(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍を有する対象を治療するための、対象における血管形成を阻害するための、卵巣癌を有する対象を治療するための、代謝障害を有する対象を治療するための薬学的組成物の製造における融合タンパク質の使用を提供する。【解決手段】シグナルペプチド、ヒトNotch3レセプタータンパク質の細胞外ドメインのEGFリピート1-X（当該Xは、12〜34の任意の整数である）、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナルペプチド、ヒトNotch3レセプタータンパク質の細胞外ドメインのEGFリピート 1-X（当該Xは、12〜34の任意の整数である）、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質。
【請求項２】
シグナルペプチド、ヒトNotch3レセプタータンパク質の細胞外ドメインのEGFリピート 1-X（当該Xは、1〜10の任意の整数である）、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質。
【請求項３】
シグナルペプチド、ヒトNotch3レセプターの細胞外ドメインの少なくとも12のEGFリピート、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質。
【請求項４】
シグナルペプチド、ヒトNotch3 レセプタータンパク質の細胞外ドメインのEGFリピート（ここで、少なくとも12のEGFリピートが存在する）、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質。
【請求項５】
前記抗体のFc部分がヒト抗体のFc部分である請求項1〜4の何れか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記シグナルペプチドがNotch3またはIgG重鎖のシグナルペプチドである請求項1〜4の何れか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記Notch１レセプタータンパク質の細胞外ドメインが、EGF様リピート1-34を含む請求項1, 3 または4に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
配列番号32に記載の配列である連続したアミノ酸を含む請求項1, 3 または4に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
配列番号33に記載の配列である連続したアミノ酸を含む請求項1, 3 または4に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
配列番号31に記載の配列である連続したヌクレオチドによりコードされた請求項1, 3または4に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
配列番号34に記載の配列である連続したヌクレオチドによりコードされた請求項1, 3または4に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
対象を治療するために有効な量の請求項1〜11の融合タンパク質を前記対象投与し、それにより腫瘍を有する前記対象を治療することを含む、腫瘍を有する対象を治療する方法。
【請求項１３】
対象において血管形成を阻害するために有効な量の請求項1〜11の融合タンパク質を前記対象に投与し、それにより当該対象における血管形成を阻害することを含む、対象において血管形成を阻害する方法。
【請求項１４】
対象を治療するために有効な量の請求項1〜11の融合タンパク質を前記対象投与し、それにより卵巣癌を有する前記対象を治療することを含む、卵巣癌を有する対象を治療する方法。
【請求項１５】
対象を治療するために有効な量の請求項1〜11の融合タンパク質を前記対象投与し、それにより代謝障害を有する前記対象を治療することを含む、代謝障害を有する対象を治療する方法。
【請求項１６】
前記代謝障害が、糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化、虚血、発作、または循環器病である請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍を有する対象を治療する薬学的組成物の製造のための請求項1〜11の融合タンパク質の使用。
【請求項１８】
対象における血管形成を阻害する薬学的組成物の製造のための請求項1〜11の融合タンパク質の使用。
【請求項１９】
対象において生理的なリンパ管形成または病理的なリンパ管形成を阻害するために有効な量の請求項1〜11の何れかの融合タンパク質を前記対象に投与することを含む、当該対象における生理的なリンパ管形成または病理的なリンパ管形成を阻害するための方法。
【請求項２０】
前記病理的なリンパ管形成が腫瘍リンパ管形成またはリンパ節転移である請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
対象において腫瘍転移を阻害するために有効な量の請求項1〜11の何れかの融合タンパク質を該対象に投与することを含む、該対象における腫瘍転移を阻害する方法。
【請求項２２】
前記転移は、血管、リンパ性脈管構造またはリンパ節を介して生じる請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
対象において二次性腫瘍の成長を阻害するために有効な量の請求項1〜11の何れかの融合タンパク質を該対象に投与することを含む、該対象における二次性腫瘍の成長を阻害する方法。
【請求項２４】
前記二次性腫瘍の成長は、二次性腫瘍に関連する血管形成の阻害により阻害される請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
対象において腫瘍による血管取り込み（blood vessel cooption）を阻害するために有効な量の請求項1〜11の何れかの融合タンパク質を該対象に投与することを含む、該対象における腫瘍による血管取り込みを阻害する方法。
【請求項２６】
それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の請求項1〜11の何れかの融合タンパク質と血管内皮成長因子(VEGF)のインヒビターとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法。
【請求項２７】
前記VEGFのインヒビターが、VEGF-A, PGIF, VEGF-B, VEGF-C, またはVEGF-Dのインヒビターである請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の請求項1〜11の何れかの融合タンパク質とVEGFレセプターのインヒビターとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法。
【請求項２９】
前記VEGFレセプターのインヒビターが、VEGFR-1インヒビター、VEGFR-2インヒビターまたはVEGFR-2インヒビターである請求項29に記載の方法。
【請求項３０】
それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の請求項1〜11の何れかの融合タンパク質と血小板由来増殖因子(PDGF)のインヒビターとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法。
【請求項３１】
血小板由来成長因子のインヒビターは、PDGF-AのインヒビターまたはPDGF-Bのインヒビターである請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の請求項1〜11の何れかの融合タンパク質とPDGFレセプターアンタゴニストとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法。
【請求項３３】
PDGFレセプターアンタゴニストは、PDGFレセプターBアンタゴニストである請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の請求項1〜11の何れかの融合タンパク質とHER2/neuのインヒビターとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法。
【請求項３５】
対象における乳癌を治療するために有効な量の請求項1〜11の何れかの融合タンパク質を対象に投与することを含む、対象における乳癌を治療する方法。
【請求項３６】
乳癌を有する対象を治療する薬学的組成物の製造のための請求項1〜11の何れかの融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の説明】
【０００１】
ここに開示される本発明は、米国保険研究所（National Institutes of Health）からの助成番号R01HL62454号、並びに国防総省からの助成番号DAMRDCW81XWH-04-1-054の米国政府の支援によりなされた。従って、合衆国政府は本発明において特定の権利を有する。
この出願を通して、種々の出版物がカッコ内にアラビア数字により、または括弧内に著者および出版データにより引用される。これらの出版物についての全引用は、本明細書の最後に見出すことが可能である。これらの出版物の開示は、引用により本出願に援用されて本発明の属する技術分野がより十分に記載される。
【０００２】
［発明の背景］脈管の発生
哺乳類の胚発生の期間において、脈管系の形成は早期の必須のプロセスである。胚における脈管の発生は沿軸（paraxial）および側板（lateral）中胚葉に由来する多能性の血管芽細胞で開始される。血管芽細胞（hemangioblast）は、血液前駆体（hematopoietic progenitor）または内皮細胞前駆体の何れにも分化する可能性を有し、血管芽細胞（angioblast）として知られる。  
血管の発達は、脈管形成として知られる過程で開始し、それにより血管芽細胞が内皮細胞に分化し、遊走し、それと共に初期の脈管叢（vascular plexus）を形成する。この初期の血管ネットワークは、大きさが均質であり、全て内皮細胞で作られている脈管からなる。脈管叢は、次に血管形成（angiogenesis）を経て再構築される。  
血管形成は、新しい血管（vessels）の出芽、これら血管の無血管領域への遊走、および付属細胞、周細胞および平滑筋細胞のリクルートを含む（Gale and Yancopoulos, 1999）。分化し、収縮性のある血管壁を形成する平滑筋細胞は、神経冠細胞（neural crest cells）、間充織細胞（mesenchymal cells）および更に内皮細胞までも含む多数の前駆体から生じる（Owens, 1995）。成人において、血管形成は、濾胞の発達（follicular development）、創傷治癒、並びに腫瘍の血管形成および心疾患などの病理学的過程に関与する。
【０００３】
NotchファミリーおよびNotchリガンド
ショウジョウバエ（Drosophila）、C.エレガンス（C. Elegans）、ゼブラフィッシュ（zebrafish）および哺乳類の研究は、Notch経路が、多数の細胞運命の決定を調節するために機能する進化的に保存されたシグナリング機構であることを示している。Notchシグナリングは、三つの胚葉全てから生ずる細胞の適切なパターニングのために必要とされる。細胞の状況に依存して、Notchシグナリングは、分化を阻害も誘導もし、増殖を誘導し、細胞生存（cell survival）を促進することが可能である(Artavanis-Tsakonas et al., 1995; Lewis, 1998; Weinmaster, 1997)。ショウジョウバエにおいて、単一のNotchタンパク質が二つのリガンド、セレイト（Serrate）とデルタ（Delta）により活性化される。哺乳類において、これらのファミリーは四つのNotch遺伝子（Notch1、Notch2、Notch3およびNotch4）と五つのリガンド、２つのセレイト様（Jagged1-2）と３つのデルタ（Dl1、3、4）にまで広がっている(Bettenhausen et al., 1995; Dunwoodie et al., 1997; Gallahan and Callahan, 1997; Lardelli et al., 1994; Lindsell et al., 1995; Shawber et al., 1996a; Shutter et al., 2000a; Uyttendaele et al., 1996; Weinmaster et al., 1992; Weinmaster et al., 1991)。胚発生の間、Notchレセプターおよびリガンドは、動的に空間的且つ時間的なパターンで発現される。しかしながら、全てのリガンドが全てのレセプターを活性化するのかどうかは不明である。
【０００４】
Notchシグナリングと機能Notchシグナリングは、環境的な状況に依存する阻害性、誘導性または増殖性のシグナルを供給することによって多くの異なる種類の細胞の運命の決定に影響している（Artavanis-Tsakonas et al., 1995; Greenwald, 1998; Robey, 1997; Vervoort et al., 1997に総説されている)。この多面的な機能は、Notchが空間時間的な様式において複数のシグナル経路を調節することを示唆する。  
Notchが細胞運命の決定を制御することと一致して、レセプターとリガンドの双方は細胞表面タンパク質であり、単一の膜貫通ドメインを有する（図１）。Notchタンパク質の調節性の細胞外ドメインは、大部分がタンデムに配置されたEGF様リピートからなり、これはリガンド結合のために必要である(Artavanis-Tsakonas et al., 1995; Weinmaster, 1998)。EGF様リピートのC末端は、付加的な三つのシステインリッチリピートであり、LIN12/Notchリピート（LIN12/Notch repeats；(LNR)）と称される(Greenwald, 1994)。LNRの下流に、フーリン様転換酵素（furin-like convertase）により認識されるタンパク分解性の切断配列（RXRR）が位置する。Notch1については、この部位での切断により180キロダルトンの細胞外ペプチドと120キロダルトンの細胞内ペプチドが得られ、これらは共に保持されて細胞表面でヘテロダイマーレセプターを生じる(Blaumueller et al., 1997; Kopan et al., 1996; Logeat et al., 1998)。  
Notchの細胞内ドメイン(NotchICD、図１)は、Notchの機能喪失表現型をレスキューし、この形態のNotchが構成的にシグナルを出すことを示している(Fortini and Artavanis-Tsakonas, 1993; Lyman and Young, 1993; Rebay et al., 1993; Struhl et al., 1993)。
【０００５】
Notchの細胞質ドメインは三つの同定可能なドメインであるRAMドメインおよびアンキリンリピートドメインおよびC末端PESTドメインを含む（図１）。リガンド活性化において、Notchは二つの更なるタンパク分解性の切断を受け、その結果、細胞質ドメインの放出が起こる(Weinmaster, 1998)。このNotchペプチドは核にトランスロケートし、CSL(CBF, Su (H), Lag-2)として知られる転写リプレッサーと相互作用し、それを転写アクチベーターに変える。CSL/Notch相互作用はNotchのRAMドメインの存在に依存し；転写活性はアンキリンリピートの存在を必要とする(Hsieh et al., 1996; Hsieh et al., 1997; Roehl et al., 1996; Tamura et al., 1995; Wettstein et al., 1997)。インビボおよびインビトロの両方の研究によって、HESおよびHey遺伝子がNotch/CSL依存性シグナリングの直接のターゲットであることが示されている(Bailey and Posakony, 1995; Eastman et al., 1997; Henderson et al., 2001; Jarriault et al., 1995; Nakagawa et al., 2000; Wettstein et al., 1997)。HESおよびHey遺伝子は、bHLH転写性リプレッサーであり、N-boxでDNAを結合する(Nakagawa et al., 2000; Sasai et al., 1992; Tietze et al., 1992)。Notchはまた、CSL非依存性の経路によりシグナリングすることも提唱されている。実際、アンキリンリピートドメインの発現はNotchシグナリングの幾つかの形態のために必要十分である(Lieber et al., 1993; Matsuno et al., 1997; Shawber et al., 1996b)。  
最後に、PESTドメインは、SEl-10/ユビキチン依存性経路によるタンパク質ターンオーバーに関連している(Greenwald, 1994; Oberg et al., 2001; Rogers et al., 1986; Wu et al., 1998; Wu et al., 2001)。当該レセプターと同様に、Notchリガンドの細胞外ドメインもまた、直列に配列されるEGF様リピートの大部分からなる（図１）。これらのリピートの上流は、当該レセプターのリガンド結合と活性化のために必要とされるDSL(Delta, Serrate, Lag-2)として知られる異なるEGF様リピートである(Artavanis-Tsakonas et al., 1995)。
【０００６】
Notchシグナリングおよび脈管発生脈管形成（vasculogenesis）および血管形成（angiogenesis）を誘導するために機能する多くの遺伝子が同定されているが、脈管発生の間にどのように細胞運命決定が特定化されるのかについては殆ど知られていない。幾つかの観察は、Notchシグナリング経路が細胞運命の決定と脈管系のパターニングに役割を担い得ることを示唆する。
【０００７】
Notch1、Notch4、Jagged1およびDl14は、全て発生中の脈管において発現され、他方でNotch３は付属的な平滑筋細胞において発現される(Krebs et al., 2000; Shutter et al., 2000b; Uyttendaele et al., 1996; Villa et al., 2001; Xue et al., 1999)。Jaggel1欠損マウスは、胚致死性であり、血管の重篤な欠陥を有する(Xue et al., 1999)。Notch1のヌル接合体マウスは、胚致死性であり、神経細胞の重篤な欠陥で死に至り、血管形成の欠陥も有する(Krebs et al., 2000; Swiatek et al., 1994)。Notch4欠損マウスは誕生し、正常であるように見えるが、Notch1およびNotch4の両方を欠損した胎芽は、重篤な出血と脈管のパターニングの欠陥でE9.5で死に至り、これはNotch1およびNotch4が血管発生の間に機能的に冗長である可能性を示している(Krebs et al., 2000)。内皮におけるNotch4の活性型の外因性発現もまた、二重のNotch1/Notch4ヌル接合体マウスについて見られるのと同様な脈管の欠陥を引き起こし、Notchシグナリングの適切なレベルが、胚の脈管構造（vasculature）の適切な発生のために重要な意味を有することを示唆している(Uyttendaele et al., 2001)。  
まとめると、Notch/Notchシグナル因子に関するマウス変異体からのデータによって、脈管のリモデリング、動脈静脈特異化、血管平滑筋細胞のリクルートおよび心臓/心流出血管の発生を含むNotch依存性の幾つかの過程が明らかとされる。
【０００８】
最近の実験は、動脈/静脈の内皮細胞特異化（endothelial cell specification）にNotchシグナリングを結び付けている。E13.5胚のインサイチュー分析によって、Notch1、Notch3、Notch4、Dl4、Jagged1およびJagged2発現が動脈に限定され、静脈では欠けていることが明らかとされた(Villa et al., 2001)。発現データと一致して、ゼブラフィッシュにおけるNotchシグナリングの破壊が、動脈性マーカーのエフリンB2の欠損と関連し、他方でNotchの活性型の異所性の発現が背動脈内の静脈性細胞マーカーEphB4の欠損を導く(Lawson et al., 2001)。これらのデータは、Notchシグナリングが血管形成の間の動脈性および静脈性の細胞運命の特定を援助する可能性を示唆する。  
まとめると、Notch/Notchシグナル因子に関するマウス変異体からのデータによって、脈管のリモデリング、動脈静脈特異化（arterial venous specification）、血管平滑筋細胞のリクルートおよび心臓/心流出血管（heart outflow vessel）の発生を含むNotch依存性の幾つかの過程が明らかとされる。
【０００９】
Notchシグナリングはまた、成人の脈管系において機能することも示唆されている。ヒトにおいて、Notch3の細胞外ドメインにおけるミスセンス変異は退行性の血管性疾患、CADASILの発生に関連する(Caronti et al., 1998; Desmond et al., 1998; Joutel et al., 2000; Joutel et al., 1996)。創傷治癒モデルにおいて、Jagged1発現の増加が、再生している内皮の創傷縁で観察され、Notchシグナリングが成人の血管形成の過程において機能している可能性が示唆されている(Lindner et al., 2001)。まとめると、これらのデータは、脈管発生:  脈管形成、脈管のパターニング/血管形成、および動脈/静脈特定化（arterial/venous specification）の間で重要な意味を持つ幾つかの段階でのNotchシグナリング機能を支持する。しかしながら、Notchシグナリング経路がこれらの異なる段階に影響することについての分子的な機序が更に明らかにされるべきである。
【００１０】
［重要性］Shimizu等（J. Biol. Chem. 274(46): 32961-32969 (1999)）は、結合試験におけるNotch1ECD/Fc, Notch2ECD/FcおよびNotch3ECD/Fcの使用を記載する。しかしながら、Shimizu等は、血管形成を阻害するためのそれらのタンパク質の使用には言及していない。  
Kitajewski等に対する2002年4月30日発行の米国特許第6,379,925号は、マウスのNotch4を記載する。しかしながら、それは、対象の出願において示されるNotchに基づく融合タンパク質を記載するものではない。  
Notchタンパク質は、脈管構造、造血系および神経系を含む発生上の決定において重要な役割を果たしている。従って、それらの機能の理解は、細胞の運命決定およびコミットメントが発生期間および成人組織においてどのように制御されているのかを理解するための鍵である。今日まで、NotchまたはNotchリガンド遺伝子の破壊についての幾つかの報告によって、幾つかの血管の表現系が記載されており、この経路が脈管の発生を導く機構の基礎的なパートであることが強調されている。異常なNotch活性は、癌および血管性疾患（CADASIL）の双方を含むヒトの病理に関連付けられてきた。腫瘍の血管形成におけるNotchの分析は最近になって始まったものであるが、我々のNotchの潜在的な下流のターゲットの発見により血管形成に関連する病理学的な過程における役割が示唆される。例えば、VEGFR-3は腫瘍血管形成および腫瘍リンパ管形成の双方に関連している。幾つかの他の潜在的なNotchターゲットの発現または機能も腫瘍の血管形成に関連している：それらにはエフリンB2（ephrinB2）、Id3、アンジオポイエチン1（Angiopoietin 1）およびPDGF-Bが含まれる。Notch遺伝子機能におけるこれらのターゲットの役割についての見識によって、ヒトの病理におけるNotchの将来の分析が明らかに促進されるであろう。
【００１１】
[発明の概要]
本発明は、シグナルペプチド、ヒトNotch3レセプタータンパク質の細胞外ドメインのEGFリピート 1-X（当該Xは、12〜34の任意の整数である）、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質を提供する。  
本発明は、シグナルペプチド、ヒトNotch3レセプタータンパク質の細胞外ドメインのEGFリピート 1-X（当該Xは、1〜10の任意の整数である）、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質を提供する。  
本発明は、シグナルペプチド、ヒトNotch3レセプターの細胞外ドメインの少なくとも12のEGFリピート、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質を提供する。  
本発明は、シグナルペプチド、ヒトNotch3 レセプタータンパク質の細胞外ドメインのEGFリピート（ここで、少なくとも12のEGFリピートが存在する）、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質を提供する。
【００１２】
本発明は、前記対象に上記の融合タンパク質の対象を治療するために有効な量を投与し、それにより腫瘍を有する前記対象を治療することを含む、腫瘍を有する対象を治療する方法を提供する。  
本発明は、対象において血管形成を阻害するために有効な量の上記融合タンパク質を前記対象に投与し、それにより当該対象における血管形成を阻害することを含む、対象において血管形成を阻害する方法を提供する。  
本発明は卵巣癌を有する対象を治療する方法を提供し、該方法は該対象の治療のために有効な量の上記融合タンパク質を前記対象に投与し、それにより卵巣癌を有する前記対象を治療することを含む。
【００１３】
本発明は、腫瘍を有する対象を治療する薬学的組成物の製造のための上記融合タンパク質の使用を提供する。  
本発明は、対象における血管形成を阻害する薬学的組成物の製造のための上記融合タンパク質の使用を提供する。  
本発明は、卵巣癌を有する対象を治療する薬学的組成物の製造のための上記融合タンパク質の使用を提供する。  
本発明は、代謝障害（metabolic disorder）を有する対象を治療する薬学的組成物の製造のための上記融合タンパク質の使用を提供する。
【００１４】
本発明は、対象において生理的なリンパ管形成または病理的なリンパ管形成を阻害するために有効な量の上記融合タンパク質を前記対象に投与することを含む、当該対象における生理的なリンパ管形成または病理的なリンパ管形成を阻害するための方法を提供する。
本発明は、対象における腫瘍転移を阻害するために有効な量の上記融合タンパク質を対象に投与することを含む、対象における腫瘍転移を阻害する方法を提供する。  
本発明は、対象における二次的な腫瘍の成長を阻害するために有効な量の上記融合タンパク質を対象に投与することを含む、対象における二次的な腫瘍の成長を阻害する方法を提供する。  
本発明は、対象における腫瘍による血管取り込み（blood vessel cooption）を阻害するために有効な量の上記融合タンパク質を前記対象に投与することを含む当該対象における腫瘍による血管取り込みを阻害する方法を提供する。
【００１５】
本発明は、それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の上記融合タンパク質と血管内皮成長因子(VEGF)のインヒビターとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法を提供する。  
本発明は、それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の上記融合タンパク質とVEGFレセプターインヒビターとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法を提供する。  
本発明は、それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の上記融合タンパク質と血小板由来増殖因子(PDGF)のインヒビターとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法を提供する。  
本発明は、それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の上記融合タンパク質とPDGFレセプターアンタゴニストとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法を提供する。  
本発明は、それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の上記融合タンパク質とHER2/neuのインヒビターを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法を提供する。  
本発明は、対象における乳癌を治療するために有効な量の上記融合タンパク質を対象に投与することを含む、対象における乳癌を治療する方法を提供する。  
本発明は、乳癌を有する対象を治療するための薬学的組成物の製造のための上記融合タンパク質の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】この図は、NotchおよびNotchリガンド：Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、Delta様1、Delta様3、Delta様4：の模式的な構造を示す。
【図２】この図は、Notchに基づく融合タンパク質（NotchECD/Fc）のデザインを模式的に示す。EGFリピートを含むNotch1、Notch2、Notch3またはNotch4の細胞外ドメインは抗体のFc部分に対して融合される。
【図３】この図は、Notchに基づく融合タンパク質の活性を試験するための共培養アッセイを示す。NotchおよびNotch応答性転写レポーターは、「Notch応答性（Notch-responsive）」細胞HeLaにおいて発現される。Notchリガンド、Jagged-1、Delta様1またはDelta様4は、「リガンド提示」細胞293において発現される。発現は個々の細胞集合体のトランスフェクションにより媒介され、細胞は共培養され、次にNotch依存性レポーター活性についてアッセイされる。
【図４】この図は、NotchとNotchリガンドとの間の相互作用によるNotchシグナリングの活性化に対するNotchに基づく融合タンパク質の阻害活性を示す。Notchシグナリングの誘導は、Notch1および3タイプのNotchリガンド発現細胞の双方の共培養により検出され、これらの誘導はNotchに基づく融合タンパク質発現ベクターのNotch1発現細胞への共トランスフェクションにより阻害された。従って、Notchに基づく融合タンパク質は、NotchとNotchリガンドとの間の相互作用の阻害に基づくNotchインヒビターとして使用可能である。
【図５】この図は、293におけるNotch1に基づく融合タンパク質（Notch1ECD/Fc）の発現を示す。パネルA:  細胞溶解物における発現(lys)または培地に分泌された発現(sup)。パネルB:  293溶解物におけるNECD/Fcの発現の一覧。
【図６】この図は、アデノウイルスコーディングVEGF-165に感染させたHUVECにおけるNotchシグナリングの活性化を示す。Notchシグナリングの活性化は、CBF1プロモーター活性を使用して検出される。CBF1プロモーターの転写活性は、Notch-ICのCBF1への結合により活性化される。我々は、異なるMOIでアデノウイルスコーディングVEGF-165に感染させたHUVECにおけるCBF1プロモーター活性を測定した。CBF1プロモーターの導入は、Ad-LacZ感染細胞と比較して、MOIに依存する様式でAd-VEGF感染HUVECにおいて明らかに検出された。このデータは、VEGFの過剰発現がHUVECにおけるNotchシグナリングを活性化できることを示した。
【図７】この図は、NotchシグナリングのVEGF誘導性の活性化におけるNotchに基づく融合タンパク質の効果を示す。Ad-Notchに基づく融合タンパク質のAd-VEGFとの重感染は、Ad-VEGF感染単独により誘導されるCBF1プロモーター活性の活性化を明らかに減少させた。パネルAにおいて、各アデノウイルスについて40MOIでの感染の場合、レポーター遺伝子のトランスフェクション後の24時間での60％の阻害と48時間での90％の阻害が検出された。このNotchトラップの阻害活性は、Ad-Notchに基づく融合タンパク質のMOIに依存した。
【図８】この図は、HUVECで過剰発現されたVEGF-165による出芽の誘導におけるNotchに基づく融合タンパク質の効果を我々が評価した実験を示す。Ad-VEGF感染HUVECをタイプ  コラーゲンゲルにおいて8日間培養した場合、出芽はコラーゲンゲルにおいて誘導された。過剰発現されたVEGFによる出芽のこの誘導は、アデノウイルスコーディングNotchベース融合タンパク質（adenoviral-encoding Notch-based fusion proteins）の重感染により明らかに阻害された。Ad-Notchに基づく融合タンパク質（Ad-Notch-based fusion protein）自身は、形態学上の影響は少なかった。
【図９】この図は、顕微鏡下で視野当たりの芽（buds）をカウントした結果を示す。HUVECへのAd-VEGF感染は使用されたMOIに依存して芽の数が増加した。Notchに基づく融合タンパク質の半分のMOIが使用された場合でさえも、Ad-VEGF誘導性の出芽はAd-VEGFと比較して明らかに阻害された。これらのデータは、VEGFがHUVECの出芽をNotchシグナリングの活性化を介して誘導し、Notchに基づく融合タンパク質がVEGF誘導性の出芽を阻害できることを示唆した。
【図１０】この図は、ラットNotch1タンパク質の細胞外ドメイン（配列番号１）とリンカー配列（配列番号２）のアミノ酸配列を示す。
【図１１】この図は、ラットNotch2タンパク質の細胞外ドメイン（配列番号３）とリンカー配列（配列番号２）のアミノ酸配列を示す。
【図１２】この図は、マウスNotch3タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す（配列番号４）。
【図１３】この図は、マウスNotch4タンパク質の細胞外ドメイン（配列番号5）とリンカー配列（配列番号２）のアミノ酸配列を示す。
【図１４Ａ】図14A - 14B  この図は、ラットNotch1遺伝子の細胞外ドメインの核酸配列（配列番号６）を示す。
【図１４Ｂ】図14A - 14B  この図は、ラットNotch1遺伝子の細胞外ドメインの核酸配列（配列番号６）を示す。
【図１５Ａ】図15A - 15B  この図は、ラットNotch2遺伝子の細胞外ドメインの核酸配列（配列番号7）を示す。
【図１５Ｂ】図15A - 15B  この図は、ラットNotch2遺伝子の細胞外ドメインの核酸配列（配列番号7）を示す。
【図１６Ａ】図16A - 16B  この図は、マウスNotch3遺伝子の細胞外ドメインの核酸配列（配列番号8）を示す。
【図１６Ｂ】図16A - 16B  この図は、マウスNotch3遺伝子の細胞外ドメインの核酸配列（配列番号8）を示す。
【図１７Ａ】図17A - 17B  この図は、マウスNotch4遺伝子の細胞外ドメインの核酸配列（配列番号９）、並びにリンカー配列の核酸配列（配列番号１０）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１７Ｂ】図17A - 17B  この図は、マウスNotch4遺伝子の細胞外ドメインの核酸配列（配列番号９）、並びにリンカー配列の核酸配列（配列番号１０）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１８Ａ】図18A - 18B  この図は、ヒトNotch1遺伝子の細胞外ドメインの核酸配列（配列番号11）を示す。
【図１８Ｂ】図18A - 18B  この図は、ヒトNotch1遺伝子の細胞外ドメインの核酸配列（配列番号11）を示す。
【図１９Ａ】図19A - 19B  この図は、ヒトNotch2 遺伝子の細胞外ドメインの核酸配列（配列番号12）を示す。
【図１９Ｂ】図19A - 19B  この図は、ヒトNotch2 遺伝子の細胞外ドメインの核酸配列（配列番号12）を示す。
【図２０Ａ】図20A - 20B  この図は、ヒトNotch3 遺伝子の細胞外ドメインの核酸配列（配列番号13）を示す。
【図２０Ｂ】図20A - 20B  この図は、ヒトNotch3 遺伝子の細胞外ドメインの核酸配列（配列番号13）を示す。
【図２１Ａ】図21A - 21B  この図は、ヒトNotch4 遺伝子の細胞外ドメインの核酸配列（配列番号14）を示す。
【図２１Ｂ】図21A - 21B  この図は、ヒトNotch4 遺伝子の細胞外ドメインの核酸配列（配列番号14）を示す。
【図２２Ａ】図22A - 22I  これらの図は、VEGFがNotchシグナリングを活性化してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECは、40 MOI（図２２Ａ、２２Ｈ、２２Ｉ）または20 MOI（図22C, 22G）でAd-VEGFを形質導入された。Ad-LacZをHUVECに対して同時形質導入して、同じトータルのアデノウイルスの60 MOI (図 22G), 80 MOI (図 22A) および100 MOI (図 22H, 22I)とした。図２２ＡはNotchおよびNotchリガンド発現のRT-PCR分析を示す。数字はPCRサイクルを示す。図２２Ｂは、CSLレポーター活性における形質導入したVEGFの効果を示す。図２２Ｃは、Ad-VEGFによりトランス活性化（transactivated）されたCSLレポーター活性におけるSU5416の効果を示す。図２２ＤはNotchデコイ（N1ECDFc）の構築物を示す。図２２ＥはAd-N1ECDFcを形質導入されたHUVECからのN1ECDFcの分泌を示す。図２２Ｆは共培養アッセイでのリガンド誘導性CSLレポーター活性に対するN1ECDFcの効果を示す（白四角：（-）；黒四角：0.33 ng pHyTC-N1ECDFc; 黒四角：0.67 ng pHyTC-N1ECDFc）。図２２Ｇ−Ｉは、Ad-VEGF形質導入HUVECに対するN1ECDFcの効果を示す。Notchシグナリングは、表示された用量でのAd-N1ECDFcの同時形質導入の存在または不在におけるHUVECへのAd-VEGFの形質導入により活性化された。図22Gは、Ad-VEGFによりトランス活性化されたCSLレポーター活性におけるN1ECDFcの効果を示す。図２２Ｈは、40 MOIのAd-N1ECDFcの同時形質導入によるAd-VEGF形質導入HUVECの出芽の阻害を示す。図２２ＩはAd-VEGF形質導入HUVECの出芽におけるN1ECDFcの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。
【図２２Ｂ】図22A - 22I  これらの図は、VEGFがNotchシグナリングを活性化してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECは、40 MOI（図２２Ａ、２２Ｈ、２２Ｉ）または20 MOI（図22C, 22G）でAd-VEGFを形質導入された。Ad-LacZをHUVECに対して同時形質導入して、同じトータルのアデノウイルスの60 MOI (図 22G), 80 MOI (図 22A) および100 MOI (図 22H, 22I)とした。図２２ＡはNotchおよびNotchリガンド発現のRT-PCR分析を示す。数字はPCRサイクルを示す。図２２Ｂは、CSLレポーター活性における形質導入したVEGFの効果を示す。図２２Ｃは、Ad-VEGFによりトランス活性化（transactivated）されたCSLレポーター活性におけるSU5416の効果を示す。図２２ＤはNotchデコイ（N1ECDFc）の構築物を示す。図２２ＥはAd-N1ECDFcを形質導入されたHUVECからのN1ECDFcの分泌を示す。図２２Ｆは共培養アッセイでのリガンド誘導性CSLレポーター活性に対するN1ECDFcの効果を示す（白四角：（-）；黒四角：0.33 ng pHyTC-N1ECDFc; 黒四角：0.67 ng pHyTC-N1ECDFc）。図２２Ｇ−Ｉは、Ad-VEGF形質導入HUVECに対するN1ECDFcの効果を示す。Notchシグナリングは、表示された用量でのAd-N1ECDFcの同時形質導入の存在または不在におけるHUVECへのAd-VEGFの形質導入により活性化された。図22Gは、Ad-VEGFによりトランス活性化されたCSLレポーター活性におけるN1ECDFcの効果を示す。図２２Ｈは、40 MOIのAd-N1ECDFcの同時形質導入によるAd-VEGF形質導入HUVECの出芽の阻害を示す。図２２ＩはAd-VEGF形質導入HUVECの出芽におけるN1ECDFcの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。
【図２２Ｃ】図22A - 22I  これらの図は、VEGFがNotchシグナリングを活性化してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECは、40 MOI（図２２Ａ、２２Ｈ、２２Ｉ）または20 MOI（図22C, 22G）でAd-VEGFを形質導入された。Ad-LacZをHUVECに対して同時形質導入して、同じトータルのアデノウイルスの60 MOI (図 22G), 80 MOI (図 22A) および100 MOI (図 22H, 22I)とした。図２２ＡはNotchおよびNotchリガンド発現のRT-PCR分析を示す。数字はPCRサイクルを示す。図２２Ｂは、CSLレポーター活性における形質導入したVEGFの効果を示す。図２２Ｃは、Ad-VEGFによりトランス活性化（transactivated）されたCSLレポーター活性におけるSU5416の効果を示す。図２２ＤはNotchデコイ（N1ECDFc）の構築物を示す。図２２ＥはAd-N1ECDFcを形質導入されたHUVECからのN1ECDFcの分泌を示す。図２２Ｆは共培養アッセイでのリガンド誘導性CSLレポーター活性に対するN1ECDFcの効果を示す（白四角：（-）；黒四角：0.33 ng pHyTC-N1ECDFc; 黒四角：0.67 ng pHyTC-N1ECDFc）。図２２Ｇ−Ｉは、Ad-VEGF形質導入HUVECに対するN1ECDFcの効果を示す。Notchシグナリングは、表示された用量でのAd-N1ECDFcの同時形質導入の存在または不在におけるHUVECへのAd-VEGFの形質導入により活性化された。図22Gは、Ad-VEGFによりトランス活性化されたCSLレポーター活性におけるN1ECDFcの効果を示す。図２２Ｈは、40 MOIのAd-N1ECDFcの同時形質導入によるAd-VEGF形質導入HUVECの出芽の阻害を示す。図２２ＩはAd-VEGF形質導入HUVECの出芽におけるN1ECDFcの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。
【図２２Ｄ】図22A - 22I  これらの図は、VEGFがNotchシグナリングを活性化してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECは、40 MOI（図２２Ａ、２２Ｈ、２２Ｉ）または20 MOI（図22C, 22G）でAd-VEGFを形質導入された。Ad-LacZをHUVECに対して同時形質導入して、同じトータルのアデノウイルスの60 MOI (図 22G), 80 MOI (図 22A) および100 MOI (図 22H, 22I)とした。図２２ＡはNotchおよびNotchリガンド発現のRT-PCR分析を示す。数字はPCRサイクルを示す。図２２Ｂは、CSLレポーター活性における形質導入したVEGFの効果を示す。図２２Ｃは、Ad-VEGFによりトランス活性化（transactivated）されたCSLレポーター活性におけるSU5416の効果を示す。図２２ＤはNotchデコイ（N1ECDFc）の構築物を示す。図２２ＥはAd-N1ECDFcを形質導入されたHUVECからのN1ECDFcの分泌を示す。図２２Ｆは共培養アッセイでのリガンド誘導性CSLレポーター活性に対するN1ECDFcの効果を示す（白四角：（-）；黒四角：0.33 ng pHyTC-N1ECDFc; 黒四角：0.67 ng pHyTC-N1ECDFc）。図２２Ｇ−Ｉは、Ad-VEGF形質導入HUVECに対するN1ECDFcの効果を示す。Notchシグナリングは、表示された用量でのAd-N1ECDFcの同時形質導入の存在または不在におけるHUVECへのAd-VEGFの形質導入により活性化された。図22Gは、Ad-VEGFによりトランス活性化されたCSLレポーター活性におけるN1ECDFcの効果を示す。図２２Ｈは、40 MOIのAd-N1ECDFcの同時形質導入によるAd-VEGF形質導入HUVECの出芽の阻害を示す。図２２ＩはAd-VEGF形質導入HUVECの出芽におけるN1ECDFcの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。
【図２２Ｅ】図22A - 22I  これらの図は、VEGFがNotchシグナリングを活性化してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECは、40 MOI（図２２Ａ、２２Ｈ、２２Ｉ）または20 MOI（図22C, 22G）でAd-VEGFを形質導入された。Ad-LacZをHUVECに対して同時形質導入して、同じトータルのアデノウイルスの60 MOI (図 22G), 80 MOI (図 22A) および100 MOI (図 22H, 22I)とした。図２２ＡはNotchおよびNotchリガンド発現のRT-PCR分析を示す。数字はPCRサイクルを示す。図２２Ｂは、CSLレポーター活性における形質導入したVEGFの効果を示す。図２２Ｃは、Ad-VEGFによりトランス活性化（transactivated）されたCSLレポーター活性におけるSU5416の効果を示す。図２２ＤはNotchデコイ（N1ECDFc）の構築物を示す。図２２ＥはAd-N1ECDFcを形質導入されたHUVECからのN1ECDFcの分泌を示す。図２２Ｆは共培養アッセイでのリガンド誘導性CSLレポーター活性に対するN1ECDFcの効果を示す（白四角：（-）；黒四角：0.33 ng pHyTC-N1ECDFc; 黒四角：0.67 ng pHyTC-N1ECDFc）。図２２Ｇ−Ｉは、Ad-VEGF形質導入HUVECに対するN1ECDFcの効果を示す。Notchシグナリングは、表示された用量でのAd-N1ECDFcの同時形質導入の存在または不在におけるHUVECへのAd-VEGFの形質導入により活性化された。図22Gは、Ad-VEGFによりトランス活性化されたCSLレポーター活性におけるN1ECDFcの効果を示す。図２２Ｈは、40 MOIのAd-N1ECDFcの同時形質導入によるAd-VEGF形質導入HUVECの出芽の阻害を示す。図２２ＩはAd-VEGF形質導入HUVECの出芽におけるN1ECDFcの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。
【図２２Ｆ】図22A - 22I  これらの図は、VEGFがNotchシグナリングを活性化してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECは、40 MOI（図２２Ａ、２２Ｈ、２２Ｉ）または20 MOI（図22C, 22G）でAd-VEGFを形質導入された。Ad-LacZをHUVECに対して同時形質導入して、同じトータルのアデノウイルスの60 MOI (図 22G), 80 MOI (図 22A) および100 MOI (図 22H, 22I)とした。図２２ＡはNotchおよびNotchリガンド発現のRT-PCR分析を示す。数字はPCRサイクルを示す。図２２Ｂは、CSLレポーター活性における形質導入したVEGFの効果を示す。図２２Ｃは、Ad-VEGFによりトランス活性化（transactivated）されたCSLレポーター活性におけるSU5416の効果を示す。図２２ＤはNotchデコイ（N1ECDFc）の構築物を示す。図２２ＥはAd-N1ECDFcを形質導入されたHUVECからのN1ECDFcの分泌を示す。図２２Ｆは共培養アッセイでのリガンド誘導性CSLレポーター活性に対するN1ECDFcの効果を示す（白四角：（-）；黒四角：0.33 ng pHyTC-N1ECDFc; 黒四角：0.67 ng pHyTC-N1ECDFc）。図２２Ｇ−Ｉは、Ad-VEGF形質導入HUVECに対するN1ECDFcの効果を示す。Notchシグナリングは、表示された用量でのAd-N1ECDFcの同時形質導入の存在または不在におけるHUVECへのAd-VEGFの形質導入により活性化された。図22Gは、Ad-VEGFによりトランス活性化されたCSLレポーター活性におけるN1ECDFcの効果を示す。図２２Ｈは、40 MOIのAd-N1ECDFcの同時形質導入によるAd-VEGF形質導入HUVECの出芽の阻害を示す。図２２ＩはAd-VEGF形質導入HUVECの出芽におけるN1ECDFcの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。
【図２２Ｇ】図22A - 22I  これらの図は、VEGFがNotchシグナリングを活性化してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECは、40 MOI（図２２Ａ、２２Ｈ、２２Ｉ）または20 MOI（図22C, 22G）でAd-VEGFを形質導入された。Ad-LacZをHUVECに対して同時形質導入して、同じトータルのアデノウイルスの60 MOI (図 22G), 80 MOI (図 22A) および100 MOI (図 22H, 22I)とした。図２２ＡはNotchおよびNotchリガンド発現のRT-PCR分析を示す。数字はPCRサイクルを示す。図２２Ｂは、CSLレポーター活性における形質導入したVEGFの効果を示す。図２２Ｃは、Ad-VEGFによりトランス活性化（transactivated）されたCSLレポーター活性におけるSU5416の効果を示す。図２２ＤはNotchデコイ（N1ECDFc）の構築物を示す。図２２ＥはAd-N1ECDFcを形質導入されたHUVECからのN1ECDFcの分泌を示す。図２２Ｆは共培養アッセイでのリガンド誘導性CSLレポーター活性に対するN1ECDFcの効果を示す（白四角：（-）；黒四角：0.33 ng pHyTC-N1ECDFc; 黒四角：0.67 ng pHyTC-N1ECDFc）。図２２Ｇ−Ｉは、Ad-VEGF形質導入HUVECに対するN1ECDFcの効果を示す。Notchシグナリングは、表示された用量でのAd-N1ECDFcの同時形質導入の存在または不在におけるHUVECへのAd-VEGFの形質導入により活性化された。図22Gは、Ad-VEGFによりトランス活性化されたCSLレポーター活性におけるN1ECDFcの効果を示す。図２２Ｈは、40 MOIのAd-N1ECDFcの同時形質導入によるAd-VEGF形質導入HUVECの出芽の阻害を示す。図２２ＩはAd-VEGF形質導入HUVECの出芽におけるN1ECDFcの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。
【図２２Ｈ】図22A - 22I  これらの図は、VEGFがNotchシグナリングを活性化してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECは、40 MOI（図２２Ａ、２２Ｈ、２２Ｉ）または20 MOI（図22C, 22G）でAd-VEGFを形質導入された。Ad-LacZをHUVECに対して同時形質導入して、同じトータルのアデノウイルスの60 MOI (図 22G), 80 MOI (図 22A) および100 MOI (図 22H, 22I)とした。図２２ＡはNotchおよびNotchリガンド発現のRT-PCR分析を示す。数字はPCRサイクルを示す。図２２Ｂは、CSLレポーター活性における形質導入したVEGFの効果を示す。図２２Ｃは、Ad-VEGFによりトランス活性化（transactivated）されたCSLレポーター活性におけるSU5416の効果を示す。図２２ＤはNotchデコイ（N1ECDFc）の構築物を示す。図２２ＥはAd-N1ECDFcを形質導入されたHUVECからのN1ECDFcの分泌を示す。図２２Ｆは共培養アッセイでのリガンド誘導性CSLレポーター活性に対するN1ECDFcの効果を示す（白四角：（-）；黒四角：0.33 ng pHyTC-N1ECDFc; 黒四角：0.67 ng pHyTC-N1ECDFc）。図２２Ｇ−Ｉは、Ad-VEGF形質導入HUVECに対するN1ECDFcの効果を示す。Notchシグナリングは、表示された用量でのAd-N1ECDFcの同時形質導入の存在または不在におけるHUVECへのAd-VEGFの形質導入により活性化された。図22Gは、Ad-VEGFによりトランス活性化されたCSLレポーター活性におけるN1ECDFcの効果を示す。図２２Ｈは、40 MOIのAd-N1ECDFcの同時形質導入によるAd-VEGF形質導入HUVECの出芽の阻害を示す。図２２ＩはAd-VEGF形質導入HUVECの出芽におけるN1ECDFcの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。
【図２２Ｉ】図22A - 22I  これらの図は、VEGFがNotchシグナリングを活性化してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECは、40 MOI（図２２Ａ、２２Ｈ、２２Ｉ）または20 MOI（図22C, 22G）でAd-VEGFを形質導入された。Ad-LacZをHUVECに対して同時形質導入して、同じトータルのアデノウイルスの60 MOI (図 22G), 80 MOI (図 22A) および100 MOI (図 22H, 22I)とした。図２２ＡはNotchおよびNotchリガンド発現のRT-PCR分析を示す。数字はPCRサイクルを示す。図２２Ｂは、CSLレポーター活性における形質導入したVEGFの効果を示す。図２２Ｃは、Ad-VEGFによりトランス活性化（transactivated）されたCSLレポーター活性におけるSU5416の効果を示す。図２２ＤはNotchデコイ（N1ECDFc）の構築物を示す。図２２ＥはAd-N1ECDFcを形質導入されたHUVECからのN1ECDFcの分泌を示す。図２２Ｆは共培養アッセイでのリガンド誘導性CSLレポーター活性に対するN1ECDFcの効果を示す（白四角：（-）；黒四角：0.33 ng pHyTC-N1ECDFc; 黒四角：0.67 ng pHyTC-N1ECDFc）。図２２Ｇ−Ｉは、Ad-VEGF形質導入HUVECに対するN1ECDFcの効果を示す。Notchシグナリングは、表示された用量でのAd-N1ECDFcの同時形質導入の存在または不在におけるHUVECへのAd-VEGFの形質導入により活性化された。図22Gは、Ad-VEGFによりトランス活性化されたCSLレポーター活性におけるN1ECDFcの効果を示す。図２２Ｈは、40 MOIのAd-N1ECDFcの同時形質導入によるAd-VEGF形質導入HUVECの出芽の阻害を示す。図２２ＩはAd-VEGF形質導入HUVECの出芽におけるN1ECDFcの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。
【図２３Ａ】図23A - 23J  これらの図は、NotchシグナリングがFlt1発現を上方制御してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECをAd-LacZまたはAd-N1ICの何れかで40 MOIで形質導入した。図２３Ａ−２３ＣはNotch誘導性のHUVEC出芽におけるレセプターチロシンキナーゼのインヒビターの効果を示す。図２３Ａは、PD166866、ZD1893の1μMおよびSU5416の0.5μMで処理されたAd-N1IC形質導入HUVECの出芽の写真である。図２３Ｂは、1μMでのインヒビターの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３cはSU5416の効果の用量依存性を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３Ｄ−ＥはAd-N1IC形質導入HUVECにおけるFlt-1発現の誘導を示す。図２３Ｄは、Flt-1 mRNA発現のRT-PCR分析を示す。図２３ＥはFlt-1タンパク質発現のW.B.分析を示す。図２３Ｆ−ＧはNotch誘導性HUVEC出芽のPlGF刺激での促進を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、完全培地の代わりに、50 ng/ml PlGFの不在または存在においてSFMと共にコラーゲンゲル上で培養された。図２３Ｆは、Ad-N1IC形質導入HUVECのPlGF誘導性の出芽を示す（矢印（arrow head）：単一の糸状仮足を伴う芽；  矢（arrow）：複数の糸状仮足を伴う芽）。図２３ＧはAd-N1IC形質導入HUVECの出芽におけるPlGFの効果の定量化を示す（白四角：複数；  黒四角：全体）。図２３Ｈ−ＩはFlt1発現におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、コントロール（CT）またはFlt-1 siRNAの何れかの200pmolでトランスフェクションされた。図２３Ｈは、Flt-1mRNA発現の減少を示す。図２３ＩはFlt-1タンパク質発現の減少を示す。図２３ＪはNotch誘導性HUVECの出芽におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、100または200pmolの何れかのsiRNAをトランスフェクションされ、コラーゲンゲル上で２日間培養された。
【図２３Ｂ】図23A - 23J  これらの図は、NotchシグナリングがFlt1発現を上方制御してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECをAd-LacZまたはAd-N1ICの何れかで40 MOIで形質導入した。図２３Ａ−２３ＣはNotch誘導性のHUVEC出芽におけるレセプターチロシンキナーゼのインヒビターの効果を示す。図２３Ａは、PD166866、ZD1893の1μMおよびSU5416の0.5μMで処理されたAd-N1IC形質導入HUVECの出芽の写真である。図２３Ｂは、1μMでのインヒビターの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３cはSU5416の効果の用量依存性を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３Ｄ−ＥはAd-N1IC形質導入HUVECにおけるFlt-1発現の誘導を示す。図２３Ｄは、Flt-1 mRNA発現のRT-PCR分析を示す。図２３ＥはFlt-1タンパク質発現のW.B.分析を示す。図２３Ｆ−ＧはNotch誘導性HUVEC出芽のPlGF刺激での促進を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、完全培地の代わりに、50 ng/ml PlGFの不在または存在においてSFMと共にコラーゲンゲル上で培養された。図２３Ｆは、Ad-N1IC形質導入HUVECのPlGF誘導性の出芽を示す（矢印（arrow head）：単一の糸状仮足を伴う芽；  矢（arrow）：複数の糸状仮足を伴う芽）。図２３ＧはAd-N1IC形質導入HUVECの出芽におけるPlGFの効果の定量化を示す（白四角：複数；  黒四角：全体）。図２３Ｈ−ＩはFlt1発現におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、コントロール（CT）またはFlt-1 siRNAの何れかの200pmolでトランスフェクションされた。図２３Ｈは、Flt-1mRNA発現の減少を示す。図２３ＩはFlt-1タンパク質発現の減少を示す。図２３ＪはNotch誘導性HUVECの出芽におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、100または200pmolの何れかのsiRNAをトランスフェクションされ、コラーゲンゲル上で２日間培養された。
【図２３Ｃ】図23A - 23J  これらの図は、NotchシグナリングがFlt1発現を上方制御してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECをAd-LacZまたはAd-N1ICの何れかで40 MOIで形質導入した。図２３Ａ−２３ＣはNotch誘導性のHUVEC出芽におけるレセプターチロシンキナーゼのインヒビターの効果を示す。図２３Ａは、PD166866、ZD1893の1μMおよびSU5416の0.5μMで処理されたAd-N1IC形質導入HUVECの出芽の写真である。図２３Ｂは、1μMでのインヒビターの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３cはSU5416の効果の用量依存性を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３Ｄ−ＥはAd-N1IC形質導入HUVECにおけるFlt-1発現の誘導を示す。図２３Ｄは、Flt-1 mRNA発現のRT-PCR分析を示す。図２３ＥはFlt-1タンパク質発現のW.B.分析を示す。図２３Ｆ−ＧはNotch誘導性HUVEC出芽のPlGF刺激での促進を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、完全培地の代わりに、50 ng/ml PlGFの不在または存在においてSFMと共にコラーゲンゲル上で培養された。図２３Ｆは、Ad-N1IC形質導入HUVECのPlGF誘導性の出芽を示す（矢印（arrow head）：単一の糸状仮足を伴う芽；  矢（arrow）：複数の糸状仮足を伴う芽）。図２３ＧはAd-N1IC形質導入HUVECの出芽におけるPlGFの効果の定量化を示す（白四角：複数；  黒四角：全体）。図２３Ｈ−ＩはFlt1発現におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、コントロール（CT）またはFlt-1 siRNAの何れかの200pmolでトランスフェクションされた。図２３Ｈは、Flt-1mRNA発現の減少を示す。図２３ＩはFlt-1タンパク質発現の減少を示す。図２３ＪはNotch誘導性HUVECの出芽におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、100または200pmolの何れかのsiRNAをトランスフェクションされ、コラーゲンゲル上で２日間培養された。
【図２３Ｄ】図23A - 23J  これらの図は、NotchシグナリングがFlt1発現を上方制御してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECをAd-LacZまたはAd-N1ICの何れかで40 MOIで形質導入した。図２３Ａ−２３ＣはNotch誘導性のHUVEC出芽におけるレセプターチロシンキナーゼのインヒビターの効果を示す。図２３Ａは、PD166866、ZD1893の1μMおよびSU5416の0.5μMで処理されたAd-N1IC形質導入HUVECの出芽の写真である。図２３Ｂは、1μMでのインヒビターの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３cはSU5416の効果の用量依存性を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３Ｄ−ＥはAd-N1IC形質導入HUVECにおけるFlt-1発現の誘導を示す。図２３Ｄは、Flt-1 mRNA発現のRT-PCR分析を示す。図２３ＥはFlt-1タンパク質発現のW.B.分析を示す。図２３Ｆ−ＧはNotch誘導性HUVEC出芽のPlGF刺激での促進を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、完全培地の代わりに、50 ng/ml PlGFの不在または存在においてSFMと共にコラーゲンゲル上で培養された。図２３Ｆは、Ad-N1IC形質導入HUVECのPlGF誘導性の出芽を示す（矢印（arrow head）：単一の糸状仮足を伴う芽；  矢（arrow）：複数の糸状仮足を伴う芽）。図２３ＧはAd-N1IC形質導入HUVECの出芽におけるPlGFの効果の定量化を示す（白四角：複数；  黒四角：全体）。図２３Ｈ−ＩはFlt1発現におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、コントロール（CT）またはFlt-1 siRNAの何れかの200pmolでトランスフェクションされた。図２３Ｈは、Flt-1mRNA発現の減少を示す。図２３ＩはFlt-1タンパク質発現の減少を示す。図２３ＪはNotch誘導性HUVECの出芽におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、100または200pmolの何れかのsiRNAをトランスフェクションされ、コラーゲンゲル上で２日間培養された。
【図２３Ｅ】図23A - 23J  これらの図は、NotchシグナリングがFlt1発現を上方制御してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECをAd-LacZまたはAd-N1ICの何れかで40 MOIで形質導入した。図２３Ａ−２３ＣはNotch誘導性のHUVEC出芽におけるレセプターチロシンキナーゼのインヒビターの効果を示す。図２３Ａは、PD166866、ZD1893の1μMおよびSU5416の0.5μMで処理されたAd-N1IC形質導入HUVECの出芽の写真である。図２３Ｂは、1μMでのインヒビターの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３cはSU5416の効果の用量依存性を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３Ｄ−ＥはAd-N1IC形質導入HUVECにおけるFlt-1発現の誘導を示す。図２３Ｄは、Flt-1 mRNA発現のRT-PCR分析を示す。図２３ＥはFlt-1タンパク質発現のW.B.分析を示す。図２３Ｆ−ＧはNotch誘導性HUVEC出芽のPlGF刺激での促進を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、完全培地の代わりに、50 ng/ml PlGFの不在または存在においてSFMと共にコラーゲンゲル上で培養された。図２３Ｆは、Ad-N1IC形質導入HUVECのPlGF誘導性の出芽を示す（矢印（arrow head）：単一の糸状仮足を伴う芽；  矢（arrow）：複数の糸状仮足を伴う芽）。図２３ＧはAd-N1IC形質導入HUVECの出芽におけるPlGFの効果の定量化を示す（白四角：複数；  黒四角：全体）。図２３Ｈ−ＩはFlt1発現におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、コントロール（CT）またはFlt-1 siRNAの何れかの200pmolでトランスフェクションされた。図２３Ｈは、Flt-1mRNA発現の減少を示す。図２３ＩはFlt-1タンパク質発現の減少を示す。図２３ＪはNotch誘導性HUVECの出芽におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、100または200pmolの何れかのsiRNAをトランスフェクションされ、コラーゲンゲル上で２日間培養された。
【図２３Ｆ】図23A - 23J  これらの図は、NotchシグナリングがFlt1発現を上方制御してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECをAd-LacZまたはAd-N1ICの何れかで40 MOIで形質導入した。図２３Ａ−２３ＣはNotch誘導性のHUVEC出芽におけるレセプターチロシンキナーゼのインヒビターの効果を示す。図２３Ａは、PD166866、ZD1893の1μMおよびSU5416の0.5μMで処理されたAd-N1IC形質導入HUVECの出芽の写真である。図２３Ｂは、1μMでのインヒビターの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３cはSU5416の効果の用量依存性を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３Ｄ−ＥはAd-N1IC形質導入HUVECにおけるFlt-1発現の誘導を示す。図２３Ｄは、Flt-1 mRNA発現のRT-PCR分析を示す。図２３ＥはFlt-1タンパク質発現のW.B.分析を示す。図２３Ｆ−ＧはNotch誘導性HUVEC出芽のPlGF刺激での促進を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、完全培地の代わりに、50 ng/ml PlGFの不在または存在においてSFMと共にコラーゲンゲル上で培養された。図２３Ｆは、Ad-N1IC形質導入HUVECのPlGF誘導性の出芽を示す（矢印（arrow head）：単一の糸状仮足を伴う芽；  矢（arrow）：複数の糸状仮足を伴う芽）。図２３ＧはAd-N1IC形質導入HUVECの出芽におけるPlGFの効果の定量化を示す（白四角：複数；  黒四角：全体）。図２３Ｈ−ＩはFlt1発現におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、コントロール（CT）またはFlt-1 siRNAの何れかの200pmolでトランスフェクションされた。図２３Ｈは、Flt-1mRNA発現の減少を示す。図２３ＩはFlt-1タンパク質発現の減少を示す。図２３ＪはNotch誘導性HUVECの出芽におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、100または200pmolの何れかのsiRNAをトランスフェクションされ、コラーゲンゲル上で２日間培養された。
【図２３Ｇ】図23A - 23J  これらの図は、NotchシグナリングがFlt1発現を上方制御してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECをAd-LacZまたはAd-N1ICの何れかで40 MOIで形質導入した。図２３Ａ−２３ＣはNotch誘導性のHUVEC出芽におけるレセプターチロシンキナーゼのインヒビターの効果を示す。図２３Ａは、PD166866、ZD1893の1μMおよびSU5416の0.5μMで処理されたAd-N1IC形質導入HUVECの出芽の写真である。図２３Ｂは、1μMでのインヒビターの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３cはSU5416の効果の用量依存性を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３Ｄ−ＥはAd-N1IC形質導入HUVECにおけるFlt-1発現の誘導を示す。図２３Ｄは、Flt-1 mRNA発現のRT-PCR分析を示す。図２３ＥはFlt-1タンパク質発現のW.B.分析を示す。図２３Ｆ−ＧはNotch誘導性HUVEC出芽のPlGF刺激での促進を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、完全培地の代わりに、50 ng/ml PlGFの不在または存在においてSFMと共にコラーゲンゲル上で培養された。図２３Ｆは、Ad-N1IC形質導入HUVECのPlGF誘導性の出芽を示す（矢印（arrow head）：単一の糸状仮足を伴う芽；  矢（arrow）：複数の糸状仮足を伴う芽）。図２３ＧはAd-N1IC形質導入HUVECの出芽におけるPlGFの効果の定量化を示す（白四角：複数；  黒四角：全体）。図２３Ｈ−ＩはFlt1発現におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、コントロール（CT）またはFlt-1 siRNAの何れかの200pmolでトランスフェクションされた。図２３Ｈは、Flt-1mRNA発現の減少を示す。図２３ＩはFlt-1タンパク質発現の減少を示す。図２３ＪはNotch誘導性HUVECの出芽におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、100または200pmolの何れかのsiRNAをトランスフェクションされ、コラーゲンゲル上で２日間培養された。
【図２３Ｈ】図23A - 23J  これらの図は、NotchシグナリングがFlt1発現を上方制御してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECをAd-LacZまたはAd-N1ICの何れかで40 MOIで形質導入した。図２３Ａ−２３ＣはNotch誘導性のHUVEC出芽におけるレセプターチロシンキナーゼのインヒビターの効果を示す。図２３Ａは、PD166866、ZD1893の1μMおよびSU5416の0.5μMで処理されたAd-N1IC形質導入HUVECの出芽の写真である。図２３Ｂは、1μMでのインヒビターの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３cはSU5416の効果の用量依存性を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３Ｄ−ＥはAd-N1IC形質導入HUVECにおけるFlt-1発現の誘導を示す。図２３Ｄは、Flt-1 mRNA発現のRT-PCR分析を示す。図２３ＥはFlt-1タンパク質発現のW.B.分析を示す。図２３Ｆ−ＧはNotch誘導性HUVEC出芽のPlGF刺激での促進を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、完全培地の代わりに、50 ng/ml PlGFの不在または存在においてSFMと共にコラーゲンゲル上で培養された。図２３Ｆは、Ad-N1IC形質導入HUVECのPlGF誘導性の出芽を示す（矢印（arrow head）：単一の糸状仮足を伴う芽；  矢（arrow）：複数の糸状仮足を伴う芽）。図２３ＧはAd-N1IC形質導入HUVECの出芽におけるPlGFの効果の定量化を示す（白四角：複数；  黒四角：全体）。図２３Ｈ−ＩはFlt1発現におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、コントロール（CT）またはFlt-1 siRNAの何れかの200pmolでトランスフェクションされた。図２３Ｈは、Flt-1mRNA発現の減少を示す。図２３ＩはFlt-1タンパク質発現の減少を示す。図２３ＪはNotch誘導性HUVECの出芽におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、100または200pmolの何れかのsiRNAをトランスフェクションされ、コラーゲンゲル上で２日間培養された。
【図２３Ｉ】図23A - 23J  これらの図は、NotchシグナリングがFlt1発現を上方制御してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECをAd-LacZまたはAd-N1ICの何れかで40 MOIで形質導入した。図２３Ａ−２３ＣはNotch誘導性のHUVEC出芽におけるレセプターチロシンキナーゼのインヒビターの効果を示す。図２３Ａは、PD166866、ZD1893の1μMおよびSU5416の0.5μMで処理されたAd-N1IC形質導入HUVECの出芽の写真である。図２３Ｂは、1μMでのインヒビターの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３cはSU5416の効果の用量依存性を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３Ｄ−ＥはAd-N1IC形質導入HUVECにおけるFlt-1発現の誘導を示す。図２３Ｄは、Flt-1 mRNA発現のRT-PCR分析を示す。図２３ＥはFlt-1タンパク質発現のW.B.分析を示す。図２３Ｆ−ＧはNotch誘導性HUVEC出芽のPlGF刺激での促進を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、完全培地の代わりに、50 ng/ml PlGFの不在または存在においてSFMと共にコラーゲンゲル上で培養された。図２３Ｆは、Ad-N1IC形質導入HUVECのPlGF誘導性の出芽を示す（矢印（arrow head）：単一の糸状仮足を伴う芽；  矢（arrow）：複数の糸状仮足を伴う芽）。図２３ＧはAd-N1IC形質導入HUVECの出芽におけるPlGFの効果の定量化を示す（白四角：複数；  黒四角：全体）。図２３Ｈ−ＩはFlt1発現におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、コントロール（CT）またはFlt-1 siRNAの何れかの200pmolでトランスフェクションされた。図２３Ｈは、Flt-1mRNA発現の減少を示す。図２３ＩはFlt-1タンパク質発現の減少を示す。図２３ＪはNotch誘導性HUVECの出芽におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、100または200pmolの何れかのsiRNAをトランスフェクションされ、コラーゲンゲル上で２日間培養された。
【図２３Ｊ】図23A - 23J  これらの図は、NotchシグナリングがFlt1発現を上方制御してHUVECの出芽を誘導することを示す。HUVECをAd-LacZまたはAd-N1ICの何れかで40 MOIで形質導入した。図２３Ａ−２３ＣはNotch誘導性のHUVEC出芽におけるレセプターチロシンキナーゼのインヒビターの効果を示す。図２３Ａは、PD166866、ZD1893の1μMおよびSU5416の0.5μMで処理されたAd-N1IC形質導入HUVECの出芽の写真である。図２３Ｂは、1μMでのインヒビターの効果の定量化を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３cはSU5416の効果の用量依存性を示す（白四角：芽；  黒四角：細胞数）。図２３Ｄ−ＥはAd-N1IC形質導入HUVECにおけるFlt-1発現の誘導を示す。図２３Ｄは、Flt-1 mRNA発現のRT-PCR分析を示す。図２３ＥはFlt-1タンパク質発現のW.B.分析を示す。図２３Ｆ−ＧはNotch誘導性HUVEC出芽のPlGF刺激での促進を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、完全培地の代わりに、50 ng/ml PlGFの不在または存在においてSFMと共にコラーゲンゲル上で培養された。図２３Ｆは、Ad-N1IC形質導入HUVECのPlGF誘導性の出芽を示す（矢印（arrow head）：単一の糸状仮足を伴う芽；  矢（arrow）：複数の糸状仮足を伴う芽）。図２３ＧはAd-N1IC形質導入HUVECの出芽におけるPlGFの効果の定量化を示す（白四角：複数；  黒四角：全体）。図２３Ｈ−ＩはFlt1発現におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、コントロール（CT）またはFlt-1 siRNAの何れかの200pmolでトランスフェクションされた。図２３Ｈは、Flt-1mRNA発現の減少を示す。図２３ＩはFlt-1タンパク質発現の減少を示す。図２３ＪはNotch誘導性HUVECの出芽におけるFlt-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す。Ad-N1IC形質導入HUVECは、100または200pmolの何れかのsiRNAをトランスフェクションされ、コラーゲンゲル上で２日間培養された。
【図２４Ａ】図24A - 24E  これらの図は、VEGFがNotchシグナリングを介したMMP-9およびMT1-MMPの両方のアップレギュレーションによりゼラチナーゼ活性を制御することを示す。図２４Ａ−Ｂは、HUVECにおいてVEGFにより刺激されたMMP-9およびMMP-2活性のゼラチン酵素電気泳動分析（gelatin zymography analysis）を示す。図２４Ａは、MM-P-9活性におけるN1ECDFcの効果を示す。形質導入HUVECを記載された日数（即ち、D2、D4、D6、D8）でフィブリンゲル上で培養した。同様な結果がコラーゲンゲルを用いることにより得られたが、MMP-9の誘導はコラーゲンゲルよりもフィブリンゲルにおいてより強いものであった（データは示さず）。図24Bは、MMP-2活性におけるN1ECDFcの効果を示す。HUVECは記載された用量でAd-N1ECDFcを形質導入され、コラーゲンゲル上で培養したHUVECから4日目に馴化培地（condition medium）を採取した。図２４Ｃ−Ｄは、NotchシグナリングでのMMP-9およびMT1-MMPのアップレギュレーションを示す。HUVECをAd-LacZまたはAd-N1ICの何れかで40 MOIで形質導入した。数字はPCRサイクルを示す。図２４Ｃは、MMP-9およびMMP-2の発現におけるNotchシグナリングの効果のRT-PCR分析を示す。図２４ＤはNotchシグナリングでの転写物およびタンパク質の両方のNT1-MMP発現の誘導を示す。図２４Ｅは、Ad-N1ECDFcの同時形質導入を伴うAd-VEGF-HUVECにおけるMMP-9およびMT1-MMP発現のRT-PCR分析を示す。HUVECは、Ad-N1ECDFcの同時形質導入の不在または存在においてAd-VEGFで各々40 MOIで形質導入された。Ad-LacZを同時形質導入して80 MOIの同じトータル量のアデノウイルスとした。
【図２４Ｂ】図24A - 24E  これらの図は、VEGFがNotchシグナリングを介したMMP-9およびMT1-MMPの両方のアップレギュレーションによりゼラチナーゼ活性を制御することを示す。図２４Ａ−Ｂは、HUVECにおいてVEGFにより刺激されたMMP-9およびMMP-2活性のゼラチン酵素電気泳動分析（gelatin zymography analysis）を示す。図２４Ａは、MM-P-9活性におけるN1ECDFcの効果を示す。形質導入HUVECを記載された日数（即ち、D2、D4、D6、D8）でフィブリンゲル上で培養した。同様な結果がコラーゲンゲルを用いることにより得られたが、MMP-9の誘導はコラーゲンゲルよりもフィブリンゲルにおいてより強いものであった（データは示さず）。図24Bは、MMP-2活性におけるN1ECDFcの効果を示す。HUVECは記載された用量でAd-N1ECDFcを形質導入され、コラーゲンゲル上で培養したHUVECから4日目に馴化培地（condition medium）を採取した。図２４Ｃ−Ｄは、NotchシグナリングでのMMP-9およびMT1-MMPのアップレギュレーションを示す。HUVECをAd-LacZまたはAd-N1ICの何れかで40 MOIで形質導入した。数字はPCRサイクルを示す。図２４Ｃは、MMP-9およびMMP-2の発現におけるNotchシグナリングの効果のRT-PCR分析を示す。図２４ＤはNotchシグナリングでの転写物およびタンパク質の両方のNT1-MMP発現の誘導を示す。図２４Ｅは、Ad-N1ECDFcの同時形質導入を伴うAd-VEGF-HUVECにおけるMMP-9およびMT1-MMP発現のRT-PCR分析を示す。HUVECは、Ad-N1ECDFcの同時形質導入の不在または存在においてAd-VEGFで各々40 MOIで形質導入された。Ad-LacZを同時形質導入して80 MOIの同じトータル量のアデノウイルスとした。
【図２４Ｃ】図24A - 24E  これらの図は、VEGFがNotchシグナリングを介したMMP-9およびMT1-MMPの両方のアップレギュレーションによりゼラチナーゼ活性を制御することを示す。図２４Ａ−Ｂは、HUVECにおいてVEGFにより刺激されたMMP-9およびMMP-2活性のゼラチン酵素電気泳動分析（gelatin zymography analysis）を示す。図２４Ａは、MM-P-9活性におけるN1ECDFcの効果を示す。形質導入HUVECを記載された日数（即ち、D2、D4、D6、D8）でフィブリンゲル上で培養した。同様な結果がコラーゲンゲルを用いることにより得られたが、MMP-9の誘導はコラーゲンゲルよりもフィブリンゲルにおいてより強いものであった（データは示さず）。図24Bは、MMP-2活性におけるN1ECDFcの効果を示す。HUVECは記載された用量でAd-N1ECDFcを形質導入され、コラーゲンゲル上で培養したHUVECから4日目に馴化培地（condition medium）を採取した。図２４Ｃ−Ｄは、NotchシグナリングでのMMP-9およびMT1-MMPのアップレギュレーションを示す。HUVECをAd-LacZまたはAd-N1ICの何れかで40 MOIで形質導入した。数字はPCRサイクルを示す。図２４Ｃは、MMP-9およびMMP-2の発現におけるNotchシグナリングの効果のRT-PCR分析を示す。図２４ＤはNotchシグナリングでの転写物およびタンパク質の両方のNT1-MMP発現の誘導を示す。図２４Ｅは、Ad-N1ECDFcの同時形質導入を伴うAd-VEGF-HUVECにおけるMMP-9およびMT1-MMP発現のRT-PCR分析を示す。HUVECは、Ad-N1ECDFcの同時形質導入の不在または存在においてAd-VEGFで各々40 MOIで形質導入された。Ad-LacZを同時形質導入して80 MOIの同じトータル量のアデノウイルスとした。
【図２４Ｄ】図24A - 24E  これらの図は、VEGFがNotchシグナリングを介したMMP-9およびMT1-MMPの両方のアップレギュレーションによりゼラチナーゼ活性を制御することを示す。図２４Ａ−Ｂは、HUVECにおいてVEGFにより刺激されたMMP-9およびMMP-2活性のゼラチン酵素電気泳動分析（gelatin zymography analysis）を示す。図２４Ａは、MM-P-9活性におけるN1ECDFcの効果を示す。形質導入HUVECを記載された日数（即ち、D2、D4、D6、D8）でフィブリンゲル上で培養した。同様な結果がコラーゲンゲルを用いることにより得られたが、MMP-9の誘導はコラーゲンゲルよりもフィブリンゲルにおいてより強いものであった（データは示さず）。図24Bは、MMP-2活性におけるN1ECDFcの効果を示す。HUVECは記載された用量でAd-N1ECDFcを形質導入され、コラーゲンゲル上で培養したHUVECから4日目に馴化培地（condition medium）を採取した。図２４Ｃ−Ｄは、NotchシグナリングでのMMP-9およびMT1-MMPのアップレギュレーションを示す。HUVECをAd-LacZまたはAd-N1ICの何れかで40 MOIで形質導入した。数字はPCRサイクルを示す。図２４Ｃは、MMP-9およびMMP-2の発現におけるNotchシグナリングの効果のRT-PCR分析を示す。図２４ＤはNotchシグナリングでの転写物およびタンパク質の両方のNT1-MMP発現の誘導を示す。図２４Ｅは、Ad-N1ECDFcの同時形質導入を伴うAd-VEGF-HUVECにおけるMMP-9およびMT1-MMP発現のRT-PCR分析を示す。HUVECは、Ad-N1ECDFcの同時形質導入の不在または存在においてAd-VEGFで各々40 MOIで形質導入された。Ad-LacZを同時形質導入して80 MOIの同じトータル量のアデノウイルスとした。
【図２４Ｅ】図24A - 24E  これらの図は、VEGFがNotchシグナリングを介したMMP-9およびMT1-MMPの両方のアップレギュレーションによりゼラチナーゼ活性を制御することを示す。図２４Ａ−Ｂは、HUVECにおいてVEGFにより刺激されたMMP-9およびMMP-2活性のゼラチン酵素電気泳動分析（gelatin zymography analysis）を示す。図２４Ａは、MM-P-9活性におけるN1ECDFcの効果を示す。形質導入HUVECを記載された日数（即ち、D2、D4、D6、D8）でフィブリンゲル上で培養した。同様な結果がコラーゲンゲルを用いることにより得られたが、MMP-9の誘導はコラーゲンゲルよりもフィブリンゲルにおいてより強いものであった（データは示さず）。図24Bは、MMP-2活性におけるN1ECDFcの効果を示す。HUVECは記載された用量でAd-N1ECDFcを形質導入され、コラーゲンゲル上で培養したHUVECから4日目に馴化培地（condition medium）を採取した。図２４Ｃ−Ｄは、NotchシグナリングでのMMP-9およびMT1-MMPのアップレギュレーションを示す。HUVECをAd-LacZまたはAd-N1ICの何れかで40 MOIで形質導入した。数字はPCRサイクルを示す。図２４Ｃは、MMP-9およびMMP-2の発現におけるNotchシグナリングの効果のRT-PCR分析を示す。図２４ＤはNotchシグナリングでの転写物およびタンパク質の両方のNT1-MMP発現の誘導を示す。図２４Ｅは、Ad-N1ECDFcの同時形質導入を伴うAd-VEGF-HUVECにおけるMMP-9およびMT1-MMP発現のRT-PCR分析を示す。HUVECは、Ad-N1ECDFcの同時形質導入の不在または存在においてAd-VEGFで各々40 MOIで形質導入された。Ad-LacZを同時形質導入して80 MOIの同じトータル量のアデノウイルスとした。
【図２５Ａ】図25A - 25D  これらの図は、VEGF依存性のインビボの血管形成におけるNotchシグナリングの役割を示す。図２５Ａ−２５ＤはマウスDASアッセイにおけるVEGF誘導性血管形成のN1ECDFcでの阻害を示す。代表的な写真を示す。図２５Ａは、293/VEGFトランスフェクションに対するNotchデコイ（Notchに基づく融合タンパク質）N1ECDFcも発現している293/VEGFでの皮下の誘導性血管形成を示す。図２５Ｂは、コントロールにおける293/VEGF  対  Notchデコイ（Notchに基づく融合タンパク質）-N1ECDFc発現293により誘導される血管新生の程度の定量化を示す。図２５Ｃは、AD-LacZ感染MDA-MB-231細胞  対  Ad-N1ECDFc（Notchに基づく融合タンパク質）感染MDA-MB-231細胞の皮下誘導性の血管形成を示す。MDA-MB-231乳癌細胞は、VEGFを産生する（データは示さず）。図２５Ｄは、Ad-LacZ感染MDA-MB-231細胞  対  Ad-N1ECDFc（Notchに基づく融合タンパク質）感染MDA-MB-231細胞により誘導される血管新生の程度の定量化を示す。
【図２５Ｂ】図25A - 25D  これらの図は、VEGF依存性のインビボの血管形成におけるNotchシグナリングの役割を示す。図２５Ａ−２５ＤはマウスDASアッセイにおけるVEGF誘導性血管形成のN1ECDFcでの阻害を示す。代表的な写真を示す。図２５Ａは、293/VEGFトランスフェクションに対するNotchデコイ（Notchに基づく融合タンパク質）N1ECDFcも発現している293/VEGFでの皮下の誘導性血管形成を示す。図２５Ｂは、コントロールにおける293/VEGF  対  Notchデコイ（Notchに基づく融合タンパク質）-N1ECDFc発現293により誘導される血管新生の程度の定量化を示す。図２５Ｃは、AD-LacZ感染MDA-MB-231細胞  対  Ad-N1ECDFc（Notchに基づく融合タンパク質）感染MDA-MB-231細胞の皮下誘導性の血管形成を示す。MDA-MB-231乳癌細胞は、VEGFを産生する（データは示さず）。図２５Ｄは、Ad-LacZ感染MDA-MB-231細胞  対  Ad-N1ECDFc（Notchに基づく融合タンパク質）感染MDA-MB-231細胞により誘導される血管新生の程度の定量化を示す。
【図２５Ｃ】図25A - 25D  これらの図は、VEGF依存性のインビボの血管形成におけるNotchシグナリングの役割を示す。図２５Ａ−２５ＤはマウスDASアッセイにおけるVEGF誘導性血管形成のN1ECDFcでの阻害を示す。代表的な写真を示す。図２５Ａは、293/VEGFトランスフェクションに対するNotchデコイ（Notchに基づく融合タンパク質）N1ECDFcも発現している293/VEGFでの皮下の誘導性血管形成を示す。図２５Ｂは、コントロールにおける293/VEGF  対  Notchデコイ（Notchに基づく融合タンパク質）-N1ECDFc発現293により誘導される血管新生の程度の定量化を示す。図２５Ｃは、AD-LacZ感染MDA-MB-231細胞  対  Ad-N1ECDFc（Notchに基づく融合タンパク質）感染MDA-MB-231細胞の皮下誘導性の血管形成を示す。MDA-MB-231乳癌細胞は、VEGFを産生する（データは示さず）。図２５Ｄは、Ad-LacZ感染MDA-MB-231細胞  対  Ad-N1ECDFc（Notchに基づく融合タンパク質）感染MDA-MB-231細胞により誘導される血管新生の程度の定量化を示す。
【図２５Ｄ】図25A - 25D  これらの図は、VEGF依存性のインビボの血管形成におけるNotchシグナリングの役割を示す。図２５Ａ−２５ＤはマウスDASアッセイにおけるVEGF誘導性血管形成のN1ECDFcでの阻害を示す。代表的な写真を示す。図２５Ａは、293/VEGFトランスフェクションに対するNotchデコイ（Notchに基づく融合タンパク質）N1ECDFcも発現している293/VEGFでの皮下の誘導性血管形成を示す。図２５Ｂは、コントロールにおける293/VEGF  対  Notchデコイ（Notchに基づく融合タンパク質）-N1ECDFc発現293により誘導される血管新生の程度の定量化を示す。図２５Ｃは、AD-LacZ感染MDA-MB-231細胞  対  Ad-N1ECDFc（Notchに基づく融合タンパク質）感染MDA-MB-231細胞の皮下誘導性の血管形成を示す。MDA-MB-231乳癌細胞は、VEGFを産生する（データは示さず）。図２５Ｄは、Ad-LacZ感染MDA-MB-231細胞  対  Ad-N1ECDFc（Notchに基づく融合タンパク質）感染MDA-MB-231細胞により誘導される血管新生の程度の定量化を示す。
【図２６Ａ】26A - 26B  これらの図は、Ad-VEGF165形質導入HUVECの増殖を示す。HUVECは、記載された用量のAd-VEGF165で形質導入された。Ad-LacZも同時形質導入し、アデノウイルスの同じトータル量で細胞当たり40pfuのMOIとした。HUVECを1％FBSを補充したSFM中に懸濁し、次に、0.4mlの培地と共にウェル当たり1 x 104 細胞で24ウェルマルチウェルプレートに播種した。4日後、細胞数をCCK-8キットを用いて決定し、その結果を細胞当たり40pfuのMOIでAd-GFPを形質導入したコントロール細胞の数に対して決定した細胞数の比で示した。図26Aは、増殖における形質導入したVEGFの効果を示す。図２６Ｂは、SU5416の阻害効果を示す。Ad-VEGF形質導入HUVECを記載された用量のSU5416で処理した。
【図２６Ｂ】26A - 26B  これらの図は、Ad-VEGF165形質導入HUVECの増殖を示す。HUVECは、記載された用量のAd-VEGF165で形質導入された。Ad-LacZも同時形質導入し、アデノウイルスの同じトータル量で細胞当たり40pfuのMOIとした。HUVECを1％FBSを補充したSFM中に懸濁し、次に、0.4mlの培地と共にウェル当たり1 x 104 細胞で24ウェルマルチウェルプレートに播種した。4日後、細胞数をCCK-8キットを用いて決定し、その結果を細胞当たり40pfuのMOIでAd-GFPを形質導入したコントロール細胞の数に対して決定した細胞数の比で示した。図26Aは、増殖における形質導入したVEGFの効果を示す。図２６Ｂは、SU5416の阻害効果を示す。Ad-VEGF形質導入HUVECを記載された用量のSU5416で処理した。
【図２７Ａ】図27A - 27B  これらの図は、タイプＩコラーゲンゲル上でのHUVECの出芽の誘導を示す。HUVECは、記載された用量でのAd-VEGF165またはAD-N1ICの何れかで形質導入された。Ad-LacZも同時形質導入されて、細胞当たり40pfuのMOIでのアデノウイルスの同じ総量とした。形質導入HUVECは完全培地を用いてコラーゲンゲル上で培養された。出芽の量を７日目に顕微鏡下で評価した。
【図２７Ｂ】図27A - 27B  これらの図は、タイプＩコラーゲンゲル上でのHUVECの出芽の誘導を示す。HUVECは、記載された用量でのAd-VEGF165またはAD-N1ICの何れかで形質導入された。Ad-LacZも同時形質導入されて、細胞当たり40pfuのMOIでのアデノウイルスの同じ総量とした。形質導入HUVECは完全培地を用いてコラーゲンゲル上で培養された。出芽の量を７日目に顕微鏡下で評価した。
【図２８Ａ】図28A - 28B  これらの図は、細胞増殖におけるNotchシグナリングの変化の影響を示す。細胞を記載されたアデノウイルスで形質導入した。Ad-GFPも同時形質導入されて、細胞当たり60pfuのMOIでアデノウイルスの同じ総量とした。4日後、細胞数をCCK-8キットを用いて決定し、その結果を細胞当たり60pfuのMOIでAD-GFPを形質導入したコントロール細胞の数に対して決定した細胞数の比で示した。図２８Ａは、HUVECの増殖における形質導入されたN1ICおよびNotch融合タンパク質の影響を示す。形質導入HUVECを完全培地に懸濁し、次に１ウェル当たり1 x 104 細胞を２４ウェルマルチウェルプレートに0.4mlの記載された培地と共に播種した（白四角：Ad-N1IC；  黒四角：Ad-N1ECDFc）。図２８Ｂは、HP1/VEGF形質移入体の増殖におけるNotch融合タンパク質の影響を示す。形質導入されたKP1/VEGF形質移入体をRPMI1640に懸濁し、次に24ウェルマルチウェルプレートに１ウェル当たり2ｘ104 細胞を0.5mlの培地と共に播種した。
【図２８Ｂ】図28A - 28B  これらの図は、細胞増殖におけるNotchシグナリングの変化の影響を示す。細胞を記載されたアデノウイルスで形質導入した。Ad-GFPも同時形質導入されて、細胞当たり60pfuのMOIでアデノウイルスの同じ総量とした。4日後、細胞数をCCK-8キットを用いて決定し、その結果を細胞当たり60pfuのMOIでAD-GFPを形質導入したコントロール細胞の数に対して決定した細胞数の比で示した。図２８Ａは、HUVECの増殖における形質導入されたN1ICおよびNotch融合タンパク質の影響を示す。形質導入HUVECを完全培地に懸濁し、次に１ウェル当たり1 x 104 細胞を２４ウェルマルチウェルプレートに0.4mlの記載された培地と共に播種した（白四角：Ad-N1IC；  黒四角：Ad-N1ECDFc）。図２８Ｂは、HP1/VEGF形質移入体の増殖におけるNotch融合タンパク質の影響を示す。形質導入されたKP1/VEGF形質移入体をRPMI1640に懸濁し、次に24ウェルマルチウェルプレートに１ウェル当たり2ｘ104 細胞を0.5mlの培地と共に播種した。
【図２９】この図は、AD-N1IC-形質導入HUVECにおけるPIGF発現の誘導のRT-PCR分析を示す。HUVECは、細胞当たり40pfuのMOIでのAd-LacZまたはAd-N1ICの何れかで感染された。全RNAを、コラーゲンゲル上で５日間にわたり完全培地で培養された形質導入HUVECから単離した。
【図３０Ａ】図30A - 30C  これらの図は、Ad-N1IC-またはAd-VEGF-形質導入HUVECの何れかの出芽のFlk-1 siRNAトランスフェクションによる阻害を示す。図３０Ａは、Ad-VEGF-HUVECにおけるFlk-1 mRNAおよびタンパク質の発現の200pmolのFlk-1 siRNAのトランスフェクションによる減少を示す。細胞当たり40pfuのMOIでAd-VEGF-HUVECをコントロール（CT）またはFlk-1 siRNAの何れかで200pmolでトランスフェクトした。総RNAをトランスフェクションの48時間後に単離した。全細胞ライセート（Total cell lysate）を、トランスフェクションの48時間にわたりSFMで血清が枯渇された細胞から収集した。図３０Ｂおよび３０Ｃは、VEGFまたはNotchの何れかの誘導性HUVEC出芽におけるFlk-1 siRNAトランスフェクションの阻害効果を示す。細胞当たり40 pfuのMOIでAd-N1IC-またはAd-VEGF-HUVECの何れかを記載された通りの200pmolのsiRNAでトランスフェクトし、５日間コラーゲンゲル上で培養した。図３０ＢはHUVEC出芽におけるFlk-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す（白四角：Ad-VEGF；  黒四角：Ad-N1IC）。図３０Ｃは、Ｆｌｋ-1 siRNAトランスフェクションの阻害効果の定量化を示す。
【図３０Ｂ】図30A - 30C  これらの図は、Ad-N1IC-またはAd-VEGF-形質導入HUVECの何れかの出芽のFlk-1 siRNAトランスフェクションによる阻害を示す。図３０Ａは、Ad-VEGF-HUVECにおけるFlk-1 mRNAおよびタンパク質の発現の200pmolのFlk-1 siRNAのトランスフェクションによる減少を示す。細胞当たり40pfuのMOIでAd-VEGF-HUVECをコントロール（CT）またはFlk-1 siRNAの何れかで200pmolでトランスフェクトした。総RNAをトランスフェクションの48時間後に単離した。全細胞ライセート（Total cell lysate）を、トランスフェクションの48時間にわたりSFMで血清が枯渇された細胞から収集した。図３０Ｂおよび３０Ｃは、VEGFまたはNotchの何れかの誘導性HUVEC出芽におけるFlk-1 siRNAトランスフェクションの阻害効果を示す。細胞当たり40 pfuのMOIでAd-N1IC-またはAd-VEGF-HUVECの何れかを記載された通りの200pmolのsiRNAでトランスフェクトし、５日間コラーゲンゲル上で培養した。図３０ＢはHUVEC出芽におけるFlk-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す（白四角：Ad-VEGF；  黒四角：Ad-N1IC）。図３０Ｃは、Ｆｌｋ-1 siRNAトランスフェクションの阻害効果の定量化を示す。
【図３０Ｃ】図30A - 30C  これらの図は、Ad-N1IC-またはAd-VEGF-形質導入HUVECの何れかの出芽のFlk-1 siRNAトランスフェクションによる阻害を示す。図３０Ａは、Ad-VEGF-HUVECにおけるFlk-1 mRNAおよびタンパク質の発現の200pmolのFlk-1 siRNAのトランスフェクションによる減少を示す。細胞当たり40pfuのMOIでAd-VEGF-HUVECをコントロール（CT）またはFlk-1 siRNAの何れかで200pmolでトランスフェクトした。総RNAをトランスフェクションの48時間後に単離した。全細胞ライセート（Total cell lysate）を、トランスフェクションの48時間にわたりSFMで血清が枯渇された細胞から収集した。図３０Ｂおよび３０Ｃは、VEGFまたはNotchの何れかの誘導性HUVEC出芽におけるFlk-1 siRNAトランスフェクションの阻害効果を示す。細胞当たり40 pfuのMOIでAd-N1IC-またはAd-VEGF-HUVECの何れかを記載された通りの200pmolのsiRNAでトランスフェクトし、５日間コラーゲンゲル上で培養した。図３０ＢはHUVEC出芽におけるFlk-1 siRNAトランスフェクションの効果を示す（白四角：Ad-VEGF；  黒四角：Ad-N1IC）。図３０Ｃは、Ｆｌｋ-1 siRNAトランスフェクションの阻害効果の定量化を示す。
【図３１Ａ】図31A - 31B  これらの図は、Ad-N1IC-形質導入HUVECの出芽のマトリックスメタロプロテイン阻害剤GM6001の処理での阻害を示す。細胞当たり40pfuでのAd-LacZまたはAd-N1IC-HUVECの何れかを50μmでのGM6001の不在または存在において５日間コラーゲンゲル上で培養した。図３１Ａは、Notch誘導性HUVEC出芽におけるGM6001の効果を示す。図３１Ｂは、GM6001の阻害効果の定量化を示す。
【図３１Ｂ】図31A - 31B  これらの図は、Ad-N1IC-形質導入HUVECの出芽のマトリックスメタロプロテイン阻害剤GM6001の処理での阻害を示す。細胞当たり40pfuでのAd-LacZまたはAd-N1IC-HUVECの何れかを50μmでのGM6001の不在または存在において５日間コラーゲンゲル上で培養した。図３１Ａは、Notch誘導性HUVEC出芽におけるGM6001の効果を示す。図３１Ｂは、GM6001の阻害効果の定量化を示す。
【図３２Ａ】図 32A, 32B および 32C:  この図は、開始ATG (nt 1)から中止 (TGA; nt 6964)までからなるヒト Notch3 (配列番号15)の完全長 ヌクレオチド配列を示す。シグナルペプチドおよび最初の34 EGF様リピートドメインはこの配列のnt 1-4158に存在する。ヌクレオチド 1-4158は、本発明に記載されるヒト Notch3 デコイ タンパク質のデザインのため利用される。EGFリピート1-34 を含むヌクレオチドに下線を引く。
【図３２Ｂ】図 32A, 32B および 32C:  この図は、開始ATG (nt 1)から中止 (TGA; nt 6964)までからなるヒト Notch3 (配列番号15)の完全長 ヌクレオチド配列を示す。シグナルペプチドおよび最初の34 EGF様リピートドメインはこの配列のnt 1-4158に存在する。ヌクレオチド 1-4158は、本発明に記載されるヒト Notch3 デコイ タンパク質のデザインのため利用される。EGFリピート1-34 を含むヌクレオチドに下線を引く。
【図３２Ｃ】図 32A, 32B および 32C:  この図は、開始ATG (nt 1)から中止 (TGA; nt 6964)までからなるヒト Notch3 (配列番号15)の完全長 ヌクレオチド配列を示す。シグナルペプチドおよび最初の34 EGF様リピートドメインはこの配列のnt 1-4158に存在する。ヌクレオチド 1-4158は、本発明に記載されるヒト Notch3 デコイ タンパク質のデザインのため利用される。EGFリピート1-34 を含むヌクレオチドに下線を引く。
【図３３】この図は、ヒトNotch3 の完全長アミノ酸(aa)配列を示し、aa 1 (M =メチオニン)からaa 2555(K =リジン)からなる（配列番号16）。シグナルペプチドおよび最初の34 EGF様リピートドメインはこの配列のaa 1-1386に存在する。アミノ酸1-1386は、ヒトNotch3デコイタンパク質のデザインに利用された（これは後のセクションに記載する）。EGF-リピート1-34を含むアミノ酸には下線を引く。
【図３４】この図は、図式化した二つのヒト Notch3 デコイ タンパク質である h-Notch3(1-34)デコイ および h-spHC-Notch3(1-34) デコイを示す。
【図３５】この図は、Notch3 デコイタンパク質におけるFcタグを産生するために利用できるヒトFcヌクレオチド配列を示す(配列番号17)。ヒトFcの713のヌクレオチドは、Notch3 のEGF様リピートのちょうど下流の、Notch3 デコイ構築物の3'端で融合される。ヒトFcのこの領域は、Notchデコイの検出および精製を可能とし、分泌ヒトNotch 3-ヒトFc融合タンパク質を安定化するために貢献する。
【図３６】この図は、Notch3 デコイタンパク質におけるFcタグを産生するために利用できるヒトFcアミノ酸配列を示す(配列番号18)。ヒトFcの237 アミノ酸は、Notch3 のEGF様リピートのまさに下流の、全てのNotch3 デコイ構築物のＣ末端で融合される。ヒトFcのこの領域は、Notchデコイの検出および精製を可能とし、分泌ヒトNotch 3-ヒトFc融合タンパク質を安定化するために貢献する。
【図３７】この図は、ヒトNotch 3のEGFリピート34の後で終止する全ての構築物についてのヒトNotch3/Fc融合配列を示す。
【図３８】この図は、ヒトNotch3のアミノ酸 1-40を含むと予測されるヒト Notch3シグナルペプチドのシグナル配列分析を示す。この測定は、デンマークのTechnical Universityによって提供されるシグナルIP 3.0サーバプログラムを用いてなされた。これらの結果は、アラニン 39 (A39) および アラニン 40 (A40)の間に位置する切断の主要な部位を予測する。切断部位を本図に供されるヒトNotch3 のアミノ酸配列1-40 に"／"により示す。
【図３９】この図は、ヒトHCのアミノ酸 1-22を含むと予測されるヒトHCシグナルペプチドのシグナル配列分析を示す。この測定は、デンマークのTechnical Universityによって提供されるシグナルIP 3.0サーバプログラムを用いてなされた。これらの結果は、アラニン 21 (A21) および アルギニン 22 (A22)の間に位置する切断の主要な部位を予測する。この切断部位を上記に供されるヒトHCのアミノ酸配列1-22 に"／"により示す。
【図４０Ａ】図40A - 40B  この図は、h-Notch3(1-34)デコイタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号31）を示す。予測されたヒト Notch3 シグナルペプチドに下線を引く (nt 1-120)。Notch3 EGF リピート1-34は、nt 121-4158でコードされる。融合のジャンクション（BglII 部位）は、nt 4158-4163に位置する。Fc タグ配列に下線を付してイタリックで示す。
【図４０Ｂ】図40A - 40B  この図は、h-Notch3(1-34)デコイタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号31）を示す。予測されたヒト Notch3 シグナルペプチドに下線を引く (nt 1-120)。Notch3 EGF リピート1-34は、nt 121-4158でコードされる。融合のジャンクション（BglII 部位）は、nt 4158-4163に位置する。Fc タグ配列に下線を付してイタリックで示す。
【図４１】この図は、h-Notch3(1-34)デコイタンパク質のアミノ酸配列（配列番号32）を示す。予測されたヒト Notch3 シグナルペプチドに下線を引く(AA 1-40)。Notch3 EGF リピート1-34は、aa 41-1386でコードされる。FC タグ配列に下線を付してイタリックで示す。
【図４２】この図は、h-spHCNotch3(1-34)デコイタンパク質のアミノ酸配列（配列番号33）を示す。予測されたヒト Notch3 シグナルペプチドに下線を引く(AA 1-22)。Notch3 EGF リピート1-34は、aa 22-1386でコードされる。FC タグ配列に下線を付してイタリックで示す。
【図４３Ａ】図43A - 43B  この図は、h-spHCNotch3(1-34)デコイタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号34）を示す。予測されたヒト HC シグナルペプチドに下線を引く (nt 1-66)。Notch3 EGF リピートは、nt 67-4104でコードされる。融合のジャンクション（BglII 部位）は、nt 5004〜5009である。Fc タグ配列に下線を付してイタリックで示す。
【図４３Ｂ】図43A - 43B  この図は、h-spHCNotch3(1-34)デコイタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号34）を示す。予測されたヒト HC シグナルペプチドに下線を引く (nt 1-66)。Notch3 EGF リピートは、nt 67-4104でコードされる。融合のジャンクション（BglII 部位）は、nt 5004〜5009である。Fc タグ配列に下線を付してイタリックで示す。
【図４４】この図は、Notch タンパク質 および リガンドの血液およびリンパ性の内皮細胞における発現を示す。RT-PCTを、HMVECから精製された血液内皮細胞(BEC：  blood endothelial cells) およびリンパ性内皮細胞(LEC：  lymphatic endothelial cells)から単離されたRNAにおいてNotch1-4, Dll4, Dll4 および Jagged1で行った。Notch1, Notch2, Notch4, Dll4 および Jagged1は、BEC および LECの双方で類似するレベルで発現された。Notch 3の発現はLECに限定されるように見え、リンパ内皮（lymphatic endothelium）におけるNotch3 シグナル伝達機能を示唆する。
【図４５】この図は、Notch3がe13.5 胚においてリンパ性の内皮細胞マーカー LYVE-1 および Prox1と共発現することを示す。胚日数（embryonic day）13.5日のマウス胚の10 ミクロンの連続切片を、LYVE-1, Prox1 および Notch3の何れかで免疫染色した。Notch3は、リンパ性の内皮細胞マーカー, LYVE-1 および Prox1も発現する細胞において発現した。
【図４６】この図は、血液内皮細胞におけるProx1誘導性Notch3発現を示す。(A)  Prox1のエクストピック（extopic）発現がNotch タンパク質またはリガンドの発現を変化させるかどうかが調査された。Ad-Prox1またはAd-LacZの何れかでのアデノウイルス感染の二十四時間後、HUVECのトータルRNAを単離し、定量的な RT-PCRをNotch1-4, Dll4 およびJagged1に関して行なった。Prox-1は、Notch3の発現を強くアップレギュレートした。Notch1, Notch2, Notch4, Dll4 および Jagged1発現は、有意に影響されなかった。(B)  化合物 E (cE)〔Notch シグナル伝達を阻害するPresenlin インヒビター〕をAd-LacZまたはAd-Prox1感染HUVECの何れかと24 時間インキュベーションした。トータルRNAを単離し、定量的なPCRを行なってNotch3 発現を決定した。Prox1はNotch3発現を誘導し、本誘導は化合物 Eの付加により阻害された。この結果は、Notch3のProx1 誘導がNotch シグナル活性化に依存することを示唆する。
【図４７】この図は、Prox1が血液内皮細胞においてNotch-標的遺伝子を誘導することを示す。HUVECをLacZ, Prox1, N1IC またはN4/int-3をコードしているアデノウイルスで感染させ、トータルRNAを感染24時間後単離した。定量的なRT-PCRを内皮のNotch-標的遺伝子, VEGFR-3, EphrinB2, Hey1 および Hey2に関して行なった。Notch1 および Notch4 シグナル活性化と類似して、Prox1は全て四つの遺伝子を誘導する(A および B)。Hey1および Hey2のリンパ内皮における発現は、知られていない。
【図４８】この図は、Prox1がNotch-標的遺伝子を誘導し、血液内皮細胞におけるNotchシグナリングに依存することを示す。HUVECを、LacZ, Prox1, N1Ic またはN4/int-3をコードしているアデノウイルスで感染させた。化合物 E (cE)〔Notch シグナル伝達を阻害するPresenlin インヒビター〕をAd-LacZまたはAd-Prox1感染HUVECの何れかと24 時間インキュベーションし、トータルRNAを単離した。定量的なRT-PCRを内皮のNotch-標的遺伝子, VEGFR-3, EphrinB2, および Hey2に関して行なった。Notch 標的遺伝子（ephrinB2, VEGFR-3 および Hey2）のProx-1 媒介性の誘導は、Notch シグナル伝達インヒビター化合物 Eの添加により阻害された。従って、Prox1は、ephrinB2, VEGFR-3 および Hey2の発現をNotchを介して制御する。
【図４９】この図は、N1ICノックイン（knock in）の模式図を示す。Notch1の活性型を、二つのLoxP 部位と接するEF1alpha 座位に挿入した。Cre-リコンビナーゼの発現に際して、neo/tpAカセットが失われ、N1ICがユビキタスなEF1 アルファプロモーターの制御下で発現される。
【図５０】この図は、SM22を発現している血管平滑筋細胞におけるNotch 活性化がE10.5前に胚致死を生じることを示す。生存可能な SM22Cre/+; EF1αN1IC/ マウスは、出生後21日(P21)で観察されなかった（p 値  0.001未満）。胚日数がE9.5で予測数のSM22Cre/+; EF1αN1IC/+ 胚が観察されたが、これらはコントロールの同腹仔と比較して重篤な成長の遅延が認められた（下のパネル）。
【図５１】この図は、SM22を発現している血管平滑筋細胞におけるNotch 活性化がアルファ平滑筋細胞のアクチン発現を変化させることを示す。E9.5 胚を、アルファ平滑筋細胞アクチンに関してホールマウントで免疫染色した。アルファ 平滑筋細胞アクチンの発現は、WTコントロールと比較してSM22Cre/+; EF1αN1IC/+ 胚において変化した。このように血管平滑筋細胞におけるNotch シグナル活性化は、心血管（cardiovascular）の発生を破壊させた。
【００１７】
[発明の詳細な記載]用語
本出願に使用される次ぎの用語のそれぞれは、他に明示的に記載がなければ、以下に記載される意味を有する。  
「投与すること」は当業者に公知の何れかの方法を使用して達成または実行されえる。当該方法は、例えば、病巣内（intralesional）、筋肉内、皮下、静脈内、腹腔内、リポソーム媒介（liposome-mediated）、経粘膜、経腸、局所的、経鼻、経口、経肛門、経眼、経耳の送達手段を含む。  
「付着された（Affixed）」は、何れかの手段により接着（attached）されることを意味するべきである。一つの態様において、「付着された」は、共有結合により接着されたことを意味する。別の態様において、「付着された」は、非共有結合により接着されたことを意味する。  
「アミノ酸」、「アミノ酸残基」および「残基」は、本発明において交換可能に使用され、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに導入されたアミノ酸を参照する。アミノ酸は、例えば、天然に発生しているアミノ酸または天然に発生しているアミノ酸と同様の様式で機能できる天然のアミノ酸の類似体であってよい。  
「抗体」は、これに制限されるものではないが、（ａ）二つの重鎖と二つの軽鎖を含み、抗原を認識するイムノグロブリン分子；（ｂ）ポリクローナルまたはモノクローナルイムノグロブリン分子；および（ｃ）その一価または二価のフラグメント；を含むであろう。イムノグロブリン分子は何れかの一般的に知られるクラスに由来してよく、これらに限定するものではないが、IgA、分泌性のIgA、IgG、IgEおよびIgMを含む。IgGのサブクラスは当業者に周知であり、これらに限定するものではないが、ヒトIgG1, IgG2、IgG3およびIgG4を含む。抗体は、天然に発生しているものと非天然に発生しているものの両方であってよい。更に、抗体は、キメラ抗体、完全な合成抗体、単一鎖抗体（single chain antibodies）及びそのフラグメントを含む。抗体は、ヒトまたは非ヒトであってよい。非ヒト抗体は、組み換え法によりヒト化されて、ヒトにおけるそれらの免疫原性を減少してもよい。抗体フラグメントは、これらに限定するものではないが、FabおよびFｃフラグメントを含む。一つの態様において、「抗体のFc部分（Fc portion of an antibody）」は、ジスルフィド結合により連結された２つの重鎖のC末端の半分からなるイムノグロブリンのパパイン消化により得られる結晶性フラグメントであり、イムノグロブリンの「エフェクター領域（effector region）」として知られている。別の態様において、「抗体のFc部分」は重鎖の一つのC端半分の全て又は実質的に全てを意味する。  
抗体に関する「ヒト化（Humanized）」は、CDR領域の外側の幾つか、殆どまたは全てのアミノ酸がヒトイムノグロブリン分子に由来する対応するアミノ酸で置換された抗体を意味する。抗体が所与の抗原に結合する能力をこれらがなくさない限り、アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換、または修飾は許される。適切なヒトイムノグロブリン分子は、これらに限定されるものではないが、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAおよびIgM分子を含む。種々の刊行物が、ヒト化された抗体をどのように作出するのかを記載しており、例えば、米国特許第4,816,567, 5,225,539, 5,585,089号、並びにPCT国際公開番号WO 90/07861に記載される。
【００１８】
本発明において使用される、薬学的組成物における場合の「組成物」の用語は、（単数または複数の）活性成分および担体を形成する（単数または複数の）不活性成分を含む生産物、並びに当該成分の何れかの二もしくは二以上の組み合わせ、複合（complexation）もしくは集合（aggregation）により、または当該成分の一もしくは一以上の分離により、または当該成分の一もしくは一以上の他の種類の反応若しくは相互作用により、直接的または間接的に結果として生じる何れかの生産物を包含することを意図する。  
本発明において使用される「有効な量（effective amount）」は、腫瘍、疾患または障害を有する対象を治療することが可能な量をいう。従って、有効な量は、治療しようとする対象および治療される状態によって変わるだろう。当業者は、そのような十分な量を決定するためにルーチンの滴定実験を行うことが可能である。化合物の有効な量は、対象および使用される特定の投与経路に依存して変化するだろう。化合物に基づいて、前記量が、連続して（例えば、連続的なポンプによって）、または断続的な間隔で（例えば、一または一以上の独立した機会に）送達できる。所望の時間間隔での特定の化合物の複数の量が、当業者による過度の実験もなく決定される。一つの態様において、有効な量は約1μg/kg〜10 mg/kgの間である。別の態様において、有効な量は、10μg/kg〜1 mg/kgの間である。更なる態様において、有効な量は100μg/kgである。
【００１９】
Notchレセプタータンパク質に関連して使用されるとき、「細胞外ドメイン（Extracellular domain）」は、全てのまたは一部分のNotchであり、これは（ｉ）細胞外に存在する（即ち、膜貫通部分または細胞内部分のどちらとしても存在しない）、および（ii）インタクトのNotchレセプタータンパク質が結合する細胞外リガンドに対して結合することを意味する。Notchの細胞外ドメインは任意でシグナルペプチドを含んでよい。「細胞外ドメイン」、「ECD」および「外部ドメイン（Ectodomain）」は同義である。
【００２０】
「半減期を増大する成分（Half-life-increasing moiety）」は、第二の成分に対して稼働可能に付着（operably affixed）されたとき、該第二の成分のインビボの半減期を増大する成分を意味する。半減期を増大する成分は、例えば、抗体のFc部分、グリコシル化タグ（即ち、グリコシル化されたポリペプチド）、ポリエチレングリコール（PEG）、それに対して付着されたPEGを有するポリペプチド、および脂質修飾化ポリペプチド（lipid-modified polypeptides）などを含む。  
疾患または望ましくない生物学的な過程の開始を「阻害する」は、疾患または過程の開始（process' onset）の可能性(likelihood)を減少すること、または完全に疾患または過程の開始を抑制することのどちらも意味するべきである。好ましい態様において、疾患または過程の開始を阻害することは、完全にその開始を抑制（preventing）することを意味する。
【００２１】
「Notch」、「Notchタンパク質」および「Notchレセプタータンパク質」は同義である。加えて、「Notchに基づく融合タンパク質」および「Notchデコイ（Notch decoy）」の用語は、同義（synonymous）である。以下のNotchアミノ酸配列は公知であり、引用することにより本発明に援用される；Notch1 (Genbank accession no. S18188 (ラット)); Notch2 (Genbank accession no. NP 077334 (ラット)); Notch3 (Genbank accession no. Q61982 (マウス)); およびNotch4 (Genbank accession no. T09059 (マウス))。以下のNotch核酸配列は公知であり、引用することにより本発明に援用される；  Notch1 (Genbank accession no. XM_342392 (ラット) およびNM_017617 (ヒト)); Notch2 (Genbank accession no. NM_024358 (ラット), M99437 (human and AF308601 (ヒト)); Notch3 (Genbank accession no. NM_008716 (マウス) およびXM_009303 (human)); およびNotch4 (Genbank accession no. NM_010929 (マウス) およびNM_004557 (ヒト))。  
「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「核酸配列」の用語は、本発明において交換可能に使用され、各々デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドのポリマーをいう。デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、天然に発生している、またはその合成的な類似体（synthetic analogues）であってよい。「核酸」は何れかの核酸を意味し、これらに限定するものではないが、DNA、RNAおよびそのハイブリッドを含む。核酸分子を形成する核酸塩基は、塩基A、C、G、TおよびU、同様にその誘導体であってもよい。これらの塩基の誘導体は当該技術において周知であり、またPCRシステム、試薬および消耗品において例示されている（Perkin Elmer Catalogue 1996-1997, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, New Jersey, USA）。核酸は、これらに限定するものではないが、アンチセンス分子および触媒的な核酸分子、例えば、リボザイムおよびDNAzymeなどを含む。核酸はまた、ペプチド類似体（peptide analogs）、フラグメントまたは誘導体をコードする核酸を含み、それらは一または一以上のアミノ酸残基の同一性の点から天然に発生している形態とは異なり（特定された残基の全体よりも少ない残基を含む欠失類似体；  一または一以上の残基が一または一以上の残基により置換されている置換類似体；および  一または一以上の残基が該ペプチドの末端または内側の部分に対して加えられている付加類似体）、該天然に発生している形態の性質の一部分または全部を共有するものである。  
第二の成分に対して付着している第一の成分に関しての「稼働可能に付着している」は、それがそのように付着されていないかのように、第一の成分の機能（例えば、結合特性などの）を可能にする様式において付着されることをいう。  
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」の用語は、本発明において交換可能に使用され、各々アミノ残基のポリマーを意味する。アミノ酸残基は、天然に発生しているものであっても、その化学的類似体であってもよい。ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質はまた、グリコシル化、脂質付着（lipid attachment）、硫酸化、ヒドロキシル化およびADPリボース化などの修飾を含んでもよい。
【００２２】
本発明において使用される「薬学的に許容される担体（pharmaceutically acceptable carrier）」は、担体が製剤の他の成分と適合性であり、且つそのレシピエントに対して有害ではないことを意味し、標準的な薬学的に許容される何れの担体をも包含する。そのような担体は、例えば、0.01〜0.1M、好ましくは0.05Mのリン酸緩衝液または0.8％の塩類溶液（saline）を含む。その上、そのような薬学的に許容される担体は、水性または非水性溶液、懸濁液および乳濁液（emulsions）であってよい。非水性の溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体は、水、アルコール性／水性溶液、乳濁液および懸濁液を含み、これらは塩類溶液および緩衝化媒体（buffered media）を含む。非経口のビヒクル（Parenteral vehicles）は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル（lactated Ringer's）および固定油（fixed oils）を含む。静脈内のビヒクルは、流体（fluid）および栄養補充剤（nutrient replenishers）、リンゲルデキストロースなどに基づくものなどの電解質補充剤を含む。保存剤および他の添加物、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどが存在してもよい。  
「対象（Subject）」は何れかの生物体を意味し、これらに限定するものではないが、哺乳類、例えば、マウス、ラット、イヌ、モルモット、フェレット、ウサギおよび霊長類などを含む。好ましい態様において、対象はヒトである。  
「治療すること（Treating）」は、疾患または障害の進行を遅くする、止めるまたは後退（reversing）することの何れかを意味する。本発明において使用される「治療する」はまた、疾患または障害に関連する症状の寛解をも意味する。疾患は、これらに限定するものではないが、腫瘍血管形成、アテローム性動脈硬化、創傷治癒、黄斑性変性、未熟児網膜症、子癇前症、糖尿病性網膜症、虚血、発作（Stroke）、循環器病（Cardiovascular Disease）、および乾癬を含む。  
血管形成は、創傷治癒過程、雌性月経周期および子宮内膜リモデリング（endometrial remodeling）の間、並びに胚発生および臓器発達の間に生じる。病理学的なセッティングにおいて、血管形成は、関節リウマチ、乾癬、黄斑性変性、糖尿病性網膜症および腫瘍成長などの異なる疾患において重要な役割を演じている。
【００２３】
異常な血管形成が幾つかの疾患状態（これには関節リウマチ、炎症、癌、乾癬、退行性の眼科的状態などが含まれる）に関連することについてのかなりのインビボ（臨床的な知見を含む）における証拠が存在する。  
ユニット（Units）、プレフィックス（prefixes）およびシンボル（symbols）は、それらのＳＩ公認の形態において表示されえる。他の記載がない限り、核酸配列は、左から右に５’から３’の配向で記載され、アミノ酸配列は左から右に、アミノ末端からカルボキシ末端の配向で記載される。本発明においてアミノ酸は、IUPAC-IUB生化学命名法委員会により推奨されるアミノ酸の一般的に知られる三文字記号または一文字記号の何れかにより参照されえる。同様に、ヌクレオチドは、ヌクレオチドの一般的に容認される一文字コードにより参照されえる。  
以下の略語が本発明において使用される：  ECD: 細胞外ドメイン; IC: 細胞内ドメイン; NECD/Fc: Notchに基づく融合タンパク質; N1: Notch1; N2: Notch2; N3: Notch3; N4: Notch4; Dll: Delta-様; EC: 内皮細胞; FGF: 繊維芽細胞成長因子; FGFR: 繊維芽細胞成長因子レセプター; HUVEC: ヒト臍帯静脈内皮細胞; m.o.i.: 感染の多重度（multiplicity of infection）; VMC:血管壁細胞（vascular mural cells）; VEGF: 血管内皮細胞成長因子; VEGFR: 血管内皮細胞成長因子レセプター; sp: シグナルペプチド; HCまたはHc: 重鎖IgG; PDGF: 血小板由来成長因子; P1GF: 胎盤性成長因子（placental growth factor）。
【００２４】
[発明の態様]
本発明は、シグナルペプチド、ヒトNotch3レセプタータンパク質の細胞外ドメインのEGFリピート 1-X（当該Xは、12〜34の任意の整数である）、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質を提供する。  
本発明は、シグナルペプチド、ヒトNotch3レセプタータンパク質の細胞外ドメインのEGFリピート 1-X（当該Xは、1〜10の任意の整数である）、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質を提供する。  
本発明は、シグナルペプチド、ヒトNotch3レセプターの細胞外ドメインの少なくとも12のEGFリピート、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質を提供する。  
本発明は、シグナルペプチド、ヒトNotch3 レセプタータンパク質の細胞外ドメインのEGFリピート（ここで、少なくとも12のEGFリピートが存在する）、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質を提供する。
【００２５】
融合タンパク質の一つの態様において、Notch3レセプタータンパク質の細胞外ドメインは、EGF様リピート1-34を含む。  
融合タンパク質の一つの態様において、抗体のFc部分はヒト抗体のFc部分である。  
融合タンパク質の一つの態様において、シグナルペプチドは、Notch3または抗体の Hc (HC; 重鎖)部分のシグナルペプチドである。  
一つの態様において、融合タンパク質は連続したアミノ酸（consecutive amino acids）を含み、その配列は配列番号32で表される。別の態様において、融合タンパク質は連続したアミノ酸（consecutive amino acids）を含み、その配列は配列番号33で表される。
一つの態様において、融合タンパク質は、連続したヌクレオチド（consecutive nucleotide）によりコードされ、その配列は配列番号31で表される。別の態様において、融合タンパク質は、連続したヌクレオチド（consecutive nucleotide）によりコードされ、その配列は配列番号34で表される。
【００２６】
本発明は、前記対象に上記の融合タンパク質の対象を治療するために有効な量を投与し、それにより腫瘍を有する前記対象を治療することを含む、腫瘍を有する対象を治療する方法を提供する。  
本発明は、対象において血管形成を阻害するために有効な量の上記融合タンパク質を前記対象に投与し、それにより当該対象における血管形成を阻害することを含む、対象において血管形成を阻害する方法を提供する。  
本発明は卵巣癌を有する対象を治療する方法を提供し、該方法は該対象の治療のために有効な量の上記融合タンパク質を前記対象に投与し、それにより卵巣癌を有する前記対象を治療することを含む。
【００２７】
本発明は、循環器病を有する対象を治療する薬学的組成物の製造のための上記融合タンパク質の使用を提供する。一つの態様において、循環器病は、アテローム性動脈硬化症,虚血または発作である。  
本発明は、腫瘍を有する対象を治療する薬学的組成物の製造のための上記融合タンパク質の使用を提供する。  
本発明は、対象における血管形成を阻害する薬学的組成物の製造のための上記融合タンパク質の使用を提供する。  
本発明は、卵巣癌を有する対象を治療する薬学的組成物の製造のための上記融合タンパク質の使用を提供する。
【００２８】
本発明は、対象において生理的なリンパ管形成または病理学的なリンパ管形成を阻害するために有効な量の上記融合タンパク質を前記対象に投与することを含む、当該対象における生理的なリンパ管形成または病理学的なリンパ管形成を阻害するための方法を提供する。一つの態様において、病理学的なリンパ管形成は、腫瘍リンパ管形成（tumor lymphangiogenesis）または腫瘍リンパ管形成による可能性があるリンパ節転移である。  
本発明は、対象において腫瘍転移を阻害するために有効な量の上記融合物を該対象に投与することを含む、該対象における腫瘍転移を阻害する方法を提供する。態様において、転移は、血管、リンパ性脈管構造またはリンパ節を介して生じる。腫瘍転移は、一つの臓器から別の非隣接的な臓器に癌が広がることである。  
本発明は、対象における二次性腫瘍（secondary tumor）の成長を阻害するために有効な上記融合タンパク質の量を対象に投与することを含む、対象における二次性腫瘍の成長を阻害する方法を提供する。また、阻害は、二次性または転移性の腫瘍に関連する腫瘍の血管形成についてのものであってもよい。一つの態様において、二次性腫瘍成長は、二次性腫瘍に関連する血管形成の阻害により阻害される。  
本発明は、対象における腫瘍による血管取り込み（blood vessel cooption）を阻害するために有効な量の上記融合タンパク質を前記対象に投与することを含む当該対象における腫瘍による血管取り込みを阻害する方法を提供する。血管取り込みの過程は、腫瘍細胞が、既存の血管と相互作用し、取り込まれた血管（coopted vessels）の補助で成長する過程である。この取り込まれた血管における腫瘍の成長は、腫瘍血管形成の不在において存在しても、腫瘍血管形成に先行して存在しても、または腫瘍血管形成との組み合わせで存在してもよい。
【００２９】
本発明は、それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の上記融合タンパク質と血管内皮成長因子(VEGF)のインヒビターとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法を提供する。一つの態様において、VEGFのインヒビターは、VEGF-Aのインヒビター、P1GFのインヒビター、VEGF-Bのインヒビター、VEGF-Cのインヒビター、またはVEGF-Dのインヒビターである。VEGFインヒビターの例は、これらに制限するものではないが、ベバシズマブ(bevacizumab)、PTK787, Bay43-9006, SU11248, AG013676, ZD6474, VEGF-trap および抗-VEGFR2を含む。そのようなインヒビターの例は、Ferrara等およびEllis等〔Ferrara et al., (2004) Nature Reviews Drug Discovery, Vol.3:391-400 およびEllis et al. (2008) Nature Reviews Cancer Vol8:579-591〕に更に十分に記載され、これらの文献のそれぞれの内容は引用することにより本発明に援用される。  
本発明は、それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の上記融合タンパク質とVEGFレセプターインヒビターとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法を提供する。一態様において、VEGFレセプターのインヒビターは、VEGFR-1 インヒビター, VEGFR-2 インヒビター, VEGFR-3 インヒビターまたはVEGFRsのインヒビターの任意の組み合わせである。  
本発明は、それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の上記融合タンパク質と血小板由来増殖因子(PDGF)のインヒビターとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法を提供する。一つの態様において、血小板由来成長因子のインヒビターは、PDGF-AのインヒビターまたはPDGF-Bのインヒビターである。  
本発明は、それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の上記融合タンパク質とPDGFレセプターアンタゴニストとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法を提供する。一つの態様において、PDGFレセプターアンタゴニストは、PDGFレセプターBアンタゴニストである。  
本発明は、それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の上記融合タンパク質とHER2/neuのインヒビターを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法を提供する。  
本発明は、対象における乳癌を治療するために有効な量の上記融合タンパク質を対象に投与することを含む、対象における乳癌を治療する方法を提供する。  
本発明は、乳癌を有する対象を治療するための薬学的組成物の製造のための上記融合タンパク質の使用を提供する。
【００３０】
また、本発明は、半減期を増大する成分（half-life-increasing moiety）に対して稼働可能に付着されたNotchレセプタータンパク質の細胞外ドメインを含む組成物の有効量を該対象に投与し、それにより該対象を治療することを含む、腫瘍を有する対象を治療するための第一の方法も提供する。  
また、本発明は、半減期を増大する成分に対して稼働可能に付着されたNotchレセプタータンパク質の細胞外ドメインを含む組成物の有効量を該対象に投与し、それにより該対象における血管形成を阻害することを含む、対象における血管形成を阻害するための第二の方法も提供する。
【００３１】
上記方法の第一の態様において、Notchレセプタータンパク質は、Notch1レセプタータンパク質である。一つの態様において、Notch1レセプタータンパク質は、ヒトNotch1レセプタータンパク質である。別の態様において、半減期を増大する成分は、抗体のFc部分である。別の態様において、抗体のFc部分は、ヒト抗体のFc部分である。更なる態様において、細胞外ドメインおよび半減期を増大する成分は、同じポリペプチド鎖の範囲内にある。
上記方法の第二の態様において、Notchレセプタータンパク質は、Notch2レセプタータンパク質である。一つの態様において、Notch2レセプタータンパク質は、ヒトNotch2レセプタータンパク質である。別の態様において、半減期を増大する成分は、抗体のFc部分である。別の態様において、抗体のFc部分は、ヒト抗体のFc部分である。更なる態様において、細胞外ドメインおよび半減期を増大する成分は、同じポリペプチド鎖の範囲内にある。
上記方法の第三の態様において、Notchレセプタータンパク質は、Notch3レセプタータンパク質である。一つの態様において、Notch3 レセプタータンパク質は、ヒトNotch3 レセプタータンパク質である。別の態様において、半減期を増大する成分は、抗体のFc部分である。別の態様において、抗体のFc部分は、ヒト抗体のFc部分である。更なる態様において、細胞外ドメインおよび半減期を増大する成分は、同じポリペプチド鎖の範囲内にある。
上記方法の第四の態様において、Notchレセプタータンパク質は、Notch4 レセプタータンパク質である。一つの態様において、Notch4 レセプタータンパク質は、ヒトNotch4 レセプタータンパク質である。別の態様において、半減期を増大する成分は、抗体のFc部分である。別の態様において、抗体のFc部分は、ヒト抗体のFc部分である。更なる態様において、細胞外ドメインおよび半減期を増大する成分は、同じポリペプチド鎖の範囲内にある。
上記方法の第五の態様において、対象は哺乳類である。一つの態様において、哺乳類は、ヒトである。
上記方法の第六の態様において、血管形成は、腫瘍血管形成である。
【００３２】
前記第二の方法のの更なる態様において、対象は腫瘍である。別の態様において、対象は、病的な脈管過形成（pathologic vascular hyperplasia）に罹患している。一つの態様において、病的な脈管過形成は、良性のヘマジオーマ（benign hemagioma）である。更なる態様において、対象は、リンパ管増殖性疾患（lymphatic vascular proliferative disease）に罹患する。
【００３３】
本発明は、半減期を増大する成分に対して稼働可能に付着されたNotch4レセプタータンパク質の細胞外ドメインを含む第一の組成物を提供する。一つの態様において、細胞外ドメインは、半減期を増大する成分に対して共有結合される。別の態様において、細胞外ドメインおよび半減期を増大する成分は、同じポリペプチド鎖の範囲内にある。
また、本発明は、半減期を増大する成分に対して稼働可能に付着されたNotch4レセプタータンパク質の細胞外ドメインおよび薬学的に許容される担体を含む第二の組成物も提供する。
【００３４】
本発明は更に、（i）半減期を増大する成分に対して稼働可能に付着されたNotchレセプタータンパク質の細胞外ドメインを含む組成物をその中に有するパッキング物質（packaging material）、および（ii）該組成物が、腫瘍または該対象における血管形成を阻害することにより治療可能な他の疾患を有する対象の治療において使用することに向けられることを指示する表示を含む製品を提供する。  
上記製品の第一の態様において、Notchレセプタータンパク質は、Notch1レセプタータンパク質である。一つの態様において、Notch1レセプタータンパク質は、ヒトNotch1レセプタータンパク質である。別の態様において、半減期を増大する成分は、抗体のFc部分である。別の態様において、抗体のFc部分は、ヒト抗体のFc部分である。更なる態様において、細胞外ドメインおよび半減期を増大する成分は、同じポリペプチド鎖の範囲内にある。  
上記製品の第二の態様において、Notchレセプタータンパク質は、Notch2レセプタータンパク質である。一つの態様において、Notch2レセプタータンパク質は、ヒトNotch2レセプタータンパク質である。別の態様において、半減期を増大する成分は、抗体のFc部分である。別の態様において、抗体のFc部分は、ヒト抗体のFc部分である。更なる態様において、細胞外ドメインおよび半減期を増大する成分は、同じポリペプチド鎖の範囲内にある。  
上記製品の第三の態様において、Notchレセプタータンパク質は、Notch3レセプタータンパク質である。一つの態様において、Notch3 レセプタータンパク質は、ヒトNotch3 レセプタータンパク質である。別の態様において、半減期を増大する成分は、抗体のFc部分である。別の態様において、抗体のFc部分は、ヒト抗体のFc部分である。更なる態様において、細胞外ドメインおよび半減期を増大する成分は、同じポリペプチド鎖の範囲内にある。  
上記製品の第四の態様において、Notchレセプタータンパク質は、Notch4 レセプタータンパク質である。一つの態様において、Notch4 レセプタータンパク質は、ヒトNotch4 レセプタータンパク質である。別の態様において、半減期を増大する成分は、抗体のFc部分である。別の態様において、抗体のFc部分は、ヒト抗体のFc部分である。更なる態様において、細胞外ドメインおよび半減期を増大する成分は、同じポリペプチド鎖の範囲内にある。
【００３５】
上記製品の別の態様において、前記組成物は、薬学的担体と混合される。最後の態様において、対象はヒトである。  
本発明は、半減期を増大する成分に対して稼働可能に付着されたNotch3 レセプタータンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドをコードする複製可能なベクターを提供する。一つの態様において、半減期を増大する成分は、抗体のFc部分である。別の態様において、ベクターは、これらに限定するものではないが、プラスミド、コスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、ラムダファージまたはYACを含む。  
また、本発明は、半減期を増大する成分に対して稼働可能に付着されたNotchレセプタータンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドをコードする複製可能なベクターおよび適切なホスト細胞を含む宿主ベクター系を提供する。一つの態様において、ホスト細胞は、真核細胞である。別の態様において、真核細胞は、CHO細胞である。別の態様において、真核細胞は、HeLa細胞である。更なる態様において、ホスト細胞は、細菌性細胞（bacterial cell）である。  
最後に、本発明は、半減期を増大する成分に対して稼働可能に付着されたNotchレセプタータンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドをコードする複製可能なベクターと、適切なホスト細胞とを具備するホストベクター系を、当該ポリペプチドの産生を可能にする条件下で増殖させること、並びにそのように産生されたポリペプチドを回収することとを具備する該ポリペプチドを産生する第三の方法を提供する。
【００３６】
本発明を、続く実験の詳細のセクションにおいて説明する。このセクションは、本発明を理解するのを助けるために記載されるものであるが、その後に続く特許請求の範囲に記載される発明を制限することを意図するものではなく、またそのように解釈されるべきでもない。
【００３７】
［実験の詳細］［第一のシリーズの実験］ヒト Notch3 融合タンパク質(Notchデコイ)
Notch3デコイは、シグナルペプチド, 全てのEGF様リピートドメインを含んでいるNotch3細胞外ドメインの部分,およびヒトFcタンパク質の部分(アミノ酸1-237)をコードしている配列を用いて組み立てられた。ヒトNotch3 の完全な全長ヌクレオチド配列は、図32に提供される。ヒトNotch3 の完全な全長アミノ酸配列は、図33に提供される。
利用されるシグナルペプチドは、本来（native）のNotch3シグナルペプチドまたはヒトHcシグナルペプチドの何れかであり、それぞれNotch3の領域に融合される。シグナルペプチドは、Notchデコイタンパク質の分泌を許容する。
使用されるNotch3細胞外ドメインは、Notchリガンドを結合するために設計され、かつヒトNotch3 タンパク質の34のEGF様リピートドメインの全てまたはサブセットからなる。
Fcタグは、所与のヒトNotch3 のEGF様リピートのC-末端に融合され、Notch3 デコイタンパク質の精製、検出および安定化をなすために貢献する。
【００３８】
ヒトNotch3デコイの全体的なデザイン（二つの構築物）は、以下をコード化するためである;  （１）  タンパク質を生産するために用いられる真核細胞の細胞外の媒体にNotch3デコイタンパク質の分泌を許容するためのシグナルペプチド,  （２）  Notchリガンドとの会合を許容させるための全てのヒトNotch3のEGF様リピートの細胞外ドメインの部分、および  （３）  検出を許容させるためのヒトFcタンパク質の部分。
【００３９】
ヒトNotch3デコイの次の二つの構築物が記載され且つ図34に図示される。
【００４０】
1)  h-Notch3(1-34) デコイ
4)  h-spHcNotch3(1-34) デコイ
ヒトNotch3配列開始ATG (nt 1) から 中止(TGA; nt 6964)までからなるヒト Notch3の完全長ヌクレオチド (nt) 配列は、図32に表される。シグナルペプチドおよび最初の34 EGF様リピートドメインはこの配列のnt 1-4158に存在する。ヌクレオチド1-4158は、ヒトNotch3デコイタンパク質のデザインに利用された（これは後のセクションに記載する）。EGFリピート1-34を含むヌクレオチドに下線を引く。  
aa 1(M= メチオニン)からaa 2555 (K=リジン)からなるヒトNotch3の完全長アミノ酸（aa）配列を図33に示す。シグナルペプチドおよび最初の34 EGF様リピートドメインはこの配列のaa 1-1386に存在する。アミノ酸1-1386は、ヒトNotch3デコイタンパク質のデザインに利用された（これは後のセクションに記載する）。EGF-リピート1-34を含むアミノ酸は下線を引く。
【００４１】
Notch3 デコイタンパク質にFcタグを生成するために利用されるヒトFc配列
ヒトFcの713のヌクレオチド（図35に表される）は、Notch3 のEGF様リピートのちょうど下流の、Notch3 デコイ構築物の3'端で融合される。ヒトFcのこの領域は、Notchデコイの検出および精製を許容し、かつ分泌ヒトNotch 3-ヒトFc融合タンパク質を安定化するために貢献する。  
ヒトFcの237 アミノ酸（図36に表される）は、Notch3 のEGF様リピートのまさに下流の、全てのNotch3 デコイ構築物のＣ末端で融合される。ヒトFcのこの領域は、Notchデコイの検出および精製を許容し、かつ分泌ヒトNotch 3-ヒトFc融合タンパク質を安定化するために貢献する。
【００４２】
Notch3 デコイ タンパク質に利用されたシグナルペプチド
二つの別個（distinct）のシグナルペプチド配列が、ヒトNotch1デコイタンパク質のデザインに導入された。第一はヒトNotch3シグナルペプチドであり、ヒトNotch3 のアミノ酸1-40を含むと予測される。この測定は、デンマークのTechnical Universityによって提供されるシグナルIP 3.0サーバプログラムを用いてなされた。第二はヒトHc シグナルペプチドであり、ヒトIgG 重鎖（HC）シグナルペプチドのアミノ酸1-22を含むと予測される。  
1.  ヒト Notch3 シグナルペプチド (nt 1-20)
MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPPPVRALPLLLLLAGPGAA/A (配列番号27)
予測されるヒトNotch3 シグナルペプチドのアミノ酸配列は、図37に図示される。デンマークのTechnical Universityによってオンラインで提供されるシグナルIP 3.0サーバを利用する分析の予測結果は、図37に示される。これらの結果は、アラニン 39 (A39) および アラニン 40 (A40)の間に位置する切断の主要な部位を予測する。これらの切断部位を上記に供されるヒトNotch3のアミノ酸配列1-40 に"／"により示す。  
2.  ヒト HC シグナルペプチド (aa 1-22)予測ヒトHcシグナルペプチドのアミノ酸配列は、次のものである：
MWGWKCLLFWAVLVTATLCTA/R (配列番号29)。
【００４３】
予測ヒトHcシグナルペプチドのヌクレオチド配列は、次のものである：
デンマークのTechnical Universityによってオンラインで提供されるシグナルIP 3.0サーバを利用する分析の予測結果は、上記の記載に示される。これらの結果は、アラニン 21 (A21) および アルギニン 22 (22)の間に位置する切断の主要な部位を予測する。この切断部位を上記に供されるヒトHCのアミノ酸配列1-22 に"／"により示す。
【００４４】
h-Notch3(1-34) デコイ
h-Notch1(1-34)デコイは、Notch3のEGF様リピート 1-34 を含むヒトNotch3デコイを示す。
【００４５】
h-Notch3(1-34) デコイ タンパク質のアミノ酸配列（これは図 41に表される）。予測されたヒト Notch3 シグナルペプチドに下線を引く(AA 1-40)。Notch3 EGF リピート1-34は、aa 41-1386でコードされる。Fc タグ配列に下線を付してイタリックで示す。  
h-Notch3(1-34) デコイ タンパク質のヌクレオチド配列（これは図 40に表される）。予測されたヒト Notch3 シグナルペプチドに下線を引く(nt 1-120)。Notch3 EGF リピート1-34は、nt 121-4158でコードされる。融合のジャンクション（BglII 部位）は、nt 4158〜4163である。Fc タグ配列に下線を付してイタリックで示す。  
h-spHcNotch1(1-34) デコイ
h-spHcNotch1(1-34) デコイは、EGF様リピート 1-34 を含むヒトNotch3デコイを示す。略語spHc は、ヒトHcシグナルペプチドがこの構築物に使用されることを意味する。
【００４６】
h-Notch3(1-34) デコイ タンパク質のアミノ酸配列（これは図 42に表される）。予測されたヒト Hc シグナルペプチドに下線を引く(AA 1-22)。Notch3 EGF リピート1-34は、aa 22-1386でコードされる。Fc タグ配列に下線を付してイタリックで示す。  
h-Notch3(1-34) デコイ タンパク質のヌクレオチド配列（これは図 43に表される）。予測されたヒト Hc シグナルペプチドに下線を引く(nt 1-66)。Notch3 EGF リピート1-34は、nt 67-4104でコードされる。融合のジャンクション（BglII 部位）は、nt 4104〜4109である。Fc タグ配列に下線を付してイタリックで示す。
【００４７】
方法ヒトNotch3デコイの構築
Prox1を過剰発現するヒトの大動脈の平滑筋細胞 (AoSMC)またはヒトの臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の何れかからのトータルRNAを使用して、ヒト Notch3 デコイバリアントを生成する。トータルRNAは、M-MLV逆転写酵素およびランダム六量体プライマーまたはNotch3デコイ特異的プライマーの何れかで逆転写した。合成されたcDNAを、それからNotch3 デコイ特異的な上流（センス）および下流（アンチセンス）のプライマーで増幅した。Notch3 デコイを、4つの個々のアンプリコン（amplicons）から構築した。3-プライムのアンプリコンを、Fc 配列におけるBglII 部位にライゲーションするため5-プライム端でBgl II制限部位をコードする下流のプライマーで増幅してインフレームのヒト Notch3/Fc キメラを生成した。  
EGF様リピート34をコードしているヌクレチド配列の後に融合が生じるNotch3 デコイの場合において、BglIIサイトを融合サイトを作るため作出し、この融合配列が提供される（Notch3、図37）。これは構築物h-Notch3(1-34)デコイ および h-spHCNotch3(1-34)デコイに適用される。  
増幅されたPCR産物は、異なるヒトNotch3/Fcキメラを作出するためにpBluescript SK II Fcにサブクローンされた。ヒト Notch3/Fc デコイ配列を、それからヒト Notch3 デコイタンパク質の発現および精製のために哺乳類発現ベクター(pAd-lox, pCCL またはpcDNA3)にシャトル（shuttled）させた。
【００４８】
［第二のシリーズの実験］材料および方法プラスミド構築物LacZ、完全長Notch4、または活性型Notch4/int3をコードするアデノウイルス構築物は以前に記載されている(Shawber et al., 2003)。6 mycタグ(Kopan et al., 1994)を有するフレームに融合された活性型Notch1 cDNAを、アデノウイルス発現ベクターであるpAd-loxにクローニングした。VEGF165およびN1ECDFcの両方もまた、当該pAd-loxにクローニングした。アデノウイルスストックを、作り、以前の記載の通り力価を求めた(Hardy et al., 1997)。LacZ、活性型Notch4/int3、J1、Dll1およびDll4の何れかをコードするレトロウイルス発現ベクターpHyTcは、以前に記載されている(Uyttendaele et al., 2000, Shawber et al., 2003, Das et al., 2004 in print)。Myc/Hisタグを有するフレームに融合されたNotch1の細胞内ドメイン(bp 5479-7833, Genbank accession# X57405)およびDll4の細胞外ドメイン(bp 1-1545, Genbank accession# AF253468, provided by Chiron)をコードするプラスミドをpHyTcに操作した。  
文献〔Clin. Exp. Immunol. (1992) 87(1):105-110〕に記載される方法を使用して、Notch1ECD、Notch2ECD、Notch3ECDおよびNotch4ECDは、プラスミドpCMX- sFR1-IgGに含まれるFcへと操作されて、Notchに基づく融合タンパク質、即ち、Notch1ECD/Fc, Notch2ECD/Fc, Notch3ECD/Fc およびNotch4ECD/Fcが作出された。
【００４９】
アデノウイルス遺伝子導入アデノウイルス感染の前日に、３継代目の7.5x105 細胞のHUVECをI型コラーゲンコーティングした６ウェルプレートに播種した。Ad-LacZ、Ad-VEGF165またはAd-N1ECDFcでのアデノウイルス感染を、記載されるm.o.i.で行い、37℃で１時間、時々プレートを回旋しながらインキュベートした。
【００５０】
ルシフェラーゼレポーターアッセイリガンド誘導性のNotchシグナリングを決定するために、Helaおよび293由来Bosc細胞を使用する共培養アッセイを行った。一過性のトランスフェクションを、リン酸カルシウム沈殿により行った。１日前に10cmプレートに1.5x106で播種されたHela細胞を、333ngのpBOSNotch1、333ngのpGA981-6、および83ngのpLNC lacZを用いて、666ngのpCMV-FcまたはpHyTC-N1ECDFcの何れかと共にトランスフェクトした（x1には333ng、x2には666ng）。１日前に10cmプレートに4x106で播種されたBosc細胞を、680ngのpHyTc-Jagged1、pHyTc-Dll1、pHyTc-Cll4またはpHyTc-x（空ベクター）の何れかでトランスフェクトした。トランスフェクション後の１日目に、細胞を、12ウェルプレートで24時間にわたりトリプリケートで共培養した(HeLa:Bosc, 1:2)。細胞を採取し、ルシフェラーゼ活性をトランスフェクション後２日目でEnhanced Luciferaseアッセイキット(BD PharMingen)を使用して決定し、β-ガラクトシダーゼ活性をGalacto-Light Plusキット(PE Biosystems)を用いて決定した。全てのアッセイは、バースオールド・デュアル-インジェクション・ルミノメーター（Berthold dual-injection luminometer）において行った。
【００５１】
VEGF誘導性Notchシグナリングの決定のために、アデノウイルスで感染させたHUVECを使用した。１日前に６ウェルプレートに8.0x105で播種されたHUVECを、記載されるとおりのm.o.i.でコントロールとしてのAd-LacZまたはAd-VEGFの何れかで、Ad-N1ECD/Fcの存在または不在下で感染させた。感染後２日目、感染させたHUVECを２４ウェルプレートに1.5 x 105細胞でトリプリケートで再播種し、２４時間にわたり培養し、次に12.5ngのpRL-SV40（Promega）および137.5ngのpGA981-6をエフェクテン・トランスフェクション・試薬（Effectene transfection reagent (Qiagen)）を用いてトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションの１日後または２日後の何れかで採取し、ルシフェラーゼ活性を、デュアル-ルシフェラーゼ（登録商標）レポーターアッセイシステム（Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)）を使用して測定した。
【００５２】
出芽アッセイコラーゲンゲルを作るために、ブタI型コラーゲン（Nitta gelatin, Tokyo, Japan）の氷冷溶液を10xTPMI1640培地および中和バッファーと、8:1:1の比で混合した。400μＬのアリコートのコラーゲンゲルを、次に24ウェルプレートに加え、少なくとも１時間にわたり37℃でゲル化させた。（上記の）アデノウイルス感染に続いて、HUVECを採取し、ウェル当たり1.3x105細胞で、0.8mLのEGM2培地中で24ウェルプレート中のコラーゲンゲルの上に播種した。HUVECは、播種後48時間で殆どコンフルエントになった。播種後、培地を１週間にわたり2日毎に交換した。出芽（Sprouting）を観察し、顕微鏡に搭載されたオリンパスデジタルカメラで８日後に写真を撮影した。出芽の数を定量化するために、各ウェル当たり5視野を無作為に選択し、二人の研究者により盲検法で顕微鏡下で出芽をカウントした。
【００５３】
結果および考察NOTCHECD/FC融合タンパク質Notchのアンタゴニストとしての機能Notchアンタゴニスト-NotchECD/Fc融合タンパク質我々は、幾つかのNotchアンタゴニストを作出した（図２）。我々の戦略は、ヒトまたはマウスFcドメインに対して細胞外ドメイン（ECD：  Extracellular Domain）中のNotchEGFリピートをコードする配列を融合するためのものであった。このデザインによって、シグナリング機能は伴わないが、リガンド結合ドメインを保持し、そのためリガンドに結合してリガンド機能を阻害する分泌タンパク質が作出される。我々は、これらのタンパク質を「NotchECD/Fc」と呼び、４つ全てのNotch-4ECD/Fcを作出している。Fcドメインは、アフィニティ精製とイムノブロットまたは免疫組織化学によるタンパク質検出を容易にする。
【００５４】
Notchアンタゴニストの試験一つの細胞において発現されたリガンドともう一つの細胞において得られたNotchレセプター活性化とを有するインビトロ共培養系（図３）を使用して、Notch経路の転写性活性化を測定した。我々は、この共培養アッセイを使用して、Notch1ECD/Fc機能がリガンド依存性のNotchシグナリングをブロックすることを示した（図４）。N1ECD/Fc発現ベクターを、HeLa細胞中で異なる比率で完全長Notch1とCSL-ルシフェラーゼレポーターと共トランスフェクトし、次にリガンド発現293細胞と共培養した。我々は、NotchリガンドによるNotch1シグナリングの活性化がN1ECD/Fc発現により減少したことを観察した。この効果は濃度依存性を示した；  N1ECD/FcのNotch1に対して2:1の比率は、1:1の比率よりもシグナリングの阻害においてより効果的であった。Notch1ECD/Fcは、Jagged1、Delta1様1またはDelta様4により媒介されるシグナリングをブロックできた。
【００５５】
Notchアンタゴニストの発現および精製我々は、タンパク質精製の目的のためにレトロウイルスベクターを使用してNotchECD/FCを発現するCHOおよびHeLa細胞株を作出した。HeLa-NotchECD/Fc株から回収された馴化培地において示される通り、N1ECD/Fcタンパク質が分泌され（図５）、プロテインA(pA)アガロースで精製される。pA精製サンプル（Sup）および全細胞溶解物（Lys）をα-Fc抗体とイムノブロットし（図５、パネルA）、N1ECD/Fcが培地に分泌されることを示した。NotchECD/Fcのためのアデノウイルスベクターを使用してHeLa細胞を感染し、これらの細胞からの溶解物をα-Fc抗体でイムノブロッティングし、それらがNotchECD/Fc（1、2、3、4）タンパク質を発現することを示した(図5、パネルB)。我々は、現在、pAアフィニティクロマトグラフィを使用してCHO細胞の馴化培地からN1ECD/Fcを精製している。
【００５６】
血管形成阻害の規定Notch 融合タンパク質の使用Notchシグナリングの活性化は、CBF1プロモーター活性を用いることにより検出できる。
【００５７】
Notchシグナリング機能を、CBF1プロモーターの転写性活性を測定することにより測定でき、これはNotch-ICのCBF1への結合により活性化される。我々は、異なるMOIでアデノウイルスコーディングVEGF-165に感染させたHUVECにおけるCBF1プロモーター活性を測定した（図6）。CBF1プロモーターの導入は、Ad-LacZ感染細胞と比較して、MOIに依存する様式でAd-VEGF感染HUVECにおいて明らかに検出された。このデータは、VEGFの過剰発現がHUVECにおけるNotchシグナリングを活性化できることを示した。このようにVEGFはNotchシグナリング活性を誘導した。  
我々は、Notch融合タンパク質がNotchシグナリングのVEGF誘導性の活性化をブロックできるか否かを求めた。Ad-Notch融合タンパク質のAd-VEGFとの重感染は、Ad-VEGF感染単独により誘導されるCBF1プロモーター活性の活性化を明らかに減少させた（図7）。図７において各アデノウイルスについて40 MOIでの感染の場合において（パネルA）、レポーター遺伝子のトランスフェクション後24時間で60％阻害、48時間で90％の阻害が検出され、また、Notchデコイの阻害活性はAd-Notch融合タンパク質のMOIに依存した。
【００５８】
Notch融合タンパク質は、VEGFにより誘導された血管形成性の出芽の開始をブロックするこの実験において、我々は、HUVECにおいて過剰発現したVEGFによる出芽の誘導（出芽の開始）におけるNotchデコイの効果を評価した。Ad-VEGF感染HUVECをタイプ  コラーゲンゲルにおいて8日間培養した場合、出芽（budding）がコラーゲンゲルにおいて誘導された。過剰発現されたVEGFによる出芽のこの誘導は、アデノウイルスコーディングNotch融合タンパク質の重感染により明らかに阻害された（図8）。Ad-Notch融合タンパク質自身では、形態学上の影響は少なかった。  
図９において、我々は顕微鏡を使用して視野当たりの芽をカウントした。HUVECへのAd-VEGF感染によって、使用されたMOIに依存して芽の数が増加した。Ad-VEGF誘導性の出芽は、明らかに阻害された。これらのデータは、VEGFがHUVECの出芽をNotchシグナリングの活性化を介して誘導し、Notch融合タンパク質がVEGF誘導性の出芽を阻害できることを示唆する。
【００５９】
［第二のシリーズの実験において引用された参考文献］
1.  Artavanis-Tsakonas, S., K. Matsuno, and M.E. Fortini. 1995. Notch signaling. Science 268:225-232. 
2.  Bailey, A.M., and J.W. Posakony. 1995. Suppressor of hairless directly activates transcription of enhancer of split complex genes in response to Notch receptor activity. Genes & Development 9:2609-22. 
3.  Bettenhausen, B., M. Hrabe de Angelis, D. Simon, J.L. Guenet, and A. Gossler. 1995. Transient and restricted expression during mouse embryogenesis of Dll, a murine gene closely related to Drosophila Delta. Development 121:2407-18. 
4.  Blaumueller, C.M., H. Qi, P. Zagouras, and S. Artavanis-Tsakonas. 1997. Intracellular cleavage of Notch leads to a heterodimeric receptor on the plasma membrane. Cell 90:281-91. 
5.  Caronti, B., L. Calandriello, A. Francia, L. Scorretti, M. Manfredi, T. Sansolini, E.M. Pennisi, C. Calderaro, and G. Palladini. 1998. Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leucoencephalopathy (CADASIL). Neuropathological and in vitro studies of abnormal elastogenesis. Acta Neurol Scand. 98:259-67. 
6.  Desmond, D.W., J.T. Moroney, T. Lynch, S. Chan, S.S. Chin, D.C. Shungu, A.B. Naini, and J.P. Mohr. 1998. CADASIL in a North American family: clinical, pathologic, and radiologic findings [see comments]. Neurology 51:844-9. 
7.  Dunwoodie, S.L., D. Henrique, S.M. Harrison, and R.S. Beddington. 1997. Mouse Dll3: a novel divergent Delta gene which may complement the function of other Delta homologues during early pattern formation in the mouse embryo. Development 124:3065-76. 
8.  Eastman, D.S., R. Slee, E. Skoufos, L. Bangalore, S. Bray, and C. Delidakis. 1997. Synergy between suppressor of Hairless and Notch in regulation of Enhancer of split m gamma and m delta expression. Mol Cell Biol. 17:5620-5634. 
9.  Fortini, M.E., and S. Artavanis-Tsakonas. 1993. Notch: neurogenesis is only part of the picture. Cell 75:1245-7. 
10.  Gale, N.W., and G.D. Yancopoulos. 1999. Growth factors acting via endothelial cell-specific receptor tyrosine kinases: VEGFs, Angiopoietins, and ephrins in vascular development. Genes and Development 13:1055-1066. 
11.  Gallahan, D., and R. Callahan. 1997. The mouse mammary tumor associated gene INT3 is a unique member of the NOTCH gene family (NOTCH4). Oncogene 14:1883-90. 
12.  Greenwald, I. 1994. Structure/function studies of lin-12/Notch proteins. Current Opinion in Genetics & Development 4:556-62. 
13.  Greenwald, I. 1998. LIN-12/Notch signaling: lessons from worms and flies. Genes Dev. 12:1751-62. 
14.  Henderson, A.M., S.J. Wang, A.C. Taylor, M. Aitkenhead, and C.C.W. Hughes. 2001. The basic helix-loop-helix transcription factor HESR1 regulates endothelial cell tube formation. J Biol Chem. 276:6169-6176. 
15.  Hicks, C., S.H. Johnston, G. diSibio, A. Collazo, T.F. Vogt, and G. Weinmaster. 2000. Fringe differentially modulates Jagged1 and Delta1 signalling through Notch1 and Notch2. Nature Cell Biology 2:515-520. 
16.  Hsieh, J.J., T. Henkel, P. Salmon, E. Robey, M.G. Peterson, and S.D. Hayward. 1996. Truncated mammalian Notch1 activates CBF1/RBPJk-repressed genes by a mechanism resembling that of Epstein-Barr virus EBNA2. Molecular & Cellular Biology 16:952-9. 
17.  Hsieh, J.J., D.E. Nofziger, G. Weinmaster, and S.D. Hayward. 1997. Epstein-Barr virus immortalization: Notch2 interacts with CBF1 and blocks differentiation. J Virol. 71:1938-45. 
18.  Jarriault, S., C. Brou, F. Logeat, E.H. Schroeter, R. Kopan, and A. Israel. 1995. Signaling downstream of activated mammalian Notch. Nature 377:355-358. 
19.  Joutel, A., F. Andreux, S. Gaulis, V. Domenga, M. Cecillon, N. Battail, N. Piga, F. Chapon, C. Godfrain, and E. Tournier-Lasserve. 2000. The ectodomain of the Notch3 receptor accumulates within the cerebrovasculature of CADASIL patients [see comments]. J Clin Invest. 105:597-605. 
20.  Joutel, A., C. Corpechot, A. Ducros, K. Vahedi, H. Chabriat, P. Mouton, S. Alamowitch, V. Domenga, M. Cecillion, E. Marechal, J. Maciazek, C. Vayssiere, C. Cruaud, E.A. Cabanis, M.M. Ruchoux, J. Weissenbach, J.F. Bach, M.G. Bousser, and E. Tournier-Lasserve. 1996. Notch3 mutations in CADASIL, a hereditary adult-onset condition causing stroke and dementia. Nature 383:707-10. 
21.  Kopan, R., E.H. Schroeter, H. Weintraub, and J.S. Nye. 1996. Signal transduction by activated mNotch: importance of proteolytic processing and its regulation by the extracellular domain. Proc Natl Acad Sci U S A 93:1683-8. 
22.  Krebs, L.T., Y. Xue, C.R. Norton, J.R. Shutter, M. Maguire, J.P. Sundberg, D. Gallahan, V. Closson, J. Kitajewski, R. Callahan, G.H. Smith, K.L. Stark, and T. Gridley. 2000. Notch signaling is essential for vascular morphogenesis in mice. Genes and Development 14:1343-1352. 
23.  Lardelli, M., J. Dahlstrand, and U. Lendahl. 1994. The novel Notch homologue mouse Notch3 lacks specific epidermal growth factor-repeats and is expressed in proliferating neuroepithelium. Mechanism of Development 46:123-136. 
24.  Lawson, N.D., N. Scheer, V.N. Pham, C. Kim, A.B. Chitnis, J.A. Campos-Ortega, and B.M. Weinstein. 2001. Notch signaling is required for arterial-venous differentiation during embryonic vascular development. Development 128:3675-3683. 
25.  Lewis, J. 1998. Notch signaling and the control of cell fate choices in vertebrates. Semin Cell Dev Biol. 9:583-589. 
26.  Lieber, T., S. Kidd, E. Alcomo, V. Corbin, and M.W. Young. 1993. Antineurogenic phenotypes induced by truncated Notch proteins indicate a role in signal transduction and may point to a novel function for Notch in nuclei. Genes Dev. 7:1949-1965. 
27.  Lindner, V., C. Booth, I. Prudovsky, D. Small, T. Maciag, and L. Liaw. 2001. Members of the Jagged/Notch gene familites are expressed in injured arteries and regulate cell phenotype via alteration in cell matrix and cell-cell interations. Pathology 159:875-883. 
28.  Lindsell, C.E., C.J. Shawber, J. Boulter, and G. Weinmaster. 1995. Jagged: A mammalian ligand that activates Notch1. Cell 80:909-917. 
29.  Logeat, F., C. Bessia, C. Brou, O. LeBail, S. Jarriault, N.G. Seidah, and A. Israel. 1998. The Notch1 receptor is cleaved constitutively by a furin-like convertase. Proc Natl Acad Sci USA 95:8108-12. 
30.  Lyman, D., and M.W. Young. 1993. Further evidence for function of the Drosophila Notch protein as a transmembrane receptor. Proc Natl Acad Sci USA 90:10395-10399. 
31.  Matsuno, K., M.J. Go, X. Sun, D.S. Eastman, and S. Artavanis-Tsakonas. 1997. Suppressor of Hairless-independent events in Notch signaling imply novel pathway elements. Development 124:4265-4273. 
32.  Nakagawa, O., D.G. McFadden, M. Nakagawa, H. Yanagisawa, T. Hu, D. Srivastava, and E.N. Olson. 2000. Members of the HRT family of basic helix-loop-helix proteins act as transcriptional repressors downstream of Notch signaling. Proc Natl Acad Sci USA 97:13655-13660. 
33.  Oberg, C., J. Li, A. Pauley, E. Wolf, M. Gurney, and U. Lendahl. 2001. The Notch intracellular domain is ubiquitinated and negatively regulated by the mammalian Sel-10 homolog. J Biol Chem. 276:35847-35853. 
34.  Owens, G.K. 1995. Regulation of differentiation of vascular smooth muscle cells. Physiol Rev. 75:487-527. 
35.  Rebay, I., R.G. Fehon, and S. Artavanis-Tsakonas. 1993. Specific truncations of Drosophila Notch define dominant activated and dominant negative forms of the receptor. Cell 74:319-29. 
36.  Robey, E. 1997. Notch in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 7:551-7. 
37.  Roehl, H., M. Bosenberg, R. Blelloch, and J. Kimble. 1996. Roles of the RAM and ANK domains in signaling by the C. elegans GLP-1 receptor. Embo J. 15:7002-7012. 
38.  Rogers, S., R. Wells, and M. Rechsteiner. 1986. Amino acid sequences common to rapidly degrade proteins:  The PEST hypothesis. Science 234:364-368. 
39.  Sasai, Y., R. Kageyama, Y. Tagawa, R. Shigemoto, and S. Nakanishi. 1992. Two mammalian helix-loop-helix factors structurally related to Drosophila hairy and Enhancer of split. Genes & Dev. 6:2620-2634. 
40.  Shawber, C., J. Boulter, C.E. Lindsell, and G. Weinmaster. 1996a. Jagged2: a serrate-like gene expressed during rat embryogenesis. Dev Biol. 180:370-6. 
41.  Shawber, C., D. Nofziger, J.J. Hsieh, C. Lindsell, O. Bogler, D. Hayward, and G. Weinmaster. 1996b. Notch signaling inhibits muscle cell differentiation through a CBF1- independent pathway. Development 122:3765-73. 
42.  Shimizu, K., S. Chiba, T. Saito, T. Takahashi, K. Kumano, H. Hamada, and H. Hirai. 2002. Integrity of intracellular domain of Notch ligand is indespensable for cleavage required for the release of the Notch2 intracellular domain. Embo J. 21:294-302. 
43.  Shutter, J.R., S. Scully, W. Fan, W.G. Richards, J. Kitajewski, G.A. Deblandre, C.R. Kintner, and K.L. Stark. 2000a. Dll4, a novel Notch ligand expressed in arterial endothelium. Genes Dev. 14:1313-1318. 
44.  Shutter, J.R., S. Scully, W. Fan, W.G. Richards, J. Kitajewski, G.A. Deblandre, C.R. Kitner, and K.L. Stark. 2000b. Dll4, a novel Notch ligand expressed in arterial endothelium. Genes and Development 14:1313-1318. 
45.  Struhl, G., K. Fitzgerald, and I. Greenwald. 1993. Intrinsic activity of the Lin-12 and Notch intracellular domains in vivo. Cell 74:331-45. 
46.  Swiatek, P.J., C.E. Lindsell, F. Franco del Amo, G. Weinmaster, and T. Gridley. 1994. Notch 1  is essential for postimplantation development in mice. Genes & Development 8:707-719. 
47.  Tamura, K., Y. Taniguchi, S. Minoguchi, T. Sakai, T. Tun, T. Furukawa, and T. Honjo. 1995. Physical interaction between a novel domain of the receptor Notch and the transcription factor RBP-J kappa/Su(H). Curr Biol. 5:1416-1423. 
48.  Tietze, K., N. Oellers, and E. Knust. 1992. Enhancer of splitD, a dominant mutation of Drosophila, and its use in the study of functional domains of a helix-loop-helix protein. Proc Natl Acad Sci USA 89:6152-6156. 
49.  Uyttendaele, H., J. Ho, J. Rossant, and J. Kitajewski. 2001. Vascular patterning defects associated with expression of activated Notch4 in embryonic endothelium. PNAS. 98:5643-5648. 
50.  Uyttendaele, H., G. Marazzi, G. Wu, Q. Yan, D. Sassoon, and J. Kitajewski. 1996. Notch4/int-3, a mammary proto-oncogene, is an endothelial cell-specific mammalian Notch gene. Development 122:2251-9. 
51.  Vervoort, M., C. Dambly-Chaudiere, and A. Ghysen. 1997. Cell fate determination in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 7:21-28. 
52.  Villa, N., L. Walker, C.E. Lindsell, J. Gasson, M.L. Iruela-Arispe, and G. Weinmaster. 2001. Vascular expression of Notch pathway receptors and ligands is restricted to arterial vessels. Mechanisms of Development 108:161-164. 
53.  Weinmaster, G. 1997. The Ins and Outs of Notch Signaling. Mol Cel Neurosci. 9:91-102. 
54.  Weinmaster, G. 1998. Notch signaling: direct or what? Curr Opin Genet Dev. 8:436-42. 
55.  Weinmaster, G., V.J. Roberts, and G. Lemke. 1992. Notch 2: a second mammalian Notch gene. Development 116:931-941. 
56.  Weinmaster, G., V.J. Roberts, and G.A. Lemke. 1991. A homolog of Drosophila Notch expressed during mammalian development. Development 113:199-205. 
57.  Wettstein, D.A., D.L. Turner, and C. Kintner. 1997. The Xenopus homolog of Drosophila Suppressor of Hairless mediates Notch signaling during primary neurogenesis. Development 124:693-702. 
58.  Wu, G., E.J. Hubbard, J.K. Kitajewski, and I. Greenwald. 1998. Evidence for functional and physical association between Caenorhabditis elegans SEL-10, a Cdc4p-related protein, and SEL-12 presenilin. Proc Natl Acad Sci USA 95:15787-91. 
59.  Wu, G., S.A. Lyapina, I. Das, J. Li, M. Gurney, A. Pauley, I. Chui, R.J. Deshaies, and J. Kitajewski. 2001. SEL-10 is an inhibitor of notch signaling that targets notch for ubiquitin-mediated protein degradation. Mol Cell Biol. 21:7403-7015. 
60.  Xue, Y., X. Gao, C.E. Lindsell, C.R. Norton, B. Chang, C. Hicks, M. Gendron-Maguire, E.B. Rand, G. Weinmaster, and T. Gridley. 1999. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Hum Mol Genet. 8:723-30.
［第三のシリーズの実験］VEGFは、Notchシグナリングの活性化を介して血管形成を開始するVEGFとNotchシグナリング経路の両方は、脈管の発生のために重要である。ここで、我々はVEGFがNotchシグナリングを活性化して血管発生を開始することを示す。VEGFは、Delta4およびNotch4の発現を増大し、Notchシグナリングの活性化を生じ、培養された初代内皮細胞において糸状仮足（filopodia）を誘導する。VEGFレセプター阻害剤を使用する研究は、Notchシグナリング活性がVEGF-1（Flt-1）発現を誘導することにより次々にVEGFの作用を増強することを示す。VEGF作用の他の因子は、MMP-9およびMT1-MMPの誘導を含み、Notchにより媒介される。VEGF誘導性の皮膚の新血管新生のモデルのためのインビボアッセイを用いて、我々は分泌されたNotch阻害剤（Notchに基づく融合タンパク質）がVEGF誘導性の新血管新生とVEGFR-1発現の誘導をブロックすることを発見した。このように、Notchシグナリングは、おそらく開始の段階で、VEGFにより調節される血管形成のためになくてはならない。
【００６０】
VEGFは、ECMの分解、出芽（糸状仮足の形成）、増殖、生存および内皮細胞の遊走などの複数の過程からなる血管形成発達の鍵となる制御因子である。殆どの段階はVEGFシグナリングの下流の分子と協同しているのだろうが、これらの段階が如何に調和して調節されて血管原性の出芽などのより複雑な形態形成の現象を起こすのかは知られていない。Notchシグナリングは、進化的に保存された細胞運命決定を制御するために機能するシグナリング機構である（１）。Jagged1およびDelta様などのリガンドによる結合において、Notch（NotchIC）の細胞質内ドメインは、プレセニリン/γ-セクレターゼにより放出され、核にトランスロケートし、転写性のリプレッサーCSL（CBF1/Su(H)/lag2）と相互作用し、それを転写性のアクチベーターに変換する（１）。Notchシグナリングの血管発生における役割は、標的変異（targeted mutation）でのマウスの研究により示唆された（２）。内皮におけるNotch活性化はまた脈管リモデリングを破壊（disrupts）することから、適切なNotchシグナリングが脈管発生のために必須である（３）。NotchのVEGFシグナリングに対する関連性は示唆されているが（4-6）、NotchシグナリングがVEGF調節性の血管発生においてどのような役割を有しているのか、Notchシグナリングが成人の脈管構造における生理的および病理的な血管形成に関係しているのか否かは、未だにはっきりしない。
【００６１】
HUVEC（Human Umbilical Vein Endothelial cell）の成長は、VEGF（図２６Aおよび２６B）および出芽などの分化関連性の生物応答に依存しており、初期の段階で評価できる（７）。最初に、我々は、報告（５）通り、アデノウイルスで形質導入されたVEGFが、bFGFを含む完全培地で培養されたHUVECにおいてNotchおよびNotchリガンド発現の両方を誘導するのか否かを試験した（図22A）。Dl4およびNotch4 mRNAの両々が、アデノウイルスで形質導入されたVEGF HUVEC（Ad-VEGF-HUVEC）において、アデノウイルスで形質導入されたLacZ HUVEC（Ad-LacZ-HUVEC）に比べてアップレギュレートされたことをRT-PCR分析は示した（図２２A）。形質導入されたVEGFは、Jagged1およびNotch1発現を誘導しているようには見えなかった。CSLルシフェラーゼレポーター活性を測定することで、形質導入されたVEGFはまた、Notchシグナリングを用量依存性に活性化し（図22B）、これはNotchシグナリングでトランス活性化された（８）。Notchシグナリングは、増殖に比べて、より高い用量のAd-VEGFで活性化された（図２６A）。VEGFRキナーゼのインヒビターであるSU5416がVEGF誘導性のCSLルシフェラーゼレセプター活性を低減したことから（図２２C）、VEGFはレセプターキナーゼの活性化によりNotchシグナリングを誘導した。膜貫通および細胞質内ドメインの両方を欠失しているNotch変異体が、Notchシグナリングに対するドミナントネガティブなインヒビターとして機能したことから（９）、我々はNotchシグナリングを阻害するためのNotchに基づく融合タンパク質またはデコイ（N1ECDFc）を作出した（図２２D）。Ad-N1ECDFc形質導入性HUVEC（Ad-N1ECDFc-HUVEC）の馴化培地のウェスタンブロット分析は、N1ECDFcが発現されてウェルに分泌されたことを示した（図２２E）。Notchリガンド（J1、Dl1またはDl4の何れか）を発現しているBosc細胞が、Notch1を発現しているHeLa細胞において、コントロールBosc細胞と比較してNotchシグナリングを活性化している共培養アッセイ使用することにより、我々は、N1ECDFc発現プラスミドのトランスフェクションでのNotchシグナリングの阻害を測定した（図２２F）。次に、N1ECDFcが、HUVECに形質導入されたVEGFによるNotchシグナリングの活性化を阻害するか否かを我々は試験した（図２２G）。HUVECへのAd-VEGFとのAd-N1ECDFcの同時形質導入は、VEGFにより誘導されるCSLルシフェラーゼ活性を明らかに減少させた。Gerhardt等は、VEGFが、脈管性出芽（vascular sprouts）の先端での糸状仮足の伸展を導くことによって初期の出生後の網膜における脈管形成を制御したことを報告した（１０）。血管原性の出芽の間に、静止状態の内皮細胞の間に糸状仮足の突出を起こす特化した内皮細胞の形成が、一つの初期の現象であるかもしれない。ここで、我々は、単一の内皮細胞の糸状仮足突出を作る形態を出芽（budding）という。初代内皮細胞の出芽は、それらをフィブリンまたはコラーゲンゲルの何れかの上で３次元で培養することにより誘導される（１１）。Ad-VEGF-HUVECが完全培地と共にコラーゲンゲル上で培養される場合に、形質導入したHUVECは5日間でコラーゲンゲルに糸状仮足の伸展を起こし（図２２H）、芽の数は用量依存性に増加した（図２７A）。Notch4の活性型をコードするアデノウイルス(Ad-Notch4/int3)によるNotchシグナリングの活性化は、HUVECの出芽を誘導し（１２）、またNotch1の活性型(Ad-N1IC)もまた、HUVECの出芽を誘導した（図２���Aおよび２７B）。VEGFおよびNotchシグナリングの両方がHUVECの出芽を誘導することから、我々は、N1ECDFcがVEGF誘導性HUVECの出芽を阻害するのか否かを試験した（図２２H-I）。Ad-VEGF-HUVECの出芽は、Ad-N1ECDFcの同時形質導入により明らかに阻害された。Ad-LacZまたはAd-N1ECDFc形質導入性HUVECは、何れも芽を形成しなかった（図２２H）。N1ECDFcは、細胞数に影響することなくVEGF誘導性のHUVECの出芽を阻害した（図２２I）。形質導入したN1ECDFcはHUVECの増殖を明らかには変化させないが、他方でAd-N1IC形質導入性HUVECの増殖は用量依存性に阻害され（図２８A）、内皮増殖に対するNotchシグナリングの阻害効果と一致していた（１３）。
【００６２】
NotchシグナリングがVEGFの下流であるのか否かを試験するために、我々は、N1IC誘導性HUVECの出芽においてVEGFRを含むレセプターチロシンキナーゼに関する３つの異なるインヒビターを評価した。というのも、三つの成長因子が完全培地に存在したからである（図２３A-C）。１μMの濃度で、各化合物は、各キナーゼに対する選択的阻害を示した（データ示さず）。PD166866またはZD1893の何れもAd-N1IC-HUVECの出芽には影響を示さなかったが、SU5416は明らかにそれを阻害した（図２３A-B）。SU5416は、より低い濃度で生存度をより減少させると共にAd-N1IC-HUVECの出芽を選択的に阻害した（図２３C）。Taylor等はNotchがFlk1/KDR/VEGFR2発現をダウンレギュレーションさせることを報告していることから（１４）、NotchがFlk1と協同して出芽を促進することはなさそうであった。従って、我々は、Notchシグナリングの活性化が、HUVECにおけるFlt1/VEGFR1発現に影響するのか否かを試験したが、これはSU5416がFlt1およびFlk1キナーゼ活性を阻害するからである（15）。RT-PCR分析はFlt1 mRNAの発現がAd-N1IC-HUVECにおいてアップレギュレートされることを示したが、他方で内皮細胞メーカー（endothelial cell maker）であるCD31 mRNAの発現はAd-LacZ-HUVECにおけるものにまさるともおとらないものであった（図２３D）。ウェスタンブロット分析も、Flt1タンパク質の発現がAd-N1IC-HUVECにおいてアップレギュレートされたことを示した（図２３E）。従って、Flt1に関する選択的リガンドであるPlGFが、Notchシグナリングの活性化を介してFLt1がアップレギュレートされているHUVECの出芽を促進するか否かを我々は試験した(図23F-G)。PlGFは、Ad-N1IC-HUVECの芽の数をPlGFの不在する場合と比較して150％に増大した（図２３F）。更に、PlGFは、複数の糸状仮足を含むHUVECの芽を250％に増加した（図２３G）。Flt1に関する低分子干渉RNA（siRNA）を用いたFlt1発現の減少がAd-N1IC-HUVECの出芽を阻害する一方で(図23J)、そのトランスフェクションは選択的にFlt1 mRNAの発現(図23H)とFlt1タンパク質の発現(図23I)を減少させた。Flk1 siRNAでのFlk1発現の減少もAd-N1IC-HUVECの出芽を阻害したが(図30B)、Flk1 siRNAの阻害効果はFlt1 siRNAのものよりも小さかった（図２３J）。Flk1 siRNAの効果は、Ad-N1IC-HUVECよりもAd-VEGF-HUVECの出芽においてより効果的であった（図３０B-C）。Flt1 siRNAでのトランスフェクションは、Ad-N1IC-およびAd-VEGF-HUVECの両方の出芽を同じ程度まで阻害した(データ示さず)。
【００６３】
VEGFが内皮細胞におけるゼラチナーゼ活性を調節し、MMP-2およびMMP-9のような有意なゼラチナーゼ活性がしっかりと確立されて血管原性の出芽を誘導したことを幾つかの研究は示した（１６）。我々は、VEGFがHUVECにおいてNotchシグナリングを介するゼラチナーゼ活性を制御するか否かを試験した。
【００６４】
ゼラチン酵素電気泳動法において、Ad-VEGF-HUVECの馴化培地は、MMP9の誘導および活性化の両方を示し、これは６日目で検出され始め（図２４A）、MMP2の活性化は４日目で検出され（図２４B）、これらをAd-LacZ-HUVECの結果と比較した。Ad-N1ECDFcとAd-VEGFの同時形質導入は、MM9の誘導および活性化の両方について阻害を示し（図２４A）、並びにMMP2の活性についても阻害を示した（図２４B）。RT-PCR分析は、MMP9 mRNAの発現がAd-N1IC-HUVECにおいてアップレギュレートされたが、MM2 ｍRNAの発現はAd-N1IC-HUVECにおいて減少したことを示した（図２４C）。MMP2活性の誘導はゼラチン酵素電気泳動法で検出されなかったので（図２４B）、この結果がおそらく結論であろう。一方で、細胞表面でMMP2を活性化できる（17）MT1-MMPの発現は、Ad-N1IC-HUVECにおける転写物およびタンパク質のレベルの両方がアップレギュレートされた（図２４D）。VEGFはゼラチナーゼおよびMT1-MMP発現の両方を調節できることから（１６）、RT-PCR分析は、MMP9およびMT1-MMPの両方がAd-VEGF-HUVECにおいて、Ad-LacZ-HUVECと比較してアップレギュレートされ、この誘導はAd-N1ECDFcの同時形質導入で阻害されたことを示した（図２４E）。Ad-N1ECDFc感染単独は、Ad-LacZ感染性HUVECにおけるMMP9またはMT1-MMPの何れの発現にも影響しなかった（データ示さず）。血管原性の出芽に関するMMPの要求性は、合成MMP阻害剤によって確立された(16)。GM6001は、MMP2、MMP9およびMT1-MMPを含むMMPに対する一つの広域の阻害剤である。GM6001は、明らかにコラーゲン(図31A-B)およびフィブリンゲル(データ示さず)の両方においてAd-N1IC-HUVECの出芽を減少させた。
【００６５】
マウス背部気嚢(Dorsa Air Sac；DAS)アッセイにおいて（19）、VEGF121 (293/VEGF)を過剰発現する293細胞の安定したトランスフェクタントは、インビボの血管形成を有意に誘導した(図25A、左側パネル)。このVEGF誘導性の血管形成は、293/VEGF単独と比較して、N1ECDFcの同時発現によって明らかに阻害された(図25A)。血管密度（Vessel density）が測定され、図25Bの中で示された血管形成のインデックスは、293/VEGF誘導性の血管形成が293/N1ECDFcの共発現により阻害されることを示している（図25B）。
【００６６】
また、マウス背部気嚢(Dorsa Air Sac；DAS)アッセイにおいて（19）、ヒト乳癌細胞株（MDA-MB-231）は、おそらくVEGFの分泌を介して有意にインビボの血管形成を誘導した(図25C、左側パネル)。このVEGF誘導性の血管形成は、LacZを発現するアデノウイルスと比較して、N1ECDFcのアデノウイルスを媒介とした発現によって明らかに阻害された(図25C)。血管密度が測定され、図25Dの中で示された血管形成のインデックスは、MDA-MB-231誘導性の血管形成がN1ECDFcの発現によって阻害されることを示している。
【００６７】
Flk1は胚におけるその強いチロシンキナーゼ活性による血管形成に関する主な陽性シグナルトランスデューサー（positive signal transducer）であり、他方でFlt1は血管形成に関する陰性シグナルトランスデューサー（negative signal transducer）であると考えられる。しかしながら、PlGF2を過剰発現するLLCのインビボの成長が細胞質のFlt-1キナーゼドメインを欠失するマウスにおいてひどく損なわれたので、Flt-1についての陽性の役割が成体マウスにおいて示された（２０）。PlGF/Flt-1シグナリングはFlk-1のリン酸化部位を変更し、虚血心筋の血管形成（ischemic myocardial angiogenesis）を強めたことから（２１）、Notchが作用してFlt-1シグナリング及び穏やかなFlk-1シグナリングを誘導することによりVEGFシグナリングを変えて糸状仮足の伸張の誘導又は血管原性の出芽を強めたのであろう。。興味深いことに、Notchシグナリングは、PlGF発現をアップレギュレートした(図29)。しかしながら、以前に(22)を報告された通り、Notchシグナリングの連続的な活性化は、血管原性の出芽を含む多細胞ルーメンの形成を阻害する。Notchシグナリングは出芽/糸状仮足形成の後に止められるべきであり、Notch経路の一時的な活性化が要求される。腫瘍血管形成がVEGF依存性である膵臓のβ細胞の発癌のトランスジェニックマウスモデル(Rip1Tag2マウス)において、VEGF発現のレベルは増加しないが、マトリックスに蓄えられた細胞外VEGFのVEGFレセプターへの動員は生じる。MMP-9はこの動員の原因であり、腫瘍発生はRip1Tag23MMP-9-ヌル  ダブル-トランスジェニックマウス（Rip1Tag23MMP-9-null double-transgenic mice）において阻害された(23)。Notchは、MMP-9発現をアップレギュレートし、血管原性の出芽の部位での局所的なVEGFレベルを増加させたのであろう。NotchはMT1-MMP発現もアップレギュレートし、細胞外MMP-2はNotch活性化内皮細胞の細胞膜に対してターゲットされるであろう。Notchは、ゼラチナーゼ活性およびVEGF濃度を調節することにより血管原性の出芽の部位を決定するであろう。内皮のMMP-9は肺特異的な転移においてFlt-1によって調節されたので（２０）、Flt-1はMMP-9の誘導に間接的に関与する可能性がある。
【００６８】
［第三のシリーズの実験において引用された参考文献］
1.   Artavanis-Tsakonas S, Rand MD, Lake RJ. Notch Signaling: Cell Fate Control and Signal Integration in Development. Science 1999;284(5415):770-776. 
2.   Shawber CJ, J. K. Notch function in the vasculature: insights from zebrafish, mouse and man. Bioessays. 2004;26(3):225-34. 
3.   Uyttendaele H, Ho J, Rossant J, J. K. Vascular patterning defects associated with expression of activated Notch4 in embryonic endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(10):5643-8. 
4.   Lawson ND, Vogel AM, BM. W. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Dev Cell 2002;3(1):127-36. 
5.   Liu ZJ, Shirakawa T, Li Y, Soma A, Oka M, Dotto GP, et al. Regulation of Notch1 and Dll4 by vascular endothelial growth factor in arterial endothelial cells: implications for modulating arteriogenesis and angiogenesis. Mol Cell Biol. 2003;23(1):14-25. 
6.   Gale NW, Dominguez MG, Noguera I, Pan L, Hughes V, Valenzuela DM, et al. Haploinsufficiency of delta-like 4 ligand results in embryonic lethality due to major defects in arterial and vascular development. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(45):5949-54. 
7.   Montesano R, L. O. Phorbol esters induce angiogenesis in vitro from large-vessel endothelial cells. J Cell Physiol. 1987;130(2):284-91. 
8.   Jarriault S, Brou C, Logeat F, Schroeter EH, Kopan R, A. I. Signalling downstream of activated mammalian Notch. Nature. 1995;377(6547):355-8. 
9.   Small D, Kovalenko D, Kacer D, Liaw L, Landriscina M, Di Serio C, et al. Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce the formation of the Src-dependent chord-like phenotype. J Biol Chem 2001;276(34):32022-30. 
10.   Gerhardt H, Golding M, Fruttiger M, Ruhrberg C, Lundkvist A, Abramsson A, et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. J Cell Biol 2003;161(6):1163-77. 
11.   Koolwijk P, van Erck MG, de Vree WJ, Vermeer MA, Weich HA, Hanemaaijer R, et al. Cooperative effect of TNFalpha, bFGF, and VEGF on the formation of tubular structures of human microvascular endothelial cells in a fibrin matrix. Role of urokinase activity. J Cell Biol 1996;132(6):1177-88. 
12.   Das I, Craig C, Funahashi Y, Jung KM, Kim TW, Byers R, et al. Notch oncoproteins depend on gamma-secretase/presenilin activity for processing and function. J Biol Chem 2004;279(29):30771-80. 
13.   Noseda M, Chang L, McLean G, Grim JE, Clurman BE, Smith LL, et al. Notch activation induces endothelial cell cycle arrest and participates in contact inhibition: role of p21Cip1 repression. Mol Cell Biol 2004;24(20):8813-22. 
14.   Taylor KL, Henderson AM, CC. H. Notch activation during endothelial cell network formation in vitro targets the basic HLH transcription factor HESR-1 and downregulates VEGFR-2/KDR expression. Microvasc Res 2002;64(3):372-83. 
15. Itokawa T, Nokihara H, Nishioka Y, Sone S, Iwamoto Y, Yamada Y, et al. Antiangiogenic effect by SU5416 is partly attributable to inhibition of Flt-1 receptor signaling. Mol Cancer Ther 2002;1(5):295-302. 
16.  Pepper MS. Role of the matrix metalloproteinase and plasminogen activator-plasmin systems in angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001;21(7):1104-17. 
17.  Seiki M, Koshikawa N, I. Y. Role of pericellular proteolysis by membrane-type 1 matrix metalloproteinase in cancer invasion and angiogenesis. Cancer Metastasis Rev 2003;22(2-3):129-43. 
18.   Yamamoto M, Tsujishita H, Hori N, Ohishi Y, Inoue S, Ikeda S, et al. Inhibition of membrane-type 1 matrix metalloproteinase by hydroxamate inhibitors: an examination of the subsite pocket. J Med Chem 1998;41(8):1209-17. 
19.   Funahashi Y, Wakabayashi T, Semba T, Sonoda J, Kitoh K, K. Y. Establishment of a quantitative mouse dorsal air sac model and its application to evaluate a new angiogenesis inhibitor. Oncol Res. 1999;11(7):319-29. 
20.  Hiratsuka S, Nakamura K, Iwai S, Murakami M, Itoh T, Kijima H, et al. MMP9 induction by vascular endothelial growth factor receptor-1 is involved in lung-specific metastasis. Cancer Cell 2002;2(4):289-300. 
21.   Autiero M, Waltenberger J, Communi D, Kranz A, Moons L, Lambrechts D, et al. Role of PlGF in the intra- and intermolecular cross talk between the VEGF receptors Flt1 and Flk1. Nat Med 2003;9(7):936-43. 
22.   Leong KG, Hu X LL, Noseda M, Larrivee B, Hull C, Hood L, et al. Activated Notch4 inhibits angiogenesis: role of beta 1-integrin activation. Mol Cell Biol 2002;22(8):2830-41. 
23.   Bergers G, Brekken R, McMahon G, Vu TH, Itoh T, Tamaki K, et al. Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. Nat Cell Biol 2000;2(10):737-44. 
［第四のシリーズの実験］血液およびリンパ性の内皮細胞におけるNotchタンパク質およびリガンドの発現 RT-PCRを、HMVECから精製された血液内皮細胞(BEC：  blood endothelial cells) およびリンパ性内皮細胞(LEC：  lymphatic endothelial cells)から単離されたRNAにおいてNotch1-4, Dll1, Dll4 および Jagged1で行った。図44に示すとおり、Notch1, Notch2, Notch4, Dll4 および Jagged1は、BEC および LECの双方で類似するレベルで発現された。Notch 3の発現はLECに限定されるように見え、リンパ内皮（lymphatic endothelium）におけるNotch3 シグナル伝達機能を示唆する。
【００６９】
Notch3は、e13.5 胚においてリンパ性の内皮細胞マーカー LYVE-1 および Prox1と共発現する。
【００７０】
胚日数（embryonic day）13.5日のマウス胚の10 ミクロンの連続切片を、LYVE-1, Prox1および Notch3の何れかで免疫染色した。図45に示すとおり、Notch3は、リンパ性の内皮細胞マーカー, LYVE-1 および Prox1も発現する細胞において発現した。
【００７１】
Prox1は、血液内皮細胞においてNotch3発現を誘導した。
【００７２】
Prox1の異所性発現がNotch タンパク質またはリガンドの発現を変化させるかどうかが調査された。図46, セクションAに示すとおり、Ad-Prox1またはAd-LacZの何れかでのアデノウイルス感染の二十四時間後、HUVECのトータルRNAを単離し、定量的な RT-PCRをNotch1-4, Dll4 および Jagged1に関して行なった。Prox-1は、Notch3の発現を強くアップレギュレートした。Notch1, Notch2, Notch4, Dll4 および Jagged1発現は、有意に影響されなかった。図46, セクションBに示すとおり、化合物 E (cE)〔Notch シグナル伝達を阻害するPresenlin インヒビター〕をAd-LacZまたはAd-Prox1感染HUVECの何れかと24 時間インキュベーションした。トータルRNAを単離し、定量的なRT-PCRを行なってNotch3 発現を決定した。Prox1はNotch3発現を誘導し、本誘導は化合物 Eの付加により阻害された。  
この結果は、Notch3のProx1 誘導がNotch シグナル活性化に依存することを示唆する。
【００７３】
Prox1は、血液内皮細胞においてNotch標的遺伝子（Notch-target genes）を誘導する。
HUVECをLacZ, Prox1, N1IC またはN4/int-3をコードしているアデノウイルスで感染させ、トータルRNAを感染24時間後単離した。定量的なRT-PCRを内皮のNotch-標的遺伝子, VEGFR-3, EphrinB2, Hey1 および Hey2に関して行なった。Notch1 および Notch4 シグナル活性化と類似して、Prox1は全て四つの遺伝子を誘導する(図47, セクションA および B)。Hey1 および Hey2のリンパ内皮における発現は、知られていない。
【００７４】
Prox1は、Notch標的遺伝子（Notch-target genes）を誘導し、血液内皮細胞におけるNotchシグナリングに依存する。  
HUVECを、LacZ, Prox1, N1Ic またはN4/int-3をコードしているアデノウイルスで感染させた。化合物 E (cE)〔Notch シグナル伝達を阻害するPresenlin インヒビター〕をAd-LacZまたはAd-Prox1感染HUVECの何れかと24 時間インキュベーションし、トータルRNAを単離した。定量的なRT-PCRを内皮のNotch-標的遺伝子, VEGFR-3, EphrinB2, および Hey2に関して行なった。図48に示すとおり、Notch 標的遺伝子（ephrinB2, VEGFR-3 および Hey2）のProx-1 媒介性の誘導は、Notch シグナル伝達インヒビター 化合物 Eの添加により阻害された。従って、Prox1は、ephrinB2, VEGFR-3 および Hey2の発現をNotchを介して制御する。
【００７５】
［第五のシリーズの実験］背景脈管のホメオスタシスにおけるNotchに関する機能の見識は、ヒトの神経血管性の障害である常染色体優性脳動脈症（CADASIL：  Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy）から得ることができる。患者の大多数において、CADASILは、Notch3におけるミスセンス変異と関連することが見出された。CADASILは遅発性(45の平均年齢)の常染色体優性の障害であり、前兆のある片頭痛および再発性発作（recurrent strokes）により特徴づけられ、精神医学的な症状, 進行性の認知の減退, 痴呆を発症し、死に至る(81)。これらの神経病理学的な症状は、ゆるやかに発生する動脈症に対し二次性に発生し、脳の動脈および細動脈の周囲の血管平滑筋細胞の組織の崩壊および破壊と関連する。血管平滑筋細胞の退行（Regression）は、血管壁厚の減少, 細胞外基質の欠損, および血管壁の弱さと関連する（82）。血管平滑筋細胞内に、Notch3の細胞外ドメインの蓄積、また細胞外基質にGOM（granular osmophilic materials）と称される粒子の異常な沈着が存在する（83）。この障害において、動脈の傷害は、脳に限定されることはなく、皮膚 および 網膜の動脈に見出された（83-85）。
【００７６】
CADASIL表現型は、血管平滑筋細胞におけるNotch3の発現に関連する（70,81）。Notch3が機能して細胞間相互作用または血管平滑筋細胞および動脈性の内皮細胞の間のコミュニケーションを維持するとの事項は仮説である。最近の研究は、特に血管平滑筋細胞においてCADASIL R90C変異をコードしているNotch3 導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおいてCADASILの血管病状を再現した（86）。これらのマウスの脈管構造は、GOM沈着およびNotch3蓄積を含む古典的なCADASIL動脈症を示した。しかしながら、これらの特徴の前に血管平滑筋細胞の足場と隣接する細胞への接着の崩壊が先行し、次に血管平滑筋細胞の変性が続いていた。このようにCADASILは、血管平滑筋細胞の接触および生存度の減少から生じる。また、Notch3の細胞外ドメインのGOMの沈着および蓄積は、この細胞衰退（cellular deterioration）の二次的な結果である。細胞生存におけるNotch3の役割と矛盾することなく、ラット大動脈の平滑筋細胞におけるNotch3の構成的な活性型の発現によって、Fas-依存的なアポトーシスのアンタゴニストであるcFlipの誘導を生じる（87）。加えて、培養した血管平滑筋細胞におけるHey1の異所性発現によってAktを介した細胞生存が促進され、血清飢餓 および Fasリガンドに応答したアポトーシスが阻害された（88）。まとめると, このデータは、Notch3が血管平滑筋細胞の生存を促進することにより動脈血管のホメオスタシスを維持することを示す。生じた動脈血管壁の漏れやすさ（leakiness）は、彼らの隣接する内皮細胞とコミュニケートするための血管平滑筋細胞の死または血管平滑筋細胞の不全から発生する可能性がある。マウスにおけるNotch3 活性の破壊は、この欠陥の性質の明確化の一助となるだろう。
【００７７】
CADASIL 変異体 Notch3 タンパク質の特異的な活性は、なお理解が不十分である。変異体 Notch3 機能を解釈することにおける一つの問題は、短縮型の細胞質 Notch3（truncated cytoplasmic Notch3）がCSL 転写制御因子を阻害または活性化できることを示すインビトロ研究と矛盾することから生じる（89,90）。  
血管平滑筋細胞におけるNotch シグナル伝達の活性化は、胚致死を生じる。  
Notch3は、血管, 平滑筋細胞および周細胞（pericytes）を囲む細胞において発現され、活性である。平滑筋は心臓血管機能に重要であり、平滑筋は発作を抑制するため健常でなければならない。周細胞は、腫瘍血管成長に寄与できる。Notch1 および Notch4は、これらの細胞タイプにおいて機能すると考えられない。  
それ故、本発明において記載されるNotch3 融合タンパク質は、異常な Notch3 活性を抑制することにより発作を抑制するため有用であろう。加えて、Notch3 融合タンパク質は、血管平滑筋細胞を維持すること、腫瘍の周細胞の成長または機能を制限すること、または周細胞の機能を調節することによりレチナールの血管形成に影響することに有用であろう。
【００７８】
我々は、活性型のNotch1 (N1IC)を伸長因子 1-アルファ プロモーター (EF1α)の制御下で、Cre-リコンビナーゼを発現する組織において発現するEF1α N1IC/+ と称されるトランスジェニックマウスを構築した（図49）。EF1α N1IC/+は、生存可能であり、繁殖性がある(図 50)。我々は、EF1α N1IC/+をSM22-Cre マウス 系統(SM22 Cre/+)と交配することによりN1ICを血管平滑筋細胞において発現させた。生じた SM22Cre/+;EF1α N1IC/+ダブルトランスジェニックは、E9.5に死亡した（図 50）。SM22Cre/+;EF1α N1IC/+ 胚は、我々が胚致死の原因である信じる心筋の欠陥を示した。これらの心筋の平滑筋細胞の欠陥と一貫した結果として、我々は血管平滑筋細胞マーカーのアルファ 平滑筋細胞アクチンの発現の変化をE9.5のSM22 Cre/+;EF1α N1IC/+ トランスジェニック動物において観察した（図51）。これらの結果は、血管平滑筋細胞におけるNotch シグナル伝達の増加が心血管の発生を破壊したことを示す。
【００７９】
［第五のシリーズの実験において引用された参考文献］
81.   Viitanen M, Kalimo H. CADASIL: Hereditary arteriopathy leading to multiple brain infarcts and dementia. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000;903:273-84. 
82.  Brulin P, Godfraind C, Leteurtre E, Ruchoux MM. Morphometric analysis of ultrastructural vascular changes in CADASIL: analysis of 50 skin biopsy specimens and pathogenic implications. Acta. Neuropathol. 2002;104:241-8. 
83.  Uyama E, Tokunaga M, Suenaga A, Kotorii S, Kamimura K, Takahashi K, Tabira T, Uchino M. Arg133Cys mutation of Notch3 in two unrelated Japanese families with CADASIL. Intern. Med. 2000;39(9):732-7. 
84.  Joutel A, Favrole P, Labauge P, Chabriat H, Lescoat C, Andreux F, Domenga V, Cecillon M, Vahedi K, Ducros A and others. Skin biospy immunostaining with a Notch3 monoclonal antibody for CADASIL diagnosis. Lancet 2001;358:2049-51. 
85.  Smith BW, Henneberry J, Connolly T. Skin biopsy findings in CADASIL. Neurology 2002;59(6):961. 
86.  Ruchoux MM, Domenga V, Brulin P, Maciazek J, Limol S, Tournier-Lasserve E, Joutel A. Transgenic mice expressing mutant Notch3 develop vascular alterations characteristic of cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leuckoencephalopathy. Am. J. Path. 2003;162(1):329-42. 
87.  Wang W, Prince CZ, Mou Y, Pollman MJ. Notch3 signaling in vascular smooth muscle cells induces c-FLIP expression via ERK/MAPK activation. J Biol Chem 2002; 277(24):21723-9. 
88.  Wang W, Prince CZ, Hu X, Pollman MJ. HRT1 modulates vascular smooth muscle cell proliferation and apoptosis. Biochem Biophys Res Commun 2003;308(3):596-601. 
89.  Beatus P, Lundkvist J, Oberg C, Lendahl U. The Notch3 intracellular domain represses Notch1-mediated activation through Hairy/Enhancer of split (HES) promoters. Development 1999;126(17):3925-35. 
90.  Saxena MT, Schroeter EH, Mumm JS, Kopan R. Murine notch homologs (N1-4) undergo presenilin-dependent proteolysis. J. Biol. Chem. 2001;276(43):40268-73.
【図１】
2015178507.tif 000002
【図２】
2015178507.tif 000003
【図３】
2015178507.tif 000004
【図４】
2015178507.tif 000005
【図５】
2015178507.tif 000006
【図６】
2015178507.tif 000007
【図７】
2015178507.tif 000008
【図８】
2015178507.tif 000009
【図９】
2015178507.tif 000010
【図１０】
2015178507.tif 000011
【図１１】
2015178507.tif 000012
【図１２】
2015178507.tif 000013
【図１３】
2015178507.tif 000014
【図１４Ａ】
2015178507.tif 000015
【図１４Ｂ】
2015178507.tif 000016
【図１５Ａ】
2015178507.tif 000017
【図１５Ｂ】
2015178507.tif 000018
【図１６Ａ】
2015178507.tif 000019
【図１６Ｂ】
2015178507.tif 000020
【図１７Ａ】
2015178507.tif 000021
【図１７Ｂ】
2015178507.tif 000022
【図１８Ａ】
2015178507.tif 000023
【図１８Ｂ】
2015178507.tif 000024
【図１９Ａ】
2015178507.tif 000025
【図１９Ｂ】
2015178507.tif 000026
【図２０Ａ】
2015178507.tif 000027
【図２０Ｂ】
2015178507.tif 000028
【図２１Ａ】
2015178507.tif 000029
【図２１Ｂ】
2015178507.tif 000030
【図２２Ａ】
2015178507.tif 000031
【図２２Ｂ】
2015178507.tif 000032
【図２２Ｃ】
2015178507.tif 000033
【図２２Ｄ】
2015178507.tif 000034
【図２２Ｅ】
2015178507.tif 000035
【図２２Ｆ】
2015178507.tif 000036
【図２２Ｇ】
2015178507.tif 000037
【図２２Ｈ】
2015178507.tif 000038
【図２２Ｉ】
2015178507.tif 000039
【図２３Ａ】
2015178507.tif 000040
【図２３Ｂ】
2015178507.tif 000041
【図２３Ｃ】
2015178507.tif 000042
【図２３Ｄ】
2015178507.tif 000043
【図２３Ｅ】
2015178507.tif 000044
【図２３Ｆ】
2015178507.tif 000045
【図２３Ｇ】
2015178507.tif 000046
【図２３Ｈ】
2015178507.tif 000047
【図２３Ｉ】
2015178507.tif 000048
【図２３Ｊ】
2015178507.tif 000049
【図２４Ａ】
2015178507.tif 000050
【図２４Ｂ】
2015178507.tif 000051
【図２４Ｃ】
2015178507.tif 000052
【図２４Ｄ】
2015178507.tif 000053
【図２４Ｅ】
2015178507.tif 000054
【図２５Ａ】
2015178507.tif 000055
【図２５Ｂ】
2015178507.tif 000056
【図２５Ｃ】
2015178507.tif 000057
【図２５Ｄ】
2015178507.tif 000058
【図２６Ａ】
2015178507.tif 000059
【図２６Ｂ】
2015178507.tif 000060
【図２７Ａ】
2015178507.tif 000061
【図２７Ｂ】
2015178507.tif 000062
【図２８Ａ】
2015178507.tif 000063
【図２８Ｂ】
2015178507.tif 000064
【図２９】
2015178507.tif 000065
【図３０Ａ】
2015178507.tif 000066
【図３０Ｂ】
2015178507.tif 000067
【図３０Ｃ】
2015178507.tif 000068
【図３１Ａ】
2015178507.tif 000069
【図３１Ｂ】
2015178507.tif 000070
【図３２Ａ】
2015178507.tif 000071
【図３２Ｂ】
2015178507.tif 000072
【図３２Ｃ】
2015178507.tif 000073
【図３３】
2015178507.tif 000074
【図３４】
2015178507.tif 000075
【図３５】
2015178507.tif 000076
【図３６】
2015178507.tif 000077
【図３７】
2015178507.tif 000078
【図３８】
2015178507.tif 000079
【図３９】
2015178507.tif 000080
【図４０Ａ】
2015178507.tif 000081
【図４０Ｂ】
2015178507.tif 000082
【図４１】
2015178507.tif 000083
【図４２】
2015178507.tif 000084
【図４３Ａ】
2015178507.tif 000085
【図４３Ｂ】
2015178507.tif 000086
【図４４】
2015178507.tif 000087
【図４５】
2015178507.tif 000088
【図４６】
2015178507.tif 000089
【図４７】
2015178507.tif 000090
【図４８】
2015178507.tif 000091
【図４９】
2015178507.tif 000092
【図５０】
2015178507.tif 000093
【図５１】
2015178507.tif 000094
【配列表】
2015178507000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月1日(2015.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナルペプチド、ヒトNotch3レセプタータンパク質の細胞外ドメインのEGFリピート 1-X（当該Xは、12〜34の任意の整数である）、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
［第五のシリーズの実験において引用された参考文献］
81.   Viitanen M, Kalimo H. CADASIL: Hereditary arteriopathy leading to multiple brain infarcts and dementia. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000;903:273-84. 
82.  Brulin P, Godfraind C, Leteurtre E, Ruchoux MM. Morphometric analysis of ultrastructural vascular changes in CADASIL: analysis of 50 skin biopsy specimens and pathogenic implications. Acta. Neuropathol. 2002;104:241-8. 
83.  Uyama E, Tokunaga M, Suenaga A, Kotorii S, Kamimura K, Takahashi K, Tabira T, Uchino M. Arg133Cys mutation of Notch3 in two unrelated Japanese families with CADASIL. Intern. Med. 2000;39(9):732-7. 
84.  Joutel A, Favrole P, Labauge P, Chabriat H, Lescoat C, Andreux F, Domenga V, Cecillon M, Vahedi K, Ducros A and others. Skin biospy immunostaining with a Notch3 monoclonal antibody for CADASIL diagnosis. Lancet 2001;358:2049-51. 
85.  Smith BW, Henneberry J, Connolly T. Skin biopsy findings in CADASIL. Neurology 2002;59(6):961. 
86.  Ruchoux MM, Domenga V, Brulin P, Maciazek J, Limol S, Tournier-Lasserve E, Joutel A. Transgenic mice expressing mutant Notch3 develop vascular alterations characteristic of cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leuckoencephalopathy. Am. J. Path. 2003;162(1):329-42. 
87.  Wang W, Prince CZ, Mou Y, Pollman MJ. Notch3 signaling in vascular smooth muscle cells induces c-FLIP expression via ERK/MAPK activation. J Biol Chem 2002; 277(24):21723-9. 
88.  Wang W, Prince CZ, Hu X, Pollman MJ. HRT1 modulates vascular smooth muscle cell proliferation and apoptosis. Biochem Biophys Res Commun 2003;308(3):596-601. 
89.  Beatus P, Lundkvist J, Oberg C, Lendahl U. The Notch3 intracellular domain represses Notch1-mediated activation through Hairy/Enhancer of split (HES) promoters. Development 1999;126(17):3925-35. 
90.  Saxena MT, Schroeter EH, Mumm JS, Kopan R. Murine notch homologs (N1-4) undergo presenilin-dependent proteolysis. J. Biol. Chem. 2001;276(43):40268-73.
以下に、本願の出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
［１］  シグナルペプチド、ヒトNotch3レセプタータンパク質の細胞外ドメインのEGFリピート 1-X（当該Xは、12〜34の任意の整数である）、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質。
［２］  シグナルペプチド、ヒトNotch3レセプタータンパク質の細胞外ドメインのEGFリピート 1-X（当該Xは、1〜10の任意の整数である）、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質。
［３］  シグナルペプチド、ヒトNotch3レセプターの細胞外ドメインの少なくとも12のEGFリピート、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質。
［４］  シグナルペプチド、ヒトNotch3 レセプタータンパク質の細胞外ドメインのEGFリピート（ここで、少なくとも12のEGFリピートが存在する）、およびそれに対して結合する抗体のFc部分を含む融合タンパク質。
［５］  前記抗体のFc部分がヒト抗体のFc部分である［1］〜［4］の何れか一項に記載の融合タンパク質。
［６］  前記シグナルペプチドがNotch3またはIgG重鎖のシグナルペプチドである［1］〜［4］の何れか一項に記載の融合タンパク質。
［７］  前記Notch１レセプタータンパク質の細胞外ドメインが、EGF様リピート1-34を含む［1］, ［3］ または［4］に記載の融合タンパク質。
［８］  配列番号32に記載の配列である連続したアミノ酸を含む［1］,［3］または［4］に記載の融合タンパク質。
［９］  配列番号33に記載の配列である連続したアミノ酸を含む［1］, ［3］ または［4］に記載の融合タンパク質。
［１０］  配列番号31に記載の配列である連続したヌクレオチドによりコードされた［1］, ［3］または［4］に記載の融合タンパク質。
［１１］  配列番号34に記載の配列である連続したヌクレオチドによりコードされた［1］, ［3］または［4］に記載の融合タンパク質。
［１２］  対象を治療するために有効な量の［1］〜［11］の融合タンパク質を前記対象投与し、それにより腫瘍を有する前記対象を治療することを含む、腫瘍を有する対象を治療する方法。
［１３］  対象において血管形成を阻害するために有効な量の［1］〜［11］の融合タンパク質を前記対象に投与し、それにより当該対象における血管形成を阻害することを含む、対象において血管形成を阻害する方法。
［１４］  対象を治療するために有効な量の［1］〜［11］の融合タンパク質を前記対象投与し、それにより卵巣癌を有する前記対象を治療することを含む、卵巣癌を有する対象を治療する方法。
［１５］  対象を治療するために有効な量の［1］〜［11］の融合タンパク質を前記対象投与し、それにより代謝障害を有する前記対象を治療することを含む、代謝障害を有する対象を治療する方法。
［１６］  前記代謝障害が、糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化、虚血、発作、または循環器病である［15］に記載の方法。
［１７］  腫瘍を有する対象を治療する薬学的組成物の製造のための［1］〜［11］の融合タンパク質の使用。
［１８］  対象における血管形成を阻害する薬学的組成物の製造のための［1］〜［11］の融合タンパク質の使用。
［１９］  対象において生理的なリンパ管形成または病理的なリンパ管形成を阻害するために有効な量の［1］〜［11］の何れかの融合タンパク質を前記対象に投与することを含む、当該対象における生理的なリンパ管形成または病理的なリンパ管形成を阻害するための方法。
［２０］  前記病理的なリンパ管形成が腫瘍リンパ管形成またはリンパ節転移である［19］に記載の方法。
［２１］  対象において腫瘍転移を阻害するために有効な量の［1］〜［11］の何れかの融合タンパク質を該対象に投与することを含む、該対象における腫瘍転移を阻害する方法。
［２２］  前記転移は、血管、リンパ性脈管構造またはリンパ節を介して生じる［21］に記載の方法。
［２３］  対象において二次性腫瘍の成長を阻害するために有効な量の［1］〜［11］の何れかの融合タンパク質を該対象に投与することを含む、該対象における二次性腫瘍の成長を阻害する方法。
［２４］  前記二次性腫瘍の成長は、二次性腫瘍に関連する血管形成の阻害により阻害される［23］に記載の方法。
［２５］  対象において腫瘍による血管取り込み（blood vessel cooption）を阻害するために有効な量の［1］〜［11］の何れかの融合タンパク質を該対象に投与することを含む、該対象における腫瘍による血管取り込みを阻害する方法。
［２６］  それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の［1］〜［11］の何れかの融合タンパク質と血管内皮成長因子(VEGF)のインヒビターとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法。
［２７］  前記VEGFのインヒビターが、VEGF-A, PGIF, VEGF-B, VEGF-C, またはVEGF-Dのインヒビターである［26］に記載の方法。
［２８］  それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の［1］〜［11］の何れかの融合タンパク質とVEGFレセプターのインヒビターとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法。
［２９］  前記VEGFレセプターのインヒビターが、VEGFR-1インヒビター、VEGFR-2インヒビターまたはVEGFR-2インヒビターである［29］に記載の方法。
［３０］  それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の［1］〜［11］の何れかの融合タンパク質と血小板由来増殖因子(PDGF)のインヒビターとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法。
［３１］  血小板由来成長因子のインヒビターは、PDGF-AのインヒビターまたはPDGF-Bのインヒビターである［30］に記載の方法。
［３２］  それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の［1］〜［11］の何れかの融合タンパク質とPDGFレセプターアンタゴニストとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法。
［３３］  PDGFレセプターアンタゴニストは、PDGFレセプターBアンタゴニストである［32］に記載の方法。
［３４］  それぞれ対象において癌を治療するために有効な量の［1］〜［11］の何れかの融合タンパク質とHER2/neuのインヒビターとを対象に投与することを含む前記対象において癌を治療する方法。
［３５］  対象における乳癌を治療するために有効な量の［1］〜［11］の何れかの融合タンパク質を対象に投与することを含む、対象における乳癌を治療する方法。
［３６］  乳癌を有する対象を治療する薬学的組成物の製造のための［1］〜［11］の何れかの融合タンパク質の使用。
【外国語明細書】
2015178507000001.pdf