(57)【要約】【課題】外部から操作することなくベシクルの分解を制御することのできる自己分解型ベシクルの提供。【解決手段】ベシクルと、上記ベシクルに内包され上記ベシクルを分解する物質を産生する微生物と、を備える自己分解型ベシクル。【選択図】図１
2015188447.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベシクルと、
前記ベシクルに内包され前記ベシクルを分解する物質を産生する微生物と、を備える自己分解型ベシクル。
【請求項２】
前記物質が両親媒性物質又は有機溶媒である、請求項１に記載の自己分解型ベシクル。
【請求項３】
前記ベシクルに内包された機能性物質を更に備える、請求項１又は２に記載の自己分解型ベシクル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己分解型ベシクルに関する。
【背景技術】
【０００２】
ベシクルは、一般的に脂質二重膜で形成された小胞であり、脂質膜で隔たれた内水相を有する。ベシクルは、内水相及び脂質膜に種々の物質を内包させることができるため、機能性物質の運搬媒体として広く利用されている。例えば、特許文献１には、微生物活性調節物質及び運搬媒体を含む、生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物用活性調節剤が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０１７２３３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ベシクルに内包された機能性物質は、ベシクルが分解することにより放出されて機能すると考えられる。しかしながら、これまで、外部から操作することなくベシクルの分解を制御する手法は知られていない。
【０００５】
そこで、本発明は、外部から操作することなくベシクルの分解を制御することのできる自己分解型ベシクルの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ベシクルと、上記ベシクルに内包され上記ベシクルを分解する物質を産生する微生物と、を備える自己分解型ベシクルを提供する。
【０００７】
本発明によれば、外部から操作することなく一定時間経過後にベシクルを自己分解させることができる。すなわち、本発明の自己分解型ベシクルは、ベシクル内水相における、上記微生物が産生する上記物質の濃度が高まることで、ベシクルが自己分解する。
【０００８】
上記物質は両親媒性物質又は有機溶媒であることが好ましい。これにより、ベシクルの自己分解の効率をより向上させることができる。
【０００９】
上記自己分解型ベシクルは、上記ベシクルに内包された機能性物質を更に備えることが好ましい。上記自己分解型ベシクルは、外部から操作することなくベシクルの分解を制御することができるため、ベシクルに内包された機能性物質を放出するタイミングを制御することができ、機能性物質をより効率よく作用させることができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、外部から操作することなくベシクルの分解を制御することのできる自己分解型ベシクルの提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】一実施形態に係る自己分解型ベシクルを示す模式断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１３】
〔自己分解型ベシクル〕
本実施形態に係る自己分解型ベシクルは、ベシクルと、当該ベシクルに内包されベシクルを分解する物質を産生する微生物と、を備える。
【００１４】
図１は、一実施形態に係る自己分解型ベシクルを示す模式断面図である。図１に示す自己分解型ベシクル１００は、ベシクル１０と、ベシクル１０に内包されベシクル１０を分解する物質を産生する微生物１３と、を備える。
【００１５】
（ベシクル）
ベシクル１０は、リン脂質等の脂質二重膜で形成された小胞であり、親水性基１１が集合している小胞の内側表面と外側表面が親水性を示し、疎水性基１２が集合している脂質二重膜の内部が疎水性を示す。脂質二重膜は、他の構成成分として、糖、タンパク質等を含むこともある。
【００１６】
ベシクル１０としては、電荷を帯びていないベシクル、電荷を帯びているベシクルを挙げることができる。電荷を帯びているベシクルとしては、カチオン性ベシクル、アニオン性ベシクルを挙げることができる。
【００１７】
カチオン性ベシクルは、カチオン性脂質、カチオン性多糖類等を脂質二重層の構成要素として含ませることで得ることができる。同様に、アニオン性ベシクルは、アニオン性脂質、アニオン性多糖類等を脂質二重層の構成要素として含ませることで得ることができる。
【００１８】
カチオン性脂質として、例えば、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン又は第四級アンモニウムカチオンが結合した脂質を挙げることができる。カチオン性脂質のより具体的な例として、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム硫酸メチル（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、ステアリルアミン等が挙げられる。カチオン性多糖類のより具体的な例として、例えば、キトサン等が挙げられる。
【００１９】
アニオン性脂質として、例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸等の脂肪酸、ドデシル硫酸、ヘキサデシル硫酸等のアルキル硫酸を挙げることができる。アニオン性多糖類として、例えば、カラギーナン、デキストラン硫酸等を挙げることができる。
【００２０】
ベシクルは化学的に合成したベシクルを本発明に好適に用いることができる。また、ベシクルは、複数の層構造を有する場合がある。
【００２１】
ベシクルとしては、リポソームが好ましい。リポソームは、リン脂質を主成分とする脂質二重膜で形成される小胞である。リン脂質は、構造中にリン酸エステル部位を有する脂質である。リン脂質は、例えば、グリセリン又はスフィンゴシンを中心骨格として脂肪酸及びリン酸が結合し、更にリン酸にアルコール（例えば、コリン、エタノールアミン、イノシトール、セリン等）がエステル結合した構造を有するものである。リン脂質としては、天然由来のリン脂質、合成されたリン脂質を挙げることができる。
【００２２】
リン脂質として、これに限定されるものではないが、例えば、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、卵黄レシチン、水素添加大豆ホスファチジルコリン等を挙げることができる。
【００２３】
リン脂質のより具体的な例として、例えば、１，２−ジデカノイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ）、１−ステアロイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＳＯＰＣ）、１，２−ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１，２−ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、スフィンゴミエリン卵黄由来（ＥＧＧ−ＳＰＭ）、スフィンゴミエリン牛乳由来（ＭＩＬＫ−ＳＰＭ）、１，２−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、１，２−ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）を挙げることができる。
【００２４】
リポソームは、電荷を帯びていないリポソーム、電荷を帯びているリポソームを挙げることができる。電荷を帯びているリポソームとしては、カチオン性リポソーム、アニオン性リポソームを挙げることができる。
【００２５】
カチオン性リポソームは、リポソームにカチオン性脂質、カチオン性多糖類等を脂質二重層の構成要素として含ませることで得ることができる。
【００２６】
アニオン性リポソームは、リポソームにアニオン性脂質、アニオン性多糖類等を脂質二重層の構成要素として含ませることで得ることができる。
【００２７】
（ベシクルを分解する物質を産生する微生物）
微生物１３は、ベシクルを分解する物質を産生する。ベシクルを分解する物質としては、脂質二重膜で形成される小胞の構造を破壊できる物質であればよい。このような物質としては、ベシクルの自己分解の効率をより向上させることができることから、両親媒性物質又は有機溶媒であることが好ましい。
【００２８】
両親媒性物質としては、例えば、グリコリピッド（糖脂質）型のバイオサーファクタント、リポペプチド型のバイオサーファクタント、高分子型のバイオサーファクタントが挙げられる。これらバイオサーファクタントの具体例としては、例えば、ラムノリピッド、トレハロースリピッド、グリセロリピッド、サーファクチン、ビスコシン、エマルザン等を挙げることができる。
【００２９】
両親媒性物質を産生する微生物としては、例えば、シュードモナス属に属する微生物、ロドコッカス属に属する微生物、コリネバクテリウム属に属する微生物、バチラス属に属する微生物、シュードモナス属に属する微生物、アシネトバクター属に属する微生物を挙げることができる。
【００３０】
有機溶媒としては、例えば、エタノール、ブタノール等のアルコール、アセトン等のケトンを挙げることができる。
【００３１】
有機溶媒を産生する微生物としては、例えば、ザイモモナス属に属する微生物、クロストリジウム属に属する微生物を挙げることができる。
【００３２】
両親媒性物質を産生する微生物、又は有機溶媒を産生する微生物としては、天然に存在する微生物のみならず、当該技術分野における公知の手法によって、両親媒性物質又は有機溶媒を産生するように遺伝子組み換えされた微生物も用いることができる。
【００３３】
（機能性物質）
本実施形態に係る自己分解型ベシクルは、ベシクルに内包された機能性物質を更に備えることが好ましい。本実施形態に係る自己分解型ベシクルは、外部から操作することなくベシクルの分解を制御することができるため、ベシクルに内包された機能性物質を放出するタイミングを制御することができ、機能性物質をより効率よく作用させることができる。
【００３４】
機能性物質は、自己分解型ベシクルの維持に影響を与えないものであれば、特に制限はない。
【００３５】
機能性物質としては、例えば、原核生物の活性に影響を与える核酸、原核生物の活性に影響を与えるタンパク質、細胞間情報伝達物質（シグナル物質）等が挙げられる。これらは１種類を単独で又は複数種類を組み合わせて使用することができる。
【００３６】
原核生物の活性に影響を与える核酸としては、タンパク質の合成や合成抑制に関わる酵素やＡＴＰ合成酵素の発現をコードするＤＮＡやＲＮＡ等が挙げられる。これらのＤＮＡは、プロモーターの下流に発現可能に連結されていることが好ましい。
【００３７】
原核生物の活性に影響を与える核酸は、大腸菌、バチルス属等の原核生物のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって取得することができる。原核生物の活性に影響を与える核酸は、ｐＧＥＭ（プロメガ社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社）、ｐＵＣ（タカラバイオ株式会社）等のベクターにクローニングし、例えば大腸菌に導入して大腸菌の菌体内でプラスミドの形態で維持することができる。また、必要に応じて上記大腸菌から大量に調製することができる。
【００３８】
原核生物の活性に影響を与えるタンパク質としてはポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ等が挙げられる。
【００３９】
原核生物の活性に影響を与えるタンパク質は、例えば、当該タンパク質を生産する微生物から精製して調製してもよい。または、原核生物の活性に影響を与えるタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを用いて、大腸菌等の体内で大量発現させ、これを精製して調製してもよい。
【００４０】
シグナル物質としては、Ｎ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン（ＡＩ１：オートインデューサー１）；４，５−ジヒドロキシ−２，３−ペンタンジオン（ＡＩ２：オートインデューサー２）；ＨＨＱ（２−アルキル−４−キノロン）、ＰＱＳ（２−アルキル−３−ヒドロキシ−４−キノロン）等のキノロン・キノリン類；インドール類；ペプチド；環状ジペプチド；ジケトピペラジン等が挙げられる。Ｎ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトンとしては、例えば、Ｎ−ブタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソブタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシブタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ペンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソペンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシペンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−オクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソオクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシオクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ノナノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソノナノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシノナノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−デカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−トリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソトリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシトリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−テトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソテトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシテトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン等のアシル基の炭素数が４〜１６であるＮ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
シグナル物質は、化学合成により調製してもよく、シグナル物質産生菌が培地中に分泌したシグナル物質を精製して調製してもよい。また、シグナル物質産生菌の培養物を、精製することなくシグナル物質として使用してもよい。シグナル物質産生菌としては、パラコッカス属、バークホルデリア属、シュードモナス属、ビブリオ属、アエロモナス属、バチルス属、ストレプトマイセス属、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属などの菌が例示できる。
【００４２】
（サイズ）
本実施形態に係る自己分解型ベシクルのサイズ（最大直径）は、数百ｎｍ〜数百μｍであることが好ましく、１μｍ〜１００μｍであることがより好ましい。自己分解型ベシクルのサイズが上記範囲であると、ベシクルを分解する物質を産生する微生物を導入しやすくなり、自己分解型ベシクルの安定性及び操作性が向上する。
【００４３】
〔自己分解型ベシクルの製造方法〕
自己分解型ベシクルは、バンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）法等の公知の方法で作製することができる。例えば、以下の方法により、自己分解型ベシクルを製造することができる。リン脂質等のベシクルの構成要素をクロロホルム等の有機溶媒に溶解する。続いて、有機溶媒を留去し脂質薄膜を得る。そこに微生物が分散した精製水又は緩衝液を加えて、微生物を内包したベシクルを製造することができる。また、脂質薄膜に精製水又は緩衝液を加えて、リン脂質等の相転移温度以上の温度となるように加温することで、自己分解型ベシクルを製造することもできる。さらに、逆相蒸発法、エタノール注入法、エーテル蒸発法等を利用してもよい。なお、ベシクルとしてリポソームを用いる場合も、同様に製造することができる。
【００４４】
より具体的には、本実施形態に係る自己分解型ベシクルは、以下のようにして製造することができる。フラスコ中、クロロホルム／メタノール溶液で脂質を溶解し、ロータリーエバポレーター等で溶媒を除去して、フラスコ底部に脂質の薄膜を形成する。次に、得られた脂質の薄膜をデシケーターで静置、乾燥させる。乾燥した脂質の薄膜に、微生物が分散した緩衝液を加え、撹拌しながら脂質の薄膜を均一に分散させる。その後、室温で一日静置して、本実施形態に係る自己分解型ベシクルを得ることができる。さらに、サイズの大きな自己分解型ベシクルを製造する場合には、微生物が分散した緩衝液を投入した後、脂質の相転移温度以上で数時間加熱し、その後撹拌するとよい。
【００４５】
〔自己分解型ベシクルの使用方法〕
本実施形態に係る自己分解型ベシクルは、単独で使用してもよく、水等に懸濁させて使用してもよい。
【００４６】
本実施形態に係る自己分解型ベシクルの具体的な使用例として、機能性物質として細胞間情報伝達物質（シグナル物質）を用いた自己分解型ベシクルを、汚泥中の微生物によって排水を処理させる生物学的排水処理装置に適用することができる。ベシクルに内包されベシクルを分解する物質を産生する微生物が、ベシクルを分解する物質を産生することにより、ベシクル内の当該物質濃度が増加すると、ベシクルが分解する。ベシクルの分解により、ベシクルに内包された機能性物質（細胞間情報伝達物質）が放出され、生物学的排水処理装置における汚泥中の微生物に作用する。すなわち、ベシクルの構成成分、サイズ、及び、ベシクルを分解する物質を産生する微生物の種類を適宜選択することにより、所望の時間後にベシクルを分解することが可能であり、より効率よく排水処理を行うことができる。
【符号の説明】
【００４７】
１０…ベシクル、１１…親水性基、１２…疎水性基、１３…微生物、１００…自己分解型ベシクル。
【図１】
2015188447.tif 000003