(57)【要約】      （修正有）【課題】血液由来癌診断用ペプチドマーカー及びそれを用いた癌診断方法を提供する。【解決手段】具体的に肺癌患者の血液から癌発生及び進行による特異的糖鎖を含む糖蛋白質を、レクチンを用いて分離して、レクチンによって分離した糖蛋白質の加水分解から生成されたペプチドを選別して、配列及び定量分析を通じてマーカータンパク質及びマーカーペプチドを選別することによって、前記マーカーペプチドを癌診断用マーカー及び診断方法として有用に用いることができる。【選択図】図１
2015105951.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）被検体から分離した試料にレクチンを処理して糖蛋白質を分離及び濃縮する工程と、
２）工程１）の糖蛋白質を加水分解してポリペプチドを製造する工程と、
３）工程２）のポリペプチドを配列分析または定量分析する工程、及び
４）工程３）の配列分析の結果、配列番号１〜１９のいずれか１つのアミノ酸配列で構成されたポリペプチドが存在する場合、または定量分析結果、分子量が1354.8、1093.7、1014.6、1195.6、1370.8、1369.7、1291.7、1140.6、1026.5、1250.6、1296.7、1115.6、1139.6、1097.6、1183.6、1191.6、1113.6、993.4および979.6からなる群から選択されたいずれか１つを有するポリペプチドが存在する場合、前記被検体が癌に罹る危険性が高いかまたは癌に罹った個体であると判定する工程とを含む、癌診断の情報を提供するためのポリペプチドの配列または定量分析方法。
【請求項２】
工程１）の試料が、細胞、細胞培養液、血液、血清及び血漿からなる群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする、請求項１に記載の癌診断の情報を提供するためのポリペプチドの配列または定量分析方法。
【請求項３】
工程１）のレクチンが、ＣｏｎＡ、ＷＧＡ、Ｊａｃａｌｉｎ、ＳＮＡ、ＡＡＬ、Ｌ−ＰＨＡ、ＰＮＡ、ＬＣＡ、ＡＢＡ、ＤＢＡ、ＤＳＡ、ＥＣＡ、ＳＢＡ、ＳＳＡ、ＵＥＡ、ＶＶＬ及びＢＰＬからなる群から選択されるいずれか１つまたは２つ以上の組み合わせであることを特徴とする、請求項１に記載の癌診断の情報を提供するためのポリペプチドの配列または定量分析方法。
【請求項４】
工程２）の加水分解が、アルギニンＣ（Ａｒｇ−Ｃ）、アスパラギン酸Ｎ（Ａｓｐ−Ｎ）、グルタミン酸Ｃ（Ｇｌｕ−Ｃ）、リジンＣ（Ｌｙｓ−Ｃ）、キモトリプシン及びトリプシンからなる群から選択される酵素を用いることを特徴とする、請求項１に記載の癌診断の情報を提供するためのポリペプチドの配列または定量分析方法。
【請求項５】
工程３）の定量分析の前に、工程２）のポリペプチドに対する抗体を使用して濃縮する工程を追加的に含むことを特徴とする、請求項１に記載の癌診断の情報を提供するためのポリペプチドの配列または定量分析方法。
【請求項６】
工程３）のポリペプチドに対する定量分析は、糖蛋白質ガレクチン−３−結合タンパク質（Galectin-3-binding protein，ＬＧＡＬＳ３ＢＰ）、α１−アンチキモトリプシン（alpha-1-antichymotrypsin，ＳＥＲＰＩＮＡ３）、α１−アンチトリプシン（Alpha-1-antitrypsin，ＳＥＲＰＩＮＡ１）、α２−ＨＳ−糖蛋白質（Alpha-2-HS-glycoprotein，ＡＨＳＧ）、セルロプラスミン（Ceruloplasmin，ＣＰ）、補体Ｃ３（Complement C3，Ｃ３）、フィブロネクチン（Fibronectin，ＦＮ１）、ヘモペキシン（Hemopexin，ＨＰＸ）、カリスタチン（Kallistatin，ＳＥＲＰＩＮＡ４）、キニノゲン−１（Kininogen-1，ＫＮＧ１）、ルミガン（Lumican，ＬＵＭ）、血漿プロテアーゼＣ１抑制剤（Plasma protease C1 inhibitor，ＳＥＲＰＩＮＧ１）、プラスミノーゲン（Plasminogen，ＬＰＡ）、セレノプロテインP（Selenoprotein P，ＳＥＰＰ１）、及び血液パラオクソナーゼ／アリールエステラーゼ１（Serum paraoxonase/arylesterase 1，ＰＯＮ１）、補体因子I(Complement factor Ｉ，ＣＦＩ)、補体Ｃ４（Ｃ４）、α１−酸性糖蛋白及びハプトグロビンからなる群から選択されたいずれか１つ以上のマーカー糖蛋白質の加水分解から遊離されるポリペプチドに対する定量分析を行なうことを特徴とする、請求項１に記載の癌診断の情報を提供するためのポリペプチドの配列または定量分析方法。
【請求項７】
工程３）のポリペプチドに対する配列分析は、糖蛋白質ガレクチン−３−結合タンパク質の加水分解から遊離されるポリペプチドは配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、α１−アンチキモトリプシンの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、α１−アンチトリプシンの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、α２−ＨＳ−糖蛋白質の加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、セルロプラスミンの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、補体Ｃ３の加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、フィブロネクチンの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、ヘモペキシンの加水分解から遊離するポリペプチドは配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、カリスタチンの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、キニノゲン−１の加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、ルミガンの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、血漿プロテアーゼＣ１抑制剤の加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、プラスミノーゲンの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、セレノプロテイン（ＳＥＰＰ１）の加水分解から遊離するポリペプチドは配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、血液パラオクソナーゼ／アリールエステラーゼ１の加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、補体因子Ｉの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１６で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、補体Ｃ４の加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１７で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、α１−酸性糖蛋白の加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ハプトグロビンの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の癌診断の情報を提供するためのポリペプチドの配列または定量分析方法。
【請求項８】
工程３）の配列分析は、シーケンシング、パイロシーケンシング、リアルタイムＰＣＲ、ＮＧＳ(next generation sequencing)からなる群から選択されたいずれか１つの方法で分析することを特徴とする、請求項１に記載の癌診断の情報を提供するためのポリペプチドの配列または定量分析方法。
【請求項９】
工程３）の定量分析は、クロマトグラフィーまたは質量分析機を用いて分析することを特徴とする、請求項１に記載の癌診断の情報を提供するためのポリペプチドの配列または定量分析方法。
【請求項１０】
前記癌が、肝臓癌、大腸癌、胃癌、肺癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌及び膵臓癌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の癌診断の情報を提供するためのポリペプチドの配列または定量分析方法。
【請求項１１】
配列番号１〜１９のいずれか１つのアミノ酸配列で構成されたポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体の組み合わせを含む癌診断用キット。
【請求項１２】
前記癌が、肝臓癌、大腸癌、胃癌、肺癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌及び膵臓癌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の癌診断用キット。
【請求項１３】
配列番号１〜１９のいずれか１つのアミノ酸配列で構成されたポリペプチドに特異的に結合する生体分子が固形基質に集積された癌診断用バイオチップ。
【請求項１４】
前記生体分子が、抗体またはアプタマーであることを特徴とする、請求項１３に記載の癌診断用バイオチップ。
【請求項１５】
前記癌が、肝臓癌、大腸癌、胃癌、肺癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌及び膵臓癌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の癌診断用バイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌発生による正常と異なるグリコシル化(glycosylation)を伴う血液に存在する糖蛋白質を、レクチン(lectin)を用いて分離及び濃縮し、その後、糖蛋白質由来のポリペプチドを選別した後、マーカーペプチドを定量分析することで癌を診断する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質のグリコシル化は、タンパク質の修飾化の中で最も代表的なものの１つである。癌細胞から分泌するか、細胞膜表面に存在する多くの糖蛋白質の場合、癌の発生と進行にしたがって、糖蛋白質の正常と異なる糖鎖化が起きる。多くの疾病の場合、癌遺伝子の正常と異なる信号伝達によって、糖転移酵素と糖分解酵素の正常と異なる作用と関連があることが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
癌細胞で進行するこのような正常と異なる糖質化のパターンには、Ｎ−連結型糖鎖の大きさ及び側鎖数の増加、シアリル化(sialylation)及びフコシル化(fucosylation)の増加、そしてポリラクトサミン(polylactosamine)の形成のような糖鎖の大きさの変化など非常に多様であり、糖蛋白質で進行されるこのような現象を用いれば、癌の存在と進行を確認することができる癌マーカーとして、この糖蛋白質を活用することができる。特に、癌細胞などで正常と異なって増加するフコシル化は、癌細胞に存在するタンパク質が正常細胞のそれらと区別することができる可能性を提供する。したがって、正常と異なる糖質化された糖蛋白質は、癌を診断することができる癌マーカーとして開発することができる。すなわち、糖蛋白質自体ではなく該当のタンパク質の正常と異なってフコシル化された糖蛋白質のグリコフォームなどに対する効果的な分析技術の開発が求められる。このような癌に関する情報を含む糖蛋白質は、必要な役割が終われば細胞外培地に分泌したり、細胞膜から培地に落ちて放出(shed)されたりするので、多様な癌細胞の培養培地、癌細胞組織の溶解物(lysis)、そして特に患者の血液などは、このような癌情報を含む糖蛋白質、すなわち癌マーカー等を検出するための適切な材料になる。
【０００４】
正常群と患者群とのそれぞれから得たタンパク質試料において、タンパク質糖鎖化の差は、患者群を正常群から区別することができる重要な手がかりになり得る。したがって、これらの差を区別するために多くの分析方法が開発されて来た。糖鎖化の差を区別するために、糖蛋白質の糖鎖構造に対するレクチンの選択性を用いて、糖蛋白質または糖ペプチドのみを分離濃縮する方法がある。糖鎖の多様な構造によって、ConA(Concanavalin A)、WGA(Wheat germ agglutinin)、Jacalin、SNA(Sambucus nigra agglutinin)、AAL(Aleuria aurantia lectin)、L-PHA(Phytohemagglutinin-L)、PNA(Peanut agglutinin)、LCA(Lens culimaris agglutinin-A)、ABA(Agaricus biflorus agglutinin)、DBA(Dolichos biflorus agglutinin)、DSA(Datura stramonium agglutinin)、ECA(Erythrina cristagalli agglutinin)、SBA(Soybean agglutinin)、SSA(Sambucus sieboldiana agglutinin)、UEA(Ulex europaeus agglutinin)、VVL(Vicia villosa lectin)、BPL(Bauhinia purpurea lectin)、またはこのようなレクチンを何種類か混合して使用する多重レクチン(multilectin)を用いたりする（非特許文献２、非特許文献３）。この方法は、糖蛋白質の糖鎖構造に対するレクチンの選択性を用いる方法なので、特異糖鎖構造を有する糖蛋白質に対する選択的な分離、濃縮が可能であるという長所がある。特に、レクチンに選択的な糖蛋白質に対する分離過程を通じて、レクチンに対して親和度を示さない多くのタンパク質を除去することで、分析試料の複雑性を大幅に低減することができるという長所もある。分離、濃縮された糖蛋白質は、多様な電気化学的方法、分光化学的方法、及び特に質量分析学的分析方法を用いて、定性及び定量分析を行なうことができる。
【０００５】
広く利用されている方法としては、レクチンの糖蛋白質の糖鎖構造に対する選択性を用いて糖蛋白質を分析するレクチンブロッティング方法が挙げられる。また、この方法は、特定タンパク質に対して高い選択性を示すイムノブロッティング方法とともに使用されるのが一般的である。したがって、抗原糖蛋白質に対する抗体の準備が必ず必要であり、抗体を求めることができないタンパク質の場合は、この方法を用いることが不可能であるという短所がある。また、基本的にゲル−分離技術を使用する該レクチンブロッティング方法は、分析速度及び定量の信頼度などにおいて、多くの限界を示す。最近は、抗体とレクチンを使用するサンドイッチ分析方法を用いることによって、既存のレクチンブロッティング方法に比べて、分析速度及び分析感度を大きく向上させることができるとされる（非特許文献４）。しかし、この場合も、信頼するに値する抗体の確保が必須で、大規模に新たに発掘されているすべての糖蛋白質に対する抗体を迅速に確保することは困難である。
【０００６】
一方、質量分析法は、非常に複雑なプロテオーム試料に対する超高速かつ高感度な定性及び定量分析に、非常に有用な分析法として活用されている。特に多重反応モニタリング質量分析（ＭＲＭ  ＭＳ）方法は、タンパク質の加水分解から生成される相対的に小さな質量を有するポリペプチドを、迅速にそして高い信頼度で定量することができる方法を提供するものであり、特に分析しようとするタンパク質に対する抗体を確保することができない場合は、特に有用な定量分析方法であると言える。ＭＲＭ方法は、分析しようとするターゲットタンパク質から加水分解などによって生成されるターゲットペプチドに対して、一回以上の液体クロマトグラフィーによるペプチドの分離及び二回の質量選択(precursor mass selection and fragment ion selection)による分離を通じて、非常に複雑な試料からもターゲットペプチドを非常に選択的に分析することができる高感度な定量分析法である（非特許文献５）。血漿などの検体におけるのと同様に、高濃度のタンパク質が一緒に存在する検体から、低濃度の微量血漿バイオマーカータンパク質を検出及び定量分析することはとても困難である。したがって、血漿内疾病バイオマーカーを捜し出すためには、検体の複雑性を最小化するために血漿の大部分を占めるアルブミン、イムノグロブリンＧ(IgG)、イムノグロブリンＡ(IgA)、トランスフェリン、ハプトグロビン(haptoglobin)などの高濃度のタンパク質を除去し、残ったタンパク質のみを使用して分析を進行することが好ましい。しかし、このような過程は、必ずしも必要ではない。血漿内高濃度のタンパク質の除去による試料の複雑性の最小化及びＬＣ−ＭＲＭ分析によるターゲットペプチドに対する高い選択性にもかかわらず、検体内のターゲットマーカータンパク質の濃度が極めて低い場合には、抗体の免疫親和性(immunoaffity)によるマーカータンパク質に対する濃縮または加水分解されたマーカーペプチドに対する濃縮工程を遂行することで、癌マーカーに対する検出限界(LOD, Limit of Detection)と定量限界(LOQ, Limit of Qualification)を改善することもできる。しかし、この場合にも該当のマーカータンパク質またはマーカーペプチドに選択的な抗体の開発が必要である。
【０００７】
そこで本発明者らは、癌診断のためのマーカーを捜すために鋭意努力した結果、肺癌患者の血液で癌発生による正常と異なって糖鎖化した糖蛋白質をレクチンを用いて分離及び濃縮し、その後、前記糖蛋白質を加水分解してポリペプチドを獲得した後、配列及び定量を分析して癌特異的糖鎖化を起こすマーカー糖蛋白質由来の加水分解されたマーカーペプチドを選別することで、前記マーカーペプチドを癌診断用マーカー及び癌診断方法に有用に用いることができることを明らかにすることによって、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Orntoft, T.F.; Vestergaard, E. M. Clinical aspects of altered glycosylation of glycoproteins in cancer. Electrophoresis 1999年, 第20巻, p.362-71
【非特許文献２】Yang, Z.ら, J. Chromatogr, A, 2004年, 第1053巻, p.79-88
【非特許文献３】Wang, Y.ら, Glycobiology, 2006年, 第16巻, p.514-523
【非特許文献４】Forrester, S.ら, Low-volume, high-throughput sandwich immunoassays for profiling plasma proteins in mice: identification of early-stage systemic inflammation in a mouse model of intestinal cancer. Mol Oncol, 2007年, 第1(2)巻, p.216-225
【非特許文献５】Anderson L,ら, Mol. Cell Proteomics. 2006年, 第5巻, p.573-588
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、癌発生及び進行によってターゲット糖蛋白質の特異的糖鎖化の定量的変化を追跡することができるマーカーペプチドを用いて癌を診断する方法を提供する。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、本発明によるマーカーペプチドを用いた癌診断用キット及びバイオチップを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は、
１）被検体から分離した試料にレクチンを処理して糖蛋白質を分離及び濃縮する工程と、
２）工程１）の糖蛋白質を加水分解してポリペプチドを製造する工程と、
３）工程２）のポリペプチドを配列分析または定量分析する工程、及び
４）工程３）の配列分析の結果、配列番号１〜１９のいずれか１つのアミノ酸配列で構成されたポリペプチドが存在する場合、または定量分析の結果、分子量が、1354.8、1093.7、1014.6、1195.6、1370.8、1369.7、1291.7、1140.6、1026.5、1250.6、1296.7、1115.6、1139.6、1097.6、1183.6、1191.6、1113.6、993.4および979.6からなる群から選択されたいずれか１つを有するポリペプチドが存在する場合、前記被検体が癌に罹る危険が高いかまたは癌に罹った個体であると判定する工程を含む、癌診断の情報を提供するためのポリペプチドの配列または定量分析方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、配列番号１〜１９のいずれか１つのアミノ酸配列で構成されたポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体の組み合わせを含む癌診断用キットを提供する。
【００１３】
同時に、本発明は、配列番号１〜１９のいずれか１つのアミノ酸配列で構成されたポリペプチド中のいずれか１つ以上に特異的に結合する生体分子(biomolecule)が固形基質に集積された癌診断用バイオチップを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、多くの種類の癌細胞で量的変化を起こす癌特異的構造の糖鎖を有するマーカー糖蛋白質アイソフォームに対する配列分析、または定量分析を行なって効果的に正常群と癌患者群を区別する方法を提供する。本発明は加水分解して生成されたマーカーペプチドに対する定量分析を通じて、癌特異的構造の糖鎖を有するマーカー糖蛋白質アイソフォームの量に対する情報を得ることで、被検体の試料から癌を簡単で速かに診断することができるので、前記選別されたペプチドは癌診断のためのマーカーとして有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、肺癌患者の血液試料及び対照血液試料でガレクチン−３−結合タンパク質(galectin-3-binding protein)由来ポリペプチド中、トリプシン加水分解から生成されたマーカーペプチドＳＤＬＡＶＰＳＥＬＡＬＬＫ（配列番号１）に対するＭＲＭ定量分析を示した図である。
【図２】肺癌患者の血液試料及び対照血液試料の差別性をターゲットペプチドＳＤＬＡＶＰＳＥＬＡＬＬＫ（配列番号１）に対する分析結果を用いて、ＲＯＣ(Receiver Operating Characteristic)カーブを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１７】
本発明は、糖蛋白質の特異的グリコシル化に対する情報を用いて、癌を診断する方法を提供する。
【００１８】
具体的に、本発明は、タンパク質を含む被検体からレクチンを使用して、癌発生と関係ある特異的糖鎖を含む糖蛋白質を分離し、これら分離した糖蛋白質を加水分解してペプチドを獲得し、加水分解して得たペプチド試料から癌発生によって特異的に糖鎖化された糖蛋白質の定量的変化を追跡することができるマーカーペプチドを選別し、選別された１つ以上のペプチドをマーカーに用いて癌を診断する方法を提供する。
【００１９】
本発明の好ましい実施方法では、下記のような工程を含む方法で癌診断のための情報を提供することが好ましいが、これに限定されない：
１）被検体から分離した試料にレクチンを処理して糖蛋白質を分離及び濃縮する工程と、
２）工程１）の糖蛋白質を加水分解してポリペプチドを製造する工程と、
３）工程２）のポリペプチドを配列分析または定量分析する工程、及び
４）工程３）の配列分析の結果、配列番号１〜１９のいずれか１つのアミノ酸配列で構成されたポリペプチドが存在する場合、または定量分析の結果、分子量が1354.8、1093.7、1014.6、1195.6、1370.8、1369.7、1291.7、1140.6、1026.5、1250.6、1296.7、1115.6、1139.6、1097.6、1183.6、1191.6、1113.6、993.4および979.6からなる群から選択されたいずれか１つを有するポリペプチドが存在する場合、前記被検体が癌に罹る危険が高いかまたは癌に罹った個体であると判定する工程を含む、癌診断の情報を提供するためのポリペプチドの配列または定量分析方法。
【００２０】
前記方法において、工程１）の被検体は、癌の存在及び進行状態と係わる情報を含むことができるタンパク質が存在する生物体から得ることができる試料であり、生体組織、生体組織の培養から設定された細胞株または培養液、唾液、血液などを含むことができる。特に、癌に関する情報を含む糖蛋白質は、必要な役割が終われば細胞外培地に分泌されたり細胞膜から培地に落ちて放出されたりするので、特に多様な癌細胞株の培養培地、及び患者の血液などはこのような癌情報を含む糖蛋白質、すなわち癌マーカーを検出するための良い検体になる。血液検体の場合は、血液に存在する構成成分タンパク質間の濃度変化が非常に大きいため、高濃度タンパク質除去用カラム［例えば、ＭＡＲＳ(Multiple Affinity Removal System)］などを使用して試料の複雑性を最小化する前処理を行なうことができる。しかし、このような高濃度のタンパク質を除去する試料前処理過程は、分析しようとするターゲットマーカーの感度及び再現性に問題がなければ、省略することがさらに好ましい。
【００２１】
前記方法において、工程３）のポリペプチドに対する定量分析は、糖蛋白質ガレクチン−３−結合タンパク質（ＬＧＡＬＳ３ＢＰ）、α１−アンチキモトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ３）、α１−アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、α２−ＨＳ−糖蛋白質（ＡＨＳＧ）、セルロプラスミン（Ceruloplasmin，ＣＰ）、補体Ｃ３（Ｃ３）、フィブロネクチン（Fibronectin，ＦＮ１）、ヘモペキシン（Hemopexin，ＨＰＸ）、カリスタチン（Kallistatin，ＳＥＲＰＩＮＡ４）、キニノゲン−１（Kininogen-1，ＫＮＧ１）、ルミガン（Lumican，ＬＵＭ）、血漿プロテアーゼＣ１抑制剤（Plasma protease C1 inhibitor，ＳＥＲＰＩＮＧ１）、プラスミノーゲン（Plasminogen，ＬＰＡ）、セレノプロテインP（Selenoprotein P，ＳＥＰＰ１）、及び血液パラオクソナーゼ／アリールエステラーゼ１（Serum paraoxonase/arylesterase 1，ＰＯＮ１）、補体因子I(Complement factor I，ＣＦＩ)、補体Ｃ４（Ｃ４）、α１−酸性糖蛋白及びハプトグロビンからなる群から選択されたいずれか１つ以上のマーカー糖蛋白質の加水分解から遊離されるポリペプチドに対する定量分析を行なうことが好ましいが、これに限定されない。
【００２２】
前記方法において、工程３）のポリペプチドに対する配列分析は、糖蛋白質ガレクチン−３−結合タンパク質の加水分解から遊離されるポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、α１−アンチキモトリプシンの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、α１−アンチトリプシンの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、α２−ＨＳ−糖蛋白質の加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、セルロプラスミンの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、補体Ｃ３の加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、フィブロネクチンの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、ヘモペキシンの加水分解から遊離するポリペプチドは配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、カリスタチンの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、キニノゲン−１の加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、ルミガンの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、血漿プロテアーゼＣ１抑制剤の加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、プラスミノーゲンの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、セレノプロテイン（ＳＥＰＰ１）の加水分解から遊離するポリペプチドは配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、血液パラオクソナーゼ／アリールエステラーゼ１の加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで、補体因子Ｉの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１６で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、補体Ｃ４の加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１７で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、α１−酸性糖蛋白の加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ハプトグロビンの加水分解から遊離するポリペプチドは、配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。
【００２３】
前記方法において、工程３）の配列分析は、シーケンシング、パイロシーケンシング（pyrosequencing）、リアルタイムＰＣＲ、ＮＧＳ（next generation sequencing）からなる群から選択されたいずれか１つの方法で分析することが好ましいが、これに限定されない。
【００２４】
前記方法において、糖蛋白質の癌発生と関係ある特異的糖鎖というのは、タンパク質の糖鎖化が正常と異なって癌患者及び癌経歴者から起きたことを意味し、このような特異的糖鎖化は、アスパラギン、スレオニンまたはセリン等の糖鎖化位置に連結された糖鎖で起き得る。このような癌と係わり得る特異的構造を有する糖鎖は、正常構造の糖鎖とともにいずれか１つの糖鎖化位置に共有して糖鎖の微小不均一性(glycan microheterogeneity)を示す。したがって、前記の特異的糖鎖はいずれか１つの糖鎖化位置に存在する多くの糖鎖アイソフォーム(glycan-isoform)中の一部としてタンパク質の総量に対して非当量的に少ない量で存在するようになって、特異的糖鎖の定量的変化を信頼性を持って測定するためには、これら特異的糖鎖を他の多様な構造の糖鎖アイソフォームから分離濃縮することが好ましいが、これに限定されない。
【００２５】
前記方法において、糖鎖構造において差を示す多様な糖鎖アイソフォームから、関心ある特異的糖鎖を有するアイソフォームのみを分離濃縮するために、レクチンを使用することができる。この方法は、糖蛋白質の糖鎖構造に対するレクチンの選択性を利用する方法なので、特異糖鎖構造を有するマーカー糖蛋白質に対する選択的な分離、濃縮が可能であるという長所がある。分離濃縮しようとする糖鎖の構造によって、ＣｏｎＡ、ＷＧＡ、Ｊａｃａｌｉｎ、ＳＮＡ、ＡＡＬ、Ｌ−ＰＨＡ、ＰＮＡ、ＬＣＡ、ＡＢＡ、ＤＢＡ、ＤＳＡ、ＥＣＡ、ＳＢＡ、ＳＳＡ、ＵＥＡ、ＶＶＬ、またはＢＰＬ等のような多様な種類のレクチンを単独で、またはそれらを組み合わせて使用することができる。互いに異なる構造の糖鎖アイソフォームを有するタンパク質を選択的に全体被検体から分離するために、多様な種類のレクチンを選択して使用することができる。
【００２６】
前記方法において、多くの種類の癌細胞及び癌患者の血液において増加することが報告されているフコシル化の量的変化を追跡するために、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）を使用してフコース構造の糖鎖を含む糖鎖アイソフォームを分離及び濃縮した。ここで、ＡＡＬに選択的な糖蛋白質に対する分離過程を通じてＡＡＬに対して親和度を示さない多くのタンパク質を除去することで、前記のＭＡＲＳなどを用いた別途の試料前処理過程なしでも、分析試料の複雑性を大きく低めることができる長所もある。
【００２７】
前記方法において、レクチンによって分離した高分子量タンパク質は、分析の効率性を高めるためにより小さな分子量のペプチド切片で加水分解することが好ましい。糖蛋白質を加水分解してペプチドを得る過程は、多様な加水分解酵素を用いる生物学的方法または特定のアミノ酸位置での加水分解を誘導することができる化学試薬を用いる化学的方法などを用いることができる。加水分解酵素は、アルギニンＣ（Ａｒｇ−Ｃ）、アスパラギン酸Ｎ（Ａｓｐ−Ｎ）、グルタミン酸Ｃ（Ｇｌｕ−Ｃ）、リジンＣ（Ｌｙｓ−Ｃ）、キモトリプシン及びトリプシンからなる群から選択されるいずれか１つ以上を用いることが好ましく、トリプシンを用いることがより好ましいが、これに限定されない。本発明ではトリプシンを使用した場合、レクチンによって濃縮されたいずれか１つの糖蛋白質から生成される配列番号１から配列番号１９までのターゲットペプチドを考慮した。しかし、トリプシン以外の他の種類の加水分解酵素（例、アルギニンＣ（Ａｒｇ−Ｃ）、アスパラギン酸Ｎ（Ａｓｐ−Ｎ）、グルタミン酸Ｃ（Ｇｌｕ−Ｃ）、リジンＣ（Ｌｙｓ−Ｃ）、キモトリプシン）を用いる場合、配列番号１から配列番号１９までのターゲットペプチドのアミノ酸配列の一部を含む、同一な糖蛋白質から生成され得る他の配列のペプチドも、当然ターゲットペプチドとして考慮することができる。また、加水分解の効率及び生成されたペプチドに対する分析の効率性のために、一般的に知られた変性、還元、システインアルキレーションなどのような試料前処理過程を、加水分解反応の前に必要によって行なうことができる。したがって、このような試料前処理過程を通じて質量値が変わったシステインを含む、または酸化過程を通じて質量値が変わり得るメチオニンを含むペプチドも、当然ターゲットペプチドとして考慮することができる。
【００２８】
前記方法において、正常群及び患者群から得たそれぞれの加水分解されたペプチド試料を定量的に分析することで、癌発生による特異的に糖鎖化されたマーカー糖蛋白質の定量的変化を追跡することができる。特に多様な癌細胞株の培養培地、及び患者の血液などはこのような癌情報を含む糖蛋白質、すなわち癌マーカーを検出するための良い検体になる。ここで、癌はタンパク質の癌特異的糖鎖化を誘導するすべての種類の癌を含むことができ、肝臓癌、大腸癌、胃癌、肺癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌及び膵臓癌などを含むことが好ましく、肺癌であることが最も好ましい。
【００２９】
前記方法において、肺癌患者の血液で増加するフコシル化糖蛋白質の定量的変化をこの糖蛋白質の代わりに候補マーカーポリペプチドに対する定量的分析を行って検証することによって、本発明のペプチドマーカーで癌を診断する方法を完成した（表１）。
【００３０】
前記方法において、レクチンで濃縮後加水分解して得たペプチド試料から選別されるマーカーペプチドは、１つの糖蛋白質から由来する１つ以上のペプチドで構成され得るし、または互いに異なる糖蛋白質に由来するペプチドを含むことができる（表１）。したがって、選別されたマーカーペプチドは、必要によって２つ以上のペプチドを一緒に検体分析に用いることができる。
【００３１】
本発明において、マーカーペプチドを含む加水分解されたペプチドを定量的に分析する方法では、分析しようとするペプチドに選択的な抗体を用いる免疫沈降または免疫ブロッティング方法と質量分析方法を基にする分析方法を使用することができる。特に、質量分析方法は、分析しようとするペプチドに対する抗体の確保問題において自由なので、分析することができるターゲットペプチドにおいて制限がほとんどないし、超高速及び高感度分析能力も質量分析方法の長所となることができる。同位元素で標識された標識物質を用いてペプチドを標識して定量分析する方法（ｉＴＲＡＱ，ＩＣＡＴ等）または同位元素で標識された標準物質を試料に内部標準物質として添加して定量分析する方法（multiple reaction monitoring，ＭＲＭ）などが用いることができる。
【００３２】
本発明の実施例では、実際に肺癌患者の血液試料及び癌所見がいない人々の血液試料を対象にして、本発明の方法によって表１のペプチドマーカーに対する定量分析を進行した。図１は、本発明の方法によって、臨床的に確認された肺癌患者の血液試料３０個及び臨床的に癌と係わる所見がないと確認された対照血液試料３０個ずつを使用して、表１のガレクチン−３−結合タンパク質（ＬＧＡＬＳ３ＢＰ）由来のマーカーペプチドＳＤＬＡＶＰＳＥＬＡＬＬＫ（配列番号１）に対して３回反復されたＭＲＭ定量質量分析から得た各血液試料でのマーカーペプチドＳＤＬＡＶＰＳＥＬＡＬＬＫ（配列番号１）の定量分析結果である。分析された全６０個の試料に対する分析値を、対照血液試料（３０個）から得た平均値で標準化して、box-and-whisker plotで示した。３０人の肺癌患者でのマーカーペプチドの平均水準が、３０人の対照血液試料の平均に比べて２．２倍高いことを確認することができる。
【００３３】
図２は、前記図１で使用された肺癌血液試料３０個と対照血液試料３０個間の差別性をＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線で分析した例である。ＡＵＲＯＣ（area under ＲＯＣ）＝０．８５６の値で、７０％の感度で９３．３％のマーカー特異性を示している。このような結果から、本発明のガレクチン−３−結合タンパク質由来のマーカーペプチドＳＤＬＡＶＰＳＥＬＡＬＬＫ（配列番号１）を用いれば、血液検体に対する分析から正常人と肺癌患者を区別することができることを確認した（図２参照）。
【００３４】
また、ペプチドマーカーを用いる本発明の方法において、開発されたマーカー糖蛋白質に対する信頼度は、同一なマーカー糖蛋白質から加水分解過程を通じて一緒に生成され得る１つ以上の他のマーカーペプチドを組み合わせて一緒に定量質量分析に使用すれば、その信頼性はもっと高くなり得ることは当然である。さらに、前記ガレクチン−３−結合タンパク質由来のマーカーペプチド製造過程を通じて、血液試料内の他の糖蛋白質、α１−アンチキモトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ３）、α１−アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、α２−ＨＳ−糖蛋白質（ＡＨＳＧ）、セルロプラスミン（ＣＰ）、補体Ｃ３（Ｃ３）、フィブロネクチン（ＦＮ１）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、カリスタチン（ＳＥＲＰＩＮＡ４）、キニノゲン−１（ＫＮＧ１）、ルミガン（ＬＵＭ）、血漿プロテアーゼＣ１抑制剤（ＳＥＲＰＩＮＧ１）、プラスミノーゲン（ＬＰＡ）、セレノプロテインP（ＳＥＰＰ１）、及び血液パラオクソナーゼ／アリールエステラーゼ１（ＰＯＮ１）、補体因子I(Complement factor Ｉ，ＣＦＩ)、補体Ｃ４（Ｃ４）、α１−酸性糖蛋白及びハプトグロビンから一緒に生成されるポリペプチドに対するＭＲＭ定量分析も一緒に行なった（表１）。その結果、表２に見られるように、一緒に分析が遂行されたこれらの糖蛋白質に由来したポリペプチドも、対照群の検体から肺癌検体を区別することができるマーカーペプチドになることができることを確認した（表２参照）。
【００３５】
したがって、本発明によって発掘されたマーカーペプチドを用いれば、血液検体に対する分析から正常人と肺癌患者を区別することができることが分かる。また、本発明のマーカー糖蛋白質に対する信頼度は、同一なマーカー糖蛋白質から加水分解されて生成され得る本発明によるマーカーペプチド中の１つ以上、または癌進行による異常なな糖質化を起こした他の糖蛋白質から加水分解して生成することができる本発明によるマーカーペプチド中の１つ以上を組み合わせて一緒に定量質量分析に用いることで、その信頼度をさらに高めることができることが分かる。
【００３６】
また、本発明は配列番号１〜１９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体、または抗体の組み合わせを含む癌診断用キットを提供する。
【００３７】
前記癌は、肝臓癌、大腸癌、胃癌、肺癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌及び膵臓癌からなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されない。
【００３８】
前記キットは、被検体の試料から加水分解酵素処理の結果生成されたマーカーペプチドに対する定量的変化を検出することによって、被検体が癌に罹ったかどうかを区別して癌をモニタリング、診断またはスクリーニングすることを可能にする。
【００３９】
前記ポリペプチド、またはそれらそれぞれの同位元素で標識されたペプチドは、標準物質として前記キットに追加で含むことができる。
【００４０】
前記キットに使用され得る抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びエピトープと結合することができる断片などを含む。前記ポリクローナル抗体は、前記ペプチドマーカー中のいずれか１つを動物に注射して該当の動物から採血して抗体を含む血清を得る従来の方法によって生産することができる。このようなポリクローナル抗体は、当業界に知られたどのような方法によっても精製することができ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、サル、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ等の任意の動物種宿主から作ることができる。前記モノクローナル抗体は、連続細胞株の培養を通じた抗体分子の生成を提供するどのような技術を使用しても製造することができる。そのような技術としては、これらに限定されるのではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれる（Kohler G ら, Nature, 1975年, 第256巻, p.495-497; Kozbor Dら, J Immunol Methods, 1985年, 第81巻, p.31-42; Cote RJら, Proc Natl Acad Sci, 1983年, 第80巻, p.2026-2030;及びCole SPら, Mol Cell Biol, 1984年, 第62巻, p.109-120）。また、前記ペプチドマーカー中のいずれか１つに対する特定結合部位を含んだ抗体断片を製造することができる（Huse WDら, Science, 1989年, 第254巻, p.1275-1281）。前記のように特定配列を有するペプチドに対する抗体を製造する方法は、当業者に自明なことである。
【００４１】
前記キットに使用できる抗体は、洗浄や複合体の分離などその後の工程を容易にするために、固形基質に結合することができる。前記固形基質は、例えば合成樹脂、ニトロセルロース、ガラス基板、金属基板、ガラス繊維、微細球体及び微細ビーズなどを使用することができるが、これに限定されない。前記合成樹脂ではポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ＰＶＤＦ及びナイロンなどを使用することができるが、これに限定されない。
【００４２】
前記キットは、被検体から得た試料を固形基質に結合された前記ペプチドマーカー中のいずれか１つに特異的に結合することができる抗体と接触させる場合、試料は抗体と接触前に適当な程度に希釈することができる。
【００４３】
前記キットは、被検体から得た試料を固形基質に結合された前記ペプチドマーカー中のいずれか１つに特異的に結合することができる抗体と接触させた後、追加的に抗体に結合しないタンパク質などは洗浄除去してマーカーペプチドを検出することができる。
【００４４】
前記キットは、追加的に前記ペプチドマーカーに特異的に結合する検出用抗体を含むことができる。前記検出用抗体は、発色酵素、蛍光物質、放射性同位元素またはコロイド等の検出体で標識した接合体であり得、前記マーカーに特異的に結合することができる２次抗体であることが好ましいが、これに限定されない。前記発色酵素は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは酸性ホスファターゼ（例：西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得るが、これに限定されない。前記蛍光物質は、フルオレセインカルボン酸（ＦＣＡ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオウレア（ＦＴＨ）、７−アセトキシクマリン−３−イル、フルオレセイン−５−イル、フルオレセイン−６−イル、２’，７’−ジクロロフルオレセイン−５−イル、２’，７’−ジクロロフルオレセイン−６−イル、ジヒドロテトラメチルロダミン−４−イル、テトラメチルロダミン−５−イル、テトラメチルロダミン−６−イル、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−エチルまたは４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−エチルであり得るが、これに限定されない。
【００４５】
本発明において、前記キットは追加的に酵素と発色反応する基質及び結合されないタンパク質などは除去して、結合されたペプチドマーカーのみを保有することができる洗浄液または溶離液を追加で含むことができる。
【００４６】
また、本発明は、配列番号１〜１９のいずれか１つのアミノ酸配列で構成されたポリペプチドに特異的に結合する生体分子が固形基質に集積された癌診断用バイオチップを提供する。
【００４７】
前記配列番号１〜１９のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドは、安定同位元素で標識されたポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。
【００４８】
前記癌は、肝臓癌、大腸癌、胃癌、肺癌、子宮癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌及び膵臓癌からなる群から選択されることが好ましく、肺癌であることがより好ましいがこれに限定されない。
【００４９】
前記バイオチップは、被検体の試料から加水分解酵素処理後、得たマーカーペプチドの定量的変化を検出することで、被検体が癌にかかっているかどうかを区別して癌をモニタリング、診断及びスクリーニングすることができるようにする。
【００５０】
前記生体分子は、抗体またはアプタマーであることが好ましいが、これに限定されない。前記生体分子は１次代謝物質、２次代謝物質及び天然物質などの小さな分子だけではなく、タンパク質、多糖類及び核酸のような巨大重合分子を含む、生きている有機体によって生産される有機分子を意味する。前記アプタマーは、特異的標的分子に結合するオリゴヌクレオチドまたはペプチドを意味する。
【００５１】
前記固形基質は、プラスチック、ガラス、金属及びシリコンからなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されない。
【００５２】
以下、本発明の実施例によって詳しく説明する。
【００５３】
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるのではない。
【００５４】
＜実施例１＞試料の製造
臨床的に確認された肺癌患者の血液試料３０個及び臨床的に癌と係わる所見がないことが確認された対照血液試料(human plasma)３０個ずつを準備した。フコース糖鎖を有する糖蛋白質に対して特異的親和度を示すＡＡＬ(ヒイロチャワンタケレクチン)レクチンを使用して同一量の血液からＡＡＬ−レクチン特異的タンパク質試料を分離して、分離した試料を加水分解して各血液検体に対するポリペプチド試料物質を確保した。ここで、レクチンを固定するための支持体として、アガロースビーズ及び磁性ビーズ(magnetic bead)などを含んで多様な種類の支持体を活用することができる。本臨床血液試料の分析では、レクチンを固定するためにストレプトアビジン−磁性ビーズ(streptvidin-magnetic beads)を使用した。すなわち、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）下で、肺癌群と正常対照群の血液試料それぞれをＡＡＬ−ビオチン−ストレプトアビジン−磁性ビーズ(AAL-biotin-streptavidin-magnetic beads)に加えて、４℃で１２時間放置した。レクチンと結合されたタンパク質を、ＰＢＳ緩衝溶液を用いて３回洗浄した後、２Ｍウレア(urea)／ジチオスレイトール（ＤＤＴ）溶液を使用してレクチンに結合したタンパク質を引き離した。獲得したタンパク質をヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で処理して、５０ｍＭ炭化水素アンモニウム(ammonium bicarbonate)を使用して薄めた後、トリプシンを使用して３７℃、一晩中加水分解させた。前記加水分解したペプチドは、減圧乾燥させた。
【００５５】
＜実施例２＞ペプチド分析によるマーカーポリペプチドの配列分析
前記＜実施例１＞の試料製造過程で製造された試料を分析するために、質量分析及び配列分析を行った。
【００５６】
具体的に、ＨＰＬＣ(high-performance liquid chromatography)を使用（trap column，Ｃ１８，５μｍ，３００Ｘ５ｍｍとanalytical column，Ｃ１８，５μｍ、７５μｍＸ１０ｃｍ）して、これを直ちに電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析機に連結して、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを遂行した。前記＜実施例１＞に記載した方法で獲得した、レクチンによって濃縮された試料蛋白体をトリプシン加水分解して準備したペプチド試料一部を１０倍希薄して質量分析機が連結された液体クロマトグラフィーに１０μｌずつ注入して分析を行なった。その次に、質量分析結果を基に、ＭＡＳＣＯＴ、ＳＥＱＵＥＳＴなどの検索エンジンを通じて使用したＡＡＬ−レクチンによって濃縮されるターゲット糖蛋白質の加水分解ポリペプチドを確認した。ターゲット糖蛋白質由来の加水分解されたポリペプチドを代理にして、これらに対するＭＲＭ  ＭＳ方法による定量分析を通じて、これらターゲット糖蛋白質が癌マーカーとして活用可能かどうか検証した。
【００５７】
下記の［表１］は、本発明で選別されたターゲット糖蛋白質のトリプシン加水分解を通じて生成されるペプチドの中から代表的に選択したターゲットポリペプチドである。理論的にトリプシン以外の他の加水分解酵素（例えば、アルギニンＣ（Ａｒｇ−Ｃ）、アスパラギン酸Ｎ（Ａｓｐ−Ｎ）、グルタミン酸Ｃ（Ｇｌｕ−Ｃ）、リジンＣ（Ｌｙｓ−Ｃ）、キモトリプシンなどの加水分解酵素）によって、前記の同一糖蛋白質から生成されるペプチドを使用してターゲットマーカーポリペプチドパネルを構成することも当然可能である。
【００５８】
【表１】
2015105951.tif 000003
【００５９】
前記の［表１］に含まれているガレクチン−３−結合タンパク質由来のマーカーペプチドＳＤＬＡＶＰＳＥＬＡＬＬＫ（配列番号１）以外にも、この同一糖蛋白質から加水分解によって生成され得る他のペプチドも、２つ以上を組み合わせて一緒に用いてマーカー糖蛋白質ガレクチン−３−結合タンパク質の代理者として使用することができることは自明である。また、ガレクチン−３−結合タンパク質由来のマーカーペプチドは、同一検体内に存在する互いに異なるターゲット糖蛋白質由来のポリペプチドとも一緒に組み合わせて癌診断のために用いることができる。
【００６０】
＜実施例３＞質量分析を用いたマーカーポリペプチドに対する定量分析
前記＜実施例１＞の試料製造過程で製造された試料を分析するために、前記［表１］のマーカーポリペプチドの配列を有する同位元素で標識された標準物質を製造した。この製造された標準物質を、前記＜実施例１＞の試料製造過程で製造されたそれぞれのペプチド試料に同一量添加して定量分析のための内部標準物質とし、それぞれの試料に対するＬＣ／ＭＲＭ定量質量分析を３回繰り返して行なった。
【００６１】
ここで、血液内で標的ポリペプチドが非常に低い濃度で存在する場合、または標的ポリペプチドの分析が試料内に共存する他のペプチドによって干渉を受ける場合、製造されたペプチド試料から標的マーカーペプチドを前記のＭＲＭ定量分析方法によって、すぐに検出することができないことがある。したがって、その場合には標的マーカーペプチドに選択的なペプチド抗体を製作して、それを使用して、各製造されたペプチド試料から標的マーカーペプチドを濃縮して定量分析を行なった。ここで、使用しようとするポリまたは単一クローンペプチド抗体は、実験上の便利性のために、ポリマー性固形体または磁気性固形体などに直接固定化させて用いるか、アビジン−ビオチンリンカーなどを使用して固定させて使用した。
【００６２】
全６０個の血液検体に対する分析から得たガレクチン−３−結合タンパク質由来のマーカーペプチドＳＤＬＡＶＰＳＥＬＡＬＬＫ（配列番号１）に対する定量分析値を、対照検体（３０個）から得た平均値で定量化して、box-and-whisker plotを使用して示した。３０人の肺癌患者でのマーカーペプチドの平均水準が、３０人の対照血液試料の平均に比べて２．２倍高いことを確認した（図１）。
【００６３】
図２は、肺癌血液試料３０個と対照血液試料３０個間の差別性をターゲットペプチドＳＤＬＡＶＰＳＥＬＡＬＬＫ（配列番号１）に対する分析結果を用いて、ＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線で示した図である。ここで、ＡＵＲＯＣ値格は０．８５６、Ｐ−値は＜０．０００１の値を示した。
【００６４】
また、ガレクチン−３−結合タンパク質由来のポリペプチド試料を製造する過程で、血液試料内の他の糖蛋白質、α１−アンチキモトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ３）、α１−アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、α２−ＨＳ−糖蛋白質（ＡＨＳＧ）、セルロプラスミン（ＣＰ）、補体Ｃ３（Ｃ３）、フィブロネクチン（ＦＮ１）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、カリスタチン（ＳＥＲＰＩＮＡ４）、キニノゲン−１（ＫＮＧ１）、ルミガン（ＬＵＭ）、血漿プロテアーゼＣ１抑制剤（ＳＥＲＰＩＮＧ１）、プラスミノーゲン（ＬＰＡ）、セレノプロテインP（ＳＥＰＰ１）、及び血液パラオクソナーゼ／アリールエステラーゼ１（ＰＯＮ１）、補体因子I(Complement factor Ｉ，ＣＦＩ)、補体Ｃ４（Ｃ４）、α１−酸性糖蛋白及びハプトグロビンから一緒に生成される表１のマーカーポリペプチドに対して、追加的に一緒にＭＲＭ定量分析を行なった結果を下記の［表２］に要約した。
【００６５】
【表２】
2015105951.tif 000004
【００６６】
これらターゲットペプチドも、肺癌群と対照群間に差異を示している。したがって、当然前記の糖蛋白質から加水分解過程を通じて一緒に生成されたマーカーターゲットペチドも代表的に使用された前記のガレクチン−３−結合タンパク質由来のポリペプチドと同じく肺癌に対するマーカーペプチドになり得ることは自明である。したがって、これらマーカーポリペプチドをガレクチン−３−結合タンパク質由来のマーカーポリペプチドＳＤＬＡＶＰＳＥＬＡＬＬＫ（配列番号１）とともに分析する場合、癌診断のためのより信頼度の高い情報を得ることができる。
【図１】
2015105951.tif 000005
【図２】
2015105951.tif 000006
【配列表】
2015105951000001.app