(57)【要約】【課題】新規フィラグリン遺伝子変異を同定・提供すること、及び臨床応用に適し、日本人検体を対象とした検査に有効であるフィラグリン遺伝子変異検出法を提供することを課題とする。【解決手段】新規フィラグリン遺伝子変異であるc.441_2delAG変異及びc.5368C>T変異が開示される。また、これらを検出対象とした検出法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
日本人被検者から採取された核酸検体について、以下の（１）又は（２）、或いは以下の（１）と（２）の両方を検出するステップを含む、フィラグリン遺伝子の変異を検出する方法：
（１）フィラグリン遺伝子のc.441_2delAG変異；
（２）フィラグリン遺伝子のc.5368C>T変異。
【請求項２】
前記変異に加えて、以下の（３）〜（１０）からなる群より選択される一以上の変異も検出することを特徴とする、請求項１に記載の変異検出法：
（３）c.1501C>T変異；
（４）c.5084C>G変異；
（５）c.5101C>G変異；
（６）c.7661C>G変異；
（７）c.8666_7CC>GA変異；
（８）c.9887C>A変異；
（９）c.12064A>T変異；及び
（１０）c.3321delA変異。
【請求項３】
前記（１）〜（１０）の全てを検出対象にすることを特徴とする、請求項２に記載の変異検出法。
【請求項４】
リアルタイムPCR法で各変異を検出することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異検出法。
【請求項５】
前記リアルタイムPCR法が、蛍光共鳴エネルギー移動の原理を利用した蛍光プローブを用いた測定法である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異検出法。
【請求項６】
前記ステップによって得られる変異情報からアトピー性皮膚炎の遺伝的リスクを判定するステップを含む、アトピー性皮膚炎のリスク検査法。
【請求項７】
フィラグリン遺伝子のc.441_2delAG変異の変異位置を含むDNA配列を標的とした、フィラグリン遺伝子の変異検出用核酸プローブ。
【請求項８】
フィラグリン遺伝子のc.441_2delAG変異の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が変異型であるときに該DNA領域にハイブリダイズする配列からなり、5'末端にはレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している蛍光プローブ、又は
フィラグリン遺伝子のc.441_2delAG変異の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が野生型であるときに該DNA領域にハイブリダイズする配列からなり、5'末端にはレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している蛍光プローブ、
である、請求項７に記載の変異検出用核酸プローブ。
【請求項９】
フィラグリン遺伝子のc.5368C>T変異の変異位置を含むDNA配列を標的とした、フィラグリン遺伝子の変異検出用核酸プローブ。
【請求項１０】
フィラグリン遺伝子のc.5368C>T変異の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が変異型であるときに該DNA領域にハイブリダイズする配列からなり、5'末端にはレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している蛍光プローブ、又は
フィラグリン遺伝子のc.5368C>T変異の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が野生型であるときに該DNA領域にハイブリダイズする配列からなり、5'末端にはレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している蛍光プローブ、
である、請求項９に記載の変異検出用核酸プローブ。
【請求項１１】
（１）フィラグリン遺伝子の441_2delAG変異検出用の核酸セット、
（２）フィラグリン遺伝子のc.5368C>T変異検出用の核酸セット、
（３）フィラグリン遺伝子のc.1501C>T変異検出用の核酸セット、
（４）フィラグリン遺伝子のc.5084C>G変異検出用の核酸セット、
（５）フィラグリン遺伝子のc.5101C>G変異検出用の核酸セット、
（６）フィラグリン遺伝子のc.7661C>G変異検出用の核酸セット、
（７）フィラグリン遺伝子のc.8666_7CC>GA変異検出用の核酸セット、
（８）フィラグリン遺伝子のc.9887C>A変異検出用の核酸セット、
（９）フィラグリン遺伝子のc.12064A>T変異検出用の核酸セット及び
（１０）フィラグリン遺伝子のc.3321delA変異検出用の核酸セット、からなる群より選択される二つ以上の核酸セットを含む、フィラグリン遺伝子の変異検出用キットであって、
各核酸セットは、
検出対象の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が変異型であるときに該DNA配列にハイブリダイズする配列からなり、5'末端には第１のレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している第１蛍光プローブ、及び／又は検出対象の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が野生型であるときに該DNA配列にハイブリダイズする配列からなり、5'末端には前記第１のレポーター蛍光色素とは異なる第２のレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している第２蛍光プローブと、
前記DNA配列を含むDNA領域を増幅するためのプライマーペアと、
からなる変異検出用キット。
【請求項１２】
前記（１）又は（２）、或いは前記（１）及び（２）の両方、を少なくとも含む、請求項１１に記載の変異検出用キット。
【請求項１３】
前記（１）〜（１０）の全てを含む、請求項１１に記載の変異検出用キット。
【請求項１４】
前記（１）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号３の配列を含み、
前記（１）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号４の配列を含み
前記（２）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号５の配列を含み、
前記（２）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号６の配列を含み
前記（３）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号７の配列を含み、
前記（３）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号８の配列を含み
前記（４）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号９の配列を含み、
前記（４）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号１０の配列を含み
前記（５）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号１１の配列を含み、
前記（５）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号１２の配列を含み
前記（６）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号１３の配列を含み、
前記（６）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号１４の配列を含み
前記（７）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号１５の配列を含み、
前記（７）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号１６の配列を含み
前記（８）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号１７の配列を含み、
前記（８）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号１８の配列を含み
前記（９）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号１９の配列を含み、
前記（９）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号２０の配列を含み
前記（１０）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号２１の配列を含み、
前記（１０）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号２２の配列を含む、
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の変異検出用キット。
【請求項１５】
前記（１)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号２３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２４の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（２)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号２５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２６の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（３)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号２７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２８の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（４)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号２９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３０の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（５)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号３１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３２の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（６)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号３３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３４の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（７)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号３５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３６の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（８)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号３７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３８の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（９)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号３９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４０の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（１０)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号４１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４２の配列からなるリバースプライマーからなる、
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の変異検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフィラグリン遺伝子の変異検出法及びその用途に関する。詳しくは、日本人に固有の新規フィラグリン遺伝子変異及びその検出法、フィラグリン遺伝子変異を網羅的に検出する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎は多様な病因、増悪因子が絡んで発症し、その病像をつくり上げているが、角層のバリア機能障害も大きな発症因子である。2006年、英国人で、表皮のバリア関連蛋白、フィラグリンの遺伝子変異がアトピー性皮膚炎の重要な発症因子であることが示された（非特許文献１）。2007年、本発明者らの研究グループは、欧州以外では初めて、日本人においてフィラグリン遺伝子変異２個を同定し、それらが日本人でもアトピー性皮膚炎の重大な発症因子であることを示した（非特許文献２）。その後、さらに日本人のフィラグリン遺伝子変異を網羅的に同定し（計７個）、日本人アトピー性皮膚炎患者の少なくとも27%ではブィラグリン遺伝子変異がその発症因子となっていることを明らかにした（非特許文献３〜５）。興味深いことに、フィラグリンの遺伝子変異は人種間で大きな差異があり、日本人における変異と欧州人における変異との間にはほとんど同一のものがみられない。
【０００３】
フィラグリンは皮膚のバリア機能に重要である。フィラグリンの前駆体であるプロフィラグリンは表皮のケラトヒアリン顆粒の重要な構成要素である。角化の過程で1本のプロフィラグリンは切断されて10から12個のフィラグリン分子になり、最終的にケラチン、フィラグリン分解産物は角化細胞内を満たす。この過程は正常の角化及び皮膚のバリア形成に非常に重要である。プロフィラグリンをコードする遺伝子FLGに遺伝子変異があることによって、プロフィラグリンが欠損、或いは著明に減少すると、ケラトヒアリン顆粒の形成不全を来たし、正常の角化過程が障害され、皮膚バリア機能の低下を来たすと考えられる（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Smith FJ et al. Nat Genet. 2006;38(3):337-42.
【非特許文献２】Nomura et al. J Allergy Clin Immunol. 2007 Feb;119(2):434-40.
【非特許文献３】Nomura et al. J Invest Dermatol. 2008;128(6):1436-41.
【非特許文献４】Nomura et al. J Invest Dermatol. 2009;129(5):1302-5.
【非特許文献５】Nemoto-Hasebe et al. Br J Dermatol. 2009 Dec;161(6):1387-90.
【非特許文献６】Hamada T，Sandilands A，Fukuda S，et al. J Invest Dermatol 2008; 128: 1323-5.
【非特許文献７】秋山真志．日本医師会雑誌．138:2536-2537; 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
日本人におけるフィラグリン遺伝子変異は8種類が報告されている（非特許文献２〜６）。アトピー性皮膚炎患者におけるフィラグリン遺伝子変異保有率は日本人では約27％であるが、ヨーロッパでは約50％の保有率を示す民族も報告されている。この事実に鑑みると、日本人のフィラグリン遺伝子変異は現在明らかになっている８種の他にも存在する可能性がある。また、日本人の約20％がアトピー性皮膚炎患者であるというデータもあり、臨床応用する場合は多数の検体処理が必要となるが、現在行われている方法（サンガー法によるダイレクトシークエンス及びPCR-RFLP（PCR産物の制限酵素断片長多型）法）では1人あたり1万円程度の費用と4日程度の日数を要する。従って、臨床検査用に多検体を迅速且つ安価に処理できる手法が切望される。また、フィラグリン遺伝子変異が人種間で顕著に相違することから、日本人に特異的な変異を正確に検出できる手法が求められる。
【０００６】
そこで本発明は、新規フィラグリン遺伝子変異を同定・提供することを第一の目的とする。また、臨床応用に適し、日本人検体を対象とした検査に有効であるフィラグリン遺伝子変異検出法及びその用途を提供することを第二の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題の下で検討を進めた。そして、日本人尋常性魚鱗癬患者のフィラグリン遺伝子の全シークエンスの結果から、二つの新規遺伝子変異を同定することに成功した。一方、当該遺伝子変異と、過去に報告された遺伝子変異を合わせた計10種の日本人フィラグリン遺伝子変異を迅速且つ安価に検出可能なプローブ及びプライマーペアを設計し、その有効性を確認した。即ち、日本人に特有のフィラグリン遺伝子変異に関して、実用性に耐えうる検出法を確立することに成功した。フィラグリン遺伝子変異の有無及びその種類はアトピー性皮膚炎の発症予測に利用され得る。
以下の発明は主として上記の成果に基づく。
［１］日本人被検者から採取された核酸検体について、以下の（１）又は（２）、或いは以下の（１）と（２）の両方を検出するステップを含む、フィラグリン遺伝子の変異を検出する方法：
（１）フィラグリン遺伝子のc.441_2delAG変異；
（２）フィラグリン遺伝子のc.5368C>T変異。
［２］前記変異に加えて、以下の（３）〜（１０）からなる群より選択される一以上の変異も検出することを特徴とする、［１］に記載の変異検出法：
（３）c.1501C>T変異；
（４）c.5084C>G変異；
（５）c.5101C>G変異；
（６）c.7661C>G変異；
（７）c.8666_7CC>GA変異；
（８）c.9887C>A変異；
（９）c.12064A>T変異；及び
（１０）c.3321delA変異。
［３］前記（１）〜（１０）の全てを検出対象にすることを特徴とする、［２］に記載の変異検出法。
［４］リアルタイムPCR法で各変異を検出することを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の変異検出法。
［５］前記リアルタイムPCR法が、蛍光共鳴エネルギー移動の原理を利用した蛍光プローブを用いた測定法である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の変異検出法。
［６］前記ステップによって得られる変異情報からアトピー性皮膚炎の遺伝的リスクを判定するステップを含む、アトピー性皮膚炎のリスク検査法。
［７］フィラグリン遺伝子のc.441_2delAG変異の変異位置を含むDNA配列を標的とした、フィラグリン遺伝子の変異検出用核酸プローブ。
［８］フィラグリン遺伝子のc.441_2delAG変異の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が変異型であるときに該DNA領域にハイブリダイズする配列からなり、5'末端にはレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している蛍光プローブ、又は
フィラグリン遺伝子のc.441_2delAG変異の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が野生型であるときに該DNA領域にハイブリダイズする配列からなり、5'末端にはレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している蛍光プローブ、
である、［７］に記載の変異検出用核酸プローブ。
［９］フィラグリン遺伝子のc.5368C>T変異の変異位置を含むDNA配列を標的とした、フィラグリン遺伝子の変異検出用核酸プローブ。
［１０］フィラグリン遺伝子のc.5368C>T変異の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が変異型であるときに該DNA領域にハイブリダイズする配列からなり、5'末端にはレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している蛍光プローブ、又は
フィラグリン遺伝子のc.5368C>T変異の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が野生型であるときに該DNA領域にハイブリダイズする配列からなり、5'末端にはレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している蛍光プローブ、
である、［９］に記載の変異検出用核酸プローブ。
［１１］（１）フィラグリン遺伝子の441_2delAG変異検出用の核酸セット、
（２）フィラグリン遺伝子のc.5368C>T変異検出用の核酸セット、
（３）フィラグリン遺伝子のc.1501C>T変異検出用の核酸セット、
（４）フィラグリン遺伝子のc.5084C>G変異検出用の核酸セット、
（５）フィラグリン遺伝子のc.5101C>G変異検出用の核酸セット、
（６）フィラグリン遺伝子のc.7661C>G変異検出用の核酸セット、
（７）フィラグリン遺伝子のc.8666_7CC>GA変異検出用の核酸セット、
（８）フィラグリン遺伝子のc.9887C>A変異検出用の核酸セット、
（９）フィラグリン遺伝子のc.12064A>T変異検出用の核酸セット及び
（１０）フィラグリン遺伝子のc.3321delA変異検出用の核酸セット、からなる群より選択される二つ以上の核酸セットを含む、フィラグリン遺伝子の変異検出用キットであって、
各核酸セットは、
検出対象の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が変異型であるときに該DNA配列にハイブリダイズする配列からなり、5'末端には第１のレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している第１蛍光プローブ、及び／又は検出対象の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が野生型であるときに該DNA配列にハイブリダイズする配列からなり、5'末端には前記第１のレポーター蛍光色素とは異なる第２のレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している第２蛍光プローブと、
前記DNA配列を含むDNA領域を増幅するためのプライマーペアと、
からなる変異検出用キット。
［１２］前記（１）又は（２）、或いは前記（１）及び（２）の両方、を少なくとも含む、［１１］に記載の変異検出用キット。
［１３］前記（１）〜（１０）の全てを含む、［１１］に記載の変異検出用キット。
［１４］前記（１）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号３の配列を含み、
前記（１）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号４の配列を含み
前記（２）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号５の配列を含み、
前記（２）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号６の配列を含み
前記（３）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号７の配列を含み、
前記（３）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号８の配列を含み
前記（４）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号９の配列を含み、
前記（４）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号１０の配列を含み
前記（５）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号１１の配列を含み、
前記（５）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号１２の配列を含み
前記（６）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号１３の配列を含み、
前記（６）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号１４の配列を含み
前記（７）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号１５の配列を含み、
前記（７）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号１６の配列を含み
前記（８）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号１７の配列を含み、
前記（８）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号１８の配列を含み
前記（９）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号１９の配列を含み、
前記（９）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号２０の配列を含み
前記（１０）の核酸セットにおける第１蛍光プローブが配列番号２１の配列を含み、
前記（１０）の核酸セットにおける第２蛍光プローブが配列番号２２の配列を含む、
［１１］〜［１３］のいずれか一項に記載の変異検出用キット。
［１５］前記（１)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号２３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２４の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（２)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号２５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２６の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（３)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号２７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２８の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（４)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号２９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３０の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（５)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号３１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３２の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（６)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号３３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３４の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（７)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号３５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３６の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（８)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号３７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３８の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（９)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号３９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４０の配列からなるリバースプライマーからなり、
前記（１０)の核酸セットにおけるプライマーペアが配列番号４１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４２の配列からなるリバースプライマーからなる、
［１１］〜［１４］のいずれか一項に記載の変異検出用キット。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】TaqMan（登録商標）-PCR用のプライマーペア及びプローブの一覧。
【図２】フィラグリン遺伝子変異の解析結果。変異保有率は、(89+2)/820＝11.1%である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の第１の局面はフィラグリン遺伝子の変異を検出する方法（以下、本発明の変異検出法ともいう）に関し、日本人被検者から採取された核酸検体について特定の変異を検出するステップが行われる。本発明の検出法では、本発明者らが新たに同定した日本人固有のフィラグリン遺伝子変異を検出対象とする。具体的には、以下の（１）の変異又は（２）の変異、或いはこれらの両方が変異対象となる。
（１）c.441_2delAG変異
（２）c.5368C>T変異（p.Gln1790X）
【００１０】
慣例に従い、本明細書では、cDNAの翻訳開始コドン基準の番号、即ち、翻訳開始コドンのAを１番目（１位の塩基）として番号付けした位置で各変異位置を特定する。フィラグリン遺伝子がコードするアミノ酸配列におけるアミノ酸置換を伴う変異については、対応するアミノ酸置換を併記する場合がある。
【００１１】
野生型（正常型）フィラグリン遺伝子のmRNAの配列を配列番号１（NCBI GenBank ACCESSION NM_002016 XM_048104 XM_378901, DEFINITION  Homo sapiens filaggrin (FLG), mRNA.）に、同アミノ酸配列を配列番号２（NCBI GenPept ACCESSION NP_002007 XP_048104 XP_378901, DEFINITION filaggrin [Homo sapiens].）にそれぞれ示す。
【００１２】
c.441_2delAG変異は441位塩基Aと442位塩基Gの欠失を表す。また、c.5368C>T変異は、5368位塩基CのTへの置換を表す。この変異は1790番アミノ酸Glnの停止コドンへの置換（ナンセンス変異）をもたらす。
【００１３】
本発明では、核酸検体が特定の変異を有するか否か、即ち、特定の変異に関して野生型であるか変異型であるかを明らかにするために、変異が検出される。従って、変異の有無を調べるための検出ないし測定を「変異の検出」又は「変異を検出する」等と表現する。
【００１４】
本発明の変異検出法では、まず、日本人被験者から採取された核酸検体を用意する。核酸検体は被検者の血液、唾液、リンパ液、尿、汗、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等から公知の抽出方法、精製方法を用いて調製することができる。検出対象の変異位置を含むものであれば任意の長さのゲノムDNAを核酸検体として用いることができる。
【００１５】
被検者は特に限定されない。後述の通り、本発明の変異検出法を実行することにより得られる情報（変異の有無）は、アトピー性皮膚炎のリスクの判定（発症予測）に有用である。従って、アトピー性皮膚炎のリスク判定が必要な者に対して広く本発明を適用することができる。例えば、アトピー性皮膚炎の患者、アトピー性皮膚炎に罹患していることが疑われる者、又は健常者が被検者となる。前二者についての判定結果はより適切な治療方針の決定に役立ち、治療効果の向上、患者のＱＯＬ（Quality of Life、生活の質）の向上を促す。一方、健常者についての判定結果はアトピー性皮膚炎の予防や早期診断に役立つ。即ち、リスクが高いとの情報に基づいて予防的措置や生活習慣の改善等を図れば、アトピー性皮膚炎の発生可能性（罹患可能性）を低下させることができる。また、リスクが高いとの情報はアトピー性皮膚炎の検診を受診させる契機となり、これによってアトピー性皮膚炎の早期診断（早期発見）が可能となる。新生児や乳幼児、或いは小児を被検者にすれば、発症前の段階においてアトピー性皮膚炎の発症リスクが高い者を特定することができ、積極的に保湿剤などの皮膚バリア機能を補う外用を行う、ダニや花粉の曝露を減らす等の方法により、アトピー性皮膚炎の発症予防も可能になる。
【００１６】
本発明の一態様では、上記の変異に加えて、以下の（３）〜（１０）からなる群より選択される一以上の変異も検出する。（３）〜（１０）の変異は、これまでに報告された、日本人のフィラグリン遺伝子変異である（非特許文献２〜６）。
（３）c.1501C>T変異（p.Arg501X）
（４）c.5084C>G変異（p.Ser1695X）
（５）c.5101C>G変異（p.Gln1701X）
（６）c.7661C>G変異（p.Ser2554X）
（７）c.8666_7CC>GA変異（p.Ser2889X）
（８）c.9887C>A変異（p.Ser3296X）
（９）c.12064A>T変異（p.Lys4022X）
（１０）c.3321delA変異
【００１７】
検出対象の変異が多い程、フィラグリン遺伝子に変異を有する被検者を特定できる確率が上がる。換言すれば、フィラグリン遺伝子に変異を有する者を見落とすことが少なくなくなる。そこで、検出対象の変異を好ましくは３個〜１０個、より好ましくは５個〜１０個、より一層好ましくは７個〜１０個、最も好ましくは１０個（全ての変異）にする。ここで、（３）〜（１０）の変異の内、（６）、（７）、（９）及び（１０）は保有率が高く、特に重要な変異である。従って、これらの変異を検出対象に含めることが好ましい。
【００１８】
変異の検出法（測定法）は特に限定されるものではなく例えばアレル特異的プライマー（及びプローブ）を用い、PCR法による増幅、及び増幅産物の変異を蛍光又は発光によって検出する方法や、PCR(polymerase chain reaction)法を利用したPCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism：制限酵素断片長多型)法、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism：単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989)等)、PCR-SSO(specific sequence oligonucleotide：特異的配列オリゴヌクレオチド)法、PCR-SSO法とドットハイブリダイゼーション法を組み合わせたASO(allele specific oligonucleotide：アレル特異的オリゴヌクレオチド)ハイブリダイゼーション法(Saiki, Nature, 324, 163-166(1986)等)、TaqMan（登録商標、Roche Molecular Systems社）-PCR法(Livak, KJ, Genet Anal,14,143(1999),Morris, T. et al., J. Clin. Microbiol.,34,2933(1996))に代表されるリアルタイムPCR法、Invader（登録商標、Third Wave Technologies社）法(Lyamichev V et al., Nat Biotechnol,17,292(1999))、FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を利用した方法（Heller, Academic Press Inc, pp. 245-256(1985)、Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8790-8794(1988)、国際公開第99/28500号パンフレット、特開2004-121232号公報など）、ASP-PCR（Allele Specific Primer-PCR)法（国際公開第01/042498号公報など）、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法(Haff LA, Smirnov IP, Genome Res 7,378(1997))、RCA(rolling cycle amplification)法(Lizardi PM et al., Nat  Genet 19,225(1998))、DNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法(Wang DG et al., Science 280,1077(1998)等)、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Southern,E., J. Mol. Biol. 98, 503-517(1975)）等、公知の方法を採用できる。さらに、検出対象の変異位置を直接シークエンスすることにしてもよい。尚、これらの方法を任意に組み合わせて変異を検出してもよい。また、PCR法又はPCR法を応用した方法などの核酸増幅法により核酸試料を予め増幅（核酸試料の一部領域の増幅を含む）した後、上記いずれかの検出法を適用することもできる。
【００１９】
多数の核酸検体を検出する場合にはアレル特異的PCR法、アレル特異的ハイブリダイゼーション法、TaqMan（登録商標）-PCR法、Invader法、FRETを利用した方法、ASP-PCR法、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法、RCA(rolling cycle amplification)法、又はDNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法等、多数の検体を比較的短時間で検出可能な検出法を用いることが特に好ましい。
【００２０】
以上の方法では、各方法に応じたプローブやプライマー等の核酸（本発明において「変異検出用核酸」ともいう）が使用される。プローブとして利用される変異検出用核酸の例としては、検出対象の変異位置を含む染色体領域（部分染色体領域）に特異的にハイブリダイズする核酸を挙げることができる。例えば、検出対象の変異がc.441_2delAGであれば、441位及び442位を含む染色体領域を標的としてプローブを設計すればよい。ここでの「部分染色体領域」の長さは、例えば16〜500塩基長、好ましくは18〜200塩基長、さらに好ましくは20〜50塩基長である。また、当該核酸は好ましくは部分染色体領域に相補的な配列を有するが、特異的なハイブリダイゼーションに支障のない限り、多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては、1〜数個、好ましくは1〜3個、更に好ましくは1〜2個である。ここでの「特異的なハイブリダイゼーション」とは、核酸プローブによる検出の際に通常採用されるハイブリダイゼーション条件（好ましくはストリンジェントな条件）の下、標的の核酸（部分染色体領域）に対してハイブリダイズする一方で、他の核酸との間にクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。尚、当業者であれば例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)を参考にしてハイブリダイゼーション条件を容易に設定可能である。
【００２１】
プライマーとして利用される変異検出用核酸の例としては、検出対象の変異位置を含む染色体領域（部分染色体領域）に相補的な配列を有し、当該変異部分を含むDNAフラグメントを特異的に増幅できるように設計された核酸を挙げることができる。プライマーとして利用される変異検出用核酸の他の例として、検出対象の変異位置がいずれかの塩基である場合にのみ当該変異位置を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計されたプライマーペアを挙げることができる。より具体的には、検出対象の変異位置を含むDNAフラグメントを特異的に増幅するように設計されたプライマーペアであって、変異位置がいずれかの塩基であるアンチセンス鎖の当該変異位置を含む染色体領域（部分染色体領域）に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域（変異位置の近傍領域）に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなるプライマーペアを例示することができる。ここで、増幅されるDNAフラグメントの長さはその検出に適した範囲で適宜設定され例えば15〜1000塩基長、好ましくは20〜500塩基長、更に好ましくは30〜200塩基長である。尚、プローブの場合と同様、プライマーとして利用される変異検出用核酸についても、増幅対象（鋳型）に特異的にハイブリダイズし、目的のDNAフラグメントを増幅することができる限り、鋳型となる配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては、1〜数個、好ましくは1〜3個、更に好ましくは1〜2個である。
【００２２】
変異検出用核酸（プローブ、プライマー）には、検出法に応じて適宜DNA、RNA、ペプチド核酸（PNA:Peptide nucleic acid：)等が用いられる。変異検出用核酸の塩基長はその機能が発揮される長さであればよく、プローブとして用いられる場合の塩基長の例としては16〜500塩基長、好ましくは18〜200塩基長、さらに好ましくは20〜50塩基長である。他方、プライマーとして用いられる場合の塩基長の例としては10〜50塩基長、好ましくは15〜40塩基長、更に好ましくは15〜30塩基長である。
【００２３】
変異検出用核酸（プローブ、プライマー）はホスホジエステル法など公知の方法によって合成することができる。尚、変異検出用核酸の設計、合成等に関しては成書（例えばMolecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New YorkやCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））を参考にすることができる。
【００２４】
本発明における変異検出用核酸を予め標識物質で標識しておくことができる。このような標識化核酸を用いることにより、例えば、増幅産物の標識量を指標として変異を検出することができる。また、変異型の遺伝子における部分DNA領域に特異的なプローブと、野生型の遺伝子における部分DNA領域に特異的名プローブを異なる標識物質で標識しておけば、増幅産物から検出される標識物質及び標識量によって、変異の有無を判別できる。
【００２５】
変異検出用核酸の標識に用いられる標識物質としてはFAMTM（6-carboxyfluorescein）、VICTM、TETTM（tetrachlorofluorescein）、NEDTM、HEXTM、CAL Fluor Gold 540、CAL Fluor Orange 560（CFO）、CAL Fluor Red 590、CAL Fluor Red 610、CAL Fluor Red 635、Quasar 570、Quasar 670、Quasar 705、T(JOETM）、7-AAD、Alexa Fluor（登録商標）488、Alexa Fluor（登録商標）350、Alexa Fluor（登録商標）546、Alexa Fluor（登録商標）555、Alexa Fluor（登録商標）568、Alexa Fluor（登録商標）594、Alexa Fluor（登録商標）633、Alexa Fluor（登録商標）647、CyTM 2、DsRED、EGFP、EYFP、FITC、PerCPTM、R-Phycoerythrin、Propidium Iodide、AMCA、DAPI、ECFP、MethylCoumarin、Allophycocyanin（APC）、CyTM 3、CyTM 5、Rhodamine-123、Tetramethylrhodamine、テキサスレッド（Texas Red（登録商標））、PE、PE-CyTM5、PE-CyTM5.5、PE-CyTM7、APC-CyTM7、オレゴングリーン（Oregon Green）、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテート、量子ドットなどの蛍光色素、32P、131I、125Iなどの放射性同位元素、ビオチンを例示でき、標識方法としてはアルカリフォスファターゼ及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた5'末端標識法、T4 DNAポリメラーゼやKlenow断片を用いた3'末端標識法、ニックトランスレーション法、ランダムプライマー法（Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 9，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）などを例示できる。
【００２６】
変異検出用核酸を不溶性支持体に固定化した状態で用いることもできる。固定化に使用する不溶性支持体をチップ状、ビーズ状などに加工しておけば、これら固定化核酸を用いて変異の検出をより簡便に行うことができる。
【００２７】
以上の通り、様々な検出手段を採用し得るが、特に、リアルタイムPCR法を用いることが好ましい。リアルタイムPCR法は迅速かつ高感度、更には定量性に優れるという利点を有する。リアルタイムPCRを利用した方法の具体例はTaqMan（登録商標、Roche Molecular Systems社）-PCR法である。この方法では、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の原理を利用した蛍光プローブを用いる。
【００２８】
以上説明した本発明の変異検出法を実行して得られる情報（変異の有無）をアトピー性皮膚炎のリスクの判定（発症予測）に利用することができる。即ち、本発明は変異検出法によって得られる変異情報からアトピー性皮膚炎の遺伝的リスクを判定するステップを含む、アトピー性皮膚炎のリスク検査法も提供する。本発明において「アトピー性皮膚炎のリスク」とは、アトピー性皮膚炎を生ずるおそれの程度（易罹患性）をいう。従って、本発明のリスク検査法によれば、アトピー性皮膚炎の易罹患性を判定・評価することが可能である。
【００２９】
アトピー性皮膚炎のリスクを判定するにあたって本発明では、例えば、上記（１）〜（１０）の変異の中のいずれかが検出された場合にアトピー性皮膚炎のリスクが高い、との判定基準（判定基準１）を採用する。このように本発明では遺伝子解析の結果に基づきリスクを判定する。一方、二つ以上の変異が検出された場合にアトピー性皮膚炎のリスクが特に高い、との判定基準（判定基準２）を採用することにしてもよい。判定基準１及び２を併用することもできる。尚、ここでの判定は、その判定基準から明らかな通り、医師や臨床検査技師など専門知識を有する者の判断によらずとも自動的／機械的に行うことができる。
【００３０】
（変異検出用プローブ）
本発明の第２の局面は、本発明の変異検出法に利用可能なプローブを提供する。具体的には、新たに同定された変異（c.441_2delAG変異）を検出するためのものであり、フィラグリン遺伝子のc.441_2delAG変異の変異位置を含むDNA配列を標的とした、フィラグリン遺伝子の変異検出用核酸プローブが提供される。また、もう一つの新規変異（c.5368C>T変異）を検出するためのものであり、フィラグリン遺伝子のc.5368C>T変異の変異位置を含むDNA配列を標的とした、フィラグリン遺伝子の変異検出用核酸プローブも提供される。これらのプローブは、採用する検出手段に応じてその配列などが設計される。
【００３１】
一態様では、FRETの原理を利用した測定手段に適するように各プローブが設計される。具体的には以下の構成を備えることになる。尚、(i)及び(iii)は変異型を特異的に検出するための構成であり、(ii)及び(iv)は野生型を特異的に検出するための構成である。
(i) c.441_2delAG変異検出用のプローブの構成１
フィラグリン遺伝子のc.441_2delAG変異の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が変異型であるときに該DNA領域にハイブリダイズする配列からなり（即ち、標的DNA領域に相補的である）、5'末端にはレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している。
(ii) c.441_2delAG変異検出用のプローブの構成２
フィラグリン遺伝子のc.441_2delAG変異の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が野生型であるときに該DNA領域にハイブリダイズする配列からなり（即ち、標的DNA領域に相補的である）、5'末端にはレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している。
(iii) c.5368C>T変異検出用のプローブの構成１
フィラグリン遺伝子のc.5368C>T変異の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が変異型であるときに該DNA領域にハイブリダイズする配列からなり（即ち、標的DNA領域に相補的である）、5'末端にはレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している。
(iv) c.5368C>T変異検出用のプローブの構成２
フィラグリン遺伝子のc.5368C>T変異の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が野生型であるときに該DNA領域にハイブリダイズする配列からなり（即ち、標的DNA領域に相補的である）、5'末端にはレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している。
【００３２】
(i)と(ii)の両者を併用すれば、c.441_2delAG変異に関して、変異型と野生型を同時に検出することができる。この場合には、変異型と野生型を区別できるように、蛍光を識別可能な２種類のレポーター蛍光色素を用意し、片方を(i)におけるレポーター蛍光色素とし、他方を(ii)におけるレポーター蛍光色素とする。(iii)及び(iv)の関係は(i)と(ii)の関係と同様であり、これらの併用は、c.5368C>T変異に関して変異型と野生型の同時検出を可能にする。
【００３３】
典型的には、本発明のプローブは、FRETの原理を利用したリアルタイムPCR（例えばTaqMan（登録商標）-PCR法）に用いられる。そこで、好ましくは、当該方法に適合するように、プローブの配列が設計され、またレポーター蛍光色素及びクエンチャーが選択される。プライマーペアが増幅するDNA配列（PCR産物）のほぼ中央を標的とするようにプローブの配列を設計するとよい。また、プローブのTmが60〜65℃になるようにするとよい。5'末端に結合させるレポーター蛍光色素としては、FAMTM（6-carboxyfluorescein）、VICTM、TETTM（tetrachlorofluorescein）、NEDTM、CAL Fluor Orange 560（CFO）、HEXTM、CAL Fluor Gold 540、CAL Fluor Orange 560、CAL Fluor Red 590、CAL Fluor Red 610、CAL Fluor Red 635、Quasar 570、Quasar 670、Quasar 705、T(JOETM）等を用いることができる。一方、3'末端に結合させるクエンチャーとしてはTAMRA（tetramethylrhodamine）、MGB（dihydrocyclopyrroloindole tripeptide minor groove binder）、BHQ（登録商標）-1（Black Hole Quencher 1）、BHQ（登録商標）-2（Black Hole Quencher 2）、BHQ（登録商標）-3（Black Hole Quencher 3）、Pulsar 650、Spacer C3等を用いることができる。以下、(i)〜(iv)のプローブを構成する配列の具体例を示す。尚、慣例に従い、5'末端側が左側に、3'末端側が右側になるように記載している。
【００３４】
(i) 5'-CAAGAGAAACGGGGGAAAAGGCA-3'（配列番号３）
(ii) 5'-CAAGAGAAACAGGGGGGAAAAGGC-3'（配列番号４）
(iii) 5'-AGGAAGATAAAGATCCCGCCACGAG-3'（配列番号５）
(iv) 5'-AGGAAGACAAAGATCCCGCCACG-3'（配列番号６）
【００３５】
以上の配列は一例であって、特異的なハイブリダイゼーションを支障なく行える限度において一部の塩基配列に改変が施されたものであってもよい。ここでの「一部の改変」とは、塩基の一部が欠失、置換、挿入及び／又は付加されていることを意味する。改変にかかる塩基数は例えば1〜3個、好ましくは1〜2個、更に好ましくは、1個である。
【００３６】
（変異検出用キット）
本発明は更に、本発明の変異検出法に利用可能なキット（フィラブリン遺伝子の変異検出用キット）を提供する。本発明の変異検出用キットは、以下の（１）〜（１０）からなる群より選択される二つ以上の核酸セットを含む。
（１）フィラグリン遺伝子の441_2delAG変異検出用の核酸セット
（２）フィラグリン遺伝子のc.5368C>T（p.Gln1790X）変異検出用の核酸セット
（３）フィラグリン遺伝子のc.1501C>T（p.Arg501X）変異検出用の核酸セット
（４）フィラグリン遺伝子のc.5084C>G（p.Ser1695X）変異検出用の核酸セット
（５）フィラグリン遺伝子のc.5101C>G（p.Gln1701X）変異検出用の核酸セット
（６）フィラグリン遺伝子のc.7661C>G（p.Ser2554X）変異検出用の核酸セット
（７）フィラグリン遺伝子のc.8666_7CC>GA（p.Ser2889X）変異検出用の核酸セット
（８）フィラグリン遺伝子のc.9887C>A（p.Ser3296X）変異検出用の核酸セット
（９）フィラグリン遺伝子のc.12064A>T（p.Lys4022X）変異検出用の核酸セット
（１０）フィラグリン遺伝子のc.3321delA変異検出用の核酸セット
【００３７】
各核酸セットは大別して、プローブとプライマーペアから構成される。プローブとしては、変異型に特異的な第１蛍光プローブ又は野生型に特異的な第２蛍光プローブ、或いはこれらの両方が用いられる。ここでの第１蛍光プローブは、検出対象の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が変異型であるときに該DNA配列にハイブリダイズする配列からなり、5'末端には第１のレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している。一方、第２プローブは検出対象の変異位置を含むDNA配列を標的とし、変異位置が野生型であるときに該DNA配列にハイブリダイズする配列からなり、5'末端には前記第１のレポーター蛍光色素とは異なる第２のレポーター蛍光色素が結合しており、3'末端には、蛍光共鳴エネルギー移動の原理によって該レポーター蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが結合している。
【００３８】
第１のレポーター蛍光色素と第２のレポーター蛍光色素の組合せとしては、FAMTMとCFO、（いずれを第１のレポーター蛍光色素にしてもよい。以下の組合せにおいても同様である）、FAMTMとVICTM、FAMTMとHEXTM、FAMTMとTETTM、HEXTMとJoeTM、HEXTMとTETTM等を挙げることができる。
【００３９】
本発明の変異検出用キットの好ましい一態様では、（１）の核酸セット又は（２）の核酸セット、或いは（１）の核酸セット及び（２）核酸セットの両方を少なくとも含むように構成される。この態様によれば、新たに同定した変異を検出可能になる。
【００４０】
既に言及した通り、検出対象の変異が多い程、フィラグリン遺伝子に変異を有する被検者を特定できる確率が上がり、変異を有する者を見落とすことが少なくなくなる。そこで、より多くの変異を検出できるように、変異検出用キットに含める核酸セットの数を３個〜１０個、より好ましくは５個〜１０個、より一層好ましくは７個〜１０個、最も好ましくは１０個（全ての変異）にする。ここで、c.7661C>G変異、c.8666_7CC>GA変異、c.12064A>T変異及びc.3321delA変異は保有率が高く、特に重要な変異である。従って、これらの変異を検出できるように、（６）、（７）、（９）及び（１０）の核酸セットを変異検出用キットに含めることが好ましい。
【００４１】
典型的には、本発明の変異検出用キットは、FRETの原理を利用したリアルタイムPCR（例えばTaqMan（登録商標）-PCR法）に用いられる。そこで、好ましくは、当該方法に適合するようにプローブ及びプライマーペアが構成される。プローブの設計については、上記「変異検出用プローブ」の欄における記述を援用し、重複する説明を省略する。プライマーペアは、変異位置を含む100bp〜200bpの領域を増幅し、Tmが68〜70℃になるように設計することが好ましい。
【００４２】
上記（１）〜（１０）の核酸セットを構成するプローブ及びプライマーペアの配列の具体例を示す。尚、慣例に従い、5'末端側が左側に、3'末端側が右側になるように記載している。
＜（１）の核酸セット＞
第１蛍光プローブ：5'-CFO-CAAGAGAAACGGGGGAAAAGGCA-BHQ1-3'（配列番号３）
第２蛍光プローブ：5'-FAM-CAAGAGAAACAGGGGGGAAAAGGC-BHQ1-3'（配列番号４）
フォワードプライマー：5'-AAGGGAATAAGGGAAGATCCAAGA-3'（配列番号２３）
リバースプライマー：5'-CTTAGCCTCTTCCTATTGTCTCCTAATCT-3'（配列番号２４）
＜（２）の核酸セット＞
第１蛍光プローブ：5'-CFO-AGGAAGATAAAGATCCCGCCACGAG-BHQ1-3'（配列番号５）
第２蛍光プローブ：5'-FAM-AGGAAGACAAAGATCCCGCCACG-BHQ1-3'（配列番号６）
フォワードプライマー：5'-CACAGGGCCCAGCACTG-3'（配列番号２５）
リバースプライマー：5'-ACCGATTGCTCATAGTGGGATC-3'（配列番号２６）
＜（３）の核酸セット＞
第１蛍光プローブ：5'-CFO-CAGGCATGAGACAGCTCCAGGC-BHQ1-3'（配列番号７）
第２蛍光プローブ：5'-FAM-AGGCACGAGACAGCTCCAGGC-BHQ1-3'（配列番号８）
フォワードプライマー：5'-GCACTGGAGGAAGACAAGGATC-3'（配列番号２７）
リバースプライマー：5'-TCCTCATTTCGTGTTTGTCTGC-3'（配列番号２８）
＜（４）の核酸セット＞
第１蛍光プローブ：5'-CFO-CCACAGACTGAGGCACTGGGC-BHQ1-3'（配列番号９）
第２蛍光プローブ：5'-FAM-CCACAGACTCAGGCACTGGGC-BHQ1-3'（配列番号１０）
フォワードプライマー：5'-ACCAGCAGTCAGCAGACAGC-3'（配列番号２９）
リバースプライマー：5'-CTGACTCTTCTGAGTGTCCCTCG-3'（配列番号３０）
＜（５）の核酸セット＞
第１蛍光プローブ：5'-CFO-CACTGGGYGCAGATAAGATTCATCTG-BHQ1-3'（配列番号１１）
第２蛍光プローブ：5'-FAM-TGGGYGCAGACAAGATTCATCTG-BHQ1-3'（配列番号１２）
フォワードプライマー：5'-GTCAGCAGACAGCTCCACAGAC-3'（配列番号３１）
リバースプライマー：5'-CTGACTCTTCTGAGTGTCCCTCG-3'（配列番号３２）
＜（６）の核酸セット＞
第１蛍光プローブ：5'-CFO-CCCTCTCATTGTCCCTGGMCC-BHQ1-3'（配列番号１３）
第２蛍光プローブ：5'-FAM-CCCTCTGATTGTCCCTGGMCC-BHQ1-3'（配列番号１４）
フォワードプライマー：5'-GCTCCAGGCACTCAGGGTC-3'（配列番号３３）
リバースプライマー：5'-TGGATCCCCAGTTCCTGCT-3'（配列番号３４）
＜（７）の核酸セット＞
第１蛍光プローブ：5'-CFO-TCCTGGCTMACACTTCATCCCTG-BHQ1-3'（配列番号１５）
第２蛍光プローブ：5'-FAM-CCTGGCTMACACTGGATCCCTG-BHQ1-3'（配列番号１６）
フォワードプライマー：5'-CTCAGGGTCGCGTCACC-3'（配列番号３５）
リバースプライマー：5'-CTCTCAGAGTCTTCTGAATGTCCCT-3'（配列番号３６）
＜（８）の核酸セット＞
第１蛍光プローブ：5'-CFO-TGAACAGGCAAGATAAAGTCCAGGAGAG-BHQ1-3'（配列番号１７）
第２蛍光プローブ：5'-FAM-ACAGGCAAGATCAAGTCCAGGAGAGA-BHQ1-3'（配列番号１８）
フォワードプライマー：5'-TGGTGGACAGGCTGCATC-3'（配列番号３７）
リバースプライマー：5'-AAGCYTGTCCACGCGGA-3'（配列番号３８）
＜（９）の核酸セット＞
第１蛍光プローブ：5'-CFO-CCTTGGATGATCTTAACCAAACGCACT-BHQ1-3'（配列番号１９）
第２蛍光プローブ：5'-FAM-CCTTGGATGATCTTTACCAAACGCACT-BHQ1-3'（配列番号２０）
フォワードプライマー：5'-AGACACTCTCAGCACGGAAGTGT-3'（配列番号３９）
リバースプライマー：5'-GCCACATAAACCTGGGTCCTTA-3'（配列番号４０）
＜（１０）の核酸セット＞
第１蛍光プローブ：5'-CFO-ACGTGACTGGTCGGGGGAAGGT-BHQ1-3'（配列番号２１）
第２蛍光プローブ：5'-FAM-CGTGACTGGTCAGGGGGAAGGTC-BHQ1-3'（配列番号２２）
フォワードプライマー：5'-AGGCCATGGACAGGATGG-3'（配列番号４１）
リバースプライマー：5'-CTCACCTGGTAGATGAAAGACCCT-3'（配列番号４２）
【００４３】
以上のプローブ及びプライマーの配列は一例であって、プローブについては特異的なハイブリダイゼーションを支障なく行える限度において、プライマーであれば目的の増幅反応を支障なく行える限度において、一部の塩基配列に改変が施されたものであってもよい。ここでの「一部の改変」とは、塩基の一部が欠失、置換、挿入及び／又は付加されていることを意味する。改変にかかる塩基数は例えば1〜3個、好ましくは1〜2個、更に好ましくは、1個である。
【００４４】
本発明の変異検出用キットには核酸セットが含まれるが、変異の検出に必要な他の試薬（DNAポリメラーゼ、反応液など）や容器、器具等を含めてもよい。尚、通常、本発明の変異検出用キットには取り扱い説明書が添付される。
【実施例】
【００４５】
１．フィラグリン遺伝子（FLG）の新規変異の検出
（１）目的
日本人に固有の新規フィラグリン遺伝子変異を見出すことを目的として以下の実験を行った。
【００４６】
（２）対象
小麦依存性運動誘発アナフィラキシー（WDEIA）の患者から採取した検体を実験に供した。
【００４７】
（３）方法
Sandilandsらの方法（Sandilands A, Terron-Kwiatkowski A, Hull PR et al. Comprehensive analysis of the gene encoding filaggrin uncovers prevalent and rare mutations in ichthyosis vulgaris and atopic dermatitis. Nat Genet 2007; 39: 650-4.）により、フィラグリン遺伝子（FLG）のエクソン領域をダイレクトシークエンスし、新規変異を検出した。
【００４８】
（４）結果
FLGの新規変異としてp.Gln1790X及びc.441_442delAGの２個を同定した。これまでに報告された８個の変異に加えて２個の変異を検出対象にできることから、より正確且つ網羅的にFLGの変異を持つ者を見つけ出すことができるようになり、臨床的な意義も高まった。
【００４９】
２．フィラグリン遺伝子（FLG）の変異の簡便スクリーニング法
（１）目的
フィラグリン遺伝子（FLG）の変異を簡便且つ迅速に検出するための方法の確立を目指し、以下の実験を行った。
【００５０】
（２）方法
各変異の検出のために、TaqMan（登録商標）-PCR用のプライマーペア及びプローブを設計した（図１）。各変異に対して、野生型検出用（-wild）と変異型検出用（-mut）の２種類のプローブを用意した。野生型検出用プローブの5'末端にはリポーター蛍光色素としてのFAMTMを結合している。一方、変異型検出用プローブの5'末端にはリポーター蛍光色素としてのCFOが結合している。このように蛍光特性の異なる２種類の蛍光色素を用いることにより、野生型と変異型の同時検出を可能にした。尚、各プローブの3'末端にはクエンチャーであるBHQ-1を結合させた。
【００５１】
野生型検出用プローブと変異型検出用プローブを併用してアッセイし、FAMTMからの蛍光強度とCFOからの蛍光強度を測定すれば（例えば、二つの蛍光強度を二次元にプロットして評価する）、検体が、(i)野生型アレルのホモ接合体、(ii)野生型アレルと変異型アレルのヘテロ接合体及び(iii)変異型アレルのホモ接合体、の中のいずれに該当するかがわかる。
【００５２】
操作手順は以下の通りである。まず、被検者の血液、唾液などからゲノムDNAを抽出する。用意したTaqManプローブ（野生型検出用プローブと変異型検出用プローブ）及びプライマーペア（図１）を用いたリアルタイムPCR法によるジェノタイピングアッセイを行った。リアルタイムPCR装置としてLightCycler 480 system II 384 plate (Roche Diagnostics)を用いた。2x LightCycler 480 Probes Master、野生型検出用プローブ及び変異型検出用プローブとプライマーペア（フォワード及びリバース）、及びゲノムDNAを加えて反応液とし、PCR反応を行った。PCR反応は、95℃で10分処理した後、95℃で10秒、60℃で1分、72℃で1秒の温度サイクルを40回行い、最後に40℃で30秒の処理とした。反応中、経時的に蛍光を検出した。得られたデータはLightCycler 480 softwareで解析した。以上の操作を各変異（計１０個）について行い、各被検者の遺伝子型を決定した。
（３）結果
本法により、従来のダイレクトシークエンス法などに比べてFLGの変異を迅速且つ安価にスクリーニングできた。820人からなる日本人集団のFLGの変異を検出した際には91個の変異を検出した（図２）。これらはダイレクトシークエンス法により確認され、全て一致した結果であった。
【００５３】
３．まとめ
本法によれば、使用する装置や試薬、環境などによって変動するものの、現在一般に利用可能な装置・試薬を利用した場合、一人あたり数百円程度、約2時間で検出結果を得ることも可能であり、費用及び所要時間の両面で飛躍的な改善がもたらされる。今回追加された２個の変異は、フィラグリン遺伝子の変異を持つ日本人全体の約５％を占めると考えられる。これまで変異がないとされていたこれらの日本人についても変異を保有すると認識できるようになったことは、臨床上、重要な意義を持つ。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の変異検出法を実施して得られる情報はアトピー性皮膚炎のリスク判定（発症予測）に有用である。即ち、本発明は臨床上有用なリスク情報を提供する。当該リスク情報は、アトピー性皮膚炎の早期診断（早期発見）、発症予防、治療法の選択などに利用され得る。アトピー性皮膚炎のテーラーメイド治療／テーラーメイド予防の実現への貢献が期待される。
【００５５】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号３〜２１：人工配列の説明：プローブ
配列番号２２〜４２：人工配列の説明：プライマー
【図１】
2015082992.tif 000002
【図２】
2015082992.tif 000003
【配列表】
2015082992000001.app