(57)【要約】      （修正有）【課題】質量分析において解析対象のペプチド断片を選択的にイオン化することができ、該ペプチド断片由来のイオンを高感度で検出することができるペプチド混合物試料の調製方法、タンパク質から調製したペプチド混合物試料を質量分析に供して、解析対象のペプチド断片を選択的に検出する方法及び該ペプチド断片のアミノ酸配列を決定する方法を提供する。【解決手段】タンパク質から質量分析に供するペプチド混合物試料を調製するための方法であって、（ａ）該タンパク質の標的アミノ酸残基を修飾用試薬によって選択的にラベル化する工程、（ｂ）該タンパク質をペプチド断片に切断する工程、及び（ｃ）該タンパク質のアルギニン残基を除去又は改変する工程を含む、ラベル化されたペプチド断片と、その他のペプチド断片とを含むペプチド混合物試料を調製する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質から質量分析に供するペプチド混合物試料を調製するための方法であって、
（ａ）該タンパク質の標的アミノ酸残基を修飾用試薬によって選択的にラベル化する工程、
（ｂ）該タンパク質をペプチド断片に切断する工程、及び
（ｃ）該タンパク質のアルギニン残基を除去又は改変する工程
を含むことを特徴とする、ラベル化されたペプチド断片と、その他のペプチド断片とを含むペプチド混合物試料を調製する方法。
【請求項２】
前記修飾用試薬が、正電荷を有する化合物又は塩基性基を有する化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記正電荷を有する化合物が、第四級ホスホニウム化合物又は第四級アンモニウム化合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第四級ホスホニウムが、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記塩基性基が、第三級アミノ基、イミダゾール基又はグアニジノ基である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）におけるタンパク質の切断が、アルギニンのＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼにより行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｃ）におけるアルギニン残基の除去又は改変が、カルボキシペプチダーゼを用いるアルギニン残基の除去、又はペプチジルアルギニンデイミナーゼを用いるグアニジノ基の脱イミン化若しくはグアニジノ基のヒドラジン分解によって行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）における標的アミノ酸残基のラベル化が、Ｎ末端のαアミノ基、Ｃ末端のαカルボキシル基、リジン残基の側鎖上のアミノ基、システイン残基の側鎖上のチオール基、又はリン酸基若しくはＯグリカンが結合しているセリン又はスレオニン残基の側鎖のラベル化である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）における標的アミノ酸残基のラベル化が、Ｎ末端のαアミノ基のラベル化である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）、工程（ｂ）、及び工程（ｃ）をこの順に行う、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、次の工程を含む、請求項１に記載の方法。
（ｄ）該タンパク質のリジン残基を除去又は改変する工程
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により調製されるペプチド混合物試料を質量分析に供し、ラベル化されたペプチド断片に由来するイオンを検出する工程を含むことを特徴とする、ラベル化されたペプチド断片の選択的検出方法。
【請求項１３】
前記検出工程において、ペプチド混合物試料をイオン化し、生成したイオンの中からイオン強度が最も高いイオンをラベル化されたペプチド断片に由来するイオンとして選択する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、選択したイオンをフラグメントイオンに解離させて、フラグメントイオンスペクトルを取得し、該フラグメントイオンスペクトルにおいてラベル化に用いた修飾用試薬に対応するｍ／ｚ値を有するレポーターイオンの存在を検出することにより、該選択したイオンがラベル化されたペプチド断片に由来するイオンであることを確認する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により調製されるペプチド混合物試料を質量分析に供し、ラベル化されたペプチド断片に由来するイオンを検出する工程、及び該ラベル化されたペプチド断片のアミノ酸配列を決定する工程を含むことを特徴とする、ラベル化されたペプチド断片のアミノ酸配列決定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の構造を解析するための質量分析用ペプチド混合物試料を調製する方法に関するものである。特に、質量分析に供した場合に解析対象のペプチド断片を選択的にイオン化することができるため、該ペプチド断片を高感度で検出することができる、ペプチド混合物試料を調製する方法に関するものである。本発明はまた、前記ペプチド混合物試料を質量分析に供して、解析対象のペプチド断片を選択的に検出する方法、該ペプチド断片の構造解析を行う方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、翻訳後に様々な修飾反応・プロセシング（翻訳後修飾）を経て成熟タンパク質となる。このため、生体内で機能している成熟タンパク質のアミノ酸配列は、ゲノム情報から得られる配列とは違っている場合が多く、そのアミノ酸配列の解析法が求められている。
【０００３】
タンパク質の構造及び機能解析手法の一つとして、質量分析が広く用いられている。質量分析によりタンパク質の配列（例えば、Ｃ末端又はＮ末端配列）を調べる場合には、タンパク質を適当な酵素で消化してペプチド断片の混合物とする。このペプチド混合物は、解析対象のペプチド断片とその他のペプチド断片とを含むが、解析対象のペプチド断片をその他のペプチド断片から分離せずに分析に供することができると、分析用試料の調製が容易であることから好ましい。
【０００４】
しかしながら、ペプチド混合物を質量分析に供すると、解析対象のペプチド断片に由来するピークだけでなく、その他のペプチド断片に由来するピークが多数検出される。このため、質量分析によってタンパク質の構造を解析するためには、タンパク質を酵素処理することによって得られる断片化されたペプチド混合物の中から、解析すべきペプチド断片に由来するイオンを選択的に検出できることが重要である。
【０００５】
質量分析において、解析対象のペプチド断片由来のイオンの検出感度を向上させるための方法として、特定のアミノ酸残基をイオン化しやすい化合物等により選択的にラベル化する方法が知られている。例えば非特許文献１には、タンパク質のＣ末端部分のアミノ酸配列をＭＡＬＤＩ−ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）により解析する方法として、タンパク質のＣ末端のαカルボニル基をトリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム（ＴＭＰＰ）でラベル化した後、酵素消化を行ってタンパク質を断片化し、得られるペプチド混合物を用いてＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を行う方法が開示されている。この方法によれば、Ｃ末端αカルボキシル基をＴＭＰＰでラベル化する際に、タンパク質中の全てのリジン残基がホルミル化されるためリジン残基含有ペプチド由来のイオンのピーク強度が低下する。一方、ＴＭＰＰはイオン化しやすく、ＴＭＰＰでラベル化されたＣ末端ペプチドのピーク強度が強くなる。その結果、夾雑ペプチド（この場合には、Ｃ末端ペプチド以外のペプチド）のイオン強度が低下し、逆にＴＭＰＰでラベル化されたＣ末端ペプチドのイオン強度が増強されるため、該Ｃ末端ペプチドが相対的に高感度に検出される。これにより、解析対象のＣ末端ペプチド断片由来のイオンの検出が容易となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nakajima et al., “C-Terminal sequencing of protein by MALDI mass spectrometry through the specific derivatization of the α-carboxyl group with 3-aminopropyltris- (2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium bromide.”, Anal Bioanal Chem, 2012, Vol. 404, pp. 125-132.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように質量分析において検出感度を向上させるため、解析対象のペプチドをイオン化しやすい基等でラベル化する方法が知られている。しかしながら、アルギニン残基の側鎖上のグアニジノ基は、ＴＭＰＰ等と同様にイオン化しやすい。このため、質量分析に供するペプチド混合物中にアルギニン残基を含むペプチドが存在すると、解析対象のペプチドがＴＭＰＰ等でラベル化されていても、該ペプチドを高感度化することができない場合がある。また、タンパク質をトリプシン等で消化した場合には、解析対象のペプチド断片の末端がアルギニン残基となる場合があるが、アルギニン残基を有するペプチド断片に由来するイオンをプリカーサーイオンとしてＭＳ／ＭＳ解析を行っても、該ペプチド断片由来のフラグメントイオンが出現せず、構造解析を行うことができないという問題もある。
【０００８】
本発明は、質量分析において解析対象のペプチド断片を選択的にイオン化することができ、該ペプチド断片由来のイオンを高感度で検出することができるペプチド混合物試料の調製方法を提供することを主な課題とする。本発明はまた、タンパク質から調製したペプチド混合物試料を質量分析に供して、解析対象のペプチド断片を選択的に検出する方法及び該ペプチド断片のアミノ酸配列を決定する方法を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ね、以下の知見を得た。
（ｉ）タンパク質を断片化して質量分析用のペプチド混合物試料を調製する際に、該タンパク質の解析対象部位のアミノ酸残基（例えば、Ｎ末端又はＣ末端のアミノ酸残基）を、質量分析において感度を向上させることができる基を有する化合物（例えば、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム（ＴＭＰＰ）化合物）等により選択的（特異的）にラベル化（化学修飾）すると共に、アルギニン残基を除去又は改変すると、質量分析においてラベル化されたアミノ酸残基を含むペプチド断片（ラベル化されたペプチド断片）が選択的にイオン化されるため、ラベル化されたペプチド断片由来のイオンを質量分析で高感度に検出することができる。
（ｉｉ）上記の解析対象部位のアミノ酸残基のラベル化と、アルギニン残基の除去又は改変とを組み合わせることにより、解析対象のペプチド断片を高感度で検出することができるため、解析対象のラベル化されたペプチド断片とその他のペプチド断片とを含むペプチド混合物を質量分析に供することができる。つまり、質量分析用試料の調製において、解析対象のペプチド断片とその他のペプチド断片とを分離する必要がない。
（ｉｉｉ）解析対象部位のアミノ酸残基のラベル化と、アルギニン残基の除去又は改変とを組み合わせるペプチド混合物試料の調製方法は、Ｎ末端又はＣ末端の解析だけでなく、末端以外の部位へのラベル化（例えば、システイン残基に対するラベル化、リジン残基に対するラベル化、リン酸化若しくは糖鎖が結合しているセリン又はスレオニン残基の側鎖に対するラベル化）がされたペプチドを選択的にイオン化するための試料の調製方法としても有用である。
（ｉｖ）ペプチド混合物試料の調製において、アルギニン残基に加えてリジン残基を除去又は改変すると、質量分析においてラベル化されたペプチド断片をより高感度に検出することができる。
（ｖ）ペプチド断片からアルギニン残基が除去又は改変されることにより、ラベル化されたペプチド断片のＭＳ／ＭＳフラグメントイオン（プロダクトイオン）スペクトル（以下、単に「ＭＳ／ＭＳスペクトル」ともいう）において多数のフラグメントイオン（プロダクトイオン）が観察されるようになり、該ペプチド断片の構造解析が可能となる。
（ｖｉ）ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて、ラベル化に用いた修飾用試薬に対応するｍ／ｚ値を有するレポーターイオンの存在を検出することにより、プリカーサーイオンとして選択したイオンがラベル化されたペプチド断片に由来するイオンであることを容易に確認することができる。例えばラベル化にＴＭＰＰ化合物を使用した場合には、ラベル化されたペプチド断片のＭＳ／ＭＳスペクトルにはＴＭＰＰ特有のピーク（５７３Ｄａ）が出現する。このため、ＭＳ／ＭＳ分析に供したプリカーサーイオンがＴＭＰＰでラベル化されたペプチド由来のイオンであることを確認することができる。
本発明者らは、上記知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、以下の試料調製方法、ラベル化されたペプチド断片の選択的検出方法などを含む。
（１）タンパク質から質量分析に供するペプチド混合物試料を調製するための方法であって、
（ａ）該タンパク質の標的アミノ酸残基を修飾用試薬によって選択的にラベル化する工程、
（ｂ）該タンパク質をペプチド断片に切断する工程、及び
（ｃ）該タンパク質のアルギニン残基を除去又は改変する工程
を含むことを特徴とする、ラベル化されたペプチド断片と、その他のペプチド断片とを含むペプチド混合物試料を調製する方法。
（２）前記修飾用試薬が、正電荷を有する化合物又は塩基性基を有する化合物である、前記（１）に記載の方法。
（３）前記正電荷を有する化合物が、第四級ホスホニウム化合物又は第四級アンモニウム化合物である、前記（２）に記載の方法。
（４）前記第四級ホスホニウムが、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムである、前記（３）に記載の方法。
（５）前記塩基性基が、第三級アミノ基、イミダゾール基又はグアニジノ基である、前記（２）に記載の方法。
（６）工程（ｂ）におけるタンパク質の切断が、アルギニンのＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼにより行われる、前記（１）〜（５）のいずれか一項に記載の方法。
（７）工程（ｃ）におけるアルギニン残基の除去又は改変が、カルボキシペプチダーゼを用いるアルギニン残基の除去、又はペプチジルアルギニンデイミナーゼを用いるグアニジノ基の脱イミン化若しくはグアニジノ基のヒドラジン分解によって行われる、前記（１）〜（６）のいずれか一項に記載の方法。
（８）工程（ａ）における標的アミノ酸残基のラベル化が、Ｎ末端のαアミノ基、Ｃ末端のαカルボキシル基、リジン残基の側鎖上のアミノ基、システイン残基の側鎖上のチオール基、又はリン酸基若しくはＯグリカンが結合しているセリン又はスレオニン残基の側鎖のラベル化である、前記（１）〜（７）のいずれか一項に記載の方法。
（９）工程（ａ）における標的アミノ酸残基のラベル化が、Ｎ末端のαアミノ基のラベル化である、前記（１）〜（８）のいずれか一項に記載の方法。
（１０）工程（ａ）、工程（ｂ）、及び工程（ｃ）をこの順に行う、前記（９）に記載の方法。
（１１）さらに、次の工程を含む、前記（１）に記載の方法。
（ｄ）該タンパク質のリジン残基を除去又は改変する工程
（１２）前記（１）〜（１１）のいずれか一項に記載の方法により調製されるペプチド混合物試料を質量分析に供し、ラベル化されたペプチド断片に由来するイオンを検出する工程を含むことを特徴とする、ラベル化されたペプチド断片の選択的検出方法。
（１３）前記検出工程において、ペプチド混合物試料をイオン化し、生成したイオンの中からイオン強度が最も高いイオンをラベル化されたペプチド断片に由来するイオンとして選択する、前記（１２）に記載の方法。
（１４）さらに、選択したイオンをフラグメントイオンに解離させて、フラグメントイオンスペクトルを取得し、該フラグメントイオンスペクトルにおいてラベル化に用いた修飾用試薬に対応するｍ／ｚ値を有するレポーターイオンの存在を検出することにより、該選択したイオンがラベル化されたペプチド断片に由来するイオンであることを確認する、前記（１３）に記載の方法。
（１５）前記（１）〜（１１）のいずれか一項に記載の方法により調製されるペプチド混合物試料を質量分析に供し、ラベル化されたペプチド断片に由来するイオンを検出する工程、及び該ラベル化されたペプチド断片のアミノ酸配列を決定する工程を含むことを特徴とする、ラベル化されたペプチド断片のアミノ酸配列決定方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、解析対象のラベル化されたペプチド断片を選択的にイオン化することができる。このため、質量分析において、ラベル化されたペプチド断片由来のイオンを高感度に検出することができ、ラベル化されたペプチド断片をその他のペプチド断片由来から区別して選択的に検出することができる。
【００１２】
また、ラベル化されたペプチド断片由来のイオンについてＭＳ／ＭＳ分析を行うと、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて多数のフラグメントイオンが観察されるため、該ペプチド断片の構造解析が可能となる。さらに、ラベル化されたペプチド断片をＭＳ／ＭＳ分析に供すると、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて、ラベル化に用いた修飾用試薬に対応するｍ／ｚ値を有するレポーターイオンが出現するため、ＭＳ／ＭＳ分析に供したプリカーサーイオンが解析対象のラベル化されたペプチド断片に由来するイオンであることを容易に確認することができる。
【００１３】
本発明の方法は、タンパク質の翻訳後修飾の解析等において有用である。例えば、タンパク質のＮ末端又はＣ末端配列の解析、タンパク質中のリジン残基の解析、タンパク質中のシステイン残基の解析、タンパク質のリン酸化部位の解析、タンパク質の糖鎖付加部位の解析のための質量分析用ペプチド混合物試料の調製方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】タンパク質のＮ末端配列を解析するための質量分析用ペプチド混合物試料の調製方法の一例を説明するための模式図である。
【図２】タンパク質のシステイン残基を解析するための質量分析用ペプチド混合物試料の調製方法の一例を説明するための模式図である。
【図３】タンパク質のリン酸化部位を解析するための質量分析用ペプチド混合物試料の調製方法の一例を説明するための模式図である。
【図４】タンパク質の糖鎖結合部位を解析するための質量分析用ペプチド混合物試料の調製方法の一例を説明するための模式図である。
【図５】Ｎ末端αアミノ基をＴＭＰＰでラベル化したタンパク質について、トリプシンによる消化、カルボキシペプチダーゼＢによる処理、及びメタロエンドペプチダーゼＬｙｓＮ（ＬｙｓＮ）による処理を行って得られた各ペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルである。図（ａ）は、Ｎ末端をＴＭＰＰでラベル化したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をトリプシンで消化したペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトル、図（ｂ）は、図（ａ）で用いたペプチド混合物をさらにカルボキシペプチダーゼＢで処理した処理物のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトル、図（ｃ）は、図（ｂ）で用いた処理物をさらにＬｙｓＮで処理した処理物のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルである。図（ｄ）は、Ｎ末端をＴＭＰＰでラベル化したトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩＳ）をトリプシンで消化したペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトル、図（ｅ）は、図（ｄ）で用いたペプチド混合物をさらにカルボキシペプチダーゼＢで処理した処理物のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトル、図（ｆ）は、図（ｅ）で用いた処理物をさらにＬｙｓＮで処理した処理物のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルである。
【図６】図６の上図（ａ）は、Ｎ末端αアミノ基をＴＭＰＰでラベル化したＴＰＩＳ（ＴＭＰＰ−ＴＰＩＳ）をトリプシンで消化したペプチド混合物に含まれるＴＭＰＰでラベル化されたＮ末端ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルであり、下図（ｂ）は、ＴＭＰＰ−ＴＰＩＳをトリプシンで消化後、さらにカルボキシペプチダーゼＢで処理したペプチド混合物に含まれるＴＭＰＰでラベル化されたＮ末端ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の方法は、タンパク質から質量分析に供するペプチド混合物試料を調製するための方法である。
本明細書中、「ペプチド断片」とは、後述する工程（ｂ）でタンパク質を切断した断片である。「ペプチド混合物試料」とは、後述するラベル化されたペプチド断片、及びその他のペプチド断片を含むペプチド断片の混合物である。「ラベル化されたペプチド断片」は、後述する工程（ａ）で選択的にラベル化されたアミノ酸残基を含むペプチド断片である。ラベル化されたペプチド断片は、質量分析における解析対象のペプチド断片である。その他のペプチド断片は、前記のラベル化されたアミノ酸残基を含まないペプチド断片であり、以下、「非ラベル化ペプチド断片」ともいう。ペプチド混合物試料に含まれるその他のペプチド断片は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。
【００１６】
本発明の方法においては、タンパク質からペプチド混合物試料を調製する際に下記の（ａ）〜（ｃ）の工程を行う。
（ａ）該タンパク質の標的アミノ酸残基を修飾用試薬によって選択的にラベル化する工程、
（ｂ）該タンパク質をペプチド断片に切断する工程、及び
（ｃ）該タンパク質のアルギニン残基を除去又は改変する工程
本発明において試料の調製に用いられるタンパク質は特に限定されないが、通常、少なくとも１個のアルギニン残基を有するものである。タンパク質は、天然から単離したタンパク質であってもよく、遺伝子工学を利用して製造したタンパク質であってもよい。また、有機合成で合成したタンパク質であってもよい。
【００１７】
工程（ａ）〜（ｃ）を行う順序は、工程（ａ）におけるラベル化の対象となる標的アミノ酸及び／又は用いる修飾用試薬の種類、工程（ｂ）におけるタンパク質の切断方法、及び工程（ｃ）におけるアルギニン残基を除去又は改変するための方法等に応じて適宜選択することができる。
【００１８】
例えば、工程（ａ）、工程（ｂ）及び工程（ｃ）の順に操作を行う場合には、まずタンパク質中の標的アミノ酸を修飾用試薬によって選択的にラベル化し（工程（ａ））、次いで、得られたラベル化されたタンパク質をペプチド断片に切断してペプチド混合物を得て（工程（ｂ））、ペプチド混合物について、アルギニン残基を除去又は改変する操作を行い（工程（ｃ））、解析対象のラベル化されたペプチド断片とその他の断片とを含むペプチド混合物試料を調製することになる。
工程（ａ）、工程（ｃ）及び工程（ｂ）の順に操作を行う場合には、工程（ａ）で得られたラベル化されたタンパク質からアルギニン残基を除去又は改変し（工程（ｃ））、得られるアルギニン残基が除去又は改変されたタンパク質を切断して（工程（ｂ））、ペプチド混合物試料を調製することになる。
【００１９】
工程（ｂ）、工程（ａ）及び工程（ｃ）の順に操作を行う場合には、まずタンパク質をペプチド断片に切断し（工程（ｂ））、得られるペプチド混合物に修飾用試薬を作用させてペプチド断片中の標的アミノ酸残基を選択的にラベル化し（工程（ａ））、次いで、ラベル化されたペプチド断片を含むペプチド混合物について、アルギニン残基を除去又は改変する操作を行い（工程（ｃ））、ペプチド混合物試料を調製することになる。
工程（ｂ）、工程（ｃ）及び工程（ａ）の順に操作を行う場合には、工程（ｂ）で得られるペプチド混合物について、アルギニン残基を除去又は改変する操作を行い（工程（ｃ））、次いでアルギニン残基が除去又は改変されたペプチド混合物に修飾用試薬を作用させてペプチド断片中の標的アミノ酸残基を選択的にラベル化し（工程（ａ））、ペプチド混合物試料を調製することになる。
【００２０】
工程（ｃ）、工程（ａ）及び工程（ｂ）の順に操作を行う場合には、まずタンパク質からアルギニン残基を除去又は改変し（工程（ｃ））、得られるアルギニン残基が除去又は改変されたタンパク質中の標的アミノ酸残基を修飾用試薬によって選択的にラベル化し（工程（ａ））、次いでラベル化されたアミノ酸残基を含むタンパク質を切断し（工程（ｂ））、ペプチド混合物試料を調製することになる。
工程（ｃ）、工程（ｂ）及び工程（ａ）の順に操作を行う場合には、工程（ｃ）で得られるアルギニン残基が除去又は改変されたタンパク質をペプチド断片に切断し（工程（ｂ））、得られるペプチド混合物に修飾用試薬を作用させてペプチド断片中の標的アミノ酸残基をラベル化し（工程（ａ））、ペプチド混合物試料を調製することになる。
【００２１】
以下に、工程（ａ）〜（ｃ）について説明する、
＜工程（ａ）＞
工程（ａ）では、タンパク質の標的アミノ酸残基を修飾用試薬によって選択的にラベル化する。
工程（ａ）において「タンパク質の標的アミノ酸残基を選択的にラベル化する」とは、試料調製に用いたタンパク質中に存在した特定の標的アミノ酸残基を選択的にラベル化することをいう。工程（ａ）を行うことによって、得られるペプチド混合物試料に含まれるペプチド断片中の前記特定の標的アミノ酸残基は、ラベル化されたものとなる。
より具体的には、工程（ａ）に供される対象は、工程（ａ）〜（ｃ）を行う順番によって異なることになり、後述する工程（ｂ）で切断される前のタンパク質、又は該タンパク質を切断したペプチド断片である。また、工程（ｃ）を工程（ａ）より先に行う場合であれば、アルギニン残基が除去又は改変されたタンパク質（切断前のタンパク質）、又は該タンパク質を切断したペプチド断片中の標的アミノ酸残基が工程（ａ）に供されてラベル化される。
例えば、本発明において、工程（ａ）を行った後に工程（ｂ）を行う場合には、切断前のタンパク質に修飾用試薬を作用させて該タンパク質中の標的アミノ酸残基を選択的にラベル化する。また、工程（ｂ）を行った後に工程（ａ）を行う場合には、タンパク質を切断したペプチド断片に修飾用試薬を作用させて該ペプチド断片中の標的アミノ酸残基を選択的にラベル化することになる。
【００２２】
標的アミノ酸残基は、通常、質量分析における解析対象のアミノ酸残基又は解析対象配列に含まれるアミノ酸残基である。本発明における標的アミノ酸残基は特に限定されないが、例えばＮ末端配列の解析であれば、Ｎ末端アミノ酸残基が好ましい。また、Ｃ末端配列の解析であれば、Ｃ末端アミノ酸残基が好ましい。また、本発明における標的アミノ酸残基として、例えば、リジン残基、システイン残基、リン酸基若しくはＯグリカン（Ｏ結合型糖鎖）が結合しているセリン又はスレオニン残基も挙げられる。中でも、Ｎ末端アミノ酸残基、又はＣ末端アミノ酸残基が好適であり、Ｎ末端アミノ酸残基がより好適である。
【００２３】
工程（ａ）における標的アミノ酸残基のラベル化は、例えばＮ末端配列の解析であれば、Ｎ末端のαアミノ基をラベル化することが好ましい。Ｃ末端配列の解析であれば、Ｃ末端のαカルボキシル基をラベル化することが好ましい。また、リジン残基の解析であれば、リジン残基の側鎖上のアミノ基（εアミノ基）をラベル化することが好ましい。システイン残基の解析であれば、システイン残基の側鎖上のチオール基をラベル化することが好ましい。リン酸化部位又はＯグリカン結合部位の解析であれば、リン酸基若しくはＯグリカンが結合しているセリン又はスレオニン残基の側鎖をラベル化することが好ましい。
【００２４】
工程（ａ）における標的アミノ酸残基のラベル化は、Ｎ末端のαアミノ基、Ｃ末端のαカルボキシル基、リジン残基の側鎖上のアミノ基、システイン残基の側鎖上のチオール基、又はリン酸基若しくはＯグリカンが結合しているセリン又はスレオニン残基の側鎖のラベル化であることが好ましく、Ｎ末端のαアミノ基又はＣ末端のαカルボキシル基のラベル化がより好ましく、Ｎ末端のαアミノ基のラベル化が特に好ましい。
【００２５】
修飾用試薬は、該試薬によりラベル化されたアミノ酸残基を有するペプチド断片が質量分析に供された場合に、該ペプチド断片由来のイオン種の感度を上げることができるモチーフ又は置換基（以下、前記モチーフ又は置換基を、「修飾基」ともいう）を有する化合物が好ましい。
修飾基として、例えば、正電荷を有する基又は塩基性基が好ましい。すなわち本発明における修飾用試薬は、正電荷を有する化合物又は塩基性基を有する化合物であることが好ましい。このような修飾用試薬によりラベル化されたペプチド断片は、質量分析に供された場合に、該断片が有する正電荷を有する基又は塩基性基により、該断片由来のイオン種の感度を上げることができる。その結果、ラベル化されたペプチド断片を質量分析によって、他のペプチド断片（非ラベル化ペプチド断片）から区別して選択的に検出することが容易となる。
【００２６】
正電荷を有する化合物として、例えば、Ｓ、Ｏ、Ｎ又はＰのオニウム塩構造を有する化合物が挙げられる。具体的には、例えば、多置換のスルホニウム化合物、ピリリウム化合物、アンモニウム化合物、又はホスホニウム化合物が好ましい。中でも、第四級ホスホニウム化合物又は第四級アンモニウム化合物がより好ましく、第四級ホスホニウム化合物が更に好ましい。
【００２７】
第四級ホスホニウムとして、例えば、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム（ＴＭＰＰ）、ビニル（２，４，６−トリフェニル）ホスホニウムブロマイド（International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes, Vol. 126, 29 July 1993, Pages 123-136）が挙げられる。中でも、ＴＭＰＰが好ましい。
第四級アンモニウムとして、例えば、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウムが挙げられる。中でも、トリメチルアンモニウムが好ましい。
【００２８】
塩基性基として、例えば、含窒素塩基性基が挙げられる。含窒素塩基性基として、例えば、第三級アミノ基、グアニジノ基、置換されていてもよい含窒素複素環基が挙げられる。第三級アミノ基として、具体的には、例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、メチルエチルアミノ基が挙げられ、好ましくはジエチルアミノ基である。含窒素複素環基としては、例えば、イミダゾール基、ピリジン基、ピペリジン基、ピペラジン基、ピリミジン基、ピリダジン基、ピロール基が挙げられ、好ましくはイミダゾール基である。中でも、本発明における好ましい塩基性基は、第三級アミノ基、イミダゾール基又はグアニジノ基である。
【００２９】
修飾用試薬は、上記のような修飾基を有し、特定の標的アミノ酸残基を選択的（特異的）に修飾できる官能基を有する化合物であればよい。修飾基及び特定の標的アミノ酸残基を選択的に修飾できる官能基は、同一の基であってもよい。また、工程（ａ）におけるラベル化は、１段階反応であってもよく、多段階反応であってもよい。
ラベル化は、通常溶媒中で修飾用試薬とタンパク質又はペプチド断片とを反応させることにより行われる。溶媒の種類及び反応条件は特に限定されず、標的アミノ酸、修飾用試薬の種類等に応じて適宜選択することができる。修飾用試薬の使用量は、標的アミノ酸の種類、修飾用試薬の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、溶媒として、重炭酸アンモニウム水溶液を使用することができる。修飾用試薬の使用量は、例えば、モル比で、試料調製に用いたタンパク質１に対して、通常１〜１００００００であり、１００〜１００００が好ましい。反応条件は、修飾用試薬の種類により適宜選択することができる。例えば、タンパク質又はペプチド断片、及び修飾用試薬を含む溶媒のｐＨは通常６〜９であり、ｐＨ７〜８に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常２０〜８０℃、好ましくは３０〜６０℃であり、反応時間は、通常０．１〜２時間、好ましくは０．２〜０．６時間とする。
【００３０】
＜工程（ｂ）＞
工程（ｂ）に供されるタンパク質、すなわち切断されるタンパク質は、工程（ａ）〜（ｃ）を行う順番によって異なることになるが、試料の調製に用いられたタンパク質、工程（ａ）でラベル化されたタンパク質又はこれらのタンパク質から工程（ｃ）によってアルギニン残基を除去又は改変したタンパク質である。
例えば、工程（ａ）の後に工程（ｂ）を行う場合であれば、標的アミノ残残基がラベル化されたタンパク質をペプチド断片に切断する。また、工程（ｃ）の後に工程（ｂ）を行う場合には、工程（ｃ）によってアルギニン残基が除去又は改変されたタンパク質をペプチド断片に切断する。
【００３１】
タンパク質の切断方法は特に限定されないが、プロテアーゼを用いて行うことが好ましく、エンドプロテイナーゼを用いることがより好ましい。エンドプロテイナーゼとして、例えば、アルギニン等の塩基性アミノ酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ（例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇＣ、リシルエンドペプチダーゼ（例えば、和光純薬社のリシルエンドペプチダーゼ（登録商標））、疎水性アミノ酸を含む配列の切断能を有するエンドプロテイナーゼ（例えば、テモラリシン（Thermolysin））、疎水性アミノ酸を含む配列の切断能を有するエンドプロテイナーゼ（例えば、キモトリプシン）、アスパラギン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ（例えば、カスパーゼ）が挙げられる。
【００３２】
工程（ｂ）で用いるプロテアーゼの種類は、工程（ａ）でラベル化する標的アミノ酸残基の種類、工程（ｃ）でアルギニン残基を除去又は改変する方法、工程（ａ）〜（ｃ）を行う順番等に応じて適宜選択することができる。例えば、後述する工程（ｃ）でアルギニン残基を除去する場合には、工程（ｂ）を行った後、工程（ｃ）を行うことが好ましく、さらに工程（ｂ）においてトリプシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇＣ等のアルギニンのＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼを用いることが好ましい。また、例えばＮ末端がアルギニン残基であるタンパク質のＮ末端配列を解析する場合であれば、アルギニン残基のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ以外のプロテアーゼを用いることが好ましい。
【００３３】
工程（ｂ）におけるタンパク質の切断は、アルギニンのＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼにより行われることが好ましく、中でも、トリプシン又はエンドプロテイナーゼＡｒｇＣにより行われることがより好ましい。
【００３４】
タンパク質の切断は、通常溶媒中でタンパク質にプロテアーゼを作用させることにより行うことができる。かかる溶媒は特に限定されず、プロテアーゼの種類等により適宜選択することができ、例えば重炭酸ナトリウム水溶液を挙げることができる。プロテアーゼの使用量は、例えば、モル比で、切断するタンパク質１に対して、通常１倍〜１／１００００倍であり、１／１０倍〜１／１０００倍が好ましい。反応条件は、タンパク質、及びプロテアーゼの種類により適宜選択することができる。例えば、タンパク質、及びプロテアーゼを含む溶媒のｐＨは通常６〜９であり、ｐＨ７〜８に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常２０〜６０℃、好ましくは３０〜４０℃であり、反応時間は、通常１〜２４時間、好ましくは２〜８時間とする。
【００３５】
＜工程（ｃ）＞
工程（ｃ）において「タンパク質のアルギニン残基を除去又は改変する」とは、試料調製に用いたタンパク質中に存在したアルギニン残基を除去又は改変することをいい、これにより本発明の方法により得られるペプチド混合物試料に含まれるペプチド断片は、アルギニン残基を含まないものとなる。
工程（ｃ）に供される対象は、工程（ａ）〜（ｃ）を行う順番によって異なることになるが、工程（ｂ）で切断される前のタンパク質、及び該タンパク質を切断したペプチド断片である。また、工程（ａ）を工程（ｃ）より先に行う場合であれば、ラベル化された切断前のタンパク質、又は該タンパク質を切断したペプチド断片を工程（ｃ）に供することになる。
より具体的には、例えば、工程（ｃ）の後で工程（ｂ）を行う場合であれば、タンパク質中のアルギニン残基を除去又は改変する。また、工程（ｂ）の後に工程（ｃ）を行う場合には、ペプチド断片中のアルギニン残基を除去又は改変する。
【００３６】
アルギニン残基を除去する方法は限定されず、公知の方法により行うことができる。工程（ｃ）においてアルギニン残基を除去する場合には、上述したように、工程（ｂ）を行った後工程（ｃ）を行うことが好ましい。また、アルギニン残基を除去する場合、工程（ｂ）におけるタンパク質の切断は、アルギニンのＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼにより行われることがより好ましい。
【００３７】
工程（ｂ）においてアルギニンのＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼを用いる場合には、Ｃ末端にアルギニン残基（トリプシンを用いる場合には、アルギニン又はリジン残基）を有するペプチド断片が生成する。よって、生成したペプチド断片にアルギニン残基のＮ末端切断能を有する酵素を作用させることにより、ペプチド断片からアルギニン残基を遊離させることができ、アルギニン残基を除去することができる。アルギニンのＮ末端切断能を有する酵素として、例えば、カルボキシペプチダーゼを使用することができる。カルボキシペプチダーゼとして、例えば、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＡが挙げられ、好ましくはカルボキシペプチダーゼＢである。
【００３８】
また、工程（ｂ）で生成するペプチド断片がそのＮ末端にアルギニン残基を有する場合であれば、アルギニンのＣ末端切断能を有する酵素により、ペプチド断片からアルギニン残基を遊離させることができる。アルギニン残基のＣ末端切断能を有する酵素として、例えば、アミノペプチダーゼ、トリプシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃを使用することができる。好ましくはアミノペプチダーゼ、トリプシンである。
【００３９】
アルギニン残基の除去は、通常溶媒中でアルギニン残基をＣ末端又はＮ末端に有するペプチド断片に前記の酵素を作用させることにより行うことができる。かかる溶媒は特に限定されず、例えば、上述した工程（ｂ）でタンパク質の切断の際に使用されるものと同じものを使用することができる。酵素の量は、酵素の種類によって適宜選択することができ、例えばカルボキシペプチダーゼ又はアミノペプチダーゼであれば、モル比で、試料の調製に用いたタンパク質１に対して、通常１倍〜１／１０００倍であり、好ましくは１／１０倍〜１／１００倍である。反応条件は、酵素の種類により適宜選択することができる。例えば、ペプチド断片、及び酵素を含む溶媒のｐＨは通常６〜９であり、ｐＨ７〜８に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃であり、反応時間は、通常０．５〜８時間、好ましくは１〜４時間とする。
【００４０】
アルギニン残基を改変するとは、通常、アルギニン残基の側鎖上のグアニジノ基を修飾して、アルギニン残基を他のアミノ酸残基に改変することを意味する。工程（ｃ）においてアルギニン残基を改変する場合、工程（ｂ）及び工程（ｃ）を行う順番は特に限定されない。また、工程（ｂ）で使用されるプロテアーゼの種類も特に限定されないが、工程（ｃ）でアルギニン残基を改変した後、工程（ｂ）を行う場合には、アルギニン残基を認識するプロテアーゼ（例えば、アルギニン残基のＮ末端又はＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ）以外のプロテアーゼを使用することが好ましい。
【００４１】
アルギニン残基を改変する方法は特に限定されず、公知の方法により行うことができる。例えば、アルギニン残基の側鎖上のグアニジノ基を脱イミン化することによりアルギニン残基をシトルリン残基に改変することができる。グアニジノ基の脱イミン化は、例えば、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ等の酵素により行うことができる。また、グアニジノ基をヒドラジン分解することにより、アルギニン残基をオルニチン残基に改変することができる。
【００４２】
グアニジノ基の脱イミン化は、通常溶媒中でタンパク質又はペプチド断片に酵素（好ましくは、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ）を作用させることにより行うことが好ましい。かかる溶媒は特に限定されず、例えば、上述した工程（ｂ）でタンパク質の切断の際に使用されるものと同じものを使用することができる。酵素の使用量は、例えば、モル比で、試料の調製に用いたタンパク質１に対して、通常１倍〜１／１００００倍であり、好ましくは１／１０倍〜１／１００倍である。反応条件は特に限定されず、酵素の種類により適宜選択することができる。例えば、タンパク質又はペプチド断片、及びペプチジルアルギニンデイミナーゼを含む溶媒のｐＨは通常６〜１０であり、ｐＨ７〜９に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃であり、反応時間は、通常２〜１０時間、好ましくは４〜８時間とする。
【００４３】
グアニジノ基のヒドラジン分解は、通常溶媒中でタンパク質又はペプチド断片にヒドラジン水溶液等の試薬を作用させて行うことができる。かかる溶媒は特に限定されず、例えば、重炭酸ナトリウム水溶液を使用することができる。重炭酸ナトリウム水溶液の濃度は、通常１〜２００ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ程度とすることができる。試薬の使用量は、例えば、モル比で、試料の調製に用いたタンパク質１に対して、通常１０倍〜１００００００倍であり、好ましくは１００倍 〜１０００００倍である。反応条件は、適宜選択することができるが、例えば、タンパク質又はペプチド断片、及び試薬を含む溶媒のｐＨは通常８〜１２であり、ｐＨ９〜１１に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常５０〜８０℃、好ましくは６５〜７５℃であり、反応時間は、通常１〜５時間、好ましくは２〜４時間とする。
【００４４】
工程（ｃ）におけるアルギニン残基の除去又は改変は、カルボキシペプチダーゼを用いるアルギニン残基の除去、又はペプチジルアルギニンデイミナーゼを用いるグアニジノ基の脱イミン化若しくはグアニジノ基のヒドラジン分解によって行われることが好ましい。より好ましくは、カルボキシペプチダーゼを用いてアルギニン残基を除去する。
【００４５】
工程（ｃ）においてアルギニン残基を除去又は改変することにより、得られるペプチド混合物試料を質量分析に供した場合に、該試料のイオン強度が全体的に低下するが、一方でラベル化されたペプチド断片は、該ラベル化によって選択的にイオン化される。この結果、ラベル化されたペプチド断片由来のイオンの強度が相対的に強くなり、顕著に検出されるようになる。
【００４６】
＜その他の工程＞
本発明の方法は、本発明の効果を損なわない限り、工程（ａ）〜（ｃ）以外の工程を含んでもよい。
例えば、タンパク質のリジン残基を除去又は改変する工程（ｄ）を含むことが好ましい。かかる工程（ｄ）でリジン残基を除去又は改変することにより、リジン残基残基を有していたペプチド断片のプロトンアフィニティが大幅に低下し、質量分析におけるそのイオン強度が低下する。その結果、ラベル化されたペプチド断片のみがより相対的に強い強度でイオン化され、該ペプチド断片由来のイオンをより選択的に検出することが可能となる。
【００４７】
工程（ｄ）において「タンパク質のリジン残基を除去又は改変する」とは、試料調製に用いたタンパク質中に存在したリジン残基を除去又は改変することをいい、これにより得られるペプチド混合物試料に含まれるペプチド断片は、リジン残基を含まないものとなる。
工程（ｄ）に供される対象は、工程（ａ）〜（ｄ）を行う順番によって異なることになるが、工程（ｂ）で切断される前のタンパク質、及び該タンパク質を切断したペプチド断片である。また、タンパク質は、工程（ａ）によってラベル化されたものであってもよく、工程（ｃ）によりアルギニン残基が除去又は改変されたものであってもよい。なお、標的アミノ酸残基がリジン残基である場合には、通常工程（ｄ）は行わないことが好ましい。
【００４８】
工程（ｄ）によりリジン残基を除去する場合には、工程（ｂ）及び工程（ｃ）を行った後、工程（ｄ）を行うことが好ましく、工程（ａ）〜（ｄ）をこの順に行うことがより好ましい。また、工程（ｂ）において、例えば、アルギニン及びリジン残基のＣ末端又はＮ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼを用いることが好ましく、アルギニン及びリジン残基のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼがより好ましく、トリプシンが特に好ましい。リジン残基を除去する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。例えば、リジン残基がペプチド断片のＣ末端に存在する場合には、リジン残基のＮ末端側でペプチド鎖を切断するメタロエンドペプチダーゼＬｙｓＮ等の酵素を用いてリジン残基を遊離させることができる。好ましくは、メタロエンドペプチダーゼＬｙｓＮを用いる。
【００４９】
リジン残基の除去は、例えば、通常溶媒中でリジン残基をＣ末端又はＮ末端に有するペプチド断片に前記の酵素を作用させることにより行うことができる。かかる溶媒は特に限定されず、例えば、上述した工程（ｂ）でタンパク質の切断の際に使用されるものと同じものを使用することができる。酵素の量は、酵素の種類によって適宜選択することができるが、例えば、モル比で、試料の調製に用いたタンパク質１に対して、通常１倍〜１／１００００倍であり、好ましくは１／１０倍〜１／１０００倍である。反応条件は、酵素の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、ペプチド断片、及び酵素を含む溶媒のｐＨは通常６〜９であり、ｐＨ７〜８に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常２０〜６０℃、好ましくは３０〜４０℃であり、反応時間は、通常０．５〜８時間、好ましくは１〜４時間とする。
【００５０】
リジン残基を改変する場合には、リジン残基の側鎖上のアミノ基を修飾して、リジン残基を他のアミノ酸残基に改変することが好ましい。工程（ｄ）においてリジン残基を改変する場合、工程（ａ）〜（ｄ）を行う順番は特に限定されない。また、工程（ｂ）で使用されるプロテアーゼの種類も特に限定されないが、工程（ｄ）でリジン残基を改変した後、工程（ｂ）を行う場合には、リジン残基を認識するプロテアーゼ（例えば、リジン残基のＮ末端又はＣ末端切断能を有するプロテイナーゼ）以外のプロテアーゼを使用することが好ましい。
【００５１】
リジン残基を改変する方法は特に限定されず、公知の方法により行うことができる。例えば、リジン残基の側鎖上のアミノ基をグアニジノ化する等の方法により、リジン残基を、ホモアルギニン残基に改変することができる。
【００５２】
リジン残基の改変は、例えば、溶媒中でタンパク質又はペプチド断片にオルトメチルイソウレアを作用させることにより行うことができる。オルトメチルイソウレアの使用量は、例えば、モル比で、試料の調製に用いたタンパク質１に対して、通常１倍〜１００００００倍であり、好ましくは１００倍〜１００００倍である。反応条件は、適宜選択することができるが、例えば、タンパク質又はペプチド断片、及びオルトメチルイソウレアを含む溶媒のｐＨは通常１２〜１４であり、ｐＨ１３〜１４に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常５０〜８０℃、好ましくは６０〜７０℃であり、反応時間は、通常０．１〜１時間、好ましくは０．１〜０．５時間とする。
【００５３】
本発明の方法においては、上記の工程以外に、タンパク質の構造解析において通常行われる工程、例えば、タンパク質を変性剤（例えば、尿素、塩酸グアニジン）により変性させる工程、タンパク質中のジスルフィド結合を還元する工程、チオール基を保護する工程、限外ろ過による溶媒置換工程の１又は２以上を行うことができる。また、工程（ａ）で使用した未反応の修飾用試薬を除く工程等を適宜行うことができる。これらの操作は、常法により行うことができる。また、これらの工程を行う順番も当業者が適宜選択できるものである。例えば、タンパク質を変性させる工程、タンパク質中のジスルフィド結合を還元する工程、チオール基を保護する工程は、工程（ａ）〜（ｄ）の前に行うことができる。また、例えば工程（ａ）〜（ｄ）の１又は２以上を変性剤の存在下で行うことにより、工程（ａ）〜（ｄ）の１又は２以上と変性工程を同時に行うこともできる。変性剤は、尿素を用いることが好ましく、尿素の濃度は通常０．１〜８Ｍ、好ましくは０．５〜２Ｍとすることができる。
【００５４】
本発明の方法により調製されるペプチド混合物試料においては、解析対象のラベル化されたペプチド断片が、質量分析で他のペプチド断片に比べて相対的に強い感度で検出されるため、質量分析に供する際に、解析対象のラベル化されたペプチド断片をその他のペプチド断片（非ラベル化ペプチド断片）から分離する工程を行わなくてもよい。
【００５５】
本発明の方法によりＮ末端ペプチド、Ｃ末端ペプチド、リジン残基、システイン残基の側鎖上のチオール基、又はリン酸基若しくはＯグリカンが結合しているセリン又はスレオニン残基を解析するための質量分析用ペプチド混合物試料を調製する場合について、以下に例を挙げて説明する。
【００５６】
＜Ｎ末端ペプチドを解析するための質量分析用ペプチド混合物試料の調製方法＞
本発明の好ましい態様として、質量分析によりＮ末端ペプチドを解析するためのペプチド混合物試料の調製方法の一例を以下に記載する。Ｎ末端ペプチドを解析するためのペプチド混合物試料は、通常、ラベル化されたＮ末端ペプチド断片、及びその他のペプチド断片を含むものである。
【００５７】
Ｎ末端ペプチドを解析するためのペプチド混合物試料を調製する場合には、工程（ａ）、工程（ｂ）及び工程（ｃ）をこの順に行うことが好ましい。また、上述したようにリジン残基を除去又は改変する工程（ｄ）を行うことが好ましい。工程（ｄ）は、本発明の効果を損なわない限り、工程（ａ）〜（ｃ）のいずれかの工程の前に行ってもよく、工程（ａ）〜（ｃ）の後に行ってもよい。
【００５８】
工程（ａ）においては、タンパク質のＮ末端のαアミノ基を選択的にラベル化することが好ましい。このためには、通常、αアミノ基及びεアミノ基の存在下でαアミノ基のみを活性化することが必要である。αアミノ基の選択的な活性化は、通常、タンパク質を含む溶液のｐＨを７〜８とすることにより行うことができる。このｐＨでは、εアミノ基はプロトン化されており反応性がきわめて低い。このような条件で、αアミノ基を選択的にラベル化するための修飾試薬を反応させることが好ましい。αアミノ基を選択的にラベル化するための修飾用試薬として、上述した正電荷又は塩基性基を有し、かつαアミノ基の選択的修飾を可能とする官能基、例えば、Ｎ−スクシンイミジル基を有する化合物を用いることが好ましい。中でも、正電荷を有し、かつＮ−スクシンイミジル基を有する化合物が好ましく、ＴＭＰＰ及びＮ−スクシンイミジル基を有する化合物がより好ましい。具体的には、（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニルメチル）トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムブロミド等が挙げられる。
【００５９】
前記の修飾用試薬を用いたαアミノ基の選択的修飾方法は、特に限定されず、当業者が適宜決定することができるものである。例えば、Rapid Communications in Mass Spectrometry, Vol. 22, Issue 13, pages 2063-2072, 2008に記載の方法を参照してこの修飾を行うことができる。
例えば、モル比で、試料の調製に用いたタンパク質１に対して、修飾用試薬を通常１倍〜１００００倍、好ましくは修飾用試薬を１０倍〜１０００倍使用する。反応条件は、修飾用試薬の種類により適宜選択することができる。例えば、タンパク質及び修飾用試薬を含む溶媒のｐＨは通常６〜９とすることができ、ｐＨ７〜８に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃であり、反応時間は、通常０．１〜１時間、好ましくは０．２〜０．６時間とする。
【００６０】
次いで、工程（ｂ）を行い、工程（ａ）で得られるＮ末端のαアミノ基がラベル化されたタンパク質を切断することができる。タンパク質の切断は、アルギニンのＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼにより行われることが好ましい。工程（ｃ）におけるアルギニン残基の除去又は改変は、カルボキシペプチダーゼを用いるアルギニン残基の除去、又はペプチジルアルギニンデイミナーゼを用いるグアニジノ基の脱イミン化若しくはグアニジノ基のヒドラジン分解によって行われることが好ましく、カルボキシペプチダーゼ（好ましくはカルボキシペプチダーゼＢ）を用いるアルギニン残基の除去により行うことがより好ましい。工程（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）における反応条件等は、上述と同様である。
【００６１】
図１に、質量分析によりＮ末端ペプチドを解析する場合のペプチド混合物試料の調製方法の一例を模式的に示す。図１では、工程（ａ）における修飾用試薬としてＴＭＰＰ化合物を使用している。また、図１では、ＴＭＰＰでＮ末端をラベル化（修飾）したタンパク質をトリプシンにより切断し（工程（ｂ））、生成するＣ末端がアルギニン残基であるペプチド断片にカルボキシペプチダーゼを作用させてアルギニン残基を除去している（工程（ｃ））。得られるペプチド混合物試料を後述する質量分析に供すると、その他のペプチド断片由来のイオンに比べて、ＴＭＰＰでラベル化されたＮ末端ペプチド由来のイオンが顕著に強い強度で検出されるため、該ペプチド由来のイオンを選択的に検出することができる。
【００６２】
＜Ｃ末端ペプチドを解析するための質量分析用ペプチド混合物試料の調製方法＞
質量分析によりＣ末端ペプチドを解析するためのペプチド混合物試料の調製方法の一例を以下に記載する。Ｃ末端ペプチドを解析するためのペプチド混合物試料は、通常、ラベル化されたＣ末端ペプチド断片、及びその他のペプチド断片を含むものである。
【００６３】
Ｃ末端ペプチドを解析するためのペプチド混合物試料を調製する場合には、工程（ａ）、工程（ｂ）及び工程（ｃ）をこの順に行うことが好ましい。また、上述したようにリジン残基を除去又は改変する工程（ｄ）を行うことが好ましい。工程（ｄ）は、本発明の効果を損なわない限り、工程（ａ）〜（ｃ）のいずれかの工程の前に行ってもよく、工程（ａ）〜（ｃ）の後に行ってもよい。
【００６４】
工程（ａ）においては、タンパク質のＣ末端のαカルボキシル基を選択的にラベル化することが好ましい。このためには、例えば、タンパク質のＣ末端におけるオキサゾロン環形成によりαカルボキシル基を選択的に活性化することが好ましい。オキサゾロン環形成のための試薬としては、例えば、酸無水物が挙げられ、具体的には、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸、無水安息香酸、オルトスルホ安息香酸無水物、無水プロピオン酸が挙げられる。このような試薬によりオキサゾロン環を形成させ、次いでαカルボキシル基をラベル化するための修飾用試薬を反応させることが好ましい。活性化されたαカルボキシル基をラベル化するための修飾用試薬として、上述した正電荷又は塩基性基を有し、かつαカルボキシル基の選択的修飾を可能とする官能基、例えば、アミノ基を有する化合物を用いることが好ましい。中でも、正電荷を有する基を有し、かつアミノ基を有する化合物が好ましく、ＴＭＰＰ及びアミノ基を有する化合物がより好ましい。具体的には、（アミノプロピル）トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムブロミド等が挙げられる。
【００６５】
前記の修飾用試薬を用いたαカルボキシル基の選択的修飾方法は、特に限定されず、当業者が適宜決定することができるものである。例えば、Anal Bioanal Chem, 2012, Vol. 404, pp. 125-132に記載の方法を参照してこの修飾を行うことができる。
例えば、モル比で、試料の調製に用いたタンパク質１に対して、修飾用試薬を通常１倍〜１０００００倍、好ましくは１０倍〜１００００倍使用する。反応条件は、例えば、タンパク質及び修飾用試薬を含む溶媒のｐＨを通常８〜１２とすることができ、ｐＨ９〜１１に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常４０〜８０℃、好ましくは５５〜６５℃であり、反応時間は、通常０．２〜４時間、好ましくは０．５〜２時間とする。
【００６６】
次いで、工程（ｂ）を行い、工程（ａ）で得られるＣ末端のαカルボキシル基がラベル化されたタンパク質を切断することができる。タンパク質の切断は、アルギニンのＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼにより行われることが好ましい。工程（ｃ）におけるアルギニン残基の除去又は改変の好ましい態様は、上述したＮ末端ペプチドを解析するための質量分析用ペプチド混合物試料の調製方法におけるものと同じである。工程（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）における反応条件等は、上述と同様である。
【００６７】
＜リジン残基を解析するための質量分析用ペプチド混合物試料の調製方法＞
質量分析によりタンパク質中のリジン残基を解析するためのペプチド混合物試料の調製方法の一例を以下に記載する。タンパク質中のリジン残基を解析するためのペプチド混合物試料は、通常、リジン残基の側鎖上のアミノ基（εアミノ基）がラベル化されたペプチド断片、及びその他のペプチド断片を含むものである。
工程（ａ）〜（ｃ）を行う順番は特に限定されない。前記のリジン残基を除去又は改変する工程（ｄ）は行わないことが好ましい
【００６８】
工程（ａ）においては、リジン残基の側鎖上のεアミノ基を選択的にラベル化することが好ましい。リジン残基の側鎖上のεアミノ基を選択的にラベル化するための修飾用試薬として、上述した正電荷又は塩基性基を有し、かつεアミノ基の選択的修飾を可能とする官能基、例えば、ピリリウムを有する化合物を用いることが好ましい。中でも、ピリリウムを有する化合物が好ましく、具体的には、２，４，６−トリメチルピリリウムテトラフルオロボラート等が挙げられる
【００６９】
前記の修飾用試薬を用いたリジン残基の側鎖上のεアミノ基の選択的修飾方法は、特に限定されず、当業者が適宜決定することができるものである。例えば、市販されているリジン残基を特異的に標識する試薬（例えば、商品名Ｐｙ−Ｔａｇ  ｆｏｒ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、大陽日酸社製）を使用することができ、該試薬に添付されている取扱説明書を参照してこの修飾を行うことができる。
例えば、モル比で、試料の調製に用いたタンパク質１に対して、修飾用試薬を通常１倍〜１００００倍、好ましくは１０倍〜１０００倍使用する。反応条件は、例えば、タンパク質及び修飾用試薬を含む溶媒のｐＨを通常６〜１０とすることができ、ｐＨ７〜９に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常２０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃であり、反応時間は、通常０．１〜５時間、好ましくは０．２〜４時間とする。
工程（ｂ）及び（ｃ）における反応条件等は、上述と同様である。
【００７０】
＜システイン残基を解析するための質量分析用ペプチド混合物試料の調製方法＞
質量分析によりタンパク質中のシステイン残基を解析するためのペプチド混合物試料の調製方法の一例を以下に記載する。タンパク質中のシステイン残基を解析するためのペプチド混合物試料は、通常、システイン残基の側鎖上のチオール基がラベル化されたペプチド断片、及びその他のペプチド断片を含むものである。
【００７１】
工程（ａ）〜（ｃ）を行う順番は特に限定されないが、上述したように、工程（ｃ）においてアルギニン残基を除去する場合には、工程（ｂ）を行った後、工程（ｃ）を行うことが好ましく、工程（ａ）〜（ｃ）をこの順番に行うことが好ましい。また、上述したようにリジン残基を除去又は改変する工程（ｄ）を行うことが好ましい。工程（ｄ）は、本発明の効果を損なわない限り、工程（ａ）〜（ｃ）のいずれかの工程の前に行ってもよく、工程（ａ）〜（ｃ）の後に行ってもよい。
【００７２】
工程（ａ）においては、システインの側鎖上のチオール基を選択的にラベル化することが好ましい。チオール基を選択的にラベル化する場合には、工程（ａ）を行う前に、タンパク質中のジスルフィド結合を還元し、チオール基とすることが好ましい。チオール基を選択的にラベル化するための修飾用試薬として、上述した正電荷又は塩基性基を有し、かつチオール基の選択的修飾を可能とする官能基、例えば、ヨードアセチル基を有する化合物を用いることが好ましい。中でも、正電荷を有し、かつヨードアセチル基を有する化合物が好ましく、具体的には、８−ヨードアセトキシ３，６−ジオキソアルキルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。
【００７３】
前記の修飾用試薬を用いたシステイン残基の側鎖上のチオール基の選択的修飾方法は、特に限定されず、当業者が適宜決定することができるものである。例えば、Shimada et al., Analytical Biochemistry, Vol. 421, Issue 2, 15 February 2012, Pages 785-787に記載の方法を参照してこの修飾を行うことができる。
例えば、モル比で、試料の調製に用いたタンパク質１に対して、修飾用試薬を通常１倍〜１０００００倍、好ましくは１０倍〜１０００倍使用する。反応条件は、例えば、タンパク質及び修飾用試薬を含む溶媒のｐＨを通常６〜９とすることができ、ｐＨ７〜８に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃であり、反応時間は、通常０．１〜１時間、好ましくは０．２〜０．５時間とする。
工程（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）における反応条件等は、上述と同様である。
【００７４】
図２に、質量分析によりシステイン残基を解析する場合のペプチド混合物試料の調製方法の一例として、工程（ａ）〜（ｃ）をこの順に行う場合を模式的に示す。図２中の「Ｌａｂｅｌ」の記載は、正電荷を有する基を示す。図２に示す方法では、タンパク質のジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を還元した後、工程（ａ）によりシステイン残基の側鎖上のチオール基をラベル化し、次いでラベル化されたタンパク質をトリプシンにより切断し（工程（ｂ））、生成するＣ末端がアルギニン残基であるペプチド断片にカルボキシペプチダーゼを作用させてアルギニン残基を除去している（工程（ｃ））。得られるペプチド混合物試料を後述する質量分析に供すると、その他のペプチド断片由来のイオンに比べて、ラベル化されたシステイン残基を含むペプチド由来のイオンが顕著に強い強度で検出されるため、該ペプチド由来のイオンを選択的に検出することができる。
【００７５】
＜リン酸化部位又は糖鎖結合部位を解析するための質量分析用ペプチド混合物試料の調製方法＞
質量分析によりタンパク質のリン酸化部位又は糖鎖（Ｏグリカン）結合部位を解析するためのペプチド混合物試料の調製方法の一例を以下に記載する。リン酸化部位を解析するためのペプチド混合物試料は、通常、リン酸基が結合していたセリン又はスレオニン残基の側鎖がラベル化されたペプチド断片、及びその他のペプチド断片を含む。Ｏグリカン結合部位を解析するためのペプチド混合物試料は、通常、Ｏグリカンが結合していたセリン又はスレオニン残基の側鎖がラベル化されたペプチド断片、及びその他のペプチド断片を含む。
【００７６】
工程（ａ）〜（ｃ）を行う順番は特に限定されない。例えば、上述したように工程（ｃ）においてアルギニン残基を除去する場合には、工程（ｂ）を行った後、工程（ｃ）を行うことが好ましい。また、上述したようにリジン残基を除去又は改変する工程（ｄ）を行うことが好ましい。工程（ｄ）は、本発明の効果を損なわない限り、工程（ａ）〜（ｃ）のいずれかの工程の前に行ってもよく、工程（ａ）〜（ｃ）の後に行ってもよい。
【００７７】
工程（ａ）においては、リン酸基若しくはＯグリカンが結合しているセリン又はスレオニン残基の側鎖を選択的にラベル化することが好ましい。リン酸基若しくはＯグリカンが結合しているセリン又はスレオニン残基の側鎖を選択的にラベル化する方法は特に限定されないが、例えば、まずリン酸基又はＯグリカンをβ脱離により脱離させてリン酸化部位又はＯグリカン結合部位に二重結合を形成させ、次いで該二重結合に対するマイケル付加反応を行うにより、該セリン又はスレオニン残基の側鎖を選択的にラベル化することができる。
【００７８】
β脱離の反応条件等は特に限定されず、当業者が適宜決定することができるものである。例えば、タンパク質又はペプチド断片を含む溶媒のｐＨを通常１３〜１５とすることができ、ｐＨ１３．５〜１４に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃であり、反応時間は、通常０．５〜４時間、好ましくは１〜３時間とする。
【００７９】
マイケル付加に用いる修飾用試薬は特に限定されず、上述した正電荷又は塩基性基（好ましくは塩基性基、より好ましくは三級アミノ基）を有し、かつ求核基を有する化合物を用いることができる。求核基として、例えばチオール基が挙げられる。具体的な修飾用試薬として、例えば、２−ジメチルアミノエタンチオールが挙げられる。
【００８０】
前記の修飾用試薬を用いたマイケル付加反応の反応条件等は、特に限定されず、当業者が適宜決定することができるものである。
例えば、モル比で、試料調製に用いたタンパク質１に対して、修飾用試薬を通常１倍〜１００００００倍、好ましくは１００倍〜１００００倍使用する。反応条件は、例えば、タンパク質及び修飾用試薬を含む溶媒のｐＨを通常１〜１４とすることができ、ｐＨ７〜１４に調整することが好ましい。また、反応温度は、通常２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃であり、反応時間は、通常０．５〜４時間、好ましくは１〜３時間とする。
工程（ｂ）、工程（ｃ）及び工程（ｄ）における反応条件等は、上述と同様である。
【００８１】
質量分析によりリン酸化部位を解析する場合のペプチド混合物試料の調製方法の一例として、工程（ｂ）、工程（ａ）及び工程（ｃ）の順に操作を行う場合の例を、図３に模式的に示す。また、Ｏグリカン結合部位を解析する場合のペプチド混合物試料の調製方法の一例として、工程（ｂ）、工程（ａ）及び工程（ｃ）の順に操作を行う場合の例を、図４に模式的に示す。図３及び図４においては、タンパク質又はペプチド断片中の側鎖がリン酸化されているスレオニン残基（図３）、又はＯグリカンが結合しているスレオニン残基（図４）を、模式的に「Ｔ」と示している。例えば図３中では、スレオニン残基（Ｔ）の側鎖に結合しているリン酸基を、「Ｐ」で表している。図３及び図４に示す方法では、まずタンパク質をトリプシンにより切断して（工程（ｂ））、Ｃ末端がアルギニン残基又はリジン残基であるペプチド断片の混合物を得、該ペプチド断片からリン酸基又はＯグリカンをβ脱離させて二重結合を形成させた後、該二重結合に修飾用試薬を作用させてマイケル付加によりスレオニン残基の側鎖をラベル化し（工程（ａ））、次いでペプチド断片にカルボキシペプチダーゼＢを作用させてＣ末端のアルギニン残基を除去している（工程（ｃ））。得られるペプチド混合物試料を後述する質量分析に供すると、その他のペプチド断片由来のイオンに比べて、ラベル化されたスレオニン残基を含むペプチド断片由来のイオンが顕著に強い強度で検出されるため、該ペプチド由来のイオンを選択的に検出することができる。図３及び４では、スレオニン残基の側鎖にリン酸基又はＯグリカンが結合している場合を例として示しているが、セリン残基の側鎖にリン酸基又はＯグリカンが結合している場合についても、同様の方法で試料を調製することができる。
【００８２】
＜質量分析＞
上記の方法によって得られたペプチド混合物試料は、質量分析に供される。
本発明は、前記の方法により調製されるペプチド混合物試料を質量分析に供し、ラベル化されたペプチド断片に由来するイオンを検出する工程を含む、ラベル化されたペプチド断片の選択的検出方法も包含する。
上記の方法で調製されたペプチド混合物試料は、解析対象のラベル化されたペプチド断片及びその他のペプチド断片を含むが、解析対象のペプチド断片には、解析対象のペプチド断片の質量分析における検出感度を向上させる効果を有する修飾基（例えば、正電荷を有する基又は塩基性基）が結合している。
例えば、工程（ａ）においてＴＭＰＰを有する修飾用試薬を用いた場合には、解析対象のペプチド断片には強い正電荷を有するＴＭＰＰが結合していることになる。さらに、ペプチド混合物試料中にはアルギニン残基が存在しない。このため本発明によれば、解析対象のペプチド断片を質量分析において選択的にイオン化することが可能となる。
【００８３】
前記検出工程においては、ペプチド混合物試料をイオン化し、生成したイオンの中からイオン強度が相対的に高いイオンをラベル化されたペプチド断片に由来するイオンとして検出することができる。また、本発明においては、ペプチド混合物試料をイオン化し、生成したイオンの中からイオン強度が最も高いイオンをラベル化されたペプチド断片に由来するイオンとして選択することが好ましい。本発明においては、通常、前記で選択されたイオン強度が最も高いイオンを、ラベル化されたペプチド断片に由来するイオンとして検出することができる。このような質量分析の工程を、「第一の質量分析工程」ともいう。
【００８４】
質量分析におけるイオン化法としては、具体的には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ；  ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ；  ＥＳＩ）法等が挙げられる。好ましくは、ＭＡＬＤＩ法によりイオン化を行う。
【００８５】
質量分析は、ＭＡＬＤＩ法を利用した質量分析装置による質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）により行われることが好ましい。ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、マトリックスにペプチド混合物試料を混合して、公知の方法により行うことができる。測定モードは、ラベル化に用いた修飾用試薬が有する修飾基により選択することができる。正電荷又は塩基性基を有する修飾用試薬を用いた場合には、ポジティブモードとすることが好ましい。マトリックスは特に限定されず、例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン、２，５−ジヒドロキシ安息香酸等を使用することができる。
【００８６】
本発明においては、該ペプチド混合物試料をＭＳ／ＭＳ分析に供することが好ましく、これにより、前記で検出又は選択されたイオンが解析対象のペプチド断片に由来するイオンであることを確認することができる。また、ＭＳ／ＭＳ分析を行うことにより、後述するように解析対象のペプチド断片のアミノ酸配列を決定することができる。
【００８７】
より具体的には、第一の質量分析工程で選択（検出）したイオンをフラグメントイオンに解離させてさらに質量分析に供し、フラグメントイオンスペクトルを取得することが好ましい。このような質量分析の工程を、「第二の質量分析工程」ともいう。前記フラグメントイオンスペクトルにおいてラベル化に用いた修飾用試薬に対応するｍ／ｚ値を有するレポーターイオンの存在を検出することにより、該選択（検出）したイオンがラベル化されたペプチド断片に由来するイオンであることを確認することができる。
【００８８】
レポーターイオンのｍ／ｚ値は、修飾用試薬に応じて異なるが、例えば、ＴＭＰＰを有する修飾用試薬を用いた場合には、ＴＭＰＰ特有のピーク（５７３Ｄａ）が出現する。従って、ＭＳ／ＭＳに供したプリカーサーイオンがラベル化されたペプチド由来のイオンであることを容易に確認することができる。
【００８９】
前記質量分析（好ましくはＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ）におけるイオンの解離方法（開裂操作方法）としては、ポストソース型を採用することができる。イオン化法に応じて当業者によって適宜選択されるが、より具体的には、ポストソース分解（Ｐｏｓｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｄｅｃａｙ；  ＰＳＤ）によるもの、衝突誘起解離（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；  ＣＩＤ）、赤外多光子解離（ＩＲＭＰＤ）、及び光誘起解離（ＵＶ−ＰＤ）のいずれかによるものが挙げられる。特に、ポストソース分解によるものが好ましい。
【００９０】
例えば、前述した第一の質量分析工程、及び第二の質量分析工程を行うことにより、ラベル化されたペプチド断片のアミノ酸配列を決定することができる。
本発明は、前記方法により調製されるペプチド混合物試料を質量分析に供し、ラベル化されたペプチド断片に由来するイオンを検出する工程、及び該ラベル化されたペプチド断片のアミノ酸配列を決定する工程を含む、ラベル化されたペプチド断片のアミノ酸配列決定方法も包含する。
検出工程の好ましい態様等は、上述した通りである。前記第一の質量分析工程において検出した解析対象のペプチド断片由来のイオンをプリカーサーイオンとしてＭＳ／ＭＳ解析に供すると、フラグメントイオンを検出することができるため、その配列を決定することができる。また、アミノ酸配列の決定に用いるＭＳ／ＭＳ解析方法としては、ＥＳＩ法を利用した質量分析装置によるＭＳ／ＭＳ解析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置によるＰＳＤ解析、ＣＩＤ解析等の方法から当業者が適宜選択することができ、好ましくはＰＳＤ解析を用いる。
【００９１】
上述のように、本発明では、解析対象のペプチド断片が質量分析において検出感度を向上させる効果を有する修飾基等で修飾されていることと、ペプチド断片からアルギニン残基を除去又は改変することによって、質量分析において解析対象のラベル化されたペプチド断片由来のイオンのピークを他のペプチド断片由来のイオンのピークと明確に区別することができる。このため、タンパク質から質量分析用の試料を調製する際に、ペプチド混合物から解析すべきペプチド断片を分離精製する必要がなく、解析すべきペプチド断片とその他のペプチド断片との混合物を質量分析に供することができる。さらに、質量分析で検出した解析対象のペプチド断片由来のイオンをプリカーサーイオンとしてＭＳ／ＭＳ解析に供すると、フラグメントイオンを検出することができるため、その配列を決定することができる。例えばタンパク質の配列が未知である場合は、ｄｅ  ｎｏｖｏシーケンシングを実行してアミノ酸配列を決定することができる。
【００９２】
本発明は、質量分析によるタンパク質の構造解析において有用であり、例えば、プロテオミクスにおける末端配列解析、医薬品等に用いるタンパク質（組換えタンパク質）の品質管理、リン酸化ペプチドのショットガンプロテオミクス、Ｏグリカン結合ペプチドのショットガンプロテオミクス等に利用することができる。
【実施例】
【００９３】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら制限されるものではない。
【００９４】
＜実施例１＞
１．試薬
アセトニトリル、及び重炭酸ナトリウムは和光純薬社製のものを使用した。α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）は、島津ＧＬＣ社製のものを使用した。メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ヨードアセトアミド、（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニルメチル）トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムブロミド（実施例中、「ＴＭＰＰ」という）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及びトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩＳ）（ウサギ由来）は、シグマ・アルドリッチ社製のものを使用した。トリプシンは、プロメガ社より購入した。メタロプロテイナーゼＬｙｓ−Ｎ（以下、単に「Ｌｙｓ−Ｎ」という）はU-Protein Express BV社（ユトレヒト、オランダ）のものを使用した。カルボキシペプチダーゼＢは、Worthington Biomedical Corp.より購入した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、インビトロジェン社のＮｕ−ＰＡＧＥ（登録商標）キットを使用した（Life technologies）。ＣＢＢ染色液は、ナカライテスク社より購入した。
【００９５】
ＢＳＡ、及びＴＰＩＳの各タンパク質について、以下の処理を行った。
２．タンパク質の還元アルキル化
タンパク質１００ｐｍｏｌ（ＢＳＡの場合には、７μｇ、ＴＰＩＳの場合には、２．７μｇ）を、１００μＬの７８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３／１．２Ｍ  尿素溶液に溶解させた。これに１μＬの０．１Ｍ  ＴＣＥＰ溶液を添加して、３７℃で１時間反応させた。この溶液に２．７μＬの０．５５Ｍ  ヨードアセトアミド溶液を添加し、暗所条件で１５分間反応させた。
【００９６】
３．タンパク質Ｎ末端のＴＭＰＰラベル化
還元アルキル化を行ったタンパク質の混合物に対して、２００ｍＭ  ＴＭＰＰ溶液を１μＬ添加した。この溶液に対し５分間超音波処理を行った後、５０℃で３０分間反応させてＮ末端のαアミノ基をＴＭＰＰで修飾した。反応させた溶液について、下記の４．に記載の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＴＭＰＰの未反応物などの不純物を除去した後、酵素処理を行った。
【００９７】
４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる残存試薬の除去
上記の３．で得られたＴＭＰＰでラベル化したタンパク質の溶液にＳａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒと還元剤（１Ｍ  ＤＴＴ）溶液を加えて混合し、７０℃で１０分間反応させた。このサンプルを遠心処理した後、ビスアクリルアミドゲルに搭載してＭＯＰＳバッファー（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ、０．１％  ＳＤＳ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて５０分間電気泳動を行った。泳動を行ったゲルをＣＢＢ染色でバンドを確認した後、ゲルを切り出した。切り出したゲルについて脱色液（５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５０％  アクリルアミド溶液）で脱染色処理を行った後、Ｉｎ−ｇｅｌで酵素消化を行った。
【００９８】
５．タンパク質のトリプシン消化及びカルボキシペプチダーゼＢ消化、並びにＬｙｓＮ消化
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製を行ったタンパク質に対し、トリプシンを添加して３７℃で一晩反応させた。ゲルから消化物ペプチドを回収した後、次にこの溶液にカルボキシペプチダーゼＢ溶液を添加し、３７℃で１時間再び反応させた。さらにこの溶液にＬｙｓＮ溶液を添加し、１時間反応させた。反応させた溶液について、Ｚｉｐ−Ｔｉｐ（登録商標、ミリポア社製）を用いて脱塩処理を行って、サンプル溶液とした。このサンプル溶液を、後述するマトリックス溶液と混合してＭＡＬＤＩ−ＭＳ解析を行った。
【００９９】
５．質量分析
ＣＨＣＡを、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と１０ｍｇ／ｍＬ  ＭＤＰＮＡとを含む５０％アセトニトリル溶液に、２ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶解しマトリックス溶液とした。サンプル溶液０．５μＬとマトリックス溶液０．５μＬとをＭＡＬＤＩプレート上で混合し、自然乾燥させた。サンプルプレートには、μＦｏｃｕｓ  ＭＡＬＤＩプレート（μｆｏｃｕｓ  ＭＡＬＤＩ  ｐｌａｔｅ（登録商標）  ７００μｍ、Ｈｕｄｓｏｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用した。ラベル化ペプチドのＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルの計測には、ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳ（ＡＸＩＭＡ−Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ／Ｋｒａｔｏｓ、ＵＫ）のＰｏｓｉｔｉｖｅモードを使用した。
【０１００】
６．結果
上述したように、ＢＳＡ及びＴＰＩＳのＮ末端をＴＭＰＰでラベル化した後、１）トリプシンによる断片化、２）カルボキシペプチダーゼＢによるアルギニン残基とリジン残基の除去、３）切れ残ったリジン残基のＬｙｓＮによる除去を行った。１）の操作、１）及び２）の操作、１）〜３）の操作を行って得られた各ペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを、図５に示す。
【０１０１】
ＴＭＰＰでラベル化したペプチドについては、アルギニン残基が含まれる場合、ＭＳ／ＭＳでのフラグメントイオンが出現しなくなる問題が報告されている（Anal. Chem., 2005, 77 (7), pp 2085-2096）。そこで、サンプルについてトリプシン消化を行った。トリプシン消化を行うと、得られるペプチド消化物に含まれるペプチド断片は、Ｃ末端にアルギニン残基又はリジン残基を有するものとなる。トリプシン消化によって得られるＮ末端ペプチド断片の配列は、ＢＳＡの場合はAsp-Thr-His-Lys（配列番号１）であり、ＴＰＩＳの場合はAla-Pro-Ser-Arg（配列番号２）である。このサンプルに対するＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルでは、ＴＭＰＰでラベル化されたペプチドが優位に検出されているが、他のペプチドも同程度の強度で出現しており識別はやや困難であった（図５の（ａ）及び（ｄ））。次に、カルボキシペプチダーゼＢを用いて、ペプチド断片のＣ末端のアルギニン残基の除去を行ったところ、ＴＭＰＰでラベル化したペプチド断片が相対的に強く検出されるようになった（図５の（ｂ）及び（ｅ）、特に図５の（ｅ））。図５の（ａ）〜（ｆ）中、矢印で示すピークが、ＴＭＰＰでラベル化されたＮ末端ペプチド由来のイオンのピークである。矢印で示すピークについてさらにＭＳ／ＭＳ分析を行い、決定したＴＭＰＰラベル化ペプチドのアミノ酸配列（一文字表記）も、図５の（ａ）〜（ｆ）中に示す。
【０１０２】
さらに、検出したＴＭＰＰでラベル化したペプチド断片のＭＳ／ＭＳスペクトルを取得すると、カルボキシペプチダーゼＢ処理前のサンプル、すなわちＴＭＰＰでラベル化されたＴＰＩＳのＮ末端断片がアルギニン残基を有する場合（Ala-Pro-Ser-Arg（配列番号２））には、ペプチド断片のフラグメントイオンがほとんど出現しなかった（図６の（ａ））。
一方、カルボキシペプチダーゼＢ処理によりペプチド断片からアルギニン残基を除去することで（アルギニン除去後のアミノ酸配列：Ala-Pro-Ser）、本来のＴＭＰＰラベル化ペプチドで出現するピークが検出されるようになり、より多くのイオン種が確認された（図６の（ｂ））。
図６の（ａ）及び（ｂ）中に示されるアミノ酸配列（一文字表記）は、ＭＳ／ＭＳ分析に供したＴＭＰＰでラベル化したペプチド断片のアミノ酸配列である。
【０１０３】
また、リジン残基はカルボキシペプチダーゼＢではあまり除去されていない傾向が見られている。これはカルボキシペプチダーゼＢによるリジン残基への反応が遅いためであることが推測され、先行文献（Anal. Chem., 2007, 79 (4), pp 1583-1590）でもリジン残基の残ったペプチドが検出されている。そこで、カルボキシペプチダーゼＢ処理の後にＬｙｓＮによってリジン残基のＮ末端側で切断する工程を加えると、ペプチド鎖からアルギニン残基及びリジン残基が除去され、ラベル化したペプチドをより選択的に検出できた（図５の（ｃ）及び（ｆ））。
【０１０４】
末端配列の解析において、１）ＴＭＰＰで末端をラベル化し、２）トリプシン消化、３）カルボキシペプチダーゼＢ消化を行い、４）ＭＡＬＤＩ−ＭＳ解析を行うと、様々なＮ末端又はＣ末端ペプチドの、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ解析において有効なアプローチとなることが示された。また、このような方法によれば、ラベル化したペプチド断片を選択的にイオン化することができるため、末端ペプチド以外にも、システイン残基に対するラベル化、リン酸又はＯ−グリカンが結合しているセリン又はスレオニン残基から該リン酸又はＯ−グリカンを脱離させることによって生じる二重結合に対するマイケル付加反応によるラベル化等の、ペプチドに対する様々なラベル化反応にも適用可能である。
【０１０５】
以下に、本発明の実施態様の例を示す。なお、本発明は、これらの各実施態様に何ら限定されるものではなく、請求項に記載される範囲で種々の変更が可能である。
＜例１＞
＜Ｎ末端解析プロトコール＞
タンパク質に、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３溶液１６μＬと８Ｍ  尿素溶液３μＬを添加し溶解させる。ここに１００ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液を２μＬ添加して、３７℃で１時間反応させる。この後１００ｍＭ  ヨードアセトアミド溶液を２μＬ添加し、室温で１時間反応させる。この溶液に氷冷したアセトンを１００μＬ添加した後、氷中で１時間沈殿させる。１時間後にアセトンを取り除き、再び１００μＬのアセトンを加えて再び１時間沈殿させる。この溶液に対して遠心分離をしてから溶液を除去した後、遠心エバポレーターを用いてアセトンを完全に除去する。ここに１０ｍＭ  （Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニルメチル）トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムブロミド（ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ）溶液（２０％アセトニトリル／水）を２０μＬ添加した後、超音波処理を５分間行った後、５５℃で３０分間反応させる。この反応液に氷冷したアセトンを再び１００μＬ添加し、１時間沈殿させた後にアセトンを除去し、再度１００μＬのアセトンを加えて１時間沈殿させる。この溶液に対して遠心分離をしてから溶液を除去した後、遠心エバポレーターを用いてアセトンを完全に除去した後、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３溶液を２０μＬ添加する。ここに１ｐｍｏｌのトリプシンを添加した後、３７℃で一晩反応させる。ここにさらに１ｐｍｏｌのカルボキシペプチダーゼＢ溶液を添加して３７℃で１時間反応させる。この溶液を１０倍希釈した後、ＣＨＣＡとＭＤＰＮＡの等量溶液と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いた解析を実施する。
【０１０６】
＜例２＞
＜Ｃ末端解析プロトコール＞
タンパク質に、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３溶液１６μＬと８Ｍ  尿素溶液３μＬを添加し溶解させる。ここに１００ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液を２μＬ添加して、３７℃で１時間反応させる。この後１００ｍＭ  ヨードアセトアミド溶液を２μＬ添加し、室温で１時間反応させる。この溶液に氷冷したアセトンを１００μＬ添加した後、氷中で１時間沈殿させる。１時間後にアセトンを取り除き、再び１００μＬのアセトンを加えて再び１時間沈殿させる。この溶液に対して遠心分離をしてから溶液を除去した後、遠心エバポレーターを用いてアセトンを完全に除去する。この乾燥したサンプルにギ酸・無水酢酸・２，２，３，３，３−ペンタフルオロ−１−プロパノール（Ｐｆｐ−ＯＨ）の混合溶液（１：１：１）を１２μＬ添加する。このサンプルを遠心エバポレーター内部で６０℃で２０分間反応させる。この手順を２回繰り返した後、トルエン・Ｐｆｐ−ＯＨ混合溶液（５：２）を１４μＬ添加し、遠心エバポレーターによる溶媒除去を行う。乾燥したサンプルに、１ｕｍｏｌ／μＬのＴＭＰＰ−プロピルアミンを２μＬと、トリエチルアミン・メタノール混合溶液（１：１）を４μＬ添加する。この溶液に対して５分間超音波処理を行った後、６０℃で１時間反応させる。この混合液を、遠心エバポレーターを用いて溶媒除去を行った後、１０μＬのＭｉｌｌｉＱ水に溶解する。この反応液に氷冷したアセトンを再び１００μＬ添加し、１時間沈殿させた後にアセトンを除去し、再度１００μＬのアセトンを加えて１時間沈殿させる。遠心分離を行った後にアセトンを再び除去して遠心エバポレーターを用いてアセトンを完全に除去した後、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３溶液を２０μＬ添加する。ここに１ｐｍｏｌのトリプシンを添加した後、３７℃で一晩反応させる。ここにさらに１ｐｍｏｌのカルボキシペプチダーゼＢ溶液を添加して３７℃で１時間反応させる。この溶液を１０倍希釈した後、ＣＨＣＡとＭＤＰＮＡの等量溶液と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いた解析を実施する。
【０１０７】
＜例３＞
＜システイン解析プロトコール＞
タンパク質に、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３溶液１６μＬと８Ｍ  尿素溶液３μＬを添加し溶解させる。ここに１００ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液を２μＬ添加して、３７℃で１時間反応させる。この後１００ｍＭ  ＴＥ−ＩＡＡ（３−ヨードアセトアミドプロピルトリエチルアンモニウムヨージド）溶液を２μＬ添加し、室温で１時間反応させる。この溶液に氷冷したアセトンを１００μＬ添加した後、氷中で１時間沈殿させる。１時間後にアセトンを取り除き、再び１００μＬのアセトンを加えて再び１時間沈殿させる。この溶液に対して遠心分離をしてから溶液を除去した後、遠心エバポレーターを用いてアセトンを完全に除去する。このサンプルに１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３溶液を２０μＬ添加する。ここに１ｐｍｏｌのトリプシンを添加した後、３７℃で一晩反応させる。ここにさらに１ｐｍｏｌのカルボキシペプチダーゼＢ溶液を添加して３７℃で１時間反応させる。この溶液を１０倍希釈した後、ＣＨＣＡとＭＤＰＮＡの等量溶液と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いた解析を実施する。
【０１０８】
＜例４＞
＜リン酸化解析プロトコール＞
タンパク質に、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３溶液１６μＬと８Ｍ  尿素溶液３μＬを添加し溶解させる。ここに１００ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液を２μＬ添加して、３７℃で１時間反応させる。この後１００ｍＭヨードアセトアミド溶液を２μＬ添加し、室温で１時間反応させる。この溶液に氷冷したアセトンを１００μＬ添加した後、氷中で１時間沈殿させる。１時間後にアセトンを取り除き、再び１００μＬのアセトンを加えて再び１時間沈殿させる。この溶液に対して遠心分離をしてから溶液を除去した後、遠心エバポレーターを用いてアセトンを完全に除去する。このサンプルを１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３溶液を２０μＬ添加する。ここに１ｐｍｏｌのトリプシンを添加した後、３７℃で一晩反応させる。ここにさらに１ｐｍｏｌのカルボキシペプチダーゼＢ溶液を添加して３７℃で１時間反応させる。この反応液を、遠心エバポレーターを用いて溶媒を除去した後、Ｂａ（ＯＨ）２飽和溶液を２０μＬ添加する。さらに２００ｍＭのＮ−（２−メルカプトエチル）−６−メチルニコチンアミド溶液（５０％アセトニトリル／水）を２０μＬ添加して、３７℃で２時間反応させる。反応後は１０％  ＴＦＡ水溶液を１０μＬ添加した後、ＭｉｌｌｉＱ水を１５０μＬ添加する。この溶液をＺｉｐ−Ｔｉｐ（登録商標、ミリポア社製）で脱塩処理を行った後、ＣＨＣＡとＭＤＰＮＡの等量溶液と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いた解析を実施する。
【０１０９】
＜例５＞
＜Ｏグリカン結合ペプチド解析プロトコール＞
タンパク質を１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３溶液１６μＬと８Ｍ  尿素溶液３μＬを添加し溶解させる。ここに１００ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液を２μＬ添加して、３７℃で１時間反応させる。この後１００ｍＭヨードアセトアミド溶液を２μＬ添加し、室温で１時間反応させる。この溶液に氷冷したアセトンを１００μＬ添加した後、氷中で１時間沈殿させる。１時間後にアセトンを取り除き、再び１００μＬのアセトンを加えて再び１時間沈殿させる。この溶液に対して遠心分離をしてから溶液を除去した後、遠心エバポレーターを用いてアセトンを完全に除去する。このサンプルを１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３溶液を２０μＬ添加する。ここに１ｐｍｏｌのトリプシンを添加した後、３７℃で一晩反応させる。ここにさらに１ｐｍｏｌのカルボキシペプチダーゼＢ溶液を添加して３７℃で１時間反応させる。この反応液を、遠心エバポレーターを用いて溶媒を除去した後、１％  トリエチルアミン、０．１％  ＮａＯＨ、２０％  エタノール混合溶液２０μＬを添加する。さらに２００ｍＭのＮ−（２−メルカプトエチル）−６−メチルニコチンアミド溶液（５０％アセトニトリル／水）を２０μＬ添加して、５０℃で２．５時間反応させる。反応後は１０％  ＴＦＡ水溶液を１０μＬ添加した後、ＭｉｌｌｉＱ水を１５０μＬ添加する。この溶液をＺｉｐ−Ｔｉｐ（登録商標、ミリポア社製）で脱塩処理を行った後、ＣＨＣＡとＭＤＰＮＡの等量溶液と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いた解析を実施する。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明は、質量分析によるタンパク質の構造解析において有用である。本発明は、例えば、プロテオミクスにおける末端配列解析、タンパク質医薬品等における末端配列の品質管理、リン酸化ペプチドのショットガンプロテオミクス、Ｏグリカン結合ペプチドのショットガンプロテオミクス等に使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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