(57)【要約】【課題】骨減少性疾患の治療および予防のための自然界起源の安全な化合物を提供する。【解決手段】びわの葉から抽出されるトリテルペノイドのうち、破骨細胞分化抑制能力が高く、刺激活性が小さく、かつ、細胞毒性が小さい、ウルソル酸、マスリン酸メチル、コロソリン酸メチル、マスリン酸、コロソリン酸、ポモル酸、トルメン酸、オイスカフ酸などの化合物を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウルソル酸、マスリン酸メチル、コロソリン酸メチル、マスリン酸、コロソリン酸、ポモル酸、トルメン酸、オイスカフ酸、3-オキソウルス-12-エン-28-オイック酸、ヒプタジエニック酸、3-O-トランス-p-クマロイルトルメンチック酸、3-O-シス-p-クマロイルトルメンチック酸、下記式で表される化合物
【化５】
2015178480.tif 000011
［式中、Ｒ１はβ−ＯＨ、Ｒ２はＨ、Ｒ３はＨ、Ｒ４はＣＯＯＣＨである。］、
または、下記式で表される化合物
【化６】
2015178480.tif 000012
［式中、Ｒ１はＯＡｃ、Ｒ２はＨ、Ｒ３はＣＯＯＨである。］、
からなる群から選択される化合物、またはその医薬的に許容され得る塩、溶媒和物または水和物を含む骨減少性疾患改善剤。
【請求項２】
びわ葉から抽出されるびわ抽出物を製造するびわ抽出物製造方法において、
中間抽出物を抽出する中間工程と、
前記中間抽出物から、3-エピコロソリック酸、6b,19-ジヒドロキシ-3-オキソウルス-12-エン-28-オイック酸、ウルソール酸メチルエステルおよびアセチルオレアノール酸、からなる群から選択される化合物のうち少なくとも１つの濃度を低減させる工程と、
を含むびわ抽出物製造方法。
【請求項３】
前記中間抽出物は、ウルソル酸、マスリン酸メチル、コロソリン酸メチル、マスリン酸、コロソリン酸、ポモル酸、トルメン酸、オイスカフ酸、3-オキソウルス-12-エン-28-オイック酸、ヒプタジエニック酸、3-O-トランス-p-クマロイルトルメンチック酸、3-O-シス-p-クマロイルトルメンチック酸、下記式で表される化合物
【化５】
2015178480.tif 000013
［式中、Ｒ１はβ−ＯＨ、Ｒ２はＨ、Ｒ３はＨ、Ｒ４はＣＯＯＣＨである。］、
および、下記式で表される化合物
【化６】
2015178480.tif 000014
［式中、Ｒ１はＯＡｃ、Ｒ２はＨ、Ｒ３はＣＯＯＨである。］、
からなる群から選択されるトリテルペノイドのうち少なくとも１つを含有する、びわ抽出物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨減少性疾患状態を治療するための骨減少性疾患改善剤およびびわ抽出物製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗しょう症は世界中で多くの人に影響を与える健康上の問題となってきている。骨粗しょう症は、高齢の女性の閉経後の卵巣ホルモン欠乏に起因した健康問題であり、女性の加齢に伴う骨損失の要因である。
【０００３】
骨吸収と骨生成とのバランスによって、骨リモデリングと呼ばれるプロセスにおいて骨ホメオスタシスが維持されている。骨の形成は、像骨細胞の増加、アルカリ性ホスファターゼ活性、コラーゲン合成、および、骨の石灰化に関連している。骨吸収は、破骨細胞の形成および酒石酸抵抗性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の活性に関連している。造骨細胞による骨生成よりも多い骨吸収は、骨粗しょう症やリウマチ性関節炎などの骨減少性疾患を引き起こす場合が多い。
【０００４】
破骨細胞の生成は、複数のステージを経ながら進行する。これらのステージは、分化、融合、および、活性化（成熟化）であり、骨を取り巻く微細環境におけるサイトカイン、ホルモンおよび他の細胞などの様々な因子によって制御される。近年、NF-κB活性受容体 (RANK)、それの配位子（RANKL）およびデコイ受容体オステオプロテジェリン（OPG）が、破骨細胞生成過程の主要制御因子であることが明らかになってきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Rollinger, J. M.、外９名、"11β-Hydroxysteroiddehydrogenase 1 inhibiting constituents from Eriobotrya japonica revealed bybioactivity-guided isolation and computational approaches"、Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 1507-1515.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ホルモン補充療法（HRT）は、骨減少を抑制し、骨吸収と骨生成の速度を回復させる治療方法である。しかし、長期間にわたるHRTは、患者の乳癌、子宮内膜癌、血栓塞栓、膣出血などを引き起こすリスクを増大させる可能性がある。
【０００７】
また、ビスホスホネート（アレンドロン酸、イバンドロン酸、リセドロン酸、ゾレドロン酸）は、現在、最も重要なクラスの骨吸収抑制剤として代謝性骨疾患の治療に用いられている。しかし、ビスホスホネートは、消化管（GI）からあまり吸収されず、また、消化管に悪影響を与える。
【０００８】
そこで、本発明は、骨減少性疾患の治療および予防のための自然界起源の安全な化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述の目的を達成するため、本発明は、骨減少性疾患改善剤において、ウルソル酸、マスリン酸メチル、コロソリン酸メチル、マスリン酸、コロソリン酸、ポモル酸、トルメン酸、オイスカフ酸、3-オキソウルス-12-エン-28-オイック酸、ヒプタジエニック酸、3-O-トランス-p-クマロイルトルメンチック酸、3-O-シス-p-クマロイルトルメンチック酸、下記式で表される化合物
【００１０】
【化１】
2015178480.tif 000002
［式中、Ｒ１はβ−ＯＨ、Ｒ２はＨ、Ｒ３はＨ、Ｒ４はＣＯＯＣＨである。］、
または、下記式で表される化合物
【００１１】
【化２】
2015178480.tif 000003
［式中、Ｒ１はＯＡｃ、Ｒ２はＨ、Ｒ３はＣＯＯＨである。］、からなる群から選択される化合物、またはその医薬的に許容され得る塩、溶媒和物または水和物を含むことを特徴とする。
【００１２】
また、本発明は、びわ葉から抽出されるびわ抽出物を製造するびわ抽出物製造方法において、中間抽出物を抽出する中間工程と、前記中間抽出物から、3-エピコロソリック酸、6b,19-ジヒドロキシ-3-オキソウルス-12-エン-28-オイック酸、ウルソール酸メチルエステルおよびアセチルオレアノール酸、からなる群から選択される化合物のうち少なくとも１つの濃度を低減させる工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、骨減少性疾患の治療および予防のための自然界起源の安全な化合物を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に係る骨減少性疾患状態を治療するための薬剤およびびわ抽出物を製造する方法の一実施の形態を、説明する。なお、この実施の形態は単なる例示であり、本発明はこれに限定されない。
【００１５】
びわは、loquat, Eriobotrya japonicaとして知られるバラ科の顕花植物である。びわの葉は、糖尿病患者治療に効果がある伝統的漢方薬として知られている。また、日本国内でも、びわの葉は、びわ茶として飲用されている。びわは、数多くの化学薬理学研究によって、肥満抑制、腫瘍抑制、炎症抑制作用などが確かめられている。そこで、びわの葉の骨粗しょう症に対する効用を調べた。
【００１６】
実験により、卵巣摘出したマウスに対するびわの葉の食餌は、骨密度（BMD）減少を抑制する可能性があることが分かった。さらに、びわ（Eriobotrya  japonica）の葉に含有されるトリテルペノイド（triterpenoid）の破骨細胞の抑制活性を調べた。
【００１７】
ここでは、びわの葉から単離した１０種類の化合物、４種類の合成誘導体、および、非特許文献１においてびわの葉から単離されたと報告された８種類のトリテルペノイドについて、多核巨細胞化した破骨細胞の発現濃度を評価した。この破骨細胞の発現濃度は、これらの化合物の酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（TRAP）活性に対する効果を判定することにより行った。
【００１８】
びわの葉から単離した１０種類の化合物とは、（１）ウルソル酸（ursolic  acid）、 （２）オレアノール酸（oleanolic acid）、（３）ウバオール（uvaol）、（４）ベツリン酸（betulinic acid）、（５）マスリン酸メチル（methyl maslinate）、（６）コロソリン酸メチル（methyl-corosolate）、（１０）ポモル酸（pomolic acid）、（１５）2α,19α-ジヒドロキシ-3-オキソ-12-ウルセン-28-オイック酸（2α,19α-dihydroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic acid）、（１７）3-O-trans-p-クマロイルトルメンチック酸メチルエステル（methyl 3-O-trans-p-coumaroyltormentic acid）、（１８）3-O-cis-p-クマロイルトルメンチック酸メチルエステル（methyl 3-O-cis-p-coumaroyltormentic  acid）、である。ここで、括弧で閉じた数字は、参照用の化合物番号である。たとえば、以下で化合物１と表現した場合、ウルソル酸を示す。これらの化合物の構造は、マススペクトロメトリー、一次元および二次元核磁気共鳴、旋光、および、文献データとの比較により同定した。
【００１９】
オレアノール型およびウルサン型のトリテルペノイドのＣ−３あるいはＣ−２８の変性に対する生物学的および薬理学的な活性を調べるため、ウルソル酸およびオレアノール酸のメチルエステルおよびアセチル化誘導体を合成した。これらの４種類の化合物を、それぞれ化合物１９、化合物２０、化合物２１および化合物２２とした。
【００２０】
非特許文献１においてびわの葉から単離されたと報告された８種類のトリテルペノイドとは、（７）マスリン酸（maslinc acid）、（８）コロソリン酸（corosolic acid）、（９）3-epicorosolic acid、（１１）トルメン酸（tormentic acid）、（１２）オイスカフ酸（euscaphic acid）、（１３）3-オキソウルス-12-エン-28-オイック酸（3-oxours-12-en-28-oic  acid）、（１４）6β,19-ジヒドロキシ-3-オキソウルソ-12-エン-28-オイック酸（6β,19-dihydroxy-3-oxours-12-en-28-oic  acid）、（１６）ヒプタジエニック酸（hyptadienic acid）、である。ここで、括弧で閉じた数字は、参照用の化合物番号である。たとえば、以下で化合物７と表現した場合、マスリン酸を示す。
【００２１】
これらの化合物の化学式を以下に示す。
【００２２】
化合物１、３、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０は、ウルサン型のトリテルペノイドであり、次の化学式で表される。
【００２３】
【化３】
2015178480.tif 000004
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、および、Ｒ４は、化合物ごとに異なり、それぞれ表１に示す通りである。
【００２４】
【表１】
2015178480.tif 000005
【００２５】
化合物２、５、７、２１、２２は、オレアノール型のトリテルペノイドであり、次の化学式で表される。
【００２６】
【化４】
2015178480.tif 000006
ここで、Ｒ１、Ｒ２、および、Ｒ３は、化合物ごとに異なり、それぞれ表２に示す通りである。
【００２７】
【表２】
2015178480.tif 000007
化合物４は、次式で表される。
【００２８】
【化５】
2015178480.tif 000008
【００２９】
化合物１６は、次式で表される。
【００３０】
【化６】
2015178480.tif 000009
【００３１】
化合物１〜２２の全てのトリテルペノイドについて、巨核化した破骨細胞の発現に対する抑制活性を調べた。破骨細胞の分化におけるＩＣ５０の評価結果を表３に示した。表３において、Ｌは巨核化細胞の抑制活性が１０％未満であることを示し、Ｓは刺激活性が現れたことを示す。刺激活性が現れたとは、破骨細胞分化が促進されたという意味である。ここで、ＩＣ５０とは、それぞれの化合物が破骨細胞分化を５０％に抑制する濃度、すなわち５０％阻害濃度である。つまり、化合物の濃度がＩＣ５０で表される濃度のとき、破骨細胞の分化が５０％となる。
【００３２】
また、表３において、細胞生存性（ＩＣ５０ｃｅｌｌ  ｖｉａｖｉｌｉｔｙ）に対する破骨細胞分化抑制能力（ＩＣ５０）の比（ＩＣ５０／ＩＣ５０ｃｅｌｌ  ｖｉａｖｉｌｉｔｙ）も併せて示した。細胞生存性（ＩＣ５０ｃｅｌｌ  ｖｉａｖｉｌｉｔｙ）とは、５０％の破骨細胞が死滅する化合物濃度である。したがって、ＩＣ５０／ＩＣ５０ｃｅｌｌ  ｖｉａｖｉｌｉｔｙは、それぞれの化合物の細胞毒性の影響を考慮した破骨細胞分化抑制能力を表している。ＩＣ５０／ＩＣ５０ｃｅｌｌ  ｖｉａｖｉｌｉｔｙが１より小さければ、その化合物は破骨細胞をあまり死滅させずに破骨細胞分化を抑制することができる。
【００３３】
表３において、Ｓは高い刺激活性が現れたものを示していて、Ｌは溶解度の制限のためＩＣ５０が評価できなかったものを示している。
【００３４】
【表３】
2015178480.tif 000010
表３に示すように、化合物１、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２２は、ＩＣ５０／ＩＣ５０ｃｅｌｌ  ｖｉａｖｉｌｉｔｙが１より小さく、破骨細胞をあまり死滅させずに破骨細胞分化を抑制することができる。特に、化合物１、５、７、８、１０、１７、１８、１９、２２は、ＩＣ５０／ＩＣ５０ｃｅｌｌ  ｖｉａｖｉｌｉｔｙが小さく、他の１０種類の化合物に比べて破骨細胞分化抑制効果が高く、細胞毒性が小さい。つまり、これらの化合物は、骨減少性疾患の治療および予防のための自然界起源の安全な化合物である。あるいは、これらの化合物の医薬的に許容され得る塩、溶媒和物または水和物であっても、骨減少性疾患の治療および予防のための自然界起源の安全な化合物、すなわち骨減少性疾患改善剤である。
【００３５】
一方、化合物２１は、ＩＣ５０／ＩＣ５０ｃｅｌｌ  ｖｉａｖｉｌｉｔｙが１より大きい。つまり、破骨細胞が分化するよりも破骨細胞が死滅する割合が大きくなる。このため、化合物２１は、破骨細胞の生成が適切に進行させない可能性があり、好ましくない。
【００３６】
また、表３に示すように、化合物９、１４、１５は、高い刺激活性を示した。つまり、これらの化合物は、破骨細胞分化を促進させる。このため、これらの化合物は、骨吸収を促進させる可能性があり、好ましくない。
【００３７】
表３に示すように、化合物２、３、４、２０は、溶解度制限のため破骨細胞分化に対するＩＣ５０が計算できない程度に、破骨細胞分化抑制能力が低い。したがって、破骨細胞分化抑制にあまり寄与しない。
【００３８】
そこで、びわ葉からびわ抽出物を製造する場合には、化合物２、３、４、２０の少なくとも１つの成分の濃度を低減させる工程を施すことが好ましい。これにより、化合物２、３、４、２０の少なくとも１つの成分の濃度が低減し、骨吸収が促進する可能性が低減する。たとえば、中間工程で複数のトリテルペノイドを抽出した中間抽出物を生成し、その後、その中間抽出物から化合物２、３、４、２０の少なくとも１つの成分の濃度を低減させて、びわ抽出物を製造すればよい。好ましくは、中間工程は、化合物１、５、７、８、１０、１７、１８、１９、２２の少なくとも１つを含む中間抽出物を抽出するものである。これにより、得られるびわ抽出物は、骨減少性疾患の治療および予防のための自然界起源の安全な化合物となる。