(57)【要約】【課題】食しても十分に安全であり、安価で簡便かつ安全なルブソシドの製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】ステビアを、乳酸菌を用いて処理する工程を含むことを特徴とするルブソシドの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステビアを、乳酸菌を用いて処理する工程を含むことを特徴とするルブソシドの製造方法。
【請求項２】
乳酸菌が、ラクトバチルス属の乳酸菌である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
乳酸菌が、ラクトバチルス カゼイ ハセガワ菌株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
ステビアが、ステビオシドを含有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
乳酸菌を用いた処理温度が、２５〜６０℃である請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
ステビオシドを、乳酸菌を用いて処理する工程を含むことを特徴とするルブソシドの製造方法。
【請求項７】
乳酸菌が、ラクトバチルス属の乳酸菌である請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
乳酸菌が、ラクトバチルス  カゼイ  ハセガワ菌株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）である請求項６又は７に記載の製造方法。
【請求項９】
乳酸菌を用いた処理温度が、２５〜６０℃である請求項６〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステビア及び甜茶に含まれる甘味成分であるルブソシドの製造方法に関する。より詳細には、ステビア又はステビオシドを原料とし、乳酸菌、好ましくはラクトバチルス属菌、さらに好ましくはラクトバチルス  カゼイ  ハセガワ菌株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）による微生物変換を利用した、ルブソシドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステビアや甜茶に含まれる甘味成分であるルブソシドは、スクロースの１００倍の甘味成分を有するがノンカロリーであり、抗う蝕性、抗血管新生、抗アレルギー作用等を有することが報告されている甘味料である。ルブソシドは、ノンカロリーの甘味成分として、過去に注目されたが、ステビアや、甜茶の原料となる植物（甜葉懸鈎子等）等の植物からの抽出による大量生産が難しいため、商品化には至らなかった。ステビアに含有されるルブソシドの量はそれほど多くはない。また、甜茶には、ステビアと比較して、ルブソシドが豊富に含有されているが、甜茶の原料となる植物の栽培が中国の一部の地域に限られ、また天候による影響から収穫量も一定ではないとされるため、ステビアの中心甘味成分であるステビオシドやレバウディオシドＡと比較して、市場価格が数倍から１０倍とも言われている（非特許文献１及び２）。更に、ルブソシドには、抗がん剤や、その他難溶性薬剤の溶解性を高める天然可溶化剤としての働きが報告されており、その利用価値が注目されている（特許文献１）。
【０００３】
ルブソシドの大量生産方法としては、麹菌（Aspergillus）由来の酵素を利用して、ステビオシドを原料としてルブソシドの生産を行なう手法が報告されている（非特許文献１及び２）。また、精製酵素でなく、クリセオバクテリウム（Chryseobacterium）の休止菌体による同様の変換も報告されている（非特許文献３）。しかしながら、非特許文献１及び２に記載された方法では、予め酵素を大量に精製する必要があり、その精製のため工程管理項目が増える、酵素精製のための菌体の増殖速度が遅い、麹菌には食経験上安全でないものも存在する、等といった問題があった。また、非特許文献３のクリセオバクテリウムについても、食経験上十分に安全なものではなく、病原性を有する可能性も排除できないため、安全性に問題があった。従って、食しても十分に安全であり、かつ精製酵素を使用するのではなく、菌自体を生体触媒、あるいは適宜乾燥固定した死菌粉体としてそのまま利用可能な菌を使用した、より簡便で安全な、ルブソシドの大量生産方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１１−５１７６８６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hui-da Wan et al. Journal of Melecular Catalysis B Enzymatic2012 82, p12-17
【非特許文献２】Ko JA et al. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2012 60, p6210-6216
【非特許文献３】Jiang Zu et al. Wei Sheng Wu Xue Bao 2011 51, p43-49
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記現状に鑑み、食しても十分に安全であり、安価で簡便かつ安全なルブソシドの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、ステビアを、食経験上安全である乳酸菌、好ましくはラクトバチルス属菌、さらに好ましくはラクトバチルス  カゼイ  ハセガワ菌株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）を用いて処理することにより、ステビア中に大量に含有されるステビオシドを基に、工業的に有利にルブソシドを生産することができることを見出した。
本発明者らは、上記以外にも下記するように種々の思いがけない新知見を得て、さらに鋭意検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、以下のルブソシドの製造方法等に関する。
[１]ステビアを、乳酸菌を用いて処理する工程を含むことを特徴とするルブソシドの製造方法。
[２]乳酸菌が、ラクトバチルス属の乳酸菌である前記[１]に記載の製造方法。
[３]乳酸菌が、ラクトバチルス  カゼイ  ハセガワ菌株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）である前記［１］又は［２］に記載の製造方法。
[４]ステビアが、ステビオシドを含有する前記[１]〜[３]のいずれか一項に記載の製造方法。
[５]乳酸菌を用いた処理温度が、２５〜６０℃である前記[１]〜[４]のいずれか一項に記載の製造方法。
[６]ステビオシドを、乳酸菌を用いて処理する工程を含むことを特徴とするルブソシドの製造方法。
[７]乳酸菌が、ラクトバチルス属の乳酸菌である前記[６]に記載の製造方法。
[８]乳酸菌が、ラクトバチルス  カゼイ  ハセガワ菌株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）である前記[６]又は[７]に記載の製造方法。
[９]乳酸菌を用いた処理温度が、２５〜６０℃である前記[６]〜[８]のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、食経験上安全な原料を使用して、安価で簡便かつ、食しても十分に安全なルブソシド、特に副産物としてヒトの健康に有害な物質を含まないルブソシドの大量生産方法を提供することができる。
また、本発明によれば、精製酵素ではなく、生体触媒、あるいは適宜乾燥固定した死菌粉体としてそのまま利用が可能な菌を使用することができるため、簡便なルブソシドの大量生産方法を提供することができる。
さらに、本発明によれば、ルブソシドを安価で簡便に製造することができるため、ルブソシドを甘味料や天然可溶化剤として実用化する新規かつ有用な産業を創造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１のステビオシド−乳酸菌処理サンプル１（乳酸菌を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））溶液に、ステビオシドのアセトニトリル溶液を添加して培養することにより得られた乳酸菌処理物）のＨＰＬＣチャートである。
【図２】実施例１のステビオシドサンプル１（乳酸菌を含有しないＰＢＳ（−）と、ステビオシドのアセトニトリル溶液の混合物）のＨＰＬＣチャートである。
【図３】実施例１の乳酸菌含有サンプル（乳酸菌を含有するＰＢＳ（−）溶液）のＨＰＬＣチャートである。
【図４】実施例１のルブソシドサンプル（乳酸菌を含有しないＰＢＳ（−）と、ルブソシドのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液の混合物）のＨＰＬＣチャートである。
【図５】実施例２のステビオシド−乳酸菌処理サンプル２（乳酸菌を含有するＰＢＳ（−）溶液に、ステビオシドのＤＭＳＯ溶液を添加して培養することにより得られた乳酸菌処理物）のＨＰＬＣチャートである。
【図６】実施例２のステビオシドサンプル２（乳酸菌を含有しないＰＢＳ（−）と、ステビオシドのＤＭＳＯ溶液の混合物）のＨＰＬＣチャートである。
【図７】実施例３のＴＬＣ写真である。
【図８】比較例１のステビア抽出物サンプル（ステビアを含有する蒸留水を加熱して得られる熱水抽出液（ステビア抽出物））及び実施例４のステビア抽出物―乳酸菌処理サンプル（ステビア抽出物の乳酸菌処理物）のＨＰＬＣチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のルブソシドの製造方法は、ステビアを、乳酸菌を用いて処理する工程を含むことを特徴とする。
本発明のルブソシドの製造方法は、ステビアを、乳酸菌を用いて処理する工程以外の工程を含んでも良い。
【００１２】
本発明において使用されるステビアは、通常、従来公知の方法により得られるものを使用することができる。前記ステビアは、例えば、従来公知の方法により得られるものをそのまま使用することができるし、従来公知の方法により得られるものを、水洗いしただけのもの、水洗いしてさらに乾燥したもの、水洗いして蒸した後乾燥したもの、それらを任意の大きさに裁断、粉砕、又はペースト状化したものを使用できる。ステビアとしては、天然品もその加工品も支障なく本発明で使用できる。加工品としては、例えば、ステビアの乾燥物、裁断物、粉砕物、抽出物、ペースト等が挙げられる。前記乾燥方法、裁断方法、粉砕方法、抽出方法、ペースト状化方法は、従来公知の方法を使用することができる。
【００１３】
本発明において使用されるステビアの部位は、特に限定されず、どの部位でも使用することができるが、例えば、ステビアの葉等を好適に使用することができる。
また、前記ステビアは、成分としてステビオシドを含有することが好ましい。ステビア中のステビオシドの含有量は、特に限定されないが、ステビア全量に対して、好ましくは、約０．１〜２０重量％であり、より好ましくは、約１〜１５重量％である。
【００１４】
本発明において使用される乳酸菌としては、特に限定されないが、例えば、ラクトバチルス属、ストレプトコックス属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、ビフィズス属等の公知の乳酸菌が挙げられる。乳酸菌は、好ましくは、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ビフィズス属等の乳酸菌であり、より好ましくは、ラクトバチルス属の乳酸菌等である。これらの乳酸菌は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００１５】
ラクトバチルス属の乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus  fermentum）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus  helveticus）、ラクトバチルス・ケフィア（Lactobacillus  kefir）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus  casei）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus  paracasei）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus  rhamnosus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus  salivarius）等が挙げられる。これらはいずれも公知の乳酸菌であり、公知の細胞供給施設（例えばＡＴＣＣ（American Type Culture Collection））より入手可能である。
【００１６】
前記ラクトバチルス属の乳酸菌の中でも、ルブソシドの生産能力が高い点で、ラクトバチルス  カゼイ  ハセガワ菌株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）が好ましい。ラクトバチルス  カゼイ  ハセガワ菌株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）は、立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：郵便番号３０５−８５６６  日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されている（受託日：平成１５年（２００３年）８月１１日、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）。
【００１７】
本発明のルブソシドの製造方法において、ステビアを、乳酸菌を用いて処理する方法は、ステビアと乳酸菌を接触させて処理する方法であれば特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。乳酸菌処理は、例えば、乳酸菌を用いた培養が好ましい。乳酸菌を用いた培養方法は、従来十分に確立されていて、本発明もそれに従ってよい。
前記乳酸菌処理は、例えば、ステビアを含有する培地を常法により加熱減菌処理した後、該培地に乳酸菌を接種し、培養することで処理する方法が挙げられる。また、予めステビアを含有しない培地にて乳酸菌を増殖させ、遠心分離により菌体を得た後、該菌体に滅菌蒸留水又はＰＢＳ（−）等の滅菌リン酸緩衝生理食塩水にてステビアを抽出した混合溶液をそのまま無菌的に加えて培養することで、乳酸菌処理を行ってもよい。後の精製作業を考慮すると、余計な培地成分を含有しない滅菌水中での処理がより好ましい。なお、処理に用いる乳酸菌は生菌体のままでもよい。生菌体としては増殖期の菌体でも良いし、休止菌体を用いても良い。あるいは適宜溶媒により固定・乾燥を経た死滅粉体を用いても良いが、生菌体が好ましい。
滅菌方法としては、例えば、加熱滅菌、高圧滅菌、濾過滅菌等が挙げられ、これらに限定されることなく従来公知の方法を使用することができる。また、死滅粉体は、従来公知の方法を用いて取得することができる。
【００１８】
本発明において使用される培地は、特に限定されないが、例えば、乳酸菌の培養に通常使用される炭素源、窒素源、ミネラル源等を含むもの等を使用することができ、天然培地又は合成培地等を用いることができる。好ましくは、液体培地を用いる。
【００１９】
炭素源としては、特に限定されないが、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ラクトース、スクロース、セロビオース、廃糖蜜、グリセロール等が挙げられ、好ましくは、グルコース、スクロース等である。窒素源としては、特に限定されないが、無機態窒素源としては、例えば、アンモニア、アンモニウム塩等が挙げられ、有機態窒素源としては、例えば、ペプトン、ポリペプトン、尿素、アミノ酸、タンパク質、大豆ぺプチド等のペプチド類等が挙げられる。窒素源は、好ましくは、ペプトン、ポリペプトン、ペプチド、アミノ酸等である。また、ミネラル源としては、特に限定されないが、酵母エキスや肉エキスの他、Ｋ、Ｐ、Ｍｇ、Ｓ等を含む、例えば、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が挙げられる。これらの炭素源、窒素源、ミネラル源は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
培地中の炭素源及び窒素源の濃度は、乳酸菌が生育できる通常の濃度であればよく、特に限定されない。培養開始時の炭素源濃度は、通常は、培地全量に対して約０．１〜１５重量％が好ましく、約１〜１０重量％がより好ましい。培養開始時の窒素源の濃度は、通常は、培地全量に対して約０．０５〜１０重量％が好ましく、約０．１〜５重量％がより好ましい。
【００２０】
前記培地は、前記の窒素源、炭素源、ミネラル源に加えて、さらに、無機質、有機質、ｐＨ緩衝剤等を添加しても良い。無機質や有機質としては、特に限定されないが、例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン、各種ビタミン類等が挙げられ、これらは１種単独で又は２種以上を組合せて使用することができる。
ｐＨ緩衝剤としては、特に限定されないが、例えば、炭酸カルシウム等が好ましく挙げられる。
本発明において、ステビアは、原料として培地に添加される。ステビアは、天然物でもその加工品でも良い。加工品としては、例えば、ステビアの乾燥物、裁断物、粉砕物、抽出物、ペースト等が挙げられる。
ステビアの使用量は、特に限定されないが、培地全量に対して、好ましくは、約１〜５０重量％であり、より好ましくは、約５〜４０重量％である。
前記培地は、本発明の効果を奏する限り、上述したステビア以外の成分や添加剤を含んでも良い。
【００２１】
前記培地のｐＨは、例えば約３〜７とすることが好ましく、約６〜７とすることがより好ましい。ｐＨを制御してもよく、酸又はアルカリを用いてｐＨの調整を行うことができる。
【００２２】
乳酸菌を用いた処理の好ましい実施態様として、下記のものが例示される。
予めステビアを含有しない培地に乳酸菌を接種して培養し、遠心分離により菌体を得た後、該菌体に滅菌蒸留水又はＰＢＳ（−）等の減菌リン酸緩衝生理食塩水を加えることにより、乳酸菌を含有する培地が好ましく得られる。該乳酸菌含有培地に、予め公知の方法で滅菌処理を施した前記ステビア又はその加工品を別途添加して、培養することにより、ステビアを乳酸菌を用いて処理した生産物を好ましく取得することができる。前記乳酸菌含有培地に添加するステビア又はその加工品としては、前記［００１２］に記載のステビアを使用することができるし、ステビアに抽出溶媒を添加してステビア成分を抽出させることにより得られる抽出液、ステビア及び抽出溶媒の懸濁液そのままのもの、又は該懸濁液を常法により加熱して得られる熱水抽出液を使用することもできる。前記懸濁液を加熱する温度は、特に限定されないが、通常、約４０〜９０℃である。
また、培地として、前記抽出液、懸濁液又は熱水抽出液を使用することもでき、該培地を減菌した後、該培地に乳酸菌を直接接種して培養することにより、ステビアを乳酸菌を用いて処理した生産物を好ましく取得することもできる。
これらの工程において使用されるステビアは、ステビアの葉を乾燥粉末化したもの、あるいは該粉末を適宜溶媒で抽出したものが好ましい。
【００２３】
前記抽出溶媒は、特に限定されないが、例えば、蒸留水、イオン交換水、生理食塩水、有機溶媒等が挙げられる。これらは１種単独で又は２種以上を組合せて使用することができる。前記有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノール等の低級アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン等のケトン類；酢酸エチルエステル等のエステル類等が挙げられる。これらは１種単独で又は２種以上を組合せて使用することができる。前記抽出溶媒は、好ましくは、蒸留水、エタノールと水の混合溶媒等であり、より好ましくは蒸留水である。
【００２４】
前記培地に使用されるステビアと抽出溶媒の重量比は、ステビアの種類、形状、及び乾燥状態等に応じて適宜選択され得るが、例えば、ステビア／抽出溶媒の重量比は、好ましくは、約１／１００〜５０／１００であり、より好ましくは、約５／１００〜４０／１００である。
【００２５】
本発明において、前記培地に乳酸菌を接種する条件は、特に限定されず、例えば、該培地中に乳酸菌を約０．０１〜３０％接種することが好ましく、約０．５〜１０％接種することがより好ましい。
【００２６】
本発明において、ステビアを、乳酸菌を用いて処理する温度は、微生物変換が効率的に実施できれば特に限定されないが、例えば、約１５〜６５℃が好ましく、約２５〜６０℃がより好ましい。
また、乳酸菌を用いて処理する処理時間は、前記培地の組成、該培地の乳酸菌接種量、前記処理温度等に応じて適宜設定され得るが、例えば、約１２〜３３６時間が好ましく、約２４〜１６８時間がより好ましい。乳酸菌処理は、好気条件下で行ってもよく、嫌気条件下で行っても良い。
【００２７】
本発明のルブソシドは、上述のようにしてステビアを乳酸菌を用いて処理して得られた生産物から、従来公知の方法を用いて、ルブソシドを採取することによって得られる。採取方法としては、ろ過、遠心分離等による粗精製又は精製、殺菌（加熱殺菌等）、希釈、濃縮、乾燥等が挙げられる。これらの採取を行なう工程を本発明の製造方法に含んでも良い。
【００２８】
本発明により製造されるルブソシドは、例えば、上述のようにしてステビアを乳酸菌を用いて処理して得られた生産物を、常法を用いて粗精製又は精製することにより該生産物の上澄み液を取得し、該上澄み液を希釈又は濃縮後に乾燥させることにより取得することができるし、前記生産物そのものを乾燥することにより取得することもできる。前記粗精製又は精製は、分離カラムを用いた精製、有機溶媒を用いた液相分離精製等により行なうことができる。このようにして得られる乾燥物を、従来公知の方法により濃縮、結晶化、再結晶等によってさらに精製しても良い。
【００２９】
本発明は、ステビオシドを、乳酸菌を用いて処理する工程を含むルブソシドの製造方法も含有する。該製造方法は、ステビオシドを、乳酸菌を用いて処理する工程以外の工程を含んでも良い。
【００３０】
本発明において使用されるステビオシドは、通常、従来公知の方法により得られるものを使用することができる。ステビオシドは、例えば、市販のステビオシドを使用することができ、市販のステビオシド粉末をそのまま使用することができるし、市販のステビオシド粉末を溶媒に溶解させた溶解液を使用することができる。またステビアから抽出、精製したものを使用してもよい。
ステビオシドを溶解させる溶媒は、特に限定されないが、例えば、蒸留水、イオン交換水、生理食塩水、有機溶媒等が挙げられる。これらは１種単独で又は２種以上を組合せて使用することができる。前記有機溶媒としては、アセトニトリル；ジメチルスルホキシド；メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノール等の低級アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン等のケトン類；酢酸エチルエステル等のエステル類等が挙げられる。これらは１種単独で又は２種以上を組合せて使用することができる。前記ステビオシドを溶解させる溶媒は、好ましくは、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、蒸留水、エタノール、含水エタノール等であり、より好ましくは、蒸留水、含水エタノール等である。
【００３１】
ステビオシドを、乳酸菌を用いて処理する工程を含む本発明の製造方法の好ましい態様は、ステビアの代りにステビオシドを使用する以外は、上述した、ステビアを、乳酸菌を用いて処理する工程を含む本発明の製造方法と同様である。
【００３２】
上述のようにして得られたルブソシドは、甘味料として使用することができ、該ルブソシドをそのままで、食品、健康食品、サプリメント、医薬品等の製造原料として使用することができるし、該ルブソシドを常法により適宜加工したものを、食品、健康食品、サプリメント、医薬品等に使用することもできる。
【００３３】
前記食品とは、経口的に摂取されるものを意味し、飲料、半固形食品、固形食品、粉末食品等が挙げられる。半固形食品、固形食品としては、例えば、ドロップ、キャンディー、チューインガム等の菓子類；クッキー、クラッカー、ビスケット、ポテトチップス、パン、ケーキ、チョコレート、ドーナツ、プリン、ゼリー等の洋菓子；煎餅、羊羹、大福、おはぎ、饅頭、カステラ等の和菓子；アイスクリーム、アイスキャンディー、シャーベット、ジェラート等の冷菓；食パン、フランスパン、クロワッサン等のパン類；うどん、そば、きしめん等の麺類；かまぼこ、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品；ハム、ソーセージ、ハンバーグ、コーンビーフ等の畜肉製品；塩、胡椒、みそ、しょう油、ソース、ドレッシング、マヨネーズ、ケチャップ、甘味料、辛味料等の調味類；明石焼き、たこ焼き、もんじゃ焼き、お好み焼き、焼きそば、焼きうどん等の鉄板焼き食品；チーズ、ハードタイプのヨーグルト等の乳製品；納豆、厚揚げ、豆腐、こんにゃく、団子、漬物、佃煮、餃子、シューマイ、コロッケ、サンドイッチ、ピザ、ハンバーガー、サラダ等の各種総菜；ビーフ、ポーク、チキン等の畜産物；海老、帆立、蜆、昆布等の水産物等が挙げられる。
粉末食品としては、例えば、野菜・果実類、植物、酵母、藻類等を粉末にした各種粉末；油脂類・香料類（バニラ、柑橘類、かつお等）を粉末固形化したもの等が挙げられる。
【００３４】
飲料としては、例えば、スープ、味噌汁等の飲食品；インスタントコーヒー、インスタント紅茶、インスタントミルク、インスタントスープ、インスタント味噌汁等の粉末飲食品；ウイスキー、バーボン、スピリッツ、リキュール、ワイン、果実酒、日本酒、中国酒、焼酎、ビール、アルコール度数１％以下のノンアルコールビール、発泡酒、酎ハイ等のアルコール飲料；果汁（例えば、リンゴ、ミカン、ブドウ、バナナ、ナシ、ウメの果汁等）入り飲料、野菜汁（例えば、トマト、ニンジン、セロリ、キュウリ、スイカの野菜汁等）入り飲料、果汁および野菜汁入り飲料、清涼飲料水、牛乳、豆乳、乳飲料、ドリンクタイプのヨーグルト、コーヒー、ココア、茶飲料（紅茶、緑茶、麦茶、玄米茶、煎茶、玉露茶、ほうじ茶、ウーロン茶、ウコン茶、プーアル茶、ルイボスティー茶、ローズ茶、キク茶、ハーブ茶（例えば、ミント茶、ジャスミン茶）等）、栄養ドリンク、スポーツ飲料、ミネラルウォーター等の非アルコール飲料等が挙げられる。
【００３５】
前記健康食品とは、保健、健康維持・増進等の目的とした食品組成物を意味し、認可された特定機能性食品や、特定機能性食品の認可のないいわゆる健康食品が含まれる。前記健康食品は、例えば、液体又は半固形、固形の製品であって、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅう等の菓子類、清涼飲料、栄養飲料、スープ等が挙げられる。また、そのままお湯や水に溶かして飲用しても良い。
【００３６】
前記サプリメントとは、栄養素等を補うための栄養補助食品、栄養機能食品等を意味するだけではなく、健康の保持・回復・増進等のために役立つ機能等を有する健康補助食品、健康機能食品等をも意味する。このようなサプリメントの形状としては、例えば、タブレット状、丸状、カプセル（ハードカプセル、ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）状、粉末状、顆粒状、細粒状、トローチ状、液状（シロップ状、乳状、懸濁状を含む）等が挙げられる。
【００３７】
本発明の製造方法により得られたルブソシドを医薬品に使用する場合、例えば、経口投与用剤、非経口投与剤等の製剤に使用することができる。経口投与用剤の剤型としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤等の固形剤；エリキシル、シロップ、懸濁液等の液剤等の剤型が挙げられる。非経口投与剤の剤型としては、例えば、注射剤（静脈注射、動脈注射、筋肉注射、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射、脊髄内注射、硬膜外注射、関節内注射、歯周組織内注射、歯槽骨周辺への注射）、経皮剤、経腸剤、点滴剤、外用剤、坐剤等が挙げられる。
【００３８】
本発明の製造方法により得られるルブソシドは、前記の食品、健康食品、サプリメント、医薬品の製造工程において、あるいは最終製品に、従来公知の方法を用いて添加することができる。これらの食品、健康食品、サプリメント、医薬品は、病的な血管新生やアレルギー作用等の予防、改善又は治療に用いることができる。また、本発明の製造方法により得られるルブソシドは、抗がん剤や、難溶解性薬剤の溶解性を高める天然可溶化剤として使用することもできる。
【実施例】
【００３９】
本発明を以下の実施例及び比較例によって具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
尚、以下の実施例及び図において、ＰＢＳ（−）とは、リン酸緩衝生理食塩水を意味し、乳酸菌とはラクトバチルス  カゼイ  ハセガワ菌株（受託番号：ＦＥＲＭ−ＢＰ−１０１２３）を意味する。
【００４０】
（実施例１）
＜ステビオシド−乳酸菌処理サンプル及びステビオシドサンプルの調製＞
予め一般乳酸菌接種用培地（ニッスイ社製）に乳酸菌（ラクトバチルス カゼイ ハセガワ菌株）を一白金耳植え、３７℃で静置培養した後、遠心及びＰＢＳ（−）にて菌体ペレットの洗浄を行い、乳酸菌１×１０１０ｃｆｕを含むＰＢＳ（−）１ｍＬ溶液を１．５ｍＬチューブへ用意した。一方で、市販のステビオシド（長良サイエンス社製）を、予め８０％アセトニトリル溶液に２０ｍｇ／ｍＬのステビオシド濃度となるように溶解したストック溶液を用意した。該ストック溶液を、乳酸菌菌体が含まれているＰＢＳ（−）溶液へステビオシドの最終濃度が４０μｇ／ｍＬになるように加え、３７℃で４８時間静置した。これをステビオシド−乳酸菌処理サンプル１とした。また、ネガティブコントロールとして、乳酸菌を含まないＰＢＳ（−）にステビオシドを最終濃度４０μｇ／ｍＬになるよう前記ストック溶液を加え、同様に３７℃で４８時間静置したものも用意した。これをステビオシドサンプル１とした。
＜ＨＰＬＣによる分析＞
上記の通り得られたステビオシド−乳酸菌処理サンプル１及びステビオシドサンプル１を遠心し、上清１０μＬを以下の条件下でＨＰＬＣへ供した。ＨＰＬＣ（島津製作所社製）では分離カラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  （Ｉ．Ｄ．  ２５０×４．６ｍｍ、Ｓ−５μｍ、１２ｎｍ；ＹＭＣ社製）を用いた逆相系を使用し、移動相として水及びアセトニトリルを用いたグラジエント条件下で分析を行った。カラムオーブンを３７℃に設定したまま１０％アセトニトリル溶液から開始し、０分から２５分までに１００％まで濃度を上げ、その後１００％アセトニトリルによる洗浄工程を経る条件を用いた。流速１ｍＬ／分で２１０ｎｍでの検出を行った。
ステビオシド−乳酸菌処理サンプル１及びステビオシドサンプル１のＨＰＬＣ測定データを、それぞれ図１及び図２に示す。
【００４１】
＜乳酸菌含有サンプルの調製＞
予め一般乳酸菌接種用培地（ニッスイ社製）に乳酸菌（ラクトバチルス カゼイ ハセガワ菌株）を植え、３７℃で静置培養した後、遠心及びＰＢＳ（−）にて菌体ペレットの洗浄を行い、乳酸菌１×１０１０ｃｆｕを含むＰＢＳ（−）１ｍＬ溶液を１．５ｍＬチューブへ用意した。これを乳酸菌含有サンプルとした。本サンプルを遠心し、上清１０μＬを上述のＨＰＬＣ条件で分析に供した。
乳酸菌含有サンプルのＨＰＬＣ測定データを図３に示す。
【００４２】
＜ルブソシドサンプルの調製＞
市販のルブソシド（和光社製）を予めジメチルスルホキシシド（ＤＭＳＯ）（ナカライテスク社製）に２０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解したストック溶液を用意した。乳酸菌を含まないＰＢＳ（−）にルブソシドを最終濃度４０μｇ／ｍＬになるよう加え、３７℃で４８時間静置したものも用意した。これをルブソシドサンプルとした。このサンプル１０μＬを上述のＨＰＬＣ条件で分析に供した。
ルブソシドサンプルのＨＰＬＣ測定データを図４に示す。
図１〜４の結果から、ステビオシドの乳酸菌処理物であるステビオシド−乳酸菌処理サンプル１（図１）では、１４．２min付近のステビオシドのピーク（図２のピーク）が消失し、１５．５min付近のルブソシドのピーク（図４のピーク）が生成したことが確認された。
【００４３】
（実施例２）
実施例１において、８０％アセトニトリル溶液をＤＭＳＯに変更した以外は、実施例１と同様の操作を行ない、ステビオシド−乳酸菌処理サンプル２、及びステビオシドサンプル２を調製し、実施例１と同様の方法を用いてＨＰＬＣを測定した。ステビオシド−乳酸菌処理サンプル２、及びステビオシドサンプル２のＨＰＬＣ測定結果を、それぞれ図５及び図６に示す。
これらの図５及び図６の結果からも、乳酸菌を用いたステビオシドの処理により、ステビオシドが消失し、ルブソシドが生成したことが確認された。
【００４４】
（実施例３）
実施例１及び２のＨＰＬＣ測定で使用した６種の各サンプル溶液、各６μＬを、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）シリカゲルプレート（TLC silica gel 60 F254、メルク社製）へスポットし、移動相をクロロホルム：メタノール：水が15:13:2（v/v/v）の割合となるよう調整し、展開した後、該ＴＬＣシリカゲルプレートを乾燥し、１０％硫酸溶液により噴霧した後、ドライヤーにて発色させた。その写真を図７に示す。
図７において、１はステビオシドサンプル１、２はステビオシドサンプル２、３はルブソシドサンプル、４はステビオシド−乳酸菌処理サンプル１、５はステビオシド−乳酸菌処理サンプル２、６は乳酸菌含有サンプルの展開パターンを示す。
その結果、ステビオシドの乳酸菌処理物である４：ステビオシド−乳酸菌処理サンプル１、及び５：ステビオシド−乳酸菌処理サンプル２は、ルブソシド単体の溶液（３：ルブソシドサンプル）と同じ位置にメインバンドを示し、ステビオシドの乳酸菌処理物が、ルブソシドを主成分として含有することが確認された。
【００４５】
（実施例４）
＜ステビア抽出物の調製＞
ステビア葉の乾燥粉末を１０ｇ測りとり、そこへ蒸留水を１００ｍＬ加え、撹拌しながら８０℃で３時間抽出を行った。その後、Ｎｏ．２のろ紙（アドバンテック社製）で濾過し、得られた溶液を凍結乾燥へと供した。
＜ステビア抽出物―乳酸菌処理サンプルの調製＞
予め一般乳酸菌接種用培地（ニッスイ社製）に乳酸菌（ラクトバチルス カゼイ ハセガワ菌株）を植え、３７℃で静置培養した後、遠心及びＰＢＳ（−）にて菌体ペレットの洗浄を行い、乳酸菌１×１０１０ｃｆｕを含むＰＢＳ（−）１ｍＬ溶液を１．５ｍＬチューブへ用意した。一方で上記のステビア抽出物を予め滅菌蒸留水（Ｈ２Ｏ）に４０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解したストック溶液を用意した。該ストック溶液を0.22μｍ滅菌フィルターを通して滅菌し、乳酸菌菌体が含まれているＰＢＳ（−）溶液へステビア抽出物の最終濃度が８ｍｇ／ｍＬになるように加え、３７℃で９６時間静置した。これをステビア抽出物―乳酸菌処理サンプルとした。
＜ＨＰＬＣによる分析＞
上記の通り得られたステビア抽出物―乳酸菌処理サンプルを遠心し、上清１０μＬを以下の条件下でＨＰＬＣへ供した。ＨＰＬＣ（島津製作所社製）では分離カラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  （Ｉ．Ｄ．  ２５０×４．６ｍｍ、Ｓ−５μｍ、１２ｎｍ；ＹＭＣ社製）を用いた逆相系を使用し、移動相として水及びアセトニトリルを用いたグラジエント条件下で分析を行った。カラムオーブンを３７℃に設定したまま１０％アセトニトリル溶液から開始し、０分から２５分までに１００％まで濃度を上げ、その後１００％アセトニトリルによる洗浄工程を経る条件を用いた。流速１ｍＬ／分で２１０ｎｍでの検出を行った。
ステビア抽出物―乳酸菌処理サンプルのＨＰＬＣ測定データを図８に示す。
【００４６】
（比較例１）
＜ステビア抽出物サンプルの調製＞
ネガティブコントロールとして、乳酸菌を含まないＰＢＳ（−）に前記ステビア抽出物を最終濃度８ｍｇ／ｍＬになるよう加え、同様に３７℃で９６時間静置したものも用意した。これをステビア抽出物サンプルとした。該サンプルを実施例４と同様の方法を用いてＨＰＬＣ測定を行った。
ステビア抽出物サンプルのＨＰＬＣ測定データを図８に示す。
図８の結果から、比較例１のステビア抽出物サンプルに含有される１４．２min付近のステビオシドのピークが、実施例４のステビア抽出物―乳酸菌処理サンプルでは減少しており、実施例４のピークでは１５．５min付近のルブソシドのピークが見られた。従って、ステビア抽出物に含有されるステビオシドを、乳酸菌を用いて処理することにより、ルブソシドを製造することができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明のルブソシドの製造方法によれば、食経験上十分に安全な原料を使用して、食しても十分に安全なルブソシドを、安価で簡便に製造することができ、大量生産することができるため、ルブソシドを甘味料や難溶解性薬剤の天然可溶化剤として実用化することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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