(57)【要約】【課題】荒れ肌又は潜在的な荒れ肌あるいは敏感肌の者のために、適切な化粧料を選択する方法を提供することを課題とする。【解決手段】荒れ肌のための化粧料を選択するにあたり、皮膚角層のガレクチン-７の発現量を測定してガレクチン−7発現量の高い場合は、ガレクチン-７を低減する効果を有する成分を配合した化粧料を選択する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
荒れ肌のための化粧料を選択するにあたり、皮膚角層のガレクチン-７の発現量を測定してガレクチン−7発現量の高い場合は、ガレクチン-７を低減する効果を有する成分を配合した化粧料を選択することを特徴とする化粧料を選択する方法。
【請求項２】
皮膚角層のガレクチン-７の発現量を測定する方法が、エンザイムイムノアッセイ法によるものである請求項１記載の化粧料を選択する方法。
【請求項３】
ガレクチン-７を低減する効果を有する成分が、ヒト３次元培養表皮モデルに被験物質を接触させ、前記モデルの細胞中のガレクチン−７の量が、被験物質を接触させない前記モデルの細胞中のガレクチン−７の量よりも少ない場合に、被験物質がガレクチン−７を低減する効果を有すると判定することで選択される成分であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の化粧料の選択方法。
【請求項４】
ガレクチン-７を低減する効果を有する成分がセイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキス、ガラクトース、セラミド２とセラミド５の混合物のいずれかであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の化粧料の選択方法  。
【請求項５】
顧客の皮膚ガレクチン−７量測定情報と、化粧料中のガレクチン−７抑制成分の含有情報を対比し、顧客のガレクチン−７濃度に適したガレクチン抑制成分を含有する化粧料を選択する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料の選択方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚は常に外界と接触しており、さまざまな刺激を受けている。その刺激の代表的なものは紫外線である。紫外線は、外見上は大きな変化を肌に与えていない場合であっても、皮膚細胞のＤＮＡの切断やコラーゲンの変性などを誘発し、皮膚老化の原因となっている。紫外線は常に肌にストレスを与え続けている。また女性にとっては、洗顔や化粧といった日常的な行為も皮膚に刺激を与えており、これらの刺激が肌には潜在的なストレスとして蓄積される。そしてこれらの刺激（ストレス）に対する抵抗性がなんらかの原因で減少すると潜在的な荒れ肌や敏感肌として認識されることとなる。このような皮膚の外的刺激が蓄積されると肌荒れとして認識される肌状態となる。肌荒れは一時的な状態をさすが、これが持続した状態を「荒れ肌」という。
【０００３】
「荒れ肌」とは、乾燥しカサカサした皮膚の状態の総称であり、その最も顕著な臨床所見は鱗屑である。このような荒れ肌状態と皮膚のバリア機能との間には密接な関係があり、荒れ肌が大きいほどバリア機能の客観的な指標である経表皮水分蒸散量（以下、ＴＥＷＬという）が高いことが知られ、物理的・化学的要因によって生じた肌荒れ状態の指標としてＴＥＷＬが測定されている（非特許文献１：日皮会誌、第92巻、第1001頁−1003頁、1982年）。
この荒れ肌は、前述のとおり紫外線、化学物質やその他様々な刺激が、皮膚内部環境に影響を及ぼし、表皮のバリア機能が阻害された結果生じるものと考えられている。このような状況を皮膚が呈するようになると、皮膚内部では細胞の増殖・分化に影響を及ぼすプロスタグランジンやサイトカイン濃度の上昇（非特許文献２：ジャーナル・オブ・インベスティゲイティブ・ダーマトロジー、第81巻、第 519-523頁、1983）、核酸（ＤＮＡ）合成能の亢進（非特許文献３：ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション、第87巻、第1668−1673頁、1991）、バリアー機能と密接な関係があるＴＥＷＬの上昇（非特許文献４：ジャーナル・オブ・リピッド・リサーチ、第26巻、第418頁-427頁、1985年及び同第30巻、第323頁-333頁、1989年）等の変化が生じる。しかしながら、これらの現象の関連性についての報告は少なく、その詳細なメカニズムは不明である。このため、荒れ肌の指標はこれまで、本人の申告や肉眼的な所見にたよっており、明確な指標がなかった。
また潜在的な荒れ肌の者も存在するが、このような潜在的な荒れ肌を肉眼で検出することは困難である。また潜在的な荒れ肌を含む肌質を敏感肌と呼ぶ場合もある。
【０００４】
荒れ肌、あるいは潜在的な荒れ肌を呈する者が化粧料を選択する場合には細心の注意が必要である。なぜならば、荒れ肌の皮膚は化粧料によってさらにその状態が悪化することがしばしば発生する。このため可能な限り低刺激性の化粧料を選択し、低刺激の化粧料の使用によって肌荒れの進行や、潜在的な荒れ肌を荒れ肌にまで憎悪させない注意が必要であった。
しかしこれまでは、荒れ肌の者や潜在的な荒れ肌または敏感肌であると意識している者が化粧品を選択する基準は、前記の通り、使用したときの刺激の少ない化粧料を選択するしか対策がないのが現実であった。このため化粧品の選択にあたっては、化粧品の購入者が販売者と対面し、肌状態を愁訴し、それに対して販売者又はカウンセラーが自己の経験と蓄積した化粧品情報に基づいて、肌に適すると考えられる化粧料を選択する方法が一般的であった。
【０００５】
近年に肌に及ぼすストレスの研究が進み、ストレスの指標となるタンパク質や遺伝子が特定されている。そのようなタンパク質としてガレクチンが注目されている。
ガレクチンとは、ガラクトース（β‐ガラクトシド構造）を認識し、結合あるいは糖鎖同士を架橋するタンパク質の総称である。発生、分化、形態形成、腫瘍転移、アポトーシス（細胞死）といった生命現象に関与することが明らかになっている。現在、哺乳類のガレクチンとしてガレクチン-１から-１５まで１５種類が知られている。ヒトの場合、-５，-６，-１４，-１５に相当するものがなく、現在のところ１０種類であるが、今後さらに増える可能性がある。特にガレクチン-７が皮膚のストレスの指標として注目されている。
【０００６】
ガレクチン-７は哺乳動物の重層上皮で検出され、ケラチノサイトでは基底層から角質層まで検出される。特許文献５（特開２００６-１８２７４４号公報）にはガレクチン-７発現促進物質のスクリーニング方法及びガレクチン-７成分配合の組成物を塗ることで保湿作用や皮膚症状改善作用が開示されている。さらに特許文献６（特開平９−２１６８３３号公報）にはガレクチンの１種又は２種以上を含む外用剤が皮膚のしわ、弾力低下といった老化症状の予防、改善および創傷治癒効果を有することが開示されている。
本発明者はガレクチン-７が荒れ肌の客観的な指標になりうることを見出し、特許出願している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１１−７６１６８号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／０９８５２３号
【特許文献３】国際公開第９８／４００４５号
【特許文献４】特開２０１０−７１９１７号公報
【特許文献５】特開２００６−１８２７４４号公報
【特許文献６】特開平９−２１６８３３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日皮会誌、第92巻、第1001頁−1003頁、1982年
【非特許文献２】J.Invest.Dermatol、Vol.81、519-523、1983
【非特許文献３】Journal of Clinical Investigation、Vol.87、1668−1673、1991
【非特許文献４】：J. Lipid. Res.、Vol.26、418−427、1985
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、荒れ肌又は潜在的な荒れ肌あるいは敏感肌の者のために、適切な化粧料を選択する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下の構成である。
（１）荒れ肌のための化粧料を選択するにあたり、皮膚角層のガレクチン-７の発現量を測定してガレクチン−７発現量の高い場合は、ガレクチン-７を低減する効果を有する成分を配合した化粧料を選択することを特徴とする化粧料を選択する方法。
（２）皮膚角層のガレクチン-７の発現量を測定する方法が、エンザイムイムノアッセイ法によるものである（１）記載の化粧料を選択する方法。
（３）ガレクチン-７を低減する効果を有する成分が、ヒト３次元培養表皮モデルに被験物質を接触させ、前記モデルの細胞中のガレクチン−７の量が、被験物質を接触させない前記モデルの細胞中のガレクチン−７の量よりも少ない場合に、被験物質がガレクチン−７を低減する効果を有すると判定することで選択される成分であることを特徴とする（１）または（２）に記載の化粧料の選択方法。
（４）ガレクチン-７を低減する効果を有する成分がセイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキス、ガラクトース、セラミド２とセラミド５の混合物のいずれかであることを特徴とする（１）または（２）に記載の化粧料の選択方法。
（５）顧客の皮膚ガレクチン−７量測定情報と、化粧料中のガレクチン抑制成分の含有情報を対比し、顧客のガレクチン−７濃度に適したガレクチン抑制成分を含有する化粧料を選択する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、荒れ肌の愁訴を有する者のために皮膚のガレクチン−７量を指標として適切な化粧料を選択することが可能となる。ガレクチン-７の測定は、テープストリッピング法など簡便な操作方法で評価試料を採取するため、負担が少なく、誰が測定しても同一の結果が得られるので、従来のような専門家の面談方式によるカウンセリングが必要なくなる。
さらにまた、あらかじめ顧客の皮膚ガレクチン−７濃度をデータベースとして作成し、保有すれば、別途作成する化粧料中のガレクチン−７抑制成分の種類、含量、抑制効果データと対比することで、化粧品販売員は瞬時に、顧客に適した荒れ肌用化粧料の選択が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒトの部位別のガレクチン-７の発現量を測定した図である。
【図２】ＳＤＳによる強制荒れ肌モデルのガレクチン-７の発現量を測定した図である。
【図３】アセトンによる強制荒れ肌モデルのガレクチン-７の発現量を測定した図である。
【図４】被験者６０８名のガレクチン-７発現量と出現頻度のグラフである。
【図５】ガレクチン-７と経表皮水分量産量（ＴＥＷＬ）の相関を確認した図である。
【図６】セイヨウシロヤナギとカニナバラのエキスがヒト３次元培養表皮モデルを用いた試験で、ＴＥＷＬを低減することを示すグラフ。
【図７】セイヨウシロヤナギとカニナバラのエキスがヒト３次元培養表皮モデルを用いた試験で、ガレクチン-７の産生を低減することを示すグラフ。
【図８】ガラクトースがヒト３次元培養表皮モデルを用いた試験で、ＴＥＷＬを低減することを示すグラフ。
【図９】ガラクトースがヒト３次元培養表皮モデルを用いた試験で、ガレクチン-７の産生を抑制することを示すグラフ。
【図１０】ラクトフェリンがヒト３次元培養表皮モデルを用いた試験で、ガレクチン-７の産生を抑制しないことを示すグラフ。
【図１１】セラミド２とセラミド５がヒト３次元培養表皮モデルを用いた試験で、ＴＥＷＬを低減することを示すグラフ。
【図１２】セラミド２とセラミド５がヒト３次元培養表皮モデルを用いた試験で、ガレクチン-７の産生を抑制することを示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の化粧料の選択方法は、皮膚の角層におけるガレクチン-７の発現量を指標としている。
本発明におけるガレクチン測定部位は、角層が入手できる部分であれば、いかなる部位であっても良い。なお化粧料の選択という目的から、主な部位としては顔面、頚部、上腕部など日常外界に露出する機会の多い部位を測定対象とすることが好ましい。また角層の採取はテープストリッピング、擦過等の簡便に角層を得られる方法が好ましい。
【００１４】
採取した各試料のガレクチン-７の発現量は、従来から知られている方法で測定することができる。例えば、ガレクチン-７に対する抗体との反応に基づくエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティング等の方法を用いることができる。このような測定手段はすでに市販されており、代表的なガレクチン-７のエンザイムイムノアッセイキットとしてアブカム社（Abcam）製のGaleectin 7 Human ELISA KitやR&D systems社製のELISA Kitを例示することができる。
各試料からガレクチン-７をそれ自体既知の生化学的方法、たとえば凍結融解法、超音波破砕法、ホモジネート法等を介して可溶性画分を調製する。抽出後、速やかに測定する。
【００１５】
外界からのストレスが蓄積された肌である荒れ肌や敏感肌は、健常肌にくらべて角層のガレクチン-７発現量が有意に高い。従って、角層におけるガレクチン-７の発現量の多寡を指標として、簡便に荒れ肌の度合い、または潜在的な荒れ肌、あるいは敏感肌であるかどうかを判断することができる。本発明に用いる角層は、テープストリッピングといった角層の表層部分のみを角質テープで採取する簡単な方法で採取することができる。また、本発明は、皮膚に紫外線や化学物質等の刺激を与えることなくガレクチン-７の発現量を測定できるので、ユーザーに負担を与えることなく、ユーザーの荒れ肌の程度を評価することができ、この結果に基づいて適切な化粧料を選択することができる。
【００１６】
本発明の方法は、角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層におけるガレクチン-７の発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたガレクチン-７の発現量に基づいて化粧料を選択する選択工程から構成される。
【００１７】
まず、測定されたガレクチン-７の発現量を健常肌の角層におけるガレクチン-７の発現量と比較する。また、被験者のある評価対象部位の角層におけるガレクチン-７の発現量を測定し、測定されたガレクチン-７の発現量を、健常肌を有する者の同一評価対象部位の角層におけるガレクチン-７の発現量と比較してもよい。健常肌を有する者の角層のガレクチン-７の発現量は、複数人の健常肌を有する者からのデータの平均値を使用することによって、より客観的な評価ができる。具体的には、無作為に抽出した被験者のガレクチン-７の発現量分布から、健常肌の分布を設定できる。
【００１８】
このように比較した結果、測定されたガレクチン-７の発現量が、健常肌のガレクチン-７の発現量より有意に大きい場合には、ストレスの蓄積が大きいと評価し、荒れ肌、または潜在的荒れ肌、あるいは敏感肌である可能性が高いと評価することができる。
【００１９】
また、被験者のある評価対象部位の角層におけるガレクチン-７の発現量が、健常肌を有する者の同一評価対象部位の角層におけるガレクチン-７の発現量より有意に大きい場合にも、ストレスの蓄積が大きいと評価する。またこの数値が顕著に高い場合に荒れ肌、または潜在的荒れ肌、あるいは敏感肌であると判断する。
【００２０】
荒れ肌であると評価した場合には、化粧料としては、肌荒れを改善させ、ガレクチン-７の産生が低減する成分を含有するものを、皮膚のガレクチン−７量に対応して選択する。しかしガレクチン−７の産生を低減する成分を含有することが明らかになっている化粧料は不明である。このためにあらかじめ、化粧料に使用される成分が皮膚のガレクチン-７の産生を低減するか否かを明らかにする必要がある。このような成分は、ヒト３次元培養表皮モデルを用いたスクリーニングを行い、選別することができる。
【００２１】
ガレクチン-７の産生を低減する成分を選択する際のスクリーニング方法において用いるヒト３次元培養表皮モデルとは、「培養下で維持される表皮組織」であって、ヒトの皮膚から採取した皮膚組織か、胚性幹細胞又は成体幹細胞を試験管内で分化させて得られた皮膚組織かを重層構造を維持しながら試験管内で培養した組織をいう。特にヒト由来については、ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ（株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング）、あるいはエピ・モデル２４のような商業的に入手可能なヒト３次元培養表皮モデル製品を用いることができる。
ヒト３次元培養表皮モデルに被験物質を接触させる場合には、ヒト３次元培養表皮モデルが搭載された培養カップにＰＢＳ等の緩衝液等に任意の濃度で溶解した被験物質を添加した後インキュベートして、次いでガレクチン-７を測定しその作用を評価する。
【００２２】
ヒト3次元培養表皮モデルを用いた試験を実施するにあたっては、ヒト細胞のガレクチン−７を増加させることが確認されている成分をあらかじめ添加しておくと、目的とする被験物質のガレクチン−７の産生低減効果を検出しやすくなる。このような物質として、界面活性剤を例示することができる。とくに、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと記載する）が好ましい。
ＳＤＳなどのガレクチン−７を増加させる成分をヒト３次元培養表皮モデルに添加する場合、ヒト３次元培養表皮モデルに被験物質とＳＤＳなどのガレクチン−７を増加させる成分を同時に添加して培養し、細胞中のガレクチン−７の量を測定する。
【００２３】
３次元培養表皮モデル細胞中のガレクチン−７の量は、従来から知られている方法で測定することができる。例えば、ガレクチン-７に対する抗体との反応に基づくエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティング等の方法を用いることができる。このような測定手段はすでに市販されている。代表的なガレクチン-７のエンザイムイムノアッセイキットとしてHuman Galectin-7 DuoSet Economy Pack（R&D Systems Inc.）、アブカム社製のGaleectin 7 Human ELISA Kitを例示することができる。３次元培養表皮モデル細胞からガレクチン-７を抽出する場合は、それ自体既知の生化学的方法、たとえば凍結融解法、超音波破砕法、ホモジネート法等を介して可溶性画分を調製する。抽出後、速やかにガレクチン-７を測定する。
かくしてガレクチン-７を低減することが確認できた成分を含有する化粧料は、荒れ肌を愁訴する者に適した化粧料として選択される。
【００２４】
下記実施例には、化粧料に配合される成分で、上記スクリーニングによってガレクチンの産生を低減することが確認できた物質としてガラクトース、セイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキスを例示している。
この試験を化粧料に配合する成分について実施し、得られた情報を蓄積しておけば、荒れ肌を愁訴する者の化粧料を選択するにあたり、皮膚のガレクチン−７量と対比することで適切な化粧料を選択することができる。
以下、具体的な実施例について説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
１．ヒトの部位別のガレクチン-７の発現量の測定
＜被験者＞
健常肌を有する男女３５名（アトピー性皮膚炎（ＡＤ）既往者含む）の頬、前腕内側部、臀部からサンプルを採取した。
＜角層サンプル抽出方法、タンパク定量＞
被験者の頬、腕、臀部に角層チェッカー(アサヒバイオメッド社)を貼り付け、角層を採取した。角層チェッカーからビーズ法（容器に検体と直径約2mmのガラスビーズと抽出液を入れて振盪抽出する方法）にてT-PER抽出バッファー（Tissue Protein Extraction Reagent Thermo Scientific製（product# 78510)500μlを用いて角層タンパク質の抽出を行った。各サンプルのタンパク質量はPierce BCA protein Assay Kit (Thermo Scientific #23225)で測定した。測定には前記角層タンパク質抽出液10μlにPierce BCA protein Assay Kitの反応試薬液200μlを加え、60℃で30分間インキュベーションしたのち、562nmの吸光度を測定した。同時にBSAで検量線をひき、吸光度の値からタンパク質量を算出した。
【００２６】
＜角層中のガレクチン-7の測定＞
同様にテープから抽出した角層タンパク質抽出液をR&D systemsのELISAキット(galectin-7：DY1339E)を用いてガレクチン-7の発現量を測定した。まず、costar製の96wellプレート#3590に1次抗体となる固相化抗体をキット指定の濃度で20℃、overnightで固相化した。次に1%BSA、37℃で1時間プレートをブロッキングし、0.01% Tween-PBSでプレートを洗浄したのち、検量線となるスタンダードおよびサンプルを100μlずつアプライし、25℃で2時間インキュベーションした。0.01% Tween-PBSでプレートを洗浄したのち、2次抗体をキット指定濃度で25℃で2時間インキュベーションした。さらに、0.01% Tween-PBSでプレートを洗浄したのち、Streptavidin-HRPをキット指定濃度で25℃で30分間インキュベーションした。最後に、0.01% Tween-PBSでプレートを洗浄したのち、発色基質であるTMB solution (Promega, G7431))を100μl/wellで加え、キット指定の時間を経過した後、stop solution (0.5M 硫酸)を100μl加え、450nmの吸光度を測定し、発現量を算出した。
【００２７】
＜結果＞
測定結果を図１に示す。
図１から明らかなように、日常的に外界刺激に晒されている頬は、いわゆる荒れ肌の通常出現しない腕や臀部（お尻）に比して顕著にガレクチン-７の発現量が高まっていることが確認できた。この試験結果から、荒れ肌の指標としてガレクチン-７が有用であることが明らかとなった。
【００２８】
２．人工的荒れ肌モデルにおけるガレクチン-７の発現量の変化
健常肌の女性１４名を被験者として試験を実施した。
＜SDSによる荒れ肌モデル作成＞
左前腕内側部に界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、以下SDS）10%溶液を2プッシュとり、100回往復する。お湯（35℃、1L）をかけ流し、界面活性剤を洗い流した。また対照として右前腕内側部にもお湯（35℃、1L）をかけ流した。この操作を1日4回、1回の操作に1時間以上空けた状態で繰り返した。これを2日間続け荒れ肌モデルを人工的に作成した。
＜角質採取＞
ＳＤＳ洗浄なし、洗浄ありのそれぞれの部分の角層を4枚ずつ深さ方向に採取した。角層を採取した日は洗浄前と洗浄後4、8、12日目に採取した。
＜角層サンプル抽出、タンパク定量、ガレクチン-7の測定＞
上記１．の方法と同様に測定した。
【００２９】
＜結果＞
被験者の個別測定結果を図２に示した。荒れ肌作成処理後8〜12日目にガレクチン-７の測定結果が顕著に上昇することが確認された。
【００３０】
＜アセトンによる荒れ肌モデル作成＞
健常肌の女性３名を被験者として試験を実施した。
上下があいたガラス製ロート(径3cm)をゴムバンドで固定し、アセトン(WAKO特級）/ジエチルエーテル (WAKO特級）等量混液をロート内にピペットマンで2ml注入し、シェーカーの上に両腕を置いて20分間処置した。
次にロート内のアセトン/ジエチルエーテル混液をスポイトで除いた後、水道水を注入し、シェーカーの上に両腕を置き5分間処置した（脱脂処置）。翌日、同一部分に同様に操作して再度脱脂処置を行い、乾燥皮膚を作成した。また水道水のみで処理した部位を対照とした。
＜角質採取＞
アセトン無処理、処理部位の角層を4枚ずつ深さ方向に採取した。採取した日はアセトン処理前日、アセトン処理後1、5、8、12、16、20日目に採取した。
＜角層サンプル抽出、タンパク定量、ガレクチン-7の測定＞
上記１の試験方法と同様に操作した。
【００３１】
＜結果＞
被験者の個別測定結果を図３に示した。荒れ肌作成処理後８〜１２日目にガレクチン-７の測定結果が顕著に上昇することが確認された。
以上の荒れ肌モデル作製試験の結果から荒れ肌の発生に伴ってガレクチン-７が上昇することが確認された。
【００３２】
３．健常肌の者のガレクチン-７の測定
＜被験者＞
健常肌の男女６０８名（アトピー性皮膚炎既往者を含む）の頬サンプルを採取しガレクチン-７の分布を確認した。またうち３５名の被験者については、従来の荒れ肌の評価指標である経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定し、ガレクチン-７の測定結果との相関関係の有無を確認した。
＜角層サンプル抽出方法、タンパク定量＞
上記１．と同様に被験者の頬に角層チェッカー(アサヒバイオメッド社)を貼り付け、角層を採取した。
＜角層中のガレクチン-７の測定測定＞
上記１．と同様にテープから抽出した角層タンパク質抽出液をR&D systemsのELISAキット(galectin-7：DY1339E,)を用いてgalectin-7の発現量を測定した。
＜経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ（transepidermal water loss）値＞
ＴＥＷＬはキーストン社のDelfinを用いて2回ずつ測定した平均値を解析に用いた。
【００３３】
＜結果＞
６０８名のガレクチン-７測定結果を表１及び図４に示す。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
表１、図４によると、健常肌の者の頬の皮膚のガレクチン-７は、435pg/μg以内に80%が属することがあきらかとなった。また被験者の聞き取り調査から、アトピー性皮膚炎の既往者や肌荒れしやすいなどの自覚を持つ者は、大半が500pg/μg以上のガレクチン-７を示すことが確認された。したがって、例えばガレクチン-７の測定値500pg/μgを荒れ肌の指標とすることができる。
【００３６】
またＴＥＷＬとの相関を図５に示す。
ガレクチン-７とＴＥＷＬには一定の相関関係が存在することが確認できた。
以上の試験結果からガレクチン-７の測定は、荒れ肌の指標として有用であった。さらにＴＥＷＬでは検出できない潜在的な荒れ肌の検出が可能であるものと判断した。
【００３７】
４．ヒト３次元培養表皮モデルを用いたガレクチン-７の産生低減剤の試験及びヒト３次元培養表皮モデルの経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）測定
１．皮膚バリア機能を改善または経表皮水分蒸散量を抑制する剤の選択
（１）細胞
ヒト３次元培養表皮モデルを用いた。
ヒト３次元培養表皮モデルとして、LabCyte EPI-MODEL24ウェルタイプ（エピ・モデル２４、株式会社ジャパンティッシュエンジニアリング製）を用いて、ヒト３次元培養表皮モデルの細胞中のガレクチン−７の抑制能を評価した。
ヒト３次元培養表皮モデルについて、ゲル培養から液体培地へ培地交換し、一晩37℃5%CO2インキュベータにて前培養した。なおヒト３次元培養表皮モデルはヒト表皮の状態を生理的、機能的に再現したインビトロモデルとして利用されている。
【００３８】
（２）試験サンプル
セイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキス、ガラクトース、ラクトフェリン、セラミド２とセラミド５混合物の５成分を選択した。
【００３９】
（３）ガレクチン-７産生低減試験及びＴＥＷＬ測定１（セイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキス）
ヒト３次元培養表皮モデルが搭載された培養カップに被験物質を表２に示す濃度で添加し、24時間37℃5%CO2インキュベータ中で培養した。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
培養終了後、３次元培養表皮モデルをＰＢＳ(−)で洗浄した。ついで、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、Wako）を0.03%の濃度で添加し、4時間後、ＰＢＳ(−)で洗浄した。
ＰＢＳ(−)で洗浄後、培養カップ上の経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）をフランツセル型アダプター付属のポータブル水分蒸散計（VapoMeter、Delfin製）で同一検体を2回測定し、平均値をＴＥＷＬ値として算出した。ＴＥＷＬ測定結果は図７に示す。測定回数は３回とし、グラフ中に標準偏差を示した。
ヒト３次元培養表皮モデルのヒト表皮組織をサンプルチューブ（TM-626  2.0ml容）に移し、ZB-50（ジルコニア5.0φ）1個とcell lysis buffer350μL加えて、ビーズ式細胞破砕装置を用いて2,800rpm120秒間ホモジナイズして、ホモジネート溶液を得た。このホモジネート溶液を、４，４００Ｇで遠心分離しして混入するポリカーボネート膜や不溶性タンパク質を沈殿物させて分離した。
上澄液をDeep plateに移し、ガレクチン−７濃度およびタンパク量を測定した。
なお、ガレクチン-７の測定は、Human Galectin-7 DuoSet Economy Pack（R&D Systems Inc.）を用い、３回測定し、結果を平均値±標準偏差で表した（図８）。
セイヨウシロヤナギエキス、カニナバラエキスはいずれもヒト３次元培養表皮モデルの荒れ肌を改善してＴＥＷＬを低減するとともに、ガレクチン-７産生を低減した。
【００４２】
（４）ガレクチン産生低減試験及びＴＥＷＬ測定２（ガラクトース）
上記と同様にしてガラクトースをヒト３次元培養表皮モデルに添加しガレクチン-７を測定した。試験に用いたガラクトース試料は培養液中で表３に示す濃度になるように調整し、添加した。
【００４３】
【表３】
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【００４４】
ＴＥＷＬ測定は、フランツセル型アダプター付属のポータブル水分蒸散計（VapoMeter、Delfin製）を用いて同様に行った。結果を図９に示す。
ガレクチン-７の測定は、同様にHuman Galectin-7 DuoSet Economy Pack（R&D Systems Inc.）を用い、３回測定し、結果を平均値±標準偏差で表した（図１０）。
ガラクトースはヒト３次元培養表皮モデルのガレクチン-７産生を抑制した。
【００４５】
（５）ガレクチン−７産生低減試験３（ラクトフェリン）
市販の化粧品原料であるラクトフェリンＳ（一丸ファルコス株式会社製）をＰＢＳで20倍または100倍に希釈して上記と同様にヒト３次元培養表皮モデルに添加しガレクチン-７を測定した。
なお20倍希釈物をラクトフェリン１、100倍希釈物をラクトフェリン２として以下の結果に表示している。
【００４６】
ガレクチン-７の測定は、前記（３）の試験と同様にHuman Galectin-7 DuoSet Economy Pack（R&D Systems Inc.）を用い、３回測定し、結果を平均値±標準偏差で表した（図１１）。
図１１に示すように、ラクトフェリンはヒト３次元培養表皮モデルのガレクチン-７産生を抑制しなかった。
【００４７】
(6) ガレクチン産生低減試験及びＴＥＷＬ測定４（セラミド２とセラミド５混合物）
市販の化粧品原料であるセラミド２およびセラミド５等量混合し、０．５％水添レシチンで４０００倍に希釈してセラミド２とセラミド５の混合溶液を調整した。この混合溶液にはセラミド２とセラミド５が合わせて250μｇ／ｍｌ含有されている。この混合溶液を、上記と同様にヒト３次元培養表皮モデルにセラミド２とセラミド５がそれぞれ12.5μｇ/ｍｌになるように添加した。またＳＤＳ負荷後のヒト３次元培養表皮モデルに同様に添加し、培養した。培養終了後にＴＥＷＬ測定し、次いでヒト３次元培養表皮モデル中のガレクチン-７量を測定した。
ＴＥＷＬ測定は、フランツセル型アダプター付属のポータブル水分蒸散計（VapoMeter、Delfin製）を用いて同様に行った。結果を図１１に示す。
ガレクチン-７の測定は、同様にHuman Galectin-7 DuoSet Economy Pack（R&D Systems Inc.）を用い、２回測定し、結果を平均値で表した（図１２）。
【００４８】
セラミド２およびセラミド５を12.5μｇ／ｍｌずつ含有する混合物はヒト３次元培養表皮モデルのＴＥＷＬ上昇を抑制し、ガレクチン-７産生を抑制した。
【００４９】
以上の試験結果から、カニナバラ、セイヨウシロヤナギ、ガラクトース、セラミド２およびセミラド５混合物は皮膚のガレクチン-７産生を低減することが判明した。したがってこれらの成分を含有する化粧料は荒れ肌用の化粧料として選択される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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