(57)【要約】      （修正有）【課題】間葉系幹細胞からの骨芽細胞の分化誘導において、従来の方法と比較して、効率的且つ強力に骨芽細胞を分化誘導する方法を提供する。【解決手段】トランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲン、若しくはそれを含む細胞培養基材、又はトランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲンを含む細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる工程を含む、骨芽細胞分化誘導方法。【選択図】図１
2015047076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲン。
【請求項２】
前記コラーゲンが、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、及びその混合物からなる群から選択されるコラーゲンである、請求項１に記載の魚類由来コラーゲン。
【請求項３】
前記コラーゲンが魚麟由来Ｉ型コラーゲンである、請求項１又は２に記載の魚類由来コラーゲン。
【請求項４】
前記魚類が、テラピア、ゴンズイ、ラベオ・ロヒータ、カトラ、コイ、雷魚、ピラルク、タイ、ヒラメ、サメ、チョウザメ、及びサケからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の魚類由来コラーゲン。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の魚類由来コラーゲンを含む細胞培養基材。
【請求項６】
間葉系幹細胞の培養用である、請求項５に記載の細胞培養基材。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の魚類由来コラーゲン、及び／又は請求項５又は６に記載の細胞培養基材を含む細胞培養キット。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の魚類由来コラーゲンを含む細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる工程を含む、骨芽細胞分化誘導方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の魚類由来コラーゲンを含む細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる工程を含む、骨芽細胞製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の骨芽細胞製造方法により得られる骨芽細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養基材、並びにそれを用いた骨芽細胞分化誘導方法及び骨芽細胞製造方法に関する。本発明によれば、間葉系幹細胞から骨芽細胞を誘導し、長期間にわたって維持することができる。
【背景技術】
【０００２】
骨芽細胞は、骨組織において骨形成を行う細胞であり、タンパク質等を産生及び分泌して、骨基質をつくる。具体的には、骨芽細胞は、生体内でコラーゲンなどの基質タンパク質を分泌し、そこにMatrix Vesicleと呼ばれる基質小胞を作製する。そして、この基質小胞の周囲にリン酸カルシウムが沈着して、骨の基質が完成し、骨芽細胞は、最終的には、この基質の中で骨細胞となる
【０００３】
この骨芽細胞は、間葉系幹細胞から分化するものであり、非特許文献１には、間葉系幹細胞にデキサメタゾン、β−グリセロリン酸、及びアスコルビン酸を作用させることにより分化誘導できることが開示されている（非特許文献１）。また、特許文献１は、（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサン等のRhoキナーゼ阻害活性を有する化合物と骨誘導因子を併用することにより、間葉系細胞が骨芽細胞に分化誘導されることを開示している。更に、特許文献２には、カルシウム拮抗薬が、間葉系細胞を骨芽細胞に分化誘導することが開示されている（特許文献２）。
【０００４】
しかしながら、前記の化合物による骨芽細胞の分化誘導活性、特に初期分化誘導活性は、十分なものではなかった。また、デキサメタゾンや（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサンは、本来生体内に存在するものではなく、得られた骨芽細胞へのこれらの合成された化合物の影響については、十分には調べられていなかった。更に、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化する際に、１０％程度のウシの胎児血清などを用いて培養を行っており、ウシ血清中にプリオンなどの人獣共通感染症の病原体が存在する可能性も考えられた。
【０００５】
前記の課題を解決するために、生物由来である魚類由来コラーゲンを用いて、骨芽細胞が分化誘導できることが報告されている（特許文献４）。この方法は、従来の方法と比較して、効率的且つ強力に骨芽細胞を分化誘導する方法であり、特には、初期分化誘導が可能であった。しかしながら、骨芽細胞への分化誘導を長期間維持させる点においては、十分ではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００１／０１７５６２号
【特許文献２】国際公開第２００６／１２３６９９号
【特許文献３】特開２００６−２５７０１４号公報
【特許文献４】特開２０１２−１２０５２９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９９年、２８４巻、ｐ．１４３−１４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、間葉系幹細胞からの骨芽細胞の分化誘導において、従来の方法と比較して、効率的且つ強力に骨芽細胞を分化誘導する方法を提供することであり、特には、骨芽細胞の分化誘導が長期間維持可能な方法を提供することである。更に、前記製造方法によって製造された骨芽細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、骨芽細胞の分化誘導が長期間維持可能な骨芽細胞分化誘導方法、又は骨芽細胞製造方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、トランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲンと、間葉系幹細胞とを接触させることにより、前記特許文献４に記載の方法と比較して、更に効率的に間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることができることを見出した。更に、この骨芽細胞への分化誘導は、長期間維持できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］トランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲン、
［２］前記コラーゲンが、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、及びその混合物からなる群から選択されるコラーゲンである［１］に記載の魚類由来コラーゲン、
［３］前記コラーゲンが魚麟由来Ｉ型コラーゲンである、［１］又は［２］に記載の魚類由来コラーゲン、
［４］前記魚類が、テラピア、ゴンズイ、ラベオ・ロヒータ、カトラ、コイ、雷魚、ピラルク、タイ、ヒラメ、サメ、チョウザメ、及びサケからなる群から選択される、［１］〜［３］のいずれかに記載の魚類由来コラーゲン、
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の魚類由来コラーゲンを含む細胞培養基材、
［６］間葉系幹細胞の培養用である、［５］に記載の細胞培養基材、
［７］［１］〜［４］のいずれかに記載の魚類由来コラーゲン、及び／又は［５］又は［６］に記載の細胞培養基材を含む細胞培養キット、
［８］［１］〜［４］のいずれかに記載の魚類由来コラーゲンを含む細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる工程を含む、骨芽細胞分化誘導方法、
［９］［１］〜［４］のいずれかに記載の魚類由来コラーゲンを含む細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる工程を含む、骨芽細胞製造方法、
及び
［１０］［９］に記載の骨芽細胞製造方法により得られる骨芽細胞に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の骨芽細胞分化誘導方法、又は骨芽細胞製造方法によれば、魚類由来コラーゲンのみでの骨芽細胞の分化誘導と比較して、効率的且つ強力に間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることができる。特には、骨芽細胞への分化誘導を長期間維持することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を、トランスグルタミナーゼで酵素処理されたテラピア鱗コラーゲンの被覆された細胞培養用プレート（実施例１：Ｔ＆ＥＣ）、テラピア鱗コラーゲンの被覆された細胞培養用プレート（比較例１；ＴＣ）、ブタコラーゲンの被覆された細胞培養用プレート（比較例３；ＰＣ）、トランスグルタミナーゼで酵素処理されたブタコラーゲンの被覆された細胞培養用プレート（比較例２；Ｐ＆ＥＣ）及びコラーゲンの被覆されていない細胞培養用プレート（比較例４：ＴＣＰＳ）で培養した場合の、ＡＬＰ活性を示した図である。
【図２】トランスグルタミナーゼで酵素処理されたテラピア鱗コラーゲン多孔体の架橋度を示した図である。トランスグルタミナーゼ処理の酵素量（ａ）、温度（ｂ）、及び時間（ｃ）の条件検討結果を示す。
【図３】テラピア鱗コラーゲン多孔体（ａ）及びトランスグルタミナーゼで酵素処理されたテラピア鱗コラーゲン多孔体（ｂ）、ブタコラーゲン多孔体（ｃ）、及びトランスグルタミナーゼで酵素処理されたブタコラーゲン多孔体（ｄ）の電子顕微鏡写真である。
【図４】トランスグルタミナーゼで酵素処理されたテラピア鱗コラーゲン多孔体の細胞培養基材（実施例６：Ｅ−Ｔ）、トランスグルタミナーゼで酵素処理されたブタコラーゲン多孔体（比較例５：Ｅ−Ｐ）、グルタルアルデヒドで架橋したテラピア鱗コラーゲン多孔体（比較例６：ＧＡ−Ｔ）及びグルタルアルデヒドで架橋したブタコラーゲン多孔体（比較例７：ＧＡ−Ｐ）で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）のＡＬＰ活性を示した図である。
【図５】トランスグルタミナーゼで酵素処理されたテラピア鱗コラーゲン多孔体の細胞培養基材（実施例７：Ｅ−Ｔ／１ｗ及びＥ−Ｔ／３ｗ）、又はトランスグルタミナーゼで酵素処理されたブタコラーゲン多孔体（比較例８：Ｅ−Ｐ／１ｗ及びＥ−Ｐ／３ｗ）の細胞培養基材で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）のオステオカルシンの発現を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［１］酵素処理をされた魚類由来コラーゲン
本発明の魚類由来コラーゲンは、トランスグルタミナーゼによる酵素処理をされたコラーゲンである。
【００１３】
（トランスグルタミナーゼ）
本発明に用いられるトランスグルタミナーゼは、魚類由来コラーゲンによる骨芽細胞の分化誘導を促進できる限りにおいて、限定されるものではない。トランスグルタミナーゼの由来の生物も限定されるものではなく、脊椎動物（哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類）、無脊椎動物（ホヤ、カニ、昆虫、貝類、イカ、及び線虫）、微生物（真正細菌、古細菌、真核生物、藻類、原生生物、菌類、及び粘菌）又は植物由来のトランスグルタミナーゼを用いることができる。
より具体的には、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、サル、ショウジョウバエ、バッタ、カブトガニ、ウニ、ゼブラフィッシュ、大腸菌、放線菌、又は粘菌由来のトランスグルタミナーゼを挙げることができる。
【００１４】
ヒトでは、トランスグルタミナーゼとして、８つのアイソザイム、すなわちFactor XIII（分子量８５ｋＤａ）、TGase 1（分子量９０−１００ｋＤａ）、TGase 2（分子量７６ｋＤａ）、TGase 3（分子量７７ｋＤａ）、TGase 4（分子量７７ｋＤａ）、TGase 5（分子量７５ｋＤａ）、TGase 6（分子量７９ｋＤａ）、又はTGase 7（分子量８０ｋＤａ）が報告されている。これらのトランスグルタミナーゼは、グルタミン酸とリシンとを共有結合により、架橋することができる。本発明においてはこれらのヒトのトランスグルタミナーゼを、制限なく使用することができる。また、放線菌由来のトランスグルタミナーゼの分子量は４０ｋＤａであり、カルシウムの非存在下で、グルタミン酸とリシンとを架橋することができる。本発明においては放線菌由来のトランスグルタミナーゼも、制限なく使用することができる。
【００１５】
本発明に用いるトランスグルタミナーゼは、限定されるものではないが、グルタミン酸とリシンとを共有結合により架橋することができるものが好ましい。コラーゲンのグルタミン酸とリシンとが共有結合されることによって、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導し、更にそれを長期間維持できるものであると推定される。しかしながら、本発明は前記の説明によって、限定されるものではない。
【００１６】
（魚類由来コラーゲン）
本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材に用いる魚類由来コラーゲンは、特に限定されるものではない。例えば、魚類の種類としては、テラピア、ゴンズイ、ラベオ・ロヒータ、カトラ、コイ、雷魚、ピラルク、タイ、ヒラメ、サメ、チョウザメ（例えば、ベステルチョウザメ又はアムールチョウザメ）、及びサケなどを挙げることができるが、後述の変性温度の観点から、水温の高い川、湖沼、又は海に生息する魚類が好ましい。このような魚類として、具体的には、オレオクロミス属の魚類を挙げる事ができ、特にはテラピアが好ましい。オレオクロミス属の魚類からは、変性温度が比較的高いコラーゲンを取得でき、例えば日本や中国で食用として養殖されているナイルテラピア（Oreochromis niloticus）は入手が容易であり、大量のコラーゲンを取得することができる。
また、コラーゲンには、Ｉ型コラーゲンからVIII型の分子種が知られている。本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材に用いる魚類由来コラーゲンのタイプは、限定されるものではないが、線維型コラーゲンであるＩ、II、III、及びＶ型コラーゲンが好ましい。I型コラーゲンとしては、テラピアの鱗のコラーゲンを挙げることができ、II型コラーゲンとしては、チョウザメの吻部軟骨又は脊索のコラーゲンを挙げることができる。コラーゲンのアミノ酸配列は、グリシンが３残基ごとに繰り返す一次構造を有しており、この繰り返し配列は、コラーゲン様配列と呼ばれ、コラーゲンタンパク質の特徴である。
【００１７】
魚類由来コラーゲンを取得する魚の部位も、限定されるものではない。例えば、鱗、皮、骨、軟骨、ひれ、及び臓器等を挙げることができるが、鱗が好ましい。鱗は、魚臭の原因となる脂質が少ないからである。また、魚類の鱗由来のコラーゲンは、他のコラーゲンと比較して線維化しやすく、線維形成速度が著しく速いからである。
【００１８】
前記のようにコラーゲンのタイプは限定されるものではないが、例えば魚類のＩ型コラーゲンは、分子量約１０万のポリペプチド鎖が３本集まって「３重らせん構造」を作っており、分子量は約３０万である。長さ３００ｎｍで、直径１．５ｎｍの１本の硬い棒のような形態をしている。魚類のＩ型コラーゲンが特異な「３重らせん構造」を作るのは、ポリペプチド鎖のアミノ酸の配列が関与している。ポリペプチド鎖は３個のアミノ酸が並んだユニット「Ｇ−Ｘ−Ｙ」のつながりからできている。Ｇはグリシンを表し、Ｘはプロリン、そしてＹはヒドロキシプロリンであることが多い。ヒドロキシプロリンは、通常のタンパク質に含まれておらず、コラーゲンに特有のアミノ酸であるが、ヒドロキシプロリンの水酸基と水和水との水素結合によって３重らせん構造が安定すると考えられている。
【００１９】
コラーゲンは、温度が上昇すると３本のポリペプチドからなる「３重らせん構造」が解けて、３本のポリペプチドがばらばらになり、ゼラチンとなる。コラーゲンからゼラチンへの変化を変性と呼び、一度変性が起きると、再び温度を低下させても「３重らせん構造」に戻すことは困難である。コラーゲンの変性温度は、通常そのコラーゲンが由来する生物の棲息温度より、若干高い程度であり、従って、水中に生息している魚類の鱗のコラーゲンの変性温度は、それほど高くない。
【００２０】
本発明に用いる魚類由来コラーゲンは、その変性温度によって、限定されるものではないが、変性温度の高い魚類由来コラーゲンが好ましく、具体的には２０℃以上が好ましく、２５℃以上がより好ましく、２８℃以上が更に好ましく、３０℃以上が最も好ましい。本発明の骨芽細胞分化誘導方法において、魚類由来コラーゲンと間葉系幹細胞とを接触させる温度は、３７℃前後のことが多く、「３重らせん構造」が破壊されたゼラチンでは、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導は起こらないと考えられるからである。
しかしながら、変性温度が２０℃未満の魚類由来コラーゲンであっても、間葉系幹細胞との接触を２０℃未満で行うことにより、コラーゲンの変性を起こさずに、間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化させることができる。
【００２１】
本発明に用いるコラーゲンの変性温度は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３２，１９９（２００３）に記載の方法に従って、ＣＤ分光計（Ｊａｓｃｏ  ｍｏｄｅｌ  ７２５  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を使用してコラーゲン水溶液の温度を段階的に上昇させることによって求める。即ち、コラーゲン水溶液をｐＨ３の希塩酸で希釈し、０．０３ｗｔ％となるように調整し、光路長１ｍｍの石英セルに入れる。セルの温度を１℃／ｍｉｎで上昇させ、２２１ｎｍにおける旋光度を０．２℃ごとに測定する。各温度における旋光度を温度に対してプロットすると、旋光度の値がコラーゲン螺旋の値からランダムコイルの値へと急激に変化する変性曲線が得られる。それらの旋光度値の中間値を与える温度、すなわち、螺旋率（Ｈｅｌｉｃｉｔｙ；％）が５０％になるときの温度を変性温度とする。
【００２２】
魚類由来コラーゲンの取得方法は、コラーゲンの３重らせん構造が破壊されない方法であれば、特に限定されないが、例えば、前記特許文献３に開示された取得方法によって得ることができる。以下に、代表例として、鱗由来のコラーゲンの製造方法について説明する。
【００２３】
まず、集めた鱗から魚皮や鰭などの不要物を水洗により取り除く。必要に応じて、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール類やアセトンなどの親水性有機溶剤、界面活性剤、塩化ナトリウムなどの塩類、水酸化ナトリウムなどのアルカリ溶液などを用いて、鱗表面に付着したコラーゲン以外のたんぱく質や脂質など、臭気の原因とされている物質を鱗から除去してもよい。
【００２４】
更に、脱灰処理溶液中で、１〜４８時間、攪拌羽根を用いて緩やかに攪拌し、鱗に含まれる無機成分（リン酸カルシウム）を除去する。処理溶液は、無機成分を溶解できればよく、塩酸やリン酸などの無機酸、酢酸、クエン酸などの有機酸、エチレンジアミン４酢酸などの水溶液を用いればよいが、汎用的に利用されている塩酸や酢酸が好ましく用いられる。使用量は、特に制限する必要はなく、脱灰終了後の鱗を水洗すればよい。
【００２５】
このようにして夾雑物を除去した鱗を、プロテアーゼを添加した酸性溶液中で２時間〜７２時間、攪拌羽根などを用いて緩やかに攪拌することでコラーゲン分子間の架橋が切断されて可溶化したコラーゲンが抽出される。この抽出工程以降の操作は、コラーゲンの変性を防ぐため、変性温度以下、望ましくは変性温度−５℃以下で行うべきである。
【００２６】
プロテアーゼの種類は、酸性溶液中で高い活性を有する、ペプシン、プロクターゼ、パパインなどが好ましく用いられる。溶液のｐＨは、プロテアーゼの活性が高くなる範囲を用いればよく、一般に２〜５程度である。プロテアーゼの使用量は、特に限定する必要はないが、通常は魚鱗の乾燥重量に対して１〜１５％程度であり、鱗が均一に攪拌できる程度の液量となるように濃度を決定すればよい。使用する酸は、特に制限されないが、塩酸や酢酸、クエン酸、リンゴ酸など、生物に対して安全性の高いものから選ぶことが望ましく、特に塩酸や酢酸が好ましく用いられる。このような方法により、コラーゲン分子の両末端に存在する非螺旋領域（テロペプチド）が分解されたコラーゲン（アテロコラーゲン）を抽出することができる。
【００２７】
このようにして可溶化したコラーゲンは、遠心分離、濾過などによって可溶化していない魚鱗残渣と分離する。魚鱗残渣は、プロテアーゼを添加した酸性溶液中で処理することで、再度、可溶化したコラーゲンを抽出することができるため、２〜４回程度繰り返して収率を高めてもよい。
【００２８】
このようにして得られたコラーゲン溶液には、プロテアーゼやコラーゲン以外のたんぱく質、ゼラチン（変性コラーゲン）などを含むため、必要に応じて精製する。精製方法について述べると、可溶化したコラーゲン溶液に、塩化ナトリウムなどの塩類を加え、塩濃度を上昇させることで、コラーゲンを析出させる。例えば、可溶化したコラーゲン水溶液中に塩化ナトリウムを終濃度１Ｍになるように添加し、５分〜２４時間程度静置することで、コラーゲンが析出する。
【００２９】
水酸化ナトリウムなどを添加して、ｐＨを中性以上にすることでも析出することができる。例えば、ｐＨ７〜９程度になるまで水酸化ナトリウム溶液を添加し、５分〜２４時間程度静置することで、コラーゲンが析出する。このようなコラーゲンの析出は、溶液が白濁することで容易に確認できる。
【００３０】
析出したコラーゲンは遠心分離や濾過など、一般的な固液分離方法により回収し、これを酸性溶液中で緩やかに攪拌して再溶解する。例えば、ｐＨ２〜４程度の塩酸溶液中で１〜４８時間程度ゆるやかに攪拌すればよい。このようにして、コラーゲンを精製することができ、繰り返すことで更に純度を高めることができる。精製工程で使用した塩類は、透析膜などを用いて純水に対して脱塩することで除去することができる。
【００３１】
細胞を培養する際、細菌などが共存することは重大な問題となるため、得られたコラーゲン溶液は、ろ過滅菌などコラーゲンの構造を壊さない方法で無菌化して用いることが望ましい。
【００３２】
（酵素処理）
トランスグルタミナーゼによるコラーゲンの酵素処理は、トランスグルタミナーゼがコラーゲンと接触し、魚類由来コラーゲンによる骨芽細胞の分化誘導を促進できる限りにおいて、特に限定されるものではない。
【００３３】
第１の態様として、緩衝液中でトランスグルタミナーゼと、魚類由来コラーゲンとを接触させることによって、処理することができる。第１の態様における緩衝液の種類、コラーゲンの濃度、酵素の量、酵素処理の温度及び酵素処理の時間は、用いるトランスグルタミナーゼによって、適宜決定することが可能であるが、例えば以下の条件で行うことができる。
【００３４】
用いる緩衝液は、トランスグルタミナーゼの酵素作用が完全に阻害されない緩衝液であれば、限定されるものではないが、例えば塩酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、ＣＡＢＳ、ピペリジン、グリシン、クエン酸塩、リンゴ酸塩、ギ酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、ピペラジン、ピリジン、カコジル酸塩、コハク酸塩、ＭＥＳ、ヒスチジン、ビス−トリス、リン酸塩、エタノールアミン、ＡＤＡ、炭酸塩、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、イミダゾール、ビス−トリスプロパン、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ピロリン酸塩、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、トリシン、ヒドラジン、グリシルグリシン、ＴＲＩＳ、ＥＰＰＳ、ビシン、ＨＥＰＢＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＤ、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、タウリン、ホウ酸塩、ＣＨＥＳ、グリシン、水酸化アンモニウム、ＣＡＰＳＯ、メチルアミン、ピペラジン、ＣＡＰＳ、またはこれらのいずれかの組み合わせの緩衝液を挙げることができる。
【００３５】
緩衝液中のコラーゲンの濃度は、特に限定されるものではないが、０．１重量％〜５重量％が好ましく、０．５重量％〜２重量％がより好ましく、１重量％〜１．５重量％が更に好ましい。０．０５重量％未満であると、コラーゲン同士の架橋が十分でないことがある。また、５重量％を超えると架橋反応が不十分になることがある。
トランスグルタミナーゼによる酵素処理の時間は、酵素反応が起きる限りにおいて特に限定されないが、５分〜７２時間が好ましく、６０分〜４８時間がより好ましく、８時間〜２４時間が更に好ましい。
緩衝液中の酵素の量も、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば０．１Ｕ〜１００Ｕ／ｍＬが好ましく、０．５Ｕ〜５０Ｕ／ｍＬがより好ましく、１Ｕ〜１０Ｕ／ｍＬが更に好ましい。例えば、放線菌由来のトランスグルタミナーゼ（アクティバ（登録商標））の場合、０．１Ｕ〜１００Ｕ／ｍＬが好ましく、０．５Ｕ〜５０Ｕ／ｍＬがより好ましく、１Ｕ〜１０Ｕ／ｍＬが更に好ましい。
酵素処理の温度は、使用するトランスグルタミナーゼの活性が維持される温度であれば、特に限定されるものではないが、５℃〜６５℃が好ましく、１０℃〜５０℃がより好ましく、１５℃〜４５℃が更に好ましい。
【００３６】
細胞培養基材の材料として、シャーレ又はプレートなどを用い、トランスグルタミナーゼによる酵素処理を行ったコラーゲンを被覆する場合において、緩衝液中の酵素処理を行った後に、細胞培養用材料への被覆を行ってもよい。この場合、コラーゲン及びトランスグルタミナーゼの濃度を高くして酵素処理を行い、濃度を希釈して細胞培養用材料へ被覆してもよい。また、緩衝液中の酵素処理と、細胞培養用材料への被覆とを同時に行うこともできる。
なお、細胞培養用材料に魚類由来コラーゲンを被覆した後に、トランスグルタミナーゼによる酵素処理を行う場合、酵素処理が十分でないことがある。従って、この態様を除いてもよい。
【００３７】
酵素処理の第２の態様として、コラーゲン成形体を、トランスグルタミナーゼを含む緩衝液中で酵素処理することもできる。
コラーゲン成形体としては、コラーゲン多孔体、コラーゲン膜、コラーゲン微粒子、エレクトロンスピニングによるコラーゲンファイバー、またはコラーゲン緻密体などを挙げることができる。これらのコラーゲン成形体を、トランスグルタミナーゼを含む緩衝液中に浸漬することによって、酵素処理をおこなうことができる。
第２の態様における、緩衝液の種類、酵素の量、酵素処理の温度及び酵素処理の時間は、用いるトランスグルタミナーゼによって、適宜決定することができるが、例えば前記第１の態様に記載の条件を用いることが可能である。
【００３８】
［２］細胞培養基材
本発明の細胞培養基材は、トランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲンを含むものである。本発明の細胞培養基材は、特には骨芽細胞分化誘導用の培養基材として、有用に用いることができる。
細胞培養基材は、細胞培養に用いることができる限りにおいて、限定されるものではない。例えば、細胞培養用材料に、本発明のトランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲンを被覆したものでもよい。また、コラーゲン成形体、例えばコラーゲン多孔体、コラーゲン膜、微粒子、エレクトロンスピニングによるファイバー又はコラーゲン緻密体そのものを細胞培養基材として用い、それらを細胞培養用容器（例えば、フラスコ、シャーレ、又はマルチカルチャープレート）に含むものでもよい。
【００３９】
（細胞培養用材料）
前記トランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲンを被覆する細胞培養用材料は、通常細胞培養用に使用される材料であれば、限定されることなく使用することが可能である。材質としては、ガラス、多孔質体（例えば、ポリカーボネート）、又はプラスチック（例えばポリスチレン、又はポリプロピレン）の材料を使用することができ、形状としては、フラスコ、シャーレ、マルチカルチャープレート（例えば６ウェルマルチカルチャープレート、１２ウェルマルチカルチャープレートなど）、又はビーズなどの形状の材料を使用することができる。但し、コラーゲン溶液が親水性であるため、親水性の材質基材あるいは親水化処理を施した表面を有する材料が好ましい。
【００４０】
（前記細胞培養用材料へのコラーゲンの被覆）
前記細胞培養用材料へのトランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲンの被覆は、前記のように酵素処理の後に行ってもよく、酵素処理と同時に行ってもよい。
コラーゲンを溶解する溶液のｐＨは、コラーゲンの等電点以下であるｐＨ２〜５が好ましい。溶液の酸源は特に制限されないが、塩酸、酢酸、クエン酸、又はリンゴ酸など、生物に対して安全性の高いものから選ぶことが好ましく、乾燥時に気化する塩酸や酢酸がより好ましい。ｐＨについては、低すぎるとコラーゲンの構造を破壊する場合があり、また高すぎると溶解性が低下し、増粘、ゲル化する場合がある。
【００４１】
使用するコーティング溶液のコラーゲン濃度は、特に限定されないが、一般的には０．０１〜１重量％であり、より好ましくは０．０３〜０．３重量％である。濃度が低いと、１回のコーティングで細胞培養用材料を被覆できるコラーゲン量が少なくなる。濃度が高いと、材料を被覆するコラーゲン量を増やすことができるが、厚みが増すだけである。本発明の効果を発揮するのは、表層部分が主であるため、被覆したコラーゲンの厚さが増しても、コラーゲン量に見合った効果を期待できない。
【００４２】
コーティング方法としては、酸性溶液を用いて適度な濃度に調整したコラーゲン溶液を、あわ立たないようにディシュなどの前記細胞培養用材料上に流し込み、基材上に均一に塗り広げた後、余剰のコラーゲンを除去する。これを乾燥させることで、基材上に線維化したコラーゲンが均一に被覆される。これは魚鱗由来コラーゲン特有の現象であり、従来から使用されている哺乳類由来のコラーゲンでは達成されない。
【００４３】
細菌が混入することは細胞培養時に重大な問題となるため、コラーゲンの被覆作業は、清浄な無菌基材を用い、クリーンルームやクリーンベンチなどの無菌環境で行うことが望ましい。必要に応じて、エチレンオキサイドやＵＶ照射など、コラーゲンの構造を壊さない滅菌工程を加えてもよい。
コーティング及び乾燥時の温度について言えば、変性温度以下、望ましくは変性温度−５℃以下で行う。変性温度を上回る温度で処理すると、基材間結合やコラーゲン線維を形成する前にコラーゲンが変性することにより線維化機能が失われ、コラーゲンとしての特性を発揮できない場合がある。
乾燥時間は湿度などにより異なるが、クリーンベンチ内のような通風下であれば、５分〜２時間程度で乾燥する。乾燥が不十分な場合は、コラーゲンの線維化や前記細胞培養用材料との接着が不十分となる場合があり、細胞培養液を添加したとき、被膜の再溶解や剥離などにより本発明の効果を十分発揮しない場合がある。十分乾燥し、線維化した状態であれば、数ヶ月保存してもその効果を発揮することができる。保存は変性温度以下の温度、望ましくは冷蔵保存が好ましい。
【００４４】
（コラーゲン成形体）
本発明の細胞培養基材として用いることのできるコラーゲン成形体は、トランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲンを含む限りにおいて、限定されるものではないが、例えばコラーゲン多孔体、コラーゲン膜、コラーゲン微粒子、エレクトロンスピニングによるコラーゲンファイバー又はコラーゲン緻密体を挙げることができる。コラーゲン成形体の酵素処理は、前記のように行うことができる。
【００４５】
（細胞培養用容器）
前記細胞培養基材であるコラーゲン成形体を含む細胞培養用容器も、通常細胞培養用に使用される容器であれば、限定されることなく使用することが可能である。材質としては、ガラス、多孔質体（例えば、ポリカーボネート）、又はプラスチック（例えばポリスチレン、又はポリプロピレン）の容器を使用することができ、形状としては、フラスコ、シャーレ、マルチカルチャープレート（例えば６ウェルマルチカルチャープレート、１２ウェルマルチカルチャープレートなど）、又はビーズなどの形状の容器を使用することができる。
【００４６】
［３］細胞培養キット及び細胞製造装置
本発明の細胞培養キットは、トランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲン、及び／又は前記細胞培養基材を含む。本発明の細胞培養基材は、特には骨芽細胞分化誘導用の培養基材として、有用に用いることができる。本発明の細胞製造装置も、トランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲン、及び／又は前記細胞培養基材を含むものである。本発明の細胞製造装置は、特には骨芽細胞分化誘導用の細胞製造装置として、有用に用いることができる。
【００４７】
本発明の細胞培養キットの１つの態様として、本発明の細胞培養基材を含む。本発明の細胞培養基材は、前記のトランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲンが被覆された細胞培養用材料であるか、又はトランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲンを含むコラーゲン成形体である。
また、本発明の細胞培養キットの別の態様として、トランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲンを含むこともできる。例えば、この魚類由来コラーゲンを細胞培養基材に被覆して、骨芽細胞分化誘導用の培養基材として用いることができる。
【００４８】
また、本発明の細胞培養キットは、骨芽細胞分化誘導因子を含んでもよい。骨芽細胞分化誘導因子としては、デキサメタゾン、ＦＫ−５０６又はシクロスポリン等の免疫抑制剤、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７又はＢＭＰ９等の骨形成タンパク質（ＢＭＰ：Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＴＧＦβ等の骨形成液性因子を挙げることができる。本発明の骨芽細胞分化誘導キットは、これらの骨芽細胞分化誘導因子から選択される１種又は２種以上を含むことができる。
また、本発明の細胞培養キットは、間葉系幹細胞からの骨芽細胞の分化誘導用であることを明記した使用説明書を含んでもよい。間葉系幹細胞からの骨芽細胞の分化誘導用である旨の記載は、キットの容器等に付されていてもよい。
【００４９】
［４］骨芽細胞分化誘導方法
本発明の骨芽細胞分化誘導方法は、トランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲンを含む細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる工程（以下、コラーゲン接触工程と称することがある）を含む。本発明の骨芽細胞分化誘導方法においては、前記トランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲン、及び前記細胞培養基材を用いることができる。
【００５０】
（コラーゲン接触工程）
骨芽細胞分化誘導方法において、前記細胞培養基材と、間葉系幹細胞との接触に用いる培地は、間葉系幹細胞が維持できる培地であれば限定されないが、通常その間葉系幹細胞の培養に用いる培地を用いればよい。例えば、ＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、又はＤＭＥＭ培地等の公知の培地を、培養する細胞に合わせて適宜選んで用いることができる。
接触時間は、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導が起きる限りにおいて、限定されないが、実質的には、下限は１０分以上であり、好ましくは１時間以上であり、より好ましくは１日以上である。接触時間の上限も限定されないが、３０日以下であり、好ましくは１５日以下であり、より好ましくは７日以下である。
接触温度は、間葉系幹細胞の最適な培養温度に従って、適宜決定することができる。例えば、哺乳類の間葉系幹細胞の場合、３０℃〜４０℃であり、３５℃〜３７℃が好ましい。しかしながら、培養温度よりも高い温度、又は低い温度で接触させることも可能である。例えば、変性温度が低い魚類由来コラーゲンを用いた場合、培養温度よりも低い接触温度で、細胞培養基材と、間葉系幹細胞との接触を行い、最適な培養温度に上昇させて、間葉系幹細胞の培養を行うことも可能である。
【００５１】
通常、骨芽細胞分化誘導は、１０〜１５％程度の血清の存在下で行う。本発明の骨芽細胞分化誘導方法においても、１０〜１５％程度の血清の存在下で分化誘導を行うことが可能であるが、低濃度の血清の存在下、又は血清の非存在下でも骨芽細胞分化誘導を行うことが可能である。間葉系幹細胞から骨芽細胞分化誘導する場合の、血清中の様々な因子の影響を排除するためには、低濃度の血清の存在下で接触させるのが好ましい。例えば、１０％以下の血清存在下が好ましく、５％以下の血清存在下がより好ましく、３％以下の血清存在下が更に好ましく、血清非存在下が最も好ましい。
骨芽細胞分化誘導において用いることのできる血清は、哺乳動物の血清であれば、特に限定されないが、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、又はヤギなどの血清を用いることができる。しかしながら、間葉系幹細胞を生体から分離した場合、その間葉系幹細胞を採取した個体の血清を用いることが最も好ましい。その個体自体の血清を用いることにより、ウシなどの血清に含まれる可能性のある人畜共通感染症の病原体との接触を防ぐことが可能である。
【００５２】
（骨芽細胞分化誘導因子）
発明の骨芽細胞分化誘導方法は、前記間葉系幹細胞を骨芽細胞分化誘導因子に接触させる工程（以下、骨芽細胞分化誘導因子接触工程と称することがある）を、含むことができる。骨芽細胞分化誘導因子接触工程は、コラーゲン接触工程と同時に行ってもよく、コラーゲン接触工程接触工程の前又は後に行ってもよい。骨芽細胞分化誘導因子接触工程は、骨芽細胞分化誘導因子を、間葉系幹細胞が含まれている培地に添加することによって行うことができる。
骨芽細胞分化誘導因子は、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導できる限り、限定されるものではないが、例えば、デキサメタゾン、ＦＫ−５０６又はシクロスポリン等の免疫抑制剤、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７又はＢＭＰ９等の骨形成タンパク質（ＢＭＰ：Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＴＧＦβ等の骨形成液性因子を挙げることができる。これらの骨芽細胞分化誘導因子から選択される１種又は２種以上を、培地に添加することにより、骨芽細胞分化誘導因子接触工程を行うことができる。
骨芽細胞分化誘導因子の濃度は、用いる骨芽細胞分化誘導因子の種類に応じて、適宜決めることができる。例えば、デキサメタゾンを用いる場合、１〜１００ｎＭの濃度で用いることができ、特には１０ｎＭが好ましい。
【００５３】
本発明の骨芽細胞分化誘導方法におけるコラーゲン接触工程、及び骨芽細胞分化誘導因子接触工程は、同時に行ってもよく、別々に行ってもよい。それぞれの工程を別に行う場合、３つの工程を別に行ってもよく、２つの工程を同時に行い、もう１つの工程を別に行うこともできる。
それぞれの工程を行う順番も、特に限定されないが、コラーゲン接触工程により、骨芽細胞の初期分化誘導が強く惹起されるため、コラーゲン接触工程の後に、骨芽細胞分化誘導因子接触工程を行うのが好ましい。
【００５４】
（間葉系幹細胞）
トランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲンを含む細胞培養基材と接触させる間葉系幹細胞としては、髄骨芽細胞に分化誘導することのできる細胞であれば、限定されないが、例えば、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ＥＳ細胞由来間葉系幹細胞、又はｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞を挙げることができる。また、前記間葉系幹細胞の由来する動物種も、特に限定されず、哺乳類としては、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ウサギ、モルモット、ラット、及びマウスを挙げることができる。また、鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、及びホロホロチョウを挙げることができ、爬虫類としては、ワニ、カメ、及びトカゲを挙げることができ、両生類としては、カエル、及びイモリを挙げることができ、魚類としては、テラピア、タイ、ヒラメ、サメ、及びサケを挙げることができる。更に、無脊椎動物としては、カニ、貝類、クラゲ、及びエビを挙げることができる。
前記間葉系幹細胞は骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、又は軟骨細胞などの間葉系に属する細胞への分化能を持つ細胞であり、骨、血管、又は心筋を構成することのできる細胞となるものである。
【００５５】
前記間葉系幹細胞は、株化細胞を用いてもよく、また、常法に従って調整することも可能であり、更には市販されている細胞を用いることもできる。また、生体から分離した間葉系幹細胞（例えば、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ＥＳ細胞由来間葉系幹細胞、又はｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞）を、本発明の骨芽細胞分化誘導方法により骨芽細胞に分化誘導することができる。この場合、生体から採取された細胞は、常法に従って結合組織等を除去して調製することが好ましい。更に、生体から採取された細胞は、初代培養細胞を用いることが好ましい。継代して用いることも可能であるが、継代数は少ないほうが好ましく、１０回以下が好ましく、５回以下が更に好ましく、２回以下であることが、最も好ましい。
【００５６】
［５］骨芽細胞製造方法及び骨芽細胞
（培養工程）
本発明の骨芽細胞製造方法における培地は、用いる間葉系幹細胞、例えば骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ＥＳ細胞由来間葉系幹細胞、又はｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞に合わせて、適宜選択することができる。例えば、骨髄間葉系幹細胞の場合、ＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、又はＤＭＥＭ培地等を用いることができる。また、前記の培地には、抗生物質等を添加してもよい。
【００５７】
培養時間は、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導が起きる限りにおいて、限定されないが、１日〜３０日であり、好ましくは１日〜１４日であり、より好ましくは３日〜１０日である。
培養温度は、間葉系幹細胞の最適な培養温度に従って、適宜決定することができるが、哺乳類の間葉系幹細胞の場合、３０℃〜４０℃が好ましく、３５℃〜３７℃がより好ましい。しかしながら、変性温度が低い魚類由来コラーゲンを用いた場合、間葉系幹細胞の培養の最適温度よりも低い温度で培養することも可能である。また、培養は、３〜１０％のＣＯ２存在下で行うことが好ましく、５％ＣＯ２存在下で行うことがより好ましい。
【００５８】
通常、間葉系幹細胞の培養は、１０〜１５％程度の血清の存在下で行い、骨芽細胞を製造する。本発明の骨芽細胞製造方法においても、１０〜１５％程度の血清の存在下で骨芽細胞を製造することが可能であるが、低濃度の血清の存在下、又は血清の非存在下でも骨芽細胞の製造を行うことが可能である。間葉系幹細胞から骨芽細胞を製造する場合の、血清中の様々な因子の影響を排除するためには、低濃度の血清の存在下で製造するのが好ましい。例えば、１０％以下の血清存在下が好ましく、５％以下の血清存在下がより好ましく、３％以下の血清存在下が更に好ましく、血清非存在下が最も好ましい。
骨芽細胞の製造において用いることのできる血清は、哺乳動物の血清であれば、特に限定されないが、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、又はヤギなどの血清を用いることができる。しかしながら、間葉系幹細胞を生体から分離した場合、その間葉系幹細胞を採取した個体の血清を用いることが最も好ましい。その個体自体の血清を用いることにより、ウシなどの血清に含まれる可能性のある人畜共通感染症の病原体との接触を防ぐことが可能である。
【００５９】
（骨芽細胞分化誘導因子）
本発明の骨芽細胞製造方法において、培養用の培地に骨芽細胞分化誘導因子を含むことができる。骨芽細胞分化誘導因子は、培養の開始から添加してもよく、培養の途中で添加してもよい。
骨芽細胞分化誘導因子は、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導できる限り、限定されるものではないが、例えば、デキサメタゾン、ＦＫ−５０６又はシクロスポリン等の免疫抑制剤、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７又はＢＭＰ９等の骨形成タンパク質（ＢＭＰ：Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＴＧＦβ等の骨形成液性因子を挙げることができる。これらの骨芽細胞分化誘導因子から選択される１種又は２種以上を、培地に添加することにより、骨芽細胞分化誘導因子接触工程を行うことができる。
骨芽細胞分化誘導因子の濃度は、用いる骨芽細胞分化誘導因子の種類に応じて、適宜決めることができる。例えば、デキサメタゾンを用いる場合、１〜１００ｎＭの濃度で用いることができ、特には１０ｎＭが好ましい。
【００６０】
（骨芽細胞）
本発明の骨芽細胞は、本発明の製造方法により得ることのできる骨芽細胞であり、骨組織において骨形成を行うことができる。前記骨芽細胞は、間葉系幹細胞から、骨芽前駆細胞に分化し、更に骨芽細胞へと分化されたものである。また、骨芽細胞の細胞質は好塩基性を示し、アルカリホスファターゼ活性を有している。更に、本発明の骨芽細胞は、アンドロゲンとエストロゲンのレセプターを持っていてもよい。アンドロゲンは骨芽細胞の活動性を低下させ、エストロゲンは骨芽細胞を刺激するものである。
【００６１】
《作用》
本発明のトランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲンが、骨芽細胞を分化誘導できる機構は、詳細には解明されていないが、以下のように考えることができる。しかしながら、本発明は、以下の説明によって限定されるものではない。
本発明に用いる魚類由来コラーゲンは配向性が優れているが、トランスグルタミナーゼ処理によって、更に配向性がよくなりその構造が長期間保持されるのではないかと考えられる。また、魚類由来コラーゲンはフレキシビリティーが優れており、トランスグルタミナーゼ処理によってフレキシビリティーが改善される、または長期間保持されるものと考えられる。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００６３】
《実施例１》
本実施例では、テラピア鱗コラーゲンをトランスグルタミナーゼで酵素処理しながら、細胞培養用プレートに被覆し、細胞培養基材を作製した。
（Ａ）細胞培養基材の作製
テラピア鱗コラーゲン（セルキャンパス（登録商標）ＡＱ−０３Ａ；多木化学）を、ｐＨ３の０．０１Ｍ塩酸溶液を用いて０．３重量％に希釈した。このテラピア鱗コラーゲン溶液に、放線菌（streptoverticillium）由来のトランスグルタミナーゼ（１００Ｕ／ｇ：アクティバ（登録商標）−ＧＳ；味の素）を５Ｕ／ｍＬになるように混合した。トランスグルタミナーゼを添加したテラピア鱗コラーゲン溶液を、組織培養用ポリスチレン６ウエルプレートに、１ｍＬ分注した。室温で２時間放置した後、ＰＢＳで洗浄し、細胞培養基材を得た。
【００６４】
（Ｂ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ；Ｌｏｎｚａ）を１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ウエルで、前記細胞培養プレートに播種した。培地は、１０％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭを用い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で、２４時間培養を行った。
【００６５】
（Ｃ）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の測定
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を確認するため、アルカリホスファターゼを測定した。培養細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞懸濁まで−８０℃で保存した。細胞をＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（100 mM Tris-HCl（pH 7.5）、5 mM塩化マグネシウム、及び0.2% TritonX-100）に懸濁し、そして超音波破砕した。６０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。アルカリホスファターゼ活性は、測定キット（LabAssay ALP：和光純薬）を用い、メーカーの指示書に従って測定した。吸光度は４５０ｎｍを用いた。結果を図１にＴ＆ＥＣとして、示す。
【００６６】
《比較例１》
本比較例では、トランスグルタミナーゼで酵素処理されていないテラピア鱗コラーゲンを細胞培養用プレートに被覆し、細胞培養基材を作製した。
トランスグルタミナーゼを使用しなかったことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。結果を図１にＴＣとして、示す。
【００６７】
《比較例２》
本比較例では、ブタコラーゲンを用い、トランスグルタミナーゼで酵素処理しながら、細胞培養用プレートに被覆し、細胞培養基材を作製した。
テラピア鱗コラーゲンに代えて、ブタコラーゲン（Cellmatrix Type I-C：新田ゼラチン）を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。結果を図１にＰ＆ＥＣとして、示す。
【００６８】
《比較例３》
本比較例では、トランスグルタミナーゼで酵素処理されていないブタコラーゲンを細胞培養用プレートに被覆し、細胞培養基材を作製した。
トランスグルタミナーゼを使用しなかったことを除いては、比較例１の操作を繰り返した。結果を図１にＰＣとして示す。
【００６９】
《比較例４》
本比較例では、コラーゲンの被覆されていない細胞培養用プレートを用いて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養し、アルカリホスファターゼ活性を測定した。
コラーゲンの被覆された細胞培養基材に代えて、コラーゲンの被覆されていない細胞培養用プレートを用いたことを除いては、実施例１の（Ｂ）及び（Ｃ）の操作を繰り返した。結果を図１にＴＣＰＳとして示す。
【００７０】
図１に示したように、コラーゲンの被覆されていない細胞培養用プレート（比較例４：ＴＣＰＳ）、ブタコラーゲンの被覆された細胞培養用プレート（比較例３；ＰＣ）、及びトランスグルタミナーゼで酵素処理されたブタコラーゲンの被覆された細胞培養用プレート（比較例２；Ｐ＆ＥＣ）では、アルカリホスファターゼ活性が低かった。しかしながら、テラピア鱗コラーゲンの被覆された細胞培養用プレート（比較例１；ＴＣ）では、ＡＬＰ活性が上昇し、更にトランスグルタミナーゼで酵素処理されたテラピア鱗コラーゲンの被覆された細胞培養用プレート（実施例１：Ｔ＆ＥＣ）では、顕著なＡＬＰ活性の上昇が認められた。
【００７１】
《実施例２》
本実施例では、テラピア鱗コラーゲンを用いたコラーゲン多孔体を製造し、そのコラーゲン多孔体をトランスグルタミナーゼで酵素処理することによって、細胞培養基材を作製した。また、架橋度をＴＮＢＳ法により測定することによって、トランスグルタミナーゼの、添加量の検討を行った。
（Ａ）細胞培養基材の作製
０．３重量％のテラピア鱗コラーゲン（セルキャンパス（登録商標）ＡＱ−０３Ａ；多木化学）溶液を、４８時間凍結乾燥した。凍結乾燥されたコラーゲン多孔体を０．０１Ｍ酢酸（ｐＨ３）３ｍＬに添加し、４℃で２４時間混合することによって１重量％テラピア鱗コラーゲン溶液を得た。テラピア鱗コラーゲン溶液を、２４ウエル細胞培養プレートに分注し、凍結乾燥することによってテラピア鱗コラーゲンスポンジを得た。得られたテラピア鱗コラーゲン多孔体は１０％塩化ナトリウムを含むＰＢＳに浸漬し、陰圧にすることにより、細孔に含まれる空気を除いた。テラピア鱗コラーゲン多孔体を、１Ｕ／ｍＬ、３Ｕ／ｍＬ、５Ｕ／ｍＬ、又は７Ｕ／ｍＬの放線菌（streptoverticillium）由来のトランスグルタミナーゼ（１００Ｕ／ｇ：アクティバ（登録商標）−ＧＳ；味の素）を含む１０％塩化ナトリウム含有ＰＢＳに浸漬し、３０℃で１２時間、放置した。処理終了後、テラピア鱗コラーゲン多孔体はＰＢＳで３回洗浄し、多孔体の細胞培養基材を得た。
【００７２】
（Ｂ）架橋度の測定
遊離のアミノ基の数を、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）吸収によって定量した。凍結乾燥したコラーゲンスポンジの質量を測定し、１．５ｍＬのチューブに入れた。２００μＬの４％ＮａＨＣＯ３及び２００μＬのＴＮＢＳ（シグマ）をそれぞれのチューブに添加し、３７℃で３時間、暗所に放置した。その後、１ｍＬの６ＭＨＣｌをそれぞれのチューブに加え、９０℃で２０分間インキュベートすることにより、加水分解し、完全に溶解させた。吸光度は、３４５ｎｍで測定した。
【００７３】
結果を図２ａに示す。トランスグルタミナーゼが５Ｕ／ｍＬで最も高い架橋度を示した。
【００７４】
《実施例３》
本実施例では、実施例２と同様に、トランスグルタミナーゼで酵素処理したテラピア鱗コラーゲン多孔体を製造し、酵素処理の温度の検討を行った。
トランスグルタミナーゼの濃度を５Ｕ／ｍＬとし、酵素処理の温度を３０℃、４０℃、又は５０℃としたことを除いては、実施例２の操作を繰り返した。
結果を図２ｂに示す。反応温度が５０℃で最も高い架橋度を示した。
【００７５】
《実施例４》
本実施例では、実施例２と同様に、トランスグルタミナーゼで酵素処理したテラピア鱗コラーゲン多孔体を製造し、酵素処理の時間の検討を行った。
トランスグルタミナーゼの濃度を５Ｕ／ｍＬとし、酵素処理の時間を４時間、８時間又は１２時間としたことを除いては、実施例２の操作を繰り返した。
結果を図２ｃに示す。反応時間が１２時間で最も高い架橋度を示した。
【００７６】
《実施例５》
本実施例では、トランスグルタミナーゼで酵素処理したテラピア鱗コラーゲン多孔体、及びトランスグルタミナーゼで酵素処理を行っていないテラピア鱗コラーゲン多孔体の電顕像を比較した。
５Ｕ／ｍＬトランスグルタミナーゼを用い、実施例２（Ａ）の操作を繰り返し、トランスグルタミナーゼで酵素処理したテラピア鱗コラーゲン多孔体を得た。また、酵素処理を行わないことを除いては、実施例２（Ａ）の操作を繰り返し、トランスグルタミナーゼで酵素処理を行っていないテラピア鱗コラーゲン多孔体を得た。
得られたコラーゲン多孔体を、電子顕微鏡で観察した。結果を図３ａ（非酵素処理）、及び図３ｂ（酵素処理）に示す。コラーゲン壁の変形又は細孔の閉塞は観察されなかった。
【００７７】
《比較例４》
本実施例では、トランスグルタミナーゼで酵素処理したブタコラーゲン多孔体、及びトランスグルタミナーゼで酵素処理を行っていないブタコラーゲン多孔体の電顕像を比較した。
５Ｕ／ｍＬトランスグルタミナーゼを用いたこと、及びテラピア鱗コラーゲンに代えてブタコラーゲン（Cellmatrix Type I-C：新田ゼラチン）を用いたことを除いては、実施例２（Ａ）の操作を繰り返し、トランスグルタミナーゼで酵素処理したブタコラーゲン多孔体を得た。また、同様に酵素処理を行わないことを除いて、実施例２（Ａ）の操作を繰り返し、トランスグルタミナーゼで酵素処理を行っていないブタコラーゲン多孔体を得た。
得られたコラーゲン多孔体を、電子顕微鏡で観察した。結果を図３ｃ（非酵素処理）、及び図３ｄ（酵素処理）に示す。コラーゲン壁の変形又は細孔の閉塞は観察されなかった。
【００７８】
《実施例６》
本実施例、及び比較例５〜７では、トランスグルタミナーゼで酵素処理した細胞培養基材と、グルタルアルデヒドによる化学架橋された細胞培養基材との骨芽細胞の分化誘導能を比較した。本実施例では、トランスグルタミナーゼで酵素処理されたテラピア鱗コラーゲン多孔体の細胞培養基材を作製した。
５Ｕ／ｍＬトランスグルタミナーゼを用いたことを除いては、実施例２（Ａ）の操作を繰り返し細胞培養基材（テラピア鱗コラーゲン多孔体）を得た。
【００７９】
（Ｂ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養
得られたテラピア鱗コラーゲン多孔体は、７０％エタノールで２０分間滅菌し、滅菌ＰＢＳで５回洗浄した。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ；Ｌｏｎｚａ）を、多孔体の細胞培養基材あたり、１．０×１０４ｃｅｌｌｓで播種した。培地は、１０％ＦＢＳ、及び１％抗生物質−抗真菌剤の添加されたＤ−ＭＥＭを用い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で、２４時間培養した。
【００８０】
（Ｃ）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の測定
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を確認するため、アルカリホスファターゼを測定した。培養細胞をＰＢＳで洗浄し、培養細胞と細胞培養基材（多孔体）を回収した。回収した細胞及び細胞培養基材をＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（100 mM Tris-HCl（pH 7.5）、5 mM塩化マグネシウム、及び0.2% TritonX-100）に添加し、ボールミルで破砕した。６０００ｇで２０分間遠心分離し、上清を回収した。アルカリホスファターゼ活性は、測定キット（LabAssay ALP：和光純薬）を用い、メーカーの指示書に従って測定した。吸光度は４５０ｎｍを用いた。
結果を図４にＥ−Ｔとして示す。
【００８１】
《比較例５》
本比較例では、トランスグルタミナーゼで酵素処理されたブタコラーゲン多孔体の細胞培養基材を作製した。
テラピア鱗コラーゲンに代えて、ブタコラーゲン（Cellmatrix Type I-C：新田ゼラチン）を用いたことを除いては、実施例６の操作を繰り返した。結果を図４にＥ−Ｐとして示す。
【００８２】
《比較例６》
本比較例では、グルタルアルデヒドで架橋処理されたテラピア鱗コラーゲン多孔体の細胞培養基材を作製した。
（Ａ）細胞培養基材の作製
０．３重量％のテラピア鱗コラーゲン（セルキャンパス（登録商標）ＡＱ−０３Ａ；多木化学）溶液を、４８時間凍結乾燥した。凍結乾燥されたコラーゲン多孔体を０．０１Ｍ酢酸（ｐＨ３）３ｍＬに添加し、４℃で２４時間混合することによって１重量％テラピア鱗コラーゲン溶液を得た。テラピア鱗コラーゲン溶液を、２４ウエル細胞培養プレートに分注し、凍結乾燥することによってテラピア鱗コラーゲン多孔体を得た。得られたテラピア鱗コラーゲン多孔体を２ｍＬの２５％グルタルアルデヒド溶液とともに、密閉した容器に入れ、３７℃で１時間放置した。コラーゲン多孔体の架橋されていない未反応のサイトを０．１Ｍグリシンでブロックした。ＰＢＳで洗浄し、細胞培養基材とした。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養、及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の測定は、前記実施例６（Ｂ）及び（Ｃ）の操作を繰り返した。結果を図４にＧＡ−Ｔとして示す。
【００８３】
《比較例７》
本比較例では、グルタルアルデヒドで架橋処理されたブタコラーゲン多孔体の細胞培養基材を作製した。
テラピア鱗コラーゲンに代えて、ブタコラーゲン（Cellmatrix Type I-C：新田ゼラチン）を用いたことを除いては、比較例６の操作を繰り返した。結果を図４にＧＡ−Ｐとして示す。
【００８４】
図４に示すように、グルタルアルデヒドで架橋した細胞培養基材（比較例６：ＧＡ−Ｔ及び比較例７：ＧＡ−Ｐ）では、ＡＬＰ活性の上昇は見られなかった。また、トランスグルタミナーゼで酵素処理されたブタコラーゲン多孔体（比較例５：Ｅ−Ｐ）でもＡＬＰ活性の上昇は見られなかった。しかしながら、トランスグルタミナーゼで酵素処理されたテラピア鱗コラーゲン多孔体の細胞培養基材（実施例６：Ｅ−Ｔ）で培養した細胞は、高いＡＬＰ活性を示し、骨芽細胞への分化が確認された。
【００８５】
《実施例７》
本実施例では、テラピア鱗コラーゲン多孔体を用いて培養した培養細胞のオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）の発現を検討した。オステオカルシンは、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化における後期のステージで発現するタンパク質である。
５Ｕ／ｍＬトランスグルタミナーゼを用いて、実施例２（Ａ）の操作を繰り返して、テラピア鱗コラーゲン多孔体の細胞培養基材を得た。
【００８６】
（Ｂ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養
得られたテラピア鱗コラーゲン多孔体は、７０％エタノールで２０分間滅菌し、滅菌ＰＢＳで５回洗浄した。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ；Ｌｏｎｚａ）を、多孔体の細胞培養基材あたり、１．０×１０４ｃｅｌｌｓで播種した。培地は、１０％ＦＢＳ、及び１％抗生物質−抗真菌剤の添加されたＤ−ＭＥＭを用い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で、２４時間培養した。その後、培地を３％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地（１０ｎＭデキサメサゾン（シグマ）、５０μｇ／ｍＬリン酸Ｌアスコルビン酸マグネシウム（和光純薬）、及び１０ｍＭβ−グリセロリン酸（シグマ）添加）に交換して、７日間又は２８日間、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。培地は、１週間に３回交換した。
【００８７】
（Ｃ）オステオカルシンの測定
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を確認するため、オステオカルシンを測定した。培養細胞は穏やかにＰＢＳで洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳに入れた。細胞及び細胞培養基材は、ボールミルで破砕した。破砕物の一部をＤＮＡ量を測定するために回収し、残りを等量の２０容量％ギ酸に混合し、４℃で２日以上、インキュベートした。１４０００ｒｐｍで、４℃、２０分間遠心分離した。上清に含まれているカルシウムをＮＡＰ−５カラム（ＧＥヘルスケア）で除去し、タンパク画分を１０％ギ酸で溶出させた。バッファーを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（５，０００ＭＷＣＯ）を用いて、ＴＥバッファーに交換した。オステオカルシンのＥＬＩＳＡキット（Human Gla-Osteocalcin High Sensitive EIA (宝酒造)）を用いてメーカーの説明書に従って、オステオカルシンを測定した。結果を図５に、Ｅ−Ｔ／１ｗ及びＥ−Ｔ／３ｗとして示す。
【００８８】
《比較例８》
本比較例では、ブタコラーゲン多孔体を用いて培養した培養細胞のオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）の発現を検討した。
テラピア鱗コラーゲンに代えて、ブタコラーゲン（Cellmatrix Type I-C：新田ゼラチン）を用いたことを除いては、実施例７の操作を繰り返した。結果を図５にＥ−Ｐ／１ｗ及びＥ−Ｐ／３ｗとして示す。
【００８９】
図５に示すように、トランスグルタミナーゼで酵素処理されたテラピア鱗コラーゲン多孔体の細胞培養基材（実施例７：Ｅ−Ｔ／１ｗ及びＥ−Ｔ／３ｗ）で培養した細胞は、トランスグルタミナーゼで酵素処理されたブタコラーゲン多孔体（比較例８：Ｅ−Ｐ／１ｗ及びＥ−Ｐ／３ｗ）と比較して、高いオステオカルシンの発現を示した。特に、培養の３週間後に高い発現を示し、骨芽細胞の分化誘導の後期のステージであることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明のトランスグルタミナーゼによる酵素処理をされた魚類由来コラーゲン、それを用いた細胞培養基材は、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導に用いることができる。また、本発明の骨芽細胞製造方法を用いて、間葉系幹細胞から骨芽細胞を製造することができ、骨疾患の治療に有効に用いることができる。特に骨芽細胞への分化誘導を長期間維持することが可能であり、有効な治療方法を提供することができる。また、本発明によれば、骨芽細胞分化誘導キット及び骨芽細胞製造装置を製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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