(57)【要約】【課題】新規な機構を有する前立腺癌の治療組成物、特に去勢抵抗性前立腺癌の治療組成物を提供することを解決すべき課題とした。【解決手段】2'-ヒドロキシフラバノンは、前立腺癌細胞の増殖の阻害作用、アンドロゲン受容体活性抑制作用、アンドロゲン受容体タンパク質の核内移行阻害作用、アンドロゲン反応性の抑制作用及びアンドロゲン受容体の発現阻害作用を有することを見出して、本発明を完成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
2'-ヒドロキシフラバノン又はその誘導体を含むアンドロゲン受容体活性抑制組成物。
【請求項２】
2'-ヒドロキシフラバノン又はその誘導体を含むアンドロゲン反応性の抑制組成物。
【請求項３】
2'-ヒドロキシフラバノン又はその誘導体を含むアンドロゲン受容体タンパク質の核内移行阻害組成物。
【請求項４】
2'-ヒドロキシフラバノン又はその誘導体を含むアンドロゲン受容体の発現阻害組成物。
【請求項５】
2'-ヒドロキシフラバノン又はその誘導体を含む前立腺癌の予防・治療組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１に記載の組成物を含む前立腺癌の予防・治療剤。
【請求項７】
前記前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌である請求項５の予防・治療剤。
【請求項８】
前記前立腺癌は、アンドロゲン合成経路阻害作用を有する前立腺癌治療剤に耐性のある前立腺癌である請求項６又は７の予防・治療剤。
【請求項９】
ドセタキセル抵抗性を示す前立腺癌の再発予防剤である請求項５〜８のいずれか１の予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、2'-ヒドロキシフラバノンを含む前立腺癌の予防・治療組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（前立腺癌）
前立腺癌（PCa）は最も多く見られる悪性腫瘍であり、米国男性の癌関連死では上位の原因である（非特許文献１）。初期の進行性PCaはアンドロゲン依存性であることから、進行性PCaにはアンドロゲン遮断療法（ＡＤＴ）が初めに選択される。ＡＤＴの一例である、去勢及び抗アンドロゲン剤の併用により、症状の改善又は前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の減少は前立腺癌患者の９０％以上に見られる。しかしながら、ＡＤＴで最初に反応した後、最終的にPCaはアンドロゲン遮断への応答性を失い、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）へ進行してしまう。
【０００３】
ＣＲＰＣへの進行を説明できる多分子機序が提示されており、PCa進行における重要な媒介物質としてアンドロゲン受容体（ＡＲ）が関与していると考えられている（非特許文献２、３）。
特に、PCaのアンドロゲン過敏状態は、副腎から分泌されるアンドロゲンの去勢レベルへ適合することに重要な役割を担っている。さらに、PCa又は骨転移領域における腫瘍内アンドロゲン合成によっても、アンドロゲン過敏性PCa細胞が生存及び増殖するに十分なアンドロゲンが供給されている（非特許文献４、５）。
【０００４】
前立腺組織内には、副腎性アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（DHEA：Dehydroepiandrosterone）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換するための多くの代謝酵素の存在が確認されている。DHEAはホルモン療法によってそれほど変化を受けないが、ホルモン治療後にも前立腺癌組織内でDHEAからＤＨＴに変換されることが、血清中より組織中にＤＨＴが高濃度で存在している理由と考えられている。
【０００５】
（フラボノイド類）
フラボノイド類は、植物起源の飲食物に含まれるポリフェノール化合物であり、フラボノール類、フラボン類、フラボノン類、フラバン-3-オール類、アントシアニジン類、イソフラボン類の6つのサブクラスに分類することができる。また、フラボノイド類は、抗酸化活性、抗炎症活性、抗増殖活性と広い薬理学的活性を持つことが知られている。
【０００６】
下記記載のように前立腺癌の治療等に関する報告は存在する。
特許文献１は、「前立腺由来間質細胞を使用した新規な酵素活性測定法に関するものであり、さらには、酵素阻害剤の評価方法」を開示している。
特許文献２は、「ヒトTMP-2蛋白質に対する抗体を含む製剤学的組成物を処置を要求される患者に投与することを特徴とする前立腺癌の治療方法」を開示している。
特許文献３は、「カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼ２(CAMKK2)若しくはCAMKK2同等物、並びに／又はCAMKK2遺伝子若しくはCAMKK2遺伝子同等物を有効成分として含む前立腺癌の予防・治療剤」を開示している。
【０００７】
上記いずれの文献は、「2'-ヒドロキシフラバノン又はその誘導体を含む前立腺癌の予防・治療組成物」について開示又は示唆がない。
【０００８】
特許文献４は、「イソフラボノイド二量体が抗癌作用を有すること」を開示している。しかし、該文献は、2'-ヒドロキシフラバノンを開示していない。さらには、2'-ヒドロキシフラバノンのアンドロゲン受容体活性抑制、アンドロゲン受容体タンパク質の核内移行阻害等を開示又は示唆をしていない。
【０００９】
以上により、新規な前立腺癌の治療剤、特にＣＲＰＣの治療剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１０−０２２２３４
【特許文献２】特開２００４−１９６８１７
【特許文献３】特開２０１３−０４３８６２
【特許文献４】特表２００８−５３７５４５
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Siegel R, Ward E, Brawley O, Jemal A. Cancer statistics, 2011: The impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths. CA: a cancer journal for clinicians 2011.
【非特許文献２】Hoimes CJ, Kelly WK. Redefining hormone resistance in prostate cancer. Ther Adv Med Oncol 2010; 2: 107-23.
【非特許文献３】Taplin ME, Balk SP. Androgen receptor: a key molecule in the progression of prostate cancer to hormone independence. Journal of cellular biochemistry 2004; 91: 483-90.
【非特許文献４】Nishiyama T, Hashimoto Y, Takahashi K. The influence of androgen deprivation therapy on dihydrotestosterone levels in the prostatic tissue of patients with prostate cancer. Clin Cancer Res 2004; 10: 7121-6.
【非特許文献５】Mizokami A, Koh E, Izumi K, et al. Prostate cancer stromal cells and LNCaP cells coordinately activate the androgen receptor through synthesis of T and DHT from DHEA. Endocrine-related cancer 2009; 16: 1139-55.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記した問題点を解決することを解決すべき課題とした。より詳しくは、新規な機構を有する前立腺癌の治療組成物、特にＣＲＰＣの治療組成物を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、2'-ヒドロキシフラバノンは下記の作用を有することを見出したことを基にして、本発明を完成した。
（１）前立腺癌細胞の増殖の阻害作用
（２）アンドロゲン受容体活性抑制作用
（３）アンドロゲン受容体タンパク質の核内移行阻害作用
（４）アンドロゲン反応性の抑制作用
（５）アンドロゲン受容体の発現阻害作用
【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
「１．2'-ヒドロキシフラバノン又はその誘導体を含むアンドロゲン受容体活性抑制組成物。
２．2'-ヒドロキシフラバノン又はその誘導体を含むアンドロゲン反応性の抑制組成物。
３．2'-ヒドロキシフラバノン又はその誘導体を含むアンドロゲン受容体タンパク質の核内移行阻害組成物。
４．2'-ヒドロキシフラバノン又はその誘導体を含むアンドロゲン受容体の発現阻害組成物。
５．2'-ヒドロキシフラバノン又はその誘導体を含む前立腺癌の予防・治療組成物。
６．前項１〜５のいずれか１に記載の組成物を含む前立腺癌の予防・治療剤。
７．前記前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌である前項５の予防・治療剤。
８．前記前立腺癌は、アンドロゲン合成経路阻害作用を有する前立腺癌治療剤に耐性のある前立腺癌である前項６又は７の予防・治療剤。
９．ドセタキセル抵抗性を示す前立腺癌の再発予防剤である前項５〜８のいずれか１の予防・治療剤。」
【発明の効果】
【００１５】
本発明の前立腺癌の予防・治療組成物は、優れた前立腺癌細胞の増殖抑制効果を示した。さらに、本発明の前立腺癌の予防・治療組成物は、アンドロゲン受容体の感受性の高いＣＲＰＣでも前立腺癌細胞の増殖抑制効果を示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】PC-3、DU145及びLNCaP細胞増殖に対する2'-ヒドロキシフラバノンの効果。  Ａ：5×104のPC-3及びDU145細胞を播種してから24時間後、図中に記載の各濃度の2'-ヒドロキシフラバノンで処理し、細胞数を計測した。培地は2日おきに交換した。  Ｂ：5×104のPC-3又はDU145細胞を6-ウェルプレートに播種後、72時間10 μM 2'-ヒドロキシフラバノン存在下又は非存在下で処理し、さらに、100 μl Annexin-V-FLUOS labeling solutionとインキュベートした。それらの細胞を位相差顕微鏡(左図) 及び蛍光顕微鏡(右図)で解析した。  Ｃ：LNCaP細胞を、図中に記載の各濃度の2'-ヒドロキシフラバノン存在下、0、10nM adione、1 nM テストステロン (T)又は1 nM ＤＨＴで処理した後、4日後に細胞数を計測した。  Ｄ：LNCaP 細胞1×105を6-ウェルプレートに播種した。該細胞を、10 μM 2'-ヒドロキシフラバノン存在下又は非存在下で処理して、さらに72時間後、100 μl Annexin-V-FLUOS labeling solutionでインキュベートした。それらの細胞を位相差顕微鏡(左図) 及び蛍光顕微鏡(右図)で解析した。  Ｅ：LNCaP細胞を播種し、24時間後、図中に記載の各濃度の2'-ヒドロキシフラバノン存在下で20時間、10 nM Adione又は10 nM ＤＨＴで処理した。PSAmRNAの発現レベルをRT-PCRで解析した。「*」は及び「***」は、それぞれ、p<0.05及びp<0.001を示す。
【図２】2'-ヒドロキシフラバノン の前立腺癌細胞のＡＲ活性への効果。  Ａ：LNCaP 細胞にルシフェラーゼレポータープラスミド (pGL3PSAp-5.8) をトランスフェクションしてから24時間後、図中に記載の各濃度の2'-ヒドロキシフラバノン存在下、0、10 nM adione、1 nMテストステロン(T) 又は1 nMＤＨＴで処理し、ルシフェラーゼー活性を計測した。  Ｂ：PC-3 細胞に300 ng pGL3PSAp-5.8と200 ng pSGAR2をトランスフェクションしてから24時間後、これらの細胞を10 μM 2'-ヒドロキシフラバノン 存在下又は非存在下で0、10 nM adione又は1 nMテストステロンで24時間処理し、その後、ルシフェラーゼアッセイを行った。
【図３】PC-3細胞でのadione又はテストステロンからのアンドロゲン生合成。5×104 PC-3 細胞を培養し、24時間後に10 nM adione 又は10 nM テストステロンを培地に添加した。培地の一部を、adione、testosterone及びDHTを測定するために、回収した。
【図４】2'-ヒドロキシフラバノンのPSA、ＡＲmRNA及びＡＲタンパク質発現への効果  Ａ：LNCaP細胞を播種してから24時間後、無添加、10 nM adione、10 nM テストステロン(T)又は10 nM ＤＨＴで処理し、さらに12時間後、細胞を回収して、総RNAを抽出した。ＡＲ、PSA及びGAPDH mRNAの発現レベルを、RT-PCRを使用して確認した。  Ｂ：pSGAR2ベクターをトランスフェクションしたLNCaP細胞又はPC-3細胞を播種し、24時間後、図中に記載の各濃度の2'-ヒドロキシフラバノンで処理し、そしてさらに24時間後回収した。ＡＲとGAPDH タンパク質の発現レベルを、ウェスタンブロット法により確認した。
【図５】ＤＨＴ存在下又は非存在下での、pEGFP-fARをトランスフェクションしたPC-3細胞のＡＲ局在。PC-3細胞にpEGFP-fARベクターをトランスフェクションした後に、GFP融合野生型fARタンパク質を、2'-ヒドロキシフラバノン存在下又は非存在下でのＤＨＴ存在下又は非存在下においてFSX100で観察した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、下記実施例により、「2'-ヒドロキシフラバノンは、前立腺癌細胞の増殖の阻害作用、アンドロゲン受容体活性抑制作用、アンドロゲン受容体タンパク質の核内移行阻害作用及びアンドロゲン反応性の抑制作用」を新規に見出したことに基づいている。
【００１８】
（2'-ヒドロキシフラバノン）
2'-ヒドロキシフラバノンは、下記の構造を有する化合物である。
【００１９】
【化１】
2015199692.tif 000002
【００２０】
（2'-ヒドロキシフラバノン誘導体）
本発明の「2'-ヒドロキシフラバノン誘導体」は、2'-ヒドロキシフラバノンの有する作用（前立腺癌細胞の増殖の阻害作用、アンドロゲン受容体活性抑制作用、アンドロゲン受容体タンパク質の核内移行阻害作用及びアンドロゲン反応性の抑制作用のいずれか１以上の作用）と同等の作用を有し、2'-ヒドロキシフラバノンの塩、溶媒和物、若しくは生理学的に機能性の誘導体を含む構造を意味する。
【００２１】
下記化合物は、2'-ヒドロキシフラバノンと同等の活性（前立腺癌細胞の増殖の阻害作用、アンドロゲン受容体活性抑制作用、アンドロゲン受容体タンパク質の核内移行阻害作用及びアンドロゲン反応性の抑制作用のいずれか１以上の作用）を有すると考えられる。
（１）ナリンゲニン（5,7-ジヒドロキシ-2-(4-ヒドロキシフェニル)クロマン-4-オン）
（２）3'-ヒドロキシフラバノン
（３）4'-ヒドロキシフラバノン
（４）5'-ヒドロキシフラバノン
（５）6'-ヒドロキシフラバノン
（６）7'-ヒドロキシフラバノン
（７）8'-ヒドロキシフラバノン
【００２２】
（アンドロゲン受容体活性抑制組成物）
本発明のアンドロゲン受容体活性抑制組成物は、有効成分として、2'-ヒドロキシフラバノン又はその誘導体を含む。特に、本組成物は、前立腺癌細胞のアンドロゲン受容体活性を抑制する。
【００２３】
（アンドロゲン受容体タンパク質の核内移行阻害組成物）
本発明のアンドロゲン受容体タンパク質の核内移行阻害組成物は、有効成分として、2'-ヒドロキシフラバノン又はその誘導体を含む。特に、本組成物は、前立腺癌細胞のアンドロゲン受容体タンパク質の核内移行を抑制する。
【００２４】
（アンドロゲン受容体の発現阻害組成物）
本発明のアンドロゲン受容体の発現阻害組成物は、有効成分として、2'-ヒドロキシフラバノン又はその誘導体を含む。特に、本組成物は、前立腺癌細胞のアンドロゲン受容体のmRNAの発現を阻害せずに、直接、タンパク質発現を阻害する。
【００２５】
（アンドロゲン反応性の抑制組成物）
本発明のアンドロゲン受容体の発現阻害組成物は、有効成分として、2'-ヒドロキシフラバノン又はその誘導体を含む。特に、本組成物は、前立腺癌細胞のアンドロゲン反応性を抑制する。
【００２６】
（前立腺癌の予防・治療組成物）
本発明の前立腺癌の予防・治療組成物は、有効成分として、2'-ヒドロキシフラバノン又はその誘導体を含む。特に、本発明の前立腺癌の予防・治療組成物は、従来治療が困難であった去勢抵抗性前立腺癌にも効果がある。
さらに、本発明の前立腺癌の予防・治療組成物は、アンドロゲン合成経路阻害作用を有する前立腺癌治療剤に耐性のある前立腺癌の効果及びドセタキセル抵抗性を示す前立腺癌の再発の予防効果を有する。
【００２７】
（組成物の形態・投与）
本発明の組成物は、予防（再発予防も含む）又は治療等の目的に応じて、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、腸溶剤、液剤、注射剤（液剤、懸濁剤）又は遺伝子療法に用いる形態などの各種の形態に、常法にしたがって調製することができる。本発明の前立腺癌の予防・治療組成物は、通常は１種又は複数の医薬用担体を用いて医薬組成物として製造することが好ましい。
本発明の組成物の投与量又は摂取量については、本発明のいずれか１の効果が得られるものであれば特に限定されるものではなく、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状及び他の医薬の使用の有無等）、及び担当医師の判断等に応じて適宜選択される。本発明の前立腺癌の予防・治療組成物は、１日１〜数回に分けて投与又は摂取することができ、数日又は数週間に１回の割合で間欠的に投与又は摂取してもよい。
【００２８】
（前立腺癌の予防・治療剤）
本発明の前立腺癌の予防・治療剤は、上記で説明した組成物を含む。
本発明の前立腺癌の予防・治療剤は、前立腺癌細胞のアンドロゲン受容体活性の抑制作用、前立腺癌細胞のアンドロゲン受容体タンパク質の核内移行の阻害作用及びアンドロゲン受容体タンパク質の発現阻害作用等を有する。
さらに、本発明の前立腺癌の予防・治療剤は、アンドロゲン合成経路阻害作用を有する前立腺癌治療剤に耐性のある前立腺癌の効果及びドセタキセル抵抗性を示す前立腺癌の再発の予防効果を有する。
【００２９】
以下、本発明を、実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
（材料及び方法）
本実施例で使用した材料及び方法は、以下の通りである。
【００３１】
（細胞株と細胞増殖アッセイ）
LNCaP及びDU145 細胞株 (ATCC, Manassas, VA, USA) を、それぞれ、1% ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)及び5%ウシ胎仔血清(FBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で培養した。
PC-3細胞株(ATCC)は、1% P/S (Invitrogen) 及び5% FBSを添加したRPMI-1640で培養した。
5×104細胞を、DMEM-5%チャコールストリップしたウシ胎仔血清(CCS; Thermo Scientific HyClone, UK) を入れた12-ウェルプレートに播種し、さらに、24時間後、該細胞をDMEM-5% CCS 培地において2'-ヒドロキシフラバノン存在下又は非存在下で、エタノール、adione、テストステロン、ＤＨＴのいずれかで処理し、そして、該培地を２日おきに交換した。
それぞれの実験において、細胞を採取し、そして血球計で細胞数を3回計測した。
データは、三回の実験の平均値±標準偏差で示した。
【００３２】
｛逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) 及びウェスタンブロット解析｝
RT-PCRに関し、1×105細胞を、DMEM-5% CCSを含む6-ウェルプレートに播種し、さらに、24時間後、該細胞を2'-ヒドロキシフラバノン存在又は非存在下において、adione有り又は無し、 ＤＨＴ有り又は無しで２４時間処理して、さらに総RNAを抽出した。
細胞からの総RNA抽出並びにＡＲ、前立腺特異抗原(PSA)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)のRT-PCRは、先の報告（Cancer Res 64:765-771, 2004及びEndcor Relat Cancer 16:1139-1155, 2009）を基にして行った。
ウェスタンブロッティング解析に関し、ブラッドフォード法を用いてタンパク質を定量し、そして、同等量のタンパク質を、10%又は12.5%  Ready  Gel  J  (Bio-Rad, Hercules, CA,  USA)で泳動した。膜は、ＡＲ (NH27)及びGAPDH (NovusBiologicals,  Littleton,  CO,  USA)に対するマウスモノクローナル抗体とインキュベートした。マウスモノクローナル又はウサギモノクローナル抗体特異性を持つ西洋ワサビペルオキシダーゼ標識２次抗体を使用し、化学発光剤(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate; Pierce, Rockford, IL, USA) とChemiDoc XRS (Bio-Rad)を用いてタンパク質のバンドを可視化し定量化した。
【００３３】
（組換えプラスミドの構築）
GFP融合全長野生型ＡＲを発現する組換プラスミドpEGFP-fARは、pSGAR2の全長ＡＲcDNA（開始コドンから24 to 3110 bp）をpEGFP-fARに挿入して、構築した。fARcDNAsの挿入部位は、配列分析で確認した。
【００３４】
（ルシフェラーゼアッセイ）
ＡＲの転写活性を確認するため、DMEM-5% CCSを含む12-ウェルプレートにLNCaP又はPC-3 細胞を5×104細胞播種し、24時間後、5.8 kb PSAプロモーターを持つルシフェラーゼレポータープラスミドpGL3PSAp-5.8を0.5 μg Lipofectamine transfection reaction (Invitrogen)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションしてから24時間後、細胞を2'-ヒドロキシフラバノン存在下又は非存在下においてＤＨＴで24時間処理した。処理した細胞を回収し、該細胞をluciferase  lysis  buffer (Promega,  Madison,  WI,  USA)で融解し、ルシフェラーゼ活性を照度計で計測した。LNCaP 細胞中のEGFP-fARを過剰発現させるため、5×104のLNCaP 細胞に0.1 μgのpEGFP-fARと0.4 μgの pGL3PSAp-5.8をトランスフェクションし、その後、細胞を、さらに、adione、ＤＨＴ及び／又は2'-ヒドロキシフラバノンにより24時間処理した。
【００３５】
（アポトーシスアッセイ）
2'-ヒドロキシフラバノンがPCa細胞のアポトーシスを誘導するかどうかを調べるため、Annexin-V-FLUOS  Staining  kit  (Roche,Mannheim,Germany)を製造元のプロトコルに従い、使用した。1×105のLNCaP、 DU145細胞及び5×104のPC-3細胞を、DMEM-5% CCSを含む6-ウェルプレートに播種し、72時間10 μM 2'-ヒドロキシフラバノンで処理した。培地を取り除きそしてPBSで洗浄した後、細胞をpropidium iodideを添加した100 μl Annexin-V-FLUOS labeling solutionで15分間、室温でインキュベートした。染色細胞をFSX100 (Olympus, Tokyo, Japan) 蛍光顕微鏡で観察した。
【００３６】
（LC-MS/MS)
PC-3細胞を、5×104でDMEM-5% CCS培地を含む12-ウェルプレートに播種後、10  nM adione 又は10  nMのテストステロンを、10 μM 2'-ヒドロキシフラバノン存在下又は非存在下、で処理した。次に、該培地を、24時間後に回収した。培地中のadione、テストステロン及びＤＨＴ濃度を、LC-MS/MS (Division of Pharmacological Research, Aska Pharma Medical Co. Ltd., Kawasaki, Japan)で測定した。
【００３７】
（ＡＲ局在の可視化）
PC-3細胞にpEGFP-fARを導入して24時間後、該細胞を24時間10 μM 2'-ヒドロキシフラバノンの存在下又は非存在下の条件で処理した。次に、細胞を10 nM ＤＨＴ存在下又は非存在下で8時間培養し、緑色蛍光タンパク質(GFP) 結合型のfARをFSX100で観察した。
【００３８】
（統計解析）
統計学的有意は、Prism 6.0ソフトウェアを用いて検定した。χ2 検定を、2者間の割合の有意性を評価するために用いた。2グループ間の連続変数の解析には、一元配置分散分析を行い、その後に、Fisher's PLSDを行った。図中の「*」、「**」及び「***」は、それぞれ、 p<0.05、p<0.01及びp<0.001を意味する。 
【実施例２】
【００３９】
（2'-ヒドロキシフラバノンのPCa細胞増殖への効果の確認）
2'-ヒドロキシフラバノンがPCa細胞増殖を阻害するかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００４０】
2'-ヒドロキシフラバノン のPCa細胞増殖に対する効果を確認するために、アンドロゲン非依存性であるPC-3細胞及びDU145細胞、並びにアンドロゲン感受性細胞であるLNCaP 細胞を2'-ヒドロキシフラバノンで処理した。
図１Ａから明らかなように、PC-3 細胞とDU145 細胞の増殖は、2'-ヒドロキシフラバノンにより用量依存的に抑制された。特に、10 μM 2'-ヒドロキシフラバノンは、PC-3 細胞とDU145 細胞増殖を、それぞれ、コントロールの22%と31%までに阻害した。
PC-3 細胞とDU145 細胞の増殖阻害は、2'-ヒドロキシフラバノンによるアポトーシスであるかどうかを確認するために、アネキシン V染色を行った。
72時間2'-ヒドロキシフラバノン処理したPC-3 細胞は、Annexin-V-FLUOSでよく染色されたので、アポトーシスの誘導を確認した。一方で、2'-ヒドロキシフラバノンを入れなかったPC-3 細胞は緑色蛍光が確認できなかった。DU145 細胞も同様の結果が得られた（図１Ｂ）。
図１Ｃから明らかなように、10 μM 2'-ヒドロキシフラバノンは、アンドロゲン非存在（コントロール）と比較して、59%まで増殖阻害をしたが、この阻害効果はPC-3 や DU145 細胞よりも低かった。LNCaP細胞は、PC-3やDU145 細胞とは異なり、10 μM 2'-ヒドロキシフラバノンではAnnexin-V-FLUOS染色を確認できなかった。つまり、LNCaP細胞では10 μM  2'-ヒドロキシフラバノンによるアポトーシスの誘導がなかった（図１Ｄ）。しかし、2'-ヒドロキシフラバノンは、10 nM adione を添加したLNCaP 細胞の増殖刺激作用を用量依存的に抑制した。10 μM の2'-ヒドロキシフラバノンは、該増殖刺激作用を基底レベルにまで抑制した。興味深いことに、1 nMテストステロン又は1 nMＤＨＴによるLNCaP細胞増殖刺激も、2'-ヒドロキシフラバノンによって阻害された。これにより、2'-ヒドロキシフラバノンは、LNCaP細胞のテストステロン合成阻害をしたわけではなく、テストステロン及びＤＨＴによる細胞増殖刺激を阻害した。
次に、2'-ヒドロキシフラバノンのPSA（前立腺特異抗原）発現に対する効果を調べた。LNCaP細胞を、2'-ヒドロキシフラバノン存在下又は非存在下において、10 nM adione又は1 nM ＤＨＴで処理した。図１Ｅから明らかなように、PSA mRNAの基底値に変化は見られないが、2'-ヒドロキシフラバノン はadione及びＤＨＴによるPSA mRNA発現の誘導を用量依存的に抑制した。これらの結果は、2'-ヒドロキシフラバノンがアンドロゲン合成に影響を与えずに、LNCaP細胞のアンドロゲン反応性を抑制したことを示した。
【実施例３】
【００４１】
（2'-ヒドロキシフラバノンによるアンドロゲン誘導性PSAプロモーター活性抑制の確認）
2'-ヒドロキシフラバノンは、PCa細胞のアンドロゲン誘導性PSAプロモーター活性を抑制するかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００４２】
2'-ヒドロキシフラバノンのＡＲ活性に対する効果をさらに確認するために、LNCaP細胞にpGL3PSAp-5.8をトランスフェクションし、ルシフェラーゼアッセイを行った。pGL3PSAp-5.8は、アンドロゲン類誘導性PSAプロモーターによりルシフェラーゼを発現するプラスミドである。図２Ａで明らかなように、10 μM 2'-ヒドロキシフラバノンはPSAプロモーター活性の基底値には影響を及ぼさなかった。
しかし、2'-ヒドロキシフラバノンは、pGL3PSAp-5.8をトランスフェクションしたLNCaP 細胞において、10 nM  adione、1  nM  テストステロン又は1 nM  ＤＨＴによって誘導されるPSA プロモーター活性を用量依存的に抑制した。さらに、10 μM の2'-ヒドロキシフラバノンは、これらの誘導をPSA プロモーター活性の基底値まで抑えた。
LNCaP 細胞のＡＲ遺伝子はコドン 877に変異があるので、この変異は2'-ヒドロキシフラバノンによる抑制と関係している可能性がある。この可能性を排除するために、PC-3 細胞に野生型ＡＲ 発現プラスミド(pSGAR2)をトランスフェクションし、2'-ヒドロキシフラバノンの効果を調べた（図２Ｂ）。野生型ＡＲ存在下での10 nM adione又は1 nM テストステロンにより誘導されるPSAプロモーター活性は、10 μM 2'-ヒドロキシフラバノンにより抑制された。つまり、この抑制は、「2'-ヒドロキシフラバノンは培地のアンドロゲン濃度とは関係なく、直接ＡＲ 活性に影響を及ぼすこと」を示している。
【実施例４】
【００４３】
（2'-ヒドロキシフラバノンによるPCa細胞のHSD17B及び5α-レダクターゼ活性への影響の確認）
2'-ヒドロキシフラバノンは、PCa細胞のHSD17B及び5α-レダクターゼ活性に影響を与えるかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００４４】
2'-ヒドロキシフラバノンが、テストステロン、ＤＨＴ、adioneによって引き起こされるＡＲ活性を抑制したことから、2'-ヒドロキシフラバノンは細胞培養の培地のアンドロゲン濃度に対して影響を及ぼすかを確認した。
PC-3 細胞を、10 μM 2'-ヒドロキシフラバノン存在又は非存在下において、10 nM adione 又は10 nM テストステロンで処理し、24時間後、LC-MS/MSで培地内のadione、テストステロン及びＤＨＴの濃度を測定した。
2'-ヒドロキシフラバノンは、adione添加条件下ではテストステロン及びＤＨＴの濃度変化を起さず、同様にテストステロン添加条件下ではＤＨＴの濃度変化を起さなかった。つまり、2'-ヒドロキシフラバノンは、in vitroではHSD17B 及び5α-レダクターゼ活性に影響を及ぼさないことを示している（図３）。
【実施例５】
【００４５】
（2'-ヒドロキシフラバノンはＡＲmRNAではなくＡＲタンパク質の発現を阻害していることの確認）
2'-ヒドロキシフラバノンは、ＡＲmRNAの発現ではなく、ＡＲタンパク質の発現を阻害していることを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００４６】
2'-ヒドロキシフラバノンのＡＲ活性阻害のメカニズムを明らかにするため、LNCaP細胞のＡＲmRNA発現レベルを調べた。2'-ヒドロキシフラバノンは、PSAの発現やadione、testosterone、ＤＨＴによって誘導される他のアンドロゲン感受性遺伝子群の発現を抑制したが、ＡＲmRNAの発現に変化を与えなかった（図４Ａ）。
次に、2'-ヒドロキシフラバノンがＡＲタンパク質の発現に影響を与えるかどうかを調べた。ウェスタンブロット解析より、2'-ヒドロキシフラバノンがLNCaP細胞のＡＲタンパクを用量依存的に下方制御していることが分かった（図４Ｂ）。加えて、SV40 プロモーターをもつpSGAR2をトランスフェクションしたPC-3 細胞での外因性ＡＲの発現レベルは、同様に、2'-ヒドロキシフラバノン添加によって抑制された。
【実施例６】
【００４７】
（ＡＲの核局在性の確認）
ＡＲは、通常、アンドロゲン非存在下では細胞質に局在しており、アンドロゲン存在下では核内に移行することが知られている。そこで、2'-ヒドロキシフラバノンがＡＲ局在に影響を与えるかどうかを調べた。
GFPタンパク質融合型全長ＡＲを発現するpEGFP-fARプラスミドをPC-3 細胞にトランスフェクションし、2'-ヒドロキシフラバノン存在下又は非存在下でＡＲの核局在性を確認した。
ＤＨＴ非存在下で細胞質に局在しているGFP-fARタンパク質は、ＤＨＴ存在下で8時間以内に核へと移行した（参照：図５）。しかし、このＡＲから核への移行は、2'-ヒドロキシフラバノン存在下では阻害され、ＤＨＴ存在下でも細胞質にとどまり続けた。
【００４８】
（総論）
本実施例では、以下のことを確認した。
（１）2'-ヒドロキシフラバノンは、アンドロゲン非依存性のPCa細胞増殖をアポトーシスにより抑えた。すなわち、本発明の組成物は、前立腺癌の予防・治療効果を有する。
（２）2'-ヒドロキシフラバノンは、テストステロン及びＤＨＴ誘導性のアンドロゲン反応性を抑制した。なお、2'-ヒドロキシフラバノンは、アンドロゲン合成系に影響を与えなかった。すなわち、本発明の組成物は、アンドロゲン反応性の抑制効果を有する。
（３）2'-ヒドロキシフラバノンは、アンドロゲン受容体タンパク質の核内移行を阻害した。すなわち、本発明の組成物は、アンドロゲン受容体タンパク質の核内移行阻害効果を有する。
（４）2'-ヒドロキシフラバノンは、PCa細胞でアンドロゲン受容体タンパク質を減少させることでアンドロゲン受容体活性を抑制した。すなわち、本発明の組成物は、アンドロゲン受容体活性抑制効果及びアンドロゲン受容体の発現阻害効果を有する。
（５）本発明の前立腺癌の予防・治療組成物は、去勢抵抗性前立腺癌の効果及びドセタキセル抵抗性を示す前立腺癌の再発の予防効果を有する。詳しくは以下の通りである。
アンドロゲン受容体経路は、前立腺癌の細胞増殖の主な原因であることから、進行性前立腺癌患者への内科的去勢術として、ＡＤＴが用いられる。しかしながら、PCaは最終的にＡＤＴへの反応性を失い、いわゆる去勢抵抗性前立腺癌へと進行する。ＡＲ 経路は、ホルモン感受性PCaから去勢抵抗性前立腺癌に移行する過程にも強く関与していることが知られている。すなわち、本発明の前立腺癌の予防・治療組成物は、アンドロゲン受容体活性抑制を有するので、去勢抵抗性前立腺癌に効果がある。
また、ＡＤＴ開始後、血清中テストステロンは5%以下に減少するが、PCaはいくつかのメカニズムにより血清中低テストステロンに適応してしまう。重要な因子として副腎アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（DHEA）が知られている。DHEAは、テストステロンへと代謝され、PCa組織内で5α-レダクターゼにより、ジヒドロテストステロン (ＤＨＴ) へと変換され、ＡＲを活性化することが知られている。事実、PCa組織のＤＨＴ濃度は治療前の20-40 %であることが報告されている。上皮細胞と間質細胞の相互作用は、PCa組織内のＤＨＴ産生に大きくかかわっていることが知られている。去勢後、間質細胞と上皮細胞において、副腎アンドロゲンのDHEAは、協調的に、ＤＨＴに代謝される。さらに、プレグネノロンからDHEAへの変換を阻害するCYP17A阻害剤（abiraterone acetate とTAK-700）は、ドセタキセル治療後の70% 以上の去勢抵抗性前立腺癌で有効である。これらの結果（知見）は、ＡＲ経路はドセタキセル抵抗性を示す前立腺癌の再発に関与していると考えられる。すなわち、本発明の前立腺癌の予防・治療組成物は、アンドロゲン受容体活性抑制を有するので、ドセタキセル抵抗性を示す前立腺癌の再発の予防剤になる。
以上により、果物や野菜に含まれる天然産物である2'-ヒドロキシフラバノンは、PCa細胞の増殖を抑制し、さらに、アンドロゲン受容体タンパク質を下方制御することでアンドロゲン抵抗性を示す。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明によれば、新規な前立腺癌、特に去勢抵抗性前立腺癌の予防・治療組成物を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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