(57)【要約】      （修正有）【課題】再生可能な生物学的供給原料からコハク酸及び／又は他の産物を効率的に生産するための生物触媒の提供。【解決手段】大腸菌においてグルコース抑制型糖新生性ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）の発現抑制解除につながる遺伝子改変、ホスホトランスフェラーゼ系の遺伝子の欠失等による不活性化、並びにＴＣＡ回路や発酵回路等の代謝経路の構成遺伝子の欠失等による不活性化を行い、もってコハク酸生産への効率的な炭素フローを持つ高コハク酸生産能大腸菌株。該菌株は既存のコハク酸生産ルーメン細菌と遜色ないコハク酸生産効率を糖質を有する最少無機塩塩培地で達成することができる高コハク酸生産能大腸菌株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
増加したレベルのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）遺伝子転写物を含む細菌細胞であって、該転写物が活性ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）をコードし、該細胞が増加したＰＣＫ活性を示す、細菌細胞。
【請求項２】
非反芻動物性細菌細胞である、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項３】
細菌が、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、グルコノバクター・アサイ（Gluconobacter asaii）、アクロモバクター・デルマーベ（Achromobacter delmarvae）、アクロモバクター・ビスコーサス（Achromobacter viscosus）、アクロモバクター・ラクティカム（Achromobacter lacticum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、アルカリゲネス・フェーカリス（Alcaligenes faecalis）、アルスロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreus）、アルスロバクター・ツメッセンス（Arthrobacter tumescens）、アルスロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、アルスロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Arthrobacter hydrocarboglutamicus）、アルスロバクター・オキシダンス（Arthrobacter oxydans）、オーレオバクテリウム・サペルダエ（Aureobacterium saperdae）、アゾトバクター・インディカス（Azotobacter indicus）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ディバリカタム（divaricatum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・グロボサム（Brevibacterium globosum）、ブレビバクテリウム・フスカム（Brevibacterium fuscum）、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム（Brevibacterium ketoglutamicum）、ブレビバクテリウム・ヘルコルム（Brevibacterium helcolum）、ブレビバクテリウム・プシルム（Brevibacterium pusillum）、ブレビバクテリウム・テスタセウム（Brevibacterium testaceum）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）、ブレビバクテリウム・インマリオフィリウム（Brevibacterium immariophilium）、ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linens）、ブレビバクテリウム・プロトファルミエ（Brevibacterium protopharmiae）、コリネバクテリウム・アセトフィラム（Corynebacterium acetophilum）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルビニア・カルトボーラ（Erwinia carotovora）、エルビニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）、エルビニア・クリザンセミ（Erwinia chrysanthemi）、フラボバクテリウム・ペレグリナム（Flavobacterium peregrinum）、フラボバクテリウム・フカタム（Flavobacterium fucatum）、フラボバクテリウム・アウランティナム（Flavobacterium aurantinum）、フラボバクテリウム・レナヌム（Flavobacterium rhenanum）、フラボバクテリウム・セワネンセ（Flavobacterium sewanense）、フラボバクテリウム・ブレベ（Flavobacterium breve）、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Flavobacterium meningosepticum）、ミクロコッカス（Micrococcus）種ＣＣＭ８２５、モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）、ノカルディア・オパカ（Nocardia opaca）、ノカルディア・ルゴーサ（Nocardia rugosa）、プラノコッカス・ユーシナタス（Planococcus eucinatus）、プロテウス・レットゲリ（Proteus rettgeri）、プロピオニバクテリウム・シャーマニ（Propionibacterium shermanii）、シュードモナス・シンキサンタ（Pseudomonas synxantha）、シュードモナス・アゾトフォルマンス（Pseudomonas azotoformans）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・オバリス（Pseudomonas ovalis）、シュードモナス・スタッツェリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナス・アシドボランス（Pseudomonas acidovolans）、シュードモナス・ムシドレンス（Pseudomonas mucidolens）、シュードモナス・テルトステロニ（Pseudomonas testosteroni）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）、ロドコッカス（Rhodococcus）種ＡＴＣＣ１５５９２、ロドコッカス（Rhodococcus）種ＡＴＣＣ１９０７０、スポロサルシナ・ウレア（Sporosarcina ureae）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ビブリオ・メッシュニコビ（Vibrio metschnikovii）、ビブリオ・チロゲネス（Vibrio tyrogenes）、アクチノマドゥラ・マドゥラ（Actinomadura madurae）、アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス（Actinomyces violaceochromogenes）、キタサトスポリア・パルロサ（Kitasatosporia parulosa）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・フラベラス（Streptomyces flavelus）、ストレプトマイセス・グリセオラス（Streptomyces griseolus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・オリバセウス（Streptomyces olivaceus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・バージニエ（Streptomyces virginiae）、ストレプトマイセス・アンチビオティカス（Streptomyces antibioticus）、ストレプトマイセス・カカオイ（Streptomyces cacaoi）、ストレプトマイセス・ラベンデュレ（Streptomyces lavendulae）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、アエロモナス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・チアミノリティカス（Bacillus thiaminolyticus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリキファシエンス（Bacillus amyloliquifaciens）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、エシェリキア・フロインディ（Escherichia freundii）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、サルモネア・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・ショットムレリ（Salmonella schottmulleri）、またはキサントモナス・シトリ（Xanthomonas citri）である、請求項１記載の細菌株。
【請求項４】
前記増加したレベルのｐｃｋ転写物が、ｐｃｋ遺伝子のネイティブな調節配列から、ｐｃｋの転写を増加させる変更された調節配列への置換に起因する、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項５】
前記調節配列が、前記ｐｃｋ遺伝子のプロモーター領域中にある、請求項４記載の細菌細胞。
【請求項６】
前記増加したレベルの前記ｐｃｋ転写物が、ｐｃｋ遺伝子のプロモーター領域中の１または複数の突然変異に起因する、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項７】
前記１または複数の突然変異が、ｐｃｋ遺伝子開始コドン上流の６８位でのヌクレオチドＡからヌクレオチドＧへの置換を含む点突然変異である、請求項６記載の細菌細胞。
【請求項８】
増加したレベルの前記ｐｃｋ転写物が、ネイティブなプロモーター配列から外因性プロモーター配列への置換に起因する、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項９】
外因性プロモーターが、構成性プロモーターである、請求項８記載の細菌細胞。
【請求項１０】
外因性プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項８記載の細菌細胞。
【請求項１１】
誘導性プロモーターが、ｌａｃプロモーターである、請求項８記載の細菌細胞。
【請求項１２】
ＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系の機能を破壊する１または複数の遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項１３】
前記遺伝的改変が、ＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系の構造成分をコードする１または複数の遺伝子中にある、請求項１２記載の細菌細胞。
【請求項１４】
前記遺伝的改変が、ＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系の発現をレギュレーションするタンパク質をコードする１または複数の遺伝子中にある、請求項１２記載の細菌細胞。
【請求項１５】
前記遺伝的改変が、ｐｔｓＧ、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、ｃｒｒおよびｃｒｐから成る群より選択される１または複数の遺伝子中にある、請求項１２記載の細菌細胞。
【請求項１６】
（ａ）ＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系の機能を破壊する１または複数の遺伝的改変；および（ｂ）糖輸送体をコードする１または複数の遺伝子の発現をアップレギュレーションする１または複数の遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項１７】
前記糖輸送体が、ＡＴＰ結合カセット輸送体のメンバーである、請求項１６記載の細菌細胞。
【請求項１８】
前記糖輸送体が、ＭＦＳ（major facilitator super family）のメンバーである、請求項１６記載の細菌細胞。
【請求項１９】
発酵経路に関与する１または複数の遺伝子における遺伝子発現の不活性化へと導く遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項２０】
ａｄｈＥ、ｌｄｈＡ、ｆｏｃＡ、ｐｆｌＡ、ａｃｋ、ｐｔａ、ｐｄｈ、ｍｇｓＡ、ｔｄｃＤ、ｔｄｃＥおよびｐｏｘＢから成る群より選択される１または複数の遺伝子における遺伝子発現の不活性化へと導く遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項２１】
（ａ）ＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系の機能を破壊する１または複数の遺伝的改変；および（ｂ）発酵経路に関与する１または複数の遺伝子における突然変異をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項２２】
（ａ）ｐｔｓＧ、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、ｃｒｒおよびｃｒｐから成る群より選択される１または複数の遺伝子における遺伝的改変；ならびに（ｂ）ａｄｈＥ、ｌｄｈＡ、ｆｏｃＡ、ｐｆｌＡ、ａｃｋ、ｐｔａ、ｐｄｈ、ｍｇｓＡ、ｔｄｃＤ、ｔｄｃＥおよびｐｏｘＢから成る群より選択される１または複数の遺伝子における遺伝子発現の不活性化へと導く遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項２３】
ＴＣＡ回路の作動に関連する１または複数の遺伝子における遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項２４】
ｍｄｈ、ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、ｆｕｍＣ、ｆｒｄＡＢＣＤ、ａｃｃｅＡＢ、ａｃｎＡＢ、ｉｃｄ、ｉｃｌＲ、ａｓｐＣ、およびｓｃｆＡから成る群より選択される１または複数の遺伝子における遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項２５】
（ａ）ｐｔｓＧ、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、ｃｒｒおよびｃｒｐから成る群より選択される１または複数の遺伝子における遺伝的改変；（ｂ）ａｄｈＥ、ｌｄｈＡ、ｆｏｃＡ、ｐｆｌＡ、ａｃｋ、ｐｔａ、ｐｄｈ、ｍｇｓＡ、ｔｄｃＤ、ｔｄｃＥおよびｐｏｘＢから成る群より選択される１または複数の遺伝子における遺伝子発現の不活性化へと導く遺伝的改変；ならびに（ｃ）ｍｄｈ、ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、ｆｕｍＣ、ｆｒｄＡＢＣＤ、ａｃｃｅＡＢ、ａｃｎＡＢ、ｉｃｄ、ｉｃｌＲ、ａｓｐＣ、およびｓｃｆＡから成る群より選択される１または複数の遺伝子における遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項２６】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ＮＡＤＨ依存性リンゴ酸酵素およびＮＡＤＰＨ依存性リンゴ酸酵素から成る群より選択される１または複数の遺伝子における遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌株。
【請求項２７】
外因性ピルビン酸カルボキシラーゼをさらに含む、請求項１記載の細菌株。
【請求項２８】
ピルビン酸カルボキシラーゼが、ラクトバチルス・ラクティス（Lactobacillus lactis）またはソルガム・ブルガレ（Sorghum vulgare）またはリゾピウム・エトリ（Rhizopium etli）由来である、請求項２７記載の細菌株。
【請求項２９】
ＸＺ３２０、ＸＺ３３２、ＸＺ３４３１、ＸＺ４６８、ＸＺ４６９、ＸＺ４７０、ＸＺ６１３、ＸＺ６１５、ＸＺ６１６、ＸＺ６１８、ＸＺ６２０、ＸＺ６４７、ＸＺ７１２１、またはＸＺ７２３である、遺伝的に改変された細菌細胞。
【請求項３０】
（ａ）不活性化されたｌｄｈＡ；（ｂ）不活性化されたｆｏｃＡ；（ｃ）不活性化されたｐｆｌＢ；（ｄ）不活性化されたａｃｋＡ；（ｅ）不活性化されたｍｇｓＡ；（ｆ）不活性化されたａｄｈＥ；（ｇ）不活性化されたｔｄｃＤ；（ｈ）不活性化されたｔｄｃＥ；（ｉ）不活性化されたａｓｐＣ；（ｊ）不活性化されたｓｆｃＡ；（ｋ）不活性化されたｐｔｓＨ；（ｌ）不活性化されたｃｉｔＤおよび（ｍ）アップレギュレーションされたｐｃｋを含むエシェリキア・コリ（Escherichia coli）細菌株。
【請求項３１】
前記細菌株が、２％〜２０％(w/v)のグルコースを含む最小塩培地中でグルコース１molあたり少なくとも０．１molのコハク酸を生産する、請求項２９または３０記載の細菌細胞。
【請求項３２】
（ａ）請求項１記載の細菌株を培養すること；
（ｂ）炭素源を提供すること；
（ｃ）該細菌に該炭素源を代謝させること；および
（ｄ）コハク酸を単離すること
を含む、コハク酸を生産する方法。
【請求項３３】
前記細菌株が、嫌気性条件、好気性条件、微好気性条件またはその組み合わせで培養される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記細菌株が、最少塩成長培地中で培養される、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記最少塩成長培地が、２％〜２０％(w/v)の炭素源を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
前記炭素源が、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース（arbinose）、ガラクトース、マンノース、ラムノース、スクロース、セロビオース、ヘミセルロース、グリセロールまたはその組み合わせである、請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
前記培養が、バッチプロセスまたは流加プロセスである、請求項３２記載の方法。
【請求項３８】
前記培養が、連続プロセスである、請求項３２記載の方法。
【請求項３９】
ｇｌｄＡ遺伝子における突然変異をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項４０】
ｄｈａＫＬＭオペロンにおける突然変異をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項４１】
（ａ）ｇｌｄＡにおける突然変異；および（ｂ）ｄｈａＫＬＭオペロンにおける突然変異をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項４２】
（ａ）ｇｌｄＡにおける突然変異；（ｂ）ｄｈａＫＬＭオペロンにおける突然変異；および（ｃ）ホスホトランスフェラーゼ系におけるタンパク質をコードする１または複数の遺伝子における突然変異をさらに含む。請求項１記載の細菌細胞。
【請求項４３】
（ａ）ｇｌｄＡにおける突然変異；（ｂ）ｄｈａＫＬＭオペロンにおける突然変異；（ｃ）ホスホトランスフェラーゼ系におけるタンパク質をコードする１または複数の遺伝子における突然変異；および（ｄ）発酵経路に関与するタンパク質をコードする１または複数の遺伝子における突然変異をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項４４】
前記ｐｃｋ転写物が内因性ｐｃｋ転写物である、請求項１〜３０または３９〜４３のいずれか一項記載の細菌細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年４月２日に提出された米国特許仮出願第６１／１６６，０９３号の優先権を主張する。本出願は、２００９年９月３日に提出された米国特許出願第１２／５２９，８２６号の一部継続出願でもあり、その一部継続出願は、２００９年３月１９日に提出されたPCT/US2008/057439の米国国内段階の出願であり、その出願は、２００７年３月２０日に提出された米国特許仮出願第６０／８９５，８０６号の利益を主張し、それらの各々の開示は、全ての図、表及びアミノ酸配列又は核酸配列を含めたその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、エネルギー省助成金第ＵＳＤＯＥ−ＤＥ  ＦＧ０２−９６ＥＲ２０２２２号及びエネルギー省・米国農務省の合同助成金第ＵＳＤＡ  ＆  ＤＯＥ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ＲＤＩ  ＤＥ  ＦＧ３６−０４ＧＯ１４０１９号から与えられた助成金に基づいて政府の支援の下でなされたものである。政府は、本発明にある一定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
本発明は、微生物性生物触媒を使用する再生可能な生物学的供給原料からのコハク酸生産の分野にある。本発明は、コハク酸生産に関して高い効率を達成することに有用な生物触媒への遺伝的改変を開示する。さらに具体的には、本発明は、商業的に重要な量で再生可能な供給原料からコハク酸を生産するために適した、遺伝的に改変された生物触媒を提供する。
【０００４】
「Top value added chemicals from biomass」という標題の２００４年米国エネルギー省報告書は、再生可能な供給原料から生産することのできる１２種の基本構成単位の化学物質を同定している。その１２種の糖ベースの基本構成単位は、１，４−二酸（コハク酸、フマル酸及びマレイン酸）、２，５−フランジカルボン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アスパラギン酸、グルカル酸、グルタミン酸、イタコン酸、レブリン酸、３−ヒドロキシブチロラクトン、グリセロール、ソルビトール、及びキシリトール／アラビニトールである。再生可能な供給原料からのこれらの基本構成単位の化学物質の発酵生産は、石油の価格が増加すると共にますます競争が激化するようになるであろう。
【０００５】
これらの基本構成単位の化学物質は、新しいファミリーの有用分子に変わる潜在性を有する、多官能基を有する分子である。これらの１２種の、基本構成単位の化学物質は、続いていくつかの高価値の生物系化学物質又は生物系物質に変換することができる。例えば、コハク酸は、現在は石油から作られているプラスチック、溶媒、及び他の化学物質に変えるのための基質として役立つことがある（Lee et al., 2004; Lee et al., 2005; McKinlay et al., 2007; Wendisch et al., 2006; Zeikus et al., 1999）。多数の細菌が、主発酵産物としてコハク酸を生産する自然能力を有すると記載されている（表１）。しかしながら、これらのコハク酸生産性天然微生物からコハク酸を生産するには、複雑なプロセス、高価な成長培地及び長いインキュベーション時間が必要とされることが多い。
【０００６】
以前にコハク酸生産用のEscherichia coli株を工学処理するために多様な遺伝的アプローチが用いられ、様々な程度の成功を収めてきた（表１）。大部分の研究では、達成された力価は低く、酵母エキス又はコーンスチープリカーのような複合培地成分が必要とされた。E. coli ＮＺＮ１１１株は１０８mMのコハク酸を生産し、代謝されたグルコース１molあたりコハク酸のモル収量は０．９８molであった（Chatterjee et al., 2001; Millard et al., 1996; Stols and Donnelly, 1997）。この株は、２種の遺伝子（ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードするｐｆｌＢ及び乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈＡ）を不活性化し、マルチコピープラスミドから２種のE. coli遺伝子、すなわちリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）を過剰発現させることによって工学処理された。E. coli ＨＬ２７６５９ｋ株は、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ｓｄｈＡＢ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）、グルコース輸送体（ｐｔｓＧ）、及びイソクエン酸リアーゼリプレッサー（ｉｃｌＲ）を突然変異させることによって工学処理された。この株は、１００mM未満のコハク酸を生産し、酸素制限的な発酵条件を必要とした（Cox et al., 2006; Lin et al., 2005a, 2005b, 2005c; Yun et al., 2005）。Mannheimia succiniciproducensにおけるネイティブなコハク酸経路に類似の経路をE. coliにおいて作り出すための遺伝子ノックアウトを設計するために、代謝のin silico分析が使用されている（Lee et al., 2005 and 2006）。しかしながら、結果として生じた株は、コハク酸をほとんど生産しなかった。Anderssonら（2007）は、ネイティブな遺伝子だけを有する工学処理E. coliによる最高レベルのコハク酸生産（３３９mM）を報告している。
【０００７】
他の研究者らは、E. coliにおいて異種遺伝子を発現させる代替アプローチを追究している。コハク酸への炭素フローを指令するマルチコピープラスミドから、Rhizobium etelotiピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）が過剰発現された（Gokarn et al., 2000; Vemuri et al., 2002a, 2002b）。ＳＢＳ５５０ＭＧ株は、イソクエン酸リアーゼリプレッサー（ｉｃｌＲ）、ａｄｈＥ、ｌｄｈＡ、及びａｃｋＡを不活性化し、マルチコピープラスミドからBacillus subtilis ｃｉｔＺ（クエン酸シンターゼ）及びR. etli ｐｙｃを過剰発現させることによって構築された（Sanchez et al., 2005a）。この株を用いてグルコースから１６０mMのコハク酸が生産され、モル収量は１．６であった。
【０００８】
コハク酸生産のために、さらに複雑なプロセスも検討された（表１）。これらのプロセスの多くには、好気性成長期に続く嫌気性生産期が含まれる。嫌気性期は、しばしば二酸化炭素、水素、又はその両者が供給される（Andersson et al., 2007; Sanchez et al., 2005a and 2005b; Sanchez et al., 2006；米国特許第５，８６９，３０１号；Vemuri et al., 2002a and 2002b）。ネイティブなコハク酸生産菌A. succiniciproducensを用いた最近の研究では、高い収量、力価及び生産性でグルコースからコハク酸を生産するために、電気透析、ＣＯ２スパージング、細胞のリサイクル、及びバッチ補給が組み合わされた（Meynial-Salles et al., 2007）。
【０００９】
E. coliの科学的知見の圧倒的大多数は、本明細書において報告された研究に使用された５％(w/v)グルコース（２７８mM）及び１０％(w/v)グルコース（５５５mM）よりもむしろ低濃度の糖基質（典型的には０．２％w/v；１１mM）を使用した、無機塩培地よりもむしろLuria液体培地などの複合培地における研究に由来する。商業的に重要なレベルの産物を生産するためには多量の糖が必要である。以前の研究者は、複合培地でコハク酸を生産するための多数のE. coli派生株の構築を記載している（表１）。複合培地を用いた場合、主経路に基づく合理的設計が代謝工学処理の学術的実証にかなり成功している。しかし、細菌発酵産物の生産のための複合栄養素の使用は、原料のコスト、精製のコスト、及び廃棄物処理に関連するコストを増加させる。複合培地成分を有さない無機塩培地を使用する方が、費用効果がずっと高いはずである。
【００１０】
E. coli Ｃは、グルコースを含有するＮＢＳ無機塩培地中で良好に成長し、発酵産物として乳酸、酢酸、エタノール及びコハク酸の混合物を生産する（図１Ａ；表４）。E. coliを用いた他の研究とは対照的に（表１）、本明細書に報告された研究は、原料、コハク酸塩精製、及び廃棄物処理のコストを最小限にするために無機塩培地を使用して、高レベルの糖をコハク酸に変換することのできる株の発生に焦点を合わせている。
【００１１】
本発明の一局面は、異種遺伝子もプラスミドも必要とせずに、ｐＨコントロールされた単純なバッチ発酵の間に無機塩培地において高い力価及び収量でコハク酸を生産する、様々な株のE. coliを提供する。驚くことに本発明者らは、高いコハク酸生産効率を達成するための生物触媒の遺伝的操作に有用ないくつかのターゲット遺伝子を同定した。
【００１２】
発明の簡単な概要
生物学的供給原料を使用してコハク酸を製造するための生物触媒を得るための方法を提供することが、本発明の目的である。生物学的供給原料からコハク酸を生産するための生物触媒を得るための方法は、合理的な遺伝的操作と代謝進化のプロセスとを組み合わせるものである。
【００１３】
微生物代謝経路に関する本発明者らの既存の知識から得られた合理的設計を使用して、生物学的供給原料からコハク酸を生産するための生物触媒を生成させる場合に、細菌染色体内の遺伝子セットが不活性化され、続いて望ましい表現型を有する株を選択するための代謝進化プロセスが行われる。
【００１４】
本発明の一局面では、細菌染色体中の遺伝子の突然変異は、外因性遺伝物質を全く導入せずに成し遂げられる。
【００１５】
本発明の別の局面では、内因性遺伝子の突然変異は、内因性遺伝子のオープンリーディングフレームに点突然変異を導入すること又は終止コドンを導入することのいずれかによって成し遂げられる。
【００１６】
本発明の別の局面では、内因性遺伝子のオープンリーディングフレーム全体が染色体ＤＮＡから欠失される。
【００１７】
本発明のある好ましい態様では、ある内因性遺伝子の発現が顕著に増加される。本発明の一局面では、内因性遺伝子の転写が、その内因性遺伝子のプロモーター領域にある突然変異を導入することによって増加される。本発明の他の局面では、内因性遺伝子の転写が、ターゲット遺伝子の抑制性コントロールを復活させることによって高まる。
【００１８】
本発明のある局面では、望ましい表現型を有する突然変異遺伝子を有する細菌株を選択する目的で外因性ヌクレオチド配列を導入してターゲット遺伝子を不活性化することができる。本発明の最も好ましい局面では、微生物ゲノムに導入された外因性ヌクレオチド配列は、続いて、外因性ヌクレオチド配列を全く残さずにシームレスに除去される。
【００１９】
合理的に設計された遺伝的操作は、全てを１段階で、又は１回に１個の遺伝的変化を成し遂げる複数段階で行うことができる。所望の有機酸の収量、力価及び体積あたりの生産性を改善するために、遺伝的操作に起因する微生物株を代謝進化に供することができる。本発明の最も好ましい局面では、合理的な遺伝的操作は段階に分けて行われ、遺伝的操作の段階と段階の間に代謝進化のプロセスが実施される。
【００２０】
本発明の一態様では、代謝進化の間に起こる自然突然変異は、染色体ＤＮＡの適切な領域を配列決定することにより同定される。本発明のなお別の態様では、代謝進化の間に起こる突然変異は、被疑酵素の活性を測定することによって同定される。
【００２１】
本発明の一態様では、合理的設計に基づいて、発酵経路において機能することが知られているタンパク質をコードする１種又は複数種の遺伝子が、１個又は複数個の突然変異を通じて不活性化される。
【００２２】
本発明のなお別の局面では、発酵経路に直接関与するタンパク質をコードする遺伝子に加えて、発酵経路において機能するタンパク質をコードする遺伝子の機能的ホモログである遺伝子が不活性化される。
【００２３】
本発明の一態様では、ＴＣＡ回路内で機能している遺伝子は、コハク酸生産に向けた炭素フローが増加するように遺伝的に操作される。本発明の一局面では、ＴＣＡ回路の還元経路を介して炭素フローが高まる。本発明の別の局面では、ＴＣＡ回路の酸化経路を介して炭素フローが遺伝的に操作される。本発明の別の局面では、コハク酸への炭素フローは、ＴＣＡ回路と密接に関連するグリオキサル酸バイパス経路の遺伝的操作を通じて改良される。
【００２４】
本発明のなお別の態様では、ＴＣＡから細胞内の他の代謝経路への炭素フローは、細胞内の炭素プールがコハク酸生産に向けて送られるように遮断される。
【００２５】
本発明の別の態様では、ＴＣＡ回路への炭素フローは、細胞内のより多くのカルボキシル化酵素の１種へと導く遺伝的操作を通じて増強される。本発明の一局面では、１種又は複数種のカルボキシル化酵素の発現は、プロモーター領域の遺伝的操作を通じて、又は遺伝子発現の抑制を緩和することによって達成される。
【００２６】
本発明の別の態様では、細胞内のホスホエノールピルビン酸プールは、ホスホエノールピルビン酸を必要とする炭素取込み経路に関与する遺伝子を突然変異させることによって一定に保たれる。本発明の一局面では、炭素取込みのためのホスホトランスフェラーゼ系は、ＴＣＡ回路の作動のために利用可能なホスホエノールピルビン酸を一定に保つために不活性化される。
【００２７】
本発明は、コハク酸生産の増加を達成するために遺伝的に操作することのできるターゲットの数を例示する。本発明に記載されたこれらの様々なターゲットの全ては、コハク酸の生産改善を達成するために遺伝的に操作することができる。最も好ましい態様では、最少数のターゲットが、望ましいコハク酸生産速度を達成する遺伝的操作のために選択される。
【００２８】
本発明の好ましい態様では、生物触媒は、それらが高い力価、収量及び体積あたりの生産性でコハク酸を生産する能力について選択される。本発明の最も好ましい局面では、消費される炭素源１molあたり少なくとも１．０molのコハク酸を生産することのできる生物触媒が好ましい。
【００２９】
本発明の別の最も好ましい態様では、生物触媒は、代謝進化の間にそれが無機塩培地中で消費される炭素源１molあたり少なくとも１．０molのコハク酸を生産する能力及びコハク酸生産と微生物の成長との関係について選択される。
【００３０】
本発明のなお別の態様では、供給原料としてグリセロールを使用してコハク酸を生産可能な生物触媒が提供される。
【００３１】
本発明の追加的な利点は、次に提供される発明の詳細な説明及び実施例から容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】グルコースからコハク酸への発酵を示す図である。図１Ａは、E. coliによるグルコース発酵についての標準経路を示す。この経路は、Unden及びKleefeld（2004）から描き直したものである。太い矢印は、中心的な発酵経路を表す。×印は、本研究においてＫＪ０１２（ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ）を工学処理するために行われた遺伝子欠失を表す。遺伝子及び酵素：ｌｄｈＡ、乳酸デヒドロゲナーゼ；ｐｆｌＢ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ；ｆｏｃＡ、ギ酸輸送体；ｐｔａ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ；ａｃｋＡ、酢酸キナーゼ；ａｄｈＥ、アルコールデヒドロゲナーゼ；ｐｐｃ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ；ｐｄｈ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体；ｇｌｔＡ、クエン酸シンターゼ；ｍｄｈ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ；ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、及びｆｕｍＣ、フマラーゼアイソザイム；ｆｒｄＡＢＣＤ、フマル酸レダクターゼ；ｆｄｈ、ギ酸デヒドロゲナーゼ；ｉｃｄ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ；ａｃｓ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ；ｍｇｓＡ、メチルグリオキサールシンターゼ；ｐｏｘＢ、ピルビン酸オキシダーゼ；ａｌｄＡ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ；及びａｌｄＢ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ。図１Ｂは、グルコース発酵の標準経路についてのE. coli工学処理株におけるＡＴＰ生産及び成長とコハク酸生産との関連を示す。実線矢印はＮＡＤＨプールを繋ぐものである。点線矢印はＮＡＤ＋プールを繋ぐものである。嫌気性条件下での解糖の間、成長はＡＴＰ生産及びＮＡＤＨ酸化と無条件に関連する。
【図１Ｂ】グルコースからコハク酸への発酵を示す図である。図１Ａは、E. coliによるグルコース発酵についての標準経路を示す。この経路は、Unden及びKleefeld（2004）から描き直したものである。太い矢印は、中心的な発酵経路を表す。×印は、本研究においてＫＪ０１２（ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ）を工学処理するために行われた遺伝子欠失を表す。遺伝子及び酵素：ｌｄｈＡ、乳酸デヒドロゲナーゼ；ｐｆｌＢ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ；ｆｏｃＡ、ギ酸輸送体；ｐｔａ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ；ａｃｋＡ、酢酸キナーゼ；ａｄｈＥ、アルコールデヒドロゲナーゼ；ｐｐｃ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ；ｐｄｈ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体；ｇｌｔＡ、クエン酸シンターゼ；ｍｄｈ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ；ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、及びｆｕｍＣ、フマラーゼアイソザイム；ｆｒｄＡＢＣＤ、フマル酸レダクターゼ；ｆｄｈ、ギ酸デヒドロゲナーゼ；ｉｃｄ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ；ａｃｓ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ；ｍｇｓＡ、メチルグリオキサールシンターゼ；ｐｏｘＢ、ピルビン酸オキシダーゼ；ａｌｄＡ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ；及びａｌｄＢ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ。図１Ｂは、グルコース発酵の標準経路についてのE. coli工学処理株におけるＡＴＰ生産及び成長とコハク酸生産との関連を示す。実線矢印はＮＡＤＨプールを繋ぐものである。点線矢印はＮＡＤ＋プールを繋ぐものである。嫌気性条件下での解糖の間、成長はＡＴＰ生産及びＮＡＤＨ酸化と無条件に関連する。
【図２Ａ】E. coliによるコハク酸生産の潜在的カルボキシル化経路を示す図である。主要なカルボキシル化酵素をコードする遺伝子を太字で示す。図２Ａは、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ酵素（ＰＰＣ）によって触媒される反応を示す。ＰＰＣ酵素によるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）のカルボキシル化からＡＴＰは生産されない。これは、グルコース発酵の間のE. coliによるコハク酸生産のための主経路と見なされる。図２Ｂは、ＮＡＤＨ依存性リンゴ酸酵素を示す。ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＡ又はｐｙｋＦ）によるＡＤＰ及びＰＥＰからのＡＴＰ生産の間にエネルギーは保存される。リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ）は、ＮＡＤＨ連結型（NADH-linked）の還元的カルボキシル化を触媒してリンゴ酸を生産する。図２Ｃは、ＮＡＤＰＨ依存性リンゴ酸酵素を示す。ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＡ又はｐｙｋＦ）によるＡＤＰ及びＰＥＰからのＡＴＰ生産の間にエネルギーは保存される。リンゴ酸酵素（ｍａｅＢ）は、ＮＡＤＰＨ連結型還元的カルボキシル化を触媒してリンゴ酸を生産する。図２Ｄは、ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）によって触媒される反応を示す。ＰＥＰがカルボキシル化されてオキサロ酢酸が生産される間に、ＡＴＰの生産によってエネルギーは保存される。
【図２Ｂ】E. coliによるコハク酸生産の潜在的カルボキシル化経路を示す図である。主要なカルボキシル化酵素をコードする遺伝子を太字で示す。図２Ａは、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ酵素（ＰＰＣ）によって触媒される反応を示す。ＰＰＣ酵素によるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）のカルボキシル化からＡＴＰは生産されない。これは、グルコース発酵の間のE. coliによるコハク酸生産のための主経路と見なされる。図２Ｂは、ＮＡＤＨ依存性リンゴ酸酵素を示す。ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＡ又はｐｙｋＦ）によるＡＤＰ及びＰＥＰからのＡＴＰ生産の間にエネルギーは保存される。リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ）は、ＮＡＤＨ連結型（NADH-linked）の還元的カルボキシル化を触媒してリンゴ酸を生産する。図２Ｃは、ＮＡＤＰＨ依存性リンゴ酸酵素を示す。ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＡ又はｐｙｋＦ）によるＡＤＰ及びＰＥＰからのＡＴＰ生産の間にエネルギーは保存される。リンゴ酸酵素（ｍａｅＢ）は、ＮＡＤＰＨ連結型還元的カルボキシル化を触媒してリンゴ酸を生産する。図２Ｄは、ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）によって触媒される反応を示す。ＰＥＰがカルボキシル化されてオキサロ酢酸が生産される間に、ＡＴＰの生産によってエネルギーは保存される。
【図２Ｃ】E. coliによるコハク酸生産の潜在的カルボキシル化経路を示す図である。主要なカルボキシル化酵素をコードする遺伝子を太字で示す。図２Ａは、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ酵素（ＰＰＣ）によって触媒される反応を示す。ＰＰＣ酵素によるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）のカルボキシル化からＡＴＰは生産されない。これは、グルコース発酵の間のE. coliによるコハク酸生産のための主経路と見なされる。図２Ｂは、ＮＡＤＨ依存性リンゴ酸酵素を示す。ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＡ又はｐｙｋＦ）によるＡＤＰ及びＰＥＰからのＡＴＰ生産の間にエネルギーは保存される。リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ）は、ＮＡＤＨ連結型（NADH-linked）の還元的カルボキシル化を触媒してリンゴ酸を生産する。図２Ｃは、ＮＡＤＰＨ依存性リンゴ酸酵素を示す。ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＡ又はｐｙｋＦ）によるＡＤＰ及びＰＥＰからのＡＴＰ生産の間にエネルギーは保存される。リンゴ酸酵素（ｍａｅＢ）は、ＮＡＤＰＨ連結型還元的カルボキシル化を触媒してリンゴ酸を生産する。図２Ｄは、ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）によって触媒される反応を示す。ＰＥＰがカルボキシル化されてオキサロ酢酸が生産される間に、ＡＴＰの生産によってエネルギーは保存される。
【図２Ｄ】E. coliによるコハク酸生産の潜在的カルボキシル化経路を示す図である。主要なカルボキシル化酵素をコードする遺伝子を太字で示す。図２Ａは、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ酵素（ＰＰＣ）によって触媒される反応を示す。ＰＰＣ酵素によるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）のカルボキシル化からＡＴＰは生産されない。これは、グルコース発酵の間のE. coliによるコハク酸生産のための主経路と見なされる。図２Ｂは、ＮＡＤＨ依存性リンゴ酸酵素を示す。ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＡ又はｐｙｋＦ）によるＡＤＰ及びＰＥＰからのＡＴＰ生産の間にエネルギーは保存される。リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ）は、ＮＡＤＨ連結型（NADH-linked）の還元的カルボキシル化を触媒してリンゴ酸を生産する。図２Ｃは、ＮＡＤＰＨ依存性リンゴ酸酵素を示す。ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＡ又はｐｙｋＦ）によるＡＤＰ及びＰＥＰからのＡＴＰ生産の間にエネルギーは保存される。リンゴ酸酵素（ｍａｅＢ）は、ＮＡＤＰＨ連結型還元的カルボキシル化を触媒してリンゴ酸を生産する。図２Ｄは、ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）によって触媒される反応を示す。ＰＥＰがカルボキシル化されてオキサロ酢酸が生産される間に、ＡＴＰの生産によってエネルギーは保存される。
【図３Ａ】ＫＪ０１２を代謝進化させてＫＪ０１７、ＫＪ０３２、及びＫＪ０６０を作出する間の成長を示す図である。ＫＪ０１２株を５％(w/v)グルコースを含有するＮＢＳ培地（図３Ａ）及び１０％(w/v)グルコースを含有するＮＢＳ培地（図３Ｂ）にそれぞれ連続的に移植し、ＫＪ０１７を作出する。ｆｏｃＡ及びｐｆｌＢの欠失後、結果として生じた株（ＫＪ０３２）を最初は酢酸塩を補充した培地に継代した（図３Ｃ）。さらなる移植を行ってＫＪ０６０を作出する間に酢酸レベルは減少し、続いて排除された。破線は、酢酸塩不在下でのＫＪ０１７による発酵を比較のために付記したものを表す。記号：●＝ＯＤ５５０nmでの吸光度。
【図３Ｂ】ＫＪ０１２を代謝進化させてＫＪ０１７、ＫＪ０３２、及びＫＪ０６０を作出する間の成長を示す図である。ＫＪ０１２株を５％(w/v)グルコースを含有するＮＢＳ培地（図３Ａ）及び１０％(w/v)グルコースを含有するＮＢＳ培地（図３Ｂ）にそれぞれ連続的に移植し、ＫＪ０１７を作出する。ｆｏｃＡ及びｐｆｌＢの欠失後、結果として生じた株（ＫＪ０３２）を最初は酢酸塩を補充した培地に継代した（図３Ｃ）。さらなる移植を行ってＫＪ０６０を作出する間に酢酸レベルは減少し、続いて排除された。破線は、酢酸塩不在下でのＫＪ０１７による発酵を比較のために付記したものを表す。記号：●＝ＯＤ５５０nmでの吸光度。
【図３Ｃ】ＫＪ０１２を代謝進化させてＫＪ０１７、ＫＪ０３２、及びＫＪ０６０を作出する間の成長を示す図である。ＫＪ０１２株を５％(w/v)グルコースを含有するＮＢＳ培地（図３Ａ）及び１０％(w/v)グルコースを含有するＮＢＳ培地（図３Ｂ）にそれぞれ連続的に移植し、ＫＪ０１７を作出する。ｆｏｃＡ及びｐｆｌＢの欠失後、結果として生じた株（ＫＪ０３２）を最初は酢酸塩を補充した培地に継代した（図３Ｃ）。さらなる移植を行ってＫＪ０６０を作出する間に酢酸レベルは減少し、続いて排除された。破線は、酢酸塩不在下でのＫＪ０１７による発酵を比較のために付記したものを表す。記号：●＝ＯＤ５５０nmでの吸光度。
【図４Ａ】コハク酸生産のために株を代謝進化させる間の発酵産物の概要を示す図である。表示したように培養物に酢酸ナトリウムを補充した。黒の矢印は、本文に示したように発酵条件の推移を表す。ＫＪ０３２の代謝進化の間にギ酸は検出されず、少量の乳酸だけが検出された。ＫＪ０７０及びＫＪ０７２の代謝進化の間にギ酸及び乳酸は検出されなかった。５％w/vグルコースを含有する培地（図４Ａ）中及び１０％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｂ）中でのＫＪ０１２からＫＪ０１７への代謝進化。５％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｃ）中及び１０％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｄ）中でのＫＪ０３２からＫＪ０６０への代謝進化。１０％グルコースを含有する培地中でのＫＪ０７０からＫＪ０７１への代謝進化（図４Ｅ）。１０％グルコースを含有する培地中でのＫＪ０７２からＫＪ０７３への代謝進化（図４Ｆ）。
【化１】
2015164429.tif 000002
【図４Ｂ】コハク酸生産のために株を代謝進化させる間の発酵産物の概要を示す図である。表示したように培養物に酢酸ナトリウムを補充した。黒の矢印は、本文に示したように発酵条件の推移を表す。ＫＪ０３２の代謝進化の間にギ酸は検出されず、少量の乳酸だけが検出された。ＫＪ０７０及びＫＪ０７２の代謝進化の間にギ酸及び乳酸は検出されなかった。５％w/vグルコースを含有する培地（図４Ａ）中及び１０％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｂ）中でのＫＪ０１２からＫＪ０１７への代謝進化。５％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｃ）中及び１０％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｄ）中でのＫＪ０３２からＫＪ０６０への代謝進化。１０％グルコースを含有する培地中でのＫＪ０７０からＫＪ０７１への代謝進化（図４Ｅ）。１０％グルコースを含有する培地中でのＫＪ０７２からＫＪ０７３への代謝進化（図４Ｆ）。
【化２】
2015164429.tif 000003
【図４Ｃ】コハク酸生産のために株を代謝進化させる間の発酵産物の概要を示す図である。表示したように培養物に酢酸ナトリウムを補充した。黒の矢印は、本文に示したように発酵条件の推移を表す。ＫＪ０３２の代謝進化の間にギ酸は検出されず、少量の乳酸だけが検出された。ＫＪ０７０及びＫＪ０７２の代謝進化の間にギ酸及び乳酸は検出されなかった。５％w/vグルコースを含有する培地（図４Ａ）中及び１０％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｂ）中でのＫＪ０１２からＫＪ０１７への代謝進化。５％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｃ）中及び１０％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｄ）中でのＫＪ０３２からＫＪ０６０への代謝進化。１０％グルコースを含有する培地中でのＫＪ０７０からＫＪ０７１への代謝進化（図４Ｅ）。１０％グルコースを含有する培地中でのＫＪ０７２からＫＪ０７３への代謝進化（図４Ｆ）。
【化３】
2015164429.tif 000004
【図４Ｄ】コハク酸生産のために株を代謝進化させる間の発酵産物の概要を示す図である。表示したように培養物に酢酸ナトリウムを補充した。黒の矢印は、本文に示したように発酵条件の推移を表す。ＫＪ０３２の代謝進化の間にギ酸は検出されず、少量の乳酸だけが検出された。ＫＪ０７０及びＫＪ０７２の代謝進化の間にギ酸及び乳酸は検出されなかった。５％w/vグルコースを含有する培地（図４Ａ）中及び１０％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｂ）中でのＫＪ０１２からＫＪ０１７への代謝進化。５％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｃ）中及び１０％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｄ）中でのＫＪ０３２からＫＪ０６０への代謝進化。１０％グルコースを含有する培地中でのＫＪ０７０からＫＪ０７１への代謝進化（図４Ｅ）。１０％グルコースを含有する培地中でのＫＪ０７２からＫＪ０７３への代謝進化（図４Ｆ）。
【化４】
2015164429.tif 000005
【図４Ｅ】コハク酸生産のために株を代謝進化させる間の発酵産物の概要を示す図である。表示したように培養物に酢酸ナトリウムを補充した。黒の矢印は、本文に示したように発酵条件の推移を表す。ＫＪ０３２の代謝進化の間にギ酸は検出されず、少量の乳酸だけが検出された。ＫＪ０７０及びＫＪ０７２の代謝進化の間にギ酸及び乳酸は検出されなかった。５％w/vグルコースを含有する培地（図４Ａ）中及び１０％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｂ）中でのＫＪ０１２からＫＪ０１７への代謝進化。５％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｃ）中及び１０％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｄ）中でのＫＪ０３２からＫＪ０６０への代謝進化。１０％グルコースを含有する培地中でのＫＪ０７０からＫＪ０７１への代謝進化（図４Ｅ）。１０％グルコースを含有する培地中でのＫＪ０７２からＫＪ０７３への代謝進化（図４Ｆ）。
【化５】
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【図４Ｆ】コハク酸生産のために株を代謝進化させる間の発酵産物の概要を示す図である。表示したように培養物に酢酸ナトリウムを補充した。黒の矢印は、本文に示したように発酵条件の推移を表す。ＫＪ０３２の代謝進化の間にギ酸は検出されず、少量の乳酸だけが検出された。ＫＪ０７０及びＫＪ０７２の代謝進化の間にギ酸及び乳酸は検出されなかった。５％w/vグルコースを含有する培地（図４Ａ）中及び１０％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｂ）中でのＫＪ０１２からＫＪ０１７への代謝進化。５％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｃ）中及び１０％w/vグルコースを含有する培地（図４Ｄ）中でのＫＪ０３２からＫＪ０６０への代謝進化。１０％グルコースを含有する培地中でのＫＪ０７０からＫＪ０７１への代謝進化（図４Ｅ）。１０％グルコースを含有する培地中でのＫＪ０７２からＫＪ０７３への代謝進化（図４Ｆ）。
【化６】
2015164429.tif 000007
【図５】コハク酸生産のための生物触媒としてのE. coli Ｃの遺伝的工学処理及び代謝進化におけるステップを要約する略図である。このプロセスは、２０００世代を超える成長ベース選択を提供する２６１回の連続移植に相当する。各方式の最終培養物からクローンを単離し、株の呼称を割り当て、表４のカッコ内に示す。
【図６】グルコース６−リン酸の発酵についての標準経路を関連経路と共に示す図であって、コハク酸生産のために工学処理された構築物で計画的に欠失された遺伝子を示す図である。実線の矢印は、中心的発酵経路を表す。破線の矢印は、ピルビン酸から酢酸への酸化のための微好気性経路を表す。点線の矢印は、普通は好気性代謝の間に機能するグリオキシル酸バイパスを含めた経路を示す。四角で囲んだ×印は、ＫＪ０１２及びＫＪ０１７を構築するために使用された３個の最初の遺伝子欠失（ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ）を表す。飾りの付いていない×印は、ＫＪ０１７派生株の構築の間に欠失された追加的な遺伝子に印を付けたものである：ＫＪ０３２（ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ、ｆｏｃＡ、ｐｆｌＢ）、及びＫＪ０７０（ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ、ｆｏｃＡ、ｐｆｌＢ、ｍｇｓＡ）、及びＫＪ０７２（ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ、ｆｏｃＡ、ｐｆｌＢ、ｍｇｓＡ、ｐｏｘＢ）。遺伝子及び酵素：ｌｄｈＡ、乳酸デヒドロゲナーゼ；ｆｏｃＡ、ギ酸輸送体；ｐｆｌＢ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ；ｐｔａ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ；ａｃｋＡ、酢酸キナーゼ；ａｄｈＥ、アルコールデヒドロゲナーゼ；ｐｐｃ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ；ｐｄｈ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体；ｇｌｔＡ、クエン酸シンターゼ；ｍｄｈ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ；ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、及びｆｕｍＣ、フマラーゼアイソザイム；ｆｒｄＡＢＣＤ、フマル酸レダクターゼ；ｆｄｈ、ギ酸デヒドロゲナーゼ；ｍｇｓＡ、メチルグリオキサールシンターゼ；ｇｌｏＡＢ、グリオキシラーゼＩ及びＩＩ；ｐｏｘＢ、ピルビン酸オキシダーゼ；ａｃｅＡ、イソクエン酸リアーゼ；ａｃｅＢ、リンゴ酸シンターゼ；ａｃｎＡＢ、アコニターゼ；ならびにａｃｓ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ。
【図７Ａ】１０％グルコース(w/v)を有する無機塩培地中でのE. coli Ｃ派生株によるコハク酸及びリンゴ酸の生産を示す図である。図７Ａは、ＡＭ１培地中でのＫＪ０６０によるコハク酸生産を示す。図７Ｂは、ＡＭ１培地中でのＫＪ０７３によるコハク酸生産を示す。図７Ｃは、ＮＢＳ培地中でのＫＪ０７１によるリンゴ酸生産を示す。発酵物は、３３mg DCW l-1のレベルで植菌されたものである。図７Ａ〜７Ｃについての記号：○、グルコース；●、コハク酸；■、リンゴ酸；△、細胞量。
【図７Ｂ】１０％グルコース(w/v)を有する無機塩培地中でのE. coli Ｃ派生株によるコハク酸及びリンゴ酸の生産を示す図である。図７Ａは、ＡＭ１培地中でのＫＪ０６０によるコハク酸生産を示す。図７Ｂは、ＡＭ１培地中でのＫＪ０７３によるコハク酸生産を示す。図７Ｃは、ＮＢＳ培地中でのＫＪ０７１によるリンゴ酸生産を示す。発酵物は、３３mg DCW l-1のレベルで植菌されたものである。図７Ａ〜７Ｃについての記号：○、グルコース；●、コハク酸；■、リンゴ酸；△、細胞量。
【図７Ｃ】１０％グルコース(w/v)を有する無機塩培地中でのE. coli Ｃ派生株によるコハク酸及びリンゴ酸の生産を示す図である。図７Ａは、ＡＭ１培地中でのＫＪ０６０によるコハク酸生産を示す。図７Ｂは、ＡＭ１培地中でのＫＪ０７３によるコハク酸生産を示す。図７Ｃは、ＮＢＳ培地中でのＫＪ０７１によるリンゴ酸生産を示す。発酵物は、３３mg DCW l-1のレベルで植菌されたものである。図７Ａ〜７Ｃについての記号：○、グルコース；●、コハク酸；■、リンゴ酸；△、細胞量。
【図８】プラスミドｐＬＯＩ４１６２の構築に携わるステップを示す図である。ｐＥＬ０４及びｐＬＯＩ４１５２に付随する短い実線の矢印は、ＤＮＡ増幅に使用されたプライマーを表す。
【図９】ＫＪ０７３におけるグルコース６−リン酸からのコハク酸生産を示す図である。本研究においてコハク酸生産に関与する主要カルボキシル化酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするｐｃｋ遺伝子を白抜きで示す。実線の矢印は、グルコースの嫌気性発酵の間に機能すると予想される反応を示す。実線の×印は、欠失された遺伝子を示す。四角で囲んだ×印は、コハク酸生産のための最初の株ＫＪ０１７（ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ）を構築するために使用された主要な欠失を表す。破線は、典型的には微好気性条件下でのみ機能するプロセスである、ｐｏｘＢによるピルビン酸から酢酸への酸化を表す。点線は、主に好気性代謝に関連する反応を示す。遺伝子及び酵素：ｌｄｈＡ、乳酸デヒドロゲナーゼ；ｐｆｌＢ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ；ｆｏｃＡ、ギ酸輸送体；ｐｔａ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ；ａｃｋＡ、酢酸キナーゼ；ａｄｈＥ、アルコールデヒドロゲナーゼ；ｐｃｋ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ｐｄｈ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体；ｇｌｔＡ、クエン酸シンターゼ；ｍｄｈ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ；ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、及びｆｕｍＣ、フマラーゼアイソザイム；ｆｒｄＡＢＣＤ、フマル酸レダクターゼ；ｆｄｈ、ギ酸デヒドロゲナーゼ；ｉｃｄ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ；ａｃｓ、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ；ｍｇｓＡ、メチルグリオキサールシンターゼ；ｐｏｘＢ、ピルビン酸オキシダーゼ；ａｌｄＡ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ；及びａｌｄＢ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ。ｔｄｃＥ遺伝子（ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ｐｆｌＢと相同）及びｔｃｄＤ遺伝子（プロピオン酸キナーゼ、ａｃｋＡと相同）をカッコ内に示すが、それらは典型的にはトレオニン分解の間に発現される。
【図１０】欠失された追加的な遺伝子の経路（実線の×印）を図解する代謝の拡大部分を示す図である。コハク酸及び酢酸は、ＫＪ０７３発酵からの主産物である（四角で囲む）。遺伝子及び酵素：ｃｉｔＤＥＦ、クエン酸リアーゼ；ｇｌｔＡ、クエン酸シンターゼ；ａｓｐＣ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ｐｃｋ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ｓｆｃＡ、ＮＡＤ＋連結型リンゴ酸酵素；ｆｕｍＡ及びｆｕｍＢ、フマラーゼ；ｆｒｄＡＢＣＤ、フマル酸レダクターゼ；ｐｙｋＡ及びｐｙｋＦ、ピルビン酸キナーゼ；ｔｄｃＥ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌＢホモログ）；ｐｔａ、リン酸トランスアセチラーゼ；ｔｃｄＤ、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡホモログ）。
【図１１】コハク酸生産のために工学処理されたE. coli株におけるグルコース発酵を示す図である。５個の黒い星印は、欠失を構築することによって遮断された代謝ステップを示す。２個の白い星印は、代謝進化の間に獲得された突然変異によって遮断された代謝ステップを示す。点線の矢印は、コハク酸生産突然変異体（ＫＪ０６０及びＫＪ０７３）における非機能的活性又は弱機能的活性を示す。縦方向の太い矢印は、ＫＪ０６０及びＫＪ０７３におけるコハク酸生産のために主経路を示す。この経路は、コハク酸生産ルーメン細菌の経路と機能的に等価である。２種の遺伝子ｇａｌＰ及びｐｃｋは、株の発生の間に転写活性化された。ｐｔｓＩにおける欠失は、成長ベースの選択の間に獲得され（白い星印）、取込み及びリン酸化のためのネイティブなグルコースホスホトランスフェラーゼ系を不活性化する。続いてｇａｌＰは、グルコキナーゼ（ｇｌｋ）によるＡＴＰ依存性リン酸化と共にグルコースについての主輸送体として役立つことが見出された。
【図１２Ａ】工学処理されたコハク酸生産株の転写物存在度の比較を示す図である。図１２Ａは、E. coliのＡＴＣＣ８７３９、ＫＪ０１２、ＫＪ０１７、ＫＪ０６０、ＫＪ０７１及びＫＪ０７３株における遺伝子ｐｃｋ、ｐｐｃ、ｓｆｃＡ及びｍａｅＢについての転写物の相対存在度を示す。図１２Ｂは、グルコース利用に関係する遺伝子、すなわちE. coliのＡＴＣＣ８７３９、ＫＪ０１２、ＫＪ０１７、ＫＪ０６０、ＫＪ０７１及びＫＪ０７３株におけるｃｙａＡ、ｃｒｐ、ｐｔｓＧ、ｇａｌＰ及びｇｌｋについての転写物の相対存在度を示す図である。図１２Ｃは、E. coliのＡＴＣＣ８７３９、ＫＪ０１２、ＫＪ０１７、ＫＪ０６０、ＫＪ０７１及びＫＪ０７３株における遺伝子ｐｔｓＩ及びｃｒｒ遺伝子についての転写物の相対存在度を示す。
【図１２Ｂ】工学処理されたコハク酸生産株の転写物存在度の比較を示す図である。図１２Ａは、E. coliのＡＴＣＣ８７３９、ＫＪ０１２、ＫＪ０１７、ＫＪ０６０、ＫＪ０７１及びＫＪ０７３株における遺伝子ｐｃｋ、ｐｐｃ、ｓｆｃＡ及びｍａｅＢについての転写物の相対存在度を示す。図１２Ｂは、グルコース利用に関係する遺伝子、すなわちE. coliのＡＴＣＣ８７３９、ＫＪ０１２、ＫＪ０１７、ＫＪ０６０、ＫＪ０７１及びＫＪ０７３株におけるｃｙａＡ、ｃｒｐ、ｐｔｓＧ、ｇａｌＰ及びｇｌｋについての転写物の相対存在度を示す図である。図１２Ｃは、E. coliのＡＴＣＣ８７３９、ＫＪ０１２、ＫＪ０１７、ＫＪ０６０、ＫＪ０７１及びＫＪ０７３株における遺伝子ｐｔｓＩ及びｃｒｒ遺伝子についての転写物の相対存在度を示す。
【図１２Ｃ】工学処理されたコハク酸生産株の転写物存在度の比較を示す図である。図１２Ａは、E. coliのＡＴＣＣ８７３９、ＫＪ０１２、ＫＪ０１７、ＫＪ０６０、ＫＪ０７１及びＫＪ０７３株における遺伝子ｐｃｋ、ｐｐｃ、ｓｆｃＡ及びｍａｅＢについての転写物の相対存在度を示す。図１２Ｂは、グルコース利用に関係する遺伝子、すなわちE. coliのＡＴＣＣ８７３９、ＫＪ０１２、ＫＪ０１７、ＫＪ０６０、ＫＪ０７１及びＫＪ０７３株におけるｃｙａＡ、ｃｒｐ、ｐｔｓＧ、ｇａｌＰ及びｇｌｋについての転写物の相対存在度を示す図である。図１２Ｃは、E. coliのＡＴＣＣ８７３９、ＫＪ０１２、ＫＪ０１７、ＫＪ０６０、ＫＪ０７１及びＫＪ０７３株における遺伝子ｐｔｓＩ及びｃｒｒ遺伝子についての転写物の相対存在度を示す。
【図１３】混合酸発酵経路を用いたE. coliの嫌気性代謝を示す図である（Bock & Sawers, 1996）。ネイティブな混合酸経路を黒矢印で示す。グルコース取込み、カルボキシル化、及びアセチル−ＣｏＡ合成についての追加的な反応を点線の矢印で示す。点線の太い矢印は、E. coli突然変異体においてコハク酸生産のために動員された新しい代謝ステップを示す。遺伝子欠失又は点突然変異によって遮断された反応に×印を付ける。ｐｃｋ＊は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼを抑制解除して活性を増加させ、この酵素がオキザロ酢酸生産のための主経路として役立つことを可能にする新規な突然変異を示す。ピルビン酸（四角で囲む）は、略図の中で２ヶ所に出現するが、単一の細胞内プールとして存在する。
【図１４】野生型E. coliにおいて混合酸発酵（嫌気性）と組み合わせたグリセロール異化について一般に認識された経路を示す図である。これらの経路は、ＥｃｏＳａｌにおける最新の総説、Ecocycから入手可能なデータ、及び一次文献の総説の組み合わせに基づく（Bachler et al., 2005; Berman and Lin, 1971; Bock and Sawers, 1996; Erni et al., 2006; Gutknecht et al., 2001; Jin et al.,1983; Keseler et al., 2005; Lin, 1996; Tang et al., 1982）。太い矢印は、一般にグリセロール異化及び混合酸発酵について優位であると見なされる経路を示す。細い矢印は、野生型E. coliにおいて潜在的で非機能的であると見なされる、中間体としてジヒドロキシアセトンを伴う経路を示す（Jin et al., 1983; Tang et al., 1982）。この経路は、ｇｌｐＫが不活性な突然変異体でのみ機能すると考えられる（Jin et al., 1983; Tang et al., 1982）。細い矢印は、ｇｌｐＡＢＣ（嫌気性代謝）の代理として好気性代謝の間に機能すると考えられるデヒドロゲナーゼであるｇｌｐＤについても示される。略語：ＤＨＡ、ジヒドロキシアセトン；ＤＨＡＰ、ジヒドロキシアセトン３−リン酸；ＰＥＰ、ホスホエノールピルビン酸；Ｇ３Ｐ、グリセロール３−リン酸；及びＧＡ３Ｐ、グリセルアルデヒド３−リン酸。共通プールを示すためにＰＥＰを四角で囲む。
【図１５】無機塩培地中でグリセロールからコハク酸を嫌気性生産するための新規なE. coli経路を示す図である。太い矢印は、コハク酸生産のための３個のコア突然変異を有するＸＺ７２１などの株におけるグリセロールの嫌気性異化のための主経路を示す。点線の矢印は、ｐｆｌＢ及びｐｔｓＩにおける突然変異によって遮断された経路を示す。この経路において、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの突然変異性活性化（ｐｃｋ＊）は、この酵素がオキザロ酢酸生産のために優位なカルボキシル化ステップとして役立つことを可能にする。代替カルボキシル化酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＰＣ）とは異なり、ＰＣＫは、エネルギーを保存して、生合成用の追加的なＡＴＰを生産する。
【００３３】
好ましい態様の詳細な説明
本発明に使用するような「力価」という用語は、発酵培養液中の特定化合物のモル濃度を意味する。したがって、本発明によるコハク酸生産のための発酵プロセスにおいて、１００mMのコハク酸力価は、測定時の発酵培養液が発酵培養液１リットルあたり１００mmolのコハク酸を含有したことを意味する。
【００３４】
本発明に使用するように、「収量」という用語は、発酵プロセスの間に消費される供給原料１molあたりに生産される特定化合物のモル数を表す。したがって、供給原料としてグルコースを用いてコハク酸を生産するための発酵プロセスにおいて、収量という用語は、消費されたグルコース１molあたりに生産されたコハク酸のモル数を表す。
【００３５】
本発明に使用するように、「体積あたりの生産性」という用語は、単位時間あたり単位体積あたりに生産される特定化合物の量をグラム数で表したものである。したがって、コハク酸についての０．９g L-1 h-1という体積あたりの生産性の値は、０．９ｇのコハク酸が１時間の成長の間に発酵培養液１リットル中に蓄積することを意味する。
【００３６】
本発明に使用するような「力価」、「収量」、及び「体積あたりの生産性」という用語には、「基準化された力価」、「基準化された収量」、及び「基準化された体積あたりの生産性」も含まれる。基準化された力価、基準化された収量、及び基準化された体積あたりの生産性の決定では、成長培地のｐＨを維持するために発酵容器に加えられた中和試薬の体積も考慮される。
【００３７】
本明細書に使用するような「遺伝的に工学処理された」又は「遺伝的に改変された」という用語は、微生物のゲノムＤＮＡを操作することによって微生物中の１種又は複数種の酵素の発現を変更する実施を表す。
【００３８】
本発明は、遺伝的に改変された細菌株（ＧＭＢＳ）によって炭素化合物から商業的に重要な量でコハク酸を生産するためのプロセスを提供する。本発明において開示されるのは、発酵プロセスを通じてコハク酸を生産するために適した微生物である。
【００３９】
本発明に使用するように、「遺伝子」という用語には、その遺伝子のオープンリーディングフレームならびに上流及び下流の調節配列が含まれる。上流の調節領域は、遺伝子のプロモーター領域とも呼ばれる。下流の調節領域は、ターミネーター配列領域とも呼ばれる。
【００４０】
本発明に使用するように、突然変異という用語は、オープンリーディングフレーム、上流の調節領域及び下流の調節領域を含めた遺伝子に加えられる遺伝的改変を表す。遺伝子の突然変異は、遺伝子のオープンリーディングフレームの転写のアップレギュレーション又はダウンレギュレーション又は完全阻害のいずれかを招く。遺伝子の突然変異は、その遺伝子のコード領域全体もしくはコードヌクレオチド配列の一部を欠失させること、又はフレームシフト突然変異、ミスセンス突然変異、及び挿入を導入すること、もしくは終止コドンを導入すること、又はその組み合わせのいずれかによって達成される。
【００４１】
本発明に使用するように、「外因性」という用語は、細胞の外側から得られる分子又は活性がホスト微生物に導入されることを意味することが意図される。微生物細胞に導入された外因性核酸分子の場合、導入された核酸は、独立したプラスミドとして存在することもあり、又はホスト染色体ＤＮＡに組み込まれることもある。タンパク質をコードする外因性核酸は、プロモーター及びターミネーター配列などのそれ自体の調節配列と共に発現可能な形で微生物細胞に導入することができる。あるいは、外因性核酸分子は、ホスト染色体ＤＮＡに組み込むことができ、ホスト調節配列のコントロール下に置くことができる。
【００４２】
「内因性」という用語は、ホスト細胞内に存在する分子及び活性を表す。生合成活性に関して使用する場合、「外因性」という用語は、ホスト参照生物に導入された活性を表す。その起源は、例えば、ホスト微生物に導入後に、参照された活性を発現する、同種又は異種のコード核酸である。タンパク質をコードする核酸が同種の微生物から得られる場合、それは同種ＤＮＡと呼ばれる。その核酸が異なる微生物種から得られる場合、それは異種ＤＮＡと呼ばれる。ホスト細胞に導入された場合にそのＤＮＡが同種であるか異種であるかのその性質に関係なく、そのＤＮＡばかりでなくその導入ＤＮＡから得られた活性は、外因性と呼ばれる。したがって、本発明のコード核酸の外因性発現は、異種及び同種のいずれか又は両者のコード核酸を利用することができる。
【００４３】
本発明は、発酵プロセスのための基質として炭素源を含有する無機塩培地中で発酵条件下で成長させた場合に、コハク酸について優れた力価、高収量及び顕著な体積あたりの生産性を示すＧＭＢＳを提供する。主題発明の微生物は、ヘキソース、ペントース、二糖などの様々な糖及びグリセロールなどの他の炭素化合物を使用した、単一ステップ生産プロセスに採用することができる。
【００４４】
本発明において、炭素フローをコハク酸生産に向けるために、遺伝子突然変異の独特で有利な組み合わせが採用された。加えて、コハク酸生産は、微生物の成長と関係し、微生物の成長は、今度は細胞ＡＴＰレベル及び酸化還元バランスと関係する。
【００４５】
「酸化還元バランス」という用語は、細胞がＮＡＤ＋に対してＮＡＤＨの適切な比を維持できることを表す。言い換えると、嫌気性発酵成長の間に糖質基質を酸化するための十分なＮＡＤ＋が存在するように、細胞はＮＡＤＨを酸化することができる。好気性成長の間、ＮＡＤ＋プールは、ＮＡＤＨを伴う酸化的リン酸化を通じて再生される。しかしながら、嫌気性成長条件下でのＮＡＤ＋プールの再生は、ＮＡＤＨを酸化できる細胞内の様々な代謝経路を通じて炭素フローを操作することによってのみ達成される。
【００４６】
本発明の一態様では、遺伝的改変は、微生物のネイティブなゲノム内の遺伝子の操作だけを伴う。本発明のその態様では、抗生物質耐性遺伝子又はある酵素タンパク質をコードする任意の他の外因性ヌクレオチド配列を担持するプラスミドなどの外因性遺伝物質は、コハク酸生産のための生物触媒として使用される細菌株に導入されない。
【００４７】
本発明に適したリコンビナント微生物は、いくつかの細菌科から、好ましくはEnterobacteriaceae科から得られる。適切な微生物は、Escherichia、Erwinia、Providencia、及びSerratia属から選択される。Escherichia属が特に好ましい。Escherichia属のうち、Escherichia coli種が特に好ましい。E. coli Ｂ、E. coli Ｃ、E. coli ＷなどのE. coliの任意の一株が、本発明に有用である。
【００４８】
有機酸を有意な量で生産可能なE. coli株は、当技術分野において周知である。例えば、米国特許出願公開第２００９／０１４８９１４号は、化学的に純粋な酢酸塩及び／又はピルビン酸塩の生産のための生物触媒としてのE. coliの株を提供する。米国特許出願公開第２００７／００３７２６５号及び米国特許第７，６２９，１６２号は、乳酸生産のために構築されたE. coli Ｋ０１１株の派生株を提供する。特許協力条約に基づき公開された国際特許出願である国際公開公報第２００８／１１５９５８号は、ｐＨコントロールしたバッチ発酵における炭素源としてグルコースを含有する最少無機塩培地中でコハク酸及びリンゴ酸を生産するように工学処理された微生物を提供する。
【００４９】
本発明のいくつかの他の態様では、本発明により改変することのできる細菌には、非限定的に、Gluconobacter oxydans、Gluconobacter asaii、Achromobacter delmarvae、Achromobacter viscosus、Achromobacter lacticum、Agrobacterium tumefaciens、Agrobacterium radiobacter、Alcaligenes faecalis、Arthrobacter citreus、Arthrobacter tumescens、Arthrobacter paraffineus、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、Arthrobacter oxydans、Aureobacterium saperdae、Azotobacter indicus、Brevibacterium ammoniagenes、divaricatum、Brevibacterium lactofermentum、Brevibacterium flavum、Brevibacterium globosum、Brevibacterium fuscum、Brevibacterium ketoglutamicum、Brevibacterium helcolum、Brevibacterium pusillum、Brevibacterium testaceum、Brevibacterium roseum、Brevibacterium immariophilium、Brevibacterium linens、Brevibacterium protopharmiae、Corynebacterium acetophilum、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium callunae、Corynebacterium acetoacidophilum、Corynebacterium acetoglutamicum、Enterobacter aerogenes、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、Erwinia herbicola、Erwinia chrysanthemi、Flavobacterium peregrinum、Flavobacterium fucatum、Flavobacterium aurantinum、Flavobacterium rhenanum、Flavobacterium sewanense、Flavobacterium breve、Flavobacterium meningosepticum、Micrococcus種ＣＣＭ８２５、Morganella morganii、Nocardia opaca、Nocardia rugosa、Planococcus eucinatus、Proteus rettgeri、Propionibacterium shermanii、Pseudomonas synxantha、Pseudomonas azotoformans、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas ovalis、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas acidovolans、Pseudomonas mucidolens、Pseudomonas testosteroni、Pseudomonas aeruginosa、Rhodococcus erythropolis、Rhodococcus rhodochrous、Rhodococcus種ＡＴＣＣ１５５９２、Rhodococcus種ＡＴＣＣ１９０７０、Sporosarcina ureae、Staphylococcus aureus、Vibrio metschnikovii、Vibrio tyrogenes、Actinomadura madurae、Actinomyces violaceochromogenes、Kitasatosporia parulosa、Streptomyces coelicolor、Streptomyces flavelus、Streptomyces griseolus、Streptomyces lividans、Streptomyces olivaceus、Streptomyces tanashiensis、Streptomyces virginiae、Streptomyces antibioticus、Streptomyces cacaoi、Streptomyces lavendulae、Streptomyces viridochromogenes、Aeromonas salmonicida、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、Bacillus amyloliqyefaciens、Bacillus coagulans、Bacillus pumilus、Bacillus circulans、Bacillus thiaminolyticus、Escherichia freundii、Microbacterium ammoniaphilum、Serratia marcescens、Salmonella typhimurium、Salmonella schottmulleri、Xanthomonas citriなどが含まれる。
【００５０】
本発明の実施に適した微生物は、好気的（酸素の存在下）又は嫌気的（酸素の完全不在下）又は微好気的（最小量の酸素供給）に成長させることができる。本発明の好ましい態様では、コハク酸生産のために選択された微生物は、嫌気条件下で成長させる。あるいは、本発明に適した微生物は、その微生物を最初は好気性成長条件で成長させ、あるレベルの細胞成長に到達してからそれを嫌気性成長条件に移植し、商業的に重要な量でのコハク酸生産を達成する二期成長方式で成長させることができる。本発明の微生物によるコハク酸生産のための二期成長の間に、コハク酸の生産及び蓄積は、嫌気性発酵成長期の間に起こる。
【００５１】
本発明は、特定の遺伝的改変技法を代謝進化プロセスと組み合わせて、糖質基質を有する無機塩培地中の嫌気性成長条件下で、コハク酸生産について高い収量、力価及び体積あたりの生産性を示す株を得るものである。
【００５２】
遺伝的操作から得られた微生物株は、コハク酸生産について予想される遺伝子型を有するであろう。しかしながら、最少無機塩培地におけるそれらの成長速度、又は必要とされる収量、力価及び体積あたりの生産性でそれらがコハク酸を生産する能力のせいで、本発明者らが、大規模発酵プロセスを通じてコハク酸を商業生産するための生物触媒としてこれらの遺伝的に改変された微生物を使用できないおそれがある。したがって、遺伝的改変から得られた遺伝的に改変された微生物株を、続いて糖質原を有する無機塩培地中で数世代成長させ、コハク酸生産について非常に高い収量を有するクローンを選択する。最も好ましい表現型を有するクローンを成長ベースで選択するためのこのプロセスは、代謝進化と呼ばれる。代謝進化の間に、新鮮な最少培地に遺伝的に改変された株をある期間繰り返し移植してクローンを得るが、その際に、代謝進化の間に起こった自然突然変異が、速い細胞成長、種々の炭素源の迅速な消費、複数の糖を同時に利用する能力、炭素源中の有毒化学物質を許容する能力ならびに高い生産収量及び他の有機酸の低い生産性を伴う所望の有機酸の生産性を示すクローンをもたらす。
【００５３】
代謝進化の間に、望ましい表現型を有するクローンを選択するために注意が払われる。炭素源を補充された最少培地中で非常に良好な成長速度を示す、代謝進化に起因するクローンであっても、所望の有機酸の収量が改善していないクローンは、望ましいクローンではない。
【００５４】
ある種の望ましい表現型を生物に強制的に獲得させるある種の選択圧を用いた代謝進化プロセスの間に、二つの可能な変化が起こる可能性がある。その生物は、ただ単に自身を選択圧に適応させ、変化した表現型を示す可能性がある。あるいは、その生物は選択圧下である種の遺伝的変化を受けて、変化した表現型を永続的に示すこともある。適応だけが起こり、遺伝的変化がない場合、いったん選択圧が軽減されるとその生物はその本来の表現型に復帰する。これらの生物は「適応した」生物と呼ばれる。これらの「適応した」微生物は、選択圧が除去されるとそれらの本来の表現型に復帰する。「適応した」微生物が変化した表現型を示すには、選択圧を受けて代謝進化が新たにもう一回り経過しなければならない。他方で、付随する遺伝的変化がある場合、変化した表現型は、選択圧がない場合であっても存在し続ける。ある種の遺伝的変化を伴う代謝進化が望ましい。代謝進化の間に安定な遺伝的変化を獲得している微生物は、選択圧を全く有さない本来の成長培地中でその微生物をある時間成長させてから、選択圧を有する新鮮培地にそれを移植することによって容易に同定することができる。これらの生物が遅延期間を全く有さずに良好な成長及び予想される表現型を示すことができる場合、その生物は、代謝進化の間に変化した遺伝子型を獲得したと見なされる。
【００５５】
代謝進化の間に獲得された遺伝的変化の基礎は、その生物の染色体ＤＮＡ内の適切な領域を配列決定し、その配列データを親株のデータと比較することによって決定することができる。ＤＮＡ配列データは、当技術分野において周知の技法に従うことによって得ることができる。例えば、代謝進化した株の染色体ＤＮＡの適切な領域は、ポリメラーゼ連鎖反応を通じて得ることができ、ポリメラーゼ連鎖反応を通じて得られた産物は、適切な配列決定プライマーを使用することによって配列決定することができる。
【００５６】
ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）などの菌株保存機関から得られた野生型E. coli株を、遺伝的操作し、続いて代謝進化させて、商業的に重要な量でコハク酸を生産する能力が高まった株を得ることができる。
【００５７】
遺伝的操作は、いくつかの異なる段階に分けて行うことができ、遺伝的操作の段階と段階の間に代謝進化を伴う。ゲノム操作は、内因性ＤＮＡ配列を変更すること又はゲノムＤＮＡから特定のＤＮＡ配列を完全に除去することのいずれかを伴う。遺伝的操作は、微生物のゲノムＤＮＡ配列内に外来ＤＮＡ配列を挿入することも伴うことがある。本発明のある態様は、遺伝的操作が、外来ＤＮＡを全く導入せずに微生物のゲノムＤＮＡから特定のＤＮＡ配列を除去することによって成し遂げられる。特定のタンパク質産物をコードする遺伝子の発現を不活性化するために必要なある種の遺伝的操作は、所望の遺伝的改変を有するクローンを選択するために、微生物のゲノムに外来ＤＮＡ配列を挿入することを必要とする。例えば、外因性抗生物質マーカー遺伝子を使用して内因性遺伝子を挿入的に不活性化し、所望の遺伝子型を有するクローンを選択することができる。本発明の一態様では、遺伝的工学処理プロセスの終了時に微生物がその本来のゲノムＤＮＡ中に外因性ＤＮＡを有さないように、導入された外因性ＤＮＡ配列は、最終的にその微生物のゲノムＤＮＡから除去される。本発明の好ましい態様の目的を成し遂げるために必要な、様々な遺伝的工学処理技法は、２冊の異なる科学刊行物に詳細に記載されている（Jantama et al., 2008a; Jantama et al., 2008b）。番号がUS2007/0037265及びUS2009/0148914の米国特許出願公開ならびに特許協力条約に基づき公開された国際公開公報番号がWO2008/115958である国際特許出願もまた、本発明の様々な態様を実施する上で有用な遺伝的工学処理技法を記載している。これらの科学刊行物及び特許文書は、本発明に有用な遺伝的工学処理技法についての詳細を提供する目的で参照により本明細書に組み入れられる。
【００５８】
かなりの量のコハク酸を生産するための微生物を作り出すために、解糖系、トリカルボン酸回路（クレブス回路又はＴＣＡ回路としても知られている）及びグリオキシル酸シャントを含めたいくつかの微生物代謝経路に関与する様々な酵素を、上記段落に引用され、参照により組み入れられた科学文献及び特許文献に記載された多様な遺伝的工学処理技法を使用して操作することができる。様々な微生物代謝経路に関する詳細は、LehningerによるPrinciples of Biochemistry及びLubert StryerによるBiochemistryなどの定評のある生化学の教科書から見出すことができる。Sigma Chemical Company（St. Louis, MO, USA）から入手可能なG. Michaelによる生化学経路のポスターもまた、細菌細胞内の様々な生化学経路に関する詳細を提供している。
【００５９】
好気性成長の間に、微生物の炭素代謝は、解糖、トリカルボン酸回路及び酸化的リン酸化を伴う。ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨなどの還元型酵素補因子は、細胞成長に必要とされるＡＴＰ生産を伴う酸化的リン酸化の作動によって再生される。本発明の好ましい態様におけるコハク酸生産のための嫌気性成長条件下で、還元型補因子ＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＨの再生は、炭素フローをトリカルボン酸回路に向けること及びＮＡＤＰ＋及びＮＡＤ＋の再生のための全ての発酵経路を排除することによって成し遂げられる。
【００６０】
本発明者らに選ばれた特定の有機酸を微生物が生産するように、好ましい有機酸の種類に応じて、代謝経路が特異的に工学処理される。微生物は、乳酸、酢酸、リンゴ酸、ピルビン酸、ギ酸及びコハク酸を含めたいくつかの有機酸を合成する能力がある。したがって、コハク酸を生産するための生物触媒を開発する上で、細胞内の炭素代謝に関与する１種又は複数種の酵素を操作することを通じて、酢酸、乳酸、ピルビン酸、及びギ酸の生産経路は遮断され、コハク酸生産への炭素フローが促進される。公知の遺伝的工学処理技法を使用して操作することのできる、微生物発酵経路において活性な酵素の一覧には、非限定的にイソクエン酸シンテターゼ（ａｃｅＡ）、リンゴ酸シンターゼ（ａｃｅＢ）、グリオキシル酸シャントオペロン（ａｃｅＢＡＫ）、酢酸キナーゼ−ホスホトランスアセチラーゼ（ａｃｋＡ−ｐｔａ）；アコニターゼヒドラターゼ１及び２（ａｃｎＡ及びａｃｎＢ）；アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ａｃｓ）；クエン酸リアーゼ（ｃｉｔＤＥＦ）；アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）；クエン酸シンターゼ（ｃｉｔＺ）；フマル酸レダクターゼ（ｆｒｄ）；乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）；リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）；ａｃｅＢＡＫオペロンリプレッサー（ｉｃｌＲ）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｅｐＣ）；ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）；ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）；ピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）；及びピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）が含まれる（図１、６、及び９）。
【００６１】
炭素源の解糖は、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の生産を招く。ＰＥＰは、さらに混合酸経路によって代謝される。本発明に使用するように、「混合酸経路」という用語は、トリカルボン酸回路及び嫌気性条件下で作動する様々な発酵経路の両者を通じた、ＰＥＰからの炭素フローを表す。嫌気性条件下では、ピルビン酸代謝のために少なくとも４種の異なる発酵経路が認識できる。ＮＡＤＨを用いてピルビン酸を乳酸に還元することができ、それによってＮＡＤ＋が生産されて炭素源の連続代謝に必要な細胞の酸化還元バランスを維持することができる。ピルビン酸から得られたアセチル−ＣｏＡは、還元されてエタノールを生産することもでき、それに伴ってＮＡＤＨが酸化されてＮＡＤ＋を生産する。図１Ａに示すように、ピルビン酸はギ酸又は酢酸にも変換されることがある。
【００６２】
ＴＣＡ回路内で二つの異なる経路が認められる。オキザロ酢酸からイソクエン酸を経てコハク酸に至る炭素フローを包含する酸化経路と呼ばれるＴＣＡ回路の一方の経路で、ＮＡＤＰ＋はイソクエン酸を酸化するために利用され、結果としてＮＡＤＰＨが生成する。オキザロ酢酸からリンゴ酸及びフマル酸を経てコハク酸に至る炭素フローを包含する、ＴＣＡ回路の還元的経路と呼ばれるＴＣＡ回路のもう一方の経路では、ＮＡＤＨは、酸化されてＮＡＤ＋を生産することによって、細胞が酸化還元バランスを維持することを助ける。
【００６３】
本発明の一態様では、発酵経路を通じたＰＥＰからの炭素フローは、その発酵経路に関与する酵素をコードする遺伝子を不活性化することによって阻止される。発酵経路を通じた炭素フローを遮断するために適した酵素には、ｌｄｈＡ、ｐｆｌＢ、ａｄｈＥ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、及びｐｏｘＢが含まれる。これらの遺伝子の１種又は複数種の排除は、発酵経路を通じたＰＥＰからの炭素フローを減少させると予想される。これら６種の遺伝子の全ての不活性化は、発酵経路を通じた炭素フローを完全に遮断すると予想される。本発明の別の局面では、発酵経路に関与する６種の他の遺伝子の不活性化に加えて、メチルグリオキサールから乳酸への変換を担うメチルグリオキサールシンターゼ（ｍｇｓＡ）をコードするｍｇｓＡ遺伝子が不活性化される。
【００６４】
本発明のなお別の態様では、一つ又は他の発酵経路に関与することが周知である遺伝子を不活性化することに加えて、その発酵経路に関与する遺伝子の機能的ホモログもまた不活性化される。酢酸キナーゼ活性を有するプロピオン酸キナーゼは、トレオニンの分解のためにのみ生産されるｔｄｃＤ遺伝子によってコードされる。しかしながら、１０％(w/v)グルコース存在下の嫌気性成長の間に、ｔｄｃＤの発現がａｃｋＡに機能的に取って代わる可能性がある。加えて、同じオペロン中の隣接ｔｄｃＥ遺伝子は、ｐｆｌＢに類似しており、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を有するα−ケト酪酸ギ酸リアーゼをコードする。本発明の一局面では、ｔｄｃＤＥ遺伝子は、発酵経路への炭素の流入を阻止し、ＴＣＡ回路への炭素フローを保証するために不活性化される。
【００６５】
本発明の別の態様では、発酵経路を通じて炭素フローを遮断することに加えて、ＴＣＡ回路内の炭素フローは、コハク酸生産に向けた炭素フローが存在するように変更される。本発明の一局面では、ＴＣＡ回路内の炭素フローの操作は、１種又は複数種の遺伝子の発現をアップレギュレーションすることによって達成される。本発明のなお別の局面では、ＴＣＡ回路内で機能している１種又は複数種の遺伝子は、コハク酸への炭素フローの増加を促進するために不活性化することができる。
【００６６】
本発明の好ましい局面では、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｍｄｈは、リンゴ酸からフマル酸及びコハク酸への変換を改善するためにアップレギュレーションされる。オキザロ酢酸からリンゴ酸及びフマル酸を経たコハク酸への炭素フローは、ＴＣＡ回路の還元経路と呼ばれる。オキサロ酢酸からコハク酸へのＴＣＡ回路のこの還元経路を通じた炭素フローは、生産された１molのコハク酸につき２molのＮＡＤＨを消費することによって嫌気性条件下で細胞の酸化還元バランスを維持することを助けるであろう。言い換えると、ｍｄｈのアップレギュレーションは、細胞の酸化還元バランスを維持するために必要とされるＮＡＤ＋の再生を助けるであろう。ｍｄｈ遺伝子発現のアップレギュレーションは、ｍｄｈ遺伝子に関するネイティブなプロモーターを何か他の強力なプロモーター配列と取り替えることによって、あるいは、その代わりにｍｄｈ遺伝子の転写の増加があるようにｍｄｈ遺伝子のプロモーター領域を突然変異させることによって達成することができる。あるいは、ｍｄｈ遺伝子の追加的なコピーをその株に付加することができる。本発明の好ましい態様では、ｍｄｈ遺伝子発現のアップレギュレーションは、そのプロモーター領域を遺伝的に操作することによって達成される。
【００６７】
ＴＣＡ回路の通常の作動において、コハク酸は、ＴＣＡ回路の酸化経路の作動を通じて生産される。オキザロ酢酸からクエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、及びスクシニル−ＣｏＡを経たコハク酸への炭素フローは、ＴＣＡ回路の酸化経路と呼ばれる。コハク酸は、また、グリオキシル酸バイパスの作動を通じて生産することができる。グリオキシル酸バイパスの作動の間に、イソクエン酸リアーゼの作用によってイソクエン酸からコハク酸及びグリオキシル酸が生産される。したがって、ＴＣＡ回路の酸化経路の作動又はグリオキシル酸バイパスの作動から生産されるコハク酸は、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ｓｄｈ）によって作用され、フマル酸を、次にリンゴ酸を生じることができる。したがって、本発明のなお別の態様では、細胞内コハク酸生産を増加させるために、遺伝子不活性化を用いてコハク酸の脱水素化を阻止することができる。
【００６８】
本発明のなお別の局面では、コハク酸生産の増加を達成するためにグリオキシル酸バイパスを経た炭素フローを操作することができる。イソクエン酸リアーゼ酵素は、イソクエン酸のグリオキシル酸及びコハク酸への切断を触媒する。イソクエン酸リアーゼは、ａｃｅＢＡＫオペロンによってコードされる。イソクエン酸リアーゼ活性は、ｉｃｌＲ遺伝子によって抑制される。言い換えると、ｉｃｌＲ遺伝子の発現は、グリオキシル酸シャントの作動を阻止する。本発明の一局面では、発酵代謝に関与する遺伝子の不活性化に加えて、ｉｃｌＲ遺伝子は不活性化される。
【００６９】
本発明のなお別の態様では、遺伝的操作を通じて発酵経路の作動を阻止すること及びコハク酸生産に向けたＴＣＡ回路内の炭素フローを増加させることに加えて、ＴＣＡ回路から他の代謝経路への外向きの炭素フローもまた、コハク酸生産を増加させる遺伝的手段を通じて遮断することができる。例えば、ＴＣＡ回路からアミノ酸代謝への炭素フローは、コハク酸に向けた炭素フローを改善するために遮断することができる。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ａｓｐＣ）は、アスパラギン酸の合成においてグルタミン酸からオキサロ酢酸にアミノ基を転移することによって、ＴＣＡ回路からの外向きの炭素フローを促進する。本発明の一局面では、ＴＣＡ回路の酸化経路又は還元経路のいずれかを経たオキザロ酢酸からコハク酸生産に向けた炭素フローを改善するために、ＴＣＡ回路からの外向きの炭素フローを遮断する、ａｓｐＣ遺伝子の不活性化が採り入れられる。
【００７０】
ＴＣＡ回路からの他の外向きの炭素フローは、リンゴ酸から始まる。リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ）によるリンゴ酸の脱カルボキシル化は、ピルビン酸の生産を招く。本発明の一局面では、ｓｆｃＡ遺伝子をコードする遺伝子は、ＴＣＡ回路からの外向きの炭素フローを削減するために不活性化される。本発明のなお別の局面では、ａｓｐＣ及びｓｆｃＡ遺伝子の両者は、コハク酸蓄積を高めるようにＴＣＡ回路からの外向きの炭素フローを阻止するために不活性化される。
【００７１】
本発明のなお別の局面では、ＴＣＡ回路からの外向きの炭素フローは、クエン酸のオキザロ酢酸及び酢酸への切断を担うクエン酸リアーゼ遺伝子（ｃｉｔＤＥＦ）を不活性化することによって阻止される。
【００７２】
発酵経路に関与する遺伝子及びその機能的アナログを不活性化すること、ＴＣＡ回路からの炭素フローを阻止すること、及びＴＣＡ回路内のコハク酸に向けた炭素フローをレギュレーションすることが、微生物発酵におけるコハク酸の収量を改善する可能性があることを発見した上に、本発明は、驚くことに、成長と関連するコハク酸収量が、微生物細胞内のカルボキシル化酵素の遺伝的操作によってさらに改善されうることも発見した。遺伝子解析及び酵素分析を行うことを通じて代謝進化の間に起こった変化を特徴づける一方で、本発明の発明者らは、細胞内のカルボキシル化酵素が、コハク酸収量改善を達成するための遺伝的操作のまた別のターゲットでありうることを予想外に発見した。
【００７３】
解糖中間体であるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びピルビン酸は、ＴＣＡ回路への炭素フローを改善するためにカルボキシル化することができる。正常条件下で、ＴＣＡ回路への炭素流入は、ピルビン酸から得られたアセチル−ＣｏＡを、ＴＣＡ回路の中間体であるオキザロ酢酸と組み合わせてクエン酸を生産するクエン酸シンターゼの作用によって成し遂げられる。細胞内に存在する１種又は複数種のカルボキシル化酵素の効率を改善することによって、ホスホエノールピルビン酸及びピルビン酸をＴＣＡ回路の中間体であるオキザロ酢酸にカルボキシル化することが可能である（図２）。このように、カルボキシル化反応から生産されたオキザロ酢酸は、ＴＣＡ回路の還元経路を経てさらに還元されてコハク酸を生産することができる。
【００７４】
本発明は、嫌気性発酵成長の間にコハク酸の収量を増加させるための方法として、細胞内に存在するカルボキシル化酵素を操作するための方法を提供する。外因性起源からピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）を導入することによってピルビン酸をオキサロ酢酸にカルボキシル化することが可能なことが、当技術分野において周知である。E. coliなどの遺伝的操作に十分に適した微生物株は、ｐｙｃ遺伝子を有さない。Rhizopium elti及びLactobacillus lactiなどの他の細菌種から得られたｐｙｃ遺伝子を、遺伝的に改変されたE. coli株に導入して、コハク酸の生産を改善させることができる。
【００７５】
E. coliでは、４種の異なる内因性カルボキシル化酵素が公知である。これらの酵素のうち２種類はホスホエノールピルビン酸のカルボキシル化を担い、残りの２種の酵素はピルビン酸キナーゼ酵素の作用によってホスホエノールピルビン酸から得られたピルビン酸のカルボキシル化を担う。酵素ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）は、ホスホエノールピルビン酸をオキザロ酢酸にカルボキシル化し、オキザロ酢酸はＴＣＡ回路の還元経路に入りコハク酸を生産することができる。第２のカルボキシル化酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）もまたホスホエノールピルビン酸をカルボキシル化し、オキザロ酢酸を生産するが、グルコースの存在下では発現されないことから、普通は逆の反応を触媒する。２種の他のカルボキシル化酵素、すなわちＮＡＤＨ連結型マレイン酸酵素（ｍａｅＢ）及びＮＡＤＰＨ連結型マレイン酸酵素（ｍａｅＡ／ｓｆｃＡ）は、ピルビン酸をリンゴ酸にカルボキシル化する。ｍａｅＢ及びｓｆｃＡ酵素は、ホスホエノールピルビン酸から得られたピルビン酸をピルビン酸キナーゼの作用によってカルボキシル化する。
【００７６】
解糖回路中間体からＴＣＡ回路への炭素フローを改善するために、細胞に存在する４種のカルボキシル化酵素の任意の１種を遺伝的に操作して、その酵素活性を増加させることができる。E.coliに存在する４種のネイティブなカルボキシル化酵素のうち、ＰＰＣ触媒反応が大きく有利である。ＰＥＰに含まれるエネルギーはこの反応で失われ、無機リン酸が放出される。残りの３種のカルボキシル化酵素、すなわちｐｃｋ、ｍａｅＡ及びｓｆｃＡ（ｍａｅＢ）は、グルコースによって抑制されることから、基質としてグルコースを使用する発酵成長の間にこれら３種のカルボキシル化酵素が機能するとは予想されない。細胞が有機酸を酸化的に代謝している場合、これら３種のカルボキシル化酵素は糖新生の間に逆方向に機能すると考えられる。
【００７７】
本発明において本発明者らは、驚くことに、糖新生性ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）を遺伝的に操作してＴＣＡ回路への炭素フローを改善できることを発見した。E. coliにおけるコハク酸生産に関する主経路としてのｐｃｋの動員は驚くべきことであったし、ｐｃｋの機能的役割に関する本発明者らの現在の理解とは対照的である。以前の研究は、E. coli及びActinobacillus succinogenesのｐｃｋの発現増加がコハク酸生産に効果を有さなかったことを示している（Kim et al., 2004; Millard et al., 1996）。最近の研究は、E. coli ｐｃｋの発現増加が、成長速度、グルコース代謝速度、及びコハク酸収量を減少させることから、最少培地中の成長に有害であることを実証している［Kwon et al., 2008）。ｐｃｋの活性を改善する利点は、この酵素がホスホエノールピルビン酸をオキザロ酢酸にカルボキシル化する一方で、生産されたオキザロ酢酸１分子あたり１分子のＡＴＰの生産を招くという事実にある。ＡＴＰの収量増加は、細胞の成長速度を増加させるであろう。
【００７８】
本発明の間に構築されたいくつかのE. coli株におけるホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の比較分析は、代謝進化の間のＰＣＫ酵素活性の増加がｐｃｋ遺伝子の転写活性の増加に起因することを明らかにした。細胞成長に関連したコハク酸生産における改善を示しているそれらの株では、ｐｃｋ転写物の存在度が増加している。実際に、本発明の結果は、ｐｃｋ転写物レベルの増加と、ＰＣＫ酵素活性の増加と、成長に関連したコハク酸生産との間に正の相関を確立した。
【００７９】
コハク酸の発酵生産のためのネイティブな糖新生性ｐｃｋの動員は、ｐｃｋ遺伝子の転写にプラスの影響を与える任意の突然変異によって達成することができる。ＰＣＫ活性レベルの増加は、ネイティブなプロモーター又はその遺伝子の発現を増加させることが公知の任意の他のプロモーター配列を用いてマルチコピープラスミド中のｐｃｋ遺伝子を発現させることによって達成することができる。細胞内のｐｃｋ遺伝子の発現を増加させる別の方法は、トランスポゾンを使用してｐｃｋ遺伝子の追加的なコピーを組み込むことである。本発明の別の態様では、ｐｃｋ遺伝子のネイティブなプロモーターは、活性レベルを高めることが公知の、何か他のプロモーターエレメントと取り替えることができる。ｐｃｋ遺伝子の発現増加は、その遺伝子のプロモーター領域における突然変異又はｐｃｋ遺伝子のプロモーター領域と相互作用することが公知の調節エレメントの遺伝的操作のいずれかによっても達成することができる。ｐｃｋ遺伝子の発現を増加させるために、ｐｃｋ遺伝子のレギュレータータンパク質をコードする遺伝子を何らかの方法で突然変異又は欠失又は過剰発現させることができる。本発明の結果は、単一の点突然変異（ｐｃｋ遺伝子のＡＴＧ開始コドンに対して−６４位でのＧからＡへのトランジション）がｐｃｋ遺伝子の転写を増加させることができ、それが、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ酵素活性における対応する増加を伴ったことを示した。ｐｃｋ遺伝子発現における類似の増加は、ｐｃｋ遺伝子の発現をレギュレーションすることが公知であるタンパク質をコードする遺伝子を遺伝的に操作することによっても達成することができる。例えば、ｃｒａタンパク質は、E. coliにおいてｐｃｋ遺伝子の発現を活性化することが示されている（Saier and Ramseier, 196）。同様に、ｃｓｒＡ系（ｃｓｒＡ、ｃｓｒＢ、ｃｓｒＣ、ｃｓｒＤ、ｕｖｒＹ又はｂａｒＡを含む）もまた、ｍＲＮＡの安定性を変更することによってｐｃｋ及びグルコースの代謝に関与する他の遺伝子のレベルをレギュレーションすることが報告されている（Babitzke and Romeo, 2007; Pernestig et al., 2003; Suzuki K et al., 2002）。
【００８０】
成長と関連したコハク酸生産を嫌気性発酵プロセスの間に増加させるための本発明のなお他の遺伝的アプローチは、生物触媒による糖取り込みにおいて消費されるエネルギーを保存することに関する。
【００８１】
微生物は、細胞膜に局在する輸送体タンパク質のセットを介して糖を取り込む（Jojima et al., 2010）。微生物糖輸送体は、三つの主要な区分に入る。細菌において最大グループの糖輸送体は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体として知られている。名前が意味する通り、ＡＢＣ輸送体は細菌細胞内に輸送される糖１分子につき１分子のＡＴＰを必要とする。ＸｙｌＦＧＨは、細胞に五炭糖であるキシロースを輸送するためのＡＢＣ輸送体である。ＡｒａＦＧＨは、さらに別の五炭糖であるアラビノースを輸送するためのＡＢＣ輸送体である。
【００８２】
２番目の種類の細菌糖輸送体は、ＭＦＳ（Major Facilitator Super family）にグループ分けされる。ＭＦＳ糖輸送体の中に二つ異なる区分の輸送体が認められる。ＭＦＳには、Ｈ＋連結型シンポーター、Ｎａ＋連結型シンポーター−対向輸送体及び単輸送体が含まれる。単輸送体は、糖輸送の単純な促進因子であり、細胞内に輸送される糖１分子につき１分子のＡＴＰを必要とする。E. coliにおける膜貫通タンパク質Ｇｌｆは、単輸送体の一例である。Ｈ＋−シンポーターは、細胞に輸送される糖１分子あたり１個のプロトン及び１分子のＡＴＰを必要とする。E. coliにおけるＧａｌＰタンパク質は、細胞に六単糖ガラクトースを輸送するためのシンポーターである。ＧａｌＰは、１２個の膜貫通ループを有する非常に良く特徴づけられたシンポーターである。ＧａｌＰは、また、細胞膜を通過してグルコースを輸送する能力を有すると報告されている。ＡｒａＥは、細胞膜を通過してアラビノースを輸送するためのプロトン連結型シンポーターである。同様に、ＸｙｌＥタンパク質は、キシロースを輸送するためのプロトン連結型シンポーターである。
【００８３】
グルコースなどの六単糖の取込みを主に担う第３の糖輸送体は、ホスホエノールピルビン酸：糖質ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）として知られている。ＰＴＳによって触媒されるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）からのホスホリル基の転移は、グルコースの輸送及びリン酸化を推進し、細胞内でのグルコース６−リン酸及びピルビン酸の生成を招く。グルコースが唯一の炭素源の場合、ＰＴＳによって生成したピルビン酸は、見たところ好気性培養条件下でＰＥＰにリサイクルされない。むしろ、ピルビン酸はトリカルボン酸回路を経由して二酸化炭素に酸化される。したがって、１分子のグルコースの輸送について１分子のＰＥＰが消費される。細胞の生体エネルギー論の点から見て、ＰＴＳを経た糖の輸送は、エネルギー集約型プロセスである。したがって、工業的に有用な化学物質を生産するために細胞内のホスホエノールピルビン酸含量を一定に保つ必要がある、嫌気的に成長している細胞では、ＰＴＳを、細胞に輸送される糖１分子について１分子のＰＥＰを必要としない何か他の糖輸送体に取り替えることが望ましい。
【００８４】
微生物代謝経路の解糖、トリカルボン酸回路及びグリオキシル酸シャントに直接関与するこれらの遺伝子に加えて、コハク酸の合成のためのエネルギー源として有用な炭素化合物の取込みに関与する遺伝子の遺伝的操作もまた操作して、炭素の取込み又は有機酸生産におけるエネルギー利用効率のいずれかを高めることができる。例えば、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）によるグルコース取り込みの排除は、微生物細胞へのグルコース取込みに費やされるエネルギーの減少を助けることができよう。ＰＴＳを操作することによって保存されるエネルギーは、有機酸生産効率を改善するように導くことができる。ホスホトランスフェラーゼ系遺伝子ｐｔｓＨ及びｐｔｓＧは、グルコース取込みにおいてエネルギーを保存するように操作することによって、微生物によるコハク酸生産効率を改善することができる。したがって、微生物代謝経路の領域で利用可能なデータを調べることによって、大部分の代謝経路を遮断するために遺伝子のセットを欠失させコハク酸生産への炭素フローを大きな効率で導くことができる。
【００８５】
ＰＴＳは、二つの細胞質成分、すなわちＥ１及びＨＰｒならびに膜結合型成分ＥＩＩから構成される。E. coliは、少なくとも１５種の異なるＥＩＩ複合体を含有する。各ＥＩＩ成分は、輸送されるべき糖の種類に特異的であって、２個の疎水性内在性膜ドメイン（Ｃ及びＤ）及び２個の親水性ドメイン（Ａ及びＢ）を有する。これら４個のドメインは、一緒になって糖分子の輸送及びリン酸化を担う。ＥＩタンパク質は、ＰＥＰからＨＰｒタンパク質にリン酸基を転移する。ＥＩＩタンパク質は、リン酸化されたＨＰｒタンパク質から糖分子にリン酸基を転移する。
【００８６】
ＥＩは、ｐｔｓＩ遺伝子によってコードされる。ＨＰｒは、ｐｔｓＨ遺伝子によってコードされる。腸内細菌のグルコース特異性ＥＩＩ複合体は、２種の別個のタンパク質、すなわち遺伝子ｃｒｒによってコードされるＥＩＩＡＧｌｃ及び遺伝子ｐｔｓＧによってコードされる膜結合タンパク質ＥＩＩＣＢＧｌｃから成る。ＰＴＳが介在する糖輸送は、ＰＴＳと結合しているタンパク質をコードするこれらの遺伝子の一つを欠失させることによって阻害することができる。代替的なホスホエノールピルビン酸非依存性取込み及びリン酸化活性によるＰＴＳの機能的置換は、グルコースからの産物収量及びいくつかのクラスの代謝物についての生産性で大きな改善を達成するための遺伝的アプローチの一つである。
【００８７】
ＰＴＳ介在性グルコース取込みを阻害することによりグルコース取込みについての他の系を活性化して、工業的に有用な化学物質を生産するために細胞内でのグルコースの継続した利用性を確実にすることができる。例えば、グルコース単輸送体であるグルコースパーミアーゼをコードするｇｌｆ遺伝子は、ＰＴＳ介在性グルコース取込みの喪失の代わりになることが示されている。同様に、ｇａｌＰ及びｇｌｋ遺伝子の過剰発現は、E. coliのｐｔｓ−株におけるグルコース取込み及びリン酸化を高めることが報告されている。ＧａｌＰは、六単糖であるガラクトースの取込みのためのシンポーターである。ＧａｌＰは、ｐｔｓ−株においてグルコースを輸送することが報告されている。ＧａｌＰ介在性グルコース取込みの重要性は、ｐｔｓ−突然変異体におけるｇａｌＰ遺伝子の不活性化が致死的であることが見出されたという事実によって証明されている（Yi et al., 2003）。グルコース分子が解糖に流入できる前にそのリン酸化を達成するために、ｇｌｋは必要である。ｐｔｓ−株におけるＧａｌＰタンパク質の発現は、構成的プロモーター下で外因性遺伝子を発現させること、又はｇａｌＳ及びｇａｌＲなどのｇａｌＰ遺伝子のリプレッサーをコードする遺伝子における突然変異を通じてｇａｌＰの発現抑制を軽減することのいずれかによって達成することができる。
【００８８】
上記のように、微生物触媒を使用したコハク酸生産は、代謝進化を伴う遺伝的操作によって達成することができる。代謝進化の間に起こる遺伝的変化は、生化学分析及び遺伝子解析を通じて同定することができる。本発明は、驚くことに細胞内に存在するホスホトランスフェラーゼ系及びカルボキシル化酵素についての遺伝子において起こる突然変異が、コハク酸生産増加にプラスの貢献をもたらしたことを発見している。これらの新たに発見された遺伝的操作についてのターゲットを、いくつかの異なる方法で、解糖、トリカルボン酸及び発酵経路における他のターゲットと組み合わせて、コハク酸生産のための生物触媒を高い効率で生成することができる。最良のコハク酸生産株を達成するためには、遺伝的操作のための最少数のターゲット遺伝子のセットを同定することも極めて望ましい。
【００８９】
本発明は、また、コハク酸生産におけるグリセロール利用を高める遺伝的アプローチを提供する。グリセロール取込みは、ｇｌｐＦ遺伝子によってコードされるタンパク質によって仲介される。細胞内にいったん取り込まれると、グリセロールは、ｇｌｄＡ遺伝子によってコードされるタンパク質によって酸化されてジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）を生産する。ＤＨＡは、ｄｈａＫＬＭオペロンによってコードされるタンパク質によってジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）にリン酸化される。ｄｈａＫＬＭによってコードされるタンパク質によるＤＨＡからＤＨＡＰへのリン酸化は、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）プールの利用性に依存する。ＤＨＡのリン酸化がＰＥＰを必要とすることから、それは、高いコハク酸収量を達成するために必要とされる適正な酸化還元バランスを確実にするために、ＰＥＰからＴＣＡ回路に炭素フローを向けるＰＣＫに利用可能なＰＥＰを枯渇させる。本発明は、驚くことに、増加したＰＣＫ酵素活性を有する細菌細胞においてｇｌｄＡ及びｄｈａＫＬＭ経路を通じたグリセロールのフローを阻止することで、グリセロールを炭素源として使用してコハク酸収量を高めることができたことを見出した。本発明は、驚くことに、ＰＣＫ酵素活性が改善され、ｇｌｄＡ遺伝子及びｄｈａＫＬＭオペロンに欠失を有する細菌細胞において発酵経路を通じた炭素フローを阻止することによって、グリセロールを炭素源として使用してコハク酸収量のさらなる改善を達成できることも発見した。
【００９０】
本発明の例示として以下の実施例を提供する。これらの発明は、本発明の範囲を全く限定しない。工業微生物学の分野で経験を積んだ者は、本発明の精神に背くことなくいくつかの異なる態様で本発明を実施できるであろう。
【００９１】
実験の部
全般的な説明
株、培地及び成長条件
成長ベースの選択と関連させた独特な組み合わせの遺伝子欠失を用いて、コハク酸生産のための新たなE. coli Ｃ派生株（ＡＴＣＣ８７３９）を発生させた。本発明において発生された様々なE. coli株は、表２に示すようなアクセッションナンバーでARS Culture Collectionに寄託されている。
【００９２】
本発明の微生物は、微生物学の分野で周知の、いくつかの異なる培地中で成長させることができる。例えば、E. coliの野生型株及び突然変異株を１％(w/v)トリプトン、０．５％(w/v)酵母エキス、及び０．５％(w/v)ＮａＣｌを含有するLuria-Bertani（ＬＢ）培地中で成長させる。生物触媒として遺伝的に改変された微生物を要する発酵プロセスを使用した有機酸の商業生産のために、炭素源を補充した最少無機塩培地が好ましい。ＬＢ培地のような肥沃な培地とは対照的に、最少無機塩培地の使用は、商業的規模で有機酸を生産するコストを低下させる。
【００９３】
本発明に適した最少無機培地には、ＮＢＳ培地（Causey et al., 2007）及びＡＭＩ培地（Martinez et al., 2007）が含まれる。ＮＢＳ培地は、１mMベタイン、２５．７２mM ＫＨ２ＰＯ４、２８．７１mM Ｋ２ＨＰＯ４、２６．５０mM （ＮＨ４）２ＨＰＯ４、１mM ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１mM ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１５mMチアミンＨＣｌ、５．９２μM ＦｅＣｌ３６Ｈ２Ｏ、０．８４μM ＣＯＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．５９μM ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．４７μM ＺｎＣｌ２、０．８３μM Ｎａ２ＭｏＯ４２Ｈ２Ｏ、及び０．８１μM Ｈ３ＢＯ３を含有する。ＡＭ１培地は、１mMベタイン、１９．９２mM （ＮＨ４）２ＨＰＯ４、７．５６mM ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、１．５mM ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０mM ベタイン−ＫＣｌ、８．８８μM ＦｅＣｌ３６Ｈ２Ｏ、１．２６μM ＣＯＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．８８μM ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２．２０μM ＺｎＣｌ２、１．２４μM Ｎａ２ＭｏＯ４２Ｈ２Ｏ、１．２１μM Ｈ３ＢＯ３及び２．５０μM ＭｎＣｌ２４Ｈ２Ｏを含有する。微量元素を１０００×原液として調製するが、それは以下の成分を含有した：１．６g/L ＦｅＣｌ３、０．２g/L ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１g/L ＣｕＣｌ２、０．２g/L ＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．２g/L ＮａＭｏＯ４、０．０５g/L Ｈ３ＢＯ３、及び０．３３g/L ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ。
【００９４】
有機酸の微生物生産のための無機培地に炭素源を補充する。本発明に有用な炭素源には、非限定的にキシロースのような五炭糖、グルコース、フルクトース、及びガラクトースのような六炭糖ならびにグリセロールが含まれる。炭素源は、グルコース及びキシロースの組み合わせなどの異なる糖の組み合わせを提供することによっても補うことができる。炭素源は、また、デンプン又はリグノセルロースの加水分解から得ることができる。デンプン及びリグノセルロースなどの複合糖質の加水分解は、当技術分野で周知の熱化学変換プロセス又は酵素法のいずれかを使用することによって達成することができる。微生物発酵を使用した有機酸の工業生産のための好ましい炭素源は、農業廃棄物又は林業廃棄物の加水分解から得られたリグノセルロース加水分解物である。リグノセルロース加水分解物は、さらに、六炭糖に富む画分及び五炭糖に富む画分を回収するためにさらに分画することができ、それらの画分を、微生物発酵プロセスを使用する有機酸の商業生産のための炭素源として役立てることができる。リグノセルロース加水分解物をさらに毒性除去して、ある濃度を超えるといくつかの微生物に有毒であることが見出されているフルフラールなどのある種の化学物質を除去することができる。
【００９５】
本研究に使用される細菌株、プラスミド、及びプライマーを表３、７、９、１４及び１５に一覧し、下記明細書の適切な箇所に詳細に説明する。株を構築する間、２％(w/v)グルコース又は５％(w/v)アラビノースを含有するLuria液体培地（１０g l-1Difcoトリプトン、５g l-1Difco酵母エキス及び５g l-1ＮａＣｌ）に培養物を入れて３０、３７、又は３９℃で好気的に成長させた。抗生物質耐性をコードする遺伝子、プラスミド、又は外来遺伝子は、どれも、コハク酸生産のために発生された最終株中に存在しない。しかしながら、異なる株を構築する初期段階の間に、様々な抗生物質耐性マーカーを使用した。抗生物質選択プロセスのために、アンピシリン（５０mg l-1）、カナマイシン（５０mg l-1）、又はクロラムフェニコール（４０mg l-1）などの抗生物質を必要に応じて添加した。
【００９６】
発酵
種培養及び発酵は、グルコース、１００mM ＫＨＣＯ３及び１mMベタインＨＣｌを含有するＮＢＳ又はＡＭ１無機塩培地中で３７℃、１００rpmで成長させた。いくつかの実験ではコーンスチープリカーを使用した。それは、トウモロコシの湿式製粉業の副産物である。酵母エキス及びペプトンに比べて、それは、ビタミン及び微量元素の安価な供給源である。
【００９７】
特に述べない限り、コハク酸の発酵生産のために、１０％(w/v)グルコース及び１００mM重炭酸カリウムを補充したＮＢＳ無機塩培地（Causey et al., 2004）中で３７℃、抗生物質不在下にて株を成長させた。発酵用の前接種菌液は、２５０mlのフラスコ（１００ml ＮＢＳ培地、２％グルコース）に新鮮コロニーを移植することによって成長させた。１６時間（３７℃、１２０rpm）後に、３００mlのＮＢＳ培地（１０%グルコース、１００mM重炭酸カリウム）を含有する小型発酵容器の中にこの培養物を希釈し、０．０３３ｇ細胞乾燥重量（ＣＤＷ）l-1の接種菌液を提供した。
【００９８】
成長培地中の有機酸の蓄積は培地のｐＨを下げる傾向があることから、必要に応じて培養培地に適切な中和剤を添加する必要がある。ｐＨプローブを使用して培養容器のｐＨを連続的にモニタリングすることができ、成長培地のｐＨを中性ｐＨ付近に維持するために適切な塩基を添加することができる。微生物培養物のｐＨを維持するために適した塩基には、非限定的にＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ４ＳＯ４、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、及びＮＨ４ＣＯ３が含まれる。この目的に適した塩基は、単独で、又は組み合わせて使用することができる。
【００９９】
ある実験では、追加的なＣＯ２を含有する塩基（１．２Ｍ水酸化カリウムに溶かした２．４Ｍ炭酸カリウム）を添加することによって、発酵物を自動的にｐＨ７．０に維持した。続いて、３Ｍ Ｋ２ＣＯ３及び６Ｎ ＫＯＨの１：１混合物を添加することによってｐＨを維持した。試料取り出し口としての１６ゲージ針を除き、発酵容器を密封した。ＣＯ２雰囲気を確実にするために役立つ重炭酸塩を添加して、成長の間に嫌気生活を迅速に達成した。
【０１００】
遺伝的方法
染色体欠失、組込み、及び抗生物質耐性遺伝子の除去のための方法は、以前に記載されている（Datsenko and Wanner, 2000; Grabar et al., 2006; Posfai et al., 1997; Zhou et al., 2006）。
【０１０１】
本発明に使用された細菌株の構築では、以前に記載されたように、外来ＤＮＡのセグメントを残さずに染色体遺伝子をシームレスに欠失させた（Jantama et al., 2008a, 2008b; Zhang et al., 2007）。Redリコンビナーゼ技法（Gene Bridges GmbH, Dresden, Germany）を使用して染色体の組み込みを促進した。構築の間に使用したプラスミド及びプライマーを表３、７、９、１４、及び１５に一覧する。株ＫＪ０１２、ＫＪ０１７、ＫＪ０３２、ＫＪ０６０、ＫＪ０７０、ＫＪ０７１、ＫＪ０７２、ＫＪ０７３、及びＳＺ２０４の構築に使用したプラスミド及びプライマーを表３に要約する。センスプライマーは、各ターゲット遺伝子のＮ末端に対応する配列（太字体）に続いてＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴカセットに対応する２０bp（下線）を有する。アンチセンスプライマーは、ターゲティングされた各遺伝子のＣ末端領域に対応する配列（太字体）に続いてカセットに対応する２０bp（下線）を有する。増幅されたＤＮＡフラグメントを、Ｒｅｄリコンビナーゼ（ｐＫＤ４６）を有するE. coli株にエレクトロポレーションした。結果として生じたリコンビナントでは、ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴカセットが相同組換えによりターゲット遺伝子の欠失領域に取って代わった（ダブルクロスオーバー事象）。続いてプラスミドｐＦＴ−Ａを使用してＦＬＰリコンビナーゼを用いて染色体から耐性遺伝子（ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ）を切除し、１個のＦＲＴ部位を有する瘢痕領域を残した。抗生物質マーカーの試験、ＰＣＲ分析、及び発酵産物の分析によって染色体の欠失及び組み込みを検証した。Ｐ１ファージ普遍導入（Miller, 1992）を用いてＳＺ２０４株由来のΔｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ：：ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ突然変異をＫＪ０１７株に移行させてＫＪ０３２を作出した。
【０１０２】
ａｄｈＥ、ｌｄｈＡ、及びｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ領域におけるＦＲＴマーカーの欠失
連続的遺伝子欠失を作り、ａｄｈＥ、ｌｄｈＡ及びｆｏｃＡ−ｐｆｌＢローカスからＦＲＴマーカーを除去するために使用した戦略は、以前に記載されている（Datsenko and Wanner, 2000; Grabar et al., 2006; Jantama et al., 2008b; Zhang et al., 2007）。ｃａｔ−ｓａｃＢカセットの供給源としてプラスミドｐＬＯＩ４１５１を使用し、相同組換え事象であるダブルクロスオーバーを促進するためにＲｅｄリコンビナーゼ（ｐＫＤ４６）を使用した。クロラムフェニコール耐性を使用して、組み込みのために選択した。スクロース存在下の成長を用いてｓａｃＢの喪失のために選択した。このアプローチで、全てのＦＲＴ部位を排除したＫＪ０７９派生株を作出するために連続欠失を構築した。ａｄｈＥ、ｌｄｈＡ及びｆｏｃＡ−ｐｆｌＢローカスからのＦＲＴマーカー除去に使用したプライマー及びプラスミドを表３に一覧する。
【０１０３】
ΔａｄｈＥ領域中のＦＲＴ部位を除去するために、ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ部位の５’及び３’領域に相同な約５０bp及びｐＬＯＩ４１５１由来のｃａｔ−ｓａｃＢ遺伝子に対応する２０bpを有するように、ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴターゲット領域についてのハイブリッドプライマー（ＷＭａｄｈＥＡ／Ｃ）を設計した。テンプレートとしてｐＬＯＩ４１５１を用いてｃａｔ−ｓａｃＢカセットをＰＣＲ増幅するために、これらのプライマーを使用した。結果として生じたＰＣＲ産物を使用して、クロラムフェニコール耐性についての選択を用いてダブルクロスオーバー相同組換え事象によって、ΔａｄｈＥ領域中のＦＲＴ部位をｃａｔ−ｓａｃＢカセットと取り替え、ＴＧ２００を作出した。
【０１０４】
ａｄｈＥ遺伝子及び周辺配列を、ｕｐ／ｄｏｗｎａｄｈＥプライマーを使用してE. coli Ｃから増幅させた。ｙｃｈＥ’−ａｄｈＥ−ｙｃｈＧ’（３．４４kb）を有するＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングし、ｐＬＯＩ４４１３を得た。第２セットのプライマー（ＩＯ−ａｄｈＥｕｐ／ｄｏｗｎ）を使用して、テンプレートとしてのｐＬＯＩ４４１３及びＰｆｕポリメラーゼを用いてインサイドアウト産物を増幅させ、ａｄｈＥ配列の２．６kb内部セグメントが欠失した平滑末端化産物を得た。このインサイドアウトＰＣＲ産物をキナーゼ処理し、自己連結し、ｐＬＯＩ４４１９が生じた。ｐＬＯＩ４４１９（ｕｐ／ｄｏｗｎａｄｈＥプライマー）から増幅したＰＣＲ産物を使用して、ｓａｃＢの喪失についてのスクロース選択を行う別の二重相同組換え事象によって、ＴＧ２００中のｃａｔ−ｓａｃＢカセットを所望の染色体配列と取り替えた。結果として生じた株をＴＧ２０１（ＦＲＴがΔａｄｈＥ領域から除去されたＫＪ０７９）と名付けた。
【０１０５】
ａｄｈＥ：：ＦＲＴ部位を欠失させるために使用したものと同様の方法で、ΔｌｄｈＡ及びΔ（ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ）領域中のＦＲＴ部位を除去した。ΔｌｄｈＡ中のＦＲＴ部位を除去するために使用された追加的なプライマーセット（ｌｄｈＡＡ／Ｃ及びＩＯ−ｌｄｈＡｕｐ／ｄｏｗｎ）を、対応するプラスミド（ｐＬＯＩ４４３０及びｐＬＯＩ４４３２）と一緒に表７に一覧する。ＴＧ２０２株は、ＴＧ２０１中のこの領域をｐＬＯＩ４１５１からのＰＣＲ産物（ＷＭｌｄｈＡＡ／Ｃプライマー）と取り替えることによって作出した。ｓａｃＢの喪失についてのスクロース選択を用いて、ＴＧ２０２中のｃａｔ−ｓａｃＢカセットをｐＬＯＩ４４３２からのＰＣＲ産物（ｌｄｈＡＡ／Ｃプライマー）と取り替え、ＴＧ２０３を作出した。
【０１０６】
Δ（ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ）中のＦＲＴ部位を除去するために使用したプライマーセット（ｕｐｆｏｃＡ／ＭｉｄｐｆｌＡ及びＩＯ−ｙｃａＯｕｐ／ＩＯ−ｍｉｄｐｆｌＡｄｏｗｎ）及び対応するプラスミド（ｐＬＯＩ４４１５及びｐＬＯＩ４４２１）を、表７に一覧する。ＴＧ２０３におけるこの領域をｐＬＯＩ４１５１からのＰＣＲ産物（ＷＭｐｆｌＢＡ／Ｃプライマー）と取り替えることによってＴＧ２０４株を作出した。ｓａｃＢの喪失についてのスクロース選択を用いて、ＴＧ２０４におけるｃａｔ−ｓａｃＢカセットを、ｐＬＯＩ４４２１からのＰＣＲ産物（ｕｐｆｏｃＡ／ＭｉｄｐｆｌＡプライマー）と取り替え、ＫＪ０９１を作出した。ＫＪ０９１は、全てのＦＲＴ部位が染色体のΔａｄｈＥ、ΔｌｄｈＡ及びΔｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ領域から除去されているＫＪ０７３の派生株である。
【０１０７】
ａｃｋＡ領域におけるＦＲＴ部位の除去ならびにｃｉｔＦ、ｓｆｃＡ、及びｐｔａ−ａｃｋＡ遺伝子欠失の構築
ＫＪ０７３のａｃｋＡ領域におけるＦＲＴ部位を排除するために、所望の突然変異の配列を有するプラスミドを以下のように構築した。ａｃｋＡ遺伝子の約２００ｂp上流及び下流に結合するＪＭａｃｋＡＦ１／Ｒ１プライマーを用いたａｃｋＡのＰＣＲ増幅のためのテンプレートとしてE. coli ＣゲノムＤＮＡを使用した。線状産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen, Carlsbad, CA）にクローニングし、ｐＬＯＩ４１５８を生産した。次に、ＪＭａｃｋＡｕｐ１／ｄｏｗｎ１プライマー及びＰｆｕポリメラーゼを用いたインサイドアウトＰＣＲのテンプレートとしてプラスミドｐＬＯＩ４１５８を使用し、ａｃｋＡの８０８bp内部セグメントを喪失した平滑末端化産物を得た。次に、ＰａｃＩがフランキングされたｃａｔ−ｓａｃＢカセット（ｐＬＯＩ４１６２由来ＳｍａＩ／ＳｆｏＩフラグメント）を平滑ＰＣＲ産物に連結し、ｐＬＯＩ４１５９を生産した。プラスミドｐＬＯＩ４１５９は、ＰＣＲ増幅（ＪＭａｃｋＡＦ１／Ｒ１プライマー）のためのテンプレートとして役立った。このＰＣＲ産物を使用して、クロラムフェニコール耐性についての選択を用いたダブルクロスオーバー相同組換えによってＫＪ０７３のａｃｋＡ領域におけるＦＲＴ部位を取り替えた。結果として生じたクローンをＫＪ０７６と名付けた。
【０１０８】
プラスミドｐＬＯＩ４１５９も、ＰａｃＩで消化してｃａｔ−ｓａｃＢカセットを除去し、自己連結し、１８bpの翻訳終止配列を保持するｐＬＯＩ４１６０を生産した。プラスミドｐＬＯＩ４１６０は、ＰＣＲテンプレートとして役立った（ＪＭａｃｋＡＦ１／Ｒ１プライマー）。この増幅されたフラグメントを使用して、ｓａｃＢの喪失についての選択を用いたダブルクロスオーバー相同組換えによってＫＪ０７６中のｃａｔ−ｓａｃＢカセットを取り替えた。高温での成長によってｐＫＤ４６を除去した後に、結果として生じた株をＫＪ０７９と名付けた。この株における欠失領域は、１８bpの翻訳終止配列に取り替えられている。
【０１０９】
ａｃｋＡ領域からＦＲＴ部位を除去するために使用した上記戦略を採用して、ｃｉｔＦ、ｓｆｃＡ及びｐｔａ−ａｃｋＡを連続的に欠失させ、欠失した領域を１８bpの翻訳終止配列と取り替えた。ｃｉｔＦ欠失を構築するために使用した追加的なプライマーセット（ｃｉｔＦｕｐ／ｄｏｗｎ及びｃｉｔＦ２／３）を、対応するプラスミド（ｐＬＯＩ４６２９、ｐＬＯＩ４６３０、及びｐＬＯＩ４６３１）と一緒に表７に一覧する。結果として生じた株をＫＪ１０４と名付けた。
【０１１０】
ＫＪ１０４及びＫＪ１１０株からｓｆｃＡ遺伝子を欠失させ、それぞれＫＪ１１９及びＫＪ１２２と名付けた株が生じた。ｓｆｃＡ欠失を構築するために使用した追加的なプライマーセット（ｓｆｃＡｕｐ／ｄｏｗｎ及びｓｆｃＡ１／２）を、対応するプラスミド（ｐＬＯＩ４２８３、ｐＬＯＩ４２８４、及びｐＬＯＩ４２８５）と一緒に表７に一覧する。
【０１１１】
ａｃｋＡ−ｐｔａオペロン（合成翻訳終止配列を含む）をＫＪ１２２から欠失させてＫＪ１３４株を生産した。この欠失を構築するために使用した追加的なプライマーセット（ａｃｋＡｕｐ／ｐｔａｄｏｗｎ及びａｃｋＡ２／ｐｔａ２）を、対応するプラスミド（ｐＬＯＩ４７１０、ｐＬＯＩ４７１１、及びｐＬＯＩ４７１２）と一緒に表７に一覧する。ＫＪ１３４株は、ＦＲＴ部位も外来遺伝子も全く有さない。
【０１１２】
マーカーレス遺伝子欠失のためのｃａｔ−ｓａｃＢカセットを有するｐＬＯＩ４１６２の構築
染色体ＤＮＡの連続欠失を容易にするために、除去可能なｃａｔ−ｓａｃＢカセットを有し、そして全てのリーディングフレームに終止コドンを有する合成ＤＮＡの１８bpセグメントを包含させるオプションを備えるプラスミドｐＬＯＩ４１６２（図８）を構築した。このプラスミドは、合成配列ならびにプラスミドｐＬＯＩ２２２８（Martinez-Morales et al., 1999）、ｐＬＯＩ２５１１（Underwood et al., 2002）、及びｐＥＬ０４（Lee et al., 2001; Thomason et al, 2005）の一部から構成される。テンプレートとしてｐＥＬ０４を使用して、ＪＭｐＥＬ０４Ｆ１／Ｒ１プライマーを用いてインサイドアウトＰＣＲを行い、ｃａｔ及びｓａｃＢ遺伝子の間の無用のＳｍａＩ及びＢａｍＨＩ部位を排除した。増幅産物をＢｇｌＩＩ（両者のプライマー内）で消化し、自己連結してｐＬＯＩ４１５２を生産した。ｐＬＯＩ２２２８由来のＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴフラグメント（Klenow処理したＢａｎＩ、ＣｌａＩ）をｐＬＯＩ２５１１の適合性部位（Klenow処理したＮｈｅＩ、ＣｌａＩ）に連結することによってプラスミドｐＬＯＩ４１３１を構築した。続いてプラスミドｐＬＯＩ４１３１をＥｃｏＲＩで消化し、自己連結してＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴフラグメントを除去し、単一のＫａｓＩ及びＸｍａＩ部位を保持するｐＬＯＩ４１４５を生産した。相補的オリゴヌクレオチド（ＳｆＰＢＸＰＳｓｅｎｓｅ及びＳｆＰＢＸＰＳｃｏｍｐ）をアニーリングすることによってポリリンカーセグメント（ＳｆＰＢＸＰＳ）を調製した。ＫａｓＩ及びＸｍａＩで消化後に、このセグメントをｐＬＯＩ４１４５の対応する部位に連結し、ｐＬＯＩ４１５３を生産した。ＪＭｃａｔｓａｃＢｕｐ３／ｄｏｗｎ３プライマーセットを用いたＰＣＲによってｐＬＯＩ４１５２中の改変ｃａｔ−ｓａｃＢカセットを増幅した。ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化後に、このカセットをｐＬＯＩ４１５３の対応する部位に連結し、ｐＬＯＩ４１４６を生産した。６個全てのリーディングフレームに終止コドンを有する１８bpの領域（５’ＧＣＣＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＣＣ３’）（配列番号：１）を作り出すために、ｐＬＯＩ４１４６をＰａｃＩで消化し、自己連結してｐＬＯＩ４１５４を生産し（図示せず）、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットを除去した。突然変異誘発プライマー（ＪＭ４１６１ｓｅｎｓｅ／ｃｏｍｐ）及び線状プラスミドの増幅を用いて、ｐＬＯＩ４１５４のＳｆｏＩ部位とＰａｃＩ部位との間に２個の追加的な塩基（Ｔ及びＡ）を挿入し、ｐＬＯＩ４１６１を生産した。最終的に、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットを有するｐＬＯＩ４１４６からのＰａｃＩ消化フラグメントをｐＬＯＩ４１６１のＰａｃＩ消化部位に連結し、ｐＬＯＩ４１６２（GenBankアクセッションＥＵ５３１５０６）を生産した。
【０１１３】
ｍｇｓＡ及びｐｏｘＢ遺伝子の欠失
２ステップ相同組換えプロセスを用いてE. coli染色体遺伝子を欠失させるための改変法を開発した（Thomason et al., 2005）。この方法を用いると、遺伝子欠失後に抗生物質遺伝子も瘢痕配列も染色体上に残らない。最初の組換えでは、ターゲット遺伝子の一部を、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）及びレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を有するＤＮＡカセットに取り替えた。第２の組換えでは、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットを、ネイティブな配列と取り替えて欠失領域を削除した。ｓａｃＢ遺伝子を有する細胞は、スクロースと共にインキュベーションする間にレバンを蓄積し、死滅する。生き残ったリコンビナントは、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットを喪失している割合が高い。
【０１１４】
遺伝子欠失を促進するためにカセットを構築した。ＪＭｃａｔｓａｃＢプライマーセットを用いたＰＣＲによってｐＥＬ０４からｃａｔ−ｓａｃＢ領域を増幅し（Lee et al., 2001; Thomason et al., 2005）（表３）、ＮｈｅＩで消化し、ｐＬＯＩ３４２１の対応する部位に連結し、ｐＬＯＩ４１５１を生産した。ｐＬＯＩ４１５１（テンプレート）及びｃａｔ−ｕｐ２／ｓａｃＢ−ｄｏｗｎ２プライマーセット（ＥｃｏＲＶ部位は各プライマーに包含される）を用いたＰＣＲによってｃａｔ−ｓａｃＢカセットを増幅し、ＥｃｏＲＶで消化し、以下の連結に使用した。
【０１１５】
プライマーセットｍｇｓＡ−ｕｐ／ｄｏｗｎを用いてｍｇｓＡ遺伝子及び隣接する５００bp領域（ｙｃｃＴ’−ｍｇｓＡ−ｈｅｌＤ’、１４３５bp）を増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）にクローニングして、プラスミドｐＬＯＩ４２２８を生産した。このプラスミドＤＮＡの１０００倍希釈調製物は、ｍｇｓＡ−１／２プライマーセット（両者のプライマーは共にｍｇｓＡ遺伝子内にあり外向きである）を用いたインサイドアウト増幅のためのテンプレートとして役立った。結果として生じたレプリコンを有する４９５８bpフラグメントを、ｐＬＯＩ４１５１由来の増幅されたＥｃｏＲＶ消化ｃａｔ−ｓａｃＢカセットに連結し、ｐＬＯＩ４２２９を生産した。この４９５８bpフラグメントも、第２のプラスミドｐＬＯＩ４２３０を構築するために使用した（リン酸化及び自己連結）。ｐＬＯＩ４２３０において、ｍｇｓＡの中心領域は存在しない。（ｙｃｃＴ’−ｍｇｓＡ’−ｍｇｓＡ”−ｈｅｌ）。
【０１１６】
ｍｇｓＡ−ｕｐ／ｄｏｗｎプライマーセットを用いた増幅のためのテンプレートとしてそれぞれ役立つｐＬＯＩ４２２９及びｐＬＯＩ４２３０をＸｍｎＩで消化後に（ベクター内）、それぞれ組み込みステップＩ（ｙｃｃＴ’−ｍｇｓＡ’−ｃａｔ−ｓａｃＢ−ｍｇｓＡ”−ｈｅｌＤ’）及びステップＩＩ（ｙｃｃＴ’−ｍｇｓＡ’−ｍｇｓＡ”−ｈｅｌＤ’）のための線状ＤＮＡフラグメントを生産した。ステップＩのフラグメントを、ｐＫＤ４６（Ｒｅｄリコンビナーゼ）を有するＫＪ０６０にエレクトロポレーションし、３０℃で２時間インキュベーションして発現させ、分離した後に、プレート上でクロラムフェニコール（４０mg l-1）及びアンピシリン（２０mg l-1）耐性についてリコンビナントを選択した（３０℃、１８時間）。３種のクローンを選択し、アンピシリン及び５％w/vアラビノースを有するLuria液体培地中で成長させ、エレクトロポレーション用に調製した。ステップＩＩのフラグメントをエレクトロポレーションした後に、細胞を３７℃で４時間インキュベーションし、１０％スクロースを含有する１００mlの改変ＬＢ（１００mM ＭＯＰＳ緩衝液を添加し、ＮａＣｌを削除したもの）を入れた２５０mlフラスコに移植した。一晩インキュベーション（３７℃）した後に、６％スクロースを含有する改変ＬＢプレート（ＮａＣｌなし；１００mM ＭＯＰＳを添加）上でクローンを選択した（３９℃、１６時間）。結果として生じたクローンをアンピシリン及びクロラムフェニコール耐性の喪失について試験した。さらにＰＣＲ分析によって構築を確認した。ｍｇｓＡ遺伝子を欠如しているクローンを選択し、ＫＪ０７０と名付けた。
【０１１７】
ｍｇｓＡ遺伝子を欠失させるために使用したものと類似の方法でｐｏｘＢ遺伝子をＫＪ０７１から欠失させた。ｐｏｘＢの欠失を構築するために使用した追加的なプライマーセット（ｐｏｘＢ−ｕｐ／ｄｏｗｎ及びｐｏｘＢ−１／２）を、対応するプラスミド（ｐＬＯＩ４２７４、ｐＬＯＩ４２７５、及びｐＬＯＩ４２７６）と一緒に表３に一覧する。結果として生じた株をＫＪ０７２と名付けた。
【０１１８】
ｔｄｃＤＥ及びａｓｐＣにおける遺伝子欠失の構築
ｔｄｃＤＥｕｐ／ｄｏｗｎプライマーを使用してｔｄｃＤＥ遺伝子及び隣接１０００bp領域（ｔｄｃＧ’−ｔｄｃＦＥＤ−ｔｄｃＣ’、５３２５bp）を増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングしてプラスミドｐＬＯＩ４５１５を生産した。このプラスミドＤＮＡの１０００倍希釈調製物は、ｔｄｃＤＥＦ７／Ｒ７プライマー（両者のプライマー共にｔｄｃＤＥ遺伝子内にあって、外向きである）を用いたインサイドアウト増幅のためのテンプレートとして役立った。結果として生じた、レプリコンを有する６８６１bpのフラグメントを、ｐＬＯＩ４１６２から増幅されたＳｍａＩ／ＳｆｏＩ消化ｃａｔ−ｓａｃＢカセット（ＪＭｃａｔｓａｃＢｕｐ３／ｄｏｗｎ３プライマー）に連結し、ｐＬＯＩ４５１６を生産した。この６８６１bpフラグメントは、また、ｔｃｄＤ及びｔｄｃＥの欠失を有する第２のプラスミドｐＬＯＩ４５１７（キナーゼ処理、自己連結）を構築するために使用した。ｐＬＯＩ４５１６及びｐＬＯＩ４５１７から増幅されたＰＣＲフラグメント（ｔｄｃＤＥｕｐ／ｄｏｗｎプライマー）を使用して、ＫＪ０９１におけるｔｄｃＤＥ領域を取り替えた。結果として生じたクローンを、アンピシリン及びクロラムフェニコール耐性の喪失について試験した。
【０１１９】
ｔｄｃＤＥ遺伝子を欠失させるために使用したものと類似の方法でＫＪ１０４からａｓｐＣ遺伝子を欠失させた。ａｓｐＣ欠失を構築するために使用した追加的なプライマーセット（ａｓｐＣｕｐ／ｄｏｗｎ及びａｓｐＣ１／２）を、対応するプラスミド（ｐＬＯＩ４２８０、ｐＬＯＩ４２８１、及びｐＬＯＩ４２８２）と一緒に表７に一覧する。結果として生じた株をＫＪ１１０と名付けた。ＫＪ０９８及びＫＪ１１０のどちらも、それぞれの欠失領域（ｔｄｃＤＥ及びａｓｐＣ）内に介在配列を全く有さない。
【０１２０】
ｇｌｄＡ及びｄｈａＫＬＭにおける遺伝子欠失の構築
上記遺伝的方法を用いて、E. coli ＸＺ６３２株からE. coli ＸＺ４６４、ＸＺ４６５、及びＸＺ４６６株を得た。E. coli ＸＺ４６４、ＸＺ４６５、ＸＺ４６６及びＸＺ６３２株の関連する特徴を表１５に提供する。
【０１２１】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
以前に記載されたように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用してメッセンジャーＲＮＡレベルを測定した（Jarboe et al., 2008）。５％又は１０％グルコースを有するＮＢＳ培地中で細胞を成長させ、ドライアイス／エタノール浴中でかき混ぜることによって対数増殖中期に細胞を採集し、続いて遠心分離し、精製するまでRNALater（Qiagen, Valencia CA）中で−８０℃で保存した。ＲＮＡの精製は、RNeasy Miniカラム（Qiagen）で行い、続いてＤＮａｓｅＩ（Invitrogen）で消化した。Superscript II（Invitrogen, Carlsbad CA）を用いた逆転写は、テンプレートとして５０ngの総ＲＮＡを使用した。リアルタイムＰＣＲは、SYBR Green ＲＴ−ＰＣＲミックスを用いたBio-Rad iCycler（Bio-Rad, Hercules CA）で行った。逆転写なしでＲＴ−ＰＣＲを実施することによってゲノムＤＮＡの混入についてＲＮＡをチェックした。転写物の存在度は、基準としてゲノムＤＮＡを使用して推定し、発現レベルは転写リプレッサーであるｂｉｒＡ遺伝子によって基準化した（Jarboe et al., 2008）。ｐｃｋ及びｂｉｒＡについて使用したＲＴ−ＰＣＲプライマーを表３に一覧する。
【０１２２】
ｐｃｋ領域の配列決定
ＫＪ０７３のｐｃｋ遺伝子に突然変異があるかどうかを知るために、ＫＪ０１２及びＫＪ０７３の両者におけるｐｃｋ遺伝子のコード領域及びプロモーター領域（コード領域前方の約８００bp）をPfuUltra High Fidelity ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene; Wilmington, DE）によって増幅した。プライマーセットｐｃｋ−Ｆ／Ｒを使用して、転写終結因子を経てコード領域を増幅した（表９）。プライマーセットｐｃｋ−２／３を使用してプロモーター領域を増幅した。ＤＮＡ配列決定は、University of Florida Interdisciplinary Center for Biotechnology Researchによって提供された（Applied Biosystems自動シークエンサー使用）。
【０１２３】
代謝進化
ｐＨコントロールされた発酵からの細胞を２４時間目に連続的に移植して、成長ベースの選択を通じた代謝進化を助長した。接種菌液は、新しい培地の体積の約１／１００であり、予備加温した新鮮培地に開始ＯＤ５５０が０．０５になるまで直接添加した。改良された発酵特性を持つクローンを単離した。代謝進化戦略を適用して、コハク酸生産の収量を改善した。
【０１２４】
分析
細胞成長：Bausch & Lomb Spectronic 70分光光度計を用いて５５０nmでの吸光度から細胞量を推定した（ＯＤ １．０＝３３３mgの細胞乾燥重量l-1）。
【０１２５】
遺伝的に工学処理された微生物による有機酸の生産は、当技術分野において周知の適切な技法を使用することによって確認及び定量することができる。例えば、ＨＰＬＣ技法は、選択されたクローンによって生産される有機酸の量を測定するために使用することができる。ＨＰＬＣ技法は、選択されたクローンによって生産される有機酸の純度を決定することにも有益である。高速液体クロマトグラフィーを使用することによって、有機酸及び糖を決定する（Grabar et al., 2006; Zhang et al., 2007）。
【０１２６】
発酵培養液中に存在するコハク酸及び他の有機酸は、BioRad Aminex HPX-87Hカラムを備えるAgilent 1200 ＨＰＬＣ装置で分析した。BioRad Microguard Cation H+をガードカラムとして使用した。ＨＰＬＣ分析のための標準は、０．００８Ｎ硫酸に入れて調製した。ＨＰＬＣのカラム温度は５０℃に維持した。濃度０．００８Ｎの硫酸を移動相として流速０．６ml/分で使用した。様々な成分の定量は、２１０nmでそれらの吸収を測定することによって行った。
【０１２７】
酵素アッセイ
対数増殖中期に遠心分離することによって細胞を採集し（８，０００×ｇ、５分、４℃）、冷１００mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液で洗浄し、同緩衝液（１ml）に再懸濁した。Fast Prep-24（MP Biomedicals, Solon, OH）を使用して細胞を破壊した後に、遠心分離によって調製物を透明化した（１３，０００×ｇ、１５分）。標準としてウシ血清アルブミンを使用してＢＣＡ法（Pierce, Rockford, IL）によってタンパク質を測定した。
【０１２８】
ＰＥＰカルボキシラーゼ活性は、Canovas 及び Kornberg（1969）によって記載されたように測定した。反応混合物は、１００mMトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１０mM ＭｇＣｌ２、１mM ＤＴＴ、２５mM ＮａＨＣＯ３、０．２mM ＮＡＤＨ２ＯＵリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、及び粗抽出物を含有した。アッセイ混合物を３７℃で１５分間インキュベーションして酵素を活性化し、その後１０mM ＰＥＰの添加によって反応を開始した。
【０１２９】
Van der Werfら（1997）によって記載されたようにＰＥＰカルボキシキナーゼ活性を測定した。反応混合物は、１００mM ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．６）、１０mM ＭｇＣｌ２、７５mM ＮａＨＣＯ３、５mM ＭｎＣｌ２、５０mM ＡＤＰ、１mM ＤＴＴ、０．２mM ＮＡＤＨ２ＯＵリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、及び粗抽出物を含有した。１０mM ＰＥＰの添加によって反応を開始した。
【０１３０】
Stols及びDonnelly(1997)によって記載されたようにリンゴ酸酵素活性（カルボキシル化方向）を測定した。反応混合物は、１００mMトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、２５mM ＮａＨＣＯ３、１mM ＭｎＣｌ２、１mM ＤＴＴ、０．２mM ＮＡＤＨ、及び粗抽出物を含有した。２５mMピルビン酸塩の添加によって反応を開始した。このアッセイ法は、乳酸デヒドロゲナーゼの存在が原因で野生型E. coliにおけるＳｆｃＡ活性の測定に適さなかった。
【０１３１】
Miller（1992）によって記載されたようにβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。全てのアッセイにおいて、１ユニットの活性は、毎分１nmolの基質を酸化又は還元するために必要とされる酵素の量に相当する。
【０１３２】
実施例１
コハク酸生産のためのＫＪ０７３株の構築
５％グルコースを含有する最少培地中でのコハク酸生産に適した株の構築において、合理的設計アプローチ及び代謝進化の両者にならった。E. coliについて一般に受け入れられている標準発酵経路を図示する図１を精査することによって、全ての代替産物、すなわち乳酸（ｌｄｈＡ）、エタノール（ａｄｈＥ）及び酢酸（ａｃｋＡ）に関して最終ステップをコードしている遺伝子に挿入不活性化を行う、コハク酸生産株の代謝的工学処理のための合理的設計を考案した。合理的設計によるこの代謝的工学処理からの結果は、完全に予想外であった。ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ及びａｃｋ遺伝子の挿入不活性化に起因するＫＪ０１２（ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ ΔａｃｋＡ：：ＦＲＴ）株は、５％グルコース（２７８mM）を含有する無機塩培地中の嫌気性条件下で非常に成長性に乏しく、主発酵産物としてコハク酸の代わりに酢酸を生産した。合理的設計からの予想とは逆に、コハク酸は副産物のままであった。これらの突然変異の結果、代謝されたグルコースに基づくコハク酸のモル収量は不変であった。５％グルコースを含有するＮＢＳ無機塩培地中での発酵の間に親株及びＫＪ０１２株の両者について、コハク酸収量は、グルコース１molあたりコハク酸０．２molであることが見出された。本発明者らは、好気性条件（好気性振盪フラスコ；５％グルコース）下でインキュベーションすることによって、ＮＢＳ無機塩培地がＫＪ０１２の成長に必要な全ての無機栄養素を含有することを確認した。好気性振盪フラスコ中でのＫＪ０１２に関する細胞収量は、嫌気性成長の間の５倍高く、嫌気性成長の間のE. coli Ｃ（親）の７５％であった。これらの結果は、全ての中心的生合成経路がＫＪ０１２において機能性を保つこともまた確認するものであった。
【０１３３】
複合栄養素が存在する場合（Luria液体培地）、ＫＪ０１２による発酵コハク酸生産が、最小塩培地中のＫＪ０１２の２０倍に増加し、コハク酸に関するモル収量は３．５倍増加した。明らかに、主経路に基づく合理的設計の方が、学術的証明に、又は複合栄養素と共に使用することが意図された設計プロセスによく適する。
【０１３４】
無機塩培地中で嫌気性代謝する間のＫＪ０１２による成長不良、コハク酸生産不良、及び酢酸生産増加の根拠は分かっていない。これらは、標準経路チャートに基づく合理的設計を用いた代謝的工学処理の結果として生じた予想外の結果である。最少培地において、代謝的工学処理のための合理的設計は、明らかに予測不可能である。結果として生じた株であるＫＪ０１２は、成長が親に劣り、コハク酸生産に関して親に勝るものではなかった。ＫＪ０１２（ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ ΔａｃｋＡ：：ＦＲＴ）は、親E. coli Ｃに比べて成長が不良であり、低いコハク酸生産速度を示し、モル収量が良好ではなかった（表４）。
【０１３５】
これらの結果にかかわらず、以下の理論的根拠に基づき成長及びコハク酸生産の改善を同時選択する方法としてこの株の連続移植を試みた。コハク酸へのグルコース発酵のための主経路（図１Ａ及び図２Ａ）は、一般にカルボキシル化ステップについてホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）を使用すると考えられている（Unden and Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Keseler et al., 2005; Millard et al., 1996; Gottschalk, 1985; Karp et al., 2007）。このカルボキシル化酵素は、ホスホエノールピルビン酸中に高エネルギーのリン酸を維持せず、成長に利用可能な正味のＡＴＰを減少させる。ＡＴＰの収量を増加させる可能性があり、それによって成長を増加させる可能性のある公知のE. coli遺伝子のレパートリーを使用して、代替コハク酸生産経路を想定することができる（図１Ａ；図２Ｂ、２Ｃ及び２Ｄ）。しかし、これらの代替経路のどれも、E. coliのネイティブな株を用いた発酵の間にコハク酸生産のために機能することが示されていない。これらの代替経路における主要な酵素は、グルコースによって抑制され、普通は糖新生の間に活性である。典型的には、これらの糖新生酵素のレベルは、グルコース及び他の代謝物の入手性と逆の変化をし（Goldie and Sanwal, 1980a; Wright and Sanwal, 1969; Sanwal and Smando, 1969a）、逆方向の脱カルボキシル化で機能する（Keseler et al., 2005; Oh et al., 2002; Kao et al., 2005; Stols and Donnelly, 1997; Samuelov et al., 1991; Sanwal, 1970a; Delbaere et al., 2004; Goldie and Sanwal, 1980b; Sanwal and Smando, 1969b; Sanwal 1970b）。
【０１３６】
これらの一つについての主要な酵素であるＮＡＤＨ連結型リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ）（図２Ｂ）は、E. coliにおいてコハク酸生産を増加させる能力があるが、そのためにプラスミドからの過剰発現を必要とすることが実証された（Stols and Donnelly, 1997）。しかしながら、これらの代替経路のどれも、高レベルのグルコース存在下で嫌気性成長する間にネイティブな株のE. coli又はＫＪ０１２において機能するとは予想されない。成長改善について選択を行うＫＪ０１２の連続移植は、酸化還元バランスを維持しＡＴＰ収量を増加させた、代替コハク酸生産経路の突然変異活性化（図１Ｂ）について選択する機会を与えた。
【０１３７】
小型ｐＨコントロール発酵装置を使用した様々な方式下で成長を改善するために連続的に継代培養することによって、ＫＪ０１２の代謝進化を実施した。発酵条件下でＮＢＳグルコース培地にＫＪ０１２を、成長が可能な限り迅速に連続移植した（図３Ａ；図４Ａ；図５）。最初の９回の移植の間、成長は低速のままであって４〜５日間のインキュベーションが必要であり、それから劇的に増加して、２４時間間隔で移植を行うことが可能になった。この事象は、酢酸の増加を伴い（図４Ａ）、コハク酸生産はあまり改善しなかった。２７回の移植後に（６０日目）、ＫＯＨを３Ｍ Ｋ２ＣＯ３及び６Ｎ ＫＯＨの１：１混合物と取り替えて、追加的な二酸化炭素（最初に１００mMを全てのＮＢＳ無機塩培地に添加）を供給した。移植を継続することでコハク酸生産の改善へと導いた。５％グルコース（２２７mM）中に合計で４０回の移植を行い、続いて１０％グルコース（５５５mM）中に４０回の移植を行った。１０％グルコース中に移植する間に、コハク酸収量は、代謝されたグルコース１molあたり約０．７molのままであり、副産物として乳酸、酢酸、及びギ酸が生じた（表４）。この収量は、E. coli Ｃ及びＫＪ０１２株より３倍高かった。クローンを単離し、ＫＪ０１７と名付けた。ＫＪ０１２の成長改善について選択してＫＪ０１７を作出することで、コハク酸生産改善について同時選択することになった（速度、力価、及びモル収量）。
【０１３８】
一般にホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）に基づくネイティブな発酵経路として見なされる経路を利用してE. coliによって生産されたコハク酸は、無機リン酸を生産することによってホスホエノールピルビン酸のエネルギーを浪費する。この経路によって生産される単位コハク酸あたり１個のＡＴＰが消失する（図１；図６）。代替酵素系を使用することによってこのエネルギーをＡＴＰとして保存することは、細胞成長の増加及びコハク酸生産増加についての同時選択を行う機会を示す。ＡＴＰを保存し、そしてそれによって成長を増加させる可能性のあるコハク酸生産についての３個の他の酵素経路が、E. coliにおける公知の遺伝子に基づいて想定された（図１；図６）。しかし、これらの代替経路における全てのカルボキシル化ステップは、有機酸などの基質で成長する間に主に糖新生のために逆方向（脱カルボキシル化）で機能すると考えられる（Keseler et al., 2005; Oh et al., 2002; Kao et al., 2005; Stols and Donnelly, 1997; Samuelov et al., 1991; Sanwal, 1970a; Delbaere et al., 2004; Goldie and Sanwal, 1980b; Sanwal and Smando, 1969b; Sanwal, 1970b）。ＫＪ０１７を発生させるための成長ベースの選択が実際に１種又は複数種のこれらの代替経路を活性化させたという仮説を検証するために、４種のカルボキシル化酵素の活性を、野生型株ＡＴＣＣ８７３９、ＫＪ０１２（主発酵経路を欠失）、及び代謝進化したＫＪ０１７株において比較した（表５）。ＰＥＰカルボキシラーゼの活性は、全株で同様に低く、２０〜３０U(mgタンパク質)-1であった。ＮＡＤＨ連結型リンゴ酸酵素の活性（ＳｆｃＡ；カルボキシル化方向）もまた低く、ＮＡＤＰＨ連結型リンゴ酸酵素の活性（ＭａｅＢ；カルボキシル化方向）は検出不能であった。対照的にＰＥＰカルボキシキナーゼ活性は、ＫＪ０１２に比べてＫＪ０１７において４倍増加したが、これは、改善した成長についての選択が、コハク酸生産についてのエネルギー保存経路の発現を増加させる結果としてＡＴＰ収量を増加させることを通じて、コハク酸の生産増加について同時選択することになるという仮説に一致する。
【０１３９】
さらなる成長ベースの選択及び追加的な遺伝子欠失を用いて、成長及びコハク酸生産がさらに改善された多数の追加的な株を構築した（図３及び図４）。
【０１４０】
ＫＪ０１７（ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ ΔａｃｋＡ：：ＦＲＴ）を用いた発酵では、主要な乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）及び酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）活性をコードする遺伝子の欠失にもかかわらず、１０％(w/v)グルコース存在下で成長する間に不要な副産物（酢酸、ギ酸、及び乳酸）が豊富に存在した（表４）。乳酸及び酢酸の生産は、成長ベースの選択の基盤となる、より高いＡＴＰ収量ももたらすことができた（図１Ａ）。
【０１４１】
ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌＢ）をコードする遺伝子をＫＪ０１７から欠失させて、ギ酸としての還元物質が喪失すること及び潜在的酢酸供給源であるアセチル−ＣｏＡが過剰になることを排除した。このオペロンにおいて上流のギ酸輸送体（ｆｏｃＡ）も欠失させた。予想通り、この欠失株（ＫＪ０３２）は、酢酸不在下で成長せず、これがＫＪ０１７におけるアセチル−ＣｏＡ生産のための主経路であることを確認した（図３Ｃ）。ｐｆｌＢの欠失は、嫌気性条件下で酢酸要求性を生じることが周知である（Sawers and Bock, 1988）。ＫＪ０３２による成長及びコハク酸生産は、２０mM酢酸塩の添加によって回復した（図３Ｃ、図４Ｃ、及び図５）。ギ酸及び酢酸の生産は、ｐｆｌＢ（及びｆｏｃＡ）欠失の結果として実質的に減少した。この株は成長のために酢酸を必要とするものの、発酵の間に追加的な酢酸も生産した。以前に同じ現象が、ピルビン酸生産のためのE.coli Ｋ−１２生物触媒を構築する間にｐｆｌＢ欠失株について報告された（Causey et al., 2004）。乳酸レベルは、ＫＪ０３２においても減少した（表４；図４Ｃ）。その後の移植は、成長及びコハク酸生産の改善を伴った。その後の移植の間に、添加する酢酸を減少させ、植菌量を減少させ、グルコース濃度を倍増した（１０％w/v）（図３Ｄ及び４Ｄ）。さらなる移植の後に酢酸を削除したため、おそらく別の遺伝子の発現増加が原因でもはや酢酸要求性でない株が発生した。しかしながら、酢酸添加を排除するとコハク酸収量は低下し、その一方でリンゴ酸及び酢酸のレベルは増加した。最後の移植からクローンを単離し、ＫＪ０６０（ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ ΔａｃｋＡ：：ＦＲＴ ΔｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ：：ＦＲＴ）と名付けた。この株は、１０％グルコースを有するＮＢＳ無機塩培地中で代謝されたグルコース１molあたり１molのコハク酸を生産した。
【０１４２】
様々な株の発酵培養液中に存在する少量の乳酸は、メチルグリオキサールシンターゼ経路に由来すると推定される（図６；Grabar et al., 2006）。これは収量の小さな損失を表すが、この経路による乳酸生産は、成長及び解糖の両者の阻害因子であるメチルグリオキサールの蓄積を示す（Egyud and Szent-Gyorgyi, 1966; Grabar et al., 2006; Hopper and Cooper, 1971）。ＫＪ０６０においてｍｇｓＡ遺伝子（メチルグリオキサールシンターゼ）を欠失させることによってメチルグリオキサール及び乳酸の生産を排除し、ＫＪ０７０（ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ ΔａｃｋＡ：：ＦＲＴ ΔｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ：：ＦＲＴ ΔｍｇｓＡ）を作出した。ＫＪ０７０株を最初に５％(w/v)グルコース中で継代した（図３Ｅ、図４Ｅ、及び図５）。ｍｇｓＡの欠失は、培地中のピルビン酸蓄積によって実証されるように解糖フラックスを増加させたと推定される（表４）。この解糖フラックスの増加は、フマル酸レダクターゼのアロステリック阻害因子であるオキザロ酢酸の生産増加が原因で、コハク酸／リンゴ酸比のさらなる低下の一因にもなる可能性がある（Iverson et al., 2002; Sanwal, 1970c）。
【０１４３】
２１回目の移植で、グルコースを１０％(w/v)に倍増し、移植を継続した。このより高いレベルのグルコース及びその後の移植の結果として新しい株が生じ、それを最終継代で単離し、ＫＪ０７１（ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ ΔａｃｋＡ：：ＦＲＴ ΔｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ：：ＦＲＴ ΔｍｇｓＡ）と名付けた。この株は、リンゴ酸生産に有用でありうる。
【０１４４】
グルコースから酢酸への変換は酸化還元的に中性であるものの、酢酸への炭素の分配はコハク酸及びリンゴ酸の収量を減少させる。ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）は、微好気性条件下でインキュベーションする間に酢酸及びＣＯ２の潜在的供給源となる（Causey et al., 2004）。それは嫌気性条件下でピルビン酸を酸化するように機能するはずはないものの、ｐｏｘＢを遺伝子欠失のターゲットとした（図６）。予想通り、ｐｏｘＢの欠失によるＫＪ０７２作出（ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ ΔａｃｋＡ：：ＦＲＴ ΔｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ：：ＦＲＴ ΔｍｇｓＡ ΔｐｏｘＢ）は、酢酸生産を減少させず、酢酸生産に代替経路が関与することを示している。しかしながら、ｐｏｘＢの排除は、発酵産物においてコハク酸の増加を含めた予想外の変化を招いた（表４；図４Ｆ）。コハク酸生産におけるこの改善のメカニズムは未知であるが、アセトイン生産、脱カルボキシル化、及び炭素連結（carboligation）などのピルビン酸オキシダーゼの他の活性に関係する可能性がある（Ajl and Werkman, 1948; Chang and Cronan, 2000）。
【０１４５】
１０％(w/v)グルコース存在下の低塩培地ＡＭ１培地中でＫＪ０７２株をさらに４０ラウンドの代謝進化に供した（表４；図３Ｆ、図４Ｆ、及び図５）。これらの移植の間に成長、細胞収量及びコハク酸生産の改善が観察された。リンゴ酸、ピルビン酸及び酢酸レベルも増加した。最終移植物からクローンを単離し、ＫＪ０７３（ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ ΔａｃｋＡ：：ＦＲＴ ΔｐｆｌＢ：：ＦＲＴ ΔｍｇｓＡ ΔｐｏｘＢ）と名付けた。
【０１４６】
ＫＪ０７３株は、カルボキシル化のためにホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ経路を保持していた（表５）。この株のin vitro活性は、ＫＪ０１２より４５倍高く、ＫＪ０１７より１０倍が高く、エネルギー保存とコハク酸生産及び成長との緊密な関係性のさらなる証拠を提供し、選択のために用いられた基盤をさらに確立した。
【０１４７】
ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性の大きな増加は、細胞収量及びコハク酸生産の改善とよく相関した（表５）。ＫＪ０１２からＫＪ０１７では（代謝進化）、ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性は４．３倍に増加し、細胞収量は５．７倍に増加し、コハク酸生産は８．８倍に増加した。ＫＪ０１７からＫＪ０６０では（ｐｆｌＢの欠失に続く代謝進化）、ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性は１２倍に増加し、細胞収量は１．３倍に増加し、コハク酸生産は２．６倍に増加した。ＫＪ０６０からＫＪ０７１では（ｍｇｓＡの欠失に続く代謝進化）、ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性は９２％減少し、細胞収量は４５％減少し、コハク酸生産は６３％減少した。ＫＪ０７１からＫＪ０７３では（ｐｏｘＢの欠失に続く代謝進化）、ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性、細胞収量、及びコハク酸生産はＫＪ０６０と等しいレベルまで回復した。
【０１４８】
ＫＪ０１２及びＫＪ０７３からｐｃｋ及び周辺領域をクローニングし、配列決定した。コード領域に変化は見られなかった。翻訳後修飾がなければ、その酵素の触媒性質は不変なはずである。ｐｃｋプロモーター領域に、翻訳開始部位に対して−６４bpの部位にＧからＡの単一突然変異を検出した。この突然変異は、翻訳開始部位に対して−１３９bpの部位の転写開始部位の後方であった。
【０１４９】
以前の研究者は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）の動力学的パラメーターが、カルボキシル化及びコハク酸生産に重要な効果を有しうることに注目した（Millard et al., 1996; Kim et al., 2004）。E. coliホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）についての重炭酸に対するＫｍは、０．１５mMであり（Morikawa et al., 1980）、E. coliホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）の９分の１であった（１３mM）（Krebs and Bridger, 1980）。マルチコピープラスミドを使用してE. coliからｐｃｋを過剰発現させることでホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が５０倍増加したものの、それはコハク酸生産に効果を有さないことが報告された（Millard et al., 1996）。Anaerobiospirillum succiniciproducens由来ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをE. coli Ｋ１２に過剰発現させた場合もまた、コハク酸生産は増加しなかった（Kim et al., 2004）。この酵素は、重炭酸に関して高いＫｍ（３０mM）も有する（Laivenieks et al., 1997）。しかしながら、A. succiniciproducens ｐｃｋをE. coli Ｋ１２のｐｐｃ突然変異体に過剰発現させた場合、コハク酸生産は６．５倍に増加した（Kim et al., 2004）。ＫＪ０１７及びその後の派生株では、ネイティブな機能的ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの存在下でさえも、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼが明らかに優位なカルボキシル化活性である。
【０１５０】
E. coli Ｃの酵素測定からの結果は、極めて驚異的であった。一般に、成長の間にネイティブなE. coliによるコハク酸生産のための優位なカルボキシル化活性であると見なされる酵素（ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ；ｐｐｃ）（Unden and Kleefeld, 2004; Fraenkel, 1996; Keseler et al, 2005; Millard et al., 1996; Gottschalk, 1985; Karp et al., 2007）は、E. coli Ｃに関してin vitroで最も活性の高い酵素ではなかった。したがって、代謝工学処理の合理的設計及び代謝フラックス推定の典型的な基礎となる、E. coliについて一般に容認された代謝経路（Unden and Kleefeld, 2004; Fraenkel, 1996; Sanchez et al., 2006; Cox et al., 2006; Vemuri et al., 2002a; Wang et al., 2006; Sanchez et al., 2005ab; Gokarn et al., 2000; Karp et al., 2007）が、全ての株において代謝を正確に反映するわけではない可能性がある。in vitro基質飽和条件下では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が最も高活性であった。E. coli Ｋ１２において、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの両者についての活性は、in vitroで等しく（１４０nm 分-1 mg-1細胞タンパク質；Van der Werf et al., 1997）、前者がコハク酸への主経路として役立っていると報告された。
【０１５１】
以前の研究から、E. coliにおけるネイティブなｐｐｃ遺伝子の過剰発現は、より多くのＰＥＰをカルボキシル化してＴＣＡ回路中間体を補充することが原因で、より高い比コハク酸生産（Millard et al., 2000）、より高い比成長速度、及びより低い比酢酸生産を招いたことが示された（Farmer and Liao, 1997）。しかしながら、ＰＥＰはグルコース輸送系に必要とされることから、ｐｐｃを過剰発現させることで、また、同質遺伝子対照に比べてコハク酸収量（単位グルコースあたり）は有意に増加せずに、グルコース取り込み速度が１５〜４０％減少する（Chao and Liao, 1993; Gokarn et al., 2000）。このようにネイティブなホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼがコハク酸収量を増加できなかったことから、大部分の研究の注意は、E. coli遺伝子のネイティブなレパートリーを使ったさらなる研究を遂行することよりもむしろ、カルボキシル化ステップとしてLactobacillus lactis又はRhizobium etli由来のＰＹＣ（ピルビン酸カルボキシラーゼ）の過剰発現に関する新しい代謝設計に方向変換された（Vemuri et al., 2002ab; Gokarn et al., 2000; Lin et al., 2005a, 2005b, 2005c）。
【０１５２】
Actinobacillus succinogenesなどのルーメン細菌は、カルボキシル化のためにエネルギー保存性ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼを使用するグルコース発酵の間に主産物としてコハク酸を生産する（Kim et al., 2004; McKinlay et al., 2005; McKinlay and Vieille, 2008）。この生物について報告された活性は、ＫＪ０１７の５倍であって、ＫＪ０７３の成長ベースの連続選択（代謝進化）によって得られた活性の半分である。したがって、代謝工学処理（ｌｄｈＡ ａｄｈＥ ａｃｋＡ）及び代謝進化（ＡＴＰ生産の効率増加についての成長ベースの選択）の組み合わせを使用することによって、本明細書に報告された研究は、E. coli遺伝子のネイティブなレパートリーのみを使用することによって、A. succinogenesなどのルーメン生物に似たE. coliコハク酸生産株が発生することを実証している。E. coliホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）の過剰発現がホスホエノールピルビン酸シンターゼの突然変異がない場合ではコハク酸生産の助けとならないという以前の報告にもかかわらず（Chao and Liao, 1993; Kim et al., 2004; Gokarn et al., 2000; Millard et al., 1996）、ＫＪ０１７及び派生株は、コハク酸及びリンゴ酸生産のための主経路としてホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼを使用するように代謝的に進化している。
【０１５３】
図７は、コハク酸生産のための２株の最良の生物触媒であるＫＪ０６０及びＫＪ０７３を用いたバッチ発酵を示す。インキュベーションの最初の４８時間以内に成長は完了したものの、コハク酸生産は９６時間継続した。コハク酸生産の３分の１は、細胞成長なしで起こった。これらの株は、力価６６８〜７３３mMのコハク酸を生産し、モル収量は、代謝されたグルコースベースで１．２〜１．６であった。ＡＭ１培地を用いた場合、収量は、ＮＢＳ無機塩培地を用いた場合よりも典型的には高くなった。酢酸、リンゴ酸、及びピルビン酸は、望ましくない副産物として蓄積し、それらによってコハク酸の潜在的収量が減少した（表４）。次式：Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋６ＣＯ２→１２Ｃ４Ｈ６Ｏ４＋６Ｈ２Ｏに基づき、グルコース及びＣＯ２（過剰）からのコハク酸の最大理論的収量は、グルコース１molあたり１．７１molである。しかし、E. coliにおいてこの収量を達成する直接的なコハク酸経路はない（図６）。
【０１５４】
本研究は、グルコースからコハク酸への変換に主に焦点を当てたものの、E. coliが、植物細胞壁の成分である全てのヘキソース及びペントース糖を代謝するネイティブな能力を有することは周知である（Asghari et al., 1996; Underwood et al., 2004）。E. coliのいくつかの株は、スクロースも代謝することができる（Moniruzzaman et al., 1997）。ＫＪ０７３株を、血清チューブ中における２％の六炭糖及び五炭糖の利用について試験した。全ての場合で、これらの糖は主にコハク酸に変換された。ＫＪ０７３株は、グリセロールもコハク酸に代謝した。２％グリセロール存在下でインキュベーションする間に、１４３mMグリセロールは代謝されて１２７mMコハク酸を生産し、モル収量は、細菌の成長のための炭素源としてグリセロールを使用したときのコハク酸についての最大理論的収量の０．８９、すなわち８９％であった。
【０１５５】
E. coliの発酵代謝は、非常に適合性があることが示されている。派生株を工学処理及び進化させて、ネイティブな発酵経路に関係する遺伝子の数多くの欠失を回避し、酸化還元バランスを維持するために残りの酵素を経たフラックスを増加させ、ＡＴＰの生産効率を増加させ、成長を増加させた。さらにずっと困難なことではあるが、細胞は、全ての生合成の必要物を提供するように炭素分配のバランスをとりながら無機塩培地中でそのような適応変化を行うことができる。ＮＡＤＨ酸化（乳酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ）及び酢酸生産（酢酸キナーゼ）のための主経路を排除した後も、成長及びＡＴＰ生産は、酸化還元バランスのためにＮＡＤＨ酸化及びリンゴ酸又はコハク酸の生産と関連したままである（図１Ｂ）。嫌気性成長ベースの選択は、酸化還元バランスを保証し、成長増加の基盤であるＡＴＰ生産の効率増加及び速度増加について選択するものである。酸化還元バランス及びＡＴＰ生産についてのこの選択は、リンゴ酸及びコハク酸の前駆体が電子受容体であることから、最終産物としての両者を容易に区別することができない。
【０１５６】
嫌気性成長の間のアセチル−ＣｏＡの主供給源であるｐｆｌＢの欠失は、酢酸要求性を招いた（Sawers and Bock, 1988）。おそらくピルビン酸デヒドロゲナーゼなどの他の経路によるアセチル−ＣｏＡの生産増加が原因で、この要求は、代謝進化を通じて排除された（de Graef et al., 1999）。この栄養要求に取って代わる酢酸又はアセチル−ＣｏＡの代謝供給源は未知である。ｐｏｘＢ欠失後の、より高いコハク酸生産への転換も驚くべきことであった。酢酸レベルのわずかな変化が観察され、このことは、この酵素が酢酸の副供給源であったか、又はそれが他の酢酸生産経路によって機能的に取り替えられたかのいずれかを示している。ｐｏｘＢの欠失後に、コハク酸は再び優位なジカルボン酸として生産された。ｐｏｘＢ欠失に付随する代謝産物におけるこの転換は、予想外であった。
【０１５７】
コハク酸生産のための最良の株、ＫＪ０６０及びＫＪ０７３を用いたとき、リンゴ酸及び酢酸は、豊富な副産物のままであった（表４；図４Ｄ及び４Ｆ）。これらの排除は、収量を増加させるさらなる機会を示す。
【０１５８】
コハク酸生産のために発生させた、以前に工学処理された全てのE. coliは、維持のための抗生物質と共に複合培地及びプラスミドを使用した。単純なバッチ発酵では、大部分がわずかな低力価のコハク酸を達成し、高力価を達成するにはより複雑なプロセスを必要とした（表１）。他の研究者らもまた、異種遺伝子と、気体（ＣＯ２、Ｈ２、Ｏ２又は空気）のスパージングならびに好気性及び嫌気性プロセスの二重ステップを含めた複雑なプロセスとを使用した。複合培地中でリコンビナントE. coliによるグルコースからのコハク酸生産を増加させる多様な遺伝的アプローチが、報告されている。このプロセス及び栄養素の複雑さは、構築、原料、精製、及び廃棄物処理のコストを増加させると予想されよう。ビタミン、アミノ酸、及び他の高分子前駆体を含有する複合培地は、代謝工学処理によって生み出された、代謝及び生合成における潜在的な調節上の問題を隠す可能性がある。本発明者らの最初の構築では、成長及び糖代謝が無機塩培地で非常に不良であったが、複合培地（Luria液体培地）で非常に強くなった。対照的に、ＫＪ０６０及びＫＪ０７３株は、複合栄養素も外来遺伝子も全く有さない無機塩培地を使用した単純なバッチ発酵（糖１０％）において、高力価のコハク酸を生産した（６００〜７００mM）。
【０１５９】
実施例２
コハク酸生産のためのＫＪ１３４株の構築
上記実施例１に記載したように、E. coli Ｃ野生型における中心的な嫌気性発酵遺伝子を、ＰＣＲ産物及び除去可能な抗生物質マーカーを用いてDatsenko及びWanner(2000)の戦略によって（ＦＲＴ認識部位及びＦＬＰリコンビナーゼを使用することによって）連続的に欠失させた。代謝進化（ＡＴＰ生産効率の増加についての成長ベースの選択）と組み合わせたこれらの構築を使用して、エネルギー保存性ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）を動員して成長及びコハク酸生産が増加した突然変異株について選択した（図９）。結果として生じたＫＪ０７３株は、代謝されたグルコース１molあたり１．２molのコハク酸を生産し（Jantama et al., 2008a）、ルーメン細菌Actinobacillus succinogenes（van der Werf et al., 1997）及びMannheimia succiniciproducens（Song et al., 2007）に極めて似通ったコハク酸経路を使用する。しかしながら、これらの遺伝子欠失を構築するために使用された方法は、各欠失遺伝子（ａｃｋＡ、ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ）の領域に単一の８２〜８５ヌクレオチド長の遺伝的瘢痕又はＦＲＴ部位を残した。これらのＦＲＴ部位は、抗生物質遺伝子を除去する間にＦＬＰリコンビナーゼのための認識部位として役立った（Storici et al., 1999）。これらの外来配列の全てを以前に記載された方法を用いてＫＪ０７３から連続的に除去し、所望の遺伝子欠失のみを有するネイティブなＤＮＡに取り替えた（Grabar et al., 2006; Zhang et al.. 2007; Jantama et al., 2008b）。結果として生じた株ＫＪ０９１は、ａｃｋＡ、ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ、ａｃｋＡ、ｍｇｓＡ、及びｐｏｘＢに特異的欠失を有し、ＫＪ０７３株に存在する全てのＦＲＴ部位を欠如する。ＫＪ０９１株は、ａｃｋＡ内に１８bpの翻訳終止配列以外の全ての外来ＤＮＡ及び合成ＤＮＡを欠如する。ＫＪ０９１株によるコハク酸生産は、ＫＪ０７３株による生産と等価であった（表８）。この株を、コハク酸生産におけるさらなる改善のための親として使用した。
【０１６０】
ＫＪ０９１株のさらなる改善のための第１ステップでは、酢酸生産を減少させるために注意を払った。E. coliによるグルコースの嫌気性発酵の間に、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌＢ）は、アセチル−Ｐの前駆体であるアセチル−ＣｏＡの主供給源として役立ち、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）は、アセチル−Ｐから酢酸を生産するための主経路として役立つ（Karp et al., 2007; Kessler & Knappe, 1996）。ＫＪ０７３及びＫＪ０９１株はａｃｋＡ及びｐｆｌＢの両者に欠失を有することから、これらの株における発酵産物としての酢酸の存在度は、驚くほどであった（図９）。発酵終了時のこの残留酢酸は、コハク酸収量の改善のために代謝をさらに変更する潜在的な可能性を表している。
【０１６１】
酢酸キナーゼ（及びプロピオン酸キナーゼ）活性を有する関連酵素は、ｔｄｃＤによってコードされるが、典型的にはトレオニンの分解のためだけに生産される（Hesslinger et al., 1998; Reed et al., 2003）。図１０に示されるように、選択の間に起こった突然変異がｔｄｃＤの発現を増加させた可能性がある。１０％(w/v)グルコース存在下で嫌気性成長する間に、ｔｄｃＤの発現がａｃｋＡに機能的に取って代わり、アセチル−Ｐからの酢酸の生産を増加させた可能性がある。同じオペロン中の隣接ｔｄｃＥ遺伝子は、ｐｆｌＢと類似しており、トレオニン分解の間に同時発現されるピルビン酸（及びα−ケト酪酸）ギ酸リアーゼ活性をコードする（Hesslinger et al., 1998）。１０％(w/v)グルコース存在下の嫌気性成長の間にこの遺伝子の発現増加が、アセチル−Ｐの直接の前駆体であるアセチル−ＣｏＡの生産を増加させ、ギ酸としての還元物質を消費することができた可能性がある（図１０）。ＫＪ０９１からｔｄｃＤ及びｔｄｃＥ（隣接）の両者を同時に欠失させてＫＪ０９８を作出した。これら２種の遺伝子の欠失は、ＫＪ０９１に比べてＫＪ０９８において酢酸の生産を半分減少させ、コハク酸収量を１０％増加させたが、このことから、この予想外の経路が炭素フローをコハク酸から転用することに重要であることが確立された。ピルビン酸代謝のための２種の代替経路であるピルビン酸ギ酸リアーゼ活性（ｔｄｃＤ）及び酢酸キナーゼ活性（ｔｄｃＥ）を排除したときに増加すると予測される中間体である、ＫＪ０９８によって生産されるピルビン酸レベルも４０％低下した。ピルビン酸生産におけるかなりの減少は、ｔｄｃＤ／ｔｄｃＥ遺伝子欠失の予想外の結果である。ｔｄｃＤ及びｔｄｃＥの同時欠失に起因するピルビン酸減少及びコハク酸増加の原因となるメカニズムは未知である。
【０１６２】
ＫＪ０９８はＫＪ０９１に比べてかなりの改善を示すものの、酢酸レベルにおけるさらなる減少及びコハク酸収量におけるさらなる増加が可能でありうる。嫌気性条件下で、オキザロ酢酸は、還元産物（リンゴ酸）及び酸化中間体（クエン酸）に分割される（図９）。クエン酸は、他の代謝機能のための細胞内ＯＡＡプールをリサイクルするためにクエン酸リアーゼ（ｃｉｔＤＥＦ）によってオキザロ酢酸及び酢酸に変換し戻すことができる（図１０）（Nilekani et al., 1983）。かなりの量のクエン酸リアーゼの発現は、クエン酸での成長と関連する（Lutgens and Gottschalk, 1980; Kulla and Gottschalk, 1977）。クエン酸リアーゼは、３本の異なるポリペプチド鎖から構成される多酵素複合体である。αサブユニット又は大サブユニットは、第１ステップを触媒するクエン酸−ＡＣＰトランスフェラーゼである。βサブユニット又は中サブユニットは、第２ステップを触媒するシトリル−ＡＣＰリアーゼである。γサブユニット又は小サブユニットは、アシル担体タンパク質として作用し、補欠分子族成分も保持する。反応が起こるために３種のサブユニット全てが必要とされる（Quentmeier et al., 1987）。これらのサブユニットの１種又は複数種をコードする遺伝子の欠失は、クエン酸リアーゼ活性を排除し、コハク酸生産の間の酢酸レベルをさらに減少させる可能性がある。ｃｉｔＦ遺伝子をＫＪ０９８から欠失させ、ＫＪ１０４を作出した。しかしながら、この欠失は、酢酸生産にも他のコハク酸収量にも効果を及ぼさなかった（表８）。ｃｉｔＦの欠失は、酢酸の減少を全く引き起こさなかったことから、この中間体は、他の経路から生じると推定される。未知の理由で、ｃｉｔＦの欠失はＫＪ１０４の成長に不都合な影響を与え（細胞収量が２２％減少）、発酵終了時のピルビン酸レベルをＫＪ０９８に比べてほぼ５０％増加させた。しかしながら、ＫＪ１０４を用いたときのコハク酸収量、力価、平均生産性、及び酢酸レベルは、ＫＪ０９８に匹敵した（表８）。
【０１６３】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）は、アミノ基転移によってアスパラギン酸、フェニルアラニン及び他の化合物の合成を触媒する多機能酵素である。この反応では、ＰＥＰカルボキシル化による中間体であるオキザロ酢酸から、Ｌ−グルタミン酸とのアミノ基転移反応によってＬ−アスパラギン酸が合成される。アスパラギン酸は、タンパク質構成成分であることに加えて、いくつかの他の生合成経路に関与する。約２７％の細胞性窒素がアスパラギン酸を通じて供給されると推定される（Reitzer, 2004）。アスパラギン酸生合成及びコハク酸生産は、共通のオキザロ酢酸の細胞内プールを一緒に使用する。ａｓｐＣの欠失は、コハク酸生産の増加へと導くことができるであろうが、ＡＭ１などの最少塩培地中で嫌気性成長を阻止する栄養要求も生み出す可能性がある。
【０１６４】
このアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ａｓｐＣ）をＫＪ１０４から欠失させてＫＪ１１０を作出した。予想外に、ａｓｐＣの欠失は、ＫＪ１０４に比べてＫＪ１１０におけるコハク酸収量又は細胞収量に効果を有さなかった（表８）。したがって、本発明者らの株では、アスパルターゼがかなりのレベルのオキザロ酢酸をコハク酸生産から転用するとは思われない。以前はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼによって触媒されていた生合成的必要性に取って代わる代替酵素が利用可能と思われる。
【０１６５】
ＫＪ１０４及びコハク酸生産のために工学処理された他のE. coli株を用いた発酵の終了時にかなりの量のピルビン酸が存在する（表８）。このピルビン酸は、不要な産物であり、コハク酸収量を増加させるさらなる機会を示す。発酵培養液中の高レベルのピルビン酸は、図１０に示すようにリンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ）によるリンゴ酸からピルビン酸への脱カルボキシル化に起因する可能性がある。この酵素は、主に、グルコースの嫌気性異化の間よりもむしろ糖新生の間に機能すると考えられる（Unden and Kleefeld, 2004; Stols and Donnelly, 1997; Oh et al., 2002）。リンゴ酸を形成するためのピルビン酸の還元的カルボキシル化が熱力学的に有利であるものの、この酵素の動力学的パラメーターは、生理学的条件下で脱水素及び脱カルボキシル化に有利である（Stols and Donnelly, 1997）。ピルビン酸をカルボキシル化するこの酵素の過剰発現は、E. coliのコハク酸生産のための株を構築するための基盤として以前に使用されている（Stols and Donnelly 1997）。
【０１６６】
リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ）がＫＪ１０４（及び関連株）においてカルボキシル化を行っており、コハク酸生産の一因となる場合、この遺伝子の欠失はコハク酸の収量を減少させ、ピルビン酸などの他の産物のレベルを増加させると予想されよう。あるいは、リンゴ酸酵素（ｓｃｆＡ）がＫＪ１０４において脱カルボキシル化を行っており、リンゴ酸をピルビン酸へ転用している場合、この酵素をコードしている遺伝子の欠失は、コハク酸収量を増加させ、ピルビン酸レベルを減少させると予想されよう。ＫＪ１０４からｓｆｃＡ遺伝子を欠失させてＫＪ１１９を作出することは、予想外に、ＫＪ１０４に比べてコハク酸生産、成長、ピルビン酸レベルなどに測定可能な効果を有さなかった（表８）。これらの結果は、ＫＪ１０４及び関連株においてリンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ）がコハク酸生産に重要でないことを明らかに実証した。この結果は、リンゴ酸酵素の生産増加がコハク酸生産のための主経路として使用された、Stols及びDonnelly（1997）によって開発されたコハク酸生産株と著しい違いがある。
【０１６７】
ＫＪ１０４では、ｓｆｃＡの欠失からもａｓｐＣの欠失からもあまり有益性が観察されなかったものの、両者の遺伝子を組み合わせて欠失させる効果を試験するための研究を実施した。これは、ＫＪ１１０におけるｓｆｃＡ遺伝子を欠失させてＫＪ１２２を作出することによって行われ、有益性が認められないと予想された。しかしながら、ｓｆｃＡ及びａｓｐＣの両者の組み合わせ欠失（ＫＪ１２２株）は、親のＫＪ１１０株及び関連株（ＫＪ１０４及びＫＪ１１９）に比べて、酢酸のわずかの減少を伴う、コハク酸の収量及び力価の予想外の増加を招いた（表８）。ＫＪ１２２における組み合わせ欠失（ａｓｐＣ及びｓｆｃＡ）は、ＫＪ１０４に比べてコハク酸収量の１８％の増加、コハク酸力価の２４％の増加、及び平均生産性の２４％の増加を招いた。そのメカニズムは未知であるものの、単一突然変異が残りの酵素活性であるリンゴ酸酵素又はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを経たフロー増加によって部分的に代償され、あらゆる潜在的有益性を低下させたことから、その単一突然変異が無効であった可能性がある（図１０）。コハク酸の収量及び力価における増加は、より大きな割合をコハク酸に進行可能にする、オキザロ酢酸の入手可能性の増加に起因すると推定される。リンゴ酸レベルもまた、極めて低いままであった。
【０１６８】
ＫＪ１２２株（表８）は、グルコース１molあたり１．５molのコハク酸を生産し、これは最大理論的収量（グルコース１molあたり１．７１mol）の８８％であった。この高レベルのコハク酸を生産して、リンゴ酸生産を十分に減少させるために、追加的な還元物質が必要であった。この追加的な還元物質の起源は未知であるものの、これらの結果はピルビン酸デヒドロゲナーゼを経たピルビン酸フローにおける増加と一致する。この酵素は、好気性代謝の間に主に機能すると考えられる（Guest et al., 1989）が、発酵の間にも低レベルで機能することが報告されている（de Graef et al., 1999）。
【０１６９】
ＫＪ１２２は、優れたコハク酸収量（１．５mol mol-1グルコース）ならびにより少量の酢酸及びピルビン酸を生産した。コハク酸についての最大理論的収量は、１．７１mol mol-1グルコースであり、これらの３炭素中間体は、さらに収量を増加させる機会を示す。ピルビン酸は、代謝オーバーフローとして解糖から蓄積すると推定され、酢酸蓄積に関係する可能性がある。アセチル−ＣｏＡは、多数の酵素のアロステリックレギュレーターである。酢酸キナーゼについての２種の主活性をコードする遺伝子（ｔｄｃＤ及びａｃｋＡ）が欠失していることから、酢酸及び酢酸キナーゼ活性の供給源は未知である（図９及び図１０）。酢酸が、ホスホトランスアセチラーゼ産物であるアセチル−Ｐから生産されると仮定して、ｐｔａ遺伝子を不活性化するためにＫＪ１２２にさらなる欠失を構築した。結果として生じた株であるＫＪ１３４は、理論的レベルに近いコハク酸を生産した（表８）。この株において、ピルビン酸及び酢酸レベルは、実質的に減少した。体積あたりの生産性もまた１７％減少した。ＫＪ１３４株でのコハク酸収量は、発酵プロセス、培地、又は成長条件の複雑さに関係なく、他の全ての株以上である。
【０１７０】
実施例３
コハク酸生産のための糖新生性ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）の動員
E. coliは、コハク酸を生産するために用いることのできるであろう４種のネイティブなカルボキシル化経路のための代謝潜在性を有する（図２Ａ〜２Ｄ）。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）によるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）からオキザロ酢酸（ＯＡＡ）へのカルボキシル化は、E. coliにおけるコハク酸の発酵生産のための主経路として認識されている（図２Ａ）（Fraenkel DG, 1996; Unden & Kleefeld, 2004; Karp et al., 2007）。この反応は、無機リンの放出に関連するエネルギー損失が原因で、本質的に不可逆である。３種の他のカルボキシル化反応は、普通は培地中の高濃度のグルコースによって抑制され、糖新生に関して逆方向で機能するとも報告されている（Samuelov et al., 1991; Oh et al., 2002; Stols & Donnelly, 1997）。第２及び第３のカルボキシル化経路（図２Ｂ及び２Ｃ）は、それぞれＮＡＤＨ連結型及びＮＡＰＤＨ連結型リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ及びｍａｅＢ）を使用して、ピルビン酸からリンゴ酸への可逆的カルボキシル化を触媒する。ＰＥＰからピルビン酸が生成する間に、両者の経路がエネルギーをＡＴＰとして保存可能にする。４番目の経路は、ＰＥＰからＯＡＡへの可逆的カルボキシル化のためにＰＥＰカルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）を使用し、エネルギーをＡＴＰとして保存する（図２Ｄ）。ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）は、典型的にはE. coliにおける糖新生の間にのみ機能するものの、コハク酸生産性ルーメン細菌では類似のＰＥＰカルボキシキナーゼが非常に高レベルで存在し、その細菌ではその酵素が主要なＰＥＰカルボキシル化活性として役立つ（Van der Werf et al.,1997）。
【０１７１】
高い成長速度及びコハク酸生産のために、ターゲティング遺伝子欠失及び進化の両者によってE. coli ＫＪ０７３株を代謝的に工学処理した（Jantama et al.,2008a）。工学処理されたＫＪ０７３株における主要なコハク酸生産経路を同定するために、４種のカルボキシル化酵素のそれぞれをコードする遺伝子（ｐｐｃ、ｓｆｃＡ、ｍａｅＢ及びｐｃｋ）を個別に欠失させた（表１０）。ネイティブなE. coli（ＸＺ３２０）における主要なカルボキシル化ステップをコードするｐｐｃ遺伝子の欠失は、コハク酸生産を変更しなかった。リンゴ酸酵素をコードする遺伝子（ｓｆｃＡ及びｍａｅＢ）を欠失させてそれぞれＸＺ３４１及びＸＺ３９６を作出することもまた、糖新生におけるそれらの主要な機能に一致して、コハク酸生産に効果を有さなかった。しかしながら、ＰＥＰカルボキシキナーゼをコードするｐｃｋの欠失（ＸＺ３３２）は、細胞成長、糖代謝、コハク酸生産、及びコハク酸収量を劇的に減少させた。ＸＺ３３２株における欠失突然変異をＫＪ０７３株由来のｐｃｋ遺伝子全体（プラスミドｐＬＯＩ４６７７）で補完すると、ＫＪ０７３近くまでコハク酸生産が実質的に改善された（表１０）。
【０１７２】
まとめると、これらの結果は、ＫＪ０７３において糖新生性ＰＥＰカルボキシキナーゼが代謝進化の間に動員され、発酵性コハク酸生産のための主要なカルボキシル化反応として役立つことを実証している。ＰＥＰカルボキシラーゼとは異なり（図２Ａ）、ＰＥＰカルボキシキナーゼは、追加的なＡＴＰを供給してエネルギーを保存する（図２Ｄ）。発酵成長及びＡＴＰ生産が密接に連関していることから、ＰＥＰカルボキシキナーゼを用いたＡＴＰの収量増加（図２Ｄ）は、ＫＪ０７３株へと導く代謝進化ステップでの成長ベースの選択の間に、競争上の利点を提供するであろう。
【０１７３】
ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性の増加は、ｐｃｋ ｍＲＮＡの存在度増加と相関した（表１１；図１２Ａ）。ｐｐｃ、ｓｆｃＡ及びｍａｅＢについての転写レベルは本質的に不変であったが、ｐｃｋ転写物の存在度は、野生型に比べてＫＪ０７３の方が増加し、ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性の亢進と見事に一致した（表１１）。
【０１７４】
ｐｃｋ遺伝子の配列決定は、ＫＪ０７３由来ｐｃｋ遺伝子のコード領域又はターミネーター領域に差がないことを明らかにした。しかしながら、単一の点突然変異（ＡＴＧ開始コドンに対して−６４位にＧからＡへのトランジション）がＫＪ０７３におけるｐｃｋ遺伝子の上流プロモーター領域から見出された（表１１）。６株全てを配列決定して、株の改良の間のこの突然変異の起源を同定した。ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性はＫＪ０１２に比べてＫＪ０１７では４倍高かったが、ＧからＡへの突然変異は見られなかった。ＫＪ０７３株におけるｐｃｋ遺伝子のプロモーター領域におけるこの点突然変異は、ｐｃｋ＊突然変異（高ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性）と呼ばれる。このｐｃｋ＊突然変異は、ＫＪ０６０及びＫＪ０７３株にのみ存在し、高いＰＥＰカルボキシキナーゼ活性を示し、ＫＪ０７１では見られなかった。ＫＪ０７１におけるこの突然変異の喪失に付随して、ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性が１０分の１に減少してＫＪ０１７に等しいレベルになった。
【０１７５】
ＫＪ０１７及びＫＪ０７１へのｐｃｋ＊点突然変異（ＧからＡ）の導入は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性を９倍増加させた（表１１）。ＫＪ０６０及びＫＪ０７３株における野生型ｐｃｋ遺伝子（ＡからＧ）の復元から、それぞれＸＺ６２２及びＸＺ６２４株を得た。ＸＺ６２２及びＸＺ６２４の両者は、ほぼ８分の１に減少したＰＥＰカルボキシキナーゼ活性を示した（表１２）。まとめると、これらの結果は、ＫＪ０６０を作出するＫＪ０１７の代謝進化の間に起こったＰＣＫ活性増加が、ｐｃｋにおける単一ヌクレオチド変化（ＡＴＧ開始コドンに対して−６４でＧからＡ）が原因であることを実証している。ＫＪ０１７におけるこの突然変異の不在は、この株で観察されたＰＥＰカルボキシキナーゼ活性の最初の４倍の増加が、まだ確定されていない他の変化が原因であることを示唆している。見たところ、コハク酸の発酵生産のためのネイティブな糖新生性ＰＣＫの動員は、ｐｃｋ遺伝子の転写に影響を及ぼした複数の突然変異に起因した。
【０１７６】
ＫＪ０１２からＫＪ０１７の発生時に起こった、ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性が４倍に増加することは、ｐｃｋにおける突然変異が原因ではなかったが、転写レギュレーターにおける突然変異に関連する可能性がある。Ｃｒａタンパク質は、E. coliにおいてｐｃｋの発現を活性化することが示されている（Saier & Ramseier、1996）。しかし、ｃｒａ遺伝子にも上流領域にも突然変異は見出されなかった。ＫＪ０１７及びＫＪ０６０におけるｃｒａの欠失（それぞれＸＺ６２６及びＸＺ６２７）は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性に影響しなかった（表１２）。
【０１７７】
ｃｓｒＡ系もまた、ｐｃｋ遺伝子及びグルコース代謝に関与する他の遺伝子のレベルをｍＲＮＡの安定性を変更することによってレギュレーションすると報告されている（Pernestig et al., 2003）。しかし、このレギュレーション系に関与する遺伝子（ｃｓｒＡ、ｃｓｒＢ、ｃｓｒＣ、ｃｓｒＤ、ｕｖｒＹ又はｂａｒＡ）の配列から突然変異は見出されなかった。
【０１７８】
E. coli ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性は、グルコース異化代謝産物抑制に供される（Goldie 1984）。２個のＣｒｐ結合部位がプロモーターから同定されており（Ramseier et al 1995）、これはＫＪ０６０及びＫＪ０７３における点突然変異と全く異なった。異化代謝産物抑制関連遺伝子（ｃｙａＡ、ｃｒｐ）及びホスホトランスフェラーゼ系によるグルコース取り込みに関連する遺伝子（ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、ｃｒｒ、ｐｔｓＧ）を配列決定した（ターミネーターを経た上流領域）。ＫＪ０６０、ＫＪ０７１、及びＫＪ０７３株では、ｐｔｓＩのカルボキシ末端領域におけるフレームシフト突然変異（１，６７３位での一塩基欠失）である１個の突然変異だけが見出された。この欠失はＫＪ０１７では見られなかったので、それは、この株においてＰＥＰカルボキシキナーゼ活性が最初４倍に増加したことの原因であり得ない（表１２）。ＫＪ０１７及びＫＪ０６０におけるｐｔｓＩの欠失（ＸＺ６１３及びＸＺ６１５）は、ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性に影響しなかった。
【０１７９】
さらに、E. coli ＡＴＣＣ８７３９、ＫＪ０１２、ＫＪ０１７、及びＫＪ０６０を５％グルコースの存在下及び不在下のＬＢ培地中で好気的に成長させることによって、ｐｃｋの異化代謝産物抑制における潜在的変化を検討した（表１３）。ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性は、後期対数増殖期の間に最大であると報告されており（Goldie, 1984）、これは、本発明者らの株で確認された。ＡＴＣＣ８７３９及び代謝進化についての出発株（ＫＪ０１２）の両者において、ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性は、グルコースの存在によって強く抑制された（＞７０％）。グルコース介在性抑制は、サイクリックＡＭＰの添加によって逆転された。対照的に、ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性は、（ＫＪ０１２よりも）ＫＪ０１７では４倍に高くなり、グルコースの添加によって影響を受けなかったことから、異化代謝産物抑制の喪失を示している。グルコース不在下で成長する間のＰＥＰカルボキシキナーゼ活性は、ＫＪ０６０の方がなお一層高く（ＫＪ０１７の５倍）、グルコースが包含されるとさらに増加した。ＫＪ０６０（及びＫＪ０７３）では、ｐｃｋのグルコース異化代謝産物抑制は、グルコース活性化に取り替えられている（表１３）。ｃｙａＡ、ｃｒｐ、ｐｔｓＧ、ｐｔｓＩ及びｃｒｒの転写物存在度をこれらの株の間で比較した（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。ｃｙａＡ、ｃｒｐ、及びｐｔｓＧについての転写物は、ＫＪ０１２及びＡＴＣＣ８７３９よりもＫＪ０１７、ＫＪ０６０、ＫＪ０７１、及びＫＪ０７３の方が一般に高かった。高レベルのこれらのタンパク質は、サイクリックＡＭＰレベルを増加させることによって異化代謝産物抑制を隠すことができよう。
【０１８０】
これらの突然変異体における異化代謝産物抑制の喪失は、ｐｃｋ発現に限定されなかった。ＡＴＣＣ８７３９及びＫＪ０１２ではグルコース存在下で成長する間に、β−ガラクトシダーゼ活性が半分減少した（表１３）。この活性は、グルコースによって普通は抑制されるが、ＫＪ０１７及びＫＪ０６０では比較的影響されず、Ｃｒｐ介在性グルコース調節の全般的な喪失と一致している。
【０１８１】
ＫＪ０１２及びＫＪ０１７におけるｃｒｐ遺伝子の欠失は、結果として生じた株（それぞれＸＺ６４２及びＸＺ６４３）におけるＰＥＰカルボキシキナーゼ活性レベルを、グルコースで抑制された親であるＡＴＣＣ８７３９よりも減少させた（表１３）。これらのｃｒｐ欠失株では、ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性は、グルコースの添加によってもサイクリックＡＭＰの添加によっても影響されなかった。したがってＣｒｐは、潜在的に、ＫＪ０１７及びその派生株で観察された、ｐｃｋ発現が４倍に増加するために不可欠な調節エレメントでありうる。ｐｃｋ発現がこのようにＣｒｐ介在的に４倍に増加することに加えて、上流のｐｃｋ突然変異に関連して発現が１０倍に増加することで、ＫＪ０６０及びＫＪ０７３の発生の間に観察されたＰＥＰカルボキシキナーゼ活性レベルの変化を説明することができる。
【０１８２】
Ｃｒｐ ｓｘｙについての転写コアクチベーターである、予測されるアデニル酸シクラーゼｙｇｉＦ、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼｃｐｄＡ及び糖質代謝の汎レギュレーターｍｌｃなどのｃＡＭＰ−ＣＲＰレギュレーションに関連する他の遺伝子もまた配列決定した（表１３）（Keseler et a., 2005; Cameron & Redfield, 2006; Imamura et al., 1996; Plumbridge, 2002）。しかしながら、ｃＡＭＰ＝ＣＲＰレギュレーションに関連するこの遺伝子のどれも上流の、コード領域又はターミネーター領域に全く突然変異を有さないことが見出された。
【０１８３】
ｐｔｓＩ遺伝子は、ホスホエノールピルビン酸依存性糖ホスホトランスフェラーゼ系の一般（糖非特異的）成分であるＰＥＰ−タンパク質ホスホトランスフェラーゼをコードする。この主要な糖質能動輸送系は、流入する糖基質のリン酸化を、細胞膜を通過するそれらの移行と同時に触媒する。ＰＥＰ−タンパク質ホスホトランスフェラーゼは、リン酸基をホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）からリン酸担体タンパク質（ＨＰｒ）に転移する（例えばUniProtKB、アクセッションナンバーＰ０８８３９参照）。
【０１８４】
ｐｔｓＩにおけるフレームシフト突然変異（１６７３bp位の一塩基対欠失）が、ＫＪ０１７からＫＪ０６０の代謝進化の間に起こったことが見出された。この突然変異の重要性を検討するために、ＫＪ０１７及びＫＪ０６０においてｐｔｓＩのカルボキシ末端の１７５bpを欠失させ、それぞれＸＺ６１３及びＸＺ６１５を作出した。ＫＪ０６０におけるｐｔｓＩ欠失（ＸＺ６１５）は、予想通り成長及びＰＥＰカルボキシキナーゼ活性に効果を有さなかった。ＫＪ０１７におけるｐｔｓＩカルボキシ末端を欠失させてＸＺ６１３を作出することが、グルコースを含有するＮＢＳ無機塩での成長不能を招き、これは、グルコースに関する主取込み系（ＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系）の喪失と一致する。数日間インキュベーションした後に、ＸＺ６１３培養物は成長し始めたが、これは、代替グルコース輸送系を活性化した派生株であると推定される（Karp et al., 2007）。
【０１８５】
ＫＪ０６０、ＫＪ０７１、及びＫＪ０７３において見出されたｐｔｓＩ突然変異は、グルコースについてのＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系を不活性化すると予想されよう。ＧａｌＰなどの代替グルコース取込み系は、ｐｔｓ突然変異体においてグルコース取り込みを回復することが示されている（Wang et a.l, 2006; Yi et al., 2003）。これらの改良株においてｇａｌＰの発現は、ＫＪ０１２及びＡＴＣＣ８７３９に比べて５〜２０倍増加し（図１２Ｂ）、グルコキナーゼ（ｇｌｋ）の増加はそれよりも小さかった。ＫＪ０６０おける突然変異体ｐｔｓＩ遺伝子を機能的野生型遺伝子（ＸＺ６１６）と取り替えることは、ＮＢＳ−グルコース培地中での成長を劇的に減少させて有害であった。この有害な効果は、野生型グルコース輸送のために必要な基質であるＰＥＰの枯渇に起因する可能性がある。機能的なＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系は、ＰＥＰカルボキシキナーゼと競合して酸化還元バランス、ＡＴＰ生産、及びコハク酸生産に利用可能なＰＥＰプールを減少させる。したがって、ＧａｌＰ（及びグルコキナーゼ）などの代替輸送系が利用可能な場合、グルコースについてのＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系の喪失は、株の発生の間の有益な事象としてとらえることができる。
【０１８６】
ＰＥＰ結節での炭素フラックスは、グルコースの嫌気性発酵の間に酸化還元バランスのために生産されるコハク酸の量を限定するために役立つ（図１３）。加えて、これらのフラックスは、成長、維持、及び生合成前駆体のために十分なエネルギー（ＡＴＰ）を提供しなければならない。主要産物としてコハク酸を生産するルーメン細菌は、ＯＡＡ生産のためにエネルギー保存性ＰＥＰカルボキシキナーゼを使用する（図２Ｄ）（Van der Werf et al., 1997; Kim et al., 2004）。E. coliのネイティブな株は、副産物としてコハク酸を生産し、ＰＥＰカルボキシラーゼ（ｐｐｃ）を使用する（図２Ａ）。ＰＥＰカルボキシキナーゼとは異なり、ＰＥＰカルボキシラーゼは無機リン酸の放出に関連するエネルギー喪失が原因で本質的に不可逆である。以前の研究は、E. coliにおけるネイティブなｐｐｃ遺伝子の過剰発現が、ＰＥＰからオキザロ酢酸へのカルボキシル化増加が原因で、より高いコハク酸比生産（Millard et al., 1996）及びより高い比成長速度を招いたことを示している（Farmer & Liao, 1997）。しかしながら、ＰＥＰがネイティブなグルコース輸送系に必要とされることから、ｐｐｃの過剰発現は、コハク酸収量をあまり増加させずにグルコース取り込み速度も減少させた（Chao & Liao, 1993; Gokarn et al., 2000）。このようにネイティブなＰＥＰカルボキシラーゼがコハク酸収量を増加させないことは、工業用生物触媒の開発のためにE. coli遺伝子のネイティブなレパートリーを用いてさらなる研究を追求するよりもむしろ、カルボキシル化ステップとしてLactobacillus lactis又はRhizobium etli由来ピルビン酸カルボキシラーゼの過剰発現（Sanchez et al.,2005b; Gokarn et al., 2000）、及びActinobacillus succinogenes由来ＰＥＰカルボキシキナーゼの過剰発現（Kim et al., 2004）という新しい代謝設計へと大部分の研究の注目を方向変換させた。
【０１８７】
ネイティブなE. coli株は、３種の代替カルボキシル化経路を有する（図２Ｂ〜２Ｄ）が、それらは、典型的には糖新生のために逆方向でのみ機能する（Samuelov et al., 1991; Kao et al., 2005; Oh et al., 2002; Stols & Donnelly, 1997）。３種全てが、ＰＥＰからのエネルギーをＡＴＰとして保存することを可能にするであろう。コハク酸が唯一のＮＡＤＨ酸化経路であることから、成長ベースの選択（代謝進化）の結果として、成長（細胞収量）及びコハク酸生産が改良されたＫＪ０１７、ＫＪ０６０、ＫＪ０７１、及びＫＪ０７３株が生じた。これらの株では、糖新生性ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）が動員され、転写活性化によって主カルボキシル化活性として役立った。E. coliにおけるコハク酸生産のための主経路としてのＰＥＰカルボキシキナーゼ動員は、驚くほどであった。多くの研究は、E. coli ｐｃｋの発現増加がコハク酸生産に効果を有さなかったことを示している（Gokarn, et al., 2001; Vemuri et al., 2002; Millard et al., 1996; Gokarn et al., 2000; Hong & Lee, 2001）。最近の研究は、E. coli ｐｃｋの発現増加が最少培地中での成長に有害であって、成長速度、グルコース代謝速度、及びコハク酸収量を減少させることを実証した（Kwon et al., 2008）。
【０１８８】
E. coliにおけるｐｃｋの発現増加は、コハク酸生産のための４炭素中間体ＯＡＡへの炭素フロー増加（酸化還元バランス）、コハク酸生産の増加、ならびに成長及び維持のためのＡＴＰ純生産の増加を招いた。少なくとも三つの事象がｐｃｋの転写増加の原因であった：１）Ｃｒｐ介在性グルコース抑制の喪失；２）グルコース活性化の獲得；及び３）ｐｃｋの上流領域における一塩基変化。これらの事象のそれぞれが、ＰＥＰカルボキシキナーゼのレベルを増加させ、コハク酸への炭素フローを増加させ、そしてＡＴＰとしての代謝エネルギーの保存を増加させることによって、代謝進化を通じた選択のための基盤を提供した。これらの遺伝的事象の組み合わせ作用は、主発酵産物としてコハク酸を生産するように進化したルーメン細菌と等しく、ＫＪ０６０及びＫＪ０７３において高レベルのＰＥＰカルボキシキナーゼ（＞７０００U(mgタンパク質)-1）を招いた（VanderWerf et al,. 1997）。
【０１８９】
コハク酸発酵生産のための主経路としてのＰＥＰカルボキシキナーゼの動員を潜在的に援助しうる追加的なエネルギー保存的変化が、ＫＪ０６０、ＫＪ０７１、及びＫＪ０７３株において見出された。ＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系は、E. coliのネイティブな株におけるグルコースの主取り込み系である。輸送の間に、グルコースから生産されたＰＥＰの半分が取込み及びリン酸化のために使用され、酸化還元バランス及びＡＴＰ生産のための代謝オプションを限定している。改良株は、この取込み系を不活性化するフレームシフト突然変異をｐｔｓＩに有した。グルコースを輸送することができるプロトンシンポーターをコードするｇａｌＰの発現は最大２０倍増加した。ＧａｌＰ及びネイティブなグルコキナーゼの発現増加は、リン酸化のためにＰＥＰよりもむしろＡＴＰを使用することによってグルコースホスホトランスフェラーゼ系に機能的に取って代わることができる（Wang et al., 2006; Yi et al., 2003; Flores et al., 2007）。この交換は、エネルギー効率的な方法を尊重し、コハク酸を使用したカルボキシル化及び酸化還元バランスのために利用可能なＰＥＰのプールの大きさを増加させる（図１１）。全ての改良株は、グルコースの炭素の半分超を４炭素産物（リンゴ酸及びコハク酸）に使用し、酸化還元バランスのためにＰＥＰの半分超を必要とした。ピルビン酸は、ＡＴＰによってＰＥＰに変換され、ＰＰｉ及びＡＭＰを形成することができるが、エネルギーはこのプロセスによって消費される。したがって、ｐｔｓＩの突然変異及びｇａｌＰの発現は、グルコースをコハク酸に代謝するエネルギー効率を増加させ、代謝進化の間の成長に有利に働く。
【０１９０】
成長の改善について選択しながら、代謝進化と一緒にコハク酸以外の代替ＮＡＤＨ酸化経路を排除した結果として、Actinobacillus succinogenes及びMannheimia succiniciproducensなどのコハク酸生産ルーメン細菌の機能的等価株であるE. coliのコハク酸生産株が生じた（VanderWerf et al., 1997; Kim et al., 2007; Martin, 1994; McKinlay et al., 2008）。ＯＡＡは、エネルギー保存性ＰＥＰカルボキシキナーゼを使用して生産される。グルコースの取込みのためにＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系よりもむしろグルコースパーミアーゼ（及びグルコキナーゼ）を使用することによってエネルギー不経済な再生（２−ＡＴＰ当量）の必要性を排除し、ＰＥＰを一定に保つ。他の発酵産物を生産しているルーメン細菌の間では、グルコース取り込みのためにホスホトランスフェラーゼ系が広く使用されることに注意されたい（Martin, 1994）。コハク酸生産のために最も有望なE. coli株であるＫＪ０６０及びＫＪ０７３は、約７００mMのコハク酸を生産し、グルコース１molあたり１．２molのコハク酸の収量であり（Jantama et al., 2008a）、これは、最良の天然コハク酸生産ルーメン細菌Actinobacillus succinogenesに匹敵した（Guettler et al.、米国特許第５，５０５，００４号）。
【０１９１】
E. coliにおけるグルコースからのコハク酸生産を改善したエネルギー保存戦略は、株の工学処理における他の重要な問題にも適用することができよう。グリセロールは、バイオディーゼル生産の世界的な増加が原因で、安価な供給原料となりつつある。グルコースよりもさらに還元されているため、各グリセロールは、コハク酸に変換されて酸化還元バランスを維持することができる。しかしながら、ネイティブなエネルギー浪費型カルボキシル化活性であるＰＥＰカルボキシラーゼを使用してグリセロールをコハク酸に代謝する間にＡＴＰは純生産されない。この問題は、エネルギー保存性ＰＥＰカルボキシキナーゼを使用することによって解決され、単位コハク酸あたり１個のＡＴＰの純生成が可能になるはずである。加えて、カルボキシル化産物ＯＡＡは、細胞代謝における重要な中間体であり、とりわけリンゴ酸、フマル酸、アスパラギン酸、リシン、トレオニン、メチオニンなどの多数の他の重要な発酵産物のための前駆体として役立つ。当業者は、本明細書に例示されたエネルギー保存戦略を使用して、多数の工業的に重要な化学物質を生産するための生物触媒を開発及び改良できることを認識しているであろう。
【０１９２】
実施例４
無機塩培地中でのコハク酸生産のためのE. coliの再工学処理
本研究に使用した株を表１６に一覧する。本発明の過程で発生した様々な株を構築する間に使用したプラスミド及びプライマーを、表１５に一覧する。
【０１９３】
E. coliにおける混合酸経路の調査から、コハク酸、乳酸、及びエタノールへと導くＮＡＤＨ酸化のための３種の主経路を示す（図１４）。ＮＡＤＨ酸化のためにこれらの競合経路を排除した遺伝子欠失も、コハク酸に炭素フローを向けるためには不十分であった（表１６）。ａｄｈＥの欠失後のわずかな増加を例外として、これらの遺伝子の個別の欠失は、ＮＢＳ無機塩培地中で発酵する間にコハク酸の生産及び収量を減少させ、親株（ＡＴＣＣ８７３９）に比べて細胞収量にほとんど効果を有さなかった。両者の代替ＮＡＤＨ酸化経路の欠失（ａｄｈＥと共にｌｄｈＡ又はｐｆｌＢと共にｌｄｈＡ）は、ＮＢＳ無機塩培地中での成長、コハク酸収量、及びコハク酸生産を実質的に減少させた。
【０１９４】
全く異なる結果がLuria液体培地中で観察された（表１６）。コハク酸収量の中程度の増加が、ｌｄｈＡにおける欠失を（単独又は組み合わせて）有した全ての株で見出された。さらに、二重突然変異体及び三重突然変異体において成長は減少した。これらの欠失のどれも、無機塩培地又は複合培地のいずれかの中で実質的な量のグルコース炭素をコハク酸に転換するには十分でなかった。E. coliにおけるネイティブな混合酸経路の観察分析に基づくと、コハク酸生産のために構築された欠失株は複合培地では予想よりも生産性が低く、ＮＢＳ無機塩培地では不成功であった。
【０１９５】
本発明者らの以前の研究（Jantama et al, 2008a; Jantama et al, 2008b）は、多数の追加的な突然変異の存在下でホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）活性を増加させ、グルコースからのコハク酸生産を増加させたプロモーター突然変異（ＡＴＧ開始に対して−６４でＧからＡ；ｐｃｋ＊と表示）を発見した。ｐｃｋが典型的にはグルコースによって抑制され（Goldie, 1984）、主に有機酸の好気性代謝の間に糖新生において機能することが示されていることから、これは驚くべきことであった（Kao et al., 2005; Keseler et al., 2005; Oh et al.. 2002; Unden & Kleefeld, 2004; Wu et al., 2007）。これをさらに調査するために、ｐｃｋ遺伝子（リボソーム結合部位、コード領域及びターミネーター領域）を増幅させ、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングして、ｌａｃプロモーターのコントロール下でｐｃｋを発現するｐＬＯＩ４６７７を生産した。このプラスミドをＡＴＣＣ８７３９にトランスフォーメーションした。同様に、ＡＴＣＣ８７３９中のネイティブなｐｃｋ遺伝子を突然変異ｐｃｋ＊遺伝子と置き換え、ＸＺ６３２を構築した。ＮＢＳ無機塩培地を使用して両者の株におけるグルコース発酵を調査した。
【０１９６】
ｐｃｋ＊の導入は、ネイティブなｐｃｋ遺伝子を有する同質遺伝子株に比べて、コハク酸の収量及び生産の中程度の増加を招いた（表１６）。ＰＣＫ活性は、ＸＺ６３２株及びＩＰＴＧ誘導性プロモーター下のｐｃｋ＊遺伝子を有するプラスミドを有する親株の両者で、親株に比べて８倍よりも大きく高まることが見出された。染色体組み込みの際に、単一コピーのｐｃｋ＊は、ＰＣＫ生産についてＩＰＴＧ誘導性プロモーター下のｐｃｋ＊遺伝子を有するマルチコピープラスミドとほぼ同じ有効性であった。両者の株について、親ＡＴＣＣ８７３９株に比べてコハク酸の収量及び生産における中程度の改善と共に、ＰＣＫ活性上昇が観察された（表１７）。しかしながら、ＰＣＫの活性増加だけでは、コハク酸にグルコース炭素を転換するために不十分であった。
【０１９７】
ＮＡＤＨ酸化経路を排除した他の突然変異と組み合わせてｐｃｋ＊突然変異を試験した（表１８）。ＮＡＤＨ酸化及びＰＣＫ活性増加についての競合経路を排除するための突然変異の組み合わせ作用もまた、コハク酸にグルコース性炭素を実質的に転換するために不十分であった。
【０１９８】
ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系は、E. coliにおけるグルコース取り込みのための主メカニズムであって、グルコース異化代謝産物抑制系の一体化部分である（Keseler et al., 2005; Postma et al., 1996）。上記実施例３に記載したように、代謝進化の結果としてｐｔｓＩのカルボキシル末端内のフレームシフト突然変異（１６７３bp位の一塩基対欠失）がコハク酸生産株ＫＪ０６０、ＫＪ０７１及びＫＪ０７３から発見された。この突然変異は、ホスホトランスフェラーゼ系の機能を破壊すると予想される（Postma et al., 1996）。この突然変異体において、グルコースの取込みはｇａｌＰ（ガラクトースパーミアーゼ）及びｇｌｋ（グルコキナーゼ）に機能的に取り替えられた（Hernandez-Montalvo et al., 2003; Keseler et al., 2005）。コハク酸生産に及ぼすｐｔｓＩ破壊の効果を検討するために、ｐｔｓＩのカルボキシ末端の１７５bpを野生型E. coli ＡＴＣＣ８７３９から欠失させ、ＸＺ６５０株を得た。驚くことに、コハク酸の生産及び収量は、親に比べてこの突然変異によって減少した（表１８）。
【０１９９】
ｐｔｓＩ短縮を、ｐｃｋ＊突然変異を使用した高レベルのＰＣＫ又はｌａｃプロモーターから過剰発現したネイティブなｐｃｋと組み合わせる効果を検討するために二つのアプローチを使用した（プラスミドｐＬＯＩ４６７７）。両者のアプローチは、ｐｔｓＩ短縮と組み合わせるとコハク酸生産における劇的な増加を招いた（表１８）。ＸＺ６４７株（ｐｃｋ＊、ΔｐｔｓＩ）は、５％グルコース存在下のＮＢＳ無機塩培地中で２１６mmolのコハク酸を生産し、収量は、グルコース１molあたり０．８９molのコハク酸であり、それは野生型E. coli ＡＴＣＣ８７３９の４．７倍であった（表１８）。ＸＺ６４７及びＸＺ６５０の両者では（ｐＬＯＩ４６７７）、ギ酸、エタノール及び少量の乳酸が、少ない副産物として残った。これらの二つの変化、すなわちホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系の不活性化及びＰＣＫ活性レベルの上昇は、発酵の酸化還元バランスに直接関係する遺伝子を全く改変することなく、ＮＢＳ無機塩培地中でグルコース代謝をコハク酸に効果的に転換するために必要な中核的な変化に相当する。
【０２００】
さらなる実験から、ホスホトランスフェラーゼ系における多種多様な突然変異が、ｐｃｋ＊バックグラウンドにおいてコハク酸を増加させることを確認した。グルコースについてのＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系を任意のステップで破壊すると、コハク酸への炭素フローが増加し、力価及び収量の両者が増加する。
【０２０１】
ＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系は、ＰＥＰからＰｔｓＩに、次にＰｔｓＨに、次にＰｔｓＧに、そして次にグルコースにリン酸をシャトル輸送してグルコース６−リン酸を生成する。表１９は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼレベルを増加させるｐｃｋ＊突然変異を有する株において、このリン酸リレー系に関与するＰｔｓ遺伝子の任意の１種（ｐｔｓＩ、ｐｔｓＨ又はｐｔｓＧ）における第２の突然変異の結果として、優位な発酵産物としてのコハク酸への炭素フローが同様に劇的に転換することを示す。これに関して、ｐｔｓＩ遺伝子全体の欠失又はｐｔｓＩ遺伝子のカルボキシ末端の短縮は、ｐｔｓＧ及びｐｔｓＨの欠失よりも優れていた。ｐｔｓＩカルボキシ末端の短縮は、ｐｔｓＩの完全な欠失よりもやや良好な、最高収量及び力価のコハク酸を生産した。不活性な遺伝子産物へと導く挿入、欠失、及びフレームシフトなどの他の突然変異は、類似の効果を有すると予想されよう。
【０２０２】
ＸＺ６４７株（ｐｃｋ＊ ΔｐｔｓＩ）は、優位な発酵産物としてコハク酸を生産したものの、相当レベルの不要な副産物（乳酸、エタノール、ギ酸、及び酢酸）も生産した（表１８）。ａｄｈＥ（ＸＺ７２３）又はｐｆｌＢ（ＸＺ７２１）のいずれかの欠失は、エタノールの生産を排除した。酢酸及びギ酸の生産は、ｐｆｌＢの欠失によってのみ実質的に減少又は排除された。結果として生じた株（ＸＺ７２１）は、グルコース１molあたり１．２molを超えるコハク酸のモル収量で高レベルのコハク酸を生産した。
【０２０３】
コハク酸は、典型的にはE. coliにおけるグルコース発酵の少量産物に相当する。グルコース炭素の大部分は、代替ＮＡＤＨ酸化経路を使用して、少量のギ酸及び酢酸と共にエタノール及び乳酸に変換される（図１４）。E. coli派生株は、コハク酸生産を改善するために１０年よりも長い間構築されており、様々な成功を収めている（Donnelly et al.、米国特許第５，７７０，４３５号;Gokarn et al., 2000; Gokarn et al.、米国特許第６，４５５，２８４号;Millard et al., 1996; San et al.、米国特許第７，２２３，５６７号;Sanchez et al, 2005b; Sanchez et al, 2005a; Stols & Donnelly, 1997; Vemuri et al., 2002a; Wu et al., 2007）。これらの株を構築するために使用された戦略は、典型的にはＮＡＤＨ酸化のための競合経路の排除に焦点を当てている（Donnelly et al.、米国特許第５，７７０，４３５号;Gokarn et al.、米国特許第６，４５５，２８４号; San et al.、米国特許第７，２２３，５６７号;Sanchez et al., 2005b; Sanchez et al. 2005a; Vemuri et al., 2002a; Wu et al., 2007）。欠失のためのターゲット遺伝子を、主として経路の調査に基づき選択した（図１４）。しかしながら、この戦略での成功は、複合培地及び２ステップ（好気性成長期に続く嫌気性生産期）プロセスに限定されている（Donnelly et al.、米国特許第５，７７０，４３５号; Gokarn et al.、米国特許第６，４５５，２８４号; Millard et al., 1996; San et al.、米国特許第７，２２３，５６７号; Sanchez et al., 2005b; Sanchez et al., 2005a; Vemuri et al., 2002a; Wu et al., 2007）。
【０２０４】
Luria液体培地などの複合培地では、成長のための生合成の必要性の大部分は、栄養素（酵母エキス及びトリプトン）中の中間体及び構成要素分子によって供給される。この培地において、発酵経路自体の観察に基づく遺伝子の欠失は、一般にコハク酸の生産を改善した（図１４；表１６）。（ｌｄｈＡ）及びｌｄｈＡを含めた全ての組み合わせのターゲット遺伝子の欠失は、Luria液体培地中での発酵の間に単位グルコースあたりのコハク酸生産の増加及びコハク酸収量の増加を招いた（表１６）。
【０２０５】
しかしながら、ＮＢＳ又はＡＭ１液体培地などの無機塩培地を用いると、混合酸発酵経路における同じターゲット遺伝子の欠失は助けにならなかった。大部分の欠失は、コハク酸生産及びコハク酸収量の両者に有害であった。ａｄｈＥの欠失後のわずかな増加を除き、混合酸発酵経路における一遺伝子欠失及び遺伝子欠失の組み合わせは、ＮＢＳ無機塩培地中のコハク酸の生産及び収量を減少させた（表１７）。複合培地中での２ステップ（好気性成長期に続く嫌気性生産期）コハク酸生産に関して特許取得済みの株の遺伝的等価物であるＫＪ０１２（ＡＴＣＣ８７３９ ΔｌｄｈＡ ΔａｄｈＥ ΔａｃｋＡ）（San et al.、米国特許第７，２２３，５６７号）は、ＮＢＳ無機塩培地中で野生型の親よりも少ないコハク酸を生産した。これらの結果に基づき、無機塩培地を使用する場合、経路の観察に基づいて欠失用のターゲット遺伝子を合理的に選択することが、コハク酸の生産改善に関する成功のあてにならない予測因子であると本発明者らは結論した。無機塩培地において、炭素は、エネルギー生成、発酵、及び細胞成長に必要な構成要素分子の生合成の間で正確に分配されるに違いない。
【０２０６】
上に示した結果が示すように、本発明は、無機塩培地中でコハク酸生産用の株を構築するための新しい戦略を提供する。コハク酸にグルコース炭素を実質的に転換するために、E. coli混合酸発酵経路をコードする遺伝子に突然変異は必要なかった（図１４）。本発明において、末梢経路における２個の中核的な変化の組み合わせの結果として、コハク酸収量が５倍に増加した。コハク酸生産に必要とされる２個の中核的な変化は：１）ネイティブな発酵ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（エネルギー消費）に取って代わるエネルギー保存性（糖新生性）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの発現増加及び２）グルコースホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系からｇａｌＰ及びＡＴＰ依存性リン酸化（ｇｌｋ）などの代替パーミアーゼへの取り替えである。まとめると、これらの変化は成長のためのＡＴＰの純生成を増加させ、カルボキシル化に利用可能なホスホエノールピルビン酸プールを増加させ、コハク酸生産を増加させた。
【０２０７】
ｐｆｌＢ及び他の欠失などの混合酸発酵経路における遺伝子の追加的な突然変異は、コハク酸の収量及び生産における中程度のさらなる増加のための機会を示す。アセチル−ＣｏＡは、発酵成長の間にｐｆｌＢによって主に生産される、生合成に不可欠な代謝物であることに留意されたい。この機能は、ｐｆｌＢ突然変異体では典型的には酸化的代謝の間に優位なアセチル−ＣｏＡ生産経路として役立つ酵素であるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ａｃｅＥＦ、ｌｐｄ）のネイティブな発現に取り替えられていると推定される（Kim et al., 2007）。無機塩培地におけるコハク酸生産のために最適に工学処理されたE. coli株において結果として生じたコハク酸経路（図１４）は、コハク酸生産ルーメン細菌において進化したネイティブな経路に機能的に類似する（Kim et al., 2004; Lee et al., 2002; Lee et al., 2006; Samuelov et al., 1991; VanderWerf et al., 1997）。
【０２０８】
実施例５
グリセロールからのコハク酸生産
グリセロール及びグルコースのための酸化還元性質及び輸送メカニズムの差にかかわらず、本発明者らは、無機塩培地中でグルコースからコハク酸への変換を可能にする同じ突然変異を使用して、グリセロールからコハク酸への変換について最大効率の８０％でグリセロール代謝をコハク酸生産に効果的に転換することができることを発見した（消費されたグリセロール１molあたり０．８molのコハク酸を生産）。
【０２０９】
これらの研究の経過中に、本発明者らは、以前に謎めいていると見なされたｇｌｄＡ及びＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ経路がグリセロール異化のための重要な機能的経路を含むことを発見した（図１５）。両者の経路では、グリセロールは促進拡散によって細胞に流入する。細胞内で、グリセロールの一部は直ちにリン酸化され、続いてＤＨＡＰに酸化されるが、これは、E. coliにおける標準グリセロール代謝経路として広く見なされている経路である。本発明者らは、グリセロールの少なくとも１／３がｇｌｄＡによって最初にＤＨＡに還元され、続いて細胞質内で作用するＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系（ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ）によってリン酸化されてＤＨＡＰが得られることを発見した。ＤＨＡＰは、取込み系及び活性化系の両者に関する中心代謝への共通の進入点として役立つ。
【０２１０】
表２０は、複合栄養素を添加せずに無機塩培地（ＮＢＳ）中でグリセロールからコハク酸を生産するために、グルコース存在下のコハク酸生産について同定された中核的突然変異を組み合わせる有効性をはっきりと実証している。ｐｆｌＢ単独の欠失がコハク酸の生産を野生型親よりも低く減少させたものの、ｐｆｌＢ欠失とｐｃｋにおけるプロモーター突然変異（ｐｃｋ＊；転写活性化）との組み合わせは、コハク酸収量を０．２５mol/molグリセロールから０．５mol/molグリセロールに倍増した。ｐｔｓＩにおける突然変異のその後の追加は、コハク酸収量を最大理論的収量の８０％である０．８molコハク酸/molグリセロールまでさらに増加させた。類似の結果が、リン酸化のためのリン酸リレー系の使用を破壊する他の主要な遺伝子（ｇｌｄＡ、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、ｄｈａＫＬ、ｄｈａＭ）の欠失についても見出された（表２０）。これらの結果は予想外であった。結果として生じたグリセロール変換経路を図１５に示す。
【０２１１】
図１５は、野生型E. coliにおける一般に認められたグリセロール異化経路（Lin, 1996）及び混合酸発酵経路（Bock and Sawers, 1996）の組み合わせを示す。コハク酸が唯一の産物として生産される場合、この経路において生産された全てのＡＴＰは、グリセロールリン酸化によって消費されるであろう。ＡＴＰは成長に利用不可能であろう。図１５に基づくと、ｐｆｌＢの欠失は還元物質及び中間体の入手性を増加させることによってコハク酸生産を増加させると予想される。この予想と対照的に、ｐｆｌＢ遺伝子を欠失させるとコハク酸生産における減少が観察された（表２０）。この経路に基づくと、普通は糖新生の間にのみ機能するｐｃｋ遺伝子の突然変異活性化がピルビン酸キナーゼと競合することによって、コハク酸へのホスホエノールピルビン酸のフローを増加させると予期することができ、その予期は、ＰＣＫ発現におけるこの増加がコハク酸への糖発酵に有益であったという本特許出願における以前の観察だけに基づき、さもなければこれは予想外であろう。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）の代わりにホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）を利用することは、ホスホエノールピルビン酸からのエネルギーを１個の追加的なＡＴＰとして保存し、それを生合成のために使用することができるという更なる利点を有した。
【０２１２】
ｐｔｓＩにおける突然変異がグルコースからコハク酸への炭素の転換に有益であったとはいえ、野生型E. coliにおいて機能的と認識された唯一のグリセロール取込み系（ｇｌｐＦ）がホスホエノールピルビン酸ホスホトランスフェラーゼ系を要さないことから、これに何らかの有益性があると予想することはできなかった（Keseler et al., 2005; Lin, 1996.）。グリセロール代謝へのホスホトランスフェラーゼ系の唯一の既知の関与は、野生型E. coliで不活性であると考えられる副経路内である（Jin et al., 1983:; Lin, 1996; Tang et al., 1982）。この副経路は、最初に細胞内グリセロールをＧｌｄＡでジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）に還元し、次にリン酸担体としてＰｔｓＨ（ｐｔｓＨ）及びＥＩ（ｐｔｓＩ）を使用して、ホスホエノールピルビン酸を細胞内ＤＨＡのリン酸化とカップリングしてジヒドロキシアセトン−リン酸を生産する（ＤＨＡＰ）。この経路は、ｇｌｐＫが不活性な突然変異株でのみ機能すると考えられる（Gutknecht et al., 2001; Keseler et al., 2005）。一般に認められたグリセロール代謝経路に基づく全ての予想とは反対に、ｐｔｓＩの突然変異は、グリセロールからのコハク酸生産をかなり増加させた。これらの結果は、ＮＢＳ無機塩培地中でグリセロールの嫌気性発酵の間にグリセロールデヒドロゲナーゼ（ｇｌｄＡ）及びＰＴＳリン酸リレー系（ホスホエノールピルビン酸、ＰｔｓＨ、ＰｔｓＩ）がグリセロールからジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）への異化のために予想外に重要であることを示している。コハク酸収量の大きな増加に基づき、このジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）経路は、解糖へのグリセロールフラックスの少なくとも３分の１を説明すると推定することができる。ｐｔｓＩにおける欠失はこの経路を不活性化し、コハク酸生産のためのホスホエノールピルビン酸の入手性を増加させた。まとめると、無機塩培地中での嫌気性発酵の間に、これらの３個の中核的突然変異（ｐｃｋ＊、ｐｔｓＩ、ｐｆｌＢ）は、最大理論的収量の８０％で有効かつ予想外に炭素フローをグリセロールからコハク酸に転換した（図１５）。加えて、この経路の使用は、ＡＴＰ生産の重要な増加を招き、成長を促進する。
【０２１３】
【表１】
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【０２１４】
ａ略語：ＣＳＬ、コーンスチープリカー；ＹＥ、酵母エキス；ＮＲ、報告なし。
ｂ体積あたりの平均生産性をコハク酸力価の下のカッコ内［g l-1 h-1］に示す。
ｃ好気性条件及び嫌気性条件の間の両者で代謝された糖からのコハク酸の生産をベースにモル収量を計算した。バイオマスは好気性成長の間に優位に生成した。コハク酸は、主にＣＯ２、Ｈ２、又は両者の混合物の存在下で嫌気性インキュベーションする間に生産された。
【０２１５】
【表２】
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【０２１６】
【表３】
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2015164429.tif 000014
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【０２１７】
【表４】
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【０２１８】
ａ様々な時点で発酵培養液からクローンを単離し、株番号を割り付けたものをカッコ内の番号で示す。
ｂ吸光度から推定した細胞収量（３ OD550nm＝１g l-1CDW）。
ｃ代謝されたグルコースをベースにコハク酸収量を計算した。
ｄ合計インキュベーション時間に関して体積あたりの平均生産性を計算した。
ｅ略語：suc、コハク酸；mal、リンゴ酸；pyr、ピルビン酸；ace、酢酸；lac、乳酸；for、ギ酸。
ｆ３回以上の発酵の平均値に標準偏差を付記。
ｇダッシュ符号は産物不在を示す。
ｈ好気性フラスコ振盪（１００rpm；１００ml ＮＢＳ、２５０mlフラスコ。
【０２１９】
【表５】
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【０２２０】
ａデータは、van der Werfら（1997）より。
ｂ乳酸デヒドロゲナーゼが存在するため野生型E. coli Ｃでは測定不能
【０２２１】
【表６】
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【０２２２】
aＮＢＳ＋１mMベタイン:ベタイン（１mM）で補正したＮＢＳ培地
ｂベタイン−ＨＣｌ原液を中和するために使用したＫＯＨを計算に含める。
ｃ微量金属原液（１０００×）は１２０mM ＨＣｌで調製した。
【０２２３】
【表７】
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【０２２４】
【表８】
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【０２２５】
ａ細胞収量は吸光度から推定した（３OD550nm＝１g l-1CDW）。
ｂコハク酸収量は、代謝されたグルコースベースで計算した。
ｃ体積あたりの生産性の平均値を、合計インキュベーション時間について計算した。
ｄ略語：ｓｕｃ、コハク酸；ｍａｌ、リンゴ酸；ｐｙｒ、ピルビン酸；ａｃｅ、酢酸；ｌａｃ、乳酸；ｆｏｒ、ギ酸。
ｅE. coli Ｃ由来の培養液にのみエタノール（１５３±３９mM）が存在した。
ｆ全てのデータは、３回以上の発酵の平均値に標準偏差を付記して表す。
ｇ理論的収量近くのコハク酸にもかかわらず、追加的な産物も見出された。副産物は、合計産物ベースで１１％に相当する
【０２２６】
【表９】
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【０２２７】
ｐｃｋ＊は、−６４（ＡＴＧ）にＧからＡのトランジションを有する突然変異型ｐｃｋを表す。
全ての株は、E. coli ＡＴＣＣ８７３９の派生株である。
【０２２８】
【表１０】
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【０２２９】
＊全ての発酵は、５％グルコース及び１００mM重炭酸カリウムを有するＮＢＳ培地中で行った。
†収量は、代謝されたグルコース１molあたり生産されたコハク酸のmol数として計算した。
【０２３０】
【表１１】
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【０２３１】
＊Ｐｃｋ、ＰＥＰカルボキシキナーゼ；Ｐｐｃ、ＰＥＰカルボキシラーゼ；ＳｆｃＡ、ＮＡＤＨ連結型リンゴ酸酵素；ＭａｅＢ、ＮＡＤＰＨ連結型リンゴ酸酵素；ＮＤ、判定せず。
Vanderwerf et al., Arch Microbiol 167:332-342からのデータ
‡成長不良
【０２３２】
【表１２】
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【０２３３】
†ＸＺ６１８及びＸＺ６２０では、それぞれＫＪ０１７及びＫＪ０７１におけるｐｃｋが突然変異（ＧからＡ）してｐｃｋ＊となった。
‡ＫＪ０６０及びＫＪ０７３におけるｐｃｋ＊突然変異は、ＸＺ６２２及びＸＺ６２４では野生型に回復した（ＡからＧ、−ｐｃｋ＋）。
§略語ｐｔｓＩＮ▽は、フレームシフト突然変異であるカルボキシ末端領域における一塩基欠失を表す。
【０２３４】
【表１３】
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【０２３５】
*Luria培養液を入れた振盪フラスコ中で培養物を好気的に成長させた。
†活性は２回の繰り返しの平均であり、U(mgタンパク質)-1で表現する。
‡比は、５％グルコース存在下の活性に対するグルコース不在下の活性である。
【０２３６】
【表１４】
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【０２３７】
＊配列決定用のプライマーを、全ての遺伝子の上流の、コードフラグメント及びターミネーターフラグメントを増幅するために使用した。
【０２３８】
【表１５】
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【０２３９】
【表１６】
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【０２４０】
１コハク酸収量は、代謝されたグルコース１molあたり生産されたコハク酸のmol数として計算した。コハク酸収量に及ぼす、代替ＮＡＤＨ酸化経路を不活性化する効果をカッコ内に示す。負符号（−）は、同条件下の野生型に比べた収量の減少を示し、正符号（＋）は収量の増加を示す。
２発酵は、５％グルコース及び１００mM重炭酸カリウムを有するＮＢＳ無機塩培地又はLuria液体培地のいずれかの中で実施した（３７℃、ｐＨ７．０、１５０rpm）。略語：Ｓｕｃ、コハク酸；Ａｃｅ、酢酸；Ｍａｌ、リンゴ酸；Ｐｙｒ、ピルビン酸；Ｌａｃ、乳酸；Ｆｏｒ、ギ酸；ＥｔＯＨ、エタノール。
【０２４１】
【表１７】
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【０２４２】
１略語ｐｃｋ＊は、突然変異型ｐｃｋ（ＡＴＧ開始に対して−６４でＧからＡ）を示す。
２ｐｃｋ遺伝子（リボソーム結合部位、コード領域及びターミネーター領域）を高コピープラスミドに過剰発現させた。
３ＰＣＫ活性をnmol 分-1(mgタンパク質) -1として表現した。
４コハク酸収量は、代謝されたグルコース１molあたり生産されたコハク酸のmol数として計算した。
５５％グルコース及び１００mM重炭酸カリウムを有するＮＢＳ無機塩培地中で発酵を実施した（３７℃、ｐＨ７．０、１５０rpm）。略語：Ｓｕｃ、コハク酸；Ａｃｅ、酢酸；Ｍａｌ、リンゴ酸；Ｐｙｒ、ピルビン酸；Ｌａｃ、乳酸；Ｆｏｒ、ギ酸；ＥｔＯＨ、エタノール
【０２４３】
【表１８】
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【０２４４】
１略語ｐｃｋ＊は、突然変異型ｐｃｋ（ＡＴＧ開始に対して−６４でＧからＡ）を表す。
２ｐｃｋ遺伝子（リボソーム結合部位、コード領域及びターミネーター領域）を高コピープラスミドに過剰発現させた。
３コハク酸収量を、代謝されたグルコース１molあたり生産されたコハク酸のmol数として計算した。
４５％グルコース及び１００mM重炭酸カリウムを有するＮＢＳ無機塩培地中で発酵を実施した（３７℃、ｐＨ７．０、１５０rpm）。略語：Ｓｕｃ、コハク酸；Ａｃｅ、酢酸；Ｍａｌ、リンゴ酸；Ｐｙｒ、ピルビン酸；Ｌａｃ、乳酸；Ｆｏｒ、ギ酸；ＥｔＯＨ、エタノール
【０２４５】
【表１９】
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【０２４６】
１略語ｐｃｋ＊は、突然変異型ｐｃｋ（ＡＴＧ開始に対して−６４でＧからＡ）を表す。ΔｐｔｓＩは、ｐｔｓＩ遺伝子のカルボキシ末端１７５bpの欠失を表し、一方でΔｐｔｓＩ−Ｗは、ｐｔｓＩ遺伝子全体の欠失を表す。
２コハク酸収量を代謝されたグルコース１molあたり生産されたコハク酸のmol数として計算した。
３５％グルコース及び１００mM重炭酸カリウムを有するＮＢＳ培地中で発酵を実施した（３７℃、ｐＨ７．０、１５０rpm）。略語：Ｓｕｃ、コハク酸；Ａｃｅ、酢酸；Ｍａｌ、リンゴ酸；Ｐｙｒ、ピルビン酸；Ｌａｃ、乳酸；Ｆｏｒ、ギ酸；ＥｔＯＨ、エタノール
【０２４７】
【表２０】
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【０２４８】
１  ５％グリセロール及び１００mM重炭酸カリウムを有するＮＢＳ培地中で発酵を３７℃、ｐＨ７．０、１５０rpmで実施した。コハク酸収量は、消費されたグリセロール１molあたり生産されたコハク酸のmol数に基づき計算した。略語：Ｓｕｃ、コハク酸；Ｆｏｒ、ギ酸；ＥｔＯＨ、エタノール；Ｌａｃ、乳酸；Ａｃｅ、酢酸。
【０２４９】
参考文献
読者の便宜上、全ての参考文献をここに一覧する。各参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。
【０２５０】
【表２１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
2015164429.tif 000089
【図１３】
2015164429.tif 000090
【図１４】
2015164429.tif 000091
【図１５】
2015164429.tif 000092
【配列表】
2015164429000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年5月20日(2015.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生株と比べて増加したレベルのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）遺伝子転写物およびａ）ｐｔｓＩ；ｂ）ｐｔｓＩおよびｐｆｌＢ；ｃ）ｐｔｓＩおよびａｄｈＥ；ｄ）ｐｔｓＩ−Ｗ；ｅ）ｐｔｓＨ；ｆ）ｐｔｓＧ；ｇ）ｐｆｌＢ；ｈ）ｇｌｄＡ；ｉ）ｄｈａＫＬ；またはｊ）ｄｈａＭの不活性化をもたらす１または複数の遺伝的改変を含む細菌細胞。
【請求項２】
増加したレベルのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）遺伝子転写物を含む細菌細胞であって、該転写物が活性ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）をコードし、該細胞が増加したＰＣＫ活性を示す、細菌細胞。
【請求項３】
ＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系の機能を破壊する１または複数の遺伝的改変をさらに含む、請求項２記載の細菌細胞。
【請求項４】
前記遺伝的改変が、ｐｔｓＧ、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、ｃｒｒおよびｃｒｐから成る群より選択される１または複数の遺伝子中にある、請求項３記載の細菌細胞。
【請求項５】
下記：
（ａ）請求項１〜４記載の細菌株を培養すること；
（ｂ）炭素源を提供すること；
（ｃ）該細菌に該炭素源を代謝させ、コハク酸を生産させることを可能にすること；および
（ｄ）コハク酸を単離すること
を含む、コハク酸を生産する方法。
【請求項６】
前記細菌株が、嫌気性条件、好気性条件、微好気性条件またはその組み合わせで培養される、請求項５記載の方法。
【外国語明細書】
2015164429000001.pdf