(57)【要約】【課題】皮膚細胞のＦＡＴＰ４産生促進剤の提供を課題とする。【解決手段】マンニトールにＦＡＴＰ４産生促進活性があることを見出し、本化合物を有効成分とする皮膚細胞のＦＡＴＰ４産生促進剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンニトールを有効成分とするＦＡＴＰ４産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＡＴＰ４産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の角質層は角質細胞と角質細胞間脂質のラメラ構造からなる。角質細胞間脂質の主成分はセラミド、脂肪酸、コレステロール、コレステロール硫酸から成り、水分と油分を交互に積み重ねることで肌の水分を保持し、外的刺激から肌を保護している。したがって、細胞間脂質により整然としたラメラ構造を形成する角質層は、皮膚外部からの刺激を受けても、防御する機能を有する。一方、細胞間脂質が少なく、ラメラ構造に乱れがある角質層は、皮膚外部からの刺激に対する防御機能が低いことから、外部刺激物質の影響を受け、角質層内部の水分が蒸散するなど、ダメージを受けやすくなる。
ところで、角質層に急性刺激が与えられた場合、皮膚のバリア機能が崩壊するが、このとき正常な皮膚であれば、角化細胞の分化とともに脂肪酸合成酵素の発現が多くなり、脂肪酸がバリア機能回復を行うことが知られている（非特許文献１）。
また、脂肪酸の細胞外からの取り込みに作用する脂肪酸輸送たんぱく質（ＦＡＴＰ／Fatty-Acid Transport Protein）の分子種と局在の点から検討すれば、皮膚にはＦＡＴＰ４が存在することが知られている（非特許文献２）。そして、野生型マウスと比べＦＡＴＰ４を欠損させたマウスは、凹凸のない硬い皮膚に覆われており（非特許文献３）、ＦＡＴＰ４を欠損させたマウスは表皮の分化がうまくいかず正常な水分保持能を有さないことが知られている（非特許文献４）。人においてもＦＡＴＰ４の遺伝子変異は、魚鱗癬未熟性症候群の原因となることが知られている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Dermatoendocrinol 2011 Apr3(2)53-61 Epub 2011 Apr 1.
【非特許文献２】J Biol Chem. 2008 Jan 25;283(4):1773-7.Epub 2007 Nov 16
【非特許文献３】PNAS 2003 Apr 29 100(9)5274-9 Epub 2003 Apr 15
【非特許文献４】Dev Biol 2010 Aug 15 344(2)707-19 Epub 2010 Jun 1
【非特許文献５】Am J Hum Genet. 2009 Aug;85(2):248-53.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、上記のとおり、ＦＡＴＰ４は皮膚の水分保持に重要な役割を担っていることから、ＦＡＴＰ４の産生を促進することができれば、皮膚の水分保持機能を高めることができ、また、魚鱗癬未熟性症候群などの皮膚異常症の予防・治療剤としても利用することができるのではないかと考え、ＦＡＴＰ４産生促進剤の探索を鋭意行った。
その結果、驚くべきことに、マンニトールにＦＡＴＰ４の産生促進活性があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
〔１〕マンニトールを有効成分とするＦＡＴＰ４産生促進剤。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、マンニトールを有効成分とするＦＡＴＰ４の産生促進剤を提供することができた。そして、本剤は、ＦＡＴＰ４の欠乏による皮膚異常、例えば魚鱗癬や魚鱗癬未熟性症候群などの治療に効果を発揮することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】皮膚角化細胞とＳＤＳを接触させることによりＦＡＴＰ４遺伝子の発現が無添加のものに対して有意に低下することを確認した結果である。(参考例１)
【図２】皮膚角化細胞とＳＤＳを接触させることにより低下するＦＡＴＰ４遺伝子の発現について、各種のサンプル物質の添加による影響を調べた結果である。(実施例１)
【図３】各種のサンプル物質の添加によるヒト皮膚角化細胞における細胞保護作用を調べた結果である。（参考例２）
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、皮膚細胞におけるＦＡＴＰ４の遺伝子の発現増進作用を有するかどうかを手がかりに被験物質をスクリーニングし、当該作用を有する物質をＦＡＴＰ４産生促進剤として提供する。
【０００９】
一般的に、遺伝子の「発現」という用語は、その遺伝子の翻訳産物すなわちタンパク質の産生のことを指すが、より広義には、その遺伝子の転写産物すなわちｍＲＮＡの産生のことを指すこともある。本明細書では、「発現」と言えば特にことわりがない限りタンパク質のレベルにおける発現とｍＲＮＡのレベルにおける発現の両方を指すものとする。タンパク質のレベルにおける発現量増加はその遺伝子の機能を遂行する最終産物の増加を反映し、ｍＲＮＡのレベルにおける発現量増加はその遺伝子の活性化に伴う直接的な結果を反映する。一般的にｍＲＮＡ発現の増加はタンパク質発現の増加につながると推定することが通常である。
本発明では後述する実施例のように、ＦＡＴＰ４の産生促進は、ｍＲＮＡ量の増加として表れる場合に産生促進であると判断した。
【００１０】
特定のタンパク質の発現を検出または定量するための種々の方法は、当業者にはよく知られており、例えばウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫染色などが挙げられる。当業者は、個々のタンパク質の特性に合わせて、適切な検出方法または定量方法を選択または設計できる。特定のｍＲＮＡの発現を検出または定量するための種々の方法も、当業者にはよく知られており、例えばノザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイなどが挙げられる。各遺伝子に特異的なプローブおよびプライマーを併用するＴａｑＭａｎ系によるＲＴ−ＰＣＲは、感度、定量性、特異性において優れており、好ましい。
【００１１】
皮膚細胞は判定の対象となる被験体に由来するものであるとよく、被験体の生物種としては、ヒト、ブタ、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ウサギ、ラット、マウス、モルモットなどの哺乳動物を挙げることができる。
【００１２】
皮膚細胞としては、表皮角化細胞、皮膚線維芽細胞、ランゲルハンス細胞、色素細胞（メラノサイト）、悪性黒色腫細胞（メラノーマ）などを挙げることができる。皮膚細胞は国内ではヒューマンサイエンス研究資源バンク、理化学研究所細胞銀行、海外ではｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから供給される。またＣｌｏｎｔｅｃｈ社、クラボウ社、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社から入手できる。また、公知の方法により皮膚から採取することができる（分子生物学研究のための新細胞培養実験法，ｐ５７−７１，羊土社，１９９９）。
【００１３】
本発明に用いるマンニトールはマンニットとも呼ばれ、マンノースの糖アルコールである。マンニトールの組成式はＣ６Ｈ１４Ｏ６、分子量は１８２である。マンニトールは市販品を用いることができる。
【００１４】
本発明のＦＡＴＰ４産生促進剤は、ＦＡＴＰ４の産生促進活性を必要とする用途のいずれにも使用することができ、例えば、医薬用組成物としての用途が考えられる。医薬用組成物としては、皮膚異常症治療用組成物、魚鱗癬や魚鱗癬未熟性症候群の治療用組成物やこれらの予防用組成物として利用することができる。本発明のＦＡＴＰ４産生促進剤の使用形態としては、経口用、経鼻用、皮膚外用、注射剤などが挙げられる。以下に実施例を挙げて、具体的に説明するが、これに限定されるものではない。 
【実施例】
【００１５】
〔参考例１〕ＳＤＳ添加による、ヒト皮膚角化細胞のＦＡＴＰ４遺伝子発現に対する影響確認試験
一般にヒト皮膚角化細胞に対して刺激物質として知られているＳＤＳを細胞に添加することにより、皮膚を損傷させ、その場合にＦＡＴＰ４遺伝子の発現に対してどのような影響を与えるかを調べた。
【００１６】
１．試験に用いた材料
細胞：ヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａｔ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ製（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０６：７６１−７７１（１９８８）
マルチプレート６Ｆ：ＭＳ−８００６０、住友ベークライト製
Ｄ−ＭＥＭ培地：１１９９５−０７３、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製
Ｄ−ＰＢＳ培地：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅｓ、１４１９０−２５０、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ製
ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）：１９１−０７１４５、和光純薬工業製
クロロホルム：０３８−０２６０６、和光純薬工業製
２−プロパノール：１６８−２１６７５、和光純薬工業製
エタノール：０５９−０７８９５、和光純薬工業製
ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水：Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ（ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ）、１０９７７−０１５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ製
【００１７】
２．試験方法
（１）細胞の培養
ヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａｔ）をマルチプレート６Ｆに４ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2 にて播種し、ＦＢＳ１０％とＰｅｎｉｓｉｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ１％を添加したＤ−ＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で、２４時間前培養を行った。培養後のマルチプレートをＤ−ＰＢＳ培地により洗浄し、Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ１％およびＳＤＳ０．２％を添加したＤ−ＭＥＭ培地で培養した。培養時間は、３０分、６０分、１８０分とした。
（２）ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出
上記（１）の細胞培養後、マルチプレートをＤ−ＰＢＳ培地で洗浄し、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、１５５９６−０１８）にて細胞を溶解し回収した。回収した細胞溶解液は−８０℃で保存し、１週間以内にｔｏｔａｌＲＮＡ抽出を行った。
ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出は、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔマニュアルに従って行った。すなわち、室温にて５分間静置したのち、クロロホルム２００μＬを加えて１５秒間激しく混合した後、室温で３分間静置した。その後、１３，０００ｒｐｍ、５分間、４°Ｃで遠心分離した上清を回収し、２−プロパノール５００μＬを加えて室温で１０分間置き、１３，０００ｒｐｍ、１０分間、４°Ｃで遠心分離してペレットを回収した。このペレットに７０ｖｏｌ％エタノールを１ｍｌ添加し、再び１０，０００ｒｐｍ、４°Ｃ、５分で遠心分離してペレットを回収し、風乾した。これにＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水２０μＬを添加して溶解したものをｔｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液として以下の試験に用いた。
（３）ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡの合成は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ、ＲＲ０３６Ａ）のマニュアルに従って行った。すなわち、５ｘ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）：ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液：ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水が１：１：３の割合（体積割合）になるように混合し、サーマルサクラーにて３７℃、１５分で逆転写、８５℃、５秒で逆転写酵素の熱失活を行った後、４℃にて冷却した。
（４）ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現量の測定
ＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ製、ＲＲ８２０Ａ）のマニュアルに従って行った。ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（２ｘ）に対し、ＰＣＲ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（終濃度０．４μＭ）、ＰＣＲ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（終濃度０．４μＭ）を含む等量のＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を加え調整した。その後、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、以下の条件にて初期変性、ＰＣＲ反応、融解曲線分析および冷却を行い、ＰＣＲ増幅産物の生成量（ｍＲＮＡ量）の検出を行った。
初期変性：９５℃、３０秒
ＰＣＲ反応：９５℃で５秒、６０℃で３０秒を４０サイクル
融解曲線分析：９５℃で５秒、６０℃で１分
冷却：５０℃、３０秒
ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現量はＡｃｔｉｎ遺伝子の発現量で標準化を行った。
培養時間３０分のコントロール（ＳＤＳ無添加の細胞）のＦＡＴＰ４遺伝子発現量を基準として、ＦＡＴＰ４遺伝子発現量の相対比を算出した。
（５）データ解析
コントロールに対する分散性をＦ検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定を行い、等分散性と仮定できない場合にはＷｅｌｃｈのｔ検定を用いて行った。有意水準は＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１とした。以下の試験についても同様である。
【００１８】
３．試験結果
結果を図１に示す。
図１によれば、ＳＤＳ添加により皮膚角化細胞におけるＦＡＴＰ４の遺伝子の発現は、コントロールの場合に比べて優位に低下し、かつ経時的に低下したことが確認された。したがって、皮膚角化細胞はＳＤＳのような皮膚刺激物質にさらされることにより、ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現が低下・抑制されることがわかった。
以下、ＦＡＴＰ４遺伝子の発現が抑制されるような皮膚への刺激が起きる環境下でＦＡＴＰ４産生促進剤のスクリーニングを行った。
【００１９】
〔実施例１〕ＦＡＴＰ４産生促進剤のスクリーニング
参考例１より、皮膚に対する刺激によってＦＡＴＰ４の遺伝子の発現が低下することが確認された。したがって、ＦＡＴＰ４遺伝子の発現を手がかりに、同遺伝子の発現低下を抑制あるいは発現を増進するような物質を探すことにより、ＦＡＴＰ４産生促進剤を取得することにつながると考え、以下のスクリーニングを行った。
【００２０】
１．試験に用いた材料
参考例１と同じ。
【００２１】
２．試験方法
（１）細胞の培養
ヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａｔ）をマルチプレート６Ｆに４ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2 にて播種し、ＦＢＳ１０％とＰｅｎｉｓｉｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ１％を添加したＤ−ＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で、２４時間前培養を行った。培養後のマルチプレートをＤ−ＰＢＳ培地により洗浄し、Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ１％およびＳＤＳ０．２％を添加したＤ−ＭＥＭ培地に、各サンプルを１μｇ／ｍＬ培地となるように添加して培養した。サンプルは、Ｄ（＋）−グルコース（和光純薬工業製、０４７−００５９２）、Ｄ（−）−フルクトース（和光純薬工業製、１２３−０２７６２）、Ｄ（＋）−ガラクトース（和光純薬工業製、０７１−０００３２）、Ｄ（＋）−マルトース一水和物（和光純薬工業製、１３６−００６１２）、ラフィノース（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、２１７４１０）、ソルビトール（東京化成工業製、Ｓ００６５）、Ｄ−マンニトール（Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、６９−６５−８）、エリスリトール（Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、１４９−３２−６）、マルチトール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｍ８８９２−２５Ｇ）を用いた。サンプルを添加しないで培養したものをコントロールとした。
サンプルはあらかじめ少量のＤ−ＰＢＳ培地に溶解したのち培地に添加した。培養時間は１８０分とした。
（２）ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出
参考例１と同じ
（３）ｃＤＮＡの合成
参考例１と同じ
（４）ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現量の測定
参考例１と同様に測定した。コントロールのＦＡＴＰ４遺伝子発現量を基準として、ＳＤＳとサンプル添加時のＦＡＴＰ４遺伝子発現量の相対比を算出した。
【００２２】
３．試験結果
結果を図２に示す。
本図によれば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マルトース、ラフィノース、ソルビトール、エリスリトール、マルチトールを添加した場合は、皮膚刺激物質であるＳＤＳによるＦＡＴＰ遺伝子の発現の低下抑制あるいは発現を増進することができず、ＳＤＳのみを添加した場合（コントロール）と同じ程度、あるいはそれ以下であった。一方、マンニトールを添加した場合は、有意にＳＤＳによるＦＡＴＰ４遺伝子の発現の低下抑制あるいは発現を増進することがわかった。
【００２３】
〔参考例２〕 ヒト皮膚角化細胞における細胞保護作用の検討
皮膚に対する刺激によって細胞生存量の低下が見られるが、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マルトース、ラフィノース、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、マルチトールがこの細胞生存量の低下を抑制する程度を調べた。
【００２４】
１．試験に用いた材料
臭化３-(４,５-ジメチル-２-チアゾリル)-２,５-ジフェニル-２Ｈ-テトラゾリウム：３４１−０１８２３、和光純薬工業製
２-プロパノール：１６３-０４８４６、和光純薬工業製
９６ウェルマイクロプレート：Ｆａｌｃｏｎ(登録商標) ９６ウェル マイクロプレート(ＢＤ製、３５３０７２)
参考例１と共通のものは省略した。
【００２５】
２．試験方法
ヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａｔ）をマルチプレート６Ｆに４ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2 にて播種し、ＦＢＳ１０％とＰｅｎｉｓｉｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ１％を添加したＤ−ＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で、２４時間前培養を行った。その後、培養後のマルチプレートをＤ−ＰＢＳ培地により洗浄し、Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ１％およびＳＤＳ０．２％を添加したＤ−ＭＥＭ培地に、各サンプルを１μｇ／ｍＬ培地となるように添加して培養した。サンプルは、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マルトース、ラフィノース、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、マルチトールを用いた。
サンプルの溶解は参考例1と同じである。培養終了後、上清を取り除いた細胞に、Ｄ-ＰＢＳ培地で５ ｍｇ／ｍＬに溶解した臭化３-(４,５-ジメチル-2-チアゾリル)-２,５-ジフェニル-２Ｈ-テトラゾリウムを２０分の１量添加したＤ−ＭＥＭ培地 １００μＬを添加し、３時間インキュベートした。培養液を除去して、２-プロパノール１００μＬを各ｗｅｌｌに添加し、マイクロプレートシェーカーにて３０分間撹拌してホルマザンを溶解し、５７０ｎｍと６３０ｎｍの吸光度を測定しその吸光度差を求め、以下の式により細胞生存量比を算出した。サンプルを添加しないで培養したものをコントロールとした。
細胞生存量比＝サンプル添加時の吸光度差 ／コントロールの吸光度差
【００２６】
３．試験結果 
結果を図３に示す。図３よりグルコース、ガラクトース、マンニトールがＳＤＳによる細胞生存量の低下を顕著に抑制することがわかった。
本結果および実施例１の結果より、マンニトールには、皮膚のＦＡＴＰ４産生促進活性があり、ガラクトース、グルコースは、皮膚のＦＡＴＰ４産生促進活性はないものの細胞保護活性があることがわかった。
また、これらの結果より、グルコース、ガラクトース、マンニトールのＳＤＳによる細胞生存量低下抑制と、ＦＡＴＰ４の産生促進効果には、特に関連性がないこともわかった。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明によれば、マンニトールを有効成分とするＦＡＴＰ４産生促進剤を提供することができた。そして、本剤を、ＦＡＴＰ４の欠乏が原因となって起こる皮膚の異常症、例えば魚鱗癬や魚鱗癬未熟性症候群などの患者に適用することによりこれらの疾病の予防や治療をすることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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