(57)【要約】【課題】Ａβペプチドの凝集抑制剤及び毒性低減剤、並びにアルツハイマー病の予防治療剤の提供。【解決手段】Ａβペプチドを構成する一以上のアミノ酸残基が酸化されているＡβペプチド酸化体（Ｍｅｔのみが酸化されているＡβペプチド酸化体を除く）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａβペプチドを構成する一以上のアミノ酸残基が酸化されているＡβペプチド酸化体（Ｍｅｔのみが酸化されているＡβペプチド酸化体を除く）。
【請求項２】
少なくともＴｙｒ及びＨｉｓから選ばれる一以上のアミノ酸残基が酸化されている請求項１記載のＡβペプチド酸化体。
【請求項３】
請求項１又は２記載のＡβペプチド酸化体を含有する医薬。
【請求項４】
請求項１又は２記載のＡβペプチド酸化体を有効成分とするＡβペプチド凝集抑制剤。
【請求項５】
請求項１又は２記載のＡβペプチド酸化体を有効成分とするＡβペプチド毒性低減剤。
【請求項６】
請求項１又は２記載のＡβペプチド酸化体を有効成分とするアルツハイマー病の予防及び／又は治療剤。
【請求項７】
Ａβペプチドを酸化することを特徴とする、Ａβペプチドを構成する一以上のアミノ酸残基が酸化されているＡβペプチド酸化体（Ｍｅｔのみが酸化されているＡβペプチド酸化体を除く）の製造法。
【請求項８】
Ａβペプチド酸化体が、少なくともＴｙｒ及びＨｉｓから選ばれる一以上のアミノ酸残基が酸化されているＡβペプチド酸化体である請求項７記載の製造法。
【請求項９】
Ａβペプチドの酸化剤又は酸化触媒を有効成分とする医薬。
【請求項１０】
Ａβペプチドの酸化剤又は酸化触媒を有効成分とするＡβペプチド凝集抑制剤。
【請求項１１】
Ａβペプチドの酸化剤又は酸化触媒を有効成分とするＡβペプチド毒性低減剤。
【請求項１２】
Ａβペプチドの酸化剤又は酸化触媒を有効成分とするアルツハイマー病の予防及び／又は治療剤。
【請求項１３】
Ａβペプチドを酸化することを特徴とするＡβペプチドの凝集抑制方法。
【請求項１４】
Ａβペプチドを酸化することを特徴とするＡβペプチドの毒性低減方法。
【請求項１５】
Ａβペプチドを酸化することを特徴とするアルツハイマー病の予防及び／又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａβペプチド酸化体及びこれを有効成分とするアルツハイマー病の予防治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は神経細胞の変性、脱落と共に老人斑の形成と神経原線維変化の病理学的特徴を有する神経変性疾患である。アルツハイマー病は記憶、認識、思考、判断等が進行的に損失する認知症状を引き起こし、最終的に死に至らせる。
脳内に沈着した老人斑を構成する主たる物質はアミロイドβペプチド（Ａβペプチド）であり、３９−４３個のアミノ酸から成る。Ａβペプチドは細胞毒性を示し、これによりアルツハイマー病が引き起こされると考えられている（非特許文献１）。細胞から分泌されるＡβペプチドは主に４０個或いは４２個のアミノ酸から成るポリペプチドであり、特に４２個から成るＡβペプチドはより凝集性が強く早期に脳内に沈着すること、及び細胞毒性が強いことが知られている（非特許文献２）。従って、Ａβペプチドの産生を阻害する薬剤及びＡβペプチドの凝集を阻害する薬剤は、アルツハイマー病予防治療薬として期待されている。
Ａβペプチドの産生を阻害する薬剤としては、Ａβペプチド産生酵素であるβ−セクレターゼ及びγ−セクレターゼを阻害する薬剤が研究されている。また、Ａβペプチドの分解酵素促進剤や抗Ａβペプチド抗体、さらにＡβペプチドの凝集を阻害する薬剤等が研究されている。
【０００３】
一方、ＡβペプチドのＭｅｔ酸化体（ＡβペプチドのＭｅｔ残基の硫黄原子が酸化（Ｏ）された酸化体）が生体内に少量存在すること、及び当該Ｍｅｔ酸化体はＡβペプチドに比べて凝集性が低いことが報告されている（非特許文献３〜５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】J. Hardy, D. J. Selkoe, Science 2002, 297, p353.
【非特許文献２】S. A. Gravina, et al. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, p7013
【非特許文献３】Hou, L. et al. J. Biol. Chem., 2002, Vol.277, No.43, p40173-40176
【非特許文献４】Bitan, G. et al. J. Am. Chem. Soc., 2003, Vol.125, No.50, p15359-15365
【非特許文献５】Moskovitz, J. et al. Biochemistry, 2011, 50, p10687-10697
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、Ａβペプチド産生酵素阻害剤では十分にＡβペプチドの産生を阻害することができず、また抗Ａβペプチド抗体は安全性の問題で未だ開発の成功に至っていない。
従って、全く新たな視点からＡβペプチドの凝集を阻害し、Ａβペプチドの毒性を低減することによるアルツハイマー病の予防治療剤を開発することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、Ａβペプチドを人工的に改変することにより凝集を抑制し、毒性を低減させるべく種々検討した。非特許文献３〜５によれば、生体内に存在するＡβペプチドのＭｅｔ酸化体はそれ自身が低い凝集性しか示さないことが知られているが、Ａβペプチドを人工的に酸化して得られた特定のＡβペプチド酸化体が、それ自身凝集性を示さないだけでなく、ネイティブＡβペプチドの凝集を強力に抑制し、かつネイティブＡβペプチドの神経毒性を低減させることから、全く新たなアルツハイマー病の予防治療剤として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の［１］〜［１５］を提供するものである。
【０００８】
［１］Ａβペプチドを構成する一以上のアミノ酸残基が酸化されているＡβペプチド酸化体（Ｍｅｔのみが酸化されているＡβペプチド酸化体を除く）。
［２］少なくともＴｙｒ及びＨｉｓから選ばれる一以上のアミノ酸残基が酸化されている［１］記載のＡβペプチド酸化体。
［３］［１］又は［２］記載のＡβペプチド酸化体を含有する医薬。
［４］［１］又は［２］記載のＡβペプチド酸化体を有効成分とするＡβペプチド凝集抑制剤。
［５］［１］又は［２］記載のＡβペプチド酸化体を有効成分とするＡβペプチド毒性低減剤。
［６］［１］又は［２］記載のＡβペプチド酸化体を有効成分とするアルツハイマー病の予防及び／又は治療剤。
［７］Ａβペプチドを酸化することを特徴とする、Ａβペプチドを構成する一以上のアミノ酸残基が酸化されているＡβペプチド酸化体（Ｍｅｔのみが酸化されているＡβペプチド酸化体を除く）の製造法。
［８］Ａβペプチド酸化体が、少なくともＴｙｒ及びＨｉｓから選ばれる一以上のアミノ酸残基が酸化されているＡβペプチド酸化体である［７］記載の製造法。
［９］Ａβペプチドの酸化剤又は酸化触媒を有効成分とする医薬。
［10］Ａβペプチドの酸化剤又は酸化触媒を有効成分とするＡβペプチド凝集抑制剤。
［11］Ａβペプチドの酸化剤又は酸化触媒を有効成分とするＡβペプチド毒性低減剤。
［12］Ａβペプチドの酸化剤又は酸化触媒を有効成分とするアルツハイマー病の予防及び／又は治療剤。
［13］Ａβペプチドを酸化することを特徴とするＡβペプチドの凝集抑制方法。
［14］Ａβペプチドを酸化することを特徴とするＡβペプチドの毒性低減方法。
［15］Ａβペプチドを酸化することを特徴とするアルツハイマー病の予防及び／又は治療方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＡβペプチド酸化体を用いれば、Ａβの凝集を抑制でき、かつＡβによる毒性を低減できるため、アルツハイマー病の予防及び／又は治療に有用である。また、Ａβペプチドの酸化剤又は酸化触媒を用いれば、生体内又は細胞内でＡβペプチド酸化体が生成する結果としてＡβペプチドの凝集を抑制し、Ａβペプチドによる毒性を低減できるためアルツハイマー病の予防及び／又は治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】光触媒リボフラビンを利用したＡβ１−４２の酸化反応を示す。Ａβ１−４２配列中＊印はＬｙｓ−Ｃの切断部位。今回酸化が確認されたアミノ酸には下線を付した。
【図２】質量分析装置（ＭＡＬＤ−ＴＯＦ ＭＳ）によるＡβ１−４２の酸化反応解析を示す。ｔは反応時間を表す。
【図３】アミノ酸分析によるネイティブＡβとＡβ酸化体との比較を示す。括弧内はＡβ中の理論的なアミノ酸の数を示す。Ratio of amino acidはフェニルアラニンを３としたときのサンプル中のアミノ酸のモル比。
【図４】酵素消化後のＬＣ／ＭＳ解析のＬＣチャートを示す。ＬＣ条件：Ｃ１８逆相カラム（１５０(４．６mm），０％−１００％アセトニトリル／０．１％aqueous TFA ４０minのグラジエントモード，流速０．９mL min-1，ＵＶ２３０nmで検出。酵素消化後のＡβフラグメントの理論質量：Ａβ１−１６［Ｍ＋２Ｈ］2+：９７７．９，Ａβ１７−２８［Ｍ＋２Ｈ］2+：６６３．３，Ａβ２９−４２［Ｍ＋Ｈ］+：１２６９．８．
【図５】酵素消化後の質量分析（ＭＡＬＤ−ＴＯＦ ＭＳ）を示す。
【図６】酵素消化後得られたＡβ１−１６のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を示す。左３つは上部に記載の保持時間に検出されたＭＳスペクトル。右チャートは抽出クロマトグラフ。LC conditions: C18 reverse-phase column（100(1.0mm,40℃）with a binary solvent system: linear gradient of 2％−42％acetonitrile in 0.1％aqueous formic acid over 20min at a flow rate of 20μL min-1.
【図７】Ａβ１−１６＋１６ＤａのMS/MSスペクトル（図６中の保持時間９．２分のピーク）を示す。Adduct of 16 Da was observed from b10 to b13 and y7 to y10 ions,whereas b2 to b9 (except for b4) and y1 to y6 ions were intact, suggesting that+16 Da modification occurred at Tyr10 residue.
【図８】チロシンおよびヒスチジンにおける酸化修飾構造（推定）を示す。
【図９】Ａβ１−１６＋１４ＤａのＭＳ／ＭＳスペクトル（図６中の保持時間１０．６分のピーク）を示す。Adduct of 14 Da was observed from b13 to b15 and y4 to y10 ions, whereas b6 to b12 and y1 to y3 ions were intact, suggesting that +14 Da modification occurred at His13 residue.
【図１０】Ａβ１−１６＋１４ＤａのＭＳ／ＭＳスペクトル（図６中の保持時間１１．５分のピーク）を示す。Adduct of 14 Da was observed from b14 and b15 and y3 to y6 ions, whereas b6 to b13 and y1 and y2 ions were intact, suggesting that + 14 Da modification occurred at His14 residue.
【図１１】チオフラビンT蛍光アッセイ結果を示す。(n=6,mean((SD; **p<0.01versusnative Aβ1-42 by Student's t-test).
【図１２】原子間力顕微鏡解析を示す。左はネイティブＡβ、右は酸化型Ａβ。ｔは反応時間を表す。
【図１３】円二色性分光分析を示す。ｔは反応時間を表す。
【図１４】ＰＣ１２細胞によるネイティブＡβ（Ｅ，Ｆ，Ｇ）およびＡβ酸化体（Ｈ）の毒性比較を示す。縦軸は細胞生存率。(n=5,mean±SEM; ***p<0.001 versus A or in indicated pair by Tukey's test).
【図１５】原子間力顕微鏡解析を示す。左はネイティブＡβ単独、右はネイティブＡβ＋Ａβ酸化体。
【図１６】ＰＣ１２細胞によるネイティブＡβ単独（Ｃ）とネイティブＡβ＋Ａβ酸化体（Ｄ）の毒性比較を示す。縦軸は細胞生存率。(n=6,mean±SEM; ***p<0.001 versus A or in indicated pair by Tukey's test)
【図１７】細胞存在下における光酸素化反応による細胞生存率の評価を示す。Ａβは、ネイティブＡβ。Catalyst 1は、リボフラビン。Catalyst 2は、Ａβ親和性ペプチド結合フラビンを示す。縦軸は細胞生存率。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のＡβペプチド酸化体は、Ａβペプチドを構成する一以上のアミノ酸残基が酸化されているＡβペプチド酸化体（Ｍｅｔのみが酸化されているＡβペプチド酸化体を除く）である。
Ａβペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列（１−４２）を有するか、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列の１−４０アミノ酸配列を有するペプチドである。
【００１２】
本発明のＡβペプチド酸化体は、Ａβペプチドを構成する４０又は４２アミノ酸残基のうちの一以上のアミノ酸残基が酸化されていればよいが、少なくともＴｙｒ及びＨｉｓから選ばれる一以上のアミノ酸残基が酸化されているＡβペプチド酸化体が好ましい。なお、Ｔｙｒ及びＨｉｓから選ばれる一以上のアミノ酸残基が酸化されていれば、さらにＭｅｔも酸化されているＡβペプチド酸化体も含まれる。好ましいＡβペプチド酸化体としては、Ｔｙｒ酸化体、Ｈｉｓ酸化体、Ｔｙｒ及びＨｉｓ酸化体、Ｔｙｒ及びＭｅｔ酸化体、Ｈｉｓ及びＭｅｔ酸化体、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ及びＭｅｔ酸化体、並びにこれらの混合物が挙げられる。なお、配列番号１中に、Ｔｙｒ及びＭｅｔはそれぞれ１個存在するだけであるから、そのＴｙｒ及びＭｅｔが酸化される。一方、Ｈｉｓは、６Ｈｉｓ、１３Ｈｉｓ及び１４Ｈｉｓが存在するので、これらのＨｉｓの全てが酸化されていてもよいが、１３Ｈｉｓ及び１４Ｈｉｓが酸化されているのがより好ましい。酸化の形態としては、酸素による酸化であるのが好ましく、具体的には各アミノ酸残基にヒドロキシ基又はオキソ基（オキシド）が付加した形態であるのがより好ましい。
【００１３】
前記のアミノ酸残基の酸化体としては、マススペクトル分析結果から、Ｔｙｒの場合には、チロシン残基のフェニル基にヒドロキシ基が２個又は３個置換した構造（ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基）を有しているものと推定される。また、Ｈｉｓの場合には、ヒスチジン残基のイミダゾール環が酸化された構造、すなわち、デヒドロイミダゾロン環、ヒドロキシイミダゾロン環を有しているものと推定される。また、Ｍｅｔの場合には、メチオニン残基中の硫黄原子に酸素が付加しているものと推定される。
【００１４】
本発明のＡβペプチド酸化体は、例えばＡβペプチドを酸化することにより製造することができる。酸化反応は、Ａβペプチドのアミノ酸残基に酸素原子を供給できる酸化反応であればよく、例えば、リボフラビン、チオフラビンＴ、コンゴレッド、メチレンブルー、ローズベンガル、アクリジン誘導体、ポルフィリンおよびその金属錯体（金属＝鉄、マンガン、亜鉛）、ルテニウムトリスビピリジン錯体、これらの分子にＡβペプチド親和性分子を結合させた化合物等の酸化触媒及び酸素の存在下に光を照射する方法、過酸化物、超原子価ヨウ素、過塩素酸等の酸化剤を反応させる方法が挙げられる。
【００１５】
酸化触媒を用いる方法においては、空気中や溶液中の酸素が利用されるので反応の場合には、Ａβペプチド及び酸化触媒を添加し、光を照射すればよい。照射する光は、酸化触媒の種類により決定すればよい。この反応は、生理的条件下、例えば３０〜４０℃で反応が進行するので特に好ましい。
【００１６】
酸化剤を用いる方法では、Ａβペプチド含有液に酸化剤を添加して反応を行えばよい。
【００１７】
本発明のＡβペプチド酸化体は、後記実施例に示すように優れたＡβペプチド凝集抑制作用、及びＡβペプチド毒性低減作用を有するため、Ａβペプチド凝集抑制剤、Ａβペプチド毒性低減剤、またヒトを含む動物のアミロイド沈着、Ａβペプチド凝集が関与する疾患、例えばアルツハイマー病、ダウン症等の予防治療薬として有用である。
【００１８】
また、生体内又は細胞内でＡβペプチドを酸化すれば、当該生体内又は細胞内で本発明のＡβペプチド酸化体が生成するため、Ａβペプチドの凝集抑制、Ａβペプチドの毒性低減、またアルツハイマー病の予防及び／又は治療が可能である。
【００１９】
生体内又は細胞内でＡβペプチドを酸化するには、生体内又は細胞内に酸化剤又は酸化触媒を導入して酸化反応を生起させればよい。ここで用いられる酸化剤としては、前記Ａβペプチド酸化体の製造において列挙した酸化剤、例えば過酸化物、超原子価ヨウ素、過塩素酸等が挙げられる。また、前記の酸化触媒と光の反応も用いることができる。光の照射は、例えば光力学的治療手段と同様に行えばよい。
具体的には、酸化触媒を生体内又は細胞内に導入し、酸化触媒が目的とする部位に移行した時点で光を照射すればよい。生体内への酸化触媒又は酸化剤の投与手段としては、筋肉内注射、静脈内注射、局所投与、経口投与等が挙げられる。
【００２０】
生体内又は細胞内で、Ａβペプチドを選択的に酸化するため、リボフラビンやチオフラビンＴに、Ａβペプチド親和性分子を結合させたリボフラビン誘導体を合成し、これを反応させることも可能である。Ａβペプチド親和性分子としては、例えばチオフラビンＴ、コンゴレッド、スチルベン誘導体、ポリチオフェン誘導体、アクリジン誘導体、アミノナフチル誘導体、Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ（配列番号２）誘導体、クルクミン、ミリセチン、リファンピシン、ノルジヒドログアイヤレチン酸が挙げられる。
【００２１】
生体内又は細胞内でＡβペプチド酸化体を生成させる成分、すなわち、Ａβペプチドの酸化剤又は酸化触媒は、Ａβペプチド凝集抑制剤、Ａβペプチド毒性低減剤及びアルツハイマー病予防及び／又は治療剤として有用である。
【００２２】
本発明の医薬は、前記Ａβペプチド酸化体、あるいはＡβペプチドの酸化剤又は酸化触媒を有効成分として含有する。
【００２３】
本発明のＡβペプチド酸化体、あるいはＡβペプチドの酸化剤又は酸化触媒を人体用の医薬として使用する場合、投与量は成人１日当たり１mg〜１ｇ、好ましくは１０mgから３００mgの範囲である。
【００２４】
本発明のＡβペプチド酸化体、あるいはＡβペプチドの酸化剤又は酸化触媒を含有する医薬組成物は投与法に応じ適当な製剤を選択し、薬学的に許容される担体を用いて各種製剤の調製法にて調製できる。本発明を主剤とする医薬組成物の剤形としては例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤や、液剤、シロップ剤、エリキシル剤、油性ないし水性の懸濁液等を経口用製剤として例示できる。
【００２５】
注射剤としては製剤中に安定剤、防腐剤、溶解補助剤を使用することもあり、これらの補助剤を含むこともある溶液を容器に収納後、凍結乾燥等によって固形製剤として用時調製の製剤としてもよい。また一回投与量を一の容器に収納してもよく、また多投与量を一の容器に収納してもよい。
【００２６】
また外用製剤として液剤、懸濁液、乳濁液、軟膏、ゲル、クリーム、ローション、スプレー、貼付剤等を例示できる。
【００２７】
固形製剤としては本発明のＡβペプチド酸化体、あるいはＡβペプチドの酸化剤又は酸化触媒とともに薬学上許容されている添加物を含み、例えば充填剤類や増量剤類、結合剤類、崩壊剤類、溶解促進剤類、湿潤剤類、潤滑剤類等を必要に応じて選択して混合し、製剤化することができる。
液体製剤としては溶液、懸濁液、乳液剤等を挙げることができるが添加剤として懸濁化剤、乳化剤等を含むこともある。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明の範囲は下記実施例に限定されることはない。
【００２９】
実施例１（各実験方法の詳細）
（１）チオフラビンＴアッセイの実験
Ａβ１−４２（２０μＭ）およびリボフラビン（４μＭ）が溶解したリン酸緩衝液（１０mM，pH７．４）を、蛍光ランプ照射下（２４Ｗ，昼白色，光源と反応液の距離約３cm）３７℃にてインキュベートした。反応液の一部（１０μＬ）を、チオフラビンＴ（５μＭ）を含む５０mMグリシン−NaOH緩衝液（pH８．５，４００μＬ）に加え、直ちに混和しチオフラビンＴの蛍光強度を測定した。蛍光強度測定において励起波長として４４０nm、蛍光波長として４７０nmを用いた。
【００３０】
（２）原子間力顕微鏡分析の実験
Ａβ１−４２（２０μＭ）およびリボフラビン（４μＭ）が溶解したリン酸緩衝液（１０mM，pH７．４）を、蛍光ランプ照射下（２４Ｗ，昼白色，光源と反応液の距離約３cm）３７℃にてインキュベートした。反応液の一部（１０μＬ）をマイカ上にのせ、室温で３分間インキュベートした後、２０μＬの水で洗浄し、風乾した。測定は、Nano Wizard II(JPK instruments AG, Berlin, Germany)を使用し、空気中室温にてタッピングモードにより行った。
【００３１】
（３）円二色性分光分析の実験
Ａβ１−４２（２０μＭ）およびリボフラビン（４μＭ）が溶解したリン酸緩衝液（１０mM，pH７．４）を、蛍光ランプ照射下（２４Ｗ，昼白色，光源と反応液の距離約３cm）３７℃にてインキュベートした。反応液の一部をModel 202SF(AVIV Biomedical, Inc., Lakewood, NJ)を使用して分析した。
【００３２】
（４）細胞実験
ラット副腎髄質由来褐色細胞腫であるＰＣ１２細胞（理化学研究所から購入）を使用した。Ａβ１−４２（２０μＭ）およびリボフラビン（４μＭ）が溶解したリン酸緩衝生理食塩水（pH７．４）を、蛍光ランプ照射下（２４Ｗ，昼白色，光源と反応液の距離約３cm）室温にてインキュベートした。反応液の一部（５０μＬ）を細胞培養培地（５０μＬ）に加え（最終Ａβ濃度は１０μＭ）、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃、４８時間インキュベートした。細胞の観察および写真撮影はデジタルカメラＤＦＣ３６０ ＦＸ(Leica Microsystems GmbH)付き倒立顕微鏡ＤＭＩ６０００ Ｂ(Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)にて行った。ＷＳＴ−８（２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，モノナトリウム塩）を含む生細胞数測定試薬(１０μＬ)を加え、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で６時間インキュベートした後、４５０nm(参照波長:６５５nm)の吸光度をｉＭａｒｋTMプレートリーダー(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)により測定した。
【００３３】
実施例２
酸化反応
Ａβ１−４２（配列番号１）（２０μＭ）およびリボフラビン（４μＭ）が溶解したリン酸緩衝液（１０mM，pH７．４）を、蛍光ランプ照射下（２４Ｗ，昼白色，光源と反応液の距離約３cm）、３７℃にてインキュベートし（図１）、質量分析装置（ＭＡＬＤ−ＴＯＦ  ＭＳ）にて反応を追跡した（図２）。反応３時間後、原料のＡβ１−４２の消失とともに、酸素原子が１−８個付加した酸化Ａβのスペクトルが観察された。同一試料をアミノ酸分析したところ、チロシンとヒスチジンの量が、酸化していないコントロールサンプルと比べ約半分に減少した（図３）。同一解析から、メチオニンの若干の減少も観察された。これらの結果から、チロシン、ヒスチジン、メチオニンにて酸化反応が進行したことおよびチロシンとヒスチジンはメチオニンと比べ酸化を受けやすいことが判明した。このように、質量分析測定の結果より、反応３時間後、ほとんどのＡβ１−４２が酸化されていることが判明した。
【００３４】
さらに詳しく酸化構造を解析するために、酸化Ａβ１−４２のサンプルをエンドペプチダーゼであるＬｙｓ−Ｃ（ＬｙｓのＣ末端側を切断（図１参照）。Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Switzerlandから購入）で酵素消化し（酵素はＡβに対して５０分の１の量、３７℃で約１２時間反応）、得られた消化物をＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）および質量分析装置（ＭＡＬＤ−ＴＯＦ ＭＳ）にて分析した。ＬＣ／ＭＳ分析において、Ａβ２９−４２の１６Ｄａ付加体が検出された（図４）。先のアミノ酸分析の結果と合わせると、３５位のメチオニンの側鎖がスルホキシドに酸化されたものと考えられる。また、質量分析装置（ＭＡＬＤ−ＴＯＦ ＭＳ）によりＡβ１７−２８が検出され、酸素原子付加体は観察されなかった（図５）。これは、Ａβ１７−２８領域においては酸化を受けていないことを示すものである。一方、質量分析装置（ＭＡＬＤ−ＴＯＦ ＭＳ）にてＡβ１−１６に酸素原子が１−６個付加したピーク群が見られた（図５）。さらに、Ａβ１−１６をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＥＳＩ−Ｑｑ−ＴＯＦ）解析したところ、Ａβ１−１６への１６Ｄａ付加体が検出され（図６，左下のスペクトル図）、保持時間９．２分（図６、右のスペクトル）のピークは１０位チロシンが＋１６Ｄａの修飾を受けている分子種由来であった（図７）。これはおそらくチロシンが３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンへ酸化されたものと考えられる（図８）。また、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＥＳＩ−Ｑｑ−ＴＯＦ）解析から、Ａβ１−１６への１４Ｄａ付加体が検出され（図６、左真ん中のスペクトル）、保持時間１０．６分と保持時間１１．５分（図６、右のスペクトル）が、それぞれ１３位ヒスチジンおよび１４位ヒスチジンの１４Ｄａ付加体であることが示唆された（それぞれ図９、図１０）。これはおそらくヒスチジンがデヒドロ−２−イミダゾロン誘導体へ酸化されたものと考えられる（図８）。また、２８Ｄａ付加体、３０Ｄａ付加体、４４Ｄａ付加体も検出され、これらは１０位チロシン、１３位ヒスチジン、１４位ヒスチジンでの複合的な酸化に由来するものと考えられる。図５の質量分析（ＭＡＬＤ−ＴＯＦ ＭＳ）において酸素原子が１〜６個付加したピーク群が見られることを考えると、一つのチロシンやヒスチジンに対して複数の酸素原子が付加した化合物の存在も示唆される。例えば、チロシンにおける３，４，５−トリヒドロキシフェニルアラニンやヒスチジンにおけるヒドロキシ−２−イミダゾロン誘導体が推定される（図８）。（１）Pattison, D. I., Rahmanto, A. S. & Davies, M. J. Photo-oxidation of proteins. Photochem. Photobiol. Sci. 11,38-53 (2012).２）Schey, K. L. & Finley, E. L. Identification of peptide oxidation by tandem mass spectrometry. Acc. Chem. Res. 33, 299-306 (2000)参照）以上のように、リボフラビン触媒システムにより１０位チロシン、１３位ヒスチジン、１４位ヒスチジン、３５位メチオニンにおける酸化の進行が確認された。
【００３５】
実施例３
凝集性に関する検討
Ａβ１−４２（２０μＭ）およびリボフラビン（４μＭ）が溶解したリン酸緩衝液（１０mM，pH７．４）を、蛍光ランプ照射下（２４Ｗ，昼白色，光源と反応液の距離約３cm）、３７℃にてインキュベートしたサンプル（「Ａβ酸化体」）と、コントロールとして光非照射下で反応したサンプル（「ネイティブＡβ」）を使用し、それぞれの凝集性をチオフラビンＴアッセイ（チオフラビンＴの蛍光強度はβシート構造に富んだ凝集体の量と相関することが知られている。）により評価した（図１１）。インキュベート３時間および６時間において、Ａβ酸化体のチオフラビンＴ蛍光強度はネイティブＡβと比べ顕著に低く、この結果は、Ａβ酸化体の低い凝集性を示唆するものである。また、原子間力顕微鏡解析より、ネイティブＡβでは明らかな繊維を形成する一方、酸化型Ａβでは繊維形成がほとんど観察されなかった（図１２）。さらに、円二色性分光分析法により、ネイティブＡβではランダムコイル構造からβシート構造への転移が見られる一方、酸化型Ａβではランダムコイル構造を維持することが分かった（図１３）。
【００３６】
実施例４
細胞毒性に関する検討
ラット副腎髄質由来褐色細胞腫であるＰＣ１２細胞（神経モデル細胞）を用いて、ネイティブＡβとＡβ酸化体の細胞毒性を比較した（図１４）。ネイティブＡβ（１０μＭ）存在下では９０％以上の細胞が死滅するのに対し、Ａβ酸化体（１０μＭ）存在下では５０％以上の細胞生存率が維持された。また、ネイティブＡβ存在下でのみアポトーシス様の細胞死が観察された。この結果は酸化修飾により細胞毒性が著しく低下することを示すものである。
【００３７】
実施例５
ネイティブＡβの凝集性および細胞毒性の阻害
原子間力顕微鏡解析より、Ａβ酸化体（２０μＭ）の共存下ネイティブＡβ（２０μＭ）をインキュベートした場合（３７℃，６時間）、ネイティブＡβ（２０μＭ）単独に比べ、アミロイド繊維量が顕著に減少した（図１５）。この結果はＡβ酸化体がネイティブＡβの凝集を阻害したことを示すものである。また、ネイティブＡβ（１０μＭ）存在下ではＰＣ１２細胞の生存率が２０％程度であったのに対し、Ａβ酸化体（１０μＭ）をネイティブＡβ（１０μＭ）に共存させた場合、細胞生存率が６０％以上であった（図１６）。この結果は、Ａβ酸化体がネイティブＡβの細胞毒性を抑えることを示すものである。
【００３８】
実施例６
ラット副腎髄質由来褐色細胞腫であるＰＣ１２細胞（理化学研究所から購入）を使用した。ＰＣ１２細胞をシードしたプレートウェル内において、２０μＭのＡβおよび触媒（４μＭの１または２０μＭの２）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４，５０μＬ）に対して５００ｎｍのＬＥＤ（light emitting diode）を１５分、３７℃の条件で照射した。反応後、０．１％の馬血清を含む培地入りのＨＥＰＥＳ緩衝液を５０μＬ加え（最終Ａβ濃度：１０μＭ）、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下４８時間インキュベートした。ＷＳＴ−８（２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，モノナトリウム塩）を含む生細胞数測定試薬（１０μＬ）を加え、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で６時間インキュベートした後、４５０nm（参照波長：６５５nm）の吸光度をｉＭａｒｋTMプレートリーダー（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）により測定した。
【００３９】
結果を図１７に示す。Ａβ選択的な酸素化を達成するために、Ａβに対して高い親和性を持つペプチド、Ｄ−［Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ（４−ｐｈｅｎｙｌ）−Ｐｈｅ］（配列番号３）を同定し、これをＡβに親和性を有するタグとしてフラビンに結合した（図１７中Catalyst 2）。Catalyst 2またはリボフラビンそのもの（図１７中Catalyst 1）を、Ａβを含むリン酸緩衝液に添加し、細胞存在下光照射を行った。５００ｎｍのＬＥＤを光源として使用し、１５分間、３７℃にて光照射した。ここで、Catalyst 2はリボフラビンそのものと比べて酸化活性が低かったためリボフラビンの５倍量使用しており、本条件において、Catalyst 1，2はＡβを同程度（約６０％程度）酸化することを確認した。本酸化反応後さらに細胞を二日間インキュベートした後の細胞生存率を調べた（図１７の棒グラフ）。リボフラビンを光照射条件下で使用した際（ｆとｈの比較）、Ａβの有無に関わらずほとんどの細胞が死滅した。これは非特異的な酸化が起こったために細胞が傷害された結果と考えられる。一方、ｊの条件において、Ａβ非存在下でCatalyst 2を用いた際、光照射後、５０％以上の細胞が生存した。これは、Catalyst 2自身の酸化活性が相対的に低いために、生体分子へのランダムな酸化反応が妨げられた可能性が考えられる。一方、Ａβ存在下では（ｋとｌの比較）、光照射した場合、光がない時と比べ細胞生存率が有意に上昇した。これは、Ａβが酸素化反応を受けて無毒化したために、細胞死が回避されたためと考えられる。以上のように、Catalyst 2を用いることによって、細胞存在下、Ａβ選択的な酸素化反応により、Ａβの毒性を低減することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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