(57)【要約】【課題】生物時計を電気化学的に検出するための電子伝達分子を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、遺伝子改変に依らずに生物時計を検出することができる電子伝達分子、該電子伝達分子を用いた生物時計を検出するシステム及び方法を提供する。本発明の電子伝達分子は、細胞外電極と細胞内の酸化還元活性分子との間での電子交換を実現させるための適切な酸化還元電位を有し、生物時計に伴う体内の酸化還元状態の周期的変動を培地の開放電位へと伝達させ、こうした開放電位の電気化学的計測を介して、生物時計を検出することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物時計に伴う生体内の酸化還元状態の周期的変動を測定するための電子伝達分子であって、該分子内にフェロセン誘導体、シクラム誘導体、ポルフィリン誘導体、ピリジン誘導体、サイクレン誘導体、キノン誘導体、フェリシアン化カリウム、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、フェノチアジン錯体、フェナジンメトサルフェート（「ＰＭＳ」）誘導体、ｐ−アミノフェノール錯体、メルドーラブルー及び２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（「ＤＣＰＩＰ」）誘導体からなる群から選択される酸化還元分子を１種以上含む電子伝達分子。
【請求項２】
生物時計に伴う生体内の酸化還元状態の周期的変動を測定するための電子伝達分子であって、下記：
（ｉ）フェロセン誘導体、シクラム誘導体、ポルフィリン誘導体、ピリジン誘導体、サイクレン誘導体、キノン誘導体、フェリシアン化カリウム、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、フェノチアジン誘導体、ＰＭＳ誘導体、ｐ−アミノフェノール錯体、メルドーラブルー、又はＤＣＰＩＰを側鎖に有する、アクリル酸、メタクリル酸、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、クロトン酸、無水マレイン酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸、アクリルアミドプロパンスルホン酸、ビニル安息香酸、ビニルリン酸、４−ビニルピリジン、２−ビニルピリジン、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート、及びジメチルアミノプロピルメタクリルアミドからなる群から選択される１種以上の単量体；及び
（ｉｉ）アクリル酸、メタクリル酸、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、クロトン酸、無水マレイン酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸、アクリルアミドプロパンスルホン酸、ビニル安息香酸、ビニルリン酸、４−ビニルピリジン、２−ビニルピリジン、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート、及びジメチルアミノプロピルメタクリルアミドからなる群から選択される１種以上の単量体
を重合してなる共重合体である電子伝達分子。
【請求項３】
下記一般式（Ｉ）：
【化１】
2015188431.tif 000012
（式中、
Ｒ１〜Ｒ８は、独立して、Ｈ；Ｃ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルアミン基；ハロＣ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルオキシ基；ハロＣ１−６アルキルオキシ基；Ｃ１−６アルキレン基；並びにハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、ハロＣ１−６アルキル基、窒素原子に１個以上のＣ１−６アルキル基を有していてもよいカルバモイル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−６アシル基、Ｃ６−１０アリール基及び５〜１０員複素環式基からなる群から選択される１個以上の置換基で置換されてもよいフェニル基、５〜６員複素環式基又はフェニル−（ＣＨ２）ｐ−基（ここで、ｐは、１〜６の整数である）からなる群から選択され；
Ｘは、Ｃ１−６アルキル基、ハロＣ１−６アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、窒素原子に１個以上のＣ１−６アルキル基を有していてもよいカルバモイル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−６アシル基、Ｃ６−１０アリール基及び５〜１０員複素環式基からなる群から選択される１個以上の置換基で置換されてもよいフェニル基、５〜６員複素環式基又はフェニル−（ＣＨ２）ｑ−基（ここで、ｑは、１〜６の整数である）からなる群から選択され；
Ｙは、単結合、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ９−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−ＮＲ９−、−Ｏ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ９−、−ＮＲ９（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ９（Ｃ＝Ｓ）Ｏ−、−ＮＲ９（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ９−、−ＮＲ９（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ９、−ＮＲ９ＳＯ−、−ＮＲ９ＳＯ２−、−ＮＲ９ＳＯＮＲ９−、及び−ＮＲ９ＳＯ２ＮＲ９−（ここで、Ｒ９は水素原子又はＣ１−６アルキル基である）からなる群から選択され；
Ｌは、単結合、式−（Ａ）ｒ−（式中、Ａは、独立して、−Ｃ（Ｒ１０）２−、−ＣＲ１０＝ＣＲ１０−、−Ｃ≡Ｃ−、又は−Ｃ（Ｒ１０）２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ここで、Ｒ１０は水素原子又はＣ１−６アルキルである）、及びｒは１〜２０の整数である）を有する合成リンカー基であり；
ｍは、１０〜１０，０００の整数を表し；並びに
ｎは、１０〜１０，０００の整数を表す）
で表される、請求項１に記載の電子伝達分子。
【請求項４】
前記式（Ｉ）において、Ｒ１〜Ｒ８がメチル基であり、Ｘがメチル基であり、Ｙが−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、及びＬがメチレン基である、請求項３に記載の電子伝達分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の電子伝達分子を用いて生物時計を電気化学的に検出するためのシステムであって、
（ｉ）作用極及び対極を内部に具備したセル；及び
（ｉｉ）上記セル内で培養される細胞からの電位を測定するための測定手段
を備えたシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物時計を電気化学的に検出するための電子伝達分子、該電子伝達分子を用いた生物時計を検出するシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球上の生物が環境に適応するために用いている、約２４時間周期という概日リズムを維持するための生物時計（概日時計又はサーカディアン・クロックともいう）は、個体の代謝や遺伝子発現に大きな影響を及ぼす生命現象の一つである。生物の生理機能は、昼／夜の光や温度の変化に対応して変化している。例えば、植物の開花、休眠の他、鳥又はミツバチに見られる方向感覚も上記のリズムによって制御されているといえる。
【０００３】
このように生物の生理機能は生物時計の刻む概日リズムによって制御されているが、現代社会では、特に、ヒトは自らの概日リズムに反する生活を強いられ、不眠症や時差ボケに悩まされることが多い。また、うつ病や神経症などの疾患も概日時計の異常との関連が深い。このように、生物時計の崩壊は、概日リズム障害及び各種疾患をもたらす。生物の持つこうした概日リズムを生じさせる基本振動は生物の細胞中で発生することは知られている。しかしながら、この基本振動の発生やそれが生物の活動に反映される機構については十分に解明されていない。
【０００４】
これまで、細胞レベルにおいて、生物時計を調節し得る可能性のある遺伝子が見出されつつあり、細胞における概日リズムの調節について検討されてきた（特許文献１）。しかしながら、生物時計の計測は、主に、発光遺伝子を導入するといった遺伝子操作が用いられるため、遺伝子操作で発光株を作成するために、対象種の遺伝情報が既知である必要がある。
【０００５】
生物時計において、上記のような遺伝子発現と関連した遺伝子の時計と同期して、生体内での酸化還元状態（代謝）が概日リズムを刻むことが分かってきた。また、この酸化還元状態の概日リズムは、生物種（例えば、シアノバクテリア、菌類、藻類、植物、哺乳動物）を超えて普遍的に存在することも分かってきた。こうした背景を鑑みると、ある物質あるいはシステムの酸化還元状態の自在制御が可能である電気化学的手法は、生物時計の制御および計測の観点から非常に有力なツールとなる。これまで、ビタミンＫ３などの酸化還元活性分子が電子伝達分子として機能し、細胞外電極との間の（細胞外）電子移動（ＥＣ−ＥＥＴ）によって、微生物の酸化還元状態を制御できることが見出された（非特許文献１）。しかしながら、ビタミンＫ３の脂溶性により、タンパク質吸着、細胞膜内蓄積、又は高濃度キノン分子の細胞毒性により、細胞活性の低下や細胞の寿命の低下化が指摘されていた（非特許文献２）。
【０００６】
一方、本発明者らは、電子伝達分子として、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）とビニルフェロセンの共重合体であるポリ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＶＦ）（ＰＭＦ）を開発した。これにより、生細胞内の酸化還元状態、及び生物時計が、電子伝達分子を用いた細胞外電子移動（ＥＣ−ＥＥＴ）によって制御され得ることを見出した（非特許文献３及び４）。より具体的には、概日リズムを刻む生物時計を単細胞レベルで有する、シアノバクテリアの一種の光合成細菌シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）をモデル系として用いて、インビボにおけるクロロフィル蛍光のモニタリングの結果、プラストキノンプールの酸化還元状態が、電極電位を単純に変化させることによってＥＣ−ＥＥＴを用いて制御され得ることが見出されている。しかしながら、使用したＰＭＦの固有の酸化還元電位が高く、細胞から電子を周期的に引き抜くことによって生物時計を制御できるが、細胞外から細胞内に電子を入れるための電子伝達分子として機能しておらず、生物時計を検出するには至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−１８３１９７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Rabinowitz, D. J., et al., J. Am. Chem. Soc., 120, 2464-2473 (1998)
【非特許文献２】Sikkema, J., et al., Microbiol. Rev., 59, 201-222 (1995)
【非特許文献３】Nishio, K., et al., ChemPhysChem, 14, 2159-2163 (2013)
【非特許文献４】Lu, Y., et al., Angew. Chem. Int. Ed., 53, 2208-2211 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、対象生物種に依存しない、生物時計を電気化学的に検出するための電子伝達分子、該電子伝達分子を用いた生物時計を検出するシステム及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、細胞外電極と細胞内の酸化還元活性分子との間での電子交換を実現させるための適切な酸化還元電位を有する電子伝達分子を作製し、これにより生物時計に伴う体内の酸化還元状態の周期的変動を培地の開放電位へと伝達させ、こうした開放電位の電気化学的計測を介して、生物時計を検出することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］生物時計に伴う生体内の酸化還元状態の周期的変動を測定するための電子伝達分子であって、該分子内にフェロセン誘導体、シクラム誘導体、ポルフィリン誘導体、ピリジン誘導体、サイクレン誘導体、キノン誘導体、フェリシアン化カリウム、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、フェノチアジン錯体、フェナジンメトサルフェート（「ＰＭＳ」）誘導体、ｐ−アミノフェノール錯体、メルドーラブルー及び２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（「ＤＣＰＩＰ」）誘導体からなる群から選択される酸化還元分子を１種以上含む電子伝達分子。
【００１２】
［２］生物時計に伴う生体内の酸化還元状態の周期的変動を測定するための電子伝達分子であって、下記：
（ｉ）フェロセン誘導体、シクラム誘導体、ポルフィリン誘導体、ピリジン誘導体、サイクレン誘導体、キノン誘導体、フェリシアン化カリウム、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、フェノチアジン誘導体、ＰＭＳ誘導体、ｐ−アミノフェノール錯体、メルドーラブルー、又はＤＣＰＩＰを側鎖に有する、アクリル酸、メタクリル酸、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、クロトン酸、無水マレイン酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸、アクリルアミドプロパンスルホン酸、ビニル安息香酸、ビニルリン酸、４−ビニルピリジン、２−ビニルピリジン、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート、及びジメチルアミノプロピルメタクリルアミドからなる群から選択される１種以上の単量体；及び
（ｉｉ）アクリル酸、メタクリル酸、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、クロトン酸、無水マレイン酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸、アクリルアミドプロパンスルホン酸、ビニル安息香酸、ビニルリン酸、４−ビニルピリジン、２−ビニルピリジン、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート、及びジメチルアミノプロピルメタクリルアミドからなる群から選択される１種以上の単量体
を重合してなる共重合体である電子伝達分子。
【００１３】
下記一般式（Ｉ）：
【００１４】
【化１】
2015188431.tif 000002
【００１５】
（式中、
Ｒ１〜Ｒ８は、独立して、Ｈ；Ｃ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルアミノ基；ハロＣ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルオキシ基；ハロＣ１−６アルキルオキシ基；Ｃ１−６アルキレン基；並びにハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、ハロＣ１−６アルキル基、窒素原子に１個以上のＣ１−６アルキル基を有していてもよいカルバモイル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−６アシル基、Ｃ６−１０アリール基及び５〜１０員複素環式基からなる群から選択される１個以上の置換基で置換されてもよいフェニル基、５〜６員複素環式基又はフェニル−（ＣＨ２）ｐ−基（ここで、ｐは、１〜６の整数である）からなる群から選択され；
Ｘは、Ｃ１−６アルキル基、ハロＣ１−６アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、窒素原子に１個以上のＣ１−６アルキル基を有していてもよいカルバモイル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−６アシル基、Ｃ６−１０アリール基及び５〜１０員複素環式基からなる群から選択される１個以上の置換基で置換されてもよいフェニル基、５〜６員複素環式基又はフェニル−（ＣＨ２）ｑ−基（ここで、ｑは、１〜６の整数である）からなる群から選択され；
Ｙは、単結合、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ９−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−ＮＲ９−、−Ｏ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ９−、−ＮＲ９（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ９（Ｃ＝Ｓ）Ｏ−、−ＮＲ９（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ９−、−ＮＲ９（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ９、−ＮＲ９ＳＯ−、−ＮＲ９ＳＯ２−、−ＮＲ９ＳＯＮＲ９−、及び−ＮＲ９ＳＯ２ＮＲ９−（ここで、Ｒ９は水素原子又はＣ１−６アルキル基である）からなる群から選択され；
Ｌは、単結合、式−（Ａ）ｒ−（式中、Ａは、独立して、−Ｃ（Ｒ１０）２−、−ＣＲ１０＝ＣＲ１０−、−Ｃ≡Ｃ−、又は−Ｃ（Ｒ１０）２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ここで、Ｒ１０は水素原子又はＣ１−６アルキルである）、及びｒは１〜２０の整数である）を有する合成リンカー基であり；
ｍは、１０〜１０，０００の整数を表し；並びに
ｎは、１０〜１０，０００の整数を表す）
で表される、上記［１］に記載の電子伝達分子。
【００１６】
［４］前記式（Ｉ）において、Ｒ１〜Ｒ８がメチル基であり、Ｘがメチル基であり、Ｙが−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、及びＬがメチレン基である、上記［３］に記載の電子伝達分子。
【００１７】
［５］上記請［１］〜［４］のいずれか一つに記載の電子伝達分子を用いて生物時計を電気化学的に検出するためのシステムであって、
（ｉ）作用極及び対極を内部に具備したセル；及び
（ｉｉ）上記セル内で培養される細胞からの電位を測定するための測定手段
を備えたシステム。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、遺伝子改変に依らず、また生物種を問わずに可逆的な生物リズムを検出することができる。これにより、本技術は、生物機能の産業的利用や創薬研究に直接的又は間接的に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の生物時計検出システムを用いて測定した、シネココッカス・エロンガタス（ＰＣＣ７９４２）を含む培地の開放電位（細胞内の酸化還元状態を反映）の周期的変動を示す結果である。縦軸は対極に対する作用電極の電位（ｍｖ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、対象生物種に依存しない、生物時計、すなわち細胞内の酸化還元状態を電気化学的に検出するための電子伝達分子、該電子伝達分子を用いた生物時計を検出するシステム及び方法に関する。以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
【００２１】
１．生物時計と酸化還元状態
本明細書で使用する「生物時計」とは、当業者に周知である一般的な意味から逸脱するものではなく、普遍的に保存された内因性生化学ペースメーカーであって、２４時間リズムを有する生物学的プロセスを制御して得る概念である。また、この生物時計は、シアノバクテリア、菌類、藻類、植物、及び哺乳動物などの様々な生物に見出されている。環境変動への内因性サーカディアンリズムの同調には、生物種によって変化に富む多数の細胞機構成分が関与する分子時間調節機構が必要とされる。特に、細胞内の酸化還元状態は、種々の生物学的プロセスに影響を及ぼし、サーカディアンリズムと密接に関係していることが知られている。例えば、哺乳動物における内因性サーカディアンリズムの主要なペースメーカーである視交叉上核（ＳＣＮ）の酸化還元状態は、ＳＣＮニューロン活動に直接影響を及ぼす昼／夜変化を示す。さらに、ほぼ全ての生物において見出される酵素であるペルオキシレドキシンは、広範な細胞型（ヒト血球などの核及びＤＮＡを持たない細胞も含む）における酸化／還元の日周リズムを有する。複数の系における新たな証拠によれば、細胞の酸化還元状態は、生物時計の機能に本質的であることが示唆されている。
【００２２】
本発明は、電子伝達分子によって誘起される、細胞外電極と細胞内の間の細胞外電子移動（ＥＣ−ＥＥＴ）に基づいて、細胞内の酸化還元状態（具体的には、酸化還元電位）を測定することを本質とする。ここで、本明細書で使用するとき、「細胞外電子移動（ＥＥＴ）」とは、生細胞の細胞内電子が細胞膜を横切って、細胞外の電極に授受されるプロセスを指す。このプロセスを媒介する分子を電子伝達分子又は電子メディエーターと称する。電子伝達分子の存在下、ＥＥＴプロセスのための細胞外の電子供与体／受容体として電極を利用することができる。電子移動の方向（電子の流入と放出）及び速度は、単に加電圧を変化させることによって制御可能である。上記の通り、細胞内の酸化還元状態が酸化還元種の交換によって決定されるため、このような電気化学的手法によるＥＥＴ（ＥＣ−ＥＥＴ）を用いることによって、酸化還元状態、すなわち生物時計の外部制御を行うことができる。
【００２３】
生物時計（細胞内の酸化還元状態）を検出するためのモデル実験系として、シアノバクテリアの一種であるシネココッカス・エロンガタス（ＰＣＣ７９４２）を用いることができる。当業者に知られているように、Ｓ．エロンガタス細胞のサーカディアンリズムは、３つの生物時計タンパク質（ＫａｉＡ、ＫａｉＢ、及びＫａｉＣ）の結合機能に起因している。ＫａｉＡ及びＫａｉＢタンパク質は、ＫａｉＣの自己リン酸化活性を増強／軽減することによって、サーカディアンペースメーカーを調節する。最近、酸化型（還元型ではない）キノンが、ＫａｉＡ機能を抑制することによって時計の位相をリセットすることが報告されている。細胞内キノンの酸化還元平衡が環境の光強度によって影響を受けるため、ＫａｉＡの酸化還元反応性リン酸化機能は、環境の明／暗サイクルと内因性の分子振動を橋渡しする。酸化型キノンが熱的摂動と同様にして時計をリセットし得ることが示されているが、この作用は一時的である。これまで、生物時計の連続的制御を目的として、本発明者らは、電子伝達分子（電子メディエーター）として、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）とビニルフェロセンの共重合体であるポリ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＶＦ）（ＰＭＦ）を開発したが、ＰＭＦ固有の酸化還元電位の高さにより、生物時計を検出することができない。そこで、本発明者らは、以下に詳述するように、ＰＭＦよりも固有の酸化還元電位が低い電子伝達分子を製造することによって、生物時計を検出することに成功した。
【００２４】
２．生物時計の検出対象
本発明は、後述する本発明の電子伝達分子及びシステムを用いることにより、対象生物種に依存せずに、生物時計を検出することができる。よって、検出対象は、限定されないが、シアノバクテリア、菌類の細胞、藻類の細胞、植物細胞、哺乳動物細胞（ヒト細胞を含む）が挙げられる。なお、哺乳動物細胞には、生物時計が存在することが知られている、核を有しない赤血球が含まれる。上記した通り、シアノバクテリアの一種の光合成細菌シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）は、概日リズムを刻む生物時計を単細胞レベルで有することで知られ、本発明の電子伝達分子及びシステムの有効性を検証するために適したモデル系として使用することができる。また、別の一態様として、検出対象は、細胞レベルに限定されず、上記細胞等を含む生体自体であってもよい。
【００２５】
３．生物時計を検出するためのシステム
本発明によれば、生物時計に伴う生体内の酸化還元状態の周期的変動を測定するために使用されるシステムを提供することができる。本発明のシステムは、細胞内の酸化還元状態を反映し得る培地の開放電位の周期的変動を検出することができる限り、該システムを構成する手段及び部材は限定されない。検出対象が細胞である場合、細胞を含む液体試料（細胞培養液、血液など）及び電子伝達分子を注入するためにセルなどの容器を用意し、セルに具備された電極を用いて細胞内の酸化還元状態を測定してもよい。別の態様として、電子伝達分子が予めコーティングされたチップを用いて、該チップ上に上記の液体試料を添加し、電極を用いて細胞内の酸化還元状態を測定してもよい。さらに別の態様では、電子伝達分子が予めコーティングされた電極を皮膚に接触させることによって、生体の酸化還元状態を測定してもよい。
【００２６】
本発明のシステムの典型例を以下に示す。一実施形態において、本発明は、後述する電子伝達分子を用いて生物時計を電気化学的に検出するためのシステムであって、
（ｉ）作用極及び対極を内部に具備したセル；及び
（ｉｉ）上記セル内で培養される細胞からの電位を測定するための測定手段
を備えたシステムを提供することができる。
【００２７】
電極を具備したセルは、酸化還元状態を測定中に液体試料を維持できる形状及び部材のものであればよい。絶縁性部材で作製されていることが好ましく、バイオセンサーで一般に使用され得るものであってよい。このような絶縁性部材として、限定されないが、シリコン、ガラス、ガラスエポキシ、セラミック、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリプロピレン、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、及びポリイミドが挙げられる。
【００２８】
本発明において使用されるセルは、作用極及び対極を内部に具備した二極系電気化学セルであってもよく、場合により、参照極を備えた三極系電気化学セルであってもよい。本明細書で使用するとき、「作用極」とは、本システムにおいて、所望の反応を起こさせる電極を指す。作用極としては、限定されないが、透明電極ｔｉｎ−ｄｏｐｅｄ−Ｉ２Ｏ３（ＩＴＯ）、白金、炭素などを用いることができる。「対極」とは、作用極に対して、電流を流す相手となる別の電極を指す。対極としては、限定されないが、Ｐｔ線、Ａｇ｜ＡｇＣｌ電極、ＳＣＥ電極などを用いることができる。本発明のシステムには、作用極と対極間の電位差を測定するための測定手段を備える。該測定手段は、限定されず、一般的に使用されているロガー、ポテンシオスタットなどを用いることができる。
【００２９】
本発明によれば、生物時計は、電位差の測定のみならず、電流の測定によっても検出することができる。この場合、上記セル内に電位印加装置を具備することが好ましい。電流を測定する場合、参照極を備えた三極系電気化学セルを用いることがより好ましい。
【００３０】
本発明のさらなる実施形態において、本発明のシステムは、細胞及び培養液をセル内に注入する注入手段、及び／又はセル内に配置される調節部等を含んでもよい。ここで、本発明のシステムに使用される「調節部」とは、生物時計の検出を支援するための、セル内に配置された制御手段等を備えた機器類を意味する。具体的には、調節部は、限定されないが、セル内で培養細胞を維持するための手段であって、培養液の温度及び／又はｐＨを制御するための制御手段、並びにセル内の圧力／ＣＯ２濃度を調節するための調節手段を含むことができ、さらに、細胞内の酸化還元状態の周期的変動を測定するために使用される電子伝達分子を培地内に供給するための供給手段を含んでもよい。上記制御手段及び調節手段は、細胞を培地中で維持するための一般的な培養条件を提供することができるものであってよく、当業者が周知の手段、装置等を使用することができる。また、上記供給手段は、電子伝達分子を適切な時期に所定量を供給するために使用される手段であって、電子伝達分子を貯留するための容器、セル内に電子伝達分子を適切な時期に所定量を添加するための制御機器類を含んでもよい。セル内に添加される電子伝達分子の濃度は、限定されないが、０．１〜２ｇ／Ｌであり、好ましくは０．２〜１ｇ／Ｌである。
【００３１】
本発明によれば、上記システムを用いて生物（細胞）の生物時計を検出することができる。生物時計の検出は、基本的には、電子伝達分子及び電極を用いる電気化学的手法に基づくものであるが、以下に、検出原理を簡単に説明する。上述したように、シネココッカス・エロンガタスにける生物時計は、生物時計の主要タンパク質であるＫａｉＣのリン酸化及び脱リン酸化に基づくが、このＫａｉＣのリン酸化及び脱リン酸化の制御は、プラストキノンの酸化状態にのみ結合するＫａｉＡの働きによる。プラストキノンの還元型（昼）と酸化型（夜）の２４時間周期でリズムを刻んでいる。そのため、培地内にＥＥＴプロセスを実現する電子伝達分子を加えることによって、プラストキノンの酸化還元状態の変動が、培地の酸化還元状態の変化を引き起こすため、培地内に設置した細胞外電極により培地の酸化還元状態の変化を検出することができる。最終的には、ＫａｉＣによる生物時計を検出することができるようになる。
【００３２】
本発明者らが従前開発したＰＭＦの固有の酸化還元電位は＋０．５Ｖ  ｖｓ．ＳＨＥと高いため、細胞内にＰＭＦが入ったとしても、ＰＭＦが、細胞内の電子伝達に関与するチトクロムｂ６ｆ複合体（Ｃｙｔ  ｂ６／ｆ）（酸化還元電位：＋０．３６Ｖ）やプラストシアニン（ＰＣ）（酸化還元電位：＋０．４Ｖ）から電子を引き抜くことはできるが、電子を受容した後のＰＭＦが電極に電子を与えることはできない。これに対して、実施例１に詳述する本発明の電子伝達分子であるＭｅ８−ＰＭＦは、酸化還元電位が＋０．２Ｖと低いため、上記のＣｙｔ  ｂ６／ｆ（＋０．３６Ｖ）やＰＣ（＋０．４Ｖ）に電子を与え、反対に、プラストキノン（ＰＱ）（＋０．１Ｖ）から電子を引き抜くことができる。すなわち、本発明の電子伝達分子においては、その酸化還元電位の低さゆえに、プラストキノンの酸化還元状態の変動が、培地の開放電位の変動へと伝えられる。したがって、培地の開放電位の変動を細胞外電極により計測することによって、細胞内の酸化還元状態の変動、すなわち概日時計を検出することができる。
【００３３】
４．電子伝達分子
本発明の生物時計に伴う生体内の酸化還元状態の周期的変動を測定するために使用される電子伝達分子は、上記測定を可能にする電子メディエーターとして機能するものであれば特に限定されない。本発明の一実施形態として、本発明の電子伝達分子としては、限定されないが、フェロセン誘導体、シクラム誘導体、ポルフィリン誘導体、ピリジン誘導体、サイクレン誘導体、キノン誘導体、フェリシアン化カリウム、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、フェノチアジン錯体、フェナジンメトサルフェート（「ＰＭＳ」）誘導体、ｐ−アミノフェノール錯体、メルドーラブルー及び２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（「ＤＣＰＩＰ」）誘導体からなる群から選択される酸化還元分子を１種以上含む化合物が挙げられる。本発明の電子伝達分子に含まれる酸化還元分子は、好ましくは、フェロセン誘導体、シクラム誘導体、ポルフィリン誘導体、ピリジン誘導体である。錯体形成の可能な金属イオンとしては、限定されないが、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋が挙げられる。なお、上記に列挙した誘導体が、電子メディエーターとして機能し得るためには金属錯体であり得る。また、本発明によれば、上述したシクラム誘導体、ポルフィリン誘導体、ピリジン誘導などを含む大環状化合物もまた、本発明の検出システムにおいて使用することができる。
【００３４】
フェロセン誘導体には、限定されないが、フェロセン、アセチルフェロセン、ベンゾイルフェロセン、ｎ−ブチルフェロセン、フェロセン  モノカルボン酸、ブチリルフェロセン、シクロヘキシルフェロセン、シクロペンテニルフェロセン、ジメチルアミノメチル  フェロセン、エチルフェロセン、ヘキサノイルフェロセン、ヘキシルフェロセン、オクタノイルフェロセン、ペンタノイルフェロセン、ペンチルフェロセン、プロピオニルフェロセン、プロピルフェロセン、１，１’−ジアセチル  フェロセン、１，１’−ジブチル  フェロセン、１，１’−ジブチリルフェロセン、１，１’−ジエチルフェロセン、１，１’−ジヘキサノイルフェロセン、１，１’−ジヘキシルフェロセン、１，１’−ジプロピルフェロセン、４−フェロセノイル酪酸、４−フェロセノイル酪酸エステル、３−フェロセノイルプロピオン酸、３−フェロセノイルプロピオン酸エステル、フェロセニル酢酸、フェロセニルアセトニトリル、４−フェロセニル酪酸、４−フェロセニル酪酸エステル、フェロセニルカルボキシアルデヒド、フェロエニルカルボン酸、フェロセニルエタノール、フェロセニルメタノール、５−フェロセニル吉草酸、５−フェロセニル吉草酸エステル、カトセン−（２，２ビス（エチルフェロセニル）プロパン、アミノフェロセン、ホルムアミドフェロセン、イソシアノフェロセン、イソチオシアナトフェロセン、及びジホスフィン−１；１’ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンが挙げられる。
【００３５】
一態様では、フェロセン誘導体として、上記の具体的な誘導体を基本骨格とし、さらに適切な置換基で置換された任意の誘導体を用いることができる。例えば、フェロセンを基本骨格とした場合、下記式：
【００３６】
【化２】
2015188431.tif 000003
【００３７】
で表される誘導体を使用することができる。ここで、上記式中、Ｒ１〜Ｒ８は、独立して、Ｈ；Ｃ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルアミノ基；ハロＣ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルオキシ基；ハロＣ１−６アルキルオキシ基；Ｃ１−６アルキレン基；並びにハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、ハロＣ１−６アルキル基、窒素原子に１個以上のＣ１−６アルキル基を有していてもよいカルバモイル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−６アシル基、Ｃ６−１０アリール基及び５〜１０員複素環式基からなる群から選択される１個以上の置換基で置換されてもよいフェニル基、５〜６員複素環式基又はフェニル−（ＣＨ２）ｐ−基（ここで、ｐは、１〜６の整数である）からなる群から選択される置換基であってもよい。
【００３８】
シクラム誘導体には、限定されないが、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（「シクラム」）、メチルシクラム、１，８−ビス（ピリジルメチル）シクラム、１，１１−ビス（ピリジルメチル）シクラム、４−［１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカ−１−イル］−メチル安息香酸（「ＣＰＴＡ」）、及びジオキシシクラムが挙げられる。なお、上述の通り、電子メディエーターとして機能し得るためには金属錯体であり得る。一態様では、シクラム誘導体として、上記の具体的な誘導体を基本骨格とし、さらに適切な置換基で置換された任意の誘導体を用いることができる。例えば、シクラム金属錯体を基本骨格とした場合、下記式：
【００３９】
【化３】
2015188431.tif 000004
【００４０】
で表される誘導体を使用することができる。ここで、上記式中、Ｒ１〜Ｒ４は、独立して、Ｈ；Ｃ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルアミノ基；ハロＣ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルオキシ基；ハロＣ１−６アルキルオキシ基；Ｃ１−６アルキレン基；並びにハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、ハロＣ１−６アルキル基、窒素原子に１個以上のＣ１−６アルキル基を有していてもよいカルバモイル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−６アシル基、Ｃ６−１０アリール基及び５〜１０員複素環式基からなる群から選択される１個以上の置換基で置換されてもよいフェニル基、５〜６員複素環式基又はフェニル−（ＣＨ２）ｐ−基（ここで、ｐは、１〜６の整数である）からなる群から選択される置換基であってもよい。また、Ｍは、金属イオンを表し、限定されないが、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋であってもよい。
【００４１】
ポルフィリン誘導体は、化学的構造の一部分としてポリピロール環を含む分子であって、限定されないが、ポルフィリン、２，３−ジヒドロポルフィリン、２，３，７，８−テトラヒドロポルフィリン、５，１０，１５，２０，２２，２４−ヘキサヒドロポルフィリン、５，１０，１５，２０−テトラアザポルフィリンが挙げられる。なお、上述の通り、電子メディエーターとして機能し得るためには金属錯体であり得る。一態様では、ポルフィリン誘導体として、上記の具体的な誘導体を基本骨格とし、さらに適切な置換基で置換された任意の誘導体を用いることができる。例えば、ポルフィリン金属錯体を基本骨格とした場合、下記式：
【００４２】
【化４】
2015188431.tif 000005
【００４３】
で表される誘導体を使用することができる。ここで、上記式中、Ｒ１〜Ｒ１２は、独立して、Ｈ；Ｃ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルアミノ基；ハロＣ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルオキシ基；ハロＣ１−６アルキルオキシ基；Ｃ１−６アルキレン基；並びにハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、ハロＣ１−６アルキル基、窒素原子に１個以上のＣ１−６アルキル基を有していてもよいカルバモイル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−６アシル基、Ｃ６−１０アリール基及び５〜１０員複素環式基からなる群から選択される１個以上の置換基で置換されてもよいフェニル基、５〜６員複素環式基又はフェニル−（ＣＨ２）ｐ−基（ここで、ｐは、１〜６の整数である）からなる群から選択される置換基であってもよい。また、Ｍは、金属イオンを表し、限定されないが、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋であってもよい。
【００４４】
ピリジン誘導体は、電子メディエーターとして機能し得るために金属錯体を形成し得るものであれば特に限定されない。例えば、ピリジン誘導体の金属錯体としては、下記式：
【００４５】
【化５】
2015188431.tif 000006
【００４６】
【化６】
2015188431.tif 000007
【００４７】
で表される構造を有するものが挙げられる。ここで、上記式中、Ｒ１〜Ｒ１６は、独立して、Ｈ；Ｃ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルアミノ基；ハロＣ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルオキシ基；ハロＣ１−６アルキルオキシ基；Ｃ１−６アルキレン基；並びにハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、ハロＣ１−６アルキル基、窒素原子に１個以上のＣ１−６アルキル基を有していてもよいカルバモイル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−６アシル基、Ｃ６−１０アリール基及び５〜１０員複素環式基からなる群から選択される１個以上の置換基で置換されてもよいフェニル基、５〜６員複素環式基又はフェニル−（ＣＨ２）ｐ−基（ここで、ｐは、１〜６の整数である）からなる群から選択される置換基であってもよい。また、Ｍは、金属イオンを表し、限定されないが、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋であってもよい。
【００４８】
サイクレン誘導体は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（「サイクレン」）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（「ＤＯＴＡ」）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトライルテトラキスメチレンテトラキスホスホン酸が挙げられる。なお、上述の通り、電子メディエーターとして機能し得るためには金属錯体であり得る。一態様では、サイクレン誘導体として、上記の具体的な誘導体を基本骨格とし、さらに適切な置換基で置換された任意の誘導体を用いることができる。例えば、サイクレン金属錯体を基本骨格とした場合、下記式：
【００４９】
【化７】
2015188431.tif 000008
【００５０】
で表される構造を有するものが挙げられる。ここで、上記式中、Ｒ１〜Ｒ１２は、独立して、Ｈ；Ｃ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルアミノ基；ハロＣ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルオキシ基；ハロＣ１−６アルキルオキシ基；Ｃ１−６アルキレン基；並びにハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、ハロＣ１−６アルキル基、窒素原子に１個以上のＣ１−６アルキル基を有していてもよいカルバモイル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−６アシル基、Ｃ６−１０アリール基及び５〜１０員複素環式基からなる群から選択される１個以上の置換基で置換されてもよいフェニル基、５〜６員複素環式基又はフェニル−（ＣＨ２）ｐ−基（ここで、ｐは、１〜６の整数である）からなる群から選択される置換基であってもよい。また、Ｍは、金属イオンを表し、限定されないが、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋であってもよい。
【００５１】
上記で具体的に定義した電子伝達分子以外の誘導体及び錯体については、一般的な定義に従うものとし、当業者であれば容易に理解し得るものである。
【００５２】
本発明の電子伝達分子としては、上述した酸化還元分子を１種以上側鎖に有する重合体を用いることができる。酸化還元分子を導入するために使用される、官能基（ピリジル基、カルボキシル基、リン酸基、アミノ基等）を有する単量体としては、例えば、以下のものから選択される：
（１）親水性単量体、例えば、
−  少なくとも１つのカルボン酸又はスルホン酸官能性を含むエチレン性不飽和単量体、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、クロトン酸、無水マレイン酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸、アクリルアミドプロパンスルホン酸、ビニル安息香酸、ビニルリン酸、及びこれらの塩；
−  少なくとも１つの第３級アミン官能性を有するエチレン性不飽和単量体、例えば、４−ビニルピリジン、２−ビニルピリジン、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、及びこれらの塩；
−  式ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＯＯＲａ（式中、Ｒａは、メチル、エチル、プロピル又はイソブチル基等の１〜４個の炭素原子を含む直鎖又は分岐アルキル基を表し、該アルキル基は、ヒドロキシル基（例えば、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート又は２−ヒドロキシエチルメタクリレート）及びハロゲン原子（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ又はＦ）（例えば、トリフルオロエチルメタクリレート）から選択される１以上の置換基で置換されている）のメタクリレート；
−  式ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＯＯＲｂ（式中、Ｒｂは、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１以上のヘテロ原子が任意に介在する直鎖又は分岐Ｃ６−Ｃ１２アルキル基を表し、該アルキル基は、ヒドロキシル基及びハロゲン原子（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ又はＦ）から選択される１以上の置換基で置換されている）のメタクリレート；
−  式ＣＨ２＝ＣＨＣＯＯＲｃ（式中、Ｒｃは、ヒドロキシル基（例えば、２−ヒドロキシプロピルアクリレート及び２−ヒドロキシエチルアクリレート）及びハロゲン原子（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ又はＦ）から選択される１以上の置換基で置換されている直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ１２アルキル基を表し、あるいは、Ｒｃは、例えばメトキシ−ＰＯＥ等の５〜３０のオキシエチレン単位の繰り返しを有する（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル−Ｏ−ＰＯＥ（ポリオキシエチレン）を表し、あるいは、Ｒｃは、５〜３０のエチレンオキシド単位を含むポリオキシエチレン化基を表す）のアクリレート；
（２）１以上のケイ素原子を含むエチレン性不飽和単量体、例えば、メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン及びメタクリルオキシプロピルトリス（トリメチルシロキシ）シラン、及びこれらの混合物。
【００５３】
一態様では、酸化還元分子を側鎖に有する重合体は、上記単量体の側鎖上の官能基と反応して結合し得る官能基（以下、「対応官能基」という）を有するように酸化還元分子を修飾し、その後、該単量体と重合させることによって得ることができる。ここで、対応官能基の例としては、単量体の側鎖上の官能基が酸性基（例えば、カルボキシル基、リン酸基）である場合には、酸化還元分子には、置換基として、塩基性基（例えば、第一級又は第二級アミン、好ましくはエチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基）が導入されていることが好ましい。なお、上記酸性基と塩基性基からアミド結合を形成させるために、縮合剤（例えば、エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等）を用いてもよい。
【００５４】
他の態様では、酸化還元分子を側鎖に有する重合体は、上述した第３級アミン官能性を有するエチレン性不飽和単量体のうち４−ビニルピリジン又は２−ビニルピリジンを側鎖に有する重合体を用いることができる。例えば、側鎖に４−ビニルピリジンを有する場合、該ピリジン環上の窒素原子が、酸化還元分子に配位した金属イオンに配位結合することによって、実質的に酸化還元分子を側鎖に有する重合体を合成することができる。
【００５５】
別の態様では、酸化還元分子を側鎖に有する重合体は、上述した単量体のうちの少なくとも２つ以上を構成単位として有する共重合体であってもよい。このような共重合体の例としては、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとフェロセン誘導体との共重合体、アクリル酸と４−ビニルピリジンとの共重合体にさらに酸化還元分子が配位した共重合体などが挙げられる。
【００５６】
より具体的には、本発明の電子伝達分子は、下記：
（ｉ）フェロセン誘導体、シクラム誘導体、ポルフィリン誘導体、ピリジン誘導体、サイクレン誘導体、キノン誘導体、フェリシアン化カリウム、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、フェノチアジン誘導体、ＰＭＳ誘導体、ｐ−アミノフェノール錯体、メルドーラブルー、又はＤＣＰＩＰを側鎖に有する、アクリル酸、メタクリル酸、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、クロトン酸、無水マレイン酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸、アクリルアミドプロパンスルホン酸、ビニル安息香酸、ビニルリン酸、４−ビニルピリジン、２−ビニルピリジン、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート、及びジメチルアミノプロピルメタクリルアミドからなる群から選択される１種以上の単量体；及び
（ｉｉ）アクリル酸、メタクリル酸、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、クロトン酸、無水マレイン酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸、アクリルアミドプロパンスルホン酸、ビニル安息香酸、ビニルリン酸、４−ビニルピリジン、２−ビニルピリジン、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート、及びジメチルアミノプロピルメタクリルアミドからなる群から選択される１種以上の単量体
を重合してなる共重合体であってもよい。なお、上記（ｉ）に示される側鎖に酸化還元分子を有する単量体の調製は、一般的なカップリング反応を用いて行ってもよい。例えば、主鎖としてアクリル酸を用いる場合、アクリル酸の側鎖であるカルボキシル基と、酸化還元分子中の置換基の１つであるＣ１−６アルキルアミノ基とを適切な縮合剤を用いて結合させることによって、酸化還元分子を側鎖に有する単量体を得ることができる。
【００５７】
本発明の電子伝達分子として、上記（ｉ）の単量体と（ｉｉ）の単量体を重合させて共重合体を製造する場合、製造方法は限定されず、一般的な重合法に従って所望の共重合体を得ることができる。したがって、所望の共重合体を目的とする場合、（ｉｉ）の単量体を重合化し、その後、側鎖に酸化還元分子を導入してもよい。
【００５８】
酸化還元分子の導入率（重合度）は、重合条件（単量体量、溶媒、重合温度、重合時間など）を適宜調整することによって変更することができる。本発明の共重合体は、溶液重合、塊状重合、乳化重合、懸濁重合などの公知の方法を用いて、重合温度０〜１００℃にて、重合時間１０分〜７２時間の条件下で重合させるによって得ることができる。なお、得られる共重合体は、ランダム共重合体、ブロック共重合体のいずれであってもよい。
【００５９】
一般的に、重合開始剤としては、特に限定されないが、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２’−アゾビス〔２−（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン〕二塩酸塩、２，２’−アゾビス〔２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン〕二塩酸塩、２，２’−アゾビスイソブチルアミド二水和物、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ターシャリブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ターシャリブチルペルオキシピバレート、ターシャリブチルペルオキシジイソブチレート、過酸化ラウロイル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）などが挙られる。これらの重合開始剤を１種又は２種以上を用いてもよい。また、重合開始剤の使用量は、全不飽和単量体に対して０．０１から５重量％が好ましく使用される。共重合体の精製は、再沈殿法、透析法、限外濾過法などの一般的な精製法により行うことができる。なお、本発明の好ましい態様としての２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）とオクタメチルビニルフェロセンとの共重合体（以下、単に「Ｍｅ８−ＰＭＦ」と記載することがある）の製造は、後述する実施例１を参照されたい。
【００６０】
本発明の共重合体を溶液重合によって合成する場合、溶媒として、限定されないが、エタノール、テトラヒドロフラン、メタノール、エーテル、ベンゼン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦなどを用いてもよい。
【００６１】
本発明に使用する共重合体の重合度は、特に限定されないが、２０〜２００，０００であることが好ましい。ここで、共重合体を他の素材にコーティングして使用する場合、共重合体を溶媒に溶解して用いることができ、この場合、共重合体溶液の粘度の関係から共重合体の重合度は１００〜５０，０００であることがより好ましく挙げられる。
【００６２】
典型的な例として、本発明によれば、下記の一般式（Ｉ）で表される共重合体を用いることができる。
【００６３】
【化８】
2015188431.tif 000009
【００６４】
上記式（Ｉ）中、「ｎ」及び「ｍ」は、それぞれ、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）とビニルフェロセン誘導体の重合度を表す。具体的には、ｍは１０〜１０，０００の整数を意味する。「ｍ」は、好ましくは１０〜５，０００であり、より好ましくは２０〜２，０００であり、さらに好ましくは２０〜１，０００である。一方、「ｎ」は、好ましくは１０〜５，０００であり、より好ましくは２０〜２，０００であり、さらに好ましくは２０〜１，０００である。
【００６５】
上記式（Ｉ）中、Ｒ１〜Ｒ８は、独立して、Ｈ；Ｃ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルアミン基；ハロＣ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルオキシ基；ハロＣ１−６アルキルオキシ基；Ｃ１−６アルキレン基；並びにハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、ハロＣ１−６アルキル基、窒素原子に１個以上のＣ１−６アルキル基を有していてもよいカルバモイル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−６アシル基、Ｃ６−１０アリール基及び５〜１０員複素環式基からなる群から選択される１個以上の置換基で置換されてもよいフェニル基、５〜６員複素環式基又はフェニル−（ＣＨ２）ｐ−基（ここで、ｐは、１〜６の整数である）からなる群から選択される置換基を表す。
【００６６】
上記式（Ｉ）中、Ｘは、Ｃ１−６アルキル基、ハロＣ１−６アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、窒素原子に１個以上のＣ１−６アルキル基を有していてもよいカルバモイル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−６アシル基、Ｃ６−１０アリール基及び５〜１０員複素環式基からなる群から選択される１個以上の置換基で置換されてもよいフェニル基、５〜６員複素環式基又はフェニル−（ＣＨ２）ｑ−基（ここで、ｑは、１〜６の整数である）からなる群から選択される置換基を表す。種々の置換基の定義については、上述した通りである。
【００６７】
上記式（Ｉ）中、Ｙは、単結合、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ９−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−ＮＲ９−、−Ｏ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ９−、−ＮＲ９（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ９（Ｃ＝Ｓ）Ｏ−、−ＮＲ９（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ９−、−ＮＲ９（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ９、−ＮＲ９ＳＯ−、−ＮＲ９ＳＯ２−、−ＮＲ９ＳＯＮＲ９−、及び−ＮＲ９ＳＯ２ＮＲ９−（ここで、Ｒ９は水素原子又はＣ１−６アルキル基である）からなる群から選択される基を表す。
【００６８】
上記式（Ｉ）中、Ｌは、単結合、式−（Ａ）ｒ−（式中、Ａは、独立して、−Ｃ（Ｒ１０）２−、−ＣＲ１０＝ＣＲ１０−、−Ｃ≡Ｃ−、又は−Ｃ（Ｒ１０）２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ここで、Ｒ１０は水素原子又はＣ１−６アルキルである）、及びｒは１〜２０の整数である）を有する合成リンカー基である。
【００６９】
本発明の典型的な一態様として、本発明は、上記式（Ｉ）において、Ｒ１〜Ｒ８がメチル基であり、Ｘがメチル基であり、Ｙが−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、及びＬがメチレン基である、下記式（ＩＩ）：
【００７０】
【化９】
2015188431.tif 000010
【００７１】
で表される電子伝達分子が提供される。なお、上記式（Ｉ）における置換基に限らず、上述した全ての式中の置換基における具体的な各置換基の定義は、以下の通りである。
【００７２】
本明細書で使用するとき、「Ｃ１−６アルキル基」とは、炭素数１〜６個の直鎖状又は分枝状のアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、１−エチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、４−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、１−メチルペンチル基、３，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基が挙げられる。好ましくは、メチル基、イソプロピル基、シクロヘキシル基が挙げられる。好ましくはメチル基、エチル基、より好ましくはメチル基である。
【００７３】
本明細書で使用するとき、「Ｃ１−６アルキルアミン基」とは、炭素数１〜４個の直鎖状又は分枝状のアルキル基を意味し、例えば、 メチルアミン基、エチルアミン基、ｎ−プロピルアミン基、イソプロピルアミン基、ｎ−ブチルアミン基、イソブチルアミン基、ｓｅｃ−ブチルアミン基、ｔｅｒｔ−ブチルアミン基、ジメチルアミン基、トリメチルアミン基、ジエチルアミン基、トリエチルアミン基、ジイソプロピルエチルアミン基が挙げられる。好ましくは、ｎ−プロピルアミン基である。
【００７４】
本明細書で使用するとき、「ハロＣ１−６アルキル基」とは、同一若しくは異なった１個〜置換可能な最大数のハロゲン原子で置換されているＣ１−６アルキル基であり、例えば、モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、モノクロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、モノブロモメチル基、モノヨードメチル基又は２，２，２−トリフルオロエチル基等が挙げられる。
【００７５】
本明細書で使用するとき、「Ｃ１−６アルキルオキシ基」とは、上記Ｃ１−６アルキル基が酸素原子に結合した基を意味する。具体的には、例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、ｓ−ブチルオキシ基、ｔ−ブチルオキシ基が挙げられる。
【００７６】
本明細書で使用するとき、「ハロＣ１−６アルキルオキシ基」とは、同一であるか又は異なっていてもよい１〜５個のハロゲン原子が前記Ｃ１−６アルキルオキシ基に結合した基を意味し、例えば、トリフルオロメチルオキシ基、２−フルオロエチルオキシ基、２−クロロエチルオキシ基、２−ブロモエチルオキシ基、３−フルオロプロピルオキシ基、３−クロロプロピルオキシ基、４−フルオロブチルオキシ基、４−クロロブチルオキシ基、２，２，２−トリフルオロエチルオキシ基、３，３，３−トリフルオロプロピルオキシ基、ペンタフルオロエチルオキシ基、２，２，２−トリフルオロ−１−トリフルオロメチルエチルオキシ基である。好ましくは、トリフルオロメチルオキシ基、２−フルオロエチルオキシ基、２，２，２−トリフルオロエチルオキシ基であり、より好ましくは、トリフルオロメチルオキシ基、２，２，２−トリフルオロエチルオキシ基である。
【００７７】
本明細書で使用するとき、「Ｃ１−６アルキレン基」とは、炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖の飽和炭化水素基を意味する。具体的には、例えば、メチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基、イソブチレン基、ｓ−ブチレン基、ｔ−ブチレン基等が挙げられる。
なお、その他の置換基については、当業者が認識する一般的な定義に従うものとする。
【実施例】
【００７８】
以下、製造例及び実験例を挙げて本発明の構成及び効果をより明確に説明する。但し、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
【００７９】
実施例１：ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ｃｏ−オクタメチルビニルフェロセン）（Ｍｅ８−ＰＭＦ）の製造
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）は、石原一彦教授（東京大学）から提供された。下記のスキーム１に従って、Ｍｅ８−ＰＭＦ（「Ｓ６」）を合成した。
【００８０】
【化１０】
2015188431.tif 000011
【００８１】
オクタメチルフェロセン（「Ｓ１」）を含む他の化合物については、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、又はＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入し、さらに精製することなしに使用した。
【００８２】
（１）オクタメチルフェロセンカルボアルデヒド（「Ｓ２」）の合成
Ｓ２は、若干の変更を伴うが、Ｚｏｕ，Ｃ．＆  Ｗｒｉｇｈｔｏｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１２，７５７８−７５８４（１９９０）に記載の手法に従って合成した。具体的には、オクタメチルフェロセン（５．００ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）、乾燥ＣＨＣｌ３（１００ｍＬ）、及び乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６．５ｍＬ、８４ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で撹拌しながら、１００ｍＬの二口丸底フラスコに添加した。次に、塩化ホスホリル（７．８ｍＬ、８４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を還流しながら一晩撹拌した。得られた溶液を氷を用いて０℃に冷却し、酢酸カリウム水溶液（１５％、５０ｍＬ）を滴下した。この混合物を大気中で３０分間撹拌し続けた。ＣＨＣｌ３と水を用いて混合物を抽出した。有機溶媒を蒸発させ、３時間、真空乾燥させて、暗紫色の粉末として表題オクタメチルフェロセンカルボアルデヒド（５．１３ｇ、９３％）を得た。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm): 10.0 (s, 1H, CHO), 3.45 (s, 1H, Cp), 2.04 (s, 6H, Me), 1.84 (s, 6H, Me), 1.70 (s, 6H, Me), 1.65 (s, 6H, Me).
【００８３】
（２）オクタメチルフェロセニルメチルアミン（「Ｓ３」）の合成
Ｓ３は、若干の変更を伴うが、Ｂａｒａｍｅｅ，Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１４，１２９４−１３０２（２００６）に記載の手法に従って合成した。エタノール（１００ｍＬ）中のＳ２（５．１１ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（３．８ｇ、９４ｍｍｏｌ）、及び水酸化塩化ヒドロキシルアミン（２．２ｇ、３２ｍｍｏｌ）の混合物を１００ｍＬの二口丸底フラスコで、窒素雰囲気下で還流しながら３時間撹拌した。得られた溶液を室温まで温めた。この溶液をＣＨＣｌ３と水を用いて抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、オクタメチルフェロセニルカルボアルデヒドオキシムを橙色の粉末として得た。
【００８４】
合成されたオクタメチルフェロセニルカルボアルデヒドオキシムを窒素雰囲気下で乾燥ＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解した。この溶液を窒素雰囲気下で撹拌しながら、乾燥ＴＨＦ（６０ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ４（２．３ｇ、６１ｍｍｏｌ）の懸濁液に滴下した。混合物を還流しながら一晩撹拌した。この混合物を氷を用いて０℃以下にし、水を添加して加水分解した。次に、ジエチルエーテルを用いて抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、有機溶媒を蒸発させて、表題オクタメチルフェロセニルメチルアミンを橙色粉末として得た（４．３１ｇ、８３％）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm): 3.50 (s, 2H, CH2), 3.27 (s, 1H, Cp), 1.82 (s, 6H, Me), 1.76 (s, 6H, Me), 1.73 (s, 6H, Me), 1.67 (s, 6H, Me).
【００８５】
（３）オクタメチルフェロセニルメチル・メタクリルアミド（「Ｓ４」）の合成
オクタメチルフェロセニルメチルアミン（１．７０ｇ、５．００ｍｍｏｌ）および乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）を窒素雰囲気下で撹拌しながら、５０ｍＬの二口丸底フラスコに添加した。還流下でモレキューラーシーブを用いて乾燥させたトリエチルアミンを混合溶液に添加した。０℃に冷却し、メタクリロイルクロリド（０．９４ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）をこの混合溶液に添加した。得られた溶液を室温まで温め、２時間放置した。反応物を外気に晒し、水性Ｎａ２ＣＯ３（１０％）をゆっくり添加し、氷を用いて０℃以下で反応を停止させた。飽和ＮａＣｌ水溶液を用いて有機溶液を連続的に洗浄し、水で１０倍に希釈した。Ｎａ２ＳＯ４上で有機層を乾燥させ、真空中で溶媒を除去した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２とヘキサンの混合物中に溶解した。再結晶させ、表題オクタメチルフェロセニルメチル・メタクリルアミドを黄色粉末として得た（１．３１ｇ、６５％）。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm): 5.60 (s, 1H, C=CH2), 5.51 (s, 1H, -NH-), 5.26 (s, 1H, C=CH2), 4.19 (d, 2H, -CH2-), 3.33 (s, 1H, Cp), 1.92 (s, 3H, MeC=CH2), 1.80 (s, 6H, MeCp), 1.76 (s, 6H, MeCp), 1.74 (s, 6H, MeCp), 1.69 (s, 6H, MeCp).
【００８６】
（４）Ｍｅ８−ＰＭＦ（「Ｓ６」）の合成
重合開始剤としてα，α’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を用いたフリーラジカル重合によってＭｅ８−ＰＭＦを合成した。ＭＰＣ（０．２２ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、オクタメチルフェロセニルメチル・メタクリルアミド（０．２０ｇ、０．５ｍｍｏｌ）およびＡＩＢＮ（５ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下でエタノール（５ｍＬ）中に溶解し、還流しながら４８時間撹拌した。合成した重合体は、ジエチルエーテル中で再沈殿させ、次に、濾過して回収した。真空乾燥後、この重合体を水に溶解させ、０．２μｍのメンブレンフィルターで濾過した。溶液を再生セルロースメンブレン（ＭＷＣＯ：１０００）を用いて４日間透析した。その後、この重合体を凍結乾燥させ、得られた緑色粉末（０．０３４ｇ，８％）を以下の実験に使用した。合成した重合体のＭＰＣとオクタメチルフェロセンの比率は、ＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルによって特徴付けられた。１０ｍＭの臭化リチウムを含む、メタノールと水（７０／３０  ｖ／ｖ）の混合物中で、ゲル浸透クロマトグラフィーによって分子量を測定した。ポリ（エチレンオキシド）を本システムの較正のための標準試料として用いた。
【００８７】
実施例２：シネココッカス・エロンガタスの細胞培養
シネココッカス・エロンガタス（ＰＣＣ７９４２）を３０℃にて振とうしながら、２０００ｌｕｘで日周明／暗（１２時間／１２時間）サイクルとして、ＢＧ１１培地中で規定通りに前培養した。シネココッカス・エロンガタス（ＰＣＣ７９４２）は、ニュートラルサイトＩにＰｋａｉＢＣ−ｌｕｘＡＢとニュートラルサイトＩＩにＰｐｓｂＡＩ−ｌｕｘＣＤＥを有し、従来報告されているように生物発光測定のために使用した。
【００８８】
実施例３：電気化学的測定
単一チャンバーの三極システムを全ての電気化学的測定に使用した。このシステムにおいて、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ：３ｃｍ２）を作用極としてリアクターの底部に配置した。さらに、Ａｇ／ＡｇＣｌ（ｓａｔ．ＫＣｌ）を対極として使用した。電気化学的測定を行うために、実施例１で作製した電子伝達分子（１ｇ／ＬのＭｅ８−ＰＭＦ）を添加した４ｍＬのＢＧ１１をこのシステムチャンバーに添加し、Ｎ２／ＣＯ２（９８／２  ｖｏｌ／ｖｏｌ）ガスを５分間、５０ｍＬ／分にて充填した。次に、シネココッカス・エロンガタス細胞をシステムに注入し、７３０ｎｍでの吸光度は２であった。電気化学培養は、特に記述がなければ、３０℃にて行われた。撹拌せずに測定した。
【００８９】
上記のシステムチャンバーを用いてシネココッカス・エロンガタス細胞を電気培養した結果、作用極−参照極に電圧の周期的変動に応じて、測定した作用極−対極間の電位（ｍＶ）の周期的変動が生じた。これにより、システム内に添加した電子伝達分子により細胞外電子移動系が構築され、細胞の酸化還元状態を制御できるだけでなく、該システムによって、細胞の酸化還元状態、すなわち生物時計を検出することができた。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
遺伝子改変に依らずに、また生物種を問わずに可逆的な生物リズムを検出することができ、生物機能の産業的利用や創薬研究に直接的又は間接的に応用することができる。
【００９１】
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【図１】
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