(57)【要約】      （修正有）【課題】標的素材に強固に結合する能力を有するペプチドの提供。【解決手段】ＡＸＰＱＫＸＸＸＸＸＸＳ、ＡＴＧＳＲＭＤＨＮＲＹＩ、ＤＬＬＡＭＨＷＮＴＳＲＱ、ＩＱＡＡＴＶＰＨＶＴＥＳ、ＫＶＫＨＰＳＳＷＡＹＹＡ、又はＳＮＳＩＤＫＶＮＲＰＩＮのアミノ酸配列を含むペプチド。並びに、以下を含む、標的素材に結合し得るペプチドのスクリーニング方法：１）標的素材をファージライブラリに接触させて、ファージ結合標的素材を得る；２）ファージ結合標的素材を回収する；３）ファージ結合標的素材を宿主に導入して、ファージ導入宿主を得る；４）ファージ導入宿主において、ファージを増幅させる；及び５）増幅したファージが発現する、標的素材に結合し得るペプチドを同定する。標的物質が、金属、シリコン、炭素等の素材であり、炭素がカーボンナノチューブやカーボンフォーンであり、金属がチタン特に酸化チタンである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＸＰＱＫＸＸＸＸＸＸＳ（配列番号１）のアミノ酸配列〔Ｘは各々独立してアミノ酸残基を表す〕を含み、かつ標的素材に対する結合活性を有するペプチド。
【請求項２】
Ｘが、各々独立して、式：−ＮＨ−Ｃ（Ｒ）（Ｈ）−ＣＯ−〔式中、Ｒは、水素原子または置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基を表す〕により表されるアミノ酸残基である、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
Ｘが各々独立してグリシン残基またはアラニン残基を表す、請求項１または２記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列が、ＡＹＰＱＫＦＸＸＸＦＭＳ（配列番号２）のアミノ酸配列〔Ｘは各々独立してアミノ酸残基を表す〕である、請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項５】
以下からなる群より選ばれるペプチド：
１）ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＦＭＳ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
２）ＡＡＰＱＫＦＮＮＮＦＭＳ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むペプチド；
３）ＡＹＰＱＫＡＮＮＮＦＭＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
４）ＡＹＰＱＫＦＡＮＮＦＭＳ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むペプチド；
５）ＡＹＰＱＫＦＮＧＮＦＭＳ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むペプチド；
６）ＡＹＰＱＫＦＮＮＡＦＭＳ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むペプチド；
７）ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＡＭＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むペプチド；
８）ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＦＡＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むペプチド；
９）ＡＴＧＳＲＭＤＨＮＲＹＩ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１０）ＤＬＬＡＭＨＷＮＴＳＲＱ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１１）ＩＱＡＡＴＶＰＨＶＴＥＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１２）ＫＶＫＨＰＳＳＷＡＹＹＡ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１３）ＳＮＳＩＤＫＶＮＲＰＩＮ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１４）配列番号３〜１５のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列において１個または２個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、標的素材に対する結合活性を有する、ペプチド；ならびに
１５）配列番号３〜１５のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、標的素材に対する結合活性を有する、ペプチド。
【請求項６】
標的素材が無機素材である、請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項７】
無機素材がチタン金属またはチタン化合物である、請求項６記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドとタンパク質との融合タンパク質。
【請求項９】
内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分、ならびに標的物質に結合し得るペプチド部分および請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドの部分を含む、融合タンパク質。
【請求項１０】
内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分がＤｐｓである、請求項９記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
標的物質が、金属素材、シリコン素材または炭素素材である、請求項９または１０記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
炭素素材がカーボンナノ素材である、請求項１１記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
融合タンパク質の多量体であって、
内腔を有し、
融合タンパク質が、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分、ならびに標的物質に結合し得るペプチド部分および請求項１〜７のいずれか一項記載のペプチドの部分を含む、多量体。
【請求項１４】
複合体であって、
請求項１３記載の多量体、ならびに標的物質およびチタンを含み、
標的物質が、前記融合タンパク質中の標的物質に結合し得るペプチド部分に結合し、かつチタンが、前記融合タンパク質中の標的素材に対する結合活性を有するペプチドの部分に結合している、複合体。
【請求項１５】
請求項８〜１２のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項１８】
形質転換体がエシェリヒア・コリである、請求項１７記載の形質転換体。
【請求項１９】
以下を含む、標的素材に結合し得るペプチドのスクリーニング方法：
１）標的素材をファージライブラリに接触させて、ファージ結合標的素材を得ること；
２）ファージ結合標的素材を回収すること；
３）ファージ結合標的素材および宿主を用いて、ファージ導入宿主を調製すること；
４）ファージ導入宿主において、ファージを増幅させること；および
５）増幅したファージが発現する、標的素材に結合し得るペプチドを同定すること。
【請求項２０】
回収したファージ結合標的素材の洗浄後に、ファージ導入宿主を調製する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記１）〜４）のサイクルを複数回繰り返した後に、前記５）の工程を行う、請求項１９または２０記載の方法。
【請求項２２】
標的素材がナノ素材である、請求項１９〜２１のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チタン結合ペプチド、融合タンパク質およびその多量体、複合体、ならびに標的素材に結合し得るペプチドのスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体素材および無機素材または有機素材の複合体を作製し、その複合体を半導体メモリや太陽電池などの高性能な電子デバイスやインプラントやバイオセンサーなどの医療素材へと応用することを目的として、無機素材または有機素材に対して結合し得るペプチドが、ファージを用いたスクリーニングにより開発されている（特許文献１および２）。すなわち、標的となる素材に結合する能力を有するペプチドを得るために、様々な配列のアミノ酸配列からなるペプチドを提示した１０９から１０１０種類のファージライブラリを、標的となる素材でコーティングされた試験管表面や粒子などと緩衝液中で混合することで結合させる。その試験管や粒子を、低濃度の界面活性剤を含む緩衝液で洗浄することで、標的への結合力の弱いペプチドを提示したファージを洗い流す。その後、酸や高濃度の界面活性剤を含む緩衝液で標的素材を洗浄することで、標的素材へ結合していたファージを剥離、回収する。そのファージが提示しているペプチド配列を特定することで、標的素材への結合力を持つペプチドを得る。このような手法を用いて無機物や炭素素材に結合する能力を有するペプチドとして、例えば、酸化チタン（特許文献３、ならびに非特許文献１〜５）、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）およびカーボンナノホン（ＣＮＨ）（特許文献４および５、ならびに非特許文献６）、金（非特許文献７）、酸化亜鉛（非特許文献８）、酸化ゲルマニウム（非特許文献９）、ならびに硫化亜鉛および硫化カドミウム（非特許文献１０）などを認識するペプチドが取得されている。
【０００３】
ところで、酸化チタンは、光を受けることで、光エネルギーによりその表面に還元力を有する電子と酸化力を有する正孔を発生する。その酸化力や還元力を利用することで、抗菌素材や脱臭素材、大気浄化素材、防汚性素材、水素発生触媒、太陽電池などへの応用が試みられている（非特許文献１１）。例えば、光によって酸化チタン表面に発生した酸化力を使って水酸化物イオンを酸化すれば、強い酸化力を有するラジカルを発生させることができ、そのラジカルは、その酸化力により殺菌効果やアセトアルデヒドやアンモニアなどの臭い物質の分解効果、空気中のＮＯｘやホルムアルデヒドなど有害物質の分解効果、そして埃などを分解する効果を高めることができる。また、発生した酸化還元力を用いて水を電気分解し、酸素と水素を発生させ、水素をクリーンなエネルギーとして利用することも試みられている。さらに、光によって酸化チタン内に発生した電子を取り出すことで、太陽電池としても利用することができる。
現在までに、酸化チタン認識ペプチドと融合された金属内包性タンパク質フェリチンを利用して、シリコン基板上にナノ粒子を配置し、そのナノ粒子の上に酸化チタン膜または酸化シリコン膜を形成させ、その酸化膜の上にナノ粒子を配置することによる、酸化膜とナノ粒子とを積層する技術が知られている（特許文献６）。さらに、酸化チタンと融合された金属内包性タンパク質フェリチンを利用して、コバルトや酸化鉄の金属ナノ粒子を内包するタンパク質をチタンで描かれたパターンの上に配向させた例も報告されている（非特許文献１２）。
【０００４】
また、炭素結晶構造であるＣＮＴやＣＮＨなどのナノ黒鉛構造物は、その電気特性や構造から他のナノ素材との複合体を構築することで電子素材や触媒、光素材および医療技術などへの応用が期待されており、ナノ黒鉛構造物と金属ナノ粒子を結合させナノ複合体を構築する技術としてＣＮＨ結合ペプチドと融合したフェリチンを用いた加工方法が報告されている（非特許文献６、および特許文献５）。
【０００５】
さらに、ＣＮＴ結合ペプチドおよび酸化チタン結合ペプチドが融合した３５個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを用いることで、ＣＮＴ表面を酸化チタンで被膜し、ＣＮＴの電気特性を変化させる技術も報告されている（非特許文献１３）。あるいは、ＣＮＴ結合ペプチドと酸化チタン結合ペプチドが融合したタンパク質やウイルスを用いてカーボンナノチューブを酸化チタンでコーティングし、ナノ複合素材を合成する技術（非特許文献１１および１４）報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５８６６３６３号明細書
【特許文献２】米国特許第５４０３４８４号明細書
【特許文献３】国際公開第２００５／０１００３１号
【特許文献４】国際公開第２００６／０６８２５０号
【特許文献５】特開２００４−１２１１５４号公報
【特許文献６】国際公開第２００６／１２６５９５号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋ．Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００５，ｖｏｌ．２１．ｐ．３０９０．
【非特許文献２】Ｍ．Ｂ．Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，２００８，ｖｏｌ．２０．ｐ．１５７８．
【非特許文献３】Ｙ．Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｓｃｉ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｍｅｄ．，２０１０，ｖｏｌ．２１．ｐ．１１０３．
【非特許文献４】Ｃ．Ｖｒｅｕｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１０，ｖｏｌ．１０４．ｐ．１０１３
【非特許文献５】Ｙ．Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００８，ｖｏｌ．１８．ｐ．３８７１
【非特許文献６】Ｓ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，２００３，ｖｏｌ．２，ｐ．１９６．
【非特許文献７】Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，ｖｏｌ．１５．ｐ．２６９．
【非特許文献８】Ｋ．Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｂｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，ｖｏｌ．６６．ｐ．１０．
【非特許文献９】Ｍ．Ｂ．Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４，ｖｏｌ．１５．ｐ．１７７６．
【非特許文献１０】Ｃ．Ｅ．Ｆｌｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００３，ｖｏｌ．１３．ｐ．２４１４．
【非特許文献１１】Ｍ．Ａ．Ｆｏｘ  ａｎｄ  Ｍ．Ｔ．Ｄｕｌａｙ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１９９３，ｖｏｌ．９３，ｐ．３４１．
【非特許文献１２】Ｋ．Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，２００７，ｖｏｌ．７．ｐ．３２００．
【非特許文献１３】Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０．
【非特許文献１４】Ｉ．Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１１，ｖｏｌ．４７．ｐ．１２６４９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
生体分子素材の持つ自己組織化能力と無機物析出能力の両方を活用することで、機能性を持つ構造や無機素材と有機素材を組み合わせた複合素材を構築できる。しかしながら、そのような機能性素材の合成に利用できるペプチドの種類は少ない。上述したような、ファージを用いたペプチドのスクリーニング手法は、標的素材でコーティングされた固相に結合したファージを剥離して回収しているため、標的素材への結合活性が高いペプチドを提示し、変性剤で容易に剥離させることのできない程度に標的素材に強固に結合したファージを回収することは難しかった。それ故、上述した従来のスクリーニング手法により得られるペプチドの標的素材への結合力は充分に強くはなく、任意の標的素材（例、有機素材、酸化チタン等の無機素材）と強固に結合する能力を有するペプチドを作製することは難しかった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意検討した結果、標的素材に強固に結合する能力を有するペプチドをスクリーニングする技術を開発すること、およびそのようなペプチドを実際に取得することに成功し、もって本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ＡＸＰＱＫＸＸＸＸＸＸＳ（配列番号１）のアミノ酸配列〔Ｘは各々独立してアミノ酸残基を表す〕を含み、かつ標的素材に対する結合活性を有するペプチド。
〔２〕Ｘが、各々独立して、式：−ＮＨ−Ｃ（Ｒ）（Ｈ）−ＣＯ−〔式中、Ｒは、水素原子または置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基を表す〕により表されるアミノ酸残基である、〔１〕のペプチド。
〔３〕Ｘが各々独立してグリシン残基またはアラニン残基を表す、〔１〕または〔２〕のペプチド。
〔４〕配列番号１のアミノ酸配列が、ＡＹＰＱＫＦＸＸＸＦＭＳ（配列番号２）のアミノ酸配列〔Ｘは各々独立してアミノ酸残基を表す〕である、〔１〕〜〔３〕のいずれかのペプチド。
〔５〕以下からなる群より選ばれるペプチド：
１）ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＦＭＳ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
２）ＡＡＰＱＫＦＮＮＮＦＭＳ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むペプチド；
３）ＡＹＰＱＫＡＮＮＮＦＭＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
４）ＡＹＰＱＫＦＡＮＮＦＭＳ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むペプチド；
５）ＡＹＰＱＫＦＮＧＮＦＭＳ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むペプチド；
６）ＡＹＰＱＫＦＮＮＡＦＭＳ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むペプチド；
７）ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＡＭＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むペプチド；
８）ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＦＡＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むペプチド；
９）ＡＴＧＳＲＭＤＨＮＲＹＩ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１０）ＤＬＬＡＭＨＷＮＴＳＲＱ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１１）ＩＱＡＡＴＶＰＨＶＴＥＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１２）ＫＶＫＨＰＳＳＷＡＹＹＡ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むペプチド；  
１３）ＳＮＳＩＤＫＶＮＲＰＩＮ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１４）配列番号３〜１５のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列において１個または２個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、標的素材に対する結合活性を有する、ペプチド；ならびに
１５）配列番号３〜１５のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、標的素材に対する結合活性を有する、ペプチド。
〔６〕標的素材が無機素材である、〔１〕〜〔５〕のいずれかのペプチド。
〔７〕無機素材がチタン金属またはチタン化合物である、〔６〕のペプチド。
〔８〕〔１〕〜〔７〕のいずれかのペプチドとタンパク質との融合タンパク質。
〔９〕内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分、ならびに標的物質に結合し得るペプチド部分および〔１〕〜〔７〕のいずれかのペプチドの部分を含む、融合タンパク質。
〔１０〕内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分がＤｐｓである、〔９〕の融合タンパク質。
〔１１〕標的物質が、金属素材、シリコン素材または炭素素材である、〔９〕または〔１０〕の融合タンパク質。
〔１２〕炭素素材がカーボンナノ素材である、〔１１〕の融合タンパク質。
〔１３〕融合タンパク質の多量体であって、
内腔を有し、
融合タンパク質が、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分、ならびに標的物質に結合し得るペプチド部分および〔１〕〜〔７〕のいずれかのペプチドの部分を含む、多量体。
〔１４〕複合体であって、
〔１３〕の多量体、ならびに標的物質およびチタンを含み、
標的物質が、前記融合タンパク質中の標的物質に結合し得るペプチド部分に結合し、かつチタンが、前記融合タンパク質中のチタン結合ペプチドの部分に結合している、複合体。
〔１５〕〔８〕〜〔１２〕のいずれかの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１６〕〔１５〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔１７〕〔１６〕の発現ベクターを含む形質転換体。
〔１８〕形質転換体がエシェリヒア・コリである、〔１７〕の形質転換体。
〔１９〕以下を含む、標的素材に結合し得るペプチドのスクリーニング方法：
１）標的素材をファージライブラリに接触させて、ファージ結合標的素材を得ること；
２）ファージ結合標的素材を回収すること；
３）ファージ結合標的素材および宿主を用いて、ファージ導入宿主を調製すること；
４）ファージ導入宿主において、ファージを増幅させること；および
５）増幅したファージが発現する、標的素材に結合し得るペプチドを同定すること。
〔２０〕回収したファージ結合標的素材の洗浄後に、ファージ結合標的素材を宿主に導入する、〔１９〕の方法。
〔２１〕前記１）〜４）のサイクルを複数回繰り返した後に、前記５）の工程を行う、〔１９〕または〔２０〕の方法。
〔２２〕標的素材がナノ素材である、〔１９〕〜〔２１〕のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のペプチドは、例えば、チタン結合剤または析出剤として、タンパク質の精製用タグとして、または本発明の融合タンパク質、多量体または複合体の作製に有用である。
本発明の融合タンパク質、多量体または複合体は、例えば、電気特性および／または光触媒活性の向上した新規デバイスの作製、ならびに医療、バイオ研究分野等の分野に有用である。例えば、酸化チタンに結合し得るペプチド部分およびカーボンナノチューブに結合し得るペプチド部分を含む融合タンパク質の使用により、抗菌素材、脱臭素材、大気浄化素材、防汚性素材、水素発生装置、太陽電池、半導体などの提供が可能になる。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、標的素材に強固に結合する能力を有するペプチドの効率的な同定に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、化学合成されたＳＴ１ペプチドとｍｉｎＴＢＰ１ペプチドの見かけ上の結合定数（ｋｂｏｓ）とペプチド濃度の関係を示す図である。
【図２】図２は、各チタン結合ペプチドを提示した変異タンパク質が析出させたチタン化合物量の比較を示す図である。
【図３】図３は、各チタン結合ペプチドが提示された変異タンパク質によるチタン化合物析出の経時変化を示す図である。
【図４】図４は、各チタン結合ペプチドが提示された変異タンパク質のチタン化合物析出活性を示す図である。
【図５】図５は、各チタン結合ペプチドが提示された変異タンパク質のＱＣＭチタンセンサーへの結合を示す図である。
【図６】図６は、各チタン結合ペプチドが提示された変異タンパク質のチタン結合定数を示す図である。
【図７】図７は、ＣＤＴＳ１とＣＮＴの複合体のＴＥＭ像を示す図である。
【図８】図８は、チタン化合物で被膜されたＣＮＴ／ＣＤＴＳ１複合体のＴＥＭ像を示す図である。
【図９】図９は、ＥＥＬＳマッピングによるＣＮＴ／ＣＤＴＳ１／Ｔｉ複合体の組成分析を示す図である。ＴＥＭは通常の電子顕微鏡像を示す。「Ｃａｒｂｏｎ」は炭素原子、「Ｔｉｔａｎｉｕｍ」はチタン原子、「Ｉｒｏｎ」は鉄原子、がそれぞれ確認された位置を示す。
【図１０】図１０は、各変異ペプチドを提示したＤｐｓのチタンセンサーへの結合量比較を示す図である。ＳＴ１：Ｄｐｓ−ＳＴ１、Ｄｐｓ：Ｄｐｓ、Ａ１Ｇ：Ｄｐｓ−ＳＴ１−１Ｇ、Ｙ２Ａ：Ｄｐｓ−ＳＴ１−２Ａ、Ｐ３Ａ：Ｄｐｓ−ＳＴ１−３Ａ、Ｑ４Ａ：Ｄｐｓ−ＳＴ１−４Ａ、Ｋ５Ａ：Ｄｐｓ−ＳＴ１−５Ａ、Ｆ６Ａ：Ｄｐｓ−ＳＴ１−６Ａ、Ｎ７Ａ：Ｄｐｓ−ＳＴ１−７Ａ、Ｎ８Ｇ：Ｄｐｓ−ＳＴ１−８Ｇ、Ｎ９Ａ：Ｄｐｓ−ＳＴ１−９Ａ、Ｆ１０Ａ：Ｄｐｓ−ＳＴ１−１０Ａ、Ｍ１１Ａ：Ｄｐｓ−ＳＴ１−１１Ａ、Ｓ１２Ａ：Ｄｐｓ−ＳＴ１−１２Ａ、をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ペプチドを提供する。本発明のペプチドは、例えば、生物学的手法により作製することができ、また、有機化学的方法により合成することができる。本発明のペプチドは、単離および／または精製されていてもよい。本発明のペプチドは、人工ペプチドであり得る。
【００１４】
一実施形態では、本発明のペプチドは、ＡＸＰＱＫＸＸＸＸＸＸＳ（配列番号１）のアミノ酸配列〔Ｘは各々独立してアミノ酸残基を表す〕を含み、かつチタン結合活性を有するペプチドである。
【００１５】
配列番号１のアミノ酸配列におけるＸは、各々独立して、アミノ酸残基を表す。本発明において、Ｘにより表されるアミノ酸残基は、ペプチドがチタン結合活性を保持する限り、特に限定されない。アミノ酸残基は、例えば、式：Ｒ−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨにより表すことができる。Ｒとしては、例えば、水素原子、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシル；好ましくは置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキル基）、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルケニル基（例、エテニル、プロペニル）、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルキニル基（例、エチニル、プロピニル）、置換されていてもよいＣ３〜Ｃ８シクロアルキル基（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル）、置換されていてもよいＣ６〜Ｃ１０アリール基（例、フェニル、ナフチル）、置換されていてもよい複素環基（例、ピロリル、ピリジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリダジニル、インドリル等の、少なくとも１個の窒素原子を環構成原子として含有する一員または二員の複素環基；フラニル、イソオキサゾリル、ベンゾフラニル等の、少なくとも１個の酸素原子を環構成原子として含有する一員または二員の複素環基；チオフェニル、イソチアゾリル、チアゾリル等の、少なくとも１個の硫黄原子を環構成原子として含有する一員または二員の複素環基）、ハロゲン原子（例、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、ヒドロキシル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルオキシ基、オキソ基、チオール基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルチオール基、アミノ、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、アミノカルボニル基、基、オキソ基、チオール基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルチオール基、アミノ、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルでモノまたはジ置換されたアミノカルボニル基、ホルミル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルカルボニル基、カルボキシル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルオキシカルボニル基、ホルミルオキシ基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキルカルボニルオキシ基、ヒドラジノ基が挙げられる。置換されていてもよい基（例、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基）とは、無置換の基、または置換基で置換された基を表す。このような置換基としては、例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル基、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、複素環基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、オキソ基、チオール基、アミノ基、アミノカルボニル基、ホルミル基、カルボキシル基、ヒドラジノ基が挙げられる。
【００１６】
一実施形態では、Ｘにより表されるアミノ酸残基は、天然タンパク質を構成する通常のＬ−α−アミノ酸の残基であってもよい。したがって、Ｘにより表されるアミノ酸残基は、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−アスパラギン（Ｎ）、Ｌ−システイン（Ｃ）、Ｌ−グルタミン（Ｑ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ）、Ｌ−メチオニン（Ｍ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ−プロリン（Ｐ）、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）、Ｌ−バリン（Ｖ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アルギニン（Ｒ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、またはＬ−リジン（Ｋ）、あるいはグリシン（Ｇ）の残基である。好ましくは、Ｘにより表されるアミノ酸残基は、中性アミノ酸の残基であってもよい。中性アミノ酸としては、例えば、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、および非極性側鎖を有するアミノ酸（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）が挙げられる。
【００１７】
好ましい実施形態では、ＡＸＰＱＫＸＸＸＸＸＸＳ（配列番号１）のアミノ酸配列〔Ｘは各々独立してアミノ酸残基を表す〕は、ＡＹＰＱＫＦＸＸＸＦＭＳ（配列番号２）のアミノ酸配列〔Ｘは各々独立してアミノ酸残基を表す〕であってもよい。Ｘとしては、例えば、上述したアミノ酸残基が挙げられる。
【００１８】
別の好ましい実施形態では、Ｘにより表されるアミノ酸残基は、上記式においてＲにより表される側鎖が水素原子であるアミノ酸残基、または上記式においてＲにより表される側鎖が置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基であるアミノ酸残基であってもよい。
【００１９】
本発明では、標的素材に対する結合活性とは、後述する標的素材に結合する能力をいう。標的素材は、好ましくは無機素材であり、より好ましくは金属であり、さらにより好ましくはチタンである。本発明では、用語「チタン」は、チタン金属（Ｔｉ）およびチタン化合物を包含する表現として用いられる。チタン化合物としては、例えば、チタンの酸化物、硫化物、炭酸化物、砒化物、塩化物、フッ化物およびヨウ化物、ならびにチタンの金属間化合物が挙げられるが、好ましくはチタンの酸化物である。チタンの酸化物としては、例えば、一酸化チタン（ＣＡＳ番号１２１３７−２０−１）、二酸化チタン（ＣＡＳ番号１３４６３−６７−７）、二酸化チタン（アナタース、アナターゼ：ＣＡＳ番号１３１７−７０−０）、二酸化チタン（ルチル：ＣＡＳ番号１３１７−８０−２）、三酸化二チタン（ＣＡＳ番号１３４４−５４−３）が挙げられる。チタン結合活性の程度は、チタンに結合する能力を保持する限り特に限定されないが、例えば、ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＦＭＳ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるペプチドのチタン結合活性の約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上または同等以上であってもよい。チタン結合活性の程度は、例えば、実施例に記載されるような水晶マイクロバランス振動法（ＱＣＭ）により決定することができる。
【００２０】
金属および／または金属化合物に結合し得るペプチドは、金属化合物の析出（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）活性を有し得ることが知られている（Ｋ．Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．、Ｍ．Ｕｍｅｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，２００５，ｖｏｌ．１７，ｐ．２５７１．）。したがって、チタン等の金属に対する結合活性を有するペプチドは、チタン等の金属の化合物の析出活性を有していてもよい。金属に対する析出活性の程度は、金属を析出させる能力を保持する限り特に限定されないが、例えばチタンを例に挙げて説明すると、チタン化合物析出活性の程度は、ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＦＭＳ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるペプチドのチタン化合物析出活性の約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上または同等以上であってもよい。チタン化合物析出活性の程度は、例えば、実施例５に記載されるような経時的な吸光度（例、６６０ｎｍの吸光度）の測定に基づき決定することができる。
【００２１】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下からなる群より選ばれるペプチドであってもよい：
１）ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＦＭＳ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
２）ＡＡＰＱＫＦＮＮＮＦＭＳ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むペプチド；
３）ＡＹＰＱＫＡＮＮＮＦＭＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
４）ＡＹＰＱＫＦＡＮＮＦＭＳ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むペプチド；
５）ＡＹＰＱＫＦＮＧＮＦＭＳ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むペプチド；
６）ＡＹＰＱＫＦＮＮＡＦＭＳ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むペプチド；
７）ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＡＭＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むペプチド；
８）ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＦＡＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むペプチド；
９）ＡＴＧＳＲＭＤＨＮＲＹＩ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１０）ＤＬＬＡＭＨＷＮＴＳＲＱ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１１）ＩＱＡＡＴＶＰＨＶＴＥＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１２）ＫＶＫＨＰＳＳＷＡＹＹＡ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むペプチド；  
１３）ＳＮＳＩＤＫＶＮＲＰＩＮ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１４）配列番号３〜１５のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列において１個または２個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、チタン結合活性を有する、ペプチド；ならびに
１５）配列番号３〜１５のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、チタン結合活性を有する、ペプチド。
チタン結合活性は、上述したとおりである。
【００２２】
上述した１４）のペプチドにおいて、置換、付加または挿入されるアミノ酸残基は、式：−ＮＨ−Ｃ（Ｒ）（Ｈ）−ＣＯ−により表される上述したアミノ酸残基であってもよいが、好ましくは、上述した通常のＬ−α−アミノ酸である。
【００２３】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有する塩基性アミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有する酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性側鎖を有する中性アミノ酸〔例、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、および非極性側鎖を有するアミノ酸（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）〕、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００２４】
上述した１５）のペプチドにおいて、配列番号３〜１５のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、配列番号３〜１５のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列に対して、好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上または９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であってもよい。
【００２５】
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性（例、同一性または類似性）は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の相同性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
【００２６】
本発明のペプチドは、例えば、チタン結合剤または析出剤として、タンパク質の精製用タグとして、または本発明の融合タンパク質、多量体または複合体の作製に有用である。
【００２７】
本発明はまた、本発明のペプチドとタンパク質との融合タンパク質を提供する。本発明において、用語「タンパク質」は、ペプチド（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）を包含する表現であり、用語「タンパク質」および「ペプチド」は交換可能に使用される。本発明のペプチドと融合されるタンパク質としては、任意のタンパク質を用いることができ、例えば、精製が意図されるタンパク質、多量体を形成し得るタンパク質（例、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質）が挙げられる。タンパク質に対する本発明のペプチドの融合は、タンパク質のＮ末端部またはＣ末端のいずれか一方または双方で行われる。本発明のペプチドは、改良されたファージディスプレイ法により得られたペプチドである。ファージディスプレイ法は、外来ＤＮＡをファージのコートタンパク質をコードする遺伝子中に挿入し、その外来ＤＮＡの産物をコートタンパク質との融合タンパク質としてファージ粒子表面に提示させる方法である。したがって、このような手法により取得された本発明のペプチドは、タンパク質と融合された状態において、その機能を発揮できることが実証されている。また、このようなペプチドは、タンパク質と融合していない状態でもその機能を発揮できる。
【００２８】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分、ならびに標的物質に結合し得るペプチド部分および本発明のペプチドの部分を含んでいてもよい。
【００２９】
用語「内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分」とは、内部に空間を有する多量体を、ポリペプチド部分の会合によって、形成する能力を有するポリペプチド部分をいう。このようなポリペプチド部分としては、幾つかのタンパク質が知られている。例えば、このようなポリペプチド部分としては、内腔を有する２４量体を形成し得るフェリチン、および内腔を有する多量体を形成し得るフェリチン様タンパク質が挙げられる。内腔を有する多量体を形成し得るフェリチン様タンパク質としては、例えば、内腔を有する１２量体を形成し得るＤｐｓ（ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｓｔａｒｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ）が挙げられる。Ｄｐｓは、分子量約１８ｋＤａの単量体単位からなる１２量体を形成することにより、約５ｎｍの直径の内腔を有する外径９ｎｍからなるかご状構造を形成し、この内腔中に、鉄分子を酸化鉄ナノ粒子として貯蔵できる。さらに、フェリチンでは、鉄以外にも、ベリリウム、ガリウム、マンガン、リン、ウラン、鉛、コバルト、ニッケル、クロムなどの金属の酸化物、また、セレン化カドミウム、硫化亜鉛、硫化鉄、硫化カドミウムなどの半導体・磁性体などのナノ粒子を人工的に貯蔵させられることが示されており、半導体素材工学分野や医療分野での応用研究が盛んにおこなわれている（Ｉ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０１０，ｖｏｌ．１８００，ｐ．８４６．）。内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分は、微生物、植物および動物等の任意の生物に由来する、天然に生じるタンパク質であっても、または天然に生じるタンパク質の変異体であってもよい。以下、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分を、単にポリペプチド部分と称する場合がある。
【００３０】
一実施形態では、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分は、Ｄｐｓである。本発明で用いられる用語「Ｄｐｓ（ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｓｔａｒｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ）」とは、上述したような、内腔を有する１２量体を形成し得るタンパク質をいう。用語「Ｄｐｓ」には、天然に生じるＤｐｓまたはその変異体が含まれる。天然に生じるＤｐｓの変異体としては、天然に生じるＤｐｓと同様に、１２量体を形成したときに、そのＮ末端部およびＣ末端部が１２量体の表面に露出し得るものが好ましい。なお、Ｄｐｓは、それが由来する細菌の種類によってはＮａｐＡ、バクテリオフェリチン、ＤｌｐまたはＭｒｇＡと称呼される場合があり、また、Ｄｐｓには、ＤｐｓＡ、ＤｐｓＢ、Ｄｐｓ１、Ｄｐｓ２等のサブタイプが知られている（Ｔ．Ｈａｉｋａｒａｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｃ．Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｎ，  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，２０１０  ｖｏｌ．６７，ｐ．３４１を参照）。したがって、本発明では、用語「Ｄｐｓ」は、これらの別名で称呼されるタンパク質も含むものとする。Ｄｐｓについてはまた、国際公開第２０１２／０８６６４７号公報を参照することができる。
【００３１】
Ｄｐｓが由来し得る微生物としては、Ｄｐｓを産生する微生物である限り特に限定されないが、例えば、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、エスケリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、サーモシネココッカス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびデイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ならびにコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が挙げられる。
【００３２】
リステリア属に属する細菌としては、例えば、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）が挙げられる。スタフィロコッカス属に属する細菌としては、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ）が挙げられる。バチルス属に属する細菌としては、例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。ストレプトコッカス属に属する細菌としては、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス  スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）が挙げられる。ビブリオ属に属する細菌としては、例えば、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）が挙げられる。エスケリシア属に属する細菌としては、例えば、エスケリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が挙げられる。ブルセラ属に属する細菌としては、例えば、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  Ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）が挙げられる。ボレリア属に属する細菌としては、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）が挙げられる。マイコバクテリウム属に属する細菌としては、例えば、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）が挙げられる。カンピロバクター属に属する細菌としては、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）が挙げられる。サーモシネココッカス属に属する細菌としては、例えば、サーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  Ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）が挙げられる。デイノコッカス属に属する細菌としては、例えば、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  Ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）が挙げられる。パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属  に属する細菌としては、例えば、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）が挙げられる。コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が挙げられる。
【００３３】
好ましい実施形態では、Ｄｐｓは、リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓのアミノ酸配列に対して７０％以上の類似性パーセントを示すアミノ酸配列からなるタンパク質であり得る。リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓのアミノ酸配列に対する、Ｄｐｓのアミノ酸配列の類似性パーセントは、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であり得る。Ｄｐｓは、二次構造として、５箇所のα−ヘリックス部分を有する（Ａ．Ｉｌａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２０００，Ｖｏｌ．７，ｐ．３８．、Ｒ．Ａ．Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．１９９８，Ｖｏｌ  ５，ｐ．２９４．、およびＲ．Ｒ．Ｃｒｉｃｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｖｏｌ．１８００，ｐ．７０６.を参照）。Ｄｐｓの機能の保持の観点からは、上記二次構造の維持が重要である。したがって、例えば、リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓのアミノ酸配列に対して７０％以上の類似性パーセントを示すアミノ酸配列からなるタンパク質を作製する場合、上記二次構造が維持されるように、部位特異的変異誘発法等の周知の変異導入法により所望の変異が導入され得る。リステリア・イノキュアに由来するＤｐｓを例に挙げて、配列番号９７のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置と、上記二次構造等との間の関係を、Ｎ末端側から具体的に説明すると、以下のとおりである：（ｉ）１〜８位のアミノ酸残基（１２量体表面上に露出しているＮ末端領域）；（ｉｉ）９〜３３位のアミノ酸残基（α−ヘリックス）；（ｉｉｉ）３９〜６６位のアミノ酸残基（α−ヘリックス）；（ｉｖ）７５〜８１位のアミノ酸残基（α−ヘリックス）；（ｖ）９５〜１２２位のアミノ酸残基（α−ヘリックス）；（ｖｉ）１２６〜１４９位のアミノ酸残基（α−ヘリックス）；（ｖｉｉ）１５０〜１５６位のアミノ酸残基（１２量体表面上に露出しているＣ末端領域）。ここで、内腔を有する多量体を形成する能力の保持には、上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうち、（ｉｉ）〜（ｖｉ）が重要であり得る。ＤｐｓのＮ末端部の１２量体表面上への露出には、ＤｐｓのＮ末端部に隣接するα−ヘリックスが１２量体の外側に向いている必要があることから、（ｉ）および（ｉｉ）、特に（ｉｉ）が重要であり得る。ＤｐｓのＣ末端部の１２量体表面上への露出には、ＤｐｓのＣ末端部に隣接するα−ヘリックスが１２量体の外側に向いている必要があることから、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）、特に（ｖｉ）が重要であり得る。したがって、上述した重要な領域中に存在するアミノ酸残基を変異させる場合には、保存的アミノ酸置換が好ましい。一方、上述した重要な領域以外の領域中に存在するアミノ酸残基を変異させる場合には、任意の変異が導入され得る。当業者は、これらの指針に基づき、天然に生じるＤｐｓに対して、その機能が保持されるような所望の変異を導入することにより、天然に生じるＤｐｓの変異体を容易に作製できる。
【００３４】
アミノ酸配列において変異を導入すべきアミノ酸残基の位置は、上述したとおり当業者に明らかであるが、配列アライメントをさらに参考にして、天然に生じるＤｐｓの変異体を作製してもよい。具体的には、当業者は、１）複数のＤｐｓのアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、上述した二次構造情報単独でも、Ｄｐｓのアミノ酸配列において変異を導入すべき位置を特定でき、また、二次構造情報および配列アライメント情報を併用して、Ｄｐｓのアミノ酸配列において変異を導入すべきアミノ酸残基の位置を特定できる。
【００３５】
一実施形態では、リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓのアミノ酸配列に対して７０％以上の類似性パーセントを示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の変異（例、欠失、置換、付加および挿入）を含むアミノ酸配列からなり、かつＤｐｓの機能を保持するタンパク質であり得る。１または数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。Ｄｐｓのアミノ酸残基の変異に関する用語「１または数個」が示す数は、例えば、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１、２、３、４または５個である。アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、上述したような保存的置換であってもよい。
【００３６】
別の実施形態では、リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓのアミノ酸配列に対して７０％以上の類似性パーセントを示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓをコードするヌクレオチド配列（例、配列番号９６または配列番号９８）に対して相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつＤｐｓの機能を保持するタンパク質であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性（例、同一性または類似性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。
【００３７】
特定の実施形態では、Ｄｐｓは、リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓのアミノ酸配列（例、配列番号９７または配列番号９９のアミノ酸配列）に対して７０％以上の同一性パーセントを示すアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。Ｄｐｓのアミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。アミノ酸配列の同一性は、上述のとおり決定することができる。
【００３８】
用語「標的物質に結合し得るペプチド部分」とは、任意の標的物質に対して親和性を有するペプチドを有し、かつ当該標的物質に対して結合できる部分をいう。標的物質に対して親和性を有する種々のペプチドが知られているので、本発明では、このようなペプチドを有する部分を、上記ペプチド部分として用いることができる。標的物質に結合し得るペプチド部分は、任意の標的物質に対して親和性を有する１個のペプチドのみを有していてもよいし、あるいは任意の標的物質に対して親和性を有する同種または異種の複数（例、２個、３個、４個、５個または６個等の数個）のペプチドを有していてもよい。例えば、標的物質に結合し得るペプチド部分が、任意の標的物質に対して親和性を有する異種の複数のペプチドを有する場合、当該ペプチド部分としては、カーボンナノ素材と結合し得るＰ１ペプチド（配列番号１００）と、チタン素材またはシリコン素材に結合し得るＲ５ペプチド（配列番号１０１）との融合ペプチドであるＰ１Ｒ５ペプチド（ＳＳＫＫＳＧＳＹＳＧＳＫＧＳＫＲＲＩＬＧＧＧＧＨＳＳＹＷＹＡＦＮＮＫＴ（配列番号１０２）を用いることができる（例、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４を参照）。標的物質に結合し得るペプチド部分が上記のような複数のペプチドを有する場合、複数のペプチドは、当該ペプチド部分中に任意の順序で融合され得る。融合は、アミド結合を介して達成され得る。融合は、直接的なアミド結合、あるいは１個のアミノ酸残基（例、メチオニン）または数個（例えば２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、さらにより好ましくは２〜１５個または２〜１０個、最も好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸残基からなるペプチド（ペプチドリンカー）が介在したアミド結合により達成され得る。種々のペプチドリンカーが知られているので、本発明でも、このようなペプチドリンカーを使用することができる。
【００３９】
標的物質としては、例えば、無機素材および有機素材、あるいは導体素材、半導体素材および磁性体素材が挙げられる。具体的には、このような標的物質としては、金属素材、シリコン素材、炭素素材、低分子化合物（例、ポルフィリン等の生体物質、放射性物質、蛍光物質、色素、薬物）、ポリマー（例、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリエチレンオキシドまたはポリ（Ｌ−乳酸）等の疎水性有機ポリマーまたは伝導性ポリマー）、タンパク質（例、オリゴペプチドまたはポリペプチド）、核酸（例、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）、糖質（例、モノサッカリド、オリゴサッカリドまたはポリサッカリド）、脂質が挙げられる。
【００４０】
金属素材としては、例えば、金属および金属化合物が挙げられる。金属としては、例えば、チタン、クロム、亜鉛、鉛、マンガン、カルシウム、銅、カルシウム、ゲルマニウム、アルミニウム、ガリウム、カドミウム、鉄、コバルト、金、銀、プラチナ、パラジウム、ハフニウム、テルルが挙げられる。金属化合物としては、例えば、金属の酸化物、硫化物、炭酸化物、砒化物、塩化物、フッ化物およびヨウ化物、ならびに金属間化合物が挙げられる。金属の酸化物としては、種々の酸化物が挙げられる。より具体的には、金属化合物としては、上述したようなチタンの酸化物、酸化クロム、酸化亜鉛、酸化鉛、酸化マンガン、ゼオライト、炭酸カルシウム、酸化銅、酸化マンガンカルシウム、酸化ゲルマニウム、酸化アルミニウム、酸化ハフニウム、チタンジルコン酸鉛、砒化ガリウム、硫化亜鉛、硫化鉛、硫化カドミウム、白金鉄、白金コバルト、カドミウムテルルが挙げられる。
【００４１】
シリコン素材としては、例えば、シリコンまたはシリコン化合物が挙げられる。シリコン化合物としては、例えば、シリコンの酸化物（例、一酸化ケイ素（ＳｉＯ）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2））、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、シラン（ＳｉＨ４）、シリコーンゴムが挙げられる。
【００４２】
炭素素材としては、例えば、カーボンナノ素材（例、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、カーボンナノホン（ＣＮＨ））、フラーレン（Ｃ６０）、グラフェンシート、グラファイトが挙げられる。
【００４３】
標的物質に結合し得るペプチド部分は、上述したような標的物質に対して親和性を有する限り特に限定されない。標的物質に対して親和性を有する種々のペプチドが知られており、また、開発されている。例えば、生体素材および無機素材または有機素材の複合体を作製することを目的として、無機素材または有機素材に対して結合し得るペプチドが、ファージを用いたスクリーニング等の手法により開発されている。このような手法により開発されたペプチドとしては、例えば、チタン（例、チタンの酸化物）ならびに銀（Ｋ．Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．、国際公開第２００５／０１００３１号）、金（Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，ｖｏｌ．１５．ｐ．２６９．）、酸化亜鉛（Ｋ．Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，ｖｏｌ．６６．ｐ．１０．、Ｕｍｅｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，１７，２５７１−２５７５（２００５））、酸化ゲルマニウム（Ｍ．Ｂ．Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４，ｖｏｌ．１５．ｐ．１７７６．）、硫化亜鉛および硫化カドミウム（Ｃ．Ｅ．Ｆｌｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００３，ｖｏｌ．１３．ｐ．２４１４．）等の金属素材に結合し得るペプチド；シリコンおよびシリコンの酸化物（Ｈ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，２００６，ｖｏｌ．７８，，ｐ．４８７２、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４、Ｋ．Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．、国際公開第２００５／０１００３１号）等のシリコン素材に結合し得るペプチド；カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、カーボンナノホン（ＣＮＨ）等の炭素素材に結合し得るペプチド（Ｓ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，２００３，ｖｏｌ．２，ｐ．１９６．および特開２００４−１２１１５４号公報）；ならびに疎水性有機ポリマー等のポリマーに結合し得るペプチド（特開２００８−１３３１９４号公報）が挙げられる。したがって、本発明でも、標的物質に結合し得るペプチド部分として、このようなペプチドを使用することができる。
【００４４】
なお、金属に結合し得るペプチドは、金属の析出（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）作用を有し得ること、および金属化合物に結合し得るペプチドは、金属化合物の析出活性を有し得ることが知られている（Ｋ．Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．、Ｍ．Ｕｍｅｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，２００５，ｖｏｌ．１７，ｐ．２５７１．）。したがって、標的物質に結合し得るペプチド部分として、金属素材（金属または金属化合物）に結合し得るペプチドを用いる場合、金属素材に結合し得るペプチドは、このような析出活性を有し得る。
【００４５】
ポリペプチド部分およびペプチド部分の融合は、アミド結合を介して達成され得る。融合は、直接的なアミド結合、あるいは１個のアミノ酸残基（例、メチオニン）または数個（例えば２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、さらにより好ましくは２〜１５個または２〜１０個、最も好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸残基からなるペプチド（ペプチドリンカー）が介在したアミド結合により達成され得る。種々のペプチドリンカーが知られているので、本発明でも、このようなペプチドリンカーを使用することができる。
【００４６】
本発明の融合タンパク質において、ポリペプチド部分、ならびに標的物質に結合し得るペプチド部分、および本発明のペプチドの部分が融合する順序は、特に限定されず、１）ポリペプチド部分のＮ末端部およびＣ末端部がそれぞれ標的物質に結合し得るペプチド部分、および本発明のペプチドの部分のＣ末端部およびＮ末端部またはＮ末端部およびＣ末端部と融合していてもよいし、あるいは２）ポリペプチド部分のＮ末端部が標的物質に結合し得るペプチド部分のＣ末端部と融合し、かつ当該標的物質に結合し得るペプチド部分のＮ末端部が本発明のペプチドの部分のＣ末端部とさらに融合していてもよく、または３）ポリペプチド部分のＣ末端部が標的物質に結合し得るペプチド部分のＮ末端部と融合し、かつ当該標的物質に結合し得るペプチド部分のＣ末端部が本発明のペプチドの部分のＮ末端部とさらに融合していてもよい。例えば、ポリペプチド部分としてフェリチンを用いる場合、フェリチンはそのＮ末端部が多量体の表面上に露出され、そのＣ末端部は表面上に露出しないことから、好ましくは、フェリチンは、上記２）の順序で融合される。一方、ポリペプチド部分としてＤｐｓを用いる場合、ＤｐｓはＮ末端部およびＣ末端部の両方が多量体の表面上に露出し得ることから、Ｄｐｓは、上記１）〜３）のいずれかの順序で融合され得る。
【００４７】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ポリペプチド部分のＮ末端側およびＣ末端側またはＣ末端側およびＮ末端側にそれぞれ標的物質に結合し得るペプチド部分、および本発明のペプチドの部分（それぞれ、１個または複数）を有し得る。
【００４８】
ポリペプチド部分のＮ末端側に融合されたペプチド部分は、翻訳開始コドンによりコードされるメチオニン、またはメチオニンをＮ末端に含む部分を、そのＮ末端側に有するように設計され得る。このような設計により、本発明の融合タンパク質の翻訳が促進され得る。メチオニンをＮ末端に含むペプチド部分は、数個（例えば２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、さらにより好ましくは２〜１５個または２〜１０個、最も好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸残基からなるペプチドであり得る。
【００４９】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、標的物質に結合し得るペプチド部分、および本発明のペプチドの部分が異なる標的物質に結合し得る。標的物質に結合し得るペプチド部分が結合する標的物質としては、例えば、無機素材および有機素材が挙げられる。より具体的には、このような標的物質としては、例えば、金属素材、シリコン素材、炭素素材が挙げられる。好ましくは、標的物質は、炭素素材またはシリコン素材である。
【００５０】
炭素素材に結合し得るペプチド部分としては、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）またはカーボンナノホン（ＣＮＨ）等のカーボンナノ素材に結合し得るペプチド部分が好ましい。このようなペプチド部分としては、例えば、後述する実施例および特開２００４−１２１１５４号公報に開示されるＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１０３）、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４に開示されるＨＳＳＹＷＹＡＦＮＮＫＴ（配列番号１０４）、ならびに特開２００４−１２１１５４号公報に開示されるＹＤＰＦＨＩＩ（配列番号１０５）、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
【００５１】
金属素材に結合し得るペプチド部分としては、例えば、亜鉛または亜鉛化合物（例、酸化亜鉛）等の亜鉛素材に結合し得るペプチド部分が挙げられる。亜鉛素材に結合し得るペプチド部分としては、例えば、後述する実施例およびＵｍｅｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，１７，２５７１−２５７５（２００５）に開示されるＥＡＨＶＭＨＫＶＡＰＲＰＧＧＧＳＣ（配列番号１０６）、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
【００５２】
シリコン素材に結合し得るペプチド部分としては、シリコンまたはシリコン化合物（例、シリコンの酸化物）に結合し得るペプチド部分が好ましい。このようなペプチド部分としては、例えば、後述する実施例および国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるＲＫＬＰＤＡ（配列番号７７）、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４に開示されるＳＳＫＫＳＧＳＹＳＧＳＫＧＳＫＲＲＩＬ（配列番号１０７）、ならびに国際公開第２００６／１２６５９５号に開示されるＭＳＰＨＰＨＰＲＨＨＨＴ（配列番号１０８）、ＴＧＲＲＲＲＬＳＣＲＬＬ（配列番号１０９）、およびＫＰＳＨＨＨＨＨＴＧＡＮ（配列番号１１０）、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドが挙げられる。
【００５３】
本発明の融合タンパク質は、本発明の融合タンパク質を発現する形質転換体から得ることができる。この形質転換体は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、本発明の融合タンパク質の発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製することができる。本発明の融合タンパク質を発現させるための宿主としては、例えば、エスケリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエスケリシア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、およびバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞が挙げられる。
【００５４】
形質転換される宿主としてＥ．ｃｏｌｉについて詳述すると、Ｅ．ｃｏｌｉとしては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株亜種のＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株が挙げられる。形質転換方法、および形質転換体を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ  （２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを作製し、これを用いて本発明の融合タンパク質を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
【００５５】
本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ、Ｔ５プロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８、ｐＱＥ３０およびその誘導体が挙げられる。
【００５６】
また、本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子の下流に、転写終結配列であるターミネータを連結してもよい。このようなターミネータとしては、例えば、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータが挙げられる。
【００５７】
本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉに導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう「改変」とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
【００５８】
ベクターは、形質転換体の選別のため、アンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（タカラバイオ社製）、ｐＫＫ２３３−２（タカラバイオ社製）、ｐＥＴ系（アジレント・テクノロジー社製）。
【００５９】
得られた発現ベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、得られたＥ．ｃｏｌｉを培養すると、本発明の融合タンパク質が発現される。
【００６０】
培地としては、例えば、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地が挙げられる。培養および生産誘導等の条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択することができる。
【００６１】
本発明の融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。本発明の融合タンパク質は、本発明の融合タンパク質を産生する形質転換体を回収した後、形質転換体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、精製タンパク質、粗精製タンパク質、または本発明の融合タンパク質含有画分を得ることができる。融合タンパク質についてはまた、国際公開第２０１２／０８６６４７号を参照することができる。
【００６２】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質の作製に用いることができる、上述したような、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびに当該発現ベクターを含む形質転換体を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の融合タンパク質をコードするので、本発明の融合タンパク質に関する上述した説明に基づいて、種々の観点から特定することができる。
【００６３】
本発明はまた、融合タンパク質の多量体を提供する。本発明の多量体は、内腔を有し得る。本発明の多量体を構成する融合タンパク質は、上述したとおりである。本発明の多量体は、本発明の融合タンパク質を発現させることで、自律的に形成され得る。本発明の多量体を構成する単量体単位の数は、本発明の融合タンパク質におけるポリペプチド部分の種類により決定され得る。好ましくは、本発明の多量体は、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分としてＤｐｓを有し得ることから、１２量体であり得る。
【００６４】
本発明の多量体は、単量体単位として、単一の融合タンパク質から構成されるホモ多量体であってもよいが、異なる複数の種類（例、２種、３種、４種、５種または６種）の融合タンパク質から構成されるヘテロ多量体であってもよい。本発明の多量体では、多量体形成の観点から、多量体を構成する融合タンパク質中のポリペプチド部分は単一のポリペプチド部分であることが好ましいが、標的物質に結合し得るペプチド部分、および本発明のペプチドの部分は、多量体を構成する融合タンパク質間で異なるものであってもよい。異なる複数の種類の融合タンパク質から構成される多量体は、例えば、異なる種類の融合タンパク質を発現する複数のベクター、または異なる種類の融合タンパク質を発現する単一のベクター（例、ポリシストロニックｍＲＮＡを発現し得るベクター）を、単一の宿主細胞に導入し、次いで、異なる種類の融合タンパク質を単一の宿主細胞中で発現させることにより、得ることができる。このような多量体はまた、単一の融合タンパク質から構成される第１の単量体と、単一の融合タンパク質（第１の多量体を構成する融合タンパク質とは異なる）から構成される第２の単量体とを、同一の媒体（例、緩衝液）中で共存させ、放置することにより、得ることができる。融合タンパク質の単量体は、例えば、本発明の多量体を、低ｐＨの緩衝液下に放置することにより調製することができる。詳細については、例えば、Ｂ．Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，ｖｏｌ．２１，ｐ．４４５６０２を参照のこと。
【００６５】
本発明の多量体は、内腔中に物質を含んでいてもよい。物質は、錯体または粒子（例、ナノ粒子、磁性粒子）のような形態で、本発明の多量体中に内包されていてもよい。当業者は、本発明の多量体の内腔のサイズ、および本発明の多量体における物質の取り込みに関与し得る領域（例、Ｃ末端の領域：Ｒ．Ｍ．Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２６，ｐ．１３２８２を参照）中のアミノ酸残基の電荷特性等を考慮することにより、本発明の多量体に内包され得る物質を適切に選択できる。例えば、ポリペプチド部分としてＤｐｓを有する本発明の多量体の場合、Ｄｐｓは、４０〜６０ｎｍ３（直径  約５ｎｍ）の程度の内腔を有する。したがって、このような多量体に内包され得る物質のサイズは、例えば６０ｎｍ３以下、好ましくは４０ｎｍ３以下、より好ましくは２０ｎｍ３以下、さらにより好ましくは１０ｎｍ３以下、最も好ましくは５ｎｍ３以下であり得る。また、多量体における物質の取り込みに関与し得る領域中の電荷特性（例、正または負に荷電し得る側鎖を有するアミノ酸残基の種類および数）を変化させることにより、多量体の内腔中への物質の取り込みをより促進できることが報告されているので（例、Ｒ．Ｍ．Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２６，ｐ．１３２８２を参照）、本発明においても、電荷特性が変化された領域を有する融合タンパク質の多量体を用いることができる。本発明の多量体に内包され得る物質としては、例えば、上述した標的物質と同様の無機素材が挙げられる。具体的には、本発明の多量体に内包され得る物質としては、上述したような金属素材やシリコン素材が挙げられる。より具体的には、このような物質としては、酸化鉄、ニッケル、コバルト、マンガン、リン、ウラン、ベリリウム、アルミニウム、硫化カドミウム、セレン化カドミウム、パラジウム、クロム、銅、銀、ガドリウム錯体、白金コバルト、酸化シリコン、酸化コバルト、酸化インジウム、白金、金、硫化金、セレン化亜鉛、カドミウムセレンが挙げられる。
【００６６】
本発明の多量体の内腔中への物質の内包は、周知の方法により行うことができ、例えば、フェリチンまたはＤｐｓ等のフェリチン様タンパク質の多量体の内腔中への物質の内包方法（例、Ｉ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．，ｌｅｔｔ．，２００５．ｖｏｌ．３３，ｐ．１１５８を参照）と同様にして行うことができる。具体的には、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液中に、本発明の多量体（または本発明の融合タンパク質）および内包されるべき物質を共存させ、次いで適切な温度（例、０〜３７℃）で放置することにより、本発明の多量体の内腔中に物質を内包させることができる（実施例３もまた参照のこと）。
【００６７】
本発明の多量体は、内腔中に物質を含む場合、異なる複数の種類（例、２種、３種、４種、５種または６種）の物質を含む、異なる複数の種類の多量体のセットとして提供されてもよい。例えば、本発明の多量体が２種の物質を含む２種の多量体のセットとして提供される場合、このようなセットは、各々別々に調製された、第１の物質を内包する第１の多量体と、第２の物質（第１の物質とは異なる）を内包する第２の多量体とを、組み合せることにより、得ることができる。上述したような融合タンパク質の多様なパターンと、内包物質の多様なパターンとを適宜組み合せることにより、非常に多様性に富む本発明の多量体を得ることができる。多量体についてはまた、国際公開第２０１２／０８６６４７号を参照することができる。
【００６８】
本発明はまた、複合体を提供する。本発明の複合体は、本発明の多量体、ならびに標的物質およびチタンを含み得る。本発明の複合体では、標的物質が、融合タンパク質中の標的物質に結合し得るペプチド部分に結合し得、かつチタンが、融合タンパク質中の本発明のペプチドの部分に結合し得る。標的物質は、上述したとおりである。標的物質は、好ましくは、チタン以外の標的物質（例、有機素材、または炭素素材もしくはシリコン素材等の無機素材）である。標的物質は、他の物質または物体と結合していてもよい。例えば、標的物質は、固相（例、ウェルプレート等のプレート、支持体、基板、素子、デバイス）上に固定されていてもよい。したがって、本発明の複合体は、本発明の多量体、ならびに標的物質および／またはチタンを含み得る限り、他の物質または物体をさらに含んでいてもよい。複合体についてはまた、国際公開第２０１２／０８６６４７号を参照することができる。
【００６９】
本発明の複合体を焼成して、本発明の複合体を構成する本発明の多量体（本発明の融合タンパク質）を除去することにより、多孔質構造体を作製することができる。このように作製された多孔質構造体は、光触媒活性または電気特性等に優れたデバイスおよび素材等の開発に有用である。例えば、多孔質構造体は、光電変換素子（例、色素増感太陽電池等の太陽電池）、水素発生素子、水浄化素材、抗菌素材、半導体メモリ素子の作製における材料または構成要素として、有用である。このような多孔質構造体については、例えば、国際公開第２０１３／０２２０５１号、国際公開第２０１２／０８６６４７号を参照することができる。
【００７０】
本発明はまた、標的素材に結合し得るペプチドのスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法は、以下を含む：
１）標的素材をファージライブラリに接触させて、ファージ結合標的素材を得ること；
２）ファージ結合標的素材を回収すること；
３）ファージ結合標的素材および宿主を用いて、ファージ導入宿主を調製すること；
４）ファージ導入宿主において、ファージを増幅させること；および
５）増幅したファージが発現する、標的素材に結合し得るペプチドを同定すること。
【００７１】
工程１）において用いられる標的素材は、ファージライブラリ中に存在し得る、標的素材に結合し得るペプチドを提示するファージが結合できる素材である。このような標的素材としては、例えば、上述した標的素材を、必要に応じて宿主に導入可能なサイズに調製した上で、工程１）に用いることができる。好ましくは、標的素材は、ナノ素材である。本発明において、ナノ素材とは、１〜１０００ｎｍの長径を有する固形状物質を意味する。ナノ素材の長径の下限値は、好ましくは１ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上であってもよい。ナノ素材の長径の上限値は、好ましくは１０００ｎｍ以下、より好ましくは１００ｎｍ以下であってもよい。ナノ素材としては、例えば、無機ナノ素材および有機ナノ素材が挙げられる。より具体的には、ナノ素材としては、例えば、金属ナノ素材（例、金属粒子、磁性粒子）、シリコンナノ素材、カーボンナノ素材（例、ＣＮＴ、ＣＮＨ）が挙げられる。ファージライブラリとの接触の際の標的素材の濃度は、標的物質とファージとの結合が可能である限り特に限定されないが、例えば１０８〜１０１３個、好ましくは１０９〜１０１２個、より好ましくは５×１０９〜５×１０１１個である。あるいは、ファージライブラリとの接触の際の標的素材の濃度は、例えば０．１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１．０μｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは２．０〜１００μｇ／ｍｌである。
【００７２】
工程１）において用いられるファージライブラリは、種々のペプチドを提示するファージの集団である。ファージとしては、例えば、繊維状ファージ（例、Ｍ１３、ｆｄ、ｆ１）、ラムダファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージが挙げられる。ファージライブラリは、ファージディスプレイ用のライブラリを好適に用いることができ、例えば、市販のものを用いてもよく、または種々の特定のペプチドを提示するように特異的に作製されたファージの集団を用いてもよい。標的素材との接触の際のファージ濃度は、標的素材とファージとの結合が可能である限り特に限定されないが、例えば１０９〜１０１３個、好ましくは１０１０〜１０１２個、より好ましくは５×１０１０〜５×１０１１個である。
【００７３】
接触は、緩衝液等の水溶液中で行うことができる。緩衝液としては、Ｔｒｉｓ緩衝液（例、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）等の任意の緩衝液を用いることができる。水溶液は、１種または２種以上の変性剤を含有していてもよい。変性剤としては、例えば、界面活性剤（例、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤および非イオン性界面活性剤）、カオトロピック剤、ｐＨ調整剤（例、酸性物質、アルカリ性物質）、有機溶媒（例、アセトン、メタノール、エタノール）が挙げられる。アニオン性界面活性剤としては、例えば、ヘキシル硫酸、オクチル硫酸、デシル硫酸、ドデシル硫酸、テトラデシル硫酸、ヘキサデシル硫酸、ドデシルベンゼンスルホン酸、ラウロイルサルコシン、およびドデカノイルサルコシン酸、ならびにこれらの塩が挙げられる。カチオン性界面活性剤としては、例えば、４級アンモニウム化合物（例、セチルジメチルエチルアンモニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）および４級ホスホニウム化合物、ならびにこれらの塩が挙げられる。両性界面活性剤としては、例えば、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ、ＡＳＢ−１４、および３−Ｎ（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホン酸、ならびにこれらの塩が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ、Ｔｗｅｅｎ、ＮＰ４０が挙げられる。カオトロピック剤としては、例えば、グアニジン、尿素、およびチオ硫酸、ならびにそれらの塩が挙げられる。変性剤の濃度は、例えば、標的素材またはファージの非特異的吸着を抑制しつつ、標的素材に対する親和性を有するペプチドを提示するファージと標的素材との結合を可能にする限り特に限定されないが、例えば０．０１〜５．０容量％、好ましくは０．０２〜２．０容量％、より好ましくは０．０５〜１．０容量％である。緩衝液のｐＨは、例えば５．０〜９．０、好ましくは５．５〜８．５である。接触の際の温度は、例えば４〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃である。接触は、遮光条件下で行われてもよい。接触時間は、特に限定されないが、例えば５分〜２４時間、好ましくは１０分〜１０時間、より好ましくは２０分〜５時間である。
【００７４】
工程２）において、ファージ結合標的素材の回収は、標的素材を回収できる任意の方法により行うことができる。このような方法としては、例えば、遠心分離、磁力の利用（標的素材が磁性素材である場合）、親和性物質の利用（例、標的素材を予め親和性物質で標識しておき、当該親和性物質と親和性を有する別の親和性物質を利用して標的素材を回収する方法）、電気泳動（標的素材が荷電している場合）が挙げられる。親和性物質としては、例えば、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートが挙げられる。本発明のスクリーニング方法は、固相（本発明の場合、標的素材に相当）からファージを溶出させずに、標的素材の回収方法により標的素材ごとファージを回収する点で、従来法と異なる。
【００７５】
回収したファージ結合標的素材は、１回または複数回（例、２回、３回、４回、５回、６回、８回、または１０回）洗浄されてもよい。洗浄液としては、例えば、緩衝液および水が挙げられる。洗浄液としては、例えば、上述した変性剤を、工程１）で採用した濃度よりも高濃度で含む水溶液を用いることができる。洗浄液中の変性剤の濃度は、洗浄回数に応じて漸増させてもよく、例えば、工程１）で採用した濃度の１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、８倍以上または１０倍以上の濃度で使用してもよい。洗浄操作は、緩衝液および水を併用してもよく、例えば、緩衝液で１回または複数回、および水で１回または複数回行ってもよい。このような操作により、標的素材に未結合のファージ、または標的素材に対する結合が弱いファージを効率的に除去することができ、標的素材に強固に結合したファージを、結合標的素材の回収により取得することができる。
【００７６】
工程３）において、ファージ導入宿主の調製は、ファージ結合標的素材および宿主を用いて行うことができる。例えば、ファージ導入宿主の調製は、標的素材ごとファージを宿主に導入できる方法より調製することができる。標的素材ごとファージを宿主に導入できる方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法が挙げられる。また、ファージ導入宿主の調製は、ファージ結合標的素材を宿主と混合することにより行うことができる。ファージ結合標的素材を宿主と混合することにより、ファージ結合標的素材から乖離したファージが宿主に感染するためである。宿主としては、ファージディスプレイ法で利用できる宿主である限り特に限定されず、例えば、大腸菌（例、ＪＭ１０９株、ＥＲ２７３８株、ＢＢ４株、ＨＢ２１５１株、およびＴＧ−１株などのＦ因子を持つ株）が挙げられる。
【００７７】
工程４）において、工程３）で得られたファージ導入宿主中で、ファージを増幅させることができる。具体的には、ファージ導入宿主を、寒天培地上で培養すると、ファージが増幅し、プラークが形成される。ファージをさらに効率よく増幅させるためには、培地中にファージを播種し、培養してもよい。
【００７８】
工程５）において、増幅したファージが発現する、標的素材に結合し得るペプチドが同定される。例えば、ファージ培養物からファージＤＮＡを回収し、試験ペプチドが融合されているコートタンパク質をコードするヌクレオチド配列を利用して、試験ペプチドをコードするヌクレオチド配列を解析することにより、増幅したファージが発現する、標的素材に結合し得るペプチドを同定することができる。
【００７９】
本発明のスクリーニング方法では、工程１）〜４）のサイクルを複数回（例、２回、３回、４回、５回、６回、８回、または１０回）繰り返した後に、工程５）を行ってもよい。これにより、標的素材に対して高い親和性を有するペプチドを発現するファージを得ることができる。このような場合、２サイクル以降の工程１）で用いられる水溶液中の変性剤の濃度は、前サイクルの工程１）で用いられる水溶液中の変性剤の濃度に比し、高濃度（例、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、８倍以上または１０倍以上の濃度）であってもよい。また、２サイクル以降の工程２）で回収したファージ結合標的素材は、１回または複数回（例、２回、３回、４回、５回、６回、８回、または１０回）洗浄されてもよい。２サイクル以降で用いられる洗浄液中の変性剤の濃度は、前サイクルの洗浄液中の変性剤の濃度に比し、高濃度（例、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、８倍以上または１０倍以上の濃度）であってもよい。
【００８０】
本発明のスクリーニング方法は、ファージディスプレイ法において、ファージ結合標的素材を宿主に導入することにより、標的素材に強固に結合したファージを利用することができる。従来のファージディスプレイ法では、標的素材でコーティングされた固相に結合したファージを剥離して回収しているため、変性剤で容易に剥離させることのできない程度に標的素材に強固に結合する能力を有するペプチドをファージディスプレイ法で同定することは難しかった。一方、本発明によれば、このようなペプチドを効率的に同定することが可能になるため、本発明のスクリーニング方法は有用である。
【００８１】
以下の実施例により、本発明を詳細に説明するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。
【実施例】
【００８２】
実施例１：酸化チタンへの結合ペプチドのスクリーニング
（ファージパニング工程）
酸化チタン吸着ペプチドのスクリーニングは、Ｐｈ．Ｄ．ＴＭ−１２  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．、米国）を用いた。すなわち、酸化チタンナノ粒子（Ｔｉｔａｎｉｕｍ（ＩＶ）  ｏｘｉｄｅ，ａｎａｔａｓｅ、直径２５ｎｍ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を終濃度０．０１ｍｇ／ｍｌ（４ｘ１０１０個／ｍｌ）で含有するＴＢＴ０１緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．１容量％  ｔｗｅｅｎ−２０含有）１ｍｌに、最終的なファージ濃度が１０１１個／ｍｌとなるようにＰｈ．Ｄ．ＴＭ−１２  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓのファージ溶液を添加し、室温で遮光しながら１時間回転放置した。反応後、酸化チタンナノ粒子を遠心回収し、ＴＢＴ０２緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．２容量％  ｔｗｅｅｎ−２０含有）１ｍｌに再度懸濁した。この酸化チタンナノ粒子を遠心回収し、新たな緩衝液１ｍｌに懸濁する工程を、ｔｗｅｅｎ−２０を０．３容量％、０．４容量％、そして０．６容量％の濃度でそれぞれ含むトリス緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０）を用いて実施した。最後に水で酸化チタンナノ粒子を２回洗浄し、水１１０μｌに懸濁した。これらの工程により、サンプルに含まれる酸化チタンに結合していないファージが多くとも１００個以下になるようにした。
【００８３】
続いて、このファージが強固に結合した酸化チタンナノ粒子を用いて、酸化チタンナノ粒子ごとファージをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９の細胞内にエレクトロポレーションにより導入しプラークを形成させた。すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）約８０μｌに酸化チタン溶液１０μｌあるいは１００μｌを加えた。その混合溶液をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸｃｅｌｌＴＭ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ用セル（０．２ｃｍギャップ）に入れ、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸｃｅｌｌＴＭ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓを用いて２．５ｋＶの電圧をかけた。その溶液に０．５ｍｌ  ＳＯＣ培地（２％    Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）を加えた。その溶液を溶解させたＴＯＰ  Ａｇａｒ（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １．０ｇ／ｌ、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ０．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／ｌ、ａｇａｒｏｓｅ  ０．７ｇ／ｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌおよび１ｍＭ  ＩＰＴＧ）３ｍｌに加え、ＬＢ寒天培地にまき３７℃で一晩放置した。その後、形成された青色プラークに含まれるファージからＤＮＡを回収し、配列を決定すると共に、１ｍｌ  ＬＢ培地（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １．０ｇ／ｌ、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ０．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／ｌ）を加え、ＴＯＰ  Ａｇａｒごと全プラークを削り取って１５ｍｌ遠沈管に回収した。その懸濁液を５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで、ファージが含まれる上清を回収した。
【００８４】
ファージＤＮＡを回収するために、ＪＭ１０９が播種されたＬＢ培地１ｍｌに爪楊枝を用いてファージの青色プラークからファージを播種した。３７℃で５時間培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍ１３  Ｋｉｔを用いてＤＮＡを回収し、配列（５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’）を用いてペプチドライブラリーをコードする塩基配列を解読した。
【００８５】
その全プラークから回収されたファージ液に含まれるファージを増幅するために、ファージ液をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９が播種されたＬＢ培地５０ｍｌに加え、３７℃で５時間培養した。その後、５０ｍｌ遠沈管に回収し、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を沈殿させ、ファージが含まれる上清を回収した。さらに、その上清を６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清に残った菌体を沈殿させ、ファージが含まれる上清４０ｍｌを５０ｍｌ遠沈管に回収した。そのファージ溶液にＰＥＧ溶液（２０容量％  ＰＥＧ８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）６．７ｍｌを加え、４℃で一晩静置した。その溶液を６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を捨てた。さらに、６０００ｒｐｍで数秒間遠心分離し、遠沈管壁面にのこった溶液を回収し、廃棄した。得られた沈殿物をＴＢＳ（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）１ｍｌに懸濁させ、１．５ｍｌ遠沈チューブに移した。その溶液にＰＥＧ溶液（２０容量％  ＰＥＧ８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）０．１７ｍｌを加え、４℃で１時間静置した。その後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。さらに、１５０００ｒｐｍで数秒間遠心分離し、遠沈管壁面にのこった溶液を回収し、廃棄した。得られた沈殿物をＴＢＳ（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）５０μｌに懸濁させ、ファージ溶液とした。
【００８６】
この回収されたファージ溶液を用いて上記ファージパニング工程を行うことで、より強固に酸化チタンナノ粒子に結合できるファージをスクリーニングした。このとき酸化チタン結合工程でのファージの最終濃度は１０１１個／ｍｌであり、酸化チタンナノ粒子の終濃度は０．０１ｍｇ／ｍｌであった。また、反応溶液としてＴＢＴ０３緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．３容量％  ｔｗｅｅｎ−２０含有）１ｍｌを用いた。酸化チタンナノ粒子の洗浄は、ＴＢＴ０３緩衝液１ｍｌで２回、ＴＢＴ０４緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．４容量％  ｔｗｅｅｎ−２０含有）１ｍｌで１回、ＴＢＴ０６緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．６容量％  ｔｗｅｅｎ−２０含有）１ｍｌで２回、水で２回行った。得られたファージが結合した酸化チタンナノ粒子を、上記と同様にＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９にエレクトロポレーションにより導入し、プラークを形成させ、回収した。そして、上記と同様にして、各プラーク内のファージが提示したペプチドをコードする塩基配列を解読すると共に、全ファージを増幅し、ファージ溶液を得た。
【００８７】
この回収されたファージ溶液を用いて、再度上記ファージパニング工程を行った。このとき酸化チタン結合工程でのファージの最終濃度は１０１１個／ｍｌであり、酸化チタンナノ粒子の終濃度は０．０１ｍｇ／ｍｌであった。また、反応溶液としてＴＢＴ０６緩衝液１ｍｌを用いた。酸化チタンナノ粒子の洗浄は、ＴＢＴ０６緩衝液１ｍｌで１回、ＴＢＴ１０緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０，１．０容量％  ｔｗｅｅｎ−２０含有）１ｍｌで２回、ＴＢＴ１５緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０，１．５容量％  ｔｗｅｅｎ−２０含有）１ｍｌで２回、ＴＢＴ２０緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０，２．０容量％  ｔｗｅｅｎ−２０含有）１ｍｌで１回、水で２回行った。得られたファージが結合した酸化チタンナノ粒子を、上記と同様にＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９にエレクトロポレーションにより導入し、プラークを形成させ、回収した。そして、上記と同様にして、各プラーク内のファージが提示したペプチドをコードする塩基配列を解読すると共に、全ファージを増幅し、ファージ溶液を得た。
【００８８】
この回収されたファージ溶液を用いて、再度上記ファージパニング工程を行った。このとき酸化チタン結合工程でのファージの最終濃度は１０１１個／ｍｌであり、酸化チタンナノ粒子の終濃度は０．０１ｍｇ／ｍｌであった。また、反応溶液としてＴＢＴ０６緩衝液１ｍｌを用いた。酸化チタンナノ粒子の洗浄は、ＴＢＴ０６緩衝液１ｍｌで２回、ＴＢＴ１０緩衝液１ｍｌで２回、ＴＢＴ１５緩衝液１ｍｌで２回、ＴＢＴ２０緩衝液１ｍｌで２回、水で２回行った。得られたファージが結合した酸化チタンナノ粒子を、上記と同様にＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９にエレクトロポレーションにより導入し、プラークを形成させ、各プラークからファージＤＮＡをした。
【００８９】
今回得られたＴｉ結合ペプチドの候補配列を表１に示す。４回ファージパニング工程を行った後には、ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＦＭＳ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるペプチドを提示したファージは全体の７６％（２１サンプル中１６サンプル）を占めていた。
【００９０】
【表１】
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【００９１】
実施例２：得られた結合ペプチドのＴｉ結合能力の評価
今回のスクリーニングで得られたＳＴ１（ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＦＭＳ（配列番号３））と従来知られていたチタン結合ペプチドｍｉｎＴＢＰ１（ＲＫＬＰＤＡ（配列番号４９）、国際公開第２００５／０１００３１号、Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２１，ｐ．３０９０）を化学合成（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社カスタムペプチド合成サービス使用）した。そして、チタンセンサーを使った水晶マイクロバランス振動法（ＱＣＭ）を用いて、各ペプチドのチタンへの結合能力を評価した。
【００９２】
はじめに、洗浄液（９８％（ｗ／ｖ）硫酸と３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素水を３対１で混合した溶液）３μｌを、測定用のチタンセンサー上に乗せ５分間放置した後、水で洗い流すことでセンサー表面を洗浄した。この洗浄工程を３回行った。センサーを乾燥させた後、チタンセンサーを本体（Ａｆｆｉｎｉｘ  ＱＮμ、Ｉｎｉｔｉｕｍ社）に取り付け、チタンセンサーにＴＢＴ緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、０．０００１容量％  ｔｗｅｅｎ−２０を含む。ｐＨ８．０）を適当量滴下し、３０分から一時間室温で放置することで、センサーの周波数値を安定させた。周波数値が安定した後、反応溶液量が５００μｌ、終濃度が２０μＭから４２μＭとなるように各ペプチドを添加し、周波数の変化を測定した。そして得られた周波数の変化が、以下の数式１の関係に則ると仮定して、解析ソフトＡＱＵＡ  （Ｉｎｉｔｉｕｍ社）を用いて各ペプチドとチタンの結合速度定数ｋｏｎと解離速度定数ｋｏｆｆを求めた。ＳＴ１の分子量は１４６０、ｍｉｎＴＢＰ１の分子量は６９９として計算に用いた。
【００９３】
その結果、ＳＴ１とｍｉｎＴＢＰ１のｋｂｏｓとペプチド濃度の関係は、図１のとおりであった。各ペプチドのｋｏｎとｋｏｆｆ、Ｋｄ、Ｋａは、表２のとおりであった。
【００９４】
すなわち、ＳＴ１ペプチドはｍｉｎＴＢＰ１よりも１０倍以上のチタン結合能力を持つことが分かった。
【００９５】
【数１】
2015082985.tif 000003
【００９６】
【表２】
2015082985.tif 000004
【００９７】
実施例３：チタン結合ペプチドを提示したカゴ状タンパク質の構築
表３に示すチタン結合ペプチドがＣ末端に融合されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａの金属内包性タンパク質Ｄｐｓを下記の手順によりそれぞれ構築した。
【００９８】
はじめに、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａのＤｐｓ遺伝子が搭載されたｐＥＴ２０（Ｋ．Ｉｗａｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．ｌｅｔｔ．，２００７，ｖｏｌ．１９，ｐ．３１０５を参照）を鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行った。以下の遺伝子を搭載するベクターを得るために、プライマーとして、以下の各ヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドを組み合わせてＰＣＲを実施した。
【００９９】
Ｄｐｓ−ＳＴ１をコードする遺伝子が搭載されたベクター
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号５０）
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣｔｔａＣＧＡＣＡＴＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＣＴＴＣＴＧＡＧＧＡＴＡＡＧＣｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃ−３’（配列番号５１）
Ｄｐｓ−Ｔｉ１をコードする遺伝子が搭載されたベクター
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号５２）
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＴＴＡｃｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃｃａｇｔｔｔａｔｇｇｇｔｃｇｇｇｔｔｔｔｔｇｇｔｇｃｇｃｔｔｔｔｔａｃｇｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃ−３’  （配列番号５３）
Ｄｐｓ−Ｔｉ２をコードする遺伝子が搭載されたベクター
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号５４）
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＴＴＡｃｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃｔｔｔｃａｇｇｃｔｇｃｔｃｇｇａａａｇｃｇｇｃｇａａｔｃａｔｇｃｇｃａｔｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃ−３’（配列番号５５）
Ｄｐｓ−Ｔｉ３をコードする遺伝子が搭載されたベクター
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号５６）
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＴＴＡｃｃａｇｃｃＡｃｃｇｃｃａｔｇＧｔｇａｔｇａａｔＧｔｇａｔｃａｔｇｇｃｇｇｃｔｃａｇｇｃｔｔｔｔｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃ−３’（配列番号５７）
Ｄｐｓ−Ｔｉ４をコードする遺伝子が搭載されたベクター
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号５８）
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＴＴＡｃｃａｇｃｃＡｃｃｇｃｃｔｔｔｇｇｔｃｇｃａｔａｇｃｇｃｇｇａｔｇｇｃｔｃａｇａｔｇｃｔｇｇｇｔｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃ−３’（配列番号５９）
Ｄｐｓ−Ｔｉ５をコードする遺伝子が搭載されたベクター
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号６０）
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣｔｔａｃｃａｇｃｃｇｃｃｇｃｃｇｇｔｃｇｇｇｃｔｃｇｃｇｃｔｃｇｇｃｔｇｇｃｇｇｃｔｃｇｇｇｃｇｇｃｔｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃ−３’（配列番号６１）
Ｄｐｓ−Ｔｉ７３１をコードする遺伝子が搭載されたベクター
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号６２）
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＴＴＡａｔａｃｇｇｇｃｔｃａｃｃｃａｇｇｔｃｇｃｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃ−３’（配列番号６３）
Ｄｐｓ−Ｔｉ（Ｓｉ）をコードする遺伝子が搭載されたベクター
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号６４）
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣｔｔａＧＧＴＧＴＴＧＧＴＣＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＧＧＡＴＡｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃ−３’（配列番号６５）
Ｄｐｓ−Ｖｒｅｕｌｓをコードする遺伝子が搭載されたベクター
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号６６）
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＴＴＡｇｃｔｇｃｃｃｇｃｃａｔｇｇｔａａａｃｇｇｃａｃＡＧＣｃｇｃｇｔｔｃａｇｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃ−３’（配列番号６７）
【０１００】
また、Ｎ末端に炭素素材結合ペプチドＮＨＢＰ−１が融合され、Ｃ末端にチタン結合ペプチドＳＴ１が融合されたＤｐｓ（ＣＤＴＳ１と呼ぶ）を構築するために、ＣＤＴ１遺伝子が搭載されたｐＥＴ２０（Ｉ．Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０１１，ｖｏｌ．４７．ｐ．１２６４９を参照）を鋳型ＤＮＡとして以下のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドを組み合わせてＰＣＲを実施した。
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号６８）
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣｔｔａＣＧＡＣＡＴＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＣＴＴＣＴＧＡＧＧＡＴＡＡＧＣｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃ−３’（配列番号６９）
【０１０１】
得られた各ＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）で精製し、制限酵素ＤｐｎＩとＢａｍＨＩで消化した。制限酵素で消化されたＰＣＲ産物を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を用いてセルフライゲーションさせた。セルフライゲーションされたＰＣＲ産物をＥＣＯＳＴＭ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ニッポンジーン社、日本）に形質転換し、Ｃ末端に各チタン結合ペプチドが融合されたＤｐｓをコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＳＴ１、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｔｉ１、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｔｉ２、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｔｉ３、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｔｉ４、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｔｉ５、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｔｉ７３１、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｔｉ（Ｓｉ）、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｖｒｅｕｌｓ、ｐＥＴ２０−ＣＤＴＳ１）を保持したＢＬ２１（ＤＥ３）を構築した。その形質転換株からＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を使って各ベクターを精製し、搭載された変異Ｄｐｓ遺伝子配列を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、Ｄｐｓ−ＳＴ１、Ｄｐｓ−Ｔｉ２、Ｄｐｓ−Ｔｉ３、Ｄｐｓ−Ｔｉ４、Ｄｐｓ−Ｔｉ５、Ｄｐｓ−Ｔｉ７３１、Ｄｐｓ−Ｔｉ（Ｓｉ）、Ｄｐｓ−Ｖｒｅｕｌｓ、ＣＤＴＳ１の発現を確認でき、タンパク質発現用株を得ることができた。一方、Ｄｐｓ−Ｔｉ１の発現は確認できなかった。
【０１０２】
実施例４：チタン結合ペプチドを提示したカゴ状タンパク質の精製
発現プラスミド（ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＳＴ１、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｔｉ２、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｔｉ３、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｔｉ４、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｔｉ５、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｔｉ７３１、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｔｉ（Ｓｉ）、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｖｒｅｕｌｓ、ｐＥＴ２０−ＣＤＴＳ１）のいずれかを保持したＢＬ２１（ＤＥ３）を５０ｍＬのＬＢ培地（１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを含む）にて３７℃で振とう培養した。培養開始２４時間後、得られた菌体を遠心分離（６０００ｒｐｍ、５分間）により回収し、５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）  １０ｍＬで懸濁した。次に、その懸濁液にＤｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ社、ＵＳＡ）を使い超音波パルス（２００Ｗ、Ｄｕｔｙ  ４５％）を５分間与えることで、菌体を破砕した。その溶液を６０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、上清画分を回収した。回収された溶液を６０℃で２０分間加熱し、加熱後は速やかに氷上で冷却した。冷却された溶液を６０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、再度、上清を回収（約１０ｍＬ）した。その溶液をディスクフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＰ  ０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）で粗い粒子を除去し、タンパク質粗抽出液を得た。
【０１０３】
続いて、そのタンパク質粗抽出液をそのタンパク質溶液からゲルろ過クロマトグラフィーを用いて、目的タンパク質画分を精製した。すなわち、そのタンパク質粗抽出液を５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＬｏａｒｄ  ２６／１０  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＵＳＡ）に注入した。そして、流速４．０ｍｌ／分、０ｍＭから５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、分離精製を行い、各蛋白質に相当する画分を回収した。その後、限外ろ過膜（ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０、１０，０００  ＭＷＣＯ  ＰＥＳ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ）を用いて濃縮し、タンパク質溶液の溶媒を水あるいは５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。溶液中のタンパク質濃度はＬｏｗｒｙ法により決定した。
【０１０４】
また、ＤｐｓやＣ末端にチタン結合ペプチドｍｉｎＴＢＰ１が融合されたＤｐｓ（Ｄｐｓ−ｍｉｎＴＢＰ１と呼ぶ）、Ｎ末端に炭素素材結合ペプチドＮＨＢＰ−１が融合され、Ｃ末端にチタン結合ペプチドｍｉｎＴＢＰ１が融合されたＤｐｓ（ＣＤＴ１と呼ぶ）やＮ末端にＮＨＢＰ１が融合されたＤｐｓ（ＮＨＢＰ−ＤｐｓあるいはＣＤ１と呼ぶ）（Ｉ．  Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０１１，ｖｏｌ．４７．，ｐ．１２６４９を参照）の精製も同様にして行った。
【０１０５】
【表３】
2015082985.tif 000005
【０１０６】
実施例５：チタン析出能力の評価
続いて、各ペプチドのチタン析出能力を評価するために、各ペプチドと融合したＤｐｓのチタン析出能力を評価した。すなわち、変異型Ｄｐｓ（Ｄｐｓ−ＳＴ１、Ｄｐｓ−Ｔｉ２、Ｄｐｓ−Ｔｉ３、Ｄｐｓ−Ｔｉ４、Ｄｐｓ−Ｔｉ５、Ｄｐｓ−Ｔｉ７３１、Ｄｐｓ−Ｔｉ（Ｓｉ）、Ｄｐｓ−Ｖｒｅｕｌｓ、ＣＤＴ１）を各々終濃度０．０１ｍｇ／ｍｌ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ（ＩＶ）  ｂｉｓ（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｌａｃｔａｔｏ）ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社、３８８１６５）を終濃度が３．０重量％となるように加えた５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に加え、室温で６時間放置した後、６６０ｎｍの吸光を測定し、タンパク質のみを含まない溶液をバックグラウンドとした。反応容量は０．２ｍｌとして実験を行った。
【０１０７】
その結果、ＳＴ１が融合されたＤｐｓにおいて最も高い吸光度を観察でき、最も多くのチタン化合物が析出していた。また、既知のペプチドでは、ｍｉｎＴＢＰ１、Ｔｉ４およびＴｉ５が融合されたＤｐｓにおいても顕著な吸光度の向上が確認でき、それらのペプチドにはチタン析出能力があることが示唆された（図２）。そして、ＳＴ１が融合されたＤｐｓでのチタン析出は、既知のペプチドが融合されたＤｐｓの最低でも１．５倍であることが示唆された。
【０１０８】
続いて、変異型Ｄｐｓ（Ｄｐｓ−ＳＴ１、ＣＤＴ１、Ｄｐｓ−Ｔｉ５）について、チタン析出の経時変化を測定し、各タンパク質のチタン析出能力を評価した。すなわち、変異Ｄｐｓを各々終濃度０．０１ｍｇ／ｍｌ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ（ＩＶ）  ｂｉｓ（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｌａｃｔａｔｏ）ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社、３８８１６５）を終濃度３．０重量％となるように加えた５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に加え、室温放置し、一時間ごとに６６０ｎｍの吸光を測定した。そして得られた吸光度の変化から、数式２に則り、チタン析出活性を求めた。
その結果、今回測定されたすべての変異型Ｄｐｓ（Ｄｐｓ−ＳＴ１、ＣＤＴ１、Ｄｐｓ−Ｔｉ５）において時間と共に吸光度が上昇する様子を確認できた（図３）。そして、Ｄｐｓ−ＳＴ１は、他のペプチドを提示したＤｐｓと比較して、約２倍チタン析出活性が高いことが示唆された（図４）。
【０１０９】
【数２】
2015082985.tif 000006
【０１１０】
実施例６：チタン結合能力の評価
変異型Ｄｐｓ（Ｄｐｓ−ＳＴ１、Ｄｐｓ−ｍｉｎＴＢＰ１、Ｄｐｓ−Ｔｉ５、Ｄｐｓ、ＣＤＴＳ１、ＣＤＴ１、ＣＤ１）を用いてＳＴ１のチタン結合能力を、チタンセンサーを使った水晶マイクロバランス振動法（ＱＣＭ）により評価した。
【０１１１】
はじめに、洗浄液（９８％（ｗ／ｖ）硫酸と３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素水を３対１で混合した溶液）３μｌを、測定用のチタンセンサー上に乗せ５分間放置した後、水で洗い流すことでセンサー表面を洗浄した。この洗浄工程を３回行った。センサーを乾燥させた後、チタンセンサーを本体（Ａｆｆｉｎｉｘ  ＱＮμ、Ｉｎｉｔｉｕｍ社）に取り付け、チタンセンサーにＴＢＴ緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、０．００１容量％  ｔｗｅｅｎ−２０を含む。ｐＨ８．０）を適当量滴下し、３０分から一時間室温で放置することで、センサーの周波数値を安定させた。周波数値が安定した後、反応溶液量が５００μｌ、終濃度が２０ｎＭから８００ｎＭとなるように各タンパク質を添加し、周波数の変化を測定した。そして得られた周波数の変化が、以下の関係に則ると仮定して、解析ソフトＡＱＵＡ  （Ｉｎｉｔｉｕｍ社）を用いて各タンパク質とチタンの結合速度定数ｋｏｎと解離速度定数ｋｏｆｆを求めた。Ｄｐｓ−ＳＴ１の分子量は２３３ｋＤａ、Ｄｐｓ−ｍｉｎＴＢＰ１の分子量は２２６ｋＤａ、Ｄｐｓ−Ｔｉ５の分子量は２３５ｋＤａ、Ｄｐｓの分子量は２１２ｋＤａ、ＣＤＴＳ１の分子量は２５４ｋＤａ、ＣＤＴ１の分子量は２４５ｋＤａ、ＣＤ１の分子量は２３４ｋＤａとして計算した。
【０１１２】
その結果、Ｄｐｓ−ＳＴ１とＤｐｓ−ｍｉｎＴＢＰ１、Ｄｐｓのチタンセンサーに結合する様子は、図５のように経時的に検出できた。そして、各タンパク質の結合定数を図６に示す。
【０１１３】
すなわち、ＳＴ１が融合されたＤｐｓはチタン結合ペプチドを持たないＤｐｓと比較して１７倍から３７倍、ｍｉｎＴＢＰ１が融合されたＤｐｓと比較しても約５倍から７倍以上の強いチタン結合能力を持つことが分かった。
【０１１４】
実施例７：ＣＮＴとＣＤＴＳ１とのナノ複合体形成
ＣＮＴとＣＤＴＳ１とのナノ複合体を形成するために、ＣＮＴとＣＤＴＳ１とを含むリン酸カリウム緩衝液［５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ６．０）、０．２ｍｇ／ｍＬのＣＤＴＳ１、及び０．１ｍｇ／ｍＬ  ＣＮＴ（Ｓｉｇｍａ社、５１９３０８，  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅ，  ｓｉｎｇｌｅ  ｗａｌｌｅｄ）を各々終濃度で含む］を調製した。ＣＤＴＳ１を含むリン酸カリウム緩衝液に、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ社、ＵＳＡ）を用いて、氷上で、３秒間隔で１秒間の超音波パルス（２００Ｗ、Ｄｕｔｙ  ２０％）を合計５分間加えた。超音波処理されたＣＤＴＳ１−ＣＮＴ混合溶液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、沈殿を回収し、多数のＣＤＴＳ１がＣＮＴに結合したＣＮＴ／ＣＤＴＳ１複合体を得た。
【０１１５】
結果を図７に示す。図７は、ＣＮＨＢＰ−Ｄｐｓ−ＳＴ１（ＣＤＴＳ１）とＣＮＴとの複合体の透過型電子顕微鏡像を示す図である。撮影は、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ３１００−ＦＥＦ、３００ｋＶ）にて、複合体を３％リンタングステン酸で染色して行った。結果として、ＣＤＴＳ１とＣＮＴとが複合体を形成していることがわかった。
【０１１６】
実施例８：ＣＮＴ／ＣＤＴＳ１／Ｔｉ複合体の調製例
得られたＣＮＴ／ＣＤＴＳ１複合体溶液に、終濃度２．５ｗｔ％となるようにチタン前駆体Ｔｉｔａｎｉｕｍ（ＩＶ）  ｂｉｓ（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｌａｃｔａｔｏ）ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社、３８８１６５）を加え、室温（２４℃）で放置した。そして、反応を開始して６時間後のサンプルを遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）して、沈殿を回収した。得られた沈殿を水で３回洗浄し、最後に水に懸濁した。得られたサンプルを、３％リンタングステン酸で染色し、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ３１００−ＦＥＦ、３００ｋＶ）にて、電子顕微鏡解析した。
【０１１７】
電子顕微鏡解析の結果を図８に示す。図８は、ＣＮＨＢＰ−Ｄｐｓ−ＳＴ１（ＣＤＴＳ１）とＣＮＴとの複合体にチタン前駆体を添加して得られた黒い析出物の透過型電子顕微鏡像を示す図である。すなわち、繊維状のＣＮＴの周囲にカゴ状タンパク質ＣＤＴＳ１が吸着し、全体を黒いマトリックスが覆っているロット状の構造物を観察することができた。
【０１１８】
この得られたロット状構造物を、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ３１００−ＦＥＦ、３００ｋＶ）を用いて、電子エネルギー損失分光法（ＥＥＬＳ）マッピングによる組成分析を行った。サンプルは無染色で解析を行った。結果を図９に示す。図９において、ＴＥＭは通常の電子顕微鏡像を示す。「Ｃａｒｂｏｎ」は炭素原子、「Ｔｉｔａｎｉｕｍ」はチタン原子、「Ｉｒｏｎ」は鉄原子、がそれぞれ確認された位置を示す。「Ｃａｒｂｏｎ」および「Ｔｉｔａｎｉｕｍ」の像ではＴＥＭ像で観察されたロッド状の構造物の位置が白く観察され、各原子が存在することを確認できた。一方、「Ｉｒｏｎ」では、像の全面が均一に観察され、ロッド状構造物に鉄原子は含有されていないことが確認できた。
よって、チタン前駆体が添加されたＣＮＴ／ＣＤＴＳ１ナノ複合体溶液を観察したときに見られるロッド状の構造物には少なくとも、炭素原子とチタン原子が含まれていることが分かった。この結果は、ＣＮＴと結合したＣＤＴＳ１のチタン析出活性を利用することで、ＣＮＴ／ＣＤＴＳ１の複合体（ナノ複合体）の周囲をチタンで被膜し、ＣＮＴ／ＣＤＴＳ１／Ｔｉの複合体（ナノ複合体）が合成できることがわかった。
【０１１９】
実施例９：変異型チタン結合ペプチドを提示したカゴ状タンパク質の構築
ＳＴ１（ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＦＭＳ（配列番号３））のチタン結合能力に必要なアミノ酸を特定すべく、ＳＴ１ペプチド配列内のアミノ酸をそれぞれアラニン（Ａ）あるいはグリシン（Ｇ）に置き換えられた配列を持つペプチドがＣ末端に融合されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａの金属内包性タンパク質Ｄｐｓを下記の手順によりそれぞれ構築した。各変異ＤｐｓがＣ末端に持つペプチド配列と構築に用いた特異的プライマーを表４に示す。
【０１２０】
はじめに、Ｄｐｓ−ＳＴ１遺伝子が搭載されたｐＥＴ２０を鋳型ＤＮＡとして、５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号７８）と表４に示す各ヌクレオチド配列からなる特異的プライマーオリゴヌクレオチドを組み合わせてＰＣＲを実施した。
得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）で精製し、制限酵素ＤｐｎＩとＢａｍＨＩで消化した。制限酵素で消化されたＰＣＲ産物を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を用いてセルフライゲーションさせた。セルフライゲーションされたＰＣＲ産物をＥＣＯＳＴＭ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ニッポンジーン社、日本）に形質転換し、Ｃ末端に各チタン結合ペプチドが融合されたＤｐｓをコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＳＴ１−１Ｇ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＳＴ１−２Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＳＴ１−３Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＳＴ１−４Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＳＴ１−５Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＳＴ１−６Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＳＴ１−７Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＳＴ１−８Ｇ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＳＴ１−９Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＳＴ１−１０Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＳＴ１−１１Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−ＳＴ１−１２Ａ）を保持したＢＬ２１（ＤＥ３）を構築した。その形質転換株からＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を使って各ベクターを精製し、搭載された変異Ｄｐｓ遺伝子配列を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、Ｄｐｓ−ＳＴ１−１Ｇ、Ｄｐｓ−ＳＴ１−２Ａ、Ｄｐｓ−ＳＴ１−３Ａ、Ｄｐｓ−ＳＴ１−４Ａ、Ｄｐｓ−ＳＴ１−５Ａ、Ｄｐｓ−ＳＴ１−６Ａ、Ｄｐｓ−ＳＴ１−７Ａ、Ｄｐｓ−ＳＴ１−８Ｇ、Ｄｐｓ−ＳＴ１−９Ａ、Ｄｐｓ−ＳＴ１−１０Ａ、Ｄｐｓ−ＳＴ１−１１Ａ、Ｄｐｓ−ＳＴ１−１２Ａｓの発現を確認でき、タンパク質発現用株を得ることができた。得られたタンパク質はＤｐｓ−ＳＴ１やＣＤＴＳ１と同様にして精製し、濃縮後、濃度決定された。
【０１２１】
【表４】
2015082985.tif 000007
【０１２２】
実施例１０：チタン結合能力の評価
先に構築された変異型Ｄｐｓ−ＳＴ１（ＳＴ１：ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＦＭＳ（配列番号３））ペプチド配列内のアミノ酸がそれぞれ１つずつ、アラニン（Ａ）あるいはグリシン（Ｇ）に置き換えられた配列を持つペプチドがＣ末端に融合されたＤｐｓ）のチタンへの結合能力を、チタンセンサーを使った水晶マイクロバランス振動法（ＱＣＭ）により評価した。
【０１２３】
はじめに、ピランハ液（濃硫酸と３０％過酸化水素水を３対１で混合した溶液）で洗浄されたチタンセンサーを本体（Ａｆｆｉｎｉｘ  ＱＮμ、イニシアム社）に取り付け、チタンセンサーにトリス緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，０．００１ｖｏｌ％  ｔｗｅｅｎ−２０を含む。ｐＨ８．０）を適当量滴下し、３０分から１時間室温で放置することで、センサーの周波数値を安定させた。周波数値が安定した後、反応溶液量が５００  μｌ、終濃度が４０−８０ｎＭとなるように各タンパク質を添加し、周波数の変化を測定した。そして各タンパク質を用いて得られた周波数の変化をチタン結合能力のないＤｐｓの周波数変化を１として比較した。
【０１２４】
その結果、ＳＴ１ペプチドのアミノ酸配列（ＡＹＰＱＫＦＮＮＮＦＭＳ（配列番号３））のうち、１番目のアラニン（Ａ）、３番目のプロリン（Ｐ）、４番目のグルタミン（Ｑ）、５番目のリジン（Ｋ）そして１２番目のセリン（Ｓ）がそれぞれ別のアミノ酸に置き換えられたペプチドはチタンへの結合力をほぼ失うことが分かった（図１０）。そして、２番目のチロシン（Ｙ）、６番目のフェニルアラニン（Ｆ）、１０番目のフェニルアラニン（Ｆ）、１１番目のメチオニン（Ｍ）を別のアミノ酸に置き換えた場合では、チタンへの結合力が低下することが分かった。そして、７番目から９番目のアスパラギン（Ｎ）の置換はチタンへの結合力に影響しないことが分かった。
【０１２５】
この結果は、ＳＴ１ペプチドの１番目のアラニン（Ａ）、３番目のプロリン（Ｐ）、４番目のグルタミン（Ｑ）、５番目のリジン（Ｋ）そして１２番目のセリン（Ｓ）がチタン結合機能に特に重要であることを示唆する。７から９番目のアスパラギンの置き換えが変化しなかった理由は、アスパラギンが３つ並んでいたため、そのうちの一つが欠けたからといってペプチドの電荷や機能には大きな影響がなかったと考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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