(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便かつ定量的に標的核酸分子を検出できる修飾核酸分子、及び標的核酸分子の検出方法の提供。【解決手段】核酸分子２と、核酸分子２に結合している少なくとも二つのナノ粒子３と、を備え、核酸分子２は、核酸分子２における一のナノ粒子の結合位置と他のナノ粒子の結合位置との間に、１５ｍｅｒ以上の一本鎖部分２ａを有する、修飾核酸分子１。凝集速度の定量化は、吸光光度分光計を用いて水中でのＡｕＮＰの凝集に伴う吸収スペクトルの変化を測定し、ＡｕＮＰの凝集の程度を定量化する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子と、該核酸分子に結合している少なくとも二つのナノ粒子と、を備え、
前記核酸分子は、該核酸分子における一の前記ナノ粒子の結合位置と他の前記ナノ粒子の結合位置との間に、１５ｍｅｒ以上の一本鎖部分を有する、修飾核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子は、少なくとも二つの二本鎖部分を有し、
前記二つのナノ粒子は、それぞれ前記二本鎖部分に結合している、請求項１に記載の修飾核酸分子。
【請求項３】
前記ナノ粒子は金属ナノ粒子である、請求項１又は２に記載の修飾核酸分子。
【請求項４】
前記一本鎖部分に含まれる塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的核酸分子の検出用又は分離用である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾核酸分子。
【請求項５】
修飾核酸分子を用いた標的核酸分子の検出方法であって、
前記修飾核酸分子として、核酸分子と、該核酸分子に結合している少なくとも二つのナノ粒子と、を備え、前記核酸分子が、該核酸分子における一の前記ナノ粒子の結合位置と他の前記ナノ粒子の結合位置との間に、前記標的核酸分子の塩基配列と相補的な塩基配列を含む１５ｍｅｒ以上の一本鎖部分を有する修飾核酸分子を用い、
前記修飾核酸分子と前記標的核酸分子とをハイブリダイズさせることにより複合体を形成させ、前記修飾核酸分子の凝集速度と前記複合体の凝集速度との違いに基づいて前記標的核酸分子を検出する、標的核酸分子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾核酸分子、及び標的核酸分子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、種々の疾病診断において、体液中に存在する２０〜３０ｍｅｒ程度の長さを持つマイクロＲＮＡ等の核酸分子の検出が注目されている。このような核酸分子を検出するためには、一般的に比較的大型の装置を必要とする。また、ポイント・オブ・ケア・テスト（ＰＯＣＴ）などベッドサイドでの検診、あるいは、食品管理や検疫などオン・サイトでの核酸分子の検出の需要が高まっている。
【０００３】
これに対して、従来、特定の塩基配列を有する標的核酸分子の検出方法が提案されている。例えば特許文献１では、銀ナノ粒子等の金属粒子及び所定の色素を用い、表面増強（共鳴）ラマン散乱（ＳＥＲ（Ｒ）Ｓ）によって標的核酸分子を検出している。また、例えば非特許文献１，２では、オリゴＤＮＡを固定した金ナノ粒子を用いて、標的核酸分子を検出している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００２−５１５５９０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】SatoK, et al., "Rapid aggregation of gold nanoparticles induced bynon-cross-linking DNA hybridization.", J. Am. Chem. Soc. 2003, 125,8102-8103
【非特許文献２】Elghanian R, etal. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on thedistance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science 1997, 277,1078-1081
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の検出方法には、簡便性及び定量性の両立の点で未だ改善の余地がある。そこで、本発明は、簡便かつ定量的に標的核酸分子を検出できる修飾核酸分子、及び標的核酸分子の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、核酸分子と、核酸分子に結合している少なくとも二つのナノ粒子と、を備え、核酸分子は、核酸分子における一のナノ粒子の結合位置と他のナノ粒子の結合位置との間に、１５ｍｅｒ以上の一本鎖部分を有する、修飾核酸分子を提供する。
【０００８】
本発明に係る修飾核酸分子では、核酸分子が１５ｍｅｒ以上の一本鎖部分を有することにより、修飾核酸分子の凝集速度が極めて遅くなる。一方で、修飾核酸分子の一本鎖部分に標的核酸分子をハイブリダイズさせて複合体を形成させた場合、修飾核酸分子が少なくとも二つのナノ粒子を有していることにより、複合体が修飾核酸分子よりも速く凝集する。つまり、修飾核酸分子と複合体とで凝集速度が異なることとなり、両者の凝集速度に基づいて標的核酸分子の検出が可能となる。したがって、本発明に係る修飾核酸分子によれば、簡便かつ定量的に標的核酸分子を検出できる。
【０００９】
核酸分子は、少なくとも二つの二本鎖部分を有し、二つのナノ粒子は、それぞれ二本鎖部分に結合していることが好ましい。この場合、二つのナノ粒子のそれぞれに担持させたオリゴＤＮＡを他のオリゴＤＮＡにハイブリダイズさせることにより、容易に修飾核酸分子を得ることができる。
【００１０】
ナノ粒子は、金属ナノ粒子であることが好ましい。この場合、二つ以上の金属ナノ粒子がナノメートルオーダーで接近すると種々の光学特性が変化するため（プラズモン共鳴現象）、高感度かつ精度のよい標的核酸分子の検出が可能となる。
【００１１】
修飾核酸分子は、上述のような特性を有するため、一本鎖部分の塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的核酸分子の検出用又は分離用として好適に用いられる。
【００１２】
本発明はまた、修飾核酸分子を用いた標的核酸分子の検出方法であって、修飾核酸分子として、核酸分子と、該核酸分子に結合している少なくとも二つのナノ粒子と、を備え、核酸分子が、該核酸分子における一のナノ粒子の結合位置と他のナノ粒子の結合位置との間に、標的核酸分子の塩基配列と相補的な塩基配列を含む１５ｍｅｒ以上の一本鎖部分を有する修飾核酸分子を用い、修飾核酸分子と標的核酸分子とをハイブリダイズさせることにより複合体を形成させ、修飾核酸分子の凝集速度と複合体の凝集速度との違いに基づいて標的核酸分子を検出する、標的核酸分子の検出方法を提供する。
【００１３】
本発明に係る標的核酸分子の検出方法では、修飾核酸分子として、標的核酸分子の塩基配列と相補的な塩基配列を含む１５ｍｅｒ以上の一本鎖部分を有する修飾核酸分子を用いることにより、修飾核酸分子の凝集速度が極めて遅くなる。一方で、修飾核酸分子の一本鎖部分に標的核酸分子をハイブリダイズさせて複合体を形成させると、修飾核酸分子が少なくとも二つのナノ粒子を有していることにより、複合体が修飾核酸分子よりも速く凝集する。つまり、修飾核酸分子と複合体とで凝集速度が異なることとなり、両者の凝集速度に基づいて標的核酸分子の検出が可能となる。したがって、本発明に係る標的核酸分子の検出方法によれば、簡便かつ定量的に標的核酸分子を検出できる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、簡便かつ定量的に標的核酸分子を検出できる修飾核酸分子、及び標的核酸分子の検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】修飾核酸分子の一実施形態を示す模式図である。
【図２】図１に示した修飾核酸分子の作製方法の一例を示す模式図である。
【図３】標的核酸分子の検出方法の一実施形態を示す模式図である。
【図４】実施例におけるオリゴＤＮＡの状態と懸濁液の沈殿状態との関係を示す図である。
【図５】実施例における標的核酸分子のハイブリダイズの状態と懸濁液の沈殿状態との関係を示す図である。
【図６】実施例における修飾核酸分子の一本鎖部分の長さと懸濁液の沈殿状態との関係を示す図である。
【図７】実施例における標的核酸分子の長さと懸濁液の沈殿状態との関係を示す図である。
【図８】金ナノ粒子の凝集状態と吸収スペクトルとの関係を示す図である。
【図９】金ナノ粒子の直径が２０ｎｍである場合の標的核酸分子の濃度と懸濁液のΔＯＤの変化との関係を示す図である。
【図１０】金ナノ粒子の直径が４０ｎｍである場合の標的核酸分子の濃度と懸濁液のΔＯＤの変化との関係を示す図である。
【図１１】金ナノ粒子の直径が６０ｎｍである場合の標的核酸分子の濃度と懸濁液のΔＯＤの変化との関係を示す図である。
【図１２】金ナノ粒子の直径が２０ｎｍである場合の単位時間当たりのΔＯＤの面積と標的核酸分子の濃度との関係を示す図である。
【図１３】金ナノ粒子の直径が４０ｎｍである場合の単位時間当たりのΔＯＤの面積と標的核酸分子の濃度との関係を示す図である。
【図１４】金ナノ粒子の直径が６０ｎｍである場合の単位時間当たりのΔＯＤの面積と標的核酸分子の濃度との関係を示す図である。
【図１５】金ナノ粒子の直径と懸濁液のΔＯＤの変化との関係を示す図である。
【図１６】金ナノ粒子の直径及び修飾核酸分子の長さと懸濁液のΔＯＤの変化との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面を参照しながら、本発明に係る修飾核酸分子、及び標的核酸分子の検出方法の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１７】
本実施形態に係る修飾核酸分子は、核酸分子と、該核酸分子に結合している少なくとも二つのナノ粒子と、を備える。核酸分子は、核酸分子における一のナノ粒子の結合位置と他のナノ粒子の結合位置との間に、１５ｍｅｒ以上の一本鎖部分を有する。なお、本発明における「核酸分子」とは、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸分子、ＰＮＡ等の核酸アナログ分子を包含するものである。
【００１８】
図１は、修飾核酸分子の一実施形態を示す模式図である。図１に示すように、修飾核酸分子１は、核酸分子２と、核酸分子２に結合している二つのナノ粒子３とを備えている。核酸分子２は、核酸分子２における一のナノ粒子３の結合位置と他のナノ粒子３の結合位置との間に一本鎖部分２ａを有している。
【００１９】
核酸分子は、一本鎖部分及び二本鎖部分からなっていてもよく、一本鎖部分のみからなっていてもよい。核酸分子が一本鎖部分及び二本鎖部分からなっている場合、一本鎖部分は核酸分子の一部分に存在していてもよく、複数部分に存在していてもよい。好ましい核酸分子の態様としては、図１に示すように、中央部に一本鎖部分２ａを有し、一端部に二本鎖部分２ｂを有し、他端部に二本鎖部分２ｃを有している核酸分子２が挙げられる。なお、本発明における「端部」とは、核酸分子の最末端を含む部分をいう。
【００２０】
一本鎖部分の長さは、１５ｍｅｒ以上であり、２０ｍｅｒ以上であることが好ましく、３０ｍｅｒ以上であることが更に好ましい。一本鎖部分の長さが上記の範囲であることにより、一本鎖部分に標的核酸分子がハイブリダイズする前後での凝集速度の差がより大きくなるため、標的核酸分子をより確実に検出することができる（詳細は後述する）。一本鎖部分が核酸分子の複数部分に存在している場合は、核酸分子における一のナノ粒子の結合位置と他のナノ粒子の結合位置との間に存在する複数の一本鎖部分の合計の長さが、上記の範囲となるようにすることが好ましい。
【００２１】
核酸分子が二本鎖部分を有する場合、二本鎖部分は、核酸分子の一部分に存在していてもよく、複数部分に存在していてもよい。上述のとおり、核酸分子の端部は二本鎖部分であることが好ましいが、核酸分子の端部は一本鎖部分であってもよい。二本鎖部分の長さは、配列の特異性の確保及び二本鎖部分の強度の観点から、５ｍｅｒ以上であることが好ましく、１０〜３０ｍｅｒであることがより好ましい。また、二本鎖部分が複数存在する場合、二本鎖部分同士の間隔は、一本鎖部分に標的核酸分子をハイブリダイズさせる前後での凝集速度の差をより生じさせやすくする観点から、１５ｍｅｒ以上であることが好ましく、２０ｍｅｒ以上であることがより好ましく、３０ｍｅｒ以上であることが更に好ましい。
【００２２】
ナノ粒子は、核酸分子の一本鎖部分に結合していてもよく、二本鎖部分に結合していてもよい。ナノ粒子は、核酸分子の端部に存在する二本鎖部分に結合していることが好ましい。
【００２３】
ナノ粒子は、金属ナノ粒子、非金属ナノ粒子のいずれでもよいが、種々の光学的検出手法による感度向上の観点から、金属ナノ粒子であることが好ましい。また、金属ナノ粒子としては、金ナノ粒子や銀ナノ粒子が好ましい。ナノ粒子の直径は、１０〜１００ｎｍであることが好ましく、２０〜４０ｎｍであることがより好ましい。核酸分子に結合している二つのナノ粒子同士は、互いに同一でも異なっていてもよい。
【００２４】
図２は、本実施形態に係る修飾核酸分子の作製方法の一例を示す模式図である。図２（ａ）に示すように、まず、第１のオリゴＤＮＡ４ａがナノ粒子３に担持されてなる第１の担持オリゴＤＮＡ５ａと、第２のオリゴＤＮＡ４ｂがナノ粒子３に担持されてなる第２の担持オリゴＤＮＡ５ｂとを用意する。ここで、ナノ粒子にオリゴＤＮＡを担持させる方法としては、公知の方法（例えば非特許文献１に記載の方法）を用いればよく、例えばオリゴＤＮＡの３’端又は５’端をチオール基（−ＳＨ）で修飾してナノ粒子に担持させる方法を用いることができる。
【００２５】
また、第３のオリゴＤＮＡ４ｃを用意する。第３のオリゴＤＮＡ４ｃは、一端部に第１のオリゴＤＮＡ４ａの塩基配列と相補的な塩基配列を有しており、他端部に第２のオリゴＤＮＡ４ｂの塩基配列と相補的な塩基配列を有している。
【００２６】
続いて、ハイブリダイゼーション緩衝液（例えば塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液）中で第１の担持オリゴＤＮＡ５ａ、第２の担持オリゴＤＮＡ５ｂ及び第３のオリゴＤＮＡ４ｃを混合し、５０℃程度で反応させると、第１のオリゴＤＮＡ４ａが第３のオリゴＤＮＡ４ｃの一端部とハイブリダイズし、第２のオリゴＤＮＡ４ｂが第３のオリゴＤＮＡ４ｃの一端部とハイブリダイズする（図２（ｂ））。これにより、中央部に一本鎖部分２ａを有し、一端部に二本鎖部分２ｂを有し、他端部に二本鎖部分２ｃを有する修飾核酸分子１が得られる。
【００２７】
本実施形態に係る修飾核酸分子は、後述するとおり、修飾核酸分子の一本鎖部分に含まれる塩基配列と相補的な塩基配列を有する標的核酸分子の検出用又は分離用として好適に用いられる。また、本実施形態に係る修飾核酸分子は、二つのナノ粒子を備えているため、標的核酸分子の検出又は分離の際に、表面増強（共鳴）ラマン散乱を利用することができる。
【００２８】
続いて、本実施形態に係る標的核酸分子の検出方法について説明する。本実施形態に係る標的核酸分子の検出方法は、修飾核酸分子を用いた標的核酸分子の検出方法であって、修飾核酸分子として、核酸分子と、核酸分子に結合している少なくとも二つのナノ粒子と、を備え、核酸分子が、核酸分子における一のナノ粒子の結合位置と他のナノ粒子の結合位置との間に、標的核酸分子の塩基配列と相補的な塩基配列を含む１５ｍｅｒ以上の一本鎖部分を有する修飾核酸分子を用い、修飾核酸分子と標的核酸分子とをハイブリダイズさせることにより複合体を形成させ、修飾核酸分子の凝集速度と複合体の凝集速度との違いに基づいて標的核酸分子を検出する。
【００２９】
図３は、標的核酸分子の検出方法の一実施形態を示す模式図である。まず、検出対象となる標的核酸分子６を含む試料に修飾核酸分子１を添加する（図３（ａ））。修飾核酸分子１は、一本鎖部分２ａに標的核酸分子６の塩基配列と相補的な塩基配列を有している。
【００３０】
続いて、溶液中で修飾核酸分子１と標的核酸分子６とを混合し、５０℃程度で反応させる。このとき、溶液としては例えばハイブリダイゼーション緩衝液（例えば塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液）を用いることができる。これにより、修飾核酸分子１の一本鎖部分２ａと標的核酸分子６とが互いにハイブリダイズして二本鎖部分２ｄを形成する（図３（ｂ））。その結果、修飾核酸分子１と標的核酸分子６とから構成される複合体７が得られる。
【００３１】
この標的核酸分子の検出方法では、修飾核酸分子１は一本鎖部分２ａを有しているのに対し、複合体７は一本鎖部分を有していないため、複合体７の凝集速度が修飾核酸分子１の凝集速度に比べて著しく速くなる。したがって、修飾核酸分子１の凝集速度と複合体７の凝集速度との違いに基づいて、標的核酸分子６が存在しているか否かを検出できる。
【００３２】
また、複合体７の凝集速度は、複合体７の存在量（すなわち標的核酸分子６の存在量）に対応するため、溶液中での複合体７の凝集速度に基づいて、標的核酸分子６を定量的に検出できる。複合体７の凝集速度は、例えばナノ粒子３の吸収スペクトルが凝集状態によって変化することを利用して、当該吸収スペクトルを測定することにより求めることができる。
【００３３】
本実施形態に係る標的核酸分子の検出方法では、修飾核酸分子の凝集速度と複合体の凝集速度とが互いに異なれば、その違いに基づいて標的核酸分子を検出できる。したがって、修飾核酸分子の凝集速度と複合体の凝集速度とが互いに異なる限りにおいて、修飾核酸分子の一本鎖部分の長さは制限されないが、両者の凝集速度の違いを大きくできる観点から、一本鎖部分の長さと標的核酸分子の長さとが互いに同じであることが好ましい。また、一本鎖部分の長さが標的核酸分子の長さより長い場合は、同様の観点から、一本鎖部分の長さは、標的核酸分子の長さより好ましくは１０ｍｅｒ以下、より好ましくは５ｍｅｒ以下、更に好ましくは３ｍｅｒ以下、更により好ましくは２ｍｅｒ以下だけ長い。
【００３４】
修飾核酸分子の凝集速度と複合体の凝集速度との違いの検出は、例えば目視により行ってもよく、ナノ粒子の吸収スペクトルを測定することにより行ってもよい。ナノ粒子の吸収スペクトルを測定する場合、例えば、ナノ粒子が凝集しているときの吸収ピークにおける吸光度（ＯＤ）とナノ粒子が凝集していないときの吸収ピークにおける吸光度との比に基づいてナノ粒子の凝集速度（すなわち、修飾核酸分子及び複合体の凝集速度）を求めることにより、修飾核酸分子の凝集速度と複合体の凝集速度との違いを検出することができる。また、ナノ粒子の吸収スペクトルを測定した上で、上記のＯＤの比から、ナノ粒子の凝集反応が例えばｙ＝Ｃ×ｅｘｐ（−ｋｔ）で進むと近似して算出した速度定数ｋに基づいてナノ粒子の凝集速度（すなわち、修飾核酸分子及び複合体の凝集速度）を求めることにより、修飾核酸分子の凝集速度と複合体の凝集速度との違いを検出することもできる。
【００３５】
本実施形態に係る標的核酸分子の検出方法は、例えば、疾病診断において、体液中に存在するマイクロＲＮＡの検出に用いることができる。また、細菌やウイルス等の病原体由来の核酸検出によるキャリアーの早期発見、防疫や食品中に混入して中毒引き起こす病原体の検出に用いることができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３７】
［金ナノ粒子表面へのオリゴＤＮＡの担持］
金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）表面へのオリゴＤＮＡの担持は、基本的に非特許文献１，２に記載の方法に従って行った。具体的には、まず、以下の塩基配列を有するオリゴＤＮＡを準備した。なお、１３６２７−Ａ及び１３６２７−Ｍｉｄは、それぞれ５’端がチオール基で修飾されたオリゴＤＮＡである。
１３６２７−Ａ：
5'SH-GCGGCAATCAGGTTG3'（１５ｍｅｒ、配列番号１）
１３６２７−Ｍｉｄ：
5'SH-AGGTTGGTCGCAGTC3'（１５ｍｅｒ、配列番号２）
【００３８】
直径２０ｎｍの金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）懸濁液（純水）（ＢＢＩソリーションズ）１ｍＬ（７×１０１１個／ｍＬ）に対し、１３６２７−Ａを３ｎｍｏｌ加え、５０℃で一晩吸着させた。その後、最終濃度０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）となるように懸濁液を調製し、さらに５０℃で４０時間反応を継続した。反応終了後、マイクロチューブ用遠心機（トミー製、ＭＲ１５０）を用いて１４０００ｒｐｍで３０分間遠心し、ＡｕＮＰをペレットとして回収した。そのペレットに０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１ｍＬ加え、１４０００ｒｐｍで３０分間遠心しＡｕＮＰを洗浄した。さらに、もう一度同様に洗浄を繰り返し、最終的に懸濁液の容積を５００μＬにして標品とした。また、同様の手順で１３６２７−ＭｉｄをＡｕＮＰ表面に担持させた。
【００３９】
［ハイブリッド形成による凝集・沈殿の生成］
ＡｕＮＰに担持された１３６２７−Ａ、１３６２７−Ｍｉｄ（以下、「ＡｕＮＰ／１３６２７−Ａ」などという。）に対し、以下の塩基配列を有するオリゴＤＮＡとのハイブリダイゼーションの有無を調べた。
１３６２７−Ｃｏｍ：
5'GACTGCGACCAACCTAGCCTGCTATGATGTATAGCAGGCTACGGTCAACCTGATTGCCGC3'（６０ｍｅｒ、配列番号３）
１３６２７−ＣｏｍＳｈｏｒｔ：
5'GACTGCGACCAACCTCAACCTGATTGCCGC3'（３０ｍｅｒ、配列番号４）
【００４０】
以下の（１）〜（３）の条件で、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にオリゴＤＮＡ等を懸濁させた懸濁液を用意し、さらに、最終濃度が０．３Ｍ塩化ナトリウムになるように調製した。その混合液を５０℃で３０分間反応させた。その後、沈殿の程度を目視で確認した。図４は、各条件におけるオリゴＤＮＡの状態を示す模式図、及び懸濁液における沈殿の様子を示す図である。
【００４１】
（１）ＡｕＮＰ／１３６２７−Ａ及びＡｕＮＰ／１３６２７−Ｍｉｄのみが存在しており、当該オリゴＤＮＡと相補的な塩基配列を有するオリゴＤＮＡを加えなかった（図４（ａ））。
（２）ＡｕＮＰ／１３６２７−Ａ及びＡｕＮＰ／１３６２７−Ｍｉｄの存在下で、１３６２７−Ａの塩基配列と１３６２７−Ｍｉｄの塩基配列とを縦列につないだ塩基配列と相補的な塩基配列を有する１３６２７−ＣｏｍＳｈｏｒｔを加えた（図４（ｂ））。
（３）ＡｕＮＰ／１３６２７−Ａ及びＡｕＮＰ／１３６２７−Ｍｉｄの存在下で、一端に１３６２７−Ａの塩基配列と相補的な塩基配列、他端に１３６２７−Ｍｉｄの塩基配列と相補な塩基配列を有する全長６０ｍｅｒの１３６２７−Ｃｏｍを加えた（図４（ｃ））。
【００４２】
（１）の条件では、沈殿は生じなかった。一方、（２）の条件では、１３６２７−Ａ及び１３６２７−Ｍｉｄと１３６２７−ＣｏｍＳｈｏｒｔとのハイブリダイゼーションにより、即座に沈殿が生じた。また、（３）の条件では、１３６２７−Ａ及び１３６２７−Ｍｉｄと１３６２７−Ｃｏｍとのハイブリダイゼーションによる沈殿が生じるまで一晩（１８時間）程度かかり、（２）の条件と比較して沈殿速度が極めて遅いことが分かった。
【００４３】
次に、条件（４）として、上記（３）の条件で生成した、１３６２７−Ｃｏｍの一端にＡｕＮＰ／１３６２７−Ａがハイブリダイズし、他端にＡｕＮＰ／１３６２７−Ｍｉｄがハイブリダイズした修飾核酸分子（図４（ｃ））を含む懸濁液に、以下の塩基配列を有する１３６２７−Ｚｅを加えた（図５（ａ））。なお、１３６２７−Ｚｅは、１３６２７−Ｃｏｍの中央部分３０ｍｅｒの塩基配列と相補的な塩基配列を有している。
１３６２７−Ｚｅ：
5'ACCGTAGCCTGCTATACATCATAGCAGGCT3'（３０ｍｅｒ、配列番号５）
【００４４】
この場合、１３６２７−Ｚｅが１３６２７−Ｃｏｍの中央部分３０ｍｅｒとハイブリダイズすることによって沈殿が生じた（図５（ｂ））。
【００４５】
また、条件（５）として、条件（２）における１３６２７−Ｃｏｍに代えて以下の塩基配列を有する１３８２８−Ｃｏｍを用いて同様の実験を行った（図５（ｃ））。
１３８２８−Ｃｏｍ：
5'AGCCTGCTATGATGTGACTGCGACCAACCTCAACCTGATTGCCGCATAGCAGGCTACGGT3'（６０ｍｅｒ、配列番号６）
【００４６】
つまり、条件（２）では、ハイブリダイズ後の核酸分子における一本鎖部分がナノ粒子間に存在していたが、条件（５）では、ハイブリダイズ後の核酸分子において一本鎖部分が両端に存在するように設計されている。条件（５）の場合、条件（４）の場合と同程度の速度で沈殿が生じた。条件（１）〜（５）の沈殿速度を比較すると、以下のようになる。
（２）≒（４）≒（５）＞＞（３）＞＞＞（１）
【００４７】
［ハイブリダイズするオリゴＤＮＡの長さによる沈殿速度の相違］
ＡｕＮＰ／１３６２７−Ａ及び１３６２７−Ｍｉｄ担持ＡｕＮＰを含む懸濁液に、以下の（６）〜（８）のオリゴＤＮＡを加え、５０℃で３０分間反応させた。その後、沈殿の程度を目視で確認した。
【００４８】
（６）一端に１３６２７−Ａの塩基配列と相補的な塩基配列、他端に１３６２７−Ｍｉｄの塩基配列と相補な塩基配列を有する１３９１８−Ｃｏｍ２０（図６（ａ））：
5'GACTGCGACCAACCTGCTATGATGTATAGCAGGCTCAACCTGATTGCCGC3'（５０ｍｅｒ、配列番号７）
（７）一端に１３６２７−Ａの塩基配列と相補的な塩基配列、他端に１３６２７−Ｍｉｄの塩基配列と相補な塩基配列を有する１３９１８−Ｃｏｍ１０（図６（ｂ））：
5'GACTGCGACCAACCTGATGTATAGCCAACCTGATTGCCGC3'（４０ｍｅｒ、配列番号８）
（８）一端に１３６２７−Ａの塩基配列と相補的な塩基配列、他端に１３６２７−Ｍｉｄの塩基配列と相補な塩基配列を有する１３９１８−Ｃｏｍ１（図６（ｃ））：
5'GACTGCGACCAACCTACAACCTGATTGCCGC3'（３１ｍｅｒ、配列番号９）
【００４９】
条件（７），（８）では、即座に沈殿が生じたのに対し、条件（６）では、条件（７），（８）に比べて著しく沈殿速度が遅かった。
【００５０】
次に、上記の条件（６）で生成した、１３６２７−Ａの一端にＡｕＮＰ／１３６２７−Ａがハイブリダイズし、他端にＡｕＮＰ／１３６２７−Ｍｉｄがハイブリダイズした修飾核酸分子（図６（ａ））を含む懸濁液に、以下の１３９１８−Ｃｏｍ２０Ｚｅを加えた（条件（９）、図６（ｄ））。なお、１３９１８−Ｃｏｍ２０Ｚｅは、１３９１８−Ｃｏｍ２０の中央部分２０ｍｅｒの塩基配列と相補的な塩基配列を有している。
１３９１８−Ｃｏｍ２０Ｚｅ：
5'AGCCTGCTATACATCATAGC3'（２０ｍｅｒ、配列番号１０）
【００５１】
条件（８）の場合、沈殿が生じた。条件（６）〜（９）における沈殿速度を比較すると、以下のようになった。
（７）≒（８）≒（９）＞＞＞（６）
【００５２】
以上より、修飾核酸分子が所定の長さの一本鎖部分を有する場合、沈殿速度が著しく遅くなることが分かった。これにより、所定の長さを持つ標的核酸分子を精度良く検出できることが示された。これは、マイクロＲＮＡ等の検出を精度良く行うことができることを意味している。
【００５３】
［標的核酸分子の長さによる沈殿速度の相違］
上記（３）の条件で生成した、１３６２７−Ｃｏｍの一端にＡｕＮＰ／１３６２７−Ａがハイブリダイズし、他端にＡｕＮＰ／１３６２７−Ｍｉｄがハイブリダイズした修飾核酸分子（図４（ｃ））を含む懸濁液に、以下の（１０）〜（１３）の長さの異なるオリゴＤＮＡを加えた。なお、各オリゴＤＮＡは、上記の修飾核酸分子の中央部分の塩基配列と相補的な塩基配列を有している。
【００５４】
（１０）１３６２７−Ｚｅ（図７（ａ））：
5'ACCGTAGCCTGCTATACATCATAGCAGGCT3'（３０ｍｅｒ、配列番号５）
（１１）１３６２７−Ｚｅ２８（図７（ｂ））：
5'CCGTAGCCTGCTATACATCATAGCAGGC3'（２８ｍｅｒ、配列番号１１）
（１２）１３６２７−Ｚｅ２４（図７（ｃ））：
5'GTAGCCTGCTATACATCATAGCAG3'（２４ｍｅｒ、配列番号１２）
（１３）１３６２７−Ｚｅ２０（図７（ｄ））：
5'AGCCTGCTATACATCATAGC3'（２０ｍｅｒ、配列番号１３）
【００５５】
条件（１０）〜（１３）では、いずれも沈殿が生じたが、沈殿速度は以下のようになった。
（１０）＞（１１）＞（１２）＞（１３）
【００５６】
［凝集速度の定量化］
凝集の度合いを定量化するに当たり、Zhao, W, et al. DNA aptamer folding on gold nanoparticles: fromcolloid chemistry to biosensors. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 3610-3618を参考とした。まず、吸光光度分光計（島津製作所  型番：UV-2500PC）を用いて水中でのＡｕＮＰの凝集に伴う吸収スペクトルの変化を測定した。図８に示すように、凝集前のＡｕＮＰ（図８のＬ１）は５２０ｎｍ付近に吸収ピークを有するのに対して、ＡｕＮＰの凝集が進行すると共に、徐々に６００〜７００ｎｍ付近に吸収ピークが現れる（図８のＬ２）。そして、さらに凝集が進行すると、６００〜７００ｎｍ付近の吸収ピークが５２０ｎｍの吸収ピークより大きくなる（図８のＬ３）。なお、図８には、水の吸収スペクトルも併せて示した。
【００５７】
以上のことから、ＡｕＮＰを含む懸濁液の５２０ｎｍ及び６００ｎｍにおける吸光度を測定し、５２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ５２０）と６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）との比（ＯＤ６００／ＯＤ５２０）を算出することによって、ＡｕＮＰの凝集の程度を定量化できることが分かった。
【００５８】
上記条件（３）と同様に、ＡｕＮＰ／１３６２７−Ａ及びＡｕＮＰ／１３６２７−Ｍｉｄを１３６２７−Ｃｏｍにハイブリダイズさせた修飾核酸分子を含む懸濁液を準備した。この懸濁液に、１３６２７−Ｃｏｍの中央部分の塩基配列と相補的な塩基配列を有する１３６２７−Ｚｅを加え、１３６２７−Ｚｅの最終濃度が５．５ｎＭ、２７．５ｎＭ、２７５ｎＭ、１３７５ｎＭである４種類の測定試料を作製した。また、標準試料として、１３６２７−Ｚｅの代わりに水を加えた試料を作製した。そして、作製した試料を３８４ウェルプレートに分注した。
【００５９】
ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ｉ３（モレキュラー・デバイス社）を４２℃に予め加温し、測定試料及び標準試料の５２０ｎｍ及び６００ｎｍでの吸光度を２分間隔で測定した。なお、バックグラウンドとして、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に最終濃度０．３Ｍ塩化ナトリウムを添加した緩衝液の吸光度を測定し、測定した試料の吸光度より減算した。そして、測定試料及び標準試料についてＯＤ６００／ＯＤ５２０を算出し、測定試料それぞれのＯＤ６００／ＯＤ５２０から標準試料のＯＤ６００／ＯＤ５２０を減算することで、各測定試料についてΔＯＤを求めた。なお、ΔＯＤの算出に用いる波長は、６００ｎｍと５２０ｎｍとの組み合わせに限らない。図８に示すように、ＡｕＮＰの凝集前後で吸光スペクトルの変化が生じる波長であれば任意に選ぶことができる。
【００６０】
図９は、１３６２７−Ｚｅの濃度が異なる各測定試料のΔＯＤの変化を示す図である。また、図１０，１１は、それぞれＡｕＮＰとして直径４０ｎｍ，６０ｎｍのＡｕＮＰを用い、上記と同様にΔＯＤの変化を測定した結果を示す図である。ＡｕＮＰとして直径４０ｎｍのＡｕＮＰを用いた場合、１３６２７−Ｚｅの最終濃度が０．５ｎＭ、２．７ｎＭ、５．５ｎＭ、１４ｎＭ、２７ｎＭ、１３７ｎＭである６種類の測定試料を作製した。ＡｕＮＰとして直径６０ｎｍのＡｕＮＰを用いた場合、１３６２７−Ｚｅの最終濃度が０．５ｎＭ、５．５ｎＭ、１４ｎＭ、２７ｎＭ、６８ｎＭである５種類の測定試料を作製した。図９〜１１に示されるように、１３６２７−Ｚｅの濃度が高いほど、ΔＯＤの上昇速度（すなわち、ＡｕＮＰの凝集速度）が大きくなることが分かった。
【００６１】
ここで、図９〜１１で得られたプロファイルはＡｕＮＰの凝集を反映しているが、そのＡｕＮＰの凝集速度を定量化するための指標が必要となる。そこで、単位時間当たりのΔОＤの変化を反映する量である単位時間あたりのΔＯＤの面積をＡｕＮＰの凝集速度の指標として採用する。
【００６２】
例えば単位時間を２０分、３０分、６０分として、時間０分から各単位時間までにおけるプロファイルと時間軸とで囲まれる面積を１３６２７−Ｚｅの濃度それぞれについて算出すると、ＡｕＮＰの直径が２０ｎｍ，４０ｎｍ，６０ｎｍの場合、それぞれ表１，２，３に示すとおりとなった。
【００６３】
【表１】
2015188322.tif 000003
【００６４】
【表２】
2015188322.tif 000004
【００６５】
【表３】
2015188322.tif 000005
【００６６】
横軸に１３６２７−Ｚｅの濃度の対数をとり、縦軸に表１〜３に示す面積をとると、ＡｕＮＰの直径が２０ｎｍ，４０ｎｍ，６０ｎｍの場合それぞれ図１２〜１４に示すとおりとなった。ＡｕＮＰの直径が２０ｎｍ，４０ｎｍ，６０ｎｍの場合を互いに比較すると、標的核酸分子が低濃度の場合は、大きな直径のＡｕＮＰを用いるとΔＯＤが大きくなり、検出感度を向上させることが可能であることが分かった。
【００６７】
また、核酸分子同士のハイブリッド形成過程をモデル化して凝集速度を定量化する方法もある。例えば、ＡｕＮＰの凝集速度を定量化するために、ＡｕＮＰの凝集を下記式で表される反応であるとみなす。
［Ａ］＋［Ｂ］→［ＡＢ］
【００６８】
さらに、反応初期では［ＡＢ］（凝集したＡｕＮＰ）の濃度が低いと考えられるので、この反応は、０次近似としてｙ＝Ｃ×ｅｘｐ（−ｋｔ）とみなすことができる。そこで、ΔＯＤの対数を取り、直線とみなせる領域で回帰分析によりｋを算出した。なお、ｋの単位は、濃度の逆数とｍｉｎ−１との積となるが、本実施例ではＯＤ５２０で濃度を規格化しているので、ｋの単位をｍｉｎ−１とみなすことができる。ＡｕＮＰとして直径２０ｎｍのＡｕＮＰを用いた場合の各測定試料について算出されたｋは表４のとおりとなった。
【００６９】
【表４】
2015188322.tif 000006
【００７０】
なお、ＡｕＮＰの凝集速度を解析する方法はとしては、これらに限定されるものではなく、これ以外により精緻なモデルを用いて解析する方法であってもよい。例えば、この目的のために、核酸のハイブリダイゼーション反応をモデル化し、非線形最小二乗法を用いて解析することができる。
【００７１】
［ＡｕＮＰの直径と凝集速度との関係］
上記と同様に、ＡｕＮＰ／１３６２７−Ａ及びＡｕＮＰ／１３６２７−Ｍｉｄを１３６２７−Ｃｏｍにハイブリダイズさせた修飾核酸分子を含む懸濁液を準備した。この懸濁液に、１３６２７−Ｃｏｍの中央部分の塩基配列と相補的な塩基配列を有する１３６２７−Ｚｅを加えた。ただし、ＡｕＮＰ／１３６２７−Ａ及びＡｕ／１３６２７−ＭｉｄのＡｕＮＰとして、直径２０ｎｍ、４０ｎｍ、６０ｎｍのＡｕＮＰを用いた。そして、修飾核酸分子における二つのＡｕＮＰの直径の組合せが２０ｎｍ−２０ｎｍ、２０ｎｍ−４０ｎｍ、２０ｎｍ−６０ｎｍ、４０ｎｍ−４０ｎｍ、４０ｎｍ−６０ｎｍ及び６０ｎｍ−６０ｎｍの測定試料をそれぞれ用意した。
【００７２】
上記の各測定試料について上記と同様の吸光度測定を行った。図１５は、各測定試料のΔＯＤの変化示す図である。また、各測定試料について上記と同様にして、２０分間、３０分間、６０分間を単位時間としたときの単位時間当たりのΔＯＤの面積を算出したところ、表５の示すとおりの結果となった。
【００７３】
【表５】
2015188322.tif 000007
【００７４】
図１５及び表５に示されるように、ＡｕＮＰの直径を変更した場合でもハイブリダイゼーションによる凝集が生じることが確認された。
【００７５】
［ＡｕＮＰの直径及び修飾核酸分子の長さと凝集速度との関係］
１３６２７−Ｃｏｍの代わりに１３９１８−Ｃｏｍ２０（５０ｍｅｒ）を用い、１３６２７−Ｚｅの代わりに１３９１８−Ｃｏｍ２０Ｚｅ（２０ｍｅｒ）を用いた以外は、上記［ＡｕＮＰの直径と凝集速度との関係］と同様にして、ΔＯＤの変化を測定した。なお、修飾核酸分子における二つのＡｕＮＰの直径の組合せは、２０ｎｍ−２０ｎｍ、４０ｎｍ−４０ｎｍ及び６０ｎｍ−６０ｎｍとした。結果を図１６示す。また、図１６には、１３６２７−Ｃｏｍ及び１３６２７−Ｚｅを用い、かつ修飾核酸分子における二つのＡｕＮＰの直径の組合せが４０ｎｍ−４０ｎｍである場合のデータを併せて示した。
【００７６】
１３９１８−Ｃｏｍ２０を用いた場合、凝集に伴うΔＯＤの上昇が見られるものの、１０分程度でΔＯＤの低下が観察された。これは、１３９１８−Ｃｏｍ２０Ｚｅを加えなくても修飾核酸分子が凝集したことによるものと推察される。つまり、１３６２７−Ｃｏｍを用いた場合でも相補的な塩基配列を有する核酸分子を加えなくても一定時間後には凝集が見られるが、１３９１８−Ｃｏｍ２０を用いた場合、その時間が１３６２７−Ｃｏｍを用いた場合と比較してかなり短いことが示唆される。
【符号の説明】
【００７７】
１…修飾核酸分子、２…核酸分子、２ａ…一本鎖部分、２ｂ，２ｃ，２ｄ…二本鎖部分、３…ナノ粒子、４ａ，４ｂ，４ｃ…オリゴＤＮＡ、５ａ，５ｂ…担持オリゴＤＮＡ、６…標的核酸分子、７…複合体。
【図１】
2015188322.tif 000008
【図２】
2015188322.tif 000009
【図３】
2015188322.tif 000010
【図８】
2015188322.tif 000011
【図９】
2015188322.tif 000012
【図１０】
2015188322.tif 000013
【図１１】
2015188322.tif 000014
【図１２】
2015188322.tif 000015
【図１３】
2015188322.tif 000016
【図１４】
2015188322.tif 000017
【図１５】
2015188322.tif 000018
【図１６】
2015188322.tif 000019
【図４】
2015188322.tif 000020
【図５】
2015188322.tif 000021
【図６】
2015188322.tif 000022
【図７】
2015188322.tif 000023
【配列表】
2015188322000001.app