(57)【要約】【課題】膜タンパク質、ペプチド、ポリフェノール類を始めとした難溶性試料の測定の際にも、余計な添加剤である界面活性剤を用いることなく、それらの難溶性試料を感度良く測定することのできるMALDI質量分析用界面活性型マトリックスを提供する。【解決手段】フェルラ酸、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸、カフェイン酸、及び、ゲンチジン酸からなる群から選択される有機酸の誘導体からなるMALDI質量分析用界面活性型マトリックスであって、該有機酸のカルボキシル基及び／又はフェノール基を親水化又は疎水化することによって得られる両親媒性有機酸誘導体からなることを特徴とするMALDI質量分析用界面活性型マトリックス。【選択図】図１
2015155884.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェルラ酸、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸、カフェイン酸、及び、ゲンチジン酸からなる群から選択される有機酸の誘導体からなるMALDI質量分析用界面活性型マトリックスであって、該有機酸のカルボキシル基及び／又はフェノール基を親水化又は疎水化することによって得られる両親媒性有機酸誘導体からなることを特徴とするMALDI質量分析用界面活性型マトリックス。
【請求項２】
下記一般式(１)で表される両親媒性有機酸誘導体からなるMALDI質量分析用界面活性型マトリックス(ただし、Ｒ2が、水素原子、ＯＨ、ＯＸ、又は、Ｏ(ＣＨ2)kＳＯ3Ｘのとき、Ｒ5は、ＮＨ(ＣＨ2)mＣＨ3、又は、Ｏ(ＣＨ2)nＣＨ3であり、Ｒ2がＯ(ＣＨ2)2(ＣＦ2)lＣＦ3のとき、Ｒ5は、ＯＨ、又は、ＯＸである。)。
【化１】
2015155884.tif 000012
［一般式(１)中において、
Ｒ1は、水素原子、又は、メトキシ基、
Ｒ2は、水素原子、ＯＨ、ＯＸ、Ｏ(ＣＨ2)kＳＯ3Ｘ、又は、Ｏ(ＣＨ2)2(ＣＦ2)lＣＦ3、
Ｒ3は、水素原子、ＯＨ、又は、メトキシ基、
Ｒ4は、水素原子、又は、ＣＮ、
Ｒ5は、ＯＨ、ＯＸ、ＮＨ(ＣＨ2)mＣＨ3、又は、Ｏ(ＣＨ2)nＣＨ3、
をそれぞれ表す(Ｒ2、Ｒ5において、Ｘは、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓから選択されるアルカリ金属、ｋは2〜8の整数、ｌは3〜17の整数、ｍは3〜17の整数、ｎは3〜17の整数である。)。］
【請求項３】
Ｒ1、Ｒ3の一方が水素原子、他方がメトキシ基であり、Ｒ2が、ＯＸ、又は、Ｏ(ＣＨ2)kＳＯ3Ｘであり、Ｒ4が水素原子であり、Ｒ5がＮＨ(ＣＨ2)mＣＨ3である、請求項２に記載のMALDI質量分析用界面活性型マトリックス。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の界面活性型マトリックスと、フェルラ酸、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸、カフェイン酸、及び、ゲンチジン酸からなる群から選択される１種又は２種以上の有機酸との混合物からなるMALDI質量分析用マトリックス。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のマトリックスを用いるMALDI質量分析方法。
【請求項６】
請求項５に記載のMALDI質量分析方法において、溶媒、分析対象試料、及び、前記マトリックスからなる混合物を調製する際に、前記界面活性型マトリックスを臨界ミセル濃度の10％以上とすることを特徴とする、MALDI質量分析方法。
【請求項７】
分析対象試料が、タンパク質、ペプチド、核酸、糖類、ポリマー、脂質、及び、有機化合物からなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項５又は６に記載のMALDI質量分析方法。
【請求項８】
下記一般式(１)で表される有機酸誘導体(ただし、Ｒ2が、水素原子、ＯＨ、ＯＸ、又は、Ｏ(ＣＨ2)kＳＯ3Ｘのとき、Ｒ5は、ＮＨ(ＣＨ2)mＣＨ3、又は、Ｏ(ＣＨ2)nＣＨ3であり、Ｒ2がＯ(ＣＨ2)2(ＣＦ2)lＣＦ3のとき、Ｒ5は、ＯＨ、又は、ＯＸである。Ｒ5がＮＨ(ＣＨ2)mＣＨ3、又は、Ｏ(ＣＨ2)nＣＨ3であって、かつ、Ｒ2が、水素原子、又は、ＯＨである場合の有機酸誘導体を除く。)。
【化１】
2015155884.tif 000013
［一般式(１)中において、
Ｒ1は、水素原子、又は、メトキシ基、
Ｒ2は、水素原子、ＯＨ、ＯＸ、Ｏ(ＣＨ2)kＳＯ3Ｘ、又は、Ｏ(ＣＨ2)2(ＣＦ2)lＣＦ3、
Ｒ3は、水素原子、ＯＨ、又は、メトキシ基、
Ｒ4は、水素原子、又は、ＣＮ、
Ｒ5は、ＯＨ、ＯＸ、ＮＨ(ＣＨ2)mＣＨ3、又は、Ｏ(ＣＨ2)nＣＨ3、
をそれぞれ表す(Ｒ2、Ｒ5において、Ｘは、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓから選択されるアルカリ金属、ｋは2〜8の整数、ｌは3〜17の整数、ｍは3〜17の整数、ｎは3〜17の整数である。)。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、MALDI質量分析において、溶媒に難溶性で検出することが困難な分析対象試料(アナライト)をも可溶化させ、良好な共結晶を形成することにより、アナライトを効率的にイオン化させ、高感度検出させうる界面活性型マトリックス、該界面活性型マトリックスを用いるMALDI質量分析方法、及び、該界面活性型マトリックスに好適に使用可能な新規有機酸誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
MALDI(マトリックス支援レーザー脱離／イオン化)は、分子のイオン化のためのプロセスである。１９８０年代に開発されて以来、生体高分子、及び、合成ポリマーの質量分析に特に効果的であることが示されている。
MALDI質量分析法では、対象試料(アナライト)とマトリックスの混合結晶(共結晶)を調製し、それにレーザー光を照射することにより分析物のイオン化を行う。マトリックスは、照射されたレーザーの光エネルギーを吸収し、イオン化すると同時に急速加熱されて気化する。レーザー照射で直接アナライト分子が気化することはないが、アナライト分子を取り囲んでいたマトリックス分子と共に脱離する。続いて、イオン化したマトリックス分子とアナライト分子との間でプロトンや電子などの授受が起こることによって、対象試料をイオン化させる。レーザー源として、窒素レーザー(波長337nm)やＹＡＧレーザー(波長355nm)が一般的に用いられるため、マトリックスにはこの波長領域に吸収帯を持つ物質が使用される。
【０００３】
マトリックスは、MALDI-MS(MALDI質量分析)での分析に適した事実上全ての物質に、すなわち、分子量の大きい又は小さい、不揮発性であって熱的に不安定な化合物、例えば、生体高分子など、例えば、タンパク質及び脂質、ならびに分子量の小さな、有機及び無機分析物、例えば、薬物、植物代謝産物などについて使用することができる。
最もよく知られたマトリックス用化合物は、最も一般的に使用されるα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(CHCA、特許文献１参照)及びその誘導体である。MALDI-MSで使用されるその他のマトリックスの例は、シナピン酸(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシ桂皮酸)、フェルラ酸(4-ヒドロキシ-3-メトキシ桂皮酸、非特許文献１参照)又は2,5-ジヒドロキシ安息香酸(2,5-DHB)である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許公開第２００２／０１４２９８２号明細書([0139]参照 )
【特許文献２】特表２０１０−５３７２０６号公報
【特許文献３】特開２００３−１２８６３２号公報
【特許文献４】特開２００３−２６１４４３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ronald C. Beavis et al. Rapid Communications in Mass Spectrometry，Vol.3，No.12. 432-435 (1989)
【非特許文献２】Santi M. Mandal et al. Eur. J. Mass Spectrom. Vol.16，567-575 (2010)
【非特許文献３】Fukuyama Y. et al. Anal. Chem. Vol.84，4237-4243 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、これらのマトリックスを用いても、膜タンパク質、ペプチド、ポリフェノール類を始めとした難溶性試料の測定には課題があるのが現状であり、こうしたアナライトを可溶化させるために、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの余計な添加物である界面活性剤が用いられる。一方、SDSを始めとした界面活性剤の添加は、MALDI-MS分析におけるアナライトの測定感度を低下するといった問題があった(非特許文献２参照)。そのために、難溶性のアナライトとマトリックスの共結晶が形成されたとしても、共結晶中から界面活性剤を取り除くプロセスが必要であった。
【０００７】
本発明は、このような従来技術を背景としたものであり、膜タンパク質、ペプチド、ポリフェノール類を始めとした疎水性で難溶性試料の測定の際にも、余計な添加剤である界面活性剤を用いることなく、それらの難溶性試料を感度良く測定することのできるMALDI質量分析用界面活性型マトリックスを提供することを課題とする。
また、本発明は、膜タンパク質、ペプチド、ポリフェノール類を始めとした難溶性試料の測定の際にも、余計な添加剤である界面活性剤を用いることなく、それらの難溶性試料を感度良く測定することのできるMALDI質量分析方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、そのような難溶性試料をも感度良く測定することのできるMALDI質量分析用界面活性型マトリックスとして有用な新規有機酸誘導体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、MALDI質量分析法における既存のマトリックスとして用いられるフェルラ酸などの有機酸を誘導体化し、両親媒化することによって、界面活性機能を有するマトリックスとすることによりアナライトを可溶化させ、効率的にイオン化、これにより既存の有機酸では検出しづらいアナライトをMALDI質量分析で高感度検出できることを見出して、本発明を完成させるに至った。
MALDI質量分析用のマトリックスは、一般に、(ａ)レーザー光の吸収能、(ｂ)高真空下での安定性、(ｃ)検出対象試料の可溶化能、(ｄ)検出対象試料との共晶形成能、の機能や性質が必要とされているが、既存のマトリックス用有機酸を誘導体化して両親媒化することにより、(ａ)レーザー光の吸収能、(ｂ)高真空下での安定性、を維持したままで、(ｃ)検出対象試料の可溶化能、(ｄ)検出対象試料との共晶形成能、を向上できるとの本発明者独自のアイデアを実施例等の各種試験により確認することで前述のような知見を得た。
【０００９】
なお、特許文献２には、陽イオン、陰イオン、及び、二重電荷又はそれ以上の電荷を有するイオンに対する検出及び感受性を改良するため、シアノ桂皮酸誘導体をMALDI質量分析用のマトリックスとして使用することが記載されているが、該シアノ桂皮酸誘導体が界面活性型であることは全く記載されていないし、また、該シアノ桂皮酸誘導体は、ベンゼン環の位置番号4の基をハロゲンや炭素1〜10のアルキルとするものであるから、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(CHCA)の誘導体とは言えない。
また、特許文献３には、アルキル基を有するフェルラ酸誘導体が、特許文献４には、アルキル基を有するフェルラ酸アミド誘導体が、それぞれ記載されているが、紫外線吸収剤や糖尿病治療剤として用いるものであって、それらのフェルラ酸誘導体をMALDI質量分析用のマトリックスとして使用することは全く記載されていない。
また、非特許文献３には、2,5-DHBのヒドロキシル基に疎水性アルキル鎖が結合したアルキル化DHB誘導体(ADHB)を疎水性ペプチド分析のためのマトリックス用添加剤としてCHCAマトリックスに添加して用いることが記載されているが、ADHB自体がマトリックスとしての機能や性質を有していることは記載されていないし、また、ADHBが界面活性型であることも記載されていない。
それ故、これらの特許文献２、３、４や非特許文献３は、本発明を示唆するものではない。
【００１０】
本発明は、前述のようなアイデアや知見に基づいてなされたものであり、この出願では、以下の発明が提供される。
〈１〉フェルラ酸、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸、カフェイン酸、及び、ゲンチジン酸からなる群から選択される有機酸の誘導体からなるMALDI質量分析用界面活性型マトリックスであって、該有機酸のカルボキシル基及び／又はフェノール基を親水化又は疎水化することによって得られる両親媒性有機酸誘導体からなることを特徴とするMALDI質量分析用界面活性型マトリックス。
〈２〉下記一般式(１)で表される両親媒性有機酸誘導体からなるMALDI質量分析用界面活性型マトリックス(ただし、Ｒ2が、水素原子、ＯＨ、ＯＸ、又は、Ｏ(ＣＨ2)kＳＯ3Ｘのとき、Ｒ5は、ＮＨ(ＣＨ2)mＣＨ3、又は、Ｏ(ＣＨ2)nＣＨ3であり、Ｒ2がＯ(ＣＨ2)2(ＣＦ2)lＣＦ3のとき、Ｒ5は、ＯＨ、又は、ＯＸである。)。
【化１】
2015155884.tif 000003
［一般式(１)中において、
Ｒ1は、水素原子、又は、メトキシ基、
Ｒ2は、水素原子、ＯＨ、ＯＸ、Ｏ(ＣＨ2)kＳＯ3Ｘ、又は、Ｏ(ＣＨ2)2(ＣＦ2)lＣＦ3、
Ｒ3は、水素原子、ＯＨ、又は、メトキシ基、
Ｒ4は、水素原子、又は、ＣＮ、
Ｒ5は、ＯＨ、ＯＸ、ＮＨ(ＣＨ2)mＣＨ3、又は、Ｏ(ＣＨ2)nＣＨ3、
をそれぞれ表す(Ｒ2、Ｒ5において、Ｘは、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓから選択されるアルカリ金属、ｋは2〜8の整数、ｌは3〜17の整数、ｍは3〜17の整数、ｎは3〜17の整数である。)。］
〈３〉Ｒ1、Ｒ3の一方が水素原子、他方がメトキシ基であり、Ｒ2が、ＯＸ、又は、Ｏ(ＣＨ2)kＳＯ3Ｘであり、Ｒ4が水素原子であり、Ｒ5がＮＨ(ＣＨ2)mＣＨ3である、〈２〉に記載のMALDI質量分析用界面活性型マトリックス。
〈４〉〈１〉〜〈３〉のいずれか１項に記載の界面活性型マトリックスと、フェルラ酸、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸、カフェイン酸、及び、ゲンチジン酸からなる群から選択される１種又は２種以上の有機酸との混合物からなるMALDI質量分析用マトリックス。
〈５〉〈１〉〜〈４〉のいずれか１項に記載のマトリックスを用いるMALDI質量分析方法。
〈６〉〈５〉に記載のMALDI質量分析方法において、溶媒、分析対象試料、及び、前記マトリックスからなる混合物を調製する際に、前記界面活性型マトリックスを臨界ミセル濃度の10％以上とすることを特徴とする、MALDI質量分析方法。
〈７〉分析対象試料が、タンパク質、ペプチド、核酸、糖類、ポリマー、脂質、及び、有機化合物からなる群から選択されるものであることを特徴とする〈５〉又は〈６〉に記載のMALDI質量分析方法。
〈８〉下記一般式(１)で表される有機酸誘導体(ただし、Ｒ2が、水素原子、ＯＨ、ＯＸ、又は、Ｏ(ＣＨ2)kＳＯ3Ｘのとき、Ｒ5は、ＮＨ(ＣＨ2)mＣＨ3、又は、Ｏ(ＣＨ2)nＣＨ3であり、Ｒ2がＯ(ＣＨ2)2(ＣＦ2)lＣＦ3のとき、Ｒ5は、ＯＨ、又は、ＯＸである。Ｒ5がＮＨ(ＣＨ2)mＣＨ3、又は、Ｏ(ＣＨ2)nＣＨ3であって、かつ、Ｒ2が、水素原子、又は、ＯＨである場合の有機酸誘導体を除く。)。
【化１】
2015155884.tif 000004
［一般式(１)中において、
Ｒ1は、水素原子、又は、メトキシ基、
Ｒ2は、水素原子、ＯＨ、ＯＸ、Ｏ(ＣＨ2)kＳＯ3Ｘ、又は、Ｏ(ＣＨ2)2(ＣＦ2)lＣＦ3、
Ｒ3は、水素原子、ＯＨ、又は、メトキシ基、
Ｒ4は、水素原子、又は、ＣＮ、
Ｒ5は、ＯＨ、ＯＸ、ＮＨ(ＣＨ2)mＣＨ3、又は、Ｏ(ＣＨ2)nＣＨ3、
をそれぞれ表す(Ｒ2、Ｒ5において、Ｘは、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓから選択されるアルカリ金属、ｋは2〜8の整数、ｌは3〜17の整数、ｍは3〜17の整数、ｎは3〜17の整数である。)。］
【００１１】
本発明は、次のような態様を含むことができる。
〈９〉前記有機酸のカルボキシル基とフェノール基の一方を親水化又は疎水化することによって得られる両親媒性有機酸誘導体からなることを特徴とする〈１〉に記載のMALDI質量分析用界面活性型マトリックス。
〈１０〉前記有機酸のカルボキシル基とフェノール基の一方を親水化し、他方を疎水化して得られる両親媒性有機酸誘導体からなることを特徴とする〈１〉に記載のMALDI質量分析用界面活性型マトリックス。
〈１１〉〈１〉〜〈３〉、〈９〉、〈１０〉のいずれか１項に記載の界面活性型マトリックスとフェルラ酸との混合物からなるMALDI質量分析用マトリックス。
〈１２〉〈９〉〜〈１１〉のいずれか１項に記載のマトリックスを用いるMALDI質量分析方法。
〈１３〉〈１２〉に記載のMALDI質量分析方法において、溶媒、分析対象試料、及び、前記マトリックスからなる混合物を調製する際に、前記界面活性型マトリックスを臨界ミセル濃度の10％以上とすることを特徴とするMALDI質量分析方法。
〈１４〉前記界面活性型マトリックスの濃度が臨界ミセル濃度の20％以上50倍以下であることを特徴とする〈６〉又は〈１３〉に記載のMALDI質量分析方法。
〈１５〉分析対象試料が、タンパク質、ペプチド、核酸、糖類、ポリマー、脂質、及び、有機化合物からなる群から選択されるものであることを特徴とする〈１２〉〜〈１４〉のいずれか１項に記載のMALDI質量分析方法。
〈１６〉下記式(２)で表される有機酸誘導体。
【化２】
2015155884.tif 000005
［式(２)中において、Ｒ2は、ＯＨ、又は、ＯＸを表し、Ｘは、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓから選択されるアルカリ金属、ｍは3〜17の整数である。］
〈１７〉下記式(３)で表される有機酸誘導体。
【化３】
2015155884.tif 000006
［式(３)中において、Ｘは、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓから選択されるアルカリ金属、ｋは2〜8の整数、ｍは3〜17の整数である。］
〈１８〉下記式(４)で表される有機酸誘導体。
【化４】
2015155884.tif 000007
［式(４)中において、Ｒ5は、ＯＨ、又は、ＯＸを表し、Ｘは、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓから選択されるアルカリ金属、ｌは3〜17の整数である。］
〈１９〉フェルラ酸、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸、カフェイン酸、及び、ゲンチジン酸からなる群から選択される有機酸の誘導体からなるMALDI質量分析用界面活性型マトリックスの製造方法であって、該有機酸のカルボキシル基及び／又はフェノール基を親水化又は疎水化して両親媒性有機酸誘導体とすることを特徴とするMALDI質量分析用界面活性型マトリックスの製造方法。
〈２０〉前記有機酸のカルボキシル基とフェノール基の一方を親水化又は疎水化して両親媒性有機酸誘導体とすることを特徴とする〈１９〉に記載のMALDI質量分析用界面活性型マトリックスの製造方法。
〈２１〉前記有機酸のカルボキシル基とフェノール基の一方を親水化し、他方を疎水化して両親媒性有機酸誘導体とすることを特徴とする〈１９〉に記載のMALDI質量分析用界面活性型マトリックスの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る界面活性型マトリックスは、その界面活性機能により、難溶性試料をも可溶化することができる。特に、臨界ミセル濃度以上の界面活性型マトリックスは、各種溶媒中でミセルを自発的に形成し、その内部に各種のアナライトを自在に可溶化することができる。従って、検出感度の低下を招く余計な添加物である界面活性剤の添加や、それを取り除くプロセスが必要なく、アナライトを高感度で検出することができる。
また、当該界面活性型マトリックスは、ミセル形成による結晶核の形成や部分的にアミド結合を導入しているため、既存の有機酸マトリックスよりも、アナライトと良好な共結晶を形成することができる。また、ミセル形成により、内部に可溶化させたアナライトに、特定のイオンを選択的に付与することにより、MALDI質量分析において良好な感度を与えることができる。よって、本発明は、既存の有機酸などのマトリックスの特性を大幅に向上させ得るものとして、産業上非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明に係るフェルラ酸誘導体１及び２(FAD1、FAD1-Na、及びFAD2)の合成スキームを示す図である。
【図２】図２は、本発明に係るフェルラ酸誘導体３(FAD3)の合成スキームを示す図である。
【図３】図３は、本発明に係るα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸誘導体(CHCA4)、ゲンチジン酸誘導体(DHB5)、シナピン酸誘導体(SA6)の合成スキームを示す図である。
【図４】図４は、本発明に係るFAD1-Na水溶液の表面張力及び散乱光強度とFAD1-Na濃度との関係を示す図である。
【図５】図５は、本発明に係るFAD1-Naの濃度とクルクミンの可溶化量との関係を示す図である。
【図６】図６は、本発明に係るFAD1-NaのMALDI基板上における結晶のSEM観察像を示す図である。(ａ)は、濃度5mMのFAD1-Naから調製したもの、(ｂ)、(ｃ)は、濃度25mMのFAD1-Naから調製したものをそれぞれ示す。
【図７】図７は、フェルラ酸ナトリウム(濃度25mMから調製したもの)のMALDI基板上におけるSEM観察像を示す図である。
【図８】図８は、本発明に係る各種濃度〔(ａ)10mM、(ｂ)1mM、(ｃ)0.1mM〕のFAD1-NaとクルクミンのMALDI基板上における共結晶のSEM観察像を示す図である。
【図９】図９は、本発明に係るFAD1-Naの各種濃度〔(ａ)50mM、(ｂ)5mM〕におけるMALDI TOFMSスペクトルを示す図である。
【図１０】図１０は、本発明に係るFAD1-Naの各種分子イオンピークの強度とFAD1-Na濃度との関係を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明に係るFAD1-Naの各種濃度〔(ａ)10mM、(ｂ)1mM、(ｃ)0.1mM)〕におけるクルクミンのMALDI TOFMSスペクトルを示す図である。
【図１２】図１２は、フェルラ酸(FA)の各種濃度(0.1mM〜10mM)におけるクルクミンのMALDI TOFMSスペクトルを示す図である。
【図１３】図１３は、フェルラ酸(FA)とフェルラ酸誘導体(FAD1)を混合した場合のアンジオテンシンＩの分子イオンピークの強度 を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（本発明のMALDI質量分析用界面活性型マトリックスの説明）
本発明のMALDI質量分析用界面活性型マトリックスは、既存のマトリックス用有機酸のカルボキシル基及び／又はフェノール基を親水化又は疎水化することによって得られる両親媒性有機酸誘導体からなる。
【００１５】
本発明のMALDI質量分析用界面活性型マトリックスを得るための既存のマトリックス用有機酸としては、フェルラ酸、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸、カフェイン酸、ゲンチジン酸を挙げることができる。
これらの有機酸の中でも、フェルラ酸は、これまでバニリンとマロン酸から化学合成されていたが、この工程には反応に約３週間もの期間を要し、製造コストがかかるため、非常に高価(２０数万円以上／ｋｇ)なものであった。そのため、各分野での利用が期待されているものの、有効利用が進んでいなかった。一方、近年、再生可能資源である米糠ピッチから、γ-オリザノール類の加水分解により製造する手法が開発され、フェルラ酸は非常に安価(１万円以上／ｋｇ)となりその利用促進が期待されている。本発明は、MALDI質量分析用のマトリックスとしてフェルラ酸の機能を大幅に向上するものである。
【００１６】
既存のマトリックス用有機酸を両親媒性有機酸誘導体化する際、カルボキシル基とフェノール基の一方のみを親水化又は疎水化しても良いが、カルボキシル基とフェノール基の一方を親水化し、他方を疎水化することもできる。
カルボキシル基やフェノール基を親水化する場合には、それらに含まれるヒドロキシル基をアルカリ金属塩やアルキルスルホン酸アルカリ金属塩とすることができる。その場合のアルカリ金属は、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓから選択されるが、Ｎａ、Ｋ、Ｌｉが望ましい。アルキルスルホン酸アルカリ金属塩のアルキル鎖としては、炭素数2〜8(好ましくは2〜5)とすることができる。
一方、カルボキシル基やフェノール基を疎水化する場合には、アルキル鎖や(部分)フッ素化アルキル鎖を付加したり、アルキルアミド結合を導入したりすることができる。疎水化する際のアルキル鎖としては、炭素数4〜18(好ましくは6〜14)とすることができる。アルキル鎖のフッ素化は、全てであっても良いし、部分であっても良い。
【００１７】
本発明の両親媒性有機酸誘導体からなる界面活性型マトリックスにおける有機酸誘導体は、具体的には、次のような一般式(１)〜(４)によって表すことができる。
【化１】
2015155884.tif 000008
［一般式(１)中において、
Ｒ1は、水素原子、又は、メトキシ基、
Ｒ2は、水素原子、ＯＨ、ＯＸ、Ｏ(ＣＨ2)kＳＯ3Ｘ、又は、Ｏ(ＣＨ2)2(ＣＦ2)lＣＦ3、
Ｒ3は、水素原子、ＯＨ、又は、メトキシ基、
Ｒ4は、水素原子、又は、ＣＮ、
Ｒ5は、ＯＨ、ＯＸ、ＮＨ(ＣＨ2)mＣＨ3、又は、Ｏ(ＣＨ2)nＣＨ3、
をそれぞれ表す(Ｒ2、Ｒ5において、Ｘは、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓから選択されるアルカリ金属、ｋは2〜8の整数、ｌは3〜17の整数、ｍは3〜17の整数、ｎは3〜17の整数である。)。ただし、Ｒ2が、水素原子、ＯＨ、ＯＸ、又は、Ｏ(ＣＨ2)kＳＯ3Ｘのとき、Ｒ5は、ＮＨ(ＣＨ2)mＣＨ3、又は、Ｏ(ＣＨ2)nＣＨ3であり、Ｒ2がＯ(ＣＨ2)2(ＣＦ2)lＣＦ3のとき、Ｒ5は、ＯＨ、又は、ＯＸである。］
【化２】
2015155884.tif 000009
［式(２)中において、Ｒ2は、ＯＨ、又は、ＯＸを表し、Ｘは、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓから選択されるアルカリ金属、ｍは3〜17の整数である。］
【化３】
2015155884.tif 000010
［式(３)中において、Ｘは、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓから選択されるアルカリ金属、ｋは2〜8の整数、ｍは3〜17の整数である。］
【化４】
2015155884.tif 000011
［式(４)中において、Ｒ5は、ＯＨ、又は、ＯＸを表し、Ｘは、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓから選択されるアルカリ金属、ｌは3〜17の整数である。］
【００１８】
本発明のMALDI質量分析用マトリックスが界面活性型であることは、後述の溶媒におけるマトリックス濃度を増加した際の表面張力の低下と、所定濃度(臨界ミセル濃度)以上でのほぼ一定の表面張力により確認することができる(図４参照)。また、本発明のMALDI質量分析用マトリックスが界面活性型であることは、ミセル形成能を有することを直接調べることによっても確認することができる。その際のミセル形成の有無は、例えば、各種マトリックス濃度の溶媒についての光散乱強度測定によって確認することができる。
【００１９】
本発明の両親媒性有機酸誘導体からなる界面活性型マトリックスは、各種溶媒中で表面張力低下能、ミセル形成能を示し、難溶性試料を含む各種のアナライトを可溶化することができる。特に、CMC値以上の界面活性型マトリックスは、ミセル内部にアナライトを自在に可溶化することができる。従って、難溶性のアナライトに対しても、検出感度の低下を招く余計な添加物である界面活性剤の添加や、それを取り除くプロセスが必要なく、アナライトをハイスループットで高感度検出できる。前記溶媒中での界面活性型マトリックスは、後述の実施例３に記載したように、アナライトとの共結晶の形成という観点からでは、その濃度をCMC値の10％以上(好ましくはCMC値の20％以上)に設定すれば良いが、ミセル内部へのアナライトの可溶化、それに基づく良好な共結晶の形成という観点からは、臨界ミセル濃度(CMC)値以上であることが好ましく、より好ましくは、CMC値の110％以上、さらに好ましくはCMC値の120％以上、さらに一層好ましくはCMC値の150％以上である。界面活性型マトリックスの濃度の上限は、特に限定するものではないが、経済的な観点から、CMC値の50倍以下、好ましくはCMC値の20倍以下、さらに好ましくはCMC値の10倍以下とすることができる。
また、マトリックスのミセル形成による結晶核の形成や、部分的にアミド基を導入することにより、既存の有機酸マトリックスよりも、アナライトと良好な共結晶を形成することができる。また、ミセル形成に伴う、ミセル表面への対イオンの束縛により、内部に可溶化させたアナライトに、特定のイオンを付与することにより、MALDI質量分析において良好な感度を与えることができる。
【００２０】
本発明の両親媒性有機酸誘導体からなる界面活性型マトリックスは、単独でマトリックスとして用いても良いが、複数種類を混合して用いることもできる。また、既存のマトリックス用有機酸であるフェルラ酸、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸、カフェイン酸、ゲンチジン酸の１種又は２種以上の有機酸と混合して用いることにより、本発明の両親媒性有機酸誘導体と既存のマトリックス用有機酸をそれぞれ単独でマトリックスとして用いた場合よりも検出感度を向上できる場合がある。そのような好ましい混合マトリックスの例としては、上記式(２)で表される有機酸誘導体とフェルラ酸との混合物が挙げられる。本発明の両親媒性有機酸誘導体と既存のマトリックス用有機酸との混合割合(モル比)は、例えば、3：7〜9：1、好ましくは4：6〜8：2である。
【００２１】
（溶媒の説明）
MALDI質量分析では、分析対象試料とマトリックスとを溶媒に混合した後、溶媒を乾燥等により除去して、分析対象試料とマトリックスとの共結晶を調製することができる。そのような際に使用する溶媒としては、水、アセトニトリル及びそれらを任意の体積割合〔例えば、水：アセトニトリル＝10：1〜1：10(好ましくは4：1〜1：2)〕で混合したものが汎用され望ましいが、当該界面活性型マトリックスは、各種媒体中でも界面活性を発現するため、これに限定されるものではなく、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン(THF)、トリフルオロ酢酸(TFA)、トルエン、クロロホルム、塩化メチレンなどでも良く、これらを任意に混合させたものでも良い。
【００２２】
（アナライトの説明）
本発明のMALDI質量分析におけるアナライト(分析対象試料)は特に限定されるものではないが、酸、アルカリ条件下では不安定なクルクミンなどのポリフェノール類、ピロロキノリンキノン(PQQ)、コエンザイムＱ１０、脂溶性ビタミン、タンパク質、アンジオテンシンＩ、β―アミロイドペプチド、ヒューマニンなどのペプチド、核酸、糖類、ポリマー、脂質及び有機化合物などである。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００２４】
（実施例１）＜各種界面活性型マトリックスの合成＞
（実施例１−１）フェルラ酸誘導体１(FAD1、FAD1-Na)の合成(図１参照)
(E)-N-オクチル-3-(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)-2-プロぺンアミド(FAD1)の合成
三つ口フラスコ中で、フェルラ酸(FA)(10.0g、51.7mmol)をジクロロメタン(DCM)(200mL)に溶解させ、室温で45分間撹拌した。反応溶液を氷浴中で冷却し、ここにオクチルアミン(7.32g、56.7mmol)、トリエチルアミン(NEt3)(3.69g、36.4mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(8.36g、61.9mmol)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(11.9g、94.0mmol)を加え、室温で17時間撹拌した。反応溶液にクロロホルムと塩酸(数滴)を加え、有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄を行った。水層についてもクロロホルムを加えて抽出を行い、これらを併せた有機層を水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。硫酸マグネシウムをろ過により取り除いた後、溶媒を留去し、SiO2カラムクロマトグラフィー(クロロホルム：エタノール＝98：2，Rf=0.15)で精製した後、さらに得られた粗生成物をジエチルエーテルで洗浄する事により目的とする(E)-N-オクチル-3-(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)-2-プロぺンアミド(FAD1)を得た(収量：8.58g、54％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6，r.t.)δ：9.39(s，1H，OH)，7.90(t，J(H,H)=4Hz，1H，NH)，7.28(d，J(H,H)=16Hz，1H，ArCH=CH)，7.09(s，1H)，6.96(d，J(H,H)=8Hz，1H，ArH)，6.77(d，J(H,H)=8Hz，1H，ArH)，6.42(d，J(H,H)=16Hz，1H，ArCH=CH)，3.79(s，3H，OCH3)，3.13(dd，J(H,H)=4，8Hz，2H，NHCH2)，1.42(t，J(H,H)=8Hz，2H，CH2)，1.15-1.30(10H，CH2)，0.84(t，J(H,H)=4Hz，3H，CH3).
13C {1H}NMR(100MHz，DMSO-d6，r.t.)δ：165.2(C=O)，156.8(C6H3)，147.8(C6H3)，138.7(ArCH)，126.4(C6H3)，121.4(C6H3)，119.1(ArCH=CH)，115.6(C6H3)，110.6(C6H3)，55.5(OCH3)，38.6(NCH2)，31.2(CH2)，28.7(CH2)，28.6(2CH2)，26.5(CH2)，22.1(CH2)，13.9(CH3).
MS(MALDI TOFMS)m/z：306(M+H)+；calcd for C18H27NO3：306.1(M +H)+.
IR(ATR，r.t.)：ν(cm-1)3337(N-H)，1563，1463(CONH)，1253，1035(OCH3).
【００２５】
(E)-N-オクチル-3-(3-メトキシ-4-ナトリウムフェノキシド)-2-プロぺンアミド(FAD1-Na)の合成
バイアル瓶中で、(E)-N-オクチル-3-(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)-2-プロぺンアミド(200mg，0.65mmol)を水に溶解させ、ここに1Nの水酸化ナトリウム水溶液(0.65mL、0.65mmol)をゆっくり滴下し、室温で撹拌した。反応溶液を凍結乾燥することで溶媒を留去し、目的とする(E)-N-オクチル-3-(3-メトキシ-4-ナトリウムフェノキシド)-2-プロぺンアミド(FAD1-Na)を得た。
1H NMR(400MHz，CD3OD，r.t.)δ：7.38 (d，J(H,H)=16Hz，1H，ArCH=CH-)，6.94(d，J(H,H)=2Hz，1H，ArH)，6.90(dd，J(H,H)=2 and 8Hz，1H，ArH)，6.57(d，J(H,H)=8Hz，1H，ArH)，6.20(d，J(H,H)=16Hz，1H，ArCH=CH-)，3.79(s，3H，OCH3)，3.78(t，J(H,H)=8Hz，2H，NHCH2)，1.55(m，2H，NHCH2CH2)，1.3-1.7(10H，CH2)，0.90(t，J(H,H)=8Hz，3H，CH3).
13C NMR(100MHz，CD3OD，r.t.) δ：170.1(C=O)，159.9(C6H3CH=CH)，152.1(C6H3)，143.4(C6H3)，124.9(C6H3)，122.5(C6H3)，118.8(C6H3)，114.5(C6H3CH=CH)，110.6(C6H3)，55.8(CH2)，42.6(OCH3)，40.5(CH2)，33.0(CH2)，30.6(CH2)，30.4(CH2)，30.3(CH2)，28.1(CH2)，14.4(CH3).
MS(MALDI TOFMS)m/z：328.1(M+H)+；calcd for C18H26NNaO3：328.2(M +H)+.
IR(ATR，r.t.)：ν(cm-1)3338(N-H)，1575，1437(CONH)，1229，1029(OCH3).
【００２６】
（実施例１−２）フェルラ酸誘導体2(FAD2)の合成(図１参照)
(E)-N-オクチル-3-{3-メトキシ-4-(ナトリウム-3-プロポキシ-1-スルホナート)}-2-プロぺンアミド(FAD2)の合成
ナスフラスコ中でFAD1(205mg、0.67mmol)を超純水(5mL)に溶解させ、ここに水酸化ナトリウム水溶液(1N、0.8mL、0.8mmol)を加え、室温で撹拌した。その後、反応溶液にTHF(1mL)に溶解させた1.3-プロパンスルトン(101mg、0.83mmol)を滴下し、室温で16時間撹拌した。反応溶液を凍結乾燥することで溶媒を留去し、粗生成物をアセトンで洗浄することにより、目的とする(E)-N-オクチル-3-{3-メトキシ-4-(ナトリウム-3-プロポキシ-1-スルホナート)}-2-プロぺンアミド(FAD2)を得た(収量：205mg、68％)。
1H NMR(400MHz，CD3OD，r.t.)δ：7.45(d，J(H,H)=6Hz，1H，ArCH=CH-)，7.15(d，J(H,H)=2Hz，1H，ArH)，7.11(dd，J(H,H)=2 and 8Hz，1H，ArH)，6.98(d，J(H,H)=8Hz，2H，ArH)，6.47(d，J(H,H)=16Hz，1H，ArCH=CH-)，4.17(t，J(H,H)=8Hz，CH2)，3.87(s，3H，OCH3)，3.86(t，J(H,H)=8Hz，2H，CH2)，3.00(t，J(H,H)=8Hz，2H，CH2)，2.27(m，2H，CH2)，1.56(m，2H，NHCH2CH2)，1.24-1.44(10H，CH2)，0.90(t，J(H,H)=8Hz，3H，CH3).
13C NMR(100MHz，CD3OD，r.t.)δ：169.0(C=O)，151.5(C6H3)，151.1(C6H3)，141.5(ArCH=CH-)，129.6(C6H3)，123.0(C6H3)，119.8(C6H3)，114.5(ArCH=CH)，111.9(C6H3)，61.9(CH2)，56.5(CH2)，49.4(CH2)，40.6(OCH3)，33.0(CH2)，30.5(CH2)，30.4(2CH2)，29.3(CH2)，28.1(CH2)，23.7(CH2)，14.4(CH3).
MS(MALDI TOFMS)m/z：450.0(M+H)+；calcd for C21H33NNaSO6：450.12(M +H)+.
IR(ATR，r.t.)：ν(cm-1)3296 (N-H)，1613，1467(CONH)，1255，1027(OCH3)，1191(SO3Na).
【００２７】
（実施例１−３）フェルラ酸誘導体3(FAD3)の合成(図２参照)
1H,1H,2H,2H-ペルフルオロ-n-オクチルヨージドの合成
ナスフラスコ中で1H,1H,2H,2H-トリデカフルオロ-1-n-オクタノール(13.9g、30.0mmol)をジエチルエーテル(Et2O)(75mL)/アセトニトリル(25mL)の混合溶媒に溶解させ、室温で撹拌した。これに、イミダゾール(6.13g、90.0mmol)、トリフェニルフォスフィン(PPh3)(11.8g、45.0mmol)を加え、氷浴中で冷却した状態でヨウ素(11.4g、45.0mmol)を加え、常温で19時間撹拌した。反応溶液にジクロロメタンを加え、有機相をチオ硫酸ナトリウム水溶液で４回洗浄し、さらに飽和塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄を行った。水層もジクロロメタンを加えて抽出を行い、これらをあわせた有機層を水で洗浄した後無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。硫酸マグネシウムをろ過により取り除いた後，溶媒を留去し，SiO2カラムクロマトグラフィー(ヘキサン、Rf=0.76)で精製を行い、目的とする1H,1H,2H,2H-ペルフルオロ-n-オクチルヨージドを得た(収量：1.18g、69％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3，r.t.) δ：2.74(m，2H，OCH2CH2-CF2)，3.24(m，2H，HOCH2).
19F NMR(377MHz，CDCl3，r.t.) δ：-80.8(CF3)，-114.9(CH2CF2)，-121.9(CF2)，-122.7(CF2)，-123.4(CF2)，-126.1(CF2CF3).
【００２８】
(E)-3-{3-メトキシ-4-(1H,1H,2H,2H-ペルフルオロ-n-オクトキシフェニル)}-2-プロぺン酸(FAD3)の合成
試験管内でフェルラ酸(847mg、4.36mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)(10mL)に溶解させ、ここに臭化テトラブチルアンモニウム(TBAB)(1.40g、8.71mmol)、1H,1H,2H,2H-ペルフルオロ-n-オクチルヨージド(5.00g、8.71mmol)を加え、50℃で10分間撹拌した。反応溶液に水酸化カリウム(733mg、13.1mmol)を加え、さらに70℃で30分間撹拌した。反応後の溶液にクロロホルム及び希塩酸(数滴)を加え、有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄を行った。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ硫酸マグネシウムをろ過により取り除いた後、溶媒を留去し、SiO2カラムクロマトグラフィー(クロロホルム：ヘキサン＝2：1、Rf=0.11)で精製を行い、目的とする(E)-3-{3-メトキシ-4-(1H,1H,2H,2H-ペルフルオロ-n-オクトキシフェニル)}-2-プロぺン酸(FAD3)を得た(収量：467mg、17％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6，r.t.) δ：9.61(s，1H，COOH)，7.56(d，J(H,H)=16Hz，1H，ArCH=CH-)，7.32(d，J(H,H)=2Hz，1H，ArH)，7.10(dd，J(H,H)=2 and 8Hz，1H，ArH)，6.78(d，J(H,H)=8Hz，1H，ArH)，6.46(d，J(H,H)=16Hz，1H，ArCH=HCCO2H)，4.42(t，J(H,H)=4Hz，OCH2)，3.80(s，3H，OCH3)，2.73(m，2H，OCH2CH2).
19F NMR(377Hz，DMSO-d6，r.t.) δ：-80.2(CF3)，-112.6(CH2CF2)，-121.7(CF2)，-122.4(CF2)，-123.1(CF2)，-125.7(CF2).
13C NMR(100MHz，DMSO-d6，r.t.) δ：166.1(C=O)，149.5(C6H3)，147.9(C6H3)，145.6(ArCH=CH)，125.3(C6H3)，123.0(C6H3)，115.4(C6H3)，113.4(ArCH=CH)，111.0(C6H3)，55.6(CH2)，55.4(OCH3)，29.5(CH2).
IR(ATR，r.t.)：ν(cm-1)3524，1670(COOH)，1263，1060(OCH3)，1241-1114(C-F).
【００２９】
（実施例１−４）α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸誘導体4(CHCA4)の合成(図３参照)
(E)-N-オクチル-2-シアノ-3-(4-ヒドロキシフェニル)-2-プロぺンアミド(CHCA4)の合成
三つ口フラスコ中でα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)(4.7g、25.0mmol)とオクチルアミン(3.6g、27.9mmol)をジクロロメタン(DCM)(300mL)に溶解させ、室温で撹拌した。反応溶液を氷浴中で冷却し、ここにトリエチルアミン(NEt3)(1.8g、17.5mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(4.1g、30.0mmol)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(6.9g、55.0mmol)を加え、室温で1日撹拌した。反応溶液にクロロホルムと塩酸(数滴)を加え、有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄を行った。水層についてもクロロホルムを加えて抽出を行い、これらを併せた有機層を水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。硫酸マグネシウムをろ過により取り除いた後、溶媒を留去し、SiO2カラムクロマトグラフィー(クロロホルム：エタノール＝９８：２, Rf = 0.19)で精製した。さらに得られた粗生成物をエタノールに溶かし、3 N HCl水溶液を加えて室温で攪拌した。溶媒を留去したのち、固体を水で洗浄することにより目的とする(E)-N-オクチル-2-シアノ-3-(4-ヒドロキシフェニル)-2-プロぺンアミド(CHCA4)を得た(収量：3.45g、11.5mmol, 41％)。
1H NMR (400MHz, DMSO-d6, r.t.) δ: 10.54 (s, 1H, OH), 8.25(t, J(H,H) = 8Hz, 1H, NH), 8.00(s, 1H, ArCH=C), 7.85(d, J(H,H) = 12Hz, 2H, ArH), 6.92(d, J(H,H) = 12Hz, 2H, ArH), 3.17(m, 2H, NHCH2), 1.47(t, J(H,H) = 8Hz, 2H, CH2), 1.15-1.30(10H, CH2), 0.85(t, J(H,H) = 4Hz, 3H, CH3).
13C {1H} NMR (100MHz, DMSO-d6, r.t.) δ: 161.6(C=O or HO-C), 161.3(C=O or HO-C), 150.1(C6H4CH=C), 132.8(C6H4), 123.0(C6H4), 117.2(CN), 116.2(C6H4), 101.4(CH=CRCN), 39.6(NCH2), 31.2(CH2), 28.9(CH2), 28.7(CH2), 28.6(CH2), 26.3(CH2), 22.1(CH2), 13.9(CH3).
MS(MALDI TOFMS) m/z : 301.5(M+H)+; calcd for C18H25N2O2: 301.9(M+H)+. 
【００３０】
（実施例１−５）ゲンチジン酸誘導体5(DHB5)の合成(図３参照)
2,5-ジヒドロキシベンゾイルアミドオクタン(DHB5)の合成
1000 mLの三つ口フラスコ中でゲンチジン酸(DHB)(5.4g、35.0mmol)とオクチルアミン(5.0g, 38.5mmol)をジクロロメタン(DCM)(500mL)に溶解させ、室温で撹拌した。反応溶液を氷浴中で冷却し、ここにトリエチルアミン(NEt3)(2.5g、24.5mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(5.7g、42.0mmol)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC) (9.7g、77.0mmol)を加え、室温で１日撹拌した。反応溶液にクロロホルムと塩酸(数滴)を加え、有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄を行った。水層についてもクロロホルムを加えて抽出を行い、これらを併せた有機層を水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。硫酸マグネシウムをろ過により取り除いた後、溶媒を留去し、SiO2カラムクロマトグラフィー(クロロホルム：エタノール＝96：4, Rf = 0.43)で精製した。さらに得られた粗生成物をエタノールに溶かし、3 N HCl水溶液を加えて室温で攪拌した。溶媒を留去したのち、固体を水で洗浄することにより目的とする2,5-ジヒドロキシベンゾイルアミドオクタン(DHB5)を得た(収量：2.67g、10.1mmol, 29％)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, r.t.) δ: 11.8(s, 1H, OH), 8.96(s, 1H, OH), 8.64(t, J(H,H) = 8Hz, 4H, NH), 7.21(d, J(H,H) = 8Hz, 1H, ArH), 6.84(dd, J(H,H) = 8 and 2Hz, 1H, ArH), 6.70,(d, J(H,H) = 8Hz, 1H, ArH), 3.23(m, 2H, NHCH2), 1.50(t, J(H,H) = 8 Hz, 2H, CH2), 1.15-1.30(10H, CH2), 0.84(t, J(H,H) = 4Hz, 3H, CH3).
13C {1H} NMR (100MHz, DMSO-d6, r.t.) δ: 168.4(C=O), 152.4(C6H3), 149.1(C6H3), 121.1(C6H3), 117.7(C6H3), 115.6(C6H3), 113.2(C6H3), 40.6(NCH2), 31.2(CH2), 28.8(CH2), 28.7(CH2), 28.6(CH2), 26.4(CH2), 22.1(CH2), 13.9(CH3).
MS (MALDI TOFMS) m/z : 266.0(M+H)+; calcd for C15H24NO3: 266.2(M+H)+.
【００３１】
（実施例１−６）シナピン酸誘導体6 (SA6)の合成(図３参照)
(E)-N-オクチル-3-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシフェニル)-2-プロぺンアミド(SA6)の合成
三つ口フラスコ中でシナピン酸(SA)(488mg、2.2mmol)とオクチルアミン(282mg、2.2mmol)をジクロロメタン(DCM)(100 mL)に溶解させ、室温で撹拌した。反応溶液を氷浴中で冷却し、ここにトリエチルアミン(NEt3)(141mg、1.4mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(324mg、2.4mmol)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(555mg、4.4mmol)を加え、室温で１日撹拌した。反応溶液にクロロホルムと塩酸(数滴)を加え、有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄を行った。水層についてもクロロホルムを加えて抽出を行い、これらを併せた有機層を水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。硫酸マグネシウムをろ過により取り除いた後、溶媒を留去し、SiO2カラムクロマトグラフィー(クロロホルム：エタノール＝98：2, Rf = 0.19)で精製した。さらに得られた粗生成物をエタノールに溶かし、3 N HCl水溶液を加えて室温で攪拌した。溶媒を留去したのち、固体を水で洗浄することにより目的とする((E)-N-オクチル-3-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシフェニル)-2-プロぺンアミド(SA6)を得た(収量：418 mg、1.2 mmol、55％)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, r.t.) δ: 8.75(s, 1H, OH), 7.90(t, J(H,H) = 4Hz, 1H, NH), 7.38(d, J(H,H) = 16Hz, 1H, ArCH=CH), 7.29,(d, J(H,H) = 16Hz, 1H, ArCH=CH), 6.83(s 2H, ArH), 6.45(d, J(H,H) = 16Hz, 1H, ArCH=CH), 3.78(s, 6H, OCH3), 3.12(m, 2H, NHCH2), 1.42(t, J(H,H) = 8Hz, 2H, CH2), 1.15-1.30(10H, CH2), 0.85(t, J(H,H) = 4Hz, 3H, CH3).
13C {1H} NMR(100MHz, DMSO-d6, r.t.) δ: 165.1(C=O), 148.0(C6H2), 139.0(ArCH=CH), 137.2(C6H2), 125.3(C6H2), 119.5(ArCH=CH), 105.1(C6H3), 56.0(OCH3), 38.6(NCH2), 31.2(CH2), 29.2(CH2), 28.7(2CH2), 26.5 (CH2), 22.1(CH2), 13.9(CH3).
MS(MALDI TOFMS) m/z : 336.0(M+H)+; calcd for C19H30NO4: 336.0(M+H)+.
【００３２】
（実施例２）＜合成したマトリックスの界面活性＞
バイアル瓶に、水：アセトニトリル＝4：1、FAD1-Naを加え、濃度が100mMになるように調整した。この溶液を撹拌後、濃度を75、50、25、10、7.5、5、2.5、1mMとなるように希釈した。ペンダントドロップ法による表面張力測定装置(協和界面科学社製，製品名「Drop Master-500」)を用い、水：アセトニトリル＝4：1に対するFAD1-Naの各濃度の表面張力を測定した。なお、針はテフロン(登録商標)コート針PD 22Gを用い、解析にはヤング・ラプラスの式を用いた。その結果を図４に示す。
FAD1-Naは、混合溶媒の表面張力を低下させたことから界面活性を示し、図４中の表面張力値が一定となる点から、臨界ミセル濃度(CMC)値は7.2mM、その際の表面張力値であるγCMC値は29.9mN/mとなることが分かった。さらに、FAD2、FAD3についても表面張力測定を行った。溶媒として、FAD2には水、FAD3には水：アセトニトリル＝1：1を用いた。その結果、FAD2のCMC値は1.49mM、γCMC値は36.5mN/m、FAD3のCMC値は0.197mM、γCMCは16.2mN/mとなった。従って、得られた新規マトリックスはいずれも界面活性型であることが明らかになった。
また、動的光散乱装置(大塚電子社製，製品名「DLS-8000」)を用い、各濃度における散乱強度測定を行った。その際、光源にはＡｒレーザー(λ＝488nm)を用い、散乱角度は90度に設定した。なお、溶液は、フィルター(メルクミリポア社製、0.45μm、PVDF)に３回通した。その結果を図４に併せて示す。FAD1-Naは、CMC以上で散乱強度の急激な増加が認められたことから、CMC以上の濃度で、FAD1-Naはミセルを形成することが分かった。
また、疎水化合物としてポリフェノール類のクルクミン(和光純薬社製)を用い、FADミセルに対する可溶化能を検討した。マイクロチューブにクルクミン(5mg、14mM)をはかりとり、各濃度のFAD1-Na溶液(上記と同様に調製)を1mL加え、24時間のインキュベート(25℃、150r/min)後、5分間の遠心分離(9000rpm)を行った。上層の溶液の429nmの吸光度(日本分光社製，製品名「V-560」)を測定し、クルクミンのFAD1ミセルに対する可溶化量を算出した。その結果を図５に示す。CMC以上で、FAD1-Naミセルのクルクミン可溶化量は急激に増加し、ミセルにクルクミンが可溶化されていることが分かった。さらに、ミセル形成により、可溶化量は約100倍以上向上した(図５参照。クルクミン可溶化量は、マトリックス濃度がモノマー領域の1mMのとき約0.03mMであるのに対し、ミセル領域でのマトリックス濃度のとき約3.5mM程度にも達している)。なお、FAD2のクルクミンの可溶化量についても測定したところ、ミセル形成により、可溶化量は約10倍以上向上した。
【００３３】
（実施例３）＜新規マトリックスの結晶性＞(図６〜８参照)
バイアル瓶に、水：アセトニトリル＝4：1、FAD1-Naを加え、濃度が5、25mMになるように調整した。これらの溶液をMALDI基板上に1μL滴下、乾燥させた後、SEM観察(JOEL社製，製品名「JSM-6010LA」)を行った。その結果を図６に示す。FAD1-NaのCMC以下の濃度では観察されなかった結晶が、CMC以上の濃度においては観測された。次に、両親媒化していないフェルラ酸のナトリウム塩に対しても、25mMにおいてSEM観察を行った結果を図７に示す。FAD1-Naで観測された結晶が、フェルラ酸のナトリウム塩では観測されず、ミセル形成や構造内部へのアミド結合の導入が結晶性の向上に寄与していることが示唆された。
また、マイクロチューブにクルクミン(5mg、14mM)をはかりとり、0.1、1、10mMのFAD1-Na溶液を1mL加え、24時間のインキュベート(25℃、150r/min)後、5分間の遠心分離(9000rpm)を行った。マトリックスミセルにアナライトが可溶化したこの上層の溶液についても、上記と同様にSEM観察を行った。その結果を図８に示す。通常の界面活性剤においても、疎水性物質を添加するとCMCは低下することが知られているが、0.1mMでは、結晶が観測されなかったのに対して、CMC値の10％程度の1mMでは、共結晶が得られることが、CMC値以上の10mMでは、より良好な共結晶が観測された。このことから、CMC値の10％以上の濃度では、マトリックスにアナライトを可溶化させて共結晶が得られることが、CMC値以上の濃度では、マトリックスミセルにアナライトを可溶化させることによって、より良好な共結晶が得られることが明らかになった。
【００３４】
なお、以上の実施例２、３は、フェルラ酸の誘導体についての界面活性、結晶性に関するものであるが、既存のMALDI質量分析用マトリックスであるα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸、カフェイン酸、ゲンチジン酸についても、前記フェルラ酸誘導体と同様に、これら有機酸化合物の基本構造を変更することなく誘導体化して両親媒化、界面活性型とする場合には、(ａ)レーザー光の吸収能、(ｂ)高真空下での安定性、を維持したままで、界面活性能やミセル形性能の獲得を通じて、(ｃ)検出対象試料の可溶化能、(ｄ)検出対象試料との共晶形成能、を向上できると考えられる。
【００３５】
（実施例４）＜新規マトリックスのMALDITOFMSスペクトル＞(図９及び図１０参照)
マイクロチューブに、水：アセトニトリル＝4：1、FAD1-Naを加え、濃度が5、50mMになるように調整した。MALDI基板上に各濃度の溶液を1μL滴下、乾燥後、MALDI TOF-MS(飛行時間型質量分析)装置(ブルカー社製，装置名「Autoflex speed TOF/TOF」)を用い、測定を行った。その際、YAGレーザ(355nm)を用い、リフレクターポジティブモード(加速電圧：20kV、引出遅延時間：130ns、レーザーパワー：80％)、積算回数：5回で測定を行った。その結果を図９に示す。いずれの濃度でも、FAD1-Naの分子イオンピークが観測され、さらに、5mMでは、H+付加体のピーク、50mMでは、Na+付加体のピークが主に観測された。より詳細な検討を行うために、FAD1-Naの濃度を50、25、10、7.5、5、2.5、1mMになるよう調整し、MALDI TOF-MS測定を行い、H+及びNa+付加体の各ピーク強度とFAD1-Naの濃度との関係を調べた。その結果を図１０に示す。図より明らかなように、Na+付加体のピーク強度は、CMC以上で急激に増加した。これは、FAD1-Naのミセル形成により、ミセル表面にNa+が束縛されるためだと考えられる。
【００３６】
（実施例５）＜新規マトリックスを用いたアナライトのMALDITOFMSスペクトル＞(図１１及び図１３参照)  
マイクロチューブに水：アセトニトリル＝4：1、FAD1を加え、濃度が0.1、1、10mMになるように調整した。さらに、他のマイクロチューブにクルクミン(5mg、14mM)をはかりとり、各濃度のFAD1溶液を1mL加え、24時間のインキュベート(25℃、150r/min)後、5分間の遠心分離(5min、9000rpm)を行った。上層の溶液を1μL、MALDI基板に滴下、乾燥後、FAD1-NaをマトリックスとしてクルクミンのMALDI TOF-MS測定を行った。この際のマトリックス(FAD1-Na)ミセルと、可溶化されたアナライト(クルクミン)のモル比は、マトリックス濃度：0.1、1、10mMに対してそれぞれ、マトリックス：アナライト＝3：1、8：1、14：１となった。その結果を図１１に示す。FAD1-Na濃度が0.1mMでは、クルクミンの分子イオンピークがほとんど観測されなかった一方で、1、10mMでは、観測された。さらに、FAD1-Naの場合と同様に、クルクミンの分子イオンピークにおいても、FAD1-NaのCMC以下(1mM)においてH+付加体、CMC以上(10mM)においでNa+付加体のピークが主に検出された。これは、マトリックスミセルに束縛されたNa+を、可溶化されたクルクミンが付加したためだと考えられる。
上記と同じ操作で、フェルラ酸をマトリックスとしてクルクミンのMALDI TOF-MS測定を行った。その結果を図１２に示す。フェルラ酸をマトリックスとした場合には、マトリックス濃度が、0.1、1mMではクルクミンの分子イオンピークが観測されなかった一方で、10mMでは、微弱な分子イオンピークが観測され、その検出感度は、FAD1-Naをマトリックスとした場合に比べて、約３０分の１程度であった。
次に、マイクロチューブに水：アセトニトリル＝1：1(0.1％TFA)、酸によりプロトン化されたFAD1又はフェルラ酸を加え、それぞれ25mMの濃度に調製した。さらに、他のチューブにアンジオテンシンＩ(0.154nmol)、FAD1及びフェルラ酸溶液を加えた。その際、FAD1：フェルラ酸は、0：10、2：8、4：6、6：4、8：2、9：1、9.9：1.1、10：0の体積比で混合して加え、総量が100μLとなるようにした。FAD1、フェルラ酸の混合系をマトリックスとして、アンジオテンシンＩのMALDI TOF-MS測定を上記と同様の操作で行った。観測されたアンジオテンシンＩの分子イオンピークのピーク強度とFAD1及びフェルラ酸のモル分率の関係を図１３に示す。FAD1：フェルラ酸＝4：6のときに最も感度よくアンジオテンシンＩの分子イオンピークが観測された。このことから、フェルラ酸の誘導体は、前駆体のフェルラ酸と混合することにより、MALDITOFMSスペクトルのアナライトの検出感度を向上することも明らかになった。
また、マイクロチューブに水：アセトニトリル＝1：1(0.1％TFA)、プロトン化されたFAD1又はフェルラ酸を加え、それぞれ25mMの濃度に調製した。また、他のマイクロチューブに難溶性のβ-アミロイド(7.55pmol)又はヒューマニン(1.04pmol)を加え、さらにFAD1溶液：フェルラ酸溶液＝1：1(50μL)を加えた。FAD1、フェルラ酸の混合系(1：1)をマトリックスとして、β-アミロイド及びヒューマニンのMALDI TOF-MS測定を上記と同様の操作で行った。その結果、β-アミロイド及びヒューマニンの分子イオンピークが観測され、両検体のピーク強度はFAD1又はフェルラ酸を単独のマトリックスを用いた場合に比べて向上することも明らかになった。
【００３７】
（実施例６）＜新規マトリックスを用いた各種アナライトのMALDITOFMSスペクトル＞
マイクロチューブに水：アセトニトリル＝4：1、フェルラ酸誘導体(FAD1)又はCHCA誘導体(CHCA4)、を加え、濃度が10mg/mLになるように調整した。また、シナピン酸誘導体(SA6)については、濃度が2.5mg/mLになるように調整した。さらに、他のマイクロチューブに、水：アセトニトリル＝4：1、クルクミン、α-シクロデキストリン、TritonX-100、イソフラボン、ピロロキノリンキノン二ナトリウム、ルチン、コエンザイムQ10、又は、カテキンを加え、濃度が10mg/mLになるように調整した。調整された各種界面活性型マトリックス溶液５mLと各種アナライト溶液１mLを混合し、1μL、MALDI基板に滴下、乾燥後、MALDI TOF-MS測定を行った。
その結果、フェルラ酸誘導体(FAD1)に関しては、クルクミン以外にも、α-シクロデキストリン、TritonX-100、イソフラボンが良好に検出された。CHCA誘導体(CHCA4)に関しては、α-シクロデキストリン、TritonX-100、ルチンが良好に検出された。シナピン酸誘導体(SA6)に関しては、α-シクロデキストリン、TritonX-100、イソフラボン、ルチンが良好に検出されることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の新規な有機酸誘導体は、両親媒性で界面活性型のものであり、各種溶媒中でミセルを自発的に形成するので、その内部に膜タンパク質、ペプチド、ポリフェノール類を始めとした難溶性アナライトをも可溶化でき、かつ、アナライトと良好な共結晶を形成することができるので、前記難溶性試料を始めとした各種アナライトのMALDI質量分析用マトリックスとして有効に活用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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