(57)【要約】【課題】肥満細胞の脱顆粒に対する新規な抑制剤の提供。【解決手段】ＳＳＶＬＹＧＧＰＰＳＡＡ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたは該ペプチドと薬学的に許容可能な担体との結合体と結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含んでなる、肥満細胞の脱顆粒抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＳＶＬＹＧＧＰＰＳＡＡ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたは該ペプチドと薬学的に許容可能な担体との結合体と結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含んでなる、肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
【請求項２】
ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号２）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号３）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、およびＱＱＷＳＳＮＰＷＴ（配列番号４）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる、請求項１に記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域が、配列番号６の第２３番〜第１２８番で表されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１または２に記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
【請求項４】
ＧＹＮＭＮ（配列番号７）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＮＩＮＰＹＹＧＳＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、およびＳＰＹＹＳＮＹＷＲＹＦＤＹ（配列番号９）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含んでなる重鎖可変領域を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域が、配列番号１１の第２０番〜第１４１番で表されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、前記ペプチドまたはペプチドと薬学的に許容可能な担体に対するものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
【請求項７】
前記薬学的に許容可能な担体が、キーホールリンペットヘモシアニン、オボアルブミンまたはウシ血清アルブミンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、ATP合成酵素活性をダウンレギュレーションしうる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体が、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
【請求項１０】
前記抗原結合断片が、Fab、Fab’、（Fab’）２、FvまたはscFvである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含んでなる、肥満細胞の脱顆粒に関連する疾患または障害の治療または予防剤。
【請求項１２】
前記肥満細胞の脱顆粒に関連する疾患または障害がアレルギー性疾患である、請求項１１に記載の治療または予防剤。
【請求項１３】
前記アレルギー性疾患がI型アレルギー性疾患である、請求項１２に記載の治療剤。
【請求項１４】
前記アレルギー性疾患がアレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、蕁麻疹、アレルギー性胃腸炎、花粉症およびアナフィラキシーから選択される、請求項１２または１３に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を有効成分とする、新規な肥満細胞の脱顆粒抑制剤、または、アレルギー性疾患の予防または治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満細胞（マスト細胞）は、ヒスタミン等の化学伝達物質を含有する顆粒及びサイトカイン産生能を有する細胞である。肥満細胞からの脱顆粒およびサイトカイン産生が、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患や自己免疫疾患等の各種炎症性疾患において、重要な役割を果たすことが明らかになっている。例えば、アレルギー反応において、いったん活性化された肥満細胞は脱顆粒によって貯蔵された伝達物質を放出、あるいはロイコトリエンやサイトカインを産出して炎症反応を引き起こす（非特許文献１）。
【０００３】
このように、肥満細胞はアレルギー性疾患等の病態形成において主要な役割を演じていると考えられることから、肥満細胞の脱顆粒を抑制することにより、アレルギー性疾患等において最初の段階での治療または予防が可能であると考えられる。
【０００４】
現在、アレルギー剤としては、抗ヒスタミン剤や免疫抑制効果のあるステロイド剤等が挙げられる。抗ヒスタミン剤は、エフェクター細胞から遊離されたヒスタミンの、標的細胞に発現する特異的な受容体への結合を抑制するものである。しかしながら、エフェクター細胞より産生される化学伝達物質にはヒスタミンだけではなくセロトニンやプロスタグランジン等が含まれており、抗ヒスタミン剤はこれらの化学伝達物質に対する効果が期待できない。また、ステロイド剤は強力な免疫抑制や抗炎症作用を有しており、アレルギー治療薬としては頻繁に使用されているが、易感染症等の副作用が多く観察されることが知られている。
【０００５】
一方、本発明者らは、ＳＳＶＬＹＧＧＰＰＳＡＡ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識しうるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を開示している。さらに、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を、移植拒絶の抑制またはその発症リスクの低減等の免疫抑制剤として用いることも開示している（特許文献１）。
【０００６】
さらに、本発明者らは、ＳＳＶＬＹＧＧＰＰＳＡＡ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識しうるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を、敗血症等の治療剤として用いることも開示している（特許文献２）。
【０００７】
しかしながら、ＳＳＶＬＹＧＧＰＰＳＡＡ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識しうるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、肥満細胞およびアレルギー疾患との関係については何ら報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】免疫生物学―免疫系の正常と病理―、南江堂、原書第５版、p.479
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／０２３６１４号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１３／１２５６８７号公報
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、今般、ＳＳＶＬＹＧＧＰＰＳＡＡ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識しうるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、肥満細胞の脱顆粒に対して優れた抑制効果を奏することを見出し、さらに、抗アレルギー作用を有することを見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
したがって、本発明は、肥満細胞の脱顆粒に対する新規な抑制剤、およびアレルギー性疾患をはじめとする肥満細胞の脱顆粒に関連する疾患または障害の治療または予防剤の提供を目的とする。
【００１１】
本発明には、以下の発明が包含される。
（１）ＳＳＶＬＹＧＧＰＰＳＡＡ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたは該ペプチドと薬学的に許容可能な担体との結合体と結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含んでなる、肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
（２）ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号２）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号３）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、およびＱＱＷＳＳＮＰＷＴ（配列番号４）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる、（１）に記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
（３）モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域が、配列番号６の第２３番〜第１２８番で表されるアミノ酸配列を含んでなる、（１）または（２）のいずれかに記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
（４）ＧＹＮＭＮ（配列番号７）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＮＩＮＰＹＹＧＳＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、およびＳＰＹＹＳＮＹＷＲＹＦＤＹ（配列番号９）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含んでなる重鎖可変領域を含んでなる、（１）〜（３）のいずれかに記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
（５）モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域が、配列番号１１の第２０番〜第１４１番で表されるアミノ酸配列を含んでなる、（１）〜（４）のいずれかに記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
（６）モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、上記ペプチドまたはペプチドと薬学的に許容可能な担体に対するものである、（１）〜（５）のいずれかに記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
（７）薬学的に許容可能な担体が、キーホールリンペットヘモシアニン、オボアルブミンまたはウシ血清アルブミンである、（１）〜（６）のいずれかに記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
（８）モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、ATP合成酵素活性をダウンレギュレーションしうる、（１）〜（７）のいずれかに記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
（９）モノクローナル抗体が、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体である、（１）〜（８）のいずれかに記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
（１０）抗原結合断片が、Fab、Fab’、（Fab’）２、FvまたはscFvである、（１）〜（９）のいずれかに記載の肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
（１１）（１）〜（１０）のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含んでなる、肥満細胞の脱顆粒に関連する疾患または障害の治療または予防剤。
（１２）肥満細胞の脱顆粒に関連する疾患または障害がアレルギー性疾患である、（１１）に記載の治療または予防剤。
（１３）アレルギー性疾患がI型アレルギー性疾患である、（１２）に記載の治療剤。
（１４）アレルギー性疾患がアレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、蕁麻疹、アレルギー性胃腸炎、花粉症およびアナフィラキシーから選択される、（１２）または（１３）に記載の治療剤。
【００１２】
本発明によれば、ＳＳＶＬＹＧＧＰＰＳＡＡ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたは該ペプチドと薬学的に許容可能な担体との結合体と結合するモノクローナル抗体または抗原結合断片を用いて、肥満細胞の脱顆粒を効果的に抑制することができる。また、本発明によれば、アレルギー性疾患をはじめとする肥満細胞の脱顆粒に関連する疾患または障害を効果的に治療または予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のモノクローナル抗体（SSV mAb）または対照試薬（Isotype IgG1）に関する、肥満細胞の脱顆粒の結果を示す。図中のp値は、Studentのt検定により算出され、本発明のモノクローナル抗体投与群の値が対照試薬投与群の値と比較して統計学的に有意な差があることを表す。
【図２Ａ】本発明のモノクローナル抗体（SSV mAb）または対照試薬（Isotype IgG1）に関する、アレルギー性鼻炎モデルマウスの鼻腔へのＯＶＡチャレンジに伴うくしゃみの結果を示す。ここで、＊は、本発明のモノクローナル抗体投与群の値が、対照試薬投与群の値と比較して統計学的に有意な差があることを表す（Studentのt検定、p＜０．０５）。
【図２Ｂ】本発明のモノクローナル抗体（SSV mAb）または対照試薬（Isotype IgG1）に関する、アレルギー性鼻炎モデルマウスの鼻腔へのＯＶＡチャレンジに伴う鼻かき行動の結果を示す。ここで、＊は本発明のモノクローナル抗体投与群の値が、対照試薬投与群の値と比較して統計学的に有意な差があることを表す（Studentのt検定、p＜０．０５）。
【図３Ａ】グラフの左２例は、対照試薬（Isotype IgG1）投与群における、ＯＶＡの初回免疫前の血清中の総IgG1抗体価および最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中の総IgG1抗体価の測定結果を示す。グラフの右２例は、SSV mAb投与群における、ＯＶＡの初回免疫前の血清中の総IgG1抗体価および最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中の総IgG1抗体価の測定結果を示す。ここで、＊＊は、最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中の総IgG1抗体価がＯＶＡの初回免疫前の血清中の総IgG1抗体価と比較して統計学的に有意な差があることを表す（Studentのt検定、p＜０．０１）。
【図３Ｂ】グラフの左２例は、対照試薬（Isotype IgG1）投与群における、ＯＶＡの初回免疫前の血清中の総IgG2a抗体価および最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中の総IgG2a抗体価の測定結果を示す。グラフの右２例は、SSV mAb投与群における、ＯＶＡの初回免疫前の血清中の総IgG2a抗体価および最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中の総IgG2a抗体価の測定結果を示す。ここで、＊は、最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中の総IgG2a抗体価がＯＶＡの初回免疫前の血清中の総IgG2a抗体価と比較して統計学的に有意な差があることを表す（Studentのt検定、p＜０．０５）。
【図３Ｃ】グラフの左２例は、対照試薬（Isotype IgG1）投与群における、ＯＶＡの初回免疫前の血清中の総IgE抗体価および最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中の総IgE抗体価の測定結果を示す。グラフの右２例は、SSV mAb投与群における、ＯＶＡの初回免疫前の血清中の総IgE抗体価および最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中の総IgE抗体価の測定結果を示す。ここで、＊＊は、最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中の総IgE抗体価がＯＶＡの初回免疫前の血清中の総IgE抗体価と比較して統計学的に有意な差があることを表す（Studentのt検定、p＜０．０１）。
【図３Ｄ】グラフの左２例は、対照試薬（Isotype IgG1）投与群における、ＯＶＡの初回免疫前の血清中のOVA-特異的IgG1抗体価および最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中のOVA-特異的IgG1抗体価の測定結果を示す。グラフの右２例は、SSV mAb投与群における、ＯＶＡの初回免疫前の血清中のOVA-特異的IgG1抗体価および最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中のOVA-特異的IgG1抗体価の測定結果を示す。ここで、＊＊は、最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中のOVA-特異的IgG1抗体価がＯＶＡの初回免疫前の血清中のOVA-特異的IgG1抗体価と比較して統計学的に有意な差があることを表す（Studentのt検定、p＜０．０１）。
【図３Ｅ】グラフの左２例は、対照試薬（Isotype IgG1）投与群における、ＯＶＡの初回免疫前の血清中のOVA-特異的IgG2a抗体価および最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中のOVA-特異的IgG2a抗体価の測定結果を示す。グラフの右２例は、SSV mAb投与群における、ＯＶＡの初回免疫前の血清中のOVA-特異的IgG2a抗体価および最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中のOVA-特異的IgG2a抗体価の測定結果を示す。ここで、＊＊は、最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中のOVA-特異的IgG2a抗体価がＯＶＡの初回免疫前の血清中のOVA-特異的IgG2a抗体価と比較して統計学的に有意な差があることを表す（Studentのt検定、p＜０．０１）。
【図３Ｆ】グラフの左２例は、対照試薬（Isotype IgG1）投与群における、ＯＶＡの初回免疫前の血清中のOVA-特異的IgE抗体価および最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中のOVA-特異的IgE抗体価の測定結果を示す。グラフの右２例は、SSV mAb投与群における、ＯＶＡの初回免疫前の血清中のOVA-特異的IgE抗体価および最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中のOVA-特異的IgE抗体価の測定結果を示す。ここで、＊＊は、最後のＯＶＡチャレンジ後の血清中のOVA-特異的IgE抗体価がＯＶＡの初回免疫前の血清中のOVA-特異的IgE抗体価と比較して統計学的に有意な差があることを表す（Studentのt検定、p＜０．０１）。
【発明の具体的説明】
【００１４】
寄託
本発明のハイブリドーマMouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3は、原寄託日を２０１０年８月１７日として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（住所：日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8バイオテクノロジー本部）において、受託番号NITE BP-972のもと寄託されている
【００１５】
肥満細胞の脱顆粒抑制剤
本発明の肥満細胞の脱顆粒抑制剤は、ＳＳＶＬＹＧＧＰＰＳＡＡ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたは該ペプチドと薬学的に許容可能な担体との結合体と結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を有効成分とすることを一つの特徴としている。かかるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、肥満細胞の脱顆粒に対して優れた抑制効果を奏することは意外な事実である。
【００１６】
本発明の好ましい態様によれば、上記抗体またはその抗原結合断片は、ＳＳＶＬＹＧＧＰＰＳＡＡ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたは該ペプチドと薬学的に許容可能な担体に対するものである。
【００１７】
また、本発明の一つの態様によれば、上記抗体またはその抗原結合断片は、ヒストンＨ１、ヒストンＨ３およびヒストンＨ４に特異的に結合するものである。
【００１８】
また、本発明の一つの態様によれば、上記抗体またはその抗原結合断片は、リンカーヒストン（ヒストンＨ１）に対する結合親和性よりも、コアヒストンに対する結合親和性が高い。
【００１９】
また、本発明の好ましい態様によれば、コアヒストンは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４であり、より好ましくはＨ２Ａ、Ｈ３またはＨ４である。
【００２０】
また、本発明の抗体またはその抗体結合断片は、重鎖および／または軽鎖を含むことができる。各軽鎖および重鎖はそのN-末端に可変領域を有することができ、各可変領域では４つのフレームワーク領域(framework region)(FR)と、３つの相補性決定領域(CDR)とを交互に含んでいてよい。可変領域中の残基はKabatらによって考えられた系に従って慣用的に番号付けられている。この系はKabatら、1987、Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Departement of Health and Human Services, NIH,USAに述べられている。特に示さない限り本明細書でこの番号付け体系が使用される。このようなKabatらの方法に基づく番号付けは、例えば、Webサイトhttp://www.bioinf.org.uk/abs/abnum/を用いて簡易に行うことができる。
【００２１】
Kabat残基命名法はアミノ酸残基の直線的番号付けと必ずしも直接一致しない。実際の直線的アミノ酸配列は、基本可変領域構造の構造的要素、フレームワークまたはCDRのいずれにせよ、その短縮または挿入に対応して、厳格なKabat番号付けにおけるよりも少ないまたは追加のアミノ酸を有することがある。残基の正確なKabatの番号付けは、与えられた抗体について、「標準的」Kabat番号付けされた配列と抗体の配列中の相同性残基を整列させることによって決定されるであろう。
【００２２】
一つの態様によれば、本発明の抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域は、ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号２）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号３）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、およびＱＱＷＳＳＮＰＷＴ（配列番号４）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含んでなる。さらに好ましい態様によれば、上記軽鎖可変領域は、配列番号６の第２３番〜第１２８番で表されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００２３】
また、別の態様によれば、本発明の抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域は、ＧＹＮＭＮ（配列番号７）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ＮＩＮＰＹＹＧＳＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、およびＳＰＹＹＳＮＹＷＲＹＦＤＹ（配列番号９）で表わされるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含んでなる。さらに好ましい態様によれば、上記重鎖可変領域は、配列番号１１の第２０番〜第１４１番で表されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００２４】
また、本発明のより一層好ましい態様によれば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６の第２３番〜第１２８番で表されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域と、配列番号１１の第２０番〜第１４１番で表されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域とを含んでなる。
【００２５】
また、本発明の好ましい態様によれば、上記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ATP合成酵素活性をダウンレギュレーションすることができる。また、本発明のより好ましい態様によれば、上記ATP合成酵素はミトコンドリアのATP合成酵素である。
【００２６】
本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の上記結合親和性およびATP合成酵素活性のダウンレギュレーション活性は、例えば、ＷＯ２０１２／０２３６１４号公報の試験例２および５に記載の手法により確認される。
【００２７】
また、本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、キメラ抗体、ヒト型化抗体または完全ヒト型抗体である。これら抗体は、例えば、Morrison,S.L., Oi, V.T., “immunoglobulin genes” Academic Press(London), 260-274(1989)、Roguska, M.L. et. Al., Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 969-973(1994)、Tomizuka, K. et.al. Functional expression and germline transmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice, Nature Genet., 16, 133-143(1997)、Winter, G. et.al., Making antibodies by phage display technology, Ann. Rev. Immunol., 12, 433-455(1994)、Griffiths, A.D. et. al., Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires, EMBO. J., 13, 3245-3260(1994) 等に記載の当該技術分野の公知技術に基づき、当業者は製造することができる。
【００２８】
また、本発明の好ましい態様によれば、上記抗原結合断片は、好ましくは、Fab、Fab’、（Fab’）２、FvまたはscFvである。
【００２９】
また、本発明の別の好ましい態様によれば、上記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ハイブリドーマはMouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3により産生されたものである。
【００３０】
本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、およびハイブリドーマは、例えば、次のようにして製造することができる。すなわち、まず、本発明のハイブリドーマは、ＳＳＶＬＹＧＧＰＰＳＡＡ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたは該ペプチドと薬学的に許容可能な担体との結合体を感作抗原として使用し、この感作抗原にて免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）を、哺乳動物のミエローマ細胞と融合させ、得られるハイブリドーマをクローニングし、そのハイブリドーマ中から選別することによりを得ることができる。そして、本発明のモノクローナル抗体は、本発明のハイブリドーマを培養し、これが産生する抗体を回収することにより得ることができる。
【００３１】
哺乳動物を免疫する方法としては、当該技術分野における一般的投与法を用いることができ、具体的には、腹腔内注射、脾臓内注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、経口投与、経粘膜投与、経皮投与などを挙げることができるが、好ましくは腹腔内注射、脾臓内注射である。感作抗原の投与間隔は、感作抗原の投与量および哺乳動物の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、１ヶ月間に数回毎とすることができる。
【００３２】
免疫される哺乳動物は、特に限定されないが、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性などを考慮して選択することが好ましく、例えば、マウス、ラット、ハムスターなどを挙げることができるが、好ましくはマウスである。
また、免疫細胞としては、好ましくは脾細胞を使用する。
【００３３】
本発明に用いるミエローマ細胞としては、例えば、Ｐ３（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）（J．Immunol., 123，1548, 1978）、ｐ３−Ｕ１（Current Topics in Micro-biology and Immunology, 81, 1-7,1978）、ＮＳ−１（Eur. J. Immunol., 6，511-519, 1976）、ＭＰＣ−１１（Cell, 8, 405-415, 1976）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Nature, 276, 269-270, 1978）、ＦＯ（J. Immunol. Meth．，35, 1-21, 1980）、Ｓ１９４（J. Exp. Med., 148, 313-323, 1978）、およびＲ２１０（Nature, 277, 131-133, 1979）などが挙げられるが、好ましくはＰ３またはｐ３−Ｕ１であり、より好ましくはＰ３である。
【００３４】
免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、例えば、ミルシュタインら（Milstein et. al．）の方法（Methods Enzymol., 73, 3-46, 1981）などに準じて行うことができる。具体的には、細胞融合は、例えば、融合促進剤の存在下、培地中にて免疫細胞とミエローマ細胞とを混合することにより実施することができる。そして、細胞融合において、適宜培地を添加して遠心分離する操作を繰り返してハイブリドーマを生成することができる。
【００３５】
細胞融合に用いる培地としては、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地などの細胞融合において通常使用される培地が挙げられる。また、牛胎児血清（ＦＢＳ）などの血清補液を適宜併用することができる。
また、細胞融合温度は、好ましくは２５〜３７℃であり、より好ましくは３０〜３７℃である。
また、ミエローマ細胞と免疫細胞との混合比率は、好ましくは１：１〜１：１０程度である。
【００３６】
融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）などを挙げることができるが、好ましくはＰＥＧである。ＰＥＧの分子量は適宜選択することができ、例えば、平均分子量１，０００〜６，０００程度とすることができる。また、培地中のＰＥＧの濃度は、好ましくは約３０〜６０％（Ｗ／Ｖ）である。
また、所望によりジメチルスルホキシドなどの補助剤を培地に適宜添加することができる。
【００３７】
本発明のハイブリドーマの選択は、細胞融合により得られるハイブリドーマを、例えば、ＨＡＴ培地などの通常の選択培地にて培養し、通常の限界希釈法を用い、例えば、ＳＳＶＬＹＧＧＰＰＳＡＡ（配列番号１）で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたは該ペプチドと薬学的に許容可能な担体との結合体に対する抗体価など指標としてスクリーニングすることにより実施することができる。ＨＡＴ培地による培養期間は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞）が死滅するのに充分な時間であり、通常、数日〜数週間とすることができる。このようにして得られる本発明のハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することができる。
【００３８】
また、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を回収する方法としては、例えば、ハイブリドーマを常法に従って培養してその培養上清からモノクローナル抗体等を得る方法、またはハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させその腹水からモノクローナル抗体等を得る方法などを挙げることができる。ここで、前者の方法は高純度の抗体を得るのに好ましく、一方、後者の方法は抗体を大量に生産にするのに好ましい。
【００３９】
さらに、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体結合断片は、塩析法、ゲル濾過法、アフィニティークロマトフラフィーなどの方法により、高純度に精製することができる。
【００４０】
本発明の肥満細胞の脱顆粒抑制剤は、上記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片をそのまま用いてもよく、薬学的に許容可能な添加剤とともに医薬組成物として用いることもできる。
本発明の肥満細胞の脱顆粒抑制剤を組成物として提供する場合、上記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の含有量は、本願発明の効果を妨げない限り特に限定されない。上記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の含有量は、例えば、脱顆粒抑制剤全量に対して、０．１〜３０質量％、好ましくは０．１〜２０質量％、特に好ましくは１０質量％とすることができる。
また、上記肥満細胞の脱顆粒抑制剤における薬学的に許容可能な添加剤としては、特に限定されないが、溶剤、溶解補助剤、保存剤、安定剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、等張化剤、緩衝剤、賦形剤、増粘剤、着色剤、公知のキャリア（各種リポソーム、ポリアミノ酸キャリア、合成高分子、天然高分子など）などが挙げられる。
【００４１】
また、本発明の肥満細胞の脱顆粒抑制剤は、剤形は特に限定されず、注射剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、乳剤、液剤、吸入剤、エアロゾル剤、粉末吸入剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、点滴剤、点眼剤、点鼻剤などとして提供することができる。
【００４２】
本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、肥満細胞の脱顆粒に関連する疾患または障害に対する優れた治療または予防効果を有している。したがって、本発明の別の態様によれば、上記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片有効成分として含んでなる、肥満細胞の脱顆粒に関連する疾患または障害の治療または予防剤が提供される。ここで、「治療」とは、確立された病態を改善することを意味し、「予防」とは、想定される悪化に対して事前に備えておくことであって、疾患の発生を未然に防ぐことを意味する。
本発明の治療または予防剤は、上記肥満細胞の脱顆粒抑制剤と同様にして調製することができる。
【００４３】
また、本発明の別の態様によれば、有効量の本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を被験体に投与することを含んでなる、肥満細胞の脱顆粒に関連する疾患または障害の治療または予防方法が提供される。また、本発明の別の態様によれば、有効量の本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を被験体に投与することを含んでなる、被験体の肥満細胞の脱顆粒に関連する疾患または障害の発生リスクを軽減する方法が提供される。
【００４４】
本発明の一つの態様によれば、上記肥満細胞の脱顆粒はヒストンの関与するものである。また、肥満細胞の脱顆粒に関連する疾患または障害とはアレルギー性疾患等、好ましくは、Ｉ型アレルギーまたは即時型アレルギー、より好ましくは、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、蕁麻疹、アレルギー性胃腸炎、花粉症またはアナフィラキシーであり、さらに一層好ましくはアレルギー性鼻炎である。
【００４５】
また、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、全身的または局所的に投与することができ、具体的な投与方法としては、点滴、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射などの注射投与、経口投与、経粘膜投与、経皮投与、鼻腔内投与、口腔内投与などが挙げられる。
【００４６】
また、本発明のモノクローナル抗体または抗原結合断片の有効量は、特に限定されず、被検体の種類、性質、性別、年齢、症状等に応じて当業者によって、適宜決定される。例えば、かかる有効量としては、０．０１〜４０ｍｇ／体重ｋｇ／日、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／体重ｋｇ／日を１回または数回等が挙げられる。
【００４７】
上記被験体としては、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００４８】
また、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、肥満細胞の脱顆粒に関連する疾患または障害に用いられる他の薬剤と組み合わせて同時または逐次に哺乳動物に投与してもよい。
【００４９】
また、本発明の別の態様によれば、肥満細胞の脱顆粒抑制剤の製造における、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用が提供される。また、本発明のさらに別の態様によれば、肥満細胞の脱顆粒に関連する疾患または障害の治療または予防剤の製造における、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用が提供される。また、本発明の別の態様によれば、肥満細胞の脱顆粒を抑制するための、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。また、本発明のさらに別の態様によれば、肥満細胞の脱顆粒に関連する疾患または障害を治療または予防するための、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。
上記別の態様はいずれも、本発明の肥満細胞の脱顆粒抑制剤、本発明の肥満細胞の脱顆粒に関連する疾患または障害の治療または予防剤、または本発明の肥満細胞の脱顆粒に関連する疾患または障害の治療または予防方法の記載に準じて実施することができる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５１】
本実施例で用いたモノクローナル抗体(SSV mAb)は、ＷＯ２０１２／０２３６１４号公報に記載の方法で製造された抗体である。具体的には、以下の方法により製造された。
【００５２】
実施例１：モノクローナル抗体(SSV mAb)の製造
抗原物質の製造
抗原物質としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびＫＬＨの結合体を使用した。
【００５３】
抗原物質の調製においては、まず、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、Ｆｍｏｃペプチド固相合成法（製造装置；ABI４３０型アプライバイオシステムズ社製）により合成した。さらに、上記ペプチドおよびＫＬＨ（SIGMA社製）の結合体は、上記ペプチド ５ｍｇ、ＫＬＨ  約２０ｍｇおよびグルタルアルデヒド ３０μｇ（片山化学工業株式会社）をリン酸緩衝液（pH 8.0）中、室温で約６時間撹拌して合成した。
【００５４】
ハイブリドーマの製造
免疫
ＰＢＳ中に抗原物質を溶解させた溶液 ０．８ｍＬ（抗原物質濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ）とフロイトコンプリートアジュバンド（和光純薬株式会社製）０．８ｍＬとを混合し、懸濁液（抗原濃度：０．２５ｍｇ／ｍＬ）を得た。次に、この懸濁液０．２ｍＬをBALB/cマウスに腹腔内投与した。さらに、この懸濁液を２週間毎に同量にてマウスに投与した。そして、投与開始から１６週間後、ＰＢＳ中抗原を溶解させた溶液 ０．２ｍＬ（抗原濃度：６００〜１０００ｍｇ/ｍＬ）をマウス腹腔内へ最終投与した。なお、投与の際には、眼底静脈より採血を行ってＥＬＩＳＡにより抗体価を測定した。最終投与の４日後、全採血を行い、得られた血液を遠心分離（２０００ｒｐｍ、２０分）し、抗血清を得て以下の実験のコントロール抗血清として用いた。また、全採血後、ラットより脾臓を摘出し、得られた脾細胞を以下の細胞融合に用いた。
【００５５】
細胞融合
上記の脾細胞およびミエローマ細胞（P3X63-Ag.8.653）を脾細胞：ミエローマ細胞＝１０：１〜１０にて混合して遠心分離（１５００ｒｐｍ，５分）した。遠心分離した後、アスピレーターを用いて上清を除去し、得られた細胞ペレットに３７℃のポリエチレングリコール４０００（５０％ＰＢＳ溶液）１ｍＬを１分間かけて添加して混合液とした。この混合液を３７℃にて１分間静置した後、３７℃のＩＭＤＭ培地（計９ｍＬ）を３０秒毎に1 ｍＬずつ加えた後、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分）した。遠心分離後、上清を吸引除去し、３７℃の１５％ＦＣＳ（JRH BIOSCIENCES製）含有ＩＭＤＭ（GIBCO製）培地を適量添加した。得られた懸濁液を９６ウェル培養プレートに１００ｍＬずつ分注を行い、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターにて１日培養した。さらにＨＡＴ培地（ＨＡＴ粉末（HAT MEDIA SUPPLEMENT（×50）、SIGMA製)を無血清ＩＭＤＭ培地１０ｍＬに溶かし、１０％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭ培地にて５０倍希釈したものである。）を１００ｍＬ添加し、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターにて培養した。ＨＡＴ培地の交換は２〜３日毎に行い、１０日後にはＨＴ培地（ＨＴ粉末（HT MEDIA SUPPLEMENT、SIGMA製)を無血清ＩＭＤＭ培地１０ｍＬに溶かし、１０％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭ培地にて５０倍希釈したものである。）に切り替え、３日間、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターにて培養を行った。以後２〜３日ごとに培地(ＨＴ培地)の交換を行った。細胞増殖を顕微鏡により確認した後、培養上清（約１００ｍＬ）を回収した。この培養上清を用いて、抗体価測定によるハイブリドーマのスクリーニングを行った。
【００５６】
ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
抗体価測定
上記抗原物質（５ｍｇ）を含む緩衝液（Baicarbonate buffer：100 mM NaHCO3-NaOH、ｐＨ９．２〜９．５、ペプチド濃度：１μｇ/ｍＬ) を１ウェル当り５０μＬずつ９６ウェル平底プレートへ添加し、室温にて２時間静置してコーティングした。プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳＴ）にて３回洗浄し、ブロッキングバッファー（３％スキムミルク１％ＢＳＡ、ＰＢＳ）を２００〜２５０μＬ/ウェルにて加え、４℃にて一昼夜反応させた後、３回洗浄した。そして、ハイブリドーマの培養上清を１００μＬ/ウェルにて加え、３７℃にて４時間または４℃にて一昼夜反応させた。プレートを３回洗浄した後、希釈バッファー（10 mM Tris-HCl ( pH 8.0 )、0.9 % ( W/V ) NaCl、0.05 % ( W/V ) Tween20）にて１００００倍希釈したビオチン標識抗マウスＩｇＧ（Biotion-labeled anti-mouse IgG 、SIGMA)を５０μＬ/ウェルにて加え、室温にて２時間反応させた。その後６回洗浄した後、希釈バッファーにて１０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプタリジン（Streptaridin）を５０μＬ/ウェルにて加え、室温にて１〜２時間反応させた。その後６回洗浄を行い、蛍光基質バッファー（Attophos substrate buffer、ロシュダイアグノスティックス社製）を５０μＬ/ウェル加えてプレートを遮光し発色させた。蛍光強度はCytoFluorII（パーセプティブ社製）にて測定した。
【００５７】
ハイブリドーマの選別
上記抗体価測定にて陽性の結果を示したウェル（１×１０５細胞／ｍＬ）に１５％ＦＣＳ１０％ＨＣＦ（Hybridoma cloning factor、オリジン社製）含有ＩＭＤＭ培地を加えて、約２００細胞／ウェル となるように９６ウェル培養プレートに分注し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて培養を行った。そして、上記と同様に抗体価測定を行い、抗体産生量の多いハイブリドーマを選択した。
【００５８】
さらに限界希釈を行い、選択したハイブリドーマが０．５〜１細胞／ウェルになるように１５％ＦＣＳ１０％ＨＣＦ含有ＩＭＤＭ培地で希釈し、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターにて約３〜４日間培養した後、上記と同様に抗体価測定を行い、抗体産生量の多いハイブリドーマを選択した。さらに限界希釈を繰り返し、上記抗原物質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。このうち、抗体価が最も高いハイブリドーマを選択してMouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3と命名した。
【００５９】
モノクローナル抗体の取得
ハイブリドーマMouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3は、１５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地を用いて培養した（１×１０６細胞／ｍＬ）。次に、ハイブリドーマ培養液を回収し、死細胞片を除くためにフィルターでろ過した。次に、終濃度４０％となるように、培養上清に硫酸アンモニウムを加え、４０℃で１時間撹拌した。次に、遠心分離（3000g、30分、４℃）を行い、上清を捨て沈殿を回収した。この沈殿を上記培養上清の１/１０量のＰＢＳで溶解し、ＰＢＳを外液として一晩透析した。
次に、上記沈殿を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で２倍希釈し、１Ｍトリス-HCl緩衝液とともに、HiTrapNHS活性化カラムに添加した。さらに、０．１Ｍグリシン−HCl溶液(pH2.7)で抗体の溶出し、フラクションチューブに回収した。
【００６０】
実施例２：SSV mAbの軽鎖および重鎖の可変領域配列の同定
ハイブリドーマcDNAの合成
FastPure RNA Kit（TaKaRa社製）を使って、実施例１で取得したハイブリドーマ（Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3）1.6×107cellsからtotal RNAを調製した。Poly (A)+ Isolation Kit from Total RNA（NIPPON GENE製）を使って、240 μgのtotal RNAからmRNAを調製した。Etachinmate（NIPPON GENE社製）を使ってエタノール沈殿を行い、mRNAを沈殿した。75% エタノールで洗浄した後、mRNAを乾燥した。これにRNase free waterを10 μL加え、mRNAを溶解した。得られたmRNA溶液は-80℃で保存した。SMARTer RACE cDNA Amplification Kit（Clontech社製）を使って、1 μgのSSVハイブリドーマmRNAから5’-RACE用のcDNAを合成した。得られたcDNA溶液は-20℃で保存した。
【００６１】
SSV mAb 軽鎖および重鎖における相補性決定領域（CDR）の同定
マウスIgG1 重鎖定常領域の塩基配列をもとに、プライマー 5’- CAC CAT GGA GTT AGT TTG GGC AGC AG -3’ （配列番号１２）を作製した。マウス軽鎖κ定常領域の塩基配列をもとにプライマー 5’- CAC GAC TGA GGC ACC TCC AGA TG -3’（配列番号１３）を作製した。それぞれのプライマーとUniversal Primer A Mix（SMARTer RACE cDNA Amplification Kit付属プライマー）を用いて、cDNAをテンプレートとした5'-RACEを行った。RACE反応はAdvantage2 PCR Kit（Clontech社製）を用いた。反応液をアガロース電気泳動し、約600 bpの重鎖5’-RACE産物および約550 bpの軽鎖5’-RACE産物を、E.Z.N.A. Gel Extraction Kit（OMEGA bio-tek社製）を用いてゲルから精製した。これをpGEM-T Easy Vector（Promega社製）に連結し、Competent high E.coli DH5α（TOYOBO社製）を形質転換した。得られた形質転換体から、E.Z.N.A. Plasmid Miniprep KitＩ（OMEGA bio-tek社製）を用いてプラスミドを調製した。調製したプラスミドをテンプレートとして、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）を用いてサイクル反応を行った。
【００６２】
次に、DNAシークエンサー（Applied Biosystems製）を用いて、軽鎖および重鎖可変領域の塩基配列を解析した。
その結果、軽鎖可変領域の塩基配列は、配列番号５の第６７番〜第３８４番で表されるものであった。
また、重鎖可変領域の塩基配列は、配列番号１０の第５８番〜第４２３番で表されるものであった。
なお、翻訳開始コドンとKabatらの方法により決定したFR（定常領域）１の位置に基づき、配列番号５の第１番〜第６６番は軽鎖シグナルペプチドの塩基配列であり、および配列番号１０の第１番〜第５７番は重鎖のシグナルペプチドの塩基配列であると推定した。
【００６３】
次に、得られた塩基配列から軽鎖および重鎖の可変領域のアミノ酸配列を推定し、Kabatらの方法に従ってCDR領域を同定した。
【００６４】
その結果、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６の第２３番〜第１２８番で表されるものであった。ここで、配列番号６の第１番〜第２２番は軽鎖シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
また、軽鎖可変領域可変領域のアミノ酸配列のうち、ＣＤＲ１はＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号２）で表わされ、ＣＤＲ２はＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号３）で表わされ、ＣＤＲ３はＱＱＷＳＳＮＰＷＴ（配列番号４）で表わされることを確認した。
【００６５】
また、重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１１の第２０番〜第１４１番で表されるものであった。ここで、配列番号１１の第１番〜第１９番は重鎖シグナルペプチドのアミノ酸配列である。
また、重鎖可変領域のアミノ酸配列のうち、ＣＤＲ１はＧＹＮＭＮ（配列番号７）で表わされ、ＣＤＲ２はＮＩＮＰＹＹＧＳＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号８）で表わされ、ＣＤＲ３はＳＰＹＹＳＮＹＷＲＹＦＤＹ（配列番号９）で表わされることを確認した。
【００６６】
試験例１：肥満細胞からの脱顆粒抑制作用の評価
脱顆粒抑制作用の評価はβ−ヘキソサミニダーゼの遊離を指標にして行った。
まず、Lewisラット（5週齢、雌）の大腿骨より骨髄細胞を採取し、１０ ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−３含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。３日毎に培地を交換し、３０日間培養して肥満細胞へ分化させた。該肥満細胞に抗ジニトロフェニルＩｇＥ（抗ＤＮＰ ＩｇＥ）（Sigma-Aldrich社製）を添加し、３７℃で１８時間培養して感作させた。次いで、該細胞をタイロード（Tyrode）緩衝液（10 mM HEPES、130 mM NaCl、5 mM KCl、1.4 mM CaCl2、1 mM MgCl2、5.6 mM glucose、0.1% BSA、pH 7.4）で洗浄した後、タイロード緩衝液に再懸濁した。終濃度２５ μｇ／ｍＬとなるようにSSV mAbまたはIsotype IgG1を加え、３７℃で１時間インキュベートした。ジニトロフェニル化ウシ血清アルブミン（ＤＮＰ−ＢＳＡ）（Life Technologies社製）を加え、３７℃で１時間インキュベートして脱顆粒を誘導した。上清を回収した後、細胞に０．５％ トリトン X-100溶液を加え、細胞内のβ−ヘキソサミニダーゼを抽出した。各サンプルに基質溶液［0.04 M クエン酸ナトリウム（pH 4.5）に溶解した1.3 mg/ml 4-ニトロフェニル-N-アセチル-β- D-グルコサミニド（Sigma-Aldrich社製）］を加え、３７℃で１時間インキュベートした。停止溶液［0.2 M グリシン （pH 10.0）］を加え、反応を停止させた。Victor（商標） X4 マルチラベルプレートリーダー（Perkin Elmer社製）で４０５ｎｍの吸光度を測定した。脱顆粒率は以下の計算式によって算出した。
【化１】
2015105250.tif 000002
各サンプルの脱顆粒に関し、上清へのβ−ヘキソサミニダーゼの遊離を指標として評価した結果は図１に示される通りであった。
その結果、ＤＮＰ−ＢＳＡの添加時には、SSV mAb投与群は非投与群およびIsotype IgG1投与群に比して有意に脱顆粒を抑制した。
これらの結果から、SSV mAbは肥満細胞の脱顆粒を抑制するものと考えられる。
【００６７】
試験例２：アレルギー性鼻炎モデルマウスを用いた抗アレルギー作用の評価
BALB/cマウス（５週齢、雌）に卵白アルブミン（ＯＶＡ、Sigma-Aldrich社製）とImject(商標) Alum（Thermo Scientific社製）の混合溶液（ＯＶＡ ４００μg／ｍＬとImject(商標) Alum ４０ｍｇ／ｍＬを１：１の体積比で混合した溶液）１００μＬを隔週で計２回腹腔に投与して免疫した。最終免疫の１週間後から、毎日マウスの各鼻腔にＯＶＡ溶液（生理食塩水に溶解した５０ｍｇ／ｍＬ ＯＶＡ）を１０μＬずつ点鼻し（以下、ＯＶＡチャレンジという）、その後の５分間、くしゃみ及び鼻掻き行動の回数を測定した。点鼻は計９回行い、点鼻直前にSSV mAbまたは対照試薬（Isotype IgG1）（eBiosciences社製）を１００μg腹腔に投与した。
その結果を図２ＡおよびＢに示した。くしゃみの回数は、ＯＶＡチャレンジ２日後以降、SSV mAb投与群が対照試薬（Isotype IgG1）投与群に比べ有意に減少した。鼻かき行動に関しては、ＯＶＡチャレンジ８日後以降、SSV mAb投与群がIsotype IgG1投与群に比べ有意に減少した。したがって、Isotype IgG1投与群と比べてSSV mAb投与群は、有意にくしゃみ、鼻かき行動を抑制しているものと認められる。
【００６８】
試験例３：マウスの血清中の抗体価の測定
試験例２における、ＯＶＡの初回免疫前と最後のＯＶＡチャレンジ後にマウスから血清を採取した。
血清中総IgG1、IgG2a、IgE抗体価は、N. Onishiら (Dietary pulverized konjac glucomannan prevents the development of allergic rhinitis-like symptoms and IgE response in mice. Biosci. Biotechnol. Biochem., 71 (10), 2551-56, 2007)を参考にして測定した。
方法について簡単に記述する。コーティングバッファー（0.1 M NaHCO3、0.5 M NaCl、pH 8.5）で２５０倍希釈した精製抗マウス IgG1、IgG2a、IgE抗体（BD Bioscience社製）を９６−ウェルマイクロプレート（Nalgene Nunc International社製）に加え、４℃で一晩インキュベートしてウェルに固定化した。0.05% Tween 20を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でウェルを洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma-Aldrich社製）を含むＰＢＳ（１％ ＢＳＡ−ＰＢＳ）を加え、３７℃で２時間インキュベートしてウェルをブロッキングした。該ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、マウスから採取した血清を加え、３７℃で２時間インキュベートした。その後、該ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、１％ ＢＳＡ−ＰＢＳで２５０倍希釈したビオチン結合抗マウスIgG1、IgG2a、IgE抗体（BD Bioscience社製）を加え、３７℃で１．５時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、１％ ＢＳＡ−ＰＢＳで２００倍希釈したストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシターゼ（R&D Systems社製）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、該ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、1-Step Ultra TMB substrate solution（Thermo Fisher Scientific社製）を加えた。適度に発色した所で停止溶液（2N HCl）を加え、反応を停止させた。Victor（商標） X4 マルチラベルプレートリーダー（Perkin Elmer社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
ＯＶＡ特異的IgG1, IgG2a, IgE抗体価についても、前記文献（N. Onishi ら、2007）を参考にして測定した。方法について簡単に記述する。重炭酸塩緩衝液［0.1 M NaHCO3（pH 9.3）］で50 μg/mlに希釈したＯＶＡを９６-ウェルマイクロプレートに加え、４℃で一晩インキュベートしてウェルに固定化した。ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、１％ ＢＳＡ−ＰＢＳを加え、３７℃で２時間インキュベートしてウェルをブロッキングした。ブロッキング以降の操作は、血中総IgG1、IgG2a、IgE抗体価の測定と同様に行った。
【００６９】
抗体価の結果は、図３Ａ（総IgG1）、図３Ｂ（総IgG2a）、図３Ｃ（総IgE）、図３Ｄ（ＯＶＡ-特異的 IgG1）、図３Ｅ（ＯＶＡ-特異的 IgG2a）、図３Ｆ（ＯＶＡ-特異的 IgE）に示されるとおりであった。
その結果、最後のＯＶＡチャレンジ後の血清において、対照試薬（Isotype IgG1）投与群と比べてSSV mAb投与群に有意差は認められなかった（Studentのt検定、有意水準5%）。SSV mAbがマウスの抗体価にほとんど影響を与えないことから、そのアレルギー抑制機序として、IgG抗体やIgE抗体を介さず、試験例１の試験結果に基づいて、肥満細胞への直接あるいは間接的に作用することが示唆された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【配列表】
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