(57)【要約】【課題】本発明は、再現性よく正確に味物質を評価するための手段を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、味物質又は味阻害物質を評価する方法であって、ａ）カルシウムイオンの存在下、Ｔ１Ｒ１の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含むタンパク質複合体と被検物質とを接触させるか、又はＴ１Ｒ２の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含むタンパク質複合体と被検物質とを接触させる工程、及びｂ）被検物質のタンパク質複合体への結合を検出する工程、を含む前記方法に関する。【選択図】図１
2015105826.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
味物質又は味阻害物質を評価する方法であって、
ａ）カルシウムイオンの存在下、Ｔ１Ｒ１の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含むタンパク質複合体と被検物質とを接触させるか、又はＴ１Ｒ２の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含むタンパク質複合体と被検物質とを接触させる工程、及び
ｂ）被検物質のタンパク質複合体への結合を検出する工程、
を含む前記方法。
【請求項２】
工程ｂ）において、被検物質のタンパク質複合体への結合による、タンパク質複合体の構造変化を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞外ドメインが蛍光標識されており、タンパク質複合体の構造変化をＦＲＥＴ解析により検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
以下のａ）及びｂ）を水性溶媒中に含む、味物質又は味阻害物質を評価するための試薬：
ａ）カルシウムイオン、
ｂ）Ｔ１Ｒ１の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含むタンパク質複合体、又はＴ１Ｒ２の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含むタンパク質複合体。
【請求項５】
水性溶媒中のカルシウムイオン濃度が０．１〜１００ｍＭである、請求項４に記載の試薬。
【請求項６】
味物質又は味阻害物質を評価するための試薬の製造方法であって、
ａ）Ｔ１Ｒ１の細胞外ドメインをコードする遺伝子及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインをコードする遺伝子、又はＴ１Ｒ２の細胞外ドメインをコードする遺伝子及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインをコードする遺伝子を宿主細胞において発現させる工程、
ｂ）培養物からＴ１Ｒ１の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメイン、又はＴ１Ｒ２の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含む画分を得る工程、及び
ｃ）画分にカルシウムイオンを加え、固液分離し、液体画分からタンパク質を回収する工程、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、味覚受容体細胞外ドメインを利用して味物質を評価する方法、そのための試薬、並びに試薬の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
味覚は、物質を口にした時に、特に舌の表面に存在する特異的な受容体と物質が結合することによって生じる感覚である。味覚は、５つの基本味、すなわち、塩味、酸味、甘味、うま味、苦味で構成されており、これらの基本味が統合することによって形成されると考えられている。
【０００３】
味物質開発は、これまで呈味性の強い食品素材からの抽出、偶然の発見などしか有効な手段がなく、味物質の評価は、これまでヒトの舌を用いた官能試験に頼っており、効果的な味物質開発を困難にしていた。ヒトによる官能試験に代えて、舌の表面の味蕾に存在する味細胞を単離し、これを用いて風味改善効果を評価することも考えられる。しかし、舌の表面の味蕾に存在する味細胞を単離したものは、培養プレートへの接着が非常に弱く、すぐに死んでしまうため、時間を要する評価には使用することができない。また、樹立された味細胞は存在しないので、上記評価方法は、味細胞の供給および試験の再現性の点で実用的でない。
【０００４】
現在のところ、塩味、酸味は、舌の表面の味蕾に存在する味細胞の近位側の細胞膜上に発現するいくつかのイオンチャネル型受容体を介して感知されると言われている。一方、甘味、うま味、苦味については、味細胞に存在する膜タンパク質であるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と、それに共役するＧタンパク質を介したシグナル伝達によって感知されると考えられており、具体的には、甘味はＴ１Ｒファミリーに属するＴ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３のヘテロ二量体（甘味受容体）、うま味はＴ１Ｒファミリーに属するＴ１Ｒ１及びＴ１Ｒ３のヘテロ二量体（うま味受容体）で受容され、苦味はＴ２Ｒファミリーと命名された約３０種類の分子（苦味受容体）で受容されることが明らかにされている。
【０００５】
そして、味物質を客観的に同定する方法として、上記受容体を発現させた細胞系を用いるアッセイが報告されている（特許文献１）。しかし細胞を用いるアッセイは、細胞の安定性・再現性などに問題があり、また、細胞膜への吸着や他の細胞膜タンパク質による応答も同時に起こってしまうという問題点があった。また、受容体Ｔ１Ｒファミリーは、これまで受容体全長はもちろん細胞外味認識領域についても機能状態を保持した試料調製が困難であり、分子レベルの解析は十分にされていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−５００３１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、再現性よく正確に味物質を評価するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、カルシウムイオンを共存させることにより、味覚受容体の細胞外ドメインを、機能単位であるヘテロ二量体の形で精製できること、このヘテロ二量体を用いて、再現性よく正確に味物質及び味阻害物質を評価できることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）味物質又は味阻害物質を評価する方法であって、
ａ）カルシウムイオンの存在下、Ｔ１Ｒ１の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含むタンパク質複合体と被検物質とを接触させるか、又はＴ１Ｒ２の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含むタンパク質複合体と被検物質とを接触させる工程、及び
ｂ）被検物質のタンパク質複合体への結合を検出する工程、
を含む前記方法。
（２）工程ｂ）において、被検物質のタンパク質複合体への結合による、タンパク質複合体の構造変化を検出する、（１）に記載の方法。
（３）細胞外ドメインが蛍光標識されており、タンパク質複合体の構造変化をＦＲＥＴ解析により検出する、（２）に記載の方法。
（４）以下のａ）及びｂ）を水性溶媒中に含む、味物質又は味阻害物質を評価するための試薬：
ａ）カルシウムイオン、
ｂ）Ｔ１Ｒ１の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含むタンパク質複合体、又はＴ１Ｒ２の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含むタンパク質複合体。
（５）水性溶媒中のカルシウムイオン濃度が０．１〜１００ｍＭである、（４）に記載の試薬。
（６）味物質又は味阻害物質を評価するための試薬の製造方法であって、
ａ）Ｔ１Ｒ１の細胞外ドメインをコードする遺伝子及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインをコードする遺伝子、又はＴ１Ｒ２の細胞外ドメインをコードする遺伝子及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインをコードする遺伝子を宿主細胞において発現させる工程、
ｂ）培養物からＴ１Ｒ１の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメイン、又はＴ１Ｒ２の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含む画分を得る工程、及び
ｃ）画分にカルシウムイオンを加え、固液分離し、液体画分からタンパク質を回収する工程、
を含む、前記方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、味覚受容体の細胞外ドメインを、機能単位であるヘテロ二量体の形で精製でき、このヘテロ二量体を用いて、再現性よく正確に味物質又は味阻害物質を評価することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＦＲＥＴ解析で得られた滴定曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者らは、Ｔ１Ｒファミリーに属する味覚受容体の細胞外ドメインを機能単位であるヘテロ二量体の形で取得することに初めて成功した。そして、味覚受容体が、リガンドとしての味物質が結合していない状態では極めて不安定であったところ、カルシウムイオンを共存させることにより、味物質が存在しない条件下でも安定に保持できることを見いだし、味物質存在下／非存在下においてタンパク質試料を調製することに成功した。したがって、味覚受容体について精製タンパク質試料を用いた物理化学的な味物質結合解析が初めて可能となった。
【００１３】
さらに、この味物質結合によるＦＲＥＴシグナル変化が味物質結合解析系として利用できると着想し、受容体応答が見られた味物質について結合解析を行った結果、カロリメトリーを含めた他の生体分子間相互作用解析の手法では原理上測定不可能な親和性の弱い味物質についても、親和性を解析し結合定数を決定することに成功した。
【００１４】
味細胞は、組織化されて舌の味蕾を形成する細胞群のうちの１種であり、例えば、葉状、茸状及び有郭乳頭などの舌乳頭に存在する。味細胞は、口蓋並びに食道及び胃のような組織にも認められる。味覚受容体である甘味受容体及びうま味受容体は、味細胞に存在する膜タンパク質で、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーに属する。これらの受容体は、Ｔ１Ｒファミリーに属する３種類のタンパク質（Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３）がヘテロ二量体を構成して機能しており、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３ヘテロ二量体がうま味受容を、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロ二量体が甘味受容を担っている。
【００１５】
ＧＰＣＲは、通常７箇所の膜貫通領域及び対応する膜貫通ドメインを持ち、種類に応じてＮ末端ドメイン、細胞外ドメイン、細胞質ドメイン、並びにＣ末端ドメインを有するものが存在する。これらのドメインは、疎水性及び親水性ドメインを同定する配列分析プログラムのような当業者に周知の方法を用いて構造的に同定することができる。
【００１６】
細胞外ドメインは、細胞膜から突き出ていて、細胞外に露出しているＴ１Ｒタンパク質のドメインを指す。そのようなドメインは、これもまた細胞外に露出しているＮ末端ドメインを含んでもよい。また細胞外ドメインは、多くの味物質、特にうま味物質及び甘味物質の、結合及び認識部位となっている。
【００１７】
本発明は、味覚受容体であるＴ１Ｒファミリーに属する味覚受容体の細胞外ドメインを、機能単位であるヘテロ二量体の形で用いることを特徴とする。Ｔ１Ｒ１の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含むタンパク質複合体（以下、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体と称する場合がある）は、うま味受容体として機能し、例えば、Ｔ１Ｒ１の細胞外ドメインをコードする遺伝子及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインをコードする遺伝子を宿主細胞に導入し、得られた細胞の培養物から目的のタンパク質複合体を精製することにより製造することができる。Ｔ１Ｒ２の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含むタンパク質複合体（以下、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体と称する場合がある）は、甘味受容体として機能し、例えば、Ｔ１Ｒ２の細胞外ドメインをコードする遺伝子及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインをコードする遺伝子を宿主細胞に導入し、遺伝子導入された細胞の培養物から目的のタンパク質複合体を精製することにより製造することができる。以下、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体を合わせて、細胞外ドメイン複合体またはタンパク質複合体と称する場合がある。また、一旦そのアミノ酸配列が決定されたタンパク質又はタンパク質複合体については、その配列を元に、当業者に公知の手法、例えば、アミノ酸１つ１つを化学的に重合してポリペプチドを合成する方法（ペプチド合成法）に従って調製することもできる。
【００１８】
Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３、並びにそれらの細胞外ドメインのアミノ酸配列及びそれらをコードする遺伝子の塩基配列は公共のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ）より入手可能である。配列が未知の生物に由来する遺伝子は、既知の配列情報を利用し、クローニングにより取得することができる。所望の遺伝子をクローニングにより取得する方法は、分子生物学の分野において周知である。例えば、遺伝子配列が既知の場合、制限エンドヌクレアーゼ消化により適したゲノムライブラリを作り、所望の遺伝子配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングすることができる。配列が単離されたら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような標準的増幅法を用いてＤＮＡを増幅し、形質転換（遺伝子導入）に適した量のＤＮＡを得ることができる。遺伝子のクローニングに用いるゲノムライブラリの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載されている。あるいは、目的タンパク質を発現する細胞または組織から調製したＲＮＡを鋳型とした逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりｃＤＮＡを得てもよい。
【００１９】
Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３としては、特に制限されないが、哺乳類、例えば、ヒト及びサルを含む霊長類、げっ歯類、ブタ、サル、イヌ及びネコ、並びに非哺乳類、例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類に由来するものを使用できる。
【００２０】
Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３の具体例を、以下にそのアクセッション番号とともに示す。ヒトＴ１Ｒ１（アミノ酸配列：ＤＡＡ００００１２、塩基配列：ＢＫ０００１５３）、ヒトＴ１Ｒ２（アミノ酸配列：ＤＡＡ００００１９、塩基配列：ＢＫ０００１５１）、ヒトＴ１Ｒ３（アミノ酸配列：ＤＡＡ００００１３、塩基配列：ＢＫ０００１５２）、メダカＴ１Ｒ１（アミノ酸配列：ＢＡＥ７８４８１、塩基配列：ＡＢ２００９０５）、メダカＴ１Ｒ２ａ（アミノ酸配列：ＢＡＥ７８４８２．２、塩基配列：ＡＢ２００９０６）、メダカＴ１Ｒ３（アミノ酸配列：ＢＡＥ７８４８５．１、塩基配列：ＡＢ２００９０９）。
【００２１】
上記Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３、並びにその細胞外ドメインと機能的に同等のタンパク質も本発明において使用することができる。例えば、上記特定のアミノ酸配列を有するＴ１Ｒ１又はその細胞外ドメインと機能的に同等のタンパク質としては、その特定のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｔ１Ｒ１又はその細胞外ドメインの活性を有するタンパク質、並びにその特定のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、Ｔ１Ｒ１又はその細胞外ドメインの活性を有するタンパク質が挙げられる。Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３、並びにその細胞外ドメインについても同様である。
【００２２】
上記におけるアミノ酸の置換は保存的置換であることが好ましい。アミノ酸の保存的置換の例としては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、グリシンとアラニン（Ａｌａ）又はバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、スレオニンとセリン（Ｓｅｒ）又はアラニン、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等のアミノ酸の間での置換が知られている。また、複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加される場合、欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の数は、通常２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
【００２３】
上記Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３、並びにその細胞外ドメインをコードする遺伝子と機能的に同等の遺伝子も本発明において使用することができる。遺伝子には、核酸が包含され、核酸には、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）及びＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）が包含される。例えば、上記特定の塩基配列を有するＴ１Ｒ１又はその細胞外ドメインをコードする遺伝子と機能的に同等の遺伝子としては、その特定の塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性又は同一性を有する塩基配列からなり、Ｔ１Ｒ１又はその細胞外ドメインの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３、並びにその細胞外ドメインをコードする遺伝子についても同様である。
【００２４】
また、機能的に同等の遺伝子には、特定の塩基配列についての、保存的に修飾されたその変異体（例えば、同義性コドン置換）及び相補的配列も含まれる。具体的には、同義性コドン置換は、例えば、１つ又は複数の選択されるコドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を発生させることにより達成することができる。特定の塩基配列に関しては、保存的に修飾された変異体は、同じ又は本質的に同じアミノ酸配列をコードする核酸を指す。
【００２５】
本発明で用いるＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体を産生する細胞（例えば、形質転換体）は、Ｔ１Ｒ１の細胞外ドメインをコードする遺伝子及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインをコードする遺伝子を宿主細胞に、一緒に又は別々に、導入することにより作製できる。すなわち、遺伝子の導入は、上記２つの遺伝子を含むベクターを作製して宿主細胞に導入することにより、又は各遺伝子を含むベクターをそれぞれ作製して宿主細胞に導入することにより実施できる。遺伝子の導入は、相同組換えにより実施してもよい。２つの遺伝子を別の宿主細胞に導入してもよいが、タンパク質複合体を安定に製造する観点から、２つの遺伝子は、同じ宿主細胞に導入することが好ましい。得られる細胞を培地に培養し、その培養物からＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体を含む画分を得、この画分からカルシウムイオンの存在下で精製して採取する方法が好ましく用いられる。あるいは、Ｔ１Ｒ１の細胞外ドメインをコードする遺伝子及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインをコードする遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることにより、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体を製造することもできる。Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体を産生する細胞についても同様である。
【００２６】
遺伝子を導入する宿主の種類は限定されず、細菌、真菌、各種の酵母などの単細胞真核生物、又は動物若しくは植物の生細胞を任意に選択できる。宿主の具体例としては、例えば、大腸菌等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等のＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌等が挙げられる。この他に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等の酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることもできる。
【００２７】
遺伝子導入のために遺伝子を連結するベクターとしては、宿主細胞に遺伝子を導入するために使用可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、ファージ及びコスミド等が挙げられる。プラスミドとしては、大腸菌のプラスミド（例えば、ｐＥＴ２１ａ（＋）、ｐＥＴ３２ａ（＋）、ｐＥＴ３９ｂ（＋）、ｐＥＴ４０ｂ（＋）、ｐＥＴ４３．１ａ（＋）、ｐＥＴ４４ａ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、また酵母でもＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ用のプラスミド（例えば、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺα、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ６、ｐＧＡＰＺ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡＯ８１５、ｐＦＬＤ、ｐＪＬ−ＩＸ、ｐＪＬ−ＳＸ等）、ｐＡｃベクターなどが挙げられる。また、クローニング、シークエンス確認用にｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（商標登録）などの市販のクローニングベクターを用いてもよい。
【００２８】
相同組換えによる遺伝子導入では、プラスミドを用いることなく、ＰＣＲ等によって、遺伝子配列の両末端相同組換え部位の遺伝子配列と導入遺伝子配列を含む線状の遺伝子配列を合成したものを用いることができる。この線状遺伝子は配列の両末端に宿主ゲノム上の遺伝子と相同配列を有し、本相同配列を介して宿主染色体中へ導入される。
【００２９】
上記ベクターにおいては、挿入した遺伝子が確実に発現されるようにするため、該遺伝子の上流に適当なプロモーターを連結する。使用するプロモーターは、宿主に応じて当業者が適宜選択すればよい。構成的プロモーターや発現誘導型プロモーターを用いてもよい。構成的プロモーターは、宿主細胞内外の刺激と関係なく一定のレベルで構造遺伝子を発現せしめるプロモーターをいう。構成的プロモーターの例としては、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、ＤＮＡジャイレース遺伝子、５ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、及び２３ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子等のプロモーター、並びにＰＧＫなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
発現誘導型プロモーターは、外的要因、例えば、薬剤、強光、ＵＶ、傷害、高温、低温、塩等の刺激によって、その下流に連結された遺伝子の発現を誘導し得るプロモーターを意味する。誘導型プロモーターの例としては、Ｔ７プロモーター、Ｔａｃプロモーター、Ｌａｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、λ−ＰＬプロモーター、などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
ベクターには、プロモーター及び目的の遺伝子に加えて、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などが連結されていてもよい。また、導入する遺伝子配列は、選択マーカーを含んでいてもよい。選択マーカーは目的遺伝子が宿主へ導入された組換え株を選抜するのに用いることができる。選択マーカーの例としては、ホルムアルデヒド耐性マーカー、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールなどの薬剤耐性マーカー、ロイシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、ウラシルなどの栄養要求性マーカーが挙げられるがこれに限定されない。
【００３２】
遺伝子を連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。好ましくは市販のライゲーションキット、例えばＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡株式会社製）を用いて、規定の条件にてライゲーション反応を行うことにより組換えベクターを得ることができる。また、これらのベクターを、必要であればボイル法、アルカリＳＤＳ法、磁性ビーズ法及びそれらの原理を使用した市販されているキット等により精製し、さらにエタノール沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法などの濃縮手段により濃縮することができる。
【００３３】
遺伝子の導入方法としては、特に制限されないが、例えば、電気パルス法、カルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。
【００３４】
相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的遺伝子を挿入する方法は、ゲノム上の配列と相同な配列に目的遺伝子をプロモーターとともに挿入し、このＤＮＡ断片をエレクトロポレーションによって細胞内に導入して相同組換えを起こさせることにより実施できる。ゲノムへの導入の際には目的遺伝子と選択マーカー遺伝子を連結したＤＮＡ断片を用いると容易に相同組換えが起こった株を選抜することができる。また、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を連結した遺伝子をゲノム上に上記の方法で相同組換えによって挿入し、その後、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を置き換える形で目的遺伝子を、相同組換えを利用して導入することもできる。
【００３５】
得られた遺伝子導入細胞を培養する培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、遺伝子導入細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３６】
炭素源としては、例えば、グルコースなどの糖類、グリセリンなどのポリオール類、エタノールなどのアルコール類、又はピルビン酸、コハク酸もしくはクエン酸等の有機酸類を使用することができる。また、窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、メチルアミンなどのアルキルアミン類、又はアンモニアもしくはその塩などを使用することができる。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン、消泡剤なども必要に応じて使用してもよい。また、導入したプロモーターに応じた遺伝子発現誘導剤を必要に応じて培地に添加してもよい。
【００３７】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは１０〜３７℃、特に好ましくは１５〜３７℃で行う。培養期間中、培地のｐＨはタンパク質複合体の活性が損なわれない範囲で適宜変更することができるが、好ましくはｐＨ３〜９程度の範囲である。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３８】
培養物またはその画分（培養液、培養上清、培養細胞、細胞の破砕物などが包含される）からの目的タンパク質の精製は、イオン交換樹脂法、沈澱法、晶析法、再結晶法、濃縮法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。タンパク質複合体が細胞内に生産される場合には、通常知られている方法、例えば、細胞を機械的方法、リゾチームなどを用いた酵素的方法又は界面活性剤などを用いた化学的処理によって破壊することが好ましい。また、タンパク質複合体が細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体を除去する。
【００３９】
本発明者らは、培養物からのタンパク質複合体の精製工程において、培養物にカルシウムイオンを加えることにより、より具体的には、カルシウムイオンを加えて固液分離し、液体画分からタンパク質を回収することにより、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体又はＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体を効率的かつ安定に取得できることを見出した。
【００４０】
カルシウムイオンは、例えばカルシウム塩として加えることができる。カルシウム塩としては、特に制限されないが、水溶性カルシウム塩が好ましく用いられる。水溶性カルシウム塩としては、塩化カルシウム、硝酸カルシウムなどの無機酸カルシウム、蟻酸カルシウム、酢酸カルシウム、プロピオン酸カルシウムなどの有機酸カルシウムが挙げられる。精製時に共存させるカルシウムイオンの濃度は、適宜調整されるが、例えば５〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭ、より好ましくは２０〜５０ｍＭ、さらに好ましくは３０〜４０ｍＭとなるように調整することが好ましい。
【００４１】
Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体の製造において、Ｔ１Ｒ１細胞外ドメインとＴ１Ｒ３細胞外ドメインを、これらをコードする遺伝子を導入した細胞で発現させる場合、Ｔ１Ｒ１細胞外ドメインあるいはＴ１Ｒ３細胞外ドメインのいずれかが過剰に発現し、複合体を形成しないＴ１Ｒ１細胞外ドメインあるいはＴ１Ｒ３細胞外ドメインがＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメインの形成及び精製を阻害する場合がある。カルシウムイオンを共存させて過剰なＴ１Ｒ１細胞外ドメインあるいはＴ１Ｒ３細胞外ドメインを沈殿させて取り除くことにより、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体を効果的に精製し回収することができる。また、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体は、不安定であり、機能を保持した状態を維持することが困難であるが、カルシウムイオンを共存させることにより、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体を安定に維持することができる。Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体の製造においても、Ｔ１Ｒ２細胞外ドメインあるいはＴ１Ｒ３細胞外ドメインのいずれかが過剰に発現し、複合体を形成しないＴ１Ｒ２細胞外ドメインあるいはＴ１Ｒ３細胞外ドメインがＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメインの形成及び精製を阻害する場合があるが、カルシウムイオンを共存させて過剰なＴ１Ｒ２細胞外ドメインあるいはＴ１Ｒ３細胞外ドメインを沈殿させて取り除くことにより、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体を効果的に精製し回収することができる。また同様にカルシウムイオンを共存させることにより、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体を安定に維持することができる。
【００４２】
また、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体の製造において、精製時に、うま味受容体であるＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３ヘテロ二量体に結合することが知られている物質（公知のリガンド）、例えば、公知のうま味物質を共存させることにより、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体をさらに安定化し、効率的に精製することができる。同様に、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体の製造において、精製時に、甘味受容体であるＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロ二量体に結合することが知られている物質（公知のリガンド）、例えば、公知の甘味物質を共存させることにより、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体をさらに安定化し、効率的に精製することができる。ヒトの味覚受容体に対する公知のうま味物質としては、例えば、グルタミン酸及びアスパラギン酸などのアミノ酸、イノシン酸、グアニル酸及びキサンチル酸などのヌクレオチド、コハク酸などの有機酸、並びにそれらの塩類が挙げられる。ヒトの味覚受容体に対する公知の甘味物質としては、例えば、グルコース、スクロース、フルクトース、アスパルテーム、アセスルファムカリウム、エリトリトール、ステビア、スクラロースなどが挙げられる。
【００４３】
精製したＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体を、味物質及び味阻害物質の評価に使用する場合は、使用の直前に、上記リガンドは除去することが好ましい。リガンドは、通常低分子の物質であることから、限外濾過などの公知の方法で容易に除去することができる。
【００４４】
一実施形態において、本発明の細胞外ドメイン複合体は、以下のように精製し、回収することができる。培養液を遠心し、上清を回収し、低温室で冷やし（０〜１０℃）、ｐＨ６．５〜８．５に調整し、公知のリガンド及び水溶性カルシウム塩を加えて撹拌し、静置することにより析出物を沈殿させる。さらに遠心し、上清をろ過し、ろ液を、公知のリガンド及び水溶性カルシウム塩を含む緩衝液で平衡化させたアフィニティカラムに流し、目的タンパク質、すなわち細胞外ドメイン複合体を結合させる。カラムを洗浄後、目的タンパク質を溶出する。目的タンパク質の溶出は、ＵＶ２８０ｎｍの吸収により確認できる。
【００４５】
一実施形態において、本発明の味物質又は味阻害物質を評価する方法は、
ａ）カルシウムイオンの存在下、上記のようにして得られたＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体（Ｔ１Ｒ１の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含むタンパク質複合体）と被検物質とを接触させる工程、及び
ｂ）被検物質のＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体への結合を検出する工程、
を含む。そして、被検物質のＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体への結合が確認された場合は、当該被検物質をうま味物質又はうま味阻害物質と判定できる。判定においては、うま味物質を含まないコントロール試料や、公知のうま味物質を含む試料と比較することが好ましい。
【００４６】
別の実施形態において、本発明の味物質又は味阻害物質を評価する方法は、
ａ）カルシウムイオンの存在下、上記のようにして得られたＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体（Ｔ１Ｒ２の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含むタンパク質複合体）と被検物質とを接触させる工程、及び
ｂ）被検物質のＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体への結合を検出する工程、
を含む。そして、被検物質のＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体への結合が確認された場合は、当該被検物質を甘味物質又は甘味阻害物質と判定できる。判定においては、甘味物質を含まないコントロール試料や、公知の甘味物質を含む試料と比較することが好ましい。
【００４７】
被検物質の結合は、例えば、分光学的特性（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）、流体力学的（例えば、形状）特性、又は溶解特性の変化を用いて検出することができる。例えば、等温滴定カロリメトリーなどが挙げられる。
【００４８】
生体内では、味覚物質が味覚受容体に結合し、化学的刺激の電気的シグナルへの変換が開始されることが知られている。活性化されたＧタンパク質が次に標的酵素、チャンネル及び他のエフェクタータンパク質の特性を変化させる。本発明者らは、上述のように取得されたＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体が、カルシウムイオンの存在下において、それぞれうま味受容体及び甘味受容体のリガンド結合機能を維持しており、細胞を用いることなく、タンパク質レベルで被検物質の結合の有無や程度を評価できることを見出した。従来、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体は、リガンド結合機能を維持した状態で安定に保持することができないため、味物質や味阻害物質の結合の有無や程度を評価することができなかったが、本発明者らは、カルシウムイオンを共存させることにより、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体への味物質又は阻害物質の結合を、再現性よく正確に評価できることを見出した。
【００４９】
さらに、本発明者らは、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体は、甘味物質が結合すると構造変化が生じることを見出した。すなわち、味覚受容体においては、細胞外ドメインの構造変化により、細胞外情報から細胞内情報への変換が開始されると考えられる。一方、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体に結合するが、それ自身はＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体の構造変化をもたらさず、さらに既知のうま味物質を共存させた場合にも構造変化をもたらさない被検物質は、うま味阻害物質と評価でき、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体に結合するが、それ自身はＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体の構造変化をもたらさず、既知の甘味物質を共存させた場合にも構造変化をもたらさない被検物質は、甘味阻害物質と評価できる。
【００５０】
味物質は、換言すれば、味覚受容体の活性化物質であり、例えば、味覚受容体に結合し、刺激し、活性化し、活性化を増強し、味覚伝達を増感又はアップレギュレートする化合物、例えば、作動物質である。味阻害物質は、例えば、味覚受容体に結合し、刺激を部分的又は完全に阻害し、活性化を減少、妨害、遅延させ、味覚伝達を不活性化又はダウンレギュレートする化合物、例えば、拮抗物質である。
【００５１】
したがって、本発明においては、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体又はＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体への被検物質の結合の検出は、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体又はＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体の構造変化を検出することにより実施することが好ましい。
【００５２】
本発明の味物質の評価方法によれば、被検物質のタンパク質複合体への結合に際して生じる構造変化の有無だけでなく程度を測定することができる。構造変化の程度を測定することによって被検物質が示す味覚の強さを定量的に評価することができる。より低濃度でより大きな構造変化を生じる被検物質は強い味覚を与え、一方、より高濃度でより小さな構造変化を生じる被検物質は弱い味覚を与えると評価される。
【００５３】
Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体及びＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体の構造変化は、ＦＲＥＴ解析により検出することが好ましい。ＦＲＥＴ（Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：蛍光共鳴エネルギー転移）は、２種類の蛍光物質ペア（ドナーとアクセプター）が１０ｎｍ以下の距離に接近したときにおこる現象で、ドナーが受けた励起エネルギーの一部を、蛍光を介在することなくアクセプターに受け渡す現象をいう。
【００５４】
本発明者らは、Ｔ１Ｒ２細胞外ドメインとＴ１Ｒ３細胞外ドメインをそれぞれドナー又はアクセプターで標識すると、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体の構造変化が生じたときにＦＲＥＴが発生し、被検物質の結合による構造変化を検出できることを見出した。Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体についても同様である。
【００５５】
ドナーの励起波長の光を照射した場合、ドナーとアクセプターが近距離にあるときはＦＲＥＴが起こり、ドナーの蛍光は減少してアクセプターの蛍光が増大するが、両者が離れるとＦＲＥＴが起こらなくなり、ドナーの蛍光が増大してアクセプターの蛍光が減少する。ＦＲＥＴにおけるドナーとは、励起光を吸収しそのエネルギーの一部分は蛍光として発光し、他の一部分は近接するアクセプターに移動する蛍光物質をいい、ＦＲＥＴにおけるアクセプターとは、直接励起光を受けなくても、ドナーからのエネルギーを吸収し蛍光を発する蛍光物質をいう。
【００５６】
蛍光強度を計測してＦＲＥＴを検出する方法では、通常、ドナー蛍光強度とアクセプター蛍光強度との蛍光強度比がＦＲＥＴの指標として用いられる。このとき、アクセプターを検出する蛍光チャネルでは、ＦＲＥＴ由来のアクセプター蛍光のほかに、ドナー蛍光の漏れ込みと、レーザにより直接励起されたアクセプター蛍光が計測される。ＦＲＥＴ解析は、蛍光分光光度計を用いて計測することができる。
【００５７】
本発明においては、蛍光物質として、好ましくは蛍光タンパク質を用いるが、蛍光強度を増強させることなどを目的として遺伝子工学的手法により改変された蛍光タンパク質であってもよい。蛍光タンパク質は、特に限定されないが、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＳＢＰ２、ＥＢＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＴａｇＢＦＰ、ｍＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＰ１、ＭｉＣｙ（Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ  Ｃｙａｎ）、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＣＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＡＧ  （Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ）、ｍＡＧ１、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ（Ｅｍｅｒａｌｄ）、ＥＧＦＰ、ＧＰ２、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＨｙＰｅｒなどの青色蛍光タンパク質；ＴａｇＹＦＰ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ＥＹＦＰ、ＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ｔｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａなどの黄色蛍光タンパク質；ｍＫＯ１、ＫＯ（Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ）、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＫＯ２などの橙色蛍光タンパク質；Ｋｅｉｍａ５７０、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＡｐｐｌｅ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＫｅｉｍａＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ２、ＴａｇＦＰ６３５、ｍＰｌｕｍ、ｅｇＦＰ６５０、Ｎｅｐｔｕｎｅ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ｅｇＦＰ６７０などの赤色蛍光タンパク質等が挙げられる。
【００５８】
ＦＲＥＴペアとして好ましい蛍光タンパク質の組合せとしては、ドナーから発せられる蛍光のスペクトルがアクセプターの励起スペクトルと重なっている組合せであれば特に限定されないが、例えば、ＣＦＰとＹＦＰ、ＡＧとＫＯ、ＣｅｒｕｌｅａｎとＶｅｎｕｓ等の組合せが挙げられる（左側がドナー、右側がアクセプターとなる）。２つの細胞外ドメインのいずれをドナーまたはアクセプターで標識するかは適宜決定することができる。例えば、Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体の場合は、Ｔ１Ｒ１細胞外ドメインをドナーで標識し、Ｔ１Ｒ３細胞外ドメインをアクセプターで標識してもよく、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞外ドメイン複合体の場合は、Ｔ１Ｒ２細胞外ドメインをドナーで標識し、Ｔ１Ｒ３細胞外ドメインをアクセプターで標識してもよい。
【００５９】
Ｔ１Ｒ１細胞外ドメイン、Ｔ１Ｒ２細胞外ドメイン、及びＴ１Ｒ３細胞外ドメインを標識する方法は、特に制限されないが、好ましくは、各細胞外ドメイン及び蛍光タンパク質のＤＮＡフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、この発現ベクターで宿主に遺伝子導入し、得られた遺伝子導入細胞を培養し、その培養物から目的とする融合タンパク質を採取することにより行うことができる。
【００６０】
味物質又は味阻害物質の候補物質として試験される被検物質は、小化合物であってもよいし、タンパク質、核酸又は脂質のような生物学的物質であってもよい。水溶液に溶ける化合物が試験されることが非常に多いが、本質的にあらゆる化合物を本発明の評価方法における可能性のある被検物質として用いることができる。アッセイ段階を自動化し、化合物を都合のよい源から供給することにより、化学ライブラリーをスクリーニングするためのアッセイを設計することもできる。
【００６１】
本発明はまた、カルシウムイオンと、Ｔ１Ｒ１の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含むタンパク質複合体とを水性溶媒中に含む、うま味物質又はうま味阻害物質を評価するための試薬に関する。さらに本発明は、カルシウムイオンと、Ｔ１Ｒ２の細胞外ドメイン及びＴ１Ｒ３の細胞外ドメインを含むタンパク質複合体とを水性溶媒中に含む、甘味物質又は甘味阻害物質を評価するための試薬に関する。当該試薬は、上述の味物質又は味阻害物質の評価方法に好適に使用できる。水性溶媒は、特に制限されないが、好ましくは水、特にイオン交換水を用いる。水とその他の溶媒、例えばアルコールとの混合物を用いてもよい。試薬に含まれるタンパク質複合体において、各細胞外ドメインは蛍光標識されていてもよい。
【００６２】
当該試薬において、水性溶媒中のカルシウムイオン濃度は、例えば０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．２〜２０ｍＭ、より好ましくは０．５〜５ｍＭ、さらに好ましくは１〜２ｍＭである。本発明の評価方法におけるタンパク質複合体を用いる操作に際しても同様のカルシウム濃度が好適に使用される。
【００６３】
上記試薬は、味物質又は味阻害物質の評価に使用するための説明書、味物質（特に、うま味物質又は甘味物質）を含まないコントロール試料、及び／又は公知の味物質（特に、うま味物質又は甘味物質）と一緒に、キットとして提供してもよい。
【００６４】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されない。
【実施例】
【００６５】
Ｔ１Ｒ味認識領域への味物質結合を解析するため、ヘテロ二量体試料のそれぞれのプロトマーを蛍光ラベルし、ＦＲＥＴ解析を行った。それぞれのプロトマーを異なる蛍光タンパク質融合体として調製し、味物質結合に伴う蛍光変化を観測した。
【００６６】
（タンパク質の発現）
結晶学的解析に使用された代謝型グルタミン酸受容体１細胞外ドメインのアミノ酸配列（Ｋｕｎｉｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０７：９７１−９７７（２０００）；Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：２６６０−２６６５（２００２））に対してＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２２）：４６７３−８０）で作製した配列アライメントを用いて、メダカのＴ１Ｒタンパク質の細胞外ドメインを、Ｔ１Ｒ２ａについては全長アミノ酸配列（配列番号１）における１−４７４番アミノ酸として同定し、Ｔ１Ｒ３ａについては全長アミノ酸配列（配列番号２）における１−４９１番アミノ酸として同定した。
【００６７】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）解析のための発現ベクターとして、ｐＡｃ−ｍｆＴ１ｒ２ａＬ−Ｃｅ及びｐＡｃ−ｍｆＴ１ｒ３ａＬ−Ｖｅを作製するため、Ｔ１ｒ２ａ−ＬＢＤをコードする遺伝子とそれに続くＣｅｒｕｌｅａｎ（Ｃｅ：ドナーとしての青色蛍光タンパク質変異体）及びＦＬＡＧ−ｔａｇ、又はＴ１ｒ３−ＬＢＤとそれに続くＶｅｎｕｓ（Ｖｅ：アクセプターとしての黄色蛍光タンパク質変異体）及びＦＬＡＧ−ｔａｇを、ｐＡｃ５．１／Ｖ５−ＨｉｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の、ＥｃｏＲＩ及びＰｍｅＩサイトの間又はＫｐｎＩ及びＰｍｅＩサイトの間に、それぞれサブクローニングした（Ｋｏｕｓｈｉｋ ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ９１，Ｌ９９−Ｌ１０１，２００６）。ｐＡｃ−ｍｆＴ１ｒ２ａＬ−Ｃｅ及びｐＡｃ−ｍｆＴ１ｒ３Ｌ−Ｖｅを、１０％ＦＢＳを添加したシュナイダー昆虫培地中、２７℃で、リン酸カルシウム法を用いたトランスフェクションにより、Ｓ２細胞にトランスフェクトし、タンパク質を一過性発現させた。ｍｆＴ１ｒ２ａＬ−Ｃｅのアミノ酸配列を配列番号３に、ｍｆＴ１ｒ３Ｌ−Ｖｅのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００６８】
（タンパク質複合体の精製）
細胞培養により得られた培養液を遠心し（５００×ｇ、２０分）、上清を回収し（２０００×ｇ、２０分）、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を、終濃度０．５ｍＭとなるように室温で添加した（培養液１Ｌに対し、ＰＭＳＦを１ｍｌのＤＭＳＯに溶かして加えた）。
【００６９】
低温室で冷やし（４℃）、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）を加えて、約ｐＨ７．８に調整した。リガンドとしてのアラニン（終濃度０．１Ｍ）、ＣａＣｌ２（４０ｍＭ）及びＥＤＴＡ（１ｍＭ）を加え、よく攪拌した。カルシウムを加えると白い沈殿が析出した。よく攪拌した後、３０分静置した。
【００７０】
ｐＨが７．８〜８．０の範囲であることを確認し、遠心し（４０００×ｇ、６０分）、上清を０．２μｍフィルター（Ｐａｌｌ  Ｖａｃｕ  Ｃａｐ  ９０ＰＦ）でろ過した。
【００７１】
ろ液を、緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．１Ｍ  アラニン、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２）で平衡化させたＦＬＡＧ樹脂（ろ液１Ｌに対し、４ｍｌ使用）を加えたカラムに、ペリスタポンプを使って流し（ろ液が１Ｌのときは３〜４ｍｌ／分、３〜５Ｌのときは１５ｍｌ／分程度）、終夜循環させて、樹脂にタンパク質を結合させた。
【００７２】
緩衝液を使って、樹脂を洗浄した。続いて、ＦＬＡＧペプチドを１００μｇ／ｍｌになるように緩衝液に溶かして、タンパク質を溶出した。ＦＬＡＧペプチド溶液（５ＣＶ）は、ピペットで何回かにわけてカラムに流した。流速は１ｍｌ／分以下になるように調整した。
【００７３】
溶出液を１ＣＶずつチューブにとり、ナノドロップでＵＶ２８０ｎｍの吸収を確認した。５ｍｇ／ｍｌ程度まで濃縮し、一晩かけて１０ｍＭ  アラニン、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０で透析を行った。ｐＨは４℃で合わせた。
【００７４】
（サンプル調製）
透析物を濃縮し（３ｍｇ／ｍｌ程度）、超遠心後（１５４０００×ｇ、３０分）に使用した。これを、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ８．０）にタンパク質濃度が約３μｇ／ｍｌの濃度となるように溶解し、その後、低温室で５分振とうしてから、チューブに分注した。チューブを上下に振って、よく混合し、タンパク質溶液を得た。
【００７５】
リガンド溶液として、それぞれ甘味物質として知られているアラニンの１Ｍ溶液、グルタミンの１００ｍＭ溶液を調製した。リガンド溶液の調製方法は、以下の通りである。まず、緩衝液Ａにリガンドを溶かし、４℃に冷却し、ｐＨ８．０に調整したあと、メスアップし、フィルターでろ過した。ろ液から、例えばアラニンの場合１００ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭの溶液を調製し、５μＭから１００ｍＭの間になるようにリガンド溶液を調製した。具体的には目的の２倍濃度のアラニン溶液又はグルタミン溶液を５００μｌ調製し、タンパク質溶液を同量ずつ分注し、最終的に１ｍｌとした。
【００７６】
このようにして、リガンド濃度が等しいサンプルを３個以上調製した。調製後、低温室で一晩放置した。
【００７７】
（測定方法）
セルホルダー及びインキュベータを４℃になるように設定した。Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ  ４のランプは測定３０分前に点灯させた。ＬＡＭＰ、ＷＡＴＥＲファイルを使って、波長のずれがないか確認した。測定は、Ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｉｎｔで実施した。
【００７８】
測定条件は以下のとおりである。
測定装置：ＦｌｕｏｒｏＭａｘ（ＨＯＲＩＢＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４３３ｎｍ、Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：４７５ｎｍ
Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４３３ｎｍ、Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：５２６ｎｍ
Ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｒｉａｌ  ５
Ｔａｒｇｅｔ  ｓｔｄ．ｅｒｒｏｒ  ２％
Ｓｌｉｔ  Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４ｎｍ
Ｓｌｉｔ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：５ｎｍ
【００７９】
（滴定曲線の作成）
測定値は、二回測定した値の平均値とした。緩衝液のみも同様に測定し、バックグラウンドとして差し引いた。５２６ｎｍの蛍光強度を４７５ｎｍの蛍光強度で割り（ＦＲＥＴ  ｉｎｄｅｘ）、リガンド濃度を横軸、ＦＲＥＴ  ｉｎｄｅｘを縦軸として散布図を描いた。得られた滴定曲線を図１に示す。
【００８０】
ＥＣ５０は、ｍ４＋ｍ１＊（ｍ０／ｍ２）＾ｍ３／（１＋（ｍ０／ｍ２）＾ｍ３の式（ヒルの式）を用いて、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈによりフィッティングを行うことにより求めた。その結果、アラニンのＥＣ５０は、１６８±１９μＭであり、グルタミンのＥＣ５０は、１２．７±２．７μＭであった。すなわち、アラニンに比較してグルタミンが強い甘味を与えることが示された。
【００８１】
以上から、実施例１で得られた細胞外ドメインのヘテロ二量体は、味物質の結合によりＦＲＥＴシグナルが増大することが確認された。また、被検物質の濃度とＦＲＥＴシグナル強度に基づいて味物質が示す味覚の程度を定量的に評価できることが確認された。このＦＲＥＴシグナル変化は、蛍光ラベルしていないＴ１Ｒ細胞外ドメインへの味物質結合（等温滴定カロリメトリーで測定）と同濃度域で見られたことから、Ｔ１Ｒの細胞外ドメインのヘテロ二量体が味物質結合に伴い構造変化をしていることが明らかになった。また、カロリメトリーを含めた他の生体分子間相互作用解析の手法では原理上測定不可能な弱い親和性を持つ味物質についても、親和性を解析し結合定数を決定することができた。
【００８２】
なお、蛍光ラベルしていないＴ１Ｒ細胞外ドメインへの味物質結合は、等温滴定カロリメトリーを用いて以下のように測定した。
【００８３】
Ｔ１ｒ２ａ−ＬＢＤとＴ１ｒ３−ＬＢＤのヘテロ二量体試料は、Ｔ１ｒ２ａ−ＬＢＤをコードする遺伝子とそれに続くＦａｃｔｏｒ  Ｘａ認識部位、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、又はＴ１ｒ３−ＬＢＤとそれに続くＦａｃｔｏｒ  Ｘａ認識部位、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｈｉｓ−ｔａｇを、ｐＡｃ５．１／Ｖ５−ＨｉｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の、ＥｃｏＲＩ及びＰｍｅＩサイトの間又はＫｐｎＩ及びＰｍｅＩサイトの間に、それぞれサブクローニングし、同様にリン酸カルシウム法を用いたトランスフェクションにより、Ｓ２細胞にトランスフェクトしたのち、安定発現株を選抜した。この細胞培養によって得られた培養液から、上記と同様にタンパク質を精製し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２で透析したのち、ｉＴＣ２００  （ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて等温滴定カロリメトリーにより味物質結合を解析した。
【図１】
2015105826.tif 000003
【配列表】
2015105826000001.app