(57)【要約】【課題】  フィルム法において、より粒子径が均一な粒度分布の狭い分子集合体を作製することができる新規な作製法を提供すること。また、フィルム法において、１ロットで作製できる分子集合体の量を増やすことができる作製法を提供すること。【解決手段】  本発明として、例えば、容器内で、直鎖型又は分岐型の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液から溶媒を留去することにより、該ブロックポリマーを有するフィルムを形成し、その後、該容器中に水又は水溶液を加えて分子集合体を作製する方法であって、  前記容器内の溶液に１個以上の粒状体を浸した状態で、溶媒を留去し前記フィルムを形成することを特徴とする、前記両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体の作製法を挙げることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器内で、直鎖型又は分岐型の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液から溶媒を留去することにより、該ブロックポリマーを有するフィルムを形成し、その後、該容器中に水又は水溶液を加えて分子集合体を作製する方法であって、
前記容器内の溶液に１個以上の粒状体を浸した状態で、溶媒を留去し前記フィルムを形成することを特徴とする、前記両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体の作製法。
【請求項２】
粒状体が、球体である、請求項１に記載の分子集合体の作製法。
【請求項３】
球体がガラスビーズである、請求項２に記載の分子集合体の作製法。
【請求項４】
粒状体の総表面積が、溶液が接している容器内壁の表面積の１０倍以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分子集合体の作製法。
【請求項５】
両親媒性ブロックポリマーが、サルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを含むものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分子集合体の作製法。
【請求項６】
親水性ブロック鎖のサルコシン単位が２〜５００個の範囲内である、請求項５に記載の分子集合体の作製法。
【請求項７】
疎水性ブロック鎖の乳酸単位が５〜１００個の範囲内である、請求項５に記載の分子集合体の作製法。
【請求項８】
両親媒性ブロックポリマーが、機能性基を有するものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分子集合体の作製法。
【請求項９】
フィルム形成前の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液が、機能性物質を含むものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分子集合体の作製法。
【請求項１０】
機能性基がシグナル基又はリガンド基である、請求項８に記載の分子集合体の作製法。
【請求項１１】
機能性物質がシグナル剤又は薬剤である、請求項９に記載の分子集合体の作製法。
【請求項１２】
粒子径や粒度分布制御のためのフィルター処理工程を含まない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分子集合体の作製法。
【請求項１３】
フィルム形成前における両親媒性ブロックポリマーの溶液中の濃度が、１０ｍｇ／ｍＬ以上である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の分子集合体の作製法。
【請求項１４】
さらに凍結乾燥工程を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の分子集合体の作製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、農薬、食品、電池材料等の分野で用いられる、ナノレベル（数十ｎｍ）の粒子径を有する微粒子（分子集合体）の新規な作製法に関するものである。詳しくは、本発明は、容器内において、両親媒性ブロックポリマーが溶解した溶媒を留去しフィルムを形成した後、水等を加えて分子集合体を作製する、いわゆるフィルム法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ナノレベルの粒子径を有する微粒子ないし分子集合体が様々な分野で応用されている。特に医薬分野では、ナノ粒子の生体内における動態に着目し、例えば、分子イメージング技術や分子プローブ、また腫瘍組織等の患部へ薬剤を効率的に搬送するためのドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）技術にナノ粒子が応用されている。具体的には、例えば、かかる微粒子にインドシアニングリーン（ＩＣＧ）のような蛍光剤や１８Ｆのような放射性同位元素を付加したポリマーを内包して、分子プローブとする試みがなされている。また、かかる微粒子に抗癌剤や光増感剤といった薬剤を内包させ、標的とする病巣へ効率的に薬剤を搬送し、治療する試みもなされている。
上記微粒子（分子集合体）として、例えば、次のものが開示されている。
（１）１０個以上のサルコシン単位を有する親水性ポリペプチド鎖と、アミノ酸単位及びヒドロキシル酸単位からなる群から選ばれる単位を必須構成単位として含み、且つ前記必須構成単位を５個以上有する疎水性分子鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーからなる分子集合体（特許文献１参照）。
（２）２０個以上のサルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、１０個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマー、及び１０個以上の乳酸単位と標識基とを少なくとも有する標識ポリマーからなる分子集合体（特許文献２参照）。
（３）サルコシンを含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸を有する疎水性ブロックとを有する、分岐型両親媒性ブロックポリマーを有する分子集合体（特許文献３参照）。
少なくとも上記（２）及び（３）に係る両親媒性ブロックポリマーについては、比較的容易に自己組織化し、３０ｎｍ程度の粒子径を有する高分子ミセル、即ち分子集合性を形成することができる。また、その優れた特性等から「ラクトソーム」（登録商標、以下省略）とも称されている。
ラクトソーム等の分子集合体の作製方法としては、例えば、インジェクション法、フィルム法、超音波法、エクストルーダー法が挙げられる。
この中、インジェクション法は、トリフルオロエタノール等の有機溶媒に両親媒性ブロックポリマーを溶解し、得られた溶液を、注射用水等の水系溶媒に分散させ、ゲルろ過クロマトグラフィー等により精製処理を行った後、有機溶媒を除去することによって作製する方法である。
フィルム法は、適当な容器内において、クロロホルム等の有機溶媒に両親媒性ブロックポリマーを溶解し、かかる有機溶媒を留去することにより、該容器内でフィルムを形成させ、それに注射用水等の水系溶媒を加えて加温等することにより作製する方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−２４８１６号公報
【特許文献２】国際公開２００９／１４８１２１号
【特許文献３】国際公開２０１２／１７６８８５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記フィルム法によれば、簡便にナノレベルの分子集合体を作製することができる。また、該フィルム法は、条件検討が比較的容易であり、更には少量（例えば１０ｍｇ／ｍＬ以下）の分子集合体の作製に適している。しかしながら、該フィルム法では、粒子径が均一な、即ち粒度分布の狭い分子集合体の作製が困難な場合がある。また、１ロットで作製できる分子集合体の量が充分でないおそれがある。
以上の現状から、本発明の主な課題は、該フィルム法において、より粒子径が均一な粒度分布の狭い分子集合体を作製することができる新規な作製法を提供することにある。また、該フィルム法において、１ロットで作製できる分子集合体の量を増やすことができる作製法を提供することも本発明の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、容器内の溶液に粒状体を浸した状態で、溶媒を留去してフィルムを形成した後、水又は水溶液を加えることにより、粒子径が均一なナノレベルの分子集合体を大量に作製することができることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００６】
本発明として、例えば、下記を挙げることができる。
［１］容器内で、直鎖型又は分岐型の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液から溶媒を留去することにより、該ブロックポリマーを有するフィルムを形成し、その後、該容器中に水又は水溶液を加えて分子集合体を作製する方法であって、
前記容器内の溶液に１個以上の粒状体を浸した状態で、溶媒を留去し前記フィルムを形成することを特徴とする、前記両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体の作製法（以下、「本発明作製法」ともいう）。
【０００７】
［２］粒状体が、球体である、前記［１］に記載の分子集合体の作製法。
【０００８】
［３］球体がガラスビーズである、前記［２］に記載の分子集合体の作製法。
【０００９】
［４］粒状体の総表面積が、溶液が接している容器内壁の表面積の１０倍以上である、前記［１］〜［３］のいずれか一に記載の分子集合体の作製法。
【００１０】
［５］両親媒性ブロックポリマーが、サルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを含むものである、前記［１］〜［４］のいずれか一に記載の分子集合体の作製法。
【００１１】
［６］親水性ブロック鎖のサルコシン単位が２〜５００個の範囲内である、前記［５］に記載の分子集合体の作製法。
【００１２】
［７］疎水性ブロック鎖の乳酸単位が５〜１００個の範囲内である、前記［５］に記載の分子集合体の作製法。
【００１３】
［８］両親媒性ブロックポリマーが、機能性基を有するものである、前記［１］〜［７］のいずれか一に記載の分子集合体の作製法。
［９］フィルム形成前の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液が、機能性物質を含むものである、前記［１］〜［８］のいずれか一に記載の分子集合体の作製法。
【００１４】
［１０］機能性基がシグナル基又はリガンド基である、前記［８］に記載の分子集合体の作製法。
【００１５】
［１１］機能性物質がシグナル剤又は薬剤である、前記［９］に記載の分子集合体の作製法。
【００１６】
［１２］粒子径や粒度分布制御のためのフィルター処理工程を含まない、前記［１］〜［１１］のいずれか一に記載の分子集合体の作製法。
【００１７】
［１３］フィルム形成前における両親媒性ブロックポリマーの溶液中の濃度が、１０ｍｇ／ｍＬより多い、前記［１］〜［１２］のいずれか一に記載の分子集合体の作製法。
【００１８】
［１４］さらに凍結乾燥工程を含む、前記［１］〜［１３］のいずれか一に記載の分子集合体の作製法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明作製法によれば、粒子径が均一な粒度分布の狭いナノレベルの分子集合体を、１ロットで大量（高濃度）に作製することができる。そのため、医薬品などの実用化、品質管理の観点から有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】従来のフィルム法の一例を説明するための模式図である。
【図２】本発明作製法の一例を説明するための模式図である。
【図３】実施例１で得られた粒子の粒子径の測定結果を表す。図中、縦軸は散乱光強度（％）を、横軸は粒子径（ｎｍ）を、それぞれ示す。実線は粒子化後の粒度分布曲線を、破線は２００ｎｍフィルター処理後の粒度分布曲線を、それぞれ示す。
【図４】実施例２で得られた粒子の粒子径の測定結果を表す。図中、縦軸は散乱光強度（％）を、横軸は粒子径（ｎｍ）を、それぞれ示す。実線は粒子化後の粒度分布曲線を、破線は２００ｎｍフィルター処理後の粒度分布曲線を、それぞれ示す。
【図５】実施例３で得られた粒子の粒子径の測定結果を表す。図中、縦軸は散乱光強度（％）を、横軸は粒子径（ｎｍ）を、それぞれ示す。実線は粒子化後の粒度分布曲線を、破線は２００ｎｍフィルター処理後の粒度分布曲線を、それぞれ示す。
【図６】実施例４で得られた粒子の粒子径の測定結果を表す。図中、縦軸は散乱光強度（％）を、横軸は粒子径（ｎｍ）を、それぞれ示す。実線は粒子化後の粒度分布曲線を、破線は２００ｎｍフィルター処理後の粒度分布曲線を、それぞれ示す。
【図７】比較例１で得られた粒子の粒子径の測定結果を表す。図中、縦軸は散乱光強度（％）を、横軸は粒子径（ｎｍ）を、それぞれ示す。実線は粒子化後の粒度分布曲線を、荒い破線（−−）は２００ｎｍフィルター処理後の粒度分布曲線を、細かい破線（---）は１００ｎｍフィルター処理後の粒度分布曲線を、それぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明作製法について詳述する。
【００２２】
本発明作製法は、容器内で、直鎖型又は分岐型の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液から溶媒を留去することにより、該ブロックポリマーを有するフィルムを形成し、その後、該容器中に水又は水溶液を加えて分子集合体を作製する方法であって、前記容器内の溶液に１個以上の粒状体を浸した状態で、溶媒を留去し前記フィルムを形成することを特徴とする、前記両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体の作製法である。
【００２３】
Ｉ．粒状体について
本発明作製法は、容器内の溶液に１個以上の粒状体を浸した状態で、溶媒を留去することを要旨とする。
【００２４】
該粒状体としては、容器内で、直鎖型又は分岐型の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液から溶媒を留去することにより、該ブロックポリマーを有するフィルムを形成する工程、及び容器中に水又は水溶液を加えて分子集合体を作製する工程が円滑に進む形状のものであれば特に限定されず、例えば、球体、楕円体、円筒体、多面体を挙げることができる。中でも、均一な厚さのフィルムを形成でき、これにより、より均一な粒子径の分子集合体を形成できると考えられることから、球体が好ましい。
【００２５】
粒状体の材質は、容器内で、両親媒性ブロックポリマーを有するフィルムを形成する工程、及び分子集合体を作製する工程に不活性であり、粒状体の表面に該ポリマーのフィルムを形成しうるものであれば特に限定されず、例えば、ガラス、樹脂、金属、ゴム、セラミック等を挙げることができる。
該粒状体の特に好ましい具体例としては、ガラスビーズ、金属ビーズ、セラミックビーズを挙げることができる。
【００２６】
本発明作製法の実施にあたっては、１個以上の粒状体を用いればよく、その個数は特に限定されないが、通常は複数個用いる。用いる粒状体の個数は、粒状体の大きさや形状、容器の容量や形状等によって異なる。
１個以上の粒状体の総表面積は、特に限定されないが、溶液が接している容器内壁の表面積の１０倍以上であることが好ましく、２０倍以上であることがより好ましい。粒状体の総表面積が、溶液が接している容器内壁の表面積の１０倍未満の場合、粒状体を入れない従来のフィルム法と同程度の量の分子集合体しか作製できない可能性がある。
【００２７】
更に、１個以上の粒状体を用いることにより、両親媒性ブロックポリマーを有するフィルムが形成される表面積が増大し、均一な薄膜フィルムが形成されうるだけでなく、該粒状体が攪拌子と同様の役割を果たし、ポリマー溶液がより均一となる。また、その後容器中に水又は水溶液を加えて分子集合体を作製する際に、フィルムの形成された粒状体が容器内壁と、又は該粒状体同士で物理的にこすれあうことにより、粒子化がスムーズに行われるという効果も得られる。
【００２８】
粒状体の大きさは、容器の容量や、口の大きさ等により適宜調整すればよいが、例えば、ガラスビーズのような球体の場合、通常、直径１〜２０ｍｍ、好ましくは、２〜１０ｍｍである。粒状体の大きさが前記範囲の場合、分子集合体作製後、容器内から粒状体を回収する際の操作等を簡便に行うことができる。
【００２９】
ＩＩ．直鎖型又は分岐型の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液について
次に、直鎖型又は分岐型の両親媒性ブロックポリマー（以下、これらを併せて単に「両親媒性ブロックポリマー」ともいう）を含む溶液について詳述する。
【００３０】
両親媒性ブロックポリマーとしては、フィルム法により分子集合体を形成できるものであれば特に限定されないが、例えば、サルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを含むものが好ましい。
【００３１】
親水性ブロック鎖のサルコシン単位は、直鎖型か分岐型か、またサルコシン単位以外の構成単位を有するか否か等によって異なるが、ブロック鎖全体（コポリマー分子）として親水性であり、かつかかるコポリマー分子が溶媒中で自己組織化して、分子集合体を形成することができる程度に親水性であれば特に制限はなく、通常、２〜５００個の範囲内であり、直鎖型であれば２０〜５００個程度の範囲内が適当であり、好ましくは４０〜３００個程度、より好ましくは５０〜１００個程度である。分岐型であれば、分岐全てに含まれるサルコシン単位の合計として、２〜６００個程度の範囲内が適当であり、好ましくは１０〜４００個程度、より好ましくは、５０〜３００個程度である。
【００３２】
親水性ブロック鎖は、サルコシン単位を有するポリペプチド鎖であることが好ましい。ポリペプチド鎖中、サルコシン単位は、連続していてもよく、非連続でもよい。
【００３３】
親水性ブロック鎖は、サルコシン単位以外の構成単位を有していてもよい。かかるサルコシン単位以外の構成単位としては、例えば、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びそれらの誘導体が挙げられる。より具体的には、例えば、セリン、スレオニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられる。
【００３４】
疎水性ブロック鎖の乳酸単位は、直鎖型か分岐型か、また乳酸単位以外の構成単位を有するか否か等によって異なるが、ブロック鎖全体（コポリマー分子）として疎水性であり、かつかかるコポリマー分子が溶媒中で自己組織化して、分子集合体を形成することができる程度に疎水性であれば特に制限はなく、通常、５〜１００個の範囲内であり、好ましくは１０〜８０個程度、より好ましくは２０〜６０個程度である。
【００３５】
乳酸単位は、Ｌ−乳酸単位のみで構成されていてもよく、Ｄ−乳酸単位のみで構成されてもよく、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両方から構成されてもよい。乳酸単位がＬ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両方から構成される場合、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との重合順番は特に限定されず、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位とが１個又は２個ずつ交互に重合されていてもよく、ランダムに重合されていてもよく、ブロック重合されていてもよい。乳酸単位がＬ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両方から構成される場合、それぞれの乳酸単位の含有量は特に限定されない。
【００３６】
疎水性ブロック鎖は、乳酸単位以外の構成単位を有していてもよい。かかる乳酸以外の構成単位としては、例えば、乳酸以外のヒドロキシル酸及びアミノ酸を挙げることができ、より具体的には、グリコール酸、ヒドロキシイソ酪酸等のヒドロキシル酸類；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン等の天然アミノ酸類；グルタミン酸メチルエステル、グルタミン酸ベンジルエステル、アスパラギン酸メチルエステル、アスパラギン酸エチルエステル、アスパラギン酸ベンジルエステル等の非天然アミノ酸類を挙げることができる。
【００３７】
両親媒性ブロックポリマーが、分岐型の両親媒性ブロックポリマーの場合、親水性ブロック鎖のみが分岐構造を有していてもよく、疎水性ブロック鎖のみが分岐構造を有していてもよく、親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖の両方が分岐構造を有していてもよい。
【００３８】
また、両親媒性ブロックポリマーは、直鎖型の両親媒性ブロックポリマーのみを用いてもよく、分岐型の両親媒性ブロックポリマーのみを用いてもよく、直鎖型及び分岐型の両親媒性ブロックポリマーの混合物を用いてもよい。
【００３９】
両親媒性ブロックポリマーは、その他の基を有していてもよい。その他の基は、本発明作製法で作製される分子集合体の用途等に応じて、当業者が適宜選択すればよい。かかるその他の基としては、例えば、有機基等の機能性基（後述）を挙げることができる。
【００４０】
両親媒性ブロックポリマーを溶解するための溶媒としては、両親媒性ブロックポリマーのフィルムを形成するのに不活性であれば特に限定されないが、１気圧における沸点が１００℃以下、好ましくは、９０℃以下の低沸点溶媒を用いることが好ましい。かかる溶媒としては、クロロホルム、ジエチルエーテル、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールアセトン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ヘキサン等を挙げることができる。
【００４１】
溶液中の両親媒性ブロックポリマーの濃度は、溶媒及び両親媒性ブロックポリマーの種類等により異なり、またそれらや粒状体の種類や形状、大きさ、個数等により適宜調整すればよく特に限定されないが、従来のフィルム法では困難な高濃度とすることができる。そのような濃度として、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ〜飽和溶解濃度以下、５０ｍｇ／ｍＬ〜飽和溶解濃度以下、１００ｍｇ／ｍＬ〜飽和溶解濃度以下を挙げることができる。これにより従来のフィルム法と比べ、分子集合体を大量に作製することができる。
【００４２】
両親媒性ブロックポリマーが溶解している溶液には、機能性物質（後述）、添加剤等の任意成分を含んでいてもよい。
【００４３】
添加剤としては、粒子径制御のためのポリ乳酸、安定性向上のための添加物、抗酸化剤等を挙げることができる。
【００４４】
上記ポリ乳酸としては、粒子径が制御できるものであれば特に限定されず、平均分子量が１０００〜５００００、好ましくは２０００〜１００００のＤ体、Ｌ体、又はその混合物を目的に応じて適宜使用することができ、市販のポリ乳酸をそのまま使用することができる。該ポリ乳酸の添加量は、両親媒性ブロックポリマーの種類、目的とする粒子径等により適宜調整すればよいが、通常、両親媒性ポリマーに対して０．１ｍｏｌ％〜１０００ｍｏｌ％であり、好ましくは、１０ｍｏｌ％〜２００ｍｏｌ％である。
【００４５】
安定性向上のための添加物としては、例えば、疎水性添加物を挙げることができる。中でも、脂肪族エステルが好ましい。添加物の添加量は、両親媒性ブロックポリマーの種類や添加物の種類等により適宜調整すればよいが、粒子径に影響を与えないためには、通常、両親媒性ポリマーに対して１０ｍｏｌ％以下、好ましくは、５ｍｏｌ％以下である。粒子径への影響を考慮しない場合、限度はない。
【００４６】
抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール、そのエステル、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピルなどを挙げることができる。中でも、トコフェロールが好ましい。抗酸化剤の添加量は、両親媒性ブロックポリマーの種類や抗酸化剤の種類等により適宜調整すればよいが、通常、粒子径に影響を与えないためには、両親媒性ポリマーに対して１０ｍｏｌ％以下、好ましくは、５ｍｏｌ％以下である。粒子径への影響を考慮しない場合、限度はない。
【００４７】
ＩＩＩ．両親媒性ブロックポリマーを有するフィルムを形成する工程について
続いて、容器内で、両親媒性ブロックポリマーを含む溶液から溶媒を留去することにより、該容器内に該ブロックポリマーを有するフィルムを形成する工程について詳述する。
【００４８】
フィルムを形成するための容器としては、両親媒性ブロックポリマー及び溶媒の種類、粒状体の種類や形状、大きさ、個数、溶媒を留去する方法等により、当業者が適宜選択すればよく、ガラス容器が適当であり、具体的には、ガラス製のナス型フラスコ、丸底フラスコ、円筒容器等を挙げることができる。また、容器の大きさも、両親媒性ブロックポリマー及び溶媒の量、粒状体の種類や形状、大きさ、個数等により、当業者が適宜選択することができる。
【００４９】
溶媒を留去する方法としては、両親媒性ブロックポリマー及び溶媒の種類等により当業者が適宜選択すればよく、減圧下における溶媒除去を行ってもよく、自然乾燥による溶媒除去や加温による溶媒除去を行ってもよい。中でも、減圧下で溶媒除去する場合は、操作が簡便で短時間で溶媒除去ができることから、エバポレーターを用いることが好ましい。このように溶媒を留去することにより、容器の内壁面に加えて、粒状体の表面にも両親媒性ブロックポリマーを有するフィルムが形成される。
【００５０】
エバポレーターを用いて、減圧下で溶媒除去する場合、減圧条件は、容器の大きさや溶媒の種類等によって適宜調整すればよいが、通常、２５℃〜６０℃の湯浴中で、５分間〜６０分間行えばよい。
また、必要に応じて、真空乾燥を行ってもよい。
【００５１】
形成される両親媒性ブロックポリマーを含むフィルムの厚さは、溶液中の両親媒性ブロックポリマーの濃度等により異なり、また容器の容量や、粒状体の種類や形状、大きさ、個数等により当業者が適宜調整すればよいが、粒子径がより均一な分子集合体を作製するためには、容器の内壁面に形成されるフィルムと粒状体の表面に形成されるフィルムとの間に水又は水溶液が入る程度の隙間ができる厚さであることが好ましい。
【００５２】
ＩＶ．容器中に水又は水溶液を加えて分子集合体を作製する工程について
続いて、容器中に水又は水溶液を加えて分子集合体を作製する工程について詳述する。
【００５３】
上記のとおり、適当な容器内で、両親媒性ブロックポリマーを含む溶液から溶媒を留去すると、容器の内壁面及び容器内の粒状体の表面に両親媒性ブロックポリマーを有するフィルムが形成される。このフィルムが形成された容器内に、水又は水溶液を加え、両親媒性ブロックポリマー等を分散ないし自己組織化させて分子集合体を作製する。
【００５４】
加える水又は水溶液としては、分子集合体が形成される水性媒体であれば特に限定されず、用途に応じて適宜選択すればよい。具体的には、精製水、蒸留水、超純水等を挙げることができる。医薬に用いる分子集合体を作製する場合には、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよく、そのような水又は水溶液として、例えば、注射用水、生理食塩水、緩衝液、その他一般輸液等を挙げることができる。
【００５５】
上記水又は水溶液の量は、特に限定されず、容器内の両親媒性ブロックポリマーが全て分子集合体を形成することのできる程度以上に加えればよい。
具体的には、得られる分子集合体の分散液中における両親媒性ブロックポリマーの濃度としては、得られる分子集合体の用途に応じて異なるが、例えば、そのまま注射剤として用いる場合は１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ程度、凍結乾燥を行い、凍結乾燥組成物とする場合は２０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ程度を挙げることができる。本発明作製法によれば、従来のフィルム法と比べ、高濃度の分子集合体とすることができる。
【００５６】
水又は水溶液を加えた後、必要に応じて、加温処理を行うことができる。加温により、両親媒性ブロックポリマーを有するフィルムが容器の内壁面及び粒状体表面から剥がれる過程で分子集合体が形成される。
加温処理は、両親媒性ブロックポリマーを有するフィルムの厚さや、容器の大きさ、粒状体の量等により適宜調整すればよいが、通常６０℃〜１００℃の範囲内で、５分間〜６０分間行うことができる。
【００５７】
加温処理と同時に、又は加温処理後に必要に応じて超音波処理や、手動又は機械的に振とうを行ってもよい。また、必要に応じて、加温処理後に粒子径や粒度分布制御のためのフィルター処理を行ってもよい。粒子径や粒度分布制御のためのフィルター処理は、不要な過大粒子を除き、均一な粒度分布の狭い分子集合体を得るために行うが、本発明作製法によれば、その粒子径や粒度分布制御のためのフィルター処理を行わなくても、又は少ない回数で不要な過大粒子を含まない均一な粒度分布の狭い分子集合体を得ることができる。
【００５８】
必要に応じて、加温処理後に、粒子径や粒度分布制御のためのフィルター処理と同時又は後に、滅菌や製造工程でのホコリ等の除去のためのフィルター処理を行ってもよい。滅菌や製造工程でのホコリ等の除去のためのフィルター処理は、常法により行うことができ、粒子径や粒度分布制御のためのフィルター処理と同様の方法でも行ってもよく、異なる方法で行ってもよい。
【００５９】
容器中に水又は水溶液を加えた後、得られた分子集合体の分散液は、次に述べる凍結乾燥処理を行わなくても、そのまま用いることができる。
【００６０】
Ｖ．凍結乾燥工程について
本発明作製法は、更に凍結乾燥工程を含んでいてもよい。
【００６１】
凍結乾燥工程は、常法により行うことができる。例えば、得られた分子集合体の分散液を液体窒素等によって凍結させ、減圧下で昇華させることによって行うことができる。より具体的には、必要に応じ、得られた分子集合体の分散液を滅菌した後、所定量をバイアル瓶等の適当な容器に分注し、約−４０℃〜−２０℃の条件で予備凍結を約２時間程度行い、約０℃〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５℃〜２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般にはバイアル等の容器内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明作製法で作製された分子集合体の凍結乾燥組成物を得ることができる。
【００６２】
得られた凍結乾燥組成物は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、例えば、注射用水、生理食塩水、緩衝液、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に限定されない。
【００６３】
ＶＩ．本発明作製法により作製される分子集合体について
本発明作製法により作製される分子集合体（以下、単に「分子集合体」ともいう）について詳述する。
【００６４】
本発明作製法により、内側（コア部）が疎水性ブロック鎖、外側（シェル部）が親水性ブロック鎖となるように構成されたミセル形状の分子集合体を作製することができる。かかる分子集合体は、分子イメージングシステムや薬剤搬送システム（ＤＤＳ）に用いられる場合に有用となる形態や機能等を持った機能性構造を備えることができる。これによって、かかる分子集合体は、分子イメージングにおけるフローブとしてや、薬剤搬送システムにおける担体として有用な構造体となる。
機能性構造を備える分子集合体を作製するためには、例えば、両親媒性ブロックポリマー自体に機能性基を結合させたものを用いればよく、また、フィルム形成前の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液に機能性物質を含有させたものを用いればよい。
【００６５】
上記機能性基としては、例えば、シグナル基、リガンド基等を挙げることができる。
【００６６】
シグナル基とは、検出によりイメージングを可能にする特性を有する基であり、例えば、蛍光基、放射性元素含有基、磁性基を挙げることができる。蛍光基としては、例えば、ＩＣＧ、Ｃｙ７、ＤＹ７７６、ＤＹ７５０、Ａｌｅａｘａ７９０、Ａｌｅａｘａ７５０、ローダミン、量子ドット等に由来する基を挙げることができる。中でも、測定対象を小動物、体表面に近い部位に特定した場合に、有用な情報を与えることが可能になることから、ＩＣＧ、Ｃｙ７、ＤＹ７７６、ＤＹ７５０、Ａｌｅａｘａ７９０、Ａｌｅａｘａ７５０に由来する基が好ましい。
【００６７】
放射性元素含有基としては、１８Ｆ、１１１Ｉｎ等の放射性同位体でラベルした、糖、アミノ酸、核酸、ペプチド、合成高分子等に由来する基を挙げることができる。
【００６８】
磁性基としては、フェリクローム、フェロセン等の磁性体を有するものを挙げることができる。
【００６９】
リガンド基とは、標的細胞に発現している生体分子に結合することによって、分子集合体の指向性を制御し、これにより分子集合体のターゲティング性を高める基であり、例えば、抗体、細胞接着ペプチド、糖鎖を挙げることができる。
【００７０】
抗体としては、ターゲッ卜部位の細胞に発現している抗原への特異的結合能を有するもの等を挙げることができる。
細胞接着ペプチドとしては、例えば、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）等の接着因子を挙げることができる。
糖鎖としては、例えば、力ルボキシルメチルセルロース、アミロース等の安定剤や、ターゲッ卜部位の細胞に発現しているタンパク質への特異的結合能を有するものを挙げることができる。
【００７１】
機能性基の結合位置は、特に限定されない。例えば、両親媒性ブロックポリマーの親水性ブロック鎖の末端構成単位に結合させれば、作製される分子集合体の表面（シェル部）に機能性基を露出させることができ、両親媒性ブロックポリマーの疎水性ブロック鎖の末端構成単位に結合させれば、作製分子集合体のコア部に機能性基を内包させることができる。
【００７２】
機能性物質は、作製される分子集合体の疎水コア部に位置することによって内包されるものである。かかる機能性物質としては、シグナル剤、薬剤等を挙げることができる。
【００７３】
シグナル剤としては、例えば、上述のシグナル基を有する化合物を挙げることができる。中でも、フルオレセイン系色素、シアニン系色素等の近赤外蛍光物質や、１８Ｆ、１１１Ｉｎ等の放射性同位体でラベルした、糖、アミノ酸、核酸、ペプチド、タンパク、合成高分子等の放射性元素含有物質が好ましい。
薬剤としては、対象となる疾患に適したものが当業者によって適宜選択される。具体的には、抗がん剤、抗菌剤、抗ウィルス剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、ステロイド剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤等が挙げられる。これら薬剤分子は、単独で文は複数種の組み合わせで用いることができる。
【００７４】
機能性物質は、ポリ乳酸基が結合しているものであってもよい。ポリ乳酸基は、乳酸単位を主たる構成成分とする基である。乳酸単位のすべてが連続していてもよいし、非連続であってもかまわない。基本的に、ポリ乳酸基の構造、鎖長及び光学純度は、上述の疎水性ブロックの分子設計における場合と同様の観点で決定することができる。このようにすることによって、分子集合体において、機能性物質と両親媒性ブロックポリマーの疎水性ブロックとの親和性に優れるという効果も得られる。
【００７５】
上記ポリ乳酸基の乳酸単位数は、通常、１５〜６０個の範囲内であり、好ましくは２５〜４５個程度である。この範囲内で、ポリ乳酸結合機能性物質全体の長さが上述の両親媒性ブロックポリマーの長さを超えないように分子設計される。好ましくは、両親媒性ブロックポリマーにおける疎水性ブロックの２倍の長さを超えないように分子設計される。構成単位数が上記範囲を上回ると、分子集合体を形成した場合に、形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。構成単位数が上記範囲を下回ると、機能性物質と両親媒性ブロックポリマーの疎水性ブロックとの親和性が弱くなる傾向にある。
【００７６】
なお、ポリ乳酸結合機能性物質におけるポリ乳酸鎖の光学活性は、分子集合体の構成要素となる分岐型両親媒性ブロックポリマーや直鎖型両親媒性ブロックポリマーと同様であることが好ましい。例えば、分岐型両親媒性ブロックポリマーや直鎖型両親媒性ブロックポリマーにおけるポリ乳酸鎖がＬ−乳酸単位からなる場合は、ポリ乳酸結合機能性物質におけるポリ乳酸鎖も、Ｌ−乳酸単位からなることが好ましい。
【００７７】
両親媒性ブロックポリマーを含む溶液中における機能性物質の含有量としては特に限定されるものではないが、例えば、蛍光物質の場合、両親媒性ブロックポリマー及び蛍光色素の合計に対し、蛍光色素の量として０．５〜５０ｍｏＬ％の範囲内が適当である。
【００７８】
動的光散乱法（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＤＬＳ）により測定される、分子集合体の個数平均粒子径は、通常、１０ｎｍ〜２００ｎｍや、２０ｎｍ〜５０ｎｍである。平均粒子径が１０ｎｍより小さいものは、ＤＬＳによる測定が難しい場合がある。
【００７９】
また、本発明作製法によれば、２００ｎｍないし１００ｎｍのフィルター処理等を行わなくても、又はその処理回数を少なくして（具体的には、１回のみ等）、過大粒子を含まない均一な粒度分布の狭い分子集合体を作製することができる。具体的には、例えば、多分散性指数（ＰＤＩ：ＰｏｌｙＤｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ）として、０．２以下の分子集合体を作製することができる。
ここで、多分散性指数（ＰＤＩ）は、ＰＤＩ＝（Ｄ９０−Ｄ１０）／Ｄ５０〔式中、Ｄ９０、Ｄ５０、Ｄ１０は、それぞれ分布関数Ｇ＝∫ｆ（Ｄ）ｄＤ（Ｇは粒子数、Ｄは粒径）の積分が、全粒子数の０．９（９０個数％）、０．５（５０個数％）及び０．１（１０個数％）に等しい粒径を表す。〕の式より求められる。つまり、上記関係式において、粒度分布が狭いほど、ＰＤＩはゼロに近づき、逆に、粒度分布が広い、つまり多分散性が大きいほど、ＰＤＩは大きくなる。
【実施例】
【００８０】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００８１】
各物性は、次のとおり測定されたものである。
［粒子径］
製造した粒子を蒸留水で１ｍｇ／ｍＬに希釈し、動的光散乱法（ＤＬＳ）による粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ社製  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓ）を用い、個数平均として測定した。
［ＰＤＩ］
測定された粒子径を使って、以下の式に基づき算出した。
ＰＤＩ＝（Ｄ９０−Ｄ１０）／Ｄ５０
（式中、Ｄ９０、Ｄ５０、Ｄ１０は、それぞれ分布関数Ｇ＝∫ｆ（Ｄ）ｄＤ（Ｇは粒子数、Ｄは粒径）の積分が、全粒子数の０．９（９０個数％）、０．５（５０個数％）及び０．１（１０個数％）に等しい粒径を表す。）
［単峰性］
粒子分散体が、単峰性であるか否かは、下記のような指標で評価した。
○：動的光散乱法（ＤＬＳ）による粒子径測定結果の粒度分布曲線が見掛け上１山と判断される場合
×：動的光散乱法（ＤＬＳ）による粒子径測定結果の粒度分布曲線が見掛け上２山以上と判断される場合
【００８２】
使用した原料は、次のとおりである。
［両親媒性ブロックポリマー］
両親媒性ブロックポリマーとして、親水性ブロック鎖のサルコシン単位が６６個（平均値）と、疎水性ブロック鎖の乳酸単位が３１個（平均値）とが結合したポリマー（以下、「ＰＳａｒ６６−ＰＬＬＡ３１」という）を用いた。
【００８３】
実施例１
１ｇのＰＳａｒ６６−ＰＬＬＡ３１をナスフラスコ内で１０ｍＬのクロロホルムに溶解し（１００ｍｇ／ｍＬ）、４０ｇのガラスビーズ（直径２．５〜３．５ｍｍ）存在下、エバポレーターを用いて、湯浴４０℃で４５分間減圧留去し、ナスフラスコ内壁面およびガラスビーズ表面にポリマーフィルムを作製した。更に室温で１晩真空乾燥を行った後、蒸留水２０ｍＬを加えて８５℃で３０分間加温処理を行うことにより粒子化を行った（５０ｍｇ／ｍＬ）。粒子化後、溶液が室温になるまで放冷し、粒子径測定を行った。その後、２００ｎｍフィルター処理を行い、粒子径測定を行った。その結果を表１に示す。
また、粒子径測定結果のグラフを図３に示す。
【００８４】
実施例２
２０ｇのガラスビーズ（直径２．５〜３．５ｍｍ）を用いた以外は、実施例１と同様にして粒子を作製し、粒子径測定を行った。その後、２００ｎｍフィルター処理を行い、粒子径測定を行った。その結果を表１に示す。
また、粒子径測定結果のグラフを図４に示す。
【００８５】
実施例３
４０ｇのガラスビーズ（直径９．０〜１１．０ｍｍ）を用いた以外は、実施例１と同様にして粒子を作製し、粒子化測定を行った。その後、２００ｎｍフィルター処理を行い、粒子径測定を行った。その結果を表１に示す。
また、粒子径測定結果のグラフを図５に示す。
【００８６】
実施例４
蒸留水４０ｍＬを加えて粒子化を行った（２５ｍｇ／ｍＬ）以外は、実施例１と同様にして粒子を作製し、粒子径測定を行った。その後、２００ｎｍフィルター処理を行い、粒子径測定を行った。その結果を表１に示す。
また、粒子径測定結果のグラフを図６に示す。
【００８７】
比較例１
ナスフラスコ内にガラスビーズを入れなかった以外は、実施例１と同様の条件でポリマーフィルムの作製及び粒子化を行い、粒子径測定を行った。その後、２００ｎｍフィルター処理を行い、粒子径測定を行った。更にその後、１００ｎｍフィルター処理を行い、粒子径測定を行った。その結果を表１に示す。
また、粒子径測定結果のグラフを図７に示す。
【００８８】
【表１】
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【００８９】
実施例１〜４及び比較例１の結果から、本発明作製法によれば、フィルター処理無しで、又はフィルター処理の回数を少なくして、従来のフィルム法に比べＰＤＩの小さな分子集合体、単分散性の均一な分子集合体を１ロットで大量に作製できることが明らかである。一方、従来のフィルム法では、フィルター処理しない場合、又は２００ｎｍのフィルター処理のみの場合では、ＰＤＩが０．２以下で単峰性の粒子を得ることができなかった。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明作製法によれば、より粒子径が均一な粒度分布の狭い分子集合体を、１ロットで大量に作製することができることから、本発明は、分子イメージングシステムや薬剤搬送システム（ＤＤＳ）等の分野で有用である。また、同様に、化粧品、食品、家庭用品等の分野における物質搬送キャリアの作製法としても有用である。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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