(57)【要約】【課題】細胞又は組織の石灰化を迅速かつ簡便に誘導できる培養方法を提供する。【解決手段】水溶性ポリマーが溶解した水溶液中に細胞又は組織を投入し、次いで該水溶液をゲル化させてヤング率が１〜１００ｋＰａのハイドロゲルからなる固体培地中に該細胞又は組織を封入してから、該細胞又は組織における石灰化を誘導することを特徴とする、細胞又は組織の培養方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性ポリマーが溶解した水溶液中に細胞又は組織を投入し、次いで該水溶液をゲル化させてヤング率が１〜１００ｋＰａのハイドロゲルからなる固体培地中に該細胞又は組織を封入してから、該細胞又は組織における石灰化を誘導することを特徴とする、細胞又は組織の培養方法。
【請求項２】
前記水溶性ポリマーが、天然高分子化合物である請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記細胞又は組織が封入された固体培地を培養液中に浮遊させて石灰化を誘導する請求項１又は２に記載の培養方法。
【請求項４】
前記固体培地中に０．１ｍｍ以上の寸法の組織を封入してから、該組織における石灰化を誘導する請求項１〜３のいずれかに記載の培養方法。
【請求項５】
前記固体培地中に骨組織、軟骨組織、腱組織又は歯組織を封入してから、これらの組織における石灰化を誘導する請求項１〜４のいずれかに記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞又は組織における石灰化を誘導する、細胞又は組織の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨や歯などの硬組織の発生・成長メカニズムの理解や、血管などにおける異所性石灰化メカニズムの理解のために、in vitroでの細胞培養や組織培養による検討が行われている。このような培養の多くは、液性因子（増殖因子やサイトカイン）が石灰化組織の発生や成長に及ぼす影響を検討するための培養であり、浮遊培養や多孔質膜上での培養が行われている。しかしながら、このような培養方法では細胞からの石灰化誘導に２〜３週間という長時間を要するのが一般的であった。
【０００３】
石灰化過程には、細胞や組織の分化のみならず、石灰化誘導有機質の分布局在や、ミネラルの供給、結晶核の生成や成長など、種々の因子が関与すると考えられている。一方、石灰化部を有する組織の発生や成長には、物理的環境（力学環境）の影響も重要であると考えられている。この影響を検討するため、周期的な力学刺激を加える実験系がいくつか提案されているが、応力負荷には高価な特殊培養装置の導入が必要であるし、それを用いるためには試料の寸法や形態などに制限があった。
【０００４】
特許文献１には、１型コラーゲン等でコーティングされ所定の剛性で維持されたゲルマトリックス中に間葉系幹細胞を懸濁させる工程と、前記ゲルマトリックスを成長調節因子に曝露する工程とを含む、間葉系幹細胞の発生を調節する方法が記載されている。この方法によれば、１５０〜７５０Ｐａの剛性を有する柔らかいゲルマトリックスを用いることで、幹細胞を静止状態に保つことができるとされている。ここで用いられるゲル化剤としては、ポリアクリルアミド、フィブリン、アガロースなどが例示されている。特許文献１の実施例１５には、２５０Ｐａのポリアクリルアミドゲルに１型コラーゲンとフィブロネクチンの混合物をコーティングした支持体の上にヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ヒトＭＳＣ）を播種した例が記載されている。このような柔らかいゲルマトリックス上にヒトＭＳＣが播種されることによって、図１０にも示されるように、ヒトＭＳＣは細胞周期の進行を停止し、その増殖が抑制される。ここで、この静止状態のヒトＭＳＣが、刺激を受けると増殖を再開、又は分化を開始する能力を有することについては、脂肪生成誘導培地で培養すると脂肪細胞に分化でき、骨芽細胞誘導培地で培養すると骨芽細胞に分化できることで実証されている。なお、図１３にも示されるように、実施例１５では、骨芽細胞への分化によるカルシウム沈着をアリザリンレッド染色で観察しているが、これは静止状態のヒトＭＳＣの多分化能力を確認したものであって、ゲルマトリックスの剛性と石灰化との関係を何ら示唆するものではない。
【０００５】
非特許文献１には、培地である三次元ハイドロゲルの弾性率が骨芽細胞の分化と石灰化に与える影響を検討した結果が記載されている。そこでは、培地として約１０ｋＰａ〜約３００ｋＰａの圧縮弾性率のグラデーションを有するポリエチレングリコールジメタクリレート重合体のハイドロゲルが用いられている。そして、ポリエチレングリコールジメタクリレート単量体の水溶液中に骨芽細胞を分散させ、紫外線照射して単量体を重合させてゲル化させてから培養して石灰化を進行させたときの、アリザリンレッドＳ染色による評価結果が図６に示されている。その結果、弾性率が１２〜７４ｋＰａのゲル中ではほとんど石灰化は進行しないのに対し、弾性率が１４０〜３０６ｋＰａのゲル中では石灰化が促進されていていることが示されている。ここでは、６週間あるいは１１週間といった長時間の培養によって石灰化が進行することが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１０−５３２１６７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１０  Ｊｕｌｙ；３１（１９）：５０５１−５０６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、細胞又は組織の石灰化を迅速かつ簡便に誘導できる培養方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題は、水溶性ポリマーが溶解した水溶液中に細胞又は組織を投入し、次いで該水溶液をゲル化させてヤング率が１〜１００ｋＰａのハイドロゲルからなる固体培地中に該細胞又は組織を封入してから、該細胞又は組織における石灰化を誘導することを特徴とする、細胞又は組織の培養方法を提供することによって解決される。このとき、前記水溶性ポリマーが、天然高分子化合物であることが好ましい。
【００１０】
上記培養方法において、前記細胞又は組織が封入された固体培地を培養液中に浮遊させて石灰化を誘導することが好適な実施態様である。前記固体培地中に０．１ｍｍ以上の寸法の組織を封入してから、該組織における石灰化を誘導することも好適な実施態様である。また、前記固体培地中に骨組織、軟骨組織、腱組織又は歯組織を封入してから、これらの組織における石灰化を誘導することも好適な実施態様である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の培養方法によれば、細胞又は組織の石灰化を迅速かつ簡便に誘導することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】培養後の試料のＸ線画像である。
【図２】石灰化領域の面積の経時変化を示したグラフである。
【図３】大腿骨のステム部分の長さの経時変化を示したグラフである。
【図４】染色試料を観察した写真である。
【図５】免疫染色試料（コラーゲン類、ＳＯＸ９）を観察した写真である。
【図６】免疫染色試料（Ｈｉｆ−１）を観察した写真である。
【図７】酸素分圧の経時変化を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、細胞又は組織における石灰化を誘導する、細胞又は組織の培養方法に関する。本発明の培養方法では、ハイドロゲルからなる固体培地中に細胞又は組織を封入してから、当該細胞又は組織における石灰化を誘導する。このとき、当該ハイドロゲルのヤング率が１〜１００ｋＰａであることが重要であり、所定のヤング率を有するハイドロゲル内で培養することによって、細胞又は組織における石灰化の誘導を効果的に促進することができることが明らかになった。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明で培養される細胞又は組織は、石灰化が誘導されるものであればよく、特に限定されない。細胞を培養することもできるし、組織を培養することもできる。ここで、組織とは、細胞が集合して特定の構造を形成しているものをいう。また石灰化とは、細胞又は組織にカルシウム塩が沈着する現象のことをいい、骨や歯などの硬組織の発生や成長に伴う正常な石灰化も含まれるし、血管、唾液腺、腎臓、尿路などにおいて発生する、異所性の石灰化も含まれる。
【００１５】
培養される細胞は、通常、動物由来のものであり、具体的には、骨髄間葉系幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞などを挙げることができる。
【００１６】
組織は、細胞よりも大きい寸法を有するものであることから、細胞と比べて固体培地からの力学的ストレスを受けやすい。そのため、組織を本発明の方法で培養した場合には、細胞に比べて石灰化が促進されやすい。本発明で培養される組織の寸法は特に限定されないが、寸法が大きいほど、組織の成長や石灰化の進行による寸法変化量が大きくなるので、寸法変化に由来してハイドロゲルから受ける力学的ストレスが大きくなりやすい。このような観点からは、培養される組織の寸法は、０．１ｍｍ以上が好ましく、０．２ｍｍ以上がより好ましく、０．５ｍｍ以上がさらに好ましい。ここでの寸法は、組織の長軸方向の長さのことをいう。培養される組織は、通常、動物由来のものである。具体的には、骨組織、軟骨組織、腱組織、歯組織、血管組織、唾液腺組織などを挙げることができる。なかでも、硬組織の発生や成長に伴う正常な石灰化が観察される骨組織、軟骨組織又は歯組織であることが好ましい。また、異所性の石灰化が発生しやすい血管組織であることも好ましい。
【００１７】
本発明の方法によって培養される細胞又は組織は、水溶性ポリマーが溶解した水溶液中に投入される。ここで使用される水溶性ポリマーは特に限定されず、天然高分子化合物であっても合成高分子化合物であっても構わないが、生体親和性の観点からは、天然高分子化合物であることが好ましい。天然高分子化合物としては、動物又は植物から抽出されたものが使用可能であり、多糖類、ポリペプチド、糖タンパクなどが挙げられる。抽出物を必要に応じて精製して用いることもできるし、さらに化学的処理を施して変性したものを用いることもできる。なかでも、アガロース、１型コラーゲン、フィブリン及びアルギン酸塩が好適なものとして例示される。これらの内でもアガロースは、培養を阻害することが少なく扱いやすいので、特に好適に採用される。水溶性ポリマーの濃度は、水溶性ポリマーの種類によっても異なるが、通常０．１〜２０重量％程度である。水溶液には、本発明の効果を阻害しない範囲であれば、水溶性ポリマー以外の成分が含まれていても構わない。例えば、培養に必要なカルシウムイオンを含む各種ミネラルや栄養素が含まれていても構わない。
【００１８】
引き続き、細胞又は組織が投入された前記水溶液をゲル化させてハイドロゲルを形成する。これによって、ハイドロゲルからなる固体培地中に該細胞又は組織が封入される。ゲル化させる方法は特に限定されず、温めた水溶液に細胞又は組織を投入してから冷却してゲル化させることもできるし、細胞又は組織が投入された水溶液にゲル化剤を添加してゲル化させることも可能である。例えば、アガロースであれば、加熱して容易に水溶液を調製できるし、冷却することで容易にゲル化させることができる。また、アルギン酸のアルカリ金属塩やアンモニウム塩であれば、カルシウムイオンのような多価金属イオンを加えることで容易にゲル化させてハイドロゲルを形成することができる。適当な型を用いれば、決まった寸法の固体培地を容易に成形することができる。
【００１９】
本発明の培養方法では、細胞又は組織が封入されるハイドロゲルのヤング率が１〜１００ｋＰａであることが重要である。細胞や組織の石灰化を促進させるためには、試料となる細胞又は組織を覆っているハイドロゲルから、適度な力学的ストレスがかかることが重要であることが今回明らかになった。ヤング率が１ｋＰａ未満の場合には、細胞又は組織にかかる力学的ストレスが弱すぎ、石灰化の促進効果が十分ではない。ヤング率は、好適には３ｋＰａ以上である。また、ヤング率が１００ｋＰａを超える場合には、細胞又は組織にかかる力学的ストレスが強すぎ、やはり石灰化の促進効果が十分ではない。ヤング率は、好適には３０ｋＰａ以下である。ヤング率は、水溶性ポリマーの濃度やゲル化剤の量などによって調整することができる。本発明におけるハイドロゲルのヤング率は、ＪＩＳ  Ｋ６５０３−１９９６に記載された、簡易堅さ試験に準じて２５℃で測定したものである。
【００２０】
ハイドロゲルからなる固体培地中に封入された細胞又は組織の石灰化を誘導する方法は特に限定されない。ハイドロゲルの中に培養に必要なミネラルや栄養素が含ませることもできる。しかしながら、十分な量のミネラルや栄養素を長時間にわたって安定的に供給するためには、細胞又は組織が封入された固体培地を培養液中に浮遊させて石灰化を誘導することが好ましい。こうすることによって、大量の培養液からハイドロゲル内に浸透拡散して一定濃度の必要成分が細胞又は組織に対して安定的に供給される。
【００２１】
また、複数の凹部が形成されたトレイを用い、当該凹部において細胞又は組織が封入されたハイドロゲルを形成すれば、いわゆるティッシュアレイとすることができる。この場合、トレイごとに異なる条件の培養液に浸漬して培養すれば、一度に多数の試料の評価を行うことも可能である。
【００２２】
ハイドロゲルからなる固体培地を浮遊させる培養液の組成は、カルシウムイオンを含み細胞又は組織を培養できるものであれば特に限定されない。増殖因子やサイトカインなど、石灰化に影響を与えうる因子を添加することもできる。
【００２３】
本発明の培養方法によれば、通常の液体培養に比べて、石灰化を誘導するために要する時間を短縮することができる。本発明の方法による培養時間は通常３０日以内であり、好適には２０日以内であり、より好適には１０日以内である。これまでの通常の液体培地中での石灰化誘導時間は少なくとも２〜３週間を要することが多かったので、早ければ５日以内に石灰化が誘導される本発明の培養方法を用いることで培養時間の大幅な短縮が可能である。したがって、様々な化学的因子あるいは物理的環境が石灰化に与える影響を迅速に判断することが可能になる。
【実施例】
【００２４】
（ハイドロゲルのヤング率の測定）
アガロース粉末（Lonza，rockland，ME，USA）を高温滅菌蒸留水に溶解させ、０．５重量％、１重量％及び４重量％のアガロース水溶液を調製してから、直径８ｍｍ、深さ２ｍｍのシリコーンゴム製の型に流し込み、４℃に冷却して固化させることにより、アガロースのハイドロゲルを作製した。得られたハイドロゲルのヤング率については、ＪＩＳ  Ｋ６５０３−１９９６に記載された、簡易堅さ試験に準じて２５℃で測定した。その結果、０．５重量％の場合に２ｋＰａ、１重量％の場合に６ｋＰａ、４重量％の場合に３５ｋＰａのヤング率をそれぞれ示した。
【００２５】
（骨組織の培養）
培養用骨組織として、胎生１６日のマウスから採取した大腿骨を使用した。マウスから取り出した大腿骨を、シリコーンゴム型に流し込まれた上記３種類の濃度のアガロース溶液中に投入し、迅速に４℃に冷却することにより固化させて、骨組織をハイドロゲル中に封入した。こうして骨組織が封入されたハイドロゲルを、βグリセロフォスフェート、アスコルビン酸、デキサメタゾン及び抗生物質を加えたα−ＭＥＭ液体培地に浮遊させて培養を行った。また、コントロールとして、ハイドロゲルに封入せずに骨組織をそのままα−ＭＥＭ液体培地に浮遊させて培養を行った。いずれの培養条件も３７℃、５％ＣＯ２環境とした。
【００２６】
（石灰化領域のＸ線画像解析）
上記方法に従って培養を行い、１日経過後、４日経過後及び７日経過後のハイドロゲル封入試料を取り出して、マイクロＣＴスキャナを用いてＸ線画像を得た。この分析では、２９ｋＶ、２７μＡの条件で発生したＸ線を使用してＸ線画像を得て、それについて三次元的な定量評価を行った。得られたＸ線画像を元に、画像解析ソフト「ＩｍａｇｅＪ」を用いて、骨形態や骨サイズ、石灰化領域の比較検討を行った。培養後の試料のＸ線画像（画像解析ソフトによるコントラスト強調後の画像）を図１に示す。石灰化領域の面積の経時変化を示したグラフを図２に示す。また、ステム（幹）部分の長さの経時変化を示したグラフを図３に示す。これらの解析の結果、コントロールでは、７日間の培養の間に軟骨部分での石灰化が観察されなかった。これに対し、ハイドロゲルに封入した試料では４日経過時から石灰化が観察され、特にヤング率が６ｋＰａのハイドロゲルに封入した試料での石灰化が顕著に促進され、短期間で効果的に石灰化が進行することがわかった。ステム部分の長さの増加は骨組織の成長の程度を示したものであるが、これは、ハイドロゲルのヤング率の影響をほとんど受けず、試料によってほとんど差異はなかった。
【００２７】
（染色試料の観察）
石灰化メカニズムの理解のために、染色試料の観察を行った。７日間の培養後、骨組織をゲルから取り出しＰＢＳにて洗浄し、４％パラフォルムアルデヒド水溶液で固定して、パラフィンに包埋してからミクロトームを用いて薄切りした切片を染色に使用した。染色は、軟骨基質の沈着を確認するためにアルシアンブルーを、石灰化基質の沈着を確認するためにアリザリンレッドを用いて行った。また同時に、ＨＥ染色も行った。それぞれの試料の染色試料を観察した写真を図４に示す。その結果、アルシアンブルー染色においては、コントロールでの染色濃度が少し薄く、ハイドロゲルに封入した試料と比べて軟骨細胞の分化が遅れていることが示唆された。また、アリザリンレッド染色においては、コントロールではほとんど染色されず、２ｋＰａ及び３５ｋＰａのハイドロゲルに封入した試料ではある程度染色され、６ｋＰａのハイドロゲルに封入した試料では広範囲で染色された。このことから、６ｋＰａのハイドロゲルに封入した試料において、石灰化が大きく促進されたことがわかった。
【００２８】
（免疫染色試料の観察）
上記と同様にして作製した切片を免疫染色に使用した。このとき使用した１次抗体はtype I collagen（1:100，ab765P，Millipore，MA，USA)、type II collagen（1:200，MAB8887，Millipore，MA，USA）、SOX9（1:300，ab26414，Abcam，Cambridge，UK）であり、これらの１次抗体を作用させた後、蛍光ラベルした２次抗体（Alexa Fluor-568conjugated secondary antibody，Life Technologies，CA，USA）を使用することで、赤の染色像を獲得した。免疫染色試料を観察した写真を図５に示す。６ｋＰａのハイドロゲルに封入した試料において、ＳＯＸ９及びtype II collagenの発現が顕著であることから、軟骨への分化が促進されていると考えられる。一方、いずれに試料でもtype I collagenの発現はほとんど認められず、骨への分化はそれほど進行していないと考えられる。
【００２９】
さらに、同様の試料について、１次抗体として、Hif-1（1:25，Santa Cruz Biotechnology，CA，USA）を作用させた後、蛍光ラベルした２次抗体（Alexa Fluor-488conjugated secondary antibody，Life Technologies，CA，USA）を使用することで、緑の染色像を獲得した。免疫染色試料を観察した写真を図６に示す。図６中、左側がコントロールであり、右側が６ｋＰａのハイドロゲルに封入した試料である。いずれもほとんど染色されておらず、低酸素誘導因子の発現がほとんど認められなかった。このことから、ハイドロゲルに封入した場合であっても、浮遊培養に比べて低酸素状態になっている訳ではないと考えられる。
【００３０】
（酸素分圧測定）
また、上記方法に従って骨組織を培養し、２ｋＰａ、６ｋＰａ及び３５ｋＰａのハイドロゲルに封入した試料について、培養開始時、１日後、３日後及び７日後の試料のハイドロゲル内部の酸素分圧を、酸素分圧測定装置（IMP-211，Intermedical，Japan）によって計測した。酸素分圧の経時変化を示したグラフを図７に示す。その結果、特に酸素分圧が大きく低下するような現象は認められなかった。したがって、上記Hif-1が未発現であった結果も併せて考えれば、ハイドロゲル内部での石灰化の進行は、酸素濃度とは関係なく、ゲルのヤング率の影響によるものであると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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