(57)【要約】      （修正有）【課題】血液の天然成分（赤血球中のヘモグロビン、白血球中のラクトフェリン）若しくは血漿の天然成分（免疫グロブリンＧ）を含む全血中の阻害物質、又はＥＤＴＡ及びヘパリン等の添加された抗凝固剤に対する耐性が上昇した耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の提供。【解決手段】ＤＮＡポリメラーゼ活性の阻害物質に対する耐性が強化されたＤＮＡポリメラーゼの突然変異体。突然変異体ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼの阻害物質を含有するサンプルにおける標的のＰＣＲ増幅によく適している突然変異体耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残基５０７、又は、別の耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼにおける前記野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残基５０７に対応する残基における、第１の突然変異と、
前記野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残基５９、１５５、２４５、及び７４９、又は、前記別の耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼにおける対応する残基における、更なる突然変異と
を含む、単離された突然変異体耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼであって、
前記突然変異体ポリメラーゼが、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ活性と、（ｉｉ）前記突然変異体ポリメラーゼが由来する前記野生型ＤＮＡポリメラーゼよりも重合活性阻害物質に対する高い耐性とを有するものであり、かつ、
前記突然変異体ポリメラーゼが、前記野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残基３７５若しくは７３４、又は、前記別の耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼにおける対応する残基に突然変異を含まないものである、
単離された突然変異体耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
前記野生型Ａ型ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１〜１０からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の突然変異体ポリメラーゼ。
【請求項３】
以下の特徴：
（ｉ）前記突然変異体ポリメラーゼが、配列番号１〜１０からなる群から選択される１つの配列に対して少なくとも７０％同一であること、
（ｉｉ）前記突然変異体ポリメラーゼが、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼであること、
（ｉｉｉ）前記第１の突然変異が、Ｅ５０７Ｋ突然変異であること、
（ｉｖ）前記突然変異体ポリメラーゼが、Ｇ５９Ｗ、Ｖ１５５Ｉ、Ｌ２４５Ｍ、Ｅ５０７Ｋ及びＦ７４９Ｉの突然変異を含むこと、
（ｖ）前記突然変異体ポリメラーゼが、配列番号１１の配列を含むこと、並びに、
（ｖｉ）前記突然変異体ポリメラーゼが、前記野生型ＤＮＡポリメラーゼより速い重合速度を有すること、
の１又は複数を有する、請求項１又は２に記載の突然変異体ポリメラーゼ。
【請求項４】
前記阻害物質が抗凝固剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の突然変異体ポリメラーゼ。
【請求項５】
（ｉ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の突然変異体ポリメラーゼと、（ｉｉ）水性バッファー、二価金属、伸長ヌクレオチド、プライマー、界面活性剤、検出剤及び標的核酸からなる群から選択される１又は複数の試薬とを含む組成物。
【請求項６】
前記標的核酸を含有する疑いのある試験サンプルを準備するステップと、
前記試験サンプルと、請求項１〜４のいずれか一項に記載の突然変異体ポリメラーゼ、前記標的核酸に特異的に結合するプライマー及び伸長ヌクレオチドとを接触させるステップと、これにより混合物を形成させ、
前記標的核酸の配列を前記伸長ヌクレオチドの取り込みのための鋳型として用いて、前記ポリメラーゼによって前記プライマーを伸長させる条件下で前記混合物をインキュベートするステップと、
を含む、標的核酸を増幅する方法。
【請求項７】
以下の特徴：（ｉ）前記方法がＰＣＲの方法であること、（ｉｉ）前記試験サンプルが血液サンプルであること、及び（ｉｉｉ）前記混合物が少なくとも１体積％の前記血液サンプルを含有することの１又は複数を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の突然変異体ポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、ベクター、又は宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の宿主細胞を、前記核酸によりコードされるポリペプチドを発現させる条件下で培地中にて培養するステップと、前記ポリペプチドを前記培養細胞又は前記培地から精製するステップと、を含む、ポリペプチドを産生する方法。
【請求項１０】
（ｉ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の突然変異体ポリメラーゼと、（ｉｉ）水性バッファー、二価金属、伸長ヌクレオチド、プライマー、プローブ、界面活性剤、検出剤、色素、蛍光分子、抗凝固剤及び細胞溶解剤からなる群から選択される１又は複数の試薬とを含む、標的核酸の増幅用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の実施用の改善されたポリメラーゼ及びＰＣＲの実施方法に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１４年２月１４日付けで出願された米国仮出願第６１／９４０，１７２号の優先権を主張する。その出願の内容は引用することにより、その全体が本明細書の一部をなすものとする。
【背景技術】
【０００３】
ＰＣＲはもっとも広く使用されている核酸検出方法の１つである。ＰＣＲは、感染性疾患及び遺伝性障害の研究及び分子診断の分野において様々な用途を有する。これら多くの用途のなかで、血液ベースのＰＣＲ診断が特に需要が多い。
【０００４】
一方では、血液は人体にとって循環系の重要な部分である。血液は、正常細胞、疾患細胞（例えば、血中循環腫瘍細胞）、及び、宿主が妊婦である場合には、胎児細胞を含む、多くのタイプの宿主細胞、並びに、マイクロＲＮＡ等のかかる細胞からの遺伝子材料を含む。実際、侵襲的性質が最小限であるために、血液ベースのＰＣＲは、従来の羊水検査に伴う流産のリスクのない、母体の血液サンプルを用いる胎児の診断等のいくつかの状況において有利である。或る特定の状況下では、血液はまた、ウイルス及び細菌等の病原体も含有する。したがって、血液ベースの診断は、常時、人体において何が起こっているかの即時の像（immediate picture）を提供することができる。他方では、血液は、種々の外傷又は病的状況において生活の質を改善し、生命を救うために使用される、様々な医薬品及び血液製剤（例えば、全血、血漿、抗体、及び幹細胞）の源である。血液、血漿、及びその他の血液由来材料のこれらの治療的使用には、これらの材料の提供により疾患細胞（例えば、腫瘍細胞）又は病原体（例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、及びＨＣＶ）の混入が可能な限り起こらないことが必要である。例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、及び特許文献７を参照されたい。
【０００５】
しかしながら、血液ベースのＰＣＲ診断は、多くの実施上（logistic）及び技術的問題により制限されてきた。生物サンプルからの核酸診断法に伴う問題は何倍も大きい。血液及び細胞溶解物等の複雑な生物サンプルは、ＰＣＲ反応に用いられるＤＮＡポリメラーゼを阻害する可能性がある様々な成分を有する。これら成分には、血液中の、ヘモグロビン、免疫グロブリンＧ、ラクトフェリン、及びプロテアーゼが含まれる。ＰＣＲ反応を試みる前にサンプルを精製する様々な手順が開発されているが、これらのステップは一般的に、時間がかかり、大きな労働力を要するものであり、引き続くＰＣＲに必要な精製を達成できない可能性がある。さらに、核酸を含有する細胞（例えば、白血球及び胎児細胞）は血液サンプルの小さい割合しか占めず、貴重な核酸がＰＣＲ反応ステップの前にサンプルから失われる可能性がある。
【０００６】
血液を操作する場合に、１つの重要な点は、凝固した血液からの核酸の単離は効率的ではなく、細胞のほとんどが血餅中へと失われてしまうため、凝血を防ぐために血液サンプルを抗凝固剤中に採取すべきであるということである。しかしながら、ＥＤＴＡ及びヘパリン等の血液サンプル採取にルーチン的に用いられている抗凝固剤は、ＰＣＲに干渉するか又はＰＣＲを阻害する。例えば、ヘパリンは高度に負に帯電しており、ＤＮＡと共に抽出され（co-extract）、それによりＰＣＲ反応を阻害する。例えば、非特許文献１及び非特許文献２を参照されたい。
【０００７】
したがって、上記の阻害物質に対してより耐性であり、かつ、血液サンプルを用いるＰＣＲ反応に適した、ＤＮＡポリメラーゼ等の試薬に対する必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１３０３１６９２５号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３０１５７２５３号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１２０３２９０６１号
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１２００７０８２７号
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１２００３４６１４号
【特許文献６】米国特許出願公開第２００７０２８１３０７号
【特許文献７】米国特許出願公開第２００７０１０５１２１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Garcia et al., J. Clin. Microbiol. April 2002 vol. 40 no. 4 1567-1568
【非特許文献２】Yokota et al., Journal of Clinical Laboratory Analysis, Volume 13, Issue 3, pages 133-140, 1999
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、血液の天然成分（赤血球中のヘモグロビン、白血球中のラクトフェリン）若しくは血漿の天然成分（免疫グロブリンＧ）を含む全血中の阻害物質、又はＥＤＴＡ及びヘパリン等の添加された抗凝固剤に対する耐性が上昇した耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体に関する。
【００１１】
したがって、１つの態様において、本発明は、単離された、突然変異体耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼを提供する。突然変異体ポリメラーゼは、野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号４）の残基５０７又は別の耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼにおける野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残基５０７に対応する残基における第１の突然変異と、野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残基５９、１５５、２４５、及び７４９、又は別の耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼにおける対応する残基における更なる突然変異とを含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。突然変異体ポリメラーゼは、：（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ活性と、（ｉｉ）突然変異体ポリメラーゼが由来する野生型ＤＮＡポリメラーゼより、重合活性阻害物質（例えば、血液の天然成分又はＥＤＴＡ若しくはヘパリン等の抗凝固剤）に対する高い耐性とを有する。突然変異体ポリメラーゼは、野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残基３７５若しくは７３４、又は別の耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼにおける対応する残基に突然変異を含まない。突然変異体はまた、野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較してより速い重合速度を有することができる。
【００１２】
いくつかの実施の形態において、野生型Ａ型ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１〜１０からなる群から選択される配列を含むか、本質的にかかる配列からなるか、又はかかる配列からなる。突然変異体ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１〜１０からなる群から選択される配列と少なくとも７０％（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一である。１つの例において、野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４の配列を含むか、本質的にかかる配列からなるか、又はかかる配列からなる。言い換えると、突然変異体ポリメラーゼは突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００１３】
好ましい実施の形態において、突然変異体における第１の突然変異は、配列番号４の配列に基づいて、Ｅ５０７Ｋ突然変異である。更に好ましい実施の形態において、突然変異体は、以下の５つの突然変異：Ｇ５９Ｗ、Ｖ１５５Ｉ、Ｌ２４５Ｍ、Ｅ５０７Ｋ、及びＦ７４９Ｉを含有する。例えば、突然変異体は、配列番号１１の配列を含むか、本質的にかかる配列からなるか、又はかかる配列からなるものとすることができる。別の実施の形態において、突然変異体は、上記の５つの突然変異を有し、かつ、配列番号１１の配列と少なくとも７０％（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一なＤＮＡポリメラーゼとすることができる。
【００１４】
本発明は更に、（ｉ）上記の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼと、（ｉｉ）水性バッファー、二価金属（例えば、マグネシウム）、伸長ヌクレオチド、プライマー、界面活性剤、検出剤（例えば、特異的若しくは非特異的な色素又は蛍光分子）、及び標的核酸鋳型からなる群から選択される１又は複数の試薬とを含む組成物（例えば、ＰＣＲ反応用マスターミックス）を提供する。上記の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ又は組成物と、突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ又は組成物用の包装材料とを含有するキットもまた提供する。キットは、水性バッファー、二価金属、伸長ヌクレオチド、プライマー、プローブ、界面活性剤、検出剤、色素、蛍光分子、抗凝固剤、及び細胞溶解剤からなる群から選択される１又は複数の試薬を含むことができる。
【００１５】
上記の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼは、プライマー伸長方法又は標的核酸を増幅する方法に用いることができる。かかる方法は、標的核酸を含有する疑いのある試験サンプル（例えば、血液サンプル）を準備するステップと、混合物を形成させるために、試験サンプルを、突然変異体ポリメラーゼ、標的核酸鎖に特異的に結合又はハイブリダイズするプライマー及び伸長ヌクレオチドと接触させるステップと、標的核酸の配列を伸長ヌクレオチドの取り込み用の鋳型として用いて、ポリメラーゼによってプライマーを伸長させる条件下で前記混合物をインキュベートするステップとを含む。この方法は、ＰＣＲの方法とすることができ、その場合、上記の標的核酸鎖の相補鎖に特異的に結合又はハイブリダイズする第２のプライマーを使用することができる。試験サンプルは混合物の少なくとも１体積％（２体積％、５体積％、１０体積％、２０体積％、２５体積％、３０体積％、３５体積％、４０体積％、４５体積％、又は５０体積％）を占めることができる血液サンプルとすることができる。
【００１６】
上記の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ、組成物（例えば、ＰＣＲ反応用マスターミックス）、及び方法は、特に血液サンプルベースのＰＣＲ反応に有用である。例えば、それらは、ガスリーカード（抗凝固剤を含まない）上にスポットされた全血から、又は遠心分離によって細胞を取り除くことにより、抗凝固剤で処理された全血から作られた血漿からの、リアルタイムＰＣＲに用いることができる。本出願において、全血サンプルを（ガスリーカードへの付着により、又は遠心分離によって赤血球を取り除くことにより）部分的に精製して、ヘム及び蛍光検出をクエンチするその他の因子を取り除くことができる。
【００１７】
本発明の別の態様は、上記の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。核酸は、配列番号１２と少なくとも７０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％）同一な配列を含有することができる。本発明はまた、核酸を含む、発現ベクター等のベクター、及び、核酸を含む宿主細胞も提供する。核酸、ベクター、及び宿主細胞は、本発明の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの産生に用いることができる。したがって、本発明はまた、ポリペプチドを産生する方法も提供する。この方法は、宿主細胞を培地中で、核酸によりコードされるポリペプチドを発現させる条件下に培養するステップと、培養細胞又は細胞の培地からポリペプチドを精製するステップとを含む。
【００１８】
本発明の１以上の実施形態の詳細を以下の本明細書に示す。本発明のその他の特徴、目的、及び利点は、本明細書及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明による改変ＤＮＡポリメラーゼを生成するために突然変異させることができる例示的な耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼのアラインメントを示す。
【図２】１０体積％〜５０体積％のヘパリン処理全血を含有するＰＣＲ反応におけるＤＮＡからのヒトＩＧＦ遺伝子の３２２ｂｐ断片のＴａｑ突然変異体１Ｃ２及び２Ｃ２による増幅を示す写真である。
【図３】図３Ａは、Ｔａｑ突然変異体１Ｃ２の活性と様々な源からのＤＮＡポリメラーゼの活性との、２．５体積％のＥＤＴＡ処理全血の存在下での比較を示す写真である。図３Ｂは、Ｔａｑ突然変異体１Ｃ２の活性と様々な源からのＤＮＡポリメラーゼの活性との、２５体積％のＥＤＴＡ処理全血の存在下での比較を示す写真である。図３Ｃは、Ｔａｑ突然変異体１Ｃ２の活性と様々な源からのＤＮＡポリメラーゼの活性との、４５体積％のＥＤＴＡ処理全血の存在下での比較を示す写真である。
【図４】図４Ａは、Ｔａｑ突然変異体１Ｃ２の活性と様々な源からのＤＮＡポリメラーゼの活性との、２．５体積％のヘパリン処理全血の存在下での比較を示す写真である。図４Ｂは、Ｔａｑ突然変異体１Ｃ２の活性と様々な源からのＤＮＡポリメラーゼの活性との、２５体積％のヘパリン処理全血の存在下での比較を示す写真である。図４Ｃは、Ｔａｑ突然変異体１Ｃ２の活性と様々な源からのＤＮＡポリメラーゼの活性との、４５体積％のヘパリン処理全血の存在下での比較を示す写真である。
【図５】図５Ａ〜５Ｆは、５体積％〜３０体積％のヘパリン処理全血を含有するＰＣＲ反応におけるヒトＩＧＦ遺伝子の３２２ｂｐ断片の６つのＴａｑ突然変異体による増幅を示す写真のセットである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、少なくとも部分的には、血液サンプル中に存在する阻害物質に対してその野生型対応物よりも耐性である、或る特定の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼの予期せぬ発見に基づく。
【００２１】
１．  突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ
第１の態様において、本発明は、ＰＣＲ反応における使用に適したものとすることができる、遺伝子改変された又は突然変異体の、単離されたＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【００２２】
本明細書に開示されるように、本発明の改変ＤＮＡポリメラーゼは、特定のＤＮＡポリメラーゼの１又は複数の阻害物質に対して耐性である。より具体的には、本発明の本態様によるＤＮＡポリメラーゼは、本発明の改変ＤＮＡポリメラーゼが由来する野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して、野生型ＤＮＡポリメラーゼの重合速度をＰＣＲ反応における産物形成の成功が認められないレベルへと低下させる、１又は複数の阻害物質の存在下におけるＰＣＲの際の許容可能なレベルのＤＮＡ重合又は所望の産物の正確な増幅を可能とする、少なくとも１つの突然変異を含む。ポリメラーゼ活性及び／又は産物形成を決定するために、あらゆる当該技術分野において既知のアッセイ、例えば以下の実施例に記載のアッセイを使用することができる。
【００２３】
本発明の本態様のＤＮＡポリメラーゼは、典型的には、（ｉ）配列番号４（野生型テルムス・アクウァーティクス（Thermus aquaticus）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）の残基５０７又は別の耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼにおける野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残基５０７に対応する残基における第１の突然変異と、（ｉｉ）野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残基５９、１５５、２４５、及び７４９、又は別の耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼにおける対応する残基における更なる突然変異とを有する。図１は、かかる野生型ＤＮＡポリメラーゼの１０例及びそれらの一次アミノ酸配列のアラインメントを列挙する。各ポリメラーゼにおける配列番号４の５９、１５５、２４５、５０７、及び７４９に対応する残基を図１において位置づけることができる。例示的な実施形態において、以下の配列番号４のＧ５９Ｗ、Ｖ１５５Ｉ、Ｌ２４５Ｍ、Ｅ５０７Ｋ、及びＦ７４９Ｉにおける突然変異は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ中、又は、これら残基に対応する残基において存在する。以下に示すのは、１つの例示的な突然変異体である、Ｔａｑ  １Ｃ２のアミノ酸配列及びそのコード配列（それぞれ配列番号１１及び１２）であり、ここで、５つの突然変異に下線を施している。
配列番号１１
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配列番号１２
ＡＴＧＣＧＴＧＧＣＡＴＧＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＧＣＣＴＡＣＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＡＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＣＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＧＧＴＣＴＡＣＧＧＣＴＴＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＧＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＧＡＣＧＣＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＴＣＣＧＣＣＡＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＧＧＧＧＧＧＴＡＣＡＡＧＧＣＧＧＧＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＡＣＧＣＣＧＧＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＣＧＧＣＡＡＣＴＣＧＣＣＣＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＧＴＣＣＣＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＧＴＣＣＧＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＡＧＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＡＣＣＧＣＡＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＧＡＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＡＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＴＴＴＧＧＧＡＡＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＧＣＣＣＧＡＣＣＡＧＴＧＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＣＧＧＧＣＣＣＴＧＡＣＣＧＧＧＧＡＣＧＡＧＴＣＣＧＡＣＡＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＧＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＧＡＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＣＣＧＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＣＣＡＴＣＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＡＴＧＧＡＣＧＡＴＣＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＣＴＧＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＧＣＡＣＣＧＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＡＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＴＡＧＧＧＣＣＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＴＴＴＣＣＣＧＣＡＡＧＧＡＧＣＣＣＡＴＧＴＧＧＧＣＣＧＡＴＣＴＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＧＧＧＧＣＣＧＧＧＴＣＣＡＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＧＡＧＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＣＧＧＧＧＧＣＴＴＣＴＣＧＣＣＡＡＡＧＡＣＣＴＧＡＧＣＧＴＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＧＡＣＧＡＣＣＣＣＡＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＴＡＣＧＧＣＧＧＧＧＡＧＴＧＧＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＣＣＴＴＴＣＣＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣＧＣＣＡＡＣＣＴＧＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＣＧＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣＣＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＡＣＧＧＧＧＧＴＧＣＧＣＣＴＧＧＡＣＧＴＧＧＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＴＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＧＡＧＡＴＣＧＣＣＣＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＴＣＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣＴＣＡＡＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＣＴＣＴＴＴＧＡＣＧＡＧＣＴＡＧＧＧＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＧＧＣＡＡＧＡＣＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＣＣＧＣＧＡＧＧＣＣＣＡＣＣＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＴＡＣＣＧＧＧＡＧＣＴＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＣＴＴＧＣＣＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＣＣＡＧＧＡＣＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＡＣＧＧＣＣＡＣＧＧＣＣＡＣＧＧＧＣＡＧＧＣＴＡＡＧＴＡＧＣＴＣＣＧＡＴＣＣＣＡＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＣＣＣＧＴＣＣＧＣＡＣＣＣＣＧＣＴＴＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＧＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＡＧＣＣＡＧＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＣＧＧＣＧＡＣＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＴＣＣＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＴＴＣＧＧＣＧＴＣＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＣＧＴＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＡＴＧＣＧＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＧＧＧＧＴＣＣＴＣＴＡＣＧＧＣＡＴＧＴＣＧＧＣＣＣＡＣＣＧＣＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＣＴＴＡＣＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＧＣＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＧＡＧＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＧＧＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＣＧＴＧＣＧＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＴＧＣＣＣＧＴＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＡＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＴＡＴＣＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＡＧＧＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＡＡ
【００２４】
本発明の本態様のＤＮＡポリメラーゼは、ヘパリン又はＥＤＴＡで処理された血液に対して、その野生型対応物よりも耐性である。このＤＮＡポリメラーゼはまた、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの別の阻害物質に対してもより耐性とすることができる。これら別の阻害物質の例としては、全血（抗凝固剤を含むか又は含まない）、全血の画分（ガスリーカードスポットを用いて採取したもの等）、又は血漿、ヘモグロビン、ヘム、免疫グロブリンＧ、及びラクトフェリン等の血液の成分；阻害濃度の多糖を含有するもの等の細胞溶解物；ペクチン、キシラン、及び酸性多糖等の植物物質；フミン酸、フルボ酸、並びに、重金属及び重金属イオンを含む金属イオン等の、土壌サンプルにおいてみられる物質；並びに特定の有機溶媒が挙げられる。阻害物質の更なる非限定的な例としては、尿素、有機化合物及びフェノール化合物（例えば、フェノール）、グリコーゲン、脂肪、カルシウム、セルロース、ニトロセルロース、鉱油、花粉、手袋の粉、ＳＤＳ、並びに界面活性剤が挙げられる。様々なその他の阻害物質が当該技術分野において既知であり、限定されないが、Kermekchiev, et al., "Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples", Nucleic Acids Research, Vol. 1, p.14, 2008及びAbu Al-Soud, W., et al., "Capacity of Nine Thermostable DNA Polymerases To Mediate DNA Amplification in the Presence of PCR-Inhibiting Samples", Applied and Environmental Microbiology, Vol.64, No.10, October 1998において論じられているものが含まれる。対象からの血液サンプルの分析は医学及び法医学分析において重要であるため、血液を安定化し、凝血を防ぐために血液に一般に添加される阻害物質（例えば、ＥＤＴＡ及び／又はヘパリン）を含む、血液又は血液画分においてみられる阻害物質に対する耐性は、本発明による突然変異体酵素の特徴である。
【００２５】
好ましい実施形態において、本発明による改変ＤＮＡポリメラーゼは、その野生型対応物と比較して、上記の少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ阻害物質（例えば、ＥＤＴＡ及び／又はヘパリン）に対する上昇した耐性と、上昇したＤＮＡ重合速度との両方を有する。かかるポリメラーゼはしたがって、野生型ＤＮＡポリメラーゼの重合速度に対して阻害性であることが広く知られている物質の存在下においてさえも、上昇した速度でプライムされたＤＮＡ鋳型から核酸鎖を重合することができる。
【００２６】
本明細書において用いる場合、「遺伝子改変」という用語は、「突然変異体」と区別なく用いられ、それぞれ由来する野生型タンパク質又は核酸における対応する残基又はヌクレオチドとは異なったアミノ酸残基又はヌクレオチドを含むように、野生型配列からのその配列が変化しているタンパク質又は核酸を表す。本発明による突然変異体は、したがって、特定の残基が意図的に変化させられた部位特異的突然変異体を含み、かかる部位特異的突然変異体には、１又は複数の残基の欠失、１又は複数の残基の挿入、及び、或るＡ型ＤＮＡポリメラーゼの１又は複数の残基の、別のＡ型ＤＮＡポリメラーゼの対応する配列等の外来配列による置き換えが含まれる。１つ又は非常に少数の残基の置き換え／置換により突然変異体が生じている状況において、「突然変異体が由来する」ＤＮＡポリメラーゼを同定することは簡単な問題である。しかしながら、配列の領域が配列の別の領域に置き換わっている状況においては、突然変異体の配列が、特に以下の図１に示す例示的な野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１〜１０）のいずれか１つと、同一性を示す、野生型耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼのいずれか（either/any）に突然変異体が「由来する」と考えることができると理解するのに十分である。
【００２７】
本明細書において詳細に論じる例示的な実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、突然変異体ポリメラーゼに有利な性質を提供するように変化した特徴を有する、野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの突然変異体型である。しかしながら、本発明は以下に詳細に論じる例示的な実施形態に限定されないということを理解すべきである。例えば、本発明は、いずれかの耐熱性Ａ型ファミリーＤＮＡポリメラーゼの突然変異体等の、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ以外のポリメラーゼの突然変異体を含む。これらの突然変異体は、テルムス（Thermus）又はサーモトガ（Thermatoga）の種からのものを含むがこれらに限定されない、ポリメラーゼの突然変異体とすることができる。耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼは高レベルの配列同一性及び保存を示すということが当業者によりよく記述され、よく理解されている。したがって、別のＡ型ＤＮＡポリメラーゼの残基に対応する或る特定のＡ型ＤＮＡポリメラーゼの残基を同定することは当業者にとって簡単なことである。したがって、野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにおける特定の突然変異に対する本明細書における言及は、その他のポリメラーゼにおける対応する突然変異に容易に関連付けることができる。
【００２８】
図１はいくつかの非限定的な例示的な耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼの一次アミノ酸配列のアラインメントを示す。図１に示すように、耐熱性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼの様々な領域が高度に保存されている一方で、別の領域は可変性である。当業者であればすぐに、本明細書において具体的に同定され、論じられているものに加えて更なる突然変異を、突然変異酵素のポリメラーゼ活性を変化させることなく、又は実質的に変化させることなく、Ａ型ＤＮＡポリメラーゼの可変性領域に作ることができるということを認識し、理解するであろう。同様に、保存されている残基における保存的突然変異を、突然変異酵素のポリメラーゼ活性を変化させることなく、又は実質的に変化させることなく、作ることができる。別の関連する酵素との比較構造分析に基づいて酵素を突然変異させることは、当業者が酵素の酵素活性に対する所与の突然変異の効果を合理的に予測することを可能とする、分子生物学分野における一般的かつ有用な技法である。アミノ酸の構造データ及び既知の物理的性質を用いることで、当業者であれば、酵素の必須の酵素的特徴を変化させることなく、又は実質的に変化させることなく、本発明により包含されるＤＮＡポリメラーゼ等の酵素を突然変異させることができる。
【００２９】
本明細書において用いる場合、「単離されたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドが天然に関連するその他のタンパク質、脂質、及び核酸から分離されているポリペプチドのことをいう。ポリペプチドは精製調製物の乾燥重量で、少なくとも１０％（即ち、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、及び９９％を包含する、１０％〜１００％のあらゆるパーセンテージ）を占めることができる。純度はあらゆる適切な標準的方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析によって測定することができる。本発明の単離されたポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法によって、又は化学的方法によって産生することができる。
【００３０】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の「パーセント同一性」は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993におけるように改変された、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを用いて決定される。かかるアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み入れられている。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いてＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチを実行することにより、本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質サーチを実行することにより、本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列の間にギャップが存在する場合は、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載されているようにしてＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。
【００３１】
上記のＤＮＡポリメラーゼペプチド／ポリペプチド／タンパク質のアミノ酸組成は、本明細書中に記載するプライマー伸長反応条件及び／又はＰＣＲ反応条件下において、ＥＤＴＡ又はヘパリン処理血液の存在下でＤＮＡの複製を触媒する能力を破壊することなく変えることができる。例えば、アミノ酸組成は、１又は複数の保存的アミノ酸置換を含有することができる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において規定されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、配列番号１１等の上記の配列における予測非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基に置き換えるのが好ましい。あるいは、飽和突然変異誘発等による、配列の全部又は一部に沿ってランダムに突然変異を導入することができ、得られる突然変異体を、例えば、米国特許出願公開第２０１１００２７８３３号におけるように以下に記載するように、活性を保持する突然変異体を同定する本明細書中に記載されるＰＣＲ条件下でＤＮＡの複製を触媒する能力についてスクリーニングすることができる。
【００３２】
種々の突然変異を、上記の野生型テルムス・アクウァーティクスＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号４）の各残基又は上記のその他の野生型ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号１〜３及び５〜１０）の対応する残基について導入することができるが、本明細書に開示する突然変異体に関して以下の非限定的な突然変異に言及することができ、これには配列番号４のＧ５９、Ｖ１５５、Ｌ２４５、Ｅ５０７、及びＦ７４９の突然変異が含まれる。いくつかの実施形態において、これらの位置の各残基を側鎖類似性に基づいてそれぞれのファミリーの別のメンバーに変化させる。
【００３３】
当業者であればすぐに認識するように、例示的な配列番号のものと同等の配列を、特定されない１又は複数の残基において１又は複数の保存的置換を作ることにより容易に作成することができる。かかる同等の配列は、突然変異体酵素の必須のポリメラーゼ特性を保持する。異なるアミノ酸についての様々な保存的置換が上記されており、当該技術分野において既知である。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びその他のＡ型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性にとって重要な領域及び残基が十分に特徴決定されており、当業者であれば、目的のＤＮＡポリメラーゼの活性を破壊することなく、どの領域及び残基を変化させることができるかをよく認識している。例えば、Alba, Replicative DNA polymerases, Genome Biol. 2001; 2(1): reviews3002.1-reviews3002.4及びSteitz, DNA Polymerases: Structural Diversity and Common Mechanisms, June 18, 1999 The Journal of Biological Chemistry, 274, 17395-17398を参照されたい。
【００３４】
選択された耐熱性Ａ型ポリメラーゼの例示的な比較が、読者にこの酵素の群内の保存領域及び可変性領域の理解を与えるよう図１に提供される。しかしながら、当業者であれば、本明細書において論じる活性を実質的に変化させることなく作ることができるその他の変化を認識しているであろう。組換えタンパク質の産生は今日の生物工学の分野においてルーチン的な事柄であるという事実を鑑みて、また、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼアッセイ等のポリメラーゼアッセイはよく知られており、ルーチン的アッセイとして広く実施されているので、本明細書に提供する情報を用いる本発明による突然変異体ポリメラーゼの産生は、当業者にとってルーチン的な事柄である。自動化及び非常に強力な技法及びキットは、本発明を実施するものが迅速かつルーチン的に本発明による突然変異体を同定し、特定のレベルの目的のポリメラーゼ活性（即ち、重合速度及び（１又は複数の）阻害物質の存在下での重合速度）を同定することを可能とする。
【００３５】
本発明はまた、本発明のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の機能等価物も提供し、機能等価物とは、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質のポリペプチド誘導体、例えば、１又は複数の点突然変異、挿入、欠失、切断を有するタンパク質、融合タンパク質、又はそれらの組合せのことをいう。機能等価物は、本明細書に記載するＰＣＲ条件下（例えば、ＥＤＴＡ及び／又はヘパリンにより前処理され、混合物の少なくとも１体積％（例えば、２体積％、２．５体積％、５体積％、１０体積％、２０体積％、２５体積％、３０体積％、３５体積％、４０体積％、４５体積％、又は５０体積％）を占める血液サンプルを含有するＰＣＲ反応混合物）で上記のＤＮＡポリメラーゼの活性を実質的に保持する。単離されたポリペプチドは、配列番号１１又はその機能的断片若しくは機能等価物を含有することができる。概して、機能等価物は配列番号１１と少なくとも７０％（例えば、７０％〜１００％のあらゆる数、例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、及び９９％を包含する）同一である。
【００３６】
本発明において記載されるポリペプチドは、組換えポリペプチドとして得ることができる。組換えポリペプチドを調製するために、該組換えポリペプチドをコードする核酸を、融合パートナ、例えば、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×−Ｈｉｓエピトープタグ、又はＭ１３Ｇｅｎｅ３タンパク質をコードする別の核酸に連結することができる。得られる融合核酸は、適した宿主細胞中で当該技術分野において既知の方法により単離することができる融合タンパク質を発現する。単離された融合タンパク質は更に、例えば、酵素消化によって処理して融合パートナを除去することができ、本発明の組換えポリペプチドを得ることができる。あるいは、本発明のペプチド／ポリペプチド／タンパク質は化学合成することができ（例えば、Creighton, "Proteins: Structures and Molecular Principles," W.H. Freeman & Co., NY, 1983を参照されたい）、又は、本明細書中に記載する組換えＤＮＡ技術により産生することができる。更なるガイダンスについて、当業者であれば、Frederick M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 2003及びSambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001）を参考にすることができる。
【００３７】
本発明の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼは、精製若しくは単離された形態で提供することができるか、又は組成物の一部とすることができる。組成物において、突然変異体ＤＮＡポリメラーゼがまず或る程度精製されていることが好ましく、高レベルの純度（例えば、約８０％、９０％、９５％、若しくは９９％又はそれより高いレベル）となるよう精製されていることがより好ましい。本発明による組成物は、所望のあらゆるタイプの組成物とすることができるが、典型的にはＰＣＲ技法の使用を介したもの等の、標的核酸の増幅用、特に血液ベースの増幅用の組成物としての使用に適した、又はかかる組成物に含まれている、水性組成物である。したがって、組成物は典型的には、水、グリセロール又は別の安定化剤、水性バッファー、水性塩バッファー、二価金属（例えば、マグネシウム）等といった、突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ以外の少なくとも１つの物質を含む。例示的な実施形態において、組成物は、溶媒、塩、バッファー、ヌクレオチド、及び典型的にはＰＣＲ反応中に存在するその他の試薬のいくつか又はすべてを含む。したがって、いくつかの実施形態において、組成物は、マグネシウム塩（例えば、塩化マグネシウム又は硫酸マグネシウム）、１若しくは複数のヌクレオシド三リン酸、１若しくは複数の核酸プライマー若しくはプローブ、１若しくは複数の更なる核酸ポリメラーゼ若しくは所望の活性を有するその断片、１若しくは複数の重合検出剤（例えば、特異的又は非特異的な色素又は蛍光分子）、及び／又は１若しくは複数の増幅若しくは配列決定用の核酸鋳型を含む。その他の例示的な物質としては、界面活性剤、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ゼラチン、グリセロール、ベタイン、スペルミジン、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、大腸菌ＳＳＢ、ＢＳＡ、及び硫酸アンモニウムが挙げられる。当業者であれば重合反応組成物に含めることができる様々な物質をよく認識しており、したがって網羅的な列挙は本明細書においては必要ではない。
【００３８】
２．  核酸、ベクター、及び宿主細胞
本発明はまた、上記の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのいずれかをコードする核酸も提供する。核酸は、単離及び／又は精製されているのが好ましい。核酸とは、ＤＮＡ分子（例えば、これらに限定されないが、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、これに限定されないが、ｍＲＮＡ）、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ類似体のことをいう。ＤＮＡ又はＲＮＡ類似体は、ヌクレオチド類似体から合成することができる。核酸分子は一本鎖又は二本鎖とすることができる。「単離された核酸」は、その構造が、いずれの天然の核酸の構造とも又は天然のゲノム核酸のいずれの断片の構造とも同一ではない核酸である。かかる用語はしたがって、例えば、（ａ）天然のゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、ＤＮＡが天然に生じる生物のゲノム中の分子のその一部に隣接するコード配列の両方によって隣接されていないＤＮＡ；（ｂ）得られる分子がいずれの天然のベクター又はゲノムＤＮＡとも同一でないように、原核生物又は真核生物のベクター又はゲノムＤＮＡ中に組み入れられている核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生じた断片、又は制限断片等の分離した分子；及び（ｄ）ハイブリッド遺伝子、即ち、融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列を包含する。
【００３９】
本発明はまた、本明細書に記載するヌクレオチド配列の１又は複数を有する組換えコンストラクト又はベクターも提供する。コンストラクトの例としては、本発明の核酸配列が順方向又は逆方向で挿入された、プラスミド又はウイルスベクター等のベクターが挙げられる。好ましい実施形態において、コンストラクトは、かかる配列に作動可能に連結した、プロモーターを含む制御配列を更に含む。多数の適したベクター及びプロモーターが当業者に知られており、市販されている。原核生物及び真核生物宿主での使用のための適切なクローニングベクター及び発現ベクターはまた、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press）に記載されている。
【００４０】
ベクターとは、核酸分子に連結している別の核酸を運ぶことができる核酸分子のことをいう。ベクターは自律的複製又は宿主ＤＮＡへの組込みができる可能性がある。ベクターの例としては、プラスミド、コスミド、又はウイルスベクターが挙げられる。本発明のベクターは宿主細胞中での核酸の発現に適した形態で核酸を含む。ベクターは発現される核酸配列に作動可能に連結した１又は複数の制御配列を含むのが好ましい。「制御配列」には、プロモーター、エンハンサー、及びその他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。制御配列には、ヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、及び誘導性制御配列が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換、形質移入、又は感染される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等の因子に応じて決めることができる。
【００４１】
発現ベクターの例としては、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の誘導体又はシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、細菌性プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクター、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、及び仮性狂犬病ウイルス等のウイルスＤＮＡが挙げられる。しかしながら、いずれかのその他のベクターも、ベクターが宿主中で複製可能であり生存可能である限り使用することができる。適切な核酸配列を種々の手順によってベクターへと挿入することができる。一般に、上記のポリペプチドの１つをコードする核酸配列を、当該技術分野において既知の手順によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（複数の場合もあり）へと挿入することができる。かかる手順及び関連するサブクローニング手順は当業者の技術範囲内である。
【００４２】
発現ベクターは、翻訳開始用のリボソーム結合部位、及び転写ターミネーターもまた含有することができる。ベクターは発現の増幅用の適切な配列を含むことができる。さらに、発現ベクターは、真核生物細胞培養についてのジヒドロ葉酸レダクターゼ若しくはネオマイシン耐性等、又は大腸菌におけるテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性等の、形質転換宿主細胞の選択用の表現型形質を提供するのに、１又は複数の選択マーカー遺伝子を含有することが好ましい。
【００４３】
上記のような適切な核酸配列、及び適切なプロモーター又は調節配列を含有するベクターは、宿主に上記のポリペプチド（例えば、配列番号１１）を発現させるように、適切な宿主を形質転換、形質移入、又は感染させるのに用いることができる。適した発現宿主の例としては、細菌細胞（例えば、大腸菌、ストレプトマイセス、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium））、真菌細胞（酵母）、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ（Drosophila）及びスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda：ヨトウガ）（Ｓｆ９））、動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、及びＨＥＫ２９３）、アデノウイルス、及び植物細胞が挙げられる。適切な宿主の選択は当業者の技術範囲内である。いくつかの実施形態において、本発明は、ポリペプチドの１つをコードするヌクレオチド配列を有する発現ベクターによって宿主細胞を形質転換、形質移入、又は感染させることにより、上記のポリメラーゼポリペプチドを産生する方法を提供する。宿主細胞は次いで適した条件下にて培養され、それによりポリペプチドの発現が可能となる。
【００４４】
３．  方法及び用途
本発明の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼは、プライマー伸長、核酸重合反応、及びその他のＤＮＡポリメラーゼを必要とする用途を含む、様々な用途に適したものである。
【００４５】
例えば、改変突然変異体ＤＮＡポリメラーゼは、プライマー伸長又はプライマー若しくはプライマーのセット及び核酸鋳型からの核酸の重合の方法に使用することができる。一般に、かかる方法は、（Ａ）本発明による改変ＤＮＡポリメラーゼを、（１）標的核酸及び（２）標的核酸の一方の鎖に相補的な核酸の重合のプライミングに適した少なくとも１つのプライマーに曝す（一緒にする、混合する、接触させる等）ステップと、（Ｂ）ポリメラーゼ、標的核酸、及びプライマー（複数の場合もある）を、プライマー（複数の場合もある）からの核酸の重合を可能とする条件に曝す（供する等）ステップとを含む。ポリメラーゼをその他の物質に曝すステップは、言及された物質が物理的に相互作用することができるように言及された物質の互いの曝露をもたらす任意の作用とすることができる。かかるステップはしたがって、物質を組成物中に一緒に添加するステップ、物質を組成物（即ち、混合物）中に一緒に混合するステップ等を含むことができる。曝すステップは、完全に若しくは部分的に手作業で行うことができるし、又は完全に若しくは部分的に自動的に（即ち、機械類、ロボット工学等によって）行うこともできる。当業者であれば認識しているように、多種多様な核酸を、複製、増幅、配列決定等に供することができる。したがって、本発明は、標的核酸、その配列、その長さ等によって限定されない。さらに、当業者であれば、標的核酸鋳型に基づく核酸の重合のプライミング用のプライマーの設計の際に考慮すべきパラメータを完全に認識している。したがって、本発明はプライマーの同一性又は配列によって限定されない。増幅が望まれる場合（例えば、ＰＣＲ）、異なる配列を有し、かつ、標的核酸の逆鎖上の２つの異なる配列に対する特異性を有する２つのプライマーを使用すべきであるということを理解すべきである。さらに、一緒にした物質を、重合を可能とする条件に曝すステップは、重合を可能とする任意の作用とすることができる。重合に適した多くの条件が当該技術分野において既知であり、当業者であれば、必要とされる状況に応じて、過度又は過剰な実験を行うことなく、任意の適切な条件を選択することができる。考慮すべきパラメータとしては、必ずしもこれらに限定されないが、塩濃度、金属イオン又はキレート剤濃度、バッファー濃度及び同一性、界面活性剤及び有機溶媒の有無、ポリメラーゼ又はその他の酵素の濃度、ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドの存在又は濃度、重合阻害物質又はターミネーターの存在又は濃度、重合産物の検出用のプローブ又は色素の存在又は濃度、温度、並びに曝露時間の長さが挙げられる。例示的な実施形態において、プライマー（複数の場合もある）からの核酸の重合を可能とする条件はＰＣＲ反応の条件である。当業者によって認識されているであろうように、物質を重合条件に曝すステップは、核酸鋳型を増幅するステップ等の重合のステップであるとみなすことができる。
【００４６】
ポリメラーゼは有利には、ＤＮＡ増幅及びＲＮＡ増幅の両方を含む、核酸増幅用のＰＣＲ反応のあらゆる変形又はタイプに使用される。ＲＮＡ鋳型（例えば、ｍＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ）の増幅については、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素；ＲＴ）をＲＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡ鎖を作るために用いることができ、本発明のＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ相補鎖の増幅用に用いることができる。
【００４７】
いくつかの例示的な実施形態において、ＰＣＲ方法は血液等の「汚れた（dirty）」サンプルに対して行われる。一般に、本明細書において用いる場合、「汚れた」サンプルは、典型的には標的核酸が存在していた環境に元々存在している不定の物質を含むものである。したがって、汚れたサンプルは一般に、標的核酸が重合反応に入る前に精製されなかったサンプルである。
【００４８】
したがって、ポリメラーゼ突然変異体及び関連する方法は、様々な様式で使用することができる。例えば、それらは病原体による感染の初期段階に血液感染を検出するのに使用することができ、より具体的には、対象（例えば、患者）からの或る体積の血液からの循環中又は生物由来物質中の低濃度の病原体を検出するのに使用することができる。かかる病原体の例としては、真菌、細菌（例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis：結核菌）及びピロリ菌（H. pylori））及びウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、及びＨＣＶ）が挙げられる。それらはまた、がん又は遺伝性障害に伴う遺伝子突然変異、マーカー又は多型（例えば、一塩基多型）の検出に用いることができる。さらに、それらは細胞の存在量が低く、かつ生物サンプルがしばしば目的の希少な細胞に加えて大多数のその他の細胞又は組織材料を含むために、検出がしばしば複雑である、母体の血液サンプル中の胎児細胞又は微小転移性腫瘍細胞等の希少な細胞の分析に用いることができる。希少な細胞及び入手可能性が制限されているその他の生物材料を分析することができることで、侵襲性の特徴がより低い新しい診断方法の開発が可能となる。例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、米国特許出願公開第２００５０００９１０８号、及び米国特許出願公開第２００２０１５５５１９号を参照されたい。これらの引用文献はすべて引用することによってそれら全体が本明細書の一部をなすものとする。
【００４９】
その上昇した重合速度により、本発明のポリメラーゼ酵素はまた、例えば、その内容を引用することによって本明細書の一部をなすものとする米国特許出願公開第２０１１００２７８３３号に記載のもの等の「高速ＰＣＲ」反応によく適するものである。さらに、血液及び血液製剤においてみられる阻害物質に対するその耐性により、本発明のポリメラーゼ酵素は特に、血液又は血液画分を含有するサンプルにおける「高速ＰＣＲ」反応によく適するものである。本発明のポリメラーゼ酵素は、ＥＤＴＡ及びヘパリン等の抗凝固剤で処理された血液又は血液画分を含有するもの等の「汚れた」サンプルにおける「高速ＰＣＲ」反応によく適するものであるのが好ましい。
【００５０】
いくつかの実施形態において、異なる配列を有する２以上のプライマーが本方法において使用される。例えば、いくつかの実施形態において、２つのプライマーが使用され、ここで一方のプライマーは鋳型ＤＮＡの一方の鎖に特異的に結合し、もう一方のプライマーは鋳型ＤＮＡのもう一方の鎖に結合し、二本鎖重合産物の産生を可能とする。いくつかの実施形態において、１つのプライマーは、ｍＲＮＡ等の一本鎖ＲＮＡ鋳型に存在する配列に特異的である。第１のプライマーからのＲＮＡの第１の相補鎖の重合は、第２のプライマー用の鋳型を提供する。第１の重合に続いて、第１のプライマーは鋳型ＲＮＡ又はＤＮＡ相補鎖のいずれかからの重合をプライムすることができる。標的核酸に対する配列特異性を有する１又は複数の核酸プローブ（標的の相補鎖を含み、ここで標的は一本鎖である）を本方法に含めて、検出用手段を提供することができる。
【００５１】
多くのＰＣＲ方法は、プローブ、色素、又は重合（例えば、増幅）産物の検出を可能とするその他の物質を含む。かかる方法の１つの例はリアルタイムＰＣＲである。したがって、本方法は、重合反応に重合産物の検出を可能とする物質を含めるステップを含むことができる。さらに、本発明の方法は、方法又は特定の方法ステップが成功裏に行われたかを決定する１又は複数の対照反応を含む方法を包含する。対照反応は、陽性対照反応又は陰性対照反応とすることができる。当業者であれば特定のステップを本明細書において詳細に説明する必要なく、適切な対照反応条件を考案することが完全に可能である。
【００５２】
４．  キット
本発明は、標的配列の検出のための、核酸複製、プライマー伸長、又は増幅用のキット及び診断システムを包含する。この目的のために、本明細書に開示する方法用の反応成分の１又は複数を、標的核酸の検出における使用のためのキットの形態で供給することができる。かかるキットにおいて、適量の１又は複数の反応成分を、１又は複数の容器中に提供するか、又は基体上に（例えば、静電相互作用又は共有結合により）保持させる。
【００５３】
本明細書に記載するキットは、上記の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼの１又は複数を含む。キットは、１又は複数の本発明の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼの入った１又は複数の容器を含むことができる。キットは、単一の突然変異体ポリメラーゼを単一の容器中に入れることができ、複数の容器に同一の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼを入れることもでき、単一の容器に２以上の異なる本発明の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼを入れることもでき、又は複数の容器に異なる突然変異体ＤＮＡポリメラーゼを入れることもでき、又は複数の容器に２以上の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼの混合物を入れることもできる。ＤＮＡポリメラーゼ（複数の場合もあり）及び容器のあらゆる組合せ又は並べ替えが本発明のキットに包含される。好ましい実施形態において、キットは、１）ポリメラーゼ、バッファー（Ｍｇ２＋を含む）、及びヌクレオチドの入った３つの別々のチューブ、又は２）ポリメラーゼ、バッファー成分、Ｍｇ２＋、及びヌクレオチドの混合物を含有するマスターミックスを含む。キットの使用者らは、適した核酸鋳型又はかかる鋳型を含有する試験サンプル（例えば、血液）及びプライマーを、使用者らの目的及びアッセイ設計に応じて添加することができる。ポリメラーゼ及び／又はバッファー（又はマスターミックス）は更に、１又は複数の界面活性剤を含有することができ、ホットスタート抗体を含有することもできる。リアルタイムＰＣＲ用のマスターミックスは、更に色素を含有することができる。
【００５４】
キットはまた、上記の方法の実行用の更なる材料を含有することもできる。いくつかの実施形態において、キットは、本発明による突然変異体ＤＮＡポリメラーゼを使用する方法を行うための試薬、材料のいくつか又はすべてを含有する。キットはしたがって本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲ反応を行うための試薬のいくつか又はすべてを含むことができる。キットの成分のいくつか又はすべては、本発明のポリメラーゼの入った容器（複数の場合もあり）とは別の容器中に提供することができる。キットの更なる成分の例としては、これらに限定されないが、１又は複数の異なるポリメラーゼ、対照核酸又は標的核酸に特異的な１又は複数のプライマー、対照核酸又は標的核酸に特異的な１又は複数のプローブ、重合反応用バッファー（１×形態又は濃縮形態におけるもの）、マグネシウム、ヌクレオチド、及び重合産物の検出用の１若しくは複数の色素又は１若しくは複数の蛍光分子が挙げられる。キットはまた、以下の成分（支持体、終結試薬、修飾試薬又は消化試薬、浸透圧調節物質、及び検出プローブ）の検出用装置の１又は複数を含むこともできる。
【００５５】
増幅及び／又は検出プロセスに使用される反応成分は、種々の形態で提供することができる。例えば、成分（例えば、酵素、ヌクレオチド三リン酸、プローブ及び／又はプライマー）は、水溶液中に懸濁させることができ、又はフリーズドライ若しくは凍結乾燥粉末、ペレット、若しくはビーズとして提供することができる。後者の場合、成分は、再構成された場合、アッセイにおける使用のための成分の完全な混合物を形成する。
【００５６】
キット又はシステムは、少なくとも１つのアッセイに十分な量で、本明細書に記載する成分のあらゆる組合せを含有することができ、成分の使用についての有形形態で記録された説明書も更に含むことができる。いくつかの用途において、１又は複数の反応成分は、個別の、典型的には使い捨てのチューブ又は同等の容器中に予め計量された単回使用量で提供することができる。かかる配置により、標的核酸の存在について試験されるサンプルを個別のチューブに添加することができ、増幅を直接行うことができる。キット中に供給される成分の量は任意の適量とすることができ、製品が向けられる標的市場に応じて決めることができる。適量の決定についての一般指針は、例えば、Joseph Sambrook and David W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001及びFrederick M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 2003においてみることができる。
【００５７】
本発明のキットは、本発明の方法の実行に有用なあらゆる数の更なる試薬又は物質を含むことができる。かかる物質としては、これらに限定されないが、抗凝固剤（例えば、ＥＤＴＡ及びヘパリン）、細胞溶解用試薬（バッファーを含む）、二価カチオンキレート剤又は望まれないヌクレアーゼを阻害するその他の作用物質、ポリメラーゼ及び反応のその他の成分が正しく機能していることを確認するのに使用される対照ＤＮＡ、ＤＮＡ分画試薬（バッファーを含む）、増幅反応試薬（バッファーを含む）、並びに洗浄液が挙げられる。本発明のキットはあらゆる温度で提供することができる。例えば、タンパク質成分又はそれらの複合体を液体中に含有するキットの貯蔵のために、キットは０℃より低温で提供し維持するのが好ましく、−２０℃以下、又はそうでなければ凍結状態で提供し維持するのが好ましい。
【００５８】
成分が供給される容器（複数の場合もあり）は、供給形態を保持することができるいずれかの従来の容器とすることができ、例えば、マイクロチューブ、アンプル、ビン、若しくは流体装置、カートリッジ、側方流動装置等の一体式試験装置、又はその他の類似の装置が挙げられる。キットは標的核酸の増幅又は検出における使用のための標識核酸プローブ又は非標識核酸プローブのいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは本明細書に記載する方法のいずれか、例えば、核酸抽出及び／又は精製を伴わない粗マトリックスを用いる方法における成分の使用についての説明書を更に含むことができる。
【００５９】
キットはまた、容器又は容器の組合せの保持用の包装材料を含むこともできる。かかるキット及びシステム用の典型的な包装材料としては、反応成分又は検出プローブを種々の配置（例えば、バイアル、マイクロタイタープレートウェル、マイクロアレイ中等）のいずれかで保持する固体マトリックス（例えば、ガラス、プラスチック、紙、ホイル、微小粒子等）が挙げられる。
【００６０】
本明細書において用いる場合、「阻害物質に対して耐性」であるＤＮＡポリメラーゼとは、野生型ＤＮＡポリメラーゼの重合速度を、ＰＣＲ反応における産物形成の成功が認められないレベルへと低下させるような阻害物質の存在下でのＰＣＲの際の許容レベルのＤＮＡ重合及び／又は所望の産物の正確な増幅を可能とする、ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体又は変異体をいう。或る特定の実施形態において、阻害物質はＥＤＴＡ又はヘパリンで処理された全血である。そして、「阻害物質に対して耐性」という用語はまた、ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体又は変異体が、かかる阻害物質で前処理され、かつ、混合物の少なくとも１体積％（例えば、２体積％、２．５体積％、５体積％、１０体積％、２０体積％、２５体積％、３０体積％、３５体積％、４０体積％、４５体積％、又は５０体積％）を占める、血液サンプルを含有するＰＣＲ反応混合物からの許容レベルのＤＮＡ重合及び／又は所望の産物の正確な増幅を可能とする状況のこともいう。
【００６１】
本明細書において用いる場合、「標的核酸」又は「標的」という用語は、標的核酸配列を含有する核酸をいう。標的核酸は一本鎖又は二本鎖とすることができ、しばしばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの誘導体、又はそれらの組合せである。「標的核酸配列」、「標的配列」又は「標的領域」は、一本鎖核酸の配列の全部又は一部を含む特異的配列を意味する。標的配列は、一本鎖又は二本鎖核酸のいずれかの形態とすることができる、核酸鋳型内とすることができる。鋳型は、精製若しくは単離された核酸とすることができ、又は精製若しくは単離されていない核酸とすることができる。
【００６２】
本明細書において用いる場合、「増幅」という用語及びその変形は、典型的には「鋳型」と称されるポリヌクレオチドである、ポリヌクレオチドの少なくともいくらかの部分の複数のコピー又は相補鎖の産生についてのあらゆるプロセスを含む。鋳型ポリヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖とすることができる。所与の鋳型の増幅は、一括して「アンプリコン」と称されるポリヌクレオチド増幅産物の集団の生成をもたらすことができる。アンプリコンのポリヌクレオチドは一本鎖若しくは二本鎖とすることができ、又はそれら両方の混合物とすることができる。典型的には、鋳型は標的配列を含み、得られるアンプリコンは標的配列と実質的に同一又は標的配列に実質的に相補的な配列のいずれかを有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、特定のアンプリコンのポリヌクレオチドは、互いに実質的に同一であるか、又は実質的に相補的であり、代替的には、いくつかの実施形態において、所与のアンプリコン内のポリヌクレオチドは互いに異なるヌクレオチド配列を有することができる。増幅は、線形様式又は指数関数的様式で進行することができ、所与の鋳型の反復及び連続した複製を伴い、２以上の増幅産物を形成させることができる。いくつかの典型的な増幅反応は、鋳型に基づく核酸合成の連続及び反復サイクルを含み、鋳型のヌクレオチド配列の少なくともいくらかの部分を含有し、かつ、少なくともいくらかの程度の鋳型とのヌクレオチド配列同一性（又は相補性）を共有する、複数の娘ポリヌクレオチドの形成をもたらす。いくつかの実施形態において、増幅の「サイクル」と称することができる、核酸合成の各事例は、（例えば、ｄｓＤＮＡの一方の鎖に切れ目を入れることにより）遊離の３’末端を作成し、それによりプライマーを生成するステップとプライマー伸長ステップとを含み、任意に、鋳型が部分的又は完全に変性される、更なる変性ステップもまた含めることができる。いくつかの実施形態において、１回の増幅は、単一の増幅サイクルの所与の数の反復を含む。例えば、増幅の回数は、５回、１０回、１５回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、５０回、７５回、１００回又はそれより多い回数の特定のサイクルの反復を含むことができる。１つの例示的な実施形態において、増幅は、特定のポリヌクレオチド鋳型が核酸合成の２つの連続したサイクルに供されるあらゆる反応を含む。合成は鋳型依存的核酸合成を含むことができる。
【００６３】
「プライマー」又は「プライマーオリゴヌクレオチド」という用語は、鋳型核酸にハイブリダイズすることができ、かつ、核酸合成用の鋳型核酸の組成に従う伸長ヌクレオチドの取り込みについての開始点として作用することができる、核酸又はオリゴヌクレオチドの鎖をいう。「伸長ヌクレオチド」とは、増幅の際に伸長産物中に組み入れられることができるあらゆるヌクレオチド、即ち、標識を含むことができる、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの誘導体をいう。
【００６４】
「ハイブリダイゼーション」又は「ハイブリダイズ」又は「アニール」とは、特定のハイブリダイゼーション条件（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で平行又は好ましくは逆平行配向にて一緒になることで、２つの構成成分である鎖が水素結合によって結合している、安定な二本鎖構造又は領域（「ハイブリッド」と称される場合もある）を形成させる、完全又は部分的に相補的な核酸鎖の能力をいう。水素結合は典型的には、アデニンとチミン若しくはウラシル（ＡとＴ若しくはＵ）又はシトシンとグアニン（ＣとＧ）との間に形成するが、その他の塩基対が形成することもある（例えば、Adams et al., The Biochemistry of the Nucleic Acids, 11th ed., 1992）。
【００６５】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」又は「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブ又はオリゴマーがその意図される標的核酸配列に特異的にハイブリダイズするが、別の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件はよく知られた因子、例えば、ＧＣ含量及び配列長に応じて変動することができ、分子生物学における当業者によく知られた標準的方法を用いて経験的に予測又は決定することができる（例えば、Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Ch. 11, pp. 11.47-11.57, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.)）。
【００６６】
本明細書中に開示されるように、多くの値の範囲が提示される。文脈により明らかに逆のことが示されない限り、その範囲の上限及び下限の間に介在する各値もまた、下限の単位の１０分の１まで、具体的に開示されているということを理解すべきである。任意の記載された値又は記載された範囲中に介在する値と記載された又はその記載された範囲中に介在する任意のその他の値との間の、より小さい各範囲が本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、この範囲中に含まれるか又は除外されてよく、上限及び下限の一方若しくは両方がそのより小さい範囲に含まれるか、又はいずれも含まれない、各範囲はまた、記載された範囲において限界値が具体的に除外されたかに応じて、本発明に包含される。記載された範囲が上限及び下限の一方又は両方を含む場合、それらの含められた上限及び下限の一方又は両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００６７】
「約」という用語は、一般に、示された数の±１０％のことをいう。例えば、「約１０％」は、９％〜１１％の範囲を示すことができ、「約１」は、０．９〜１．１を意味することができる。「約」のその他の意味は文脈から明らかにすることができ、四捨五入を意味するような場合、例えば、「約１」はまた、０．５〜１．４を意味することもできる。
【００６８】
本明細書において用いる場合、「対象」という用語は、ゲノムを有するあらゆる生物のことをいい、好ましくは、診断、治療、観察又は実験の対象である、生きている動物、例えば、哺乳類である。対象の例としては、ヒト、家畜動物（肉牛及び乳牛、ヒツジ、家禽、ブタ等）、又は伴侶動物（イヌ、ネコ、ウマ等）を挙げることができる。
【００６９】
「生物サンプル」という用語は、生物（例えば、患者）又は生物の成分（例えば、細胞）から得られたサンプルをいう。サンプルは、あらゆる生物組織、細胞（複数の場合もあり）又は体液のものとすることができる。サンプルは、ヒト患者又は動物対象等の対象に由来するサンプルである、「臨床サンプル」とすることができる。かかるサンプルとしては、これらに限定されないが、唾液、痰、血液、血液細胞（例えば、白血球）、羊水、血漿、精液、骨髄、及び組織若しくは細針生検サンプル、尿、腹水、及び胸水、又はそれらからの細胞が挙げられる。生物サンプルはまた、組織学的目的で採取された凍結切片等の組織の切片も含むことができる。生物サンプルはまた、「患者サンプル」とも称することができる。生物サンプルはまた、実質的に精製若しくは単離されたタンパク質、膜標品、又は細胞培養物も含むことができる。
【００７０】
本明細書において用いる場合、「接触させる」という用語及びその変形は、任意の成分のセットに関連して用いられる場合、接触されるべき成分が混合されて同一の混合物となる（例えば、同じ区画又は溶液へと添加される）あらゆるプロセスを含み、言及された成分の間の実際の物理的な接触を必ずしも必要としない。言及された成分は、あらゆる順序で接触されることができ、又はあらゆる組合せ（若しくは部分的組合せ）で接触されることができ、言及された成分の１つ又はいくつかが、所望によりその他の言及された成分の添加の前に、引き続いて混合物から取り出されるような状況をも含むことができる。例えば、「Ａと、Ｂ及びＣとを接触させる」には、以下の状況がいずれもすべて含まれる。（ｉ）ＡがＣと混合され、次いでＢが混合物に添加される；（ｉｉ）ＡとＢとが混合されて混合物となり、Ｂが混合物から取り出され、次いでＣが混合物に添加される；並びに（ｉｉｉ）ＡがＢとＣとの混合物に添加される。「鋳型と反応混合物とを接触させる」には、以下の状況がいずれもすべて含まれる。（ｉ）鋳型が反応混合物の第１の成分と接触して混合物が生じ、次いで反応混合物のその他の成分が任意の順序又は組合せで混合物に添加される；及び（ｉｉ）反応混合物が鋳型との混合の前に完全に形成される。
【００７１】
本明細書において用いる場合、「混合物」という用語は、散在しており、いかなる特定の順序にもない、要素の組合せをいう。混合物は、不均一（heterogeneous）であり、その異種の構成成分へと空間的に分離可能ではない。要素の混合物の例としては、同一の水溶液に溶解された多くの異なる要素、又は異なる要素が空間的に別々になく、ランダムに若しくは不特定の順序で固体支持体に付着した多くの異なる要素が挙げられる。言い換えると、混合物はアドレス指定可能ではない。具体的には、表面結合オリゴヌクレオチドの種は空間的に別々であり、アレイはアドレス指定可能であるため、表面結合オリゴヌクレオチドのアレイは、当該技術分野において一般に知られており、以下に記載するように、表面結合オリゴヌクレオチドの混合物ではない。
【実施例】
【００７２】
＜実施例１：突然変異体ポリメラーゼの生成及びスクリーニング＞
突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを、その内容全体を引用することによって本明細書の一部をなすものとする米国特許出願公開第２０１１００２７８３３号に記載のように、野生型テルムス・アクウァーティクスＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする配列番号４の配列を含む核酸のランダム突然変異誘発によって生成した。
【００７３】
簡単に説明すると、ランダム突然変異体ライブラリを、高速サイクリング条件下での５回の選択、次いで、スクリーニング（２回目、４回目、及び５回目のラウンド後）に供し、短縮伸長時間を用いる増幅を支持するクローンを同定した。野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較して、高速サイクリング条件下におけるリアルタイムＰＣＲの際に性能の改善を示すポリメラーゼを、ＤＮＡ配列決定に供し、突然変異を同定した。高速増幅クローンにおいて現れる目的の突然変異を同定し、部位特異的突然変異誘発を用いて組換えを行った。組換え体を高速サイクリング条件でのリアルタイムＰＣＲを用いてスクリーニングした。野生型Ｔａｑ及び元の選択／スクリーニングからの最良の性能のものの両方よりも性能が優れた突然変異体ポリメラーゼを、同定し、配列決定し、精製し、更に特徴決定して、最短の伸長時間を用いるＰＣＲを支持する突然変異の組合せを有するクローンを同定した。
【００７４】
選択された上記のようにして得られた突然変異体ポリメラーゼを更に特徴決定してＥＤＴＡ及びヘパリン等の抗凝固剤で処理された血液の存在下でプライマーから核酸鎖を重合するそれらの能力を評価した。
【００７５】
＜実施例２：ＥＤＴＡに対する突然変異体酵素の耐性の特徴決定＞
この実施例において、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害することが知られているＥＤＴＡ中に採取され貯蔵された全血の存在下でのエンドポイントＰＣＲの際に、標的ＤＮＡを増幅する様々な突然変異体酵素の能力を調べるアッセイを行った。
【００７６】
具体的には、エンドポイントアッセイに典型的な成分を含有するＰＣＲ反応を、野生型Ｔａｑ（Ｔａｑ２０００、アジレント・テクノロジーズ；配列番号４）及びそれに由来する多くの突然変異体を用いて構築した。調べた突然変異体には、上記の突然変異体Ｔａｑ  １Ｃ２、米国特許出願公開第２０１１００２７８３３号に記載の、Ｔａｑ  ４２、Ｔａｑ  ３Ｂ、Ｔａｑ  ２Ｃ２、及びＴａｑ  ５Ａ２を含む多くの突然変異体、並びに３つのその他の突然変異体Ｔａｑ  ７Ｐ、Ｔａｑ  ８Ｐ、及びＴａｑ  ５が含まれる。以下の表はこれらの突然変異体における突然変異をまとめる。
【００７７】
【表１】
2015156858.tif 000002
【００７８】
ＥＤＴＡに対するこれらの酵素の耐性を調べるために、ＰＣＲを行って、ＥＤＴＡにより処理しておいた全血中のヒトゲノムＤＮＡからのヒトＩＧＦ遺伝子の３２２塩基対標的を増幅した。ＥＤＴＡ処理血液は、１．８μｇ／μｌのＫ２ＥＤＴＡを含有する。ＰＣＲ反応において、血液の終濃度は１体積％〜６５体積％の範囲であった。ＰＣＲストリップチューブに前もって分注しておいた酵素マスターミックスにヒト血液を個々に鋳型として添加した。ポリメラーゼと鋳型との組合せをそれぞれ二重にアッセイした。増幅は５０μｌの１つの反応液あたり５０ｎｇの各酵素を用いて行った。熱サイクリングパラメータは以下の通りとした。９５℃、５分；９５℃、３０秒；６０℃、３０秒、及び７２℃、１分を３０サイクル。
【００７９】
増幅産物を臭化エチジウムで前染色したアガロースゲルで分画した。ＰＣＲ産物を生じた血液の最大量を以下の表に要約する。
【００８０】
【表２】
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【００８１】
結果は、野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはＥＤＴＡ処理血液が反応混合物の１体積％未満である場合にのみ３２２ｂｐ産物を増幅することができたことを示す。対照的に、突然変異体の多くは、５０％を超えるほどの多量のＥＤＴＡ処理血液の存在下で特異的標的産物を産生することができた。これらのなかでも、Ｔａｑ  ４２、Ｔａｑ  ２Ｃ２、及びＴａｑ  １Ｃ２はＥＤＴＡに対してもっとも耐性が高く、これらはそれぞれ６０％、６５％、及び６０％のＥＤＴＡ処理血液サンプルの存在下で特異的標的産物を産生することができた。
【００８２】
＜実施例３：ヘパリンに対する突然変異体酵素の耐性の特徴決定＞
ヘパリンは、もう１つのルーチン的に用いられている抗凝固剤である。この実施例において、ヘパリンにより処理しておいた全血の存在下で標的ＤＮＡを増幅するＴａｑ  ２Ｃ２及びＴａｑ  １Ｃ２突然変異体酵素の能力を調べるアッセイを行った。ヘパリン処理血液は、１５．８ＵＳＰ単位／ｍｌのヘパリンナトリウムを含有する。
【００８３】
エンドポイントアッセイに典型的な成分を含有するＰＣＲ反応を構築し、アッセイを、ヘパリン処理血液を各反応についての鋳型として用いた以外は、上記のようにして行った。ＰＣＲ反応において、ヘパリン処理血液の終濃度は１０体積％〜５０体積％の範囲であった。結果を図２に示す。図２に示すように、Ｔａｑ  ２Ｃ２は、１０体積％〜３０体積％のヘパリン処理血液の存在下でかなりの量の特異的標的産物を産生することができた。しかし、標的産物の量又は収率は、概してヘパリン処理血液の量が上昇すると、低下した。ヘパリン処理血液が３０体積％以上の場合、Ｔａｑ  ２Ｃ２は活性の迅速な損失を示し、５０体積％のヘパリン処理血液の存在下では活性の完全な欠乏を示した。対照的に、Ｔａｑ  １Ｃ２は一貫して試験範囲全体にわたって（１０体積％〜５０体積％）かなりの量の特異的産物を産生した。より驚くべきことに、Ｔａｑ  １Ｃ２は、１０体積％〜５０体積％のヘパリン処理血液の存在下で、ほぼ同じ活性レベルを維持し、本質的に同等の量の産物を産生した。
【００８４】
これらの結果は、Ｔａｑ  １Ｃ２突然変異体ＤＮＡポリメラーゼは、実施例２に記載のその他のＥＤＴＡ耐性突然変異体ＤＮＡポリメラーゼと比較して有利な性質を有するということを支持する。
【００８５】
追加のアッセイを更に行って、ＳｕｒｅＣｙｃｌｅｒで同様にして、Ｔａｑ  １Ｃ２、２Ｃ２、４２、５、５Ａ２、及び７Ｐ突然変異体がヘパリン処理全血中のヒトゲノムＤＮＡからのヒトＩＧＦ遺伝子の上記の３２２塩基対標的を増幅する能力を調べた。熱サイクリングパラメータは以下の通りとした。９５℃、５分、次いで３０サイクルの、９５℃、３０秒、６０℃、３０秒、及び７２℃、１分。反応混合物には、３００ｎＭの各プライマー、１５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）、９６ｍＭのＫＣｌ、２％のＤＭＳＯ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、各２００μＭのｄＡ、ｄＧ、ｄＣ及びｄＴを含有する反応バッファー、０．５μｌの、各０．５％のＩｇｅｐａｌ及びＴｗｅｅｎ−２０を含むＦＤＢ中５０ｎｇ／ｌのＴａｑ突然変異体を含有させた。遠心分離により細片を沈殿させた後、各５０μｌの反応混合物のうち８μｌをＮｕｓｉｅｖｅ−ＴＢＥゲルで泳動した。結果を図５に示す。
【００８６】
この場合も、Ｔａｑ  １Ｃ２突然変異体は、５体積％〜３０体積％のヘパリン処理血液の存在下でほぼ同じ活性レベルを維持しており、本質的に同等の量の産物を産生した。そして、Ｔａｑ  １Ｃ２突然変異体は３０体積％のヘパリン処理血液の存在下で標的ＤＮＡを増幅した唯一の突然変異体である。
【００８７】
＜実施例４：Ｔａｑ  １Ｃ２と市販のＤＮＡポリメラーゼとの比較＞
この実施例において、Ｔａｑ  １Ｃ２突然変異体ＤＮＡポリメラーゼを多くの市販のＤＮＡポリメラーゼと更に比較した。この目的のために、血液から増幅した標的はヒトゲノムの２３２ｂｐ非コード単一コピー領域であった。
【００８８】
簡単に説明すると、全血サンプルを対象から得て、標準的プロトコルに従ってＥＤＴＡ又はヘパリンのいずれかで処理した。これらのサンプルを、２３２ｂｐ領域を増幅するための鋳型として用いた。各ＰＣＲ反応液は５０μｌの体積であり、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＣｙｃｌｅｒ（アジレント・テクノロジーズ・インク）を用いて３０回のサイクルに供した。４００ｎＭの各プライマーをすべての場合において用いた。用いたＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  １Ｃ２突然変異体（「Ａｇｉｌｅｎｔ」）並びに多くの製造業者らにより市販されている、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｌｏｏｄ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ  Ａ（「ＫＡＰＡ−Ａ」、カパ・バイオシステムズ）、ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｏｍｎｉ  ＫｌｅｎＴａｑ（「ＫｌｅｎＴａｑ」、シグマ・アルドリッチ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｔｅｒｒａ  Ｄｉｒｅｃｔ（「ＣｌｏｎＴｅｃｈ」、クローンテック・ラボラトリーズ・インク）及びＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｒｅｃｔ（「Ｔｈｅｒｍｏ」、サーモ・サイエンティフック）を含むポリメラーゼを含む。反応混合物を製造業者らの説明書に従って調合した。熱サイクリングプロファイルは製造業者らの勧めに従い、以下に詳細に記載する。
【００８９】
【表３】
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【００９０】
増幅産物を、臭化エチジウムで前染色しておいた４％Ｎｕｓｉｅｖｅアガロースゲルで分画した。結果を図３及び４に示し、ここで、サイズラダーは１００ｂｐ単位であり、同じ量の各産物（各５０μｌの反応液の８μｌ又は６％）をゲルにローディングした。ＥＤＴＡ又はヘパリンに対するこれらのＤＮＡポリメラーゼの耐性を以下に順位付けする。
【００９１】
【表４】
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【００９２】
上に示すように、Ｔａｑ  １Ｃ２突然変異体はその他のポリメラーゼのほとんどよりも優れた性能を示した。さらに、Ｔａｑ  １Ｃ２突然変異体は４５体積％のヘパリン処理血液の存在下で良好な収率を示す唯一の突然変異体であることが判明した。Ｔａｑ  １Ｃ２突然変異体はまた、ＥＤＴＡとヘパリンとの両方に対して良好な耐性を示す唯一の突然変異体であった。
【００９３】
好ましい実施形態の上記の実施例及び記載は、特許請求の範囲により規定される本発明を限定するものではなく、例示するものと解釈すべきである。容易に認識されるように、上記の特徴の多数の改変及び組合せを、特許請求の範囲に示す本発明から逸脱することなく用いることができる。かかる改変は本発明の範囲から逸脱するものとみなされるものではなく、すべてのかかる改変は以下の特許請求の範囲内に含まれる意図である。本明細書において引用したすべての文献は、それらの全体が引用することによって本明細書の一部をなすものとする。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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