(57)【要約】【課題】疼痛誘発に関与する新規遺伝子、それをコードするタンパク質等を提供する。【解決手段】四肢大関節痛を有する患者家系の連鎖解析及び全ゲノムエクソーム解析を行い、当該家系においてPSAPL1遺伝子にミスセンス変異が生じることを見出した。さらに、その転写産物から、疼痛誘発タンパク質としてPaintamideを単離した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列（496位のアラニンへの置換を除く）を有し、かつ、疼痛誘発作用を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列の相補鎖配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ、かつ、疼痛誘発作用を有するタンパク質
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の、他の哺乳動物におけるオルソログであって、該アミノ酸配列の496位に対応するアミノ酸残基がアラニン以外のアミノ酸であり、かつ疼痛誘発作用を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
宿主細胞が哺乳動物細胞であり、内因性PSAPL1をコードする核酸が請求項２に記載の核酸で置換された、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
請求項４に記載の宿主細胞を培養し、該培養物から請求項１に記載のタンパク質を回収することを含む、該タンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項２に記載の核酸を外因的に発現し、疼痛の表現型を示すトランスジェニック非ヒト哺乳動物又はその生体の一部。
【請求項８】
非ヒト哺乳動物の内因性PSAPL1をコードする核酸が請求項２に記載の核酸で置換された、請求項７に記載の動物又はその生体の一部。
【請求項９】
請求項１に記載のタンパク質又は請求項２に記載の核酸の投与により、疼痛の表現型を示す非ヒト哺乳動物又はその生体の一部。
【請求項１０】
非ヒト哺乳動物が、マウス又はラットである、請求項７−９のいずれか１項に記載の動物又はその生体の一部。
【請求項１１】
請求項５に記載の細胞、あるいは請求項７−１０のいずれか１項に記載の動物又はその生体の一部に被検物質を接触させ、疼痛の表現型を改善した被検物質を選択することを特徴とする、疼痛を抑制する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
疼痛を抑制する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項５に記載の細胞あるいは請求項７−１０のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物又はその生体の一部に、被験物質を接触させる工程、
（ｂ）被検物質を接触させた場合と、させない場合とのそれぞれにおいて、請求項１に記載のタンパク質又は請求項２に記載の核酸の発現レベルを測定する工程、及び
（ｃ）（ｂ）において、発現レベルを低下させた被検物質を、疼痛を抑制する物質として選択する工程
を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体又はその断片。
【請求項１４】
被験者から採取した生体試料中の、請求項１に記載のタンパク質又は請求項２に記載の核酸の存在を検出することを特徴とする、該被験者における疼痛関連疾患の診断のための検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疼痛誘発に関与するPaintamideと称するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、これらを用いた疼痛抑制物質をスクリーニングする方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
疼痛（以下、「痛み」という場合もある）は、急性疼痛と慢性疼痛とに大別される。急性疼痛は、怪我や火傷等に伴い一過的に痛みが生じるが、痛み刺激の消失や治癒と共に消えていくのに対し、慢性疼痛は、長期間痛みが継続し、怪我等が回復しても痛みが継続する場合や、糖尿病、がん等に付随して生じる場合もある。当該慢性疼痛を生じる疾患としては、前述の糖尿病、がん等以外にも、変形性脊椎症や腰痛症といった筋骨格系及び結合組織の疾患、神経疾患、リウマチ性疾患等の内科的疾患、線維筋痛症等の原因不明のもの等、様々な疾患が挙げられる。
【０００３】
痛みが長期間継続する慢性疼痛は、患者の生活の質を著しく低下させ、就労困難を招く等、社会的損失もあるため、適切な痛みの対策が求められている。しかしながら、従来技術としては、例えば、疼痛知覚に関与するカルシウムチャネルに拮抗するペプチド（クモ毒由来）が同定されたこと（特許文献１）、生体内アミン量を低下させることにより、慢性筋肉痛又は慢性触アロディニアを惹起した病態モデル動物が得られたこと（特許文献２）、α1B Ca2+ チャネル機能障害による慢性疼痛モデル動物が得られたこと（特許文献３）等が報告されているにすぎず、慢性疼痛に関わる根本的な発痛物質は同定されていない。
【０００４】
あるいは、発痛とは逆に、プロサポシン（Prosaposin、以下、「PSAP」ともいう）からライソゾーム分解により生成されるサポシンA,B,C,Dドメインのうち、サポシンC又はそのペプチド断片が、糖尿病ラットにおいて神経障害痛を緩和した等の報告がなされているにすぎない（特許文献４）。
【０００５】
慢性疼痛の一つである非炎症性の大関節の疼痛は高齢者に多く、そのメカニズムは不明である。一方、小児期において周期的に四肢大関節痛が生じ、そのメカニズムが不明な家系も存在する。当該家系の患者は、乳児期より突発的な四肢大関節痛が生じ、思春期まで10〜20回／月程度の頻度にて痛みが推移するものの、その後徐々に改善し、成人期では1〜2回／年程度の頻度となる。しかも、臨床検査では炎症所見を認めず、骨、筋変化、神経所見も異常所見も認められない上に、成人後の体格異常等も認められない等、長らく当該疼痛の原因は不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表2012-514992号公報
【特許文献２】再表2010/070971号公報
【特許文献３】特開2003-18945号公報
【特許文献４】特表2001-524944号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、疼痛誘発に関与する新規タンパク質を提供することである。さらに、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子又はタンパク質を用いて、疼痛抑制物質をスクリーニングする方法等も提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を行い、小児期に周期的に四肢大関節痛を訴える患者家系に対して連鎖解析及び全ゲノムシークエンス解析を行った。その結果、当該家系の中に、PSAPL1（Prosaposin-like 1）遺伝子の1580番目のGがTに置換されたミスセンス変異が存在し、当該変異により、PSAPL1タンパク質の496番目のアラニンがセリンに置換されることを見出した。このように、PSAPL1遺伝子に特定の変異を有する翻訳産物で、特有の痛みを誘発するタンパク質をPaintamideと命名した。
【０００９】
PSAPL1遺伝子のパラログ遺伝子であるPSAP遺伝子の翻訳産物（PSAP）が分解されて生成されるサポシン Cは、上述のように疼痛抑制作用を有すると考えられている。これに対し、Paintamideが疼痛を誘発するという真逆の作用は、従来技術からは予測することができない、新たに見出した画期的な作用である。
【００１０】
以上の知見に基づき、本発明が完成された。
即ち、本発明は下記のとおりである： 
［１］以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列（496位のアラニンへの置換を除く）を有し、かつ、疼痛誘発作用を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列の相補鎖配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ、かつ、疼痛誘発作用を有するタンパク質
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の、他の哺乳動物におけるオルソログであって、該アミノ酸配列の496位に対応するアミノ酸残基がアラニン以外のアミノ酸であり、かつ疼痛誘発作用を有するタンパク質
［２］［１］に記載のタンパク質をコードする核酸。
［３］［２］に記載の核酸を含むベクター。
［４］［３］に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
［５］宿主細胞が哺乳動物細胞であり、内因性PSAPL1をコードする核酸が［２］に記載の核酸で置換された、［４］に記載の細胞。
［６］［４］に記載の宿主細胞を培養し、該培養物から［１］に記載のタンパク質を回収することを含む、該タンパク質の製造方法。
［７］［２］に記載の核酸を外因的に発現し、疼痛の表現型を示すトランスジェニック非ヒト哺乳動物又はその生体の一部。
［８］非ヒト哺乳動物の内因性PSAPL1をコードする核酸が［２］に記載の核酸で置換された、［７］に記載の動物又はその生体の一部。
［９］［１］に記載のタンパク質又は［２］に記載の核酸の投与により、疼痛の表現型を示す非ヒト哺乳動物又はその生体の一部。
［１０］非ヒト哺乳動物が、マウス又はラットである、［７］−［９］のいずれかに記載の動物又はその生体の一部。
［１１］［５］に記載の細胞、あるいは［７］−［１０］のいずれかに記載の動物又はその生体の一部に被検物質を接触させ、疼痛の表現型を改善した被検物質を選択することを特徴とする、疼痛を抑制する物質をスクリーニングする方法。
［１２］疼痛を抑制する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）［５］に記載の細胞あるいは［７］−［１０］のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物又はその生体の一部に、被験物質を接触させる工程、
（ｂ）被検物質を接触させた場合と、させない場合とのそれぞれにおいて、［１］に記載のタンパク質又は［２］に記載の核酸の発現レベルを測定する工程、及び
（ｃ）（ｂ）において、発現レベルを低下させた被検物質を、疼痛を抑制する物質として選択する工程
を含む、方法。
［１３］［１］に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体又はその断片。
［１４］被験者から採取した生体試料中の、［１］に記載のタンパク質又は［２］に記載の核酸の存在を検出することを特徴とする、該被験者における疼痛関連疾患の診断のための検査方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明で得られたPaintamideは、疼痛誘発作用を有するため、Paintamideの発現又は機能を抑制することで、当該疼痛の抑制が可能となる。また、Paintamideの発現又は機能の抑制を指標に、疼痛抑制物質のスクリーニングを行い、得られた前記物質を含む疼痛の予防又は治療薬を提供すること等が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明で連鎖解析を行った家系の家系図を示す。□、■、○、●、はそれぞれ、男性、男性患者、女性、女性患者を示す。
【図２】図２は、連鎖解析の結果を示す。第４番染色体領域にLOD score 2.36の連鎖領域が認められた。
【図３】図３は、PSAPL1とPSAPとのアミノ酸配列アラインメントの結果を示す。両者のアミノ酸配列同一性は44％であった。
【図４】図４は、表２の結果からPSAP及びPSAPL1との相関性を調べた結果を示す。縦軸がPSAPL1の濃度、横軸がPSAPの濃度を示す。P=0.0000、R2=0.8336
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の詳細を説明する。本発明は、Paintamide又はそれをコードする核酸、これらを用いて疼痛抑制物質をスクリーニングする方法等を提供する。
【００１４】
本発明において疼痛とは、急性疼痛、慢性疼痛のうち、主に慢性疼痛の場合をいう。また、本発明において、疼痛を誘発するとは、鈍痛、激痛等の痛みの程度、痛みの種類を問わず、痛みが誘発されることをいう。
疼痛を抑制するとは、前記疼痛の程度、種類を問わず、痛みが抑制されることをいう。好ましくは、痛みが中程度又は軽度にまで抑制されることをいい、より好ましくは、痛みがなくなる程度に抑制されることをいう。
【００１５】
「Paintamide」とは、変異PSAPL1（Prosaposin-like 1）遺伝子およびそのタンパク質産物の通称名（alias）であって、PSAPL1遺伝子内に種々の変異が生じた結果として疼痛が誘発される場合に、該変異遺伝子より生成されるタンパク質産物、あるいは遺伝子自体を意味する包括的な概念である。即ち、タンパク質として発現されない変異を生じた場合のその変異遺伝子や、発現調節領域の変異やRNAの安定性に関わる変異によるタンパク質の量的変化をもたらす変異におけるその変異遺伝子も、該変異により疼痛を誘発する限り「Paintamide」に包含される。
PSAPL1はヒトの塩基配列（GenBankアクセッション番号NM_001085382（2013年5月14日更新））及びそれに基づくPSAPL1のアミノ酸配列が公知である（GenBankアクセッション番号NP_001078851（2013年5月14日更新））ものの、その機能については未知である。
【００１６】
本発明は、上述の変異の中でも、特に配列番号２に示される521個のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、既知のヒトPSAPL1のアミノ酸配列において、496位のアラニンがセリンに置換されたタンパク質、並びに該タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、かつ該タンパク質と同質の生理活性を有するタンパク質を含む。
【００１７】
より具体的には、本発明のPaintamideには、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質が含まれる。
（ａ）配列番号２に示される521個のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列（496位のアミノ酸がアラニンへ置換される場合を除く）を有し、かつ、疼痛誘発作用を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列の相補鎖配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、かつ、疼痛誘発作用を有するタンパク質
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の、他の哺乳動物におけるオルソログであって、該アミノ酸配列の496位に対応するアミノ酸残基がアラニン以外のアミノ酸であり、かつ疼痛誘発作用を有するタンパク質
なお、本明細書において「及び／又は」は、いずれか一方、あるいは、両方を包含する意味で使用される。
【００１８】
上記（ｂ）に関し、より具体的には、（i）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の1〜50個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号２に示されるアミノ酸配列に1〜50個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号２に示されるアミノ酸配列に1〜50個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の1〜50個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、又は（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。ただし、配列番号２において、496位がアラニンへ置換される場合を除く。
【００１９】
さらに、性質の似たアミノ酸（例えば、グリシンとアラニン、バリンとロイシンとイソロイシン、セリンとトレオニン、アスパラギン酸とグルタミン酸、アスパラギンとグルタミン、リシンとアルギニン、システインとメチオニン、フェニルアラニンとチロシン等）同士の置換等であれば、より多くの個数の置換等があり得る。上述のようにアミノ酸が欠失、置換又は挿入されている場合、その欠失、置換、挿入の位置は、疼痛誘発作用が保持される限り、特に限定されない。そして、変異の導入は、部位特異的突然変異誘発、アラニンスキャニング、又はPCRによる突然変異誘発等、自体公知の方法により行うことができる。
【００２０】
上記（ｃ）において「ストリンジェントな条件」とは、同一性が高いヌクレオチド配列同士、例えば80％以上、好ましくは90以上、より好ましくは95％以上、いっそう好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の同一性を有するヌクレオチド配列同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いヌクレオチド配列同士がハイブリダイズしない条件、具体的には通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である60℃、1xSSC、0.1％SDS、好ましくは、0.1xSSC、0.1％SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1xSSC、0.1％SDSに相当する塩濃度及び温度で、1回、より好ましくは2〜3回洗浄する条件等が挙げられる。
【００２１】
上記（ｄ）においてヒト以外の哺乳動物種由来のPSAPL1遺伝子オルソログとしては、マウス（塩基配列：GenBankアクセッション番号NM_175249（2013年5月11日更新））、ラット（塩基配列：GenBankアクセッション番号NM_001144850（2012年5月2日更新））、チンパンジー（塩基配列：GenBankアクセッション番号XM_003310244（2012年10月25日更新））、テナガザル（塩基配列：GenBankアクセッション番号XM_004091686（2013年1月14日更新））、ウシ（塩基配列：GenBankアクセッション番号NM_001103267（2012年9月2日更新））、等の塩基配列が報告されている。
【００２２】
上記配列のみならず、他の哺乳動物におけるPSAPL1遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列をクエリーにして、ヒト以外の哺乳動物のゲノム及び／又はcDNAのデータベースに対してBLASTやFASTAを用いて検索を行う等により、所望の種由来の塩基配列を取得することができる。
【００２３】
上述のヒト以外の種由来のPSAPL1としては、マウス（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号NP_780458（2013年1月5日更新））、ラット（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号NP_001138322（2012年5月2日更新））、チンパンジー（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号XP_003310292（2012年10月25日更新））、テナガザル（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号XP_004091734（2013年1月14日更新））、ウシ（アミノ酸配列：GenBankアクセッション番号NP_001096737（2012年9月2日更新））、等のアミノ酸配列が報告されている。例えば、チンパンジーのPSAPL1は、塩基配列レベル及びアミノ酸配列レベルのいずれでも約99％の同一性を示す。一方、マウス及びラットのPSAPL1は塩基配列レベルで74-75％、アミノ酸レベルでは67-68％の同一性を有するにとどまるが、チンパンジー、マウス及びラットPSAPL1タンパク質をヒトPSAPL1タンパク質（NP_001078851）とBLASTによりアラインメントさせた場合の、ヒトPSAPL1の496位に対応するアミノ酸残基はいずれもアラニンであり、この位置のアミノ酸は、霊長類に限らず哺乳動物間で高度に保存されている。これらのアミノ酸配列において、上述の変異を有し、疼痛誘発作用を有するものを選択することで、他の種由来のPaintamideを得ることができる。
【００２４】
本発明のPaintamideをコードする核酸（以下、「本発明の核酸」という場合もある）は、上記Paintamideタンパク質をコードするアミノ酸配列を含む限り特に制限はない。該核酸は、二本鎖DNA、一本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、DNA/RNAハイブリッドのいずれであってもよいが、好ましくは二本鎖DNA又は一本鎖RNAであり、より好ましくは二本鎖DNAである。本発明の核酸は、ベクター（クローニングベクター又は発現ベクター）に連結して使用することができる。さらに、目的（例えば、タンパク質の発現）に応じて、当該ベクターを導入する宿主細胞に適したものを適宜選択し、当該ベクターを宿主細胞に形質転換することができる。当該ベクターはさらに、適切なプロモーター、ターミネーター領域、形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子（薬剤耐性遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）等も含むことができる。
【００２５】
加えて、当該ベクターはタンパク質の分離・精製に有用なタグ配列（例えばHisタグ、GSTタグ、FLAG（商標）タグ等）をコードする配列等を含んでいてもよく、当該ベクターは、対象宿主細胞のゲノムに組み込まれるものであってもよい。
【００２６】
ベクターの種類としては、特に限定されないが、pBTrp2、pBTac1、pBTac2、pBluescript II SK(+)、pBluescript II SK(-)、pSTV28、pUC118、pUC19、pKK233-2、pSE280、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pETベクター、pAGEベクター、pcDNAベクター、pGEXベクター、pMC1neo、λgt11、pkk223-3、pBlue BacIII、pVL1392、pVL1393等が挙げられる。
【００２７】
宿主細胞としては、前記ベクターを発現することのできる任意の細胞、例えば、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞等が挙げられる。形質転換細胞をPaintamideタンパク質の精製の目的で使用する場合、精製を容易にするために、宿主細胞として内因性PSAPL1を産生しない細胞を用いることが好ましいが、動物細胞を用いる場合でも、ヒトとマウス、ラット等との間ではPSAPL1タンパク質のアミノ酸配列にある程度の差異があるので、例えば、ヒト由来のPaintamideタンパク質を組換え生産する場合には、マウス又はラット等の霊長類以外の哺乳動物細胞を使用することもできる。一方、形質転換細胞を、例えば後述の疼痛抑制物質のスクリーニング系として使用することを意図する場合、宿主細胞として哺乳動物細胞を用いることが好ましく、さらに内因性のPSAPL1のコード領域を該ベクターに搭載されたPaintamideをコードする核酸で置換することが望ましい。
【００２８】
細菌細胞としては、特に限定されないが、大腸菌（Escherichia coli）、バチルス（Bacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ストレプトマイセス（Streptomyces）等が挙げられる。真菌細胞としては、特に限定されないが、サッカロミセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）やアスペルギルス（Aspergillus）属真菌等が挙げられる。昆虫細胞としては、特に限定されないが、カイコ（Bombyx mori）、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)等が挙げられる。動物細胞としては、特に限定されないが、CHO細胞、HeLa細胞、COS-1細胞、COS-7細胞、HEK293細胞、BALL-1細胞、HCT-15細胞、PC12細胞等が挙げられる。
【００２９】
上述のベクターは、コンピテント細胞法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等、自体公知の形質転換法で、対象宿主細胞内に導入することができる。
【００３０】
上述の宿主細胞は、自体公知の方法により培養することができる。培養時間、培養温度等は細胞の種類に応じて、当業者は適宜決定することができる。例えば、培養温度は１０〜４５℃、好ましくは、２０〜４０℃、培養時間は、１時間〜１４日間、好ましくは、１０時間〜７日間等を設定することができる。pHも適宜調整することができる。
【００３１】
培養に使用する培地は、所望の細胞毎に、適宜選択することができる。例えば、大腸菌の培養であれば、LB培地等、酵母の培養であればSD培地等、哺乳動物の培養であれば、DMEM培地、EMEM培地等を使用することができる。さらに、培地（半固形培地、液体培地、粉末培地）には、必要に応じて、各種ビタミン類（ビタミンA、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE等）、各種アミノ酸（天然アミノ酸又は合成アミノ酸も含む）、核酸塩基（プリン、ピリミジン）、無機塩類（MgSO4、MnSO4、FeSO4、NaCl等）抗生物質（アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン）等を添加することができる。
【００３２】
上述の方法で得られるタンパク質は、自体公知の方法で精製することができる。例えば、遠心分離等で集菌した菌体を、超音波又はガラスビーズ等で摩砕した後、遠心分離等により細胞片等の固形物を除き、粗酵素液を調製し、さらに、硫安、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニテイクロマトグラフィー等のクロマトグラフ法、ゲル電気泳動法等を用いることができる。
このようにして精製されたPaintamideタンパク質は、後述の疼痛モデル動物の誘発剤として非ヒト哺乳動物に投与することができる。また、後述するようにPaintamideの受容体の探索のために用いることもできる。
【００３３】
本発明のPaintamideは、哺乳動物において疼痛を誘発することができるので、Paintamideをコードする核酸を非ヒト哺乳動物細胞に導入し、トランスジェニック動物を作製することにより、疼痛モデル動物を提供することができる。従って、本発明はまた、本発明の核酸を外因的に発現し、疼痛の表現型を示すトランスジェニック（以下、Tgともいう）非ヒト哺乳動物を提供する。
【００３４】
本発明のTg動物は、非ヒト哺乳動物の受精卵や、未受精卵、精子及びその前駆細胞（始原生殖細胞、卵原細胞、卵母細胞、卵細胞、精原細胞、精母細胞、精細胞等）等に、好ましくは受精卵の胚発生の初期段階（さらに好ましくは8細胞期以前）において、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、DEAE-デキストラン法等の遺伝子導入法によって、本発明の核酸を導入することにより作製される。
発現ベクターとしてウイルスを用いる場合の一実施態様として、PaintamideをコードするDNAを含むウイルスで、非ヒト哺乳動物の初期胚もしくはES細胞を感染させる方法が挙げられる（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(4): 2140-2145, 2002参照）。例えば、レトロウイルスやレンチウイルスを用いる場合、ディッシュなどの適当な培養器に細胞を播き、培養液にウイルスベクターを加えて、1〜2日間培養後、初期胚であれば、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植し、ES細胞であれば、G418やハイグロマイシンなどの選択薬剤を添加して培養を続け、ベクターが組み込まれた細胞を選択する。
さらに、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 13090-13095 (2001) に記載されるように、雄非ヒト哺乳動物から採取した精原細胞をSTOフィーダー細胞と共培養する間にウイルスベクターに感染させた後、雄性不妊非ヒト哺乳動物の精細管に注入して雌非ヒト哺乳動物と交配させてることにより、効率よく外来性PaintamideへテロTg（+/-）産仔を得ることができる。
【００３５】
また、該遺伝子導入法により、非ヒト哺乳動物の体細胞、組織、臓器などに本発明の核酸を含むDNAを導入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、この細胞を上述の胚（もしくは生殖）細胞と公知の細胞融合法を用いて融合させることによりTg動物を作製することもできる。あるいは、ノックアウト動物を作製する場合と同様に、非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞（ES細胞）に上記の遺伝子導入法を用いて本発明の核酸を含むDNAを導入し、予め該DNAが安定に組み込まれたクローンを選択した後に、該ES細胞を胚盤胞に注入するかあるいはES細胞塊と8細胞期胚とを凝集させてキメラマウスを作製し、生殖系列に導入DNAが伝達されたものを選択することによってもTg動物を得ることが可能である。
【００３６】
さらに、Tg動物は、内在性PSAPL1遺伝子がヒトPaintamideをコードする配列で置換されたノックイン（KI）動物であることがより好ましい。そのため、本発明のTg動物は、ES細胞へ、目的DNAを適当なターゲッティングベクターを用いて導入し、相同組換えにより内在性のPSAPL1遺伝子を、ヒトPaintamideをコードする配列で置換することによっても作製され得る。
【００３７】
本発明は、上述のように作製されたTg動物（好ましくはKI動物）の生体の一部（例えば、(1)キメラPaintamideをコードするDNAを安定に保持する細胞、組織、臓器等、(2)これらに由来する細胞または組織を培養し、必要に応じて継代したもの等）も、本発明のヒトPaintamideを産生し得るキメラPaintamide遺伝子を発現可能な状態で保持するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の生体の一部として、本発明のヒト型Paintamideを産生し得るキメラPaintamide遺伝子を発現可能な状態で保持する非ヒト哺乳動物と同様な目的に用いることができる。上述の方法で得られるTg非ヒト哺乳動物は、疼痛誘発モデル動物として使用し得る。
【００３８】
さらに、本発明は、上述の本発明のタンパク質又は核酸を投与することにより、疼痛を誘発させた非ヒト哺乳動物又はその生体の一部を提供する。核酸はDNAであってもRNAであってもよいが、DNAの場合は二本鎖DNAとして、投与対象の哺乳動物で機能的なプロモーターを含む発現ベクターに搭載された形態で投与される。一方、RNAの場合はセンス一本鎖RNAの形態で投与される。投与方法は、静注、筋肉内注射、皮下注射等が例示されるが、これらに限定されない。前記タンパク質又は核酸は、水又は水以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤などの注射剤として調製することができる。より具体的には、前記タンパク質又は核酸を、生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等とともに、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。
【００３９】
本発明のTg動物（好ましくはKI動物）又は上述の疼痛誘発を示す非ヒト動物の生体の一部としては、神経、脳、脳の各部位（例えば、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳等）の組織片および細胞等が例示されるが、これらに限定されない。
【００４０】
本発明で対象とし得る非ヒト哺乳動物（レシピエント動物）は、トランスジェニック系（KI動物の場合はノックアウト系）が確立されたヒト以外の哺乳動物であれば特に制限はなく、例えば、マウス、ラット、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスターなどが挙げられる。好ましくは、疾患モデル動物作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、繁殖が容易な齧歯動物がより好ましく、とりわけマウス（例えば、純系としてC57BL/6系統、BALB/c系統、C3H系統、FVB系統、DBA2系統等、交雑系としてB6C3F1系統、BDF1系統、B6D2F1系統、ICR系統等）及びラット（例えば、Wistar、SD等）が好ましい。
また、哺乳動物以外にもニワトリ等の鳥類が本発明で対象とする非ヒト哺乳動物と同様の目的に用いることができる。
【００４１】
本発明の別の一側面においては、PSAPL1が疼痛抑制機能を有し、Paintamideは当該機能の欠損の結果として、疼痛を誘発する場合があり得る。そのため、本発明はまた、PSAPL1遺伝子の発現不全非ヒト哺乳動物の疼痛モデルとしての使用を提供する。「PSAPL1遺伝子の発現不全非ヒト哺乳動物」とは、内因性PSAPL1の発現が不活性化された非ヒト哺乳動物を意味し、PSAPL1遺伝子がノックアウト（KO）されたES細胞から作製されるPSAPL1 KO動物の他、アンチセンスもしくはRNAi技術によりPSAPL1遺伝子の発現が不活性化されたノックダウン（KD）動物なども含まれる。ここで「ノックアウト（KO）」とは、内在性遺伝子を破壊したり、除去したりすることにより完全なmRNAを産生不能にすることを意味し、他方、「ノックダウン（KD）」とは、mRNAからタンパク質への翻訳を阻害することにより、結果的に内因性遺伝子の発現を不活性化することを意味する。PSAPL1遺伝子をノックアウトする具体的な手段としては、対象非ヒト哺乳動物由来のPASPL1遺伝子（ゲノムDNA）を常法に従って単離し、例えば、(1)そのエキソン部分やプロモーター領域に他のDNA断片（例えば、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子等）を挿入することによりエキソンもしくはプロモーターの機能を破壊するか、(2)Cre-loxP系やFlp-frt系を用いてPSAPL1遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させるか、(3)タンパク質コード領域内へ終止コドンを挿入して完全なタンパク質の翻訳を不能にするか、あるいは(4)転写領域内部へ遺伝子の転写を終結させるDNA配列（例えば、polyA付加シグナルなど）を挿入して、完全なmRNAの合成を不能にすることによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築したDNA配列を有するDNA鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、相同組換えにより対象非ヒト哺乳動物のPSAPL1遺伝子座に組み込ませる方法などが好ましく用いられ得る。
尚、PaintamideがPSAPL1の疼痛抑制機能を欠損する場合、上述の外因性Paintamideのノックイン動物は、機能欠損変異遺伝子で野生型遺伝子を置換することになるので、同様に疼痛モデル動物となり得る。
【００４２】
さらに、本発明は、Paintamideに作用する物質をスクリーニングする方法も含まれる。作用する物質とは、Paintamideに結合する物質、Paintamideの疼痛誘発作用と関連する物質等が含まれ、例えば、Paintamideの標的受容体を同定する等のために、当該スクリーニングを行うことができる。
【００４３】
当該手法としては、特に限定されないが、上述のPaintamide又はその断片を発現する細胞、組織又はトランスジェニック非ヒト哺乳動物に対し、被験物質の存在下及び／又は非存在下における前記細胞等の変化を評価する方法、Paintamide又はその断片を、例えば、カルシウムチャネルを発現させた細胞と接触させ、パッチクランプ法など自体公知の方法により、カルシウムイオン電流を測定し、電流の増加又は低下を確認する方法等が挙げられる。
【００４４】
電位依存性カルシウムチャネルとしては、Ｌ型（Cav1.1〜Cav1.4）、Ｐ型／Ｑ型（Cav2.1）、Ｎ型（Cav2.2）、Ｒ型（Cav2.3）、Ｔ型（Cav3.1〜Cav3.3）等が挙げられる。カルシウムチャネルを発現させる細胞は、目的に応じて当業者が適宜決定することができる。
【００４５】
さらに、本発明には、疼痛を抑制する物質をスクリーニングする方法も含まれる。当該方法としては、特に限定されないが、例えば、上記のPaintamide又はその断片をを発現する細胞、組織又はトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被検物質を接触させ、被検物質を接触させない場合との間で、該細胞、組織又は動物における疼痛の表現型の変化を測定・比較し、疼痛の表現型を改善した被検物質を、疼痛抑制物質の候補として選択する方法が挙げられる。
被検物質の接触は、細胞もしくは組織にあっては、培地又は緩衝液などに被検物質を添加することにより、トランスジェニック非ヒト哺乳動物にあっては、被検物質を経口もしくは非経口的に投与することにより行われ得る。培地等への添加量、動物への投与量は、被検物質に応じて適宜選択することができる。
疼痛抑制作用は、疼痛の表現型、例えば、細胞・組織にあってはカルシウムイオン電流の変化等、動物にあっては疼痛症状の緩和を、それぞれ指標として評価することができる。
【００４６】
あるいは、疼痛を抑制する物質をスクリーニングする別の方法として、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法が挙げられる。（ａ）上述のPaintamideを発現する細胞、組織又はトランスジェニック非ヒト哺乳動物に対し、被験物質を接触させる工程、（ｂ）被検物質を接触させた場合と、させない場合とにおいて、それぞれPaintamideタンパク質又はそれをコードする核酸の発現レベルを測定する工程、及び（ｃ）（ｂ）において、発現レベルを低下させた被検物質を疼痛抑制物質の候補として選択する工程。
工程（ａ）における被検物質の接触は、上記と同様に行うことができる。工程（ｂ）における発現レベルの測定は、自体公知のタンパク質又はRNAの検出方法を用いて行うことができる。ここで使用される細胞、組織、Tg動物は、内因性のPSAPL1タンパク質又はそれをコードするmRNAを発現しないものが好ましく、また、Paintamideの発現が内因性のPSAPL1遺伝子の発現調節領域に制御されることが好ましい。従って、好ましい一実施態様においては、Paintamideをコードする核酸で内因性PSAPL1遺伝子のコード領域を置換したノックイン細胞・組織又は動物が使用される。しかし、内因性PSAPL1を発現する形質転換細胞やTg動物を用いた場合でも、後述の疼痛関連疾患の診断のための臨床検査に使用し得る、抗Paintamide特異的抗体（即ち、内因性のPSAPL1とは交叉反応しない抗体）や、PaintamideをコードするmRNAのみを特異的に検出するプライマー及び／又はプローブを用いて、Paintamide又はそれをコードするmRNAのみを測定することができる。
【００４７】
上記いずれかのスクリーニング方法において試験され得る被験物質としては、特に限定されないが、例えば、低分子化合物、高分子化合物、タンパク質（サイトカイン、ケモカイン、抗体等）、核酸（DNA、RNA等）、ウイルス、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、微生物、動植物若しくは海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。このような物質は、当業者が適宜決定することができる。
【００４８】
上述の方法で得られる疼痛を抑制する物質は、当該物質を有効成分とし、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を添加して製剤化し、疼痛予防剤及び／又は治療剤として使用することもできる。
【００４９】
本発明は、さらに一態様として、対象のPSAPL1遺伝子のp.A496S（c.1580 G>T）変異を検出する工程を含む、疼痛関連疾患の診断のための検査方法も提供する。
一実施態様においては、当該変異は公知のいずれかのSNP検出法を用いて検出され得る。例えば、被験者の細胞等から抽出したゲノムDNAを試料とし、上記したいずれかの多型部位の塩基を含む約15〜約500塩基の連続した塩基配列を含有してなる核酸をプローブとして用い、例えばWallaceら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 80, 278-282 (1983)）の方法に従って、ストリンジェンシーを正確にコントロールしながらハイブリダイゼーションを行い、プローブと完全相補的な配列のみを検出する方法や、上記核酸と上記核酸において多型部位の塩基が他の塩基に置換された核酸のいずれか一方を標識し、他方を未標識としたミックスプローブを用い、変性温度から徐々に反応温度を低下させながらハイブリダイゼーションを行い、一方のプローブと完全相補的な配列を先にハイブリダイズさせ、ミスマッチを有するプローブとの交差反応を防ぐ方法などが挙げられる。ここで標識剤としては、例えば、放射性同位元素（例、125I、131I、3H、14Cなど）、酵素（例、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、蛍光物質（例、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート、Cy3、Cy5など）、発光物質例、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）などが用いられる。
好ましくは、多型の検出は、例えば、WO 03/023063に記載された種々の方法、例えば、RFLP法、PCR-SSCP法、ASOハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ARMS法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、RNase A切断法、化学切断法、DOL法、TaqMan PCR法、インベーダー法、MALDI-TOF/MS法、TDI法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法、UCAN法、DNAチップまたはDNAマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法、、およびECA法などにより実施することができる（WO 03/023063、第17頁第5行〜 第28頁第20行を参照）。
【００５０】
上記検査方法の実施に適したキットとして、上述のPaintamideをコードする核酸の塩基配列の中から、例えば、PSAPL1遺伝子のp.A496S（c.1580 G>T）を含む領域を増幅し得るプライマーを作製し、当該プライマーを含むキットが挙げられる。プライマーは、自体公知の方法により作製することができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列の15個以上の連続した核酸を有し、PSAPL1遺伝子のp.A496S（c.1580 G>T）を含む領域を増幅し得るプライマーとすることができる。
【００５１】
PSAPL1遺伝子のp.A496S（c.1580 G>T）変異を検出する別の態様として、対象のPaintamideタンパク質の発現を検出する方法が挙げられる。例えば、血中のPaintamideは、例えば、ウェスタンブロッティング法、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、蛍光抗体法、ELISA法等の免疫学的手法を用いて検出することができる。
上記Paintamideタンパク質の検出には、Paintamideのみに特異的に結合し、p.A496S変異を有しないするPSAPL1タンパク質には結合いない抗体又はその断片が使用される。当該抗体の作製法は周知であり、自体公知の手法で作製することができる。免疫原としては、上記Paintamideタンパク質の全部を用いてもよいし、496位のセリンを含むそのフラグメントを用いてもよい。該抗体はモノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。抗体断片としては、特に限定されないが、scFv、Fab、Fab’、（Fab’）2、Fv、Fd、scFv、sdFv等が挙げられる。
【００５２】
疼痛関連疾患としては、四肢大関節痛、外傷による神経障害あるいは代謝性の神経炎症による疼痛,糖尿病により末梢神経炎等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００５４】
サンプル
以下の実施例では、被験者全員からインフォームドコンセントを得た。また、本研究は、京都大学及び秋田大学の倫理委員会により承認を受けて行った。
【実施例１】
【００５５】
本研究の対象とした家系図を図１に示す。４世代にわたり小児期において周期的に四肢大関節痛を訴える家系を選択した。突発的な四肢大関節痛は乳児期より生じ、関節痛は思春期まで10〜20回／月程度の頻度にて当該痛みが推移するものの、その後徐々に改善し、成人期では1〜2回／年程度の頻度となる。疼痛は四肢に限定しているものの疼痛部位は不定であり、単肢のみの場合から四肢全ての場合まで様々であり、上肢のみの場合もある。疼痛部位の腫脹、発赤を認めず、拍動痛を伴わず、冷感を伴う鈍痛であり、加温および非ステロイド性抗炎症薬にてやや改善する。
図１に示す家系の内、円で囲んだ12人を被験者として連鎖解析を行った。
結果を図２に示す。第4番染色体（Ch4）にLODスコア2.36の連鎖領域（p15.33-16.3）を認めた。
【実施例２】
【００５６】
全ゲノムエクソーム解析
次世代シクエンサーHiSeq2000（イルミナ社）を使用して、上記家系内の四肢大関節痛患者3人（III-1、V-1、V-3）について、全ゲノムエクソーム解析を行った。ゲノムDNAのキャプチャーには、SureSelect Human All Exon V4 + UTRｓKit（Aglient社）を使用し、イルミナ社のプロトコールに従い、ライブラリーを作製した。被験者から調製したゲノムDNAを断片化し、150-200bp（アダプターを含まず）の該ゲノム断片を前記キャプチャーと連結させライブラリーとした。イルミナ社指定のフローセルを使用し、Multiplex sequencingを行った。Read lengthは100bpとした。RefSeqのデータベースとして、UCSC Genome Browser hg19を使用し、Burrows-Wheeler Aligner 0.6.2(BWA)を用いて解析した。
SNP、In/delの解析には、The Genome Analysis Toolkit(GATK) (version 1.5-32-g2761da9)を使用した。有効なリード数、塩基数は３検体で平均して、約8800万read pair、約5.3 Gbpであった。
解析結果を表１にまとめた。
【００５７】
【表１】
2015029480.tif 000002
【００５８】
MS/NS/Indel/SS/FS/RT (MS, Missense; NS, Nonsense; Indel, Insertion or deletion; SS, Splice Site; FS, Fragile Sites; RT, Read through)を含め、各検体それぞれにおいて変異は約１万個認められ、3検体に共通するヘテロ接合体変異は、1040個であった。そのうち、1kゲノムにおいて、マイナー対立遺伝子頻度 (Minor Allele Frequency, MAF) 1％以下の変異は121個であり、日本人におけるMAF 1％以下の変異は102個であった。これらの中で、dbSNP135に登録されていない新規変異は42個であり、さらに連鎖解析で得られた連鎖領域Ch4 p15.33-16.3に位置する変異はPSAPL1（Prosaposin-Like 1）遺伝子のみであった。PSAPL1遺伝子のエクソン１において、p.A496S（c.1580 G>T）のミスセンス変異を認めた。
【００５９】
そこで、患者の居住地域における一般人口150人に対し、制限酵素を用いて変異アリルp.A496Sの頻度を解析した。その結果、一般人口150人において同変異は認められず、95%信頼区間（CI）は0-0.0122であった。
【００６０】
PSAPL1のパラログ遺伝子はPSAP遺伝子であることが公知である。PSAPL1とPSAPとのアミノ酸配列を比較した結果を図３に示す。両者は44％のアミノ酸配列同一性を示すが、PSAPL1はイントロンを欠く1エクソン遺伝子であり、両者のゲノム構造は大きく異なっている。しかし、PSAPL1遺伝子は、PSAP遺伝子のサポシンA、B、C及びD領域に相同な4つのドメインを有している。
【実施例３】
【００６１】
慢性疼痛患者血清中におけるPSAP及びPSAPL1の発現
慢性疼痛を訴える患者及びコントロールとして、疼痛のない健常人から血清を調製し、各検体中のPSAP及びPSAPL1の発現量（ng/mL）を、Human PSAP ELISA Kit（MBS 730310；MyBioSource社）及びHuman PSAPL1 ELISA Kit（MBS 903152；MyBioSource社）を用いて、ELISA法により測定した。PSAPの測定には50倍希釈血清を、PSAPL1の測定には血清原液を使用した。
結果を表２に示す。PSAPは、コントロールにおいて、加齢に伴い増加していた。これに対し、PSAPL1は、コントロールにおいて、加齢に伴い低下していた。両者の発現は逆相関していた（図４）。
【００６２】
【表２】
2015029480.tif 000003
【００６３】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明である。
【００６４】
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明により疼痛誘発効果を有するタンパク質をコードする遺伝子を初めて同定された。本発明により、四肢関節の疼痛メカニズムの解明や疼痛に関与する医薬のスクリーニングが可能となる点で、本発明は産業上極めて有用である。
【図１】
2015029480.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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