(57)【要約】      （修正有）【課題】バイオ燃料、機能性油、機能性(健康)食品、養殖用餌料など製造に有用な新規微細藻類の提供。【解決手段】リノレン酸などの機能性油を含有し、乾燥重量の１８％以上の燃料油を産生することを特徴とする（ａ）〜（ｄ）のいずれかの微細藻類。（ａ）クラミドモナスｓｐ．ＴＡ−１（ｂ）ナノフラストゥラムｓｐ．ＴＡ−２（ｃ）テトラセルミスｓｐ．ＴＡ−３（ｄ）クロレラｓｐ．ＴＡ−４【選択図】図１
2015231363.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性油を含有し、乾燥重量の１８％以上の燃料油を産生することを特徴とする（ａ）〜（ｄ）のいずれかの微細藻類。
（ａ）クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄ）ｓｐ．ＴＡ−１
（ｂ）ナノフラストゥラム（Ｎａｎｏｆｒｕｓｔｕｌｕｍ）ｓｐ．ＴＡ−２
（ｃ）テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）ｓｐ．ＴＡ−３
（ｄ）クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ｓｐ．ＴＡ−４
【請求項２】
機能性油がリノレン酸である請求項１に記載の微細藻類。
【請求項３】
クラミドモナスｓｐ．ＴＡ−１が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２６３である請求項１または２に記載の微細藻類。
【請求項４】
ナノフラストゥラムｓｐ．ＴＡ−２である請求項１または２に記載の微細藻類。
【請求項５】
テトラセルミスｓｐ．ＴＡ−３が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２６４のテトラセルミスである請求項１または２に記載の微細藻類。
【請求項６】
クロレラｓｐ．ＴＡ−４が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２６５のクロレラである請求項１または２に記載の微細藻類。
【請求項７】
（ａ）〜（ｄ）のいずれかの微細藻類を使用することを特徴とする機能性油の製造法。
（ａ）クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄ）ｓｐ．ＴＡ−１
（ｂ）ナノフラストゥラム（Ｎａｎｏｆｒｕｓｔｕｌｕｍ）ｓｐ．ＴＡ−２
（ｃ）テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）ｓｐ．ＴＡ−３
（ｄ）クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ｓｐ．ＴＡ−４
【請求項８】
機能性油がリノレン酸である請求項７に記載の機能性油の製造法。
【請求項９】
（ａ）〜（ｄ）のいずれかの微細藻類を使用することを特徴とする燃料油の製造法。
（ａ）クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄ）ｓｐ．ＴＡ−１
（ｂ）ナノフラストゥラム（Ｎａｎｏｆｒｕｓｔｕｌｕｍ）ｓｐ．ＴＡ−２
（ｃ）テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）ｓｐ．ＴＡ−３
（ｄ）クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ｓｐ．ＴＡ−４
【請求項１０】
燃料油が微細藻類の乾燥重量の１８％以上である請求項９に記載の燃料油の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ燃料となる油および機能性を有する油を産生する微細藻類に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
石油資源の枯渇と温室効果ガスの削減の面から、バイオマス燃料の開発に高い関心が集まり、現在、微細藻類から燃料油を生産する研究がなされている（非特許文献１）。一方で、微細藻類の多くは、リノレン酸、ドコサヘキサセン酸、エイコサペンタエン酸などのω６やω３−不飽和脂肪酸を産生する（非特許文献２、３）。それらの不飽和脂肪酸が様々な機能性を有することから、健康・機能性食品や医薬品等への利用が注目されており、事業化の可能性を高めるため、新規微細藻種(藻株)の探索が進められている
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Biotechnology Advances 25 (2007) 294-306
【非特許文献２】Journal of Experimental Sciences 2011, 2(10);29-49
【非特許文献３】PLoS ONE 7(7) e40751 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のように、燃料油として炭化水素あるいは機能性油を産生する微細藻種(藻株)のさらなる単離が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、富山湾の海水中の微細藻類の探索を行い、その中に燃料油製造が容易な油脂類および機能性油を産生するものを見出し、単離・特定し本発明を完成した。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００６】
本発明は、機能性油を含有し、乾燥重量の１８％以上の燃料油を産生することを特徴とする（ａ）〜（ｄ）のいずれかの微細藻類である。
（ａ）クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄ）ｓｐ．ＴＡ−１
（ｂ）ナノフラストゥラム（Ｎａｎｏｆｒｕｓｔｕｌｕｍ）ｓｐ．ＴＡ−２
（ｃ）テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）ｓｐ．ＴＡ−３
（ｄ）クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ｓｐ．ＴＡ−４
【０００７】
本発明のクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄ）ｓｐ．ＴＡ−１は、以下の特徴を有する。
・形態は楕円形（タマゴ型）で、黄緑色をしている。
・浮遊する細胞の出現がある。
・大きさは長軸14〜15μm、短軸10〜11μm
・液体培地、寒天培地で増殖し、培養初期には鮮やかな緑色を呈するが、1週間前後で黄色味が強くなる。寒天培地上では円形のコロニーを形成するが、液体培地よりも増殖速度が遅い。培養時間の経過とともに、細胞体内に形成される油滴の数が増加する。
・乾燥重量の約20%。総油量の約66-80%が燃料油になる。α-リノレン酸、γ-リノレン酸などの機能性油を総油量の約7-27%産生する。
・図２（配列番号１）の１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子を有する
・最近縁種は、以下の微細藻類である。
i)Chlamydomonad sp. Tow 2/24 P-6w  AY220093  549/557 (99%)
【０００８】
本発明のナノフラストゥラム（Ｎａｎｏｆｒｕｓｔｕｌｕｍ）ｓｐ．ＴＡ−２は、以下の特徴を有する。
・形態は直方体で、細胞分裂後に分かれず、連結しているものが多く、10個体を超える連結もある。
・液体培地、寒天培地で増殖するが、寒天培地での増殖は遅い。寒天培地上では不定形で硬いコロニーを形成する。細胞の色は薄い褐色で、長期間の培養で黒味を帯びてくる。培養初期から細胞体内に油滴を複数形成する。培養液を静置すると短時間で沈殿する。
・乾燥重量の約34%。総油量の約75%が燃料油になる。γ-リノレン酸・ジホモγ-リノレン酸を総油量の約10%、ＥＰＡ異性体を総油量の約6%産生する。
・大きさ：長さ15.5〜16.5μm、幅8.5〜9.5μm
・図４（配列番号２）の１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子を有する
・最近縁種は、以下の微細藻類である。
i) Nanofrustulum cf. shiloi strain CCMP2649 HQ912578  1,746/1,747 (99.9%)ii) Opephora guenter-grassii    AB436781    1,727/1,747 (98.9%)iii) Opephora sp. s0357   AB430604   1,726/1,747 (98.8%)
【０００９】
本発明のテトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）ｓｐ．ＴＡ−３は、以下の特徴を有する。
・形態は楕円形で、サイズも大きく、緑色をしている。
・大きさは、長軸20〜21μm、短軸18.5〜19.5μm
・液体培地、寒天培地で増殖する。寒天培地上では円形で緑色のコロニーを形成する。培養時間の経過とともに、細胞体内に形成される油滴の数が増加する。培養液を静置すると短時間で沈殿する。
・乾燥重量の約19%。総油量の約30%が燃料油になる。α-リノレン酸を総油量の約24%、γ-リノレン酸を総油量の約24%、アラキドン酸を総油量の約24%産生する。
大きさ：長軸20〜21μm、短軸18.5〜19.5μm
・図６（配列番号３）の１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子を有する
・最近縁種は、以下の微細藻類である。
i)Tetraselmis sp. AC 254   JX195104  540/541 (99%)
ii)T. striata 70802   540/541 (99%)
iii)Tetraselmis sp. RG-07 U41900   539/541 (99%)
・二枚貝であるイガイの餌料になる。
【００１０】
本発明のクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ｓｐ．ＴＡ−４は、以下の特徴を有する。
・形態は楕円形で、サイズは小さく、鮮やかな緑色をしている。
・大きさ：長軸8〜9μm、短軸6〜7μm
・液体培地、寒天培地で増殖する。増殖速度が速い（倍加時間5時間）。寒天培地上では円形で鮮緑色のコロニーを形成する。窒素を含む培地から窒素を含まない培地へ移植すると、時間の経過とともに細胞体内に形成される油滴の数が増加する。また、硫黄を含む培地から硫黄を含まない培地に移植すると水素を産生する。
・乾燥重量の約18-22%。総油量の約57%が燃料油になる。α-リノレン酸を総油量の約43％産生する。
・図８（配列番号４）の１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子を有する
・最近縁種は、以下の微細藻類である。
i)Chlorella vulgaris      AB080308  1729/1730 (99%)
ii)Chlorella sorokiniana   AB080307  1729/1730 (99%)
【発明の効果】
【００１１】
本発明の4種の微細藻類は、バイオ燃料として有用な燃料油および機能性油として有用な各種の高級脂肪酸を産生する。本発明の微細藻類を用いることにより、燃料油および機能性油を同時にかつ、容易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄ）ｓｐ．ＴＡ−１の写真である。上段は位相差顕微鏡像、下段はNile Redで染色後の蛍光顕微鏡像である。
【図２】クラミドモナス ｓｐ．ＴＡ−１の１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列である。
【図３】ナノフラストゥラム（Ｎａｎｏｆｒｕｓｔｕｌｕｍ）ｓｐ．ＴＡ−２の写真である。上段は位相差顕微鏡像、下段はNile Redで染色後の蛍光顕微鏡像である。
【図４】ナノフラストゥラム ｓｐ．ＴＡ−２の１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列である。
【図５】テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）ｓｐ．ＴＡ−３の写真である。左図は位相差顕微鏡像、右図はNile Redで染色後の蛍光顕微鏡像である。
【図６】テトラセルミス ｓｐ．ＴＡ−３の１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列である。
【図７】クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ｓｐ．ＴＡ−４の写真である。上段は位相差顕微鏡像で、中段はNile Redで染色後の蛍光顕微鏡像、下段は、蛍光顕微鏡像の拡大である。
【図８】クロレラ ｓｐ．ＴＡ−４の１８Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の全配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施例により説明する。
実施例１
＜微細藻類の選別＞
富山湾沿岸域の岩瀬漁港、四方漁港（富山市)、海老江浜（射水市）などから採水した海水を滅菌済みのポリエチレンビンに入れ、氷冷しながら研究室に持ち帰った。次に、各海水を0.45μmのポリカーボネートメンブレンフィルターで減圧濾過し、フィルター上に微細藻類を含む微生物を捕獲した。そして、そのフィルターごと、KWSW培地（表１）、ドナリエラ用培地（表２）、SGI培地（表３）などが入った培養液に入れ、白色蛍光灯下でエアレーションしながら培養した。その結果、微細藻類が増殖し、緑色または褐色に濁った培養液の一部を、上記各培地で作製した1.5%(w/v)寒天培地上に塗布し、白色蛍光灯下で培養した。寒天培地上に塗布された微細藻類が増殖し、形成された個々のコロニーを単離することで微細藻類の選別・単離（単一種化）を行った。
【００１４】
【表１】
2015231363.tif 000003
【００１５】
【表２】
2015231363.tif 000004
【００１６】
【表３】
2015231363.tif 000005
【００１７】
＜藻類の培養＞
藻類の培養は、上記のKWSW培地、ドナリエラ用培地、SGI培地などが入った培養液に入れ、白色蛍光灯下でエアレーションしながら培養した。必要に応じて、各培地で作製した寒天培地上でも培養し、例えば各藻類株の継代培養や選別のためのコロニー形成を行った。
【００１８】
＜藻類の同定＞
各単離株の種の同定を、18S-rRNA遺伝子の塩基配列の一部を解析し、BLAST検索に掛けることにより行った。
ＴＡ−１及びＴＡ−３は，液体培地で培養した試料をそれぞれ1ml採取し, 12,000rpmで5分間遠心し, 細胞を集め, DWで置換した。その懸濁液を10分間沸騰水中に置くことでDNAを抽出した。
一方，ＴＡ−２及びＴＡ−４は，100μLの滅菌超純水に1つのコロニーを懸濁させ、 100℃の熱水中で10分間加熱し、 その懸濁液を12,000rpmで5分間遠心し、その上清に各株のコロニーからDNAを抽出した（熱水抽出法）。
これらのDNA溶液をテンプレートとして, 18S-rRNA遺伝子のほぼ全長を増幅するプライマーSR-1(配列番号５：TACCTGGTTGATCCTGCCAG)とSR-12 (配列番号６：CCTTCCGCAGGTTCACCTAC) を用いてPCRにかけた。続いて, その増幅産物をテンプレートとしてそれぞれのプライマーを用いてnested PCRを行った。PCRには，サーマルサイクラ− (Takara PCR Thermal Cycler Dice; タカラバイオ) を用い，PCR反応液には、×1buffer、200μM dNTP、0.25μM プライマーｆ、0.25μM プライマーr、0.5U Ex Taq HS（タカラバイオ）、1μL鋳型DNA（計20μL）を用いた。DNAの増幅プログラムは94℃で3分間の熱変性を1回させた後、94℃で1分間の熱変性、60℃で1分間のアニーリング、72℃で1分間の伸長反応のサイクルを35回繰り返した後、72℃で3分間の伸長反応を1回させて、4℃で保存する設定とした。
次に, それぞれのPCR反応で得た増幅産物を, QIAquick PCR Purification Kit (キアゲン) を用いて精製し, BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) のプロトコルに従ってサイクルシークエンス反応を行った。反応後に得られた産物をエタノール沈殿させた後, 風乾させたDNAをHi-Di Formamide (Applied Biosystems) に溶解させ, ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) を用いて塩基配列の解析を行った。得られた塩基配列を、BLAST (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/)で検索することによって種の同定を行った。
【００１９】
＜燃料油・機能性油の分析・抽出＞
微細藻類中の油脂成分は、培養した各藻類の凍結乾燥試料1〜30 mgを秤量した後、キャップ付きの耐圧試験管に入れた。そこへ、BF3-Methanol溶液を0.4mL入れ、100℃で40分間反応させることにより、微細藻類に含まれる中性脂肪酸を、脂肪酸メチル(バイオディーゼルフューエル成分)へ変換した。反応終了後冷却し、反応液中へペンタンを入れることにより、生成した脂肪酸メチルをペンタン層へ移した。一定時間放置後、ペンタン層を回収した。このペンタン抽出を数回繰り返した。その後、得られたペンタン抽出液を揮発させ、脂肪酸メチルを残渣とした回収した。この残渣をヘキサンに溶解させ、脂肪酸分析の試料とした。
一方、微細藻類中の炭化水素成分は、凍結乾燥試料1〜30 mgを秤量した後、ビーズ入りアシストチューブに入れた。そこへ、0.1M水酸化カリウムのメタノール液1.0mLを入れた後、キャップ付きの試験管に入れ、80℃で90分間反応させることによりケン化させた。反応終了後冷却し、反応液中へ水 1.0mLを加えて撹拌し、さらに、ヘキサン2mLを入れて撹拌した後、静置し、ヘキサン層をキャップ付きの試験管に回収した。キャップを開けたまま乾燥器内でヘキサンを気化させた後、トリメチルシリル(TMS)化剤を50μL加え、キャップをした後60℃で30〜60分間放置した。その後、水0.5mL加え混合した後、ヘキサン0.5mL加えた。ヘキサン層を1.5mLバイアルに移し、ヘキサンを気化させた後、そこへ正確にヘキサン1mLを加え、炭化水素の試料とした。
分析は、キャピラリーガスクロマトグラフィー(GC、GC-2010 島津製作所)を用いて分析した。脂肪酸の分析は、InertCAP WAX (GLサイエンス、30m、内径0.25mm)カラムを用いて分析した。また、炭化水素成分の分析は、DB-1ms(SEG、内径0.25mm)カラムを用いて分析した。また、いずれも検出器はFIDを使用し、キャリアーガスはヘリウムガスを用いた。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明の微細藻類は、バイオ燃料、機能性油、機能性(健康)食品、養殖用餌料など製造に有用である。
【図１】
2015231363.tif 000006
【図２】
2015231363.tif 000007
【図３】
2015231363.tif 000008
【図４】
2015231363.tif 000009
【図５】
2015231363.tif 000010
【図６】
2015231363.tif 000011
【図７】
2015231363.tif 000012
【図８】
2015231363.tif 000013
【配列表】
2015231363000001.app