(57)【要約】      （修正有）【課題】反応液が容器の内壁への付着を防止し、反応液が容器内を適切に移動できるバイオチップの提供。【解決手段】界面活性剤を含む反応液が容器の長手方向に移動するバイオチップであって、容器と、前記反応液とは比重が異なり、前記反応液とは混和しない液体と、カルビノール変性シリコーンレジン、カルボキシル変性シリコーンレジン、アミノ変性シリコーンレジン、ポリエーテル変性シリコーンレジン、シラノール変性シリコーンレジン、又はフルオロ変性シリコーンレジンを主成分とする添加剤と、を含むバイオチップ。前記液体はミネラルオイル又はシリコーンオイルであるバイオチップ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面活性剤を含む反応液が容器の長手方向に移動するバイオチップであって、
容器と、
前記反応液とは比重が異なり、前記反応液とは混和しない液体と、
カルビノール変性シリコーンレジン、カルボキシル変性シリコーンレジン、アミノ変性シリコーンレジン、ポリエーテル変性シリコーンレジン、シラノール変性シリコーンレジン、またはフルオロ変性シリコーンレジンを主成分とする添加剤と、
を含むバイオチップ。
【請求項２】
前記液体は、ミネラルオイルまたはシリコーンオイルである、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項３】
前記添加剤は、X-22-160AS、X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、KF-6017、KF-8005（以上、信越シリコーン社）、SR1000、SS4230、SS4267、YR3370、XS66-C1191、TSF4703、TSF4708、XF42-C5196、XF42-C5197（以上、Momentive社）のいずれかである、請求項１または２に記載のバイオチップ。
【請求項４】
前記液滴は、前記容器の長手方向に移動することができる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のバイオチップ。
【請求項５】
前記反応液は、核酸増幅反応用試薬を含有する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のバイオチップ。
【請求項６】
前記添加剤の濃度が、１％（ｖ/ｖ）以上５０％（ｖ/ｖ）以下である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のバイオチップ。
【請求項７】
前記容器がポリプロピレン製である、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のバイオチップ。
【請求項８】
前記界面活性剤が、NP40、Triton-X100、またはTween20である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のバイオチップ。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のバイオチップが装着された核酸増幅装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されてきている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの核酸増幅技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は、生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
【０００３】
ＰＣＲ法では、チューブやチップ（以下、バイオチップという）と称する、生化学反応を行うための容器を用いて反応を行う手法が一般的である。しかしながら、従来の手法においては、必要な試薬等の量が多く、また反応に必要な熱サイクルを実現するために装置が複雑化したり、反応に時間がかかったりするという問題があった。そのため微少量の試薬や検体を用いてＰＣＲを短時間で行うためのバイオチップや反応装置が必要とされていた。
【０００４】
このような問題を解決するために、特許文献１には、反応液と混和せず反応液とは比重が異なる液体（ミネラルオイル等）を充填したチューブの中で、液滴の状態で含まれる反応液を往復移動させることによって熱サイクルをかけて反応を行うバイオチップ及び装置が開示されている。
【０００５】
しかしながら、特許文献１に開示されたバイオチップを、容器外部から蛍光測定を行って増幅産物を検出するような用途に用いる場合は、容器を透明な材料で形成する必要があった。透明な材料としては、樹脂や耐熱ガラスが挙げられるが、これらの材料は摩擦などによって帯電しやすい。容器の内表面に親水処理を施せば帯電を抑制することは可能であるが、水溶液である反応液が容器に付着して移動が妨げられてしまうため、親水処理をバイオチップに採用することは困難であった。
【０００６】
一方、反応液と混和せず反応液とは比重が異なる液体としては、熱や反応液に対する安定性の観点から、シリコーンオイルやミネラルオイルを用いることができるが、これらのオイルは一般に絶縁体であるため、オイル中に導入された反応液の液滴が容易に分極する。そのため、透明な材料の容器にオイルを充填し、反応液を導入すると、反応液と容器との間に電場が生じて、反応液が容器の内壁に引き寄せられて付着したり、反発によってオイル中に浮遊したりすることがある。このような状態で、特許文献１に記載のような、バイオチップ中で反応液を重力によって移動させる方式（以下、本明細書において、この方式を「昇降型」と称する。）のＰＣＲを行うと、反応液が適切に移動せず、所望の熱サイクルを施すことができなくなる場合があった。
【０００７】
そこで、特許文献２では、バイオチップに生じた電荷を解消し、反応液に安定した熱サイクルを施すために、反応液とは混和しない液体が充填された容器を用いる際、前記液体の体積固有抵抗を０Ω・ｃｍよりも大きく５×１０13Ω・ｃｍ以下とするバイオチップが開示された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−１３６２５０号公報
【特許文献２】特開２０１２−１２５１６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、特許文献２のようにして帯電を防止しても、まだ液滴が容器に付着し、液滴がオイル中を適切に移動できない場合があった。
【００１０】
本発明は、反応液が容器の内壁への付着を防止し、反応液が容器内を適切に移動できるバイオチップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、上述の課題の少なくとも一部を解決するためになされたものであり、以下の形態として実現することができる。
【００１２】
本発明の一実施態様は、界面活性剤を含む反応液が容器の長手方向に移動するバイオチップであって、容器と、前記反応液とは比重が異なり、前記反応液とは混和しない液体と、カルビノール変性シリコーンレジン、カルボキシル変性シリコーンレジン、アミノ変性シリコーンレジン、ポリエーテル変性シリコーンレジン、シラノール変性シリコーンレジン、またはフルオロ変性シリコーンレジンを主成分とする添加剤と、を含むバイオチップである。前記液体は、ミネラルオイルまたはシリコーンオイルであってもよい。前記添加剤は、X-22-160AS、X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、KF-6017、KF-8005（以上、信越シリコーン社）、SR1000、SS4230、SS4267、YR3370、XS66-C1191、TSF4703、TSF4708、XF42-C5196、XF42-C5197（以上、Momentive社）のいずれかであってもよい。前記反応液は、液滴として、前記容器の長手方向に移動することができる。前記反応液は、核酸増幅反応用試薬を含有してもよい。前記添加剤の濃度が、１％（ｖ/ｖ）以上５０％（ｖ/ｖ）以下であってもよい。前記容器がポリプロピレン製であってもよい。前記界面活性剤が、NP40、Triton-X100、またはTween20であってもよい。
【００１３】
本発明のさらなる実施態様は、上記いずれかのバイオチップが装着された核酸増幅装置である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によって、反応液が容器の内壁への付着を防止し、反応液が容器内を適切に移動できるバイオチップを提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施形態に係る核酸増幅反応用チップの断面図である。ｇは重力の方向を表す。
【図２】本発明の一実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置の斜視図である。（Ａ）は蓋を閉じた状態、（Ｂ）は蓋を開けた状態を示す。
【図３】本発明の一実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置における本体の分解斜視図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置における本体の、図１（Ａ）のＡ−Ａ線における断面を模式的に示す断面図である。（Ａ）は第１の配置、（Ｂ）は第２の配置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
（１）バイオチップ
本発明のバイオチップは、界面活性剤を含む反応液が容器の長手方向に移動するバイオチップであって、容器と、反応液とは比重が異なり、反応液とは混和しない液体と、カルビノール変性シリコーンレジン、カルボキシル変性シリコーンレジン、アミノ変性シリコーンレジン、ポリエーテル変性シリコーンレジン、シラノール変性シリコーンレジン、またはフルオロ変性シリコーンレジンを主成分とする添加剤と、を含むバイオチップである。このバイオチップにおいては、液滴状の反応液が容器の内壁に付着するリスクが少なくなり、容器の長手方向に移動しやすくなっている。以下に、その構成を詳細に述べる。
【００１７】
図１は、バイオチップ１００の断面図である。図１は、バイオチップに反応液を入れた状態を表す。
【００１８】
本発明のバイオチップ１００は、容器１５０及び封止部１２０を含んで構成されている。バイオチップ１００の大きさや形状は、特に限定されないが、例えば、反応液１４０と混和しないオイル３０の量、熱伝導率、容器１５０及び封止部１２０の形状、あるいは取り扱いの容易さの少なくとも１つを考慮して設計されてもよい。
【００１９】
バイオチップ１００の容器１５０は透明な材質から形成することができる。それによって、バイオチップ１００の外部から、容器１５０内の反応液１４０の移動を観察したり、リアルタイムＰＣＲ等の、容器１５０の外部から測定等を行うような用途に使用したりすることができる。なお、本明細書において「透明」という場合には、容器１５０の外部から容器１５０内の反応液１４０を観察できる程度の視認性が確保できるものとし、この条件が満たされる限り、必ずしもバイオチップ１００の全体が透明でなくても良いものとする。
【００２０】
バイオチップ１００の用途は特に限定されないが、例えばリアルタイムＰＣＲのような、蛍光測定を伴う用途に使用する場合には、容器１５０は、自発蛍光の小さい材質で形成されることが望ましい。容器１５０はＰＣＲにおける加熱に耐えられる材質であることが好ましい。また、容器１５０の材質は、核酸やタンパク質の吸着が少なく、ポリメラーゼ等による酵素反応を阻害しない材質であることが好ましい。これらの条件を満たす材質としては特に限定されず、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、シクロオレフィンポリマー（例えば、ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）４８０Ｒ）、耐熱ガラス（例えばＰＹＲＥＸ（登録商標）ガラス）等やこれらの複合材料であってもよいが、ポリプロピレンが好ましい。
【００２１】
図１に示すバイオチップ１００では、容器１５０は円筒状に形成されており、中心軸方向（図１における上下方向）が長手方向となっている。ここで用いる容器１５０は、チューブであることが好ましく、小型遠心用チューブや、ＰＣＲ用に設計されたチューブであってもよいが、長手方向を有する、即ち細長い形状であることにより、例えば、後述する昇降型のサーマルサイクラーを用いて、容器１５０内のオイル３０に温度の異なる領域が形成されるようにバイオチップ１００を温度制御する場合に、異なる温度の領域の間の距離を長くしやすくなる。これにより、容器１５０内の領域毎に、オイル３０を異なる温度に制御することが容易となるので、ＰＣＲに適した熱サイクルを実現できる。なお、昇降型のサーマルサイクラーとは、容器１５０を満たしたオイル中に少なくとも２つの温度領域を形成し、オイルと相分離する反応液１４０をこれらの温度領域間で往復移動させることによって熱サイクルを実現する装置である。
【００２２】
容器１５０の形状は、長手方向を有する限り、特に限定されないが、昇降型ＰＣＲに用いる場合には、略円筒形状で内径Ｄと長手方向の長さＬとの比が１：５〜１．５：２０の範囲であることが好ましい。さらには、内径Ｄが１．５〜２ｍｍ、長さＬが１０〜２０ｍｍであることがより好ましい。
【００２３】
容器１５０は、開口部及び開口部を封止する封止部１２０を有し、容器１５０中は反応液１４０と、反応液１４０と比重が異なり、相分離する液体１３０を含む。開口部を封止部１２０により封止した場合に、容器１５０内に空気が残らないことが好ましい。容器１５０内に気泡が残ると、反応液１４０の移動が妨げられることがあるからである。封止部１２０は、容器１５０と同様の材質から形成することができる。封止部１２０の構造は、容器１５０を密閉できる構造であればよく、例えば、ねじ蓋、栓、はめ込み等の構造とすることができる。図１においては、封止部１２０はねじ蓋の構造である。
【００２４】
反応液１４０が対象とする反応は特に限定されないが、例えば、核酸増幅反応用であって、核酸増幅反応用試薬を含んでもよく、増幅対象の標的核酸を含んでもよい。標的核酸としては、例えば、血液、尿、唾液、髄液、組織などの検体から調整されたＤＮＡ、又は、それらの検体から調製されたＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡなどが挙げられる。核酸増幅反応用試薬は、標的核酸を増幅するためのプライマー、バッファー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ2及び、標的核酸の増幅産物を検出するための蛍光プローブなどを含んでいてもよい。ＤＮＡポリメラーゼは特に限定されないが、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。ｄＮＴＰや塩の濃度は、用いる酵素について適した濃度にすれば良いが、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、Ｍｇ2+を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ-を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。
【００２５】
反応液１４０はまた、界面活性剤を含む。界面活性剤は特に限定されないが、NP40、Triton-X100、Tween20などが例示できる。界面活性剤の濃度は特に限定されないが、核酸増幅反応を阻害しない濃度が好ましく、０．００１％〜０．１％以下であってもよく、０．００２％〜０．０２％であることが好ましく、０．００５％〜０．０１％であることが最も好ましい。界面活性剤は、上述の酵素のストック溶液からの持ち込みであってもよいが、それとは独立に界面活性剤溶液を反応液１４０に添加してもよい。
【００２６】
液体１３０は、反応液１４０とは混和しないものを用いることにより、容器１５０に反応液１４０を入れた場合に、反応液１４０と液体１３０とが相分離するため、液体１３０中において反応液１４０を液滴状にすることができる。こうして、反応液１４０が液体１３０中に液滴状で保持されている。
【００２７】
液体１３０は、反応液１４０よりも比重が小さいものが好ましい。この場合、液体１３０中に反応液１４０を入れた場合に、反応液１４０の液滴は液体１３０よりも比重が大きいので、重力の作用によって重力の作用する方向に移動する。また、液体１３０は、反応液１４０よりも比重が大きい液体であってもよい。この場合には、反応液１４０の液滴は液体１３０よりも比重が小さいので、重力の作用によって重力の作用する方向とは反対方向に移動する。
【００２８】
液体１３０はオイルを含むことが好ましく、例えば、シリコーンオイル又はミネラルオイルを使用することができる。ここで、シリコーンとは、主骨格としてシロキサン結合を有するオリゴマーまたはポリマーを意味する。本明細書においては、シリコーンのうち熱サイクル処理に使用する温度帯において液体の状態であるものを特にシリコーンオイルと称する。また、本明細書においては、石油から精製され、熱サイクル処理に使用する温度帯において液体であるものをミネラルオイルと称する。これらのオイルは熱に対する安定性が高く、例えば粘度が５×１０3Ｎｓｍ-2以下の製品も入手しやすいので、昇降型のＰＣＲに好適である。
【００２９】
シリコーンオイルとしては、信越シリコーン社製のＫＦ−９６Ｌ−０．６５ｃｓ、ＫＦ−９６Ｌ−１ｃｓ、ＫＦ−９６Ｌ−２ｃｓ、ＫＦ−９６Ｌ−５ｃｓ、東レ・ダウコーニング社製のＳＨ２００ Ｃ ＦＬＵＩＤ ５ ＣＳ、あるいはモメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ・ジャパン合同会社製のＴＳＦ４５１−５Ａ、ＴＳＦ４５１−１０等のジメチルシリコーンオイルが例示される。ミネラルオイルとしては、主成分として炭素数１４から２０程度のアルカンを含有するものが例示される。すなわち、ｎ−テトラデカン、ｎ−ペンタデカン、ｎ−ヘキサデカン、ｎ−ヘプタデカン、ｎ−オクタデカン、ｎ−ノナデカン、ｎ−テトラコサンが例示される。
【００３０】
液体１３０は、添加剤を含む。添加剤としては、カルビノール変性シリコーンレジン、カルボキシル変性シリコーンレジン、アミノ変性シリコーンレジン、ポリエーテル変性シリコーンレジン、シラノール変性シリコーンレジン、またはフルオロ変性シリコーンレジンを主成分とする添加剤であればよく、例えば、X-22-160AS、X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、 KF-6017 、KF-8005（以上、信越シリコーン社）などの変性シリコーンオイル、SR1000、SS4230、SS4267、YR3370（以上、Momentive社）などのシリコーンレジン、XS66-C1191（Momentive社）などのフルオロ変性シリコーンレジン、などのほか、TSF4703、TSF4708、XF42-C5196、XF42-C5197（以上、Momentive社）などの変性シリコーンオイルを使用することができる。添加剤の濃度は、特に限定されないが、容器の構造、材質、形状などを考慮して決定することができる。例えば、１％（ｖ/ｖ）以上５０％（ｖ/ｖ）以下であることが好ましく、２％（ｖ/ｖ）以上２０％（ｖ/ｖ）以下であることがより好ましく、５％（ｖ/ｖ）であることがさらに好ましい。
（２）昇降式核酸増幅反応装置の装置構成
本実施形態では、核酸増幅反応を行うのに用いるバイオチップとして、チューブ型の核酸増幅反応用チューブ１００を用いる。以下、核酸増幅反応用チューブ１００に適した昇降式核酸増幅反応装置（以下、昇降式ＰＣＲ装置とも記す）の一例について、詳細に述べる。
【００３１】
図２は、昇降式ＰＣＲ装置１の一例を示す。（Ａ）は昇降式ＰＣＲ装置１の蓋５０を閉じた状態、（Ｂ）は昇降式ＰＣＲ装置１の蓋５０を開けた状態であり、装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００が装着された状態を表す。図３は、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１における本体１０の分解斜視図である。図４（Ａ）は、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１における本体１０の、図２（Ａ）のＡ−Ａ線における断面を模式的に示す断面図である。
【００３２】
この昇降式ＰＣＲ装置１は、図２（Ａ）に示すように、本体１０及び駆動機構２０を含む。図３に示すように、本体１０は、装着部１１、第１加熱部１２及び第２加熱部１３を含む。第１加熱部１２と第２加熱部１３との間にはスペーサー１４が設けられている。本実施形態の本体１０においては、第１加熱部１２が底板１７の側、第２加熱部１３が蓋５０の側に配置されている。本実施形態の本体１０においては、第１加熱部１２、第２加熱部１３、及びスペーサー１４はフランジ１６、底板１７及び固定板１９に固定されている。
【００３３】
装着部１１は、後述する核酸増幅反応用チューブ１００を装着する構造である。図２（Ｂ）および図２に示すように、本実施形態の装着部１１は、核酸増幅反応用チューブ１００を差し込んで装着するスロット構造であり、第１加熱部１２の第１ヒートブロック１２ｂ、スペーサー１４、及び第２加熱部１３の第２ヒートブロック１３ｂを貫通する穴に核酸増幅反応用チューブ１００を差し込む構造となっている。装着部１１の数は複数であってもよく、図２（Ｂ）の例では、２０個の装着部１１が本体１０に設けられている。
【００３４】
この昇降式ＰＣＲ装置１は、核酸増幅反応用チューブ１００を第１加熱部１２及び第２加熱部１３に対して所定の位置に保持する構造を含む。より具体的には、図４に示すように、後述する核酸増幅反応用チューブ１００を構成する流路１１０の、第１領域１１１を第１加熱部１２によって、第２領域１１２を第２加熱部１３によって、加熱できる。本実施形態においては核酸増幅反応用チューブ１００の位置を定める構造は底板１７であり、図４（Ａ）に示すように、核酸増幅反応用チューブ１００を底板１７に接触する位置まで差し込むことで、第１加熱部１２及び第２加熱部１３に対して核酸増幅反応用チューブ１００を所定の位置に保持できる。
【００３５】
第１加熱部１２は、装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００を装着した場合に、後述する核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１を第１の温度に加熱する。図４（Ａ）に示す例では、第１加熱部１２は本体１０において、核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１を加熱する位置に配置されている。
【００３６】
第１加熱部１２は、熱を発生させる機構と、発生した熱を核酸増幅反応用チューブ１００に伝える部材とを含んでもよい。図３に示す例では、第１加熱部１２は第１ヒーター１２ａ及び第１ヒートブロック１２ｂを含む。本実施形態においては、第１ヒーター１２ａはカートリッジヒーターであり、導線１５によって図示しない外部電源に接続されている。第１ヒーター１２ａは第１ヒートブロック１２ｂに挿入されており、第１ヒーター１２ａが発熱することで第１ヒートブロック１２ｂが加熱される。第１ヒートブロック１２ｂは、第１ヒーター１２ａから発生した熱を核酸増幅反応用チューブ１００に伝える部材である。本実施形態においてはアルミニウム製のブロックである。
【００３７】
第２加熱部１３は、装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００を装着した場合に、核酸増幅反応用チューブ１００の第２領域１１２を、第１の温度とは異なる第２の温度に加熱する。図４（Ａ）に示す例では、第２加熱部１３は本体１０において、核酸増幅反応用チューブ１００の第２領域１１２を加熱する位置に配置されている。図２に示すように、第２加熱部１３は、第２ヒーター１３ｂ及び第２ヒートブロック１３ｂを含む。第２加熱部１３は、加熱する核酸増幅反応用チューブ１００の領域及び加熱する温度が第１加熱部１２と異なる以外は、第１加熱部１２と同様である。
【００３８】
本実施形態においては、第１加熱部１２及び第２加熱部１３の温度は、図示しない温度センサー及び後述する制御部によって制御される。第１加熱部１２及び第２加熱部１３の温度は、核酸増幅反応用チューブ１００が所望の温度に加熱されるように設定されることが好ましい。本実施形態においては、第１加熱部１２を第１の温度に、第２加熱部１３を第２の温度に制御することで、核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１を第１の温度に、第２領域１１２を第２の温度に加熱できる。本実施形態における温度センサーは熱電対である。
【００３９】
駆動機構２０は、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３を駆動する機構である。本実施形態においては、駆動機構２０は図示しないモーター及び駆動軸を含み、駆動軸と本体１０のフランジ１６とが接続されている。本実施形態における駆動軸は、装着部１１の長手方向に対して垂直に設けられており、モーターを動作させると駆動軸を回転の軸として本体１０が回転する。
【００４０】
本実施形態の昇降式ＰＣＲ装置１は、図示しない制御部を含む。制御部は、後述する第１の温度、第２の温度、第１の時間、第２の時間、及び熱サイクルのサイクル数のうち、少なくとも１つを制御する。制御部が第１の時間または第２の時間を制御する場合には、制御部は駆動機構２０の動作を制御することによって、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３が所定の配置に保持される時間を制御する。制御部は、制御する項目ごとに異なる機構を設けても、全項目を一括して制御するものであってもよいが、本実施形態の昇降式ＰＣＲ装置１における制御部は電子制御であり、上記項目を全て制御する。本実施形態の制御部は図示しないＣＰＵ等のプロセッサー、及び、ＲＯＭ（Read Only Memory）やＲＡＭ（Random Access Memory）等の記憶装置を含む。記憶装置には上記各項目を制御するための各種プログラム、データ等が記憶されている。また、記憶装置は各種処理の処理中データ、処理結果などを一時的に記憶するワークエリアを有する。
【００４１】
本実施形態の本体１０は、図３及び図４（Ａ）の例に示すように、第１加熱部１２と第２加熱部１３との間にスペーサー１４が設けられている。本実施形態のスペーサー１４は、第１加熱部１２または第２加熱部１３を保持する部材である。本実施形態においては、スペーサー１４は断熱材であり、図４（Ａ）の例においては、装着部１１はスペーサー１４を貫通している。
【００４２】
本実施形態の本体１０は、固定板１９を含む。固定板１９は、装着部１１、第１加熱部１２及び第２加熱部１３を保持する部材である。図２（Ｂ）及び図３に示す例においては、２枚の固定板１９がフランジ１６に嵌め合わされており、第１加熱部１２、第２加熱部１３及び底板１７が固定されている。
【００４３】
本実施形態の昇降式ＰＣＲ装置１は、蓋５０を含む。図２（Ａ）及び図４（Ａ）の例では、装着部１１は蓋５０によって覆われている。蓋５０は、固定部５１によって本体１０に固定されてもよい。本実施形態においては、固定部５１は磁石である。図２（Ｂ）及び図３の例に示すように、本体１０の蓋５０の接触する面には磁石が設けられている。図２（Ｂ）及び図３には示されていないが、蓋５０にも、本体１０の磁石が接触する位置に磁石が設けられており、蓋５０で装着部１１を覆うと、磁力によって蓋５０が本体１０に固定される。
【００４４】
なお、固定板１９、底板１７、蓋５０、フランジ１６は断熱材を用いて形成されることが好ましい。
（３）昇降式ＰＣＲ装置を用いた熱サイクル処理
図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、昇降式ＰＣＲ装置１の、図２（Ａ）のＡ−Ａ線における断面を模式的に示す断面図である。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、昇降式ＰＣＲ装置１に核酸増幅反応用チューブ１００が装着された状態を示す。図４（Ａ）は第１の配置、図４（Ｂ）は第２の配置を示す。図６は、実施形態における昇降式ＰＣＲ装置１を用いた熱サイクル処理の手順を表すフローチャートである。以下では、まず、実施形態に係る核酸増幅反応用チューブ１００について説明し、次に、核酸増幅反応用チューブ１００を用いた場合の、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１を用いた熱サイクル処理について説明する。
【００４５】
図１の例に示すように、実施形態に係る核酸増幅反応用チューブ１００は流路１１０及び封止部１２０を含む。流路１１０には、反応液１４０と、反応液１４０よりも比重が小さく、かつ、反応液１４０とは混和しないオイル１３０とが充填され、封止部１２０によって封止されている。
【００４６】
流路１１０は、対向する内壁に近接して反応液１４０が移動するように形成されている。ここで、流路１１０の「対向する内壁」とは、流路１１０の壁面の、向かい合う位置関係にある２つの領域を意味する。「近接」とは、反応液１４０と流路１１０の壁面との距離が近いことを意味し、反応液１４０が流路１１０の壁面に接触する場合を含む。したがって、「対向する内壁に近接して反応液１４０が移動する」とは、「流路１１０の壁面の、向かい合う位置関係にある２つの領域の両方に対して距離が近い状態で、反応液１４０が移動する」こと、すなわち、対向する内壁に沿って反応液１４０が移動することを意味する。
【００４７】
図１の例では、核酸増幅反応用チューブ１００の外形は円柱状であり、中心軸方向（図１における上下方向）に流路１１０が形成されている。流路１１０の形状は、流路１１０の長手方向に対して垂直な方向の断面、すなわち流路１１０のある領域における反応液１４０が移動する方向に対して垂直な断面（これを流路１１０の「断面」とする）が円形の筒状である。したがって、本実施形態の核酸増幅反応用チューブ１００においては、流路１１０の対向する内壁は、流路１１０の断面の直径を構成する流路１１０の壁面上の２点を含む領域であり、対向する内壁に沿って反応液１４０が流路１１０の長手方向に移動する。
【００４８】
核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１は、第１加熱部１２によって第１の温度に加熱される、流路１１０の一部の領域である。第２領域１１２は、第２加熱部１３によって第２の温度に加熱される、第１領域１１１とは異なる流路１１０の一部の領域である。本実施形態の核酸増幅反応用チューブ１００においては、第１領域１１１は、流路１１０の長手方向における一方の端部を含む領域であり、第２領域１１２は、流路１１０の長手方向における他方の端部を含む領域である。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）に示す例では、流路１１０の封止部１２０側の端部を含む点線で囲まれた領域が第２領域１１２であり、封止部１２０から遠い側の端部を含む点線で囲まれた領域が第１領域１１１である。
【００４９】
図１に示すように、流路１１０は、オイル１３０と、反応液の液滴１４０とを含む。オイル１３０と反応液１４０は、（１）核酸増幅反応用チップの記載に従って準備される。
【００５０】
以下、図４（Ａ）及び図４（Ｂ）を参照しながら、実施形態に係る熱サイクル装置１を用いた熱サイクル処理を説明する。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）においては、矢印ｇの方向（図における下方向）が重力の作用する方向である。本実施形態においては、熱サイクル処理の例としてシャトルＰＣＲ（２段階温度ＰＣＲ）を行う場合を説明する。なお、以下に説明する各工程は熱サイクル処理の一例を示すものである。必要に応じて工程の順序を入れ替えたり、２以上の工程を連続的にあるいは並行して行ったり、工程を追加したりしてもよい。
【００５１】
シャトルＰＣＲは、高温と低温の２段階の温度処理を繰り返し反応液に施すことにより、反応液中の核酸を増幅させる手法である。高温の処理においては２本鎖ＤＮＡの解離が、低温の処理においてはアニーリング（プライマーが１本鎖ＤＮＡに結合する反応）及び伸長反応（プライマーを始点としてＤＮＡの相補鎖が形成される反応）が起こる。
【００５２】
一般に、シャトルＰＣＲにおける高温は８０℃から１００℃の間の温度、低温は５０℃から７０℃の間の温度である。各温度における処理は所定時間行われ、高温に保持する時間は低温に保持する時間よりも短いことが一般的である。例えば、高温が１秒から１０秒程度、低温が１０秒から６０秒程度としてもよく、反応の条件によってはこれよりも長い時間であってもよい。
【００５３】
なお、使用する試薬の種類や量によって、適切な時間、温度およびサイクル数（高温と低温を繰り返す回数）は異なるので、試薬の種類や反応液１４０の量を考慮して適切なプロトコールを決定した上で反応を行うことが好ましい。
【００５４】
まず、核酸増幅反応用チューブ１００を、装着部１１に装着する。本実施形態では、オイル１３０が充填された流路１１０に反応液１４０を導入後、封止部１２０によって封止された核酸増幅反応用チューブ１００を装着部１１に装着する。反応液１４０の導入は、マイクロピペットやインクジェット方式の分注装置等を用いて行うことができる。装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００を装着した状態においては、第１加熱部１２は第１領域１１１を、第２加熱部１３は第２領域１１２を、それぞれ含む位置において核酸増幅反応用チューブ１００に接している。
【００５５】
ここで、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３、の配置は第１の配置である。図４（Ａ）に示すように、第１の配置は、核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１を、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置させる。第１の配置においては、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に第１領域１１１が位置するので、オイル１３０よりも比重の大きい反応液１４０は、第１領域１１１に位置する。本実施形態においては、装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００を装着したら、蓋５０によって装着部１１を覆い、昇降式ＰＣＲ装置１を作動させる。
【００５６】
次に、第１加熱部１２及び第２加熱部１３により核酸増幅反応用チューブ１００を加熱する。第１加熱部１２と第２加熱部１３とは、核酸増幅反応用チューブ１００の異なる領域を異なる温度に加熱する。すなわち、第１加熱部１２は第１領域１１１を第１の温度に加熱し、第２加熱部１３は第２領域１１２を第２の温度に加熱する。これにより、流路１１０の第１領域１１１と第２領域１１２との間には、第１の温度と第２の温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成される。ここでは、第１領域１１１から第２領域１１２へ向けて温度が低くなる温度勾配が形成される。本実施形態の熱サイクル処理はシャトルＰＣＲであるので、第１の温度は２本鎖ＤＮＡの解離に適した温度、第２の温度はアニーリング及び伸長反応に適した温度とする。
【００５７】
装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置は第１の配置であるので、核酸増幅反応用チューブ１００を加熱すると、反応液１４０は第１の温度に加熱される。第１の時間が経過したら、駆動機構２０によって本体１０を駆動し、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置を第１の配置から第２の配置へ切換える。第２の配置は、第２領域１１２を重力の作用する方向において流路１１０の最下部に位置させる配置である。換言すると、第２領域１１２は、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３が、第１の配置とは異なる所定の配置にある場合に、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置する領域である。本実施形態の熱サイクル装置１においては、制御部の制御によって駆動機構２０が本体１０を回転駆動する。駆動軸を回転の軸として、モーターによってフランジ１６を回転駆動すると、フランジ１６に固定されている装着部１１、第１加熱部１２及び第２加熱部１３が回転する。駆動軸は装着部１１の長手方向に対して垂直な方向の軸であるので、モーターの動作によって駆動軸が回転すると、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３が回転する。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）に示す例では、本体１０を１８０°回転させる。これにより、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置が第１の配置から第２の配置へ切換えられる。
【００５８】
ここで、第１領域１１１と第２領域１１２との重力の作用する方向における位置関係が第１の配置とは逆になるので、反応液１４０は重力の作用によって第１領域１１１から第２領域１１２へと移動する。装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置が第２の配置に達した場合に、駆動機構２０の動作が停止すると、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置が第２の配置に保持される。第２の配置において、第２の時間が経過したら、再度回転し、所定の回数が来るまで、このようにして第１の位置と第２の位置を入れ替えながら回転することにより、核酸増幅反応が行われる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
（１）界面活性剤の効果
本実施例では、市販の酵素（DNA polymerase）中に含まれる界面活性剤の濃度を参考にし、様々な濃度の界面活性剤溶液を作成し、その溶液のチューブへの付着を観察した。
【００６０】
まず、昇降式ＰＣＲ装置用ポリプロピレンチューブにオイルを充填し、１.６μLの界面活性剤溶液を添加して界面活性剤溶液の液滴を作り、チューブを横にして液滴が底に付かない状態で５分間静置した。その後、チューブを縦にして界面活性剤溶液をチューブの底へ移動させた。界面活性剤溶液が底に到達してから１分後、チューブを逆さにして、界面活性剤溶液のチューブ底への付着を評価した。すぐに落ちたものを○、振ると落ちるものや振っても落ちないものまで、少しでも付着の気配があれば×とした。なお、オイルとして、高純度のジメチルシリコーンオイルであるＫＦ−９６Ｌ−２ｃｓを用いた。
【００６１】
その結果、界面活性剤が、ある一定以上の濃度になった時、チューブ底への付着が生じた。表１に、用いたチューブに対し、チューブ底への付着が発生しない最大の濃度を記した。即ち、界面活性剤の濃度が、表１に記載の濃度以下の場合、反応液の内壁への付着はなかったが、この濃度より高い場合、反応液の内壁への付着が観察された。
【００６２】
【表１】
2015188343.tif 000002
このように、反応液中に、一定濃度以上の界面活性剤を含有させると、反応液がチューブの内壁に付着し、チューブを逆さにしても反応液が落ちないという現象を引き起こす。
（２）添加剤の効果
本実施例では、高純度の2ｃｓのジメチルシリコーンオイルに対し、表２に示したような添加剤を５％（ｖ/ｖ）になるように加えて混合し、オイルとして用いた。また、反応液は、以下のように準備した。
Takara Ex Taq HS (x50)          0.25
10×Ex Taq Buffer               5.0
dNTP Mixture (2.5 mM each)      4.0
InfA forward primer (20 μM)    2.0
InfA reverse primer (20 μM)    2.0
InfA probe (10 μM)             1.0
plasmid                         5.0
DW                              up to 50.0（単位はμL）
市販のTakara Ex Taq HSには、０．５％のNP40と０．５％のTween20が含まれているため、この反応液中には、０．０２％のNP40と０．０２％のTween20が含まれていることになる。
【００６３】
これらのオイルと反応液を用い、反応液のチューブへの付着を観察した。チューブへの付着は、（１）と同様に評価した。
【００６４】
【表２】
2015188343.tif 000003
このように、表２で示される添加剤を５％（ｖ/ｖ）程度添加することによって、反応液のチューブへの付着が防止できる。
【符号の説明】
【００６５】
１…昇降式ＰＣＲ装置、１０…本体、１１…装着部、１２…第１加熱部、１２ａ…第１ヒーター、１２ｂ…第１ヒートブロック、１３…第２加熱部、１３ａ…第２ヒーター、１３ｂ…第２ヒートブロック、１４…スペーサー、１５…導線、１６…フランジ、１７…底板、１９…固定板、２０…駆動機構、５０…蓋、５１…固定部、１００…バイオチップ（実施例では、核酸増幅反応用チューブ）、１１０…流路、１１１…第１領域、１１２…第２領域、１２０…封止部、１３０…液体（実施例では、オイル）、１４０…反応液（実施例では、核酸増幅反応液）、１５０…容器。
【図１】
2015188343.tif 000004
【図２】
2015188343.tif 000005
【図３】
2015188343.tif 000006
【図４】
2015188343.tif 000007