(57)【要約】【課題】腸内菌叢について老齢タイプと若齢タイプのいずれであるかを判定する方法の提供。【解決手段】糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する１７の門又は科に属する菌群のうち少なくとも一つ以上の菌群の割合と、予め定められた各菌群における基準値とを比較して腸内菌叢が老齢タイプ又は若齢タイプのいずれであるかを判定する判定工程を有する、腸内菌叢の老若判定方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する下記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群のうち少なくとも一つ以上の菌群の割合と、予め定められた各菌群における基準値とを比較して腸内菌叢が老齢タイプ又は若齢タイプのいずれであるかを判定する判定工程を有する、腸内菌叢の老若判定方法であって、
前記判定工程においては、（ａ）下記（１）〜（１５）の門又は科に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には老齢タイプと判定し、（ｂ）下記（１６）の科に属する菌群の前記割合が前記基準値未満である場合には老齢タイプと判定し、又は（ｃ）下記（１７）の科に属する菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には若齢タイプと判定する、方法。
（１）Methanobacteriaceae科
（２）Campylobacteraceae科
（３）Desulfitobacteraceae科
（４）Proteobacteria門
（５）Synergistetes門
（６）Comamonadaceae科
（７）Dethiosulfovibrionaceae科
（８）Leuconostocaceae科
（９）Staphylococcaceae科
（１０）Catabacteriaceae科
（１１）Synergistaceae科
（１２）Pseudomonadaceae科
（１３）Peptococcaceae科
（１４）Odoribacteraceae科
（１５）Enterobacteriaceae科
（１６）Lachnospiraceae科
（１７）Propionibacteriaceae科
【請求項２】
前記判定工程の（ａ）に用いられる基準値が、任意の年齢又は月齢以下の若齢集団から得た個々の糞便検体における各々の前記割合のうちの最大値である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記判定工程の（ｂ）に用いられる基準値が、任意の年齢又は月齢以下の若齢集団から得た個々の糞便検体における各々の前記割合のうちの最小値である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記判定工程の（ｃ）に用いられる基準値が、任意の年齢又は月齢を超える高齢集団から得た個々の糞便検体における各々の前記割合のうちの最大値である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記判定工程の（ａ）における下記（１）〜（１５）の門又は科に属する菌群の各々に対する前記基準値が下記値である、請求項１に記載の方法。
（１）Methanobacteriaceae科：０
（２）Campylobacteraceae科：０
（３）Desulfitobacteraceae科：０
（４）Proteobacteria門：０．０６８１
（５）Synergistetes門：０．００１５
（６）Comamonadaceae科：０．０００２
（７）Dethiosulfovibrionaceae科：０．０００３
（８）Leuconostocaceae科：０．０００３
（９）Staphylococcaceae科：０．０００４
（１０）Catabacteriaceae科：０．００１１
（１１）Synergistaceae科：０．００１５
（１２）Pseudomonadaceae科：０．００１７
（１３）Peptococcaceae科：０．００２６
（１４）Odoribacteraceae科：０．００３２
（１５）Enterobacteriaceae科：０．０６６３
【請求項６】
前記判定工程の（ｂ）における下記（１６）の科に属する菌群に対する前記基準値が下記値である、請求項１又は５に記載の方法。
（１６）Lachnospiraceae科：０．２２８
【請求項７】
前記判定工程の（ｃ）における下記（１７）の科に属する菌群に対する前記基準値が下記値である、請求項１、５又は６のいずれか一項に記載の方法。
（１７）Propionibacteriaceae科：０
【請求項８】
前記判定工程の前に前記割合を測定する測定工程を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の判定方法の結果に基づいて糞便検体を複数の群に分ける選別工程と、
選別された前記複数の群のうちの少なくともいずれか一つの群の糞便検体に含まれる菌群を同定する菌群同定工程と、を有する、腸内菌叢の老若判定マーカーとなる菌群のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、腸内菌叢の老若判定方法及び老若判定マーカーとなる菌群のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトなど動物の腸内には、多種類の細菌が常在している。これらの常在細菌によって形成される腸内菌叢においては、乳児期にビフィズス菌が増加したり、老人でウェルシュ菌が増加し、ビフィズス菌が減少するなど、成長や加齢に伴い特定の菌群が増減することが知られている。また、宿主の健康状態や宿主が摂取する薬剤、食物等によって腸内菌叢を構成する菌群の種類やその数が変動することも知られている。
【０００３】
このような腸内菌叢については、近年、そのバランスが崩れると腸内環境を悪化させ、便秘症状や下痢症状を発症したり、宿主の免疫機能が低下することなどが明らかとなってきている。これに対し、良好な腸内菌叢の維持や悪化した腸内菌叢を改善する薬剤や飲食物も開発されてきている。例えば、特許文献１には、「ラクトパーオキシダーゼを有効成分とする腸内フローラ改善剤」が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２４６７５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記特許文献１に記載された腸内フローラ改善剤のような腸内菌叢に作用する成分の効能を評価するためには、腸内菌叢の状態が改善しているか否かを判定する必要がある。一方、腸内菌叢を構成する菌群は多様であり、個体差も大きいため、腸内菌叢に含まれる菌群については、未だに同定されていない種もある。このため、腸内菌叢の状態に関してより詳細に判定するために、腸内菌叢の状態と関連する菌群の同定や当該菌群の数の変動を調べることが求められている。特に、老化現象は、多様な症状を含む現象であり、個体差も大きいため、腸内菌叢の状態について「老齢の状態」にあるか又は前記老齢の状態より若い「若齢の状態」にあるかを判定するためには、適切な指標を用いることが求められている。そこで、本開示は、腸内菌叢について老齢タイプと若齢タイプのいずれであるかを判定する方法等を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は鋭意検討した結果、菌叢全体の菌数に対する各種菌群に属する菌の割合について、高齢集団と若齢集団との間で、平均値だけでなく分布範囲についても異なる菌群が存在することを新規に見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち本開示は、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する下記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群のうち少なくとも一つ以上の菌群の割合と、予め定められた各菌群における基準値とを比較して腸内菌叢が老齢タイプ又は若齢タイプのいずれであるかを判定する判定工程を有する、腸内菌叢の老若判定方法であって、前記判定工程においては、（ａ）下記（１）〜（１５）の門又は科に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には老齢タイプと判定し、（ｂ）下記（１６）の科に属する菌群の前記割合が前記基準値未満である場合には老齢タイプと判定し、又は（ｃ）下記（１７）の科に属する菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には若齢タイプと判定する、方法を提供する。
（１）Methanobacteriaceae科
（２）Campylobacteraceae科
（３）Desulfitobacteraceae科
（４）Proteobacteria門
（５）Synergistetes門
（６）Comamonadaceae科
（７）Dethiosulfovibrionaceae科
（８）Leuconostocaceae科
（９）Staphylococcaceae科
（１０）Catabacteriaceae科
（１１）Synergistaceae科
（１２）Pseudomonadaceae科
（１３）Peptococcaceae科
（１４）Odoribacteraceae科
（１５）Enterobacteriaceae科
（１６）Lachnospiraceae科
（１７）Propionibacteriaceae科
前記判定工程の（ａ）に用いられる基準値は、任意の年齢又は月齢以下の若齢集団から得た個々の糞便検体における各々の前記割合のうちの最大値であってもよい。
また、前記判定工程の（ｂ）に用いられる基準値は、任意の年齢又は月齢以下の若齢集団から得た個々の糞便検体における各々の前記割合のうちの最小値であってもよい。
さらに、前記判定工程の（ｃ）に用いられる基準値は、任意の年齢又は月齢を超える高齢集団から得た個々の糞便検体における各々の前記割合のうちの最大値であってもよい。
前記判定工程の（ａ）における下記（１）〜（１５）の門又は科に属する菌群の各々に対する前記基準値を下記値とすることもできる。
（１）Methanobacteriaceae科：０
（２）Campylobacteraceae科：０
（３）Desulfitobacteraceae科：０
（４）Proteobacteria門：０．０６８１
（５）Synergistetes門：０．００１５
（６）Comamonadaceae科：０．０００２
（７）Dethiosulfovibrionaceae科：０．０００３
（８）Leuconostocaceae科：０．０００３
（９）Staphylococcaceae科：０．０００４
（１０）Catabacteriaceae科：０．００１１
（１１）Synergistaceae科：０．００１５
（１２）Pseudomonadaceae科：０．００１７
（１３）Peptococcaceae科：０．００２６
（１４）Odoribacteraceae科：０．００３２
（１５）Enterobacteriaceae科：０．０６６３
また、前記判定工程の（ｂ）における下記（１６）の科に属する菌群に対する前記基準値を下記値とすることもできる。
（１６）Lachnospiraceae科：０．２２８
さらに、前記判定工程の（ｃ）における下記（１７）の科に属する菌群に対する前記基準値を下記値とすることもできる。
（１７）Propionibacteriaceae科：０
前記腸内菌叢の老若判定方法は、前記判定工程の前に前記割合を測定する測定工程を有していてもよい。
【０００８】
本開示はまた、上記老若判定方法の結果に基づいて糞便検体を複数の群に分ける選別工程と、選別された前記複数の群のうちの少なくともいずれか一つの群の糞便検体に含まれる菌群を同定する菌群同定工程と、を有する、腸内菌叢の老若判定マーカーとなる菌群のスクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本開示により、腸内菌叢について老齢タイプと若齢タイプのいずれであるかを判定する方法等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本開示に係る腸内菌叢の老若判定方法の工程の一例を示すフローチャートである。
【図２】本開示に係る菌群のスクリーニング方法の工程の一例を示すフローチャートである。
【図３】選別工程の一例を示すフローチャートである。
【図４】本開示に係る菌群のスクリーニング方法の工程の一例を示すフローチャートである。
【図５】選別工程の一例を示すフローチャートである。
【図６】本開示に係る菌群のスクリーニング方法の工程の一例を示すフローチャートである。
【図７】選別工程の一例を示すフローチャートである。
【図８】本開示に係る物質のスクリーニング方法の工程を示すフローチャートである。
【図９】実験例１における、全ての菌の数に対するBifidobacteriaceae科に属する菌群の割合を示す図面代用グラフである。
【図１０】実験例１における、全ての菌の数に対するMethanobacteriaceae科に属する菌群の割合を示す図面代用グラフである。
【図１１】Ａは、実験例１における、全ての菌の数に対するCampylobacteraceae科に属する菌群の割合を示す図面代用グラフであり、Ｂは、Ａの一部を拡大した図面代用グラフである。
【図１２】実験例１における、全ての菌の数に対するDesulfitobacteraceae科に属する菌群の割合を示す図面代用グラフである。
【図１３】実験例１における、全ての菌の数に対するProteobacteria門に属する菌群の割合を示す図面代用グラフである。
【図１４】実験例１における、全ての菌の数に対するSynergistetes門に属する菌群の割合を示す図面代用グラフである。
【図１５】Ａは、実験例１における、全ての菌の数に対するComamonadaceae科に属する菌群の割合を示す図面代用グラフであり、Ｂは、Ａの一部を拡大した図面代用グラフである。
【図１６】Ａは、実験例１における、全ての菌の数に対するDethiosulfovibrionaceae科に属する菌群の割合を示す図面代用グラフであり、Ｂは、Ａの一部を拡大した図面代用グラフである。
【図１７】Ａは、実験例１における、全ての菌の数に対するLeuconostocaceae科に属する菌群の割合を示す図面代用グラフであり、Ｂは、Ａの一部を拡大した図面代用グラフである。
【図１８】Ａは、実験例１における、全ての菌の数に対するStaphylococcaceae科に属する菌群の割合を示す図面代用グラフであり、Ｂは、Ａの一部を拡大した図面代用グラフである。
【図１９】実験例１における、全ての菌の数に対するCatabacteriaceae科に属する菌群の割合を示す図面代用グラフである。
【図２０】実験例１における、全ての菌の数に対するSynergistaceae科に属する菌群の割合を示す図面代用グラフである。
【図２１】Ａは、実験例１における、全ての菌の数に対するPseudomonadaceae科に属する菌群の割合を示す図面代用グラフであり、Ｂは、Ａの一部を拡大した図面代用グラフである。
【図２２】実験例１における、全ての菌の数に対するPeptococcaceae科に属する菌群の割合を示す図面代用グラフである。
【図２３】実験例１における、全ての菌の数に対するOdoribacteraceae科に属する菌群の割合を示す図面代用グラフである。
【図２４】実験例１における、全ての菌の数に対するEnterobacteriaceae科に属する菌群の割合を示す図面代用グラフである。
【図２５】実験例１における、全ての菌の数に対するLachnospiraceae科に属する菌群の割合を示す図面代用グラフである。
【図２６】実験例１における、全ての菌の数に対するPropionibacteriaceae科に属する菌群の割合を示す図面代用グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本開示を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本開示の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本開示の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１２】
（１）腸内菌叢の老若判定方法
本開示に係る腸内菌叢の老若判定方法では、腸内菌叢について老齢タイプと若齢タイプのいずれであるかを判定する。図１は、本開示に係る腸内菌叢の老若判定方法の一例を示すフローチャートである。腸内菌叢の老若判定方法には、少なくとも判定工程Ｓ１２が含まれる。また、本開示に係る腸内菌叢の老若判定方法では、判定工程Ｓ１２の前に、後述する、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する特定の菌群の割合を測定する測定工程Ｓ１１を有していてもよい。
以下、測定工程Ｓ１１と判定工程Ｓ１２について順に説明する。なお、本開示に係る腸内菌叢の老若判定方法において、腸内菌叢を構成する菌群の「菌」とは、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）及び古細菌（ａｒｃｈａｅａ）を含み、かつ、真菌（ｆｕｎｇｉ）を含まないものである。また、これは、後述する菌群のスクリーニング方法においても同様である。
【００１３】
測定工程Ｓ１１は、糞便検体に含まれる下記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群のうち少なくとも一つ以上の菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する割合を測定する工程である。測定対象とする菌群は、（１）Methanobacteriaceae科、（２）Campylobacteraceae科、（３）Desulfitobacteraceae科、（４）Proteobacteria門、（５）Synergistetes門、（６）Comamonadaceae科、（７）Dethiosulfovibrionaceae科、（８）Leuconostocaceae科、（９）Staphylococcaceae科、（１０）Catabacteriaceae科、（１１）Synergistaceae科、（１２）Pseudomonadaceae科、（１３）Peptococcaceae科、（１４）Odoribacteraceae科、（１５）Enterobacteriaceae科、（１６）Lachnospiraceae科、（１７）Propionibacteriaceae科のうち少なくともいずれかの門又は科に属するものである。
【００１４】
本開示に係る腸内菌叢の老若判定方法では、糞便検体として動物から得られたものを用いることができる。動物としては、例えば、サル、チンパンジー、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ等が挙げられる。ヒトから得られる糞便検体が好ましく、ヒトについては、２０歳以上の成人から得られる糞便検体がより好ましい。
【００１５】
本工程Ｓ１１では、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する、上記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群のうち少なくとも一つ以上の菌群の割合を求める。全菌数及び上記割合は、例えば、下記の手法により求めることができる。
【００１６】
＜（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群の測定＞
糞便検体に含まれる菌のうち、上記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群に分類される菌の数は、公知の手法を用いて求めることができ、その手法は特に限定されない。例えば、菌の分類については、リボソームを構成する小型のサブユニット（１６Ｓ）に存在するＲＮＡをコードする遺伝子（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子）の塩基配列に基づき、各々の菌を、上記（１）〜（１７）の門又は科に属する各々の菌群又は、その他の菌群に分けることができる。また、糞便検体に含まれる各々の菌群の菌数の算出についても、例えば、糞便検体中に含まれる、各々の菌に由来する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量やコピー数を定量することにより行うこともできる。菌数の算出について、以下に例を挙げる。
【００１７】
塩基配列に基づき菌数を算出するためには、先ず、糞便検体に含まれる菌群のＤＮＡを抽出する。糞便検体からのＤＮＡの抽出は、公知の手法を用いて行うことができ、その手法は特に制限されない。例えば、フェノール・クロロホルムを用いる抽出法により、糞便検体からＤＮＡを抽出することができる。本開示に係る腸内菌叢の老若判定方法においては、フェノール・クロロホルムを用いる抽出方法によりＤＮＡを抽出することが好ましい。
【００１８】
また、フィルターを備えるスピンカラムなどを用いて、糞便検体からＤＮＡを抽出してもよい。なお、本工程Ｓ１１では、ＤＮＡの抽出は必須の工程ではなく、予め糞便検体から抽出されたＤＮＡ溶液を試料とすることもできる。
【００１９】
糞便検体から得られるＤＮＡについては、菌数の測定に必要なＤＮＡ量又はコピー数を得るために、核酸増幅反応を行うことが好ましい。ＤＮＡの増幅については、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等、公知の手法を用いて行うことができ、核酸増幅反応において用いるプライマーについても、公知の設計手法を用いて設計することができる。さらに、核酸増幅反応の際に、ＤＮＡの解析に必要な配列を増幅核酸鎖に組み込ませるように、プライマーを設計してもよい。
【００２０】
上記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群に分類される菌の数は、例えば、上記ＤＮＡ溶液に含まれるＤＮＡを鋳型とする定量的ＰＣＲ法やＴ−ＲＦＬＰ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法によって行うことができる。定量的ＰＣＲ法では、各々の菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち特異的な配列部分に結合するプライマーを用い、核酸増幅反応を行うことにより、所望の菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量又はコピー数を測定することができる。またＴ−ＲＦＬＰ法では、末端に標識が付されたプライマーを用いて、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の各菌群に特異的な配列部分を含む増幅核酸鎖を生成し、得られた増幅核酸鎖を制限酵素で処理し、断片化してサイズの異なるＤＮＡ断片とする。このＤＮＡ断片を電気泳動により分離し、泳動パターンにおける各々のピークの同定とピーク強度から、所望の菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量又はコピー数を測定することができる。
【００２１】
また、上記ＤＮＡ溶液に含まれるＤＮＡについては、ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法により、所望の菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量又はコピー数を算出してもよい。この他、ＤＮＡマイクロアレイを用いて１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量又はコピー数を算出することもできる。
【００２２】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ量又はコピー数は、上述した方法の他に、シーケンサーを用いて糞便検体から抽出されたＤＮＡの塩基配列を決定し、特定の配列を解読した回数から求めることもできる。また、シーケンサーを用いる方法の場合、同じ操作によって、糞便検体に含まれる上記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群以外の菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子についても解読することができる。このため、糞便検体に含まれる上記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群以外の菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピー数も併せて求めることができる。
【００２３】
シーケンサーを用いる方法としては、例えば、クローンライブラリー法、ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ／Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、メタゲノム解析等がある。クローンライブラリー法では、糞便検体から抽出されたＤＮＡの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の、各々の菌群に特異的な配列部分を増幅して、得られた増幅核酸鎖をプラスミドに挿入して、増幅核酸鎖を含むプラスミドの塩基配列を解読する。ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ法では、クローンライブラリー法と同様にＤＮＡを増幅し、得られた核酸鎖を電気泳動によって核酸鎖の配列に応じて分離し、バンドを切り出して、ゲル内のＤＮＡを回収して当該ＤＮＡの塩基配列を決定する。メタゲノム解析では、糞便検体から得られたＤＮＡを断片化して、必要に応じて核酸増幅反応等を行った後、各々のＤＮＡ断片又は増幅核酸鎖の塩基配列を決定する。
【００２４】
上述した塩基配列の決定は、サンガー法の原理を利用したシーケンサーで行うこともでき、また、次世代シーケンサーで行うこともできる。特にメタゲノム解析は、解読性能がより高い次世代シーケンサーで行うことが好ましい。
【００２５】
シーケンサーを用いて解読された塩基配列から菌群を同定する場合には、解析ソフトウェアやデータベース等を利用する公知の解析方法を利用することができる。データベースとしては、例えば、Genbank、ENA、DDBJ等が挙げられる。また、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に特化したデータベースであるGreengenes database 等も利用することができる。
糞便検体から得られるＤＮＡの解析結果を、これらのデータベースに蓄積された菌群の塩基配列に対して相同性検索することにより、糞便検体に含まれる菌群を同定することができる。いずれかの菌群に同定された配列のうち、上記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子として同定された配列のコピー数を、上記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群の数とすることができる。
【００２６】
＜糞便検体に含まれる全ての菌の数の測定＞
糞便検体に含まれる全ての菌の数の測定は、公知の手法を用いて求めることができ、その手法は特に限定されない。例えば、上述したシーケンサーを用いる方法においては、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列中、糞便検体に含まれる菌で共通の塩基配列部分に結合するプライマーを用いて１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列を解読することにより、上記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群以外の菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピー数も算出することができる。このため、糞便検体に含まれる全菌数は、例えば、糞便検体で測定される全ての菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピー数の和としてもよい。また、顕微鏡等を用いて、糞便検体に含まれる菌を数えることによって、糞便検体に含まれる全ての菌の数を求めることもできる。本開示に係る腸内菌叢の老若判定方法においては、測定工程Ｓ１１に、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を解読する工程を有する方法が好ましい。なお、本工程Ｓ１１に用いられる糞便検体は、採取後に培養操作が行われていない検体が望ましい。培養操作において、各々の菌の増殖率が異なることによって、採取時の糞便検体における各菌の割合が変化してしまうおそれがあるためである。
【００２７】
＜割合の算出＞
糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する上記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群の各々の割合とは、糞便検体に含まれる全菌数を「１」としたときの相対値である。従って、上記割合は、上記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群の各々に分類された菌の数と糞便検体に含まれる全菌数から求めることができる。また、上述したように、上記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピー数と、糞便検体に含まれる全て菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のコピー数とから上記割合を求めることもできる。なお、上記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群が検出されなかった場合には、その菌群の割合は０とする。
【００２８】
判定工程Ｓ１２は、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する上記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群のうち少なくとも一つ以上の菌群の割合と、予め定められた各菌群における基準値とを比較して腸内菌叢が老齢タイプ又は若齢タイプのいずれであるかを判定する工程である。また、本開示に係る老若判定方法において、上述した菌群の割合は、測定工程Ｓ１１によって求めることもできる。
【００２９】
本工程Ｓ１２においては、（ａ）上記（１）〜（１５）の門又は科に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の上記割合が基準値を超える場合には老齢タイプと判定し、（ｂ）上記（１６）の科に属する菌群の上記割合が基準値未満である場合には老齢タイプと判定し、又は（ｃ）上記（１７）に属する菌群の上記割合が、基準値を超える場合には若齢タイプと判定する。
【００３０】
本工程Ｓ１２で用いる基準値とは、予め定められた値であれば、算出方法等は特に限定されないが、例えば、測定工程Ｓ１１で測定対象として選択した菌群ごとに、下記に記載の基準値をを採用することもできる。
判定工程Ｓ１２の（ａ）に用いられる基準値を、任意の年齢又は月齢以下の若齢集団から得た個々の糞便検体における各々の上記割合のうち、最大値とする。
判定工程Ｓ１２の（ｂ）に用いられる基準値を、任意の年齢又は月齢以下の若齢集団から得た個々の糞便検体における各々の上記割合のうち、最小値とする。
判定工程Ｓ１２の（ｃ）に用いられる基準値を、任意の年齢又は月齢を超える高齢集団から得た個々の糞便検体における各々の上記割合のうち、最大値とする。
【００３１】
高齢集団及び若齢集団については、集団の大きさは特に限定されず、少なくとも２以上の糞便検体が、任意の年齢又は月齢に基づいて一つの集団に含まれていればよい。より精度の高い基準値を得るためには、例えば検体数は１００以上、好ましくは２００以上、より好ましくは５００以上である。
【００３２】
例えばヒトの糞便検体について本開示に係る腸内菌叢の老若判定方法を用いる場合、任意の年齢を超えるヒトを高齢集団とし、任意の年齢以下のヒトを若齢集団とすることができる。任意の年齢とは、例えば、５９歳とすることができる。
なお、若齢集団には、乳幼児など、腸内菌叢に関して成人とは異なる特徴を有することが知られている年齢層を除外することが好ましい。このような年齢層を除外することによって、若齢集団における腸内菌叢を構成する菌群の種類や菌数についてのばらつきが、より抑制される。この場合、若齢集団については、任意の年齢又は月齢以下で、かつ当該任意の年齢又は月齢より若い任意の年齢又は月齢を超える集団とすることができる。
【００３３】
また、例えば、マウスの糞便検体について、本開示に係る腸内菌叢の老若判定方法を用いる場合、任意の月齢を超えるマウスを高齢集団とし、任意の月齢以下のマウスを若齢集団とすることができる。また、上記ヒトの場合と同様に、若齢集団の月齢に関して、任意の月齢を下限値とすることもできる。
【００３４】
上述した本工程Ｓ１２の（ａ）における上記（１）〜（１５）の門又は科に属する菌群の各々に対する基準値は、例えば、下記値とすることができる。
（１）Methanobacteriaceae科：０、
（２）Campylobacteraceae科：０、
（３）Desulfitobacteraceae科：０、
（４）Proteobacteria門：０．０６８１、
（５）Synergistetes門：０．００１５、
（６）Comamonadaceae科：０．０００２、
（７）Dethiosulfovibrionaceae科：０．０００３、
（８）Leuconostocaceae科：０．０００３、
（９）Staphylococcaceae科：０．０００４、
（１０）Catabacteriaceae科：０．００１１、
（１１）Synergistaceae科：０．００１５、
（１２）Pseudomonadaceae科：０．００１７、
（１３）Peptococcaceae科：０．００２６、
（１４）Odoribacteraceae科：０．００３２、
（１５）Enterobacteriaceae科：０．０６６３、
【００３５】
また、上述した本工程Ｓ１２の（ｂ）における上記（１６）の科に属する菌群に対する基準値は、例えば、下記値とすることができる。
（１６）Lachnospiraceae科：０．２２８、
【００３６】
さらに、上述した本工程Ｓ１２の（ｃ）における上記（１７）の科に属する菌群に対する基準値は、例えば、下記値とすることができる。
（１７）Propionibacteriaceae科：０
【００３７】
本工程Ｓ１２においては、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する上記（１）〜（１７）のうちいずれか一つの菌群の割合について、基準値と比較すれば判定結果を得ることができるが、複数種類の菌群の上記割合の各々と、これらの菌群に対する各基準値と、を比較して判定してもよい。
例えば、老齢タイプであるか否かの判定に用いられる上記（１）〜（１６）の門又は科に属する菌群の中から、複数種類を選択して、老齢タイプであるか否かの判定を行ってもよい。また、例えば、上記（１）〜（１６）の門又は科に属する菌群のうち一つと、若齢タイプであるか否かの判定に用いられる上記（１７）の科に属する菌群とを選択して、腸内菌叢を老齢タイプと若齢タイプのいずれであるかを判定することもできる。
【００３８】
本開示に係る腸内菌叢の老若判定方法においては、測定対象とした菌群の上記割合に基づいて、腸内菌叢について老齢タイプであるか否か、又は若齢タイプであるか否か、を判定することができる。腸内菌叢のタイプを判別することによって、例えば、腸内菌叢の状態の把握が容易となる。また、腸内菌叢のタイプを判別することは、後述する菌群のスクリーニング方法や物質のスクリーニング方法において、好適に用いられ得る。
【００３９】
（２）菌群のスクリーニング方法
本開示に係る菌群のスクリーニング方法では、腸内菌叢に含まれる菌群のうち、腸内菌叢を老齢タイプ又は若齢タイプに判定するための老若判定マーカーとなる菌群を探索する。
図２は、本開示に係る菌群のスクリーニング方法の工程を示すフローチャートである。
【００４０】
菌群のスクリーニング方法には、少なくとも選別工程Ｓ２１及び菌群同定工程Ｓ２２が含まれる。なお、老若判定マーカーとは、腸内菌叢が老齢タイプであるか否かを判定するためのマーカー、腸内菌叢が若齢タイプであるか否かを判定するためのマーカー、及び腸内菌叢が老齢タイプと若齢タイプのいずれであるかを判定するためのマーカーのうち、少なくともいずれかに該当するものである。
【００４１】
選別工程Ｓ２１は、糞便検体について、上述した腸内菌叢の老若判定方法の結果に基づき糞便検体を複数の群に分ける工程である。腸内菌叢の判定については、上述した通りである。選別工程Ｓ２１の一例を図３に示す。
【００４２】
図３に示す選別工程Ｓ２１では、上述した（１）〜（１６）の門又は科に属する菌群のうちいずれか一つの上記割合を用いて、糞便検体を老齢タイプに該当するか否かによって分ける。例えば、老齢タイプに該当する糞便検体を第１群とし、老齢タイプに該当しない糞便検体を第２群とする。図３では、老齢タイプに該当するか否かによって糞便検体を２群に分けているが、選別工程Ｓ２１では、上述した（１７）の科に属する菌群の上記割合を用いて、若齢タイプに該当するか否かによって糞便検体を分けてもよい。
なお、図３と後述する図５と図７における第１群〜第４群は、選別工程Ｓ２１によって分けられる糞便検体の各群に便宜的に付したものにすぎず、各数字に意味はない。
【００４３】
菌群同定工程Ｓ２２は、上述した選別工程Ｓ２１によって選別された複数の群のうち、少なくともいずれか一つの群の糞便検体に含まれる菌群を同定する工程である。また、本開示において「菌群を同定する」とは、少なくとも門レベルまで同定されていることを指し、さらに綱レベル、目レベル、科レベル、属レベル及び種レベルのうち、いずれかのレベルまで同定することも含まれる。
【００４４】
本工程Ｓ２２において、糞便検体に含まれる菌群の同定は、公知の手法を用いて行うことができ、その手法は限定されない。例えば、糞便検体に含まれる菌群のゲノムを解読して、塩基配列に基づいて行うこともできる。この場合、菌群の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を解析して、各々の菌群を同定することができる。以下に、本工程Ｓ２２の一例を示す。
【００４５】
先ず、糞便検体に含まれる菌群のＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの抽出については、上述した腸内菌叢の老若判定方法における測定工程Ｓ１１と同様の方法で行うことができる。
【００４６】
次に、得られたＤＮＡの塩基配列を解読する。塩基配列の解読は、公知の手法によって行うことができ、その手法は限定されない。塩基配列の決定については、上述した腸内菌叢の老若判定方法における測定工程Ｓ１１と同様に、例えばシーケンサーを用いる方法等によって行うことができる。また、上述した腸内菌叢の老若判定方法における測定工程Ｓ１１と同様の方法により、例えば、解読されたＤＮＡの塩基配列をデータベースに照会することで、菌群を同定することができる。
【００４７】
菌群同定工程Ｓ２２において対象とする群は、老齢タイプに該当する糞便検体を含む群であってもよく、若齢タイプに該当する糞便検体を含む群であってもよく、選別工程Ｓ２１によって分けられたいずれかの群であれば、その群の内容は特に限定されない。対象とする群は、菌群のスクリーニングの目的に応じて決めることができる。
例えば、老齢タイプと判定するためのマーカー探索が目的であれば、老齢タイプに該当する糞便検体に含まれる菌群を同定することが好ましい。また、若齢タイプと判定するためのマーカー探索が目的であれば、若齢タイプに該当する糞便検体に含まれる菌群を同定することが好ましい。
【００４８】
また、複数の群の各々について、それらの群に含まれる糞便検体を、菌群を同定する対象としてもよい。例えば老齢タイプに該当する糞便検体と、老齢タイプに該当しなかった糞便検体の各々から菌群を同定することもできる。
【００４９】
本開示に係る菌群のスクリーニング方法では、上述した腸内菌叢の老若判定方法を利用して、糞便検体を複数の群に分けて選別することができる。例えば、予め老齢タイプに該当すると判定された糞便検体は、該当しなかった他の糞便検体に比べて、加齢によって腸内菌叢がより大きく変化している可能性の高い検体である。従って、本開示に係る菌群のスクリーニング方法では、より効率的に老若判定マーカーを探索することができる。
【００５０】
また、例えば、老齢タイプに該当しなかった糞便検体から同定された菌群やその菌数を、老齢タイプを判定するためのマーカー検索において、リファレンスとして用いることもできる。このリファレンスにより、老齢タイプであると判定されなかった糞便検体においても同程度の割合で存在した菌群や菌種を、老齢タイプを判定するためのマーカー候補から除外することができる。
このため、より効率的に老齢タイプと判定するためのマーカーを探索することができる。この点については、若齢タイプに該当しなかった糞便検体から同定された菌群やその菌数を、若齢タイプを判定するためのマーカー検索において、リファレンスとして用いる場合も同様である。
【００５１】
本開示に係る菌群のスクリーニング方法では、選別工程Ｓ２１において、２種類の菌種の上記割合を用いてもよい。この場合、選別工程Ｓ２１は、第１選別工程Ｓ２１−ａと、第２選別工程Ｓ２１−ｂの２工程を含んでいてもよい（図４参照）。図５に、選別工程Ｓ２１が２工程からなる場合の一例を示す。図５に示す選別工程Ｓ２１では、第１選別工程Ｓ２１−ａにおいて、老齢タイプであるか否かによって糞便検体を２群に分ける。さらに、第２選別工程Ｓ２１−ｂでは、第１選別工程Ｓ２１−ａにおいて老齢タイプに該当するものとして分けられた糞便検体について、若齢タイプに該当するか否かで２群に分ける。
【００５２】
このように複数の菌種の上記割合を用いることで、糞便検体を３群に分けることができる。なお、図５においては、老齢タイプと判定するための菌種と若齢タイプと判定するための菌種とを組み合わせているが、本開示に係る菌群のスクリーニング方法では、上記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群うち、いずれを組み合わせてもよい。また、選別工程Ｓ２１において用いられる菌種の順序は、特に限定されない。これは、後述する図７に示す選別工程Ｓ２１についても同様である。
【００５３】
本開示に係る菌群のスクリーニング方法では、さらに、選別工程Ｓ２１において、２種類の菌種の上記割合を用いて、糞便検体を４群に分けてもよい。この場合、選別工程Ｓ２１は、第１選別工程Ｓ２１−ａ、第２選別工程Ｓ２１−ｂ及び第３選別工程Ｓ２１−ｃの３工程を含んでいてもよい（図６参照）。図７に、選別工程Ｓ２１が３工程からなる場合の一例を示す。図７に示す選別工程Ｓ２１では、第１選別工程Ｓ２１−ａにおいて、老齢タイプであるか否かによって糞便検体を２群に分ける。
【００５４】
次に、第２選別工程Ｓ２１−ｂでは、第１選別工程Ｓ２１−ａにおいて老齢タイプに該当するものとして分けられた糞便検体について、若齢タイプに該当するか否かで２群に分ける。さらに、第３選別工程Ｓ２１−ｃでは、第１選別工程Ｓ２１−ａにおいて老齢タイプに該当しないものとして分けられた糞便検体について、若齢タイプに該当するか否かで２群に分ける。このように複数の菌種の上記割合を用いることで、糞便検体を４群に分けることができる。
【００５５】
上述したように、上記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群のうち複数種類を、選別工程Ｓ２１において糞便検体を選別する際の指標として組み合わせることもできる。例えば、選別工程Ｓ２１において、老齢タイプと判定するための菌群を複数種類用いた場合、いずれの菌群についても上記割合が老齢タイプに該当した糞便検体は、より老齢タイプに特異的な腸内菌叢の特徴を有している可能性の高い糞便検体である。また、若齢タイプに該当する糞便検体の選別に関しても同様である。このように糞便検体を予め選別することにより、より効率的に腸内菌叢の老若判定マーカーを探索することができる。
【００５６】
上述した腸内菌叢の老若判定マーカーとなる菌群の探索については、任意の年齢又は月齢で分けた若齢集団と高齢集団における、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する任意の菌群の割合の分布の差異に基づき、老若判定マーカーを同定してもよい。
即ち、本開示の腸内菌叢の老若判定マーカーとなる菌群のスクリーニング方法は、糞便検体に含まれる任意の種類の菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する割合を測定する測定工程と、任意の年齢又は月齢を超える高齢集団における上記割合の分布と、任意の年齢又は月齢以下の若齢集団における上記割合の分布と、を比較する比較工程と、比較工程において、下記（ａ）〜（ｄ）のうち少なくともいずれか一つに該当する場合には、任意の種類の菌群を腸内菌叢の老若判定マーカーとして同定する同定工程と、を含むものとすることもできる。
（ａ）若齢集団における上記割合の最大値を超える範囲に、高齢集団の分布が存在する。
（ｂ）若齢集団における上記割合の最小値未満の範囲に、高齢集団の分布が存在する。
（ｃ）高齢集団における上記割合の最大値を超える範囲に、若齢集団の分布が存在する。
（ｄ）高齢集団における上記割合の最小値未満の範囲に、若齢集団の分布が存在する。
【００５７】
上記測定工程は、上述した腸内菌叢の老若判定方法における測定工程Ｓ１１と同様の方法で行うことができる。また、高齢集団又は若齢集団に属する少なくとも２以上の検体が最大値を超える範囲又は最小値未満の範囲に存在していれば、分布が存在するものとする。さらに、上記同定工程では、上記割合について、高齢集団における分布のレンジ幅と、若齢集団における分布のレンジ幅とが異なる場合に、任意の種類の菌群を腸内菌叢の老若判定マーカーとして同定することが好ましい。
【００５８】
（３）物質のスクリーニング方法
本開示に係る物質のスクリーニング方法では、食餌や物質に含まれる腸内菌叢へ作用するものを探索する。図８は、本開示に係る物質のスクリーニング方法のフローチャートである。物質のスクリーニング方法には、少なくとも測定工程Ｓ３１、相関算出工程Ｓ３２及び物質同定工程Ｓ３３が含まれる。なお、本開示に係る物質のスクリーニング方法において、腸内菌叢へ作用するものとは、例えば、腸内菌叢の老化を促進したり、あるいは抑制したりするなど、腸内菌叢のバランスを変化させるものである。
【００５９】
測定工程Ｓ３１は、上述した菌群のスクリーニング方法により、老若判定マーカーとして同定された菌群について、動物から得た糞便検体に含まれる全菌数に対する割合を測定する。菌群の割合の測定については、上述した通りである。
【００６０】
本開示に係る物質のスクリーニング方法において、食餌又は物質の動物への摂取は、経口摂取であっても、非経口摂取であってもよい。また、摂取回数は、１回でも複数回でもよい。複数回の場合、同じ食餌又は物質を複数回に渡って摂取してもよい。動物から得られる糞便検体は、食餌又は物質を摂取する前と摂取した後の各々の時点で採取されたものであってもよい。
【００６１】
相関算出工程Ｓ３２は、測定工程Ｓ３１で測定された菌群の割合について、その増減と、動物が摂取した食餌又は物質との相関を求める工程である。動物が食餌又は物質を摂取した後、上述した菌群のスクリーニングによって老若判定マーカーとされた菌群の数が糞便検体において変動すれば、その食餌又は物質は腸内菌叢へ作用するものである可能性が高い。また、動物が摂取した食餌又は物質の量に応じて、菌群の割合の変動の程度も変化すれば、その食餌又は物質は腸内菌叢へ作用するものである可能性が高い。本工程Ｓ３２では、このような、動物が摂取した食餌又は物質と、糞便検体の全菌数に対する特定の菌群の割合における相関関係を解析する。
【００６２】
本工程Ｓ３２では、例えば相関係数ｒを算出してもよい。また、例えば、カイ二乗検定やマンホイットニーＵ検定等の検定方法を用いて、食餌又は物質を摂取した群と摂取していない群との間の、老若判定マーカーとした菌群の上記割合の差異について、χ２値やＵ等を求めてもよい。相関について数値で表わすことができれば、その算出方法は特に限定されず、母集団の大きさや測定工程Ｓ３１で測定する菌群の種類の数等に合わせて、公知の統計手法の中から適宜選択できる。
【００６３】
また、相関算出工程Ｓ３２では、任意の統計手法に基づき、老若判定マーカーとして用いた菌群の上記割合の増減と、動物が摂取した食餌又は物質との相関について、計算機等により自動的に相関関係を解析してもよい。
【００６４】
物質同定工程Ｓ３３は、相関算出工程Ｓ３２において算出された値が閾値を満たす場合に、その食餌又は物質を腸内菌叢へ作用するものとして同定する工程である。閾値は、相関算出工程Ｓ３２において相関の算出に用いた方法に合わせて適宜設定できる。
例えば、相関算出工程Ｓ３２において相関係数ｒ、χ２値又はＵを算出するのであれば、本工程Ｓ３３では、これらの数値に対応するｐ値に対して閾値を設定できる。例えば、閾値をｐ＜０．０５とする場合、前記ｐ値がこれに該当すれば、閾値を満たすものとする。また、前記ｐ値がこれに該当しなければ、閾値を満たさないものとする。
【００６５】
上記閾値を満たした場合、その動物が摂取した食餌又は物質は、腸内菌叢へ作用するものとして同定される。例えば、食餌又は物質の摂取後に、老齢タイプと判定するためのマーカーとされる菌群の上記割合が老齢タイプの範囲外へ変動し、相関算出工程Ｓ３２によって算出された値が閾値を満たす場合には、その食餌又は物質は、腸内菌叢の若齢タイプへの変化を促進するものとして同定される。
また、食餌又は物質の摂取後に、若齢タイプと判定するためのマーカーとされる菌群の上記割合が若齢タイプの範囲外へ変動し、その相関が閾値を満たす場合には、その食餌又は物質は、腸内菌叢の老齢タイプへの変化を促進するものとして同定される。
【００６６】
本開示に係る物質のスクリーニング方法では、上述した菌群のスクリーニング方法によって老若判定マーカーとされる菌群の上記割合を指標とすることにより、簡便に腸内菌叢へ作用するものをスクリーニングすることができる。
【００６７】
本開示は、以下の構成を採用することもできる。
〔１〕糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する下記（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群のうち少なくとも一つ以上の菌群の割合と、予め定められた各菌群における基準値とを比較して腸内菌叢が老齢タイプ又は若齢タイプのいずれであるかを判定する判定工程を有する、腸内菌叢の老若判定方法であって、前記判定工程においては、（ａ）下記（１）〜（１５）の門又は科に属する菌群のうち少なくともいずれか一つの菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には老齢タイプと判定し、（ｂ）下記（１６）の科に属する菌群の前記割合が前記基準値未満である場合には老齢タイプと判定し、又は（ｃ）下記（１７）の科に属する菌群の前記割合が前記基準値を超える場合には若齢タイプと判定する、方法。
（１）Methanobacteriaceae科
（２）Campylobacteraceae科
（３）Desulfitobacteraceae科
（４）Proteobacteria門
（５）Synergistetes門
（６）Comamonadaceae科
（７）Dethiosulfovibrionaceae科
（８）Leuconostocaceae科
（９）Staphylococcaceae科
（１０）Catabacteriaceae科
（１１）Synergistaceae科
（１２）Pseudomonadaceae科
（１３）Peptococcaceae科
（１４）Odoribacteraceae科
（１５）Enterobacteriaceae科
（１６）Lachnospiraceae科
（１７）Propionibacteriaceae科
【００６８】
〔２〕前記判定工程の（ａ）に用いられる基準値が、任意の年齢又は月齢以下の若齢集団から得た個々の糞便検体における各々の前記割合のうちの最大値である、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記判定工程の（ｂ）に用いられる基準値が、任意の年齢又は月齢以下の若齢集団から得た個々の糞便検体における各々の前記割合のうちの最小値である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記判定工程の（ｃ）に用いられる基準値が、任意の年齢又は月齢を超える高齢集団から得た個々の糞便検体における各々の前記割合のうちの最大値である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
【００６９】
〔５〕前記判定工程の（ａ）における下記（１）〜（１５）の門又は科に属する菌群の各々に対する前記基準値が下記値である、上記〔１〕に記載の方法。
（１）Methanobacteriaceae科：０
（２）Campylobacteraceae科：０
（３）Desulfitobacteraceae科：０
（４）Proteobacteria門：０．０６８１
（５）Synergistetes門：０．００１５
（６）Comamonadaceae科：０．０００２
（７）Dethiosulfovibrionaceae科：０．０００３
（８）Leuconostocaceae科：０．０００３
（９）Staphylococcaceae科：０．０００４
（１０）Catabacteriaceae科：０．００１１
（１１）Synergistaceae科：０．００１５
（１２）Pseudomonadaceae科：０．００１７
（１３）Peptococcaceae科：０．００２６
（１４）Odoribacteraceae科：０．００３２
（１５）Enterobacteriaceae科：０．０６６３
〔６〕前記判定工程の（ｂ）における下記（１６）の科に属する菌群に対する前記基準値が下記値である、上記〔１〕又は〔５〕に記載の方法。
（１６）Lachnospiraceae科：０．２２８
〔７〕前記判定工程の（ｃ）における下記（１７）の科に属する菌群に対する前記基準値が下記値である、上記〔１〕、〔５〕又は〔６〕のいずれかに記載の方法。
（１７）Propionibacteriaceae科：０
【００７０】
〔８〕前記判定工程の前に前記割合を測定する測定工程を有する、上記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
【００７１】
〔９〕上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の判定方法の結果に基づいて糞便検体を複数の群に分ける選別工程と、選別された前記複数の群のうちの少なくともいずれか一つの群の糞便検体に含まれる菌群を同定する菌群同定工程と、を有する、腸内菌叢の老若判定マーカーとなる菌群のスクリーニング方法。
【００７２】
〔１０〕上記〔９〕に記載の菌群のスクリーニング方法により同定された菌群について、動物から得た糞便検体に含まれる全て菌の数に対する割合を測定する測定工程と、前記菌群の前記割合の増減と、前記動物が摂取した食餌又は物質と、の相関を求める相関算出工程と、前記相関算出工程において算出された値が閾値を満たす場合に、前記食餌又は物質を腸内菌叢へ作用するものとして同定する物質同定工程と、を含む物質のスクリーニング方法。
【００７３】
〔１１〕糞便検体に含まれる任意の種類の菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する割合を測定する測定工程と、
任意の年齢又は月齢を超える高齢集団における前記割合の分布と、前記任意の年齢又は月齢以下の若齢集団における前記割合の分布と、を比較する比較工程と、該比較工程において、下記（ａ）〜（ｄ）のうち少なくともいずれか一つに該当する場合には、前記任意の種類の菌群を腸内菌叢の老若判定マーカーとして同定する同定工程と、を含む、
腸内菌叢の老若判定マーカーとなる菌群のスクリーニング方法。
（ａ）前記若齢集団における前記割合の最大値を超える範囲に、前記高齢集団の前記分布が存在する
（ｂ）前記若齢集団における前記割合の最小値未満の範囲に、前記高齢集団の前記分布が存在する
（ｃ）前記高齢集団における前記割合の最大値を超える範囲に、前記若齢集団の前記分布が存在する
（ｄ）前記高齢集団における前記割合の最小値未満の範囲に、前記若齢集団の前記分布が存在する
【００７４】
〔１２〕前記同定工程では、さらに、前記高齢集団における前記分布のレンジ幅と、前記若齢集団における前記分布のレンジ幅と、が前記菌群について異なる場合に、前記任意の種類の菌群を腸内菌叢の老若判定マーカーとして同定する上記〔１１〕に記載の菌群のスクリーニング方法。
【実施例】
【００７５】
１．実験例１
本実験例では、糞便検体に含まれる菌群について、老齢及び若齢の各々に特徴的な菌群の同定を試みた。
【００７６】
＜検体＞
本実験例では、健常な１７４名（２１〜１０４歳）の日本人から提供された糞便検体を用いた。この１７４名の内訳は、２０歳代：９人、３０歳代：４５人、４０歳代：２１人、５０歳代：１３人、６０歳代：５人、７０歳代：１０人、８０歳代：４６人、９０歳代：１９人、１００歳以上：６人であり、平均年齢は６１．７歳である。
【００７７】
＜ＤＮＡの抽出＞
本実験例では、先ず、糞便検体からのＤＮＡの抽出を行った。約２０ｍｇの糞便検体に対して、４５０μｌの抽出用溶液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）を加えて懸濁し、さらに、１０％ＳＤＳ溶液５０μｌ、０．１ｍｍ径のガラスビーズ３００ｍｇ、５００μｌのＴＥ飽和フェノール（和光純薬）を加えて混合した。得られた懸濁液に対しては、ＦａｓｔＰｒｅｐ  ＦＰ  １００Ａ（フナコシ社製）を用いてパワーレベル５で３０秒の破砕処理を実施した後、１４，０００×ｇで５分間遠心して４００μｌの上清を得た。
得られた上清に２５０μｌのフェノール・クロロホルム溶液（和光純薬）を加えて混合し、１４，０００×ｇで５分間遠心した後、２５０μｌの上清を回収した。回収した上清に、２−プロパノールを２５０μｌ加え、ＤＮＡを沈殿させ、２００μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ８．０）に再度溶解させて、これをＤＮＡ溶液とした。
【００７８】
＜ＤＮＡの増幅＞
次に、上記ＤＮＡ溶液に含まれる菌群のゲノムに対して核酸増幅反応を行った。下記表１〜表３に、本実験例で用いたプライマーの配列を示す。表１に示すプライマーセットは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の第３〜４可変領域を増幅させるためのプライマーである。これらのプライマーについては、便宜的に第１プライマーセットとする。
【００７９】
【表１】
2015188379.tif 000002
【００８０】
表１中、「Ｒ」は、グアニン又はアデニンを意味する。「Ｗ」は、アデニン又はチミン若しくはウラシルを意味する。「Ｈ」は、アデニン又はシトシン又はチミン若しくはウラシルを意味する。「Ｖ」は、アデニン又はグアニン又はシトシンを意味する。
【００８１】
また、下記表２及び表３に示すプライマーセットは、次世代シーケンサー（Ｍｉｓｅｑ（イルミナ社製））を用いて塩基配列を解析するために必要な配列（アダプター領域及びインデックス領域）を増幅核酸鎖に組み込むためのプライマーセットである。表２に示すプライマーはフォワードプライマーであり、表３に示すプライマーは、リバースプライマーである。これらのプライマーは、便宜的に第２プライマーセットとする。なお、表１〜表３に示すプライマーは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のオリゴプライマー作成サービスにより得た。
【００８２】
【表２】
2015188379.tif 000003
【００８３】
【表３】
2015188379.tif 000004
【００８４】
上述したＤＮＡ溶液及び第１プライマーセットを含む総液量２５μｌの反応液を、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  ＨＳ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて調製した。核酸増幅反応は、サーマルサイクラー（Ｖｅｒｉｔｉ  ２００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））を用いて行い、９４℃−３分の後、９４℃−３０秒、５０℃−３０秒、７２℃−３０秒を１サイクルとし、これを２０回繰り返し、その後７２℃−１０分として、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンにより、増幅核酸鎖を確認した。
【００８５】
続いて、得られたＰＣＲ産物１μｌを鋳型とし、第２プライマーセットを用いて上述した条件と同様にＰＣＲ反応を行った。但し、サイクル数は１５回とした。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンを確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ９６  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＰＣＲ産物を精製した。精製後のＰＣＲ産物については、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によりＤＮＡ濃度を測定した。
【００８６】
＜ＤＮＡのシークエンス＞
複数の糞便検体に由来するＰＣＲ産物を同じ濃度で混合したものをＭｉｓｅｑ  ｖ２  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（イルミナ社製）に供し、Ｍｉｓｅｑにてシークエンス解析を実施した。
【００８７】
＜菌群の同定及び菌数の算出＞
上記シークエンス解析により得られたペアエンド配列をfastq-join （version.1.1.2-301）（http://code.google.com/p/ea-utils/wiki/FastqJoin）にて、ＱＩＩＭＥソフトウェア（version 1.6.0）（http://qiime.org/）にて９７％の相同性を有する配列ごとをＯＵＴ（Operational Taxonomy Unit）とした。各ＯＵＴの代表配列を下記データベースに対してＢＬＡＳＴ検索することにより、腸内菌叢の構成を解析した。
データベース：Greengenes database 12_10
(http://greengenes.secondgenome.com/downloads/database/12_10)
【００８８】
＜結果＞
上述した腸内菌叢の構成の解析の結果、個々の糞便検体について８２９５±２３６６の配列が得られた。本実験例では、この配列数を各糞便検体に含まれる全菌数とした。また、これらの配列のうち、個々の門又は科ごとの数を各々の門又は科に属する菌群の数とした。上記相同性検索の結果、表４及び表５に示す腸内菌叢構成が得られた。表４は、門レベルでの分類を示し、表５は、科レベルでの分類を示す。
【００８９】
【表４】
2015188379.tif 000005
【００９０】
【表５】
2015188379.tif 000006
【００９１】
図９に、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対するBifidobacteriaceae科に属する菌群の割合の分布を示す。図９に示すグラフの縦軸は割合を示し、横軸は年齢を示す。Bifidobacteriaceae科に属する菌群は、加齢に伴い腸内で数が減少していくことが知られている菌群である。本実験例の結果、５９歳以下の若齢集団におけるBifidobacteriaceae科に属する菌群の割合の最大値は０．４８７５であり、６０歳以上の若齢集団における割合の最大値は、０．２６０１であった。なお、本実験例では、５９歳以下の集団について「若齢集団」とし、６０歳以上の集団について「高齢集団」とする。
【００９２】
一方、Bifidobacteriaceae科に属する菌群の上記割合について、各集団における最小値と最大値の差異は、若齢集団で約５１４倍、高齢集団で約５０６倍と、同程度であった。
【００９３】
図１０〜２６は、上記表４及び表５に示す門又は科に属する菌群のうち、上述した（１）〜（１７）の門又は科に属する菌群について、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する各菌群の割合の分布を示す。図１０〜図２６に示すグラフの縦軸は割合を示し、横軸は年齢を示す。
【００９４】
図２５に示すLachnospiraceae科に属する菌群の割合については、各集団における最小値と最大値の差異は、若齢集団では約３．９倍であるのに対して、高齢集団では約２１．２倍であった。また、若齢集団における割合の最小値は０．２２８であり、高齢集団において、割合が０．２２８に満たない検体は、１７であった。
【００９５】
また、図９に示すBifidobacteriaceae科に属する菌群の割合については、各集団における最大値から最小値を引いた差分は、１．９倍程度、若齢集団の方が大きかった。これに対して、図２４に示すEnterobacteriaceae科に属する菌群の割合では、上記差分は、７．６倍程度、高齢集団の方が大きかった。
即ち、Enterobacteriaceae科に属する菌群における上記割合の分布幅は、若齢集団と高齢集団の間で、Bifidobacteriaceae科に属する菌群に比べて、より差異が大きかった。さらに、Enterobacteriaceae科に属する菌群の割合については、若齢集団における割合の最大値は０．０６６３であり、高齢集団では、割合が０．０６６３を超える検体は、３７であった。
【００９６】
若齢集団及び高齢集団の各集団における上記割合の最大値と最小値の差分については、各々、
図１３に示すProteobacteria門に属する菌群では、約１０．７倍、
図１４に示すSynergistetes門に属する菌群では、約１８．７倍、
図１５に示すComamonadaceae科に属する菌群では、約４６８．６倍、
図１６に示すDethiosulfovibrionaceae科に属する菌群では、約４６．６倍、
図１７に示すLeuconostocaceae科に属する菌群では、約７５．０倍、
図１８に示すStaphylococcaceae科に属する菌群では、約１６４．９倍、
図１９に示すCatabacteriaceae科に属する菌群では、約６８．５倍、
図２０に示すSynergistaceae科に属する菌群では、約１３．８倍、
図２１に示すPseudomonadaceae科に属する菌群では、約４１１．８倍、
図２２に示すPeptococcaceae科に属する菌群では約７．８倍、
図２３に示すOdoribacteraceae科に属する菌群では、約１２．１倍、
といずれも、Bifidobacteriaceae科に属する菌群に比べて、より差異が大きかった。
【００９７】
さらに、Methanobacteriaceae科に属する菌群（図１０）、Campylobacteraceae科に属する菌群（図１１）、Desulfitobacteraceae科に属する菌群（図１２）、Propionibacteriaceae科に属する菌群（図２６）、の各菌群では、若齢集団又は高齢集団のいずれか一方で、いずれの検体もその割合が０であった。
【００９８】
そして、Methanobacteriaceae科に属する菌群については、高齢集団で、割合が０を超える検体は、９であった。
Campylobacteraceae科に属する菌群については、高齢集団で、割合が０を超える検体は、２１であった。
Desulfitobacteraceae科に属する菌群については、高齢集団で、割合が０を超える検体は、４であった。
Propionibacteriaceae科に属する菌群については、若齢集団では、割合が０を超える検体は、８であった。
【００９９】
Proteobacteria門に属する菌群については、若齢集団における割合の最大値は０．０６８１であった。これに対して、高齢集団では、割合が０．０６８１を超える検体は、７８であった（図１３）。
【０１００】
Synergistetes門に属する菌群については、若齢集団における割合の最大値は０．００１５であった。これに対して、高齢集団では、割合が０．００１５を超える検体は、２０であった（図１４）。
【０１０１】
Comamonadaceae科に属する菌群については、若齢集団における割合の最大値は０．０００２であった。これに対して、高齢集団では、割合が０．０００２を超える検体は、１１であった（図１５）。
【０１０２】
Dethiosulfovibrionaceae科に属する菌群については、若齢集団における割合の最大値は０．０００３であった。これに対して、高齢集団では、割合が０．０００３を超える検体は、９であった（図１６）。
【０１０３】
Leuconostocaceae科に属する菌群では、若齢集団における割合の最大値は０．０００３であった。これに対して、高齢集団では、割合が０．０００３を超える検体は、９であった（図１７）。
【０１０４】
Staphylococcaceae科に属する菌群については、若齢集団における割合の最大値は０．０００４であった。これに対して、高齢集団では、割合が０．０００４を超える検体は、５であった（図１８）。
【０１０５】
Catabacteriaceae科に属する菌群については、若齢集団における割合の最大値は０．００１１であった。これに対して、高齢集団では、割合が０．００１１を超える検体は、３１であった（図１９）。
【０１０６】
Synergistaceae科に属する菌群については、若齢集団における割合の最大値は０．００１５であった。これに対して、高齢集団では、割合が０．００１５を超える検体は、１７であった（図２０）。
【０１０７】
Pseudomonadaceae科に属する菌群については、若齢集団における割合の最大値は０．００１７であった。これに対して、高齢集団では、割合が０．００１７を超える検体は、７であった（図２１）。
【０１０８】
Peptococcaceae科に属する菌群については、若齢集団における割合の最大値は０．００２６であった。これに対して、高齢集団では、割合が０．００２６を超える検体は、１５であった（図２２）。
【０１０９】
Odoribacteraceae科に属する菌群については、若齢集団における割合の最大値は０．００３２であった。これに対して、高齢集団では、割合が０．００３２を超える検体は、２３であった（図２３）。
【０１１０】
本実験例の結果から、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する割合に関して、高齢集団と若齢集団との間で、平均値だけでなく分布範囲についても異なる菌群が存在することが明らかとなった。
また、Methanobacteriaceae科、Campylobacteraceae科、Desulfitobacteraceae科、Proteobacteria門、Synergistetes門、Comamonadaceae科、Dethiosulfovibrionaceae科、Leuconostocaceae科、Staphylococcaceae科、Catabacteriaceae科、Synergistaceae科、Pseudomonadaceae科、Peptococcaceae科、Odoribacteraceae科、Enterobacteriaceae科の各門又は各科に属する菌群については、若齢集団における割合の最大値を超える範囲に高齢集団の分布が見られた。さらに、Lachnospiraceae科に属する菌群については、若齢集団の割合の最小値に満たない範囲に高齢集団の分布が見られた。
【０１１１】
一方、Propionibacteriaceae科に属する菌群については、高齢集団の最大値を超える範囲に若齢集団の分布が見られた。従って、これらの門又は科に属する菌群の割合は、腸内菌叢が老齢タイプであるか若齢タイプであるかを判定する試験に、マーカーとして用いることができる。
【０１１２】
また、図１０〜２５に示すように、糞便検体に含まれる全ての菌の数に対する割合について、若齢集団の最大値や最小値を基準とすると、高齢集団にのみ見られる分布範囲に該当する検体を選別することができた。また、同様に、図２６に示すように、高齢集団の最大値を基準とすることにより若齢集団にのみ見られる分布範囲に該当する検体を選別することができた。
従って、上記の門又は科に属する菌群の、若齢集団における上記割合の上限値及び下限値、並びに高齢集団における上記割合の上限値及び下限値は、上記の門又は科に属する菌群をマーカーとして用いる場合に、基準値とすることができることが示された。
【図１】
2015188379.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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