(57)【要約】      （修正有）【課題】糖尿病および肥満などの代謝性障害の治療、予防、および低減に関する医薬組成物の提供。【解決手段】哺乳動物の代謝性障害を治療する、代謝性障害の症状を緩和する、代謝性障害の進行を阻害する、または代謝性障害を予防するための医薬組成物であって、少なくとも１つの環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）を含む治療的有効量を含み、ここで該環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常化されたミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する、医薬組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の代謝性障害を治療する、代謝性障害の症状を緩和する、代謝性障害の進行を阻害する、または代謝性障害を予防する方法であって、少なくとも１つの環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）を含む治療的有効量の医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含み、ここで環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常化されたミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する、方法。
【請求項２】
環境影響因子が哺乳動物の正常細胞において、ミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを実質的に誘発しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物がヒト（または非ヒト哺乳動物）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
代謝性障害がコエンザイムＱ１０またはその代謝産物もしくはその類似体による治療に応答性または感受性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
代謝性障害が、代謝性疾患の一因となるか、または原因となって代謝性疾患を引き起こす改変された遺伝子調節および／またはタンパク質−タンパク質相互作用を引き起こすミトコンドリア酸化的リン酸化機能の調節不全によって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
環境影響因子が：
（ａ）ベンゾキノンまたはベンゾキノン環の生合成を容易にする少なくとも１つの分子、ならびに
（ｂ）イソプレノイドユニットの合成および／またはイソプレノイドユニットのベンゾキノン環への結合を容易にする少なくとも１つの分子
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ベンゾキノン環の生合成を容易にする前記少なくとも１つの分子が：Ｌ−フェニルアラニン、ＤＬ−フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、ＤＬ−チロシン、Ｄ−チロシン、４−ヒドロキシ−フェニルピルベート、３−メトキシ−４−ヒドロキシマンデレート（バニリンマンデレートまたはＶＭＡ）、バニリン酸、ピリドキシン、またはパンテノールを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
イソプレノイドユニットの合成および／またはイソプレノイドユニットのベンゾキノン環への結合を容易にする前記少なくとも１つの分子が：酢酸フェニルフェニルアセテート、４−ヒドロキシベンゾエート、メバロン酸、アセチルグリシン、アセチルＣｏＡ、またはファルネシルを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
環境影響因子が：
（ａ）Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、および４−ヒドロキシフェニルピルベートの１つ以上；ならびに
（ｂ）４−ヒドロキシベンゾエート、フェニルアセテート、およびベンゾキノンの１つ以上；を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
環境影響因子が：
（ａ）Ｂｃｌ−２発現を阻害するおよび／もしくはカスパーゼ−３発現を増進する；ならびに／または
（ｂ）細胞増殖を阻害する、
請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
環境影響因子が多次元細胞内分子（ＭＩＭ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＭＩＭが：アルファケトグルタレート／アルファケトグルタル酸、マレート／リンゴ酸、スクシネート／コハク酸、グルコサミン、アデノシン、アデノシン二リン酸、グルクロニド／グルクロン酸、ニコチン酸、ニコチン酸ジヌクレオチド、アラニン／フェニルアラニン、ピリドキシン、チアミン、またはフラビンアデニンジヌクレオチドから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
環境影響因子がエピメタボリックシフター（エピシフター）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
エピメタボリックシフターが：トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、スクシニルＣｏＡシンターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、またはリボフラビンから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
エピメタボリックシフターがコエンザイムＱ１０である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
治療されているヒトの組織における環境影響因子の濃度が、健常または正常状態を表すヒト組織の対照標準の環境影響因子の濃度とは異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ヒトに投与された環境影響因子の形態がヒトにおける全身循環中で見出される優勢形態とは異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ヒトの代謝性障害を治療するのに十分な量が、ミトコンドリア酸化的リン酸化を上方調節または下方調節する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ヒトの代謝性障害を治療するのに十分な量が、グルコースの嫌気的使用および／またはラクテート生合成を調節する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
治療がｅｎｖ影響因子とＨＮＦ４アルファとの相互作用を介してなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
治療がｅｎｖ影響因子とトランスアルドラーゼとの相互作用を介してなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
代謝性障害が糖尿病、肥満、前糖尿病、メタボリックシンドロームおよび代謝性障害のいずれかの主要な要素からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
代謝性障害が糖尿病であり、ｅｎｖ影響因子がベータ細胞機能、インスリン代謝、および／またはグルカゴン沈着に影響を及ぼす、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
代謝性障害が肥満であり、ｅｎｖ影響因子がミトコンドリアにおけるベータ細胞酸化、脂肪細胞サイズの低下、および／またはコルチゾールレベルの制御に影響を及ぼす、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
代謝性障害が心血管疾患であり、ｅｎｖ影響因子が中膜における平滑筋細胞増殖の低下、脂質過酸化、トロンボキサン−ａｘ２合成、ＴＮＦａ、ＩＬ−１Ｂ、血小板凝集、一酸化窒素（ＮＯ）産生の低下、プラーク沈着および／または正常化した血糖制御に影響を及ぼす、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記代謝性障害の主要な要素が空腹時血糖異常、耐糖能異常、腹囲増加、内臓脂肪量増加、空腹時血漿グルコースの増加、空腹時血漿トリグリセリドの増加、空腹時高密度リポタンパク質レベルの低下、血圧の上昇、インスリン抵抗性、高インスリン血症、心血管疾患、動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、脳血管疾患、うっ血性心不全、血漿ノルエピネフリンの上昇、心血管関連炎症因子の上昇、血管内皮機能障害を増強する血漿因子の上昇、高リポタンパク血症、動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症、過食症、高血糖症、高脂血症、および高血圧症（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）または高血圧症（ｈｉｇｈ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、食後血漿トリグリセリドレベルまたは遊離脂肪酸レベルの上昇、細胞酸化ストレスまたはその血漿指標の上昇、循環過凝固状態の増加、肝臓脂肪症、肝臓脂肪症（ｈｅｔａｐｔｉｃ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、腎不全および腎機能不全を含む腎疾患からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
追加の治療剤が真性糖尿病治療剤、糖尿病合併症治療剤、抗高脂血剤、降圧剤または抗高血圧剤、抗肥満剤、利尿薬、化学治療剤、免疫治療剤および免疫抑制剤からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
代謝性障害の治療を必要する哺乳動物の疾患細胞においてミトコンドリア酸化的リン酸化を選択的に増強する方法であって、少なくとも１つのｅｎｖ影響因子を含む治療的有効量の医薬組成物を前記哺乳動物に投与して、これにより哺乳動物の前記疾患細胞にてミトコンドリア酸化的リン酸化を選択的に増強することを含む、方法。
【請求項３０】
正の倍率変化を有する表２〜４および表６〜２８および表６３〜６８に挙げられた分子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の発現を上方調節すること；ならびに／または負の倍率変化を有する表２〜４および表６〜２８および表６３〜６８に挙げられた分子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の発現を下方調節することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＨＮＦ４−アルファ、Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ＢＮＩＰ−２、Ｂｃｌ−２、Ｂｉｒｃ６、Ｂｃｌ−２−Ｌ１１、ＸＩＡＰ、２０  ＢＲＡＦ、Ｂａｘ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｂｍｆ、ＰＵＭＡ、ｃＭｙｃ、トランスアルドラーゼ１、ＣＯＱ１、ＣＯＱ３、ＣＯＱ６、プレニルトランスフェラーゼ、４−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子２、一酸化窒素シンターゼ２Ａ、スーパーオキシドディスムターゼ２、ＶＤＡＣ、Ｂａｘチャネル、ＡＮＴ、シトクロムｃ、複合体Ｉ、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩ、複合体ＩＶ、Ｆｏｘｏ３ａ、ＤＪ−１、ＩＤＨ−１、Ｃｐｔ１ＣおよびカムキナーゼＩＩからなる群より選択される１つ以上の遺伝子の発現を調節することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
代謝性障害が糖尿病、肥満、前糖尿病、メタボリックシンドロームおよび代謝性障害のいずれかの主要な要素からなる群より選択される、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記代謝性障害の主要な要素が空腹時血糖異常、耐糖能異常、腹囲増加、内臓脂肪量増加、空腹時血漿グルコースの増加、空腹時血漿トリグリセリドの増加、空腹時高密度リポタンパク質レベルの低下、血圧の上昇、インスリン抵抗性、高インスリン血症、心血管疾患、動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、脳血管疾患、うっ血性心不全、血漿ノルエピネフリンの上昇、心血管関連炎症因子の上昇、血管内皮機能障害を増強する血漿因子の上昇、高リポタンパク血症、動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症、過食症、高血糖症、高脂血症、および高血圧症または高血圧症、食後血漿トリグリセリドレベルまたは遊離脂肪酸レベルの上昇、細胞酸化ストレスまたはその血漿指標の上昇、循環過凝固状態の増加、肝臓脂肪症、肝臓脂肪症、腎不全および腎機能不全を含む腎疾患からなる群より選択される、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
追加の治療剤が真性糖尿病治療剤、糖尿病合併症治療剤、抗高脂血剤、降圧剤または抗高血圧剤、抗肥満剤、利尿薬、化学治療剤、免疫治療剤および免疫抑制剤からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
代謝性障害を治療するのに有効である薬剤を同定する方法であって：
（１）環境影響因子を選択することと；
（２）細胞の代謝状態をシフトさせることができる環境影響因子を同定することと；
（３）環境影響因子が代謝性障害を治療するのに有効か否かを判定して；
これにより代謝性障害を治療するのに有効である薬剤を同定することとを含む、方法。
【請求項３７】
環境影響因子がｍＲＮＡ発現、タンパク質発現、脂質または代謝産物濃度、生体エネルギー分子のレベル、細胞エネルギー特性、ミトコンドリア機能およびミトコンドリア数のいずれか１つ以上の変化を測定することによって、細胞の代謝状態をシフトさせることができるとして同定される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
代謝性障害の治療に有効な環境影響因子が患者のグルコースレベルまたは脂質レベルを低下させることができる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法によって同定された薬剤を含む組成物。
【請求項４０】
請求項３９に記載の組成物を含むキット。
【請求項４１】
患者のグルコースレベルを低下させる方法であって、請求項３９に記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む、方法。
【請求項４２】
患者の脂質レベルを低下させる方法であって、請求項３９に記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む、方法。
【請求項４３】
哺乳動物のコエンザイムＱ１０応答性障害を治療する、コエンザイムＱ１０応答性障害の症状を緩和する、コエンザイムＱ１０応答性障害の進行を阻害する、またはコエンザイムＱ１０応答性障害を予防する方法であって、少なくとも１つの環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）を含む治療的有効量の医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含み、環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常な生理学的条件下にて哺乳動物の正常細胞中で観察された解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルへの細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する、方法。
【請求項４４】
コエンザイムＱ１０応答性障害が代謝性障害である、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅｐｉｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｈｉｆｔｅｒ（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ｑ１０）”という名称の２００９年５月１１日に出願された米国仮出願番号６１／１７７，２４１（代理人整理番号：１１７７３２−００６０１）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｐｉｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｈｉｆｔｅｒｓ，Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｒｓ”という名称の２００９年５月１１日に出願された米国仮出願番号６１／１７７，２４３（代理人整理番号：１１７７３２−００７０１）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｐｉｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｈｉｆｔｅｒｓ，Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｒｓ”という名称の２００９年５月１１日に出願された米国仮出願番号６１／１７７，２４４（代理人整理番号：１１７７３２−００８０１）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｐｉｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｈｉｆｔｅｒｓ，Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｒｓ”という名称の２００９年５月１１日に出願された米国仮出願番号６１／１７７，２４５（代理人整理番号：１１７７３２−００９０１）、および“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｐｉｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｈｉｆｔｅｒｓ，Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｒｓ”という名称の２００９年５月１１日に出願された米国仮出願番号６１／１７７，２４６（代理人整理番号：１１７７３２−０１００１）の優先権を主張し、上述の各出願の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられている。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、糖尿病および肥満などの代謝性障害の治療、予防、および低減に関するものである。
【０００３】
食事後に血糖のレベルが上昇するにつれて、インスリンが分泌され、エネルギー源として血液からグルコースを活動的に取り込むために末梢組織（骨格筋および脂肪）の細胞を刺激する。調節異常となったインスリンの分泌および作用の結果としてのグルコース恒常性の損失は、典型的には、糖尿病などの代謝性障害を生じ、これは、肥満によって同時に誘発されるか、または肥満によってさらに悪化される可能性がある。これらの状態はしばしば致死的であるので、血流からの適切なグルコースクリアランスを回復させるためのストラテジーが必要とされている。
【０００４】
糖尿病は膵臓に対する広範な損傷を引き起こすいかなる状態（例えば、膵炎、腫瘍、コルチコステロイドまたはペンタミジンなどの特定の薬物の投与、鉄過剰（例えば、血色素症）、後天性または遺伝性内分泌障害、および外科的切除）に対して二次的に発生する可能性があるが、典型的には、糖尿病の最も一般的な型はインスリンシグナル伝達系の一次的障害から発生する。２つの主要な型の糖尿病、すわわち、１型糖尿病（インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）としてもまた知られる）および２型糖尿病（インスリン非依存性または非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）としてもまた知られる）が存在しており、これらは、それらの異なる病原メカニズムにも関わらず、共通の長期にわたる合併症を共有している。
【０００５】
一次性糖尿病のすべての症例の約１０％に達する１型糖尿病は、膵臓のインスリン産生β細胞の広範な破壊によって特徴付けられる器官特異的自己免疫疾患である。結果としてのインスリン産生の減少は、不可避的にグルコース代謝の調節不全をもたらす。インスリンの投与は、この状態に罹患している患者に顕著な利益を提供するが、インスリンの短い血清半減期は、正常血糖の維持に対する主要な障害である。代替治療は膵島移植であるが、このストラテジーに付随する成功は限られいる。
【０００６】
より大きな割合の集団に影響を与えている２型糖尿病は、インスリンの分泌の調節不全および／またはインスリンへに対する末梢組織の応答の減少、すなわち、インスリン抵抗性によって特徴付けられる。２型糖尿病の病因は不明のままであるが、疫学的研究は、この型の糖尿病は、各々が、それ自体の素因のリスクに寄与し、かつ過剰体重、食事、運動不足、薬物、および過度のアルコール消費を含む環境因子によって改変される複数の遺伝子欠損または多型の集合から生じることを示唆している。種々の治療的処置が２型糖尿病の管理のために利用可能であるが、これらには、種々の衰弱性副作用が付随する。したがって、２型糖尿病であるかまたはそのリスクがあると診断された患者は、しばしば、体重の減少、食事の変更、運動、および適度なアルコール摂取を含む、より健康的なライフスタイルを採るようにアドバイスされる。しかし、このようなライフスタイルの変化は、糖尿病によって引き起こされた血管および器官の損傷を逆転させるには十分ではない。
【０００７】
本明細書でＣｏＱ１０、Ｑ１０、ユビキノン、またはユビデカレノンとも呼ばれるコエンザイムＱ１０は、普及している栄養補助食品であり、ＣｏＱ１０の還元型であるユビキノールの抗酸化特性を通じて免疫系の保護を助けるビタミン様栄養補助食品として、カプセル剤形で栄養食品店、健康食品店、薬局などにて見出すことができる。ＣｏＱ１０は、当分野で認識されており、その全体の開示が参照により本明細書に組み入れられている、国際公開番号ＷＯ２００５／０６９９１６にさらに記載されている。
【０００８】
ＣｏＱ１０は、人体の大半の組織および他の哺乳動物の組織のいたるところで見出される。ヒトにおけるＣｏＱ１０の組織分布および酸化還元状態は、ＢｈａｇａｖａｎおよびＣｈｏｐｒａ（２００６  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０（５）：４４５−４５３）による総論において概説されている。著者らは、「一般原則として、心臓、腎臓、肝臓および筋肉などのエネルギー要求または代謝活性の高い組織は、比較的高濃度のＣｏＱ１０を含有する」ことを報告している。著者らはさらに「脳および肺を除く組織中のＣｏＱ１０の大部分はヒドロキノンまたはユビキノール（ｕｎｉｑｕｉｎｏｌ）としての還元型であり、このことはこれらの２つの組織における酸化ストレスの上昇を反映するものと思われる」ことを報告している。特に、Ｂｈａｇａｖａｎは、心臓、腎臓、肝臓、筋肉、腸（ｉｎｔｅｎｓｔｉｎｅ）、および血液（血漿）の中で、それぞれ、約６１％、７５％、９５％、６５％、９５％、および９６％のＣｏＱ１０が還元型で存在することを報告している。同様に、Ｒｕｉｚ−Ｊｉｍｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００７  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａ  Ａ，  １１７５，  ２４２−２４８）は、ヒト血漿がＱ１０および還元型のＱ１０（Ｑ１０Ｈ２）について評価されたときに、この分子の大部分（９０％）が還元型で見い出されたことを報告している。
【０００９】
ＣｏＱ１０は非常に親油性であり、大部分は水に不溶性である。ＣｏＱ１０は非常に親油性であり、大部分は水に不溶性である。水中でのその不溶性、脂質中での限られた溶解性、および比較的大きな分子量に起因して、経口投与されたＣｏＱ１０の吸収の効率は乏しい。ＢｈａｇａｖａｎおよびＣｈｏｐｒａは「ラットを用いた１つの研究において、経口投与されたＣｏＱ１０の約２〜３％のみが吸収されたことが報告された」と報告している。ＢｈａｇａｖａｎおよびＣｈｏｐｒａは、「ラット研究からのデータは、腸における吸収の間またはその後のいずれかに、ＣｏＱ１０はユビキノールに還元されることを示す」とさらに報告している。
【００１０】
糖尿病の管理のために現在利用可能であるストラテジーが最適に次ぐものであるならば、より効果的でありかつこのような消耗性副作用と関連しない治療の切実な必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、一部は、ミトコンドリア機能不全が代謝性疾患（糖尿病および肥満など）を含む広範囲の疾患に関連しており、ＣｏＱ１０などのある内因性分子がこのような代謝性疾患の診断、治療、および予防の成功の鍵を握っているという発見に基づいている。本発明は、一部は、これらの主要な内因性分子が、酸化的リン酸化に直接影響を及ぼすことによって正常なミトコンドリア機能を維持するのに重要な役割を果たし、より正常化されたミトコンドリア酸化的（ｏｓｉｄａｔｉｖｅ）リン酸化の回復または促進が代謝性疾患の進行を有効に治療または予防できるという発見にも基づいている。本発明はさらに、あるクラスの環境影響因子（例えばＣｏＱ１０）が代謝性疾患の疾患細胞において、より正常化されたミトコンドリア酸化的リン酸化に向けた細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発することができるという発見に基づいている。これらの環境影響因子は、治療エンドポイントを表す方式で、代謝性障害（糖尿病など）の主要な指標となる細胞内ターゲットを調節することができる。
【００１２】
本発明はさらに、内因性コエンザイムＱ１０（本明細書ではＣｏＱ１０またはＱ１０とも呼ばれる）の細胞への適用がアポトーシス応答を生じるという発見に少なくとも１部において基づいている。アポトーシス性応答は、癌細胞において選択的に誘導される。ミトコンドリアＱ１０レベルの時間および用量応答が観察され、４８時間後に細胞ミトコンドリア中のＱ１０のレベルは６倍上昇した。本発明はさらに、Ｑ１０が、供給された酸化型（酸化促進）に維持され、還元型のＱ１０Ｈ２（抗酸化）にはいかなる有意な量でも転換されないという驚くべきかつ予想されなかった発見に基づいている。本発明は、Ｑ１０で処置された細胞中で有意な数のタンパク質およびｍＲＮＡのレベルが調節されるというさらなる発見に基づいている。これらの調節されたタンパク質は、アポトーシス，癌生物学および細胞増殖、解糖および代謝、分子輸送、ならびに細胞シグナル伝達を含む、複数の細胞経路中に密集することが見出された。
【００１３】
本明細書に記載される出願人らのデータは、Ｑ１０の作用のメカニズムに洞察を与えてきた。特に、理論に拘束されることを望むものではないが、出願人の発見は、Ｑ１０が細胞微小環境に代謝シフトを誘導することを示す。多くの疾患は、改変された代謝状態に関連して（ａｓｓｏｃｉｅａｔｅｄ）いることが公知である。例えば、示差的代謝が癌細胞において起こることが知られており（Ｗａｒｕｒｇ効果）、それによって、多くの癌細胞が、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化（ピルビン酸の酸化）によるのではなく、サイトゾル中での解糖、続いて乳酸発酵によって優勢にエネルギーを産生する。別の例において、糖尿病および肥満などの代謝性障害は、グルコース代謝の変化と関連する。
【００１４】
したがって本発明は、第１の態様において、哺乳動物のＣｏＱ１０応答性障害を治療する、ＣｏＱ１０応答性障害の症状を緩和する、ＣｏＱ１０応答性障害の進行を阻害する、またはＣｏＱ１０応答性障害を予防する方法であって、少なくとも１つの環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）を含む治療的有効量の医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含み、環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常な生理学的条件下にて哺乳動物の正常細胞中で観察された解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルへの細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する方法を提供する。
【００１５】
一実施形態において、ＣｏＱ１０応答性障害は代謝性障害である。
【００１６】
本発明は、別の態様において、哺乳動物の代謝性障害を治療する、代謝性障害の症状を緩和する、代謝性障害の進行を阻害する、または代謝性障害を予防する方法であって、少なくとも１つの環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）を含む治療的有効量の医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含み、環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常化されたミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する方法を提供する。
【００１７】
一実施形態において、環境影響因子は、哺乳動物の正常細胞において、ミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを実質的に誘発しない。
【００１８】
一実施形態において、哺乳動物はヒト（または非ヒト哺乳動物）である。
【００１９】
一実施形態において、代謝性障害はコエンザイムＱ１０またはその代謝産物もしくはその類似体による治療に応答性または感受性である。
【００２０】
一実施形態において、代謝性障害は、代謝性疾患の原因となる、または原因として代謝性疾患を引き起こす、改変された遺伝子調節および／またはタンパク質−タンパク質相互作用を引き起こす、ミトコンドリア酸化的リン酸化機能の調節不全によって特徴付けられる。
【００２１】
一実施形態において、環境影響因子は（ａ）ベンゾキノンまたはベンゾキノン環の生合成を容易にする少なくとも１つの分子、ならびに（ｂ）イソプレノイドユニットの合成および／またはイソプレノイドユニットのベンゾキノン環への結合を容易にする少なくとも１つの分子を含む。
【００２２】
一実施形態において、ベンゾキノン環の生合成を容易にする前記少なくとも１つの分子は、以下を含む：Ｌ−フェニルアラニン、ＤＬ−フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、ＤＬ−チロシン、Ｄ−チロシン、４−ヒドロキシ−フェニルピルベート、３−メトキシ−４−ヒドロキシマンデレート（バニリンマンデレートまたはＶＭＡ）、バニリン酸、ピリドキシン、またはパンテノールを含む。
【００２３】
一実施形態において、イソプレノイドユニットの合成および／またはイソプレノイドユニットのベンゾキノン環への結合を容易にする前記少なくとも１つの分子は：フェニルアセテート、４−ヒドロキシベンゾエート、メバロン酸、アセチルグリシン、アセチルＣｏＡ、またはファルネシルを含む。
【００２４】
一実施形態において、環境影響因子は：（ａ）Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、および４−ヒドロキシフェニルピルベートの１つ以上；ならびに（ｂ）４−ヒドロキシベンゾエート、フェニルアセテート、およびベンゾキノンの１つ以上を含む。
【００２５】
一実施形態において、環境影響因子は：（ａ）Ｂｃｌ−２発現を阻害するおよび／もしくはカスパーゼ−３発現を促進する；ならびに／または（ｂ）細胞増殖を阻害する。
【００２６】
一実施形態において、環境影響因子は多次元細胞内分子（ＭＩＭ）である。一実施形態において、ＭＩＭは：アルファケトグルタレート／アルファケトグルタル酸、リンゴ酸塩／リンゴ酸、コハク酸塩／コハク酸、グルコサミン、アデノシン、アデノシン２リン酸、グルクロニド／グルクロン酸、ニコチン酸、ニコチン酸ジヌクレオチド、アラニン／フェニルアラニン、ピリドキシン、チアミン、またはフラビンアデニンジヌクレオチドから選択される。一実施形態において、多次元細胞内分子はアセチルＣｏ−Ａ、パルミチルＣｏ−Ａ、Ｌ−カルニチン、およびアミノ酸、例えばチロシン、フェニルアラニン、およびシステインからなる群より選択される。
【００２７】
一実施形態において、環境影響因子はエピメタボリックシフター（エピシフター）である。一実施形態において、エピメタボリックシフターは：トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、スクシニルＣｏＡシンターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、またはリボフラビンから選択される。一実施形態において、エピメタボリックシフターは：コエンザイムＱ１０、ビタミンＤ３および細胞外マトリクス構成要素からなる群より選択される。一実施形態において、エピメタボリックシフターはコエンザイムＱ１０である。一実施形態において、細胞外マトリクス構成要素は、フィブロネクチン、免疫調節薬（例えばＴＮＦαまたはインターロイキン）、血管新生因子、およびアポトーシス因子からなる群より選択される。
【００２８】
一実施形態において、ヒトの集団が治療され、集団の少なくとも２５％は、治療されている障害に対して治療的である全身的環境影響因子レベルを有していた。他の実施形態では、ヒトの集団が治療され、上記集団のうちの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上が、治療されている障害についての治療効果のある、全身性コエンザイムＱ１０レベルを有していた。上限または下限としてのこれらの値のいずれか１つを有する範囲、例えば１０％〜２５％、１５％〜３５％、２５％〜５０％、３５％〜６０％、４０％〜７０％、５０％〜７５％、６０％〜８５％または７０％〜９０％も本発明の一部であると意図されることが理解されるべきである。
【００２９】
一実施形態において、代謝性障害は、治療的有効レベルでの活性剤の全身送達を期待した局所投与を介して通例治療される障害ではない。
【００３０】
一実施形態において、治療されているヒト組織における環境影響因子の濃度は、健常または正常状態を表すヒト組織の対照標準の環境影響因子の濃度とは異なる。
【００３１】
一実施形態において、ヒトに投与された環境影響因子の型は、ヒトにおける全身循環中で見出される優勢型とは異なる。一実施形態において、環境影響因子はヒトに酸化型で投与される。
【００３２】
一実施形態において、ヒトの代謝性障害を治療するのに十分な量は、ミトコンドリア酸化的リン酸化を上方調節または下方調節する。
【００３３】
一実施形態において、ヒトの代謝性障害を治療するのに十分な量は、グルコースの嫌気的使用および／またはラクテート生合成を調節する。
【００３４】
本発明は、別の態様において、ヒトの代謝性障害を治療または予防する方法であって、環境影響因子を代謝性障害を治療または予防するのに十分な量でヒトに投与することを含み、環境影響因子が治療の間にその酸化型が維持されるように投与され、これにより代謝性障害を治療または予防する方法を提供する。
【００３５】
一実施形態において、ヒトに投与された環境影響因子の形態は、ヒトにおける全身循環中で見出される優勢形態とは異なる。
【００３６】
本発明は、また別の態様において、ヒトの代謝性障害を治療または予防する方法であって、代謝性障害に罹患しているヒト対象を選択すること；ならびにミトコンドリア酸化的リン酸化を増強することができる、および場合によりグルコースの嫌気的使用を遮断することができるｅｎｖ影響因子の治療的有効量を前記ヒトに投与して、これにより代謝性障害を治療または予防することを含む方法を提供する。
【００３７】
本発明は、別の態様において、代謝性障害の治療を必要する哺乳動物の疾患細胞においてミトコンドリア酸化的リン酸化を選択的に増強する方法であって、少なくとも１つのｅｎｖ影響因子を含む治療的有効量の医薬組成物を前記哺乳動物に投与して、これにより哺乳動物の前記疾患細胞にてミトコンドリア酸化的リン酸化を選択的に増強することを含む方法を提供する。
【００３８】
本発明の方法の一実施形態において、方法は、正の倍率変化を有する表２〜４および表６〜２８および表６３〜６８に挙げられた分子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の発現を上方調節して；ならびに／または負の倍率変化を有する表２〜４および表６〜２８および表６３〜６８に挙げられた分子からなる群より選択されるの１つ以上の遺伝子の発現を下方調節して、これにより代謝性障害を治療または予防することをさらに含む。一実施形態において、方法は、ＨＮＦ４−アルファ、Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ＢＮＩＰ−２、Ｂｃｌ−２、Ｂｉｒｃ６、Ｂｃｌ−２−Ｌ１１、ＸＩＡＰ、ＢＲＡＦ、Ｂａｘ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｂｍｆ、ＰＵＭＡ、ｃＭｙｃ、トランスアルドラーゼ１、ＣＯＱ１、ＣＯＱ３、ＣＯＱ６、プレニルトランスフェラーゼ、４−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子２、一酸化窒素シンターゼ２Ａ、スーパーオキシドディスムターゼ２、ＶＤＡＣ、Ｂａｘチャネル、ＡＮＴ、シトクロムｃ、複合体Ｉ、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩ、複合体ＩＶ、Ｆｏｘｏ３ａ、ＤＪ−１、ＩＤＨ−１、Ｃｐｔ１ＣおよびカムキナーゼＩＩからなる群より選択される１つ以上の遺伝子の発現を調節することをさらに含む。
【００３９】
本発明の方法の一実施形態において、治療は、環境影響因子と表２〜４および６〜２８および６３〜６８に挙げられた分子からなる群より選択される分子との相互作用を介してなされる。一実施形態において、治療は、環境影響因子とＨＮＦ４−アルファ、Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ＢＮＩＰ−２、Ｂｃｌ−２、Ｂｉｒｃ６、Ｂｃｌ−２−Ｌ１１（Ｂｉｍ）、ＸＩＡＰ、ＢＲＡＦ、Ｂａｘ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｂｍｆ、ＰＵＭＡ、ｃＭｙｃ、トランスアルドラーゼ１、ＣＯＱ１、ＣＯＱ３、ＣＯＱ６、プレニルトランスフェラーゼ、４−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子２、一酸化窒素シンターゼ２Ａ、スーパーオキシドディスムターゼ２、ＶＤＡＣ、Ｂａｘチャネル、ＡＮＴ、シトクロムｃ、複合体Ｉ、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩ、複合体ＩＶ、Ｆｏｘｏ３ａ、ＤＪ−１、ＩＤＨ−１、Ｃｐｔ１ＣおよびカムキナーゼＩＩからなる群より選択されるタンパク質との相互作用を介してなされる。一実施形態において、治療は、ｅｎｖ影響因子とＨＮＦ４アルファとの相互作用を介してなされる。一実施形態において、治療は、ｅｎｖ影響因子とトランスアルドラーゼとの相互作用を介してなされる。
【００４０】
本発明の方法の一実施形態において、代謝性障害は、糖尿病、肥満、前糖尿病、メタボリックシンドロームおよび代謝性障害の主要な要素からなる群より選択される。
【００４１】
一実施形態において、代謝性障害は糖尿病であり、ｅｎｖ影響因子はベータ細胞機能、インスリン代謝、および／またはグルカゴン沈着に影響を及ぼす。
【００４２】
一実施形態において、代謝性障害が肥満であり、ｅｎｖ影響因子はミトコンドリアにおけるベータ細胞酸化、脂肪細胞サイズの低下、および／またはコルチゾールレベルの制御に影響を及ぼす。
【００４３】
一実施形態において、代謝性障害は心血管疾患であり、ｅｎｖ影響因子は中膜における平滑筋細胞増殖の低下、脂質過酸化、トロンボキサン−ａｘ２合成、ＴＮＦａ、ＩＬ−１Ｂ、血小板凝集、一酸化窒素（ＮＯ）産生の低下、プラーク沈着および／または正常化した血糖制御に影響を及ぼす。
【００４４】
一実施形態において、代謝性障害の主要な要素は、空腹時血糖異常、耐糖能異常、腹囲増加、内臓脂肪量増加、空腹時血漿グルコースの増加、空腹時血漿トリグリセリドの増加、高密度リポタンパク質レベルの低下、血圧の上昇、インスリン抵抗性、高インスリン血症、心血管疾患、動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、脳血管疾患、うっ血性心不全、血漿ノルエピネフリンの上昇、心血管関連炎症因子の上昇、血管内皮機能障害を増強する血漿因子の上昇、高リポタンパク血症、動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症、過食症、高血糖症、高脂血症、および高血圧症（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）または高血圧症（ｈｉｇｈ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、食後血漿トリグリセリドレベルまたは遊離脂肪酸レベルの上昇、細胞酸化ストレスまたはその血漿指標の上昇、循環過凝固状態の増加、肝臓脂肪症、肝臓脂肪症（ｈｅｔａｐｔｉｃ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、腎不全および腎機能不全を含む腎疾患を含む。
【００４５】
本発明の方法の一実施形態において、方法は、追加の治療剤、例えば真性糖尿病治療剤、糖尿病合併症治療剤、抗高脂血剤、降圧剤または抗高血圧剤、抗肥満剤、利尿薬、化学治療剤、免疫治療剤および免疫抑制剤の投与をさらに含む。一実施形態において、代謝性障害は、糖尿病、肥満、前糖尿病、メタボリックシンドロームおよび代謝性障害のいずれかの主要な要素からなる群より選択される。一実施形態において、代謝性障害の主要な要素は、空腹時血糖異常、耐糖能異常、腹囲増加、内臓脂肪量増加、空腹時血漿グルコースの増加、空腹時血漿トリグリセリドの増加、空腹時高密度リポタンパク質レベルの低下、血圧の上昇、インスリン抵抗性、高インスリン血症、心血管疾患、動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、脳血管疾患、うっ血性心不全、血漿ノルエピネフリンの上昇、心血管関連炎症因子の上昇、血管内皮機能障害を増強する血漿因子の上昇、高リポタンパク血症、動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症、過食症、高血糖症、高脂血症、および高血圧症または高血圧症、食後血漿トリグリセリドレベルまたは遊離脂肪酸レベルの上昇、細胞酸化ストレスまたはその血漿指標の上昇、循環過凝固状態の増加、肝臓脂肪症、肝臓脂肪症、腎不全および腎機能不全を含む腎疾患からなる群より選択される。
【００４６】
本発明の方法の一実施形態において、方法は、追加の治療剤、例えば真性糖尿病治療剤、糖尿病合併症治療剤、抗高脂血剤、降圧剤または抗高血圧剤、抗肥満剤、利尿薬、化学治療剤、免疫治療剤および免疫抑制剤の投与をさらに含む。
【００４７】
本発明は、別の態様において、代謝性障害を治療するのに有効である薬剤を同定する方法であって、環境影響因子を選択することと；細胞の代謝状態をシフトさせることができる環境影響因子を同定することと；環境影響因子が代謝性障害を治療するのに有効であるか否かを判定して；これにより代謝性障害を治療するのに有効である薬剤を同定することとを含む方法を提供する。
【００４８】
一実施形態において、環境影響因子は、ｍＲＮＡ発現、タンパク質発現、脂質または代謝産物濃度、生体エネルギー分子のレベル、細胞エネルギー特性、ミトコンドリア機能およびミトコンドリア数のいずれか１つ以上の変化を測定することによって、細胞の代謝状態をシフトさせることができるとして同定される。
【００４９】
一実施形態において、代謝性障害の治療に有効な環境影響因子は、患者のグルコースレベルまたは脂質レベルを低下させることができる。
【００５０】
本発明は、なお別の態様において、多次元細胞内分子を同定する方法であって、細胞を内因性分子と接触させることと；細胞微小環境プロフィールに対する内因性分子の効果を監視することと；細胞微小環境プロフィールに変化を誘発する内因性分子を同定して；これにより多次元細胞内分子を同定することとを含む方法を提供する。
【００５１】
一実施形態において、方法は、罹患した細胞および正常な対照細胞の細胞微小環境プロフィールに対する内因性分子の効果を比較することと；罹患した細胞の細胞微小環境プロフィールに対する変化を、正常な対照細胞と比較して示差的に発する内因性分子を同定して；これによりＭＩＭを同定することをさらに含む。
【００５２】
一実施形態において、細胞微小環境プロフィールに対する効果は、ｍＲＮＡ、タンパク質、脂質および代謝産物からなる群より選択される細胞分子のレベルまたは活性の変化を測定することによって監視される。
【００５３】
本発明は、なお別の態様において、エピメタボリックシフターを同定する方法であって、示差的疾患状態を提示する２つ以上の細胞または組織について分子プロフィールを比較することと；レベルの変化が疾患状態に相関する分子プロフィールから分子を同定することと；分子を細胞に導入することと；分子が細胞の代謝状態をシフトさせる能力を評価することとを含み、細胞の代謝状態をシフトさせることができる分子がエピメタボリックシフターとして同定される方法を提供する。
【００５４】
一実施形態において、分子プロフィールは、代謝産物プロフィール、脂質プロフィール、タンパク質プロフィールまたはＲＮＡプロフィールからなる群より選択される。
【００５５】
一実施形態において、分子は、正常な細胞の健康または増殖に悪影響を及ぼさない。
【００５６】
本発明は、別の態様において、本発明の方法のいずれかによって同定された薬剤を含む組成物を提供する。本発明は、関連する態様において、本発明の組成物を含むキットをさらに提供する。
【００５７】
本発明は、別の態様において、患者のグルコースレベルを低下させる方法であって、本発明の組成物の有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。本発明は、関連する態様において、患者の脂質レベルを低下させる方法であって、本発明の組成物の有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】早期および後期アポトーシス細胞の量によって測定された、２４時間のＱ１０処置に対するＳＫ−ＭＥＬ−２８の感受性。
【図２】早期および後期アポトーシス細胞の量によって測定された、２４時間のＱ１０処置に対するＳＫＢＲ３の感受性。
【図３】早期および後期アポトーシス細胞の量によって測定された、２４時間のＱ１０処置に対するＰａＣａ２の感受性。
【図４】早期および後期アポトーシス細胞の量によって測定された、２４時間のＱ１０処置に対するＰＣ−３の感受性。
【図５】早期および後期アポトーシス細胞の量によって測定された、２４時間のＱ１０処置に対するＨｅｐＧ２の感受性。
【図６】早期および後期アポトーシス細胞の量によって測定された、２４時間のＱ１０処置に対するＭＣＦ−７の感受性。
【図７】アポストランドＥＬＩＳＡ法によって測定されたような、Ｑ１０による２４時間処置時のアポトーシス細胞の測定。
【図８】２次元ゲル電気泳動のゲル分析例。同定のために切除されたスポットがマーキングされている。
【図９】ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞中でＱ１０によって調節されているような、２次元ゲル電気泳動によって同定されたタンパク質間の相互作用のネットワーク。
【図１０】Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００１  ６８（５）：１０８６−１０９２）から転載された、ペントースリン酸経路。
【図１１】ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞のミトコンドリア高濃度物質の２次元ゲル。切除され、質量分析キャラクタリゼーションによって同定されたスポットがマーキングされている。
【図１２】培養培地中への１００μＭ  Ｑ１０の外部からの添加後の、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ミトコンドリアに存在するＱ１０の相対量の比較プロット。
【図１３Ａ】公知のプロセスのアポトーシス経路マッピング。
【図１３Ｂ】公知のプロセスのアポトーシス経路マッピング。
【図１４】Ｂｃｌ−ｘｌのウェスタンブロット分析。
【図１５】ビメンチン抗体によって証明されたＳＫ−ＭＥＬ−２８試料セットのウェスタンブロット分析。
【図１６】酸化的リン酸化複合体（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ番号ＭＳ６０１）をターゲティングする５種類の抗体によって評価されたいくつかの株化細胞からの細胞溶解のウェスタンブロット分析。
【図１７】Ｆ１−アルファレベルのウェスタンブロット比較。
【図１８】Ｃ−ＩＩＩ−Ｃｏｒｅ２とのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図１９】Ｃ−ＩＩ−３０とのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図２０】Ｃ−ＩＶ−ＣＯＸＩＩとのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図２１】Ｃ−Ｉ−２０（ＮＤ６）とのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図２２】５種類のミトコンドリアタンパク質に対する多種多様の細胞タイプのウェスタンブロット分析。
【図２３】複合体Ｖタンパク質Ｃ−Ｖ−αとのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図２４】Ｃ−ＩＩＩ−Ｃｏｒｅ１とのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図２５】ポリン（ＶＤＡＣ１）とのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図２６】シクロフィリンＤとのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図２７】シトクロムＣとのＱ１０応答のウェスタンブロット比較。
【図２８】Ｈｅｌｉｘ１０オープン立体配座のＨＮＦ４アルファ（１Ｍ７Ｗ．ｐｄｂ）の脂質結合チャネルに挿入されたＱ１０（球）の理論モデル。
【図２９】正常酸素条件および低酸素条件での各種のグルコース条件におけるＨＤＦａ細胞のＯＣＲ。
【図３０】正常酸素条件および低酸素条件での各種のグルコース条件におけるＨＡＳＭＣ細胞のＯＣＲ。
【図３１】３１５１０およびストレッサーの非存在および存在下でのＭＣＦ−７乳癌細胞のＯＣＲ値。
【図３２】３１５１０およびストレッサーの非存在および存在下でのＰａＣａ−２膵臓癌細胞のＯＣＲ値。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
Ｉ．定義
本明細書で使用する場合、以下の用語のそれぞれが、本セクションおける用語と関連する意味を有する。
【００６０】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法的対象のうち１つまたは１つを超える（すなわち少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。１例として、「要素」は、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
【００６１】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「限定されるわけではないが、含む」という句を意味するために本明細書で使用され、「限定されるわけではないが、含む」と互換的に使用される。
【００６２】
「または」という用語は、状況が別途明らかに指摘しない限り、「および／または」という用語を意味するために本明細書で使用され、「および／または」という用語と互換的に使用される。
【００６３】
「などの」という用語は、「限定されるわけではないが、などの」という句を意味するために本明細書で使用され、「限定されるわけではないが、などの」と互換的に使用される。
【００６４】
本発明の方法によって治療される「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物のどちらか、好ましくは哺乳動物を意味することができる。
【００６５】
「治療的有効量」は、疾患を治療するために患者に投与されたときに疾患に対してこのような治療をもたらすのに十分である化合物の量を意味する。疾患を予防するために投与されたときに、量は、疾患の開始を回避または遅延するのに十分である。「治療的有効量」は、化合物、疾患およびその重症度ならびに治療される患者の年齢、体重などに応じて変動するであろう。
【００６６】
「予防すること」または「予防」は、疾患または障害を獲得するリスクの低減（すなわち疾患の臨床症候の少なくとも１つを、疾患に曝露され得るまたは疾患の素因があり得るが、疾患の症候をまだ経験または提示していない患者において発症させないようにすること）を指す。
【００６７】
「予防」または「治療」処置という用語は、対象組成物の１つ以上の対象への投与を指す。望ましくない症状（例えば宿主動物の疾患または他の望ましくない状態）の臨床顕在化の前に投与される場合、ここで処置は予防的であり、すなわち処置は宿主が望ましくない症状を発症することから保護するのに対して、望ましくない症状の顕在化後に投与される場合、処置は治療である（すなわち既存の望ましくない症状またはそれからの副作用を減少、緩和または維持するものとする）。
【００６８】
「治療効果」という用語は、動物、特に哺乳動物、およびさらに詳細にはヒトにおいて薬理学的活性物質によって引き起こされる、局所または全身効果を指す。該用語はそれゆえ、動物またはヒトにおける疾患の診断、治癒、軽減、処置もしくは予防でのまたは所望の身体的もしくは精神的発達および状態の増強での使用が意図されるいずれの物質も意味する。「治療的有効量」という句は、いずれの処置にも適用できる合理的な利益／リスク比にてある望ましい局所または全身効果を産生するような物質の量を意味する。ある実施形態において、化合物の治療的有効量は、その治療指数、溶解性などに依存するであろう。例えば、本発明の方法によって見出されたある化合物は、このような処置に適用できる合理的な利益／リスク比を産生するために十分な量で投与され得る。
【００６９】
「患者」とは、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、サル、モルモット、ラット、マウス、トカゲ、ヘビ、ヒツジ、ウシ、魚およびトリを含む、いずれかの動物（例えばヒト）を意味する。
【００７０】
「代謝経路」は、１つの化合物を別の化合物に変換して、中間体および細胞機能のためのエネルギーを提供する、一連の酵素媒介反応を指す。代謝経路は線形または環式であることができる。
【００７１】
「代謝状態」は、各種の化学的および生物学的指標が健康または疾患の状態に関連するため、各種の化学的および生物学的指標によって測定されるような所与の時点における特定の細胞、多細胞または組織環境の分子内容物を指す。
【００７２】
「マイクロアレイ」という用語は、基質、例えば紙、ナイロンもしくは他の種類の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、またはその他の好適な固体支持体上で合成された別個のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド（例えば抗体）またはペプチドのアレイを指す。
【００７３】
「障害」および「疾患」という用語は、包括的に使用され、体のいずれの部分、器官または系（またはそのいずれの組み合わせ）の正常な構造または機能からのいずれの逸脱も指す。特異的疾患は、生物学的、化学的および物理的変化を含む特徴的症候および徴候によって明らかとなり、限定されるわけではないが、人口統計学的因子、環境因子、雇用因子、遺伝的因子および病歴因子を含む、多種多様の他の因子と関連することが多い。ある特徴的な徴候、症候、および関連因子は、重要な診断情報を産する多種多様の方法によって定量化することができる。
【００７４】
「発現」という用語は、ポリペプチドがＤＮＡから産生されるプロセスを意味するために本明細書で使用される。プロセスは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写およびこのｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を包含する。使用される状況に応じて、「発現」は、ＲＮＡ、タンパク質またはその両方の産生を指す。
【００７５】
「遺伝子の発現レベル」または「遺伝子発現レベル」という用語は、ｍＲＮＡ、ならびにプレｍＲＮＡ新生転写物、転写プロセシング中間体、成熟ｍＲＮＡおよび分解生成物のレベル、または細胞中の遺伝子によってコードされたタンパク質のレベルを指す。
【００７６】
「調節」という用語は、応答の上方調節（すなわち活性化または刺激）、下方調節（すなわち阻害または抑制）、または組み合わされたもしくは別々のその２つを指す。「モジュレーター」は、調節する化合物または分子であり、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、アクチベーター、刺激物質、サプレッサー、または阻害剤であり得る。
【００７７】
「コエンザイム生合成経路の中間体」という用語は、本明細書で使用する場合、チロシンおよびアセチルＣｏＡのユビキノン（ｕｑｉｑｕｉｎｏｎｅ）への化学的／生物学的変換の間に形成される化合物を特徴付ける。コエンザイム生合成経路の中間体は、３−ヘキサプレニル−４−ヒドロキシベンゾエート、３−ヘキサプレニル−４，５−ジヒドロキシベンゾエート、３−ヘキサプレニル−４−ヒドロキシ−５−メトキシベンゾエート、２−ヘキサプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−ヘキサプレニル−３−メチル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−ヘキサプレニル−３−メチル−５−ヒドロキシ−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシベンゾエート，２−オクタプレニルフェノール、２−オクタプレニル−６−メチルオキシ（ｍｅｔｈｏｌｘｙ）フェノール，２−オクタプレニル−３−メチル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−オクタプレニル−３−メチル−５−ヒドロキシ−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−デカプレニル−３−メチル−５−ヒドロキシ−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−デカプレニル−３−メチル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−デカプレニル−６−メトキシ−１，４−ベンゾキノン、２−デカプレニル−６−メトキシフェノール、３−デカプレニル−４−ヒドロキシ−５−メトキシベンゾエート、３−デカプレニル−４，５−ジヒドロキシベンゾエート、３−デカプレニル−４−ヒドロキシベンゾエート、４−ヒドロキシフェニルピルベート、４−ヒドロキシフェニルラクテート、４−ヒドロキシ−ベンゾエート、４−ヒドロキシシンナメートおよびヘキサプレニル（ｈｅｘａｐｒｅｎｙ）ジホスフェートを含む。
【００７８】
本明細書中で使用される場合は、表現「グルコースの嫌気的使用」または「嫌気的解糖」は、解糖、それに続くサイトゾル中での乳酸発酵による細胞のエネルギー産生をいう。例えば多くの癌細胞は、嫌気的解糖によってエネルギーを産生する。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「好気的解糖」または「ミトコンドリア酸化的リン酸化」は、ミトコンドリアでの解糖によるエネルギーの細胞産生とそれに続くピルビン酸の酸化を指す。
【００８０】
本明細書中で使用される場合は、表現「グルコースの嫌気的使用を遮断し、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を促進することができる」は、嫌気的解糖から好気的解糖へまたはミトコンドリアの酸化的リン酸化への細胞の代謝状態のシフトあるいは変化を誘導する環境影響因子（例えば、エピメタボリックシフター）の能力をいう。
【００８１】
ここで本発明の好ましい実施形態への参照が詳細になされるであろう。本発明は好ましい実施形態と併せて記載されるが、本発明をこれらの好ましい実施形態に制限することが意図されていないことが理解されるであろう。反対に、添付請求項によって定義されるような本発明の精神および範囲に含まれ得る代替、修正、および均等物を扱うことが意図される。
【００８２】
ＩＩ．環境影響因子
本発明は、環境影響因子の投与によって代謝性障害を治療する方法を提供する。「環境影響因子（Ｅｎｖ−ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｒｓ）」は、有効な方法でヒトの疾患環境に影響を及ぼすかまたはヒトの疾患環境を調節する分子であり、これによりヒトの疾患環境を、正常な環境または正常な状態に通じる健康な環境にシフトさせる、そのような環境に戻して再度確立させる、あるいはそのような環境を維持することが可能となる。ｅｎｖ影響因子は、下で定義するような多次元細胞内分子（ＭＩＭ）およびエピメタボリックシフター（エピシフター）の両方を含む。
【００８３】
１．多次元細胞内分子（ＭＩＭ）
「多次元細胞内分子（ＭＩＭ）」という用語は、体によって自然に産生されるおよび／またはヒトの少なくとも１つの細胞中に存在する内因性分子の単離されたものまたは合成産生されたものである。ＭＩＭは、以下の機能の１つ以上、２つ以上、３つ以上、またはすべてによって特徴付けられる。ＭＩＭは細胞に進入することが可能であり、細胞への進入は、分子の生物活性部分が完全に細胞に進入する限り、細胞への完全または部分進入を含む。ＭＩＭは、細胞内でシグナル伝達および／または遺伝子発現機構を誘導することが可能である。ＭＩＭは、治療薬および担体の両方、例えば薬物送達効果を有するという点で多次元である。ＭＩＭはまた、疾患状態において１つの方法で作用し、正常な状態においては異なる方法で作用するという点で多次元である。例えばＣｏＱ−１０の場合、ＶＥＧＦの存在下での黒色腫細胞へのＣｏＱ−１０の投与は、Ｂｃｌ２レベルの低下をもたらし、次に黒色腫細胞の発癌能の低下をもたらす。対照的に、正常な線維芽細胞において、ＣｏＱ−１０およびＶＥＦＧの同時投与は、Ｂｃｌ２のレベルに対する効果は有さない。好ましくはＭＩＭは、疾患状態の細胞において選択的に作用し、正常な状態の（マッチング）細胞において実質的に効果を有さない。好ましくはＭＩＭは、疾患状態の細胞を、表現型、代謝状態、遺伝子型、ｍＲＮＡ／タンパク質発現レベルなどで正常な状態の（マッチング細胞）に選択的に近づける。
【００８４】
一実施形態において、ＭＩＭはエピシフターでもある。別の実施形態において、ＭＩＭはエピシフターではない。当業者は、本発明のＭＩＭが２つ以上の内因性分子の混合物を含むことも意図され、混合物が上述の機能の１つ以上によって特徴付けられることを認識するであろう。混合物中の内因性分子は、混合物がＭＩＭとして機能するような比で存在する。
【００８５】
ＭＩＭは、脂質ベース分子または非脂質ベース分子であることができる。ＭＩＭの例は、限定されるわけではないが、ＣｏＱ１０、アセチルＣｏ−Ａ、パルミチルＣｏ−Ａ、Ｌ−カルニチン、例えばチロシン、フェニルアラニン、およびシステインなどのアミノ酸を含む。一実施形態において、ＭＩＭは小型分子である。本発明の一実施形態において、ＭＩＭはＣｏＱ１０でない。ＭＩＭは、本明細書で詳細に記載されたアッセイのいずれかを使用して、当業者によって日常的に同定することができる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＭＩＭは、ビタミンＢファミリーの化合物、またはビタミンＢファミリーの化合物を含むヌクレオシド、モノヌクレオチドもしくはジヌクレオチドを含む。ビタミンＢファミリーの化合物は、例えばチアミン（ビタミンＢ１）、ナイアシン（ニコチン酸またはビタミンＢ３としても公知）、またはピリドキシン（ビタミンＢ６）ならびにパンテノール（プロビタミンＢ５）などのプロビタミンを含む。いくつかの実施形態において、ＭＩＭは、チアミン、ナイアシンおよびピリドキシンから選択される。ビタミンＢファミリーの化合物を含むヌクレオシド、モノヌクレオチドまたはジヌクレオチドは例えば、アデニンまたはナイアシン（ニコチン酸）分子を含むヌクレオシド、モノヌクレオチドまたはジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＭＩＭは、アデノシン、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）、フラビンアデノシンジヌクレオチド（ＦＡＤ、ビタミンＢ２およびＡＤＰの一部を含む）およびニコチン酸ジヌクレオチドから選択される。
【００８７】
他の実施形態において、ＭＩＭはアミノ酸を含む。アミノ酸の例は、例えばチロシン（例えばＬ−チロシン）、システイン、フェニルアラニン（例えばＬ−フェニルアラニン）およびアラニンを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸はフェニルアラニンまたはアラニンである。いくつかの実施形態において、ＭＩＭは、４−ヒドロキシフェニルピルベートまたはアセチルグリシンなどのアミノ酸誘導体を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ＭＩＭはグルコース類似体、例えば１個の−ＯＨまたは−ＣＨ２ＯＨ置換基が−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−または−ＮＨ２置換基によって置換されているグルコース分子である。グルコース類似体の例は、グルコサミン、グルクロン酸、グルクロニドおよびグルクロン酸塩を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ＭＩＭは、式（Ｉ）の化合物から選択され：
【化１】
2015199746.tif 000003
【００９０】
式中
ｎは０または１の整数であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は存在するとき、水素およびヒドロキシルからそれぞれ独立して選択される、またはＲ１およびＲ２は、これらが結合されている炭素と共にまとめられてカルボニル（Ｃ＝Ｏ）基を形成し；
Ｗは−ＣＯＯＨまたは−Ｎ（ＣＨ３）３＋であり；ならびに
Ｘは、水素、負の電荷またはＮａ＋などのアルカリ金属カチオンである。
【００９１】
ｎが０であるとき、ＣＨＲ３基がＷ置換基に結合されていることが理解される。
【００９２】
いくつかの実施形態において、Ｗは−Ｎ（ＣＨ３）３＋である。いくつかの実施形態において、ＭＩＭは、Ｌ−カルニチンなどのカルニチンである。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ＭＩＭはジカルボン酸である。いくつかの実施形態において、Ｗは−ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ３は水素である。いくつかの実施形態において、ｎは０である。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して水素である。いくつかの実施形態において、Ｗは−ＣＯＯＨであり、Ｒ３は水素であり、ｎは０であり、ならびにＲ１およびＲ２はそれぞれ独立して水素である。いくつかの実施形態において、ｎは１である。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合されている炭素と共にまとめられてカルボニル（Ｃ＝Ｏ）基を形成する。いくつかの実施形態において、Ｒ４は水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ４はヒドロキシルである。いくつかの実施形態において、Ｗは−ＣＯＯＨであり、Ｒ３は水素であり、ｎは１であり、ならびにＲ１およびＲ２は、これらが結合されている炭素と共にまとめられてカルボニル（Ｃ＝Ｏ）基を形成する。
【００９４】
いくつかの実施形態において、ＭＩＭはクレブス回路の中間体であり、過剰な中間体がクレブス回路を生産的な酸化的リン酸化に向けて操縦する。ＭＩＭである例示的なクレブス回路中間体は、コハク酸またはコハク酸塩、リンゴ酸またはリンゴ酸塩、およびα−ケトグルタル酸またはα−ケトグルタレートを含む。
【００９５】
いくつかの実施形態において、ＭＩＭは、以下の構造を有する、ＣｏＱ１０の構成単位である。
【化２】
2015199746.tif 000004
【００９６】
それゆえ、ＣｏＱ１０の構成単位は、限定されるわけではないが、フェニルアラニン、チロシン、４−ヒドロキシフェニルピルベート、フェニルアセテート、３−メトキシ−４−ヒドロキシマンデレート、バニリン酸、４−ヒドロキシベンゾエート、メバロン酸、ファルネシル、２，３−ジメトキシ−５−メチル−ｐ−ベンゾキノン、ならびに対応するその酸またはイオンを含む。いくつかの実施形態において、ＭＩＭは、フェニルアラニン、チロシン、４−ヒドロキシフェニルピルベート、フェニルアセテートおよび４−ヒドロキシベンゾエートから選択される。
【００９７】
（ｉ）ＭＩＭを同定する方法
本発明は、ＭＩＭを同定する方法を提供する。ＭＩＭを同定する方法は、細胞への内因性分子の外部からの添加および内因性分子の細胞、例えば細胞微小環境プロフィールに対する効果の評価を包含する。細胞に対する効果は細胞、ｍＲＮＡ、タンパク質、脂質、および／または代謝産物レベルの１つ以上で評価されて、細胞微小環境プロフィールにおける改変を同定する。一実施形態において、細胞は例えばインビトロで培養された培養細胞である。一実施形態において、細胞は生物中に存在する。内因性分子は、細胞に単一の濃度で添加され得る、または細胞に一連の濃度にわたって添加され得る。一実施形態において、内因性分子は対照の未処置細胞中の内因性分子のレベルと比較して、細胞中の内因性分子のレベルが上昇するように細胞に添加される（例えば１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５．０倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍またはそれ以上、上昇する）。
【００９８】
例えば形態、生理機能、および／または組成（例えばｍＲＮＡ、タンパク質、脂質、代謝産物）のいずれか１つ以上における改変により検出されるような、細胞中の変化を誘導する分子は、細胞微小環境プロフィールに対して誘導された変化が疾患細胞状態と正常な細胞状態との間で異なるか否かを判定するためにさらに評価され得る。多様な組織源、細胞タイプ、または疾患状態の細胞（例えば細胞培養系統）が、比較評価のために評価され得る。例えば癌細胞の細胞微小環境プロフィールにおける誘導された変化は、非癌性または正常な細胞に誘導された変化と比較され得る。細胞の微小環境プロフィールにおける変化を誘導すること（例えば細胞の形態、生理機能および／または組成、例えばｍＲＮＡ、タンパク質、脂質もしくは代謝産物の変化を誘導する）および／または正常な細胞と比較して疾患細胞の微小環境プロフィールにおける変化を示差的（例えば優先的）に誘導することが観察される内因性分子は、ＭＩＭとして同定される。
【００９９】
本発明のＭＩＭは、脂質ベースＭＩＭまたは非脂質ベースＭＩＭであり得る。脂質ベースＭＩＭを同定する方法は、脂質ベース内因性分子が細胞に外部から添加される上記の細胞ベース方法を包含する。好ましい実施形態において、脂質ベース内因性分子は、細胞中の脂質ベース内因性分子のレベルが上昇するように、細胞に添加される。一実施形態において、脂質ベース内因性分子のレベルは、未処置対照細胞のレベルと比較して、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５．０倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍またはそれ以上、上昇する。脂質ベース分子の製剤および細胞への送達は、試験された各分子の特性に依存するが、多くの方法が当分野で公知である。脂質ベース分子の製剤および送達の例は、限定されるわけではないが、共溶媒による可溶化、担体分子、リポソーム、分散剤、懸濁剤、ナノ粒子分散剤、乳剤、例えば水中油型または油中水型乳剤、多相乳剤、例えば油中水中油型乳剤、ポリマー捕捉および封入を含む。脂質ベースＭＩＭの細胞への送達は、質量分析法などの当分野で公知の所定の方法による、細胞脂質の抽出およびＭＩＭの定量によって確認することができる。
【０１００】
非脂質ベースＭＩＭを同定する方法は、非脂質ベース内因性分子が細胞に外部から添加される上記の細胞ベース方法を包含する。好ましい実施形態において、非脂質ベース内因性分子は、細胞中の非脂質ベース内因性分子のレベルが上昇するように、細胞に添加される。一実施形態において、非脂質ベース内因性分子のレベルは、未処置対照細胞のレベルと比較して、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５．０倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍またはそれ以上、上昇する。非脂質ベース分子の製剤および細胞への送達は、試験された各分子の特性に依存するが、多くの方法が当分野で公知である。非脂質ベース分子の製剤および送達様式の例は、限定されるわけではないが、共溶媒による可溶化、、担体分子、能動輸送、ポリマー捕捉または吸着、ポリマーグラフト化、リポソーム封入およびターゲット化送達系を用いた製剤を含む。非脂質ベースＭＩＭの細胞への送達は、質量分析法などの当分野で公知の所定の方法による、細胞内容物の抽出およびＭＩＭの定量によって確認され得る。
【０１０１】
２．エピメタボリックシフター（エピシフター）
本明細書で使用する場合、「エピメタボリックシフター」（エピシフター）は、健常（または正常な）状態から疾患状態へのおよびまたはその逆の代謝シフトを調節して、これによりヒトにおける細胞、組織、器官系および／または宿主の健康を維持または再建する分子（内因性または外因性）である。エピシフターは、組織微小環境の正常化を達成することができる。例えば、エピシフターは、細胞に添加されたまたは細胞で消耗されたときに、細胞の微小環境（例えば代謝状態）に影響を及ぼすことができるいずれの分子も含む。当業者は、本発明のエピシフターが２つ以上の分子の混合物を含むことも意図され、混合物が上述の機能の１つ以上によって特徴付けられることを認識するであろう。混合物中の分子は、混合物がエピシフターとして機能するような比で存在する。エピシフターの例は、限定されるわけではないが、ＣｏＱ−１０；ビタミンＤ３；フィブロネクチンなどのＥＣＭ構成要素；ＴＮＦαまたはインターロイキンのいずれかなどの免疫調節薬、例えばＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３；血管新生因子；およびアポトーシス因子を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、エピシフターは、クレブス回路における１つ以上の反応への触媒作用に直接関与する、またはクレブス回路中間体（過剰な中間体がクレブス回路を操縦する）を産生するかのどちらかである酵素などの、酵素である。いくつかの実施形態において、酵素は、トランスアルドラーゼ、またはトランスケトラーゼなどのペントースリン酸経路の非酸化的段階の酵素である。他の実施形態において、酵素は、シンターゼまたはリガーゼなどの、クレブス回路を容易にする構成要素酵素または酵素複合体である。例示的な酵素は、スクシニルＣｏＡシンターゼ（クレブス回路酵素）またはピルビン酸カルボキシラーゼ（クレブス回路中間体であるオキサロ酢酸（ＯＡＡ）を形成するために、ピルビン酸の可逆的カルボキシル化を触媒するリガーゼ）を含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、エピシフターはＣｏＱ１０の構成単位である。ＣｏＱ１０の構成単位は、限定されるわけではないが、フェニルアラニン、チロシン、４−ヒドロキシフェニルピルベート、フェニルアセテート、３−メトキシ−４−ヒドロキシマンデレート、バニリン酸、４−ヒドロキシベンゾエート、メバロン酸、ファルネシル、２，３−ジメトキシ−５−メチル−ｐ−ベンゾキノン、ならびに対応するその酸またはイオンを含む。いくつかの実施形態において、エピシフターは、フェニルアラニン、チロシン、４−ヒドロキシフェニルピルベート、フェニルアセテートおよび４−ヒドロキシベンゾエートから選択される。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、エピシフターはビタミンＢファミリーの化合物である。ビタミンＢファミリーの化合物は例えば、リボフラビン（ビタミンＢ２）、またはその類似体を含む。エピシフターは、本明細書に記載する内因性ＭＩＭなどの、内因性ＭＩＭのいずれにもインビボで代謝され得る、いずれの類似体またはプロドラッグも含む。
【０１０５】
一実施形態において、エピシフターもＭＩＭである。一実施形態において、エピシフターはＣｏＱ１０でない。エピシフターは、本明細書で詳細に記載されたアッセイのいずれかを使用して、当業者によって日常的に同定することができる。
【０１０６】
（ｉ）エピシフターを同定する方法
エピメタボリックシフター（エピシフター）は、細胞の代謝状態を調節する、例えば健常（または正常な）状態から疾患状態へのおよびまたはその逆の代謝シフトを誘導することが可能である分子であり、これによりヒトにおける細胞、組織、器官系および／または宿主の健康を維持または再建することが可能である。本発明のエピシフターはそれゆえ、罹患状態の診断評価に有用性を有する。本発明のエピシフターは、エピシフターの適用または投与（他の治療分子によるエピシフターの調節）効果が組織微小環境および疾患状態における正常化をもたらす治療用途においてさらなる有用性を有する。
【０１０７】
エピメタボリックシフターの同定は概して、示差的な疾患状態、進行、または侵襲性を提示する細胞または組織のパネルについて、例えば代謝産物、脂質、タンパク質またはＲＮＡの分子プロフィール（個別のまたは併用されたプロフィール）を確立することを包含する。レベルの変化（例えばレベルの上昇または低下）が疾患状態、進行または侵襲性に相関するプロフィールからの分子は、潜在的エピシフターとして同定される。
【０１０８】
一実施形態において、エピシフターはＭＩＭでもある。潜在的なエピシフターは、当分野で公知のいくつもの所定の技法を使用することによって、および本明細書に記載する方法のいずれかを使用することによって、細胞への外部からの添加時に細胞に進入するその能力が評価され得る。例えば、潜在的エピシフターの細胞中への進入は、質量分析法などの当分野で公知の所定の方法による、細胞内容物の抽出および潜在的エピシフターの定量によって確認され得る。これにより、細胞に進入することができる潜在的エピシフターは、ＭＩＭとして同定される。
【０１０９】
エピシフターを同定するために、潜在的エピシフターは次に、細胞の代謝状態をシフトさせる能力について評価される。潜在的エピシフターが細胞微小環境の代謝状態をシフトさせる能力は、細胞に潜在的エピシフターを導入すること（例えば外部から添加すること）ならびに細胞において：遺伝子発現の変化（例えばｍＲＮＡもしくはタンパク質発現の変化）、脂質もしくは代謝産物レベルの濃度変化、生体エネルギー分子レベルの変化、細胞エネルギー特性の変化、および／またはミトコンドリアの機能もしくは数の変化の１つ以上を監視することによって評価される。細胞微小環境の代謝状態をシフトさせることが可能である潜在的エピシフターは、本明細書で詳細に記載されたアッセイのいずれかを使用して、当業者によって日常的に同定することができる。潜在的エピシフターは、疾患細胞の代謝状態を正常な健常状態に向けてシフトさせる能力について（または反対に、正常細胞の代謝状態をを罹患状態に向けてシフトさせる能力について）、さらに評価される。それゆえ、疾患細胞の代謝状態を正常な健常状態に向けてシフトさせる（または健常な正常細胞の代謝状態を罹患状態に向けてシフトさせる）ことが可能である潜在的エピシフターは、エピシフターとして同定される。好ましい実施形態において、エピシフターは、正常細胞の健康および／または増殖に悪影響を及ぼさない。
【０１１０】
本発明のエピメタボリックシフターは、限定されるわけではないが、小型分子代謝産物、脂質ベース分子、ならびにタンパク質およびＲＮＡを含む。小型分子内因性代謝産物のクラスでエピメタボリックシフターを同定するために、示差的な疾患状態、進行、または侵襲性を提示する細胞または組織のパネルについて、代謝産物プロフィールが確立される。各細胞または組織の代謝産物プロフィールは、細胞または組織から代謝産物を抽出することならびに次に例えば液体−クロマトグラフィー連結質量分析法またはガスクロマトグラフィー連結質量分析法を含む、当業者に公知の所定の方法を使用して、代謝産物を同定および定量することによって決定される。レベルの変化（例えばレベルの上昇または低下）が疾患の状態、進行または侵襲性に相関する代謝産物は、潜在的エピシフターとして同定される。
【０１１１】
内因性脂質ベース分子のクラスでエピメタボリックシフターを同定するために、示差的な疾患状態、進行、または侵襲性を提示する細胞または組織のパネルについて、脂質プロフィールが確立される。各細胞または組織の脂質プロフィールは、脂質抽出法と、続いての例えば液体−クロマトグラフィー連結質量分析法またはガスクロマトグラフィー連結質量分析法を含む、当業者に公知の所定の方法を使用する脂質の同定および定量によって決定される。レベルの変化（大量または微量レベルの上昇または低下）が疾患の状態、進行または侵襲性に相関する脂質は、潜在的エピシフターとして同定される。
【０１１２】
タンパク質およびＲＮＡのクラスでエピメタボリックシフターを同定するために、示差的な疾患状態、進行、または侵襲性を提示する細胞または組織のパネルについて、遺伝子発現プロフィールが確立される。各細胞または組織の発現プロフィールは、例えば本明細書に詳細に記載されているような標準プロテオミクス法、ｍＲＮＡアレイ法、またはゲノムアレイ法を使用して、ｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルで決定される。発現の変化（例えばｍＲＮＡまたはタンパク質レベルでの発現の上昇または低下）が疾患の状態、進行または侵襲性に相関する遺伝子は、潜在的エピシフターとして同定される。
【０１１３】
（例えば可溶性代謝産物、脂質ベース分子、タンパク質、ＲＮＡ、または他の生物学的クラスの組成物について）上記の分子プロフィールがいったん確立されると、細胞および生化学経路分析が行われて、細胞環境における同定された潜在的エピシフターの間の公知の連関が解明される。このような細胞および／または生化学経路分析によって得られた本情報は、経路および潜在的エピシフターを分類するために利用され得る。
【０１１４】
エピシフターが疾患状態を調節する有用性は、当分野で公知のまたは本明細書で詳細に記載されたいくつものアッセイを使用して、当業者がさらに評価および確認することができる。エピシフターが疾患状態を調節する有用性は、エピシフターの細胞または生物への直接外因性送達によって評価することができる。エピシフターが疾患状態を調節する有用性は代わりに、エピシフター（例えばエピシフターのレベルまたは活性）を直接調節する分子の発生によって評価することができる。エピシフターが疾患状態を調節する有用性はまた、エピシフターと同じ経路に配置された（例えばＲＮＡまたはタンパク質レベルで調節される）遺伝子などの他の分子を調節することによる、エピシフター（例えばエピシフターのレベルまたは活性）を間接的に調節する分子の発生によって評価することができる。
【０１１５】
本明細書に記載するエピメタボローム手法は、細胞微小環境に存在し、そのレベルが遺伝子機構、ｍＲＮＡ機構、またはタンパク質ベース機構を通じて検知および管理される内因性分子の同定を容易にする。本発明のエピシフターが引き起こす、正常細胞で見出される調節応答経路は、誤調節または疾患細胞環境における治療価値を提供し得る。加えて、本明細書に記載するエピメタボリック手法は、臨床患者選択における、疾患診断キットにおける、または予後指標としての使用のための診断指示を提供し得るエピシフターを同定する。
【０１１６】
ある実施形態において、本明細書で開示するＭＩＭおよびエピシフターは、栄養補助食品として慣習的に使用されているものを除く。ある実施形態において、本明細書で開示されるこれらのＭＩＭおよび／またはエピシフターは製薬グレードである。ある実施形態において、製薬グレードのＭＩＭおよび／またはエピシフターは、約９５％と約１００％の間の純度を有し、９５％と１００％の間のすべての値を含む。ある実施形態において、ＭＩＭおよび／またはエピシフターの純度は、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９または１００％である。ある実施形態において、ＭＩＭおよび／またはエピシフターは、内毒素を含まない。他の実施形態においては、ＭＩＭＳおよび／またはエピシフターは外来のタンパク質物質を含まない。ある実施形態において、ＭＩＭおよび／またはエピシフターはＣｏＱ１０である。
【０１１７】
ＩＩＩ．ＭＩＭ／エピシフターを同定するのに有用なアッセイ
目的の分子および化合物を分離および同定するために用いた本発明の技法および方法は、限定されるわけではないが：液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、フーリエ変換赤外（ＦＴ−ＩＲ）、および誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）を含む。質量分析技法は、限定されるわけではないが、扇形磁場２重収束型装置、透過型４重極装置、４重極イオントラップ型装置、飛行時間型装置（ＴＯＦ）、フーリエ変換サイクロトロン共鳴型装置（ＦＴ−ＭＳ）およびマトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）の使用を含むことが、さらに理解される。
【０１１８】
生体エネルギー分子レベルの定量：
環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、候補エピシフターが適用された細胞の細胞生体エネルギー分子レベル（例えばＡＴＰ、ピルビン酸、ＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＰ、アセチルＣｏＡ、ＦＡＤＨ２）の変化によって同定され得る。生体エネルギー分子レベルの例示的なアッセイは、比色（ｃｏｌｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）、蛍光、および／または生物発光ベースの方法を使用する。このようなアッセイの例は下で提供される。
【０１１９】
細胞内のＡＴＰのレベルは、当分野で公知のいくつかのアッセイおよび系を用いて測定することができる。例えば１つの系において、溶解細胞から放出された細胞質ＡＴＰは、ルシフェリンおよび酵素ルシフェラーゼと反応して、光を産生する。本生物発光はバイオルミノメータによって測定され、溶解細胞の細胞内ＡＴＰ濃度を計算することができる（ＥｎｚｙＬｉｇｈｔ（商標）ＡＴＰアッセイキット（ＥＡＴＰ−１００）、ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡＣＡ）。別の系において、例えばＡＴＰおよびその脱リン酸化型のＡＤＰの両方が生物発光を介して計算される；ＡＴＰレベルが計算された後、ＡＤＰはＡＴＰに変換されて、次に同じルシフェラーゼ系（ＡｐｏＳＥＮＳＯＲ（商標）ＡＤＰ／ＡＴＰ比アッセイキット、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して検出および計算される。
【０１２０】
ピルベートは、細胞代謝経路において重要な中間体である。ピルベートは、細胞の代謝状態に応じて、糖新生を介して炭水化物に変換され得るか、アセチルＣｏＡを介して脂肪酸に変換もしくは代謝され得るか、またはアラニンもしくはエタノールに変換され得る。それゆえピルベートレベルの検出は、細胞試料の代謝性活性および状態の尺度を提供する。ピルベートを検出する１つのアッセイは例えば、比色および蛍光定量の両方を使用して、異なる範囲内でのビルベート濃度を検出する（ＥｎｚｙＣｈｒｏｍ（商標）ピルビン酸アッセイキット（カタログ番号ＥＰＹＲ−１００）、ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）。
【０１２１】
環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、細胞中での生体エネルギー分子の発生および維持に関与している細胞中のミトコンドリアによって行われる、酸化的リン酸化のプロセスに影響を及ぼし得る。細胞培養物および試料の細胞エネルギー特性の変化を直接検出するアッセイ（後述する）に加えて、細胞中のミトコンドリアの別々の酵素および複合体に対する化合物の効果を検出および定量するアッセイが存在する。例えばＭＴ−ＯＸＣ  ＭｉｔｏＴｏｘ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＯＸＰＨＯＳ活性アッセイ（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）は、ミトコンドリアから抽出された複合体Ｉ〜Ｖに直接適用された化合物の効果を検出および定量することができる。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（複合体Ｉ）、シトクロムｃオキシダーゼ（複合体ＩＶ）およびＡＴＰシンターゼ（複合体Ｖ）などの個別のミトコンドリア複合体に対する効果の検出および定量のアッセイも利用可能である（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。
【０１２２】
細胞エネルギー特性の測定：
環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、細胞エネルギー特性の変化によっても同定され得る。細胞エネルギー特性の測定の１例は、分子酸素の消費および／または細胞培養物の培地のｐＨの変化のリアルタイム測定である。例えば潜在的エピシフターが細胞の代謝状態を調節する能力は、例えばＸＦ２４アナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ，Ｉｎｃ．）を使用して分析され得る。本技術によって、細胞微小環境の生体エネルギーを評価するための、細胞の単層における酸素およびｐＨ変化のリアルタイム検出が可能となる。ＸＦ２４アナライザは、どちらも細胞エネルギー特性の主要な指標である、好気性代謝の尺度である酸素消費速度（ＯＣＲ）および解糖の尺度である細胞外酸化（ＥＣＡＲ）を測定および比較する。
【０１２３】
酸化的リン酸化およびミトコンドリア機能の測定
酸化的リン酸化は、ミトコンドリアの膜に埋め込まれたタンパク質複合体を介して真核生物中で行われる栄養化合物の酸化を介して、ＡＴＰが発生されるプロセスである。大半の生物の細胞における主なＡＴＰ源として、酸化的リン酸化活性の変化は、細胞内での代謝およびエネルギーバランスを強力に改変することができる。本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、酸化的リン酸化に対するその効果によって検出および／または同定され得る。いくつかの実施形態において、環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、限定されるわけではないが、電子輸送鎖およびＡＴＰ合成を含む、酸化的リン酸化の特異的な態様に対するその効果によって検出および／または同定され得る。
【０１２４】
酸化的リン酸化に関与するプロセスを行うミトコンドリア膜埋込みタンパク質複合体は、特異的タスクを実行し、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶとナンバリングされる。これらの複合体は、内膜貫通膜ＡＴＰシンターゼ（複合体Ｖとしても公知）と共に、酸化的リン酸化プロセスに関与する主要な実体である。環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）の、一般にミトコンドリア機能、および特に酸化的リン酸化プロセスに対する効果を検査できるアッセイに加えて、個別の複合体に対するエピシフターの効果を、他の複合体と別に検査するために使用できるアッセイが利用可能である。
【０１２５】
ＮＡＤＨ−コエンザイムＱオキシドレダクターゼまたはＮＡＤＨデヒドロゲナーゼとしても公知の複合体Ｉは、電子輸送鎖中の第１のタンパク質である。いくつかの実施形態において、複合体ＩによるＮＡＤ＋の産生に対するエピシフターの効果の検出および定量が行われ得る。例えば複合体は、９６ウェルプレート中の試料から免疫捕捉することができる；ＮＡＤＨからＮＡＤ＋への酸化は、４５０ｎＭにて吸光度の上昇を有する染料分子の還元と同時に起こる（複合体Ｉ酵素活性マイクロプレート・アッセイ・キット、ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。
【０１２６】
シトクロムｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）としても公知の複合体ＩＶは、電子輸送鎖中の最後のタンパク質である。いくつかの実施形態において、シトクロムｃの酸化および複合体ＩＶによる酸素の水への還元に対するエピシフターの効果の検出および定量が行われ得る。例えばＣＯＸをマイクロウェルプレート中で免疫捕捉して、ＣＯＸの酸化を比色アッセイ（複合体ＩＶ酵素活性マイクロプレート・アッセイ・キット、ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）によって測定することができる。
【０１２７】
酸化的リン酸化プロセスの最後の酵素は、他の複合体によって生成されたプロトン勾配を使用して、ＡＤＰからのＡＴＰの合成を促進する、ＡＴＰシンターゼ（複合体Ｖ）である。いくつかの実施形態において、ＡＴＰシンターゼの活性に対するエピシフターの効果の検出および定量が行われ得る。例えば試料中のＡＴＰシンターゼの活性およびＡＴＰシンターゼの量はどちらも、マイクロウェル・プレート・ウェル中で免疫捕捉されたＡＴＰシンターゼについて測定され得る。酵素は、ある条件下でＡＴＰアーゼとしても機能することができ、それゆえＡＴＰシンターゼ活性についての本アッセイにおいて、ＡＴＰがＡＤＰに還元される速度は、ＮＡＤＨのＮＡＤ＋への同時酸化を検出することによって測定される。ＡＴＰの量は、ＡＴＰアーゼに標識された抗体を使用して計算される（ＡＴＰシンターゼ・デュプレクシング（活性＋量）マイクロプレート・アッセイ・キット、ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。酸化的リン酸化の追加のアッセイは、複合体ＩＩおよびＩＩＩの活性に対する効果を試験するアッセイを含む。例えばＭＴ−ＯＸＣ  ＭｉｔｏＴｏｘ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＯＸＰＨＯＳシステム（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用して、複合体ＩＩおよびＩＩＩならびに複合体Ｉ、ＩＶおよびＶに対する効果を評価し、酸化的リン酸化系全体に対する化合物の効果についてのデータを提供することができる。
【０１２８】
上記のように、無処置細胞試料のリアルタイム観察は、細胞培養培地における酸素消費およびｐＨの変化のためのプローブを使用して行うことができる。細胞エネルギー特性のこれらのアッセイは、ミトコンドリア機能の大まかな概要および試料の細胞内のミトコンドリアの活性に対する潜在的環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）の効果を提供する。
【０１２９】
環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、ミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）の形成のために透過性の上昇を経験する現象である、ミトコンドリア膜透過性遷移（ＭＰＴ）にも影響を及ぼし得る。ミトコンドリア透過性の上昇は、ミトコンドリア膨潤、すなわち酸化的リン酸化およびＡＴＰ発生および細胞死の実行不能をもたらすことができる。ＭＰＴは、アポトーシスの誘導に関与し得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Ｈａｌｅｓｔｒａｐ，Ａ．Ｐ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３４：２３２−２３７（２００６）およびＬｅｎａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄ．７：１３−２６（２００９）を参照）。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、ＭＰＴおよびＭＰＴＰの形成、中断および／または遂行に対する環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）の効果の検出および定量が測定される。例えばアッセイは、ミトコンドリアおよび他のサイトゾルコンパートメントの内膜内に局在する特殊化染料分子（カルセイン）の使用を通じて検出することができる。別の分子、ＣｏＣｌ２の適用は、サイトゾル中でのカルセイン染料の蛍光をスケルチするよう働く。しかしＣｏＣｌ２はミトコンドリア内部にアクセスできず、それゆえＭＰＴが起こって、ＣｏＣｌ２がＭＰＴＰを介してミトコンドリア内部にアクセスできない限り、ミトコンドリア中のカルセイン蛍光はスケルチされない。ミトコンドリア特異的蛍光シグナルの消失は、ＭＰＴの発生を通知する。フローサイトメトリが使用されて、細胞および細胞小器官の蛍光を評価することができる（ＭｉｔｏＰｒｏｂｅ（商標）遷移孔アッセイキット、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。追加のアッセイは、実験結果を評価するために蛍光顕微鏡を利用する（Ｉｍａｇｅ−ｉＴ（商標）ＬＩＶＥミトコンドリア遷移孔アッセイキット、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。
【０１３１】
細胞増殖および炎症の測定
本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、細胞増殖および／または炎症に関連する分子の産生または活性に対するその影響によって同定および評価され得る。これらの分子は、限定されるわけではないが、サイトカイン、成長因子、ホルモン、細胞外マトリクスの構成要素、ケモカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ニューロトロフィンおよび細胞シグナル伝達に関与する他の分子、ならびにシグナル伝達に関与する細胞内分子などの細胞内分子を含む。
【０１３２】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、強力な血管新生特性、血管特性および分裂促進特性を有する成長因子である。ＶＥＧＦは内皮透過性および膨潤を刺激し、ＶＥＧＦ活性は、関節リウマチ、転移性癌、老年性黄斑変性および糖尿病性網膜症を含む多数の疾患および障害に関わっている。
【０１３３】
本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、ＶＥＧＦの産生に対するその効果によって同定および特徴付けされ得る。例えば低酸素条件またはアシドーシスを模倣する条件で維持された細胞は、ＶＥＧＦ産生の向上を呈するであろう。培地中に分泌されたＶＥＧＦは、ＥＬＩＳＡまたは、利用可能な抗ＶＥＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用する他の抗体ベースアッセイを使用してアッセイすることができる。本発明のいくつかの実施形態において、エピシフターは、細胞のＶＥＧＦへの応答性に対するその効果に基づいておよび／またはＶＥＧＦ受容体の発現もしくは活性に対するその効果に基づいて同定および／または特徴付けされ得る。
【０１３４】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、健常免疫系機能ならびに自己免疫疾患の両方に関わり、炎症および免疫系活性化の主要なメディエータである。本発明のいくつかの実施形態において、エピシフターは、ＴＮＦの産生または活性に対するその効果によって同定および特徴付けされ得る。例えば培養細胞により産生され、培地中に分泌されたＴＮＦは、ＥＬＩＳＡおよび当分野で公知の他の抗体ベースアッセイを介して定量することができる。さらに、いくつかの実施形態において、環境影響因子は、ＴＮＦの受容体（ヒトＴＮＦ  ＲＩ  Ｄｕｏｓｅｔ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）の発現に対するその効果によって同定および特徴付けされ得る。
【０１３５】
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の構成要素は、細胞および組織の構造ならびにシグナル伝達プロセスの両方において役割を果たす。例えば潜在型形質転換成長因子ベータ結合タンパク質は、ＥＣＭ内に形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）のリザーバを生成するＥＣＭ構成要素である。マトリクス結合ＴＧＦβは、マトリクス再構築のプロセスの間に放出され、付近の細胞に成長因子効果を及ぼすことができる（Ｄａｌｌａｓ，Ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３９：２３１−２４３（２０００））。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、培養された細胞のＥＣＭの生成に対するその効果によって同定および特徴付けされ得る。研究者らは、細胞によるＥＣＭの生成、ならびにＥＣＭの組成を研究および定量することができる技法を開発してきた。例えば細胞によるＥＣＭの合成は、インキュベーションの前に細胞をハイドロゲルに埋込むことによって評価することができる。細胞によって発生したＥＣＭに対する生化学的分析および他の分析は、細胞収集およびハイドロゲルの消化の後に遂行される（Ｓｔｒｅｈｉｎ，Ｉ．ａｎｄ  Ｅｌｉｓｓｅｅｆｆ，Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．５２２：３４９−３６２（２００９））。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、生物中のＥＣＭまたはその構成要素の１つの産生、状態または欠失に対する環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）の効果は同定および特徴付けされ得る。別々の種類の細胞中でまたは発生のあるステージにおいてのみ特定のＥＣＭ遺伝子のノックアウトを可能にする条件的ノックアウト（ＫＯ）マウスを生成する技法が開発されている（Ｂｒａｎｃａｃｃｉｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ．５２２：１５−５０（２００９））。特定の組織中でまたは発生の特定のステージにおける特定のＥＣＭ構成要素の活性または非存在に対するエピシフターまたは潜在的エピシフターの適用または投与の効果は、それゆえ評価され得る。
【０１３８】
原形質膜完全性および細胞死の測定
環境影響因子（例えばＭＩＭまたはエピシフター）は、細胞死の見込みの上昇または低下を証明する、アポトーシス、壊死もしくは細胞変化を受ける細胞試料の原形質膜完全性の変化および／または細胞の数もしくはパーセンテージの変化によって同定され得る。
【０１３９】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）のアッセイは、細胞ステータスおよび損傷のレベルの測定を提供することができる。ＬＤＨは、安定で比較的豊富な細胞質酵素である。原形質膜が物理的完全性を失うとき、ＬＤＨは細胞外コンパートメントへ逃れる。ＬＤＨのより高い濃度は、原形質膜損傷および細胞死のより高いレベルと相関する。ＬＤＨアッセイの例は、試料中のＬＤＨのレベルを検出および定量する比色系を使用し、テトラゾリウム塩の還元型がＬＤＨ酵素の活性を介して産生されるアッセイを含む（ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（商標）乳酸デヒドロゲナーゼキット（ＤＬＤＨ−１００）、ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ；ＬＤＨ細胞傷害性検出キット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）。
【０１４０】
アポトーシスは、多種多様の異なる開始イベントを有し得るプログラムされた細胞死のプロセスである。いくつかのアッセイを使用して、アポトーシスを受ける細胞の速度および／または数の変化を検出することができる。アポトーシスを検出および定量するために使用される１種類のアッセイは、カスパーゼ（ｃａｐａｓｅ）アッセイである。カスパーゼ（Ｃａｐａｓｅ）は、アポトーシスの間のタンパク質分解切断を介して活性化される、アスパラギン酸特異的システインプロテアーゼである。活性化カスパーゼ（ｃａｐａｓｅ）を検出するアッセイの例は、ＰｈｉＰｈｉＬｕｘ（登録商標）（ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｉｎ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）およびＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む。比較試料中でアポトーシスを受けている細胞のパーセンテージまたは数の変化を検出できる追加のアッセイは、ＴＵＮＥＬ／ＤＮＡ断片化アッセイを含む。これらのアッセイは、アポトーシスの実行段階の間にヌクレアーゼによって発生した１８０〜２００塩基対ＤＮＡフラグメントを検出する。例示的なＴＵＮＥＬ／ＤＮＡ断片化は、インサイチュ細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）およびＤｅａｄＥｎｄ（商標）比色および蛍光定量ＴＵＮＥＬシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む。
【０１４１】
いくつかのアポトーシスアッセイは、アポトーシスおよび／または非アポトーシス状態に関連するタンパク質を検出および定量する。例えばＭｕｌｔｉＴｏｘ−Ｆｌｕｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）は、単一基質の蛍光定量（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）システムを使用して、生細胞および死細胞に特異的なプロテアーゼを検出および定量し、それゆえ細胞または組織試料における生細胞の、アポトーシスを受けた細胞に対する比を提供する。
【０１４２】
アポトーシスを検出または定量するために利用可能な追加のアッセイは、細胞透過性（例えばＡＰＯＰｅｒｃｅｎｔａｇｅ（商標）アポトーシスアッセイ、Ｂｉｏｃｏｌｏｒ、ＵＫ）およびアネキシンＶについてのアッセイ（例えばアネキシンＶ−ビオチンアポトーシス検出キット、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を含む。
【０１４３】
ＩＶ．代謝性障害の治療
いくつかの実施形態において、本発明の化合物、本明細書に記載する例えば環境影響因子、例えばＭＩＭまたはエピシフターは、それを必要とする対象においてコエンザイムＱ１０応答性状態を治療するために使用され得る。言語「コエンザイムＱ１０反応性状態」または「ＣｏＱ１０反応性状態」には、コエンザイムＱ１０の投与により治療する、予防する、または別の意味で緩和することができる疾患、障害、状態、および／または症状が含まれる。いずれかの特定の理論によって拘束されることを望むものではなく、本明細書でさらに記載されるように、細胞微小環境への代謝シフト、例えば正常状態細胞における酸化的リン酸化の種類および／またはレベルに向けたシフトを誘導することによって、少なくとも部分的に機能することが考えられる。したがって、いくつかの実施形態において、ＣｏＱ１０応答性状態は、細胞微小環境の代謝の改変から生じる状態である。一実施形態において、ＣｏＱ１０応答性障害は代謝性障害である。コエンザイムＱ１０応答性状態は、例えば肥満、糖尿病、糖尿病前症、メタボリックシンドローム、満腹、および内分泌異常などの代謝性障害を含む。コエンザイムＱ１０応答性状態は、本明細書に記載するような他の代謝性障害をさらに含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、本発明の化合物、例えば本明細書に記載するＭＩＭまたはエピシフターは、コエンザイムＱ１０と共通の活性を共有する。本明細書で使用する場合、「コエンザイムＱ１０と共通の活性を共有する」という句は、化合物がコエンザイムＱ１０と同じまたは類似の活性の少なくとも一部を呈する能力を指す。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コエンザイムＱ１０の活性の２５％またはそれ以上を呈する。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コエンザイムＱ１０の活性の最大約１３０％（１３０％を含む）を呈する。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コエンザイムＱ１０の活性の約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、または１３０％を呈する。本段落に挙げられた各値が「約」という用語によって修飾され得ることが理解される。加えて、本段落に挙げられたいずれの２つの値によって定義されたいずれの範囲も、本発明に含まれることを意味することが理解される。例えばいくつかの実施形態において、本発明の化合物は、コエンザイムＱ１０の活性の約５０％〜約１００％を呈する。いくつかの実施形態において、コエンザイムＱ１０および本発明の化合物によって共有される活性は、細胞代謝におけるシフトを誘導する能力である。ある実施形態において、ＣｏＱ１０および本発明の化合物はによって共有される活性は、ＯＣＲ（酸素消費速度）および／またはＥＣＡＲ（細胞外酸性化速度）によって測定される。
【０１４５】
本発明は、哺乳動物のＣｏＱ１０応答性障害を治療する、ＣｏＱ１０応答性障害の症状を緩和する、ＣｏＱ１０応答性障害の進行を阻害する、またはＣｏＱ１０応答性障害を予防する方法であって、少なくとも１つの環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）を含む治療的有効量の医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含み、環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常な生理学的条件下にて哺乳動物の正常細胞中で観察された解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルへの細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する方法を提供する。
【０１４６】
本発明は、哺乳動物の代謝性障害を治療する、代謝性障害の症状を緩和する、代謝性障害の進行を阻害する、または代謝性障害を予防する方法であって、少なくとも１つの環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）を含む治療的有効量の医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含み、環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常化されたミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する方法をさらに提供する。
【０１４７】
本発明は、代謝性障害の治療を必要とする哺乳動物の疾患細胞においてミトコンドリア酸化的リン酸化を選択的に増強する方法であって、少なくとも１つのｅｎｖ影響因子を含む治療的有効量の医薬組成物を前記哺乳動物に投与して、これにより哺乳動物の前記疾患細胞にてミトコンドリア酸化的リン酸化を選択的に増強することを含む方法をさらに提供する。
【０１４８】
本発明は、ヒトの代謝性障害を治療または予防する方法であって、環境影響因子を代謝性障害を治療または予防するのに十分な量でヒトに投与して、これにより代謝性障害を治療または予防することを含む方法をさらに提供する。
【０１４９】
本発明は、ヒトの代謝性障害を治療または予防する方法であって、代謝性障害に罹患しているヒト対象を選択することと、グルコースの嫌気的使用の遮断およびミトコンドリア酸化的リン酸化の増強が可能であるｅｎｖ影響因子の治療的有効量を前記ヒトに投与して、これにより代謝性障害を治療または予防することとを含む方法をさらに提供する。
【０１５０】
本発明は、ヒトの代謝性障害を治療または予防する方法であって、環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）を代謝性障害を治療または予防するのに十分な量でヒトに投与することを含み、環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）が治療の間にその酸化型が維持されるように投与され、これにより代謝性障害を治療または予防する方法をなおさらに提供する。
【０１５１】
「代謝性障害」とは、患者の代謝の改変から生じるいずれの病的症状も意味する。このような障害には、異常な全身グルコース、脂質および／またはタンパク質の代謝、ならびにそこから発生する病理学的な結果に関連するものが含まれる。代謝性障害には、例えば、高血糖を生じる、グルコース恒常性の変化から生じるものが含まれる。本発明に従うと、グルコースレベルの変化は、典型的には、健常個体におけるこのようなレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％さえのグルコースレベルの増加である。代謝性障害は細胞増殖、成長、分化、または移動、恒常性の細胞調節、細胞内もしくは細胞間の連絡；組織機能、例えば、肝臓機能、筋肉機能、または脂肪細胞機能；生物における全身性応答、例えば、ホルモン応答（例えば、インスリン応答）などの細胞機能に有害な影響を与え得る。代謝性障害には、肥満、糖尿病（本明細書では真性糖尿病ともいわれる）（例えば、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、ＭＯＤＹ、および妊娠性糖尿病）、前糖尿病、メタボリックシンドローム、満腹、および、例えば、加齢からくる内分泌異常が含まれるがこれらに限定されない。代謝性障害のさらなる例には、過食症、食欲不振、トリグリセリド貯蔵疾患、バルデー−ビードル症候群、ローレンス−ムーン症候群、プラーダ−ラブハート−ウィリー症候群、カーンズ−セイヤー症候群、拒食症、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損、および悪液質が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、代謝性障害はコエンザイムＱ１０応答性状態である。
【０１５２】
「代謝性障害を治療、減少、または予防する」により、このような状態を、それが起こる前または起こった後で緩和することが意味される。等価な未処置対照と比較した場合に、このような減少または予防の程度は、任意の標準的な技術によって測定されるように、少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、または１００％である。
【０１５３】
真性糖尿病は、血糖の慢性的な上昇（高血糖）をもたらす代謝性疾患の異質な一群である。糖尿病は、グルコース調節の損失をもたらす、膵島の破壊または機能不全によって特徴付けられる。２つの主要な型の真性糖尿病は、「インスリン依存性糖尿病」（「ＩＤＤＭ」）または「若年発症型糖尿病」としてもまた知られるＩ型糖尿病、および「インスリン非依存性糖尿病」（「ＮＩＤＤＭ」）または「成人発症型糖尿病」としてもまた知られるＩＩ型糖尿病である。
【０１５４】
「Ｉ型糖尿病」は、高血糖症を生じるインスリン産生の結果的な消失を伴う、膵臓ベータ細胞の自己免疫媒介破壊から発生する症状を指す。Ｉ型糖尿病は、生存を確実にするために、インスリン補充療法を必要とする。注射用インスリンおよび経口血糖降下薬などの医薬は、糖尿病患者をより長く生かすことを可能にするが、糖尿病は、心臓病および癌に次ぐ第３の主要な死亡要因のままである。しかし、これらの医薬は、高血糖レベルと低血糖レベルの間の揺れを妨害するために完全に十分な血糖レベルを制御せず、腎臓、眼、および血管に損傷を生じる。糖尿病のコントロールと合併症に関する臨床試験（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｔｒｉａｌ）（ＤＣＣＴ）は、血糖の強烈な制御が、１日あたり１回もしくは２回のインスリン注射からなる従来の治療と比較して、網膜症、腎症、および神経障害などの糖尿病の合併症を有意に遅延することを示す。ＤＣＣＴにおける強烈な治療は、１日あたり３回以上のインスリンの複数注射、または外部ポンプによる連続皮下インスリン注入（ＣＳＩＩ）を含んだ。インスリンポンプは、インスリンの生理学的置き換えに近似するために皮下の複数毎日注射（ＭＤＩ）に対する種々の代替的アプローチの１つである。
【０１５５】
「２型糖尿病」とは、患者が１２５ｍｇ／ｄｌ（６．９４ｍｍｏｌ／Ｌ）よりも高い空腹時血糖または血清グルコースの濃度を有する状態をいう。ＩＩ型糖尿病は、正常レベルより高レベルの血漿インスリンの存在下で高血糖によって特徴付けられ、すべての症例の９０％より多くを表し、最も頻繁には過体重の４０歳より上の成人で起こる。ＩＩ型糖尿病の進行は血糖の濃度の増加と関連し、グルコース誘導性インスリン分泌の速度の相対的な減少と連動している。ＩＩ型糖尿病において、炭水化物代謝を制御する組織プロセスは、インスリンに対する感受性の減少を有すると考えられており、それゆえに、インスリン産生の欠如からは起こらず、血中のグルコースレベルの増加に対する感受性の減少およびインスリンを産生することによって応答する能力のなさから起こる。あるいは、糖尿病は、インスリンの標的細胞上でのインスリンの作用を媒介する分子機構における種々の欠損、例えば、それらの細胞表面上のインスリン受容体の欠如から生じるのかもしれない。それゆえに、ＩＩ型糖尿病の治療は、頻繁にはインスリンの投与を必要としないが、例えば、スルホニルウレアなどの経口血糖降下薬を用いる治療によって増強される、食事およびライフスタイルの変化に基づいてもよい。
【０１５６】
「前糖尿病」とは、患者が２型糖尿病を発症しやすい状態をいう。前糖尿病は、損なわれた耐糖能の定義を拡張し、１００ｍｇ／ｄＬ以上の高い正常範囲内での空腹時血糖（Ｍｅｉｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００３  ５２：１４７５−１４８４）および空腹時高インスリン血（血漿インスリン濃度の上昇）を有する個体を含む。
【０１５７】
「肥満」とは、患者が３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する症状を指す。「内臓型肥満」とは、男性患者では１．０、女性患者では０．８のウエスト対ヒップ比率をいう。別の態様において、内臓肥満は、インスリン抵抗性および前糖尿病の発症のリスクを規定する。
【０１５８】
「過体重」は、２５ｋｇ／ｍ２を超えて３０ｋｇ／ｍ２未満のＢＭＩを有する患者を指す。「体重増加」とは、行動の習慣もしくは嗜癖、例えば、過食もしくは暴食、禁煙と関連した、または生物学的な（生命の）変化、例えば、男性における加齢および女性における閉経に伴う体重増加、もしく妊娠後の女性の体重増加と関連した、体重の増加をいう。
【０１５９】
Ｘ症候群とも呼ばれる「メタボリックシンドローム」（ＭＳ）は、身体における他の経路および系に影響を与える代謝性障害をいう。もともと、メタボリックシンドロームは、心臓血管疾患を強化するように相乗作用する一群の代謝性障害（肥満、インスリン抵抗性、高血圧、および異常脂質血症、主に高トリグリセリド血症）として定義された。より最近では（２００１）、米国コレステロール教育プログラム（ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＮＣＥＰ）は、以下の５つの判断基準からのいずれか３つに合致するものとして「メタボリックシンドローム」を分類した：少なくとも１１０ｍｇ／ｄＬの空腹時グルコースレベル、少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬの血漿トリグリセリドレベル（高トリグリセリド血症）、男性においては４０ｍｇ／ｄｌよりも下、女性においては５０ｍｇ／ｄｌよりも下のＨＤＬコレステロール、少なくとも１３０／８５ｍｍＨｇの血圧（高血圧）、および中心性肥満、中心性肥満は男性では４０インチより上、女性では３５インチよりも上の含む腰周りとして定義される。現在のところ、メタボリックシンドロームについて国際的に認められている定義が以下のように他に３つ存在する：１）世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）２）米国心臓協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）／国立心肺血液研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＡＨＡ／ＮＨＬＢＩ）および３）国際糖尿病連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ）（ＩＤＦ）。ＷＨＯ、ＡＨＡ／ＮＨＬＢＩ、およびＩＤＦによるメタボリックシンドロームの定義はＮＥＣＰの定義と非常に類似しており、すべてがこの症候群を定義するために同じ代謝パラメーターを使用しているが、ＷＨＯはまた、空腹時インスリンレベルの評価も含んでいる（Ｍｏｅｂｕｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｙ，  ６：１−１０，２００７；Ａｔｈｙｒｏｓ  Ｖ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，１１７：２０４−２１０，２００７）。これらの異なる定義の中でこの症候群を有するとして分類される必要があるこれらの代謝パラメーターについての閾値のさらにわずかな違いは、これらの異なる定義に従うと、この症候群を有するか、または有さないという特定の対象の異なる分類を生じ得る。また、ＭＳを伴う心臓血管疾患（ＣＶＤ）の有病率は使用される定義によって変動する。（Ｍｏｅｂｕｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｙ，６：１−１０，２００７；Ａｔｈｙｒｏｓ  Ｖ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，１１７：２０４−２１０，２００７）。米国糖尿病学会（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）は、過体重５人のうち１人がメタボリックシンドロームに苦しんでいると見積もっている。
【０１６０】
他の態様において、メタボリックシンドロームは、Ｘ症候群、インスリン抵抗性症候群、インスリン抵抗性高血圧、代謝高血圧症候群、代謝異常症候群を含むがこれらに限定されない、受け入れられている同義語によって説明される。メタボリックシンドロームの構成要素には、耐糖能異常、損なわれた耐糖能、損なわれた空腹時血清グルコース、損なわれた空腹時血糖、高インスリン血症、前糖尿病、肥満、内臓型肥満、高トリグリセリド血症、遊離脂肪酸の血清濃度の上昇、Ｃ反応性タンパク質の血清濃度の上昇、リポタンパク質の血清濃度の上昇、ホモシステインの血清濃度の上昇、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）−コレステロールの血清濃度の上昇、リポタンパク質関連ホスホリパーゼ（Ａ２）の血清濃度の上昇、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）−コレステロールの血清濃度の減少、ＨＤＬ（２ｂ）−コレステロールの血清濃度の減少、アディポネクチンの血清濃度の減少、およびタンパク尿が含まれるがこれらに限定されない（以下を参照のこと：Ｐｅｒｓｈａｄｓｉｎｇｈ  ＨＡ．Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ：  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｂｅｙｏｎｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ：ｑｕｏ  ｖａｄｉｓ？Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．（２００４）１３：２１５−２８、およびそこに引用される参考文献）。
【０１６１】
前述の代謝性障害の「主要な要素」には、空腹時血糖異常、耐糖能異常、腹囲増加、内臓脂肪量増加、空腹時血漿グルコースの増加、空腹時血漿トリグリセリドの増加、空腹時高密度リポタンパク質レベルの低下、血圧の上昇、インスリン抵抗性、高インスリン血症、心血管疾患（またはその構成要素、例えば、動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢血管疾患、または脳血管疾患）、うっ血性心不全、血漿ノルエピネフリンの上昇、心血管関連炎症因子の上昇、血管内皮機能障害を増強する血漿因子の上昇、高リポタンパク血症、動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症、過食症、高血糖症、高脂血症、および高血圧症または高血圧症、食後血漿トリグリセリドレベルまたは遊離脂肪酸レベルの上昇、細胞酸化ストレスまたはその血漿指標の上昇、循環過凝固状態の増加、肝臓脂肪症、肝臓脂肪症（ｈｅｔａｐｔｉｃ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、腎不全および腎機能不全が含まれるがこれらに限定されない。
【０１６２】
「インスリン抵抗性」とは、グルコース負荷への通常の応答を超えている循環インスリンレベルが正常血糖状態を維持するために必要とされる状態をいう（Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ．２００２，  ２８７：３５６−９）。インスリン抵抗性および治療に対してインスリン抵抗性を有する患者の応答は、インスリン抵抗性の信頼できる指標である、インスリン抵抗性に対する恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）スコアを評価することによって定量されてもよい（Ｋａｔｓｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２００１，２４：３６２−５）。恒常性評価モデル（ＨＯＭＡ）−ＩＲスコアによるインスリン抵抗性の見積もりはＧａｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔ  Ｍｅｄ  １９９２，９：９２１−８において開示されている式、ＨＯＭＡ−ＩＲ＝［空腹時血清インスリン（μＵ／ｍＬ）］×［空腹時血漿グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）／２２．５］によって計算されてもよい。
【０１６３】
「高インスリン血症」は、対象が、インスリン抵抗性を有し、正常血糖を有するかまたは有さず、空腹時または食後血清または血漿インスリン濃度が正常のインスリン抵抗性を有さないやせた個体のそれよりも上に上昇しており、＜１．０（男性）または＜０．８（女性）のウエスト対ヒップ比率を有する状態として定義される。
【０１６４】
「耐糖能異常」（ＩＧＴ）という用語は、耐糖能試験が行われたときに、正常と高血糖の間に含まれる血糖レベルを有する人を説明するために使用される。このような人は、彼らが糖尿病であると考えられていないにも関わらず、糖尿病を発症するリスクがより高い。例えば、耐糖能異常とは、患者が１１０ｍｇ／ｄｌより大きくかつ１２６ｍｇ／ｄｌ（７．００ｍｍｏｌ／Ｌ）未満の空腹時血糖濃度もしくは空腹時血清グルコース濃度、または１４０ｍｇ／ｄｌ（７．７８ｍｍｏｌ／Ｌ）より大きくかつ２００ｍｇ／ｄｌ（１１．１１ｍｍｏｌ／Ｌ）未満の食事２時間後の血糖もしくは血清グルコース濃度を有する状態をいう。
【０１６５】
「高血糖症」（高い血液糖類）の状態は、血糖レベルが高すぎる状態である。典型的には、高血糖は、血糖レベルが１８０ｍｇ／ｄｌより上に上昇するときに起こる。高血糖の徴候には、頻尿、過度の口渇、およびより長い時間スパンでは、体重減少が含まれる。
【０１６６】
「低血糖症」（低い血液糖類）の状態は、血糖レベルが低すぎる状態である。典型的には、低血糖は、血糖レベルが７０ｍｇ／ｄｌよりも下に低下するときに起こる。低血糖の徴候には、不機嫌、四肢の無感覚（とりわけ、手および腕）、錯乱、身震い、または眩暈が含まれる。この状態は利用可能な量を超えた過度のインスリンが存在する場合に生じるので、これは、時折、インスリン反応といわれる。
【０１６７】
（ｉ）代謝性障害の診断
本発明の方法および組成物は、糖尿病などの代謝性障害と診断された、または代謝性障害を有するリスクに瀕している、いずれの患者も治療するのに有用である。代謝性障害（例えば、糖尿病または肥満）の発症が予防される患者は、このような診断を受けてもよいし、受けなくてもよい。当業者は、本発明の患者が標準的な試験に供されてもよく、または１つ以上のリスク要因の存在に起因して高いリスクがある患者であるとして、検査なしで同定されてもよいことを理解する。
【０１６８】
代謝性障害の診断は、本明細書に記載する方法などの、当分野で公知のいずれの標準方法を使用しても遂行され得る。糖尿病を診断するための方法は、例えば、米国特許番号６，５３７，８０６号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。糖尿病は、例えば、グルコースおよびケトンレベル（脂肪の分解産物）を測定する尿検査（検尿）；血中のグルコースのレベルを測定する検査；耐糖能検査；および哺乳動物から収集された生物試料（例えば、血液、血清、または尿）中の代謝性障害に特徴的な分子マーカーを検出するアッセイ（例えば、糖尿病の場合においてはヘモグロビンＡｌｃ（ＨｂＡｌｃ）レベルの測定）を使用して診断および監視されてもよい。
【０１６９】
代謝性障害について治療される患者は、医療実務者がこのような状態を有すると診断した人である。診断は、本明細書に記載されているものなどの任意の適切な手段によって実施されてもよい。糖尿病または肥満の発症が予防される患者は、このような診断を受けてもよいし、受けなくてもよい。当業者は、本発明の患者が標準的な検査に供されたかもしれないか、または、家族歴、肥満、特定の民族性（例えば、アフリカ系アメリカ人およびヒスパニック系アメリカ人）、妊娠性糖尿病または９ポンドより重い赤ちゃんの出産、高血圧、肥満または糖尿病の素因がある病理学的状態を有すること、高い血液レベルのトリグリセリド、高い血液レベルのコレステロール、分子マーカーの存在（例えば、自己抗体の存在）、および年齢（４５歳を超える年齢）などの１つ以上のリスク因子の存在に起因して検査なしで高リスクであるとして同定されたかもしれないことを理解する。個体は、彼らの体重が、彼らの身長のために所望される最大体重よりも２０％（女性では２５％）以上である場合に肥満であると考えられる。１００ポンドを超える過体重である成人は、病的に肥満であると考えられる。肥満は、３０ｋｇ／ｍ２を超えるボディマス指数（ＢＭＩ）としても定義される。
【０１７０】
ランダム血漿グルコース検査（１日のうちの任意の時間に採取される）が２００ｍｇ／ｄＬ以上の値を示す場合、空腹時血漿グルコース検査が１２６ｍｇ／ｄＬ以上の値を示す場合（８時間後）、または人が水に溶解された７５グラムのグルコースを含む飲料を消費した２時間後に採取された血液試料中で、経口耐糖能検査（ＯＧＴＴ）が２００ｍｇ／ｄＬ以上の血漿グルコース値を示す場合に、患者は糖尿病のリスクがあるかまたは糖尿病であると診断される可能性がある。ＯＧＴＴは３時間の時間にわたる時間が決められた間隔で血漿グルコースを測定する。望ましくは、本発明に従って治療された糖尿病患者における血漿グルコースのレベルは、１６０〜６０ｍｇ／ｄＬの間、１５０〜７０ｍｇ／ｄＬの間、１４０〜７０ｍｇ／ｄＬの間、１３５〜８０ｍｇ／ｄＬの間、および好ましくは１２０〜８０ｍｇ／ｄＬの間の範囲である。
任意に、２ヶ月および３ヶ月の間の平均血糖レベルを評価するヘモグロビンＡｌｃ（ＨｂＡｌｃ）検査が利用されてもよい。糖尿病ではない人は、典型的には、４％〜６％の間の範囲のＨｂＡｌｃ値を有する。ＨｂＡｌｃの１％毎の増加で、血糖レベルは約３０ｍｇ／ｄＬ増加し、合併症のリスクは増加する。好ましくは、本発明に従って治療される患者のＨｂＡｌｃ値は、９％未満、７％未満、６％未満、および最も好ましくは、約５％まで減少される。したがって、治療される患者のＨｂＡｌｃレベルは、好ましくは、治療の前のこのようなレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上低減される。
【０１７１】
妊娠性糖尿病は、典型的には、ＯＧＴＴの間に測定される血漿グルコース値に基づいて診断される。グルコースレベルは、通常、妊娠の間にはより低いので、妊娠における糖尿病の診断のための閾値は、妊娠の前の同じ人よりも低い。女性が以下の数字のいずれかに合致するかまたはこれを超える２つの血漿グルコースの読み取りを有する場合、彼女は妊娠性糖尿病である：９５ｍｇ／ｄＬの空腹時血漿グルコースレベル、１８０ｍｇ／ｄＬの１時間レベル、１５５ｍｇ／ｄＬの２時間レベル、または１４０ｍｇ／ｄＬの３時間レベル。
【０１７２】
ケトン検査もまた、Ｉ型糖尿病を診断するために利用されてもよい。十分なインスリンがない場合にケトン類は血中に蓄積するので、これらは最終的には尿に蓄積する。高レベルの血中ケトンは、ケトアシドーシスと呼ばれる深刻な状態を生じる可能性がある。
【０１７３】
米国糖尿病協会のガイドラインによれば、２型糖尿病と診断されるためには、個体は、１２６ｍｇ／ｄｌ以上の空腹時血漿グルコースレベル、または２００ｍｇ／ｄｌ以上の２時間経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）血漿グルコース値を有さなければならない（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２６：Ｓ５−Ｓ２０，２００３）。
【０１７４】
前糖尿病と呼ばれる関連状態は、１００ｍｇ／ｄｌより上であるが１２６ｍｇ／ｄｌ未満の空腹時グルコースレベル、または１４０ｍｇ／ｄｌより上であるが２００ｍｇ／ｄｌ未満の２時間ＯＧＴＴ血漿グルコースレベルを有するとして定義される。山のような証拠が、前糖尿病状態が心臓血管疾患を発症するためのリスク因子であり得ることを示唆している（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２６：２９１０−２９１４，２００３）。損なわれた耐糖能または損なわれた空腹時グルコースともまたいわれる前糖尿病は、２型糖尿病、心臓血管疾患、および死亡を発症するための大きなリスク因子である。前糖尿病を効果的に治療することによって、２型糖尿病の発症を予防する治療的介入を開発することに大きな注目が集まってきた（Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，２４：３６２−７１，２００４）。
【０１７５】
肥満（普通、約＞３０ｋｇ／ｍ２のボディマス指数として定義される）は、高インスリン血症、インスリン抵抗性、糖尿病、高血圧症、および脂質異常症などの多種多様の病的症状に関連することが多い。これらの状態の各々は、心臓血管疾患のリスクに寄与する。
【０１７６】
インスリン抵抗性、高血圧、および異常脂質血症とともに、肥満はメタボリックシンドローム（Ｘ症候群としても知られる）の構成要素と考えられており、これらは、一緒に相乗作用して心臓血管疾患を促進する。より最近では、米国コレステロール教育プログラムは、会議にて、以下の５つの判断基準からのいずれか３つに合致するものとして「メタボリックシンドローム」を分類した：少なくとも１１０ｍｇ／ｄＬの空腹時グルコースレベル、少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬの血漿トリグリセリドレベル（高トリグリセリド血症）、男性においては４０ｍｇ／ｄｌよりも下、女性においては５０ｍｇ／ｄｌよりも下のＨＤＬコレステロール、少なくとも１３０／８５ｍｍＨｇの血圧（高血圧）、および中心性肥満、中心性肥満は男性では４０インチより上、女性では３５インチよりも上の含む腹部腰周りとして定義される。
【０１７７】
（ｉｉ）代謝性障害の治療有効性の影響評価
当業者は、上記の試験のいずれかの使用、または当該分野において公知である任意の他の試験が本発明の治療的処置の有効性を監視するために使用されてもよいことを認識する。ヘモグロビンＡｌｃ（ＨｂＡｌｃ）レベルの測定は以前の２〜３ヶ月の間に平均血糖の指標であるので、この試験は、糖尿病治療に対する患者の応答を監視するために使用されてもよい。
【０１７８】
本発明の治療方法は、患者におけるグルコースレベルまたは脂質レベルの減少において有効である。「グルコースレベルの減少」によって、未処置対照と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％グルコースレベルを減少することが意味される。望ましくは、グルコースレベルは、正常血糖レベルまで、すなわち、１５０〜６０ｍｇ／ｄＬの間、１４０〜７０ｍｇ／ｄＬの間、１３０〜７０ｍｇ／ｄＬの間、１２５〜８０ｍｇ／ｄＬの間、および好ましくは１２０〜８０ｍｇ／ｄＬの間まで減少される。グルコースレベルのこのような減少は、血液からのグルコースのクリアランスに関連する生物学的活性の任意の１つを増加させることによって得られてもよい。したがって、グルコースレベルを減少させる能力を有する薬剤は、インスリンの産生、分泌、または作用を増加させてもよい。インスリンの作用は、例えば、末梢組織によるグルコースの取り込みを増加させることによって、および／または肝臓のグルコース産生を減少させることによって増加されてもよい。あるいは、本発明の薬剤は、腸からの炭水化物の吸収を減少させ、グルコーストランスポーター活性を変化させ（例えば、ＧＬＵＴ４発現、固有活性、または移行を増加させることによって）、インスリン感受性組織の量を増加させ（例えば、筋肉細胞または脂肪細胞分化を増加させることによって）、または脂肪細胞もしくは筋肉細胞における遺伝子転写を変化させてもよい（例えば、代謝経路遺伝子の脂肪細胞発現からの因子の分泌の変化）。望ましくは、本発明の薬剤は、グルコースクリアランスに関連する２以上の活性を増加する。「脂質レベルの減少」によって、未処置対照と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％脂質のレベルを減少することが意味される。
【０１７９】
「グルコースレベルが減少するようにインスリンシグナル伝達経路を変化させる」によって、全体の結果が血漿からのグルコースのクリアランスの増加であるように、インスリンシグナル伝達に関与する活性のいずれか１つを変化させる（増加または減少させることによって）ことが意味される。例えば、本発明のｅｎｖ影響因子は、インスリンシグナル伝達経路を変化させ、インスリンの産生、分泌、もしくは作用の増加、末梢組織によるグルコースの取り込みの増加、肝臓グルコース産生の減少、または腸からの炭水化物の吸収の減少を引き起こす。
【０１８０】
環境影響因子、例えば、エピシフターがグルコースレベルを減少させ、それによって代謝性障害を治療する能力は、当該分野において公知である標準的なアッセイを使用して評価されてもよい。例えば、グルコースの取り込みを増加させる薬剤を同定する細胞ベースのスクリーニングアッセイが利用されてもよい。特に、細胞培養中の分化した脂肪細胞が、放射性標識されたグルコースによって検出されるように、インスリン刺激の際にグルコースの取り込みを増加するエピシフターの能力を評価するために利用できる。別の例示的なアッセイにおいて、非糖尿病対象に由来する細胞の条件付き不死化によって得られたヒト筋芽細胞が、インスリンを陽性対照として使用して、グリコーゲン合成に対する薬剤の効果をスクリーニングするために使用できる。処置の前に、細胞は血清飢餓状態にされ、次いで、２時間の時間の間、放射性標識されたグルコースを含む無血清培地中で、エピシフターまたは対照のいずれかを用いてインキュベートされ、その後、グリコーゲン合成が測定される。例示的なアッセイは実施例においてさらに説明される。
【０１８１】
Ｖ．代謝性障害の治療ターゲット
本発明は、代謝性障害の治療ターゲットを同定する方法を提供する。本発明は、このような方法によって同定された治療ターゲットをさらに提供する。治療ターゲットの同定は概して、ｅｎｖ影響因子または候補ｅｎｖ影響因子の細胞または株化細胞のパネルへの外因性適用、および続いての、処置細胞に対して誘導された変化の、未処置細胞と比較した評価を包含する。監視される誘導された細胞変化は、限定されるわけではないが、細胞の形態、生理機能または組成物、例えばＲＮＡ、タンパク質、脂質または代謝産物のレベルに対する変化を含む。候補ｅｎｖ影響因子による処置の結果として誘導された細胞変化は、本明細書に記載するアッセイのいずれを使用しても監視することができる。例えばｍＲＮＡレベルでの遺伝子発現の変化はリアルタイムＰＣＲアレイによって評価することができるが、タンパク質レベルでの遺伝子発現の変化は抗体マイクロアレイおよび２次元ゲル電気泳動を使用することによって監視することができる。候補ｅｎｖ影響因子によって調節されているとして（例えばｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルで）同定された遺伝子は次に、経路分析を使用するシステム・バイオロジー・パースペクティブ（Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  ＩＰＡソフトウェア）からおよび公知の文献の検討によって評価される。潜在的な治療ターゲットとして同定された遺伝子を次に、ウェスタンブロット分析、ｓｉＲＮＡノックダウン、または組換えタンパク質産生およびキャラクタリゼーション方法などの確認アッセイに供する。次にスクリーニングアッセイを使用して、ターゲットのモジュレーターを同定することができる。治療ターゲットのモジュレーターは、代謝性障害の新規治療剤として有用である。治療ターゲットのモジュレーターは、本明細書で詳細に記載するスクリーニングアッセイを使用して、または当業者に公知の所定の方法を使用することによって、日常的に同定することができる。
【０１８２】
ＭＩＭ／エピシフター、ＣｏＱ１０によって調節されている（例えばｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのどちらかで上方調節または下方調節されている）として本明細書で同定された遺伝子は、本発明の薬物ターゲットである。本発明の薬物ターゲットは、限定されるわけではないが、本明細書の表２〜４および６〜２８および６３〜６８に続いて挙げられた遺伝子を含む。出願人によって本明細書に記載された実験の結果に基づいて、Ｑ１０によって調節された主要なタンパク質は、転写因子、アポトーシス応答、ペントースリン酸経路、生合成経路、酸化ストレス（酸化促進物質）、膜改変、および酸化的リン酸化代謝を含む異なる経路または分子の群に関連する、または分類することができる。本明細書で提供された結果に基づいて、ＣｏＱ１０によって調節される主要なタンパク質は下のようにまとめられる。ＣｏＱ１０によって調節され、転写因子である主要なタンパク質は、ＨＮＦ４アルファである。ＣｏＱ１０によって調節され、アポトーシス応答に関連する主要なタンパク質は、Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ＢＮＩＰ−２、Ｂｃｌ−２、Ｂｉｒｃ６、Ｂｃｌ−２−Ｌ１１（Ｂｉｍ）、ＸＩＡＰ、ＢＲＡＦ、Ｂａｘ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｂｍｆ、ＰＵＭＡ、およびｃＭｙｃを含む。ＣｏＱ１０によって調節され、ペントースリン酸経路に関連する主要なタンパク質は、トランスアルドラーゼ１である。ＣｏＱ１０によって調節され、生合成経路に関連する主要なタンパク質は、ＣＯＱ１、ＣＯＱ３、ＣＯＱ６、プレニルトランスフェラーゼおよび４−ヒドロキシベンゾエートを含む。ＣｏＱ１０によって調節され、酸化ストレス（酸化促進物質）に関連する主要なタンパク質は、好中球サイトゾル因子２、一酸化窒素シンターゼ２Ａおよびスーパーオキシドディスムターゼ２（ミトコンドリア）を含む。ＣｏＱ１０によって調節され、酸化的リン酸化代謝に関連する主要なタンパク質は、シトクロムｃ、複合体Ｉ、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩおよび複合体ＩＶを含む。ＣｏＱ１０によって直接または間接的に調節されるさらなる主要なタンパク質は、Ｆｏｘｏ３ａ、ＤＪ−１、ＩＤＨ−１、Ｃｐｔ１ＣおよびカムキナーゼＩＩを含む。
【０１８３】
したがって、本発明の一実施形態において、薬物ターゲットはＨＮＦ４−アルファ、Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ＢＮＩＰ−２、Ｂｃｌ−２、Ｂｉｒｃ６、Ｂｃｌ−２−Ｌ１１（Ｂｉｍ）、ＸＩＡＰ、ＢＲＡＦ、Ｂａｘ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｂｍｆ、ＰＵＭＡ、ｃＭｙｃ、トランスアルドラーゼ１、ＣＯＱ１、ＣＯＱ３、ＣＯＱ６、プレニルトランスフェラーゼ、４−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子２、一酸化窒素シンターゼ２Ａ、スーパーオキシドディスムターゼ２、ＶＤＡＣ、Ｂａｘチャネル、ＡＮＴ、シトクロムｃ、複合体Ｉ、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩ、複合体ＩＶ、Ｆｏｘｏ３ａ、ＤＪ−１、ＩＤＨ−１、Ｃｐｔ１ＣおよびカムキナーゼＩＩを含み得る。好ましい実施形態において、薬物ターゲットはＨＮＦ４Ａ、トランスアルドラーゼ、ＮＭ２３およびＢＳＣｖを含み得る。一実施形態において、薬物ターゲットはＴＮＦ４Ａである。一実施形態において、薬物ターゲットはトランスアルドラーゼである。一実施形態において、薬物ターゲットはＮＭ２３である。一実施形態において、薬物ターゲットはＢＳＣｖである。同定された薬物ターゲットのモジュレーターを同定するのに有用なスクリーニングアッセイが下に記載される。
【０１８４】
ＶＩ．スクリーニングアッセイ
本発明は、本発明の同定された治療ターゲットの発現および／または活性を調節する、モジュレーター、すなわち候補または試験化合物または薬剤（例えばタンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、ペプトイド、小型分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）も提供する。このようなアッセイは通例、本発明の治療ターゲットと１つ以上のアッセイ構成要素との間の反応を含む。他の構成要素は、試験化合物自体、または試験化合物および本発明のマーカーの天然結合パートナーの組み合わせのどちらかであり得る。本明細書に記載するアッセイなどのアッセイを介して同定された化合物は、代謝性障害を治療または予防するのに有用であり得る。
【０１８５】
本発明のスクリーニングアッセイで使用される試験化合物は、天然および／または合成化合物の系統的ライブラリーを含む、いずれの利用可能な供給源からも取得され得る。試験化合物はまた：生物ライブラリー；ペプトイドライブラリー（ペプチドの官能基を有するが、酵素分解の抵抗性であるが、それにもかかわらず生物活性を保持する新規の非ペプチド主鎖を持つ、分子のライブラリー；例えばＺｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５を参照）；空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー；逆重畳を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティクロマトグラフィー選択を使用するライブラリー法を含む、当分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数の手法のいずれによっても取得され得る。生物ライブラリーおよびペプトイドライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されているが、他の４つの手法は化合物のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーまたは小型分子ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。１２：１４５）を参照のこと。
【０１８６】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当分野において、例えば：ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見出すことができる。
【０１８７】
化合物のライブラリーは、溶液中に（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ，１９９２，Ｂｉｏ技法ｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌および／もしくは胞子（Ｌａｄｎｅｒ，米国特許５，２２３，４０９）、プラスミドの上に（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）またはファージの上に（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ、上掲）提供され得る。
【０１８８】
本発明のスクリーニング方法は、細胞を試験化合物と接触させることと、試験化合物が細胞中での本発明の治療ターゲットの発現および／または活性を調節する能力を決定することとを含む。本発明の治療ターゲットの発現および／または活性は、本明細書に記載するように決定することができる。本発明の治療ターゲットの発現および／または活性は、当業者に公知の所定の方法によっても決定することができる。一実施形態において、化合物は、本発明の治療ターゲットの発現および／または活性を上昇させるその能力に基づいて選択される。一実施形態において、化合物は、表２〜４および６〜２８および６３〜６８に挙げられたタンパク質から選択される治療ターゲットの発現および／または活性を上昇させるその能力に基づいて選択され、該治療ターゲットはＣｏＱ１０によって上方調節されている（例えば正の倍率変化を呈する）。一実施形態において、化合物は、本発明の治療ターゲットの発現および／または活性を低下させるその能力に基づいて選択される。一実施形態において、化合物は、表２〜４および６〜２８および６３〜６８に挙げられたタンパク質から選択される治療ターゲットの発現および／または活性を低下させるその能力に基づいて選択され、該治療ターゲットはＣｏＱ１０によって下方調節されている（例えば負の倍率変化を呈する）。
【０１８９】
別の実施形態において、本発明は、本発明の治療ターゲットの基質またはその生物活性部分である候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。また別の実施形態において、本発明は、本発明の治療ターゲットの基質またはその生物活性部分に結合する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。試験化合物が治療ターゲットに直接結合する能力を決定することは、例えば、化合物の薬物ターゲットへの結合が複合体中の標識マーカー化合物を検出することによって決定できるように、化合物を放射性同位体または酵素標識とカップリングすることによって達成することができる。例えば化合物（例えばマーカー基質）に１３１Ｉ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈを直接または間接的のどちらかで標識して、放射性同位体を電波放出の直接カウントによってまたはシンチレーションカウントによって検出することができる。あるいは、アッセイ構成要素に例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼを酵素標識して、酵素標識を適切な基質の生成物への変換の決定によって検出することができる。
【０１９０】
本発明は、上記のスクリーニングアッセイによって同定された新規薬剤にさらに関する。したがって、適切な動物モデルにおいて本明細書に記載するように同定された薬剤をさらに使用することは、本発明の範囲内である。例えば本明細書に記載するように同定された本発明のマーカーの発現および／または活性を調節することができる薬剤を動物モデルで使用して、このような薬剤を用いた治療の有効性、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは、本明細書に記載するように同定された薬剤を動物モデルで使用して、このような薬剤の作用機序を決定することができる。さらに、本発明は、上記スクリーニングアッセイによって同定された、上記治療のための新規薬剤の使用に関する。
【０１９１】
ＶＩＩ．医薬組成物および製薬的投与
本発明の環境影響因子を対象への投与に好適な医薬組成物中に組み入れることができる。通例、医薬組成物は、本発明の環境影響因子および製薬的に許容され得る担体を含む。本明細書で使用する場合、「製薬的に許容され得る担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散剤、媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合性である同様のものを含む。製薬的に許容され得る担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つ以上、ならびにその組み合わせを含む。多くの場合において、等張性剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを包含することが好ましいであろう。製薬的に許容され得る担体は、環境影響因子の有効期間または有効性を増強する、湿潤剤または乳化剤、保存料または緩衝液などの微量の補助物質をさらに含み得る。
【０１９２】
本発明の組成物は、多種多様の形であり得る。これらは例えば、液体剤（例えば注射用および輸液用液剤）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、粉剤、クリーム、ローション、軟膏またはペースト剤（ｐａｓｔｓ）、眼、耳または鼻への投与に好適な滴剤、リポソームおよび坐剤などの液体、半固体および固体投薬形を含む。好ましい形は、投与および治療用途の所期の様式に依存する。
【０１９３】
本発明の環境影響因子は、当分野で公知の多種多様の方法によって投与することができる。多くの治療用途では、好ましい投与経路／様式は、皮下注射、静脈内注射または輸液である。当業者によって認識されるように、投与経路および／または様式は、所望の結果に応じて変動するであろう。ある実施形態において、活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、高速放出から化合物を保護するであろう担体を用いて調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製のための多くの方法は、特許が取得されているか、または概して当業者に公知である。例えばＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照。一実施形態において、投与様式は非経口（例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。一実施形態において、環境影響因子は、静脈内輸液または注射によって投与される。別の実施形態において、環境影響因子は、筋肉内または皮下注射によって投与される。好ましい実施形態において、環境影響因子は局所投与される。
【０１９４】
治療組成物は通例、製造および貯蔵条件下で滅菌および安定性でなければならない。組成物は、液剤、マイクロエマルション、分散剤、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤することができる。滅菌注射用液剤は、要求される量の活性化合物（すなわち環境影響因子）を、必要に応じて上で列挙した各種の他の成分を含む適切な溶媒に組み入れ、それに続いて濾過滅菌することによって調製できる。概して、分散剤は、活性化合物を、基本分散媒および上に列挙されたものから要求される他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射用液剤の調製のための滅菌凍結乾燥粉剤の場合、好ましい調製方法は、その先に滅菌濾過した溶液から活性成分およびいずれかの追加の望ましい成分の粉剤を産する、真空乾燥および噴霧乾燥技法である。液剤の適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合には要求される粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。注射用組成物の延長吸収は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【０１９５】
技法および製剤は一般に、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に見出され得る。全身投与のためには、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む注射が好ましい。注射の場合、本発明の化合物は、液体剤中で、好ましくはハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合性の緩衝液中で製剤することができる。加えて、化合物は固体形で製剤され、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形も含まれる。
【０１９６】
経口投与では、医薬組成物は、結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム）；または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの製薬的に許容され得る賦形剤を用いて慣習的な手段によって調製された、例えば錠剤またはカプセル剤の形をとり得る。錠剤は、当分野で周知の方法によってコーティングされ得る。経口投与のための液体調製物は、例えば液剤、シロップ剤または懸濁剤の形をとり得る、またはこれらは、使用前の水または他の好適なビヒクルによる構成のための無水生成物として提供され得る。このような液体調製物は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えばレシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えばアチオンド油（ａｔｉｏｎｄ  ｏｉｌ）、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）；および保存料（例えばメチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの製薬的に許容され得る添加剤を用いて慣習的な手段によって調製され得る。調製物は必要に応じて、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。
【０１９７】
経口投与用の調製物は、活性化合物の制御放出を与えるように好適に製剤され得る。頬側投与では、組成物は、慣習的な方式で製剤された錠剤またはロゼンジ剤の形を取り得る。吸入による投与では、本発明による使用のための化合物は、好適な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスの使用による加圧パックまたはネブライザからのエアゾールスプレー提供の形で便利に送達される。加圧エアゾールの場合、投薬単位は、計量された量を送達する弁を設けることによって決定され得る。吸入器または注入器での使用のための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末ベースの粉末ミックスを含有して製剤され得る。
【０１９８】
化合物は、注射による、例えばボーラス注射または連続輸液による非経口投与のために製剤され得る。注射用製剤は、保存料が添加されて、単位投薬形で、例えばアンプルでまたは複数用量容器で与えられ得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤としてのこのような形を取り得て、懸濁化剤、安定剤および／または分散化剤などの製剤化剤を含有し得る。あるいは、活性成分は、使用前に好適なビヒクル、例えば発熱物質を含まない滅菌水による構成のための粉末形であり得る。
【０１９９】
化合物は、例えばココアバターまたは他のグリセリドなどの慣習的な坐剤用ベースをを含有する、坐剤または留置浣腸などの経直腸組成物としても製剤され得る。
【０２００】
先に記載した製剤に加えて、化合物はデポー調製物としても調合され得る。このような長期作用型製剤は、インプラントによって（例えば皮下的にまたは筋肉内に）または筋肉内注射によって投与され得る。それゆえ、例えば化合物は、好適なポリマー材料または疎水性材料（例えば許容され得る油中の乳剤として）もしくはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として製剤され得る。
【０２０１】
全身投与は、経粘膜または経皮手段によっても可能である。経粘膜または経皮投与では、透過されるバリアにとって適切な浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は、概して当分野で公知であり、含む，例えば経粘膜投与のためには、胆汁塩およびフシジン酸誘導体を含み、加えて洗剤が透過を容易にするために使用され得る。経粘膜投与は、鼻内スプレーまたは坐剤の使用により得る。局所投与では、本発明の化合物は、概して当分野で公知の軟膏、塗布剤、ゲル、またはクリームに製剤される。洗浄液を局所的に使用して、傷害または炎症を処置し、治癒を加速することができる。
【０２０２】
組成物は所望ならば、活性成分を含有する１つ以上単位投薬形を含有し得るパックまたはディスペンサデバイスで与えられ得る。パックは例えば、金属箔またはブリスターパックなどのプラスチック箔を含み得る。パックまたはディスペンサデバイスは、投与のための説明書が添付され得る。
【０２０３】
核酸の投与を包含する療法では、全身および局所または局在投与を含む多種多様の投与様式のために、本発明の化合物を製剤することができる。技法および製剤は一般に、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に見出され得る。全身投与のためには、筋肉内、静脈内、腹腔内、結節内、および皮下を含む注射が好ましい。注射の場合、本発明の化合物は、液体剤中で、好ましくはハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合性の緩衝液中で製剤することができる。加えて、化合物は固体形で製剤され、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形も含まれる。
【０２０４】
一実施形態において、環境影響因子を含む組成物は局所投与される。活性成分、すなわちｅｎｖ影響因子を製薬的製剤として与えることが好ましい。活性成分は、局所投与のの場合、最終生成物において製剤の重量で約０．００１％〜約２０％ｗ／ｗを構成し得るが、活性成分は製剤の３０％ｗ／ｗ、好ましくは約１％〜約２０％ｗ／ｗをも構成し得る。本発明の局所製剤は、活性成分を１つ以上のそのための許容され得る担体および場合によりその他の治療成分と共に含む。担体は、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントにとって有害でないという意味で、「許容され得る」べきである。
【０２０５】
目的の障害を呈している患者を治療するにあたって、これらのような１つまたは複数の薬剤の治療的有効量が投与される。治療的有効用量は、患者における症候の改善または生存の延長を生じる化合物の量を指す。
【０２０６】
このような化合物の毒性および治療有効性は、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死性である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％にとって治療的有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物の標準製薬手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比は治療指数であり、治療指数は比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きい治療指数を呈する化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から取得したデータは、ヒトで使用するための投薬量の範囲を製剤するのに使用することができる。このような化合物の投薬量は好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に存在する。投薬量は、用いた投薬形および利用した投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
【０２０７】
本発明の方法で使用されるいずれの化合物でも、治療的有効用量は細胞培養アッセイから最初に推定することができる。例えば用量は、細胞培養で決定されたようなＩＣ５０を含む循環血漿濃度を達成する動物モデルにおいて、製剤することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより的確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣによって測定され得る。
【０２０８】
正確な製剤、投与経路および投薬量は、患者の症状を考慮して個別の医師によって選定されることができる（例えばＦｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１９７５，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照）。担当医が毒性、または器官障害のために投与を中止、中断、または調整する方法および時点を理解していることに注目すべきである。反対に、担当医は（毒性を除く）臨床応答が十分でなかった場合に、治療をより高レベルに調整することも理解しているであろう。目的の発癌（ｏｎｅｏｇｅｎｉｃ）障害の管理における投与用量の大きさは、治療される症状の重症度および投与経路によって変動するであろう。症状の重症度は、例えば一部は、標準予後評価方法によって評価され得る。さらに用量およびおそらく投薬頻度も、個別の患者の年齢、体重、および応答によって変動するであろう。獣医学において、上述のプログラムに匹敵するプログラムが使用され得る。
【０２０９】
治療されている特定の症状に応じて、このような薬剤は、全身的または局所的に製剤および投与され得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）に見出され得る。好適な経路は、ほんのいくつか例を挙げると、経口、経直腸、経皮、経膣、経粘膜、または経腸投与；筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射を含む非経口送達を含み得る。
【０２１０】
上記の組成物は、いずれの好適な製剤中でも対象に投与され得る。環境影響因子、例えばＣｏＱ１０の局所製剤による代謝性障害の治療に加えて、本発明の他の態様において、環境影響因子、例えばＣｏＱ１０は他の方法によって送達されるかもしれない。例えば、環境影響因子、例えばＣｏＱ１０は非経口送達のために、例えば皮下、静脈内、筋肉内、または腫瘍内注射のために製剤化されるかもしれない。送達の他の方法、例えばリポソーム送達または組成物を含浸させたデバイスからの拡散が使用されるかもしれない。組成物は、単回ボーラス、複数回注射で、または連続輸液によって（例えば静脈内にまたは腹膜透析によって）によって投与され得る。非経口投与では、組成物は好ましくは、発熱物質を含まない滅菌形で製剤される。本発明の組成物は、組成物を細胞が含有されている流体に単に添加することによって、（例えばインビトロ培養物中の癌細胞のアポトーシスを誘導するために）インビトロで細胞に投与することもできる。
【０２１１】
治療されている特定の症状に応じて、このような薬剤は、全身的または局所的に製剤および投与され得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）に見出され得る。好適な経路は、ほんのいくつか例を挙げると、経口、経直腸、経皮、経膣、経粘膜、または経腸投与；筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射を含む非経口送達を含み得る。
【０２１２】
注射では、本発明の薬剤は水溶液で、好ましくはハンクス液、リンゲル液などの生理学的に適合性の緩衝液、または生理学的生理食塩水緩衝液で製剤され得る。このような経粘膜投与では、透過されるバリアにとって適切な浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は、概して当分野で公知である。
【０２１３】
本発明の実施のために本明細書で開示された化合物を全身投与に好適な投薬形に製剤するための、製薬的に許容され得る担体の使用は、本発明の範囲内である。担体の適正な選出および好適な製造実施によって、本発明の組成物、特に液剤として製剤された組成物は、静脈内注射になどによって非経口的に投与され得る。化合物は、当分野で周知の製薬的に許容され得る担体を使用して、経口投与に好適な投薬形にただちに製剤することができる。このような担体によって、本発明の化合物を治療される患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤することができる。
【０２１４】
細胞内投与されることを意図される薬剤は、当業者に周知の技法によって投与され得る。例えばこのような薬剤は、リポソーム中に封入され、次に上記のように投与され得る。リポソームは、水性の内部を有する球状脂質２重層である。リポソーム形成の時点で水溶液中に存在するすべての分子は、水性の内部に組み入れられる。リポソームの内容物は、外部微小環境から保護されながらも、リポソームが細胞膜と融合するために、細胞質中に効率的に送達される。加えて、小型有機分子は、その疎水性のために、細胞内に直接投与され得る。
【０２１５】
本発明での使用に好適な医薬組成物は、その所期の目的を達成する有効量で含有されている組成物を含む。有効量の決定は、とりわけ本明細書で提供された詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、製薬的に使用することができる活性化合物の調製物への処理を容易にする賦形剤および助剤を含んだ、好適な製薬的に許容され得る担体を含有し得る。経口投与用に製剤された調製物は、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、または液剤の形であり得る。本発明の医薬組成物は、それ自体公知である方式で、例えば慣習的混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、浮上、乳化、封入、捕捉または凍結乾燥のプロセスによって製造され得る。
【０２１６】
局所投与に好適な製剤は、皮膚を通じた治療が必要である部位への浸透に好適なリニメント剤、液剤、クリーム、軟膏またはペースト剤、および眼、耳または鼻への投与に好適な滴剤などの液体または半液体調製物を含む。本発明による滴剤は、滅菌水性または油性溶液または懸濁剤を含んでもよく、殺菌剤および／または殺真菌剤および／またはその他の好適な保存料の、および好ましくは表面活性界面活性剤を含む好適な水溶液に、活性成分を溶解することによって調製され得る。得られた溶液は次に、濾過によって清澄および滅菌され、無菌技法によって容器に移され得る。滴剤への包含に好適な殺菌剤および殺真菌剤は、硝酸または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）である。油性液剤の調製に好適な溶媒は、グリセロール、希釈アルコールおよびプロピレングリコールを含む。
【０２１７】
本発明によるローションは、皮膚または眼への適用に好適なローションを含む。眼用ローションは、場合により殺菌剤を含有する滅菌水溶液を含んでもよく、液剤の調製方法に類似した方法によって調製され得る。皮膚への適用のためのローションまたはリニメント剤は、アルコールもしくはアセトンなどの乾燥を促進して皮膚を冷やす薬剤および／またはグリセロールなどの保湿剤またはヒマシ油もしくはラッカセイ油などの油も含み得る。
【０２１８】
本発明によるクリーム、軟膏またはペースト剤は、外部適用のための活性成分の半固体製剤である。これらは単独のまたは水性もしくは非水性流体による溶液または懸濁液中の微粉化形または粉末化形の活性成分を、好適な機械を用いてグリースまたは非グリース基剤と混合することによって作製され得る。基剤は、固形パラフィン、軟パラフィンまたは流動パラフィンなどの炭化水素、グリセロール、ミツロウ、金属石鹸；滑粘薬；アーモンド油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、ヒマシ油またはオリーブ油などの天然源の油；羊毛脂もしくはその誘導体、またはプロピレングリコールなどのアルコールまたはマクロゲルと共にステアリン酸またはオレイン酸などの脂肪酸を含み得る。製剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤またはソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体などの非イオン性界面活性剤などのいずれの好適な界面活性剤も組み入れ得る。天然ゴム、セルロース誘導体などの懸濁化剤またはケイ質（ｓｉｌｉｃａｃｅｏｕｓ）シリカなどの無機材料、およびラノリンなどの他の成分も含まれ得る。
【０２１９】
非経口投与のための製薬的製剤は、水溶形の活性化合物の水溶液を含む。加えて、活性化合物の懸濁剤は、適切な油性注射用懸濁剤として調製され得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油など脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪油、またはリポソームを含む。水性注射用懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁剤の粘度を上昇させる物質を含有し得る。場合により、懸濁剤は、高濃度の液剤の調製を可能にするために、好適な安定剤または化合物の溶解性を上昇させる薬剤も含有し得る。
【０２２０】
経口使用のための製薬調製物は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせて、場合により得られた混合物を粉砕し、所望の場合には錠剤または糖衣錠コアを取得するための好適な助剤を添加した後に顆粒の混合物を処理することによって取得することができる。好適な賦形剤は、特にラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤；例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物である。所望ならば、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩が添加され得る。
【０２２１】
糖衣錠コアは、好適なコーティングを施されている。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー液、ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る、濃縮糖溶液が使用され得る。色素または顔料は、同定のためにまたは活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０２２２】
経口的に使用することができる製薬調製物は、ゼラチンで作製されたプッシュ・フィット・カプセル剤、ならびにグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤で作製された軟シールカプセル剤を含む。プッシュ・フィット・カプセル剤は、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および場合により安定剤と混合された活性成分を含むことができる。軟カプセル剤において、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解または懸濁され得る。加えて、安定剤が添加され得る。
【０２２３】
組成物は所望ならば、緩衝液系を含むことができる。緩衝液系は、組成物のｐＨを望ましい範囲内に維持または緩衝するように選定される。「緩衝液系」または「緩衝液」という用語は本明細書で使用する場合、１つまたは複数の溶質剤であって、水溶液中にあるときに、酸または塩基がそれに添加された場合のｐＨ（または水素イオン濃度もしくは活性）の大きな変化に対してこのような溶液を安定させる溶質剤を指す。それゆえ上で指摘された範囲における開始時の緩衝ｐＨ値からのｐＨの抵抗または変化に関係する、１つまたは複数の溶質剤は周知である。無数の好適な緩衝剤があるが、リン酸カリウム１水和物が好ましい緩衝液である。
【０２２４】
医薬組成物の最終ｐＨ値は、生理学的に適合可能な範囲内で変動し得る。最終ｐＨ値は、ヒト皮膚を必ずしも刺激する値ではなく、好ましくは活性化合物、すなわちＣｏＱ１０の経皮輸送が促進されるような値である。ｐＨは、本制約に反することなく、ＣｏＱ１０化合物の安定性を改善し、必要なときには稠度を調整するように選択され得る。一実施形態において、好ましいｐＨ値は、約３．０〜約７．４、さらに好ましくは約３．０〜約６．５、最も好ましくは約３．５〜約６．０である。
【０２２５】
好ましい局所送達ビヒクルでは、組成物の残りの構成要素は、必然的に精製されている水、例えば脱イオン水である。このような送達ビヒクル組成物は、組成物の総重量に基づいて、約５０〜約９５パーセントを超える範囲の水を含有する。しかし存在する水の明確な量は重要ではなく、所望の粘度（通常約５０ｃｐｓ〜約１０，０００ｃｐｓ）および／または他の構成要素の濃度を取得するように調整することができる。局所送達ビヒクルは好ましくは、少なくとも約３０センチポイズの粘度を有する。
【０２２６】
他の公知の経皮浸透エンハンサーを使用して、ＣｏＱ１０の送達を容易にすることもできる。例証的なのは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などのスルホキシド；１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン（アゾン（商標）、Ｎｅｌｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．の登録商標）などの環式アミド；Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）Ｎ，Ｎ−ジエチルトルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルデカアミドなどのアミド；Ｎ−メチル−２−ピロリドン、２−ピロリドン、２−ピロリドン−５−カルボン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２−ピロリドンまたはその脂肪酸エステル、１−ラウリル−４−メトキシカルボニル−２−ピロリドン、Ｎ−タローアルキルピロリドンなどのピロリドンの誘導体；プロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセロール、ヘキサントリオールなどのポリオール；オレイン酸、リノレン酸、ラウリン酸、吉草酸、ヘプタン酸、カプロン酸、ミリスチン酸、イソ吉草酸、ネオペンタン酸、トリメチルヘキサン酸、イソステアリン酸などの直鎖または分枝脂肪酸；エタノール、プロパノール、ブタノール、オクタノール、オレイル、ステアリル、リノレイルなどのアルコール；ラウリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムなどのアニオン性界面活性剤；塩化ベンザルコニウム、ドデシルトリメチル塩化アンモニウム、セチルトリメチル臭化アンモニウムなどのカチオン性界面活性剤；プロポキシ化ポリオキシエチレンエーテル、例えばポロキサマー２３１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８４など、エトキシ化脂肪酸、例えばツイン２０，Ｍｙｊｒ４５など、ソルビタン誘導体、例えばツイン４０、ツイン６０、ツイン８０、スパン６０など、エトキシ化アルコール、例えばポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）、ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ９３）など、レシチンおよびレシチン誘導体などの非イオン性界面活性剤；Ｄ−リモネン、α−ピネン、β−カレン、α−テルピネオール、カルボール、カルボン、メントン、酸化リモネン、酸化α−ピネン、ユーカリ油などのテルペンである。サリチル酸、サリチル酸メチル、クエン酸、コハク酸などの有機酸およびエステルも、皮膚浸透エンハンサーとして好適である。
【０２２７】
一実施形態において、本発明は、ＣｏＱ１０組成物およびその調製方法を提供する。好ましくは、組成物は少なくとも約１％〜約２５％ｗ／ｗのＣｏＱ１０を含む。ＣｏＱ１０は旭化成Ｎ＆Ｐ（北海道、日本）から、ユビデカレノン（ＵＳＰ）として入手することができる。ＣｏＱ１０は、Ｋａｎｅｋａ  Ｑ１０から粉末形のＫａｎｅｋａＱ１０（ＵＳＰ  ＵＢＩＤＥＣＡＲＥＮＯＮＥ）（Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）として取得することもできる。本明細書で例示された方法で使用されるＣｏＱ１０は、以下の特徴を有する：残りの溶媒はＵＳＰ  ４６７の必要条件を満足する；水含有率は、０．０％未満、０．０５％未満、または０．２％未満である；強熱残分は０．０％、０．０５％未満、または０．２％未満である；重金属含有率は０．００２％未満、または０．００１％未満である；純度は９８〜１００％もしくは９９．９％、または９９．５％。組成物を調製する方法は、下の実施例のセクションに提供されている。
【０２２８】
本発明のある実施形態において、コエンザイムＱ１０を、治療または予防が行われるようにヒトに局所投与することによって、ヒトの代謝性障害を治療または予防する方法であって、コエンザイムＱ１０がターゲット組織に皮膚１平方センチメートルに付きコエンザイムＱ１０約０．０１〜約０．５ミリグラムの範囲で適用される、局所ビヒクル中のコエンザイムＱ１０の局所用量がヒトに投与される方法が提供される。一実施形態において，コエンザイムＱ１０はターゲット組織に、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０約０．０９〜約０．１５ｍｇで適用される。各種の実施形態において、コエンザイムＱ１０はターゲット組織に、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０約０．００１〜約５．０ｍｇ、約０．００５〜約１．０ｍｇ、約０．００５〜約０．５ｍｇ、約０．０１〜約０．５ｍｇ、約０．０２５〜約０．５ｍｇ、約０．０５〜約０．４ｍｇ、約０．０５〜約０．３０ｍｇ、約０．１０〜約０．２５ｍｇ、または約０．１０〜０．２０ｍｇの範囲で適用される。他の実施形態において，コエンザイムＱ１０はターゲット組織に皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０約０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．０６ｍｇ、０．０７ｍｇ、０．０８ｍｇ、０．０９ｍｇ、０．１０ｍｇ、０．１１ｍｇ、０．１２ｍｇ、０．１３ｍｇ、０．１４ｍｇ、０．１５ｍｇ、０．１６ｍｇ、０．１７ｍｇ、０．１８ｍｇ、０．１９ｍｇ、０．２０ｍｇ、０．２１ｍｇ、０．２２ｍｇ、０．２３ｍｇ、０．２４ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．２６ｍｇ、０．２７ｍｇ、０．２８ｍｇ、０．２９ｍｇ、０．３０ｍｇ、０．３１ｍｇ、０．３２ｍｇ、０．３３ｍｇ、０．３４ｍｇ、０．３５ｍｇ、０．３６ｍｇ、０．３７ｍｇ、０．３８ｍｇ、０．３９ｍｇ、０．４０ｍｇ、０．４１ｍｇ、０．４２ｍｇ、０．４３ｍｇ、０．４４ｍｇ、０．４５ｍｇ、０．４６ｍｇ、０．４７ｍｇ、０．４８ｍｇ、０．４９ｍｇまたは０．５ｍｇの用量で適用される。一実施形態において，コエンザイムＱ１０はターゲット組織に、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０約０．１２ｍｇの用量で適用される。上限または下限としてのこれらの値のいずれか１つを有する範囲、例えば皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０約０．０３〜約０．１２ｍｇ、約０．０５〜約０．１５ｍｇ、約０．１〜約０．２０ｍｇ、または約０．３２〜約０．４９ｍｇも本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
【０２２９】
本発明の別の実施形態において、コエンザイムＱ１０はＣｏＱ１０クリームの形で、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０クリーム０．５〜１０ミリグラムの投薬量にて投与され、ここでＣｏＱ１０クリームは１〜５％のコエンザイムＱ１０を含む。一実施形態において、ＣｏＱ１０クリームは、約３％のコエンザイムＱ１０を含む。他の実施形態において、ＣｏＱ１０クリームは、約１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％または５％のコエンザイムＱ１０を含む。各種の実施形態において、ＣｏＱ１０クリームは、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０クリーム約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５または１０ミリグラムの投薬量で投与される。上限または下限としてのこれらの値のいずれか１つを有する範囲、例えば皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０クリーム約０．５〜約５．０ｍｇ、約１．５〜２．５ｍｇ、または約２．５〜５．５ｍｇも本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
【０２３０】
別の実施形態において、コエンザイムＱ１０はＣｏＱ１０クリームの形で、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０クリーム３〜５ミリグラムの投薬量にて投与され、ここでＣｏＱ１０クリームは１〜５％のコエンザイムＱ１０を含む。一実施形態において、ＣｏＱ１０クリームは、約３％のコエンザイムＱ１０を含む。他の実施形態において、ＣｏＱ１０クリームは、約１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％または５％のコエンザイムＱ１０を含む。各種の実施形態において、ＣｏＱ１０クリームは、皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０クリーム約３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９または５．０ミリグラムの投薬量で投与される。上限または下限としてのこれらの値のいずれか１つを有する範囲、例えば皮膚１平方センチメートルに付きＣｏＱ１０クリーム約３．０〜約４．０ｍｇ、約３．３〜５．３ｍｇ、または約４．５〜４．９ｍｇも本発明の一部であるとすることが理解されるべきである。
【０２３１】
本発明のある態様は、コエンザイムＱ１０を治療または予防が行われるようにヒトに局所投与することによって、ヒトの代謝性障害を治療または予防する方法であって、コエンザイムＱ１０は２４時間につき１回以上、６週間以上にわたって局所適用される方法を提供する。
【０２３２】
本発明のある態様は、相Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを調製するステップと、３％ＣｏＱ１０クリームの水中油型乳剤が形成されるようにすべての相を合せるステップとを含む、コエンザイムＱ１０クリーム３％を調製する方法を提供する。
【０２３３】
いくつかの実施形態において、相Ａ成分は、４．００％ｗ／ｗのアルキルＣ１２−１５ベンゾエートＮＦ、２．００％ｗ／ｗのセチルアルコールＮＦ、４．５％ｗ／ｗのステアリン酸グリセリル／ＰＥＧ−１００および１．５０％ｗ／ｗのステアリルアルコールＮＦを含むが、相Ｂ成分は、５．００％ｗ／ｗのジエチレングリコールモノエチルエーテルＮＦ、２．００％ｗ／ｗのグリセリンＵＳＰ、１．５０％ｗ／ｗのプロピレングリコールＵＳＰ、０．４７５％ｗ／ｗのフェノキシエタノールＮＦ、１６．７２５％ｗ／ｗの精製水ＵＳＰおよび４０．００％ｗ／ｗのカルボマー分散剤２％を含み、相Ｃ成分は、０．５０％ｗ／ｗの乳酸ＵＳＰ、２．００％ｗ／ｗの乳酸ナトリウム溶液ＵＳＰ、１．３０％ｗ／ｗのトロラミンＮＦ、および２．５０％ｗ／ｗの精製水ＵＳＰを含む。さらにこれらの実施形態において、相Ｄ成分は１．００％ｗ／ｗの二酸化窒素ＵＳＰを含むが、相Ｅ成分は１５％ｗ／ｗのＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を含む。
【０２３４】
「トロラミン」という用語は、本明細書で使用する場合、トロラミンＮＦ、トリエタノールアミン、ＴＥＡｌａｎ（登録商標）、ＴＥＡｌａｎ９９％、トリエタノールアミン、９９％、トリエタノールアミン、ＮＦまたはトリエタノールアミン、９９％、ＮＦを指すこれらの用語は、本明細書で互換的に使用され得る。
【０２３５】
ある他の実施形態において、相Ａ成分は、４．００％ｗ／ｗのカプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、２．００％ｗ／ｗのセチルアルコールＮＦ、４．５％ｗ／ｗのステアリン酸グリセリル／ＰＥＧ−１００および１．５０％ｗ／ｗのステアリルアルコールＮＦを含むが、相Ｂ成分は、５．００％ｗ／ｗのジエチレングリコールモノエチルエーテルＮＦ、２．００％ｗ／ｗのグリセリンＵＳＰ、１．５０％ｗ／ｗのプロピレングリコールＵＳＰ、０．４７５％ｗ／ｗのフェノキシエタノールＮＦ、１６．７２５％ｗ／ｗの精製水ＵＳＰおよび４０．００％ｗ／ｗのカルボマー分散剤２％を含み、相Ｃ成分は、０．５０％ｗ／ｗの乳酸ＵＳＰ、２．００％ｗ／ｗの乳酸ナトリウム溶液ＵＳＰ、１．３０％ｗ／ｗのトロラミンＮＦ、および２．５０％ｗ／ｗの精製水ＵＳＰを含む。さらにこれらの実施形態において、相Ｄ成分は１．００％ｗ／ｗの二酸化窒素ＵＳＰを含むが、相Ｅ成分は１５％ｗ／ｗのＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を含む。
【０２３６】
本発明のある実施形態において、（１）相Ａ成分を好適な容器に添加して、水浴内で７０〜８０℃まで加熱するステップと；（２）カルボマー分散剤を除く相Ｂ成分を好適な容器に添加して、混合して混合相Ｂを形成するステップと；（３）相Ｅ成分を好適な容器に入れ、水浴を使用して５０〜６０℃にて相Ｅ成分を溶融して、溶融相Ｅを形成するステップと；（４）カルボマー分散剤を混合タンクに添加して、混合しながら７０〜８０℃まで加熱するステップと；（５）温度を７０〜８０℃に維持しながら、混合相Ｂを混合タンクに添加するステップと；（６）温度を７０〜８０℃に維持しながら、相Ｃ成分を混合タンクに添加するステップと；（７）相Ｄ成分を混合タンクに添加して、次に混合タンクの内容の混合および均質化を続けるステップと；次に（８）均質化を停止して、混合タンクの内容物を５０〜６０℃に冷却するステップと；次に（９）混合を中止して、溶融相Ｅを混合タンクに添加して分散剤を形成するステップと；（１０）次に、分散剤が滑らかで均一になるまで混合を再開するステップと；次に（１１）混合タンクの内容物を４５〜５０℃まで冷却するステップとを含む、コエンザイムＱ１０クリーム３％の調製方法が提供される。
【０２３７】
本発明のいくつかの他の実施形態において、ＣｏＱ１０クリーム３％を含む医薬組成物が提供される。クリームは、組成物の４．００％ｗ／ｗのＣ１２−１５アルキルベンゾエート、組成物の２．００％ｗ／ｗのセチルアルコール、組成物の１．５％ｗ／ｗのステアリルアルコール、４．５％ｗ／ｗのステアリン酸グリセリルおよびＰＥＧ−１００を有する相Ａ；２．００％ｗ／ｗのグリセリン、１．５％ｗ／ｗのプロピレングリコール、５．０％ｗ／ｗのエトキシジグリコール、０．４７５％ｗ／ｗのフェノキシエタノール、４０．００％ｗ／ｗのカルボマー分散剤、１６．７２５％ｗ／ｗの精製水を有するＢ相；１．３００％ｗ／ｗのトリエタノールアミン、０．５００％ｗ／ｗの乳酸、２．０００％ｗ／ｗの乳酸ナトリウム溶液、２．５％ｗ／ｗの水を有する相Ｃ；１．０００％ｗ／ｗの二酸化チタンを有する相Ｄ；および１５．０００％ｗ／ｗのＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を有する相Ｅを含む。いくつかの実施形態において、カルボマー分散剤は、水、フェノキシエタノール、プロピレングリコールおよびカルボマー９４０を含む。
【０２３８】
本発明のいくつかの他の実施形態において、ＣｏＱ１０クリーム３％を含む医薬組成物が提供される。クリームは、組成物の４．００％ｗ／ｗのカプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、組成物の２．００％ｗ／ｗのセチルアルコール、組成物の１．５％ｗ／ｗのステアリルアルコール、４．５％ｗ／ｗのステアリン酸グリセリルおよびＰＥＧ−１００を有する相Ａ；２．００％ｗ／ｗのグリセリン、１．５％ｗ／ｗのプロピレングリコール、５．０％ｗ／ｗのエトキシジグリコール、０．４７５％ｗ／ｗのフェノキシエタノール、４０．００％ｗ／ｗのカルボマー分散剤、１６．７２５％ｗ／ｗの精製水を有するＢ相；１．３００％ｗ／ｗのトリエタノールアミン、０．５００％ｗ／ｗの乳酸、２．０００％ｗ／ｗの乳酸ナトリウム溶液、２．５％ｗ／ｗの水を有する相Ｃ；１．０００％ｗ／ｗの二酸化チタンを有する相Ｄ；および１５．０００％ｗ／ｗのＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を有する相Ｅを含む。いくつかの実施形態において、カルボマー分散剤は、水、フェノキシエタノール、プロピレングリコールおよびカルボマー９４０を含む。
【０２３９】
本発明のいくつかの他の実施形態において、ＣｏＱ１０クリーム１．５％を含む医薬組成物が提供される。クリームは、５．０００％ｗ／ｗのＣ１２−１５アルキルベンゾエート、２．０００％ｗ／ｗのセチルアルコール、１．５％ｗ／ｗのステアリルアルコール、４．５００％ｗ／ｗのステアリン酸グリセリルおよびＰＥＧ−１００ステアリン酸を有するＡ相；２．０００％ｗ／ｗのグリセリン、１．７５０％ｗ／ｗのプロピレン、５．０００％ｗ／ｗのエトキシジグリコール、０．４６３％ｗ／ｗのフェノキシエタノール、５０％ｗ／ｗのカルボマー分散剤、および１１．３７７％ｗ／ｗの精製水を有する相Ｂ；１．３％ｗ／ｗのトリエタノールアミン、０．４００％ｗ／ｗの乳酸、２．０００％ｗ／ｗの乳酸ナトリウム溶液および４．２１０％ｗ／ｗの水を有する相Ｃ；１．０００％ｗ／ｗの二酸化チタンを有する相Ｄ；ならびに１．５００％ｗ／ｗのＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を有する相Ｅを含む。
【０２４０】
本発明のいくつかの他の実施形態において、ＣｏＱ１０クリーム１．５％を含む医薬組成物が提供される。クリームは、５．０００％ｗ／ｗのカプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、２．０００％ｗ／ｗのセチルアルコール、１．５％ｗ／ｗのステアリルアルコール、４．５００％ｗ／ｗのステアリン酸グリセリルおよびＰＥＧ−１００ステアリン酸を有するＡ相；２．０００％ｗ／ｗのグリセリン、１．７５０％ｗ／ｗのプロピレン、５．０００％ｗ／ｗのエトキシジグリコール、０．４６３％ｗ／ｗのフェノキシエタノール、５０％ｗ／ｗのカルボマー分散剤、および１１．３７７％ｗ／ｗの精製水を有する相Ｂ；１．３％ｗ／ｗのトリエタノールアミン、０．４００％ｗ／ｗの乳酸、２．０００％ｗ／ｗの乳酸ナトリウム溶液および４．２１０％ｗ／ｗの水を有する相Ｃ；１．０００％ｗ／ｗの二酸化チタンを有する相Ｄ；ならびに１．５００％ｗ／ｗのＣｏＱ１０  ２１％濃縮物を有する相Ｅを含む。いくつかの実施形態において、カルボマー分散剤は、水、フェノキシエタノールおよびプロピレングリコールを含む。
【０２４１】
１．併用療法
ある実施形態において、本発明の環境影響因子および／またはその医薬組成物は、異なる環境影響因子および／またはその医薬組成物であり得る、少なくとも１つの他の治療剤を用いる併用療法で使用することができる。環境影響因子および／またはその医薬組成物ならびに他の治療剤は、相加的に、またはさらに好ましくは相乗的に作用することができる。一実施形態において、環境影響因子および／またはその医薬組成物は、別の治療剤の投与と同時に投与される。別の実施形態において、化合物および／またはその医薬組成物は、他の治療剤の投与の前にまたはそれに続いて投与される。
【０２４２】
本発明の環境影響因子と共に使用できる他の治療剤の例は、限定されるわけではないが、真性糖尿病治療剤、糖尿病合併症治療剤、抗高脂血剤、降圧剤または抗高血圧剤、抗肥満剤、利尿薬、化学治療剤、免疫治療剤、免疫抑制剤などを含む。
【０２４３】
真性糖尿病を治療する薬剤の例は、インスリン製剤（例えばウシまたはブタの膵臓から抽出された動物インスリン製剤；微生物または方法を使用する遺伝子工学技術によって合成されたヒトインスリン製剤）、インスリン感受性増強剤、その製薬的に許容され得る塩、水和物、または溶媒和物（例えばピオグリタゾン、トログリタゾン、ロシグリタゾン、ネトグリタゾン、バラグリタゾン、リボグリタゾン、テサグリタザル、ファルグリタザル、ＣＬＸ−０９２１、Ｒ−４８３、ＮＩＰ−２２１、ＮＩＰ−２２３、ＤＲＦ−２１８９、ＧＷ−７２８２ＴＡＫ−５５９、Ｔ−１３１、ＲＧ−１２５２５、ＬＹ−５１０９２９、ＬＹ−５１９８１８、ＢＭＳ−２９８５８５、ＤＲＦ−２７２５、ＧＷ−１５３６、ＧＩ−２６２５７０、ＫＲＰ−２９７、ＴＺＤ１８（Ｍｅｒｃｋ）、ＤＲＦ−２６５５など）、アルファ−グリコシダーゼ阻害剤（例えばボグリボース、アカルボース、ミグリトール、エミグリテートなど）、ビグアニド（例えばフェンホルミン、メトホルミン、ブホルミンなど）またはスルホニル尿素（例えばトルブタミド、グリベンクラミド、グリクラジド、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、グリクロピラミド、グリメピリドなど）ならびに他のインスリン分泌促進剤（例えばレパグリニド、セナグリニド、ナテグリニド、ミチグリニド、ＧＬＰ−１など）、アミリンアゴニスト（例えばプラムリンチドなど）、ホスホチロシンホスファターゼ阻害剤（例えばバナジン酸など）などを含む。
【０２４４】
糖尿病合併症を治療する薬剤の例は、限定されるわけではないが、アルドースレダクターゼ阻害剤（例えばトルレスタット、エパルレスタット、ゼナレスタット、ゾポルレスタット、ミナルレスタット、フィダレスタット（ｆｉｄａｒｅａｔａｔ）、ＳＫ−８６０、ＣＴ−１１２など）、神経栄養因子（例えばＮＧＦ、ＮＴ−３、ＢＤＮＦなど）、ＰＫＣ阻害剤（例えばＬＹ−３３３５３１など）、終末糖化産物（ＡＧＥ）阻害剤（例えばＡＬＴ９４６、ピマゲジン、ピラドキサミン（ｐｙｒａｄｏｘａｍｉｎｅ）、フェナシルチアゾリウムブロミド（ＡＬＴ７６６）など）、活性酸素失活剤（例えばチオクト酸またはその誘導体、フラボン、イソフラボン、フラボノン、プロシアニジン、アントシアニジン、ピクノジェノール、ルテイン、リコピンを含むバイオフラボノイド、ビタミンＥ、コエンザイムＱなど）、脳血管拡張剤（例えばチアプリド、メキシレチン（ｍｅｘｉｌｅｔｅｎｅ）など）を含む。
【０２４５】
抗高脂血症剤は、例えばコレステロール合成阻害剤であるスタチンベース化合物（例えばプラバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、アトロバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチンなど）、トリグリセリド低下効果を有するスクアレンシンターゼ阻害剤またはフィブラート化合物（例えばフェノフィブラート、ゲムフィブロジル、ベザフィブラート、クロフィブラート、シンフィブラート、クリノフィブラートなど）を含む。
【０２４６】
降圧剤は、例えばアンジオテンシン変換酵素阻害剤（例えばカプトプリル、エナラプリル、デラプリル、ベナゼプリル、シラザプリル、エナラプリル、エナラプリラト、ホシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリルなど）またはアンジオテンシンＩＩアンタゴニスト（例えばロサルタン、カンデサルタンシレキセチル、オルメサルタンメドキソミル、エプロサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、イルベサルタン、タソサルタン、ポミサルタン、リピサルタン、フォラサルタンなど）を含む。
【０２４７】
抗肥満剤は、例えば中枢性抗肥満剤（例えばデクスフェンフルラミン、フェンフルラミン、フェンテルミン、シブトラミン、アンフェプラモン、デクスアンフェタミン、マジンドール、フェニルプロパノールアミン、クロベンゾレックスなど）、消化管リパーゼ阻害剤（例えばオルリスタットなど）、β−３アゴニスト（例えばＣＬ−３１６２４３、ＳＲ−５８６１１−Ａ、ＵＬ−ＴＧ−３０７、ＳＢ−２２６５５２、ＡＪ−９６７７、ＢＭＳ−１９６０８５など）、ペプチドベース食欲抑制剤（例えばレプチン、ＣＮＴＦなど）、コレシストキニンアゴニスト（例えばリンチトリプト、ＦＰＬ−１５８４９など）などを含む。
【０２４８】
利尿剤は、例えばキサンチン誘導体（例えばサリチル酸ナトリウムテオブロミン、サリチル酸カルシウムテオブロミンなど）、チアジド製剤（例えばエチアジド、シクロペンチアジド、トリクロロメチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、ベンチルヒドロクロロチアジド、ペンフルチジド、ポリチアジド、メチクロチアジドなど）、抗アルドステロン製剤（例えばスピロノラクトン、トリアムテレンなど）、デカルボキシラーゼ阻害剤（例えばアセタゾラミドなど）、クロルベンゼンスルホンアミド製剤（例えばクロルタリドン、メフルシド、インダパミドなど）、アゾセミド、イソソルビド、エタクリン酸、ピレタニド、ブメタニド、フロセミドなどを含む。
【０２４９】
化学治療剤は、例えばアルキル化剤（例えばシクロホスファミド、イホスファミドなど）、代謝アンタゴニスト（例えばメトトレキサート、５−フルオロウラシルなど）、抗癌性抗生物質（例えばマイトマイシン、アドリアマイシンなど）、植物由来抗癌剤（例えばビンクリスチン、ビンデシン、タキソールなど）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシドなどを含む。これらの物質の中で、フルツロンおよびネオフルツロンなどの５−フルオロウラシル誘導体が好ましい。
【０２５０】
免疫治療剤は、例えば微生物または細菌構成要素（例えばムラミルジペプチド誘導体、ピシバニールなど）、免疫増強活性を有する多糖類（例えばレンチナン、シゾフィラン、クレスチンなど）、遺伝子工学技術によって取得されたサイトカイン（例えばインターフェロン、インターロイキン（ＩＬ）など）、コロニー刺激因子（例えば顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｎ）など）などを含み、これらの物質の中で、好ましいものはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２などである。
【０２５１】
免疫抑制剤は、例えばカルシニューリン阻害剤／イムノフィリンモジュレーター、例えばシクロスポリン（サンドイミューン、ジェングラフ、ネオーラル）、タクロリムス（プログラフ、ＦＫ５０６）、ＡＳＭ９８１、シロリムス（ＲＡＰＡ、ラパマイシン、ラパミューン）、またはその誘導体ＳＤＺ−ＲＡＤ、グルココルチコイド（プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾンなど）、プリン合成阻害剤（ミコフェノール酸モフェチル、ＭＭＦ、セルセプト（登録商標）、アザチオプリン、シクロホスファミド）、インターロイキンアンタゴニスト（バシリキシマブ、ダクリズマブ、デオキシスパガリン）、リンパ球除去剤、例えば抗胸腺細胞グロブリン（サイモグロブリン、リンフォグロブリン）、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）などを含む。
【０２５２】
加えて、動物モデルにおいてまたは臨床段階で悪液質改善効果が確認された薬剤、例えばシクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えばインドメタシンなど）［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４９，ｐａｇｅ  ５９３５−５９３９，１９８９］、プロゲステロン誘導体（例えばメゲストロール酢酸）［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２，ｐａｇｅ  ２１３−２２５，１９９４］、グルコステロイド（例えばデキサメタゾンなど）、メトクロプラミドベース剤、テトラヒドロカンナビノールベース剤、脂質代謝改善剤（例えばエイコサペンタン酸など）［Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．６８，ｐａｇｅ  ３１４−３１８，１９９３］、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、ＴＮＦ−α、ＬＩＦ、ＩＬ−６およびオンコスタチンＭに対する抗体も、本発明による化合物と同時に用いられ得る。
【０２５３】
本発明は、制限するとして解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例証される。本願を通じて引用されているすべての参考文献ならびに公開された特許および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられている。
【実施例】
【０２５４】
本発明はここで一般に記載されており、当業者が、本明細書の上記の教示および以下の実施例から、他のアッセイ、細胞の種類、薬剤、作製物、またはデータ分析方法が、すべて制限なく、請求された本発明の範囲から逸脱せずに使用できることを認識しているので、単に本発明の実施形態のある態様の例証の目的のために含まれており、本発明を制限する意図するものではない、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。
【０２５５】
本出願のいずれの箇所で参照されたいずれの特許、特許出願、特許公報、または科学論文の内容も、その全体が本明細書に組み入れられている。
【０２５６】
本発明の実施は、適切な場合および別途指摘しない限り，当業者の技法範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ、および免疫学の慣習的な技法を用いるであろう。このような技法は、文献に記載されている。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：２００１）；専門書、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．ｂｙ  Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｄａｓｓｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｈａｒｆｏｒｄ，およびＹａｍａｄａ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９；ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．ｂｙ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００３を参照。
【０２５７】
実施例１：ＭＩＭとしてのＣｏＱ１０の同定
潜在的なＭＩＭとしてＣｏＱ１０を評価するために、酸化型のＣｏＱ１０を癌株化細胞および正常な対照株化細胞の両方を含む株化細胞のパネルに外部から添加して、パネルの各株化細胞について細胞微小環境プロフィールに誘導された変化を影響評価した。ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方を含む、細胞形態／生理機能に対するおよび細胞組成物に対する変化を、正常細胞との比較として疾患細胞について評価および比較した。これらの実験結果は、ＣｏＱ１０、および特にＣｏＱ１０の酸化型をＭＩＭとして同定した。
【０２５８】
実験の第１セットでは、細胞形態／生理機能に対する変化をＣｏＱ１０に対する細胞の感受性およびアポトーシス応答を検査することによって評価した。対照株化細胞（ケラチノサイトおよびメラノサイトの初代培養）および複数の皮膚癌株化細胞（ＳＫ−ＭＥＬ−２８、非転移性皮膚黒色腫；ＳＫ−ＭＥＬ−２、転移性皮膚黒色腫；またはＳＣＣ、扁平上皮細胞癌腫；ＰａＣａ２、膵臓癌株化細胞；またはＨＥＰ−Ｇ２、肝臓癌株化細胞）を含む皮膚株化細胞のパネルを各種のレベルのコエンザイムＱ１０によって処置した。これらの実験結果は、癌株化細胞が、対照株化細胞と比較して改変された用量依存性応答を癌細胞のみにおけるアポトーシスおよび細胞死の誘導と共に呈することを証明した。例示的な実験を下の実施例３に詳細に記載する。
【０２５９】
次に、ＣｏＱ１０による処置後に細胞の組成の変化を影響評価するアッセイを用いた。リアルタイムＰＣＲアレイ法を使用して、ｍＲＮＡレベルでの遺伝子発現の変化を分析した。例示的な実験を下の実施例６および９〜１３に詳細に記載する。相補的実験において、抗体マイクロアレイ法、２次元ゲル電気泳動、それに続く質量分析キャラクタリゼーションを使用するタンパク質同定（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃｕａｔｉｏｎ）を使用することによって、およびウェスタンブロット分析によって、タンパク質レベルでの遺伝子発現の変化を分析した。例示的な実験を下の実施例４、７および８にそれぞれ詳細に記載する。これらのアッセイからの結果は、検査された株化細胞において、遺伝子発現の著しい変化がｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で、酸化型ＣｏＱ１０の添加により誘導されることを証明した。ＣｏＱ１０処置によって調節された遺伝子は、アポトーシス、癌生物学および細胞増殖、解糖および代謝、分子輸送、ならびに細胞シグナル伝達を含む、複数の細胞経路中に密集することが見出された。
【０２６０】
ＣｏＱ１０の細胞中への進入を確認し、細胞中に存在するＣｏＱ１０のレベルおよび型を決定するために実験を行った。特に、ミトコンドリア中に存在するコエンザイムＱ１０のレベル、ならびにＣｏＱ１０の型（すなわち酸化型または還元型）を、ＣｏＱ１０で処置した細胞からのミトコンドリア濃縮調製物を分析することによって決定した。ミトコンドリア中に存在するコエンザイムＱ１０のレベルは、外因性Ｑ１０の添加に伴って、時間および用量依存的な様式で増加することが確認された。驚くべき予想外の結果において、ＣｏＱ１０はミトコンドリア中に主に酸化型で存在することが決定された。加えて、濃縮試料からのタンパク質のレベルの変化を２次元ゲル電気泳動および質量分析キャラクタリゼーションによるタンパク質同定によって分析した。これらの実験からの結果は、検査された時間経過でのミトコンドリア中の酸化型ＣｏＱ１０のレベルが、代謝経路およびアポトーシス経路に関連する特異的タンパク質のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの調節によって明示されるように、多岐にわたる細胞変化に相関することを証明した。例示的な実験を下の実施例５に詳細に記載する。
【０２６１】
本明細書で出願人らによって記載された結果は、内因性分子ＣｏＱ１０、および特にＣｏＱ１０の酸化型をＭＩＭとして同定した。例えば結果がＣｏＱ１０をＭＩＭとして同定したのは、ＣｏＱ１０がｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方での遺伝子発現の変化を誘導することが観察されたためである。結果がＣｏＱ１０が多次元特徴を有するとして同定したのは、ＣｏＱ１０が、正常な（例えば非癌性）状態と比較した疾患状態（例えば癌）において、細胞形態／生理機能および細胞組成物の示差的変化（例えばｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方での遺伝子発現の示差的変化）を誘導したためである。その上、結果は、ＣｏＱ１０が細胞に進入することができ、それゆえ治療効果および担体効果の両方を呈するという点で多次元特徴を有するとして同定した。
【０２６２】
実施例２：代謝性障害についての疾患関連プロセスおよびバイオマーカーを同定するための方法
株化細胞が目的の分子によって処置された細胞ベースアッセイから、処置細胞対非処置細胞の相違をｍＲＮＡアレイ、タンパク質抗体アレイ、および２次元ゲル電気泳動によって評価する。比較試料分析からＭＩＭまたはエピシフターによって調節されることが同定されたタンパク質を、経路分析を使用するシステム・バイオロジー・パースペクティブ（Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  ＩＰＡソフトウェア）および公知の文献の検討から評価した。潜在的な治療ターゲットまたはバイオマーカーターゲットとして同定されたタンパク質を、ウェスタンブロット分析、ｓｉＲＮＡノックダウン、または組換えタンパク質産生およびキャラクタリゼーション方法などの確認アッセイに供する。
【０２６３】
実施例３〜８の物質および方法
コエンザイムＱ１０ストック
５００μＭコエンザイムＱ１０（細胞増殖培地中５％イソプロパノール）を以下のように調製した。５００μＭコエンザイムＱ１０ストック１０ｍＬは、毎回更新した。分子量：８６３．３４
（０．０００５ｍｏｌ／Ｌ）（０．０１０Ｌ）（８６３．３４ｇ／ｍｏｌ）＝０．００４３１７ｇ
５００μＭストック１０ｍＬを作製するために、４．３２ｍｇコエンザイムＱ１０を１５ｍＬファルコンチューブに秤量して、イソプロパノール５００μＬを添加した。溶液を完全に溶解するために撹拌しながら、５０〜６０℃の水浴で加温した。本溶液に培地９．５ｍＬ（細胞を培養したのと同じ培地）を添加した。
【０２６４】
細胞培養
細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたはＧｉｂｃｏから取得した。細胞を５％ウシ胎仔血清、０．２５ｕｇ／ｍＬアンホテリシン、１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１００ＵｍＬ−１ペニシリンを補足したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で培養した。細胞を３７℃の９５％空気および５％ＣＯ２の雰囲気中で維持した。
【０２６５】
コエンザイムＱ１０処置および全タンパク質単離
細胞をＱ１０に曝露する前に８５％コンフルエントまで培養した。補足培地をＱ１０によって５０および１００マイクロモル濃度に調整した。フラスコを対照、５０μＭＱ１０、および１００μＭＱ１０によって３通り処置した。タンパク質を処置フラスコおよび対照フラスコから４、８、１２、および２４時間後に単離した。タンパク質の単離のために、細胞はｐＨ７．４の氷冷ＰＢＳ５ｍＬによって３回洗浄した。細胞を次にＰＢＳ３ｍＬ中でこすり取り、遠心分離によってペレット化し、ｐＨ７．４の溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤およびリン酸阻害剤を含む、８０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１％ＳＤＳ）に再懸濁させた。ＢＣＡ法を使用してタンパク質濃度を定量した。
【０２６６】
株化細胞
下に挙げる株化細胞を増殖させて、それぞれについて細胞バンクを樹立した。各種のアッセイのための細胞の大規模産生を遂行して、分析のために材料を収集した。一般に、株化細胞の維持に細胞特異的培地が不要であるとき、細胞増殖増殖に使用した培地は５％血清を含むＤＭＥＭＦ−１２であった。細胞は通例、続いての分割ならびに細胞アッセイおよび標準実施方法における使用の前に、７５〜８０％コンフルエント（クリアスペーシング（ｃｌｅａｒ  ｓｐａｃｉｎｇ））まで増殖させた。実験のために以下の株化細胞を樹立した：
ＳＫ−ＭＥＬ−２８（非転移性皮膚黒色腫）
ＳＫ−ＭＥＬ−２（転移性皮膚黒色腫）
ＨＥＫａ（ケラチノサイト、皮膚対照）
ＨＥＭａ（メラノサイト、皮膚対照）
ｎＦＩＢ（新生児線維芽細胞）
ＨＥＰ−Ｇ２（肝臓癌）［ＳＢＨ株化細胞］
ＳｋＢｒ−３（乳癌、Ｈｅｒ２過剰発現）
ＭＣＦ−７（乳癌、ｐ５３突然変異）
ＰＣ−３（前立腺癌）［ＳＢＨ株化細胞］
ＳｋＢｒ−３（ヒト乳腺癌）
ＮＣＩ−ＥＳ−０８０８
ＳＣＣ（扁平上皮細胞癌腫）
ＰａＣａ−２
ＮＩＨ−３Ｔ３
細胞培養：
細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたはＧｉｂｃｏから取得した。細胞を５％ウシ胎仔血清、０．２５ｕｇ／ｍＬアンホテリシン、１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１００ＵｍＬ−１ペニシリンを補足したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で培養した。細胞を３７℃の９５％空気および５％ＣＯ２の雰囲気中で維持した。
【０２６７】
皮膚悪性黒色腫ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞を５％ＦＢＳ、アンホテリシンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補足したグルタマックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養および維持した。細胞を３７℃にて５％ＣＯ２によって増殖させた。追加の株化細胞および成長条件の詳細事項を下の表で概説する。
【表１】
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【０２６８】
ＳＫＭＥＬ２８細胞のＱ１０処置：
ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞を１００μＭ  Ｑ１０または対照ビヒクルによって処置した。Ｑ１０の製剤は以下の通りである。１５ｍＬキャップ付きチューブに、Ｑ１０  ４．３２ｍｇ（Ｃｙｔｏｔｅｃｈより供給）を移し、次にイソプロパノール５００μｌの添加により溶解させた。得られた溶液を６５℃の水浴で加温して、高速でボルテックスした。Ｑ１０／イソプロパノール溶液の体積を平衡にした細胞培養培地の添加により、１０ｍＬにした。ストック溶液を次にボルテックスして、Ｑ１０の溶解性を最大にした。ストック溶液を希釈して（培地８ｍＬによりストック２ｍＬ）１００μ  ＭＱ１０の最終濃度を取得した。対照ビヒクルでは、培地９．５ｍＬをイソプロパノール５００μＬに添加した。対照ストック（ストック２ｍＬ）を培地８ｍＬでさらに希釈した。細胞を処置開始の６、１６、２４、４８または７２時間後に収集した。
【０２６９】
ＳＣＣ細胞のＱ１０処置：
ＳＣＣ細胞を１００μＭ  Ｑ１０（上記のように調製）によって６時間または２４時間のどちらかで処置した。対照細胞は未処置細胞であった。処置後、各種の時間にて収集およびペレット化して、ペレットを急速凍結させ、ＲＮＡを下記のようにＸＴＡＬにて単離するまで−８０℃にて貯蔵した。
【０２７０】
ＲＮＡ単離：
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）キットをメーカーの説明書に従って使用して、細胞を各種の処置時間にＲＮＡ単離のために溶解させた。ＲＮＡを２６０ｎｍにおける光学密度を測定することによって定量した。
【０２７１】
第１鎖合成：
第１鎖ｃＤＮＡを、ＲＴ２第１鎖合成キット（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）をメーカーの推奨に従って使用して、全ＲＮＡ  １μｇから合成した
リアルタイムＰＣＲ：
第１鎖合成からの生成物を水で希釈して、ＳＹＢＲグリーン・マスター・ミックス（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）と混合し、ＰＣＲアレイ上に添加した。リアルタイムＰＣＲをＢｉｏｒａｄ  ＣＦＸ９６でＰＣＲアレイ（アポトーシスアレイ、糖尿病アレイ、酸化ストレスアレイおよび抗酸化防御アレイならびに熱ショックタンパク質アレイ）（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）に対して実行した。
【０２７２】
アポトーシスのためのネキシンアッセイによる、コエンザイムＱ１０に対する株化細胞感受性の決定：
早期および後期アポトーシスでの細胞のパーセンテージをコエンザイムＱ１０処置の２４時間後に定量した。早期および後期アポトーシスを、コエンザイムＱ１０に対する各種の癌株化細胞の感受性の相違を理解するためのマーカーとして使用した。試験した各種の株化細胞は、ＰａＣａ２、ＨｅｐＧ２、ＰＣ−３、ＳＫＢｒ３、ＭＣＦ−７およびＳＫ−ＭＥＬ２８であった。細胞を９６ウェルプレート内で一晩接着させた。これらの細胞を対照ビヒクル、５０μＭ  Ｑ１０または１００μＭコエンザイムＱ１０のいずれかによって処置した。２４時間後、アポトーシス細胞の存在がＰＣＡ９６フローサイトメータ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）で推定された。加えていくつかの細胞を、アポトーシスの正の対照としての４μＭスタウロスポリンで２時間処置した。細胞を最初にＰＢＳで洗浄して、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）５０μＬによって室温にて剥離させた。１％プルロニックＦ−６８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する培養培地の添加によって、解離を停止させた。ネキシン試薬１００μＬ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）を各ウェルに添加した。暗所での２０分間のインキュベーションの後、アッセイを低結合プレートにて遂行して、細胞の基質への再結合を最小限に抑えた。ネキシン試薬は２種類の染料を含有している。アネキシン−Ｖ−ＰＥは、早期アポトーシス細胞の特徴である、ホスファチジル（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌ）セリンを細胞の外部にて検出する。第２の染料７−ＡＡＤは、生（健常）および早期アポトーシス細胞から排除されるが、後期アポトーシス細胞のみに浸透する。４つの細胞集団；生、早期アポトーシス細胞、後期アポトーシスおよび破片のパーセンテージは、Ｃｙｔｏｓｏｆｔ  ２．５．７ソフトウェア（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）を使用して決定した。
【０２７３】
免疫ブロッティング
試料当りおよそ５０μｇのタンパク質を、免疫ブロッティングによってアッセイした。すべての処置は対照を用いて３通り実行した。タンパク質を１２％ＴＲＩＳ−ＨＣｌゲル上で分離し、電気泳動を介してニトロセルロース膜に移し、１次抗体によるインキュベーションの前に５％牛乳およびＴＢＳＴ溶液を使用して遮断した。１次抗体を５％ＢＳＡおよびＴＢＳＴ溶液中４℃にて一晩インキュベートした。２次抗体を４℃にて１時間インキュベートした。すべての抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗体は、１：５０００の比のβアクチンを除いて、１：１０００の比で使用した。ブロットを展開させて、結果はＮＩＨ  Ｊａｖａベースの濃度計分析ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｊを使用して定量した。すべてのブロットはプローブも行い、そのそれぞれのβアクチン発現に正規化した。
【０２７４】
２次元電気泳動
等電点電気泳動（ＩＥＦ）の前に、試料を４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、および１％Ｃ７両性イオン洗剤中に溶解させて、トリブチルホスフィンによって還元し、１０ｍＭアクリルアミドによって室温にて９０分間アルキル化した。試料を１０ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａデバイスに通した後、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、および２％ＣＨＡＰＳからなる少なくとも３倍量の再懸濁緩衝液によって、試料の伝導率を低下させる。タンパク質１００マイクログラムを、１１ｃｍ  ｐＨ３〜１０、ｐＨ４〜７またはｐＨ６〜１１の固定化ｐＨ勾配ストリップ（ＧＥ，Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＳＡ）にて１００，０００ボルト時までＩＥＦに供した。ＩＥＦの後、固定化ｐＨ勾配ストリップを６Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液、ｐＨ７．０、および０．０１％ブロムフェノールブルー中で平衡にして、８〜１６％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌプレキャストゲル１ｍｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルは２通り実行した。これらにどちらも固定、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ、８０ｍＬ／ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）での染色および５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーでの撮像、またはＰＶＤＦ膜上への移動を行った。
【０２７５】
対照試料についての追加の情報を取得して、ｄＰＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｉｎｃ．）選択的ｐＩ分画、それに続くｄＰＣプラグのトリプシン消化を質量分析同定および半定量（ｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｚａｔｉｏｎ）（ＮａｎｏｍａｔｅまたはＬＣ／ＬＴＱ／ＭＳ）と共に利用する方法を使用して、タンパク質同定の有用性を試験した。対照試料を用いて遂行したｄＰＣ分析は、タンパク質の大型サブセットの同定でその有用性を証明した。試験の間に産生された材料は、将来、必要が生じた場合に資源として利用され得るように保存した。
【０２７６】
２次元ゲル画像分析：
すべてのゲル画像の分析は、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏ（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｕｐｏｎ  Ｔｙｎｅ、ＵＫ）を使用して遂行した。スポット検出、マッチング、バックグラウンド除去、正規化、およびフィルタリングの後、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙゲル画像のデータをエクスポートした。Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙでスチューデントのｔ検定を使用して群間の対比較を遂行し、発現が著しく改変されたスポットを同定した（ｐ＞０．０５）。
【０２７７】
抗体アレイ：
抗体マイクロアレイ（Ｐａｎｏｒａｍａ  ＸＰ７２５抗体アレイ、Ｓｉｇｍａ）を利用して７００超のタンパク質抗体をスクリーニングし、Ｑ１０処置細胞（ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＳＣＣ）におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。細胞抽出物におけるタンパク質の発現は、スライド上にスポットされた対応する抗体にタンパク質が結合されたときに検出される。結合の前に、タンパク質を蛍光描出および定量的分析に使用される蛍光染料で直接標識する。アレイを異なるＣｙＤｙｅ（Ｃｙ３またはＣｙ５）によってそれぞれ標識された２つの試料のタンパク質発現プロフィールを比較するために使用して（試験試料対参照試料）、２つの試料を等しいタンパク質濃度でアレイ上に同時に適用する。次に各試料の蛍光シグナル強度を試料の染料標識に対応する波長にて個別に記録して、比較する。
【０２７８】
高用量のコエンザイムＱ１０は、培養されたＳＫＭＥＬ−２８細胞のアポトーシス経路、糖尿病経路および酸化ストレス経路に関与する遺伝子の発現を調節する。
【０２７９】
実験詳細事項：５％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンホテリシンを補足した、グルタマックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０５６５−０４２）を含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２中で培養されたＳＫＭＥＬ−２８細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−７２）は、非転移性、皮膚黒色腫細胞であり、ビヒクルまたは１００ｕＭコエンザイムＱ１０によって各種の長さの時間にわたって処置した。コエンザイムＱ１０処置の結果として生じる遺伝子発現のいずれの変化も、リアルタイムＰＣＲアレイ（アポトーシスカタログ番号ＰＡＨＳ−１２、糖尿病カタログ番号ＰＡＨＳ−０２３および酸化ストレスカタログ番号ＰＡＨＳ−０６５）（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）を使用して定量した。
【０２８０】
５００ｕＭコエンザイムＱ１０のストック濃縮物を、イソプロパノール５００ｕｌ中に４．３２ｍｇを溶解することによって調製して、これを培地の添加により１０ｍｌまでさらに希釈した。ボルテックスおよび６５℃までの加熱を交互に行って、コエンザイムＱ１０を溶解させた。ストック溶液２ｍｌを培地により１０ｍｌに希釈して、１００ｕＭ  Ｑ１０含有培地を得て、これを細胞の処置に使用した。コエンザイムＱ１０を添加しないことを除いた類似のプロトコールによって、ビヒクルを並行して調製した。
【０２８１】
ＳＫＭＥＬ−２８細胞を６ウェルプレートにて１×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間後、細胞が結合して５０％コンフルエントであるときに、ビヒクルまたは１００ｕＭ  Ｑ１０のどちらかを添加した。細胞をＱ１０処置の６、１６、２４、４８または７２時間後に収集したが、ビヒクル処置細胞は２４時間後に収集した。スピンカラムおよびオンカラムＤＮアーゼ処置を用い、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ  カタログ番号７４１０４）キットをメーカーの説明書に従って使用して、細胞を各種の処置時間にＲＮＡ単離のために溶解させた。２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによってＲＮＡを定量した。
【０２８２】
リアルタイムＰＣＲを、全ＲＮＡ０．４〜１ｕｇをテンプレートとして使用する第１鎖ｃＤＮＡ合成によって、ゲノムＤＮＡ消失ステップを用いるＲＴ２第１鎖合成キット（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ、カタログ番号Ｃ−０３）をメーカーの推奨に従って用いて行った。第１鎖合成からの生成物を水で希釈して、ＳＹＢＲグリーン・マスター・ミックス（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ、カタログ番号ＰＡ−０１０−１２）と混合し、共通経路内で連結された８４種類の異なる遺伝子、正規化に使用される５種類のハウスキーピング遺伝子、逆転写およびＰＣＲ対照を含有するＰＣＲアレイ上に添加した。リアルタイムＰＣＲをＢｉｏｒａｄ  Ｃｆｘ９６に対して実行した。酵素を活性化させるホットスタートによって増幅を開始し、それぞれ（９５℃−１５秒変性ステップおよび６０℃−１分アニーリングおよび伸長ステップ）の４０サイクルがに続き、溶融曲線プログラムが続いた。Ｃｔ値（全ての処置群についてのＰＣＲサーモサイクラーによる出力）をエクセルシートにまとめ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｐｃｒ／ａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓ．ｐｈｐ．で入手できる比較分析ソフトウェアにロードした。
【０２８３】
ミトコンドリア濃縮試料の精製：
実験詳細事項：１００μＭ  Ｑ１０によって２４または４８時間処置されたＳＫＭＥＬ−２８細胞、ＮＣＩ−ＥＳ０８０８細胞およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、ｔ＝０にて収集された細胞と共に、Ｔ１６０フラスコから洗浄およびこすり落としによって収集した。細胞を遠心分離して、ペレット化し、急速凍結させ、ミトコンドリアが単離されるまで−８０℃にて貯蔵した。細胞ペレットを解凍して、再懸濁させ、ダウンスホモジナイザで破砕した。ホモジネートを遠心分離して、培養細胞用ミトコンドリア単離キット（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ）（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ、カタログ番号ＭＳ８５２）によって推奨された試薬およびプロトコールを使用してミトコンドリアを単離した。ミトコンドリア画分をアリコートし、−８０℃で保存した。
【０２８４】
コエンザイムＱ１０およびユビキノール−１０の定量方法：
コエンザイムＱ１０（Ｑ１０）および還元型ユビキノール−１０（Ｑ１０Ｈ２）の同時決定の方法は、最近公開された方法（Ｒｕｉｚ−Ｊｉｍｅｎｅｚ，２００７，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１１７５，２４２−２４８）に基づいて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）と共に使用することによって行った。Ｑ１０およびＱ１０Ｈ２の両方の高選択的同定および高感受性定量は、他の選択された脂質の同定と共に可能である。１００μＭ  Ｑ１０によって処置されたＳＫ−ＭＥＬ−２８からのミトコンドリア濃縮試料の一定分量を、タンパク質沈殿（１−プロパノール３００μｌ中で超音波処理された充填細胞１００μｌ）、液液抽出（上清に水１００μｌを添加して、Ｘ３をｎ−ヘキサン２００μｌで抽出する）、合せたヘキサン抽出物の蒸発乾固および９５：５メタノール／ヘキサン（ｖ／ｖ）５０μｌでの再構成に基づく、慣習的な前処置に供した。分析は、Ｐｒｉｓｍ  ＲＰ  １×１００ｍｍ、５μｍ粒径カラムを備えたＷａｔｅｒｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＩＩ  ３連４重極質量分析計（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによった。流速５０μｌ／分での２０％イソプロピルアルコール８０％メタノール中の４ｍＭギ酸アンモニウムによる定組成溶離。各試料１０μｌを注入した。ＭＲＭ分析は、ｍ／ｚ８８２．７＞１９７．００（Ｑ１０Ｈ２）およびｍ／ｚ８８０．８０＞１９７．００（Ｑ１０）トランジションをコーン電圧４０および衝突エネルギー３０と共に使用して遂行した。
【０２８５】
実施例３：ＣｏＱ１０に対する株化細胞の感受性
いくつかの株化細胞のＱ１０に対する感受性を、適用の２４時間後に２種類の染料、７ＡＡＤおよびアネキシン−Ｖ−ＰＥの組み合わせを含有する試薬（ネキシン試薬）を使用することによって試験した。７ＡＡＤ染料は、透過性細胞膜によって細胞；主に後期アポトーシスにある細胞の中に進入するであろう。アネキシン−Ｖ−ＰＥは、早期アポトーシス細胞の原形質膜の外面に露出されたホスファチジル（Ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌ）セリンに結合する染料である。それゆえネキシン試薬を使用して、フローサイトメータでアポトーシス細胞の異なる集団を区別することができる。
【０２８６】
ＰａＣａ２細胞は、５０μＭ  Ｑ１０および１００μＭ  Ｑ１０によりＱ１０適用の２４時間後に、早期および後期アポトーシス細胞の両方で上昇を示した（ゲート細胞の５〜１０％の間）。ＰＣ−３細胞も、５０μＭおよび１００μＭ  Ｑ１０によって早期および後期アポトーシス集団で上昇を示したが、上昇はＰａＣａ２細胞と比較して小さかった。ＭＣＦ−７およびＳＫ−ＭＥＬ２８細胞は５０μＭおよび１００μＭ  Ｑ１０によって、早期アポトーシス集団のみで上昇を示した。ＨｅｐＧ２細胞も５０μＭ  Ｑ１０処置に感受性であり、後期アポトーシスステージおよび早期アポトーシスステージに集まったゲート細胞の約２０％の上昇があった。ＳＫＢｒ３は、５０μＭまたは１００μＭ  Ｑ１０処置のどちらによっても早期および後期アポトーシスで大きな上昇を少しも示さなかった、試験した中で唯一の株化細胞であった。結果を図１〜６に示す。
【０２８７】
Ｑ１０処置がＨｅｐＧ２肝臓癌細胞でアポトーシス応答を引き起こすことをさらに確認するために、第２のアポトーシスアッセイを、単鎖ＤＮＡを測定するＡｐｏＳｔｒａｎｄ（商標）ＥＬＩＳＡベース法を使用して評価した。ＡｐｏＳｔｒａｎｄ（商標）ＥＬＩＳＡは、アポトーシス細胞中のＤＮＡのホルムアミド変性に対する感受性および単鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に対するモノクローナル抗体による変性ＤＮＡの検出に基づく。肝臓癌株化細胞ＨｅｐＧ２の５０および１００μＭ  Ｑ１０による処置は、それぞれ１７％および３２％の用量応答で検出可能なアポトーシスを生じた（図７）。これらの結果は、他の組織からの他の癌株化細胞（例えばＳＣＣ、ＳＫＭＥＬ−２８、ＭＣＦ−７、およびＰＣ−３）においてアポトーシスを誘導するＱ１０の観察結果と一致する。
【０２８８】
実施例４：Ｑ１０によって処置した細胞のプロテオミクス分析
Ｑ１０によって処置した試料の細胞ペレットをプロテオミクス法によって分析した。細胞ペレットを溶解させて、２次元ゲルおよびウェスタンブロット分析で使用するために処置した。３つの細胞タイプ（ＳＫＭＥＬ−２８、ＳＣＣ、およびｎＦｉｂ）をＱ１０によって処置して、２次元ゲル電気泳動によるプロテオミクスキャラクタリゼーションに供した。
【０２８９】
Ｑ１０によって処置したＳＫＭＥＬ−２８細胞のプロテオミクス分析
ウェスタンブロットおよび２次元ゲル電気泳動によって処理および評価された第１の実験セットは、皮膚癌株化細胞ＳＫＭＥＬ−２８であった。本実験セットは、０、５０または１００μＭ  Ｑ１０によって３、６、１２、および２４時間処置されたＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を包含していた。
【０２９０】
Ｑ１０処置ＳＫ−ＭＥＬ−２８試料のセットを、２次元ゲル電気泳動に供し（図８）、対照試料に対するタンパク質レベルの変化を同定するために分析した。すべての２４時間ゲルにわたる９４３スポットの比較分析を遂行して、対照試料を処置試料すべてに対して比較した。分析は、上昇、低下、または翻訳後修飾による、時間経過にわたるスポット変化の同定を含んでいた。
【０２９１】
分析は、３２の統計的に有意な示差的スポット変化を見出した。これより、２０個の非冗長性スポットを切除して、トリプシン消化によるタンパク質同定および質量分析キャラクタリゼーションに供した。キャラクタリゼーションされたペプチドをＭａｓｃｏｔ  ａｎｄ  ＭＳＲＡＴソフトウェア分析を用いてタンパク質データベースで検索して、タンパク質を同定した（表２）。
【表２】
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【０２９２】
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【０２９３】
本実験の主要な発見は、トランスアルドラーゼ１の減少であり、このことはＱ１０が癌細胞内の代謝状態を改変することにより作用するという前提を裏付けた。トランスアルドラーゼ１は、ペントースリン酸経路（ヘキソースモノリン酸分路としても公知）中の酵素である。トランスアルドラーゼ（ＥＣ：２．２．１．２）は、３炭素ケトールユニットのセドヘプツロース７−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸への可逆的移動を触媒して、エリトロース４−リン酸およびフルクトース６−リン酸を形成する。本酵素は、トランスケトラーゼと共に、解糖経路とペントース−リン酸経路との間に連結を提供する。このことはヌクレオチドおよびＮＡＤＰＨ合成に関連しており、生合成反応のための還元等価物の産生および還元環境の維持を容易にする。
【０２９４】
最近の刊行物（Ｂａｓｔａ，Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．Ａｕｇｕｓｔ  ２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，３２，２００−２０８）は、トランスアルドラーゼにおける遺伝的多型の証拠を提供し、頭部および頸部の扁平上皮細胞癌腫に結び付けられた。最近の別の刊行物（Ｑｉａｎ，Ｙ．，ｅｔ．ａｌ．Ｍａｙ  ２００８，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，４１５，１２３−１３４）は、ミトコンドリアホメオスタシスのモジュレーターとしてのトランスアルドラーゼの欠乏、Ｃａ２＋流入およびアポトーシスを同定した。
【０２９５】
これらの初期の結果から、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞中でＱ１０によって調節されているような、２次元ゲル電気泳動によって同定された残りのタンパク質を公知の関係について分析した（図９）。これらのタンパク質の機能性評価は、１４−３−３−媒介シグナル伝達に関与する群（ＰＤＣＰ６ＩＰ、ＹＷＨＡＺ、およびＶＩＭ）が、多種多様のプロセス［細胞周期；ペントースリン酸経路（ＴＡＬＤＯ１）；セラミドシグナル伝達（ＣＴＳＤ）；アミノアシル−ｔＲＮＡ生合成（ＧＡＲＳ）、およびミトコンドリアタンパク質インポート（ＴＯＭ２２）］に結び付けられた個別のタンパク質と共にあることを明らかにした。
【０２９６】
Ｑ１０によって処置したＳＣＣ細胞のプロテオミクス分析
別の皮膚癌株化細胞の扁平上皮細胞癌腫（ＳＣＣ）も調製して、前のＳＫ−ＭＥＬ−２８分析の追跡実験として、２次元ゲル電気泳動によって分析した。ＳＣＣ細胞を１００μＭ  Ｑ１０によって、収集前に６時間または２４時間処置した。未処置細胞の対照も収集した。細胞ペレットを溶解させ、試料を２次元電気泳動に供した（２通り）。比較試験での６００個を超えるタンパク質スポットの分析を遂行して、対照試料を６時間および２４時間処置に対して比較した。
【０２９７】
上位２５の統計的に有意な示差的スポット変化を２次元電気泳動ゲルの比較分析から評価した。これより、２０個のスポットを切除して、トリプシン消化による同定および質量分析キャラクタリゼーションに供した（結果を下の表３にまとめる）。
【表３】
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【０２９８】
トランスアルドラーゼ１：Ｑ１０で処置したＳＫＭＥＬ−２８細胞で先に観察されたように、酵素トランスアルドラーゼ１はレベルの低下によって調節された。これは、Ｑ１０とトランスアルドラーゼの改変（およびそれゆえ細胞の代謝状態）との連関についての以前の観察結果を独立して確証するものである。
【０２９９】
トランスアルドラーゼは、ペントースリン酸経路の非酸化的段階における酵素である（図１０）。ペントースリン酸経路は、還元的生合成のためのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型ＮＡＤＨ）の発生のための細胞の代謝状態において、ならびにＡＴＰ、ＤＮＡ、およびＲＮＡの必須構成要素であるリボースの形成において重要である。トランスアルドラーゼはまた、ペントースリン酸経路を解糖に連結する。解糖は、酸化的リン酸化のミトコンドリアプロセスが利用されないため、癌細胞が細胞生存に必要なエネルギーを取得する代謝経路である。Ｑ１０は、酸化的リン酸化およびミトコンドリアＡＴＰ産生に必要とされる必須のコエンザイム因子である。
【０３００】
ＢＳＣｖ：スポット２３は、ＢＳＣｖという名称の、染色体２０からの新規ヒトタンパク質であった。ＢＳＣｖタンパク質は、脂肪細胞血漿膜結合型タンパク質（遺伝子名：ＡＰＭＡＰまたはＣ２０ｏｒｆ３）としても公知であり、タンパク質のストリクトシジン・シンターゼ・ファミリーに配列類似性を有するシングルパスＩＩ型膜タンパク質であることが予測されている。Ｑ１０処置は、本タンパク質のレベルの低下を引き起こした。本タンパク質は、十分に特徴付けもされておらず、ストリクトシジンシンターゼとのその相同性も確認されてもいない。興味深いことに、本タンパク質は脂肪細胞分化の役割に関連してきた（Ａｌｂｒｅｋｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ヒト大網脂肪組織の最近のプロテオミクス研究はＢＳＣｖを、病的肥満女性による多嚢胞性（ｐｏｌｃｙｓｔｉｃ）卵巣症候群（ＰＣＯＳ）の差次的発現を有する９種類のタンパク質のうちの１つとして同定した（Ｃｏｒｔｏｎ，２００８  Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：６５１−６６１に概説されている）。Ｑ１０に応答する細胞表面タンパク質としてのＢＳＣｖに対する抗体は、バイオマーカーとして有用であろう。現在の結果および入手可能な文献に基づいて、ＢＳＣｖは癌および糖尿病で潜在的な役割を有し得る。
【０３０１】
ＮＭ２３Ａ：非転移性細胞１タンパク質（ＮＭ２３Ａ、ＮＭＥ１としても公知）は、転移サプレッサーとであると考えられる。本遺伝子（ＮＭＥ１）は、高転移性細胞におけるその低下したｍＲＮＡ転写レベルのために同定された。該タンパク質は、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ（ＮＤＫ）としての活性を有し、「Ａ」アイソフォーム（本遺伝子によりコードされた）および「Ｂ」アイソフォーム（ＮＭＥ２によりコードされた）で構成されたヘキサマーとして存在する。本遺伝子における突然変異は、侵襲性神経芽細胞腫において同定されている。ＮＤＫ活性は、例えばクエン酸（クレブス）回路で産生されたＧＴＰがＡＴＰに変換されるときなどに、異なるヌクレオシド３リン酸の濃度の間で平衡を維持する。ＮＤＫ複合体は、ＳＴＲＡＰとの相互作用を通じてｐ５３に関連している。ＳＴＲＡＰがＨＮＦ４Ａに連結されていることは注目に値する。それゆえＮＭ２３Ａは、細胞制御および疾患治療に重要な経路に関与する潜在的タンパク質である。
【０３０２】
Ｒｈｏ  ＧＤＰ解離阻害剤（ＧＤＩ）アルファ：ＧＤＩは、Ｒｈｏタンパク質からのＧＤＰの解離、および続いてのＲｈｏタンパク質へのＧＴＰの結合を阻害することによって、ＲｈｏタンパクのＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を調節する。該タンパク質は、癌細胞において上方調節される。
【０３０３】
実施例５：ミトコンドリア濃縮分析
複数の一連の証拠は、ミトコンドリアタンパク質の役割および癌生物学およびＱ１０応答のより綿密な評価が正当化されることを示唆した。第１に、正常細胞におけるエネルギー産生のためのミトコンドリア酸化的リン酸化プロセスには、Ｑ１０の不可欠の役割がある。しかし、癌細胞に出現するのは、Ｑ１０を必要としない解糖の代わりの経路によるエネルギー産生への代謝シフトである。第２に、細胞のアポトーシス応答は、ミトコンドリアタンパク質の出現を必要とする。Ｑ１０は、癌細胞における刺激アポトーシスとして樹立されてきた（Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質、シトクロムｃ）。最後に、ミトコンドリアインポート受容体タンパク質ＴＯＭ２２のタンパク質レベルの調節によって例示されるように（本明細書に記載する実験を参照）、新たなミトコンドリアタンパク質がＱ１０処置によって調節されていることが同定された。
【０３０４】
ミトコンドリア濃縮試料の産生
皮膚癌ＳＫＭＥＬ−２８細胞を１００μＭ  Ｑ１０または偽ビヒクルによって６、１９、または４８時間にわたって処置した。細胞をＴ−１６０フラスコ（各時点ごとに４個）から洗浄およびこすり落としによって収集した。細胞を遠心分離によって採取し、ペレットを急速凍結させて−８０℃にて貯蔵した。細胞ペレットを再懸濁させ、２ｍＬダウンスホモジナイザを使用して破砕した。試薬および方法は、培養細胞用ミトコンドリア単離キット（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号ＭＳ８５２）から取得した。結果として生じたミトコンドリア試料一定分量７５μＬ（１試料に付き、４〜５個の一定分量）に分け、−８０℃にて貯蔵した。
【０３０５】
Ｑ１０によって処置されたＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞から単離されたミトコンドリア濃縮試料のプロテオミクス分析
２次元ゲル電気泳動は、１００μＭ  Ｑ１０によって６、１９、および４８時間処置されたＳＫ−ＭＥＬ−２８ミトコンドリア濃縮試料に２個の一定分量から溶解されたタンパク質に対して（対応する偽ビヒクル対照と共に）遂行した。試料を２次元電気泳動に供した（２通り）。５２５個のタンパク質スポットの分析を遂行して、対照試料を残りの時点の試料に対して比較した（図１１）。
【０３０６】
９つの統計的に有意な示差的スポット変化を２次元電気泳動ゲルの比較分析から選択した。９個のスポットを切除して、トリプシン消化による同定および質量分析キャラクタリゼーションに供した。
【表４】
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【０３０７】
アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ７：アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ７（ＡＣＯＴ７）は、脂肪アシル−ＣｏＡの遊離脂肪酸およびＣｏＡの加水分解を触媒する酵素ファミリーのメンバである。本酵素はそれゆえ、脂質代謝および細胞シグナル伝達の調節に役割を果たす。ＡＣＯＴ７は、８〜１６個の炭素原子（Ｃ８−Ｃ１６）の脂肪酸鎖を有する長鎖アシルＣｏＡ基質に対する選択性を有する。ＡＣＯＴ７における正確な細胞機能は、十分に理解されていない。本遺伝子の転写は、ステロール調節要素結合タンパク質２によって活性化され、それゆえコレステロール代謝における機能を示唆する。
【０３０８】
本実施例の結果は、ＡＣＯＴ７がＱ１０の代謝に直接または間接的に潜在的に関与することを指摘する。それゆえターゲティングＡＣＯＴ７は、Ｑ１０の細胞間レベルの調節を促進して、それゆえ細胞Ｑ１０効果に影響を及ぼすことができる。
【０３０９】
ピルビン酸キナーゼ：ピルビン酸キナーゼは、解糖の最後のステップに関与する酵素である。ピルビン酸キナーゼは、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）からＡＤＰへのリン酸基の移動を触媒して、ピルビン酸１分子およびＡＴＰ１分子を産する。
【化３】
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【０３１０】
タンパク質は、これがミトコンドリア濃縮ＳＫ−ＭＥＬ−２８試料から同定されたので、おそらく２型アイソフォームのＰＫＭ２のタンパク質である。本アイソフォームは、腫瘍細胞形成および調節に関与することが周知である。
【０３１１】
ミトコンドリアにおけるＱ１０レベルの定量
コエンザイムＱ１０（Ｑ１０）および還元型ユビキノール−１０（Ｑ１０Ｈ２）の同時決定の方法は、最近公開された方法（Ｒｕｉｚ−Ｊｉｍｅｎｅｚ，２００７，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ  Ａ，１１７５，２４２−２４８）に基づいて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）と共に使用することによって実行した。Ｑ１０およびＱ１０Ｈ２の両方の高選択的同定および高感受性定量は、他の選択された脂質の同定と共に可能である。１００μＭ  Ｑ１０によって処置されたＳＫ−ＭＥＬ−２８からのミトコンドリア濃縮試料の一定分量を、タンパク質沈殿、液液抽出、合せたヘキサン抽出物の蒸発乾固および９５：５メタノール／ヘキサン（ｖ／ｖ）での再構成に基づく、慣習的な前処置に供した。
【０３１２】
本分析において、Ｑ１０、Ｑ１０Ｈ２、およびＱ９を定量した（表５）。関連する分子Ｑ９のレベルは低く、検出レベル付近であった。未処置試料のレベルは、この同じレベルを有する６時間Ｑ１０処置試料と比較的一致していた。全材料の試料分散を制御するために、コレステロールのレベルも測定して、差が試料サイズ誤差によるものでないことを確認した。Ｑ１０レベルが同じミトコンドリア調製物の他の一定分量のタンパク質抽出によって取得された全タンパク質値に対して補正されたときに、相対比は比較可能であった。それゆえＱ１０レベルの著しい上昇が１９時間後に得られ（約３倍）、４８時間時点までになお大きな上昇（約６倍）が得られた（図１２）。
【表５】
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【０３１３】
本試験からの驚くべき結果は、Ｑ１０が酸化型として細胞に供給されるという発見であった。４８時間試料では、還元型Ｑ１０Ｈ２も測定され、著しく低い量で存在することが見出された（ＣｏＱ１０  ４６．６３ｎｇ／試料と比較して、ＣｏＱ１０Ｈ２  ０．２８ｎｇ／試料）。Ｑ１０処置４８時間試料においてＱ１０Ｈ２のレベルの一般的な上昇（３倍）があったが、レベルはアッセイの推定検出限界付近であった。興味深いことに、酸化型（Ｑ１０）は、生物系において酸化エンハンサーとして作用することができる。文献によれば、ヒト血漿をＱ１０およびＱ１０Ｈ２を評価したとき、分子の大部分（９０％）は、抗酸化剤として作用することができる、Ｑ１０Ｈ２の還元型で見出された（Ｒｕｉｚ−Ｊｉｍｅｎｅｚ，２００７，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ  Ａ，１１７５，２４２−２４８）。
【０３１４】
それゆえこれらの結果は、培地へのＱ１０の外部からの添加時にＱ１０のレベルがミトコンドリア中で上昇することを確認および定量する。驚くべきおよび予想外の発見は、Ｑ１０がいずれの著しい量でも供給された酸化型（酸化促進）で維持されて、Ｑ１０Ｈ２の還元（抗酸化）型に変化されないことであった。
【０３１５】
実施例６：リアルタイムＰＣＲアレイ
実験１：アポトーシスアレイ
実施例３で上述したように、癌細胞のＱ１０への曝露は、アポトーシスプロセスによりこれらの細胞の部分に死を誘導する。Ｑ１０応答に関与するタンパク質を同定するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて、アポトーシスにターゲットされた経路アレイに関与する遺伝子／タンパク質についてのｍＲＮＡのレベルの変化を同定した。
【０３１６】
それゆえＰＣＲアレイをスクリーニングツールとして使用して、細胞内のＱ１０の生物学的作用の様式への洞察を潜在的に供給する一連の分子ターゲットを評価した。８０の経路特異的ターゲットを含有する事前に選択されたサブセットのｍＲＮＡレベルを影響評価するためのリアルタイムＰＣＲ定量を使用して、ｍＲＮＡの変化を評価した。
【０３１７】
ｍＲＮＡ結果の解釈のために、そのｍＲＮＡ転写が２倍のレベルで改変された遺伝子を同定および評価した。ｍＲＮＡのみを産生する遺伝子転写のレベルは、発現されたタンパク質のレベルの潜在的な変化の大まかな推定値を提供する。当業者は、各ｍＲＮＡが非効率的なことに、ｍＲＮＡの分解またはその翻訳で異なる速度を有し得て、それゆえ異なる量のタンパク質を生じることを認識するであろう。
【０３１８】
５０ｕｍ  Ｑ１０によって２４時間処置したＳｋＢｒ−３細胞
ＲＴ−ＰＣＲのアッセイ方法を利用して、合計８４のアポトーシス経路関連タンパク質に対するｍＲＮＡレベルの変化の尺度を提供した。Ｑ１０（２４時間）を用いた、ＳｋＢｒ３に対するリアルタイムＰＣＲアポトーシス分析による実験は、以下のｍＲＮＡ：Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ２Ｌ１、Ｂｃｌ２Ｌ１１、Ｂｉｒｃ６、Ｂａｘ、Ｘｉａｐ、Ｈｐｒｔ１、Ａｐａｆ１、Ａｂｌ１、Ｂｒａｆが影響されていることを同定した。これらの結果は再度、Ｑ１０処置に対する癌細胞のアポトーシス応答を裏付ける証拠を提供した。
【表６Ａ】
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【０３１９】
ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞による３つの独立した実験からの一致した結果を下の表６Ｂにまとめる。１００μＭ  Ｑ１０処置により多くの遺伝子は、ＳＣＣ細胞において同様に調節される。ＳＣＣ細胞で調節されると思われるアポトーシスアレイの遺伝子を表７に記載する。我々は、多くの遺伝子がＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞およびＳＣＣ細胞の両方で６時間後に調節されていることを見出している。２４時間までに調節は低下する。ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞およびＳＣＣ細胞の両方で調節されると思われる遺伝子を表８に記載する。
【表６Ｂ】
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【０３２０】
2015199746.tif 000014
【表７】
2015199746.tif 000015
【表８】
2015199746.tif 000016
【０３２１】
興味深いことに、改変されたｍＲＮＡレベルは、一連のアポトーシスタンパク質において著しい上方調節を示し、Ｂｃｌ−ｘｌは最も高いものの１つであった。これはＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞に対するタンパク質アレイ実験でも観察された。
【０３２２】
Ｂｃｌ−ｘｌは、ミトコンドリア中の膜貫通分子である（Ｂｃｌ−ｘｌは「基底細胞リンパ腫−特大」を表す）。Ｂｃｌ−ｘｌは、ＦＡＳ−Ｌのシグナル伝達経路に関与し、タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーのメンバである複数の抗アポトーシスタンパク質の１つである。Ｂｃｌ−ｘｌは、癌細胞の生存に関わってきた。しかし、ヒトＢｃｌ−ｘｍＲＮＡの選択的スプライシングが少なくとも２種類の別個のＢｃｌ−ｘｍＲＮＡ種、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｘＳを生じ得ることが公知である。優勢なタンパク質生成物（２３３アミノ酸）は、成長因子除去時に細胞死を阻害する、より大型のＢｃｌ−ｘ  ｍＲＮＡであるＢｃｌ−ｘＬである（Ｂｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｃｅｌｌ７４，５９７−６０８）。他方では、Ｂｃｌ−ｘＳは、Ｂｃｌ−２が細胞死を阻害する能力を阻害して、細胞をアポトーシス細胞死に対して感受性にする。利用した使用アッセイは、どのＢｃｌ−ｘのアイソフォームが上方調節されているかを識別しない。これらの研究でＣｏＱによって上方調節されているＢｃｌ−ｘアイソフォームは、当分野で公知の所定の方法によって、例えばＲＴ−ＰＣＲ方法を使用することによって決定され、２種類のｍＲＮＡスプライシングアイソフォームの比（Ｂｃｌ−ｘＬ対Ｂｃｌ−ｓＬ）が評価され得る。
【０３２３】
アポトーシス関連タンパク質の調査から、複数のアポトーシス促進因子および抗アポトーシス因子がＢＣＬ−２ファミリー中にあること、またはこれらの因子と相互作用するタンパク質が発現レベルを調節したこと（ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＮＩＰ２、ＢＡＧ１、ＨＲＫ、ＢＡＫ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１）が観察された。これらのタンパク質は、ミトコンドリア外膜透過を支配する。
【０３２４】
アポトーシス応答の早期マーカーは、カスパーゼ３／７タンパク質によるアポトーシスの以前の観察結果と一致する、カスパーゼ−９の上方調節（１６時間）によって観察される。ストレスシグナル伝達経路の誘導は、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出およびａｐａｆ−１（アポトソーム）の活性化を引き起こし、次にカスパーゼ−９のプロ酵素を切断して活性型とする。いったん開始されると、カスパーゼ−９はプロカスパーゼ−３およびプロカスパーゼ−７の切断を進めて、追加のアポトーシス経路を始動させる。
【０３２５】
調節されているタンパク質の腫瘍壊死因子受容体ファミリーへの一貫した連結もある。
【０３２６】
腫瘍タンパク質ｐ７３の強力な下方調節も注目される。乳癌および卵巣癌を含む、ヒトに見出される多くの腫瘍の分析は通例、対応する範囲において正常な組織と比較したときに、ｐ７３の高い発現を示す。最近の発見は、哺乳動物細胞において細胞周期制御およびＤＮＡの合成に関与する体内の転写因子（すなわち：Ｅ２Ｆ−１）の調節解除された過剰発現がｐ７３の発現を誘導することを示唆している。該示唆は、ｐ７３は腫瘍性タンパク質であり得るが、関連するｐ５３タンパク質とは異なる機構を包含し得ることである。アポトーシス経路のマッピングを示す概略図を図１３に示す。
【０３２７】
ＳＫＭＥＬ−２８細胞
アポトーシス関連タンパク質の調査から、複数のアポトーシス促進因子および抗アポトーシス因子がＢＣＬ−２ファミリー中にあること、またはこれらの因子と相互作用するタンパク質が発現レベルを調節したこと（ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＮＩＰ２、ＢＡＧ１、ＨＲＫ、ＢＡＫ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１）が観察された。これらのタンパク質は、ミトコンドリア外膜透過を支配する。
【０３２８】
アポトーシス応答の早期マーカーは、カスパーゼ３／７タンパク質によるアポトーシスの以前の観察結果と一致する、カスパーゼ−９の上方調節（１６時間）によって観察される。ストレスシグナル伝達経路の誘導は、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出およびａｐａｆ−１（アポトソーム）の活性化を引き起こし、次にカスパーゼ−９のプロ酵素を切断して活性型とする。いったん開始されると、カスパーゼ−９はプロカスパーゼ−３およびプロカスパーゼ−７の切断を進めて、追加のアポトーシス経路を始動させる。
【表９】
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【０３２９】
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【０３３０】
調節されているタンパク質の腫瘍壊死因子受容体ファミリーへの一貫した連結がある。
【０３３１】
腫瘍タンパク質ｐ７３の強力な下方調節も注目される。乳癌および卵巣癌を含む、ヒトに見出される多くの腫瘍の分析は通例、対応する範囲において正常な組織と比較したときに、ｐ７３の高い発現を示す。最近の発見は、哺乳動物細胞において細胞周期制御およびＤＮＡの合成に関与する体内の転写因子（すなわち：Ｅ２Ｆ−１）の調節解除された過剰発現がｐ７３の発現を誘導することを示唆している。該示唆は、ｐ７３は腫瘍性タンパク質であり得るが、関連するｐ５３タンパク質とは異なる機構を包含し得ることである。
【０３３２】
実験２：酸化ストレスおよび抗酸化防御アレイを使用するリアルタイムＰＣＲアレイ
Ｑ１０応答に関与するタンパク質を同定するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて、酸化ストレスおよび抗酸化防御にターゲットされた経路アレイに関与する遺伝子／タンパク質についてのｍＲＮＡのレベルの変化を同定した。
【０３３３】
下の表１０は、１００μＭ  Ｑ１０処置によりＳＫ−ＭＥＬ２８細胞で調節される遺伝子を挙げる。結果は、２つの独立した実験で調節されるこのような遺伝子のみについて与える。６時間では著しい量の遺伝子調節が見られるが、４８時間ではＲＮＡレベルの最も著しい変化が見られる。
【表１０】
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【０３３４】
2015199746.tif 000020
【０３３５】
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【０３３６】
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【０３３７】
好中球サイトゾル因子２（ＮＣＦ２、６５ｋＤａ、慢性肉芽腫性疾患、常染色体２）は、初期トップ誘導ｍＲＮＡの１つであった（６時間にて観察された）。続いて１６時間の時点以降、好中球サイトゾル因子１（ＮＣＦ１）（慢性肉芽腫性疾患、常染色体１）は、初期誘導相後に非常に高レベルで誘導された。
【０３３８】
好中球サイトゾル因子２は、好中球に普通見出されるＮＡＤＰＨオキシダーゼとして公知の多タンパク質複合体のサイトゾルサブユニットである。本オキシダーゼは、好中球食胞の内腔に送達されるスーパーオキシドのバーストを産生する。
【０３３９】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ）は、膜結合酵素複合体である。ＮＡＤＰＨオキシダーゼは、原形質膜ならびに食胞の膜に見出すことができる。ＮＡＤＰＨオキシダーゼは、原形質膜ならびに食胞の膜に見出すことができる。これは６つのサブユニットで構成されている。これらのサブユニットは：
１つのＲｈｏグアノシントリホスファターゼ（ＧＴＰアーゼ）、通常Ｒａｃ１またはＲａｃ２（Ｒａｃは、Ｒｈｏ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質を表す）
・５つの「ｐｈｏｘ」ユニット（Ｐｈｏｘは、食細胞オキシダーゼを表す。）
○  Ｐ９１−ＰＨＯＸ（ヘムを含有する）
○  ｐ２２ｐｈｏｘ
○  ｐ４０ｐｈｏｘ
○  ｐ４７ｐｈｏｘ（ＮＣＦ１）
○  ｐ６７ｐｈｏｘ（ＮＣＦ２）
別のＮＡＤＰＨオキシダーゼレベルが変化しないことに注目される。酵素は、スーパーオキシドを発生して、Ｃａ（２＋）依存性方式でＨ＋チャネルとして機能する新規ＮＡＤＰＨオキシダーゼである、ＮＯＸ５である。
【０３４０】
加えて、ホスファチジルイノシトール３，４，５−３リン酸依存性ＲＡＣ交換因子１（ＰＲＥＸ１）も上方調節された。本タンパク質は、小型ＧＴＰ結合タンパク質（ＲＡＣ）のＲＨＯファミリーのグアニンヌクレオチド交換因子として作用する。結合されているＧＤＰを遊離ＧＴＰと交換することによって、ＲＡＣ１を結合および活性化することが示されてきた。主に細胞質で見出されるコードされたタンパク質は、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−３リン酸およびヘテロトリマーＧタンパク質のベータガンマサブユニットによって活性化される。
【０３４１】
第２の主な早期誘導タンパク質は、一酸化窒素シンターゼ２Ａ（誘導性、肝細胞）（ＮＯＳ２Ａ）であった。一酸化窒素は、神経伝達ならびに抗菌および抗腫瘍活性を含む複数のプロセスにおいて、生物学的媒介物として作用する反応性遊離ラジカルである。本遺伝子は、肝臓で発現され、リポ多糖類およびあるサイトカインの併用によって誘導可能である一酸化窒素シンターゼをコードする。
【０３４２】
スーパーオキシドディスムターゼ２、ミトコンドリア（ＳＯＤ２）は、鉄／マンガンスーパーオキシドディスムターゼファミリーのメンバである。これはホモテトラマーを形成し、サブユニットに付きマンガンイオン１個を結合するミトコンドリアタンパク質をコードする。本タンパク質は、酸化的リン酸化のスーパーオキシド副生成物に結合して、これらを過酸化水素および２原子酸素に変換する。本遺伝子の突然変異は、関連する特発性心筋症（ＩＤＣ）、早期老化、散発性運動ニューロン疾患、および癌に関連してきた。
【０３４３】
下方調節されたタンパク質の例は、内因性ＦＯＸＭ１発現がＳ期およびＧ２／Ｍ期にピークに達する細胞周期進行で主要な役割を果たすことが公知である、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）である。最近の研究は、Ｇ２／Ｍ特異的遺伝子、例えばＰｌｋ１、サイクリンＢ２、Ｎｅｋ２およびＣＥＮＰＦの大型アレイの発現を調節して、染色体分離およびゲノム安定性の維持において重要な役割を果たすことを示している。ＦＯＸＭ１遺伝子は今や、ヒト癌原遺伝子として公知である。ＦＯＸＭ１の異常な上方調節は、基底細胞癌腫（ＢＣＣ）の腫瘍形成に関与している。ＦＯＸＭ１上方調節は続いて、肝臓、乳房、肺、前立腺、子宮頸部、結腸、膵臓、および脳を含む、固形ヒト癌の大部分で見出された。ＢＣＣおよびＱ１０によるさらなる研究によってＦＯＸＭ１レベルを評価すべきである。
【０３４４】
ＳＫＭＥＬ−２８細胞
ＳＫＭＥＬ−２８細胞を使用して、さらなる実験を行った。リアルタイムＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、１００μＭ  Ｑ１０によって処置されたＳＫＭＥＬ−２８細胞中に存在するｍＲＮＡのレベルを未処置細胞のレベルと各種の時点にて比較した。ＰＣＲアレイ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、経路または疾患に焦点を合せた遺伝子ならびに適切なＲＮＡ品質管理のための、９６ウェルプレートでの最適化リアルタイムＰＣＲプライマアッセイのセットである。ＰＣＲアレイは、リアルタイムＰＣＲ感度およびマイクロアレイの多遺伝子プロファイリング能力を有する遺伝子発現分析を実施する。
【表１１】
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【表１２】
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【０３４５】
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【０３４６】
好中球サイトゾル因子２（ＮＣＦ２、６５ｋＤａ、慢性肉芽腫性疾患、常染色体２）は、初期トップ誘導ｍＲＮＡの１つであった（６時間にて観察された）。続いて１６時間の時点以降、好中球サイトゾル因子１（ＮＣＦ１）（慢性肉芽腫性疾患、常染色体１）は、初期誘導相後に非常に高レベルで誘導された。
【０３４７】
好中球サイトゾル因子２は、好中球に普通見出されるＮＡＤＰＨオキシダーゼとして公知の多タンパク質複合体のサイトゾルサブユニットである。本オキシダーゼは、好中球食胞の内腔に送達されるスーパーオキシドのバーストを産生する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ）は、膜結合酵素複合体である。ＮＡＤＰＨオキシダーゼは、原形質膜ならびに食胞の膜に見出すことができる。これは６つのサブユニットで構成されている。これらのサブユニットは：
・１つのＲｈｏグアノシントリホスファターゼ（ＧＴＰアーゼ）、通常Ｒａｃ１またはＲａｃ２（Ｒａｃは、Ｒｈｏ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質を表す）
・５つの「ｐｈｏｘ」（食細胞オキシダーゼ）ユニット
Ｐ９１−ＰＨＯＸ（ヘムを含有する）
ｐ２２ｐｈｏｘ
ｐ４０ｐｈｏｘ
ｐ４７ｐｈｏｘ（ＮＣＦ１）
ｐ６７ｐｈｏｘ（ＮＣＦ２）である。
【０３４８】
別のＮＡＤＰＨオキシダーゼレベルが変化しないことに注目される。酵素は、スーパーオキシドを発生して、Ｃａ（２＋）依存性方式でＨ＋チャネルとして機能する新規ＮＡＤＰＨオキシダーゼである、ＮＯＸ５である。
【０３４９】
加えて、ホスファチジルイノシトール３，４，５−３リン酸依存性ＲＡＣ交換因子１（ＰＲＥＸ１）も上方調節された。本タンパク質は、小型ＧＴＰ結合タンパク質（ＲＡＣ）のＲＨＯファミリーのグアニンヌクレオチド交換因子として作用する。結合されているＧＤＰを遊離ＧＴＰと交換することによって、ＲＡＣ１を結合および活性化することが示されてきた。主に細胞質で見出されるコードされたタンパク質は、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−３リン酸およびヘテロトリマーＧタンパク質のベータガンマサブユニットによって活性化される。
【０３５０】
第２の主な早期誘導タンパク質は、一酸化窒素シンターゼ２Ａ（誘導性、肝細胞）（ＮＯＳ２Ａ）であった。一酸化窒素は、神経伝達ならびに抗菌および抗腫瘍活性を含む複数のプロセスにおいて、生物学的媒介物として作用する反応性遊離ラジカルである。本遺伝子は、肝臓で発現され、リポ多糖類およびあるサイトカインの併用によって誘導可能である一酸化窒素シンターゼをコードする。
【０３５１】
下方調節されたタンパク質の例は、内因性ＦＯＸＭ１発現がＳ期およびＧ２／Ｍ期にピークに達する細胞周期進行で主要な役割を果たすことが公知である、ＦＯＸＭ１である。最近の研究は、Ｇ２／Ｍ特異的遺伝子、例えばＰｌｋ１、サイクリンＢ２、Ｎｅｋ２およびＣＥＮＰＦの大型アレイの発現を調節して、染色体分離およびゲノム安定性の維持において重要な役割を果たすことを示している。ＦＯＸＭ１遺伝子は今や、ヒト癌原遺伝子として公知である。ＦＯＸＭ１の異常な上方調節は、基底細胞癌腫（ＢＣＣ）の腫瘍形成に関与している。ＦＯＸＭ１上方調節は続いて、肝臓、乳房、肺、前立腺、頸部、子宮、結腸、膵臓、および脳を含む、固形ヒト癌の大部分で見出された。
【０３５２】
実験３：熱ショックアレイを使用するリアルタイムＰＣＲアレイ
ＳＣＣ細胞に熱ショックアレイを実行して、調節された遺伝子のデータを下の表１３にまとめる。
【表１３】
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【０３５３】
実験４：糖尿病アレイを使用するリアルタイムＰＣＲアレイ
本実施例に記載した実験を遂行して、Ｑ１０が、複数の遺伝子に影響を有し、細胞の代謝状態を変更するであろうという仮説全体を試験した。１００μＭ  Ｑ１０によって処置したＳＫＭＥＬ−２８細胞からのｍＲＮＡを糖尿病および関連経路に関与するターゲットタンパク質のパネルに対して評価した。本実験からの結果は、解糖経路およびインスリンプロセシングに関与する複数のタンパク質のｍＲＮＡ発現レベルが改変されることを証明している（表１４にまとめる）。
【表１４】
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【０３５４】
本初期実験の結果は、多種多様のインスリン関連タンパク質のｍＲＮＡレベルが両方向に調節されたことを示す。結果は、糖尿病の治療および／または評価に影響を有するであろうことを指摘する。
【０３５５】
次にさらなる実験を行って、Ｑ１０によって処置したＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞から取得した上の結果を確認した。ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞中の遺伝子の多くが、Ｑ１０処置の早くも６時間後に調節されている。しかし初期調節は、１６時間および２４時間までにより明らかでなくなる。４８時間付近で、我々は糖尿病アレイの多くの遺伝子が再度強力に調節されることを見出している。２つ以上の独立した実験からの一致した結果を下の表１５にまとめる。ＳＣＣ細胞もＱ１０処置の６時間後および２４時間後の両方に、いくつかの遺伝子における調節を呈するように思われる。表１６にはＳＣＣ細胞のこれらの結果をまとめ、表１７にはＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞およびＳＣＣ細胞の両方で調節される遺伝子をまとめる。
【表１５】
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【０３５６】
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【表１６】
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【表１７】
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【０３５７】
多種多様のインスリン関連タンパク質のｍＲＮＡレベルが両方向に調節された。Ｑ１０は細胞代謝に対して影響を有し、それゆえ糖尿病などの代謝調節疾患に影響する。著しく調節された２種類のタンパク質について、下でさらに述べる。
【０３５８】
マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１４（ＭＡＰＫ１４）：マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１４（ＭＡＰＫ１４）は、ＭＡＰキナーゼファミリーのメンバである。ＭＡＰキナーゼは、複数の生化学シグナルの統合点として作用し、増殖、分化、転写調節および発生などの多岐にわたる細胞プロセスに関与している。本実験の結果は、ＭＡＰＫ１４が著しく下方調節されたことを示す。
【０３５９】
肝細胞核因子４、アルファ（ＨＮＦ４Ａ）：ＨＮＦ４（肝細胞核因子４）は、肝臓発生に不可欠である肝臓、腸、腎臓、および膵臓ベータ細胞で大部分が発現される核受容体タンパク質である。ヒトにおいては、２種類の別々の遺伝子ＨＮＦ４ＡおよびＨＮＦ４ＧによってそれぞれコードされたＮＨＦ４の２種類のアイソフォーム、アルファおよびガンマがある（例えばＣｈａｒｔｉｅｒ  ＦＬ，Ｂｏｓｓｕ  ＪＰ，Ｌａｕｄｅｔ  Ｖ，Ｆｒｕｃｈａｒｔ  ＪＣ，Ｌａｉｎｅ  Ｂ（１９９４）．“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｃＤＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４  ｉｎｄｉｃａｔｅ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ”．Ｇｅｎｅ  １４７（２）：２６９−７２を参照）。
【０３６０】
ＨＮＦ４は当初、オーファン受容体として分類された。しかしＨＮＦ４は後に、多種多様の脂肪酸に連続的に結合されるために構成的に活性であることが見出された（例えばＳｌａｄｅｋ  Ｆ（２００２）．“Ｄｅｓｐｅｒａｔｅｌｙ  ｓｅｅｋｉｎｇ．．．ｓｏｍｅｔｈｉｎｇ”．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０（２）：２１９−２２１およびＪｕｍｐ  ＤＢ，Ｂｏｔｏｌｉｎ  Ｄ，Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｘｕ  Ｊ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｂ，Ｄｅｍｅｕｒｅ  Ｏ（２００５）．“Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ”．Ｊ  Ｎｕｔｒ  １３５（１１）を参照）。  ＨＮＦ４のリガンド結合ドメインは、他の核受容体と同様に、基準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）アルファらせんサンドイッチフォールディングを取り（例えばＷｉｓｅｌｙ  ＧＢ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＢ，Ｄａｖｉｓ  ＲＧ，Ｔｈｏｒｎｑｕｅｓｔ  ＡＤ  Ｊｒ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｒ，Ｓｐｉｔｚｅｒ  Ｔ，Ｓｅｆｌｅｒ  Ａ，Ｓｈｅａｒｅｒ  Ｂ，Ｍｏｏｒｅ  ＪＴ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＢ，ＷｉｌｌｓｏｎＴＭ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＳＰ（２００２）．“Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４  ｉｓ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ｂｉｎｄｓ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ”．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １０（９）：１２２５−３４およびＤｈｅ−Ｐａｇａｎｏｎ  Ｓ，Ｄｕｄａ  Ｋ，Ｉｗａｍｏｔｏ  Ｍ，Ｃｈｉ  ＹＩ，Ｓｈｏｅｌｓｏｎ  ＳＥ（２００２）．“Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＮＦ４  ａｌｐｈａ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ”．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（４１）：３７９７３−６を参照）、コアクチベータータンパク質と相互作用する（例えばＤｕｄａ  Ｋ，Ｃｈｉ  ＹＩ，Ｓｈｏｅｌｓｏｎ  ＳＥ（２００４）．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ＨＮＦ−４ａｌｐｈａ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｉｇａｎｄ  ａｎｄ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ”．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９（２２）：２３３１１−６に概説されている）。ＨＮＦ４−α遺伝子の突然変異は、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）と結び付けられてきた（例えばＦａｊａｎｓ  ＳＳ，Ｂｅｌｌ  ＧＩ，Ｐｏｌｏｎｓｋｙ  ＫＳ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｉｔｙ−ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｏｕｎｇ”．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４５（１３）：９７１−８０を参照）。
【０３６１】
肝細胞核因子４（ＨＮＦ４）は、肝細胞および膵臓細胞において多数の遺伝子を調節することが公知の組織特異的転写因子である。ＨＮＦ４は腎臓のいくつかの部位で高度に発現されることが公知であるが、本器官におけるその役割についておよび腎臓細胞におけるＨＮＦ４調節遺伝子についてはほとんど知られていない。ＨＮＦ４の存在量および活性は腎臓細胞癌腫（ＲＣＣ）では頻繁に低下し、腎臓細胞におけるＨＮＦ４の多少の腫瘍抑制機能を示す。興味深いことに、ＨＮＦ４によって調節された遺伝子の多くは、ＲＣＣマイクロアレイ試験では調節解除されることが示されている。これらの遺伝子（ＡＣＹ１、ＷＴ１、ＳＥＬＥＮＢＰ１、ＣＯＢＬ、ＥＦＨＤ１、ＡＧＸＴ２Ｌ１、ＡＬＤＨ５Ａ１、ＴＨＥＭ２、ＡＢＣＢ１、ＦＬＪ１４１４６、ＣＳＰＧ２、ＴＲＩＭ９およびＨＥＹ１）は、ＲＣＣにおけるＨＮＦ４の低下時に活性が変化する遺伝子の良好な候補である。
【０３６２】
ＨＮＦ４アルファのリガンド結合ドメインの構造において（１Ｍ７Ｗ．ｐｄｂ；Ｄｈｅ−Ｐａｇａｎｏｎ（２００２）ＪＢＣ，２７７，３７９７３）；小型脂質が観察され、大腸菌産生から同時精製された。結晶はタンパク質の２種類の立体配座を含有し、ここで伸長らせん１０および短らせん１２が交互の立体配座を有している。脂質結合領域の検査時に、興味深いことに、２つの出口領域があることが見出された。一方の領域は小型脂質の頭基を保持して、複数のポケット領域が本出口ポートと共局在していることが注目される。仮説は、Ｑ１０が本転写因子に特異的に結合するということである。本脂質結合トンネル中にモデル化されるとき、Ｑ１０環は表面ポケット中に適合するであろう（図２８）。公知の機能喪失型突然変異（Ｅ２７６Ｑ）は、本表面ポケットを裏打ちするように残基を配列する潜在能を有し、それゆえ推定上のＱ１０結合に悪影響を有するであろう。
【０３６３】
加えて、本Ｑ１０結合モデルによって、疎水性尾部は内部空洞から延出して、次に伸長らせん１０と相互作用するであろう。それゆえ、本相互作用は、らせん１０／１２基の立体配座を潜在的に改変することができる。このことは次に、転写因子活性の活性化／不活性化平衡を改変し得る。
【０３６４】
実施例７：抗体マイクロアレイ分析
Ｑ１０の存在によるタンパク質濃度の評価を、抗体マイクロアレイ法の利用によって評価した。マイクロアレイは、７００超のタンパク質の抗体を含有し、広範囲のタンパク質タイプおよび潜在的な経路マーカーをサンプリングした。
【０３６５】
Ｑ１０によって処置された細胞におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価するための初期実験は、抗体マイクロアレイ（Ｐａｎｏｒａｍａ  ＸＰ７２５抗体アレイ、Ｓｉｇｍａ）および６時間または２４時間処置したＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を用いて行った。細胞を収集および抽出して、可溶性タンパク質上清を取得した。各試料（１ｍｇ／ｍＬの）からのタンパク質の２つの分量（合計約１ｍｇ）を蛍光染料（それぞれＣｙ３およびＣｙ５）によってそれぞれ標識した。過剰な染料をタンパク質から除去して、材料をマイクロアレイインキュベーションに利用した。２つの時点の試料を比較するために、等量のタンパク質を異なる標識タイプである各試料と混合した（例えばＣｙ３で標識された３時間抽出物を、Ｃｙ５で標識された２４時間抽出物と混合した）。（メーカーの推奨プロトコールに従った）マイクロアレイチップによるインキュベーション後に、チップを洗浄および乾燥した。マイクロアレイを蛍光レーザスキャナーによってスキャンして、Ｃｙ３およびＣｙ５染料の相対蛍光強度を測定した。
【表１８】
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【表１９】
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【０３６６】
先に観察されたアポトーシスタンパク質を確認するために、およびより多数のアポトーシス促進および抗アポトーシスタンパク質への評価を拡張するために、潜在的に包含される広範なタンパク質のファミリーをスクリーニングすることができる２種類のアッセイ方法を選定した。
【０３６７】
第１に、抗体マイクロアレイ（Ｐａｎｏｒａｍａ  ＸＰ７２５抗体アレイ，Ｓｉｇｍａ）を利用して７００超のタンパク質抗体をスクリーニングし、５０μＭ  Ｑ１０によって２４時間処置されたＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。
【０３６８】
以下は、Ｑ１０（２４時間）を用いたＳＫＭＥＬ−２８に対する抗体アレイ実験からのレベルの改変を有する同定されたタンパク質の一部である：Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｍｆ、ＢＴＫ、ＢＬＫ、ｃＪｕｎ（ｐＳｅｒ６３）、コネキシン３２、ＰＵＭＡ  ｂｂｃ３、ＢＩＤ、Ｐａｒ４、ｃＣｂｌ。本初期試験からの主な結論は、予想されたアポトーシス促進タンパク質が改変されたことであった。
【０３６９】
ＳＫ−ＭＥＬ−２８の抗体マイクロアレイ
抗体マイクロアレイ（Ｐａｎｏｒａｍａ  ＸＰ７２５抗体アレイ，Ｓｉｇｍａ）を利用して７００超のタンパク質抗体をスクリーニングし、５０μＭ  Ｑ１０によって２４時間処置されたＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。
【表２０】
2015199746.tif 000034
【０３７０】
以下は、Ｑ１０（２４時間）を用いたＳＫＭＥＬ−２８に対する抗体アレイ実験からのレベルの改変を有する同定されたタンパク質の一部である：Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｍｆ、ＢＴＫ、ＢＬＫ、ｃＪｕｎ（ｐＳｅｒ６３）、コネキシン３２、ＰＵＭＡ  ｂｂｃ３、ＢＩＤ、Ｐａｒ４、ｃＣｂｌ。これらのデータは、外部から添加されたＱ１０のレベルの上昇により、アポトーシス促進タンパク質のレベルがインキュベーション時に改変されることを確認している。
【０３７１】
Ｂｃｌ−ｘｌ（「基底細胞リンパ腫−特大」）は、ミトコンドリア中の膜貫通分子である。Ｂｃｌ−ｘｌは、ＦＡＳ−Ｌのシグナル伝達経路に関与し、タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーのメンバである複数の抗アポトーシスタンパク質の１つである。Ｂｃｌ−ｘｌは、癌細胞の生存に関わってきた。しかし、ヒトＢｃｌ−ｘｍＲＮＡの選択的スプライシングが少なくとも２種類の別個のＢｃｌ−ｘｍＲＮＡ種、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｘＳを生じ得ることが公知である。優勢なタンパク質生成物（２３３アミノ酸）は、成長因子除去時に細胞死を阻害する、より大型のＢｃｌ−ｘ  ｍＲＮＡであるＢｃｌ−ｘＬである（Ｂｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｃｅｌｌ  ７４，５９７−６０８）。他方では、Ｂｃｌ−ｘＳは、Ｂｃｌ−２が細胞死を阻害する能力を阻害して、細胞をアポトーシス細胞死に対して感受性にする。
【表２１】
2015199746.tif 000035
【０３７２】
2015199746.tif 000036
【表２２】
2015199746.tif 000037
【０３７３】
実施例８：ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロットおよび２次元ゲル電気泳動によって処理および評価された第１の実験を皮膚癌株化細胞ＳＫＭＥＬ−２８に対して行った。本実験セットは、５０または１００μＭ  Ｑ１０によって３、６、１２、および２４時間処置されたＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を包含していた。
【０３７４】
多種多様の細胞タイプを、Ｂｃｌ−ｘＬの抗体（図１４）、ビメンチンの抗体（図１５）、ミトコンドリア酸化的リン酸化機能の一連の抗体（図１６〜２１）およびミトコンドリア膜完全性に関連する一連の抗体（図２２〜２７）に対してウェスタンブロット分析によって評価した。これらの実験による結果は、複数の検査されたタンパク質がＱ１０による細胞処置の結果として上方調節または下方調節されることを証明した。
【０３７５】
実施例９：１００ｕｍ  Ｑ１０による膵臓癌細胞（ＰａＣａ２）の処置によってｍＲＮＡレベルが調節されているとして同定された糖尿病関連遺伝子
１００ｕＭ  Ｑ１０によって処置された試料に、処置後の各種の時間に糖尿病アレイを実行した。実験は本質的に上記のように実施された。Ｑ１０処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表２３に要約される。これらの結果は、以下の遺伝子がＱ１０処理によって調節されることを示した：ＡＢＣＣ８、ＡＣＬＹ、ＡＤＲＢ３、ＣＣＬ５、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＢＲＡ、ＦＯＸＧ１、ＦＯＸＰ３、Ｇ６ＰＤ、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＰＤ１、ＨＮＦ４Ａ、ＩＣＡＭ１、ＩＧＦＢＰ５、ＩＮＰＰＬ１、ＩＲＳ２、ＭＡＰＫ１４、ＭＥ１、ＮＦＫＢ１、ＰＡＲＰ１、ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＴＰＮ１、ＰＹＧＬ、ＳＬＣ２Ａ４、ＳＮＡＰ２５、ＨＮＦ１Ｂ、ＴＮＲＦＳＦ１Ａ、ＴＲＩＢ３、ＶＡＰＡ、ＶＥＧＦＡ、ＩＬ４ＲおよびＩＬ６。
【表２３】
2015199746.tif 000038
【０３７６】
実施例１０：１００μＭ  Ｑ１０を用いる膵臓癌細胞（ＰａＣａ２）の処理によってｍＲＮＡレベルが調節されるとして同定される血管新生関連遺伝子
処理後の様々な時点において１００μＭ  Ｑ１０で処理された試料について血管新生アレイが実行された。実験は本質的に上記のように実施された。Ｑ１０処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表２４に要約される。これらの結果は、以下の遺伝子がＱ１０処理によって調節されることを示した：ＡＫＴ１、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＥＰ、ＣＣＬ２、ＣＤＨ４、ＣＸＣＬ１、ＥＤＧ１、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦ、ＦＧＦ１、ＩＤ３、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ８、ＫＤＲ、ＮＲＰ１、ＰＥＣＡＭ１、ＰＲＯＫ２、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＰＨＫ１、ＳＴＡＢ１、ＴＧＦＢ１、ＶＥＧＦＡ、およびＶＥＧＦＢ。
【表２４】
2015199746.tif 000039
【０３７７】
実施例１１：１００μＭ  Ｑ１０を用いる膵臓癌細胞（ＰａＣａ２）の処理によってｍＲＮＡレベルで調節されるとして同定されるアポトーシス関連遺伝子
処理後の様々な時点において１００μＭ  Ｑ１０で処理された試料についてアポトーシスアレイが実行された。実験は本質的に上記のように実施された。Ｑ１０処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表２５に要約される。これらの結果は、以下の遺伝子がＱ１０処理によって調節されることを示した：ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、Ｂｃｌ２Ｌ１、ＢｃｌＡＦ１、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ６、ＣＩＤＥＡ、ＦＡＤＤ、ＬＴＡ、ＴＮＦ、ＴＮＦＳＦ１０Ａ、およびＴＮＦＳＦ１０。
【表２５】
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【０３７８】
実施例１２：肝臓癌（ＨｅｐＧ２）細胞上でのＰＣＲ糖尿病アレイ
ＨｅｐＧ２（肝臓癌）細胞は、２４時間ビヒクルと、または様々な時間の間１００μＭ  Ｑ１０のいずれかで処理された。処理は、ＰａＣａ２細胞において利用された手順に従って（上記、実施例９〜１１）、ウェルあたり１×１０５細胞で開始された。しかし、これらのサンプルから抽出されたＲＮＡの総量は、予測されたものよりも低かった。逆転写は、通常、１μｇの総ＲＮＡ（２６０ｎｍにおける測定によって決定される）を使用して行われる。逆転写あたりに使用できる最大量は８μｌである。ＲＮＡ濃度が低いので、ビヒクル、ならびに１６時間および４８時間Ｑ１０処理された試料を使用するＲＴ−ＰＣＲアレイ分析が、０．４４μｇのＲＮＡを使用して実施された。これらのアレイは、以下の表２６において要約されるように、１００μＭ  Ｑ１０処理を用いる、ＨｅｐＧ２遺伝子調節における傾向およびパターンの初期の分析を提供した。結果は、遺伝子ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＲＫＡＡ１、およびＳＮＡＰ２５の各々が処理の１６時間後に下方調節されたことを示した（それぞれ、約２０倍、６倍、および５倍）。処理後４８時間において、ＰＰＡＲＧＣ１ＡおよびＰＲＫＡＡ１は正常化され、またはわずかに上方調節されたのに対して、ＳＮＡＰ２５は約２倍下方調節された。
【表２６】
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【０３７９】
実施例１３：肝臓癌（ＨＥＰＧ２）細胞上のＰＣＲ血管新生アレイ
ＨｅｐＧ２（肝臓癌）細胞は、２４時間ビヒクルと、または様々な時間の間１００μＭ  Ｑ１０のいずれかで処理された。処理は、ＰａＣａ２細胞において利用された手順に従って（上記、実施例９〜１１）、ウェルあたり１×１０５細胞で開始された。しかし、これらのサンプルから抽出されたＲＮＡの総量は、予測されたものよりも低かった。逆転写は、通常、１μｇの総ＲＮＡ（２６０ｎｍにおける測定によって決定される）を使用して行われる。逆転写あたりに使用できる最大量は８μｌである。ＲＮＡ濃度が低いので、ビヒクル、ならびに１６時間および４８時間Ｑ１０処理された試料を使用するＲＴ−ＰＣＲアレイ分析が、０．４４μｇのＲＮＡを使用して実施された。これらのアレイは、以下の表２７において要約されるように、１００μＭ  Ｑ１０処理を用いる、ＨｅｐＧ２遺伝子調節における傾向およびパターンの初期の分析を提供した。Ｑ１０処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表２７に要約される。結果は、遺伝子ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＥＮＧ、ＭＭＰ２、およびＴＩＭＰ３の各々が処理の１６時間後に上方調節されたことを示した（それぞれ、対照のそれよりも、約５．５倍、３倍、３倍、３．２倍、３倍、３倍、１倍、および６．５倍、６倍および５倍）。ＩＤ３は、Ｑ１０処理の１６時間後に、対照の約５倍下方調節された。処理の４８時間後に、ＡＮＧＰＴＬ３、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ３、ＥＮＧ、およびＴＩＭＰ３はまだ上方調節されたのに対して（それぞれ、対照よりも約３．５倍、１．５倍、３．１７５倍、２倍、および３倍）、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＸＣＬ５、ＩＤ３、およびＭＭＰ２は、対照よりも、それぞれ、約１倍、１倍、２倍、および１８倍下方調節された。
【表２７】
2015199746.tif 000042
【０３８０】
血管新生のプロセスに関与していることが知られているタンパク質は、ＲＴ−ＰＣＲアレイの構成要素であった。血管新生は、癌細胞が悪性になる決定的なプロセスである。これらのタンパク質のいくつかは糖尿病にも関わりがある。
【０３８１】
ＡＮＧＰＴＬ３およびＡＮＧＰＴＬ４：ＡＮＧＰＴＬ３に関連する文献は、このタンパク質を脂質代謝の調節に関連付けている。特に、この文献（Ｌｉ，Ｃ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｌｉｐｉｄｏｌ．２００６  Ａｐｒ；１７（２）：１５２−６）は、アンジオポエチンとアンジオポエチン様タンパク質の両方が類似のドメイン構造を共有することを教示している。ＡＮＧＰＴＬ３および４は、リポタンパク質リパーゼ活性を阻害するこのスーパーファミリーの２つのみのメンバーである。しかし、ＡＮＧＰＴＬ３および４は、複数のレベルで示差的に調節されており、インビボでの冗長でない機能を示唆している。ＡＮＧＰＴＬ３および４は、タンパク質分解的に２つの半分にプロセスされ、核受容体によって示差的に調節されている。ＡＮＧＰＴＬ４のトランスジェニック過剰発現ならびにＡＮＧＰＴＬ３または４のノックアウトは、これらの２つのタンパク質が脂質タンパク質代謝において本質的な役割を果たしていることを実証している：肝臓由来のＡＮＧＰＴＬ３は食事を与えられた状態で主にリポタンパク質リパーゼ活性を阻害するのに対して、ＡＮＧＰＴＬ４は、食事を与えられた状態と空腹時状態の両方で重要な役割を果たしている。加えて、ＡＮＧＰＴＬ４は、リポタンパク質誘導脂肪酸の組織特異的送達を調節する。このように、ＡＮＧＰＴＬ４は、発現のその部位に依存して、リポタンパク質リパーゼのエンドクリンまたはオートクリン／パラクリン阻害剤である。
【０３８２】
リポタンパク質リパーゼは、キロミクロンおよび超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）において見い出されるものなどのリポタンパク質中の脂質を、３つの遊離脂肪酸と１つのグリセロール分子に加水分解する酵素である。所定の組織中でのリポタンパク質リパーゼ活性は、トリグリセリド誘導脂肪酸の取り込みのための律速段階である。脂肪酸の分配のバランスの悪さは、大きな代謝的な結果を有する。高脂肪食はＬＰＬの組織特異的過剰発現を引き起こすことが示されており、これは、組織特異的インスリン抵抗性および結果としての２型糖尿病の発症に関わってきた。
【０３８３】
本実施例の結果は、Ｑ１０が脂質代謝に関わっている調節タンパク質であり、従って、ＡＮＧＰＴＬ３／ＡＮＧＰＴＬ４およびそれらの関連する経路のさらなる研究を正当化することを示す。例えば、ＡＮＧＰＴＬ３／ＡＮＧＰＴＬ４は、以下の経路において役割を果たすことに関わっている：Ａｋｔ、コレステロール、脂肪酸、ＨＤＬ−コレステロール、ＨＮＦ１Ａ、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧ８３、Ｌ−トリヨードチロニン（ｔｒｉｌｏｄｏｔｈｙｎｏｎｉｎｅ）、ＬＩＰＧ、ＬＰＬ、Ｍａｐｋ、Ｎｒｔｈ、ＮＲ１Ｈ３、ＰＰＡＲＤ、ＰＴＫ２、ＲＸＲＡ、トリアシルグリセロール（ｔｒｉａｃｙｌｇｌｅｒｏｌ）、および９−シス−レチノイン酸。
実施例１４：肝臓癌（ＨＥＰＧ２）細胞上のＰＣＲアポトーシスアレイ
アポトーシスアレイは、上記のように、１６時間および４８時間、１００μＭ  Ｑ１０で処理された試料について実行された。しかし、４８時間のアレイは、ＳＹＢＲの代わりに蛍光団としてＦＡＭを選んで実行された。ＦＡＭとＳＹＢＲの両方は同じ波長で蛍光を発する。
【０３８４】
Ｑ１０処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表２８に要約される。これらの結果は、ＣＡＳＰ９がＱ１０処理の１６時間後に対照の約６１倍上方調節されたのに対し、ＢＡＧ１およびＴＮＦＲＳＦ１Ａは、処理の１６時間後に対照よりもそれぞれ約６倍および４倍下方調節されたことを示す。処理後４８時間では、ＣＡＳＰ９、ＢＡＧ１、およびＴＮＦＲＳＦ１Ａは、対照よりもそれぞれ約５５倍、１倍、および１倍上方調節された。
【表２８】
2015199746.tif 000043
【０３８５】
実施例１５：代謝性障害を治療するためのエピシフターの能力の評価
選択されたエピシフター、例えば、ＣｏＱ１０が代謝性障害、例えば、糖尿病を治療することが可能か否かを決定するために、インスリン刺激されたグルコースの取り込みの増加をインビトロで監視する細胞ベースのアッセイが利用される。特に、分化したマウス脂肪細胞が、放射活性グルコースのシンチレーション計数によって検出されるのと同様に（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  ＪＥＴ  ｒｅａｄｅｒを使用する）、インスリン刺激の際にグルコース取り込みが増加する能力を有する薬剤を同定するために使用される。これらのアッセイは以下のように実施される。
【０３８６】
材料および方法
Ｐｒｅｅｓ培地：「Ｐｒｅｅｓ」培地とも呼ばれるＣｏｍｐｌｅｔｅ培地は以下のように調製される。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、Ｌ−グルタミン、ペニシリン−Ｇおよびストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）、および熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（６５℃で３０分間熱不活化）で補充される。血清は細胞の成長、接着および分化に影響を与え得るので、任意の新たなロットの血清は使用前に最初に試験された。指示色素の赤色／オレンジ色によって示されるように、ｐＨが適正な範囲内（約７）になるまで、培地はインキュベーター（５％ＣＯ２）中で平衡化された。培地がピンク色になる場合（高ｐＨを示す）、基礎条件が細胞に影響を与え、分化培地−１（ＤＭ１）および分化培地−２（ＤＭ２）において使用されるインスリンを変性させる可能性があるので、本発明者らは培地を廃棄した。
【０３８７】
分化培地：分化培地１（ＤＭ１）は、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、ＩＢＭＸ（３７５μＭ）、インスリン（１２０ｎＭ）、およびデキサメタゾン（１８８ｎＭ）を補充することによって調製された。分化培地２（ＤＭ２）は、１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ、Ｌ−グルタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、およびインスリン（１２０ｎＭ）を補充することによって調製された。
【０３８８】
ゼラチン処理プレートの調製：細胞培養プレートの調製は以下のようにゼラチン処理される。ゼラチン（蒸留水中１％  ｗ／ｖ）は、オートクレーブされ、室温で保存された。各細胞培養ウェルの底はゼラチン溶液で均一に覆われ、泡が形成されていないことを確実にした。この溶液は除去され、ゼラチンの薄膜を残した。これらのプレートは、組織培養フードの下に放置して乾燥させる。次に、プレートはＰＢＳで洗浄され、その後、０．５％グルタル酸ジアルデヒド溶液（蒸留水中グルタルアルデヒド）が細胞培養ウェルに加えられた。１０分後、ウェルはｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭで２回洗浄される。各洗浄工程は、約５分間続くべきである。
【０３８９】
細胞培養：３Ｔ３−Ｌ１プレ脂肪細胞は、およそ２〜３日毎に、または約６０％のコンフルエンスに到達した際に分けられる。過度のコンフルエンスは、これらの細胞が脂肪細胞に分化する能力に影響を与える可能性がある。
【０３９０】
他の試薬：Ｄ−（＋）グルコース（「コールド」グルコース、放射性標識されていない）が、１０ｍＭの最終濃度までＤＰＢＳミックスに加えられた。
【０３９１】
溶解緩衝液、塩基の混合物（例えば、０．５Ｎ最終濃度の水酸化ナトリウム）、および洗剤（例えば、０．１％  ｗ／ｖの最終濃度に希釈されたドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））が各回新鮮に調製された（使用の１〜２時間以内）。使用前に、溶解緩衝液は、緩衝剤の沈殿を回避するために、約３０分間の時間、室温を超える温度まであたためられた。
【０３９２】
グルコース取り込みの決定：プレ脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１細胞が、約５０００細胞／ウェルの密度でプレートされる（黒色ＮＵＮＣ９６ウェルプレート中）。これらの細胞は、２つの別々の工程で脂肪細胞に分化される。最初に、細胞は、分化培地−１（ＤＭ１）中で、２〜３日間の間培養される（脂肪細胞分化の１日目）。ＤＭ１は、増殖を妨害し、脂肪細胞特異的遺伝子の発現を誘導する。次に、細胞は分化培地−２（ＤＭ２）中で３〜４日間培養され、その後、培養培地は新鮮なＤＭ２によって置き換えられる。グルコース取り込みアッセイは、分化の９〜１５日目に実施される。
【０３９３】
実験の２日前に（分化の７〜１３日目）、ＤＭ２は除去され、新鮮なＰｒｅｅｓ培地で置き換えられる。候補化合物はこのときに加えられ、約４８時間のインキュベーション時間を与える。実験の当日に、細胞（この時点で分化の９〜１５日目）は、ＤＰＢＳ、硫酸マグネシウム（０．８ｍＭ）、およびＨｅｐｅｓ（１０ｍＭ）、ｐＨ約７中で３時間血清飢餓状態とされる。このインキュベーション時間後、インスリン（１０ｎＭ）を含有する新鮮なＤＰＢＳが脂肪細胞に加えられる。いかなるインスリンも有さない新鮮なＤＰＢＳが細胞上に配置され、これは陰性対照として働く。３７℃で２５分間のインキュベーション後、放射性グルコース（１４Ｃで標識、最終濃度０．０４ｍＭ、各ウェル中約０．２６μＣｉ１４Ｃ−グルコース）が室温で１５分間の間、培地に加えられる。次に、培地が除去され、細胞は徹底的に洗浄され、そして溶解される。溶解に際して、細胞は、ウェルの底から脱離して、小さな、曇った固まりを形成する。１０％氷酢酸が各ウェルに加えられ、溶解反応を中和する。次に、シンチレーション液がウェルに加えられ、グルコースの取り込みが、ＭｉｃｒｏＢｅｔａプレートリーダーを使用して、各ウェル中の放射能の量を測定することによって決定される。
【０３９４】
前述の実験プロトコールを使用して、エピシフターが、インビトロで細胞中のインスリン刺激されたグルコースの取り込みを増強、増加、または増大するときに、エピシフターは、代謝性障害、例えば、糖尿病を治療することが可能であると同定される。
【０３９５】
実施例１６：代謝性障害と関連するＭＩＭの同定
潜在的なＭＩＭとしての候補分子（例えば、環境影響因子）を評価するために、選択された候補ＭＩＭが、疾患（癌）細胞系統と正常対照細胞系統の両方を含む細胞系統のパネルに外因的に加えられ、パネル中の各細胞系統の細胞微少環境プロフィールに対して誘導された変化が評価される。例えば、ｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルを含む、細胞形態学、生理学、および／または細胞組成に対する変化が評価され、正常細胞との比較と同様に、疾患細胞について比較される。
【０３９６】
細胞形態学／生理学の変化は、候補ＭＩＭに対する細胞の感受性およびアポトーシス性応答を調べることによって評価される。これらの実験は、実施例３に詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、少なくとも１つの対照細胞系統および少なくとも１つの癌細胞系統からなる細胞系統のパネルが、種々の濃度の候補ＭＩＭで処理される。潜在的なＭＩＭに対する細胞系統の感受性は、様々な時間、および適用される濃度の範囲にわたって細胞生存を監視することによって評価される。潜在的ＭＩＭに対する細胞系統のアポトーシス性応答は、例えば、フローサイトメトリー方法論と組み合わせたネキシン試薬を使用することによって評価される。ネキシン試薬は、２種の染料、７ＡＡＤおよびアネキシン−Ｖ−ＰＥの組み合わせを含み、初期および後期のアポトーシスにおける細胞集団の定量化を可能にする。例えば、Ａｐｏｓｔｒａｎｄ（商標）ＥＬＩＳＡ方法論を使用する、一本鎖ＤＮＡを測定するさらなるアポトーシスアッセイが使用されてもよい。疾患および対照の細胞系統の感受性およびアポトーシス性応答が評価および比較される。正常細胞と比較されるような疾患細胞において、示差的な細胞傷害性を表示し、および／またはアポトーシス性応答を示差的に誘導する分子がＭＩＭとして同定される。
【０３９７】
候補ＭＩＭを用いる下の処置後の細胞の組成の変化が評価される。ｍＲＮＡレベルでの遺伝子発現の変化がリアルタイムＰＣＲアレイ方法論を使用して分析される。これらの実験は、実施例６および９〜１３において詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、候補ＭＩＭは、例えば、疾患細胞系統および正常対照細胞系統を含む１種以上の細胞系統に外因的に加えられ、ｍＲＮＡは処置後の様々な時点で細胞から抽出される。特定の経路に関与する遺伝子のｍＲＮＡのレベルは、例えば、アポトーシス、酸化ストレスおよび自己酸化防御、血管新生、熱ショック、または糖尿病に特異的なアレイを含む、標的とされる経路アレイを使用することによって評価される。２倍レベル以上で遺伝子のｍＲＮＡ転写が変化される遺伝子が同定および評価される。細胞中でｍＲＮＡレベルの変化を誘導し、および／または正常細胞と比較して疾患細胞において１種以上のｍＲＮＡのレベルの示差的な変化を誘導する分子はＭＩＭとして同定される。
【０３９８】
相補実験において、タンパク質レベルでの遺伝子発現の変化は、抗体マイクロアレイ方法論、二次元ゲル電気泳動、続いて質量分析による特徴付けを使用するタンパク質の同定を使用することによって、およびウェスタンブロット分析によって分析される。これらの実験は、それぞれ、実施例７、４、および８において詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、候補ＭＩＭは、例えば、疾患細胞系統および正常対照細胞系統を含む１種以上の細胞系統に外因的に加えられ、可溶性タンパク質が、処置後の様々な時点、例えば、６時間または２４時間で細胞から抽出される。タンパク質レベルで誘導された候補ＭＩＭによる変化が、広い範囲のタンパク質型および潜在的な経路マーカーをサンプリングしている７００種を超えるタンパク質に対する抗体を含む抗体マイクロアレイを使用することによって評価される。さらなる相補プロテオーム分析は、質量分析方法論と連動した二次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動を利用することによって実行できる。候補ＭＩＭは、例えば、疾患細胞および正常対照細胞系統を含む１種以上の細胞系統に外因的に加えられ、細胞ペレットは溶解され、二次元ゲル電気泳動に供される。ゲルは、未処置試料である対照と比べて処置試料でのタンパク質レベルの変化を同定するために分析される。ゲルは、レベルの増加、レベルの減少、または翻訳後修飾に起因する、処置の時間経過にわたるスポット変化の同定について分析される。統計学的に有意な変化を示すスポットは、トリプシン消化および質量分析による特徴付けによるタンパク質同定のために、切り出され、提出される。特徴付けされたペプチドは、例えば、ＭａｓｃｏｔおよびＭＳＲＡＴソフトウェア分析を用いて、タンパク質データベースに対して検索され、タンパク質を同定する。前述の２−Ｄゲル分析および抗体マイクロアレイ実験に加えて、候補ＭＩＭによって誘導される特定のタンパク質のレベルに対する潜在的な変化が、ウェスタンブロット分析によって評価されてもよい。すべてのプロテオーム実験において、種々の細胞系統におけるレベルの増加または減少を伴うタンパク質が同定および評価される。細胞中でタンパク質レベルの変化を誘導し、および／または正常細胞と比較して疾患細胞において１種以上のタンパク質のレベルの示差的な変化を誘導する分子がＭＩＭとして同定される。
【０３９９】
前述の実験から候補ＭＩＭを用いる処置によって調節されることが見い出された遺伝子は、細胞および生化学的経路分析に供され、それによって、例えば、アポトーシス、癌生物学、および細胞増殖、解糖および代謝、分子輸送、ならびに細胞シグナル伝達を含む種々の細胞経路に分類できる。
【０４００】
候補ＭＩＭの細胞への侵入を確認するため、候補ＭＩＭが細胞内に局在化されるようになるか否かを決定するため、ならびに細胞中に存在する候補ＭＩＭのレベルおよび型を決定するための実験が実行される。これらの実験は、例えば、実施例５に詳細に記載されているように実行される。例えば、ミトコンドリアに存在する候補ＭＩＭのレベルおよび型を決定するために、候補ＭＩＭで処置された細胞からのミトコンドリア富化調製物が調製および分析される。ミトコンドリアに存在する候補ＭＩＭのレベルは、それによって、外因性候補ＭＩＭの添加に伴って、時間および用量依存的な様式で増加することが確認できる。加えて、ミトコンドリア富化試料からのタンパク質のレベルの変化は、全体の細胞タンパク質試料のために上記に記載されたように、二次元ゲル電気泳動および質量分析の特徴付けによるタンパク質同定を使用することによって分析される。細胞に侵入することが見い出され、例えば、ミトコンドリアにおいて増加レベルで存在することが見い出された候補ＭＩＭは、ＭＩＭとして同定される。試験された時間経過にわたる細胞中の、または例えば、具体的には、ミトコンドリア中の候補ＭＩＭのレベルは、例えば、特定のタンパク質のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの調節によって証明されるように、他に観察される細胞の変化と相関できる。
【０４０１】
細胞組成の変化を誘導すること、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルでの遺伝子発現の変化を誘導することが観察された候補ＭＩＭは、ＭＩＭとして同定される。疾患状態（例えば、糖尿病または肥満）において、正常状態と比較して、細胞形態学、生理学、または細胞組成（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルでの遺伝子発現のディファレンシャルな変化）のディファレンシャルな変化を誘導することが観察された候補ＭＩＭは、ＭＩＭとして、特に、多次元特性を有するとして同定される。細胞に入ることが可能であることが見い出された候補ＭＩＭは、候補ＭＩＭがそれによって治療効果に加えてキャリア効果を提示するので、ＭＩＭとして、特に、多次元性質を有するとして同定される。
【０４０２】
実施例１７：代謝性障害と関連するエピシフターとしてのＣｏＱ１０の同定
対照細胞系統（ケラチン形成細胞およびメラニン形成細胞の初代培養）およびいくつかの皮膚癌細胞系統（非転移性皮膚黒色腫であるＳＫ−ＭＥＬ−２８；転移性皮膚黒色腫であるＳＫ−ＭＥＬ−２；または扁平上皮細胞癌であるＳＣＣ；膵臓癌細胞系統であるＰａＣａ２；または肝臓癌細胞系統であるＨＥＰ−Ｇ２）からなる皮膚細胞系統のパネルが様々なレベルのコエンザイムＱ１０で処置された。癌細胞系統は、対照細胞系統と比較したときに、用量依存的応答の変化を示し、癌細胞においてのみ、アポトーシスおよび細胞死の誘導を伴った。詳細な例示的な実験は、例えば、本明細書の実施例３に提示される。
【０４０３】
アッセイは、ＣｏＱ１０を用いる処置後に上記に同定される細胞のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルでの組成の変化を評価するために利用される。ｍＲＮＡ発現の変化は、アポトーシス、酸化ストレスおよび抗酸化剤、血管新生、および糖尿病の各々について特異的であるリアルタイムＰＣＲマイクロアレイを使用して分析された。タンパク質発現の変化は、抗体マイクロアレイ分析およびウェスタンブロット分析を使用して分析された。これらのアッセイからの結果は、ｍＲＮＡとタンパク質の両方のレベルで、コエンザイムＱ１０の添加に起因して、細胞系統中で、遺伝子発現の有意な変化が起こっていたことを実証した。細胞の代謝プロセスに付随するか、またはそれに関与することが知られている多数の遺伝子が、ＣｏＱ１０を用いる処置の結果として、調節されるものとして観察された。例えば、核受容体タンパク質ＨＮＦ４Ａの発現は、Ｑ１０処置後に細胞中で上方調節されていることが見い出された。トランスアルドラーゼ１（ＴＡＬ）の発現もまた、Ｑ１０で処置された細胞中で調節された。ＴＡＬはＮＡＤＰＨおよび反応性酸素中間体のレベルのバランスをとり、それによって、ミトコンドリアの膜電位を調節し、これは、ＡＴＰ合成および細胞生存の決定的なチェックポイントである。代謝性障害と特に関連するものの中で、例えば、糖尿病と関連することが知られている多数の遺伝子がＱ１０によって調節されるとして同定された。詳細な例示的な実験が、例えば、本明細書の実施例４、６、７、８、および９に提示されている。
【０４０４】
Ｑ１０は、エネルギー産生のためにミトコンドリアの中での酸化的（ｅｘｉｄａｔｉｖｅ）リン酸化プロセスのための必須のコファクターである。ミトコンドリア中に存在するコエンザイムＣｏＱ１０のレベルは、ＣｏＱ１０の型と同様に、ＣｏＱ１０で処置された細胞からミトコンドリアが富化された調製物を分析することによって決定される。ミトコンドリア中に存在するコエンザイムＱ１０のレベルは、外因性Ｑ１０の添加に伴って、時間および用量依存的な様式で増加することが確認された。時間経過は、代謝およびアポトーシス経路と関連する特定のタンパク質についてｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの調節において観察されるような広範な種々の細胞の変化と相関した。詳細な例示的な実験は、例えば、本明細書の実施例５に提示される。
【０４０５】
本明細書に記載された結果は、エピシフターとして内因性分子ＣｏＱ１０を同定した。特に、結果は、細胞中で、代謝状態のシフト、および部分的にミトコンドリア機能の回復を誘導するとしてＣｏＱ１０を同定した。これらの結論は、本明細書に記載されているデータの以下の解釈、および関連分野における現在の知見に基づいている。
【０４０６】
Ｑ１０は、合成され、ミトコンドリア内膜に能動輸送され、そこで富化され、およびそこで利用されることが知られている。Ｑ１０はまた、エネルギー産生のためのミトコンドリアにおける酸化的リン酸化のプロセスのための必須のコファクターであることも知られている。しかし、多くの癌細胞は、多くの正常細胞のようにミトコンドリアにおいてピルビン酸の酸化によるのではなく、解糖とその後の細胞質ゾル中での乳酸発酵によって、優勢にエネルギーを生産する。酸化的リン酸化は、電子伝達系およびシトクロムｃを含む。アポトーシスはミトコンドリアの破壊を含み、アポトーシス促進性因子によるミトコンドリア内膜の浸透能（ｐｅｒｍｉａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を伴う。様々な代謝エネルギー合成経路を利用することによって、癌細胞は、細胞中の異常に対する通常のアポトーシス性応答を軽減することが可能である。理論によって束縛されることを望まないが、出願人は、酸化的リン酸化経路のタンパク質を上方調節すること、従って、発癌の欠陥を認識し、アポトーシスの引き金を引く状態に戻るようにミトコンドリアの機能にスイッチを入れることによってＱ１０が機能していることを提案する。したがって、Ｑ１０は、細胞の代謝状態をシフトさせることによってエピシフターとして作用している。
【０４０７】
実施例１８：代謝性障害と関連するエピシフターの同定
対照細胞系統（例えば、ケラチン形成細胞およびメラニン形成細胞の初代培養）および癌細胞系統（例えば、非転移性皮膚黒色腫であるＳＫ−ＭＥＬ−２８；転移性皮膚黒色腫であるＳＫ−ＭＥＬ−２；または扁平上皮細胞癌であるＳＣＣ；膵臓癌細胞系統であるＰａＣａ２；または肝臓癌細胞系統であるＨＥＰ−Ｇ２）からなる皮膚細胞系統のパネルが様々なレベルの候補エピシフターで処置された。細胞形態学／生理学の変化は、候補エピシフターに対する細胞の感受性およびアポトーシス性応答を調べることによって評価される。これらの実験は、実施例３に詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、候補エピシフターに対する細胞系統の感受性は、様々な時間、および適用される濃度の範囲にわたって細胞生存を監視することによって評価される。候補エピシフターに対する細胞系統のアポトーシス性応答は、例えば、フローサイトメトリー方法論と組み合わせたネキシン試薬を使用することによって評価される。ネキシン試薬は、２種の染料、７ＡＡＤおよびアネキシン−Ｖ−ＰＥの組み合わせを含み、初期および後期のアポトーシスにおける細胞集団の定量化を可能にする。例えば、Ａｐｏｓｔｒａｎｄ（商標）ＥＬＩＳＡ方法論を使用する、一本鎖ＤＮＡを測定するさらなるアポトーシスアッセイが使用されてもよい。疾患および対照の細胞系統の感受性およびアポトーシス性応答が評価および比較される。候補エピシフターは、正常または対照細胞と比較された場合に、癌細胞において優勢にまたは選択的に細胞増殖を阻害するそれらの能力に基づいて評価される。候補エピシフターはさらに、正常または対照細胞と比較された場合に、癌細胞において優勢にまたは選択的にアポトーシスを誘導するそれらの能力に基づいて評価される。
【０４０８】
候補エピシフターを用いる処置後に上記に同定された細胞のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルでの組成物の変化を評価するためのアッセイが利用される。ｍＲＮＡレベルの変化はリアルタイムＰＣＲマイクロアレイを使用して分析される。これらの実験は、実施例６および９〜１３において詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、ｍＲＮＡは、処置後の様々な時点で細胞から抽出される。特定の経路に関与する遺伝子のｍＲＮＡのレベルは、アポトーシス、酸化ストレスおよび自己酸化防御、血管新生、熱ショック、または糖尿病に特異的なアレイを含む、標的とされる経路アレイを使用することによって評価される。２倍レベル以上で遺伝子のｍＲＮＡ転写が変化される遺伝子が同定および評価される。
【０４０９】
タンパク質発現の変化は、抗体マイクロアレイ分析、質量分析特徴付けと連動した二次元ゲル電気泳動分析、およびウェスタンブロット分析を使用して分析される。これらの実験は、それぞれ、実施例７、４、および８において詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、可溶性タンパク質は、候補エピシフターを用いる処置後の様々な時間、例えば、６時間または２４時間で細胞から抽出される。候補エピシフターによってタンパク質レベルまで誘導された変化は、広い範囲のタンパク質型および潜在的な経路マーカーをサンプリングしている７００種を超えるタンパク質に対する抗体を含む抗体マイクロアレイを使用することによって評価される。さらなる相補プロテオーム分析は、質量分析方法論と連動した二次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動を利用することによって実行できる。候補エピシフターは、細胞系統に外因的に加えられ、細胞ペレットは溶解され、２−Ｄゲル電気泳動に供される。ゲルは、未処置試料である対照と比べて処置試料でのタンパク質レベルの変化を同定するために分析される。ゲルは、レベルの増加、レベルの減少、または翻訳後修飾に起因する、処置の時間経過にわたるスポット変化の同定について分析される。統計学的に有意な変化を示すスポットは、トリプシン消化および質量分析による特徴付けによるタンパク質同定のために、切り出され、提出される。特徴付けされたペプチドは、例えば、ＭａｓｃｏｔおよびＭＳＲＡＴソフトウェア分析を用いて、タンパク質データベースに対して検索され、タンパク質を同定する。前述の２−Ｄゲル分析および抗体マイクロアレイ実験に加えて、候補ＭＩＭによって誘導される特定のタンパク質のレベルに対する潜在的な変化が、ウェスタンブロット分析によって評価されてもよい。すべてのプロテオーム実験において、種々の細胞系統におけるレベルの増加または減少を伴うタンパク質が同定および評価される。
【０４１０】
候補エピシフターは、候補エピシフターの添加に起因して、細胞系統中で、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルで遺伝子発現に誘導される変化に基づいて評価される。特に、候補エピシフターは、細胞代謝プロセスに付随するかまたはそれに関与することが知られている遺伝子を調節するそれらの能力に基づいて評価される。代謝性障害と特に関連するものの中で、候補エピシフターは、例えば、糖尿病または肥満と関連することが知られている遺伝子を調節するそれらの能力に基づいて評価される。
【０４１１】
細胞または特定の細胞位置に存在する候補エピシフターのレベル、ならびに候補エピシフターの型は、当業者に公知である日常的な方法を使用して決定される。例えば、経時的かつ一定の範囲の用量にわたるミトコンドリアにおける候補エピシフターのレベルは、候補エピシフターを用いて処置された細胞からのミトコンドリア富化調製物を分析することによって決定される。時間経過にわたってのミトコンドリアにおける候補エピシフターのレベルは、観察された他の細胞の変化、例えば、代謝経路およびアポトーシス経路に関連する特定のタンパク質のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルの調節と比較および相関できる。
【０４１２】
前述の実験から得られた結果に基づいて細胞の代謝状態のシフトを誘導することが観察された候補エピシフターは、エピシフターとして同定される。例えば、細胞中でインスリン刺激されたグルコースの取り込みを増強、増加、または増大する候補エピシフターはエピシフターとして同定される。
【０４１３】
実施例１９：エピシフターとしてのビタミンＤ３の同定
ビタミンＤ３、すなわち、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオールとしてもまた知られる）は、ビタミンＤから２段階酵素プロセスによって合成されるビタミンＤ代謝物である。ビタミンＤ３はその遍在性核ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）と相互作用し、カルシウムおよびリン酸の恒常性ならびに細胞分裂および分化に関与する遺伝子の広範なスペクトルの転写を調節する。ビタミンＤ３は、扁平上皮細胞癌、前立腺腺癌、卵巣癌、乳癌、および肺癌を含む多数のモデル系において抗癌効果を有することが報告されている（Ｄｅｅｂ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ７：６８４−７００に概説されている）。
【０４１４】
ビタミンＤ３の抗癌効果は、細胞周期のＧ１期での増殖停止、アポトーシス、腫瘍細胞分化、増殖因子媒介性細胞生存シグナルの破壊、ならびに血管新生および細胞接着の阻害を含む、複数のメカニズムを含むことが報告されている（Ｄｅｅｂ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ７：６８４−７００に概説されている）。例えば、特にアポトーシスに関して、ビタミンＤ３は、アポトーシスの鍵となる媒介因子を調節すること、例えば、抗アポトーシス性の、生存促進性タンパク質ＢＣＬ２およびＢＣＬ−ＸＬの発現を抑制すること、またはアポトーシス促進性タンパク質（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ、およびＢＡＤ）の発現を誘導することによってアポトーシスを誘導することが報告されてきた（Ｄｅｅｂ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。さらなる例において、特に血管新生に関連して、ビタミンＤ３は、いくつかの腫瘍由来内皮細胞の増殖を阻害すること、および腫瘍において血管新生を誘導する血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現を阻害することが報告されてきた（Ｍａｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，２００６  Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．５（４）：７９７−８０７０に概説されている）。別の例において、特に細胞周期停止に関して、ビタミンＤ３は、サイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ２１ＷＡＦＩ／ＣＩＰＩの遺伝子転写を誘導すること、ならびにサイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ２７ＫＩＰＩタンパク質の合成および／または安定化を誘導することが報告されており、これらの両方とも、Ｇ１停止の誘導のために決定的である（Ｄｅｅｂ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。
【０４１５】
上述の観察に基づいて、すなわち、細胞の代謝状態をシフトされるその能力により、ビタミンＤ３はエピシフターとして同定される。ビタミンＤ３は、細胞中でアポトーシスを誘導するその能力により、特に、正常細胞と比較した場合に、疾患（癌）細胞において示差的に細胞増殖を阻害し、およびアポトーシス性応答を誘導するその能力に基づいて、エピシフターである（例えば、正常細胞と比較した場合に、癌細胞においてアポトーシスに関与する、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、およびＢＡＸなどのタンパク質の発現を示差的に調節する）。
【０４１６】
実施例２０：コエンザイムＱ１０を用いて処置された細胞のウェスタン分析
過去５０年にわたって、悪性形質転換の根底にある原因としての特定のプロセスに影響を与える内因性／外因性因子に関わりがある膨大な量の情報が生じてきた。臨床的および基礎的文献は、ＤＮＡ構造および機能の変化が、癌を遺伝病として規定する、癌の開始および進行において顕著な役割を果たすという証拠を提供している（Ｗｏｏｓｔｅｒ，２０１０；Ｈａｉｍａｎ，２０１０）。１９２０年代初頭、発癌の病因論の根本的な変化を特徴付けることに従事していたＯｔｔｏ  Ｗａｒｂｕｒｇおよび他の研究者は、２つの主要な観察（ａ）Ｗａｒｂｕｒｇ効果としてもまた知られる、酸素の存在下でのエネルギー産生のためのＡＴＰの生成においてグルコースを輸送および利用する細胞の能力、ならびに（ｂ）ミトコンドリアＡＴＰの産生の減少に導く電子伝達の変化を含む、ミトコンドリアの構造および機能の変動を記述した。過去数年間は、癌の病因論、すなわち、癌を転移性疾患として見ることにおける細胞バイオエネルギーの中心的な役割を調べることの復活であった。
【０４１７】
歴史的には、遺伝子の変異が遺伝子発現の変化の原因であると考えられてきたけれども、発癌を支持する遺伝子発現に影響を与える際に決定的な役割を果たす後成的プロセスを支持している文献が蓄積しつつある。これは、多くの遺伝子の突然変異率が低く、癌細胞において見い出される多数の（スペクトルの）変異を説明できないという観察によって証明されている。後成的変化は、ヒストンテールのメチル化および修飾によって調節され、両方の変化は、ヒストンアセチル化のために、コファクター、例えば、アセチルＣｏＡ要求の利用性を必要とするので、細胞のエネルギー（栄養）状態に固有に連関している（参照）。アセチルＣｏＡの生合成は、解糖とクレブス回路に依存し、細胞内エネルギー状態を遺伝子の発現および活性の調節に直接連関させる。
【０４１８】
正常細胞において、ミトコンドリアの酸化的リン酸化は、十分なＡＴＰを生成して、正常な生理学的活性および細胞生存を維持するためのエネルギー要求に合致している。ミトコンドリアのエネルギー産生の結果は、反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成であり、その異常な産生はミトコンドリアの損傷に導く（参照）。発癌の病因論に関わりがある現象である、ミトコンドリアによる長期ＲＯＳ生成は、遺伝子の変異の累積的蓄積をもたらすことが十分に確立されている。癌細胞はＲＯＳ生成を最小化するようにミトコンドリア呼吸を減少し、エネルギー産生を維持するために解糖に切り替わることが示唆されてきた。したがって、酸化的リン酸化から解糖へのエネルギー産生の進行的シフトは、生理学的機能を維持するためにエネルギー産生を維持するために細胞にとって必須であり、正常細胞の表現型から癌細胞の表現型への進行に付随し得る。ミトコンドリアの遺伝的構成における変化（変異）の蓄積と連携した細胞のエネルギー（生体エネルギー）プロフィールの進行性シフトは、細胞メタボロームを変化させる。解糖の推移に対するミトコンドリアのリン酸化の結果としての全細胞メタボロームプロフィールの変化は、異常な生体エネルギー誘導性メタボロームプロフィールに対応し、発癌を支持する根底にある原因である。非癌性正常ミトコンドリア酸化的リン酸化関連細胞生体エネルギーの状態への細胞メタボロームシフトを誘発するために内因性分子を使用する標的化介入は、癌の治療における治療エンドポイントを表す。
【０４１９】
エピメタボロームシフトを引き起こすＭＩＭとしてのコエンザイムＱ１０
本明細書に提示されるデータは、コエンザイムＱ１０を用いた正常および癌細胞の処置が、解糖−ミトコンドリア酸化ストレス連続体の中で鍵となる生化学的末端を調節するタンパク質の発現の変化に関与することを実証する。ウェスタンブロッティングおよび酸素消費によるタンパク質発現の評価を説明するデータの組み合わせは、正常細胞において、コエンザイムＱ１０の曝露後に、正常な解糖およびミトコンドリア速度の有意な変化がないことを実証する。したがって、正常細胞系統、例えば、ＨＤＦａ（正常ヒト成体線維芽細胞）、ＨＡＳＭＣ（正常ヒト大動脈平滑筋細胞）、ｎＦｉｂ（正常線維芽細胞）、およびＨｅＫａ（正常ヒトケラチン生成細胞）におけるタンパク質の発現の値およびミトコンドリア呼吸速度は、ベースライン生理学的状態を表すと見なすことができる。癌細胞系統、例えば、ＨｅｐＧ２（肝臓癌）、ＰａＣａ−２（膵臓癌）、ＭＣＦ７（乳癌）、ＳＫ−ＭＥＬ（黒色腫）、およびＳＣＣ−２５（扁平上皮細胞癌）におけるタンパク質の発現およびミトコンドリア呼吸速度の何らかの逸脱は、この場合は、癌における疾患の開始／進行に起因する変化を表す。実験的証拠は、癌細胞に対するコエンザイムＱ１０の曝露が、正常細胞を彷彿とさせる細胞の病態生理学的再組織化と関わりがあるという仮説に対するサポートを提供する。具体的には、本明細書に提供されるデータは、癌細胞中でのコエンザイムＱ１０曝露は、正常細胞において観察される細胞構造に対する、細胞構造の全体的な再組織化の誘導の原因である、解糖経路におけるシフトおよびミトコンドリアの酸化的リン酸化と関わりがあることを実証する。
【０４２０】
正常細胞において、解糖アウトプットの終点は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）、すなわち、クレブスサイクル（トリカルボン酸回路、ＴＣＡ、またはクエン酸回路としても知られる）に入るための解糖経路を経由したグルコースからピルビン酸の生成に連関しており、還元当量を生成して、ＡＴＰ産生のためにＯＸＰＨＯＳをサポートする。したがって、正常細胞において、解糖に関与する遺伝子産物の発現および機能的な方向付けは、ピルビン酸の十分な生成およびそれがクレブスサイクルに入ることに向けて準備される。癌細胞における解糖およびクレブスサイクルに関与する鍵となるタンパク質の発現および機能の異常調節は、ミトコンドリア機能の顕著な減少に伴う解糖の増強を生じる。ミトコンドリア呼吸鎖に選択的に影響を与える内因性分子であるコエンザイムＱ１０への癌細胞の曝露は、解糖およびクレブスサイクル経路のタンパク質の発現を変化させ（正常化し）、エネルギー産生（すなわち、ＡＴＰ生成）がミトコンドリアに回復されるように、生体エネルギーシフトを容易にする。
【０４２１】
実験手順
ウェスタンブロット実験１
実験のために使用された細胞はＨＤＦａ細胞およびＭＣＦ−７細胞であり、これらは、２つの異なる濃度、５０μＭおよび１００μＭでコエンザイムＱ１０で処置されるかまたは処置されず、そして処置の２４時間後に収穫された。全細胞ペレットが１ｍＬのＣ７緩衝液中で一度に再懸濁され、ラベルされた１５ｍＬチューブに移された。次いで、試料は、低温室にて、氷上で、番号１４の設定で６回の超音波パルスを使用して超音波処理された。超音波処理後、試料は２５００ｇで短時間遠心分離し、試料は２ｍｌチューブに移された。５０ｍＬ試料チューブに残っている泡を使用して、各試料のｐＨが確認された（ｐＨは９．０である）。
【０４２２】
試料のアルキル化および還元は、１０μｌの１Ｍアクリルアミド、２５μｌのトリブチルホスフィン（ｔｒｉｂｕｔｙｌｐｈｏｓｈｅｎｅ）を加えること、および断続的に混合しながらの９０分間のインキュベーションによって、各試料について実施された。インキュベーション後、１０μｌの１Ｍ  ＤＴＴが加えられ、チューブは２０，０００ｇで２０℃にて１０分間遠心分離され、そして１０ｋカットオフを有するラベルしたＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  カタログ番号ＵＦＣ８０１０２４）に上清が移された。試料は、２分間隔で、２５００ｇで１５分間遠心分離された。電気伝導度は、Ｃｈａｐｓ単独ならびに試料について、電気伝導度メーターを使用して測定された。試料の電気伝導度が高い場合、１ｍｌのｃｈａｐｓが緩衝液交換のために加えられ、体積が２５０μｌに下がるまで、２５００ｇで再度遠心分離された。電気伝導度が２００以下であったとき、試料は、上清の体積が１５０〜１００μｌの間になるまで、５分間隔で２５００ｇで遠心分離された。試料上清はエッペンドルフチューブに移され、ＢＳＡを標準として使用してＢｒａｄｆｏｒｄアッセイが実施された。
【０４２３】
試料は上記のような標準のプロトコールに従って処置され、各試料中のタンパク質の量はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定された。１０μｇタンパク質に等価な試料体積が、以下に示されるように、Ｌａｍｅｌｌｉローディング染料（ＬＤＳ）およびＭｉｌｌｉＱ水を用いて調製され、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号ＮＰ０３２３Ｂｏｘ）上で泳動された。
【０４２４】
ゲルは、１×ＭＯＰＳ緩衝液を使用し、ＮＯＶＥＸ  Ｘｃｅｌｌ  Ｓｕｒｅｌｏｃｋシステムを使用して、２００Ｖで５０分間泳動された。次いで、ゲルは、ＮＯＶＥＸ  Ｘｃｅｌｌ  Ｓｕｒｅｌｏｃｋ湿式転写プロトコールを使用して、３０Ｖで１時間転写された。ブロットは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（ＬＣ６０６５）で染色された。
【０４２５】
ＨＤＦａおよびＭＣＦ−７試料におけるＩＤＨ１およびＡＴＰクエン酸リアーゼレベル
転写後、各ブロットは、２枚のＷｈａｔｍａｎ濾紙の間に配置され、１５〜２０分間乾燥された。乾燥後、ブロットは、日付、試料の型、およびブロット１かブロット２のいずれかをＨＢ鉛筆でラベルされた。分子量マーカーは、鉛筆で輪郭が描かれ、１本線は青色であり、２本線は着色マーカーであった。ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で１時間室温でブロッキングされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄された。ブロット１は５％ＢＳＡを有するＴＢＳＴ中のＩＤＨ１に対する一次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ番号３９９７）（１：１０００希釈）でプローブされ、ブロット２は、振盪しながら４℃で一晩のインキュベーションによって、１：１０００希釈の５％ＢＳＡ中のＡＴＰクエン酸リアーゼについてのウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ番号４３３２）を用いた。一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０４２６】
ＨＤＦａおよびＭＣＦ−７試料におけるアクチンレベル
上記のブロットは、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。２つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。次いで、ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして１：５０００希釈の５％  ＢＳＡ中のアクチンに対する抗体（Ｓｉｇｍａ  カタログ  番号Ａ５３１６、クローンＡＣ−７４）で、振盪しながら、室温で１時間プローブされた。アクチンに対する一次抗体との１時間のインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗マウス；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０４２７】
ウェスタンブロット実験２
この実験において使用された細胞は、ＳＫＭＥＬ２８、ＳＣＣ−２５、ｎＦｉｂ、およびＨｅｋａであり、これらは、２つの異なる濃度、５０μＭおよび１００μＭでコエンザイムＱ１０で処置されるかまたは処置されず、そして処置の３、６、および／または２４時間後に収穫された。試料は、上記のように、処理され、４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
【０４２８】
４つの細胞系統についてのＩＤＨ１のレベル
転写後、ブロットは１５〜２０分間乾燥され、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄された。次いで、これは、５％  ＢＳＡを有するＴＢＳＴ中のＩＤＨ１に対する一次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  番号３９９７）（１：１０００希釈）を用いて、振盪しながら、４℃で一晩のインキュベーションによってプローブされた。ＩＤＨ１に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、二次抗体（抗ウサギ；１：１０，０００希釈）を用いて、室温で１時間プローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０４２９】
４つの異なる細胞系統におけるＡＴＰクエン酸リアーゼレベル
イソクエン酸デヒドロゲナーゼブロットが、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄された。次いで、これは、１：１０００希釈の５％  ＢＳＡ中のＡＴＰクエン酸リアーゼについてのウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  番号４３３２）で、振盪しながら、４℃で一晩プローブされた。ＡＴＰクエン酸リアーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
異なる４つの細胞系統におけるアクチンレベル
ＡＴＰクエン酸リアーゼブロットが、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、１：５０００希釈の５％  ＢＳＡ中のアクチンに対する抗体（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号  Ａ５３１６、クローンＡＣ−７４）で、振盪しながら、室温で１時間プローブされた。アクチンに対する一次抗体との１時間のインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗マウス；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０４３０】
ウェスタンブロット実験３
この実験において使用された細胞は、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＡＳＭＣ細胞、およびＰＡＣＡ２細胞であり、これらは、２つの異なる濃度、５０μＭおよび１００μＭでコエンザイムＱ１０で処置されるかまたは処置されず、そして処置の４８時間後に収穫された。この実験において（ウェスタンブロット実験３）、および本実施例において以下に記載される実験のすべてにおいて（すなわち、ウェスタンブロット実験４〜９）、細胞は、５ｍＭ  グルコース（「５Ｇ」）または２２ｍＭ  グルコース（「２２Ｇ」）のいずれかでさらに処置された。細胞に由来する試料は処理され、そして上記のように４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
【０４３１】
ＨＡＳＭＣ対ＰＡＣＡ２およびＨｅｐＧ２におけるＩＤＨ１、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、およびアクチンレベル
ＩＤＨ１、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、およびアクチンのレベルは、本質的に、上記のように、ＩＤＨ１、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、およびアクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
【０４３２】
ウェスタンブロット実験４
この実験において使用された細胞はＨｅｐＧ２であり、これらは、２つの異なる濃度、５０μＭおよび１００μＭでコエンザイムＱ１０で処置されるかまたは処置されず、そして処置の２４または４８時間後に収穫された。試料は、上記のように、処理され、４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰＡＧＥゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
【０４３３】
ＨｅｐＧ２細胞における乳酸デヒドロゲナーゼレベル
転写後、各ブロットは１５〜２０分間乾燥され、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。次いで、このブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で、室温で１時間ブロッキングされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、５％  ＢＳＡ中の乳酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体（ａｂｃａｍ  ａｂ２１０１；ポリクローナル）（１：１０００希釈）を用いて、振盪しながら、４℃で一晩のインキュベーションによってプローブされた。乳酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、二次抗体（ウサギ抗ヤギ；１：１０，０００希釈）を用いて、室温で１時間プローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０４３４】
ＨｅｐＧ２細胞における筋肉型ピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ２）レベル
乳酸デヒドロゲナーゼブロットが、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。２つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、１：５００希釈の５％  ＢＳＡ中のピルビン酸キナーゼＭ２に対するウサギポリクローナル抗体（ＮＯＶＵＳ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＳ  カタログ番号  Ｈ００００５３１５−Ｄ０１Ｐ）で、振盪しながら、室温で１時間プローブされた。ピルビン酸キナーゼＭ２に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、各ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０４３５】
ＨｅｐＧ２細胞におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼβレベル
ピルビン酸キナーゼブロットが、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。２つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。抗体が剥がされたことおよびＥＣＦ試薬が働いたことを確認した後、ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、１：５０００希釈の５％  ＢＳＡ中のピルビン酸デヒドロゲナーゼに対する抗体（ＡＢＮＯＶＡ  カタログ番号  Ｈ００００５１６２−Ｍ０３）で、振盪しながら、４℃で一晩プローブされた。ピルビン酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗マウス；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、各ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０４３６】
ＨｅｐＧ２細胞におけるアクチンレベル
ピルビン酸デヒドロゲナーゼブロットは、本質的に上記のように、剥がされ、次いで、アクチンについて再プローブされた。
【０４３７】
ウェスタンブロット実験５
この実験において使用された細胞はＭＩＡＰＡＣＡ２（ＰＡＣＡ２）であり、これらは、２つの異なる濃度、５０μＭおよび１００μＭでコエンザイムＱ１０で処置されるかまたは処置されず、そして処置の２４または４８時間後に収穫された。ＰＡＣＡ２試料は、本質的に上記のように、処理され、そしてゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
【０４３８】
ＰａＣａ２細胞中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）レベル
ＬＤＨおよびＰＤＨのレベルは、本質的に上記のように、ＬＤＨおよびＰＤＨに対する一次抗体でブロットを連続的にプローブすることによって決定された。
【０４３９】
ＰａＣａ２細胞におけるカスパーゼ３レベル
ブロットは、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。２つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、５％  ＢＳＡ中のカスパーゼ３に対する抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  番号ｓｃ７２７２、１：２００希釈）で、振盪しながら、４℃で一晩プローブされた。カスパーゼ３に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗マウス；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、各ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０４４０】
ウェスタンブロット実験６
このウェスタンブロット実験において使用された細胞はＰＣ−３、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７、ＨＤＦａ、およびＰＡＣＡ２であり、これらは、コエンザイムＱ１０  ＩＶ製剤で処置されるかまたは処置されず、そして処置の２４時間後に収穫された。本質的に上記のように、試料は処理され、ゲルは泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
【０４４１】
異なる細胞型におけるカスパーゼ（Ｃａｐａｓｅ）３およびアクチンレベル
カスパーゼ３およびアクチンのレベルは、本質的に上記に記載されるように、カスパーゼ３およびアクチンに対する一次抗体を用いて、ブロットを連続的にプローブすることによって決定された。
【０４４２】
ウェスタンブロット実験７
この実験において使用された細胞はヒト大動脈平滑筋（ＨＡＳＭＣ）細胞であり、これは、２つの異なる濃度、５０μＭおよび１００μＭでコエンザイムＱ１０で処置されるかまたは処置されず、そして処置の２４または４８時間後に収穫された。本質的に上記のように、ＨＡＳＭＣ試料は処置され、ゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
【０４４３】
アクチンのための実験プロトコール：
アクチンのレベルは、本質的に上記のように、アクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
【０４４４】
Ｈｉｆ  １α、カスパーゼ３、およびＰＤＨＢのための実験プロトコール：
アクチンブロットが、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、１：２００希釈の５％ＢＳＡ中のＨｉｆ  １α、カスパーゼ３、またはＰＤＨＢに対する抗体で、穏やかに振盪しながら、４℃で一晩プローブされた。Ｈｉｆ  １αに対する一次抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ２１８５；抗ウサギ）は、５％ＢＳＡ中で１：５００希釈であった。カスパーゼ３に対する一次抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  ｓｃ７２７２；抗ウサギ）は、５％ＢＳＡ中で１：２００希釈であった。ピルビン酸デヒドロゲナーゼβ（ＰＤＨＢ）に対する一次抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｈ００００５１６２−Ｍ０３；抗マウス）は、５％ＢＳＡ中で１：５００希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、室温にて１時間、二次抗体（ＰＤＨＢ抗マウス；Ｈｉｆ  １ａ、およびカスパーゼ３抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、各ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０４４５】
ＰＫＭ２、ＳＤＨＢ、およびＳＤＨＣのための実験プロトコール：
上記のブロットは、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ＢＳＡ中のＰＫＭ２、ＳＤＨＢ、またはＳＤＨＣに対する一次抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、４℃で一晩プローブされた。ＳＤＨＣに対する一次抗体（ＡＢＮＯＶＡ  Ｈ００００６３９１−Ｍ０２；抗マウス）は１：５００希釈であった。ＳＤＨＢに対する一次抗体は、Ａｂｃａｍ  ａｂ４７１４−２００から；抗マウス；１：１０００希釈であっった。ピルビン酸キナーゼＭ２（ＰＫＭ２）に対する一次抗体は、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｈ００００５３１５−Ｄ０ＩＰから；抗ウサギ；１：５００希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（ＳＤＨＢ＆Ｃ抗マウス；およびＰＫＭ２抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０４４６】
ＬＤＨおよびＢｉｋのための実験プロトコール：
上記のブロットは、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、５％ＢＳＡ中のＬＤＨまたはＢｉｋに対する一次抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、４℃で一晩プローブされた。ＬＤＨに対する一次抗体はＡｂｃａｍ  ａｂ２１０１から；抗ヤギ；１：１０００希釈であった。Ｂｉｋに対する一次抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ番号９９４２から；抗ウサギ；１：１０００希釈であった。一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（ＬＤＨ抗ヤギ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＢｉｋ抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０４４７】
ウェスタンブロット実験９
使用された細胞はＨｅｐＧ２細胞であり、これは、２つの異なる濃度、５０μＭおよび１００μＭでコエンザイムＱ１０で処置されるかまたは処置されず、そして処置の２４または４８時間後に収穫された。本質的に上記のように、ＨｅｐＧ２試料は処理され、ゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
【０４４８】
アクチンのための実験プロトコール：
アクチンのレベルは、本質的に上記のように、アクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
【０４４９】
カスパーゼ３およびＭＭＰ−６のための実験プロトコール：
アクチンブロットが、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、５％ＢＳＡ中のカスパーゼ３またはＭＭＰ−６に対する抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、４℃で一晩プローブされた。カスパーゼ３に対する一次抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ４４９７６−１００；抗ウサギ）は５％ＢＳＡ中１：５００希釈であった。ＭＭＰ−６に対する一次抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  ｓｃＭＭ００２９−ＺＢ５；抗マウス）は５％ＢＳＡ中１：１００希釈であった。一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、室温にて１時間、二次抗体（ＭＭＰ−６抗マウス；カスパーゼ３抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０４５０】
ＬＤＨのための実験プロトコール：
上記のブロットは、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、穏やかに振盪を伴う、５％ＢＳＡ中または５％ミルク中のＬＤＨに対する一次抗体とのインキュベーションによって、４℃で一晩プローブされた。ＬＤＨ０８０３０９ｂ１に対する一次抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ２１０１；抗ヤギ）は５％ＢＳＡ中１：１０００希釈であった。ＬＤＨ０８０３０９ｂ２に対する一次抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ２１０１；抗ヤギ）は５％ミルク中１：１０００希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  抗ヤギ；１：１０，０００希釈；３０５−０５５−０４５）で１時間プローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０４５１】
トランスアルドラーゼおよびＨｉｆ１ａのための実験プロトコール：
上記のブロットは、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、４℃で一晩のインキュベーションによって、５％ＢＳＡ中のトランスアルドラーゼまたはＨｉｆ１ａに対する一次抗体で一晩プローブされた。トランスアルドラーゼに対する抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ６７４６７；抗マウス）は１：５００希釈であった。Ｈｉｆ１ａに対する抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ２１８５；抗ウサギ）は１：５００希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗マウスまたは抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０４５２】
ＩＧＦＢＰ３およびＴＰ５３のための実験プロトコール：
上記のブロットは、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、４℃で一晩のインキュベーションによって、５％ＢＳＡ中のＩＧＦＢＰ３またはＴＰ５３に対する一次抗体で一晩プローブされた。ＩＧＦＢＰ３に対する一次抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ７６００１；抗ウサギ）は１：１００希釈であった。ＴＰ５３に対する一次抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ＡＶ０２０５５；抗ウサギ）は１：１００希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗ウサギ；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０４５３】
トランスアルドラーゼおよびＰＤＨＢのための実験プロトコール：
上記のブロットは、メタノールと３０分間インキュベートされ、続いて２回のＴＢＳ−Ｔを用いる１０分間の洗浄、次いで５０℃のストリッピング緩衝液との３０分間のインキュベーション、続いて、１００ｍｌ以上のＴＢＳ−Ｔを用いる各３０分間の２回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで５秒間活性化され、水で５分間、そしてＴＢＳＴで１５分間洗浄された。ブロットは、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ブロッキング試薬で室温で１時間ブロックされ、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、４℃で一晩のインキュベーションによって、５％ＢＳＡ中のトランスアルドラーゼまたはＰＤＨＢに対する一次抗体で一晩プローブされた。トランスアルドラーゼに対する一次抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  ｓｃ５１４４０；抗ヤギ）は１：２００希釈であった。ＰＤＨＢに対する一次抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｈ００００５１６２−Ｍ０３；抗マウス）は１：５００希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて１時間、二次抗体（抗ヤギまたは抗マウス；１：１０，０００希釈）でプローブされた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、ブロットはＴＢＳ−Ｔ（１×−１５’；２×各５’）で３回洗浄され、次いで、５分間、ＥＣＦ試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、５１００  Ｆｕｊｉ  Ｌａｓｅｒスキャナーで、２５μＭ解像度、１６ビット、緑色レーザー、４００Ｖ、および５００Ｖでスキャンされた。
【０４５４】
結果
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−１−（ＩＤＨ−１）
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−１−（ＩＤＨ−１）は、ミトコンドリア基質の中に通常存在するＴＣＡ回路の一部である酵素の１つである。しかし、ＩＤＨ１は、イソクエン酸からα−ケトグルタル酸への酸化的脱カルボキシル化を触媒し、２段階工程で二酸化炭素を生成する細胞質ゾル型の酵素である。ＩＤＨ１は、細胞質ゾルおよびペルオキシソームに存在するＮＡＤＰ＋依存性型である。ＩＤＨ１はＳｅｒ１１３リン酸化によって不活性化され、クエン酸回路がないものを含む多くの種において発現される。ＩＤＨ１は、部分的にＨＩＦ−１の活性化を通して、不活性化が腫瘍形成に寄与する腫瘍抑制因子として通常は機能しているようである（Ｂａｙｌｅｙ２０１０；Ｒｅｉｔｍａｎ，２０１０）。最近の研究は、膠芽細胞腫の病因学におけるＩＤＨ１の不活性化変異に関わっている（Ｂｌｅｅｋｅｒ，２００９；Ｂｌｅｅｋｅｒ，２０１０）。
【０４５５】
コエンザイムＱ１０での処置は、ＭＣＦ−７、ＳＫＭＥＬ２８、ＨｅｐＧ２、およびＰａＣａ−２細胞を含む癌細胞株におけるＩＤＨ１の発現を増加した。ＳＣＣ２５細胞系統においては中程度の発現の増加が存在した。ヒト由来初代線維芽細胞ＨＤＦａとは対照的に、ｎＦＩＢおよびヒト大動脈平滑筋細胞ＨＡＳＭＣは、コエンザイムＱ１０に応答して、ＩＤＨ１の発現パターンの有意な変化を実証しなかった。α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）は、ＴＣＡ回路における鍵となる中間体であり、イソクエン酸から生化学的に合成され、最終的にはスクシニルＣｏＡに転換され、薬物となり得るＭＩＭおよびエピシフターである。α−ＫＧはＴＣＡ回路の中間体を補充するために細胞によって使用でき、酸化的リン酸化を増加するための還元当量の生成を生じるので、α−ＫＧの生成はＴＣＡ回路における決定的な岐路として働く。したがって、コエンザイムＱ１０媒介性のＩＤＨ１発現の増加は、癌細胞における酸化的リン酸化を増強するためにミトコンドリアのＴＣＡ回路によって使用できる中間体の形成を生じる。結果は以下の表に要約される。
【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【０４５６】
ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬ）
ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬ）は、細胞質ゾル中でアセチルＣｏＡおよびオキサロ酢酸の形成を触媒するホモテトラマー（〜１２６ｋｄ）酵素である。この反応は、糖生成と同様に、脂肪酸、コレステロール、およびアセチルコリンの生合成のための最初の非常に重要なステップである（Ｔｏｗｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。栄養およびホルモンがこの鍵となる酵素の発現レベルおよびリン酸化状態を調節している。ＡｋｔおよびＰＫＡによるＡＣＬのＳｅｒ４５４リン酸化が報告されている（Ｂｅｒｗｉｃｋ．，ＤＣ  ＭＷ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｐｉｅｒｃｅ  ＭＷ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。
【０４５７】
データは、正常細胞および癌細胞におけるＡＴＰクエン酸リアーゼに対するコエンザイムＱ１０の効果を説明している。癌細胞において、ＡＣＬ酵素の発現の用量依存的な減少が存在することが一貫して観察されている。対照的に、正常細胞においては、ＡＣＬの発現の増加に向かう傾向が存在するようである。細胞質ゾルＡＣＬは、増殖因子刺激の間および分化の間に、細胞におけるヒストンアセチル化のために必須であることが実証されてきた。新生物プロセスにおいて重要なプロセスであるヒストンアセチル化のために必須であるアセチルＣｏＡを生成するために、ＡＣＬが細胞質ゾルのグルコース由来のクエン酸を利用するという事実は、癌細胞機能に影響を与える際のコエンザイムＱ１０誘導ＡＣＬ発現の役割を実証する。細胞質ゾルＡＣＬによってクエン酸から生成されたアセチルＣｏＡは、細胞分裂の間の新たな脂質およびコレステロールの生合成のための供給源として働く。したがって、コエンザイムＱ１０で誘導されるＡＣＬ発現の変化は、癌細胞に対して正常細胞における脂質およびコレステロールの合成のためのアセチルＣｏＡの利用可能性を変化させる。結果は以下の表に要約される。
【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【０４５８】
ピルビン酸キナーゼＭ２（ＰＫＭ２）
ピルビン酸キナーゼは、解糖経路に関わる酵素である。これは、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）からアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）へのリン酸の転移の原因であり、ＡＴＰおよびピルビン酸を生成する。ＰＫＭ２は、解糖のピルビン酸キナーゼのアイソザイムであり、その発現は組織の代謝機能によって特徴付けられ、すなわち、Ｍ２アイソザイムは、胚細胞などの高いエネルギーの必要性を伴う正常細胞を迅速に増殖させる際に発現され、高い率の核酸合成を必要とする肺細胞および膵島細胞などの少数の分化した正常細胞においてもまた発現される。ＰＫＭ２は、細胞のエネルギーの要求に合致するために解糖経路に対するそれらの依存性に起因して、腫瘍細胞中で高度に発現されている。通常は胚に限定されていると考えられているＰＫＭ２アイソフォームは、癌性細胞中で再発現されている。ＰＫＭ２を発現する細胞は、より強力な好気性解糖表現型を好み（代謝表現型のシフトを示す）、乳酸産生の増加および酸化的リン酸化の減少を伴う。したがって、癌細胞におけるＰＫＭ２の発現の減少は、解糖経路を経由してエネルギー生成をシフトまたは下方調節し、これは、癌の治療において有用であるストラテジーである。データは、正常細胞および癌細胞におけるＰＫＭ２の変動する発現パターンを実証し、癌細胞は正常と比較してより高いレベルの発現を実証する。コエンザイムＱ１０での細胞の処置は、正常細胞および癌細胞において、ＰＫＭ２のより上側のおよびより下側のバンドレベルの発現パターンを変化させた。試験された癌細胞においてＰＫＭ２発現の用量依存的な減少が存在し、および癌細胞において大きな変化は観察されなかった。結果は以下の表に要約される。
【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【０４５９】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）
ＬＤＨは、ＮＡＤＨおよびＮＡＤ＋の同時相互変換を伴う、ピルビン酸および乳酸の相互交換を触媒する酵素である。これは、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を負担して、還元当量の生成およびＡＴＰ生成のための低い細胞酸素の緊張の下で、ピルビン酸をラクテート（乳酸）に転換する能力を有する。癌細胞は、典型的には、ＡＴＰおよび還元当量および還元ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳを生成するために解糖流入を維持するためにＬＤＨの発現の増加を実証する。したがって、癌細胞における還元当量は、ＴＣＡ回路にピルビン酸が入ることを容易にするための乳酸の生成から代謝をシフトさせる。コエンザイムＱ１０を用いる処置は、癌における乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）発現を減少させ、これは正常細胞においては最小の効果を伴うものであり、細胞質ピルビン酸から乳酸への転換を最小化することによって、解糖からミトコンドリアＯＸＰＨＯＳへのＡＴＰの生成のための癌細胞の生体エネルギーのシフトを誘発する際のコエンザイムＱ１０の役割を支持する。結果は以下の表に要約される。
【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【０４６０】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ−Ｂ（ＰＤＨ−Ｅ１）
ピルビン酸デヒドロゲナーゼベータ（ＰＤＨ−Ｅ１）は、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに転換するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）の一部である第１の酵素成分である。ＰＤＨ−Ｅ１は、その活性のためにチアミンをコファクターとして必要とし、ミトコンドリアにおけるＴＣＡサイクルに入るためにピルビン酸からアセチルＣｏＡへの転換のために必須であるＰＤＣ複合体における最初の２つの生化学反応を実施する。したがって、癌細胞におけるＰＤＨ−Ｅ１の発現の増加に伴って、同時に起こるＰＫＭ２およびＬＤＨの発現の減少は、ＡＴＰの生成のためにミトコンドリアＯＸＰＨＯＳを増強することに向けてピルビン酸が入ることの速度を増強する。データは、正常細胞および癌細胞系統におけるＰＤＨ−Ｅ１の発現のために、この酵素のベースライン発現が、正常細胞と比較して、癌細胞で減少されていることを示す。コエンザイムＱ１０を用いる処置は、癌細胞におけるＰＤＨ−Ｅ１タンパク質の発現の進行的な増加に関連し、正常細胞においては最小限の変化を伴う。結果は以下の表に要約される。
【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【０４６１】
カスパーゼ３
アポトーシスの開始の制御は、しばしば、開始因子のカスパーゼである、カスパーゼ−２、−９、および−８／１０のレベルで発揮される。外部のアポトーシスの経路において、カスパーゼ−８は、一旦活性になると、実行因子のカスパーゼ（例えば、カスパーゼ−３）を直接切断し、活性化する。活性型カスパーゼ−３は、他のカスパーゼ（６、７、および９）ならびに細胞中の関連する標的（例えば、ＰＡＲＰおよびＤＦＦ）を活性化する。これらの研究において、エフェクターカスパーゼ−３タンパク質のレベルは、コエンザイムＱ１０に応答して、癌細胞系統および正常細胞系統において測定された。アポトーシスの制御は開始因子カスパーゼを通してであり、その代わりに、多数のシグナル伝達経路が、エフェクターカスパーゼの直接阻害を通してアポトーシスシグナルの伝達を遮断することが注目されるべきである。例えば、Ｐ３８ＭＡＰＫは、カスパーゼ−３をリン酸化し、その活性を抑制する（Ａｌｖａｒａｄｏ−Ｋｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。興味深いことに、同じ研究におけるタンパク質ホスファターゼ（ＰＰ２Ａ）またはプロテインキナーゼＣデルタ（ＰＫＣデルタ）の活性化（Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）は、カスパーゼ−３活性化を増幅し、そしてアポトーシスシグナルの伝達を強化するように、ｐ３８ＭＡＰＫの効果と反対に作用できる。それゆえに、カスパーゼ−３活性化のレベルにおける事象またはカスパーゼ３活性化後の事象は、いくつかの場合において細胞の究極の運命を決定するかもしれない。
【０４６２】
カスパーゼ−３はシステイン−アスパラギン酸プロテアーゼであり、これは、細胞アポトーシスの実行フェーズで中心的な役割を果たす。癌細胞におけるカスパーゼ３のレベルは、コエンザイムＱ１０処置に伴って増加される。対照的に、正常細胞におけるカスパーゼ−３の発現は、正常細胞において中程度に減少された。結果は以下の表に要約される。
【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【０４６３】
コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）
コハク酸−コエンザイムＱ還元酵素としてもまた知られるコハク酸デヒドロゲナーゼは、ＴＣＡと電子伝達系の両方に関わるミトコンドリア内膜の複合体である。ＴＣＡにおいては、この複合体は、ユビキノンからユビキノールへの同時に起こる還元に伴って、コハク酸からフマル酸への酸化を触媒する（Ｂａｙｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００２）。ＳＤＨのＢ、Ｃ、およびＤサブユニットにおける生殖系列突然変異は、家族性傍神経節腫または平滑筋腫の開始事象であることが見い出された（Ｂａｙｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００）。
【０４６４】
ウェスタンブロッティング分析は、コエンザイムＱ１０で処置された癌細胞のミトコンドリア調製物においてＳＤＨサブユニットＢの発現を特徴付けるために使用された。結果は、コエンザイムＱ１０処置が、細胞のミトコンドリアにおけるＳＤＨタンパク質レベルの増加に関連することを示唆する。これらの結果は、コエンザイムＱ１０の作用のメカニズムの１つがＴＣＡ回路およびミトコンドリアに向かう細胞の代謝を、ＳＤＨＢなどのミトコンドリア酵素のレベルを増加することによってシフトされることを示唆する。結果は以下の表に要約される。
【表４８】
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【０４６５】
低酸素誘導因子−１
低酸素誘導因子（Ｈｉｆ）は、αおよびβサブユニットから構成される転写因子である。酸素正常状態下では、Ｈｉｆ１αのタンパク質レベルは、翻訳後事象の結果を介するその連続的な分解により、非常に低い。解糖と酸化的リン酸化の間のシフトは、一般的には、ピルビン酸の異化的な運命を決定する２つの酵素ＰＤＨおよびＬＤＨの相対的な活性によって制御されると考えられている。Ｈｉｆは、ＰＤＫを刺激することによって、ＬＤＨレベルを誘導し、ＰＤＨ活性を阻害することによって、この決定的な分岐（ｂｉｆｕｒｇａｔｉｏｎ）点を制御する。ミトコンドリアから細胞質ゾルにピルビン酸代謝を迂回させるこの能力により、Ｈｉｆは、癌細胞における生体エネルギーのスイッチの決定的な媒介因子であると考えられている。
【０４６６】
コエンザイムＱ１０での処置は、癌細胞のミトコンドリア調製物において、後でのＨｉｆ１αタンパク質レベルを減少させた。正常細胞の全細胞溶解物において、Ｈｉｆ１ａの下側のバンドが観察され、同様に減少を示した。結果は以下の表に要約される。
【表４９】
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【表５０】
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【０４６７】
実施例２１：ＣｏＱ１０によって処置された正常細胞および癌細胞における酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸化（ＥＣＡＲ）の分析
この実施例は、ストレッサー（例えば、高血糖、低酸素、乳酸）の非存在下および／または存在下で、本発明の代表的なＭＩＭ／エピシフター−ＣｏＱ１０−による処置への細胞の曝露が、正常な生理学的条件下での正常細胞において観察される値を代表する解糖／乳酸生合成およびミトコンドリア酸化的リン酸化（ＥＣＡＲおよびＯＣＲ値によって測定されるような）へのシフトと関連することを実証する。
【０４６８】
出願人は、癌細胞中のＣｏＱ１０での処置が、解糖および乳酸生合成の同時に起こる減少を伴う、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を増強する特定のタンパク質の発現の変化と関連することを先のセクションで実証した。この実施例は、インビトロ実験モデルにおける溶存酸素および細胞外ｐＨレベルを測定する機器であるＳｅａＨｏｒｓｅ  ＸＦ分析装置（ＳｅａＨｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ，Ｎｏｒｔｈ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して細胞系統において酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定することによって、ミトコンドリアの酸化的リン酸化の直接測定を得ることができることを示す。
【０４６９】
細胞外微小環境のｐＨは、腫瘍中では、細胞内（細胞質）および周囲の正常組織のｐＨと比較して、比較的酸性である。この腫瘍の特徴は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に侵入する能力、続いてシグナル伝達カスケードを開始する腫瘍転移の代表的な特質を含む複数の目的に役立ち、このシグナル伝達カスケードは、以下をさらに調節する：
・腫瘍の血管新生
・細胞周期のターンオーバーを制御する停止メカニズムの活性化の増加
・免疫監視に対する細胞の回避システムを容易にする免疫調節メカニズム
・解糖流入および乳酸利用への依存性を増加する代謝制御エレメント
・発癌性を増加させるように働く、Ｂｃｌ−２、ＩＡＰ、ＥｎｄｏＧ、ＡＩＦなどの鍵となるアポトーシス遺伝子ファミリーの異常調節。
【０４７０】
任意の特定の理論に束縛されることは望まないが、腫瘍における外部微小環境の酸性ｐＨは、解糖表現型の変化からの乳酸産生の増加に起因する、腫瘍細胞から押し出された水素イオン濃度の増加の結果である。
【０４７１】
この実験において、正常細胞系統におけるＯＣＲおよび細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）は、ベースラインの値を決定するために、ＣｏＱ１０の存在下および非存在下で得られた。そのネイティブな栄養環境において、正常細胞系統における基礎ＯＣＲ速度は異なっており、通常は、身体中の細胞の生理学的役割の関数であることが観察された。
【０４７２】
例えば、１つのセットの実験は、ヒト成体皮膚線維芽細胞系統である、非癌性細胞系統ＨＤＦａを使用して実施された。線維芽細胞は、最初に合成され、組織のために構造フレームワーク（ストロマ）を形成する、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分およびコラーゲンを分泌する。加えて、線維芽細胞は、創傷治癒および局所的免疫調節などの多数の機能の組織の使節（ａｍｂａｓｓａｄｏｒｓ）として働くことが知られている。正常な生理学的条件下では、正常な線維芽細胞におけるエネルギー要求は、解糖と酸化的リン酸化の組み合わせを使用することに合致する−解糖はＥＣＭの合成のための必要な栄養を提供する。
【０４７３】
ＨＤＦａと対照的に、ＨＡＳＭＣ（ヒト大動脈平滑筋細胞）は、動脈、静脈、リンパ管、胃腸管、呼吸管、膀胱、および興奮−収縮結合の調節を受ける能力を有する他の組織において見い出される。ＨＡＳＭＣ細胞などの平滑筋の収縮を受ける能力はＡＴＰによって提供されるエネルギーを要求する。これらの組織は、ＡＴＰがミトコンドリアから供給され得る低いエネルギーモードから、迅速なＡＴＰの生成のために解糖に切り換えることによってエネルギーが提供される高エネルギーモード（運動／ストレスの間）に移行する。したがって、正常平滑筋細胞は、ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳと解糖の組み合わせを使用でき、正常な生理学的環境下でのそれらのエネルギー要求を満たす。
【０４７４】
それらのそれぞれの生理学的役割（すなわち、ＨＤＦａおよびＨＡＳＭＣ）の違いは、ＳｅａＨｏｒｓｅ  ＸＦ分析装置を使用してこれらの細胞系統において測定される休止状態のＯＣＲ値で観察された。図２９および３０は、生理学的に正常なグルコース条件（約４．６ｍＭ）および高グルコース（高血糖）条件において増殖したＨＤＦａおよびＨＡＳＭＣ細胞におけるＯＣＲを記載する。
【０４７５】
正常な酸素利用能下にあるいずれの処理も行わなかったＨＤＦａについてのベースラインＯＣＲ値は、５．５ｍＭのグルコースの存在下ではおよそ４０ｐｍｏｌ／分である（図２９）。この値は、細胞が２２ｍＭグルコースに維持されたときにわずかに上昇された。対照的に、ＨＡＳＭＣ細胞において、５．５ｍＭグルコースにおけるＯＣＲ値は約９０ピコモル／分であり、ＯＣＲ値は、２２ｍＭグルコースの間に約４０ピコモル／分まで下降した。したがって、高血糖条件下では、ＨＤＦａとＨＡＳＭＣの間の示差的な応答が存在し、それらのそれぞれの生理学的な構成および機能における固有の違いをさらに実証する。
【０４７６】
細胞におけるＣｏＱ１０での処置は、正常（５ｍＭ）グルコース条件において観察された状態に代表的であるＯＣＲの変化と関連する。生理学的応答の複雑性は、低酸素緊張の存在下で混合される。したがって、ＣｏＱ１０曝露は、特定の細胞に対して固有である生理学的状態に向かう正常細胞中のＯＣＲ速度の変化と関連する。
【０４７７】
以下の表５１は、５．５ｍＭおよび２２ｍＭグルコースにおける正常酸素および低酸素条件下でのＣｏＱ１０の存在下および非存在下でのＨＤＦａ細胞中のＥＣＡＲ値（ｍｐＨ／分）を説明する。正常細胞において、ＣｏＱ１０での処置は、それがたとえこれらの細胞においてＯＣＲに影響を与えたとしても、ＥＣＡＲ値に対して最小限の影響を有したことが観察できる。高グルコース低酸素条件において、ＣｏＱ１０での処置は、未処置の正常酸素条件において観察された値までの、上昇したＥＣＡＲの低下に関連した。
【表５１】
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【０４７８】
表５２において、ＨＡＳＭＣにおける測定されたベースラインＥＣＡＲ値（ｍｐＨ／分）はＨＤＦａのそれと比較して高かった。低酸素状態の誘導は、解糖の増加に続いて起こる細胞内低酸素誘導性アシドーシスと関連する可能性が最も高いＥＣＡＲの増加を引き起こした。
【表５２】
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【０４７９】
ＣｏＱ１０での処置は、正常酸素での正常グルコース条件において観察される値に向けた低酸素条件における高血糖ＨＡＳＭＣ細胞におけるＥＣＡＲ速度の下向きの傾向と関連することが観察された。これらのデータは、特定の細胞の型の生理学的役割に固有である生理学的変数、異常な状態において観察される変化（例えば、高血糖）の存在が、ＣｏＱ１０で処置されたときに正常に向けてシフトされることを実証する。
【０４８０】
対照的に、癌細胞（例えば、ＭＣＦ−７、ＰａＣａ−２）は、培養中の維持のための解糖表現型に起因して、正常細胞と比較してより高いレベルのグルコースでの培養に固有に準備されている。ＣｏＱ１０での処置は、ＯＣＲ値の一貫した減少を引き起こした（図３１および図３２）。
【０４８１】
ＭＣＦ−７およびＰａＣａ−２細胞におけるＯＣＲ値に対するＣｏＱ１０の効果は、正常ＨＤＦａおよびＨＡＳＭＣ細胞のそれと類似しており、この変動性応答は、癌細胞系統の個々の代謝プロフィールに基づいて治療応答を示唆するものであった。
【表５３】
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【０４８２】
表５３は、ＰａＣａ−２細胞におけるＥＣＡＲ値を記載する。正常細胞と比較して、癌細胞は、ＡＴＰ生成のために高グルコースを使用するように表現型的に準備されており（解糖の増強）、２１ｍｐＨ／分でより高いＥＣＡＲを生じる（表５３、未処置正常酸素についてのＥＣＡＲ１７ｍＭ）。ＣｏＱ１０での処置は、解糖で生成された乳酸の減少に付随する可能性が最も高い、これらの条件下でのＥＣＡＲ速度の有意な減少を生じる。これらの細胞におけるＯＣＲの関連する減少は、ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳの効率の増加と最も関連したようであった。
【０４８３】
ＯＣＲおよびＥＣＡＲの同様の比較（データ示さず）は、ＨＡＥＣ（正常ヒト大動脈内皮細胞）、ＭＣＦ−７（乳癌）、ＨｅｐＧ２（肝臓癌）、および高度に転移性のＰＣ−３（前立腺癌）細胞系統を含む多数の他の正常細胞および癌細胞において決定された。試験された細胞系統のすべてにおいて、ストレッサー（例えば、高血糖、低酸素、乳酸）の非存在下および／または存在下でのＣｏＱ１０への曝露は、正常の生理学的条件下での正常細胞において観察される値に代表的なＯＣＲおよびＥＣＡＲの値のシフトと関連した。したがって、細胞死を含む、癌の治療におけるＣｏＱの全体的な効果は、解糖からミトコンドリアＯＸＰＨＯＳへの細胞の生体エネルギーのシフトと協調した、プロテオミクス的、ゲノム的、代謝学な結果に対するその集合的な影響の下流の効果である。
【０４８４】
実施例２２：ＣｏＱ１０の生合成のためのビルディングブロック分子
この実施例は、ＣｏＱ１０生合成の特定の前駆体、例えば、ベンゾキノン環の生合成のためのもの、およびイソプレノイド反復の生合成のためのもの、ならびにベンゾキノン環へのそれらの付属物（「ビルディングブロック成分」）が、単独で投与でき、もしくは標的細胞と組み合わせて投与でき、ならびにアポトーシス阻害剤Ｂｃｌ−２の下方調節、および／またはアポトーシス促進因子カスパーゼ−３の上方調節をもたらすことを実証する。特定の前駆体またはそれらの組み合わせは、細胞増殖もまた阻害し得る。データは、ＣｏＱ１０投与と実質的に同じ結果を達成するために、ＣｏＱ１０前駆体がＣｏＱ１０の代わりに使用されてもよいことを示唆する。
【０４８５】
実験において使用された特定の例示的な実験条件は以下に列挙される。
【０４８６】
Ｓｋｍｅｌ−２８黒色腫細胞は、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１×最終濃度の抗生物質を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養された。細胞は、８５％コンフルエンシーまで増殖され、３、６、１２、および２４時間の間、ビルディングブロック（構成単位）成分で処置された。次いで、細胞はペレット化され、ウェスタンブロット分析が実施された。
【０４８７】
試験ビルディングブロック成分は、Ｌ−フェニルアラニン、ＤＬ−フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、ＤＬ−チロシン、Ｄ−チロシン、４−ヒドロキシ−フェニルピルベート、フェニルアセテート、３−メトキシ４−ヒドロキシマンデレート（バニリルマンデル酸またはＶＭＡ）、バニリン酸、４−ヒドロキシ−ベンゾエート、ピリドキシン、パンテノール、メバロン酸、アセチルグリシン、アセチルＣｏＡ、ファルネシル、および２，３−ジメトキシ−５−メチル−ｐ−ベンゾキノンを含んだ。
【０４８８】
ウェスタンブロット分析において、細胞は冷ＰＢＳ中でペレット化され、溶解され、そしてタンパク質レベルはＢＣＡタンパク質アッセイを使用して定量された。全細胞溶解物は、４％ローディング１２％泳動Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルにロードされた。次いで、タンパク質はニトロセルロースペーパーに転写され、次いで、５％ミルクＴｒｉｓ緩衝液で１時間ブロックされた。次いで、タンパク質は、一次抗体（Ｂｃｌ−２およびカスパーゼ−３）に一晩曝露された。次いで、ニトロセルロースペーパーは、Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔに５分間曝露され、タンパク質発現が記録された。曝露後、アクチンが同じ方法を使用して定量された。ＩｍａｇｅＪを使用して、タンパク質発現のレベルが定量された。ｔ検定が使用されて統計学的有意さについて分析した。
【０４８９】
実験の例証的な結果は以下に要約される。
【０４９０】
ビルディングブロック成分Ｌ−フェニルアラニンのウェスタンブロット分析：キノン環構造についての合成経路に着手する前に、Ｌ−フェニルアラニンがチロシンに転換される。ウェスタンブロット分析は、黒色腫細胞におけるアポトーシスタンパク質の発現の任意の変化を定量するように実施された。試験された濃度は５μＭ、２５μＭ、および１００μＭであった。初期の研究は、０．４Ｍの濃度のフェニルアラニンを含んだＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にＬ−フェニルアラニンを加えた。５μＭ、２５μＭ、および１００μＭについては、培地中のＬ−フェニルアラニンの最終濃度は、それぞれ、０．４０５Ｍ、０．４２５Ｍ、および０．５００Ｍであった。これらの最終濃度は、３、６、１２、および２４時間のインキュベーション時間の間、Ｓｋｍｅｌ−２８細胞に対して試験された。細胞は、８０％コンフルエンシーまで増殖され、その後、処置培地を加え、上記のようにウェスタンブロット分析手順を使用して収穫された。統計学的に有意なＢｃｌ−２の減少は、３時間および１２時間のインキュベーション後に、１００μＭ  Ｌ−フェニルアラニンについて観察された。５μＭ  Ｌ−フェニルアラニンについては、統計学的に有意なＢｃｌ−２の減少は、インキュベーションの６時間後に観察された。２５μＭ  Ｌ−フェニルアラニンについては、統計学的に有意なＢｃｌ−２の減少、および統計学的に有意なカスパーゼ−３の増加が１２時間のインキュベーション後に観察された。統計学的に有意なＢｃｌ−２の減少は、アポトーシス能力の変化を示し、統計学的に有意なカスパーゼ−３の増加は細胞がアポトーシスを受けていることを確認する。たとえ試料サイズおよび標準偏差に起因して、この実験においてこれらの時点は統計学的に有意ではないとしても、対照と比較してＢｃｌ−２の減少の一定の傾向が存在した。
【０４９１】
ビルディングブロック成分Ｄ−フェニルアラニンのウェスタンブロット分析：生物活性Ｌ−フェニルアラニンの化学合成型であるＤ−フェニルアラニンは、Ｌ−フェニルアラニンに対する比較のために試験された。３つすべての濃度について（５μＭ、２５μＭ、および１００μＭのＤ−フェニルアラニン）、インキュベーションの６時間後にＢｃｌ−２発現の有意な減少が存在した。加えて、５μＭおよび２５μＭについては、インキュベーションの３時間後に有意な減少が存在した。５μＭおよび１００μＭ濃度については、カスパーゼ−３発現の有意な増加が、６時間のインキュベーション後に観察された。
【０４９２】
ビルディングブロック成分ＤＬ−フェニルアラニンのウェスタンブロット分析：ＤＬ−フェニルアラニンもまた、Ｌ−フェニルアラニンとの比較のために試験された。再度、５μＭ、２５μＭ、および１００μＭの濃度がＳｋｍｅｌ−２８細胞に対して試験された。インキュベーション時間は、３、６、１２、および２４時間であった。統計学的に有意なカスパーゼ−３の増加が３時間のインキュベーション後に観察された。統計学的に有意なＢｃｌ−２の減少が２４時間のインキュベーション後に観察された。Ｂｃｌ−２の減少およびカスパーゼ−３の増加の傾向が、すべての他の濃度およびインキュベーション時点であるが、これらは、この実験においては統計学的に有意ではなかった。
【０４９３】
ビルディングブロック成分Ｌ−チロシンのウェスタンブロット分析：Ｌ−チロシンはＣｏＱ１０のキノン環構造の合成のためのビルディングブロック成分である。Ｌ−チロシンの初期の試験は、ウェスタンブロット分析のために十分に高いタンパク質濃度を生じなかった。この研究から２５μＭより下の濃度がウェスタンブロット分析のために試験された。使用されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地は、０．３９８４６７ＭのＬ−チロシン二ナトリウム塩を含んだ。初期濃度は５００ｎＭ、５μＭ、および１５μＭ増加された。統計学的に有意なカスパーゼ−３の増加は、１２時間のインキュベーション後に５００ｎＭ濃度について観察された。統計学的に有意なカスパーゼ−３の増加もまた、５Ａについて観察され、統計学的に有意なＢｃｌ−２の減少は、２４時間のインキュベーション後に５μＭ濃度について観察された。統計学的に有意なＢｃｌ−２の減少は、２４時間のインキュベーション後に５００μＭおよび５μＭ濃度について観察された。
【０４９４】
ビルディングブロック成分Ｄ−チロシンのウェスタンブロット分析：Ｌ−チロシンの合成型であるＤ−チロシンは、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｎａｌ）細胞に対するＬ−チロシンのアポトーシス性効果に対しての比較のために試験された。Ｌ−チロシンを用いる初期の研究に基づいて、ウェスタンブロット分析のために２５μＭより下の濃度が選ばれた。試験された濃度は１μＭ、５μＭ、および１５μＭであった。Ｄ−チロシンは、１２および２４時間の期間の間、５μＭおよび１５μＭ濃度についてＢｃｌ−２発現の減少を示した。カスパーゼ−３は、３、１２、および２４時間の期間で、５μＭ濃度について有意に増加された。１２および２４時間の期間で、１μＭについてカスパーゼ−３発現の増加もまた存在した。加えて、１２時間の期間で、５μＭについてカスパーゼ−３発現の増加が存在する。
【０４９５】
ビルディングブロック成分ＤＬ−チロシンのウェスタンブロット分析：Ｌ−チロシンの合成型であるＤＬ−チロシンもまた、細胞に対するＬ−チロシンのアポトーシス効果に対する比較のために試験された。１２時間のインキュベーション後に１μＭおよび１５μＭ濃度において、ならびに２４時間のインキュベーション後に５μＭについて見られたＢｃｌ−２発現の統計学的な減少が存在する。カスパーゼ−３発現の増加もまた、１２時間のインキュベーション後に５μＭおよび１５μＭについて観察された。
【０４９６】
ビルディングブロック成分４−ヒドロキシ−フェニルピルベートのウェスタンブロット分析：４−ヒドロキシ−フェニルピルベートは、アミノ酸であるチロシンおよびフェニルアラニンから誘導され、環構造の合成において役割を果たす可能性がある。１μＭ、５μＭ、および１５μＭの濃度がＢｃｌ−２およびカスパーゼ−３発現のために試験された。５μＭおよび１５μＭ濃度について、２４時間のインキュベーション後にＢｃｌ−２発現の有意な減少が存在し、１２時間のインキュベーション後にカスパーゼ−３発現の有意な増加が存在した。
【０４９７】
ビルディングブロック成分フェニルアセテートのウェスタンブロット分析：フェニルアセテートは、４−ヒドロキシ−ベンゾエートに転換される能力を有し、これは、環構造への側鎖の結合において役割を果たす。試験された濃度は、１μＭ、５μＭ、および１５μＭであった。フェニルアセテートについては、１２時間および２４時間のインキュベーション後に５μＭおよび１５μＭの濃度についてＢｃｌ−２発現の減少が存在した。カスパーゼ−３発現の増加は、１２時間および２４時間のインキュベーション後に５μＭおよび１５μＭの濃度について観察された。
【０４９８】
ビルディングブロック成分３−メトキシ４−ヒドロキシマンデレート（バニリルマンデレートまたはＶＭＡ）のウェスタンブロット分析：ＶＭＡは、ＣｏＱ１０キノン環構造の合成のためのさらなる成分である。試験された濃度は１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、２５μＭ、５０μＭ、および１００μＭであった。統計学的に有意なアポトーシス効果はこの実験において観察されなかったが、データはＢｃｌ−２発現の下向きの傾向を示した。
【０４９９】
ビルディングブロック成分バニリン酸のウェスタンブロット分析：バニリン酸（Ｖａｎｉｌｌｉｃ）はキノン環の合成のための前駆体であり、５００ｎｍ、５μＭ、および１５μＭの濃度で試験された。ウェスタンブロット分析は、Ｂｃｌ−２およびカスパーゼ−３発現を測定した。バニリン酸は２４時間インキュベーション時点での５００ｎＭおよび５μＭの濃度についてＢｃｌ−２発現を有意に減少することが示された。１５μＭ濃度について、３時間のインキュベーション後にＢｃｌ−２発現の減少が存在した。２４時間、１５μＭとともにインキュベートした細胞において、カスパーゼ−３発現の有意な増加が存在した。
【０５００】
ビルディングブロック成分４−ヒドロキシベンゾエートのウェスタンブロット分析：４−ヒドロキシベンゾエートは、環構造へのイソプレノイド側鎖の結合において役割を果たす。試験された濃度は、５００ｎＭ、１μＭ、および５０μＭであった。２４時間のインキュベーション後、１５μＭ濃度でＢｃｌ−２発現の有意な減少が存在した。
【０５０１】
ビルディングブロック成分４−ピリドキシンのウェスタンブロット分析：ピリドキシンはＣｏＱ１０のキノン環構造の合成のための別の前駆体ビルディングブロックである。この化合物のために試験された濃度は、５μＭ、２５μＭ、および１００μＭである。細胞はＢｃｌ−２およびカスパーゼ−３のそれらのレベルについてアッセイされた。ピリドキシンは黒色腫細胞中での２４時間のインキュベーション後にＢｃｌ−２の有意な減少を示した。
【０５０２】
ビルディングブロック成分パンテノールのウェスタンブロット分析：パンテノールはＣｏＱ１０のキノン環構造の合成のおいて役割を果たす。黒色腫細胞に対して試験された濃度は５μＭ、２５μＭ、および１００μＭである。この化合物は、２５μＭ濃度についてＢｃｌ−２発現の有意な減少を示した。
【０５０３】
ビルディングブロック成分メバロン酸のウェスタンブロット分析：メバロン酸はＣｏＱ１０の合成のための主要な成分の１つである。この化合物は、５００ｎＭ、１μＭ、２５μＭ、および５０μＭの濃度で試験された。この実験において、Ｂｃｌ−２発現の有意な減少またはカスパーゼ−３発現の有意な増加は存在しなかった。
【０５０４】
ビルディングブロック成分アセチルグリシンのウェスタンブロット分析：ＣｏＱ１０の合成のための別の経路は、イソプレノイド（側鎖）合成である。アセチルグリシンの付加は、コエンザイムＡをアセチルＣｏＡに転換し、これは、イソプレノイド合成のためのメバロン酸経路に入る。試験された濃度は５μＭ、２５μＭ、および１００μＭであった。アセチルグリシンの試験は、５μＭおよび２５μＭの濃度についての１２時間のインキュベーション後にＢｃｌ−２発現の有意な減少を示した。Ｂｃｌ−２の有意な減少は、２４時間インキュベーションの時点で１００μＭ濃度について記録された。
【０５０５】
ビルディングブロック成分アセチルＣｏＡのウェスタンブロット分析：アセチルＣｏＡはＣｏＱ１０の合成のためのメバロン酸経路のための前駆体である。試験された濃度は５００ｎｍ、１μＭ、２５μＭ、および５０μＭであった。試験された時点および濃度について、Ｂｃｌ−２発現の有意な減少またはカスパーゼ−３発現の有意な増加は観察されなかった。
【０５０６】
ファルネシルと組み合わせたビルディングブロック成分Ｌ−チロシンのウェスタンブロット分析：Ｌ−チロシンは、ＣｏＱ１０のキノン環構造の合成のための前駆体の１つである。以前の実験は、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−チロシンとの、培地中のＬ−チロシンの反応を試験した。本研究において、Ｌ−チロシンは、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−チロシンの添加なしの培地中で試験された。本研究において、試験されたＬ−チロシンの最終濃度は、５００ｎＭ、５μＭ、および１５μＭであった。ファルネシルは、５０μＭの濃度で試験された。３時間および６時間の時点について、有意な応答は観察されなかった。
【０５０７】
ファルネシルと組み合わせたビルディングブロック成分Ｌ−フェニルアラニンのウェスタンブロット分析：キノン環構造の合成のための前駆体であるＬ−フェニルアラニンは、Ｌ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンを含まない培地中でファルネシルと組み合わせて試験された。ウェスタンブロット分析は、Ｂｃｌ−２およびカスパーゼ−３の発現をアッセイするために実施された。Ｌ−フェニルアラニンの最終濃度は、５μＭ、２５μＭ、および１００μＭであった。ファルネシルは５０μＭの濃度で加えられた。本研究は、以下の表に示されるような試験された濃度および組み合わせの多くについてＢｃｌ−２発現の減少を示した。
【表５４】
2015199746.tif 000069
【０５０８】
４−ヒドロキシ−ベンゾエートのベンゾキノンとの組み合わせの細胞増殖アッセイ：この実験のセットは、細胞増殖に対する異なるビルディングブロック分子を組み合わせることの効果を評価するための細胞増殖アッセイを使用した。
【０５０９】
最初の研究は、４−ヒドロキシ−ベンゾエートをベンゾキノンと組み合わせる効果を試験した。細胞は４８時間インキュベートされ、その後、細胞の計数が生細胞について実施された。各試験群は対照と比較され、各組み合わせ群はベンゾキノン対照と比較された。化合物はベンゾキノンの付加のために統計学的に分析された。以下の表は細胞計数結果を要約し、ここで、Ｘ印は細胞数の統計学的な減少を示す。
【表５５】
2015199746.tif 000070
【０５１０】
４−ヒドロキシベンゾエート（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ）およびベンゾキノンおよび組み合わせとともにインキュベートされた細胞の細胞数の有意な減少が存在した。７０μＭベンゾキノンと組み合わせた５０μＭ  ４−ヒドロキシベンゾエートの組み合わせについて、ベンゾキノン対照と比較して細胞数の有意な減少が存在した。これは、このモル比についての相乗効果を示唆する。
【０５１１】
さらなるモル比を試験するさらなる研究が実施された。最初の試験において、４−ヒドロキシベンゾエート（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ）は、５００ｎＭ、１μＭ、および５０μＭの濃度で試験された。これらの濃度は、２，３−ジメトキシ−５−メチル−ｐ−ベンゾキノン（Ｂｅｎｚｏ）との組み合わせで試験された。試験されたＢｅｎｚｏの濃度は２５μＭ、５０μＭ、および１００μＭであった。黒色腫細胞は８０％コンフルエンシーまで増殖され、ウェルあたり４０Ｋ細胞の濃度で、６ウェルプレートに播種された。細胞は、ＣｏＱ１０、４−ヒドロキシベンゾエート、Ｂｅｎｚｏ、および４−ヒドロキシベンゾエート／Ｂｅｎｚｏの組み合わせで処置された。
【０５１２】
Ｔ−検定が、ｐ＜０．０５を統計学的に有意であるとして実施された。Ｘは細胞数の統計学的減少を意味する。
【表５６】
2015199746.tif 000071
【０５１３】
ＨＢを含有する処置培地について細胞増殖の有意な減少が存在する。さらに、ベンゾキノンとのＨＢの組み合わせは、対応するベンゾキノン濃度とともにインキュベートされた細胞と比較して、細胞数の有意な減少を示した。
【０５１４】
細胞増殖アッセイもまた、新生児線維芽細胞に対して実施された。試験されたＨＢの濃度は、５００ｎＭ、５μＭ、および２５μＭであった。ＨＢはまた、２５μＭ、５０μＭ、および１００μＭの濃度でベンゾキノンと組み合わせて試験された。黒色腫細胞は、ウェルあたり４０ｋ細胞で播種され、２４時間の間処置された。細胞はトリプシン処理され、コールターカウンターを使用して定量された。
【０５１５】
統計学的分析は、線維芽細胞の有意な減少を示さなかった。このことは、正常細胞における毒性は、最小限から全くないまでであることを示す。
【０５１６】
フェニル酢酸とベンゾキノンの組み合わせの細胞増殖アッセイ：フェニル酢酸は、４−ヒドロキシ安息香酸（環構造の結合を容易にする）の合成の前駆体である。細胞増殖アッセイが、ＣｏＱ１０およびベンゾキノンと組み合わせてフェニル酢酸をインキュベートすることの効果をアッセイするために実施された。
【表５７】
2015199746.tif 000072
【０５１７】
データは、ベンゾキノンと組み合わせたフェニル酢酸の付加が、細胞増殖を有意に減少したことを示す。ＣｏＱ１０とフェニル酢酸の組み合わせは、ＣｏＱ１０およびベンゾキノンの単独とのインキュベーションと比較して、細胞数を有意に減少する。
【０５１８】
４−ヒドロキシ−ベンゾエートのファルネシルとの組み合わせの細胞増殖アッセイ：４−ヒドロキシ−ベンゾエートは、ファルネシルと組み合わせてインキュベートされた。結果の要約は以下に列挙される。４−ヒドロキシベンゾエートグループは対照およびファルネシル対照グループと比較された。Ｘは細胞数の統計学的減少を意味する。
【表５８】
2015199746.tif 000073
【０５１９】
Ｌ−フェニルアラニンのベンゾキノンとの組み合わせの細胞増殖アッセイ：細胞増殖アッセイは、ベンゾキノンと組み合わせたＬ−フェニルアラニンの組み合わせを試験するために実施された。以下は、対照およびベンゾキノン対照と比較されたＬ−フェニルアラニンの結果の要約である。Ｘは統計学的な減少を意味する。
【表５９】
2015199746.tif 000074
【０５２０】
同様の相乗作用的役割は、ベンゾキノンと組み合わせたＬ−フェニルアラニンについて見られる。
【０５２１】
Ｌ−フェニルアラニンのファルネシルとの組み合わせの細胞増殖アッセイ：ファルネシルと組み合わせてインキュベートされたＬ−フェニルアラニンの組み合わせ細胞増殖研究の予備的結果。Ｌ−フェニルアラニンは、対照およびファルネシル対照グループに対して比較された。Ｘは細胞数の統計学的減少を意味する。
【表６０】
2015199746.tif 000075
【０５２２】
Ｌ−チロシンのベンゾキノンとの組み合わせの細胞増殖アッセイ：Ｌ−チロシンはベンゾキノンと組み合わせてインキュベートされ、その後、細胞計数が実施された。グループは、対照グループおよびベンゾキノン対照グループと比較された。
【表６１】
2015199746.tif 000076
【０５２３】
ベンゾキノンの付加は、細胞数に対するＬ−チロシンの効果を増幅しなかった。
【０５２４】
Ｌ−チロシンのベンゾキノンとの組み合わせの細胞増殖アッセイ：本研究は、Ｌ−チロシンのファルネシルとの組み合わせを試験した。グループは対照およびファルネシル対照グループと比較された。
【表６２】
2015199746.tif 000077
【０５２５】
Ｌ−チロシンおよびファルネシルを組み合わせることは、この実験において細胞数を減少させることに対して相乗作用を有するようには見えない。
【０５２６】
ＣｏＱ１０の合成は２つの主要部分に分けられ、これは、環構造の合成および側鎖構造の合成からなる。ここで、発癌性細胞は、側鎖および環構造の構成要素の合成のための前駆体である化合物が補充された。これらの結果は、環構造の合成に関与する３つの主要な構成要素および環構造の側鎖構造への結合において役割を果たす２つの化合物の研究に焦点を当ててきた。Ｂｃｌ−２の有意な減少を示し、カスパーゼ−３発現を増加するこれら３つの化合物は、１）Ｌ−フェニルアラニン、２）Ｌ−チロシン、および３）４−ヒドロキシフェニルピルベートである。側鎖の環構造への結合に関与する２つの化合物は、１）４−ヒドロキシベンゾエートおよび２）フェニル酢酸である。
【０５２７】
これらの結果は、２，３ジメトキシ−５−メチル−ｐ−ベンゾキノン（ベンゾキノン）と組み合わされたこれらの化合物の外部からの送達が、細胞増殖をかなり阻害することも示した。このことは、ベンゾキノン環への側鎖の結合のための化合物での環構造の補充は、損なわれたＣｏＱ１０合成メカニズムを補充し得ることを示す。このことはまた、細胞プロセスによって必要とされる機能的特性を維持するために分子の安定化を補助し得る。フェニル酢酸は、４−ヒドロキシベンゾエートの合成のための前駆体であり、ベンゾキノンと組み合わせたこの外因性送達は、発癌性細胞において同様の効果を有する。
【０５２８】
実施例２３：糖尿病の細胞モデルにおけるコエンザイムＱ１０による遺伝子発現の調節
コエンザイムＱ１０は、酸化的リン酸化に直接的に影響を与えることによって正常なミトコンドリア機能の維持において確立された役割を有する内因性分子である。糖尿病などの代謝性障害の鍵となる指標として治療エンドポイントを示す様式で働く細胞内標的を調節する際のコエンザイムＱ１０の能力を実証する実験的な証拠が提示されている。
【０５２９】
糖尿病の原因または治療に関連する遺伝子の発現をコエンザイムＱ１０がいかにして調節するかを理解するために、ヒト腎臓由来の不死化初代腎臓近位尿細管細胞系統（ＨＫ−２）およびヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）の初代培養が実験モデルとして使用された。ＨＫ−２およびＨＡＳＭＣ細胞は、５．５ｍＭグルコースで培養中に正常に維持され、これは、ヒト血液中で正常と考えられる範囲に対応する濃度である。しかし、糖尿病環境を刺激するために、両方の細胞系統は、続いて、２２ｍＭグルコースに維持され、これは、慢性高血糖に関連するヒト血液中で観察される範囲に対応する。続いて、細胞内調節プロセスが糖尿病状態を模倣するように機能的に適合されるように、細胞は３継代にわたり増殖させた。細胞系統の選択は、損なわれた心臓血管機能の進行性の病態生理学に加えて、腎機能不全および末期の腎臓病（ＥＳＲＤ）への進行に対する糖尿病の生理学的影響に基づいた。
【０５３０】
糖尿病ＰＣＲアレイを使用するＨＫ−２細胞における遺伝子発現に対するコエンザイムＱ１０の効果
糖尿病ＰＣＲアレイ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、同時に８４種の遺伝子のスクリーニングを提供する。本研究において試験された４種の処置は以下の通りである。
【０５３１】
・ＨＫ−２；
・ＨＫ−２Ｈ維持された２２ｍＭグルコース；
・ＨＫ２（Ｈ）＋５０μＭコエンザイムＱ１０；および
・ＨＫ２（Ｈ）＋１００μＭコエンザイムＱ１０。
【０５３２】
糖尿病アレイ（カタログ番号ＰＡＨＳ−０２３Ｅ，ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）に対するＨＫ−２試料のリアルタイムＰＣＲデータのストリンジェント分析は、遺伝子調節がＨＫ−２正常未処置細胞よりも少なくとも２倍の調節ではなく、０．０５未満のｐ値であるすべての結果を排除するように行われた。慢性高血糖またはコエンザイムＱ１０のいずれかによって調節されることが観察された遺伝子が表６３に列挙され、それらの機能および細胞下局在（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ由来）は表６４に列挙される。
【表６３】
2015199746.tif 000078
【表６４】
2015199746.tif 000079
【０５３３】
調節されたレベルを用いて検出されたＲＮＡ転写物の中で、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）が、特に、１００μＭコエンザイムＱ１０処置を用いて、ＨＫ２（Ｈ）細胞において高度に上方調節されているとして同定された。ＣＤ６６ａおよびＢＧＰ−Ｉとしてもまた知られているＣＥＡＣＡＭ−１は、ＣＥＡスーパーファミリーの膜結合ＣＥＡサブファミリーに属する、１１５−２００ＫＤＩ型膜貫通糖タンパク質である。細胞の表面上で、これは非共有結合性のホモ−およびヘテロダイマーを形成する。細胞外領域は、３つのＣ２型Ｉｇ様ドメインおよび１つのＮ末端Ｖ型Ｉｇ様ドメインを含む。Ｃ末端から第２のＣ２型ドメイン（ａａ３２０およびその向こう）を含む複数のスプライシング変異体が存在する。インタクトなマウスにおけるＣＥＡＣＡＭ１発現の欠如は、糖尿病に関連するメタボリックシンドロームを促進することが提案されているのに対して、ＣＥＡＣＡＭ１発現の増加はインスリンの内部化と関連し、これは、インスリン感受性の増加およびグルコースの利用（例えば、血液から細胞へのグルコースの移動）を示唆し、従って、２型糖尿病に特徴的な特質であるインスリン抵抗性を軽減する。
【０５３４】
表６３に示されるように、インスリン受容体（ＩＮＳＲ）発現もまた、コエンザイムＱ１０で処置された糖尿病性ＨＫ−２細胞中で変化された。理論によって束縛されることは望まないが、コエンザイムＱ１０処置に伴うＩＮＳＲの発現の増加は、インスリン感受性を増強し（単独でまたはＣＥＡＣＡＭ１の発現に加えてのいずれかで）、糖尿病に関連する主要な生理学的／代謝的合併症を逆転する潜在能力を有する。
【０５３５】
ミトコンドリアアレイを使用するＨＫ−２細胞における遺伝子発現に対するコエンザイムＱ１０の効果
糖尿病におけるミトコンドリア遺伝子の示差的な発現は、ミトコンドリアアレイ（カタログ番号ＰＡＨＳ  ０８７Ｅ、ＳＡＢｉｓｏｃｉｅｎｃｅｓ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）を使用してアッセイされた。慢性高血糖および／またはコエンザイムＱ１０処置によって調節された遺伝子は表６５に列挙され、一方それらの機能は表６６に含まれる。
【表６５】
2015199746.tif 000080
【表６６】
2015199746.tif 000081
【０５３６】
現在までに、糖尿病におけるコエンザイムＱ１０によって処置された糖尿病ＨＫ−２細胞中で同定された４種類のミトコンドリア遺伝子（表６５）の役割は、特徴付けられていない。
【０５３７】
研究２：糖尿病ＰＣＲアレイを使用するＨＡＳＭＣ細胞における遺伝子発現に対するコエンザイムＱ１０の効果
糖尿病ＰＣＲアレイ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、同時に８４種の遺伝子のスクリーニングを提供する。本研究において試験された４種の処置は以下の通りである。
【０５３８】
・ＨＡＳＭＣ；
・ＨＡＳＭＣＨ維持された２２ｍＭグルコース；
・ＨＡＳＭＣ（Ｈ）＋５０μＭコエンザイムＱ１０；および
・ＨＡＳＭＣ（Ｈ）＋１００μＭコエンザイムＱ１０。
【０５３９】
糖尿病アレイ（カタログ番号ＰＡＨＳ−０２３Ｅ，ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）に対するＨＡＳＭＣ試料のリアルタイムＰＣＲデータのストリンジェント分析は、遺伝子調節がＨＡＳＭＣ正常未処置細胞よりも少なくとも２倍の調節ではなく、０．０５未満のｐ値であるすべての結果を排除するように行われた。慢性高血糖またはコエンザイムＱ１０のいずれかによって調節されることが観察された遺伝子が表６７に列挙される。
【表６７】
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【０５４０】
ＨＡＳＭＣ細胞において、コエンザイムＱ１０での高血糖細胞の処置は、血管機能の調節に関与する遺伝子（ＡＧＴ）、インスリン感受性の調節に関与する遺伝子（ＣＥＡＣＡＭ１、ＩＮＳＲ、ＳＥＬＬ）、および炎症／免疫機能の調節に関与する遺伝子（ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＣＣＬ５）の発現の変化を生じた。理論によって束縛されることは望まないが、ＩＮＳＲの発現の増加は、ＨＡＳＭＣ細胞におけるインスリン感受性の増加と関する可能性があり、これは、糖尿病の治療において有益である生理学的特性であり、一方、ＩＬ−６は、その免疫調節特性に加えて、骨格筋細胞、脂肪細胞、肝細胞、膵臓β細胞、および神経内分泌細胞に対する作用によって、直接的と間接的の両方で、グルコースの恒常性および代謝に影響を与えることが提案されてきた。活性化の際に、正常Ｔ細胞は、ＲＡＮＴＥＳおよびケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド（ＣＣＬ５）を発現および分泌する。ＣＣＬ５は脂肪細胞によって発現され、血清レベルのＲＡＮＴＥＳは肥満および２型糖尿病において増加される。しかし、表６７において示されるように、コエンザイムＱ１０でのＨＡＳＭＣ細胞の処置は、ＣＣＬ５の発現の有意な減少を引き起こす。前述のデータに基づいて、コエンザイムＱ１０の投与が、糖尿病の管理における治療的な利点を有することが予測される。
【０５４１】
ミトコンドリアアレイを使用するＨＡＳＭＣ細胞中での遺伝子発現に対するコエンザイムＱ１０の効果
糖尿病におけるミトコンドリア遺伝子の示差的な発現は、ミトコンドリアアレイ（カタログ番号ＰＡＨＳ  ０８７Ｅ、ＳＡＢｉｓｏｃｉｅｎｃｅｓ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）を使用してアッセイされた。慢性高血糖および／またはコエンザイムＱ１０処置によって調節された遺伝子は表６８に示される。
【表６８】
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【０５４２】
コエンザイムＱ１０でのＨＡＳＭＣ細胞の処置は、プログラムされた細胞死、すなわち、アポトーシスを調節する遺伝子（ＢＣＬ２Ｌ１、ＮＯＸＡとしても知られるＰＭＩＡＰ１）、トランスポータータンパク質（ＳＬＣ２５Ａ１［クエン酸トランスポーター］、ＳＬＣ２５Ａ１３［アスパラギン酸−グルタミン酸エクスチェンジャー］、ＳＬＣ２５Ａ１９［チアミンピロリン酸トランスポーター］、およびＳＬＣ２５Ａ２２［グルタミン酸−水素同時トランスポーター］）、およびミトコンドリアマトリックス輸送タンパク質（ＭＦＮ１、ＴＩＭＭ４４、およびＴＯＭＭ４０）の発現の変化を生じた。これらのトランスポーターの活性は、クレブス回路のために必須の前駆体の調節、およびミトコンドリアの酸化的リン酸化の維持において重要な役割を果たしている。これらの結果は、コエンザイムＱ１０への糖尿病性ＨＡＳＭＣ細胞の曝露は、細胞質およびミトコンドリアの遺伝子の発現の変化と関連し、これは次には、コエンザイムＱ１０と一致しており、糖尿病の処置における治療の利点を提供する。
【０５４３】
コエンザイムＱ１０でＨＡＳＭＣ細胞およびＨＫ−２細胞を処置することによって、または高血糖性環境において得られたデータの比較は、４種の遺伝子が両方の細胞系統（例えば、遺伝子発現アッセイにおけるＰＩＫ３Ｃ２ＢおよびＳＥＬＬならびにミトコンドリアアレイアッセイにおけるＴＯＭＭ４０およびＴＳＰＯ）においてコエンザイムＱ１０によって共通して調節されることを明らかにする。これらの結果は、糖尿病環境におけるコエンザイムＱ１０での細胞の処置が、糖尿病の原因または治療に関与することが知られている遺伝子の発現の変化に関連することを実証する。
【０５４４】
等価物
当業者は、日常的な範囲を超えない実験を使用して、本明細書に記載された特定の実施形態および方法の多くの等価物を認識し、またはそれを確認することが可能である。このような等価物は、添付の特許請求の範囲の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年7月2日(2015.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の代謝性障害を治療する、代謝性障害の症状を緩和する、代謝性障害の進行を阻害する、または代謝性障害を予防するための医薬組成物であって、少なくとも１つの環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）の治療的有効量を含み、ここで該環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常化されたミトコンドリア酸化的リン酸化への細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する、医薬組成物。
【請求項２】
代謝性障害の治療を必要する哺乳動物の疾患細胞においてミトコンドリア酸化的リン酸化を選択的に増強するための医薬組成物であって、少なくとも１つのｅｎｖ影響因子の治療的有効量を含み、ここで該ｅｎｖ影響因子が哺乳動物の前記疾患細胞にてミトコンドリア酸化的リン酸化を選択的に増強する、医薬組成物。
【請求項３】
代謝性障害を治療するのに有効である薬剤を同定する方法であって：
（１）環境影響因子を選択することと；
（２）細胞の代謝状態をシフトさせることができる環境影響因子を同定することと；
（３）環境影響因子が代謝性障害を治療するのに有効か否かを判定すること；
を含み、これにより代謝性障害を治療するのに有効である薬剤を同定する、方法。
【請求項４】
哺乳動物のコエンザイムＱ１０応答性障害を治療する、コエンザイムＱ１０応答性障害の症状を緩和する、コエンザイムＱ１０応答性障害の進行を阻害する、またはコエンザイムＱ１０応答性障害を予防するための医薬組成物であって、少なくとも１つの環境影響因子（ｅｎｖ影響因子）の治療的有効量を含み、ここで該環境影響因子が哺乳動物の疾患細胞において、正常な生理学的条件下にて哺乳動物の正常細胞中で観察された解糖およびミトコンドリア酸化的リン酸化のレベルへの細胞代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する、医薬組成物。
【請求項５】
代謝性障害が糖尿病、肥満、前糖尿病、メタボリックシンドロームおよび代謝性障害のいずれかの主要な要素からなる群より選択される、請求項１、２および４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
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