(57)【要約】【課題】  2種以上の検出対象生物を同時に、迅速かつ正確に検出することができる検出方法およびキットを提供する。【解決手段】  本発明は、2種以上の検出対象生物のそれぞれに対応する2種以上のオリゴマーセットを同時に用いて、検出対象試料を鋳型としてリガーゼ連鎖反応を行うリガーゼ連鎖反応工程と、前記リガーゼ連鎖反応による各オリゴマーセット由来の増幅DNA断片の有無を検出する検出工程とを含み、前記オリゴマーセットが、対応する検出対象生物の任意の一塩基多型（SNP）を挟んで設計したリガーゼ連鎖反応のための4つのオリゴマーにより構成される、2種以上の検出対象生物を同時に検出する方法を提供する。【選択図】      図2
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
2種以上の検出対象生物のそれぞれに対応する2種以上のオリゴマーセットを同時に用いて、検出対象試料を鋳型としてリガーゼ連鎖反応を行うリガーゼ連鎖反応工程と、
前記リガーゼ連鎖反応による各オリゴマーセット由来の増幅DNA断片の有無を検出する検出工程と
を含み、
前記オリゴマーセットは、対応する検出対象生物の任意の一塩基多型（SNP）を挟んで設計したリガーゼ連鎖反応のための4つのオリゴマーにより構成される、
2種以上の検出対象生物を同時に検出する方法。
【請求項２】
前記4つのオリゴマーが、
（＋）鎖における前記SNP部位の5’側の領域に相補的な配列からなる第一のオリゴマー；
前記（＋）鎖における前記SNP部位の3’側の領域に相補的な配列からなる第二のオリゴマー；
（−）鎖における前記SNP部位の3’側の領域に相補的な配列からなる第三のオリゴマー；および
前記（−）鎖における前記SNP部位の5’側の領域に相補的な配列からなる第四のオリゴマー
であり、
第一のオリゴマーおよび第二のオリゴマーのいずれか一方は前記SNP部位の塩基を含み、かつ
第三のオリゴマーおよび第四のオリゴマーのいずれか一方は前記SNP部位の塩基を含む、
請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記検出対象生物がファイトプラズマであり、前記検出対象試料が植物体由来のDNA試料である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記検出対象生物が、ファイトプラズマ・マリ（Phytoplasma mali）、ファイトプラズマ・プルノラム（Phytoplasma prunorum）、ファイトプラズマ・ピリ（Phytoplasma pyri）、ファイトプラズマ・プルニ（Phytoplasma pruni）、ファイトプラズマ・オランティフォリア（Phytoplasma aurantifolia）、ファイトプラズマ・ヴィチス（Phytoplasma vitis）、ファイトプラズマ・キャスタネアエ（Phytoplasma castaneae）およびファイトプラズマ・フォエニシウム（Phytoplasma phoenicium）、並びにファイトプラズマ・マリ、ファイトプラズマ・ピリおよびファイトプラズマ・プルノラムにより構成される16SrXグループからなる群より選択される少なくとも2種であり、
前記SNPが、ファイトプラズマ・マリの16S rDNA（配列番号1）の第308塩基、第402塩基、第560塩基、第617塩基もしくは第1398塩基、ファイトプラズマ・プルノラムの16S rDNA（配列番号2）の第178塩基、第415塩基、第1090塩基もしくは第1400塩基、ファイトプラズマ・ピリの16S rDNA（配列番号3）の第203塩基、第258塩基もしくは第678塩基、ファイトプラズマ・ピリPD-TW株の16S rDNA（配列番号4）の第179塩基、第396塩基もしくは第1224塩基、ファイトプラズマ・プルニの16S rDNA（配列番号5）の第167塩基、第182塩基、第195塩基、第202塩基、第230塩基、第448塩基、第461塩基、第462塩基、第823塩基、第828塩基、第975塩基、第1017塩基、第1218塩基、第1221塩基、第1267塩基、第1270塩基、第1418塩基、第1437塩基もしくは第1462塩基、ファイトプラズマ・オランティフォリアの16S rDNA（配列番号6）の第429塩基、第441塩基、第442塩基、第443塩基、第450塩基、第453塩基、第454塩基、第458塩基、第459塩基、第464塩基、第473塩基、第572塩基、第575塩基、第582塩基、第583塩基、第588塩基、第593塩基、第594塩基、第613塩基、第619塩基、第627塩基、第629塩基、第630塩基、第650塩基、第718塩基、第945塩基、第972塩基、第985塩基、第986塩基、第990塩基、第996塩基、第1014塩基、第1080塩基、第1174塩基、第1226塩基、第1240塩基、第1248塩基、第1256塩基もしくは第1258塩基、ファイトプラズマ・ヴィチスの16S rDNA（配列番号7）の第186塩基、第206塩基、第554塩基、第557塩基、第622塩基、第761塩基、第982塩基、第1019塩基、第1028塩基、第1080塩基、第1084塩基、第1104塩基、第1159塩基、第1205塩基、第1207塩基、第1217塩基、第1250塩基、第1337塩基、第1359塩基、第1430塩基もしくは第1443塩基、ファイトプラズマ・キャスタネアエの16S rDNA（配列番号8）の第63塩基、第124塩基、第125塩基、第151塩基、第152塩基、第230塩基、第246塩基、第260塩基、第276塩基、第461塩基、第462塩基、第485塩基、第577塩基、第585塩基、第595塩基、第596塩基、第620塩基、第629塩基、第882塩基、第905塩基、第907塩基、第987塩基、第996塩基、第1122塩基、第1142塩基、第1155塩基、第1220塩基、第1328塩基、第1399塩基、第1400塩基、第1401塩基、第1424塩基、第1429塩基、第1431塩基もしくは第1452塩基、およびファイトプラズマ・フォエニシウムの16S rDNA（配列番号9）の第336塩基、第377塩基、第414塩基、第445塩基、第573塩基、第590塩基、第803塩基、第804塩基、第964塩基、第983塩基、第996塩基、第1083塩基、第1098塩基、第1216塩基、第1217塩基もしくは第1380塩基、並びに前記16SrXグループを識別するための配列番号3の第126塩基、第136塩基、第137塩基、第189塩基、第190塩基、第192塩基、第193塩基、第205塩基、第209塩基、第219塩基、第289塩基、第308塩基、第438塩基、第439塩基、第449塩基、第453塩基、第500塩基、第513塩基、第534塩基、第584塩基、第603塩基、第604塩基、第696塩基、第701塩基、第807塩基、第818塩基、第821塩基、第1049塩基、第1093塩基、第1097塩基、第1100塩基、第1114塩基、第1241塩基、第1298塩基、第1331塩基、第1398塩基、第1413塩基もしくは第1416塩基からなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅DNA断片のサイズが、前記オリゴマーセット毎に異なり、前記検出工程において前記リガーゼ連鎖反応により増幅したDNA断片のサイズを検出することによって前記増幅DNA断片の有無を検出する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴマーセットを構成する4つのオリゴマーの少なくとも1つが標識分子によって標識され、
前記検出工程において前記リガーゼ連鎖反応により増幅したDNA断片の標識分子を検出することによって前記増幅DNA断片の有無を検出する、
請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
2種以上の検出対象生物のそれぞれに対応する2種以上のオリゴマーセットを含み、
前記オリゴマーセットが、対応する検出対象生物の任意の一塩基多型（SNP）を挟んで設計したリガーゼ連鎖反応のための4つのオリゴマーにより構成される、2種以上の検出対象生物を同時に検出するためのキット。
【請求項８】
前記4つのオリゴマーが、
（＋）鎖における前記SNP部位の5’側の領域に相補的な配列からなる第一のオリゴマー；
前記（＋）鎖における前記SNP部位の3’側の領域に相補的な配列からなる第二のオリゴマー；
（−）鎖における前記SNP部位の3’側の領域に相補的な配列からなる第三のオリゴマー；および
前記（−）鎖における前記SNP部位の5’側の領域に相補的な配列からなる第四のオリゴマー
であり、
第一のオリゴマーおよび第二のオリゴマーのいずれか一方は前記SNP部位の塩基を含み、かつ
第三のオリゴマーおよび第四のオリゴマーのいずれか一方は前記SNP部位の塩基を含む、
請求項7に記載のキット。
【請求項９】
前記検出対象生物がファイトプラズマであり、前記検出対象試料が植物体由来のDNA試料である、請求項7または8に記載のキット。
【請求項１０】
前記検出対象生物が、ファイトプラズマ・マリ（Phytoplasma mali）、ファイトプラズマ・プルノラム（Phytoplasma prunorum）、ファイトプラズマ・ピリ（Phytoplasma pyri）、ファイトプラズマ・プルニ（Phytoplasma pruni）、ファイトプラズマ・オランティフォリア（Phytoplasma aurantifolia）、ファイトプラズマ・ヴィチス（Phytoplasma vitis）、ファイトプラズマ・キャスタネアエ（Phytoplasma castaneae）およびファイトプラズマ・フォエニシウム（Phytoplasma phoenicium）、並びにファイトプラズマ・マリ、ファイトプラズマ・ピリおよびファイトプラズマ・プルノラムにより構成される16SrXグループからなる群より選択される少なくとも2種であり、
前記SNPが、ファイトプラズマ・マリの16S rDNA（配列番号1）の第308塩基、第402塩基、第560塩基、第617塩基もしくは第1398塩基、ファイトプラズマ・プルノラムの16S rDNA（配列番号2）の第178塩基、第415塩基、第1090塩基もしくは第1400塩基、ファイトプラズマ・ピリの16S rDNA（配列番号3）の第203塩基、第258塩基もしくは第678塩基、ファイトプラズマ・ピリPD-TW株の16S rDNA（配列番号4）の第179塩基、第396塩基もしくは第1224塩基、ファイトプラズマ・プルニの16S rDNA（配列番号5）の第167塩基、第182塩基、第195塩基、第202塩基、第230塩基、第448塩基、第461塩基、第462塩基、第823塩基、第828塩基、第975塩基、第1017塩基、第1218塩基、第1221塩基、第1267塩基、第1270塩基、第1418塩基、第1437塩基もしくは第1462塩基、ファイトプラズマ・オランティフォリアの16S rDNA（配列番号6）の第429塩基、第441塩基、第442塩基、第443塩基、第450塩基、第453塩基、第454塩基、第458塩基、第459塩基、第464塩基、第473塩基、第572塩基、第575塩基、第582塩基、第583塩基、第588塩基、第593塩基、第594塩基、第613塩基、第619塩基、第627塩基、第629塩基、第630塩基、第650塩基、第718塩基、第945塩基、第972塩基、第985塩基、第986塩基、第990塩基、第996塩基、第1014塩基、第1080塩基、第1174塩基、第1226塩基、第1240塩基、第1248塩基、第1256塩基もしくは第1258塩基、ファイトプラズマ・ヴィチスの16S rDNA（配列番号7）の第186塩基、第206塩基、第554塩基、第557塩基、第622塩基、第761塩基、第982塩基、第1019塩基、第1028塩基、第1080塩基、第1084塩基、第1104塩基、第1159塩基、第1205塩基、第1207塩基、第1217塩基、第1250塩基、第1337塩基、第1359塩基、第1430塩基もしくは第1443塩基、ファイトプラズマ・キャスタネアエの16S rDNA（配列番号8）の第63塩基、第124塩基、第125塩基、第151塩基、第152塩基、第230塩基、第246塩基、第260塩基、第276塩基、第461塩基、第462塩基、第485塩基、第577塩基、第585塩基、第595塩基、第596塩基、第620塩基、第629塩基、第882塩基、第905塩基、第907塩基、第987塩基、第996塩基、第1122塩基、第1142塩基、第1155塩基、第1220塩基、第1328塩基、第1399塩基、第1400塩基、第1401塩基、第1424塩基、第1429塩基、第1431塩基もしくは第1452塩基、およびファイトプラズマ・フォエニシウムの16S rDNA（配列番号9）の第336塩基、第377塩基、第414塩基、第445塩基、第573塩基、第590塩基、第803塩基、第804塩基、第964塩基、第983塩基、第996塩基、第1083塩基、第1098塩基、第1216塩基、第1217塩基もしくは第1380塩基、並びに前記16SrXグループを識別するための配列番号3の第126塩基、第136塩基、第137塩基、第189塩基、第190塩基、第192塩基、第193塩基、第205塩基、第209塩基、第219塩基、第289塩基、第308塩基、第438塩基、第439塩基、第449塩基、第453塩基、第500塩基、第513塩基、第534塩基、第584塩基、第603塩基、第604塩基、第696塩基、第701塩基、第807塩基、第818塩基、第821塩基、第1049塩基、第1093塩基、第1097塩基、第1100塩基、第1114塩基、第1241塩基、第1298塩基、第1331塩基、第1398塩基、第1413塩基もしくは第1416塩基からなる群より選択される、請求項9に記載のキット。
【請求項１１】
耐熱性DNAリガーゼをさらに含む、請求項7〜10のいずれか1項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、2種以上の検出対象生物を同時に検出する方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ファイトプラズマは、植物の篩部組織に寄生する病原細菌である。ファイトプラズマは、培養が成功しておらず、その生態については不明な点が多い。ファイトプラズマは、果樹および花きを含む様々な農作物に感染することが報告されており、感染することにより葉の黄化、萎縮および叢生、果実の萎縮、品質低下、並びに樹体の枯死等を引き起こす。
【０００３】
欧州の果樹、並びにアフリカおよびカリブのココヤシなどでは、ファイトプラズマ感染による経済的被害が大きく深刻化している。たとえば2001年にドイツおよびイタリアで激発したリンゴのファイトプラズマ病では、それぞれ2500万ユーロおよび1億ユーロにも及ぶ被害が生じた（Strauss, 2009）。
【０００４】
日本国内においては樹木のキリおよび花きのアジサイ等へのファイトプラズマ感染が知られている。一方、欧米等において大きな被害をもたらしているリンゴ、ナシ、ブドウおよびモモ等の果樹に感染するファイトプラズマは、日本国内にはまだ侵入しておらず、そのため輸入検疫により対象植物が厳しく検査されている。
【０００５】
従来のファイトプラズマの検出方法は、主にPCR法によるものであり、広範なファイトプラズマを対象としたプライマーセットを用いたPCR法が報告されている（Heinrich et al., 2001; Deng and Hiruki, 1991）。このPCR法によって得られた増幅断片が真にファイトプラズマ由来のものであるか、さらにどの種もしくは病原グループであるかを特定するために、増幅断片の塩基配列を解読する方法、およびRFLP法（制限酵素断片長多型法）等の手法によってファイトプラズマ特有のバンドパターンまたは種もしくは病原グループごとの特有のバンドパターンを確認する方法が従来知られている（Sawayanagi et al., 1999; Martini and Lee, 2013）。
【０００６】
しかし、塩基配列解読には時間が掛かってしまい、検疫の場などで利用することが困難である。RFLP法では、必要な酵素にコストが掛かり、また処理時間について十分な検討が必要である等の欠点が挙げられる。さらに、複数の種もしくは病原グループのファイトプラズマが混合感染する場合があり、この場合には、塩基配列解読およびRFLP法のいずれによっても、混合しているファイトプラズマの全てを検出することが技術上不可能であり、検出が漏れてしまう危険性がある。
【０００７】
また、特許文献1には、ファイトプラズマの膜タンパク質に対する特異的抗体を用いて広範なファイトプラズマを検出する方法が開示されている。しかし、この方法は時間およびコストが掛かるため、検疫の場などで利用することが困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−２８１２５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
植物の輸入および輸出検疫では、新たなファイトプラズマが国内に侵入したり、輸出先に流出したりしないように、感染しているファイトプラズマの種もしくは病原グループを迅速かつ正確に検出することが求められている。また、国内においても、植物のファイトプラズマによる感染の有無を迅速に診断することによって、感染被害の拡大を抑える必要がある。
【００１０】
また、ファイトプラズマの種もしくは病原グループによっては、広範な宿主植物および媒介昆虫に感染・寄生するものがある。そのため、検査対象以外の植物種への二次感染を防ぐために、植物および媒介昆虫などに感染または寄生したファイトプラズマの種もしくは病原グループを個別に識別する必要がある。
【００１１】
しかし、上述したように、従来の方法では種もしくは病原グループを特定するのに時間やコストが掛かるという問題がある。また、複数の種もしくは病原グループのファイトプラズマが混合感染した場合に、従来の方法ではこれらのファイトプラズマのそれぞれを迅速かつ正確に検出することは不可能である。特に、広範なファイトプラズマを対象としたプライマーセットを用いたPCR法では擬陽性も多く、複数のファイトプラズマの種もしくは病原グループを一度に解析することはできない。
【００１２】
本発明は、上述した課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、2種以上の検出対象生物を同時に、迅速かつ正確に検出することができる検出方法およびキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために、ファイトプラズマの16S rDNA配列中の一塩基多型（SNP: Single Nucleotide Polymorphism）の違いを種間および病原グループ間で見出した。そして、このSNPの違いを利用したリガーゼ連鎖反応（ligase chain reaction：LCR；以下、「LCR」ともいう。）法によって、極めて近縁な種もしくは病原グループであっても高感度に識別できる方法を開発した。また、SNPsの違いによって設計された種々のオリゴマーを組み合わせて用いたLCR法を使用することにより、混合感染している場合であっても複数のファイトプラズマを同時に、迅速かつ正確に識別することが可能であることを見出した。そして、本発明者らは、これらの知見に基づき本発明を完成させた。
【００１４】
本発明は、2種以上の検出対象生物のそれぞれに対応する2種以上のオリゴマーセットを同時に用いて、検出対象試料を鋳型としてリガーゼ連鎖反応を行うリガーゼ連鎖反応工程と、上記リガーゼ連鎖反応による各オリゴマーセット由来の増幅DNA断片の有無を検出する検出工程とを含み、上記オリゴマーセットが、対応する検出対象生物の任意の一塩基多型（SNP）を挟んで設計したリガーゼ連鎖反応のための4つのオリゴマーにより構成される、2種以上の検出対象生物を同時に検出する方法を提供する。
【００１５】
また本発明は、2種以上の検出対象生物のそれぞれに対応する2種以上のオリゴマーセットを含み、上記オリゴマーセットが、対応する検出対象生物の任意の一塩基多型（SNP）を挟んで設計したリガーゼ連鎖反応のための4つのオリゴマーにより構成される、2種以上の検出対象生物を同時に検出するためのキットを提供する。
【００１６】
また本発明は、上記方法およびキットにおいて、上記4つのオリゴマーが、
（＋）鎖における上記SNP部位の5’側の領域に相補的な配列からなる第一のオリゴマー；
上記（＋）鎖における上記SNP部位の3’側の領域に相補的な配列からなる第二のオリゴマー；
（−）鎖における上記SNP部位の3’側の領域に相補的な配列からなる第三のオリゴマー；および
上記（−）鎖における上記SNP部位の5’側の領域に相補的な配列からなる第四のオリゴマー
であり、第一のオリゴマーおよび第二のオリゴマーのいずれか一方は上記SNP部位の塩基を含み、かつ第三のオリゴマーおよび第四のオリゴマーのいずれか一方は上記SNP部位の塩基を含む、方法およびキットを提供する。
【００１７】
また本発明は、上記方法およびキットにおいて、上記検出対象生物がファイトプラズマであり、上記検出対象試料が植物体由来のDNA試料である方法およびキットを提供する。
【００１８】
また本発明は、上記方法およびキットにおいて、上記検出対象生物が、ファイトプラズマ・マリ（Phytoplasma mali）、ファイトプラズマ・プルノラム（Phytoplasma prunorum）、ファイトプラズマ・ピリ（Phytoplasma pyri）、ファイトプラズマ・プルニ（Phytoplasma pruni）、ファイトプラズマ・オランティフォリア（Phytoplasma aurantifolia）、ファイトプラズマ・ヴィチス（Phytoplasma vitis）、ファイトプラズマ・キャスタネアエ（Phytoplasma castaneae）およびファイトプラズマ・フォエニシウム（Phytoplasma phoenicium）、並びにファイトプラズマ・マリ、ファイトプラズマ・ピリおよびファイトプラズマ・プルノラムにより構成される16SrXグループからなる群より選択される少なくとも2種であり、上記SNPが、ファイトプラズマ・マリの16S rDNA（配列番号1）の第308塩基、第402塩基、第560塩基、第617塩基もしくは第1398塩基、ファイトプラズマ・プルノラムの16S rDNA（配列番号2）の第178塩基、第415塩基、第1090塩基もしくは第1400塩基、ファイトプラズマ・ピリの16S rDNA（配列番号3）の第203塩基、第258塩基もしくは第678塩基、ファイトプラズマ・ピリPD-TW株の16S rDNA（配列番号4）の第179塩基、第396塩基もしくは第1224塩基、ファイトプラズマ・プルニの16S rDNA（配列番号5）の第167塩基、第182塩基、第195塩基、第202塩基、第230塩基、第448塩基、第461塩基、第462塩基、第823塩基、第828塩基、第975塩基、第1017塩基、第1218塩基、第1221塩基、第1267塩基、第1270塩基、第1418塩基、第1437塩基もしくは第1462塩基、ファイトプラズマ・オランティフォリアの16S rDNA（配列番号6）の第429塩基、第441塩基、第442塩基、第443塩基、第450塩基、第453塩基、第454塩基、第458塩基、第459塩基、第464塩基、第473塩基、第572塩基、第575塩基、第582塩基、第583塩基、第588塩基、第593塩基、第594塩基、第613塩基、第619塩基、第627塩基、第629塩基、第630塩基、第650塩基、第718塩基、第945塩基、第972塩基、第985塩基、第986塩基、第990塩基、第996塩基、第1014塩基、第1080塩基、第1174塩基、第1226塩基、第1240塩基、第1248塩基、第1256塩基もしくは第1258塩基、ファイトプラズマ・ヴィチスの16S rDNA（配列番号7）の第186塩基、第206塩基、第554塩基、第557塩基、第622塩基、第761塩基、第982塩基、第1019塩基、第1028塩基、第1080塩基、第1084塩基、第1104塩基、第1159塩基、第1205塩基、第1207塩基、第1217塩基、第1250塩基、第1337塩基、第1359塩基、第1430塩基もしくは第1443塩基、ファイトプラズマ・キャスタネアエの16S rDNA（配列番号8）の第63塩基、第124塩基、第125塩基、第151塩基、第152塩基、第230塩基、第246塩基、第260塩基、第276塩基、第461塩基、第462塩基、第485塩基、第577塩基、第585塩基、第595塩基、第596塩基、第620塩基、第629塩基、第882塩基、第905塩基、第907塩基、第987塩基、第996塩基、第1122塩基、第1142塩基、第1155塩基、第1220塩基、第1328塩基、第1399塩基、第1400塩基、第1401塩基、第1424塩基、第1429塩基、第1431塩基もしくは第1452塩基、およびファイトプラズマ・フォエニシウムの16S rDNA（配列番号9）の第336塩基、第377塩基、第414塩基、第445塩基、第573塩基、第590塩基、第803塩基、第804塩基、第964塩基、第983塩基、第996塩基、第1083塩基、第1098塩基、第1216塩基、第1217塩基もしくは第1380塩基、並びに前記16SrXグループを識別するための配列番号3の第126塩基、第136塩基、第137塩基、第189塩基、第190塩基、第192塩基、第193塩基、第205塩基、第209塩基、第219塩基、第289塩基、第308塩基、第438塩基、第439塩基、第449塩基、第453塩基、第500塩基、第513塩基、第534塩基、第584塩基、第603塩基、第604塩基、第696塩基、第701塩基、第807塩基、第818塩基、第821塩基、第1049塩基、第1093塩基、第1097塩基、第1100塩基、第1114塩基、第1241塩基、第1298塩基、第1331塩基、第1398塩基、第1413塩基もしくは第1416塩基からなる群より選択される方法およびキットを提供する。
【００１９】
また本発明は、上記方法において、上記増幅DNA断片のサイズが、上記オリゴマーセット毎に異なり、上記検出工程において上記リガーゼ連鎖反応により増幅したDNA断片のサイズを検出することによって上記増幅DNA断片の有無を検出する方法およびキットを提供する。
【００２０】
また本発明は、上記方法において、上記オリゴマーセットを構成する4つのオリゴマーの少なくとも1つが標識分子によって標識され、上記検出工程において上記リガーゼ連鎖反応により増幅したDNA断片の標識分子を検出することによって上記増幅DNA断片の有無を検出する方法およびキットを提供する。
【００２１】
また本発明は、上記キットにおいて、耐熱性DNAリガーゼをさらに含むキットを提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、2種以上の検出対象生物を同時に、迅速かつ正確に検出することができる。本発明を利用すれば、病原体の感染の有無および感染している病原体の種を迅速に検出することができる。本発明の方法は、種のレベルで病原体を同定することが可能である。また本発明であれば、複数の病原体に感染している場合であっても、それぞれの病原体の種を迅速に検出することができる。したがって、たとえば対象植物がファイトプラズマに感染しているかどうか、および感染しているファイトプラズマの種を迅速に診断することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施例において、PCR産物を電気泳動した結果を示す図。
【図２】本発明の一実施例において、LCR後の産物を電気泳動した結果を示す図。
【図３】本発明の一実施例において、LCR後の産物を電気泳動した結果を示す図。
【図４】本発明の一実施例において、LCR後の産物を電気泳動した結果を示す図。
【図５】ファイトプラズマの16SrDNA配列内で見出されたSNPの箇所の一例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明に係る方法およびキットは、2種以上の検出対象生物を同時に検出する方法およびキットである。
【００２５】
検出対象生物は、任意の生物であってよく、たとえば動物、植物、虫、細菌、真菌、ウイルスおよびファイトプラズマなどが含まれる。本発明は、特に他の生物に感染または寄生する細菌、真菌、ウイルスおよびファイトプラズマなどの病原体の迅速な検出に有用である。
【００２６】
本明細書において「2種以上」とは、生物分類の単位である「種」または2つ以上の近縁の種を含む群（グループ）が複数あることを意味する。すなわち、本発明の方法およびキットは、複数の種またはグループの検出対象生物を同時に検出する方法およびキットである。
【００２７】
〔2種以上の検出対象生物を同時に検出する方法〕
本発明に係る2種以上の検出対象生物を同時に検出する方法は、リガーゼ連鎖反応工程（以下、「LCR工程」ともいう。）と検出工程とを含む。
【００２８】
［リガーゼ連鎖反応工程］
リガーゼ連鎖反応工程は、2種以上の検出対象生物のそれぞれに対応する2種以上のオリゴマーセットを同時に用いて、検出対象試料を鋳型としてリガーゼ連鎖反応を行う工程である。
【００２９】
（オリゴマーセット）
オリゴマーセットは、対応する検出対象生物の任意の一塩基多型（SNP）を挟んで設計したリガーゼ連鎖反応のための4つのオリゴマーにより構成される。本発明において「オリゴマー」とは、数個〜100個ほどの塩基からなる一本鎖DNAを意味する。
【００３０】
リガーゼ連鎖反応は、耐熱性のDNAリガーゼを用いて温度サイクリング反応（加熱と冷却の繰り返し反応）を行うことにより、特定の遺伝子配列を増幅および検出する方法である（Barany, 1991; Wiedmann et al., 1994）。まず、標的DNAの（＋）鎖および（−）鎖にそれぞれアニーリングする2種類の隣り合ったオリゴマーおよび鋳型DNAを加熱し、DNAを一本鎖に分離させる。続いて冷却することにより、鋳型DNAの（＋）鎖および（−）鎖に、それぞれ2種類の隣り合ったオリゴマーがアニーリングする。次に、耐熱性DNAリガーゼによって、隣り合ったオリゴマーを連結させる。この一連の反応を繰り返すことによって、ライゲーション産物が増幅し、増幅DNA断片を生じる。
【００３１】
耐熱性のDNAリガーゼとしては、たとえばTaq DNA Ligase（New England Biolabs社、MA、USA）、Ampligase（Epicentre社、WI、USA）、およびApe DNA Ligase（株式会社耐熱性酵素研究所、兵庫県、日本）などを用いることができる。
【００３２】
オリゴマーセットを構成する4つのオリゴマーは、対応する検出対象生物の任意の一塩基多型（SNP）を挟んで設計した、（＋）鎖にアニーリングする2種類の隣り合ったオリゴマーと、（−）鎖にアニーリングする2種類の隣り合ったオリゴマーとからなる。本明細書において「SNPを挟んで設計」するとは、SNP部位の塩基の5’側または3’側を挟んで設計することを意味する。すなわち、SNPを挟んだ2種類の隣り合ったオリゴマーは、いずれか一方がSNP部位の塩基を含むように設計される。4つのオリゴマーは、対応する検出対象生物のDNAを鋳型にしたLCRにおいて増幅DNA断片を生じるが、異なる種のDNA、すなわちSNP部位の塩基が異なる鋳型DNAに対しては、LCRにおいて増幅しないように設計される。
【００３３】
本明細書において「一塩基多型（SNP）」は、所定の生物集団のゲノム配列において一つの種またはグループにのみ保存されている一塩基の変異をいう。本発明において利用するSNPは、ゲノム配列中の任意のSNPであることができ、遺伝子コード領域内であっても非コード領域内であってもよい。たとえば、ファイトプラズマの種または病原グループを個別に識別する場合、16S rDNA配列中のSNPであることができる。16S rDNA配列のSNPは、たとえば図5に示した箇所であることができる。
【００３４】
本明細書において「（＋）鎖」および「（−）鎖」は、二本鎖DNAの一方の鎖と、これに相補的な配列をもつ他方の鎖とを意味し、たとえばセンス鎖およびアンチセンス鎖であってもよい。
【００３５】
オリゴマーセットを構成する4つのオリゴマー（第一のオリゴマー、第二のオリゴマー、第三のオリゴマーおよび第四のオリゴマー、以下、オリゴマーA〜Dともいう。）は、以下の4つのオリゴマーであってもよい：
第一のオリゴマー（オリゴマーA）：（＋）鎖におけるSNP部位の5’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマー、
第二のオリゴマー（オリゴマーB）：（＋）鎖におけるSNP部位の3’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマー、
第三のオリゴマー（オリゴマーC）：（−）鎖におけるSNP部位の3’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマー、および
第四のオリゴマー（オリゴマーD）：（−）鎖におけるSNP部位の5’側の領域に相補的な配列からなる第四のオリゴマー。
第一のオリゴマーおよび第二のオリゴマーのいずれか一方はSNP部位の塩基を含み、第三のオリゴマーおよび第四のオリゴマーのいずれか一方はSNP部位の塩基を含む。
【００３６】
たとえば、オリゴマーセットを構成する4つのオリゴマーは、以下の4つのオリゴマーであってもよい：
第一のオリゴマー（オリゴマーA）：（＋）鎖におけるSNP部位の塩基の5’側に隣接する塩基から5’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマー、
第二のオリゴマー（オリゴマーB）：（＋）鎖における該SNP部位の塩基と、該塩基の3’側に隣接する塩基から3’側の領域に相補的な配列とからなるオリゴマー、
第三のオリゴマー（オリゴマーC）：（−）鎖における該SNP部位の塩基と、該塩基の3’側に隣接する塩基から3’側の領域に相補的な配列とからなるオリゴマー、および
第四のオリゴマー（オリゴマーD）：（−）鎖における該SNP部位の塩基の5’側に隣接する塩基から5’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマー。
【００３７】
また、オリゴマーセットを構成する4つのオリゴマーは、以下の4つのオリゴマーであってもよい：
第一のオリゴマー（オリゴマーA）：（＋）鎖におけるSNP部位の塩基と、該塩基の5’側に隣接する塩基から5’側の領域に相補的な配列とからなるオリゴマー、
第二のオリゴマー（オリゴマーB）：（＋）鎖における該SNP部位の塩基の3’側に隣接する塩基から3’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマー、
第三のオリゴマー（オリゴマーC）：（−）鎖における該SNP部位の塩基の3’側に隣接する塩基から3’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマー、および
第四のオリゴマー（オリゴマーD）：（−）鎖における該SNP部位の塩基と、該塩基の5’側に隣接する塩基から5’側の領域に相補的な配列とからなるオリゴマー。
【００３８】
また、オリゴマーセットを構成する4つのオリゴマーは、以下の4つのオリゴマーであってもよい：
第一のオリゴマー（オリゴマーA）：（＋）鎖におけるSNP部位の塩基と、該塩基の5’側に隣接する塩基から5’側の領域に相補的な配列とからなるオリゴマー、
第二のオリゴマー（オリゴマーB）：（＋）鎖における該SNP部位の塩基の3’側に隣接する塩基から3’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマー、
第三のオリゴマー（オリゴマーC）：（−）鎖における該SNP部位の塩基と、該塩基の3’側に隣接する塩基から3’側の領域に相補的な配列とからなるオリゴマー、および
第四のオリゴマー（オリゴマーD）：（−）鎖における該SNP部位の塩基の5’側に隣接する塩基から5’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマー。
【００３９】
また、オリゴマーセットを構成する4つのオリゴマーは、以下の4つのオリゴマーであってもよい：
第一のオリゴマー（オリゴマーA）：（＋）鎖におけるSNP部位の塩基の5’側に隣接する塩基から5’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマー、
第二のオリゴマー（オリゴマーB）：（＋）鎖における該SNP部位の塩基と、該塩基の3’側に隣接する塩基から3’側の領域に相補的な配列とからなるオリゴマー、
第三のオリゴマー（オリゴマーC）：（−）鎖における該SNP部位の塩基の3’側に隣接する塩基から3’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマー、および
第四のオリゴマー（オリゴマーD）：（−）鎖における該SNP部位の塩基と、該塩基の5’側に隣接する塩基から5’側の領域に相補的な配列とからなるオリゴマー。
【００４０】
オリゴマーA〜Dは、このようにSNPを挟んで設計されるため、LCRの鋳型に検出対象生物のDNAが含まれている場合には、LCR工程においてオリゴマーAおよびオリゴマーBが連結した断片ABと、オリゴマーCおよびオリゴマーDが連結した断片CDとがハイブリダイズした増幅DNA断片を生じる。一方、検出対象生物以外のDNA、すなわちSNP部位の塩基が異なる鋳型DNAに対しては、LCR工程においてオリゴマー同士が連結できず、増幅DNA断片は生じない。
【００４１】
オリゴマーAの5’末端およびオリゴマーDの5’末端は、LCRにおいてそれぞれオリゴマーBまたはCと連結するために、リン酸化されていることができる。
【００４２】
各オリゴマーの長さは、LCRおよびその後の検出が可能な長さであれば特に限定されず、たとえば20〜100bpであってもよい。
【００４３】
断片ABと断片CDとは、互いに相補的な配列を有する同じ長さの断片であることができる。しかし、これに限定されず、断片ABと断片CDとは、部分的に非相補的配列を有していてもよく、また同じ長さであっても異なる長さであってもよい。
【００４４】
増幅DNA断片は、任意の長さに設計することができる。限定されないが、たとえば50〜100塩基対の長さの増幅DNA断片を生じるようにオリゴマーセットを設計することができる。断片ABと断片CDとがハイブリダイズした増幅DNA断片の長さは、オリゴマーセットによって同じであってもよいし、互いに異なっていてもよい。長さが互いに異なっている場合には、各オリゴマーセット由来の増幅DNA断片の有無をサイズの違いにより検出することができる。
【００４５】
オリゴマーセットを構成するオリゴマーの少なくとも1つは、標識されていてもよい。たとえばオリゴマーAの3’末端、オリゴマーBの5’末端、オリゴマーCの5’末端およびオリゴマーDの3’末端のいずれか1つまたは2つ以上が標識されていてもよい。オリゴマーは、任意の方法によって標識されることができ、たとえば、蛍光色素および放射線同位体などの直接的に検出可能な標識分子、免疫学的手法を用いて間接的に検出可能な標識分子並びにその他の検出可能な標識分子などによって標識することができる。
【００４６】
蛍光色素は、一般的に核酸を標識して検出し得る蛍光色素であればよく、たとえばフルオレセイン（fluorescein）またはその誘導体（たとえばフルオロセイン-イソチオシアネート（FITC））、ローダミン（Rhodamine）、テキサスレッド（Texas Red）、Alexa 488、Alexa 532、cy3、cy5、6-joeおよびEDANSなどが含まれる。
【００４７】
免疫学的手法を用いて間接的に検出可能な標識分子には、たとえばビオチン、ジゴキシゲニン、抗原および補酵素などが含まれる。
【００４８】
オリゴマーが標識されていることにより、断片ABと断片CDとがハイブリダイズした増幅DNA断片を容易に検出することができる。検出方法としては、蛍光発光測定、放射線量測定、ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）、およびイムノストリップアッセイなどを用いることができる。
【００４９】
たとえば、オリゴマーAの3’末端またはオリゴマーCの5’末端と、オリゴマーBの5’末端またはオリゴマーDの3’末端とが、それぞれ互いに異なる標識分子によって標識されていてもよい。たとえば、断片ABと断片CDとがハイブリダイズした増幅DNA断片が、ELISAなどの免疫学的手法を利用して検出可能なように標識されてもよい。
【００５０】
（検出対象試料）
検出対象試料は、検出対象生物の有無を検出するための、検出対象生物のDNAが含まれている可能性がある試料である。検出対象試料は、たとえば検出対象生物の混入が疑われる物質、検出対象生物の感染または保菌が疑われる生物体、およびこの生物体由来のDNA試料などであってもよい。DNA試料は、生物体から抽出したDNA、および抽出DNAに対して行ったPCR等による増幅産物などであってもよい。生物体からDNAを抽出する方法およびPCR等による増幅方法には、既知の方法を用いることができる。
【００５１】
（リガーゼ連鎖反応（LCR））
本発明において、リガーゼ連鎖反応は、2種以上の検出対象生物のそれぞれに対応する各オリゴマーセットを同時に用いて、検出対象試料を鋳型として行う。
【００５２】
リガーゼ連鎖反応の一例としては、まず、各オリゴマーセット、検出対象試料および耐熱性DNAリガーゼを含む反応液を加熱により変性させ、DNAを１本鎖に分離させる。加熱する温度および時間は、適宜設定することができる。
【００５３】
続いて、この反応液を冷却する。冷却する温度および時間は適宜設定することができる。ここで、検出対象試料中に検出対象生物由来のDNAが含まれている場合には、1本鎖に分離した鋳型DNAの（＋）鎖および（−）鎖のそれぞれに対応する2種類の隣りあったオリゴマーがアニーリングする。次いで、耐熱性DNAリガーゼによって隣り合うオリゴマーが連結する。
【００５４】
この加熱および冷却の一連の反応を繰り返すことによってライゲーション産物（オリゴマーの連結産物）が指数関数的に増幅される。この一連の反応を繰り返す回数は、適宜設定することができる。
【００５５】
一方、検出対象試料中に検出対象生物とは異なる種の生物由来のDNAが含まれている場合には、このDNAは検出対象生物とはSNP部位の塩基が異なるため、このDNAに対してオリゴマーが完全にアニーリングできず、ライゲーション産物が生成されない。すなわち、検出対象生物以外の生物由来のDNAに対しては、隣り合うオリゴマーの境界部位に鋳型とのミスマッチが存在し、ライゲーションが起こらず、DNAが増幅されない。
【００５６】
したがって、LCR工程および後述する検出工程を行うことにより、SNP部位の塩基の違いによって、種のレベルで検出対象生物を同定することができる。
【００５７】
上記リガーゼ連鎖反応は、たとえば以下の工程によって実施することができる：
（1）94℃で2分変性させる；
（2）94℃で90秒変性させる；
（3）55℃で6分アニーリングさせる；
（4）上記2および3のサイクルを2回繰り返す；
（5）91℃で30秒変性させる；
（6）55℃で6分アニーリングさせる；
（7）上記（5）および（6）のサイクルを20回繰り返す。
あるいは、以下の工程によっても実施することができる：
（1）94℃で2分変性させる；
（2）94℃で1分変性させる；
（3）55℃で6分アニーリングさせる；
（4）上記（2）および（3）のサイクルを30回繰り返す。
【００５８】
［検出工程］
検出工程は、リガーゼ連鎖反応による各オリゴマーセット由来の増幅DNA断片（本明細書において「増幅断片」ともいう。）の有無を検出する工程である。言い換えれば、検出工程では、リガーゼ連鎖反応により増幅したDNA断片がいずれのオリゴマーセット由来の増幅断片かを検出する。
【００５９】
増幅断片は、核酸を検出するための任意の方法を用いて検出することができ、たとえば電気泳動、免疫学的手法を用いた検出および塩基配列解読などによって検出することができる。
【００６０】
各オリゴマーセットによって増幅断片の長さが異なっている場合には、電気泳動等によって増幅断片のサイズを検出することにより、各オリゴマーセット由来の増幅断片の有無を容易に検出することができる。電気泳動には、高分離ゲル等を用いることができる。
【００６１】
オリゴマーが標識分子により標識されている場合には、増幅断片を免疫学的手法により検出することができる。免疫学的手法により検出する場合、たとえば増幅断片の一方の端がビオチンなどの固定化可能な標識分子で標識され、他方の端がFITC、ローダミンもしくはテキサスレッドなどの蛍光色素または抗体により検出可能なDIG等の標識分子で標識されていてもよい。この場合には、増幅断片の一方の端をアビジンプレートまたはアビジン標識した粒子（金コロイドおよびラテックス粒子等）等に固定化し、他方の端からの発光を検出することにより、増幅断片を検出することができる。あるいは、他方の端の標識分子を、蛍光色素または酵素に結合した抗体等と結合させた後に、蛍光発光または酵素反応の生成物を検出してもよい。
【００６２】
増幅断片は、オリゴマーセットによって異なる方法で標識されていてもよい。たとえば、オリゴマーセットによって異なる種類の蛍光分子により標識されていてもよい。これにより、検出工程において、検出された蛍光によっていずれのオリゴマーセット由来の増幅断片が存在するかを簡便に検出することができる。
【００６３】
［PCR工程］
本発明の方法では、LCR工程より前にPCR工程を有していてもよい。PCR工程は、一次スクリーニングとして、検出対象試料を鋳型として、検出対象生物およびこれと近縁の種を含む生物群のDNAを増幅するためのPCRを行う工程である。
【００６４】
PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）には、通常使用される任意の方法および条件を用いることができる。
【００６５】
PCRに用いるプライマーは、検出対象生物およびこれと近縁の種を含む生物群のDNAを鋳型とする場合にのみPCRによる増幅断片を生じるプライマーを用いることができる。PCRにより増幅される断片は、LCRのためのオリゴマーがアニーリングする領域を含んでいてもよい。
【００６６】
PCR工程によるPCR増幅断片の有無を検出することにより、検出対象生物およびこれと近縁の種を含む生物群の有無を同定することができる。PCR増幅断片の有無は、核酸を検出するための任意の方法を用いて検出することができ、たとえば電気泳動、免疫学的手法を用いた検出および塩基配列解読などによって検出することができる。
【００６７】
本発明の方法では、PCR工程による増幅が認められた場合にのみLCR工程および検出工程を行ってもよい。これにより、コストを削減することができる。
【００６８】
また、複数の生物群を対象としてPCR工程を行うことによって、複数の生物群の中から検出対象生物を含む可能性の高い1個または複数の生物群を特定してもよい。PCR工程によって検出対象生物を含む可能性の高い生物群を特定することにより、検出対象試料によっては、検出対象生物の種もしくはグループの候補を絞ることができる。たとえば検出対象試料が植物体または媒介虫であり、検出対象生物を含む可能性の高い生物群としてファイトプラズマが特定された場合には、この植物体または媒介虫の種類によって検出対象とするファイトプラズマの種または病原グループの候補を予め絞ることができる。したがって、LCR工程および検出工程を行う回数を減らすことができ、コストを削減できるとともに、迅速な検出を可能にする。
【００６９】
また、PCR工程においてLCR用オリゴマーがアニーリングする領域を含む配列が増幅された場合には、このPCR増幅断片の一部をLCR工程の鋳型として用いてもよい。この場合には、LCR工程において鋳型DNA量が十分に存在するため、非特異的な増幅バンドの発生を防止し、精度を向上させることができる。
【００７０】
〔キット〕
本発明のキットは、2種以上の検出対象生物を同時に検出するキットであり、2種以上の検出対象生物のそれぞれに対応する2種以上の上述したようなオリゴマーセットを含む。オリゴマーセットは、上述のように、対応する検出対象生物の任意のSNPを挟んで設計したリガーゼ連鎖反応のための4つのオリゴマーにより構成される。オリゴマーセットを構成する4つのオリゴマーは、対応する検出対象生物の任意の一塩基多型（SNP）を挟んで（＋）鎖にアニーリングする2種類の隣り合ったオリゴマーと、当該SNPを挟んで（−）鎖にアニーリングする2種類の隣り合ったオリゴマーとからなる。SNPを挟んだ2種類の隣り合ったオリゴマーは、いずれか一方がSNP部位の塩基を含むように設計される。4つのオリゴマーは、対応する検出対象生物のDNAを鋳型にしたLCRにおいて増幅DNA断片を生じるが、異なる種のDNA、すなわちSNP部位の塩基が異なる鋳型DNAに対しては、LCRにおいて増幅しないように設計される。たとえば、オリゴマーセットを構成する4つのオリゴマーは、以下の4つのオリゴマーであってもよい：
第一のオリゴマー（オリゴマーA）：（＋）鎖におけるSNP部位の5’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマー、
第二のオリゴマー（オリゴマーB）：（＋）鎖におけるSNP部位の3’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマー、
第三のオリゴマー（オリゴマーC）：（−）鎖におけるSNP部位の3’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマー、および
第四のオリゴマー（オリゴマーD）：（−）鎖におけるSNP部位の5’側の領域に相補的な配列からなる第四のオリゴマー。
第一のオリゴマーおよび第二のオリゴマーのいずれか一方はSNP部位の塩基を含み、第三のオリゴマーおよび第四のオリゴマーのいずれか一方はSNP部位の塩基を含む。
【００７１】
オリゴマーAの5’末端およびオリゴマーDの5’末端は、LCRにおいてそれぞれオリゴマーBまたはCと連結するために、リン酸化されていることができる。
【００７２】
各オリゴマーの長さは、LCRおよびその後の検出が可能な長さであれば特に限定されず、たとえば20〜100bpであってもよい。
【００７３】
各オリゴマーセットは、たとえば50〜100塩基対の長さの増幅DNA断片を生じるように設計することができる。
【００７４】
本発明のキットは、上述した方法に好適に利用することができる。本発明のキットを用いることにより、検出対象試料に対し2種以上の検出対象生物の有無を同時にかつ簡便に検出することができる。
【００７５】
本発明のキットにおいて、各オリゴマーセットを構成する4つのオリゴマーは、互いに別々に含まれていてもよいし、混合していてもよい。また、各オリゴマーセットの4つのオリゴマーが混合されている場合に、オリゴマーセットの各々は、互いに別々に含まれていてもよいし、混合されていてもよい。
【００７６】
本発明のキットは、LCRに使用可能な耐熱性DNAリガーゼをさらに含んでいてもよい。また、本発明のキットは、LCR増幅産物を検出するための試薬、オリゴマーを標識するための試薬、および一次スクリーニング用プライマーなどをさらに含んでいてもよい。
【００７７】
本発明において、検出対象生物は、たとえばファイトプラズマであってもよい。その場合、検出対象試料は、ファイトプラズマの感染または保菌が疑われる植物体または媒介虫由来のDNA試料であってもよい。
【００７８】
検出対象生物は、たとえば、ファイトプラズマ・マリ（Phytoplasma mali）、ファイトプラズマ・プルノラム（Phytoplasma prunorum）、ファイトプラズマ・ピリ（Phytoplasma pyri）、ファイトプラズマ・プルニ（Phytoplasma pruni）、ファイトプラズマ・オランティフォリア（Phytoplasma aurantifolia）、ファイトプラズマ・ヴィチス（Phytoplasma vitis）、ファイトプラズマ・キャスタネアエ（Phytoplasma castaneae）およびファイトプラズマ・フォエニシウム（Phytoplasma phoenicium）から選択される少なくとも2種であってもよい。また、検出対象生物の少なくとも1種は、たとえばリボソームRNAの配列に基づき系統分類された複数の種を含むグループであってもよく、たとえば、ファイトプラズマ・マリ、ファイトプラズマ・ピリおよびファイトプラズマ・プルノラムにより構成されるグループ（16SrXグループ）などであってもよい。
【００７９】
検出対象生物が上述したようなファイトプラズマである場合、SNPは、任意のSNPであることができ、16S rDNA配列のSNPは、たとえば図5に示した箇所であることができる。また、たとえば、後述する実施例において見出したような16S rDNAにおけるSNPであってもよい。
【００８０】
本発明により、たとえば植物体にファイトプラズマが混合感染している場合でも、各ファイトプラズマの種もしくは病原グループを同時に、迅速かつ正確に検出することができる。したがって、本発明は、植物の輸入および輸出検疫並びに病害診断などに利用することができる。本発明は、国内だけでなく、ファイトプラズマによって深刻な被害を受けている国々において有用である。たとえば、植物の輸入検疫では、新たなファイトプラズマが国内に侵入することを未然に防ぐことができる。また、輸出検疫では、輸出対象植物がファイトプラズマに感染しているかどうかを迅速に検査し、その結果を相手国に通知することができる。一方、国内では、既存のファイトプラズマによる感染の有無を迅速に診断することによって、感染被害の拡大を抑えることができる。
【００８１】
本発明は、検出対象生物を識別するためのオリゴマーセットを多数設計して用意し、これらを適切に組み合わせることによって、様々な検出対象生物の識別に利用可能である。
【００８２】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。
【実施例】
【００８３】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８４】
［実施例1］
〔識別用SNPsの選抜〕
NCBI GenBank等公共のDNA配列データベースより、種々のファイトプラズマの16S rDNA配列を抽出した。任意に選んだ82個の配列を配列解析ソフトウェアMEGA5．2を用いてアラインメントした。アラインメント解析によって、16S rDNA配列において一つの種もしくは病原グループにのみ保存されているSNPs（一塩基多型）を見出した。
【００８５】
各ファイトプラズマの識別用SNPsとして、以下を見出した：
ファイトプラズマ・マリ（Phytoplasma mali；以下、「P. mali」とも称する）：16S rDNA（配列番号1；GenBank番号X68375より）の第308塩基、第402塩基、第560塩基、第617塩基および第1398塩基；
ファイトプラズマ・プルノラム（Phytoplasma prunorum；以下、「P. prunorum」とも称する）：16S rDNA（配列番号2；GenBank番号AY029540より）の第178塩基、第415塩基、第1090塩基および第1400塩基；
ファイトプラズマ・ピリ（Phytoplasma pyri；以下、「P. pyri」とも称する）：16S rDNA（配列番号3；GenBank番号AJ542543より）の第203塩基、第258塩基および第678塩基
ファイトプラズマ・ピリ（Phytoplasma pyri）PD-TW株：16S rDNA（配列番号4；GenBank番号DQ011588より）の第179塩基、第396塩基および第1224塩基；
ファイトプラズマ・プルニ（Phytoplasma pruni；以下、「P. pruni」とも称する）：16S rDNA（配列番号5；GenBank番号JQ044396より）の第167塩基、第182塩基、第195塩基、第202塩基、第230塩基、第448塩基、第461塩基、第462塩基、第823塩基、第828塩基、第975塩基、第1017塩基、第1218塩基、第1221塩基、第1267塩基、第1270塩基、第1418塩基、第1437塩基および第1462塩基；
ファイトプラズマ・オランティフォリア（Phytoplasma aurantifolia）：16S rDNA（配列番号6；GenBank番号AB295056より）の第429塩基、第441塩基、第442塩基、第443塩基、第450塩基、第453塩基、第454塩基、第458塩基、第459塩基、第464塩基、第473塩基、第572塩基、第575塩基、第582塩基、第583塩基、第588塩基、第593塩基、第594塩基、第613塩基、第619塩基、第627塩基、第629塩基、第630塩基、第650塩基、第718塩基、第945塩基、第972塩基、第985塩基、第986塩基、第990塩基、第996塩基、第1014塩基、第1080塩基、第1174塩基、第1226塩基、第1240塩基、第1248塩基、第1256塩基および第1258塩基；
ファイトプラズマ・ヴィチス（Phytoplasma vitis）：16S rDNA（配列番号7；GenBank番号AF122912より）の第186塩基、第206塩基、第554塩基、第557塩基、第622塩基、第761塩基、第982塩基、第1019塩基、第1028塩基、第1080塩基、第1084塩基、第1104塩基、第1159塩基、第1205塩基、第1207塩基、第1217塩基、第1250塩基、第1337塩基、第1359塩基、第1430塩基および第1443塩基；
ファイトプラズマ・キャスタネアエ（Phytoplasma castaneae）：16S rDNA（配列番号8；GenBank番号AB054986より）の第63塩基、第124塩基、第125塩基、第151塩基、第152塩基、第230塩基、第246塩基、第260塩基、第276塩基、第461塩基、第462塩基、第485塩基、第577塩基、第585塩基、第595塩基、第596塩基、第620塩基、第629塩基、第882塩基、第905塩基、第907塩基、第987塩基、第996塩基、第1122塩基、第1142塩基、第1155塩基、第1220塩基、第1328塩基、第1399塩基、第1400塩基、第1401塩基、第1424塩基、第1429塩基、第1431塩基および第1452塩基；
ファイトプラズマ・フォエニシウム（Phytoplasma phoenicium）：16S rDNA（配列番号9；GenBank番号AF515637より）の第336塩基、第377塩基、第414塩基、第445塩基、第573塩基、第590塩基、第803塩基、第804塩基、第964塩基、第983塩基、第996塩基、第1083塩基、第1098塩基、第1216塩基、第1217塩基および第1380塩基。
【００８６】
また、P. mali、P. prunorumおよびP. pyriを含むグループ（16SrXグループ）の識別用SNPsとして、以下を見出した：
ファイトプラズマ・ピリ（Phytoplasma pyri）の16S rDNA（配列番号3）の第126塩基、第136塩基、第137塩基、第189塩基、第190塩基、第192塩基、第193塩基、第205塩基、第209塩基、第219塩基、第289塩基、第308塩基、第438塩基、第439塩基、第449塩基、第453塩基、第500塩基、第513塩基、第534塩基、第584塩基、第603塩基、第604塩基、第696塩基、第701塩基、第807塩基、第818塩基、第821塩基、第1049塩基、第1093塩基、第1097塩基、第1100塩基、第1114塩基、第1241塩基、第1298塩基、第1331塩基、第1398塩基、第1413塩基および第1416塩基。
【００８７】
〔オリゴマーの設計〕
P. pyri、P. mali、P. prunorumおよびP. pruniについて、LCR法に用いるための4つのオリゴマーを設計した。オリゴマーは、各ファイトプラズマの識別用SNPsとその周辺配列（ターゲット配列）に基づき設計した。具体的には、ターゲット配列の（＋）鎖におけるSNP部位の5’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマーAおよび該SNP部位の3’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマーB、並びに（−）鎖における該SNP部位の3’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマーCおよび該SNP部位の5’側の領域に相補的な配列からなるオリゴマーDを設計した。なお、オリゴマーAおよびBのいずれか一方はSNP部位の塩基を含み、オリゴマーCおよびDのいずれか一方はSNP部位の塩基を含むように設計した。
【００８８】
P. pyri識別用オリゴマーとして、16S rDNA（配列番号3）の第203塩基のSNPを挟んで、オリゴマーA（配列番号10）、オリゴマーB（配列番号11）、オリゴマーC（配列番号12）およびオリゴマーD（配列番号13）を設計した。
【００８９】
P. mali識別用オリゴマーとして、16S rDNA（配列番号1）の第308塩基のSNPを挟んで、オリゴマーA（配列番号14）、オリゴマーB（配列番号15）、オリゴマーC（配列番号16）およびオリゴマーD（配列番号17）を設計した。
【００９０】
P. prunorum識別用オリゴマーとして、16S rDNA（配列番号2）の第1090塩基のSNPを挟んで、オリゴマーA（配列番号18）、オリゴマーB（配列番号19）、オリゴマーC（配列番号20）およびオリゴマーD（配列番号21）を設計した。
【００９１】
P. pruni識別用オリゴマーとして、16S rDNA（配列番号5）の第462塩基のSNPを挟んで、オリゴマーA（配列番号22）、オリゴマーB（配列番号23）、オリゴマーC（配列番号24）およびオリゴマーD（配列番号25）を設計した。
【００９２】
それぞれ、オリゴマーAおよびオリゴマーDの5’末端は、リン酸化されていた。
【００９３】
〔LCR法〕
P. pyri、P. mali、P. prunorumおよびP. pruniがそれぞれ感染したファイトプラズマ感染植物から、既知の方法でDNAを抽出した。
【００９４】
各感染植物から抽出したDNAを鋳型として、一次スクリーニングとしてファイトプラズマに共通な配列を増幅するための既知のプライマーセット（P1/P7（配列番号26／配列番号27）、fU1/rU1（配列番号28／配列番号29）およびf0/r0（配列番号30／配列番号31）の3種類）を用いたPCRを実施した。PCRは、DNAポリメラーゼとして、ExTaq hot start version （タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）を用い、100ng/μlの鋳型DNAおよび0.2μMのプライマーを含有する、酵素添付のバッファーによる混合液において実施した。PCRの条件は、以下であった：
（1）96℃で4分変性させる；
（2）96℃で30秒変性させる；
（3）55℃で1分アニーリングさせる；
（4）72℃で30秒伸長させる；
（5）上記（2）、（3）および（4）のサイクルを30回繰り返す。
図1は、PCR産物を電気泳動した結果を示す図である。図1に示すように、それぞれのプライマーによるPCR増幅断片の存在が確認できた。
【００９５】
次に、P1/P7プライマーセットにより増幅した断片を鋳型として、P. pruniのために設計したオリゴマーA〜Dを用いてLCR法を実施した。LCRは、耐熱性DNAリガーゼとしてTaq DNA ligase (New England Biolabs社)を用い、100ng/μlの鋳型DNA、0.1μMの各オリゴマーおよび0.4μg/μlのサケDNAを含有する、酵素添付のバッファーによる混合液において実施した。LCRの条件は、以下であった：
（1）94℃で1.5分変性させる；
（2）55℃で6分アニーリングさせる；
（3）上記（1）および（2）のサイクルを5回繰り返す；
（4）91℃で30秒変性させる；
（5）55℃で6分アニーリングさせる；
（1）上記（4）および（5）のサイクルを15回繰り返す。
【００９６】
LCR後の産物を3％のLonza MetaPhor Agaroseゲル（タカラバイオ社、滋賀、日本）にて電気泳動した。図2は、LCR後の産物を電気泳動した結果を示す図である。図2に示すように、P. pruni感染植物サンプルにおいてのみ、P. pruniのオリゴマーセット由来の96bpの長さの増幅断片を得た。
【００９７】
この結果から、植物に感染しているファイトプラズマの種を正確かつ迅速に診断することができることが示された。
【００９８】
［実施例2］
複数の種が混合感染した植物のDNA試料のモデルとして、P. pyri、P. maliおよびP. prunorumのそれぞれが感染したファイトプラズマ感染植物からのDNAを混合した（試料1）。また、別のモデルとして、P. pyri、P. maliおよびP. pruniのそれぞれが感染したファイトプラズマ感染植物からのDNAを混合した（試料2）。
【００９９】
それぞれの混合感染DNA試料を鋳型として、P. pyri、P. mali、P. prunorumおよびP. pruniのそれぞれについて設計したオリゴマーセットを用いてLCR法を実施した。LCRの条件は、実施例1と同様とした。
【０１００】
図3は、LCR後の産物を電気泳動した結果を示す図である。図3に示すように、試料1ではP. pyri、P. maliまたはP. prunorumのオリゴマーセットを用いた場合に増幅断片が認められ、P. pruniのオリゴマーセットを用いた場合には増幅断片が認められなかった。また、試料2では、P. pyri、P. maliまたはP. pruniのオリゴマーセットを用いた場合に増幅断片が認められ、P. prunorumのオリゴマーセットを用いた場合には増幅断片が認められなかった。
【０１０１】
したがって、各ファイトプラズマを識別するためのオリゴマーセットを用いることによって、複数種のファイトプラズマが感染した植物試料から、感染しているファイトプラズマの複数の種を正確かつ迅速に診断することができることが示された。
【０１０２】
［実施例3］
P. pruni感染植物からのDNA試料（P. pruni単独感染DNA）、P. prunorum感染植物からのDNA試料（P. prunorum単独感染DNA）、およびこれらの両ファイトプラズマが混合感染した植物のDNA試料のモデルとしてこれらのDNA試料を混合したDNA試料（P. pruni, P. prunorum混合感染DNA）を用意した。
【０１０３】
それぞれのDNA試料を鋳型として、これら2種のファイトプラズマを識別するための各オリゴマーセットを単独で、または混合して用いてLCR法を実施した。
【０１０４】
図4の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、LCR後の産物を電気泳動した結果を示す図である。P. pruni単独感染DNAでは、図4の（ａ）に示すように、P. pruni用識別オリゴマーセットを単独で用いた場合およびP. prunorum用識別オリゴマーセットと同時に用いた場合に、P. pruni用識別オリゴマーセット由来の96bpのLCR増幅断片が見られた。P. prunorum用識別オリゴマーセット由来のLCR増幅断片は見られなかった。なお、P. prunorum用識別オリゴマーセットを単独で用いた場合および2種のオリゴマーセットを同時に用いた場合に観察される短いDNA断片は、増幅断片ではなく、オリゴマーセットの1つである42bpのオリゴマーである。
【０１０５】
P. prunorum単独感染DNAでは、図4の（ｂ）に示すように、P. prunorum用識別オリゴマーセットを単独で用いた場合およびP. pruni用識別オリゴマーセットと同時に用いた場合に、P. prunorum用識別オリゴマーセット由来の63bpのLCR増幅断片が見られた。P. pruni用識別オリゴマーセット由来のLCR増幅断片は見られなかった。
【０１０６】
混合感染DNAでは、図4の（ｃ）に示すように、P. pruni用識別オリゴマーセット由来の96bpのLCR増幅断片およびP. prunorum用識別オリゴマーセット由来の63bpのLCR増幅断片の両方が見られた。特に、P. pruni用識別オリゴマーセットおよびP. prunorum用識別オリゴマーセットを同時に用いた場合には、両方のLCR増幅断片が同時に観察された。
【０１０７】
これらの結果から、本発明は、植物に感染している2種以上のファイトプラズマの種を同時に正確に検出できることが示された。したがって、本発明は、2種以上の検出対象生物を同時に検出することが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明は、2種以上の生物の同時検出に利用することができる。特に植物の輸入および輸出検疫、並びに国内の病害診断などにおける、複数のファイトプラズマの同時検出などに好適に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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