(57)【要約】      （修正有）【課題】貧血の発現に関連する身体的ストレスは、自己免疫疾患、大手術、外傷、感染症、癌、重症疾患、糖尿病、肝疾患、腎疾患、心不全、及び寄生虫症を含む。全身性の炎症は、循環中の炎症性サイトカインの増加。ヘモグロビン異常症による貧血、例えば、鎌状赤血球症またはサラセミアにおいて、炎症性カイトカインレベルは上昇する。炎症性サイトカインレベルが上昇した結果の１つは、酵素レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の肝産生の減少であり、血漿中のＬＣＡＴは血漿脂質交代を促進し、血液中のコレステロールおよびリン脂質と血液により灌流された組織とのバランスを維持しているが、ＬＣＡＴの減少はこれらのバランスを崩し、血漿中のコレステロールの上昇をまねく。これらの血漿中の脂質代謝異常を是正する方法の提供【解決手段】コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の投与。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＢＣ膜における高ＰＣ／ＳＭ比を特徴とする状態（但し、貧血または赤血球機能不全は除く。）を有する患者を治療するための医薬の製造におけるＬＣＡＴの使用。
【請求項２】
前記状態は、鎌状赤血球症、糖尿病、サラセミア、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、関節炎、肝疾患、肝硬変、肝炎、有蕀赤血球増加症、敗血症、認知症、または微小血管障害、炎症性障害、寄生虫症、勃起不全、癌、子癇前症、重篤疾患、または外傷である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＰＣ対ＳＭのベースライン比を決定することと、ＬＣＡＴの投与後のＰＣ対ＳＭの比率を決定することと、をさらに含み、前記ＰＣ対ＳＭの比率の低下は、前記状態における改善を示す、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
高ＦＣ含量を特徴とする状態（但し、貧血または赤血球機能不全は除く。）を有する患者を治療するための医薬の製造におけるＬＣＡＴの使用。
【請求項５】
前記状態は、鎌状赤血球症、糖尿病、サラセミア、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、関節炎、肝疾患、肝硬変、肝炎、有蕀赤血球増加症、敗血症、認知症、または微小血管障害、炎症性障害、寄生虫症、勃起不全、癌、子癇前症、重篤疾患、または外傷である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記ＬＣＡＴは、静脈内注射、皮下注射、または筋肉内注射により投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記投与されるＬＣＡＴの量は、約１０ｍｇ〜約５０００ｍｇである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記投与されるＬＣＡＴの量は、前記正常なＬＣＡＴレベルの１倍〜１０００倍である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記ＬＣＡＴは修飾されたＬＣＡＴである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記修飾されたＬＣＡＴは、３１位にアミノ酸置換を含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＬＣＡＴの投与から４時間後の前記患者の前記血漿ＨＤＬ−Ｃレベルは、ＬＣＡＴ投与前の前記血漿ＨＤＬ−Ｃレベルの少なくとも５０％増加する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＬＣＡＴの投与から２４時間後の前記患者の前記血漿ＨＤＬ−Ｃレベルは、ＬＣＡＴ投与前の前記血漿ＨＤＬ−Ｃレベルの少なくとも１００％増加する、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年６月１２日に出願された米国仮出願第６１／１８６，６６８号、および２０１０年９月９日に出願された米国仮出願第６１／２４１，２２３号に対して優先権を主張する。米国仮出願第６１／１８６，６６８号および米国仮出願第６１／２４１，２２３号の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、概して、医学の分野、特に、貧血および／または変形能、酸素化、凝集、一酸化窒素代謝、もしくは寿命に関して異常機能を有する赤血球を特徴とする疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
血流中の赤血球（ＲＢＣ）の質および量は、身体的ストレスが増加する時期に低下することが多く、貧血ならびに罹患率および死亡率の高リスクをもたらす。貧血の発現に関連する身体的ストレスは、自己免疫疾患、大手術、外傷、感染症、癌、重症疾患、糖尿病、肝疾患、腎疾患、心不全、および寄生虫症を含む。全身性の炎症は、循環中の炎症性サイトカインの増加したレベルの存在により明白であるように、これらの全ての状態に共通する特徴である。ヘモグロビン異常症による貧血、例えば、鎌状赤血球症またはサラセミアに罹患しやすい個人においてさえ、炎症性サイトカインレベルは上昇することが多く、特にクリーゼ発症中、疾患の症状を悪化させる場合がある。
【０００４】
炎症性サイトカインレベルが上昇した結果の１つは、酵素レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の肝産生の減少である。通常、ＬＣＡＴは肝臓から血漿中に放出され、血漿脂質交代を促進し、血液中のコレステロールおよびリン脂質と血液により灌流された組織とのバランスを維持する。過剰コレステロールは、動脈等の組織から除去され、コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）として知られるプロセスにより、胆汁中に排出するために肝臓に送達される。ＲＣＴの第１段階において、コレステロールは、循環中、組織細胞から高密度のリポタンパク質（ＨＤＬ）に渡される。第２段階において、酵素ＬＣＡＴは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）（レシチンとしても知られる）からコレステロールへの脂肪酸のエステル転移反応を触媒して、コレステリルエステル（ＣＥ）を形成することにより、ＨＤＬのコレステロール輸送能力を強化する。ＣＥ産物は、肝臓のＨＤＬレセプターで除去されるまで、ＨＤＬ内部に蓄積される。ＨＤＬにより肝臓に送達されたＣＥは、胆汁中に排出されるコレステロールおよび胆汁酸に転換される。
【０００５】
血漿ＬＣＡＴ活性の減少の健康上の結果は、血漿ＬＣＡＴ活性が存在しない稀な遺伝性疾患である、家族性ＬＣＡＴ欠損症（ＦＬＤ）を有する個人において最も明白である。ＬＣＡＴ活性の不在は、血漿ＣＥレベルの大幅な減少をもたらし、これは、ＨＤＬの減少、および低密度リポタンパク質、ならびに血漿中の過剰なＬＣＡＴ基質の蓄積に反映される。ＦＬＤの主な健康上の結果は、角膜における脂質のびまん性増加の結果起こる視力低下、腎脂質蓄積による最終的な腎不全（糸球体硬化症）、および溶血性貧血である。
【０００６】
低ＬＣＡＴ活性の結果起こるもの等の、脂質代謝障害による血漿リポタンパク質脂質組成の歪みは、ＲＢＣの脂質含量の変化に関連している。血漿脂質の変化に応じるＲＢＣ脂質の変化は、これらの性質が細胞脂質含量に依存するため、ＲＢＣの性能および生存を変更する可能性がある。起こり得るＲＢＣ脂質変化の種類は、ＲＢＣがコレステロールおよびＰＣ中に富化され、かつスフィンゴミエリン（ＳＭ）含量が減少する、ＦＬＤの対象において明白である。これらのＲＢＣ脂質の異常がＬＣＡＴ欠損の結果としての血漿リポタンパク質脂質における妨害によって決まるというエビデンスは、ＲＢＣコレステロール含量の一時的な正常化が、正常な血漿をＦＬＤの対象に注入した後に生じた実験で得られた（Ｍｕｒｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１６：１２９−１３７、１９８４）。ＲＢＣ脂質のこの一時的な正常化は、ＦＬＤを有する患者において、存在しない、または非常に減少したＬＣＡＴ、ＨＤＬ、アポリオタンパク質Ａ−Ｉ、または他の血漿因子の補充による可能性がある。
【０００７】
血漿ＬＣＡＴ活性の減少がそれほど重度でない場合、貧血とＬＣＡＴ活性との間に因果関係は見られない。例えば、軽度のＬＣＡＴ欠損症である魚眼病を有する患者は、正常な血漿ＬＣＡＴ活性の３０％未満を示すが、正常なヘモグロビンおよびヘマトクリットを有する（Ｒｏｕｓｓｅｔ  ｅｉ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ．１６：１６３−１７１、２００９）。同様に、肝疾患を有する対象における研究では、低ＬＣＡＴ活性と貧血との間（ＬＷ  Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）  Ａｕｓｔ．Ｎ．Ｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．５：１０１−１０７）、またはＬＣＡＴ活性とＲＢＣ脂質異常との間（ＲＡ  Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５１：３１８２−３１９２）に相関関係は認められなかった。
【０００８】
ＦＬＤ患者において検出されるものと類似する身体的ストレス下にある個人において、ＲＢＣの有害な脂質変化のエビデンスがあるが、ＬＣＡＴとＲＢＣレベルまたは脂質との間に明らかな関係はない。異常なＲＢＣ脂質組成の例としては、肝疾患を有する個人からのＲＢＣ、およびリポタンパク質リパーゼ欠損症またはタンジール病による脂質異常症を有する個人におけるＰＣ／ＳＭ比の増加の報告を含む。我々（図１）および他の研究者は、クリーゼ状態ではない鎌状疾患の患者からのＲＢＣにおいて、ＰＣ／ＳＭ比の増加も認めた。さらに、糖尿病、心疾患（急性肝動脈症候群）、高コレステロール血症、鎌状赤血球貧血を有する個人からのＲＢＣ、および宇宙飛行後の個人のコレステロール富化が報告されている。
【０００９】
修飾されたＲＢＣ脂質組成物の結果は完全に理解されていないが、ＲＢＣコレステロール上昇の場合において、膜タンパク質の活性が異常になるエビデンスがある。肝疾患患者からのコレステロール富化ＲＢＣは、Ｍｇ＋＋−ＡＴＰａｓｅおよびアセチルコリンエステラーゼの活性の減少を示す。コレステロール富化は、内部から細胞外膜表面へのホスファチジルセリンの移動強化に関連しており、これは、網内系によるＲＢＣのクリアランス強化のシグナルである。ＲＢＣコレステロールの増加は、ＲＢＣ変形能を低下させ、ＲＢＣ形態の異常を誘発する可能性があり、その両方は、毛細管を通過するＲＢＣを損傷する可能性がある。重要なＲＢＣ機能である膜貫通型ガス交換も、コレステロール上昇により影響を受ける。
【００１０】
最近のエビデンスは、異常なＲＢＣ脂質組成が、赤血球の機能に有害な作用を有する可能性があり、よって、ＲＢＣ脂質組成を正常化するための方法、および赤血球機能障害を治療するための方法が必要であることを示唆する。
【発明の概要】
【００１１】
ＨＤＬ−Ｃと内因性ＬＣＡＴ活性との間の相関関係に関して、文献に共通の見解はない。我々は、組み換えヒトＬＣＡＴの注射による血漿ＬＣＡＴレベルの増加が、速やかに組織からのコレステロールの除去をもたらすという意外な発見をした。加えて、ＨＤＬ−Ｃは、速やかに増加した。ＨＤＬとＲＢＣとの間に存在する平衡を考えると、これらの意外な結果は、ＬＣＡＴの注入が速やかに血液細胞脂質の異常性を修正し、血液細胞の機能を改善するために使用することも可能であることを示す。
【００１２】
血漿ＨＤＬ−Ｃレベルは、しばしば、身体的ストレス、例えば、自己免疫疾患、大手術、外傷、感染症、癌、重症疾患、糖尿病、肝疾患、腎疾患、心不全、および寄生虫症の場合に減少することが報告されており、ＲＢＣとリポタンパク質との間の直接的な脂質交換を考慮すると、ＲＢＣ脂質含量の歪みの主な要因である可能性がある。貧血は、ＨＤＬが減少する場合において、多発している。
【００１３】
本開示は、ＬＣＡＴの治療有効量を投与することにより、ＬＣＡＴ濃度および／または活性を正常なヒトＬＣＡＴを超える濃度および／または活性に増加させることによって赤血球膜の脂質含量を調節する方法に関する。
【００１４】
本開示の一実施形態は、治療有効量のＬＣＡＴを対象に投与することを含む、赤血球機能障害を特徴とする状態を有する患者を治療する方法である。
【００１５】
別の実施形態は、貧血、または変形能の低下、酸素化の低下、一酸化窒素機能の低下、付着および／もしくは凝集の増加、または寿命の減少、またはそれらの任意の組み合わせを伴う赤血球を特徴とする状態を有する患者を治療する方法であり、それを必要とする対象に治療有効量のＬＣＡＴを投与することを含む。
【００１６】
別の実施形態において、貧血、または変形能の低下、酸素化の低下、一酸化窒素機能の低下、付着および／もしくは凝集の増加、または寿命の減少、またはそれらの任意の組み合わせを伴う赤血球を特徴とする状態を有する患者を治療する方法は、ＲＢＣ変形能、またはＲＢＣ酸素化、またはＲＢＣ凝集もしくは付着、またはＲＢＣの寿命のベースラインを決定することと、治療有効量のＬＣＡＴを、治療を必要とする患者に投与することと、ＬＣＡＴ投与後の変化を決定することとを含み、ＲＢＣ変形能もしくはＲＢＣ酸素化の向上、またはＲＢＣ凝集もしくは付着の減少、またはＲＢＣの寿命の増加は、状態の改善を示す。
【００１７】
いくつかの実施形態において、治療される状態は、鎌状赤血球症、糖尿病、サラセミア、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、関節炎、肝疾患、肝硬変、肝炎、有蕀赤血球増加症、敗血症、認知症、貧血、または微小血管障害、炎症性障害、寄生虫症、勃起不全、癌、子癇前症、重篤疾患、または外傷である。
【００１８】
別の実施形態は、有効治療量のＬＣＡＴを、治療を必要とする対象に投与することを含む、ＲＢＣ膜における高ＦＣレベルを特徴とする状態を有する患者を治療する方法である。別の実施形態は、ＦＣ対ＰＬのベースライン比を決定すること、治療有効量のＬＣＡＴを、治療を必要とする対象に投与すること、およびＬＣＡＴの投与後のＦＣ対ＰＬの比率を決定することと、を含む、ＲＢＣ膜における高ＦＣレベルを特徴とする状態を有する患者を治療する方法であり、ここで、ＦＣ対ＰＬの比率における減少は、状態の改善を示す。別の実施形態は、ＬＣＡＴの治療有効量を患者に投与することを含む、患者の血液細胞のＦＣ含量を減少させる方法である。
【００１９】
別の実施形態は、治療有効量のＬＣＡＴを、治療を必要とする対象に投与することを含む、ＲＢＣ膜におけるＰＣ／ＳＭ比の増加を特徴とする状態を有する患者を治療する方法である。別の実施形態は、ＰＣ対ＳＭのベースライン比を決定することと、治療有効量のＬＣＡＴを、治療を必要とする対象に投与することと、およびＬＣＡＴの投与後のＰＣ対ＳＭの比率を決定することと、を含む、ＲＢＣ膜におけるＰＣ／ＳＭ比の増加を特徴とする状態を有する患者を治療する方法であり、ここで、ＰＣ対ＳＭの比率における減少は、状態の改善を示す。別の実施形態は、ＬＣＡＴの治療有効量を患者に投与することを含む、患者の血液細胞のＰＣ／ＳＭ比を減少させる方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】正常な対象および鎌状赤血球症を有する対象からのＲＢＣのリン脂質組成を示す。
【図２】ＬＣＡＴを注射した後のヒトＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子導入マウスにおける血漿ＨＤＬ−Ｃの増加を示すグラフである。
【図３】組み換えヒトＬＣＡＴを注射した後の、ＬＣＡＴ−ノックアウト／アポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子導入マウスからの組織のコレステロール含量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書に使用される、「治療有効量」とは、所望の治療レジメンに従い投与された時に、所望の治療効果または応答を引き出すＬＣＡＴの量を意味する。好ましい治療有効量は、血漿ＬＣＡＴのレベルを、正常を超えるレベルに増加させるＬＣＡＴの量である。
【００２２】
本明細書に使用される「ＬＣＡＴレベル」とは、ＬＣＡＴの血漿濃度を指す。
【００２３】
本明細書に使用される、ＬＣＡＴの「正常なレベル」とは、ＬＣＡＴレベルを変更するかもしれない任意の薬物療法を現在受けていない、平均的な健康な未治療の対象に存在するＬＣＡＴの血漿濃度を意味する。「正常なレベル」および「内因性レベル」は、本明細書において互換的に使用される。
【００２４】
疑念の回避のため、本明細書において、「治療」または「治療する」への言及は、治癒的治療、姑息的治療、および予防的治療を含む。
【００２５】
「対象」および「患者」は、互換的に使用される。
【００２６】
有効量または単位投与量に関して本明細書に使用される、「〜」とは、包括的であり、例えば、「１ｍｇ〜５０００ｍｇ」とは、１ｍｇおよび５０００ｍｇを含む。
【００２７】
有効量または単位投与量に関して本明細書に使用される、「から」とは、包括的であり、例えば、１ｍｇから５０００ｍｇ」は、１ｍｇおよび５０００ｍｇを含む。
【００２８】
「ＦＣ」とは、遊離コレステロールの略語であり、本明細書に使用されるように、非エステル化コレステロールを意味する。
【００２９】
「一酸化窒素機能」とは、一酸化窒素産生、微小血管への一酸化窒素送達、血小板および白血球付着の阻害、血管拡張、ＲＢＣ変形能およびＲＢＣ生存を含む、一酸化窒素に依存するＲＢＣ媒介プロセスを意味する。
【００３０】
「ＰＣ」とは、ホスファチジルコリンの略語である。
【００３１】
「ＳＭ」とは、スフィンゴミエリンの略語である。
【００３２】
「ＲＢＣ変形能」とは、細胞の流れ抵抗を最小限にし、細胞が小さい血管を通過できるようにするために、動的に変化する流況にそれらの形状を適応させる細胞の能力を意味する。変形能の低下は、硬性の増加と同じである。
【００３３】
「遺伝子療法ベクター」とは、軟組織細胞中の染色体において、関心の遺伝子を組み込み、積極的に発現させるために使用される薬剤である。例えば、アデノウイルスは、ヒトＬＣＡＴ遺伝子を運搬するために操作された。
【００３４】
「浸透圧脆弱性」とは、周囲の浸透圧の変化による、破裂に対する細胞の感受性を意味する。
【００３５】
「ＲＢＣ凝集性」とは、血漿タンパク質または他の巨大分子の存在下において、通常ルロー形状で、多細胞型凝集体を形成する能力を意味する。
【００３６】
「ＬＣＡＴ」は、「レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ」と互換的に使用される。
【００３７】
「ＬＣＡＴ」または「ＬＣＡＴポリペプチド」は、本明細書で使用される時、天然配列ＬＣＡＴ、ＬＣＡＴ変異体、修飾されたＬＣＡＴ、およびキメラＬＣＡＴを包含する。ＬＣＡＴ配列におけるアミノ酸位置の特定において、配列番号１を参照とする。
ヒトＬＣＡＴ配列番号１（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＢ３４８９８）
【表１】
2015199751.tif 000002
【００３８】
天然ヒトＬＣＡＴタンパク質配列における特定のアミノ酸は、一文字でアミノ酸を指定した後にタンパク質配列の位置を用いて表され、例えば、Ｗ２は、２位がトリプトファンであることを示す。特定の位置での置換を表すために、置換されたアミノ酸は位置の後に続き、例えば、Ｗ２Ｙは、２位のトリプトファンがチロシンと置換されることを示す。
【００３９】
「天然配列ＬＣＡＴ」は、天然に由来するＬＣＡＴと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。よって、天然配列ＬＣＡＴは、自然に生じるＬＣＡＴの切断型形態、および自然に生じる変異形態（例えば、交互にスプライスされた形態）である、自然に生じるＬＣＡＴの対立遺伝子変異体を特に包含する。好ましい天然配列ＬＣＡＴは、成熟天然配列ＬＣＡＴである。
【００４０】
「修飾されたＬＣＡＴ」とは、天然ＬＣＡＴポリペプチドの１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸と置換されるか、または１つ以上のアミノ酸が天然ポリペプチドの一部、例えば、これらに限定されないが、Ｎ末端もしくはＣ末端アミノ酸に結合される、ポリペプチドを意味する。例えば、これらに限定されないが、修飾されたＬＣＡＴは、米国特許出願第１２／１７９，８１５号に記載される、修飾されたＬＣＡＴタンパク質であってもよい。別の実施形態において、１つ以上のアミノ酸は、保存的置換と置換される。保存的置換の例を表２に提供するが、これらに限定されない。他の実施形態において、１つ以上のアミノ酸は、天然には存在しないアミノ酸と置換される。加えて、修飾されたＬＣＡＴポリペプチドは、ＬＣＡＴまたは修飾されたＬＣＡＴの誘導体を含む。これらの誘導体は、例えば、ポリペプチドの溶解性、吸収、生物学的半減期を改善する場合がある。ポリペプチドの誘導体は、当該分野において周知である。当業者は、それらの薬理学的性質を改善するために、どのようにポリペプチドを誘導体化するかを認識しているであろう。
【表２】
2015199751.tif 000003
【００４１】
本開示は、ＬＣＡＴの活性を増加させる、もしくはＬＣＡＴの血漿レベルを増加させる、またはその両方の薬剤を、治療を必要とする患者に投与することを含む、貧血または赤血球の機能不全を特徴とする状態を有する患者を治療する方法に関する。ＬＣＡＴレベルおよび／またはＬＣＡＴ活性は、任意の利用可能な手段によって増加させることができる。これは、ＬＣＡＴの直接投与、遺伝子療法によるＬＣＡＴの発現、および薬物の投与を通した内因性ＬＣＡＴの上方制御を含むが、これらに限定されない。
【００４２】
一実施形態において、ＬＣＡＴレベルおよび／または活性のレベルは、ＬＣＡＴの直接投与によって増加する。好ましくは、本開示に従う方法で投与されるＬＣＡＴは、組み換えにより産生されたヒトＬＣＡＴ（例えば、組み換えタンパク質発現系として、動物、哺乳動物の細胞、真菌、昆虫細胞、または植物を使用して）である。組み換えによりタンパク質を産生する方法は、当該分野において周知である。ＬＣＡＴは、例えば、ヒト血漿からの単離等の、任意の適切な方法によっても得ることができる。ＬＣＡＴは、安定したバルク形態または単位投与形に調製され得る。一実施形態において、ＬＣＡＴ活性のレベルは、遺伝子療法の使用によって増加する。本明細書に使用される、「遺伝子療法」とは、新しい遺伝子情報の対象の細胞への導入、かつ好ましくは、安定した組み込みを指す。遺伝子療法によりＬＣＡＴ活性レベルを増加させる方法は、ＬＣＡＴの発現をコードする核酸配列を含む核酸を細胞に形質移入することを含む。形質移入された細胞はＬＣＡＴを発現し、それを対象の血漿中に分泌する。細胞は、ＬＣＡＴの量を治療有効レベルに増加させるのに十分な数で、またはＬＣＡＴのそのような高発現に十分であるように形質移入される。ＬＣＡＴをコードする遺伝子は、任意の適切な方法により、対象に導入することが可能である。一実施形態において、遺伝子は、発現ベクターを用いて、生体内で個人の細胞の中に導入される。別の実施形態において、遺伝子は、生体外で細胞に導入され、ＬＣＡＴを発現し、分泌する形質移入された細胞を対象に投与する。生体内アプローチにおいて、肝細胞は、形質移入に有用な標的である。肝細胞はＬＣＡＴを産生するため、それらは、組み換えにより酵素を作製するための処理機構を備える。さらに、血流に注入されたベクターは、迅速に肝臓を通過するため、肝細胞は、速やかにベクターに曝される。血液幹細胞も、急速に増殖し、それによって、ＬＣＡＴを産生することができるより多くの細胞を作製するため、遺伝子療法に有用な標的である。生体外アプローチも、形質移入プロセスより制御を強化できるため、魅力的である。例えば、形質移入された細胞を検査し、最高量でＬＣＡＴを発現するものを選択することができる。血液幹細胞を対象から採取し、生体外で形質移入し、対象に再導入することができる。したがって、一実施形態において、細胞は、対象からの細胞である。生体内および生体外のいずれかで遺伝子を哺乳動物の細胞の中に形質移入し、それらの発現を得る方法は、当該分野において周知である。
【００４３】
本開示は、ＬＣＡＴレベルおよび／活性を、正常を超えるヒトＬＣＡＴレベルに増加させることにより赤血球膜の脂質含量を調節する方法に関する。本開示の一実施形態は、治療有効量のＬＣＡＴを対象に投与することを含む、赤血球機能障害を特徴とする状態を有する患者を治療する方法である。本開示の別の実施形態は、ＬＣＡＴの内因性産生を増加させる、またはＬＣＡＴ活性を増加させる薬物の治療有効量を対象に投与することを含む、赤血球機能不全を特徴とする状態を有する患者を治療する方法である。特定の実施形態において、薬物は小分子治療薬である。
【００４４】
いくつかの実施形態は、正常化を必要とする対象のＬＣＡＴレベルを増加させる、またはＬＣＡＴ活性を増加させることにより、ＲＢＣ細胞膜のＦＣ含量を正常化する方法に関する。本開示に従う一実施形態は、治療有効用量のＬＣＡＴを、治療を必要とする患者に投与することにより、ＦＣ含量の増加を伴うＲＢＣを有することを特徴とする状態を有する患者を治療する方法である。ＬＣＡＴレベルの増加は、急速に、ＲＢＣからＨＤＬへのＦＣの純移送をもたらし、よって、ＲＢＣ膜の組成をより流体状態に変化させる。この作用は、ＲＢＣの酸素化を向上させる、レオロジーを改善する（変形能、流動を増加させ、ホスファチジルセリン外在化を減少させ、付着および凝集の傾向を減少させる）、貧血を減少させる（変形能の低下、ＲＢＣの寿命の増加に関連する構造上のストレスおよび破壊を減少させる）、および組織、特に抹消組織を酸素化するＲＢＣの能力を増加させる。いくつかの実施形態において、赤血球生成は、治療有効量のＬＣＡＴの投与後、増加する。いくつかの実施形態において、一酸化窒素機能は、ＬＣＡＴの治療有効量の投与後、増加する。ＲＢＣの細胞膜がリン脂質レベルに関して増加したＦＣレベル有する、多くの状態が存在する。血液細胞膜におけるＦＣ含量の増加は、鎌状赤血球症、糖尿病、サラセミア、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、関節炎、肝疾患、肝硬変、肝炎、有蕀赤血球増加症、敗血症、認知症、貧血、または微小血管障害、炎症性障害、寄生虫症、勃起不全、癌、子癇前症、重篤疾患、または外傷を含むが、これらに限定されない数多くの疾患状態に存在する。
【００４５】
ＲＢＣ組成および機能の変化は、これらの疾患において原発性病理ではないが、根底にある障害の罹患率の悪化をもたらす。よって、本開示の一実施形態は、治療有効用量のＬＣＡＴを、治療を必要とする患者に投与することにより、鎌状赤血球症、糖尿病、サラセミア、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、関節炎、肝疾患、肝硬変、肝炎、有蕀赤血球増加症、敗血症、認知症、貧血、または微小血管障害、炎症性障害、寄生虫症、勃起不全、癌、子癇前症、重篤疾患、または外傷を有する患者を治療する方法である。
【００４６】
鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、サラセミア、およびヘモグロビンＥ（ＨｂＥ）等のヘモグロビン遺伝子変異は、ＲＢＣ変形能および酸素を運搬／送達する能力を減少させる、種々の病理をもたらす可能性がある。例として、ＳＣＤは、ヘモグロビンのβ−グロブリンサブユニット（ＨｂＳ）における単一アミノ酸置換により生じる、遺伝性障害である。低酸素状態下において、ＨｂＳは重合し（凝集し）、正常な凹状から「鎌状」にＲＢＣの形状に変化をもたらす。硬質なＨｂＳ重合体の形成は、ＲＢＣの弾性または変形能を低下させ、これは、これらが組織を酸素化するために、それら自体の大きさより４倍小さい毛細管を繰り返し通過しなければならないため、それらの機能に有害である。したがって、鎌状化は、全ての大きさの後毛細管小静脈の閉塞およびＲＢＣの脆弱性の増加による血管閉塞性疾患をもたらし、溶解および溶血性貧血を引き起こす。低酸素状態下の鎌状化は、急性クリーゼおよび疾患に関連する主な問題を引き起こすが、鎌状化されない患者からのＲＢＣは、正常な酸素状態下で、変形能の低下、および凝集性の増加を伴う、より硬質な膜を有する。ＳＣＤからの赤血球膜の化学分析は、ＦＣ含量の増加も実証する。加えて、これらの患者は、通常、ＣＥ含量の減少を伴う低ＨＤＬを有し、ＬＣＡＴ活性の減少、または機能的ＬＣＡＴ欠損の減少が推測される。実際、一研究において、ＬＣＡＴ活性は、ＳＣＤの患者において、３０％減少することを示した。したがって、本開示の一実施形態は、治療有効量のＬＣＡＴを、治療を必要とする患者に投与することにより、鎌状赤血球症を有する患者を治療する方法である。
【００４７】
高レベルのＬＣＡＴ、例えば、ＳＣＤ患者におけるＬＣＡＴの内因性活性の１０００倍に内因性活性の倍増をもたらす量の注入は、ＲＢＣからＦＣを強制的に移動させ、同時に、血漿ＨＤＬ−Ｃレベルを増加させるだろう。ＲＢＣのＦＣ含量における減少は、ＲＢＣの変形する能力を増加させ、Ｏ２交換の速度を改善する。ＲＣＤ機能の改善は、血液の流動性質の改善と鎌状化の速度の減少（ＲＢＣの良好な再酸素化により）の両方により、閉塞事象を少なくする可能性がある。別の実施形態において、治療有効量のＬＣＡＴを患者に投与することは、ＲＢＣの変形能およびＲＢＣの酸素化を増加させる。いくつかの実施形態において、ＲＢＣの寿命は、ＬＣＡＴの投与後に増加する。
【００４８】
肝疾患において、ＲＢＣコレステロールが増加し、しばしば、貧血が起こる。ＬＣＡＴ療法は、ＲＢＣコレステロールを正常化し、正常な形状およびもたらされたＲＢＣの機能を回復させ、ＲＢＣ破壊を減少させ、寿命を増加させ、よって貧血の傾向を減少させる。したがって、別の実施形態は、治療有効量のＬＣＡＴを患者に投与することにより、貧血を有する患者を治療する方法である。
【００４９】
標的細胞および棘細胞性貧血（有棘赤血球増加症）：標的細胞および棘細胞は、機能の低下ならびに溶血および貧血の増加をもたらす、増加したＦＣ含量を有する。
【００５０】
敗血症、リウマチ性疾患、および炎症性障害（炎症による貧血を含む）等の状態において、さらなる合併症をもたらす、ＲＢＣ変形能の低下、および異常なレオロジー等の、無数の病理がある。酸素化の低下およびＲＢＣ凝集の増加による組織および臓器系の破損は、初期の炎症性障害により罹患率および死亡率の増加をもたらす。よって、別の実施形態は、ＬＣＡＴの治療有効量を、減少を必要とする患者に投与することにより、ＲＢＣの凝集性を減少させる方法である。ＬＣＡＴは、炎症中に生成された酸化リン脂質にも作用する場合がある。酸化脂質は、非常に反応性であり、細胞および臓器系への破損を増加させる可能性がある。ＲＢＣ膜脂質の正常化は、流動および組織の酸素化を改善し、反応性酸化脂質の濃度を低下させるだろう。これは、潜在性感染がＲＢＣ機能を低下させ、創傷の治癒時間を増加させる、術後に有用である。
【００５１】
微小血管障害は、ＲＢＣ  ＦＣが増加し、それによって、硬化を生じ、ＲＢＣの付着および凝集を増加させる時に生じる場合がある。これらの変化は、毛細管および細静脈に認められる低流（または低圧）に誇張される。ＲＢＣが適切に変形できない場合、それらの通過は、これらの小さい血管において、大幅に遅くなる。凝集および付着の傾向が増加すると、抹消血管における閉塞の可能性が高くなる。微小血管が正常な機能にとって重要である臓器（例えば、眼、耳、脳、腎臓、陰茎、肺）において、これらの血管において繰り返される虚血事象は、機能の損失（例えば、失明、難聴、腎不全、虚血性微小血管脳疾患（例えば、認知症、アルツハイマー病）、勃起不全）をもたらす可能性がある。ＬＣＡＴ治療は、ＲＢＣ  ＦＣを減少させ、ＲＢＣレオロジーを改善し、さらなる閉塞および最終臓器破損のリスクを低減するだろう。
【００５２】
本開示の実施例１に実証するように、正常なＬＣＡＴ活性レベルの約３０倍を有するマウスは、正常なマウスと比較して、増加したＲＢＣ量を有し、ＬＣＡＴ活性がＲＢＣ量の調節の主要な要因であり、この点で、律速であり得ることを実証する。
【００５３】
よって、異常なレオロジー（貧血、変形能の低下、凝集の増加、流動の減少、ＲＢＣ寿命の減少）を特徴とする状態を有する患者への高用量のＬＣＡＴ、例えば、ＬＣＡＴの内因性レベルの１倍〜１０００倍、またはＬＣＡＴの内因性レベルの１倍〜５００倍、またはＬＣＡＴの内因性レベルの１倍〜１００倍の投与は、状態の改善をもたらすだろう。
【００５４】
よって、別の実施形態は、治療有効用量のＬＣＡＴを投与することにより、鎌状赤血球症、糖尿病、サラセミア、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、関節炎、肝疾患、肝硬変、肝炎、有蕀赤血球増加症、敗血症、認知症、貧血、または微小血管障害、炎症性障害、寄生虫症、勃起不全、癌、子癇前症、重篤疾患、または外傷を有する患者を治療する方法である。本開示のまた別の実施形態は、ＬＣＡＴ活性またはＬＣＡＴレベルを増加させる薬物の投与により、鎌状赤血球症、糖尿病、サラセミア、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、関節炎、肝疾患、肝硬変、肝炎、有蕀赤血球増加症、敗血症、認知症、貧血、または微小血管障害、炎症性障害、寄生虫症、勃起不全、癌、子癇前症、重篤疾患、または外傷を有する患者を治療する方法である。好ましい実施形態において、薬物は小分子治療である。別の実施形態において、ＬＣＡＴレベルおよび／またはＬＣＡＴ活性は、遺伝子療法を使用することにより増加する。
【００５５】
別の実施形態は、治療有効用量のＬＣＡＴを投与することにより、アルツハイマー病関連認知症を有する患者を治療する方法である。別の実施形態は、治療有効用量の修飾されたＬＣＡＴを投与することにより、鎌状赤血球症、糖尿病、サラセミア、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、関節炎、肝疾患、肝硬変、肝炎、有蕀赤血球増加症、敗血症、認知症、貧血、または微小血管障害、炎症性障害、寄生虫症、勃起不全、癌、子癇前症、重篤疾患、または外傷を有する患者を治療する方法である。いくつかの実施形態において、修飾されたＬＣＡＴは、保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、修飾されたＬＣＡＴは、位置Ｆ１、Ｌ３、Ｌ４、Ｎ５、Ｌ７、Ｃ３１、Ｎ３８４、またはＥ４１６での置換を含む。種々の実施形態において、修飾されたＬＣＡＴは、３１位にアミノ酸置換を含む。他の実施形態において、修飾されたＬＣＡＴは、Ｃ３１Ｙ置換、およびアミノ酸残基Ｆ１、Ｌ４、Ｌ３２、またはＮ３４のうちの１つ以上での置換を含む。別の実施形態において、修飾されたＬＣＡＴは、Ｃ３１Ｙ置換、および以下の置換のうちの１つ以上を含む：Ｆ１Ｓ、Ｆ１Ｗ、Ｌ４Ｍ、Ｌ４Ｋ、Ｎ３４Ｓ、Ｌ３２Ｆ、またはＬ３２Ｈ。種々の実施形態において、修飾されたＬＣＡＴは、以下の置換のうちの１つ以上を含む：Ｆ１Ａ、Ｆ１Ｇ、Ｆ１Ｉ、Ｆ１Ｌ、Ｆ１Ｍ、Ｆ１Ｐ、Ｆ１Ｖ、Ｆ１Ｙ、Ｆ１Ｔ、Ｆ１Ｑ、Ｆ１Ｎ、Ｆ１Ｈ、Ｆ１Ｄ、Ｌ３Ｉ、Ｌ３Ｆ、Ｌ３Ｃ、Ｌ３Ｗ、Ｌ３Ｙ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｉ、Ｌ４Ｍ、Ｌ４Ｆ、Ｌ４Ｖ、Ｌ４Ｗ、Ｌ４Ｙ、Ｌ４Ｔ、Ｌ４Ｑ、Ｌ４Ｒ、Ｎ５Ａ、Ｎ５Ｍ、Ｎ５Ｈ、Ｎ５Ｋ、Ｎ５Ｄ、Ｎ５Ｅ、Ｌ７Ｍ、Ｌ７Ｒ、Ｌ７Ｅ、Ｃ３１Ａ、Ｃ３１Ｉ、Ｃ３１Ｍ、Ｃ３１Ｆ、Ｃ３１Ｖ、Ｃ３１Ｗ、Ｃ３１Ｙ、Ｃ３１Ｔ、Ｃ３１Ｒ、Ｃ３１Ｈ、Ｎ３８４Ｃ、Ｎ３８４Ｑ、またはＥ４１６Ｃ。他の実施形態において、患者のＬＣＡＴのレベルは、遺伝子療法技術を使用することにより増加する。別の実施形態において、ＬＣＡＴ発現は、薬物投与により亢進される。
【００５６】
本開示に従う方法において、ＬＣＡＴは、概して、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物で、対象に投与される。薬学的組成物は、選択された投与経路、すなわち、経口的、非経口的、静脈内、筋肉内、または皮下経路に適応する薬学的組成物として、日常的手順に従い製剤化することができる。
【００５７】
本開示の化合物の送達およびそれらの調製方法に適した薬学的組成物は、当業者に容易に理解されるだろう。そのような組成物およびそれらの調製方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）に見出すことができる。
【００５８】
組成物は、懸濁液、溶液、または油性もしくは水性ビヒクル中のエマルジョン等の形態をとることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤等の製剤用薬剤を含有してもよい。代替的に、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、減菌発熱性物質除去蒸留水で構成するための粉末形態であってもよい。典型的に、そのような組成物は、減菌等張水性懸濁液中の溶液である。組成物は、防腐剤が添加された、または添加されていないアンプル、シリンジ、またはバイアル等の気密密封された容器であってもよい。
【００５９】
液状担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、植物油、非毒性グリセリルエステル、およびそれらの適切な混合物を含む、溶媒または液状分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散液の場合においては、必要とされる粒径の維持によって、または界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の種々の抗菌剤および抗真菌剤によって実現することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、緩衝剤、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注入可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによって実現することができる。
【００６０】
本開示によると、ＬＣＡＴは、単独で、または前述の状態を治療するために使用される他の薬物と併用療法で使用することができる。そのような療法は、関与する薬物の同時または遂次投与を含むが、これらに限定されない。例えば、ＬＣＡＴ製剤は、特定の状態の標準的な治療として通常使用される薬物とともに投与することができる。例えば、ＬＣＡＴは、貧血の治療のための、エリスロポエチン、メトキシポリエチレン−グリコール−エポエチン−β、ダルベポエチン−α、ロミプロスチム、およびエポエチン−α等の、赤血球形成刺激剤（ＥＳＡ）と組み合わせて投与することができる。または、例えば、ＬＣＡＴは、鎌状赤血球症の治療のための、ヒドロキシ尿素、ヒドロキシカルバミド、デシタビン、または酪酸塩と組み合わせて投与することができる。
【００６１】
一実施形態において、治療有効量のＬＣＡＴは、皮下注射により投与される。別の実施形態において、治療有効量のＬＣＡＴは、筋肉内注射により投与される。別の実施形態において、治療有効量のＬＣＡＴは、静脈内注射または注入により投与される。いくつかの実施形態において、ＬＣＡＴの治療有効量は、１ｍｇ〜５０００ｍｇ、または１ｍｇ〜２０００ｍｇ、または１０ｍｇ〜５０００ｍｇ、または１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、または１０ｍｇ〜５００ｍｇ、または５ｍｇ〜１００ｍｇである。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ＬＣＡＴの治療有効量は、ＬＣＡＴ内因性レベルの１倍〜１０００倍、２５倍〜１０００倍、５０倍〜１０００倍、１倍〜１００倍、５０倍〜５００倍、または１倍〜５００倍である。
【００６３】
使用される特定の投与量は変動し得る。例えば、投与量は、投与頻度、組み換えＬＣＡＴ酵素の特異的活性、患者の体重、患者の特別な必要条件、患者の特別な状態（例えば、腎臓または肝臓機能の異常）、治療される状態等を含むが、これらに限定されない数多くの要因に依存し得る。投与頻度および投与量は、主治医の判断で、本明細書に記載される典型的な範囲外であってもよい。これらの投与量は、約６０ｋｇ〜７０ｋｇの体重の平均的なヒト対象に基づく。特定の患者についての最適な投与量の決定は、当業者に周知である。医師は、乳児および高齢者等の、本範囲外の体重の対象についての用量を容易に決定することができる。
【００６４】
治療される障害および患者により、当業者（すなわち、医師）は、以下の用量より高い初期用量が適切であることを決定することができる。例えば、クリーゼ状態の鎌状赤血球症を示す患者は、「通常」レベルの３０倍の初期用量で投与される場合がある。患者のＲＢＣ酸素化レベルが所望のレベルに達したら、用量は、例えば、「通常」レベルの３倍に減少される。
【００６５】
特定の用量の有効性は、バイオマーカー、または特定の生理学的パラメータにおける改善を参照することによって評価することができる。適切なバイオマーカーは、ＦＣ対ＰＬ、ＦＣ対膜タンパク質、ＰＣ対ＳＭ、またはＨＤＬ−Ｃレベルの比率を含むが、これらに限定されない。適切な生理学的パラメータは、貧血の減少、ＲＢＣにおける増加、ＲＢＣ変形能、血流および／またはＲＢＣ凝集性により測定されるレオロジーの改善、浸透圧脆弱性、またはＲＢＣ酸素化レベルを含むが、これらに限定されず、これらのパラメータのいずれか１つにおける増加は、改善を示す。バイオマーカーレベルの測定および上述のパラメータは、当該分野に周知の方法を使用して測定することができる。例えば、貧血の減少は、標準的な、十分に確立されている臨床技法を用いて測定されたヘマトクリットもしくはヘモグロビンの増加、またはヘモグロビン分解産物（例えば、非抱合ビリルビン）により測定することができる。変形能は、濾過、粘性、エクタサイトメトリー、およびマイクロピペットの使用により測定することができる。凝集は、エクタサイトメトリーおよび凝集計（ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ）を含む、種々の機器により測定することが可能である。ＲＢＣ酸素化は、標準的なパルスオキシメトリーおよび血液ガス分析により測定することができ、組織酸素化は、酸素センサを備えるサイラスティックトノメータを用いて、指向プローブで測定することができる。当業者は、結果の有意性を理解し、上述のもの等の評価に基づき、用量を調節するように選択してもよい。
【００６６】
実施例４に記載され、また図２に示されるように、ＬＣＡＴをヒトアポリポタンパク質Ａ−１遺伝子導入マウスに投与した後、血漿ＨＤＬ−Ｃレベルは増加した。増加は、意外にも速く、血漿ＨＤＬ−Ｃレベルは、４時間で対照の約７０％、２４時間までに約１２０％増加した。よって、本開示の別の実施形態は、治療有効量のＬＣＡＴを、治療を必要とする対象に投与することを含む、貧血または赤血球機能不全を特徴とする状態を有する患者を治療する方法であり、対象の血漿ＨＤＬ−Ｃレベルは、ＬＣＡＴの投与後、速やかに増加する。特定の実施形態において、ＬＣＡＴの投与後４時間の対象の血漿ＨＤＬ−Ｃレベルは、ＬＣＡＴ投与前の血漿ＨＤＬ−Ｃレベルの少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％増加する。また別の実施形態において、ＬＣＡＴの投与後１２時間の対象の血漿ＨＤＬ−Ｃは、ＬＣＡＴ投与前の血漿ＨＤＬ−Ｃレベルの少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１１０％、または少なくとも１２０％増加する。さらに別の実施形態において、ＬＣＡＴの投与後２４時間の対象の血漿ＨＤＬ−Ｃは、ＬＣＡＴ投与前の血漿ＨＤＬ−Ｃレベルの少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１１０％、または少なくとも１２０％、または少なくとも１３０％、または少なくとも１４０％、または少なくとも１５０％増加する。
【００６７】
実施例５に記載され、また図３に示されるように、ＬＣＡＴのＬＣＡＴ−ノックアウト／アポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子導入マウスへの投与は、血漿コレステロールレベルの増加である、組織コレステロール（大動脈および肝臓）の増加をもたらした。実施例４および５からの統合したデータは、ＬＣＡＴの注入が、迅速に、組織から血漿ＨＤＬに脂質を再分配したことを実証する。肝臓および大動脈のコレステロール含量に対するＬＣＡＴ注入の作用を考えると、類似する変化が赤血球において迅速に観察されるであろうことが予想される。
【００６８】
ＲＢＣからＨＤＬへのＦＣの移送は、ＲＢＣ膜の組成をより正常な状態に変更するはずである。この作用は、ＲＢＣの酸素化を向上させる、レオロジーを改善する（変形能、流動を増加させ、付着および凝集の傾向を減少させる）、貧血を減少させる（変形能の低下、ＲＢＣの寿命の増加に関連する構造上のストレスおよび破壊を減少させる）、および組織、特に抹消組織を酸素化するＲＢＣの能力を増加させる。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ＬＣＡＴは、皮下注射または筋肉内注射のいずれかにより、患者により自己投与される。自己投与は、これらに限定されないが、鎌状赤血球症、糖尿病、リウマチ様疾患、または肝炎に罹患する患者を含む、患者の長期治療において、好ましい実施形態である。
実施例１
マウスにおけるヘマトクリットに対するＬＣＡＴの作用
【００７０】
血液を３つの群のマウスから採取した：ＬＣＡＴ欠損（ＬＣＡＴ−ＫＯ）マウス、ＬＣＡＴ過剰発現遺伝子導入（正常なＬＣＡＴ活性の約３０倍）マウス、および対照Ｃ５７／ｂ６マウス。ＲＢＣ膜を血液試料から単離し、ＲＢＣ量またはヘマトクリットの代替として、リン脂質を含有するコリンを測定した（Ｗａｋｏ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  Ｂ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）。ＲＢＣ量は、正常なマウスと比較して、ＬＣＡＴ欠損マウスにおいて、有意に低かった（それぞれ、４０２±２２．０μｇ／ｍｌ全血対４８６±２５．７μｇ／ｍｌ全血）。ここで実証されたＬＣＡＴ欠損マウスにおける貧血は、ＦＬＤ患者において観察された貧血の程度と類似する。意外にも、ＲＢＣ量は、正常なＬＣＡＴ活性のマウスと比較して、ＬＣＡＴ過剰発現の遺伝子導入マウスにおいて、有意に上昇した（それぞれ、５５６±２０．１μｇ／ｍＬ全血対４８６＋２５．７μｇ／ｍＬ全血）。これらの結果は、ＬＣＡＴレベルとヘマトクリットとの間に正の関係があることを示す。加えて、また最も重要なことには、超正常レベルのＬＣＡＴは、貧血性であるとみなされない動物において、ヘマトクリットを増加させる可能性がある。これらの試験は、増加レベルが、正常なＬＣＡＴ活性を有する患者においても、種々の原因により、貧血を有する患者において有望な治療選択肢であることを示す。
実施例２
正常およびＳＣＤ対象（クリーゼでない）から調製されたＲＢＣゴースト膜のリン脂質組成
【００７１】
リン酸緩衝生理食塩水中で洗浄されたＲＢＣの試料は、正常な対象（ｎ＝７）およびＳＣＤ患者（ｎ＝６）から採集された新鮮な血液から調製された。濃縮ＲＢＣの５０マイクロリットルアリコートを、０．９５ｍＬリン酸緩衝生理食塩水中に懸濁した。ガラス管に各ＲＢＣ懸濁液の０．４ｍＬアリコートを２０μＬの酢酸エチルアセトン中の１−エイコサノール（２：１）（内部標準）の１ｍｇ／ｍＬ溶液および２ｍＬの酢酸エチル：アセトン：メタノール（６：３：１）と混合することにより、脂質を抽出した。蓋をした管を２分間振盪した後、５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離した。上部有機相を１２×３２ｍｍ  ＨＰＬＣバイアルに移動した。Ｎ２流下で、その後、少なくとも１時間、高真空で、溶媒をバイアルから蒸発させた。乾燥させた脂質を、２００μＬのトリメチルペンタン：メタノール：テトラヒドロフラン（９５：５：２）で再構成した。シリカカラム上の高速液体クロマトグラフィーにより、膜脂質をクロマトグラフィーにかけた。ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）を検出し、蒸発光散乱検出器を用いて定量化した。結果は、正常な対象（図１）と比較して、ＳＣＤ患者のＲＢＣ脂質がＰＣに富化され、ＳＭ含量において減少し、それぞれ、対照とＳＣＤについて、０．６７から０．９８のＰＣ／ＳＭ比の増加をもたらしたことを示す。本試験で分析されたＳＣＤのＲＢＣは、正常なＲＢＣと異なるリン脂質組成パターンを示す。ＳＣＤのＲＢＣ脂質組成は、低血漿ＬＣＡＴ活性の他の例症のＲＢＣについて報告されたものと類似する。
実施例３
組み換えヒトＬＣＡＴの調製
【００７２】
ヒトＬＣＡＴタンパク質をコードするプラスミドｐＣＭＶ６−ＸＬ４／ＬＣＡＴをＯｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の中に連結した。ｐｃＤＮＡ３．１ベクターをＨＥＫ２９３ｆ細胞に形質移入した。安定に形質移入された細胞を２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを用いて選択し、４日間、１０Ｌの振盪フラスコ中のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で成長させた。塩化亜鉛を用いた沈殿によりｒｈＬＣＡＴを培養培地から単離した後、バッチ捕捉し、フェニルセファロースを用いて溶出した。
実施例４
ＨＤＬコレステロールはＬＣＡＴを注入されたヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子導入マウスにおいて増加する
【００７３】
ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を発現する雄の遺伝子導入マウスを、自由摂取で、通常の食餌で保持した。後眼窩洞を介して、生理食塩水または生理食塩水中の組み換えヒトＬＣＡＴ（４ｍｇ／ｋｇ）をマウスに単回静脈内注射した。注射後０、１、４、２４、４８、および７２時間で、イソフルランで麻酔した動物の眼窩神経嚢から血液を採集した。血漿コレステロール濃度を、市販の酵素アッセイキットを用いて決定した。Ｈｅｌｅｎａ  ＬａｂｓのＳＰＩＦＥシステムを用いて、アガロースゲル電気泳動により、ＨＤＬ中のコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の量を決定した。図２は、ＬＣＡＴを投与されたマウスが血漿ＨＤＬ−Ｃのレベルにおいて、対照の１２０％もの有意な増加を示したことを示す。ＨＤＬ−Ｃレベルは、実験の間（７２時間）、増加したレベルのままであった。血漿ＨＤＬの上昇は、意外にも速く、４時間で対照の約７０％、２４時間までに約１２０％の増加を示した。
実施例５
ＬＣＡＴ−ノックアウト／アポリポタンパク質Ａ−Ｉ遺伝子導入マウスの組織におけるコレステロール含量に対するＬＣＡＴ注入の作用
【００７４】
ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を発現する遺伝子導入マウスをＬＣＡＴ−ＫＯマウスと交差交配して、ＬＣＡＴ−ＫＯ／ａｐｏＡ−Ｉ−Ｔｇマウスを得た。ＬＣＡＴ−ＫＯ／ａｐｏＡ−Ｉ−Ｔｇマウスを、自由摂取で、通常のゲッ齒類食餌で保持した。生理食塩水または０．４ｍｇのＬＣＡＴの静脈内（ＩＶ）注射は、後眼窩洞を介して、４日間、毎日行われた。動物を５日目に致死した。動物に麻酔をし、ヘパリン処置された生理食塩水で灌流により失血させた。肝臓葉および大動脈を各動物から除去し、クロロホルムおよびメタノール溶液で抽出した。抽出した組織から回収した脂質中のコレステロールを商業用酵素アッセイキットで測定した。
【００７５】
図３は、生理食塩水（Ｃｔｒｌ）またはＬＣＡＴ（Ｅｘｐ）を注入されたマウスの（Ａ）肝臓、（Ｂ）大動脈、および（Ｃ）血漿のコレステロール含量を示す。ＬＣＡＴを用いた治療は、肝臓および大動脈におけるコレステロールのレベルを有意に低下させ、血漿コレステロールレベルを有意に上昇させた。実施例４および５からの統合したデータは、ＬＣＡＴの注入が、迅速に、組織から血漿ＨＤＬに脂質を再分配したことを実証する。肝臓および大動脈のコレステロール含量に対するＬＣＡＴ注入の作用を考えると、類似する変化が赤血球において観察されるであろうことが予想される。
実施例６
【００７６】
鎌状赤血球クリーゼの子供（３０ｋｇ）が病院に入院した。標準的な診察治療とともに、総量１００ｍＬの生理食塩水で、１時間にわたり、５ｍｇ／ｋｇの組み換えヒトＬＣＡＴ（ｒｈＬＣＡＴ）を子供（男の子）に注入する。治療後、血液酸素レベルが測定され、改善された。クリーゼの緩和として、赤血球の形態および物理的特徴（ＲＢＣ変形能、ＲＢＣ凝集性、および浸透圧脆弱性）を測定し、結果を入院時に採取した血液試料からの結果と比較する。ＲＢＣの物理的特徴および酸素化の改善は、０．５ｍｇ／ｋｇの用量のｒｈＬＣＡＴの週１回の皮下注射により維持される。
実施例７
【００７７】
関節リウマチを呈する３５歳の女性（５５ｋｇ）は、９ｇ／ｄｌ（正常な範囲は１２〜１４ｇ／ｄｌ）のヘモグロビンレベルの貧血を有する。血液試料を採取し、女性の赤血球はあまり変形せず、正常な赤血球より容易に凝集することが実証される。患者は、皮下的に投与される１ｍｇ／ｋｇの用量のｒｈＬＣＡＴの週１回の注射を処方される。ヘマトクリットおよびヘモグロビンレベルは、６回の週１回の注射後に測定され、２０％増加したことが分かった。６ヶ月の治療後、ヘモグロビンは１４ｇ／ｄｌである。医師は、隔週で注射される１ｍｇ／ｋｇの用量のｒｈＬＣＡＴに患者を維持することを決める。
実施例８
【００７８】
６５歳の男性（８０ｋｇ）は、四重バイパス手術を予定している。患者は、術後の出血の可能性を低減するために、手術５日前にクロピドグレルの服薬を止めるよう助言される。血小板の活性化、血栓症、またはＲＢＣ凝集のリスクを低減するために、患者は、手術の５日前に、１ｍｇ／ｋｇのｒｈＬＣＡＴ注入のために、診療所に連れてこられる。患者は、術後直後、術後７日目、および術後１４日目に、１ｍｇ／ｋｇのｒｈＬＣＡＴを注入される。回復後（術後２１日目）、患者は長期クロピドグレル治療に戻る。
実施例９
ＬＣＡＴの肝特異的過剰発現における遺伝子導入
【００７９】
関節リウマチを呈する患者は、慢性貧血を伴った。患者は、門脈内カテーテルを通した注入により、４×１０１２アデノウイルス粒子（ＡｄｒＬＣＡＴ）／ｋｇの用量を投与される。ＬＣＡＴレベルは、治療後、毎週、監視される。治療４週後、患者は、１０ｍｇ／ＬのＬＣＡＴレベル、または関節炎ではない対象より約２倍高い濃度を有する。治療８週後、患者、毎月監視される。患者のＬＣＡＴレベルが５ｍｇ／Ｌを下回る場合、手順を繰り返す。
実施例１０
【００８０】
鎌状赤血球発症の子供（３０ｋｇ）が病院に入院した。標準的な診察治療とともに、総量１００ｍＬの生理食塩水で、１時間にわたり、５ｍｇ／ｋｇの組み換えヒトＬＣＡＴ（ｒｈＬＣＡＴ）を子供（男の子）に注入する。治療後、血液酸素レベルが測定され、改善された。クリーゼの緩和として、赤血球の形態および物理的特徴（ＲＢＣ変形能、ＲＢＣ凝集性、および浸透圧脆弱性）を測定し、結果を入院時に採取した血液試料からの結果と比較する。患者には、その後、医療装置が皮膚下に設置される手順がある。医療装置は、活性ＬＣＡＴを分泌するように操作された哺乳動物の細胞を含む。十分なＬＣＡＴが細胞により放出されて、内因性ＬＣＡＴ活性を、正常を１００％超えるＬＣＡＴレベルに上昇させる。
【００８１】
本発明の範囲は、特許請求の範囲により定義され、本明細書に詳細に記載される実施形態および実施例により制限されないことを理解するべきである。
【図１】
2015199751.tif 000004
【図２】
2015199751.tif 000005
【図３】
2015199751.tif 000006
【配列表】
2015199751000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月11日(2015.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＢＣ膜における高ＰＣ／ＳＭ比を特徴とする状態を有する患者を治療するための医薬の製造におけるＬＣＡＴの使用。
【請求項２】
前記状態は、鎌状赤血球症、糖尿病、サラセミア、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、関節炎、肝疾患、肝硬変、肝炎、有蕀赤血球増加症、敗血症、認知症、または微小血管障害、炎症性障害、寄生虫症、勃起不全、癌、子癇前症、重篤疾患、または外傷である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＰＣ対ＳＭのベースライン比を決定することと、ＬＣＡＴの投与後のＰＣ対ＳＭの比率を決定することと、をさらに含み、前記ＰＣ対ＳＭの比率の低下は、前記状態における改善を示す、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
高ＦＣ含量を特徴とする状態を有する患者を治療するための医薬の製造におけるＬＣＡＴの使用。
【請求項５】
前記状態は、鎌状赤血球症、糖尿病、サラセミア、リウマチ様疾患、自己免疫疾患、関節炎、肝疾患、肝硬変、肝炎、有蕀赤血球増加症、敗血症、認知症、または微小血管障害、炎症性障害、寄生虫症、勃起不全、癌、子癇前症、重篤疾患、または外傷である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記ＬＣＡＴは、静脈内注射、皮下注射、または筋肉内注射により投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記投与されるＬＣＡＴの量は、約１０ｍｇ〜約５０００ｍｇである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記投与されるＬＣＡＴの量は、前記正常なＬＣＡＴレベルの１倍〜１０００倍である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記ＬＣＡＴは修飾されたＬＣＡＴである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記修飾されたＬＣＡＴは、３１位にアミノ酸置換を含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＬＣＡＴの投与から４時間後の前記患者の前記血漿ＨＤＬ−Ｃレベルは、ＬＣＡＴ投与前の前記血漿ＨＤＬ−Ｃレベルの少なくとも５０％増加する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＬＣＡＴの投与から２４時間後の前記患者の前記血漿ＨＤＬ−Ｃレベルは、ＬＣＡＴ投与前の前記血漿ＨＤＬ−Ｃレベルの少なくとも１００％増加する、請求項１０に記載の使用。