(57)【要約】【課題】微細藻類の培養工程から回収工程、オイル抽出工程までの工程で必要とされるコスト、及び投入するエネルギーを下げること。【解決手段】微細藻類を担持した刺激応答性ポリマーを用いてオイル蓄積工程を含む培養を行い、刺激応答環境にて、微細藻類担持刺激応答性ポリマーの体積収縮と共にオイルを放出させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺激応答性ポリマーで形成された構造体内に担持されたオイル産生微細藻類を、オイル生産上有効な第一の条件で培養して構造体内にオイルを蓄積させる工程；
オイルが蓄積された構造体を、微細藻類非障害性であり、かつポリマーが応答して収縮する第二の条件で処理して構造体体積を減少させ、それにより構造体外にオイルを放出させる工程
を含む、オイルの製造方法。
【請求項２】
オイルを放出させた後の構造体を、再び第一の条件及び第二の条件で順に処理する工程を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
構造体外にオイルを放出させる工程が、オイルが蓄積された構造体を回収し、回収した構造体を第二の条件に曝すものである、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
オイルを蓄積させる工程が培養器内で行われ、構造体外にオイルを放出させる工程が、構造体を含む培養器内を第二の条件とするものである、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項５】
油膜状又は油滴状である放出されたオイルを回収する工程を含む、請求項１〜４のいずれか一に記載の製造方法。
【請求項６】
刺激応答性ポリマーが、温度に応答するものである、請求項１〜５のいずれか一に記載の製造方法。
【請求項７】
構造体が、粒子状であることを特徴とする、請求項１〜６に記載の製造方法。
【請求項８】
刺激応答性ポリマーの構造が、架橋構造を有していることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一に記載の製造方法。
【請求項９】
微細藻類が、細胞内又は細胞近傍の少なくとも一方にオイルを蓄積するものである、請求項１〜８のいずれか一に記載の製造方法。
【請求項１０】
微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ属、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ属、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ属、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ属、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ属、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ属、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｅｕｇｌｅｎａ属、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ属、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｏｓ属、又はＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属する微細藻類から選ばれるいずれかである、請求項１〜９のいずれか一に記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一に記載された製造方法を含み、得られたオイルを処理する工程を含む、バイオ燃料の製造方法。
【請求項１２】
刺激応答性ポリマーで形成された構造体内に担持されたオイル産生微細藻類。
【請求項１３】
微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ属、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ属、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ属、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ属、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ属、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ属、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｅｕｇｌｅｎａ属、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ属、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｏｓ属、又はＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属する微細藻類から選ばれるいずれかである、請求項１２に記載の微細藻類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オイル産生藻類からのオイルの蓄積及び回収方法に関する。より詳細には、本発明は、刺激応答性ポリマーの網目構造の中に微細藻類を担持させ、微細藻類の細胞内又は細胞近傍の少なくとも一方にオイル蓄積を行った後、刺激応答による構造体の体積収縮を利用し、放出させたオイルを回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、植物由来のバイオ燃料と比べて、面積あたりの燃料生産性が高いこと、食料由来の穀物などと競合しないことなどから、微細藻類を用いたバイオ燃料の開発が盛んに行われている（非特許文献１）。
しかし、これまでに微細藻類由来の燃料を商業規模で生産した例はない。この理由は主として、微細藻類由来の燃料生産が非常に高コストであるからである。この高コストの原因は、微細藻類の小ささに由来する回収の困難さ、回収物中の水分の多さに由来する乾燥工程に投じるエネルギー量の多さ（非特許文献２）、オイル抽出工程で低コスト抽出法がないことが主な原因である。
【０００３】
微細藻類のボツリオコッカス（特許文献１）などは、細胞内又は細胞近傍の少なくとも一方にオイルを蓄積する。顕微鏡下、スライドガラス上に藻体含有溶液を滴下し、カバーガラスでこれを被覆することで、時間の経過と共に、細胞内又は細胞近傍の少なくとも一方に蓄積しているオイルを放出することが知られている（非特許文献３）。また、圧力を加えて、オイルを抽出する方法も知られている（非特許文献１）。
【０００４】
一方、刺激応答性ポリマー（刺激応答性高分子を含む）は、温度、ｐＨ、光などの様々な刺激によって、体積などが変化する素材である。刺激応答性ポリマーは、細胞シート（特許文献２）、ドラッグデリバリー素材、クロマトグラフィー（特許文献３）などに用いられ、工業的にも重要な素材である。
また、温度応答性ポリマーの膜で形成された領域にオイルを分解する藻類などを保持したオイルなどの分解用装置が公開されている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平７−２６５０５９公報
【特許文献２】再表２００６−０９３１５１公報
【特許文献３】特開平０７−３１８５５１公報
【特許文献４】特開２００８−５５２８６公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】National Conference on Innovative Paradigms in Engineering & Technology (NCIPET-2012), Proceedings published by International Journal of Computer Applications (IJCA), p.7
【非特許文献２】松本光史ら、第６２回日本生物工学会大会（２０１０）  トピックス集  ｐ３３
【非特許文献３】藻類 Jpn. J. Phycol. (Sorui) 59: 159-162, November 10, 2011
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、微細藻類の培養工程から回収工程と、オイル抽出工程で必要とされるコスト、及び投入エネルギー量を下げることにある。従来、微細藻類の培養は、小さな微細藻類を分散させながら培養していたが、これらを回収するためには、凝集剤を用いたり、遠心分離機を用いて回収する方法が行われていた。しかし、凝集剤を用いる場合には、凝集剤のコスト、投入の手間など様々な問題点があった。また、遠心分離機を用いたとしても、装置の導入コスト、運転のためのエネルギーが必要であった。本発明では、これらの方法を用いずに、低コストで微細藻類を培養し、回収し、オイルを抽出する方法を提供することを課題としている。
【０００８】
また、従来法は、回収した藻体の含水率が高く、膨大な乾燥エネルギーを必要としていた。本発明では、含水率に関する概念を取り除く方法を提供することも課題としている。
【０００９】
また、従来の方法では、乾燥藻体からオイルを抽出するためには、硬い細胞壁を持った微細藻類を多量のエネルギーを用いて破砕し、藻体外に放出されたオイル状物質をヘキサンやクロロホルムなどの有機溶媒を用いて抽出する操作が行われていた。本発明では、細胞を破砕する工程そのものを取り除くこと、可能であれば、有機溶剤による抽出操作を取り除くことも課題としている。
【００１０】
また、従来の方法では、微細藻類の培養において、種藻を培養し、ある程度培養が進行した後、途中でオイル蓄積を行うための培地置換などの工程を経由した後、十分にオイルを蓄積した微細藻類を収穫（回収）し、再び、種藻を用いて最初から培養を繰り返す工程を行っていた。本発明では、最初の一回目の培養を除き、種藻を使用せず、また、基本的には増殖工程も経由せず、オイル蓄積工程のみで培養工程を構成することによって、培養期間の大幅な短縮と、培養コストの大幅な削減とを同時に満足させることも課題としている。
【００１１】
また、従来の培養方法では、培養途中で目的外の微生物の存在により栄養成分が消費され、培養効率が低下したり、微細藻類そのものを捕食する微生物や小動物の混入により、目的の微細藻類の量が減少する問題点があった。本発明では、この様な問題点を解決することも課題としている。また、目的外微生物が混入したとしても、容易に除去できる培養方法を提供することも課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記の課題を達成するために鋭意検討した結果、刺激応答性ポリマーが形成するゲルの中に微細藻類を封じ込めた状態で培養を行い、オイルを蓄積させ、十分にオイルを蓄積した時点で外部環境を変化させることで、刺激応答性ポリマーの体積を収縮させ、その圧力変化により微細藻類からオイルを放出させ、その後、外部環境を元に戻すことで、刺激応答性ポリマーの体積を元に戻し、再度、オイル蓄積工程から培養を繰り返すことを可能とすることで、効率的にオイル生産を行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は上述の課題を解決するための知見に基づいて完成したものであり、以下の構成を有する。
[１]  刺激応答性ポリマーで形成された構造体内に担持されたオイル産生微細藻類を、オイル生産上有効な第一の条件で培養して構造体内にオイルを蓄積させる工程；
オイルが蓄積された構造体を、微細藻類非障害性であり、かつポリマーが応答して収縮する第二の条件で処理して構造体体積を減少させ、それにより構造体外にオイルを放出させる工程
を含む、微細藻類オイルの製造方法。
[２]  オイルを放出させた後の構造体を、再び第一の条件及び第二の条件で順に処理する工程を含む、[１]に記載の製造方法。
[３]  構造体外にオイルを放出させる工程が、オイルが蓄積された構造体を回収し、回収した構造体を第二の条件に曝すものである、[１]又は[２]に記載の製造方法。
[４]  オイルを蓄積させる工程が培養器内で行われ、構造体外にオイルを放出させる工程が、構造体を含む培養器内を第二の条件とするものである、[１]又は[２]に記載の製造方法。
[５]  油膜状又は油滴状である放出されたオイルを回収する工程を含む、[１]〜[４]のいずれか一に記載の製造方法。
[６]  刺激応答性ポリマーが、温度に応答するものである、[１]〜[５]のいずれか一に記載の製造方法。
[７]  構造体が、粒子状であることを特徴とする、[１]〜[６]に記載の製造方法。
[８]  刺激応答性ポリマーの構造が、架橋構造を有していることを特徴とする、[１]〜[７]のいずれか一に記載の製造方法。
[９]  微細藻類が、細胞内又は細胞近傍の少なくとも一方にオイルを蓄積するものである、[１]〜[８]のいずれか一に記載の製造方法。
[１０]  微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ属、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ属、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ属、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ属、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ属、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ属、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｅｕｇｌｅｎａ属、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ属、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｏｓ属、又はＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属する微細藻類から選ばれるいずれかである、[１]〜[９]のいずれか一に記載の製造方法。
[１１]   [１]〜[１０]のいずれか一に記載された製造方法を含み、得られたオイルを処理する工程を含む、バイオ燃料の製造方法。
[１２]  刺激応答性ポリマーで形成された構造体内に担持されたオイル産生微細藻類。
[１３]  微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ属、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ属、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ属、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ属、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ属、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ属、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｅｕｇｌｅｎａ属、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ属、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｏｓ属、又はＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属する微細藻類から選ばれるいずれかである、[１２]に記載の微細藻類。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法を用いることによって、複数個の微細藻類を刺激応答性ポリマー構造体の中に閉じ込め、その構造体を回収対象としていることから、微細藻類単独のときよりも回収効率を大幅に向上させることができる。また、刺激応答性高分子を回収せずに、その培養器内で体積変化を誘導し、微細藻類内又は微細藻類近傍の少なくとも一方に蓄積したオイルを放出させることもできる。従って、微細藻類を凝集するための凝集剤や遠心分離機は不要であるから、低コストかつ投入エネルギーが少ない培養法となる。また、オイル蓄積のためやコンタミ微生物の除去、微細藻類の生命の維持に必要な新鮮な栄養素を含む培地への交換、及び微細藻類の生命の維持に悪影響を及ぼす微細藻類自身によって放出された物質などを除去するための培地の置換を、容易に行うことができる。
本発明の方法では、刺激応答性ポリマーが形成するネットワーク構造の中に微細藻類を封じ込め、体積収縮作用によってオイルを抽出するため、回収した藻体を乾燥するための工程を行わずにオイルを回収することができる。従って、回収した藻体の含水率については考慮しなくてもよい。これらのことから、本発明の方法を用いることにより、オイルの抽出が、低コストかつ投入エネルギーが少ない方法となる。
【００１５】
また、本発明でのオイル抽出法は、刺激応答性ポリマーの収縮によってオイルを抽出しているため、微細藻類の破砕を行うことなくオイルの抽出ができる。また、基本的には、ヘキサンなどの有機溶媒を使用することもなく、オイルを得ることも可能である。従って、これらのことからも、低コストかつ投入エネルギーが少ない抽出法となる。なお、ヘキサンなどの有機溶媒を回収して再利用したとしても、回収に要するエネルギーや有機溶媒の回収量に対する問題点を避けることはできない。
また、本発明は、刺激応答性ポリマー構造体の中で微細藻類を生かしたまま全工程を行うことを基本としているため、最初の培養を除き、基本的には、種藻を使用しなくてよい。従って、種藻の培養を行う必要もなく、低コストかつ投入エネルギーが少ない培養法となる。
また、基本的には増殖を必要としない方法であるため、培養に必要な窒素化合物やリン化合物などの高価格栄養成分の使用が最小限であり、この点からも本発明の方法は低コスト培養法となる。
また、本発明は、微生物よりもサイズの大きな構造体を用いているため、培養時に目的外微生物が混入したとしても容易に分離することができる。また、刺激応答性ポリマーのネットワーク構造のサイズは通常、混入微生物のサイズよりも小さく、その内部に侵入することは困難である。
本発明の方法は、培養及び回収、さらに、オイル抽出工程において、基本的には刺激応答性ポリマーの内部に担持された微細藻類を死滅させずに維持することができることから、微細藻類担持刺激応答性ポリマーを触媒的に繰り返し用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の微細藻類担持刺激応答性ポリマー周辺の模式図。（ａ）は、微細藻類担持刺激応答性ポリマーのミクロ構造を示しており、１が高分子鎖、２が微細藻類、３が架橋点である。これを、例えば温度刺激として４０℃以上に昇温すると、微細藻類担持刺激応答性ポリマーのネットワーク構造が縮小し、ネットワーク内に存在している微細藻類への圧力が高まる結果、オイルが放出される。４は、放出されたオイル粒子を示している。
【図２】本発明の微細藻類担持刺激応答性ポリマーを用いた培養の模式図。（ａ）は、培養器に培地と微細藻類担持刺激応答性ポリマー構造体とを入れた直後を示している。５は微細藻類担持刺激応答性ポリマー構造体、６は液面、７は培養器、８は培地を示す。（ｂ）は、培養を開始した直後の模式図。９は攪拌のための攪拌棒、１０は二酸化炭素をバブリングするための配管、１１は二酸化炭素を含むバブルを示す。（ｃ）は、オイル蓄積工程によって藻体内にオイルが蓄積された様子を示す。１２は藻体内にオイルを蓄積した微細藻類担持刺激応答性ポリマー粒子を示す。（ｄ）は、昇温することによって、微細藻類担持刺激応答性ポリマーの体積が減少し、それに伴って微細藻類内又は微細藻類近傍の少なくとも一方のオイルが放出され、培地の液面上にオイルが蓄積した様子を示す。１３は昇温によって体積を減少させ、その過程に伴って微細藻類内又は微細藻類近傍の少なくとも一方のオイルを放出した微細藻類担持刺激応答性ポリマー構造体、１４は液面に現れたオイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明による微細藻類の培養方法の好ましい実施の形態について詳細に説明する。
［微細藻類］
本発明の微細藻類とは、人の肉眼では、個々の存在が識別できないような微小な藻類を指す。微細藻類の分類としては、原核生物及び真核生物のいずれであってもよい。
上記微細藻類としては、オイルを生産する藻類である限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、藍色植物門、灰色植物門、紅色植物門、緑色植物門、クリプト植物門、ハプト植物門、不等毛植物門、渦鞭毛植物門、ユーグレナ植物門、クロララクニオン植物門などがあげられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
なお、オイルを多く含む微細藻類のことを、本発明では、オイル産生微細藻類ということがある。
【００１８】
オイルを生産する微細藻類としては、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ属、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ属、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ属、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ属、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ属、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ属、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｅｕｇｌｅｎａ属、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ属、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｏｓ属、又はＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に属する微細藻類を好適に用いることができる。この中でも、Ｂｏｔｏｒｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｃｈｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｓｐ．、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｐｒｉｍｏｌｅｃｔａ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．、Ｍｏｎｏｌｌａｎｔｈｕｓ  ｓａｌｉｎａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｓｐ．  Ｐｈａｅｏｄａｒｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｓｈｃｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｉｃａ、Ｃｈｌａｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｃ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｏｕｒｉｃｉｓｓｙｓ  ｓｐ．、Ｓｃｅｈｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｓ、Ｓｅｌｅｎａｓｔｒｕｍ  ｇｒａｃｉｌｅ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｐａｌｅａ、Ｎａｖｉｃｕｌａｐｅｌｌｃｕｌｏｓａ、Ｓｙｎｅｄｒａ  ｕｌｎａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ  ｃａｒｔｅｒａｅ、Ｔｈａｌａｓｓｉａｓｉｒａ  ｗｅｉｓｓｌｌｏｇｉ、Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍ、Ｂｉｄｄｕｌｐｈｉａ  ａｕｒｉｔａ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａを用いることができ、特に、オイル含有量の高さから、ボツリオコッカス属（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）に属するものを用いることが好ましい。
【００１９】
上記の微細藻類を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、自然界より採取する方法、市販品を用いる方法、保存機関や寄託機関から入手する方法などがあげられる。なお、本発明で用いられる微細藻類は、純化工程を経由したものであることが好ましい。
【００２０】
本発明では、上記微細藻類の中でも高い増殖速度を持つこと、高いオイル含有率を有していること、少なくとも培養中は臭いが殆どなく、有毒物質の産生が確認されていないこと、の少なくともいずれかひとつを満たす微細藻類を用いることが好ましい。
【００２１】
［刺激応答性ポリマー］
本発明での刺激応答性ポリマーとは、温度やイオン強度、ｐＨ、電場、磁場、光、化学物質などの環境因子によって、そのコンフォメーションが変化する素材のことをいう。本発明に用いられる刺激応答性ポリマーは、微細藻類に対して非障害性であれば、どのような刺激に応答するものであってもよい。本発明の方法では、刺激応答性ポリマーにより形成される構造体の体積が変化することが重要である。この中でも容易に体積を変化させることが可能な温度による刺激因子が最も良い。また、繰り返して使用できるように、上記環境因子を変化させ、環境因子を元に戻すと変化前のコンフォメーション近くにまで戻ることが好ましい。なお、本発明で「応答」というときは、一の状態から他の状態へ変化すること（例えば、収縮すること）、それとは逆の方向へ変化すること（例えば、膨潤すること）との双方を含む。
【００２２】
刺激応答性ポリマーとしては、架橋構造が形成でき、架橋構造が形成するポリマーネットワーク内に微細藻類を担持できる物質であれば特に限定されない。なお本発明では、ポリマーネットワーク構造、ゲル、架橋構造、及び網目構造をほぼ同意語として取り扱っている。
【００２３】
刺激応答性を示すポリマー化合物を得るためのモノマーとしては、種々のものを使用することができる。例えば、温度応答性ポリマーを得るためには、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルアクリルアミド、アルキル置換アクリルアミド、アクリルアミドアルキルスルホン酸、メタアクリルアミドとの共重合体、メタアクリル酸などが、ｐＨ応答性ポリマーを得るためには、ポリジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、メタアクリロニトリル、ビニルスルホン酸、ビニルベンゼンスルホン酸、マレイン酸、ヒドロキシエチルメタアクリレート、メタアクリルアミド、メタアクリル酸などが、光応答性ポリマーを得るためには、トリアリールメタン誘導体やスピロベンゾピラン誘導体などが、電流又は電界応答性ポリマーを得るためには、ジメチルアミノプロピルメタアクリルアミド等のアミノ置換メタアクリルアミド、ジメチルアミノエチルメタアクリレート、ジエチルアミノエチルメタアクリレート、ジメチルアミノプロピルアクリレート、スチレン、ビニルピリジン、ビニルカルバゾール、ジメチルアミノスチレンなどをあげることができるが、これらには限定されない。
【００２４】
本発明では、微細藻類を担持するために、刺激応答性ポリマーで形成された構造体を用いる。その構造体は、温度、イオン強度、ｐＨ、電場、磁場、光、化学物質などの環境因子の変化によって、温度応答性ポリマーのコンフォメーションが変化し、体積が変化する。例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）を刺激応答性ポリマーとして用いた場合、水溶液中のＰＮＩＰＡＭは、低温域では膨潤しているが、特定の温度以上になると、急激に水和分子を放出して収縮する。そのため、ＰＮＩＰＡＭで形成された構造体は、低温域から特定の温度へと昇温することにより、体積が減少する。
【００２５】
刺激応答性ポリマーの刺激印加前後での体積変化（刺激前体積÷刺激後体積）は、１．１倍以上１０００倍以下が好ましく、２倍以上１００倍以下がより好ましく、５倍以上５０倍以下がさらに好ましい。５倍以上５０倍以下であると、担持された微細藻類からのオイル放出が可能で、また、微細藻類に悪影響を及ぼさずに再利用することができるからである。なお、刺激前体積は、刺激後体積よりも大きいものとする。
【００２６】
刺激応答性ポリマー構造体の形体は、粒子状、破砕状、フィルム状、棒状、糸状、板状などどの様な形状でもかまわないが、取扱いのしやすさから及び合成のしやすさから、粒子状であることが好ましい。また、これらの混合物であっても良い。粒子のサイズ、すなわち直径としては、０．０１ｍｍ以上１ｍ以下が好ましく、０．１ｍｍ以上１０ｃｍ以下がさらに好ましく、１ｍｍ以上１ｃｍ以下が最も好ましい。１ｍｍ以上１ｃｍ以下であると、合成がしやすく、微細藻類の担持量が多く、体積変化の応答速度が速く、オイルの放出効率が高く、構造体内の培地の交換速度が速く、光の透過性が良く、攪拌がしやすく、粒子の破砕がしにくいなどの点から好ましい。なお、粒子の直径は、粒子直径の分布の平均値を示したものであり、粒子の一部がこれらの範囲を超えて存在していても良い。なお、本明細書では、上記の形状をひとまとめにして、粒子状ということがある。
【００２７】
ポリマーに与える刺激は、微細藻類が再利用できるように、微細藻類に対して非障害性である（微細藻類の生存に影響を与えないか、与えたとしても極わずかである）ことが好ましい。刺激として温度を変化させる場合、微細藻類が死滅することなく生存できる範囲内で変化させることが好ましい。そのような温度範囲は、例えば０℃以上１００℃以下であり、１０℃以上７５℃以下が好ましく、２０℃以上５０℃以下がより好ましい。２０℃以上５０℃以下であれば、微細藻類に対して非障害性である。例えば、最も一般的に使用されているＮ−イソプロピルアクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドとの共重合体の場合、３７℃近辺がＬＣＳＴ（Ｌｏｗｅｒ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、下限臨界溶液温度）である。なお、ＬＣＳＴとは、温度応答の変化点である。
【００２８】
［担持］
本発明での担持とは、刺激応答性ポリマー構造体の中から微細藻類が出ないような状態のことを言い、網目構造の中に微細藻類が存在しており、微細藻類が網目構造を通過しにくい状態のことである。また、微細藻類と高分子鎖との間には、微細藻類に対して非障害性である限り、イオン結合、化学結合、ファンデルワールス結合などの相互作用があっても良いし、なくても良い。また、直接化学結合していても良い。なお、非障害性とは、障害が全くないというものではなく、オイル生産の商業化に影響を及ぼさない程度の障害性であれば問題はない。
【００２９】
刺激応答性ポリマー構造体への微細藻類の担持量は、特に限定しないが、粒子１個について、１匹の微細藻類があれば良い。また、担持量が少ない場合には、粒子中で微細藻類を増殖させても良い。担持量の最大量は、上記、本発明で必要とされる刺激因子の数値範囲をはみ出さない限り、特に限定されない。構造体内における微細藻類密度は、微細藻類の浮遊培養に適した密度とすることができる。例えば、１〜１００×１０４個／ｍＬの微細藻類懸濁液にモノマー等を添加することにより、微細藻類を担持したポリマー構造体を調製する場合、ほぼ１〜１００×１０４個／ｍＬの細胞密度である、微細藻類担持刺激応答性ポリマー構造体を得ることができる。
【００３０】
刺激応答性ポリマー構造体への微細藻類の担持は、刺激応答性材料の重合と同時に行うことが好ましい。重合後に担時させると、ゲル内部に微細藻類を導入することが非常に困難だからである。このことから、重合用の溶媒としては、水を主成分とする溶媒を用いることが好ましく、水中でも重合を開始できる重合開始剤を用いることが好ましい。また、重合時の温度は、微細藻類に対して悪影響を及ぼす温度は避けなければならない。望ましい重合温度は、微細藻類の種類によって異なるが、一般的には、０℃以上５０℃以下である。
【００３１】
刺激応答性ポリマーの重合は、架橋剤を用いて重合を行うことが好ましい。架橋剤の使用で、網目構造が形成され、担時された微細藻類が粒子外に流出する可能性を低くするためである。この性質があるからこそ、オイルを抽出するのに必要な圧力を加えることができる。また、網目構造のサイズは、微細藻類やよりサイズの小さなバクテリアなどが通過しにくいサイズであることが望ましい。
【００３２】
なお、純化した微細藻類を前培養工程によって増殖させてから、種藻を調製し、刺激応答性ポリマー粒子の網目構造内に、これら微細藻類を担持させることができる。なお、本発明で言う純化工程とは、自然状態環境下生存している微細藻類のように、様々な種類の生物やゴミなどが共存した状態で生育している状態を、目的の微細藻類のみの集合体にする目的を持って行う工程のことを言う。なお、本発明では、主となる微細藻類が得られれば純化工程を経由したとしている。純化の方法としては、公知のいかなる方法を用いることもでき、寒天培地上で微細藻類を含む希釈懸濁液を展開後、培養し、コロニーを形成させた後で、コロニーを採取する方法や、顕微鏡下で一匹ずつ採取する方法などが挙げられる。また種藻とは、刺激応答性ポリマー構造体に担持するために用いる微細藻類のことである。
【００３３】
微細藻類担持刺激応答性ポリマー構造体は、培養の繰り返し回数が増えるほど、その活性が低下する場合がある。その場合には、培養器内の微細藻類担持刺激応答性ポリマー構造体の全部又は一部を交換してもよい。これにより、高いオイル生産能力を維持することができる。なお、活性の低下は、微細藻類の少なくとも部分的な死滅により生じると推定している。
【００３４】
微細藻類担持刺激応答性ポリマー構造体は、その比重を調整することができる。例えば、培地よりも軽い場合には、液面に浮かすことができ、培地よりも重い場合には、底面に沈めることができる。また、培地と同じ比重にすることで、攪拌を最小限にし、二酸化炭素のバブリングだけで攪拌ができる可能性があるためにより好ましい。また、微細藻類担持刺激応答性ポリマー構造体の比重とともに、培地の溶質成分を調整することでその比重を同時に調整しても良い。
【００３５】
［本発明の方法］
本発明の培養方法の基本的な構成を図１に示した。なお、本模式図は、本発明を説明するためのものであることから、簡略化して表記されている部分がある。なお、以下では、本発明の一例として、温度応答性ポリマーを用いた場合で説明するが、その説明は、他の刺激応答性ポリマーを用いた場合にも当てはまる。また、構造体の形状として、粒子である場合を例に説明するが、その説明は、他の形状の構造体を用いた場合にも当てはまる。また、昇温で構造体の体積が減少する場合を例としたが、逆に降温で構造体の体積が減少する場合にも当てはまる。
【００３６】
図１は、刺激応答性ポリマーの高分子鎖のレベルまで拡大した場合の模式図である。
（ａ）は、微細藻類を担持した温度応答性ポリマーが膨潤している状態を示している。本発明の第一の工程、すなわち、刺激応答性ポリマーで形成された構造体内に担持されたオイル産生微細藻類を、オイル生産上有効な第一の条件で培養して構造体内にオイルを蓄積させる工程では、このような状態にある。図では、二匹の微細藻類を図示しているが、その数は特に限定しない。また、非凝集性の微細藻類を図示しているが、凝集性の微細藻類であっても良い。ポリマーネットワークは、微細藻類が構造体から外へ出て行けないような構造体であることが好ましく、また、一般的には微細藻類よりも小さいサイズのバクテリアなどの微生物が入ってこないサイズであることが好ましい。しかし、オイルドロップや培地中の栄養素などが自由に通過できるサイズであることが好ましい。
【００３７】
本発明の第一の工程に適用される「第一の条件」とは、構造体内にオイル蓄積を促進するための条件のことであり、このためには、培養環境が微細藻類に対して非障害性であり、刺激応答性ポリマーが膨潤した状態である必要がある。構造体内にオイル蓄積を促進するための条件とは、微細藻類の細胞内又は細胞近傍の少なくとも一方にオイルが蓄積されることを指す。
第一の工程では、窒素化合物やリン化合物などの濃度が低い培地を用いることができる。そのため、低コストで実施することができる。また、第一の工程は、基本的には微細藻類の増殖を必要としない。そのためオイル製造のための全工程を、従来法と比較して大幅に短く、低コスト、低エネルギーで行うことができる。なお、一般的に、窒素化合物やリン化合物が低いと微細藻類はオイルを蓄積するようになる。
【００３８】
（ｂ）は、刺激により高分子ネットワーク構造が収縮した場合の模式図である。本発明の第二の工程、すなわちオイルが蓄積された微細藻類担持刺激応答性ポリマー構造体を、微細藻類非障害性であり、かつポリマーが応答して収縮する第二の条件で処理して体積を減少させ、それにより構造体外にオイルを放出させる工程では、このような状態にある。本模式図は、ミクロなスケールで図示したが、マクロなスケールでは、刺激応答性ポリマーで形成される構造体の体積が縮小する。この体積の縮小と同時に、ポリマーゲルネットワーク内の微細藻類は圧力を受けて、細胞内や細胞近傍に蓄積しているオイルを細胞外に放出し、更に、オイルは、ポリマーネットワーク構造から放出される。なお、本発明では、微細藻類から放出されたオイルは、構造体以外に放出されることが好ましいが、構造体内や構造体表面に一部が残存していても良い。
【００３９】
温度応答性ポリマーは、温度を下げると周りの水分を吸収し、ネットワーク構造が広がることでその体積を膨張させることができる。その結果、（ｂ）の状態から（ａ）の状態へと変化する。すなわち、該温度応答性ポリマー粒子内に担持されている微細藻類は、培養によって再びオイルを蓄積し、オイル蓄積後、昇温によって体積収縮と共にオイルを放出させることができる。すなわち、触媒の様に、何度でもリサイクルして使用することができる。本模式図では、４０℃を刺激温度として例示したが、モノマーの種類、例えば、置換基の種類を変えることによって、刺激応答温度を変えることができる。
【００４０】
本発明の第二の工程に適用される「第二の条件」は、微細藻類非障害性であり、かつポリマーが応答して収縮する条件である。
【００４１】
図２は、微細藻類の培養に焦点をあてて図示した模式図である。なお、本模式図では、架橋構造は省いて描画している。
（ａ）の状態が、培養準備を終了した直後の状態であり、培養器７に、培地８と微細藻類担持温度応答性ポリマー粒子５とを準備した状態である。
【００４２】
（ｂ）は、培養を開始した状態である。すなわち、攪拌装置９によって、微細藻類担持温度応答性ポリマー粒子が培養器内の一ヶ所に集合しないように、また、光が粒子に対して均一に照射されるように攪拌を行う。また、バブリングにより二酸化炭素を供給する配管１０も設置している。この状態でしばらく培養することで、微細藻類の細胞内又は細胞近傍の少なくともいずれか一方にオイルを蓄積するようになる。また、バブリングによって十分に培地を攪拌できる場合には、攪拌装置９は設置しなくても良い。また、本模式図では、攪拌装置によって攪拌を行っているが、培養器全体を振とうしても良い。なお、細胞内又は細胞近傍の少なくともいずれか一方にオイルを蓄積するとは、細胞の周りに存在する多糖などの細胞外マトリックスにオイルを蓄積するという意味である。
【００４３】
なお、第一の工程は、微細藻類が実質的に増殖しないことを想定しているが、本発明の目的を阻害しない限り、第一の工程において微細藻類を増殖させてもよい。増殖を伴わない場合、増殖のための時間を必要とせず、結果、オイル生産のための期間を大幅に短くすることができる。なお、増殖を伴わないとは、例えば、培地中の窒素化合物やリン化合物の濃度を減らしたり削除したりすることによって達成することができる。この様な方法は、微細藻類のオイル含有量を高める方法として知られている（特許文献４、非特許文献４）。培地の交換は、上記の目的以外に、刺激応答性ポリマーに担持されている微細藻類の生命を維持するために必要な最低限の栄養源を供給する目的でも行うことができる。
【００４４】
［培地置換］
本発明では、図２の（ａ）から（ｂ）への工程で、有用物質の含有比を向上させるために、培地置換を行っても良い。例えば、窒素化合物やリン化合物の濃度を、培養対象の微細藻類の数を増やすために必要な濃度を大幅に減らした培地への置換を行うことができる。
本発明では、より窒素化合物やリン化合物などの濃度の低い培地を添加することで、培地中の窒素化合物、リン源の濃度を減らすことも培地置換に含めることができる。すなわち、培養器内の培地を除去しないため、培地量は増加する。
【００４５】
本発明では、図２の（ｄ）から（ｂ）への工程の様に、繰り返し培養を行う場合、培地中の栄養源が培養に必要な濃度に到達していない場合がある。その様な場合に、少なくとも培地の一部を入れ替えたり、栄養源を培地に添加することで、栄養源の濃度を向上させたりすることもできる。この様な方法も、本発明では、培地置換という。
【００４６】
［糖］
本発明の実施態様の一例によれば、糖を含む培地を用いることで、光と炭素源としての二酸化炭素を用いた場合と比べて、好適にオイル含有量も高くすることができる場合がある。
本発明では、微細藻類が資化可能な、単糖、二糖、又は多糖の少なくとも一つを用いることができ、公知のいかなるものも用いることができる。例えば、単糖としては、ガラクトース、マンノース、タロース、リボース、キシロース、アラビノース、エリトロース、トレオース、グリセルアルデヒド、フルクトース、キシルロース、エリトルロースなど、二糖としては、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、マルトース、イソマルトースなどを用いることができる。さらに、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖、七炭糖のいずれも用いることができるし、多糖を用いることもできる。多糖としては、デンプン、アミロース、グリコーゲン、セルロースなどを用いることができる。
糖としては、単一種の糖を用いても良いし、二種以上の糖を用いても良い。
【００４７】
培地を交換するタイミングは、工程のどこで行ってもかまわないが、図２の（ｄ）から（ｂ）への間で行うことが好ましい。これは、微細藻類担時刺激応答性ポリマーの膨潤時に、周りの培地を吸収しながら膨潤するため、置換後の新鮮培地を粒子内に導入し易すく、培地置換が容易だからである。また、培養の進展に伴って、微細藻類から成長阻害因子や微細藻類の生存に悪影響を及ぼす物質が蓄積してしまう場合があることも報告されている。これらの物質の濃度を減少させるためにも、この工程で行うことが好ましい。培地置換には、微細藻類担時刺激応答性ポリマー構造体を回収してから行う方法と、攪拌を停止し、微細藻類担時刺激応答性ポリマー構造体を培養器底面や液面に集合させた後に行う方法の、一方又は両方を採用することができる。また、培地中に目的外の微生物などが増殖してしまった場合にも培地の交換を行うことができる。本発明の方法は、目的外微生物や担持微細藻類よりも大きな構造体を操作対象としているため、これらの操作を簡便に行うことができる特徴も有している。
【００４８】
（ｃ）は、温度応答性ポリマー粒子（１２）中の微細藻類の細胞内又は細胞近傍の少なくとも一方にオイルが蓄積した状態を図示したものである。
【００４９】
（ｄ）は、昇温によって、微細藻類担持温度応答性ポリマー粒子の体積を減少させ、その内部に担持させている微細藻類からオイルを放出させた状態を図示している。なお、本模式図では、細胞外へと放出されたオイルは、液面に集合しているように図示しているが、培地中に分散する場合もある。また、本模式図では、培養器内部にオイル相が位置しているが、培養器の高さと同等の培地を入れ、少量の培地を添加することでオイル相を培養器からあふれさせることによって、オイルを回収しても良い。また、本模式図では、培養器内でオイルを放出させているが、微細藻類担持刺激応答性ポリマーゲル粒子を回収することで培養器外へと移動させ、別の容器内でオイルを放出させても良い。
【００５０】
温度の制御として、例えば、農業用フィルムなどを用いても良い。農業用フィルムで培養器を被覆することで内部の温度を上昇させ、農業用フィルムの少なくとも一部を開放することで温度を下げることができる。また、日中と夜間の温度差を利用することも良い。すなわち、自然現象を利用して温度を制御することもできる。
【００５１】
なお、図２では、（ｃ）から（ｄ）への段階でオイルが粒子外へと放出されることを記載したが、粒子内に蓄積されたすべてのオイルが放出されなくとも良い。これは、刺激応答後も素材の体積が有限の値を示すことから、すべてのオイルを放出するのが困難だからである。
【００５２】
オイルの放出は、図２の（ｃ）から（ｄ）に示した様に、培養器内で環境変化による刺激を与えることで、オイルを培養器内に放出させても良いし、（ｃ）の状態の微細藻類を担持させた刺激応答性ポリマー粒子を回収し、別の容器に移してから、環境変化による刺激を与えることでオイルを放出させても良い。この場合、溶媒を入れておいても良い。例えば、水を溶媒として用いた場合には、放出されたオイルが液面に浮く場合があるからである。
【００５３】
また、図２の（ｄ）のように液面にオイルが集まらずに、培地中に分散してしまった場合には、オイルを溶解させることのできる有機溶媒と混合することで培地中に放出されたオイルを回収することもできる。これは、刺激応答性ポリマーを回収し、別の容器内で抽出する場合も同様のことができる。なお、別容器への回収は、刺激応答性ポリマーに環境変化を与え、体積変化を起こしてから回収しても良いし、環境変化を与える前に回収し、別容器で環境変化を与えてからオイル抽出を行っても良い。なお、有機溶媒を用いて抽出する場合には、微細藻類担持刺激応答性ポリマーが存在していない状態で行うことが望ましい。これは、有機溶媒の存在が微細藻類に悪影響を及ぼす可能性を減らすためである。
【００５４】
図２の（ｄ）では、液面上のオイル相を回収してから、（ｂ）の工程、さらには、オイル蓄積工程（ｃ）へと培養を進行させているが、オイル相を回収することなくこれらの工程を繰り返しても良い。ただし、繰り返し工程を何度か行いある程度のオイル量が液面に蓄積された場合には、回収を行った方が良い。また、培地中にオイルが分散した場合も同様のことを行うことができる。
【００５５】
（ｄ）から（ｂ）への工程を行うことによって、再び、オイル蓄積工程を行うことができる。すなわち、温度を元に戻すことによって、微細藻類担持刺激応答性ポリマー粒子が膨潤し、その体積がほぼ元の大きさに戻る。そのため、何度でも繰り返しオイルを生産することができる。すなわち、触媒的に微細藻類を利用することができる。なお、培養器は、開放系でも閉鎖系でも良い。また、微細藻類担持刺激応答性ポリマーの回収を容易にするために、粒子を液面上に浮かせることもできる。そのためには、微細藻類担持刺激応答性ポリマー粒子の比重を調整したり、バブリングによって粒子に小さな気泡を付着させることができる。また、濾過による回収を行っても良い。
【００５６】
［前培養工程］
本発明の前培養工程とは、純化工程を終了した後に得られた保存用微細藻類を増殖させ、本培養を行うための刺激応答性ポリマー粒子に担持できるまでの藻体量を確保する目的で行う培養工程である。前培養工程の培養法は、公知のいかなる培養方法でも選択可能である。例えば、分散培養法や付着培養法、また、本発明者らにより開発された液面浮遊培養などを行うことが可能である。また、前培養工程は、本培養が行える規模まで微細藻類を増殖させるために、前培養工程を数回行っても良い。
また、一般的には、１ｃｍ２〜１ｍ２以下の表面積を持つ培養器を使用し、屋内外いずれでも培養可能であるが、屋内での培養の方が好ましい。
【００５７】
［本培養工程］
本培養工程とは、前培養工程を行った後の培養工程のことである。
本培養工程は、第一の工程と第二の工程とから構成されている。
第一の工程とは、刺激応答性ポリマーで形成された構造体内に担持されたオイル産生微細藻類を、オイル生産上有効な第一の条件で培養して構造体内にオイルを蓄積させる工程である。また、第一の条件とは、構造体内にオイル蓄積を促進するための条件のことである。なお、本発明では、第一の工程をオイル蓄積工程と記すことがある。
第二の工程とは、オイルが蓄積された微細藻類担持刺激応答性ポリマー構造体を、微細藻類非障害性であり、かつポリマーが応答して収縮する第二の条件で処理して体積を減少させ、それにより構造体外にオイルを放出させる工程のことである。第二の条件での処理は、微細藻類を担持している構造体を回収し、回収した構造体を第二の条件に曝すことによって行ってもよく、また微細藻類を担持している構造体が含まれる培養器内を第二の条件とすることによって行ってもよい。第二の条件が温度に関する条件である場合、培養器内を第二の条件とすることは、培地の温度を変化させる等して、微細藻類を担持している構造体が含まれる培養全体の温度を変化させることによって行ってもよい。
本培養工程は、複数回行っても良い。本培養工程は、また、一般的には、１００ｃｍ２以上の表面積を持つ培養器を使用し、屋内外いずれでも培養可能であるが、屋外での培養の方が好ましい。
【００５８】
［懸濁処理］
本発明では、刺激応答性ポリマーに担持する種類は、凝集性微細藻類を使用する場合、懸濁処理した微細藻類試料を用いる方が好ましい。懸濁処理を行うことで、試料内の微細藻類集合体のサイズが小さくなり、均一に担持ができ、その結果、担持効率が向上するからである。懸濁処理としては、公知のいかなる方法でも用いることができるが、ピペッティングや容器内に入れた微細藻類溶液を手で振る処理、スターラーチップや攪拌棒による処理などの弱い処理、超音波処理や高速振盪処理などの強い処理、細胞間マトリックスのような接着物質を分解する酵素などの物質を用いる方法などをあげることができる。ただし、凝集性を示さない微細藻類の場合には、本処理工程は不要である。
【００５９】
［培地（液体培地）］
本発明では、微細藻類を培養できる限り、公知のいかなる培地（液体培地）も使用することができる。公知の培地として、ＡＦ−６培地、Ａｌｌｅｎ培地、ＢＢＭ培地、Ｃ培地、ＣＡ培地、ＣＡＭ培地、ＣＢ培地、ＣＣ培地、ＣＨＵ培地、ＣＳｉ培地、ＣＴ培地、ＣＹＴ培地、Ｄ培地、ＥＳＭ培地、ｆ／２培地、ＨＵＴ培地、Ｍ−１１培地、ＭＡ培地、ＭＡＦ−６培地、ＭＦ培地、ＭＤＭ培地、ＭＧ培地、ＭＧＭ培地、ＭＫＭ培地、ＭＮＫ培地、ＭＷ培地、Ｐ３５培地、ＵＲＯ培地、ＶＴ培地、ＶＴＡＣ培地、ＶＴＹＴ培地、Ｗ培地、ＷＥＳＭ培地、ＳＷ培地、ＳＯＴ培地などを挙げることができる。このうち淡水性のものはＡＦ−６培地、Ａｌｌｅｎ培地、ＢＢＭ培地、Ｃ培地、ＣＡ培地、ＣＡＭ培地、ＣＢ培地、ＣＣ培地、ＣＨＵ培地、ＣＳｉ培地、ＣＴ培地、ＣＹＴ培地、Ｄ培地、ＨＵＴ培地、Ｍ−１１培地、ＭＡ培地、ＭＡＦ−６培地、ＭＤＭ培地、ＭＧ培地、ＭＧＭ培地、ＭＷ培地、Ｐ３５培地、ＵＲＯ培地、ＶＴ培地、ＶＴＡＣ培地、ＶＴＹＴ培地、Ｗ培地、ＳＷ培地、ＳＯＴ培地である。前述のＡＶＦＦ００７株を培養する培地としては、Ｃ培地、ＣＳｉ培地、ＣＨＵ培地、及びこれら培地の混合物が好ましい。なお培地は、微細藻類の種類に応じて選択することが望ましい。
【００６０】
培地は、紫外線滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌しても良く、しなくても良い。
【００６１】
培地は、前培養工程と本培養工程、オイル蓄積工程で異なる培地を使用しても良い。また、培養工程の途中で異なる培地に変更しても良い。
【００６２】
オイル蓄積工程では、窒素化合物やリン化合物などの濃度を、前培養工程で用いた培地と比較して下げるか、又は、完全に０にしてもかまわない。これは、本発明では、微細藻類の増殖を伴わずに、オイル蓄積工程だけで培養を行うことも可能だからである。
【００６３】
なお、環境変化による体積変化量を調整するために、培地中の溶質の濃度を調整しても良い。すなわち、溶質の濃度を調整することで、ＬＣＳＴを微調整しても良い。
【００６４】
［二酸化炭素］
多くの微細藻類の培養には、二酸化炭素の供給が必要であり、本発明でも二酸化炭素を使用することができる。さらに、二酸化炭素の供給、例えば、バブリングによる供給は、微細藻類担持刺激応答性ポリマー構造体を攪拌することも目的として使用することができる。
本発明では、大気濃度の二酸化炭素の利用も可能であるが、大気中濃度よりも高濃度の二酸化炭素を利用することもできる。この場合の二酸化炭素の濃度は本発明の効果が達成できる限り特に限定しないが、好ましくは大気濃度以上、２０体積％未満であり、好ましくは０．０１〜１５体積％であり、より好ましくは０．１〜１０体積％である。また、二酸化炭素は、燃焼装置によって排出された二酸化炭素であってもよい。また、試薬によって二酸化炭素を発生させてもよい。
【００６５】
［光源及び光量］
本発明で用いることのできる光源は、公知のいかなる光源も用いることができるが、太陽光、ＬＥＤ光、蛍光燈、白熱球、キセノンランプ光、ハロゲンランプなどを用いることができ、この中でも、自然エネルギーである太陽光、発光効率の良いＬＥＤ、簡便に使用することのできる蛍光燈を用いることが好ましい。
【００６６】
光量は、１００ルクス以上１００万ルクス以下であることが好ましく、３００ルクス以上５０万ルクス以下がさらに好ましい。最も好ましい光量は、１０００ルクス以上２０万ルクス以下である。光量が１０００ルクス以上であると、微細藻類のオイル蓄積量が十分に高く、２０万ルクス以下であると、光障害によるオイル蓄積への悪影響が少ない。
【００６７】
光は、連続照射、ある一定の時間間隔で照射と非照射を繰り返す方法のいずれでもかまわないが、人工光を用いる場合、１２時間間隔で光をＯＮ、ＯＦＦすることが好ましい。
【００６８】
光の波長は、光合成が行える波長であれば、どの様な波長でも用いることができ、その制限を設けないが、好ましい波長は、太陽光又は太陽光に類似の波長である。単一の波長を照射することで光合成生物の育成速度が向上する例も報告されており、本発明でもこの様な照射方法を用いることもできる。
【００６９】
［その他培養条件］
本発明では、前培養工程や本培養工程で使用する液体培地（以下、液体培地のことを培養液とも言う）のｐＨは、１〜１３の範囲内であることが好ましく、３〜１１の範囲内であることがより好ましく、５〜９の範囲内であることがさらに好ましく、６〜８の範囲内であることが最も好ましい。
【００７０】
また、微細藻類の種類に応じて、好適なｐＨは変化することから、微細藻類の種類に応じたｐＨを選択することが好ましい。なお、液体培地のｐＨとは、培養開始時のｐＨのことである。また、ｐＨは、培養の進行に伴って変化する場合があることから、培養中にｐＨは変化しても良い。
【００７１】
本発明では、培地中のｐＨを一定に保つ緩衝作用を持った物質を培地中に添加することができる。これにより、培養の進行とともに培地中のｐＨが変化する問題を抑制することや、培地中への二酸化炭素の供給でｐＨが変化する現象を抑制できる場合がある。緩衝作用を持った物質としては、公知の物質を使用することができ、その使用には制限がないが、４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）や、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液などを好適に用いることができる。これら、緩衝物質の濃度や種類は、微細藻類の種類や培養環境に応じて決めることができる。ただし、ｐＨ応答性の刺激応答性ポリマーを用いる場合には、この限りではない。
【００７２】
培養温度は、微細藻類の種類に応じて選択することができ、特に限定はしないが、０℃以上ＬＣＳＴ温度未満であることが好ましく、１５℃以上ＬＣＳＴ温度未満がより好ましく、２０℃以上ＬＣＳＴ温度未満が最も好ましい。培養温度が２０℃以上ＬＣＳＴ温度未満であると、微細藻類を好適に培養させることができる。なお、刺激が温度以外の場合には、この限りではない。
微細藻類担持刺激応答性ポリマーからのオイル抽出時の温度は、ＬＣＳＴ温度以上９０℃以下であることが好ましく、ＬＣＳＴ温度以上６０℃以下がより好ましく、ＬＣＳＴ温度以上５０℃以下が最も好ましい。オイル抽出時の温度がＬＣＳＴ温度以上５０℃以下であると、微細藻類への悪影響が最小限であり、微細藻類担持刺激応答性ポリマーの刺激応答速度が十分に速い。  ＬＣＳＴ温度は、０℃以上９０℃以下であることが好ましく、１５℃以上６０℃以下がより好ましく、２０℃以上５０℃以下が最も好ましい。ＬＣＳＴ温度が２０℃以上５０℃以下であると、微細藻類への悪影響が小さく、微細藻類担持刺激応答性ポリマーの刺激応答性速度が十分に速い。
【００７３】
本発明での前培養期間、本培養期間は、微細藻類の種類に応じて選択することができ、特に限定はしないが、１日以上３００日以下が好ましく、３日以上１００日以下がより好ましく、７日以上５０日以下がさらに好ましい。
【００７４】
液体培地の水深は、特に限定されないが、水深は浅い方が好ましい。これは、水の使用量が少なく、ハンドリング効率が良くなるからである。水深は、１０ｃｍ〜１０ｍがより好ましく、２０ｃｍ〜１ｍが更に好ましく、３０ｃｍ〜５０ｃｍが最も好ましい。水深が２０ｃｍ〜１ｍであると、微細藻類担持刺激応答性ポリマー構造体の量を十分に多くすることができ、光の有効活用、攪拌効率を最適なものにすることができる。
【００７５】
［培養器］
培養器（培養池）の形状は、懸濁液を保持できる限り、公知のいかなる形状でも用いることができる。例えば、円柱状、方形状、球状、板状、チューブ状、プラスチックバッグなどの不定形状のものを使用することができる。また、オープンポンド（開放池）型、レースウェイ型、チューブ型（Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ９２，  １１３，  ２００１）など様々な公知の方式を用いることができる。培養器として使用することの可能な形状は、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７０  （１９９９）  ３１３−３２１，  Ｅｎｇ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ９，  １６５−１７７  （２００９）．  に記載の培養器をあげることができる。これらの中で、オープンポンド型又はレースウェイ型を用いることが、コスト面からは好ましい。
【００７６】
本発明で使用可能な培養器は、開放型、閉鎖型のいずれでも使用することができる。閉鎖型の培養器の場合には、例えば、培養器を農業用フィルムなどの被覆物で覆った培養器で培養することができる。
【００７７】
［素材］
本発明で使用可能な培養器の素材は、特に限定することはなく、公知のものを使用することができる。例えば、有機高分子化合物や無機化合物、金属、それらの複合体から構成された素材を使用することができる。また、それらの混合物を用いることも可能である。
【００７８】
有機高分子化合物としては、ポリエチレン誘導体、ポリ塩化ビニル誘導体、ポリエステル誘導体、ポリアミド誘導体、ポリスチレン誘導体、ポリプロピレン誘導体、ポリアクリル誘導体、ポリエチレンテレフタレート誘導体、ポリブチレンテレフタレート誘導体、ナイロン誘導体、ポリエチレンナフタレート誘導体、ポリカーボネート誘導体、ポリ塩化ビニリデン誘導体、ポリアクリロニトリル誘導体、ポリビニルアルコール誘導体、ポリエーテルスルホン誘導体、ポリアリレート誘導体、アリルジグリコールカーボネート誘導体、エチレン−酢酸ビニル共重合体誘導体、フッ素樹脂誘導体、ポリ乳酸誘導体、アクリル樹脂誘導体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体等などを用いることができる。
無機化合物としては、ガラス、セラミックス、コンクリートなどを用いることができる。
金属化合物としては、鉄、アルミニウム、銅やステンレスなどの合金を用いることができる。
【００７９】
上記の中でも、培養器の素材の一部は、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリスチレン、塩化ビニル、ポリエステルの中から選ばれる少なくとも一つから構成されていることが好ましい。
また、閉鎖型の培養器を用いる場合には、受光面は、光が透過する素材である方が良く、透明材料であれば更に良い。
【００８０】
［含水率］
本発明での含水率とは、物質中に含まれる水分の重量を、物質の重量で割って、１００を掛けたものである。
【００８１】
［オイル］
本発明でのオイルとは、可燃性の流動性物質のことであり、主として、炭素、水素から構成された化合物のことであり、場合によっては、酸素原子、窒素原子などを含む物質のことである。オイルは、一般的に混合物であり、ヘキサンやアセトンなどの低極性溶媒を用いて抽出される物質である。その組成は、炭化水素化合物や脂肪酸、トリグリセリドなどから構成される場合や、これらから選ばれる複数種の組成から構成されている場合もある。なお、本発明でバイオ燃料というときは、生物学的生産工程を経て得られた燃料を指し、藻類由来のオイル（藻類オイル）、藻類オイルからエステル化して得たバイオディーゼルを含む。
なお、本発明で利用可能な微細藻類内のオイルとは、細胞壁内部のオイル状物質のことであり、微細藻類近傍のオイルとは、微細藻類近傍に存在する微細藻類が放出した細胞外マトリックス内、又は、刺激応答性ポリマー構造体の中に存在しているオイルのことである。
【００８２】
また本発明に係る微細藻類は、オイル含有量が高いことが好ましい。具体的には、微細藻類の乾燥藻体あたりのオイル含有量が５質量％以上であることが好ましく、１０質量％以上であることがより好ましく、１５質量％以上であることが特に好ましい。微細藻類の乾燥藻体あたりのオイル含有量は通常８０質量％以下である。
【実施例】
【００８３】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
［実施例１］前培養
前培養として、Ｃ培地を入れた１００ｍＬの三角フラスコにＮＩＥＳ−２１９９（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、国立環境研究所）を播種した。なお、Ｃ培地の組成は、Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ  １５ｍｇ、ＫＮＯ３  １０ｍｇ、β−Ｎａ２ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ・５Ｈ２Ｏ  ５ｍｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ４ｍｇ、Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２  ０．０１μｇ、Ｂｉｏｔｉｎ  ０．０１μｇ、Ｔｈｉａｍｉｎｅ  ＨＣｌ  １μｇ、ＰＩＶ  ｍｅｔａｌｓ  ０．３ｍＬ、Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｏｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ  ５０ｍｇを蒸留水  ９９．７ｍＬに溶解させ、ｐＨを７．５に調製したものである。なお、ＰＩＶ  ｍｅｔａｌｓは、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  １９．６ｍｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ３．６ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２．２ｍｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．４ｍｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．２５ｍｇ、Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇを蒸留水１００ｍＬに溶解させたものである。
【００８４】
これを１００ｒｐｍの振盪数で振盪させながら、４０００ルクスの連続光を照射し、１ヶ月間培養することで、培養開始時には、ほぼ透明であったものが緑色に着色した微細藻類懸濁液となった。なお、二酸化炭素は、シリコセン（アズワン株式会社）で栓をしたので、ここから供給したことになる。
【００８５】
［実施例２］微細藻類担時刺激応答性ポリマー粒子の調製
実施例１で調製した微細藻類懸濁液の藻体数を、血球計数板を用いてカウントした。この溶液を適当に希釈することで、５×１０５個／ｍＬの微細藻類懸濁液を１００ｍＬ得た。なお、希釈のための溶液はＣ培地とした。
【００８６】
この溶液に対して、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを１ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを０．１ｇ、過硫酸カリウムを０．０５ｇ添加し、良く攪拌した。
【００８７】
５００ｍＬの三口フラスコに、３００ｍＬのシリコーンオイルを入れ、三口フラスコの一つに攪拌機をセットし、さらに、別の口に上記微細藻類とモノマー原料とを混合した溶液を入れた分液ロートをセットした。２５℃に設定したウォーターバス用いて三口ロートの温度を一定温度に設定し、攪拌機を激しく攪拌しながら、分液ロートからゆっくりと微細藻類とモノマーとの混合溶液を滴下した。この状態で、５時間反応を行った。反応終了後、三口フラスコ内の内容物を濾紙により濾過し、数回の洗浄を行うことで、微細藻類を担持させた温度応答性ポリマー粒子を調製した。なお、粒子はおおよそ球形であり、直径にはかなりのバラツキがあったものの０．１ｍｍから３ｍｍ程度の大きさであった。また、粒子は、薄い緑色を呈していた。
【００８８】
［実施例３］微細藻類担持温度応答性ポリマーを用いた培養
実施例２で調製した微細藻類担時温度応答性ポリマー粒子約５０ｍＬを、２５０ｍＬのＣ培地を入れた１０００ｍＬ三角フラスコの中に入れ、１００ｒｐｍで振盪し、８０００ルクスの連続光を照射しながら、培養温度２５℃での培養を１０日間行った。なお、炭素源として、１％二酸化炭素をバブリングによって供給した。次に、攪拌を停止し、微細藻類担持刺激応答性ポリマーと培地との混合物とをフィルター濾過することによって、微細藻類担持刺激応答性ポリマーを回収した。培養器には、Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、ＫＮＯ３とを抜いたＣ培地を入れ、フィルター濾過して得られた微細藻類担持刺激応答性ポリマーを入れ、１％二酸化炭素をバブリングしながら、オイル蓄積工程を１０日間行った。
【００８９】
培養開始から２０日後、振盪を停止しした。これを４０℃に設定した恒温槽に入れると、微細藻類担持温度応答性ポリマー粒子の体積が減少すると共に、白っぽく変色した。なお、体積変化は、フラスコの目盛りからおよそ２０倍程度であった。また液面上には、オイルが浮いていた。濾過によって微細藻類担持刺激応答性ポリマーを分離した後、濾液に対してヘキサンを２５０ｍＬ添加し、分液ロートを用いて溶液中に含まれるオイル成分を抽出した。ヘキサン層を集め、ヘキサンをエバポレーションによって除去し、残った液状物を微細藻類由来のオイルとした。最終的に、０．１３ｇのオイル状物が得られた。
【００９０】
［実施例４］微細藻類担時温度応答性ポリマーを用いた再培養
実施例３で、オイル回収後の微細藻類担持温度応答性ポリマー粒子を、新たに調製しなおしたＣ培地（Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ、ＫＮＯ３とを加えていない）に入れ、実施例３と同様の条件で培養を開始した。なお、培養温度が２５℃であることから、微細藻類担持温度応答性ポリマー粒子は、培養中にほぼ元の体積に戻ったようである。
【００９１】
実施例３と同様の条件で培養を行い、実施例３と同様の手順でオイルを得た。オイル量は、０．１１ｇであった。
【図１】
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【図２】
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