(57)【要約】      （修正有）【課題】インボルクリンの発現を抑制する、インボルクリン発現抑制剤及びくせ毛改善剤の提供。【解決手段】下記式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物を有効成分とするインボルクリン発現抑制剤。2015178471.tif 000020【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
【化１】
2015178471.tif 000014
〔式中、Ｒ1は下記（ａ）〜（ｅ）で示される何れかの基（式中、実線と破線からなる二重線は単結合又は二重結合を示す）を示し、
【化２】
2015178471.tif 000015
Ｒ２は水素原子又は水酸基を示し、Ｘ及びＹは、Ｘがメチル基でＹが基−ＣＨ２ＯＨを示すか、ＸとＹが一緒になって基−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−を示す。〕
で表されるラブダン型ジテルペン化合物を有効成分とするインボルクリン発現抑制剤。
【請求項２】
下記式（１）：
【化３】
2015178471.tif 000016
〔式中、Ｒ1は下記（ａ）〜（ｅ）で示される何れかの基（式中、実線と破線からなる二重線は単結合又は二重結合を示す）を示し、
【化４】
2015178471.tif 000017
Ｒ２は水素原子又は水酸基を示し、Ｘ及びＹは、Ｘがメチル基でＹが基−ＣＨ２ＯＨを示すか、ＸとＹが一緒になって基−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−を示す。〕
で表されるラブダン型ジテルペン化合物を有効成分とするくせ毛改善剤。
【請求項３】
下記式（２）：
【化５】
2015178471.tif 000018
〔式中、Ｒ1ａは下記（ｃ）又は（ｄ）で示される基を示し、
【化６】
2015178471.tif 000019
Ｒ２は水素原子又は水酸基を示す。〕
で表されるラブダン型ジテルペン化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インボルクリン発現抑制剤及びくせ毛改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インボルクリンは、表皮角化細胞の分化にしたがって有棘細胞で産生されるタンパク質で、角質細胞の細胞膜を裏打ちする強靭な不溶性膜であるコーニファイドエンベロープ（角質肥厚膜、cornified envelope：以下ＣＥとも略記する）の主構成要素の１つである（非特許文献１）。ＣＥは、インボルクリンをはじめとする複数のＣＥ前駆体タンパク質が、酵素トランスグルタミナーゼにより架橋され不溶化して形成される。さらに、ＣＥを構成するインボルクリンは、その一部にセラミド等の脂質が共有結合し、疎水的な構造をとることで細胞間脂質ラメラ構造の形成にも寄与している（非特許文献２）。こうしたＣＥの形成・成熟化によって、細胞間脂質のラメラ構造が安定化して角質層のバリア機能が正常に働き、皮膚の水分保持機能や外部からの刺激に対する抵抗性を高めることができる。
【０００３】
また最近、本出願人は、毛髪形状と毛髪毛根部における各種遺伝子の遺伝子発現との関係を探索したところ、非くせ毛者の毛根部に比して、くせ毛者の毛根部において、インボルクリン（IVL）遺伝子の発現量が有意に増加しており、インボルクリンの発現を制御することにより、くせ毛を抑制したり、促進できることを報告している（特許文献１）。
【０００４】
一方、アンドログラフォリド（Andrographolide）やアンドログラパニン（Andrograpanin）は、キツネノマゴ科植物であるセンシンレン（Andrographis paniculata）やヒルムシロ科植物であるオヒルムシロ（Potamogeton natans L.）に含まれているラブダン型ジテルペン類であり、抗炎症作用（特許文献２）や、害虫防御作用（特許文献３）があることが報告されている。
しかしながら、これらのラブダン型ジテルペン類にインボルクリン発現抑制作用やくせ毛改善作用があることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０４３３３０号
【特許文献２】特許５３４７０９号公報
【特許文献３】特開平１０−１２０５１０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Steinert, PM. Et al., J. Biol. Chem., 270(30), p17702-17711 (1995)
【非特許文献２】Nemes, Z., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(15), p8402-8407 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、インボルクリンの発現を抑制する、インボルクリン発現抑制剤、くせ毛改善剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、インボルクリンの発現抑制について検討したところ、下記式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物に優れたインボルクリン発現抑制作用があり、これがインボルクリン発現抑制、くせ毛の改善のための成分又は素材として有用であることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記の１）〜２）に係るものである。
１）下記式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物を有効成分とするインボルクリン発現抑制剤。
２）下記式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物を有効成分とするくせ毛改善剤。
【００１０】
【化１】
2015178471.tif 000002
【００１１】
〔式中、Ｒ1は下記（ａ）〜（ｅ）で示される何れかの基（式中、実線と破線からなる二重線は単結合又は二重結合を示す）を示し、
【化２】
2015178471.tif 000003
【００１２】
Ｒ２は水素原子又は水酸基を示し、Ｘ及びＹは、Ｘがメチル基でＹが基−ＣＨ２ＯＨを示すか、ＸとＹが一緒になって基−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−を示す。〕
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、インボルクリンの発現抑制作用を有し、くせ毛を改善するための化粧品、医薬品、医薬部外品、或いはこれらに使用される原料又は素材を提供できる。したがって、本発明によれば、インボルクリンの発現を抑制して、くせ毛の改善が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ラブダン型ジテルペン化合物の分画例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、「インボルクリン発現抑制」とは、インボルクリンの遺伝子レベルでの発現抑制及びタンパク質レベルでの発現抑制の何れをも包含する意味である。前記遺伝子レベルでの発現抑制はｍＲＮＡへの転写抑制を含み、前記タンパク質レベルでの発現抑制とは、例えば、翻訳における抑制を含み、翻訳後に修飾される場合は、当該修飾の抑制も含むものである。
【００１６】
一般式（１）中、Ｒ１としては、Ｘがメチル基でＹが基−ＣＨ２ＯＨである場合、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｅ）であるのが好ましく、インボリクリン発現抑制の点から、（ａ）としては、更に以下の（ａ−１）〜（ａ−４）であるのが好ましく、（ａ−１）であるのがより好ましい。また、（ｅ）としては、（ｅ−１）であるのがより好ましい。
【００１７】
【化３】
2015178471.tif 000004
【００１８】
ＸとＹが一緒になって基−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−である場合には、Ｒ１としては、下記（ｃ）又は（ｄ）であるのが好ましい。ＸとＹが一緒になって基−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−である化合物は、文献未記載の新規化合物である。
【００１９】
【化４】
2015178471.tif 000005
【００２０】
Ｒ２としては、水素原子であるのが好ましい。
【００２１】
式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物このうち、インボリクリン発現抑制の点から、より好適な化合物として下記のものを例示できる。
【００２２】
【化５】
2015178471.tif 000006
【００２３】
本発明の式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物においては、ｄ体−、ｌ体−等の光学異性体が存在し得る。本発明においては、当該各異性体の混合物や単離されたものの何れをも包含する。
【００２４】
本発明の式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物は、それを含む植物体から抽出・精製することにより取得することができる。例えば、ヒルムシロ科ヒルムシロ属の植物（例えば、オヒルムシロ（Potamogeton natans））、キツネノマゴ科植物（例えば、センシンレン（Andrographis paniculata））等の植物やベニクスノキダケ（Antrodia comphorata）から溶剤抽出して得られる抽出物を、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を用いて分離・精製することにより得ることができる（例えば、１) Phytochemistry 56 (2001) 469-473、２）J. Nat. Prod. 2006, 69, 689-691)。以下に、本発明のラブダン型ジテルペン化合物の単離例を示す。
【００２５】
１）オヒルムシロ全草の乾燥物を細断し、５０ｖｏｌ％ＥｔＯＨで室温抽出し、オヒルムシロ５０％ＥｔＯＨ抽出物とする。
２）この抽出物を用い、水および酢酸エチルを用いて分配した。分層後、水層をダイヤイオンＨＰ２０を充填したカラムに通液し、吸着した成分を１０，３０，５０，９９．５％ＥｔＯＨで順次溶出する。このうち９９．５％ＥｔＯＨ溶出画分と先の酢酸エチル層を合わせて減圧濃縮する。
３）これを８０％ＭｅＯＨおよびヘキサン各５００ｍＬを用いて分配する。分層後、８０％ＥｔＯＨ層に水を加え、６０％ＭｅＯＨ溶液に濃度調整した後、クロロホルムを加えて再び分配する。
４）分層後、クロロホルム層を減圧濃縮し、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画し、活性画分１を得る。当該画分を、ＯＤＳカラムを備えた分取ＨＰＬＣにて７つの画分（１ａ〜１ｇ）に分け（図１参照）、このうち一つの活性画分（１ｅ）を用い、分取ＨＰＬＣで９つの画分（１ｅ−１〜１ｅ−９）に分け、活性成分（１ｅ−２＜化合物１＞，１ｅ−７＜化合物２＞）を単離することができる。
５）また、別の活性画分（１ｆ）について、同様に７つの画分（１ｆ−１〜１ｆ−７）に分け、活性成分（１ｆ−５＜化合物３；アンドログラパニン＞）を得ることができる。
【００２６】
尚、斯かる抽出・分画によれば、式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物が、単独のみならず、数種の混合物として取得される場合があるが、本発明のインボリクリン発現抑制剤及びくせ毛改善剤においては、これらの何れをも用いることができる。
【００２７】
得られたラブダン型ジテルペン化合物は、そのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、あるいは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、水・エタノール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００２８】
後記実施例で示すとおり、本発明の式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物は、遺伝子レベル及びタンパク質レベルで、インボルクリンの発現を抑制する。前述したように、くせ毛者の毛根部においては、非くせ毛者の毛根部に比してインボルクリン（IVL）遺伝子の発現量が有意に増加しており、インボルクリンの発現を抑制することにより、くせ毛を改善することができると考えられる（前記特許文献1参照）。
【００２９】
よって、本発明の式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物は、インボルクリン発現抑制剤又はくせ毛改善剤となり得、また、インボルクリン発現抑制剤又はくせ毛改善剤を製造するために使用することができる。また、ヒトに使用して、インボルクリンの発現抑制又はくせ毛の改善を図ることができる。ここで、ヒトに対する使用は、治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
【００３０】
ここで、「くせ毛」とは、特に説明がなければ、直毛と対比する場合に直毛以外の形状を総括的に指し、「くせ毛を改善する」とは、くせ毛のカール半径や曲率を低減し、形質を直毛に近づけることをいう。
【００３１】
本発明のインボルクリン発現抑制剤又はくせ毛改善剤は、それ自体、インボルクリン発現抑制及びくせ毛改善のための、化粧品、医薬品、医薬部外品であり得、又はインボルクリン発現抑制及びくせ毛改善のための、化粧品、医薬品、医薬部外品を製造するための原料又は素材であり得る。
【００３２】
本発明の式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物を含む、化粧品、医薬品、医薬部外品等の各種製剤組成物の形態は、皮膚外用剤、具体的には、軟膏、乳化化粧料、クリーム、乳液、ローション、ジェル、エアゾール等の種々の形態で用いることができるが、とりわけヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアトリートメント、ヘアローション、ヘアパック、ヘアクリーム、コンディショニングムース、ヘアムース、ヘアスプレー、シャンプー、リーブオントリートメント等の形態とするのが好ましい。
上記製剤組成物は、それぞれ一般的な製造法により、式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物を製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、色素、香料等とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの製剤組成物には、式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物の他、夫々化粧品、医薬部外品、医薬品等の製剤の種類に応じて、適宜、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗炎症剤、抗菌剤、清涼剤、抗脂漏剤等の薬効成分を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
【００３３】
当該製剤組成物中の式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物の含有量は、一般的に好ましくは０．０００５質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上、且つ好ましくは５０質量％以下、より好ましく２０質量％以下であり、また好ましくは０．０００５〜５０質量％、より好ましくは０．０００１〜２０質量％である。
【００３４】
上記医薬品、医薬部外品の投与量は、本発明の効果が得られる量であれば特に限定されず、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日、式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物として、例えば好ましくは０．０１ｍｇ以上、より好ましくは０．０３ｍｇ以上であり、且つ好ましくは６００ｍｇ以下、より好ましくは１５００ｍｇである。また、好ましくは０．０１〜１５００ｍｇ、より好ましくは０．０３〜６００ｍｇである。また、当該製剤は、任意の摂取・投与計画に従って摂取・投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数カ月間継続して投与することが好ましい。
また、上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用対象者としては、それを必要としていれば特に限定されないが、インボルクリンの発現抑制、くせ毛改善を目的とするヒトが好ましい。
【００３５】
上述した実施形態に関し、本発明においてはさらに以下の態様が開示される。
＜１＞下記式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物を有効成分とするインボルクリン発現抑制剤。
＜２＞下記式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物を有効成分とするくせ毛改善剤。
＜３＞下記式（２）で表されるラブダン型ジテルペン化合物。
【００３６】
＜４＞インボルクリン発現抑制剤を製造するための、下記式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物の使用。
＜５＞くせ毛改善剤を製造するための、下記式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物の使用。
＜６＞インボルクリン発現抑制に使用するための、下記式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物。
＜７＞くせ毛改善に使用するための、下記式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物。
＜８＞下記式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物を用いるインボルクリン発現抑制方法。
＜９＞下記式（１）で表されるラブダン型ジテルペン化合物を用いるくせ毛改善方法。
＜１０＞非治療的である＜８＞又は＜９＞の方法。
＜１１＞使用が非治療的な使用である＜５＞又は＜６＞の化合物。
【００３７】
【化６】
2015178471.tif 000007
【００３８】
〔式中、Ｒ1は下記（ａ）〜（ｅ）で示される基（式中、実線と破線からなる二重線は単結合又は二重結合を示す）を示し、
【化７】
2015178471.tif 000008
【００３９】
Ｒ２は水素原子又は水酸基を示し、Ｘ及びＹは、Ｘがメチル基でＹが基−ＣＨ２ＯＨを示すか、ＸとＹが一緒になって基−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−を示す。〕
【００４０】
【化８】
2015178471.tif 000009
【００４１】
〔式中、Ｒ1ａは下記（ｃ）又は（ｄ）で示される基を示し、
【化９】
2015178471.tif 000010
Ｒ２は水素原子又は水酸基を示す。〕
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００４２】
製造例１  オヒルムシロ由来のジテルペンの取得
オヒルムシロ（北海道十勝産）全草の乾燥物を細断し、５０ｖｏｌ％ＥｔＯＨで室温１週間抽出した。ろ過後、残渣に５０ｖｏｌ％ＥｔＯＨを加え、再び抽出した。ろ過後、先の抽出液と合わせて濃縮し、オヒルムシロ５０％ＥｔＯＨ抽出物とした。
この抽出物７．０ｇを用い、水および酢酸エチルを用いて分液ロートで振り混ぜ、分配した。分層後、水層をダイヤイオンＨＰ２０を充填したカラムに通液し、吸着した成分を１０，３０，５０，９９．５％ＥｔＯＨで順次溶出した。このうち９９．５％ＥｔＯＨ溶出画分と先の酢酸エチル層を合わせて減圧濃縮し、溶媒を留去して固形物０．７４ｇを得た。これを８０％ＭｅＯＨおよびヘキサン各５００ｍＬを用いて分液ロートで振り混ぜ、分配した。分層後、８０％ＥｔＯＨ層に水を加え、６０％ＭｅＯＨ溶液に濃度調整した後、クロロホルムを加えて再び分液ロートで振り混ぜ、分配した。
分層後、クロロホルム層を減圧濃縮して溶媒を留去し、固形物０．６４ｇを得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画し、活性画分１（１３５ｍｇ）を得た。うち９０ｍｇを用い、ＯＤＳカラムを備えた分取ＨＰＬＣにて７つの画分（１ａ〜１ｇ）に分けたところ、画分１ｄ〜１ｆに活性を認めた（図１参照）。
うち１ｅ画分（１４．３ｍｇ）を用い、分取ＨＰＬＣで９つの画分（１ｅ−１〜１ｅ−９）に分けた結果、１ｅ−２（２．３ｍｇ），１ｅ−７（１．７ｍｇ）を活性成分として単離した。また、１ｆ画分（１４．０ｍｇ）も同様に７つの画分（１ｆ−１〜１ｆ−７）に分けたところ、単一成分として１ｆ−５（３．２ｍｇ）を得た。１ｅ−２で単離された化合物、１ｅ−７で単離された化合物、及び１ｆ−５で単離された化合物を、夫々化合物１、化合物２及び化合物３とし、各化合物の13C NMR  スペクトルデータを表１に示す。尚、化合物３（１ｆ−５）は、アンドログラパニンと同定された。
【００４３】
【表１】
2015178471.tif 000011
【００４４】
実施例１  インボルクリン発現抑制作用
（１）細胞培養
ヒト表皮角化細胞株ＨａＣａＴはドイツ癌研究所（ＤＫＦＺ）より入手し、ＤＭＥＭ（Invitrogen）に非働化した１０％ウシ胎児血清（Invitrogen）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Invitrogen）を添加した培地で３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
【００４５】
（２）定量的RT-PCRによる遺伝子発現解析
６穴プレートに２×１０５個／ｗｅｌｌとなるようにＨａＣａＴ細胞を播種し、２４時間後に製造例１で調製された化合物１、化合物２及び化合物３を所定の濃度で添加した。更に２４時間後に培地を吸引、ＰＢＳで２回洗浄後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（QIAGEN）を用いてメーカーの使用説明書に従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡの濃度を測定し、１μｇを用いてＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＲＴ（QIAGEN）による逆転写反応を実施し、ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを４ｎｇ／μＬに希釈し、評価サンプルとした。調製したｃＤＮＡ  ８ｎｇにＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Applied Biosystems）を１０μＬ、Ｔａｑｍａｎプローブ（Applied Biosystems）を１μＬ、滅菌水を７μＬ添加し、７５００  リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems）を用いてＰＣＲ反応を実施した。内部標準にはＲＰＬＰ０遺伝子を用いた。ＴａｑｍａｎプローブはＩＶＬ：Ｈｓ００８４６３０７＿ｓ１、ＲＰＬＰ０：Ｈｓ９９９９９０２＿ｍ１を使用した。結果を、表２に示す。
【００４６】
【表２】
2015178471.tif 000012
【００４７】
（３）ウエスタンブロッティング
６穴プレートに１×１０５個／ウェルとなるようにＨａＣａＴ細胞を播種し、２４時間後に化合物４（「アンドログラフォリド」＜シグマ・アルドリッチ社製＞；10μＭ）を添加した。４８時間後に培地を吸引、ＰＢＳで２回洗浄後、Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Thermo Scientific）を含むＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒ（Sigma）１５０μＬにて細胞を溶解した。その後、セルスクレーパーにより、細胞を剥離・回収し、遠心して回収した上清を細胞抽出液としてとして評価に用いた。
細胞抽出液の総タンパク質濃度はＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Thermo Scientific）を用いて定量した。細胞抽出液の蛋白質量として５μｇを０．３５Ｍ  ＤＴＴ（sigma）を含むLaemmli Sample Buffer（Bio-Rad）と１：１で混合し、９５℃で５分間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは７．５％  ＴＧＸゲル（Bio-Rad）を用いて定法に従い実施した。ゲルを転写するメンブレンにはメタノールにより親水化したPVDFメンブレン（Bio-Rad）、ブロッティングバッファーにはＴｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／メタノール転写バッファー（Bio-Rad）を用いた。
４℃で一晩転写後、メンブレンを５％スキムミルク溶液／ＰＢＳ−Ｔで室温、２時間ブロッキングした後、抗ＩＶＬ抗体（BTI、BT-651）、抗Ａｃｔｉｎ抗体（SantaCruz）を０．３％スキムミルク／ＰＢＳ−Ｔで１０００倍希釈して室温、２時間反応させた。メンブレンをＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、抗ＩＶＬ抗体に対して、抗ウサギ−ＨＲＰ抗体（NA934VS、GE）、抗Ａｃｔｉｎ抗体に対して、抗ヤギ−ＨＲＰ抗体（岩井化学）を０．３％スキムミルク／ＰＢＳ−Ｔ  で２０００倍希釈して室温、１時間反応させた。反応終了後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（GE）を用いて発光を検出した。各バンドの積算値の算出はＭｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ  Ｖ３．２（FUJIFILM）ソフトウェアを用いた。結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
2015178471.tif 000013
【００４９】
（４）結果
表２、３から明らかなように、化合物１、化合物２及び化合物３には、遺伝子レベルで優れたインボリクリン発現抑制作用が認められ、化合物４にはタンパク質レベルで優れたインボリクリン発現抑制作用が認められた。
【図１】
2015178471.tif 000021