(57)【要約】      （修正有）【課題】グルカゴン及び／又はＧＬＰ−Ｉ活性に加えてＧＩＰアゴニスト活性も示すグルカゴンペプチドの提供。【解決手段】ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰの活性の少なくとも１％の活性を示す、ＧＩＰアゴニスト活性を有する、グルカゴンの類縁体であって、特定の位置でのアミノ酸修飾によりＧＩＰアゴニスト活性を付与する。そのようなグルカゴンペプチドを含む医薬組成物、及びそのようなペプチドを用いる治療方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）の修飾を有し、
ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰの活性の少なくとも１％の活性を示す、
ＧＩＰアゴニスト活性を有する、グルカゴン（配列番号１）の類縁体：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する、位置１でのアミノ酸修飾、
（ｂ）下記から成る群から選ばれる修飾：
（ｉ）位置ｉとｉ＋４のアミノ酸の側鎖の間、または位置ｊとｊ＋３のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋（ここで、ｉは１２、１３、１６、１７、２０または２４であり、ｊは１７である）、および
（ｉｉ）類縁体の位置１６、２０、２１および２４のうちの１、２、３つ、または全てのアミノ酸が、α，α−二置換アミノ酸で置換されている、
ならびに、
（ｃ）１〜１０個の更なるアミノ酸修飾。
【請求項２】
位置１でのアミノ酸修飾が、イミダゾール側鎖を欠いているアミノ酸によるＨｉｓの置換である、請求項１に記載の類縁体。
【請求項３】
イミダゾール側鎖を欠いているアミノ酸が、大型の芳香族アミノ酸である、請求項２に記載の類縁体。
【請求項４】
大型の芳香族アミノ酸がＴｙｒである、請求項３に記載の類縁体。
【請求項５】
ラクタム架橋が、位置１６と２０のアミノ酸の間にあり、位置１６および２０のアミノ酸の一方がＧｌｕで置換され、位置１６および２０のアミノ酸の他方がＬｙｓで置換されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項６】
α，α−二置換アミノ酸がＡＩＢである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項７】
位置１６または位置２０のアミノ酸がα，α−二置換アミノ酸で置換されている、請求項１〜４および６のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項８】
位置２０のアミノ酸がＡＩＢであり、位置１６のアミノ酸が、正に帯電しているアミノ酸で置換されている、請求項７に記載の類縁体。
【請求項９】
正に帯電しているアミノ酸が、式ＩＶ：
【化１】
2015164922.tif 000037
〔式中、ｎは、１〜７であり、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ2〜Ｃ5複素環式）、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ6〜Ｃ10アリール）Ｒ7および（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ9ヘテロアリール）から成る群から独立して選ばれ、Ｒ7は、ＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は、遊離アミノ基を含む〕
で示されるアミノ酸である、請求項８に記載の類縁体。
【請求項１０】
式ＩＶのアミノ酸が、ホモＬｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、または２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）である、請求項９に記載の類縁体。
【請求項１１】
位置２７、２８、および２９のうちの１、２つ、または全てにおけるアミノ酸修飾を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１２】
下記のいずれかを特徴とする、請求項１１に記載の類縁体：
（ａ）位置２７のＭｅｔが、大型の脂肪族アミノ酸で置換されており、Ｌｅｕで置換されていてもよい、
（ｂ）位置２８のＡｓｎが、小型の脂肪族アミノ酸で置換されており、Ａｌａで置換されていてもよい、
（ｃ）位置２９のＴｈｒが、小型の脂肪族アミノ酸で置換されており、Ｇｌｙで置換されていてもよい、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）のうちの２つ、または全ての組み合わせ。
【請求項１３】
位置２７にＬｅｕ、位置２８にＡｌａ、および位置２９にＧｌｙまたはＴｈｒを含む、請求項１２に記載の類縁体。
【請求項１４】
位置２９のアミノ酸のＣ末端側への１〜２１個のアミノ酸の延長部を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１５】
延長部が配列番号９５または９６のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の類縁体。
【請求項１６】
延長部の１〜６個のアミノ酸が正に帯電しているアミノ酸である、請求項１４または１５に記載の類縁体。
【請求項１７】
１〜６個の正に帯電したアミノ酸が、式ＩＶ：
【化２】
2015164922.tif 000038
〔式中、ｎは、１〜７であり、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ2〜Ｃ5複素環式）、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ6〜Ｃ10アリール）Ｒ7および（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ9ヘテロアリール）から成る群から独立して選ばれ、Ｒ7は、ＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は、遊離アミノ基を含む〕
で示されるアミノ酸である、請求項１６に記載の類縁体。
【請求項１８】
式ＩＶのアミノ酸が、ホモＬｙｓ、Ｌｙｓ、ＯｒｎまたはＤａｂである、請求項１７に記載の類縁体。
【請求項１９】
アシル基またはアルキル基に共有結合している側鎖を含むアミノ酸を含み、アシルまたはアルキル基は、天然型のアミノ酸に対して非天然である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項２０】
アシルまたはアルキル基に結合しているアミノ酸が、式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩのアミノ酸である、請求項１９に記載の類縁体。
【請求項２１】
式Ｉのアミノ酸がＬｙｓである、請求項１９に記載の類縁体。
【請求項２２】
アシルまたはアルキル基に結合しているアミノ酸が、配列番号１に対して類縁体の位置１０に配置されている、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項２３】
位置２９のアミノ酸のＣ末端側への１〜２１個のアミノ酸の延長部を含み、アシルまたはアルキル基に結合しているアミノ酸が、位置３７〜４３のいずれかに対応する位置に配置されている、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項２４】
アシルまたはアルキル基に結合しているアミノ酸が、位置４０に配置されている、請求項２３に記載の類縁体。
【請求項２５】
アシルまたはアルキル基が、スペーサーを介して前記アミノ酸の側鎖に結合している、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項２６】
スペーサーが３〜１０原子長である、請求項２５に記載の類縁体。
【請求項２７】
スペーサーがアミノ酸またはジペプチドである、請求項２６に記載の類縁体。
【請求項２８】
スペーサーが６アミノヘキサン酸である、請求項２７に記載の類縁体。
【請求項２９】
スペーサーが、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、およびγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕから成る群より選択されるジペプチドである、請求項２７に記載の類縁体。
【請求項３０】
スペーサーとアシル基との全長が、約１４〜約２８原子長である、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の類縁体。
【請求項３１】
アシル基がＣ１２〜Ｃ１８脂肪アシル基である、請求項１９〜３０のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項３２】
アシル基がＣ１４またはＣ１６脂肪アシル基である、請求項３１に記載の類縁体。
【請求項３３】
下記から成る群から選ばれる一つの修飾を含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の類縁体：
（ａ）Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸で置換されている、位置２のＳｅｒ；
（ａ）Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌで置換されている、位置１０のＴｙｒ；
（ｂ）位置１０のＬｙｓへのアシル基の結合；
（ｃ）ＡｒｇまたはＩｌｅで置換されている位置１２のＬｙｓ；
（ｄ）Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、ＧｌｙまたはＡＩＢで置換されている、位置１６のＳｅｒ；
（ｅ）Ｇｌｎで置換されている位置１７のＡｒｇ；
（ｆ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙで置換されている、位置１８のＡｒｇ；
（ｇ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはＡＩＢで置換されている、位置２０のＧｌｎ；
（ｈ）Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている、位置２１のＡｓｐ；
（ｉ）Ｉｌｅで置換されている位置２３のＶａｌ：
（ｊ）Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡＩＢで置換されている、位置２４のＧｌｎ；ならびに
（ｋ）位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１，２４、２７、２８、および２９のいずれかでの保存的置換。
【請求項３４】
アシル基を含み、ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰの活性の少なくとも１％の活性を示す、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号１）の類縁体であって、該アシル基がスペーサーに結合しており、下記のいずれかを特徴とする、類縁体：
（ｉ）位置１０のアミノ酸の側鎖に、該スペーサーが結合している、または
（ｉｉ）位置２９のアミノ酸のＣ末端側への１〜２１個のアミノ酸の延長部を含み、配列番号１の位置３７〜４３の１つに対応するアミノ酸の側鎖に、該スペーサーが結合している。
【請求項３５】
下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の類縁体：
（ｉ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する、位置１でのアミノ酸修飾、
（ｉｉ）下記（Ａ）〜（Ｂ）の少なくとも１つまたは両方：
（Ａ）類縁体が、位置ｉとｉ＋４のアミノ酸の側鎖の間、または位置ｊとｊ＋３のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋を含む（ここで、ｉは１２、１３、１６、１７、２０または２４であり、ｊは１７である）；および
（Ｂ）類縁体の位置１６、２０、２１および２４のうちの１、２、３つ、または全てのアミノ酸が、α，α−二置換アミノ酸で置換されている、
ならびに
（ｉｉｉ）６個までの更なるアミノ酸修飾。
【請求項３６】
類縁体が、（ｉ）式ＩＶ：
【化３】
2015164922.tif 000039
〔式中、ｎは、１〜７であり、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ2〜Ｃ5複素環式）、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ6〜Ｃ10アリール）Ｒ7および（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ9ヘテロアリール）から成る群から独立して選ばれ、Ｒ7は、ＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は、遊離アミノ基を含む〕で示されるアミノ酸による位置１６のＳｅｒのアミノ酸置換、ならびに（ｉｉ）アルファ，アルファ二置換アミノ酸による位置２０のＧｌｎのアミノ酸置換、を含む、請求項３５に記載の類縁体。
【請求項３７】
位置２７、２８、および２９のうちの１、２つ、または全てにおけるアミノ酸修飾を含む、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項３８】
位置２７にＬｅｕ、位置２８にＡｌａ、および位置２９にＧｌｙまたはＴｈｒを含む、請求項３７に記載の類縁体。
【請求項３９】
延長部が配列番号９５または９６のアミノ酸配列を含む、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項４０】
スペーサーが、式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩのアミノ酸の側鎖に結合している、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項４１】
式Ｉのアミノ酸がＬｙｓである、請求項４０に記載の類縁体。
【請求項４２】
スペーサーが３〜１０原子長である、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項４３】
スペーサーがアミノ酸またはジペプチドである、請求項４２に記載の類縁体。
【請求項４４】
スペーサーが６アミノヘキサン酸である、請求項４３に記載の類縁体。
【請求項４５】
スペーサーが、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、およびγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕから成る群より選択されるジペプチドである、請求項４３に記載の類縁体。
【請求項４６】
スペーサーとアシル基との全長が、約１４〜約２８原子長である、請求項３４〜４５のいずれか１項に記載の類縁体。
【請求項４７】
アシル基がＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸である、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項４８】
アシル基がＣ１４またはＣ１６である、請求項４７に記載の類縁体。
【請求項４９】
下記の修飾（ａ）〜（ｄ）を有し、
ＧＩＰ受容体活性化におけるＥＣ５０が、約１０ｎＭ以下であることを特徴とする、
ＧＩＰアゴニスト活性を有する、グルカゴン（配列番号１）の類縁体：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する、位置１でのアミノ酸修飾、
（ｂ）位置ｉとｉ＋４のアミノ酸の側鎖の間、または位置ｊとｊ＋３のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋（ここで、ｉは１２、１３、１６、１７、２０、または２４であり、ｊは１７である）、
（ｃ）位置２７、２８、および２９のうちの１、２つ、または全てにおけるアミノ酸修飾、ならびに
（ｄ）１〜６個の更なるアミノ酸修飾。
【請求項５０】
位置１でのアミノ酸修飾が、イミダゾール側鎖を欠いているアミノ酸によるＨｉｓの置換である、請求項４９に記載の類縁体。
【請求項５１】
下記を特徴とする、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の類縁体：
（ａ）位置１でのアミノ酸修飾が、大型の芳香族アミノ酸によるＨｉｓの置換であり、Ｔｙｒによる置換であってもよい、
（ｂ）ラクタム架橋が、位置１６と２０のアミノ酸の間にあり、位置１６および２０のアミノ酸の一方がＧｌｕで置換され、位置１６および２０のアミノ酸の他方がＬｙｓで置換されている、
（ｃ）位置２７のＭｅｔが、大型の脂肪族アミノ酸で置換されており、Ｌｅｕで置換されていてもよい、
（ｄ）位置２８のＡｓｎが、小型の脂肪族アミノ酸で置換されており、Ａｌａで置換されていてもよい、ならびに
（ｅ）位置２９のＴｈｒが、小型の脂肪族アミノ酸で置換されており、Ｇｌｙで置換されていてもよい。
【請求項５２】
下記の修飾のうちの１つ以上を含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の類縁体：
（ａ）位置１２でのアミノ酸修飾、これはＩｌｅによる置換であってもよい、
（ｂ）位置１７および１８でのアミノ酸修飾、これは位置１７でのＱによる置換および位置１８でのＡによる置換であってもよい、
（ｃ）Ｃ末端へのＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）の付加。
【請求項５３】
下記の修飾のうちの１つ以上を含む、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の類縁体：
（ｌ）Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸で置換されている、位置２のＳｅｒ；
（ｍ）Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌで置換されている、位置１０のＴｙｒ；
（ｎ）位置１０のＬｙｓへのアシル基の結合；
（ｏ）Ａｒｇで置換されている位置１２のＬｙｓ；
（ｐ）Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡＩＢで置換されている、位置１６のＳｅｒ；
（ｑ）Ｇｌｎで置換されている位置１７のＡｒｇ；
（ｒ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙで置換されている、位置１８のＡｒｇ；
（ｓ）Ａｌａ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはＡＩＢで置換されている、位置２０のＧｌｎ；
（ｔ）Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている、位置２１のＡｓｐ；
（ｕ）Ｉｌｅで置換されている位置２３のＶａｌ：
（ｖ）Ａｓｎ、Ａｌａ、またはＡＩＢで置換されている、位置２４のＧｌｎ；ならびに
（ｗ）位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１，２４、２７、２８、および２９のいずれかので保存的置換、あるいは
これらの任意の組み合わせ。
【請求項５４】
下記の修飾（ａ）〜（ｄ）を有し、
ＧＩＰ受容体活性化におけるＥＣ５０が、約１０ｎＭ以下であることを特徴とする、
ＧＩＰアゴニスト活性を有する、グルカゴン（配列番号１）の類縁体：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する、位置１でのアミノ酸修飾、
（ｂ）類縁体の位置１６、２０、２１、および２４のうちの１、２、３つ、または全てのアミノ酸が、α，α−二置換アミノ酸で置換されている、
（ｃ）位置２７、２８、および２９のうちの１、２つ、または全てにおけるアミノ酸修飾、ならびに
（ｄ）１〜６個の更なるアミノ酸修飾。
【請求項５５】
位置１でのアミノ酸修飾が、イミダゾール側鎖を欠いているアミノ酸によるＨｉｓの置換である、請求項５４に記載の類縁体。
【請求項５６】
下記を特徴とする、請求項５４または５５に記載の類縁体：
（ａ）位置１でのアミノ酸修飾が、大型の芳香族アミノ酸によるＨｉｓの置換であり、Ｔｙｒによる置換であってもよい、
（ｂ）α，α−二置換アミノ酸がＡＩＢである、
（ｃ）位置２７のＭｅｔが、大型の脂肪族アミノ酸で置換されており、Ｌｅｕで置換されていてもよい、
（ｄ）位置２８のＡｓｎが、小型の脂肪族アミノ酸で置換されており、Ａｌａで置換されていてもよい、ならびに
（ｅ）位置２９のＴｈｒが、小型の脂肪族アミノ酸で置換されており、Ｇｌｙで置換されていてもよい。
【請求項５７】
下記の修飾のうちの１つ以上を含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の類縁体：
（ａ）位置１２でのアミノ酸修飾、これはＩｌｅによる置換であってもよい、
（ｂ）位置１７および１８でのアミノ酸修飾、これは位置１７でのＱによる置換および位置１８でのＡによる置換であってもよい、
（ｃ）Ｃ末端へのＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）の付加。
【請求項５８】
下記の修飾のうちの１つ以上を含む、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の類縁体：
（ａ）Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸で置換されている、位置２のＳｅｒ；
（ｂ）Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌで置換されている、位置１０のＴｙｒ；
（ｃ）位置１０のＬｙｓへのアシル基の結合；
（ｄ）Ａｒｇで置換されている位置１２のＬｙｓ；
（ｅ）Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡＩＢで置換されている、位置１６のＳｅｒ；
（ｆ）Ｇｌｎで置換されている位置１７のＡｒｇ；
（ｇ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙで置換されている、位置１８のＡｒｇ；
（ｈ）Ａｌａ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはＡＩＢで置換されている、位置２０のＧｌｎ；
（ｉ）Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている、位置２１のＡｓｐ；
（ｊ）Ｉｌｅで置換されている位置２３のＶａｌ：
（ｋ）Ａｓｎ、Ａｌａ、またはＡＩＢで置換されている、位置２４のＧｌｎ；ならびに
（ｌ）位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１，２４、２７、２８、および２９のいずれかでの保存的置換；あるいは
これらの任意の組み合わせ。
【請求項５９】
下記（ａ）〜（ｅ）の修飾を有し、
ＧＩＰ受容体活性化におけるＥＣ５０が、約１０ｎＭ以下であることを特徴とする、
ＧＩＰアゴニスト活性を有する、グルカゴン（配列番号１）の類縁体：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する、位置１でのアミノ酸修飾、
（ｂ）下記の式ＩＶで示されるアミノ酸による位置１６でのアミノ酸置換：
【化４】
2015164922.tif 000040
〔式中、ｎは、１〜７であり、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ2〜Ｃ5複素環式）、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ6〜Ｃ10アリール）Ｒ7および（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ9ヘテロアリール）から成る群から独立して選ばれ、Ｒ7は、ＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は、遊離アミノ基を含む〕、
（ｃ）アルファ，アルファ二置換アミノ酸による位置２０のＧｌｎのアミノ酸置換、
（ｄ）位置２７、２８、および２９のうちの１、２つ、または全てにおけるアミノ酸修飾、ならびに
（ｅ）１〜６個の更なるアミノ酸修飾。
【請求項６０】
位置１でのアミノ酸修飾が、イミダゾール側鎖を欠いているアミノ酸によるＨｉｓの置換である、請求項５９に記載の類縁体。
【請求項６１】
イミダゾール側鎖を欠いているアミノ酸が、大型の芳香族アミノ酸である、請求項６０に記載の類縁体。
【請求項６２】
大型の芳香族アミノ酸がＴｙｒである、請求項６１に記載の類縁体。
【請求項６３】
（ｂ）の式ＩＶのアミノ酸が、ホモＬｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、または２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）である、請求項５９〜６２のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項６４】
アルファ，アルファ二置換アミノ酸がＡＩＢである、請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項６５】
下記のいずれかを特徴とする、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の類縁体：
（ｉ）位置２７のＭｅｔが、大型の脂肪族アミノ酸で置換されており、Ｌｅｕで置換されていてもよい、
（ｉｉ）位置２８のＡｓｎが、小型の脂肪族アミノ酸で置換されており、Ａｌａで置換されていてもよい、若しくは
（ｉｉｉ）位置２９のＴｈｒが、小型の脂肪族アミノ酸で置換されており、Ｇｌｙで置換されていてもよい、
又は、
類縁体が、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の組み合わせを含む。
【請求項６６】
位置２９のアミノ酸のＣ末端側に、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を更に含む、請求項５９〜６５のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項６７】
下記の修飾のうちの１つ以上を含む、請求項５９〜６６のいずれか一項に記載の類縁体：
（ａ）Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸で置換されている、位置２のＳｅｒ；
（ｂ）Ｇｌｕで置換されている位置３のＧｌｎ；
（ｃ）アシル基またはアルキル基に共有結合している側鎖を含むアミノ酸による、位置１０のアミノ酸Ｔｙｒの置換；
（ｄ）アシル基またはアルキル基に共有結合している側鎖を含むアミノ酸の、類縁体のＣ末端アミノ酸としての付加；
（ｅ）Ｉｌｅで置換されている位置１２のＬｙｓ；
（ｆ）Ｇｌｎで置換されている位置１７のＡｒｇ；
（ｇ）Ａｌａで置換されている位置１８のＡｒｇ；
（ｈ）Ｇｌｕで置換されている位置２１のＡｓｐ、および
（ｉ）Ａｓｎで置換されている位置２４のＧｌｎ。
【請求項６８】
（ａ）ＤＰＰ−ＩＶに対して耐性を付与する、位置２でのアミノ酸修飾、および（ｂ）アシル基またはアルキル基に共有結合している位置４０のアミノ酸、を含む、請求項６６に記載の類縁体。
【請求項６９】
位置２４のアミノ酸に結合している親水性部分を含む、請求項６８に記載の類縁体。
【請求項７０】
下記（ａ）〜（ｂ）を含み、
ＧＩＰ受容体活性化におけるＥＣ５０が、約１０ｎＭ以下であることを特徴とする、
ＧＩＰアゴニスト活性を有する、グルカゴン（配列番号１）の類縁体：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する、位置１でのアミノ酸修飾、および
（ｂ）位置２９のアミノ酸のＣ末端側の、約１〜約２１個のアミノ酸の延長部（ここで、延長部の、配列番号１の位置３７〜４３のいずれかに対応する少なくとも１個のアミノ酸は、アシル化またはアルキル化されている）。
【請求項７１】
下記の修飾（Ａ）〜（Ｄ）のうちの１つを更に含む、請求項７０に記載の類縁体：
（Ａ）類縁体が、位置ｉとｉ＋４のアミノ酸の側鎖の間、または位置ｊとｊ＋３のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋を含む（ここで、ｉは１２、１３、１６、１７、２０または２４であり、ｊは１７である）；
（Ｂ）類縁体の位置１６、２０、２１、および２４のうちの１、２、３個、または全てのアミノ酸が、α，α−二置換アミノ酸で置換されている；あるいは
（Ｃ）類縁体が、（ｉ）式ＩＶ：
【化５】
2015164922.tif 000041
〔式中、ｎは、１〜７であり、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ2〜Ｃ5複素環式）、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ6〜Ｃ10アリール）Ｒ7および（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ9ヘテロアリール）から成る群から独立して選ばれ、Ｒ7は、ＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は、遊離アミノ基を含む〕で示されるアミノ酸による、位置１６のＳｅｒのアミノ酸置換、ならびに（ｉｉ）アルファ，アルファ二置換アミノ酸による位置２０のＧｌｎのアミノ酸置換、を含む。
【請求項７２】
位置２７および２８のうちの一方または両方において更なるアミノ酸修飾を含む、請求項７０または７１に記載の類縁体。
【請求項７３】
位置１でのアミノ酸修飾が、イミダゾール側鎖を欠いているアミノ酸によるＨｉｓの置換である、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項７４】
イミダゾール側鎖を欠いているアミノ酸が、大型の芳香族アミノ酸である、請求項７３に記載の類縁体。
【請求項７５】
大型の芳香族アミノ酸がＴｙｒである、請求項７４に記載の類縁体。
【請求項７６】
前記１〜２１個のアミノ酸が、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）を含むか、または、配列番号９５または９６に対して保存的な１つ以上の置換を含めたアミノ酸配列を含む、請求項７０〜７５のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項７７】
前記１〜２１個のアミノ酸が、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を含み、Ｘが任意のアミノ酸である、請求項７６に記載の類縁体。
【請求項７８】
アシル化またはアルキル化されたアミノ酸が、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ酸である、請求項７０〜７７のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項７９】
アシル化またはアルキル化されたアミノ酸がＬｙｓである、請求項７８に記載の類縁体。
【請求項８０】
アシル化またはアルキル化されたアミノ酸が、類縁体の位置３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３のいずれかに配置されている、請求項７０〜７９のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項８１】
アシル化またはアルキル化されたアミノ酸が、類縁体の位置４０に配置されている、請求項８０に記載の類縁体。
【請求項８２】
位置１６と２０のアミノ酸の間にあるラクタム架橋を含み、位置１６および２０のアミノ酸の一方がＧｌｕで置換され、位置１６および２０のアミノ酸の他方がＬｙｓで置換されている、請求項７０〜８１のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項８３】
ＡＩＢであるα，α−二置換アミノ酸による、位置２６、２０、２１または２４のアミノ酸のうちの１、２、３つ、または全ての置換を含む、請求項７０〜８１のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項８４】
位置２０にＡＩＢを含む、請求項８３に記載の類縁体。
【請求項８５】
位置１６にホモＬｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、または２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）を含み、位置２０にＡＩＢを含む、請求項７０〜８１のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項８６】
下記の修飾のうちの１つ以上を含む、請求項７０〜８５のいずれか一項に記載の類縁体：
（ａ）Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸で置換されている、位置２のＳｅｒ；
（ｂ）Ｇｌｕで置換されている位置３のＧｌｎ；
（ｃ）アシル基またはアルキル基に共有結合している側鎖を含むアミノ酸による、位置１０のアミノ酸Ｔｙｒの置換；
（ｅ）Ｉｌｅで置換されている位置１２のＬｙｓ；
（ｆ）Ｇｌｎで置換されている位置１７のＡｒｇ；
（ｇ）Ａｌａで置換されている位置１８のＡｒｇ；
（ｈ）Ｇｌｕで置換されている位置２１のＡｓｐ、および
（ｉ）Ａｓｎで置換されている位置２４のＧｌｎ。
【請求項８７】
ＤＰＰ−ＩＶに対して耐性を付与する、位置２でのアミノ酸修飾を含む、請求項７０〜８６のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項８８】
位置２のアミノ酸が、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸から成る群から選ばれる、請求項８７に記載の類縁体。
【請求項８９】
６個の更なるアミノ酸修飾を含む、請求項７７〜８８のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項９０】
配列番号２２７、２２８、２２９、または２３０のいずれかのアミノ酸配列、および位置２９のアミノ酸のＣ末端側への１〜２１個のアミノ酸の延長部を含み、
ＧＩＰ受容体活性化におけるＥＣ５０が、約１０ｎＭ以下であることを特徴とする、
グルカゴン類縁体。
【請求項９１】
１〜２１個のアミノ酸の延長部が、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列（ここでＸは任意のアミノ酸である）を含むか、または、配列番号９５または９６に対して保存的な１つ以上の置換を含めたアミノ酸配列を含む、請求項９０に記載の類縁体。
【請求項９２】
１〜２１個のアミノ酸の延長部が、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を含み、ここでＸは任意のアミノ酸である、請求項９０に記載の類縁体。
【請求項９３】
延長部の、位置３７〜４３のいずれかに対応する位置の少なくとも１個のアミノ酸が、アシル化またはアルキル化されている、請求項９０〜９２のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項９４】
アシル化またはアルキル化されたアミノ酸が、類縁体の位置４０に配置されている、請求項９３に記載の類縁体。
【請求項９５】
グルカゴンペプチドが、アミノ酸位置２４の親水性部分に共有結合している、請求項９０〜９４のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項９６】
親水性部分が、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニンに共有結合している、請求項９５に記載の類縁体。
【請求項９７】
親水性部分がポリエチレングルコール（ＰＥＧ）である、請求項９５または９６に記載の類縁体。
【請求項９８】
６個の更なるアミノ酸修飾を含む、請求項９０〜９７のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項９９】
下記の修飾のうちの１つ以上を含む、請求項９８に記載の類縁体：
（ａ）位置２のアミノ酸が、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸のいずれか１つである；
（ａ）位置１０のアミノ酸が、Ｔｒｙ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌである；
（ｂ）位置１０のＬｙｓへのアシル基の結合；
（ｃ）位置１２のアミノ酸が、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇである；
（ｄ）位置１６のアミノ酸が、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡＩＢのいずれか１つである；
（ｅ）位置１７のアミノ酸が、Ｇｌｎ、またはＡｒｇである；
（ｆ）位置１８のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙのいずれか１つである；
（ｇ）位置２０のアミノ酸が、Ａｌａ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、若しくはＡＩＢ、または、他のアルファ，アルファ二置換アミノ酸、のいずれか１つである；
（ｈ）位置２１のアミノ酸が、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸のいずれか１つである；
（ｉ）位置２３のアミノ酸が、ＶａｌまたはＩｌｅである；
（ｊ）位置２４のアミノ酸が、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、またはＡＩＢのいずれか１つである；ならびに
（ｋ）位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１，２４、２７、２８、および２９のいずれか１つ以上での、保存的置換。
【請求項１００】
配列番号９９〜１４１、１４４〜１６４、１６６、１９２〜２０７、２０９〜２２１、および２２３から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含む類縁体。
【請求項１０１】
配列番号１６７〜１６９、１７３〜１７８、および２２５から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含む類縁体。
【請求項１０２】
配列番号５〜９４から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含む類縁体。
【請求項１０３】
アシル基が、スペーサーを介して前記Ｌｙｓに結合している、請求項５３または５８に記載の類縁体。
【請求項１０４】
アシルまたはアルキル基が、スペーサーを介して前記アミノ酸の側鎖に結合している、請求項６７〜６９、８６および９９のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１０５】
配列番号１に対する位置３７〜４３のいずれかにおけるアシル化またはアルキル化されたアミノ酸は、スペーサーを介して該アシルまたはアルキル基に共有結合している、請求項７０、９３および９４のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１０６】
アシル化またはアルキル化されたアミノ酸が、配列番号１に対する位置４０に配置されている、請求項１０５に記載の類縁体。
【請求項１０７】
類縁体がアシルまたはアルキル基を含む場合、アシルまたはアルキル基が、スペーサーを介して該類縁体に結合している、請求項１００〜１０２のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１０８】
スペーサーが３〜１０原子長である、請求項１０３〜１０７のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１０９】
スペーサーがアミノ酸またはジペプチドである、請求項１０８に記載の類縁体。
【請求項１１０】
スペーサーが６アミノヘキサン酸である、請求項１０９に記載の類縁体。
【請求項１１１】
スペーサーが、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、およびγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕから成る群より選択されるジペプチドである、請求項１０９に記載の類縁体。
【請求項１１２】
スペーサーとアシル基との全長が、約１４〜約２８原子長である、請求項１０３〜１１１のいずれか１項に記載の類縁体。
【請求項１１３】
アシル基がＣ１２〜Ｃ１８脂肪アシル基である、請求項１０３〜１１２のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１１４】
アシル基がＣ１４またはＣ１６脂肪アシル基である、請求項１１３に記載の類縁体。
【請求項１１５】
ＧＩＰ受容体活性化におけるＥＣ５０が約１ｎＭ以下である、請求項１〜１１４のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１１６】
、ＧＩＰ受容体に対する野生型ＧＩＰ（配列番号４）の活性の少なくとも約４％の活性を有する、請求項１〜１１５のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１１７】
ＧＬＰ−１Ｐ受容体活性化におけるＥＣ５０が約１ｎＭ以下である、請求項１〜１１６のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１１８】
ＧＬＰ−１受容体に対するＧＬＰ−１（配列番号２）の活性の少なくとも約４％の活性を有する、請求項１〜１１７のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１１９】
グルカゴン受容体活性化におけるＥＣ５０が約１ｎＭ以下である、請求項１〜１１８のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１２０】
グルカゴン受容体に対するグルカゴンの活性の少なくとも約２０％の活性を有する、請求項１〜１１９のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１２１】
位置３でのアミノ酸修飾を含み、グルカゴン受容体に対するグルカゴンの活性の１％未満の活性を有する、請求項１〜１１９のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１２２】
類縁体が、位置７でのアミノ酸修飾を含み、ＧＬＰ−１受容体に対するＧＬＰ−１の活性の約１０％未満を有する、請求項１１７および１１８を除く請求項１〜１２１のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１２３】
前記グルカゴンペプチドが、アミノ酸位置１９、２０、２３、２４、２７、３２、４３、またはＣ末端のいずれかにおいて、親水性部に共有結合している、請求項１〜１２２のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１２４】
前記グルカゴンペプチドが、アミノ酸位置２７または４３において、親水性部分に共有結合している、請求項１２３に記載の類縁体。
【請求項１２５】
親水性部分が、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニンに共有結合している、請求項１２３または１２４に記載の類縁体。
【請求項１２６】
親水性部分がポリエチレングルコール（ＰＥＧ）である、請求項１２３〜１２５のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１２７】
ＰＥＧが約１，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１２６に記載の類縁体。
【請求項１２８】
ＰＥＧが約２０，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１２６に記載の類縁体。
【請求項１２９】
ＧＩＰ受容体活性化におけるＥＣ５０が約１０ｎＭ以下である、請求項１２３〜１２８のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１３０】
ＧＩＰ受容体に対する野生型ＧＩＰ（配列番号４）の活性の少なくとも約０．４％の活性を有する、請求項１２３〜１２８のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１３１】
ＧＬＰ−１受容体活性化におけるＥＣ５０が約１０ｎＭ以下である、請求項１２３〜１３０のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１３２】
ＧＬＰ−１受容体に対するＧＬＰ−１（配列番号２）の活性の少なくとも約０．４％の活性を有する、請求項１２３〜１３０のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１３３】
グルカゴン受容体活性化におけるＥＣ５０が約１０ｎＭ以下である、請求項１２３〜１３２のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１３４】
グルカゴン受容体に対するグルカゴンの活性の少なくとも約２％の活性を有する、請求項１２３〜１３３のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１３５】
類縁体のＧＩＰ効力がＧＬＰ−１効力の約１５倍以内である、請求項１２２を除く請求項１〜１３４のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１３６】
類縁体のＧＩＰ効力がグルカゴン効力の約１５倍以内である、請求項１２１を除く請求項１〜１３５のいずれか一項に記載の類縁体。
【請求項１３７】
リンカーを介して結合している２つのペプチドを含み、２つのペプチドの少なくとも一方が請求項１〜１３６のいずれか一項に記載の類縁体である、二量体。
【請求項１３８】
二量体がホモ二量体である、請求項１３７に記載の二量体。
【請求項１３９】
リンカーが、二官能チオール架橋剤および二官能アミン架橋剤から成る群から選ばれる、請求項１３７または１３８に記載の二量体。
【請求項１４０】
請求項１〜１３６のいずれか一項に記載の類縁体、請求項１３７〜１３９のいずれか一項に記載の二量体、またはこれらの組み合わせと共有結合している、結合体。
【請求項１４１】
第２のペプチドに融合した、請求項１〜１３６のいずれか一項に記載の類縁体または請求項１３７〜１３６のいずれか一項に記載の二量体を含む、融合ペプチド。
【請求項１４２】
請求項１〜１３６のいずれか一項に記載の類縁体、請求項１３７〜１３９のいずれか一項に記載の二量体、請求項１４０に記載の結合体、請求項１４１に記載の融合ペプチド、またはこれらの組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１４３】
請求項１４２に記載の医薬組成物と、前記医薬組成物を患者に投与する装置とを含む、キット。
【請求項１４４】
装置が、医薬組成物を含むシリンジを含む、請求項１４３に記載のキット。
【請求項１４５】
体重増加を低減する、または減量を誘導する方法であって、体重増加を低減する、または減量を誘導するのに有効な量の請求項１４２に記載の医薬組成物を、体重増加の低減または減量の誘導を必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項１４６】
糖尿病を治療する方法であって、血中グルコースレベルを低下するのに有用な量の請求項１４２に記載の医薬組成物を、糖尿病の治療を必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項１４７】
腸管の一過性麻痺を誘導する方法であって、腸管の一過性麻痺を誘導するのに有効な量の請求項１４２に記載の医薬組成物を、腸管の一過性麻痺の誘導を必要とする患者に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
プレプログルカゴンは、１５８アミノ酸前駆体ポリペプチドであり、異なる組織においてプロセシングされて、グルコースホメオスタシス、インスリン分泌、胃排出および腸管成長、並びに食物摂取の調節を含む多種多様な生理学的機能に関わる、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）およびオキシントモジュリン（ＯＸＭ）を含む多数の異なるプログルカゴン誘導ペプチドを形成する。グルカゴンは、プレプログルカゴンのアミノ酸３３から６１に対応する２９アミノ酸ペプチドであり、一方、ＧＬＰ−１は、プレプログルカゴンのアミノ酸７２から１０８に対応する３７アミノ酸ペプチドとして産生される。
【０００２】
血中グルコースが下降し始めると、膵臓により産生されるホルモンであるグルカゴンは、肝臓にグリコーゲンを分解し、グルコースを放出するようにシグナルを送り、血中グルコースレベルを正常なレベルに上昇させる。ＧＬＰ−１は、グルカゴンと比較すると異なる生物学的活性を有する。その作用には、インスリン合成および分泌の刺激、グルカゴン分泌の阻害および食物摂取の阻害が含まれる。ＧＬＰ−１は、糖尿病患者において高血糖症（グルコースレベルの上昇）を低減することが示されている。ＧＬＰ−１と５０％のアミノ酸同一性を共有する、トカゲ毒液からのペプチドであるエキセンディン−４（Exendin-4）は、ＧＬＰ−１受容体を活性化し、同様に糖尿病患者において高血糖症を低減することが示されている。
【０００３】
グルコース依存性のインスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）は、グルコースの存在下で膵臓ベータ細胞からのインスリンの分泌を刺激する４２アミノ酸胃腸調節ペプチドである。タンパク質分解プロセッシングにより、１３３アミノ酸前駆体であるプレプロＧＩＰから誘導される。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書に開示されているように、天然グルカゴン（配列番号１）の類縁体であり、ＧＩＰ活性を示すグルカゴンペプチドが提供される。本発明は、そのようなペプチドを使用する方法も提供する。
【０００５】
天然グルカゴンは、ＧＩＰ受容体を活性化せず、通常、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の約１％の活性しか有さない。本明細書に記載されている天然グルカゴン配列に対する修飾は、天然グルカゴン（配列番号１）の活性と同等な若しくはよりも良好な強力なグルカゴン活性、天然ＧＩＰ（配列番号４）の活性と同等な若しくはよりも良好な強力なＧＩＰ活性、および／または、天然ＧＬＰ−１の活性と同等な若しくはよりも良好な強力なＧＬＰ−１活性、を示すことができる、グルカゴンペプチドを産生する。ＧＬＰ−１（７−３６）アミド（配列番号３）またはＧＬＰ−１（７−３７）（酸）（配列番号２）は、ＧＬＰ−１受容体に対して実質的に同等の活性を示す、生物学的に活性のある形態のＧＬＰ−１である。
【０００６】
本明細書に記載されるデータは、ＧＩＰ活性とＧＬＰ−１活性の両方を有するペプチドが、減量を誘導するため、または体重増加を予防するため、また、糖尿病を含む高血糖症を治療するために、特に有利であることを示す。本明細書に開示されるインビボデータは、ＧＩＰアゴニスト活性とＧＬＰ−１アゴニスト活性の組み合わせが、ＧＬＰ−１単独よりも体重低減に対して大きな効果を生じることを示す。この活性は、ＧＩＰをアンタゴナイズすることが、毎日の食物摂取および体重を低減するため、ならびにインスリン感受性およびエネルギー消費量を増加するために望ましい、という当該技術の教示の観点から、特に予想外であった。（Irwin et al., Diabetologia 50: 1532-1540 (2007);およびAlthage et al., J Biol Chem, e-publication on April 17, 2008）。
【０００７】
したがって、一つの態様において、本発明は、減量を誘導する、または体重増加を予防する方法であって、ＧＩＰ受容体とＧＬＰ−１受容体の両方の活性を示し、更にグルカゴン受容体に対しても活性を示してもよい化合物、例えばグルカゴンペプチド、の治療有効量を、それを必要とする患者に登用することを含む方法を提供する。そのような化合物には、本明細書に記載されるＧＩＰ／ＧＬＰ−１コアゴニスト（co-agonist）およびグルカゴン／ＧＩＰ／ＧＬＰ−１トリアゴニスト（tri-agonist）が含まれる。
【０００８】
ＧＩＰ受容体に対する増加された活性は、位置１でのアミノ酸修飾によりもたらされる。例えば、位置１のＨｉｓは、大型の芳香族アミノ酸（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、アミノ−Ｐｈｅ、ニトロ−Ｐｈｅ、クロロ−Ｐｈｅ、スルホ−Ｐｈｅ、４−ピリジル−Ａｌａ、メチル−Ｔｙｒ、または３−アミノＴｙｒでもよい）で置換されている。
【０００９】
ＧＩＰ受容体に対する増加された活性は、グルカゴンペプチドまたはその類縁体のＣ末端部分（アミノ酸１２−２９）のアルファ−へリックス構造を安定化する修飾によりもたらされる。例えば、分子内架橋を、位置ｉおよびｉ＋４、または位置ｊおよびｊ＋３、または位置ｋおよびｋ＋７の２つのアミノ酸の側鎖の間の共有結合により、形成することができる。例示的な実施態様において、架橋は、位置１２と１６、１６と２０、２０と２４、２４と２８または１７と２０の間にある。他の実施態様において、塩架橋などの非共有相互作用を、これらの位置の正および負に帯電したアミノ酸の間で形成することができる。あるいは、例えば、グルカゴンペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９あたり）のアルファ−へリックス構造の安定化は、所望の活性を保持する位置への１個以上のα，α−二置換アミノ酸の意図的な導入を介して、達成される。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドの位置１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、又は２９のうちの１、２、３、４つ又はそれ以上は、α，α−二置換アミノ酸で置換されている。例えば、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）によるグルカゴンペプチドの位置１６の置換は、塩架橋又はラクタムの不在下で、安定化されたアルファ−へリックスをもたらす。そのようなペプチドは、本明細書において、分子内架橋を欠いているペプチドとして考慮される。特定の態様において、アルファ−へリックスの安定化は、共有分子内架橋、例えばラクタム架橋やジスルフィド架橋、を導入することなく、１個以上のα，α−二置換アミノ酸を導入することにより達成される。そのようなペプチドは、本明細書において共有分子内架橋を欠いているペプチドと考慮される。幾つかの実施態様において、位置１６、２０、２１又は２４のうちの１、２、３つ、又はそれ以上は、ＡＩＢで置換されている。
【００１０】
ＧＩＰ受容体に対する増加された活性は、位置２７および／または２８（更に位置２９でもよい）でのアミノ酸修飾によってもたらされる。例えば、位置２７のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸（Ｌｅｕでもよい）で置換され、位置２８のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸（Ａｌａでもよい）で置換され、位置２９のＴｈｒは、小型の脂肪族アミノ酸（Ｇｌｙでもよい）で置換されている。
【００１１】
ＧＩＰ受容体に対する増加された活性は、また、位置１２でのアミノ酸修飾によりもたらされる。例えば、位置１２は、大型で脂肪族で非極性のアミノ酸（Ｉｌｅでもよい）で置換されている。
【００１２】
ＧＩＰ受容体に対する増加された活性は、また、位置１７および／または１８でのアミノ酸修飾によりもたらされる。例えば、位置１７は、極性残基（Ｇｌｎでもよい）で置換され、位置１８は、小型の脂肪族アミノ酸（Ａｌａでもよい）で置換されている。
【００１３】
グルカゴン受容体に対する増加された活性は、本明細書に記載されているように、天然グルカゴン（配列番号１）の位置１６でのアミノ酸修飾によりもたらされる。
【００１４】
ＧＬＰ−１受容体に対する低減、維持、または増加された活性は、本明細書に記載されているように、例えば位置３でのアミノ酸修飾によりもたらされる。
【００１５】
位置１および／または２でのアミノ酸修飾により低減されたグルカゴン活性の回復は、グルカゴンペプチドまたはその類縁体のＣ末端部分（アミノ酸１２−２９）のアルファ−へリックス構造を安定化する修飾により、もたらされる。例えば、分子内架橋を、位置ｉおよびｉ＋４、または位置ｊおよびｊ＋３、または位置ｋおよびｋ＋７の２つのアミノ酸の側鎖の間の共有結合により、形成することができる。他の実施態様において、塩架橋などの非共有相互作用を、これらの位置の正および負に帯電したアミノ酸の間で形成することができる。更に他の実施態様において、１個以上のα，α−二置換アミノ酸が、このＣ末端部分（アミノ酸１２−２９）に所望の活性を保持する位置で挿入または置換される。例えば、位置１６、２０、２１、または２４のうちの１、２、３つ、または全てが、α，α−二置換アミノ酸、例えばＡＩＢで置換されている。
【００１６】
ＧＬＰ−１受容体に対する増加された活性は、Ｃ末端アミノ酸のカルボン酸を、アミドまたはエステルなどの電荷中性基に代えることによってもたらされる。
【００１７】
ＧＩＰ−１受容体に対する増加された活性は、グルカゴンペプチドまたはその類縁体のＣ末端部分（アミノ酸１２−２９周辺）のアルファ−へリックス構造を安定化する修飾によりもたらされる。幾つかの実施態様において、分子内架橋を、位置ｉおよびｉ＋４、または位置ｊおよびｊ＋３、または位置ｋおよびｋ＋７の２つのアミノ酸の側鎖の間の共有結合により、形成することができる。他の実施態様において、塩架橋などの非共有相互作用を、これらの位置の正および負に帯電したアミノ酸の間で形成することができる。更に他の実施態様において、１個以上のα，α−二置換アミノ酸が、このＣ末端部分（アミノ酸１２−２９）に所望の活性を保持する位置で挿入または置換される。例えば、位置１６、２０、２１または２４のうちの１、２、３つ、または全てが、α，α−二置換アミノ酸、例えばＡＩＢで置換されている。
【００１８】
ＧＬＰ−１受容体に対する増加された活性は、本明細書に記載されているように、位置２０でのアミノ酸修飾によりもたらされる。
【００１９】
ＧＬＰ−１受容体に対する増加された活性は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９６）などのＣ末端延長ペプチドを、Ｃ末端に付加することによりもたらされる。そのような類似体におけるＧＬＰ−１活性を、本明細書に記載されているように、位置１８、２８若しくは２９のアミノ酸、または位置１８および２９のアミノ酸を修飾することにより、更に増加することができる。
【００２０】
ＧＬＰ−１効力の更なる中程度の増加は、位置１０のアミノ酸を修飾して、大型の芳香族アミノ酸残基（Ｔｒｐでもよい）にすることによりもたらされる。
【００２１】
ＧＬＰ−１受容体に対する低減された活性は、本明細書に記載されるように、例えば、位置７でのアミノ酸修飾、位置２７または２８のアミノ酸のＣ末端側のアミノ酸（複数または単数）の欠失、２７または２８アミノ酸ペプチドの生成、あるいはこれらの組み合わせ、によりもたらされる。
【００２２】
ペグ化後の活性の保存は、Ｃ末端へのＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）の付加によりもたらされる。
【００２３】
本明細書に示されているように、グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体およびＧＩＰ受容体のそれぞれに対する、維持または増加（ラクタムを含有しＧＩＰ活性がありグルカゴンに基づいた類縁体と比較して）された活性は、（ｉ）下記の式ＩＶで示されるアミノ酸による、位置１６のＳｅｒのアミノ酸置換：
【化１】
2015164922.tif 000002
〔式中、ｎは、１〜１６または１〜１０または１〜７または１〜６または２〜６または２若しくは３若しくは４若しくは５であり、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ2〜Ｃ5複素環式）、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ6〜Ｃ10アリール）Ｒ7および（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ9ヘテロアリール）から成る群から独立して選ばれ、Ｒ7は、ＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は、遊離アミノ基を含む〕、ならびに（ｉｉ）アルファ，アルファ二置換アミノ酸、例えばＡＩＢによる、位置２０のＧｌｎのアミノ酸置換、によってもたらされる。幾つかの実施態様において、位置１６のアミノ酸はＬｙｓであり、位置２０のアミノ酸はＡＩＢである。
【００２４】
位置１６に式ＩＶのアミノ酸および位置２０にアルファ，アルファ二置換アミノ酸を含む類縁体のグルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体およびＧＩＰ受容体のそれぞれに対する活性は、ペプチドの長さを延長することにより、例えば約１−２１、約９−２１、約６−１８、約９−１２または約１０若しくは１１アミノ酸長さのＣ末端延長ペプチドと、例えば融合させることにより、更に増強することができる。幾つかの実施態様において、Ｃ末端は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９６）との融合により延長され、ここでＸは、Ｇｌｙであるか、または小型の、脂肪族若しくは非極性若しくは僅かに極性のアミノ酸である。代替的な実施態様において、Ｃ末端は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）との融合により延長され、１〜１１個のアミノ酸（例えば、１〜５、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個のアミノ酸）が、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）のＣ末端に融合している。ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）のＣ末端の１〜１１個のアミノ酸は、例えば、ＡｌａまたはＧｌｙなどの１個以上の小型脂肪族アミノ酸を含むことができる。この点において、Ｃ末端延長部は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＸmであることができ、ここで、ｍは１〜１１（例えば、１〜５）であり、そしてＸは、ＡｌａまたはＧｌｙである。あるいは、配列番号９５のＣ末端に融合している１〜１１個（例えば１〜５個）のアミノ酸は、異なる小型脂肪族アミノ酸の組み合わせであることができる。例えば、１〜１１個（例えば、１〜５個）のアミノ酸は、Ａｌａ残基とＧｌｙ残基の組み合わせであることができる。
【００２５】
位置１６に式ＩＶのアミノ酸および位置２０にアルファ，アルファ二置換アミノ酸を含む類縁体が含まれる、ＧＩＰ活性がありグルカゴンに基づいている類縁体の、グルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体のそれぞれに対する活性の増強を、Ｃ末端延長部に配置されているアミノ酸またはＣ末端アミノ酸（例えば、Ｃ末端延長部のＣ末端に付加されたアミノ酸）のアシル化またはアルキル化によって、更に達成することができる。アシル化またはアルキル化は、例えば、位置３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０のいずれかに配置されているアミノ酸において行うことができる。幾つかの実施態様において、アシル化またはアルキル化されるアミノ酸は、位置３７、３８、３９、４０、４１、４２または４３に配置されている。幾つかの実施態様において、アシル化またはアルキル化されるアミノ酸は、アシルまたはアルキル基、例えばＣ１０〜Ｃ２２に結合している、Ｌｙｓである。特定の実施態様において、Ｌｙｓは、配列番号９５のアミノ酸配列から構成されるＣ末端延長部のＣ末端に配置されており、そのためにＬｙｓは類縁体の位置４０に配置される。更に、アシル化Ｃ末端延長ペプチドは、例えば位置２４でペグ化もされていてもよい。
【００２６】
ＧＩＰ活性がありグルカゴンに基づいている類縁体の、グルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体のそれぞれに対する活性の増強は、スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能スペーサー、疎水性二官能スペーサー）を介するアミノ酸のアシル化またはアルキル化によって、更に達成することができる。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ活性がありグルカゴンに基づいている類縁体は、スペーサーを介してアシルまたはアルキル基を含み、ここでスペーサーは、類縁体の位置１０または位置４０のアミノ酸の側鎖に結合している。他の実施態様において、類縁体は、位置２９のアミノ酸のＣ末端側への１〜２１個のアミノ酸のＣ末端延長部を含み、アシルまたはアルキル基に共有結合しているスペーサーは、配列番号１の位置３７〜４３の１つに対応する位置で延長部のアミノ酸に結合している。特定の実施態様において、スペーサーは３〜１０原子長である。特定の態様において、スペーサーとアシルまたはアルキル基との全長は、約１４〜約２８原子長である。グルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体の１つ以上に対する活性を増加する目的に適したスペーサーは、本明細書において更に記載される。
【００２７】
ＧＩＰ活性を増加又は減少する、グルカゴン受容体活性を増加又は減少する、及びＧＬＰ−１受容体活性を増加するような、上記に記載された修飾のいずれも、個別に又は組み合わせて適用することができる。上記に記載された修飾のいずれかを、本明細書に記載されている、溶解性及び／又は安定性及び／又は作用持続時間の増加のような、他の所望の特性を付与する他の修飾と組み合わせることもできる。あるいは、上記に記載された修飾のいずれかを、溶解性又は安定性又は活性に実質的に影響を与えない、本明細書に記載されている他の修飾と組み合わせることができる。例示的な修飾には以下が含まれるが、これらに限定されない：
（Ａ）例えば、天然グルカゴンのＣ末端部分、好ましくは位置２７Ｃ末端側の位置への１、２、３個又はそれ以上の荷電アミノ酸の導入により溶解性を向上させること。そのような荷電アミノ酸は、例えば位置２８又は２９で天然アミノ酸を荷電アミノ酸により置換する、あるいは位置２７、２８又は２９の後に荷電アミノ酸を付加することによって導入することができる。例示的な実施態様において、１、２、３個又は全ての荷電アミノ酸は、負に荷電されている。他の実施態様において、１、２、３個又は全ての荷電アミノ酸は、正に荷電されている。そのような修飾は溶解性を増加し、例えば、２５℃で２４時間後に測定したとき、約５．５〜８の所定のｐＨ、例えばｐＨ７で、天然グルカゴンを基準として少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、３０倍又はそれ以上の溶解性をもたらす。
（Ｂ）例えばペプチドの位置１６、１７、２０、２１、２４若しくは２９、Ｃ末端延長内、又はＣ末端アミノ酸への、本明細書に記載されているポリエチレングリコール鎖のような親水性部分の付加により、溶解性及び作用持続時間又は循環半減期を増加すること。
（Ｃ）本明細書に記載されているグルカゴンペプチドのアシル化又はアルキル化により、溶解性及び／若しくは作用持続時間若しくは循環半減期を増加すること、並びに／又は作用開始を遅延すること。
（Ｄ）本明細書に記載されている位置１又は２のアミノ酸の修飾により、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）への耐性を導入することを介して、作用持続時間又は循環半減期を増加すること。
（Ｅ）位置１５のＡｓｐの修飾により、例えばグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸又はホモシステイン酸による欠失又は置換により、溶解性を増加すること。そのような修飾は、５．５〜８の範囲内のｐＨにおいて分解又は切断を低減することができ、例えば２５℃で２４時間後に元のペプチドの少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を保持することができる。そのような修飾は、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６のペプチド結合の切断を低減する。
（Ｆ）位置１６のＳｅｒの修飾により、例えばＴｈｒ又はＡＩＢでの置換により、安定性を増加すること。そのような修飾も、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６のペプチド結合の切断を低減する。
（Ｇ）位置２７のメチオニンの修飾により、例えばロイシン又はノルロイシンでの置換により、安定性を増加すること。そのような修飾は酸化分解を低減することができる。安定性は、位置２０又は２４のＧｌｎの修飾により、例えば、Ａｌａ又はＡＩＢでの置換により増強することもできる。そのような修飾は、Ｇｌｎの脱アミド化を介して生じる分解を低減することができる。安定性は、位置２１のＡｓｐの修飾により、例えばＧｌｕでの置換により増強することができる。そのような修飾は、Ａｓｐの脱水により環状スクシンイミド中間体を形成し、続く異性化によりイソアスパラギン酸塩を形成することによって生じる分解を低減することができる。
（Ｈ）実質的に活性に影響を与えない非保存的若しくは保存的置換、付加又は欠失、例えば、位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８若しくは２９の１つ以上での保存的置換；Ａｌａによるこれらの位置の１つ以上での置換；位置２７、２８若しくは２９の１つ以上でのアミノ酸の欠失；又は、Ｃ末端カルボン酸基の代わりにＣ末端アミド若しくはエステルと組み合わせてもよい、アミノ酸２９の欠失；Ａｒｇによる位置１２のＬｙｓの置換；Ｖａｌ若しくはＰｈｅによる位置１０のＴｙｒの置換。
【００２８】
幾つかの実施態様において、本明細書に記載されているグルカゴンペプチドは、ＧＩＰ受容体活性化の活性において約１００ｎＭ以下または約７５、５０、２５、１０、８、６、５、４、３、２若しくは１ｎＭ以下のＥＣ５０を示す。幾つかの実施態様において、本明細書に記載されるグルカゴンペプチドは、ＧＩＰ受容体に対して、約０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭまたは０．１ｎＭのＥＣ５０を示す。幾つかの実施態様において、本明細書に記載されるグルカゴンペプチドは、ＧＩＰ受容体に対して、約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭまたは１００ｎＭ以下のＥＣ５０を示す。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体活性化において約１００ｎＭ以下または約７５、５０、２５、１０、８、６、５、４、３、２若しくは１ｎＭ以下のＥＣ５０を示す。幾つかの実施態様において、本明細書に記載されるグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対して、約０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭまたは０．１ｎＭのＥＣ５０を示す。幾つかの実施態様において、グルカゴン受容体に対するＥＣ５０は、約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭまたは１００ｎＭ以下である。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体活性化において約１００ｎＭ以下または約７５、５０、２５、１０、８、６、５、４、３、２若しくは１ｎＭ以下のＥＣ５０を示す。幾つかの実施態様において、本明細書に記載されるグルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対して、約０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭまたは０．１ｎＭのＥＣ５０を示す。幾つかの実施態様において、ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０は、約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭまたは１００ｎＭ以下である。受容体活性化は、受容体を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰ誘導を測定するインビトロアッセイにより、例えば、実施例１６に記載されているように、レセプターをコードするＤＮＡと、ｃＡＭＰ応答配列に結合したルシフェラーゼ遺伝子とを同時形質移入されたＨＥＫ２９３細胞をアッセイすることにより、測定することができる。
【００２９】
幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、天然ＧＩＰ（ＧＩＰ効力）と比べて、ＧＩＰ受容体に対して少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％若しくは２００％またはそれ以上の活性を示す。幾つかの実施態様において、本明細書に記載されるグルカゴンペプチドは、天然ＧＩＰと比べて、ＧＩＰ受容体に対して約１００％、１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％以下の活性を示す。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、グルカゴン（グルカゴン効力）と比べて、グルカゴン受容体に対して少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％若しくは５００％またはそれ以上の活性を示す。幾つかの実施態様において、本明細書に記載されるグルカゴンペプチドは、天然グルカゴンと比べて、グルカゴン受容体に対して、１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％以下の活性を示す。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、天然ＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１効力）と比べて、ＧＬＰ−１受容体に対して少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％若しくは２００％またはそれ以上の活性を示す。幾つかの実施態様において、本明細書に記載されるグルカゴンペプチドは、天然ＧＬＰ−１と比べて、ＧＬＰ−１受容体に対して、１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％以下の活性を示す。受容体の天然リガンドと比べた受容体に対するグルカゴンペプチドの活性は、天然リガンドと比べたグルカゴンペプチドのＥＣ５０の逆比として計算される。
【００３０】
したがって、本発明の一つの態様は、グルカゴン受容体およびＧＩＰ受容体の両方に対して活性を示すグルカゴンペプチド（「グルカゴン／ＧＩＰコアゴニスト）を提供する。これらのグルカゴンペプチドは、ＧＩＰ受容体と比べてグルカゴン受容体への天然グルカゴンの選択性を失っている。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ受容体に対するグルカゴンペプチドのＥＣ５０は、グルカゴン受容体に対するＥＣ５０と約５０倍、４０倍、３０倍または２０倍未満の差がある（より高い、またはより低い）。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドのＧＩＰ効力は、グルカゴン効力と約５００倍、４５０倍、４００倍、３５０倍、３００倍、２５０倍、２００倍、１５０倍、１００倍、７５倍、５０倍、２５倍、２０倍、１５倍、１０倍または５倍未満の差（より高い、またはより低い）がある。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ受容体に対するグルカゴンペプチドのＥＣ５０を、グルカゴン受容体に対するグルカゴンペプチドのＥＣ５０で割った比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０または５未満である。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０をグルカゴン受容体に対するＥＣ５０で割った比は、約１または１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドのＧＩＰ効力を、グルカゴンペプチドのグルカゴン効力と比較した比は、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０または５未満である。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ受容体に対する効力をグルカゴン受容体に対する効力で割った比は、約１または１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。幾つかの実施態様において、ＧＬＰ−１活性は、例えば、位置７のアミノ酸修飾、位置２７または２８のアミノ酸のＣ末端のアミノ酸（複数または単数）の欠失、２７または２８アミノ酸ペプチドの生成あるいはこれらの組み合わせにより、有意に低減または破壊される。
【００３１】
本発明の別の態様は、グルカゴン、ＧＩＰおよびＧＬＰ−受容体に対して活性を示すグルカゴンペプチド（「グルカゴン／ＧＩＰ／ＧＬＰ−１トリアゴニスト」）を提供する。これらのグルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１とＧＩＰの両方の受容体と比べてグルカゴン受容体への天然グルカゴンの選択性を失っている。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ受容体に対するグルカゴンペプチドのＥＣ５０は、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体に対するそれぞれのＥＣ５０と約５０倍、４０倍、３０倍または２０倍未満の差がある（より高い、またはより低い）。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドのＧＩＰ効力は、グルカゴンおよびＧＬＰ−１効力と約５００倍、４５０倍、４００倍、３５０倍、３００倍、２５０倍、２００倍、１５０倍、１００倍、７５倍、５０倍、２５倍、２０倍、１５倍、１０倍または５倍未満の差（より高い、またより低い）がある。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０を、ＧＬＰ−１受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０で割った比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０または５未満である。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０をＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０で割った比は、約１または１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。幾つかの実施態様において、トリアゴニストのＧＩＰ効力をトリアゴニストのＧＬＰ−１効力と比較した比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０または５未満である。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ受容体に対する効力をＧＬＰ−１受容体に対する効力で割った比は、約１または１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。関連する実施態様において、ＧＩＰ受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０を、グルカゴン受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０で割った比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０または５未満である。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０をグルカゴン受容体に対するＥＣ５０で割った比は、約１または１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。幾つかの実施態様において、トリアゴニストのＧＩＰ効力をトリアゴニストのグルカゴン効力と比較した比は、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０または５未満である。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ受容体に対する効力をグルカゴン受容体に対する効力で割った比は、約１または１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。幾つかの実施態様において、ＧＬＰ−１受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０を、グルカゴン受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０で割った比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０または５未満である。幾つかの実施態様において、ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０をグルカゴン受容体に対するＥＣ５０で割った比は、約１または１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。幾つかの実施態様において、トリアゴニストのＧＬＰ−１効力をトリアゴニストのグルカゴン効力と比較した比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０または５未満である。幾つかの実施態様において、ＧＬＰ−１受容体に対する効力をグルカゴン受容体に対する効力で割った比は、約１または１未満（例えば、約０．０１、０．０１３、０．０１６７、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０５、０．０６７、０．１、０．２）である。
【００３２】
本発明の更に別の態様は、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体に対して活性を示すが、グルカゴン活性が、例えば位置３のアミノ酸修飾により有意に低減または破壊されているグルカゴンペプチド（「ＧＩＰ／ＧＬＰ−１コアゴニスト」）を提供する。例えば、酸性、塩基性または疎水性アミノ酸（グルタミン酸、オルチニン、ノルロイシン）によるこの位置での置換は、グルカゴン活性を低減する。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ受容体に対するグルカゴンペプチドのＥＣ５０は、ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０と約５０倍、４０倍、３０倍または２０倍未満の差（より高い、またはより低い）がある。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドのＧＩＰ効力は、ＧＬＰ−１効力と約２５倍、２０倍、１５倍、１０倍または５倍未満の差（より高い、またはより低い）がある。幾つかの実施態様において、これらのグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対して天然グルカゴンの活性の約１０％以下の活性を有し、例えば、約１〜１０％または約０．１〜１０％または約０．１超であるが約１０％未満である。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ受容体に対するグルカゴンペプチドのＥＣ５０を、ＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴンペプチドのＥＣ５０で割った比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０または５未満であり、１以上である。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドのＧＩＰ効力をグルカゴンペプチドのＧＬＰ−１効力と比較した比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０または５未満であり、１以上である。
【００３３】
本発明の更なる態様は、ＧＩＰ受容体に対する活性を示すが、グルカゴンおよびＧＬＰ−１活性が、例えば位置３および７のアミノ酸修飾により、有意に低減または破壊されている、グルカゴンペプチド（「ＧＩＰアゴニストグルカゴンペプチド」）を提供する。幾つかの実施態様において、これらのグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の約１０％以下の活性を有し、例えば、約１〜１０％または約０．１〜１０％または約０．１、０．５％若しくは１％超であるが約１％、５％若しくは１０％未満である。幾つかの実施態様において、これらのグルカゴンペプチドは、また、ＧＬＰ−受容体に対して天然ＧＬＰ−１の活性の約１０％以下の活性しか有さず、例えば、約１〜１０％または約０．１〜１０％または約０．１、０．５％若しくは１％超であるが約１％、５％若しくは１０％未満である。
【００３４】
本発明の幾つかの実施態様によると、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号１）の類縁体は、（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する位置１でのアミノ酸修飾、（ｂ）類縁体のＣ末端部分（アミノ酸１２−２９）のアルファ−へリックス構造を安定化する修飾、を含み、（ｃ）更に、１〜１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）の更なるアミノ酸修飾を有する配列番号１、を含んでもよい。幾つかの実施態様において、類縁体は、ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰの少なくとも約１％の活性、または本明細書に記載されるＧＩＰ受容体に対する他の任意の活性レベルを示す。アルファ−へリックス構造を安定化する修飾は、例えば本明細書に記載されている任意のものなどの、当該技術において既知の任意のものであることができる。「アルファ−へリックス構造の安定化」のセクションにおける教示を参照すること。幾つかの実施態様において、アルファ−へリックス構造を安定化する修飾は、（ｉ）位置ｉおよびｉ＋４のアミノ酸の側鎖の間または位置ｊおよびｊ＋３のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋（ここで、ｉは、１２、１３、１６、１７、２０また２４であり、ｊは１７である）、ならびに（ｉｉ）類縁体の位置１６、２０、２１および２４のうちの１、２、３つ、または全てのアミノ酸がα，α−二置換アミノ酸で置換されている、から成る群から選ばれる修飾である。ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンのそのような類縁体は、本明細書において更に記載される。
【００３５】
幾つかの実施態様において、本発明は、以下の修飾：
（ａ）位置１でのアミノ酸修飾、
（ｂ）（ｉ）位置ｉおよびｉ＋４のアミノ酸の側鎖の間または位置ｊおよびｊ＋３のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋（ここで、ｉは、１２、１３、１６、１７、２０または２４であり、ｊは１７である）、あるいは（ｉｉ）位置１６、２０、２１または２４のうちの１、２、３つ、または全てにおけるα，α−二置換によるアミノ酸置換、
（ｃ）位置２７、２８および２９のうちの１、２つ、または全てにおけるアミノ酸修飾、ならびに
（ｄ）１、２、３、４、５、６または８個の更なるアミノ酸修飾
を含む、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号１）の類縁体を提供し、
ここで、ＧＩＰ受容体活性化における類縁体のＥＣ５０は、約１００ｎＭ以下である。
【００３６】
例示的な実施態様において、
（ａ）位置１でのアミノ酸修飾は、大型の芳香族アミノ酸（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、アミノ−Ｐｈｅ、ニトロ−Ｐｈｅ、クロロ−Ｐｈｅ、スルホ−Ｐｈｅ、４−ピリジル−Ａｌａ、メチル−Ｔｙｒ、または３−アミノＴｙｒでもよい）による位置１のＨｉｓの置換である、
（ｂ）（ｉ）ラクタム架橋は、位置１６および２０のアミノ酸の間にあり、位置１６および２０のアミノ酸の一方はＧｌｕで置換され、位置１６および２０のアミノ酸の他方はＬｙｓで置換されている、または（ｉｉ）α，α−二置換アミノ酸はＡＩＢである、
（ｃ）位置２７のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸（Ｌｅｕでもよい）で置換されている、
（ｄ）位置２８のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸（Ａｌａでもよい）で置換されている、ならびに
（ｅ）位置２９のＴｈｒは、小型の脂肪族アミノ酸（Ｇｌｙでもよい）で置換されている。
【００３７】
類縁体は、下記：
（ａ）位置１２のアミノ酸修飾（Ｉｌｅによる置換でもよい）、
（ｂ）位置１７および１８のアミノ酸修飾（位置１７のＱによる置換、および位置１８のＡによる置換でもよい）、
（ｃ）Ｃ末端へのＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）の付加、または
これらの任意の組み合わせ
を含む(但しこれらに限定されない)、更なる修飾を含むことができる。
【００３８】
類縁体は、下記：
（ａ）Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌまたはα−アミノ−Ｎ−酪酸で置換されている位置２のＳｅｒ；
（ｂ）Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＶａｌで置換されている位置１０のＴｙｒ；
（ｃ）位置１０のＬｙｓへのアシル基の結合；
（ｄ）Ａｒｇで置換されている位置１２のＬｙｓ；
（ｅ）Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、ＧｌｙまたはＡＩＢで置換されている位置１６のＳｅｒ；
（ｆ）Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＧｌｕで置換されている位置１７のＡｒｇ；
（ｇ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＧｌｙで置換されている位置１８のＡｒｇ；
（ｈ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、ＯｒｎまたはＡＩＢで置換されている位置２０のＧｌｎ；
（ｉ）Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている位置２１のＡｓｐ；
（ｊ）Ｉｌｅで置換されている位置２３のＶａｌ：
（ｋ）Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、ＬｙｓまたはＡＩＢで置換されている位置２４のＧｌｎ；ならびに
（ｌ）位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１，２４、２７、２８、および２９のいずれかでの保存的置換；あるいは
これらの任意の組み合わせ
を含む（但しこれらに限定されない）、更なる修飾を、代替的にまたは追加的に含むことができる。
【００３９】
幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドがペグ化されていない場合、ＧＩＰ受容体活性化における類縁体のＥＣ５０は、約４、２、１ｎＭ以下であるか、または類縁体は、ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰの活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％若しくは５％の活性を有する。関連する実施態様において、ＧＬＰ−１受容体活性化における非ペグ化類縁体のＥＣ５０は、約４、２、１ｎＭ以下であるか、またはＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％若しくは５％の活性を有する。更に他の関連する実施態様において、グルカゴン受容体活性化における非ペグ化類縁体のＥＣ５０は、約４、２、１ｎＭ以下であるか、またはグルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の少なくとも約５％、１０％、１５％若しくは２０％の活性である。幾つかの実施態様において、非ペグ化類縁体は、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の約１％未満を有する。他の実施態様において、非ペグ化類縁体は、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の約１０％、５％または１％未満を有する。
【００４０】
幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、Ｃ末端延長内のアミノ酸位置１６、１７、２０、２１、２４若しくは２９、位置２９の後のＣ末端延長部内（例えば、位置３０）の付加アミノ酸、またはＣ末端アミノ酸のいずれかで、親水性部分に共有結合している。例示的な実施態様において、この親水性部分は、これらの位置のいずれかにおける、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチル−フェニルアラニン残基に共有結合している。例示的な親水性部分には、例えば約１，０００ダルトンから約４０，０００ダルトン、または約２０，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの分子量の、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。
【００４１】
類縁体がＰＥＧなどの親水性部分に結合している実施態様において、１つ以上の受容体に対する相対的ＥＣ５０は、親水性部分を欠いている類縁体と比べて、より高い、例えば約１０倍高い場合がある。例えば、ＧＩＰ受容体活性化におけるペグ化類縁体のＥＣ５０は、約１０ｎＭ以下であるか、または類縁体は、ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰの活性の少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％または０．５％の活性を有する。関連する実施態様において、ＧＬＰ−１受容体活性化におけるペグ化類縁体のＥＣ５０は、約１０ｎＭ以下であるか、またはＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％若しくは０．５％の活性を有する。更に他の関連する実施態様において、グルカゴン受容体活性化におけるペグ化類縁体のＥＣ５０は、約１０ｎＭ以下であるか、またはグルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の少なくとも約０．５％、１％、１．５％％若しくは２％の活性である。幾つかの実施態様において、類縁体は、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴンの活性の約１％未満を有する。幾つかの実施態様において、類縁体は、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の約１０％、５％または１％未満の活性を有する。
【００４２】
グルカゴンペプチドは、リンカーを介して結合している少なくとも２、３つまたはそれ以上のペプチドを含む二量体、三量体またはより高次な多量体の一部であることができ、ここで少なくとも１つまたは両方のペプチドはグルカゴンペプチドである。二量体は、ホモ二量体であってもよいしヘテロ二量体であってもよい。幾つかの実施態様において、リンカーは、二官能チオール架橋剤及び二官能アミン架橋剤からなる群より選択される。特定の実施態様において、リンカーは、ＰＥＧ、例えば５kDaのＰＥＧ、２０kDaのＰＥＧである。幾つかの実施態様において、リンカーはジスルフィド結合である。例えば、二量体のそれぞれのモノマーは、Ｃｙｓ残基（例えば、末端又は内部に位置したＣｙｓ）を含むことができ、それぞれのＣｙｓ残基の硫黄原子はジスルフィド結合の形成に参加する。本発明の幾つかの態様において、複数のモノマーは、複数の末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端若しくはＣ末端）同士を介して、又は複数の内部アミノ酸同士を介して、又は少なくとも一方のモノマーの末端アミノ酸と少なくとももう一方のモノマーの内部アミノ酸とを介して、連結している。特定の態様において、複数のモノマーはＮ末端アミノ酸を介して連結してはいない。幾つかの態様において、多量体のモノマーは、各モノマーのＣ末端アミノ酸が互いに結合している「尾−尾」配向で互いに結合している。二量体、三量体、またはより高次な多量体を含む、本明細書に記載されているグルカゴンペプチドのいずれかに対して、結合体部分が結合していてもよい。
【００４３】
グルカゴン受容体活性を増加する、部分的なグルカゴン受容体活性を保持する、溶解性を向上させる、安定性を増加する、又は分解を低減するような、上記に記載された修飾のいずれも、個別に、又は組み合わせて、グルカゴンペプチドに適用することができる。いくつかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、６〜８又は６〜９のｐＨ（例えば、ｐＨ７）で２５℃で２４時間経過後、少なくとも１mg/mLの濃度で溶解性を有し、更に、元のペプチドの少なくとも９５％を保持して（例えば、元のペプチドの５％以下しか分解又は切断されない）もよい。  
【００４４】
薬学的に許容される担体または希釈剤を含む滅菌された医薬組成物、および装置を含むキットが提供される。体重増加を低減する、または減量を誘導する方法であって、体重増加を低減する、または減量を誘導するのに有効な量の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。糖尿病を治療する方法であって、血中グルコースレベルを低下するのに有用な量の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。
【００４５】
本明細書に記載されている全ての治療方法、医薬組成物、キット、及び他の同様の実施態様は、ペプチド、アゴニスト、コアゴニスト、トリアゴニスト、又は類縁体という用語の使用には、それらの薬学的に許容される全ての塩またはエステルも含まれる、ということを考慮する。
【００４６】
前述の概要は、本発明の全ての態様を定義することを意図せず、追加の実施態様が発明を実施するための形態のような他の章に記載されている。この文書は全体として統一された開示として関連し、本明細書に記載されている特徴の全ての可能な組み合わせは、たとえそのような特徴の組み合わせがこの文書の同じ行、段落又は章において一緒に見あたらないとしても、本明細書に記載されていると理解されるべきである。
【００４７】
更に、本発明は、本明細書の特定の段落により定義された変形よりも多少なりとも狭い範囲である本発明の実施態様のうちの１つ又は全てを含む。例えば、本発明の特定の態様が属として記載される場合、その属の全ての構成要素が個別に本発明の実施態様であること、及びその属の２つ以上の構成要素の組み合わせも本発明の実施態様であることを理解するべきである。
【００４８】
（関連出願の相互参照）
本出願は、以下に対する優先権を請求する：
米国仮出願第６１／０７３，２７４号（２００８年６月１７日出願）、米国仮出願第６１／０７８，１７１号（２００８年７月３日出願）、米国仮出願第６１／０９０，４４８号（２００８年８月２０日出願）、および米国仮出願第６１／１５１，３４９号（２００９年２月１０日出願）。それぞれの出願の開示は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、ビヒクルのみ（中空逆三角）、キメラ２  ＡＩＢ２  Ｃｙｓ２４（４０Ｋ  ＰＥＧ）（中実四角）、ＧＩＰアンタゴニスト  Ｐｒｏ３  Ｃｙｓ２４  ＧＩＰ−ＮＨ2（１−４２）４０Ｋ  ＰＥＧ（中空菱形）、ＧＩＰアゴニスト  ＡＩＢ２  Ｃｙｓ２４  ＧＩＰ（１−４２）４０Ｋ  ＰＥＧ（中空三角と点線）または無関係なペプチドホルモン（網掛逆三角）の投与後の時間（日）の関数としての、マウスの体重の変化％のグラフを表す。
【図２】図２は、ビヒクルのみ（中空逆三角）、キメラ２  ＡＩＢ２  Ｃｙｓ２４（４０Ｋ  ＰＥＧ）（中実四角）、ＧＩＰアンタゴニスト  Ｐｒｏ３  Ｃｙｓ２４  ＧＩＰ−ＮＨ2（１−４２）４０Ｋ  ＰＥＧ（中空菱形）、ＧＩＰアゴニスト  ＡＩＢ２  Ｃｙｓ２４  ＧＩＰ（１−４２）４０Ｋ  ＰＥＧ（中空三角と点線）または無関係なペプチドホルモン（網掛逆三角）の投与後の時間の関数としての、マウスの食物摂取量（グラム）のグラフを表す。
【図３】図３は、ビヒクルのみ（黒色棒）、キメラ２  ＡＩＢ２  Ｃｙｓ２４（４０Ｋ  ＰＥＧ）（白色棒）、ＧＩＰアンタゴニスト  Ｐｒｏ３  Ｃｙｓ２４  ＧＩＰ−ＮＨ２（１−４２）４０Ｋ  ＰＥＧ（網掛棒）、ＧＩＰアゴニスト  ＡＩＢ２  Ｃｙｓ２４  ＧＩＰ（１−４２）４０Ｋ  ＰＥＧ（横線棒）または無関係なペプチドホルモン（縦線棒）の投与の７日後の、マウスにおける血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）の変化のグラフを表す。
【図４】図４は、ビヒクルのみ（中実逆三角）、キメラ２  ＡＩＢ２（中空菱形）、キメラ２  ＡＩＢ２  ラクタム（中空三角）、トリアゴニストペプチドＭＴ−１７０（中空四角）、ＧＩＰ／グルカゴンコアゴニストペプチドＭＴ−１８２（中実菱形）、ＧＬＰ−１／ＧＩＰコアゴニストペプチドＭＴ−１７８（網掛三角と点線）またはＧＩＰ／グルカゴンコアゴニストペプチドＭＴ−１７９（中実四角）の投与後の時間（日）の関数としての、マウスの体重の変化％のグラフを表す。ペグ化ＭＴ−１７９がトリアゴニストとして作用することに注意すること。
【図５】図５は、ビヒクルのみ（中実三角）、ＧＬＰ−１  Ｅ１６アゴニストの１０ｎｍｏｌ／ｋｇ（中実逆三角）若しくは３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（中空四角）、トリアゴニストペプチドＭＴ−１７０の１０ｎｍｏｌ／ｋｇ（中空逆三角）若しくは３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（中実菱形）またはＧＬＰ−１／ＧＩＰコアゴニストペプチドＭＴ−１７８の１０ｎｍｏｌ／ｋｇ（灰色逆三角）若しくは３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（灰色四角）の投与後の時間（日）の関数としての、マウスの体重の変化％のグラフである。
【図６】図６は、ビヒクルのみ（黒色棒）、ＧＬＰ−１  Ｅ１６アゴニストの１０ｎｍｏｌ／ｋｇ（白色棒）若しくは３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（灰色棒）、トリアゴニストペプチドＭＴ−１７０の１０ｎｍｏｌ／ｋｇ（横線棒）若しくは３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（縦線棒）またはＧＬＰ−１／ＧＩＰコアゴニストペプチドＭＴ−１７８の１０ｎｍｏｌ／ｋｇ（右左斜線棒）若しくは３５ｎｍｏｌ／ｋｇ（左右斜線棒）の投与の７日後の、マウスにおける血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）の変化のグラフである。
【図７】図７は、ビヒクル対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチド対照、ラクタムを含有し（環状）ペグ化されたＧＩＰ活性のグルカゴン類縁体（「ｍｔ−１７８」）またはラクタムを欠き（直鎖）ペグ化されたＧＩＰ活性のグルカゴン類縁体（「ｍｔ−２７４」）を１、３または１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週により（−６０の時点で）注射されたマウスへの、グルコース注射（０時点で投与）前後の時間の関数としての、血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。この図のデータは、４匹のマウスのデータを排除しており、それはこれらのマウスが攻撃的行動を示し、顕著な減量を示したからである。
【図８】図８は、ビヒクル対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチド対照、ｍｔ−１７８またはｍｔ−２７４を１、３または１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週により（グルコース注射の２４時間前）に注射されたマウスの、グルコース注射（０時点で投与）前後の時間の関数としての、血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。この図のデータは、４匹のマウスのデータを排除しており、それはこれらのマウスが攻撃的行動を示し、顕著な減量を示したからである。
【図９】図９は、ビヒクル対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチド対照、ｍｔ−１７８またはｍｔ−２７４の１、３または１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週での注射の０または７日後の、マウスの血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。この図のデータは、４匹のマウスのデータを排除しており、それはこれらのマウスが攻撃的行動を示し、顕著な減量を示したからである。
【図１０】図１０は、ビヒクル対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチド対照、ｍｔ−１７８またはｍｔ−２７４の１、３または１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週での注射の０、１、３、５および７日後の、マウスの体重の変化率のグラフを表す。この図のデータは、４匹のマウスのデータを排除しており、それはこれらのマウスが攻撃的行動を示し、顕著な減量を示したからである。
【図１１】図１１は、ビヒクル対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチド対照、ｍｔ−１７８、ｍｔ−１７８（ＴＥ）、ｍｔ−２４７またはｍｔ−２７４（ＴＥ）の１０または３５ｎｍｏｌ／ｋｇ／週での注射の０または７日後の、マウスの血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。「ＴＥ」は、位置４０のＣｙｓに結合したＰＥＧ基を示す。
【図１２】図１２は、ビヒクル対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチド対照、ｍｔ−１７８、ｍｔ−１７８（ＴＥ）、ｍｔ−２４７またはｍｔ−２７４（ＴＥ）の１０または３５ｎｍｏｌ／ｋｇ／週での注射の７日後の、マウスの血中グルコースの変化（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。「ＴＥ」は、位置４０のＣｙｓに結合したＰＥＧ基を示す。
【図１３】図１３は、ビヒクル対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチド対照、ｍｔ−１７８、ｍｔ−１７８（ＴＥ）、ｍｔ−２７４またはｍｔ−２７４（ＴＥ）の１０または３５ｎｍｏｌ／ｋｇ／週での注射の０、１、３、５、７および１０日後の、マウスの体重の変化率のグラフを表す。「ＴＥ」は、位置４０のＣｙｓに結合したＰＥＧ基を示す。
【図１４】図１４は、ビヒクル対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチド対照、ｍｔ−１７８、ｍｔ−１７８（ＴＥ）、ｍｔ−２４７またはｍｔ−２７４（ＴＥ）の１０または３５ｎｍｏｌ／ｋｇ／週での注射の７日後の、マウスの体重に変化率のグラフを表す。「ＴＥ」は、位置４０のＣｙｓに結合したＰＥＧ基を示す。
【図１５】図１５は、ビヒクル対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチド対照、ｍｔ−１７８、ｍｔ−２７４、直鎖非ペグ化非アシル化ペプチド（「ｍｔ−３１１」）、Ｃ１４脂肪アシル化直鎖ペプチド（「ｍｔ−３０９」）、Ｃ１６脂肪アシル化直鎖ペプチド（「ｍｔ−２９８」）またはＣ１８脂肪アシル化直鎖ペプチド（「ｍｔ−３１０」）の１０ｎｍｏｌ／ｋｇでの注射の０または７日後の、マウスの血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。
【図１６】図１６は、ビヒクル対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチド対照、ｍｔ−１７８、ｍｔ−２７４、ｍｔ−３１１、ｍｔ−３０９、ｍｔ−２９８またはｍｔ−３１０の１０ｎｍｏｌ／ｋｇでの注射の０、１、３、５および７日後の、マウスの体重の変化率のグラフを表す。
【図１７】図１７は、ビヒクル対照、ＧＬＰ−１アゴニストペプチド対照、ｍｔ−１７８、ｍｔ−２７４、ｍｔ−３１１、ｍｔ−３０９、ｍｔ−２９８またはｍｔ−３１０の１０ｎｍｏｌ／ｋｇでの注射の７日後の、マウスの体重の変化率のグラフを表す。
【図１８】図１８は、ビヒクル対照、リラグルチド（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ、アシル化ＧＬＰ−１類縁体の一つ）、Ｃ１４脂肪アシル化非ペグ化直鎖ペプチド（「ｍｔ−２６０」）、Ｃ１６脂肪アシル化非ペグ化直鎖ペプチド（「ｍｔ−２６１」）、またはＣ１８脂肪アシル化非ペグ化直鎖ペプチド（「ｍｔ−２６２」）を、２５または１２５ｎｍｏｌ／ｋｇで７日間毎日一度ずつ注射した後の、０および７日間のマウスの血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）の変化のグラフを表す。
【図１９】図１９は、ビヒクル対照、リラグルチド、ｍｔ−２６０、ｍｔ−２６１またはｍｔ−２６２の２５または１２５ｎｍｏｌ／ｋｇでの注射の０、１、３、５および７日後の、マウスの体重の変化率のグラフを表す。
【図２０】図２０は、ビヒクル対照、リラグルチド、ｍｔ−２６０、ｍｔ−２６１またはｍｔ−２６２の２５または１２５ｎｍｏｌ／ｋｇでの注射の７日後の、マウスの体重の変化率のグラフを表す。
【図２１】図２１は、ビヒクル対照、リラグルチド（３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）またはｍｔ−２６１（０．３、１、３、１０若しくは３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）での最初の注射の０、１、３、５および７日後の、マウスの体重の変化（ｇ）のグラフを表す。
【図２２】図２２は、ビヒクル対照、リラグルチド（３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）またはｍｔ−２６１（０．３、１、３、１０若しくは３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）での最初の注射の７日後の、マウスの脂肪量のグラフを表す。
【図２３】図２３は、ビヒクル対照、リラグルチド（３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）またはｍｔ−２６１（０．３、１、３、１０若しくは３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）での最初の注射の０または７日後の、マウスの血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。
【図２４】図２４は、ｍｔ−２６３、エキセンディン−４またはビヒクル対照を括弧に示された用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）で注射したマウスの時間の関数としての、体重の変化（変化％）の線グラフを表す。
【図２５】図２５は、ｍｔ−２６３、エキセンディン−４またはビヒクル対照を括弧に示された用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）で注射したマウスの（０日目と比較した７日目の測定としての）、体重の総変化（％）の棒グラフを表す。
【図２６】図２６は、ｍｔ−２６３、エキセンディン−４またはビヒクル対照を括弧に示された用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）で注射したマウスの（０日目と比較した７日目の測定としての）、血中グルコースレベルの変化（ｍｇ／ｄＬ）の棒グラフを表す。
【図２７】図２７は、ビヒクル対照、リラグルチド、ｍｔ−２７７、ｍｔ−２７８またはｍｔ−２７９の最初の注射の０、１、３、５および７日後の、マウスの体重の変化％のグラフを表す。
【図２８】図２８は、ビヒクル対照、リラグルチド、ｍｔ−２７７、ｍｔ−２７８またはｍｔ−２７９の最初の注射の０および７日後の、マウスの血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。
【図２９】図２９は、ｍｔ−３３１、ｍｔ−３１１またはビヒクル対照の投与の７日後に測定した、マウスの体重の総変化（％）のグラフを表す。用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ）は、括弧に示されている。
【図３０】図３０は、ｍｔ−３３１、ｍｔ−３１１またはビヒクル対照の投与の７日後に測定した、マウスの総食物摂取量（ｇ）のグラフを表す。用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ）は、括弧に示されている。
【図３１】図３１は、ｍｔ−３３１、ｍｔ−３１１またはビヒクル対照の投与の７日後に測定した、マウスの血中グルコースの総変化のグラフを表す。用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ）は、括弧に示されている。
【図３２】図３２は、ｍｔ−３３１、ｍｔ−３５３またはビヒクル対照の括弧に示された用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ）での投与の７日後に測定した、マウスの体重の総変化のグラフを表す。
【図３３】図３３は、ｍｔ−３３１、ｍｔ−３５３またはビヒクル対照の括弧に示された用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ）での投与の７日後に測定した、マウスの総食物摂取量（ｇ）のグラフを表す。
【図３４】図３４は、ｍｔ−３３１、ｍｔ−３５３またはビヒクル対照の括弧に示された用量（ｎｍｏｌ／ｋｇ）での投与の７日後に測定した、マウスの血中グルコースレベルの変化（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。
【図３５】図３５は、ｍｔ−２７７、ｍｔ−２７８、ｍｔ−２７９またはビヒクル対照の最初の投与の７日後に測定した、マウスの体重の総変化（％）のグラフを表す。
【図３６】図３６は、ｍｔ−２６１、ｍｔ−３０９またはビヒクル対照の最初の投与の６日後に測定した、マウスの体重の総変化（％）のグラフを表す。
【図３７】図３７は、ｍｔ−２６１、ｍｔ−３０９またはビヒクル対照の最初の投与の６日後に測定した、マウスの血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを表す。同じパターンの棒の各対の１番目の棒は、０日目に測定した血中グルコースレベルであり、各対の２番目の棒は、６日目のレベルである。
【図３８】図３８は、本明細書において更に記載されるように、ビヒクル対照またはｍｔ−２６１を注射したマウスのｍｔ−２６１の最初の投与の６日後に測定した（投与初日に測定した体重と比較した）、体重の総変化（％）の棒グラフを表す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
＜定義＞
本発明を説明し、特許請求するに際し、以下に記載される定義に従って下記の語法が使用される。
【００５１】
用語「約」は、本明細書で使用されるとき、記述されている値または値の範囲よりも１０パーセント多いまたは少ないことを意味するが、この広義のみに対する任意の値または値の範囲を指定することを意図しない。用語「約」に続くそれぞれの値または値の範囲は、絶対値または絶対値の範囲の記述の実施態様を包含することも意図される。
【００５２】
本明細書で用いる「薬学的に受容可能な担体」という用語は、標準的な製剤担体、例えば、リン酸バッファー生理的食塩水、水、乳液、例えば、油／水または水／脂乳液、および種々のタイプの湿潤剤の内のいずれかを含む。本用語はさらに、ヒトを含む動物における使用に関して、米国連邦政府の規制当局によって承認されるか、または、米国薬局方に掲載されている、任意の薬剤を包含する。
【００５３】
本明細書で用いる「薬学的に受容可能な塩」という用語は、母体化合物の生物活性を保持するが、生物学的にもまたは他の点でも有害でない、化合物の塩を指す。本明細書に開示される化合物の多くは、アミノ基および／またはカルボキシル基、または、それと同様の基があるために、酸性および／または塩基性塩を形成することが可能である。
【００５４】
薬学的に受容可能な塩基添加塩は、無機および有機塩から調製することが可能である。無機塩から得られる塩としては、例示としてのみ述べると、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、およびマグネシウム塩が挙げられる。有機塩基から得られる塩としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、一級、二級、および三級アミンの塩が挙げられる。
【００５５】
薬学的に受容可能な酸添加塩は、無機および有機酸から調製されてもよい。無機酸から得られる塩としては、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。有機酸から得られる塩としては、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、シナモン酸、マンデル酸、メタンスルフォン酸、エタンスルフォン酸、ｐ−トルエンスルフォン酸、サリチル酸などが挙げられる。
【００５６】
本明細書で用いる「治療する」という用語は、特定の障害または病態の予防、または、特定の障害または病態に関連する症状の緩和、および／または、前記症状の防止または根絶を含む。例えば、本明細書で用いる「糖尿病を治療する」という用語は、一般に、血中のグルコースレベルを正常レベルに向けて変えることを指し、所定の状況に応じて血中のグルコースレベルを上昇または下降させることを含んでもよい。
【００５７】
本明細書で用いる、グルカゴンペプチドの「有効」な量、または「治療的有効量」とは、該ペプチドの、無害であるが、所望の作用を実現するのに十分な量を指す。例えば、所望の作用の一つとしては、例えば、血中グルコースレベルの増加によって測定される、低血糖症の予防または治療が考えられる。本開示のコアゴニスト類縁体の、別の所望の作用としては、例えば、血中グルコースレベルの正常により近づく変化によって測定される、高血糖症の治療、または、例えば、体重の低下によって測定される減量の誘導／体重増加の阻止、または、体重増加の阻止若しくは軽減、または、体脂肪分布の正常化が挙げられよう。「有効な」量は、被検体によってまちまちで、個体の年齢および一般的状態、投与方式などに応じて変動する。従って、正確な「有効量」を特定することは常に可能とは限らない。しかしながら、任意の個別の症例における適切な「有効」量は、当業者であれば、慣用的な実験手法によって定めることが可能である。
【００５８】
「非経口的」という用語は、消化管を介さず、何らかの別のルート、例えば、皮下、筋肉内、脊髄内、または静脈内によることを意味する。
【００５９】
本明細書で用いる「精製された」および同様の用語は、ある分子または化合物について、それが生まれた環境または天然の環境において通常それに付随するような汚染物を実質的含まない形になるように、該分子または化合物を単離することを指す。本明細書で用いる「精製」という用語は、絶対的純度を必要とせず、むしろ、相対的な定義であることが意図される。「精製ポリペプチド」という用語は、本明細書では、他の化合物、例えば、ただしこれらに限定されないが、核酸分子、脂質、および炭水化物、から分離されたポリペプチドを記載するのに用いられる。
【００６０】
「単離された」という用語は、参照される物質が、その元々の環境（例えば、それが天然産であれば、天然環境）から取り出されていることを必要とする。例えば、生きている動物の体内に存在する天然産ポリヌクレオチドは、単離されていないが、同じポリヌクレオチドが天然系において共存する物質のいくつかまたは全てから分離されていれば、単離されている。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド」は、３個以上のアミノ酸、典型的には５０個未満のアミノ酸の配列を包含し、ここでアミノ酸は、天然型または非天然型のアミノ酸である。非天然型のアミノ酸とは、インビボで天然に生じないが、それでも、本明細書に記載されるペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸を意味する。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸のポリマーを、ポリマーの長さに関わりなく意味するために、相互交換的に使用される用語である。典型的には、ポリペプチドおよびタンパク質は、「ペプチド」よりも長いポリマー長さを有する。
【００６３】
本明細書で用いる「グルカゴンペプチド」は、配列番号１のアミノ酸配列か、または、配列番号１のアミノ酸配列の類縁体であって、アミノ酸置換、付加、欠失、または翻訳後修飾（例えば、メチル化、アシル化、ユビキチン化、分子内共有結合、例えば、ラクタム架橋形成、ＰＥＧ化など）を含み、例えば実施例１６に記載するアッセイを用いてｃＡＭＰ生産により測定した場合、グルカゴンまたはＧＬＰ−１またはＧＩＰ受容体活性を刺激するような類縁体を含む、任意のペプチドを含む。
【００６４】
「グルカゴンアゴニスト」という用語は、例えば実施例１６に記載するアッセイを用いてｃＡＭＰ生産により測定した場合、グルカゴン受容体活性を刺激するようなグルカゴンペプチドを含む、複合体を指す。
【００６５】
本明細書で用いるアミノ酸「修飾」とは、アミノ酸の置換、付加、または欠失を指し、ヒトのタンパク質中に一般的に見出される２０種のアミノ酸、および、異型または非天然産アミノ酸の内の任意のアミノ酸による、置換または付加を含む。本明細書を通じて、数字による、ある特定アミノ酸位置への参照（例えば、位置２８）は、全て、天然グルカゴン（配列番号１）中のその位置におけるアミノ酸、または、天然グルカゴンの任意の類縁体中の、対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸を指す。例えば、本明細書における「位置２８」への参照は、配列番号１の最初のアミノ酸が欠失したグルカゴン類縁体では、対応する位置２７を意味する。同様に、本明細書における「位置２８」への参照は、配列番号１のＮ末端の前に１個のアミノ酸を付加されたグルカゴン類縁体では、対応する位置２９を意味する。異型アミノ酸の商業供給源には、Sigma-Aldrich（Milwaukee, WI）、ChemPep Inc.（Miami, FL）およびGenzyme Pharmaceuticals（Cambridge, MA）が含まれる。異型アミノ酸は、商業供給者から購入しても、新規に合成しても、または他のアミノ酸から化学的に修飾若しくは誘導体化してもよい。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、用語「天然グルカゴン」は、配列番号１の配列から構成されるペプチドを意味し、用語「天然ＧＩＰ」は、配列番号４の配列から構成されるペプチドを意味し、用語「天然ＧＬＰ−１」は、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド（配列番号３の配列から構成される）、ＧＬＰ−１（７−３７）酸（配列番号２の配列から構成される）、またはこれら２つの化合物の混合物、を示す一般的用語である。本明細書で使用されるとき、更なる名称が不在なときの「グルカゴン」または「ＧＩＰ」または「ＧＬＰ−１」への一般的な参照は、それぞれ天然グルカゴンまたは天然ＧＩＰまたは天然ＧＬＰ−１を意味することが意図される。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、アミノ酸「置換」は、１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に代えることを意味する。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、用語「保存的アミノ酸置換」は、本明細書において、以下の５つの群のうちの１つの群内での交換として定義される：
Ｉ．小型で脂肪族の非極性又は僅かに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の負荷電残基及びそれらのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、システイン酸及びホモシステイン酸；
ＩＩＩ．極性の正荷電残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）；
ＩＶ．大型で脂肪族の非極性残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン；
Ｖ．大型の芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、「ポリエチレングリコール鎖」又は「ＰＥＧ鎖」という総称は、一般式：Ｈ（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨ（ｎは９以上）により表される、分岐鎖又は直鎖の、エチレンオキシドと水の縮合ポリマーの混合物を意味する。更なる特定がない限り、この用語は、５００〜４０，０００ダルトンの範囲から選択される平均総分子量を有するエチレングリコールのポリマーを含むことが意図される。「ポリエチレングリコール鎖」又は「ＰＥＧ鎖」は、およその平均分子量を示す数字の接尾辞と組み合わせて使用される。例えば、ＰＥＧ−５，０００は、平均約５，０００の総分子量を有するポリエチレングリコールを意味する。
【００７０】
本明細書で使用するとき、用語「ペグ化」及び同様の用語は、ポリエチレングリコールポリマーを結合することにより、天然の状態から修飾された化合物を意味する。「ペグ化グルカゴンペプチド」は、共有結合しているＰＥＧ鎖を有するグルカゴンペプチドである。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、ペプチドに対する一般的な参照は、修飾されたアミノ末端及びカルボキシ末端を有するペプチドも包含することが意図される。例えば、末端カルボン酸の代わりにアミド基を含むアミノ酸鎖は、標準的なアミノ酸を示すアミノ酸配列に包含されることが意図される。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、「リンカー」は、２つの別々の実体を互いに結合する結合、分子、又は分子群である。リンカーは、２つの実体の間に最適な間隔をもたらしてもよいし、更に２つの実体が互いに分離することを可能にする不安定な結合を提供してもよい。不安定な結合には、光切断基、酸不安定部分、塩基不安定部分、及び酵素切断基が含まれる。
【００７３】
本明細書で使用されるとき「二量体」は、リンカーを介して互いに共有結合している２つのサブユニットを含む複合体である。二量体という用語は、意味を限定する言葉無しに使用される場合、ホモ二量体とヘテロ二量体の両方を包含する。ホモ二量体は、２つの同一のサブユニットを含み、一方、ヘテロ二量体は、互いに実質的に類似してはいるものの異なった２つのサブユニットを含む。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、用語「荷電アミノ酸」は、生理学的ｐＨの水溶液中で負に帯電（すなわち、脱プロトン化）している、又は正に帯電（すなわち、プロトン化）している側鎖を含むアミノ酸を意味する。例えば、負荷電アミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、及びホモグルタミン酸が含まれ、一方、正荷電アミノ酸には、アルギニン、リシン、及びヒスチジンが含まれる。荷電アミノ酸には、ヒトタンパク質において一般的に見出される２０個のアミノ酸に加え、異形又は非天然型のアミノ酸のうちの荷電アミノ酸も含まれる。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、用語「酸性アミノ酸」は、例えばカルボン酸又はスルホン酸基のような第２の酸性部分を含むアミノ酸を意味する。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、ある分子の、第２受容体と比べた第１受容体への「選択性」という用語は、以下の比：第２受容体に対するその分子のＥＣ５０を、第１受容体に対するその分子のＥＣ５０で割ったもの、を意味する。例えば、第１受容体に対するＥＣ５０が１ｎＭで第２受容体に対するＥＣ５０が１００ｎＭである分子は、第２受容体に比べて第１受容体に対して１００倍の選択性を有する。
【００７７】
本明細書で使用されるとき、ある分子の「グルカゴン効力」は、グルカゴン受容体に対するその分子のＥＣ５０をグルカゴン受容体に対する天然グルカゴンのＥＣ５０で割った比、を意味する。
【００７８】
本明細書で使用されるとき、ある分子の「ＧＩＰ効力」は、ＧＩＰ受容体に対するその分子のＥＣ５０をＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰのＥＣ５０で割った比、を意味する。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、ある分子の「ＧＬＰ−１効力」は、ＧＬＰ−１受容体に対するその分子のＥＣ５０をＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１のＥＣ５０で割った比、を意味する。
【００８０】
用語「アルキル」は、示された数の炭素原子を含有する、直鎖又は分岐鎖の炭化水素を意味する。例示的アルキルには、メチル、エチル及び直鎖プロピル基が含まれる。
【００８１】
用語「ヘテロアルキル」は、示された数の炭素原子、及び少なくとも１つのヘテロ原子を構造の主鎖に含有する、直鎖又は分岐鎖の炭化水素を意味する。本明細書の目的に適したヘテロ原子には、Ｎ、Ｓ、及びＯが含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
本明細書で使用されるとき、用途「シクロアルキル」は、示された数の炭素原子を含有する環状炭化水素基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシルおよびシクロペンチルを意味する。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、用語「複素環式」は、示された数の炭素原子と、酸素、窒素および硫黄から成る群から独立して選ばれる１〜３個のヘテロ原子とを含有する環状炭化水素基を意味する。ヘテロシクロアルキル基の非限定例には、ピペリジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ジヒドロフラン、モルホリン、チオフェンなどが挙げられる。
【００８４】
本明細書で使用されるとき、用語「アリール」は、示された数の炭素原子を含有する、単環式または多環式の芳香族基を意味し、好ましくは単環式または二環式芳香族基、例えばフェニルまたはナフチルを意味する。特に示されない限り、アリール基は非置換型であっても、置換されていてもよい。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロアリール」は、示された数の炭素原子と、酸素、窒素および硫黄から成る群から選ばれる少なくとも１個のヘテロ原子とを含有する単環式または多環式芳香族基を意味する。特に示されない限り、アリール基は非置換型であっても、置換されていてもよい。
【００８６】
〔実施態様〕
本明細書に開示される修飾は、グルカゴン（配列番号１）の操作によって、増加されたＧＩＰ活性、グルカゴン活性および／またはＧＬＰ−１活性を示すグルカゴンペプチドを作り出すことを可能にする。本明細書に開示される他の修飾は、得られるペプチドの半減期を延長する、溶解性を増加する、または安定性を増加する。本明細書に開示される更に他の修飾は、活性に対して何も効果を有さないか、または所望の活性（単数または複数）を破壊することなく実施することができる。同じ目的を果たす（例えば、ＧＩＰ活性を増加する）任意の組み合わせを、個別にまたは組み合わせて適用することができる。増強された特性を付与する単一または一連の組み合わせのいずれかを、個別にまたは組み合わせて適用することができ、例えば、ＧＩＰおよび／またはＧＬＰ−１活性の増加を、半減期の増加と組み合わせることができる。
【００８７】
例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドは、天然グルカゴン配列に対して合計で１個、２個まで、３個まで、４個まで、５個まで、６個まで、７個まで、８個まで、９個まで、又は１０個までの、アミノ酸修飾を含むことができる。幾つかの実施態様において、そのようなアミノ酸修飾は、天然グルカゴンの対応する位置の天然型アミノ酸のうちの少なくとも２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個を保持する（天然グルカゴンに対して例えば１〜７個、１〜５個、又は１〜３個の修飾を有する）。関連する実施態様において、アミノ酸修飾のうちの１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上は、非保存的な置換、付加、または欠失であってもよい。幾つかの実施態様において、アミノ酸修飾のうちの１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上は、保存的置換であってもよい。幾つかの実施態様において、１、２、３、４又は５個の非保存的置換が、位置２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、又は２９のいずれかにおいて実施され、５個までの更なる保存的置換が、これらの位置のいずれかにおいて実施される。幾つかの実施態様において、１、２、又は３個のアミノ酸修飾が位置１〜１６の範囲内のアミノ酸で実施され、１、２、又は３個のアミノ酸修飾が位置１７〜２６の範囲内のアミノ酸で実施される。
【００８８】
＜ＧＩＰ活性に影響を与える修飾＞
ＧＩＰ受容体に対して増強された活性は、位置１でのアミノ酸修飾によりもたらされる。例えば、位置１のＨｉｓは、大型の芳香族アミノ酸（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、アミノ−Ｐｈｅ、ニトロ−Ｐｈｅ、クロロ−Ｐｈｅ、スルホ−Ｐｈｅ、４−ピリジル−Ａｌａ、メチル−Ｔｙｒ、または３−アミノＴｙｒでもよい）で置換されている。予想外なことに、位置１のＴｙｒと、アミノ酸１２−２９に対応する領域内のアルファ−へリックスの安定化との組み合わせは、ＧＩＰ受容体、またＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体を活性化するグルカゴンプチドを提供する。アルファ−へリックス構造を、例えば共有若しくは非共有分子内架橋の形成によって、またはアルファ−へリックス安定化アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）による位置１２〜２９周辺のアミノ酸の置換および／若しくは挿入によって、安定化することができる。
【００８９】
ＧＩＰ受容体に対して増強された活性は、また、位置２７および／または２８のアミノ酸修飾によってもたらされ、更に位置２９のアミノ酸修飾によってもたらされてもよい。例えば、位置２７のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸（Ｌｅｕでもよい）で置換され、位置２８のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸（Ａｌａでもよい）で置換され、位置２９のＴｈｒは、小型の脂肪族アミノ酸（Ｇｌｙでもよい）で置換されている。ＬＡＧによる位置２７〜２９での置換は、これらの位置において天然型のＭＮＴ配列と比べて増加したＧＩＰ活性をもたらす。
【００９０】
ＧＩＰ受容体に対して増強された活性は、また、位置１２のアミノ酸修飾によりもたらされる。例えば、位置１２は、大型で脂肪族で非極性のアミノ酸（Ｉｌｅでもよい）で置換されている。
【００９１】
ＧＩＰ受容体に対して増強された活性は、また、位置１７および／または１８のアミノ酸修飾によりもたらされる。例えば、位置１７は、極性残基（Ｇｌｎでもよい）で置換され、位置１８は、小型の脂肪族アミノ酸（Ａｌａでもよい）で置換されている。ＱＡによる位置１７および１８での置換は、これらの位置において天然型のＲＲ配列に比べて増加したＧＩＰ活性をもたらす。
【００９２】
ＧＩＰ受容体活性を増加する上記に記載された修飾のいずれかを、個別にまたは組み合わせて適用することができる。ＧＩＰ受容体活性を増加する修飾の組み合わせは、一般に、単独で実施されるそのような修飾のいずれのものよりも高いＧＩＰ活性をもたらす。
【００９３】
＜グルカゴン活性に影響を与える修飾＞
幾つかの実施態様において、増強された効力を有し、更に向上した溶解性および安定性を有してもよい、グルカゴンの類縁体が提供される。一つの実施態様において、増強されたグルカゴン効力は、天然グルカゴン（配列番号１）の位置１６のアミノ酸修飾によりもたらされる。非限定例によると、そのような増強された効力は、位置１６の天然型のセリンを、グルタミン酸により置換する、または４原子の長さの側鎖を有する別の負に帯電したアミノ酸により置換する、あるいはグルタミン、ホモグルタミン酸若しくはホモシステイン酸のいずれかにより置換する、または少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含有し約４（若しくは３〜５）原子長さの側鎖を有する荷電アミノ酸により置換することによって、もたらすことができる。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、元々の、ＧＬＰ−１受容体と比べたグルカゴン受容体への選択性を保持する。
【００９４】
グルカゴン受容体活性は、位置３におけるアミノ酸修飾、例えば位置３の天然型のグルタミンの酸性、塩基性、又は疎水性アミノ酸による置換、により低減することができる。例えば、位置３のアミノ酸の、グルタミン酸、オルニチン、又はノルロイシンによる置換は、グルカゴン受容体活性を実質的に低減または破壊することが示されている。
【００９５】
ＧＬＰ−１受容体に対する活性の増強又は維持は、位置３のＧｌｎをグルタミン類縁体により置換することで達成できる。例えば、位置３にグルタミン類縁体を含むグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対する天然グルカゴン（配列番号１）の活性の約５％、約１０％、約２０％、約５０％、若しくは約８５％またはそれ以上の活性を示すことができる。幾つかの実施態様において、位置３にグルタミン類縁体を含むグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対する、位置３の修飾アミノ酸以外は、グルタミン類縁体を含むペプチドと同じアミノ酸配列を有するような対応するグルカゴンペプチド（例えば、配列番号２５０または配列番号２５１）のグルカゴン受容体に対する活性の、約２０％、約５０％、約７５％、約１００％、約２００％、若しくは約５００％またはそれ以上の活性を示すことができる。幾つかの実施態様において、位置３にグルタミン類縁体を含むグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対する増強された活性を示すが、増強された活性は、天然グルカゴンのまたは位置３の修飾アミノ酸以外は、グルタミン類縁体を含むペプチドと同じアミノ酸配列を有するような対応するグルカゴンペプチドの活性の、１０００％、１０，０００％、１００，０００％、または１，０００，０００％以下の活性である。
【００９６】
幾つかの実施態様において、グルタミン類縁体は、下記の構造Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ：
【化２】
2015164922.tif 000003
〔式中、Ｒ1は、Ｃ0-3アルキルまたはＣ0-3ヘテロアルキルであり；Ｒ2は、ＮＨＲ4またはＣ1-3アルキルであり；Ｒ3は、Ｃ1-3アルキルであり；Ｒ4は、ＨまたはＣ1-3アルキルであり；Ｘは、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり；そしてＹは、ＮＨＲ4、ＳＲ3、またはＯＲ3である〕で示される側鎖を含む、天然型のまたは非天然型のアミノ酸である。幾つかの実施態様において、Ｘは、ＮＨであるか、またはＹは、ＮＨＲ4である。幾つかの実施態様において、Ｒ1は、Ｃ0-2アルキルまたはＣ1ヘテロアルキルである。幾つかの実施態様において、Ｒ2は、ＮＨＲ4またはＣ1アルキルである。幾つかの実施態様において、Ｒ4は、ＨまたはＣ1アルキルである。例示的な実施態様において、構造Ｉの側鎖を含み、以下のいずれかが成り立つアミノ酸が提供される：Ｒ1はＣＨ2−Ｓであり、ＸはＮＨであり、そしてＲ2はＣＨ3である（アセトアミドメチル−システイン、Ｃ（Ａｃｍ））；Ｒ1はＣＨ2であり、ＸはＮＨであり、そしてＲ2はＣＨ3である（アセチルジアミノブタン酸、Ｄａｂ（Ａｃ））；Ｒ1はＣ0アルキルであり、ＸはＮＨであり、Ｒ2はＮＨＲ4であり、そしてＲ4はＨである（カルバモイルジアミノプロパン酸、Ｄａｐ（尿素））；または、Ｒ1はＣＨ2−ＣＨ2であり、ＸはＮＨであり、そしてＲ2はＣＨ3である（アセチルオルニチン、Ｏｍ（Ａｃ））。例示的な実施態様において、構造ＩＩの側鎖を含むアミノ酸が提供され、ここで、Ｒ1はＣＨ2であり、Ｙは、ＮＨＲ4であり、そしてＲ4は、ＣＨ3である（メチルグルタミン、Ｑ（Ｍｅ））。例示的な実施態様において、構造ＩＩＩの側鎖を含むアミノ酸が提供され、ここで、Ｒ1はＣＨ2であり、そしてＲ4は、Ｈである（メチオニン−スルホキシド、Ｍ（Ｏ））。特定の実施態様において、位置３のアミノ酸はＤａｂ（Ａｃ）により置換されている。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号２４３〜２４８、２５０、２５１、および２５３〜２５６のアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。
【００９７】
＜ＧＬＰ−１活性に影響を与える修飾＞
ＧＬＰ−１受容体に対する増強された活性は、また、例えば、２個のアミノ酸の側鎖の間の分子内架橋の形成を介して、またはアルファ−へリックス安定化アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）による位置１２〜２９周辺のアミノ酸置換および／若しくは挿入を介して、グルカゴンのＣ末端部分（アミノ酸１２−２９周辺）のアルファ−へリックス構造を安定化することによって、もたらされる。これらのアミノ酸の側鎖は、水素結合、または塩架橋の形成などのイオン相互作用、または共有結合を介して互いに結合することができる。幾つかの実施態様において、架橋は、３個の介在アミノ酸で隔てられているアミノ酸同士、すなわち位置「ｉ」のアミノ酸と位置「ｉ＋４」のアミノ酸との間に形成され、ここでｉは、１２〜２５（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５）の任意の整数である。例示的な実施態様において、アミノ酸対１２と１６、１３と１７、１６と２０、１７と２１、２０と２４、または２４と２８（ｉ＝１２、１６、２０また２４のアミノ酸対）の側鎖は、互いに結合しており、したがってグルカゴンのアルファ−へリックスを安定化する。
【００９８】
他の実施態様において、架橋は、２個の介在アミノ酸で隔てられているアミノ酸同士、すなわち位置「ｊ」のアミノ酸と位置「ｊ＋３」のアミノ酸との間に形成され、ここでｊは、１２〜２６（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６）の任意の整数である。例示的な実施態様において、ｊは１７である。更なる実施態様において、架橋は、６個の介在アミノ酸で隔てられているアミノ酸同士、すなわち位置「ｋ」のアミノ酸と位置「ｋ＋７」のアミノ酸との間に形成され、ここでｋは、１２〜２２（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２）の任意の整数である。一つの実施態様において、ｋは１７である。
【００９９】
幾つかの実施態様において、架橋またはリンカーは、特に架橋が位置ｉおよびｉ＋４の間にある場合、約８（または７〜９）原子長である。幾つかの実施態様において、架橋またはリンカーは、特に架橋が位置ｊおよびｊ＋３の間にある場合、約６（または５〜７）原子長である。
【０１００】
幾つかの実施態様において、分子内架橋は、（ａ）グルタミン酸による、または４原子長の側鎖を有する別の負に帯電したアミノ酸による、あるいはグルタミン、ホモグルタミン酸若しくはホモシステイン酸のうちの１つによる、または、少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含有し約４（若しくは３〜５）原子長の側鎖を有するような荷電アミノ酸による、位置１６の天然型のセリンの置換、ならびに（ｂ）帯電しているか、または水素結合の能力を有し、少なくとも約５（または４〜６）原子長の側鎖を有する別の親水性アミノ酸、例えば、リシン、シトルリン、アルギニンまたはオルニチンによる、位置２０の天然型のグルタミンの置換によって、形成される。位置１６および２０のそのようなアミノ酸の側鎖は、塩架橋を形成することができるか、または共有結合することができる。
【０１０１】
一つの実施態様において、２つのアミノ酸は、互いに結合してラクタム環を形成する。ラクタム環の大きさは、アミノ酸の側鎖の長さに応じて変わることができ、一つの実施態様において、ラクタムは、リシンアミノ酸の側鎖をグルタミン酸の側鎖に結合することによって形成される。ラクタム環におけるアミド結合の順番を逆転することができる（例えば、ラクタム環を、Ｌｙｓ１２とＧｌｕ１６の側鎖、あるいはＧｌｕ１２とＬｙｓ１６の側鎖の間に形成することができる）。
【０１０２】
幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドのＣ末端部分におけるアルファ−へリックス構造の安定化は、ラクタム架橋以外の分子内架橋の形成によって達成される。例えば、適切な共有結合方法には、オレフィンメタセシス、ランチオニンに基づいた環化、ジスルフィド架橋または改質硫黄含有架橋形成、α，ω−ジアミノアルカン鎖の使用、金属原子架橋の形成、ペプチド環化の他の方法、のいずれかの１つ以上が含まれ、これらがアルファ−へリックスの安定化のために使用される。
【０１０３】
ＧＬＰ−１受容体に対する効力を、位置１８の天然アルギニンのアラニン置換により更に増強することができる。
【０１０４】
ＧＬＰ−１受容体活性を増加する上記に記載された修飾のいずれかも、個別にまたは組み合わせて適用することができる。ＧＬＰ−１受容体活性を増加する修飾の組み合わせは、一般に、単独で実施されるそのような修飾のいずれのものよりも高いＧＬＰ−１活性をもたらす。例えば、本発明は、、位置１６、位置２０およびＣ末端カルボン酸基に修飾を含むグルカゴンペプチド（更に、位置１６と位置２０のアミノ酸の間に共有結合を有してもよい）；位置１６およびＣ末端カルボン酸基に修飾を含むグルカゴンペプチド；位置１６および位置２０に修飾を含むグルカゴンペプチド（更に、位置１６と位置２０のアミノ酸の間に共有結合を有してもよい）；ならびに位置２０およびＣ末端カルボン酸基に修飾を含むグルカゴンペプチド、を提供する。
【０１０５】
ＧＬＰ−１活性は、（ｉ）Ｃ末端アルファカルボキシレート基、（ｉｉ）ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸、例えばＡｂｕ若しくはＩｌｅによる、位置７のＴｈｒの置換、（ｉｉｉ）２７若しくは２８アミノ酸長のペプチドを生じる、位置２７若しくは２８のアミノ酸のＣ末端側のアミノ酸（複数若しくは単数）の欠失（例えば、位置２８のアミノ酸の欠失、位置２８および２９のアミノ酸の欠失）、または（ｉｖ）これらの組み合わせ、のいずれかを含むことにより、低減することができる。
【０１０６】
＜グルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体のそれぞれに対する活性に影響を与える修飾＞
グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体およびＧＩＰ受容体のそれぞれに対して増強された活性は、（ｉ）式ＩＶ：
【化３】
2015164922.tif 000004
〔式中、ｎは、１〜１６または１〜１０または１〜７または１〜６または２〜６または２若しくは３若しくは４若しくは５であり、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ2〜Ｃ5複素環式）、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ6〜Ｃ10アリール）Ｒ7および（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ9ヘテロアリール）から成る群から独立して選ばれ、Ｒ7は、ＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は、遊離アミノ基を含む〕で示されるアミノ酸による、位置１６のＳｅｒのアミノ酸置換、ならびに（ｉｉ）アルファ，アルファ二置換アミノ酸、例えばＡＩＢによる、位置２０のＧｌｎのアミノ酸置換によって、もたらされる。幾つかの実施態様において、位置１６のアミノ酸はＯｒｎ、Ｄａｂ、ＬｙｓまたはホモＬｙｓであり、位置２０のアミノ酸はＡＩＢである。特定の実施態様において、位置１６のアミノ酸はＬｙｓであり、位置２０のアミノ酸はＡＩＢである。
【０１０７】
位置１６に式ＩＶのアミノ酸および位置２０にアルファ，アルファ二置換アミノ酸を含む類縁体のグルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体のそれぞれに対する活性は、ペプチドの長さを延長することにより、例えば約１〜２１、約９〜２１、約６〜１８、約９〜１２または約１０若しくは１１アミノ酸長さのＣ末端延長ペプチドに、例えば融合することにより、更に増強することができる。幾つかの実施態様において、Ｃ末端は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９６）への融合により延長され、ここでＸは、Ｇｌｙまたは小型の脂肪族若しくは非極性若しくは僅かに極性のアミノ酸である。代替的な実施態様において、Ｃ末端は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）への融合により延長され、１〜１１個のアミノ酸が、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）のＣ末端に融合される。例えば、類縁体のＣ末端延長部は、ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）を、続いて配列番号９５のＣ末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個の付加アミノ酸を含むことができる。１〜１１個の付加アミノ酸は、例えば、Ａｌａなどの小型の脂肪族アミノ酸であることができる。この点において、Ｃ末端延長部は、例えば、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＡmのアミノ酸配列を含むことができ、ここでｍは１〜１１である。
【０１０８】
位置１６に式ＩＶのアミノ酸および位置２０にアルファ，アルファ二置換アミノ酸を含む類縁体が含まれる、ＧＩＰ活性がありグルカゴンに基づいている類縁体の、グルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体のそれぞれに対する活性の増強を、Ｃ末端延長部内に配置されているアミノ酸またはＣ末端アミノ酸（例えば、Ｃ末端延長部のＣ末端に付加されたアミノ酸）のアシル化またはアルキル化によって、更に達成することができる。アシル化またはアルキル化は、例えば、Ｃ末端延長類縁体の位置３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０のいずれかに配置されているアミノ酸において行うことができる。幾つかの実施態様において、アシル化またはアルキル化されるアミノ酸は、Ｃ末端延長類縁体の位置３７、３８、３９、４０、４１、４２または４３に配置されている。幾つかの実施態様において、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのアミノ酸であり、例えば、アシルまたはアルキル基に、例えばＣ１０〜Ｃ２２に結合している、Ｌｙｓである。特定の実施態様において、Ｌｙｓは、配列番号９５から構成されるＣ末端延長部のＣ末端に配置されており、そのためにＬｙｓ、Ｄａｂ、ＯｒｎまたはホモＬｙｓは類縁体の位置４０に配置される。更に、Ｃ末端延長ペプチドは、本明細書に記載される位置のいずれか（例えば、位置２４）でペグ化もされていてもよい。
【０１０９】
ＧＩＰ活性がありグルカゴンに基づいている類縁体の、グルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体のそれぞれに対する活性の増強は、スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能スペーサー、疎水性二官能スペーサー）を介するアミノ酸のアシル化またはアルキル化によって、更に達成することができる。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ活性がありグルカゴンに基づいている類縁体は、スペーサーを介してアシルまたはアルキル基を含み、ここでスペーサーは、類縁体の位置１０のアミノ酸の側鎖に結合している。他の実施態様において、類縁体は、位置２９のアミノ酸のＣ末端側への１〜２１個のアミノ酸のＣ末端延長部（例えば、配列番号９５または９６のアミノ酸配列を含む延長部）を含み、アシルまたはアルキル基に共有結合しているスペーサーは、配列番号１の位置３７〜４３の１つに対応する位置で延長部のアミノ酸に結合している。特定の実施態様において、スペーサーは、配列番号１に対して位置４０のアミノ酸に結合している。特定の実施態様において、スペーサーは３〜１０原子長である。特定の態様において、スペーサーとアシルまたはアルキル基との全長は、約１４〜約２８原子長である。例えば、スペーサーは、本明細書に記載されるいずれかが含まれるが、これらに限定されないアミノ酸であることができる。また、例えば、スペーサーは、本明細書に記載されるアミノ酸を含むジペプチドまたはトリペプチドであることができる。スペーサーは、特定の態様において、次のジペプチド：Ａｌａ−Ａｌａ、βＡｌａ−βＡｌａまたはγＧｌｕ−γＧｌｕ、のうちの１つである。グルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体の１つ以上に対して活性を増加する目的に適した追加的なスペーサーは、本明細書において更に記載される。
【０１１０】
＜ＤＰＰ−ＩＶ耐性を向上させる修飾＞
位置１および／または２の修飾は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）切断に対するペプチドの耐性を増加することができる。例えば、位置２のアミノ酸は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、またはアミノイソ酪酸で置換されていることができる。幾つかの実施態様において、位置１のアミノ酸は、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、またはアルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）で置換されていることができる。
【０１１１】
位置２の修飾（例えば、位置２のＡＩＢ）および幾つかの場合において、位置１の修飾（例えば、位置１のＤＭＩＡ）は、グルカゴン活性を（時には顕著に）低減できることが観察された、驚くべきことに、本明細書に記載されているように、このグルカゴン活性の低減は、グルカゴンのＣ末端部分（アミノ酸１２−２９周辺）におけるアルファ−へリックス構造を、例えば２個のアミノ酸の側鎖の間の共有結合の形成を介して安定化することによって回復できる。幾つかの実施態様において、共有結合は、位置「ｉ」と「ｉ＋４」、または位置「ｊ」と「ｊ＋３」のアミノ酸の間、例えば位置１２と１６、１６と２０、２０と２４、２４と２８、または１７と２０の間にある。例示的な実施態様において、この共有結合は、位置１６のグルタミン酸と位置２０のリシンとの間のラクタム架橋である。幾つかの実施態様において、この共有結合は、ラクタム架橋以外の分子内架橋である。例えば、適切な共有結合方法（すなわち、共有分子内架橋を形成する方法）には、オレフィンメタセシス、ランチオニンに基づいた環化、ジスルフィド架橋または改質硫黄含有架橋形成、α，ω−ジアミノアルカン鎖の使用、金属原子架橋の形成およびペプチド環化の他の方法、のいずれかの１つ以上が含まれる。
【０１１２】
＜分解を低減する修飾＞
なお更なる例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドのいずれかを、配列番号１の位置１５および／または１６のアミノ酸を修飾して、特に酸性またはアルカリ性の緩衝液におけるペプチドの経時的な分解を低減することによって更に修飾して、その安定性を向上させることができる。そのような修飾は、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６のペプチド結合の切断を低減する。例示的な実施態様において、位置１５のアミノ酸修飾は、Ａｓｐの欠失、または、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、若しくはホモシステイン酸によるＡｓｐの置換である。他の例示的な実施態様において、位置１６のアミノ酸修飾は、Ｓｅｒの欠失、またはＴｈｒ若しくはＡＩＢによるＳｅｒの置換である。他の例示的な実施態様において、位置１６のＳｅｒは、グルタミン酸により、または４原子長の側鎖を有する別の負に帯電したアミノ酸により、あるいはグルタミン、ホモグルタミン酸またホモシステイン酸のいずれかにより、置換されている。
【０１１３】
幾つかの実施態様において、天然ペプチドの位置２７に存在するメチオニン残基は、例えば欠失または置換により修飾される。そのような修飾は、ペプチドの酸化分解を防止することができる。幾つかの実施態様において、位置２７のＭｅｔは、ロイシン、イソロイシンまたはノルロイシンで置換されている。幾つかの特定の実施態様において、位置２７のＭｅｔは、ロイシンまたはノルロイシンで置換されている。
【０１１４】
幾つかの実施態様において、位置２０および／または２４のＧｌｎは、例えば欠失または置換により修飾される。そのような修飾は、Ｇｌｎの脱アミド化を介して生じる分解を低減することができる。幾つかの実施態様において、位置２０および／または２４のＧｌｎは、ＡｌａまたはＡＩＢで置換されている。幾つかの実施態様において、位置２０および／または２４のＧｌｎは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎまたはシトルリンで置換されている。
【０１１５】
幾つかの実施態様において、位置２１のＡｓｐは、例えば欠失または置換により修飾される。そのような修飾は、Ａｓｐの脱水により環状スクシンイミド中間体を形成し、続く異性化によりイソアスパラギン酸塩を形成することによって生じる分解を低減することができる。幾つかの実施態様において、位置２１は、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸で置換されている。幾つかの実施態様において、位置２１はＧｌｕで置換されている。
【０１１６】
＜他の修飾＞
天然グルカゴンペプチドの幾つかの位置を、母体となるペプチドの少なくとも幾つかの活性を保持しつつ、修飾することができる。したがって、出願者たちは、位置２、５、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８または２９に配置された１個以上のアミノ酸を、天然グルカゴンペプチドに存在するものと異なるアミノ酸で置換し、グルカゴン受容体に対して依然として活性を保持することができると予測する。
【０１１７】
幾つかの実施態様において、位置１８は、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒから成る群から選ばれるアミノ酸で置換されている。幾つかの実施態様において、位置２０のアミノ酸は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、シトルリンまたはＡＩＢで置換されている。幾つかの実施態様において、位置２１は、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸で置換されている。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、位置１６、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７、２８および２９から選ばれる１〜１０個のアミノ酸修飾を含む。例示的な実施態様において、修飾は、Ｇｌｎ１７、Ａｌａｌ８、Ｇｌｕ２１、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２４、Ｖａｌ２７およびＧｌｙ２９から成る群から選ばれる１個以上のアミノ酸置換である。幾つかの実施態様において、位置１７〜２６から選ばれる１〜２個のアミノ酸は、母体ペプチドと異なる。他の実施態様において、位置１７〜２２から選ばれる１〜２個のアミノ酸は、母体ペプチドと異なる。更に他の実施態様において、修飾は、Ｇｌｎ１７、Ａｌａ１８、Ｇｌｕ２１、Ｉｌｅ２３およびＡｌａ２４である。
【０１１８】
幾つかの実施態様において、１個以上のアミノ酸がグルカゴンペプチドのカルボキシ末端に付加されている。アミノ酸は、典型的には、２０個の通常のアミノ酸の１つから選ばれ、幾つかの実施態様において、アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸の代わりにアミド基を有する。例示的な実施態様において、付加アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸およびグリシンから成る群から選ばれる。
【０１１９】
活性を破壊しない他の修飾は、Ｗ１０またはＲ２０を含む。
【０１２０】
幾つかの実施態様において、本明細書に開示されているグルカゴンペプチドは、１または２個のアミノ酸残基によるＣ末端の切断により修飾され、それでもなお、グルカゴン、ＧＬＰ−１および／またはＧＩＰ受容体に対して同様の活性および効力を保持する。この点において、位置２９および／または２８のアミノ酸を欠失することができる。
【０１２１】
グルカゴンペプチドのＣ末端部分（アミノ酸位置１２〜２９付近）におけるアルファ−へリックス構造の安定化は、ＧＬＰ−１及び／又はＧＩＰ活性の増強、並びに、位置１及び／又は２でのアミノ酸修飾により低減されたグルカゴン活性の回復をもたらす。アルファ−へリックス構造は、例えば共有若しくは非共有分子内架橋の形成によって、又はアルファ−へリックス安定化アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）による位置１２〜２９付近のアミノ酸の置換及び／若しくは挿入によって、安定化することができる。
【０１２２】
幾つかの実施態様において、分子内架橋が２つのアミノ酸側鎖の間に形成されて、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端部分（例えば、アミノ酸１２〜２９）の三次元構造を安定化する。２つのアミノ酸側鎖は、非共有結合、例えば水素結合、塩架橋の形成のようなイオン相互作用を介して、又は共有結合により、互いに結合することができる。２つのアミノ酸側鎖が１つ以上の共有結合を介して互いに結合している場合、本明細書において、ペプチドは共有分子内架橋を含んでいると考慮することができる。２つのアミノ酸側鎖が非共有結合、例えば水素結合、イオン相互作用を介して互いに結合している場合、本明細書において、ペプチドは非共有分子内架橋を含んでいると考慮することができる。
【０１２３】
幾つかの実施態様において、分子内架橋は、３個のアミノ酸で離れている２個のアミノ酸、例えばｉとｉ＋４の位置のアミノ酸の間に形成され、ここでｉは、１２〜２５の間の任意の整数（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４及び２５）である。より詳細には、アミノ酸対の１２と１６、１６と２０、２０と２４、又は、２４と２８（ｉ＝１２、１６、２０、又は２４であるようなアミノ酸対）の側鎖は、互いに結合しており、したがってグルカゴンアルファ−へリックスを安定化する。代替的には、ｉは１７であることができる。
【０１２４】
幾つかの特定の実施態様において、ｉとｉ＋４の位置のアミノ酸が分子内架橋で結合している場合、リンカーの大きさは、約８個の原子又は約７〜９個の原子である。
【０１２５】
他の実施態様において、分子内架橋は、２個のアミノ酸で離れている２個のアミノ酸、例えばｊとｊ＋３の位置のアミノ酸の間に形成され、ここでｊは、１２〜２６の間の任意の整数（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、及び２６）である。幾つかの特定の実施態様において、ｊは１７である。
【０１２６】
幾つかの特定の実施態様において、ｊとｊ＋３の位置のアミノ酸が分子内架橋で結合している場合、リンカーの大きさは、約６個の原子又は約５〜７個の原子である。
【０１２７】
さらに他の実施態様において、分子内架橋は、６個のアミノ酸で離れている２個のアミノ酸、例えばｋとｋ＋７の位置のアミノ酸の間に形成され、ここでｋは、１２〜２２の間の任意の整数（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、及び２２）である。幾つかの特定の実施態様において、ｋは、１２、１３又は１７である。例示的な実施態様において、ｋは１７である。
【０１２８】
共有結合して６原子結合架橋を形成することができるアミノ酸対形成の例には、ＯｒｎとＡｓｐ、Ｇｌｕと式Ｉ（式中、ｎは２である）のアミノ酸、及び、ホモグルタミン酸と式Ｉ（式中、ｎは１である）のアミノ酸、が挙げられ、ここで、式Ｉは下記である：
【化４】
2015164922.tif 000005
【０１２９】
共有結合して７原子結合架橋を形成することができるアミノ酸対形成の例には、Ｏｒｎ−Ｇｌｕ（ラクタム環）、Ｌｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）、又は、ホモＳｅｒ−ホモＧｌｕ（ラクトン）、が挙げられる。８原子リンカーを形成することができるアミノ酸対形成の例には、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）、ホモＬｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）、Ｏｒｎ−ホモＧｌｕ（ラクタム）、４−アミノＰｈｅ−Ａｓｐ（ラクタム）、又はＴｙｒ−Ａｓｐ（ラクトン）、が挙げられる。９原子リンカーを形成することができるアミノ酸対形成の例には、ホモＬｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）、Ｌｙｓ−ホモＧｌｕ（ラクタム）、４−アミノＰｈｅ−Ｇｌｕ（ラクタム）、又はＴｙｒ−Ｇｌｕ（ラクトン）、が挙げられる。これらのアミノ酸の側鎖のいずれも、アルファ−へリックスの三次元構造が妨げられない限り、追加的な化学基で更に置換することができる。当業者であれば、同様の大きさ及び所望の効果の構造の安定化を作り出すような、代替的な対形成又は化学的に修飾された誘導体を含む代替的なアミノ酸類縁体を着想することができる。例えば、ホモシステイン−ホモシステインジスルフィド架橋は、長さが６個の原子であり、更に修飾して所望の効果をもたらすことができる。共有結合がなくても、上記に記載されたアミノ酸対形成又は当業者が想像できる同様の対形成も、非共有結合を介して、例えば塩架橋の形成又は水素結合相互作用を介して、アルファ−へリックスに追加的な安定性をもたらすことができる。
【０１３０】
ラクタム環の大きさは、アミノ酸の側鎖の長さに応じて変わることができ、一つの実施態様において、ラクタムは、リシンアミノ酸の側鎖をグルタミン酸の側鎖に結合することによって形成される。更なる例示的な実施態様は、以下の対形成を含み、これらはラクタム架橋による対形成であってもよい：位置１２のＧｌｕと位置１６のＬｙｓ；位置１２の天然Ｌｙｓと位置１６のＧｌｕ；位置１６のＧｌｕと位置２０のＬｙｓ；位置１６のＬｙｓと位置２０のＧｌｕ；位置２０のＧｌｕと位置２４のＬｙｓ；位置２０のＬｙｓと位置２４のＧｌｕ；位置２４のＧｌｕと位置２８のＬｙｓ；位置２４のＬｙｓと位置２８のＧｌｕ。あるいは、ラクタム環におけるアミド結合の順番を逆転することができる（例えば、ラクタム環を、Ｌｙｓ１２とＧｌｕ１６の側鎖、あるいはＧｌｕ１２とＬｙｓ１６の側鎖の間に形成することができる）。
【０１３１】
ラクタム架橋以外の分子内架橋を使用して、グルカゴン類縁体ペプチドのアルファ−へリックスを安定化することができる。一つの実施態様において、分子内架橋は疎水性架橋である。この場合、分子内架橋は、グルカゴン類縁体ペプチドのアルファ−へリックスの疎水性面の部分である２個のアミノ酸の側鎖の間にあってもよい。例えば、疎水性架橋により結合しているアミノ酸のうちの１個は、位置１０、１４、及び１８のアミノ酸であることができる。
【０１３２】
一つの特定の態様において、全炭化水素架橋系を使用してグルカゴンペプチドのアルファ−へリックスの１又は２巻きを架橋するために、オレフィンメタセシスが用いられる。この場合、グルカゴンペプチドは、多様な長さのオレフィン性側鎖を有し、Ｒ又はＳ立体化学のいずれかに配置されているα−メチル化アミノ酸を、ｉの位置とｉ＋４又はｉ＋７の位置とに含むことができる。例えば、オレフィン性側鎖は（ＣＨ2）ｎを含むことができ、ここでｎは、１〜６の任意の整数である。一つの実施態様において、架橋長さが８個の原子では、ｎは３である。そのような分子内架橋を形成する適切な方法は、当該技術において記載されている。例えば、Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000)及びWalensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004)を参照すること。あるいは、グルカゴンペプチドは、ヘリックスの隣接する２巻きに配置されている２つのＯ−アリルＳｅｒ残基を含むことができ、これらはルテニウム触媒閉環メタセシスを介して互いに架橋されている。そのような架橋の手順は、例えばBlackwell et al., Angew, Chem., Int. Ed. 37: 3281-3284 (1998)に記載されている。
【０１３３】
別の特定の態様において、システインのペプチド模倣体として広く採用されている、非天然チオ−ジアラニンアミノ酸であるランチオニンを、アルファ−へリックスの１巻きを架橋するために使用する。ランチオニンに基づく環化の適切な方法は、当該技術において知られている。例えば、Matteucci et al., Tetrahedron Letters 45: 1399-1401 (2004); Mayer et al., J. Peptide Res. 51: 432-436 (1998); Polinsky et al., J. Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992); Osapay et al., Ｊ. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997); Fukase et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 65: 2227-2240 (1992); Harpp et al., J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971); Goodman and Shao, Pure Appl. Chem. 68: 1303-1308 (1996);及びOsapay and Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600 (1993)を参照すること。
【０１３４】
幾つかの実施態様において、位置ｉとｉ＋７の２つのＧｌｕ残基の間のα，ω−ジアミノアルカン鎖（例えば１，４−ジアミノプロパンや１，５−ジアミノペンタン）を使用して、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスを安定化する。そのようなジアミノアルカン鎖は、鎖の長さに応じて、９原子又はそれ以上の長さの架橋の形成をもたらす。そのような鎖で架橋されたペプチドを産生する適切な方法は、当該技術において記載されている。例えば、Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 455-460 (1997)を参照すること。
【０１３５】
本発明の更に別の実施態様において、ジスルフィド架橋を使用して、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスの１又は２巻きを架橋する。あるいは、一方又は両方の硫黄原子がメチレン基に代えられて等配電子マクロ環化をもたらしている修飾ジスルフィド結合を使用して、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスを安定化する。ジスルフィド架橋又は硫黄に基づく環化により修飾する適切な方法は、例えば、Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 9391-9392 (1991)及びRudinger and Jost, Experientia 20: 570-571 (1964)に記載されている。
【０１３６】
更に別の実施態様において、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスは、ｉとｉ＋４に位置する２つのＨｉｓ残基又はＨｉｓとＣｙｓの対による、金属原子の結合を介して安定化される。金属原子は、例えば、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、又はＣｄ（ＩＩ）であることができる。そのような金属結合に基づいたアルファ−へリックス安定化の方法は、当該技術において知られている。例えば、Andrews and Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743 (1999); Ghadiri et al., Ｊ. Am. Chem. Soc. 112: 1630-1632 (1990);及びGhadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 9063-9064 (1997)を参照すること。
【０１３７】
グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスは、代替的には他のペプチド環化の方法により安定化することもでき、その方法は、Davies, J. Peptide. Sci. 9: 471-501 (2003)により検討されている。アルファ−へリックスは、アミド架橋、チオエーテル架橋、チオエステル架橋、尿素架橋、カルバメート架橋、スルホンアミド架橋などの形成を介して、安定化することができる。例えば、チオエステル架橋を、Ｃ末端とＣｙｓ残基の側鎖との間に形成することができる。あるいは、チオエステルを、チオールを有するアミノ酸（Ｃｙｓ）及びカルボン酸を有するアミノ酸（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の側鎖を介して形成することができる。別の方法において、ジカルボン酸、例えばスベリン酸（オクタン二酸）などのような架橋剤は、遊離アミン、ヒドロキシル、チオール基、及びこれらの組み合わせのような、アミノ酸側鎖の２つの官能基の間に結合を導入することができる。
【０１３８】
一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスは、ｉとｉ＋４の位置への疎水性アミノ酸の組み込みを介して安定化される。例えば、ｉはＴｙｒであることができ、そしてｉ＋４はＶａｌ又はＬｅｕであることができる；ｉはＰｈｅであることができ、そしてｉ＋４はＣｙｓ又はＭｅｔであることができる；ｉはＣｙｓであることができ、そしてｉ＋４はＭｅｔであることができる；或いはｉはＰｈｅであることができ、そしてｉ＋４はＩｌｅであることができる。本明細書の目的のために、上記のアミノ酸対形成を逆転することができ、これにより位置ｉの示されたアミノ酸を代替的にｉ＋４の位置に配置することができ、一方、位置ｉ＋４のアミノ酸をｉに配置することができることが理解されるべきである。
【０１３９】
本発明の他の実施態様によると、アルファ−へリックスは、グルカゴンペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９あたり）に１個以上のアルファ−へリックス安定化アミノ酸を（アミノ酸の置換又は挿入のいずれかにより）組み込むことを介して安定化される。特定の実施態様において、アルファ−へリックス安定化アミノ酸は、α，α−二置換アミノ酸であり、その例として、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）や、メチル、エチル、プロピル、及びｎ−ブチルから選択される同一若しくは異なる基により二置換されているアミノ酸や、シクロオクタン若しくはシクロヘプタンにより二置換されているアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドの位置１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、又は２９のうちの１、２、３、４つ又はそれ以上は、α，α−二置換アミノ酸で置換されている。特定の実施態様において、位置１６、２０、２１及び２４のうちの１、２、３つ又は全ては、ＡＩＢで置換されている。例えば、グルカゴンペプチドは、分子内架橋、例えば非共有分子内架橋（例えば、塩架橋）又は共有分子内架橋（例えば、ラクタム）の不在下で、ＡＩＢによる位置１６での置換を含むことができる。有利なことに、分子内架橋を欠いているそのようなペプチドは調製が容易である。
【０１４０】
幾つかの実施態様によると、分子内架橋を欠いているグルカゴンペプチドは、アミノ酸位置１２〜２９の範囲において、α，α−二置換アミノ酸による１つ以上の置換と、グルカゴンペプチドのアミノ酸、例えばグルカゴンペプチドの位置１０のアミノ酸、の側鎖に共有結合しているアシル又はアルキル基とを含む。特定の実施態様において、アシル又はアルキル基は、天然型のアミノ酸に対して非天然型である。特定の態様において、アシル又はアルキル基は、位置１０のアミノ酸に対して非天然型である。分子内架橋を欠いているそのようなアシル化又はアルキル化グルカゴンペプチドは、非アシル化対応ペプチドの活性と比較して、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対して増強された活性を示す。ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性の更なる増強は、分子内架橋を欠いているアシル化グルカゴンペプチドにおいて、スペーサーをアシル又はアルキル基とペプチドの位置１０のアミノ酸の側鎖との間に組み込むことによって達成することができる。アシル化及びアルキル化は、スペーサーの組み込みを伴う場合も伴わない場合も、本明細書において更に記載されている。
【０１４１】
特定の実施態様において、アシル化若しくはアルキル化グルカゴンペプチド又はその類縁体は、更に、ＧＬＰ−１受容体に対する活性を選択的に減少する修飾を含む。例えば、アシル化若しくはアルキル化グルカゴンペプチド又はその類縁体は、以下のうちの１つ又は組み合わせを含む：Ｃ末端アルファカルボキシレート、位置２７又は２８のＣ末端側のアミノ酸のアミノ酸の欠失（例えば、位置２９のアミノ酸の、欠失、位置２８及び２９のアミノ酸の欠失）、大型で脂肪族で非極性のアミノ酸、例えばＩｌｅによる、位置７のＴｈｒの置換。
【０１４２】
幾つかの実施態様において、位置１６または位置２０は、α，α−二置換アミノ酸、例えばＡＩＢで置換されている。幾つかの実施態様において、位置２０は、α，α−二置換アミノ酸、例えばＡＩＢで置換されている。特定の実施態様において、位置２０は、α，α−二置換アミノ酸、例えばＡＩＢで置換され、位置１６は、式ＩＶ：
【化５】
2015164922.tif 000006
〔式中、ｎは、１〜１６または１〜１０または１〜７または１〜６または２〜６または２若しくは３若しくは４若しくは５であり、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ2〜Ｃ5複素環式）、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ6〜Ｃ10アリール）Ｒ7および（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ9ヘテロアリール）から成る群から独立して選ばれ、Ｒ7は、ＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は、遊離アミノ基を含む〕で示されるアミノ酸により置換されている。特定の実施態様において、式ＩＶのアミノ酸は、２，３−ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）、２，４−ジアミノ酪酸（ＤＡＢ）、Ｏｒｎ、ＬｙｓまたはホモＬｙｓである。位置１６の式ＩＶのアミノ酸とアルファ，アルファ二置換アミノ酸の組み合わせは、有利には、グルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体のそれぞれに対して改善された活性をもたらす。
【０１４３】
＜親水性部分の結合＞
別の実施態様において、本明細書に開示されているグルカゴンペプチドの溶解性は、ペプチドへの親水性部分の共有結合により増強される。親水性部分を、タンパク質と活性化ポリマー分子との反応に使用される任意の適切な条件下でグルカゴンペプチドに結合することができる。アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化またはＰＥＧ部分の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミドまたはヒドラジノ基）と標的化合物の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミドまたはヒドラジノ基）との他の化学選択的結合／連結方法を含む、当該技術において既知のあらゆる方法を使用することができる。水溶性ポリマーを１つ以上のタンパク質に結合するのに使用できる活性化基には、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、５−ピリジルおよびアルファ−ハロゲン化アシル基（例えば、アルファ−ヨード酢酸、アルファ−ブロモ酢酸、アルファ−クロロ酢酸）が含まれるが、これらに限定されない。還元的アルキル化によりペプチドに結合する場合、選ばれるポリマーは、重合の程度が制御されるように単一の反応性アルデヒドを有するべきである。例えば、Kinstler et al., Adv. Drug.Delivery Rev. 54: 477-485 (2002)；Roberts et al., Adv.Drug Delivery Rev.54: 459-476 (2002)、およびZalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182(1995)を参照すること。
【０１４４】
本発明の特定の態様において、チオールを有するグルカゴンペプチドのアミノ酸残基は、ＰＥＧのような親水性部分で修飾されている。幾つかの実施態様において、チオールはマイケル付加反応においてマレイミド活性化ＰＥＧで修飾され、下記に示されるチオエーテル結合を含むペグ化ペプチドをもたらす。
【化６】
2015164922.tif 000007
【０１４５】
幾つかの実施態様において、チオールは核酸置換反応においてハロアセチル活性化ＰＥＧで修飾され、下記に示されるチオエーテル結合を含むペグ化ペプチドをもたらす。
【化７】
2015164922.tif 000008
【０１４６】
適切な親水性部分には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えば、ＰＯＧ）、ポリオキシエチレン化ソルビトール、ポリオキシエチレン化グルコース、ポリオキシエチレン化グリセロール（ＰＯＧ）、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングルコールプロピオンアルデヒド、エチレングルコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（ベータ−アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）および他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、コロン酸または他の多糖ポリマー、フィコールまたはデキストラン、ならびにこれらの混合物が含まれる。
【０１４７】
親水性部分、例えばポリエチレングリコール鎖は、幾つかの実施態様によると、約５００から約４，００００ダルトンの範囲から選ばれる分子量を有する。一つの実施態様において、親水性部分、例えばＰＥＧは、約５００から約５，０００ダルトンの範囲または約１，０００から約５，０００ダルトンの範囲から選ばれる分子量を有する。別の実施態様において、親水性部分、例えばＰＥＧは、約１０，０００から約２０，０００ダルトンの分子量を有する。更に他の例示的な実施態様において、親水性部分、例えばＰＥＧは、約２０，０００から約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
【０１４８】
一つの実施態様において、デキストランが親水性部分として使用される。デキストランは、主にα１−６結合により結合しているグルコースサブユニットの多糖ポリマーである。デキストランは、多くの分子量範囲、例えば１ｋＤ〜約１００ｋＤの範囲、または約５、１０、１５若しくは２０ｋＤから約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０若しくは９０ｋＤの範囲、で入手することができる。
【０１４９】
直鎖または分岐鎖ポリマーが考慮される。得られる結合体の調製物は、実質的に単分散または多分散であることができ、ペプチド１つ当たり約０．５、０．７、１、１．２、１．５または２つのポリマー部分を有することができる。
【０１５０】
一つの実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖であり、更に、位置１６、１７、２１、２４、２９の１つ以上、Ｃ末端延長部の範囲内の位置、例えば３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、またはＣ末端アミノ酸（例えば、４０）でペプチドに結合していてもよい。幾つかの実施態様において、その位置の天然アミノ酸は、ペプチドへの親水性部分の結合を促進するために、親水性部分との架橋に適した側鎖を有するアミノ酸で置換されている。例示的な実施態様において、その位置の天然アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチル−フェニルアラニン残基で置換されている。他の実施態様において、親水性基を含むように修飾されているアミノ酸が、ペプチドのＣ末端に付加される。
【０１５１】
＜溶解性を増強する他の修飾＞
別の実施態様において、グルカゴンペプチドのいずれかの溶解性を、ペプチドのＣ末端部分、好ましくは配列番号１の位置２７のＣ末端側の位置、において荷電アミノ酸を導入するアミノ酸置換及び／又は付加によって、改善することができる。更に、１、２又は３個の荷電アミノ酸を、Ｃ末端部分の範囲内に、好ましくは位置２７のＣ末端側に導入してもよい。幾つかの実施態様において、位置２８及び／又は２９の天然アミノ酸が１又は２個の荷電アミノ酸で置換されている、並びに／或いは更なる実施態様において、１〜３個の荷電アミノ酸もまたペプチドのＣ末端に付加されている。例示的な実施態様において、１、２個又は全ての荷電アミノ酸は、負に荷電されている。幾つかの実施態様において、負荷電アミノ酸（酸性アミノ酸）は、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。
【０１５２】
更なる修飾、例えば保存的置換をグルカゴンペプチドに行い、ＧＩＰ活性（ならびに場合によりＧＬＰ−１活性および／またはグルカゴン活性）を依然として保持することが可能でありうる。
【０１５３】
＜結合体及び融合体＞
本開示は、本発明のグルカゴンペプチドが結合体部分に結合しているような他の結合体も包含し、この結合は、場合により共有結合を介してでもよく、場合によりリンカーを介してでもよい。結合は、共有化学結合、静電気、水素、イオン、ファンデルワールスのような物理的な力、又は疎水性若しくは親水性相互作用により達成することができる。ビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞付着分子パートナー、又は互いに親和性を有する任意の結合パートナー若しくはそのフラグメントを含む、多様な非共有結合系を使用することができる。
【０１５４】
ペプチドを、ペプチドの標的アミノ酸残基と、これらの標的アミノ酸の選択された側鎖又はＮ若しくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤との反応により、直接共有結合を介して結合体部分に結合することができる。ペプチド又は結合体部分の反応性基には、例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基が含まれる。誘導体化剤には、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介して）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸又は当該技術に既知の他の作用物質が含まれる。あるいは、結合体部分を、多糖又はポリペプチド担体のような中間体担体を介してペプチドに間接的に結合することができる。多糖担体の例にはアミノデキストランが挙げられる。適切なポリペプチド担体の例には、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらのコポリマー、及び、これらのアミノ酸と、得られる装填担体に望ましい溶解性の特性を付与する他のもの、例えばセリン、との混合ポリマーが挙げられる。
【０１５５】
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドのようなα−ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応して、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイニルン残基は、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾエート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることによっても、誘導体化される。
【０１５６】
ヒスチジル残基は、ジエチルピロカーボネートとｐＨ５．５〜７．０で反応させることによって誘導体化されるが、それはこの作用物質がヒスチジル側鎖に比較的特異性があるからである。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり、反応は、好ましくは０．１Mのカコジル酸ナトリウムによりｐＨ６．０で実施される。
【０１５７】
リシニル及びアミノ末端残基は、無水コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応する。これらの作用物質による誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転する効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するのに適した他の試薬には、メチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオンのようなイミドエステル及びグリオキシレートとのトランスアミダーゼ触媒反応、が含まれる。
【０１５８】
アルギニル残基は、１つ又は幾つかの従来の試薬、なかでもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンによる反応で修飾される。アルギニン残基の誘導体化の反応は、グアニジン官能基のpKaが高いので、アルカリ条件下で実施される必要がある。更に、これらの試薬は、リシンの基、またアルギニン−イプシロン−アミノ基と反応することができる。
【０１５９】
チロシル残基の特定の修飾は、スペクトル標識をチロシル残基に導入するのに特に興味深く、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンによる反応によって行うことができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンを使用して、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体がそれぞれ形成される。
【０１６０】
カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、Ｒ及びＲ′が異なるアルキル基であるカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ′）、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド、との反応により選択的に修飾される。更に、アスパルチル又はグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。
【０１６１】
他の修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)）、アスパラギン又はグルタミンの脱アミド化、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び／又はＣ末端カルボン酸基のアミド化若しくはエステル化、が含まれる。
【０１６２】
別の種類の共有的修飾には、ペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合が含まれる。糖を、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン若しくはヒドロキシプロリンのような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）チロシン若しくはトリプトファンのような芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基、に結合することができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０及びAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
【０１６３】
本明細書に記載されているグルカゴンペプチドのいずれかに結合することができる例示的な結合体部分には、異種ペプチド又はポリペプチド（例えば、血漿タンパク質を含む）、標的作用物質、免疫グロブリン若しくはその一部（例えば、可変部領域、ＣＤＲ若しくはＦｃ領域）、放射性同位体、蛍光体若しくは酵素標識のような診断用標識、水溶性ポリマーを含むポリマー、又は他の治療若しくは診断剤、が含まれるが、これらに限定されない。一つの実施態様において、本発明のグルカゴンペプチド及び血漿タンパク質を含む結合体が提供され、ここで血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノゲン、及びグロブリンからなる群より選択される。
【０１６４】
幾つかの実施態様において、リンカーは、１〜約６０個、又は１〜３０個以上の原子長さ、２〜５個の原子、２〜１０個の原子、５〜１０個の原子又は１０〜２０個の原子長さの原子鎖を含む。幾つかの実施態様において、原子鎖は全て炭素原子である。幾つかの実施態様において、リンカーの主鎖の原子鎖は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群より選択される。原子鎖及びリンカーは、より溶解度の高い結合体をもたらすために、予想される溶解性（親水性）に従って選択することができる。幾つかの実施態様において、リンカーは、酵素若しくは他の触媒による切断、又は標的組織若しくは臓器若しくは細胞において見出される加水分解的条件による切断の対象となる官能基を提供する。幾つかの実施態様において、リンカーの長さは、立体障害の潜在性を低減するのに十分な長さである。リンカーが共有結合又はペプチジル結合であり、結合体がポリペプチドである場合、結合体は全体が融合タンパク質であることができる。そのようなペプチジルリンカーは任意の長さであることができる。例示的なリンカーは、約１〜５０個のアミノ酸長さ、５〜５０個、３〜５個、５〜１０個、５〜１５個又は１０〜３０個のアミノ酸長さである。そのような融合タンパク質は、代替的には当業者に既知の組み換え遺伝子操作法により産生することもできる。
【０１６５】
上記に記述したように、幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、免疫グロブリン又はその一部（例えば、可変部領域、ＣＤＲ又はＦｃ領域）に結合、例えば融合している。既知の種類の免疫グロブリン（Ｉｇ）には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭが含まれる。Ｆｃ領域はＩｇ重鎖のＣ末端領域であり、これは、再循環（延長された半減期をもたらす）、抗体依存性細胞仲介細胞障害性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）のような活性を実施するＦｃ受容体への結合に関与している。
【０１６６】
例えば、幾つかの定義によると、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６からＣ末端まで伸びている。「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０まで伸びている（他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、システイン結合に関わるシステインを整列することによりＩｇＧ１配列と整列させることができる）。ＩｇＧのＦｃ領域には２つの定常部ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３、が含まれる。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインは、通常、アミノ酸２３１からアミノ酸３４１まで伸びている。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、通常、アミノ酸３４２から酸４４７まで伸びている。免疫グロブリン又は免疫グロブリンのフラグメント若しくは領域のアミノ酸番号付けに関する参照は、全て、Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.に基づいている。関連する実施態様において、Ｆｃ領域は、１つ以上の、ＣＨ１以外の免疫グロブリン重鎖の天然の又は修飾された定常部領域、例えばＩｇＧ及びＩｇＡのＣＨ２及びＣＨ３領域又はＩｇＥのＣＨ３及びＣＨ４領域、を含むことができる。
【０１６７】
適切な結合体部分としては、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリン配列の一部が挙げられる。サルベージ受容体であるＦｃＲｎは、免疫グロブリンを再循環して、血液循環に戻すことに関与する。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶構造解析に基づいて記載されている（Burmeister et al. 1994, Nature 372:379）。ＦｃＲｎへのＦｃの主な接触領域は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの接合部に近接している。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接触点は、全て単一Ｉｇ重鎖の範囲内である。主な接触部位には、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、及び３１４、並びにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、及び４３３〜４３６が含まれる。
【０１６８】
幾つかの結合体部分は、ＦｃγＲ結合部位を含んでもよいし含まなくてもよい。ＦｃγＲは、ＡＤＣＣ及びＣＤＣに関与する。ＦｃγＲと直接接触するＦｃ領域内の位置の例は、アミノ酸２３４〜２３９（低ヒンジ領域）、アミノ酸２６５〜２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７〜２９９（Ｃ′／Ｅループ）及びアミノ酸３２７〜３３２（Ｆ／Ｇ）ループである（Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000）。ＩｇＥの低ヒンジ領域は、ＦｃＲＩ結合にも関わっている（Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997）。ＩｇＡ受容体結合に関わる残基は、Lewisらにより記載されている（J Immunol. 175: 6694-701, 2005）。ＩｇＥ受容体結合に関わるアミノ酸残基は、Sayers らにより記載されている（J Biol Chem. 279(34): 35320-5, 2004）。
【０１６９】
アミノ酸修飾を免疫グロブリンのＦｃ領域において行うことができる。そのようなＦｃ領域変異体は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン（残基３４２〜４４７）に少なくとも１つのアミノ酸修飾、及び／又はＦｃ領域のＣＨ２ドメイン（残基２３１〜３４１）に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。ＦｃＲｎに親和性の増加を付与すると考えられる突然変異には、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ及びＮ４３４Ａが含まれる（Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591）。他の突然変異は、ＦｃＲｎの親和性を有意に低減することなく、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡへのＦｃ領域の結合を低減することができる。例えば、Ａｌａ又は他のアミノ酸によるＦｃ領域の位置２９７のＡｓｎの置換は、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を除去し、Ｆｃ領域の延長された半減期を伴って免疫原性の低減、また、ＦｃγＲへの結合の低減をもたらすことができる（Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591）。ＦｃγＲへの結合を低減する、ＩｇＧ１の位置２３３〜２３６でのアミノ酸の修飾が行われた（Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613）。幾つかの例示的なアミノ酸置換は、米国特許第７，３５５，００８号及び同第７，３８１，４０８号に記載されており、それぞれその全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０１７０】
本開示はまた、第２のペプチドまたはポリペプチドが、グルカゴンペプチドの末端、例えばカルボキシ末端に融合されている、グルカゴン融合ペプチドまたはタンパクも包含する。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端に付加されている第２ペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に連結した、配列番号９５（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号９７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、または配列番号９８（ＫＲＮＲ）である。他の実施態様において、第２ペプチドはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９６）であり、ここでＸは、２０個の通常のアミノ酸のうちの１つから選ばれ、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸またはグリシンである。一つの実施態様において、Ｘは、アミノ酸の側鎖に共有結合している親水性部分を更に含むアミノ酸、例えばＣｙｓを表す。そのようなＣ末端延長部は溶解性を改善し、ＧＩＰまたはＧＬＰ−１活性も向上させることができる。グルカゴンペプチドがカルボキシ末端延長を更に含む幾つかの実施態様において、延長部のカルボキシ末端アミノ酸は、カルボン酸ではなくアミド基またはエステル基で終わる。
【０１７１】
幾つかの実施態様において、例えばＣ末端延長部を含むグルカゴンペプチドにおいて、天然グルカゴンペプチドの位置２９のトレオニンはグリシンに代えられている。例えば、位置２９のトレオニンにグリシン置換を有し、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）のＣ末端延長部を含むグルカゴンペプチドは、同じＣ末端延長部を含むように修飾された天然グルカゴンと比べてＧＬＰ−１受容体に対して４倍効力がある。このＴ２９Ｇ置換を、本明細書に開示されている他の修飾と一緒に使用して、ＧＬＰ−１受容体へのグルカゴンペプチドの親和性を増強することができる。例えば、Ｔ２９Ｇ置換を、Ｓ１６ＥおよびＮ２０Ｋアミノ酸置換と組み合わせることができ、更に、本明細書に記載されているように、アミノ酸１６と２０の間のラクタム架橋と、また、ＰＥＧ鎖の付加と、組み合わせることができる。
【０１７２】
幾つかの実施態様において、アミノ酸がＣ末端に付加されており、付加アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸およびグリシンから成る群から選ばれる。
【０１７３】
本開示は、本明細書に開示されている修飾グルカゴンペプチドの多量体も包含する。２つ以上の修飾グルカゴンペプチドを、標準的な結合剤および当業者に既知の手順を使用して一緒に結合することができる。例えば、二量体は、特にシステイン、リシン、オルチニン、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニン残基により置換されているグルカゴンペプチドでは、二官能チオール架橋剤および二官能アミン架橋剤の使用を介して２つの修飾グルカゴンペプチドから形成することができる
【０１７４】
＜アシル化およびアルキル化＞
幾つかの実施態様によると、本明細書に開示されているグルカゴンペプチドは修飾されて、アシル基またはアルキル基、例えば天然型のアミノ酸に対して非天然であるアシルまたはアルキル基を含む。アシル化またはアルキル化は、循環しているグルカゴンペプチドの半減期を増加することができる。アシル化またはアルキル化は、有利には、グルカゴンおよび／若しくはＧＬＰ−受容体に対して作用の開始を遅延するおよび／若しくは作用の持続時間を延長する、ならびに／またはＤＰＰ−ＩＶなどのプロテアーゼに対する耐性を向上させる、ならびに／または溶解性を向上させることができる。グルカゴンペプチドのグルカゴンおよび／またはＧＬＰ−１および／またはＧＩＰ受容体に対する活性を、アシル化の後で維持することができる。幾つかの実施態様において、アシル化グルカゴンペプチドの効力は、非アシル化型のグルカゴンペプチドに匹敵する。代替的な実施態様において、アシル化グルカゴンペプチドの効力は、非アシル化型のグルカゴンペプチドと比較して増加される。
【０１７５】
幾つかの実施態様において、本発明は、グルカゴンペプチドの位置１０のアミノ酸に共有結合しているアシル基またはアルキル基を含むように修飾されているグルカゴンペプチドを提供する。グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドの位置１０のアミノ酸とアシル基またはアルキル基との間にスペーサーを更に含むことができる。幾つかの実施態様において、アシル基は、脂肪酸若しくは胆汁酸またはこれらの塩であり、例えばＣ４０〜Ｃ３０脂肪酸、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸、コール酸、Ｃ４〜Ｃ３０アルキル、Ｃ８〜Ｃ２４アルキルまたは胆汁酸のステロイド部分を含むアルキルである。スペーサーは、アシルまたはアルキル基を結合するのに適した反応性基を有する任意の部分である。例示的な実施態様において、スペーサーは、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能または疎水性二官能スペーサーを含む。幾つかの実施態様において、スペーサーは、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＣｙｓおよびＮＨ2（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ（ＣＨ2）ｍＣＯＯＨを含むスペーサーから成る群から選ばれ、ここでｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数である。そのようなアシル化またはアルキル化グルカゴンペプチドは、親水性部分（ポリエチレングリコールでもよい）を更に含むこともできる。前述のグルカゴンペプチドのいずれも、２つのアシル基若しくは２つのアルキル基またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１７６】
アシル化は、ＧＩＰ活性（ならびに場合によりＧＬＰ−１および／またはグルカゴン活性）が増強されまでも少なくとも保持される限り、位置１〜２９のいずれか、Ｃ末端延長部内の位置、またはＮ若しくはＣ末端アミノ酸を含む、グルカゴンペプチド内の任意の位置で実施することができる。アシル化は、例えば、グルカゴン配列（配列番号１）の、例えばＮまたはＣ末端に付加される任意のアミノ酸において生じることができる。非限定例には、グルカゴンペプチドの位置１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０が挙げられる。アシル基を、グルカゴンペプチドのアミノ基に直接的に、またはグルカゴンペプチドのアミノ基にスペーサーを介して間接的に共有結合することができ、ここでスペーサーは、グルカゴンペプチドのアミノ基とアシル基との間に位置している。グルカゴンペプチドを、親水性部分が結合している同じアミノ酸の位置または異なるアミノ酸の位置でアシル化することができる。非限定例には、グルカゴンペプチドの位置１０または位置４０におけるアシル化、および、Ｃ末端部分における１つ以上の位置、例えば位置２４、２８若しくは２９、Ｃ末端延長部内、またはＣ末端（例えば、Ｃ末端Ｃｙｓの付加を介する）におけるペグ化、が挙げられる。
【０１７７】
幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは修飾されて、配列番号１のグルカゴンペプチドまたはその類縁体のＣ末端側への約１〜約２１個のアミノ酸の延長部を含み、延長部の少なくとも１個のアミノ酸は、アシル化またはアルキル化されている。例えば、修飾されたグルカゴンペプチドは、配列番号１のグルカゴンペプチドまたはその類縁体の位置２９のアミノ酸のＣ末端側への約１〜約２１個のアミノ酸の延長部を含むことができる。あるいは、グルカゴンペプチドまたはその類縁体が１または２個のアミノ酸で切断されている場合、約１〜約２１個のアミノ酸の延長部は、グルカゴンペプチドまたはその類縁体の位置２７または２８のアミノ酸のＣ末端側であることができる。したがって、Ｃ末端延長部の内のアシル化またはアルキル化アミノ酸は、例えば、Ｃ末端延長グルカゴンペプチドの位置２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０のいずれかのアミノ酸であることができる。Ｃ末端延長部は、幾つかの実施態様において、配列番号９５または９６のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号９５のアミノ酸配列および配列番号９５のＣ末端への１〜１１個の付加アミノ酸を含むＣ末端延長部を含み、付加アミノ酸（複数または単数）は、本明細書に記載されているようにアシル化またはアルキル化されている。特定の実施態様において、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、ＬｙｓまたはホモＬｙｓ残基であり、Ｃ末端延長グルカゴンペプチドまたはその類縁体の位置４０に配置されている。
【０１７８】
一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドは、循環の半減期を延長する、ならびに／または作用の開始を遅延するおよび／若しくは持続時間を延長する、ならびに／またはＤＰＰ−ＩＶなどのプロテアーゼに対する耐性を向上させる目的で修飾されて、エステル、チオエーテルまたはアミド結合を介してグルカゴンペプチドに結合しているアシル基を含む。
【０１７９】
本発明の特定の態様において、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル、又はチオールの直接的なアシル化により、アシル基を含むように修飾される。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを介して直接アシル化される。幾つかの実施態様において、アシル化は位置１０、２０、２４、２９、又は４０において行われる。この点において、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよいし、位置１０、２０、２４、２９、及び４０のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはチオールを含む任意のアミノ酸となる、本明細書に記載されている１個以上のアミノ酸修飾を含むような、配列番号１の修飾アミノ酸配列を含んでもよい。本発明の幾つかの特定の実施態様において、グルカゴンペプチドの直接アシル化は、位置１０又は４０のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを介して生じる。
【０１８０】
幾つかの実施態様において、側鎖アミンを含むアミノ酸は、式Ｉ：
【化８】
2015164922.tif 000009
で示されるアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４であるアミノ酸（Ｌｙｓ）又はｎが３であるアミノ酸（Ｏｒｎ）である。
【０１８１】
他の実施態様において、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は、式ＩＩ：
【化９】
2015164922.tif 000010
で示されるアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１であるアミノ酸（Ｓｅｒ）である。
【０１８２】
さらに他の実施態様において、側鎖チオールを含むアミノ酸は、式ＩＩＩ：
【化１０】
2015164922.tif 000011
で示されるアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩＩのアミノ酸は、ｎが１であるアミノ酸（Ｃｙｓ）である。
【０１８３】
さらに他の実施態様において、側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを含むアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩ、又は式ＩＩＩのアミノ酸のアルファ炭素に結合している水素が第２側鎖に代えられていること以外は、式Ｉ、式ＩＩ、又は式ＩＩＩと同じ構造を含む、二置換アミノ酸である。
【０１８４】
本発明の一つの実施態様において、アシル化グルカゴンペプチドは、ペプチドとアシル基との間にスペーサーを含む。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、アシル基と共有結合しているスペーサーと共有結合する。
【０１８５】
スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーへの結合を可能とする部分を含むような任意のアミノ酸（例えば、一置換型のα−置換アミノ酸、又はα，α−二置換アミノ酸）であることができる。例えば、側鎖ＮＨ2、−ＯＨ、又は−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕ）が適している。この点に関して、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよいし、位置１０、２０、２４、２９、及び４０のアミノ酸のうちの少なくとも１個が側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはカルボキシレートを含む任意のアミノ酸となるように修飾された、本明細書に記載されている１個以上のアミノ酸修飾を含む、修飾された配列番号１のアミノ酸配列を含んでもい。
【０１８６】
幾つかの実施態様において、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはチオールを含むアミノ酸であるか、又は、側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはチオールを含むアミノ酸を含む、ジペプチド若しくはトリペプチドである。
【０１８７】
アシル化がスペーサーのアミン基を介して生じる場合、アシル化は、アミノ酸のアルファアミン又は側鎖アミンを介して生じることができる。アルファアミンがアシル化される場合、スペーサーのアミノ酸は、任意のアミノ酸であることができる。例えば、スペーサーのアミノ酸は、疎水性アミノ酸、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、であることができる。あるいは、スペーサーのアミノ酸は、酸性残基、例えばＡｓｐ及びＧｌｕ、であることができる。
【０１８８】
スペーサーのアミノ酸の側鎖アミンがアシル化される場合、スペーサーのアミノ酸は、側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば式Ｉのアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ又はＯｒｎ）である。この場合、スペーサーのアミノ酸のアルファアミンと側鎖アミンの両方ともアシル化されることが可能であり、それによりグルカゴンペプチドがジアシル化される。本発明の実施態様はそのようなジアシル化分子を含む。
【０１８９】
アシル化がスペーサーのヒドロキシル基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＳｅｒである。
【０１９０】
アシル化がスペーサーのチオール基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＣｙｓである。
【０１９１】
幾つかの実施態様において、スペーサーは、親水性二官能スペーサーである。特定の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、２つ以上の反応性基、例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基、又はこれらの任意の組み合わせ、を含む。特定の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、ヒドロキシル基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、アミン基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、チオール基及びカルボキシレートを含む。特定の実施態様において、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。この点において、スペーサーは、例えばＮＨ2（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n（ＣＨ2）mＣＯＯＨを含むことができ（式中、ｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数である）、例えば、Peptides International, Inc. (Louisville, KY)により販売されている、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸であってもよい。
【０１９２】
幾つかの実施態様において、スペーサーは、疎水性二官能スペーサーである。疎水性二官能スペーサーは当該技術において知られている。例えば、Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996)（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）を参照すること。特定の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、２つ以上の反応性基、例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基、又はこれらの任意の組み合わせ、を含む。特定の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、ヒドロキシル基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、アミン基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、チオール基及びカルボキシレートを含む。カルボキシレートとヒドロキシル基又はチオール基を含む適切な疎水性二官能スペーサーは、当該技術において知られており、例えば８−ヒドロキシオクタン酸及び８−メルカプトオクタン酸が含まれる。
【０１９３】
幾つかの実施態様において、二官能スペーサーは、カルボキシレート基の間に１〜７個の炭素を持つ非分岐鎖メチレンを含むジカルボンサンではない。幾つかの実施態様において、二官能スペーサーは、カルボキシレート基の間に１〜７個の炭素を持つ非分岐鎖メチレンを含むジカルボンサンである。
【０１９４】
スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性又は疎水性二官能スペーサー）は、特定の実施態様において、３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子（例えば、６、７、８、９又は１０個の原子））の長さを有する。より特定の実施態様において、スペーサーは、約３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）の長さであり、アシル基はＣ１２〜Ｃ１８脂肪アシル基、例えばＣ１４脂肪アシル基、Ｃ１６脂肪アシル基、であり、これによりスペーサーとアシル基の全長は、１４〜２８個の原子、例えば約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８個の原子の長さとなる。幾つかの実施態様において、スペーサーとアシル基の長さは、１７〜２８個（例えば、１９〜２６個、１９〜２１個）の原子の長さである。
【０１９５】
特定の前述の実施態様によると、二官能スペーサーは、長さが３〜１０個の原子のアミノ酸主鎖（例えば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、及び８−アミノオクタン酸）を含む、合成又は天然型のアミノ酸（本明細書に記載されているいずれもが含まれるが、これらに限定されない）であることができる。あるいは、スペーサーは、長さが３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）のペプチド主鎖を有する、ジペプチド又はトリペプチドスペーサーであることができる。ジペプチド又はトリペプチドスペーサーのそれぞれのアミノ酸は、ジペプチド又はトリペプチドの他のアミノ酸と同一でもよいし異なっていてもよく、以下からなる群より独立して選択することができる：天然型のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）のＤ若しくはＬ異性体のいずれか、又は、以下からなる群より選択される非天然型のアミノ酸のＤ若しくはＬ異性体のいずれかを含む、天然型の及び／又は非天然型のアミノ酸：β−アラニン（β−Ａｌａ）、Ｎ−α−メチル−アラニン（Ｍｅ−Ａｌａ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、γ−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、アミノメチルピロールカルボン酸、アミノピペリジンカルボン酸、アミノセリン（Ａｍｓ）、アミノテトラヒドロピラン−４−カルボン酸、アルギニンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、β−アスパラギン酸（β−Ａｓｐ）、アゼチジンカルボン酸、３−（２−ベンゾチアゾリル）アラニン、α−tert−ブチルグリシン、２−アミノ−５−ウレイド−ｎ−吉草酸（シトルリン、Ｃｉｔ）、β−シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、アセトアミドメチル−システイン、ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ジメチルチアゾリジン（ＤＭＴＡ）、γ−グルタミン酸（γ−Ｇｌｕ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、イソロイシンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、メチル−イソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、イソニペコ酸（Ｉｓｎ）、メチル−ロイシン（ＭｅＬｅｕ）、メチル−リシン、ジメチル−ロイシン、トリメチル−リシン、メタノプロリン、メチオニン−スルホキシド（Ｍｅｔ（Ｏ））、メチオニン−スルホン（Ｍｅｔ（Ｏ2））、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチル−ノルロイシン（Ｍｅ−Ｎｌｅ）、ノルバリン、（Ｎｖａ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、パラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））、４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））、４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＮＯ2））、４−シアノフェニルアラニン（（Ｐｈｅ（４−ＣＮ））、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ピペリジニルアラニン、ピペリジニルグリシン、３，４−デヒドロプロリン、ピロリジニルアラニン、サルコシン（Ｓａｒ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、Ｏ−ベンジル−ホスホセリン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（Ｓｔａ）、４−アミノ−５−シクロヘキシル−３−ヒドロキシペンタン酸（ＡＣＨＰＡ）、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸（ＡＨＰＰＡ）、１，２，３，４，−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、テトラヒドロピラングリシン、チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、Ｏ−ベンジル−ホスホチロシン、Ｏ−ホスホチロシン、メトキシチロシン、エトキシチロシン、Ｏ−（ビス−ジメチルアミノ−ホスホノ）−チロシン、チロシンスルフェートテトラブチルアミン、メチル−バリン（ＭｅＶａｌ）、及びアルキル化３−メルカプトプロピオン酸。
【０１９６】
幾つかの実施態様において、スペーサーは、全体として負の電荷を含み、例えば１又は２個の負荷電アミノ酸を含む。幾つかの実施態様において、ジペプチドは、一般構造Ａ−Ｂのジペプチドのいずれでもなく、ここで、Ａは、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ及びＰｒｏからなる群より選択され、Ｂは、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐからなる群より選択される。幾つかの実施態様において、ジペプチドスペーサーは、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸、及びγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕからなる群より選択される。
【０１９７】
幾つかの例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル、又はチオールのアシル化により、アシル基を含むように修飾され、ここでスペーサーは、グルカゴンペプチドの位置１０、２０、２４、２９、若しくは４０のアミノ酸、又はＣ末端アミノ酸の側鎖に結合している。
【０１９８】
さらに特定の実施態様において、アシル基は、グルカゴンペプチドの位置１０又は４０のアミノ酸に結合しており、スペーサーとアシル基の長さは、１４〜２８個の原子である。位置１０又は４０のアミノ酸は、幾つかの態様において、式Ｉのアミノ酸、例えばＬｙｓであるか、又は式Ｉに関連する、二置換アミノ酸である。より特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、分子内架橋、例えば共有分子内架橋、を欠いている。グルカゴンペプチドは、例えば、ペプチドのアルファ−へリックスの安定化のために、１個以上のアルファ，アルファ−二置換アミノ酸、例えばＡＩＢ、を含むペプチドであることができる。従って、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号５５５〜５６１および６１０〜６１２の配列、並びに表２０および２８に記載のＡＩＢ含有ペプチドのいずれかを含むことができる。本明細書に示されているように、位置４０のアミノ酸の側鎖に共有結合しているアシル化スペーサーを含むそのようなペプチドは、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、グルカゴンの各受容体に対する増強した効力を示す。
【０１９９】
アミン、ヒドロキシル、及びチオールを介したペプチドアシル化に適した方法は、当該技術において知られている。例えば、実施例１９（アミンを介したアシル化の方法）、Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, lnt J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982);及びPreviero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972)（ヒドロキシルを介したアシル化の方法）;並びにSan and Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005)（チオールを介したアシル化の方法）; Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" pages 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989)を参照すること。
【０２００】
アシル化グルカゴンペプチドのアシル基は、任意の大きさ、例えば任意の長さの炭素鎖であることができ、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。本発明の幾つかの特定の実施態様において、アシル基は、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸である。例えば、アシル基は、Ｃ４脂肪酸、Ｃ６脂肪酸、Ｃ８脂肪酸、Ｃ１０脂肪酸、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸、Ｃ２４脂肪酸、Ｃ２６脂肪酸、Ｃ２８脂肪酸、又はＣ３０脂肪酸のいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、アシル基は、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸、例えばＣ１４脂肪酸又はＣ１６脂肪酸、である。
【０２０１】
代替的な実施態様において、アシル基は胆汁酸である。胆汁酸は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸及びコレステロール酸が含まれるが、これらに限定されない任意の適切な胆汁酸であることができる。
【０２０２】
本発明の幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、長鎖アルカンをアシル化することによって、アシル基を含むよう修飾される。特定の実施態様において、長鎖アルカンは、グルカゴンペプチドのカルボキシル基又はその活性化形態と反応するような、アミン、ヒドロキシル、又はチオール基（例えば、オクタデシルアミン、テトラデカノール及びヘキサデカンチオール）を含む。グルカゴンペプチドのカルボキシル基又はその活性化形態は、グルカゴンペプチドのアミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）の側鎖の一部であってもよいし、ペプチド主鎖の一部であってもよい。
【０２０３】
特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、それに結合しているスペーサーで長鎖アルカンをアシル化することによって、アシル基を含むように修飾される。特定の実施態様において、長鎖アルカンは、スペーサーのカルボキシル基又はその活性化形態と反応するような、アミン、ヒドロキシル、又はチオール基を含む。カルボキシル基又はその活性化形態を含む適切なスペーサーは、本明細書に記載されており、例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能スペーサー、又は疎水性二官能スペーサーが含まれる。
【０２０４】
本明細書で使用されるとき、用語「カルボキシル基の活性化形態」は、一般式Ｒ（Ｃ＝Ｏ）Ｘのカルボキシル基を意味し、ここで、Ｘは離脱基であり、そしてＲはグルカゴンペプチド又はスペーサーである。例えば、カルボキシル基の活性化形態には、塩化アシル、アシル無水物、及びアシルエステルが含まれうるが、これらに限定されない。幾つかの実施態様において、活性化カルボキシル基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）離脱基のエステルである。
【０２０５】
長鎖アルカンがグルカゴン又はスペーサーでアシル化されている本発明のこれらの態様に関して、長鎖アルカンは、任意の大きさであることができ、任意の長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。特定の態様において、長鎖アルカンは、Ｃ４〜Ｃ３０アルカンである。例えば、長鎖アルカンは、Ｃ４アルカン、Ｃ６アルカン、Ｃ８アルカン、Ｃ１０アルカン、Ｃ１２アルカン、Ｃ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、Ｃ１８アルカン、Ｃ２０アルカン、Ｃ２２アルカン、Ｃ２４アルカン、Ｃ２６アルカン、Ｃ２８アルカン、又はＣ３０アルカンのいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、長鎖アルカンは、Ｃ８〜Ｃ２０アルカン、例えばＣ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、又はＣ１８アルカン、を含む。
【０２０６】
また、幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドのアミン、ヒドロキシル、又はチオール基は、コレステロール酸によりアシル化されている。特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは修飾されたＣｙｓスペーサーを介してコレステロール酸に結合している。
【０２０７】
本明細書に記載されているアシル化グルカゴンペプチドは、親水性部分を含むように更に修飾されることができる。幾つかの特定の実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載されたいずれかの方法のような任意の適切な手段によって達成することができる。この点において、アシル化グルカゴンペプチドは、本明細書に記載されている修飾のいずれかを含む配列番号１を含むことができ、ここで、位置１０、２０、２４、２９、及び４０の少なくとも１個のアミノ酸はアシル基を含み、位置１６、１７、２１、２４、２９、若しくは４０の少なくとも１個のアミノ酸、Ｃ末端延長部内の位置、又はＣ末端のアミノ酸は修飾されて、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、又はＡｃ−Ｐｈｅとなり、アミノ酸の側鎖は、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。幾つかの実施態様において、アシル基は、位置１０又は４０に結合しており（この結合は場合によりＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、又はＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介してであってもよい）、親水性部分は、位置２４のＣｙｓ残基に組み込まれている。
【０２０８】
あるいは、アシル化グルカゴンペプチドは、スペーサーを含むことができ、ここでスペーサーは、アシル化され、且つ、親水性部分を含むように修飾される。適切なスペーサーの非限定例としては、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ、及びＡｃ−Ｐｈｅからなる群より選択される１個以上のアミノ酸を含むスペーサーが挙げられる。
【０２０９】
本発明の特定の態様において、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号１０１〜１０６、１１３〜１１５、１１７〜１１９、１２３〜１２５、１２８〜１３０、１３２〜１３４、１３６〜１３８、１４１〜１４５、１４８、１５１、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６３、１６５、１６６、２３１、２３４〜２３９、２５７、及び２５８、のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【０２１０】
幾つかの実施態様によると、グルカゴンペプチドは修飾されて、アルキル基、例えばアミノ酸において天然に生じてはいないアルキル基（例えば、天然型のアミノ酸に対して非天然型であるアルキル基）を含む。任意の特定の理論にとらわれることなく、グルカゴンペプチドのアルキル化は、グルカゴンペプチドのアシル化と比べて、もしも同一でないとしても少なくとも同様の効果、例えば、循環半減期の延長、作用開始の遅延、作用の持続時間の延長、ＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性の改善、並びにＧＬＰ−１ＧＩＰ、及びグルカゴン受容体に対する効力の増加、を達成すると考えられる。
【０２１１】
アルキル化は、ＧＩＰ活性（更にＧＩＰ及び／又はグルカゴン活性でもよい）が、たとえ増強されないとしても少なくとも保持される限り、位置１〜２９のいずれか若しくはＣ末端延長部内の位置又はＮ若しくはＣ末端アミノ酸を含む、グルカゴンペプチド内の任意の位置で実施することができる。アルキル化は、例えば、グルカゴン配列（配列番号１）に付加された任意のアミノ酸において、例えばＮ又はＣ末端において行われてもよい。非限定例としては、位置１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０が挙げられる。アルキル基を、グルカゴンペプチドのアミノ基に直接的に共有結合することもできるし、グルカゴンペプチドのアミノ基にスペーサーを介して間接的に共有結合することもでき、この場合スペーサーは、グルカゴンペプチドのアミノ基とアルキル基との間に位置している。グルカゴンペプチドを、親水性部分が結合している位置と同じアミノ酸の位置でも、異なるアミノ酸の位置でも、アルキル化することができる。非限定例としては、グルカゴンペプチドの、位置１０又は４０でのアルキル化、及びＣ末端部分における１つ以上の位置、例えば位置２４、２８、２９、若しくは４０、Ｃ末端延長部内、又はＣ末端（例えば、Ｃ末端Ｃｙｓの付加を介する）でのペグ化、が挙げられる。
【０２１２】
本発明の特定の態様において、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル、又はチオールの直接的なアルキル化により、アルキル基を含むように修飾される。幾つかの実施態様において、アルキル化は位置１０、２０、２４２９、又は４０においてである。この点において、アルキル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよいし、位置１０、２０、２４、２９、及び４０のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを含む任意のアミノ酸となる、本明細書に記載されている１個以上のアミノ酸修飾を含むような、配列番号１の修飾アミノ酸配列を含んでもよい。本発明の幾つかの特定の実施態様において、グルカゴンペプチドの直接アルキル化は、位置１０のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを介して生じる。
【０２１３】
幾つかの実施態様において、側鎖アミンを含むアミノ酸は、式Ｉのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４であるアミノ酸（Ｌｙｓ）か又はｎが３であるアミノ酸（Ｏｒｎ）である。
【０２１４】
他の実施態様において、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は、式ＩＩのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１であるアミノ酸（Ｓｅｒ）である。
【０２１５】
さらに他の実施態様において、側鎖チオールを含むアミノ酸は、式ＩＩＩのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩＩのアミノ酸は、ｎが１であるアミノ酸（Ｃｙｓ）である。
【０２１６】
さらに他の実施態様において、側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを含むアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩ、又は式ＩＩＩのアミノ酸のアルファ炭素に結合している水素が第２側鎖に代えられていること以外は、式Ｉ、式ＩＩ、又は式ＩＩＩと同じ構造を含む、二置換アミノ酸である。
【０２１７】
本発明の一つの実施態様において、アルキル化グルカゴンペプチドは、ペプチドとアルキル基との間にスペーサーを含む。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、アルキル基と共有結合しているスペーサーと共有結合する。幾つかの例示的な実施態様において、グルカゴンペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル又はチオールのアルキル化により修飾されてアルキル基を含み、ここでスペーサーは、グルカゴンペプチドの位置１０、２０、２４、２９、又は４０のアミノ酸の側鎖に結合している。スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーへの結合を可能とする部分を含むような任意のアミノ酸（例えば、α−一置換アミノ酸、又はα，α−二置換アミノ酸）であることができる。例えば、側鎖ＮＨ2、−ＯＨ又は−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕ）が適している。この点に関して、アルキル化グルカゴンペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよいし、位置１０、２０、２４、２９、及び４０のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて側鎖アミン、ヒドロキシル、若しくはカルボキシレートを含む任意のアミノ酸となる、本明細書に記載されている１個以上のアミノ酸修飾を含むような、配列番号１の修飾アミノ酸配列を含んでもよい。
【０２１８】
幾つかの実施態様において、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸であるか、又は側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチド若しくはトリペプチドである。
【０２１９】
アルキル化がスペーサーのアミン基を介して生じる場合、アルキル化は、アミノ酸のアルファアミン又は側鎖アミンを介して生じることができる。アルファアミンがアルキル化される場合、スペーサーのアミノ酸は、任意のアミノ酸であることができる。例えば、スペーサーのアミノ酸は、疎水性アミノ酸、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸であることができる。あるいは、スペーサーのアミノ酸は、アルキル化が酸性残基のアルファアミンで生じる限り、酸性残基、例えばＡｓｐ及びＧｌｕであることができる。スペーサーのアミノ酸の側鎖アミンがアルキル化される場合、スペーサーのアミノ酸は、側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば式Ｉのアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ又はＯｒｎ）である。この場合、スペーサーのアミノ酸のアルファアミンと側鎖アミンの両方ともアルキル化されることが可能であり、それによりグルカゴンペプチドがジアルキル化される。本発明の実施態様はそのようなジアルキル化分子を含む。
【０２２０】
アルキル化がスペーサーのヒドロキシル基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＳｅｒである。
【０２２１】
アルキル化がスペーサーのチオール基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＣｙｓである。
【０２２２】
幾つかの実施態様において、スペーサーは、親水性二官能スペーサーである。特定の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、２つ以上の反応性基、例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基、又はこれらの任意の組み合わせ、を含む。特定の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、ヒドロキシル基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、アミン基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、親水性二官能スペーサーは、チオール基及びカルボキシレートを含む。特定の実施態様において、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。この点において、スペーサーは、例えばＮＨ2（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n（ＣＨ2）mＣＯＯＨを含むことができ(式中、ｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数である)、例えば、Peptides International, Inc. (Louisville, KY)により販売されている、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸であってもよい。
【０２２３】
幾つかの実施態様において、スペーサーは、疎水性二官能スペーサーである。特定の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、２つ以上の反応性基、例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基、又はこれらの任意の組み合わせ、を含む。特定の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、ヒドロキシル基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、アミン基及びカルボキシレートを含む。他の実施態様において、疎水性二官能スペーサーは、チオール基及びカルボキシレートを含む。カルボキシレートとヒドロキシル基又はチオール基を含む適切な疎水性二官能スペーサーは、当該技術において知られており、例えば８−ヒドロキシオクタン酸及び８−メルカプトオクタン酸が含まれる。
【０２２４】
スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性又は疎水性二官能スペーサー）は、特定の実施態様において、３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子（例えば、６、７、８、９、又は１０個の原子））の長さを有する。より特定の実施態様において、スペーサーは、約３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）の長さであり、アルキルはＣ１２〜Ｃ１８アルキル基、例えばＣ１４アルキル基、Ｃ１６アルキル基であり、これによりスペーサーとアルキル基の全長は、１４〜２８個の原子、例えば約４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個の原子の長さとなる。幾つかの実施態様において、スペーサーとアルキルの長さは、１７〜２８個（例えば、１９〜２６個、１９〜２１個）の原子である。
【０２２５】
特定の前述の実施態様によると、二官能スペーサーは、長さが３〜１０個の原子のアミノ酸主鎖（例えば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸及び８−アミノオクタン酸）を含む合成又は非天然型のアミノ酸であることができる。あるいは、スペーサーは、長さが３〜１０個の原子（例えば、６〜１０個の原子）のペプチド主鎖を有するジペプチド又はトリペプチドスペーサーであることができる。ジペプチド又はトリペプチドスペーサーは、例えば本明細書に教示されているアミノ酸のいずれかを含む天然型の及び／又は非天然型のアミノ酸から構成されうる。幾つかの実施態様において、スペーサーは、全体として負の電荷を含み、例えば１又は２個の負荷電アミノ酸を含む。幾つかの実施態様において、ジペプチドスペーサーは、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸、及びγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕからなる群より選択される。
【０２２６】
アミン、ヒドロキシル、及びチオールを介したペプチドアルキル化に適した方法は、当該技術において知られている。例えば、ウィリアムソンエーテル合成を使用して、グルカゴンペプチドのヒドロキシル基とアルキル基との間にエーテル結合を形成することができる。また、ハロゲン化アルキルによるペプチドの求核置換反応は、エーテル、チオエーテル又はアミノ結合のいずれかをもたらすことができる。
【０２２７】
アルキル化グルカゴンペプチドのアルキル基は、任意の大きさ、例えば任意の長さの炭素鎖であることができ、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。本発明の幾つかの実施態様において、アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ３０アルキルである。例えば、アルキル基は、Ｃ４アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキル、又はＣ３０アルキルのいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、アルキル基は、Ｃ８〜Ｃ２０アルキル、例えばＣ１４アルキル又はＣ１６アルキルである。
【０２２８】
幾つかの実施態様において、アルキル基は、胆汁酸のステロイド部分、例えば、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、及びコレステロール酸を含む。
【０２２９】
本発明の幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、求核長鎖アルカンとグルカゴンペプチドとを反応させることにより、アルキル基を含むように修飾されており、ここでグルカゴンペプチドは、求核置換に適した離脱基を含む。特定の態様において、長鎖アルカンの求核基は、アミン、ヒドロキシル基、又はチオール基を含む（例えば、オクタデシルアミン、テトラデカノール、及びヘキサデカンチオールである）。グルカゴンペプチドの離脱基は、アミノ酸の側鎖の一部であってもよいし、ペプチド主鎖の一部であってもよい。適切な離脱基には、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ハロゲン、及びスルホネートエステルが含まれる。
【０２３０】
特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、求核長鎖アルカンと、グルカゴンペプチドに結合しているスペーサーとを反応させることにより、アルキル基を含むように修飾されており、ここでスペーサーは離脱基を含む。特定の態様において、長鎖アルカンは、アミン、ヒドロキシル、又はチオール基を含む。特定の実施態様において、離脱基を含むスペーサーは、本明細書において考察された任意のスペーサー、例えば、適切な離脱基を更に含む、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能スペーサー又は疎水性二官能スペーサー、であることができる。
【０２３１】
長鎖アルカンがグルカゴン又はスペーサーでアルキル化されている本発明のこれらの態様に関して、長鎖アルカンは、任意の大きさであることができ、任意の長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは、直鎖であってもよいし、分岐鎖であってもよい。特定の態様において、長鎖アルカンは、Ｃ４〜Ｃ３０アルカンである。例えば、長鎖アルカンは、Ｃ４アルカン、Ｃ６アルカン、Ｃ８アルカン、Ｃ１０アルカン、Ｃ１２アルカン、Ｃ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、Ｃ１８アルカン、Ｃ２０アルカン、Ｃ２２アルカン、Ｃ２４アルカン、Ｃ２６アルカン、Ｃ２８アルカン又はＣ３０アルカンのいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、長鎖アルカンは、Ｃ８〜Ｃ２０アルカン、例えばＣ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、又はＣ１８アルカン、を含む。
【０２３２】
また、幾つかの実施態様において、アルキル化は、グルカゴンペプチドとコレステロール部分の間で生じることができる。例えば、コレステロール酸のヒドロキシル基が長鎖アルカンの離脱基を置換して、コレステロール−グルカゴンペプチド産物を形成することができる。
【０２３３】
本明細書に記載されているアルキル化グルカゴンペプチドは、親水性部分を含むように更に修飾されてもよい。幾つかの特定の実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載されたいずれかの方法のような任意の適切な手段によって達成することができる。この点において、アルキル化グルカゴンペプチドは、配列番号１を含んでもよいし、本明細書に記載されている１個以上のアミノ酸修飾を含む配列番号１の修飾アミノ酸配列を含んでもよく、この場合、位置１０、２０、２４、２９、及び４０の少なくとも１個のアミノ酸はアルキル基を含み、位置１６、１７、２１、２４、２９、若しくは４０、若しくはＣ末端延長部内の位置の少なくとも１個のアミノ酸、又はＣ末端アミノ酸は修飾されて、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅとなり、アミノ酸の側鎖は、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。幾つかの実施態様において、アルキル基は位置１０又は４０に結合しており（この結合は、場合によりＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介してであってもよい）、親水性部分は、位置２４のＣｙｓ残基に組み込まれている。
【０２３４】
あるいは、アルキル化グルカゴンペプチドは、スペーサーを含むことができ、ここでスペーサーは、アルキル化され、且つ、親水性部分を含むように修飾もされる。適切なスペーサーの非限定例には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ及びＡｃ−Ｐｈｅからなる群より選択される１個以上のアミノ酸を含むスペーサーが挙げられる。
【０２３５】
＜例示的な実施態様＞
本発明の幾つかの実施態様によると、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号１）の類縁体は、配列番号１であって、（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する位置１でのアミノ酸修飾、（ｂ）類縁体のＣ末端部分（アミノ酸１２−２９）のアルファ−へリックス構造を安定化する修飾を含み、（ｃ）更に、１〜１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）の更なるアミノ酸修飾を有してもよい、配列番号１を含む。幾つかの実施態様において、類縁体は、ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰのの活性少なくとも約１％の活性、または本明細書に記載されるＧＩＰ受容体に対する他の任意の活性レベルを示す。
【０２３６】
特定の実施態様において、アルファ−へリックス構造を安定化する修飾は分子内架橋、例えば本明細書に記載されている任意のものなどの共有分子内架橋が含まれる分子内架橋を、もたらす、または導入するものである。分子内架橋は、幾つかの実施態様において、ラクタム架橋である。これらの実施態様の類縁体のラクタム架橋は、本明細書に記載されているラクタム架橋であることができる。例えば、「アルファ−へリックス構造の安定化」のセクションにおけるラクタム架橋の教示を参照すること。例えば、ラクタム架橋は、位置ｉとｉ＋４のアミノ酸の側鎖の間、または位置ｊとｊ＋３のアミノ酸の側鎖の間にあるものであることができ、ここで、ｉは１２、１３、１６、１７、２０または２４であり、ｊは１７である。特定に実施態様において、ラクタム架橋は、位置１６と２０のアミノ酸の間にあることができ、ここで、位置１６および２０のアミノ酸の一方はＧｌｕで置換され、位置１６および２０のアミノ酸の他方はＬｙｓで置換されている。
【０２３７】
代替的な実施態様において、アルファ−へリックス構造を安定化する修飾は、類縁体の位置（単数または複数）の２０、２１および２４のうちの１、２、３または４個のα，α−二置換アミノ酸の導入である。幾つかの実施態様において、α，α−二置換アミノ酸はＡＩＢである。特定の態様において、α，α−二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）は、位置２０にあり、位置１６のアミノ酸は、例えば本明細書に記載されている式ＩＶのアミノ酸などの正に帯電しているアミノ酸で置換されている。式ＩＶのアミノ酸は、ホモＬｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎまたは２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）であることができる。
【０２３８】
本発明の特定の態様において、位置１でのアミノ酸修飾は、イミダゾール側鎖を欠いているアミノ酸、例えば大型の芳香族アミノ酸（例えば、Ｔｙｒ）によるＨｉｓの置換である。
【０２３９】
特定の態様において、グルカゴンの類縁体は、位置２７、２８および２９のうちの１、２つ、または全てにおいてアミノ酸修飾を含む。例えば、位置２７のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸（（Ｌｅｕでもよい）で置換されていることができるか、位置２８のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸（Ａｌａでもよい）で置換されていることができるか、位置２９のＴｈｒは、小型の脂肪族アミノ酸（Ｇｌｙでもよい）で置換されていることができるか、または前記の２若しくは３つの組み合わせであることができる。特定の態様において、グルカゴンの類縁体は、位置２７にＬｅｕ、位置２８にＡｌａおよび位置２９にＧｌｙまたはＴｈｒを含む。
【０２４０】
本発明の特定の実施態様において、グルカゴンの類縁体は、位置２９のアミノ酸のＣ末端側に１〜２１個のアミノ酸の延長部を含む。延長部は、例えば、配列番号９５または９６のアミノ酸配列を含むことができる。追加的にまたは代替的に、グルカゴンの類縁体は、延長部の１〜６個のアミノ酸が正に帯電しているアミノ酸である延長部を含むことができる。正に帯電しているアミノ酸は、Ｌｙｓ、ホモＬｙｓ、ＯｒｎおよびＤａｂが含まれるが、これらに限定されない式ＩＶのアミノ酸であることができる。
【０２４１】
グルカゴンの類縁体は、幾つかの実施態様において、本明細書に記載されているようにアシル化またはアルキル化される。例えば、アシルまたはアルキル基は、本明細書において更に記載されるように、類縁体の位置１０または４０に、スペーサーを伴いまたは伴わないで、グルカゴンの類縁体に結合することができる。類縁体は、本明細書において更に記載されるように、追加的にまたは代替的に修飾されて親水性部分を含むことができる。更に、幾つかの実施態様において、類縁体は、以下の修飾：
（ａ）Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸で置換されている、位置２のＳｅｒ；
（ｂ）Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌで置換されている、位置１０のＴｙｒ；
（ｃ）位置１０のＬｙｓへのアシル基の結合；
（ｄ）ＡｒｇまたはＩｌｅで置換されている位置１２のＬｙｓ；
（ｅ）Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡＩＢで置換されている、位置１６のＳｅｒ；
（ｆ）Ｇｌｎで置換されている位置１７のＡｒｇ；
（ｇ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙで置換されている、位置１８のＡｒｇ；
（ｈ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはＡＩＢで置換されている、位置２０のＧｌｎ；
（ｉ）Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている、位置２１のＡｓｐ；
（ｊ）Ｉｌｅで置換されている位置２３のＶａｌ：
（ｋ）Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡＩＢで置換されている、位置２４のＧｌｎ；ならびに
（ｌ）位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１，２４、２７、２８、および２９のいずれかでの保存的置換
のうちの任意の１つまたは組み合わせを含む。
【０２４２】
例示的な実施態様において、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号１）の類縁体は、以下の修飾：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する位置１でのアミノ酸修飾、
（ｂ）位置ｉとｉ＋４のアミノ酸の側鎖の間、または位置ｊとｊ＋３のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋（ここで、ｉは１２、１３、１６、１７、２０または２４であり、ｊは１７である）、
（ｃ）位置２７、２８および２９のうちの１、２つ、または全てでのアミノ酸修飾、例えば位置２７および／または２８でのアミノ酸修飾、ならびに
（ｄ）１〜９個または１〜６個の更なるアミノ酸修飾、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個の更なるアミノ酸修飾
を含み、
ＧＩＰ受容体活性化における類縁体のＥＣ５０は、約１０ｎＭ以下である。
【０２４３】
これらの実施態様の類縁体のラクタム架橋は、本明細書に記載されているラクタム架橋であることができる。例えば、「アルファ−へリックス構造の安定化」のセクションにおけるラクタム架橋の教示を参照すること。例えば、ラクタム架橋は、位置１６と２０のアミノ酸の間にあることができ、ここで、位置１６および２０のアミノ酸の一方はＧｌｕで置換され、位置１６および２０のアミノ酸の他方はＬｙｓで置換されている。
【０２４４】
これらの実施態様によると、類縁体は、例えば、配列番号５〜９４のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
【０２４５】
他の例示的な実施態様において、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号１）の類縁体は、以下の修飾：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する位置１でのアミノ酸修飾、
（ｂ）類縁体の位置１６、２０、２１および２４のうちの１、２、３つ、または全てのアミノ酸が、α，α−二置換アミノ酸で置換されている、
（ｃ）位置２７、２８および２９のうちの１、２つ、または全てでのアミノ酸修飾、例えば位置２７および／または２８でのアミノ酸修飾、ならびに
（ｄ）１〜９個または１〜６個の更なるアミノ酸修飾、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個の更なるアミノ酸修飾
を含み、
ＧＩＰ受容体活性化における類縁体のＥＣ５０は、約１０ｎＭ以下である。
【０２４６】
これらの実施態様の類縁体のα，α−二置換アミノ酸は、メチル、エチル、プロピルおよびｎ−ブチルから選ばれる同一若しくは異なる基により二置換されているアミノ酸である、またはシクロオクタン若しくはシクロヘプタンにより二置換されているアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）であるアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）が含まれるが、これに限定されない任意のα，α−二置換アミノ酸であることができる。特定の実施態様において、α，α−二置換アミノ酸はＡＩＢである。特定の態様において、位置２０のアミノ酸は、α，α−二置換アミノ酸、例えばＡＩＢで置換されている。
【０２４７】
これらの実施態様によると、類縁体は、例えば、配列番号９９〜１４１、１４４〜１６４、１６６〜１６９および１７３〜１７８のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
【０２４８】
更に他の例示的な実施態様において、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号１）の類縁体は、以下の修飾：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する位置１でのアミノ酸修飾、
（ｂ）式ＩＶ：
【化１１】
2015164922.tif 000012
〔式中、ｎは、１〜１６または１〜１０または１〜７または１〜６または２〜６であり、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ2〜Ｃ5複素環式）、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ6〜Ｃ10アリール）Ｒ7および（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ9ヘテロアリール）から成る群から独立して選ばれ、Ｒ7は、ＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は、遊離アミノ基を含む〕
で示されるアミノ酸による位置２６のＳｅｒのアミノ酸置換、
（ｃ）アルファ，アルファ二置換アミノ酸による位置２０のＧｌｎのアミノ酸置換、
（ｄ）位置２７、２８および２９のうちの１、２つ、または全てのアミノ酸修飾、例えば位置２７および／または２８のアミノ酸修飾、ならびに
（ｅ）１〜９個または１〜６個の更なるアミノ酸修飾、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個の更なるアミノ酸修飾
を含み、
ＧＩＰ受容体活性化における類縁体のＥＣ５０は、約１０ｎＭ以下である。
【０２４９】
これらの実施態様の類縁体の式ＩＶのアミノ酸は、例えば式ＩＶのアミノ酸などの任意のアミノ酸であることができ、ここでｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６である。特定の態様において、ｎは２、３、４または５であり、この場合では、アミノ酸は、それぞれＤａｂ、Ｏｒｎ、ＬｙｓまたはホモＬｙｓである。
【０２５０】
これらの実施態様の類縁体のアルファ，アルファ二置換アミノ酸は、任意のアルファ，アルファ二置換アミノ酸であってもよく、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）や、メチル、エチル、プロピルおよびｎ−ブチルから選ばれる同一若しくは異なる基により二置換されているアミノ酸、またはシクロオクタン若しくはシクロヘプタンにより二置換されているアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、アルファ，アルファ置換アミノ酸はＡＩＢである。
【０２５１】
これらの実施態様によると、類縁体は、例えば、配列番号９９〜１６５のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
【０２５２】
更に他の例示的な実施態様において、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号１）の類縁体は、
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する位置１でのアミノ酸修飾、および
（ｂ）位置２９のアミノ酸のＣ末端側への約１〜約２１個のアミノ酸の延長部（ここで延長部の少なくとも１個のアミノ酸はアシル化またはアルキル化されている）
を含み、
ここで、ＧＩＰ受容体活性化における類縁体のＥＣ５０は、約１０ｎＭ以下である。
【０２５３】
幾つかの実施態様において、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのアミノ酸である。より特定の実施態様において、式Ｉのアミノ酸は、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、ＬｙｓまたはホモＬｙｓである。また、幾つかの実施態様において、約１〜約２１個のアミノ酸の延長部は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９６）（ここでＸは任意のアミノ酸である）またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１７０）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１７１）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号１７２）（ここでＸは、Ｇｌｙまたは小型の脂肪族若しくは非極性若しくは僅かに極性のアミノ酸である）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様において、前記の約１〜約２１個のアミノ酸は、配列番号９５、９６、１７０、１７１、または１７２に対して保存的な１つ以上の置換を含めた配列を含むことができる。幾つかの実施態様において、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、Ｃ末端延長類縁体の位置３７、３８、３９、４０、４１、４２または４３に配置されている。特定の態様において、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、Ｃ末端延長類縁体の位置４０に配置されている。
【０２５４】
幾つかの実施態様において、ＧＩＰアゴニスト活性を有する類縁体は、位置２７、２８および２９のうちの１、２つ、または全てでのアミノ酸修飾、例えば位置２７および／または２８でのアミノ酸修飾を更に含む。
【０２５５】
上記の例示的な実施態様のいずれかにおいて、ＧＩＰアゴニスト活性を付与する位置１でのアミノ酸修飾は、イミダゾール側鎖を欠いているアミノ酸によるＨｉｓの置換であることができる。位置１でのアミノ酸修飾は、例えば、大型の芳香族アミノ酸によるＨｉｓの置換であることができる。幾つかの実施態様において、大型の芳香族アミノ酸は、例えばＴｙｒを含む、本明細書に記載されている任意のものである。
【０２５６】
また、上記の例示的な実施態様に関して、位置２７、２８および２９のうちの１、２つ、または全てにおけるアミノ酸修飾は、本明細書に記載されるこれらの位置の修飾のいずれかであることができる。例えば、位置２７のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸（Ｌｅｕでもよい）で置換されていることができる、位置２８のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸（Ａｌａでもよい）で置換されていることができる、および／または位置２９のＴｈｒは、小型の脂肪族アミノ酸（Ｇｌｙでもよい）で置換されていることができる。あるいは、類縁体は、位置２７および／または２８にそのようなアミノ酸修飾を含むことができる。
【０２５７】
上記の例示的な実施態様の類縁体は、例えば、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体のいずれかに対して活性を増加若しくは減少する、溶解性を向上させる、作用の持続時間若しくは循環半減期を向上させる、作用の開始を遅延する、または安定性を増加する本明細書の記載されている修飾のいずれかなどの、１〜９個または１〜６個の更なる付加アミノ酸修飾、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個の更なるアミノ酸修飾を更に含むことができる。類縁体は、例えば、位置１２のアミノ酸修飾（Ｉｌｅでもよい）による置換、ならびに／あるいは１７および１８のアミノ酸修飾（位置１７のＱによる置換および位置１８のＡによる置換でもよい）、ならびに／あるいはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）若しくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９６）の配列、または配列番号９５若しくは９６に対して保存的な１つ以上の置換を含めた配列の、Ｃ末端への付加を更に含むことができる。類縁体は、以下の修飾：
（ｉ）Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸で置換されている、位置２のＳｅｒ；
（ｉｉ）Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌで置換されている、位置１０のＴｙｒ；
（ｉｉｉ）位置１０のＬｙｓへのアシル基の結合；
（ｉｖ）Ａｒｇで置換されている位置１２のＬｙｓ；
（ｖ）Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡＩＢで置換されている、位置１６のＳｅｒ；
（ｖｉ）Ｇｌｎで置換されている位置１７のＡｒｇ；
（ｖｉｉ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙで置換されている、位置１８のＡｒｇ；
（ｖｉｉｉ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはＡＩＢで置換されている、位置２０のＧｌｎ；
（ｉｘ）Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている、位置２１のＡｓｐ；
（ｘ）Ｉｌｅで置換されている位置２３のＶａｌ：
（ｘｉ）Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡＩＢで置換されている、位置２４のＧｌｎ；ならびに
（ｘｉｉ）位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１，２４、２７、２８、および２９のいずれかでの、保存的置換、
のうちの１つ以上を含むことができる。
類縁体は、幾つかの実施態様において、（ｉ）から（ｘｉｉ）の修飾の組み合わせを含む。代替的にまたは追加的に、類縁体は、位置３にアミノ酸修飾（例えば、ＧｌｕによるＧｌｎのアミノ酸置換）を含むことができ、ここで類縁体は、グルカゴン受容体に対するグルカゴンの活性の１％未満の活性を有する。代替的にまたは追加的に、類縁体は、位置７にアミノ酸修飾（例えば、ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸、例えばＡｂｕまたはＩｌｅによる、Ｔｈｒのアミノ酸置換）を含むことができ、ここで類縁体は、ＧＬＰ−１受容体に対するＧＬＰの活性の１０％未満の活性を有する。
【０２５８】
例示的な実施態様に関して、類縁体は、親水性部分に共有結合することができる。幾つかの実施態様において、類縁体は、位置１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０のいずれかのアミノ酸またはＣ末端アミノ酸における親水性部分に共有結合している。特定の実施態様において、類縁体は、Ｃ末端延長部（例えば、配列番号９５のアミノ酸配列）と、親水性部分を含むアミノ酸の付加とを含み、それにより、親水性部分が類縁体の位置４０に共有結合している。
【０２５９】
幾つかの実施態様において、親水性部分は、類縁体のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチル−フェニルアラニン残基に共有結合している。Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチル−フェニルアラニンは、グルカゴン配列（配列番号１）に対して天然であるアミノ酸であってもよいし、配列番号１の天然アミノ酸を交換するアミノ酸であってもよい。親水性部分がＣｙｓに結合している幾つかの実施態様において、親水性部分への結合は、下記構造：
【化１２】
2015164922.tif 000013
を含むことができる。
【０２６０】
親水性部分を含む類縁体に関して、親水性部分は、本明細書に記載された任意のものであることができる。例えば、「親水性部分の結合」のセクションの教示を参照すること。幾つかの実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、特定の態様において、約１，０００ダルトンから約４０，０００ダルトン、例えば約２０，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
【０２６１】
例示的な実施態様に関して、類縁体は、側鎖がアシルまたはアルキル基（例えば、天然型のアミノ酸に対して非天然であるアシルまたはアルキル基）に共有結合している修飾アミノ酸を含むことができる。アシル化またはアルキル化類縁体は、「アシル化およびアルキル化」のセクションに記載されているアシル化またはアルキル化ペプチドによるものであることができる。幾つかの実施態様において、アシル基は、例えばＣ１０脂肪アシル若しくはアルキル基、Ｃ１２脂肪アシル若しくはアルキル基、Ｃ１４脂肪アシル若しくはアルキル基、Ｃ１６脂肪アシル若しくはアルキル基、Ｃ１８脂肪アシル若しくはアルキル基、Ｃ２０アシル若しくはアルキル基、またはＣ２２アシル若しくはアルキル基などの、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪アシル基である。アシルまたはアルキル基は、位置１０若しくは４０のアミノ酸またはＣ末端アミノ酸が含まれるが、これらに限定されない、類縁体の任意のアミノ酸に共有結合することができる。特定の実施態様において、類縁体は、Ｃ末端延長部（例えば、配列番号９５のアミノ酸配列）と、アシルまたはアルキル基が類縁体の位置４０に共有結合するように、アシルまたはアルキル基を含むアミノ酸の付加とを含む。幾つかの実施態様において、アシルまたはアルキル基は、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのアミノ酸、例えばＬｙｓ残基の側鎖に共有結合している。アシルまたはアルキル基は、グルカゴン配列（配列番号１）に対して天然であるアミノ酸に共有結合してもよいし、配列番号１の配列若しくは配列番号９５が続いている（Ｎ若しくはＣ末端に）配列番号１の配列に付加されているアミノ酸に結合してもよいし、配列番号１の位置１０で天然アミノ酸を交換するアミノ酸、例えばＴｙｒに結合してもよい。
【０２６２】
類縁体がアシルまたはアルキル基を含む上記の例示的な実施態様において、類縁体は、本明細書に記載されているように、スペーサーを介してアシルまたはアルキル基に結合することができる。スペーサーは、例えば、３〜１０原子長であることができ、例えば、アミノ酸（例えば、６アミノヘキサン酸、本明細書に記載される任意のアミノ酸）、ジペプチド（例えば、Ａｌａ−Ａｌａ、βＡｌａ−βＡｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γＧｌｕ−γＧｌｕ）、トリペプチドまたは親水性若しくは疎水性二官能スペーサーであることができる。特定の態様において、スペーサーとアシルまたはアルキル基との全長は、約１４〜約２８原子である。
【０２６３】
さらに更なる例示的な実施態様において、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類縁体は、以下の修飾：
（ａ）場合により、ＧＩＰアゴニスト活性を付与する位置１でのアミノ酸修飾も含んでもよく、また、
（ｂ）位置２９のアミノ酸のＣ末端側への約１〜約２１個のアミノ酸の延長部（ここで延長部の少なくとも１個のアミノ酸はアシル化またはアルキル化されている）、および
（ｄ）６個までの更なるアミノ酸修飾
を更に含む、配列番号２２７、２２８、２２９または２３０のいずれかのアミノ酸配列を含み、
ここで、ＧＩＰ受容体活性化における類縁体のＥＣ５０は、約１０ｎＭ以下である。
【０２６４】
幾つかの態様において、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのアミノ酸である。より特定の実施態様において、式Ｉのアミノ酸は、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、ＬｙｓまたはホモＬｙｓである。また、幾つかの実施態様において、約１〜約２１個のアミノ酸は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９６）（ここでＸは任意のアミノ酸である）またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１７０）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１７１）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号１７２）（ここでＸは、Ｇｌｙまたは小型の脂肪族若しくは非極性若しくは僅かに極性のアミノ酸である）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様において、約１〜約２１個のアミノ酸は、配列番号９５、９６、１７０、１７１または１７２に対して保存的な１つ以上の置換を含めた配列を含むことができる。幾つかの実施態様において、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、Ｃ末端延長類縁体の位置３７、３８、３９、４０、４１、４２または４３に配置されている。特定の態様において、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、Ｃ末端延長類縁体の位置４０に配置されている。
【０２６５】
上記の例示的な実施態様のいずれかにおいて、ＧＩＰアゴニスト活性を付与する位置１のアミノ酸は、イミダゾール側鎖を欠いているアミノ酸であることができる。位置１のアミノ酸は、例えば、大型の芳香族アミノ酸であることができる。幾つかの実施態様において、大型の芳香族アミノ酸は、例えばＴｙｒを含む、本明細書に記載されている任意のものであることができる。
【０２６６】
上記の例示的な実施態様の類縁体は、１〜６個の更なる付加アミノ酸修飾、例えば、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体のいずれかに対する活性を増加若しくは減少する、溶解性を向上させる、作用の持続時間若しくは循環半減期を向上させる、作用の開始を遅延する、または安定性を増加するような、本明細書に記載されている修飾のいずれかなどを、更に含むことができる。
【０２６７】
特定の態様において、上記の例示的な実施態様に記載されたグルカゴンの類縁体は、位置２７、２８および２９のうちの１、２つ、または全てにおいて、更なるアミノ酸修飾を含む。これらの位置の修飾は、これらの位置に関して本明細書に記載されている修飾のいずれかであることができる。例えば、配列番号２２７、２２８、２２９または２３０に関して、位置２７を大型の脂肪族アミノ酸（例えば、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ若しくはノルロイシン）またはＭｅｔで置換することができる、位置２８を別の小型の脂肪族アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ若しくはＡｌａ）またはＡｓｎで置換することができる、および／あるいは、位置２９を別の小型の脂肪族アミノ酸（例えば、Ａｌａ若しくはＧｌｙ）またはＴｈｒで置換することができる。あるいは、類縁体は、位置２７および／または２８にそのようなアミノ酸修飾を含むことができる。
【０２６８】
類縁体は、以下の追加的な修飾：
（ｉ）位置２のアミノ酸は、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌまたはα−アミノ−Ｎ−酪酸のいずれか１つである；
（ｉｉ）位置１０のアミノ酸は、Ｔｒｙ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＶａｌである；
（ｉｉｉ）位置１０のＬｙｓへのアシル基の結合；
（ｉｖ）位置１２のアミノ酸は、Ｉｌｅ、ＬｙｓまたはＡｒｇである；
（ｖ）位置１６のアミノ酸は、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、ＧｌｙまたはＡＩＢのいずれか１つである；
（ｖｉ）位置１７のアミノ酸はＧｌｎまたはＡｒｇである；
（ｖｉｉ）位置１８のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＧｌｙのいずれか１つである；
（ｖｉｉｉ）位置２０のアミノ酸は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ若しくはＡＩＢまたは他のアルファ，アルファ二置換アミノ酸のいずれか１つである；
（ｉｘ）位置２１のアミノ酸は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸のいずれか１つである；
（ｘ）位置２３のアミノ酸はＶａｌまたはＩｌｅである；
（ｘｉ）位置２４のアミノ酸は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡＩＢのいずれか１つである；ならびに
（ｘｉｉ）位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１，２４、２７、２８、および２９のいずれか１つ以上での保存的置換
の１つ以上を更に含むことができる。
類縁体は、幾つかの実施態様において、（ｉ）から（ｘｉｉ）の修飾の組み合わせを含む。代替的にまたは追加的に、類縁体は、位置３にアミノ酸修飾（例えば、ＧｌｕによるＧｌｎのアミノ酸修飾）を含むことができ、ここで類縁体は、グルカゴン受容体に対してグルカゴンの活性の１％未満の活性を有する。代替的にまたは追加的に、類縁体は、位置７にアミノ酸修飾（例えば、ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸、例えばＡｂｕまたはＩｌｅによるＴｈｒのアミノ酸置換）を含むことができ、ここで類縁体は、ＧＬＰ−１受容体に対してＧＬＰの活性の１０％未満の活性を有する。
【０２６９】
例示的な実施態様に関して、類縁体は、親水性部分に共有結合することができる。幾つかの実施態様において、類縁体は、位置１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０のいずれかのアミノ酸またはＣ末端アミノ酸における親水性部分に共有結合している。特定の態様において、類縁体は、類縁体の位置２４に共有結合している親水性部分を含む。
【０２７０】
幾つかの実施態様において、親水性部分は、類縁体のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチル−フェニルアラニン残基に共有結合している。Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチル−フェニルアラニンは、配列番号１、２２７、２２８、２２９若しくは２３０に対して天然であるアミノ酸であってもよいし、置換アミノ酸であってもよい。親水性部分がＣｙｓに結合している幾つかの実施態様において、架橋は、下記構造：
【化１３】
2015164922.tif 000014
を含むことができる。
【０２７１】
親水性部分を含む類縁体に関して、親水性部分は、本明細書に記載された任意のものであることができる。例えば、「親水性部分の結合」のセクションの教示を参照すること。幾つかの実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、特定の態様において、約１，０００ダルトンから約４０，０００ダルトン、例えば約２０，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
【０２７２】
例示的な実施態様に関して、類縁体は、Ｃ末端延長部内に、側鎖がアシルまたはアルキル基に共有結合している修飾アミノ酸を含むことができる。アシル化またはアルキル化類縁体は、「アシル化およびアルキル化」のセクションに記載されているアシル化またはアルキル化ペプチドによるものであることができる。幾つかの実施態様において、アシル基は、例えばＣ１０脂肪アシル若しくはアルキル基、Ｃ１２脂肪アシル若しくはアルキル基、Ｃ１４脂肪アシル若しくはアルキル基、Ｃ１６脂肪アシル若しくはアルキル基、Ｃ１８脂肪アシル若しくはアルキル基、Ｃ２０アシル若しくはアルキル基、またはＣ２２アシル若しくはアルキル基などのＣ４〜Ｃ３０脂肪アシル基である。アシルまたはアルキル基は、位置１０若しくは４０のアミノ酸またはＣ末端アミノ酸が含まれるが、これらに限定されない、類縁体の任意のアミノ酸に共有結合することができる。幾つかの実施態様において、アシルまたはアルキル基は、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのアミノ酸、例えばＬｙｓ残基の側鎖に共有結合している。アシルまたはアルキル基は、配列番号１、２２７、２２８、２２９若しくは２３０に対して天然であるアミノ酸に共有結合しているか、または置換アミノ酸に結合することができる。アシルまたはアルキル基は、配列番号９５、９６、１７１若しくは１７２に対して天然であるアミノ酸に共有結合しているか、または置換アミノ酸に結合することができる。
【０２７３】
類縁体がアシルまたはアルキル基を含む上記の例示的な実施態様において、類縁体は、本明細書に記載されているように、スペーサーを介してアシルまたはアルキル基に結合することができる。スペーサーは、例えば、３〜１０原子長であることができ、例えば、アミノ酸（例えば、６アミノヘキサン酸、本明細書に記載される任意のアミノ酸）、ジペプチド（例えば、Ａｌａ−Ａｌａ、βＡｌａ−βＡｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γＧｌｕ−γＧｌｕ）、トリペプチドまたは親水性若しくは疎水性二官能スペーサーであることができる。特定の態様において、スペーサーとアシルまたはアルキル基との全長は、約１４〜約２８原子である。
【０２７４】
幾つかの極めて特定の態様において、本発明の類縁体は、配列番号９９〜１４１、１４４〜１６４、１６６、１９２〜２０７、２０９〜２２１および２２３から成る群から選ばれるか、または配列番号１６７〜１６９、１７３〜１７８および２２５から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含む。
【０２７５】
更に、本発明の類縁体の特定の例には、表１〜３において参照される任意のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７６】
更に別の例示的な実施態様において、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類縁体は、アシルまたはアルキル基（例えば、天然型のアミノ酸に対して非天然であるアシルまたはアルキル基）を含み、ここで、アシルまたはアルキル基はスペーサーに結合しており、（ｉ）スペーサーは、類縁体の位置１０のアミノ酸の側鎖に結合しているか、または（ｉｉ）類縁体は、位置２９のアミノ酸のＣ末端側への１〜２１個のアミノ酸の延長部を含み、スペーサーは、配列番号１の位置３７〜４３の１つに対応するアミノ酸の側鎖に結合しており、ＧＩＰ受容体活性化における類縁体のＥＣ５０は、約１０ｎｍ以下である。
【０２７７】
そのような実施態様において、類縁体は、下記（ｉ）〜（ｉｖ）を有する配列番号１のアミノ酸配列を含むことができる：（ｉ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する位置１でのアミノ酸修飾、（ｉｉ）位置２７、２８および２９のうちの１、２つ、または全てにおけるアミノ酸修飾、（ｉｉｉ）下記（Ａ）〜（Ｃ）のうちの少なくとも一つ：
（Ａ）類縁体は、位置ｉとｉ＋４のアミノ酸の側鎖の間、または位置ｊとｊ＋３のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋（ここで、ｉは１２、１３、１６、１７、２０または２４であり、ｊは１７である）を含む；
（Ｂ）類縁体の位置１６、２０、２１および２４のうちの１、２、３個または全てのアミノ酸が、α，α−二置換アミノ酸で置換されている；あるいは
（Ｃ）類縁体は、下記（ｉ）〜（ｉｉ）を含む、すなわち、（ｉ）式ＩＶ：
【化１４】
2015164922.tif 000015
〔式中、ｎは、１〜７であり、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ18アルキル、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1〜Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ2〜Ｃ5複素環式）、（Ｃ0〜Ｃ4アルキル）（Ｃ6〜Ｃ10アリール）Ｒ7および（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）（Ｃ3〜Ｃ9ヘテロアリール）から成る群から独立して選ばれ、Ｒ7は、ＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は、遊離アミノ基を含む〕で示されるアミノ酸による位置１６のＳｅｒのアミノ酸置換、及び（ｉｉ）アルファ，アルファ二置換アミノ酸による位置２０のＧｌｎのアミノ酸置換；
ならびに
（ｉｖ）６個までの更なるアミノ酸修飾。
【０２７８】
これらの実施態様の類縁体のアルファ，アルファ二置換アミノ酸は、任意のアルファ，アルファ二置換アミノ酸であってもよく、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）や、メチル、エチル、プロピルおよびｎ−ブチルから選ばれる同一若しくは異なる基により二置換されているアミノ酸、またはシクロオクタン若しくはシクロヘプタンにより二置換されているアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、アルファ，アルファ置換アミノ酸はＡＩＢである。
【０２７９】
これらの実施態様の類縁体の式ＩＶのアミノ酸は、例えば式ＩＶのアミノ酸などの任意のアミノ酸であることができ、ここでｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６である。特定の態様において、ｎは２、３、４または５であり、この場合では、アミノ酸は、それぞれＤａｂ、Ｏｒｎ、ＬｙｓまたはホモＬｙｓである。
【０２８０】
上記の例示的な実施態様のいずれかにおいて、ＧＩＰアゴニスト活性を付与する位置１でのアミノ酸修飾は、イミダゾール側鎖を欠いているアミノ酸によるＨｉｓの置換であることができる。位置１でのアミノ酸修飾は、例えば、大型の芳香族アミノ酸によるＨｉｓの置換であることができる。幾つかの実施態様において、大型の芳香族アミノ酸は、例えばＴｙｒを含む、本明細書に記載されている任意のものである。
【０２８１】
また、上記の例示的な実施態様に関して、位置２７、２８および２９のうちの１、２つ、または全てにおけるアミノ酸修飾は、本明細書に記載されるこれらの位置の修飾のいずれかであることができる。例えば、位置２７のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸（Ｌｅｕでもよい）で置換されていることができる、位置２８のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸（Ａｌａでもよい）で置換されていることができる、および／または位置２９のＴｈｒは、小型の脂肪族アミノ酸（Ｇｌｙでもよい）で置換されていることができる。あるいは、類縁体は、位置２７および／または２８にそのようなアミノ酸修飾を含むことができる。
【０２８２】
上記の例示的な実施態様の類縁体は、例えば、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体のいずれかに対して活性を増加若しくは減少する、溶解性を向上させる、作用の持続時間若しくは循環半減期を向上させる、作用の開始を遅延する、または安定性を増加する本明細書の記載されている修飾のいずれかなどの、１〜９個または１〜６個の更なる付加アミノ酸修飾、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個の更なるアミノ酸修飾を更に含むことができる。類縁体は、例えば、位置１２のアミノ酸修飾（Ｉｌｅによる置換、ならびに／あるいは１７および１８のアミノ酸修飾（位置１７のＱによる置換および位置１８のＡによる置換でもよい）、ならびに／あるいはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）若しくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９６）の配列、または配列番号９５若しくは９６に対して保存的な１つ以上の置換を含めた配列の、Ｃ末端への付加を更に含むことができる。類縁体は、以下の修飾：
（ｉ）Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸で置換されている、位置２のＳｅｒ；
（ｉｉ）Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌで置換されている、位置１０のＴｙｒ；
（ｉｉｉ）位置１０のＬｙｓへのアシル基の結合；
（ｉｖ）Ａｒｇで置換されている位置１２のＬｙｓ；
（ｖ）Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、またはＡＩＢで置換されている、位置１６のＳｅｒ；
（ｖｉ）Ｇｌｎで置換されている位置１７のＡｒｇ；
（ｖｉｉ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙで置換されている、位置１８のＡｒｇ；
（ｖｉｉｉ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはＡＩＢで置換されている、位置２０のＧｌｎ；
（ｉｘ）Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている、位置２１のＡｓｐ；
（ｘ）Ｉｌｅで置換されている位置２３のＶａｌ：
（ｘｉ）Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡＩＢで置換されている、位置２４のＧｌｎ；ならびに
（ｘｉｉ）位置２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１，２４、２７、２８、および２９のいずれかでの、保存的置換
のうちの１つ以上を含むことができる。
類縁体は、幾つかの実施態様において、（ｉ）から（ｘｉｉ）の修飾の組み合わせを含む。代替的にまたは追加的に、類縁体は、位置３にアミノ酸修飾（例えば、ＧｌｕによるＧｌｎのアミノ酸置換）を含むことができ、ここで類縁体は、グルカゴン受容体に対するグルカゴンの活性の１％未満の活性を有する。代替的にまたは追加的に、類縁体は、位置７にアミノ酸修飾（例えば、ヒドロキシル基を欠いているアミノ酸、例えばＡｂｕ若しくはＩｌｅによるＴｈｒのアミノ酸置換）、２７若しくは２８アミノ酸ペプチドを生じる、位置２７若しくは２８のアミノ酸のアミノ酸（複数若しくは単数）Ｃ末端の欠失、またはこれらの組み合わせを含むことができ、ここで類縁体は、ＧＬＰ−１受容体に対するＧＬＰ−１活性の約１０％未満の活性を有する。
【０２８３】
例示的な実施態様に関して、類縁体は、親水性部分に共有結合することができる。幾つかの実施態様において、類縁体は、位置１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０のいずれかのアミノ酸またはＣ末端アミノ酸における親水性部分に共有結合している。特定の実施態様において、類縁体は、Ｃ末端延長部（例えば、配列番号９５のアミノ酸配列）と、親水性部分を含むアミノ酸の付加とを含み、それにより、親水性部分が類縁体の位置４０に共有結合している。
【０２８４】
幾つかの実施態様において、親水性部分は、類縁体のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチル−フェニルアラニン残基に共有結合している。Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチル−フェニルアラニンは、グルカゴン配列（配列番号１）に対して天然のアミノ酸であってもよいし、配列番号１の天然アミノ酸を交換するアミノ酸であってもよい。親水性部分がＣｙｓに結合している幾つかの実施態様において、親水性部分への結合は、下記構造：
【化１５】
2015164922.tif 000016
を含むことができる。
【０２８５】
親水性部分を含む類縁体に関して、親水性部分は、本明細書に記載された任意のものであることができる。例えば、「親水性部分の結合」のセクションの教示を参照すること。幾つかの実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、特定の態様において、約１，０００ダルトンから約４０，０００ダルトン、例えば約２０，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
【０２８６】
類縁体が、スペーサーを介して類縁体に結合しているアシルまたはアルキル基を含む例示的な実施態様において、スペーサーは、本明細書に記載されている任意のスペーサーであることができる。スペーサーは、例えば、３〜１０原子長であることができ、例えば、アミノ酸（例えば、６アミノヘキサン酸、本明細書に記載される任意のアミノ酸）、ジペプチド（例えば、Ａｌａ−Ａｌａ、βＡｌａ−βＡｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γＧｌｕ−γＧｌｕ）、トリペプチドまたは親水性若しくは疎水性二官能スペーサーであることができる。特定の態様において、スペーサーとアシルまたはアルキル基との全長は、約１４〜約２８原子である。
【０２８７】
アシルまたはアルキル基は、天然型のアミノ酸に対して非天然であるアシルまたはアルキル基などの、本明細書に記載されている任意のアシルまたはアルキル基である。アシルまたはアルキル基は、幾つかの実施態様において、例えばＣ１０脂肪アシル若しくはアルキル基、Ｃ１２脂肪アシル若しくはアルキル基、Ｃ１４脂肪アシル若しくはアルキル基、Ｃ１６脂肪アシルもしくはアルキル基、Ｃ１８脂肪アシル若しくはアルキル基、Ｃ２０アシル若しくはアルキル基、またはＣ２２アシルもしくはアルキル基などのＣ４〜Ｃ３０脂肪アシル基、あるいはＣ４〜Ｃ３０アルキル基である。特定の実施態様において、アシル基はＣ１２〜Ｃ１８脂肪アシル基（例えばＣ１４またはＣ１６脂肪アシル基）である。
【０２８８】
幾つかの実施態様において、類縁体の位置２９のアミノ酸のＣ末端側への約１〜約２１個のアミノ酸の延長部は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９６）（ここでＸは任意のアミノ酸である）またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１７０）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１７１）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号１７２）（ここでＸは、Ｇｌｙまたは小型の脂肪族若しくは非極性若しくは僅かに極性のアミノ酸である）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様において、約１〜約２１個のアミノ酸は、配列番号９５、９６、１７０、１７１または１７２に対して保存的な１つ以上の置換を含めた配列を含むことができる。幾つかの実施態様において、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、Ｃ末端延長類縁体の位置３７、３８、３９、４０、４１、４２または４３に配置されている。特定の態様において、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、Ｃ末端延長類縁体の位置４０に配置されている。
【０２８９】
＜医薬組成物および治療方法＞
幾つかの態様において、本発明は、好ましくは滅菌され、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の純度レベルを有する、本明細書に開示されている任意の新規グルカゴンペプチドと、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、少なくともＡの濃度でグルカゴンペプチドを含有することができ、ここでＡは、０．００１ｍｇ／ｍｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ、２２ｍｇ／ｍｌ、２３ｍｇ／ｍｌ、２４ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上である。他の実施態様において、そのような組成物は、最大でもＢの濃度でグルカゴンペプチドを含有することができ、ここでＢは、３０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、２４ｍｇ／ｍｌ、２３ｍｇ／ｍｌ、２２ｍｇ／ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌまたは０．１ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施態様において、組成物はＡ〜Ｂのｍｇ／ｍｌ、例えば０．００１〜３０．０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲でグルカゴンペプチドを含有することができる。一つの実施態様において、医薬組成物は、滅菌され場合より多様な容器に保存されている水性液剤を含む。本発明の化合物を、幾つかの実施態様おいて使用して、注射用の予備処方液剤を調製することができる。別の実施態様において、医薬組成物は凍結乾燥粉末剤を含む。医薬組成物を、患者に組成物を投与する使い捨て装置を含むキットの一部として更に包装することができる。容器またはキットにラベルを付けて周囲温度または冷蔵温度で保存することができる。
【０２９０】
グルカゴンペプチドを、静脈内、腹腔内、皮下若しくは筋肉内などの非経口、鞘内、経皮、直腸内、経口、鼻腔内または吸入を含む、任意の標準的投与経路を使用して、患者に投与することができる。一つの実施態様において、組成物は皮下または筋肉内投与される。
【０２９１】
一つの実施態様において、キットは、患者にグルカゴン組成物を投与する装置、例えば、シリンジニードル、ペン型装置、ジェット式注射器または他の無針注射器を備える。キットは、代替的また追加的に、１つ以上の容器、例えば、バイアル、チューブ、ボトル、単室または複室型の充填済シリンジ、カートリッジ、注入ポンプ（体外型または埋め込み型）、ジェット式注射器、充填済ペン型装置などを含むことができ、更にその中に、グルカゴンペプチドを凍結乾燥形態または水性液剤形態で含んでもよい。好ましくは、キットは使用説明書も含む。幾つかの実施態様において、キットの装置は、エアゾール・ディスペンサー装置であり、ここで組成物はエアゾール装置内に予め包装されている。別の実施態様において、キットは、シリンジおよび針を含み、一つの実施態様において、滅菌グルカゴン組成物は、シリンジの中に予め包装されている。
【０２９２】
一つの実施態様によると、医薬組成物が提供され、組成物は本開示のＧＩＰ活性グルカゴン類縁体またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む。医薬組成物は、例えば以下の様な、任意の薬学的に許容される成分を含むことができる：酸化剤、添加剤、吸着剤、エアゾール噴射剤、排気剤、アルキル化剤、凝結防止剤、抗凝固剤、抗菌性保存剤、酸化防止剤、消毒剤、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、被覆剤、着色剤、乾燥剤、洗剤、希釈剤、殺菌剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、色素、緩和剤、乳化剤、乳化安定剤、充填剤、皮膜形成剤、風味強化剤、風味剤、流動性向上剤、ゲル化剤、造粒剤、保湿剤、潤滑剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏、油性ビヒクル、有機基剤、芳香基剤、顔料、可塑剤、研磨剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定剤、坐薬基剤、表面活性剤、界面活性剤、懸濁剤、甘味剤、治療剤、増粘剤、等張化剤、毒性剤、粘度増加剤、吸水剤、水混和性共溶媒、硬水軟化剤、又は、湿潤剤。
【０２９３】
幾つかの実施態様において、医薬組成物は、以下の構成成分のうちの任意の１つ又は組み合わせを含む：アカシア、アセスルファムカリウム、アセチルトリブチルシトレート、アセチルトリエチルシトレート、寒天、アルブミン、アルコール、無水アルコール、変性アルコール、希アルコール、アロイリチン酸、アルギニン酸、脂肪族ポリエステル、アルミナ、水酸化アルミニウム、ステアリン酸アルミニウム、アミロペクチン、α−アミロース、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、アスパルテーム、注射用静菌性水、ベントナイト、ベントナイトマグマ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、ブロノポール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチルパラベン、ブチルパラベンナトリウム、アルギン酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、炭酸カルシウム、シクラミン酸カルシウム、無水第二リン酸カルシウム、脱水第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸カルシウム半水和物、カノーラ油、カルボマー、二酸化炭素、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、β−カロテン、カラギーナン、ヒマシ油、硬化ヒマシ油、カチオン性乳化ロウ、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、微晶質セルロース、粉末セルロース、ケイ化微晶質セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、セトステアリルアルコール、セトリミド、セチルアルコール、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、コレステロール、酢酸クロルヘキシジン、グルコン酸クロルヘキシジン、塩酸クロルヘキシジン、クロロジフルオロエタン（ＨＣＦＣ）、クロロジフルオロメタン、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、クロロフェノキシエタノール、クロロキシレノール、コーンシロップ固形物、無水クエン酸、クエン酸一水和物、カカオ脂、着色剤、トウモロコシ油、綿実油、クレゾール、ｍ−クレゾール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロスカメロースナトリウム、クロスポビドン、シクラミン酸、シクロデキストリン、デキストラン、デキストリン、デキストロース、デキストロース無水物、ジアゾリジニル尿素、フタル酸ジブチル、セバシン酸ジブチル、ジエタノールアミン、フタル酸ジエチル、ジフルオロエタン（ＨＦＣ）、ジメチル−β−シクロデキストリン、Captisol（登録商標）のようなシクロデキストリン型化合物、ジメチルエーテル、フタル酸ジメチル、エデト酸二カリウム、エデト酸二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、ドキュセートカルシウム、ドキュセートカリウム、ドキュセートナトリウム、没食子酸ドデシル、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸、エグルミン、エチルアルコール、エチルセルロース、没食子酸エチル、ラウリン酸エチル、エチルマルトール、オレイン酸エチル、エチルパラビン、エチルパラベンカリウム、エチルパラベンナトリウム、エチルバニリン、フルクトース、フルクトース液、粉砕フルクトース、発熱物質無含有フル���トース、粉末フルクトース、フマル酸、ゼラチン、グリコール、液状グルコース、飽和植物性脂肪酸のグリセリド混合物、グリセリン、ベヘン酸グリセリル、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、自己乳化グリセリルモノステアレート、グリセリルパルミトステアレート、グリシン、グリコール、グリコフロール、グアーガム、ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＣ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、高級フルクトースシロップ、ヒト血清アルブミン、炭化水素（ＨＣ）、希塩酸、ＩＩ型硬化植物油、ヒドロキシエチルセルロース、２−ヒドロキエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、イミド尿素、インジゴカルミン、イオン交換体、酸化鉄、イソプロピルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、等張食塩水、カオリン、乳酸、ラクチトール、ラクトース、ラノリン、ラノリンアルコール、脱水ラノリン、レクチン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、炭酸マグネシウム、規定炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム無水物、炭酸マグネシウム水酸化物、水酸化マグネシウム、ラウリル硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム無水物、リンゴ酸、モルト、マルチトール、マルチトール溶液、マルトデキストリン、マルトール、マルトース、マンニトール、中鎖トリグリセリド、メグルミン、メントール、メチルセルロース、メタクリル酸メチル、オレイン酸メチル、メチルパラベン、メチルパラベンカリウム、メチルパラベンナトリウム、微晶質セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウム、鉱油、軽鉱油、鉱油及びラノリンアルコール、油、オリーブ油、モノエタノールアミン、モンモリロナイト、没食子酸オクチル、オレイン酸、パルミチン酸、パラフィン、ヤシ油、ペトロラクタム、ペトロラクタム及びラノリンアルコール、製剤釉薬、フェール、液状フェノール、フェノキシエタノール、フェノキシプロパノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、ポラクリリン、ポラクリリンカリウム、ポロキサマー、ポリデキストロース、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリアクリレート、ポリエチレン−ポリプロピレンブロックポリマー、ポリメタクリレート、ポリエチレンアルキルエーテル、ポリエチレンヒマシ油誘導体、ポリエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリエチレンステアレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アルギン酸カリウム、安息香酸カリウム、重炭酸カリウム、重亜硫酸カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、クエン酸カリウム無水物、リン酸水素カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、プロピオン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、ポビドン、プロパノール、プロピオン酸、プロピレンカーボネート、プロピレングリコール、アルギン酸プロピレングリコール、没食子酸プロピル、プロピルパラベン、プロピルパラベンカリウム、プロピルパラベンナトリウム、硫酸プロタミン、ナタネ油、リンゲル液、サッカリン、サッカリンアンモニウム、サッカリンカルシウム、サッカリンナトリウム、ベニバナ油、サポナイト、血清タンパク質、ゴマ油、コロイドシリカ、コロイド二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、無水クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム脱水物、塩化ナトリウム、シクラミン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、硫酸ドデシルナトリウム、硫酸ラウリルナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、無水第三リン酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、フマル酸ステアリルナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビタンエステル（ソルビタン脂肪エステル）、ソルビトール、７０％ソルビトール溶液、ダイズ油、クジラロウ、デンプン、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルファ化デンプン、滅菌トウモロコシデンプン、ステアリン酸、精製ステアリン酸、ステアリルアルコール、スクロース、糖、圧縮性糖、粉糖、糖球体、転化糖、Sugartab、スーパーイエローＦＣＦ、合成パラフィン、タルク、酒石酸、タルトラジン、テトラフルオロエタン（ＨＦＣ）、カカオ脂、チメロサール、二酸化チタン、アルファトコフェロール、酢酸トコフェリル、アルファトコフェリル酸スクシネート、ベータ−トコフェロール、デルタ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール、トラガカント、トリアセチン、クエン酸トリブチル、トリエタノールアミン、クエン酸トリエチル、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチルテトラデシルアンモニウムブロミド、トリス緩衝液、エデト酸三ナトリウム、バニリン、Ｉ型硬化植物油、水、軟水、硬水、二酸化炭素無含有水、発熱物質無含有水、注射用水、吸入用滅菌水、注射用滅菌水、潅注用滅菌水、ロウ、アニオン性乳化ロウ、カルナウバロウ、カチオン性乳化ロウ、セチルエステルロウ、微晶質ロウ、非イオン性乳化ロウ、坐剤用ロウ、白ロウ、黄ロウ、白色ペトロラクタム、羊毛脂、キサンタンガム、キシリトール、ゼイン、プロピオン酸亜鉛、亜鉛塩、ステアリン酸亜鉛、又は、Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000）（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）における任意の賦形剤。Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980）（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）は、薬学的に許容される組成物の配合に使用される多様な構成成分及びそれらを調製する既知の技術を開示する。従来の作用物質のいずれについても、医薬組成物と不適合である場合を除いて、医薬組成物におけるその使用が考慮される。補助活性成分を組成物に組み込むこともできる。
【０２９４】
本明細書に開示されている医薬製剤は、下記に記載されているように、短期作用、迅速放出、長期作用、又は持続的放出であるように設計することができる。医薬製剤を即時放出、制御放出、又は徐放性放出用として配合することもできる。本組成物は、更に、保存性及び／又は送達効果の延長をもたらすために、例えばミセル若しくはリポソーム、又は他の封入形態を含んでもよいし、或いは延長放出形態で投与してもよい。開示されている医薬製剤を、任意のレジメンに従って、例えば毎日（１日あたり１回、１日あたり２回、１日あたり３回、１日あたり４回、１日あたり５回、１日あたり６回）、２日毎に１回、３日毎に１回、４日毎に１回、５日毎に１回、６日毎に１回、毎週、隔週、３週間毎に１回、毎月、又は隔月に、投与することができる。
【０２９５】
幾つかの実施態様において、前述の構成成分は、任意の濃度、例えば少なくともＡの濃度、で医薬組成物に含まれてもよく、ここでＡは、０．０００１％w/v、０．００１％w/v、０．０１％w/v、０．１％w/v、１％w/v、２％w/v、５％w/v、１０％w/v、２０％w/v、３０％w/v、４０％w/v、５０％w/v、６０％w/v、７０％w/v、８０％w/v、又は９０％w/vである。幾つかの実施態様において、前述の構成成分は、任意の濃度、例えば最大でＢの濃度、で医薬組成物に含まれてもよく、ここでＢは、９０％w/v、８０％w/v、７０％w/v、６０％w/v、５０％w/v、４０％w/v、３０％w/v、２０％w/v、１０％w/v、５％w/v、２％w/v、１％w/v、０．１％w/v、０．０１％w/v、０．００１％w/v、又は０．０００１％である。他の実施態様において、前述の構成成分は、例えば約Ａから約Ｂのような、任意の濃度範囲で医薬組成物に含まれることができる。幾つかの実施態様において、Ａは０．０００１％であり、Ｂは９０％である。
【０２９６】
医薬組成物は、生理学的に適合するｐＨを達成するように配合することができる。幾つかの実施態様において、医薬組成物のｐＨは、製剤又は投与経路に応じて、少なくとも５、少なくとも５．５、少なくとも６、少なくとも６．５、少なくとも７、少なくとも７．５、少なくとも８、少なくとも８．５、少なくとも９、少なくとも９．５、少なくとも１０、又は少なくとも１０．５からｐＨ１１以下であることができる。特定の実施態様において、医薬組成物は、生理学的に適合するｐＨを達成するために、１つ以上の緩衝剤を含むことができる。緩衝剤には、所望のｐＨで緩衝することができる任意の化合物、例えば、リン酸緩衝液（例えばＰＢＳ）、トリエタノール、トリス、ビシン、ＴＡＰＳ、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸、ＭＥＳ、及びその他、が含まれていてもよい。特定の実施態様において、緩衝液の強度は、少なくとも０．５mM、少なくとも１mM、少なくとも５mM、少なくとも１０mM、少なくとも２０mM、少なくとも３０mM、少なくとも４０mM、少なくとも５０mM、少なくとも６０mM、少なくとも７０mM、少なくとも８０mM、少なくとも９０mM、少なくとも１００mM、少なくとも１２０mM、少なくとも１５０mM、又は少なくとも２００mMである。幾つかの実施態様において、緩衝液の強度は、３００mM以下（例えば、最大で２００mM、最大で１００mM、最大で９０mM、最大で８０mM、最大７０mM、最大で６０mM、最大で５０mM、最大で４０mM、最大で３０mM、最大で２０mM、最大で１０mM、最大で５mM、最大で１mM）である。
【０２９７】
ＧＩＰ／ＧＬＰ−１コアゴニスト、グルカゴン／ＧＩＰコアゴニスト、およびグルカゴン／ＧＩＰ／ＧＬＰ−１トリアゴニストであるようなグルカゴンペプチドを、これらそれぞれの活性が有用であると以前に記載されている任意の適応症に使用することができる。例えば、グルカゴン活性は、インスリンを緩衝するため、または放射線検査の際に消化管の運動を減少するために、グルコースレベルを増加することができる。ＧＬＰ−１活性は、グルコースレベルを低下することができ、この活性は、高血糖症、例えば糖尿病の治療に有用である。ＧＬＰ−１活性は、例えば食欲を減少することによって、減量を誘導する、または体重増加を予防することもできる。ＧＩＰ活性も、グルコースレベルを低下することができ、この活性は、高血糖症、例えば糖尿病の治療に有用である。
【０２９８】
ＧＩＰ／ＧＬＰ−１コアゴニストおよびグルカゴン／ＧＩＰ／ＧＬＰ−１トリアゴニストは、減量を誘導するため、または体重増加を予防するため、また糖尿病を含む高血糖症を治療するために特に有利である。本明細書に開示されるインビボデータは、ＧＩＰアゴニスト活性とＧＬＰ−１アゴニスト活性の組み合わせが、ＧＬＰ−１単独よりも体重低減に対して大きな効果を生じることを示す。この活性は、ＧＩＰの拮抗が毎日の食物摂取および体重を低減するため、ならびにインスリン感受性およびエネルギー消費量を増加するために望ましいという当該技術の教示の観点から、特に予想外であった。（Irwin et al., Diabetologia 50: 1532-1540(2007)；およびAlthage et al.,J Biol Chem, e-publication on April 17,2008）。
【０２９９】
本明細書に開示されるインビボデータは、ＧＩＰアゴニスト活性とＧＬＰ−１アゴニスト活性の組み合わせがグルコースレベルを低下することも示す。
【０３００】
したがって、本明細書に記載されているグルカゴンペプチドは、体重を低減若しくは維持すること、または高血糖症を治療すること、または血中グルコースレベルを低減すること、または血中グルコースレベルを正常化する、および／または安定化することに使用されることが予測される。
【０３０１】
幾つかの実施態様において、高血糖症を治療する方法、または体重増加を低減する若しくは減量を誘導する方法であって、本発明のグルカゴンペプチドを含む水性液剤の有効量を投与することを含む方法が提供される。更なる実施態様において、従来の用量または低減された用量のインスリンと本発明のグルカゴンペプチドとを同時投与することを含む、糖尿病の治療方法が提供される。インスリンの同時投与を伴うことなく、本発明のグルカゴンペプチドにより糖尿病を治療する方法も提供される。
【０３０２】
高血糖症を治療するそのような方法は、インスリン依存性またはインスリン非依存性のいずれかの糖尿病、Ｉ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病または妊娠糖尿病を含む多様な種類の高血糖症に有用であること、ならびに腎障害、網膜症および血管疾患を含む糖尿病の合併症を低減することに有用であることが予想される。
【０３０３】
食欲を減退するまたは体重の減少を促進する方法は、体重を低減する、体重増加を防止する、または薬剤誘導肥満を含む多様な原因の肥満を治療する、ならびに血管疾患（冠動脈疾患、発作、末梢血管疾患、虚血再灌流など）、高血圧、ＩＩ型糖尿病の発症、高脂血症および筋骨格系疾患を含む肥満に関連する合併症を低減することに有用であることが予想される。
【０３０４】
代謝症候群Ｘ、インスリン抵抗症候群、またはＲｅａｖｅｎ症候群としても知られているメタボリックシンドロームは、５千万人を超えるアメリカ人が罹患している疾患である。メタボリックシンドロームは、典型的には、以下の危険因子の少なくとも３つ以上の集団により特徴付けられる：（１）腹部肥満（腹部およびその周りの過剰脂肪組織）、（２）アテローム性異脂肪血症（動脈の壁にプラークの蓄積を増強する、高トリグリセリド、低ＨＤＬコレステロールおよび高ＬＤＬコレステロールを含む血中脂肪障害）、（３）血圧の上昇、（４）インスリン抵抗性またはグルコース不耐性、（５）血栓形成促進状態（例えば、高濃度の血中フィブリノゲンまたはプラスミノゲン活性化剤阻害剤−１）、ならびに（６）炎症促進性状態（例えば、血中Ｃ反応性タンパク質の上昇）。他の危険因子には、加齢、ホルモンの不均衡および遺伝的素因が含まれうる。
【０３０５】
メタボリックシンドロームは、冠動脈性心疾患の危険性、ならびに、卒中や、アテローム性動脈硬化症（ＡＳＣＶＤ）と呼ばれる末梢血管疾患のような、血管プラークの蓄積に関連する他の障害の危険性の増加に関連する。メタボリックシンドロームの患者は、インスリン抵抗性状態の初期段階から完全なＩＩ型糖尿病まで進行し、ＡＳＣＶＤの危険性を更に増加する。特定の理論に束縛されることを意図せずに、インスリン抵抗性、メタボリックシンドロームおよび血管疾患の間の関係は、インスリン刺激血管拡張障害、増強された酸化ストレスに起因するＮＯ利用能のインスリン抵抗性関連の低減、およびアジポネクチンのような脂肪細胞誘導ホルモンの異常を含む、一つ以上の同時発病機構を伴いうる（Lteif and Mather,Can.J.Cardiol.20(suppl.B):66B-76B(2004)）。
【０３０６】
２００１年の全米コレステロール教育プログラムの成人治療パネル（ＡＴＰＩＩＩ）によると、同じ個人において以下のいずれか３つの特徴がメタボリックシンドロームの基準を満たす：（ａ）腹部肥満（男性では１０２ｃｍを超える、女性では８８ｃｍを超える胴回り）；（ｂ）血清トリグリセリド（１５０ｍｇ／ｄｌ以上）；（ｃ）ＨＤＬコレステロール（男性では４０ｍｇ／ｄｌ以下、女性では５０ｍｇ／ｄｌ以下）；（ｄ）血圧（１３０／８５以上）；ならびに（ｅ）空腹時血糖（１１０ｍｇ／ｄｌ以上）。世界保険機構（ＷＨＯ）によると、以下の少なくともいずれか２つの基準を有する高インスリンレベル（空腹時血糖の上昇または食後血糖のみの上昇）を有する個人は、メタボリックシンドロームの基準を満たす：（ａ）腹部肥満（胴回りと臀部の比が０．９超、肥満指数が少なくとも３０ｋｇ／ｍ2または胴回りの寸法が３７インチ超）；（ｂ）コレステロールパネルが少なくとも１５０ｍｇ／ｄｌのトリグリセリドレベルまたは３５ｍｇ／ｄｌより低いＨＤＬコレステロールを示す；（ｃ）血圧が１４０／９０以上または高血圧の治療中。（Mathur, Ruchi, "Metabolic Syndrome," ed. Shiel, Jr., William C., MedicineNet.com, May 11, 2009）。
【０３０７】
本明細書における目的のために、ある個人が、２００１年の全米コレステロール教育プログラムの成人治療パネル（ＡＴＰＩＩＩ）またはＷＨＯにより設定された基準のいずれかまたは両方の基準を満たす場合、その個人は、メタボリックシンドロームに罹患していると考慮される。
【０３０８】
特定の理論に束縛されることなく、本明細書に記載されるグルカゴンペプチドは、メタボリックシンドロームの治療に有効である。したがって、本発明は、被験者において、メタボリックシンドロームを予防若しくは治療する、またはその危険因子のうちの１、２、３つ若しくはそれ以上を低減する方法であって、メタボリックシンドロームまたはその危険因子を予防または治療するのに有効な量の本明細書に記載されるグルカゴンペプチドを、被験者に投与することを含む方法を提供する。
【０３０９】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、単純な脂肪肝（脂肪変性）から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、硬変（肝臓の不可逆性進行瘢痕化）までの範囲の広範囲の肝疾患を意味する。ＮＡＦＬＤの全ての病期は、共通して、肝臓の細胞（肝細胞）における脂肪の蓄積（脂肪浸潤）を有する。単純な脂肪肝は、炎症または瘢痕化を有さない肝臓の細胞に特定の種類の脂肪、トリグリセリドが異常蓄積することである。ＮＡＳＨでは、脂肪蓄積は、肝臓の多様な程度の炎症（肝炎）および瘢痕化（線維症）に関連する。炎症性細胞は肝臓細胞を破壊することができる（肝細胞壊死）。用語「脂肪性肝炎」および「脂肪壊死」において、脂肪（steato）は、脂肪浸潤を意味し、肝炎は、肝臓における炎症を意味し、壊死は、破壊された肝臓細胞を意味する。ＮＡＳＨは、最終的に、肝臓の瘢痕化（線維症）、次に不可逆性で進行型の瘢痕化（硬変）をもたらす可能性がある。ＮＡＳＨにより引き起こされる硬変は、ＮＡＦＬＤの範囲において最終的で最も重篤な病期である。（Mendler, Michel, "Fatty Liver: Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) and Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH)," ed. Schoenfield, Leslie J., Medicine Net.com, August 29,2005）。
【０３１０】
アルコール性肝疾患またはアルコール誘導肝疾患は、アルコールの過剰消費に関連するまたはより引き起こされる、３つの病理的に異なる肝臓疾患：脂肪肝（脂肪変性）、慢性または急性肝炎および硬変、を包含する。アルコール性肝炎は、実験室試験における異常が疾患の唯一の指標である中程度の肝炎から、横断（ビリルビンの保持により引き起こされる黄色皮膚）、肝性脳症（肝不全により引き起こされる神経性機能不全）、腹水症（腹部における流体の蓄積）、出血性食道静脈瘤（食道の静脈瘤）、血液凝固異常および昏睡のような合併症を伴う重篤な肝機能不全までの範囲でありうる。組織学的には、アルコール性肝炎は、肝細胞の気球状変性、好中球による、時にはマロリ小体による炎症（細胞中間体フィラメントタンパク質の異常蓄積）による特徴的な外観を有する。硬変は、線維症と組み合わされた、肝臓に広範囲に分布した小結節により解剖学的に特徴付けられる。（Worman, Howard J., "Alcoholic Liver Disease", Columbia University Medical Center website）。
【０３１１】
特定の理論に束縛されることなく、本明細書に記載されるグルカゴンペプチドは、例えば、脂肪変性、脂肪性肝炎、肝炎、肝臓炎症、ＮＡＳＨ、硬変またはこれらの合併症を含む、アルコール性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、またはこれらの任意の病期の治療に有用である。したがって、本発明は、被験者においてアルコール性肝疾患、ＮＡＦＬＤまたはこれらの任意の病期を予防または治療する方法であって、アルコール性肝疾患、ＮＡＦＬＤまたはこれらの任意の病期を予防または治療するのに有効な量の本明細書に記載されるグルカゴンペプチドを被験者に投与することを含む方法を提供する。そのような治療方法には、以下のうちの１、２、３つまたはそれ以上の低減が含まれる：肝臓の脂肪含有量、硬変の発症または進行、肝細胞癌の発症、炎症の兆候、例えば異常な肝酵素レベル（例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡＳＴおよび／またはアラニンアミノトランスフェラーゼＡＬＴまたはＬＤＨ）、血清フェリチンの上昇、血清ビリルブビンの上昇ならびに／あるいは線維症の兆候、例えばＴＧＦ−ベータレベルの上昇。好ましい実施態様において、グルカゴンペプチドを使用して、単純な脂肪肝（脂肪変性）を超えて進行し、炎症または肝炎の兆候を示す患者を治療する。そのような方法は、例えば、ＡＳＴおよび／またはＡＬＴレベルの低減をもたらす場合がある。
【０３１２】
本発明のグルカゴンペプチドを、単独でまたは他の抗糖尿病若しくは抗肥満剤と組み合わせて投与することができる。当該技術において既知であるか、または調査中の抗糖尿病剤としては、以下のものが挙げられる：インスリン；トルブタミド（Ｏｒｉｎａｓｅ）、アセトヘキサミド（Ｄｙｍｅｌｏｒ）、トラザミド（Ｔｏｌｉｎａｓｅ）、クロルプロパミド（Ｄｉａｂｉｎｅｓｅ）、グリピジド（Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ）、グリブリド（Ｄｉａｂｅｔａ、Ｍｉｃｒｏｎａｓｅ、Ｇｌｙｎａｓｅ）、グリメピリド（Ａｍａｒｙｌ）またはグリクラジド（Ｄｉａｍｉｃｒｏｎ）などのスルホニル尿素；レパグリニド（Ｐｒａｎｄｉｎ）またはナテグリニド（Ｓｔａｒｌｉｘ）などのメグリチニド；メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）またはフェンホルミンなどのビグアナイド；ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）、ピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ）若しくはトログリタゾン（Ｒｅｚｕｌｉｎ）または他のＰＰＡＲγ阻害剤などのチアゾリジンジオン；ミグリトール（Ｇｌｙｓｅｔ）、アルカボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ／Ｇｌｕｃｏｂａｙ）などの炭水化物の消化を阻害するアルファグルコシダーゼ阻害剤；エクセナチド（Ｂｙｅｔｔａ）またはプラムリンチド；ビルダグリプチンまたはシタグリプチンのようなジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害剤；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコーストランスポーター１）阻害剤；グルコキナーゼ活性化剤（ＧＫＡ）；グルカゴン受容体アンタゴニスト（ＧＲＡ）；またはＦＢＰａｓｅ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）阻害剤。
【０３１３】
当該技術において既知であるか、または調査中の抗肥満剤としては、以下のものが挙げられる：レプチンおよび線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）；フェネチルアミン型刺激薬、フェンテルミン（更に、フェンフルラミンまたはデクスフェンフルラミンを伴ってもよい）、ジエチルプロピオン（Ｔｅｎｕａｔｅ（登録商標））、フェンジメトラジン（Ｐｒｅｌｕ−２（登録商標）、Ｂｏｎｔｒｉｌ（登録商標））、ベンズフェタミン（Ｄｉｄｒｅｘ（登録商標））、シブトラミン（Ｍｅｒｉｄｉａ（登録商標）、Ｒｅｄｕｃｔｉｌ（登録商標））などの食欲抑制薬；リモナバン（Ａｃｏｍｐｌｉａ（登録商標））、他のカンナビノイドレセプターアンタゴニスト；オキシントモジュリン；塩酸フルオキセチン（Ｐｒｏｚａｃ）；Ｑｎｅｘａ（トピラメートおよびフェンテルミン）、Ｅｘｃａｌｉａ（ブプロピオンおよびゾニサミド）またはＣｏｎｔｒａｖｅ（ブプロピオンおよびナルトレキソン）；あるいはゼニカル（Ｏｒｌｉｓｔａｔ）若しくはＣｅｔｉｌｉｓｔａｔ（ＡＴＬ−９６２としても知られている）またはＧＴ３８９−２５５と類似しているリパーゼ阻害剤。
【０３１４】
低血糖症の患者においてグルコースを上昇させるグルカゴンの効果を保持する、本発明のグルカゴンペプチドを、低血糖症を治療すること、例えば急性、周期的または夜間低血糖症を予防または治療することに使用できる。そのようなグルカゴンペプチドを、糖尿病患者においてインスリンの作用を緩衝するため、および安定した血中グルコースレベルを維持するために、インスリンと一緒に投与することもできる。そのような実施態様では、インスリン依存性患者において血中グルコースレベルを調節する、改善された方法が提供される。本開示のグルカゴンペプチドは、単一組成物としてインスリンと同時投与することや、別々の液剤として同時に投与することができるし、インスリンとグルカゴンペプチドを互いに異なる時間で投与することもできる。幾つかの実施態様において、この方法は、糖尿病を制御するのに治療上有効な量でインスリンを投与する工程、および低血糖症の予防に治療上有効な量で本開示の新規修飾グルカゴンペプチドを投与する工程を含み、前記投与工程は、互いに１２時間以内に実施される。修飾グルカゴンペプチドと投与インスリンの正確な比は、部分的には患者のグルカゴンレベルを決定すること、および他の臨床パラメーターによって決まる。血中レベルを「正常化する」とは、血中グルコースレベルを正常に戻す（例えば、正常より高い場合は血中グルコースレベルを下げる、または正常より低い場合は血中グルコースレベルを上げる）ことを意味する。血中グルコースレベルを「安定化する」とは、血中グルコースレベルの最大変動を、一定の期間にわたって、例えば８時間、１６時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間または１週間にわたって、低減することを意味する。例えば、グルカゴンペプチドの投与は、グルカゴンペプチドの投与の不在の場合よりも、血中グルコースレベルをグルコース値の正常範囲の近くに経時的に維持させる。
【０３１５】
所望の活性を保持する本発明のグルカゴンペプチドを、放射線用途において消化管に一過性麻痺を誘導すること、またはグルカゴンの低血中レベルによりもたらされる他の代謝疾患を治療することに使用できる。そのような実施態様において、腸管の一過性麻痺を誘導する方法が提供される。この方法は、本明細書に開示されている１つ以上のグルカゴンペプチドを患者に投与する工程を含む。
【０３１６】
異なる態様において、本発明は、体重増加を低減する、または減量を誘導する、または高血糖症を治療する方法であって、ＧＩＰ受容体アゴニスト分子およびＧＬＰ−１受容体アゴニスト分子を、体重増加を低減する、または減量を誘導する、または食欲を減少するのに有効な量で、それを必要とする患者に同時投与することを含む方法を提供する。２つの分子を同じ組成物中で一緒にまとめることができる。あるいは、ＧＩＰとＧＬＰ−１の両方の受容体を活性化する一つの分子を、そのような方法において投与することができる。多様な受容体アゴニスト特性、すなわち受容体活性化特性の組み合わせは、予想外の付加的若しくは相乗的効果または他の予想外の臨床的利益（複数または単数）をもたらす。従来用量のインスリン、若しくは低減用量のインスリンを伴う投与、またはインスリンなしの投与は、そのような方法に考慮される。例示的なＧＩＰ受容体アゴニスト分子には、ＧＩＰやＧＩＰ類縁体、例えば、最大適合となるよう配列比較を行うと、可視検査により少なくとも５０％、６０％、７０％または８０％の配列相同性を保持するようなＧＩＰ類縁体が含まれる。例示的なＧＬＰ−１受容体アゴニスト分子には、ＧＬＰ−１やＧＬＰ−１類縁体、例えば、最大適合となるよう配列比較を行うと、可視検査により少なくとも５０％、６０％、７０％または８０％の配列相同性を保持するようなＧＬＰ−１類縁体、最大適合となるよう配列比較を行うと、可視検査により少なくとも５０％、６０％、７０％または８０％の配列相同性を保持するようなエキセンディン−４類縁体、またはこれらの誘導体、が含まれる。両方の活性を示す例示的な分子には、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体の両方を活性化するＧＬＰ−１類縁体、ＧＩＰとＧＬＰ−１との融合体、またはＧＩＰ類縁体とＧＬＰ−１類縁体との融合体、あるいはこれらの化学的修飾された誘導体が含まれる。
【０３１７】
低血糖症の治療が含まれるが、但しこれに限定されない、本発明による治療方法は、静脈内、腹腔内、皮下若しくは筋肉内などの非経口、鞘内、経皮、直腸内、経口、鼻腔内または吸入を含む、任意の標準的投与経路を使用して、本開示のグルカゴンペプチドを患者に投与する工程を含むことができる。
【０３１８】
幾つかの実施態様によると、そのような方法から排除されているものは、各々の疾患に応じて、その特定の疾患を治療するのに有用であることが従来技術において開示されている、任意のグルカゴン類縁体またはＧＬＰ−１類縁体である。別の実施態様において、糖尿病の治療においてＧＬＰ−１アゴニストとグルカゴンアンタゴニストの両方として作用する米国特許第６，８６４，０６９号に記載されるペプチドも排除される。別の実施態様において、本発明は、Unson et al., J. Biol. Chem., 264: 789-794 (1989)、Ahn et al., J. Med. Chem., 44: 3109-3116(2001)およびSapse et al., Mol. Med., 8(5): 251-262 (2002)に記載されているアゴニストなどの、糖尿病を治療するグルカゴンアンタゴニストの使用を排除することができる。幾つかの実施態様において、オキシントモジュリンまたはオキシントモジュリン（配列番号９７）の８Ｃ末端アミノ酸を含有するグルカゴンペプチドが排除される。
【０３１９】
小腸において見出された天然型の消化ホルモンであるオキシントモジュリンは、ラット又はヒトに投与されたときに減量を引き起こすことが報告されている（Diabetes 2005; 54:2390-2395を参照すること）。オキシントモジュリンは、グルカゴン（すなわち、配列番号１）の２９アミノ酸配列と、その後に続く配列番号９７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）の８アミノ酸カルボキシ末端延長部とを有する、３７アミノ酸ペプチドである。本発明は、本明細書に記載されているグルカゴン類縁体が、この８アミノ酸カルボキシ末端延長部（配列番号９７）と結合してもよいということを考慮するが、本発明は、幾つかの実施態様において、配列番号９７の８個の連続するカルボキシアミノ酸を欠いているグルカゴンペプチドも特に考慮する。
【０３２０】
以下のペプチドのいずれも本発明の化合物から排除されるが、所望のコアゴニスト又はトリアゴニスト活性を示す、それら化合物への更なる修飾、およびそのような化合物を使用する医薬組成物、キット、治療方法は、いずれも本発明に含まれてもよい：〔Ａｒｇ１２〕置換およびＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；〔Ａｒｇ１２、Ｌｙｓ２０〕置換およびＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；〔Ａｒｇ１２、Ｌｙｓ２４〕置換およびＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；〔Ａｒｇ１２、Ｌｙｓ２９〕置換およびＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；〔Ｇｌｕ９〕置換を有する配列番号１のペプチド；〔Ｇｌｕ９、Ｇｌｕ１６、Ｌｙｓ２９〕置換およびＣ末端アミドを有する、Ｈｉｓ１を欠いている配列番号１のペプチド；〔Ｇｌｕ９、Ｇｌｕ１６、Ｌｙｓ２９〕置換およびＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；ラクタム架橋を介して結合している〔Ｌｙｓ１３、Ｇｌｕ１７〕置換およびＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；ラクタム架橋を介して結合している〔Ｌｙｓ１７，Ｇｌｕ２１〕置換およびＣ末端アミドを有する配列番号１のペプチド；ラクタム架橋を介して結合している〔Ｇｌｕ２０，Ｌｙｓ２４〕置換を有する、Ｈｉｓ１を欠いている配列番号１のペプチド；以下の各文献（それらの全体が参照により本出願に組み込まれる）に開示されているペプチド：２００８年２月１３日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３８５７；２００６年５月５日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１７４９４；２００７年８月１７日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１８４１５；２００５年２月２５日出願のＰＣＴ／ＧＢ２００５／０００７１０；２０００年３月２９日出願のＰＣＴ／ＧＢＯＯ／０１０８９；２００６年２月１０日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００６／００５０２０。
【０３２１】
〔実施例〕
本発明の化合物を、標準的な合成方法、組み換えＤＮＡ技術またはペプチドおよび融合タンパク質を調製する他の任意の方法により調製することができる。特定の非天然アミノ酸は、標準的な組み換えＤＮＡ技術によっては発現することはできないが、それらを調製する技術は当該技術において知られている。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物を、適用可能であれば、標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応により合成することができる。グルカゴンペプチドのグルカゴンおよびＧＬＰ−１活性についての追加的なデータは、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３８５７、２００８年２月１３日出願にも開示されており、その全体は参照として本明細書に組み込まれる。
【０３２２】
＜実施例１＞
一般的合成プロトコール：
グルカゴン類縁体を、改良Applied Biosystem 430 Aペプチド合成機により、０．２mmolのBoc Thr(OBzl)Pam樹脂から出発し、ＨＢＴＵ活性化「Ｆａｓｔ  Ｂｏｃ」単一カップリングを使用して合成した。Ｂｏｃアミノ酸及びＨＢＴＵは、Midwest Biotech（Fishers, IN）から得た。使用した側鎖保護基は、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｙｒ（２Ｂｒ−Ｚ）及びＴｒｐ（ＣＨＯ）であった。Ｎ末端Ｈｉｓの側鎖保護基はＢｏｃであった。
【０３２３】
合成の完了したそれぞれのペプチジル樹脂を、ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンの溶液で処理して、トリプトファンからホルミル基を除去した。液体フッ化水素切断を、ｐ−クレゾール及びジメチルスルフィドの存在下で実施した。切断は、ＨＦ装置（Penninsula Labs）を使用して氷浴で１時間実施した。ＨＦを蒸発させた後、残渣をジエチルエーテルに懸濁し、固体物質を濾過した。ペプチドをそれぞれ３０〜７０mlの酢酸水溶液に抽出し、希釈したアリコートをＨＰＬＣ〔Beckman System Gold、０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm、Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル、１０分間かけて１０％から８０％Ｂの勾配〕により分析した。
【０３２４】
精製を２．２×２５cmのKromasil C18カラムのＦＰＬＣにより実施し、その間、２１４nmのＵＶでモニタリングし、５分毎の画分を収集した。均質画分をまとめ、凍結乾燥して、生成物純度＞９５％を得た。正確な分子量及び純度は、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を使用して確認した。
【０３２５】
＜実施例２＞
一般的ペグ化プロトコール：（Ｃｙｓ−マレイミド）
典型的には、グルカゴンＣｙｓ類縁体をリン酸緩衝食塩水（５〜１０mg/ml）に溶解し、０．０１Mエチレンジアミン四酢酸を加える（総容量の１０〜１５％）。過剰（２倍）マレイミドメトキシＰＥＧ試薬（Nektar）を加え、反応を室温で撹拌し、その間、ＨＰＬＣで反応進行をモニタリングする。８〜２４時間後、反応混合物を酸性化し、精製のために、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を使用する分取逆相カラムに装填する。適切な画分をまとめ、凍結乾燥して、所望のペグ化類縁体を得た。
【０３２６】
＜実施例３＞
グルカゴンＣｙｓ17（１−２９）及び同様のモノＣｙｓ類縁体の合成
６０mlの反応容器中の０．２mmolのBoc Thr(OBzl) Pam樹脂（SynChem Inc）及び以下の配列を改良Applied Biosystems 430Aペプチド合成機に入れ、ＦａｓｔＢｏｃ  ＨＢＴＵ活性化単一カップリングを使用して合成を行った。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＣＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ
以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）及びＴｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。合成の完了したペプチジル樹脂を２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで処理して、Ｔｒｐホルミル保護を除去し、次にＨＦ反応容器に移し、真空下で乾燥した。１．０mlのｐ−クレゾール及び０．５mlのジメチルスルフィドを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をＨＦ装置（Pennisula Labs）に取り付け、ドライアイス／メタノール浴で冷却し、排気し、およそ１０mlの液体フッ化水素を圧入した。反応を氷浴で１時間撹拌し、次にＨＦを減圧留去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを５０mlの酢酸水溶液に抽出した。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm、Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂの勾配〕を少量の切断抽出物試料により実施した。残りの抽出物を２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、Pharmacia ＦＰＬＣシステムを使用してアセトニトリル勾配を実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル。勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。
【０３２７】
最高純度の生成物を含有する画分（４８−５２）をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、３０．１mgを得た。生成物のＨＰＬＣ分析は、＞９０％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、所望の質量の３４２９．７を示した。グルカゴンＣｙｓ21、グルカゴンＣｙｓ24及びグルカゴンＣｙｓ29を同様に調製した。
【０３２８】
＜実施例４＞
グルカゴン−Ｃｅｘ及び他のＣ末端延長部類縁体の合成
２８５mg（０．２mmol）のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂（Midwest Biotech）を６０mlの反応容器に入れ、以下の配列を改良Applied Biosystems 430Aペプチド合成機に入れ、ＦａｓｔＢｏｃ  ＨＢＴＵ活性化単一カップリングを使用して合成を行った。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ
以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）及びＴｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。合成の完了したペプチジル樹脂を２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで処理して、Ｔｒｐホルミル保護を除去し、次にＨＦ反応容器に移し、真空下で乾燥した。１．０mlのｐ−クレゾール及び０．５mlのジメチルスルフィドを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をＨＦ装置（Pennisula Labs）に取り付け、ドライアイス／メタノール浴で冷却し、排気し、およそ１０mlの液体フッ化水素を圧入した。反応物を氷浴で１時間撹拌し、次にＨＦを減圧留去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを５０mlの酢酸水溶液に抽出した。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm、Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂの勾配〕を切断抽出物のアリコートにより実施した。残りの抽出物を２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、Pharmacia ＦＰＬＣシステムを溶出に使用してアセトニトリル勾配を実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル。勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。画分５８〜６５をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、１９８．１mgを得た。
【０３２９】
生成物のＨＰＬＣ分析は、９５％を超える純度を示した。ＭＡＤＩ質量スペクトル分析は、Ｃ末端アミドとして、所望の理論質量の４３１６．７を有する生成物の存在を示した。オキシントモジュリン及びオキシントモジュリン−ＫＲＮＲを、適切な装填ＰＡＭ樹脂から出発して、Ｃ末端カルボン酸として同様に調製した。
【０３３０】
＜実施例５＞
グルカゴンＣｙｓ17Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
１５．１mgのグルカゴンＣｙｓ17（１−２９）及び２７．３mgの平均分子量５０００のメトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド（ｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００、Nektar Therapeutics）を、３．５mlのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、０．５mlの０．０１Mエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加えた。反応物を室温で撹拌し、反応の進行をＨＰＬＣ分析〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕によりモニターした。
【０３３１】
５時間後、反応混合物を２．２×２５cmのKromasil C18分取逆送カラムに装填した。アセトニトリル勾配をPharmacia ＦＰＬＣにより実施し、その間、２１４nmのＵＶ波長でモニタリングし、５分毎の画分を収集した。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル、勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。生成物に対応する画分をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、２５．９mgを得た。
【０３３２】
この生成物をＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕により分析し、およそ９０％の純度を示した。ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量スペクトル分析は、８７００〜９５００の（ＰＥＧ誘導体に典型的な）広い質量範囲を示した。これは、出発グルカゴンペプチドの質量（３４２９）へのおよそ５，０００amuの追加を示す。
【０３３３】
＜実施例６＞
グルカゴンＣｙｓ21Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２１．６mgのグルカゴンＣｙｓ21（１−２９）及び２４mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、０．５mlの０．０１Mエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加えた。反応物を室温で撹拌した。２時間後、更なる１２．７mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を加えた。８時間後、反応混合物を２．２×２５cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を４ml／分のPharmacia ＦＰＬＣにより実施し、その間、５分毎の画分を収集した。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。勾配＝４５０分間かけて２０％から８０％Ｂ。
【０３３４】
生成物の出現に対応する画分をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、３４mgを得た。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕によるこの生成物の分析は、出発グルカゴンペプチドと異なる均質な生成物を示した。ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量スペクトル分析は、８７００〜９７００の（ＰＥＧ類縁体に典型的な）広い質量範囲を示した。これは、出発グルカゴンペプチドの質量（３４７０）へのおよそ５，０００amuの追加を示す。
【０３３５】
＜実施例７＞
グルカゴンＣｙｓ24Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２０．１mgのグルカゴンＣ24（１−２９）及び３９．５mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのＰＢＳに撹拌しながら溶解し、０．５mlの０．０１M  ＥＤＴＡを加えた。反応物を室温で７時間撹拌し、次に更なる４０mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を加えた。およそ１５時間後、反応混合物を、２．２×２５cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を、Pharmacia ＦＰＬＣを使用して実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ、勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。生成物に対応する画分をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、４５．８mgを得た。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、最大値が９１７５．２のＰＥＧに典型的な幅広いシグナルを示し、これはグルカゴンＣ24（３４５７．８）よりもおよそ５，０００amu多い。
【０３３６】
＜実施例８＞
グルカゴンＣｙｓ24Ｍａｌ−ＰＥＧ−２０Ｋ
２５．７mgのグルカゴンＣ24（１−２９）及び４０．７mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−２０Ｋ（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのＰＢＳに撹拌しながら室温で溶解し、０．５mlの０．０１M  ＥＤＴＡを加えた。６時間後、出発物質と生成物の比率は、ＨＰＬＣにより決定すると、およそ６０：４０であった。更なる２５．１mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−２０Ｋを加え、反応物を更に１６時間撹拌した。生成物比率が有意に改善されなかったので、反応混合物を、２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、４５０分かけて３０％Ｂから１００％Ｂへの勾配を使用するPharmacia ＦＰＬＣにより精製した。Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ、流量＝４ml／分、５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。均質な生成物を含有する画分をまとめ、冷凍及び凍結乾燥して、２５．７mgを得た。分析ＨＰＬＣにより決定された純度は約９０％であった。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、２３，０００〜２７，０００の幅広のピークを示し、これは出発グルカゴンＣ24（３４５７．８）よりもおよそ２０，０００amu多い。
【０３３７】
＜実施例９＞
グルカゴンＣｙｓ29Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２０．０mgのグルカゴンＣｙｓ29（１−２９）及び２４．７mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのＰＢＳに撹拌しながら室温で溶解し、０．５mlの０．０１M  ＥＤＴＡを加えた。４時間後、更なる１５．６mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を加えて、反応の完了を促進した。８時間後、反応混合物を、２．２×２５cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を、Pharmacia ＦＰＬＣシステムにより実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分７５−９７を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、ＨＰＬＣにより回収された出発物質（画分５８−６３）と異なる、４０．０mgの生成物を得た。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml／分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕によるこの生成物の分析は、９５％を超える純度を示した。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、８，０００〜１０，０００（最大９０２５．３）の範囲の質量を有するＰＥＧ成分の存在を示し、これは出発物質（３４８４．８）よりも５，５４０amu多い。
【０３３８】
＜実施例１０＞
グルカゴンＣｙｓ24（２−ブチロラクトン）
２４．７mgのグルカゴンＣｙｓ24（１−２９）に、４mlの０．０５M重炭酸アンモニウム／５０％アセトニトリル及び５．５ulの２−ブロモ−４−ヒドロキシ酪酸−γ−ラクトンの溶液（アセトニトリル９００ul中１００ul）を加えた。室温で３時間撹拌した後、更なる１０５ulのラクトン溶液を反応混合物に加え、更に１５時間撹拌した。反応混合物を、１０％酢酸水溶液で１０mlに希釈し、２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填した。アセトニトリル勾配（４５０分かけて２０％Ｂから８０％Ｂ）をPharmacia ＦＰＬＣにより実施し、その間、５分毎の画分を収集し、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。流量＝４ml／分、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分７４−７７を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、７．５mgを得た。ＨＰＬＣ分析は、９５％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、３５４０．７の質量又は出発物質よりも８４質量単位多い質量を示した。この結果は、単一ブチロラクトン部分の付加と一致している。
【０３３９】
＜実施例１１＞
グルカゴンＣｙｓ24（Ｓ−カルボキシメチル）
１８．１mgのグルカゴンＣｙｓ24（１−２９）を、９．４mlの０．１Mリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．２）に溶解し、０．６mlのブロモ酢酸溶液（アセトニトリル中１．３mg/ml）を加えた。反応を室温で撹拌し、反応の進行を分析ＨＰＬＣにより追跡した。１時間後、更なる０．１mlのブロモ酢酸溶液を加えた。反応を更に６０分間撹拌し、酢酸水溶液で酸性化し、精製のために２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填した。アセトニトリル勾配をPharmacia ＦＰＬＣ（流量＝４ml／分）により実施し、その間、５分毎の画分を収集し、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分２６−２９を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、数mgの生成物を得た。分析ＨＰＬＣは、９０％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、所望の生成物の質量３５１５を確認した。
【０３４０】
＜実施例１２＞
グルカゴンＣｙｓ24マレイミド，ＰＥＧ−３．４Ｋ−二量体
１６mgのグルカゴンＣｙｓ24及び１．０２mgのＭａｌ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−３４００、平均分子量３４００のポリ（エチレングリコール）−ビス−マレイミド（Nektar Therpeutics）を、３．５  のリン酸緩衝食塩水及び０．５mlの０．０１M  ＥＤＴＡに溶解し、反応を室温で撹拌した。１６時間後、更なる１６mgのグルカゴンＣｙｓ24を加え、撹拌を続けた。およそ４０時間後、反応混合物をPharmcia PepRPC 16/10カラムに装填し、アセトニトリル勾配をPharmacia ＦＰＬＣにより実施し、その間、２分毎の画分を収集し、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。流量＝２ml／分、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分６９−７４を合わせ、冷凍及び凍結乾燥して、１０．４mgを得た。分析ＨＰＬＣは、９０％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、９５００〜１１，０００の範囲の成分を示し、これは所望の二量体と一致する。
【０３４１】
【化１６】
2015164922.tif 000017
【０３４２】
＜実施例１３＞
グルカゴンラムタムの合成
２８５ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂（Midwest Biotech）を６０ｍＬの反応容器に入れ、以下の配列を、Ｂｏｃ  ＤＥＰＢＴ活性化単一結合を使用する改良Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａペプチド合成機により構築した。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ−ＮＨ２（１２−１６ラクタム）
【０３４３】
以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｇｌｕ（ＯＦｍ）、Ｈｉｓ（ＢＯＭ）、Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。ラクタムが１６−２０、２０−２４または２４−２８から構成された場合、Ｌｙｘ（Ｃｌ−Ｚ）を位置１２で使用した。合成の完了したペプチジル樹脂を２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドにより回転させながら１時間処理して、Ｔｒｐホルミル基を、ならびにＬｙｓ１２およびＧｌｕ１６からＦｍｏｃおよびＯＦｍ保護を除去した。陽性ニンヒドリン試験により除去を確認してから、樹脂をジメチルホルムアミド、続いてジクロロメタン、次に再びジメチルホルムアミドで洗浄した。樹脂を、ジメチルホルムアミドおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）中のベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）の５２０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）で処理した。反応は８〜１０時間進行し、環化は、陰性ニンヒドリン試験により確認した。樹脂を、ジメチルホルムアミド、続いてジクロロメタンで洗浄し、その後トリフルオロ酢酸で１０分間処理した。Ｂｏｃ基の除去は、陽性ニンヒドリン反応より確認した。樹脂を、ジメチルホルムアミドおよびジクロロメタンで洗浄し、フッ化水素酸（ＨＦ）反応容器に移す前に乾燥した。５００μＬのｐ−クレゾールを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をＨＦ装置（Pennisula Labs）に取り付け、ドライアイス／メタノール浴で冷却し、排気し、およそ１０ｍＬの液体フッ化水素を容器の中に圧入した。反応を氷浴で１時間撹拌し、次にＨＦを真空下で除去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを１５０ｍＬの２０％アセトニトリル／１％酢酸に溶解した。
【０３４４】
粗溶解ペプチドの分析ＨＰＬＣによる分析を次の条件〔０．４６×３０ｍｍのＸｔｅｒｒａ  Ｃ８、１．５０ｍＬ／分、２２０ｎｍ、Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／１０％ＡＣＮ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／１００％ＡＣＮ、１５分間かけて５〜９５％Ｂの勾配〕で実施した。抽出物を水で２倍に希釈し、２．２×２５ｃｍ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ４分取逆相カラムに装填し、ＷａｔｅｒｓＨＰＬＣ系（Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／１０％ＡＣＮ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／１０％ＡＣＮおよび流量１５．００ｍｌ／分で１２０分間かけて０〜１００％Ｂの勾配）によりアセトニトリル勾配を使用して溶出した。精製ペプチドのＨＰＬＣ分析は、９５％を超える純度を示し、エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析は、１２−１６ラクタムで３５０６Ｄａの質量を確認した。１６−２０、２０−２４および２４−２８からのラクタムを同様に調製した。
【０３４５】
＜実施例１４＞
グルカゴン溶解性アッセイ：
グルカゴン（または類縁体）の溶液（１ｍｇ／ｍｌまたは３ｍｇ／ｍｌ）を０．０１NのＨＣｌで調製する。１００ulの保存液を、０．０１ＮのＨＣｌで１ｍｌに希釈し、ＵＶ吸光度（２７６ｎｍ）を決定する。残りの保存液のｐＨを、２００〜２５０ｕｌの０．１Ｍ  Ｎａ2ＨＯＰ4（ｐＨ９．２）を使用して、ｐＨ７に調整する。溶液を４℃で一晩放置し、次に遠心分離する。次に１００ｕｌの上澄みを、０．０１ＮのＨＣｌで１ｍｌに希釈し、ＵＶ吸光度を決定する（２回繰り返す）。
【０３４６】
初期吸光度の読み取りを容量の増加で補正し、以下の計算を使用して、溶解率を確立する。
最終吸光度／初期吸光度×１００＝パーセント溶解率
【０３４７】
＜実施例１５＞
グルカゴン受容体結合アッセイ
グルカゴン受容体へのペプチドの親和性を、シンチレーション近接アッセイ技術を利用する競争結合アッセイにより測定した。シンチレーション近接アッセイ緩衝液（０．０５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１％ｗ／ｖのウシ血清アルブミン）により作製したペプチドの一連の３倍希釈を、９６ウエル白色／透明底プレート（Corning Inc.,Acton, MA）において、０．０５ｎＭの（３−〔125Ｉ〕−ヨードチロシル）Ｔｙｒ１０グルカゴン（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）、１ウエル当たり１〜６マイクログラムの、ヒトグルカゴン受容体を過剰発現している細胞から調製した原形質膜画分および１ｍｇ／ウエルのポリエチレンイミン処理ムギ胚芽凝集素Ａ型シンチレーション近接アッセイビーズ（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）と混合した。ロータリー振とう器により８００ｒｐｍで５分間振とうしてから、プレートを室温で１２時間インキュベートし、次にＭｉｃｒｏＢｅｔａ１４５０液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で読み取った。非特異的結合（ＮＳＢ）放射能を、試験サンプルの最高濃度よりも４倍高い濃度の「非放射性」天然リガンドを有するウエルで測定し、総結合放射能を、競合物質を有さないウエルで検出した。特異的結合の率を以下のように計算した：特異的結合％＝（（結合−ＮＳＢ）／（総結合−ＮＳＢ））×１００。ＩＣ50値は、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（OriginLab, Northampton, MA）を使用して決定した。
【０３４８】
＜実施例１６＞
機能アッセイ−ｃＡＭＰ合成
ｃＡＭＰを誘導するグルカゴン類縁体の能力を、ホタルルシフェラーゼに基づいたレポーターアッセイにより測定した。グルカゴン受容体又はＧＬＰ−１受容体のいずれかと、ｃＡＭＰ応答配列に結合したルシフェラーゼ遺伝子とを同時形質移入されたＨＥＫ２９３細胞から、０．２５％ウシ増殖血清（HyClone, Logan, UT）が補充されたＤＭＥＭ（Invitrogen, Carlsbad, CA）における１６時間の培養により血清を取り除き、次にグルカゴン、ＧＬＰ−１又は新規グルカゴン類縁体のいずれかによる一連の希釈と共に、９６ウエルポリ−Ｄ−リシン被覆「バイオコート」プレート（BD Biosciences, San Jose, CA）において３７℃、５％ＣＯ2で５時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、１００マイクロリットルのLucLiteルミネセンス基質試薬（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）を各ウエルに加えた。プレートを短時間振とうし、暗黒で１０分間インキュベートし、発光をMicroBeta-1450液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で測定した。有効５０％濃度を、Originソフトウェア（OriginLab, Northampton, MA）を使用して計算した。
【０３４９】
＜実施例１７＞
グルカゴンＣｙｓ−マレイミドＰＥＧ類縁体の安定性アッセイ
各グルカゴン類縁体を水又はＰＢＳに溶解し、初期ＨＰＬＣ分析を実施した。ｐＨを調整した後（４、５、６、７）、試料を３７℃で特定の時間インキュベートし、ＨＰＬＣにより再び分析して、ペプチドの完全性を決定した。特定の目的のペプチドの濃度を決定し、無傷のまま残っている率を初期分析と比較して計算した。
【０３５０】
＜実施例１８＞
アシル化および／またはペグ化ペプチドを以下のように調製した。ペプチドは、ＣＳ  Ｂｉｏ  ４８８６ペプチド合成機またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａペプチド合成機のいずれかを使用して、固体支持樹脂上に合成した。Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992)に記載されている現場中和化学を使用した。アシル化ペプチドでは、アシル化される標的アミノ酸残基（例えば、位置１０）をＮε−ＦＭＯＣリシン残基で置換した。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンによる、合成の完了したＮ末端ＢＯＣ保護ペプチドの３０分間の処理によって、ＦＭＯＣ／ホルミル基を除去した。遊離ε−アミノＬｙｓ残基へのカップリングは、ＦＭＯＣ保護スペーサーアミノ基（例えば、ＦＭＯＣ−（Ｎ−ＢＯＣ）−トリプトファン−ＯＨ）またはアシル鎖（例えば、Ｃ１７−ＣＯＯＨ）のいずれかの１０倍モル過剰との、およびＤＭＦ／ＤＩＥＡ中のＰｙＢＯＰまたはＤＥＰＢＴカップリング試薬とのカップリングにより達成した。その後のスペーサーアミノ酸のＦＭＯＣ基の除去に続いて、アシル鎖とのカップリングを繰り返した。１００％ＴＦＡによる最終処理は、あらゆる側鎖保護基およびＮ末端ＢＯＣ基の除去をもたらした。ペプチド樹脂を、５％ＤＩＥＡ／ＤＭＦで中和し、乾燥し、次にＨＦ／ｐ−クレゾールの９５：５を０℃で１時間使用して支持体から切断した。エーテル抽出の後、５％ＨＯＡｃ溶液を使用して粗ペプチドを溶媒和した。次に溶液の試料を、正確な分子量のペプチドを含有しているかについてＥＳＩ−ＭＳにより確認した。正確なペプチドを、１００％ＣＨ３ＣＮ中の１０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡから０．１％ＴＦＡの直線勾配を使用してＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８の２２ｍｍ×２５０ｍｍタンパク質カラムを精製に使用した。アシル化ペプチド類縁体は、一般に、緩衝液比の２０：８０で完全に溶出した。一部を一緒にプールし、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより純度を調べた。純粋な画分を凍結乾燥して、白色の固体ペプチドを得た。収量は、合成に応じて１０ｍｇ〜１００ｍｇの範囲であった。
【０３５１】
ペプチドがアシル化されるラクタム架橋および標的残基を含む場合、アシル化は、ペプチド主鎖へのアミノ酸の付加の直後に、上記に記載されたとおりに実施される。
【０３５２】
ペプチドのペグ化では、４０ｋＤａのメトキシポリ（エチレングルコール）マレイミド−プロピオンアミド（Chirotech Technology Ltd.）を、ペプチドとＰＥＧの両方を溶解して透明な溶液にするのに必要な最小量の溶媒（一般に、２〜３ｍｇのペプチドを使用する反応において２ｍＬ未満）を使用して、７Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液中のモル当量のペプチドと反応させた。室温での激しい撹拌を開始して４〜６時間行い、反応を分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。ペグ化生成物は、出発物質とは別に、より短い保持時間で出現した。精製は、初期ペプチド精製に使用した条件と同じ条件のＶｙｄａｃ  Ｃ４カラムにより実施した。溶出は、緩衝剤比が５０：５０のあたりで生じた。純粋なペグ化ペプチドの画分を収集し、凍結乾燥した。
【０３５３】
ペプチドを、生物学的活性について、前述の実施例１６に記載されているようにアッセイした。アシル化ペプチドは、ＧＬＰ−１に対する増強された効力を示してもよい。トリプトファンスペーサーを含めることは、グルカゴン受容体に対するより良好な効力をもたらしうる。
【０３５４】
アシル化は、ペプチドの半減期を１時間以上延長することができるが、数十のｋＤａ範囲の繰り返しを有するペグ化は、さらに延長することができる。両方の種類の修飾を含むペプチドを調製した。これらのペプチドは、延長された循環半減期、ならびにＤＰＰ−ＩＶおよび他のプロテアーゼに対する耐性を示すと予測される。
【０３５５】
＜実施例２０＞
体重増加、食欲および血中グルコースレベルに対するインビボ効果
以下のペプチドを実質的に上記に記載されたように合成した。
（Ａ）ペグ化グルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニストペプチド（位置２のＡＩＢにより、４０Ｋ  ＰＥＧ基に結合している位置２４のＣｙｓによりさらに修飾されているキメラ２ペプチド（実施例２１を参照すること）である、キメラ２  ＡＩＢ２  Ｃ２４  ４０Ｋ  ＰＥＧ）；
（Ｂ）ペグ化ＧＩＰアンタゴニスト（位置３におけるＰｒｏ、４０Ｋ  ＰＥＧ基に結合している位置２４におけるＣｙｓ、およびＣ末端カルボキシレートを置換するアミドにより修飾されている、ＧＩＰのアミノ酸１−４２（天然ＧＩＰの配列は配列番号４）である、Ｐｒｏ３  Ｃ２４  ＧＩＰ  ＮＨ２（１−４２）４０Ｋ  ＰＥＧ）；ならびに
（Ｃ）ＧＩＰアゴニスト（位置２におけるＡＩＢおよび４０Ｋ  ＰＥＧ基に結合している位置２４におけるＣｙｓにより修飾されている、ＧＩＰのアミノ酸１−４２（天然ＧＩＰの配列は配列番号４）である、ＡＩＢ２  Ｃ２４  ＧＩＰ（１−４２）４０Ｋ  ＰＥＧ）。
【０３５６】
多様なペプチドまたはビヒクルのみを食餌誘導肥満（ＤＩＯ）マウスに毎週一度（７０または２１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週）皮下注射することによって、ペプチドをインビボで試験した。各群は、８匹のマウスを含有し、それぞれ初期平均体重の５０ｇを有した。体重、身体組成、食物摂取および血中グルコースレベルを周期的に決定した。
【０３５７】
図１〜３に示されているように、ＧＩＰアンタゴニストもＧＩＰアゴニストペプチドも、ペグ化グルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニストと比較して、マウスにおいて体重、累積食物摂取および血中グルコースレベルの低減に対して効果がなかった。
【０３５８】
＜実施例２１＞
ペプチドのＧＩＰ、ＧＬＰ−１およびグルカゴン活性
配列番号５〜９４のペプチド（それぞれＣ末端カルボキシレートの代わりにアミドを含む）を、実質的に上記に記載されたように合成し、実施例１６によって、ＧＩＰ受容体、ＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体に対する活性についてインビトロで試験した。それぞれのペプチドのＥＣ５０を表１に示す。
【０３５９】
【表１】
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2015164922.tif 000019
2015164922.tif 000020
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【０３６０】
これらのデータに基づいて、ペプチドｍｔ−１４０、ｍｔ−１４７、ｍｔ−１５１、ｍｔ−１５２、ｍｔ−１５８、ｍｔ−１６４、ｍｔ−１６５、ｍｔ−１６６、ｍｔ−１６９、ｍｔ−１７０、ｍｔ−１７２、ｍｔ−１７５およびｍｔ−１７９は、例示的なＧＬＰ−１／ＧＩＰ／グルカゴントリアゴニストペプチドであり、一方、ペプチドｍｔ−１４８、ｍｔ−１４９、ｍｔ−１６２、ｍｔ−１７４、ｍｔ−１７８、ｍｔ−２０１およびｍｔ−２０４は、例示的なＧＬＰ−１／ＧＩＰコアゴニストペプチドであり、ペプチドｍｔ−１１６、ｍｔ−１７６、ｍｔ−１７７およびｍｔ−１８２は、例示的なＧＩＰ／グルカゴンコアゴニストペプチドであることが決定された。
【０３６１】
＜実施例２２＞
実施例２１のＧＬＰ−１／ＧＩＰ／グルカゴントリアゴニストペプチド（ｍｔ−１７０）、ＧｌＰ−１／ＧＩＰコアゴニストペプチド（ｍｔ−１７８）、および２つのＧＩＰ／グルカゴンコアゴニストペプチド（ｍｔ−１８２およびｍｔ−１７９）について、これらのペプチドか、グルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニストペプチド（キメラ２  ＡＩＢ２（次の修飾：位置１７にＧｌｎ、位置２８にＡｌａ、位置２０にＬｙｓ、位置２１にＧｌｕ、位置２３にＩｌｅおよび位置２４にＡｌａ、ならびに位置２にＡＩＢの更なる修飾を有するＣ末端アミド（「キメラ２」）を含む天然グルカゴンアミド配列（配列番号１））か、キメラ２  ＡＩＢ２  ラクタム（キメラ２  ＡＩＢ２と同じであるが、位置１６のＧｌｕおよび位置２０のＬｙｓの更なる修飾を有し、ラクタムがＧｌｕ１６とＬｙｓ２０の側鎖を架橋する））、またはビヒクルのみを、食餌誘導肥満（ＤＩＯ）マウスに毎週一度ずつ（ＱＷ）（７０または２１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週）皮下注射することにより、インビボで試験した。各群は、８匹のマウスを含有し、それぞれ初期平均体重の５０ｇを有した。体重を周期的に決定した。
【０３６２】
図４に示されているように、トリアゴニストおよびＧＬＰ−１／ＧＩＰコアゴニストは、キメラ２  ＡＩＢ２と同様に、マウスの体重を低下するのに少しだけ効果的であったが、体重の低減に最良の能力を示したキメラ２  ＡＩＢ２  ラクタムほど効果的ではなかった。対照的に、両方のＧＩＰ／グルカゴンコアゴニスト、特にｍｔ−１８２は、体重の低減に対して効果が低かった。
【０３６３】
＜実施例２３＞
ＧＬＰ−１／ＧＩＰ／グルカゴントリアゴニストペプチド（ｍｔ−１７０）およびＧＬＰ−１／ＧＩＰコアゴニストペプチド（ｍｔ−１７８）について、これらのペプチドか、ＧＬＰアゴニスト（位置１６にＧｌｕを有する配列番号３を含む）か、またはビヒクルのみを、食餌誘導肥満（ＤＩＯ）マウスに毎週一度ずつ（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週を４週間または３５ｎｍｏｌ／ｋｇ／週を２週間）皮下注射することによって、インビボで試験した。各群は、８匹のマウスを含有し、マウスはそれぞれ初期平均体重の４９ｇを有した。体重および血中グルコースレベルを周期的に決定した。図５および６に示されているように、ＧＬＰ−１／ＧＩＰコアゴニストおよびトリアゴニストは両方とも、ＧＬＰ−１アゴニストよりも、体重および血中グルコースレベルの低減において効果があった。
【０３６４】
＜実施例２４＞
ラクタムの代わりにアルファ，アルファ二置換アミノ酸を有するグルカゴンに基づいた類縁体の、アルファ−へリックスを安定化する効果は、ｍｔ−１６５（配列番号６４）およびｍｔ−１７０（配列番号６９）のラクタムを位置１６のＡＩＢに代えることによって調査した。ラクタムの代わりに位置１６のＡＩＢを有するｍｔ−１６５の配列を含むペプチドは、「ｍｔ−２４１」と呼ばれ、配列番号１６７のアミノ酸配列を有し、一方、ラクタムの代わりに位置１６のＡＩＢを有するｍｔ−１７０の配列を含むペプチドは、「ｍｔ−２４８」と呼ばれ、配列番号１７３のアミノ酸配列を有した。
【０３６５】
ラクタム架橋を欠いており、位置１６および／または２０にＡＩＢを含む付加直鎖ペプチドも、実質的に上記に記載されたように作製した。これらのペプチドを、「ｍｔ−２４２」、「ｍｔ−２４９」、「ｍｔ−２５０」、「ｍｔ−２５１」、「ｍｔ−２５２」、「ｍｔ−２５５」、「ｍｔ−２５８」および「ｍｔ−２５９」と呼び、それぞれ配列番号１６８、１７４〜１７６、１０７、１０８、１７７および２５８のアミノ酸配列を有した。これらのペプチドのそれぞれのグルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体に対すインビトロ生物学的活性を、実施例１６に実質的に記載されたように試験した。結果を表２に示す。
【０３６６】
【表２】
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【０３６７】
表２の結果から明らかなように、ラクタムを含有しない直鎖ペプチドは、グルカゴンおよび／またはＧＬＰ−１受容体に対する活性と共に、ＧＩＰ受容体に対する活性ももたらした。さらに具体的には、ｍｔ−２４２、ｍｔ−２４８、ｍｔ−２４９、ｍｔ−２５０、ｍｔ−２５２、ｍｔ−２５５、ｍｔ−２５８およびｍｔ−２５９は、グルカゴン／ＧＬＰ−１／ＧＩＰトリアゴニストの活性を示し、一方、ｍｔ−２５１は、ＧＬＰ−１／ＧＩＰコアゴニストの活性を示した。位置１６にＬｙｓおよび位置２０にＡＩＢを有するペプチドｍｔ−２５２は、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体に対して効力を示し、ＧＩＰ受容体に対して増強された活性を示した。
【０３６８】
＜実施例２５＞
ラクタム環を欠いており、位置１６にＬｙｓまたは同様の残基および位置２０にＡＩＢを有する直鎖ペプチドを、実質的に上記に記載されたように作製した。ペプチドは、配列番号９９〜１４１、１４４〜１６４および１６６のアミノ酸配列を有した。ペプチドを、グルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体に対する生物学的活性について、実施例１６に実質的に記載されたようにインビトロで試験した。結果を表３に示す。
【０３６９】
【表３】
2015164922.tif 000024
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2015164922.tif 000027
【０３７０】
表３に示されているように、直鎖ペプチドは、ＧＩＰ受容体に対して活性であり、多くの場合において、ペプチドは、グルカゴン受容体および／またはＧＬＰ−１受容体に対しても活性であった。さらに具体的には、ｍｔ−２５２、ｍｔ−２５５、ｍｔ−２５７、ｍｔ−２６０、ｍｔ−２６１、ｍｔ−２６２、ｍｔ−２６５、ｍｔ−２６６、ｍｔ−２６７、ｍｔ−２７５、ｍｔ−２７６、ｍｔ−２７７、ｍｔ−２７８、ｍｔ−２７９、ｍｔ−２８０、ｍｔ−２８６、ｍｔ−２８７、ｍｔ−２８８、ｍｔ−２８９、ｍｔ−２９０、ｍｔ−２９１、ｍｔ−２９２、ｍｔ−２９３、ｍｔ−２９５、ｍｔ−２９６、ｍｔ−２９７、ｍｔ−２９９、ｍｔ−３０６、ｍｔ−３０７、ｍｔ−３１０、ｍｔ−３２３、ｍｔ−３２４およびｍｔ−３４５は、全て、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体に対して活性を示し、一方、表３の他のペプチドは、ＧＩＰおよびＧＬＰ−１受容体に対して活性を示した（ＧＩＰ受容体のみに対して活性を示したｍｔ−２８５、ならびにグルカゴンおよびＧＩＰ受容体に対して活性を示したがＧＬＰ−１受容体に対しては示さなかったｍｔ−３２５を除く）。
【０３７１】
Ｃ末端延長部を含むｍｔ−２５２のデータを、ｍｔ−２５７、ｍｔ−２５８およびｍｔ−２５９（これらのペプチドはＣ末端延長部を含まない）のデータと比較すると、Ｃ末端延長部はグルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体の全てに対する活性を増強したことが明らかであった。
【０３７２】
位置１６にＬｙｓを含むｍｔ−２５２のデータをｍｔ−２７５およびｍｔ−２７６（これらのペプチドは位置１６にそれぞれＯｒｎおよびＤａｂ残基を含む）のデータと比較すると、ＬｙｓをＬｙｓ様残基に代えることができることが明らかであった。
【０３７３】
更に、位置３にＧｌｎを含むｍｔ−２５２のデータをｍｔ−２５６およびｍｔ−２７４（これらのペプチドは位置３のＧｌｕを含む）のデータと比較すると、Ｇｌｕ残基による位置３のＧｌｎの置換は、グルカゴン受容体と比べたＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体への選択性が達成されることが明らかとなった。
【０３７４】
Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８脂肪酸によるアシル化の効果は、ｍｔ−２６３に対するｍｔ−２６０およびｍｔ−２７２に対するｍｔ−２６５のデータから明らかであった。これらのデータから、Ｃ１６およびＣ１８脂肪酸によるアシル化は、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体に対する増加した活性をもたらすことが明らかであった。これらのペプチドのアシル化は、さらに、ペプチドがＧｌｎ３Ｇｌｕ置換を含んでいても、グルカゴン受容体に対する増加した活性を可能にした。グルカゴン受容体に対する増加した活性は、ｍｔ−２８０対するトリアゴニストｍｔ−２７７のデータからも分かった。
【０３７５】
＜実施例２６＞
ペグ化環状ラクタム含有ペプチドｍｔ−１７８（配列番号７５）およびペグ化直鎖ラクタム欠失ペプチドｍｔ−２７４（配列番号９９）のインビボ活性を、ＤＩＯマウスで試験し、配列番号１７９のＧＬＰ−１に基づいた構造を有する純粋なＧＬＰ−１アゴニスト対照のインビボ活性と比較した。ペプチドまたはビヒクル対照を、０日目に１、３または１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週でマウスに腹腔内注射した。
【０３７６】
ペプチドのうちの１つまたはビヒクル対照の注射の１時間後、マウスに２５％（ｗ／ｖ）グルコース食塩水を腹腔内注射することによって、１時間グルコース負荷試験（ＧＴＴ）をマウスに実施した。グルコース食塩水を、マウスの体重１ｋｇ当たり１．５ｇの用量でマウスに投与した。血中グルコースレベルを、ペプチドまたはビヒクル対照の注射時（−６０分）、グルコース食塩水の注射時（０分）またはグルコース食塩水の注射の１５、３０、６０若しくは１２０分後に、測定した。１時間ＧＴＴの結果を図７に示す。
【０３７７】
グルコース食塩水を、ペプチドまたはビヒクル対照の注射の２４時間後に投与したこと以外は、１時間ＧＴＴと同様の方法で、２４時間ＧＴＴもマウスにおいて実施した。２４時間ＧＴＴの結果を図８に示す。
【０３７８】
各マウスの総血中グルコースレベルを、ペプチドまたはビヒクル対照の注射の０および７日後に測定し、図９に示す。
【０３７９】
更に、各マウスの体重を、ペプチドまたはビヒクル対照の注射の０、１、３、５および７日後に測定した。マウスの体重の変化％を図１０に示す。
【０３８０】
図１０に示されているように、ｍｔ−１７８およびｍｔ−２７４を３または１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週の用量で注射したマウスは、ＧＬＰアゴニスト対照ペプチドを（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週の用量で）注射したマウスと同じまたはそれ以上の程度で、減量した。
【０３８１】
図７および８に示されているように、ｍｔ−１７８、ｍｔ−２７４またはＧＬＰ−１アゴニスト対照を注射したマウスは、ビヒクル対照を注射したマウスと比較して、血中グルコースレベルの減少を示した。３ｎｍｏｌ／ｋｇ／週のｍｔ−１７８およびｍｔ−２７４が１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週の用量のＧＬＰ−１アゴニスト対照ペプチドと同じ効果を達成したので、ｍｔ−１７８およびｍｔ−２７４の効力はＧＬＰ−１アゴニスト対照ペプチドよりも大きいと思われた。１ｎｍｏｌ／ｋｇ／週のｍｔ−２７４が、１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週のＧＬＰ−１アゴニスト対照ペプチドと同様の結果を達成したので、このペプチドは最高の効力を有すると思われた。
【０３８２】
＜実施例２７＞
より高い用量（１０または３５ｎｍｏｌ／ｋｇ／週）のペプチドをマウスに皮下注射したこと以外は、実施例２６に記載されたものと同様にして、同じペプチドをマウスにおいて試験した。以下の２つの追加的なペプチドも、これらの用量で試験した：第１のペプチドは、ｍｔ−１７９と同じ構造を有するが、ｍｔ−１７８において見出されるようなマイケル付加を介してマレイミドＰＥＧにより形成される伝統的なチオエーテル結合を介してではなく、求核置換により形成されるより安定したチオエーテル結合（−ＳＣＨ２ＣＯ−）を介して位置４０のＣｙｓに結合している、ＰＥＧ基を含み、第２ペプチドは、ｍ−２７４と同じ構造を有するが、求核置換により形成されるチオエーテル結合（−ＳＣＨ２ＣＯ−）を介して位置４０のＣｙｓに結合しているＰＥＧ基を含む。これらのペプチドは、本明細書において、それぞれｍｔ−１７８（ＴＥ）およびｍｔ−２７４（ＴＥ）と呼ばれる。
【０３８３】
マウスの総血中グルコースレベルを、ペプチドまたはビヒクル対照の注射の０および７日後に測定し、図１１に示す。マウスの血中グルコースレベルの総変化を、ペプチドまたはビヒクル対照の注射の７日後に測定し、図１２に示す。
【０３８４】
各マウスの体重を、ペプチドまたはビヒクル対照の注射の０、１、３、５、７および１０後に測定した。マウスの体重の変化％を時間の関数として図１３に示し、一方、ペプチドまたはビヒクル対照の注射の７日後に測定した、マウスの体重の総変化を図１４に示す。
【０３８５】
図１２に示されているように、試験ペプチドのいずれかを注射した全てのマウスにおいて、血中グルコースの総変化は、ビヒクル対照を注射したマウスと比較して減少した。血中グルコースの最も劇的な変化は、３５ｎｍｏｌ／ｋｇ／週のｍｔ−２７４またはｍｔ−１７８（ＴＥ）を注射したマウスにおいて見られた。
【０３８６】
図１４に示されているように、試験ペプチドのいずれかを注射した全てのマウスにおいて、体重の総変化は、ビヒクル対照を注射したマウスと比較して減少した。血中グルコースの総変化と同様に、体重の最も劇的な変化は、３５ｎｍｏｌ／ｋｇ／週のｍｔ−２７４またはｍｔ−１７８（ＴＥ）を注射したマウスにおいて観察された。
【０３８７】
＜実施例２８＞
実施例２６に記載されたペプチドのインビボ活性を、アシル化型の直鎖ｍｔ−２７４ペプチドのインビボ活性と比較した。さらに具体的には、Ｃ末端アミノ酸（Ｌｙｓ残基）がＣ１６脂肪アシル基、Ｃ１４脂肪アシル基またはＣ１８脂肪アシル基に共有結合している３つのアシル化型のｍｔ−２７４を作製し、試験した。これらのペプチドは、本明細書において、それぞれｍｔ−２９８、ｍｔ−３０９およびｍｔ−３１０と呼ばれる。母体ペプチドと同様に、アシル化ペプチドｍｔ−２７４も、４０ｋＤａ  ＰＥＧ基を含んだ。しかし、アシル化ペプチドのＰＥＧ基は、ペプチドの位置２４のＣｙｓ残基の側鎖に共有結合していた。アシル化ペプチドｍｔ−２９８、ｍｔ−３０９およびｍｔ−３１０のアミノ酸配列は、本明細書において、それぞれ配列番号１０１〜１０３として提供される。
【０３８８】
非アシル化型のｍｔ−２９８、ｍｔ−２０９およびｍｔ−３１０（以下ｍｔ−３１１と呼ぶ）を作製し、試験した。ペプチドｍｔ−３１１は、ｍｔ−３１１が位置２４のＣｙｓ残基（ｍｔ−２７４において見出されるようなＣ末端のＣｙｓと対照的に）の側鎖を介してＰＥＧに共有結合している点、およびｍｔ−３１１のＣ末端残基が、ｍｔ−２７４において見出されるようなＣｙｓ残基ではなく、Ｌｙｓ残基である点において、ｍｔ−２７４と異なっていた。
【０３８９】
ペプチドまたはビヒクル対照を、０日目に１０ｎｍｏｌ／ｋｇでＤＩＯマウスに１週間皮下注射した。
【０３９０】
マウスの血中グルコースレベルを、ペプチドまたはビヒクル対照の注射の０および７日後に測定し、図１５に示す。各マウスの体重を、ペプチドまたはビヒクル対照の注射の０、１、３、５および７日後に測定した。マウスの体重の変化％を時間の関数として図１６に示し、一方、ペプチドまたはビヒクル対照の注射の７日後に測定したマウスの体重の総変化を図１７に示す。
【０３９１】
図１７に示されているように、ペプチドのいずれかを注射したマウスは、ビヒクル対照を注射したマウスと比較して、体重の減少を示した。ペグ化環状ラムタム含有ペプチド（ｍｔ−１７８）を注射したマウスは、注射の７日後に最大の体重減少を示した。
【０３９２】
図１５に示されているように、ｍｔ−１７８、ｍｔ−２７４、ｍｔ−３１１、またはそれらのＣ１４若しくはＣ１６アシル化型、を注射したマウスの血中グルコースレベルは、減少した。Ｃ１８脂肪アシル基によるアシル化は、血中グルコースレベルに変化を起こさないように思われ、アシル基の大きさは、ペプチドのグルコース低下効果にとって重要でありうることを示唆した。
【０３９３】
＜実施例２９＞
アシル化されているがペグ化されていない直鎖グルカゴンに基づいたラクタム欠失ペプチドを、実質的に上記に記載されたように作製した。具体的には、Ｃ末端アミノ酸（配列番号１０４）にＣ１４脂肪アシル基を含むｍｔ−２６０、Ｃ末端アミノ酸（配列番号１０５）にＣ１６脂肪アシル基を含むｍｔ−２６１、およびＣ末端アミノ酸（配列番号１０６）にＣ１８脂肪アシル基を含むｍｔ−２６２を作製した。これらのペプチドのそれぞれの構造は、ｍｔ−２９８、ｍｔ−３０９およびｍｔ−３１０と同様であったが、ｍｔ−２６０、ｍｔ−２６１およびｍｔ−２６２が位置２４においてペグ化Ｃｙｓ残基の代わりにＡｓｎ残基を含む点において異なっていた。
【０３９４】
ペプチドｍｔ−２６０、ｍｔ−２６１若しくはｍｔ−２６２、対照ペプチド（リラグルチド、アシル化ＧＬＰ−１類縁体）またはビヒクル対照を、２５または１２５ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で７日間マウスに毎日一度ずつ（ＱＤ）注射した。
【０３９５】
マウスの血中グルコースレベルを、ペプチドまたはビヒクル対照の注射の０および７日後に測定し、図１８に示す。各マウスの体重を、ペプチドまたはビヒクル対照の注射の０、１、３、５および７日後に測定した。マウスの体重の変化％を時間の関数として図１９に示し、一方、ペプチドまたはビヒクル対照の注射の７日後に測定したマウスの体重の総変化を図２０に示す。
【０３９６】
図１８に示されているように、アシル化非ペグ化直鎖ペプチド（ｍｔ−２６０、ｍｔ−２６１およびｍｔ−２６２）が血中グルコースレベルに対して有した効果は劇的なものであった。２５ｎｍｏｌ／ｋｇでは、これらのペプチドは、血中グルコースレベルの約５０％の減少を引き起こし、より高い用量では、血中グルコースレベルの５０％を超える減少を引き起こした。
【０３９７】
図１９に示されているように、アシル化非ペグ化直鎖ペプチドのそれぞれは（低または高用量のいずれでも）、低用量のリラグルチドにより引き起こされる体重の減少よりも強力に、体重の低下を引き起こした。体重は、７日間のアッセイの期間にわたって減少し続けた。
【０３９８】
これらの結果は、ＧＩＰおよびＧＬＰ−１受容体に対して活性であるアシル化非ペグ化直鎖グルカゴンに基づいたペプチドが、血中グルコースレベルおよび体重を劇的に減少させ得ることを示唆しており、それにより、これらのペプチドを、糖尿病を含む代謝障害の治療および肥満の治療に使用できることを示している。
【０３９９】
＜実施例３０＞
直鎖グルカゴンに基づいたペプチドｍｔ−２６１（配列番号１０５）を、異なる用量でＤＩＯマウス（１群当たりＮ＝８匹；平均初期体重＝４８ｇ）において試験した。マウスには、ビヒクルのみ、リラグルチド（３０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）またはｍｔ−２６１（０．３、１、３、１０若しくは３０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）を毎日一度ずつ１週間注射した。
【０４００】
マウスの体重を、最初の注射の０、１、３、５および７日後に測定した。図２１に示されているように、ｍｔ−２６１またはリラグルチドの注射は、マウスに減量を引き起こした。３ｎｍｏｌ／ｋｇのｍｔ−２６１が、３０ｎｍｏｌ／ｋｇのリラグルチドと実質的に同じ効果を達成したので（図２１）、ペプチドｍｔ−２６１は、リラグルチドよりも高い効力を示した。
【０４０１】
マウスの脂肪量を、最初の注射の７日後に、核磁気共鳴画像法により測定した。図２２に示されているように、ｍｔ−２６１の増加用量は、一般に脂肪量の減少と相関した。３ｎｍｏｌ／ｋｇのｍｔ−２６１を注射したマウスの脂肪量は、３０ｎｍｏｌ／ｋｇのリラグルチドを注射したマウスの脂肪量とほぼ同じであり、リラグルチドと比較して、ｍｔ−２６１の高い効力が実証された。
【０４０２】
マウスの血中グルコースレベルを、最初の注射の０および７日後に測定した。図２３に示されているように、３ｎｍｏｌ／ｋｇの低い用量のｍｔ−２６１は、血中グルコースレベルに有意な減少を引き起こした。脂肪量および体重アッセイの結果と一致して、３ｎｍｏｌ／ｋｇのｍｔ−２６１を注射したマウスの血中グルコースレベルの減少は、３０ｎｍｏｌ／ｋｇのリラグルチドを注射したマウスの血中グルコースレベルの減少と同様であり、リラグルチドと比較して、ｍｔ−２６１の高い効力が実証された。
【０４０３】
別個の実験において、非アシル化型のｍｔ−２６１、すなわちｍｔ−２６３（配列番号１１１）を、体重、食物摂取、血中グルコースレベルおよび脂肪量に対するインビボ効果について、９群のＣ５７ＢＩ／６マウス（１群当たり８匹のマウス）で試験した。マウスは１１か月齢であり、試験時には糖尿病誘発性食餌を９か月間摂っていた。マウスの平均体重は５７ｇであった。マウスには、３、１０または３０ｎｍｏｌ／ｋｇのｍｔ−２６３を毎日、１週間皮下注射した。対照群は、ビヒクル対照または１０若しくは３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日のエキセンディン−４の投与を受けた。
【０４０４】
体重に対するインビボ効果を評価するために、マウスの体重を０、１、３、５および７日目に測定したが、ここで０日目とは注射の初日のことである。図２４に示されているように、３つの用量のいずれかでのｍｔ−２６３の注射は、７日間の試験期間にわたって体重の一定した減少を引き起こした。体重に対する効果も、体重の総変化（図２５に示されている）がｍｔ−２６３ペプチドの増加用量によって増加したので、用量依存的であると思われた。図２５に示されているように、ｍｔ−２６３の３つの用量のいずれかにより達成された体重の総変化は、エキセンディン−４により（いずれの用量でも）達成された体重の総変化よりも、実質的に大きかった。
【０４０５】
食物摂取、脂肪量および血中グルコースに対するインビボ効果も決定した。ｍｔ−２６３を注射したマウスの７日目に測定した総食物摂取量および脂肪量は、ビヒクル対照およびエキセンディン−４と比較して、低減した。更に、ｍｔ−２６３を注射したマウスの（０日目に測定したレベルと比較して７日目に測定した）血中グルコースレベルの総変化は、ビヒクル対照またはエキセンディン−４のいずれかを注射したマウスと比較して、有意に低減した（図２６）。ペプチドの１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量は、血中グルコースレベルに最大の減少（ほぼ−８０ｍｇ／ｄＬ）を達成したので、最適な用量であると思われた。
【０４０６】
ペプチドｍｔ−２６３の体重、食物摂取および血中グルコースレベルに対するインビボ効果を、ｍｔ−３４９（配列番号２６２）、ｍｔ−２８０、ｍｔ−３５６およびｍｔ−３５７、ならびにビヒクル対照とも比較した。マウスには、ペプチドのいずれか１つを３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で１週間与えた。全てのペプチドは、ビヒクル対照と比較して、マウスの体重を低減するのに有効であった。
【０４０７】
＜実施例３１＞
直鎖アシル化グルカゴンに基づいたペプチドｍｔ−２７７、ｍｔ−２７８およびｍｔ−２７９のインビボ効果を試験し、リラグルチドと比較した。ＤＩＯマウス（１群当たり８匹のマウス；平均初期体重＝５１．４ｇ）には、ビヒクル対照、または１０ｎｍｏｌ／ｋｇのリラグルチド、ｍｔ−２７７、ｍｔ−２７８若しくはｍｔ−２７９を毎日、１週間皮下注射した。
【０４０８】
マウスの体重を、最初の注射の０、１、３、５および７日後に測定した。図２７に示されているように、ｍｔ−２７７、ｍｔ−２７８またはｍｔ−２７９の注射は、マウスに有意な減量を引き起こした。更にこれらのペプチドは、全て、リラグルチドよりも高い効力を示した。
【０４０９】
マウスの血中グルコースレベルを、最初の注射の０および７日後に測定した。図２８に示されているように、ｍｔ−２７７、ｍｔ−２７８およびｍｔ−２７９は、それぞれ、血中グルコースレベルに有意な減少を引き起こし、その減少は、リラグルチドを注射したマウスにおいて見られるものよりもかなり大きかった。
【０４１０】
＜実施例３２＞
ＧＬＰ−１受容体活性のグルカゴンに基づいた類縁体を修飾して、配列番号９５のアミノ酸配列のＣ末端延長部を含ませ、更に修飾して、配列番号９５のＣ末端にＬｙｓを含ませた。類縁体の位置４０に配置したＬｙｓ残基を、Ｃ１４脂肪アシル基でアシル化した。このアシル化類縁体を、グルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体に対するインビトロ活性について、実質的に実施例１６に記載されたように試験した。そのインビトロ活性は、母体である、Ｃ末端延長部を欠き、位置４０でアシル化されている、ＧＬＰ−１受容体活性のグルカゴンに基づいた類縁体のインビトロ活性と比較した。Ｃ末端延長アシル化類縁体は、ＧＩＰ受容体に対する活性のおよそ１５％の増加を示し、グルカゴン受容体に対する活性のおよそ５２％の増加を示した。ＧＬＰ−１受容体に対する活性は、Ｃ末端延長アシル化類縁体により刺激されると、実際に減少した。しかし、活性は、依然として、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１により達成される活性の１００％超であった。
【０４１１】
＜実施例３３＞
アシル化グルカゴン類縁体ペプチド（それぞれ、Ｃ末端カルボキシレートの代わりにアミドを含む）を実質的に上記に記載されたように合成した。ペプチドｍｔ−３５８、ｍｔ−３６７、ｍｔ−３６８およびｍｔ−３６９は、アシル化単量体であり、一方、ｍｔ−３５４、ｍｔ−３７６およびｍｔ−３７７は、アシル化二量体であり、ここで二量体は、それぞれ、Ｃ末端Ｃｙｓ残基を介して結合する２つの単量体を含んだ。ペプチドｍｔ−３６７、ｍｔ−３６８およびｍｔ−３６９は、アシル基を結合する目的でγＧｌｕ−γＧｌｕジペプチドスペーサーを含み、一方、ｍｔ−３５８はスペーサーの不在下でアシル化された。ペプチドｍｔ−２２５、ｍｔ−２２７およびｍｔ−２９４は、位置１６のグルタミン酸と位置２０のリシンの間にラクタム架橋を含む、ペグ化単量体であった。ペプチドｍｔ−２２５およびｍｔ−２２７は、ＰＥＧを結合する目的で、ジペプチドスペーサーを含み、一方、ｍｔ−２９４は、ハロアセチルとの反応により作製されるチオエーテルを介してアシル化された。ペプチドｍｔ−３５６およびｍｔ−３５７は、非アシル化対照ペプチドとして機能し、ｍｔ−３５７は位置７にＩｌｅを含んだが、ｍｔ３５６はＴｈｒを含んだ。全てについて、ＧＩＰ受容体、ＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体に対するインビトロ活性を、実質的に実施例１６に記載されたように試験した。それぞれのペプチドの天然ホルモンに関するＥＣ５０（ｎＭ）および活性を表４に示す。
【０４１２】
【表４】
2015164922.tif 000028
2015164922.tif 000029
【０４１３】
【化１７】
2015164922.tif 000030
【０４１４】
表４に示されているように、３つのアシル化二量体は、全て、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体に対して強力な活性を示した。また、ｍｔ−３６９により示されたＧＬＰ−１受容体に対する活性は、ｍｔ−３５８により示されたものと比較して劇的に増強され、ｍｔ−３６８のＧＩＰ受容体に対する活性は、ｍｇ−３５８と比較して実質的に維持されており、このことは、スペーサーを介したグルカゴンペプチドのアシル化が、ＧＬＰ−１受容体に対する活性を増加し、同時にＧＩＰ受容体に対する強い活性を維持できることを示唆した。グルカゴン類縁体の位置１０のスペーサーを介したアシル化は、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体に対する相対的活性がｍｔ−３６７およびｍｔ−３６９とほぼ同じだったので、グルカゴン類縁体の位置４０と同じほど良好な位置であると思われた。
【０４１５】
＜実施例３４＞
同じアミノ酸配列を有するが、ペグ化リンカーが異なる、以下の２つのアシル化グルカゴン類縁体ペプチドを、実質的に本明細書に記載されたように作製した：ｍｔ−３３１（配列番号１５３）は、下記構造：
【化１８】
2015164922.tif 000031
のＰＥＧへの結合を含み、一方、ｍｔ−３３１（配列番号１００）は、下記構造：
【化１９】
2015164922.tif 000032
のＰＥＧへの結合を含んだ。
【０４１６】
２つのペプチドまたはビヒクル対照を、複数群のＤＩＯマウス（１群当たり６匹のマウス；平均体重＝６４．６ｇ）に毎週一度ずつ１週間の皮下注射により投与した。ペプチドを１０または３５ｎｍｏｌ／ｋｇのいずれかの用量で投与した。
【０４１７】
マウスの体重を、ペプチドまたはビヒクル対照の投与の０、１、３、５および７日後に測定した。高用量のｍｔ−３１１またはｍｔ−３３１のいずれかを注射したマウスの体重は、１週間にわたって一定に減少した。体重の総変化（％）を図２９に示す。この図に示されているように、体重の総変化は、ｍｔ−３１１を注射したマウスにおいて最大であった。
【０４１８】
マウスの各群による総食物摂取量も、ペプチドまたはビヒクル対照の投与の０、１、３、５および７日後に測定した。図３０に示されているように、ｍｔ−３１１またはｍｔ−３３１の用量のいずれかを注射したマウスの群による総食物摂取量は、ビヒクル対照を注射したマウスと比較して減少した。
【０４１９】
マウスの各群の血中グルコースレベルを、ペプチドまたはビヒクル対照の投与の０および７日後に測定した。マウスの血中グルコースレベルは、高用量のｍｔ−３１１またはｍｔ−３３１のいずれかを投与すると減少した。図３１に示されているように、血中グルコースレベルの減少は、３５ｎｍｏｌ／ｋｇのｍｔ−３３１を注射したマウスにおいて最大であった。
【０４２０】
マウスの各群の脂肪量を測定した。しかし、ペプチドの投与は、脂肪量に対して効果を有するとは思われなかった。
【０４２１】
＜実施例３５＞
アミノ酸配列が同じであるが、位置４０のＬｙｓに結合しているアシル基が不在である（ｍｔ−３３１（配列番号１５３））またはＣ１４脂肪アシル基が存在する（ｍｔ−３５３（配列番号１６６））ことにより異なる、これら２つのペプチドの、体重、食物摂取、血中グルコースレベルおよび脂肪量に対するインビボ効果を、７か月齢のＣ５７ＢＩ／６マウスにおいて試験した。マウスは糖尿病誘発性食餌を５か月摂り、平均初期体重は５３ｇであった。ペプチドまたはビヒクル対照を、０．１、０．３、３または１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で１週間皮下注射することによってマウスに投与した。
【０４２２】
体重を、ペプチドまたはビヒクル対照の投与の０、１、３、５および７日後に測定した。図３２に示されているように、体重の総変化は、ｍｔ−３３１またはｍｔ−３５３のいずれかの１０ｎｍｏｌ／ｋｇを注射したマウスにおいて最も有意であった。
【０４２３】
マウスによる食物摂取を、ペプチドまたはビヒクル対照の投与の０、１、３、５および７日後に測定した。図３３に示されているように、ｍｔ−３３１またはｍｔ−３５３のいずれかの３または１０ｎｍｏｌ／ｋｇを注射したマウスによる総食物摂取量は、ビヒクル対照を投与したマウスと比較して減少した。
【０４２４】
マウスの血中グルコースレベルをモニターした。図３４に示されているように、ｍｔ−３３１は、血中グルコースレベルに用量依存的に減少を引き起こした。２つの用量のｍｔ−３５３も、血中グルコースレベルに減少を引き起こした。脂肪量レベルは、いずれのペプチドの投与によっても有意に影響を受けなかった。
【０４２５】
＜実施例３６＞
配列番号１２３、１２４および１２５の構造をそれぞれ有する３つのアシル化トリアゴニストペプチドｍｔ−２７７、ｍｔ−２７８およびｍｔ−２７９の、体重、血中グルコースレベルおよび食物摂取に対するインビボ効果を、ＤＩＯマウスの８群（１群当たり８匹のマウス）において試験した。ペプチドは、同じアミノ酸構造を有したが、それらが結合している脂肪アシル基の大きさが異なっていた。濃度が１０ｎＭ／ｋｇのリラグルチドを対照として使用した。ペプチドまたはビヒクル対照を、皮下注射により毎日、１週間投与した。
【０４２６】
グルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体に対するインビトロ活性を試験し、天然ホルモンと比べたそれぞれのペプチドの活性％を下記の表５に示す。
【０４２７】
【表５】
2015164922.tif 000033
【０４２８】
マウスの体重を、ペプチドまたはビヒクル対照の投与の０、１、３、５および７日後に測定した。１週間にわたって、アシル化トリアゴニストペプチドの１つを注射したマウスの体重は、ビヒクル対照と比較して劇的に減少した。図３５に示されているように、アシル化トリアゴニストペプチドの１つを注射したマウスの体重の総変化（％）は、およそ−１５％であり、一方、リラグルチドは、体重の５％未満の減少しか達成しなかった。
【０４２９】
＜実施例３７＞
ペグ化アシル化ペプチド（ｍｔ−３０９；配列番号１０２）および非ペグ化アシル化ペプチド（ｍｔ−２６１；配列番号１０５）の効能に対する、投与頻度の効果を、平均体重の５８ｇを有するＤＩＯマウスマウスの７群（１群当たり８匹のマウス）により試験した。ペプチドは、５ｎｍｏｌ／ｋｇの用量を毎日一度ずつ、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量を２日毎に、または３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量を毎週一度ずつ、マウスに皮下注射した。マウスの各群が試験期間の終了までに３０ｎｍｏｌ／ｋｇを摂取するように、研究を６日間続けた。体重および血中グルコースレベルを、最初の投与の０および６日後に測定した。
【０４３０】
図３６に示されているように、ｍｔ−３０９を毎週一度ずつ注射したマウスの体重の総変化（％）は、同じペプチドを毎日一度ずつ注射したマウスの体重の総変化とほぼ同じであった。また、図３６に示されているように、ｍｔ−２６１を毎日一度ずつ注射したマウスの体重の総変化は、同じペプチドを２日毎に注射したマウスの体重の総変化とほぼ同じであった。
【０４３１】
体重における同じ傾向が血中グルコースレベルにおいても観察され（図３７）、ｍｔ−３０９の毎週一度ずつの注射は、このペプチドの毎日一度ずつの注射と同じ血中グルコースレベルの減少を達成し、ｍｔ−２６１の毎日一度ずつの注射は、このペプチドの２日毎の注射と同じ血中グルコースレベルの減少を達成した。
【０４３２】
＜実施例３８＞
効能に対する投与頻度の効果を、アシル化グルカゴンアゴニストペプチドｍｔ−２６１（配列番号１０５）について、初期体重５６ｇを有するＤＩＯマウスの８群（１群当たり８匹のマウス）に、各群が１週間当たり３０ｎｍｏｌ／ｋｇの総用量を摂取するように、５ｎｍｏｌ／ｋｇを毎日、１０ｎｍｏｌ／ｋｇを２日毎、１５ｎｍｏｌ／ｋｇを３日毎、または３０ｎｍｏｌ／ｋｇを１日、それぞれ皮下注射することにより試験した。マウスは８か月齢であり、糖尿病誘発性食餌を６か月間摂っていた。各群の体重、食物摂取、血中グルコースレベルおよび脂肪量を測定した。図３８に示されているように、３日毎にペプチドを注射したマウスは、最大の体重減少を示した。興味深いことに、ペプチドを毎日注射したマウスおよびペプチドを２日毎に注射したマウスは、ほぼ同じ体重減少を示した。
【０４３３】
＜実施例３９＞
グルカゴン受容体に対してのみ測定可能なアゴニスト活性を有し、ＧＩＰ受容体に対しては活性を有さず、下記のペプチドＪ：
ＨＳ−Ｘ−ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＴＲＲＡＡＥＦＶＡＷＬ（Ｎｌｅ）ＤＥ（配列番号２４０）の主鎖、または、
ペプチドＫ：
ＨＳ−Ｘ−ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（Ａｉｂ）ＲＲＡＡＤＦＶＡＷＬＭＤＥ（配列番号２４１）
の主鎖を含み、位置３に付加的修飾を有する、グルカゴン類縁体ペプチドを、実質的に本明細書に記載されているように、固相ペプチド合成により作製した。ペプチドを、実質的に実施例１６に記載されているように、グルカゴン受容体に対するインビトロ活性について試験した。それぞれのペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）を表６に示す。
【０４３４】
【表６】
2015164922.tif 000034
【０４３５】
表６に示されているように、複数のアミノ酸は、グルカゴン受容体において活性を実質的に失うことなく位置３のＧｌｎを置換することができ、幾つかの場合、例えばペプチドＫ主鎖にＤａｂ（Ａｃ）やＱ（Ｍｅ）を有する場合は、実際には活性は修飾により増加した。
【０４３６】
＜実施例４０＞
グルカゴン受容体に対しては検出可能な活性を有するが、ＧＩＰ受容体に対しては活性を有さず、多様なグルカゴン類縁体主鎖上の位置３にＤａｂ（Ａｃ）を含む、グルカゴン類縁体ペプチドを、実質的に本明細書に記載されているように作製し、グルカゴン受容体に対するインビトロ活性を試験した。それぞれのペプチドの構造および活性を表７に示す。
【０４３７】
【表７】
2015164922.tif 000035
【０４３８】
＜実施例４１＞
Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミドを有するグルカゴンの類縁体を実質的に本明細書に記載されたように作製した。
【０４３９】
ペプチドｍｔ−３６７、ｍｔ−３６８およびｍｔ−３６９は、それぞれ配列番号２３５、２３６および２３７の構造を含んだ。ペプチドｍｔ−３８４は、以下のアミノ酸修飾を有する配列番号１のアミノ酸を含んでいた：位置１にＴｙｒ、位置２にＡＩＢ、位置１０にＬｙｓ（ここでＬｙｓは、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕジペプチドスペーサーを介してＣ１６アシル基に共有結合していた）、位置１２にＩｌｅ、位置１６にＬｙｓ、位置１７にＧｌｎ、位置１８にＡｌａ、位置２０にＡＩＢ、位置２１にＧｌｕ、位置２４にＡｓｎ、位置２７にＬｅｕ、位置２８にＡｌａおよび位置２９にＧｌｙ、続いて、位置２９のアミノ酸のＣ末端側に、配列番号９５のアミノ酸。ペプチドｍｔ−３８５は、位置７のＴｈｒがＩｌｅに交換されている以外は、ペプチドｍｔ−３８４と同じ構造を有した。
【０４４０】
類縁体を、グルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体に対するインビトロ活性について、実質的に本明細書に記載されたように試験した。結果を表８に示す。
【０４４１】
【表８】
2015164922.tif 000036
【０４４２】
８匹のＤＩＯマウスの９群（系統：Ｃ５７Ｂ１６  ＷＴ）に、表８のペプチドのうちの１つの１０ｎｍｏｌ／ｋｇを毎日、７日間皮下注射した。マウスの平均初期体重は５７．６ｇであった。マウスは、およそ１０か月齢であり、高脂肪食餌を約８か月間摂っていた。
【０４４３】
体重の総変化を７日目に測定した。表８のペプチドを注射したマウスは、全て、ビヒクル対照と比較して、体重の減少を示した。ｍｔ−３６９を注射したマウスが最大量の減量（約２５％の減少）を示し、ｍｔ−３６９を注射したマウス（約２２％の減少）およびｍｔ−３８４を注射したマウス（約２１％の減少）がその次であった。ｍｔ−３６７またはｍｔ−３８５を注射したマウスは、低いが、依然として有意な減量（ｍｔ−３６７：約１８％の減少、およびｍｔ−３８５：約１５％の減少）を示した。
【０４４４】
本明細書に引用されている、出版物、特許出願、及び特許を含む、全ての参考文献は、まるでそれぞれの参考文献が個別にかつ明確に参照として組み込まれているように示され、その全体が本明細書に記載されているのと同じ程度で、参照として本明細書に組み込まれる。
【０４４５】
本発明を記載する文脈における（特に、後に続く請求項の文脈における）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」、並びに類似の参照の使用は、本明細書において特に指定がない限り又は文脈において明らかに相反しない限り、単数及び複数の両方を網羅することが考慮されるべきである。用語「含む」、「有する」、「含まれる」、及び「含有する」は、特に示されない限り、非限定的用語である（すなわち、「含まれるが、これらに限定されない」を意味する）と考慮されるべきである。
【０４４６】
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において特に指定のない限り、単に、範囲内にあるそれぞれ別個の値及びそれぞれの終点を個別に参照するための省略的な方法として機能することが意図され、それぞれの別個の値及び終点は、まるで本明細書において個別に引用されているかのように本明細書に組み込まれる。
【０４４７】
本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書において特に指定のない限り又は文脈において明らかに相反しない限り、任意の適切な順番で実施することができる。本明細書において提供されている任意の又は全ての例又は例示的な言葉（例えば「のような」）は、単に本明細書をより良好に説明することだけが意図され、特に請求項に記載されていない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書におけるどの言葉も、請求項に記載されていない何らかの要素が本発明の実施に必須であることを示している、と考慮されるべきではない。
【０４４８】
本発明を実施するために、発明者たちが知っている最良の形態を含む、本発明の好ましい実施態様が本明細書に記載されている。これらの好ましい実施態様の変更は、前述の記載を読むことにより当業者に明らかとなりうる。発明者たちは、当業者がそのような変更を適切な場合に用いることを予想し、発明者たちは、発明が本明細書に特定的に記載されている以外の方法で実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法令が許す限り、添付の請求項に引用されている主題の全ての修正及び等価物を含む。更に、全ての可能な変更における上記記載の要素の任意の組み合わせは、本明細書において特に指定のない限り又は文脈において明らかに相反しない限り、本明細書に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年4月10日(2015.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）の修飾を有し、
ＧＩＰ受容体に対する天然ＧＩＰの活性の少なくとも１％の活性を示す、
ＧＩＰアゴニスト活性を有する、グルカゴン（配列番号１）の類縁体：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する、位置１でのアミノ酸修飾、
（ｂ）下記から成る群から選ばれる修飾：
（ｉ）位置ｉとｉ＋４のアミノ酸の側鎖の間、または位置ｊとｊ＋３のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋（ここで、ｉは１２、１３、１６、１７、２０または２４であり、ｊは１７である）、および
（ｉｉ）類縁体の位置１６、２０、２１および２４のうちの１、２、３つ、または全てのアミノ酸が、α，α−二置換アミノ酸で置換されている、
ならびに、
（ｃ）１〜１０個の更なるアミノ酸修飾。
【外国語明細書】
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