(57)【要約】【課題】鱗翅目昆虫への感染率の高いウイルス接種方法を提供する。【解決手段】鱗翅目昆虫へのウイルス接種方法であって、ウイルスを腹部後方に接種することを特徴とする接種方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鱗翅目昆虫へのウイルス接種方法であって、ウイルスを鱗翅目昆虫の腹部後方に接種することを特徴とする接種方法。
【請求項２】
前記鱗翅目昆虫がカイコであることを特徴とする請求項１に記載のウイルス接種方法。
【請求項３】
前記鱗翅目昆虫がカイコであり、第６節（星状紋）より後部に接種することを特徴とする請求項１に記載のウイルス接種方法。
【請求項４】
前記カイコが５齢であることを特徴とする請求項２又は３に記載のウイルス接種方法。
【請求項５】
ウイルスを含む薬液を自動的にかつ定量的に注射器に送る自動注射装置がついた注射器を用いて注射針を前記鱗翅目昆虫の体に刺し、予め定めた一定量の薬液を体内に注入することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のウイルス接種方法。
【請求項６】
前記自動注射装置が、ペリスタリックポンプ、ダイアフラムポンプ、コギールポンプ、プランジャーポンプ又はディスペンサーとそれに接続された注射器とを有していることを特徴とする請求項５に記載のウイルス接種方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カイコやヨトウガなど鱗翅目昆虫の体液中でインターフェロン等の有用物質を生産するために元となる遺伝子組換えウイルス等を鱗翅目昆虫に感染させるための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カイコ等の鱗翅目昆虫の幼虫やその培養細胞を用いて有用タンパク質を生産する技術が研究されており、該技術を用いて動物薬の生産も行われている。これらの昆虫や昆虫細胞を用いる方法としては、核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）をベクターとして用いる方法が一般的である。鱗翅目昆虫の一例としてカイコがあるが、カイコを用いることは、カイコが大腸菌や酵母と比べて遺伝的に動物に近いものであるため、産生有用物質の活性や抗原性の点等から好ましい。またカイコは２０００年以上にわたり養蚕に利用されており、人畜に対する病原性は知られておらず、家畜化されているため、室外では生存できないのでバイオハザードの面でも有利である。また卵から一ヶ月程度で体重が１万倍にも増加し、生産性が優れている。このようなカイコを用いた手法では、カイコ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）の有する多角体遺伝子を他の有用タンパク質をコードする遺伝子に置き換えて組換えウイルスを調製し、これを５齢カイコ幼虫に接種して感染させ、４〜６日後に組換えウイルスが増殖するにつれてカイコ幼虫細胞内に産生された有用物質を、カイコを切開して体液を採取して精製する方法が一般的である。カイコに組換えウイルスを接種する方法としては、小型ポンプを利用して接種液を送りながら連続する方法（特許文献１）や、スポイトを用いて空気圧で接種する方法（特許文献２）が提案されている。またカイコ体液中のプロテアーゼで有用タンパク質が分解されるのを防ぐ目的で蛹の段階のカイコに接種する方法（特許文献３）がある。
【０００３】
特許文献１や２の方法では一定量で連続的に接種を行うことが可能であるが、接種部位が頭部に近い場合、中腸内のプロテアーゼが影響してウイルスに感染しない個体が発生し、有用タンパク質の産生が安定しない。また特許文献３の方法ではプロテアーゼの影響を防ぐため、蛹の状態で接種することが提案されているが、蛹の場合、通常の状態では繭に覆われ、作業効率が悪い。また裸蛹系統のカイコを使用するとしても飼育が難しく必要量確保することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−５１７４２号公報
【特許文献２】特開平１１−１６９１６４号公報
【特許文献３】特開平９−２１５４９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、かかる従来技術の背景に鑑み、有用タンパク質の産生を安定させ、作業効率の良い、カイコなど鱗翅目昆虫の感染率の高いウイルス接種方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、前記課題を解決するために以下の構成をとる。
【０００７】
第１の発明は、鱗翅目昆虫へのウイルス接種方法であって、ウイルスを鱗翅目昆虫の腹部後方に接種することを特徴とする接種方法である。
【０００８】
第２の発明は、前記鱗翅目昆虫がカイコであることを特徴とする。
【０００９】
第３の発明は、前記鱗翅目昆虫がカイコであり、第６節（星状紋）より後部に接種することを特徴とする。
【００１０】
第４の発明は、前記カイコが５齢であることを特徴とする。
【００１１】
第５の発明は、ウイルスを含む薬液を自動的にかつ定量的に注射器に送る自動注射装置がついた注射器を用いて注射針を前記鱗翅目昆虫の体に刺し、予め定めた一定量の薬液を体内に注入することを特徴とする。
【００１２】
第６の発明は、前記自動注射装置が、ペリスタリックポンプ、ダイアフラムポンプ、コギールポンプ、プランジャーポンプ又はディスペンサーとそれに接続された注射器とを有していることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ウイルスを接種したときのカイコなど鱗翅目昆虫の感染率（感染頭数／接種頭数×100）が95%以上と高くなる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明における実施の形態を示す概念図
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、鱗翅目昆虫へのウイルス接種方法であって、ウイルスを鱗翅目昆虫の腹部後方に接種することを特徴とする接種方法である。
【００１６】
本発明において、鱗翅目昆虫とは、分類群がチョウ目の昆虫類であり、いわゆるチョウやガであり、カイコ等があげられる。
【００１７】
本発明において、ウイルスとしては、例えばカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（ＢｍＮＰＶ  ＤＮＡ）に有用タンパク質の遺伝子を組み込んだ組換えウイルスがあげられる。組換えウイルスの調製は常法にしたがって行うことができる。例えば、有用タンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを作製し、ベクターであるカイコ核多角体病ウイルスとコトランスフェクションすることによって組換えウイルスを調製することができる。
【００１８】
本発明方法により生産される有用タンパク質の例としては、ウロキナーゼなどの酵素類、インシュリンなどのホルモン類、インターフェロン（α、β、γ）などのサイトカイン類などをあげることができる。
【００１９】
鋭意検討した結果、鱗翅目昆虫の腹部後方にウイルスを接種すると、ウイルスの感染率が上がることを見出した。ここで、腹部後方とは、腹部の中心より後方である。接種場所を、腹部後方とすると、中腸より離れた場所なので、プロテアーゼの影響が小さく、ウイルスの感染率が上がるものと推定される。
【００２０】
また、カイコの場合、特に、第６節（星状紋）より後部に接種すると、ウイルスの感染率が顕著に上がることも見出した。すなわち、５齢のカイコに組換えウイルスを接種する際、接種場所を、中腸より離れた場所であり、プロテアーゼの影響が小さい腹部後方、カイコの場合、第６節（星状紋）より後部に限定することによって、ウイルスの感染率が上がり、有用タンパク質の産生を安定させることができることを見出した。なお、カイコ体内へ接種する針の深さを３mm以内とするのがより好ましい。
【００２１】
５齢カイコへの組換えウイルス接種は、ウイルス液を微量接種する方法で行うことができる。接種時にカイコ体内へ接種する針の深さは、一般的な二段針などを用いて３mm以内とし、ウイルスの接種量は、使用する組換えウイルスの種類、産生させる有用タンパク質の種類により調節することが好ましい。
【００２２】
自動注射装置がついた注射器を用いて注射針を前記鱗翅目昆虫の体に刺し、予め定めた一定量の薬液を体内に注入することが好ましい。
【００２３】
自動注射装置とは、薬液を自動的にかつ定量的に注射器に送る装置であり、自動注射装置は、ペリスタリックポンプ、ダイアフラムポンプ、コギールポンプ、プランジャーポンプ又はディスペンサーとそれに接続された注射器とを有していることが好ましい。
【００２４】
ウイルス接種の時期は、昆虫の大きさと感染期間確保の面から、安定した産生量を得るためには、５齢１〜２日目が好ましい。組換えウイルスを接種した後は、目的タンパク質が最も蓄積されるまで飼育を行う。飼育時の温度、湿度は一定にすることが有用タンパク質の生産安定化につながるが、その条件は、用いるウイルスや有用タンパク質の種類によって異なるため、実験的に定めることが好ましい。例えば、組換えウイルスとしてカイコ核多角体病ウイルスを使用して、インターフェロンを生産する場合は、５齢４〜６日まで、温度２０〜３０℃、湿度５９〜６９%の条件で飼育することが適当である。
【００２５】
また目的タンパク質は、カイコを切開して体液を回収、精製することによって得ることができる。回収・精製手段としては、遠心分離やクロマトグラフィーなど各種分離手段を使用することができる。
【実施例】
【００２６】
本発明の実施例を以下に示すが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
（実施例１）
注射針を付けた注射器に”テフロン”（登録商標）チューブを付けたペリスタリックポンプを接続し、ポンプのチューブの先に、核多角体病ウイルスにネコインターフェロンの生産をつかさどるＤＮＡを組み込んだ遺伝子組換えウイルス液を入れた容器を設置した。飼育容器（３００頭）毎に、カイコの接種場所を第６節から第７節まで変えて、注射針を刺して遺伝子組換えウイルス液をカイコの体に注入して接種し、接種場所の違いによる感染率の違いを比較した。これを２回実施した。第６節以後に接種した場合は、感染率が９８％となった（表１）。
（比較例１）
注射針を付けた注射器に”テフロン”（登録商標）チューブを付けたペリスタリックポンプを接続し、ポンプのチューブの先に、核多角体病ウイルスにネコインターフェロンの生産をつかさどるＤＮＡを組み込んだ遺伝子組換えウイルス液を入れた容器を設置した。飼育容器（３００頭）毎に、カイコの接種場所を第２節から第５節まで変えて、注射針を刺して遺伝子組換えウイルス液をカイコの体に注入して接種し、接種場所の違いによる感染率の違いを比較した。これを２回実施した。表２に示すように、腹部の中心より後方でない、第２節から第５節に接種した場合は、感染率が８３〜９２％であり、実施例１と比較して明らかに感染率が低くなっていた（表２）。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明による鱗翅目昆虫への接種方法は、インターフェロン等の有用タンパク質を安定生産する方法として用いられる。
【符号の説明】
【００３０】
１  ペリスタリックポンプ
２  プラスチックチューブ
３  薬液容器
４  注射器
５  カイコ
６  飼育容器
７  注射針
８  スイッチ
９  自動注射装置
１０  星状紋
１１  第２節
１２  第３節
１３  第４節
１４  第５節
１５  第６節
１６  第７節
１７  第８節
【図１】
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