(57)【要約】【課題】非アルコール性脂肪性肝疾患及び/又は非アルコール性脂肪性肝炎における肝再生障害を改善する。【解決手段】小胞体ストレス応答の経路のうち、RNA依存性プロテインキナーゼ様小胞体キナーゼ（PERK）を小胞体ストレスセンサーとする経路を阻害する。【選択図】図１
2015199693.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小胞体ストレス応答の経路のうち、RNA依存性プロテインキナーゼ様小胞体キナーゼ（PERK）を小胞体ストレスセンサーとする経路を阻害する、肝再生能改善剤。
【請求項２】
RNA依存性プロテインキナーゼ様小胞体キナーゼのリン酸化を阻害する又は脱リン酸化する、真核生物翻訳開始因子２のαサブユニット（eIF2α）のリン酸化を阻害する又は脱リン酸化する、若しくは転写因子ATF4による転写促進活性を阻害する、ことを特徴とする請求項１記載の肝再生能改善剤。
【請求項３】
真核生物翻訳開始因子２のαサブユニット（eIF2α）を脱リン酸化することを特徴とする請求項１記載の肝再生能改善剤。
【請求項４】
増殖停止/DNA損傷誘導性タンパク質34（growth arrest and DNA damage-inducible protein 34：GADD34）をコードする遺伝子を発現可能に含むベクターであることを特徴とする請求項１記載の肝再生能改善剤。
【請求項５】
上記ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターであることを特徴とする請求項４記載の肝再生能改善剤。
【請求項６】
非アルコール性脂肪性肝疾患及び/又は非アルコール性脂肪性肝における肝再生能を改善することを特徴とする請求項１乃至５いずれか一項記載の肝再生能改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患及び/又は非アルコール性脂肪性肝炎における肝再生能の低下を改善する肝再生能改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪性肝疾患（nonalcoholic fatty liver disease：NAFLD）とは、脂肪性肝疾患の原因がアルコール性ではない類型である。具体的には、アルコール量として２０ｇ/日以下のアルコール摂取量で、ウイルス性肝炎や自己免疫性肝炎など原因を有さず、肝への脂肪沈着を認める疾患を非アルコール性脂肪性肝疾患としている。非アルコール性脂肪性肝疾患は、単純性脂肪肝の病態から、非アルコール性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis：NASH）に進行する。非アルコール性脂肪肝炎は、炎症、肝細胞壊死、風船様変化、又は線維化を伴う病態であり、非アルコール性脂肪性肝疾患の重症型と考えられている。
【０００３】
非特許文献１には、脂肪性肝疾患では肝切除後の肝再生が阻害されることが開示されている。すなわち、一般に、肝臓には一部切除されても元の大きさに再生する機能（肝再生能）があるが、非アルコール性脂肪肝炎の肝臓はこの肝再生能が著しくて低下していることが指摘されている。
【０００４】
一方、非特許文献２には、肥満が小胞体ストレスを引き起こし、小胞体ストレスによりインスリン受容体シグナル伝達が抑制されることが示されている。また、非特許文献３には、4-フェニル酪酸（PBA）やタウロウルソデオキシコール酸（TUDCA）を使用して小胞体ストレス応答を阻害することで、虚血性再灌流下の部分切除において、脂肪肝及び非脂肪肝ともに肝再生を改善したことが開示されている。小胞体ストレス応答とは、折り畳み不全のタンパク質（unfolded proteins）が蓄積する状態（小胞体ストレス）に起因して、これを回避するための防御システム（翻訳抑制、小胞体分子シャペロン翻訳誘導、異常タンパク質分解、アポトーシス誘導）を活性化させる機構である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Vetelainen et.al, Ann Surg, 2007; 245: 20-30
【非特許文献２】Ozcan et.al, Science 306 (2004) 457-461
【非特許文献３】Mosbah et.al, Cell Death and Disease (2010) 1, e52
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、PBAやTUDCAにより小胞体ストレスを阻害することで肝再生が改善することが非特許文献３に記載されるものの、NAFLDやNASHにおける肝再生障害と小胞体ストレスとの関連について詳細は未知であった。そこで、本発明は、NAFLDやNASHにおける肝再生障害を改善できる肝再生能改善剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、小胞体ストレス応答のうち、RNA依存性プロテインキナーゼ様小胞体キナーゼ（PERK）を小胞体ストレスセンサーとする経路を阻害することで、NAFLDやNASHにおける肝再生障害を改善できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は以下を包含する。
（１）小胞体ストレス応答の経路のうち、RNA依存性プロテインキナーゼ様小胞体キナーゼ（PERK）を小胞体ストレスセンサーとする経路を阻害する、肝再生能改善剤。
（２）RNA依存性プロテインキナーゼ様小胞体キナーゼのリン酸化を阻害する又は脱リン酸化する、真核生物翻訳開始因子２のαサブユニット（eIF2α）のリン酸化を阻害する又は脱リン酸化する、若しくは転写因子ATF4による転写促進活性を阻害する、ことを特徴とする（１）記載の肝再生能改善剤。
（３）真核生物翻訳開始因子２のαサブユニット（eIF2α）を脱リン酸化することを特徴とする（１）記載の肝再生能改善剤。
（４）増殖停止/DNA損傷誘導性タンパク質34（growth arrest and DNA damage-inducible protein 34：GADD34）をコードする遺伝子を発現可能に含むベクターであることを特徴とする（１）記載の肝再生能改善剤。
（５）上記ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターであることを特徴とする（４）記載の肝再生能改善剤。
（６）非アルコール性脂肪性肝疾患及び/又は非アルコール性脂肪性肝における肝再生能を改善することを特徴とする（１）乃至（５）いずれか記載の肝再生能改善剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、非アルコール性脂肪性肝疾患及び/又は非アルコール性脂肪性肝において低下する肝再生能を改善することができる。すなわち、本発明に係る肝再生能改善剤を利用することで、非アルコール性脂肪性肝疾患及び/又は非アルコール性脂肪性肝における肝再生能が改善するため、当該疾患に対して例えば部分的肝切除術を行った後の予後を良好にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】３種類の小胞体ストレスセンサーを含む小胞体ストレス応答経路を模式的に示す特性図である。
【図２】db/dbマウス及びLeanマウスについて肝臓体重比を測定した結果を示す特性図である。
【図３】db/dbマウス及びLeanマウスについて血漿ALTを測定した結果を示す特性図である。
【図４】rAAV-Flag-Gadd34を感染させたdb/dbマウス及びrAAV-GFPを感染させたdb/dbマウスについて肝臓体重比を測定した結果を示す特性図である。
【図５】rAAV-Flag-Gadd34を感染させたdb/dbマウス及びrAAV-GFPを感染させたdb/dbマウスについて血漿ALTを測定した結果を示す特性図である。
【図６】rAAV-Flag-Gadd34を感染させたdb/dbマウス及びrAAV-GFPを感染させたdb/dbマウスについて、抗GFP抗体、抗Gadd34抗体、抗リン酸化Ser51-eIF2α抗体及び抗eIF2α抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明に係る肝再生能改善剤について詳細に説明する。
本発明に係る肝再生能改善剤は、小胞体ストレス応答の経路のうち、RNA依存性プロテインキナーゼ様小胞体キナーゼ（PERK）を小胞体ストレスセンサーとする経路を阻害するものである。
【００１２】
ここで、小胞体ストレス応答とは、細胞に対して小胞体ストレスが負荷されると、小胞体ストレスを緩和・回避するための機構が活性化することをいう。小胞体ストレスを緩和・回避するための機構とは、特に限定されないが、新たな翻訳抑制、小胞体分子シャペロン翻訳誘導、異常タンパク質分解及びアポトーシス誘導を挙げることができる。
【００１３】
小胞体ストレス応答には、図１に示すように、３種類の独立した小胞体ストレスセンサーが含まれる。これら小胞体ストレスセンサーが小胞体ストレスをセンシングすることで、小胞体ストレス応答が開始することとなる。３種類の小胞体ストレスセンサーとは、RNA依存性プロテインキナーゼ様小胞体キナーゼ（PKR-like ER kinase: PERK）、イノシトール要求性酵素１（inositol-requiring enzyme 1: IRE1）、及び活性型転写因子６（activating transcription factor 6: ATF6）である。本発明では、これら３種類の小胞体ストレスセンサーのうちPERKからの小胞体ストレス応答経路を抑制することで、非アルコール性脂肪性肝疾患及び/又は非アルコール性脂肪性肝における肝再生能を改善する。
【００１４】
PERKからの小胞体ストレス応答経路とは、先ず、小胞体ストレスの負荷により、1回膜貫通型タンパクであるPERKの活性化から始まる。PERKの活性化とは、GRP78/BiPとヘテロダイマーを形成した非活性化状態から、GRP78/BiPが解離し、PERKがオリゴマーを形成して自己リン酸化することと同義である。PERKからの小胞体ストレス応答経路では、次に、活性化したPERKが翻訳開始因子の一つであるeIF2α(eukaryotic initiation factor 2α)をリン酸化する。すなわち、eIF2αのリン酸化によって、eIF2αを含む翻訳開始複合体が形成されず、当該複合体によるmRNAの翻訳が抑制される。また、PERKからの小胞体ストレス応答経路では、PERKの活性化及びeIF2αのリン酸化とともに、活性型転写因子４（activating transcription factor 4: ATF4）の翻訳量が増加する。ATF4をコードするmRNAは、5’側非翻訳領域には複数の短いORF（open reading frame）があり、その下流にATF4のコーディング領域があるという構造を有している。小胞体ストレスのない状態では、リボソームが複数の短いORFを翻訳した後にmRNAから離れ、ATF4のコーディング領域の翻訳が起こらない。小胞体ストレスが負荷された状態では、複数の短いORFの翻訳は起こらず、ATF4のコーディング領域の翻訳が起こる。転写因子であるATF4は、アポトーシスに関わる転写因子であるCHOP（C/EBP-homologous protein）、アスパラギン酸合成酵素遺伝子（ASNS）、転写リプレッサーであるATF3（activating transcription factor 3）遺伝子等の転写を促進することが知られている。
【００１５】
以上のように、PERKからの小胞体ストレス応答経路とは、PERKの活性化から、eIF2αが関与する翻訳抑制及びATF4による各種遺伝子の転写促進を含む意味である。したがって、PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害するとは、PERKの活性化を阻害すること、eIF2αのリン酸化を阻害すること、リン酸化したeIF2αの脱リン酸化を促進すること、ATF4の転写促進活性を阻害することを意味する。特に、PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害するには、これらPERK活性化の阻害、eIF2αのリン酸化の阻害、リン酸化したeIF2αの脱リン酸化の促進及びATF4の転写促進活性の阻害から選ばれる少なくとも１以上の事象を引き起こすことを意味する。
【００１６】
よって、PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害するには、PERK、eIF2α、eIF2αにより翻訳される遺伝子群、ATF4及びATF4により転写制御される遺伝子群をターゲットとすることができる。
【００１７】
<PERKをターゲットとする場合>
より具体的に、PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害する際にPERKをターゲットとするとは、PERKとGRP78/BiPとの解離を阻害すること、PERKのオリゴマー形成を阻害すること、PERKの自己リン酸化を阻害することのいずれでも良い。また、siRNA法やアンチセンスオリゴヌクレチド法といった従来公知の手法により、PERKをコードする遺伝子をノックダウンすることで、PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害してもよい。
【００１８】
なお、PERKとGRP78/BiPとの解離を阻害するには、特に限定されないが、例えばGRP78/BiPを始めとした化学シャペロンを含むシャペロンの細胞内発現レベルの増加といった手法を適用することができる。
【００１９】
<eIF2αをターゲットとする場合>
PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害する際にeIF2αをターゲットとするとは、オリゴマーを形成して自己リン酸化したPERKによるeIF2αのリン酸化を阻害すること、リン酸化eIF2αの脱リン酸化を促進することのいずれであっても良い。
【００２０】
PERKによるeIF2αのリン酸化を阻害するには、例えば、PERKの活性阻害作用を有する低分子化合物や抗体を投与するといった手法を適用することができる。また、リン酸化eIF2αの脱リン酸化を促進するには、特に限定されないが、例えば、リン酸化eIF2αを基質とする脱リン酸化酵素をコードする遺伝子を導入する、当該脱リン酸化酵素の活性を亢進する作用を有する分子を投与するといった手法を適用することができる。
【００２１】
リン酸化eIF2αを基質とする脱リン酸化酵素をコードする遺伝子としては、例えば、GADD34（growth-arrest DNA damage gene 34）遺伝子を挙げることができる。GADD34はプロテインフォスファターゼ１と複合体を形成し、リン酸化eIF2αを脱リン酸化する。なお、GADD34遺伝子は、PERKからの小胞体ストレス応答経路が活性化したときに転写促進される遺伝子であって、eIF2αのリン酸化による翻訳反応停止を正常化するようにフィードバック制御するものである。
【００２２】
<ATF4をターゲットとする場合>
PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害する際にATF4をターゲットとするとは、ATF4のmRNAのうち5’側非翻訳領域に存在する複数の短いORFの転写を促進し、下流に存在するATF4のコーディング領域の転写を抑制すること、翻訳されたATF4による転写促進作用を阻害することのいずれであっても良い。
【００２３】
ATF4のmRNAのうち5’側非翻訳領域に存在する複数の短いORFの転写を促進し、下流に存在するATF4のコーディング領域の転写を抑制するには、特に限定されないが、例えば、siRNA法やアンチセンスオリゴヌクレチド法といった従来公知の手法を適用することができる。翻訳されたATF4による転写促進作用を阻害するには、例えば、ATF4を特異的に阻害する低分子化合物や抗体を投与するといった手法を適用することができる。
【００２４】
<GADD34遺伝子の遺伝子導入>
より具体的な一例として、GADD34遺伝子を導入することでリン酸化eIF2αの脱リン酸化を促進する方法について詳述する。ここで、ヒト由来GADD34遺伝子のコーディング領域の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。なお、マウス由来GADD34遺伝子のコーディング領域の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。また、ヒト及びマウス以外の哺乳類動物のGADD34遺伝子に関して、コーディング領域の塩基配列及びアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBankデータベース等の遺伝子関連情報を格納した公知のデータベースより入手することができる。
【００２５】
本発明に係る肝再生能改善剤は、ヒトを含む哺乳類動物の医薬として適用することができる。本発明に係る肝再生能改善剤を使用する哺乳類動物に応じて、適宜、GADD34遺伝子を選択することが好ましい。
【００２６】
例えば、ヒトの治療を行なうためには、ヒト由来GADD34遺伝子を用いることが望ましい。すなわち、この場合、配列番号１及び２にて特定されるGADD34遺伝子を用いることが望ましい。ただし、ヒトの治療目的であっても、使用するGADD34遺伝子としては、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子に限定されず、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列を有し、リン酸化eIF2αを脱リン酸化する活性を有するタンパク質をコードするものであっても良い。ここで複数個とは、２〜７０個のアミノ酸とすることができ、２〜６０個のアミノ酸とすることが好ましく、２〜５０個のアミノ酸とすることがより好ましく、２〜４０個のアミノ酸とすることが更に好ましく、２〜３０個のアミノ酸とすることが更に好ましく、２〜２０個のアミノ酸とすることが更に好ましく、２〜１０個のアミノ酸とすることが更に好ましく、２〜５個のアミノ酸とすることが更に好ましい。
【００２７】
また、ヒトの治療目的であっても、使用するGADD34遺伝子としては、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子に限定されず、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性、好ましくは８０％以上の配列同一性、より好ましくは９０％以上の配列同一性、更に好ましくは９５％以上の配列同一性、或いは更に好ましくは９７％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、リン酸化eIF2αを脱リン酸化する活性を有するタンパク質をコードするものであっても良い。ここで配列同一性の値は、配列番号２のアミノ酸配列（６７４個）とのペアワイズアライメントを行い、完全に一致するアミノ酸残基の割合として算出することができる。
【００２８】
さらに、ヒトの治療目的であっても、使用するGADD34遺伝子としては、配列番号１に示す塩基配列をコーディング領域と有する遺伝子に限定されず、配列番号１に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、リン酸化eIF2αを脱リン酸化する活性を有するタンパク質をコードするものであっても良い。ストリンジェントな条件とは、例えば、通常、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であり、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であるが、これらの条件に特に制限されるものではない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度など複数の要素があり、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。ハイブリダイゼーションは、例えばMolecular Cloning: A laboratory Manual, 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,などに記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２９】
なお、配列番号２と異なるアミノ酸配列を有するタンパク質や、配列番号１に示す塩基配列以外の塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が、リン酸化eIF2αを脱リン酸化する活性を有するかについては、例えば、Mol. Cell Biol. 2003 Feb;23(4):1292-1303.に記載された方法に従って検討することができる。
【００３０】
本発明に係る肝再生能改善剤は、上述したGADD34遺伝子をベクターに組み入れ、当該ベクターを用いて肝臓において発現させることができるように調製することができる。ベクターとしては、特に限定されず、ヒトに使用することができる各種ベクターを用いることができる。ベクターとしては、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターのいずれを用いてもよい。これらのうち、ウイルスベクターを用いることが好ましい。ウイルスベクターとしては、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどが利用可能であるが、これらのうち、AAVベクターが好ましい。AAVベクターは安全性が高く、比較的長期の遺伝子発現を期待できることから特に好ましく用いられる。アデノ随伴ウイルスとしては、1型AAVウイルス（AAV1）、2型AAVウイルス（AAV2）、3型AAVウイルス（AAV3）、4型AAVウイルス（AAV4）、又は5型AAVウイルス（AAV5）などが知られているが、AAVベクターの製造にはいずれを用いることも可能である。例えば、AAV3の塩基配列はGene Bankに登録されており（NC_001729）、文献にも記載されている（Virology, 221, pp.208-217, 1996）。総説として、神経進歩, 45, pp.92-103, 2001又は実験医学, 20, pp.1296-1300, 2002などを参照することができる。これらの刊行物の開示及びこれらの刊行物に引用された文献の開示のすべてを参照により本発明の開示に含める。
【００３１】
本発明に係る肝再生能改善剤は特に限定されないが、AAVベクターを用いる場合には、以下の方法に従って組換えベクターを調製することができる。以下、本発明の好ましい態様としてAAVベクターを用いる場合について具体的に説明するが、本発明の範囲はAAVベクターを用いる場合に限定されることはない。上述したGADD34遺伝子をサイトロメガロウイルス(CMV)プロモーター領域とSV40のpolyA領域の間に挿入して3型AAV（AAV3）ウイルスゲノムの両端に存在するinverted terminal repeat (ITR)配列とともにプラスミドに組み込むことによりベクタープラスミドを調製する。上記のベクタープラスミド、パッケージングプラスミド（AAVの非構造蛋白質であるRepとカプシド蛋白であるVPを発現するためのプラスミド）、及びヘルパープラスミド（アデノウイルス由来の塩基配列でE2A、E4、及びVA領域を含む）の３種類のプラスミドをヒト腎由来のHEK293細胞にトランスフェクトすることにより、GADD34遺伝子を含むAAVベクターを調製することができる。
【００３２】
<非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝>
本発明に係る肝再生能改善剤は、非アルコール性脂肪性肝疾患及び/又は非アルコール性脂肪性肝における肝切除後の肝臓再生不良（肝再生能の阻害）を改善する効果を有している。
【００３３】
ここで、非アルコール性脂肪性肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease: NAFLD）とは、肝細胞に脂肪(中性脂肪)が沈着して肝障害を引き起こす脂肪性肝疾患のうち、飲酒歴はないがアルコール性肝障害に類似した脂肪性肝障害がみられる病態を意味する。なお、脂肪肝とは、肝臓に脂肪が過剰に蓄積した状態であり、肝臓内の肝細胞の３０％以上に脂肪空胞が認められる状態と定義することができる。また、飲酒歴がないとは、例えば１日あたりアルコール摂取量がエタノール換算で20g以下の場合を意味する。
【００３４】
ここで、非アルコール性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis: NASH）とは、NAFLDにおける脂肪沈着とともに炎症や線維化がおこる脂肪性肝炎に進行した病態を意味する。すなわち、NAFLDは肝細胞に脂肪が沈着するのみの単純性脂肪肝と、NASHとに大別される。
【００３５】
本発明に係る肝再生能改善剤は、NAFLD及び/又はNASHと診断された患者、特にNASHと診断された患者であって、肝臓の部分切除を予定する患者或いは肝臓の部分切除術を行った患者に対して投与される。本発明に係る肝再生能改善剤の投与量は、PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害する際のターゲット（PERK、eIF2α、eIF2αにより翻訳される遺伝子群、ATF4及びATF4により転写制御される遺伝子群）により異なり、また、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、NASH進行度によって異なる。一例として、上述したGADD34遺伝子をクローニングしたアデノ随伴ウイルスベクターを肝再生能改善剤として使用する場合、例えば、肝臓組織重量で約1×105〜約1×1010PFU/gとなるように、好ましくは約1×106〜約1×109PFU/gとなるように、より好ましくは約1×107〜約1×108PFU/gとなるように投与する。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３７】
〔実施例１〕
本実施例では、マウス由来GADD34遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルスベクター（以下、pAAV-Flag-Gadd34 Expression vector）を作製し、肥満糖尿病モデルであるレプチン受容体欠損肥満マウス（db/dbマウス）に当該アデノ随伴ウイルスベクターを投与して、肝再生能の改善効果について検証した。また、db/dbマウスとの比較のため、痩せたマウス（Leanマウス）としてC57BLKsJ db/+mを使用した。
【００３８】
本実施例で作製したpAAV-Flag-Gadd34 Expression vectorは、Cell Biolabs社の商品名AAVヘルパーフリー発現システムを使用して作製した。特に、GADD34遺伝子（配列番号３及び４）については、以下の一対のプライマー： 5’-CAGGAATTCGCCCCGAGCCCAAGACCCCAG-3’(Forward：配列番号５)及び5’-ATGCTCGAGTTAGCCCCGCCTCCCTCCCAAGTAC-3’(Reverse：配列番号６)を使用してマウスゲノムを鋳型として増幅した。得られたGADD34遺伝子をpcDNA3.1-Flag VectorのEcoRI、XhoIサイトに挿入した。Flag-Gadd34をBamHI及びXhoI にて切り出し、当該キットに含まれるpAAV-MCS Expression VectorのBamHI, XhoIサイトに挿入することでpAAV-Flag-Gadd34 Expression vectorを作製した。なお、当該キットには、pAAV-DJ Vector、pHelper Vector及びpAAV-GFP Control Vectorが含まれている。
【００３９】
そして、pAAV-Flag-Gadd34 Expression vector (又はpAAV-GFP Control Vector)、pAAV-DJ及びpHelperを、FuGENE6トランスフェクション試薬(Promega社製)を用いてAgilent Technologies社の293AAV細胞にコトランスフェクションした。48〜72時間後、細胞を回収し、凍結融解することによりrAAV-Flag-Gadd34 (又はrAAV-GFP) を得た。なお、本例ではViraBindアデノ随伴ウイルス精製キット(Cell Biolabs, Inc.) にて精製した。
【００４０】
一方、肥満糖尿病モデルであるdb/dbマウス(♂)は、日本エスエルシー株式会社より入手した。7週齢のdb/dbマウス(♂)にrAAV-Flag-Gadd34又はrAAV-GFPを2x107 PFU/gで尾静脈注射した。rAAV投与2週間後に70%肝切除を行なった。肝切除前、及び肝切除48時間後まで12時間ごとに採血し、肝切除48時間後に肝臓を採取した。
【００４１】
本実施例では、採取した血液に含まれるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT又はGPT）&アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST又はGOT）を測定した。ALT及びASTの測定にはトランスアミナーゼCII-テストワコー (Wako社製) を使用した。
【００４２】
肝組織は、protease inhibitor cocktail (Sigma社製) 含有CelLytic MT Cell Lysis Reagent (Sigma社製) で融解した。蛋白量測定後、蛋白量50μgを含む細胞融解液を、SDS-PAGEにて分離後し、ウエスタンブロッティングを行なった。抗Gadd34抗体、抗CHOP抗体 (以上、Santa Cruz Biotechnology社製)、リン酸化Ser51-eIF2α抗体、抗eIF2α抗体、抗Cleaved caspase3抗体、抗caspase3抗体(以上、Cell Signaling Technology社製)、抗GFP抗体（MLB社製）を購入して実験に供した。2次抗体としてRabbit TrueBlot (eBioscience社製) を用いた。
【００４３】
RNA抽出には、SV Total RNA Isolation System (Promega社製) を用い、cDNA合成には、PrimeScript RT reagent Kit(Takara社製)を用いた。定量的PCRは、CFX384 Real-Time System (Bio-Rad Laboratories社製)を使用し、SYBR Premix ExTaq2 Kit (Takara社製) により行い、36B4を対照遺伝子として解析した。
【００４４】
なお、本実施例では、n=4で行なった。データは、means±SEで示した。統計解析は、Student's t-testを用いて行った。また、p < 0.05である場合に有意差があるとした。
【００４５】
先ず、db/dbマウスとLeanマウスについて、肝切除後の肝臓体重比を測定した結果を図２に示す。図２に示すように、Leanマウスでは肝切除後48時間で、肝臓体重比が1.6倍に増加したのに対し、db/dbマウスでは変化が見られなかった。また、血漿ALTについては、図３に示すように、db/dbマウスで有意に高い値を示していた。これらの結果から、db/dbマウスでは、肝切除後、肝再生脳が阻害されていることが確認された。なお、この結果は、詳細な結果を示さないが、高脂肪食を与えることで作製した脂肪肝を有する軽度肥満モデルにおいても同様な障害が観察されている。
【００４６】
一方、db/dbマウスにrAAV-Flag-Gadd34を感染させ、肝切除後肝再生障害を評価した結果を図４及び５に示した。図４は、rAAV-Flag-Gadd34を感染させたdb/dbマウス及びコントロールのrAAV-GFPを感染させたdb/dbマウスについて肝臓体重比を測定した結果を示している。また、図５は、rAAV-Flag-Gadd34を感染させたdb/dbマウス及びコントロールのrAAV-GFPを感染させたdb/dbマウスについて血漿ALTを測定した結果を示している。
【００４７】
また、rAAV-Flag-Gadd34を感染させたdb/dbマウス及びコントロールのrAAV-GFPを感染させたdb/dbマウスについて、抗GFP抗体、抗Gadd34抗体、抗リン酸化Ser51-eIF2α抗体及び抗eIF2α抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を図６に示した。図６に示すように、rAAV-Flag-Gadd34を感染させたdb/dbマウスでは、Gadd34が過剰発現しており、eIF2αのリン酸化が減衰していることが分かる。
【００４８】
また、図４及び５に示すように、rAAV-Flag-Gadd34を感染させたdb/dbマウスでは、肝臓/体重比が有意に増加し、血漿ALT値が有意に抑制されていることが明らかとなった。この結果から、Gadd34遺伝子を過剰発現して、PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害することによって、肥満モデルにおける肝切除後の肝再生障害を改善できることが示された。
【図１】
2015199693.tif 000003
【図２】
2015199693.tif 000004
【図３】
2015199693.tif 000005
【図４】
2015199693.tif 000006
【図５】
2015199693.tif 000007
【図６】
2015199693.tif 000008
【配列表】
2015199693000001.app