(57)【要約】【課題】本発明は、新しい二重特異性抗体融合タンパク質に関する。【解決手段】対象とする抗原に対する第１特異性を有する免疫グロブリン部分、例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含み、ジスルフィド結合によって連結されている、対象とする第２抗原に対する特異性を有する２つの単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）をさらに含む多価抗体融合タンパク質。Ｆａｂ又はＦａｂ’断片、及び単一ドメイン抗体間のジスルフィド結合によって安定化できる１つ又は複数の単一ドメイン抗体を含む、特定の二重特異性抗体融合タンパク質も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象とする抗原に対する第１特異性を有する免疫グロブリン部分、例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含み、対象とする第２抗原に対する特異性を有する２つの単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）をさらに含む多価抗体融合タンパク質であって、該２つの単一ドメイン抗体がジスルフィド結合によって連結されている、上記多価抗体融合タンパク質。
【請求項２】
前記第１抗原及び第２抗原が異なる実体である、請求項１に記載の多価抗体融合タンパク質。
【請求項３】
前記２つの単一ドメイン抗体がＶＨ／ＶＬ対である、請求項１又は２に記載の多価抗体融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＶＨｄＡｂが、Ｆａｂ又はＦａｂ’重鎖に直接的又は間接的に接続されている、請求項４に記載の多価抗体融合タンパク質。
【請求項５】
前記ＶＬｄＡｂが、Ｆａｂ又はＦａｂ’軽鎖重鎖に直接的又は間接的に接続されている、請求項４又は５に記載の多価抗体融合タンパク質。
【請求項６】
前記ＶＨｄＡｂが、Ｆａｂ又はＦａｂ’軽鎖に直接的又は間接的に接続されている、請求項４に記載の多価抗体融合タンパク質。
【請求項７】
前記ＶＬｄＡｂが、Ｆａｂ又はＦａｂ’重鎖に直接的又は間接的に接続されている、請求項４又は６に記載の多価抗体融合タンパク質。
【請求項８】
第２抗原がアルブミンである、請求項１から７までのいずれか一項に記載の多価抗体融合タンパク質。
【請求項９】
アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項８に記載の多価抗体融合タンパク質。
【請求項１０】
対象とする抗原に対する第１特異性を有する免疫グロブリン部分、例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含み、対象とする第２抗原に対する特異性を有し、ヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）をさらに含む二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記単一ドメイン抗体が、ＣＤＲ−Ｈ１に関して図５（ｅ）配列番号５６又は図５（ｋ）配列番号６２に示された配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２に関して図５（ｆ）配列番号５７又は図５（ｌ）配列番号６３に示された配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｈ３に関して図５（ｇ）配列番号５８又は図５（ｍ）配列番号６４に示された配列を有するＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む重鎖ＶＨ単一ドメイン抗体である上記二重特異性抗体融合タンパク質。
【請求項１１】
対象とする抗原に対する第１特異性を有する免疫グロブリン部分、例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含み、対象とする第２抗原に対する特異性を有し、ヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）をさらに含む二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記単一ドメイン抗体が、ＣＤＲ−Ｌ１に関して図５（ｈ）配列番号５９又は図５（ｎ）配列番号６５に示された配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２に関して図５（ｉ）配列番号６０又は図５（ｏ）配列番号６６に示された配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３に関して図５（ｊ）配列番号６１又は図５（ｐ）配列番号６７に示された配列を有するＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む軽鎖ＶＬ単一ドメイン抗体である上記二重特異性抗体融合タンパク質。
【請求項１２】
対象とする抗原に対する第１特異性を有する免疫グロブリン部分、例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含み、対象とする第２抗原に対する特異性を有し、ヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）をさらに含む二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記単一ドメイン抗体が、配列番号５６に示された配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号５７に示された配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号５８に示された配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号５９に示された配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号６０に示された配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６１に示された配列を有するＣＤＲＬ３から選択される１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む上記二重特異性抗体融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新しい二重特異性抗体融合タンパク質に関する。かかる抗体は、対象とする抗原への第１特異性、及び対象とする第２抗原に対する第２特異性を含み、例えば、それらのインビボでの血清半減期を延長させるのに使用するための血清担体タンパク質である。かかる分子及びそれらを含む医薬組成物を産生するための方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、その特異性及び親和性が高いと、特にタンパク質間相互作用を調節するための、理想的な診断及び治療の作用剤になる。組換え抗体技術の分野の進歩は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片並びに他の抗体断片などの抗体断片の産生をもたらした。これらのより小さい分子は、全抗体の抗原結合活性を保持し、全免疫グロブリン分子と比較して、改善された組織浸透性及び薬物動態学的特性も示すことができる。実際に、抗体断片は、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）及びＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）などの製品に最近成功したことによってわかったように、多用途の治療剤であることが判明している。かかる断片は、完全免疫グロブリンに優るいくつもの利点を示すようであるが、インビボでの長い寿命をもたらすＦｃドメインを欠くため、血清からのクリアランス速度が上昇するという欠点がある（Ｍｅｄａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：２２１１−２２１７）。
【０００３】
二重特異性を有する、すなわち２つの異なる抗原に結合する抗体は、以前に記載されている（レビューに関しては、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：５５８−５６２；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ＆Ｐａｃｋ、１９９７、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：８３−１０５；Ｆｉｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｇｅｒ、２００７、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ、７４、３−１４を参照されたい）。二重特異性抗体は、ＷＯ０２／０２７７３、ＵＳ２００７０６５４４０、ＵＳ２００６２５７４０６、ＵＳ２００６１０６２０３及びＵＳ２００６２８０７３４にも記載されている。ヘテロ二重特異性抗体ベースの分子をつくるための以前のアプローチは、一般的に化学的架橋結合又はタンパク質工学技術を採用している。化学的架橋結合は、ヘテロ及びホモ二量体形成の乏しい産生率、及び続くそれらのクロマトグラフィの分離の必要性に悩まされる。タンパク質工学のアプローチは、高度に精巧であるか（例えば、ノブイントゥホール工学；Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９（７）：６１７−６２１）、不適切な安定特性を有する分子を使用するか（例えば、ディアボディ、ｓｃＦｖ）のいずれかである。いくつかの場合では、二重特異性抗体は、両抗原が、抗体の各腕に同時に結合できないほどの立体障害の問題にも悩まされ得る。
【０００４】
単一可変ドメイン抗体は、単一ドメイン抗体又はｄＡｂとしても知られ、抗体の重鎖（ＶＨ）又は軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に相当する。マウス単一ドメイン抗体は、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４−５４６に記載された。ヒト及び「ラクダ化」ヒト単一ドメイン抗体も記載されている（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００３、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１、４８４−４９０）。単一ドメイン抗体は、ラクダ科（ラクダ及びラマ）及び軟骨魚類（ウォビゴン及びテンジクザメ）からも得ている。これらの生物は、（ラクダ科ではＶｈＨ及びサメではＶ−ＮＡＲと呼ばれる）高い親和性の単一Ｖ様ドメインを進化させており、それらの免疫系の不可欠で重要な構成成分として、Ｆｃ同等の定常ドメインのフレームワーク上に載っている（総説に関しては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３（９）：１１２６−１１３６を参照されたい）。
【０００５】
単一ドメイン抗体−酵素融合物は、ＥＰ０３６８６８４に記載されている。単一可変ドメインを含む、単一ドメイン−エフェクター群融合物も、ＷＯ２００４／０５８８２０に記載されている。二重可変ドメイン免疫グロブリンは、ＷＯ２００７／０２４７１５に記載されている。異なる特異性を有する２つの単一ドメイン抗体を含む二重特異的リガンドは、ＥＰ１５１７９２１に記載されている。
【０００６】
Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及び他の抗体断片などの抗体断片の半減期を改善する手段は既知である。１つのアプローチは、断片とポリマー分子をコンジュゲートすることである。したがって、動物中のＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２断片の短い循環半減期は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；例えば、ＷＯ９８／２５７９１、ＷＯ９９／６４４６０及びＷＯ９８／３７２００を参照されたい）とのコンジュゲートによって改善されている。別のアプローチは、ＦｃＲｎ受容体と相互作用する抗原とコンジュゲートすることによって抗体断片を修飾することである（例えば、ＷＯ９７／３４６３１を参照されたい）。半減期を延長させるさらに別のアプローチは、血清アルブミンを結合させるポリペプチドを使用することである（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１２：７５０−７５６；ＥＰ０４８６５２５；ＵＳ６２６７９６４；ＷＯ０４／００１０６４；ＷＯ０２／０７６４８９及びＷＯ０１／４５７４６を参照されたい）。しかし、それらはＦｃＲｎ受容体と相互作用するため、長い半減期を有するものの代替手段として、ＰＥＧとのコンジュゲートによる化学的修飾又はヒト血清アルブミンとのコンジュゲートなしに、インビボでの長い半減期を有する抗原結合性免疫グロブリンタンパク質を産生する必要性が依然として残っている。
【０００７】
様々なタンパク質が血漿中に存在し、サイロキシン結合性タンパク質、トランスサイレチン、α１−酸性糖タンパク質、トランスフェリン、フェブリノーゲン及びアルブミン又はそれらのいずれかの断片が挙げられる。血清担体タンパク質は、数日、例えば、サイロキシン結合性タンパク質に関しては５日、又はトランスサイレチンに関しては２日（Ｂａｒｔａｌｅｎａ＆Ｒｏｂｂｉｎｓ、１９９３、Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｉｎ  Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１３：５８３−５９８）、又はヨウ素化したα１−酸性糖タンパク質のターンオーバーの第２相では６５時間（Ｂｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９８６、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．１１：３３６−３４２）と測定された半減期で、体内を循環する。Ｇｉｔｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．からのデータ（１９６４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０：１９３８−１９５１）は、妊婦等において、α１−酸性糖タンパク質の半減期は３．８日、トランスフェリンに関しては１２日、及びフィブリノーゲンに関しては２．５日であることを示唆する。血清アルブミンは、男性では約１９日の半減期を有する、血管及び血管外の両区画で豊富なタンパク質である（Ｐｅｔｅｒｓ、１９８５、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．３７：１６１−２４５）。これは、約２１日であるＩｇＧ１の半減期と似ている（Ｗａｌｄｅｍａｎ＆Ｓｔｒｏｂｅｒ、１９６９、Ｐｒｏｇｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ、１３：１−１１０）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、組換えによって産生でき、２つの抗原、特に別個の／異なる２つの抗原と同時に結合できる、改良した二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
【０００９】
したがって、本発明は、免疫グロブリン部分、例えば、対象とする抗原に対する第１特異性を有するＦａｂ又はＦａｂ’断片を含み、対象とする第２抗原に対する特異性を有する単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）をさらに含む二重特異性抗体融合タンパク質であって、特に第１抗原及び第２抗原が異なる実体である上記二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
【００１０】
本明細書で採用されるような多価とは、２つ以上の結合部位、例えば２つの結合部位などの２又は３つの結合部位を有する実体を指すものとする。各結合部位は、同じ抗原上の同じエピトープ又は異なるエピトープに結合でき、又は異なる（別個の）抗原と結合することができる。
【００１１】
本発明は、免疫グロブリン部分、例えば、対象とする抗原に対する第１特異性を有するＦａｂ又はＦａｂ’断片を含み、対象とする第２抗原に対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体をさらに含む二重特異性抗体融合タンパク質も提供する。
【００１２】
本発明の二重特異性抗体融合物は、対象とする２つの抗原と選択的に結合することができよう。
【００１３】
一実施形態では、第１及び第２抗原は、同じ抗原である。
【００１４】
一実施形態では、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片が結合する、対象とする抗原は、細胞結合型タンパク質、例えば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞又は腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面タンパク質であってよく、又はそれは可溶性タンパク質であってよい。対象とする抗原は、疾患又は感染の間にアップレギュレートされるそれらのタンパク質などの、医学的に関連する任意のタンパク質、例えば、受容体及び／又はそれらの対応するリガンドであってもよい。細胞表面タンパク質の特定の例には、接着分子、例えば、例としてＶＬＡ−４などのβ１インテグリンなどのインテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、デュデュリン２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪球（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原並びにＶＥＧＦ、並びに適切な場合にはそれらの受容体が挙げられる。
【００１５】
可溶性抗原には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６又はＩＬ−１７などのインターロイキン、ウイルス抗原、例えば、呼吸器多核体ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、並びにＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−βなどの血小板由来増殖因子、並びに適切な場合にはそれらの受容体が挙げられる。他の抗原には、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ及びＣなどのウイルス、バイオテロリズムの作用剤、放射性核種及び重金属、並びにヘビ及びクモの毒液及び毒素が挙げられる。
【００１６】
一実施形態では、本発明の抗体融合タンパク質は、対象とする抗原の活性を機能的に変えるために使用することができる。例えば、抗体融合タンパク質は、前記抗原の活性を、直接的又は間接的に、中和、アンタゴナイズ又はアゴナイズすることができる。
【００１７】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質における単一ドメイン抗体（単数又は複数）が結合する、対象とする第２抗原は、細胞結合型タンパク質、例えば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞又は腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面タンパク質であってよく、又はそれは可溶性タンパク質であってよい。対象とする抗原は、疾患又は感染の間にアップレギュレートされるそれらのタンパク質などの、医学的に関連する任意のタンパク質、例えば、受容体及び／又はそれらの対応するリガンドであってもよい。細胞表面タンパク質の特定の例には、接着分子、例えば、例としてＶＬＡ−４などのβ１インテグリンなどのインテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、デュデュリン２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪球（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原並びにＶＥＧＦ、並びに適切な場合にはそれらの受容体が挙げられる。
【００１８】
可溶性抗原には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６又はＩＬ−１７などのインターロイキン、ウイルス抗原、例えば、呼吸器多核体ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、並びにＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−βなどの血小板由来増殖因子、並びに適切な場合にはそれらの受容体が挙げられる。他の抗原には、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ及びＣなどのウイルス、バイオテロリズムの作用剤、放射性核種及び重金属、並びにヘビ及びクモの毒液及び毒素が挙げられる。
【００１９】
単一ドメイン抗体（単数又は複数）が結合できる他の抗原には、血清担体タンパク質、細胞媒介性エフェクター機能の動員を可能にするポリペプチド、及び核種キレータータンパク質が挙げられる。
【００２０】
したがって、一例では、本発明は、対象とする抗原に対する第１特異性を有する免疫グロブリン部分を含み、第２タンパク質に対する特異性を有する単一ドメイン抗体をさらに含み、後者が、補体の経路の活性化及び／又はエフェクター細胞の動員などの、エフェクター機能の動員能をもたらす、二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。さらに、本発明の融合タンパク質は、核種キレータータンパク質と結合する単一ドメイン抗体のおかげで、放射性核種をキレート化するために使用することができる。かかる融合タンパク質は、イメージング又は放射性核種標的型の治療アプローチに役に立つ。
【００２１】
したがって、一例では、対象とする抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含む単離された二重特性抗体融合タンパク質であって、前記断片が、動員ポリペプチドに対する特異性を有する少なくとも１つのｄＡｂと融合しており、前記ｄＡｂが、前記動員ポリペプチドとの結合によって、細胞媒介性エフェクター機能（単数又は複数）を直接的又は間接的に動員する能力をもたらす上記単離された二重特性抗体融合タンパク質が提供される。
【００２２】
エフェクター機能の動員は、エフェクター機能が細胞に直接的に結合でき、前記細胞がその表面上で動員分子を運ぶことができる。間接的な動員は、ｄＡｂと動員分子の結合により、例えば、順にエフェクター機能を直接的又は間接的に動員できる因子、又はシグナル経路の活性化を媒介できる因子の放出が引き起こされるとき、起こり得る。例には、ＴＮＦα、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１７、ＩＦＮγ、ヒスタミン、Ｃ１ｑ、オプソニン、並びにＣ２、Ｃ４、Ｃ３−転換酵素及びＣ５からＣ９などの、古典的及び代替の補体活性化カスケードの他のメンバーが挙げられる。
【００２３】
本明細書で使用するとき、「動員ポリペプチド」には、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩなどのＦｃγＲ、これに限定されないが、Ｃ１ｑ及びＣ３などの補体経路のタンパク質、これに限定されないが、ＣＤ６８、ＣＤ１１５、ＣＤ１６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ２２などのＣＤマーカータンパク質（表面抗原分類マーカー）が挙げられる。さらに、ＣＤマーカータンパク質である動員ポリペプチドには、ＣＤ１、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２、Ｄ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０６、ＣＤ１１４、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１２０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ１６９、ＣＤ１８４、ＣＤ２０６、ＣＤ２０９、ＣＤ２５７、ＣＤ２７８、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３及びＣＤ３０４、又は細胞媒介性エフェクター機能を直接的又は間接的のいずれかで動員する能力を保持する任意のそれらの断片が挙げられる。動員ポリペプチドには、エフェクター機能を保有する、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ及びＩｇＡなどの免疫グロブリン分子も挙げられる。
【００２４】
一実施形態では、ｄＡｂが特異性を有する第２タンパク質は、補体経路のタンパク質であり、Ｃ１ｑが特に好ましい。
【００２５】
好ましい実施形態では、ｄＡｂが特異性を有する第２タンパク質は、ＣＤマーカータンパク質であり、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ１６及びＣＤ３５が特に好ましい。
【００２６】
したがって、対象とする抗原に対する特異性を有する抗体断片を含む単離された二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記断片が、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ１６及びＣＤ３５から成る群から選択されるＣＤ分子に対して特異性を有する少なくとも１つのｄＡｂと融合している、上記単離された二重特異性抗体融合タンパク質も提供される。
【００２７】
一実施形態では、単一ドメイン抗体（単数又は複数）により、第１特異性を有する免疫グロブリン部分に、延長された半減期をもたらす。
【００２８】
したがって、一実施形態では、対象とする抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含む二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記断片が、血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子又はＣＤ３５／ＣＲ１に対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体と融合しており、前記単一ドメイン抗体が、前記血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子又はＣＤ３５／ＣＲ１との結合によって、対象とする前記抗原に対する特異性を有する抗体断片に延長された半減期をもたらす、上記二重特異性抗体融合タンパク質が提供される。
【００２９】
一実施形態では、対象とする抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含む単離された二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記断片が、血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子又はＣＤ３５／ＣＲ１に対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体と融合しており、前記単一ドメイン抗体が、前記血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子又はＣＤ３５／ＣＲ１との結合によって、対象とする前記抗原に対する特異性を有する抗体断片に、延長された半減期をもたらす、上記単離された二重特異性抗体融合タンパク質が提供される。
【００３０】
本明細書で使用するとき、「血清担体タンパク質」には、サイロキシン結合性タンパク質、トランスサイレチン、α１−酸性糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン及びアルブミン、又は任意のそれらの断片が挙げられる。
【００３１】
本明細書で使用するとき、「循環免疫グロブリン分子」には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ｓＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＤ、又は任意のそれらの断片が挙げられる。
【００３２】
ＣＤ３５／ＣＲ１は、３６日の半減期を有する赤血球上に存在するタンパク質である（通常の範囲は２８から４７日；Ｌａｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９７１、Ｃａｎｃｅｒ、２８（３）：６５８−６６１）。
【００３３】
好ましい実施形態では、ｄＡｂが特異性を有する第２タンパク質は、血清担体タンパク質であり、ヒト血清担体タンパク質が特に好ましい。最も好ましい実施形態では、血清担体タンパク質は、ヒト血清アルブミンである。
【００３４】
したがって、対象とする抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含み、前記断片が、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体と融合された、二重特異性抗体融合タンパク質が提供される。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、対象とする抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含み、前記断片が、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体と融合された、単離された二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
【００３６】
一実施形態では、対象とする抗原に対する特異性を有する抗体断片は、Ｆａｂ断片である。別の実施形態では、対象とする抗原に対する特異性を有する抗体断片は、Ｆａｂ’断片である。
【００３７】
したがって、最も好ましい一実施形態では、本発明の抗体融合タンパク質は、翻訳融合タンパク質、すなわち遺伝子融合物、すなわち発現ベクターによってコードされる各配列である。或いは、抗体融合タンパク質の構成成分は、化学的手段を用いて、すなわち化学的コンジュゲーション又は化学的架橋によって融合した。かかる化学的手段は、当技術分野で既知である。
【００３８】
一例では、抗体断片は、天然又は修飾したヒンジ領域を保有するＦａｂ’断片である。本発明の二重特異性抗体融合タンパク質の調製に使用するための抗体断片が、Ｆａｂ’断片である場合、前記断片は、一般的に１つ又は複数のアミノ酸によって重鎖のＣ末端で伸長させる。したがって、本発明の抗体融合は、直接的に又はリンカーを介して、ｄＡｂと融合した（又は化学的に融合した）Ｆａｂ’断片の翻訳を含み得る。さらに、適した抗体Ｆａｂ’断片の例には、ＷＯ２００５００３１７０及びＷＯ２００５００３１７１に記載されたものが挙げられる。
【００３９】
別の実施例では、抗体断片はＦａｂ断片である。したがって、本発明の抗体融合物は、リンカー配列と融合された（又は化学的に融合された）Ｆａｂ断片翻訳物を含むことができ、前記リンカー配列は、ｄＡｂと融合された（又は化学的に融合された）翻訳物である。好ましくは、Ｆａｂ断片は、ＷＯ２００５／００３１６９に記載のように、鎖間のシステインで終止するＦａｂ断片である。
【００４０】
本発明で使用の抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片は、任意の種から得られるが、好ましくは、モノクローナル抗体、すなわちヒト抗体に由来し、又はヒト化断片である。本発明で使用するための抗体断片は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ又はＩｇＡ）又は免疫グロブリン分子のサブクラスに由来でき、例えば、マウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトが挙げられる任意の種から得ることができる。
【００４１】
一実施形態では、抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片は、完全ヒト、ヒト化又はキメラ化モノクローナル抗体断片である。一実施形態では、抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片は、完全ヒト又はヒト化である。
【００４２】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、２５６、４９５−４９７）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、１９８３、４、７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、「モノクローナル抗体及び癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、ｐｐ．７７−９６、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５）などの当技術分野で既知の任意の方法によって調製することができる。
【００４３】
本発明で使用するための抗体は、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ、Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６、９３（１５）、７８４３−７８４８、ＷＯ９２／０２５５１、ＷＯ２００４／０５１２６８及びＷＯ２００４／１０６３７７に記載の方法による特異的抗体の産生に選択された単一リンパ球からつくられた、免疫グロブリン可変領域のｃＤＮＡをクローニング又は発現することにより、単一リンパ球抗体法を使用してつくることもできる。
【００４４】
ヒト化抗体は、非ヒトの種に由来する１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する、非ヒトの種に由来する抗体分子である（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９を参照されたい）。
【００４５】
本発明に使用するための抗体は、当技術分野で既知の様々なファージ提示法を使用してつくることもでき、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２、４１−５０；Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４、１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４、２４、９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、１９９７  １８７、９−１８；及びＢｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、５７、１９１−２８０：ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２及びＷＯ９５／２０４０１並びにＵＳ５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３及び５，９６９，１０８に開示のものが挙げられる。トランスジェニックマウス又は他の哺乳類を含む他の生物を、ヒト化抗体をつくるために使用することもできる。
【００４６】
完全ヒト抗体は、重及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が、全てヒト由来であるか、実質的にヒト由来の配列と一致しているそれらの抗体であり、必ずしも同じ抗体由来ではない。完全ヒト抗体の例には、例えば、上記のファージ提示法によって産生された抗体、及びマウスの免疫グロブリンの可変及び／又は定常領域の遺伝子を、例えば、ＥＰ０５４６０７３Ｂ１、ＵＳ５，５４５，８０６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，７７０，４２９、ＥＰ０４３８４７４Ｂ１及びＥＰ０４６３１５１Ｂ１に一般的な言葉で記載されているような、それらのヒトのカウンターパートに置換したマウスによって産生された抗体が挙げられ得る。
【００４７】
本発明で使用するための抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の出発物質は、例えば、ペプシンを用いる処理によって、任意の適した酵素的開裂及び／又は消化の技法を使用して、任意の全抗体、特に全モノクローナル抗体から得ることができる。或いは、さらに、抗体の出発物質は、抗体の可変及び／又は定常領域をコードするＤＮＡの操作及び再発現に関わる組換えＤＮＡ技法の使用によって、調製することができる。標準的な分子生物学的技法を、所望のようなアミノ酸又はドメインの修飾、追加又は欠失に使用することができる。可変又は定常領域の任意の変化もやはり、本明細書で使用するとき、用語「可変」及び「定常」領域に包含される。
【００４８】
抗体断片の出発物質は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含む任意の種から得ることができる。抗体断片の部分は、１つ以上の種から得ることができ、例えば、抗体断片はキメラであってよい。一例では、定常領域は、ある種に由来し、可変領域は別の種に由来する。抗体断片の出発物質は、修飾することもできる。別の実施例では、抗体断片の可変領域は、組換えＤＮＡ工学技法を使用してつくり出した。かかる操作したバージョンには、例えば、天然抗体のアミノ酸配列中又はその配列への挿入、欠失又は変更によって、天然抗体の可変領域からつくり出したものが挙げられる。このタイプの特定の例には、少なくとも１つのＣＤＲ、並びに任意選択で、１つの抗体に由来する１つ又は複数のフレームワークのアミノ酸、及び第２抗体に由来する可変領域ドメインの残部を含む、それらの操作した可変領域ドメインが挙げられる。これらの抗体断片の作成及び製造の方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＵＳ４，８１６，３９７；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、ＵＳ６，３３１，４１５；Ｓｈｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ９２／０２５５１；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４；Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、３８３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３２２、３２３；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＵＳ５，５８５，０８９；Ａｄａｉｒ、ＷＯ９１／０９９６７；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ａｎｄ  Ａｄａｉｒ、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ、１０、１−１４２；Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５−１８１を参照されたい）。
【００４９】
本発明では、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片と融合される各単一ドメイン抗体は、直接的に又はリンカーを介して連結することができる。
【００５０】
本明細書で採用する、直接的に連結するとは、Ｆａｂ又はＦａｂ’の「最後の」アミノ酸を、単一ドメイン抗体の「最初の」アミノ酸とペプチド結合によってつなぐという事実を指すことを意図する（又は全く逆も同様）。
【００５１】
ｄＡｂとＦａｂ又はＦａｂ’を連結するための適したリンカー領域の例には、これに限定されないが、可動性リンカー配列及び硬性リンカー配列が挙げられる。可動性リンカー配列には、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、ＰＮＡＳ８５；５８７９−５８８３；Ｗｒｉｇｈｔ＆Ｄｅｏｎａｒａｉｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００７、４４（１１）：２８６０−２８６９；Ａｌｆｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、１９９５、８（７）：７２５−７３１；Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９５、１１８（４）：８２５−８３１；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２６）：１５６８２−１５６８６；及びＴｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、ＪＩＭＭ２０５、４２−５４に記載のものが挙げられる（代表例に関しては表１を参照されたい）。
【表１−１】
2015178536.tif 000002
【表１−２】
2015178536.tif 000003
【００５２】
硬性リンカーの例には、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号３４）、ＰＰＰＰ（配列番号３５）及びＰＰＰが挙げられる。
【００５３】
一実施形態では、ペプチドリンカーは、アルブミン結合性ペプチドである。アルブミン結合性ペプチドの例は、ＷＯ２００７／１０６１２０に提供され、次のものが挙げられる：
【表２】
2015178536.tif 000004
【００５４】
一実施形態では、抗体のヒンジ配列又はその部分は、リンカー、例えば、上側のヒンジ配列として使用する。一般的に、本発明で使用するための抗体Ｆａｂ’断片は、天然又は修飾したヒンジ領域を保有する。かかるヒンジ領域は、ｄＡｂ部分への天然リンカーとして使用する。天然ヒンジ領域は、通常、抗体分子のＣＨ１ドメインと結合したヒンジ領域である。修飾されたヒンジ領域は、天然ヒンジ領域とは長さ及び／又は組成が異なる任意のヒンジである。かかるヒンジには、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ、ラマ又はヤギのヒンジ領域などの任意の他の種に由来するヒンジ領域が挙げられ得る。他の修飾されたヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインのものとは異なるクラス又はサブクラスの抗体に由来する完全ヒンジ領域を含むことができる。したがって、例えば、クラスγ１のＣＨ１ドメインを、クラスγ４のヒンジ領域に結合させることができる。或いは、修飾されたヒンジ領域は、天然ヒンジの部分、又は反復中の各ユニットが天然ヒンジ領域に由来する反復ユニットを含み得る。さらに代替的には、１つ若しくは複数のシステイン又は他の残基を、アラニンなどの中性残基に変換することによって、或いは適切に配置された残基をシステイン残基に変換することによって、天然ヒンジ領域を変えることができる。かかる手段によって、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数を、増加又は減少させることができる。その上、軽鎖の鎖間システインからヒンジのシステイン（単数又は複数）の距離、ヒンジのシステイン間の距離、及び例えば、グリシンをヒンジに組み込むことにより回転可動性を増加でき、又はプロリンを組み込むことにより可動性を低下できる、可動性などのヒンジの特性に影響を与え得るヒンジ中の他のアミノ酸の組成などの、ヒンジの他の特徴を制御することができる。或いは、荷電又は疎水性残基の組み合わせを、ヒンジに組み込むことにより、多量体化の特性を与えることができ、例えば、荷電した又はイオン性の尾部、例えば、リンカーとしての酸性の尾部の使用に関しては、Ｒｉｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１４（１０）：７７５−７８３、及びロイシンジッパー配列に関しては、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（１）：１５４７−１５５３を参照されたい。他の修飾されたヒンジ領域は、完全に合成であってよく、長さ、組成及び可動性などの所望の特性を保有するように設計することができる。
【００５５】
多くの修飾されたヒンジ領域が、例えば、ＵＳ５，６７７，４２５、ＵＳ６６４２３５６、ＷＯ９９１５５４９、ＷＯ２００５００３１７０、ＷＯ２００５００３１６９、ＷＯ２００５００３１７０、ＷＯ９８２５９７１及びＷＯ２００５００３１７１にすでに記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。かかるヒンジは、一般的に、ＣＨ１領域から続いて生じるが、軽鎖のカッパ又はラムダ断片の定常領域の末端上に組み込むこともでき、例えば表３を参照されたい。
【表３】
2015178536.tif 000005
【００５６】
本発明で使用するための単一ドメイン抗体又はｄＡｂとしても知られている単一可変ドメインは、当技術分野で既知の方法を使用してつくることができ、ＷＯ２００５１１８６４２、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４−５４６及びＨｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００３、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１、４８４−４９０に開示のものが挙げられる。一実施形態では、本発明で使用するための単一ドメイン抗体は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又は軽鎖ドメイン（ＶＬ）である。各軽鎖ドメインは、カッパ又はラムダのサブグループのいずれかであってよい。ＶＨ及びＶＬドメインを単離するための方法は、当技術分野で記載されており、例えば、ＥＰ０３６８６８４  ａｎｄ  Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａを参照されたい。かかるドメインは、任意の適した種又は抗体の出発物質に由来することができる。一実施形態では、１つの単一ドメイン抗体は、げっ歯類、ヒト又は他の種に由来することができる。一実施形態では、単一ドメイン抗体はヒト化である。
【００５７】
一実施形態では、単一ドメイン抗体は、例えば、ＷＯ２００５／１１８６４２、Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２２、１１６１−１１６５及びＨｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００３、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１、４８４−４９０に記載の方法を用いて、ファージ提示ライブラリに由来する。好ましくは、かかる単一ドメイン抗体は、完全にヒトであるが、他の種に由来することもできる。一実施形態では、単一可変ドメインは、フレームワークがヒトであるか、実質的にヒト由来であり、ＣＤＲ（単数又は複数）が非ヒト由来である、キメラである。一度単離された単一ドメイン抗体の配列は、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａに記載のように、単一ドメイン抗体の特徴、例えば可溶性を改善するように修飾できることを、理解されよう。
【００５８】
本明細書で採用するとき、実質的にヒトとは、免疫原性に関連し得る、もととなる物質のヒトの特徴が保持されていることを指すことを意図している。実質的にヒトの物質には、フレームワーク配列における１つのアミノ酸が、別のアミノ酸に、追加、欠失又は置換されるものが挙げられよう。
【００５９】
一実施形態では、ｄＡｂは、ｓｃＦｖファージ提示又はトランスジェニックＨｕｍｏｕｓｅ（商標）若しくはＶｅｌｏｃｉｍｏｕｓｅ（商標）又はヒト化げっ歯類から得たヒト配列である。
【００６０】
一実施形態では、ｄＡｂは、ヒト又はヒト化げっ歯類、ラクダ科又はサメから得る。かかるｄＡｂは、好ましくは、ヒト化であろう。一例では、単一ドメイン抗体は、ＥＰ０６５６９４６に記載のような、ラクダ科免疫グロブリンに基づくＶＨＨドメインである。一例では、ラクダ又はラマは、対象とする抗原、及び力価が適切であるときに採取した血液を用いて免疫した。ｄＡｂをコードする遺伝子は、単一細胞ＰＣＲによってクローニングでき、又はｄＡｂをコードするＢ細胞（単数又は複数）は、ＥＢＶ形質転換、若しくは不死性細胞系との融合によって、不死化することができる。
【００６１】
本明細書で上記のように、本発明は、対象とする抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含む二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記断片が、対象とする第２抗原に対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体と直接的に又はリンカーを介して融合している、上記二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
【００６２】
したがって、一実施形態では、抗体断片、例えば、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片は、重鎖又は軽鎖の可変領域のＮ末端で、直接的に又はリンカーを介してｄＡｂと融合している。或いは、抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片は、重鎖又は軽鎖のＣ末端で、直接的に又はリンカーを介してｄＡｂと融合している。別の実施形態では、抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖又は軽鎖は、それぞれＣ末端で、直接的に又はリンカーを介してｄＡｂと融合している。リンケージは、化学的コンジュゲーションであってよいが、最も好ましくは、翻訳融合、すなわち、各配列が、発現ベクターによって配列中にコードされる遺伝子融合である。
【００６３】
一般的に、単一ドメイン抗体のＮ末端は、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖又は軽鎖のＣ末端と、直接的に又はリンカーを介して融合することになり、単一ドメイン抗体が、Ｆａｂ又はＦａｂ’のＮ末端と融合する場合、単一ドメイン抗体は、そのＣ末端を介して、任意選択でリンカーを介して融合されよう。
【００６４】
一実施形態では、本発明は、対象とする抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含むか、それから成る二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記断片が、対象とする第２抗原に対する特異性を有する単一ドメイン抗体と重鎖又は軽鎖のＮ末端で融合している、上記二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
【００６５】
一実施形態では、本発明は、対象とする抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含むか、それから成る二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記断片が、対象とする第２抗原に対する特異性を有する単一ドメイン抗体と、重鎖又は軽鎖のＣ末端で融合している、上記二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
【００６６】
一実施形態では、本発明は、対象とする抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含むか、それから成る二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記断片が、対象とする第２抗原に対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体と、重鎖又は軽鎖のＣ末端で融合している、上記二重特性抗体融合タンパク質を提供する。
【００６７】
一実施形態では、本発明は、対象とする抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含むか、それから成る二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記断片が２つの単一ドメイン抗体と融合しており、各単一ドメイン抗体が直鎖配列において、任意選択でリンカーを介して互いに融合しており、結果として生じる単一ドメイン抗体融合物が、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の軽鎖又は重鎖のＣ末端と融合している、上記二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
【００６８】
一実施形態では、本発明は、対象とする抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含むか、それから成る二重特異性抗体融合タンパク質であって、前記断片が２つの単一ドメイン抗体と融合しており、１つの単一ドメイン抗体がＦａｂ又はＦａｂ’断片の軽鎖のＣ末端と融合しており、他の単一ドメイン抗体がＦａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖のＣ末端と融合しており、前記単一ドメイン抗体が対象とする第２抗原に対する特異性を有する、上記二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
【００６９】
一実施形態では、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖及び軽鎖が、それぞれＣ末端で単一ドメイン抗体を含む場合、２つの単一ドメイン抗体は同一である、すなわち、同じ抗原に対する同じ結合特異性を有する。一例では、それらは同じ抗原上の同じエピトープと結合する。例えば、単一ドメイン抗体は、両方とも、同じＶＨｄＡｂ、同じＶＨＨｄＡｂ又は同じＶＬｄＡｂであってよい。
【００７０】
好ましくは、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖及び軽鎖が、それぞれＣ末端で単一ドメイン抗体を含む場合、２つの単一ドメイン抗体は、協同的に抗原と結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対である、すなわち、それらは、同じ結合特異性を有する相補的ＶＨ／ＶＬ対である。一般的には、それらは、同じ抗体に由来するＶＨ／ＶＬ対であろう。
【００７１】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質が、相補的ＶＨ／ＶＬ対である２つの単一ドメイン抗体を含む場合、ＶＨ単一ドメイン抗体は、重鎖の定常領域（ＣＨ１）のＣ末端と融合しており、ＶＬ単一ドメイン抗体は、軽鎖の定常領域（Ｃカッパ又はＣラムダ）のＣ末端と融合している。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質が、相補的ＶＨ／ＶＬ対である２つの単一ドメイン抗体を含む場合、ＶＬ単一ドメイン抗体は、重鎖の定常領域（ＣＨ１）のＣ末端と融合し、ＶＨ単一ドメイン抗体は、軽鎖の定常領域（Ｃカッパ又はＣラムダ）のＣ末端と融合している。
【００７２】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質が、１つ又は複数のジスルフィド結合によって連結されている２つの単一ドメイン抗体、例えば、１つ又は複数（１又は２つなど）のジスルフィド結合によって連結されている、相補的ＶＨ／ＶＬ対である２つの単一ドメイン抗体を含む場合、ＶＨ単一ドメイン抗体などは、重鎖の定常領域（ＣＨ１）のＣ末端と融合しており、ＶＬ単一ドメイン抗体は、軽鎖の定常領域（Ｃカッパ又はＣラムダ）のＣ末端と融合している。或いは、ＶＬ単一ドメイン抗体は、重鎖の定常領域（ＣＨ１）のＣ末端と融合しており、ＶＨ単一ドメイン抗体は、軽鎖の定常領域（Ｃカッパ又はＣラムダ）のＣ末端と融合している。
【００７３】
ジスルフィド結合は、構築物に追加の安定性を与えると考えられ、これは好都合であり得る。
【００７４】
１つ又は複数の実施形態では、ＣＨドメイン及びＣＬ又はＣＫドメイン間などの、重鎖及び軽鎖間のジスルフィド結合は、例えば、結合を形成する１つ又は複数のシステインが置換されるため、存在しない。前記１つ又は複数のシステインは、例えばセリンを用いて置換することができる。
【００７５】
１つ又は複数の実施形態では、ＣＨドメイン及びＣＬ又はＣＫドメイン間の、重鎖及び軽鎖間の鎖間ジスルフィド結合が存在する。
【００７６】
一実施形態では、１、２、３又は４つの単一ドメイン抗体、例えば、同じ又は異なる抗原を対象にできる２つの別々のＶＨ／ＶＬ対を含む、Ｆ（ａｂ）２断片が提供される。
【００７７】
本発明の二重特異性融合タンパク質では、単一ドメイン抗体（単数又は複数）は、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の構成成分と結合されるものとは異なる第２抗原と結合する。
【００７８】
一例では、本発明で使用するためのｄＡｂは、補体経路のタンパク質、ＣＤマーカータンパク質又はＦｃγＲに対して特異性を示す。この場合、ｄＡｂは、好ましくはＣＤ分子に対して特異的である。最も好ましくは、ｄＡｂは、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ１６及びＣＤ３５から成る群から選択されるＣＤ分子に対して特異性を示す。
【００７９】
好ましい実施例では、本発明で使用するためのｄＡｂは、血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子又はＣＤ３５／ＣＲ１に対する特異性を示し、血清担体タンパク質は、好ましくは、サイロキシン結合性タンパク質、トランスサイレチン、α１−酸性糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン又は血清アルブミンなどのヒト血清担体タンパク質である。最も好ましくは、ｄＡｂは、ヒト血清アルブミンに対する特異性を示す。したがって、一例では、ウサギ、マウス、ラット、ラクダ又はラマは、血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子又はＣＤ３５／ＣＲ１（例えば、ヒト血清アルブミン）及び力価が適切なときに採取した血液を用いて、免疫される。ｄＡｂをコードする遺伝子は、単一細胞ＰＣＲによってクローニングでき、又はｄＡｂをコードするＢ細胞（単数又は複数）は、ＥＢＶ形質転換又は不死性細胞系との融合によって、不死化することができる。或いは、単一ドメイン抗体は、本明細書で上記のようなファージ提示によって得ることができる。
【００８０】
一実施形態では、単一ドメイン抗体（単数又は複数）は、ヒト血清アルブミンと結合する。一実施形態では、単一ドメイン抗体（単数又は複数）は、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン及びラット血清アルブミンと結合する。
【００８１】
一実施形態では、血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ＷＯ２００５／１１８６４２で提供されたｄＡｂ（例えば、図１ｃ及び１ｄを参照されたい）、又はＷＯ２００４／０４１８６２で提供されたＶＨＨ、又は例えば、ＷＯ２００６／１２２７８７の表ＩＩＩに記載のヒト化ナノボディである。
【００８２】
一実施形態では、本発明で使用するための、ヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１に関して図５（ｅ）配列番号５６又は図５（ｋ）配列番号６２に示された配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２に関して図５（ｆ）配列番号５７又は図５（ｌ）配列番号６３に示された配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｈ３に関して図５（ｇ）配列番号５８又は図５（ｍ）配列番号６４に示された配列を有するＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む、重鎖ＶＨ単一ドメイン抗体である。
【００８３】
別の実施形態では、本発明で使用するための、ヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも２つが、ＣＤＲ−Ｈ１に関して配列番号５６又は配列番号６２に示された配列、ＣＤＲ−Ｈ２に関して配列番号５７又は配列番号６３に示された配列、及びＣＤＲ−Ｈ３に関して配列番号５８又は配列番号６４に示された配列から選択される重鎖ＶＨ抗体である。例えば、単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号５６に示された配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号５７に示された配列を有するＶＨドメインを含むことができる。或いは、単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号５６に示された配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が、配列番号５８に示された配列を有するＶＨドメインを含むことができる。誤解を避けるために、全ての並べ替えたものが含まれることは理解されよう。
【００８４】
別の実施形態では、本発明で使用するための、ヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ＶＨドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１に関して配列番号５６に示された配列、ＣＤＲ−Ｈ２に関して配列番号５７に示された配列、及びＣＤＲ−Ｈ３に関して配列番号５８に示された配列を含む、重鎖ＶＨ単一ドメイン抗体である。
【００８５】
別の実施形態では、本発明で使用するための、ヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ＶＨドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１に関して配列番号６２に示された配列、ＣＤＲ−Ｈ２に関して配列番号６３に示された配列、及びＣＤＲ−Ｈ３に関して配列番号６４に示された配列を含む、重鎖ＶＨ単一ドメイン抗体である。
【００８６】
一実施形態では、本発明で使用するための、ヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ヒト化重鎖ＶＨ単一ドメイン抗体であり、ｄＡｂＨ１が、図５（ａ）（配列番号５２）に示された配列を有する。Ｇ４Ｓリンカーを含む、適したＣＨ１−ｄＡｂＨ１融合物の例は、図６（配列番号６８）に示される。
【００８７】
一実施形態では、本発明で使用するための、ヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ヒト化重鎖ＶＨ単一ドメイン抗体であり、ｄＡｂＨ２が、図５（ｃ）（配列番号５４）に示された配列を有する。Ｇ４Ｓリンカーを含む、適したＣＨ１−ｄＡｂＨ２融合物の例は、図６（配列番号６９）に示される。
【００８８】
抗体の可変ドメインにおける残基は、ＫａＢａｔ  ｅｔ  ａｌ．によってデバイスされたシステムに従って、習慣的に順番付けられる。このシステムは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ（以降は「Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記を参照）」）に示されている。この順番付けシステムは、他に指示がある場合を除き、本明細書において使用する。
【００８９】
Ｋａｂａｔの残基指定は、アミノ酸残基の直鎖状の順番付けと、いつも直接的に対応するわけではない。実際の直鎖状のアミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワーク又は相補性決定領域（ＣＤＲ）であろうと、構造成分の短縮、又はそれへの挿入に相当する、厳密なＫａｂａｔ順番付けより、少ない又は追加のアミノ酸を含む場合がある。残基の正しいＫａｂａｔ順番付けは、「標準的な」Ｋａｂａｔ順番付けの配列を有する抗体の配列において、相同の残基のアラインメントによって、所与の抗体に関して決定することができた。
【００９０】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ順番付けシステムに従って、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６、９０１−９１７（１９８７））に従うと、ＣＤＲ−Ｈ１に相当するループは、残基２６から残基３２に延長する。したがって、本明細書で使用するとき、「ＣＤＲ−Ｈ１」は、Ｋａｂａｔ順番付けシステム及びＣｈｏｔｈｉａのトポロジー的ループ定義の組み合わせによって説明されるように、残基２６から３５を含む。
【００９１】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ順番付けシステムに従って、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。
【００９２】
一実施形態では、本発明で使用するための、ヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１に関して図５（ｈ）配列番号５９又は図５（ｎ）配列番号６５に示された配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２に関して図５（ｉ）配列番号６０又は図５（ｏ）配列番号６６に示された配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３に関して図５（ｊ）配列番号６１又は図５（ｐ）配列番号６７に示された配列を有するＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む、軽鎖ＶＬ単一ドメイン抗体である。
【００９３】
別の実施形態では、本発明で使用するための、ヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ＶＬドメインのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つが、ＣＤＲ−Ｌ１に関して配列番号５９又は配列番号６５に示された配列、ＣＤＲ−Ｌ２に関して配列番号６０又は配列番号６６に示された配列、及びＣＤＲ−Ｌ３に関して配列番号６１又は配列番号６７に示された配列から選択される軽鎖ＶＬ抗体である。例えば、ドメイン抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号５９に示された配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号６０に示された配列を有するＶＬドメインを含むことができる。或いは、ドメイン抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号５９に示された配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号６１に示された配列を有するＶＬドメインを含むことができる。誤解を避けるために、全ての並び変えたものが含まれることは理解されよう。
【００９４】
別の実施形態では、本発明で使用するための、ヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ＶＬドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１に関して配列番号５９に示された配列、ＣＤＲ−Ｌ２に関して配列番号６０に示された配列、及びＣＤＲ−Ｌ３に関して配列番号６１に示された配列を含む、軽鎖ＶＬドメイン抗体である。
【００９５】
別の実施形態では、本発明で使用するための、ヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ＶＬドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１に関して配列番号６５に示された配列、ＣＤＲ−Ｌ２に関して配列番号６６に示された配列、及びＣＤＲ−Ｌ３に関して配列番号６７に示された配列を含む、軽鎖ＶＬドメイン抗体である。
【００９６】
一実施形態では、本発明で使用するための、ヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ヒト化軽鎖ＶＬ単一ドメイン抗体であり、ｄＡｂＬ１が、図５（ｂ）（配列番号５３）に示された配列を有する。両方ともＧ４Ｓリンカーを含む、適したＣＨ１−ｄＡｂＬ１融合物及びＣｋ１−ｄＡｂＬ１融合物の例は、図６に示される（配列番号７０及び配列番号７２）。
【００９７】
一実施形態では、本発明で使用するための、ヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ヒト化軽鎖ＶＬ単一ドメイン抗体であり、ｄＡｂＬ２が、図５（ｄ）（配列番号５５）に示された配列を有する。両方ともＧ４Ｓリンカーを含む、適したＣＨ１−ｄＡｂＬ２融合物及びＣｋ１−ｄＡｂＬ２融合物の例は、図６に示される（配列番号７１及び配列番号７３）。
【００９８】
一実施形態では、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖及び軽鎖が、それぞれＣ末端で単一ドメイン抗体を含み、２つの単一ドメイン抗体が、本明細書で上記に記載のように、抗原と協同的に結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対である場合、ＶＨｄＡｂはｄＡｂＨ１（配列番号５２）であり、ＶＬｄＡｂはｄＡｂＬ１（配列番号５３）である。
【００９９】
一実施形態では、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の重及び軽鎖が、それぞれＣ末端で単一ドメイン抗体を含み、２つの単一ドメイン抗体が、本明細書で上記のように、抗原と協同的に結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対である場合、ＶＨｄＡｂはｄＡｂＨ２（配列番号５４）であり、ＶＬｄＡｂはｄＡｂＬ２（配列番号５５）である。
【０１００】
別の態様では、本発明は、本明細書の上記及び図５（ｅ−ｐ）に提供され、特に、配列番号５６に示された配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号５７に示された配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号５８に示された配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号５９に示された配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号６０に示された配列を有するＣＤＲＬ２、及び／又は配列番号６１に示された配列を有するＣＤＲＬ３を含む、１つ又は複数のＣＤＲを含む、アルブミン結合性抗体又はその断片を提供する。一実施形態では、アルブミン結合性抗体又は断片は、配列番号６２に示された配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号６３に示された配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号６４に示された配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号６５に示された配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号６６に示された配列を有するＣＤＲＬ２、及び／又は配列番号６７に示された配列を有するＣＤＲＬ３を含む。前記ＣＤＲは、任意の適した抗体フレームワーク及び任意の適した抗体フォーマットに組み込むことができる。かかる抗体には、全抗体及び機能的活性のある断片又はその誘導体が挙げられ、これに限定されないが、モノクローナル、ヒト化、完全ヒト又はキメラ化抗体であってよい。したがって、かかるアルブミン結合性抗体は、完全長の重及び軽鎖又はその断片を有する完全な抗体分子を含むことができ、これに限定されないが、Ｆａｂ、修飾されたＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、二価、三価又は四価抗体、ビスｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び上記の任意のエピトープ結合性断片（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１３６；Ａｄａｉｒ  ａｎｄ  Ｌａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ２（３）、２０９−２１７を参照されたい）であってよい。これらの抗体断片を作成及び製造するための方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５−１８１を参照されたい）。多価抗体は、複数の特異性を含むことができ、又は単一特異性であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。本発明のこの態様が、これらのアルブミン結合性抗体の変異体にも及ぶことは理解されよう。
【０１０１】
かかるアルブミン結合性抗体、特に単一ドメイン抗体が、任意の他の適した状況で所望又は使用されるときに、任意の他の抗体若しくはタンパク質又は他の分子にコンジュゲートできることは理解されよう。一例では、上記又は図５（ａ−ｄ）に示されるような、単一ドメイン抗体ｄＡｂＨ１、ｄＡｂＬ１、ｄＡｂＨ２、ｄＡｂＬ２は、任意の適した抗体フォーマットに組み込むことができ、又は任意の適した状況において、融合物又はコンジュゲートなどの単一ドメイン抗体として使用することができる。
【０１０２】
一実施形態では、本発明のこの態様の抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１に関して図５（ｅ）に示された配列、ＣＤＲ−Ｈ２に関して図５（ｆ）に示された配列、及びＣＤＲ−Ｈ３に関して図５（ｇ）に示された配列を含む。
【０１０３】
一実施形態では、本発明のこの態様の抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１に関して図５（ｋ）に示された配列、ＣＤＲ−Ｈ２に関して図５（ｌ）に示された配列、及びＣＤＲ−Ｈ３に関して図５（ｍ）に示された配列を含む。
【０１０４】
一実施形態では、本発明のこの態様の抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１に関して図５（ｈ）に示された配列、ＣＤＲ−Ｌ２に関して図５（ｉ）に示された配列、及びＣＤＲ−Ｌ３に関して図５（ｊ）に示された配列を含む。
【０１０５】
一実施形態では、本発明のこの態様の抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１に関して図５（ｎ）に示された配列、ＣＤＲ−Ｌ２に関して図５（ｏ）に示された配列、及びＣＤＲ−Ｌ３に関して図５（ｐ）に示された配列を含む。
【０１０６】
以下の抗体フォーマットでは、本明細書の配列リストからの各配列は、天然ポジション又は非天然ポジションに相当するポジションに位置することができる。天然ポジションは、リスト中の関連配列に関して標識されたＣＤＲＨ１ポジションＨ１、リスト中の関連配列に関して標識されたＣＤＲＨ２ポジションＨ２、リスト中の関連配列に関して標識されたＣＤＲＨ３ポジションＨ３、リスト中の関連配列に関して標識されたＣＤＲＬ１ポジションＬ１、リスト中の関連配列に関して標識されたＣＤＲＬ２ポジションＬ２、及びリスト中の関連配列に関して標識されたＣＤＲＬ３ポジションＬ３であろう。Ｈ１及びＨ２、Ｈ１及びＨ３、Ｈ１及びＬ１、Ｈ１及びＬ２、Ｈ１及びＬ３、Ｈ２及びＬ１、Ｈ２及びＬ２、Ｈ２及びＬ３、Ｈ２及びＨ３、Ｈ３及びＬ１、Ｈ３及びＬ２、Ｈ３及びＬ３、Ｈ１及びＨ２及びＨ３、Ｈ１及びＨ２及びＬ１、Ｈ１及びＨ２及びＬ２、Ｈ１及びＨ２及びＬ３、Ｈ２及びＨ３及びＬ１、Ｈ２及びＨ３及びＬ２、Ｈ２及びＨ３及びＬ３、Ｈ３及びＬ１及びＬ２、Ｈ３及びＬ１及びＬ３、Ｈ３及びＬ２及びＬ３、Ｌ１及びＬ２及びＬ３、Ｈ１及びＨ２及びＨ３及びＬ１、Ｈ１及びＨ２及びＨ３及びＬ２、Ｈ１及びＨ２及びＨ３及びＬ３、Ｈ２及びＨ３及びＬ１及びＬ２、Ｈ２及びＨ３及びＬ１及びＬ３、Ｈ２及びＨ３及びＬ２及びＬ３、Ｈ３及びＬ１及びＬ２及びＬ３、Ｈ１及びＨ２及びＨ３及びＬ１及びＬ２、Ｈ１及びＨ２及びＨ３及びＬ２及びＬ３、Ｈ１及びＨ２及びＨ３及びＬ１及びＬ３、Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＨ１及びＨ２、Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＨ１及びＨ３、Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＨ２及びＨ３、Ｈ１及びＨ２及びＨ３及びＬ１及びＬ２及びＬ３などのそれらの組み合わせも、予想される。
【０１０７】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号８８から９３から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１０８】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号９４から９９から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１０９】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１００から１０５から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１１０】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１０６から１１１から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１１１】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１１２から１１７から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１１２】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１１８から１２３から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１１３】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１２４から１２９から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１１４】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１３０から１３５から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１１５】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１３６から１４１から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１１６】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１４２から１４７から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１１７】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１４８から１５３から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１１８】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１５４から１５９から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１１９】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１６０から１６５から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１２０】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１６６から１７１から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１２１】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１７２から１７７から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１２２】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１７８から１８３から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１２３】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１８４から１８９から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１２４】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１９０から１９５から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１２５】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列、例えば、配列番号１９６から２０１から選択される、１、２、３、４、５又は６つの配列（単数又は複数）を含む。
【０１２６】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０２を含む。
【０１２７】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０３を含む。
【０１２８】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０２及び２０３を含む。
【０１２９】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０４を含む。
【０１３０】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０５を含む。
【０１３１】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０４及び２０５を含む。
【０１３２】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０６を含む。
【０１３３】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０７を含む。
【０１３４】
一実施形態では、開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０６及び２０７を含む。
【０１３５】
本発明の二重特異性融合タンパク質の単一ドメイン抗体（単数又は複数）が、アルブミンと結合する場合、アルブミンに対する単一ドメイン抗体の結合親和性は、インビボでのＦａｂ又はＦａｂ’の半減期を延長させるのに十分であろう。２．５μＭの親和性より少ないかそれと同等の、アルブミンに対する親和性が、インビボでの半減期を延長させることが報告された（Ｎｇｕｙｅｎ、Ａ．ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、１９（７）、２９１−２９７）。本発明の単一ドメイン抗体分子は、好ましくは、それらの目的、及びそれらが結合する抗原に適した結合親和性を有する。一例では、単一ドメイン抗体は、高い結合親和性、例えばピコモルを有する。一例では、単一ドメイン抗体は、ナノモル又はマイクロモルである、抗原に対する結合親和性を有する。親和性は、天然又は組換え抗原を使用する本明細書の実施例に記載のような、ＢＩＡｃｏｒｅが挙げられる、当技術分野において既知の任意の適した方法を使用して測定することができる。
【０１３６】
好ましくは、アルブミンと結合する本発明の単一ドメイン抗体分子は、約２μＭ又はよりよい結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗原分子は、約１μＭ又はよりよい結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体分子は、約５００ｎＭ又はよりよい結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体分子は、約２００ｎＭ又はよりよい結合親和性を有する。一実施形態では、本発明のドメイン抗体分子は、約１ｎＭ又はよりよい結合親和性を有する。本発明によって提供される、及び当技術分野で既知の単一ドメイン抗体の親和性は、当技術分野で既知の任意の適した方法を使用して、変えられることを理解されよう。したがって、本発明は、アルブミンに対する改善された親和性を有する、本発明のドメイン抗体分子の変異体にも関する。かかる変異体は、ＣＤＲの変異（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５４、３９２−４０３、１９９５）、チェインシャフリング（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９−７８３、１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異誘発株の使用（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５０、３５９−３６８、１９９６）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８、７２４−７３３、１９９７）、ファージ提示（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６、７７−８８、１９９６）及びセクシャルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９１、２８８−２９１、１９９８）が挙げられる、多くの親和性成熟プロトコルによって得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（上記）は、親和性成熟のこれらの方法を議論する。
【０１３７】
二重特性融合タンパク質の単一ドメイン抗体（単数又は複数）は、必要に応じて、単量体、二量体又は三量体として提供することができる。所望の産物は、物質がさらされる下流プロセシングのステップを調節することによって、得ることができる。一実施形態では、プロセシングされた物質は、実質的に同種の単量体として提供される。一実施形態では、プロセシングされた物質は、実質的に同種の二量体として提供される。一実施形態では、プロセシングされた物質は、実質的に同種の三量体として提供される。
【０１３８】
本発明は、本発明の二重特性抗体融合タンパク質をコードする、単離されたＤＮＡ配列も提供する。本発明のＤＮＡ配列は、例えば、化学的プロセシング、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はそれらの任意の組み合わせによって産生される合成ＤＮＡを含み得る。
【０１３９】
本発明の二重特性抗体融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、当業者によく知られている方法によって得ることができる。例えば、抗体断片、リンカー及び／又はｄＡｂの部分又は全てをコードするＤＮＡ配列は、決定されたＤＮＡ配列から、又は対応するアミノ酸配列に基づき、所望通り合成することができる。
【０１４０】
分子生物学の標準的技法を、本発明の二重特性抗体融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を調製するために、使用することができる。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技法を用いて、完全又は部分的に、合成することができる。部位特異的変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を、適切に使用することができる。
【０１４１】
本発明はさらに、本発明の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターに関する。したがって、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、クローニング又は発現ベクターが提供される。好ましい一実施形態では、クローニング又は発現ベクターは、完全な二重特異性抗体融合タンパク質をコードする単一ＤＮＡ配列を含む。したがって、クローニング又は発現ベクターは、翻訳融合タンパク質が産生されるような、配列における転写ユニットをコードするＤＮＡを含む。
【０１４２】
実際に、本発明の融合タンパク質が、Ｎ末端又はＣ末端でｄＡｂを有することができ、したがって、ｄＡｂＤＮＡコード化転写ユニットは、翻訳融合物をコードするＤＮＡ配列内の、それぞれ最初又は最後であろうことを、当業者は理解されよう。したがって、翻訳融合物は、Ｎ−末端のｄＡｂ及びＣ末端のＦａｂ又はＦａｂ’を含み得る。さらに、翻訳融合物は、Ｎ末端のＦａｂ又はＦａｂ’及びＣ末端のｄＡｂを含み得る。
【０１４３】
Ｆａｂ又はＦａｂ’の重鎖及び軽鎖が、同じ又は異なるベクターに組み込むことができると理解されよう。一実施形態では、あるベクターは、Ｆａｂ又はＦａｂ’の重鎖及びＣ末端のｄＡｂを含む翻訳融合物を含むことができ、別のベクターは、Ｆａｂ又はＦａｂ’の軽鎖及びＣ末端のｄＡｂを含む翻訳融合物を含むことができる。
【０１４４】
例えば、抗体断片のＮ末端部にｄＡｂ部分を有する二重特異性抗体融合タンパク質の産生を望む場合、ベクターは、次の配列順序のＤＮＡ転写ユニット；ｄＡｂ部分をコードするＤＮＡ転写ユニット、任意選択でリンカー配列をコードするＤＮＡ転写ユニット、及び抗体断片をコードするＤＮＡ転写ユニットを含むであろう。抗体断片のＣ末端部でｄＡｂ部分を有する二重特異性抗体融合タンパク質の産生を望む場合、ベクターは、次の配列順序のＤＮＡ転写ユニット；抗体断片をコードするＤＮＡ転写ユニット、任意選択で、リンカー配列をコードするＤＮＡ転写ユニット、及び血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子又はＣＤ３５／ＣＲ１、例えばヒト血清アルブミンに対する特異性を有するｄＡｂ部分をコードするＤＮＡ転写ユニットを含むであろう。したがって、本発明の翻訳融合物は、例えば、これに限定されないが、ｄＡｂ−リンカー−Ｆａｂ、Ｆａｂ−リンカー−ｄＡｂ、ｄＡｂ−Ｆａｂ、Ｆａｂ−ｄＡｂ、Ｆａｂ’−ｄＡｂ、ｄＡｂ−Ｆａｂ’、ｄＡｂ−リンカーＦａｂ’、Ｆａｂ’−リンカー−ｄＡｂを含む、異なる立体配置であってよい。２つのベクターが使用される場合、例えば、第１は、ｄＡｂと融合されるＦａｂ又はＦａｂ’の重鎖を含むことができ、第２は、ｄＡｂと融合されるＦａｂ又はＦａｂ’の軽鎖を含むことができる。
【０１４５】
本発明の翻訳融合物内に含まれる抗体断片に対するＤＮＡコードは、当業者に既知のような立体配置の転写ユニットとしてベクターに組み込むことができ、例えば、転写ユニットは、軽鎖に対するコードに続いて重鎖のコード又はその逆を含むことができ、特に、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２６：３０９−３２０を参照されたい。
【０１４６】
好ましくは、本発明によるベクターは、抗体のリーダー配列などの、適切なリーダー配列を含む。かかるリーダー配列は、当技術分野でよく知られている。
【０１４７】
ベクターを構築できる一般的な方法、すなわちトランスフェクション及び形質転換法及び培養法は、当業者によく知られている。この点においては、「分子生物学における最新のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮｅｗＹｏｒｋ、及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ出版によりつくられたＭａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌを参照とする。
【０１４８】
本発明の二重特異性抗体融合タンパク質をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。任意の適した宿主細胞／ベクター系は、二重特性抗体融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現に使用することができる。細菌、例えば大腸菌、及び他の微生物系を使用でき、又は真核生物、例えば哺乳類の宿主細胞の発現系も使用することができる。適した哺乳類宿主細胞には、ＮＳ０、ＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞が挙げられる。したがって、一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、大腸菌において発現する。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、哺乳類細胞において発現する。
【０１４９】
本発明は、二重特異性抗体融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列に由来するタンパク質の発現に適した条件下で、本発明のベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含む、前記二重特異性抗体融合タンパク質を産生するための方法も提供する。本発明はさらに、二重特異性抗体融合タンパク質を単離するための方法を提供する。
【０１５０】
産生において、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質は、必要な場合、当技術分野で既知の任意の適した方法を使用して、精製することができる。例えば、これに限定されないが、イオン交換、サイズ排除、プロテインＧ又は疎水性相互作用クロマトグラフィなどのクロマトグラフィ技法を使用することができる。
【０１５１】
二重特異性抗体融合タンパク質の大きさは、サイズ排除クロマトグラフィ及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの、当技術分野で既知の従来の方法によって確認することができる。かかる技法は、例えば、タンパク質が二量体化されなかった、及び／又は例えばｄＡｂ部分の部分欠損をもたないことを確認するために使用することができる。もし二量体が検出され、同種の単量体産物を必要とすれば、次いで単量体二重特異性抗体融合タンパク質を、上記のような従来のクロマトグラフィ技法を用いて、二量体種から離して精製することができる。
【０１５２】
本発明の二重特異性抗体融合タンパク質は、炎症性疾患及び障害、免疫疾患及び障害、線維障害及び癌を含む、疾患又は障害の治療に有用である。
【０１５３】
用語「炎症性疾患」又は「障害」及び「免疫疾患又は障害」は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、スチル症、マックルウェルズ疾患、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、血管炎、Ｉ型糖尿病、移植及び移植片対宿主病を含む。
【０１５４】
用語「線維障害」は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、全身性硬化症（又は強皮症）、腎線維症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、高血圧、末期全疾患、腹膜線維症（持続的外来腹膜透析）、肝硬変、加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）、網膜症、心臓反応性線維症、瘢痕、ケロイド、熱傷、皮膚潰瘍、血管形成術、冠動脈バイパス形成手術、関節形成術及び白内障手術を含む。
【０１５５】
用語「癌」は、皮膚、又はより一般には、身体器官の内側、例えば、乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃、膀胱又は腸で見られる、上皮から生じる悪性腫瘍を含む。癌は、隣接組織に浸潤し、離れた器官、例えば、骨、肝臓、肺又は脳に広がる（転移する）傾向がある。
【０１５６】
したがって、本発明のさらなる態様によって、１つ又は複数の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と関連する、本発明の抗体融合物を含む医薬組成物が提供される。疾患又は障害の治療用の薬物の製造のための、本発明の抗体融合タンパク質の使用も提供される。最も好ましくは、疾患又は障害は、炎症性疾患又は障害である。
【０１５７】
本発明による医薬組成物は、経口、口腔、非経口、皮下、経鼻、局所的、点眼若しくは直腸投与に適した形態、又は吸入若しくはガス注入による投与に適した形態をとることができる。
【０１５８】
必要に応じて、例えば、抗体融合タンパク質の単一ドメイン抗体（単数又は複数）がアルブミンに結合する場合、当技術分野で既知の任意の適した方法を用いて、ヒト又は組換え血清アルブミンを有する二重特異性融合タンパク質を、事前に処方することが望ましい可能性がある。
【０１５９】
医薬製剤が液体、例えば、水溶液又は懸濁液である場合、そのとき製剤は、アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、特に、組換えヒト血清アルブミンなどの組換えアルブミンを、さらに含むことができる。適した量は、製剤全体の２％ｗ／ｗより少ない、特に１、０．５又は０．１％ｗ／ｗより少ない範囲であってよい。これは、製剤中の抗体成分の安定化の助けとなり得る。医薬組成物は、水性溶媒を用いて、後の再構成のために凍結乾燥することができる。
【０１６０】
一実施形態では、本発明による凍結乾燥した「抗体」を含むバイアルなどの単位用量容器が提供される。
【０１６１】
経口投与のために、医薬組成物は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、フィラー（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース又リン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石又はシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン又はグリコール酸ナトリウム）又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの、薬学的に許容される賦形剤を用いる従来の手段によって調製される、例えば、錠剤、トローチ剤又はカプセルの形態をとることができる。錠剤は、当技術分野でよく知られている方法によってコートすることができる。経口投与のための液体薬剤は、例えば、水溶液、シロップ又は懸濁液の形態をとることができ、又はそれらは、使用する前の、水又は他の適した媒体との構成のための乾燥した生成物として示され得る。かかる液体薬剤は、懸濁剤、乳化剤、非水性媒体又は保存剤などの、薬学的に許容される添加物を用いる従来の手段によって、調製することができる。薬剤は、必要に応じて、緩衝塩、香味剤、着色剤又は甘味剤も含むことができる。
【０１６２】
経口投与用の薬剤は、活性化合物の制御された放出を可能にするように、適切に処方することができる。
【０１６３】
口腔投与のために、組成物は、従来のやり方で処方された錠剤又はトローチ剤の形態をとることができる。
【０１６４】
本発明の二重特異性抗体は、注射、例えば、ボーラス注射又は注入による非経口投与のために処方することができる。注射用の製剤は、単位投与量の形態、例えば、ガラス製アンプル又は複数回用量容器、例えばガラス製バイアルで示され得る。注射用の組成物は、油性の懸濁液、水溶液若しくは乳濁剤又は水性媒体のような形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤、保存剤及び／又は分散剤などの処方剤を含むことができる。或いは、活性成分は、使用する前に、可溶性媒体、例えば滅菌発熱性物質除去蒸留水と構成するために粉末形態であってもよい。
【０１６５】
上記の製剤に加えて、本発明の二重特異性抗体は、持続性薬剤として処方することもできる。かかる長時間作用型製剤は、インプランテーション又は筋肉内注射によって投与することができる。
【０１６６】
経鼻投与又は吸入による投与のために、本発明による化合物は、適した噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、フルオロトリクロロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素若しくは他の適したガス又はガスの混合物を使用して、加圧パック又は噴霧器用のエアロゾルスプレープレゼンテーションの形態で、便利に送達することができる。
【０１６７】
組成物は、必要であれば、活性成分を含む、１つ又は複数の単位投与量形態を含むことができるパック又はディスペンサー装置で示すことができる。パック又はディスペンサー装置は、投与のための指示が伴い得る。
【０１６８】
局所投与用の本発明による化合物は、薬学的に許容される１つ又は複数の担体中で懸濁又は溶解した活性成分を含む適した軟膏で、便利に処方することができる。特定の担体には、例えば、鉱物油、液体石油、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、乳化ワックス及び水が挙げられる。或いは、本発明による化合物は、薬学的に許容される１つ又は複数の担体中で懸濁又は溶解した活性成分を含む可溶性ローションで、処方することができる。特定の担体には、例えば、鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、ベンジルアルコール、２−オクチルドデカノール及び水が挙げられる。
【０１６９】
一実施形態では、製剤は、吸入を含む局所投与用の製剤として提供される。
【０１７０】
適した吸入可能な薬剤には、吸入可能な粉末、噴霧剤ガス又は噴霧剤ガスを含まない吸入可能な水溶液を含む測定式エアロゾルが挙げられる。活性物質を含む、開示による吸入可能な粉末は、単独に、上述の活性物質、又は生理学的に許容される賦形剤を伴う上述の活性物質の混合物から成り得る。
【０１７１】
これらの吸入可能な粉末には、単糖類（例えば、グルコース又はアラビノース）、二糖類（例えば、ラクトース、ショ糖、マルトース）、オリゴ及び多糖類（例えば、デキストラン）、ポリアルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）又はこれらの互いの混合物が挙げられ得る。単又は二糖類は、適切に使用され、ラクトース又はグルコースの使用は、特に独占的ではないが、それらの水和物の形態である。
【０１７２】
肺における沈着のための粒子は、１〜９ミクロンなどの１０ミクロンより小さい粒子サイズ、例えば、０．１から５μｍ、特に１から５μｍを必要とする。活性成分（抗体又は断片など）の粒子サイズは、第一に重要である。
【０１７３】
吸入可能なエアロゾルを調製するために使用できる噴射剤ガスは、当技術分野で既知である。適した噴射剤ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタン、及びメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンの塩素化又はフッ素化した誘導体などのハロ炭化水素などの炭化水素の中から選択される。上述の噴射剤ガスは、それら自体で又はそれらの混合物中で使用することができる。
【０１７４】
特に適した噴射剤ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上述のハロゲン化炭化水素の中で、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−へプタフルオロプロパン）及びその混合物は、特に適している。
【０１７５】
噴射剤ガス含有の吸入可能なエアロゾルは、共溶媒、安定剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、潤滑剤及びｐＨの調節手段などの他の成分も含むことができる。これらの全成分は、当技術分野で既知である。
【０１７６】
本発明による噴射剤ガス含有の吸入可能なエアロゾルは、活性物質の重量につき最大５％まで含むことができる。本発明によるエアロゾルは、例えば、活性成分の重量につき０．００２から５％、重量につき０．０１から３％、重量につき０．０１５から２％、重量につき０．１から２％、重量につき０．５から２％又は重量につき０．５から１％を含む。
【０１７７】
或いは、肺への局所投与は、例えば、噴霧器などの装置、例えば、圧縮器に接続された噴霧器（例えば、リッチモンド、Ｖａ．のＰａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ社によって製造された、Ｐａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒ）圧縮器に接続されたＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（Ｒ）噴霧器）を採用する、液体溶液又は懸濁製剤の投与であってもよい。
【０１７８】
本発明の抗体フォーマットは、例えば、水溶液又は懸濁液の形態で、溶媒中で送達し、分散することができる。それは、適切な生理溶液、例えば、生理食塩水又は薬理学的に許容される他の溶媒又は緩衝溶液中で、懸濁することができる。当技術分野で既知の緩衝溶液は、約４．０から５．０のｐＨに到達するように、１ｍｌの水につき、０．０５ｍｇから０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇから９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇから０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇから０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇから０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含むことができる。懸濁液は、例えば、凍結乾燥させた抗体を採用することができる。
【０１７９】
治療用懸濁液又は水溶液製剤は、１つ又は複数の賦形剤も含むことができる。賦形剤は、当技術分野でよく知られており、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液及び重炭酸塩緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール及びグリセロールが挙げられる。水溶液又は懸濁液は、リポソ−ム又は生分解性ミクロスフェア中にカプセル封入することができる。製剤は一般的に、無菌製造工程を採用する、実質的に無菌の形態で提供されよう。
【０１８０】
これは、製剤、すなわち無菌緩衝溶媒溶液中の抗体の無菌的懸濁液に使用する緩衝溶媒／溶液の濾過、及び当業者に精通している方法による製剤の無菌容器への分注によって、生成及び無菌化するステップを含み得る。
【０１８１】
本開示による噴霧可能な製剤は、例えば、ホイルエンベロープ中にパックした単回用量単位（例えば、シールしたプラスチック容器又はバイアル）として提供することができる。各バイアルは、例えば２ｍｌの量の緩衝溶媒／溶液中に単位用量を含む。
【０１８２】
本開示の抗体フォーマットは、噴射による送達に適していると考えられる。
【０１８３】
点眼投与用の本発明による化合物は、殺菌剤又は殺真菌剤などの保存剤、例えば、硝酸フェニル水銀、塩化ベンジルアルコニウム又は酢酸クロルヘキシジンの有無に関わらず、等張のｐＨ調節した無菌生理食塩水中のマイクロイオン化した懸濁液として、便利に処方することができる。或いは、点眼投与用の化合物は、ワセリンなどの軟膏で処方することができる。
【０１８４】
本発明による直腸投与用の化合物は、坐薬として便利に処方することができる。これらは、活性化合物と、室温では固体であるが、直腸温度では液体であるため、直腸中で溶けて活性化合物を放出することになる適した非刺激性賦形剤を混合することによって調製することができる。かかる物質には、例えば、ココアバター、蜜蝋及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１８５】
特定条件の予防又は治療に必要な本発明の化合物の量は、選んだ化合物及び治療する患者の状態によって変わるであろう。しかし一般的に、１日の投与量は、経口又は口腔投与に関しては、約１０ｎｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ、典型的には１００ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇから４０ｍｇ／ｋｇ、非経口投与に関しては、約１０ｎｇ／ｋｇ体重から５０ｍｇ／ｋｇ、及び経鼻投与又は吸入若しくはガス注入による投与に関しては、約０．０５ｍｇから約１０００ｍｇ、例えば、約０．５ｍｇから約１０００ｍｇの範囲であってよい。
【０１８６】
本発明の各実施形態の好ましい特徴は、他の各実施形態に関して変更すべきところは変更する。これに限定されないが、本明細書に引用される特許及び特許出願を含む全公表文献は、参照により本明細書に組み込まれ、あたかも個々の各公表文献が、完全に示すように、明確及び個々に、参照により本明細書に組み込まれることを示す。
【０１８７】
本明細書の状況で、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味するものとする。
【０１８８】
技術的に適切な場合、本発明の実施形態は、組み合わせることができる。
【０１８９】
実施形態は、ある種の特徴／要素を含むものとして本明細書に記載される。本開示は、前記特徴／要素から成る又は本質的に成る別々の実施形態にも及ぶ。
【０１９０】
本発明は、以下の実施例を参照して、これから説明することになり、これは単なる実例であり、決して本発明の範囲を制限すると解釈するべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】ｄＡｂがＣ末端にある場合のＦａｂ−ｄＡｂの図式表示である。
【図２Ａ】Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂの図式表示である。
【図２Ｂ】ｄＡｂ間の追加のジスルフィド安定化を有するＦａｂ−ｄｉｄＡｂの図式表示である。
【図３】ＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ４ＳＥ）（１）及びＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］２）（２）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ解析の図である。
【図４】ＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ４ＳＥ）（１）及びＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］２）（２）のウェスタンブロット解析である。
【図４ａ】ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂのＳＤＳ  ＰＡＧＥの図である。ラインＭ＝ＳｅｅＢｌｕｅマーカーライン１＆２＝ＩｇＧ対照ライン３＝ＦａｂＢライン４＝ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）ライン５＝ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）
【図５】ドメイン抗体ｄＡｂＨ１、ｄＡｂＨ２、ｄＡｂＬ１及びｄＡｂＬ２、並びにこれらの各抗体に由来するＣＤＲの配列である。
【図６】ドメイン抗体と融合されたＦａｂＢの重鎖又は軽鎖の可変ドメインを含むＦａｂＢ−ｄＡｂ構築物の配列である。
【図７】Ｆａｂ’Ａの重及び軽鎖の配列並びにＦａｂＡの重鎖の配列である。
【図８ａ】マウス化Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂアミノ酸配列である。図８ａは、様々なマウスｄＡｂにおけるＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【図８ｂ】マウス化Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂアミノ酸配列である。図８ｂは、ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ：ｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）ｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）のアミノ酸配列を示す。
【図８ｃ】マウス化Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂアミノ酸配列である。図８ｃは、ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ：ｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）ｍＦａｂＣ−ｍｄＡｂＨ１ｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）のアミノ酸配列を示す。
【図９】ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂのＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す図である。ライン１＆４は、Ｆａｂ’Ｂである。ライン２＆５は、ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆−ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）である。ライン３＆６は、ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆−ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）である。
【図１０】Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ熱安定性アッセイの図式表示である。
【図１１】ＨＡＳ−ＦＩＴＣシグナル／活性化したマウスＴ細胞に結合したＨＡＳ−ＦＩＴＣ混合物のプロットを示す図である。
【図１２】凝集安定性アッセイのプロットを示す図である。
【図１３】皮下及び静脈内投薬後の、インビボでの経時的濃度プロファイルを示す図である。
【図１４Ａ】ある種のＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の読み出し情報を示す図である。
【図１４Ｂ】ある種のＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の読み出し情報を示す図である。
【図１４Ｃ】ある種のＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の読み出し情報を示す図である。
【図１５】ＦａｂＢ−６４５ＦｖのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。
【図１６】ＦａｂＢ−６４５Ｆｖのサイズ排除解析を示す図である。
【図１７】様々なリンカー長を有するＦａｂＢ−６４５Ｆｖのサーモグラムを示す図である。
【図１８】ある種のＦａｂＢ構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。
【図１９】様々なＦａｂＢ−６４５Ｆｖ構築物のサイズ排除解析を示す図である。
【図２０】ある種のフォーマットに関する配列である。
【図２１】ある種のフォーマットに関する配列である。
【図２２】ある種のフォーマットに関する配列である。
【図２３】ある種のフォーマットに関する配列である。
【図２４】ある種のフォーマットに関する配列である。
【０１９２】
鍵
−６４５Ｆｖは、ｄｉｄＡｂＬ１及びＨ１と同等である（他に指示がない限り、各ｄＡＢに使用するリンカーは同じになる）。
６４８Ｆｖは、ｄｉｄＡｂＬ２及びＨ２と同等である（他に指示がない限り、各ｄＡＢに使用するリンカーは同じになる）。
−６４５ｄｓＦｖは、ｄｉｄＡｂＬ１及びＨ１と同等であり（他に指示がない限り、各ｄＡＢに使用するリンカーは同じになる）、Ｌ１及びＨ１が、ジスルフィド結合によって安定化される。
−６４８ｄｓＦｖは、ｄｉｄＡｂＬ２及びＨ２と同等であり（他に指示がない限り、各ｄＡＢに使用するリンカーは同じになる）、Ｌ２及びＨ３が、ジスルフィド結合によって安定化される。
ＦａｂΔは、鎖間システイン結合（すなわち、ＣＨ及びＣＬ又はＣＫ間）を欠くＦａｂである。
【実施例】
【０１９３】
略語：他に文脈で指示がない限り、接頭辞としての「ｍ」は、マウスを指すことを意図する。
【０１９４】
他に文脈で指示がない限り、接頭辞としての「ｈ」は、ヒトを指すことを意図する。
【０１９５】
ＦａｂＡ、ＦａｂＢ、ＦａｂＣ及びＦａｂＤ構成成分は、異なるフォーマットで以下に提供することができる。
【０１９６】
（例１）
ヒト血清アルブミンに対して特異的なｄＡｂの産生
ヒト血清アルブミンに対する特異性を有するｄＡｂをコードする、インフレームＤＮＡコード型転写ユニットを、組換えＤＮＡ技術を用いて産生した。
【０１９７】
必要に応じて、動員タンパク質に対する特異性を有するｄＡｂをコードする、インフレームＤＮＡコード型転写ユニットを、組換えＤＮＡ技術を用いて産生することができる。
【０１９８】
（例２）
抗体断片の産生
軽鎖のＣ末端へのｄＡｂの融合のために、（カッパの定常領域のＫｍ３アロタイプを有する）ヒトカッパ軽鎖の定常領域、ペプチドリンカー及びｄＡｂをコードするＤＮＡを合成し、ＳａｃＩ−ＰｖｕＩＩの制限断片として、ヒトガンマ−１  ＣＨ１定常領域をコードするＤＮＡを含む、ＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈの組織内の発現ベクターｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ）（Ｐｏｐｐｌｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５；３０８：１７−３０に記載の、ｐＴＴＯ−１の誘導体）中にクローニングした。これにより、リンカーを介し、ｄＡｂと融合したヒト化軽鎖に対する遺伝子に続き、ヒト化重鎖Ｆａｂ断片に対する遺伝子から成る、ジシストロニックな遺伝子配置を生じさせることが可能になり、両方ともｔａｃプロモーターの制御下である。Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーの上流のユニークなＢｓｐＥ１部位、又はＡｌａ−Ｐｒｏリッチなリンカーの上流のＡｓｃＩ部位もコードされる。
【０１９９】
重鎖のＣ末端へのｄＡｂの融合のために、（γ１アイソタイプの）ヒトＣＨ１断片に続き、リンカーコード配列及びｄＡｂをコードするＤＮＡを合成した。これを、ＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ制限断片として、ヒトガンマ−１  ＣＨ１定常領域をコードするＤＮＡを含む、ＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈの自家発現ベクターｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ）（上記のＰｏｐｐｌｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．に記載のｐＴＴＯ−１の誘導体）中にサブクローニングした。これにより、ヒト化軽鎖の非コードの遺伝子間配列に対する遺伝子に続き、リンカーを介してｄＡｂと融合した重鎖から成る、ジシストロニックな遺伝子配置を生じさせることが可能になり、両方ともｔａｃプロモーターの制御下である。組換え発現プラスミドを、発現がＩＰＴＧの添加によって誘導される大腸菌株Ｗ３１１０中に形質転換した。発現実験は、およそ０．５のＯＤ（６００ｎｍ）で２００μＭのＩＰＴＧの添加で、最初は小規模（５ｍｌの培地量）で行い、誘導から２時間後に細胞を収穫し、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡにおいて３０℃で一晩抽出した。浄化した抽出物を、Ｂｉａｃｏｒｅによる親和性解析に使用した。期待できる発現収率及び活性をもたらす構築物を、発酵のために選択した。
【０２００】
以下の実施例に適用可能な方法
以下の実施例では、ｄＡｂが融合する抗体鎖は、ｃカッパの軽鎖に関しては、ＣＫ又はＬＣのいずれか、重鎖の定常ドメインＣＨ１に関しては、ＣＨ１又はＨＣと示す。
【０２０１】
大腸菌における発現のためのＦａｂＡ−ｄＡｂ融合プラスミドの構築
Ｆａｂ−ｄＡｂ融合タンパク質を、ｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４と、ＦａｂＡの軽鎖又は重鎖のいずれかの定常領域のＣ末端と融合させることによって構築した。可動性（ＳＧＧＧＧＳＥ（配列番号１））又は硬性（Ｇ（ＡＰＡＰＡ）２（配列番号３４））リンカーを使用して、ｄＡｂとｃカッパ領域（配列番号７５）を連結させる一方、リンカーＤＫＴＨＴＳ（配列番号２）を使用して、ｄＡｂとＣＨＩ領域（配列番号７６）を連結させた。定常領域−ｄＡｂ融合物をコードするＤＮＡ配列を、自家ｐＴＴＯＤベクターのＦａｂＡ配列中にサブクローニングできるように、断片として合成的に製造した。
【０２０２】
（ＳＧＧＧＧＳＥ（配列番号１））又は硬性（Ｇ（ＡＰＡＰＡ）２（配列番号３４））リンカーのいずれかを介して、ｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４のいずれかと融合したＣ末端のｃカッパをコードする、合成した遺伝子のＳａｃＩ−ＡｐａＩ断片を、ＦａｂＡを発現できるプラスミドの相当する部位にサブクローニングすることによって、軽鎖−ｄＡｂ融合物を構築した。
【０２０３】
ＤＫＴＨＴＳリンカーを介して、ｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４のいずれかと融合したＣ末端のＣＨＩをコードする、合成した遺伝子のＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ＦａｂＡを発現できるプラスミドの相当する部位にサブクローニングすることによって、重鎖−ｄＡｂ融合物を構築した。
【０２０４】
Ｆａｂ’Ａは、ＩＬ−１ベータ結合性抗体に由来し、重鎖及び軽鎖配列は、図７に示されるように、それぞれ配列番号７４及び７５に提供される。結合したｄＡｂを有する軽鎖のＦａｂ’Ａでは、ｄＡｂが重鎖に結合しない場合でも、重鎖のヒンジをＤＫＴＨＴＳに変えた（配列番号７６）。
【０２０５】
ＦａｂＡは、同じ軽鎖配列（配列番号７５）、及び鎖間システインで終止する切断した重鎖配列（配列番号７７）を含む。
【０２０６】
ｄＡｂＬ３及びｄＡｂＨ４は、それぞれ、ヒト血清アルブミンと結合する軽鎖及び重鎖ドメイン抗体である。
【０２０７】
大腸菌における発現のためのＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂ融合プラスミドの構築
ＣＨ１−ｄＡｂ融合物をコードするＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ｄＡｂが可動性リンカーを介して軽鎖と融合している、既存のＦａｂ−ｄＡｂプラスミド中にサブクローニングすることによって、軽鎖及び重鎖上の両方にｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４を有するＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂを構築した。
【０２０８】
哺乳類細胞における発現のためのＦａｂＢ−ｄＡｂ融合プラスミドの構築
ＦａｂＢ−ｄＡｂ、ＦａｂＢ−ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）、ＦａｂＢ−ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）、ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）、ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）を、ＰＣＲによって全てアセンブルし、次いでＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及びＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下で、哺乳類の発現ベクターにクローニングした。これらを、哺乳類細胞における発現のために、ＦａｂＢ軽鎖を含む同様のベクターと対にした（以下を参照されたい）。
【０２０９】
ＦａｂＢは、細胞表面の同時刺激性分子と結合する抗体に由来する。
【０２１０】
ｄＡｂＨ１、ｄＡｂＨ２、ｄＡｂＬ１及びｄＡｂＬ２は、例３に記載のように得た。
【０２１１】
ＦａｂＢ−ｄＡｂ及びｄｉｄＡｂの哺乳類の発現
製品説明書に従い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬を使用して、ＨＥＫ２９３細胞に重鎖及び軽鎖のプラスミドをトランスフェクトした。簡潔には、２μｇの重鎖プラスミド＋２μｇの軽鎖プラスミドを、１０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ＋３４０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ培養液を用いてＲＴで２０分間インキュベートした。混合物を、次いで懸濁液中で、５×１０６個のＨＥＫ２９３細胞に添加し、３７℃で振動させながら４日間インキュベートした。
【０２１２】
Ｂｉａｃｏｒｅ
Ｆａｂ−ｄＡｂ構築物の相互作用に関する結合親和性及び動態学的パラメータを、ＣＭ５センサーチップ及びＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０）泳動用緩衝液を使用して、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００上で行う表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。Ｆａｂ−ｄＡｂ試料を、ヒトＦ（ａｂ’）２特異的ヤギＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９−００６−０９７）又は自家産生の抗ヒトＣＨ１モノクローナル抗体のいずれかを使用して、センサーチップの表面に捕捉した。捕捉抗体の共有結合的固定化を、標準的なアミンカップリング化学反応によって成し遂げた。
【０２１３】
各アッセイサイクルは、３分の抗原注入から成る結合フェーズの前に、最初に１分の注入によるＦａｂ−ｄＡｂの捕捉、その後、５分間の解離のモニターから構成した。各サイクルの後、捕捉表面を、４０ｍＭのＨＣｌの２×１分の注入に続き、３０秒の５ｍＭのＮａＯＨで再生した。使用した流速は、捕捉に関しては１０μｌ／ｍｉｎ、結合及び解離フェーズに関しては３０μｌ／ｍｉｎ、及び再生に関しては１０μｌ／ｍｉｎであった。
【０２１４】
動態学的アッセイのために、抗原の滴定（ヒト血清アルブミンに関しては一般的に６２．５ｎＭ〜２μＭ、ＩＬ−１βに関しては１．２５〜４０ｎＭ）を行い、空のフローセルを参照の減算に使用し、機器のノイズ及びドリフトの減算のために緩衝液なしの注入を含めた。
【０２１５】
動態学的パラメータを、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００評価ソフトウェアを用いて、標準的な１：１結合モデルに結果のセンサーグラムを同時包括的に適合することによって決定した。
【０２１６】
同時結合に関して試験するために、別々の５μＭのＨＳＡ若しくは１００ｎＭのＩＬ−１βのいずれかを３分注入、又は５μＭのＨＳＡ及び１００ｎＭのＩＬ−１βの混合溶液を、捕捉したＦａｂ−ｄＡｂ上に注入した。
【０２１７】
大腸菌からのＦａｂ−ｄＡｂ精製
周辺質の抽出
周辺質内のＦａｂ−ｄＡｂを含む大腸菌ペレットを、１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４のＥＤＴＡ１０ｍＭのオリジナルな培地量で再懸濁した。これらの懸濁液を、次いで２５０ｒｐｍで１６時間４℃でインキュベートした。再懸濁したペレットを、１００００×ｇ、４℃で１時間遠心分離した。上澄み液を除去し、０．４５μｍ濾過した。
【０２１８】
プロテインＧの捕捉
Ｆａｂ−ｄＡｂを、プロテインＧクロマトグラフィによって、濾過した上澄み液から捕捉した。簡潔には、２０分の滞留時間で、２０ｍＭのホスフェート、ｐＨ７．１のＮａＣｌ１５０ｍＭで平衡化したＧａｍｍａｂｉｎｄ  Ｐｌｕｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに上澄み液をアプライした。カラムを２０ｍＭのホスフェート、ｐＨ７．１のＮａＣｌ１５０ｍＭで洗浄し、結合した物質を、ｐＨ２．８のグリシン／ＨＣｌ０．１Ｍで溶出した。溶出のピークを採取し、ｐＨを、１Ｍの酢酸ナトリウムで約ｐＨ５に調節した。ｐＨを調節した溶出物を濃縮し、１０ｋのＭＷＣＯメンブレンを使用して、ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム５０ｍＭ中でダイアフィルトレーションにかけた。
【０２１９】
イオン交換
Ｆａｂ−ｄＡｂを、ＮａＣｌの溶出勾配を用いて、ｐＨ４．５で陽イオン交換クロマトグラフィによって、さらに精製した。簡潔には、ダイアフィルトレーションにかけたタンパク質Ｇ溶出物を、ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム５０ｍＭで平衡化したＳｏｕｒｃｅ１５Ｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにアプライした。カラムを、ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム５０ｍＭで洗浄し、結合した物質を、ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム５０ｍＭにおいて、０から１ＭのＮａＣｌの２０カラム容積直線的勾配を用いて溶出した。第３のカラム容積画分を、勾配の間中、採取した。画分を、Ａ２８０及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、関連画分をプールした。
【０２２０】
ゲル濾過
必要である場合、Ｆａｂ−ｄＡｂを、ゲル濾過によってさらに精製した。簡潔には、ＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ４ＳＥ）のプールしたイオン交換の溶出画分を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０のＮａＣｌ１２５ｍＭで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにアプライし、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０のＮａＣｌ１２５ｍＭのアイソクラチックな勾配により溶出した。１／１２０カラム容積画分を、勾配の間中、採取した。画分を、Ａ２８０及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、関連画分をプールした。
【０２２１】
ゲル濾過を受けなかったＦａｂ−ｄＡｂに関しては、プールしたイオン交換溶出画分を濃縮し、１０ｋのＭＷＣＯメンブレンを使用して、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０のＮａＣｌ１２５ｍＭ中でダイアフィルトレーションにかけた。
【０２２２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
必要な場合、試料を水で希釈し、次いで１０μＬの２Ｘ試料泳動用緩衝液を１０μｌまで添加した。非還元試料に関しては、１００ｍＭのＮＥＭ２μＬを、このポイントまで添加し、還元試料に関しては、１０Ｘ還元剤２μＬを添加した。試料をボルテックスし、８５℃で５分間インキュベートし、冷却し、１２５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。調製した試料を、４〜２０％のアクリルアミンＴｒｉｓ／グリシンＳＤＳゲルにロードし、１２５Ｖで１００分間泳動した。ゲルを、ウェスタンブロット用ＰＶＤＦメンブレン上に転写するか、クーマシーブルータンパク質染色で染色した。
【０２２３】
ウェスタンブロット
ゲルを、１５０ｍＡで１６時間、１２ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．３のグリシン９６ｍＭ中のＰＶＤＦメンブレンに転写した。ＰＶＤＦメンブレンを、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ブロッキング緩衝液）中で、２％のＭａｒｖｅｌ（商標）で１時間ブロックした。
【０２２４】
抗軽鎖
ＨＲＰ−ウサギ抗ヒトカッパ軽鎖、ブロッキング緩衝液中で１時間５０００倍希釈。
【０２２５】
抗重鎖
マウス抗ヒト重鎖、ブロッキング緩衝液中で１時間７０００倍希釈。続いてＨＲＰ−ヤギ抗マウス、ブロッキング緩衝液中で１時間２０００倍希釈。
【０２２６】
抗Ｈｉｓタグ
ウサギ抗Ｈｉｓ６、ブロッキング緩衝液中で１時間１０００倍希釈。続いてＨＲＰ−ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ブロッキング緩衝液中で１時間１０００倍希釈。
【０２２７】
全ブロットを、１００ｍｌのＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄１回につき１０分間で、６回洗浄した。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍにさらす前にＥＣＬ試薬で１分間、又は金属増感型ＤＡＢ試薬で２０〜３０分間に続き水のいずれかで、ブロットを展開した。
【０２２８】
高温逆相ＨＰＬＣ
試料（２μｇ）を、２．１ｍｍのＣ８Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌカラムにおいて８０℃で、２ｍｌ／ｍｉｎの流速、及び４分間中１８〜３８％Ｂの勾配により解析した。Ａ＝Ｈ２Ｏ中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＩＰＡ：ＭｅＯＨが８０：２０中の０．０６５％ＴＦＡ。２１４ｎｍの吸光度により検出する。
【０２２９】
ＥＬＩＳＡ
Ｆａｂ−ｄＡｂの収率を、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。簡潔は、Ｆａｂ−ｄＡｂを抗ＣＨ１抗体で捕捉し、次いで抗カッパ−ＨＲＰで明らかにした。
【０２３０】
ＦＡＣＳ
試料（ｍＦａｂＤ−ｄｉｄＡｂ’）を、５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）標識したＨＳＡとともに４５分間インキュベートした。試料／ＨＳＡ−ＦＩＴＣインキュベーション物を、次いで活性化マウスＣＤ４＋Ｔ細胞に添加し、さらに４５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞が結合したフルオレセインを、ＦＡＣＳ（フルオレセイン活性化細胞選別）によって測定した。
【０２３１】
（例３）
抗アルブミン抗体の発生
１／２ロップウサギを、組換えｃｈｒｏｍａｐｕｒｅヒト血清アルブミン（Ｊａｃｋｓｏｎから購入）で免疫した。ウサギは、皮下的に１００μｇのＨＳＡタンパク質で３回免疫化を受け、完全フロイントアジュバントにおいて最初の免疫化、及び不完全フロイントにおいて次の免疫化を受けた。ヒト、マウス、ラット血清アルブミンと結合する、抗体１及び２、６４６、６４７及び６４９を、ＷＯ０４／０５１２６８に記載の方法を用いて単離した。抗体１及び２の重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）に対する遺伝子を単離し、逆転写ＰＣＲによるクローニングの後に配列決定した。
【０２３２】
軽鎖をグラフトした配列を、ウサギＣ−カッパの定常領域をコードするＤＮＡを含む、ウサギ軽鎖の発現ベクターｐＶＲｂｃＫ中にサブクローニングした。重鎖をグラフトした配列を、ウサギＦａｂ’重鎖の定常領域をコードするＤＮＡを含む、ウサギ重鎖の発現ベクターｐＶＲｂＨＦａｂ中にサブクローニングした。プラスミドをＣＨＯ細胞に共トランスフェクトし、産生された抗体を、アルブミン結合性及び親和性に関して選別した（表１）。ＣＨＯ細胞のトランスフェクションを、製品説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００手順を用いて行った（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＮｏ．１１６６８）。
【０２３３】
ヒト化ドメイン抗体ｄＡｂＬ１、ｄＡｂＨ１、ｄＡｂＬ２及びｄＡｂＨ２の発生
ヒト化ＶＬ及びＶＨ領域を、ヒトＶ領域のアクセプターフレームワーク及びフレームワーク領域におけるドナー残基を用いて設計した。１つのグラフトしたＶＬ領域（Ｌ１（配列番号５３）及びＬ２（配列番号５５））及び１つのＶＨ領域（Ｈ１（配列番号５２）及びＨ２（配列番号５４））を、各抗体１及び２それぞれに対して設計し、遺伝子を、オリゴヌクレオチドのアッセンブリ及びＰＣＲ変異誘発によって構築した。グラフトしたドメイン抗体及びそれらのＣＤＲを図５に示す。
【表４】
2015178536.tif 000006
【０２３４】
（例４）
哺乳類細胞において発現したＦａｂＢ−ｄＡｂの解析
ＦａｂＢ−ｄＡｂ構築物を、方法に記載のように産生し、ＦａｂＢ−ｄＡｂを含む、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの上澄み液を、ＢＩＡｃｏｒｅにおいて直接的に試験した。
【０２３５】
動態学的解析を、ＨＳＡとＦａｂＢ−ｄＡｂ構築物の相互作用を評価するために行った。これらは、ＦａｂＢのＣＨ１のＣ末端と融合したｄＡｂＬ１、ｄＡｂＨ２又はｄＡｂＬ３のいずれかから構成した（図６を参照されたい）。ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ１は、ＨＳＡに対して、ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ３のＫＤ＝３９２ｎＭより高い親和性、ＫＤ＝１７０ｎＭを有する。ＦａｂＢ−ｄＡｂＨ２は、ＨＳＡに対して、最も乏しい親和性、ＫＤ＝１０７４ｎＭを保持することが示され、表２を参照された。
【表５】
2015178536.tif 000007
【０２３６】
親和性及び動態学的パラメータを、ｄＡｂＬ１、ｄＡｂＨ２又はｄＡｂＬ３と融合したＦａｂＢとＨＳＡの結合性に関して決定した。示したデータは、平均値±ＳＥＭである。（ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ１及びＦａｂＢ−ｄＡｂＨ２に関してはｎ＝４。ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ３に関してはｎ＝２）。
【０２３７】
ＦａｂＢ−ｄＡｂタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにより、産生されたＦａｂＢ−ｄＡｂは、期待したサイズであることが確認された。
【０２３８】
（例５）
哺乳類細胞において発現したＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂの解析
ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ構築物を、方法に記載のように産生し、ｄｉｄＡｂを含む、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの上澄み液を、ＢＩＡｃｏｒｅにおいて直接的に試験した。
【０２３９】
単一ｄＡｂが、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖両方のＣ末端に融合されたｄｉｄＡｂ構築物を用いて、さらなる解析を行った。ｄｉｄＡｂが、天然重鎖及び軽鎖の可変ドメイン対に由来する構築物は、単一ｄＡｂ単独と比較した親和性において、著しい改善を示した（表２及び３）。２つの同一のｄＡｂＬ１から成るｄｉｄＡｂ融合物は、単一ｄＡｂＬ１に対して見られる場合を超える親和性の改善は示さなかった（データは示していない）。
【表６】
2015178536.tif 000008
【０２４０】
親和性及び動態学的パラメータを、ｄＡｂＬ１＆ｄＡｂＨ１又はｄＡｂＬ２＆ｄＡｂＨ２の両方と融合したＦａｂＢとＨＳＡの結合性に関して決定した。
【０２４１】
ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂは、よく発現し、期待したサイズであることが確認された（図４ａを参照されたい）。留意すべきは、このＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルが、細胞により発現した全てのタンパク質であることである。
【０２４２】
（例６）
精製したＦａｂＡ−ｄＡｂの解析
大腸菌中でＦａｂ−ｄＡｂ、Ｆａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ４ＳＥ）Ｆａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］２）を発現させるためのプラスミドを、方法に記載のように構築した。Ｆａｂ−ｄＡｂを、大腸菌の周辺質中に発現させ、方法に記載のように均一に精製した。Ｆａｂ−ｄＡｂの純度を、高温逆相ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによって評価した。Ｆａｂ−ｄＡｂを、Ｂｉａｃｏｒｅによって抗原結合性に関しても評価した。
【０２４３】
高温逆相ＨＰＬＣ
方法に記載のように行った高温逆相ＨＰＬＣにより、ＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ４ＳＥ）及びＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］２）に含まれる全種の定量的解析が得られた。各種の存在パーセンテージを表４に示す。
【表７】
2015178536.tif 000009
【０２４４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
Ｆａｂ−ｄＡｂ試料を、方法に記載のように、非還元及び還元条件下で調製し、ゲルで泳動した。ゲルをクーマシー染色した。Ｆａｂ−ｄＡｂ試料、すなわちＦａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ４ＳＥ）及びＦａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］２）の両方の結合性プロファイルは、高温逆相ＨＰＬＣによって観察したプロファイルとよく一致する（図３）。
【０２４５】
ウェスタンブロット
Ｆａｂ−ｄＡｂ試料を、方法に記載のように、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにさらし、続いて抗軽鎖及び抗重鎖の抗体を用いてウェスタンブロット解析にさらした。これにより、ｄＡｂが、Ｆａｂの軽鎖上にあり、重鎖が、両試料において修飾されなかったことが確認された（図４）。クーマシー染色、非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって検出された全バンドが、Ｆａｂ−ｄＡｂ関連産物であることも実際に示す。
【０２４６】
Ｂｉａｃｏｒｅ
方法に記載のようなＳＰＲによる動態学的解析を、ヒト血清アルブミンとＦａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ４ＳＥ）及びＦａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］２）との結合性を評価するために使用した。表５の結果は、両構築物が、およそ１μＭの同様の親和性（ＫＤ）で、ヒト血清アルブミンと結合できることを実際に示す。
【表８】
2015178536.tif 000010
【０２４７】
さらなる動態学的解析により、全融合構築物が、ＩＬ−１βに対するオリジナルなＦａｂＡの相互作用特性を保持し（表６）、動態学的及び親和性パラメータにおいてわずかに小さい差異が見られることが実際に示された。
【表９】
2015178536.tif 000011
【０２４８】
５μＭのヒト血清アルブミン若しくは１００ｎＭのＩＬ−１β、又は５μＭのヒト血清アルブミン及び１００ｎＭのＩＬ−１βの両方の混合溶液のいずれかの別々の３分注入を行う前に、各構築物が、ヒト血清アルブミン及びＩＬ−１β抗原の両方と同時に結合する潜在力を、センサーチップの表面に各構築物を捕捉することによって評価した。各Ｆａｂ−ｄＡｂ構築物に関して、組み合わせたＨＳＡ／ＩＬ−１β溶液に見られた応答は、独立した注入の応答の和とほとんど同一であり、表７を参照されたい。これは、Ｆａｂ−ｄＡｂが、同時に、ＩＬ−１β及びヒト血清アルブミンの両方に結合できること、並びにＩＬ−１β又はヒト血清アルブミンのいずれかの結合が、他方の相互作用を阻害しないことを示す。オリジナルのＦａｂＡは、ヒト血清アルブミンとの無視できる結合を有し、ＩＬ−１βのみと結合した。
【表１０】
2015178536.tif 000012
【０２４９】
上の表は、ＨＳＡ若しくはＩＬ−１βの別々の注入、又は事前に混合したＨＳＡ及びＩＬ−１βの注入の後、各構築物に対して見られた結合応答（ＲＵ）を示す。各場合において、最終濃度は、ＨＳＡに関しては５μＭであり、ＩＬ−１βに関しては１００ｎＭであった。個々のＨＳＡ及びＩＬ−１βの応答の和を括弧中に示す。
【０２５０】
（例７）ＦａｂＡ  ｄｉｄＡｂ
大腸菌におけるＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂの発現
Ｃ末端ヒスチジンタグ（ＨＩＳ６タグ）で停止するＦａｂＡ−ｄＡｂ及びＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂ融合物を、大腸菌中で発現させた。周辺質の抽出後、ｄＡｂ融合タンパク質を、Ｃ末端のＨｉｓ６タグにより精製した。Ｆａｂの発現を、抗ＣＨ１及び抗ｃカッパ抗体を用いて、非還元ゲルのウェスタンブロットによって解析した。ＦａｂＡ−ｄＡｂ及びＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂは、完全長タンパク質として発現し、両抗体の検出試薬と反応することが示された。
【０２５１】
大腸菌において発現したＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂの解析
１つ又は複数のｄＡｂが融合するＦａｂＡ構築物とＨＳＡとの結合性を特性評価するために、さらなる解析を行った。結合アッセイを、ｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４が、ＦａｂＡの軽鎖又は重鎖のいずれかと融合している様々な構築物において行った（構築物の詳細及び結合性データの概要に関しては表８を参照されたい）。軽鎖又は重鎖上のいずれかに、ｄＡｂＨ４のみを保有する構築物が、比較的乏しい親和性（それぞれ約９μＭ及び３μＭ）でＨＳＡと結合することがわかったが、（軽鎖又は重鎖上のいずれかの）単一融合物として、又は反対の鎖上の第２ｄＡｂ（ｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４）と一組になって、ｄＡｂＬ３を保有する構築物に関して、より高い結合親和性が観察された。
【表１１】
2015178536.tif 000013
【０２５２】
示したように、軽鎖（ＬＣ）若しくは重鎖（ＨＣ）上のいずれか、又は両鎖上に、ｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４を保有するＦａｂＡとＨＳＡとの結合性に関して、親和性及び動態学的パラメータを決定した。ＨＳＡとオリジナルなＦａｂＡとの結合がないもの（ｎｂ）を検出した。（ＨＣ上のｄＡｂＨ４）又は（ＬＣ上のｄＡｂＨ４）を有するＦａｂＡとＨＳＡとの結合性に関する相互作用動態は、速すぎて決定できず、したがって、親和性（ＫＤ）は定常状態の結合性から決定した。
【０２５３】
（例８）
ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂの発現及び精製
哺乳類の発現
トランスフェクションに先立って、ＣＨＯ−ＸＥ細胞を、Ｅａｒｌｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＥＢＳＳ）中で洗浄し、ペレットにし、２×１０８細胞／ｍｌでＥＢＳＳに再懸濁した。重鎖及び軽鎖のプラスミドを、４００ｕｇの全濃度で細胞に添加した。自家のエレクトロポレータ上の８００μｌの細胞／ＤＮＡ混合に関する最適化した電気的パラメータを、トランスフェクションに使用した。トランスフェクトした細胞を、ｇｌｕｔａｍａｘ、ＨＴ及び抗真菌抗菌溶液を供給した１ＬのＣＤ−ＣＨＯ培地に、直接的にトランスフェクトした。細胞を、３７℃で２４時間、振動させながらインキュベートし、次いで３２℃に変えた。酪酸ナトリウム３ｍＭを４日目に添加した。１５００×ｇの遠心分離によって上澄み液を１４日目に採取し、細胞を除去した。発現レベルを、ＥＬＩＳＡによって決定した。
【０２５４】
哺乳類での発現の上澄み液の濃度
ＥＬＩＳＡによって評価したときの約５５μｇ／ｍｌのＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂを含む哺乳類の上澄み液を、分子量１０ｋＤａカットオフのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜に適合したＭｉｎｉｓｅｔｔｅ濃縮器を使用して、１．８Ｌから２００ｍｌまで濃縮した。
【０２５５】
プロテインＧの精製
濃縮した上澄み液を、２０ｍＭのホスフェート、ｐＨ７．１のＮａＣｌ１５０ｍＭで平衡化したＧａｍｍａｂｉｎｄ  Ｐｌｕｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにアプライした。カラムを、２０ｍＭのホスフェート、ｐＨ７．１のＮａＣｌ１５０ｍＭで洗浄し、結合した物質を、ｐＨ２．７のグリシン／ＨＣｌ０．１Ｍで溶出した。溶出ピークを採取し、ｐＨを、ｐＨ８．８のＴｒｉｓ／ＨＣｌ２Ｍで約ｐＨ７に調節した。ｐＨ調節した溶出物を、１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、分子量１０ｋＤカットオフのＰＥＳ膜を用いて、２０ｍＭのホスフェート、ｐＨ７．１のＮａＣｌ１５０ｍＭ中でダイアフィルトレーションにかけた。
【０２５６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
必要な場合、試料を水で希釈し、次いで１０μＬの４ＸＬＤＳ試料泳動用緩衝液を２６μｌまで添加した。非還元試料に関しては、１００ｍＭのＮＥＭ４μＬを添加し、還元試料に関しては、１０Ｘ還元剤４μＬを添加した。試料をボルテックスし、８５℃で５分間インキュベートし、冷却し、１２５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。調製した試料を、４〜２０％のアクリルアミンＴｒｉｓ／グリシンＳＤＳゲルにロードし、１２５Ｖで１１０分間泳動した。ゲルを、クーマシーブルータンパク質染色で染色した。
【０２５７】
ＥＬＩＳＡ
Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂの収率を、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。簡潔には、Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂを、抗ＣＨ１抗体で捕捉し、次いで抗カッパ−ＨＲＰで明らかにした。
【０２５８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＦａｂＢ及びＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ試料を、方法に記載のように、非還元及び還元条件下で調製し、ゲルで分離し、染色した。図９を参照されたい。
【０２５９】
（例９）
ＦａｂＢ−ＦｖにおけるＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ熱安定性アッセイ
試料（約１ｍｇ／ｍｌでの試料１μｌ、ＰＢＳ８μｌ及びＳｙｐｒｏオレンジ蛍光色素の３０×ストック１μｌ）を、３８４穴プレート中に４連で泳動した。７９００ＨＴファストリアルタイムＰＣＲシステムを使用して、プレートを２０から９９℃に加熱し、蛍光（４９０ｎｍで励起、５３０ｎｍで発光）を測定する。結果を表Ｄ及び図１０に示す。
【表１２】
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【０２６０】
（例１０）
ＦａｂＢ−Ｆｖの凝集安定性アッセイ
ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌでの試料を、１４００ｒｐｍでボルテックスしながら、２５℃でインキュベートした。吸光度を５９５ｎｍで測定した。この吸光度は、粒子による光散乱によるものであり、試料の凝集と相関することができる。ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（Ｇ４Ｓｘ２）及びＦａｂＢ−６４８Ｆｖ（Ｇ４Ｓｘ２）の両方は、ＦａｂＢ単独と同じくらい凝集への抵抗性がある。それらは全て、ＩｇＧ対照より凝集への耐性がある（図１２）。
【０２６１】
（例１１）
ＨＳＡに結合するＦａｂ−ＦｖのｐＨ依存性
所望のｐＨを実現するために、ｐＨ５．０、５．５、６．０及び７．０の泳動用緩衝液を、４０ｍＭのクエン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０及び８０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０を混合することによってつくった場合を除き、方法に記載のように、Ｆａｂ−Ｆｖ構築物とＨＳＡの相互作用に関する結合親和性を決定した。
【０２６２】
ＨＳＡに対するＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（Ｇ４Ｓｘ２）の親和性は、ｐＨ７．４（標準的なアッセイのｐＨ）から５．０による影響を受けない。ＨＳＡに対するＦａｂＢ−６４８Ｆｖ（Ｇ４Ｓｘ２）の親和性はｐＨによって影響を受け、ｐＨ７．４及びｐＨ５．０の間のおよそ１０倍低い親和性である。
【表１３】
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【０２６３】
（例１２）
ＦａｂＢ−ＦｖのインビボでのマウスＰＫ
オスのＢＡＬＢ／ｃマウス中でのＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（Ｇ４Ｓｘ２）及びＦａｂＢ−６４８Ｆｖ（Ｇ４Ｓｘ２）の薬物動態を、皮下（ｓｃ）又は静脈内（ｉｖ）のいずれかで、１０ｍｇ／ｋｇの単回投与の後に決定した。６匹のマウスに、各構築物及び投与経路で投与した。連続的な血液試料（３０μＬ）を、皮下投与の後、次の時点：１、４、８、２４、４８、７２、１０２及び１６８時間で、静脈内投与の後、３０分、１、８、２４、４８、７２、９６及び１６８時間で、尾静脈から採取した。採取した血液を、血清分離のために凝血活性剤を含むＳａｒｓｔｅｄｔマイクロベットＣＢ３００Ｚ中に分注し、室温で少なくとも２０分間放置した。マイクロベットを次いで２０℃で１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。血清を取り出し、解析に先立って貯蔵冷凍した。血清試料中のＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（Ｇ４Ｓｘ２）又はＦａｂＢ−６４８Ｆｖ（Ｇ４Ｓｘ２）の濃度を、ＥＬＩＳＡによって評価した。簡潔には、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌｅプレートを、ＰＢＳ中のｈＯＸ４０−Ｆｃでコートし、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックした。血清試料及び標準物質をＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中で希釈し、プレートに１時間アプライした。プレートをＰＢＳで洗浄し、明らかになったヤギ抗ヒトカッパＨＲＰコンジュゲートの抗体を、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中に１時間アプライした。プレートを洗浄し、次いでＴＭＢ基質により展開し、続いて２．５Ｍの硫酸で停止した。６３０ｎｍでの吸光度を測定し、濃度を標準曲線から決定した。
【０２６４】
ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（Ｇ４Ｓｘ２）及びＦａｂＢ−６４８Ｆｖ（Ｇ４Ｓｘ２）の両方は、血漿中での延長された半減期を有する、図１３。ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（Ｇ４Ｓｘ２）に関する半減期は、ｓｃで７１ｈ、ｉｖで６２ｈであり、ＦａｂＢ−６４８Ｆｖ（Ｇ４Ｓｘ２）に関しては、ｓｃで２５ｈ、ｉｖで３０ｈである。
【０２６５】
（例１３）
ＦａｂＢ−Ｆｖのインビボでの有効性試験
ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ及びＦａｂＢ−６４８Ｆｖがインビボで有効であるかどうかを調べる試験を行った。簡潔には、これはＨｕＳＣＩＤマウスにおける定常状態での投与に関わり、読み出し情報は、Ｔ細胞移植の防止であった。
【０２６６】
ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスに、２．４７５ｍｇ／ｋｇのＦａｂＢ−６４５Ｆｖ又はＦａｂＢ−６４８Ｆｖ又はＦａｂＢ−ＰＥＧ４０ｋ又はＰＢＳを、−２日目に皮下に負荷用量で投与した。１０日目を含むこの日までのその後の毎日、それらに、０．７５ｍｇ／ｋｇのＦａｂＢ−６４５Ｆｖ又はＦａｂＢ−６４８Ｆｖ又はＦａｂＢ−ＰＥＧ４０ｋ又はＰＢＳの維持用量で皮下に投与した。各投与グループは、９〜１０匹のマウスで構成した。−１日目に、全マウスを０．８７ｍｇ／マウスのラット抗マウスＴＭ−β１抗体で処置し、ナチュラルキラー細胞活性を抑制した。０日目に、全マウスは、８×１０６個のヒト末梢血中単核球細胞の腹膜内注射を受けた。１４日目に、マウスを屠殺し、血液、脾臓及び腹膜の洗浄を行った。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に関してＦＡＣＳによって試料を解析した。データセットを、Ｄｕｎｎｅｔｔのポスト試験の比較を用いて、あるＡｎｏｖａ方法によって解析した。全試験の構築物ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ、ＦａｂＢ−６４８Ｆｖ及びＦａｂＢ−ＰＥＧ４０ｋは、試験した全区画、すなわち血液、腹膜及び脾臓において、同等に有効であった。図１４Ａ、Ｂ及びＣ。
【０２６７】
（例１４）
アルブミンに対する６４５Ｆｖの親和性を変化させるためのＦａｂＢ−６４５Ｆｖ変異
ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（Ｓ３ｘＧ４Ｓ）の６４５Ｆｖ部分の重鎖のＣＤＲにおける選択した残基中に、変異誘発ＰＣＲによって点変異を導入した。例えば、Ｉ５０Ａは、Ｉｌｅ５０とＡｌａの置換である。様々な変異を、以下の表１１に示す。ヒトアルブミンに対するＦａｂ−６４５Ｆｖ変異体の親和性を、方法に記載のようなＢＩＡｃｏｒｅによって評価した。全変異は、ヒトアルブミンに対する親和性を変化させない又は低下させた。
【表１４】
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【０２６８】
（例１５）
Ｆａｂ及びＦｖ間の１−５Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカー長
哺乳類細胞における発現のためのＦａｂＢ−６４５Ｆｖ融合プラスミドの構築
ＦａｂのＣ末端及びＦｖのＮ末端の間のＳＧＧＧＧＳ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ又はＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカーのいずれかを有するＦａｂＢ−６４５Ｆｖ’をＰＣＲによってアッセンブルし、次いでＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及びＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下で、哺乳類の発現ベクター中にクローニングした。関連の重鎖及び軽鎖プラスミドを、哺乳類細胞中での発現のために対にした。
【０２６９】
ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（１−５ｘＧ４Ｓ）の哺乳類の発現
製品説明書に従い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬を使用して、ＨＥＫ２９３細胞に重鎖及び軽鎖のプラスミドにトランスフェクトした。簡潔には、２４μｇの重鎖プラスミド＋２４μｇの軽鎖プラスミドを、１２０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ＋４０８０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地を用いてＲＴで２０分間インキュベートした。混合物を、次いで６０ｍＬの懸濁液中の６０×１０６個のＨＥＫ２９３細胞に添加し、３７℃で振動させながら、４日間インキュベートした。全構築物は、同等によく発現した。
【０２７０】
プロテインＧの精製
哺乳類の発現の懸濁液を、遠心分離によって澄まし、分子量１０ｋＤａカットオフの遠心分離濃縮器を用いて、上澄み液を約１．８ｍＬに濃縮した。濃縮した上澄み液を、１６０００×ｇで１０分間遠心分離して任意の沈殿物を除去し、次いで１．５ｍＬを、１ｍｌのＨｉＴｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に１ｍｌ／ｍｉｎでロードした。カラムを、２０ｍＭのホスフェート、ｐＨ７．４のＮａＣｌ４０ｍＭで洗浄し、結合した物質を、ｐＨ２．７のグリシン／ＨＣｌ０．１Ｍで溶出した。溶出ピーク（２ｍＬ）を採取し、ｐＨを、１Ｍの酢酸ナトリウム２５０μＬで約ｐＨ５に調節した。ｐＨ調節した溶出物を、分子量１０ｋＤａカットオフの遠心分離濃縮器を用いて、２０ｍＭのホスフェート、ｐＨ７．１のＮａＣｌ１５０ｍＭ中でダイアフィルトレーションにかけ、約２５０μＬに濃縮した。全構築物は、同様の精製プロファイルを有し、最終濃度は０．５〜１．１ｍｇ／ｍｌであった。
【０２７１】
アルブミンに対するＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（１−５ｘＧ４Ｓ）の親和性
ヒト及びマウスアルブミンに対する、精製したＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（１−５ｘＧ４Ｓ）構築物の親和性を、方法に記載のように決定した。ＦａｂのＣ末端及びＦｖのＮ末端の間の１から５ｘＧｌｙ４ＳｅｒのＦｖの異なるリンカー長は、ヒト又はマウスアルブミンのいずれかに対する６４５Ｆｖの親和性に影響を与えなかった。
【表１５】
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【０２７２】
精製したＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（１−５ｘＧ４Ｓ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（１−５ｘＧ４Ｓ）試料を、方法に記載のように、非還元及び還元条件下で精製し、ゲルで分離し、染色した。図１５を参照されたい。
【０２７３】
精製したＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（１−５ｘＧ４Ｓ）のサイズ排除解析
ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（１−５ｘＧ４Ｓ）試料を、１ｍｌ／ｍｉｎで、２０ｍＭのホスフェート、ｐＨ７．４のＮａＣｌ１５０ｍＭのアイソクラチックな勾配で展開したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００ＧＬ  Ｔｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でサイズに関して解析した。
【０２７４】
１ｘＧ４Ｓ又は２ｘＧ４ＳのいずれかのＦａｂのＣ末端及びＦｖのＮ末端の間のリンカー長により、単量体ＦａｂＢ−６４５Ｆｖの量は減少するが、二量体及びより高次の多量体の量は増加する。単量体の量は、１ｘＧ４Ｓのリンカー長に関して最も少ない。３ｘＧ４Ｓ、４ｘＧ４Ｓ又は５ｘＧ４ＳのいずれかのＦａｂのＣ末端及びＦｖのＮ末端の間のリンカー長により、単量体ＦａｂＢ−６４５Ｆｖの量は増加するが、３つの全リンカー長に関して同様のレベルを有する二量体及びより高次の多量体の量は減少する。図１６。
【表１６】
2015178536.tif 000018
【０２７５】
精製したＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（１−５ｘＧ４Ｓ）のＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ熱安定性解析
試料（約１ｍｇ／ｍｌの試料１μｌ、ＰＢＳ８μｌ及びＳｙｐｒｏオレンジ蛍光色素の３０×ストック１μｌ）を、３８４穴プレート中、４連で泳動した。７９００ＨＴファストリアルタイムＰＣＲシステムを用いて、プレートを２０から９９℃に加熱し、蛍光（４９０ｎｍで励起、５３０ｎｍで発光）を測定した。結果を表１４及び図１７に示す。
【表１７】
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【０２７６】
（例１６）
Ｆａｂ−ＦｖにおけるＦｖのジスルフィド安定性
哺乳類細胞中での発現のためのＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）及びＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）融合プラスミド
変異誘発ＰＣＲによって、Ｆｖの重鎖及び軽鎖の両方のフレームワーク領域において選択した残基での、ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（２ｘＧ４Ｓ）及びＦａｂＢ−６４８Ｆｖ（２ｘＧ４Ｓ）ＤＮＡ配列中に、点変異を導入した。Ｆｖの重鎖と軽鎖の間の鎖間ジスルフィド結合を作るために導入した変異は、重鎖Ｇ４４Ｃ及び軽鎖Ｇ１００Ｃであった。同様に、システインを添加してＦｖ中に鎖間ジスルフィド結合をつくり、変異誘発ＰＣＲにより、システインをセリンに変えることによって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の間の天然鎖間ジスルフィドを除去した。鎖間ジスルフィド結合を含むＦｖを、ｄｓＦｖと名付け、鎖間ジスルフィド結合を欠くＦａｂを、ＦａｂΔと名付けた。これらの全構築物に対するＤＮＡを、次いでＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及びＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下で、哺乳類の発現ベクター中にクローニングした。関連する重鎖及び軽鎖のプラスミドを、哺乳類細胞中での発現のために対にした。
【０２７７】
ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）及びＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）の哺乳類の発現
製品説明書に従い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬を用いて、ＨＥＫ２９３細胞に重鎖及び軽鎖のプラスミドをトランスフェクトした。簡潔に述べると、２４μｇの重鎖プラスミド＋２４μｇの軽鎖プラスミドを、１２０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ＋４０８０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地を用いてＲＴで２０分間インキュベートした。混合物を、次いで６０ｍＬの懸濁液中で６０×１０６個のＨＥＫ２９３細胞に添加し、３７℃で振動させながら、４日間インキュベートした。全構築物は、同等によく発現した。
【０２７８】
ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）及びＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）のプロテインＧの精製
哺乳類の発現の懸濁液を、遠心分離によって澄まし、分子量１０ｋＤａカットオフの遠心分離濃縮器を用いて、上澄み液を約１．８ｍＬに濃縮した。濃縮した上澄み液を、１６０００×ｇで１０分間遠心分離して任意の沈殿物を除去し、次いで１．５ｍＬを、１ｍｌのＨｉＴｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に１ｍｌ／ｍｉｎでロードした。カラムを、２０ｍＭのホスフェート、ｐＨ７．４のＮａＣｌ４０ｍＭで洗浄し、結合した物質を、ｐＨ２．７のグリシン／ＨＣｌ０．１Ｍで溶出した。溶出ピーク（２ｍＬ）を採取し、ｐＨを、１Ｍの酢酸ナトリウム２５０μＬで約ｐＨ５に調節した。ｐＨ調節した溶出物を、分子量１０ｋＤａカットオフの遠心分離濃縮器を用いて、２０ｍＭのホスフェート、ｐＨ７．１のＮａＣｌ１５０ｍＭ中でダイアフィルトレーションにかけ、約２５０μＬに濃縮した。全構築物は、同様の精製プロファイルを有し、最終濃度は０．５〜０．８ｍｇ／ｍｌであった。
【０２７９】
アルブミンに対する、ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）及びＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）の親和性
ヒト及びマウスアルブミンに対する、精製したＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）構築物の親和性を、方法に記載のように決定した。Ｆｖのジスルフィド安定化は、ヒト又はマウスアルブミンの両方に対するＦｖの親和性に影響を与えないか、親和性をわずかに増加させた。
【表１８】
2015178536.tif 000020
【０２８０】
精製したＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）及びＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
精製したＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）試料を、方法に記載のように、非還元及び還元条件下で調製し、ゲルで分離し、染色した。図１８を参照されたい。
【０２８１】
精製したＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）及びＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）のサイズ排除解析
精製したＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）試料を、１ｍｌ／ｍｉｎで２０ｍＭのホスフェート、ｐＨ７．４のＮａＣｌ１５０ｍＭのアイソクラチックな勾配により展開したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００ＧＬ  Ｔｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でサイズに関して解析した。
【０２８２】
６４５Ｆｖ又は６４８ＦｖのいずれかのＦｖ中への鎖間ジスルフィド結合の導入により、Ｆｖが鎖間ジスルフィドをもたなかったＦａｂ−Ｆｖと比較して、単量体Ｆａｂ−Ｆｖ種の量が増加した。Ｆａｂ−ＦｖのＦｂ部分から天然鎖間ジスルフィド結合を除去することにより、存在する単量体種の量にわずかに小さな影響があった。図１９。
【表１９】
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【０２８３】
精製したＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）及びＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２ｘＧ４Ｓ）のＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ熱安定性解析
試料（約１ｍｇ／ｍｌの試料１μｌ、ＰＢＳ８μｌ及びＳｙｐｒｏオレンジ蛍光色素の３０ｘストック１μｌ）を、３８４穴プレート中で４連で泳動した。７９００ＨＴファストリアルタイムＰＣＲシステムを用いて、プレートを２０から９９℃に加熱し、蛍光（４９０ｎｍで励起、５３０ｎｍで発光）を測定した。
【０２８４】
６４５Ｆｖ又は６４８ＦｖのいずれかのＦａｂ−ＦｖのＦｖ部分中に鎖間ジスルフィド結合を導入することにより、Ｆｖが鎖間ジスルフィドをもたなかったＦａｂ−Ｆｖと比較して、Ｆｖの熱安定性が増加した。Ｆａｂ−ＦｖのＦａｂ部分から天然鎖間ジスルフィド結合を除去することにより、Ｆａｂ−ＦｖのＦａｂ部分の熱安定性が低下した。
【表２０】
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【０２８５】
ＦａｂＤに関するＢｉａｃｏｒｅ法
Ｆａｂ−ｄＡｂ及びＦａｂ−ｄｉｄＡｂ構築物の相互作用に関する結合親和性及び動態学的パラメータを、ＣＭ５センサーチップ及びＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０）泳動用緩衝液を用いて、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００において行う表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。ヒトＦａｂ試料を、ヒトＦ（ａｂ’）２特異的ヤギＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９−００６−０９７）又は自家産生の抗ヒトＣＨ１モノクローナル抗体のいずれかを使用して、センサーチップの表面に捕捉した。マウスＦａｂ試料を、マウスＦ（ａｂ’）２特異的ヤギＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１５−００６−０７２）を用いて捕捉した。捕捉抗体の共有結合的固定化を、標準的なアミンカップリング化学反応によって成し遂げた。
【０２８６】
各アッセイサイクルは、３分の抗原注入から成る結合フェーズの前に、最初に１分の注入によるＦａｂ−ｄＡｂ又はＦａｂ−ｄｉｄＡｂ構築物の捕捉、その後、５分間の解離のモニターから構成した。各サイクルの後、捕捉表面を、４０ｍＭのＨＣｌの２×１分の注入に続き、３０秒の５ｍＭのＮａＯＨで再生した。使用した流速は、捕捉に関しては１０μｌ／ｍｉｎ、結合及び解離フェーズに関しては３０μｌ／ｍｉｎ、及び再生に関しては１０μｌ／ｍｉｎであった。
【０２８７】
動態学的アッセイのために、抗原の滴定（ヒト又はマウス血清アルブミンに関しては一般的に６２．５ｎＭ〜２μＭ、ＩＬ−１βに関しては１．２５〜４０ｎＭ、細胞表面受容体に関しては、Ｄ２０〜１．２５ｎＭ）を行い、空のフローセルを参照の減算に使用し、機器のノイズ及びドリフトの減算のために緩衝液なしの注入を含めた。
【０２８８】
動態学的パラメータを、ＢｉｏｃｏｒｅＴ１００評価ソフトウェアを用いて、標準的な１：１結合モデルに結果のセンサーグラムを同時包括的に適合することによって決定した。
【０２８９】
同時結合に関して試験するために、別々の５μＭのＨＳＡ若しくは１００ｎＭのＩＬ−１βのいずれかを３分注入、又は５μＭのＨＳＡ及び１００ｎＭのＩＬ−１βの混合溶液を、捕捉したＦａｂ−ｄＡｂ上に注入した。アルブミン及び細胞表面受容体Ｄの同時結合性を、２μＭのＨＳＡ又はＭＳＡ及び２０ｎＭのマウス細胞表面受容体Ｄの最終濃度を使用して、同じ方法で評価した。
【０２９０】
（例１７）
ｍＦａｂＣ−ｍｄｉｄＡｂ及びｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂの哺乳類の発現
製品説明書に従い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬を使用して、ＨＥＫ２９３細胞に重鎖及び軽鎖のプラスミドをトランスフェクトした。簡潔には、２μｇの重鎖プラスミド＋２μｇの軽鎖プラスミドを、１０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ＋３４０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地を用いてＲＴで２０分間インキュベートした。次いで、混合物を懸濁液中の５×１０６個のＨＥＫ２９３細胞に添加し、３７℃で振盪させながら、６日間インキュベートした。
【０２９１】
ＥＬＩＳＡ
ｍＦａｂ−ｍｄｉｄＡｂの収率を、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。簡潔に述べると、ｍＦａｂ−ｍｄｉｄＡｂを抗ＣＨ１抗体で捕捉し、次いで抗カッパ−ＨＲＰで明らかにした。
【表２１】
2015178536.tif 000023
【０２９２】
（例１８）
血清アルブミン及びヒトＯＸ４０と、精製したＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆−ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）及びＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆−ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）融合物との相互作用を評価するために、さらなる動態学的解析を行った（表１９）。ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆−ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）及びＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆−ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）の両方は、オリジナルなＦａｂＢのヒトＯＸ４０に対する親和性を保持した（表２０）。
【０２９３】
２μＭのアルブミン（ヒト若しくはマウス）又は５０ｎＭのヒトＯＸ４０、或いは２μＭのアルブミン及び５０ｎＭのＯＸ４０の両方の混合溶液のいずれかの別々の３分間注入を行う前に、ヒト又はマウス血清アルブミン及びヒトＯＸ４０の両方に同時に結合する、ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆−ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）及びＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆−ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）構築物の潜在力を、センサーチップ表面に各Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂ構築物を捕捉することによって評価した。ＨＳＡ結合性は、両Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂ構築物に対して見られた。各Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂ構築物に関して、組み合わせたアルブミン／ＯＸ４０溶液に対して見られた応答は、独立の注入の応答の和とほとんど同一であった（表２１にまとめた）。これは、Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂが、ＯＸ４０及び血清アルブミンの両方と同時に結合できることを示す。オリジナルなＦａｂＢは、ＯＸ４０のみと結合し、ヒト又はマウスアルブミンのいずれかとの有意な結合はなかった。
【表２２】
2015178536.tif 000024
【０２９４】
親和性及び動態学的パラメータを、Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂ融合物に結合するＨＳＡ及びＭＳＡに関して決定した。
【表２３】
2015178536.tif 000025
【０２９５】
ＦａｂＢ及びＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ融合物に結合するｈＯＸ４０−Ｆｃに関する親和性及び動態学的パラメータ
【表２４】
2015178536.tif 000026
【０２９６】
上の表は、ＨＳＡ若しくはＭＳＡ若しくはｈＯＸ４０−Ｆｃの別々の注入後、又は事前に混合したアルブミン及びｈＯＸ４０−Ｆｃの注入後に、各構築物に関して見られた結合応答（ＲＵ）を示す。各場合において、最終濃度は、アルブミンＨＳＡが２μＭであり、ｈＯＸ４０−Ｆｃが５０ｎＭであった。個々のアルブミン及びｈＯＸ４０−Ｆｃ応答の和は括弧中に示す。
【０２９７】
（例１９）
血清アルブミン及びマウス細胞表面受容体Ｄと、ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｍｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）及びｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｍｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）との相互作用を評価するために、さらなる動態学的解析を行った（表２２）。両ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂは、ＨＳＡとの高い結合親和性をそれぞれ示した（それぞれＫＤ＝２．７８ｎＭ及び８．９７ｎＭ）。ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｍｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）は同様の親和性（ＫＤ＝２２ｎＭ）で、ＭＳＡとも結合したが、ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｍｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）に関しては、ＭＳＡとの結合性は見られなかった。両ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂは、元のｍＦａｂＤのマウス細胞表面受容体Ｄに対する親和性を保持した（表２３）。
【０２９８】
２μＭのアルブミン（ヒト若しくはマウス）又は２０ｎＭのマウス細胞表面受容体Ｄ、或いは２μＭのアルブミン及び２０ｎＭの細胞表面受容体Ｄの両方の混合溶液のいずれかの別々の３分間注入を行う前に、ヒト又はマウス血清アルブミン及びマウス細胞表面受容体Ｄの両方に同時に結合する、ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｍｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）及びｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｍｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）の潜在力を、センサーチップ表面に各ｍＦａｂ−ｍｄｉｄＡｂ構築物を捕捉することによって評価した。再びＨＳＡ結合性は、両ｍＦａｂ−ｍｄｉｄＡｂ構築物に対して見られたが、ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｍｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）は、ＭＳＡのみと結合した。各ｍＦａｂ−ｍｄｉｄＡｂ構築物に関して、組み合わせたアルブミン／細胞表面受容体Ｄ溶液に対して見られた応答は、独立の注入の応答の和とほとんど同一であった（表２４にまとめた）。これは、ｍＦａｂ−ｍｄｉｄＡｂが、細胞表面受容体Ｄ及び血清アルブミンの両方と同時に結合できることを示す。元のｍＦａｂＤは、細胞表面受容体Ｄのみと結合し、ヒト又はマウスアルブミンのいずれかとの有意な結合はなかった。
【表２５】
2015178536.tif 000027
【０２９９】
親和性及び動態学的パラメータを、ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｍｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）及びｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｍｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）に結合するＨＳＡ及びＭＳＡに関して決定した。
【表２６】
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【０３００】
ｍＦａｂＤ、ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｍｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）及びｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｍｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）に結合するマウス細胞表面受容体Ｄ−Ｆｃに関する親和性及び動態学的パラメータ。
【表２７】
2015178536.tif 000029
【０３０１】
上の表は、ＨＳＡ若しくはＭＳＡ若しくはマウス細胞表面受容体Ｄ−Ｆｃの別々の注入後、又は事前に混合したアルブミン及びマウス細胞表面受容体Ｄ−Ｆｃの注入後に、各構築物に関して見られた結合応答（ＲＵ）を示す。各場合において、最終濃度は、アルブミンＨＳＡが２μＭであり、マウス細胞表面受容体Ｄ−Ｆｃが２０ｎＭであった。個々のアルブミン及びマウス細胞表面受容体Ｄ−Ｆｃ応答の和は括弧中に示す。
【０３０２】
（例２０）
血清アルブミン及び細胞表面上で発現したマウス細胞表面受容体Ｄと、ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｍｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）又はｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓｘ２）＆ｍｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓｘ２）との同時の相互作用を評価するために、さらなる解析を行った。両ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂは、ＦＩＴＣ標識したＨＳＡ、及び活性化マウスＴ細胞の細胞表面上で発現した細胞表面受容体Ｘと同時に結合できた（図１１）。ｍＦａｂＤは、活性化マウスＴ細胞の細胞表面上で発現した細胞表面受容体Ｘと結合でき、データは示さないが、ＦＩＴＣ標識したＨＳＡとは結合しなかった。
【図２Ａ】
2015178536.tif 000030
【図４ａ】
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【図１】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
2015178536.tif 000037
【図６−２】
2015178536.tif 000038
【図７】
2015178536.tif 000039
【図８ａ】
2015178536.tif 000040
【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
2015178536.tif 000051
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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