(57)【要約】【課題】HBV感染の根治を目的とする新たな治療手段を提供することを目的とする。【解決手段】HBV DNAと特異的に結合するように改変されたXanthomonas属細菌由来のTALEと、配列非依存性のエンドヌクレアーゼとを含んでなる、HBV特異的人工DNAヌクレアーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
B型肝炎ウイルス（HBV）DNAのセンス鎖上の特定の領域に特異的に結合するように改変されたXanthomonas属細菌由来のTALE (Transcription Activator-Like Effectors)と、配列非依存性のエンドヌクレアーゼとが連結されてなる第１の融合タンパク質；ならびに
HBV DNAのアンチセンス鎖上の特定の領域に特異的に結合するように改変されたXanthomonas属細菌由来のTALEと、配列非依存性のエンドヌクレアーゼとが連結されてなる第２の融合タンパク質、
を含む人工DNAヌクレアーゼであって、
該第１の融合タンパク質及び該第２の融合タンパク質が配列番号２〜４のいずれかで示される塩基配列を有するセンス鎖及びそのアンチセンス鎖より選択される15〜30個の連続した塩基からなる領域に対してそれぞれ結合し、該第１の融合タンパク質が結合するセンス鎖上の領域と第２の融合タンパク質が結合するアンチセンス鎖上の領域は相補的でなく、かつ、両領域によって挟まれる領域にて該第１の融合タンパク質及び該第２の融合タンパク質に連結するエンドヌクレアーゼがHBV DNAを切断し、かつ、該第１の融合タンパク質及び該第２の融合タンパク質が核移行シグナルペプチドを含む、上記人工DNAヌクレアーゼ。
【請求項２】
第１の融合タンパク質が配列番号５で示される塩基配列からなる領域と特異的に結合し、かつ第２の融合タンパク質が配列番号６で示される塩基配列からなる領域と特異的に結合する、請求項１に記載の人工DNAヌクレアーゼ。
【請求項３】
配列非依存性のエンドヌクレアーゼが、DNA認識機能ドメインが除去されたFokIエンドヌクレアーゼである、請求項１又は２に記載の人工DNAヌクレアーゼ。
【請求項４】
第１の融合タンパク質が配列番号７で示されるアミノ酸配列からなり、かつ第２の融合タンパク質が配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に記載の人工DNAヌクレアーゼ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の人工DNAヌクレアーゼをコードするDNAであって、第１の融合タンパク質をコードするDNAと第２の融合タンパク質をコードするDNAを含む、上記人工DNAヌクレアーゼをコードするDNA。
【請求項６】
請求項５に記載の人工DNAヌクレアーゼをコードするDNAを含む発現ベクターであって、第１の融合タンパク質をコードするDNAと第２の融合タンパク質をコードするDNAが同一のベクター中に含まれるか、または別々のベクター中に含まれる、上記発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを含む、HBV DNAを切断するための医薬組成物。
【請求項８】
HBV DNAがHBV cccDNAである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
HBV感染を治療又は予防するための、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HBV DNAと特異的に結合するように改変されたXanthomonas属細菌由来のTALEと、配列非依存性のエンドヌクレアーゼとを含んでなる、HBV特異的人工DNAヌクレアーゼ及びそれを用いたHBV 感染の治療及び予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
B型肝炎ウイルス（以下、「HBV」と記載する。）は、ヘパドナウイルス族に属するウイルスであり、外被（envelope）と不完全環状二本鎖DNAとDNAポリメラーゼ、逆転写酵素などを含む、直径27nmの芯（core）からなる、球状（直径約42nm）のDNAウイルスである。
【０００３】
現在、全世界で350〜400万人もの人々がHBVに感染していると考えられ、そのうちの多くの人が将来的に非代償性肝硬変や肝細胞癌を発症するリスクを有する。
【０００４】
HBVは肝細胞に侵入すると、ウイルス遺伝子が肝細胞の核内に移動し、不完全環状二本鎖DNAは完全閉鎖二本鎖DNA（covalenty closed circular DNA）(以下、「cccDNA」と記載する。)に転換される。cccDNAは核内にて転写・翻訳され、ウイルス粒子を形成する。
【０００５】
現在、HBV感染の治療においては抗ウイルス剤や逆転写酵素阻害剤が使用されている。これら治療剤の投与によりウイルス粒子の形成が阻害されるために、肝細胞より血中に分泌、放出されるウイルス粒子の量を顕著に減少させることができる。しかしながら、当該治療剤の投与によっても、cccDNAは核内にて減少されることなく維持される。これにより、たとえウイルス粒子の血中レベルが検出感度未満になったとしても、治療剤投与の中止により、cccDNAからのウイルス粒子形成が再燃する（非特許文献１）。すなわち、今日の治療法においては、肝細胞中のcccDNA量を減少・消失させることができないことから、HBV感染の根治は不可能であるといえる。故に、当該分野においてはHBV感染に対する新たな治療手段が切望されている。
【０００６】
今日、遺伝子組換えの手段としてTALEN(登録商標)（Transcription activator-like effector nuclease）とよばれる人工DNAヌクレアーゼが利用されている。TALEN(登録商標)は、DNA結合ドメインである植物病原性Xanthomonas属細菌のTALE（Transcription activator-like effector）とDNA切断ドメインであるFokIが融合されてなるサブセットを2つ含むヘテロ二量体の人工DNAヌクレアーゼである。各TALEは高度に保存された33〜35アミノ酸残基からなるユニットのリピート構造を有しており、各ユニットがそれぞれの塩基を特異的に認識し結合する。TALEN(登録商標)においてはTALE部分がDNA上の標的配列に特異的に結合するように改変されている。これによりTALEN(登録商標)の2つのサブセットはそれぞれDNA上の特定の配列に特異的に結合し、当該結合部位の近傍にて各サブセットに由来するFokIが二量体を構成し、2本鎖DNAを切断する。2本鎖DNAの切断によって誘導される非相同末端再結合 (Non Homologous End Joining：NHEJ)によって塩基の欠損や置換が誘発され、これにより遺伝子のノックアウトを容易に行うことができる。また、2本鎖DNAの切断の際に、ドナーを同時にトランスフェクションしておけば、相同組換え(Homologous Recombination: HR)を利用して切断部に遺伝子のノックインを容易に行うことができる。その特異性と容易性から、TALEN(登録商標)は、DNAの点変異、欠損、挿入、逆位、重複、転移などの様々な遺伝子操作において利用されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】田中靖人ら、モダンメディア、2008年、54巻、12号、347−352頁
【非特許文献２】Joung JK et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2013 Jan;14(1):49-55.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、HBV感染の根治を目的とする新たな治療手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、HBV DNA（より詳細にはHBV cccDNA）を標的とする人工DNAヌクレアーゼを、HBV感染の危険にある肝細胞に導入することによって、感染後のHBV DNA（より詳細にはHBV cccDNA）増加を抑制又は阻害できることを見出した。また、当該、人工DNAヌクレアーゼを、HBV感染した肝細胞に導入することによって、HBV DNA（より詳細にはHBV cccDNA）量を減少又は消失させることができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づく。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の特徴を有する。
【００１１】
［１］  B型肝炎ウイルス（HBV）DNAのセンス鎖上の特定の領域に特異的に結合するように改変されたXanthomonas属細菌由来のTALE (Transcription Activator-Like Effectors)と、配列非依存性のエンドヌクレアーゼとが連結されてなる第１の融合タンパク質；ならびに
HBV DNAのアンチセンス鎖上の特定の領域に特異的に結合するように改変されたXanthomonas属細菌由来のTALEと、配列非依存性のエンドヌクレアーゼとが連結されてなる第２の融合タンパク質、
を含む人工DNAヌクレアーゼであって、
該第１の融合タンパク質及び該第２の融合タンパク質が配列番号２〜４のいずれかで示される塩基配列を有するセンス鎖及びそのアンチセンス鎖より選択される15〜30個の連続した塩基からなる領域に対してそれぞれ結合し、該第１の融合タンパク質が結合するセンス鎖上の領域と第２の融合タンパク質が結合するアンチセンス鎖上の領域は相補的でなく、かつ、両領域によって挟まれる領域にて該第１の融合タンパク質及び該第２の融合タンパク質に連結するエンドヌクレアーゼがHBV DNAを切断し、かつ、該第１の融合タンパク質及び該第２の融合タンパク質が核移行シグナルペプチドを含む、上記人工DNAヌクレアーゼ。
［２］  第１の融合タンパク質が配列番号５で示される塩基配列からなる領域と特異的に結合し、かつ第２の融合タンパク質が配列番号６で示される塩基配列からなる領域と特異的に結合する、［１］の人工DNAヌクレアーゼ。
［３］  配列非依存性のエンドヌクレアーゼが、DNA認識機能ドメインが除去されたFokIエンドヌクレアーゼである、［１］又は［２］の人工DNAヌクレアーゼ。
［４］  第１の融合タンパク質が配列番号７で示されるアミノ酸配列からなり、かつ第２の融合タンパク質が配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる、［１］又は［２］の人工DNAヌクレアーゼ。
［５］  ［１］〜［４］のいずれかの人工DNAヌクレアーゼをコードするDNAであって、第１の融合タンパク質をコードするDNAと第２の融合タンパク質をコードするDNAを含む、上記人工DNAヌクレアーゼをコードするDNA。
［６］  ［５］の人工DNAヌクレアーゼをコードするDNAを含む発現ベクターであって、第１の融合タンパク質をコードするDNAと第２の融合タンパク質をコードするDNAが同一のベクター中に含まれるか、または別々のベクター中に含まれる、上記発現ベクター。
［７］  ［６］の発現ベクターを含む、HBV DNAを切断するための医薬組成物。
［８］  HBV DNAがHBV cccDNAである、［７］の医薬組成物。
［９］  HBV感染を治療又は予防するための、［７］又は［８］の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、HBV感染の根治を可能とする新たな治療手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１（A）は、HBVの17クローンの遺伝子配列のホモロジー検索の結果得られた、保存性の高いHBVポリメラーゼ遺伝子領域の塩基配列を示す。（a）及び(c)は、HBV特異的ヌクレアーゼの第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質が結合する標的配列の領域を示し、(b)は各サブセットのエンドヌクレアーゼ（FokI）によって切断される部位を含む領域を示す。図１（B）は、HBV DNAの模式的な構造図を示す。(d)は図１（A）に示す（a）−(c)を含む領域を示す。
【図２】図２はHBV特異的ヌクレアーゼの各サブセットの発現ベクターの模式図を示す。（A）pTAL.CMV.T7.HBV-L；（B）pTAL.CMV.T7. HBV-R。
【図３】図３（A）はヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞におけるHBV感染実験の実験プロトコルを示す。図３（B）は、HBV感染させたヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞の培養上清におけるHBV DNA(遺伝子型A及びC)の定量結果を示す。図３（C）は、HBV感染後22日目における、ヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞の細胞内HBV DNA(遺伝子型A及びC)の定量結果を示す。図３（D）は、間接免疫蛍光分析による、HBV感染後22日目におけるヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞におけるHB抗原の検出結果を示す写真図である。
【図４】図４（A）は、HBV特異的ヌクレアーゼによるHBV感染阻害実験の実験プロトコルを示す。図４（B）は、HBV感染後27日目における、ヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞の細胞内HBV cccDNA(遺伝子型C)の定量結果を示す。
【図５】図５（A）は、HBV持続感染に対するHBV特異的ヌクレアーゼの効果を確認するための実験プロトコルを示す。図５（B）は、HBV特異的ヌクレアーゼで処置した、持続的にHBV感染したヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞の細胞内HBV cccDNA(遺伝子型C)の定量結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．TALE (Transcription Activator-Like Effector)
TALEは植物病原性Xanthomonas属細菌に由来し、特定の塩基を認識することが可能なユニットが15〜30個連結してなり、これにより特定の塩基配列を有するDNAを認識し、特異的に結合することができる。各ユニットは33〜35個のアミノ酸からなり、12番目及び13番目のアミノ酸残基（可変残基）を除き、同一又は非常に高い配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。本発明においてユニットは、以下のアミノ酸配列によって表わすことができる（各アミノ酸は一文字表記にて示す）。
【００１５】
2015002723.tif 000002
【００１６】
配列中「X」にて示される12番目及び13番目のアミノ酸残基が、N及びIである場合アデニンを、H及びDである場合シトシンを、N及びGである場合チミンを、N及びNである場合グアニンを、N及びKである場合グアニンを、各ユニットが認識することができる。
【００１７】
本発明におけるユニットには、各ユニットが目的の塩基を認識することができる限り、上記配列番号１のアミノ酸配列の12番目及び13番目のアミノ酸残基を除く部分において一又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで「複数個」とは1〜5個、好ましくは1〜4個である。
【００１８】
本発明におけるTALEは、HBV DNAのセンス鎖、又はアンチセンス鎖上の特定の塩基配列に対して特異的に結合することができるように上記ユニットが組み合わせられた改変型のTALEである。本発明におけるTALEが標的とする塩基配列は、HBV DNA上の領域より任意に選択すること可能であるが、好ましくはHBVの遺伝子型（A,B,C型）の全てにおいて保存されている領域から選択する。当該保存された領域は、遺伝子型A,B,C型の遺伝子配列をホモロジー検索に付すことにより得ることができる。このような領域としてHBVポリメラーゼ遺伝子中の塩基配列（配列番号２〜４のいずれか）からなる領域がある。この領域はPreC/C及びポリメラーゼコード領域の重複部位である。本発明においては、この領域のセンス鎖及びアンチセンス鎖上の15〜30個の連続した塩基からなる配列をTALEの標的配列とすることができる。
【００１９】
ただし、本発明において、第１の融合タンパク質に含まれるTALEの標的配列とされるセンス鎖上の塩基配列と、第２の融合タンパク質に含まれるTALEの標的配列とされるアンチセンス鎖上の塩基配列とは相補的な関係になく、かつ、両標的配列によって挟まれる領域にエンドヌクレアーゼによって切断される領域が配置される。エンドヌクレアーゼによって切断される領域の長さは、他方のTALEの標的配列に最も近い側の端から2〜30塩基、好ましくは5〜25塩基程度とすることができる。この長さは、本発明に用いられるエンドヌクレアーゼの種類や、TALEとエンドヌクレアーゼを連結するリンカーの長さなどの要因に応じて、最適な切断が得られるように適宜選択することができる。
【００２０】
本発明におけるTALEの標的配列は、上記保存されている領域より公知の手法、例えば、TALEN（登録商標） Hitソフトウェアプログラム (http://talen-hit.cellectis-bioresearch.com/search)を使用して選択することができる。
【００２１】
好ましくは、本発明におけるTALEの標的配列は、HBVポリメラーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号２〜４のいずれか）における9〜25番目の塩基を含むか当該塩基からなる領域のセンス鎖及びアンチセンス鎖、ならびに48〜64番目の塩基を含むか当該塩基からなる領域のセンス鎖及びアンチセンス鎖より選択される。より好ましくは、本発明におけるTALEは、HBV DNAのセンス鎖上：5’-TAGAAGAAGAACTCCCT-3’（配列番号５）又はアンチセンス鎖上：5’-TTCTGCGACGCGGCGAT-3’（配列番号６）を標的配列とし、当該配列に特異的に結合する。
【００２２】
２．HBV特異的人工DNAヌクレアーゼ
本発明のHBV特異的人工DNAヌクレアーゼ（以下、「HBV特異的ヌクレアーゼ」と記載する。）は、上記HBV DNAのセンス鎖上の特定の領域に特異的に結合することができるTALEと当該TALEに機能し得るかたちで連結されたエンドヌクレアーゼを含む第１の融合タンパク質、ならびに、上記HBV DNAのアンチセンス鎖上の特定の領域に特異的に結合することができるTALEと当該TALEに機能し得るかたちで連結されたエンドヌクレアーゼを含む第２の融合タンパク質、を含む。なお、本明細書中において、本発明のHBV特異的人工DNAヌクレアーゼに含まれる融合タンパク質を、HBV特異的人工DNAヌクレアーゼの「サブセット」とよぶ場合がある。本発明において、「融合タンパク質」と「サブセット」なる用語は相互互換的に使用される。
【００２３】
本発明において利用可能なエンドヌクレアーゼとしては、HBV DNAの塩基配列非依存的に、二量体を形成して2本鎖DNAを切断するものであればよい。これによって本発明のHBV特異的ヌクレアーゼにおいては、第１の融合タンパク質のTALE部分及び第２の融合タンパク質のTALE部分がそれぞれ配列特異的にHBV DNAと結合し、そしてその近傍において第１の融合タンパク質に連結されたエンドヌクレアーゼと第２の融合タンパク質に連結されたエンドヌクレアーゼとが二量体を形成し2本鎖HBV DNAを切断する。
【００２４】
このようなエンドヌクレアーゼとして、DNA認識機能ドメインが除去されたIIS型のクラスに属するエンドヌクレアーゼを利用することができる。IIS型のクラスに属するエンドヌクレアーゼは一般的に、DNA認識機能ドメインとDNA切断機能ドメインを含み、DNA認識機能ドメインがDNA配列を認識・結合し、そしてDNA認識機能ドメインが結合したDNA配列の外側でDNA切断機能ドメインがDNAを切断する。したがって、DNA認識機能ドメインを除去することによって配列非依存的にDNAを切断することが可能なエンドヌクレアーゼを得ることができる。DNA認識機能ドメインが除去されたエンドヌクレアーゼは一般的な遺伝子組換え手法を用いて製造することが可能であり、またIIS型のクラスに属する種々のエンドヌクレアーゼの遺伝子情報は既に公知となっており、製造に際してはこれらの遺伝子情報を利用することができる。例えば、DNA認識機能ドメインが除去されたFoKIが既に公知となっており（特開2013-31447号公報）、本発明においてはこのような変異型のFoKIを利用することができる。このような変異型のFoKIとしては配列番号９で示されるアミノ酸配列を含むか、係るアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００２５】
ここで「機能し得るように連結された」とは、第１の融合タンパク質のTALE部分及び第２の融合タンパク質のTALE部分がそれぞれ配列特異的にHBV DNAに結合した状態において、第１の融合タンパク質のエンドヌクレアーゼと第２の融合タンパク質のエンドヌクレアーゼとが二量体を構成し2本鎖DNAを切断し得るように、TALEとエンドヌクレアーゼとがそれぞれ連結されていることを意味する。TALEとエンドヌクレアーゼとは、機能し得るように連結される限り、直接又は適当なリンカーを介して間接的に連結することができる。好ましくは、TALEとエンドヌクレアーゼとは、リンカーを介して連結される。リンカーは公知のアミノ酸リンカー（例えば、特開2013-31447号公報に記載されるリンカー）を利用することができる。アミノ酸リンカーの長さは、エンドヌクレアーゼによる最適な切断が得られるように調節することが可能であり、例えば2〜40残基程度の長さから適宜選択することができる。この長さは、本発明に用いられるエンドヌクレアーゼの種類や、両標的配列によって挟まれる領域の長さなどの要因に応じて、最適な切断が得られるように適宜選択することができる。エンドヌクレアーゼはTALEのN末及びC末のいずれの側にも連結することが可能であるが、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質のTALEの各標的配列に挟まれる領域にてエンドヌクレアーゼによるDNAの切断が効率的に生じるように、第１の融合タンパク質のTALE部分及び第２の融合タンパク質のTALE部分がHBV DNAに結合した状態において、他方のTALEに近い側の各TALE末端にエンドヌクレアーゼを連結することができる。
【００２６】
第１の融合タンパク質、及び、第２の融合タンパク質は、TALEとエンドヌクレアーゼに加えてさらに、核局在シグナル（Nuclear localization signal：NLS）を含む。核局在シグナルを含むことによって、第１の融合タンパク質、及び、第２の融合タンパク質は、導入／発現された細胞において核内へと移行される。NLSとしては公知のものを利用することができ、例えば-PKKKRKV-（配列番号１０）などが挙げられる。NLSは当該融合タンパク質のN末及びC末のいずれの側にも連結することが可能であるが、好ましくはエンドヌクレアーゼが連結された側とは反対側のTALEに連結する。NLSは適当なリンカーを介して連結されてもよいし、または直接連結されてもよい。
【００２７】
第１の融合タンパク質、及び、第２の融合タンパク質には、必要に応じてさらに、膜透過ペプチド（例えば、Tat、オリゴアルギニン、DrosophilaのAntennapedia タンパク質由来ペプチド（penetratin））や標識ペプチド（His等）を含めてもよい。膜透過ペプチドを含むことによって、投与された第１の融合タンパク質、及び、第２の融合タンパク質は細胞内へと移行される。膜透過ペプチドや標識ペプチドは当該融合タンパク質のN末又はC末のいずれの側にも連結することができる。
【００２８】
本発明においてHBV特異的ヌクレアーゼに含まれる第１の融合タンパクとしては例えば配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むか、係るアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられ、また第２の融合タンパクとしては例えば配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むか、係るアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。また、本発明において第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質には、元のタンパク質の活性、すなわちTALE部分がHBV DNA上の標的配列に特異的に結合し、エンドヌクレアーゼ部分がHBV DNAを切断する活性を保持する限り、配列番号７又は配列番号８で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含むか係るアミノ酸配列からなるポリペプチドも含む。ここで「複数個」とは1〜20個、好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。さらに、本発明において第１の融合タンパク及び第２の融合タンパクには、元のタンパク質の活性を保持する限り、配列番号７又は配列番号８で示されるアミノ酸配列と80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、最も好ましくは99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか係るアミノ酸配列からなるポリペプチドも含む。アミノ酸配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール）)等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。
【００２９】
第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質は慣用の液相合成法、固相合成法などのペプチド合成法、自動ペプチド合成機によるペプチド合成などによって製造してもよいし、あるいは以下に記載する、第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質をコードするDNAを用いた遺伝子組換え法によって製造してもよい。遺伝子組換え法においては、第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターを適当な宿主細胞にベクターを導入し、細胞を培養し、培養物から目的のタンパク質を回収することを含む。宿主細胞としては、E. coli、酵母、SF9、SF21、COS1、COS7、CHO、HEK293など周知の細胞を用いることが可能である。
【００３０】
製造された第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質は、常法により、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、HPLCなどのクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過、免疫吸着法などにより、回収又は精製することができる。
【００３１】
HBV特異的ヌクレアーゼの活性は、Single Strand Annealing (SSA)アッセイ等の公知の手法によって評価することができる。すなわち、HBV特異的ヌクレアーゼの標的部位によって中断された非機能的レポーター遺伝子（例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を発現する宿主細胞（例えば酵母）に、以下に記載するHBV特異的ヌクレアーゼをコードするDNA又は当該DNAを含む発現ベクターを導入し、HBV特異的ヌクレアーゼを発現させる。HBV特異的ヌクレアーゼによって、その標的部位にてDNAの二本鎖切断(DSB)が誘導されるとレポーター遺伝子は、宿主細胞の一本鎖アニーリング（SSA）機構によって再構成される。レポーター遺伝子の発現量は、用いたレポーター遺伝子に応じた一般的な検出方法によって検出・定量することができ、当該レポーター遺伝子の発現量が、HBV特異的ヌクレアーゼの活性を反映する。
【００３２】
３．HBV特異的ヌクレアーゼをコードするDNA及び発現ベクター
本発明のHBV特異的ヌクレアーゼに含まれる第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質コードするDNAならびにHBV特異的ヌクレアーゼの発現ベクターは、当業者にとって周知であるように、遺伝子工学的手法を用いて製造することができる。例えば、Xanthomonas属細菌を、乳鉢などを用いて液体窒素中で摩粋後、例えばフェノール/クロロホルム法、グアニジウム法又はフェノール/SDS法により全RNAを抽出する。必要に応じて、RNAをオリゴ（dT）セルロースカラムに通してpoly(A)+RNAを得るか、あるいは、poly(A)+RNAから既知の逆転写反応を経てcDNAを作製する。NCBI、GenBank等のデータバンクにアクセスすることによって入手可能であるTALEの公知塩基配列を基にプライマーを設計し、上記RNAまたはcDNAを鋳型としてPCRを行い菌体のTALEユニットをコードするDNAをクローニングする。（必要に応じて）PCRによる特異的変異導入法などの公知の手法によってTALEユニット中の12番目及び13番目の残基（可変残基）をコードする塩基配列を改変し、アデニン、グアニン、シトシン、チミンのいずれかの塩基を特異的に認識し得るTALEユニットをコードするDNAを作製する。HBV DNA上の標的配列に応じて、各塩基を認識・結合するユニットを連結させることによって本発明におけるTALE部分をコードするDNAを得ることができる。得られたTALE部分をコードするDNAを、上記エンドヌクレアーゼ、リンカー、核局在シグナル等をコードするDNAと所定の順序で連結することによって第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質コードするDNAを得ることができる。
【００３３】
本発明においては、配列番号７又は配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質をコードするDNAとして、例えば配列番号１１又は１２の塩基配列からなるDNAを利用することができる。
【００３４】
第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質をコードするDNAは、被験体／宿主細胞に適合性を有する適当な発現ベクターに、プロモーター及び／又はその他の制御配列と機能し得るかたちで連結して挿入する。ここで「機能し得るかたちで連結して挿入する」とは、当該発現ベクターが導入された細胞において、プロモーター及び／又はその他の制御配列の制御の下、第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質が発現されるように、プロモーター及び／又はその他の制御配列を連結してベクターに組み込むことを意味する。１つの発現ベクター中に第１の融合タンパク質をコードするDNA及び第２の融合タンパク質をコードするDNAを含めてもよいし、第１の融合タンパク質をコードするDNA及び第２の融合タンパク質をコードするDNAをそれぞれ別々の発現ベクター中に含めてもよい。好ましくは、第１の融合タンパク質をコードするDNAと第２の融合タンパク質をコードするDNAとはそれぞれ別々の発現ベクター中に含める。
【００３５】
本発明において用いることができるベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター、非ウイルスベクターなどが挙げられる。プラスミドベクターとしては、例えばpTAL等を使用することができる。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等を使用することができる。
【００３６】
ベクターに組み込むことができるプロモーター及び／又はその他の制御配列は特に限定されないが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、時期特異的プロモーター、tRNAプロモーター、H1プロモーター、U6プロモーター、ポリメラーゼII系プロモーター、CMVプロモーターなど、その他の調節エレメントなど（例えば、ターミネーター配列）を適宜選択することができる。
【００３７】
第１の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクター、及び第２の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターの構造及び構成は、TALE部分を除く部分において同一の構造及び構成であってもよいし、異なる構造及び構成を有していてもよい。
【００３８】
このように作製された発現ベクターは、導入された細胞内で第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を発現し、核内に移行した第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質は、HBV DNA（存在すれば）を特異的に切断することができる。
【００３９】
なお、本発明における第１の融合タンパク質をコードするDNA及び第２の融合タンパク質をコードするDNA、並びにそれらを含む発現ベクターは、TALEN（登録商標）を製造するメーカー（例えば、Cellectis bioresearch (Paris, France)）に製造を委託することができる。
【００４０】
４．医薬組成物
本発明の医薬組成物は有効成分としてHBV特異的ヌクレアーゼ発現ベクター、より詳細には上記第１の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクター、及び第２の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターを含む。
【００４１】
あるいは、本発明の医薬組成物は有効成分としてHBV特異的ヌクレアーゼ、より詳細には上記第１の融合タンパク質、及び第２の融合タンパク質を含む。ただし、ここで第１の融合タンパク質、及び第２の融合タンパク質は膜透過ペプチドを有し、投与後に細胞内へ移行する。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、経口投与または非経口投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、注射による局所投与、腹腔または胸腔への投与、皮下投与、筋肉内投与、舌下投与、経皮吸収または直腸内投与など）によって投与することができる。また、発現ベクターがプラスミドベクターや非ウイルスベクターである場合には、遺伝子治療の分野で用いられている種々の遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、またはリポフェクション法）を適宜用いて投与することができる。
【００４３】
本発明の医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とすることができる。具体的には注射剤、懸濁剤、乳化剤、軟膏剤、クリーム剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ錠、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤等の各種製剤形態に調製することができる。
【００４４】
これらの各種製剤は、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、浸潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、着色料、香味剤、および安定化剤などを用いて常法により製造することができる。
【００４５】
第１の融合タンパク質をコードするDNAと第２の融合タンパク質をコードするDNAとは、あるいは、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とは、それぞれ別個の製剤中に含めてもよいし、あるいは同一の製剤中に含めてもよい。別個の製剤中に含める場合において、第１の融合タンパク質をコードするDNAの剤形と第２の融合タンパク質をコードするDNAの剤形とは、あるいは、第１の融合タンパク質の剤形と第２の融合タンパク質の剤形とは、同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、HBVに感染している、又はHBV感染の危険にある被験体に対して投与することができる。投与量は被験体の年齢、体重、感染の重篤度などの要因によって変化し得るが、第１の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクター及び第２の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターをそれぞれ、１回の投与につき体重1kgあたり0.00001mg〜100mg、好ましくは0.0001mg〜10mgの範囲から適宜選択される量を投与することができる。あるいは、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質をそれぞれ、１回の投与につき体重1kgあたり0.00001mg〜100mg、好ましくは0.0001mg〜10mgの範囲から適宜選択される量を投与することができる。第１の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターと第２の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターの投与量、あるいは、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質の投与量は同一であってもよいし、異なっていてもよいが、好ましくは同一である。投与スケジュールは、被験体の年齢、体重、疾患の重篤度などの要因によって変化し得るが、本発明の医薬組成物を被験体に対して、１日に１回または複数回（例えば、２回、３回またはそれ以上）、毎日または週に２〜５日の連続投与を１〜８週間にわたって、投与することができる。第１の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターと第２の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターとがそれぞれ別個の製剤中に含まれる場合、あるいは、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とがそれぞれ別個の製剤中に含まれる場合において、各製剤は同時に投与してもよいし、細胞内（より詳細には核内）にて導入／発現された第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質が共存し得る範囲において非同時に投与してもよい。
【００４７】
本発明の医薬組成物に含まれる発現ベクターは導入された被験体の細胞において転写・翻訳され、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を発現することができる。また、本発明に医薬組成物に含まれる第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質は、膜透過ペプチドにより細胞内に移行される。その後、発現された、あるいは移行された第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質は核内に移行し、HBV DNA（より詳細にはHBV cccDNA）に特異的に結合し、各融合タンパク質のエンドヌクレアーゼが二量体を構成して、HBV DNA（より詳細にはHBV cccDNA）の2本鎖DNAを切断し、HBVの複製を阻害することができる。
【００４８】
本発明の医薬組成物は、HBV感染の前に被験体に投与することによって、被験体におけるHBVの増殖を阻害することができHBV感染を予防することができる。また、本発明の医薬組成物は、HBVに持続的に感染している被験体に投与することによって、肝細胞の核内に存在するHBV cccDNAを切断することが可能であり、HBV感染を根治することができる。
【実施例】
【００４９】
次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５０】
［材料及び方法］
１．HBV特異的ヌクレアーゼの設計及び構築
HBVの17クローン (遺伝子型A：X51970, AM282986, AY161149, AF373065, AF297621；遺伝子型B：AB073858, AB033554, AF100309, D00329, D00330；遺伝子型C：AB246345, NC_003977, AB033556, AB231908, AY123041, AB014381, AY206389)について、HBVポリメラーゼ遺伝子領域のホモロジーを検索し、全ての遺伝子型で保存されている領域を同定した。この領域の配列を元に、TALEN（登録商標） Hitソフトウェアプログラム (http://talen-hit.cellectis-bioresearch.com/search)を使用して、HBV特異的ヌクレアーゼの標的部位を決定した。HBV特異的ヌクレアーゼ発現プラスミドの合成はCellectis bioresearch (Paris, France)に委託した。
【００５１】
HBV特異的ヌクレアーゼの活性は、HBV特異的ヌクレアーゼを発現するプラスミドを有する第１のハプロイド酵母、及び非機能的LacZ遺伝子（HBV特異的ヌクレアーゼの標的配列を含む領域によって中断されている）を担持するプラスミドを有する第2のハプロイド酵母を用いたSingle Strand Annealing (SSA)アッセイにより評価した。
【００５２】
２．ヒト化キメラマウスの初代肝細胞の単離
ヒト肝臓を有するヒト化キメラマウスは公知の手法により作製した。すなわち、凍結保存されたヒト肝細胞（BD Bioscience (CA, USA)）2〜4週齢の免疫不全肝障害マウス(uPA/SCID) (Tateno C et al. Am J Pathol. 2004;165:901-912.)に移植した。移植から7〜11週後に、ヒトアルブミンの高い血中レベル(>12 mg/mL)を示すマウスより、ヒト肝細胞を二段階のコラゲナーゼ灌流法を用いる公知の手法(Yamasaki C et al. Drug Metab Pharmacokinet. 2010;25(6):539-550.)により単離した。得られたヒト肝細胞は、I型コラーゲンをコートしたプレート中、ウシ胎仔血清を添加したDlbecco改変Eagle培地にて培養した。
【００５３】
３．HBV接種源
遺伝子型A(AB246337)及びC (AB246345)のHBVプラスミドにてそれぞれ形質転換されたHepG2細胞の培養上清（名古屋市立大学医学研究科田中靖人博士より譲渡されたもの(Sugiyama M et al. HEPATOLOGY 2006; 44:915-924.)）を、ヒト化キメラマウスにそれぞれ注射した。高レベルのHBV 血症が安定して観察された後、それぞれのマウスより血清を回収した。これらの血清を、本実験にて接種源として用いた。
【００５４】
４．ヒト血清アルブミンの測定
キメラマウスの血中ヒト血清アルブミンレベルは、Alb-IIキット(Eiken Chemical, Tokyo, Japan)を製造元の指示書に従い使用して測定した。
【００５５】
５．HBV DNAの定量
HBVゲノムDNAの抽出及び定量は、公知の手法により行った。すなわち、培養上清又は細胞よりDNAを、SMI test EX R&Dキット(NIPPON Genetics Co.Ltd, Tokyo, Japan)を製造元の指示書に従い使用して抽出した。HBVゲノムDNAの定量は、Universal master mix II (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)及びCFX96 real-time PCR detection system (Bio-Rad, CA, USA)を使用するquantitative real-time polymerase chain reaction（qPCR）にて行った。30μlの増幅反応混合物（5μl DNA溶液, 200nM フォワードプライマー, 200nM リバースプライマー, 300nM TaqManプローブ、15μl Universal master mix II）を以下の条件の増幅反応に供した：50℃にて2分間；95℃にて10分間；続いて、95℃にて20秒間及び60℃にて1分間を53サイクル。定量においては、HBVゲノムが挿入された組換えプラスミドの10倍希釈系列を使用して得られた標準曲線を用いた。
【００５６】
６．酵素免疫吸着測定法（Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)）
HBs抗原濃度は、酵素免疫吸着測定(ELISA) Kit (TFB, Tokyo, Japan)を製造元の指示書に従い使用して測定した。
【００５７】
７．間接免疫蛍光分析
HBVに感染した初代細胞の免疫蛍光分析は、一次抗体として抗HBs抗原モノクローナル抗体(Thermo Fisher Scientific K.K. Kanagawa, Japan)、二次抗体として抗ヤギIgG Alexa-594 (Life Technologies Japan, Tokyo, Japan)を用いて行った。核染色には、Hoechst 33342 (Dojindo, Kumamoto, Japan)を用いた。
【００５８】
８．トランスフェクション
ヒト化キメラマウスの初代肝細胞へのmGFP発現プラスミド又はHBV特異的ヌクレアーゼ発現ベクターのトランスフェクションは、X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent (Roche Diagnostics, Almere, Netherlands)を製造元の指示書に従い使用して行った。
【００５９】
９．ウェスタンブロット
細胞を溶解バッファー(1% SDS, 0.5% Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA及び1 mMジチオスレイトールを含有する10 mM Tris (pH 7.4))に懸濁し、得られたタンパク質サンプルを8%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、そしてPVDF (polyvinylidene difluoride)メンブレン (Immobilon-P; Millipore, Billerica, MA, USA)に転写した。HBV特異的ヌクレアーゼが有するHA-tagをウサギ抗HAモノクローナル抗体(3F10) (Roche Diagnostics, Almere, Netherlands)にて検出した。
【００６０】
１０．HBV cccDNAの定量
上記「５．HBV DNAの定量」と同様に、細胞からDNAを抽出した後、HBVcccDNAを検出するためのqPCRを、5μl DNAサンプル及び20μl PCR mixture (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて、CFX96 real-time PCR detection system (Bio-Rad, CA, USA)を使用して行った。HBV cccDNA に対するプローブは以下のものを使用した： 5’-6FAM-CGTCGCATGGARACCACCGTGAACGCC-BHQ1-3’（配列番号１３）。HBV cccDNAに対するプライマーは0.9μM、プローブは0.4μMの濃度にてそれぞれ使用した。増幅反応は以下の条件にて行った：50℃にて2分間；95℃にて10分間；続いて、95℃にて10秒間、58℃にて5秒間、63℃にて10秒間、及び72℃にて20秒間を55サイクル。定量においては、HBVゲノムが挿入された組換えプラスミドの10倍希釈系列を使用して得られた標準曲線を用いた。
【００６１】
１１．細胞生存アッセイ
細胞生存率は、cell counting kit (Dojindo, Kumamoto, Japan)を製造元の指示書に従い使用して生細胞数を計測することによって行った。
【００６２】
１２．統計的分析
統計的分析はStudent-t検定にて行い、p値 < 0.05を有意差ありと判断した。
【００６３】
［結果］
１．HBV特異的ヌクレアーゼ
17クローンに由来するHBVポリメラーゼ遺伝子領域のホモロジー検索の結果、全ての遺伝子型で保存されている領域を同定した（図１(A)）。この領域はPreC/C及びポリメラーゼコード領域の重複部位であった（図１(B)における(d)）。この領域より、センス鎖上：5’-TAGAAGAAGAACTCCCT -3’（配列番号５）及びアンチセンス鎖上：5’-TTCTGCGACGCGGCGAT-3’（配列番号６）を標的配列として選択し、HBV特異的ヌクレアーゼを構築した。HBV特異的ヌクレアーゼの第1のサブセット（配列番号７）（配列番号５で示される塩基配列を標的とする）の発現ベクター：pTAL.CMV.T7.HBV-L、ならびに、HBV特異的ヌクレアーゼの第2のサブセット（配列番号８）（配列番号６で示される塩基配列を標的とする）の発現ベクター：pTAL.CMV.T7. HBV-Rの模式図をそれぞれ図２(A)及び(B)に示す。
【００６４】
得られたHBV特異的ヌクレアーゼの活性は酵母を用いたSingle Strand Annealing (SSA)アッセイにより確認した。
【００６５】
２．ヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞におけるHBV増殖
ヒト肝臓を有するヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞にて、HBVの増殖が可能であるか否かを調べたるためにHBV感染実験を行った。図３(A)に記載のプロトコルに従い、細胞を播種した後HBV接種源を用いてHBV感染(遺伝子型A及びC)させ、感染から0, 2, 7, 12, 17及び22日目の培養上清及び細胞を回収し、当該上清中及び細胞中のHBV DNAをqPCRにて定量した。
【００６６】
上清中のHBV DNAレベルは両遺伝子型共に、2及び7日目におよそ104 copies/mlに達し、その後22日目にはおよそ105-106 copies/mlまで増加した（図３（B））。細胞中のHBV-DNAレベルもまた、22日目にはおよそ105-106 copies/mlまで増加した（図３（C））。さらに、間接免疫蛍光分析においては、HBs抗原が細胞にて発現していることが観察された（図３（D））。
【００６７】
これらの結果は、HBVがヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞に感染し、当該細胞にて複製・増殖できることを示す。
【００６８】
３．HBV特異的ヌクレアーゼによるHBV感染の阻害
HBV特異的ヌクレアーゼによる前処理により、HBV感染を阻害できるか否かを調べた。HBV特異的ヌクレアーゼの発現ベクターをヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞にトランスフェクトし、HBV特異的ヌクレアーゼの発現をウェスタンブロット法により確認した。ヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞にHBV特異的ヌクレアーゼの発現ベクター（pTAL.CMV.T7.HBV-L及びpTAL.CMV.T7. HBV-R）をトランスフェクトし（０日目）、その後HBV(遺伝子型C)を感染させ（1日目）、そして7日目に肝細胞を回収した（図４（A））。対照として、HBV特異的ヌクレアーゼの発現ベクターに代えてmGFP発現プラスミドを用いて同様に操作して得られたヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞を用いた。
【００６９】
HBV感染肝細胞における細胞内HBV cccDNAを定量した結果、HBV特異的ヌクレアーゼで前処理された細胞において遺伝子型Cに由来するHBV cccDNA量が、HBV特異的ヌクレアーゼの発現ベクター（pTAL.CMV.T7.HBV-L及びpTAL.CMV.T7. HBV-R）の用量依存的に、減少していることが確認された（図４(B)）。
【００７０】
これらの結果は、HBV特異的ヌクレアーゼによる前処置によって、肝細胞へのHBV感染を阻害できることを示す。
【００７１】
４．HBV持続感染に対するHBV特異的ヌクレアーゼの効果
次に、HBVが持続的に感染した状況下における、HBV特異的ヌクレアーゼの効果について調べた。上記したとおり、HBVに感染したヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞におけるHBV DNAレベルは、感染から22日目まで増加してプラトーに達した。この結果を鑑みて、HBV(遺伝子型C)を感染させてから25日後に、HBV特異的ヌクレアーゼの発現ベクター（pTAL.CMV.T7.HBV-L及びpTAL.CMV.T7. HBV-R）をトランスフェクトし（０日目）、その7日後に肝細胞を回収した（図５（A））。対照として、HBV特異的ヌクレアーゼの発現ベクターに代えてmGFP発現プラスミドを用いて同様に操作して得られたヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞を用いた。
【００７２】
HBV感染肝細胞における細胞内HBV cccDNAを定量した結果、HBV特異的ヌクレアーゼにより処理され細胞において遺伝子型Cに由来するHBV cccDNA量が、HBV特異的ヌクレアーゼの発現ベクター（pTAL.CMV.T7.HBV-L及びpTAL.CMV.T7. HBV-R）の用量依存的に、減少していることが確認された（図５(B)）。
【００７３】
以上より、HBV特異的ヌクレアーゼによる処置によって、感染によるHBV cccDNA量の増大を防ぎ、またHBV持続感染におけるHBV cccDNA量を減少させることが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明のHBV特異的ヌクレアーゼによれば、感染によるHBV cccDNA量の増大を防ぎ、またHBV持続感染におけるHBV cccDNA量を減少させることが可能である。したがって、本発明のHBV特異的ヌクレアーゼを利用することによって、HBV感染の予防ならびにHBV感染の寛解又は根治を可能としHBV治療の新たな治療手段として大いに貢献することが期待できる。
【図１】
2015002723.tif 000003
【図２】
2015002723.tif 000004
【図３】
2015002723.tif 000005
【図４】
2015002723.tif 000006
【図５】
2015002723.tif 000007
【配列表】
2015002723000001.app