(57)【要約】【課題】ＨＳＶ−２に対して一定の高い効果があるワクチンを提供すること【解決手段】単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）感染は、大きな健康上の懸案事項である。本開示は、特に、ＨＳＶ−２に対して一定の高い効果があるワクチンおよび免疫原性組成物を提供する。抗原は、治療または予防に使用することができる。一態様では、本開示は、薬学的に許容され得るキャリア、ならびに配列番号２、３、４、および５からなる少なくとも１つのポリペプチドまたはその免疫原性断片を含み、必要に応じて、配列番号１またはその免疫原性断片をさらに含むワクチン製剤を記載する。ワクチン製剤は、上記の配列番号の１つからなる第１のポリペプチドおよび上記の配列番号の別の１つからなる第２のポリペプチドを含み得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００９年５月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／１８０，７８４号、２００９年８月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／２３５，６２８号、２００９年９月８日に出願された米国仮特許出願第６１／２４０，５８７号、２００９年９月８日に出願された米国仮特許出願第６１／２４０，６２６号、および２０１０年２月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／３０５，９１８号の出願日の利益を主張する。これらの米国仮特許出願の全体の教示は、本明細書中に明確に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）は、性器ヘルペスの主な原因である。ＨＳＶ−２は、性的接触によって伝染される場合が最も多く、ウイルスの感染は、典型的には、生殖器および肛門周辺部における病変の再発性の発症をもたらすと同時に、ウイルス粒子を生殖管内に排出する。ウイルス排出は、病変または他の症状が存在しなくても起こり得る。ＨＳＶ−２はまた、知覚神経節で潜伏を確立する。ＨＳＶ−２感染は、感染患者に身体的不快感を与え、性的罹患を引き起こし、さらなる健康上のリスクをもたらす。具体的には、ＨＳＶ−２に感染した患者は、ＨＩＶに感染するリスクが上昇し、ＨＳＶ−２に感染した妊婦は、最終的にＨＳＶ−２を胎児に感染させ得る。免疫不全個体または新生児では、ＨＳＶ−２感染は、致命的であり得る。現在、ＨＳＶ−２感染の治癒法が存在しない。
【０００３】
ＨＳＶ−２感染は、蔓延しており、ある研究によると、世界人口のほぼ２０％が感染していると推定される（非特許文献１）。男性よりも女性の方が多く感染し、年齢と共に罹患率が上昇する。ＨＳＶ−２と診断された若者の患者数が多いことは、ＨＳＶ−２感染が生涯にわたるため、人口に対する罹患率が上昇し続けることを示唆している。
【０００４】
ＨＳＶ−２の症状に対する処置の選択肢は限られている。ファムシクロビル、バラシクロビル、またはアシクロビルなどの化合物を用いる抗ウイルス治療は、症状の期間を限定し、場合によっては、病変の治癒を速め、ウイルス排出の発生を低減する。しかしながら、抗ウイルス薬は、治癒法ではなく、発症の再発を防止するのものでも、ウイルスを完全に除去するものでもない。加えて、抗ウイルス薬の使用では、患者がＨＳＶ−２感染の症状を認識し、確実な診断を受け、最終的に抗ウイルス療法に従う必要がある。これらの要件は、抗ウイルス薬が入手しにくい世界の地域では支持され得ない。加えて、患者は、症状が出ていないため、または初期感染の症状が鎮静したために、疾患から回復したと推測して、感染していることに気付かない場合が多い。
【０００５】
ＨＳＶ−２に関連した医療問題および社会問題に取り組むために、ＨＳＶ−２の感染を抑制または妨げるための医薬組成物の開発が強く望まれている。有効な組成物を使用して、ＨＳＶ−２に対する免疫応答を増大させて、初期感染を防止し、ウイルスが視覚神経節で潜伏を確立する能力を阻害し、発症の再発を排除し、かつ／またはウイルス排出を防止することができる。免疫系は、再感染の場合には症状が少なくて弱く、時間と共に頻度が低下することから明らかなように、ＨＳＶ−２に対する防御を開始することが知られている。
【０００６】
ＨＳＶワクチンの最終目標は、ウイルス感染から長期間防御することであろうが、疾患の症状の抑制も、健康に著しい恩恵をもたらすであろう。予防用または治療用ワクチンのいずれかの現在の目標の１つは、一次感染および潜伏感染による臨床症状およびウイルス排出を低減することである。予防用ワクチンの３つのカテゴリー、（ｉ）全ウイルス、（ｉｉ）サブユニットタンパク質、および（ｉｉｉ）遺伝子をベースとしたサブユニットワクチン（非特許文献２）を臨床試験で試験したが不本意な結果となった。１９７０年代に、多数の死滅ウイルスワクチンが開発されたが、いずれも効果がなかった。近年、免疫原性の低い弱毒化ＨＳＶが見出された。２つの組換え糖タンパク質に基づいたサブユニットワクチンが、様々なアジュバント製剤と組み合わせられて臨床評価された。Ｃｈｉｒｏｎによって開発された１つのワクチンは、トランスフェクト・チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から精製されてアジュバントＭＦ５０で製剤された、ＨＳＶ−２の糖タンパク質Ｄ（ｇＤ２）および糖タンパク質Ｂ（ｇＢ２）の両方の切断型を含む。Ｇｌａｘｏ−Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ（ＧＳＫ）によって開発された別のワクチンは、アジュバントミョウバンおよび３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）で製剤された切断型ｇＤ２を含む。両方のワクチンは、第１相／第２相試験において免疫原性であり、耐容性が良好であった。しかしながら、第３相分析では、Ｃｈｉｒｏｎワクチンは、ＨＳＶ−２セロコンバージョンに対して全体的な有効性を示さなかったため、研究が中止された。ＧＳＫワクチンは、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２血清陰性女性ボランティアではかなりの有効性（７３〜７４％）を示したが、男性では全く有効性を示さなかった。
【０００７】
たとえ限定されたワクチン有効性が、ＨＳＶ患者には有用な効果を与えようが、これらの試験は、少数のワクチンの実現性のみを試験している。これは、ワクチンの発見が系統的ではないためである。全ウイルスワクチンの追跡は、免疫系への病原体自体の提示が最適な免疫をもたらすことを前提としている。実際、全病原体ワクチンに対する免疫応答の広さと期間は、歴史的に見てサブユニットワクチンよりも優れていた。しかしながら、ワクチン株の病原性も考慮しなければならない。サブユニットワクチンは、これまで、疾患原因および感染中の免疫原性における推定重要性に基づいてワクチン試験用に選択されてきた。これらの手法は、一部の製剤で限られた有効性を有する、ＨＳＶに対する１つの候補を同定したが、他の製剤では有効性がなかった。したがって、ヘルペス疾患を防ぐためにはヘルペスウイルスワクチン発見の新たな改善された方法論が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｌｏｏｋｅｒら、２００８、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００８、８６（１０）
【非特許文献２】Ｓｔａｎｂｅｒｒｙら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、３０（３）：５４９−５６６、２０００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＨＳＶ−２の感染および伝染は、大きな健康上の懸案事項である。本開示は、特に、ＨＳＶ−２に対して一定の高い効果があるワクチンを提供する。このようなワクチンは、治療用または予防用に使用することができる。本開示は、特定の抗原、およびこれらの抗原を用いてＨＳＶ−２に対する免疫応答を誘導する方法も提供する。
【００１０】
一態様では、本開示は、薬学的に許容され得るキャリア、ならびに配列番号２、３、４、および５からなる少なくとも１つのポリペプチドまたはその免疫原性断片を含み、必要に応じて、配列番号１またはその免疫原性断片をさらに含むワクチン製剤を記載する。ワクチン製剤は、上記の配列番号の１つからなる第１のポリペプチドおよび上記の配列番号の別の１つからなる第２のポリペプチドを含み得る。
【００１１】
本発明の別の態様は、薬学的に許容され得るキャリア、キラヤサポニンの１つ以上の精製画分を含むアジュバント、ならびに配列番号２、３、４、および５のいずれかを含む少なくとも１つのポリペプチドまたはその免疫原性断片を含み、必要に応じて、配列番号１またはその免疫原性断片をさらに含むワクチン製剤を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、薬学的に許容され得るキャリアおよび配列番号２からなるポリペプチドまたはその免疫原性断片を含むワクチン製剤を提供する。残基を、配列番号２から切断することができる。このポリペプチドは、グリコシル化しても良いし、または非グリコシル化しても良い。
【００１３】
なおさらなる態様では、本発明は、薬学的に許容され得るキャリアおよび配列番号５を含むポリペプチドを含むワクチン製剤を提供し、このポリペプチドは、膜貫通ドメインの貫通残基３４１〜３６３のうちすべてまたは少なくとも８つの連続したアミノ酸残基が欠失している。したがって、本発明の一態様は、薬学的に許容され得るキャリアおよび配列番号４を含むポリペプチドを含むワクチン製剤を提供する。このポリペプチドは、グリコシル化されても良いし、または非グリコシル化されても良い。
【００１４】
本発明のなお別の態様は、薬学的に許容され得るキャリアおよび配列番号５を含むポリペプチドを含むワクチン製剤を提供する。このポリペプチドは、グリコシル化されても良いし、または非グリコシル化されても良い。
【００１５】
本発明のさらに別の態様は、薬学的に許容され得るキャリアおよび配列番号３を含むポリペプチドを含むワクチン製剤を提供する。このポリペプチドは、グリコシル化されても良いし、または非グリコシル化されても良い。
【００１６】
一部の実施形態では、ワクチン製剤中のポリペプチドは、免疫原性キャリア、例えば、キーホールリンペットヘモシアニンにコンジュゲートしても良い。他の実施形態では、ワクチン製剤は、アジュバントをさらに含む。アジュバントは、キラヤサポニンの１つ以上の精製画分とすることができる。
【００１７】
本発明は、本明細書に開示される有効量のワクチン製剤を投与することによってＨＳＶ−２に感染している、またはＨＳＶ−２に感染しやすい被験体を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、例えば、ヘルペス性病変の数の低減、被験体がヘルペス性病変を患う日数の低減、未感染被験体のＨＳＶ−２感染の低減、１つ以上のＨＳＶ−２抗原に対するＩｇＧ力価および／またはＴ細胞応答の増大、および／またはＨＳＶ−２の感染の発症時のヘルペス病変の数の低減によってＨＳＶ−２の症状を抑制する。
【００１８】
別の態様では、本開示は、有効なＴ細胞のライブラリーをｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングしてＨＳＶ−２の完全なプロテオームからＴ細胞の特異的な標的抗原を同定するハイスループットのシステムの結果を記載する。この技術は、個々の抗原の同定を可能にし、予防用または治療用組成物としてｉｎ  ｖｉｖｏで有効である可能性が高い。一態様では、本明細書では、免疫応答を誘導するタンパク質をベースとした組成物に含めることができるいくつかの重要な防御Ｔ細胞抗原を提供する。
【００１９】
本発明の一態様は、配列番号１〜３８の少なくとも１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドから選択される２つ以上の単離されたポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、薬学的に許容され得るキャリアおよび配列番号１〜３８の少なくとも１つを含むポリペプチドまたはその免疫原性断片を含むワクチン製剤を提供する。ある実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１〜３８の少なくとも１つからなる。
【００２１】
本発明の別の態様は、被験体における免疫応答を誘導する方法であって、配列番号１〜３８の少なくとも１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドから選択される２つ以上の単離されたポリペプチドまたはその免疫原性断片を有効量含む有効量のワクチン製剤または医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２２】
本発明のさらに別の態様は、被験体におけるＨＳＶ−２感染の１つ以上の症状を軽減する方法であって、配列番号１〜３８の少なくとも１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドから選択される２つ以上の単離されたポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む有効量のワクチン製剤または医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、ＨＳＶ−２感染の症状には、病変形成、痛み、刺激、かゆみ、発熱、倦怠感、頭痛、ウイルス排出、および前駆症状の１つ以上が含まれる。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、ＨＳＶ−２感染の発現を抑制する方法であって、配列番号１〜３８の少なくとも１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドから選択される２つ以上の単離されたＨＳＶポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む有効量のワクチン製剤または組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２４】
本出願者らは、本発明の別の態様を開示し、この態様は、ＨＳＶ−２に曝露された被験体における潜伏ＨＳＶ−２感染の確立を抑制する方法であって、配列番号１〜３８の少なくとも１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドから選択される２つ以上の単離されたＨＳＶ−２ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む有効量のワクチン製剤または組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２５】
関連した態様では、本発明は、ＨＳＶ−２に感染した被験体におけるウイルス排出を低減する方法であって、配列番号１〜３８の少なくとも１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドから選択される２つ以上の単離されたＨＳＶ−２ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む有効量のワクチン製剤または組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２６】
さらに、本発明の一態様は、ＨＳＶ−２に感染した被験体における発症の再発を低減する方法であって、配列番号１〜３８の少なくとも１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドから選択される２つ以上の単離されたＨＳＶ−２ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む有効量のワクチン製剤または組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、上記の任意の医薬組成物を生産する方法であって、前記２つ以上のポリペプチドを発現させるステップと、前記２つ以上のポリペプチドを単離するステップとを含む、方法を提供する。
【００２８】
本出願者らは、本発明の一態様をさらに開示し、この態様は、ＨＳＶ−２に感染した被験体における症状の重症度を診断する方法であって、（ｉ）配列番号１〜３８に示されているポリペプチドから選択される１つ以上の単離されたＨＳＶ−２ポリペプチドまたはその免疫原性断片でパルス処理された自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）に応答したＴ細胞の活性化を測定するステップと、（ｉｉ）前記レベルを、頻繁に発症する感染被験体から得た基準レベルと比較するステップであって、基準レベルに対する前記応答における有意な増加が、前記被験体が、軽度の症状を有する（例えば、被験体が無症状である）ことを示す、ステップとを含む、方法を提供する。応答における有意な増加は、例えば、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、５倍以上、１０倍以上、または実に２０倍以上の増加を含み得る。
【００２９】
本発明の別の態様は、ＨＳＶ−２に感染した被験体における症状の重症度を診断する方法であって、（ｉ）配列番号１〜３８に示されているポリペプチドから選択される１つ以上の単離されたＨＳＶ−２ポリペプチドまたはその免疫原性断片を提示するＡＰＣに応答した、自然感染したまたはウイルスに曝露された被験体からのＴ細胞の活性化を測定するステップと、（ｉｉ）前記レベルを、頻繁に発症する感染被験体から得た基準レベルと比較するステップであって、基準レベルに対する前記活性化における有意な減少が、前記被験体が、より重度の症状（例えば、頻繁な発症）を有することを示す、ステップとを含む、方法を提供する。
【００３０】
本発明の別の態様は、配列番号１〜３８からなるリストから選択される１つ以上の単離されたＨＳＶポリペプチドまたはその免疫原性断片に結合する抗体を含む医薬組成物を提供する。
【００３１】
さらに、本発明の異なる態様は、配列番号１〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドから選択される２つ以上のポリペプチドまたはその免疫原性断片を、哺乳動物Ｔ細胞におけるサイトカインの産生を促進する能力について試験することによって、ＨＳＶ−２に対する免疫原性組成物を同定する方法であって、免疫原性組成物が、サイトカインのレベルを、未感作哺乳動物Ｔ細胞によって産生されるサイトカインのレベルよりも有意に高いレベルに上昇させる組成物である、方法を提供する。サイトカインのレベルにおける有意な上昇は、典型的には、未感作細胞によって産生されるレベルの少なくとも１．５倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、または実に２０倍の上昇である。
【００３２】
本発明のなお別の態様は、被験体からのサンプルにおいてＨＳＶ−２を検出する方法であって、（ｉ）配列番号１〜３８のアミノ酸配列を有する１つ以上のポリペプチドまたはその免疫原性断片に対して産生される１つ以上の抗体に前記サンプルを接触させるステップと、（ｉｉ）サンプルからの前記１つ以上のＨＳＶ−２ポリペプチドに結合した前記１つ以上の抗体を検出するステップとを含む、方法を提供する。
【００３３】
最後に、本発明の一態様は、ヌクレオチド配列番号１〜３８から選択される２つ以上の単離されたポリヌクレオチドまたはその免疫原性ペプチドをコードする断片を含む医薬組成物を提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
薬学的に許容され得るキャリア、ならびに配列番号２、３、４、および５からなる少なくとも１つのポリペプチドまたはその免疫原性断片を含み、必要に応じて、配列番号１またはその免疫原性断片をさらに含むワクチン製剤。
（項目２）
配列番号１からなる第１のポリペプチドおよび配列番号３または配列番号４からなる第２のポリペプチドを含む、項目１に記載のワクチン製剤。
（項目３）
配列番号２からなる第１のポリペプチドおよび配列番号３または配列番号４からなる第２のポリペプチドを含む、項目１に記載のワクチン製剤。
（項目４）
配列番号３からなる第１のポリペプチドおよび配列番号４からなる第２のポリペプチドを含む、項目１に記載のワクチン製剤。
（項目５）
配列番号１からなる第１のポリペプチド、配列番号３からなる第２のポリペプチド、および配列番号４からなる第３のポリペプチドを含む、項目１に記載のワクチン製剤。
（項目６）
配列番号２からなる第１のポリペプチド、配列番号３からなる第２のポリペプチド、および配列番号４からなる第３のポリペプチドを含む、項目１に記載のワクチン製剤。
（項目７）
薬学的に許容され得るキャリア、キラヤサポニンの１つ以上の精製画分を含むアジュバント、ならびに配列番号２、３、４、および５のいずれかを含む少なくとも１つのポリペプチドまたはその免疫原性断片を含み、必要に応じて、配列番号１またはその免疫原性断片をさらに含む、ワクチン製剤。
（項目８）
薬学的に許容され得るキャリアおよび配列番号２からなるポリペプチドまたはその免疫原性断片を含むワクチン製剤。
（項目９）
前記断片が、配列番号２の切断断片であり、１〜２０のアミノ酸残基がそのＮ末端、Ｃ末端、または両末端から除去されている、項目８に記載のワクチン製剤。
（項目１０）
前記断片が、配列番号２の切断断片であり、１〜１０のアミノ酸残基がそのＮ末端、Ｃ末端、または両末端から除去されている、項目９に記載のワクチン製剤。
（項目１１）
薬学的に許容され得るキャリア、および配列番号５を含むポリペプチドを含むワクチン製剤であって、前記ポリペプチドが、膜貫通ドメインの貫通残基３４１〜３６３のうちすべてまたは少なくとも８つの連続したアミノ酸残基が欠失している、ワクチン製剤。
（項目１２）
薬学的に許容され得るキャリアおよび配列番号４を含むポリペプチドを含むワクチン製剤。
（項目１３）
薬学的に許容され得るキャリアおよび配列番号５を含むポリペプチドを含むワクチン製剤。
（項目１４）
前記ポリペプチドが非グリコシル化されている、項目１３に記載のワクチン製剤。
（項目１５）
薬学的に許容され得るキャリアおよび配列番号３を含むポリペプチドを含むワクチン製剤。
（項目１６）
前記少なくとも１つのポリペプチドが、免疫原性キャリアにコンジュゲートしている、項目１、８、１１、１３、または１５のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
（項目１７）
さらにアジュバントを含む、項目１、８、１１、１３、または１５のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
（項目１８）
前記アジュバントが、キラヤサポニンの１つ以上の精製画分である、項目１７に記載のワクチン製剤。
（項目１９）
前記アジュバントが、サポニン画分Ａおよびサポニン画分Ｃを含む、項目１８に記載のワクチン製剤。
（項目２０）
前記アジュバントが、コレステロール、ホスファチジルコリン、サポニン画分Ａ、およびサポニン画分Ｃを含む、項目１９に記載のワクチン製剤。
（項目２１）
前記アジュバントが粒子の形態である、項目２０に記載のワクチン製剤。
（項目２２）
サポニン画分Ａを含む粒子が、サポニン画分Ｃを実質的に含まず、サポニン画分Ｃを含む粒子が、サポニン画分Ａを実質的に含まない、項目２１に記載のワクチン製剤。
（項目２３）
前記ワクチン製剤が、５〜２００μｇの前記少なくとも１つのポリペプチドおよび５〜２００μｇの前記アジュバントを含む、項目１、８、１１、１３、または１５のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
（項目２４）
前記ポリペプチドが、さらにタグを含む融合タンパク質である、項目１、７、８、１１、１３、または１５のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
（項目２５）
前記ワクチン製剤がＨＳＶ−２の症状を抑制する、項目１〜２４のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
（項目２６）
前記ワクチン製剤が、ヘルペス性病変の数を低減する、項目２５に記載のワクチン製剤。
（項目２７）
前記ワクチン製剤が、被験体が患うヘルペス性病変の日数を低減する、項目２５に記載のワクチン製剤。
（項目２８）
前記ワクチン製剤が、未感染被験体のＨＳＶ−２感染を抑制する、項目１〜２４のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
（項目２９）
前記ワクチン製剤が、１つ以上のＨＳＶ−２抗原に対するＩｇＧ力価を上昇させる、項目２８に記載のワクチン製剤。
（項目３０）
前記ワクチン製剤が、１つ以上のＨＳＶ−２抗原に対してＴ細胞応答を増強する、項目２８に記載のワクチン製剤。
（項目３１）
前記ワクチン製剤が、ＨＳＶ−２感染の発症時のヘルペス性病変の数を低減する、項目２８に記載のワクチン製剤。
（項目３２）
前記ワクチン製剤が、３回以下の投与でＨＳＶ−２の症状を抑制する、またはＨＳＶ−２による感染を抑制する、項目１〜２４のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
（項目３３）
ＨＳＶ−２に感染している、またはＨＳＶ−２に感染しやすい被験体を処置する方法であって、項目１〜２４に記載の有効量のワクチン製剤を投与するステップを含む、方法。
（項目３４）
前記方法が、ＨＳＶ−２の症状を抑制する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記方法が、ヘルペス性病変の数を低減する、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記方法が、被験体がヘルペス性病変を患う日数を低減する、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記方法が、未感染被験体のＨＳＶ−２感染を抑制する、項目３３に記載の方法。
（項目３８）
前記方法が、１つ以上のＨＳＶ−２抗原に対してＩｇＧ力価を上昇させる、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記方法が、１つ以上のＨＳＶ−２抗原に対してＴ細胞応答を増強させる、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記方法が、ＨＳＶ−２感染の発症時のヘルペス性病変の数を低減する、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記方法が、３回以内の投薬計画で被験体を処置する、項目３３に記載の方法。
（項目４２）
前記被験体がヒトである、項目３３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】図１Ａおよび図１Ｂはそれぞれ、ｇＤ２完全長タンパク質、ｇＤ２ΔＴＭＲ、または膜貫通ドメイン（３０６ｔとして示されている）のすぐ上流で切断されたｇＤ２での免疫化後のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を示すグラフである。
【図１Ｂ】図１Ａおよび図１Ｂはそれぞれ、ｇＤ２完全長タンパク質、ｇＤ２ΔＴＭＲ、または膜貫通ドメイン（３０６ｔとして示されている）のすぐ上流で切断されたｇＤ２での免疫化後のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を示すグラフである。
【図２Ａ】図２Ａおよび図２Ｂはそれぞれ、ｇＬ２、ＩＣＰ４．１、またはＲＳ１．１、ＲＳ１．３．１、およびＲＳ１．３．２によってコードされるＩＣＰ４断片に跨る重複ペプチドのプールでの免疫化後のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ａおよび図２Ｂはそれぞれ、ｇＬ２、ＩＣＰ４．１、またはＲＳ１．１、ＲＳ１．３．１、およびＲＳ１．３．２によってコードされるＩＣＰ４断片に跨る重複ペプチドのプールでの免疫化後のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂはそれぞれ、ｇＤ２ΔＴＭＲまたはｇＤ２ΔＴＭＲとＩＣＰ４．２での免疫化後のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ａおよび図３Ｂはそれぞれ、ｇＤ２ΔＴＭＲまたはｇＤ２ΔＴＭＲとＩＣＰ４．２での免疫化後のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本願は、ＨＳＶ−２に対するワクチンおよび免疫原性組成物を記載する。ワクチン製剤は、表１の配列を含むポリペプチドもしくはその免疫原性断片、または表１の配列を含む少なくとも２つのポリペプチドの組み合わせもしくはその免疫原性断片を含み得る。ある実施形態では、ワクチンのポリペプチド（複数可）は、配列番号１〜２６の少なくとも１つの全配列を含む、または配列番号１〜２６のいずれか１つの全配列からなる。免疫原性組成物は、表１もしくは表２の配列を含むポリペプチドもしくはその免疫原性断片、または表１もしくは表２の配列を含む少なくとも２つのポリペプチドの組み合わせもしくはその免疫原性断片を含み得る。ある実施形態では、免疫原性組成物のポリペプチド（複数可）は、配列番号１〜３８のいずれか１つの全配列を含む、または配列番号１〜３８の全配列からなる。表１または表２におけるポリペプチドは、配列表に示されている配列番号３９〜４６および１１７〜１３４および／またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚから公的に入手可能なｃＤＮＡ配列によってコードされ得る。ｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、ＨＧ５２、３３３、およびＳｔｒａｉｎ  Ｇを含むＨＳＶ−２の任意の既知の株からも得ることができる。したがって、ｃＤＮＡ配列は、ＮＣ＿００１７９８．１のゲノム配列の遺伝子名またはタンパク質名によってアクセスすることができ、ＮＣ＿００１７９８．１に開示されている配列に対して約９７％保存されているであろう。本明細書に記載されるように、ポリペプチドは、タンパク質名、配列番号、および／またはタンパク質をコードするゲノム名で呼ぶことができる。
【００３６】
ポリペプチドは、様々な発現系で調製することができる。適切な発現系には、大腸菌、およびバキュロウイルスを使用した発現系（例えば、昆虫細胞における）が含まれる。大腸菌を用いて調製されたポリペプチドは、典型的には、完全長であり、非グリコシル化されているが、切断型変異体も調製することができる。ある実施形態では、これらの切断型変異体は、シグナルドメインのすべてまたは一部を維持する。バキュロウイルス系を用いて調製されたポリペプチドは、典型的には、Ｎ末端シグナル配列が欠失しているが、完全または部分的にグリコシル化されている。
【００３７】
【表１−１】
2015178529.tif 000002
【００３８】
【表１−２】
2015178529.tif 000003
【００３９】
【表１−３】
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【００４０】
【表２−１】
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【００４１】
【表２−２】
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Ａ．免疫原性ＨＳＶ−２ポリペプチド
表１および／または表２に示されている免疫原性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、医薬組成物に使用することができる。本発明は、免疫原性ポリペプチドまたはこれらの免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと共に医薬キャリアを含む医薬組成物を提供する。ＨＳＶ−２に対する抗原は、ＨＳＶ−２に感染した患者からの免疫細胞をスクリーニングすることによって同定することができる。簡単に述べると、ＨＳＶ−２抗原のライブラリーは、細菌によって発現され、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と混合された。次いで、ＡＰＣが、ＨＳＶ−２由来ポリペプチドをプロセシングして、ＨＳＶ−２に感染したヒト患者から単離されたリンパ球に提示した。患者は、いくつかの集団：（１）ＨＳＶ−２に曝露されたが感染に対して血清陰性、（２）ＨＳＶ−２に感染したが無症状、（３）ＨＳＶ−２に感染し、低頻度で発症する、（４）ＨＳＶ−２に感染し、頻繁に発症する、（５）未感作、（６）ＨＳＶ−２（ＨＳＶ−２−）に対して血清陰性であるが、ＨＳＶ−１（ＨＳＶ−１＋）に対しては血清反応陽性、に属した。各集団のリンパ球応答を、ＨＳＶ−２由来ポリペプチドに対する反応性について比較し、スクリーニングにより、他の患者集団と比較してある患者集団でより頻繁に反応性リンパ球を誘導した抗原を検出した。感染したが無症状である患者および曝露されたが血清陰性である患者は、頻繁に発症する患者が活性化できない防御免疫応答を活性化させることができ；特に、曝露されたが血清陰性である患者は、ＨＳＶ−２感染に対する殺菌免疫を開始すると推測される。ポリペプチドの固有のセットが、これらの患者集団のリンパ球を活性化すると考えられる。したがって、本発明は、感染したが無症状である患者または曝露されたが血清陰性である患者のリンパ球を活性化する特定のＨＳＶ−２ポリペプチドの組成物、またはＨＳＶ−２による感染を抑制または妨げるこれらのポリペプチドの組み合わせも企図する。
【００４２】
感染したが無症状である患者または曝露されたが血清陰性である患者における免疫原性に基づいて同定された抗原は、同様に、あらゆる被験体で免疫原性であると予想される。
【００４３】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、先天性免疫応答、体液性免疫応答、または細胞性免疫応答を誘導し得る。細胞性免疫応答は、ＴＨ１細胞が関与し得、ある実施形態では、ＴＨ１細胞が関与する免疫応答は、ＴＨ１細胞が活性化される免疫応答である。一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、ＴＨ２サイトカインの誘導を回避する。一部の実施形態では、細胞性免疫応答は、ＴＨ１７細胞に関与し得、ある実施形態では、ＴＨ１７細胞が関与する免疫応答は、ＴＨ１７細胞が活性化される免疫応答である。
【００４４】
本発明の組成物中のポリペプチド（またはその免疫原性断片）は、個体のＨＬＡハプロタイプに関係なく、多数の個体でＴ細胞応答を誘導し得る。具体的には、ポリペプチド上のエピトープは、次のＨＬＡスーパータイプ：ＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３、−Ａ２４、−Ａ１、−Ｂ７、−Ｂ８、−Ｂ２７、−Ｂ４４、−Ｂ５８、およびＢ６２、ならびにＨＬＡ−ＤＱＢ０１、−ＤＱＢ０２、−ＤＱＢ０３、−ＤＱＢ−０４、および−ＤＱＢ０５の１つ以上をもつ個体でＴ細胞応答を誘導し得る。
【００４５】
一部の実施形態では、表１および／または表２の１つ以上、例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のポリペプチド（またはその免疫原性断片）が、本発明の組成物に含められる。一部の実施形態では、表１および／または表２の２つのポリペプチドが、本発明の組成物に含められる。他の実施形態では、表１および／または表２の３つのポリペプチドが、本発明の組成物に含められる。
【００４６】
一部の実施形態では、表１および／または表２の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のポリペプチド（またはその免疫原性断片）が、コンジュゲート体として共に提供される。一部の実施形態では、表１および／または表２の２つのポリペプチド、または表１および／または表２の３つのポリペプチドが、コンジュゲート体として提供される。一部の実施形態では、表１および／または表２の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のポリペプチドが、例えば、融合タンパク質として、互いに共有結合している。一部の実施形態では、一部の実施形態では、表１および／または表２の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のポリペプチドが、例えば、融合タンパク質として、互いに共有結合している。一部の実施形態では、表１および／または表２の２つのポリペプチド、または表１および／または表２の３つのポリペプチドが、例えば、融合タンパク質として、互いに共有結合している。
【００４７】
一部の実施形態では、組成物は、配列番号１〜３８からなる群から選択される２つ以上のポリペプチドを含み、任意の他のＨＳＶ−２ポリペプチドを含んでも良いし、または含まなくても良い。
【００４８】
ある実施形態では、本出願者らは、表１および／または表２の遺伝子によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチド、または前記ポリペプチドの一部を提供する。ある実施形態では、相同ポリペプチドは、少なとも８、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、４５０、または５００のアミノ酸長である。一部の実施形態では、すぐ上に記載されたポリペプチドのように、ポリペプチドは、３００以下、３５０以下、４００以下、４５０以下、または５００以下のアミノ酸長である。
【００４９】
免疫原性組成物は、前記ポリペプチドおよび遺伝子の一部、例えば、欠失突然変異体、切断突然変異体、オリゴヌクレオチド、およびペプチド断片も含み得る。一部の実施形態では、前記タンパク質の一部は、免疫原性である。
【００５０】
タンパク質の一部またはその相同体の免疫原性は、完全長タンパク質の免疫原性を決定するために使用されるアッセイと同じアッセイで容易に決定することができる。一部の実施形態では、タンパク質の一部は、完全長タンパク質と実質的に同じ免疫原性を有する。一部の実施形態では、免疫原性は、完全長タンパク質の免疫原性の１０％以下、２０％以下、３０％以下、４０％以下、または５０％以下である。タンパク質断片は、例えば、線形、環状、または分岐型であり得る。一部の実施形態では、タンパク質またはタンパク質断片は、１つ以上の非天然アミノ酸（例えば、天然のタンパク質で典型的に見られる２０以外のアミノ酸）を含む。非天然アミノ酸は、非定型側鎖を有し得る。加えて、ペプチド模倣物を使用することもできる：これらは、ペプチド主鎖の変更を含み得る。
【００５１】
本明細書に記載されるポリペプチド組成物の一部の実施形態は、免疫原性ポリペプチドの哺乳動物細胞への導入および続く細胞性免疫応答の刺激を促進するために膜輸送配列（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＭＴＳ）を含む免疫原性ポリペプチドを含む。例示的な膜輸送配列には、カポジ線維芽細胞成長因子のシグナル配列における疎水性領域、αシヌクレイン、βシヌクレイン、またはγシヌクレインのＭＴＳ、アンテナペディアホメオドメインの第３のへリックス、ＳＮ５０、インテグリンβ３  ｈ領域、ＨＩＶ  Ｔａｔ、ｐＡｎｔｐ、ＰＲ−３９、アバエシン（ａｂａｅｃｉｎ）、アピダエシン（ａｐｉｄａｅｃｉｎ）、Ｂａｃ５、Ｂａｃ７、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ  ＣＳタンパク質、ならびに米国特許第６，２４８，５５８号、同第６，４３２，６８０号、および同第６，２４８，５５８に記載されているＭＴＳが含まれる。
【００５２】
ある実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、別の分子にコンジュゲートしている（すなわち、共有結合している）。これは、例えば、抗原の半減期、可溶性、バイオアベイラビリティ、または免疫原性を増加させ得る。免疫原性ポリペプチドにコンジュゲートし得る分子には、炭水化物、ビオチオン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、Ｎ−プロピオニル化ポリシアル酸、核酸、多糖、およびＰＬＧＡが含まれる。３００ｇ／モル未満〜１０，０００，０００ｇ／モルを超える分子量範囲の多様なタイプのＰＥＧが存在する。ＰＥＧ鎖は、直鎖、分岐鎖、または櫛型もしくは星型の形状であり得る。
【００５３】
Ｂ．ワクチンに使用される免疫原性ＨＳＶ−２ポリペプチドおよび核酸
ある実施形態では、１つ以上、例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の免疫原性断片またはその変異体が、混合物に含められる。例えば、ワクチン製剤は、配列番号１〜２６のいずれか１つ以上を含み得る。
【００５４】
ある実施形態では、ワクチン製剤は、ＩＣＰ４、ＩＣＰ４．２、ｇＬ２、ｇＤ２ΔＴＭＲ、およびｇＤ２（配列番号１〜５）のいずれか１つ、２つ、もしくは３つ、またはこれらの免疫原性断片（複数可）を含み得る。ある実施形態では、組み合わせは、ＩＣＰ４（配列番号１）またはＩＣＰ４．２（配列番号２）の一方のみのポリペプチドまたは免疫原性断片を含む。他の実施形態では、組み合わせは、ｇＤ２ΔＴＭＲ（配列番号４）およびｇＤ２（配列番号５）の一方のみのポリペプチドまたは免疫原性断片を含む。
【００５５】
ＩＣＰ４、ＩＣＰ４．２、ｇＬ２、ｇＤ２ΔＴＭＲ、およびｇＤ２の例示的な組み合わせは、以下を含む。
【００５６】
【化１】
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上記の個々の抗原および組み合わせは、配列番号６〜２６から選択される配列を含むポリペプチドまたはその免疫原性断片などのＨＳＶ−２の、またはＨＳＶ−２に由来する追加のペプチドも含み得る。
【００５７】
１．ＲＳ１によってコードされるＩＣＰ４（配列番号１）
ＲＳ１は、基本転写機構の特定の成分と相互作用してその成分をウイルスプロモータに動員し、転写開始のために構造を安定させ得る転写トランス活性化因子であるＩＣＰ４をコードする。ＩＣＰ４は、トランス活性化／リン酸化ドメイン（配列番号１のアミノ酸残基１５０〜２００にほぼ跨っている）、ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号１の残基３８０〜５４０にほぼ跨っている）、核局在ドメイン（配列番号１の残基６３０〜７３０にほぼ跨っている）、および遅発制御性トランス活性化ドメイン（配列番号１の残基１２２０〜１３１９にほぼ跨っている）の異なるドメインを含む。ＲＳ１のＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、ヒトヘルペスウイルス２完全ゲノムにおいて、公的に利用可能なデータベース、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ（ＮＣＢＩ  ＮＩＨのウェブサイトに掲載されている：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅ）でのＲＳ１の検索によって確認することができる。
【００５８】
一部の実施形態では、ＨＳＶ−２に対するワクチンは、ＩＣＰ４（配列番号１）の１０００以下のアミノ酸である、ＩＣＰ４（配列番号１）の残基３８３〜７６６から選択される少なくとも２０の連続したアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む。このポリペプチドは、少なくとも２０の残基の断片の変異体でも良い。
【００５９】
ある実施形態では、このポリペプチドは、ＩＣＰ４の９５０以下、９００以下、８５０以下、８００以下、７５０以下、７００以下、６５０以下、６００以下、５５０以下、５００以下、４５０以下、または４００以下の連続したアミノ酸を含む。完全長ＩＣＰ４のアミノ酸残基にほぼ相当する例示的なポリペプチドは次の通りである：３８３〜７６６（ＲＳ１．２）；１〜４００（ＲＳ１．１）；７５０〜１０２４（ＲＳ１．３．１）；１００８〜１３１９（ＲＳ１．３．２）；７５０〜１３１９（ＲＳ１．３）；２８０〜７８５（全ＤＮＡ結合領域を含むＲＳ１．４）；６８０〜１３１９（グリコシラーゼ／Ｃ末端領域を含むＲＳ１．５）；２０８〜１３１９（Ｎ末端のＭｅｔ残基も含み得るＲＳ１．６）；１〜３８０と５４５〜１３１９（残基３８１〜５４４にほぼ跨る領域が欠失して、ＤＮＡ結合領域が除去されたＲＳ１．７）；１〜７８５と８７０〜１３１９（残基７８６〜８６９にほぼ跨る領域が欠失して、核局在ドメインが除去されたＲＳ１．８）、またはＩＣＰ４（配列番号１）の１〜７６６、３８３〜１３１８、１００〜７５０、４００〜１３００、２５０〜７６６、３８３〜９００など。
【００６０】
２．ＲＳ１．２によってコードされるＩＣＰ４内部断片ＩＣＰ４．２（配列番号２）
ＲＳ１．２は、ＩＣＰ４．２と示されるＩＣＰ４の残基３８３〜７６６（またはＲＳ１配列のヌクレオチド１１５０〜２３９８）に相当する３８４のアミノ酸断片をコードする。ＲＳ１．２のＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、ヒトヘルペスウイルス２完全ゲノムにおいて、公的に利用可能なデータベース、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ（ＮＣＢＩ  ＮＩＨのウェブサイトに掲載されている：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅ）でのＲＳ１の検索によって確認することができる。
【００６１】
特定の実施形態では、ＨＳＶ−２に対するワクチンは、残基１００〜３８４、２００〜３８４、または２５０〜３５０などのＩＣＰ４．２（配列番号２）の５０〜全３８４のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む。一定の実施形態では、このポリペプチドは、ＩＣＰ４．２（配列番号２）のすべてを含む、またはＩＣＰ４．２（配列番号２）自体である。これらのポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されているＩＣＰ４．２（配列番号２）の完全長または断片を含み、ＩＣＰ４（配列番号１）のアミノ酸残基１〜３８２もしくは７６７〜１３１８またはその断片が、ある実施形態では、使用されるＩＣＰ４．２のアミノ酸残基と連続している。配列番号２の残基を配列番号１の１〜３８２または７６７〜１３１８の選択残基に結合する例示的な断片を上記に記載する。
【００６２】
ＩＣＰ４．２の免疫原性断片は、実験的に測定された、またはアルゴリズムによって同定された少なくとも１つの免疫原性部分を含む。このような方法によって同定されたペプチドは、以下を含む。
【００６３】
【化２】
2015178529.tif 000008
【００６４】
【化３】
2015178529.tif 000009
したがって、一部の態様では、本出願は、ＩＣＰ４．２の免疫原性断片を提供する。これらの断片は、場合によっては、サイズが完全長ポリペプチドに近い。例えば、これらの断片は、一方または両方の末端から多くても１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、または２０のアミノ酸が欠失し得る。他の実施形態では、断片は、１００〜３８４のアミノ酸長、または１５０〜３８４、または２００〜３８４、または２５０〜３８４のアミノ酸長である。他の例示的な断片は、アミノ酸残基１〜３５０、１〜３００、１〜２５０、１〜２００、１〜１５０、１〜１００、１〜５０、５０〜３８４、５０〜３５０、５０〜３００、５０〜２５０、５０〜２００、５０〜１５０、５０〜１００、１００〜３８４、１００〜３５０、１００〜３００、１００〜２５０、１００〜２００、１００〜１５０、１５０〜３８３、１５０〜３５０、１５０〜３００、１５０〜２５０、１５０〜２００、２００〜３８３、２００〜３５０、２００〜３００、２００〜２５０、２５０〜３８３、２５０〜３５０、２５０〜３００、３００〜３８３、および３５０〜３８３である。上記の断片またはその部分断片（例えば、８〜５０、８〜３０、または８〜２０のアミノ酸残基の断片）は、好ましくは、Ｔ細胞応答を少なくとも１．５倍または２倍に増加させるなどの、後述する生物学的活性の１つを有する。断片は、本明細書に記載されるワクチン中のポリペプチドとして使用しても良いし、または別のタンパク質、タンパク質断片、またはポリペプチドに融合させても良い。
【００６５】
ある態様では、本出願は、ＩＰＣ４．２に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する免疫原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を提供する。
【００６６】
３．ＵＬ１によってコードされる糖タンパク質Ｌ−２（配列番号３）
ＵＬ１は、ウイルスと細胞膜の融合に必要であり、かつウイルスの宿主細胞への侵入を可能にするヘテロ二量体糖タンパク質である糖タンパク質Ｌ−２（ｇＬ２）をコードする。ＵＬ１のＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、ヒトヘルペスウイルス２完全ゲノムにおいて、公的に利用可能なデータベース、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ（ＮＣＢＩ  ＮＩＨのウェブサイトに掲載されている：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅ）での検索によって確認することができる。
【００６７】
一部の実施形態では、ＨＳＶ−２に対するワクチンは、ｇＬ２（配列番号３）の２２４以下のアミノ酸である、ｇＬ２（配列番号３）の残基１〜２２４から選択される少なくとも２０の連続したアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む。このポリペプチドは、少なくとも２０の残基の断片の変異体でもあり得る。
【００６８】
一部の実施形態では、このポリペプチドは、配列番号３の２００〜２５０のアミノ酸の断片に対して少なくとも８５％同一である。
【００６９】
ある実施形態では、このポリペプチドは、ｇＬ２からの２００以下または１００以下の連続したアミノ酸を含む。例示的なポリペプチドは、ｇＬ２（配列番号３）のアミノ酸残基１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０１〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２２１などである。
【００７０】
他の態様では、本出願は、ｇＬ２の免疫原性断片を提供する。ｇＬ２の免疫原性断片は、実験的に測定された、またはアルゴリズムによって同定された少なくとも１つの免疫原性部分を含む。このような方法によって同定されたペプチドは、以下を含む。
【００７１】
【化４】
2015178529.tif 000010
【００７２】
【化５】
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４．ＵＳ６によってコードされる糖タンパク質Ｄ−２（配列番号１１８）およびＵＳ６ΔＴＭＲによってコードされる内部欠失糖タンパク質Ｄ−２（配列番号４）
ＵＳ６は、宿主細胞侵入受容体に結合して、ウイルスと宿主膜の融合を引き起こし得るエンベロープ糖タンパク質であるエンベロープ糖タンパク質Ｄ−２（ｇＤ２）をコードする。ｇＤ２タンパク質は、成熟タンパク質から切断されたシグナルドメイン（アミノ酸残基１〜２５）および膜貫通ドメイン（アミノ酸残基３４０〜３６３にほぼ跨る）を含む、いくつかの異なるドメインを有する。ＵＳ６のＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、ヒトヘルペスウイルス２完全ゲノムにおいて、公的に利用可能なデータベース、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ（ＮＣＢＩ  ＮＩＨのウェブサイトに掲載されている：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅ）での検索によって確認することができる。
【００７３】
一部の実施形態では、ＨＳＶ−２に対するワクチンは、膜貫通ドメイン（アミノ酸残基３４０〜３６３にほぼ跨り、これらの残基を含む）のすべてまたは一部およびシグナル配列が欠失しているｇＤ２を有するポリペプチドを含む。他の実施形態では、欠失領域は、膜貫通ドメインに隣接する配列の５〜１０のアミノ酸をさらに含み得る。欠失した領域は、膜貫通ドメインの一部、例えば、残基３４０〜３６３の間の少なくとも３つのアミノ酸も含み得る。一部の実施形態では、膜貫通ドメインの少なくとも１つの残基が、修飾、欠失、または置換されて、膜貫通ドメインが機能しなくなっている。例えば、変異体は、アミノ酸残基３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、または３４６で始まり、アミノ酸残基３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、または３６８で終わる内部欠失を有し得る。
【００７４】
アミノ酸残基３４１〜３６３（膜貫通ドメイン）が欠失しているｇＤ２をコードする構築物は、ＵＳ６ΔＴＭＲ（配列番号４０）と呼ばれる。対応するタンパク質は、ｇＤ２ΔＴＭＲ（配列番号４）と呼ばれる。他の実施形態では、ｇＤ２またはｇＤ２ΔＴＭＲの免疫原性断片は、膜貫通ドメインの一部における欠失を含み得、かつ／または膜貫通ドメインの外部の隣接配列における欠失を含み得る。
【００７５】
他の態様では、本出願は、ｇＤ２またはｇＤ２ΔＴＭＲの免疫原性断片を提供する。ｇＤ２またはｇＤ２ΔＴＭＲの免疫原性断片は、実験的に測定された、またはアルゴリズムによって同定された少なくとも１つの免疫原性部分を含む。このような方法によって同定されたペプチドは、以下を含む。
【００７６】
【化６】
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【００７７】
【化７】
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したがって、一部の態様では、本出願は、ｇＤ２（配列番号５）またはｇＤ２ΔＴＭＲ（配列番号４）の免疫原性断片を提供する。断片は、場合によっては、サイズが完全長ポリペプチドに近い。例えば、これらの断片は、一方または両方の末端から多くても１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、または２０のアミノ酸が欠失し得る。他の実施形態では、断片は、１００〜３８４のアミノ酸長、または１５０〜３８４、または２００〜３８４、または２５０〜３８４のアミノ酸長である。他の例示的な断片は、アミノ酸残基１〜３５０、１〜３００、１〜２５０、１〜２００、１〜１５０、１〜１００、１〜５０、５０〜３８４、５０〜３５０、５０〜３００、５０〜２５０、５０〜２００、５０〜１５０、５０〜１００、１００〜３８４、１００〜３５０、１００〜３００、１００〜２５０、１００〜２００、１００〜１５０、１５０〜３８３、１５０〜３５０、１５０〜３００、１５０〜２５０、１５０〜２００、２００〜３８３、２００〜３５０、２００〜３００、２００〜２５０、２５０〜３８３、２５０〜３５０、２５０〜３００、３００〜３８３、および３５０〜３８３である。上記の断片またはその部分断片（例えば、８〜５０、８〜３０、または８〜２０のアミノ酸残基の断片）は、好ましくは、Ｔ細胞応答を少なくとも１．５倍または２倍に増加させるなどの、後述する生物学的活性の１つを有する。断片は、本明細書に記載されるワクチン中のポリペプチドとして使用しても良いし、または別のタンパク質、タンパク質断片、またはポリペプチドに融合させても良い。
【００７８】
他の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４または配列番号５の全配列を含む、または配列番号４または配列番号５の全配列からなる。ある実施形態では、ｇＤ２の免疫原性断片は、シグナルドメイン（アミノ酸残基１〜２５）のすべてもしくは一部および／または膜貫通ドメイン（アミノ酸残基３３９〜３６３）を維持している。
【００７９】
ある実施形態では、ポリペプチドは、ヒト自己抗原に対して２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、または７０％未満の相同性を有する。このような自己抗原の例には、ＨＳＶ−１からのＵＬ６またはＨＳＶ−２からのｇＫまたはＵＬ５３が含まれる。
【００８０】
ある態様では、本出願は、ｇＤΔＴＭＲに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する免疫原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を提供する。
【００８１】
Ｃ．ＨＳＶ−２ポリペプチドの追加の特色
典型的には、本明細書に記載されるワクチン製剤または医薬組成物中に存在するポリペプチドは、単独で、または変異体として免疫原性であり、この変異体は、別のポリペプチドに融合したポリペプチド、またはアジュバントと混合されたもしくは複合体を形成したポリペプチドを含む。変異体は、本明細書に記載されているように、配列同一性が１００％未満の配列も含む。加えて、適切な免疫原性を有する断片、前駆体、および類似体を使用しても良い。
【００８２】
これらのポリペプチドは、哺乳動物、例えば、マウス、モルモット、またはヒトで免疫原性であり得る。免疫原性ポリペプチドは、典型的には、アッセイで、または被験体で有意な免疫応答を引き起こすことができるポリペプチドである。別法では、免疫原性ポリペプチドは、（ｉ）抗体、例えば、ポリペプチドに結合する中和抗体の産生を誘導し得る、（ｉｉ）ＴＨ１免疫を誘導し得る、（ｉｉｉ）例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の感染または再感染部位への局在の増加によってＣＤ８＋ＣＴＬ応答を活性化させ得る、（ｉｖ）ＴＨ１７免疫を誘導し得る、かつ／または（ｖ）先天性免疫を活性化させ得る。一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、その抗原に特異的な抗体の検出可能な量の産生をもたらす。
【００８３】
ある実施形態では、ポリペプチドは、ヒト自己抗原に対して２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、または７０％未満の相同性を有する。
【００８４】
ポリペプチドは、１つ以上の免疫原性部分および１つ以上の非免疫原性部分を含み得る。免疫原性部分は、タンパク質マイクロアレイ、ＥＬＩＳＰＯＴ／ＥＬＩＳＡ技術、および／またはこのポリペプチドの様々な欠失変異体（例えば、断片）に対する特有のアッセイを含め、様々な方法によって同定することができる。免疫原性部分は、コンピュータアルゴリズムによって同定することもできる。ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（ＥｐｉＶａｘが開発）のような一部のこのようなアルゴリズムは、計算マトリックス手法を使用する。抗原エピトープを同定するための他の計算ツールには、ＰＥＰＶＡＣ（Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト：ｉｍｍｕｎａｘ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＰＥＰＶＡＣに掲載されているＰｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  ＥＰｉｔｏｐｅ−ｂａｓｅｄ  ＶＡＣｃｉｎｅ）、ＭＨＣＰｒｅｄ（部分最小二乗法を使用し、ワールド・ワイド・ウェブ：ｗｗｗ．ｊｅｎｎｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ＭＨＣＰｒｅｄのＴｈｅ  Ｊｅｎｎｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに掲載されている）、およびウェブサイト：ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／に掲載されているＳｙｆｐｅｉｔｈｉが含まれる。
【００８５】
一部の実施形態では、ワクチンまたは医薬組成物は、融合タンパク質および／または融合ＤＮＡ構築物を含み得る。上記の基本的なＤＮＡ配列は、タンパク質産物の配列に影響を与えないように改変され得る。例えば、ＤＮＡ配列は、コドンを最適化して、大腸菌などの宿主、昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス発現系を使用）、または哺乳動物（チャイニーズハムスター卵巣）細胞系での発現を改善することができる。一定の実施形態では、約５，０００ダルトン未満、例えば、１，５００〜５，０００ダルトンの分子量を有するポリペプチドなどを含む、低分子量の関連ポリペプチドが使用される場合は、改変が、望ましい免疫応答を誘導するのに有用であり得る。例えば、低分子量ポリペプチドは、他の病原体またはウイルス（例えば、破傷風トキシド）からのタンパク質、または高分子量タンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン）などの適切な免疫原性キャリアにコンジュゲートし得る。コンジュゲートは、直接でも良いし、または間接的（例えば、リンカーを介して）でも良い。他の一定の実施形態では、融合タンパク質は、上記のポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくは変異体およびタグを含み得る。タグは、Ｎ末端またはＣ末端とすることができる。例えば、タグは、核酸またはポリペプチドに付加して、精製、検出、可溶性を促進することができる、またはタンパク質もしくは核酸に対する他の望ましい特徴を付与することができる。例えば、精製タグは、親和性精製に使用できるペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドとすることができる。例として、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、ＴＡＰ、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ＨＡ、ＭＢＰ、ＶＳＶ−Ｇ、チオレドキシン、Ｖ５、アビジン、ストレプトアビジン、ＢＣＣＰ、カルモジュリン、Ｎｕｓ、Ｓタグ、リポタンパク質Ｄ、およびβガラクトシダーゼが挙げられる。一部の実施形態では、融合タンパク質は短鎖である。したがって、場合によっては、融合タンパク質は、上記のポリペプチドの一方または両方の末端に、表１のいずれかのポリペプチドの連続したアミノ酸などの１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、５つ以下、１０以下、２０以下、または５０以下の追加のアミノ酸を含む。
【００８６】
一部の実施形態では、タグ、分泌シグナル、または他のシグナル配列を、ポリペプチドのＣ末端および／またはＮ末端に付加することができる。タグは、発現ポリペプチドの精製を容易にするために使用することができる。例示的なタグには、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３０）およびＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３１）が含まれる。分泌シグナルは、昆虫細胞などの非哺乳動物細胞に使用するために最適化することができる。例示的な分泌シグナルは、ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号１３２）である。
【００８７】
検出タグを使用して、タグを検出し、続いてタグに融合したあらゆるアミノ酸配列を検出することができる。検出タグには、蛍光タンパク質、蛍光標識に結合するタンパク質、および高電子密度部分に結合するタンパク質が含まれる。蛍光タンパク質の例には、ｄｓＲｅｄ、ｍＲＦＰ、ＹＦＰ、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、およびＶｅｎｕｓが含まれる。蛍光標識または高電子密度標識に結合するタンパク質の一例として、ＦｌＡｓＨが挙げられる。
【００８８】
本明細書に開示される別の態様は、本発明の組成物（例えば、表１に列記された１つ以上または２つ以上のポリペプチドを含む組成物）に対して生産される抗体調製物である。様々なあらゆる抗体が含まれる。このような抗体の例には、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト化または部分ヒト化抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂ抗体、およびこれらの断片などが含まれる。抗体は、あらゆるアイソタイプ、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、様々なＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などであり；抗体は、ヤギ、ウサギ、マウス、またはニワトリなどを含む、抗体を産生する任意の動物種に由来し得る。一部の実施形態では、Ｆａｂ分子は、大腸菌のような遺伝的に形質転換された宿主で発現され、構築される。したがって、λベクター系を、前駆抗体を産生する対象と同等またはそれ以上の潜在的多様性をもつＦａｂ’ｓの集団を発現させるために利用可能である。Ｈｕｓｅら、（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６、１２７５−８１を参照されたい。
【００８９】
Ｄ．ワクチンおよび医薬組成物の成分
ある実施形態では、ワクチンおよび医薬組成物は、上記の１つ以上のポリペプチドおよび核酸、ならびに次の１つ以上：アジュバント、安定剤、緩衝剤、界面活性剤、徐放成分、塩、保存剤、および前記抗原に特異的な抗体を含む。
【００９０】
１．アジュバント
上記のワクチン製剤および医薬組成物はそれぞれ、アジュバントを含み得る。アジュバントは、作用の主な機序に基づいて２つのクラス：ワクチン送達系および免疫賦活性アジュバント（例えば、Ｓｉｎｇｈら、Ｃｕｒｒ．ＨＩＶ  Ｒｅｓ．、１：３０９−２０、２００３を参照されたい）に大きく分類される。ワクチン送達系は、粒子状製剤、例えば、エマルジョン、微粒子、粒子および／またはマトリックスなどであり得る免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、およびリポソームの場合が多い。対照的に、免疫賦活性アジュバントは、時には病原体に由来し、先天性免疫系の細胞を活性化させる病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）、モノホスホリルリピッド（ＭＰＬ）、またはＣｐＧ含有ＤＮＡであり得る。
【００９１】
別法では、アジュバントは、有機および無機として分類することができる。無機アジュバントには、ヒトワクチンに一般に使用されるミョウバン塩、例えば、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸非晶質アルミニウム硫酸塩（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｕｌｆａｔｅ）、および水酸化アルミニウムが含まれる。有機アジュバントには、巨大分子を含む有機分子が含まれる。有機アジュバントの一例には、コレラ毒素が挙げられる。
【００９２】
アジュバントは、アジュバントが誘導する応答によっても分類することができ、アジュバントは、２つ以上のタイプの応答を活性化することができる。一部の実施形態では、アジュバントは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘導する。アジュバントは、ＴＨ１細胞の活性化および／またはＴＨ１７細胞の活性化および／またはＴＨ２細胞の活性化を誘導し得る。別法では、アジュバントは、ＴＨ１細胞および／またはＴＨ１７細胞の活性化を誘導し得るが、ＴＨ２細胞の活性化を誘導し得ない、またはこの逆である。一部の実施形態では、アジュバントは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘導する。さらなる実施形態では、アジュバントは、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞の活性化を誘導し得る。一部の実施形態では、アジュバントは、ＴＨ１細胞、ＴＨ１７細胞、またはＴＨ２細胞の活性化を誘導する。他の実施形態では、アジュバントは、Ｂ細胞の活性化を誘導する。さらに他の実施形態では、アジュバントは、抗原提示細胞の活性化を誘導する。これらの区分は、相互に排他的ではなく；場合によっては、アジュバントは、２つ以上のタイプの細胞を活性化する。
【００９３】
ある実施形態では、アジュバントは、樹状細胞などの抗原提示細胞の数または活性を増大させる物質である。ある実施形態では、アジュバントは、樹状細胞などの抗原提示細胞の成熟を促進する。一部の実施形態では、アジュバントは、サポニンであるか、またはサポニンを含む。典型的には、サポニンは、トリテルペングリコシド、例えば、キラヤ樹の樹皮から単離されたトリテルペングリコシドである。生物学的起源からのサポニン抽出物は、さらに分画して（例えば、クロマトグラフィーによって）、最適なアジュバント活性および許容され得る毒性をもつ抽出物の部分を単離することができる。アジュバントとして使用されるキラヤ樹からの抽出物の典型的な画分は、画分Ａおよび画分Ｃとして知られている。例示的なサポニンアジュバントは、Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓから入手可能なＱＳ−２１である。ＱＳ−２１は、オリゴ糖接合小分子である。必要に応じて、ＱＳ−２１は、３Ｄ−ＭＰＬまたはコレステロールなどの脂質と混合することができる。
【００９４】
本明細書に記載されるワクチン製剤に使用できるサポニンの特定の形態は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）である。ＩＳＣＯＭは、一般にＱｕｉｌｌａｊａサポニン画分および脂質（例えば、コレステロールおよびリン脂質、例えば、ホスファチジルコリンなど）を含む、当技術分野で知られているアジュバントのクラスである。ある実施形態では、ＩＳＣＯＭは、目的のポリペプチドまたは核酸と一緒に構築される。しかしながら、様々なサポニン画分を、様々な割合で使用することができる。加えて、様々なサポニン画分は、同じ粒子内に一緒に存在するか、または１つの粒子に実質的に１つの画分のみを有し得る（画分Ａと画分Ｃの指定された割合が、様々な割合で粒子を互いに混合することによって達成されるように）。この文脈では、「実質的に」は、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満さえも指す。このようなアジュバントは、７０〜９５Ａ：３０〜５Ｃ、例えば、７０Ａ：３０Ｃ〜７５Ａ：５Ｃ、７５Ａ：５Ｃ〜８０Ａ：２０Ｃ、８０Ａ：２０Ｃ〜８５Ａ：１５Ｃ、８５Ａ：１５Ｃ〜９０Ａ：１０Ｃ、９０Ａ：１０Ｃ〜９５Ａ：５Ｃ、または９５Ａ：５Ｃ〜９９Ａ：１Ｃなどの割合に混合された画分Ａおよび画分Ｃを含み得る。ＣＳＬが生産するＩＳＣＯＭマトリックス、ならびにＩｓｃｏｎｏｖａが生産するＡｂＩＳＣＯ１００および３００は、典型的には直径が４０〜５０ｎｍのケージ状構造をなす、サポニン、コレステロール、およびリン脂質（細胞膜からの脂質）を含むＩＳＣＯＭマトリックスである。Ｎｏｒｄｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓが生産するＰｏｓｉｎｔｒｏは、多種多様な機序、例えば、電荷の変更による静電相互作用、キレート化基の取り込み、または直接結合によって免疫原が粒子に結合されているＩＳＣＯＭマトリックスである。
【００９５】
一部の実施形態では、アジュバントは、ＴＬＲリガンドである。ＴＬＲは、白血球膜で見られるタンパク質であり、外来抗原（微生物抗原を含む）を認識する。例示的なＴＬＲリガンドは、Ｉｎｔｅｒｅｃｅｌｌから入手可能なＩＣ−３１である。ＩＣ３１は、抗微生物ペプチド、ＫＬＫ、および免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチド、ＯＤＮ１ａを含む。ＩＣ３１は、ＴＬＲ９アゴニスト活性を有する。別の例として、ＣｐＧ含有ＤＮＡが挙げられ、多種多様なＣｐＧ含有ＤＮＡは、Ｐｒｉｚｅｒ（Ｃｏｌｅｙ）から入手可能であり：ＶａｘＩｍｍｕｎｅは、ＣｐＧ７９０９（（ＣｐＧ）含有オリゴデオキシヌクレオチド）であり、Ａｃｔｉｌｏｎは、ＴＬＲ９アゴニスト、ＣｐＧ１０１０１（（ＣｐＧ）含有オリゴデオキシヌクレオチド）である。
【００９６】
一部の実施形態では、アジュバントは、ナノエマルジョンである。１つの例示的なナノエマルジョンは、Ｎａｎｏｂｉｏが生産するＮａｎｏｓｔａｔ  Ｖａｃｃｉｎｅである。このナノエマルジョンは、高エネルギー水中油型エマルジョンである。このナノエマルジョンは、典型的には、１５０〜４００ナノメートルのサイズであり、安定性を与える界面活性剤を含む。Ｎａｎｏｓｔａｔについてのさらなる情報は、米国特許第６，０１５，８３２号、同第６，５０６，８０３号、同第６，５５９，１８９号、同第６，６３５，６７６号、および同第７，３１４，６２４号に記載されている。
【００９７】
アジュバントは、抗原（例えば、上記のポリペプチド）に共有結合し得る。一部の実施形態では、アジュバントは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化によって炎症応答を誘導するタンパク質であり得る。一部の実施形態では、１つ以上のこれらのタンパク質は、最適な抗原と組換え技術で融合させることができ、得られる融合分子は、樹状細胞の成熟を促進し、樹状細胞を活性化させてサイトカインおよびケモカインを産生させ、最終的に、Ｔ細胞への抗原の提示およびＴ細胞の応答の開始を促進する（Ｗｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００５；６５（１１）、ｐｐ４９４７−４９５４を参照されたい）。抗原に共有結合し得る他の例示的なアジュバントには、多糖、合成ペプチド、リポペプチド、および核酸が含まれ得る。
【００９８】
アジュバントは、単独で使用しても、または２種類以上組み合わせて使用しても良い。アジュバントは、抗原に直接コンジュゲートし得る。アジュバントを組み合わせて、抗原に対する免疫応答を増大させることもできる。典型的には、同じアジュバントまたはアジュバントの混合物が、ワクチンの各用量中に存在する。しかしながら、必要に応じて、アジュバントは、ワクチンの最初の投与量に含めて投与しても良いが、続く投与量（すなわち、追加免疫）には含めない。別法では、強いアジュバントを、ワクチンの最初の投与量に含めて投与しても良く、弱いアジュバントまたは低用量の強いアジュバントを、次の投与量にも含めて投与しても良い。アジュバントは、抗原の投与の前、抗原の投与と同時、または抗原の投与の後（ある時は、１時間、２時間、６時間、または１２時間以内、別のときは、１日、２日、または５日以内）に被験体に投与することができる。あるアジュバントは、ヒト患者、非ヒト患者、または両方に適している。
【００９９】
２．ワクチンおよび医薬組成物の追加の成分
本明細書に記載される抗原およびアジュバントに加えて、ワクチン製剤または医薬組成物は、１つ以上の追加の成分を含み得る。
【０１００】
ある実施形態では、ワクチン製剤または医薬組成物は、１つ以上の安定剤、例えば、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはフルクトース）、リン酸塩（例えば、第２リン酸ナトリウム、第１リン酸カリウム、第２リン酸カリウム、または第１ナトリウムリン酸塩）、グルタミン酸塩（例えば、Ｌ−グルタミン酸一ナトリウム）、ゼラチン（例えば、処理ゼラチン、加水分解ゼラチン、またはブタゼラチン）、アミノ酸（例えば、アルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、Ｌ−ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、リシン、フェニルアラニン、チロシン、およびこれらのアルキルエステル）、イノシン、またはホウ酸ナトリウムを含み得る。
【０１０１】
ある実施形態では、ワクチン製剤または医薬組成物は、１つ以上の緩衝剤、例えば、重炭酸ナトリウムとアスコルビン酸との混合物などを含む。一部の実施形態では、ワクチン製剤は、生理食塩水、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または蒸留水に溶解して投与しても良い。
【０１０２】
ある実施形態では、ワクチン製剤または医薬組成物は、１つ以上の界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ポリエチレングリコール−ｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル−ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００）；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ２０）；ならびにホルムアルデヒドおよびオキシランを伴う４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノールポリマー（ＴＹＬＯＸＡＰＯＬ）を含む。界面活性剤は、イオン性または非イオン性であり得る。
【０１０３】
ある実施形態では、ワクチン製剤または医薬組成物は、１つ以上の塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、または塩化カリウムを含む。
【０１０４】
ある実施形態では、保存剤がワクチンに含められる。他の実施形態では、保存剤は使用されない。保存剤は、複数回投与ワクチンバイアルで最も良く使用され、単回投与ワクチンバイアルではそれほど使用されない。ある実施形態では、保存剤は、２−フェノキシエタノール、メチルおよびプロピルパラベン、ベンジルアルコール、および／またはソルビン酸である。
【０１０５】
ある実施形態では、ワクチン製剤または医薬組成物は徐放製剤である。
【０１０６】
Ｅ．ＤＮＡワクチン
ある態様では、ワクチンは、本明細書に開示される核酸の１つを含む。核酸ワクチンが患者に投与されると、対応する遺伝子産物（例えば、望ましい抗原）が患者の体内で生産される。一部の実施形態では、最適化された組換えポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンベクターを哺乳動物（ヒトを含む）に送達して、治療または予防免疫応答を誘導することができる。核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または合成核酸でも良い。核酸は、１本鎖でも２本鎖でも良い。
【０１０７】
核酸ワクチンベクター（例えば、アデノウイルス、リポソーム、パピローマウイルス、レトロウイルスなど）を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために哺乳動物に直接投与することができる。核酸ワクチンは、非経口投与を含む任意の適切な方式で投与するために医薬組成物として製剤することができる。
【０１０８】
感染または他の症状の処置または予防で投与されるベクターの有効量の決定では、医師は、ベクターの毒性、疾患の進行度、および抗ベクター抗体の産生（存在する場合）を評価する。多くの場合、ベクターからの裸核酸に等しい用量は、典型的な７０ｋｇの患者では、約１μｇ〜１ｍｇであり、核酸を送達するために使用されるベクターの用量は、等量の治療用核酸が産生されるように計算する。投与は、単回投与または分割投与によって達成することができる。核酸ワクチンベクターの毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物での標準薬学手順で決定することができる。
【０１０９】
核酸ワクチンは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、改変核酸、またはこれらの組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、ワクチンは、１つ以上のクローニングベクターまたは発現ベクター含む；例えば、ワクチンは、それぞれが哺乳動物細胞でヌクレオチドコード領域を自律発現して少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドを産生できる複数の発現ベクターを含み得る。発現ベクターは、真核生物プロモーター配列、例えば、１つ以上のコード領域に機能的に連結された強い真核生物プロモーターのヌクレオチド配列などを含む場合が多い。本明細書に記載される組成物および方法は、任意の特定の真核生物プロモーターの使用を伴うこともあり得、ＣＭＶまたはＲＳＶプロモーターなどの多種多様なプロモーターが周知である。プロモーターは、宿主細胞に対して異種性であるのが良いが、必ずしも異種性である必要はない。使用されるプロモーターは、構成的プロモーターとすることができる。
【０１１０】
本組成物および本方法に有用なベクターは、環状または線形、１本鎖または２本鎖とすることができ、プラスミド、コスミド、またはエピソームとすることができる。適切な実施形態では、各ヌクレオチドコード領域は、別個のベクター上にある；しかしながら、１つ以上のコード領域が１つのベクター上に存在することができ、これらのコード領域を、１つまたは複数のプロモーターの制御下とすることができることを理解されたい。
【０１１１】
多数のプラスミドを、核酸ワクチンの生産に使用することができる。核酸ワクチンの適切な実施形態は、プラスミドＶＲ１０１２（Ｖｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆ．）、ｐＣＭＶＩ．ＵＢＦ３／２（Ｓ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ）、またはｐｃＤＮＡ３．１（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）をベクターとして用いる構築物を利用する。加えて、ベクター構築物は、動物の免疫系を刺激する、非メチル化ｄＣｐＧモチーフなどの免疫賦活性配列（ＩＳＳ）を含み得る。核酸ワクチンは、免疫原性ポリペプチドを含む融合産物もコードし得る。プラスミドＤＮＡは、送達システムとして弱毒化細菌を用いて送達することもでき、これは、経口投与されるＤＮＡワクチンに適した方法である。細菌を、自己複製プラスミドで形質転換し、自己複製プラスミドが、宿主細胞で弱毒化細菌が死んだ後で宿主細胞の細胞質内に放出される。
【０１１２】
核酸を動物に送達する別の手法では、ウイルスベクターまたは細菌ベクターを使用する。適切なウイルスベクターの例には、アデノウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、例えば、αウイルス、ワクシニア、カナリア痘、および鶏痘、ナマズ・ヘルペス・ウイルスを含むヘルペスウイルス、アデノウイルス関連ベクター、およびレトロウイルスが含まれる。ウイルス様ベクターには、ビロゾームおよびウイルス様粒子が含まれる。例示的な細菌ベクターには、弱毒型のサルモネラ菌、赤痢菌、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ  ｉｃｔａｌｕｒｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｒｕｃｋｅｒｉｉ、およびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅが含まれる。一部の実施形態では、核酸は、免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を自己発現できるプラスミドなどのベクターである。
【０１１３】
Ｆ．ワクチンの使用
本明細書に記載されるワクチンは、ＨＳＶ−１および特にＨＳＶ−２を含むヘルペスの予防および／または治療処置に使用することができる。ワクチン接種を受ける被験体は、男性でも女性でも良く、子供でも成人でも良い。一部の実施形態では、処置される被験体はヒトである。他の実施形態では、被験体は、非ヒト動物である。
【０１１４】
１．予防的使用
予防の実施形態では、ＨＳＶ−２ワクチンを、ＨＳＶ−２の確立の防止に役立ち得る免疫応答を誘導するために被験体に投与する。
【０１１５】
一部の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、防御免疫を付与し、ワクチン接種をされた個体が、その個体のワクチンへの曝露の結果として（例えば、メモリー応答）、症状の発現を遅らせる、または症状の重症度を軽減することができる（例えば、感染の発現時の病変の数を減少させる）。ある実施形態では、症状の重症度の軽減は、少なくとも２５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または実に９０％である。ワクチン接種をされた一部の個体は、ＨＳＶ−２との接触時に症状を全く示さない、またはＨＳＶ−２の感染さえも示さないこともあり得る。防御免疫は、典型的には、次の１つ以上の機序：粘膜免疫、体液性免疫、または細胞性免疫によって達成される。粘膜免疫は主に、気道、胃腸管、および泌尿生殖器の粘膜表面におけるＩｇＡ（ｓＩＧＡ）抗体の分泌の結果である。ｓＩＧＡ抗体は、抗原処理細胞、ＢおよびＴリンパ球によって媒介される一連の事象の後に産生され、体の粘膜に覆われた組織におけるＢリンパ球によるｓＩＧＡの産生がもたらされる。体液性免疫は、典型的には、血清中のＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体の結果である。例えば、ＩｇＧ力価は、本明細書に記載されるワクチン製剤の投与後に１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または実に１００倍以上まで上昇し得る。細胞性免疫は、細胞障害性Ｔリンパ球によって、またはマクロファージおよびＴリンパ球が関与する遅延型過感受性によって達成され得る他、抗体を必要としないＴ細胞が関与する他の機序によっても達成され得る。具体的には、細胞性免疫は、ＴＨ１細胞またはＴＨ１７細胞によって活性化され得る。ＴＨ１細胞の活性化は、免疫応答を引き起こさないポリペプチドに応答して放出されるＩＦＮ−γのレベルに対するＩＦＮ−γの分泌によって測定することができる。ある実施形態では、放出されるＩＦＮ−γの量は、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または実に１００倍以上である。防御免疫の主な結果は、ＨＳＶ−２ウイルス粒子の破壊またはＨＳＶ−２の複製能力の阻害である。一部の実施形態では、ＨＳＶ−２への曝露前の抗原提示によって付与される防御免疫は、ＨＳＶ−２陽性状態へのセロコンバージョンの可能性を低減する。
【０１１６】
防御免疫の期間は、可能な限り長いのが好ましい。ある実施形態では、ワクチン製剤は、６ヶ月、１年、２年、５年、１０年、２０年、または実に一生涯続く防御免疫を確立する。
【０１１７】
２．治療での使用
治療への適用では、本発明のポリペプチドまたは核酸を含むワクチンを、ＨＳＶ−２に罹患している患者に患者の処置に十分な量投与することができる。患者の処置は、この場合、感染した個体におけるＨＳＶ−２の症状を遅延させる、または軽減することが該当し得る。一部の実施形態では、患者の処置は、病変の期間を低減すること、病変の数を低減すること、１回の発症における症状の期間を低減すること、および／またはそれら以外の、１回の発症における症状の強さを低減することが該当する。ある実施形態では、ワクチンは、軽度の症状の期間または重症度を低減し；ある実施形態では、ワクチンは、重度の症状の期間または重症度を低減する。一部の実施形態では、ワクチンは、ウイルス排出を低減し、これによりワクチン接種された患者からのＨＳＶ−２の伝染性を低減する。ある実施形態では、上記の低減は、少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または実に９０％である。ある実施形態では、上記の低減は、症状、ウイルス排出、および／または将来の発症の完全な阻止を含む（例えば、知覚神経節での潜伏を確立するウイルスの能力を阻害することによって）。
【０１１８】
治療の実施形態では、ＨＳＶ−２ワクチンを、感染後に患者に投与する。ＨＳＶ−２ワクチンは、感染の直後、例えば、症状の顕在化の前に投与しても良いし、または症状の顕在化の最中または後で投与しても良い。一部の実施形態では、ＨＳＶ−２ワクチンは、初期の感染の内因性の再活性化を防止することができる。一部の実施形態では、感染後ワクチンを、高リスク群の患者に投与することができる。
【０１１９】
本明細書に開示されるワクチン製剤の治療効果の期間は、可能な限り長いのが好ましい。ある実施形態では、ワクチン製剤は、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年、１０年、２０年、または実に一生涯続く治療効果をもたらす。
【０１２０】
３．ワクチン接種の有効性のアッセイ
本明細書に開示されるワクチンでのワクチン接種の有効性を多数の方式で決定することができる。
【０１２１】
ワクチンの有効性は、様々なモデル系でアッセイすることができる。ＨＳＶ−２の研究に使用される適切なモデル系には、以下の実施例に記載されるようにモルモットモデルおよびマウスモデルが含まれる。簡単に述べると、動物にワクチン接種してからＨＳＶ−２を曝露する、または既に感染している動物にワクチンを投与する。ＨＳＶ−２暴露またはワクチンに対する動物の応答を、上記の測定の１つを用いてコントロール動物と比較する。同様のアッセイを、ヒトの臨床試験に使用することができる。上記の処置および予防効果は、ワクチンの有効性を決定するさらなる手段を表している。
【０１２２】
加えて、有効性は、未感作ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫化によって評価することができ、ＡＰＣをワクチンに曝露してから、ＡＰＣを同じドナーからの未感作Ｔ細胞と共培養して、試験管での免疫化に対する一次応答を評価する。ワクチンに曝露されなかったＡＰＣを用いたＴ細胞の活性に対して１．５倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍以上のＴ細胞の活性化は、ある実施形態では、十分な応答と見なされる。
【０１２３】
ワクチンの有効性は、ウイルス中和アッセイによってさらに決定することができる。簡単に述べると、動物を免疫化し、血清を、免疫化後の様々な日に収集した。血清の連続希釈液を、ウイルスと共に事前にインキュベートし、このインキュベート中に、ウイルスに特異的な血清中の抗体がウイルスに結合する。次いで、ウイルス／血清混合物を許容細胞に添加して、プラークアッセイによって感染力を決定する。血清中の抗体がウイルスを中和すると、コントロール群と比較して存在するプラークが少ない。
【０１２４】
Ｇ．医薬組成物の使用
１．ＨＳＶ感染に対する防御
本開示の医薬組成物は、ＨＳＶ−２に対して免疫応答を惹起するようにデザインされている。本明細書に記載される組成物は、これらの組成物が投与された被験体において、先天性免疫応答、抗体応答、細胞性免疫応答、またはこれらの応答の組み合わせを刺激し得る。一部の実施形態では、本組成物は、好中球、マクロファージ、およびＮＫ細胞などの免疫細胞を、感染の末梢部位または知覚神経節で刺激する。組成物は、マクロファージによる浸潤；好中球による一酸化窒素、ＴＮＦ−α、インターフェロン（ＩＦＮ）、およびインターロイキン１２（ＩＬ−１２）などを含む抗ウイルス化合物の産生；および／またはＮＫ細胞の刺激によるＩＦＮ−γの産生を刺激することができる。ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、およびＩＦＮ−βの産生は、本組成物のポリペプチドによっても開始させることでき、感染の制御に役立つと考えられる。
【０１２５】
一部の実施形態では、本組成物は、中和抗体の産生を刺激する抗原を含む。中和抗体は、ウイルスエンベロープの糖タンパク質を標的とすることができ、この糖タンパク質は、ウイルス粒子と宿主細胞の相互作用を媒介し、ＨＳＶ−２の細胞への付着、結合、および侵入に関与する。したがって、例示的な組成物は、上記の１つ以上の糖タンパク質、または上記の核酸によってコードされる１つ以上の糖タンパク質を含む。本明細書に記載される免疫原性抗原および／またはエピトープは、互いに別個に連続してまたは組み合わせて投与することができる。
【０１２６】
一部の実施形態では、本組成物は、細胞性応答を惹起し、この細胞性応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、および／または抗ウイルスサイトカインの産生に関与し得る。本組成物は、例えば、先天性免疫応答の活性化によってＩＦＮ−γの分泌を引き起こし、ＣＤ８＋Ｔ細胞のウイルス除去を媒介することができる。ＩＦＮ−γは、ＴＨ１細胞、（ＴＨ１７細胞？）ＴＣ細胞、樹状細胞、およびＮＫ細胞によっても分泌され、本組成物は、任意のこれらの細胞型によるＩＦＮ−γの分泌を引き起こすことができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞のこのような活性は、細胞溶解性であり得る、あるいは、ニューロンの死滅を防止するニューロン表面の阻害分子によって制御され得る。ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、ウイルスの潜伏期の持続に役立ち、ウイルスの再活性化を防止し得る。一部の実施形態では、本組成物は、ウイルスの潜伏状態からの再活性化を防止するＣＤ４＋Ｔ細胞応答および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強する。
【０１２７】
一部の実施形態では、本組成物は、ＨＳＶの宿主免疫応答を回避する能力を阻害する、あるいは通常はＨＳＶによって回避される免疫応答を増強する。一部の実施形態では、本組成物は、ＨＳＶ−２がＨＳＶ抗原の寛容に向かって免疫バランスを変化するのを抑制する。ＨＳＶ−２は、ＴＨ２細胞による寛容を媒介する。まず、ＨＳＶ−２は、ＩＬ−１０、ＴＨ２サイトカインを分泌するＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞およびＴｒ１細胞などのサプレッサーＴ細胞を誘導し得る。ＴＨ２サイトカインは、同時刺激分子を下方制御し、抗原提示樹状細胞の成熟および機能を抑制する。加えて、ＨＳＶ−２の感染は、効率的なＣＴＬ刺激に必須である樹状細胞の成熟および遊走を抑制する。注目すべきことに、ＴＨ２サイトカインは、再発しない症状の発現中に産生されるＴＨ１サイトカインとは対照的に、ＨＳＶ−２感染の再発中に産生される。したがって、ある実施形態では、本発明の組成物は、サプレッサーＴ細胞を抑制し、かつ／または樹状細胞の成熟もしくは遊走または両方を誘導する。
【０１２８】
一部の実施形態では、ＨＳＶ−２に対する免疫応答を哺乳動物で誘導する方法は、上記の組成物を投与するステップを含む。組成物は、異なる時点、例えば、ＨＳＶ−２への曝露の前、ＨＳＶ−２の初期感染の後、ＨＳＶ−２が潜伏を確立する前または後、ＨＳＶ−２の排出が起こる前または後、および／または発症の再発が起こる前または後などで免疫応答を誘導するために用いることができる。一部の実施形態では、ＨＳＶ−２に対する免疫応答は、上記の１つ以上の時点で誘導することができる。組成物は、ＴＨ２応答は誘導できないが、ＴＨ１応答および／またはＴＨ１７応答を誘導できる、または同時もしくは異なる時点で応答を活性化することができる。
【０１２９】
一部の実施形態では、組成物の投与により、ＨＳＶの初期感染、潜伏期、または再感染に関連した症状を低減する。このような組成物は、ＨＳＶ感染もしくは発症に関連した病変、ただれ、痛み、刺激、かゆみ、発熱、倦怠感、頭痛、ウイルス排出、または前駆症状の発生率および／または重症度を低減し得る。
【０１３０】
一部の実施形態では、ＨＳＶ−２の抗原に対する１つ以上の抗体を、受動免疫を引き起こすために個体に投与することができる。受動免疫は、既存の抗体の形態である活性な体液性免疫のある個体から別の個体への移動によって生じる。受動免疫は、高い感染リスクがあり、かつ体が自己の免疫応答を起こすのに十分な時間がない、または進行中もしくは免疫抑制疾患の症状を軽減するのに十分な時間がない場合に用いることができる。Ｔ細胞の養子免疫伝達は、患者のＨＳＶ−２抗原に対する免疫応答を惹起する別の方法を提供し得る。一実施形態では、自己Ｔ細胞は、上記のポリペプチドに由来する抗原を提示するＡＰＣで増大させることができる。続いて、増大したＨＳＶ−２特異的Ｔ細胞を、このＴ細胞が由来する患者に戻す。
【０１３１】
２．診断での使用
本出願は、患者におけるＨＳＶ−２の検出のための、とりわけ迅速かつ安価で精度の高い特殊な方法を提供する。これに関連して、病院および医師が、ＨＳＶ−２に感染している、または感染のリスクのある患者を検査し処置することが有用なはずである。本明細書で使用される場合、「患者」は、ＨＳＶ−２に感染しているか、またはＨＳＶ−２に感染する可能性のある個体（例えば、ヒト）を指す。
【０１３２】
一部の実施形態では、個体におけるＨＳＶ−２を検出するために、表１および／または表２のポリペプチドなどの本明細書に記載されるポリペプチドの１つに対する抗体を使用することができる。本開示は、ＨＳＶ−２感染の疑いのある患者からの生物学的サンプルのフェノタイピングの方法であって、（ａ）必要に応じて、生物学的サンプルをイムノアッセイしやすくするステップと、（ｂ）ＨＳＶ−２のエピトープへの抗体または抗原結合部分の結合を可能にする条件下で、このサンプルを、適切なＨＳＶ−２特異的抗体またはその抗原結合部分に接触させるステップと、（ｃ）このサンプルが、コントロール組織と比較してＨＳＶ−２の存在を示すか否かを決定するステップであって；試験組織がＨＳＶ−２の存在を示す場合は、患者が、ＨＳＶ−２に感染している可能性が高いと認定される、ステップとを含む、方法も提供する。
【０１３３】
別法では、個体における抗ＨＳＶ−２抗体を検出するために上記のポリペプチドを使用することができる。本開示は、ＨＳＶ−２感染の疑いのある患者からの生物学的サンプルのフェノタイピングの方法であって、（ａ）必要に応じて、生物学的サンプルを、ＥＬＩＳＡなどの親和性アッセイをしやすくするステップと、（ｂ）サンプル中に存在する任意の宿主抗体への抗原の結合を可能にする条件下で、このサンプルを、ＨＳＶ−２特異的抗原またはその一部に接触させるステップと、（ｃ）このサンプルが、コントロール組織と比較してＨＳＶ−２の存在を示すか否かを決定するステップであって；試験組織がＨＳＶ−２の存在を示す場合は、患者が、ＨＳＶ−２に感染している可能性が高いと認定される、ステップとを含む、方法も提供する。上記の試験は、他のウイルス感染を検出するために、例えば、表１および／または表２に示されているような上記のタンパク質の相同体（別のウイルス種由来）を用いることによって適切に調整することができる。
【０１３４】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ウエスタンブロット法、競合アッセイ、およびスポットブロットを含め、抗体と抗原の結合を測定する多数の方法が、当技術分野で周知である。検出ステップは、例えば、化学発光法、蛍光法、または比色分析とすることができる。抗体とタンパク質の結合を測定する１つの適切な方法は、ペプチドが色素含有マイクロスフィアにコンジュゲートするＬｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰシステムである。ｘＭＡＰシステムを含むあるシステムは、いくつかの異なるマーカーを多重測定しやすく、抗体のレベルを即座に測定するために使用することができる。一部の実施形態では、他のシステムを使用して、複数のマーカーを多重アッセイする。例えば、次のシステム：抗原マイクロアレイ、ビーズマイクロアレイ、ナノバーコード粒子技術、ｃＤＮＡ発現ライブラリーからの整列されたタンパク質、タンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕアレイ、生きた形質転換体のタンパク質アレイ、ユニバーサルタンパク質アレイ、ラブ・オン・チップ・マイクロ流体工学、およびペプチドピン（ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ｐｉｎｓ）のいずれかを用いてプロファイリングを行うことができる。臨床アッセイの別のタイプは、抗体の結合を検出する化学発光アッセイである。ＶＩＴＲＯＳ  Ｅｃｉ  抗ＨＣＶアッセイを含め、一部のこのようなアッセイでは、抗体が、液体懸濁液中の微小粒子からなる固相支持体に結合し、表面蛍光光度計を用いて、酵素による蛍光産物の産生を定量する。
【０１３５】
他の実施形態では、ＨＳＶ−２に特異的なＴ細胞を検出するために、表１および／または表２のポリペプチドなどの上記のポリペプチドを使用することができる。本開示は、ＨＳＶ−２感染の疑いのある患者からの生物学的サンプルのフェノタイピングの方法であって、（ａ）必要に応じて、生物学的サンプルを、Ｔ細胞の活性化についてのアッセイをしやすくするステップと、（ｂ）ＡＰＣがＨＳＶ−２特異的ポリペプチドを処理できる条件下で、このサンプルを、ＨＳＶ−２特異的ポリペプチドまたはその一部に接触させるステップと、（ｃ）ＨＳＶ−２特異的ポリペプチドに応答したＴ細胞の活性化を決定するステップであって；非感染患者に対するＴ細胞活性化の上昇がＨＳＶ−２感染を示唆する、ステップとを含む、方法を提供する。この診断アッセイは、ＨＳＶ−２に曝露されてもセロコンバージョンされずに検出可能なレベルの抗ＨＳＶ−２抗体を産生しない患者を含め、あらゆる患者におけるＨＳＶ−２特異的Ｔ細胞の存在を検出することを目的とする。
【０１３６】
Ｔ細胞活性化は、サイトカイン特異的ＥＬＩＳＡ、トリチウム化チミジン取り込みまたは膜介在（ＰＫＨ−６７）もしくは細胞質（ＣＦＳＥ）色素によって測定される細胞増殖、ＥＬＩＳＰＯＴ、フローサイトメトリー、およびビーズアレイを含む様々な増殖アッセイを用いて測定することができる。加えて、抗原に特異的であるマウスまたはヒトからのＴ細胞系またはＴ細胞ハイブリドーマにおけるＴ細胞応答を測定することができる。活性化Ｔ細胞の読み取りは、Ｔ細胞またはＴ細胞ハイブリドーマが抗原に応答して活性化されたときに誘導されるＴ細胞ハイブリドーマによって発現された代理酵素の増殖、サイトカイン産生、または読み取りが含まれる。例えば、Ｔ細胞応答の活性化は、β−ガラクトシダーゼを産生するように操作されたＴ細胞ハイブリドーマによって検出することができる。β−ガラクトシダーゼは、クロロフェニルレッドβ−Ｄガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ）などの発色β−ガラクトシダーゼ基質の使用によって検出することができる。
【０１３７】
ＨＳＶ−２感染は、急性または潜伏性であり得る。一部の実施形態では、生物学的サンプルが、ＨＳＶ−２の存在を示す場合は、本明細書に記載される治療有効量の組成物および治療を患者に施すことができる。生物学的サンプルには、例えば、血液、精液、尿、膣液、粘液、唾液、便、尿、脳脊髄液、または組織サンプルが含まれ得る。一部の実施形態では、生物学的サンプルは、植え込み用の器官である。ある実施形態では、検出ステップの前に、生物学的サンプルを、ＨＳＶ−２の増殖を促進する培養条件で培養する。
【０１３８】
本明細書に記載される診断試験を用いて、患者から得たサンプルおよび他の供給源から得たサンプルを含む様々なサンプルでＨＳＶ−２を検出することができる。例えば、診断試験を用いて、医療器具などの物体におけるＨＳＶ−２を検出することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される試験は、家畜（ウシ、ブタ、ニワトリ、ヤギ、およびウマなど）、ペット動物（イヌ、ネコ、およびトリなど）、または野生動物などの動物から得たサンプルに対して行うことができる。ある実施形態では、本明細書に記載される試験は、治療用タンパク質を産生するヒト細胞の培養物、有用な生物学的分子の産生用の細菌の培養物、または研究目的で増殖される細胞の培養物などの細胞培養物から得たサンプルに対して行うことができる。
【０１３９】
本発明は、患者におけるＨＳＶ−２感染の位置を決定する方法であって、（ａ）標識ＨＳＶ−２抗体またはその抗原結合部分を含む医薬組成物を患者に投与するステップと、（ｂ）標識を検出するステップと、（ｃ）患者がコントロールと比較してＨＳＶ−２を有するか否かを決定するステップとを含む、方法も包含する。ある実施形態では、この方法は、患者がＨＳＶ−２に感染している場合に、本明細書に記載される治療有効量の組成物を患者に投与するステップをさらに含む。この方法は、患者における感染細胞型および／またはＨＳＶ−２の量を決定するステップをさらに含み得る。この方法を用いて、患者におけるＨＳＶ−２の拡散を評価して、局所治療が適切であるか否かを決定することができる。
【０１４０】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドを用いて、感染経路の診断を行うことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドに特異的なＴ細胞または抗体の応答を、患者から得たサンプルで検出することができる。抗体またはＴ細胞が通常のレベルで存在する場合は、患者が、病原体に対する有効な免疫応答を引き起こしたことを示唆する。抗体またはＴ細胞が存在しない、または低レベルで存在する場合は、患者が病原体に対する十分な応答を引き起こせなかったことを示唆し、より積極的な処置が推奨される。一部の実施形態では、低レベルで存在する抗体またはＴ細胞とは、防御免疫応答での患者の典型的なレベルの５０％、２０％、１０％、５％、２％、または１％で存在する応答を指す。Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞増殖、ＥＬＩＳＰＯＴ、またはＥＬＩＳＡなどの当技術分野で周知の方法によって検出することができ、抗体は、ＥＬＩＳＡなどの当技術分野で周知の方法を用いて、本明細書に記載される任意の抗原の親和性によって検出することができる。
【０１４１】
一部の実施形態では、ＨＳＶ−２抗原に特異的なＴ細胞の検出を用いて、患者におけるＨＳＶ−２感染の進行および症状を予測することができる。ＨＳＶ−２に感染した後、一部の患者は、無症状のままであるが、ウイルスは潜伏を確立し得る。他の患者は、ＨＳＶ−２感染の症状を示し、発症を再発し得る。無症状の患者に見られるＨＳＶ−２抗原は、症状および／または発症の再発を示す患者に見られる抗原とは異なり得る。したがって、本発明の検出方法を用いて、ＨＳＶ−２に感染した患者の集団内の亜群を区別することができる。亜群は、発症が頻繁に起きる患者および発症がまれに起きるかもしくは決して起きない患者、またはウイルスを高レベルで排出する患者およびウイルスを低レベルで排出するかもしくは排出しない患者にさらに分類することができる。他の抗原ではなくあるＨＳＶ−２抗原に対するＴ細胞応答の存在およびレベルに基づいた患者の分類は、医療従事者が適切な処置計画を決定するのに役立ち得る。同様に、Ｔ細胞応答の程度の差および／またはＴ細胞によって産生されるサイトカインの組み合わせおよびレベルにおける差を用いて、患者のＨＳＶ−２感染の進行および症状を予測することもできる。したがって、Ｔ細胞が応答するＨＳＶ−２抗原の補体が、重度の症状、頻繁な発症、および／または高レベルのウイルス排出を予測する感染患者は、ＨＳＶ−２抗原の補体が無症状感染を予測する患者よりも集中的な抗ウイルス治療および／または期間の長い治療処置を必要とし得る。
【０１４２】
当業者であれば、本明細書に記載される方法がＨＳＶ−２の検出に限定されるものではないことを理解できよう。他の実施形態は、表１および／または表２に示されているような上記のタンパク質に相同なタンパク質をもつウイルスを含む近縁ウイルスの検出を含む。このような近縁ウイルスには、例えば、ヘルペスウイルスファミリーの他のメンバーも含まれる。相同性によって、これらの近縁ウイルスは、ヘルペスウイルスファミリーのメンバーではないウイルスも含まれ得る。
【０１４３】
３．ＨＳＶ−２の感染リスクが高い群での使用
本質的にあらゆる個体は、ＨＳＶ−２に対してある感染リスクがある。しかしながら、ある亜母集団は、感染リスクが高い。一部の実施形態では、ＨＳＶ−２に対する組成物が投与される患者は、免疫不全である。
【０１４４】
医療処置によって生じる免疫不全状態は、その個体を高い感染リスクにさらす可能性が高い。免疫不全状態をもたらすことが知られている処置の前または最中に、免疫不全状態である個体の感染を予防的に処置することが可能である。このような状態をもたらすことが知られている処置の前または最中に抗原で予防的に処置することにより、後の感染を防止する、または免疫不全状態のために個体が感染するリスクを低減することが可能である。個体が、例えば、免疫不全状態をもたらす処置の後に感染した場合、個体に抗原組成物を投与することによって感染を処置することも可能である。
【０１４５】
ある実施形態では、本組成物を子供または成人患者に投与する。他の実施形態では、組成物は、胎児または乳児の感染の防止などで、妊娠前に感染した妊婦または妊娠中に感染した妊婦に適切である。組成物は、子宮で、または出産中に感染した新生児または乳児に投与することもできる。
【０１４６】
Ｈ．投与の量および経路
１．投与量およびタイミング
各ワクチン投与量における抗原の量は、単回投与または複数回投与で、上記のように予防または治療応答を誘導する有効量として選択される。好ましくは、この投与量は、典型的なワクチン接種で有意な有害副作用がない。このような量は、どの特異的抗原が利用されるかによって異なる。一般に、投与量は、１〜１，０００μｇ、場合によっては、２〜１００μｇ、例えば、４〜４０μｇのタンパク質を含むと思われる。一定のワクチンの最適な量は、抗体力価、Ｔ細胞の活性化レベル、および被験体における他の応答の観察を含む標準的な研究によって確定することができる。一部の実施形態では、送達される抗原の適切な量は、被験体の年齢、体重、および健康状態（例えば、免疫不全状態など）によって異なる。存在する場合は、アジュバントは、典型的には、１回の投与量に付き１μｇ〜２５０μｇ、例えば、５０〜１５０μｇ、７５〜１２５μｇ、または１００μｇの量で存在する。
【０１４７】
一部の実施形態では、上記の結果を得るために１回投与量のワクチンのみが投与される。他の実施形態では、最初のワクチン接種の後、１回以上のブーストワクチン接種、例えば、合計で２回、３回、４回、または５回、被験体がワクチン接種される。３回以下の回数が有利である。１回のワクチン接種療法が、０ヶ月、０．５〜２ヶ月、および４〜８ヶ月で行われるように、ブーストワクチン接種を、例えば、最初のワクチン接種から約１ヵ月後、２ヵ月後、４ヵ月後、６ヵ月後、または１２ヵ月後に行うことができる。同じまたは異なる経路で投与できるワクチンは、分割投与すると有利であろう。
【０１４８】
本明細書に記載される医薬組成物は、様々な剤形とすることができる。ある実施形態では、医薬組成物は、固体または粉末（例えば、凍結乾燥）形態で提供される：または溶液形態でも提供され得る。ある実施形態では、剤形は、１回投与量の凍結乾燥組成物と少なくとも１つの別個の希釈剤の滅菌容器として提供される。
【０１４９】
一部の実施形態では、抗原は、１回の投与量当たり１μモルの量で患者に送達される。一部の実施形態では、抗原は、１回の投与量当たり１０ｎモル〜１００ｎモルの範囲の量で送達される。送達される抗原の適切な量は、当業者が決定することができる。一部の実施形態では、送達される抗原の適切な量は、被験体の年齢、体重、および健康状態（例えば、免疫不全状態）によって異なる。
【０１５０】
本明細書に開示される医薬組成物は、（一部の実施形態では）免疫応答の一部として抗体の産生を誘導するのに十分な量で投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、５ｍｃｇ／０．５ｍＬ、または１０ｍｃｇ／１ｍＬ〜２００ｍｃｇ／１ｍＬの抗原を含むように製剤することができる。他の実施形態では、医薬組成物は、抗原の組み合わせを含み得る。複数の抗原はそれぞれ、同じ濃度でも良いし、または異なる濃度でも良い。
【０１５１】
一部の実施形態では、組成物は、組成物の次の投与が前の投与よりも高濃度の組成物を含むように、段階的に増大する投与量で投与される。一部の実施形態では、組成物は、組成物の次の投与が前の投与よりも低濃度の組成物を含むように投与される。
【０１５２】
治療への適用では、組成物は、疾患を患う患者に、疾患およびその合併症を治癒する、または少なくとも部分的に抑止するのに十分な量で投与される。
【０１５３】
本明細書に記載される組成物の治療への適用は、例えば、組成物で処置されていない個体で起こるレベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％に、ＨＳＶ−２に感染した患者において伝染性を低減する、疾患の進行を遅らせる、ウイルス排出を低減する、または再感染を排除することを含む。組成物は、例えば、組成物で処置されていない個体で起こるレベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％に、感染した個体によるＨＳＶ−２排出の量を低減する、感染した患者の潜伏段階からのＨＳＶ−２の再活性化に必要なタンパク質の発現を抑制する、および／または感染した患者のニューロンにおけるＨＳＶ−２の複製を抑制することもできる。
【０１５４】
予防の実施形態では、組成物は、感染性疾患または他の症状の確立を抑制できる免疫応答を誘導するためにヒトまたは他の哺乳動物に投与される。一部の実施形態では、組成物は、ウイルスが潜伏を確立するのを部分的に阻止する、または潜伏が確立される効率を低減することができる。
【０１５５】
一部の実施形態では、１回の投与量（投与）のみの組成物が与えられる。他の実施形態では、組成物は、複数回投与で投与される。様々な実施形態では、組成物は、１回、２回、３回、または４回以上投与される。被験体に投与される投与回数は、抗原、疾患の程度または予想される疾患への曝露、および被験体の組成物に対する応答によって異なる。
【０１５６】
一部の実施形態では、組成物は、抗菌分子と組み合わせて投与される。抗菌分子には、抗ウイルス分子が含まれ得る。多数の抗ウイルス分子が、現在、当技術分野で周知であり、ウイルスの宿主細胞への付着、ウイルス遺伝子および／または酵素の宿主細胞内への放出、宿主細胞機構を用いたウイルス成分の複製、ウイルス成分の完全ウイルス粒子への組み込み、および新たな宿主に感染するためのウイルス粒子の放出を含むウイルスのライフサイクルの１つ以上の段階を標的とする。
【０１５７】
２．投与の経路
本明細書に記載されるワクチン製剤および医薬組成物は、個体への投与、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、皮下、経皮、真皮下、頭蓋内、鼻腔内、粘膜、肛門、膣、経口、舌下、頬経路、または吸引され得る）によって送達することができ、または局所適用によって投与することができる。
【０１５８】
一部の実施形態では、組成物は、感染の可能性がある部位に直接投与することができる。女性患者では、組成物は、粘膜に局所適用する、または当技術分野で周知の装置および方法を用いて経膣的または経直腸的に送達することができる。膣および直腸の送達経路は、長期、連続的、またはパルス送達を可能にし、組成物の使用が予防用かまたは治療用かによって、ＨＳＶへの曝露の前または後で投与することができる。男性患者では、組成物は、皮膚または粘膜に局所適用する、または経直腸的に送達することができる。両方の患者集団では、組成物は、知覚神経節を標的とすることもできる。
【０１５９】
ＨＳＶ−２ワクチンまたは医薬組成物は、筋肉内経路を介して投与される場合が多い。典型的には、この経路では、ワクチンは、粘膜組織のアクセス可能な領域に注射される。筋肉内注射は、一部の実施形態では、三角筋、外側広筋、腹側または背側殿筋に行われる。注射は、典型的には、ワクチンが筋肉に達するように皮膚の表面に対して約９０度の角度で行われる。
【０１６０】
ＨＳＶ−２ワクチンは、皮下投与することができる。注射は、典型的には、ワクチンが筋肉ではなく皮下組織に投与されるように皮膚の表面に対して４５度の角度で行われる。
【０１６１】
一部の実施形態では、ＨＳＶ−２ワクチンは皮内投与される。皮内投与は、皮下投与に類似しているが、注射は、それほど深くなく、標的とする皮膚層は、真皮である。注射は、典型的には、ワクチンが表皮のすぐ下側に送達されるように皮膚の表面に対して１０〜１５度の角度で行われる。
【０１６２】
３．製剤
ワクチン製剤は、ヒト患者に投与するのに適し得、ワクチン調製物は、ＵＳＦＤＡのガイドラインに適合し得る。一部の実施形態では、ワクチン製剤は、非ヒト動物に投与するのに適している。一部の実施形態では、ワクチンは、エンドトキシンもエキソトキシンも実質的に含まない。エンドトキシンは、リポ多糖（ＬＰＳ）分子などの発熱物質を含む。ワクチンは、不活性なタンパク質断片も実質的に含み得ない。一部の実施形態では、ワクチンは、工業用水、水道水、または蒸留水よりも低いレベルの発熱物質を有する。他のワクチン成分を、当技術分野で周知の方法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、限外ろ過、または蒸留などで精製することができる。他の実施形態では、発熱物質は、患者に投与する前に不活化または破壊することができる。ワクチンの原料、例えば、水、緩衝剤、塩、および他の化学物質を、スクリーニングして脱発熱化することもできる。ワクチン中のすべての物質を滅菌して、ワクチンの各ロットを滅菌性について試験することができる。したがって、ある実施形態では、ワクチン中のエンドトキシンのレベルが、ＵＳＦＤＡによって規定されたレベル、例えば、くも膜下注入組成物の場合は、製品１ｋｇ当たり０．２エンドトキシン（ＥＵ）、非くも膜下注入組成物の場合は、製品１ｋｇ当たり５ＥＵ、そして滅菌水が１ｍＬ当たり０．２５〜０．５ＥＵよりも低くなる。
【０１６３】
一部の実施形態では、ポリペプチドを含むワクチンは、望ましいポリペプチドの量に対して、５％、２％、１％、０．５％、０．２％、０．１％の他の望ましくない非ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ワクチンは、５％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．２％未満、または０．１％未満のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む。
【０１６４】
ワクチンは、妥当なリスク便益比の範囲内で低い毒性を有するか、または毒性を有していないことが好ましい。
【０１６５】
医薬組成物の導入に適した製剤は、投与経路によって異なる。例えば、関節内（関節の内部）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、鼻腔内、および皮下経路などによる非経口投与に適した製剤には、目的のレシピエントの血液で製剤を等張性にする溶質、酸化防止剤、緩衝剤、および静菌剤を含み得る水性および非水性の等張性滅菌注射液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数回用量の密封容器内に入れて提供することができる。
【０１６６】
注射用の溶液および懸濁液は、既に記載された種類の滅菌された粉末、顆粒、およびタブレットから調製することができる。パッケージ核酸が形質導入された細胞も、静脈内投与または非経口投与することができる。
【０１６７】
経口投与に適した製剤は、（ａ）水、生理食塩水、またはＰＥＧ４００などの希釈液に懸濁された有効量のポリペプチドまたはパッケージ核酸などの液体溶液；（ｂ）液体、固体、顆粒、またはゼラチンとして所定量の活性剤をそれぞれ含むカプセル、小袋、またはタブレット；（ｃ）適切な液体に懸濁された懸濁液；および（ｄ）適切なエマルジョンからなり得る。タブレット形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、トラガカント、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、充填材、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香料、染料、崩壊剤、および薬学的に適合され得るキャリアの１つ以上を含み得る。トローチ形態は、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカントである香料中の活性成分を含み得、同様に芳香錠は、不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアエマルジョン、およびゲルなどの中に活性成分を含み、活性成分に加えて当技術分野で周知のキャリアも含む。医薬組成物は、例えば、リポソーム中に、または活性成分を徐放する製剤中に封入することができる。
【０１６８】
抗原は、単独で、または他の適切な成分と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤（例えば、「噴霧状」にされ得る）にすることができる。エアロゾル製剤は、ジクロロジルオロメタン、プロパン、および窒素などの許容され得る加圧推進剤の中に入れることができる。
【０１６９】
膣または直腸投与に適切な製剤には、例えば、ポリペプチドまたはパッケージ核酸と座薬基剤からなる坐薬が含まれる。適切な座薬基剤には、天然または合成のトリグリセリドまたはパラフィン炭化水素が含まれる。加えて、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレグリコール、およびパラフィン炭化水素を含む基剤とポリペプチドまたはパッケージ核酸の組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルを使用することも可能である。製剤は、ヒト患者に投与するのに適し得、この調製物は、ＵＳＦＤＡガイドラインに適合し得る。一部の実施形態では、製剤は、非ヒト動物に投与するのに適している。一部の実施形態では、組成物は、エンドトキシンもエキソトキシンも実質的に含まない。エンドトキシンは、リポ多糖（ＬＰＳ）分子などの発熱物質を含み得る。組成物は、発熱または他の副作用を引き起こし得る不活性なタンパク質断片も実質的に含み得ない。一部の実施形態では、組成物は、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満、または０．０００１％未満のエンドトキシン、エキソトキシン、および／または不活性なタンパク質断片を含む。一部の実施形態では、組成物は、工業用水、水道水、または蒸留水よりも低いレベルの発熱物質を有する。他の成分を、当技術分野で周知の方法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、限外ろ過、または蒸留などで精製することができる。他の実施形態では、発熱物質は、患者に投与する前に不活化または破壊することができる。組成物の原料、例えば、水、緩衝剤、塩、および他の化学物質を、スクリーニングして脱発熱化することもできる。組成物中のすべての物質を滅菌して、組成物の各ロットを滅菌性について試験することができる。したがって、ある実施形態では、組成物中のエンドトキシンのレベルが、ＵＳＦＤＡによって規定されたレベル：くも膜下注入組成物の場合は、製品１ｋｇ当たり０．２エンドトキシン（ＥＵ）；非くも膜下注入組成物の場合は、製品１ｋｇ当たり５ＥＵ；滅菌水が１ｍＬ当たり０．２５〜０．５ＥＵよりも低くなる。
【０１７０】
ある実施形態では、調製物は、５０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満（乾燥重量で）の汚染タンパク質を含む。ある実施形態では、望ましい分子は、他の生物学的巨大分子、例えば、他のタンパク質（特に、精製された調製物としてまたは対象の再構成混合物中でのその機能に関して成分タンパク質の特徴を実質的に覆い隠す、減弱する、あいまいにする、または変更することができる他のタンパク質）などが実質的に存在しない中で存在する。ある実施形態では、同じ種類の生物学的巨大分子の少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．８％（乾燥重量で）存在する（しかしながら、水、緩衝剤、および他の小分子、特に分子量が５，０００未満の分子も存在し得る）。
【０１７１】
組成物は、妥当なリスク便益比の範囲内の低い毒性を有するか、毒性を有していないのが好ましい。ある実施形態では、組成物は、組成物で処置された動物のＬＤ５０測定値未満の濃度で成分を含む。ＬＤ５０測定値は、マウスまたは他の実験動物系で得て、ヒトおよび他の動物に対して推定することができる。ヒトおよび他の動物における化合物のＬＤ５０を推定する方法は、当技術分野で周知である。組成物および組成物中のどの成分も、１００ｇ／ｋｇを超える、５０ｇ／ｋｇを超える、２０ｇ／ｋｇを超える、１０ｇ／ｋｇを超える、５ｇ／ｋｇを超える、２ｇ／ｋｇを超える、１ｇ／ｋｇを超える、５００ｍｇ／ｋｇを超える、２００ｍｇ／ｋｇを超える、１００ｍｇ／ｋｇを超える、５０ｍｇ／ｋｇを超える、２０ｍｇ／ｋｇを超える、または１０ｍｇ／ｋｇを超えるラットでのＬＤ５０値を有し得る。一部の実施形態では、組成物の治療指数（集団の５０％にとって中毒である量（ＴＤ５０）を集団の５０％にとって有効な最少量（ＥＤ５０）で除して得る）は、１よりも大きい、１０よりも大きい、または１００よりも大きい。
【０１７２】
Ｉ．ワクチン製剤および免疫原性組成物の調製および貯蔵
本明細書に記載されるＨＳＶ−２ワクチンは、様々な技術を用いて生産することができる。例えば、ポリペプチドを、組換えＤＮＡ技術を用いて適切な宿主細胞で産生させることができる。適切な宿主細胞は、細菌、酵母、哺乳動物、または他の種類の細胞とすることができる。宿主細胞は、関連ポリペプチド遺伝子の１つの外来性コピーを発現するように改変することができる。典型的には、遺伝子は、強いプロモーターおよびポリアデニル化配列などの適切な制御配列に機能的に連結される。一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性または抑制性である。他の制御配列は、ポリペプチドをどのように精製したいかによって、細胞質または膜における目的のポリペプチドの分泌もしくは排出または目的のポリペプチドの保持を行うことができる。遺伝子は、染色体外プラスミドに存在しても良いし、または宿主ゲノムに組み込まれても良い。当業者であれば、天然配列と１００％同一の核酸を使用する必要はないことを理解できよう。むしろ、これらの配列に対するある程度の改変は許容され、望ましい場合もある。例えば、核酸を変更して、コードされたポリペプチドが同じままであるように遺伝子コードの縮重を利用することができる。一部の実施形態では、遺伝子は、特定の宿主における発現を改善するためにコドンが最適化される。核酸は、例えば、ＰＣＲまたは化学合成によって作製することができる。
【０１７３】
組換え細胞系が作製されたら、ポリペプチドを組換え細胞系から単離することができる。この単離は、例えば、親和性精製技術または物理的分離技術（例えば、サイズカラム）によって行うことができる。
【０１７４】
本開示のさらなる態様では、１つ以上のポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくは変異体をキャリアおよび／またはアジュバントと混合するステップを含む製造方法が提供される。一部の実施形態では、アジュバントは、ＴＨ１細胞応答を刺激するアジュバントである。
【０１７５】
一部の実施形態では、本発明の組成物に含める抗原を、細胞培養で生産することができる。１つの方法は、１つ以上の哺乳動物発現ベクターを用意するステップ、配列番号１〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドから選択される２つ以上のポリペプチドをコードするヌクレオチドをクローニングするステップ、次いでこのポリペプチドを発現させて単離するステップを含む。
【０１７６】
本明細書に記載される免疫原性ポリペプチド、およびこのポリペプチドを発現する核酸組成物を、核酸組成物を哺乳動物に投与するためのパック、ディスペンサー装置、およびキットにパッケージングすることができる。例えば、１つ以上の単位剤形を含むパックまたはディスペンサー装置が提供される。典型的には、化合物の投与の取扱説明書がパッケージングに設けられると共に、本明細書に開示されている状態などの示された状態の処置に化合物が適しているという適切な表示がラベルに設けられる。
【実施例】
【０１７７】
Ｖ．実施例
実施例１、ＨＳＶ−２抗原の同定
ＨＳＶ−２抗原のライブラリー（ＨＳＶ−２  Ｓｔｒａｉｎ  Ｇ、ロット番号７Ｃ００１３、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用意し、ヒトドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）でスクリーニングした。簡単に述べると、ＨＳＶ抗原のライブラリーを細菌によって発現させ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と混合した。次いで、ＡＰＣが、ＨＳＶ−２に感染したヒト患者から単離されたリンパ球にＨＳＶ由来ペプチドを提示した。患者は、後述されるように、いくつかの集団に属した。各集団からのリンパ球の応答を、発現された各タンパク質に対する反応性について比較し、スクリーニングにより、他の患者集団と比較してある患者集団でより頻繁に反応性リンパ球を誘導した抗原を検出した。感染したが無症状の患者および曝露されても血清陰性の患者は、頻繁に発症した患者が活性化しない防御免疫応答を活性化することができる；特に、曝露されたが血清陰性の患者は、ＨＳＶ−２感染に対して殺菌免疫を開始したと推測される。ポリペプチドの固有のセットが、これらの患者集団からのリンパ球を活性化させると考えられる。
【０１７８】
各集団に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γの放出を、候補抗原に対する曝露の後にＥＬＩＳＡによって測定した。抗原を、１年に５回以上発症した高頻度再発者によって放出されたＩＦＮ−γのレベルに対する、放出されたＩＦＮ−γの増加倍率に基づいて選択した。
【０１７９】
Ａ．ＵＬ１０、ＵＬ１９、ＵＬ４０、ＵＳ４、ＵＳ６、ＲＳ１（ＲＳ１．１、ＲＳ１．２、ＲＳ１．３）、ＵＬ３６（ＵＬ３６．３、ＵＬ３６．４、ＵＬ３６．５）、ＵＬ３２、およびＲＬ２によってコードされる抗原の同定
リンパ球を、いくつかの集団：無症状（ｎ＝４０）、曝露（ｎ＝４０）、１年に４回以上発症した高頻度再発者（ｎ＝４３）、１年に４回未満しか発症しない低頻度再発者（ｎ＝１９）、未感作（ｎ＝１０）、およびＨＳＶ−２−／ＨＳＶ−１＋（ｎ＝１０）に属する患者から単離した。表３は、１年に２回以上の再発者と比較した、曝露された患者コホートにおけるＵＬ１０、ＵＬ１９、ＵＬ４０、ＵＳ４、ＵＳ６、ＲＳ１（ＲＳ１．１、ＲＳ１．２、ＲＳ１．３）、ＵＬ３６（ＵＬ３６．３、ＵＬ３６．４、ＵＬ３６．５）、ＵＬ３２、およびＲＬ２によってコードされる１３のＨＳＶ−２抗原についての頻度分析を示す。
【０１８０】
【表３】
2015178529.tif 000014
Ｂ．ＵＬ１、ＵＬ４９．５、およびＵＬ５４によってコードされる抗原の同定
リンパ球を、いくつかの集団：無症状（ｎ＝４０）、曝露（ｎ＝４０）、１年に４回以上発症した高頻度再発者（ｎ＝４３）、１年に４回未満しか発症しない低頻度再発者（ｎ＝１９）、未感作（ｎ＝１０）、およびＨＳＶ−２−／ＨＳＶ−１＋（ｎ＝１０）に属する患者から単離した。
【０１８１】
表４は、１年に２回以上の再発者と比較した、曝露された患者コホートにおけるＵＬ１、ＵＬ４９．５、およびＵＬ５４によってコードされる３つのＨＳＶ−２抗原についての頻度分析を示す。
【０１８２】
【表４】
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Ｃ．ＲＬ１、ＵＩ１、およびＵＬ１１によってコードされる抗原の同定
リンパ球を、いくつかの集団：無症状（ｎ＝４０）、曝露（ｎ＝４０）、１年に４回以上発症した高頻度再発者（ｎ＝４３）、１年に４回未満しか発症しない低頻度再発者（ｎ＝１９）、未感作（ｎ＝１０）、およびＨＳＶ−２−／ＨＳＶ−１＋（ｎ＝１０）に属する患者から単離した。
【０１８３】
表５は、１年に２回以上の再発者と比較した、曝露された患者コホートにおけるＲＬ１、ＵＩ１、およびＵＬ１１によってコードされる３つのＨＳＶ−２抗原についての頻度分析を示す。
【０１８４】
【表５】
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実施例２．ｉｎ  ｖｉｖｏでのデータ
Ａ．［プロトコルＡ］モルモット治療ワクチン接種プロトコル
雌ハートレイ系モルモットに、生殖器感染を確立するために５×１０５ｐｆｕでＨＳＶ−２株ＭＳを経膣的に曝露した。動物を、感染後第１日目に膣用スワブによって感染を監視し、感染後第３日目〜第１４日目に急性疾患を観察した。第１４日目に、原発性疾患の回復後、動物を１２の群に無作為に分け、抗原（１５μｇの用量のＨＳＶ−２ポリペプチド）とアジュバント（５０μｇの用量のＩＳＣＯＭマトリックスとＱｕｉｌｌａｊａサポニン画分ＡとＣが９１：９の混合物）を用いて皮下免疫した。各群に、感染後第１４日目、第２１日目、および第３４日目に合計３回のワクチン接種を行った。生殖器用スワブをワクチン接種期間中に回収して、ウイルス排出を監視し、観察結果を毎日記録した。症状を、重症度に基づいた０〜４のスコア：０＝無症状、１＝赤みまたは腫れ、２＝少数の小水疱、３＝いくつかの大きな小水泡、４＝浸軟を伴ういくつかの大きな小水泡、でスコアを付けた。加えて、症状が上記のスコア間の中間の病変をもつ動物には、０．５、１．５、２．５、または３．５のスコアを付けた。
【０１８５】
１．ＩＣＰ４．２、ｇＤ２ΔＴＭＲ、およびｇＤ２を用いた治療ワクチン接種研究の結果
研究の結果が、以下の表６〜表１０に示されている。ＩｇＧ力価を、各群の１２匹の動物のうちの４匹の平均を用いて、感染後第４１日目および第３の免疫化の７日後に決定した。平均再発病変スコアおよび平均病変日数をそれぞれ、感染後第１５日目〜第６３日目に決定した。病変スコアは、第１５日目〜第６０日目の各群に対する合計病変数を表し、平均を計算した。平均病変日数は、免疫化または非免疫化動物にヘルペス性病変が現れるまでの感染してからの平均日数である。膣用スワブサンプルを、感染後第２０日目〜第５９日目の間の１２日間にすべての動物から回収し、量的リアルタイムＰＣＲによるウイルス排出力価についてのアッセイまで−８０℃で保存した。
【０１８６】
【表６】
2015178529.tif 000017
【０１８７】
【表７】
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【０１８８】
【表８】
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【０１８９】
【表９】
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【０１９０】
【表１０】
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Ｂ．［プロトコルＢ］マウスの予防ワクチン接種のプロトコル
第０日目および第９日目に、６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、抗原（ＨＳＶ−２ポリペプチド）とアジュバント（１２μｇの用量のＩＳＣＯＭマトリックスとＱｕｉｌｌａｊａサポニン画分ＡとＣが８２：１８の混合物）を用いて皮下免疫した。第１１日目に、発情周期をデポプロベラと同期させ、次いで第１６日目に、マウスに、麻酔下でＬＤ５０値の１０倍量のＨＳＶ−２株３３３を膣内沈着により曝露した。すべての動物を、罹患率（臨床スコア）、死亡率、および体重について監視し、膣用スワブを感染後第１７日目〜第２８日目の間に回収した。臨床スコアを、次のスコア：０＝無症状、１＝膣の紅斑、２＝膣の紅斑および浮腫、３＝膣のヘルペス性病変、４＝片側性麻痺または重度の陰部潰瘍、および５＝両側性麻痺または死亡、を用いて記録した。
【０１９１】
１．ＩＣＰ４．２、ＶＰ５、ｇＤ２ΔＴＭＲ、およびｇＤ２ΔＴＭＲとＩＣＰ４．２を用いたマウスの予防ワクチン接種の研究結果
実験群では、第０日目および第９日目に、マウスを、５μｇまたは１０μｇの抗原とアジュバント（１２μｇの用量のＩＳＣＯＭマトリックスとＱｕｉｌｌａｊａサポニン画分ＡとＣが８２：１８の混合物）を用いて皮下免疫した。コントロール動物に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のみまたはアジュバントのみを投与した。
【０１９２】
ＰＢＳのみまたはアジュバントのみが投与されたマウスはすべて、曝露後第９日目までに死亡した（生存マウス無し）。対照的に、抗原が投与されたマウスは、多くが第９日目まで生存し、２０〜７５％が曝露後第１２日目までに生存した。疾患（生殖器疾患および神経疾患）の症状の重症度にも、曝露後第９日目または第１０日目にスコアを付けた。ＩＣＰ４．２、ＶＰ５、ｇＤ２ΔＴＭＲ、またはｇＤ２ΔＴＭＲとＩＣＰ４．２に加えてＩＳＣＯＭアジュバントで免疫化したマウスは、ＰＢＳのみまたはアジュバントのみの群と比較して疾患の症状の有意な低減を示した。
【０１９３】
【表１１】
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Ｃ．［プロトコルＣ］モルモットの予防ワクチン接種のプロトコル
２５０〜３５０ｇ（体重）の雌ハートレイ系モルモットに、第０日目および第１４日目〜第２１日目に、１５μｇの抗原とアジュバント（５０μｇの用量のＩＳＣＯＭマトリックスとＱｕｉｌｌａｊａサポニン画分ＡとＣが９１：９の混合物）を用いて皮下免疫した。ブーストワクチン接種の２〜３週間後に足の爪クリップで血清を採取し、次いでモルモットに、膣沈着により５×１０５ＰＦＵのＨＳＶ−２株ＭＳを曝露した。膣用スワブサンプルを、第３０日目および第３２日目にすべての動物から回収し、量的リアルタイムＰＣＲによるウイルス力価についてのアッセイまで−８０℃で保存した。モルモットは、毎日（第１日目〜第１４日目）評価し、原発性性器皮膚疾患を、１〜４の病変重症度スコアで表した。数字スコアを、次の通り特定の疾患症状に割り当てた：０、無疾患；１、赤みまたは腫れ；２、少数の小水疱；３、いくつかの大きな水泡；４、浸軟を伴ういくつかの大きな水泡。研究の最後で、モルモットを安楽死させ、後根神経節（ＤＲＧ）を採取し、量的リアルタイムＰＣＲ分析のための処理まで−８０℃で保存した。
【０１９４】
【表１２】
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Ｄ．［プロトコルＤ］免疫原性アッセイＩ（標準）
マウスを、生理食塩水に溶解した５μｇの抗原とアジュバント（１２μｇの用量のＩＳＣＯＭマトリックスとＱｕｉｌｌａｊａサポニン画分ＡとＣが８２：１８の混合物）を１００μｌ、首根に注射して皮下免疫した。マウスに、１回または２回（７日間空けて）注射した。注射の免疫原性の分析を、最後の注射から７日後に行った。
【０１９５】
免疫原性アッセイを、ｅｘ  ｖｉｖｏでＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴで行った。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を脾臓から濃縮し、別個に分析した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために、膜プレートを捕捉抗体で一晩コーティングし、続いて３７℃で少なくとも２時間、添加培地でブロッキングして、膜プレートを用意した。マウスを安楽死させ、マウスの脾臓を回収した。次いで、Ｔ細胞を、磁気ビーズを用いてＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を脾細胞から選別することによって用意した。ブロッキング溶液を、ＥＬＩＳＰＯＴプレートから洗い流して、Ｔ細胞を、ブロッキングされたプレートに播種した。プレートをインキュベーターに戻して、Ｔ細胞を落ち着かせた。ＡＰＣを、未感作Ｔ枯渇脾細胞を３７℃で２時間、抗原でパルス処理することによって用意した。ＣＤ４＋ＥＬＩＳＰＯＴの場合は、ＡＰＣを全タンパク質でパルス処理した。ＣＤ８＋ＥＬＩＳＰＯＴの場合は、ＡＰＣを、タンパク質を発現する大腸菌とｃＬＬＯでパルス処理した。培地コントロールを、抗原を追加しないで３７℃２時間、ＡＰＣと共にインキュベートした。パルス処理されたＡＰＣを放射線照射し、洗浄し、２×１０６細胞／ｍｌに調整した。ＡＰＣを、Ｔ細胞を含むプレートの適切ウェルに添加した。次いで、ホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシンを、陽性コントロールとしてコントロールウェルに添加した。プレートを、５％ＣＯ２下、３７℃で１８時間インキュベートした。次いで、二次ビオチン化抗体、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、および３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）基質を用いてプレートを展開した。
【０１９６】
１．ＩＣＰ４．２を用いた免疫原性アッセイＩの結果
免疫原性アッセイＩは、ＩＣＰ４．２を用いた１回および２回の注射療法の両方で強い免疫原性応答を示した。１回の注射療法の場合は、２００，０００のＴ細胞当たりのＩＦＮ−γスポットの数は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞のそれぞれで８および１０１であった。２回の注射療法の場合は、スポットの数がそれぞれ５０および７０であった。対照的に、１５未満のスポットが、培地またはアジュバントのみで、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞で観察された。
【０１９７】
２．ｇＤ２ΔＴＭＲおよびｇＤ２を用いた免疫原性アッセイＩの結果
免疫原性アッセイＩの結果が、図１Ａおよび図１Ｂに示されている。強いＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、完全長ｇＤ２およびｇＤ２ΔＴＭＲの両方で得られた。対照的に、膜貫通ドメイン（図１に３０６ｔとして示されている）のすぐ上流で切断されたｇＤ２抗原は、有意に低い応答を示した。
【０１９８】
Ｅ．［プロトコルＥ］免疫原性アッセイＩＩ（迅速）
ＨＳＶ−２  ｏｒｆｅｏｍｅのＧｅｎｏｃｅａ所有のライブラリーからの組換え大腸菌を、ｇＬ２またはＩＣＰ４タンパク質の断片（ＩＣＰ４．２、ならびにＲＳ１．１、ＲＳ１．３．１、およびＲＳ１．３．２によってコードされるポリペプチド）を発現するように作製した。タンパク質は、細菌細胞内で維持される。次いで、細菌をＰＦＡで固定し、ＰＢＳで広範囲に洗浄し、免疫化に使用するまで−８０℃で保存した。
【０１９９】
１群に付き３匹のマウスを、腹腔内注射によって、１マウス当たり１×１０８のＰＢＳに溶解した細菌で免疫化した。マウスに、１週間の間隔で１〜２回の追加免疫を行った。最後の追加免疫から７日後に、血清を採取し、ＨＳＶ−２中和アッセイで分析した。９６ウェル丸底プレートの血漿または血清サンプルに対し５倍の連続希釈液を行い、次いで各ウェルに５０ＰＦＵ  ＨＳＶ−２（株３３３）を添加した。プレートを覆い、３７℃で１時間インキュベートした。２００μｌのウイルス血清希釈液を、４８ウェル組織培養プレートで増殖されたベロ細胞の２つのウェルに入れ、３７℃１時間インキュベートした。３００μｌの２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを各ウェルに添加し、プレートを３７℃４８時間インキュベートした。ウイルスプラークを視覚化するために、プレートをクリスタルバイオレットで染色した。
【０２００】
【表１３】
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Ｆ．［プロトコルＦ］免疫原性アッセイＩＩＩ（重複ペプチドのプール）
マウスを、ｇＬ２、ＩＣＰ４、ならびにＲＳ１．３．１およびＲＳ１．３．２によってコードされるＩＣＰ４断片の全配列に跨る重複ペプチドのプール（ＯＬＰ）を２μｇ／マウスで免疫化した。ＯＬＰは、１マウス当たり１００μｌの総量にＴｉｔｅｒＭａｘアジュバント（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）と配合し、アジュバントは、皮下投与量の１／３を占めた。マウスを、第０日目に免疫化し、第６日目に追加免疫し、脾臓および血液を第１１日目に採取した。１つの細胞懸濁液を脾臓から調製し、赤血球を溶解した。次いで、脾細胞懸濁液を半分に分けた。初めの半分を、抗原提示細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞に分け；ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴプレートの１ウェルに付き２００，０００のＴ細胞を播種し、１００，０００のＡＰＣと、免疫化、無関係のペプチド、陽性コントロール、および陰性コントロールに対応するＯＬＰプールとで刺激した。細胞を、プレートで一晩インキュベートしてから、プレートを展開し、ウェルごとにスポットをカウントした。各脾細胞懸濁液の次の半分を、分けられていない脾細胞（４００，０００／ウェル）として行い、ペプチドでパルス処理し、上記のようにアッセイした。
【０２０１】
結果は、免疫化群ごとの応答の大きさとして図２Ａおよび図２Ｂに示されている。
【０２０２】
Ｇ．［プロトコルＧ］少なくとも２つの抗原を用いたワクチン接種
実施例１．Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｇＤ２ΔＴＭＲおよびＩＣＰ４またはＩＣＰ４．２の免疫原性
精製タンパク質をアジュバントと混合し、未感作マウスを免疫化して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をタンパク質抗原に対して応答させる能力を評価した。簡単に述べると、抗原のみ（ｇＤ２ΔＴＭＲ（５μｇ））または抗原の組み合わせ（ｇＤ２ΔＴＭＲおよびＩＣＰ４．２（１０μｇ））をアジュバント（１２μｇの用量のＩＳＣＯＭマトリックスとＱｕｉｌｌａｊａサポニン画分ＡとＣが８２：１８の混合物）と混合し、９日間の間隔で２回、マウスに皮下投与した。第２の免疫化から７日後に、マウスを安楽死させ、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために脾臓を回収した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗体被覆磁気ビーズを用いて脾細胞集団から選別し、次いで、特異的または非特異的抗原（上記）でパルス処理されてＸ線照射器でＸ線照射された未感作脾細胞と共に、９６ウェルプレート内のＩＦＮγ特異的抗体被覆膜上で共培養した。インキュベーションから１８時間後に、捕捉したＩＦＮγをビオチン化二次ＩＦＮγ特異的抗体で検出し、西洋わさびペルオキシダーゼおよび３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質で可視化した。データは、各群に付き３匹のマウスの、２×１０５のＴ細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成単位数±標準偏差として記録した。図３は、各群に付き３匹のマウスの、２×１０５のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成単位数±標準偏差を示す。図３Ａおよび図３Ｂに示されているように、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成単位数は、ｇＤ２ΔＴＭＲ抗原のみと比較すると、ＩＣＰ４．２と組み合わせたｇＤ２ΔＴＭＲ抗原で免疫化されたマウスで増加した。
【０２０３】
実施例２．ｇＤ２およびＩＣＰ４．２の組み合わせとアジュバントでの免疫化によるマウスにおける疾患の症状および死亡率の低減
ｇＤ２と組み合わせたＩＣＰ４．２タンパク質とアジュバントでの免疫化後に防御免疫を引き起こす能力を、致死ＨＳＶ−２曝露マウスモデルで評価した。簡単に述べると、１群に付き８匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ｇＤ２（２μｇ）またはＩＣＰ４．２（１０μｇ）とアジュバントで個々に、または両方の抗原を互いに混合したものとアジュバントで免疫化した。製剤を、９日の間隔で２回、首根に皮下投与した。ウイルス感染の５日前に発情周期をデポプロベラと同期させ、二次免疫化の７日後に動物に、ＬＤ５０値の２０倍量のＨＳＶ−２株３３３を経膣的に曝露した。疾患の症状を、感染後にスコアを付け、生存動物を監視した。疾患の重症度のスコアは、次の通りとした：０＝無症状、１＝赤み、２＝赤みおよび腫れ、３＝ヘルペス性病変、４＝重度の潰瘍または片側性麻痺、および５＝両側性麻痺または死亡。
【０２０４】
【表１４】
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実施例３．ｇＤ２ΔＴＭＲとＩＣＰ４．２の組み合わせとアジュバントの免疫化によるマウスにおける疾患の症状および死亡率の低減
ｇＤ２ΔＴＭＲとＩＣＰ４．２抗原の組み合わせでのマウスの免疫化は、個々の抗原とアジュバントが曝露された動物と比較して、ウイルス曝露から１０日後の平均疾患スコアが低いことを示した。
【０２０５】
【表１５】
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実施例４．ｇＤ２とＩＣＰ４．２の組み合わせとアジュバントでの免疫化による、ＨＳＶ−２感染モルモットに治療として投与したときの再発病変の重症度の軽減
抗原とアジュバントでの治療免疫後の感染モルモットでＨＳＶ−２を再活性化する能力を評価した。簡単に述べると、モルモットを、５×１０５ｐｆｕのＨＳＶ−２株ＭＳで経膣的に感染させ、１４日間にわたって原発性疾患を監視し、次いで無作為に免疫化群（ｎ＝１５）に分けた。動物を、抗原（１５μｇ）とアジュバント（５０μｇ）またはアジュバントのみ、または賦形剤コントロールでの感染後第１４日目、第２１日目、および第３５日目の３回、皮下免疫し、局所疾患の重症度について毎日スコアを付けた。スコア付けの方法は、次の通りとした：０＝無症状、１＝赤み、２＝１つの病変、３＝大きい病変または融合病変、４＝重度の潰瘍または片側性麻痺、および５＝両側性麻痺または死亡。
【０２０６】
表１６は、モルモットが急性疾患から回復した後の各週の平均再発病変スコアとしてデータを示している。ｇＤ２およびＩＣＰ４．２抗原の組み合わせで処置されたモルモットは、個々の抗原とアジュバントに曝露された動物と比較して、最後の免疫化から７日目（第４２日目）および１４日目（第４９日目）の平均病変スコアが低いことを示した。
【０２０７】
【表１６】
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【０２０８】
【化８】
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【０２０９】
【化９】
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【０２１０】
【化１０】
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【０２１１】
【化１１】
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【０２１２】
【化１２】
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【０２１３】
【化１３】
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【０２１４】
【化１４】
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【０２１５】
【化１５】
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【０２１６】
【化１６】
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【０２１７】
【化１７】
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【０２１８】
【化１８】
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【０２１９】
【化１９】
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【０２２０】
【化２０】
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【０２２１】
【化２１】
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【０２２２】
【化２２】
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【０２２３】
【化２３】
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【０２２４】
【化２４】
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【０２２５】
【化２５】
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【０２２６】
【化２６】
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【０２２７】
【化２７】
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【０２２８】
【化２８】
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【０２２９】
【化２９】
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【０２３０】
【化３０】
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【０２３１】
【化３１】
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【０２３２】
【化３２】
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【０２３３】
【化３３】
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【０２３４】
【化３４】
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【０２３５】
【化３５】
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【０２３６】
【化３６】
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【０２３７】
【化３７】
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【０２３８】
【化３８】
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【０２３９】
【化３９】
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【０２４０】
【化４０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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