養されていた（例えば、特許文献１［００２７］段落等参照）。
【０００４】
しかしながら、このような細胞培養においては、ウェルプレートからフラスコに移し替える際にピペッティング作業を何回も繰り返す必要があり、継代のたびに新たなフラスコやバックなどの培養容器に細胞を移さなければならず、作業が煩雑になるだけでなく、細胞にダメージを与える可能性があった。また、コンタミネーションのリスクが高いという問題もあった。
【０００５】
一方、コンタミネーションのリスクを低減し得る細胞培養装置等が、特許文献３及び特許文献４に記載されている。
すなわち、特許文献３には、インキュベータ内に気密に形成された細胞の培養器を設置し、培養器に気密に接続された送液管を介して培地容器と洗浄液容器と骨髄液容器の液を選択的に培養器に注入する送液手段と、培養器内の液を排液管を介して排出する排液手段とを備えた自動培養装置が開示されている。そして、この構成により、培養器に接着した幹細胞を選択的に分離した後、培地を培養器に注入して幹細胞を培養し、次いで、分化培養用の培地を培養器に注入して目的の組織細胞に分化させる技術が開示されている。
また、特許文献４には、複数の培養容器を用いて、密閉系で付着細胞の継代培養を行うことが可能な自動継代培養装置が開示されている。具体的には、複数の培養容器に、培地が収容された培地供給タンクと、洗浄液が収容された洗浄液供給タンクと、剥離液が収容された剥離液供給タンクと、処理容器とが接続され、処理容器内に細胞の通過を阻止するためのフィルタが設けられ、フィルタの表面に細胞を集めた後に、フィルタの外側から培地を供給して、細胞を培地により押し流して移送する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−２４１１５９号公報
【特許文献２】特開２００７−３１２６６８号公報
【特許文献３】特開２００５−１９８６２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、これらの細胞培養装置等は、継代を行うことによって、細胞を大量に培養する場合に、最適なものであるとは言えなかった。
すなわち、特許文献３の細胞培養装置によれば、一つの培養器で幹細胞を培養し、かつ目的の組織細胞に分化させることはできるが、細胞を大量に培養するために必要となる培養面積増加による継代に利用し得るものではなかった。
また、特許文献４の自動継代培養装置では、複数の培養容器を用いて細胞の継代培養が行われるが、最初に一つの培養容器で培養した細胞をフィルタの表面に集めた後、フィルタの外側から培地を供給して細胞を三つの培養容器に移送して再度培養し、この再度培養した細胞をフィルタの表面に集めた後、フィルタの外側から培地を供給して細胞の一部又は全部を回収する構成となっている。この培養装置では、再度培養した細胞の一部を継代培養することはできるが、全部は行えないことから細胞の大量培養に最適なものとは言えず、また操作手順が煩雑であるという問題があった。さらに細胞を培地や洗浄液と共に送流してフィルタで堰き止めた後に、培養容器への移送や細胞の取出しを行うものであるため、細胞にダメージを与えるおそれがあった。
【０００８】
また、複数の培養容器を用いて細胞の継代培養を行う場合、従来は、細胞の移送に際して、培養容器内に細胞が残存してしまうという問題があった。このような培養容器内における細胞の残存が生じると、全ての細胞を利用することができず、細胞の一部廃棄につながるため、細胞の増殖効率が低減することから重大な問題となっていた。
【０００９】
本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであり、複数の培養容器を用いて細胞の継代培養を行う場合に、コンタミネーションのリスクを低減すると共に、細胞の移送に際して、培養容器内における細胞の残存を減少させることの可能な細胞培養方法、及び細胞培養システムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る細胞培養方法は、複数の培養容器を用いて、接着系の細胞を培養する細胞培養方法であって、前記複数の培養容器として、それぞれ他の容器との内容物の移送用のポートを二つ有する培養面積の異なる培養容器を用い、前記複数の培養容器における培養面積の最も小さい第一の培養容器に細胞及び培地を含む細胞懸濁液を収容し、前記複数の培養容器に培地を供給する培地供給容器に前記複数の培養容器を培養面積の小さい順にチューブを用いてループ状に接続して、前記第一の培養容器において細胞の培養を開始し、前記第一の培養容器での培養が終了した後、前記第一の培養容器に接続された第二の培養容器に前記第一の培養容器から培養された細胞を含む細胞懸濁液を移送し、前記第一の培養容器を流路として、前記第二の培養容器に前記培地供給容器から培地を供給して、前記第二の培養容器において細胞の培養を行い、前記第二の培養容器での培養が終了した後、培養が終了した培養容器に接続された次の培養容器がある場合、前記次の培養容器への細胞懸濁液の移送、前記培養が終了した培養容器を流路としての前記次の培養容器への培地の供給、及び前記次の培養容器における細胞の培養を、前記培養が終了した培養容器に接続された前記次の培養容器がなくなるまで、繰り返して行う方法としてある。
なお、前記第一の培養容器において細胞の培養を開始した後に、培養細胞の増殖等に合わせて、前記培地供給容器に接続された前記第一の培養容器に前記培地供給容器から培地を供給して、前記第一の培養容器において細胞の培養を継続することも好ましい。
【００１１】
また、本発明に係る細胞培養システムは、接着系の細胞を培養するための複数の培養容器を備えた細胞培養システムであって、前記複数の培養容器に培地を供給する培地供給容器と、前記複数の培養容器として、それぞれ他の容器との内容物の移送用のポートを二つ有する培養面積の異なる培養容器を備え、前記培地供給容器に前記複数の培養容器が培養面積の小さい順にチューブを用いてループ状に接続された構成としてある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、複数の培養容器を用いて細胞の継代培養を行う場合に、コンタミネーションのリスクを低減すると共に、細胞の移送に際して、培養容器内における細胞の残存を減少させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施形態に係る細胞培養システムの概略を示す説明図である。
【図２】本発明の実施形態に係る細胞培養システムにおける攪拌手段の概略を示す説明図である。
【図３】本発明の実施形態に係る細胞培養システムの応用例の概略を示す説明図である。
【図４】本発明の実施形態に係る細胞培養方法における一次培養工程を示す斜視図である。
【図５】本発明の実施形態に係る細胞培養方法における細胞移送工程を示す斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態に係る細胞培養方法、及び細胞培養システムの好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
【００１５】
［細胞培養システム］
まず、本実施形態に係る細胞培養システムについて、図１〜図３を参照して説明する。
本実施形態に係る細胞培養システムは、主として、繊維芽細胞などの接着系の細胞を培養するための細胞培養システムであって、培養面積の異なる複数の培養容器と培地供給容器等とをチューブ（導管）によりループ状（直列かつ環状）に接続した構成となっている。
具体的には、図１に示すように、本実施形態に係る細胞培養システムは、培地供給容器１（以下、培地容器１と称する場合がある）を備えると共に、複数の培養容器として、一次培養容器２ａ、二次培養容器２ｂ、及び三次培養容器２ｃ（以下、これらの培養容器を培養容器２と総称する場合がある）を備えている。また、洗浄液供給容器３（以下、洗浄液容器３と称する場合がある）、酵素溶液供給容器４（以下、酵素容器４と称する場合がある）、阻害剤溶液供給容器５（以下、阻害剤容器５と称する場合がある）、及び廃液回収容器６（以下、廃液容器６と称する場合がある）を備え、これらの容器を、移送チューブ７（以下、単にチューブと称する場合がある）を用いてループ状に接続した構成となっている。
なお、複数の培養容器２は、これらに限定されるものではなく、三次培養容器２ｃを備えなくても良く、また四次培養容器、五次培養容器などを備えても良く、その個数はいくつであっても良い。
【００１６】
本実施形態に係る細胞培養システムによれば、これら複数の培養容器を用いて、閉鎖系で細胞の継代培養を行うことができるため、コンタミネーションのリスクを低減することが可能になっている。
また、一次培養容器２ａで細胞培養を行った後、培養された細胞が一次培養容器２ａから培養面積のより大きい二次培養容器２ｂに移送され、次いで培地が二次培養容器２ｂに流加される。このとき、培地は、培地容器１から一次培養容器２ａを流路として二次培養容器２ｂに供給されるため、一次培養容器２ａに残存していた細胞も培地と共に二次培養容器２ｂに移送される。また、二次培養容器２ｂで細胞培養を行った後、培養された細胞を培養面積のさらに大きい三次培養容器２ｃに移送して培地を流加するときも、同様に、培地は、培地容器１から一次培養容器２ａと二次培養容器２ｂを流路として三次培養容器２ｃに供給されるため、二次培養容器２ｂに残存していた細胞も培地と共に三次培養容器２ｃに移送される。したがって、本実施形態に係る細胞培養システムによれば、培養容器内における細胞の残存を顕著に減少させることが可能となっている。
さらに、本実施形態に係る細胞培養システムでは、複数の培養容器が、後に接続された培養容器ほど、培養面積がより大きくなるようにチューブを用いてループ状に接続されており、接続する培養容器の数は、培養する細胞数等に応じて適宜決定することができる。このため、接着系の細胞を効率的に大量培養するのに適したものとなっている。
【００１７】
［培地供給容器］
培地容器１は、細胞を培養するための培地を培養容器に供給する容器であり、一次培養容器２ａ、二次培養容器２ｂ、及び三次培養容器２ｃに供給する培地を格納する。
培地容器１は、図１において、一個のみ備えられているが、これに限定されず、同一又は異なる培地を供給するための複数の容器を用いて構成しても良い。
【００１８】
培地容器１は、格納している培地のｐＨが培養期間中に大きく変化しないように、酸素及び二酸化炭素に対するガスバリア性を有することが好ましい。これは、培地中に含まれている高濃度の炭酸ガスが空気中に抜け、培地中の炭酸ガス濃度が低下し、結果としてｐＨが上昇することを回避するために、培地容器１の内部から二酸化炭素が外部に漏れ出るのをできるだけ少なくすることが望ましいからである。また培地の酸化を防ぐことが望ましいからである。
【００１９】
培地容器１には、二つのポートが備えられている。このうち一つのポートには、一次培養容器２ａに連結する移送チューブ７が接続され、培養細胞の増殖等に合わせて、培地を培地容器１からポンプを用いて複数の培養容器に供給することができるようになっている。このとき、二次培養容器２ｂ以降に接続された培養容器に対しては、それより前に接続された培養容器を流路として、培地の供給を行うことができ、これによって培養容器に残存する細胞を培地と共に次の培養容器に送流することができるため、培養容器における細胞の残存を顕著に低減することが可能になっている。
また、培地容器１の他の一つのポートには、最後に接続される培養容器（図１の例では三次培養容器２ｃ）に連結する移送チューブ７が接続されている。培地容器１が空になった後、これを第二の廃液回収容器として用いて、三次培養容器２ｃから使用済みの培地等を培地容器１に送流可能にすることもできる。
【００２０】
［培養容器］
一次培養容器２ａ、二次培養容器２ｂ、三次培養容器２ｃは、接着系の細胞を増殖させるための容器であり、その容量及び培養面積は、後に接続されるものほど大きくしてある。例えば、二次培養容器２ｂとして、一次培養容器２ａの容量の２倍以上のものを好適に用いることができ、一次培養容器２ａの培養面積の１．５倍以上のものを好適に用いることができる。また、三次培養容器２ｃとして、二次培養容器２ｂの容量の１０倍程度のものを好適に用いることができ、二次培養容器２ｂの培養面積の６倍以上のものを好適に用いることができる。なお、一次培養容器２ａ、二次培養容器２ｂ、三次培養容器２ｃの容量及び培養容器の比率は、これらに限定されない。
【００２１】
培養容器２は、軟包材を材料として袋状（バッグ型）に形成されており、内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有している。
また、培養容器２は、細胞の培養に必要なガス透過性（酸素及び二酸化炭素透過性）を有していることが必要であり、３７℃、５％二酸化炭素濃度の培養環境下で使用することが好ましい。さらに、培養容器２は、高い細胞増殖効率を実現するために、低細胞毒性、低溶出性、及び放射線滅菌適性を有することが好ましい。
【００２２】
このような条件を満たす培養容器２の材料としては、ポリエチレン系樹脂が好ましい。このポリエチレン系樹脂としては、ポリエチレン、エチレンとα−オレフィンの共重合体、エチレンと酢酸ビニルの共重合体、エチレンとアクリル酸やメタクリル酸共重合体と金属イオンを用いたアイオノマー等が挙げられる。また、ポリオレフィン、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーン樹脂等を用いることもできる。
【００２３】
培養容器２の形状は、特に限定されないが、図１において、長方形状とされており、二つのポートが備えられ、それぞれに移送チューブ７が接続されている。培地容器１から培養容器２への培地の注入、及び培養容器２からの細胞や培地等の次の培養容器２への移送は、これらの移送チューブ７を経由して行われる。
ポートの位置は、一次培養容器２ａと二次培養容器２ｂなどの、次の培養容器２が接続される培養容器２（最後に接続されたものではない培養容器２）では、短辺側の対抗する二辺に備えることが好ましい。これによって後述するように、培養容器２を、次の培養容器２へ接続するためのポートが下側になるように傾斜させることで、培養された細胞を次の培養容器２に自然送流することができる。
また、最後の培養容器２では、短辺側の対抗する二辺に二つのポートを備えても良く、また一方の短辺側に二つのポートを備えても良い。
【００２４】
培養容器２の四辺はヒートシールにより密封されている。
また、培養容器２の収容部の形状は、長方形状とすることができるが、最後に接続されたものではない培養容器２では、図１の一次培養容器２ａと二次培養容器２ｂのように、収容部を、チューブの取り付け部分に向かって次第に狭くなるようにすることが好ましい。最後の培養容器２では、チューブの取り付け部分に向かって次第に狭くなるようにしたシール部を、チューブ毎に設けることもできる。なお、培養容器２は、ブロー成形による一体成型バッグでもよい。
【００２５】
［攪拌手段］
本実施形態に係る細胞培養システムでは、酵素溶液を用いることによって、培養された細胞を培養容器２内の底面から剥離するようにしているが、応用例として、酵素溶液による剥離を促進するために、培養容器２の内容液を撹拌する攪拌手段を設けることによって、培養された細胞を培養容器２内の底面から剥離するようにすることも好ましい。
【００２６】
このとき、攪拌手段により、培養容器２を初期位置よりも上方に移動させる上動工程と、培養容器２を初期位置まで戻すとともに、初期位置に戻った培養容器２に振動を加える下動工程とを繰り返すことによって培養容器２の内容液を撹拌することができる。
なお、上動工程と下動工程とを繰り返すにあたり、培養容器２の内容液の撹拌が確実になされるように、必要に応じて下動工程後にインターバルをおいて、所定の時間が経過してから上動工程が繰り返されるようにしてもよい。
【００２７】
このようにすることで、培養容器２の上下動による内容液の撹拌に加えて、下動工程において培養容器２に加わる振動によって剥離された細胞が内容液中を舞い上がるように拡散する。これにより、培養容器２の内容液が上下方向にも効率よく攪拌され、細胞が培養容器２の培養面を転がり落ちる際のずり応力を軽減して、細胞に与えるダメージを少なくしつつ、培養容器２の培養面からの細胞の剥離を促すことが可能である。
【００２８】
上記のようにして培養容器２の内容液を撹拌するために、例えば図２に示すように、一端縁に設けられた回動軸８２を基台１０に軸支した平板状の保持板８１を有する積載部８と、保持板８１をフォロワとするカム機構とを備え、培養容器２が積載部８に保持されて、カム機構により回動軸８２を中心に保持板８１を上下に繰り返し回動させるとともに、保持板８１が下動して基台１０に当接したときに生じる振動を培養容器２に加えることにより培養容器２の内容液を撹拌する装置を用いるのが好ましい。複数の培養容器２は、それぞれ別個の保持板８１に保持させるようにしても良く、一つの保持板８１に一括して保持させるようにしても良い。
【００２９】
このような装置において、上動工程では、積載部８に保持された培養容器２は、カム機構によって保持板８１が上方に回動するに伴って、初期位置よりも上方に移動しながら傾いていき、これによって可撓性材料を用いて形成された培養容器２が撓み変形しつつ、その内容液が回動軸８２側に偏るように流動する（図２（ａ）〜（ｅ）参照）。下動工程では、保持板８１は、最大傾斜角度θｍａｘに達した後、下方に回動し、これに伴って培養容器２は初期位置に戻るが（図２（ｆ），（ｇ）参照）、その際に培養容器２の内容液に揺り戻しが生じ、これとともに、保持板８１が基台１０に当接したときの衝撃によって生じた振動により細胞が底面から引き剥がされて、内容液中を舞い上がる。
【００３０】
このようにして培養容器２の内容液を撹拌するにあたり、細胞に与えるダメージをより少なくして、細胞をより効率よく底面から剥離するためには、基台１０に水平に支持した保持板８１を緩やかに上方に回動させ、保持板８１が最大傾斜角度θｍａｘに達した後に、保持板８１を落下により下方に回動させて、落下する保持板８１を基台１０が受けたときに生じる衝撃によって、培養容器２に振動が加わるようにするのが好ましい。特に図示しないが、保持板８１が基台１０に当接したときの衝撃によって生じた振動を培養容器２に加えるに際しては、培養容器２に振動を加えるのに好適な位置に応じて、保持板８１に当接する凸部を基台１０に設けておくことができる。
【００３１】
また、保持板８１を落下により下方に回動させるには、例えば、輪郭が円弧状の第一カム面９１と、輪郭が直線状の第二カム面９２とを有する板カム９によってカム機構を構成し、カム面９１，９２の曲率、板カム９を回転させる駆動軸９３の位置及び駆動軸９３の回転速度を適宜設定し、第一カム面９１によって保持板８１を上方に回動させ、第二カム面９２に切り替わる際に板カム９が保持板８１から離れるようにすることで（図２（ｆ）参照）、保持板８１を落下により下方に回動させることができる。
【００３２】
なお、前述したように、培養容器２の形状は、長方形状とすることができ、保持板８１の形状も培養容器２の形状に合わせて設計するが、保持板８１を長方形状とした場合、回動軸８２を設ける一端縁は、短辺側であっても、長辺側であってもよい。
【００３３】
また、この攪拌手段の応用例として、培養容器２の底面から細胞を剥離すること以外を目的として用いることもできる。例えば、培養容器２の内容液を単に攪拌するだけのために用いることができる。具体的には、例えば培養容器２から培地を排出した後に、洗浄液を注入し、攪拌手段を用いて培養容器２内の洗浄液を攪拌してから排出することで、培養容器２に残存する培地を効率的に排出することができる。この場合、培養容器２の内容液を攪拌する力は、細胞を剥離する場合に比べて小さくてよいため、第二カム面９２に切り替わる際に板カム９が保持板８１に接したままになるようにすると共に、カム面９１，９２の曲率、駆動軸９３の位置及び駆動軸９３の回転速度を適宜設定することにより、培養容器２に衝撃を加えずに、単に揺動することも好ましい。
【００３４】
［洗浄液供給容器］
洗浄液容器３は、洗浄液を培養容器２に供給する容器であり、図１に示すように、培地容器１と一次培養容器２ａの間にチューブを用いて接続される。
洗浄液は、培養容器２内に酵素溶液を供給するのに先立って、培養容器２内に残存する培地を洗い流すために用いられる。
この洗浄液としては、生理食塩水やＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）など、一般的に使用されているものを用いることができる。
【００３５】
［酵素溶液供給容器］
酵素容器４は、培養された細胞を培養容器２内の底面から剥離するための酵素溶液を、培養容器２に供給する容器であり、図１に示すように、培地容器１と一次培養容器２ａの間にチューブを用いて接続される。
酵素溶液は、培養容器２の培養面全体に細胞が増殖して当該培養容器２における細胞培養が完了すると、培養された細胞を次の培養容器２へ移送するのに先立って、細胞を培養容器２内の底面から剥離するために用いられる。
この酵素溶液としては、接着系の細胞を容器内の底面から剥離する際に通常使用可能なものを用いることができ、例えばトリプシンなどのプロテアーゼを用いることができる。
【００３６】
［阻害剤溶液供給容器］
阻害剤容器５は、上記酵素溶液における酵素の活性を阻害するための阻害剤溶液を、培養容器２に供給する容器であり、図１に示すように、培地容器１と一次培養容器２ａの間にチューブを用いて接続される。
阻害剤溶液は、細胞を培養容器２内の底面から剥離するために用いられた酵素の活性を阻害させるために用いられる。
この阻害剤溶液としては、上記酵素を活性阻害させる際に通常使用可能なものを用いることができ、例えばトリプシンインヒビターなどのプロテアーゼインヒビターを用いることができる。
なお、酵素を培地によって活性阻害させることができる場合には、本実施形態に係る細胞培養システムにおいて阻害剤容器５を省略しても良い。
【００３７】
［廃液回収容器］
廃液容器６は、培養容器２から洗浄液、酵素溶液、阻害剤溶液、及び培地等の廃液を回収する容器であり、図１に示すように、培地容器１と最後に接続された培養容器２（三次培養容器２ｃ）と間に移送チューブ７を用いて接続される。
廃液容器６への廃液の回収は、ポンプを用いて、培養容器２から後に接続された培養容器２と移送チューブ７を経由して行うことができる。また、後述する本実施形態に係る細胞培養システムの応用例では、連結チューブ７ａを用いて、後に接続された培養容器２を経由することなく、各培養容器２から直接廃液容器６への廃液等の回収を行うことを可能にしている。
【００３８】
［移送チューブ］
移送チューブ７は、培地容器１と複数の培養容器とをループ状に接続する。また、洗浄液容器３、酵素容器４、阻害剤容器５、及び廃液回収容器６は、移送チューブ７により、上記ループ状に接続された移送チューブ７に接続されている。これによって、これらの容器間における細胞や培地、酵素溶液、阻害剤溶液等の移送を行うことを可能にしている。
移送チューブ７の材料は、使用環境に合わせて適宜選択すれば良いが、ガス透過性に優れるものが望ましい。例えば、シリコーンゴム、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー等を用いることができる。また、スチレン系エラストマーとしては、例えば、ＳＢＳ（スチレン・ブタジエン・スチレン）、ＳＩＳ（スチレン・イソプレン・スチレン）、ＳＥＢＳ（スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン）、ＳＥＰＳ（スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン）等を用いることができる。
図１では、移送チューブ７におけるポンプを取り付ける部分にはシリコーンチューブが用いられ、その他の部分には軟質塩化ビニル樹脂チューブが用いられている。
【００３９】
移送チューブ７の流路には流路開閉手段とポンプを適宜配置し、流路開閉手段によって送液流路を制御している。流路開閉手段としては、例えばピンチバルブや二方活栓、三方活栓等を用いることができ、特に限定されない。
また、図１では、各培養容器２と移送チューブ７の接続や移送チューブ７同士の接続を、ルアーコネクターを用いて行っているが、その他の方法で接続しても良い。
【００４０】
［連結チューブ］
本実施形態に係る細胞培養システムの応用例として、図３に示すように、連結チューブ７ａを用いることも好ましい。
連結チューブ７ａは、複数の培養容器２の間のチューブと、廃液容器６と最後に接続された培養容器２の間のチューブとを接続するチューブであり、一又は二以上設けることができる。
このような連結チューブ７ａを用いることによって、後に接続された培養容器２を経由することなく、培養が終了した培養容器２からの培地や、培養容器２からの洗浄液、酵素溶液、阻害剤、及び培地を含む廃液を、廃液容器６に直接移送して排出することが可能になっている。
【００４１】
なお、図示しないが、細胞培養システムには、各培養容器２内の細胞や培地の状態を観察するための観察装置を備えることが好ましい。観察装置としては、例えばＣＣＤカメラ、対物レンズ、照明、及び情報処理装置等からなるものを用いることができる。この場合、観察孔を有する積載台に水平に載置された培養容器２の上方から光を照らし、観察孔の下方からＣＣＤカメラと対物レンズにより培養容器２内の細胞などを所定のタイミングで自動的に撮影することができる。そして、得られた画像データを情報処理装置に送信し、情報処理装置において画像データを解析して、培養容器２内の細胞数や細胞密度などを算出することが可能である。
【００４２】
［細胞培養方法］
次に、本実施形態に係る細胞培養方法について図３〜図５を参照して詳細に説明する。
本実施形態に係る細胞培養方法は、複数の培養容器を用いて、接着系の細胞を培養する細胞培養方法であって、複数の培養容器として、それぞれ他の容器との内容物の移送用のポートを二つ有する培養面積の異なる培養容器を用い、複数の培養容器における培養面積の最も小さい第一の培養容器に細胞及び培地を含む細胞懸濁液を収容し、複数の培養容器に培地を供給する培地供給容器に複数の培養容器を培養面積の小さい順にチューブを用いてループ状に接続して、第一の培養容器において細胞の培養を開始し、第一の培養容器での培養が終了した後、第一の培養容器に接続された第二の培養容器に第一の培養容器から培養された細胞を含む細胞懸濁液を移送し、第一の培養容器を流路として、第二の培養容器に培地供給容器から培地を供給して、第二の培養容器において細胞の培養を行い、第二の培養容器での培養が終了した後、培養が終了した培養容器に接続された次の培養容器がある場合、次の培養容器への細胞懸濁液の移送、培養が終了した培養容器を流路としての次の培養容器への培地の供給、及び次の培養容器における細胞の培養を、培養が終了した培養容器に接続された次の培養容器がなくなるまで、繰り返して行うことを特徴とする。
【００４３】
具体的には、本実施形態に係る細胞培養方法は、（１）容器接続工程と、（２）一次培養工程と、（３）培地排出工程１と、（４）洗浄工程１と、（５）細胞剥離工程１と、（６）酵素活性阻害工程１と、（７）細胞移送工程１と、（８）培地流加工程１と、（９）酵素等排出工程１と、（１０）培地流加工程２と、（１１）二次培養工程と、（１２）培地排出工程２と、（１３）洗浄工程２と、（１４）細胞剥離工程２と、（１５）酵素活性阻害工程２と、（１６）細胞移送工程２と、（１７）培地流加工程３と、（１８）酵素等排出工程２と、（１９）培地流加工程４と、（２０）三次培養工程とを有するものとすることができる。なお、培養容器２を４個以上接続して用いる場合には、四次培養以降の工程として、各培養容器２について（１２）〜（２０）の工程をさらに繰り返し行う。
【００４４】
（１）容器接続工程
まず、本実施形態に係る細胞培養方法において用いる培地容器１と複数の培養容器等を、図３に示すように接続して、閉鎖系の細胞培養システムを構成する。
すなわち、培地容器１と、一次培養容器２ａと、二次培養容器２ｂと、三次培養容器２ｃとをこの順番で移送チューブ７を用いて接続する。また、洗浄液容器３と酵素容器４と阻害剤容器５は、培地容器１と一次培養容器２ａを連結する移送チューブ７に接続する。廃液容器６は、培地容器１と最後の培養容器（三次培養容器２ｃ）を連結する移送チューブ７に接続する。さらに、連結チューブ７ａを、複数の培養容器の間のチューブと、廃液容器６と最後に接続された培養容器の間のチューブとの間に接続する。
このとき、一次培養容器２ａには培養を行う細胞と培地を含む細胞懸濁液を収容して接続する。また、培地容器１には培養容器２に供給するための培地を、洗浄液容器３には洗浄液を、酵素容器４には酵素溶液を、阻害剤容器５には阻害剤溶液をそれぞれ充填して接続する。二次培養容器２ｂ、三次培養容器２ｃ、及び廃液容器６は空のまま接続する。
【００４５】
培地容器１と一次培養容器２ａの間、及び培地容器１と最後の培養容器の間の移送チューブ７上にはポンプが備えられ、これらのポンプにより培地や細胞等の移送が行われる。また、培地容器１と洗浄溶液容器３との間と、培地容器１と酵素容器４との間と、培地容器１と阻害剤容器５との間と、一次培養容器２ａと二次培養容器２ｂの間、及び二次培養容器２ｂと三次培養容器２ｃの間等にピンチバルブが備えられ、これらのピンチバルブにより細胞培養システムにおける送液流路が制御される。
【００４６】
また、図４に示すように、複数の培養容器２は、培地容器１により近く接続されたものほど相対的に高い位置になるように配置される。すなわち、一次培養容器２ａが最も高い位置に配置され、二次培養容器２ｂが次に高い位置に配置され、三次培養容器２ｃが最も低い位置に配置される。これにより、それぞれの培養容器２を傾けることで、培養された細胞を含む内容液（細胞懸濁液）を自然送流によって次に接続された培養容器２に移送することが可能になっている。なお、図４，図５において、攪拌手段は省略してある。
また、図示しないが、培地容器１は、培養容器２よりも相対的に低い位置に配置することが好ましく、例えば培養容器２を配置している積載台１１の下側に配置することができる。これによって、培地が培養系に意図せず流入することを防止することが可能になる。
【００４７】
さらに、本実施形態に係る細胞培養システムにおいて、培養容器２を載置した基台１０の重量を計測するための計測手段を備えることも好ましい。このような計測手段を用いて、培養容器２を載置した基台１０の重量の減少をモニターすることによって、培養容器２から液漏れが生じた場合に、これを検出することが可能になる。
【００４８】
（２）一次培養工程
このように細胞培養システムを構成すると、まず培養面積の最も小さい一次培養容器２ａにおいて、継代培養１回目（一次培養）が開始する。一次培養容器２ａでは、細胞の初代培養が行われる。また、培養細胞の増殖等に合わせて、培地が培地容器１からポンプを用いて一次培養容器２ａに供給される。
【００４９】
（３）培地排出工程１
一次培養容器２ａの培養面全体に細胞が増殖すると、一次培養は完了である。そして、培養に使用された培地を、ポンプを用いて一次培養容器２ａから廃液容器６に移送して排出する。
このとき、培地は、一次培養容器２ａから連結チューブ７ａを介して廃液容器６へ排出することができる。
【００５０】
（４）洗浄工程１
次に、洗浄液容器３から洗浄液を一次培養容器２ａに送流し、前述した攪拌手段を用いて一次培養容器２ａ内の洗浄液を攪拌してからポンプを用いて廃液容器６に排出する。
これによって、培養容器２に残存する培地を除去することができ、次の細胞剥離工程１において一次培養容器２ａに酵素溶液を送流するに際し、酵素の活性が培地により阻害されることを防止することが可能となる。
【００５１】
（５）細胞剥離工程１
次に、酵素容器４から酵素溶液を一次培養容器２ａに送流して、一次培養容器２ａ内の底面に接着している細胞を剥離する。
このとき、細胞の剥離を、前述した攪拌手段を用いて、一次培養容器２ａの内容液を攪拌することによって促進することが好ましい。このような攪拌手段を用いた細胞の剥離促進は、二次培養容器２ｂ及びこれ以降に接続されるその他の培養容器についても同様に適用することができる。
【００５２】
（６）酵素活性阻害工程１
次に、阻害剤容器５から阻害剤溶液を一次培養容器２ａに送流して、一次培養容器２ａ内の酵素を活性阻害させる。
【００５３】
（７）細胞移送工程１
次に、剥離された細胞を、一次培養容器２ａから二次培養容器２ｂへ移送する。
このとき、図５に示すように、一次培養容器２ａを、二次培養容器２ｂへ接続するためのポートが下側になるように傾斜させることで、剥離された細胞を含む内容液を一次培養容器２ａから二次培養容器２ｂに自然送流することができる。
なお、剥離された細胞を、二次培養容器２ｂから三次培養容器２ｃへ移送する場合も同様に、二次培養容器２ｂを、三次培養容器２ｃへ接続するためのポートが下側になるように傾斜させて行うことができる。
【００５４】
（８）培地流加工程１
次に、培地容器１から培地を、一次培養容器２ａを流路としながら、ポンプを用いて二次培養容器２ｂに移送する。
このとき、一次培養容器２ａを流路とすることで、一次培養容器２ａ内に残存している細胞を、培地と共に二次培養容器２ｂに移送することができ、一次培養容器２ａにおける残存細胞を顕著に低減することが可能となっている。
【００５５】
（９）酵素等排出工程１
二次培養容器２ｂ内において、細胞が底面に接着したら、二次培養容器２ｂから酵素溶液、阻害剤溶液、及び培地を、ポンプを用いて廃液容器６に排出する。
このとき、酵素溶液、阻害剤溶液、及び培地は二次培養容器２ｂから連結チューブ７ａを介して廃液容器６へ移送することができる。
【００５６】
（１０）培地流加工程２
次に、培地容器１から培地を、一次培養容器を流路としながら、ポンプを用いて二次培養容器２ｂに再度移送する。
このように、一次培養容器２ａを再度流路として培地の移送を行うことによって、一次培養容器２ａ内の細胞の残存を限りなく低く抑えることが可能となっている。
【００５７】
（１１）二次培養工程
以上の工程によって、培養面積のより大きい二次培養容器２ｂにおいて、継代培養２回目（二次培養）が開始する。また、培養細胞の増殖等に合わせて、培地が培地容器１からポンプを用いて二次培養容器２ｂに供給される。
【００５８】
そして、（１２）培地排出工程２〜（１９）培地流加工程４の工程として、前述した（３）培地排出工程１〜（１０）培地流加工程２と同様の工程が行われ、続く（２０）三次培養工程で、培養面積のさらに大きい三次培養容器２ｃにおいて継代培養３回目（三次培養）が開始し、培養細胞の増殖等に合わせて、培地が培地容器１からポンプを用いて三次培養容器２ｃに供給される。
そして、三次培養容器２ｃの培養面全体に細胞が増殖すると、三次培養が完了し、三次培養容器２ｃから大量に増殖した培養細胞を回収することが可能となる。
【００５９】
以上説明した通り、本実施形態の細胞培養システム及びこれを用いる細胞培養方法によれば、複数の培養容器を用いて、閉鎖系で細胞の継代培養を行うことができるため、コンタミネーションのリスクを低減することが可能になっている。
また、培地供給容器と複数の培養容器とをチューブを用いてループ状に接続して、複数の培養容器間で培養された細胞を移送した後に、先に接続された培養容器を流路にして、培地の流加が行われるため、先に接続された培養容器に残存している細胞を、培地と共に次に接続された培養容器に送流することができる。このため、培養容器内における細胞の残存を顕著に減少させることが可能となっている。
さらに、複数の培養容器が、後に接続された培養容器ほど、培養面積がより大きくなるようにチューブを用いてループ状に接続され、接続する培養容器の数は、培養する細胞数等に応じて適宜決定することができる。このため、接着系の細胞を効率的に大量培養するのに適したものとなっている。
【００６０】
以上、本発明について、好ましい実施形態を示して説明したが、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲で種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、前述した実施形態では、一つの培地容器１を用いる例について説明したが、同一又は異なる培地を収容する複数の培地容器１を用いて、本発明の実施形態に係る細胞培養システムを構成しても良い。また、図１又は図３に示す細胞培養システムから阻害剤容器５を省略した構成にしたりするなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、細胞の培養容器を用いて、閉鎖系で細胞を大量に培養する再生医療や抗体医薬生産などにおいて好適に利用することが可能である。
【符号の説明】
【００６２】
１      培地供給容器（培地容器）
２      培養容器
２ａ      一次培養容器
２ｂ      二次培養容器
２ｃ      三次培養容器
３      洗浄液供給容器（洗浄液容器）
４      酵素溶液供給容器（酵素容器）
５      阻害剤溶液供給容器（阻害剤容器）
６      廃液回収容器（廃液容器）
７      移送チューブ
７ａ    連結チューブ
８      積載部
８１      保持板
８２      回動軸
９      板カム
９１      第一カム面
９２      第二カム面
９３      駆動軸
１０      基台
１１  積載台
【図１】
2015188391.tif 000003
【図２】
2015188391.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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