(57)【要約】【課題】再生医療に用いられる細胞の輸送及び／又は保管中、細胞の活性を容易に維持可能な培養細胞格納容器を提供する。【解決手段】  格納容器１と、格納容器の内部の酸素濃度を７体積％以下又は２体積％以下にする雰囲気調整剤２と、格納容器に格納される、細胞が培養される培養容器３と、を備える、培養細胞格納容器であって、所定の時間培養後の細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、雰囲気の酸素濃度が２１体積％である場合の細胞のｐ１６遺伝子の発現量と比較して少ない、細胞輸送及び／又は保管用の培養細胞格納容器。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
格納容器と、
前記格納容器の内部の酸素濃度を７体積％以下にする雰囲気調整剤と、
前記格納容器に格納される、細胞が培養される培養容器と、
を備える、
培養細胞格納容器であって、
７２時間培養後の前記細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、雰囲気の酸素濃度が２１体積％である場合の前記細胞のｐ１６遺伝子の発現量と比較して少ない、
細胞輸送及び／又は保管用の培養細胞格納容器。
【請求項２】
前記雰囲気調整剤による格納容器内部の酸素濃度が７体積％以下であり、前記細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、酸素濃度が２１体積％である場合と比較して７５％以下である、請求項１記載の培養細胞格納容器。
【請求項３】
前記雰囲気調整剤による格納容器内部の酸素濃度が２体積％以下であり、前記細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、酸素濃度２１体積％である場合と比較して２５％以下である、請求項１記載の培養細胞格納容器。
【請求項４】
格納容器と、
前記格納容器の内部の酸素濃度を２体積％以下にする雰囲気調整剤と、
前記格納容器に格納される、細胞が培養される培養容器と、
を備える、
培養細胞格納容器であって、
２４時間培養後の前記細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、雰囲気の酸素濃度が２１体積％である場合の前記細胞のｐ１６遺伝子の発現量と比較して少ない、
細胞輸送及び／又は保管用の培養細胞格納容器。
【請求項５】
前記雰囲気調整剤による格納容器内部の酸素濃度が２体積％以下であり、前記細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、酸素濃度２１体積％である場合と比較して５０％以下である、請求項４記載の培養細胞格納容器。
【請求項６】
前記雰囲気調整剤が、
アスコルビン酸類と、
水と、
多孔性担体と、
アルデヒド除去剤と、
遷移金属触媒、及び／又はアルカリ土類金属水酸化物と、
を含み、
前記アルデヒド除去剤が、エチレン尿素、尿素、アルギニン、リジン塩酸塩、又はポリアリルアミンである、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の培養細胞格納容器。
【請求項７】
前記細胞が再生医療用細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の培養細胞格納容器。
【請求項８】
前記細胞が間葉系幹細胞及び／又はｉＰＳ細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の培養細胞格納容器。
【請求項９】
前記細胞が創薬又は薬物感受性試験用の皮膚細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の培養細胞格納容器。
【請求項１０】
前記雰囲気調整剤が、前記格納容器の内部の二酸化炭素濃度を、７２時間の間、２〜１０体積％にする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の培養細胞格納容器。
【請求項１１】
前記雰囲気調整剤が、前記格納容器の内部の酸素濃度を、７２時間の間、目標濃度の±２体積％にする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の培養細胞格納容器。
【請求項１２】
前記培養容器を覆う隔離膜であって、気体を透過させ、液体を実質的に透過させない隔離膜を更に備える、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の培養細胞格納容器。
【請求項１３】
格納容器、前記格納容器の内部の酸素濃度を７体積％以下にする雰囲気調整剤、及び前記格納容器に格納される、細胞が培養される培養容器を備える培養細胞格納容器を用意することと、
前記培養容器に細胞を播種し、前記培養細胞格納容器で前記細胞を輸送及び／又は保管することと、
を含む、
細胞の輸送及び／又は保管方法であって、
７２時間培養後の前記細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、雰囲気の酸素濃度が２１体積％である場合の前記細胞のｐ１６遺伝子の発現量と比較して少ない、
方法。
【請求項１４】
前記雰囲気調整剤による格納容器内部の酸素濃度が７体積％以下であり、前記細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、酸素濃度が２１体積％である場合と比較して７５％以下である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記雰囲気調整剤による格納容器内部の酸素濃度が２体積％以下であり、前記細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、酸素濃度２１体積％である場合と比較して２５％以下である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
格納容器、前記格納容器の内部の酸素濃度を２体積％以下にする雰囲気調整剤、及び前記格納容器に格納される、細胞が培養される培養容器を備える培養細胞格納容器を用意することと、
前記培養容器に細胞を播種し、前記培養細胞格納容器で前記細胞を輸送及び／又は保管することと、
を含む、
細胞の輸送及び／又は保管方法であって、
２４時間培養後の前記細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、雰囲気の酸素濃度が２１体積％である場合の前記細胞のｐ１６遺伝子の発現量と比較して少ない、
方法。
【請求項１７】
前記雰囲気調整剤による格納容器内部の酸素濃度が２体積％以下であり、前記細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、酸素濃度２１体積％である場合と比較して５０％以下である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記雰囲気調整剤が、
アスコルビン酸類と、
水と、
多孔性担体と、
アルデヒド除去剤と、
遷移金属触媒、及び／又はアルカリ土類金属水酸化物と、
を含み、
前記アルデヒド除去剤が、エチレン尿素、尿素、アルギニン、リジン塩酸塩、又はポリアリルアミンである、
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が再生医療用細胞である、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が間葉系幹細胞及び／又はｉＰＳ細胞である、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が創薬又は薬物感受性試験用の皮膚細胞である、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記雰囲気調整剤が、前記格納容器の内部の二酸化炭素濃度を、７２時間の間、２〜１０体積％にする、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記雰囲気調整剤が、前記格納容器の内部の酸素濃度を、７２時間の間、目標濃度の±２体積％にする、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記培養細胞格納容器が、前記培養容器を覆う隔離膜であって、気体を透過させ、液体を実質的に透過させない隔離膜を更に備える、請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療技術に関し、培養細胞格納容器及びそれを用いた細胞の輸送及び／又は保管方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医科学の分野では、ヒト由来物質や動物由来物質を用いて患者の治療を行うことが研究されており、一部では実用化もなされている。例えば、患者から採取した細胞や血液などを、増殖・分化させた上で患者に移植することで組織の再生を図るというような試みがなされている。
【０００３】
ところで、細胞を採取した後や、増殖・分化させた後などにおいて、これらの細胞を施設間で輸送及び／又は保管することが必要になる場合がある。即ち、病院などで患者から採取した細胞を、増殖・分化させるために研究施設などに輸送したり、研究施設などで増殖・分化された細胞を患者の居る病院へ輸送したりすることが必要となる。また、輸送の前後において、細胞を保管することが必要になる場合もある。
【０００４】
一方で、病院などで患者から採取した細胞を、増殖・分化させるために研究施設などに輸送する間、もしくは、増殖・分化させた細胞を患者の居る病院へ輸送する間に、二酸化炭素濃度や酸素濃度などのガス濃度の環境管理がなされていないと、増殖・分化を行った培養環境から二酸化炭素濃度が変化し、これに伴い、培養液のｐＨが変化したり、酸素濃度が変化したりして、細胞にストレスを与え、悪影響を及ぼすことになる。保管時においても同様である。
【０００５】
この課題を解決するため、二酸化炭素供給ポンプと二酸化炭素供給タンクにより、０〜１００（体積％）の範囲内で二酸化炭素の濃度を調節する細胞運搬容器が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１２４５５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、特許文献１に開示された容器は、酸素濃度を調整する際には酸素の供給タンクが必要となり、簡便かつ安価に細胞を輸送できない。そこで、本発明は、培養細胞の輸送及び／又は保管中、細胞の活性を容易に維持可能な培養細胞格納容器及びそれを用いた細胞の輸送及び／又は保管方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、細胞の輸送及び／又は保管中に、細胞周期に係るｐ１６遺伝子の発現を抑制することにより、細胞の活性を容易に維持可能であることを見出した。係る本発明者らの知見に基づく本発明の第１の態様は、（ａ）格納容器と、（ｂ）格納容器の内部の酸素濃度を７体積％以下にする雰囲気調整剤と、（ｃ）格納容器に格納される、細胞が培養される培養容器と、を備える、（ｄ）培養細胞格納容器であって、（ｅ）７２時間培養後の細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、雰囲気の酸素濃度が２１体積％である場合の細胞のｐ１６遺伝子の発現量と比較して少ない、（ｆ）細胞輸送及び／又は保管用の培養細胞格納容器であることを要旨とする。
【０００９】
本発明の第１の態様において、例えば、雰囲気調整剤による格納容器内部の酸素濃度が７体積％以下であり、細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、酸素濃度が２１体積％である場合と比較して７５％以下である。また、本発明の第１の態様において、例えば、雰囲気調整剤による格納容器内部の酸素濃度が２体積％以下であり、細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、酸素濃度２１体積％である場合と比較して２５％以下である。
【００１０】
本発明の第２の態様は、（ａ）格納容器と、（ｂ）格納容器の内部の酸素濃度を２体積％以下にする雰囲気調整剤と、（ｃ）格納容器に格納される、細胞が培養される培養容器と、を備える、（ｄ）培養細胞格納容器であって、（ｅ）２４時間培養後の細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、雰囲気の酸素濃度が２１体積％である場合の細胞のｐ１６遺伝子の発現量と比較して少ない、（ｆ）細胞輸送及び／又は保管用の培養細胞格納容器であることを要旨とする。
【００１１】
本発明の第２の態様において、例えば、雰囲気調整剤による格納容器内部の酸素濃度が２体積％以下であり、細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、酸素濃度２１体積％である場合と比較して５０％以下である。
【００１２】
本発明の第１及び第２の態様において、例えば、雰囲気調整剤が、アスコルビン酸類と、水と、多孔性担体と、アルデヒド除去剤と、遷移金属触媒、及び／又はアルカリ土類金属水酸化物と、を含み、アルデヒド除去剤が、エチレン尿素、尿素、アルギニン、リジン塩酸塩、又はポリアリルアミンである。
【００１３】
本発明の第１及び第２の態様において、例えば、細胞が再生医療用細胞である。あるいは、例えば、細胞が間葉系幹細胞及び／又はｉＰＳ細胞である。またあるいは、例えば、細胞が創薬又は薬物感受性試験用の皮膚細胞である。
【００１４】
本発明の第１及び第２の態様において、例えば、雰囲気調整剤が、格納容器の内部の二酸化炭素濃度を、７２時間の間、２〜１０体積％にする。また、例えば、雰囲気調整剤が、格納容器の内部の酸素濃度を、７２時間の間、目標濃度の±２体積％にする。
【００１５】
本発明の第１及び第２の態様において、例えば、培養細胞格納容器が、培養容器を覆う隔離膜であって、気体を透過させ、液体を実質的に透過させない隔離膜を更に備える。
【００１６】
本発明の第３の態様は、（ａ）格納容器、格納容器の内部の酸素濃度を７体積％以下にする雰囲気調整剤、及び格納容器に格納される、細胞が培養される培養容器を備える培養細胞格納容器を用意することと、（ｂ）培養容器に細胞を播種し、培養細胞格納容器で細胞を輸送及び／又は保管することと、を含む、（ｃ）細胞の輸送及び／又は保管方法であって、（ｄ）７２時間培養後の細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、雰囲気の酸素濃度が２１体積％である場合の細胞のｐ１６遺伝子の発現量と比較して少ない、方法であることを要旨とする。
【００１７】
本発明の第３の態様において、例えば、雰囲気調整剤による格納容器内部の酸素濃度が７体積％以下であり、細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、酸素濃度が２１体積％である場合と比較して７５％以下である。また、本発明の第３の態様において、例えば、雰囲気調整剤による格納容器内部の酸素濃度が２体積％以下であり、細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、酸素濃度２１体積％である場合と比較して２５％以下である。
【００１８】
本発明の第４の態様は、（ａ）格納容器、格納容器の内部の酸素濃度を２体積％以下にする雰囲気調整剤、及び格納容器に格納される、細胞が培養される培養容器を備える培養細胞格納容器を用意することと、（ｂ）培養容器に細胞を播種し、培養細胞格納容器で細胞を輸送及び／又は保管することと、を含む、（ｃ）細胞の輸送及び／又は保管方法であって、（ｄ）２４時間培養後の細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、雰囲気の酸素濃度が２１体積％である場合の細胞のｐ１６遺伝子の発現量と比較して少ない、方法であることを要旨とする。
【００１９】
本発明の第４の態様において、例えば、雰囲気調整剤による格納容器内部の酸素濃度が２体積％以下であり、細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、酸素濃度２１体積％である場合と比較して５０％以下である。
【００２０】
本発明の第３及び第４の態様において、例えば、雰囲気調整剤が、アスコルビン酸類と、水と、多孔性担体と、アルデヒド除去剤と、遷移金属触媒、及び／又はアルカリ土類金属水酸化物と、を含み、アルデヒド除去剤が、エチレン尿素、尿素、アルギニン、リジン塩酸塩、又はポリアリルアミンである。
【００２１】
本発明の第３及び第４の態様において、例えば、細胞が再生医療用細胞である。あるいは、例えば、細胞が間葉系幹細胞及び／又はｉＰＳ細胞である。またあるいは、例えば、細胞が創薬又は薬物感受性試験用の皮膚細胞である。
【００２２】
本発明の第３及び第４の態様において、例えば、雰囲気調整剤が、格納容器の内部の二酸化炭素濃度を、７２時間の間、２〜１０体積％にする。また、例えば、雰囲気調整剤が、格納容器の内部の酸素濃度を、７２時間の間、目標濃度の±２体積％にする。
【００２３】
本発明の第３及び第４の態様において、例えば、培養細胞格納容器が、培養容器を覆う隔離膜であって、気体を透過させ、液体を実質的に透過させない隔離膜を更に備える。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、培養細胞の輸送及び／又は保管中、細胞の活性を容易に維持可能な培養細胞格納容器及びそれを用いた細胞の輸送及び／又は保管方法を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の実施の形態に係る培養細胞格納容器の模式図である。
【図２】本発明の実施例に係るｐ１６遺伝子の発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
【００２７】
図１に示すように、実施の形態に係る培養細胞格納容器は、格納容器１と、格納容器１の内部の酸素濃度を７体積％以下又は２体積％以下にする雰囲気調整剤２と、格納容器１に格納される、細胞が培養される培養容器３と、を備える培養細胞格納容器であって、細胞のｐ１６遺伝子の発現を抑制する、培養細胞格納容器である。
【００２８】
格納容器１は、内部と外部との間で気体を実質的に連通させない密閉容器である。したがって、格納容器１内部に配置された雰囲気調整剤２によって、格納容器１内部の酸素濃度を一定に長時間保つことが可能となる。格納容器１の材料としては、ガラス、金属、及びポリカーボネート等の樹脂が使用可能である。また、単層あるいは多層のガスバリア性フィルムも、格納容器１の材料として使用可能である。格納容器１の好ましい材料は、γ線滅菌可能な物質である。
【００２９】
雰囲気調整剤２は、格納容器１の内部に配置され、例えば少なくとも７２時間、格納容器１の内部の酸素濃度を７体積％以下、好ましくは５体積％以下、より好ましくは２体積％以下、さらに好ましくは０．１体積％以下にする。格納容器１の内部の酸素濃度が７体積％を超えると、培養容器３で培養される細胞において、細胞周期に係るｐ１６遺伝子の発現が亢進し、細胞の増殖能が低下する傾向にある。好ましくは、雰囲気調整剤２は、例えば少なくとも７２時間、格納容器１の内部の酸素濃度を目標濃度の±２体積％にする。
【００３０】
また、雰囲気調整剤２は、例えば少なくとも７２時間、格納容器１の内部の二酸化炭素濃度を２以上１０体積％以下、好ましくは３以上７体積％以下、より好ましくは５体積％にする。一般的な細胞培養では、培養液のｐＨを一定に維持することが好ましい。ここで、二酸化炭素―炭酸水素ナトリウムのｐＨ緩衝系を利用した培養液を用いる場合、二酸化炭素濃度が７体積％を超えると、培養液のｐＨを７．４に維持することが困難になる傾向にある。
【００３１】
雰囲気調整剤２は、例えば、アスコルビン酸類と、水と、多孔性担体と、アルデヒド除去剤と、遷移金属触媒及び／又はアルカリ土類金属水酸化物と、を含む。アルデヒド除去剤は、例えば、エチレン尿素、尿素、アルギニン、リジン塩酸塩、又はポリアリルアミンである。
【００３２】
雰囲気調整剤２は、好ましくは、１００質量部のアスコルビン酸類と、１００〜２００質量部の水と、５０〜４００質量部の多孔性担体と、０．５〜２５質量部のアルデヒド除去剤と、２０〜５５質量部のアルカリ土類金属水酸化物と、を含む。当該組成により、雰囲気調整剤２は、格納容器１の内部の酸素濃度を１〜７体積％にし、二酸化炭素濃度を２〜１０体積％にする。
【００３３】
雰囲気調整剤２は、より好ましくは、１００質量部のアスコルビン酸類と、１００〜２００質量部の水と、５０〜４００質量部の多孔性担体と、０．５〜２５質量部のアルデヒド除去剤と、５〜２５質量部の遷移金属元素と、１〜１０質量部の水酸化マグネシウムと、２０〜４０質量部の水酸化カルシウムと、を含む。当該組成により、雰囲気調整剤２は、格納容器１の内部の酸素濃度を２体積％以下、好ましくは０．１体積％以下にし、二酸化炭素濃度を２〜１０体積％にする。
【００３４】
雰囲気調整剤２は、例えば、通気性の包装材で包装されている。雰囲気調整剤２の製造方法は、例えば、国際公開２０１１／０６５３６３号に記載されている。また、三菱ガス化学株式会社製のカルチャーパルシリーズが、雰囲気調整剤２として使用可能である。
【００３５】
細胞が播種され、培養液が入れられる培養容器３には、培養皿、及びチューブ等が使用可能である。培養容器３の材料には、ガラス及び樹脂等が使用可能であるが、これらに限定されない。培養容器３で培養される細胞は、例えば、再生医療に用いられる細胞であり、間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）、分化済みの細胞、ｉＰＳ細胞、及びＥＳ細胞等である。あるいは、培養容器３で培養される細胞は、創薬又は薬物感受性試験用の皮膚細胞であるが、これらに限定されない。また、培養液は、培養される細胞に応じて適宜選択される。
【００３６】
培養容器３の開口部は、例えば、気体を透過させ、液体を実質的に透過させない隔離膜４で覆われる。これにより、培養容器３内部の培養液で満たされていない空間の気体の組成が、雰囲気調整剤２で調整された格納容器１内部と同じになる。また、培養細胞格納容器の輸送及び／又は保管時に、振動等により培養容器３内部の培養液が培養容器３外部に出ることを防止することが可能となる。
【００３７】
隔離膜４のガーレー式透気度は、例えば０．１〜５０，０００ｓ／１００ｍＬであり、好ましくは０．１〜１，０００ｓ／１００ｍＬであり、より好ましくは０．１〜１００ｓ／１００ｍＬである。隔離膜４のガーレー式透気度を上記好ましい範囲とすることで、培養容器３内部の気体の組成をより速やかに格納容器１内部と同じにすることが出来ると同時に、培養容器３内部の培養液が隔離膜４を透過して培養容器３外部へ流出することをより抑制しやすくなる傾向にある。
【００３８】
隔離膜４としては、例えば、紙、不織布、マイクロポーラスフィルム、微多孔膜、開孔樹脂フィルム等が使用可能であり、好ましくはＨＤＰＥ製の不織布や、撥水性のテフロン（登録商標）製微多孔膜（ＤｕＰｏｎｔ社製Ｔｙｖｅｋフィルムなど）が使用可能である。
【００３９】
格納容器１には、培養容器３を格納容器１内の一定の位置に保持する装着部が設けられていてもよい。あるいは、格納容器１には、地表面に対して培養容器３を水平に保つスウィング機構が設けられていてもよい。さらに、格納容器１には、温度制御機構及び衝撃緩衝機構等が設けられていてもよい。
【００４０】
実施の形態に係る培養細胞格納容器は、７２時間以内の細胞の輸送及び／又は保管に使用され、７２時間の輸送及び／又は保管中、細胞のｐ１６遺伝子の発現を抑制する。具体的には、７２時間培養後の細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、雰囲気の酸素濃度が２１体積％である場合の細胞のｐ１６遺伝子の発現量と比較して少ない。
【００４１】
実施の形態に係る培養細胞格納容器は、７２時間以内の細胞の輸送及び／又は保管に使用される場合、例えば、雰囲気調整剤による格納容器内部の酸素濃度が７体積％以下であり、細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、酸素濃度が２１体積％である場合と比較して７５％以下である。また、実施の形態に係る培養細胞格納容器は、７２時間以内の細胞の輸送及び／又は保管に使用される場合、例えば、雰囲気調整剤による格納容器内部の酸素濃度が２体積％以下であり、細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、酸素濃度２１体積％である場合と比較して２５％以下である。
【００４２】
あるいは、実施の形態に係る培養細胞格納容器は、２４時間以内の細胞の輸送及び／又は保管に使用され、２４時間の輸送及び／又は保管中、ｐ１６遺伝子の発現を抑制する。具体的には、２４時間培養後の細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、雰囲気の酸素濃度が２１体積％である場合の細胞のｐ１６遺伝子の発現量と比較して少ない
【００４３】
実施の形態に係る培養細胞格納容器は、２４時間以内の細胞の輸送及び／又は保管に使用される場合、例えば、雰囲気調整剤による格納容器内部の酸素濃度が２体積％以下であり、細胞のｐ１６遺伝子の発現量が、酸素濃度２１体積％である場合と比較して５０％以下である。
【実施例】
【００４４】
３回継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）を用意した。用意した細胞を１８個の６ｃｍ径の培養皿のそれぞれに播種し、二酸化炭素（ＣＯ2）インキュベーター内で８０〜９０％コンフルエントまで増殖させた。培養液としては、ＭＥＭ  α，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いた。なお、培養液には、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン（ナカライテスク社製）、及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ナカライテスク社製）を含有させた。ＣＯ2インキュベーターの内部環境は、３７℃、湿度９５％、ＣＯ2濃度５％に設定した。
【００４５】
次に、容量が２．５Ｌのジャーを４つ用意し、それぞれのジャーに３個の培養皿を静置した。これにより、ＣＯ2インキュベーターに配置されていた１８個の培養皿のうち、１２個の培養皿がジャーの内部に配置された。また、４つのジャーのうち２つのジャーに、酸素濃度を５±３体積％に制御する雰囲気調整剤（三菱ガス化学株式会社製、商品名「カルチャーパル・ファイブ」）を配置し、さらに、４つのジャーのうちの残りの２つのジャーに、酸素濃度を０．１体積％未満にする雰囲気調整剤（三菱ガス化学株式会社製、商品名「カルチャーパル・ゼロ」）を配置した。その後、４つのジャーを３７℃、湿度９５％に設定した恒温槽内に配置した。また、ジャー内部に移動されなかった残りの６個の培養皿は、コントロールとして、引き続きＣＯ2インキュベーター内に配置した。このとき、ＣＯ2インキュベーター内であってジャーの外部の酸素濃度は、大気組成とほぼ同等であった。
【００４６】
１８個の培養皿をジャーに移動してから２４時間後、「カルチャーパル・ゼロ」と共にジャーに入れられていた３個の培養皿、「カルチャーパル・ファイブ」と共にジャーに入れられていた３個の培養皿、及びＣＯ2インキュベーター内に直接入れられていた３個の培養皿を取り出し、培養細胞の遺伝子発現解析を行った。さらに、１８個の培養皿をジャーに移動してから７２時間後、「カルチャーパル・ゼロ」と共にジャーに入れられていた３個の培養皿、「カルチャーパル・ファイブ」と共にジャーに入れられていた３個の培養皿、及びＣＯ2インキュベーター内に直接入れられていた３個の培養皿を取り出し、培養細胞の遺伝子発現解析を行った。
【００４７】
遺伝子発現解析の際には、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、細胞からトータルＲＮＡを抽出した。次に、１μｇのトータルＲＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｋｉｔ（東洋紡）を用いて逆転写してｃＤＮＡを生成し、ｐ１６遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲにて定量解析した。その結果を図２に示す。なお、全ての発現量の測定値は、２４時間、酸素濃度２１体積％で培養された細胞における発現量の測定値で除すことで正規化し、平均値±９５％信頼区間として表した。各群間の比較は一元配置分散分析及びＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法を用いて解析した。有意水準は５％未満とした。なお、実験は２回繰り返し、同様の結果が得られることを確認した。
【００４８】
図２に示すように、カルチャーパル・ゼロで酸素濃度が０．１体積％未満に調整された雰囲気に２４時間暴露された細胞におけるｐ１６遺伝子の発現量は、酸素濃度が５体積％に調整された雰囲気に２４時間暴露された細胞、及び酸素濃度が２１体積％である雰囲気に２４時間暴露された細胞と比較して、少なくとも５０％少なかった（Ｐ＜０．０１）。
【００４９】
また、カルチャーパル・ゼロで酸素濃度が０．１体積％未満に調整された雰囲気に７２時間暴露された細胞におけるｐ１６遺伝子の発現量は、酸素濃度が５体積％に調整された雰囲気に７２時間暴露された細胞と比較して、少なくとも５０％少なかった（Ｐ＜０．０１）。また、カルチャーパル・ゼロで酸素濃度が０．１体積％未満に調整された雰囲気に７２時間暴露された細胞におけるｐ１６遺伝子の発現量は、酸素濃度が２１体積％に調整された雰囲気に７２時間暴露された細胞と比較して２５％以下であり、少なくとも７５％少なかった（Ｐ＜０．０１）。さらに、カルチャーパル・ゼロで酸素濃度が５体積％に調整された雰囲気に７２時間暴露された細胞におけるｐ１６遺伝子の発現量は、酸素濃度が２１体積％である雰囲気に７２時間暴露された細胞と比較して７５％以下であり、少なくとも２５％少なかった（Ｐ＜０．０５）。
【００５０】
ｐ１６遺伝子の発現は、細胞老化に重要な役割を果たしていると報告されている（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３９１，Ｉｓｓｕｅ  ３，１５  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０，Ｐａｇｅｓ１４７１‐１４７６参照。）。再生医療用細胞を輸送する際には、輸送時間が短時間であることが多く、ｐ１６遺伝子の発現の抑制効果が短時間に表れることが好ましい。これに対し、雰囲気調整剤であるカルチャーパルを用いることによって、２４時間という短時間においても、ｐ１６遺伝子の発現が抑制できた。
【符号の説明】
【００５１】
１      格納容器
２      雰囲気調整剤
３      培養容器
４      隔離膜
【図１】
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【図２】
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