(57)【要約】【課題】口腔内細菌を活用し、体内を循環する物質との相互作用によって、持続的かつ安全的に、歯周病原菌に対して特異的な殺菌効果がある口腔用組成物を提供する。【解決手段】Actinomyces属やRothia属の細菌が、硝酸還元菌として作用し、口腔善玉菌として働き、歯周病原菌を殺菌することを見出した。すなわち、口腔用組成物は、アクチノマイセス（Actinomyces）属またはロシア（Rothia）属の細菌と、硝酸塩あるいは硝酸イオンを含有してなる。Actinomyces属やRothia属の細菌が、硝酸還元菌として作用し、硝酸塩存在下で一酸化窒素（ＮＯ）を生成することによって、歯周病原菌の殺菌および歯周病の予防や治療を可能とする。口腔用組成物は、口腔内に適用したときに、唾液のｐＨを５．５〜６．５の範囲に下降させることが好ましく、また、硝酸濃度が２〜１０ｍＭであることが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチノマイセス（Actinomyces）属またはロシア（Rothia）属の細菌と、硝酸塩あるいは硝酸イオンを含有してなることを特徴とする口腔用組成物。
【請求項２】
前記細菌が、Actinomyces oris MG-1菌株、Actinomyces naeslundii ATCC12104菌株、Rothia aeria JCM11412菌株、Rothia mucilaginosa DY-18菌株、Rothia dentocariosa ATCC17931菌株から選ばれる菌株から得られることを特徴とする請求項１に記載の口腔用組成物。
【請求項３】
口腔内に適用したときに、唾液のｐＨを５．５〜６．５の範囲に下降させることを特徴とする請求項１又は２に記載の口腔用組成物。
【請求項４】
口腔内に適用したときに、硝酸濃度が２〜１０ｍＭであることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の口腔用組成物。
【請求項５】
硝酸塩が、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）または硝酸カリウム（ＫＮＯ３）であることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の口腔用組成物。
【請求項６】
Porphyromonas gingivalis及びPrevotella intermediaの歯周病原菌を殺菌することを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載の口腔用組成物。
【請求項７】
歯磨剤、洗口剤、歯肉マッサージクリーム、トローチ、チューイングガム、タブレットまたはジュースの形態にある請求項１〜６の何れかに記載の口腔用組成物。
【請求項８】
口腔内細菌叢（フローラ）におけるアクチノマイセス（Actinomyces）属およびロシア（Rothia）属の細菌の存在割合を測定する手段を備え、歯周病疾患の発生リスクを予測する歯周病疾患リスク予測装置。
【請求項９】
口腔内における硝酸還元能を測定する手段を備え、歯周病疾患の発生リスクを予測する歯周病疾患リスク予測装置。
【請求項１０】
硝酸塩水溶液を歯肉炎下へ注入することにより、人を除く動物の歯周病を治療する歯周病治療方法。
【請求項１１】
前記硝酸塩水溶液には、アクチノマイセス（Actinomyces）属またはロシア（Rothia）属の細菌が混入されていることを特徴とする請求項１０に記載の人を除く動物の歯周病を治療する歯周病治療方法。
【請求項１２】
前記細菌が、Actinomyces oris MG-1菌株、Actinomyces naeslundii ATCC12104菌株、Rothia aeria JCM11412菌株、Rothia mucilaginosa DY-18菌株、Rothia dentocariosa ATCC17931菌株から選ばれる菌株から得られることを特徴とする請求項１１に記載の人を除く動物の歯周病を治療する歯周病治療方法。
【請求項１３】
硝酸塩水溶液のｐＨを５．５〜６．５の範囲に調製することを特徴とする請求項１０〜１２の何れかに記載の人を除く動物の歯周病を治療する歯周病治療方法。
【請求項１４】
硝酸塩水溶液の濃度が２〜１０ｍＭであることを特徴とする請求項１０〜１３の何れかに記載の人を除く動物の歯周病を治療する歯周病治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔用組成物、歯周病疾患リスク予測装置および動物の歯周病治療方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
歯周病を予防するためには、歯周病の原因であるプラーク（歯垢）を除去することが重要であり、プラークを取り除くことやプラークをつきにくくするプラークコントロールによる歯周病菌の除去が行われている。
また、歯周病のリスクファクター（危険因子）を少なくすることも重要である。
昨今、歯周病予防剤として薬用歯磨剤（練り歯磨き、液体歯磨き）が多数商品化されており、プラーク除去を目的として、薬用成分としてデキストラナーゼ（酵素）を含み、プラークの分解を促進させている。
【０００３】
歯周病（歯肉炎・歯周炎）の予防を目的としては、出血防止効果があるトラネキサム酸、抗炎症作用があるε-アミノカプロン酸、グリチルリチン酸ジカリウムまたはβ-グリチルレチン酸、殺菌作用があるＩＰＭＰ（イソプロピルメチルフェノール）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）またはトリクロサン、収れん作用がある塩化ナトリウム、血行作用がある酢酸トコフェロール（ビタミンＥ）が薬用成分として知られている。
【０００４】
また、むし歯予防を目的としては、モノフルオロリン酸ナトリウム（ＭＦＰ）やフッ化ナトリウム（ＮａＦ）が薬用成分として知られており、これらの成分は歯質強化、再石灰化の促進、酸産生の抑制の働きがある。
また、歯石予防を目的として、歯石形成の抑制効果があるポリリン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウムが薬用成分として知られている。
この他、冷たいものが歯にしみるのを防ぐのを目的として、乳酸アルミニウムや硝酸カリウムが薬用成分として知られており、これらは刺激の伝達を防ぐ働きを担っている。
【０００５】
また、薬用歯磨剤の他、歯周病予防や歯周病治療として、歯周病巣に殺微生物的有効量の金属イオンを投入する技術（特許文献１）、口腔細菌の菌体外水溶性低分子物質を含有する口腔用組成物の技術（特許文献２）、有効量のカテキンを含有する口腔常在菌叢調整剤の技術（特許文献３）、生きた乳酸菌とキシリトールを含有する口腔内疾患の予防剤の技術（特許文献４）が知られている。
また、有効塩素濃度が５０〜７００ｐｐｍ、ｐＨが６．３〜８であって、次亜塩素酸及び炭酸水素ナトリウムを含んでなり、歯周病原菌を殺菌する技術（特許文献５）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００１−５１５０４２号公報
【特許文献２】特開２００４−２９２４０１号公報
【特許文献３】特開２０１０−０６４９６１号公報
【特許文献４】特許第３９２１１７５号公報
【特許文献５】特許第４３６９５３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
歯周病の病原菌として、嫌気性のグラム陰性桿菌が主に知られている。具体的には、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、エイケネラ・コローデンス(Eikenella corrodens)、カンピロバクター・レクタス(Campylobacter rectus)である。
歯周病の予防法や治療法は以前から多くの方法があるが、いずれも根本的な治療方法を見出せていないのが現状である。これは、歯周病原菌の殆どが、浮遊菌ではなく、自ら産生した菌体外多糖からなるバイオフィルムで保護されており、このバイオフィルムで抗生剤等を遮断しながら、緩やかに増殖を続けるためである。
【０００８】
このため、歯周病原菌の殺菌には、持続的に効果が続くことが期待でき、体内に安全で、さらに、歯周病原菌に対して特異的な殺菌効果があり他の常在菌（共生菌）を殺菌しないことが望まれる。
かかる状況に鑑みて、本発明は、口腔内細菌を活用し、体内を循環する物質との相互作用によって、持続的かつ安全的に、歯周病原菌に対して特異的な殺菌効果がある口腔用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、口腔内細菌を鋭意検討した結果、口腔内細菌の内、Actinomyces属やRothia属の細菌が、硝酸塩存在下で、歯周病原菌を殺菌できることの知見を得た。すなわち、Actinomyces属やRothia属の細菌が、硝酸還元菌として作用し、口腔善玉菌として働くこと、ならびに歯周病原菌の殺菌の仕組みを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明の口腔用組成物は、アクチノマイセス（Actinomyces）属またはロシア（Rothia）属の細菌と、硝酸塩あるいは硝酸イオンを含有してなることを特徴とする。
Actinomyces属やRothia属の細菌が、硝酸還元菌として作用し、硝酸塩存在下で一酸化窒素（ＮＯ）を生成することによって、歯周病原菌の殺菌および歯周病の予防や治療を可能とする。
具体的な細菌は、例えば、Actinomyces oris MG-1菌株、Actinomyces naeslundii ATCC12104菌株、Rothia aeria JCM11412菌株、Rothia mucilaginosa DY-18菌株、Rothia dentocariosa ATCC17931菌株から選ばれる菌株から得られる。
【００１１】
本発明の口腔用組成物は、口腔内に適用したときに、唾液のｐＨを５．５〜６．５の範囲に下降させることが好ましい。歯周病原菌の硝酸塩存在下での殺菌は、ｐＨが６．５以下になると著しく効果が現れる。ｐＨが５．５より下回っても殺菌効果は現れるが、他の副作用を生じさせるリスクを回避すべく上記の範囲とする。
また、本発明の口腔用組成物は、口腔内に適用したときに、硝酸濃度が２〜１０ｍＭであることが好ましい。硝酸濃度が２ｍＭ以上とすることで著しく殺菌効果が現れる。硝酸濃度が１０ｍＭを超えても殺菌効果は現れるが、他の副作用を生じさせるリスクを回避すべく上記の範囲とする。
【００１２】
硝酸塩は、具体的には、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）または硝酸カリウム（ＫＮＯ３）である。硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）または硝酸カリウム（ＫＮＯ３）は、本来的に食品に含まれる硝酸塩であり、葉菜類(ホウレンソウ、春菊、レタス)に多く含まれる。これらの硝酸塩であれば口腔内に投与しても安全である。
【００１３】
本発明の口腔用組成物は、Porphyromonas gingivalis及びPrevotella intermediaの歯周病原菌を殺菌できる。
Porphyromonas gingivalis及びPrevotella intermediaは、代表的な歯周病原菌であり、後述する実施例において、これらの歯周病原菌が硝酸依存的に殺菌されることが確認できている。
【００１４】
本発明の口腔用組成物は、歯磨剤、洗口剤、歯肉マッサージクリーム、トローチ、チューイングガム、タブレットまたはジュースの形態で提供できる。
【００１５】
次に、本発明の歯周病疾患リスク予測装置について説明する。
本発明の歯周病疾患リスク予測装置は、口腔内細菌叢（フローラ）におけるアクチノマイセス（Actinomyces）属およびロシア（Rothia）属の細菌の存在割合を測定する手段を備え、歯周病疾患の発生リスクを予測する。
Actinomyces属やRothia属の細菌が、硝酸還元菌として作用し、硝酸塩存在下で一酸化窒素（ＮＯ）を生成して歯周病原菌を殺菌するので、口腔内細菌叢（フローラ）におけるアクチノマイセス（Actinomyces）属およびロシア（Rothia）属の細菌の存在割合を測定することで、歯周病疾患の発生リスクを予測することができる。
【００１６】
また、本発明の歯周病疾患リスク予測装置は、口腔内における硝酸還元能を測定する手段を備え、歯周病疾患の発生リスクを予測する。例えば、唾液成分の硝酸還元能の測定、その他口腔内における硝酸還元能を測定することにより、硝酸塩存在下で一酸化窒素（ＮＯ）を生成して歯周病原菌を殺菌できる能力を測定するのである。
【００１７】
次に、本発明の歯周病治療方法について説明する。
本発明の歯周病治療方法は、硝酸塩水溶液を歯肉炎下へ注入することにより、人を除く動物の歯周病を治療する。硝酸塩水溶液を歯肉炎下へ注入することにより、口腔内に元々存在するアクチノマイセス（Actinomyces）属またはロシア（Rothia）属の細菌が、硝酸を還元して亜硝酸を生成する。亜硝酸は、口腔内の弱酸性環境によって還元され、一酸化窒素（ＮＯ）を生成するので歯周病原菌が殺菌される。なお、硝酸塩水溶液を歯肉炎下へ注入することにより、人の歯周病を治療することも可能である。
また、歯周病の治療や予防目的で、硝酸塩水溶液を口腔内に投与することも効果的である。例えば、野菜ジュース程度の硝酸濃度（５ｍＭ）でも歯周病原菌の十分な殺菌効果がある。なお、過剰摂取した硝酸イオンは尿として排出され、人体に害となる亜硝酸や一酸化窒素が過剰になることはない。
【００１８】
ここで、硝酸塩水溶液は、アクチノマイセス（Actinomyces）属またはロシア（Rothia）属の細菌が混入されているのが好ましい。口腔内に元々存在するアクチノマイセス（Actinomyces）属またはロシア（Rothia）属の細菌の量を増加して、硝酸還元能を高めるためである。
混入されている細菌は、具体的には、Actinomyces oris MG-1菌株、Actinomyces naeslundii ATCC12104菌株、Rothia aeria JCM11412菌株、Rothia mucilaginosa DY-18菌株、Rothia dentocariosa ATCC17931菌株から選ばれる菌株から得られる。
また、本発明の歯周病治療方法において、硝酸塩水溶液のｐＨを５．５〜６．５の範囲に調製することが好ましい。弱酸性環境に保つことにより、亜硝酸が還元されやすく、一酸化窒素（ＮＯ）が生成される量が多くなるからである。また、本発明の歯周病治療方法において、硝酸塩水溶液の濃度が２〜１０ｍＭであること好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の口腔用組成物によれば、歯周病原菌を硝酸依存的に殺菌することができ、また特異的に歯周病原菌を殺菌でき、歯周病の予防や治療が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】歯周病原菌を殺菌する仕組みの説明図
【図２】歯周病原菌を殺菌する仕組みを検証する方法の説明図
【図３】R. mucilaginosaとP. gingivalisを共培養した際のP. gingivalisの生存率を示すグラフ
【図４】R. mucilaginosaとP. gingivalisを共培養した際のR. mucilaginosaの生存率を示すグラフ
【図５】P. gingivalis単独培養時の生存率を示すグラフ
【図６】硝酸カリウム添加時のP. gingivalisの生存率を示すグラフ
【図７】ＰＴＩＯによる硝酸イオン依存的殺菌の抑圧の様子を示すグラフ
【図８】培養液のpHと殺菌効果を示すグラフ
【図９】硝酸ナトリウム濃度と殺菌効果を示すグラフ
【図１０】硝酸還元酵素と亜硝酸還元酵素の欠損株における殺菌効果を示すグラフ
【図１１】A. orisとP. gingivalisの共培養におけるA. orisの生存率を示すグラフ
【図１２】口腔内細菌（Rothia属，Actinomyces属）における殺菌効果を示すグラフ
【図１３】R. mucilaginosaによる硝酸ナトリウム依存的P. intermediaの殺菌作用を示すグラフ
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施形態の一例を、図面を参照しながら詳細に説明していく。なお、本発明の範囲は、以下の実施例や図示例に限定されるものではなく、幾多の変更及び変形が可能である。
【００２２】
まず、本発明者らが見出した歯周病原菌の殺菌の仕組みについて説明する。
図１は、アクチノマイセス（Actinomyces）属またはロシア（Rothia）属の細菌が、硝酸銀存在下で、歯周病原菌を殺菌する仕組みを示している。アクチノマイセス（Actinomyces）属またはロシア（Rothia）属の細菌が善玉菌として働き、硝酸イオン（ＮＯ３−）を亜硝酸イオン（ＮＯ２−）に還元する。弱酸性環境下では亜硝酸イオン（ＮＯ２−）から一酸化窒素（ＮＯ）への還元過程が自発的に起きる。歯周病原菌（P. intermediaなど）は、一酸化窒素（ＮＯ）に非常に弱い細菌であるため、一酸化窒素によって歯周病原菌を特異的に殺菌できるのである。
【００２３】
次に、歯周病原菌を殺菌する仕組みを検証する方法について、図２を参照して説明する。
図２に示すように、歯周病原菌（P. intermediaなど）と、善玉菌であるアクチノマイセス（Actinomyces）属またはロシア（Rothia）属の細菌を共培養する。共培養は、硝酸塩（硝酸イオン）を添加する場合と非添加の場合の２通りの条件で行い、それぞれ３７℃、嫌気条件で数分から数時間振盪培養する。培養開始時および培養中における生菌数の算出は、段階希釈した培養液を寒天培地上へ塗抹して、生じたコロニー数からコロニー形成単位（ＣＦＵ：Colony Forming Unit）を求めることで行う。
【００２４】
後述する実施例で使用した菌株、実験方法、共培養と共存率の算出方法について、以下に説明する。
＜アクチノマイセス（Actinomyces）属の口腔内細菌＞
・Actinomyces odontolyticus ATCC17929（以下、A. odontolyticus）
・Actinomyces oris MG-1（以下、A. oris）
・Actinomyces oris TN9011 (narG)
・Actinomyces oris TN9012 (nirK)
・Actinomyces naeslundii ATCC12104（以下、A. naeslundii）
＜ロシア（Rothia）属の口腔内細菌＞
・Rothia aeria JCM11412（以下、R. aeria）
・Rothia mucilaginosa DY-18（以下、R. mucilaginosa）
・Rothia dentocariosa ATCC17931（以下、R. dentocariosa）
＜歯周病原菌＞
・Porphyromonas gingivalis ATCC33277（以下、P. gingivalis）
・Prevotella intermedia ATCC25611（以下、P. intermedia）
【００２５】
（方法、共培養と共存率の算出方法について）
R. mucilaginosa，R. aeria，R. dentocariosa， A. naeslundiiは、ハートインフュージョン培地（ＨＩＢ：Heart Infusion Broth，Ｄｉｆｃｏ社製）に接種し、３７℃、好気条件で一晩静置培養した。また、A. orisは、ＨＩＢに接種し，３７℃、好気条件で一晩振盪培養した。
また、歯周病原菌のP. gingivalis，P. intermediaは、変法ＧＡＭ培地（ニッスイ社製）で一晩嫌気培養した。
培養後の細菌細胞は嫌気培養装置内での遠心操作によりＨＩＢで２回洗浄した。ＨＩＢに懸濁したロシア（Rothia）属の細菌あるいはアクチノマイセス（Actinomyces）属の細菌を２００、歯周病原菌のP. gingivalisあるいはP. intermediaを１の容量比で混合した。
【００２６】
必要に応じて、終濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（和光純薬工業製）でｐＨを７．２，６．５，６．０に調整したＨＩＢ、終濃度０．１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液（和光純薬工業製）でｐＨを５．５に調整したＨＩＢを用いた。
また、必要に応じて硝酸ナトリウム（和光純薬工業製），硝酸カリウム（和光純薬工業製），ＰＴＩＯ（2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-3-oxide-1-oxyl（東京化成工業社製）を加えた。
【００２７】
なお、ＰＴＩＯを用いる際は、ＨＩＢではなくリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，タカラバイオ社製）で洗浄した細菌細胞を用いた。それぞれの共培養液は、３７℃嫌気条件で数分から数時間振盪培養した。培養開始時、培養中における生菌数の算出は、段階希釈した培養液を寒天培地上へ塗抹し、生じたコロニー数からコロニー形成単位（ＣＦＵ）を求めることで行った。
歯周病原菌（P. gingivalis，P. intermedia）のＣＦＵの算出は、段階希釈液を２５ｍｇ／Ｌのゲンタマイシン（和光純薬工業製）を添加した変法ＧＡＭ培地へ塗抹して、嫌気培養することにより求めた。また、ロシア（Rothia）属の細菌あるいはアクチノマイセス（Actinomyces）属の細菌のＣＦＵの算出は、段階希釈液をＨＩＢ寒天培地へ塗抹して好気培養することにより求めた。
共培養開始時（０時間）のそれぞれの菌種のＣＦＵを１００％として、経時的に得たＣＦＵから生存率（％）を求めた。なお、全ての実験は独立した３系統で行っており、平均と標準誤差を求めて図に示すグラフにプロットした。
【実施例１】
【００２８】
ロシア（Rothia）属のR. mucilaginosaによる歯周病原菌（P. gingivalis）の硝酸依存的な殺菌効果について調べた結果を説明する。
まず、R. mucilaginosaとP. gingivalisをＨＩＢに懸濁し、３７℃で３時間インキュベートした。培養は、終濃度１０ｍＭとなるよう硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）を添加した場合（＋）と非添加の場合（−）で行い、培養開始時のP. gingivalisのＣＦＵ（３．４×１０７）を１００％とし、経時的に測定したＣＦＵからP. gingivalisの生存率を求めた。
【００２９】
R. mucilaginosaとP. gingivalisを共培養した際のP. gingivalisの生存率を図３に示す。
P. gingivalisの生存率は、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）非添加条件では時間経過に関わらずほぼ１００％で推移したのに対して、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）添加条件では、経時的に著しい生存率の低下がみられ、３時間後では約９５％のP. gingivalisが殺菌されていた。
一方、培養開始時のR. mucilaginosaのＣＦＵ（２．８×１０７）を１００％とし、培養３時間後のＣＦＵからR. mucilaginosaの生存率を求めた。R. mucilaginosaの生存率を図４に示す。R. mucilaginosaは、P. gingivalisと異なり、硝酸ナトリウムの添加、非添加の条件に関わらず、生存率の低下はみられなかった。
図３および図４に示す生存率の結果から、P. gingivalisとR. mucilaginosaを共培養した場合、硝酸ナトリウム依存的にP. gingivalisの殺菌がみられることが理解できる。
【００３０】
また、P. gingivalis単独培養時の生存率を確認するため、P. gingivalisをＨＩＢに懸濁し、３７℃で３時間インキュベートした。培養は、終濃度１０ｍＭとなるよう硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）を添加した場合（＋）と非添加の場合（−）で行い、培養開始時のP. gingivalisのＣＦＵ（２．０×１０７）を１００％とし、培養３時間後のＣＦＵから生存率を求めた。P. gingivalis単独培養時の生存率を図５に示す。
図５から、培養液にR. mucilaginosa を加えず、P. gingivalis単独での培養を行った場合、硝酸依存的な殺菌は見られなかった。
【実施例２】
【００３１】
次に、硝酸カリウム（ＫＮＯ３）添加時のP. gingivalisの生存率を調べた。
R. mucilaginosaとP. gingivalisをＨＩＢに懸濁し、３７℃で３時間インキュベートした。培養は、終濃度１０ｍＭとなるよう硝酸カリウムを添加した場合（＋）と非添加の場合（−）で行い、培養開始時のP. gingivalisのＣＦＵ（３．８×１０７）を１００％とし、培養３時間後のＣＦＵからP. gingivalisの生存率を求めた。
【００３２】
硝酸カリウム（ＫＮＯ３）添加時のP. gingivalisの生存率を図６に示す。硝酸カリウム（ＫＮＯ３）添加時も、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）の場合と同様に、経時的に著しい生存率の低下がみられ、３時間後では約９０％のP. gingivalisが殺菌されていた。
一方、培養開始時のR. mucilaginosaのＣＦＵ（３．０×１０７）を１００％とし、培養３時間後のＣＦＵからR. mucilaginosaの生存率を求めたが、硝酸カリウムの添加、非添加の条件に関わらず、生存率の低下はみられなかった。
【００３３】
すなわち、硝酸カリウムを用いて共培養した場合でも、硝酸ナトリウムを用いた場合と同様の結果が得られた。実施例１および実施例２の結果から、R. mucilaginosaとP. gingivalisの共培養系でのP. gingivalisの殺菌は、R. mucilaginosaと硝酸イオン依存的であることが確認できた。
【実施例３】
【００３４】
R. mucilaginosaとP. gingivalisの共培養系でみられたP. gingivalisの殺菌は、R. mucilaginosaが硝酸イオンを還元した際に生じる一酸化窒素が原因となっている可能性があり、これを調べるために、共培養系に一酸化窒素スカベンジャー（捕捉剤）を添加して、硝酸イオン依存的な殺菌が抑圧されるか確認した。
実験は、ＰＢＳで洗浄したR. mucilaginosaとP. gingivalisをＨＩＢに懸濁し、３７℃、４時間でインキュベートした。培養は、終濃度１０ｍＭとなるよう硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）を添加した場合（＋）と非添加の場合（−）、また、終濃度１ｍＭとなるようＰＴＩＯを添加した場合（＋）と非添加の場合（−）で行った。
培養開始時のP. gingivalisのＣＦＵ（２．０×１０７）を１００％とし、経時的に測定したＣＦＵから生存率を求めた。また、培養開始時のR. mucilaginosaのＣＦＵ（２．１×１０７）を１００％とし、経時的に測定したＣＦＵから生存率を求めた。
【００３５】
結果を図７に示す。R. mucilaginosaとP. gingivalisの共培養系に一酸化窒素スカベンジャー（捕捉剤）であるＰＴＩＯを加えた際のP. gingivalisの生存率の変化を調べた。硝酸ナトリウム非添加の場合、培養液へのＰＴＩＯの添加の有無に関わらず、培養４時間後のP. gingivalisの生存率はほぼ１００％であった。
一方、硝酸ナトリウムを添加した場合、ＰＴＩＯ非添加では著しい生存率の減少がみられたが、ＰＴＩＯ添加によって生存率の減少の程度が抑圧されたことが確認できた。このことから、P. gingivalisの殺菌は、R. mucilaginosaによる硝酸イオン還元の結果生じた一酸化窒素によるものであると理解できる。
【実施例４】
【００３６】
硝酸還元により生じた亜硝酸イオンは、酸性側ｐＨ環境下でその一部が自発的に一酸化窒素に変換する。従って、一酸化窒素が殺菌効果に関与しているのであれば、ｐＨ環境の違いでP. gingivalisの生存率が異なるはずであり、それを調べた。
R. mucilaginosaとP. gingivalisをリン酸ナトリウム緩衝液（終濃度０．１Ｍ）でｐＨ７．２，６．５，６．０に調整したＨＩＢに懸濁し、３７℃で２時間インキュベートした。また、これらの菌をクエン酸ナトリウム緩衝液（終濃度０．１Ｍ）でｐＨ５．５に調整したＨＩＢにも懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。培養は、終濃度１０ｍＭの硝酸ナトリウムを添加した場合（＋）と非添加の場合（−）で行った。培養開始時のP. gingivalisのＣＦＵ（ｐＨ７．２とｐＨ６．５では２．３×１０７、ｐＨ６．０では２．６×１０７、ｐＨ５．５では４．４×１０７）を１００％とし、経時的に測定したＣＦＵから生存率を求めた。また、培養開始時のR. mucilaginosaのＣＦＵ（ｐＨ７．２とｐＨ６．５では２．０×１０７、ｐＨ６．０では２．７×１０７、ｐＨ５．５では３．０×１０７）を１００％とし、経時的に測定したＣＦＵから生存率を求めた。
【００３７】
結果を図８に示す。R. mucilaginosaとP. gingivalisを異なるｐＨに調整されたＨＩＢに懸濁し、３７℃でインキュベートした。培養２時間後のP. gingivalisの生存率を求めたところ、ｐＨ７．２とｐＨ６．５に調製した培養液を用いた場合では、硝酸ナトリウム添加時においてもほとんど生存率の低下はみられなかった。一方、ｐＨ６．０の培養液を用いた場合，生存率が１％以下に減少した。さらに、ｐＨ５．５の培養液を用いた場合、１時間で生存率が１％以下に減少した。このことから、中性より酸性側ｐＨの方が、P. gingivalisの殺菌効果が高いことがわかった。
【実施例５】
【００３８】
硝酸イオン濃度と殺菌効果を調べた。R. mucilaginosaとP. gingivalisをリン酸ナトリウム緩衝液（終濃度０．１Ｍ）でｐＨ６．０に調整したＨＩＢに懸濁し、３７℃で２時間インキュベートした。培養は、終濃度１０ｍＭの硝酸ナトリウムを添加した場合（＋）と非添加の場合（−）で行った。培養開始時のP. gingivalisのＣＦＵ（１．６×１０７）を１００％とし、経時的に測定したＣＦＵから生存率を求めた。なお、培養開始時のR. mucilaginosaのＣＦＵは、２．０×１０７であったが、生存率の変化はなかった。
【００３９】
結果を図９に示す。R. mucilaginosaとP. gingivalisを異なる硝酸ナトリウム濃度に調整されたＨＩＢに懸濁し、３７℃でインキュベートした。培養２時間後のP. gingivalisの生存率を求めたところ、硝酸ナトリウムの濃度依存的にP. gingivalisの生存率の減少が確認された。
【実施例６】
【００４０】
次に、R. mucilaginosa以外にも硝酸還元活性を持つとされるActinomycesでも硝酸イオン依存的にP. gingivalisを殺菌できるか調べた。具体的には、硝酸還元酵素をコードする遺伝子（ｎａｒＧ）、亜硝酸還元酵素をコードする遺伝子（ｎｉｒＫ）の欠損株（亜硝酸還元酵素の欠損株）において、P. gingivalisの殺菌効果が消失するか確認した。
A. oris（ＭＧ−１）、その硝酸還元酵素欠損株（ＴＮ９０１１，ｎａｒＧ）、亜硝酸還元酵素欠損株（ＴＮ９０１２，ｎｉｒＫ）のいずれかと、P. gingivalisをリン酸ナトリウム緩衝液（終濃度０．１Ｍ）で、ｐＨ６．０に調整したＨＩＢに懸濁し、３７℃で８時間インキュベートした。培養は、終濃度１０ｍＭの硝酸ナトリウムを添加した場合（＋）と非添加の場合（−）で行った。培養開始時のP. gingivalisのＣＦＵ（ＭＧ−１，ＴＮ９０１１，ＴＮ９０１２との培養では、それぞれ４．１×１０７，４．５×１０７，４．４×１０７）を１００％とし、経時的に測定したＣＦＵから生存率を求めた。
【００４１】
結果を図１０、図１１に示す。図１０に示すように、A. orisとP. gingivalisを共培養したところ、P. gingivalisの生存率は硝酸依存的に著しく減少した。しかし、硝酸還元酵素ｎａｒＧ欠損株ＴＮ９０１１を添加した場合では、P. gingivalisの生存率が減少しておらず、硝酸依存的殺菌効果が消失したことを確認できた。このことは硝酸イオンの還元反応の結果生じた一酸化窒素が、P. gingivalisを殺菌しているということと矛盾しない。
一方、亜硝酸還元酵素ｎｉｒＫ欠損株ＴＮ９０１２を添加した場合では、P. gingivalisの生存率は著しく減少し、硝酸依存的殺菌効果は消失しなかったことを確認できた。これは、酸性ｐＨ環境では亜硝酸から一酸化窒素への還元過程が自発的に起こることから説明できる。
なお、図１１に示すように、A. orisとP. gingivalisを共培養において、A. orisの生存率はいずれの場合も変化しなかった。
【実施例７】
【００４２】
上述の実施例で、R. mucilaginosaやA. orisが、硝酸依存的にP. gingivalisを殺菌することを示したが、これら以外の口腔に存在するRothia属の細菌またはActinomyces属の細菌も、硝酸依存的にP. gingivalisを殺菌することができるか調べた。
具体的には、口腔内のRothia属の細菌（R. dentocariosa，R. aeria）、あるいは口腔内のActinomyces属の細菌（A. naeslundii）のいずれかと、P. gingivalisを共培養した際のP. gingivalisの生存率を調べた。培養開始時のP. gingivalisのＣＦＵを１００％とし、３時間後のＣＦＵとの比較から生存率を求めた。培養は、終濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨを６．０に調整したＨＩＢを用い、終濃度１０ｍＭの硝酸ナトリウムを添加した場合（＋）と非添加の場合（−）で行った。培養開始時の培養液には、２．７×１０７ＣＦＵのP. gingivalisと１．０×１０９ＣＦＵのR. dentocariosa，２．９×１０７ＣＦＵのP. gingivalisと１．３×１０８ＣＦＵのR. aeria，２．８×１０７ＣＦＵのP. gingivalisと１．０×１０８ＣＦＵのA. naeslundiiが含まれていた。
【００４３】
結果を図１２に示す。図１２のグラフの横軸において、ＲｄはR. dentocariosa、ＲａはR. aeria、ＡｎはA. naeslundiiを表す。
P. gingivalisと口腔内のRothia属の細菌（R. aeria，R. dentocariosa）あるいは口腔内のActinomyces属の細菌（A. naeslundii）とを共培養したところ、硝酸ナトリウム依存的にP. gingivalisの生存率の低下が確認できた。このことから、上述の実施例で示されたR. mucilaginosaやA. orisにおよる硝酸依存的なP. gingivalisの殺菌は、口腔内の主要なRothia属の細菌やActinomyces属の細菌でもみられる共通の特徴であることがわかった。すなわち、硝酸依存的殺菌効果は、Actinomyces属，Rothia属細菌で一般化できることが確認できた。
【実施例８】
【００４４】
次に、P. gingivalisと並び、歯周病原菌として知られるP. intermediaにおいても、R. mucilaginosaとの共培養で硝酸ナトリウム依存的に殺菌されるかを調べた。
R. mucilaginosaとP. intermediaをリン酸ナトリウム緩衝液（終濃度０．１Ｍ）でｐＨ６．０に調整したＨＩＢに懸濁し、３７℃で２時間インキュベートした。培養は、終濃度１０ｍＭの硝酸ナトリウムを添加した場合（＋）と非添加の場合（−）で行い、培養開始時のP. intermediaのＣＦＵ（２．１×１０７）を１００％とし、経時的に測定したＣＦＵから生存率を求めた。なお、培養開始時のR. mucilaginosaのＣＦＵは、４．１×１０７であったが、生存率の変化はなかった。
【００４５】
結果を図１３に示す。R. mucilaginosaとP. intermediaを共培養したところ、硝酸ナトリウム存在下において著しいP. intermediaの生存率の減少が確認できた。R. mucilaginosaによる硝酸ナトリウム依存的殺菌効果は、歯周病原菌のP. gingivalisだけではなく、P. intermediaにも有効であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、歯周病菌殺菌剤、歯周病菌予防剤または歯周病菌治療剤として、歯磨剤、サプリメント、食品（タブレット、ジュース）に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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