(57)【要約】【課題】ボツリヌス毒素注入による神経ブロック療法において、治療効果をより長期にわたり持続させることができる手段を提供する。【解決手段】みかけの分子量が１４０〜１５０ｋＤａであり、みかけの等電点が６．１０〜６．４０であるタンパク質（Ａ）および拡散抑制添加剤を含有する生理食塩水溶液を、３７℃において平板状アガロースゲル内で拡散させ、前記タンパク質（Ａ）を染色し、前記ゲルを脱色し、染色された部分の水平投影面積を測定して得られるタンパク質（Ａ）の拡散面積の、前記拡散抑制添加剤非含有である前記生理食塩水溶液のタンパク質（Ａ）の拡散面積に対する比率が前記拡散抑制添加剤を９５％以下となる濃度で含有する生理食塩水溶液からなる、製剤の拡散抑制に用いるボツリヌス毒素製剤用溶解剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
みかけの分子量が１４０〜１５０ｋＤａであり、みかけの等電点が６．１０〜６．４０であるタンパク質（Ａ）および拡散抑制添加剤を含有する生理食塩水溶液を、３７℃において平板状アガロースゲル内で拡散させ、前記タンパク質（Ａ）を染色し、前記ゲルを脱色し、染色された部分の水平投影面積を測定して得られるタンパク質（Ａ）の拡散面積の、前記拡散抑制添加剤非含有である前記生理食塩水溶液のタンパク質（Ａ）の拡散面積に対する比率が９５％以下となる濃度で前記拡散抑制添加剤を含有する生理食塩水溶液からなる、製剤の拡散抑制に用いるボツリヌス毒素製剤用溶解剤。
【請求項２】
前記拡散抑制添加剤がポロキサマーである、請求項１に記載のボツリヌス毒素製剤用溶解剤。
【請求項３】
前記拡散抑制添加剤がプロピレンオキシドとエチレンオキシドとからなり、ポリプロピレンオキシドブロックがポリエチレンオキシドブロックに挟まれてなるトリブロック共重合体である、請求項１または２に記載のボツリヌス毒素製剤用溶解剤。
【請求項４】
前記拡散抑制添加剤を前記比率が７５％以下となる濃度で含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のボツリヌス毒素製剤用溶解剤。
【請求項５】
みかけの分子量が１４０〜１５０ｋＤａであり、みかけの等電点が６．１０〜６．４０であるタンパク質（Ａ）および拡散抑制添加剤を含有するＲＯ水溶液を、３７℃において平板状アガロースゲル内で拡散させ、前記タンパク質（Ａ）を染色し、前記ゲルを脱色し、染色された部分の水平投影面積を測定して得られるタンパク質（Ａ）の拡散面積の、前記拡散抑制添加剤非含有である前記ＲＯ水溶液のタンパク質（Ａ）の拡散面積に対する比率が９５％以下となる濃度で前記拡散抑制添加剤を含有するＲＯ水溶液からなる、製剤の拡散抑制に用いるボツリヌス毒素製剤用溶解剤。
【請求項６】
前記タンパク質（Ａ）がみかけの分子量が１４０ｋＤａであり、みかけの等電点が６．１０〜６．４０である乳酸脱水素酵素である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のボツリヌス毒素製剤用溶解剤。
【請求項７】
１分子中にエチレンオキシド単位を６０〜９０モル％含み、１分子中のポリプロピレンオキシドブロックの分子量が１８００〜３８００であるポロキサマーと、水とを含み、前記ポロキサマーの含有量が１．５〜３．５質量％である、製剤の拡散抑制に用いるボツリヌス毒素製剤用溶解剤。
【請求項８】
さらに、塩化ナトリウムを、７．０〜１０．０ｇ／Ｌ含有する、請求項７に記載のボツリヌス毒素製剤用溶解剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ボツリヌス毒素製剤用溶解剤に関する。より詳細には、本発明は、ボツリヌス毒素の拡散抑制添加剤の生理食塩水溶液または水溶液であるボツリヌス毒素製剤用溶解剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性脳梗塞の後遺症や変性疾患に伴う嚥下障害は、飲込みの障害による低栄養や脱水、気道内への流入による窒息や誤嚥性肺炎などの原因となる。
【０００３】
嚥下障害の治療方法としては、従来、咽頭挙上術や輪状咽頭筋切断術が行われているが、患者の多くは様々な合併症を伴っており、高齢者が多いことから、全身麻酔を必要とする手術はリスクが大きいこと、また、組織を不可逆的に損傷することから、本人や家族の手術希望がないこと等を理由に手術が不可能な場合がある。
【０００４】
近年、特に手術が適用不可能な輪状咽頭筋弛緩不全患者に対する治療法として、ボツリヌス毒素注入による神経ブロック療法が着目されている（非特許文献１）。
輪状咽頭筋の弛緩不全は、多発性脳梗塞等により口腔咽頭の諸筋の麻痺が生じて嚥下圧が低下した結果として生じる例が多く存在する。ボツリヌス毒素注入による神経ブロック療法は、輪状咽頭筋にボツリヌス毒素を局所注入することで筋を弛緩させ、嚥下障害を改善するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】横山智一、外４名、「ボツリヌストキシンの輪状咽頭筋内注入により嚥下障害の軽快が見られた２症例」、日本耳鼻咽喉科学会会報、日本耳鼻咽喉科学会、2003年7月20日、第106巻、第7号、ｐ．754-757
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ボツリヌス毒素注入による神経ブロック療法は低侵襲で組織を障害しないというメリットがあり、効果も高いが、１回の注入により効果が持続する期間が短く、概ね３〜６カ月間で効果が消失する。そのため、非常に高価な薬剤であるボツリヌス毒素製剤を１年間に何回も注入する必要があり、治療を受ける患者の副作用リスクおよび経済的負担が増大している。
【０００７】
そこで、本発明は、ボツリヌス毒素注入による神経ブロック療法において、治療効果をより長期にわたり持続させることができる手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ボツリヌス毒素製剤は生理食塩液に溶解して注射剤として使用されている点に鑑み、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ね、様々な手段の利害得失を比較考量した結果、特定の拡散抑制添加剤を特定の濃度で含有する生理食塩水溶液からなるボツリヌス毒素製剤溶解剤を用いることで、ボツリヌス毒素注入による神経ブロック療法において、治療効果をより長期にわたり持続させることができることを知得し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下に掲げるものである。
（１）みかけの分子量が１４０〜１５０ｋＤａであり、みかけの等電点が６．１０〜６．４０であるタンパク質（Ａ）および拡散抑制添加剤を含有する生理食塩水溶液を、３７℃において平板状アガロースゲル内で拡散させ、前記タンパク質（Ａ）を染色し、前記ゲルを脱色し、染色された部分の水平投影面積を測定して得られるタンパク質（Ａ）の拡散面積の、前記拡散抑制添加剤非含有である前記生理食塩水溶液のタンパク質（Ａ）の拡散面積に対する比率が９５％以下となる濃度で前記拡散抑制添加剤を含有する生理食塩水溶液からなる、製剤の拡散抑制に用いるボツリヌス毒素製剤用溶解剤。
（２）前記拡散抑制添加剤がポロキサマーである、上記（１）に記載のボツリヌス毒素製剤用溶解剤。
（３）前記拡散抑制添加剤がプロピレンオキシドとエチレンオキシドとからなり、ポリプロピレンオキシドブロックがポリエチレンオキシドブロックに挟まれてなるトリブロック共重合体である、上記（１）または（２）に記載のボツリヌス毒素製剤用溶解剤。
（４）前記拡散抑制添加剤を前記比率が７５％以下となる濃度で含有する、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のボツリヌス毒素製剤用溶解剤。
（５）みかけの分子量が１４０〜１５０ｋＤａであり、みかけの等電点が６．１０〜６．４０であるタンパク質（Ａ）および拡散抑制添加剤を含有するＲＯ水溶液を、３７℃において平板状アガロースゲル内で拡散させ、前記タンパク質（Ａ）を染色し、前記ゲルを脱色し、染色された部分の水平投影面積を測定して得られるタンパク質（Ａ）の拡散面積の、前記拡散抑制添加剤非含有である前記ＲＯ水溶液のタンパク質（Ａ）の拡散面積に対する比率が９５％以下となる濃度で前記拡散抑制添加剤を含有するＲＯ水溶液からなる、製剤の拡散抑制に用いるボツリヌス毒素製剤用溶解剤。
（６）前記タンパク質（Ａ）がみかけの分子量が１４０ｋＤａであり、みかけの等電点が６．１０〜６．４０である乳酸脱水素酵素である、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のボツリヌス毒素製剤用溶解剤。
（７）１分子中にエチレンオキシド単位を６０〜９０モル％含み、１分子中のポリプロピレンオキシドブロックの分子量が１８００〜３８００であるポロキサマーと、水とを含み、前記ポロキサマーの含有量が１．５〜３．５質量％である、製剤の拡散抑制に用いるボツリヌス毒素製剤用溶解剤。
（８）さらに、塩化ナトリウムを、７．０〜１０．０ｇ／Ｌ含有する、上記（７）に記載のボツリヌス毒素製剤用溶解剤。
（９）ボツリヌス毒素と、上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載のボツリヌス毒素溶解剤とを混合して得られる、ボツリヌス毒素製剤。
（１０）筋肉内注射または皮下注射に適する、上記（９）に記載のボツリヌス毒素製剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ボツリヌス毒素注入による神経ブロック療法において、治療効果をより長期にわたり持続させることができる手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１のＡは平板状アガロースゲルに３個の貫通孔（Through Hole）をあけた状態を示す図である。図１のＢはＣＢＢ染色および脱色後の平板状アガロースゲルである。貫通孔から拡散したＬＤＨがＣＢＢにより染色されている。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。まず、本発明の従来技術と比較した特徴的な点を述べる。
【００１３】
本発明のボツリヌス毒素製剤用溶解剤の一つの特徴は、ボツリヌス毒素の局所滞留性を向上させることにより、周囲への拡散を抑制し、もって治療効果をより長期にわたり持続させる点にある。また、ボツリヌス毒素の周囲筋肉への拡散が抑制されることにより、副作用リスクの低減を図ることができる。
【００１４】
本発明のボツリヌス毒素製剤用溶解剤の別の一つの特徴は、ボツリヌス毒素製剤を溶解するために従来用いられている生理食塩液に代えて使用することができる点にある。このため、従来の手順に大きな変更を加えることなく、本発明のボツリヌス毒素製剤用溶解剤を用いてボツリヌス毒素製剤を溶解し、注射剤として用いることができる。
【００１５】
［ボツリヌス毒素］
ボツリヌス毒素はボツリヌス菌（Clostridium botulinum）が生産する分子量約１５０ｋＤａのタンパク質である。ボツリヌス毒素は、細胞外に分泌された後に、菌自身のプロテアーゼまたは動物消化管のトリプシンによって、分子量約５０ｋＤａの活性サブユニット（Ａサブユニット、軽鎖）と、約１００ｋＤａの結合サブユニット（Ｂサブユニット、重鎖）とに切断される。ＡサブユニットとＢサブユニットとはジスルフィド結合によって一分子ずつ結合している。ＡＢ型毒素に分類される細菌外毒素である。活性サブユニットが、毒素の本体である亜鉛結合性の金属プロテアーゼであり、結合サブユニットは標的となる神経細胞表面に特異的に存在する特定のタンパク質（毒素受容体となる）との結合に関与する。ボツリヌス毒素は神経-筋接合部や自律神経のシナプスへ作用して、神経伝達物質であるアセチルコリンの放出を阻害するので、弛緩性の麻痺をおこす。
ボツリヌス毒素製剤は、ボツリヌス毒素を精製した医療用医薬品であり、Ａ型ボツリヌス毒素製剤、Ｂ型ボツリヌス毒素製剤等がある。例を挙げれば、Ａ型ボツリヌス毒素製剤としては、ボトックス（Ｒ）（グラクソ・スミスクライン）が、Ｂ型ボツリヌス毒素製剤としては、ナーブロック（Ｒ）（エーザイ）が、それぞれ販売されている。
【００１６】
［ボツリヌス毒素注入による神経ブロック療法］
ボツリヌス毒素注入による神経ブロック療法は、輪状咽頭筋弛緩不全に陥っている嚥下障害の患者を対象として、輪状咽頭筋にボツリヌス毒素を注入し、輪状咽頭筋を開いて、咽頭期の反射を起こすことにより、嚥下障害を改善するものである。
【００１７】
［みかけの分子量、みかけの等電点］
本発明では、タンパク質のみかけの分子量は、非変性条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って測定される分子量をいう。また、本発明では、タンパク質のみかけの等電点は、非変性条件で一次元等電点電気泳動を行って測定される等電点をいう。
非変性条件は複数のタンパク質サブユニットからなるタンパク質複合体のサブユニット同士が解離しない条件をいう。
【００１８】
［ボツリヌス毒素製剤用溶解剤］
１．本発明のボツリヌス毒素製剤用溶解剤（以下、単に「本発明の溶解剤（１）」という場合がある。）は、特定の拡散抑制添加剤を特定濃度で含有する生理食塩水溶液からなる。
【００１９】
〈拡散抑制添加剤およびその濃度〉
本発明の溶解剤（１）に含有される拡散抑制添加剤およびその濃度は、みかけの分子量が１４０〜１５０ｋＤａであり、みかけの等電点が６．１０〜６．４０であるタンパク質（Ａ）と、特定濃度の候補化合物とを含有する生理食塩水溶液を、３７℃において平板状アガロースゲル内で拡散させ、前記タンパク質（Ａ）を染色し、前記ゲルを脱色し、染色された部分の水平投影面積を測定して得られるタンパク質（Ａ）の拡散面積の、前記候補化合物を非含有である、前記生理食塩水溶液のタンパク質（Ａ）の拡散面積に対する比率（拡散率）が９５％以下となる候補化合物およびその濃度である。
【００２０】
〈拡散抑制添加剤およびその濃度の決定方法〉
本発明の溶解剤（１）に含有される拡散抑制添加剤およびその濃度は、以下の（ａ）〜（ｋ）を備えるスクリーニング試験によって決定することができる。なお、各工程の順序はアルファベットの順に限定されず、適切な場合には、順序を変更することができる。
【００２１】
（ａ）みかけの分子量が１４０〜１５０ｋＤａであり、みかけの等電点が６．１０〜６．４０であるタンパク質（Ａ）を準備する。タンパク質（Ａ）は、みかけの分子量１４０ｋＤａ、みかけの等電点６．３７のＬ−乳酸酸脱水素酵素（EC 1.1.1.27）またはみかけの分子量１５０ｋＤａ、みかけの等電点６．１４のＡ型ボツリヌス毒素が好ましい。見かけの分子量および見かけの等電点は、従来公知の方法により測定することができる。
（ｂ）拡散抑制添加剤の候補となる候補化合物を準備する。候補化合物としては、筋注・静注実績あるポリマーであること、安全に使用可能であること、シリンジによる吸引および注入が可能であることを条件として、選定することが好ましい。候補化合物としては、例えば、プロピレンオキシドとエチレンオキシドとからなり、ポリプロピレンオキシドブロックがポリエチレンオキシドブロックに挟まれてなるトリブロック共重合体、デキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸等が挙げられる。
【００２２】
（ｃ）候補化合物と、タンパク質（Ａ）と、生理食塩水とを混合し、特定濃度の候補化合物および１．６ｍｇ／Ｌのタンパク質（Ａ）を含有する生理食塩水溶液を準備する。混合の方法は特に限定されないが、生理食塩水と候補化合物とを混合し、得られる混合液にさらにタンパク質（Ａ）を混合してもよいし、生理食塩水とタンパク質（Ａ）とを混合し、得られる混合液にさらに候補化合物を混合してもよい。生理食塩水は、ヒトの体液とほぼ等張の塩化ナトリウム水溶液であれば特に限定されない。生理食塩水としては、例えば、塩化ナトリウムを０．７〜１．０ｗ／ｖ％（７〜１０ｇ／Ｌ）、好ましくは０．９ｗ／ｖ％（９ｇ／Ｌ）含有する食塩水、日本薬局方生理食塩液等が挙げられる。
以下、この生理食塩水溶液をサンプル溶液という。
（ｄ）タンパク質（Ａ）と、生理食塩水とを混合し、１．６ｍｇ／Ｌのタンパク質（Ａ）を含有する生理食塩水溶液を準備する。
以下、この生理食塩水溶液をリファレンス溶液という。
【００２３】
（ｅ）シャーレにＲＯ水に溶解したアガロース（０．８ｗ／ｖ％）を注ぎ込み、シャーレの中に平板状アガロースゲルを作製する。シャーレは特に限定されないが、直径８〜１２ｃｍ、深さ１〜２ｃｍのガラス製またはプラスチック製のものが好ましく、プラスチック製のものがより好ましい。ＲＯ水は逆浸透水であれば特に限定されず、ｐＨは５．６〜７．０の範囲内が好ましく、５．８〜６．８の範囲内がより好ましい。
（ｆ）平板状アガロースゲルにサンプル溶液またはリファレンス溶液を注入するための貫通孔をあける。貫通孔を複数あける場合には、貫通孔同士の間隔が狭くなり過ぎないようにする。貫通孔から拡散するタンパク質（Ａ）が近隣の貫通孔から拡散するタンパク質（Ａ）と混合しないようにし、拡散面積をより正確に測定できるようにするためである。
【００２４】
（ｇ）平板状アガロースゲルにあけた貫通孔に、２０μＬのサンプル溶液またはリファレンス溶液を注入する。
（ｈ）サンプル溶液またはリファレンス溶液を注入した平板状アガロースゲルを３７℃で９時間静置する。
【００２５】
（ｉ）静置後、クーマジーブリリアントブルー（ＣＢＢ）を用いて、アガロースゲルの染色および脱色をする。ＣＢＢ染色された面積がタンパク質（Ａ）の拡散面積である。
（ｊ）画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ）を用いて、サンプル溶液およびリファレンス溶液のタンパク質（Ａ）の拡散面積を測定し、リファレンス溶液のタンパク質（Ａ）の拡散面積に対するサンプル溶液のタンパク質（Ａ）の拡散面積の比率（拡散率）（％）を求める。
（ｋ）拡散率が９５％以下、好ましくは７５％以下となる候補化合物およびその濃度の組合せが、本発明の溶解剤（１）が含有する拡散抑制添加剤およびその濃度である。
【００２６】
２．本発明のボツリヌス毒素製剤用溶解剤（以下、単に「本発明の溶解剤（２）」という場合がある。）は、特定の拡散抑制添加剤を特定濃度で含有するＲＯ水溶液からなるものであってもよい。
【００２７】
〈拡散抑制添加剤およびその濃度〉
本発明の溶解剤（２）中に含有される拡散抑制添加剤およびその濃度は、みかけの分子量が１４０〜１５０ｋＤａであり、みかけの等電点が６．１０〜６．４０であるタンパク質（Ａ）と、特定濃度の候補化合物とを含有するＲＯ水溶液を、３７℃において平板状アガロースゲル内で拡散させ、前記タンパク質（Ａ）を染色し、前記ゲルを脱色し、染色された部分の水平投影面積を測定して得られるタンパク質（Ａ）の拡散面積の、前記候補化合物を非含有である、前記ＲＯ水溶液のタンパク質（Ａ）の拡散面積に対する比率（拡散率）が９５％以下となる候補化合物およびその濃度である。
【００２８】
本発明の溶解剤（２）は、上述した本発明の溶解剤の生理食塩水をＲＯ水に変更したものである、したがって、上述した事項は、生理食塩水をＲＯ水と読み替えることにより、本発明の溶解剤（２）についても該当する。
【００２９】
３．本発明のボツリヌス毒素製剤用溶解剤（以下、単に「本発明の溶解剤（３）」という場合がある。）は、１分子中にエチレンオキシド単位を６０〜９０モル％含み、１分子中のポリプロピレンオキシドブロックの分子量が１８００〜３８００であるポロキサマーと、水とを含み、前記ポロキサマーの含有量が１．５〜３．５質量％であるものであってもよく、所望によりさらに７．０〜１０．０ｇ／Ｌ（０．７〜１．０ｇ／１００ｍＬ）、好ましくは９．０ｇ／Ｌ（０．９ｇ／１００ｍＬ）の塩化ナトリウムを含有してもよい。
【００３０】
上記ポロキサマーは、反復投与毒性がより低いという観点から、１分子中にエチレンオキシド単位を７０〜８５モル％含むことが好ましく、７５〜８０モル％含むことがより好ましく、また、１分子中のポリプロピレンオキシドブロックの分子量が２０５０〜３２５０であることが好ましく、２２５０〜３２５０であることがより好ましい。
【００３１】
本発明の溶解剤（３）中、上記ポロキサマーの含有量は、拡散抑制効果がより優れるという観点から、２．５〜３．５質量％が好ましい。
【００３２】
上記ポロキサマーとしては、具体的には、プルロニック（Ｒ）  Ｆ１０８、プルロニック（Ｒ）  Ｆ９８、プルロニック（Ｒ）  Ｆ７７、プルロニック（Ｒ）  Ｆ８７等が挙げられ、拡散抑制効果の観点から、プルロニック（Ｒ）  Ｆ１０８およびプルロニック（Ｒ）  Ｆ９８が好ましく、反復投与毒性がより低いことから、プルロニック（Ｒ）  Ｆ１０８がより好ましい。
【００３３】
上記水としては、ＲＯ水、パイロジェン除去蒸留水、日本薬局方注射用水等を使用することができる。ボツリヌス毒素製剤溶解剤が塩化ナトリウムを含有する場合には、水として食塩水を使用してもよく、食塩水としては、例えば、日本薬局方生理食塩液（塩化ナトリウムを約９．０ｇ／Ｌ含有する）が挙げられる。
【００３４】
［ボツリヌス毒素製剤］
本発明は、さらに、ボツリヌス毒素と、上述した本発明のボツリヌス毒素製剤用溶解剤とを混合して得られるボツリヌス毒素製剤（以下「本発明のボツリヌス毒素製剤」という場合がある。）を提供する。
【００３５】
本発明のボツリヌス毒素製剤は、従来のボツリヌス毒素を生理食塩液に溶解したものに比べて、薬効期間の延長が見込まれる。これは、ボツリヌス毒素の細胞内への取込み量が増加し、ボツリヌス毒素の局所滞留性が増大することで、周囲筋肉への拡散が抑制されることによるものであると考えられる。周囲筋肉への拡散が抑制されるので、標的筋肉以外にボツリヌス毒素が作用することがなくなることによって副作用リスクが軽減され、また、治療有効量を局所に滞留させることが可能になるので１回あたりのボツリヌス毒素注入量を減少させることもできる。
【００３６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
［候補化合物の選定］
筋注・静注実績あるポリマーであること、安全に使用可能であること、シリンジによる吸引および注入が可能であることを条件として、表１に示す候補化合物を選定した。
【００３８】
【表１】
2015105261.tif 000002
【００３９】
［スクリーニング例１］
１．サンプル溶液およびリファレンス溶液の準備
（１）候補化合物
ポロキサマーとして、プルロニック F-98（BASF）、プルロニック F-108（BASF）、プロノン #188（日油）およびプロノン #407（日油）を、カルボキシメリルセルロースとして CMC DAICEL（ダイセル）を、ポリエチレングリコールとして PEG 6000（和光純薬株式会社）を、デキストランとして Dextran 70 （名糖産業株式会社）を、ポリソルベートとして Polysorbate 80（日油株式会社）を、ポリビニルピロリドンとして K-30PH （第一工業株式会社）を、それぞれ用いた。
（２）タンパク質（Ａ）
タンパク質（Ａ）として、豚心臓由来乳酸脱水素酵素（オリエンタル酵母；分子量１４０ｋＤａ，等電点６．３７）（以下「ＬＤＨ」という場合がある。）を用いた。
（３）生理食塩水
日本薬局方生理食塩液（テルモ）を用いた。
（４）リファレンス溶液
生理食塩水にＬＤＨの濃度が１．６ｍｇ／Ｌとなるようにタンパク質（Ａ）を溶解して、リファレンス溶液（Ｎｏ．１−０）を作製した。
（５）サンプル溶液
生理食塩水にタンパク質（Ａ）の濃度が１．６ｍｇ／Ｌとなるようにタンパク質（Ａ）を溶解し、さらに、表２に示す候補化合物を表２に示す濃度となるように添加して、サンプル溶液（Ｎｏ．１−１〜１−１２）を作製した。
【００４０】
２．平板状アガロースゲルの準備
アガロース（Agarose L03「TAKARA」，タカラバイオ）をＲＯ水（逆浸透濾過水）に加熱溶解し、０．８ｗ／ｖ％アガロース溶液を調製した。
調製した０．８ｗ／ｖ％アガロース溶液を、テルモシャーレ（ＳＨ−２０Ｓ，テルモ；90φ×20mm）に注入し、固化させて、厚みが５ｍｍの平板状アガロースゲルを作製した。
作製した平板状アガロースゲルに直径４ｍｍの貫通孔を正三角形に配置されるように３個あけた。
【００４１】
３．拡散試験
（１）平板状アガロースゲルにあけた貫通孔に、１つあたり２０μＬのサンプル溶液またはリファレンス溶液を注入した（図１のＡを参照）。各サンプル溶液およびリファレンス溶液につき、３連（ｎ＝３）で行った。すなわち、１つのシャーレを１つのサンプル溶液またはリファレンス溶液で使用した。
（２）サンプル溶液またはリファレンス溶液を注入した平板状アガロースゲルを３７℃で９時間静置した。
（３）静置後、各シャーレについて、クーマジーブリリアントブルー（ＣＢＢ）を用いて、アガロースゲルの染色および脱色をした（図１のＢを参照）。脱色後、画像処理ソフトＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて、ＣＢＢ染色された面積を測定し、ＬＤＨの拡散面積を求めた。
（４）以下の式により、拡散率を算出した。
拡散率（％）＝（サンプル溶液のＬＤＨの拡散面積）／（リファレンス溶液のＬＤＨの拡散面積）×１００ 
各サンプル溶液について、拡散率を表２に示す。
【００４２】
４．表２中、拡散率が９５％以下であるものが本発明のボツリヌス毒素製剤用溶解剤である。なお、プロノン #188を使用したサンプル溶液Ｎｏ．１−５は、ゲル化（gelation）したため、拡散率を算出することができなかった。
【００４３】
【表２】
2015105261.tif 000003
【００４４】
［スクリーニング例２］
生理食塩水に代えてＲＯ水を使用した点を除き、スクリーニング例１と同様にしてリファレンス溶液（Ｎｏ．２−０）およびサンプル溶液（Ｎｏ．２−１〜２−１２）を調製してスクリーニングを行った。
【００４５】
結果を表３に示す。表３中、拡散率が９５％以下であるものが本発明のボツリヌス毒素製剤用溶解剤である。なお、プロノン#188を使用したサンプル溶液Ｎｏ．２−５は、ゲル化（gelation）したため、拡散率を算出することができなかった。
【００４６】
【表３】
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【図１】
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