(57)【要約】【課題】従来の浮遊ウイルス検出技術における表面増強ラマン分光測定法による検出では、表面増強ラマン散乱を発生させるために励起するプラズモン共鳴における電場増強領域に測定対象が存在するため、検出感度が向上する。しかし、抗体のサイズが大きく、抗体と検出対象である抗原が結合する領域が電場増強領域に存在しない。このため、表面増強ラマン散乱現象を利用した高感度検出は難しかった。【解決手段】空気中を浮遊するウイルスを検出する装置であって、表面増強ラマン散乱を発生させる構造を有する検出領域と、この検出領域に固定化された、ウイルス、およびウイルス構成成分の被検出物質と結合する断片化抗体と、断片化抗体と被検出物質とが複合体を形成し、その複合体に光を照射する光照射部と、光照射部が照射した光により得られる被検出物質特有のシグナルを検出する光検出部と、を備える。【選択図】図２
2015178993.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
空気中を浮遊するウイルスを検出する装置であって、
表面増強ラマン散乱を発生させる構造を有する検出領域と、
前記検出領域に固定化された、ウイルス、およびウイルス構成成分の被検出物質と結合する断片化抗体と、
前記断片化抗体と前記被検出物質とが複合体を形成し、その複合体に光を照射する光照射部と、
前記光照射部が照射した光により得られる前記被検出物質特有のシグナルを検出する光検出部と、
を備えるウイルス検出装置。
【請求項２】
空気中を浮遊するウイルスを検出する装置であって、
前記ウイルス、およびウイルス構成成分の被検出物質を結合する断片化抗体は、Ｆ（ａｂ‘）２、あるいは、Ｆａｂ’、あるいは、Ｆａｂである
請求項１に記載のウイルス検出装置。
【請求項３】
空気中を浮遊するウイルスを検出する装置であって、
前記ウイルス、およびウイルス構成成分の被検出物質を結合する断片化抗体は、前記検出領域に直接固定化されている、あるいは、リンカー材料を介して間接的に固定化されている
請求項１または２に記載のウイルス検出装置。
【請求項４】
前記リンカー材料は、一方の末端がカルボキシル基でもう一方の末端がチオール基またはアミノ基であるアルキル鎖であり、鎖長が６以下であるアルキル鎖である
請求項３記載のウイルス検出装置。
【請求項５】
請求項１から４の何れかに記載のウイルス検出装置と
空気中を浮遊するウイルスを空気と供に吸引、液体中又は固体上に捕集する装置をさらに備えたウイルス検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、空気中を浮遊するウイルス等の病原体を捕集して検出する、浮遊ウイルスの検出方法及び装置に関する。本発明により、空気中を浮遊するウイルス等の病原体を捕集し、当該空気中に含まれるウイルス等の病原体の濃度を、蛍光分光法、表面増強ラマン散乱分光法、抗原抗体反応を利用した免疫クロマトデバイス等により計測することで、空気中を浮遊するウイルスの濃度を計測することができる。
【背景技術】
【０００２】
空気中を浮遊するウイルス等の病原体を捕集する技術としては、例えば、ウイルス等を捕集可能なフィルターに空気を流した後、抽出液を用いて当該フィルターに捕集されたウイルス等を抽出液中に抽出する技術が開示されている（例えば、特許文献１参照）。また、ウイルス等を、サイクロン効果を利用して直接液体に衝突させて、液体中にウイルス等を捕集する技術が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００３】
なお、空気中を浮遊しているウイルスは、ウイルス単体で浮遊している訳ではなく、他の浮遊している微粒子に付着して、又は人が放出する飛沫等に含まれて浮遊していることが知られている。
【０００４】
また、人の咳、くしゃみによって、体液に含まれているウイルスが放出されるが、体液は放出後瞬時に乾燥して、飛沫核になる。このウイルスを含んだ飛沫核の直径は、約１（μｍ）で、空気中を浮遊する。（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００５】
空気中に含まれるウイルス等の病原体を捕集し、当該空気中に含まれる病原体の濃度が、例えば、蛍光分光法、表面増強ラマン散乱分光法等により測定される。
【０００６】
従来、蛍光分光法、表面増強ラマン散乱法等の光学計測技術は様々な応用に用いられており、例えば、蛍光分光法を用いて空気中の細菌、カビ等の病原体の濃度を測定する技術が開示されている（例えば、特許文献３参照）。蛍光分光法を用いることにより、空気中の病原体の濃度を消耗品である試薬、試験紙片及び酵素などを不要にし、さらにはそれらの消耗品の使用前の保存安全性や使用後の廃棄の問題、誤差を生じる原因となる煩雑な操作や他の成分による干渉作用などの問題をなくし、定量測定することができる。
【０００７】
表面増強ラマン分光測定方法としては、分析対象物質と量論関係をなすウイルス等を特異的に捕捉する抗体等のラマン活性物質を、貴金属で形成されたナノメートル程度の構造からなる表面増強ラマン散乱を発生させる基板上にて共存させ、そのナノ構造上で発生する局在化表面プラズモンによる増強電場によって発生する表面増強ラマン散乱を測定する技術が開示されている（例えば、非特許文献２参照）。本技術によると、表面増強ラマン散乱を近赤外領域の光の波長を用いて高効率で励起でき、近赤外領域の光で励起することにより、近赤外領域においてラマン分光法によって分析することにより、分析対象物が含有されるマトリックス中のきょう雑物の光吸収や蛍光といった影響を排除して、分析対象物の検出において特異性・選択性を向上させることが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１２−５２８６５号公報
【特許文献２】特開２０１２−５２８６６号公報
【特許文献３】特表２０１３−５２０６３９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】西村秀一、阪田総一郎、“くしゃみ咳によるエアロゾル粒子中のインフルエンザウィルスの活性と空調”、冷凍２０１０年５月号第８５巻第９９１号
【非特許文献２】Ｒａｌｐｈ  Ａ．  Ｔｒｉｐ，  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．  Ｄｌｕｈｙ，  Ｙｉｐｉｎｇ  Ｚｈａｏ，  ”Ｎｏｖｅｌ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ＳＥＲＳ  ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ”，  Ｎａｎｏ  ｔｏｄａｙ，  Ｖｏｌ．  ３，  Ｎｕｍｂｅｒ  ３−４，  ３１−３７  （２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上述した従来の浮遊ウイルス検出技術における表面増強ラマン分光測定法による検出の場合、表面増強ラマン散乱を発生させるために励起するプラズモン共鳴における電場増強領域に測定対象が存在することにより検出感度の向上が得られる。しかしながら、抗体のサイズが大きいため、抗体と検出対象である抗原が結合する領域が前記電場増強領域に存在しないため、表面増強ラマン散乱現象を利用した高感度検出は難しかった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、空気中を浮遊するウイルスを検出する装置であって、表面増強ラマン散乱を発生させる構造を有する検出領域と、前記検出領域に固定化された、ウイルス由来の被検出物質と結合する断片化抗体と、前記断片化抗体と前記被検出物質とが複合体を形成し、その複合体に光を照射する光照射部と、前記光照射部が照射した光により得られる前記被検出物質特有のシグナルを検出する光検出部と、を備えるウイルス検出装置。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は空気中を浮遊するウイルスを検出する技術で、表面増強ラマン分光測定法による検出の場合に、抗体のサイズを断片化することにより小さくすることで、表面増強ラマン散乱現象を利用した高感度検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明に係る浮遊ウイルスの捕集方法及び検出装置のセンサデバイスの概略構成を示すブロック図
【図２】本発明に係る浮遊ウイルスの検出方法及び検出部の概略構成を示すブロック図
【図３】本発明に係る浮遊ウイルスの検出方法及び装置の検出領域詳細構成を示すブロック図
【図４】断片化抗体Ｆａｂ’をプラズモン共鳴の発生するナノ構造が設けられた基板に固定化したときの表面増強ラマン散乱光の測定結果を示したグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態に関して図１、２、３を用いて詳細に説明する。
【００１５】
（実施の形態）
図１は、本発明の実施の形態１における浮遊ウイルスの捕集方法及び装置１００の概略構成を示すブロック図である。装置１００は、人が出入りする部屋に設置されている。１０１は、空気吸入口で、周辺の雰囲気空気を吸入する。１０２は周辺の雰囲気空気中を浮遊するウイルスを含んだ微粒子で、空気吸入口１０１より吸入される。１０３はフィルターで、約１０（μｍ）以上の粒子は透過できない。１０４は、吸入した空気中を浮遊するウイルスを含んだ微粒子を捕集する捕集液体である。１０５は、フィルター１０３を透過した空気を捕集液体１０４へ導く空気流路である。
【００１６】
１０６は、捕集液体１０４を保持する捕集液体保持容器、１０７は捕集液体保持容器１０６内の空気を外部に導く空気流路である。１０８は空気ポンプで、空気流路１０７を介して捕集液体保持容器１０６内の空気を外部へ排気することで、空気流路１０５を介して周辺の雰囲気空気を吸入し捕集液体１０４へ導く。空気ポンプ１０８の駆動力を調整して、吸入空気速度を制御することができる。
【００１７】
１１０は、ウイルスを捕集した捕集液体１０４を、ウイルスを計測するセンサデバイス１１１に導く液体流路。１１２は、液体ポンプで、所定体積の捕集液体１０４をサンプル液体１１３としてセンサデバイス１１１に供給する。
【００１８】
センサデバイス１１１は、ウイルスと反応する試薬又はこの試薬を担持したセンサセル１２０を具備している。ここで、センサセルはセンサデバイスに複数あってもよい。さらに、前記ウイルスとの反応を光源１１６により発せられた光１１９がセンサセル１２０に照射され、センサセル１２０より帰還した光１１９をビームスプリッタ１１７で取り出し、光検出部１１８により、光１１９を分光し、検出することにより電気信号に変換して、ウイルス量に相当する信号を出力する。本実施の形態でのセンサデバイス１１１は、所定体積＝１ｍｌのサンプル液体１１３中のウイルスの個数＝１０３〜１０６（個）の範囲を計測できる。また、光検出部１１８には、簡単のため、光１１９を分光するための装置に関しては図示していない。本実施の形態では、ウイルス量を光学的に検出するために、表面増強ラマン分光法を利用することができる。ここで、光源１１６は公知の技術を特に限定することなく利用することができる。例えば半導体レーザ、ガスレーザ等のレーザを利用することができる。さらに、液体中のウイルスを測定するため、ウイルスに含まれる物質と相互作用が小さい波長を照射する光源を利用することが好ましい。例えば、４００〜２０００ｎｍ程度の波長で、水、あるいは、ウイルス構成物質と相互作用が少ない波長が好ましい。さらには、６５０ｎｍ、７８５ｎｍ、８３０ｎｍといった半導体レーザが利用できる波長が好ましい。光検出部１１８は、光１１９を分光し、検出できるものであれば公知の技術を特に限定無く利用することができる。例えば、光１１９を分光するために特定の波長を透過させる干渉フィルター、回折格子を用いて分光するツェルニー型分光器、エシェル型分光器等を利用することができる。さらには、光検出部１１８に光１１９を導入する前に光源１１６からの光を除去するためのノッチフィルター、あるいは、光源１１６からの光を透過させず、かつ、センサセル１２０で発生した表面増強ラマン散乱光を透過させることができるロングパスフィルターを利用することができる。
【００１９】
１０９は、装置全体の動作を制御するコントローラーである。コントローラー１０９は、測定の開始を制御し、かつ、捕集液体１０４をセンサデバイス１１１に供給するように、空気ポンプ１０８と液体ポンプ１１２を制御し、さらには、光源１１６、光検出部１１８を制御する。本コントローラー１０９に各種パラメーターを入力することで、予め設定された条件で、各ポンプを制御して所定体積の捕集液体１０４をセンサデバイス１１１に供給することができる。さらに、本コントローラー１１４に計時機能も有しており、各動作に要した時間情報を発生及び記憶することもできる。またセンサデバイス１１１の計測値を受信して、前記計測値と前記時間情報から浮遊するウイルスの濃度を算出する機能も有する。
【００２０】
図２は、本発明の実施の形態に係る検出部１２１の概略を示している。検出部１２１は、光源１１６、光源１１６から照射された光を集光し、検出領域１２２に結像させるレンズ１２３、検出領域１２２で発生した表面増強ラマン散乱光を光検出部１１８に導くビームスプリッタ１１７、および、検出領域１２２で発生した表面増強ラマン散乱光を分光し、検出する光検出部１１８を備えている。レンズ１２３は、公知の技術を特に限定無く利用することができる。ここで、センサセル１２０は、ウイルス、または、ウイルス構成成分を含むサンプル液体１１３が通る流路１２４、ウイルス、および、ウイルス構成成分を測定する領域である検出領域１２２を備えている。このようにすることにより、ウイルス、および、ウイルス構成成分の検知が正確に行うことができる。ここで、ウイルスとは、種類を特に限定するものではなく、一般にウイルスと分類される対象を測定することができる。また、ウイルス構成成分とは、前記ウイルスを構成する成分であれば特に限定されない。ウイルス構成成分として、ウイルス構成するタンパク質、核酸を測定することが好ましい。
【００２１】
図３は、本発明に係る浮遊ウイルスの検出方法及び装置の検出領域詳細構成を示すブロック図である。検出領域１２２には、表面増強ラマン散乱法を利用する場合には、プラズモン共鳴を発生するナノ構造が設けられている（図示せず）。本ナノ構造は、さらに、金、銀、銅等の貴金属で作製されていることが好ましい。ナノ構造をこのように作製することにより、ウイルス、および、ウイルス構成成分と反応する試薬の担持が容易に実施できる。また、前記検出領域１２２の基板表面にはウイルス、およびウイルス構成成分の被検出物質１２５と結合する断片化抗体１２６が固定化されている。ここで、断片化抗体１２６とは、ウイルス構成成分と結合する領域が保存されていれば、特に限定されるものではなく、Ｆ（ａｂ’）２であっても、Ｆａｂ’であっても、Ｆａｂであってもよい。これら断片化抗体をナノ構造に担持する際には、結合能を保持している限りは検出領域に直接固定化されていても、リンカー材料を介して間接的に固定化されていてもよい。リンカー反応を利用する場合、例えば、ＥＤＣ−ＮＨＳ反応といった反応を利用することができる。
【００２２】
（実施例１）
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これら実施例は、本発明を何ら制限するものではない。
【００２３】
まず、断片化抗体の作製方法に関して具体的に説明する。全抗体ＩｇＧをｐＨ４．４の酢酸ナトリウム水溶液に溶解する。また、同溶媒で平衡化したペプシン保持ビーズに前記抗体溶液を加えた後、攪拌しながら３７度の恒温槽内で抗体とペプシンを反応させる。この際の反応時間は抗体の量及び抗体種に依存する。例えば、ｍｏｕｓｅの抗体でＩｇＧ  １ｍｇ／ｍｌであれば、約３０分から１時間ぐらい反応させる。反応液を回収後、Ｎａｂ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｐｌｕｓ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、８９９５６）を用いて精製し、未反応抗体を除去すると、Ｆ（ａｂ’）２を得ることができる。このＦ（ａｂ’）２を断片化抗体として用いてもよい。また、続いてＦａｂ‘を得るために還元化反応を行う。前記断片化抗体Ｆ（ａｂ’）２をＥＤＴＡ含有ＰＢＳバッファーに溶解し、前記断片化抗体液に２−メルカプトエチルアミン塩酸塩溶液（終濃度５０ｍＭ）を加えて３７度の恒温槽内で攪拌させながら反応させる。このとき、ＥＤＴＡの濃度は２−１０ｍＭの範囲であればよく、反応時間は９０分で十分であるがそれ以上でもよい。本実施例においては、ＥＤＴＡ濃度１０ｍＭ、反応時間は９０分であった。反応液を回収して、Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、４３２４０）を用いて精製することにより、２−メルカプトエチルアミン塩酸塩を除去し、Ｆａｂ’を得ることが出来る。このＦａｂ’を断片化抗体として用いてもよい。
図４は、前記断片化抗体Ｆａｂ’をプラズモン共鳴の発生するナノ構造が設けられた基板に固定化し、前記断片化抗体と相互作用する抗原と反応させた場合及び反応させなかった場合に表面増強ラマン散乱光を測定した結果を示したグラフである。図４に示すように、９９０ｃｍ−１のあたりに注目すると、抗原の有無により変化が生じていることから、前記断片化抗体との結合性に関して表面増強ラマン散乱現象を用いて測定できたことがわかった。
【００２４】
（実施例２）
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これら実施例は、本発明を何ら制限するものではない。
【００２５】
まず、断片化抗体の作製方法に関して具体的に説明する。全抗体ＩｇＧをｐＨ４．４の酢酸ナトリウム水溶液に溶解する。また、同溶媒で平衡化したペプシン保持ビーズに前記抗体溶液を加えた後、攪拌しながら３７度の恒温槽内で抗体とペプシンを反応させる。この際の反応時間は抗体の量及び抗体種に依存する。例えば、ｍｏｕｓｅの抗体でＩｇＧ  １ｍｇ／ｍｌであれば、約３０分から１時間ぐらい反応させる。反応液を回収後、Ｎａｂ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｐｌｕｓ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、８９９５６）を用いて精製し、未反応抗体を除去すると、Ｆ（ａｂ’）２を得ることができる。本実施例では、Ｆ（ａｂ’）２を断片化抗体として用いているが、Ｆａｂを断片化抗体として用いてもよい。
【００２６】
プラズモン共鳴の発生するナノ構造が設けられた基板にリンカー材料としては、一方の末端がカルボキシル基でもう一方の末端がチオール基であるカルボキシアルキルチオール、または、一方の末端がカルボキシル基でもう一方の末端がアミノ基であるカルボキシアルキルアミンを利用することができる。まず、前記リンカー材料をチオール基、または、アミノ基を介して前記検出領域に固定化する。その後、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等のカルボジイミド、および、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを利用することにより、活性エステルを生成する。その後、前記断片化抗体のアミノ基を介して前記リンカー材料に固定化する。リンカー材料としては、前記カルボキシアルキルチオール、または、カルボキシアルキルアミンのアルキル鎖が短いほうが表面増強ラマン散乱の増強度を大きくするという観点で好ましい。さらに、前記カルボキシアルキルチオール、または、カルボキシアルキルアミンを前記検出領域に稠密に固定化するという観点から、リンカー材料のアルキル鎖は３〜６であるリンカー材料が好ましい。例えば、５―メルカプトヘキサン酸を利用することができる。前記断片化抗体と相互作用する抗原と反応させた場合及び反応させなかった場合に表面増強ラマン散乱光を測定した結果は実施例１と同様であるため省略する。
【００２７】
以上の様に、本実施例は、空気中に浮遊しているウイルス及び、ウイルス構成成分を浮遊ウイルス検出技術における表面増強ラマン散乱法によって高感度に検出できることを可能とする。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明は、部屋に滞在している人へのウイルスの感染リスクを低減するために、部屋の空気中の浮遊するウイルス濃度を高感度に計測するために用いられる。
【符号の説明】
【００２９】
１００    浮遊ウイルス捕集装置
１０１    空気吸入口
１０２    微粒子
１０３    フィルター
１０４    捕集液体
１０５    空気流路
１０６    捕集液体保持容器
１０７    空気流路
１０８    空気ポンプ
１０９    コントローラー
１１０    液体流路
１１１   センサデバイス
１１２    液体ポンプ
１１３    サンプル液体
１１４    液体流路
１１５    液体ポンプ
１１６    光源
１１７    ビームスプリッタ
１１８    光検出部
１１９    光
１２０    センサセル
１２１    検出部
１２２    検出領域
１２３    レンズ
１２４    流路
１２５    被検出物質
１２６    断片化抗体
【図１】
2015178993.tif 000003
【図２】
2015178993.tif 000004
【図３】
2015178993.tif 000005
【図４】
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