(57)【要約】【課題】ＥＲ陽性の症例における乳癌術前化学療法に対する感受性およびＥＲ陰性の症例における乳癌術前化学療法に対する感受性の双方を精度よく判定することができる乳癌術前化学療法に対する感受性の診断補助方法を提供する。【解決手段】被験者から採取された検体から抽出されたＲＮＡを増幅し、測定用試料を調製し、当該測定用試料を用いて、所定の各遺伝子の発現量を測定し、前記発現量を解析した結果に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｉ−１）被験者から採取された検体からＲＮＡを含む測定用試料を調製する工程、
（Ｉ−２）前記工程（Ｉ−１）で得られた測定用試料を用い、下記（Ａ１）〜（Ａ１９）の遺伝子の発現量を測定する工程、
（Ａ１）ヒトのカスパーゼリクルートメントドメインファミリー、メンバー９（ＣＡＲＤ９）遺伝子、
（Ａ２）ヒトのインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）遺伝子、
（Ａ３）ヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）遺伝子、
（Ａ４）ヒトのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）遺伝子、
（Ａ５）ヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＸＣＬ１１）遺伝子、
（Ａ６）ヒトのＣＣＡＡＴ／エンハンサーバインディングプロテイン（ＣＥＢＰＢ）遺伝子、
（Ａ７）ヒトのＣＤ８３遺伝子、
（Ａ８）ヒトのインターロイキン６シグナルトランスデューサー（ＩＬ６ＳＴ）遺伝子、
（Ａ９）ヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃ）レセプター１（ＣＸ３ＣＲ１）遺伝子、
（Ａ１０）ヒトのＣＤ１Ｄ遺伝子、
（Ａ１１）ヒトのカテプシンＣ（ＣＴＳＣ）遺伝子、
（Ａ１２）ヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１０（ＣＸＣＬ１０）遺伝子、
（Ａ１３）ヒトの免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｇ１アイソタイプ（ＩＧＨＧ１）遺伝子、
（Ａ１４）ヒトのジンクフィンガーＥ−ボックス結合ホメオボックス１（ＺＥＢ１）遺伝子、
（Ａ１５）ヒトの血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）遺伝子、
（Ａ１６）ヒトのセマフォリン−３Ｃ前駆体（ＳＥＭＡ３Ｃ）遺伝子、
（Ａ１７）ヒトの補体レセプター（ＣＲ２）遺伝子、
（Ａ１８）ヒトのＨＦＥ遺伝子、
（Ａ１９）ヒトのＥＤＡ遺伝子、
（Ｉ−３）前記工程（Ｉ−２）で測定された前記各遺伝子の発現量を解析する工程、および
（Ｉ−４）前記工程（Ｉ−３）で得られた解析結果に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定する工程
を含む、乳癌術前化学療法に対する感受性の診断補助方法。
【請求項２】
（ＩＩ−１）被験者から採取された検体からＲＮＡを含む測定用試料を調製する工程、
（ＩＩ−２）前記工程（ＩＩ−１）で得られた測定用試料を用い、下記（Ｂ１）〜（Ｂ２３）のプローブによって検出される各核酸の発現量を測定する工程、
（Ｂ１）配列番号：１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２）配列番号：２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ３）配列番号：３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ４）配列番号：４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ５）配列番号：５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ６）配列番号：６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ７）配列番号：７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ８）配列番号：８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ９）配列番号：９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１０）配列番号：１０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１１）配列番号：１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１２）配列番号：１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１３）配列番号：１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１４）配列番号：１４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１５）配列番号：１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１６）配列番号：１６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１７）配列番号：１７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１８）配列番号：１８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１９）配列番号：１９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２０）配列番号：２０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２１）配列番号：２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２２）配列番号：２２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２３）配列番号：２３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（ＩＩ−３）前記工程（ＩＩ−２）で測定された前記各核酸の発現量を解析する工程、および
（ＩＩ−４）前記工程（ＩＩ−３）で得られた解析結果に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定する工程
を含む、乳癌術前化学療法に対する感受性の診断補助方法。
【請求項３】
前記発現量を、表１に記載されたプローブセットを用いて測定する請求項１または２に記載の方法。
【表１】
2015047101.tif 000011
【請求項４】
前記発現量の解析を、クラス分け手法を用いて行なう請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記発現量の解析において、前記発現量と、式（Ｉ）：
【数１】
2015047101.tif 000012
〔式中、ｉは表２に記載の各核酸に付与された番号を示し、ｗiは表２に記載された番号ｉの核酸の重み係数を示し、ｙiは式（ＩＩ）：
【数２】
2015047101.tif 000013
（式中、ｘiは表２に記載された番号ｉの核酸の発現量を示し、ｍiは表２に記載された番号ｉの核酸の発現量の検体に渡る平均値を示す）
で表わされる式にしたがって標準化された核酸の発現量を示し、Σiは各核酸に渡る総和を示す〕
で表わされる判別式とを用いて当該判別式の解Ｄを求め、
前記工程（Ｉ−４）または前記（ＩＩ−４）において、前記判別式の解Ｄが正の数であるとき、乳癌術前化学療法に対して感受性であり、解Ｄが０または負の数であるとき、乳癌術前化学療法に対して非感受性であると判定する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【表２】
2015047101.tif 000014
【請求項６】
前記検体が乳癌細胞を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記発現量が、マイクロアレイを用いて測定される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
被験者から採取された検体から調製されたＲＮＡを含む測定用試料における下記（Ａ１）〜（Ａ１９）の各遺伝子の発現量の情報を取得する取得部と、
前記取得部によって取得された各遺伝子の発現量の情報に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性の感受性を判定する判定部と、
前記判定部の判定結果を出力する出力部と、
を備えていることを特徴とする、乳癌術前化学療法に対する感受性の判定装置。
（Ａ１）ヒトのカスパーゼリクルートメントドメインファミリー、メンバー９（ＣＡＲＤ９）遺伝子、
（Ａ２）ヒトのインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）遺伝子、
（Ａ３）ヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）遺伝子、
（Ａ４）ヒトのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）遺伝子、
（Ａ５）ヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＸＣＬ１１）遺伝子、
（Ａ６）ヒトのＣＣＡＡＴ／エンハンサーバインディングプロテイン（ＣＥＢＰＢ）遺伝子、
（Ａ７）ヒトのＣＤ８３遺伝子、
（Ａ８）ヒトのインターロイキン６シグナルトランスデューサー（ＩＬ６ＳＴ）遺伝子、
（Ａ９）ヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃ）レセプター１（ＣＸ３ＣＲ１）遺伝子、
（Ａ１０）ヒトのＣＤ１Ｄ遺伝子、
（Ａ１１）ヒトのカテプシンＣ（ＣＴＳＣ）遺伝子、
（Ａ１２）ヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１０（ＣＸＣＬ１０）遺伝子、
（Ａ１３）ヒトの免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｇ１アイソタイプ（ＩＧＨＧ１）遺伝子、
（Ａ１４）ヒトのジンクフィンガーＥ−ボックス結合ホメオボックス１（ＺＥＢ１）遺伝子、
（Ａ１５）ヒトの血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）遺伝子、
（Ａ１６）ヒトのセマフォリン−３Ｃ前駆体（ＳＥＭＡ３Ｃ）遺伝子、
（Ａ１７）ヒトの補体レセプター（ＣＲ２）遺伝子、
（Ａ１８）ヒトのＨＦＥ遺伝子、および
（Ａ１９）ヒトのＥＤＡ遺伝子
【請求項９】
被験者から採取された検体から調製されたＲＮＡを含む測定用試料における下記（Ｂ１）〜（Ｂ２３）のプローブによって検出される各核酸の発現量の情報を取得する取得部と、
前記取得部によって取得された各遺伝子の発現量の情報に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性の感受性を判定する判定部と、
前記判定部の判定結果を出力する出力部と、
を備えていることを特徴とする、乳癌術前化学療法に対する感受性の判定装置。
（Ｂ１）配列番号：１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２）配列番号：２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ３）配列番号：３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ４）配列番号：４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ５）配列番号：５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ６）配列番号：６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ７）配列番号：７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ８）配列番号：８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ９）配列番号：９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１０）配列番号：１０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１１）配列番号：１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１２）配列番号：１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１３）配列番号：１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１４）配列番号：１４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１５）配列番号：１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１６）配列番号：１６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１７）配列番号：１７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１８）配列番号：１８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１９）配列番号：１９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２０）配列番号：２０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２１）配列番号：２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２２）配列番号：２２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、および
（Ｂ２３）配列番号：２３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌術前化学療法に対する感受性の診断補助方法および判定装置に関する。さらに詳しくは、本発明は、乳癌術前化学療法に対する感受性の診断を補助する情報の提供に有用な乳癌術前化学療法に対する感受性の診断補助方法および判定装置に関する。
【０００２】
近年、局所進行乳癌の手術の適応性を向上させることだけでなく、比較的腫瘍の大きな患者に対する乳房温存手術の適応性を向上させることを目的として、乳癌の術前化学療法を受ける患者の数が増加している。また、乳癌術前化学療法によって病理学的完全寛解（以下、「ｐＣＲ」ともいう）を得た場合、その患者の予後が良好であることが知られている。
【０００３】
現在、臨床上、タキサンおよびアンスラサイクリンを用いる逐次化学療法が多く実施されている。しかし、前記逐次化学療法のｐＣＲ率（ｐＣＲに至った症例数／化学療法を受けた全症例数）は、１０〜３０％であり、必ずしも高くはないのが現状である。また、エストロゲン受容体（以下、「ＥＲ」という）陽性の症例とＥＲ陰性の症例とを比べると、ＥＲ陰性の症例のほうが、ｐＣＲ率が高いことが報告されている。しかし、ＥＲ陰性を示す症例であっても、全ての症例が乳癌術前化学療法によってｐＣＲとなるとは限らない一方、ＥＲ陽性を示す症例であっても、乳癌術前化学療法によってｐＣＲとなることもある。そのため、ＥＲ陽性およびＥＲ陰性に基づく分類などによらず、乳癌術前化学療法に対する感受性を精度よく判定することができる方法が求められている。
【０００４】
乳癌術前化学療法に対する感受性を予測する方法として、例えば、被験者から採取された検体から抽出されたＲＮＡを用いて所定の遺伝子群の発現量を測定および解析して乳癌術前化学療法に対する感受性を判定する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、特許文献１に記載の方法では、測定対象の遺伝子群としてＥＲ遺伝子を含む遺伝子群が用いられている。
【０００５】
一方、非特許文献１には、ＤＮＡマイクロアレイを用いる網羅的遺伝子発現解析による遺伝子発現プロファイルから、ケモカインレセプター−３のシグナル伝達に関与する遺伝子群、ケモカインレセプター−５のシグナル伝達に関与する遺伝子群およびインターロイキン−８のシグナル伝達に関与する遺伝子群などがＥＲ陽性乳癌における化学療法応答性と関連していることが開示されているが、具体的に特定した遺伝子群を用いた感受性の予測判定については行われていない。
【０００６】
また、非特許文献２には、体液性免疫系を担うＢ細胞に関連する遺伝子群からなるＢ細胞メタジーンが、リンパ節転移陰性であって高増殖性の乳癌の予後因子であることが開示されている。そして、非特許文献３には、イムノグロブリンκＣ遺伝子の発現量が、Ｂ細胞メタジーンと相関するとともに、ＥＲ陰性乳癌におけるアンスラサイクリンを用いる化学療法に対する感受性の予測に有用であることが開示されている。
【０００７】
さらに、非特許文献４には、ＥＲ陰性の乳癌症例における予後マーカーとして免疫応答性に関連する７つの遺伝子（Ｃ１ＱＡ、ＸＣＬ２、ＳＰＰ１、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＬＹ９、ＩＧＬＣ２およびＨＬＡ−Ｆの各遺伝子）からなる遺伝子群が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０６５５３３号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】イワモト（Ｉｗａｍｏｔｏ  Ｔ）ら、「乳癌の分子サブタイプにおける予後および化学療法感受性に関連する遺伝子経路（Ｇｅｎｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．）」、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティチュート（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、２０１１年、第１０３巻、ｐ．２６４−２７２
【非特許文献２】シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ）ら、「体液性免疫機構は、リンパ節転移陰性乳癌における主要な予後的インパクトを有する（Ｔｈｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｈａｓ  ａ  ｋｅｙ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｍｐａｃｔ  ｉｎ  ｎｏｄｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．）」、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００８年、第６８巻、ｐ．５４０５−５４１３
【非特許文献３】シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ）ら、「ヒト遺伝子発現プロファイルの包括的分析は、ヒト固形腫瘍の適合性予後マーカーとして間質免疫グロブリンκＣを同定する（Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｋａｐｐａ  Ｃ  ａｓ  ａ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．）」、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１２年、第１８巻、ｐ．２６９５−２７０３
【非特許文献４】テッシェンドルフ（Ｔｅｓｃｈｅｎｄｏｒｆｆ  ＡＥ）ら、「免疫応答性遺伝子発現モジュールは、エストロゲン受容体陰性乳癌における良好な予後サブタイプを同定する（Ａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｇｏｏｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｉｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．）」、ゲノム・バイオロジー（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２００７年、第８巻、Ｒ１５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献１および非特許文献２〜４に記載の遺伝子や遺伝子群を用いて乳癌術前化学療法に対する感受性を予測した場合、後述するように、ＥＲ陽性およびＥＲ陰性に基づいて分類された被験者群の検体や、乳癌術前化学療法のレジメンに基づいて分類された被験者群の検体においては、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無の判定の信頼性が低くなる場合があることが本発明者らによって明らかにされている。
【００１１】
本発明は、ＥＲ陽性または陰性、化学療法のレジメンなどの被験者の背景によらず、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無の双方をより精度よく診断するための補助となる情報を提供することができる乳癌術前化学療法に対する感受性の診断補助方法および判定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
すなわち、本発明は、
〔１〕  （Ｉ−１）被験者から採取された検体からＲＮＡを含む測定用試料を調製する工程、
（Ｉ−２）前記工程（Ｉ−１）で得られた測定用試料を用い、下記（Ａ１）〜（Ａ１９）の遺伝子の発現量を測定する工程、
（Ａ１）ヒトのカスパーゼリクルートメントドメインファミリー、メンバー９（ＣＡＲＤ９）遺伝子、
（Ａ２）ヒトのインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）遺伝子、
（Ａ３）ヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）遺伝子、
（Ａ４）ヒトのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）遺伝子、
（Ａ５）ヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＸＣＬ１１）遺伝子、
（Ａ６）ヒトのＣＣＡＡＴ／エンハンサーバインディングプロテイン（ＣＥＢＰＢ）遺伝子、
（Ａ７）ヒトのＣＤ８３遺伝子、
（Ａ８）ヒトのインターロイキン６シグナルトランスデューサー（ＩＬ６ＳＴ）遺伝子、
（Ａ９）ヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃ）レセプター１（ＣＸ３ＣＲ１）遺伝子、
（Ａ１０）ヒトのＣＤ１Ｄ遺伝子、
（Ａ１１）ヒトのカテプシンＣ（ＣＴＳＣ）遺伝子、
（Ａ１２）ヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１０（ＣＸＣＬ１０）遺伝子、
（Ａ１３）ヒトの免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｇ１アイソタイプ（ＩＧＨＧ１）遺伝子、
（Ａ１４）ヒトのジンクフィンガーＥ−ボックス結合ホメオボックス１（ＺＥＢ１）遺伝子、
（Ａ１５）ヒトの血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）遺伝子、
（Ａ１６）ヒトのセマフォリン−３Ｃ前駆体（ＳＥＭＡ３Ｃ）遺伝子、
（Ａ１７）ヒトの補体レセプター（ＣＲ２）遺伝子、
（Ａ１８）ヒトのＨＦＥ遺伝子、
（Ａ１９）ヒトのＥＤＡ遺伝子、
（Ｉ−３）前記工程（Ｉ−２）で測定された前記各遺伝子の発現量を解析する工程、および
（Ｉ−４）前記工程（Ｉ−３）で得られた解析結果に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定する工程
を含む、乳癌術前化学療法に対する感受性の診断補助方法、
〔２〕  （ＩＩ−１）被験者から採取された検体からＲＮＡを含む測定用試料を調製する工程、
（ＩＩ−２）前記工程（ＩＩ−１）で得られた測定用試料を用い、下記（Ｂ１）〜（Ｂ２３）のプローブによって検出される各核酸の発現量を測定する工程、
（Ｂ１）配列番号：１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２）配列番号：２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ３）配列番号：３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ４）配列番号：４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ５）配列番号：５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ６）配列番号：６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ７）配列番号：７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ８）配列番号：８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ９）配列番号：９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１０）配列番号：１０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１１）配列番号：１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１２）配列番号：１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１３）配列番号：１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１４）配列番号：１４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１５）配列番号：１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１６）配列番号：１６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１７）配列番号：１７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１８）配列番号：１８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１９）配列番号：１９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２０）配列番号：２０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２１）配列番号：２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２２）配列番号：２２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２３）配列番号：２３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（ＩＩ−３）前記工程（ＩＩ−２）で測定された前記各核酸の発現量を解析する工程、および
（ＩＩ−４）前記工程（ＩＩ−３）で得られた解析結果に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定する工程
を含む、乳癌術前化学療法に対する感受性の診断補助方法、
〔３〕  前記発現量を、表１に記載されたプローブセットを用いて測定する前記〔１〕または〔２〕に記載の方法、
〔４〕  前記発現量の解析を、クラス分け手法を用いて行なう前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法、
〔５〕  前記発現量の解析において、前記各核酸の発現量と、式（Ｉ）：
【００１３】
【数１】
2015047101.tif 000002
【００１４】
〔式中、ｉは表２に記載の各核酸に付与された番号を示し、ｗiは表２に記載された番号ｉの核酸の重み係数を示し、ｙiは式（ＩＩ）：
【００１５】
【数２】
2015047101.tif 000003
【００１６】
（式中、ｘiは表２に記載された番号ｉの核酸の発現量を示し、ｍiは表２に記載された番号ｉの核酸の発現量の検体に渡る平均値を示す）
で表わされる式にしたがって標準化された核酸の発現量を示し、Σiは各核酸に渡る総和を示す〕
で表わされる判別式とを用いて当該判別式の解Ｄを求め、
前記工程（Ｉ−４）または前記（ＩＩ−４）において、前記判別式の解Ｄが正の数であるとき、乳癌術前化学療法に対して感受性であり、解Ｄが０または負の数であるとき、乳癌術前化学療法に対して非感受性であると判定する前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法、
〔６〕  前記検体が乳癌細胞を含む、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
〔７〕  前記発現量が、マイクロアレイを用いて測定される、前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
〔８〕  被験者から採取された検体から調製されたＲＮＡを含む測定用試料における前記（Ａ１）〜（Ａ１９）の各遺伝子の発現量の情報を取得する取得部と、
前記取得部によって取得された各遺伝子の発現量の情報に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性の感受性を判定する判定部と、
前記判定部の判定結果を出力する出力部と、
を備えていることを特徴とする、乳癌術前化学療法に対する感受性の判定装置、ならびに
〔９〕  被験者から採取された検体から調製されたＲＮＡを含む測定用試料における前記（Ｂ１）〜（Ｂ２３）のプローブによって検出される各核酸の発現量の情報を取得する取得部と、
前記取得部によって取得された各遺伝子の発現量の情報に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性の感受性を判定する判定部と、
前記判定部の判定結果を出力する出力部と、
を備えていることを特徴とする、乳癌術前化学療法に対する感受性の判定装置
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の乳癌術前化学療法に対する感受性の診断補助方法および判定装置によれば、ＥＲ陽性または陰性、化学療法のレジメンなどの被験者の背景によらず、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無の双方をより精度よく診断するための補助となる情報を提供することができるという優れた効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の一実施形態に係る乳癌術前化学療法に対する感受性の判定装置の概略説明図である。
【図２】図１に示された判定装置の機能構成を示すブロック図である。
【図３】図１に示された判定装置のハードウェア構成を示すブロック図である。
【図４】図１に示された判定装置を用いた乳癌術前化学療法に対する感受性の判定のフローチャートである。
【図５】実施例１において、プローブセット数と正確度との関係を調べた結果を示す。
【図６】実施例１において、トレーニングセットについて、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定結果と、病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【図７】実施例１において、バリデーションセットについて、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定結果と、病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【図８】実施例２において、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【図９】実施例３において、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【図１０】実施例４において、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【図１１】比較例１において、被験者群１−１〜１−６について、特許文献１の表１および表２に記載された７０個のプローブセットに対応する遺伝子の発現量を用いて得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【図１２】比較例１において、被験者群２−１〜２−３について、特許文献１の表１および表２に記載された７０個のプローブセットに対応する遺伝子の発現量を用いて得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【図１３】比較例１において、被験者群３−１〜３−５について、特許文献１の表１および表２に記載された７０個のプローブセットに対応する遺伝子の発現量を用いて得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【図１４】比較例２において、被験者群１−１〜１−６について、非特許文献２に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【図１５】比較例２において、被験者群２−１〜２−３について、非特許文献２に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【図１６】比較例２において、被験者群３−１〜３−５について、非特許文献２に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【図１７】比較例３において、被験者群１−１〜１−６について、非特許文献３に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【図１８】比較例３において、被験者群２−１〜２−３について、非特許文献３に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【図１９】比較例３において、被験者群３−１〜３−５について、非特許文献３に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【図２０】比較例４において、被験者群１−１〜１−６について、非特許文献４に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【図２１】比較例４において、被験者群２−１〜２−３について、非特許文献４に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【図２２】比較例４において、被験者群３−１〜３−５について、非特許文献４に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の乳癌術前化学療法に対する感受性の診断補助方法は、１つの側面では、
（Ｉ−１）被験者から採取された検体からＲＮＡを含む測定用試料を調製する工程、
（Ｉ−２）前記工程（Ｉ−１）で得られた測定用試料を用い、下記（Ａ１）〜（Ａ１９）の遺伝子の発現量を測定する工程、
（Ａ１）ヒトのカスパーゼリクルートメントドメインファミリー、メンバー９（ＣＡＲＤ９）遺伝子、
（Ａ２）ヒトのインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）遺伝子、
（Ａ３）ヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）遺伝子、
（Ａ４）ヒトのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）遺伝子、
（Ａ５）ヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＸＣＬ１１）遺伝子、
（Ａ６）ヒトのＣＣＡＡＴ／エンハンサーバインディングプロテイン（ＣＥＢＰＢ）遺伝子、
（Ａ７）ヒトのＣＤ８３遺伝子、
（Ａ８）ヒトのインターロイキン６シグナルトランスデューサー（ＩＬ６ＳＴ）遺伝子、
（Ａ９）ヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃ）レセプター１（ＣＸ３ＣＲ１）遺伝子、
（Ａ１０）ヒトのＣＤ１Ｄ遺伝子、
（Ａ１１）ヒトのカテプシンＣ（ＣＴＳＣ）遺伝子、
（Ａ１２）ヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１０（ＣＸＣＬ１０）遺伝子、
（Ａ１３）ヒトの免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｇ１アイソタイプ（ＩＧＨＧ１）遺伝子、
（Ａ１４）ヒトのジンクフィンガーＥ−ボックス結合ホメオボックス１（ＺＥＢ１）遺伝子、
（Ａ１５）ヒトの血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）遺伝子、
（Ａ１６）ヒトのセマフォリン−３Ｃ前駆体（ＳＥＭＡ３Ｃ）遺伝子、
（Ａ１７）ヒトの補体レセプター（ＣＲ２）遺伝子、
（Ａ１８）ヒトのＨＦＥ遺伝子、
（Ａ１９）ヒトのＥＤＡ遺伝子、
（Ｉ−３）前記工程（Ｉ−２）で測定された前記各遺伝子の発現量を解析する工程、および
（Ｉ−４）前記工程（Ｉ−３）で得られた解析結果に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定する工程
を含む方法である（以下、「診断補助方法１」ともいう）。
【００２０】
また、本発明の乳癌術前化学療法に対する感受性の診断補助方法は、他の側面では、
（ＩＩ−１）被験者から採取された検体からＲＮＡを含む測定用試料を調製する工程、
（ＩＩ−２）前記工程（ＩＩ−１）で得られた測定用試料を用い、下記（Ｂ１）〜（Ｂ２３）のプローブによって検出される各核酸の発現量を測定する工程、
（Ｂ１）配列番号：１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２）配列番号：２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ３）配列番号：３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ４）配列番号：４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ５）配列番号：５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ６）配列番号：６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ７）配列番号：７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ８）配列番号：８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ９）配列番号：９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１０）配列番号：１０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１１）配列番号：１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１２）配列番号：１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１３）配列番号：１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１４）配列番号：１４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１５）配列番号：１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１６）配列番号：１６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１７）配列番号：１７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１８）配列番号：１８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ１９）配列番号：１９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２０）配列番号：２０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２１）配列番号：２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２２）配列番号：２２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（Ｂ２３）配列番号：２３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするプローブ、
（ＩＩ−３）前記工程（ＩＩ−２）で測定された前記各核酸の発現量を解析する工程、および
（ＩＩ−４）前記工程（ＩＩ−３）で得られた解析結果に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定する工程
を含む方法である（以下、「診断補助方法２」ともいう）。
【００２１】
なお、以下において、「所定の核酸」は、前記（Ａ１）〜（Ａ１９）の遺伝子および前記（Ｂ１）〜（Ｂ２３）のプローブによって検出される各核酸を包含する概念である。また、以下において、「所定の核酸の発現量」は、前記（Ａ１）〜（Ａ１９）の遺伝子の発現量および前記（Ｂ１）〜（Ｂ２３）のプローブによって検出される各核酸の発現量を包含する概念である。
【００２２】
本発明の診断補助方法は、所定の核酸の発現量を測定し、解析するという操作が採用されているので、ＥＲ陽性の症例における乳癌術前化学療法に対する感受性の有無およびＥＲ陰性の症例における乳癌術前化学療法に対する感受性の有無の双方を精度よく判定することができる。したがって、本発明の診断補助方法によれば、得られた判定結果を診断支援情報として、診断を行なう者（医師など）に提供することにより、乳癌術前化学療法に対する感受性の診断を補助することができる。
【００２３】
本発明者らは、配列番号：１〜２３のそれぞれを標的とする表１に記載されたプローブセットを用い、当該プローブセットによって検出される各核酸の発現量を測定し、かかる発現量を網羅的に解析した結果に基づいて乳癌術前化学療法に対する感受性を評価した場合に、ＥＲ陽性およびＥＲ陰性に基づく分類や、乳癌術前化学療法のレジメンに基づく分類などによらず、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無を精度よく判定できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づき完成されたものである。
【００２４】
なお、本明細書において、「ポリヌクレオチドを標的とするプローブ」とは、当該ポリヌクレオチドの検出を目的として設計されたプローブをいう。通常、「ポリヌクレオチドを標的とするプローブ」は、当該ポリヌクレオチドの塩基配列の部分配列、または前記部分配列のうち１または数個のヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドの塩基配列と異なる配列からなる。また、本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行なう際に当業者が一般的に用いる条件である。前記「ストリンジェントな条件」は、プローブと検出対象となる核酸とがハイブリダイゼーションすることができる条件であれば、特に限定されるものではない。ハイブリダイゼーションを行なう際の条件のストリンジェンシーは、温度、ハイブリダイゼーション緩衝液の塩濃度、プローブの鎖長、プローブの塩基配列のＧＣ含量およびハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られており、当業者であれば、これらの条件を考慮して適宜設定することができる。ストリンジェントな条件としては、例えば、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル第２版〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．）、１９９８年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス発行〕に記載された条件などを用いることができる。
【００２５】
本明細書において、「術前化学療法」とは、乳癌患者に対して手術前に腫瘍組織サイズの縮小を図ることなどの目的で施される抗がん剤治療法をいう。当該術前化学療法に用いられる薬剤は、抗がん作用を有していればよく、特に限定されるものではない。前記薬剤としては、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、エピルビシン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、イキサベピロン、アンスラサイクリンなどが挙げられる。術前化学療法においては、これらの薬剤を単独でまたは２種類以上を併用して、所定の投薬スケジュールに基づいて患者に投与する。
【００２６】
本発明の診断補助方法では、まず、被験者から採取された検体からＲＮＡを含む測定用試料を調製する〔診断補助方法１の工程（Ｉ−１）および診断補助方法２の工程（ＩＩ−２）〕。
【００２７】
前記検体は、治療前生検により被検者から採取された乳癌細胞を含む検体が好ましい。前記検体としては、具体的には、治療前生検により被検者から採取した組織などが挙げられる。ここで、生検としては、例えば、穿刺吸引生検、コア針生検、吸引装置付き針生検装置〔例えば、ジョンソン・エンド・ジョンソン（株）製、商品名：マンモトーム（登録商標）など〕を用いた生検（「マンモトーム生検」という）などが挙げられる。これらの中では、容易にかつ低負荷で検体を得ることができることから、前記マンモトーム生検が好ましい。
【００２８】
公知の方法により、検体からのＲＮＡを抽出してもよい。また、検体からのＲＮＡの抽出は、ＲＮＡを抽出するための市販のキットを用いることもできる。ここで、市販のキットとしては、インビトロジェン社製、商品名：Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）や、キアゲン社製、商品名：Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（登録商標）などが挙げられる。
【００２９】
つぎに、遺伝子の発現量、すなわち、当該遺伝子に対応する転写産物（ｍＲＮＡ）の産生量などを測定するのに適した測定用試料を調製する。例えば、所定の核酸の発現量の定量をＲＴ−ＰＣＲによって行なう場合は、前記のように抽出されたＲＮＡから精製されたｍＲＮＡ、または前記のように抽出されたＲＮＡをそのまま測定用試料として用いることができる。前記ｍＲＮＡの精製は、公知の精製方法を用いて行なうことができる。また、ｍＲＮＡの精製には、市販の精製キットを用いてもよい。一方、所定の核酸の発現量の定量をマイクロアレイによって行なう場合は、抽出されたＲＮＡを用いて、対応するｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを調製することによって測定用試料を取得することができる。
【００３０】
ここで、本明細書において、「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡから逆転写により精製したＤＮＡだけでなく、当該ＤＮＡの相補鎖、およびｃＤＮＡとｃＤＮＡの相補鎖との二本鎖ＤＮＡも含む。ｃＤＮＡの増幅は、公知の方法により行なうことができる。ｃＤＮＡの増幅には、ｃＤＮＡの増幅するための市販のキットおよび核酸増幅装置を用いることもできる。ここで、前記市販のキットとしては、例えば、ニューゲン・テクノロジーズ（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製、商品名：ＷＴ−ＯｖａｔｉｏｎTM  ＦＦＰＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２などが挙げられる。
【００３１】
ｃＲＮＡは、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡから、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写反応（ＩＶＴ）によって合成され得る。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。マイクロアレイに適用する前に、必要に応じて、合成されたｃＲＮＡを精製してもよい。ｃＲＮＡの精製には、エタノール沈殿などの当該技術分野において公知の方法や、市販の核酸精製キットを用いることができる。さらに、ｃＲＮＡとマイクロアレイ上のプローブとのハイブリダイゼーションを容易にするために、ｃＲＮＡを断片化してもよい。ｃＲＮＡの断片化は、当該技術において公知の方法により行なうことができる。当該方法としては、例えば、金属イオン存在下で加熱する方法、リボヌクレアーゼなどの酵素を用いる方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３２】
後述のマイクロアレイによる核酸の検出方法において、測定用試料中のｃＤＮＡまたはｃＲＮＡとプローブとのハイブリッドの形成を蛍光、色、放射線などの検出により測定する場合、当該ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを、検出可能なシグナルを発生する物質、前記検出可能なシグナルを発生する物質と結合可能な物質などの標識物質で標識することが好ましい。当該標識物質としては、当該技術において通常用いられる物質であればよく、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光物質；ビオチンなどのハプテン；放射性物質などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを前記標識物質で標識する方法は、当該技術において公知である。例えば、ｃＤＮＡやｃＲＮＡを合成する工程において、ビオチン化リボヌクレオチドまたはビオチン化デオキシリボヌクレオチドを基質として反応液に混合しておくことにより、ビオチンで標識されたｃＤＮＡまたはビオチンで標識されたｃＲＮＡを合成することができる。
【００３３】
つぎに、得られた測定用試料を用い、前記所定の核酸の発現量を測定する〔診断補助方法１の工程（Ｉ−２）および診断補助方法２の工程（ＩＩ−２）〕。
【００３４】
診断補助方法１の工程（Ｉ−２）および診断補助方法２の工程（ＩＩ−２）において、所定の核酸の発現量は、例えば、マイクロアレイ、定量的ＲＴ-ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、ノーザンブロット解析などにより測定することができる。これらのなかでは、所定の核酸の発現量を迅速、かつ簡便に測定することができることから、マイクロアレイを用いて測定することが好ましい。ここで、前記「所定の核酸の発現量」には、測定用試料中に含まれる所定の核酸のコピー数、測定用試料における当該所定の核酸の濃度、または前記所定の核酸のコピー数もしくは前記所定の核酸の濃度を表す値を含む。前記所定の核酸のコピー数もしくは前記所定の核酸の濃度を表す値としては、例えば、マイクロアレイに測定用試料を適用し、前記所定の核酸とマイクロアレイ上のプローブとをハイブリダイズさせた後、測定される蛍光の強度などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３５】
マイクロアレイによる前記所定の核酸の発現量の測定は、公知の方法を用いて行なうことができる。具体的には、例えば、ヒトゲノムの発現解析が可能なマイクロアレイであるアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製の商品名：Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙを用いることにより、前記所定の核酸の発現量を一度に測定することができる。具体的には、測定用試料をマイクロアレイに接触させて、測定用試料中のｃＤＮＡまたはｃＲＮＡをマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイズさせ、前記所定の核酸を検出することができる。
【００３６】
本発明の診断補助方法に用いられるマイクロアレイは、後述の（Ｂ１）〜（Ｂ２３）のプローブが基材上に配置されたものであればよく、特に限定されるものではない。前記マイクロアレイは、好ましくはＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）である。このようなマイクロアレイとしては、当該技術において公知の方法によって作製されたマイクロアレイ、市販のマイクロアレイなどが例示される。
【００３７】
前記測定用試料とマイクロアレイとの接触は、前記測定用試料をマイクロアレイに添加することによって行なうことができる。この場合、前記測定用試料は、当該測定用試料の核酸濃度を定量し、当該核酸濃度がマイクロアレイによる検出に適する濃度になるように測定用試料を希釈した希釈物として用いてもよい。なお、前記測定用試料とマイクロアレイとの接触は、用いられるマイクロアレイの種類によって異なるが、通常、約１０〜７０℃で２〜２０時間行なえばよい。また、前記測定用試料とマイクロアレイとの接触には、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社の商品名：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｖｅｎ  ６４０などを用いることもできる。
【００３８】
さらに、測定用試料との接触後、プローブを介してマイクロアレイの基材上に固定されたｃＤＮＡまたはｃＲＮＡの染色および当該マイクロアレイの洗浄を行なってもよい。例えば、測定用試料中の前記所定の核酸に対応するｃＤＮＡもしくはｃＲＮＡがビオチンによって標識されている場合は、当該ビオチンに、アビジンまたはストレプトアビジンで標識した蛍光物質などを結合させることにより、マイクロアレイのプローブとハイブリダイズしたｃＤＮＡまたはｃＲＮＡの染色を行なうことができる。前記蛍光物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリン、フィコエリスリンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、本実施形態においては、ビオチンにアビジンまたはストレプトアビジンを結合させた後、前記アビジンまたはストレプトアビジンに結合可能であり、かつ蛍光物質などで標識された抗体を、マイクロアレイに接触させることにより、プローブとハイブリダイズした測定対象の核酸の染色を行なうことができる。マイクロアレイの染色および洗浄は、マイクロアレイ洗浄・染色装置（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社の商品名：Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０）などを用いて行なうことができる。
【００３９】
前記（Ａ１）のヒトのカスパーゼリクルートメントドメインファミリー、メンバー９（ＣＡＲＤ９）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２２３５２に対応する配列を有する。
前記（Ａ２）のヒトのインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ３４４５５に対応する配列を有する。
前記（Ａ３）のヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２４１６に対応する配列を有する。
前記（Ａ４）のヒトのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０００２７０に対応する配列を有する。
前記（Ａ５）のヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＸＣＬ１１）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ００２９８５またはＡＦ０３０５１４に対応する配列を有する。
前記（Ａ６）のヒトのＣＣＡＡＴ／エンハンサーバインディングプロテイン（ＣＥＢＰＢ）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＬ５６４６８３に対応する配列を有する。
前記（Ａ７）のヒトのＣＤ８３遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００４２３３に対応する配列を有する。
前記（Ａ８）のヒトのインターロイキン６シグナルトランスデューサー（ＩＬ６ＳＴ）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２１８４、ＡＢ０１５７０６またはＢＥ８５６５４６に対応する配列を有する。
前記（Ａ９）のヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃ）レセプター１（ＣＸ３ＣＲ１）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ２０３５０に対応する配列を有する。
前記（Ａ１０）のヒトのＣＤ１Ｄ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１７６６に対応する配列を有する。
前記（Ａ１１）のヒトのカテプシンＣ（ＣＴＳＣ）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１８１４に対応する配列を有する。
前記（Ａ１２）のヒトのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１０（ＣＸＣＬ１０）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１５６５に対応する配列を有する。
前記（Ａ１３）のヒトの免疫グロブリン重鎖遺伝子座Ｇ１アイソタイプ（ＩＧＨＧ１）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ２７５３９７に対応する配列を有する。
前記（Ａ１４）のヒトのジンクフィンガーＥ−ボックス結合ホメオボックス１（ＺＥＢ１）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＩ３７３１６６またはＵ１２１７０に対応する配列を有する。
前記（Ａ１５）のヒトの血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０２２３７５に対応する配列を有する。
前記（Ａ１６）のヒトのセマフォリン−３Ｃ前駆体（ＳＥＭＡ３Ｃ）遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＩ９６２８９７に対応する配列を有する。
前記（Ａ１７）のヒトの補体レセプター（ＣＲ２）遺伝子は、ヒトの補体レセプター（ＣＲ２）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１８７７）に対応する配列を有する。
前記（Ａ１８）のヒトのＨＦＥ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ１４４２４３に対応する配列を有する。
前記（Ａ１９）のヒトのＥＤＡ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１３９９に対応する配列を有する。
【００４０】
前記（Ｂ１）のプローブは、配列番号：１に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：１に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００４１】
前記（Ｂ２）のプローブは、配列番号：２に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：２に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００４２】
前記（Ｂ３）のプローブは、配列番号：３に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：３に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００４３】
前記（Ｂ４）のプローブは、配列番号：４に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：４に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００４４】
前記（Ｂ５）のプローブは、配列番号：５に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：５に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００４５】
前記（Ｂ６）のプローブは、配列番号：６に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：６に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００４６】
前記（Ｂ７）のプローブは、配列番号：７に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：７に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる
【００４７】
前記（Ｂ８）のプローブは、配列番号：８に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：８に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００４８】
前記（Ｂ９）のプローブは、配列番号：９に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：９に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００４９】
前記（Ｂ１０）のプローブは、配列番号：１０に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：１０に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００５０】
前記（Ｂ１１）のプローブは、配列番号：１１に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：１１に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００５１】
前記（Ｂ１２）のプローブは、配列番号：１２に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：１２に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００５２】
前記（Ｂ１３）のプローブは、配列番号：１３に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：１３に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００５３】
前記（Ｂ１４）のプローブは、配列番号：１４に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：１４に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００５４】
前記（Ｂ１５）のプローブは、配列番号：１５に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：１５に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００５５】
前記（Ｂ１６）のプローブは、配列番号：１６に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：１６に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００５６】
前記（Ｂ１７）のプローブは、配列番号：１７に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：１７に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００５７】
前記（Ｂ１８）のプローブは、配列番号：１８に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：１８に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００５８】
前記（Ｂ１９）のプローブは、配列番号：１９に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：１９に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００５９】
前記（Ｂ２０）のプローブは、配列番号：２０に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：２０に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００６０】
前記（Ｂ２１）のプローブは、配列番号：２１に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：２１に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００６１】
前記（Ｂ２２）のプローブは、配列番号：２２に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：２２に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００６２】
前記（Ｂ２３）のプローブは、配列番号：２３に示される塩基配列からなるポリペプチドを標的とするプローブである。かかるプローブは、配列番号：２３に示される塩基配列のうちの部分配列またはその相補的な配列からなる。
【００６３】
前記（Ｂ１）〜（Ｂ２３）のプローブの長さは、通常、１０〜６０ヌクレオチド長であり、乳癌術前化学療法に対する非感受性の有無をより精度よく判定する観点から、１５〜５０ヌクレオチド長である。
【００６４】
本発明においては、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無を精度よく判定する観点から、表１に記載されたプローブセットを用いて前記所定の核酸の発現量の測定を行なうことが好ましい。
【００６５】
【表１】
2015047101.tif 000004
【００６６】
なお、表１において「プローブセットＩＤ」は、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製のヒトゲノム発現解析用アレイ〔商品名：Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ〕において、基材上に固定されたプローブの１１〜２０個をまとめたプローブセットそれぞれにつけられているＩＤ番号を示す。各プローブセットは、表１に示される配列番号の塩基配列からなるプローブを含む。
【００６７】
つぎに、前記所定の核酸の発現量を解析する〔診断補助方法１の工程（Ｉ−３）および診断補助方法２の工程（ＩＩ−３）〕。その後、得られた解析結果に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定する〔診断補助方法１の工程（Ｉ−３）および診断補助方法２の工程（ＩＩ−３）〕。
【００６８】
診断補助方法１の工程（Ｉ−３）および診断補助方法２の工程（ＩＩ−３）において、前記所定の核酸の発現量は、例えば、クラス分け手法、スコア化手法、クラスター解析手法などによって行なうことができる。
【００６９】
前記クラス分け手法として、公知の方法を用いることができる。かかるクラス分け手法としては、例えば、対角線形判別分析〔Ｄｉａｇｏｎａｌ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＤＬＤＡ）〕、Ｂｅｔｗｅｅｎ−ｇｒｏｕｐ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＧＡ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ｋ最近傍分類（ｋＮＮ）、決定木、Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔ、ニューラルネットなどが挙げられる。これらのなかでは、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無を簡便な操作で判定することができる観点から、ＤＬＤＡが好ましい。かかるクラス分け手法を用いて発現量を解析する場合、前記発現量に基づいて、乳癌術前化学療法に対して感受性である検体と、非感受性である検体とにクラス分けがされる。したがって、この場合、診断補助方法１の工程（Ｉ−３）および診断補助方法２の工程（ＩＩ−３）においては、かかるクラス分けの結果によって、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定することができる。
【００７０】
診断補助方法１の工程（Ｉ−３）および診断補助方法２の工程（ＩＩ−３）において、前記所定の核酸の発現量の解析をクラス分け手法であるＤＬＤＡによって行なう場合、ＤＬＤＡを用いて構築された判別式を用いることができる。
【００７１】
前記判別式としては、式（Ｉ）：
【００７２】
【数３】
2015047101.tif 000005
〔式中、ｉは表２に記載の各核酸に付与された番号を示し、ｗiは表２に記載された番号ｉの核酸の重み係数を示し、ｙiは式（ＩＩ）：
【００７３】
【数４】
2015047101.tif 000006
（式中、ｘiは表２に記載された番号ｉの核酸の発現量を示し、ｍiは表２に記載された番号ｉの核酸の発現量の検体に渡る平均値を示す）
で表わされる式にしたがって標準化された核酸の発現量を示し、Σiは各核酸に渡る総和を示す〕
で表わされる判別式が挙げられる。
【００７４】
【表２】
2015047101.tif 000007
【００７５】
式（Ｉ）で表わされる判別式を用いて各核酸の発現量を解析する場合、式（Ｉ）で表わされる判別式のｘi（ｉ＝１，２，・・・，２３）に、順に、検体における当該核酸の発現量の値を代入し、解Ｄを求める。この場合、前記工程（Ｄ）においては、解Ｄが正の値のとき、乳癌術前化学療法に対して感受性であり、解Ｄがゼロまたは負の値のとき、乳癌術前化学療法に対して非感受性であると判定することができる。
【００７６】
以上説明したように、本発明の診断補助方法によれば、前記所定の核酸の発現量を測定し、解析するという操作が採用されているので、ＥＲ陽性の症例における乳癌術前化学療法に対する感受性の有無およびＥＲ陰性の症例における乳癌術前化学療法に対する感受性の有無の双方を精度よく判定することができる。したがって、本発明の診断補助方法は、被験者の分類の種類によらず、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無の双方を精度よく判定することができるので、乳癌術前化学療法の実施の適否の判断を助けるための情報や、治療を最適化するためのより適切な情報を提供するのに好適である。
【００７７】
前述した乳癌術前化学療法に対する感受性の判定は、例えば、図１に示される判定装置１によって行なうことができる。以下、乳癌術前化学療法に対する感受性の判定に用いることができる判定装置を、添付の図面を参照しながら、より詳細に説明するが、本発明は、かかる実施形態のみに限定されるものではない。図１は、本発明の一実施形態に係る乳癌術前化学療法に対する感受性の判定装置の概略説明図である。図１に示された判定装置１は、測定装置２と、当該測定装置２と接続されたコンピュータシステム３とを含んでいる。
【００７８】
本実施形態において、測定装置２は、マイクロアレイ上のプローブと結合した前記所定の核酸に基づくシグナルを検出するマイクロアレイスキャナーである。本実施形態において、前記シグナルは、光学的情報である。前記光学的情報としては、例えば、蛍光シグナルなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。この場合、前記測定用試料と接触させた後のマイクロアレイを測定装置２にセットすると、測定装置２は、マイクロアレイ上のプローブに結合した前記所定の核酸に基づく光学的情報を取得し、得られた光学的情報をコンピュータシステム３に送信する。
【００７９】
前記マイクロアレイスキャナーは、前記所定の核酸に基づくシグナルの検出が可能なものであればよい。前記所定の核酸に基づくシグナルは、前記測定用試料中のｃＤＮＡまたはｃＲＮＡの標識に用いられた標識物質によって異なることから、マイクロアレイスキャナーは、標識物質の種類に応じて、当該標識物質から生じるシグナルを検出するのに適したものを適宜選択することができる。例えば、前記標識物質が放射性物質である場合、測定装置２として、当該放射性物質から生じる放射線を検出可能なマイクロアレイスキャナーを用いることができる。
【００８０】
なお、遺伝子の発現量を核酸増幅法により検出する場合、測定装置２は、核酸増幅検出装置であってもよい。この場合、測定用試料、核酸増幅用の酵素、プライマーなどを含む反応液を測定装置２にセットし、核酸増幅法によって反応液中の核酸を増幅する。測定装置２は、増幅反応によって反応液から生じる蛍光や反応液の濁度などの光学的情報を取得し、この光学的情報をコンピュータシステム３に送信する。
【００８１】
コンピュータシステム３は、コンピュータ本体３ａと、入力デバイス３ｂと、検体情報、判定結果などを表示する表示部３ｃとを含む。コンピュータシステム３は、測定装置２から光学的情報を受信する。そして、コンピュータシステム３のプロセッサは、前記光学的情報に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定するプログラムを実行する。
【００８２】
図２は、図１に示された判定装置の機能構成を示すブロック図である。
コンピュータシステム３は、図２に示されるように、取得部３０１と、記憶部３０２と、算出部３０３と、判定部３０４と、出力部３０５とを備える。取得部３０１は、測定装置２と、ネットワークを介して通信可能に接続されている。なお、算出部３０３と判定部３０４とは、制御部３０６を構成している。
取得部３０１は、測定装置２から送信された情報を取得する。記憶部３０２は、式（Ｉ）で表わされる判定式および判定基準を記憶する。算出部３０３は、取得部３０１で取得された情報を用い、記憶部３０２に記憶された判定式にしたがって、判定式の解Ｄを算出する。判定部３０４は、算出部３０３によって算出された解Ｄと、記憶部３０２に記憶された判定基準とに基づいて乳癌術前化学療法に対する感受性の有無を判定する。出力部３０５は、判定部３０４による判定結果を出力する。
【００８３】
図３は、図１に示された判定装置のハードウェア構成を示すブロック図である。
図３に示されるように、コンピュータ本体３ａは、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）３０と、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ  Ｏｎｌｙ  Ｍｅｍｏｒｙ）１２１と、ＲＯＭ３２と、ハードディスク３３と、入出力インターフェイス３４と、読出装置３５と、通信インターフェイス３６と、画像出力インターフェイス３７とを備えている。ＣＰＵ３０、ＲＯＭ３１、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）３２、ハードディスク３３、入出力インターフェイス３４、読出装置３５、通信インターフェイス３６および画像出力インターフェイス３７は、バス３８によってデータ通信可能に接続されている。
ＣＰＵ３０は、ＲＯＭ３１に記憶されているコンピュータプログラムおよびＲＯＭ３２にロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３０がアプリケーションプログラムを実行することにより、前述した各機能ブロックが実現される。これにより、コンピュータシステムが、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無の判定装置としての端末として機能する。
ＲＯＭ３１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３１には、ＣＰＵ３０によって実行されるコンピュータプログラムおよびこれに用いるデータが記録されている。
ＲＯＭ３２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３２は、ＲＯＭ３１およびハードディスク３３に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。ＲＯＭ３２はまた、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３０の作業領域として利用される。
ハードディスク３３は、ＣＰＵ３０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム（乳癌術前化学療法に対する感受性の有無の判定のためのコンピュータプログラム）などのコンピュータプログラムおよび当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
読出装置３５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置３５は、可搬型記録媒体４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。
入出力インターフェイス３４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３４には、キーボード、マウスなどの入力デバイス３ｂが接続されている。操作者は、当該入力デバイス３ｂを使用することにより、コンピュータ本体３ａにデータを入力することが可能である。
通信インターフェイス３６は、例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）インターフェイスなどである。コンピュータシステム３は、通信インターフェイス３６により、プリンタへの印刷データの送信が可能である。
画像出力インターフェイス３７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３ｃに接続されている。これにより、表示部３ｃは、ＣＰＵ３０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力することができる。表示部３ｃは、入力された映像信号にしたがって画像（画面）を表示する。
【００８４】
つぎに、判定装置１による乳癌術前化学療法に対する感受性の有無の判定の処理手順を説明する。図４は、図１に示された判定装置を用いた乳癌術前化学療法に対する感受性の判定のフローチャートである。ここでは、測定用試料と接触させたマイクロアレイ上のプローブに結合した測定対象の核酸に基づく蛍光情報を用いて判定を行なう場合を例として挙げて説明するが、本発明は、かかる実施形態のみに限定されるものではない。
【００８５】
まず、ステップＳ１−１において、判定装置１の取得部３０１は、測定装置２から蛍光情報を取得する。そして、ステップＳ１−２において、算出部３０３は、取得部３０１が取得した蛍光情報から蛍光強度を算出し、記憶部３０２に送信する。
つぎに、ステップＳ１−３において、算出部３０３は、記憶部３０２に記憶された前記蛍光強度に基づき、記憶部３０２に記憶された式（Ｉ）で表わされる判定式（Ｉ）にしたがって、式（Ｉ）の解Ｄを算出する。
その後、ステップＳ１−４において、判定部３０４は、算出部３０３で算出された解Ｄの値と、記憶部３０２に記憶された判定基準とを用い、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無（すなわち、感受性および非感受性）を判定する。
ここで、解Ｄが正の数であるとき、処理は、ステップＳ１−４に進行し、判定部３０４は、乳癌術前化学療法に対して対して感受性であることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。また、解Ｄが０または負の数であるとき、乳癌術前化学療法に対して非感受性であることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
その後、ステップＳ１−７において、出力部３０５は、判定結果を出力し、表示部３ｃに表示させたり、プリンタに印刷させたりする。これにより、医師などが乳癌術前化学療法に対して感受性か、あるいは非感受性かについて判断することを補助する情報を提供することができる。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の実施例などにおいては、特に断りのない限り、ＣＥＬファイルのデータの前処理（正規化）は、解析ソフトウェア〔アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）社製、商品名：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェア〕のＲＭＡ統計アルゴリズムを用いて行なった。また、それ以外の解析は、全て統計解析ソフトウェアＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）および統計解析ソフトウェアＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／）を用いて実施した。
【００８７】
（実施例１）
（１）被験者からの検体の採取
２００２年から２０１０年の間に大阪大学医学部附属病院で術前化学療法が施された１１７人の乳癌患者それぞれから、採取針（サイズ８Ｇ）を取り付けた吸引装置付き針生検装置〔ジョンソン・エンド・ジョンソン（株）製、商品名：マンモトーム（登録商標）〕を用いて乳癌細胞を含む検体を採取した。検体の採取後すぐに、当該検体を、液体窒素に入れ、使用時まで、−８０℃で保存した。
【００８８】
（２）被験者の分類
前記（１）における検体の採取後、前記１１７人の患者に、乳癌術前化学療法として、１２週間にわたる毎週１回のパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）８０ｍｇ／ｍ2の投与、つづく３週間毎に計４回のエピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）７５ｍｇ／ｍ2、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）５００ｍｇ／ｍ2および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）５００ｍｇ／ｍ2の投与を行なった。
【００８９】
その後、組織病理学的検査によって病理学的診断と抗癌剤の効果の判定とを行ない、前記１１７人の患者を、病理学的完全寛解群（ｐＣＲ群）と非寛解群（ｎｐＣＲ群）とに分類した。ここで、「ｐＣＲ」とは、腫瘍が完全消失しているか、または腫瘍が乳管内だけに残存し浸潤部位が無く、かつリンパ節転移がない状態をいう。また、「ｎｐＣＲ」とは、前記ｐＣＲ以外の状態をいう。
【００９０】
（３）検体からのＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの調製
前記（１）で得られた検体（約２０ｍｇ）より、ＲＮＡ抽出用試薬〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、商品名：ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、またはキアゲンサイエンシーズ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製、商品名：ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ〕を用いて、ＲＮＡを抽出して、ＲＮＡ試料を得た。
【００９１】
前記ＲＮＡ試料（ＲＮＡ５０ｎｇ相当量）と、転写産物増幅用キット〔ニューゲン・テクノロジーズ（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製、商品名：ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ  ＦＦＰＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２〕に添付のランダムプライマーとを用いて、ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡおよびｓｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成し、Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡTM増幅技術によって、ｃＤＮＡを増幅した。このようにして、１１７例の検体に対応する１１７種類のｃＤＮＡを得た。
【００９２】
（４）遺伝子発現解析
断片化・標識用試薬〔ニューゲン・テクノロジーズ（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製、商品名：ＦＬ−ＯｖａｔｉｏｎTM  ｃＤＮＡ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｍｏｄｕｌｅ  Ｖ２〕を用いて、前記（３）で得られたｃＤＮＡを、ビオチンで標識するとともに、断片化した。
【００９３】
得られた断片化ビオチン標識ｃＤＮＡを、ヒトゲノム発現解析用アレイ〔アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製、商品名：Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ〕上の核酸（プローブセット）と一晩ハイブリダイズさせた。なお、前記断片化ビオチン標識ｃＤＮＡと前記アレイ上の核酸（プローブセット）とのハイブリダイゼーションは、製造者〔アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社〕による推奨条件に従って行なった。
【００９４】
つぎに、ハイブリダイゼーション後のアレイを、マイクロアレイ洗浄・染色処理専用機器〔アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製、商品名：ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０〕に供して、前記アレイ上の核酸（プローブセット）にハイブリダイズしたｃＤＮＡを蛍光染色し、洗浄した。
【００９５】
その後、前記アレイをマイクロアレイスキャナー〔アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製、商品名：ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００〕に供して、前記アレイ上の核酸（プローブセット）にハイブリダイズしたｃＤＮＡの蛍光標識物質に基づくシグナルを読み取り、蛍光強度を定量化した。得られた蛍光強度のデータをソフトウェア〔アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製、商品名：ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ〕によって処理して、ＣＥＬファイルを得た。前記ＣＥＬファイルを遺伝子発現解析に用いた。このようにして、１１７例の検体それぞれにおける前記プローブセットのプローブに対応する核酸に基づく蛍光強度のデータについて、ＣＥＬファイルを得た。
【００９６】
（５）プローブセットの選択、および乳癌術前化学療法に対する感受性の判定のための判別式の構築
アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製、商品名：Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ上に搭載されている全５４６７５個のプローブセットに対応するデータのうち、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製、商品名：Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３Ａ  Ａｒｒａｙと共通している２２２８３個のプローブセットを以下の解析に用いた。
【００９７】
さらに、前記２２２８３個のプローブセットのうち、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社より公開されている各プローブセットの情報（バージョンｎａ３２、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／）を参照し、ジーン・オントロジー・バイオロジカル・プロセス上で“Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ”と分類されている９３４個のプローブセットを選択した。
【００９８】
取得された１１７例それぞれのＣＥＬファイルのデータにおいて、前記９３４個のプローブセットのそれぞれについて、プローブセットによって検出される核酸の発現量から、１１７例における当該核酸の発現量の平均値を減算することで発現量を標準化した（ｍｅａｎ−ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ）。
【００９９】
つぎに、前記１１７例の検体それぞれの蛍光強度のデータを、トレーニングセット５８例とバリデーションセット５９例とに無作為に振り分けた。このとき、プローブセットに対応する遺伝子の発現量と、ｐＣＲおよびｎｐＣＲとの関連性を検定した際の検出力を高めるため、トレーニングセットにおけるｐＣＲ例数がバリデーションセットにおけるｐＣＲ例数の約２倍となるように振り分けを実施した。以降の解析については、別途記載のあるもの以外は全てトレーニングセットのデータに対して適用した。
【０１００】
プローブセットに対応する遺伝子の発現量がｐＣＲおよびｎｐＣＲの間で異なることをＷｅｌｃｈのＴ検定で評価し、ｐ値が０．０１未満となるプローブセットを選択した。
【０１０１】
つぎに、判別式のアルゴリズムとして対角線形判別分析〔Ｄｉａｇｏｎａｌ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＤＬＤＡ）〕を用い、前記ＷｅｌｃｈのＴ検定におけるｐ値の低い順に、１個ずつ選択するプローブセットの個数を増加させながら、当該プローブセット群を選択し、判別式の構築を行なった。
【０１０２】
そして、Ｌｅａｖｅ−Ｏｎｅ−Ｏｕｔ  Ｃｒｏｓｓ−Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ法を用い、正確度が最大となるプローブセットの個数を決定した。前記Ｌｅａｖｅ−Ｏｎｅ−Ｏｕｔ  Ｃｒｏｓｓ−Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ法は、トレーニングセットのデータのなかから１例のデータを除いて構築した判別式を用い、前記で除かれた１例を予測した結果を、除外する１例のデータを入れ替えながら５８回繰り返し、５８例分の病理学的診断結果と判別式で予測された５８例分の結果とを集計することによって行なった。また、正確度は、［病理学的診断結果がｐＣＲであり、かつｐＣＲと予測された検体の数］と、［病理学的診断結果がｎｐＣＲであり、かつｎｐＣＲと予測された検体の数］との和を、全検体の数で除算することによって求めた。実施例１において、プローブセット数と正確度との関係を調べた結果を図５に示す。
【０１０３】
図５に示された結果から、正確度が最大となるプローブセットとして、Ｗｅｌｃｈのｔ検定におけるｐ値の低い順で上位２３番目までの２３個のプローブセット（表３参照）を用いた場合に、正確度が最大になることがわかる。これらの２３個のプローブセットは、それぞれ、配列番号：１〜２３に示されるポリヌクレオチドを標的とするものである。これらの２３個のプローブセットについて、全トレーニングセットのデータを用いて最終的な判別式を構築した。
【０１０４】
【表３】
2015047101.tif 000008
【０１０５】
得られた判別式は、式（Ｉ）：
【０１０６】
【数５】
2015047101.tif 000009
【０１０７】
〔式中、ｉは表２に記載の各核酸に付与された番号を示し、ｗiは表２に記載された番号ｉの核酸の重み係数を示し、ｙiは式（ＩＩ）：
【０１０８】
【数６】
2015047101.tif 000010
【０１０９】
（式中、ｘiは表２に記載された番号ｉの核酸の発現量を示し、ｍiは表２に記載された番号ｉの核酸の発現量の検体に渡る平均値を示す）
で表わされる式にしたがって標準化された核酸の発現量を示し、Σiは各核酸に渡る総和を示す〕
で表わされる判別式である。ここで、式（Ｉ）で表わされる判別式の解Ｄが正の数であるとき、乳癌術前化学療法に対して感受性であり、解Ｄが０または負の数であるとき、乳癌術前化学療法に対して非感受性であると判定する。
【０１１０】
（６）判別式による判定結果と、病理学的診断結果との対比
トレーニングセットに振り分けられた５８例の検体について測定された発現量のデータ（蛍光強度のデータ）と、式（Ｉ）で表わされる判別式とを用いて、５８例の検体それぞれがｐＣＲ群およびｎｐＣＲ群のいずれの乳癌患者の検体に該当するかを判定した。そして、病理学的診断結果を真値として用い、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定結果と、当該病理学的診断結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。実施例１において、トレーニングセットについて、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定結果と、病理学的診断結果とを比較した結果を図６に示す。図中、「Ｇｐ−Ｒ」は判別式によって「乳癌術前化学療法に対して感受性を有する被験者の検体である」と判定された検体、「Ｇｐ−ＮＲ」は判別式によって「乳癌術前化学療法に対して非感受性である被験者の検体である」と判定された検体を示す。
【０１１１】
つぎに、バリデーションセットに振り分けられた５９例の検体について測定された発現量のデータ（蛍光強度のデータ）と、前記判別式とを用いて、５９例の検体それぞれがｐＣＲ群およびｎｐＣＲ群のいずれの乳癌患者の検体に該当するかを判定することによって、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定した。また、病理学的診断結果を真値として、当該病理学的診断結果と前記判別式による判定結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。実施例１において、バリデーションセットについて、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定結果と、病理学的診断結果とを比較した結果を図７に示す。図中、「Ｇｐ−Ｒ」は判別式によって「乳癌術前化学療法に対して感受性を有する被験者の検体である」と判定された検体、「Ｇｐ−ＮＲ」は判別式によって「乳癌術前化学療法に対して非感受性である被験者の検体である」と判定された検体を示す。
【０１１２】
図６に示された結果から、トレーニングセットに振り分けられた５８例の検体のうち、式（Ｉ）で表わされる判別式により、２６例がＧｐ−Ｒ、３２例がＧｐ−ＮＲと判定されていることがわかる。また、図６に示された結果から、Ｇｐ−Ｒと判定された検体のうちの１６例がｐＣＲ群の乳癌患者の検体であり、Ｇｐ−ＮＲと判定された検体のうちの３０例がｎｐＣＲ群の乳がんの患者の検体であることがわかる。したがって、これらの結果から、トレーニングセットにおいて、式（Ｉ）で表わされる判別式により、乳癌術前化学療法に対して感受性である検体と乳癌術前化学療法に対して非感受性である検体とを判別することができることがわかる。
【０１１３】
さらに、図７に示された結果から、バリデーションセットに振り分けられた５９例の検体のうち、式（Ｉ）で表わされる判別式により、２４例がＧｐ−Ｒ、３５例がＧｐ−ＮＲと判定されていることがわかる。また、図７に示された結果から、Ｇｐ−Ｒと判定された検体のうちの９例がｐＣＲ群の乳癌患者の検体であり、Ｇｐ−ＮＲと判定された検体のすべてがｎｐＣＲ群の乳がんの患者の検体であることがわかる。したがって、これらの結果から、バリデーションセットにおいて、式（Ｉ）で表わされる判別式により、乳癌術前化学療法に対して感受性である検体と乳癌術前化学療法に対して非感受性である検体とを判別することができることがわかる。
【０１１４】
以上の結果から、被験者から採取された検体における前記（１）〜（２３）のプローブによって検出される各核酸の発現量を用いることにより、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無を精度よく判定することができることが示唆される。
【０１１５】
（実施例２）
マイクロアレイ実験の遺伝子発現情報データベース〔ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）〕のアクセッション番号：ＧＳＥ１６４４６（被験者群１−１）、ＧＳＥ２０１９４（被験者群１−２）、ＧＳＥ２０２７１（被験者群１−３）、ＧＳＥ２２０９３（被験者群１−４）、ＧＳＥ２３９８８（被験者群１−５）およびＧＳＥ４１９９８（被験者群１−６）の６つの被験者群のデータセットから、術前化学療法の施された乳癌症例９０１例分のデータを抽出した。抽出されたデータについて、データセット毎に、ＲＭＡ正規化およびｍｅａｎ−ｃｅｎｔｅｒｉｎｇを行なった。得られたデータにおける前記（１）〜（２３）のプローブによって検出される各核酸の発現量と、式（Ｉ）で表わされる判別式とを用い、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無を判定した。
【０１１６】
つぎに、データセット毎に、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定結果と、前記データベースから取得された病理学的診断結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。実施例２において、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を図８に示す。
【０１１７】
図８に示された結果から、被験者群１−１〜１−６のすべてについて、オッズ比が１を超えており（３．０９以上）、９５％信頼区間における最小値も１を超えていることから、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定は、いずれも偶然の結果ではなく、有意な結果であることがわかる。したがって、これらの結果から、前記（１）〜（２３）のプローブによって検出される各核酸の発現量を用いることにより、乳癌術前化学療法に対する感受性を精度よく判定することができることが示唆される。
【０１１８】
（実施例３）
実施例２において抽出された９０１例分のデータを、ＥＲおよびＨＥＲ２それぞれの有無に基づき、下記被験者群２−１〜２−３：
被験者群２−１：ＥＲ陽性を示し、かつＨＥＲ２陰性を示す被験者（ＥＲ+、ＨＥＲ２-）からなる群、
被験者群２−２：ＥＲ陽性またはＥＲ陰性を示し、かつＨＥＲ２陽性を示す被験者（ＥＲ+-、ＨＥＲ２+）からなる群、および
被験者群２−３：ＥＲ陰性を示し、かつＨＥＲ２陰性を示す被験者（ＥＲ-、ＨＥＲ２-）からなる群
の３通りのデータセットに分類した。なお、「ＥＲ陽性を示し、かつＨＥＲ２陽性を示す被験者（ＥＲ+、ＨＥＲ２+）からなる群」および「ＥＲ陰性を示し、ＨＥＲ２陽性を示す被験者（ＥＲ-、ＨＥＲ２+）からなる群」は、ハーセプチンに対して感受性である点が共通していることから、被験者群２−２に求めている。
【０１１９】
つぎに、データセット毎に、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。実施例３において、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を図９に示す。
【０１２０】
図９に示された結果から、被験者群２−１〜２−３のすべてについて、オッズ比が１を超えており（３．４１以上）、９５％信頼区間における最小値も１を超えていることから、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定は、いずれも偶然の結果ではなく、有意な結果であることがわかる。したがって、これらの結果から、ＥＲおよびＨＥＲ２それぞれの有無に基づいて分類されたデータセットにおいても、前記（１）〜（２３）のプローブによって検出される各核酸の発現量を用いることにより、乳癌術前化学療法に対する感受性を精度よく判定することができることが示唆される。また、これらの結果から、前記（１）〜（２３）のプローブによって検出される各核酸の発現量を用いることにより、ＥＲ陽性およびＥＲ陰性に基づく分類によらず、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無を精度よく判定することができることが示唆される。
【０１２１】
（実施例４）
実施例２において抽出された９０１例分のデータを、用いられた乳癌術前化学療法のレジメンの種類に基づき、５通りのデータセットに分類した。
【０１２２】
つぎに、データセット毎に、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。実施例４において、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を図１０に示す。図中、「Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ」はエピルビシンを投与された被験者からなる群（被験者群３−１）、「ＦＡＣ  ｏｒ  ＦＥＣ」は５−フルオロウラシルとアドリアマイシンとシクロホスファミドとの組み合わせまたは５−フルオロウラシルとエピルビシンとシクロホスファミドとの組み合わせが投与された被験者からなる群（被験者群３−２）、「Ａ．ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ」はアンスラサイクリンとパクリタキセルとが投与された被験者からなる群（被験者群３−３）、「Ａ．ｄｏｃｅｔａｘｅｌ」はアンスラサイクリンとドセタキセルとが投与された被験者からなる群（被験者群３−４）、「Ａ．Ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ」はアンスラサイクリンとイキサベピロンとが投与された被験者からなる群（被験者群３−５）を示す。
【０１２３】
図１０に示された結果から、被験者群３−１〜３−５のすべてについて、オッズ比が１を超えており（３．４５以上）、９５％信頼区間における最小値も１を超えていることから、式（Ｉ）で表わされる判別式による判定は、いずれも偶然の結果ではなく、有意な結果であることがわかる。したがって、これらの結果から、用いられた乳癌術前化学療法のレジメンに基づいて分類されたデータセットにおいても、前記（１）〜（２３）のプローブによって検出される各核酸の発現量を用いることにより、乳癌術前化学療法に対する感受性を精度よく判定することができることが示唆される。また、これらの結果から、前記（１）〜（２３）のプローブによって検出される各核酸の発現量を用いることにより、乳癌術前化学療法のレジメンに基づく分類によらず、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無を精度よく判定することができることが示唆される。
【０１２４】
（比較例１）
実施例２において抽出された９０１例分のデータにおける特許文献１の表１および表２に記載された７０個のプローブセットに対応する遺伝子の発現量を用い、特許文献１に記載の診断補助方法にしたがって、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無を判定した。
【０１２５】
つぎに、前記被験者群１−１〜１−６のデータセット毎に、特許文献１の表１および表２に記載された７０個のプローブセットに対応する遺伝子の発現量を用いて得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。比較例１において、被験者群１−１〜１−６について、特許文献１の表１および表２に記載された７０個のプローブセットに対応する遺伝子の発現量を用いて得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を図１１に示す。
【０１２６】
また、前記被験者群２−１〜２−３のデータセット毎に、特許文献１の表１および表２に記載された７０個のプローブセットに対応する遺伝子の発現量を用いて得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。比較例１において、被験者群２−１〜２−３について、特許文献１の表１および表２に記載された７０個のプローブセットに対応する遺伝子の発現量を用いて得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を図１２に示す。
【０１２７】
さらに、前記被験者群３−１〜３−５のデータセット毎に、特許文献１の表１および表２に記載された７０個のプローブセットに対応する遺伝子の発現量を用いて得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。比較例１において、被験者群３−１〜３−５について、特許文献１の表１および表２に記載された７０個のプローブセットに対応する遺伝子の発現量を用いて得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を図１３に示す。図中、「Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ」、「ＦＡＣ  ｏｒ  ＦＥＣ」、「Ａ．ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ」、「Ａ．ｄｏｃｅｔａｘｅｌ」および「Ａ．Ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ」は図１０における「Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ」、「ＦＡＣ  ｏｒ  ＦＥＣ」、「Ａ．ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ」、「Ａ．ｄｏｃｅｔａｘｅｌ」および「Ａ．Ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ」と同じである。
【０１２８】
図１１に示された結果から、判定結果に関するオッズ比およびその９５％信頼区間における最小値のいずれもが１以下となっているものがあり、被験者群の母体の種類によっては、判定結果の信頼性が低くなる場合があることがわかる。また、図１２に示された結果から、ＥＲおよびＨＥＲ２それぞれの有無に基づいて分類された被験者群のデータセット毎の判定結果においても、判定結果に関するオッズ比の９５％信頼区間における最小値が１以下となっているものがあることから、特許文献１の表１および表２に記載された７０個のプローブセットに対応する遺伝子の発現量を用いた場合、ＥＲ陽性の症例およびＥＲ陰性の症例それぞれにおける判定結果の信頼性が低いことがわかる。さらに、図１３に示された結果から、用いられた乳癌術前化学療法のレジメンの種類に基づいて分類された被験者群のデータセット毎の判定結果においても、判定結果に関するオッズ比およびその９５％信頼区間における最小値のいずれもが１以下となっているものがあることから、特許文献１の表１および表２に記載された７０個のプローブセットに対応する遺伝子の発現量を用いた場合、投与される抗癌剤の種類によっては、判定結果の信頼性が低くなる場合があることがわかる。
【０１２９】
（比較例２）
実施例２において抽出された９０１例分のデータにおける非特許文献２に記載のＢ細胞メタジーンの発現量を用い、非特許文献２に記載された方法にしたがって、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無を判定した。
【０１３０】
つぎに、前記被験者群１−１〜１−６のデータセット毎に、非特許文献２に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。比較例２において、被験者群１−１〜１−６について、非特許文献２に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を図１４に示す。
【０１３１】
また、前記被験者群２−１〜２−３のデータセット毎に、非特許文献２に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。比較例２において、被験者群２−１〜２−３について、非特許文献２に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を図１５に示す。
【０１３２】
さらに、前記被験者群３−１〜３−５のデータセット毎に、非特許文献２に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。比較例２において、被験者群３−１〜３−５について、非特許文献２に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を図１６に示す。図中、「Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ」、「ＦＡＣ  ｏｒ  ＦＥＣ」、「Ａ．ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ」、「Ａ．ｄｏｃｅｔａｘｅｌ」および「Ａ．Ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ」は図１０における「Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ」、「ＦＡＣ  ｏｒ  ＦＥＣ」、「Ａ．ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ」、「Ａ．ｄｏｃｅｔａｘｅｌ」および「Ａ．Ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ」と同じである。
【０１３３】
図１４に示された結果から、判定結果に関するオッズ比の９５％信頼区間における最小値が１以下となっているものがあり、非特許文献２に記載された方法によれば、被験者群の母体の種類によっては、判定結果の信頼性が低くなる場合があることがわかる。また、図１５に示された結果から、ＥＲおよびＨＥＲ２それぞれの有無に基づいて分類された被験者群のデータセット毎の判定結果においても、判定結果に関するオッズ比の９５％信頼区間における最小値が１以下となっているものがあることから、非特許文献２に記載された方法は、ＥＲ陽性の症例およびＥＲ陰性の症例それぞれにおける判定結果の信頼性が低いことがわかる。さらに、図１６に示された結果から、用いられた乳癌術前化学療法のレジメンの種類に基づいて分類された被験者群のデータセット毎の判定結果においても、判定結果に関するオッズ比の９５％信頼区間における最小値が１以下となっているものがあることから、非特許文献１に記載された方法によれば、投与される抗癌剤の種類によっては、判定結果の信頼性が低くなる場合があることがわかる。
【０１３４】
（比較例３）
実施例２において抽出された９０１例分のデータにおける非特許文献３に記載のイムノグロブリンκＣ遺伝子の発現量を用い、非特許文献３に記載された方法にしたがって、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無を判定した。
【０１３５】
つぎに、前記被験者群１−１〜１−６のデータセット毎に、非特許文献３に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。比較例３において、被験者群１−１〜１−６について、非特許文献３に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を図１７に示す。
【０１３６】
また、前記被験者群２−１〜２−３のデータセット毎に、非特許文献３に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。比較例３において、被験者群２−１〜２−３について、非特許文献３に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を図１８に示す。
【０１３７】
さらに、前記被験者群３−１〜３−５のデータセット毎に、非特許文献３に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。比較例３において、被験者群３−１〜３−５について、非特許文献３に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を図１９に示す。図中、「Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ」、「ＦＡＣ  ｏｒ  ＦＥＣ」、「Ａ．ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ」、「Ａ．ｄｏｃｅｔａｘｅｌ」および「Ａ．Ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ」は図１０における「Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ」、「ＦＡＣ  ｏｒ  ＦＥＣ」、「Ａ．ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ」、「Ａ．ｄｏｃｅｔａｘｅｌ」および「Ａ．Ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ」と同じである。
【０１３８】
図１７に示された結果から、判定結果に関するオッズ比の９５％信頼区間における最小値が１以下となっているものがあり、非特許文献３に記載された方法によれば、被験者群の母体の種類によっては、判定結果の信頼性が低くなる場合があることがわかる。また、図１８に示された結果から、ＥＲおよびＨＥＲ２それぞれの有無に基づいて分類された被験者群のデータセット毎に、非特許文献３に記載された方法によって乳癌術前化学療法に対する感受性を判定した場合、前記（１）〜（２３）のプローブによって検出される各核酸の発現量を用いる本発明の診断補助方法によって乳癌術前化学療法に対する感受性を判定した場合（図９参照）と比べ、判定結果に関するオッズ比およびが小さいことから、非特許文献３に記載された方法は、前記（１）〜（２３）のプローブによって検出される各核酸の発現量を用いる本発明の方法よりも、ＥＲ陽性の症例およびＥＲ陰性の症例それぞれにおける判定結果の信頼性が低いことがわかる。さらに、図１９に示された結果から、用いられた乳癌術前化学療法のレジメンの種類に基づいて分類された被験者群のデータセット毎の判定結果においても、判定結果に関するオッズ比の９５％信頼区間における最小値が１以下となっているものがあることから、非特許文献３に記載された方法によれば、投与される抗癌剤の種類によっては、判定結果の信頼性が低くなる場合があることがわかる。
【０１３９】
（比較例４）
実施例２において抽出された９０１例分のデータにおける非特許文献４に記載のＣ１ＱＡ、ＸＣＬ２、ＳＰＰ１、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＬＹ９、ＩＧＬＣ２およびＨＬＡ−Ｆの各遺伝子の発現量を用い、非特許文献４に記載された方法にしたがって、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無を判定した。
【０１４０】
つぎに、前記被験者群１−１〜１−６のデータセット毎に、非特許文献４に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。比較例４において、被験者群１−１〜１−６について、非特許文献４に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を図２０に示す。
【０１４１】
また、前記被験者群２−１〜２−３のデータセット毎に、非特許文献４に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。比較例４において、被験者群２−１〜２−３について、非特許文献４に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を図２１に示す。
【０１４２】
さらに、前記被験者群３−１〜３−５のデータセット毎に、非特許文献４に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。比較例４において、被験者群３−１〜３−５について、非特許文献４に記載された方法にしたがって得られた判定結果と、データベースから取得された病理学的診断結果とを比較した結果を図２２に示す。図中、「Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ」、「ＦＡＣ  ｏｒ  ＦＥＣ」、「Ａ．ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ」、「Ａ．ｄｏｃｅｔａｘｅｌ」および「Ａ．Ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ」は図１０における「Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ」、「ＦＡＣ  ｏｒ  ＦＥＣ」、「Ａ．ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ」、「Ａ．ｄｏｃｅｔａｘｅｌ」および「Ａ．Ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ」と同じである。
【０１４３】
図２０に示された結果から、判定結果に関するオッズ比の９５％信頼区間における最小値が１以下となっているものがあり、非特許文献４に記載された方法によれば、被験者群の母体の種類によっては、判定結果の信頼性が低くなる場合があることがわかる。また、図２１に示された結果から、ＥＲおよびＨＥＲ２それぞれの有無に基づいて分類された被験者群のデータセット毎の判定結果においても、判定結果に関するオッズ比の９５％信頼区間における最小値が１以下となっているものがあることから、非特許文献４に記載された方法は、ＥＲ陽性の症例およびＥＲ陰性の症例それぞれにおける判定結果の信頼性が低いことがわかる。さらに、図２２に示された結果から、用いられた乳癌術前化学療法のレジメンの種類に基づいて分類された被験者群のデータセット毎の判定結果においても、判定結果に関するオッズ比の９５％信頼区間における最小値が１以下となっているものがあることから、非特許文献４に記載された方法によれば、投与される抗癌剤の種類によっては、判定結果の信頼性が低くなる場合があることがわかる。
【０１４４】
以上の結果から、前記（１）〜（２３）のプローブによって検出される各核酸の発現量を用いることにより、ＥＲ陽性およびＥＲ陰性に基づく分類や、乳癌術前化学療法のレジメンの種類に基づく分類などの被験者の分類の種類によらず、乳癌術前化学療法に対する感受性の有無をより精度よく判定することができることが示唆される。したがって、本発明の診断補助方法は、乳癌術前化学療法の実施の適否の判断を助けるための情報や、治療を最適化するためのより適切な情報を提供するのに好適である。
【配列表フリーテキスト】
【０１４５】
配列番号：２４〜２７２は、プローブセットに含まれる配列である。
【図１】
2015047101.tif 000015
【図２】
2015047101.tif 000016
【図３】
2015047101.tif 000017
【図４】
2015047101.tif 000018
【図５】
2015047101.tif 000019
【図６】
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【図７】
2015047101.tif 000021
【図８】
2015047101.tif 000022
【図９】
2015047101.tif 000023
【図１０】
2015047101.tif 000024
【図１１】
2015047101.tif 000025
【図１２】
2015047101.tif 000026
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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