(57)【要約】【課題】ニホンウナギ等のウナギ目葉形仔魚の成長に有用な、成長促進剤を提供すること。【解決手段】ヒアルロン酸産生促進物質を有効成分とするウナギ目葉形仔魚の成長促進剤を提供する。さらに詳しくは、ヒアルロン酸産生促進物質が真菌類および／または海藻類から得られるヒアルロン酸産生促進物質であるウナギ目葉形仔魚の成長促進剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸産生促進物質を有効成分とするウナギ目葉形仔魚の成長促進剤。
【請求項２】
ヒアルロン酸産生促進物質が真菌類および／または海藻類から得られるヒアルロン酸産生促進物質である請求項１に記載の成長促進剤。
【請求項３】
ウナギ目葉形仔魚がウナギ科魚類、ハモ科魚類、アナゴ科魚類またはウツボ科魚類の仔魚である請求項１または２に記載の成長促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウナギ目葉形仔魚の成長促進剤に関する。さらに、該剤を含む養殖用飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウナギ目魚類の一つであるニホンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）はレプトケファルス幼生と呼ばれる浮遊生活に適応した葉形仔魚期を有し、約４ヶ月から５ヶ月ほどでシラスウナギへと変態する（非特許文献１、２参照）。シラスウナギは日本各地の河川へ遡上し、採捕された後、養鰻用池で肥育され、可食サイズとなって販売される。現在、ウナギ養殖に必要な種苗は１００％河川で捕獲された天然のシラスウナギに依存している。近年、シラスウナギの採捕量が激減し、国内で必要な種苗が十分確保できない事態になっており、人工種苗生産の必要性が迫られている。
【０００３】
サメ卵を基本とする飼料によって、ニホンウナギ仔魚期に相当するレプトケファルス幼生の成長が確認されている（特許文献１参照）。そこで、サメ卵を基本として、低分子化させた大豆ペプチド、オキアミエキス、ビタミン類等を加えた栄養強化飼料が開発された。さらにサメ卵の代替として鶏卵も利用できるとされた（特許文献２参照）。しかし、現在でもサメ卵を基本とした飼料がニホンウナギ仔魚の成長において最も優れた飼料とされている。
【０００４】
ニホンウナギを含めたウナギ目魚類レプトケファルス幼生の体内には、グリコサミノグリカンスの一種であるヒアルロン酸が蓄積されている。ウナギ目魚類であるマアナゴ（Ｃｏｎｇｅｒ  ｍｙｒｉａｓｔｅｒ）のレプトケファルス幼生を用いてヒアルロン酸の特徴に関する研究がなされており、１）乾燥重量の５０％以上をヒアルロン酸が占め、２）変態期にヒアルロン酸が代謝分解されることが明らかとなっている（非特許文献３参照）。
また、他のウナギ目魚類、カライワシ目魚類レプトケファルス幼生の生体内に含まれるグリコサミノグリカンスのほとんどはヒアルロン酸で構成され（非特許文献４参照）、さらに、カライワシ目魚類レプトケファルス幼生の生体内グリコサミノグリカンスは変態時のエネルギー源として利用されているとの報告がある（非特許文献５参照）。よって、レプトケファルス幼生内のヒアルロン酸は初期成長時の生命活動に重要な役割を担っていると考えられる。しかし、ウナギ目魚類レプトケファルス幼生時のヒアルロン酸代謝はほとんど明らかにされておらず、ヒアルロン酸代謝と成長との関連性も明らかにされていない。
【０００５】
ヒアルロン酸の合成を促進させる物質である、所謂、ヒアルロン酸産生促進物質は、ほ乳類の皮膚繊維芽細胞へ添加したり、皮膚に塗擦したりすることにより、ヒアルロン酸合成酵素やヒアルロン酸量を増加することが報告されている。
このようなヒアルロン酸産生促進物質として、マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）からの抽出物（特許文献３参照）、スジアオノリ（Ｕｌｖａ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａ）、アラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ  ｂｉｃｙｃｌｉｓ）、アナアオサ（Ｕｌｖａ  ｐｅｒｔｕｓａ）、フクロフノリ（Ｇｌｏｉｏｐｅｌｌｔｉｓ  ｆｕｒｃａｔａ）等の海藻類からの抽出物（特許文献４、５、６参照）が報告されている。しかし、これらの物質が、ほ乳類以外の脊椎動物もしくは非ほ乳類培養細胞においてヒアルロン酸合成酵素の発現もしくはヒアルロン酸合成にどのような影響を与えるかについては全く分かっていない。
【０００６】
アブラツノザメ（Ｓｑｕａｌｕｓ  ａｃａｎｔｈｉａｓ）等のサメ卵をベースとしたウナギ仔魚用飼料は、ニホンウナギ仔魚期に相当するレプトケファルス幼生の消化吸収能に併せて開発された飼料である（非特許文献６参照）。しかし、人工的に得られたニホンウナギレプトケファルス幼生が、養殖用種苗として用いられるシラスウナギへと変態するまでに要する養成期間は、耳石日齢より解析した天然のシラスウナギ（非特許文献１、２）より相対的に長く（非特許文献７参照）、多くの飼料も必要となる。
そこで、従来から使用されているサメ卵を基本とするウナギ仔魚用飼料より、ウナギ仔魚の成長が早く、シラスウナギまでの養成期間が短縮できる飼料、即ち、１尾辺りの人工種苗生産のコスト削減が可能な飼料の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１１―２５３１１１号公報
【特許文献２】特開２００５―１３１１６号公報
【特許文献３】特許第４５８３５０１号（Ｐ４５８３５０１）
【特許文献４】特開平５―１０１８７１号公報
【特許文献５】特開平６―９４２２号公報
【特許文献６】特開平８―１９８７４１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｙｕｔａｋａ  Ｋａｗａｋａｍｉ，  Ｎｏｒｉｔａｋａ  Ｍｏｃｈｉｏｋａ，  Ａｋｉｎｏｂｕ  Ｎａｋａｚｏｎｏ．  １９９９．  Ｉｍｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｇｌａｓｓ−ｅｅｌｓ  Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  ｅｎｔｅｒｉｎｇ  ｒｉｖｅｒ  ｉｎ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｋｙｕｓｈｕ．  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６４，３１５−３２７．
【非特許文献２】Ｙｕｔａｋａ  Ｋａｗａｋａｍｉ，  Ｎｏｒｉｔａｋａ  Ｍｏｃｈｉｏｋａ，  Ｒｙｏ  Ｋｉｍｕｒａ  ａｎｄ  Ａｋｉｎｏｂｕ  Ｎａｋａｚｏｎｏ．１９９９．  Ｓｅａｓｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｒａｔｉｏ，  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｄａｐｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｇｌａｓｓ−ｅｅｌｓ，  Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ，  ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｋｙｕｓｈｕ，  Ｊａｐａｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ２３８，１−１９．
【非特許文献３】Ｙｕｔａｋａ  Ｋａｗａｋａｍｉ，  Ｈｉｒｏｍｉ  Ｏｋｕ，  Ｋａｚｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｕｒａ，  Ｓｈｉｇｅａｋｉ  Ｇｏｒｉｅ  ａｎｄ  Ｈｉｒｏｍｉ  Ｏｈｔａ．２００９．  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ａ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｅｔａｍｏｒｐｈｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｃｏｎｇｅｒ  ｅｅｌ，  Ｃｏｎｇｅｒ  ｍｙｒｉａｓｔｅｒ．  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ２５１７３１，  ５  ｐａｇｅｓ  ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／２５１７３１．
【非特許文献４】Ｅｄｗａｒｄ  Ｐｆｅｉｌｅｒ，  Ｈｉｄｅｎａｏ  Ｔｏｙｏｄａ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｄ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｒｏｎａｌｄ  Ａ．  Ｎｉｅｍａｎ．  ２００２．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｆｉｓｈ  ｌａｒｖａｅ  （ｌｅｐｔｏｃｅｐｈａｌｉ）．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｐａｒｔ  Ｂ  １３２，  ４４３−４５１．
【非特許文献５】Ｅｄｗａｒｄ  Ｐｆｅｉｌｅｒ．  １９９６．  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｍｏｒｐｈｏｓｉｓ  ｉｎ  ｂｏｎｅｆｉｓｈ  （Ａｌｂｕｌａ  ｓｐ．）  ｌｅｐｔｏｃｅｐｈａｌｉ：  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ．  Ｆｉｓｈ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５，  ３５９−３６２
【非特許文献６】増田賢嗣，  今泉均，  橋本博，  小田憲太朗，  古板博文，  松成宏之，  照屋和久，薄浩則，  ２０１１．  イタチザメ卵とアイザメ卵を主体とした飼料によるウナギ初期飼育の可能性．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４  （１），  ７−１３．
【非特許文献７】Ｈｉｄｅｋｉ  Ｔａｎａｋａ，  Ｈｉｒｏｈｉｋｏ  Ｋａｇａｗａ，  Ｈｉｒｏｍｉ  Ｏｈｔａ，  Ｔａｔｓｕｙａ  Ｕｎｕｍａ，  Ｋａｚｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｕｒａ．  ２００３．  Ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌａｓｓ  ｅｅｌ  ｉｎ  ｃａｐｔｉｖｉｔｙ：  ｆｉｓｈ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｇｒｅａｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｆｉｓｈ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８，  ４９３−４９７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記した従来の問題点に鑑み、従来用いられているウナギ仔魚用飼料よりも、ニホンウナギ等のウナギ目葉形仔魚の成長に有用な成長促進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、ヒアルロン酸産生能を促進する物質を添加した飼料を与えることにより、ウナギ目葉形仔魚においてヒアルロン酸合成が促進され、葉形仔魚の成長も促進されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のウナギ目葉形仔魚の成長促進剤等に関する。
〔１〕ヒアルロン酸産生促進物質を有効成分とするウナギ目葉形仔魚の成長促進剤。
〔２〕ヒアルロン酸産生促進物質が野菜類、真菌類、野草類、海藻類または動物性材料から得られる１種以上のヒアルロン酸産生促進物質である上記〔１〕に記載の成長促進剤。
〔３〕ヒアルロン酸産生促進物質が化合物である上記〔１〕に記載の成長促進剤。
〔４〕ウナギ目葉形仔魚がウナギ科魚類、ハモ科魚類、アナゴ科魚類またはウツボ科魚類の葉形仔魚である上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の成長促進剤。
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の成長促進剤を含む飼料。
〔６〕上記〔５〕に記載の飼料を用いてなるウナギ目葉形仔魚の成長促進方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のウナギ目葉形仔魚の成長促進剤によって、従来の飼料よりも効果的にウナギ目葉形仔魚の成長促進が可能となる。本発明の成長促進剤を用いることにより、従来の飼料を用いた場合よりも短い養成期間で、ウナギ科魚類、アナゴ科魚類、ハモ科魚類またはウツボ科魚類等のシラスウナギを得ることが可能となることから１尾辺りの人工種苗生産のコストを削減することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤を加えた飼料の調製方法（一例）をフローチャートで示した図である。
【図２】ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤（マイタケ抽出物）投与終了後のヒアルロン酸合成酵素２（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  ２  ；ＨＡＳ２（以下、ＨＡＳ２と示す場合がある））の発現推移を示した図である（実施例２）。平均±標準偏差。Ｃｏｎｔｒｏｌ：コントロール区、Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ：マイタケ抽出区、Ｉｎｉ：イニシャル（初期値）、１０ｍ：１０分後、２０ｍ：２０分後、３０ｍ：３０分後、１ｈ：１時間後、２ｈ：２時間後、４ｈ：４時間後、８ｈ：８時間後。各ｎ＝６、＊＜０．０５。
【図３】ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤（マイタケ抽出物）を含む飼料におけるウナギ目葉形仔魚の飼育期間における生残率の推移を示した図である（実施例３）。Ｃｏｎｔ：通常餌区、Ｌｏｗ：マイタケ低濃度区、Ｈｉｇｈ：マイタケ高濃度区。
【図４】ウナギ目葉形仔魚の飼育期間後の全長を示した図である（実施例３）。平均±標準偏差。ＴＬ：全長、Ｉｎｉ：イニシャル（初期値）、Ｃｏｎｔ：通常餌区、Ｌｏｗ：マイタケ低濃度区、Ｈｉｇｈ：マイタケ高濃度区、＊＜０．０１。
【図５】ウナギ目葉形仔魚の飼育期間後の体高を示した図である（実施例３）。平均±標準偏差。ＢＤ：体高、Ｉｎｉ：イニシャル（初期値）、Ｃｏｎｔ：通常餌区、Ｌｏｗ：マイタケ低濃度区、Ｈｉｇｈ：マイタケ高濃度区、＊＜０．０５。
【図６】ウナギ目葉形仔魚の飼育期間後のヒアルロン酸量を示した図である（実施例３）。平均±標準偏差。ＨＡ：ヒアルロン酸、Ｉｎｉ：イニシャル（初期値）、Ｃｏｎｔ：通常餌区、Ｌｏｗ：マイタケ低濃度区、Ｈｉｇｈ：マイタケ高濃度区、＊＜０．０００１。
【図７】ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤（海藻抽出物）を含む飼料におけるウナギ目葉形仔魚の飼育期間における生残率の推移を示した図である（実施例４）。Ｃｏｎｔ：通常餌区、Ｕ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａ：スジアオノリ投与区、Ｅ．ｂｉｃｙｃｌｉｓ：アラメ投与区。
【図８】ウナギ目葉形仔魚の飼育期間後の全長を示した図である（実施例４）。平均±標準偏差。ＴＬ：全長、Ｉｎｉ：イニシャル（初期値）、Ｃｏｎｔ：通常餌区、Ｕ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａ：スジアオノリ投与区、Ｅ．ｂｉｃｙｃｌｉｓ：アラメ投与区、＊＜０．０１，＊＊＜０．００５。
【図９】ウナギ目葉形仔魚の飼育期間後の体高を示した図である（実施例４）。平均±標準偏差。ＢＤ：体高、Ｉｎｉ：イニシャル（初期値）、Ｃｏｎｔ：通常餌区、Ｕ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａ：スジアオノリ投与区、Ｅ．ｂｉｃｙｃｌｉｓ：アラメ投与区、＊＜０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の「ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤」とは、ウナギ目葉形仔魚の育成環境に添加したり、飼料に加えて給餌させたりすることにより、ウナギ目葉形仔魚からシラスウナギへの成長を促進する剤のことを言う。この「成長の促進」の程度はウナギ目葉形仔魚の全長や体高、体内におけるヒアルロン酸量の推移等から判断することができる。
なお、本発明において「葉形仔魚」とは、レプトケファルス幼生と呼ばれ、浮遊生活に適応した仔魚期に属するもののことをいい、ウナギ型を呈した透明な魚となったシラスウナギは「葉形仔魚」には含まれない。また、本発明において、ウナギ科魚類以外のアナゴ科魚類、ハモ科魚類またはウツボ科魚類等の他のウナギ目魚類においても、ウナギ型を呈した透明な魚となったものはシラスウナギとして示す。
【００１５】
本発明の「ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤」は、ヒアルロン酸産生促進物質を有効成分として含む剤であり、ヒアルロン酸産生促進物質のみからなる剤であってもよい。また、ウナギ目葉形仔魚の成長を阻害しないその他の成分を含む剤であってもよい。
本発明の「ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤」の有効成分となる「ヒアルロン酸産生促進物質」は、ヒアルロン酸の産生を促進する物質であって、ウナギ目葉形仔魚の成長を促進し得る物質であれば、従来知られているいずれの物質であっても良い。
ここで「ヒアルロン酸産生促進物質」とは、例えばヒト繊維芽細胞等のヒアルロン酸産生細胞に対して培養条件下で同物質を添加した際に、ヒアルロン酸合成酵素が活性化される、もしくはヒアルロン酸量の増大が認められる物質のことをいう。また、本発明の「ヒアルロン酸産生促進物質」とは、ヒトを含む動物の皮膚に塗布した際、表皮もしくは真皮内にヒアルロン酸量の増大が認められる物質のことであっても良い。
【００１６】
本発明の「ヒアルロン酸産生促進物質」として、例えば、野菜類、真菌類、野草類もしくは海藻類の植物性材料や動物性材料から得られるヒアルロン酸産生促進物質、またはこれらの植物性材料と動物性材料との混合物から得られるヒアルロン酸産生促進物質等が挙げられる。これらの「ヒアルロン酸産生促進物質」はこれらの材料から蒸留水もしくは有機溶媒等を用いて抽出された単一物質または混合物質であっても良く、これらを精製して得られる物質であっても良い。また、これらのヒアルロン酸産生促進物質を含む単一物質または混合物質そのものをミキサー等で粉砕した物質であっても良い。
本発明のこのような「ヒアルロン酸産生促進物質」は、使用目的によって必要な形状とすることができ、エタノール、油脂類もしくは蒸留水に溶解した液体状や、凍結乾燥させた固形状等の形状であっても良い。
【００１７】
このような「ヒアルロン酸産生促進物質」として、オクラ、アロエ、アスパラガス等の野菜類からの抽出物、マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）等の真菌類からの抽出物、マルバチシャノキ、リュウキュウチシャノキ、チシャノキ等の野草類からの抽出物、βクリプトキサンチンもしくはその誘導体を含む柑橘類からの抽出物、スジアオノリ（Ｕｌｖａ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａ）、アラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ  ｂｉｃｙｃｌｉｓ）、アナアオサ（Ｕｌｖａ  ｐｅｒｔｕｓａ）もしくはフクロフノリ（Ｇｌｏｉｏｐｅｌｌｔｉｓ  ｆｕｒｃａｔａ）等の海藻類からの抽出物、サケ由来コラーゲンペプチドとエラスチンペプチド等である動物性材料からの抽出物が挙げられる。
これらの「ヒアルロン酸産生促進物質」は、本発明の「ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤」の有効成分として使用できる物質であれば、独自に抽出したものであっても、抽出物や抽出物の精製物として市販されているものであっても使用することができる。市販されている「ヒアルロン酸産生促進物質」としては、例えば、マイタケ抽出物であるグリピン等が挙げられる。
【００１８】
また、本発明の「ヒアルロン酸産生促進物質」として、ホスファジチルセリンやホスファジチルイノシトール等のグリセロリン脂質、Ｎ−メチル−Ｌ−セリン、エタノールアミン、Ｎ−メチルエタノールアミン、３−メチルシクロペンダデカノン、Ｎ−メチル−Ｌ−セリン、エタノールアミン、またはＮ−メチルエタノールアミン等の化合物を使用することもできる。
【００１９】
本発明の「ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤」における「ウナギ目葉形仔魚」とは、ウナギ目に属する葉形仔魚（レプトケファルス；  ｌｅｐｔｏｃｅｐｈａｌｉ）のことをいう。このような「ウナギ目葉形仔魚」として、例えば、ニホンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、ニューギニアウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｂｉｃｏｌｏｒ  ｐａｃｉｆｉｃａ）、オオウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｍａｒｍｏｒａｔａ）、ヨーロッパウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ａｎｇｕｉｌｌａ）、オーストラリアウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、モザンビークウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｍｏｓｓａｍｂｉｃａ）もしくはアメリカウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｒｏｓｔｒａｔａ）等のウナギ科魚類の葉形仔魚が挙げられる。また、スズハモ（Ｍｕｒａｅｎｅｓｏｘ  ｂａｇｉｏ）もしくはハモ（Ｍｕｒａｅｎｅｓｏｘ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）等のハモ科魚類の葉形仔魚、マアナゴ（Ｃｏｎｇｅｒ  ｍｙｒｉａｓｔｅｒ）、ゴテンアナゴ  （Ａｎａｇｏ  ａｎａｇｏ）もしくはチンアナゴ（Ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｇｅｒ  ｈａｓｓｉ）等のアナゴ科魚類の葉形仔魚、またはウツボ（Ｇｙｍｎｏｔｈｏｒａｘ  ｋｉｄａｋｏ）等のウツボ科魚類の葉形仔魚も本発明の「ウナギ目葉形仔魚」として挙げられる。
なお、本発明の「成長促進剤」はウナギ目葉形仔魚以外に限られず、例えば、カライワシ目魚類等の「葉形仔魚」の成長促進のために使用することも可能である。
【００２０】
本発明の「ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤」は、ウナギ目葉形仔魚の飼料に加えて使用することができる。「飼料」は、ウナギ目葉形仔魚の成長に有用な飼料であれば、従来知られているいずれの飼料であっても良い。例えば、ウナギ仔魚用飼料として知られるアブラツノザメの卵や鶏卵を主成分とする飼料に加えても良い。
本発明の「ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤」は、その他の全飼料成分に対し、重量比で０．００２％以上加えることが好ましく、さらに０．０２％、０．２％以上、または２．０％以上となるように加えることが好ましい。
【００２１】
本発明の「飼料」は、「ウナギ目葉形仔魚」が摂取可能な形状であればいずれの形状であってもよい。例えば、水溶液内で分散し懸濁するコロイド状、ペクチン、グアーガム、キサンタンガム、カラギーナン、カルボキシルメチルセルロース等の増粘剤を加えることによって形成されるペースト状、マイクロカプセル化した粒子状、乾燥後ゼラチン等で封入したタブレット状の飼料が挙げられる。
【００２２】
本発明の「飼料」はさらに、本発明の「ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤」とともに、ヒアルロン酸の基質または前駆体であるグルクロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはブドウ糖を加えても良い。さらに麦芽糖等の二糖類や多糖類を本発明の「ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤」とともに加えても良い。また、糖質が含まれる食材を加えても良い。
【００２３】
このような本発明の「飼料」は、例えば、本発明の成長促進剤を他の飼料材料とともに、ミキサーで２分から４分程度撹拌することで、流動性のあるペースト飼料として調製することができる。また、図１に飼料の調製工程の一例として示したように、他の飼料材料を混合した後に、本発明の成長促進剤を加えてさらにミキサーで２分から４分程度撹拌することで調製することもできる。
【００２４】
このように調製した「飼料」を用い、「ウナギ目葉形仔魚の成長促進方法」を行うことが可能である。この「成長促進方法」は、この「飼料」を用いて「ウナギ目葉形仔魚」の成長を促進できる方法であれば従来知られているいずれの成長方法を用いても良く、従来の成長方法を改良した方法であっても良い。
「ウナギ目葉形仔魚」として、孵化後、摂餌開始時期から変態するまでの仔魚期、所謂、レプトケファルス幼生期の仔魚を対象とすることが好ましい。これらの葉形仔魚を、例えば１０ｍＬ容積の小型水槽や数１００トンクラスの大型化水槽等に入れ、止水状態や流水下環境で給餌することで「ウナギ目葉形仔魚の成長促進方法」を行うことができる。水槽の大きさや給餌方法は特に限定されず、水槽水面、底面や壁面に投餌したり、飼育水中に分散したりすることで給餌できる。
【００２５】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが，本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
１．ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤の調製
ヒアルロン酸産生促進物質として次のマイタケ抽出物および海藻抽出物を調製した。これらをウナギ目葉形仔魚の成長促進剤の有効成分とした。
１）マイタケ抽出物
市販のマイタケ子実体の乾燥物を準備し、乾燥物の１０倍重量の純エタノールを加え２４時間スターラーを用いて抽出を行った。抽出液は不純物を除くためにろ過し、回収した抽出液の溶媒を凍結乾燥器で除去し、マイタケ抽出物を得た。
２）海藻抽出物
市販のスジアオノリとアラメの乾燥物を準備し、それぞれに乾燥物の１０倍重量の３０％エタノールを加え半日室温に静置した。エタノールを回収後、ろ過により不純物を除去し、再回収した抽出液の溶媒を凍結乾燥器で除去し、スジアオノリ抽出物およびアラメ抽出物を得た。
【００２７】
２．ウナギ目葉形仔魚の飼料の調製
アブラツノザメ卵４８ｇ、自己消化オキアミエキス２５ｇ、不二製油社製ハイニュートＨＫ３ｇ、日本水産社製ＹＯＰ−Ｃ６ｇに、上記１．にて調製したマイタケ抽出物、スジアオノリ抽出物またはアラメ抽出物を、飼料全体量に対しそれぞれ０．００２％以上の重量比となる量加え、ミキサーで２分から４分撹拌し、流動性のあるペースト飼料として、本発明のウナギ目葉形仔魚の飼料を調製した。
また、アブラツノザメ卵４８ｇ、自己消化オキアミエキス２５ｇ、不二製油社製ハイニュートＨＫ３ｇ、日本水産社製ＹＯＰ−Ｃ６ｇのみで調製したものは従来型のウナギ葉形仔魚用飼料とした。
【実施例２】
【００２８】
＜ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤（マイタケ抽出物）によるニホンウナギヒアルロン酸合成酵素タイプ２のｍＲＮＡの発現増強効果の解析＞
１）飼育環境
人為催熟によって得られた受精卵から孵化した、摂餌開始期に相当する７日齢のニホンウナギレプトケファルス幼生を用いた。１０Ｌ円形アクリル水槽を２基用意し、水槽内に海水を注水し、容積を５Ｌとした。全長平均６．０９±０．５０ｍｍのニホンウナギレプトケファルス幼生を各水槽に約１０００尾収容した。
実施例１、１．にて調製したマイタケ抽出物１００ｍｇと麦芽糖２ｇに対し、０．８％キサンタンガム溶液を加え溶解し、容量を１０ｍＬとした（マイタケ抽出区）。さらに麦芽糖２ｇに対し、０．８％キサンタンガム溶液を加え容量を１０ｍＬとした飼料をコントロール区とした。
各ニホンウナギレプトケファルス幼生を水槽に馴致させた後、上述した飼料１０ｍＬをピペットで水槽底面に投与し給餌を開始した。給餌期間中は止水状態で１５分間給餌させた。１５分終了時点をスタートとし、１０分、２０分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間経過後のレプトケファルス幼生を回収し−８０℃で凍結保存した。
【００２９】
２）解析
上記１．にて回収した各時間のレプトケファルス幼生（約５０尾）に対し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を１ｍＬ添加し、ＩＳＯＧＥＮ添付のグアニジンイソシアネート法に従ってトータルＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡの分収には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＶＩＬＯ（商標）  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（インビトロジェン）を使用し、本キットに添付の操作手順に準じて行った。
各時間のレプトケファルス幼生のｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡを鋳型とし、ＨＡＳ２（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー（配列表配列番号１）およびＨＡＳ２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）（配列表配列番号２）プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲ（バイオラッド）によってヒアルロン酸合成酵素タイプ２（ＨＡＳ２）の遺伝子量の定量をおこなった。
またＰＣＲ反応用のキットはＳｓｏＦａｓｔ（商標）  ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（バイオラッド）を使用し、反応時間は９５℃３０秒×１サイクル、９５℃５秒・６０℃１０秒×４０サイクルとした。
【００３０】
３）結果
その結果、図２に示したように、給餌後３０分までのマイタケ抽出区のニホンウナギレプトケファルス幼生では、コントロール区のレプトケファルス幼生との間に有意な差が認められなかったが、１時間、２時間、４時間後では、マイタケ抽出区のレプトケファルス幼生においてＨＡＳ２の発現量が有意に増加した。
これにより、コントロール区のレプトケファルス幼生では給餌終了１時間後にはＨＡＳ２の発現が減少するが、ヒアルロン酸産生促進物質であるマイタケ抽出物を添加することにより、ニホンウナギレプトケファルス幼生において、ＨＡＳ２の長時間にわたる高発現が維持されることが確認された。
【実施例３】
【００３１】
＜ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤（マイタケ抽出物）の飼育における効果の検討＞
１）飼育環境
人為催熟によって得られた受精卵から孵化した、摂餌開始期に相当する７日齢のニホンウナギレプトケファルス幼生を用いた。１０Ｌ円形アクリル水槽を６基用意し、水槽内に海水を注水し、容積を５Ｌとした。水槽内に収容するウナギレプトケファルス幼生の全長、体高を測定しイニシャル（初期値）とした。全長平均７．０３±０．３４ｍｍのウナギレプトケファルス幼生を各水槽に２００尾収容した。
従来型ウナギ仔魚用飼料を与える群を通常餌区とした。実施例１、１．にて調製したマイタケ抽出物を飼料全体量に対し０．２ｍｇ／ｇとなるように加えて調製した飼料を与える群をマイタケ低濃度区とし、実施例１、１．にて調製したマイタケ抽出物を飼料全体量に対し２ｍｇ／ｇとなるように加えて調製した飼料を与える群をマイタケ高濃度区とした。各試験区では、それぞれ２基の水槽を用意した。
各ニホンウナギレプトケファルス幼生を水槽に馴致させた後、３．５ｍＬ相当の上述した飼料をピペットで水槽底面に投与し給餌を開始した。給餌期間中は止水状態で１５分間給餌させた。１５分経過後、１分間に０．４Ｌの流量で底面に残った餌を洗い流した。この作業を２時間おきに計５回繰り返した。給餌時刻は、９時、１１時、１３時、１５時、１７時とし、５回目の給餌後に同型の水槽にニホンウナギレプトケファルス幼生を移し替えた。給餌以外の時間帯は、１分間に０．４Ｌの流量で注水し続けた。給餌実験期間中はすべて２５℃の濾過海水を掛け流しで行い、給餌飼育期間は２０日とした。
【００３２】
２）仔魚測定
飼育期間中の生残数を計測するとともに、飼育終了（２０日目）後にそれぞれ全長と体高を測定した。その結果、図３に示したように、本発明のヒアルロン酸産生促進物ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤（マイタケ抽出物）を加えても、従来型の飼料と同等の生残が認められた。
また、図４に示したように、飼育終了時点において、マイタケ高濃度区のニホンウナギレプトケファルス幼生では、通常餌区のニホンウナギレプトケファルス幼生よりも有意に全長の増加が認められた。さらに、図５に示したように、飼育終了時点において、マイタケ高濃度区のニホンウナギレプトケファルス幼生は、通常餌区のニホンウナギレプトケファルス幼生よりも有意に体高の増加が認められた。従って、これらの結果より、本発明のウナギ目葉形仔魚の成長促進剤（マイタケ抽出物）を飼料に加えることにより、ニホンウナギレプトケファルス幼生の成長が促進されることが確認できた。
【００３３】
３）ヒアルロン酸量測定
飼育終了（２０日目）後に、全長、体高を測定した各ニホンウナギレプトケファルス幼生の個体を−２０℃で凍結保存した。２０−３０尾の凍結個体をまとめ、遠心濃縮機を用いて水分を除去し、乾燥重量を測定した。乾燥させたサンプルにアクチナーゼＥ溶液を加え、５０℃で２４時間反応させ、サンプル内のタンパク質を分解した。酵素処理したサンプルはｘ７０００ｇで１０分間遠心し、上澄みを回収しヒアルロン酸量を測定した。ヒアルロン酸量の測定には、ヒアルロン酸定量Ｅｌｉｓａキット（フナコシ）を用いた。
【００３４】
その結果、図６に示すように、飼育終了時点において、マイタケ低濃度区、マイタケ高濃度区は共に通常餌区よりも有意にヒアルロン酸量の増加が認められた。従って、この結果より、本発明のウナギ目葉形仔魚の成長促進剤（マイタケ抽出物）を飼料に加えることにより、ニホンウナギレプトケファルス幼生内のヒアルロン酸の蓄積が促進されることが確認できた。
【実施例４】
【００３５】
＜ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤（海藻抽出物）の飼育における効果の検討＞
１）飼育環境
人為催熟によって得られた受精卵から孵化した、摂餌開始期に相当する７日齢のニホンウナギレプトケファルス幼生を用いた。１０Ｌ円形アクリル水槽を６基用意し、水槽内に海水を注水し、容積を５Ｌとした。水槽内に収容するウナギレプトケファルス幼生の全長、体高を測定しイニシャル（初期値）とした。全長平均６．９６±０．２１ｍｍのウナギレプトケファルス幼生を各１８０尾収容した。
従来型ウナギ仔魚用飼料を与える群を通常餌区とした。実施例１、１．にて調製した海藻抽出物（スジアオノリ抽出物またはアラメ抽出物）を飼料全体量に対し２ｍｇ／ｇとなるように加えて調製した飼料を与える群をそれぞれスジアオノリ投与区またはアラメ投与区とした。各試験区では、それぞれ２基の水槽を用意した。
各ニホンウナギレプトケファルス幼生を水槽に馴致させた後、３．５ｍＬ相当の上述した飼料をピペットで水槽底面に投与し給餌を開始した。給餌期間中は止水状態で１５分間給餌させた。１５分経過後、１分間に０．４Ｌの流量で底面に残った餌を洗い流した。この作業を２時間おきに計５回繰り返した。給餌時間は、９時、１１時、１３時、１５時、１７時とした。５回目の給餌後に同型の水槽にニホンウナギレプトケファルス幼生を移し替えた。給餌以外の時間帯は、１分間に０．４Ｌの流量で注水し続けた。給餌実験期間中はすべて２５℃の濾過海水を掛け流しでおこなった。給餌飼育期間は１８日とした。
【００３６】
２）仔魚測定
飼育期間中の生残数を計測するとともに、飼育終了（１８日目）後にそれぞれ全長と体高を測定した。その結果、図７に示したように、本発明のヒアルロン酸産生促進物ウナギ目葉形仔魚の成長促進剤（海藻抽出物）を加えても、従来型の飼料と同等の生残が認められた。
また、図８に示したように、飼育終了時点において、スジアオノリ投与区、アラメ投与区のニホンウナギレプトケファルス幼生はいずれも通常餌区のニホンウナギレプトケファルス幼生よりも有意に全長の増加が認められた。さらに、図９に示したように、飼育終了時点において、スジアオノリ投与区、アラメ投与区のニホンウナギレプトケファルス幼生いずれも通常餌区のニホンウナギレプトケファルス幼生よりも有意に体高の増加が認められた。従って、これらの結果より、本発明のウナギ目葉形仔魚の成長促進剤（海藻抽出物）を飼料に加えることにより、ニホンウナギレプトケファルス幼生の成長が促進されることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明のウナギ目葉形仔魚の成長促進剤によって、従来の飼料よりも効果的にウナギ目葉形仔魚の成長促進が可能となる。本発明の成長促進剤を用いることにより、従来の飼料を用いた場合よりも早く、ウナギ科魚類、アナゴ科魚類、ハモ科魚類等のシラスウナギを得ることが可能となることから、１尾辺りの人工種苗生産のコストを削減することも可能となる。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【配列表】
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