(57)【要約】      （修正有）【課題】培養温度よりも融点が高く、且つ、培養温度において水への溶解度の低い脂肪酸類、及び油脂類、またはそれらの混合物などを炭素源として利用して、微生物の生産や微生物による微生物代謝産物の製造を、工業的に効率よく行う方法を提供する。また、上記炭素源を用いて、工業的に効率よくPHAを製造する方法を提供する。【解決手段】培養温度よりも融点が高く、且つ25℃での水への溶解度が10g/L以下の炭素源を用いる微生物の培養方法であって、前記炭素源の比表面積を20cm2/g以上にする工程を含むことを特徴とする微生物の培養方法。また、該培養方法を用いた微生物の培養工程を含むことを特徴とする微生物代謝産物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養温度よりも融点が高く、且つ25℃での水への溶解度が10g/L以下の炭素源を用いる微生物の培養方法であって、
前記炭素源の比表面積を20cm2/g以上にする工程を含むことを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項２】
前記炭素源の比表面積を20cm2/g以上にする工程が、前記炭素源を培地に添加する前に予め乳化する工程であることを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
予め乳化された前記炭素源の乳化物中における油分が、10％〜70％であることを特徴とする請求項２に記載の培養方法。
【請求項４】
前記炭素源として乳化活性を有する炭素源を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項５】
前記炭素源として微生物によって資化可能な乳化剤を含む炭素源を用いることを特徴とする請求項４に記載の培養方法。
【請求項６】
前記炭素源として前記炭素源全量に対してモノグリセライドとジグリセライドの総量を0.1重量％以上含む炭素源を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項７】
前記炭素源にレシチンを0.01〜10重量％添加することを特徴とする請求項４〜６のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項８】
前記炭素源の融点が、培養温度よりも２℃以上高いことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項９】
前記炭素源が、油脂類、脂肪酸類、及び／又はそれらの混合物であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１０】
前記油脂類、脂肪酸類、及び／又はそれらの混合物が、パーム油に由来することを特徴とする請求項９に記載の培養方法。
【請求項１１】
前記微生物が、バクテリアであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１２】
前記微生物が、Cupriavidus属又はEsherichia属に属する微生物であることを特徴とする請求項１１に記載の培養方法。
【請求項１３】
前記微生物が、Cupriavidus属に属する微生物であることを特徴とする請求項１２に記載の培養方法。
【請求項１４】
前記微生物が、Cupriavidus necatorであることを特徴とする請求項１３に記載の培養方法。
【請求項１５】
前記微生物が、Esherichia属に属する微生物であることを特徴とする請求項１２に記載の培養方法。
【請求項１６】
前記微生物が、Esherichia coliであることを特徴とする請求項１５に記載の培養方法。
【請求項１７】
前記微生物が、酵母であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の培養方法を用いた微生物の培養工程を含むことを特徴とする微生物代謝産物の製造方法。
【請求項１９】
前記微生物代謝産物が、PHAであることを特徴とする請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記PHAが、PHBHであることを特徴とする請求項１９に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養温度よりも融点が高く、且つ、水への溶解度（以下、溶解度）が極めて低い炭素源を微生物が好適に資化できる乳化状態で利用して、微生物の生産や微生物によるポリヒドロキシアルカノエート（以下、PHA）の生産を工業的に効率よく行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境問題、食糧問題、健康・安全に対する意識の高まり、天然／自然志向の高まりなどを背景に、微生物の生産や微生物による物質製造（発酵生産、バイオ変換など）の意義・重要性が益々高まっている。
【０００３】
微生物の生産や微生物による物質の製造においては、微生物によって好適に資化される炭素源（培養、発酵などのための炭素源）が必要である。その炭素源の代表的なものとして、糖質、油脂（例えば、動植物油脂）、脂肪酸（例えば、動植物由来の脂肪酸）などが挙げられる。
【０００４】
しかしながら、培養温度よりも融点が高く、かつ、水への溶解度が極めて低い油脂や脂肪酸などの炭素源は培養液中で固化してしまうことから、微生物の資化性が低く、好適に利用することが出来なかった。例えば、高融点であるラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸などの脂肪酸の溶解度は、最も水への溶解度の高いラウリン酸でも0.1g/L以下であり、また、パルミチン酸、ステアリン酸などは1μM以下の濃度で凝集してしまう（非特許文献１）。これらの性質は、微生物による資化性を低下させてしまう原因である。培養温度よりも融点の高い炭素源を利用した例として、脂肪酸やその塩を利用したPHAの生産例が挙げられる。例えば、Aeromonas hydrophilaをラウリン酸を単独で炭素源として用いて培養し、PHAを生産した例（非特許文献２）が挙げられるが、乾燥菌体量は約8g/Lと好適に利用されているとは言えず、また、ラウリン酸は培養温度で固体であることが、培養の難易度を高めていると記載されている。
【０００５】
また、Ralstonia eutropha（現在の分類でCupriavidus necator）をラウリン酸やミリスチン酸を単独で炭素源として用いて培養し、PHAを生産した例（特許文献１）が報告されているが、PHA生産性は1g/L以下と低く、炭素源として好適に利用しているとは言えない。
【０００６】
さらに、Escherichia coliをラウリン酸ナトリウムなどの脂肪酸金属塩を単独で炭素源として用いて培養し、PHAを生産した例（非特許文献３）があるが、ラウリン酸ナトリウムの使用量は2g/LL程度であった。
【０００７】
また、AeromonascaviaeのPHBH合成酵素遺伝子を導入したRalstonia eutropha（現在の分類でCupriavidus necator）を用い、低溶解度の油脂を用いたPHAの生産研究が行われている。該研究では、培養温度（30℃）よりも融点の高いパーム油を用いているが、乾燥菌体量は培養72時間で4.1g/Lと低く、好適に利用されているとは言えない（非特許文献４）。パーム油は融点36℃程度の固体油脂であり、パーム油やその構成成分である脂肪酸やその誘導体を微生物の炭素源として好適に利用する技術を開発することは本発明の課題の１つであった。
【０００８】
また、溶解度が低い炭素源を効率的に利用する技術として、サンフラワー油をセラミック製の膜を通しながら、培養液中に供すことで、溶解度の低い油を培地中で微分散させる方法が報告されている（非特許文献５）。該文献では、Pseudomonas属細菌を用いた、界面活性剤やPHAの製造例が記載されている。この技術は膜を使用するという特徴を有するため、培養温度で液体の炭素源に適用範囲が限られるといった課題があり、また、乳化状態ではないため、分散後に粒子が融合することで微分散状態が維持されないことが予想される。
【０００９】
さらに、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸を乳化処理することによって、該脂肪酸からのＬ−スレオニン、Ｌ−リジンの発酵生産性を向上させた例も報告されている（特許文献２）。該技術では、培養温度よりも融点の高いラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸を用いた培養方法が記載されている。しかしながら、アミノ酸の生産性は改善するものの、生菌数が減る例があり、細胞中にPHAを蓄積させる本生産技術には不適であった。さらには、例えばパルミチン酸に対するオレイン酸の含有比が減少することにより、生産性の低下が引き起こされることが記載されていることから、適用範囲が限定される。
【００１０】
さらに、パーム油に乳化剤としてアラビアガム（GA）添加し、乳化することで、培養開始時のラグタイムを短縮する試みが報告されている。しかしながら、概研究におけるGAの効果は明確ではなく、また、脂肪酸系の乳化剤であるSDSや、TritonX-100は微生物の生育を阻害してしまうことが記載されている。また、概文献では、乳化した炭素源を用いることで微生物の生育速度が向上したとの記載はなく、さらに、GAを用いて乳化することは経済性の観点から工業生産への適用は困難であると記載されている。（非特許文献６）。
【００１１】
炭素源の融点を制御する培養技術としては、油脂や脂肪酸、またはそれらの混合物を原料に用いたPHAの効率的生産例が挙げられる（特許文献３）。該技術では複数の脂肪酸、油脂混合物を用いることで炭素源の融点を低下させる方法が記載されているが、炭素源の融点が培養温度よりも高い場合は、炭素源の融点と培養温度の温度差が大きいほど微生物による資化性低下が認められることから、使用可能な炭素源が限定的であった。上記のように、培養温度よりも融点が高く、且つ、溶解度の低い炭素源を好適に利用し、微生物の生産や微生物による物質の生産を工業的に効率よく行うには課題が残されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国公開公報20020086377号
【特許文献２】特開2008-167746公報
【特許文献３】国際公開公報WO2010/113497号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Henrik Vorum., et.al., .Biochmicaet Biophysica Acta, 1126: 135-142 (1992)
【非特許文献２】Lee S., et.al., Biotechnol. Bioeng., 67:240-244 (2000)
【非特許文献３】Regina V., et.al., FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, 111-117 (2000)
【非特許文献４】T.Fukui., et.al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 49:333-336 (1998)
【非特許文献５】Anuj Dhariwal, et.al., Bioprocess Biosyst. Eng., 31:401-409 (2008)
【非特許文献６】Charles F.Budde, et.al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 89:1611-1619 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、培養温度よりも融点が高く、且つ、培養温度において水への溶解度の低い脂肪酸類、及び油脂類、またはそれらの混合物などを炭素源として利用して、微生物の生産や微生物による微生物代謝産物の製造を、工業的に効率よく行う方法を提供することを課題とする。また、上記炭素源を用いて、工業的に効率よくPHAを製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、培養温度よりも融点が高く、且つ、培養温度において水への溶解度の低い炭素源を利用し、微生物の生産や、微生物を用いた物質生産を工業的に効率よく行なうための検討を鋭意行なった。その結果、炭素源をある一定の比表面積以上に調整して培養に供することにより、培養温度よりも融点の高い炭素源を微生物が好適に資化できることを見出し、さらに該炭素源を利用して、微生物の生産や微生物によるPHAの生産を工業的に効率的に行なえることを発見し、本発明を完成させた。
【００１６】
本発明の特徴の一つは、培養温度よりも融点が高く、且つ25℃での水への溶解度が10g/L以下の炭素源を用いる微生物の培養方法であって、前記炭素源の比表面積を20cm2/g以上にする工程を含むことを特徴とする微生物の培養方法である。
【００１７】
本発明の別の特徴の一つは、炭素源を培地に添加する前に予め乳化することを特徴とする上記の培養方法である。
【００１８】
本発明の別の特徴の一つは、予め乳化された前記炭素源の乳化物中における油分が、10％〜70％であることを特徴とする上記の培養方法である。
【００１９】
本発明の別の特徴の一つは、前記炭素源として乳化活性を有する炭素源を用いることを特徴とする上記の培養方法である。
【００２０】
本発明の別の特徴の一つは、前記炭素源として微生物によって資化可能な乳化剤を含む炭素源を用いることを特徴とする上記の培養方法である。
【００２１】
本発明の別の特徴の一つは、前記炭素源として前記炭素源全量に対してモノグリセライドとジグリセライドの総量を0.1重量％以上含む炭素源を用いることを特徴とする上記の培養方法である。
【００２２】
本発明の別の特徴の一つは、前記炭素源にレシチンを0.01〜10重量％添加することを特徴とする上記の培養方法である。
【００２３】
本発明の別の特徴の一つは、前記炭素源の融点が、培養温度よりも２℃以上高いことを特徴とする上記の培養方法である。
【００２４】
本発明の別の特徴の一つは、前記炭素源が、油脂類、脂肪酸類、及び／又はそれらの混合物であることを特徴とする上記の培養方法である。
【００２５】
本発明の別の特徴の一つは、前記油脂類、脂肪酸類、及び／又はそれらの混合物が、パーム油に由来することを特徴とする上記の培養方法である。
【００２６】
本発明の別の特徴の一つは、前記微生物が、バクテリアであることを特徴とする上記の培養方法である。
【００２７】
本発明の別の特徴の一つは、前記微生物が、Cupriavidus属又はEsherichia属に属する微生物であることを特徴とする上記の培養方法である。
【００２８】
本発明の別の特徴の一つは、前記微生物が、Cupriavidus属に属する微生物であることを特徴とする上記の培養方法である。
【００２９】
本発明の別の特徴の一つは、前記微生物が、Cupriavidus necatorであることを特徴とする上記の培養方法である。
【００３０】
本発明の別の特徴の一つは、前記微生物が、Esherichia属に属する微生物であることを特徴とする上記の培養方法である。
【００３１】
本発明の別の特徴の一つは、前記微生物が、Esherichia coliであることを特徴とする上記の培養方法である。
【００３２】
本発明の別の特徴の一つは、前記微生物が、酵母であることを特徴とする上記の培養方法である。
【００３３】
本発明の別の特徴の一つは、上記のいずれかに記載の培養方法を用いた微生物の培養工程を含むことを特徴とする微生物代謝産物の製造方法である。
【００３４】
本発明の別の特徴の一つは、前記微生物代謝産物が、PHAであることを特徴とする上記の製造方法である。特にPHAとしては３−ヒドロキシ酪酸（以下、3HBと略す）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、PHBと略す）、3HBと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、3HHと略す）の共重合体（以下、PHBHと略す）が挙げられる。
【００３５】
また、本発明においては環境への負荷を考慮し、該炭素源が非石油由来であることが好ましい。例えば植物油としては高融点の脂肪酸をその構成単位とするパーム油、及びパーム油を構成する脂肪酸などが挙げられる。
【００３６】
また、本発明に用いられる微生物は、古細菌、バクテリア、酵母、カビ、放線菌などが考えられる。
【００３７】
また、本発明に用いる微生物としては該炭素源を資化する微生物であれば、特に限定されないが、Cupriavidus属、Escherichia属、または、Aeromonas属に属する微生物が好ましい。
【発明の効果】
【００３８】
本発明をもちいることで、培養温度における水への溶解度が低く、かつ、培養温度よりも融点の高い炭素源を微生物が好適に資化できる炭素源として利用し、微生物の生産や微生物によるＰＨＡの生産を工業的に効率よく行うことが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４０】
微生物の生産や、微生物を用いた物質生産において、一般に、グルコースやシュークロースなどの糖質のように、水への溶解度が高い炭素源を用いる場合、通常の操作条件において炭素源は微生物の培養に用いる培養液等の液中に溶解しており、炭素源として利用しやすい。
【００４１】
一方、再生可能資源である動植物由来の脂肪酸類や油脂類は微生物の生産や、微生物によるPHA等の物質生産に有用な炭素源であるが、一般に、水への溶解度が低いために微生物培養の炭素源として利用し難く、特に培養温度より融点が高く、培養液中で固体の性状を示す炭素源は、微生物にとって好適に利用し難い。
【００４２】
近年、常温で固体であるパーム油は、安定性が高く、価格競争力もあることから年々生産量が増加している。それに伴い、油脂の精製時に副産物として生成する脂肪酸類も年々増加している。こういった培養温度より融点が高く、かつ培地に低溶解性の油脂類、脂肪酸類を微生物の炭素源として利用することが望まれているが、融点が高いために培地中で固化してしまい培養槽内での分散性が悪くなり、微生物が有効に利用することは極めて困難であった。
【００４３】
しかしながら、本発明を用いることにより、これら炭素源を極めて有効に利用できる。特に25℃での水への溶解度が10g/L以下の炭素源を好適に利用できる。また、25℃での水への溶解度が1 g/L以下の炭素源であっても好適に利用できる。更に、25℃での水への溶解度が0.1g/L以下の炭素源であっても好適に利用できる。
【００４４】
本発明における炭素源は、培養に供される際に比表面積が大きくなるように調整して添加することにより、培地中での分散性が良好になり微生物によって好適に資化される。また、本発明では、水中油型乳化物の形態で炭素源の比表面積が大きくなるように事前に調整することがより好ましく、こういった処理によって、比表面積が20cm2/g以上に制御された炭素源を用いた培養方法である。
【００４５】
本発明における「乳化」とは、互いに溶け合わない２つ以上の物質を攪拌するなどして一方を他方の中へ分散させた状態を指す。例えば、水と油脂、水と脂肪酸、水と油脂と脂肪酸の混合物などが物質として挙げられる。また、本発明による乳化とは、２つ以上の物質が同相である必要は無く、例えば連続相が液体、分散相が固体などの状態においても乳化と定義する。
【００４６】
本発明で用いられる炭素源としては、微生物の培養温度よりも融点が高く、通常では微生物が利用しにくい形態のものであれば特に限定されず、融点が培養温度よりも2℃以上高い炭素源では一般的には培地への分散性が悪いため本発明による分散性向上効果が高い。より好ましくは融点が培養温度より5℃以上高い炭素源、さらに好ましくは融点が培養温度より10℃以上高い炭素源では、一般的な方法では炭素源の培地での分散性が悪いためより効果的である。例えば融点が32℃以上の炭素源を好適に利用できる。また、融点が35℃以上の炭素源を好適に利用できる。さらには、36℃以上、39℃以上、40℃以上、42℃以上、44℃以上の炭素源を好適に利用できる。
【００４７】
また、本発明における炭素源とは、使用する微生物の種類や、微生物によって製造するPHAの種類、培養の諸条件（培地成分、pＨ、培養温度など）によって異なり、必ずしも一律に規定できないが、微生物が資化可能であり、水への溶解度が窮めて低く、かつ融点が培養温度よりも高い炭素源であれば、本発明の効果を発揮可能である。
【００４８】
また、培養温度よりも融点が高く、且つ25℃での水への溶解度が10g/L以下の炭素源としては、好ましくは油脂類、脂肪酸類、及び／又はそれらの混合物が挙げられる。もちろん、培養温度よりも融点が低い炭素源や、25℃での水への溶解度が10g/Lを超える炭素源を併用しても構わない。
【００４９】
油脂類としては、トリグリセライド、ジグリセライド、モノグリセライド等の脂肪酸グリセリンエステル等が挙げられ、これらが単独又は混合物であっても良い。用いる微生物が代謝経路を持つ油脂類であれば本発明で好適に用い得る。
【００５０】
脂肪酸類としては、遊離脂肪酸の他に、脂肪酸塩、脂肪酸エステル等が挙げられ、これらが単独又は混合物であっても良い。用いる微生物が代謝経路を持つ脂肪酸類であれば本発明で好適に用い得ることが可能であり、微生物が利用する際に加水分解する必要が無いことから、微生物が利用しやすい形態としては油脂類より脂肪酸類の方がより好ましい。
【００５１】
また、油脂類、脂肪酸類、及び／又はそれらの混合物は、本発明においては環境への負荷を考慮し、非石油由来であることが好ましく、一般的に動植物油類ならびに動植物油由来の脂肪酸類であることが好ましい。さらに好ましくは、食料問題への影響を考慮し、非可食用途の油脂類、脂肪酸類を用いることがより望ましい。
【００５２】
動植物油の例としては、牛脂、豚脂、乳脂、魚油、大豆油、菜種油、ひまわり油、オリーブ油、ゴマ油、キャノーラ油、綿実油、米油、サフラワー油、ヤシ油、パーム油、パーム核油、シア脂、サル脂、イリッペ脂、カカオ脂、ヤトロファ油、これらの油脂の分別油、硬化油、エステル交換油や、その構成成分である脂肪酸、脂肪酸塩、脂肪酸エステルなどが挙げられ、これら油脂は単独又は２種類以上の組み合わせで用いることが出来る。
【００５３】
また、上記油脂を精製処理する過程で副産物として生成する成分を利用することは、食糧との競合を避ける上で好ましい。
【００５４】
精製処理における副産物としては、アルカリ脱酸工程で生成する脂肪酸塩類、蒸留脱酸工程で生成する蒸留残渣、脱臭工程で生成する蒸留残渣などが挙げられる。
【００５５】
脂肪酸塩類としては脂肪酸ナトリウムや脂肪酸カリウム、脂肪酸カルシウム、脂肪酸マグネシウム等が挙げられる。
【００５６】
蒸留残渣としては、主成分である脂肪酸の他に、モノグリセライド、ジグリセライド等を含んでも良い。
【００５７】
更に、微生物が利用しやすい形態としては、炭素源中の脂肪酸類の割合が高いことが好ましく、脂肪酸類が炭素源に対して5％以上含まれていることが好ましく、より好ましくは30％以上、更に好ましくは50％以上、特に好ましくは70％以上含まれていることが好ましい。
【００５８】
しかしながら、上記組成はあくまで好適な炭素源の例であり、本発明は上記炭素源に限定されない。また、上記炭素源には必要に応じて他の成分を加えても良い。
【００５９】
本発明において、培養液中に添加した炭素源の比表面積を大きくすることにより、培養温度よりも融点が高く、かつ培地に低溶解性の炭素源を微生物によって好適に資化させることが可能になる。
【００６０】
炭素源の比表面積を大きくする方法としては、特に限定はしないが、炭素源を固化させた後、物理的に分散させる方法や、水中油型乳化物の形態で炭素源の比表面積を大きくした後に培養液に添加する方法が挙げられる。
【００６１】
培養温度よりも融点が高く、かつ培地に低溶解性の炭素源を微生物によって資化させるに好適な炭素源の比表面積は、20cm2/g以上であることが好ましく、より好ましくは300cm2/g以上、更に好ましくは1000cm2/g、特に好ましくは3000cm2/g、最も好ましくは40000cm2/g以上の表面積であることが望ましい。炭素源の比表面積が20cm2/g以下だと、培地に添加した炭素源の培地中における分散が良好でなく、微生物によって良好に利用されないことがある。比表面積の大きさは大きいほど培地中における炭素源の分散性が良好になり、微生物によって好適に資化されるため、比表面積の大きさに特に上限は無いが、比表面積の大きい水中油型乳化物を製造する際の経済性を加味して最適な比表面積を選択することがより好ましい。
【００６２】
炭素源を固化させる方法としては、温度を炭素源の融点以下に下げることにより固化させても良いし、油脂類や脂肪酸類をアルカリ金属塩とを反応させることにより、脂肪酸の金属塩を形成させて固化させても良い。
【００６３】
固化させた炭素源の比表面積を大きくする方法としては、固化した炭素源を微細な孔を通過させながら、所望の比表面積になるように刃などでカットする方法等が挙げられる。また、融解させた炭素源を融点以下の温度の培地に滴下、固化させることによっても製造することが出来る。
【００６４】
炭素源を固化させ比表面積を大きくする処理を行なう時期は、予め処理を行なってから培養槽に添加しても良いし、培養槽内で処理を行なっても良い。融点以下の培地に融解した炭素源を滴下して比表面積を大きくする方法では、直接培養槽内で処理を行なうのが効率的であり好ましい。
【００６５】
本発明においては、予め水中油型乳化物の形態に調整して比表面積を高めた炭素源を微生物の培養に用いることができる。
【００６６】
予め作製する水中油型乳化物の油分は、乳化物の安定性を考慮すると、3％〜70％であることが好ましい。一方、商業的な微生物生産、ならびに微生物を用いた物質生産においては、しばしば、培養期間中に炭素源を簡潔、または連続的に培養槽に添加することが行なわれる。その際、追加で添加される培地中の炭素源濃度が低いと、培養液量が増加し生産性が損なわれる恐れがあるため、予め作製される水中油型乳化物の油分は、より好ましくは10％〜65％、更に好ましくは20％〜60％、特に好ましくは40％〜60％の油分であることが望ましい。また、いうまでも無く、水中油型乳化物の油分が60％以上であれば炭素源として極めて有効に利用可能である。
【００６７】
水中油型乳化物の製造方法は、特に限定しないが、従来公知の水中油型乳化物の製造方法が利用できる。
【００６８】
例えば、プロペラ等を用いた攪拌機や、スタティックミキサーのようなインラインミキサーを用いた方法や、複数の分散盤を組み合わせることで乳化する方法。予め予備乳化を行なった後、TK、ウルトラミキサー、クレアミックス、コロイドミル、高圧ホモジナイザー、マイクロフルイダイザー、アルティマイザー、ナノマイザー、エマルダー等の均質化処理機を用いた製造方法等が利用できる。こういった均質化処理は２回以上行なってもよい。また、超音波乳化機を用いることもできる。
【００６９】
培養温度よりも融点が高く、かつ培地に低溶解性の炭素源を油相部に含む水中油型乳化物を培養に利用する方法は、特に限定しないが、予め水中油型乳化物を作製した後タンク等に保持した後培地に添加しても良いし、別々に用意した原料タンクから水相と油相を同一のラインに供給し、インラインで乳化を行なった後に培地に添加しても良い。
【００７０】
また、本発明の水中油型乳化物の製造には、乳化を安定化させる目的で乳化剤を用いることができる。
【００７１】
例えば、モノグリセライドやジグリセライドのようなグリセリン脂肪酸エステル；酢酸モノグリセライド、乳酸モノグリセライド、クエン酸モノグリセライド、コハク酸モノグリセライド、ジアセチルモノグリセライドのような有機酸モノグリセライド；ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン縮合リシノール酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、レシチン、分別レシチン、酵素処理レシチン、サポニン、アラビアガムやキサンタンガムのような多糖類；カゼインナトリウムや大豆タンパク質、グルテン部分分解物のようなたんぱく質等が利用できるが、微生物による資化が不可能な乳化剤は培養後に不純物として残存するため好ましくないことは言うまでもない。そのため、本発明にて選択される炭素源は使用する微生物によって資化されるものが好ましく、また、炭素源が油脂、又は、脂肪酸であるという観点から、本発明における乳化剤としては、油脂、又は、脂肪酸と同じグリセリンや脂肪酸から構成され、微生物によって資化可能である乳化剤が好ましく、モノグリセライド、ジグリセライド、レシチンなどが特に好ましい。炭素源を水中油型乳化物の形態で利用するにあたっては、原料炭素源由来のモノグリセライド、ジグリセライドが含まれていることが有効であり、モノグリセライドとジグリセライドの総量が、炭素源に対して0.1％以上含まれていることが好ましく、より好ましくは0.3％以上、更に好ましくは0.5％、特に好ましくは0.7％以上、最も好ましくは1％以上含まれていることが好ましい。また、モノグリセライド、ジグリセライド、レシチン等の乳化剤は別途添加しても構わない。
【００７２】
本発明における、レシチンとは、リン脂質のことであり、レシチン、分別レシチン、酵素処理レシチンなどを指す。
【００７３】
本発明における炭素源に対するレシチンの添加量は経済性も考慮して、0.01〜10重量％が好ましく、上限値についてより好ましくは1重量％以下、さらに好ましくは0.5重量％以下、特に好ましくは0.3重量％以下である。
【００７４】
しかしながら、経済性なども考慮すると、乳化剤等の添加を行なわないことがより好ましいことは言うまでも無く、乳化活性を有する炭素源を用いることが意義深い。
【００７５】
ＰＨＡは、多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として産生・蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在、環境への意識の高まりから非石油由来のプラスチックが注目されるなか、特に、微生物が菌体内に産生・蓄積するＰＨＡは、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響が小さいと予想されており、その実用化が切望されているため、本発明を用いて生産する物質の好例の一つである。
【００７６】
本発明の微生物の生産、また、微生物によるPHAの製造に用いられる微生物としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、及び、油脂などを資化可能で、かつＰＨＡを生産可能な微生物であれば特に限定はないが、天然から単離された微生物や、遺伝子操作された微生物等を好適に使用できる。
【００７７】
具体的には、カピリアビダス・ネケータ（Cupriavidus necator）等のカピリアビダス属、アルカリゲネス・ラタス（Alcaligenes latas）等のアルカリゲネス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonasfluorescens）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・レジノボランス（Pseudomonas resinovorans）、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）等のシュードモナス属、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）等のバチルス属、アゾトバクター属、ノカルディア属、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）等のアエロモナス属、ラルストニア（Ralstonia）属、ワウテルシア（Wautersia）属、コマモナス（Comamonas）属などが挙げられる（Microbiological Reviews, 54(4), 450-472 (1990)）。
【００７８】
これら微生物等の他にも遺伝子工学的な手法を用いて、PHA合成酵素遺伝子等を導入することにより、人為的にPHAを生産させる改変を施した生物細胞を用いることもできる。例えば、上記カピリアビダス属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、バチルス属、アゾトバクター属、ノカルディア属、アエロモナス属、ラルストニア属、ワウテルシア（Wautersia）属、コマモナス（Comamonas）属などに属する微生物のほかにも、エシェリキア（Escherichia）属等のグラム陰性の細菌、バチルス（Bacillus）属等のグラム陽性の細菌、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ヤロウィア（Yarrowia）属、キャンディダ（Candida）属等の酵母類などを好適に用いて人為的にPHAを生産させる改変を施した生物細胞を得ることができる。
【００７９】
PHAの中でもPHBHの生産に関しては、例えばAeromonas caviaeやAeromonas hydrophilaなど元来PHBHを生産する微生物を用いる方法や、元来PHBHを生産しない微生物に遺伝子工学的な手法を用いて、PHA合成酵素遺伝子等を導入することにより、人為的にPHBHを生産させる改変を施した生物細胞を用いることもできる。遺伝子を導入するホスト微生物としては、たとえばCupriavidus necatorを好適に用いることができる。また、PHA合成酵素遺伝子としてはAeromonas caviae、Aeromonas hydrophilaやChromobacterium sp.由来のPHA合成酵素遺伝子やそれらの改変体などを用いることができる。改変体としてはアミノ酸基が欠失、付加、挿入、若しくは置換されたPHA合成酵素をコードする塩基配列などを用いることができる。
【００８０】
PHAの種類としては、微生物が生産するPHAであれば特に限定されないが、好ましくは、炭素数４〜１６の３−ヒドロキシアルカン酸から選択される構成成分の重合体や炭素数４〜１６の３−ヒドロキシアルカン酸から選択される２種以上の構成成分の共重合体が良い。例えば炭素数４の３−ヒドロキアルカン酸のホモポリマーであるポリ３−ヒドロキシブチレート（PHB）、炭素数４と６の３−ヒドロキシアルカン酸のコポリマーであるポリ（３−ヒドロキシブチレート‐コ‐３−ヒドロキシヘキサノエート）（PHBH）、炭素数４と５の３−ヒドロキシアルカン酸のコポリマーであるポリ（３−ヒドロキシブチレート‐コ‐３−ヒドロキシバレレート（PHBV）、炭素数４〜１４の３−ヒドロキシアルカン酸の重合体などが挙げられる。
【００８１】
培養方法としては、培地に炭素源を添加する方法を用いる微生物の培養方法であれば、培地組成、炭素源の添加方法、培養スケール、通気攪拌条件や培養温度、培養時間などに一切限定されないが、連続的、または、間欠的に培地に炭素源を添加する培養方法がより好ましい。ただし、使用する培地は培養槽にて攪拌できる状態である必要がある。この条件を満たす限り、液体培地であっても、２相に分離する培地であっても、懸濁液状態の培地であっても、本発明に用いることができる。
【００８２】
本発明のPHAの製造方法は、上述した培養方法によって微生物内にPHAを蓄積させ、その後、周知の方法を用いて菌体からPHAを回収すれば良い。例えば、次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてPHAを抽出する。このPHAを含んだ溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてPHAを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてPHAを回収する方法などが挙げられる。
【００８３】
本発明における融点とは、上昇融点のことを指す。
【００８４】
本発明において、炭素源の上昇融点は以下の方法で測定する事が出来る。
（１）内径1mm、外形2mm以下、長さ50〜80mm、両端が開いている毛細管の一端を完全に融解した試料につけて10mmの高さまで試料をみたし、速やかに氷片等で固化させる。
（２）10℃以下で24h、あるいは氷上で1h放置した後試験に供する。
（３）上昇融点測定器（ELEX SCIENTIFIC社製 EX-871A）に毛細管をセットする。
（４）予想される融点よりも約20℃低い温度の水を満たした容器に毛細管を浸し、温度計の下端を水面下30mmの深さに置く。
（５）容器内の水を適当な方法でかき混ぜながら、最初は2℃/minずつ水温が上昇するように加熱する。
（６）予想される融点の約10℃低い温度に達した後は0.5℃/minずつ水温が上昇するように加熱する。
（７）試料が毛細管中で上昇を始める温度を上昇融点とする。
【００８５】
本発明において、資化性の向上とは、時間当たりの炭素源の消費量が増加し、その結果、微生物菌体の生産量や微生物が産生する物質の生産量が増加することを意味する。また、本発明における炭素源は、培地に添加する際にすでに混合物であって良いし、別々に添加して培地内で混合しても良い。
【００８６】
微生物菌体の生産量は吸光度法や乾燥菌体重量測定法などの公知の方法で測定でき、また、微生物が産生する物質の生産量はGC法、HPLC法などの公知の方法で測定できる。細胞中に蓄積されたPHAの含量は、加藤らの方法（Appl.MicroBiol.Biotechnol.,45巻、363頁、（1996）；Bull.Chem.Soc.,69巻、515頁（1996））に従い、培養細胞からクロロホルムなどの有機溶媒を用いて抽出し、乾燥することで測定出来る。
【実施例】
【００８７】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【００８８】
（実験例１）炭素源中のジグリセライド、モノグリセライド含量の測定
基準油脂分析試験法「2.4.6.1-1996  トリアシルグリセリン組成（ガスクロマトグラフ法）」に準じて行なった。
【００８９】
（実験例２）固化炭素源の比表面積の測定
培地に分散した固化炭素源の画像を、デジタルマイクロスコープVHX（キーエンス社製）を用いて撮影した後、画像処理ソフト（Image-J（アメリカ国立衛生研究所(NIH)製））を用いて粒子個数と各粒子面積をデータ化し、得られた分散粒子の平均面積から求めた円相当平均径に基づき、固化炭素源の比表面積を算出した。
【００９０】
（実験例３）乳化炭素源の比表面積の測定
予め乳化処理を行なった炭素源の比表面積の測定は、レーザー回折／散乱式粒度分布測定装置  LA-920（堀場製作所製）を用いて粒径分布測定を行い、得られた平均粒子径を基に比表面積を算出した。
【００９１】
実施例にて使用した炭素源PFAD（Palm Fatty Acid Distillate、MALAYSIAN BIOTECHNOLOGY CORPORATION SDN BDHより入手）、及びCPO（Crude Palm Oil、MALAYSIAN BIOTECHNOLOGY CORPORATION SDN BDHより入手）のジグリセライド（DG）、モノグリセライド（MG）、トリグリセライド（TG）含量、及び遊離脂肪酸（FFA）含量とその脂肪酸組成を表１に示した。また、製造例１〜１３で製造した炭素源の分析結果を表２に示した。なお表２〜６中の油分とは、乳化物中の油分（W/W（％））を指す。
【００９２】
【表１】
2015002678.tif 000002
【００９３】
【表２】
2015002678.tif 000003
【００９４】
（製造例１）固化PFADの作製
70℃に加熱したPFADを、出口直径2mmのラインを用いて実施例１、８、１９及び２９で使用する培地に滴下供給して固化PFADを作製した。培地中のPFADの比表面積を実験例２に記載の方法にて測定したところ、22cm2/gであった。
【００９５】
（製造例２）固化PFADの作製
PFADを滴下するラインに出口直径4mmのラインを用いて参考例１、２、４及び６で使用する培地に滴下供給して固化PFADを作製した。培養液中のPFADの比表面積を実験例２に記載の方法にて測定したところ、10cm2/gであった。
【００９６】
（製造例３）CPOの乳化
60℃に加熱したCPO及び水各50gを等量混合後、ケミスターラーを用いて攪拌数500rpmにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ300cm2/gであった。
【００９７】
（製造例４）PFADの乳化
60℃に加熱したPFAD及び水各50gを等量混合後、ケミスターラーを用いて攪拌数500rpmにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ300cm2/gであった。
【００９８】
（製造例５）CPOの乳化
60℃に加熱したCPO及び水各50gを等量混合後、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数1800rpmにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ3300cm2/gであった。
【００９９】
（製造例６）PFADの乳化
60℃に加熱したPFAD及び水各50gを等量混合し、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数1800rpmにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ3000cm2/gであった。
【０１００】
（製造例７）CPOの乳化
60℃に加熱したCPO10g及び水90gを混合し、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数1800rpmにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ3400cm2/gであった。
【０１０１】
（製造例８）PFADの乳化
60℃に加熱したPFAD10g及び水90gを混合し、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数1800rpmにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ3300cm2/gであった。
【０１０２】
（製造例９）CPOの乳化
60℃に加熱したCPO及び水各200gを混合し、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数2500rpmにて予備乳化を行った。予備乳化後の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ3200cm2/gであった。
【０１０３】
さらに、この予備乳化液を高圧ホモジナイザー（PANDA2K型、ニロ・ソアビ社製）にて圧力10barrにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ25000cm2/gであった。
【０１０４】
（製造例１０）PFADの乳化
60℃に加熱したPFAD及び水各200gを混合後、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数2500rpmにて予備乳化を行った。予備乳化後の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ3200cm2/gであった。
【０１０５】
さらに、この予備乳化液を高圧ホモジナイザー（PANDA2K型、ニロ・ソアビ社製）にて圧力10barrにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ22000cm2/gであった。
【０１０６】
（製造例１１）CPOの乳化
60℃に加熱したCPO2gと水98gとを混合後、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数1800rpmにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ3600cm2/gであった。
【０１０７】
（製造例１２）MG、DG、非存在化での乳化検討
表３に記載の脂肪酸混合物50gを60℃に加熱したのち、水50gを混合し、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数1800rpmにて乳化操作を行った。しかしながら、乳化状態を保持しにくく、乳化物を得ることは出来なかった。
【０１０８】
【表３】
2015002678.tif 000004
【０１０９】
（製造例１３）乳化剤を用いたPFADの乳化
乳化剤としてレシチン（Yelikin TS、ARCHER DANIELS MIDLAND社製）0.2重量％を混合したPFAD、及び水、各200gを混合後、ホモミキサー（SILVERSON社製、LABORATORY MIXER EMULSIFIER）を用いて攪拌数2500rpmにて予備乳化を行った。予備乳化後の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ4000cm2/gであった。
【０１１０】
さらに、この予備乳化液を高圧ホモジナイザー（PANDA2K型、ニロ・ソアビ社製）にて圧力10barrにて乳化操作を行い、乳化物を得た。乳化物中の乳化炭素源の比表面積を実験例３に記載の方法にて測定したところ44000cm2/gであった。
【０１１１】
（実施例１〜７、参考例１）大腸菌を用いた培養
E. coli HB101株（タカラバイオ社製）を用いた培養検討を行なった。前培地はLB培地（10g/L Bacto-tryptone、5g/L Bacto-yeast extract、5g/L NaCl）を用いた。生育試験にはM9培地（6g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl、1mM MgSO4、0.001w/v% Thiamine、0.1mM CaCl2）を用いた。E. coli HB101株のグリセロールストックを前培地に接種して37℃にて12時間培養し、前培養を行なった。次に前培養液を、製造例１、２、４、６、８、１０、１１、又は１３の固化炭素源又は乳化炭素源を含む50mLのM9培地を入れた500ml用の坂口フラスコに2v/v％で接種し、37℃で96時間振とう培養した。固化炭素源は上記M9培地に直接滴下し作製した。また、乳化炭素源は別途作製したものを坂口フラスコ内に一括添加した。炭素源濃度は0.5w/v％にて行った。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。結果を表４に示した。
【０１１２】
【表４】
2015002678.tif 000005
【０１１３】
（実施例８〜１８、参考例２〜３）C. necator PHB-4株を用いた培養
Cupriavidus necator PHB-4株（DSM541、DSMZより入手）を用いた培養検討を行なった。この株はPHAを合成しない株である。前培地組成は、1w/v% Meat-extract、1w/v% Bacto-tryptone、0.2w/v% Yeast extract、0.9 w/v% Na2HPO4・12H2O、0.15 w/v% KH2PO4、（pH6.8）とした。
【０１１４】
生育試験培地の組成は1.1w/v% Na2HPO4・12H2O、0.19 w/v% KH2PO4、1.29w/v% (NH4)2SO4、0.1w/v% MgSO4・7H2O、0.5v/v% 微量金属塩溶液（0.1N塩酸に1.6w/v% FeCl3・6H2O、1w/v% CaCl2・2H2O、0.02w/v% CoCl2・6H2O、0.016w/v%CuSO4・5H2O、0.012w/v%NiCl2・6H2Oを溶かしたもの）とした。
【０１１５】
Cupriavidus necator PHB-4株のグリセロールストックを前培地に接種して12時間培養し前培養を行なった。次に前培養液を製造例１〜１３のいずれかの固化炭素源、乳化炭素源又は脂肪酸混合物を含む50mlの生育試験培地を入れた500ml用の坂口フラスコに2v/v％で接種し、30℃で24時間振とう培養した。固化炭素源は生育試験培地に直接滴下し作製した（製造例１、及び２に記載）。また、乳化炭素源および脂肪酸混合物は別途作製したものを坂口フラスコ内に一括添加した。炭素源濃度は1.0w/v％にて行った。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。結果を表５に示した。
【０１１６】
【表５】
2015002678.tif 000006
【０１１７】
（実施例１９〜２８、参考例４〜５）Candida maltosaAHU-71 pARR-149/171NSx2  -phbB株を用いたPHA生産
製造例１〜１０、１２、及び１３のいずれかの固化炭素源、乳化炭素源又は脂肪酸組成物を炭素源に用いてPHAの生産を行なった。
【０１１８】
実験にはCandida maltosaAHU-71 pARR-149/171NSx2-phbB株（国際公開公報WO2005/085415号明細書参照）を用いた。
【０１１９】
前培地はYNB培地（0.67w/v% Yeast Nitrogen base without amino acid、2w/v% Glucose）を用いた。PHA生産培地にはM2培地（12.75g/L (NH4)2SO4、1.56g/L KH2PO4、0.33g/L K2HPO4・3H2O、0.08g/L KCl、0.5g/L NaCl、0.41g/L MgSO4・7H2O、0.4 g/L Ca(NO3)2・4H2O、0.01g/L FeCl3・4H2O）に、0.45ml/Lの微量金属塩溶液（0.1N塩酸に1g/L FeSO4・7H2O、8g/L ZnSO4・7H2O、6.4g/L MnSO4・4H2O、0.8g/L CuSO4・5H2Oを溶かしたもの）を添加した培地を用いた。
【０１２０】
Candida maltosa AHU-71 pARR-149/171NSx2-phbB株のグリセロールストックを50mlの前培地を入れた500ml用の坂口フラスコに500μl接種した。これを培養温度30℃で20時間培養した。次に培養液を300mlのPHA生産培地を入れた2L用の坂口フラスコに10v/v％で接種し、30℃で48時間振とう培養した。固化炭素源は上記M9培地に直接滴下し作製した。また、乳化炭素源および脂肪酸混合物は別途作製したものを坂口フラスコ内に一括添加した。培養は炭素源濃度2.0w/v％にて行った。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄し、凍結乾燥し、得られた乾燥菌体重量を測定した。
【０１２１】
得られた乾燥菌体約1gに100mlのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のPHAを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が約30mlになるまで濃縮し、その後、約90mlのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、1時間放置した。析出したPHAをろ別後、50℃で3時間真空乾燥した。乾燥PHAの重量を測定し、菌体内のポリマー含量を算出した。乾燥菌体重量、PHA生産量を表６に示した。
【０１２２】
【表６】
2015002678.tif 000007
【０１２３】
生産されたPHAのモノマー組成分析は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥PHAの20mgに2mlの硫酸−メタノール混液（15:85）と2mlのクロロホルムを添加して密栓し、100℃で140分間加熱することでPHA分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに1.5gの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。4mlのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のPHA分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所GC-17A、キャピラリーカラムはGLサイエンス社製NEUTRA BOND-1（カラム長25m、カラム内径0.25mm、液膜厚０．４μm）を用いた。キャリアガスとしてHeを用い、カラム入口圧100kPaとし、サンプルは1μlを注入した。温度条件は、初発温度100〜200℃まで8℃／分の速度で昇温、さらに200〜290℃まで30℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、炭素数４及び６の３−ヒドロキシアルカン酸モノマーから構成されるPHA（PHBH）である事が確認された。
【０１２４】
（実施例２９〜３５、参考例６〜１０）KNK-005株を用いたＰＨＡ生産
実験にはKNK-005株（米国特許7,384,766号明細書参照）を用いた。
【０１２５】
種母培地の組成は1w/v% Meat-extract、1w/v% Bacto-tryptone、0.2w/v% Yeast extract、0.9 w/v% Na2HPO4・12H2O、0.15 w/v% KH2PO4、（pH6.8）とした。
【０１２６】
前培養培地の組成は1.1w/v% Na2HPO4・12H2O、0.19 w/v% KH2PO4、1.29w/v% (NH4)2SO4、0.1w/v% MgSO4・7H2O、2.5w/v% パームオレインオイル、0.5v/v% 微量金属塩溶液（0.1N塩酸に1.6w/v% FeCl3・6H2O、1w/v% CaCl2・2H2O、0.02w/v% CoCl2・6H2O、0.016w/v%CuSO4・5H2O、0.012w/v%NiCl2・6H2Oを溶かしたもの）、とした。炭素源はパームオレインオイルを10g/Lの濃度で一括添加した。
【０１２７】
PHA生産培地の組成は0.385w/v% Na2HPO4・12H2O、0.067w/v% KH2PO4、0.291w/v% (NH4)2SO4、0.1w/v% MgSO4・7H2O、0.5v/v% 微量金属塩溶液（0.1N塩酸に1.6w/v% FeCl3・6H2O、1w/v% CaCl2・2H2O、0.02w/v% CoCl2・6H2O、0.016w/v%CuSO4・5H2O、0.012w/v%NiCl2・6H2Oを溶かしたもの）とした。
【０１２８】
まず、KNK-005株のグリセロールストック（50μl）を種母培地（10ml）に接種して24時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を1.8Lの前培養培地を入れた3Lジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製MDL-300型）に1.0v/v％接種した。運転条件は、培養温度28℃、攪拌速度500rpm、通気量1.8L/minとし、pHは6.7〜6.8の間でコントロールしながら28時間培養し、前培養を行なった。pHコントロールには14％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
【０１２９】
次に、前培養液を2.5LのPHA生産培地を入れた5Lジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製MDS-U50型）に5.0v/v％接種した。運転条件は、培養温度28℃、攪拌速度400rpm、通気量2.1L/minとし、pHは6.7から6.8の間でコントロールした。pHコントロールには14％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源（製造例１、２、及び４〜１３）は断続的に添加した。培養は64時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
【０１３０】
得られた乾燥菌体1gに100mlのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のPHAを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が30mlになるまで濃縮後、90mlのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、1時間放置した。析出したPHAをろ別後、50℃で3時間真空乾燥した。乾燥PHAの重量を測定し、菌体内のポリマー含量を算出した。
【０１３１】
乾燥菌体重量、PHA生産量を表７に示した。
【０１３２】
【表７】
2015002678.tif 000008
【０１３３】
生産されたPHAのモノマー組成分析は実施例１５〜２３及び参考例７〜９と同様の方法にて分析した。その結果、炭素数４及び６の３−ヒドロキシアルカン酸モノマーから構成されるPHA（PHBH）である事が確認された。
【０１３４】
以上の結果より、表面積が比表面積20cm2/g以上であれば、比較的良好な資化性が達成されることが明らかとなった。また、MG、DGが含まれていない場合は乳化が困難であり、資化性が低下することが明らかとなった。また、乳化物中の油分含量（油脂、及び脂肪酸含量の合計）が少ないと所定の生産物量を達成することは不可能であることが明らかとなった。