(57)【要約】【課題】  ジャトロファの系統図を構築できるような、ジャトロファの系統分類・識別方法、及び当該方法に好適なプライマーセットを提供する。【解決手段】  ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをマーカーとして用いる方法であり、主たるＬＴＲ型レトロトランスポゾンファミリー、ＬＴＲ配列の同定に基づき、効率的なプライマーセット（（ｉ）隣接フォワードプライマー、（ii）隣接リバースプライマー、（iii）ＬＴＲフォアワードプライマー又はＬＴＲリバースプライマー、（iv）ＲＴＰフォワードプライマー又はＲＴＰリバースプライマーの組み合わせ）を設計した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＴＲ（Long  Terminal  Repeat）型レトロトランスポゾンマーカーを用いたジャトロファの系統分類・識別方法であって、
下記（ｉ）及び（ｉｉ）、並びに（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のプライマーを含むプライマーセットを用いて、判定対象のジャトロファから調製したＤＮＡを鋳型として、核酸増幅反応を行う工程：
（ｉ）左側ＬＴＲの５’側隣接領域の塩基配列と相補性を有する１５〜６０塩基のフォワードプライマー（以下、「隣接フォワードプライマー」という）、
（ｉｉ）右側ＬＴＲの３’側隣接領域の塩基配列と相補性を有する１５〜６０塩基のリバースプライマー（以下、「隣接リバースプライマー」という）、
（ｉｉｉ）前記右側ＬＴＲ配列の３’末端配列およびその３’側隣接配列と相補性を有する１５〜６０塩基のフォワードプライマー又は前記左側ＬＴＲ配列の５’末端配列およびその５’側隣接配列と相補性を有する１５〜６０塩基のリバースプライマー（以下、「ＬＴＲプライマー」という）、
（ｉｖ）前記左右ＬＴＲ配列の間に存するレトロトランスポゾン配列の少なくとも一部と相補性を有する１５〜６０塩基のフォワード又はリバースプライマー（以下、「ＲＴＰフォワードプライマー」又は「ＲＴＰリバースプライマー」という）；
並びに前記増幅反応により得られた増幅産物の有無及び長さに基づいて、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）で用いたレトロトランスポゾン配列を含むＬＴＲ型レトロトランスポゾンの挿入の有無を判定する工程
を含むジャトロファの系統分類・識別方法。
【請求項２】
前記プライマーセットとして、上記（ｉ）及び（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のＬＴＲフォワードプライマー及びＬＴＲリバースプライマーを用いる、請求項１に記載のジャトロファの系統分類・識別方法。
【請求項３】
前記レトロトランスポゾンは、Ｊｃ３（配列番号４９）、Ｊｃ７（配列番号５０）、Ｊｃ８（配列番号５１）、及びＪｃ９（配列番号５２）、並びに前記各配列と８５％以上の相同性を有する配列で表されるレトロトランスポゾンからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１又は請求項２に記載のジャトロファの系統分類・識別方法。
【請求項４】
前記ＬＴＲの塩基配列は、配列番号３９〜４１より選ばれる１種で示される配列と８５％以上の相同性を有する配列である請求項１又は請求項２に記載のジャトロファの系統分類・識別方法。
【請求項５】
配列番号１、２及び３に示すプライマー、又は前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなるプライマーセットを用いて、Ｊｃ３ＳのＬＴＲ型レトロトランスポゾンの有無を検出するジャトロファの系統分類・識別方法。
【請求項６】
配列番号３５、３６、３７及び３８に示すプライマー、又は前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなるプライマーセットを用いて、Ｊｃ９ＳのＬＴＲ型レトロトランスポゾンの有無を検出するジャトロファの系統分類・識別方法。
【請求項７】
前記プライマーセットとして、複数のレトロトランスポゾンの挿入の有無を判定するための複数のプライマーセットを使用し、
さらに、各レトロトランスポゾンの挿入の有無に基づいて、ジャトロファの系統を分類・識別する工程を含む請求項１又は請求項２に記載のジャトロファの系統分類・識別方法。
【請求項８】
レトロトランスポゾンを含む系統の増幅産物の断片長は、５０〜２０００ｂｐである請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のジャトロファの系統分類・識別方法。
【請求項９】
前記核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載のジャトロファの系統分類・識別方法。
【請求項１０】
前記増幅産物の長さの区別は、アガロースゲル電気泳動又はポリアクリルアミドゲル電気泳動により行う請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のジャトロファの系統分類・識別方法。
【請求項１１】
下記ＬＴＲの配列に基づく前記プライマーセットは、以下のとおりである請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載のジャトロファの系統分類・識別方法：
（１）前記ＬＴＲが配列番号３９の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ａ）配列番号１，２，及び３のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のプライマーセット；
（２）前記ＬＴＲが配列番号４０の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ｂ）配列番号４，５，及び６のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（３）前記ＬＴＲが配列番号４１の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、を有する場合、（ｃ）配列番号７，８，９，及び１０のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（４）前記ＬＴＲ配列が配列番号４２の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ｄ）配列番号１１，１２，１３，及び１４のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（５）前記ＬＴＲが配列番号４３の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ｅ）配列番号１５，１６，１７，及び１８のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（６）前記ＬＴＲが配列番号４４の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ｆ）配列番号１９，２０，２１，及び２２のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（７）前記ＬＴＲが配列番号４５の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ｇ）配列番号２３，２４，２５，及び２６のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（８）前記ＬＴＲが配列番号４６の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ｈ）配列番号２７，２８，２９，及び３０のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも３種のプライマーセット；
（９）前記ＬＴＲが配列番号４７の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ｉ）配列番号３１，３２，３３及び３４のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；及び
（１０）前記ＬＴＲが配列番号４８の配列を有する場合、（ｊ）配列番号３５，３６，３７，及び３８のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のプライマーセット。
【請求項１２】
下記プライマーセットから選択される少なくとも１つのプライマーセットを含むジャトロファの系統分類・識別キット。
（ａ）配列番号１，２，及び３のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のプライマーセット；
（ｂ）配列番号４，５，及び６のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｃ）配列番号７，８，９，及び１０のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｄ）配列番号１１，１２，１３，及び１４のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｅ）配列番号１５，１６，１７，及び１８のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｆ）配列番号１９，２０，２１，及び２２のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｇ）配列番号２３，２４，２５，及び２６のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｈ）配列番号２７，２８，２９，及び３０のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｉ）配列番号３１，３２，３３及び３４のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも３種のプライマーセット；及び
（ｊ）配列番号３５，３６，３７，及び３８のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のプライマーセット。
【請求項１３】
下記プライマーセットをすべて含むジャトロファの系統分類・識別キット。
（ａ）配列番号１，２，及び３のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のプライマーセット；
（ｂ）配列番号４，５，及び６のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｃ）配列番号７，８，９，及び１０のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｄ）配列番号１１，１２，１３，及び１４のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｅ）配列番号１５，１６，１７，及び１８のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｆ）配列番号１９，２０，２１，及び２２のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｇ）配列番号２３，２４，２５，及び２６のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｈ）配列番号２７，２８，２９，及び３０のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｉ）配列番号３１，３２，３３及び３４のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも３種のプライマーセット；及び
（ｊ）配列番号３５，３６，３７，及び３８のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジャトロファ（Ｊａｔｒｏｐｈａ）属ゲノムで、新規に同定されたcopia型レトロトランスポゾンのＬＴＲ（Long  Terminal  Repeat）配列に基づき、ジャトロファの系統を分類・識別する方法、及び系統分類・識別のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ジャトロファ・クルカス（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ  Ｌ）は種子から非食用ジャトロファ油を製造することができるため、バイオディーゼル燃料生産のための生物資源として注目を集めている。
バイオ燃料資源としてのジャトロファの利用性を高めるためには、耕作限界地でも生産可能なジャトロファ系統を選択する必要がある。さらに、環境ストレス耐性を高め、油の収率が高いジャトロファの育種開発のためには、現在存在しているジャトロファの品種、系統を分類・識別し、育種に活用することが望まれる。
【０００３】
しかしながら、現在のところ、ジャトロファについては、明確な品種分類というものはなされておらず、系統間の分類についても明確になされていないのが現状である。
ジャトロファは、メキシコ及び南米を起源とし、アフリカ、アジアにも広がったといわれている。ジャトロファのメキシコ・グアテマラ系統とアジア・アフリカ系統とが区別されているが、これらの系統の分類・識別方法についても、確立されていないのが現状である。
【０００４】
植物の系統分類を含めた品種識別方法としては、近年の分子生物学的技術の発展に伴いＤＮＡ多型を利用した品種識別方法が使われるようになっている。ＤＮＡマーカーを用いる識別方法は、植物体でその形質が現れているかどうかに関係なく、品種の違いを識別することができるという点で有利である。
【０００５】
ＤＮＡマーカーとしては、ＲＦＬＰ（Restriction  Fragment  Length  Polymorphism：制限酵素断片長多型）、ＡＦＬＰ（Amplified  Fragment  Length  Polymorphism：増幅断片長多型）、ＣＡＰＳ（Cleaved  Amplified  Polymorphic  Sequence：増幅切断多型配列）、ＳＳＲ（Simple  Sequence  Repeat）などが知られている。
【０００６】
ジャトロファについては、ＳＳＲマーカーを用いて、メキシコ・グアテマラ系統とアジア・アフリカ系統とが識別されている。
ここで、ＳＳＲとは、１〜４ヌクレオチドのモチーフがタンデムに繰り返している配列である。ゲノムに多数、散在しており、繰り返し数が変化しやすいので、ＤＮＡマーカーとして適している。また、ＳＳＲマーカーは共優性であり、ＲＡＰＤ等の優性マーカーより信頼性が高く、より多くの情報が得られる。例えば、繰り返し数の違いにより系統の違いを識別することが可能である。
しかしながら、ＳＳＲは、２〜４塩基の繰り返し配列回数の違いによる多型であることから、繰り返し回数の違いに基づいて、メキシコ・グアテマラ系統とアジア・アフリカ系統のような、種分化の違いを検出することはできるが、これらの系統の正確な区別のためには、さらなる検討が必要である。また、ＳＳＲでは、同系統内で、さらに分化した系統を区別、識別することは困難である。
【０００７】
上記の他、植物のゲノム中に多数存在する反復配列の１つであるレトロトランスポゾンも優れたＤＮＡマーカーとして知られている。レトロトランスポゾンは、そのゲノム中の配列が転写されると、さらに逆転写されて元の配列のコピーＤＮＡ断片を生成する。このＤＮＡ断片が、新たにゲノム中に挿入されると、挿入されたレトロトランスポゾン配列は安定的に子孫に遺伝する。したがって、レトロトランスポゾンに隣接するゲノム配列は、それぞれの種、系統に固有のものであり、ある系統、品種ではレトロトランスポゾンの挿入がみられるゲノムの場所に、別の系統、品種では挿入が見られないという品種間又は系統間の多型が存在する。このようなことから、レトロトランスポゾンは、植物ゲノム中に多数散在しており、挿入部位は、系統又は品種に特異的であることから、優れた共優性の遺伝的マーカーとなる。また、レトロトランスポゾンが、ゲノムに挿入されているか否かにより、進化の過程がわかり、ＳＳＲよりも正確に系統間の違いを知ることもできる。
【０００８】
レトロトランスポゾンマーカーを用いた品種識別方法としては、特許４８８９３２８号で、キクの品種識別方法として、レトロトランスポゾン配列内に設計されたプライマーを含むプライマーセットを用いてキクの品種を識別することが提案されている。
また、特開２００６−４２８０８号公報、特開２０１０−１７２３２２号公報では、加工食品に含まれる原料植物の植物種を判定する方法として、植物ゲノムの特定位置にレトロトランスポゾンが挿入されているか否かを検出する方法が開示されている。
【０００９】
また、非特許文献１において、豆（Pisum  sativum）について、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの挿入有無により、品種を識別することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許４８８９３２８号
【特許文献２】特開２００６−４２８０８号公報
【特許文献３】特開２０１０−１７２３２２号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Andrew  J.  Flavell  et  al.,  "Retrotransposon-based  insertion  polymorphism  (RBIP)  for  high  throughput  marker  analysis",  The  Plant  Journal,  (1998)  16(5)，  p.643-650
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ジャトロファについては、ＳＳＲマーカーを用いてメキシコ・グアテマラ系統とアジア・アフリカ系統の違い、及びメキシコ・グアテマラ系統間の違いを検出している程度であり、信頼できるマーカーでアジア・アフリカの各系統をさらに分類、識別したという報告は特になく、有用なマーカーも特に報告された例がない。
【００１３】
本発明の目的は、ジャトロファの系統の分類、さらには識別を行うことが可能なＤＮＡマーカーを用いたジャトロファの系統分類・識別方法、及び当該分類・識別のためのプライマーキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、メキシコ・グアテマラ系統、アジア・アフリカ系統の区別だけでなく、さらに、これらの系統内において分化した系統の分類・識別を行う方法として、レトロトランスポゾンマーカーを用いる方法を試みた。
ジャトロファについては、一部のタンパク質コード配列について同定情報が公開されている。同定されていない配列データは、ゲノム配列の一部として公開されている（http://www.kazusa.or.jp/jatropha)。
本発明者らは、上記配列データを基に、Ty1-copia型レトロトランスポゾンの主要メンバーとそれらのＬＴＲの配列を同定し、同定したＬＴＲ配列を基に、特定領域にレトロトランスポゾンの挿入があるか否かを検出できるプライマーを設計し、本発明を完成した。
【００１５】
すなわち、本発明のレトロトランスポゾンをマーカーとするジャトロファの系統分類・識別方法は、ＬＴＲ（Long  Terminal  Repeat）型レトロトランスポゾンマーカーを用いたジャトロファの系統分類・識別方法であって、
下記（ｉ）及び（ｉｉ）、並びに（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のプライマーを含むプライマーセットを用いて、判定対象のジャトロファから調製したＤＮＡを鋳型として、核酸増幅反応を行う工程：
（ｉ）左側ＬＴＲの５’側隣接領域の塩基配列と相補性を有する１５〜６０塩基のフォワードプライマー（以下、「隣接フォワードプライマー」という）、
（ｉｉ）右側ＬＴＲの３’側隣接領域の塩基配列と相補性を有する１５〜６０塩基のリバースプライマー（以下、「隣接リバースプライマー」という）、
（ｉｉｉ）前記右側ＬＴＲ配列の３’末端配列およびその３’側隣接配列と相補性を有する１５〜６０塩基のフォワードプライマー若しくは前記左側ＬＴＲ配列の５’末端配列およびその５’側隣接配列と相補性を有する１５〜６０塩基のリバースプライマー（以下、「ＬＴＲプライマー」という）、
（ｉｖ）前記左右ＬＴＲ配列の間に存するレトロトランスポゾン配列の少なくとも一部と相補性を有する１５〜６０塩基のフォワード又はリバースプライマー（以下、「ＲＴＰフォワードプライマー」又は「ＲＴＰリバースプライマー」という）；
並びに前記増幅反応により得られた増幅産物の有無及び長さに基づいて、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）で用いたレトロトランスポゾン配列を含むＬＴＲ型レトロトランスポゾンの挿入の有無を判定する工程を含む。
【００１６】
また、本発明は、本発明の識別方法の実施に有効なプライマーセットも包含する。すなわち、本発明のジャトロファの系統分類・識別用キットは、下記プライマーセットから選択される少なくとも１つのプライマーセットを含む：
（ａ）配列番号１，２，及び３のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のプライマーセット；
（ｂ）配列番号４，５，及び６のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｃ）配列番号７，８，９，及び１０のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｄ）配列番号１１，１２，１３，及び１４のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｅ）配列番号１５，１６，１７，及び１８のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｆ）配列番号１９，２０，２１，及び２２のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｇ）配列番号２３，２４，２５，及び２６のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｈ）配列番号２７，２８，２９，及び３０のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｉ）配列番号３１，３２，３３及び３４のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；及び
（ｊ）配列番号３５，３６，３７，及び３８のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のプライマーセット。
【００１７】
なお、本明細書において、「右側」「左側」とは、ゲノム地図を慣用にしたがって、５’側から３’側にむけて塩基が配列されるように表したときの右側（５’側）、左側（３’側）をいう。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のレトロトランスポゾンをマーカーとするジャトロファの系統分類・識別方法によれば、現在、明確な分類・識別がなされていないジャトロファの系統を、進化・分化の過程も含めて系統分類をすることができ、系統図を確立することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】copia型ＬＴＲレトロトランスポゾンの構成を説明するための図である。
【図２】Ｊｃ３ファミリーのレトロトランスポゾンの配列を示す図である。
【図３】Ｊｃ７ファミリーのレトロトランスポゾンの配列を示す図である。
【図４】Ｊｃ８ファミリーのレトロトランスポゾンの配列を示す図である。
【図５】Ｊｃ９ファミリーのレトロトランスポゾンの配列を示す図である。
【図６】本発明の系統分類・識別方法で使用するプライマーを説明するための図である。
【図７】系統分類・識別方法の態様を説明するための図である。
【図８】実施例で得られた電気泳動結果のゲルを撮像した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に本発明の実施の形態を説明するが、今回、開示された実施の形態は、すべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【００２１】
本実施形態のジャトロファの系統分類・識別方法は、ＬＴＲ（Long  Terminal  Repeat）型レトロトランスポゾンマーカーを用いたジャトロファの系統分類・識別方法であって、
下記（ｉ）及び（ｉｉ）、並びに（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のプライマーを含むプライマーセットを用いて、判定対象のジャトロファから調製したＤＮＡを鋳型として、核酸増幅反応を行う工程：
（ｉ）左側ＬＴＲの５’側隣接領域の塩基配列と相補性を有する１５〜６０塩基のフォワードプライマー（以下、「隣接フォワードプライマー」という）、
（ｉｉ）右側ＬＴＲの３’側隣接領域の塩基配列と相補性を有する１５〜６０塩基のリバースプライマー（以下、「隣接リバースプライマー」という）、
（ｉｉｉ）前記右側ＬＴＲ配列の３’末端配列およびその３’側隣接配列と相補性を有する１５〜６０塩基のフォワードプライマー若しくは前記左側ＬＴＲ配列の５’末端配列およびその５’側隣接配列と相補性を有する１５〜６０塩基のリバースプライマー（以下、「ＬＴＲプライマー」という）、
（ｉｖ）前記左右ＬＴＲ配列の間に存するレトロトランスポゾン配列の少なくとも一部と相補性を有する１５〜６０塩基のフォワード又はリバースプライマー（以下、「ＲＴＰフォワードプライマー」又は「ＲＴＰリバースプライマー」という）；
並びに前記増幅反応により得られた増幅産物の有無及び長さに基づいて、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）で用いたレトロトランスポゾン配列を含むＬＴＲ型レトロトランスポゾンの挿入の有無を判定する工程を含む。
【００２２】
レトロトランスポゾンをマーカーとして用いることにより、進化の過程を考慮して、ジャトロファの系統を分類することができる。
また、上記実施形態の方法によれば、レトロトランスポゾンの挿入の有無に基づいて増幅産物が得られる又は得られないことになり、あるいは得られる増幅産物の断片長が異なる。従って、増幅産物の有無及び断片長の差異に基づいて、レトロトランスポゾンの挿入の有無を検出することができ、作業が簡便である。
【００２３】
前記プライマーセットとして、上記（ｉ）及び（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のＬＴＲフォワードプライマー及びＬＴＲリバースプライマーを用いることが好ましい。これにより、レトロトランスポゾンの多型、隣接領域の多型も含めて、さらに分化した系統を分類・識別することが可能となる。
【００２４】
前記レトロトランスポゾンとしては、代表的には、Ｊｃ３（配列番号４９）、Ｊｃ７（配列番号５０）、Ｊｃ８（配列番号５１）、及びＪｃ９（配列番号５２）、並びに前記各配列と８５％以上の相同性を有する配列で表されるレトロトランスポゾンからなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
また、前記ＬＴＲの塩基配列としては、配列番号３９〜４１及び前記各配列と８５％以上の配列同一性を有する配列より選ばれる１種で示される配列が挙げられる。
【００２５】
好ましい実施態様として、配列番号１、２及び３に示すプライマー、又は前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなるプライマーセットを用いて、Ｊｃ３ＳのＬＴＲ型レトロトランスポゾンの有無を検出するジャトロファの系統分類・識別方法がある。また、別の好ましい実施態様として、配列番号３５、３６、３７及び３８に示すプライマー、又は前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなるプライマーセットを用いて、Ｊｃ９ＳのＬＴＲ型レトロトランスポゾンの有無を検出するジャトロファの系統分類・識別方法がある。
Ｊｃ３ＳのＬＴＲ型レトロトランスポゾン及びＪｃ９ＳのＬＴＲ型レトロトランスポゾンは、それぞれＪｃ３レトロトランスポゾン、Ｊｃ９レトロトランスポゾンの変異型で、ＬＴＲ配列のみを有するレトロトランスポゾンである。したがって、Ｊｃ３Ｓ、Ｊｃ９ＳのＬＴＲ配列の存在の有無を検出することにより、ジャトロファの系統を分類することができる。
【００２６】
前記プライマーセットとして、複数のレトロトランスポゾンの挿入の有無を判定するための複数のプライマーセットを使用し、さらに、各レトロトランスポゾンの挿入の有無に基づいて、ジャトロファの系統を分類・識別する工程を含んでもよい。
複数種類のレトロトランスポゾンの挿入の有無を検出し、検出結果の組み合わせにより、下流の系統分類までを総合的に行うことができる。
【００２７】
レトロトランスポゾンを含む系統の増幅産物の断片長は、５０〜２０００ｂｐであることが好ましい。また、前記核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であることが好ましい。さらに、前記増幅産物の長さの区別は、アガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動により行うことが好ましい。
これらの手法を用いることで、検出作業の簡便化を図ることができる。
【００２８】
上記実施形態において、下記ＬＴＲの配列に基づく前記プライマーセットの具体的態様は、好ましくは以下のとおりである。
（１）前記ＬＴＲが配列番号３９の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ａ）配列番号１，２，及び３のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のプライマーセット；
（２）前記ＬＴＲが配列番号４０の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ｂ）配列番号４，５，及び６のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（３）前記ＬＴＲが配列番号４１の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ｃ）配列番号７，８，９，及び１０のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（４）前記ＬＴＲ配列が配列番号４２の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ｄ）配列番号１１，１２，１３，及び１４のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット、
（５）前記ＬＴＲが配列番号４３の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ｅ）配列番号１５，１６，１７，及び１８のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（６）前記ＬＴＲが配列番号４４の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ｆ）配列番号１９，２０，２１，及び２２のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（７）前記ＬＴＲが配列番号４５の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ｇ）配列番号２３，２４，２５，及び２６のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（８）前記ＬＴＲが配列番号４６の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ｈ）配列番号２７，２８，２９，及び３０のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも３種のプライマーセット；
（９）前記ＬＴＲが配列番号４７の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ｉ）配列番号３１，３２，３３及び３４のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；及び
（１０）前記ＬＴＲが配列番号４８の配列又は当該配列と８５％以上の相同性を有する場合、（ｊ）配列番号３５，３６，３７，及び３８のプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のプライマーセット。
【００２９】
したがって、本発明は、本発明の実施形態を実行するジャトロファの系統分類・識別キットも包含し、好ましい態様としては、下記プライマーセットから選択される少なくとも１つのプライマーセットを含む。
（ａ）配列番号１，２，及び３のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のプライマーセット；
（ｂ）配列番号４，５，及び６のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｃ）配列番号７，８，９，及び１０のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｄ）配列番号１１，１２，１３，及び１４のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｅ）配列番号１５，１６，１７，及び１８のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｆ）配列番号１９，２０，２１，及び２２のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｇ）配列番号２３，２４，２５，及び２６のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｈ）配列番号２７，２８，２９，及び３０のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも２種のプライマーセット；
（ｉ）配列番号３１，３２，３３及び３４のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも３種のプライマーセット；及び
（ｊ）配列番号３５，３６，３７，及び３８のプライマー、並びに前記各プライマーと３’端側１５塩基において８０％以上の配列同一性を有するプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１種のプライマーセット。
【００３０】
上記プライマーセットは、１種類だけであってもよいし、複数の組み合わせであってもよいし、（ａ）−（ｊ）の全てを含んでもよい。
【００３１】
〔レトロトランスポゾン〕
本発明のジャトロファの系統分類・識別方法においてＤＮＡマーカーとして使用するレトロトランスポゾンは、配列の両末端にＬＴＲ（Long  Terminal  Repeat）と呼ばれる反復配列をもつＬＴＲ型のレトロトランスポゾンである。レトロトランスポゾンのうち、Ty1-copia型に分類されるＬＴＲ型レトロトランスポゾンについては、図１に示すように、その両端にＬＴＲが存在し、５’側及び３’側のＬＴＲのすぐ内側には、逆転写の際に必要な配列であるＰＢＳ（primer  binding  site）及びＰＰＴ（poly  purine  truct）がそれぞれ存在する。ＬＴＲに挟まれた内部翻訳領域には、自身の転写後のｃＤＮＡの形成、組み込みに必要なタンパク質をコードするｐｏｌ領域、組み込み酵素などを包み込むウィルス粒子を形成するのに必要なＧＡＧ領域、インテグラーゼ領域などが存在する。
これらの特徴から、レトロトランスポゾンの全長配列が調べられていない作物であっても、ＤＮＡデータべースにおいて既知の、あるいは新たに逆転写領域の配列を同定すれば、その延長配列を単離するＴＡＩＬ（Thermal  Asymmetric  InterLaced）ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）、SuppressionＰＣＲ等により、末端のＬＴＲ配列までを同定することが可能である。
【００３２】
ジャトロファの場合、copia型レトロトランスポゾンは約３２０００個存在することが知られている。本発明者らは、ジャトロファについて、機能が同定されていないゲノム配列データをもとに、Contig配列を整列し、Ty1-copia型レトロトランスポゾンの主要ファミリーを同定した。
【００３３】
本発明者らは、さらに、レトロトランスポゾンのＬＴＲ配列を同定した。ＬＴＲ配列は、レトロトランスポゾンの左右端に存在する、ほぼ完全に一致する配列で、同じファミリーに属するレトロトランスポゾン配列間でホモロジーがなくなる位置をＬＴＲの末端とした。さらに、ＬＴＲの端に、特徴的な配列（５’端でＴＧＴ、３’端でＡＣＡ）が存在するかどうか、さらにその３’側の内部領域にＰＢＳ、５’側の内部領域にＰＰＴの配列を有しているか否かを調べた。これらの配列を有していた場合に、該当する領域をＬＴＲであるとした。そして、その５’端のＴＧＴと３’端のＡＣＡ間の配列をＬＴＲ配列と同定した。
【００３４】
今回、同定したジャトロファのレトロトランスポゾンのファミリーのコンセンサス配列を、図２〜図５及び配列番号４９〜５２に示す。図２〜図５中、四角で囲んだ部分がＬＴＲ配列部分である。
同定したＬＴＲ配列を表１及び配列番号３９〜４８に示す。表１−１は、Ｊｃ３ファミリーのＬＴＲ配列を示す。表１−２は、Ｊｃ７ファミリーのＬＴＲ配列を示す。Ｊｃ７ファミリーについては、３種類の多型（Ｊｃ７Ａ，Ｊｃ７Ｂ，Ｊｃ７Ｃ）が存在した。表１−３は、Ｊｃ８ファミリーのＬＴＲ配列を示す。Ｊｃ８ファミリーについては、４種類の多型（Ｊｃ８Ａ，Ｊｃ８Ｂ，Ｊｃ８Ｃ，Ｊｃ８Ｄ）が存在した。表１−４は、Ｊｃ９ファミリーの多型を示す。Ｊｃ９ファミリーについては、２種類の多型（Ｊｃ９Ａ、Ｊｃ９Ｓ１）が存在した。尚、表１に示すＬＴＲ配列は、今回同定したレトロトランスポゾンファミリーの配列であり、実際のジャトロファでは、これらの配列に多型が存在する。通常、表１に示す配列と８５％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する多型が存在する。
【００３５】
【表１−１】
2015047132.tif 000002
【表１−２】
2015047132.tif 000003
【表１−３】
2015047132.tif 000004
【表１−４】
2015047132.tif 000005
【００３６】
今回、同定されたレトロトランスポゾンファミリーのうち、共通のＬＴＲをもつ系統の中で、進化の過程において左右ＬＴＲ同士の相同組換えでＰＢＳ配列やＰＰＴ配列を含む内部配列が脱落し、実質的に単一のＬＴＲ配列のみを有する特殊な短いレトロトランスポゾンのみの特殊なメンバーの存在が認められた。
表１中、Ｊｃ３Ｓ１、Ｊｃ９Ｓ２は、単一のＬＴＲ配列のみを有するメンバーのＬＴＲ配列を示している。
【００３７】
ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの左右のＬＴＲは、レトロトランスポゾンの転移時には完全に同じ配列を有していたが、その後、時間が経過するほど点突然変異が蓄積して左右の配列は異なってくる。したがって、以上のようなＬＴＲ型レトロトランスポゾンをＤＮＡマーカーとして、当該レトロトランスポゾンの挿入の有無を検出することで、当該レトロトランスポゾンの転移してきた年代を知ることができ、進化の過程を表す系統樹に基づいて、分岐年代を推定することが可能となる。またそのような転移後のＬＴＲの配列の突然変異による多型、内部配列の多型、および隣接領域の多型を知ることにより、近縁の系統をさらに細かく分類、識別することもできる。
【００３８】
〔プライマーの設計〕
本発明の方法で使用するプライマーは、下記（ｉ），（ｉｉ），（ｉｉｉ），（ｉｖ）である。
【００３９】
（ｉ）左側ＬＴＲの５’側隣接領域の塩基配列と相補性を有する１５〜６０塩基のフォワードプライマー（以下、「隣接フォワードプライマー」又は「Ｆ＿Ｌプライマー」という）；
（ｉｉ）右側ＬＴＲの３’側隣接領域の塩基配列と相補性を有する１５〜６０塩基のリバースプライマー（以下、「隣接リバースプライマー」又は「Ｆ＿Ｒプライマー」という）；
（ｉｉｉ）前記右側ＬＴＲ配列の３’末端配列およびその３’側隣接配列と相補性を有する１５〜６０塩基のフォワードプライマー若しくは前記左側ＬＴＲ配列の５’末端配列及びその５’側隣接配列と相補性を有する１５〜６０塩基のリバースプライマー（以下、「ＬＴＲプライマー」、フォワードプライマー，リバースプライマーを区別する場合にはそれぞれ「ＬＴＲ＿Ｌプライマー」「ＬＴＲ＿Ｒプライマー」という）
（ｉｖ）前記左右ＬＴＲ配列の間に存するレトロトランスポゾン配列の少なくとも一部と相補性を有する１５〜６０塩基のフォワード又はリバースプライマー（以下、「ＲＴＰプライマー」という）；
【００４０】
上記プライマーは、（ｉ），（ｉｉ），及び（ｉｉｉ）のプライマーを組み合わせたプライマーセット（第１態様の識別方法）；（ｉ），（ｉｉ），及び（ｉｖ）のプライマーを組み合わせたプライマーセット（第２態様の識別方法）；（ｉ），（ｉｉ），並びに（ｉｉｉ）のＬＴＲ＿Ｌ及びＬＴＲ＿Ｒのプライマーを組み合わせたプライマーセット（第３態様の識別方法）；あるいは（ｉ），（ｉｉ），（ｉｉｉ），及び（ｉｖ）のプライマーを組み合わせたプライマーセット（第４態様の識別方法）として用いられる。
【００４１】
上記（ｉ）グループのプライマー（隣接フォワードプライマー）は、図６に示すゲノム図において、Ａを５’端とするＤＮＡ断片である。上記（ｉｉ）グループのプライマー（隣接リバースプライマー）は、図６に示すゲノム図において、Ｅを５’端とするＤＮＡ断片である。
【００４２】
上記（ｉｖ）グループのプライマー（ＲＴＰプライマー）は、図６に示すゲノム地図において、Ｃ1を５’端とするＤＮＡ断片（フォワードプライマー）又はＣ2を５’端とするＤＮＡ断片（リバースプライマー）である。
ＲＴＰプライマーの場合、レトロトランスポゾンとして特異的な配列が含まれるように、開始点Ｃ1、Ｃ2の塩基位置を選択する必要がある。
【００４３】
上記（ｉｉｉ）グループのプライマー（ＬＴＲプライマー）は、図６に示すゲノム地図において、Ｂを５’端とするＤＮＡ断片（フォワードプライマー）又はＤを５’端とするＤＮＡ断片（リバースプライマー）である。
ＬＴＲプライマーの場合、ＬＴＲと隣接領域との境界を横断するように、ＬＴＲ配列及び隣接領域の一部と相補性を有する配列を含むように開始点Ｂ、Ｄの塩基位置を選択する必要がある。
【００４４】
いずれのプライマーも、断片長１５〜６０ｂｐであり、好ましくは２０〜３０ｂｐであある。短すぎると、ターゲットとする領域に対する特異性が低くなり、所望の増幅反応が行われないおそれがある。一方、長くなりすぎると、安定的に得られる増幅産物との関係で、ターゲットとする領域に対する特異性部分を鋳型として伸長される部分が少なくなり、ひいては系統の分類、識別が困難になるおそれがある。
【００４５】
上記（ｉ）〜（ｉｖ）のプライマーにおいて、「相補性を有する」とは、１００％完全に相補的であることに限定されず、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる程度の相補性を包含する意味である。
従って、プライマーの設計に当たっては、３’端側１５塩基において標的とする配列と通常８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有すればよい。かかる配列同一性により、通常、数塩基だけ配列が相異する多型も増幅させることが可能となる。
【００４６】
かかるプライマーセットは、核酸増幅反応により得られるＰＣＲ産物の長さが異なるように設計することが好ましい。増幅産物の断片長は、５０〜２０００ｂｐ、好ましくは６０〜２０００ｂｐの範囲で、より好ましくは、長くとも４００〜６００ｂｐとなるように設計することが好ましい。長くなりすぎると、核酸増幅反応物が得られにくくなったり、繰り返し反応の間に、伸長エラーなどが生じやすくなるからである。
【００４７】
この他、プライマー設計にあたっては、ＧＣ含量率４０〜６０％とすること、プライマー内部に二次構造を含まないようにすること、プライマー内に自己相補的配列を含まないこと、プライマーセットの組み合わせにおいて３’末端同士が相補的でないこと、アニーリングのための融解温度を５５〜６５℃となるようにすることなどの要件を充足するように設計することが好ましい。
【００４８】
以上のように、ターゲットとするＬＴＲレトロトランスポゾンの配列に応じて、（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）（ｉｖ）の各プライマーを設計し、分類・識別方法に用いるためのプライマーセットを設計する。
【００４９】
表１に示すような各ファミリーのＬＴＲ配列を有するＬＴＲ型レトロトランスポゾンの識別に有用なプライマーセットの代表例を表２に示す。表２に示すプライマーは代表例であり、これに限定されず、上記プライマーの設計条件を充足する他のプライマーも含まれる。尚、表中、種類の欄のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅは、各プライマーについて、図６で示す開始点位置を示す。
【００５０】
【表２−１】
2015047132.tif 000006
【００５１】
【表２−２】
2015047132.tif 000007
【００５２】
以上のようなプライマーは、検出できるように、適宜標識されていてもよい。標識としては、ＰＣＲの分野で通常用いられている標識、例えば、染料、蛍光、アイソトープ、酵素などを用いて標識することができる。
【００５３】
〔系統分類・識別方法〕
以上のようにして設計されたプライマーセットを用いて、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの有無を検出することにより、未だ分類されていないジャトロファの系統を分類することができる。また、本発明の分類方法により分類した系統樹に基づき、対象とするジャトロファ個体がいずれの系統に属するか、さらにはいずれの系統から分化、進化したものであるかといった情報を得ることができる。
【００５４】
以上のようにして設計されたプライマーセットを用いて、ジャトロファの系統を分類・識別する方法について説明する。
【００５５】
対象とするジャトロファ個体から調製したＤＮＡを鋳型として、上記プライマーセットを用いて増幅反応を行う。
【００５６】
増幅反応に供するジャトロファのＤＮＡ試料は、ジャトロファ個体から、植物分子生物学の分野で慣用されている手法にしたがって、ゲノムＤＮＡを抽出し、調製することができる。市販のＤＮＡ抽出試薬（例えば、DNeasy  Plant  Mini  Kit）を用いてもよい。
ゲノムＤＮＡの抽出には、ジャトロファ個体の任意の組織（例えば、葉、茎、根、花弁、カルスなど）を用いることができる。
【００５７】
対象とするジャトロファについて、特定のＬＴＲ型レトロトランスポゾンのＪｃの挿入の有無を検出することにより、例えば、図３の系統図において、Ｊｃレトロトランスポゾンを有する系統Ｉと有しない系統ＩＩのいずれかに属するか分類することができる。さらに、異なる遺伝子座について、異なるレトロトランスポゾンファミリーの挿入の有無を検出してもよい。レトロトランスポゾンファミリーの挿入の有無の組み合わせから、さらに下流の系統ＩＩＩ、ＩＶを識別することができる。複数の遺伝子座について、異なるレトロトランスポゾンファミリーの挿入の有無を検出する場合、各遺伝子座ごとにそれぞれレトロトランスポゾンの有無を検出してもよいし、マルチプルＰＣＲ等の利用により、同時に検出することもできる。
【００５８】
＜第１態様＞
第１態様の識別方法は、上記プライマー（ｉ）（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のプライマーセットを用いる場合である。すなわち、図６において、開始点Ａの隣接フォワードプライマー、開始点Ｅの隣接リバースプライマー、及び開始点ＢのＬＴＲフォワードプライマー又はＤのＬＴＲリバースプライマーの組み合わせであるプライマーセットを用いる。
【００５９】
かかるプライマーセットを用いて増幅反応を行った場合、判定対象となるジャトロファ個体が、マーカーとして使用したレトロトランスポゾンが挿入された系統Ｉの場合、ターゲットとしたレトロトランスポゾン配列及びＬＴＲを含むＡ−Ｅ間領域、並びにプライマー（ｉｉｉ）として使用したＬＴＲフォワードプライマー又はＬＴＲバースプライマーと相補性を有する配列から開始されるＬＴＲ配列を含むＡ−Ｂ間又はＤ−Ｅ間の配列の増幅産物が得られることになる。通常、Ａ−Ｅ間は断片長が長くなりすぎて、安定的に複製・増幅反応が行われず、結果として、レトロトランスポゾン領域を含む長いＡ−Ｅ断片は得られない傾向にある。                          
【００６０】
一方、判定対象となるジャトロファ個体がマーカーとして使用したレトロトランスポゾンが挿入されていない系統ＩＩの場合、図６で示すように、短いＡ−Ｅ間配列の増幅産物のみが得られることになる。
このような態様では、系統Ｉの増幅産物であるＡ−Ｂ断片（又はＤ−Ｅ断片）と、系統ＩＩの増幅産物であるＡ−Ｅ断片との長さが、区別が容易な程度に断片長の異なるものを得られる場合にマルチプルＰＣＲを行うことができる。
【００６１】
ただし、レトロトランスポゾンがＬＴＲ配列のみからなる特殊な系統の場合、レトロトランスポゾンを有する系統及びレトロトランスポゾンが挿入されていない系統の双方について、Ａ−Ｅの増幅産物が得られる。しかしながら、レトロトランスポゾンを有する系統のＡ−Ｅ増幅産物と、レトロトランスポゾンが挿入されていないＡ−Ｅの増幅産物とでは、得られる増幅産物の長さ、種類（配列）が相違するので、増幅産物の種類又は断片長の違いに基づいて、これらの系統を区別することができる。
【００６２】
＜第２態様＞
使用するプライマーセットは、上記プライマー（ｉ）（ｉｉ）及び（ｉｖ）のプライマーセットである。すなわち、図２に示す開始点Ａの隣接フォワードプライマー、開始点Ｅの隣接リバースプライマー、及び開始点Ｃ1のＲＴＰフォワードプライマー又はＣ2 のＲＴＰリバースプライマーである。
【００６３】
かかるプライマーセットを用いて、増幅反応を行った場合、判定対象となるジャトロファ個体が、マーカーとして使用するＬＴＲ型レトロトランスポゾンＪｃが挿入された系統Ｉに属する場合、ターゲットしたレトロトランスポゾン配列及びＬＴＲを含むＡ−Ｅ間領域、並びにプライマー（ｉｖ）として使用したＲＴＰフォワードプライマー又はＲＴＰリバースプライマーと相補性を有する配列から開始されるレトロトランスポゾン配列の一部及びＬＴＲ配列を含むＡ−Ｃ2又はＣ1−Ｅ間領域で増幅反応が起こる。通常、Ａ−Ｅ間は断片長が長くなりすぎて、安定的に複製・増幅反応が行われないことから、結果として、レトロトランスポゾン領域を含む長いＡ−Ｅ断片の増幅産物は得られず、Ａ−Ｃ2領域又はＣ1−Ｅ領域の増幅産物が得られる。
【００６４】
一方、判定対象となるジャトロファ個体が、マーカーとして使用したレトロトランスポゾンが挿入されていない系統ＩＩの場合、図６で示すように、短いＡ−Ｅ間配列の増幅産物のみが得られることになる。
よって、系統Ｉと系統ＩＩとは、得られた増幅産物の種類（長さ、配列など）が相違するので、区別することができる。すなわち、得られた増幅産物の種類（長さ、配列など）に応じて判定対象となるジャトロファ個体が系統Ｉに属するか、系統ＩＩに属するかを判定できる。
【００６５】
＜第３態様＞
第３態様は、複数のレトロトランスポゾンのファミリーを検出できるように、レトロトランスポゾン検出のためのプライマー対を適宜組み合わせたプライマーセットを用いて、異なる遺伝子座に挿入されている、対応のレトロトランスポゾンを検出し、挿入されているレトロトランスポゾンの組み合わせに基づいて、系統を分類、識別する態様である。
例えば、Ｊｃ７ファミリーのレトロトランスポゾンの挿入の有無と、Ｊｃ８ファミリーのレトロトランスポゾンの挿入の有無をそれぞれ検出し、これらのレトロトランスポゾンの挿入の組み合わせに基づき、分類する。例えば、Ｊｃ７ファミリーのレトロトランスポゾンの挿入の有無により、系統Ｉと系統ＩＩに分類され、さらに、系統Ｉについて、Ｊｃ８ファミリーのレトロトランスポゾンの有無に基づき、系統ＩＩＩと系統ＩＶを分類することができる。
【００６６】
個々のレトロトランスポゾンの検出については、上記第１態様又は第２態様で用いるようなプライマー対を選択することができる。
【００６７】
複数のレトロトランスポゾンを検出する場合、各レトロトランスポゾン検出のためのプライマー対を用いて、レトロトランスポゾンを各順に検出してもよいし、複数のレトロトランスポゾン検出のためのプライマー対の組み合わせを用いて、マルチプルＰＣＲなどを利用して、同時に増幅産物を得て、検出してもよい。
【００６８】
＜第４態様＞
第４態様でレトロトランスポゾンを検出する場合、（ｉ）隣接フォワードプライマー、（ｉｉ）隣接リバースプライマー、（ｉｉｉ）ＬＴＲフォワード又はリバースプライマー、（ｉｖ）ＲＴＰフォワード又はリバースプライマーを含む。
このような態様は、ＬＴＲ多型又は隣接領域の多型の差異も含めた系統の識別を行いたい場合に有用である。
【００６９】
かかるプライマーセットを用いて増幅反応を行った場合、判定対象となるジャトロファ個体が、マーカーとして使用したレトロトランスポゾンが挿入された系統Ｉに属する場合、上記第１態様及び第２態様で得られる双方の増幅産物、すなわちＬＴＲ配列を含むＡ−Ｂ間又はＤ−Ｅ間の配列の増幅産物、及びＡ−Ｃ間又はＣ−Ｅ間の増幅産物が得られることになる。ここで、例えば系統ＩＶにおいてＬＴＲ又は隣接領域の配列が突然変異により、プライマーとして使用した配列と一致しない場合、Ａ−Ｃ2間又はＣ1−Ｅ間の増幅産物は得られるが、Ａ−Ｂ間又はＤ−Ｅ間の増幅産物は得られない。一方、プライマーとして使用したＬＴＲと一致するＬＴＲ配列を有する系統ＩＩＩの場合、Ａ−Ｂ間又はＤ−Ｅ間の配列の増幅産物、及びＡ−Ｃ間又はＣ−Ｅ間の増幅産物が得られることになる。
【００７０】
他方、判定対象となるジャトロファ個体がマーカーとして使用したレトロトランスポゾンが挿入されていない系統ＩＩの場合、短いＡ−Ｅ間配列の増幅産物のみが得られることになる。
【００７１】
以上のように、判定対象とするジャトロファ個体が、マーカーとして使用したレトロトランスポゾンを有していない系統ＩＩであるか否か、さらに当該レトロトランスポゾンが挿入されている系統Ｉの場合において、ＬＴＲ多型で分類されているいずれの系統（例えば図７に示す系統ＩＩＩ又は系統ＩＶ）に属するかといったことまで判定することができる。
【００７２】
上記第１〜第４の態様において行われる核酸増幅反応は、公知の核酸増幅手段を適宜選択して用いればよい。具体的には、例えば、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法、ＵＣＡＮ法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、プライマーエクステンション法等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。中でもＰＣＲ法が好適である。また、複数のレトロトランスポゾンのファミリーの有無を検出するために、複数のプライマー対の組み合わせを用いて増幅反応を行い、検出するマルチプルＰＣＲを行ってもよい。
判定対象であるジャトロファ個体から抽出したＤＮＡサンプルを鋳型として、識別しようとする系統に特異的なプライマーセットを用いて、増幅反応を行う。複数のレトロトランスポゾンを検出するためのプライマー対のセットを用いて、未分類のジャトロファがいかなる系統に属するかという分類、識別を行うことができる。
【００７３】
増幅産物の有無を確認する方法としては、例えばアガロースゲル電気泳動、アクリルアミドゲル電気泳動などの電気泳動を挙げることができる。電気泳動法により、増幅産物の有無及び長さの違いを検出することができる。ここで検出する増幅産物の長さは、目的とする配列（ＬＴＲ配列又はレトロトランスポゾン配列の一部）の有無であることから、数塩基の違いを検出する厳密なものである必要がない。したがって、アガロース電気泳動等の簡便な電気泳動であっても、検出可能である。
【００７４】
例えば、上記第１態様のプライマーセットを用いた場合、所定のＬＴＲ型レトロトランスポゾンを有する系統ではＡ−Ｂ又はＤ−Ｅの増幅産物が得られる。一方、所定のＬＴＲ型レトロトランスポゾンを有しない系統ではＡ−Ｅの増幅産物しか得られない。Ａ−Ｂ又はＤ−Ｅの増幅産物は、プライマーの種類にもよるが、通常、４００〜６００ｂｐに設計していることから、得られる断片も４００〜６００ｂｐである。これに対して、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンを有しない品種から得られるＡ−Ｅ増幅産物は、通常、２００〜３００ｂｐ程度となる。このように、比較する断片長は、２倍近く相違することから、マルチプルＰＣＲを行った場合でも、電気泳動の結果、異なるバンドが得られるので容易に区別することができる。すなわち、得られる断片長から、所定のＬＴＲ型レトロトランスポゾンを有する系統と有しない系統を区別することができる。
【００７５】
なお、ＬＴＲ多型を判別する場合、例えば、上記と同様に増幅反応を行った後、得られた増幅産物の配列決定を行うことにより、多型を検出することが好ましい。また、多型変異が既知の場合、既知のＬＴＲ配列とハイブリダイズすることができるプローブを支持体に固定したプローブアレイを用いて、プローブとハイブリダイズする増幅産物を検出することにより、挿入されているレトロトランスポゾンファミリーの種類を判定するようにしてもよい。
以上のようにして、未分類のジャトロファの系統を分類することができる。そして、各ジャトロファ個体が、各種ＬＴＲファミリーメンバーとの関係分類に基づき、いずれの系統に属するかを判別できる。また、増幅産物の配列を調べることにより、同系統の近縁種の系統間を識別することができる。
【実施例】
【００７６】
本発明を実施するための形態を実施例により説明する。下記実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７７】
〔ＰＣＲによる増幅及び系統の分類・識別〕
種々の系統のジャトロファの葉から、ＣＴＡＢ（Cetyl  trimethyl  ammonium  bromide）法にてＤＮＡ抽出し、識別用サンプルを調製した。
各識別用サンプルについて、表２に示すＪｃ７ＢのＬＴＲ検出用プライマー群（ＬＴＲ＿Ｌ、ＬＴＲ＿Ｒ、Ｆ＿Ｌ、Ｆ＿Ｒ）を用いて、下記条件でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ反応は、プライマー対１（Ｆ＿ＬとＬＴＲ＿Ｌ）、プライマー対２（ＬＴＲ＿ＲとＦ＿Ｒ）、プライマー対３（Ｆ＿ＬとＦ＿Ｒ）を用いてそれぞれについて行った。
【００７８】
ＰＣＲ条件：
９４℃で２分置いた後、９４℃で１５秒、５５℃で４５秒、７２℃で２分を１サイクルとして、３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分間伸長反応を行った。
【００７９】
得られたＰＣＲ産物を、ＴＡＥバッファーで作製した２％アガロースゲルで、１００Ｖ、４０分間電気泳動に供した。なお、増幅産物の長さの指標として、１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｅｒマーカーを用いた。泳動終了後、ゲル板からゲルをはずし、エチジウムブロマイドで染色後、ＵＶ照射下でＤＮＡバンドを観察した。ゲルを撮像した写真を図８に示す。
【００８０】
図８に示すように、アジア・アフリカ系統に属するウガンダ（Uganda）、カーポヴェルデ（Cape  verde）、マダカスカル（Madagascar）、タンザニア（Tanzania）、中国（Chinese）、タイ（Thai）、インドネシア（Indonesia  IS）、フィリピン（Parawan）産のジャトロファでは、ＬＴＲ及び隣接領域を増幅するプライマー対１（Ａ−Ｂ増幅産物）、プライマー対２（Ｄ−Ｅ増幅産物）を用いた場合に増幅産物が得られ、対応するバンドが認められた。これに対して、メキシコ・グアテマラ系統に属するメキシコ（Mexico２ｂ）及びグアテマラ（Guatemala１）産のジャトロファでは、プライマー対１、プライマー対２を用いた場合には、増幅産物が得られず、対応するバンドが認められなかったが、プライマー対３（短いＡ−Ｅ増幅産物）が得られ、３８５ｂｐ程度のところにバンドが認められた。従って、Ｊｃ７のレトロトランスポゾンの存在は、アジア・アフリカ系統に共通する特徴であると考えられる。
なお、Guatemala２については、メキシコ・グアテマラ系統であるにもかかわらず、プライマー対１、プライマー対２を用いた場合に増幅産物が得られ、対応するバンドが認められた。この結果によれば、Guatemala２はMexico２ｂやGuatemala１よりもアジア・アフリカ系統に近い系統であると考えられる。すなわち、Mexico２ｂやGuatemala１の共通祖先と、Guatemala２とアジア・アフリカ系統の共通祖先がまず分岐し、その後、Guatemala２とアジア・アフリカ系統が分かれたと考えられる。
このように、Ｊｃ７のレトロトランスポゾンに着目することにより、メキシコ・グアテマラ系統における更なる系統分類が可能であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明のジャトロファの識別方法によれば、進化の過程を考慮したジャトロファの遠い系統、ＬＴＲ多型に基づく近縁の系統まで、所望により分類・識別することができるので、ジャトロファの各種系統の分類・識別方法として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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