(57)【要約】      （修正有）【課題】パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴムの供給源となり得るセイタカアワダチソウのポリイソプレノイド生合成経路に関する特定の酵素のアミノ酸配列及び塩基配列の解析の提供。【解決手段】Ａ１〜Ａ３のいずれかに記載の蛋白質。Ａ１：特定のアミノ酸配列からなる蛋白質、Ａ２：特定のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質、Ａ３：特定のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の［Ａ１］〜［Ａ３］のいずれかに記載の蛋白質。
［Ａ１］配列番号１で表されるアミノ酸番号１−３３３のアミノ酸配列からなる蛋白質
［Ａ２］配列番号１で表されるアミノ酸番号１−３３３のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［Ａ３］配列番号１で表されるアミノ酸番号１−３３３のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の［Ａ４］又は［Ａ５］に記載の遺伝子。
［Ａ４］配列番号２で表される塩基番号１−９９９の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ａ５］配列番号２で表される塩基番号１−９９９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項２又は３記載の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるファルネシル二リン酸の生合成量を向上させた形質転換体。
【請求項５】
請求項２又は３記載の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるファルネシル二リン酸の生合成量を向上させる方法。
【請求項６】
以下の［Ｂ１］〜［Ｂ３］のいずれかに記載の蛋白質。
［Ｂ１］配列番号３で表されるアミノ酸番号１−３６０のアミノ酸配列からなる蛋白質
［Ｂ２］配列番号３で表されるアミノ酸番号１−３６０のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［Ｂ３］配列番号３で表されるアミノ酸番号１−３６０のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【請求項７】
請求項６記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項８】
以下の［Ｂ４］又は［Ｂ５］に記載の遺伝子。
［Ｂ４］配列番号４で表される塩基番号１−１０８０の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｂ５］配列番号４で表される塩基番号１−１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項９】
請求項７又は８記載の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるゲラニルゲラニル二リン酸の生合成量を向上させた形質転換体。
【請求項１０】
請求項７又は８記載の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるゲラニルゲラニル二リン酸の生合成量を向上させる方法。
【請求項１１】
以下の［Ｃ１］〜［Ｃ３］のいずれかに記載の蛋白質。
［Ｃ１］配列番号５で表されるアミノ酸番号１−３０２のアミノ酸配列からなる蛋白質
［Ｃ２］配列番号５で表されるアミノ酸番号１−３０２のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［Ｃ３］配列番号５で表されるアミノ酸番号１−３０２のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【請求項１２】
請求項１１記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項１３】
以下の［Ｃ４］又は［Ｃ５］に記載の遺伝子。
［Ｃ４］配列番号６で表される塩基番号１−９０６の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｃ５］配列番号６で表される塩基番号１−９０６の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるジメチルアリル二リン酸又はイソペンテニル二リン酸の生合成量を向上させた形質転換体。
【請求項１５】
請求項１２又は１３記載の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるジメチルアリル二リン酸又はイソペンテニル二リン酸の生合成量を向上させる方法。
【請求項１６】
以下の［Ｄ１］〜［Ｄ３］のいずれかに記載の蛋白質。
［Ｄ１］配列番号７で表されるアミノ酸番号１−２６３のアミノ酸配列からなる蛋白質
［Ｄ２］配列番号７で表されるアミノ酸番号１−２６３のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［Ｄ３］配列番号７で表されるアミノ酸番号１−２６３のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【請求項１７】
請求項１６記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項１８】
以下の［Ｄ４］又は［Ｄ５］に記載の遺伝子。
［Ｄ４］配列番号８で表される塩基番号１−７８９の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｄ５］配列番号８で表される塩基番号１−７８９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項１９】
請求項１７又は１８記載の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物における生合成量を向上させた形質転換体。
【請求項２０】
請求項１７又は１８記載の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物における生合成量を向上させる方法。
【請求項２１】
請求項２、３、７、８、１２、１３、１７、１８のいずれかに記載の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるイソプレノイドの生産性を向上させた形質転換体。
【請求項２２】
請求項２、３、７、８、１２、１３、１７、１８のいずれかに記載の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるイソプレノイドの生産性を向上させる方法。
【請求項２３】
請求項２、３、７、８、１２、１３、１７、１８のいずれかに記載の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるポリイソプレノイドの生産性を向上させた形質転換体。
【請求項２４】
請求項２、３、７、８、１２、１３、１７、１８のいずれかに記載の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるポリイソプレノイドの生産性を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子が導入されたイソプレノイド産生植物の形質転換体、及び該遺伝子を導入することにより特定の化合物の生合成量又は生産性を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）などのイソプレノイド産生植物より採取することにより得られる。
【０００３】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴムは、パラゴムノキをほぼ唯一の採取源としている。パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、天然ゴムを採取できる期間は２０〜３０年に限られる。今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれているが、上述の理由によりパラゴムノキによる天然ゴムの大幅な増産は困難である。
【０００４】
パラゴムノキでの天然ゴムの生産性を改善する方法としては、例えば、より大量の天然ゴムを得るために、より大量のラテックスを採取する方法が挙げられる。具体的には、例えば、ゴムノキの幹に対してエチレンやＥｔｈｅｐｈｏｎ（２−クロロエチルホスホン酸）による刺激を加える方法、ジャスモン酸やジャスモン酸前駆体のリノレン酸等を配合したラノリンにより乳管分化を促進する方法がある（例えば、非特許文献１）。
【０００５】
しかし、エチレン刺激によるラテックスを増産する方法は、幹に対し長期的に使用し続けると樹皮割れが生じ易くなるおそれがある。また、エチレン刺激は、乳管からのラテックスの流出をより円滑にする方法であり、樹木のラテックス生産能力そのものを改善するものではなく、当該方法によるラテックスの増産には限界があり、十分ではない。
【０００６】
また、ジャスモン酸等を用いて乳管形成を促進し、乳管数を増大させることが可能であるが、タッピングによってラテックスを回収する際に、乳管から流出するラテックスが傷口で凝固し、生産されたラテックスを十分に回収できないという問題がある。
【０００７】
このように、天然ゴム資源の枯渇が懸念されており、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴムの供給源の開発やイソプレノイドの生産性を向上させる技術の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈａｏ、他、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ、２０００年、第８５巻、３７〜４３ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記課題を解決し、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴムの供給源となり得るセイタカアワダチソウにおいて、ポリイソプレノイドの生合成経路に関与する特定の酵素のアミノ酸配列及び塩基配列の解析を提供することを目的とする。また、該塩基配列の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、イソプレノイドの生産性を向上させた形質転換体、及びイソプレノイドの生産性を向上させる方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の［Ａ１］〜［Ａ３］のいずれかに記載の蛋白質に関する。
［Ａ１］配列番号１で表されるアミノ酸番号１−３３３のアミノ酸配列からなる蛋白質
［Ａ２］配列番号１で表されるアミノ酸番号１−３３３のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［Ａ３］配列番号１で表されるアミノ酸番号１−３３３のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【００１１】
本発明はまた、上記蛋白質をコードする遺伝子に関する。
本発明はまた、以下の［Ａ４］又は［Ａ５］に記載の遺伝子に関する。
［Ａ４］配列番号２で表される塩基番号１−９９９の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ａ５］配列番号２で表される塩基番号１−９９９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
本発明はまた、該遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるファルネシル二リン酸の生合成量を向上させた形質転換体に関する。
本発明はまた、該遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるファルネシル二リン酸の生合成量を向上させる方法に関する。
【００１２】
本発明は、以下の［Ｂ１］〜［Ｂ３］のいずれかに記載の蛋白質に関する。
［Ｂ１］配列番号３で表されるアミノ酸番号１−３６０のアミノ酸配列からなる蛋白質
［Ｂ２］配列番号３で表されるアミノ酸番号１−３６０のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［Ｂ３］配列番号３で表されるアミノ酸番号１−３６０のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【００１３】
本発明はまた、上記蛋白質をコードする遺伝子に関する。
本発明はまた、以下の［Ｂ４］又は［Ｂ５］に記載の遺伝子に関する。
［Ｂ４］配列番号４で表される塩基番号１−１０８０の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｂ５］配列番号４で表される塩基番号１−１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
本発明はまた、該遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるゲラニルゲラニル二リン酸の生合成量を向上させた形質転換体に関する。
本発明はまた、該遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるゲラニルゲラニル二リン酸の生合成量を向上させる方法に関する。
【００１４】
本発明は、以下の［Ｃ１］〜［Ｃ３］のいずれかに記載の蛋白質に関する。
［Ｃ１］配列番号５で表されるアミノ酸番号１−３０２のアミノ酸配列からなる蛋白質
［Ｃ２］配列番号５で表されるアミノ酸番号１−３０２のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［Ｃ３］配列番号５で表されるアミノ酸番号１−３０２のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【００１５】
本発明はまた、上記蛋白質をコードする遺伝子に関する。
本発明はまた、以下の［Ｃ４］又は［Ｃ５］に記載の遺伝子に関する。
［Ｃ４］配列番号６で表される塩基番号１−９０６の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｃ５］配列番号６で表される塩基番号１−９０６の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
本発明はまた、該遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるジメチルアリル二リン酸又はイソペンテニル二リン酸の生合成量を向上させた形質転換体に関する。
本発明はまた、該遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるジメチルアリル二リン酸又はイソペンテニル二リン酸の生合成量を向上させる方法に関する。
【００１６】
本発明は、以下の［Ｄ１］〜［Ｄ３］のいずれかに記載の蛋白質に関する。
［Ｄ１］配列番号７で表されるアミノ酸番号１−２６３のアミノ酸配列からなる蛋白質
［Ｄ２］配列番号７で表されるアミノ酸番号１−２６３のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［Ｄ３］配列番号７で表されるアミノ酸番号１−２６３のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【００１７】
本発明はまた、上記蛋白質をコードする遺伝子に関する。
本発明はまた、以下の［Ｄ４］又は［Ｄ５］に記載の遺伝子に関する。
［Ｄ４］配列番号８で表される塩基番号１−７８９の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｄ５］配列番号８で表される塩基番号１−７８９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
本発明はまた、該遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物における生合成量を向上させた形質転換体に関する。
本発明はまた、該遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物における生合成量を向上させる方法に関する。
【００１８】
本発明はまた、上記いずれかの遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるイソプレノイドの生産性を向上させた形質転換体に関する。
本発明はまた、上記いずれかの遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるイソプレノイドの生産性を向上させる方法に関する。
本発明はまた、上記いずれかの遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるポリイソプレノイドの生産性を向上させた形質転換体に関する。
本発明はまた、上記いずれかの遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該植物におけるポリイソプレノイドの生産性を向上させる方法に関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の遺伝子は、ポリイソプレノイドの生合成経路に関与する特定の酵素をコードする遺伝子である。従って、該遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、該遺伝子がコードする蛋白質が触媒する反応の生成物の生合成量、ひいては、イソプレノイド及びポリイソプレノイドの生産性を向上でき、該遺伝子がコードする蛋白質が触媒する反応の生成物の生合成量を向上させた形質転換体や、イソプレノイド及びポリイソプレノイドの生産性を向上させた形質転換体が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を示す模式図である。
【図２】ポリイソプレノイドの生合成経路に関与するプレニルトランスフェラーゼ群のそれぞれの酵素が触媒する反応を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
イソプレノイド産生植物では、図１に示すようなイソプレノイドの生合成経路により、様々なイソプレノイドが生合成されている。イソプレノイドの生合成経路では、アリル性基質に順次イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）が連結される反応が進行する。この反応を触媒する酵素は、イソプレン単位を順次つなげていくという意味からプレニルトランスフェラーゼと総称されている。なお、本明細書において、プレニルトランスフェラーゼとは、ＩＰＰとイソプレニル二リン酸（イソプレン単位がｎ個）（アリル性基質）との間の縮合反応を触媒し、イソプレン単位が１単位増えた新たなイソプレニル二リン酸（イソプレン単位がｎ＋１個）を合成する酵素の総称を意味する。
【００２２】
プレニルトランスフェラーゼは、イソプレン単位を連結することにより、各テルペノイドの基本的前駆体となるゲラニル二リン酸（ＧＰＰ：Ｃ１０）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ：Ｃ１５）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ：Ｃ２０）、ゲラニルファルネシル二リン酸（ＧＦＰＰ：Ｃ２５）、ヘキサプレニル二リン酸（ＨＰＰ：Ｃ３０）などの各種のイソプレニル二リン酸を合成する酵素群であり、テルペンペノイド生合成の主流に位置している。各種のプレニルトランスフェラーゼにより産生されるイソプレニル二リン酸類を図２に示す。本明細書において、プレニルトランスフェラーゼとしては、例えば、ゲラニル二リン酸合成酵素、ファルネシル二リン酸合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素、ゲラニルファルネシル二リン酸合成酵素、ヘキサプレニル二リン酸合成酵素等のｔｒａｎｓ−イソプレニル二リン酸合成酵素や、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ（図２におけるｃｉｓ−イソプレニル二リン酸合成酵素）などが挙げられる。
【００２３】
本発明者らは、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴムの供給源を開発するために、種々の検討を行った結果、イソプレノイド産生植物のなかでも、直鎖状で比較的高分子量のゴム（ポリイソプレノイド）を生産し、繁殖力も旺盛である点から、セイタカアワダチソウに着目した。そして、セイタカアワダチソウにおけるイソプレノイド生合成経路に関与する酵素群のなかでも、種々のイソプレノイドやポリイソプレノイドが生合成される際に基質となっていることが推測されるファルネシル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸の生合成を担っている酵素は、特に重要な働きをしていると予想されるため、これらの物質の生合成を担っている各蛋白質について解析を行った。
【００２４】
具体的には、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）の生合成に関与するファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）の生合成に関与するゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の異性化に関与するイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）、並びにの生合成に関与するｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ（ｃｉｓ型プレニルトランスフェラーゼ）の４種の酵素蛋白質に着目し、セイタカアワダチソウ由来のこれらの４種の酵素蛋白質をコードする遺伝子を解析することにより、これら４種の塩基配列及びアミノ酸配列を明らかにした。
【００２５】
更に、明らかにした４種の遺伝子をそれぞれ導入した各形質転換体の大腸菌を使用して確認試験を行ったところ、これら４種の酵素蛋白質は、それぞれが有する所定の酵素活性を示すことも明らかとなった。したがって、これら４種それぞれの遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することで、それぞれが所定の酵素活性を示すこととなる。
【００２６】
上記４種の酵素蛋白質は、比較的高分子量のポリイソプレノイドを生産するセイタカアワダチソウ由来の酵素蛋白質であるため、他の植物由来の同種の酵素蛋白質に比べて優れた性質を有する蓋然性が非常に高く、これら４種それぞれの遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することで、それぞれが所定の酵素活性を示し、当該蛋白質（酵素）が触媒し、生合成する化合物の生合成量を増大させるだけではなく、イソプレノイド及びポリイソプレノイドの生産性を向上することもできる。なお、本明細書において、イソプレノイド及びポリイソプレノイドの生産性を向上とは、イソプレノイド及びポリイソプレノイドの生産量を向上させることを意味する。
【００２７】
なお、本明細書において、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）及びゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を基質としてファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）の生合成反応を触媒する酵素である。
また、本明細書において、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）及びファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）の生合成反応を触媒する酵素である。
また、本明細書において、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）と、その異性体であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の間の異性化反応を触媒する酵素である。
また、本明細書において、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ（ｃｉｓ型プレニルトランスフェラーゼ）は、イソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素である。ここで、本明細書において、イソプレノイド化合物とは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）を有する化合物を意味する。また、ｃｉｓ型イソプレノイドは、イソプレン単位がシス型に結合したイソプレノイド化合物を有する化合物であり、例えばｃｉｓ−イソプレニル二リン酸などが挙げられる。
【００２８】
（蛋白質）
本発明の蛋白質は、下記［Ａ１］、［Ｂ１］、［Ｃ１］、［Ｄ１］のいずれかに示す蛋白質である。
［Ａ１］配列番号１で表されるアミノ酸番号１−３３３のアミノ酸配列からなる蛋白質
［Ｂ１］配列番号３で表されるアミノ酸番号１−３６０のアミノ酸配列からなる蛋白質
［Ｃ１］配列番号５で表されるアミノ酸番号１−３０２のアミノ酸配列からなる蛋白質
［Ｄ１］配列番号７で表されるアミノ酸番号１−２６３のアミノ酸配列からなる蛋白質
【００２９】
［Ａ１］、［Ｂ１］、［Ｃ１］、［Ｄ１］で示される蛋白質はそれぞれ、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ（ｃｉｓ型プレニルトランスフェラーゼ）である。
【００３０】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、本発明の蛋白質は下記［Ａ２］、［Ｂ２］、［Ｃ２］、［Ｄ２］のいずれかに示す蛋白質でもある。
［Ａ２］配列番号１で表されるアミノ酸番号１−３３３のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつ本来持つ機能を有する蛋白質
［Ｂ２］配列番号３で表されるアミノ酸番号１−３６０のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつ本来持つ機能を有する蛋白質
［Ｃ２］配列番号５で表されるアミノ酸番号１−３０２のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつ本来持つ機能を有する蛋白質
［Ｄ２］配列番号７で表されるアミノ酸番号１−２６３のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつ本来持つ機能を有する蛋白質
ここで、本明細書において、配列番号１で表される蛋白質が本来持つ機能とは、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）が本来持つ機能、すなわち、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性である。
ここで、本明細書において、配列番号３で表される蛋白質が本来持つ機能とは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）が本来持つ機能、すなわち、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性である。
ここで、本明細書において、配列番号５で表される蛋白質が本来持つ機能とは、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）が本来持つ機能、すなわち、イソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性である。
ここで、本明細書において、配列番号７で表される蛋白質が本来持つ機能とは、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ（ｃｉｓ型プレニルトランスフェラーゼ）が本来持つ機能、すなわち、イソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性である。
【００３１】
なお、上記酵素活性を維持するためには、配列番号１で表されるアミノ酸番号１−３３３のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸、好ましくは１〜６７個のアミノ酸、より好ましくは１〜５０個のアミノ酸、更に好ましくは１〜３３個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１７個のアミノ酸、最も好ましくは１〜７個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００３２】
また、酵素活性を維持するためには、配列番号３で表されるアミノ酸番号１−３６０のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸、好ましくは１〜７２個のアミノ酸、より好ましくは１〜５４個のアミノ酸、更に好ましくは１〜３６個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１８個のアミノ酸、最も好ましくは１〜７個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜４個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００３３】
また、酵素活性を維持するためには、配列番号５で表されるアミノ酸番号１−３０２のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸、好ましくは１〜６０個のアミノ酸、より好ましくは１〜４５個のアミノ酸、更に好ましくは１〜３０個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１５個のアミノ酸、最も好ましくは１〜６個のアミノ酸、より最も好ましくは３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００３４】
また、酵素活性を維持するためには、配列番号７で表されるアミノ酸番号１−２６３のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸、好ましくは１〜５３個のアミノ酸、より好ましくは１〜３９個のアミノ酸、更に好ましくは１〜２６個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１３個のアミノ酸、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【００３５】
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
【００３６】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、本発明の蛋白質は下記［Ａ３］、［Ｂ３］、［Ｃ３］、［Ｄ３］のいずれかに示す蛋白質でもある。
［Ａ３］配列番号１で表されるアミノ酸番号１−３３３のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ同様の機能を有する蛋白質
［Ｂ３］配列番号３で表されるアミノ酸番号１−３６０のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ同様の機能を有する蛋白質
［Ｃ３］配列番号５で表されるアミノ酸番号１−３０２のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ同様の機能を有する蛋白質
［Ｄ３］配列番号７で表されるアミノ酸番号１−２６３のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ同様の機能を有する蛋白質
ここで、本明細書において、配列番号１で表される蛋白質と同様の機能とは、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）が本来持つ機能、すなわち、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性である。
ここで、本明細書において、配列番号３で表される蛋白質と同様の機能とは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）が本来持つ機能、すなわち、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性である。
ここで、本明細書において、配列番号５で表される蛋白質と同様の機能とは、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）が本来持つ機能、すなわち、イソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性である。
ここで、本明細書において、配列番号７で表される蛋白質と同様の機能とは、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼ（ｃｉｓ型プレニルトランスフェラーゼ）が本来持つ機能、すなわち、イソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性である。
【００３７】
なお、同様の機能、すなわち酵素活性を維持するためには、配列番号１、３、５、７のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【００３８】
アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０，  ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １８３，  ６３  （１９９０）］を用いて決定することができる。
【００３９】
酵素活性を有する蛋白質であることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【００４０】
（遺伝子）
本発明の遺伝子は、上記［Ａ１］〜［Ａ３］、［Ｂ１］〜［Ｂ３］、［Ｃ１］〜［Ｃ３］、［Ｄ１］〜［Ｄ３］のいずれかで表される蛋白質をコードする遺伝子である。
【００４１】
本発明の遺伝子はまた、下記［Ａ４］、［Ｂ４］、［Ｃ４］、［Ｄ４］のいずれか、又は［Ａ５］、［Ｂ５］、［Ｃ５］、［Ｄ５］のいずれかに示す遺伝子である。
［Ａ４］配列番号２で表される塩基番号１−９９９の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｂ４］配列番号４で表される塩基番号１−１０８０の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｃ４］配列番号６で表される塩基番号１−９０６の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｄ４］配列番号８で表される塩基番号１−７８９の塩基配列からなるＤＮＡ
［Ａ５］配列番号２で表される塩基番号１−９９９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本来持つ機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｂ５］配列番号４で表される塩基番号１−１０８０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本来持つ機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｃ５］配列番号６で表される塩基番号１−９０６の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本来持つ機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｄ５］配列番号８で表される塩基番号１−７８９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本来持つ機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
ここで、本明細書において、配列番号２で表される遺伝子がコードする蛋白質が本来持つ機能とは、上述の配列番号１で表される蛋白質が本来持つ機能と同様である。
ここで、本明細書において、配列番号４で表される遺伝子がコードする蛋白質が本来持つ機能とは、上述の配列番号３で表される蛋白質が本来持つ機能と同様である。
ここで、本明細書において、配列番号６で表される遺伝子がコードする蛋白質が本来持つ機能とは、上述の配列番号５で表される蛋白質が本来持つ機能と同様である。
ここで、本明細書において、配列番号８で表される遺伝子がコードする蛋白質が本来持つ機能とは、上述の配列番号７で表される蛋白質が本来持つ機能と同様である。
【００４２】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【００４３】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍａｎｕａｌ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【００４４】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【００４５】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【００４６】
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号２で表される塩基番号１−９９９の塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。配列番号４、６、８で表される塩基配列についても、それぞれが上記範囲の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【００４７】
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【００４８】
また、上記蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、ｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次に目的蛋白質に相当する既知の植物由来の蛋白質のアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、部分的にＤＮＡ断片の増幅を行い、部分的に配列を同定する。次いで、ＲＡＣＥ法などを行い、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定する。ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ法）とは、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に把握されているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡ末端までの未知領域をクローニングする方法で、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、ＰＣＲ法によって全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。
なお、縮重プライマーは、上記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
【００４９】
（形質転換体）
本発明の遺伝子（上記の蛋白質をコードする遺伝子、又は上記［Ａ４］〜［Ｄ４］、［Ａ５］〜［Ｄ５］に記載の遺伝子）をイソプレノイド産生植物に導入することにより、所定の蛋白質を発現するように形質転換された生物体（形質転換体）が得られる。そして、当該形質転換体では、所定の蛋白質が発現することにより、導入したイソプレノイド産生植物内で新たに該蛋白質が有する所定の酵素活性が得られ、該蛋白質（酵素）が触媒し、生合成する化合物の生合成量を向上させることができる。更には、導入したイソプレノイド産生植物内のイソプレノイド生合成経路中の部分的な反応が促進されることから、イソプレノイド及びポリイソプレノイドの生産性も向上させることもできる。
【００５０】
上記形質転換体に用いられる宿主としては、イソプレノイドを産生可能な植物であれば特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃ  ａｒｐａｆ．  ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｇｉｇａｎｔｅａ  Ａｉｔ．  ｖａｒ．  ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ  Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｖｅｎｕｓｔｕｍ  Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ  Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ  Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ  ｐｕｍｉｌａ  Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｒｅｃｔａ  Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ａｍｐｅｌａｓ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｉｒｉｓａｎａ  Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ  Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｓｅｐｔｉｃａ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓｅｒｒｉｏｌａ）、ベンガルボダイジュ等が挙げられる。なかでも、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｈｅｎｉｕｍ属から���る群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましい。
【００５１】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、上記組換え体ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものを使用できる。
【００５２】
発現ベクターとして、例えば、ｐＢＩ系のベクター、ｐＵＣ系のベクター、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、タバコモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター、イネ由来アクチン遺伝子プロモーター等をあげることができる。
【００５３】
なお、イソプレノイド化合物が生合成される組織、例えば乳管に特異的に発現するプロモーターを持った発現ベクターを使用することが好ましい。ポリイソプレノイドが生合成される組織に特異的に発現させることにより、植物の生長遅延などの弊害を抑制することが出来る。
【００５４】
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５号公報、特開昭６０−７００８０号公報、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７号公報）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等をあげることができる。
【００５５】
以上の方法等により、上記形質転換体（形質転換植物細胞）が得られる。
【００５６】
本発明はまた、本発明の遺伝子が導入されたイソプレノイド産生植物を提供するものである。該イソプレノイド産生植物は、形質転換植物細胞を有するイソプレノイド産生植物であれば特に限定されず、例えば、上述の方法で得られた形質転換植物細胞のみならず、その子孫又はクローン、さらにそれらを継代させて得られる子孫植物の全てを含む概念である。一旦、ゲノム内に上記ＤＮＡやベクターが導入された形質転換植物細胞が得られれば、該形質転換植物細胞から有性生殖、無性生殖、組織培養、細胞培養、細胞融合等により子孫又はクローンを得ることが可能である。また、該形質転換植物細胞やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、不定芽、不定胚、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該イソプレノイド産生植物を量産することも可能である。
【００５７】
形質転換植物細胞から植物体を再生する方法は、例えば、ユーカリでは土肥らの方法（特願平１１−１２７０２５号公報）、イネではＦｕｊｉｍｕｒａらの方法（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５），  Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２：ｐ７４−）、トウモロコシではＳｈｉｌｌｉｔｏらの方法（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９），  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７：ｐ５８１−）、ジャガイモではＶｉｓｓｅｒらの方法（Ｖｉｓｓｅｒら（１９８９），  Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．７８：ｐ５８９−）、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法（Ａｋａｍａら（１９９２），  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１２：ｐ７−）が知られており、当業者であれば、これらを参照して形質転換植物細胞から植物体を再生できる。
【００５８】
再生した植物体において、周知の手法を用いることで、目的の蛋白質遺伝子の発現を確認することが出来る。例えば、目的の蛋白質の発現をウエスタンブロット解析すればよい。
【００５９】
上記形質転換植物体から種子を得る方法としては、例えば、形質転換植物体を適当な培地において発根させ、その発根体を水分含有の土を入れたポットに移植する。適当な栽培条件下で生育させ、最終的に種子を形成させて、該種子を得る。また、種子から植物体を得る方法としては、例えば、前記のようにして得られた形質転換植物体由来の種子を、水分含有の土に播種し、適当な栽培条件下で生育させることにより植物体を得ることができる。
【００６０】
本発明では、本発明の遺伝子が導入されたイソプレノイド産生植物を使用してイソプレノイドやポリイソプレノイドの製造を行うことにより、イソプレノイドやポリイソプレノイドの生産性を向上できる。具体的には、上述の方法で得られた形質転換植物細胞、形質転換植物細胞から得られたカルス、該カルスから再分化した細胞等を適当な培地で培養したり、形質転換植物細胞から再生された形質転換植物体、該形質転換植物体から得られた種子から得られた植物体等を適当な栽培条件下で生育させたりすることにより、イソプレノイドやポリイソプレノイドを製造することができる。本発明の形質転換体は、導入された蛋白質によりイソプレノイドやポリイソプレノイドの生合成経路の一部の反応が向上されるので、該蛋白質（酵素）が触媒し、生合成する化合物の生合成量を向上させることができ、ひいてはイソプレノイドの生産性を向上でき、更にはポリイソプレノイドの生産性も向上できる。
【００６１】
ここで、本明細書において、ポリイソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）で構成された重合体の総称である。ポリイソプレノイドとしては、例えばモノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セスタテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、テトラテルペン（Ｃ４０）、天然ゴムなどの重合体が挙げられる。また、本明細書において、イソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）を有する化合物を意味し、ポリイソプレノイドをも含む概念である。
【００６２】
以上の説明の通り、本発明では、セイタカアワダチソウにおけるファルネシル二リン酸シンターゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列及び塩基配列を見出した。また、それぞれ特有の酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、イソプレノイドの生合成経路の特定の化合物の生合成量を向上でき、ひいてはイソプレノイドの生産性を向上、更にはポリイソプレノイドの生産性も向上できる。
【００６３】
具体的には、［Ａ１］〜［Ａ３］のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子、又は［Ａ４］、［Ａ５］のいずれかに記載の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、ファルネシル二リン酸の生合成量を向上でき、ひいてはイソプレノイドの生産性を向上、更にはポリイソプレノイドの生産性も向上できる。
【００６４】
また、［Ｂ１］〜［Ｂ３］のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子、又は［Ｂ４］、［Ｂ５］のいずれかに記載の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、ゲラニルゲラニル二リン酸の生合成量を向上でき、ひいてはイソプレノイドの生産性を向上、更にはポリイソプレノイドの生産性も向上できる。
【００６５】
また、［Ｃ１］〜［Ｃ３］のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子、又は［Ｃ４］、［Ｃ５］のいずれかに記載の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、ジメチルアリル二リン酸又はイソペンテニル二リン酸の生合成量を向上でき、ひいてはイソプレノイドの生産性を向上、更にはポリイソプレノイドの生産性も向上できる。
【００６６】
また、［Ｄ１］〜［Ｄ３］のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子、又は［Ｄ４］、［Ｄ５］のいずれかに記載の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、の生合成量を向上でき、ひいてはイソプレノイドの生産性を向上、更にはポリイソプレノイドの生産性も向上できる。
【００６７】
また、［Ｄ１］〜［Ｄ３］のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子、又は［Ｄ４］、［Ｄ５］のいずれかに記載の遺伝子は、比較的高分子量のポリイソプレノイドを生産するセイタカアワダチソウ由来の遺伝子又は該遺伝子と配列同一性の高い遺伝子であるため、これらの遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、従来は低分子量のポリイソプレノイドしか生合成できなかった植物においても、比較的高分子量のポリイソプレノイドが製造可能となる。
【００６８】
本発明では、４種の上記蛋白質のうち少なくとも１種の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、イソプレノイド、ポリイソプレノイドの生産性を向上できるが、４種の上記蛋白質をコードする遺伝子のうち、２種以上の遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより、イソプレノイド及びポリイソプレノイドの生産性はより向上し、４種すべての遺伝子をイソプレノイド産生植物に導入することにより本発明の効果が最も顕著に発揮される。
【実施例】
【００６９】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００７０】
（セイタカアワダチソウにおけるイソプレノイド生合成経路に関与する酵素群の目的蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列の同定）
山形県天童市に生育したセイタカアワダチソウを採取し、葉からＡＧＰＣ（ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法により、ｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。そして、抽出したｔｏｔａｌＲＮＡをもとに逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。
次に、目的蛋白質に相当する既知であるパラゴムノキ、ヒマワリ、シロイヌナズナ、ニチニチソウ又はカナダイチイ由来の蛋白質のアミノ酸配列（既知の保存領域配列）をもとに、共通性の高い配列部位を選定し、下記に示す縮重プライマー１〜１６を設計し、ＲＴ−ＰＣＲを行うことで部分的に目的蛋白質のＤＮＡの断片を増幅し、その断片部分の配列をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＡＢＩ３１００シークエンサーを用いて同定した。
その断片部分の配列から、新たに下記に示すプライマー１７〜３７を設計し、ＲＡＣＥ法により、目的蛋白質の全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。それぞれの目的蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１、３、５、７に、当該塩基配列は配列番号２、４、６、８に示した。
【００７１】
目的蛋白質がファルネシル二リン酸シンターゼであるときに用いた縮重プライマーを以下に示す。なお、該縮重プライマーの設計は、以下に示す既知の保存領域配列をもとにした。
（プライマー１：配列番号９）
５’−ｇｇｉｇｇｉａａｒｔｋｎａａｙｍｃｎｇｇ−３’
（プライマー２：配列番号１０）
５’−ｇｔｉｎｙｉｇａｙｇａｙａｔｈａｔｇｇａ−３’
（プライマー３：配列番号１１）
５’−ａｔｒｔｃｉｇｔｎｃｃｄａｔｙｔｔｉｃｃ−３’
（プライマー４：配列番号１２）
５’−ｔｃｉａｒｒｗａｒｔｃｒｔｃｙｔｇ−３’
（既知の保存領域１（プライマー１に対応）：配列番号１３）
ＧｌｙＧｌｙＬｙｓＬｅｕＡｓｎＡｒｇＧｌｙ
（既知の保存領域２（プライマー２に対応）：配列番号１４）
ＬｅｕＡｓｐＡｓｐＩｌｅＭｅｔＡｓｐ
（既知の保存領域３（プライマー３に対応）：配列番号１５）
ＧｌｙＬｙｓＩｌｅＧｌｙＴｈｒＡｓｐ
（既知の保存領域４（プライマー４に対応）：配列番号１６）
ＴｈｒＴｙｒＰｈｅＧｌｎＶａｌＧｌｎ
【００７２】
目的蛋白質がゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼであるときに用いた縮重プライマーを以下に示す。なお、該縮重プライマーの設計は、以下に示す既知の保存領域配列をもとにした。
（プライマー５：配列番号１７）
５’−ｇａｒａｔｇａｔｈｃａｙａｖｎａｔｇ−３’
（プライマー６：配列番号１８）
５’−ａｔｇｗｓｉｙｔｉａｔｈｃａｙｇａｙｇａ−３’
（プライマー７：配列番号１９）
５’−ａｃｒｔｃｉａｒｄａｔｒｔｃｒｔｃ−３’
（プライマー８：配列番号２０）
５’−ａｔｒｔｃｒｔｃｉａｃｉａｃｙｔｇｒａａ−３’
（既知の保存領域５（プライマー５に対応）：配列番号２１）
ＧｌｕＭｅｔＩｌｅＨｉｓＴｈｒＭｅｔ
（既知の保存領域６（プライマー６に対応）：配列番号２２）
ＭｅｔＳｅｒＬｅｕＩｌｅＨｉｓＡｓｐＡｓｐ
（既知の保存領域７（プライマー７に対応）：配列番号２３）
ＡｓｐＡｓｐＩｌｅＬｅｕＡｓｐＶａｌ
（既知の保存領域８（プライマー８に対応）：配列番号２４）
ＰｈｅＧｌｎＶａｌＶａｌＡｓｐＡｓｐＩｌｅ
【００７３】
目的蛋白質がイソペンテニル二リン酸イソメラーゼであるときに用いた縮重プライマーを以下に示す。なお、該縮重プライマーの設計は、以下に示す既知の保存領域配列をもとにした。
（プライマー９：配列番号２５）
５’−ａａｒｔａｙａａｙｔｇｙｃａｙｙｔｎａｔｇｇ−３’
（プライマー１０：配列番号２６）
５’−ａｔｇｔｔｙｇａｎｇａｙｇａｒｔｇｙａｔ−３’
（プライマー１１：配列番号２７）
５’−ｇｃｎａｃｙｔｃｒｔｃｎｇｇｒｔｔｎｇｇ−３’ 
（プライマー１２：配列番号２８）
５’−ｔｃｒｔｃｙｔｃｎｃｃｃｃａｙｔｔｎｃｃ−３’
（既知の保存領域９（プライマー９に対応）：配列番号２９）
ＬｙｓＴｙｒＡｓｎＣｙｓＨｉｓ
（既知の保存領域１０（プライマー１０に対応）：配列番号３０）
ＣｙｓＨｉｓＬｅｕＡｓｎＧｌｕＬｙｓ
（既知の保存領域１１（プライマー１１に対応）：配列番号３１）
ＰｒｏＡｓｎＰｒｏＡｓｐＧｌｕＶａｌＡｌａ
（既知の保存領域１２（プライマー１２に対応）：配列番号３２）
ＧｌｙＬｙｓＴｒｐＧｌｙＧｌｕＨｉｓ
【００７４】
目的蛋白質がｃｉｓ−イソプレニルトランスフェラーゼであるときに用いた縮重プライマーを以下に示す。なお、該縮重プライマーの設計は、以下に示す既知の保存領域配列をもとにした。
（プライマー１３：配列番号３３）
５’−ｃａｙｒｔｉｇｓｉｗｔｈｒｔｉａｔｇｇａｙｇｇ−３’
（プライマー１４：配列番号３４）
５’−ａｔｇｇａｙｇｇｉａａｙｖｇｉｍｇｉｔｇｇ−３’
（プライマー１５：配列番号３５）
５’−ｙｃｉａｇｉｔｃｎｇｇｃｃａｙａｒ−３’
（プライマー１６：配列番号３６）
５’−ｔｇｃｃａｙａｒｎａｒｒａａｒｔｔ−３’
（既知の保存領域１３（プライマー１３に対応）：配列番号３７）
ＨｉｓＩｌｅＡｌａＰｈｅＩｌｅＬｅｕＡｓｐＧｌｙ
（既知の保存領域１４（プライマー１４に対応）：配列番号３８）
ＬｅｕＴｒｐＰｒｏＧｌｕＩｌｅＧｌｙ
（既知の保存領域１５（プライマー１５に対応）：配列番号３９）
ＬｅｕＡｓｐＧｌｙＡｓｎＡｒｇＡｒｇ
（既知の保存領域１６（プライマー１６に対応）：配列番号４０）
ＡｓｎＰｈｅＰｈｅＴｒｐＧｌｎ
【００７５】
目的蛋白質がファルネシル二リン酸シンターゼであるときに、ＲＡＣＥ法で用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー１７：配列番号４１）
５’−ａｔａｃａｃｇｃａｇａｇｇｔｃａａｃｃｃ−３’
（プライマー１８：配列番号４２）
５’−ａａａｃａｔｔｔｃｃｇａｇｇａａａｇｃｃ−３’
（プライマー１９：配列番号４３）
５’−ｔａｔｔｃａｔｔｇｔｃｔａｔｔｃａｃｃｇ−３’
（プライマー２０：配列番号４４）
５’−ｔａｔｔｃａｔｔｇｔｃｔａｔｔｃａｃｃｇ−３’
（プライマー２１：配列番号４５）
５’−ａｃｔｃｃｔｔａｔｇｔｔｔｇｇｔｇａｇｇ−３’
（プライマー２２：配列番号４６）
５’−ａｇｇｔｃａａｃｃｃｔｇｔｔｇｇｔｔｃａ−３’
（プライマー２３：配列番号４７）
５’−ｃｇｇａｔｇａｔａｔｔａｔｇｇａｔｇａｇｔｃｔｃ−３’ 
【００７６】
目的蛋白質がゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼであるときに、ＲＡＣＥ法で用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー２４：配列番号４８）
５’−ｃｇａｃｔｇｇａｇｃａｃｇａｇｇａｃａｃ−３’
（プライマー２５：配列番号４９）
５’−ｃｔａａｃｃｃａａｃａａｃｔｔｇｔｃｃｔｔｃ−３’
【００７７】
目的蛋白質がイソペンテニル二リン酸イソメラーゼであるときに、ＲＡＣＥ法で用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー２６：配列番号５０）
５’−ｇｃｔｔａｔｔｇａａｇａｇａａｇｔｃａｃｔｃｇｇ−３’
（プライマー２７：配列番号５１）
５’−ｇａｇｇａａｇｃｔｔｔｔａｇａｔｇａａｃｔｇｇｇ−３’
（プライマー２８：配列番号５２）
５’−ａｃｔｔｃｃｇｇｔｔｇａｔｇａｇｔｔｔａｔｃｃｃ−３’
（プライマー２９：配列番号５３）
５’−ｇａｇｇａａｇｃｔｔｔｔａｇａｔｇａａｃｔｇｇｇ−３’
（プライマー３０：配列番号５４）
５’−ａｃｔｔｃｃｇｇｔｔｇａｔｇａｇｔｔｔａｔｃｃｃ−３’
（プライマー３１：配列番号５５）
５’−ａａｇａｔｃｔｇｇａａｃａａａｇｇｔｇａｃｔｔ−３’
（プライマー３２：配列番号５６）
５’−ｔａｇｇｇｃｔｔｔｃａｇｔｇｔａｔｔｃｔｔｇ−３’ 
【００７８】
目的蛋白質がｃｉｓ−イソプレニルトランスフェラーゼであるときに、ＲＡＣＥ法で用いたプライマーを以下に示す。
（プライマー３３：配列番号５７）
５’−ｇｇａｇｇａａａａｇａｔｔｇａａａｇｔｔｔｇａｃａａａａ−３’
（プライマー３４：配列番号５８）
５’−ａｇｃｔｇａｇａａｇｇｃｃａｔｇｇａｔｇｃ−３’
（プライマー３５：配列番号５９）
５’−ｇｃａｔｇｃｔｇｔｔｃａａｇａａｔｃｔｔｇｔｇａａｇ−３’ 
（プライマー３６：配列番号６０）
５’−ｃａａａｇａｔｔｔｔａｃｔｔｃｔｔｃａｇｇａｔｔｇｃｇ−３’
（プライマー３７：配列番号６１）
５’−ｃｃｃｃａａｇｃｔｃａｔａｇｃａｇｔａｃｃｔａａｇｃ−３’
【００７９】
（目的蛋白質発現ベクターの構築）
まず、目的蛋白質をコードする遺伝子（塩基配列）をｐＣｏｌｄＩＩＩ（ｐＣｏｌｄＩＩＩ／ＳＡ−ＦＰＳ）のマルチクローニングサイト上のＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩサイト内に組み込んだ目的蛋白質発現ベクターを構築した。なお、該ＤＮＡ断片を組み込む際のライゲーションには、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２を用いた。
また、目的蛋白質の一つであるイソペンテニル二リン酸イソメラーゼの場合は、ベクターはｐＣｏｌｄ  ＰｒｏＳ２、制限酵素サイトはＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで行い、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼの場合は、ベクターはｐＣｏｌｄＰｒｏＳ２（ｐＣｏｌｄＰｒｏＳ２／ＳＡ−ＣＰＴ）、制限酵素サイトはＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで行った。
【００８０】
（大腸菌の形質転換体）
大腸菌ＢＬ２１株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株）及び上記目的蛋白質発現ベクターを用いて、ヒートショック法により形質転換を行った。そして、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布し、２０℃で一晩培養することで、形質転換体を選択し、得た。
なお、目的蛋白質の一つであるイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼの場合も、大腸菌ＢＬ２１株を用いた。
【００８１】
（目的蛋白質の発現）
得られた上記形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ液体培地が入った試験管に加え、３７℃で５時間振盪培養した。得られた培養液のうち、１ｍｌを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地１００ｍｌが入った５００ｍｌ三角フラスコに添加し、２０℃で３時間振盪培養した。次いで、０．１ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、再度２０℃で１８時間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体を得た。得られた湿菌体を超音波処理により破砕し、再度遠心分離を行い、上清を採取し、ＨｉｓＴｒａｐ（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株））を用いて目的蛋白質を精製した。目的蛋白質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確認を行った。
【００８２】
（目的蛋白質の活性測定）
下記に示す測定方法により、それぞれの目的蛋白質の酵素活性の有無を確認した。結果は表１〜４に示す。なお、それぞれの基準（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、得られた目的蛋白質を配合しないもので行った。
【００８３】
（ファルネシル二リン酸の生合成量測定）
上記精製によって得られた目的蛋白質（配列番号１で表される蛋白質）１０μｇ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）、４０ｍＭ  塩化マグネシウム、２５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ジメチルアリル二リン酸、１ｍＭ  イソペンテニル二リン酸を含む反応液を調製し、３７℃水浴にて１時間反応させた。反応終了後、飽和食塩水１００ｍｌとペンタン５００ｍｌを加え、撹拌後、静置した。その後、上清（ペンタン層）を抽出し、液体シンチレーションカウンターにより、ファルネシル二リン酸の生合成量を測定した。
【００８４】
（ゲラニルゲラニル二リン酸の生合成量測定）
配列番号３で表される蛋白質を用いた以外は、上記ファルネシル二リン酸の生合成量測定と同様の条件で行い、ゲラニルゲラニル二リン酸の生合成量を測定した。
【００８５】
（ジメチルアリル二リン酸の生合成量測定）
上記精製によって得られた目的蛋白質（配列番号５で表される蛋白質）３μｇ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  塩化マグネシウム、５０ｍＭ  ２―メルカプトエタノール、１．２５μＭ  イソペンテニル二リン酸を含む反応液を調製し、３７℃水浴にて３０分反応させた。反応終了後、飽和食塩水２００μｌと４００μｌの１ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌを加え、撹拌後、更に３７℃水浴にて２０分反応させた。その後、ジエチルエーテルを６００μｌ加え、上清（ジエチルエーテル層）を抽出し、液体シンチレーションカウンターにより、ジメチルアリル二リン酸の生合成量を測定した。
【００８６】
（ｃｉｓ型イソプレノイドであるｃｉｓ−イソプレニル二リン酸の生合成量測定）
上記精製によって得られた目的蛋白質（配列番号７で表される蛋白質）１０μｇ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）、４０ｍＭ  塩化マグネシウム、２５ｍＭ  ２―メルカプトエタノール、１ｍＭ  ファルネシル二リン酸、１５μＭ  イソペンテニル二リン酸を含む反応液を調製し、３７℃水浴にて１時間反応させた。反応終了後、飽和食塩水１ｍｌを加え撹拌後、ジエチルエーテルを１ｍｌ加え、撹拌後、静置した。その後、上清（ジエチルエーテル層）を除去し、１−ブタノールを１ｍｌ加え、撹拌後、静置した。その後、上清（１−ブタノール層）を除去し、トルエン／ヘキサン（１：１）溶液を１ｍｌ加え、撹拌後、静置した。その後、上清（トルエン／ヘキサン層）を除去し、液体シンチレーションカウンターにより、ｃｉｓ−イソプレニル二リン酸の生合成量を測定した。
【００８７】
【表１】
2015047142.tif 000002
【００８８】
【表２】
2015047142.tif 000003
【００８９】
【表３】
2015047142.tif 000004
【００９０】
【表４】
2015047142.tif 000005
【００９１】
表１〜４の結果から、目的の蛋白質はそれぞれ本来持つ酵素活性を有することが明らかとなり、それぞれが、セイタカアワダチソウにおけるイソプレノイド生合成経路に関与する酵素群のファルネシル二リン酸シンターゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、ｃｉｓ−イソプレニルトランスフェラーゼであるということが明確になった。
【００９２】
また、本発明で得られた上記目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体（形質転換イソプレノイド産生植物体）においても、上記目的蛋白質により生合成されるそれぞれの化合物の生合成量が向上することも裏付けられた。更に、該形質転換イソプレノイド産生植物体において、イソプレノイド及びポリイソプレノイドの生産性が向上することも裏付けられた。
【００９３】
（配列表フリーテキスト）
配列番号１：セイタカアワダチソウ由来のファルネシル二リン酸シンターゼのアミノ酸配列
配列番号２：セイタカアワダチソウ由来のファルネシル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号３：セイタカアワダチソウ由来のゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼのアミノ酸配列
配列番号４：セイタカアワダチソウ由来のゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号５：セイタカアワダチソウ由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼのアミノ酸配列
配列番号６：セイタカアワダチソウ由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号７：セイタカアワダチソウ由来のｃｉｓ−イソプレニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号８：セイタカアワダチソウ由来のｃｉｓ−イソプレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号９：プライマー１
配列番号１０：プライマー２
配列番号１１：プライマー３
配列番号１２：プライマー４
配列番号１３：既知の保存領域１
配列番号１４：既知の保存領域２
配列番号１５：既知の保存領域３
配列番号１６：既知の保存領域４
配列番号１７：プライマー５
配列番号１８：プライマー６
配列番号１９：プライマー７
配列番号２０：プライマー８
配列番号２１：既知の保存領域５
配列番号２２：既知の保存領域６
配列番号２３：既知の保存領域７
配列番号２４：既知の保存領域８
配列番号２５：プライマー９
配列番号２６：プライマー１０
配列番号２７：プライマー１１
配列番号２８：プライマー１２
配列番号２９：既知の保存領域９
配列番号３０：既知の保存領域１０
配列番号３１：既知の保存領域１１
配列番号３２：既知の保存領域１２
配列番号３３：プライマー１３
配列番号３４：プライマー１４
配列番号３５：プライマー１５
配列番号３６：プライマー１６
配列番号３７：既知の保存領域１３
配列番号３８：既知の保存領域１４
配列番号３９：既知の保存領域１５
配列番号４０：既知の保存領域１６
配列番号４１：プライマー１７
配列番号４２：プライマー１８
配列番号４３：プライマー１９
配列番号４４：プライマー２０
配列番号４５：プライマー２１
配列番号４６：プライマー２２
配列番号４７：プライマー２３
配列番号４８：プライマー２４
配列番号４９：プライマー２５
配列番号５０：プライマー２６
配列番号５１：プライマー２７
配列番号５２：プライマー２８
配列番号５３：プライマー２９
配列番号５４：プライマー３０
配列番号５５：プライマー３１
配列番号５６：プライマー３２
配列番号５７：プライマー３３
配列番号５８：プライマー３４
配列番号５９：プライマー３５
配列番号６０：プライマー３６
配列番号６１：プライマー３７
【図１】
2015047142.tif 000006
【図２】
2015047142.tif 000007
【配列表】
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