(57)【要約】【課題】抗ＧＣＣ抗体分子と治療剤とを含む免疫結合体を含有し、安定性に優れた、胃腸癌等の予防または治療剤として有用な製剤を提供すること。【解決手段】（ｉ）下式（Ｉ）の免疫結合体：2015209384.tif 000019（式中、Ａｂは、抗ＧＣＣ抗体分子であり、Ｘは、リンカー成分であり、Ｚは、治療剤であり、ｍは、１〜１５の整数である。）またはその薬学的に許容される塩、（ｉｉ）ポリソルベート２０、および（ｉｉｉ）ヒスチジンまたはその塩を含む製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）下式（Ｉ）の免疫結合体：
【化１】
2015209384.tif 000018
（式中、
Ａｂは、抗ＧＣＣ抗体分子であり、
Ｘは、リンカー成分であり、
Ｚは、治療剤であり、
ｍは、１〜１５の整数である。）
またはその薬学的に許容される塩、
（ｉｉ）ポリソルベート２０、および
（ｉｉｉ）ヒスチジンまたはその塩
を含む製剤。
【請求項２】
さらに糖類を含む、請求項１記載の製剤。
【請求項３】
糖類が非還元糖である、請求項２記載の製剤。
【請求項４】
糖類がスクロースである、請求項２記載の製剤。
【請求項５】
抗ＧＣＣ抗体分子が、以下のアミノ酸配列で定義される相補性決定領域を含む、請求項１記載の製剤；
軽鎖：ＣＤＲ１配列番号：１
ＣＤＲ２配列番号：２
ＣＤＲ３配列番号：３
重鎖：ＣＤＲ１配列番号：４
ＣＤＲ２配列番号：５
ＣＤＲ３配列番号：６。
【請求項６】
抗ＧＣＣ抗体分子が、配列番号：７のアミノ酸配列で定義される軽鎖可変領域および配列番号：８のアミノ酸配列で定義される重鎖可変領域を含む、請求項１記載の製剤。
【請求項７】
Ｘが、−Ａｐ−Ｗｑ−Ｙｒ−
（式中、
Ａは、ストレッチャー単位であり、
ｐは、０または１であり、
Ｗは、それぞれ独立して、アミノ酸単位であり、
ｑは、０〜１２の整数であり、
Ｙは、自壊的スペーサー単位であり、
ｒは、０〜２の整数である。）
である、請求項１記載の製剤。
【請求項８】
Ｚが、メイタンシンまたはアウリスタチンである、請求項１記載の製剤。
【請求項９】
Ｚが、モノメチルアウリスタチンＥである、請求項１記載の製剤。
【請求項１０】
ｍが、３〜５の整数である、請求項１記載の製剤。
【請求項１１】
注射用製剤である、請求項１記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＧＣＣ抗体分子と治療剤とを含む免疫結合体を含有する製剤に関する。
【０００２】
（発明の背景）
グアニリルシクラーゼＣ（本明細書中、ＧＣＣと略記することがある）は、小腸、大腸、および直腸を裏打ちする粘膜細胞で発現する、腸液の維持、電解質の恒常性、および細胞増殖において機能する膜貫通細胞表面受容体である（非特許文献１および２）。ＧＣＣの発現は、腸上皮細胞の新生物性形質転換に際して維持されることが知られている（非特許文献２〜４）。
抗ＧＣＣ抗体およびその免疫結合体としては、例えば特許文献１のものが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開２０１１/０５０２４２号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００巻：３０１８〜３０２０頁（２００３年）
【非特許文献２】Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓら、Ｄｉｓ Ｃｏｌｏｎ Ｒｅｃｔｕｍ ３９巻：１７１〜１８１頁（１９９６年）
【非特許文献３】Ｂｕｃら、Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４１巻：１６１８〜１６２７頁（２００５年）
【非特許文献４】Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０７巻：１６５３〜１６６１頁（１９９４年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、抗ＧＣＣ抗体分子と治療剤とを含む免疫結合体を含有する、安定性に優れた、胃腸癌等の予防または治療剤として有用な製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、下式（Ｉ）で示される免疫結合体を含有する製剤について鋭意検討した結果、上記免疫結合体に加えて、ポリソルベート２０およびヒスチジンまたはその塩等を添加することにより、安定性に優れた製剤が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］（ｉ）下式（Ｉ）の免疫結合体：
【０００８】
【化１】
2015209384.tif 000002
【０００９】
（式中、
Ａｂは、抗ＧＣＣ抗体分子であり、
Ｘは、リンカー成分であり、
Ｚは、治療剤であり、
ｍは、１〜１５の整数である。）
またはその薬学的に許容される塩、
（ｉｉ）ポリソルベート２０、および
（ｉｉｉ）ヒスチジンまたはその塩
を含む製剤（本明細書中、「本発明の製剤」と略記する場合がある）；
［２］さらに糖類を含む、［１］記載の製剤；
［３］糖類が非還元糖である、［２］記載の製剤；
［４］糖類がスクロースである、［２］記載の製剤；
［５］抗ＧＣＣ抗体分子が、以下のアミノ酸配列で定義される相補性決定領域を含む、［１］〜[４]のいずれかに記載の製剤；
軽鎖：ＣＤＲ１配列番号：１
ＣＤＲ２配列番号：２
ＣＤＲ３配列番号：３
重鎖：ＣＤＲ１配列番号：４
ＣＤＲ２配列番号：５
ＣＤＲ３配列番号：６
［６］抗ＧＣＣ抗体分子が、配列番号：７のアミノ酸配列で定義される軽鎖可変領域および配列番号：８のアミノ酸配列で定義される重鎖可変領域を含む、［１］〜[４]のいずれかに記載の製剤；
［７］Ｘが、−Ａｐ−Ｗｑ−Ｙｒ−
（式中、
Ａは、ストレッチャー単位であり、
ｐは、０または１であり、
Ｗは、それぞれ独立して、アミノ酸単位であり、
ｑは、０〜１２の整数であり、
Ｙは、自壊的スペーサー単位であり、
ｒは、０〜２の整数である。）
である、［１］〜[６]のいずれかに記載の製剤；
［８］Ｚが、メイタンシンまたはアウリスタチンである、［１］〜[７]のいずれかに記載の製剤；
［９］Ｚが、モノメチルアウリスタチンＥである、［１］〜[７]のいずれかに記載の製剤；
［１０］ｍが、３〜５の整数である、［１］〜[９]のいずれかに記載の製剤；
［１１］注射用製剤である、［１］〜[１０]のいずれかに記載の製剤；
等に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、上記免疫結合体を含有する安定性に優れた製剤が提供される。具体的には、前記免疫結合体に加えて、ポリソルベート２０およびヒスチジンまたはその塩等を添加することにより、免疫結合体の複合体（本明細書中、単に複合体と称することもある）の発生が抑えられるため、安定性に優れた医薬が提供される。また、本発明によれば、製剤中の免疫結合体が単量体として安定して存在するため、安定性に優れた医薬が提供される。また、本発明によれば、ストレス存在下における溶液製剤における濁りの発生が抑制された、安定性に優れた医薬が提供される。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
【００１２】
本明細書において、本発明に関連して使用される科学用語および専門用語は、他に定義されない限り、当業者によって共通して理解される意味を有する。例えば、本明細書に記載の細胞培養および組織培養；分子生物学的手法（例えば、ＤＮＡ組換え、組織培養、およびトランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション））；タンパク質、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの合成；およびハイブリダイゼーションに関連して利用される技術は、当技術分野において公知の文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００年））；Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．およびＬａｎｅ， Ｄ．（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）に記載された一般的な方法、特許文献１に記載された方法またはそれらの方法に準じた方法で行うことができる。また、酵素反応および精製技術は、自体公知の方法または製造業者の説明書に従って行うことができる。そのほか、本明細書に記載の分析化学、有機合成化学、ならびに医薬品化学および薬化学に関連して利用される命名法、検査法および技術も、当技術分野において公知である。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号またはＧｅｎＰｅｐｔ受託番号は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤによって維持されるウェブサイトで見出すことができる。
【００１３】
本明細書中、「ハロゲン」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
本明細書中、「Ｃ１〜Ｃ８アルキル」としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、および３，３−ジメチル−２−ブチルが挙げられる。
本明細書中、「Ｃ２〜Ｃ８アルケニル」としては、例えば、エテニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、および２，３−ジメチル−２−ブテニルが挙げられる。
本明細書中、「Ｃ２〜Ｃ８アルキニル」としては、例えば、プロパルギル、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、および３−メチル−１ブチニルが挙げられる。
【００１４】
本明細書中、「アリーレン」とは、Ｃ６〜Ｃ１４アリーレンを示す。Ｃ６〜Ｃ１４アリーレンの例としては、フェニレン、ナフチレン、アントリレンが挙げられる。アリーレンが例えばフェニレンである場合、以下の構造において示されるようにオルト、メタ、またはパラ配置をとり得る。
【００１５】
【化２】
2015209384.tif 000003
【００１６】
本明細書中、「Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン」としては、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニレン、デカレン、１，４−シクロヘキシレンが挙げられる。
【００１７】
本発明で用いられる免疫結合体について、以下に詳述する。
Ａｂで表される抗ＧＣＣ抗体分子とは、特許文献１に記載の抗ＧＣＣ抗体分子を示す。本明細書における抗ＧＣＣ抗体分子としては、モノクローナル抗体が好ましい。また別の観点では、本明細書における抗ＧＣＣ抗体分子としては、完全ヒト抗体分子が好ましい。さらに別の観点では、本明細書における抗ＧＣＣ抗体分子としては、ＩｇＧが好ましく、なかでもＩｇＧ１が好ましい。
【００１８】
抗ＧＣＣ抗体分子としては、以下のアミノ酸配列で定義される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗ＧＣＣ抗体分子または当該抗ＧＣＣ抗体分子を参照抗体分子とした誘導抗体分子（特に、以下のＣＤＲを含む抗ＧＣＣ抗体分子）が好ましい。
軽鎖：ＣＤＲ１配列番号：１
ＣＤＲ２配列番号：２
ＣＤＲ３配列番号：３
重鎖：ＣＤＲ１配列番号：４
ＣＤＲ２配列番号：５
ＣＤＲ３配列番号：６
【００１９】
抗ＧＣＣ抗体分子としては、以下のアミノ酸配列で定義される可変領域を含む、抗ＧＣＣ抗体分子または当該抗ＧＣＣ抗体分子を参照抗体分子とした誘導抗体分子（特に、以下の可変領域を含む抗ＧＣＣ抗体分子）がより好ましい。
軽鎖：可変領域  配列番号：７
重鎖：可変領域  配列番号：８
【００２０】
本明細書における抗ＧＣＣ抗体分子としては、以下のアミノ酸配列で定義される軽鎖および重鎖を含む、抗ＧＣＣ抗体分子または当該抗ＧＣＣ抗体分子を参照抗体分子とした誘導抗体分子がさらに好ましく、とりわけ以下に定義される軽鎖および重鎖を含む、抗ＧＣＣ抗体分子が好ましい。
軽鎖：配列番号：９
重鎖：配列番号：１０
【００２１】
本明細書における抗ＧＣＣ抗体分子としては、抗体５Ｆ９（本明細書中、５Ｆ９または５Ｆ９ ｍＡｂと称する場合がある）が特に好ましい。
抗体５Ｆ９は、ハイブリドーマ４６．５Ｆ９．８．２とも呼ばれるハイブリドーマ５Ｆ９によって産生することができ、これは、受託番号ＰＴＡ−８１３２の下で、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０、Ｕ．Ｓ．Ａ．に、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、４０ Ｌａｎｄｓｄｏｗｎｅ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、０２１３９、ＵＳＡを代表して２００７年１月１０日に寄託された（その寄託は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅに従って成され、その要求を満たすものである）。
【００２２】
本明細書中、誘導抗体分子とは、参照抗体分子の機能（例えば、ＧＣＣ（例えば、ヒトＧＣＣ）と相互作用する機能、またはそれを認識する（例えば、ＧＣＣ（例えば、ヒトＧＣＣ）と特異的に結合する）機能）に実質的な影響を及ぼさない範囲で当該参照抗体分子のアミノ酸配列が保存的アミノ酸置換または非必須アミノ酸置換されたアミノ酸配列を有する抗体分子を示す。
特定の保存的アミノ酸置換または非必須アミノ酸置換が許容されるかどうかは、例えば、Ｂｏｗｉｅ， ＪＵら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７巻：１３０６〜１３１０頁（１９９０年）やＰａｄｌａｎら ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９巻：１３３〜１３９頁（１９９５年）に記載された方法で決定することができる。
本明細書中、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、当該アミノ酸残基に類似する側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられることをいう。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において一般的に知られている。上記ファミリーとしては、例えば、塩基性側鎖ファミリー（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖ファミリー（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖ファミリー（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖ファミリー（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖ファミリー（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖ファミリー（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
本明細書中、「非必須アミノ酸置換」とは、生物学的活性の消失を伴わないまたは生物学的活性の実質的な変化を伴わない、アミノ酸残基の置換をいう。
【００２３】
Ｘで示される「リンカー成分」とは、特許文献１に記載のリンカー成分を示す。
リンカー成分の例としては、−Ａｐ−Ｗｑ−Ｙｒ−
（式中、Ａは、ストレッチャー単位であり、
ｐは、０または１であり、
Ｗは、それぞれ独立して、アミノ酸単位であり、
ｑは、０〜１２の整数であり、
Ｙは、自壊的スペーサー単位であり、
ｒは、０〜２の整数である。）
が挙げられる。
【００２４】
Ａで示される「ストレッチャー単位」とは、特許文献１に記載のストレッチャー単位を示す。
「ストレッチャー単位」としては、例えば、下式（ＩＩａ）：
【００２５】
【化３】
2015209384.tif 000004
【００２６】
（式中、ＲＩＩａは、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２−、−アリーレン−または−アリーレン−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−を示す。）、
下式（ＩＩｂ）：
【００２７】
【化４】
2015209384.tif 000005
【００２８】
（式中、ＲＩＩｂは、−（ＣＨ２）５−を示す。）、または
下式（ＩＩｃ）：
【００２９】
【化５】
2015209384.tif 000006
【００３０】
（式中、ＲＩＩｃは、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２−、−アリーレン−または−アリーレン−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−を示す。）
中の角括弧内に表される構造が挙げられる。
【００３１】
ただし、本明細書中、下式中のＳ成分は、文脈によって他に示されない限り、Ａｂ単位（すなわち、抗ＧＣＣ抗体）中の硫黄原子を示す。
【００３２】
【化６】
2015209384.tif 000007
【００３３】
「ストレッチャー単位」としては、上式（ＩＩａ）中の角括弧内に表される構造（式中、ＲＩＩａは、−（ＣＨ２）５−を示す。）が好ましい。
【００３４】
ｐは、好ましくは１である。
【００３５】
Ｗで示される「アミノ酸単位」とは、特許文献１に記載のアミノ酸単位を示す。
ｑは、好ましくは０〜５の整数であり、より好ましくは２である。
−Ｗｑ−としては、例えば、バリン−シトルリン、フェニルアラニン−リシン、Ｎ−メチルバリン−シトルリン、５−アミノ吉草酸、ホモフェニルアラニンリシン、テトライソキノリンカルボキシレートリシン、シクロヘキシルアラニンリシン、イソニペコチン酸（ｉｓｏｎｅｐｅｃｏｔｉｃ ａｃｉｄ）リシン、ベータ−アラニンリシン、グリシンセリンバリングルタミン、およびイソニペコチン酸が挙げられる。
−Ｗｑ−としては、バリン−シトルリンが好ましい。
【００３６】
Ｙで示される「自壊的スペーサー単位」とは、特許文献１に記載の自壊的スペーサー単位を示す。
【００３７】
「自壊的スペーサー単位」としては、例えば
(１)フェニレン部分が−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、−Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ８アルキニル）、−ハロゲン、−ニトロ、および−シアノから選択される１ないし３個の置換基で置換されていてもよいｐ−アミノベンジルアルコール、および
（２）フェニレン部分が−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、−Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ８アルケニル）、−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ８アルキニル）、−ハロゲン、−ニトロ、および−シアノから選択される１ないし３個の置換基で置換されていてもよいｐ−アミノベンゼン、が挙げられる。
「自壊的スペーサー単位」としては、ｐ−アミノベンジルアルコールが好ましい。
【００３８】
ｒとしては、１または２が好ましく、１がより好ましい。
【００３９】
リンカー成分の具体例としては、マレイミドカプロイル（ｍｃ）；マレイミドカプロイル−ｐ−アミノベンジルカルバメート；マレイミドカプロイル−ペプチド−アミノベンジルカルバメート（例えば、マレイミドカプロイル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−リシン−ｐ−アミノベンジルカルバメートおよびマレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメート（ｖｃ））；Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート；４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−２−メチル−２−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）；Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）；２−イミノチオラン；Ｓ−アセチルコハク酸無水物；ジスルフィドベンジルカルバメート；カルボネート；ヒドラゾンリンカー；Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル；Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＭＡＳ）；Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）；［Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）；Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）；スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］（ＬＣ−ＳＭＣＣ）；スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）；スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド（ＳＰＤＰ）；［Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＥＭＣＳ）；Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）；４−スルホスクシンイミジル−６−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート）（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；スルホスクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）；スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）；スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）；エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＥＧＳ）；酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４���７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）；ジエチレントリアミン−五酢酸（ＤＴＰＡ）；およびチオ尿素リンカーが挙げられる。
リンカー成分としては、マレイミドカプロイル−ペプチド−アミノベンジルカルバメートが好ましく、マレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメート（本明細書中、ｖｃと称することがある）がより好ましい。
【００４０】
Ｚで示される「治療剤」とは、特許文献１に記載の治療剤を示す。
「治療剤」の例としては、抗癌剤または化学療法剤（例えば、ヒトにおける新生物（特に、癌腫、肉腫、リンパ腫、または白血病などの病変）の発症または進行を阻害する作用物質；新生物の転移または新脈管形成の阻害する作用物質；細胞傷害剤；細胞増殖抑制剤（細胞成長および／または細胞の増殖を阻害または抑制する作用物質））が挙げられる。
細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤の例としては、代謝拮抗薬（例えば、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）、シトシンアラビノシド（シタラビン）、メトトレキセート、トリメトプリム、ピリメタミン、ペメトレキセド）；アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、ウラムスチン、メルファラン、クロラムブシル、チオテパ／クロラムブシル、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、ジブロモマンニトール、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、トリプラチンテトラニトレート、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド）；アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン）；抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン、ストレプトゾトシン、グラミシジンＤ、マイトマイシン類（例えば、マイトマイシンＣ）、デュオカルマイシン類（例えば、ＣＣ−１０６５）、カリケアマイシン類）；有糸分裂阻害剤（メイタンシノイド類（例えば、メイタンシン）、アウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥ、アウリスタチンフェニルアラニンフェニレンジアミン（ＡＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ、およびモノメチルアウリスタチンＦ）、ドラスタチン類、クリプトフィシン類、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、タキサン類（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、または新規なタキサン（例えば、国際特許出願公開ＷＯ０１／３８３１８を参照）、およびコルヒチン類；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、テニポシド、ミザントロン）；およびプロテアソーム阻害剤（例えば、ペプチジルボロン酸）；またはそれらの薬学的に許容される塩（具体的には、ヒスチジンの塩の具体例として後に挙げられる塩と同種の塩）である。
治療剤としては、有糸分裂阻害剤が好ましく；メイタンシノイド類またはアウリスタチンがより好ましく；メイタンシンまたはアウリスタチン（特に、モノメチルアウリスタチンＥ）がさらに好まく；モノメチルアウリスタチンＥ（本明細書中、ＭＭＡＥと称することがある）がさらにより好ましい。
【００４１】
ｍとしては、１〜１０の整数が好ましく、１〜６の整数がより好ましく、３〜５の整数がさらにより好ましい。
【００４２】
本明細書において、「免疫結合体」とは、非抗体成分（例えば、治療剤）と結合体化されている抗体分子（例えば、抗ＧＣＣ抗体分子）を示す。
本明細書中、免疫結合体とは、特許文献１に記載の免疫結合体を示す。
【００４３】
本発明における免疫結合体としては、下式（Ｉ−５）
【化７】
2015209384.tif 000008
【００４４】
（式中、Ａｂは、抗ＧＣＣ抗体分子を示し、ｍは、１〜１５の整数を示す。）
で表される免疫結合体が好ましい。
本発明における免疫結合体としては、上式（Ｉ−５）における抗ＧＣＣ抗体分子が５Ｆ９であり、かつ、ｍが３〜５の整数である免疫結合体がさらにより好ましい。
【００４５】
本発明の免疫結合体において、Ａｂ、ＸおよびＺ間の結合形成は、自体公知の方法、公知文献（例えば、Ｄｏｒｏｎｉｎａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ２１巻：７７８〜７８４頁（２００３年）；Ｈａｍｂｌｅｔｔら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １０巻：７０６３〜７０７０頁（２００４年）；ＣａｒｔｅｒおよびＳｅｎｔｅｒ、Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．， １４ １５４〜１６９頁（２００８年）；米国特許第７，４９８，２９８号、第７，０９１，１８６号、第６，８８４，８６９号；第６，３２３，３１５号；第６，２３９，１０４号；第６，０３４，０６５号；第５，７８０，５８８号；第５，６６５，８６０号；第５，６６３，１４９号；第５，６３５，４８３号；第５，５９９，９０２号；第５，５５４，７２５号；第５，５３０，０９７号；第５，５２１，２８４号；第５，５０４，１９１号；第５，４１０，０２４号；第５，１３８，０３６号；第５，０７６，９７３号；第４，９８６，９８８号；第４，９７８，７４４号；第４，８７９，２７８号；第４，８１６，４４４号；および第４，４８６，４１４号；米国特許出願公開第２００９００１０９４５号、第２００６００７４００８号、第２００８０３００１９２号、第２００５０００９７５１号、第２００５０２３８６４９号、および第２００３００８３２３６号；ならびに国際特許出願公開第ＷＯ０４／０１０９５７、ＷＯ０２／０８８１７２およびＷＯ２０１１／０５３６８６）において記載された方法、およびそれらに準じた方法により行うことができる。
免疫結合体は、薬学的に許容される塩であってもよい。このような塩としては、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩が挙げられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩が挙げられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。
無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。
有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
【００４６】
本発明の製剤中の免疫結合体またはその塩の含有量は、製剤全量に対して、好ましくは０．１〜２０重量％であり、より好ましくは０．８〜６重量％であり、さらに好ましくは１．５〜３．０重量％であり、さらにより好ましくは２．５重量％である。
本発明の製剤が液状製剤である場合、当該液状製剤中の免疫結合体またはその塩の濃度は、好ましくは１〜２００ｍｇ/ｍｌであり、より好ましくは８〜６０ｍｇ/ｍｌであり、さらに好ましくは１５〜３０ｍｇ/ｍｌであり、さらにより好ましくは２５ｍｇ/ｍｌである。
【００４７】
本発明の製剤は、（ｉｉ）ポリソルベート２０を含む。これにより、製剤中での免疫結合体の安定性を向上させる（免疫結合体の複合体形成を抑制する、メカニカルストレス下での濁度の増加を抑制する等）ことができる。また、ポリソルベート２０の代わりにポリソルベート４０またはポリソルベート６０を用いることもできる。
本発明の製剤としては、免疫結合体のストレス（例：メカニカルストレス）に対する安定性が増すため、製剤全量に対して０．０３重量％以上のポリソルベート２０を含む製剤が好ましい。
本発明の製剤中のポリソルベート２０の含有量は、製剤全量に対して、好ましくは０．０３〜１重量％であり、より好ましくは０．０４〜０．５重量％であり、さらに好ましくは０．０６〜０．１重量％であり、さらにより好ましくは０．０８重量％である。
【００４８】
本発明の製剤は、（ｉｉｉ）ヒスチジンまたはその塩を含む。これにより、製剤中での免疫結合体の安定性を向上させることができる。また、ヒスチジンまたはその塩の代わりにリン酸またはその塩を用いることもできる。
ヒスチジンの塩としては、薬学的に許容される塩が好ましく、このような塩としては、例えば、前記免疫結合体が取りうる塩のうち、無機塩基との塩、有機塩基との塩が挙げられる。ヒスチジンの塩としては、塩酸塩が好ましい。
本発明の製剤中のヒスチジンまたはその塩の含有量は、製剤全量に対して、好ましくは０．１〜３重量％であり、より好ましくは０．１〜０．７５重量％であり、さらに好ましくは０．１〜０．２重量％であり、さらにより好ましくは０．１３重量％である。
本発明の製剤が液状製剤である場合、当該液状製剤中のヒスチジンまたはその塩の濃度は、好ましくは５〜２００ｍＭであり、より好ましくは５〜５０ｍＭであり、さらに好ましくは５〜１５ｍＭであり、さらにより好ましくは１０ｍＭである。ここで、ヒスチジンまたはその塩は、ヒスチジンとヒスチジン塩酸塩とを含有する緩衝液として用いることが好ましい。
【００４９】
本発明の製剤は、さらに糖類を含んでいてもよい。糖類の例としては、還元糖（例えば、グルコース、フルクトース、マルトース、ラクトース、アラビノース、マンニトール）、および非還元糖（例えば、トレハロース、スクロース）が挙げられる。糖類を含むことにより、製剤中での式（Ｉ）の免疫結合体の安定性をさらに向上させる（免疫結合体の複合体形成を抑制する等）ことができる。糖類は、好ましくは、非還元糖であり、より好ましくは、スクロース、トレハロースであり、さらに好ましくは、スクロースである。
本発明の製剤中の糖類の含有量は、製剤全量に対して、好ましくは１〜２０重量％であり、より好ましくは３〜１５重量％であり、さらに好ましくは５〜１０重量％であり、さらにより好ましくは７．５重量％である。
【００５０】
本発明の製剤は、さらに薬学的に許容される添加剤を含んでいてもよい。
薬学的に許容される添加剤としては、担体、賦形剤、緩衝剤、等張化剤、分散媒、分散保護剤、非イオン性界面活性剤、表面活性剤、保存剤、吸収遅延剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。
【００５１】
本発明の製剤の剤形としては、例えば、液状製剤（例えば、溶液製剤、分散製剤または懸濁製剤、リポソーム製剤、および凍結乾燥製剤を再溶解した製剤）、半固体製剤（例えば、濃厚な水性注射剤）および固体製剤（例えば、凍結製剤、凍結乾燥製剤）が挙げられる。
本発明の製剤としては、安定性等の観点（例えば、製剤成分（例：免疫結合体）の分解抑制や副生成物（例：免疫結合体の複合体）の発生を抑制）から、溶液製剤、凍結製剤、凍結乾燥製剤、凍結乾燥製剤を再溶解した溶液製剤が好ましく、凍結乾燥製剤が特に好ましい。
【００５２】
本発明の製剤は、免疫結合体またはその薬学的に許容される塩、ポリソルベート２０およびヒスチジンまたはその塩を用いて、製剤技術分野で慣用の方法により、製造することができる。
本発明の製剤が液状製剤である場合、例えば、免疫結合体、ポリソルベート２０およびヒスチジンまたはその塩を自体公知の方法に従って注射用蒸留水に溶解することにより本発明の製剤を製造することができる。
本発明の製剤が凍結製剤である場合、例えば、上記液状製剤を自体公知の方法に従って凍結することにより本発明の製剤を製造することができる。
本発明の製剤が凍結乾燥製剤である場合、例えば、上記液状製剤を凍結乾燥に付すことにより本発明の製剤を製造することができる。「凍結乾燥」は、自体公知の方法に従って行えばよく、例えば−２５℃以下の温度で凍結後、乾燥庫内真空度を約１３.３Ｐａ以下に保ちながら、乾燥庫内の温度を−２５℃ないし４０℃に到達するまで昇温させる方法を用いることができる。
本発明の製剤が凍結乾燥製剤である場合、安定化等のために糖類（例えば、非還元糖（特に、スクロース））を含有していることが好ましい。
本発明の製剤が凍結乾燥製剤を再溶解した製剤である場合、例えば、上記凍結乾燥製剤を輸液または溶媒に再溶解することで本発明の製剤を製造することができる。
「輸液」としては、電解質液、栄養輸液などが挙げられる。
「溶媒」としては、例えば、注射用水（注射用蒸留水）、蛋白アミノ酸注射液、ビタミン注射液、電解液や栄養輸液（糖液など）を組み合わせた代用血液、脂肪を乳化した脂肪乳剤、またはこれら二種以上の混合溶媒が挙げられる。溶媒には、必要に応じ、ｐＨ調整剤（例えば、酸性物質、弱アルカリ性物質）などを加えてもよい。
前記「電解質液」は、電解質を注射用水に溶解した液であり、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、炭酸マグネシウムなどの一種または二種以上を含む溶液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液が挙げられる。好ましい電解質液は塩化ナトリウムを含む溶液であり、特に好ましくは生理食塩液〔０.９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム溶液〕である。
前記「糖液」は、糖類を注射用水に溶解した液であり、例えば、グルコース、果糖、ソルビトール、マンニトール、デキストランなどの一種または二種以上を含む溶液などが挙げられる。好ましい糖液は、５〜７０％（ｗ／ｖ）のグルコース溶液、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）グルコース溶液および１０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液などである。
前記「蛋白アミノ酸注射液」は、アミノ酸を注射用水に溶解した液であり、例えば、グリシン、アスパラギン酸、リジン等などの一種または二種以上を含む溶液が挙げられる。
前記「ビタミン注射液」は、ビタミン類を注射用水に溶解した液であり、例えば、ビタミンＢ１、ビタミンＣなどの一種または二種以上を含む溶液が挙げられる。
再溶解に用いる輸液または溶媒としては、注射用水、生理食塩液、またはグルコース溶液（例えば、５％（ｗ／ｖ）グルコース溶液）が好ましい。
１回の投薬に使用する前記「輸液」あるいは「溶媒」の使用量は、例えば５〜１０００ｍｌ、好ましくは５〜５００ｍｌである。
【００５３】
本発明の製剤は、製剤成分（例：免疫結合体）の分解抑制や反応副生成物（例：免疫結合体の複合体）の発生を抑制等するため、ｐＨが調整されてもよい。本発明の製剤としては、当該製剤中における免疫結合体の安定性の観点から、ｐＨ４．５〜７.０が好ましく、ｐＨ４．７〜６.０がより好ましく、ｐＨ４．９〜５.５がさらに好ましく、ｐＨ５．２がさらにより好ましい。
【００５４】
本発明の製剤は医薬として優れた効果を有しており、特にＧＣＣに媒介される細胞シグナル伝達を阻害する活性に優れている。本発明の製剤は毒性が低く、副作用も少ないので、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、マウス、ラット、特にヒト）に対する、例えば癌の治療および予防剤として有用である。
本発明の製剤が効果を示す癌としては、ＧＣＣを発現している癌（例えば、胃腸癌（例えば、（１）結腸直腸癌（例えば、結腸直腸腺癌、結腸直腸平滑筋肉腫、結腸直腸リンパ腫、結腸直腸黒色腫、または結腸直腸神経内分泌腫瘍）、（２）胃癌（例えば、胃腺癌、胃リンパ腫、または胃肉腫）、（３）食道癌（例えば、食道扁平上皮細胞癌または食道腺癌））が挙げられる。
なお、本明細書において、効果を示すとは、例えば、被験者における癌細胞の成長および／または転移を遅らせる、中断する、阻止する、または停止させることを指し、腫瘍成長の完全な排除を必ずしも示すものではない。
【００５５】
本発明の製剤は経口的にまたは非経口的に安全に投与されうるが、非経口的に投与されることが好ましい。非経口的な投与の例としては、静脈内投与、皮下投与、腹腔投与、筋肉投与、または静脈投与が挙げられ、なかでも静脈投与が好ましい。
本発明の製剤は、好ましくは注射用製剤である。
本発明の製剤の投与量は、投与対象、その投与回数などにより変化するが、広範囲にわたって有効性を発揮する。例えば、成人の固形腫瘍患者（例えば、胃腸癌患者）に対して、本発明の製剤の一日当たりの投与量は、本発明の製剤に含有される免疫結合体またはその塩の量として、通常、０．０５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．４〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。本発明の製剤が他の抗癌剤と併用される場合、その投与量は、一般に前記投与量より少ない投与量になる。しかし、実際に投与される製剤の量は、各種製剤形態、患者の年齢、体重、性別、疾患の程度、投与経路、その投与を実施する期間および間隔などの状況によって決定されるものであり、医師の判断によって随時変更が可能である。
本発明の製剤は１日１回、または１日２〜３回に分けて投与され得る。もちろん、本発明の製剤の投与期間および間隔は、種々の状況に応じて変更されるものであり、医師の判断により随時判断されるものである。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明について、実施例を挙げて更に詳細に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例および比較例において、製剤添加剤としては、日本薬局方第１６改正あるいは医薬品添加物規格２００３適合品を用いた。
【００５７】
参考例１
免疫結合体Ａ（５Ｆ９ ｖｃＭＭＡＥ）の調製
ｖｃとＭＭＡＥ（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）との結合体化、ならびに上記結合体化により生成されるｖｃＭＭＡＥと抗体５Ｆ９との結合体化は、自体公知の方法（例えば、ＵＳ２００６／００７４００８を参照されたい）またはそれに準じた方法で行った。本明細書では、ｖｃＭＭＡＥと抗体５Ｆ９との結合体化により生じる免疫結合体を免疫結合体Ａまたは５Ｆ９ ｖｃＭＭＡＥと称することもある。
【００５８】
まず、ｐＨ５．８の１００ｍＭの酢酸塩中の１７．８ｍｇ／ｍＬの５Ｆ９ ｍＡｂ溶液を、０．３Ｍのリン酸二ナトリウムを用いてｐＨ８に調整し、最終の５Ｆ９ ｍＡｂ濃度１１．３ｍｇ／ｍｌを得た。次いで、最終濃度を１ｍＭにするために反応混合物にＤＴＰＡを加えた。次いで５Ｆ９ ｍＡｂを、２．２８モル当量のトリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン（５Ｆ９ ｍＡｂのモルに対して）を加えることによって部分的に還元し、次いで３７℃で１．５時間撹拌した。次いで、部分的に還元された５Ｆ９ ｍＡｂ溶液を４℃まで冷却し、４．４モル当量のｖｃＭＭＡＥ（抗体のモルに対して）をＤＭＳＯ中２０．３ｍＭ溶液として加えた。混合物を２２℃で３０分間攪拌し、次いで５モル当量のＮ−アセチルシステイン（ｖｃＭＭＡＥのモルに対して）を加えた後さらに１５分間撹拌した。過剰なクエンチされたｖｃＭＭＡＥおよびその他の反応構成成分を、１０ダイアフィルトレーション容積のＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いる免疫結合体の限外濾過／ダイアフィルタレーションによって除去し、免疫結合体Ａを製造した。
免疫結合体Ａは下式（ＩＩＩ）
【００５９】
【化８】
2015209384.tif 000009
【００６０】
（式中、Ａｂは５Ｆ９ ｍＡｂを示し、ｍは１〜８を示す。）
で示される。
免疫結合体を上記製造方法に基づいて製造することにより、例えば平均薬物の負荷量（ｍ）が約３．６である免疫結合体を製造することができた。
【００６１】
実施例１
８ｍｇ／ｍＬ免疫結合体Ａを含む３０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン塩酸塩溶液（ｐＨ  ６）を用意した。その溶液を０．３ｍＬずつガラスバイアル（大和特殊硝子株式会社製）に分注し、小分けサンプルを作成した。
上記小分けサンプルに対し、最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）となるように１０％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を加え、ポリソルベート２０添加サンプルを作成した。
【００６２】
比較例１
８ｍｇ／ｍＬ免疫結合体Ａを含む３０ｍＭクエン酸／クエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ  ７）を用意した。その溶液を０．３ｍＬずつガラスバイアル（大和特殊硝子株式会社製）に分注し、小分けサンプルを作成した。
上記小分けサンプルに対し、最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）となるように１０％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を加え、ポリソルベート２０添加サンプルを作成した。
【００６３】
試験例１
比較例１および実施例１に記載の各サンプルを４０℃で１０日保存した後、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ社製）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供し、サンプル中に含まれる単量体の割合（ＳＥＣ  ％単量体）を測定した。上記測定の結果を表１に記す。
【００６４】
【表１】
2015209384.tif 000010
【００６５】
表１より、ヒスチジン緩衝剤（ヒスチジン／ヒスチジン塩酸塩溶液）を処方することにより、免疫結合体Ａの安定性が向上することが分かった。
また、ヒスチジン緩衝剤による免疫結合体Ａの安定性向上効果は、ポリソルベート２０存在下でも認められることが分かった。
【００６６】
比較例２
８ｍｇ／ｍＬ免疫結合体Ａを含む、３０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン塩酸塩溶液（ｐＨ  ６）を用意した。その溶液を０．３ｍＬずつガラスバイアル（大和特殊硝子株式会社製）に分注し、小分けサンプルを作成した。
【００６７】
実施例２
比較例２に記載の小分けサンプルに、最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）となるように１０％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を加え、ポリソルベート２０添加サンプルを作成した。
【００６８】
比較例３
比較例２に記載の小分けサンプルに、最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）となるように１０％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を加え、ポリソルベート８０添加サンプルを作成した。
【００６９】
試験例２
比較例２〜３および実施例２に記載の各サンプルを４０℃で１０日保存した後、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ社製）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供し、サンプル中に含まれる複合体の割合（ＳＥＣ  ％複合体）を測定した。上記測定の結果を表２に記す。
【００７０】
【表２】
2015209384.tif 000011
【００７１】
表２より、ポリソルベート２０を添加することにより、免疫結合体Ａの複合体形成が抑制されることが分かった。一方、ポリソルベート８０を添加した場合には、免疫結合体Ａの複合体形成は抑制されなかった。
【００７２】
実施例３
２５ｍｇ／ｍＬ免疫結合体Ａおよび７．５％スクロースを含む、１０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン塩酸塩溶液（ｐＨ  ５）を用意した。その溶液を０．６ｍＬずつ３．５ｍＬガラスバイアル（大和特殊硝子株式会社製）に分注し、小分けサンプルを作成した。
上記小分けサンプルに、最終濃度が０．０８％（ｗ／ｖ）となるように１０％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を加えた。
【００７３】
試験例３
スターラーチップを実施例４に記載の小分けサンプルに投入し、８００ｒｐｍで４０分攪拌した。濁度計（ＴＮ−１００、ＥＵＴＥＣＨ社製）にて各サンプルの濁度を測定した。上記測定の結果を表３に記す。
【００７４】
【表３】
2015209384.tif 000012
【００７５】
表３より、ポリソルベート２０を添加することにより、メカニカルストレスに対する免疫結合体Ａの安定性が向上することが確認された。
【００７６】
２５．０  ｍｇ／ｍＬ  免疫結合体Ａ、７．５％スクロースおよび０．０８％ポリソルベート２０を含む１０ｍＭヒスチジン／ヒスチジン塩酸塩溶液（ｐＨ５．２）を試験サンプルとして用意し、以下の試験例４〜８で使用した。試験例４〜８においては、長期保存条件（−６０℃以下（本明細書中、「＜−６０℃」と示す場合がある））下で保存した試験サンプル、またはストレス条件（温度：４０℃±２℃かつ相対湿度（ＲＨ）：７５％±５％）下で保存した試験サンプルの安定性について検討を行った。
【００７７】
試験例４
長期保存条件またはストレス条件下で保存した試験サンプル（７５μｇ）を、リン酸−塩化ナトリウム緩衝系（ｐＨ  ６．８）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析（具体的には、シリカベースの多孔性ビーズカラム（タンデム式カラム）を用いた分析）に供した。上記分析においては、波長２８０ｎｍの吸光度をモニターし、上記吸光度から、試験サンプルに含まれる単量体および複合体の割合を算出した。上記分析結果を表４に記す。
【００７８】
【表４】
2015209384.tif 000013
【００７９】
試験例５
長期保存条件またはストレス条件下で保存した試験サンプルを、純水および両性電解質溶液で希釈したあと、画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）で分析した。上記電気泳動の安定性の確認は、コントロールとしてヘモグロビンを用いることにより行った。また、上記分析で得られたｉｃＩＥＦプロファイルの各ピークのｐＩは、低および高ｐＩマーカー（具体的には、それぞれ８．１８および１０．１０）で補正することにより算出した。各ピークの割合は、ピーク下面積から算出した。試験サンプルから検出された主要なアイソフォームのｐＩ、主要アイソフォームが当該試験サンプルに占める割合、酸性ピークおよび塩基性ピークが占める割合を表５および６に記す。
【００８０】
【表５】
2015209384.tif 000014
【００８１】
【表６】
2015209384.tif 000015
【００８２】
試験例６
長期保存条件またはストレス条件下で保存した試験サンプルを、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて分析し、薬物負荷分布、抗体と複合体を形成している治療剤の平均モル比（ＤＡＲ）およびＡＤＣ非複合体化（遊離）抗体の量を決定した。具体的には、保存後の試験サンプルを、まず希釈緩衝液、次いでリン酸、硫酸アンモニウム緩衝液で希釈したあと、ブチルベースの非多孔性ビーズカラムを用いたＨＩＣ分析に供した。上記分析においては、波長２８０ｎｍの吸光度をモニターし、得られたプロファイルの曲線下面積に基づいて試験サンプル中に占める各分子種の割合を算出した。なお、本分析において、治療剤と抗体分子が結合した免疫結合体は、治療剤が結合していない抗体分子に比してより遅い保持時間で溶出した。免疫結合体に含まれる治療剤の平均モル比を表７に記す。
【００８３】
【表７】
2015209384.tif 000016
【００８４】
試験例７
長期保存条件またはストレス条件下で保存した試験サンプルのＧＣＣ結合活性を、ＥＬＩＳＡによって測定した。具体的には、ＣＨＯ細胞上澄みから精製したＧＣＣ融合タンパク質（グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）抗原）を被覆した９６ウェルプレートをブロッキングしたあと、試験サンプルの希釈シリーズを添加した。上記添加の後、プレートを洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を共有結合したヤギ抗ヒト抗体を添加した。上記添加した後、プレートを洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加して発色させた。上記発色の信号レベルは、結合したＡＤＣ分子の数に直接比例した。参照基準および保存後の試験サンプルのサンプル希釈の濃度を、測定した信号強度に対してプロットした後、４パラメーター曲線に適合させることにより結合定数を算出することが可能である。長期保存条件またはストレス条件下で保存した試験サンプルの結合定数ＥＣ５０値を参照基準の百分率として表８に記す。
【００８５】
試験例８
長期保存条件またはストレス条件下で保存した試験サンプルが有する細胞増殖阻害活性を、標的抗原を発現する細胞（具体的には、ＧＣＣを発現するＨＥＫ２９３細胞）を用いて測定した。ＨＥＫ２９３細胞（親およびＧＣＣ形質転換体）は液体窒素中に保存し、各アッセイでの使用ごとに溶解して使用した。成長培地中に希釈した上記細胞を９６ウェルプレートに播種した後、参照基準サンプルおよび試験サンプルを９６ウェルプレートに添加し、３７℃、７０±２時間インキュベートした。上記インキュベーション後、各ウェルに生存細胞のインジケーター（具体的には、アラマーブルー）を添加した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を蛍光プレートリーダー上で測定した。参照基準およびサンプル希釈の濃度を、測定した相対信号強度に対してプロットした後、４パラメーター曲線に適合させることにより細胞増殖阻害活性を算出することが可能である。長期保存条件またはストレス条件下で保存した試験サンプルの細胞増殖阻害活性（ＩＣ５０）を参照基準の百分率として表８に記す。
【００８６】
【表８】
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【００８７】
長期保存条件下で保存した試験サンプルについては、２か月保存した場合であっても、試験例４〜８で検討した各特性に有意な変化は認められなかった。
ストレス条件下で保存した試験サンプルについても、１ヶ月または２か月保存した後のサンプルにおいて、試験例７および８における結合活性や細胞毒性活性に大きな変化は認められなかった。このことから、各試験に供した製剤が高度に安定であったことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明の製剤は、抗ＧＣＣ抗体分子と治療剤とを含む免疫結合体を含有し、胃腸癌等の予防または治療剤として有用である。
【配列表】
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