(57)【要約】【課題】安全で高い活性を有する終末糖化産物生成阻害剤を提供する。【解決手段】本発明の終末糖化産物生成阻害剤は、ヒシ科に属する植物の果皮及び果実の一方又は双方の熱水抽出物より分離され、タンパク質と糖からの終末糖化産物の生成に関連する１又は複数の反応を阻害する活性を有する１又は複数の化合物を有効成分として含み、当該１又は複数の化合物が、好ましくは、ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定された分子量が７０〜１３０及び２９０〜３８０のいずれかの範囲内である化合物のうち１又は複数を含んでいる。【選択図】図１
2015209420.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒシ科に属する植物の果皮及び果実の一方又は双方の熱水抽出物より分離され、タンパク質と糖からの終末糖化産物の生成に関連する１又は複数の反応を阻害する活性を有する１又は複数の化合物を有効成分として含むことを特徴とする終末糖化産物生成阻害剤。
【請求項２】
前記１又は複数の化合物において、ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定された分子量が７０〜１３０及び２９０〜３８０のいずれかの範囲内であることを特徴とする請求項１記載の終末糖化産物生成阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全で高活性な終末糖化産物生成阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
終末糖化産物（Advanced  Glycation  Endproduct、ＡＧＥｓ）は、糖化タンパク質、メイラード反応産物等とも呼ばれ、グルコース等の還元糖とタンパク質のアミノ基との非酵素的な反応により生成する種々の構造を有するタンパク質誘導体である。ＡＧＥｓは、細胞外マトリックスタンパク質、膜タンパク質及び細胞内タンパク質の糖化修飾に起因するこれらのタンパク質の機能及びそれに依存する細胞機能の破綻、或いはＡＧＥｓをリガンドとするレセプターが引き起こす細胞応答の結果として、種々の病変の発症及び増悪に関与している。
【０００３】
例えば、ＡＧＥｓレセプターの１つであるＲＡＧＥによってＡＧＥｓが認識されると、細胞内ＮＡＤＰＨオキシダーゼによる細胞内酸化ストレス物質の産生が亢進し、これが上皮細胞における遺伝子発現を変化させることにより、種々の糖尿病性血管障害が発症すると考えられている（非特許文献１参照）。
【０００４】
また、近年、ＡＧＥｓは、糖尿病性血管障害に加え、心筋梗塞、動脈硬化症等の心血管障害（非特許文献２参照）、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患（非特許文献３参照）、アルコール依存症による脳障害及び肝障害（非特許文献４参照）、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症（非特許文献５参照）、骨粗鬆症等の骨代謝異常（非特許文献６参照）、老化現象（非特許文献７参照）、インスリン抵抗性（非特許文献８参照）、腫瘍の増殖及び転移（非特許文献９参照）等にも関与していることが示唆されている。
【０００５】
生体内におけるＡＧＥｓの形成を阻害することにより、ＡＧＥｓに関連する疾患を治療又は予防するための薬剤として、例えば、特許文献１では、ムラサキ、セイヨウムラサキ、イヌムラサキ等のムラサキ属植物の培養細胞抽出エキス若しくはその処理物、又はコーヒー酸重合体を有効成分として含有するメイラード反応阻害剤が開示されている。特許文献２では、アミノグアニジン等のメイラード反応阻害剤と、ビタミンＢ6又はその医薬的に許容される塩とを含有したＡＧＥｓ生成阻害組成物が開示されている。また、特許文献３では、カルボニル化合物トラップ剤を有効成分とする、腹膜透析における腹腔内のカルボニルストレス状態改善剤が開示されている。
【０００６】
また、ＡＧＥｓに関連する疾患の治療及び予防のためには、キレート能、抗酸化作用等の複数の作用を併せ持つ物質が有望であると考えられている（非特許文献１０参照）。
【０００７】
また、食品に含まれるクレメジン、キチン、キトサン等の高分子が、食品中のＡＧＥｓを吸着することが報告されているが（例えば、非特許文献１１及び１２参照）、これらが食品中に含まれるＡＧＥｓを吸着し、排泄を促進することにより血中ＡＧＥｓ濃度を低下させると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−２１４２５０号公報
【特許文献２】特開平１０−３２４６２９号公報
【特許文献３】特開２００６−３０５３４５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Marie−Paule  Wautier他著、「Activation  of  NADPH  oxidase  by  AGE  links  oxidant  stress  to  altered  gene  expression  via  RAGE」、Amarican  Journal  of  Physiology  −Endocrinology  and  Metabolism、（米国）、アメリカ生理学会（American  Physiological  Society）、２００１年５月、第２８０巻、Ｅ６８５−Ｅ６９４
【非特許文献２】Yoshihide  Jinnouchi他著、「Glycolaldehyde−modified  low  density  lipoprotein  leads  macrophages  to  foam  cells  via  the  macrophage  scavenger  receptor」、The  Journal  of  Biochemistry、日本生化学会、１９９８年、１２３巻、第６号、ｐ．１２０８−１２１７
【非特許文献３】Nobuyuki  Sasaki他著、「Advanced  Glycation  End  Products  in  Alzheimer's  Disease  and  Other  Neurodegenerative  Diseases」、The  American  Journal  of  Pathology、（米国）、アメリカ研究病理学会（American  Society  for  Investigative  Pathology）、１９９８年１０月、第１５３巻、第４号、ｐ．１１４９−１１５５
【非特許文献４】Keiko  Iwamoto他著、「Advanced  glycation  end  products  enhance  the  proliferation  and  activation  of  hepatic  stellate  cells」、Journal  of  Gastroenterology、シュプリンガー・ジャパン、２００８年４月、第４３巻、第４号、ｐ．２９８−３０４
【非特許文献５】C  W  Yang他著、「Advanced  glycation  end  products  up−regulate  gene  expression  found  in  diabetic  glomerular  disease」、Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America、（米国）、アメリカ国立科学協会（National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America）、１９９４年９月２７日、第９１巻、第２０号、ｐ．９４３６−９４４０
【非特許文献６】James  J.  Tomasek他著、「Diabetic  and  age−related  enhancement  of  collagen−linked  fluorescence  in  cortical  bones  of  rats」、Life  Sciences、（オランダ）、エルゼビア（Elsevier  B.V.）、１９９４年、第５５巻、ｐ．８５５−８６１
【非特許文献７】Melpomeni  Peppa他著、「Aging  and  glycoxidant  stress」、Hormones、（ギリシア）、ギリシア内分泌学協会（Hellenic  Endocrine  Society）、２００８年、第７巻、第３号、ｐ．１２３−１３２
【非特許文献８】水田雅也、「インスリン作用不足と酸化ストレス」、日本薬理学雑誌、日本薬理学会、第１２５巻、第３号、ｐ．１２５−１２８
【非特許文献９】Riichiro  Abe他著、「Regulation  of  Human  Melanoma  Growth  and  Metastasis  by  AGE−AGE  Receptor  Interactions」、Journal  of  Investigative  Dermatology、（英国）、ネイチャー・パブリッシング・グループ（Nature  Publishing  Group）、２００４年２月、第１２２巻、第２号、ｐ．４６１−４６７
【非特許文献１０】Sean  M.  Culbertson他著、「Paradoxical  Impact  of  Antioxidants  on  Post−Amadori  Glycoxidation:  COUNTERINTUITIVE  INCREASE  IN  THE  YIELDS  OF  PENTOSIDINE  AND  Nε−CARBOXYMETHYLLYSINE  USING  A  NOVEL  MULTIFUNCTIONAL  PYRIDOXAMINE  DERIVATIVE」、Journal  of  Biological  Chemistry、（米国）、米国生化学・分子生物学会（American  Society  for  Biochemistry  and  Molecular  Biology）、２００３年１０月、第２７３巻、ｐ．３８３８４−３８３９４
【非特許文献１１】S.  Yamagishi他著、「Oral  administration  of  AST−120  (Kremezin)  is  a  promising  therapeutic  strategy  for  advanced  glycation  end  product  (AGE)−related  disorders」、Medical  Hypotheses、（オランダ）、エルゼビア（Elsevier  B.V.）、２００７年、第６９巻、第３号、ｐ．６６６−６６８
【非特許文献１２】S.  Ueda他著、「Oral  Adsorbent  AST−120  Decreases  Serum  Levels  of  AGEs  in  Patients  with  Chronic  Renal  Failure」、Molecular  Medicine、（米国）、ファインスタイン医学研究所（Feinstein  Institute  for  Medical  Research）、２００６年、第１２巻、ｐ．１８０−１８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献１記載のメイラード反応阻害剤については、経口摂取時の安全性が未知数である。また、特許文献２記載のＡＧＥｓ生成阻害組成物は合成物であり、副作用の発生が懸念されるアミノグアニジン等が含まれている。また、特許文献３、非特許文献１１、１２記載の、高分子をベースとするＡＧＥｓの吸着除去剤においては、非特異的な吸着により、有用な栄養成分が同時に吸着除去されるおそれがある。
【００１１】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、安全で高い活性を有する終末糖化産物生成阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的に沿う本発明は、ヒシ科に属する植物の果皮及び果実の一方又は双方の熱水抽出物より分離され、タンパク質と糖からの終末糖化産物の生成に関連する１又は複数の反応を阻害する活性を有する１又は複数の化合物を有効成分として含むことを特徴とする終末糖化産物生成阻害剤を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１３】
本発明の終末糖化産物生成阻害剤において、前記１又は複数の化合物において、ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定された分子量が７０〜１３０及び２９０〜３８０のいずれかの範囲内であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の終末糖化産物生成阻害剤の有効成分は、食経験のあるヒシ科に属する植物の果皮及び果実の一方又は双方の熱水抽出物より分離された化合物である。したがって、安全性が確認されたものであると共に、高い終末糖化産物生成阻害能を有する。このように、本発明によると、安全で活性の高い終末糖化産物生成阻害剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒシ科植物の熱水抽出物中の分子量１００００以下の画分を、疎水性カートリッジカラムで分画（溶離液：水）後、ゲルろ過クロマトグラフィーで分画した各画分の終末糖化産物生成阻害率を示すグラフである。
【図２】ヒシ科植物の熱水抽出物中の分子量１００００以下の画分を、疎水性カートリッジカラムで分画（溶離液：水−アセトニトリル  １００：３０（ｖ／ｖ））後、ゲルろ過クロマトグラフィーで分画した各画分の終末糖化産物生成阻害率を示すグラフである。
【図３】ゲルろ過クロマトグラフィーの溶離時間と分子量との関係について、分子量が既知の化合物を用いて作成した検量線である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
続いて、添付した図面を参照しつつ、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
本発明の一実施の形態に係る終末糖化産物生成阻害剤は、ヒシ科植物の果皮及び果実の一方又は双方の熱水抽出物より分離された１又は複数の化合物を有効成分として含んでいる。ヒシ科植物の果実及び果皮は、生の実又は生の実から採取したもの、採取後乾燥したもの、乾燥した実又は乾燥した実から採取したもののいずれであってもよく、抽出効率を向上させるために、溶媒抽出の前に任意の方法を用いて破砕又は粉砕等の前処理を行ってもよい。
【００１７】
熱水抽出に用いられるヒシ科植物は特に制限されないが、具体例としては、ヒシ（Trapa  japonica）、オニビシ（Trapa  natans  L.  ver.  japonica）、ヒメビシ（Trapa  incisa）及びトウビシ（Trapa  bispinosa  Roxb.）が挙げられる。
【００１８】
熱水抽出に用いる溶媒としては、水、水溶液、水と混和する任意の１種以上の溶媒と水とを任意の割合で混合した混合溶媒（水性溶媒）を用いることができるが、好ましい抽出溶媒は、水、メタノール、エタノール及びこれらの任意の２以上を任意の割合で混合した水性溶媒であり、特に好ましい抽出溶媒は、水、食品添加物として認められている有機溶媒であるエタノールと水とを任意の割合で混合した水性溶媒である。抽出溶媒の温度は、室温を超え抽出溶媒の沸点以下の任意の温度であってよいが、抽出効率、被抽出物の耐熱性及び揮発性等を考慮して決定されることが好ましい。
【００１９】
抽出溶媒として水及び水性溶媒を用いる場合には、抽出効率を向上させるために、必要に応じて、酸、塩基、塩等を適宜含んでいてもよい。抽出に用いる水の温度及びｐＨについては特に制限はないが、ｐＨについては、生体への使用を考慮して中性付近、より具体的にはｐＨ４〜９であることが好ましく、６〜８であることがより好ましい。必要に応じて、抽出効率を向上させるために、加熱した抽出溶媒を用いてもよい。
【００２０】
熱水抽出は任意の公知の方法により行うことができ、例えば、ヒシ科植物の果皮及び果実の一方又は双方を溶媒中で所定時間混合後、ろ過、遠心分離、デカンテーション等により固形分と分離する方法、ソックスレー抽出法等の連続抽出法等の方法を用いることができる。
【００２１】
ヒシ科植物の果皮の溶媒抽出物から、１又は複数の化合物を分離する前に、高分子量成分や不溶分等を除去するために、透析、限外ろ過、ろ過、カラムクロマトグラフィー等による前処理を行ってもよい。
【００２２】
ろ過により不溶分等を除去する場合には、必要に応じて、不純物を除去するために活性炭、ベントナイト、セライト等の吸着剤やろ過助剤を添加してもよい。特に抽出液の状態で用いる場合には、メンブレンフィルター等による除菌ろ過を併せて行うことが好ましい。
【００２３】
必要に応じて上述のような前処理を行った熱水抽出物の分離は、カラムクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー等の任意の公知の方法を用いて行うことができ、終末糖化産物生成阻害活性の高い画分を分画することにより行うことができる。終末糖化産物生成阻害活性は、例えば、終末糖化産物生成阻害剤の非存在下における終末糖化産物の生成量に対する、終末糖化産物生成阻害剤の存在下におけるそれの比（阻害率）を求めることにより評価することができる。終末糖化産物の生成量は、例えば、終末糖化産物に特有な蛍光強度等の物理量を測定することにより行うことができる。
【００２４】
終末糖化産物生成阻害剤の阻害対象となる終末糖化産物は、任意のタンパク質及び任意の糖より誘導される終末糖化産物であり、具体例としては、アルブミン、グロブリン等の血清タンパク質、コラーゲン、エラスチン等の細胞外マトリックスタンパク質、Ｇタンパク質等の膜タンパク質及び細胞内タンパク質の糖化により形成される終末糖化産物等が挙げられる。糖の典型例としては、血液及び体液中に高濃度で存在するグルコース及びフルクトースが挙げられる。
【００２５】
終末糖化産物生成阻害剤の阻害対象となる反応は、タンパク質のアミノ基と還元糖との反応によるシッフ塩基の生成、アマドリ転位による１，２−エナミノール又は２，３−エンジオールの生成、アマドリ転移生成物の分解及び分解産物とアミノ酸、ペプチド又はタンパク質との重合生成物の生成等の任意の１又は複数の反応であってよい。
【００２６】
終末糖化産物生成阻害剤を担体等と混合することにより、糖尿病及びそれに関連する疾患及び症状に対する治療効果及び予防効果の一方又は双方を有する医薬組成物として用いることができる。医薬組成物のヒト或いは動物に対する投与形態としては、経口、経直腸、非経口（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与など）等が挙げられ、投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定され一義的に決定することは困難であるが、ヒトの場合、一般には製剤中に含有される有効成分の量で、好ましくは成人１日当り０．１〜２０００ｍｇ／日である。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、或いは上記範囲を超えて必要な場合もある。
【００２７】
経口投与製剤として調製する場合は、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤等の形態に調製でき、非経口投与製剤にする場合には、注射剤、点滴剤、座薬等の形態に調製することができる。製剤化には、任意の公知の方法を用いることができる。例えば、終末糖化産物生成阻害剤と、製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤、安定剤、及びその他の所望の添加剤を配合して、上記の所望の剤形とすることができる。
【００２８】
終末糖化産物生成阻害剤を含む食品としては、終末糖化産物生成阻害剤を食品に配合したもの、或いは、カプセル、錠剤等、食品又は健康食品に通常用いられる任意の形態をとることができる。配合される食品の種類に特に制限はなく、例えば、コーヒー、果汁、清涼飲料水、ビール、牛乳、味噌汁、スープ、紅茶、茶、栄養剤、シロップ、マーガリン、ジャム等の液状（流動状）食品、米飯、パン、じゃがいも製品、もち、飴、チョコレート、ふりかけ、ハム、ソーセージ、キャンディーなどの固形形状食品等の主食、副食、菓子類ならびに調味料に配合することも可能である。用途に応じて、粉末、顆粒、錠剤等の形に成形してもよい。また、必要に応じて、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料等と適宜混合してもよい。
【００２９】
また、ヒトの消費に供する食品以外にも、終末糖化産物生成阻害剤を飼料中に混合して、家畜、ペット等の動物に投与する場合には、予め飼料の原料中に混合して、機能性を付与した飼料として調製することができる。また、終末糖化産物生成阻害剤を飼料に添加して投与することもできる。すなわち、終末糖化産物生成阻害剤を有効成分として含む食品は、ブタ、ニワトリ、ウシ、ウマ、ヒツジ等の家畜や、魚類、ペット（イヌ、ネコ、鳥類）等の飼料に添加することにより、安全で、糖尿病及びそれに関連する疾患及び症状の治療効果及び予防効果の一方又は双方を有する機能性飼料として用いることができる。
【実施例】
【００３０】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
（１）ヒシ科植物の熱水抽出物の調製
トウビシ（Trapa  bispinosa）の果皮及び果実を乾燥（６５℃、２０時間）後にフードプロセッサーを使用して粉末化した。粉末２ｇを熱水抽出（８０℃、１時間）し、抽出液を遠心分離した上清をヒシ科植物の熱水抽出物とした。
【００３１】
（２）終末糖化産物生成阻害活性の評価
終末糖化産物生成阻害活性の評価は、ヒト血清アルブミンとグルコースを反応（６０℃、４０時間）させて生成したＡＧＥｓを蛍光法（励起波長３７０ｎｍ／検出波長４４０ｎｍ）で測定し、終末糖化産物生成阻害剤を加えた時の生成阻害率（％）を算出することにより行った。生成阻害率（％）は下式より求めた。
【００３２】
生成阻害率（％）＝１００−{（Ａ−Ａｂ）／（Ｂ−Ｂｂ）}×１００
ただし、式中のＡ、Ａｂ、Ｂ、Ｂｂは、それぞれ；
Ａ：終末糖化産物生成阻害剤を含む反応系における蛍光強度
Ａｂ：終末糖化産物生成阻害剤を含む反応系（ブランク）における蛍光強度
Ｂ：対照試料（終末糖化産物生成阻害剤を含まない）の反応系における蛍光強度
Ｂｂ：対照試料の反応系（ブランク）における蛍光強度
を表す。
【００３３】
（３）ヒシ科植物の熱水抽出物からの終末糖化産物生成阻害剤の分離
ヒシ科植物の熱水抽出物からの活性成分の分離は、下記のような要領で行った。まず、限外ろ過膜（Amicon  Ultra−0.5mL  10K、MILLIPORE  社製）を用いて、分子量１００００以上及び１００００以下の画分に分離した。ついで、疎水性カートリッジカラム（OASYS  HLB、Waters  社製）を用いて、分子量１００００以下の画分を分離した（溶離液：水−アセトニトリル（１００：ｘ（ｖ／ｖ）：０≦ｘ≦１１０））。ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを使用し、終末糖化産物生成反応阻害作用成分の分画を分離することにより行った。
【００３４】
限界ろ過膜により分離した分子量１００００以下の画分について、疎水性カートリッジカラムで分画した画分のうち、水を用いて溶離させた画分及び水−アセトニトリル  １００：３０（ｖ／ｖ）を用いて溶離させた画分が、高い生成阻害率を示すことが確認された。これらの画分について、ゲルろ過クロマトグラフィー（Superdex  Peptide  HR  10/30、ＧＥヘルスケア社製）を用いて更に精製を行い、生成阻害率の高い画分として、前者から２つ（図１中のフラクションＮｏ．２２及び２７。以下、「画分ａ」、「画分ｂ」という。）、後者から１つの画分（図２中のフラクションＮｏ．２６。以下、「画分ｃ」という。）を得た。これらの画分ａ、ｂ、ｃは、４０％以上の高い生成阻害率を示すことが確認された。
【００３５】
ゲルろ過クロマトグラフィーの溶離時間と分子量との関係について、分子量が既知の化合物を用いて作成した検量線（図３参照）に基づき、画分ａ、ｂ、ｃについて、分子量を求めたところ、それぞれ、２９０〜３８０、７０〜１００、１００〜１３０の範囲内であることが確認された。また、それぞれの吸光スペクトル測定を行ったところ、フラボノイド骨格を有する化合物に類似するスペクトルが観測された。
【図１】
2015209420.tif 000003
【図２】
2015209420.tif 000004
【図３】
2015209420.tif 000005