(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト膵臓特異的リボヌクレアーゼ１（ＲＮａｓｅ１）及び該ＲＮａｓｅ１を簡便に分離する方法の提供。【解決手段】ＲＮａｓｅ１の３つのＮ型糖鎖修飾可能部位のうち１つ以上の部位がＮ型糖鎖修飾を受けていないＲＮａｓｅ１及びＲＮａｓｅ１のＮ型糖鎖修飾可能部位にＮ型糖鎖が付加していないＲＮａｓｅ１に対して特異的に結合可能な抗体と試料とを接触させ、次いで抗体に結合したＲＮａｓｅ１を分離することを特徴とする該ＲＮａｓｅ１の分離方法。【選択図】図３
2015156821.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト膵臓特異的リボヌクレアーゼ１の３つのＮ型糖鎖修飾可能部位のうち、１つ以上の部位がＮ型糖鎖修飾を受けていないことを特徴とする、ヒト膵臓特異的リボヌクレアーゼ１。
【請求項２】
Ｎ型糖鎖修飾可能部位である配列番号１の８８番目のアスパラギン残基がＮ型糖鎖修飾を受けていない、請求項１に記載のヒト膵臓特異的リボヌクレアーゼ１。
【請求項３】
Ｎ型糖鎖修飾可能部位である配列番号１の７６番目のアスパラギン残基がＮ型糖鎖修飾を受けていない、請求項１又は２に記載のヒト膵臓特異的リボヌクレアーゼ１。
【請求項４】
Ｎ型糖鎖修飾可能部位である配列番号１の３４番目のアスパラギン残基がＮ型糖鎖修飾を受けていない、請求項１〜３いずれかに記載のヒト膵臓特異的リボヌクレアーゼ１。
【請求項５】
リボヌクレアーゼ活性を有する、請求項１〜４いずれかに記載のヒト膵臓特異的リボヌクレアーゼ１。
【請求項６】
ヒト膵臓特異的リボヌクレアーゼ１のＮ型糖鎖修飾可能部位にＮ型糖鎖が付加していない場合にヒト膵臓特異的リボヌクレアーゼ１に結合可能な抗体と、試料とを接触させ、次いで抗体に結合したヒト膵臓特異的リボヌクレアーゼ１を分離することを特徴とする、請求項１〜５いずれかに記載のヒト膵臓特異的リボヌクレアーゼ１を分離する方法。
【請求項７】
Ｎ型糖鎖が付加していないＮ型糖鎖修飾可能部位が、配列番号１の８８番目のアスパラギン残基である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｎ型糖鎖が付加していないＮ型糖鎖修飾可能部位が、配列番号１の７６番目のアスパラギン残基である請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
Ｎ型糖鎖が付加していないＮ型糖鎖修飾可能部位が、配列番号１の３４番目のアスパラギン残基である、請求項６〜８いずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜５いずれかに記載のヒト膵臓特異的リボヌクレアーゼ１を含有する医薬品組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５いずれかに記載のヒト膵臓特異的リボヌクレアーゼ１を含有する体外診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト膵臓特異的リボヌクレアーゼ１（以下、ＲＮａｓｅ１と記述する）に関する。より詳しくは、３箇所のＮ型糖鎖修飾可能部位が存在し、各部位におけるＮ型糖鎖修飾の有無によって複数のアイソフォームが存在するＲＮａｓｅ１のうち、１箇所以上のＮ型糖鎖修飾可能部位において糖鎖修飾を受けていないＲＮａｓｅ１、及びそれを分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮａｓｅ１は、配列番号１で示されたペプチド配列の３４、７６、８８番目の３箇所のアスパラギン残基（以下それぞれ“Ａｓｎ３４”、“Ａｓｎ７６”，“Ａｓｎ８８”と表記する）がＮ型糖鎖修飾可能部位である。ＲＮａｓｅ１は、ヒト血中や、ヒト膵臓由来培養細胞培養上清に存在することが知られているが、そのＮ型糖鎖修飾可能部位はすべてＮ型糖鎖で修飾されているわけではなく不完全であることが知られ（非特許文献１）、各Ｎ型糖鎖修飾可能部位における糖鎖の有無に応じて、最大８つの糖鎖修飾アイソフォームが存在すると考えられる。これらを分離するにはゲル濾過法などがあげられるが、より簡便に分離する方法が求められていた。
【０００３】
一方で、全ての糖鎖修飾可能部位にＮ型糖鎖構造が付加していないＲＮａｓｅ１を得る方法は報告されている。例えば、Ｎ型糖鎖生合成系を持たない原核生物、特に大腸菌発現系での組換え体ＲＮａｓｅ１の発現によって得ることができる。ＲＮａｓｅ１を大腸菌発現系で発現した場合に、発現したＲＮａｓｅ１は封入体に取り込まれ、変性剤によって可溶化した後にリフォールディング処理によって活性をもつＲＮａｓｅ１として得ることができる。このようにして得られたＲＮａｓｅ１は、糖鎖を有しておらず、また分子内システイン残基間のジスルフィド結合が形成されていない状態であるため、厳密な意味ではヒト血中のＲＮａｓｅ１と同等であるとは言い難い。
【０００４】
また、Ｎ型糖鎖生合成系を持つ真核生物、特に一般的に利用される哺乳動物発現系、昆虫細胞発現系、酵母細胞発現系などにおいてＮ型糖鎖の生合成を阻害する試薬、例えばツニカマイシンの存在下で発現することで、糖鎖付加を抑制することができる。しかしながら、ツニカマイシンは細胞性ストレスである小胞体ストレス応答を引き起こすことが知られ、ツニカマイシンで処理された細胞からは正常な高次構造を取らないタンパク質の発現が多くなることが知られている（非特許文献２）。よって、ツニカマイシンのような糖鎖生合成阻害剤の存在下で培養された細胞からは、糖鎖が全く付加していないＲＮａｓｅ１が発現するが、そのほとんどがタンパク質として正常に折り畳まれた構造をしていない可能性が高い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１８７３７１号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ．Ｓｅｙｌｅｒ．１９９４、３７５、３５７−３６３
【非特許文献２】Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２０１２、３３，１８１４−１８２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、ＲＮａｓｅ１の糖鎖修飾可能部位のうち１つ以上が糖鎖修飾をうけていないＲＮａｓｅ１を提供し、かつそれを簡便に分離する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題について鋭意検討した結果、本発明に達した。即ち、本発明は以下の通りである。
（１）ＲＮａｓｅ１の３つのＮ型糖鎖修飾可能部位のうち、１つ以上の部位がＮ型糖鎖修飾を受けていないことを特徴とするＲＮａｓｅ１。
（２）Ｎ型糖鎖修飾可能部位である配列番号１の８８番目のアスパラギン残基がＮ型糖鎖修飾を受けていない、（１）に記載のＲＮａｓｅ１。
（３）Ｎ型糖鎖修飾可能部位である配列番号１の７６番目のアスパラギン残基がＮ型糖鎖修飾を受けていない、（１）又は（２）に記載のＲＮａｓｅ１。
（４）Ｎ型糖鎖修飾可能部位である配列番号１の３４番目のアスパラギン残基がＮ型糖鎖修飾を受けていない、（１）〜（３）いずれかに記載のＲＮａｓｅ１。
（５）リボヌクレアーゼ活性を有する、（１）〜（４）いずれかに記載のＲＮａｓｅ１。
（６）ＲＮａｓｅ１のＮ型糖鎖修飾可能部位にＮ型糖鎖が付加していない場合にＲＮａｓｅ１に結合可能な抗体と、試料とを接触させ、次いで抗体に結合したＲＮａｓｅ１を分離することを特徴とする、（１）〜（５）いずれかに記載のＲＮａｓｅ１を分離する方法。
（７）Ｎ型糖鎖が付加していないＮ型糖鎖修飾可能部位が、配列番号１の８８番目のアスパラギン残基である、（６）に記載の方法。
（８）Ｎ型糖鎖が付加していないＮ型糖鎖修飾可能部位が、配列番号１の７６番目のアスパラギン残基である（６）又は（７）に記載の方法。
（９）Ｎ型糖鎖が付加していないＮ型糖鎖修飾可能部位が、配列番号１の３４番目のアスパラギン残基である、（６）〜（８）いずれかに記載の方法。
（１０）上述の（１）〜（５）いずれかに記載のＲＮａｓｅ１を含有する医薬品組成物。
（１１）上述の（１）〜（５）いずれかに記載のＲＮａｓｅ１を含有する体外診断薬。
【０００９】
以下に本発明を更に詳細に説明する。
【００１０】
本発明のＲＮａｓｅ１は、３か所あるＮ型糖鎖修飾可能部位の１つ以上の部位でＮ型糖鎖が付加していない状態のＲＮａｓｅ１である。そのＮ型糖鎖が付加していない部位は、Ａｓｎ３４，Ａｓｎ７６，Ａｓｎ８８のいずれか１つ以上である。このようなＲＮａｓｅ１はリボヌクレアーゼ活性を有することが好ましい。リボヌクレアーぜ活性を有するということは、ＲＮａｓｅ１が生理的条件下での３次元構造を有していることを意味し、即ち生体内に存在するＲＮａｓｅ１と同等の３次元構造を有することを意味する。
【００１１】
本発明のＲＮａｓｅ１は、抗体を用いたアフィニティ精製法により得ることができる。具体的には、ＲＮａｓｅ１のＮ型糖鎖修飾可能部位にＮ型糖鎖が付加していない場合にＲＮａｓｅ１と結合できる抗体を試料と接触させ、次いで抗体に結合したＲＮａｓｅ１を分離すればよい。このとき用いられる抗体は、特に限定されないが、Ａｓｎ８８に糖鎖が付加していないＲＮａｓｅ１を分離する場合は、Ａｓｎ８８に糖鎖が付加していないＲＮａｓｅ１に特異的に結合する抗ＲＮａｓｅ１抗体を使用すればよく、例えば抗体ＲｒｈＲＮ０７２３を使用することが好ましい（特許文献１参照）。同様に、Ａｓｎ７６に糖鎖が付いていないＲＮａｓｅ１に結合する抗ＲＮａｓｅ１抗体、又はＡｓｎ３４糖鎖が付いていないＲＮａｓｅ１に結合する抗ＲＮａｓｅ１抗体を使用することで、それぞれＡｓｎ７６又はＡｓｎ３４に糖鎖が付加していないＲＮａｓｅ１を結合し、次いで分離することが可能である。
【００１２】
このアフィニティ精製を行う場合、適宜基材、吸着液、溶離液等を用いることができる。なお、このようなアフィニティ精製により得られた本発明のＲＮａｓｅ１は、リボヌクレアーゼ活性を有するものである。
【００１３】
また本発明のＲＮａｓｅ１は、医薬品組成物や体外診断薬として使用できる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ＲＮａｓｅ１の糖鎖修飾可能部位のうち１つ以上が糖鎖修飾をうけていないＲＮａｓｅ１を得ることができる。またそのようなＲＮａｓｅ１は、本発明の方法によって簡便に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１のＣａｐａｎ−１由来ＲＮａｓｅ１とＣＨＯ−Ｋ１由来ＲＮａｓｅ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色結果を示す図である。
【図２】実施例２でＲＮａｓｅ１を発現する細胞株培養上清からＲＮａｓｅ１を精製するスキームを示す図である。
【図３】実施例２で、ＲｒｈＲＮ０７２３抗体を固定化したＨｉＴｒａｐカラムを使用してＲＮａｓｅ１を分離した各フラクションを、２つの免疫学的測定法で測定した結果を示す図である。
【図４】実施例３で行った、精製されたＲＮａｓｅ１の定量的酵素活性測定の結果を示す図である。
【図５】ＲＮａｓｅ１の変性処理が、酵素活性に与える影響を示した図である。
【実施例】
【００１６】
［実施例１］  膵臓癌由来培養細胞Ｃａｐａｎ−１細胞株およびＲＮａｓｅ１遺伝子安定導入ＣＨＯ−Ｋ１細胞株が分泌するＲＮａｓｅ１の精製
培養細胞由来のＲＮａｓｅ１を得るために、膵臓癌から樹立された細胞株Ｃａｐａｎ−１と、組換え体ＲＮａｓｅ１を培地中に分泌するＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用した。組換え体ＲＮａｓｅ１を培地中に分泌するＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＲＮａｓｅ１の遺伝子全長（配列番号１）をＳＶ４０プロモーター以下に組み込んだ哺乳動物発現ベクターを、常法に従ってＣＨＯ−Ｋ１細胞に遺伝子導入することによって得た。Ｃａｐａｎ−１細胞と、組換え体ＲＮａｓｅ１分泌ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、それぞれ３００〜５００ｎｇ／ｍｌ／週、２００〜５００ｎｇ／ｍｌ／週のＲＮａｓｅ１を発現することから、発現量に極めて大きな差は無いことが確認できた。
【００１７】
Ｃａｐａｎ−１細胞の培養上清と、組換え体ＲＮａｓｅ１分泌ＣＨＯ−Ｋ１細胞培養上清それぞれから、ＲＮａｓｅ１をアフィニティー精製した。このとき、糖鎖修飾の有無に依存しないで結合する抗ＲＮａｓｅ１抗体ＭｒｈＲＮ０６１４抗体を共有結合で固定化したＨｉＴｒａｐカラムを使用した（特許文献１参照）。図１に精製されたＲＮａｓｅ１をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色法によって分析した結果を示す。図１から明らかなように、Ｃａｐａｎ−１から分泌されたＲＮａｓｅ１については、糖鎖修飾数０，１，２は明瞭なバンドであったが、糖鎖修飾数３はスメア（ｓｍｅａｒ）なバンドであった。またＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現させた組換え体ＲＮａｓｅ１については、糖鎖修飾数０，１は明瞭なバンドであったが、糖鎖修飾数２以上はスメアなバンドであった。
【００１８】
次に、このアフィニティ精製された試料に含まれる総ＲＮａｓｅ１量を、糖鎖修飾に依存しないで結合する２種類の抗ＲＮａｓｅ１抗体（ＭｒｈＲＮ０６１４抗体とＲｒｈＲＮ１１１１抗体）を使用した免疫学的測定法（以下、Ｒ１１１１測定と記載する）によって測定した。また、ＭｒｈＲＮ０６１４抗体と、Ａｓｎ８８に糖鎖が付加していない場合にＲＮａｓｅ１に結合する抗ＲＮａｓｅ１抗体ＲｒｈＲＮ０７２３とを使用した免疫学的測定法（以下、Ｒ０７２３測定と記載する）によって、Ａｓｎ８８に糖鎖が付加していないＲＮａｓｅ１（Ａｓｎ８８糖鎖未修飾ＲＮａｓｅ１）量を測定した。
【００１９】
以下に、上記の抗体を用いて構築した免疫測定系の測定試薬の調製法、評価方法を示す。水不溶性担体（内部にフェライトを練り込んだ粒子径約１．５ｍｍのＥＶＡ製）にＭｒｈＲＮ０６１４を９０ｎｇ／担体となるよう物理的に吸着させ、吸着後ＢＳＡを用いてブロッキング処理を行った。水不溶性担体については、１個当たり約１００ｎｇの蛋白質を物理的に吸着可能である。磁力透過性の容器（容量１．２ｍｌ）に１２個の担体を入れた後、０．５μｇ／ｍＬのアルカリ性フォスファターゼ標識を施した抗体ＲｒｈＲＮ０７２３または０．５μｇ／ｍＬのアルカリ性フォスファターゼ標識を施した抗体ＲｒｈＲＮ１１１１を含む緩衝液（１％  ＢＳＡ、２．５％デキストラン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０，２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４）を加え、凍結乾燥した。この試薬を市販の全自動免疫測定装置（東ソー（株）製、商品名ＡＩＡ−６００ＩＩ）を用いて全自動で測定を行った。即ち、前述の試薬に測定サンプルを１５０μＬ加え、水不溶性担体を３７℃で１０分間磁石を用いて運動させ、混合液を攪拌した状態で免疫反応させた。反応後、Ｂ／Ｆ分離操作を行って遊離の標識抗体を分離除去し、アルカリ性フォスファターゼの基質である４−メチルウンベリフェリルリン酸を加え、該基質添加後２０秒から２９５秒までの酵素反応分解物（４−メチルウンベリフェロン）の単位時間あたりの生成速度（ｎＭ／秒）を測定した。
【００２０】
この免疫学的測定法によって、Ｃａｐａｎ−１細胞および組換え体ＲＮａｓｅ１分泌ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養上清から精製された総ＲＮａｓｅ１量、Ａｓｎ８８糖鎖未修飾ＲＮａｓｅ１量、Ａｓｎ８８糖鎖未修飾率を表１に示す。Ｃａｐａｎ−１が分泌するＲＮａｓｅ１では約４４％が糖鎖修飾可能部位Ａｓｎ８８に糖鎖が付加しておらず、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に安定発現させた組換え体ＲＮａｓｅ１では約７９％が糖鎖修飾可能部位Ａｓｎ８８に糖鎖が付加していないことが明らかになった。従って、糖鎖修飾可能部位Ａｓｎ８８に糖鎖が付加していないＲＮａｓｅ１を得るには、ＣＨＯ−Ｋ１細胞で発現したＲＮａｓｅ１から精製することが効率的であることが明らかとなった。
【００２１】
【表１】
2015156821.tif 000003
［実施例２］  組換え体ＲＮａｓｅ１分泌ＣＨＯ−Ｋ１細胞から分泌された、Ａｓｎ８８糖鎖未修飾ＲＮａｓｅ１の精製
実施例１の組換え体ＲＮａｓｅ１分泌ＣＨＯ−Ｋ１細胞培養上清を精製の出発材料として、図２の精製スキームに従って組換え体ＲＮａｓｅ１を精製した。各精製の段階で、実施例１で示した免疫学的測定法によって、試料に含まれる総ＲＮａｓｅ１量とＡｓｎ８８糖鎖未修飾ＲＮａｓｅ１量を測定した。
【００２２】
まず５１５μｇ／Ｌの濃度で組換え体ＲＮａｓｅ１を含む細胞培養上清１Ｌを、糖鎖修飾の有無に依存しないで結合する抗ＲＮａｓｅ１抗体ＭｒｈＲＮ０６１４抗体を共有結合で固定化したＨｉＴｒａｐカラムを使用して、アフィニティー精製した。このとき、カラムへの吸着は、ＲＮａｓｅ１を含む細胞培養上清のｐＨを中性に調整した上で行い、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄したのち、酸性の溶離液であるＩｇＧ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ  ２．８、サーモサイエンティフィック社）を使用して溶出した。精製して得られた組換え体ＲＮａｓｅ１（ＭｒｈＲＮ０６１４結合画分）は、４４０μｇ（回収率８５％）であった。
【００２３】
ＭｒｈＲＮ０６１４抗体固定化カラムで精製されたＭｒｈＲＮ０６１４結合画分のうち、総ＲＮａｓｅ１量で１００μｇ相当の試料をさらにＡｓｎ８８糖鎖未修飾ＲＮａｓｅ１に特異的に結合する抗ＲＮａｓｅ１抗体ＲｒｈＲＮ０７２３抗体を共有結合で固定化したＨｉＴｒａｐカラムを使用して、分離した。このとき、カラムへの吸着は、精製されＰＢＳにバッファー置換したＲＮａｓｅ１を含む試料を用いて行い、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄したのち、酸性の溶離液であるＩｇＧ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ  ２．８、サーモサイエンティフィック社）を使用して溶出した。非結合（素通り・洗浄）画分と結合（溶出）画分をそれぞれ１０画分に分けて回収し、各画分について、Ｒ１１１１測定法とＲ０７２３測定法で総ＲＮａｓｅ１量とＡｓｎ８８糖鎖未修飾ＲＮａｓｅ１量を測定した。結果を図３に示す。非結合画分、結合画分共にＲ１１１１測定法でＲＮａｓｅ１が検出された。これに対しＲ０７２３測定法では、結合画分のみ検出された。従って、非結合画分にはＡｓｎ８８に糖鎖が付加したＲＮａｓｅ１が回収され、結合画分にはＡｓｎ８８糖鎖未修飾ＲＮａｓｅ１が回収されたことが確認された。即ち、Ａｓｎ８８に糖鎖が付加していないＲＮａｓｅ１に特異的に結合する抗ＲＮａｓｅ１抗体を固定化したアフィニティー精製カラムを使用することで、Ａｓｎ８８糖鎖未修飾ＲＮａｓｅ１を特異的に精製することが可能であることが示された。
【００２４】
［実施例３］  各種変性処理を施したＲＮａｓｅ１の酵素活性の測定
ＲＮａｓｅ１酵素活性は、特開２００９−５４１３３３号公報を参考にして合成したＲＮａｓｅ１活性測定基質（５‘ＦＡＭ−ＡｒＵＡＡ−３‘ＢＨＱ１）を使用して測定した。具体的には、高純度に精製された濃度既知のＲＮａｓｅ１から、１０μｌあたり１〜２５００ｐｇのＲＮａｓｅ１を含むように希釈されたＲＮａｓｅ１溶液と、ＲＮａｓｅ１活性測定基質を含む４０μｌの活性検出溶液（５０ｐｍｏｌ基質、２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ  ７．２）、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ）を混合して２５℃で１５分間反応させ、反応液の蛍光強度（励起波長；４９０ｎｍ、蛍光波長；５２０ｎｍ）を蛍光検出器で測定した。検出された蛍光強度が、反応液中のＲＮａｓｅ１量依存的に増加することから、このＲＮａｓｅ１活性測定基質を使用した測定方法により、ＲＮａｓｅ１酵素活性を定量的に測定が可能であることが示された。反応液中のＲＮａｓｅ１量が４０ｐｇ〜２５００ｐｇの場合に、上記の測定方法で定量的な測定が可能であった（図４）。
【００２５】
次に、精製されたＲＮａｓｅ１（ＭｒｈＲＮ０６１４結合画分）を、表２に記載の前処理をしたときの相対ＲＮａｓｅ１酵素活性を測定した。結果を表２、図５に示す。ここでは還元剤未添加、３７℃で前処理した時の値を１００％として相対値で示した。３７℃で処理したＲＮａｓｅ１は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の添加濃度依存的に酵素活性が低下するが、１００ｍＭ添加しても完全には酵素活性を失わないことが確認できた。また還元剤が未添加では、１００℃で加熱しても完全には酵素活性を失わないが、還元剤の存在下では、１００℃で加熱することにより、完全に酵素活性が失われることが確認できた。
【００２６】
また実施例２において抗ＲＮａｓｅ１抗体ＲｒｈＲＮ０７２３を用いて精製された各画分の酵素活性を前述と同様に測定すると、非結合画分、結合画分ともに酵素活性が検出された。
【００２７】
【表２】
2015156821.tif 000004
【図１】
2015156821.tif 000005
【図２】
2015156821.tif 000006
【図３】
2015156821.tif 000007
【図４】
2015156821.tif 000008
【図５】
2015156821.tif 000009
【配列表】
2015156821000001.app