(57)【要約】      （修正有）【課題】溶血作用により生成したヘモグロビンの影響を回避し、溶血した試料であっても、試料中の酵素活性を正確に測定することが出来る測定試薬及び測定方法を提供する。【解決手段】酵素活性測定試薬中に８〜１２００ｐｐｂの範囲の微量の亜鉛イオンを存在させ、亜鉛イオンの存在下で酵素反応を行わせ、酵素活性測定試薬が４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測定するものである生体試料中の酵素活性測定方法。該酵素の例がアルカリホスファターゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、コリンエステラーゼ、アリルアミダーゼ、α−アミラーゼ、Ｌ−シスチンアミノトランスペプチダーゼ等である上記測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
８〜１２００ｐｐｂの濃度の亜鉛イオンを含有する生体試料中の酵素活性測定試薬。
【請求項２】
酵素活性測定試薬が４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測定するものである、請求項１記載の生体試料中の酵素活性測定試薬。
【請求項３】
酵素活性測定試薬が第１試薬及び第２試薬の２試薬より構成されるものであって、亜鉛イオンが少なくとも第１試薬又は第２試薬のいずれかに含有される、請求項１又は２に記載の生体試料中の酵素活性測定試薬。
【請求項４】
亜鉛イオンを、ヘモグロビンの影響回避剤として含有させる、請求項１〜３に記載の生体試料中の酵素活性測定試薬。
【請求項５】
８〜１２００ｐｐｂの濃度の亜鉛イオンを含有する酵素活性測定試薬と生体試料を混合し、亜鉛イオンの存在下で酵素反応を行わせ、４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測定する、生体試料中の酵素活性測定方法。
【請求項６】
酵素活性測定試薬が第１試薬及び第２試薬の２試薬より構成されるものであって、亜鉛イオンが少なくとも第１試薬又は第２試薬のいずれかに含有される、請求項４又は５に記載の生体試料中の酵素活性測定方法。
【請求項７】
亜鉛イオンを、ヘモグロビンの影響回避剤として含有させる、請求項５又は６に記載の生体試料中の酵素活性測定方法。
【請求項８】
４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測定する、生体試料中の酵素活性測定方法において、８〜１２００ｐｐｂの濃度の亜鉛イオンの存在下で測定を行うことにより、ヘモグロビンの影響を回避する方法。
【請求項９】
８〜１２００ｐｐｂの濃度の亜鉛イオンよりなる、生体試料中の酵素活性測定時のヘモグロビンの影響回避剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中の酵素活性を測定するための試薬及び方法に関するものであり、酵素活性の測定におけるヘモグロビンの影響を回避するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
血液等の生体試料中の酵素活性を測定し、その変動を見ることは、疾患の診断、治療、早期発見や予防に不可欠であり、広く実施されている。この生体試料中の酵素活性を測定するには、ニトロフェニル基又はニトロアニリン基等を有する基質にこれらの酵素が反応して生ずる４−ニトロフェノール、２−クロロ−４−ニトロフェノール、４−ニトロアニリン又は３−カルボキシ−４−ニトロアニリン等の４００〜５００ｎｍに吸収極大を持つ物質の波長４００〜５００ｎｍでの時間経過による吸光度の増加速度を求め、その測定結果から酵素活性を求めるレートアッセイが一般的である。
【０００３】
ところで、このような方法では、溶血作用により生成したヘモグロビンが試料中に含まれていると、測定中にそれが分解して、測定波長域における吸光度の経時的な減少を引き起こし、酵素活性測定の波長域での吸光度の増加速度を低下させてしまい、負の誤差が生じて、正確な測定値が得られないという問題があった。
【０００４】
そこで、溶血作用により生成したヘモグロビンが測定中に分解するのを防止するため、酵素活性測定試薬にチオ尿素を含有させる方法（例えば、特許文献１参照。）や、ピリジン類、イミダゾール類、ヒスタミン類を含有させる方法（例えば、特許文献２参照。）等が提案されているが、必ずしも完全とは言えなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公平６−１２９９８号公報
【特許文献２】特公平３−５６４２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記のように従来の生体試料中の酵素活性測定試薬及び酵素活性測定方法は、溶血した試料中のヘモグロビンの影響を受け、測定値に負誤差を生じてしまうという問題があった。このため、例えば、医療の場における臨床検査において、生体試料中の酵素活性の測定値を診断に利用しようとする場合、疾患等の診断を誤らせる可能性があった。
【０００７】
従って、本発明の課題は、溶血作用により生成したヘモグロビンの影響を回避し、溶血した試料であっても、試料中の酵素活性を正確に測定することが出来る測定試薬及び測定方法を提供することである。
また、本発明の課題は、ヘモグロビンの影響を回避する方法を提供することであり、ヘモグロビンの影響回避剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の問題点の解決を目指して鋭意検討を行った結果、酵素活性測定試薬中に亜鉛イオンが８〜１２００ｐｐｂの範囲で存在すると上記課題を解決できることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）８〜１２００ｐｐｂの濃度の亜鉛イオンを含有する生体試料中の酵素活性測定試薬。
（２）酵素活性測定試薬が４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測定するものである、前記（１）記載の生体試料中の酵素活性測定試薬。
（３）酵素活性測定試薬が第１試薬及び第２試薬の２試薬より構成されるものであって、亜鉛イオンが少なくとも第１試薬又は第２試薬のいずれかに含有される、前記（１）又は（２）に記載の生体試料中の酵素活性測定試薬。
（４）亜鉛イオンを、ヘモグロビンの影響回避剤として含有させる、前記（１）〜（３）に記載の生体試料中の酵素活性測定試薬。
（５）８〜１２００ｐｐｂの濃度の亜鉛イオンを含有する酵素活性測定試薬と生体試料を混合し、亜鉛イオンの存在下で酵素反応を行わせ、４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測定する、生体試料中の酵素活性測定方法。
（６）酵素活性測定試薬が第１試薬及び第２試薬の２試薬より構成されるものであって、亜鉛イオンが少なくとも第１試薬又は第２試薬のいずれかに含有される、前記（４）又は（５）に記載の生体試料中の酵素活性測定方法。
（７）亜鉛イオンを、ヘモグロビンの影響回避剤として含有させる、前記（５）又は（６）に記載の生体試料中の酵素活性測定方法。
（８）４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測定する、生体試料中の酵素活性測定方法において、８〜１２００ｐｐｂの濃度の亜鉛イオンの存在下で測定を行うことにより、ヘモグロビンの影響を回避する方法。
（９）８〜１２００ｐｐｂの濃度の亜鉛イオンよりなる、生体試料中の酵素活性測定時のヘモグロビンの影響回避剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、生体試料中の酵素活性測定試薬及び測定方法において、酵素活性測定試薬中に８〜１２００ｐｐｂの濃度の微量の亜鉛イオンを含有させることにより、ヘモグロビンの影響を回避し、測定値に誤差が生じるのを防ぐことができるものである。
【００１１】
すなわち、本発明の生体試料中の酵素活性の測定試薬、測定方法、ヘモグロビンの影響を回避する方法、及びヘモグロビンの影響回避剤においては、溶血作用により生成したヘモグロビンの影響を受けずに、正確な測定値を得ることができるものである。
【００１２】
これにより、本発明の生体試料中の酵素活性測定試薬、測定方法、ヘモグロビンの影響を回避する方法、及びヘモグロビンの影響回避剤は、例えば、医療の場において、診断を誤らせることを防ぐことができるものである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明はこの実施の形態に限定されるものではない。また、本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施することができる。
【００１４】
〔１〕亜鉛イオン
本発明においては、酵素活性測定試薬に亜鉛イオンを含有させる。この測定試薬に含有させる亜鉛イオンとしては、亜鉛イオンであればどのようなものでもよい。例えば、亜鉛イオンを含む化合物を用いることができる。
具体的には、亜鉛イオンと酸基よりなる化合物、亜鉛イオンの水酸化物、亜鉛イオンの塩等を挙げることができる。
より具体的には、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、酢酸亜鉛、乳酸亜鉛、又は塩化亜鉛等の亜鉛塩等を挙げることができる。
【００１５】
本発明において、溶血した試料における負誤差を回避するために、酵素活性測定試薬に含有させる亜鉛イオンの濃度は、８〜１２００ｐｐｂであればよく、好ましくは８〜１０００ｐｐｂであり、より好ましくは８〜８００ｐｐｂであり、特に好ましくは８〜６００ｐｐｂである。
【００１６】
また、本発明の酵素活性測定試薬において、測定試薬が１試薬よりなる場合には、測定試薬に含有させる亜鉛イオンの濃度は、上記の範囲のものとすればよく、測定試薬が第１試薬及び第２試薬の２試薬よりなる場合には、この第１試薬及び第２試薬を生体試料中の酵素活性を測定する際の各々の添加量の比で混合した際に、この混合後の測定試薬中の亜鉛イオンの濃度が上記の範囲となるように、亜鉛イオンを第１試薬又は第２試薬のいずれかに含有させればよい。
また、混合後の測定試薬中の亜鉛イオンの濃度が上記濃度範囲に入るのであれば、亜鉛イオンは第１試薬と第２試薬の両方に含有させてもよい。
なお、測定試薬が３試薬以上の試薬から構成される場合も同様である。
【００１７】
本発明において亜鉛イオンを酵素活性測定試薬に存在させる方法であるが、少なくとも生体試料と試薬成分との酵素反応が行われる測定反応時に、亜鉛イオンを存在させることにより、溶血作用により生成したヘモグロビンによる影響を抑制することができる。
従って、本発明の酵素活性測定試薬において、亜鉛イオンは少なくとも第１試薬または第２試薬のうちいずれかに含有させればよく、第１試薬と第２試薬の両方に含有させることもできる。なお、溶血作用により生成したヘモグロビンの影響を抑制するためには、亜鉛イオンが第１試薬に含有されていることが好ましい。
【００１８】
また、本発明の酵素活性測定試薬において、第１試薬と第２試薬を測定時の添加量の比で混合した後の測定試薬中の亜鉛イオンの濃度と第１試薬及び第２試薬に含有させる亜鉛イオンの濃度の関係の式を下記の数式１に示した。
【００１９】
【数１】
2015029444.tif 000002
【００２０】
数式１において、ＣＭは混合後の測定試薬中の亜鉛イオンの濃度（ｐｐｂ）を、Ｃ１は第１試薬に含有させる亜鉛イオンの濃度（ｐｐｂ）を、Ｃ２は第２試薬に含有させる亜鉛イオンの濃度（ｐｐｂ）を、Ｖ１は測定時の第１試薬の添加量の比を、Ｖ２は測定時の第２試薬の添加量の比をそれぞれ示す。
【００２１】
測定時の第１試薬と第２試薬の添加量の比（Ｖ１、Ｖ２）が定まっている場合、混合後の測定試薬中の亜鉛イオン濃度（ＣＭ）が、８〜１２００ｐｐｂ（好ましくは８〜１０００ｐｐｂ、より好ましくは８〜８００ｐｐｂ、特に好ましくは８〜６００ｐｐｂ）の範囲内の特定の値となるよう数式１に従って、第１試薬及び第２試薬に含有させる亜鉛イオンの濃度を決めればよい。
なお、測定試薬が３試薬以上の試薬から構成される場合も同様である。
【００２２】
ところで、本発明においては、酵素活性測定試薬中の濃度、又は第１試薬、第２試薬等の測定試薬を構成する試薬の混合後の測定試薬中での濃度で、亜鉛イオンの濃度を８〜１２００ｐｐｂ（好ましくは８〜１０００ｐｐｂ、より好ましくは８〜８００ｐｐｂ、特に好ましくは８〜６００ｐｐｂ）と規定しているが、これを酵素活性測定試薬と生体試料の混合後の濃度、又は第１試薬、第２試薬等の測定試薬を構成する試薬と生体試料の混合後の濃度、つまり酵素活性測定反応の最終反応液中の濃度に置き換えても支障はない。
【００２３】
それは、現在行われている生体試料中の酵素活性の測定において、試料の添加量を酵素活性測定試薬の添加量で割った時の比率は、測定試薬の添加量に対する試料の添加量が大変小さいため通常１〜５％の範囲内に収まるものであり、試料の添加量を考慮してもしなくても大差はないからである。
【００２４】
〔２〕酵素活性測定時のｐＨ
本発明において、酵素活性測定時のｐＨは特に限定されないが、酵素活性測定時の反応が進むｐＨ域にあればよい。なお、この測定反応時のｐＨは、当該反応の至適ｐＨ域又はその近辺にあることが好ましい。  
例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴ）、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）等の酵素は、至適ｐＨ域がｐＨ７〜１４の範囲にあることから、酵素活性測定時のｐＨをｐＨ７〜１４近辺にすることが好ましい。
【００２５】
また、前記のｐＨ範囲となるように使用する緩衝液としては、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝液を適宜使用することができる。
【００２６】
このような緩衝液として使用できるものとしては、例えば、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシルグリシン、モノエタノールアミン（ＭＥＡ）、ジエタノールアミン（ＤＥＡ）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、Ｎ，Ｎ‐ビス（２‐ヒドロキシエチル）‐２‐アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、２，２−ビス（ヒドロキシエチル）−（イミノトリス）−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、１，３−ビストリスヒドロキシメチルメチルアミノプロパン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノエタンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、２−エチルアミノエタノール（ＥＡＥ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−プロパンスルホン酸モノハイドレート（ＨＥＰＰＳＯ）、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）デハイドレート（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、若しくはＮ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、又はこれらの塩等の各緩衝剤を挙げることができる。
【００２７】
また、本発明においては、緩衝液が、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノエタンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２−エチルアミノエタノール（ＥＡＥ）、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧ）、モノエタノールアミン（ＭＥＡ）、ジエタノールアミン（ＤＥＡ）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）等のアルカリ性緩衝液であることが好ましい。
【００２８】
また、本発明においては、緩衝液が、特に２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、２−エチルアミノエタノール（ＥＡＥ）、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧ）、ジエタノールアミン（ＤＥＡ）等のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性測定に用いられる緩衝液であることが好ましい。
【００２９】
〔３〕生体試料
本発明において、生体試料とは、生体試料中の酵素活性の測定を行おうとするもののことであり、このようなものであれば特に限定されない。
このような生体試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、大便、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水、脳等の臓器、毛髪や皮膚や爪や筋肉若しくは神経等の組織及び細胞等の抽出液等が挙げられる。
【００３０】
〔４〕生体試料中の酵素
本発明において、酵素活性の測定を行う酵素とは、４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測定することにより酵素活性の測定を行うことができるものである。
つまり、この活性の測定を行おうとする酵素が反応を触媒して生成する物、又はこの生成物より導かれる物質が４００〜５００ｎｍの波長域に吸収を持つような化合物を、基質とすることができる酵素である。
【００３１】
このような酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アリルアミダーゼ（ＡＡ）、α−アミラーゼ（ＡＭＹ）、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、Ｌ−シスチンアミノトランスペプチダーゼ（ＣＡＰ）等を挙げることができる。
【００３２】
また、本発明においては、酵素活性の測定を行う酵素が、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）であることが好ましい。
【００３３】
また、本発明は上記の酵素のアイソザイムの活性測定に用いることもできる。
この場合、例えば特定のアイソザイムを阻害する抗体等の阻害剤を生体試料中の酵素に作用させ、酵素活性を測定することにより行うことができる。
【００３４】
〔５〕酵素活性測定試薬
本発明の生体試料中の酵素活性測定試薬は、８〜１２００ｐｐｂの濃度の亜鉛イオンを含有させることを特徴とするものである。これにより、溶血作用により生成したヘモグロビンの影響を回避し、生体試料中の酵素活性を正確に測定することができる。
なお、本発明の酵素活性測定試薬においては、８〜１２００ｐｐｂの濃度の微量の亜鉛イオンを含有させること以外は、従来より公知の生体試料中の酵素活性を測定する試薬に従えばよい。
【００３５】
また、この本発明の酵素活性測定試薬は、終点法（エンドポイント法）により測定を行うものであってもよく、又は反応速度法（レート法）により測定を行うものであってもよく、適宜選択すればよい。
【００３６】
また、この本発明の酵素活性測定試薬は、一段階のステップにより測定を行う１ステップ法（１試薬法）のものであってもよく、又は二段階若しくはそれ以上の多段階のステップにより測定を行う多ステップ法（多試薬法）のものであってもよく、適宜選択すればよい。
【００３７】
また、この本発明の酵素活性測定試薬においては、前記した成分の他に、測定反応に使用する成分として、金属イオン若しくはこれを含む金属塩、キレート剤、糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、界面活性剤、賦形剤又は活性化剤等を必要に応じて適宜使用することができる。
【００３８】
また、この本発明の酵素活性測定試薬において、その測定は、用手法により行うものであってもよく、又は自動分析装置等の装置を用いて行うものであってもよい。
【００３９】
また、この本発明の酵素活性測定試薬は、その構成試薬の全て又は一部が液状試薬であってよい。
【００４０】
また、この本発明の酵素活性測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は生体試料中の酵素活性の測定に使用することができる。
【００４１】
また、この本発明の酵素活性測定試薬は、前記した測定試薬以外のその他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中の測定対象物質の測定に使用することもできる。
前記した測定試薬以外のその他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、検量（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
【００４２】
また、この本発明の酵素活性測定試薬は、第１試薬及び第２試薬、又はその他の試薬等の複数の構成試薬からなる測定試薬キットであってもよい。
【００４３】
また、本発明においては、酵素活性測定試薬がアルカリホスファターゼの活性を測定するためのものであることが好ましい。この場合、測定試薬の構成としては、例えば、第１試薬にアルカリ性緩衝液を含み、第２試薬にアルカリ性緩衝液と４−ニトロフェニルリン酸等の基質を含む構成のもの、第１試薬にアルカリ性緩衝液を含み、第２試薬に４−ニトロフェニルリン酸等の基質を含む構成のもの、又は、第１試薬に４−ニトロフェニルリン酸等の基質を含み、第２試薬にアルカリ性緩衝液を含む構成のもの等を挙げることができる。
【００４４】
〔６〕酵素活性測定方法
本発明の生体試料中の酵素活性測定方法においては、８〜１２００ｐｐｂの濃度の亜鉛イオンを含有する酵素活性測定試薬と生体試料を混合し、微量の亜鉛イオンの存在下で酵素反応を行わせ、４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測定すること以外は、従来より公知の酵素活性測定方法に従えばよい。
また、本発明の生体試料中の酵素活性測定方法は、１ステップ法（１試薬系）からなるものでもよく、複数ステップ法（複数試薬系）からなるものであってもよい。
【００４５】
本発明の生体試料中の酵素活性測定方法が２試薬系からなるものである場合、第１試薬と第２試薬を測定時の添加量の比で混合した際にこの混合後の測定試薬中の亜鉛イオンの濃度が８〜１２００ｐｐｂとなるように亜鉛イオンを第１試薬及び／又は第２試薬に含有する酵素活性測定試薬の第１試薬並びに第２試薬及び生体試料を混合し、微量の亜鉛イオンの存在下で酵素反応を行わせ、酵素が基質と反応して生成する物又はこの生成物より導かれる物質の４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測定し、この測定値より生体試料中の酵素活性を算出する。
【００４６】
なお、先に述べたように、試料の添加量を酵素活性測定試薬の添加量で割った時の比率は、通常１〜５％の範囲内に収まるものであり、試料の添加量はほとんど無視できるものであるので、酵素反応を行わせる時の微量の亜鉛イオンの濃度は、８〜１２００ｐｐｂ（好ましくは８〜１０００ｐｐｂ、より好ましくは８〜８００ｐｐｂ、特に好ましくは８〜６００ｐｐｂ）とほぼ同じである。
【００４７】
本発明の生体試料中の酵素活性測定方法は、酵素が基質と反応して生成する物又はこの生成物より導かれる物質の生成速度を４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度の１分間当たりの変化量より算出するか、酵素が基質と反応して生成する物又はこの生成物より導かれる物質の生成量を４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を測ることにより求める測定原理のものであれば、いかなる方法にも用いることができる。例えば、反応速度法（レート法）又は終点法（エンドポイント法）に適用できる。
このような測定方法において、それ自体公知の方法によって、用手法又は自動分析装置による方法により酵素活性を測定することができる。
【００４８】
例えば、アルカリホスファターゼの測定用基質としては、グリセロリン酸、４−ニトロフェニルリン酸等が用いられ；α−アミラーゼの測定用基質としては、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド、４，６−ベンジリデン−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド、４５
−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトペンタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシド等が用いられ；コリンエステラーゼの測定用基質としては、ブチリルチオコリン等が用いられ；γ−グルタミルトランスペプチダーゼの測定用基質としては、Ｌ−γ−グルタミル−４−ニトロアニリド、Ｌ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド等が用いられ；ロイシンアミノペプチダーゼの測定用基質としては、Ｌ−ロイシル−４−ニトロアニリド等が用いられ；Ｌ−シスチンアミノトランスペプチダーゼの測定用基質としては、Ｓ−ベンジル−Ｌ−システイン−４−ニトロアニリド等が用いられる。
これらの基質に酵素が作用して遊離してくる４−ニトロフェノール、２−クロロ−４−ニトロフェノール、４−ニトロアニリン若しくは３−カルボキシ−４−ニトロアニリン等の４００〜５００ｎｍに吸収極大を持つ物質の４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を経時的に測定して、その吸光度の増加より酵素活性を算出する。
【００４９】
または、これらの基質に酵素が作用して遊離してくるチオコリン等の物質に、ＳＨ基と反応して定量的に４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度の変化を生ずるＤＴＮＢ〔５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）〕等を加えて反応させ、生成してきた４００〜５００ｎｍに吸収極大を持つ物質の４００〜５００ｎｍの波長域の吸光度を経時的に測定して、その吸光度の増加より酵素活性を算出する。
この場合、本発明によれば、生体試料中のヘモグロビンの分解により生じる誤差を抑制することができる。
【００５０】
〔７〕ヘモグロビンの影響を回避する方法
本発明における、ヘモグロビンの影響を回避する方法は、生体試料中の酵素活性の測定方法において、８〜１２００ｐｐｂの濃度の亜鉛イオンの存在下で測定を行うことによるものである。
この生体試料中の酵素活性の測定方法において、８〜１２００ｐｐｂの濃度の亜鉛イオンの存在下で測定を行うことにより、溶血作用によって生体試料中にヘモグロビンが混在している場合であっても、このヘモグロビンによる測定値への誤差が生じることを回避でき、精度が高い酵素活性の測定値を得ることができる。
また、本発明における溶血作用により生成したヘモグロビンの影響を回避する方法を実施する際の試薬の構成成分や生体試料や条件等は、前記した通りである。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５２】
〔実施例１〕
（本発明によるヘモグロビンの影響回避効果の確認）
第１試薬及び第２試薬より構成される、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に準拠するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性測定試薬を調製し、この第１試薬に亜鉛イオンを含有させた場合のヘモグロビンによる影響回避効果を確認した。
【００５３】
１．試薬の調製
【００５４】
（１）ＡＬＰ第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを１０．１（２０℃）に調整して、硫酸亜鉛濃度の異なる１２種類のＡＬＰ第１試薬を調製した。
【００５５】
２−エチルアミノエタノール（緩衝液）  １．０１Ｍ
塩化マグネシウム（６水塩）  ０．５０５ｍＭ
硫酸亜鉛（７水塩）  ０ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、５０ｐｐｂ、１００ｐｐｂ、１５０ｐｐｂ、２００ｐｐｂ、４００ｐｐｂ、６００ｐｐｂ、８００ｐｐｂ、１０００ｐｐｂ、１２００ｐｐｂ、又は１４００ｐｐｂ
【００５６】
（２）ＡＬＰ第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを１０．２（２０℃）に調整して、ＡＬＰ第２試薬を調製した。
【００５７】
２−エチルアミノエタノール（緩衝液）  １．０１Ｍ
４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩  ７５．７５ｍＭ
塩化マグネシウム（６水塩）  ０．５０５ｍＭ
【００５８】
２．試料の調製
ヒト血清試料の９容と、ヘモグロビンを含まない水溶液、干渉チェックＡプラスＨｂ〔シスメックス社製〕又はヒト赤血球を溶血させて調製したヘモグロビン濃度が、５０００ｍｇ／ｄＬの水溶液の１容をそれぞれ混合して、ヘモグロビン濃度が各々０、１００、２００、３００、４００、又は５００ｍｇ／ｄＬである血清試料を調製した。
【００５９】
３．ヒト血清試料中のアルカリホスファターゼ活性の測定
ヒト血清試料中のアルカリホスファターゼ活性の測定は日立製作所社製７１８０形自動分析装置にて行い、ヒト血清試料２．５μＬに第１試薬としてＡＬＰ第１試薬を１６０μＬ加え３７℃で５分間反応させた後、第２試薬としてＡＬＰ第２試薬を４０μＬ添加し混合液（最終反応液）とし、３７℃で反応を行わせ、第２試薬添加１分１０秒目（２１ポイント）から５分目（３４ポイント）の主波長４０５ｎｍ及び副波長５０５ｎｍにおける吸光度の増加速度よりアルカリホスファターゼ活性値の算出を行った。
【００６０】
なお、本発明においては、酵素キャリブレータ（Ａａｌｔｏ ＥＣ；シノテスト社製）を用いて検量及び校正を行い、アルカリホスファターゼ活性値を算出した。
【００６１】
なお、上記の１２種類のＡＬＰ第１試薬と上記ＡＬＰ第２試薬とを上記の添加量で混合した後の測定試薬中の硫酸亜鉛の濃度は、各々、下記の様になる。
０ｐｐｂ、８ｐｐｂ、４０ｐｐｂ、８０ｐｐｂ、１２０ｐｐｂ、１６０ｐｐｂ、３２０ｐｐｂ、４８０ｐｐｂ、６４０ｐｐｂ、８００ｐｐｂ、９６０ｐｐｂ、又は１１２０ｐｐｂ
【００６２】
４．測定結果
測定の結果を表１に示す。
なお、表１において、かっこ内の数値は、１２種類の各試薬における、ヘモグロビン濃度０ｍｇ／ｄＬの血清試料のＡＬＰ活性測定値を１００％とした時のヘモグロビン濃度１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、又は５００ｍｇ／ｄＬの血清試料のＡＬＰ活性測定値を相対比率（％）で表したものである。また、硫酸亜鉛濃度は、混合後の測定試薬中の硫酸亜鉛濃度（ｐｐｂ）を示す。
【００６３】
【表１】
2015029444.tif 000003
【００６４】
５．考察
表１から明らかなように、試薬に硫酸亜鉛（亜鉛イオン）を含有させていない場合は、試料中のヘモグロビンの影響を受けて、ＡＬＰの活性測定値に負誤差が生じていることが分かる。更に、試料中のヘモグロビン濃度が高くなるにつれて、ＡＬＰの活性測定値が下降しており、負誤差の程度が大きくなっていることが分かる。
これに対して、第１試薬に硫酸亜鉛（亜鉛イオン）を含有させた場合は、混合後の測定試薬中の硫酸亜鉛濃度がいずれの場合も、この測定値の負誤差が減少し改善されていることが分かる。すなわち、混合後の測定試薬中の硫酸亜鉛濃度が８ｐｐｂ以上及び１２００ｐｐｂ以下の各濃度においてヘモグロビンの影響によって生じる誤差を抑制できることが分かる。
【００６５】
これらのことより、生体試料中の酵素活性測定試薬において、８〜１２００ｐｐｂの微量の亜鉛イオンを含有させることにより、溶血した試料においても、ヘモグロビンによる測定値への誤差が生じることを回避でき、精度が高い酵素活性値を得ることができることが確かめられた。
よって、本発明の酵素活性測定試薬及び測定方法は、溶血した試料においても、誤差を生じずに正確な酵素活性値を得ることができることが確かめられた。
【００６６】
〔実施例２〕
（本発明によるヘモグロビンの影響回避効果の確認）
第１試薬及び第２試薬より構成される、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に準拠するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性測定試薬を調製し、この第１試薬に亜鉛イオンを含有させた場合のヘモグロビンによる影響回避効果を確認した。
【００６７】
１．試薬の調製
【００６８】
（１）ＡＬＰ第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを１０．１（２０℃）に調整して、硫酸亜鉛濃度の異なる７種類のＡＬＰ第１試薬を調製した。
【００６９】
２−エチルアミノエタノール（緩衝液）  １．０１Ｍ
塩化マグネシウム（６水塩）  ０．５０５ｍＭ
硫酸亜鉛（７水塩）  ０ｐｐｂ、１００ｐｐｂ、１５０ｐｐｂ、２００ｐｐｂ、４００ｐｐｂ、６００ｐｐｂ、又は８００ｐｐｂ
【００７０】
（２）ＡＬＰ第２試薬の調製
前記実施例１の１の（２）で調製したＡＬＰ第２試薬を、ＡＬＰ第２試薬として用いた。
【００７１】
２．試料の調製
前記実施例１の２で調製した６種類の試料を、試料として用いた。
【００７２】
３．ヒト血清試料中のアルカリホスファターゼ活性の測定
前記２の各試料について、前記１で調製した７種類のＡＬＰ第１試薬及びＡＬＰ第２試薬にて実施例１の３と同様にして測定を行い、ヘモグロビンによる影響回避効果を確認した。
【００７３】
なお、上記の７種類のＡＬＰ第１試薬と上記ＡＬＰ第２試薬とを上記の添加量で混合した後の測定試薬中の硫酸亜鉛の濃度は、各々、下記の様になる。
０ｐｐｂ、８０ｐｐｂ、１２０ｐｐｂ、１６０ｐｐｂ、３２０ｐｐｂ、４８０ｐｐｂ、又は６４０ｐｐｂ
【００７４】
４．測定結果
測定の結果を表２に示す。
なお、表２において、かっこ内の数値は、７種類の各試薬における、ヘモグロビン濃度０ｍｇ／ｄＬの血清試料のＡＬＰ活性測定値を１００％とした時のヘモグロビン濃度１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、又は５００ｍｇ／ｄＬの血清試料のＡＬＰ活性測定値を相対比率（％）で表したものである。また、硫酸亜鉛濃度は、混合後の測定試薬中の硫酸亜鉛濃度（ｐｐｂ）を示す。
【００７５】
【表２】
2015029444.tif 000004
【００７６】
５．考察
表２から明らかなように、試薬に硫酸亜鉛（亜鉛イオン）を含有させていない場合は、試料中のヘモグロビンの影響を受けて、ＡＬＰの活性測定値に負誤差が生じていることが分かる。更に、試料中のヘモグロビン濃度が高くなるにつれて、ＡＬＰの活性測定値が下降しており、負誤差の程度が大きくなっていることが分かる。
これに対して、第１試薬に硫酸亜鉛（亜鉛イオン）を含有させた場合は、混合後の測定試薬中の硫酸亜鉛濃度がいずれの場合も、この測定値の負誤差が減少し改善されていることが分かる。すなわち、ヘモグロビンの影響によって生じる誤差を抑制できることが分かる。
【００７７】
これらのことより、生体試料中の酵素活性測定試薬において、微量の亜鉛イオンを含有させることにより、溶血した試料においても、ヘモグロビンによる測定値への誤差が生じることを回避でき、精度が高い酵素活性値を得ることができることが確かめられた。
よって、本発明の酵素活性測定試薬及び測定方法は、溶血した試料においても、誤差を生じずに正確な酵素活性値を得ることができることが確かめられた。
【００７８】
〔実施例３〕
（本発明によるヘモグロビンの影響回避効果の確認）
第１試薬及び第２試薬より構成される、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に準拠するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性測定試薬を調製し、この第１試薬及び第２試薬に亜鉛イオンを含有させた場合のヘモグロビンによる影響回避効果を確認した。
【００７９】
１．試薬の調製
【００８０】
（１）ＡＬＰ第１試薬の調製
前記実施例２の１の（１）で調製したＡＬＰ第１試薬を、ＡＬＰ第１試薬として用いた。
【００８１】
（２）ＡＬＰ第２試薬ａの調製
前記実施例２の１の（２）で調製したＡＬＰ第２試薬を、第２試薬ａとして用いた。
【００８２】
（３）ＡＬＰ第２試薬ｂの調製
６００ｐｐｂの硫酸亜鉛（７水塩）を含有すること以外は、前記実施例２の１の（２）で調製したＡＬＰ第２試薬と成分及び濃度が同じである、ＡＬＰ第２試薬ｂを調製した。
【００８３】
２．試料の調製
前記実施例１の２で調製した６種類の試料を、試料として用いた。
【００８４】
３．ヒト血清試料中のアルカリホスファターゼ活性の測定
前記２の各試料について、前記１で調製した硫酸亜鉛を含有しない（０ｐｐｂ）ＡＬＰ第１試薬及びＡＬＰ第２試薬ａ、並びに７種類のＡＬＰ第１試薬及びＡＬＰ第２試薬ｂにて前記実施例１の３と同様にして測定を行い、ヘモグロビンによる影響回避効果を確認した。
【００８５】
なお、上記の硫酸亜鉛を含有しない（０ｐｐｂ）ＡＬＰ第１試薬及びＡＬＰ第２試薬ａとを上記の添加量で混合した後の測定試薬中の硫酸亜鉛の濃度は、０ｐｐｂとなる。
また、上記の７種類のＡＬＰ第１試薬と上記ＡＬＰ第２試薬ｂとを上記の添加量で混合した後の測定試薬中の硫酸亜鉛の濃度は、各々、下記の様になる。
１２０ｐｐｂ、２００ｐｐｂ、２４０ｐｐｂ、２８０ｐｐｂ、４４０ｐｐｂ、６００ｐｐｂ、又は７６０ｐｐｂ
【００８６】
４．測定結果
測定の結果を表３に示す。
なお、この表３に示した数値は、各試薬における、ヘモグロビン濃度０ｍｇ／ｄＬの血清試料のＡＬＰ活性測定値を１００％とした時のヘモグロビン濃度１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、又は５００ｍｇ／ｄＬの血清試料のＡＬＰ活性測定値を相対比率（％）で表したものである。また、硫酸亜鉛濃度は、混合後の測定試薬中の硫酸亜鉛濃度（ｐｐｂ）を示す。
【００８７】
【表３】
2015029444.tif 000005
【００８８】
５．考察
表３から明らかなように、試薬に硫酸亜鉛（亜鉛イオン）を含有させていない場合は、試料中のヘモグロビンの影響を受けて、ＡＬＰの活性測定値に負誤差が生じていることが分かる。更に、試料中のヘモグロビン濃度が高くなるにつれて、ＡＬＰの活性測定値が下降しており、負誤差の程度が大きくなっていることが分かる。
これに対して、第１試薬及び第２試薬に硫酸亜鉛（亜鉛イオン）を含有させた場合は、混合後の測定試薬中の硫酸亜鉛濃度がいずれの場合も、この測定値の負誤差が減少し改善されていることが分かる。すなわち、ヘモグロビンの影響によって生じる誤差を抑制できることが分かる。
【００８９】
これらのことより、生体試料中の酵素活性測定試薬において、微量の亜鉛イオンを含有させることにより、溶血した試料においても、ヘモグロビンによる測定値への誤差が生じることを回避でき、精度が高い酵素活性値を得ることができることが確かめられた。
よって、本発明の酵素活性測定試薬及び測定方法は、溶血した試料においても、誤差を生じずに正確な酵素活性値を得ることができることが確かめられた。
【００９０】
〔実施例４〕
（本発明によるヘモグロビンの影響回避効果の確認）
第１試薬及び第２試薬より構成される、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に準拠するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性測定試薬を調製し、この第２試薬に亜鉛イオンを含有させた場合のヘモグロビンによる影響回避効果を確認した。
【００９１】
１．試薬の調製
【００９２】
（１）ＡＬＰ第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、１Ｎ塩酸でｐＨを８．０（２０℃）に調整して、ＡＬＰ第１試薬を調製した。
【００９３】
４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩  １８．９４ｍＭ
塩化マグネシウム（６水塩）  ０．５０５ｍＭ
【００９４】
（２）ＡＬＰ第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを１０．２（２０℃）に調整して、硫酸亜鉛濃度の異なる７種類のＡＬＰ第２試薬を調製した。
【００９５】
２−エチルアミノエタノール（緩衝液）  ５．０５ｍＭ
塩化マグネシウム（６水塩）  ０．５０５ｍＭ
硫酸亜鉛（７水塩）  ０ｐｐｂ、１０００ｐｐｂ、２０００ｐｐｂ、３０００ｐｐｂ、４０００ｐｐｂ、５０００ｐｐｂ、又は６０００ｐｐｂ
【００９６】
２．試料の調製
前記実施例１の２で調製した６種類の試料を、試料として用いた。
【００９７】
３．ヒト血清試料中のアルカリホスファターゼ活性の測定
前記２の各試料について、前記１で調製したＡＬＰ第１試薬及び７種類のＡＬＰ第２試薬にて実施例１の３と同様にして測定を行い、ヘモグロビンによる影響回避効果を確認した。
【００９８】
なお、上記ＡＬＰ第１試薬と上記７種類のＡＬＰ第２試薬とを上記の添加量で混合した後の測定試薬中の硫酸亜鉛の濃度は、各々、下記の様になる。
０ｐｐｂ、２００ｐｐｂ、４００ｐｐｂ、６００ｐｐｂ、８００ｐｐｂ、１０００ｐｐｂ、又は１２００ｐｐｂ
【００９９】
４．測定結果
測定の結果を表４に示す。
なお、この表４に示した数値は、各試薬における、ヘモグロビン濃度０ｍｇ／ｄＬの血清試料のＡＬＰ活性測定値を１００％とした時のヘモグロビン濃度１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、又は５００ｍｇ／ｄＬの血清試料のＡＬＰ活性測定値を相対比率（％）で表したものである。また、硫酸亜鉛濃度は、混合後の測定試薬中の硫酸亜鉛濃度（ｐｐｂ）を示す。
【０１００】
【表４】
2015029444.tif 000006
【０１０１】
５．考察
表４から明らかなように、試薬に硫酸亜鉛（亜鉛イオン）を含有させていない場合は、試料中のヘモグロビンの影響を受けて、ＡＬＰの活性測定値に負誤差が生じていることが分かる。更に、試料中のヘモグロビン濃度が高くなるにつれて、ＡＬＰの活性測定値が下降しており、負誤差の程度が大きくなっていることが分かる。
これに対して、第２試薬に硫酸亜鉛（亜鉛イオン）を含有させた場合は、混合後の測定試薬中の硫酸亜鉛濃度がいずれの場合も、この測定値の負誤差が減少し改善されていることが分かる。すなわち、ヘモグロビンの影響によって生じる誤差を抑制できることが分かる。
【０１０２】
これらのことより、生体試料中の酵素活性測定試薬において、微量の亜鉛イオンを含有させることにより、溶血した試料においても、ヘモグロビンによる測定値への誤差が生じることを回避でき、精度が高い酵素活性値を得ることができることが確かめられた。
よって、本発明の酵素活性測定試薬及び測定方法は、溶血した試料においても、誤差を生じずに正確な酵素活性値を得ることができることが確かめられた。