(57)【要約】【課題】液浸対物レンズ先端における液体の光学的検出方法はコスト高であり、かつスペースを大きくとるため、装置の小型化が困難である。【解決手段】サンプルを観察するための対物レンズと、前記対物レンズを光軸方向に駆動する機構と、前記サンプルを照明する光源と、前記対物レンズを介して前記サンプルからの発光を検出する光センサと、前記サンプルと前記対物レンズとの間に液体を供給するノズルと、前記サンプルの温度を調整する手段と、前記サンプルに複数の試薬を供給する手段、を有し、前記液体の状態を電気的に検出する。【選択図】  図１
2015090458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを観察するための対物レンズと、前記対物レンズを光軸方向に駆動する機構と、前記サンプルを照明する光源と、前記対物レンズを介して前記サンプルからの発光を検出する光センサと、前記サンプルと前記対物レンズとの間に液体を供給するノズルと、前記サンプルの温度を調整する手段と、前記サンプルに複数の試薬を供給する手段、を有し、
前記液体の状態を電気的に検出することを特徴とする分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の分析装置において、
前記液体の状態の電気的な検出は、静電容量を測定することにより行うことを特徴とする、分析装置。
【請求項３】
請求項２に記載の分析装置において、
前記静電容量を測定するのは、前記ノズルであることを特徴とする、分析装置。
【請求項４】
請求項３に記載の分析装置において、
さらに、内部に流路を有するフローセルを固定する機構と、該フローセルを水平方向へ駆動する機構とを有し、
前記ノズルは、該ノズルと前記フローセルとの間の静電容量を測定することを特徴とする、分析装置。
【請求項５】
請求項３に記載の分析装置において、
前記ノズルを覆う導電性の電気シールドが設けられていることを特徴とする、分析装置。
【請求項６】
請求項２に記載の分析装置において、
前記対物レンズの周辺に複数の通電センサを備え、
当該通電センサを用いて液体の状態を電気的に検出することを特徴とする、分析装置。
【請求項７】
請求項６に記載の分析装置において、
前記通電センサは円周上に並んで配置されていることを特徴とする、分析装置。
【請求項８】
請求項６に記載の分析装置において、
前記通電センサは等間隔に並んで配置されていることを特徴とする、分析装置。
【請求項９】
請求項１に記載の分析装置において、
前記ノズルの先端が環状であり、複数の液体吐出口を持つことを特徴とする、分析装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の分析装置において、
前記サンプルは、光透過性を持つフローチップに保持され、当該フローチップは試薬の注入口、排出口、および流路を備え、フローチップの表面が疎水性であり、純水を弾く性質を持つことを特徴とする、分析装置。
【請求項１１】
請求項１０記載の分析装置において、
前記フローチップの流路の上下面に塩基配列の異なる複数のDNA分子が離散的に固定されていることを特徴とする、分析装置。
【請求項１２】
請求項１０記載の分析装置において、
前記フローチップの表面が透明電極膜で被覆されていることを特徴とする、分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分析装置に関わる。より具体的には、液浸対物レンズを用いて光学測定を行う場合にサンプルと対物レンズ間に液体を自動で供給する分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
対物レンズとサンプルの間に自動で純水あるいは油などのカップリング剤を供給する方法について特許文献１に述べられている。この特許ではカップリング剤である液体を、対物レンズとサンプル間に注入する機構を保持している。特に液体が純水である場合には、長期間に渡る計測においては対物レンズ先端の純水が乾燥するという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−２６２１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これまでに液浸対物レンズ先端における液体の検出は光学的測定を用いて行われてきた。しかし、光学的検出方法はコスト高であり、かつスペースを大きくとるために装置の小型化が困難であった。
【０００５】
より具体的に光学検出における問題点を挙げる。特許文献１に示される赤外線発光光学系は対物レンズの光軸に対して60°程度の角度に入射光路と反射光路を設けなければならない。これはそもそもの対物レンズを用いた光学系のスペースを左右方向に大きく拡張することが必要となる。そのため、コストが高くなるという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の分析装置は、サンプルを観察するための対物レンズと、前記対物レンズを光軸方向に駆動する機構と、前記サンプルを照明する光源と、前記対物レンズを介して前記サンプルからの発光を検出する光センサと、前記サンプルと前記対物レンズとの間に液体を供給するノズルと、前記サンプルの温度を調整する手段と、前記サンプルに複数の試薬を供給する手段、を有し、前記液体の状態を電気的に検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の分析装置は、コストを抑え、小型化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】乾燥系対物レンズと液浸対物レンズにおける開口数および分解能について説明図。
【図２】液浸対物レンズにおけるフローチップ流路内の上面と下面の計測方法についての説明図。
【図３】液浸対物レンズを用いたDNAシーケンサの装置全体構成についての説明図。
【図４】静電容量を検知するノズルを用いて対物レンズ下に純水を供給する方法についての説明図。
【図５】静電容量を検知するノズルおよび対物レンズ先端の電通センサを用いて対物レンズ下に純水を供給する方法についての説明図。
【図６】静電容量を検知する、先端が環状であるノズルおよび対物レンズ先端の電通センサを用いて対物レンズ下に純水を供給する方法についての説明図。
【図７】静電容量を検知する対物レンズを用いて対物レンズ下に純水を供給する方法についての説明図。
【図８】対物レンズ先端の電通センサおよびフローチップ表面に塗布した透明電極膜を用いて対物レンズ下に純水を供給する方法についての説明図。
【図９】静電容量を検知するノズルを用いて対物レンズ下に純水を供給する方法についての説明図。
【図１０】静電容量を検知する環状ノズルおよび通電センサを用いて対物レンズ下に純水を供給する方法についての説明図。
【図１１】TDI方式におけるスキャン方式についての説明図。
【図１２】液浸対物レンズを用いて基板上に光学分解能の間隔で格子状に配置した高密度DNA nanoballを検出する方法についての説明図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（乾燥系対物レンズ、および液浸対物レンズについて）
まず、乾燥系対物レンズ、および液浸対物レンズについて説明する。乾燥系対物レンズと液浸（例えば、水浸）対物レンズを用いた顕微鏡計測方法について図1を用いて説明する。
【００１０】
光軸109に垂直に乾燥系対物レンズ104が配置されている。乾燥系対物レンズ104が集光できる最大角度は下記の式で計算することができる。
ＮＡ＝ｎsinθ
【００１１】
ここでNAは対物レンズの開口数であり、対物レンズの種類により異なる。図１（ｃ）に示すように乾燥系対物レンズ104の開口数を0.75とすると、乾燥系対物レンズ104と上板ガラス101の間の媒質は空気であり、その屈折率は１である。これより乾燥系対物レンズ104が集光可能な最大角度θ１は48.6度と算出することができる。この角度は図１（a）のθ１で表現される。図１（ａ）は本発明の比較例である。図１（ｂ）に示すように、水浸対物レンズ114は上板ガラス111の間の空間は純水117で満たされている。図1（c）に示されるように水浸対物レンズ114の開口数は乾燥系対物レンズ101より大きく、1.2である。水浸対物レンズ101の集光可能な最大角度θ2は64.5°と算出することが可能となる。これらの角度はそれぞれの対物レンズが回収できる光線の最大角度を表現したものである。従って液浸対物レンズの集光率は乾燥系よりも優れており、より鮮明が画像を取得できる。また、大きいNAのため、分解能についても液浸対物レンズのほうが優れていることが分かっている。
【００１２】
一方、計測対象となるフローチップは上板ガラス111と下板ガラス112で溶液116を挟み込むことで流路を形成する。本実施例では上板ガラス111の溶液116に接するガラス面に観察対象となる蛍光物質を含むDNA分子113が固定されている。
【００１３】
DNA分子113に適当な励起光が照射されると、DNA分子113に保持された蛍光色素が発光する。蛍光色素より発せられる光は等方的に発光する。乾燥系対物レンズ114方向に発光した光は上板ガラス111に入射し、更に乾燥系対物レンズ114と上板ガラス101との間に存在する空気に入射する。ここで、乾燥系対物レンズ114が集光できる光は少なくとも乾燥系対物レンズ114方向へ進む光であり、フローチップを横方向に進行する光は集光することができない。これはn・sinθ=1.33・sin90°=1.33の光は集光できないということである。従って集光に寄与できる光の開口数は1.33未満であり、これは蛍光物質の環境として存在する純水の屈折率に限定されるということである。
【００１４】
（水浸対物レンズと油浸対物レンズについて）
次に、水浸対物レンズを用いてフローセルの上面と下面を計測する方法について説明する。フローセルの上板ガラス201と下板ガラス204の間には溶液209が挟まれて流路を形成している。溶液209の屈折率は純水と同じ1.33である。従って図２（a）で示される水浸対物レンズ202先端から上板ガラス201の下面までの光路長と、図２（b）で示される下板ガラス209上面までの光路長は等しい。これは純水で満たされた空間で同じ厚さのガラス板を上下に移動させても、対物レンズから計測面までの距離は不変であるということである。
【００１５】
従って図２（a）と図２（b）の光学性能は全く同一となる。これは液浸媒質と流路内の溶液の屈折率が同一であることにより達成される。換言すれば、油浸対物レンズを使用した場合には図２（a）と図２（b）の場合におけるそれぞれの観察面までの光路長は異なる。油浸対物レンズの場合図２（a）で示される状態で対物レンズが設計されているため、観察対象が上板ガラス206下面よりも10μm離れると、画像がぼけてしまう。従って水溶液系の液体を保持した流路内の上面と下面の生体物質の挙動を計測する場合、水浸レンズの採用がより好ましい。
【実施例１】
【００１６】
本発明の第１の実施例として、液浸対物レンズを用いてDNAの塩基配列解析を行うDNAシーケンサの装置（分析装置）構成および計測方法（分析方法）について説明する。
【００１７】
フローチップ301はヒートブロック307にエアーチャックで固定される。ヒートブロック307の下面にはペルチェ素子305が配置され、フローセル301の温調を行う。温度制御範囲は4〜95℃である。温度制御はフローチップ301で酵素反応による塩基伸長、伸長の足場となるプライマの解離などに必要となる。ヒートブロック307内部には温度センサとして測温抵抗体331が配置され、温度制御のフィードバックに使用される。
【００１８】
ヒートシンク306はペルチェ素子305に密着し、ペルチェ素子305の駆動に伴って発生した熱を放熱する。ヒートシンク306からの放熱は冷却された空気を庫内で循環することにより達成される。酵素、4種類の蛍光試薬、バッファ、ヌクレオチド、洗浄液などは冷却庫308に設置され、4℃に冷却される。冷却庫308は装置内のヒートシンク306に冷気を循環し、排熱が可能なように風路が形成されている。風路内には冷気の循環を促進するファン309が配置される。
【００１９】
風路内を循環し、ヒートシンク306で発生した熱を再び冷却庫308まで運ぶことにより効率のいい温調を行うことができる。また、冷却庫308とヒートブロック307の温調を1つの冷却機構で達成できるため、装置の小型化が可能になる。ヒートブロック307およびフローチップ301はXYステージ324に保持されており、フローチップ301を水浸対物レンズ330に対して水平に移動することができる。水浸対物レンズ330はZステージ319に固定され、測定対象物にフォーカスを合わせるために上下に移動することができる。水浸対物レンズ330とフローチップ301の間には純水332が、ノズル314を介して満たされる。ノズル314は静電容量変化を検出することにより純水332の供給量を制御することができる。純水容器310に補充された純水は、チューブ333を介してシリンジ313により送液することができる。流路には逆止弁311および開閉バルブ312が設置され、純水の供給を制御することができる。
【００２０】
DNA鎖の伸長反応はそれぞれ異なる蛍光色素でラベルされた4種類のヌクレオチドおよびポリメラーゼをフローチップ301上で反応させることで行う。各ヌクレオチドはそれぞれ FAM-dCTP, Cy3-dATP, Texas Red -dGTP, Cy5-dTsTPである。各ヌクレオチドの濃度は200nMである。また、反応液は伸張反応が効率よく行なわれるように塩濃度、マグネシウム濃度およびpHが最適化されている。反応溶液中にはポリメラーゼが含まれており、DNA断片に相補的な蛍光ヌクレオチドが1塩基だけ取り込まれる。2塩基目の伸長が発生しないのは、1塩基目の蛍光色素がバルキーであるため、2塩基目の取り込みについて立体障害を起こすからである。1塩基が取り込まれた後、浮遊する蛍光ヌクレオチドを洗浄により除去した後、蛍光計測を行う。なお、以降の最小ユニットの反応を行うために、蛍光計測後、解離溶液により塩基から蛍光色素を解離させる工程が必須である。この工程により、最小ユニットの反応における蛍光色素の立体障害をリセットすることができる。これにより反応の継続が可能となる。再び蛍光ヌクレオチドをフローセル内に送液し、反応を繰り返すことにより、の逐次的なシーケンスが可能となる。本実施例で採用している反応方式はSequence By Synthesisと呼ばれる。
【００２１】
2つのLED316,317は蛍光色素を励起するための光源である。LED316および317の中央波長はそれぞれ490、595nmである。LED316はFAM-dCTP, Cy3-dATPを、LED317はTexas Red -dGTP, Cy5-dTsTPの励起光照射に用いる。ダイクロイックミラー315はLED316,317からの光を同一光軸上に揃える。更にダイクロイックミラー318により励起光は対物レンズ330の瞳面に入射させられる。対物レンズ330を介して励起光はフローチップ301内の蛍光色素に照射され、蛍光を発する。等方的に発光した蛍光の一部分はフローチップ301、純水332を経て対物レンズ330に回収される。対物レンズ330を経た光は平行光となり、ダイクロイックミラー319まで直進し、分割される。ダイクロイックミラー319は4色の蛍光波長領域について緩やかな反射特性を持つ。このため、CMOSカメラ322および324の受光面にはフローチップ上の反応場から発光した輝点の蛍光強度比をそれぞれ算出することができる。2つのCMOSカメラ結像面上での比をとることによって、この発光点が4色のいずれに帰属するかを判定することが可能となる。なおダイクロイックミラー319で分割された平行光はそれぞれエミッションフィルタ320、325を経た後、チューブレンズ321、323でCMOSカメラ322、324の受光面に結像する。
【００２２】
次に、図３における液浸対物レンズに自動的に液体を供給する装置構成および方法について図４を用いて説明する。
【００２３】
フローチップ401は真空チャックによりヒートブロック419に保持される。フローチップ401の水浸対物レンズ402側のカバーガラス面は疎水性であり、水滴を弾く特性を持つ。これは水浸対物レンズ402に純水403を滴下したときにガラス表面に純水403が広がらず、ある接触角を保持しながら液浸対物レンズ402と接触するためである。また、XYステージを用いてフローチップ401内の異なる視野を観察するときにも純水403が移動時の振動などでガラス表面に拡がってしまうなどの問題を回避するのに有用な性質となる。
【００２４】
ヒートブロック419は内部に流路を持ち、流路内には蛍光色素を含んだDNA断片を保持する。水浸対物レンズ402はZステージ410に保持され、フローチップ401に対するフォーカスを調整することができる。ノズル404はZステージ410により保持され、水浸対物レンズ402について間接的に固定され、水浸対物レンズ402およびノズル404の相対距離は一定に保たれる。
【００２５】
ノズル404は外周を電気シールド405で覆われ、同軸二重管構造となっている。ノズル404は導電性の電気シールド405で覆われているため、検出電極であるノズル404先端部の露出面積が最小にされ、これにより静電容量の検出感度を向上させることができる。また、シールド405は磁気シールドにもなっているため、Zステージ410の駆動によって生じる外界からのノイズに起因する液面検出の誤動作を防止することができる。
【００２６】
純粋容器406には純水が保持され、チューブ433を介してノズル404に接続されている。開閉バルブ409を開けシリンジ408を駆動させることで純粋容器406内の純水を汲みだし、ノズル404に対して純水を送液できる。なお、逆止弁407はシリンジ408で加圧された純水の逆流を防止している。これら一連の動作により、ノズル404は水浸対物レンズ402とフローチップ401に純水を供給することで、空間を純水で満たすことができる。水浸対物レンズ402とフローチップ401の間に純水403が満たされると、ノズル404先端とフローチップ401間の静電容量が急激に大きくなる。これにより水浸対物レンズ402先端に純水403が満たされたかどうかについて直接検知できる。なお、より具体的な静電容量変化の検出は、静電容量検出回路411、液面判定回路412、モーター駆動回路414、制御部413より自動化される。なお、フローチップ401は電気的に接地されており、静電容量を計測する場合のグラウンドとなる。また、本実施例では水浸対物レンズ402を用いて説明を行ったが、これは水浸に限定されるものではなく、油浸対物レンズにも適用することが可能である。静電容量は空間を満たす物質の誘電率に依存するため、本実施例の場合、空気と異なる誘電率を持ち物質であれば、原理的に検出可能である。従ってシリンジ408およびノズル404内を満たす液体は油でもよく、原理的には空気と異なる誘電率を持つ物質であれば、検出が可能である。
【実施例２】
【００２７】
本発明の分析装置第２の実施例として、液浸対物レンズに自動的に液体を供給する装置構成および方法について説明する。本実施例では対物レンズのレンズ周辺部に複数の通電センサを配置することで、対物レンズとフローチップ間における液体の供給精度を高めるものである。液浸対物レンズ502には先端のレンズ周辺に4つの通電センサ521が配置されている。なお、純水517に接触する前の通電センサ間の通電を防止するため、水浸対物レンズ502のレンズ以外の先端部526は絶縁状態になっている。
【００２８】
フローチップ501と水浸対物レンズ502との間の静電容量を計測することによりノズル504は純水517を適量供給することができる。しかし、水浸対物レンズ502先端のレンズが純水517に完全に浸されたかどうかについては正確に判定することができない。もしもレンズの一部のみが純水517と接触し、他の一部が純水517ではなく空気と接触している場合には、屈折率が異常であるため良好な画像を取得することができない。従ってレンズ全体が純水517と接触していることが必要となる。本実施例ではこれを達成する手段として4個の通電センサ522, 523, 524, 525を対物レンズ502のレンズ周辺に配置する。これにより、液浸対物レンズ502のレンズ周辺の4点が確実に純水517に接触している場合には、4個のいずれの通電センサ522, 523, 524, 525も通電する。4個全てが通電していない場合は、対物レンズ502と純水517が完全に接触していないことを検知できる。しかし、この手法では液浸対物レンズ502とフローチップ501との接触を保証するものではなく、あくまでも検知しているのは、通電センサ522, 523, 524, 525が純水517と通電状態である。一方、静電容量をノズル504により検知することにより、水浸対物レンズ502とフローチップ501の接触の有無を検知できるが、水浸レンズ502と純水517との接触は直接検知することができない。従って静電容量による検知方法と、通電方法による検知方法を相補的に用いることでフローチップ501と水浸対物レンズ502との間に正確に純水517を供給することができる。
【実施例３】
【００２９】
本発明の分析装置の第３の実施例として、水浸対物レンズに自動的に液体を供給する装置構成および方法について説明する。本実施例では実施例5に加え、液体供給を行うノズルの先端形状を改変した方法について図6を用いて説明する。
【００３０】
ノズル604は先端が環状になっている。装置にノズル604を配置したときにフローチップ601面に向けた下方に純水617を吐出することができる3個の穴を保持する。本実施例ではノズルは環状となっている。ノズルの先端が線状の場合において、フローチップを移動させると水浸対物レンズ602先端の純水617がフローチップに引きずられ、最悪の場合、対物レンズとフローチップの間に空気が混入してしまう。これに対し、ノズル先端を環状部604の形状にすると、フローチップ駆動時においても環状部が純水を保持する土手として働くため、水浸対物レンズ602先端から純水が解離し、空気層が混入するという問題を回避することができる。
【実施例４】
【００３１】
本発明の分析装置の第４の実施例として、水浸対物レンズに自動的に液体を供給する装置構成および方法について説明する。実施例4ではノズルを用いて静電容量を検知しているのに対して、本実施例では水浸対物レンズ702自体を用いて静電容量を検知する。静電容量を計測するセンサとして対物レンズ702を用いる利点を以下に説明する。静電容量の計測の対象は、「水浸対物レンズ702とフローチップ701の間にある純水の有無」である。しかし、図４を用いて示した計測では、「ノズル706とフローチップ701の間にある純水の有無」を検知している。ノズルを液浸対物レンズ702に変換し、静電容量を直接に計測することにより、より正確な計測を行うことが可能となる。この場合、水浸対物レンズ702は静電容量を計測するため、装置本体のグラウンドとは絶縁されている必要がある。そうでなければ、フローチップ701が接地している状態と水浸対物レンズ702が同じ電位になってしまうからである。従って液浸対物レンズ702は、たとえば対物レンズの胴付面のネジ部が樹脂などの絶縁物質で作製されており、装置本体のグラウンドから絶縁されていることが肝要である。また、水浸対物レンズ702はノイズを防止するためにシールドされていることが望ましい。
【実施例５】
【００３２】
本発明の分析装置の第５の実施例として、液浸対物レンズに自動的に液体を供給する装置構成および方法について説明する。本実施例では対物レンズ先端は通電センサを保持し、更にフローチップ801の上板ガラス面には導電性がある透明電極膜(ITO膜)803が塗布されている。この構成において、ノズル804が純水833をフローチップ801の上面である透明電極膜803に滴下する。液浸対物レンズ802とフローチップ801間に純水が満たされたかどうかについては、通電センサ821、823、824、825と透明電極803の間の通電状態を検知することで確認できる。また、純水833が液浸対物レンズ802の先端部を浸したかどうかについても上述した方法で同様に確認することができる。
【００３３】
（液体の供給について）
液浸対物レンズに自動的に液体を供給する装置構成および方法についてより図9を用いて詳細に説明する。
【００３４】
ここでノズル905は静電容量を検知することができる。
a)ではフローチップ902はヒートブロック901上に真空チャックで固定されている。
b)において、フローチップ902に対して液浸対物レンズ904がZステージにより駆動され、所定の位置まで下方に移動する。
c)ではノズル905とフローチップ902間に純水906の供給が開始される。ここではフローチップ902とノズル905先端は接触していないため、静電容量は予め定められたしきい値を超えず、純水906は供給されていないと判断する。
d)において純水907の供給は継続され、純水907はフローチップ902表面に接し、フローチップ902と対物レンズ904の間の静電容量が急激に増大する。静電容量はしきい値を超え、ノズル905は純水907の供給を停止する
e)表面張力で対物レンズ904に吸着していた液滴907は、フローチップ902と接触すると、水特有の強い表面張力のため、対物レンズ904とフローチップ902の間を満たしたまま、フローチップ902表面に落下し、拡がる。このとき、ノズル905先端が純水909と接触できなくなった場合において、ノズル905は純水909の供給を再開する。純水909がノズル905と接触するまで純水909の供給を継続する。純水909がノズル905と接触すると静電容量がしきい値を超え、ノズル905は純水909の供給を停止する。なお、純水909の形状を安定させるためにXYステージを用いてフローセルをステップ状に駆動させることも可能である。
f)光学計測を長時間継続して行うと、次第に純水910の蒸発が発生する。蒸発が進行すると、純水910とノズル905の接触が離れ、ノズル905は静電容量の急激な低下を検知する。これを受け、静電容量がしきい値を超えるまでノズル905は再度純水の供給を行う。これにより、たとえば一週間にわたる長期の計測においても自動で液浸対物レンズ904直下に純水910を供給することで、液浸対物レンズ904を用いた自動計測を行うことが可能となる。また、本実施例で説明した方式は液浸対物レンズ904に限定されるものではなく、油浸対物レンズでも同様に行うことができるものである。
液浸対物レンズに自動的に液体を供給する装置構成および方法についてより図10を用いて詳細に説明する。
【００３５】
本実施例では線状のノズルの代わりに実施例6で用いた環状ノズル1005を用いて純水を対物レンズ1004下に供給する。また、液浸対物レンズ1004先端には通電センサ1006が4個配置されている。また、液浸対物レンズ1004先端は絶縁処理されている。第9の実施例と同様にa)からb)で対物レンズがフローチップ1001に対してフォーカスする位置まで降下する。c)で環状ノズル1005が純水1010をフローチップ1001方向に滴下し始める。なお、実施例6で説明したように、環状ノズル1005には3個の吐出口を保持するため、滴下される液滴の数は3つとなる。d)において純水1007はフローチップ1001と接触し、次第に形状を大きくする。e)において純水1009は液浸対物レンズ1004上の通電センサ1006および環状ノズル1005と接触する。これによりフローチップ1001と液浸対物レンズ1004の間に純水1009が存在することと、液浸対物レンズ1004の先端が純水1009内に浸っていることが確認される。f)において純水の蒸発が進行すると、環状ノズル1005と純水1010の接触が断たれ、純水1010の量が足りないことが検知される。環状ノズル1005は純水の供給を再開し、環状ノズル1005が再び純水1009と接触するまで供給を継続する。これを持って純水1010の乾燥にも関わらず安定した長時間にわたる計測の継続が可能となる。
【００３６】
液浸対物レンズに自動的に液体を供給する機構を用いて、TDI（Time Delay Integration）方式によりフローチップ表面をスキャンする装置構成および方法についてより図11を用いて詳細に説明する。
【００３７】
TDI（Time Delay Integration）は、CCDの特殊な読み出し方式で、一定速度で移動する対象物に対して、その移動方向・速度とCCDの電荷転送方向・速度を合わせた撮像を行う手法である。高速性に加え、移動する対象物を繰り返し（CCDの垂直段数分）露光することで高い感度を得ることができる。このため、TDI方式はエリアセンサではなく、ラインセンサを採用する。
【００３８】
また、従来のエリアセンサではフローチップ流路面に固定された反応場の蛍光計測について、ステップアンドリピートを繰り返す必要があった。この方式ではステージ駆動後にステージの振動が収まるまでの90〜200ミリ秒の間、像ブレが発生するため、蛍光計測ができないという問題があった。この問題は逐次的なXYステージ停止を伴わないTDI方式では、XYステージの停止振動問題は発生しない。従って、ステージ停止後の振動が減衰する時間を省略し、連続して計測を継続することが可能となる。結果としてスループットが増大するという効果をもたらす。
【００３９】
本実施例では開口数0.95、20倍の液浸対物レンズ1105を用いる。開口数0.95の場合の分解能は0.35μm杜なる。また、視野数は26.5mmである。この場合サンプル面での観察領域はφ1.325mmとなる。
また、フローチップ610内には流路611が4レーンある。流路の形状は80×3.5mmである。また、使用するTDIカメラは4096×24画素を持つ。また画素サイズは6×6μmである。従ってサンプル面に投影されるラインセンサの大きさは1.2×0.077mmとなり、対物レンズの観察領域であるφ1.325mmをほぼカバーできる形状となる。流路611は3回のスキャン動作で全領域をカバーできることになる。また、サンプル面上での画素サイズは0.3×0.3μｍとなる。また、TDIカメラは実施例3で詳述したように2個のTDIカメラを用いて、流路内より発する4種類の蛍光色素の判別を蛍光強度比より行う。またTDIカメラは背面照射タイプの撮像素子構造を持ち、ピクセルクロックは30MHzである。仮にTDIカメラ常時動作した状態で計測が行え、かつ反応場の平均密度が1個/25ピクセルと仮定すると、理論上想定されるスループットは30Mピクセル/秒÷25ピクセル/base×60秒×60分×24時間/日=100Gbase/日となる。
【００４０】
より詳細な計測方法を以下に述べる。フローチップ1110はヒートブロック1101上にバキュームチャックされる。液浸対物レンズ1105とフローチップ1110の間には静電容量による液面検知機能を有するノズル1107を介して純水1106が供給される。フローチップ1101は流路1111の端から端までXYステージにより連続的に停止することなく駆動される。XYステージ駆動あるいは時間経過による純水1106の蒸発により、フローセル1110上の純水1106の量が減少した場合は、ノズル1108はしきい値加減より静電容量が低下したことを検知し、速やかに純水1106を供給する。また、移動に伴って純水1106がフローチップ1110表面に残存し、TDI動作の動作時にそれらの純水が再結合し、純水1106の量が増大し、静電容量がしきい値上限を超えた場合には、純水1106の回収を行う。液面検知機能を保持した純水供給ノズル1107により、液浸対物レンズ1105を用いて円滑にTDIラインスキャンによる蛍光画像取得を行うことができる。
【００４１】
環状ノズル1107は純水1106を保持する効果も持つ。純水1106がフローチップ1110の移動方向とは逆方向に引きずる表面張力が発生する場合でも、環状ノズル1107が外周方向より純水1106を保持しようとする力が働くため、TDIのような連続的な動作環境下でも本実施例で説明した液浸対物レンズによるTDI計測法は問題なく機能する。
【００４２】
基板に格子状に高密度にDNA分子を固定し、液浸対物レンズを用いてシーケンシングする方法について図12を用いて以下に説明する。
【００４３】
基板1201にはシリコンウェハより切り出した、25×75mmのスライドガラスの形状を持つ。基板1201表面には直径300nmのアミノシラン修飾されたDNA結合面1202が390nmピッチで格子状に規則正しく形成されている。アミノシランはDNA分子と効率よく吸着することが知られており、DNAチップなどの表面修飾に積極的に用いられている。また、DNA非結合面1203はDNAと吸着しない性質を持つHMDS(=hexamehyldisilzane)で修飾されている。従ってDNA分子を基板上に注入すると、DNA分子はDNA結合面1204にのみ積極的に結合し、DNA非結合面1203には結合しない。現在の半導体技術では45nmの線幅を露光できるため、上述したDNA結合面1202を390nmピッチに格子状に保持する基板1201の製造は容易に達成することができる。
【００４４】
また、Science, vo327, pp78, 2010に詳しいように試験管内で直径300nmのDNAナノボール1202を2×1010個/mLの濃度で合成することが可能である。これらのDNAナノボール1202はそれぞれ固有の1個のDNA断片が増幅されているため、DNAナノボール1202にプライマを結合させ、塩基伸長を逐次的に進行させることで塩基配列解析が可能であることも知られている。また、DNAナノボール1202は直径300nmの直径を保持している一方、基板1201上で結合できるDNA結合面1204の直径も同様に300nmである。従って１つのDNA結合面1204に2つのDNAナノボール1202は体積排除効果により、結合することができない。つまり、１つのDNA結合面1204には1つのDNAナノボール1202のみ結合する。従ってDNAナノボール1202を基板上に350nmピッチに最密充填した形で光学計測を行うことができる。
【００４５】
本実施例では開口数1.2である60×の液浸対物レンズを採用する。開口数1.2の対物レンズの分解能はδ=0.61×550nm/開口数で計算することができ、この場合分解能は280nmであることが示される。従って390nmピッチで基板に配置されたDNAナノボール1202を光学的に識別することが可能である。乾燥系対物レンズの開口数は最大でも0.9程度であるため、この場合の分解能は370nmであるため、390nmのピッチで配置されたDNAナノボール1202を光学的に識別できない。従って直径300nmのDNAナノボールを390nmピッチで格子状に配置した場合に光学検出を行うためには、液浸対物レンズを使用することが必須となる。また、開口数0.75の乾燥系対物レンズと比較して開口数1.2の液浸対物レンズを用いると、立体角による集光効率を0.09から0.28まで上昇させるため、信号強度を3.2倍まで高めることができる。これは塩基配列の解析精度向上に寄与する。
【００４６】
光信号を検出するセンサとして、画素サイズ6.5μm、2048×2048画素数を持つCMOSカメラを採用する。センサによる検出を行う。一般に異なる反応場を精度よく判別にするためには反応場の大きさに辺方向について2画素以上を割り当てることが望ましい。本実施例においては、サンプル面に投影される画素サイズは0.11μm/ピクセルとなり、反応場の間隔である350nmについて3ピクセルを割り当てることができるため、良好な光学検出を行うことが可能となる。液浸対物レンズの視野数は26.5mmであるため、サンプル面での光学的に計測可能な領域は26.5/60=φ440μmとなる。サンプル面に投影されるCCD面の大きさは222μm角であるため、全てのCCD面を検出に用いることが可能である。従って0.35μmピッチではCCD一視野あたり403×103の反応場を計測することが可能となる。一反応場あたり80baseの塩基伸長が可能であると仮定すると、一視野あたり32Mbaseの塩基配列解析が可能となる。FOVあたりに励起光を照射する領域を440μm /√2として312μm、かつスライドガラス面の80%の面積にナノボールを固定できると仮定する。この場合、32Mbase/FOV × 12000FOV/slide ≒ 400Gbase/slide程度の読取塩基数を得ることができる。さらに流路の上面および下面にナノボールを固定できるとすると読取塩基数は800Gbase/slideとなる。
【符号の説明】
【００４７】
101, 111, 201, 207…上板ガラス
102, 112, 204, 209…下板ガラス
103, 113…DNA分子
104…乾燥系対物レンズ
109…光軸
106, 116, 204, 208…溶液
117, 203, 206,332, 403, 517, 617, 906, 909, 910, 1007, 1009, 1010, 1106…純水
115, 202, 209, 330, 402, 502, 702, 802, 904, 1004, 1105…水浸対物レンズ
301, 401, 501, 601, 701, 801, 902, 1001, 1110…フローチップ
307, 419, 901, 1101…ヒートブロック
305…ペルチェ素子
306…ヒートシンク
308…冷却庫
324…XYステージ
319, 410…Zステージ
314, 404, 504, 706, 804, 905,…ノズル
310, 406…純水容器
333…チューブ
313, 408…シリンジ
311, 407…逆止弁
312, 409…開閉バルブ
316, 317…LED
318, 319…ダイクロイックミラー
322, 324…CMOSカメラ
320, 325…エミッションフィルタ
321, 323…チューブレンズ
405…電気シールド
411…静電容量検出回路
412…液面判定回路
413…制御部
414…モーター駆動回路
521,522, 523, 524, 525, 821, 823, 824, 825, 1006…通電センサ
803…透明電極膜
907…液滴
604,1005, 1107…環状ノズル
1111…流路
1202…DNAナノボール
1204…DNA結合面
1203…DNA非結合面
1201…基板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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