(57)【要約】【課題】多孔質膜を用いたタンパク質の精製において、溶出後のタンパク質の滞留時間を最小限にし、以ってタンパク質の失活を速やかに抑制する方法を提供すること。【解決手段】多孔質膜を含むモジュールのハウジングの側面に備えられた第１のノズルおよび第２のノズルを介して受け液をハウジング内に供給しかつハウジング内から排出することにより、ハウジング内の２次側領域において受け液を循環させながら、ハウジングの開口部から１次側領域に溶出液を供給してタンパク質を溶出することを特徴とする、溶出方法。【選択図】図４
2015066479.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のタンパク質と夾雑物とを含む混合溶液を多孔質膜に通液して該タンパク質を該多孔質膜に吸着させた後、吸着した該タンパク質を溶出することを含む該タンパク質の精製手順において用いるための、該多孔質膜に吸着した該タンパク質を溶出するための方法であって、
該精製手順は多孔質膜を含むモジュールを使用するものであり、該モジュールは、
片端または両端に開口部を有するハウジングを有し、該開口部の１つは該ハウジング内への溶出液の供給を可能とするためのものであり、
該ハウジング内に収容された少なくとも１つの多孔質膜を有し、該多孔質膜は、前記の混合溶液および溶出液の通過を可能とするように多孔質であり、該タンパク質に対する吸着能を有する官能基が多孔内に固定されており、かつ、該ハウジング内において、溶出液を供給するための前記の開口部と該多孔質膜を介することなく流体連通している１次側領域と、溶出液を供給するための前記の開口部と該多孔質膜を介して流体連通している２次側領域とを規定するように配置されており、
該２次側領域に接する該ハウジングの壁面に設置された第１のノズルおよび第２のノズルを有し、該第１のノズルおよび該第２のノズルは、該多孔質膜から溶出された該タンパク質を安定化するための受け液を該２次側領域において循環させることを可能とするように構成されており、
当該方法は、該２次側領域において該受け液を循環させながら、該１次側領域に溶出液を供給して該タンパク質を溶出することを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
該多孔質膜が中空糸膜または平膜である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該多孔質膜が中空糸膜である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該官能基が、カチオン交換基、アニオン交換基、疎水性基、およびアフィニティ型官能基からなる群から選択される少なくとも１種の官能基を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該官能基が、カチオン交換基またはアニオン交換基である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該多孔質膜が、その多孔内にグラフト鎖を有し、該グラフト鎖に該官能基が形成されている構成を有している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該タンパク質が血漿タンパク質を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
血漿タンパク質が血液凝固第VIII因子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
目的のタンパク質と夾雑物とを含む混合溶液を多孔質膜に通液して該タンパク質を該多孔質膜に吸着させる工程と、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により該多孔質膜に吸着した該タンパク質を溶出する工程とを含む、目的のタンパク質を含有する組成物の製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の製造方法により得られた、目的のタンパク質を含有する組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の精製に関する。より詳細には、本発明は、多孔質膜を使用したタンパク質の精製手順における溶出方法、および該溶出方法を利用したタンパク質含有組成物の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の精製において、タンパク質吸着能を有する官能基が基材に固定された多孔質膜は頻繁に使用されている。多孔質膜を用いてタンパク質の精製を行う場合、溶出は塩濃度およびｐＨによりコントロールされる。ｐＨ変化により失活しやすいタンパク質を扱う場合、失活を防ぐために溶出液を直ちに受け液と混合して中和を行う。しかし、多孔質膜を用いたタンパク質の精製手順の操作の多くは多孔質膜２次側領域やノズル内に滞留が生じるためタンパク質は溶出液のｐＨにさらされ、失活が進むと考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決すべき課題】
【０００３】
従来、タンパク質の精製には樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーが用いられてきた。その溶出工程においては、溶出液をカラム入口から供給し、カラム出口を通じて溢れ出た液を受け液と混合することで溶出および中和を行っていた。近年、多孔質膜を用いたタンパク質の精製技術が開発されたが、これもカラムクロマトグラフィーを用いた精製と同様に、溶出工程において、溶出液を１次側から供給して多孔質膜に通し、２次側のノズルを通じて溢れ出た液を受け液と混合することで溶出および中和を行う。多孔質膜が中空糸膜である場合の従来の溶出法の模式図を図１に示す。この方法論では、タンパク質は、溶出された後に受け液と混合されるまで、溶出液のｐＨにさらされながらモジュール内に滞留することになる。
【０００４】
そのため、タンパク質の精製において、溶出後のタンパク質の滞留時間を最小限にし、以ってタンパク質の失活を速やかに抑制する方法を提供することは有益である。本発明はそのような方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記の課題を解決するために鋭意検討を行った。その過程で、本発明者らは、多孔質膜を用いた精製モジュールを使い、溶出工程において、精製モジュールの２次側に予め受け液を循環させておき、１次側から溶出液を送液して溶出および中和を行う方法論を考案した。この方法論によれば、ハウジング内の２次側に溶出されたタンパク質は、２次側領域内を循環している受け液に直ちに混合されることができる。しかし、従来のカラムクロマトグラフィーでは、カラム内部領域での受け液の循環は不可能であり、溶出タンパク質の受け液との混合は当該タンパク質がカラム出口に達するまで不可能のため、この方法論は採用できない。本発明者らは、従来の方法論と新規の方法論とを中空糸型イオン交換膜を用いた血液凝固第VIII因子（ＦVIII）の精製にて比較したところ、新規溶出法によりＦVIII回収率が有意に向上されたことを確認した。本発明者らは、係る知見に基づいて更なる検討を行い、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
本発明は即ち、以下の通りである。
［１］目的のタンパク質と夾雑物とを含む混合溶液を多孔質膜に通液して該タンパク質を該多孔質膜に吸着させた後、吸着した該タンパク質を溶出することを含む該タンパク質の精製手順において用いるための、該多孔質膜に吸着した該タンパク質を溶出するための方法であって、
該精製手順は多孔質膜を含むモジュールを使用するものであり、該モジュールは、
片端または両端に開口部を有するハウジングを有し、該開口部の１つは該ハウジング内への溶出液の供給を可能とするためのものであり、
該ハウジング内に収容された少なくとも１つの多孔質膜を有し、該多孔質膜は、前記の混合溶液および溶出液の通過を可能とするように多孔質であり、該タンパク質に対する吸着能を有する官能基が多孔内に固定されており、かつ、該ハウジング内において、溶出液を供給するための前記の開口部と該多孔質膜を介することなく流体連通している１次側領域と、溶出液を供給するための前記の開口部と該多孔質膜を介して流体連通している２次側領域とを規定するように配置されており、
該２次側領域に接する該ハウジングの壁面に設置された第１のノズルおよび第２のノズルを有し、該第１のノズルおよび該第２のノズルは、該多孔質膜から溶出された該タンパク質を安定化するための受け液を該２次側領域において循環させることを可能とするように構成されており、
当該方法は、該２次側領域において該受け液を循環させながら、該１次側領域に溶出液を供給して該タンパク質を溶出することを特徴とする、前記方法。
［２］該多孔質膜が中空糸膜または平膜である、上記［１］に記載の方法。
［３］該多孔質膜が中空糸膜である、上記［２］に記載の方法。
［４］該官能基が、カチオン交換基、アニオン交換基、疎水性基、およびアフィニティ型官能基からなる群から選択される少なくとも１種の官能基を含む、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］該官能基が、カチオン交換基またはアニオン交換基である、上記［４］に記載の方法。
［６］該多孔質膜が、その多孔内にグラフト鎖を有し、該グラフト鎖に該官能基が形成されている構成を有している、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］該タンパク質が血漿タンパク質を含む、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］血漿タンパク質が血液凝固第VIII因子である、上記［７］に記載の方法。
［９］目的のタンパク質と夾雑物とを含む混合溶液を多孔質膜に通液して該タンパク質を該多孔質膜に吸着させる工程と、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の方法により該多孔質膜に吸着した該タンパク質を溶出する工程とを含む、目的のタンパク質を含有する組成物の製造方法。
［１０］上記［９］に記載の方法により得られた、目的のタンパク質を含有する組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、タンパク質の精製手順において溶出されたタンパク質の失活を抑制し、以ってタンパク質の収率の向上を達成することができる。それにより、タンパク質（例えば、血漿タンパク質）を含有する薬剤の製造工程において顕著な効率化を実現することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】中空糸膜を含むモジュールを用いた従来の溶出法を示す模式図である。
【図２】中空糸膜または平膜を用いた本発明の溶出法を概略的に説明する図であり、また１次側領域および２次側領域の位置をあわせて示している。
【図３】本発明の方法のために使用され得る中空糸膜を含むモジュールの例示的な構成を示す図である。
【図４】中空糸膜を含むモジュールを使用した場合の本発明の溶出法を概略的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明による溶出方法（以下、「本発明の方法」ともいう。）を詳細に説明する。
【００１０】
本発明の方法を用いて精製され得るタンパク質（すなわち、「目的のタンパク質」）は、特に限定されるものではなく、任意のタンパク質であってよい。目的のタンパク質は、精製の目的に応じて、１種または複数種のタンパク質であり得る。本発明の方法が有利に適用され得る目的のタンパク質として、特には、使用される溶出液中で（例えば、溶出液のｐＨ、塩濃度等に起因して、）失活しやすいタンパク質が挙げられる。目的のタンパク質としては、以下に限定されないが、例えば、血漿タンパク質（例えば、血液凝固第VIII因子等）が挙げられる。
【００１１】
本発明の方法のために使用され得るタンパク質精製用のモジュールに関して説明する。
【００１２】
該モジュールは、上記で定義したハウジング、少なくとも１つの多孔質膜、第１のノズルおよび第２のノズルを有してなり、かつ本発明の方法の実施を可能とするものである限り、その構成は特に制限されず、当該技術分野において従来使用されているモジュールを使用してもよい。
【００１３】
多孔質膜の形態は、上記で定義した通りにモジュールを構成することを可能とする限り特に限定はされない。該形態としては、例えば、平膜、不織布、中空糸膜、モノリス、キャピラリー、円板または円筒状等が挙げられる。これらの形態の中でも、製造の容易さ、スケールアップ性、およびモジュール成型した際の膜のパッキング性等から、多孔質膜は中空糸膜であることが好ましい。本発明の方法のために使用され得る多孔質膜のより詳細については後述する。以下では、多孔質膜が中空糸膜である場合のモジュールの構成を主に説明するが、当業者は本明細書の説明および従来のモジュールに基づいて、各々の形態の多孔質膜に適したモジュールの構成を適宜決定することができる。
【００１４】
ハウジングの形態は、使用される多孔質膜の形態に応じて異なり得る。いずれの場合も、ハウジングは、（１）片端または両端に開口部を有し、該開口部の１つはハウジング内への溶出液の供給を可能とするものであること、（２）ハウジング内に少なくとも１つの多孔質膜を収容できるように構成されていること、（３）ハウジング内に収容された少なくとも１つの多孔質膜により、ハウジング内に１次側領域および２次側領域が規定されること、ならびに、（４）２次側領域に接するハウジングの壁面には第１のノズルおよび第２のノズルが設置され得るように構成されていることを要件とする。本明細書において「１次側領域」とは、ハウジング内へ溶出液を供給するための開口部に対して、多孔質膜を介することなく流体連通しているハウジング内の領域をいう。一方、本明細書において「２次側領域」とは、ハウジング内へ溶出液を供給するための開口部に対して、多孔質膜を介して流体連通しているハウジング内の領域をいう。図２に模式的に示されるように、多孔質膜が中空糸膜の場合、中空糸膜の内側の領域が１次側に対応し、中空糸膜の外側の領域が２次側に対応する。一方、多孔質膜が平膜の場合、平膜により隔てられたハウジング内の領域のうち、溶出液が供給される側が１次側に対応し、平膜により１次側からは隔てられた領域が２次側に対応する。
【００１５】
図３には、中空糸膜３を含むモジュール１の典型的な構成が示されている。図３に示した構成は、後述の説明からも明らかな通り、例示的なものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。
【００１６】
モジュール１のハウジング２は、通常、円筒形状を有する。ハウジング２の寸法は、目的とする精製のスケールに応じて適宜決定され得るが、通常、長手方向の長さとして５〜２５０ｃｍであり、長手方向に垂直な断面における直径として１〜１４ｃｍである。ハウジング２の材料としては、タンパク質精製用のモジュールのハウジングとして通常使用されているものを使用することができる。該材料としては、例えば、ポリスルホン、ポリカーボネート、塩化ビニル、ＡＢＳ、テフロンやＰＶＤＦを始めとするフッ素系樹脂等の樹脂類、あるいはＳＵＳ等の金属類、ガラス類等が挙げられ、使用目的やコストに応じて選択できる。
【００１７】
ハウジング２では、長手方向の両端のうちの少なくとも一端に開口部が形成されている。モジュール内に混入した空気を抜きやすい等の観点から、図３に示す構成のように、開口部は両端にあることが好ましい。開口部は、任意には配管接続材６を介して、チューブに連結され、精製に供される原液や溶出液をハウジング内に供給することを可能とする。効率的な送液を可能とするために、原液や溶出液のリザーバと開口部との間にチューブを介してペリスタポンプを備えることも好ましい。
【００１８】
ハウジング２の長手方向の一端付近の側面には第１のノズル４が形成されており、他端付近の側面には第２のノズル５が形成されている。これらのノズル４，５はいずれも、任意には配管接続材を介して、チューブに連結され、タンパク質の受け液をハウジング２内に供給することおよびハウジング２内から排出することを可能とする。受け液の効率的な循環を可能とするために、受け液のリザーバと一方のノズルとの間にチューブを介してペリスタポンプを備えることもまた好ましい。
【００１９】
ハウジング２内には、少なくとも１本、好ましくは図３に示されるように複数本の中空糸膜３が収容されている。複数の中空糸膜３は、封止樹脂７により束をまとめて固定された状態となっていてもよく、あるいは中空糸膜一本一本がばらばらの状態であってもよい。図３に示す構成では、複数本の中空糸膜３が封止樹脂７によりハウジング２の両端においてハウジング２に直接的に固定されている。代替的には、中空糸膜３は、間接部材や固定治具を介して間接的にハウジング２または外部の配管接続材６等に固定されていてもよい。該固定されている中空糸膜３の一端（図３では上側の端部）では、中空糸膜３の内側領域（即ち、１次側）が解放されている（即ち、中空糸膜３の長手方向の一端が封鎖または閉塞されていない）。それにより、精製に供される原液や溶出液を中空糸膜３の１次側に供給することが可能となる。他端は開放されていてもよいし、あるいは封止樹脂等により閉塞されていてもよいが、吸着や溶出を効率よく行うという観点から、図３に示す構成の下側の端部のように、閉塞されていることが好ましい。また、該他端についても、封止樹脂７により直接的に、あるいは間接部材、固定治具を介して間接的に、ハウジング２または外部の配管接続材６等に固定されていることが好ましい。封止樹脂７としては、特に限定されるものではなく、従来からタンパク質精製用のモジュールに用いられている封止樹脂として公知のものを使用目的に応じて選択できる。例えば、硬化性注入樹脂として、エポキシ樹脂、ポリウレタン樹脂、シリコンゴムが挙げられる。熱可塑性樹脂としては、例えばポリプロピレン等のサーモプラストが挙げられる。
【００２０】
中空糸膜３または一般に多孔質膜の素材は特に限定はされないが、機械特性の保持のために、ポリオレフィン系重合体、またはオレフィンおよびハロゲン化オレフィンの共重合体から構成されていることが好ましい。ポリオレフィン系重合体、またはオレフィンおよびハロゲン化オレフィンの共重合体としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリフッ化ビニリデン等のオレフィンの単独重合体、もしくはそれら２種以上の共重合体、または前述したオレフィンの１種もしくは２種以上とテトラフルオロエチレンおよびクロロトリフルオロエチレン等のハロゲン化オレフィンとの共重合体等が挙げられる。これらの多孔質膜の素材の中でも、機械的強度に特に優れ、かつタンパク質の吸着容量が高いポリエチレン、ポリフッ化ビニリデン、およびポリプロピレンが好ましく、特にポリエチレンが好ましい。
【００２１】
中空糸膜３または一般に多孔質膜のサイズは、タンパク質の精製で通常用いられるものと同様であってよく、また精製のスケールに応じても変動する。通常、中空糸膜の外径は０．１〜１０ｍｍ、有効膜長（即ち、タンパク質の吸着に寄与する、膜の長手方向の長さ）は５ｃｍ〜２５０ｃｍである。
【００２２】
中空糸膜３または一般に多孔質膜は、溶出されたタンパク質が多孔質膜の外側の領域（即ち、２次側領域）に出ることを可能とするように多孔質構造を有する。タンパク質吸着能を有する官能基（および、後述するグラフト鎖）が導入される前の、基材としての多孔質膜の最大細孔径は、官能基を導入した後も十分な通液性を有し、なおかつタンパク質の効果的な吸着を可能とするために、通常０．０１μｍ〜５μｍの範囲内であり、好ましくは０．０５μｍ〜３μｍの範囲内であり、より好ましくは０．１μｍ〜１μｍの範囲内である。
【００２３】
多孔質膜の空孔率は、多孔質膜全体１００体積％に対して、好ましくは５〜９９体積％、より好ましくは１０〜９５体積％、さらにより好ましくは３０〜９０体積％である。空孔率が高くなるにつれて、膜の吸着能力が増加する傾向があるが、空孔率が高過ぎると、耐圧性等の機械的強度が低下する恐れがある。
【００２４】
細孔径及び空孔率の測定は、Marcel Mulder著「膜技術」（株式会社アイピーシー）などに記載されているような、当業者にとって公知の方法により行うことができるが、測定方法としては、例えば、電子顕微鏡による観察、バブルポイント法、水銀圧入法、及び透過率法などが挙げられる。
【００２５】
タンパク質吸着能を有する官能基としては、イオン交換基（カチオン交換基およびアニオン交換基を含む。）、疎水性基、およびアフィニティ型官能基（群特異的アフィニティ吸着型官能基および個別特異的アフィニティ吸着型官能基を含む。）が挙げられる。
カチオン交換基としては、例えば、スルホン酸基、カルボン酸基、リン酸基等が挙げられる。
アニオン交換基としては、例えば、４級アンモニウム塩基、ピリジウム塩基、３〜２級アミノ基等が挙げられる。
疎水性基としては、例えば、フェニル基、アルキル基等が挙げられる。
群特異的アフィニティ吸着型官能基としては、例えば、Cibacron Blue F3G-A、Protein A、コンカナバリンA、ヘパリン、タンニン、金属キレート基等が挙げられる。
個別特異的アフィニティ吸着型官能基としては、例えば、抗原、抗体等が挙げられる。
上記のようなタンパク質吸着能を有する官能基は、その１種または複数種が基材に固定されていてよい。
【００２６】
好ましくは、該官能基は、担体である多孔質膜に形成された細孔の側壁において基材表面に固定された高分子側鎖（基材へのグラフト鎖）を介して、該基材に固定されている。こうすることで、基材表面そのものだけでなく、基材表面に固定されたグラフト鎖を介して基材表面から離れた位置にも官能基を配することができる。それにより、タンパク質の立体的かつ多点的な吸着を実現し、より高い吸着力を発揮することが可能となる。
【００２７】
高分子側鎖としては、架橋構造の少ないものが好ましい。架橋構造が多い場合、タンパク質分子が架橋構造内に入り込むまたは移動することを阻害し、高分子側鎖のごく一部しか吸着に関与することができなくなり、結果的に吸着力が低下するためである。高分子側鎖としては、屈曲性の高いメチレン鎖からなるものが好ましい。メチレン鎖からなる高分子側鎖は、例えば基材へのビニルモノマーのグラフト重合にて得ることができる。最も好適な高分子側鎖はポリグリシジルメタクリレートであり、グリシジルメタクリレートの重合によって形成することができる。グリシジルメタクリレートは重合後も反応性に富むグリシジル基を有しており、グリシジル基中のエポキシ環に開環付加させることで種々の官能基を導入することができる点でも好都合である。
【００２８】
タンパク質の吸着容量および溶出率を最適化するために、高分子側鎖のグラフト率を適切に設定することが重要であることが知られている。ここで、グラフト率は、基材となる多孔質膜の重量に対するグラフト鎖の重量の比率として定義される。一般に、グラフト率が低過ぎるとタンパク質の十分な吸着容量が得られない一方、グラフト率が高過ぎるとタンパク質吸着膜の通液性が低下し、溶出率が低下する。この観点から、グラフト率は、通常１０〜２５０％、好ましくは１０〜１５０％、より好ましくは２０〜９０％である。
【００２９】
多孔質膜は、吸着能力の観点から、タンパク質吸着能を有する低分子官能基の場合は、多孔質膜の質量（乾燥質量）あたり０．１ｍｍｏｌ／ｇ以上有することが好ましい。上限は、実質的に、０．５ｍｍｏｌ／ｇ程度である。また、抗体、プロテインAやヘパリン等の高分子リガンドの場合には、多孔質膜の体積あたり０.０１ｍｇ／ｍＬ以上有することが好ましい。
さらに、高分子側鎖には、タンパク質吸着能を有する官能基だけでなく、タンパク質の非特異的吸着や非可逆的吸着を防止する目的で、水酸基をも固定することが好ましい。
【００３０】
グラフト鎖および官能基の導入後の膜の最大細孔径は、通常０．０１〜５μｍ、好ましくは０．０５〜３μｍ、より好ましくは０．１〜１μｍの範囲内である。該最大細孔径は、上記と同様に、例えば、電子顕微鏡による観察、バブルポイント法、水銀圧入法、及び透過率法などの公知の方法により測定することができる。
【００３１】
上述したような多孔質膜は、例えば、J. Chromatogr. A, 689, 211-218 (1995)、又は特開2012-224729号公報等の文献に記載されている公知の技術を使用して製造することができる。
【００３２】
また、タンパク質精製用のモジュールについては、上述の多孔質膜を使用して、例えば、J. Chromatogr. A, 689, 211-218 (1995)、または特開2012-224729号公報等の文献の教示に基づいて作製することもできるし、あるいは、Qyu Speed D（旭化成メディカル株式会社）等の市販品を利用することもできる。
【００３３】
上述のような装置を使用して、本発明の溶出方法を一工程として含むタンパク質の精製が行われる。以下、精製の手順を説明する。
【００３４】
精製の手順は、タンパク質を多孔質膜に吸着させる工程、および、吸着したタンパク質を溶出する工程を含む。通常、吸着工程の前に多孔質膜の平衡化が行われ、吸着工程後に多孔質膜の洗浄を行ってから溶出工程が行われる。以下の説明から明らかなように、溶出より以前の工程については、タンパク質精製用のモジュールを使用する従来の精製手順に従って行うことができる。例えば、MEMBRANE, 22(2), 105-110 (1997)または特開2012-116828号公報等の文献を参照されたい。なお、平衡化工程、吸着工程および洗浄工程における各送液は、各工程の目的が達成され得る限り、モジュールの構成に応じて内圧式（即ち、１次側から２次側への送液）および外圧式（即ち、２次側から１次側への送液）のいずれを採用することもできる。溶出液は、内圧式（１次側から２次側へ）で送液される。
【００３５】
多孔質膜の平衡化は、精製に供される試料用の緩衝液に近い溶媒強度およびｐＨを有する緩衝液（平衡化溶液）（例えば、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）等）を使用して行われる。平衡化は、通常、１〜１５膜体積/分の流速で、２〜５０分（１０〜５０膜体積）かけて行われる。
【００３６】
平衡化工程後に、適切な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）等）中の試料をモジュールに送液して、目的のタンパク質を多孔質膜の１次側壁面および細孔内に吸着させる。吸着は、通常、１〜１５膜体積/分の流速で行われる。
【００３７】
吸着工程後に、洗浄溶液を通液して、吸着していない物質を洗い流す。洗浄溶液としては、平衡化溶液として用いたものと同様のものを使用できる。洗浄は好ましくは２回行われる。各回の洗浄は、通常、１〜１５膜体積/分の流速で、２〜５０分（１０〜５０膜体積）かけて行われる。
【００３８】
図４には、中空糸膜を含むモジュールを用いた場合の溶出工程を概略的に示している。図示されるように、溶出工程では、上記の第１のノズル４および第２のノズル５を介して受け液をハウジング２内に供給しかつハウジング２内から排出することにより、ハウジング２内の２次側領域において受け液を循環させながら、開口部から１次側領域に溶出液を供給する。多孔質膜に吸着したタンパク質を溶出するためには、例えば低ｐＨ条件等タンパク質によっては不安定な緩衝液が使用される場合がある。よって、溶出後は直ちに受け液（例えば高ｐＨ条件の緩衝液）と混合することで目的タンパクが安定な液性に戻す必要がある。受け液を多孔質膜の２次側領域において循環させておくことで、多孔質膜の細孔から流出した目的タンパク質を即座に安定な液性に戻すことができる。
受け液は、１次側領域に溶出液を供給するより以前から、そして溶出工程の期間を通じて、循環されることが好ましい。溶出液の供給は、通常、１〜１５膜体積／分の流速で、２〜５０分（１０〜５０膜体積）かけて行われる。一方、受け液の循環は、溶出中に一次側に逆流しない程度の流速であれば、特に限定されない。このようにして、受け液中に精製された目的のタンパク質を取得することができる。
【００３９】
本発明はまた、本発明の溶出方法を利用した、目的のタンパク質を含有する組成物の製造方法、および該製造方法により得られるタンパク質含有組成物も提供する。該製造方法は、目的のタンパク質と夾雑物とを含む混合溶液を多孔質膜に通液して該タンパク質を該多孔質膜に吸着させる工程と、本発明の溶出方法により該多孔質膜に吸着した該タンパク質を溶出する工程を含む。該吸着工程、および本発明の溶出方法による溶出工程は、上述した通りに行うことができ、好ましい実施形態についても上述した通りである。
【００４０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこの実施例により限定されない。
【実施例】
【００４１】
本発明の溶出法と通常溶出法とによるFVIIIタンパク質の精製における回収率の比較
【００４２】
１．材料
中空糸膜を含むモジュールとしては、中空糸型イオン交換膜Qyu Speed D(旭化成メディカル株式会社；有効膜体積0.6 mL)を使用し、精製に供されるサンプルとしては、FVIII力価を約80U/mLとしたものを使用した。
【００４３】
２．方法
(新規溶出法)
平衡化の後、中空糸型イオン交換膜の内側（即ち、１次側）にサンプルを送液し、FVIIIを吸着した。続いて、pH 6.4の洗浄液を用いて洗浄を2回繰り返した。その後、中空糸膜の外側（即ち、２次側）に受け液（pH=8.2）を循環した。この状態で中空糸膜の内側（即ち、１次側）に溶出緩衝液（pH=5.5）を送液し、２次側へと溶出を行った。
新規溶出法では、溶出液が２次側に溶出すると同時に受け液と混合して中和されるため、FVIIIの失活を防ぐことができる。
混合液を回収し、凝固一段法によりFVIII力価を測定し、FVIII回収率を計算した。
送液、循環にはペリスタポンプを使用し、流速は全て3 mL/minで行った。
（通常溶出法）
通常溶出法による精製は、溶出工程において受け液を循環させることなく、２次側のノズルを通じて溢れ出た液を受け液と混合することで中和を行う以外は、新規溶出法と同様にして行った。
【００４４】
３．結果
同一サンプルを使用して、新規溶出法と通常溶出法とにおけるFVIII回収率を比較した結果を下記表1に示す。
【００４５】
【表１】
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【符号の説明】
【００４６】
１．タンパク質精製用のモジュール
２．ハウジング
３．中空糸膜
４．第１のノズル
５．第２のノズル
６．配管接続材
７．封止樹脂
８．中空部が閉塞した接着端面
９．固定治具 
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図２】
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