(57)【要約】【課題】末梢血細胞のみならず骨髄細胞にも適用可能であり、小核を有する多染性赤血球数の比率だけでなく全赤血球に対する多染性赤血球の比率を計測することもでき、画像データを残すことができ、更に目視による計測と同等以上の精度を有する遺伝毒性評価方法及び前記毒性評価方法を行うための毒性評価キットを提供すること。【解決手段】１つの視野で可視光により全細胞を認識し、さらに細胞の核を検出する波長および多染性赤血球数の細胞質を検出する波長を照射することにより蛍光画像を取得し、上記により得られた３つの画像から、全赤血球数、多染性赤血球数、及び小核を有する多染性赤血球数を同定することを含む、骨髄細胞又は末梢血細胞に対する遺伝毒性及び骨髄毒性の評価方法、並びに上記評価方法で使用するための遺伝毒性又は骨髄毒性評価試薬キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含む骨髄細胞又は末梢血細胞に対する遺伝毒性及び骨髄毒性の評価方法。
（１）被験物質を投与した動物から採取した骨髄細胞又は末梢血細胞を含む試料をプレートに塗沫する工程；
（２）プレート上の骨髄細胞又は末梢血細胞を、ＤＮＡを染色する第１蛍光色素、及び前記第１蛍光色素の励起波長とは異なる励起波長を有しＲＮＡを染色する第２蛍光色素で染色する工程；
（３）イメージアナライザーによりプレート上の同一視野で、可視光による画像、第１蛍光色素による画像、及び第２蛍光色素による画像を取得する工程；
（４）前記同一視野において、可視光で細胞として認識され、第１蛍光色素で染色される所定以上の面積の主核を有する細胞を有核球として解析から排除し、残りの細胞を全赤血球の数として計測する工程；
（５）前記同一視野において、（４）で全赤血球として認識された細胞の中で、第２蛍光色素で励起される細胞の数を、多染性赤血球の数として計測する工程；
（６）前記同一視野において、（５）で多染性赤血球として認識された細胞の中で、第１蛍光色素で染色される所定の長さの直径の小核を有する細胞の数を、小核を有する多染性赤血球の数として計測する工程；
（７）多染性赤血球数における小核を有する多染性赤血球数の比率、及び全赤血球数における多染性赤血球数の比率に基づいて、被験物質の遺伝毒性および骨髄毒性を評価する工程。
【請求項２】
下記工程を含む骨髄細胞又は末梢血細胞に対する骨髄毒性の評価方法。
（１）被験物質を投与した動物から採取した骨髄細胞又は末梢血細胞を含む試料をプレートに塗沫する工程；
（２）プレート上の骨髄細胞又は末梢血細胞を、ＤＮＡを染色する第１蛍光色素、及び前記第１蛍光色素の励起波長とは異なる励起波長を有しＲＮＡを染色する第２蛍光色素で染色する工程；
（３）イメージアナライザーによりプレート上の同一視野で、可視光による画像、第１蛍光色素による画像、及び第２蛍光色素による画像を取得する工程；
（４）前記同一視野において、可視光で細胞として認識され、第１蛍光色素で染色される所定以上の面積の主核を有する細胞を有核球として解析から排除し、残りの細胞を全赤血球の数として計測する工程；
（５）前記同一視野において、（４）で全赤血球として認識された細胞の中で、第２蛍光色素で励起される細胞の数を、多染性赤血球の数として計測する工程；
（７）全赤血球数における多染性赤血球数の比率に基づいて、被験物質の骨髄毒性を評価する工程。
【請求項３】
下記工程を含む骨髄細胞又は末梢血細胞に対する遺伝毒性の評価方法。
（１）被験物質を投与した動物から採取した骨髄細胞又は末梢血細胞を含む試料をプレートに塗沫する工程；
（２）プレート上の骨髄細胞又は末梢血細胞を、ＤＮＡを染色する第１蛍光色素、及び前記第１蛍光色素の励起波長とは異なる励起波長を有しＲＮＡを染色する第２蛍光色素で染色する工程；
（３）イメージアナライザーによりプレート上の同一視野で、可視光による画像、第１蛍光色素による画像、及び第２蛍光色素による画像を取得する工程；
（４）前記同一視野において、可視光で細胞として認識され、第１蛍光色素で染色される所定以上の面積の主核を有する細胞を有核球として解析から排除し、残りの細胞を全赤血球の数として計測する工程；
（５）前記同一視野において、（４）で全赤血球として認識された細胞の中で、第２蛍光色素で励起される細胞の数を、多染性赤血球の数として計測する工程；
（６）前記同一視野において、（５）で多染性赤血球として認識された細胞の中で、第１蛍光色素で染色される所定の長さの直径の小核を有する細胞の数を、小核を有する多染性赤血球の数として計測する工程；
（７）多染性赤血球数における小核を有する多染性赤血球数の比率に基づいて、被験物質の遺伝毒性を評価する工程。
【請求項４】
工程（１）において、被験物質を投与した動物から採取した骨髄細胞又は末梢血細胞を含む試料に含まれる有核球を除去してから、プレートに塗沫する、請求項１から３の何れか１項に記載の評価方法。
【請求項５】
プレートが、複数のウエルを有するマイクロプレートである、請求項１から４の何れか１項に記載の評価方法。
【請求項６】
第１蛍光色素が2'-(4-エトキシフェニル)-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)-2,6'-ビ[1H-ベンゾイミダゾール]（Hoechst33342）、2'-(4-ヒドロキシフェニル)-5-(4-メチル-1-ピペラジニル)-2,5'-ビ-1H-ベンズイミダゾール（Hoechst33258）又は4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)であり、第２蛍光色素がヨウ化プロピジウムである、請求項１から５の何れか１項に記載の評価方法。
【請求項７】
多染性赤血球の数が２０００個以上となる画像まで計測を行うことにより多染性赤血球数における小核を有する多染性赤血球数の比率を求め、及び／又は全赤血球の数が１０００個以上となる画像まで計測を行うことにより全赤血球数における多染性赤血球数の比率を求める、請求項１から６の何れか１項に記載の評価方法。
【請求項８】
ＤＮＡを染色する第１蛍光色素、及び前記第１蛍光色素の励起波長とは異なる励起波長を有しＲＮＡを染色する第２蛍光色素とを含む、請求項１から７の何れか１項に記載の評価方法で使用するための遺伝毒性又は骨髄毒性評価試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄および末梢血中の全赤血球数、多染性赤血球数、及び小核を有する多染性赤血球数を自動的に計測し、多染性赤血球数における小核を有する多染性赤血球数の比率、及び／又は全赤血球数における多染性赤血球数の比率を算出することによる、遺伝毒性又は骨髄毒性の評価方法、並びに上記した遺伝毒性又は骨髄毒性の評価方法を行うためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
日本において事業者は、新規化学物質の製造または輸入の際に、化学物質の審査および製造等の規制に関する法律（化学物質審査規制法）に従う必要がある。化学物質審査規制法で必要な遺伝毒性試験としてAmes試験および染色体異常試験の実施が必要であるが、この試験において安全性が担保されない場合は、げっ歯類を用いた小核試験の実施が必要である。また、医薬品の申請においては、げっ歯類を用いる小核試験の実施が必須である。ガイドライン化されたげっ歯類を用いた小核試験では、被験物質を動物に投与した後、骨髄血または末梢血をスライドグラスに塗沫して、アクリジンオレンジ等の蛍光色素で染色した後、蛍光顕微鏡下で観察者が、２０００個の多染性赤血球（以下、PCEとも略記する）を計測し、そのうち小核を有する多染性赤血球（以下、MNPCEとも略記する）の数を計測している。さらに、化合物の骨髄細胞及び末梢血細胞に対する骨髄毒性を評価するために、PCEおよび正染性赤血球（以下、NCEとも略記する）の数を計測し、全赤血球（PCE+NCE）当たりのPCEの比率を算出することもガイドラインで決められている。これらの作業は血球の種類を見分けながら長時間顕微鏡を観察する必要があるため多くの時間がかかり、個人に負担が多いため連続的な作業は困難である。また、個人によって血球の判別基準が異なる可能性もあるため、１９９０年代から自動で判定する試みがなされてきた。これまで報告されてきた自動計測の方法は、大きく分けて２種類の報告があり、一つ目は血球の画像を自動的に撮影し画像解析技術により血球の種類を区別して計数するもの、もう一つはフローサイトメトリーを用いて、血球１個ずつに複数の波長の蛍光を照射し細胞の蛍光強度の情報から血球の種類を区別して計数するものである。
【０００３】
例えば、特許文献１では、光ビームにより励起された細胞からの蛍光のうち、小核を標識する蛍光を検出するとともに、細胞全体を標識する蛍光により得られる走査画像領域のうち、第１の閾値を超える第１画像領域を算出し、第２の閾値を超える第２画像領域を算出することにより小核を検出している。また、特許文献２には、アクリジンオレンジで超生体染色した末梢血を顕微鏡で撮像する装置、ＲＧＢ別に像を記憶する装置、該像から網赤血球と小核とを抽出識別する装置、および網赤血球と小核とを計数する装置とを備え、かつ雑音除去条件設定機能と雑音除去機能とを有する小核試験装置が記載されている。
【０００４】
非特許文献１には、画像解析技術を使って、アクリジンオレンジで蛍光染色された末梢血中のMNPCEを検出することが記載されているが、骨髄血中のMNPCEの検出については報告されていない。正染性赤血球（NCE）は、アクリジンオレンジで特異的には染色されないので、PCEを赤色蛍光領域のpixel数で4段階に区分し、赤色蛍光領域が15 pixel以上のPCEを1〜3段階のPCEとし、PCE中の1〜3段階のPCEの割合を骨髄毒性の指標として用いている。非特許文献２は、マウスの末梢血においてMNPCEの検出だけで、正染性赤血球(NCE) と多染性赤血球(PCE)の自動区分はしていない。非特許文献３にはフローサイトメトリーを用いた方法が記載されており、マウスの骨髄血および末梢血においてMNPCEの検出だけなく、NCEとPCEの区別を２種類の蛍光色素を用いて可能にしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０９−１１９８９２号公報
【特許文献２】特開平０９−０８９８８６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Asano N, Katsuma Y, Tamura H, Higashikuni N, Hayashi M. An automated new technique for scoring the rodent micronucleus assay: computerized image analysis of acridine orange supravitally stained peripheral blood cells. Mutat Res. 1998, Aug3; 404(1-2): 149-54.
【非特許文献２】Styles JA, Clark H, Festing MF, Rew DA. Automation of mouse micronucleus genotoxicity assay by laser scanning cytometry. Cytometry. 2001 Jun 1;44(2):153-5.
【非特許文献３】Harada A, Matsuzaki K, Takeiri A, Tanaka K, Mishima M. Fluorescent dye-based simple staining for in vivo micronucleus test with flow cytometer. Mutat Res. 2013 Mar 18;751(2):85-90.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１及び２の方法又は装置によれば、蛍光染色した末梢血における小核を有する赤血球の比率を自動的に検出することができるが、多染性赤血球(PCE)と正染性赤血球(NCE)を区別することについては記載がない。また、特許文献１及び２は末梢血についての報告であり、骨髄細胞に関する記載はない。非特許文献１は、画像解析技術を使ってアクリジンオレンジで染色された末梢血中の小核を有するPCEを検出しているが、NCEはアクリジンオレンジで染色されないため、全赤血球（NCE＋PCE）中のPCEの割合（PCE比）を算出することができないとしている。そのため、非特許文献１では、NCEの数を計数することができないので、PCEを赤色蛍光領域のpixel数で4段階に区分し、赤色蛍光領域が15 pixel以上のPCEを1〜3段階のPCEとし、PCE中の1〜3段階のPCEの割合を骨髄毒性の指標として用いている。また、非特許文献１には骨髄の小核試験に関する記載はない。非特許文献２においては、マウスの末梢血においてMNPCEを検出しただけで、成熟した赤血球(NCE)と未熟な赤血球(PCE)の自動区別はしておらず、また骨髄の小核試験についての記載もない。非特許文献３はフローサイトメトリーを用いた方法であり、画像解析のように目視等で確認することができず、画像データを残すことができない。
【０００８】
上記のように蛍光色素を使用した場合、NCEは特異的に染色されないためにNCEの検出が課題である。従来の方法によればNCEを検出することができないので、PCEを赤色蛍光領域のpixel数で4段階に区分し、赤色蛍光領域が15 pixel以上のPCEを1〜3段階のPCEとし、PCE中の1〜3段階のPCEの割合を骨髄毒性の指標として用いている。この指標は、アクリジンオレンジで染色される赤血球を蛍光強度から４段階に分けて蛍光強度の強い１〜３の段階の血球の割合を算出するものであるが、蛍光色素はサンプルの状態によって染まり方が違う場合が多いので、１サンプルごとに４段階に分けるのはバラツキが生じやすくなると考えられる。
【０００９】
一方、フローサイトメトリーによる手法は高速な測定が可能であるが、画像解析のように目視等で確認することができず、画像データを残すことができない。また、フローサイトメトリーを使用した小核試験は、全赤血球に対するPCEの比率を正確に出すことはできない。非特許文献３のように新しく報告された方法でも精度の点で十分とは言えない。
【００１０】
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消した毒性評価方法、及び前記毒性評価方法を行うための毒性評価キットを提供することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、末梢血細胞のみならず骨髄細胞にも適用可能であり、MNPCE比率だけでなく全赤血球に対するPCEの比率（PCE/(PCE+NCE)）を計測することもでき、画像データを残すことができ、更に目視による計測と同等以上の精度を有する毒性評価方法、及び前記毒性評価方法を行うための毒性評価キットを提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、１つの視野で可視光により全細胞を認識し、さらに細胞の核を検出する波長およびPCEの細胞質を検出する波長を照射することにより蛍光画像を取得し、上記により得られた３つの画像から全赤血球数、多染性赤血球数、及び小核を有する多染性赤血球数を測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明によれば、下記工程を含む骨髄細胞又は末梢血細胞に対する遺伝毒性及び骨髄毒性の評価方法が提供される。
（１）被験物質を投与した動物から採取した骨髄細胞又は末梢血細胞を含む試料をプレートに塗沫する工程；
（２）プレート上の骨髄細胞又は末梢血細胞を、ＤＮＡを染色する第１蛍光色素、及び第１蛍光色素の励起波長とは異なる励起波長を有しＲＮＡを染色する第２蛍光色素で染色する工程；
（３）イメージアナライザーによりプレート上の同一視野で、可視光による画像、第１蛍光色素による画像、及び第２蛍光色素による画像を取得する工程；
（４）同一視野において、可視光で細胞として認識され、第１蛍光色素で染色される所定以上の面積の主核を有する細胞を有核球として解析から排除し、残りの細胞を全赤血球の数として計測する工程；
（５）同一視野において、（４）で全赤血球として認識された細胞の中で、第２蛍光色素で励起される細胞の数を、多染性赤血球の数として計測する工程；
（６）同一視野において、（５）で多染性赤血球として認識された細胞の中で、第１蛍光色素で染色される所定の長さの直径の小核を有する細胞の数を、小核を有する多染性赤血球の数として計測する工程；
（７）多染性赤血球数における小核を有する多染性赤血球数の比率、及び全赤血球数における多染性赤血球数の比率に基づいて、被験物質の遺伝毒性および骨髄毒性を評価する工程。
【００１３】
更に本発明によれば、下記工程を含む骨髄細胞又は末梢血細胞に対する骨髄毒性の評価方法が提供される。
（１）被験物質を投与した動物から採取した骨髄細胞又は末梢血細胞を含む試料をプレートに塗沫する工程；
（２）プレート上の骨髄細胞又は末梢血細胞を、ＤＮＡを染色する第１蛍光色素、及び第１蛍光色素の励起波長とは異なる励起波長を有しＲＮＡを染色する第２蛍光色素で染色する工程；
（３）イメージアナライザーによりプレート上の同一視野で、可視光による画像、第１蛍光色素による画像、及び第２蛍光色素による画像を取得する工程；
（４）同一視野において、可視光で細胞として認識され、第１蛍光色素で染色される所定以上の面積の主核を有する細胞を有核球として解析から排除し、残りの細胞を全赤血球の数として計測する工程；
（５）同一視野において、（４）で全赤血球として認識された細胞の中で、第２蛍光色素で励起される細胞の数を、多染性赤血球の数として計測する工程；
（７）全赤血球数における多染性赤血球数の比率に基づいて、被験物質の骨髄毒性を評価する工程。
【００１４】
更に本発明によれば、下記工程を含む骨髄細胞又は末梢血細胞に対する遺伝毒性の評価方法が提供される。
（１）被験物質を投与した動物から採取した骨髄細胞又は末梢血細胞を含む試料をプレートに塗沫する工程；
（２）プレート上の骨髄細胞又は末梢血細胞を、ＤＮＡを染色する第１蛍光色素、及び第１蛍光色素の励起波長とは異なる励起波長を有しＲＮＡを染色する第２蛍光色素で染色する工程；
（３）イメージアナライザーによりプレート上の同一視野で、可視光による画像、第１蛍光色素による画像、及び第２蛍光色素による画像を取得する工程；
（４）同一視野において、可視光で細胞として認識され、第１蛍光色素で染色される所定以上の面積の主核を有する細胞を有核球として解析から排除し、残りの細胞を全赤血球の数として計測する工程；
（５）同一視野において、（４）で全赤血球として認識された細胞の中で、第２蛍光色素で励起される細胞の数を、多染性赤血球の数として計測する工程；
（６）同一視野において、（５）で多染性赤血球として認識された細胞の中で、第１蛍光色素で染色される所定の長さの直径の小核を有する細胞の数を、小核を有する多染性赤血球の数として計測する工程；
（７）多染性赤血球数における小核を有する多染性赤血球数の比率に基づいて、被験物質の遺伝毒性を評価する工程。
【００１５】
好ましくは、工程（１）において、被験物質を投与した動物から採取した骨髄細胞又は末梢血細胞を含む試料に含まれる有核球を除去してから、プレートに塗沫する。
好ましくは、プレートは、複数のウエルを有するマイクロプレートである。
好ましくは、第１蛍光色素が2'-(4-エトキシフェニル)-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)-2,6'-ビ[1H-ベンゾイミダゾール]（Hoechst33342）、2'-(4-ヒドロキシフェニル)-5-(4-メチル-1-ピペラジニル)-2,5'-ビ-1H-ベンズイミダゾール（Hoechst33258）又は4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)であり、第２蛍光色素がヨウ化プロピジウムである。
【００１６】
好ましくは、多染性赤血球の数が２０００個以上となる画像まで計測を行うことにより多染性赤血球数における小核を有する多染性赤血球数の比率を求め、及び／又は全赤血球の数が１０００個以上となる画像まで計測を行うことにより全赤血球数における多染性赤血球数の比率を求める。
【００１７】
更に本発明によれば、ＤＮＡを染色する第１蛍光色素、及び第１蛍光色素の励起波長とは異なる励起波長を有しＲＮＡを染色する第２蛍光色素とを含む、上記した本発明の評価方法で使用するための遺伝毒性又は骨髄毒性評価試薬キットが提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、化合物の安全性評価に必要な「げっ歯類を用いた小核試験」において、従来は熟練した研究者が顕微鏡観察により血球の種類を分別・計数していた作業を、自動で正確に計数することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、IN Cell Analyzer 2000で得られた明視野画像及び蛍光顕微鏡画像を示す。Ａ；明視野画像、Ｂ：Hoechst33342染色による蛍光画像、Ｃ：ＰＩ染色による蛍光画像、Ｄ：明視野画像とHoechst33342（青：ＭＮ）染色とＰＩ（赤：ＭＮ及びＲＮＡ）染色による蛍光画像との重ね合わせ、Ｅ：細胞（赤ライン）、ＭＮ（黄色ライン）及びＲＮＡ（緑ライン）の領域の自動同定。赤血球の型の自動同定は以下の通りである。ＰＣＥ：赤及び緑の二重輪郭、ＮＣＥ：赤の一重輪郭、ＭＮＰＣＥ：赤及び緑の二重輪郭の内部に小さな黄色の輪郭、矢頭はＭＮを示す。
【図２】図２は、骨髄におけるPCE中のMNPCEの比率 (%)および全赤血球中のPCEの比率(%)において、目視による計測（４人：A, B, C, D）と自動計測のバラツキの比較を示す。マイトマイシンC（MMC）は2mg/kg、ビンブラスチンは1mg/kgの量で投与した場合の結果である。
【図３】図３は、末梢血におけるPCE中のMNPCEの比率 (%)および全赤血球中のPCEの比率(%)において、目視による計測（４人：A, B, C, D）と自動計測のバラツキの比較を示す。マイトマイシンC（MMC）は2mg/kg、ビンブラスチンは1mg/kgの量で投与した場合の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明の骨髄細胞又は末梢血細胞に対する遺伝毒性及び骨髄毒性の評価方法は、以下の工程を含む方法である。
（１）被験物質を投与した動物から採取した骨髄細胞又は末梢血細胞を含む試料をプレートに塗沫する工程；
（２）プレート上の骨髄細胞又は末梢血細胞を、ＤＮＡを染色する第１蛍光色素、及び第１蛍光色素の励起波長とは異なる励起波長を有しＲＮＡを染色する第２蛍光色素で染色する工程；
（３）イメージアナライザーによりプレート上の同一視野で、可視光による画像、第１蛍光色素による画像、及び第２蛍光色素による画像を取得する工程；
（４）同一視野において、可視光で細胞として認識され、第１蛍光色素で染色される所定以上の面積の主核を有する細胞を有核球として解析から排除し、残りの細胞を全赤血球の数として計測する工程；
（５）同一視野において、（４）で全赤血球として認識された細胞の中で、第２蛍光色素で励起される細胞の数を、多染性赤血球の数として計測する工程；
（６）同一視野において、（５）で多染性赤血球として認識された細胞の中で、第１蛍光色素で染色される所定の長さの直径の小核を有する細胞の数を、小核を有する多染性赤血球の数として計測する工程；
（７）多染性赤血球数における小核を有する多染性赤血球数の比率、及び全赤血球数における多染性赤血球数の比率に基づいて、被験物質の遺伝毒性および骨髄毒性を評価する工程。
【００２１】
本発明においては、上記工程（１）〜（７）のうち、工程（６）を省略して、全赤血球数における多染性赤血球数の比率のみを算出し、これに基づいて被験物質の骨髄毒性を評価してもよい。また、上記工程（７）においては、多染性赤血球数における小核を有する多染性赤血球数の比率に基づいて、被験物質の遺伝毒性のみを評価してもよい。
【００２２】
従来から報告されている画像解析技術を使った方法は、可視光の画像を取得しなかったのでPCEとNCEの区別が明確ではなかった。しかし、本発明の方法によれば、骨髄細胞または末梢血細胞の試料において、イメージアナライザーにより、同一視野で可視光、第１蛍光色素および第２蛍光色素による画像を連続的に高速で取得し、３枚の画像より、全赤血球数、多染性赤血球数、及び小核を有する多染性赤血球数を高精度に計数することができる。
【００２３】
本発明によれば、PCEとNCEの識別は、第２蛍光色素により染色されたPCEの細胞質の蛍光強度を１段階で簡単に分けることができる。今まで報告された報告とは違い、本発明は全赤血球とPCEの数を数えることができるので、その差し引きで結果的にNCEの数も算出することができる。そのため本発明は、今まで報告された画像解析を使った小核試験において、精度の悪かった全赤血球に対するPCEの比率（PCE/(PCE+NCE)）を正確に算出することができる。上記の通り本発明は、イメージアナライザーが可視光の画像からでも個々の細胞を認識することができることを利用しているので、NCEのように蛍光染色されない細胞も細胞として明確に認識することができることが、精度よくPCEとNCEを区別できる要因である。本発明の方法によれば、顕微鏡下での目視による計測により得られる値と非常に近い値が得られることから、精度の高い結果が得られることが分かる。
【００２４】
また、画像解析を利用した小核試験の自動計測法は、MNPCEだけをリストアップして１つずつ画像の確認をすることもできるので、本発明の方法は、GLP試験のようなデータの信頼性を要求されるグレードの試験に対しても充分に対応することができる。
以下に工程（１）〜（７）について説明する。
【００２５】
工程（１）
工程（１）においては、被験物質を投与した動物から採取した骨髄細胞又は末梢血細胞を含む試料をプレートに塗沫する。
被験物質としては、遺伝毒性及び／又は骨髄毒性を評価する対象となる物質であり、その種類は特に限定されず、例えば、無機化合物、有機化合物（合成低分子化合物を含む）、タンパク質、ペプチド、微生物培養物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。被験物質は、そのまま動物に投与してもよいし、必要に応じて溶媒に溶解させて投与してもよい。
【００２６】
被験物質を投与する動物の種類は特に限定されないが、非ヒト哺乳動物が好ましく、マウスまたはラット等のげっ歯類が特に好ましい。
被験物質の投与回数は特に限定されないが、例えば１回／日で１日〜３日間（一例としては２日間）投与することができる。
【００２７】
本発明においては、被験物質を投与した動物から、骨髄細胞又は末梢血細胞を含む試料を採取する。骨髄細胞を含む試料を採取するためには、動物から骨髄を摘出し、骨髄の両端を切断し、例えば25mM EDTA含有ウシ胎児血清などを充填した注射筒の注射針を片端に刺して、骨内の骨髄細胞を洗い出すことにより、骨髄細胞を含む試料を採取することができる。末梢血細胞を含む試料を採取するためには、予めヘパリンをなじませた注射筒を用いて麻酔をした動物の血管から採血すればよい。
【００２８】
本発明においては、上記のようにして採取した試料をプレートに塗沫するが、試料の塗沫に先立って、上記試料に含まれる有核球を除去してもよい。細胞の計測の効率・精度を向上させる観点から見て、上記試料に含まれる有核球を除去してからプレートに塗沫することは本発明の好ましい態様である。有核球を除去する方法は特に限定されないが、好ましくはカラムを用いて有核球を除去することができる。例えば、以下の実施例に記載の通り、注射筒の先端にはアクロディスクPSF（25mm, 10μm, PALL）をセットし、カラム（Sigmatype50とalpha-celluloseの等量混合物）を注射筒に充填し、骨髄細胞を含む試料をカラムに添加して緩衝液を用いて溶出させることにより、有核球を除去した試料を得ることができる。注射筒の先端にアクロディスクPSF（25mm, 10μm, PALL）をセットすることにより、試料中にカラムが漏れることを防ぐことができ、またこのディスクを装着しても溶出速度は遅くなることはない。
【００２９】
骨髄細胞又は末梢血細胞を含む試料は、常法によりプレートに塗沫する。プレートへの塗沫の際には、骨髄細胞又は末梢血細胞を含む試料は、蛍光染色後に取得した画像の視野における細胞密度が好適な範囲となるように、希釈することが好ましい。即ち、画像の視野における細胞密度が高すぎると、複数の細胞が重なり合うことにより細胞数の正確な計測が困難となり好ましくなく、また画像の視野における細胞密度が低すぎると、多数の画像を取得して計測する必要が生じるため、効率が低下し、好ましくない。即ち、取得した画像の視野において複数の細胞が重なり合うことが実質的にないか、又はそれが少なくなるように、試料は必要に応じて希釈して使用することが好ましい。特に末梢血の場合は、血球密度が高いため、プレートに塗沫する際には希釈しないと細胞同士が重なり合い、画像解析の際に１個ずつの細胞を認識することが困難になる。末梢血の場合には、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32などの適当な希釈率で末梢血を希釈した試料を用いてイメージアナライザーで解析を行い、最適な希釈率を決定してから使用することが好ましい。
【００３０】
骨髄細胞又は末梢血細胞を含む試料は、常法によりプレートに塗沫される。試料を塗沫した後、風乾し、メタノールなどで固定してから分析に供することができる。プレートの種類は特に限定されないが、好ましくはプラスチックプレートを使用することができる。またプレートとしては、複数のウエルを有するマイクロプレートを使用することが好ましい。マイクロプレートとしては、６ウエル、１２ウエル、又は２４ウエルのマイクロプレートなどを使用できる。例えば、１２ウエルのプラスチックプレートに２〜３μLの試料を滴下し、1〜1.5cmにカットしたプラスチック片を使用してプレート上に塗沫することができる。上記したようなプラスチック片を使用して塗沫することにより、プラスチックプレートにも均一な細胞密度で安定して塗沫をすることができる。
【００３１】
また、従来から報告されている画像解析を利用した小核試験の自動計測法はスライドグラスに塗沫して、１枚ずつ染色し、カバーガラスをかけ、マニキュアで封入する等の作業をする必要があるためサンプルを作製するために手間がかかった。本発明の好ましい態様においては、複数のウエルを有するマイクロプレートを使用することにより、従来のスライドグラスに塗抹する方法と違い１枚ずつ標本を作成する作業は不要であり、世界中で使用頻度が増えているHigh Content Analysis (HCA)に使用される機器での分析が可能になり、分析時間および標本作製の時間の削減ができる。
【００３２】
工程（２）
工程（２）においては、プレート上の骨髄細胞又は末梢血細胞を、ＤＮＡを染色する第１蛍光色素、及び第１蛍光色素の励起波長とは異なる励起波長を有しＲＮＡを染色する第２蛍光色素で染色する。ＤＮＡを染色する第１蛍光色素で染色することにより、プレート上の細胞の小核が染色される。第２蛍光色素で染色することにより、多染性赤血球(PCE)が染色される。蛍光色素による細胞の染色は常法により行うことができ、例えば、ＰＢＳ等の緩衝液中に蛍光色素を含む染色液をプレートに添加し、室温で遮光放置した後、染色液を除去し、洗浄し、以後の測定に供することができる。
【００３３】
第１蛍光色素としては、ＤＮＡを染色する色素であればその種類は特に限定されず、例えば、2'-(4-エトキシフェニル)-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)-2,6'-ビ[1H-ベンゾイミダゾール]（Hoechst33342）、2'-(4-ヒドロキシフェニル)-5-(4-メチル-1-ピペラジニル)-2,5'-ビ-1H-ベンズイミダゾール（Hoechst33258）又は4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)などを使用することができる。
【００３４】
第２蛍光色素としては、第１蛍光色素の励起波長とは異なる励起波長を有しＲＮＡを染色する色素であればその種類は特に限定されず、例えば、ヨウ化プロピジウムなどを使用することができる。
上記の中でも、第１蛍光色素としてHoechst33342を使用し、第２蛍光色素としてヨウ化プロピジウムを使用することが特に好ましい。
【００３５】
工程（３）
工程（３）においては、イメージアナライザーによりプレート上の同一視野で、可視光による画像、第１蛍光色素による画像、及び第２蛍光色素による画像を取得する。例えば、第１蛍光色素としてHoechst33342を使用し、第２蛍光色素としてヨウ化プロピジウムを使用する場合には、同一視野で、フィルターなし（可視光）、励起／発光(Ex/Em)：350/461nm（Hoechst33342）、並びに励起／発光(Ex/Em)：530/625nm(ヨウ化プロピジウム)の画像を取得すればよい。可視光による画像には、プレート上の全細胞が観察される。第１蛍光色素による画像には、核（主核、小核、又はその両方）を有する細胞が観察される。第２蛍光色素による画像には、多染性赤血球(PCE)が観察される。
【００３６】
イメージアナライザーとしては、既存のイメージアナライザーを使用することができ、例えば、インセルアナライザー2000（GEヘルスケア）、ArrayScan VTI HCS Reader（サーモフィッシャー）、  MetaXpress（モレキュラーディバイス）、OperaTM（パーキンエルマー）などを使用することができる。上記したようなイメージアナライザーを使用することにより、画像を自動的に高速で保存することができる。
【００３７】
工程（４）
工程（４）においては、同一視野において、可視光で細胞として認識され、第１蛍光色素で染色される所定以上の面積の主核を有する細胞を有核球として解析から排除し、残りの細胞を全赤血球として計測する。なお、ここで計測される細胞には、小核を有する多染性赤血球（MNPCE）、多染性赤血球（PCE）および正染性赤血球（NCE）が含まれる。
【００３８】
上記により、白血球などの有核球を解析から除去することにより、多染性赤血球数における小核を有する多染性赤血球数の比率、及び／又は全赤血球数における多染性赤血球数の比率を正確に求めることが可能になる。工程（１）の説明において前記した通り、試料の塗沫に先立って試料に含まれる有核球をカラムなどにより除去することは、本発明の好ましい態様である。このように予め有核球を除去する場合であっても、有核球を完全に除去することはできないので、第１蛍光色素で染色されている核の大きさが所定の面積以上である場合には、有核球として解析から排除することが必要になる。ここで、有核球として解析から排除する基準となる所定の面積は、当業者であれば適宜設定することができる。以下の実施例においては、第１蛍光色素で染色される有核球の核の大きさを設定するために、画像をみながら面積を設定したところ、核の大きさを７μｍ２以上にした場合に、有核球を完全に除去し、かつ小核を同定しないことが判明したことから、有核球の核の面積の設定値を７μｍ２とした。しかし、有核球の核の面積の設定値は７μｍ２に限定されるものではなく、有核球を完全に除去し、小核を同定しない値であれば適宜設定することができる。このような有核球の核の面積の設定値としては、例えば、５〜１０μｍ２の何れかの値とすることができる。
【００３９】
工程（５）
工程（５）においては、同一視野において、（４）で全赤血球として認識された細胞の中で、第２蛍光色素で励起される細胞の数を、多染性赤血球（PCE）の数として計測する。
なお、工程（５）においては、標準サンプル等を用いて、顕微鏡下で目視により計測した場合のPCE比（即ち、全赤血球数における多染性赤血球数の比率）とおおよそ同じ比率になるように、第２蛍光色素の感度値を決定し、実際の計測では、その値より強い蛍光強度を持つ細胞の数を、第２蛍光色素で励起される細胞の数として計測することが好ましい。
【００４０】
これまでの画像解析法では、蛍光色素で染色されない正染性赤血球（NCE）の検出が課題となっていた。本発明においては、イメージアナライザーが可視光の画像からでも個々の細胞を認識することができることを利用して、可視光での画像も解析に使用することによりNCEのように蛍光染色されない細胞も細胞として認識するこことができる。これにより、本発明によれば、精度よくPCEとNCEを区別することができる。
【００４１】
工程（６）
工程（６）においては、同一視野において、（５）で多染性赤血球として認識された細胞の中で、第１蛍光色素で励起される所定の長さの直径の小核を有する細胞の数を、小核を有する多染性赤血球の数として計測する。工程（４）において、可視光で細胞として認識され、第１蛍光色素で染色される所定以上の面積の主核を有する細胞は、解析から排除されていることから、工程（６）における「第１蛍光色素で励起される細胞」とは、所定の長さの直径の小核をもった細胞である。好ましくは、工程（６）においては、多染性赤血球として認識され、第１蛍光色素で励起される核の直径が設定値の長さの範囲内である細胞の数を、小核を有する多染性赤血球の数として計測することができる。第１蛍光色素で励起される小核の大きさの設定値については、小核の大きさを考慮して設定することができる。小核は、一般的には、主核の直径の１／４程度の大きさである。但しPCEは脱核して核がないため、PCEの場合は、小核の大きさはPCEの直径（約10μｍ）の１／４程度以下に設定した。このような小核の直径の長さの設定値としては、例えば、0.6〜2.5μｍの何れかの値とすることができる。
【００４２】
以下の実施例の実験条件においては、第１蛍光色素で染色される小核の大きさを設定するために、PCEの直径の１／４程度の大きさの小核の画像をみながら、第１蛍光色素で励起される核の大きさの面積を設定したところ、小核の直径の長さは1μm（対物レンズ40倍の時5 pixel）であったため、設定値を1μmとした。
【００４３】
また、工程（６）においては、顕微鏡下において目視により計測した場合のMNPCE比（即ち、多染性赤血球数における小核を有する多染性赤血球数の比率）とおおよそ同じ比率になるように、予め第２蛍光色素の感度値を設定し、その値より強い蛍光強度を持つ細胞の数を、第２蛍光色素で励起される細胞の数として計測することが好ましい。
【００４４】
工程（７）
工程（７）においては、多染性赤血球数における小核を有する多染性赤血球数の比率、及び全赤血球数における多染性赤血球数の比率に基づいて、被験物質の遺伝毒性および骨髄毒性を評価する。
即ち、多染性赤血球数における小核を有する多染性赤血球数の比率が高い場合には、被験物質の遺伝毒性が高いと評価し、多染性赤血球数における小核を有する多染性赤血球数の比率が低い場合には、被験物質の遺伝毒性が低いと評価することができる。同様に、全赤血球数における多染性赤血球数の比率が高い場合には、被験物質の骨髄毒性が低いと評価し、全赤血球における多染性赤血球数の比率が低い場合には、被験物質の骨髄毒性が高いと評価することができる。一般的には、骨髄毒性がある用量（全赤血球に対する多染性赤血球の割合が対照群と比較して有意に減少する）が試験用量に含まれていることが望ましい。骨髄毒性のある用量を投与することにより、遺伝毒性又は骨髄毒性を評価するのに十分な量を投与していることが裏付けられる。
【００４５】
本発明において計測する細胞の数は特に限定されない。一例としては、多染性赤血球の数が２０００個以上となる画像まで計測を行うことにより多染性赤血球数における小核を有する多染性赤血球数の比率を求めることができ、また、全赤血球数が１０００個以上となる画像まで計測を行うことにより全赤血球数における多染性赤血球数の比率を求めることができる。
【００４６】
試料の状態にも依存するが、１２ウエルプレートを使用する場合、骨髄から採取した試料については１ウエルあたり取得する画像は20枚程度になり、末梢血の場合は１ウエルあたり取得する画像は200枚程度になる。これらの画像を保存して、解析した数値データをエクセル等により設定した上限の細胞数（例えば、PCEは2000個、全赤血球は1000個）を超える画像までのそれぞれの血球の数を自動的に集計することができる。
【００４７】
染色後のサンプルの測定可能時間について
以下の実施例においては、細胞を塗沫した12ウエルプレートに、Hoechest33342およびヨウ化プロピジウム（PI）を含有する染色液を添加し、30分間遮光放置した後、染色液を除去し、PBS(-)で洗浄し、新しいPBS(-)を添加してから測定に使用したが、多数の測定プレートがある場合は染色後の時間経過により安定したデータがとれなくなる場合がある。本発明においては、染色後24時間まではMNPCE比およびPCE比影響がないことを確認することができた。従って、本発明の方法は、スタッカーを用いた大量サンプルの無人測定を実施することも可能である。
【００４８】
遺伝毒性又は骨髄毒性評価試薬キット
上記の通り、本発明においては、被験物質を投与した動物から採取した細胞を、ＤＮＡを染色する第１蛍光色素、及び第１蛍光色素の励起波長とは異なる励起波長を有しＲＮＡを染色する第２蛍光色素で染色した後、可視光による画像、第１蛍光色素による画像、及び第２蛍光色素による画像を取得し、細胞数を計測することにより被験物質の遺伝毒性又は骨髄毒性の評価を行うことができる。上記方法で使用される、ＤＮＡを染色する第１蛍光色素と、第１蛍光色素の励起波長とは異なる励起波長を有しＲＮＡを染色する第２蛍光色素とを組み合わせることにより遺伝毒性又は骨髄毒性の評価のための試薬キットとして提供することができる。上記の遺伝毒性又は骨髄毒性の評価のための試薬キットを用いて、本発明の遺伝毒性又は骨髄毒性の評価方法を行うことができる。
【００４９】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５０】
実施例１：vivo遺伝毒性及び骨髄毒性試験における自動計測および人による目視計測による骨髄細胞及び末梢血細胞における、「多染性赤血球数における小核を有する多染性赤血球数の比率（以下、小核出現率とも略記する）」及び「全赤血球数における多染性赤血球数の比率（以下、PCE比とも略記する）」の比較
（１）染色用の細胞標本の作成
本発明の方法の精度（目視による計測結果との一致性）を検証するために、小核試験の代表的な陽性対照化合物であるマイトマイシンC（以下、MMCと略記）を段階的に投与したマウスの骨髄細胞中及び末梢血細胞中の小核出現率およびPCE比を、本発明の方法と人間の目視による計測法とで求めて比較した。
【００５１】
7週齢のCrlj:CD1 (ICR) マウス（雄）に、コントロールとして生理食塩液、陽性対照物質として代表的なMMCを0.5mg/kg、1mg/kg および2mg/kg（10mL/kg）の量で1日1回、2日連続で腹腔内投与し、3日目に麻酔下で腹大動脈よりあらかじめヘパリン溶液を通した注射筒で末梢血（PB）を100μL以上採血した。
【００５２】
安楽死させた後、大腿骨を摘出した。大腿骨の両端をハサミで切って、24Gの注射針をセットした注射筒を大腿骨の中に刺し、約1mLの25mM EDTA含有ウシ胎児血清（EDTA-FBS）で洗い出した。20mLのディスポーザブル注射筒の内底にレンズクリーニングティッシュ105（whatman）を敷き、注射筒の先端にはアクロディスクPSF（25mm, 10μm, PALL）をセットした。1gのカラム（Sigmatype50とalpha-celluloseの等量混合物）を注射筒に充填した。骨髄細胞は、セルストレーナー（40μm）（日本BD）を通して、一部を目視による計数用としてスライドガラスに塗沫した。残りの骨髄細胞をカラムに添加して約25mLのHBSS（Hanks’ Balanced Salt Solution）で50mL容チューブに溶出させた。遠心して上清を捨てた後に塗沫した時に細胞が重ならない濃度になるようにウシ胎児血清を添加した。
【００５３】
カラムで精製した骨髄細胞懸濁液、およびウシ胎児血清で1/16希釈した末梢血は12ウエルプラスチックプレートに２〜３μL滴下して、１〜1.5cmに切断したプラスチック片を使ってプレート上に塗沫した。目視計測用の標本は、ウシ胎児血清で1/2希釈したものをスライドグラスに塗沫した。12ウエルプレート及びスライドグラスは風乾した後、メタノールで細胞を固定した。
【００５４】
（２）染色、画像取得及び計測
メタノールで固定した12ウエルプラスチックプレートを、10μg/mL Hoechest33342および0.25μg/mL ヨウ化プロピジウム（PI）を含有するPBS(-)（以下、洗浄液）を各ウエルに1mLずつ添加し、室温で30分間遮光放置した後、染色液を除去し1mLのPBS(-)で洗浄し、新しいPBS(-)を1mL添加して測定に供した。12ウエルプレートは、インセルアナライザー2000（GEヘルスケア）で、１視野について可視光、ヘキストで染色される第一蛍光（Ex:350nm, Ex:461nm）およびヨウ化プロピジウム（PI）で染色される第二蛍光（Ex:530nm, Ex:625nm）の画像を取得し、その画像を重ね合わせることで、多染性赤血球（PCE）、正染性赤血球（NCE）及び小核を有する多染性赤血球数（MNPCE）を識別した（図１）。
【００５５】
PCEの数が2000個を超えた画像までに計数したPCE中のMNPCEの比率（%）、全赤血球（NCE+PCE）が1000個を超えた画像までに計数した全赤血球中のPCEの比率（%）を算出した。目視計測では、顕微鏡下で2000個のPCEを計測しその中に存在するMNPCEの数を識別した。さらに全赤血球中のPCEの比率(%)については、1000個の全赤血球中に存在するPCEの数を計測して算出した。
【００５６】
（３）骨髄における小核出現率及びPCE比
本発明の方法で計測された骨髄におけるPCE中のMNPCEの比率 (%)および全赤血球中のPCEの比率(%)、並びに顕微鏡下で目視により計測された骨髄におけるPCE中のMNPCEの比率 (%)および全赤血球中のPCEの比率(%)を表１に示す。
【００５７】
【表１】
2015017820.tif 000002
【００５８】
表１に示す通り、本発明の方法によって自動的に計測された骨髄（BM）におけるPCE中のMNPCEの比率 (%)および全赤血球中のPCEの比率(%)は、人の目視により計測された値に近かった(表１)。人の目視による計測法では、熟練した人が実施しても１サンプルを計測するのに20分程度かかる。従って、下記の表のサンプルを熟練者が計測すると、６(n数)×4（群）×2項目（PCE中のMNPCEの比率 (%)および全赤血球中のPCEの比率(%)）×20分＝960分（16時間）かかる。しかし、本発明の方法によれば、１サンプルに20〜30枚程度の画像で規定のPCE数を計測できるので、人の労力なしに約1.5時間（4分×24サンプル）で自動的にPCE中のMNPCEの比率 (%)および全赤血球中のPCEの比率(%)を算出するのに必要なMNPCE数、PCE数および全赤血球（PCE+NCE）数を計測することができる。
【００５９】
本発明の自動計測法を使用すると、今回実施した実験のように熟練者の16時間以上分の労力が無人化できるだけでなく、計測速度も１０倍以上向上することができる。
【００６０】
（４）末梢血における小核出現率及びPCE比
本発明の方法で計測された末梢血におけるPCE中のMNPCEの比率 (%)および全赤血球中のPCEの比率(%)、並びに顕微鏡下で目視により計測された骨髄におけるPCE中のMNPCEの比率 (%)および全赤血球中のPCEの比率(%)を表２に示す。
【００６１】
【表２】
2015017820.tif 000003
【００６２】
表２に示す通り、本発明の方法によって自動的に計測された末梢血におけるPCE中のMNPCEの比率 (%)および全赤血球中のPCEの比率(%)は、人の目視により計測された値に近かった(表２)。末梢血細胞は、正常血の場合95%程度がNCEであり5%程度がPCEである。従って、骨髄血と比較すると1視野（画像）の中のPCEの割合は、1/10以下程度のため、規定（2000個）のPCEを計測するためには、1サンプルにつき200枚程度の画像が必要である。従って、1サンプルを計測するのに25分程度の時間が必要である。末梢血の場合、血球の密度が濃いため自動計測では1/16希釈してプレートに塗抹しているので、骨髄の時と比較して末梢血では計測に時間がかかっている。目視による計測ではNCEは重なっても染色されず、PCE中のMNPCEの比率(%)を算出するためにはNCEの計測の必要がないため1/2〜1/3希釈程度でPCEの観察が可能である。このサンプルでは一視野で観察できるPCEの割合が多いので、人の目視による計測でも１サンプルあたり20分程度で規定のPCEの数を計測することができる。しかしながら、このサンプルはNCEの血球密度が濃いため、NCEを計測するのは困難である。そのため、PCE%を求めるためにはさらに希釈した別のサンプルを用意することが必要である。従って、末梢血の場合、本発明の自動計測と目視による計測ではデータの生成速度はあまり変わらないが、本発明の自動計測では、無人で、PCE中のMNPCEの比率 (%)および全赤血球中のPCEの比率(%)を算出するのに必要なMNPCE数、PCE数およびNCE数を同時に求めることができることから、データの生成時間において1/2程度の時間削減を実現できる。
【００６３】
［実施例２］vivo遺伝毒性及び骨髄毒性試験における自動計測および人の目視による計測による小核出現率およびPCE比のバラツキの比較
本発明で確立した方法の精度（バラツキ）を検証するために、小核試験の代表的な陽性対照化合物であるマイトマイシンC（MMC）（2mg/kg）またはビンブラスチン（VIN）（1mg/kg）を1日1回、2日連続で腹腔内投与し、3日目に骨髄血（BM）および末梢血（PB）を採取した。同一試料から４人分以上の目視計測用のスライドグラス標本および本発明の自動計測用の１２ウエルプラスチックプレートサンプルを作製した。人の目視による計測は、一定以上のスキルを持った４人の観察者（A、B、C、D）がコントロール、MMC投与およびVIN投与サンプルに対して1人につき、骨髄細胞および末梢血細胞におけるPCE中のMNPCEの比率 (%)および全赤血球中のPCEの比率(%)を算出するのに必要なMNPCE、PCEおよびNCEの数を５回ずつ計測した。本発明の自動計測法についても同様にそれぞれのサンプルについて５回ずつ測定を実施した。
【００６４】
骨髄におけるPCE中のMNPCEの比率 (%)および全赤血球中のPCEの比率(%)において、目視による計測（４人：A, B, C, D）と自動計測とのバラツキを比較した結果を図２に示し、末梢血におけるPCE中のMNPCEの比率 (%)および全赤血球中のPCEの比率(%)において、目視による計測（４人：A, B, C, D）と自動計測とのバラツキの比較した結果を図３に示す。
【００６５】
自動計測では、骨髄のPCE中のMNPCEの比率 (%)においては、コントロールのPCE中のMNPCEの比率 (%)でバラツキが大きい傾向が認められたが、MMC処理およびVIN処理サンプルではデータのバラツキは目視による計測と同じ程度であった（図２）。また、骨髄の全赤血球中のPCEの比率(%)は、すべてのサンプルにおいて自動計測と人の目視による計測のバラツキが同じ程度であった（図２）。
【００６６】
末梢血では、PCE中のMNPCEの比率 (%)および全赤血球中のPCEの比率(%)について、自動計測のバラツキは人の目視による計測と同じ程度であった（図３）。バラツキについては、個人内では小さいが、個人間でバラツキがある傾向があった。自動計測では客観的に測定することができることから、安定したデータを取得することができる。
【図１】
2015017820.tif 000004
【図２】
2015017820.tif 000005
【図３】
2015017820.tif 000006