(57)【要約】【課題】本発明は、細胞のホルモン分泌能を簡便に測定する方法に関するものである。【解決手段】本発明は、ホルモン分泌細胞のホルモン分泌能を測定する方法であって、該ホルモン分泌細胞内で小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体を発現させ、細胞外に放出された該融合体から得られる蛍光強度を検出し、該ホルモン分泌細胞のホルモン分泌能を測定する方法を提供する。また、本発明は、当該方法を使用した、ホルモン分泌を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルモン分泌細胞のホルモン分泌能を測定する方法であって、
該ホルモン分泌細胞内で小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体を発現させ、細胞外に放出された該融合体から得られる蛍光強度を検出し、該ホルモン分泌細胞のホルモン分泌能を測定する方法。
【請求項２】
前記小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質が、細胞外プロテアーゼの前駆体タンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞外プロテアーゼが、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ホルモン分泌細胞が、Ｌ細胞又はＬ細胞由来の細胞株である請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ホルモンが，グルカゴン様ペプチド−１（GLP-1）である請求項１乃至４に記載の方法。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ホルモン分泌を誘導、又は阻害する物質のスクリーニング方法。
（ａ）小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体を発現しているホルモン分泌細胞と、ホルモン分泌を誘導又は阻害する候補物質とを接触させる工程、
（ｂ）細胞外に放出された該融合体から得られる蛍光強度を測定する工程、及び
（ｃ）蛍光強度が増加していれば該候補物質を、ホルモン分泌を誘導する物質と決定し、蛍光強度が減少していれば該候補物質を、ホルモン分泌を阻害する物質と決定する工程
【請求項７】
前記小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質がtPAの前駆体タンパク質である請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記ホルモンがGLP-1である請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記ホルモンがインスリンである請求項６又は７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ホルモン分泌細胞がＬ細胞である請求項７乃至９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記ホルモン分泌細胞がGPRC6Aを発現している細胞である請求項７乃至９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体を発現しているホルモン分泌細胞を含む、ホルモン分泌促進物質又はホルモン分泌阻害物質のスクリーニングキット。
【請求項１３】
前記ホルモン分泌細胞がＬ細胞であり、前記小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質がtPAの前駆体タンパク質であり、前記ホルモンがGLP-1である請求項１２に記載のスクリーニングキット。
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、GLP-1分泌を誘導又は阻害する物質のスクリーニング方法。
（ａ）GPRC6Aレセプターを発現する細胞と、GLP-1分泌を誘導又は阻害する候補物質とを接触させる工程、
（ｂ）細胞内のCa2+濃度変化を検出する工程、
（ｃ）細胞内のCa2+濃度が上昇した場合、該候補物質はGLP-1分泌を誘導する物質と決定し、細胞内のCa2+濃度が減少した場合、該候補物質はGLP-1分泌を阻害する物質と決定する工程
【請求項１５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、GLP-1分泌を誘導又は阻害する物質のスクリーニング方法。
（ａ）GPRC6Aレセプターを発現する細胞と、GLP-1分泌を誘導又は阻害する候補物質とを接触させる工程、
（ｂ）細胞外へ分泌されたGLP-1濃度を検出する工程、
（ｃ）細胞外へ分泌されたGLP-1濃度が上昇した場合、該候補物質はGLP-1分泌を誘導する物質と決定し、分泌されたGLP-1濃度が減少した場合、該候補物質はGLP-1分泌を阻害する物質と決定する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内分泌細胞のホルモン分泌能を簡便に測定する方法に関する。また、本発明は、GLP-1の分泌を制御するレセプター、及び該レセプターのアゴニスト（ホルモン分泌を促進する物質）又はアンタゴニスト（ホルモン分泌を阻害する物質）のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルカゴン様ペプチド−１（GLP-1;glucagon-like peptide-1）は、小腸内分泌Ｌ細胞（以下、L細胞）から分泌される消化管ホルモンであり、膵臓β細胞に発現しているGLP-1受容体を介してインスリン分泌を促進する。GLP-1は、Ｌ細胞で生成されるプログルカゴンから翻訳後プロセッシングにより生成される。グルコース濃度に応答してインスリンの分泌を誘導することから、特にＩＩ型（インスリン非依存型）糖尿病の治療に効果を示す可能性が指摘されてきた。
また、GLP-1は、インスリン分泌の調節の他にも、中枢の視床下部に作用して「満腹感」の刺激、及び摂食の低減を誘導することが明らかとなっており、GLP-1の分泌を調節する薬剤の探索を進めることで、糖尿病のみならず、肥満症を含む摂食障害等に対する新たな治療方法の開発が期待される。
【０００３】
GLP-1は、消化管腔内のグルコース、脂肪酸及びアミノ酸など、様々な栄養素に応答して、Ｌ細胞から分泌される。グルコース及び脂肪酸によって誘導されるGLP-1の分泌のメカニズムについては、徐々に明かにされつつあるが、アミノ酸によるGLP-1分泌の誘導メカニズムについては、ほとんど解明されていない。
これまでに、食物の消化によって生じるアミノ酸が、GLP-1の分泌を促進することが報告されている（非特許文献１〜３）。例えば、Ｌ−グルタミンは、マウスのＬ細胞株であるGLUTag細胞株及びマウス初代培養Ｌ細胞中において、GLP-1の強力な分泌促進因子であることが見出されている（非特許文献４及び５）。Ｌ−グルタミンによって誘導されるGLP-1の分泌は、ナトリウム依存性アミノ酸トランスポーターによるアミノ酸の取り込みによって制御されることが示されていたが、GLP-1の分泌を誘導するには、さらなる、別のメカニズムが存在すると考えられていた（非特許文献４，５）。従って、Ｌ細胞において、Ｌ−グルタミンなどのアミノ酸が誘導するGLP-1の分泌には、未知のアミノ酸感受性レセプターの関与が想定される。
しかしながら、現在のところ、Ｌ細胞からのGLP-1の分泌に関与するアミノ酸レセプターは同定されておらず、アミノ酸によるGLP-1の制御機構に関しては、不明な点が多く残されている。
【０００４】
このように、GLP-1の分泌を制御するメカニズムの解明が思うように進展しないのは、GLP-1などホルモンの分泌を簡便に測定する技術が存在しないことが１つの原因であると考えられる。
これまで、細胞から放出されたGLP-1やインスリンなどのホルモン濃度は、例えば、酵素結合免疫吸着法（ELISA法）や放射免疫測定法（RIA法）により検出・定量されていた。ところが、これらの方法は、抗体や放射性物質を用いるため、費用がかかり、また、放射性物質による人体への被爆の危険性などを伴うものである。さらに、抗体を使用する場合には、抗体の特異性によって検出感度が左右されるため、測定サンプル中に測定対象のホルモン以外のタンパク質が混入等している場合には、検出感度が急激に低下するなどの欠点が存在していた。
このような従来法に対し、ホルモンを蛍光色素あるいは蛍光タンパク質等で標識化することができれば、ホルモンの細胞外への分泌の過程を直接可視化することができる。さらに、蛍光を定量することで分泌されたホルモン量の測定が可能となるため、簡便で、比較的安価かつ安全にホルモン量の測定を行うことができる。
しかしながら、GLP-1などの分泌ホルモンは、翻訳後、その前駆体タンパク質からプロセッシングによって産生されるため、GFPなどの蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現させ、その放出過程をモニターすることは技術的に非常に困難である。
【０００５】
以上のように、当該技術分野においては、アミノ酸に応答したＬ細胞からのGLP-1の分泌メカニズムを解明するという課題が存在しているのみならず、ホルモン分泌のメカニズムを簡便に評価するための方法論を確立するという課題も、存在している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Herrmannら, Digestion 56:117-126, 1995
【非特許文献２】Elliottら, J. Endocrinol. 138:159-166, 1993
【非特許文献３】Hallら, Br. J. Nutr. 89:239-248, 2003
【非特許文献４】Reinmannら, Diabetologia 47:1592-1601, 2004
【非特許文献５】Tolhurstら, Endocrinology 152:405-413, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、内分泌細胞のホルモン分泌能を簡便に測定する方法を提供する。
また、本発明は、アミノ酸に応答し、GLP-1の分泌を誘導するレセプターを提供する。
さらに、該レセプターに対するアゴニスト（分泌促進物質）又はアンタゴニスト（分泌阻害物質）のスクリーニング方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者は、マウスＬ細胞のモデル細胞株であるGLUTag細胞を用いて、アミノ酸に応答し、GPL-1の分泌を誘導するレセプターの同定を試みたところ、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーＣグループ６サブタイプＡ（G protein-coupled Receptor (GPCR) Family C Group 6 subtype A (GPRC6A)）レセプターがGLUTag細胞からのアミノ酸により誘導されるGLP-1の分泌に関与していることを見出した。
発明者は、GPRC6AレセプターのアンタゴニストであるホスホリパーゼＣ阻害剤、あるいは、IP3レセプターのアンタゴニストが、Ｌ−オルニチンが誘導する細胞内カルシウム濃度（[Ca2+]i）の上昇を顕著に抑制することを見出した。さらに、発明者は、Ｌ−オルニチンによって増強された[Ca2+]iの増大は、GLP-1の分泌と関連しており、Ｌ−オルニチンによる刺激が、濃度依存的にGLP-1分泌の頻度を増加させることを見出した。さらに、内在性のGPRC6Aの発現をsiRNAで阻害すると、Ｌ−オルニチンで誘導される[Ca2+]iの増大及びGLP-1の分泌が抑制されることを確認した。
これらの結果から、GPRC6Aレセプターは、アミノ酸センサーとしてGLUTag細胞において機能しており、GLP-1の分泌を誘導することが示唆された。
【０００９】
さらに、発明者は、GPRC6Aレセプターがアミノ酸に応答してGLP-1の分泌を誘導することを検討する過程において、GLP-1などのホルモンの細胞外への分泌を視覚的にモニターでき、かつ、ホルモン分泌量を定量する方法につき、鋭意検討を行った。発明者は、小胞体シグナルペプチドを有する細胞外プロテアーゼである組織プラスミノーゲン活性化因子の前駆体（tPA; tissue-type plasminogen activator）と蛍光タンパク質（GFP）の融合体を、GLUTag細胞内で発現させたところ、GLP-1と同じ分泌顆粒にtPA-GFPが局在することを見出した。そして、tPA-GFPが細胞外へ放出されることを蛍光強度の変化をモニターすることにより検出し、この蛍光強度変化をGLP-1の細胞外への分泌の指標にできることを明かにした。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１５）である。
（１）ホルモン分泌細胞のホルモン分泌能を測定する方法であって、
該ホルモン分泌細胞内で小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体を発現させ、細胞外に放出された該融合体から得られる蛍光強度を検出し、該ホルモン分泌細胞のホルモン分泌能を測定する方法。
（２）前記小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質が、細胞外プロテアーゼの前駆体タンパク質である上記（１）に記載の方法。
（３）前記細胞外プロテアーゼが、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）である上記（２）に記載の方法。
（４）前記ホルモン分泌細胞が、Ｌ細胞又はＬ細胞由来の細胞株である上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記ホルモンが，グルカゴン様ペプチド−１（GLP-1）である上記（１）乃至（４）に記載の方法。
（６）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ホルモン分泌を誘導、又は阻害する物質のスクリーニング方法。
（ａ）小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体を発現しているホルモン分泌細胞と、ホルモン分泌を誘導又は阻害する候補物質とを接触させる工程、
（ｂ）細胞外に放出された該融合体から得られる蛍光強度を測定する工程、及び
（ｃ）蛍光強度が増加していれば該候補物質を、ホルモン分泌を誘導する物質と決定し、蛍光強度が減少していれば該候補物質を、ホルモン分泌を阻害する物質と決定する工程
（７）前記小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質がtPAの前駆体タンパク質である上記（６）に記載のスクリーニング方法。
（８）前記ホルモンがGLP-1である上記（６）又は（７）に記載の方法。
（９）前記ホルモンがインスリンである上記（６）又は（７）に記載の方法。
（１０）前記ホルモン分泌細胞がＬ細胞である上記（７）乃至（９）に記載のスクリーニング方法。
（１１）前記ホルモン分泌細胞がGPRC6Aを発現している細胞である上記（７）乃至（９）に記載のスクリーニング方法。
（１２）小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体を発現しているホルモン分泌細胞を含む、ホルモン分泌促進物質又はホルモン分泌阻害物質のスクリーニングキット。
（１３）前記ホルモン分泌細胞がＬ細胞であり、前記小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質がtPAの前駆体タンパク質であり、前記ホルモンがGLP-1である上記（１２）に記載のスクリーニングキット。
（１４）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、GLP-1分泌を誘導又は阻害する物質のスクリーニング方法。
（ａ）GPRC6Aレセプターを発現する細胞と、GLP-1分泌を誘導又は阻害する候補物質とを接触させる工程、
（ｂ）細胞内のCa2+濃度変化を検出する工程、
（ｃ）細胞内のCa2+濃度が上昇した場合、該候補物質はGLP-1分泌を誘導する物質と決定し、細胞内のCa2+濃度が減少した場合、該候補物質はGLP-1分泌を阻害する物質と決定する工程
（１５）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、GLP-1分泌を誘導又は阻害する物質のスクリーニング方法。
（ａ）GPRC6Aレセプターを発現する細胞と、GLP-1分泌を誘導又は阻害する候補物質とを接触させる工程、
（ｂ）細胞外へ分泌されたGLP-1濃度を検出する工程、
（ｃ）細胞外へ分泌されたGLP-1濃度が上昇した場合、該候補物質はGLP-1分泌を誘導する物質と決定し、分泌されたGLP-1濃度が減少した場合、該候補物質はGLP-1分泌を阻害する物質と決定する工程
【発明の効果】
【００１１】
本発明のホルモン分泌能の測定方法を使用することにより、ホルモン分泌を誘導（又は促進）又は阻害する物質のスクリーニングを簡便に行うことができる。特に、ホルモン分泌細胞がＬ細胞である場合には、当該測定方法を使用することで、GLP-1の分泌を促進又は阻害する分子のスクリーニングを簡便に行うことができる。さらに、GLP-1はインスリン分泌を促す因子であることから、本方法は、インスリン分泌を促進又は阻害する因子を簡便にスクリーニングすることができ、糖尿病の治療薬の同定にも効果を発揮する。
【００１２】
さらに、本発明者は、アミノ酸に応答しGLP-1の分泌を誘導するレセプターとして、GPRC6Aレセプターが機能していることを明かにした。従って、本発明は、GPRC6Aレセプターを発現する細胞を使用したGLP-1の分泌促進因子又は分泌阻害因子のスクリーニング方法、さらには、インスリンの分泌促進因子又は分泌阻害因子のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】GLUTag細胞、STC-1細胞及びマウス小腸細胞におけるアミノ酸感受性レセプターの発現状況をRT-PCRで解析した結果である。RT-は、RT-PCRを行っていないコントロールである。Small intestineは、小腸組織由来の細胞である。
【図２】GLUTag細胞又はSTC-1細胞に種々のアミノ酸を添加した場合の[Ca2+]iの変化。Ａ及びＣは、各々GLUTag細胞の結果とSTC-1細胞の結果を示す。また、Ｂ及びＤは、各々、刺激投与前の状態での蛍光強度を１００として標準化した結果であり、ＢがGLUTag細胞、ＤがSTC-1細胞の結果である。アミノ酸を添加したタイミングを点線で示す。データは、値±標準誤差で示した。*P<0.05, **P<0.01
【図３】GLUTag細胞における[Ca2+]iの変化に対するＬ−オルニチンの影響。Ａ；種々の濃度のＬ−オルニチンを添加したときの、[Ca2+]iの変化を示す。Ｌ−オルニチンを添加したタイミングは、点線で示す。また、刺激投与前の状態での蛍光強度を１００として標準化した。Ｂ；Ｌ−オルニチンが[Ca2+]iを濃度依存的に上昇させた結果を示す。種々の濃度のＬ−オルニチンによって誘導されたピークの振幅の値を標準化した。Ｃ；U-73122、2-APB、又はカリンドールを1mMのＬ−オルニチンと共に添加したときの、[Ca2+]iの経時変化である。Ｄ；1mMのＬ−オルニチンとU-73122、2-APB、又はカリンドールを添加することで誘導されたピークの振幅の値を標準化した。データは、値±標準誤差で示した。*P<0.05, **P<0.01
【図４】GLUTag細胞内において、tPA-GFPがGLP-1を含む分泌顆粒中に共局在する様子を示す。Ａ；GLUTag細胞内におけるtPA-GFPとGLP-1の分布を示す、共焦点顕微鏡像である。細胞はパラホルムアルデヒト固定を行って観察した。スケールバーは10μm。Ｂ；tPA-GFPを発現するGLUTag細胞の全反射蛍光顕微鏡によるイメージ。エキソサイトーシス前の小胞を□で囲った。スケールバーは10μm。Ｃ；1mMのＬ−オルニチン添加後のエキソサイトーシスによるtPA-GFPの放出過程を経時的に示した全反射蛍光顕微鏡イメージである。スケールバーは1μm。
【図５】GLP-1の分泌に対するＬ−オルニチンの影響。Ａ；Ｌ−オルニチンを種々の濃度で添加した後に生じるエキソサイトーシスの数を示す。Ｂ；種々の濃度のＬ−オルニチンを添加した後、培地に放出されたtPA-GFPの蛍光強度を蛍光分光光度計で測定した。刺激をしていないコントロール細胞の培地の蛍光インデックス（ＦＩ）値を１とした。Ｃ；Ｌ−オルニチンを添加した後に分泌されたGLP-1の量をELISA法で測定した結果である。Ｄ；Ｌ−オルニチンと共に、U-73122、2-APB、又はカリンドールを添加した後に生じるエキソサイトーシスの数を示す。Ｅ；Ｌ−オルニチンと共に、U-73122、2-APB、又はカリンドールを添加した後、培地に放出されたtPA-GFPの蛍光強度を蛍光分光光度計で測定した。刺激をしていないコントロール細胞の培地のＦＩ値を１とした。Ｆ；Ｌ−オルニチンと共に、U-73122、2-APB、又はカリンドールを添加した後に分泌されたGLP-1の量をELISA法で測定した結果である。データは、値±標準誤差で示した。*P<0.05, **P<0.01
【図６】GPRC6Aの発現抑制が、Ｌ−オルニチンによって誘導される細胞内[Ca2+]iの変化及びGLP-1の分泌に与える影響。Ａ；GLUTag細胞内でのGPRC6Aの発現に対するGPRC6A siRNAの影響をRT-PCRで解析した結果を示す。Ｂ；1mMのL-アミノ酸をGLUTag細胞に添加した場合（コントロール）、GPRC6Aの発現を阻害したGLUTag細胞に添加した場合（siRNA）の[Ca2+]iの経時変化を示す。Ｃ；1mM のＬ−オルニチンにより、GLUTag細胞（■）又はGPRC6Aの発現を阻害したGLUTag細胞（□）において誘導された蛍光強度のピークの振幅の値を標準化した結果である。刺激投与前の状態での蛍光強度を１００として標準化した。Ｄ；Ｌ−オルニチンをGLUTag細胞（■）又はGPRC6Aの発現を阻害したGLUTag細胞（□）に添加した後、分泌されたGLP-1の量をELISA法により測定した結果である。データは、値±標準誤差で示した。**P<0.01
【図７】GLUTag細胞において内在性のGPRC6Aの発現を阻害するとエキソサイトーシス数が減少することを示す。Ａ；無処理のGLUTag細胞（control）又はGPRC6A（GPRC6A siRNA）で阻害したGLUTag細胞における、細胞膜にドッキング（結合）したtPA-GFPを含む分泌顆粒の全反射蛍光顕微鏡イメージを示す。Ｂ；細胞膜にドッキング（結合）したtPA-GFPを含む分泌顆粒の密度を測定した結果である。GPRC6A siRNA処理によって、細胞膜にドッキングしたtPA-GFPを含む分泌顆粒の密度が増減することはなかった。Ｃ；GPRC6A siRNA処理により、Ｌ−オルニチンによって誘導されるエキソサイトーシス数が減少することを示すグラフである。データは、値±標準誤差で示した。**P<0.01
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の第１の態様は、ホルモン分泌細胞のホルモン分泌能を測定する方法であって、該ホルモン分泌細胞内で小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体を発現させ、細胞外に放出された該融合体から得られる蛍光強度を検出し、該ホルモン分泌細胞のホルモン分泌能を測定する方法である。
本発明は、小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体をホルモン分泌細胞内で発現させると、ホルモンを含む分泌顆粒中に融合体が移行し、ホルモンが細胞外へエキソサイトーシスによって放出されるのと同時に、融合体も細胞外へ放出されることを初めて見出したことに基づくものである。すなわち、本発明は、細胞外（例えば、細胞の培地中）に放出された融合体から得られる蛍光の強度を測定することにより、分泌顆粒内に該融合体と共局在していたホルモンの放出量及びその変動を定量化する方法を提供する。
具体的には、細胞を培養する培地に放出された融合体の量は、蛍光スペクトロメーターを利用して、融合体中の蛍光タンパク質に適した波長領域において、蛍光強度を測定して定量化することができる。このように定量化された培地中の融合体の量は、同じ分泌顆粒に含まれていたホルモンの細胞外放出量と相関するため、融合体の放出量を定量することで、細胞外へ放出されたホルモン量を定量することが可能となる。
【００１５】
本発明の方法は、ホルモン分泌細胞であれば、いかなる細胞に対しても適用することができ、特に限定はしないが、例えば、表１に示す臓器由来のホルモン分泌細胞に関し、該細胞から分泌される放出ホルモンの分泌能の測定について適用することができる。表１において細胞名がないものについて、表１に示される「臓器」由来の各ホルモンの分泌細胞に対して適用できることを示すものである。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
本発明において使用される「小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質」とは、小胞体へ移行するために必要なシグナル配列（小胞体シグナルペプチド）を保持して細胞内で発現するタンパク質のことであり、小胞体への移行後は、小胞体でプロセッシングにより切断されるものであってもよい。「小胞体シグナル配列」は、タンパク質のアミノ末端（N-末端；H2N-）にある疎水性アミノ酸を中心とするアミノ酸配列のことである。「小胞体シグナル配列」としては、特に限定はしないが、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、あるいは、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）のシグナルペプチド（配列番号２）などを挙げることができる。天然に存在する「小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質」は、その多くが細胞外へ分泌されるタンパク質であり、一般に、小胞体シグナルペプチドを含む前駆体タンパク質として細胞内で発現される。「小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質」としては、例えば、細胞外プロテアーゼのように、細胞外で機能するタンパク質のシグナルペプチドを有する前駆体タンパク質を挙げることができる。細胞外プロテアーゼとしては、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）（前駆体の配列として、ラット：配列番号３（アミノ酸配列）、配列番号４（核酸配列）；ヒト：配列番号５（アミノ酸配列）、配列番号６（核酸配列）などを挙げることができる）、トロンビン、プラスミン、ニューロトリプシン、ニューロプシンなどを挙げることができ、中でも、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）が好ましい。また、「小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質」として、インスリン（その前駆体）などのホルモンを使用することもできる。さらには、「小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質」として、本来は分泌顆粒に移行しないタンパク質であっても、小胞体シグナルペプチドを融合させ、小胞体へ移行し分泌顆粒へ局在するようになったタンパク質であれば、使用することが可能であり、このようなタンパク質が小胞体へ移行し分泌顆粒に局在するかどうかは、予備的な実験により、当業者であれば、容易に確認することが可能である。
【００１８】
本発明で使用される「蛍光タンパク質」とは、蛍光を発する能力を有するタンパク質であれば如何なるものであってもよく、例えば、クラゲ由来、サンゴ由来、あるいは、イソギンチャクモドキ由来の蛍光タンパク質を挙げることができる。特に、クラゲ由来の蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（GFP：Green Fluorescent Protein）（例えば、配列番号７など）及びその誘導体を挙げることができ、誘導体には、例えば、ＢＦＰ（blue fluorescent protein）、ＣＦＰ（cyan fluorescent protein）、単量体化ＣＦＰ（monomeric super enhanced CFP）、ＹＦＰ（yellow fluorescent protein）、ＲＦＰ（red fluorescent protein）、Ｖｅｎｕｓ（ＹＦＰの変異体）、単量体化Ｖｅｎｕｓ（cp173-monomericVenus）、Ｃｉｔｒｉｎｅ（ＹＦＰの変異体）などが含まれる。好ましい蛍光タンパク質として、ＧＦＰを挙げることができる。
【００１９】
本発明を実施するにあたり、「小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体」の細胞内での発現は、当該技術分野における通常の技術を利用して行うことができる。小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体は、小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質（例えば、シグナルペプチドを保持した組織プラスミノーゲン活性化因子前駆体タンパク質）と、蛍光タンパク質（例えば、GFP）が連結した形態で発現するように、各々をコードする核酸同士のフレームを調整し、適当な発現ベクターに挿入し、細胞内にトランスフェクトして、発現させることができる。好ましくは、小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質がＮ末端側になるように発現コンストラクトを構築するのがよい。
また、予め、GFPなどの蛍光タンパク質をコードする核酸が挿入されている発現ベクター（例えば、Clontech社のpEGFP-N1など；GenBankアクセッション番号U55762）などの市販品を購入し、このベクターに小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質（例えば、シグナルペプチドを保持した組織プラスミノーゲン活性化因子前駆体タンパク質）をコードする核酸を挿入して、発現コンストラクトを作製することもできる。
【００２０】
「小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体」を発現させるための発現ベクターを構築した後、これを、細胞内へ導入する場合、当業者にとって周知のいかなる方法を用いて行ってもよい。例えば、細胞へのベクターの導入方法として、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等が挙げられる。これらの方法は、市販のキットを使用して行うこともできる。
「小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体」は、導入したホルモン分泌細胞内で、一過的に発現しても、構成的に発現してもよい。構成的に発現する安定発現株は、適切なベクター（例えば、pcDNAベクター（Invitrogen社））などを使用して、小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体を発現する発現ベクターを構築し、これを目的のホルモン分泌細胞に導入したのち、安定に融合体を発現する組換体細胞を適切な選択マーカー（例えば、イグロマイシン耐性マーカー（Hygr）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（dhfr）、アンピシリン耐性遺伝子（Ampr）、カナマイシン耐性遺伝子（Kanr）、ネオマイシン耐性遺伝子（Neor，G418）など）を使用して、選択することができる。
【００２１】
本発明の別の実施態様は、ホルモン分泌を誘導する物質又は、ホルモン分泌を阻害する物質のスクリーニング方法である。
小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体を発現しているホルモン分泌細胞に対し、ホルモン分泌を誘導（又は促進）することが期待される候補物質を添加した（又は接触させ）場合、該候補物質がホルモン分泌を誘導（又は促進）する物質であれば、小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体が分泌顆粒から細胞外へ放出され、細胞外の培地中に蛍光が検出されることになる。このように、培地など細胞外における蛍光強度が増加した場合に、該候補物質は、ホルモン分泌を誘導（又は促進）する物質であると決定することができる。例えば、GLP-1の分泌を誘導（又は促進）する物質をスクリーニングする場合には、Ｌ細胞又はＬ細胞に由来する細胞株をホルモン分泌細胞として選択し、候補物質を添加した後の培地中の蛍光強度の変化を測定する。
また、既知のホルモン分泌を誘導する物質の存在下において、候補物質を、小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体を発現しているホルモン分泌細胞に添加し（又は接触させ）、候補物質を添加する前の培地中の蛍光強度よりも添加後の蛍光強度が減少した場合には、該候補物質は、ホルモン分泌を阻害する物質であると決定することができる。あるいは、既知のホルモン分泌を誘導する物質の非存在下において、候補物質を、小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体を発現しているホルモン分泌細胞に添加し（又は接触させ）、候補物質を添加する前の培地中の蛍光強度と比較して、添加後の蛍光強度が減少した場合には、該候補物質は、ホルモン分泌を阻害する物質であると決定することができる。
既知のホルモン誘導物質存在下において、該ホルモン分泌を阻害する物質をスクリーニングする場合には、使用する既知のホルモン誘導物質は、対象とするホルモンに適した物質を選択する必要がある。例えば、GLP-1の分泌を阻害する物質をスクリーニングする場合には、Ｌ細胞又はＬ細胞に由来する細胞株をホルモン分泌細胞として選択し、既知の分泌誘導物質である、グルコース、脂肪酸あるいはアミノ酸を添加して、培地中の蛍光強度が増加する状況下において、候補物質を添加し、培地中の蛍光強度が低下するかどうかを調べる。
以上のように、本発明のホルモン分泌能を測定する方法を使用することで、新規のホルモン分泌誘導（又は促進）物質、又は、ホルモン分泌誘導物質によるホルモン分泌を阻害する物質のスクリーニングを行うことができる。
【００２２】
さらに、本発明にはホルモン分泌誘導（又は促進）物質、あるいは、ホルモン分泌の阻害物質のスクリーニングのためのキットが含まれる。当該キットには、小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体を発現するベクター（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子前駆体とGFPなどの蛍光タンパク質の融合体を発現するベクター）の他、ベクター形質導入に必要な試薬等が含まれる。あるいは、小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子前駆体とGFPなどの蛍光タンパク質の融合体）を構成的に安定に発現する各種内分泌細胞（例えば、Ｌ細胞、Ｓ細胞、Ｋ細胞、α細胞、β細胞、δ細胞又は、これらの細胞に由来する細胞株）がキットに含まれていてもよい。
【００２３】
本発明の第２の態様は、
Ｇタンパク質共役受容体ファミリーＣグループ６サブタイプＡ（G protein-coupled Receptor (GPCR) Family C Group 6 subtype A (GPRC6A)）レセプターがGLUTag細胞からアミノ酸によって誘導されるGLP-1の分泌に関与していることを見出したことに基づく。
すなわち、本発明の実施態様には、GPRC6Aレセプターと特異的に結合する物質を同定し、GLP-1の分泌を促進又は阻害する物質、あるいは、インスリンの分泌促進又は阻害する物質の候補となる物質のスクリーニング方法が含まれる。
ここで、GPRC6Aレセプターとは、配列番号８（ヒト：アクセッション番号；NM_148963）（核酸配列は配列番号９）又は配列番号１０（マウス：アクセッション番号；NM_153071）（核酸配列は配列番号１１）で表されるアミノ酸からなるタンパク質、あるいは、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、もしくは、付加されたアミノ酸配列からなり、内分泌細胞上に分布し、そのリガンド（アミノ酸など）の結合により、GLP-1の分泌のためのシグナルを細胞内に伝達するGタンパク質共役型レセプターのことである。
【００２４】
GPRC6Aレセプターを用いた上記スクリーニング方法として、例えば、GPRC6Aレセプターのリガンド候補物質を標識し（例えば、放射性物質による標識、あるいは、蛍光物質による標識）、該標識物質を、GPRC6Aレセプターを発現している細胞、又は、該細胞の膜画分と接触させた後、該細胞画分又は該細胞の膜画分を回収し、回収された画分に標識物質が存在する場合には、該候補物質がGPRC6Aレセプターのリガンド候補であると決定することができる。ここで、GPRC6Aレセプターを発現している細胞は、GPRC6Aレセプターを通常発現していない細胞にGPRC6Aレセプターを発現させた細胞を使用すすることもできる。
【００２５】
また、GPRC6Aレセプターを発現する細胞（好ましくは、GPRC6Aレセプターを過剰発現する細胞、又は、GPRC6Aレセプター以外のGLP-1分泌に関与するレセプターを発現していない細胞）にGLP-1分泌促進物質又は阻害物質の候補物質を接触させ、GLP-1の分泌を指標として、GLP-1分泌促進物質であるか、あるいは、GLP-1分泌阻害物質であるかを決定することができる。候補物質のGLP-1分泌に対する影響を調べるためには、例えば、前述の「小胞体シグナルペプチドを有するタンパク質と蛍光タンパク質の融合体」を発現するＬ細胞などを使用すれば、培地中の蛍光強度を測定することで、簡便に調べることができる。あるいは、培地に放出されたGLP-1の量を、抗GLP-1抗体などを用いたELISA法によって測定し、GLP-1分泌への影響を調べてもよい。また、GPRC6Aレセプターを発現する細胞において、GPRC6Aレセプターへのリガンドの結合によりGLP-1の分泌が誘導される場合、細胞内のカルシウム濃度（[Ca2+]i）の上昇をGLP-1分泌の指標とすることができる。従って、リガンド候補物質を、GPRC6Aレセプターを発現する細胞に添加し（又は接触させ）て、細胞内カルシウム濃度（[Ca2+]i）の変化を検出することによって、リガンド候補物質がGLP-1分泌を誘導するか、あるいは、阻害するかを調べることができる。細胞内カルシウム濃度の変化は、Fluo-3 acetoxymethylesterやカルシウム感受性蛍光タンパク質（例えば、Cameleon、GCamp、PericamやCamgarooなど）、などを使用して容易に測定することができる。
【００２６】
GPRC6Aレセプターを発現する細胞を、GLP-1又はインスリンの分泌誘導又は阻害物質のスクリーニングに使用する場合、好ましくは、GLP-1又はインスリン分泌制御に関与するGPRC6A以外のレセプターが発現していない細胞を使用することが好ましい。
GLP-1又はインスリンの分泌誘導物質をスクリーニングする場合、細胞内のCa2+濃度が上昇した場合、又は、細胞外へ分泌されたGLP-1濃度が上昇した場合には、該候補物質はGLP-1分泌を誘導する物質、又は、インスリンの分泌を誘導する物質と決定することができる。
また、GPRC6Aレセプターを介してGLP-1分泌を誘導する既知の物質、例えば、Ｌ−アミノ酸（Ｌ−オルニチンなど）の存在下において、候補物質を、GPRC6Aレセプターを発現している細胞に添加（又は接触させ）したことで、細胞内のCa2+濃度が減少した場合、あるいは、細胞外へ分泌されたGLP-1濃度が減少した場合、該候補物質は、GPRC6Aレセプターを介したGLP-1分泌を阻害する物質、あるいは、インスリンの分泌を阻害する物質であると決定することができる。あるいは、GPRC6Aレセプターを介してGLP-1分泌を誘導する既知の物質の非存在下において、候補物質を、GPRC6Aレセプターを発現している細胞に添加（又は接触させ）したことで、細胞内のCa2+濃度が減少した場合、あるいは、細胞外へ分泌されたGLP-1濃度が減少した場合、該候補物質は、GPRC6Aレセプターを介したGLP-1分泌を阻害する物質、あるいは、インスリンの分泌を阻害する物質であると決定することができる。
【００２７】
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
実験方法
１．試薬及び発現ベクター
Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンは和光純薬工業から購入した。カリンドールは、Santa Cruz Biotechnologyから購入した。U-73122、2-アミノエトキシジフェニルボレート(2-APB)は、Sigma-Aldrichから購入した。
GPRC6Aに対するsiRNA（Gprc6a-MSS210013: 5’-UCCAGAUGAUUUCACGACAGGUGUC-3’）（配列番号１２）は、Invitrogenから購入した。GFPタグ化組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA-GFP)の発現ベクターは、配列番号３のラット由来組織プラスミノーゲン活性化因子前駆体をコードする核酸（配列番号４）を、常法に従い、pEGFP-N1ベクター（Clontech）のマルチクローニングサイト（SalI/SacII）にクローニングして構築した。
【００２９】
２．細胞培養及びトランスフェクション
GLUTag細胞（Daniel Drucker博士、トロント大学、に供与頂いた）及びSTC-1細胞（Douglas Hanahan博士、カリフォルニア大学サンフランシスコ校、に供与頂いた）は、10%FBSを添加したDMEM (Invitrogen)中で培養を行った。トランスフェクションは、Lipofectamine reagent 2000（Invitrogen）を使用し、取り扱い説明書に従って行った。
【００３０】
３．RNAの単離とRT-PCR解析
GLUTag細胞、STC-1細胞及びマウス小腸組織由来の細胞から、全RNAを単離し、RNaseフリーのDNase (Promega)で処理を行った。cDNAは、Prime Script（タカラバイオ）を用いて作製した。GPRC6A (アクセッション番号；NM_153071)（配列番号１１）のPCR増幅には、５’側プライマーとして、5’-AGACGACCACAAATCCAG-3’（配列番号１３）を、３’側プライマーとして、5’-GATTCATAACTCACCTGTGGC-3’ （配列番号１４）を使用した。CaR (アクセッション番号；NM_013803)のPCR増幅には、５’側プライマーとして、5’-AGCAGGTGACCTTCGATGAGT-3’ （配列番号１５）を、３’側プライマーとして、5’-ACTTCCTTGAACACAATGGAGC-3’ （配列番号１６）を使用した。Taste receptors type-1 member-1(T1R1)(アクセッション番号；NM_031867)のPCR増幅には、５’側プライマーとして、5’-CTGCCAAAGGACAGAATCCTC-3’ （配列番号１７）を、３’側プライマーとして、5’-GAACCGCATGGCTTGGAAG-3’ （配列番号１８）を使用した。Taste receptors type-1 member-3(T1R3)(アクセッション番号；NM_031872)のPCR増幅には、５’側プライマーとして、5’-TGGGGGCCTCTTTGTGTCT-3’ （配列番号１９）を、３’側プライマーとして、5’-TGGGTTGTGTTCTCTGGTTGA-3’ （配列番号２０）を使用した。GAPDH (アクセッション番号；NM_008084)のPCR増幅には、５’側プライマーとして、5’-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3’ （配列番号２１）を、３’側プライマーとして、5’-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3’ （配列番号２２）を使用した。
【００３１】
４．定量RT-PCR及び蛍光発色セルソーター（FACS）により単離・精製したマウス初代培養小腸内分泌Ｌ細胞
小腸内分泌Ｌ細胞は、プログルカゴンプロモーター下に蛍光タンパク質Venusを融合させた遺伝子を発現する細胞をトランスジェニックマウスから取得した。蛍光を発する細胞は、FACSにより選別・精製した。FACSで調製した細胞由来の全RNAは、microscale RNA isolation kit (Ambio)を使用して単離し、常法に従って逆転写した。定量RT-PCRは、は7900HT Fast Real-Time PCRシステムを用いて、既報（Reimannら, Cell Metab. 8:532-539 2008）の手順に従って行った。
【００３２】
５．細胞内Ca2+濃度の測定
細胞内Ca2+濃度（[Ca2+]i）の変動は、Fluo-3 acetoxymethylester (sigma)を用いて測定した。Ringer Buffer (RB)中、カバーグラス上の細胞に5μMのFluo-3を添加し、30分間、37℃でインキュベートした。その後、細胞をオリンパスIX-71倒立顕微鏡のステージに静置し、480nmで励起し、観察した。
【００３３】
６．免疫組織化学
GLUTag細胞を、ポリ−L−リジンでコートしたカバーグラス上で培養し、Lipofectamine 2000を使用して、tPA-GFPをGLUTag細胞に遺伝子導入した。トランスフェクション２日後、細胞をPBSで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで、室温にて、20分間固定した。その後、GLP-1抗体（希釈率1:200,矢内原研究所、静岡）で反応させ、次いで、Alex Fluor 568-結合抗ウサギ二次抗体（希釈率1:1,000, Invitrogen）で反応させた。免疫染色した細胞は、共焦点顕微鏡で観察した。
【００３４】
７．全反射蛍光顕微鏡（TIRF ; Total Internal Reflection Fluorescence）によるtPA-GFP放出反応の観察。
細胞からのtPA-GFP放出をモニターするために、全反射蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。tPA-GFP放出反応の可視化は、組成を通常のリンゲル溶液（RB）から少し改変した(130mM NaCl, 3.6mM KCl, 0.5mM NaH2PO4, 0.5mM MgSO4, 1.5mM CaCl2, 10mM HEPES, 2mM NaHCO3, 5mM グルコース, pH 7.4)ものを用いた。アミノ酸による刺激は、1mM Ｌ−オルニチン又は1mM Ｌ−オルニチンに、10μM U-73122、2-APB又はカリンドールを加えたもので潅流して行った。全反射蛍光顕微鏡で取得した画像データの解析は、単一のエキソサイトーシス画像を選択し、分泌顆粒の中央を中心として、0.7μm×0.7μm四方の範囲における各分泌顆粒の平均蛍光強度を計算した（Aokiら, Biochem. J. 429:497-504 2010などを参照のこと）。エキソサイトーシスする分泌顆粒と、細胞膜近傍に運ばれてくるが、その後エキソサイトーシスはせずに、そのまま細胞質内へとまた輸送される分泌顆粒とを区別するために、蛍光シグナルが消失する直前の蛍光変化を観察した。分泌顆粒のエキソサイトーシス過程は、一過的な蛍光強度の増加によって特徴付けられるが、小胞の移動（vesicle movement）は、徐々にバックグランドレベルにまで減少する蛍光変化によって特徴づけられる。20分間の分泌顆粒のエキソサイトーシスをカウントした。
【００３５】
８．tPA-GFPの放出とGLP-1の分泌の測定
６穴プレートにGLUTag細胞を3.0×105個の細胞密度で培養し、２日後に、Lipofectamine 2000を用いて、tPA-GFPを細胞に遺伝子導入した。トランスフェクションの２日後、細胞をRB中で30分間インキュベートした後、1mM  Ｌ−オルニチン又は1mM  Ｌ−オルニチン＋アンタゴニストの存在下、又は、非存在下において、RB中、２時間インキュベートした。RBに分泌されたtPA-GFPの量は、蛍光スペクトロメーター（460nm〜650nm；F-7000; Hitachi, Tokyo, Japan）により、検出を行った。また、別途、RBに分泌されたGLP-1の量は、GLP-1用のELISAキット（Milipore）を用いて測定を行った。
【００３６】
９．GPRC6AのRNA干渉による解析
GLUTag細胞は、ポリ−Ｌ−リジンでコートしたカバーグラス上に培養した。Lipofectamine 2000を使用して、細胞を20pmol/μlのGPRC6A siRNAでトランスフェクトし、２日後に、画像の取得及び分泌実験を行った。
【００３７】
結果
１．GLUTag細胞、STC-1細胞及び小腸組織由来の細胞におけるアミノ酸レセプターの発現
Ｌ細胞由来のGLUTag細胞が、既知のアミノ酸感受性レセプター（CaR, taste receptors-1(T1R), GPRC6A）を発現しているかどうか検討した。RT-PCR解析から、GLUTag細胞は、GPRC6A, CaR, T1R1及びT1R3のmRNAを発現していた（図１）。これに対して、STC-1細胞では、GPRC6A及びT1R3のmRNAは検出されたが、T1R1のmRNAは検出されなかった。また、マウスの小腸組織由来の細胞においては、GPRC6A, CaR及びT1R3のmRNAは検出されたが、T1R1のmRNAは検出されなかった（図１）。ここで、T1R3がアミノ酸センサーとして機能するためには、T1R1が必要であることから、GPRC6A及びCaRに焦点をしぼり、小腸におけるアミノ酸センサーとしての可能性について検討することにした。
【００３８】
２．Ｌ−オルニチンは、GLUTag細胞及びSTC-1細胞の細胞内Ca2+濃度を増大させる。
CaRは、Ｌ−トリプトファン及びＬ−フェニルアラニンなどの芳香族アミノ酸に応答する傾向が強いが、GPRC6Aは、塩基性Lアミノ酸（Ｌ−オルニチン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン）との応答性が高い。
Ｌ−アミノ酸に対するGLUTag細胞の応答性を検討するために、Ca2+感受性色素であるFluo-3を用いて、各種Ｌ−アミノ酸処理後の細胞内Ca2+濃度（[Ca2+]i）を調べた。Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン及びＬ−リジンは、GLUTag細胞における[Ca2+]i上昇を強く誘導した。また、CaRアゴニストであるＬ−トリプトファン及びＬ−フェニルアラニンで処理すると、Ｌ−フェニルアラニンは顕著に[Ca2+]iを上昇させたが、Ｌ−トリプトファンは、多少[Ca2+]iを上昇させるに止まった（図２、Ａ及びＢ）。これらの結果から、GLUTag細胞において、種々のアミノ酸が[Ca2+]iを上昇させており、このCa2+濃度の上昇は、GPRC6A及び／又はCaRを介していることが示唆された。
他方、STC-1細胞は、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン及びＬ−リジンには応答したが、Ｌ−トリプトファン及びＬ−フェニルアラニンには応答しなかった。この結果から、STC-1細胞においては、GPRC6Aが使用されており、CaRは使用されていないと考えられる（図２Ｃ及びＤ）。
【００３９】
Ｌ−オルニチンは、GPRC6Aに対する刺激因子であることが報告されている（Christiansenら, Br. J. Pharmacol. 150:798-807, 2007）。そこで、GLUTag細胞におけるGPRC6Aの機能を解析するために、Ｌ−オルニチンを使用することにした。使用したＬ−オルニチンの濃度範囲において、[Ca2+]iの顕著な上昇が認められ（図３Ａ及びＢ）、かつ、この[Ca2+]i上昇は加えるＬ−オルニチンの量に依存して変動した。
GPRC6Aは、Gqタンパク質と共役し、PLCgを活性化し、IP3を産生する。そして小胞体のIP3レセプターを介して、小胞体からのカルシウム放出を引き起こし[Ca2+]iを上昇させる。そこで、PLCγとIP3レセプターの阻害剤（各々、U-73122及び2-APB）の[Ca2+]iに対する影響を検討した。1mMのＬ−オルニチンと共に、U-73122又は2-APBでGLUTag細胞を処理すると、Ｌ−オルニチンによって誘導される[Ca2+]i上昇が顕著に抑制された（図３Ｃ及びＤ）。また、GPRC6AアンタゴニストであるカリンドールもＬ−オルニチンによる[Ca2+]iの変動を消失させた（図３Ｃ及びＤ）。
以上の結果から、Ｌ−オルニチンがGPRC6Aレセプターに結合すると、IP3が産生され、その結果、小胞体からのカルシウム放出が起こり、その結果[Ca2+]iが上昇すると考えられる。
【００４０】
３．Ｌ−オルニチンが、GLUTag細胞からのGLP-1の分泌を引き起こす（GLP-1の分泌をtPA-GFPの細胞外への放出をモニターすることで評価する）。
Ｌ−オルニチンによって誘導される[Ca2+]iの上昇は、GLUTag細胞からのGLP-1の分泌を促進するかどうかを検討するために、全反射蛍光顕微鏡を用いて、細胞を化学的に固定をせずに、生きたGLUTag細胞において生じるGLP-1の分泌の動態を観察することを試みた。
GLP-1を内包する分泌顆粒を可視化するためには、蛍光タンパク質を融合させたGLP-1を細胞内で発現させてモニターすることが望ましい。しかしながら、GLP-1は、プログルカゴンペプチド前駆体の翻訳後のプロセッシングによって生じる。従って、このプロセッシングにより蛍光タンパク質が排除されてしまう可能性が高く、GLP-1を直接GFPなどの蛍光タンパク質で標識するのは困難である。
そこで、発明者は、細胞外プロテアーゼである組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）の前駆体タンパク質と蛍光タンパク質であるGFPの融合体を、GLUTag細胞内で発現させ、その細胞内局在を調べた。tPA-GFPからの緑色蛍光の像と、Alexa Fluor 568を結合した二次抗体で蛍光標識したGLP-1からの赤色蛍光の像がほぼ一致したことから（局在率は、80.3±5.6%, n=5）、tPA-GFPは、GLP-1が存在する分泌顆粒に高い効率で貯蔵されることが明かになった（図４Ａ）。
【００４１】
次に、tPA-GFPを発現させたGLUTag細胞の細胞膜近傍に局在する、tPA-GFPを含む分泌顆粒の挙動を、全反射蛍光顕微鏡を用いて解析した。tPA-GFPをGLUTag細胞内で過剰発現させると、斑点状のパターンが観察された（図４Ｂ）。1mMのＬ−オルニチンで処理すると、細胞膜近傍に局在するtPA-GFPの蛍光スポットは、急に輝きを増し（図４Ｃの５０ｓ）、その後、暗くなった。この蛍光強度の変動は、pH依存的なクエンチングによる急速な減少、及び、その後、蛍光タンパク質が細胞外スペースへと放出されることによると考えられ、tPA-GFPを含む分泌顆粒が細胞膜へ融合し、その後、エキソサイトーシスが起こることを示唆している。
【００４２】
GLUTag細胞をＬ−オルニチンで処理している間、tPA-GFPを含む分泌顆粒が細胞膜へ融合する数は、オルニチン濃度依存的に増大した（図５Ａ）。tPA-GFPの融合現象が、小胞の放出を表すものなのかどうか確認するため、細胞を２時間Ｌ−オルニチンで処理した後、培地を回収し、培地に放出されたtPA-GFPの蛍光強度を測定した。蛍光インデックス（ＦＩ）は、tPA-GFPの量を表し、460nm〜650nmの波長領域における培地のＦＩを積算して算出した。分泌されたtPA-GFPのＦＩは、Ｌ−オルニチンで刺激をしていないコントロールの細胞と比較して、Ｌ−オルニチンの濃度依存的に顕著に増大した（図５Ｂ）。Ｌ−オルニチンで処理した細胞から分泌されたGLP-1の濃度をELISAでも測定したところ、処理したＬ−オルニチンの濃度に依存して上昇することが確認された（図５Ｃ）。
Ｌ−オルニチン刺激に応答して、GPRC6Aの下流で機能するPLCとIP3の役割を調べるため、PLCとIP3が関与するシグナル伝達経路の薬理的阻害剤を用いて検討を行った。1mM  Ｌ−オルニチンと共に、U-73122、2-APB又はカリンドールで処理すると、Ｌ−オルニチンによって誘導されたtPA-GFPの細胞膜への融合数（すなわちエキソサイトーシス数）（図５Ｄ）、tPA-GFPのＦＩ（図５Ｅ）、及び、分泌されたGLP-1の量（図５Ｆ）が、顕著に減少することが分かった。これらの結果は、Ｌ−オルニチンは、GPRC6Aと結合し、細胞内IP3濃度上昇を引き起こし、小胞体に存在するIP3レセプターを開口させることで、カルシウム放出を引き起こし、[Ca2+]iを上昇させる。その結果GLP-1のエキソサイトーシスをＬ−オルニチン濃度依存的に増加させることを示すものである。
【００４３】
４．GLUTag細胞において、GPRC6Aは、Ｌ−オルニチンに誘導されるGLP-1の分泌に関与している。
これまでの結果は、細胞外のＬ−オルニチンが、GPRC6Aを介して[Ca2+]iを上昇させ、GLP-1の分泌を増大させることを示している。発明者は、次に、内在性のGPRC6Aの発現をsiRNAで阻害し、Ｌ−オルニチンが誘導する[Ca2+]iの増加がGPRC6Aを介して生じているかどうか検討を行った。
RT-PCRによる解析の結果、GPRC6Aに対するsiRNAでGLUTag細胞を処理すると、GPRC6Aの発現が顕著に抑制されることが確認された（図６Ａ）。そして、siRNAでGPRC6Aの発現を阻害すると、Ｌ−オルニチン及びＬ−リジンによって誘導される[Ca2+]iの上昇が顕著に抑制された（図６Ｂ及びＣ）。これに対し、CaRリガンドあるＬ−フェニルアラニンは、GPRC6Aの発現がない場合にも、[Ca2+]iの上昇を引き起こした（図６Ｂ及びＣ）。この結果から、Ｌ−オルニチンとＬ−フェニルアラニンは、異なるレセプターを選択的に刺激していることが分かった。
次に、GPRC6Aに対するsiRNAが、Ｌ−オルニチンに誘導されるGLP-1の分泌にどのような影響を与えるか調べるために、分泌されたGLP-1の量をELISA法により測定した。GPRC6A siRNAをGLUTag細胞へトランスフェクトすると、Ｌ−オルニチンによって誘導されたGLP-1の分泌が有意に減少した（図６Ｄ）。
さらに、GPRC6Aの発現をsiRNAで阻害したGULTag細胞において、Ｌ−オルニチンによって誘導されるGLP-1の分泌がどのような影響を受けるか、全反射蛍光顕微鏡を使用して観察を行った。siRNAにより内在性GPRC6Aの発現を阻害しても、細胞膜にドッキング（結合）したtPA-GFP小胞の数に影響はなかったが（図７Ａ及びＢ）、tPA-GFPの融合数は顕著に抑制された（図７Ｃ）。従って、これらのデータは、GPRC6Aが、分泌顆粒の輸送及び分泌顆粒と細胞質との結合や膜融合の過程には関与せず、細胞内IP3濃度上昇を引き起こす経路を介して、分泌顆粒のエキソサイトーシスに関与していることを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の方法によれば、細胞からのホルモン分泌を簡便に検出し、定量化することができるため、ホルモン分泌を誘導又は促進する物質、あるいは、ホルモン分泌を阻害する物質のスクリーニングを迅速に行うことが可能になる。従って、本発明は、各種ホルモンが関与する疾患等の治療剤の開発や、ホルモン異常に関連する疾患の診断の迅速化等に貢献するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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