(57)【要約】      （修正有）【課題】クロマチン構造の制御能に優れたクロマチン構造制御剤を提供する。【解決手段】特定の両性高分子、特定のポリアニオン高分子、または特定の複合体キャリアを含むクロマチン構造制御剤。当該両性高分子は、側鎖にカルボキシル基を有するアニオン性高分子における該カルボキシル基末端の一部にカチオン基を導入してなる両性高分子（たとえばエチレンジアミン修飾ポリアクリル酸、マルトテトラオース修飾ポリアクリル酸等）であり、当該ポリアニオン高分子はβ−ＣＤ修飾ポリアニオン高分子である。複合体キャリアは、ベクター又は阻害剤が生分解性高分子粒子内に封入されてなり、該生分解性高分子表面がカチオン性高分子で被覆され、該表面に存在するカチオンによりＤＮＡと複合化される構造を有するものであるクロマチン構造制御剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
側鎖にカルボキシル基を有するアニオン性高分子における該カルボキシル基末端の一部にカチオン基を導入してなる両性高分子、またはポリアニオン高分子を含む、クロマチン構造制御剤。
【請求項２】
上記両性高分子が、次式： 
【化１】
2015164420.tif 000024
［式中、ｎは、１０≦ｎ≦９０であり；ｍは、１０≦ｍ≦９０である］
で示されるエチレンジアミン修飾ポリアクリル酸、または、次式：
【化２】
2015164420.tif 000025
［式中、ｎは、０≦ｎ≦９０；ｍは、０≦ｍ≦９０；ｌは、０≦ｌ≦９０である］
で示されるマルトテトラオース修飾ポリアクリル酸、を含むことを特徴とする請求項１記載のクロマチン構造制御剤。
【請求項３】
上記ポリアニオン高分子が、次式：
【化３】
2015164420.tif 000026
［式中、ｎは、２０≦ｎ≦７０；ｍは、２０≦ｍ≦７０；ｌは、２≦ｌ≦６０である］
で示されるシクロデキストリン（ＣＤ）修飾系ポリアスパラギン酸長鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾体（ＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤ）；
次式：
【化４】
2015164420.tif 000027
［式中、ｎは、０＜ｎ≦５０；ｍは、５０≦ｍ≦９０である］
で示されるシクロデキストリン（ＣＤ）修飾系ポリアスパラギン酸エチレンジアミン（ＥＤＡ）修飾体（ＰＬＤ−ＥＤＡ−ＣＤ）；または
次式：
【化５】
2015164420.tif 000028
［式中、ｘは、０＜ｘ＜１０；ｙは、０＜ｙ≦３０；ｚは、０＜ｚ≦９０である］
で示されるシクロデキストリン（ＣＤ）部分修飾系ポリアスパラギン酸エチレンジアミン（ＥＤＡ）修飾体（ＰＬＤ−ＣＤ）；
を含むことを特徴とする、請求項１記載のクロマチン構造制御剤。
【請求項４】
クロマチン構造制御剤であって、以下のｉ）からｖｉｉｉ）：
ｉ）ヒストンアセチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｉ）ヒストンメチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｉｉ）ヒストン脱アセチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｖ）ヒストン脱メチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｖ）ヒストンアセチル化阻害剤；
ｖｉ）ヒストン脱アセチル化阻害剤；
ｖｉｉ）ヒストンメチル化阻害剤；および
ｖｉｉｉ）ヒストン脱メチル化阻害剤；
からなる群より選択されるベクター又は阻害剤、生分解性高分子粒子、カチオン性脂質またはカチオン性高分子、およびＤＮＡ、を含む複合体キャリアを含み、
ここで当該複合体キャリアは、当該ベクター又は阻害剤が当該生分解性高分子粒子内に封入されてなり、該生分解性高分子粒子表面がカチオン性脂質またはカチオン性高分子で被覆され、そして該表面に存在するカチオンによりＤＮＡと複合化される構造を有する、前記クロマチン構造制御剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はクロマチン構造を弛緩させてＤＮＡやヒストンの修飾・保護を容易にするクロマチン構造制御剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
我々の遺伝情報を担うゲノムＤＮＡは、ヒストンと呼ばれる塩基性タンパク質に巻き付いたクロマチンと呼ばれる構造を取ることにより、１０μｍの１つの細胞核内に２ｍものＤＮＡが収納されている。遺伝子発現制御において重要な役割を果たしているクロマチンの高次構造は、ヒストンやＤＮＡ修飾により制御されており、ユークロマチンとして知られている凝縮度の低い転写許容領域と、ヘテロクロマチンとして知られている凝縮度の高い転写抑制領域に分別される（図１参照）。
【０００３】
難治性疾患の場合、クロマチン構造の凝縮が観察されるケースが多く、クロマチン構造の弛緩技術を開発することができれば難治性疾患の新たな治療法の提案に繋がる。また、クロマチン構造が弛緩することによりＤＮＡへのアクセシビリティが向上するため、効率的な遺伝子治療や抗がん治療への応用も期待できる。
【０００４】
このような観点から本発明者らは、特許文献１及び非特許文献１において、クロマチン構造を制御し得る高分子化合物について提案してきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１６２０５４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Polymer Preprints, Japan, 2011, Vol.60, No.2, p.4781-4782
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述の提案における高分子化合物では未だクロマチン構造の制御が十分ではなく、よりクロマチンの制御能力の高い物質の開発が要望されているのが現状である。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、クロマチン構造の制御能に優れたクロマチン構造制御剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解消すべく鋭意検討した結果、特定の両性高分子、特定のポリアニオン高分子、および特定の構造を有する複合体キャリアが上記目的を達成し得ることを知見し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、一態様において、本発明は以下の各発明を提供するものであってもよい。
【００１１】
（１）側鎖にカルボキシル基を有するアニオン性高分子における該カルボキシル基末端の一部にカチオン基を導入してなる両性高分子、またはポリアニオン高分子を含む、クロマチン構造制御剤。
【００１２】
（２）上記両性高分子が、次式： 
【００１３】
【化１】
2015164420.tif 000002
【００１４】
［式中、ｎは、１０≦ｎ≦９０であり；ｍは、１０≦ｍ≦９０である］
で示されるエチレンジアミン修飾ポリアクリル酸、または、次式：
【００１５】
【化２】
2015164420.tif 000003
【００１６】
［式中、ｎは、０≦ｎ≦９０；ｍは、０≦ｍ≦９０；ｌは、０≦ｌ≦９０である］
で示されるマルトテトラオース修飾ポリアクリル酸、を含むことを特徴とする（１）記載のクロマチン構造制御剤。
【００１７】
（３）上記ポリアニオン高分子が、次式：
【００１８】
【化３】
2015164420.tif 000004
【００１９】
［式中、ｎは、２０≦ｎ≦７０；ｍは、２０≦ｍ≦７０；ｌは、２≦ｌ≦６０である］
で示されるシクロデキストリン（ＣＤ）修飾系ポリアスパラギン酸長鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾体（ＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤ）；
次式：
【００２０】
【化４】
2015164420.tif 000005
【００２１】
［式中、ｎは、０＜ｎ≦５０；ｍは、５０≦ｍ≦９０である］
で示されるシクロデキストリン（ＣＤ）修飾系ポリアスパラギン酸エチレンジアミン（ＥＤＡ）修飾体（ＰＬＤ−ＥＤＡ−ＣＤ）；または
次式：
【００２２】
【化５】
2015164420.tif 000006
【００２３】
［式中、ｘは、０＜ｘ＜１０；ｙは、０＜ｙ≦３０；ｚは、０＜ｚ≦９０である］
で示されるシクロデキストリン（ＣＤ）部分修飾系ポリアスパラギン酸エチレンジアミン（ＥＤＡ）修飾体（ＰＬＤ−ＣＤ）；
を含むことを特徴とする、（１）記載のクロマチン構造制御剤。
【００２４】
（４）クロマチン構造制御剤であって、以下のｉ）からｖｉｉｉ）：
ｉ）ヒストンアセチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｉ）ヒストンメチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｉｉ）ヒストン脱アセチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｖ）ヒストン脱メチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｖ）ヒストンアセチル化阻害剤；
ｖｉ）ヒストン脱アセチル化阻害剤；
ｖｉｉ）ヒストンメチル化阻害剤；および
ｖｉｉｉ）ヒストン脱メチル化阻害剤；
からなる群より選択されるベクター又は阻害剤、生分解性高分子粒子、カチオン性脂質またはカチオン性高分子、およびＤＮＡ、を含む複合体キャリアを含み、
ここで当該複合体キャリアは、当該ベクター又は阻害剤が当該生分解性高分子粒子内に封入されてなり、該生分解性高分子粒子表面がカチオン性脂質またはカチオン性高分子で被覆され、そして該表面に存在するカチオンによりＤＮＡと複合化される構造を有する、前記クロマチン構造制御剤。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のクロマチン構造制御剤は、クロマチン構造の制御能に優れたものである。本発明のクロマチン構造制御剤は、難治性疾患の治療や効率的な遺伝子治療等への実現に繋がるものであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、クロマチン構造と転写活性との関連性を摸式的に示す概要図である。
【図２】図２は、両性高分子又はポリアニオン高分子を含むクロマチン構造制御剤のクロマチン構造制御のメカニズムを摸式的に示す概要図である。
【図３】図３は、ポリエチレンイミンを加えた複合体キャリアの例を摸式的に示す概要図である。
【図４】図４は、ポリ乳酸−ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）を用いた複合体キャリアの例を摸式的に示す概要図である。
【図５】図５は、カチオン性脂質を用いた複合体キャリアの例を模式的に示す概略図である。
【図６】図６は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）をポリ乳酸（ＰＬＡ）粒子に包埋させ、この粒子表面を１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）：コレステロールを１：１としたカチオン性リポソームで覆い、そこに静電相互作用によりプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を相互作用させた複合体キャリアを摸式的に示す概要図である。
【図７】図７は、エチレンジアミン修飾ポリアクリル酸（ＰＡＡ−ＥＤＡ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル解析結果を示すチャートである。
【図８】図８は、リアルタイムＰＣＲによるクロマチン構造解析の結果を示すチャートである。
【図９】図９は、共焦点レーザー顕微鏡による核局在性評価を示す写真である。
【図１０】図１０は、メチル化ポリ（１−ビニルイミダゾール）（ＰＶＩｍ−Ｍｅ）のＮＭＲチャートである。
【図１１】図１１は、リアルタイムＰＣＲデータ解析の結果を示すチャートである。
【図１２】図１２は、共焦点レーザー顕微鏡による核局在性評価の結果を示す写真である。
【図１３】図１３は、ＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示すチャートである。
【図１４】図１４は、ＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤの共焦点顕微鏡画像を示す写真である。
【図１５】図１５は、ＰＬＤ−ＥＤＡ−ＣＤ（完全ポリアニオン）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示すチャートである。
【図１６】図１６は、ラベル化したＰＬＤ−ＥＤＡ−ＣＤ（完全ポリアニオン）共焦点顕微鏡画像を示す写真である。
【図１７】図１７は、ＰＬＡ／ＰＥＩ複合体の様々な電荷比における粒径及びゼータ電位を示すチャートである。
【図１８】図１８は、ＰＬＧＡキャリアを添加した細胞のアセチル化ヒストン量の実験結果を示す写真及びチャートである。
【図１９】図１９は、ＰＬＧＡキャリアを添加した細胞のヒストントリメチル化量の実験結果を示す写真及びチャートである。
【図２０】図２０は、ＰＬＧＡキャリアを添加した細胞の顆粒球への分化率を示すチャートである。
【図２１】図２１は、ポリ乳酸粒子をコアに有するカチオン性脂質キャリアを添加した細胞のアセチル化ヒストン量の実験結果を示す写真及びチャートである。
【図２２】図２２は、ポリ乳酸粒子をコアに有するカチオン性脂質キャリアを添加したＨＬ６０細胞の顆粒球への分化率を示すチャートである。
【図２３】図２３は、キャリア／プラスミドＤＮＡ複合体を用いた遺伝子発現評価を示すチャートである。
【図２４】図２４は、ラベル化したＰＬＤ−ＣＤ共焦点顕微鏡画像を示す写真である。（Ａ）細胞核を染色したＤＡＰＩによる蛍光像；（Ｂ）ＦＩＴＣ−ＰＬＤ−ＣＤによる蛍光像；（Ｃ）微分干渉像；（Ｄ）（Ａ）−（Ｃ）の画像をMergeしたもの。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
【００２８】
クロマチン構造制御剤
本発明のクロマチン構造制御剤は、両性高分子、ポリアニオン高分子、もしくは複合体キャリア、又はそれらの組み合わせ、のいずれかを含む。
【００２９】
本発明のクロマチン構造制御剤に含まれる両性高分子、ポリアニオン高分子、および複合体キャリア、について以下に詳述する。
【００３０】
＜両性高分子＞
本発明のクロマチン構造制御剤は、側鎖にカルボキシル基を有するアニオン性高分子における該カルボキシル基末端の一部にカチオン基を導入してなる両性高分子からなることを特徴とする。
【００３１】
このような両性高分子としては、以下に説明する高分子などが挙げられる。
【００３２】
・エチレンジアミン修飾ポリアクリル酸（ＰＡＡ−ＥＤＡ）（下記化学式参照）
【００３３】
【化６】
2015164420.tif 000007
【００３４】
式中、ｎは、１０≦ｎ≦９０であり；
ｍは、１０≦ｍ≦９０、より好ましくは５０≦ｍ≦９０、５０≦ｍ≦７０である。
【００３５】
平均分子量は１，０００から１００，０００程度であり、より好ましくは２，０００から７０，０００程度、３，０００から５０，０００程度である。
【００３６】
・マルトテトラオース修飾ポリアクリル酸（ＰＡＡ−Ｍａｌ）（下記化学式参照）
【００３７】
【化７】
2015164420.tif 000008
【００３８】
式中、ｎは、０≦ｎ≦９０；ｍは、０≦ｍ≦９０；ｌは、０≦ｌ≦９０が好ましい。但し、ｎ、ｍ及びｌが同時に０であることはない。より好ましくは、クロマチン構造を弛緩する場合には５０≦ｌであり、クロマチン構造を凝縮させる場合には５０≦ｍである。さらに好ましくはｎ：ｍ：ｌは１：０．００５〜０．１：０．１〜２である。
平均分子量は１，０００から１００，０００程度、好ましくは２，０００から７０，０００程度、３，０００から５０，０００程度である。
【００３９】
このような両性高分子によるクロマチン構造の制御は図２に示すようにアニオン性の電荷をもったポリマーがＤＮＡとヒストンとの静電結合を弱まることにより生じるものと推測される。
【００４０】
＜ポリアニオン高分子＞
本発明のクロマチン構造制御剤は、一態様においてポリアニオン高分子からなることを特徴とする。
【００４１】
上記ポリアニオン高分子としてはβ−ＣＤ修飾ポリアニオン高分子、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ＰＥＧ修飾ポリアニオン、糖鎖修飾ポリアニオンなどが挙げられる。一例として、シクロデキストリン（ＣＤ）修飾系ポリアスパラギン酸長鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾体（ＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤ）、ＣＤ修飾系ポリアスパラギン酸エチレンジアミン（ＥＤＡ）修飾体（ＰＬＤ−ＥＤＡ−ＣＤ（完全ポリアニオン））、ＣＤ部分修飾系ポリアスパラギン酸ＥＤＡ修飾体を以下に示す。
【００４２】
・ＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤ
【００４３】
【化８】
2015164420.tif 000009
【００４４】
式中、ｎは、２０≦ｎ≦７０；ｍは、２０≦ｍ≦７０；ｌは、２≦ｌ≦６０であることが望ましい。
シクロデキストリン（ＣＤ）導入率に関わらず、ｍ＜ｎであることが望ましい。ＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤのＣＤ導入率（％）は、次式：ｌ÷（ｌ＋ｍ）×１００で計算される。より好ましくは、ＣＤ導入率は０＜（ＣＤ導入率）≦８０％であり、ｍ＜ｎである。さらに好ましくは、ＣＤ導入率は０＜（ＣＤ導入率）≦６０％であり、ｍ＜ｎである。
平均分子量は、１，０００から１００，０００程度であり、より好ましくは、１，５００から７０，０００程度、２，０００から３０，０００程度である。
また、ＰＥＧの重合度（ｘ）は、２０≦ｘ≦１２０が好ましい。
【００４５】
・ＰＬＤ−ＥＤＡ−ＣＤ
【００４６】
【化９】
2015164420.tif 000010
【００４７】
式中、ｎは、０＜ｎ≦５０；ｍは、５０≦ｍ≦９０が好ましい。
【００４８】
ＰＬＤ−ＥＤＡ−ＣＤのＣＤ導入率（％）は、次式：ｎ÷（ｎ＋ｍ）×１００で計算される。好ましくは、ＣＤ導入率は０＜（ＣＤ導入率）≦８０％、さらに好ましくは０＜（ＣＤ導入率）≦６０％、０＜（ＣＤ導入率）≦５０％、である。
【００４９】
平均分子量は、２，０００から１００，０００程度が好ましい。より好ましくは平均分子量は、２，５００から７０，０００程度、３，０００から５０，０００程度である。
・ＰＬＤ−ＣＤ
【００５０】
【化１０】
2015164420.tif 000011
【００５１】
式中、ｘは、０＜ｘ＜１０；ｙは、０＜ｙ≦３０；ｚは、０＜ｚ≦９０である。
シクロデキストリン（ＣＤ）導入率に関わらず、ｙ＜ｚであることが望ましい。ＰＬＤ−ＣＤのＣＤ導入率（％）は、次式：ｘ÷（ｘ＋ｙ）×１００で計算される。より好ましくは、ＣＤ導入率は０＜（ＣＤ導入率）≦５０％であり、ｙ＜ｚである。さらに好ましくは、ＣＤ導入率は０＜（ＣＤ導入率）≦３５％であり、ｙ＜ｚである。
【００５２】
平均分子量は、１，０００から１００，０００程度が望ましい。さらに好ましくは平均分子量は、２，０００から７０，０００程度、３，０００から３０，０００程度である。
【００５３】
このようなポリアニオン高分子によるクロマチン構造の制御は図２に示すようにアニオン性の電荷をもったポリマーがＤＮＡとヒストンとの静電結合を弱まることにより生じるものと推測される。
＜複合体キャリア＞
本発明はまた、クロマチン構造を制御可能なベクターおよび／または阻害剤、生分解性高分子粒子、カチオン性脂質またはカチオン性高分子、ならびにＤＮＡ、を含む複合体キャリアを提供する。本発明はまた、当該複合体キャリアを含むクロマチン構造制御剤を提供する。複合体キャリアは、無毒若しくは低毒で成体への適用が可能であり、クロマチン構造を制御可能なベクターおよび／または阻害剤を細胞の核まで運搬することができる。
以下、本発明の複合体キャリアを構成する各成分および複合体キャリアの構造について詳細に説明する。
【００５４】
・ベクター／阻害剤
本発明の複合体キャリアを構成するベクターおよび／または阻害剤として、以下のｉ）からｖｉｉｉ）：
ｉ）ヒストンアセチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｉ）ヒストンメチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｉｉ）ヒストン脱アセチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｖ）ヒストン脱メチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｖ）ヒストンアセチル化阻害剤；
ｖｉ）ヒストン脱アセチル化阻害剤；
ｖｉｉ）ヒストンメチル化阻害剤；および
ｖｉｉｉ）ヒストン脱メチル化阻害剤；
からなる群より選択される１種類以上の物質が含まれる。好ましい態様において、複合体キャリアを構成するベクター及び／または阻害剤には、上記の群より選択される２種類またはそれ以上の物質が含まれる。
【００５５】
ｉ）−ｖｉｉｉ）の物質はいずれもクロマチンのヒストンのアセチル化、脱アセチル化、メチル化、あるいは脱メチル化に関与する物質である。ヒストンはリジン残基のアミノ基がアセチル化されるとアミノ基の正電荷が中和され、ヌクレオソーム間の相互作用が緩むと考えられている。よって、ヒストンのアセチル化によりクロマチン構造が弛緩し、転写が活性化される。脱アセチル化により反対にクロマチン構造は凝縮する。ｉ）及びｖｉ）はクロマチン構造を弛緩する作用を有する。一方、ｉｉｉ）及びｖ）は、クロマチン構造を凝縮させる構造を有する。一方ヒストンのメチル化は、Ｈ３Ｋ９がメチル化されるとクロマチンを凝縮させ、ヘテロクロマチンを形成することが知られており、位置に依存すると考えられる。一方、ヒストンＨ３Ｋ４がメチル化されると転写が活性化する。
【００５６】
「ヒストンアセチル化酵素」（ＨＡＴ）は、ヒストンのリジン側鎖のアセチル化を促進する酵素である。ＨＡＴは公知であり、例えば、ヒト等においてタンパク質のアミノ酸配列、並びに当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列が知られている。例えば、ヒトヒストンアセチル化酵素（ＫＡＴ２Ｂ）遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩデータバンクのアクセッション番号ＮＭ ００３８８４に開示されている。
【００５７】
「ヒストンメチル化酵素」（ＨＭＴ）は、ヒストンにメチル基を促進する酵素である。ヒストンメチル化酵素は公知であり、例えば、ヒト等においてタンパク質のアミノ酸配列、並びに当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列が知られている。例えば、ヒトヒストンメチル化酵素（ＥＨＭＴ２）の変異体（Ｇ９ａ）遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩデータバンクのアクセッション番号ＮＭ ００６７０９に開示されている。
【００５８】
「ヒストン脱アセチル化酵素」（ＨＤＡＣ）は、ヒストンのリシン側鎖のアセチル基を加水分解し、リシンに変換する酵素である。ＨＤＡＣは公知であり、例えば、ヒト等においてタンパク質のアミノ酸配列、並びに当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列が知られている。例えば、ヒトヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ３）遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩデータバンクのアクセッション番号ＮＭ ０２９６７８に開示されている。ヒトヒストン脱アセチル化酵素（ＳＩＲＴ２）遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩデータバンクのアクセッション番号ＮＭ ０３４１４６に開示されている。
【００５９】
「ヒストン脱メチル化酵素」は、ヒストンに結合したメチル基を加水分解する酵素である。
【００６０】
各遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、好ましくは天然のタンパク質の配列である。あるいは、各酵素の機能が維持される範囲内であれば、その変異体も本発明に使用しうる。具体的には天然のアミノ酸配列又は当該アミノ酸をコードする塩基配列に対して、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％の配列相同性を有する。
【００６１】
２つの配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Needleman,S.B.及びWunsch,C.D.（J. Mol. Biol., 48:443-453, 1970）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Henikoff,S.及びHenikoff,J.G.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００６２】
あるいは、天然のアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するものであってもよい。このような天然のタンパク質と相同なアミノ酸配列を有し、天然の酵素と同一の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子も本発明において使用可能である。限定されるわけではないが、変更可能なアミノ酸数は、１ないし１００アミノ酸残基、１ないし８０アミノ酸残基、１ないし５０アミノ酸残基、１ないし３０アミノ酸残基、１ないし２０アミノ酸残基、１ないし１５アミノ酸残基、１ないし１０アミノ酸残基、１ないし５アミノ酸残基である。公知の部位特異的突然変異法で修飾可能な数のアミノ酸残基、例えば、１ないし１０アミノ酸残基、１ないし８、１ないし５、１ないし３アミノ酸残基がより好ましい。
【００６３】
「発現ベクター」は、複合体キャリアを作用させる細胞、組織または個体において、上述の遺伝子を発現可能なベクターであれば、特に限定されない。例えば、発現ベクターとして、遺伝子を発現するための、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター等、公知のベクターを使用しうる。生体に投与することを目的とするため、生体に対し無毒若しくは低毒性のベクターが好ましい。本発明の組成物により２種類以上の遺伝子を発現させることを目的とする場合、各遺伝子を含む２種類以上の発現ベクターを用いてもよく、あるいは、１つの発現ベクターに２種類以上の遺伝子を含ませてものを用いてもよい。
【００６４】
「ヒストンアセチル化阻害剤」は、公知のものを使用しうる。例えば、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、アナカルジン酸（ＡＡ）、クルクミン、ＭＢ−３を含む。
【００６５】
「ヒストン脱アセチル化阻害剤」は、公知のものを使用しうる。例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ボリノスタット、ＭＳ−２７５を含む。ヒストン脱アセチル化阻害剤は、癌細胞に対して、細胞周期の停止、分化誘導、アポトーシスなどの活性を示し、癌細胞の増殖に影響を与えることが知られている。
【００６６】
「ヒストンメチル化阻害剤」は、公知のものを使用しうる。例えば、ケトシン、ＢＩＸ−０１２９４、ＤＺＮｅｐ、ＡＭＩ−１を含む。
【００６７】
「ヒストン脱メチル化阻害剤」は、公知のものを使用しうる。例えば、トラニルシプロミン、を含む。
【００６８】
・生分解性高分子
本発明の複合体キャリアを構成する生分解性高分子は、特に限定されないが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、およびキトサン、からなる群より選択される生分解性ポリマーである。
【００６９】
・カチオン性脂質
本発明の複合体キャリアを構成するカチオン性脂質は、カチオン性リポソームを構成することができる脂質である。カチオン性脂質を含むカチオン性リポソームは、遺伝子送達に有用であり得る。カチオン性リポソームを構成できることができるカチオン性脂質は、特に限定されないが、以下：
ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；
ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；
ジオクタデシル−ジメチル−アンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；
１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウム  トリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；
３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−アミノエタン−カルバモイル−コレステロール）（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；および
Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミン  クロリド；
からなる群より選択されるものであってもよい。好ましいカチオン性脂質としては、１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）が挙げられる。
【００７０】
本発明の複合体キャリアを構成するカチオン性脂質は、カチオン性リポソームを形成していてもよい。カチオン性脂質がカチオン性リポソームを構成する場合、当該カチオン性リポソームは、少なくとも１つのカチオン性脂質に加えて少なくとも１つの非カチオン性脂質を含んでいてもよい。カチオン性リポソームを構成する非カチオン性脂質は、特に限定されないが、以下：
ジアシルホスファチジルコリン；
リゾホスファチジルコリン；
ジアシルホスファチジルグリセロール；
ジアシルホスファチジン酸；
ジアシルホスファチジルセリン；
ジアシルホスファチジルエタノールアミン；
スフィンゴミエリン；
セラミド；
ジアシルグリセロール；および
コレステロール；
からなる群より選択されるものであってもよく、ここで上記非カチオン性脂質に含まれるアシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基である。例えば、上記非カチオン性脂質に含まれるアシル基は、ドデカノイル基（ラウロイル基）、テトラデカノイル基（ミリストイル基）、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基（パルミトイル基）、９−ヘキサデセノイル基（パルミトレノイル基）、ヘプタデカノイル基（マルガロイル基）、オクタデカノイル基（ステアロイル基）、９−オクタデセノイル基（オレオイル基）、１１−オクタデセノイル基（バクセノイル基）、９，１２−オクタデカジエノイル基（リノレオイル基）、９，１２，１５−オクタデカントリエノイル基（９，１２，１５−リノレノイル基）、６，９，１２−オクタデカトリエノイル基（６，９，１２−リノレノイル基）、エイコサノイル基（アラキジノイル基）、８，１１−エイコサジエノイル基、５，８，１１−エイコサトリエノイル基、５，８，１１−エイコサテトラエノイル基（アラキドノイル基）、などが挙げられる。
【００７１】
・カチオン性高分子
本発明の複合体キャリアを構成するカチオン性高分子は、遺伝子送達に有用なカチオン性高分子であれば、特に限定されない。例えば、カチオン性高分子には、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアリルアミンが含まれる。
【００７２】
・ＤＮＡ
本発明の複合体キャリアを構成するＤＮＡは、複合体キャリアを作用させる細胞、組織または個体において、外来的に発現させる遺伝子を含むＤＮＡである。好ましくは当該ＤＮＡはプラスミドベクターの形態であってもよい。
【００７３】
当該ＤＮＡは、ヒストンアセチル化酵素をコードする遺伝子、ヒストンメチル化酵素をコードする遺伝子、ヒストン脱アセチル化酵素をコードする遺伝子、およびヒストン脱メチル化酵素をコードする遺伝子からなる群より選択される遺伝子を含む発現ベクターであることもまた可能である。これらの発現ベクターについては上記「ベクター／阻害剤」の項目において説明したとおりである。
【００７４】
・複合体キャリアの構造
本発明の複合体キャリアは、ベクター又は阻害剤、生分解性高分子粒子、カチオン性脂質またはカチオン性高分子、およびＤＮＡ、を含む限り、その構造に特に限定はない。
【００７５】
例えば、本発明の複合体キャリアは、ベクター又は阻害剤が当該生分解性高分子粒子内に封入されてなり、該生分解性高分子粒子表面がカチオン性脂質またはカチオン性高分子で被覆され、そして該表面に存在するカチオンによりＤＮＡと複合化される構造を有していてもよい。このような構造の例は、図３、図５及び図６において示される。
【００７６】
別の態様において、本発明の複合体キャリアは、ＤＮＡとカチオン性脂質を先に複合化し、得られたＤＮＡとカチオン性脂質の複合体と、阻害剤及び生分解性高分子をさらに複合化させることにより得られる構造を有していてもよい。このような構造の例は図４において示される。
【００７７】
本発明のクロマチン構造制御剤は、その有効成分として、上述の両性高分子、ポリアニオン高分子、または複合体キャリアをそれぞれ単独で含んでいてもよく、あるいはこれらの組み合わせ含んでいてもよい。また、本発明のクロマチン構造制御剤は、上述の両性高分子、ポリアニオン高分子、複合体キャリア、又はそれらの組み合わせ、の他に本発明の所望の効果を損なわない範囲で種々添加剤を添加することができる。
【００７８】
また、上記の両性高分子（特にＰＡＡ−ＥＤＡ）並びにポリアニオン高分子は、より細胞内への取込みを効率的に行わせるために、他のキャリア（例えばＰＶＩｍ−Ｍｅ等のｐＨ応答性キャリア）との複合体とし、この複合体をクロマチン構造制御剤として用いることが好ましい。合成高分子（ＰＡＡ−ＥＤＡ）によるクロマチン構造の弛緩については本発明によって初めて成功した。ＥＤＡ導入率が高いＰＡＡ−ＥＤＡ／ＰＶＩｍ−Ｍｅ二元複合体により、ＰＡＡ−ＥＤＡの効率的な核移行が起こり、クロマチン構造を弛緩できることを明らかにした。
【００７９】
クロマチンの構造制御
本発明は、上述した本発明のクロマチン構造制御剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで投与することにより、クロマチン構造を制御する方法を含む。
【００８０】
上述の両性高分子、ポリアニオン高分子、または複合体キャリアをそれぞれ単独で含む組成物を投与してもよく、あるいは、両性高分子、ポリアニオン高分子、および複合体キャリアから成る群より選択される２種以上の成分の組み合わせを含む組成物を投与する態様も含む。
【００８１】
クロマチン構造の制御とは、クロマチン構造を弛緩、あるいは逆に凝縮することを指す。クロマチン構造が「弛緩する」とは、クロマチンが凝縮した状態の高次構造が緩み、遺伝子の転写が進みやすくなる、即ち、転写が活性化しオンの状態になることを意味する。クロマチン構造が「凝縮する」とは、弛緩とは逆に、クロマチンが凝縮した高次構造をとり、転写が生じにくいオフの状態になることを意味する。
【００８２】
クロマチンの「弛緩」及び「凝縮」は、クロマチン構造制御剤等の物質を作用させた細胞において、クロマチンを消化してゲノムＤＮＡを抽出した後、特定の解析領域の遺伝子をリアルタイムＰＣＲで増幅し、その増幅の挙動から判別することができる。すなわち、解析領域の遺伝子の増幅の挙動が、一般的に細胞では発現していない遺伝子の増幅の挙動に近ければ、クロマチンは「凝縮」していると判断する。解析領域の遺伝子の増幅の挙動が細胞において構成的に発現している遺伝子の増幅の挙動に近ければ、クロマチンは「弛緩」していると判断する。また、クロマチンの「弛緩」及び「凝縮」は、例えば、遺伝子の転写及び／又は翻訳活性を測定することにより、調べることが可能である。遺伝子の転写及び／又は翻訳活性は、公知の方法を用いて確認することが可能である。例えば、蛍光タンパク質の発現により蛍光測定することができる。あるいは、クロマチンの「弛緩」及び「凝縮」は、より直接的にクロマチン構造を観察することにより確認してもよい。
【００８３】
本願発明のクロマチン構造制御剤の投与量は特に限定されない。当業者は、クロマチン構造制御剤に含まれる物質等の種類、投与対象の状態等に応じて適宜量を決定することが可能である。本発明の両性高分子及びアニオン性高分子を用いる場合、アニオン数とクロマチン構造中のＤＮＡの割合は、クロマチン構造の弛緩作用の効果の大きさに影響を与える可能性がある。
【実施例】
【００８４】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８５】
（合成例１）エチレンジアミン修飾ポリアクリル酸（ＰＡＡ−ＥＤＡ）の合成
ポリアクリル酸（ＰＡＡ）（７２９ｍｇ、ＣＯＯＨ１０．０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ  ８ｍＬに溶解させた。ＨＯＢｔ  ４．１６ｇ（８ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ  １．５５ｇをＤＭＳＯ  １５ｍＬに溶解し、溶解させたポリアクリル酸溶液を加えた。その混合溶液にＮ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン  ３ｍＬ（２０ｍｍｏｌ）を加え、４０℃、５日間ウォーターバス内で攪拌した。撹拌後、得られた水溶液をＭＷＣＯ＝１，０００の透析膜で、５日間透析後、凍結乾燥によって白色粉末を回収した（収量５４９ｍｇ）。得られた粉末にトリフルオロ酢酸を添加し、室温で１時間撹拌することで、脱保護を行った。脱保護を行った後、エチレンジアミンにより再沈殿を行い、透析により精製、凍結乾燥後、目的物であるＰＡＡ−ＥＤＡの白色粉末を得た。１Ｈ  ＮＭＲは、白色粉末３ｍｇにＤ２Ｏ（７００μＬ）で溶解し、測定を行った。ＮＭＲの測定結果を図７に示す。エチレンジアミン導入率は６７％であった。
【００８６】
同様の合成実験により、エチレンジアミン導入率が５０％のＰＡＡ−ＥＤＡも得た。
【００８７】
エチレンジアミン修飾ポリアクリル酸（ＰＡＡ−ＥＤＡ）の合成スキームを以下に示す。
【００８８】
【化１１】
2015164420.tif 000012
【００８９】
（合成例２）マルトテトラオース修飾ポリアクリル酸（ＰＡＡ−Ｍａｌ）の合成
エチレンジアミン修飾ポリアクリル酸（ＰＡＡ−ＥＤＡ）（３０．８ｍｇ、ＣＯＯＨ  ０．２ｍｍｏｌ）、マルトテトラオース２６４．３ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）をホウ酸バッファー（ｐＨ８．５）２ｍＬに溶解させ、４０℃、５日間撹拌した。その後、シアン化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）１９４．６ｍｇをホウ酸バッファー（ｐＨ８．５）２．５ｍＬに溶解させ、４０℃、５日間撹拌した。撹拌後、得られた水溶液をＭＷＣＯ＝１，０００の透析膜で、５日間透析し、凍結乾燥によって目的物であるＰＡＡ−Ｍａｌの白色粉末を得た。反応式を以下に示す。
【００９０】
また、アミノ基定量によりマルトテトラオースの修飾率を算出した。ブランクの平均発光強度は９．８７３、反応前の平均発光強度は２３８．６３、反応後の平均発光強度は１２．８３であった。
【００９１】
【化１２】
2015164420.tif 000013
【００９２】
（合成例３）メチル化ポリビニルイミダゾール（ＰＶＩｍ−Ｍｅ）の合成
ｐＨ応答性キャリアとして当研究室で開発したメチル化ポリビニルイミダゾールを用いた。
【００９３】
（１）ポリビニルイミダゾール（ＰＶＩｍ）の合成
ラジカル重合開始剤としてＶ−６５（２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル））を用いたラジカル重合によりポリビニルイミダゾール（ＰＶＩｍ）をラジカル重合する。Ｖ−６５は４５℃で温度応答的に不対電子を持つので、Ｃ＝Ｃ結合を有する１−ビニルイミダゾールに添加することでラジカル重合を行った。
【００９４】
１−ビニルイミダゾール３００ｍｇ（３．１９ｍｍｏｌ、密度１．０４ｇ／ｍＬ、２８８．５μＬ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２，４００μＬに溶解させた。Ｖ６５  １５．８ｍｇ（０．０６４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ３００μＬに溶解させた。二種の溶液を混合させた後、ラジカル反応中におけるラジカルの消失を防ぐために溶液中の酸素を除去する必要があるため、窒素によるバブリングを４０分間行った。ラジカル発生温度である４５℃に予め設定したウォーターバスで２４時間撹拌せずにインキュベートした。アセトン  ８０ｍＬ中に滴下することで再沈殿を行った。２，６００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みのアセトンを除去した。少量のＤＭＦに溶解させた後、再度アセトン  ８０ｍＬによる再沈殿、遠心分離、上澄みの除去を行った。ドラフト内で２４時間静置することでアセトンを揮発させた。得られた生成物をＨ２Ｏ（２０ｍＬ）に溶解させた後、ＭＷＣＯ：１，０００の透析膜を用いて２日間の透析を行った。凍結乾燥を施して得られた物質を回収した。収量５７．９７ｍｇ、収率１９．３２％であった。
【００９５】
【化１３】
2015164420.tif 000014
【００９６】
（２）メチル化ポリビニルイミダゾール（ＰＶＩｍ−Ｍｅ）の合成
ＰＶＩｍ（３０ｍｇ）をＤＭＦ（２．４ｍＬ）に溶解させ、ヨードメタン７．２ｍｇを加え、２４時間、４０℃で撹拌した。反応後は、ジエチルエーテルで再沈殿を行い、上澄みを捨て、ドラフト内で残存したジエチルエーテルを飛ばした。残った溶液を純粋に溶解し、ＭＷＣＯ：１，０００の透析膜を用いて水で透析後、凍結乾燥により目的生成物である白色粉末（収量２８．７ｍｇ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲの結果より、メチル化導入率が２３．３％のＰＶＩｍ−Ｍｅの合成を確認した（図１０）。
【００９７】
【化１４】
2015164420.tif 000015
【００９８】
（合成例４）ＰＬＤ−ＰＥＧおよびＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤの合成
（１）ＰＬＤ−ＰＥＧの合成
ポリ−（α，β）−ＤＬ−アスパラギン酸（ＰＬＤ）ナトリウム塩  ２０ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ／ＣＯＯＨ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）  ２７．７ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート）１０５．１ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）に脱水ＤＭＦ１０ｍＬ中に溶解し、超音波を照射しながら１０分間インキュベートした後に、２ｍＬの脱水ＤＭＦ中に溶解したＮ−Ｂｏｃ−ＰＥＧ（ＢＯ−０２０−ＥＡ）  ２００ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を加え、６０℃オイルバス中で７２時間撹拌した。反応液は室温まで放冷した後に蒸留水中で分画分子量３，５００の再生セルロース膜を用いて５日間透析を行なった。その後５日間凍結乾燥を行い、得られた粉末に２ｍＬのＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を加えて２時間撹拌し、反応液は４０ｍＬのジエチルエーテル中に沈殿した。上澄みは４割以上を捨てた後に再び４０ｍＬになるまでジエチルエーテルを加え、この操作を５回繰り返した。室温で一晩ジエチルエーテルを乾燥させた後、７．７ｍｇのＰＬＤ−ＰＥＧを得た。
【００９９】
（２）ＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤの合成
（１）で得られたＰＬＤ−ＰＥＧ  ７．７ｍｇ（０．００４ｍｍｏｌ／ＰＥＧ）と６−Ｏ−Ｔｓ−β−シクロデキストリン（ＣＤ）  ２３５ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＳＯ  １０ｍＬに溶解し、８０℃オイルバス中で７２時間撹拌し、反応液を室温まで放冷した後、水中で分画分子量３，５００の再生セルロース膜を用いて８日間透析を行った。その後、凍結乾燥を４８時間行い、９．０ｍｇのＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤを得た。
【０１００】
ＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤはゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）によってフリーなＣＤの除去と分子量損失がないことを確認した。また、重水中で１Ｈ−ＮＭＲ測定し、δ５．１ｐｐｍ（シクロデキストリンＣ１プロトン）、δ２．５−３．０ｐｐｍ（ＰＬＤβＨ２）、δ３．５−３．９ｐｐｍ（エチレングリコール）のピークからＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤの合成を確認し、それぞれのピーク強度比からＣＯＯＨ：ＮＨ２：ＣＤ＝５９．４：３６．６：４．０の修飾率を算出した（図１３）。
【０１０１】
（３）ＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤのＦＩＴＣラベル化
（２）で合成したＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤ  ２．５ｍｇ（３μｍｏｌ／ＮＨ２）は１．１７ｍｇ（３μｍｏｌ）のＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）とともに１０ｍＭ  Ｋ２ＣＯ３中で遮光しながら室温で２時間撹拌し、ＦＩＴＣラベル化を行った。その後分画分子量３，５００の膜を用いて水中で遮光しながら６日間透析し、残った不溶性の物質を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで取り除き、上清を２日間凍結乾燥することでＦＩＴＣラベル化ＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤを得た。
【０１０２】
（合成例５）ＰＬＤ−ＥＤＡ−ＣＤの合成
（１）ＣＤ−ＥＤＡ−Ｂｏｃの合成
モノ−６−Ｏ−Ｔｓ−β−ＣＤ  ５００ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）に脱水ＤＭＳＯ  １０ｍＬを加えて撹拌し、完全に溶解させた。モノ−６−Ｏ−Ｔｓ−β−ＣＤのＤＭＳＯ溶液にＮ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（Ｎ−Ｂｏｃ−ＥＤＡ）１００μＬ（０．６３ｍｍｏｌ）を加え、８０℃のオイルバス中で７２時間撹拌した。この反応液を室温で放冷し、蒸留水を加えて溶液を薄めた。この時発熱するのでもう一度室温で放置し、その後分画分子量１００〜５００の透析膜で３日間透析した。透析終了後、凍結乾燥を行い、薄茶色の個体であるＣＤ−ＥＤＡ−Ｂｏｃ  ０．１４７９ｇを得た。
【０１０３】
（２）ＣＤ−ＥＤＡ−ＢｏｃのＢｏｃ脱保護
ＣＤ−ＥＤＡ−Ｂｏｃ  ５４ｍｇ（０．０４２ｍｍｏｌ）にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）２ｍＬを加え、１時間室温で撹拌した。この反応液に４０ｍＬのジエチルエーテルを加え、上澄みをピペットで取り除いた。この操作を５回繰り返した後、上澄みを出来る限り取り除き、完全にジエチルエーテルを揮発させた。その後、残った個体を蒸留水に溶解させ、凍結乾燥をして薄茶色の個体であるＣＤ−ＥＤＡ  ０．０４３１ｇを得た。
【０１０４】
（３）ＰＬＤ−ＥＤＡ−ＣＤの合成
ポリ−（α，β）−ＤＬ−アスパラギン酸  １５ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ／ＣＯＯＨ）、ＣＤ−ＥＤＡ  ０．０３５５ｇ（０．０３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ  ０．０４２０ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ  ０．４７９６ｇ（０．９ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＳＯ  ５ｍＬに溶解し、６０℃のオイルバスで４８時間撹拌した。反応液を室温で放置し、蒸留水を加えて溶液を薄めた。この時発熱するのでもう一度室温になるまで放置し、その後分画分子量３，５００の透析膜で３日間透析した。このとき生じた不溶成分を遠心分離機（３，５００ｒｐｍ、３０分間）によって遠心分離を行い、得られた上澄みのみを凍結乾燥し、茶色の個体であるＰＬＤ−ＥＤＡ−ＣＤ  ３．６ｍｇを得た。
【０１０５】
重水中において測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルより、ＰＬＤとＣＤのピークをそれぞれδ２．７−３．０ｐｐｍ及び３．０−３．４ｐｐｍ（ＰＬＤ  βＨ２）、δ３．６−４．１ｐｐｍ（シクロデキストリンＣ２−６）に確認し、目的とするＰＬＤ−ＥＤＡ−ＣＤの合成を確認した（図１５）。
【０１０６】
（合成例６）ＰＬＤ−ＣＤの合成
・６−Ｏ−Ｔｓ−β−ＣＤの合成（Org. Biomol. Chem., 2011, 9, 7799）
β−シクロデキストリン（ＣＤ）  ５ｇ（１２．３ｍｍｏｌ）を４１ｍＬの水に添加し、０．６ｇ（４１ｍｍｏｌ）の水酸化ナトリウムを溶解させた水酸化ナトリウム水溶液１．７ｍＬを１５分間かけて添加した。その後反応液を氷中に移し、２．５ｍＬのアセトニトリルに溶解した１．０２ｇ（１４．８ｍｍｏｌ）のＴｓＣｌ（ｐ−トルエンスルホニルクロリド）を２５分かけて添加した。その後氷中で４時間撹拌し、桐山ろ紙（Ｎｏ．５）によって沈殿をろ過し、ろ液を４℃で一晩静置した。生じた結晶を桐山ろ紙（Ｎｏ．４）で回収し、水とエタノールによって洗浄した。エタノールをデシケーター内で乾燥させ、１．０５ｇの６−Ｏ−Ｔｓ−β−ＣＤを得た。
・ＰＬＤ−ＥＤＡの合成
ＰＬＡ−ＥＤＡの合成の一例を以下に示す。
【０１０７】
ＰＬＤ（ポリアスパラギン酸）  ２０ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ／ＣＯＯＨ）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）  ２７．７ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート）１０５．１ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ１０ｍＬ中に溶解し、超音波を照射しながら１０分間インキュベートした後に、２ｍＬの脱水ＤＭＦ中に溶解したＮ−Ｂｏｃ−ＥＤＡ（Ｎ−ブトキシカルボニルエチレンジアミン）  ４６５μＬ（３．０ｍｍｏｌ）を加え、窒素パージし６０℃オイルバス中で４８時間撹拌した。反応液は室温まで放冷した後に２０倍量のエタノール中に沈殿させ、３０分間３，５００ｒｐｍで遠心した。上澄みを捨て、新たにエタノールを４０ｍＬ加えて３０分間３，５００ｒｐｍで遠心し、この操作を２回繰り返した。残った沈殿はエタノールを用いてバイアル瓶へ流し込み、７０℃常圧で一晩エタノールを乾燥させた。生成した粉末に１ｍＬのＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を加えて１時間室温で撹拌し、反応液は２０ｍＬのジエチルエーテル中に沈殿した。上澄みは４割以上を捨てた後に再び２０ｍＬになるまでジエチルエーテルを加え、この操作を５回繰り返した。室温で一晩ジエチルエーテルを乾燥させた後、残った固体を２０ｍＬの超純水に溶解し、５日間凍結乾燥し、３．９ｍｇのＰＬＤ−ＥＤＡを得た。
【０１０８】
ＰＬＤ−ＥＤＡはまた、以下の手法によっても合成することができる。
【０１０９】
ＰＬＤ（ポリアスパラギン酸）  １０ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ／ＣＯＯＨ）とＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）１７．６μＬ（０．１ｍｍｏｌ）を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液中に溶解し、氷冷しながら１時間撹拌した後に、Ｎ−Ｂｏｃ−ＥＤＡ（Ｎ−ブトキシカルボニルエチレンジアミン）  １５．８１μＬ（０．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間撹拌した。反応液は分画分子量１，０００の膜で純水に対して透析を行い、５日間凍結乾燥を行うことで１１．３ｍｇの白色の粉末を得た。生成した粉末に１ｍＬのＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を加えて室温で１時間撹拌し、反応液は２０ｍＬのジエチルエーテル中に沈殿した。上澄みは４割以上を捨てた後に再び２０ｍＬになるまでジエチルエーテルを加え、この操作を５回繰り返した。室温で一晩ジエチルエーテルを乾燥させた後、残った固体を２０ｍＬの超純水に溶解し、５日間凍結乾燥し、８．３ｍｇのＰＬＤ−ＥＤＡを得た。
・ＰＬＤ−ＣＤの合成
以上の方法で合成したＰＬＤ−ＥＤＡ  ２０ｍｇ（１６．８μｍｏｌ／ＥＤＡ）と６−Ｏ−Ｔｓ−β−ＣＤ  １１０ｍｇ（０．８８ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＳＯ  １０ｍＬに溶解し、７０℃オイルバス中で７２時間撹拌した。反応液を室温まで放冷した後、水中で分画分子量３，５００の再生セルロース膜を用いて透析を行った。その後、凍結乾燥を７２時間行い、１３．１ｍｇのＰＬＤ−ＣＤを得た。
・ＰＬＤ−ＣＤの同定
ＰＬＤ−ＣＤはＧＦＣによってフリーなＣＤの除去と分子量損失がないことを確認し、１Ｈ−ＮＭＲよりＣＤ由来のピークおよびＰＬＤ由来のピークを確認した。
・ＰＬＤ−ＣＤのＦＩＴＣラベル化
先の項で合成したＰＬＤ−ＣＤ  ６．０ｍｇ（７．５４μｍｏｌ／ＮＨ２）は２．９ｍｇ（７．４５μｍｏｌ）のＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）とともに１０ｍＭ  Ｋ２ＣＯ３中で遮光しながら室温で２時間撹拌し、ＦＩＴＣラベル化を行った。その後分画分子量３，５００の膜を用いて水中で遮光しながら６日間透析し、残った不溶性の物質を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで取り除き、上清を２日間凍結乾燥することでＦＩＴＣラベル化ＰＬＤ−ＣＤ（ＦＩＴＣ−ＰＬＤ−ＣＤ）を得た。
【０１１０】
（合成例７）ポリ乳酸／ポリエチレンイミン（ＰＬＡ／ＰＥＩ）複合体の調製
平均分子量１０，０００のポリ乳酸（ＰＬＡ）１００ｍｇを１０ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解したものをＭＷＣＯ：１，０００の再生セルロース膜を用いて、透析を４日間行った。その溶液を凍結乾燥させ、ＰＬＡ粒子を回収した。回収したＰＬＡ粒子１０ｍｇを５０ｍＬのＰＢＳに分散させ、ＰＬＡ粒子  ０．２ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）  ０．１ｍｇ／ｍＬの溶液を調製し、２つの溶液を様々な電荷比で混合し、室温で１時間静置した。１時間後、動的光散乱法（ＤＬＳ）により粒径及びゼータ電位を測定した。
【０１１１】
ポリエチレンイミンの構造を次式に示す：
【０１１２】
【化１５】
2015164420.tif 000016
【０１１３】
図１７は様々な電荷比におけるＰＬＡ／ＰＥＩ複合体の粒径及びゼータ電位である。電荷比の上昇に伴いゼータ電位も上昇しているが、粒径の増大は確認されなかった。
【０１１４】
この結果より、ＰＢＳ中にＰＬＡ粒子が分散した状態のまま、粒子表面にＰＥＩが静電相互作用したことが示唆される。
【０１１５】
（合成例８）ポリ乳酸−ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）キャリアの調製
乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）は、乳酸とグリコール酸の組成比が１：１、平均分子量が１０，０００のものを使用した。まず、ヒストンＨ３Ｋ４トリメチル化酵素（ＭＬＬ５）をコードしたプラスミドＤＮＡ  １．５ｍｇとカチオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル硫酸（ＤＯＴＡＰ）  ３．５ｍｇを複合化した。ＰＬＧＡ  １００ｍｇとヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）  ５０ｎＭ、プラスミドＤＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体は、アセトン：メタノール＝２：１の混合溶媒に溶解した。この混合溶媒は、１％ｗ／ｖ  ポリビニルアルコール溶媒に滴下し、４００ｒｐｍで５分間攪拌した。得られた懸濁液は、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、上清を除去し、蒸留水で洗浄した。上述の操作を２回行い、凍結乾燥した後、ＰＬＧＡナノ粒子を回収した。得られたナノ粒子は、ＤＬＳにより粒径とゼータ電位を測定した。
【０１１６】
ＰＬＧＡ、ＴＳＡおよびＤＯＴＡＰの構造式を下記に示す。
【０１１７】
１）乳酸−グリコール酸共重合体  （組成比１：１、分子量１０，０００）
【０１１８】
【化１６】
2015164420.tif 000017
【０１１９】
２）トリコスタチンＡ（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤）
【０１２０】
【化１７】
2015164420.tif 000018
【０１２１】
３）Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル硫酸（ＤＯＴＡＰ）（カチオン性脂質）
【０１２２】
【化１８】
2015164420.tif 000019
【０１２３】
結果：ＰＬＧＡキャリアの粒径及びゼータ電位
得られたＰＬＧＡキャリアの粒径は、２９５±２４ｎｍであった。ゼータ電位は−３６ｍＶであった。ゼータ電位がマイナスであることは、ＰＬＧＡに存在するカルボキシ末端が最表面に存在することを示唆している。
【０１２４】
合成例９：ポリ乳酸粒子をコアに有するカチオン性脂質キャリアの調製
まず、平均分子量１０，０００であるポリ乳酸（ＰＬＡ）４０ｍｇとヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）５０ｎＭをＤＭＳＯに溶解した。得られた溶液は、透析（ＭＷＣＯ＝１，０００）をしたのち凍結乾燥を行い、阻害剤を封入したＰＬＡ粒子を得た。次に、表面を被覆するカチオン脂質の調製は、以下の手順で行った。カチオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル硫酸（ＤＯＴＡＰ）３０ｍｇをクロロホルム  ４ｍＬに溶解し、ロータリーエバポレータを用いて脂質薄膜を得た。得られた薄膜に対してＰＬＡ  ４０ｍｇを懸濁させたＰＢＳ  ５ｍＬを添加し、１時間超音波処理を行った。その後、室温で１時間静置し、ヒストンアセチル化酵素（ＣＡＦ）をコードしたプラスミドＤＮＡ  １３ｍｇと複合化することで目的のキャリアを得た。得られたキャリアの粒径・ゼータ電位はＤＬＳ測定により評価した。
【０１２５】
ポリ乳酸（平均分子量１０，０００）の構成単位の構造式を以下に示す。ＴＳＡおよびＤＯＴＡＰの構造式は、合成例７において示したとおりである。
【０１２６】
【化１９】
2015164420.tif 000020
【０１２７】
結果：ポリ乳酸粒子をコアに有するカチオン性脂質キャリアの粒径・ゼータ電位
得られたキャリアの粒径は、３１９±１７４ｎｍであった。ゼータ電位は＋１９ｍＶであった。ゼータ電位がプラスであることは、ＰＬＡ粒子表面にカチオン性脂質が存在していることを示唆している。
【０１２８】
合成例１０：カチオン性脂質としてＤＭＲＩＥ−コレステロールを使用した系
ＰＬＡコアＤＭＲＩＥ−コレステロールリポソームキャリアの調製
トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）２ｍｇと平均分子量が１０，０００のポリ乳酸（ＰＬＡ）１０ｍｇをジメチルスルホキシド  ３ｍＬを溶媒として混合し、１時間攪拌した。攪拌後、ＭＷＣＯ：１，０００の再生セルロース膜を用いて４日間透析し、溶媒を蒸留水へと変換し、粒子懸濁液を得た。この溶液を凍結乾燥させ、ＰＬＡ粒子を得た。次にリポソームを形成するため、クロロホルム  ２ｍＬにカチオン性脂質である１，２−ジミリスチルオキシプロピル‐３‐ジメチル‐ヒドロキシエチル・アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）と中性脂質であるコレステロールが等モル混合しリポソーム状になっているＤＭＲＩＥ−Ｃ  ３００μＬを混合し、ロータリーエバポレータ（６０℃、１８０ｒｐｍ）で溶媒をとばし、脂質薄膜を得た。この脂質薄膜に凍結乾燥で得られたＰＬＡ粒子０．７５ｍｇをＰＢＳ  ３ｍＬに分散させたものを添加し、３０分間氷水で冷やしながら超音波処理した。超音波処理後、室温にて１時間静置し、コアにＴＳＡ含有ＰＬＡ粒子を含むＤＭＲＩＥ−コレステロールリポソームを得、コア粒子および調整後のキャリアの粒径およびゼータ電位をＤＬＳにて測定した。
【０１２９】
ＤＭＲＩＥおよびコレステロールの構造式を以下に示す。ポリ乳酸（平均分子量１０，０００）の構成単位の構造式は、合成例８において示したとおりである。
【０１３０】
１）１，２−ジミリスチルオキシプロピル‐３‐ジメチル‐ヒドロキシエチル・アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）
【０１３１】
【化２０】
2015164420.tif 000021
【０１３２】
２）コレステロール
【０１３３】
【化２１】
2015164420.tif 000022
【０１３４】
結果：調製したキャリアの粒径及びゼータ電位
コアのＰＬＡ粒子の粒径は１７８ｎｍ、ゼータ電位は−６４ｍＶであり、調整後のキャリアの粒径は３０６ｎｍ、ゼータ電位は２９ｍＶであった。この結果はＰＬＡ粒子表面をカチオン性脂質のリポソームで被覆できたことを示唆している。
【０１３５】
実施例１：リアルタイムＰＣＲによるクロマチン弛緩率測定（ＰＡＡ−ＥＤＡ）
両性高分子であるＰＡＡ−ＥＤＡ（合成例１）のクロマチン弛緩能評価は、EpiQ Chromatin Analysis Kit(Catalog#172- 5400,#172-5401(Bio-rad))を用いて下記のように行った（キットのプロトコル記載事項）。
【０１３６】
ヒト肝癌由来細胞（HepG2）（２．３×１０５細胞／ｍＬ）を４８ウェル（１プレート）に１５０μＬずつ播種した。細胞播種２４時間後、ＰＡＡ−ＥＤＡ（１７．６μｇ）を細胞に添加した。サンプル添加２４時間後、高分子をアスピレーターで除去後、新鮮な培地（２００μＬ）と交換した。４８時間後、クロマチン構造解析のサンプルを調製した。
【０１３７】
クロマチン構造解析サンプル調製
［クロマチン消化］
EpiQ chromatin bufferを室温で溶解し、使用前にボルテックスした。１．５ｍＬチューブ（未消化／Ｕと記す）を１サンプル分、１．５ｍＬチューブ（消化／Ｄと記す）を２サンプル分用意した。上記チューブにchromatin bufferを分注した。
【０１３８】
サンプル（処理ごとに）    ２
Chromatin buffer（Ｄチューブにのみ添加）    ２４０μＬ
Ｕのチューブには１サンプル分  chromatin buffer １２０μＬを分注した。チューブを３７℃、１０分インキュベートした。
Ｄチューブのchromatin buffer １００μＬあたり２μＬのEpiQ nucleaseを加えた。
【０１３９】
サンプル（処置ごとに）    ２
EpiQ nuclease（Ｄチューブにのみ添加）    ５μＬ
軽く混和して、室温においた。
【０１４０】
インキュベーターから培養細胞プレートを取り出し、培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した（２００μＬ）。未消化サンプルのウェルにＵチューブから１００μＬ添加、消化サンプルのウェルにＤチューブから１００μＬそれぞれ添加した。バッファーが細胞を覆うようにプレートを揺らし、３７℃、１時間でインキュベートした。３７℃インキュベーターからプレートを取り出し、２５μＬ  EpiQ stop bufferを各ウェルに添加し、プレートを揺らし、３７℃、１０分間インキュベートした。３７℃インキュベーターからプレートを取り出し、プレートを６０度に傾けて底から細胞溶解液を溜めた。
【０１４１】
２００μＬピペットを用い、各ウェルから細胞溶解液（１２５μＬ）を、印をつけたDNA lysis solutionの入った１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移した。数回転倒混和し、５秒間スピンダウンした。各チューブに２５０μＬの１００％エタノールを添加した。数回転倒混和し、５秒間スピンダウンした。（このチューブで２時間保存可）
［遠心によるゲノムＤＮＡ精製］
細胞溶解液のチューブから１ｍＬピペットを使って、準備しておいたミニカラムに液を移した。
【０１４２】
カラムをセットしたチューブを１２，０００ｒｐｍで１分間遠心した。通過画分を捨て、カラムを同じ２ｍＬのチューブに戻した。次に、DNA low-stringency wash solutionを各カラムに６５０μＬ添加し、カラムをセットしたチューブを１２，０００ｒｐｍ，１分間で遠心した。通過画分を捨て、カラムを同じ２ｍＬのチューブに戻した。その後、DNA high-stringency wash solutionを各カラムに６５０μＬ添加し、カラムをセットしたチューブを１２，０００ｒｐｍ、１分間で遠心した。通過画分を捨て、DNA low-stringency wash solutionを各カラムに６５０μＬ添加した。カラムをセットしたチューブを１２，０００ｒｐｍ、１分間で遠心した。通過画分を捨て、カラムを同じ２ｍＬのチューブに戻した。
【０１４３】
DNA low-stringency wash solutionを各カラムに６５０μＬ添加し、カラムをセットしたチューブを１２，０００ｒｐｍ、１分間で遠心した。通過画分を捨て、カラムを同じ２ｍＬのチューブに戻した。
【０１４４】
カラムをセットしたチューブを１２，０００ｒｐｍ、３分間で遠心して、カラムを乾燥させた。準備していた２ｍＬキャップ付きチューブにミニカラムを移した。温めておいたDNA elution solution  ５２μＬをカラムの中央に添加し、２分間静置後、カラムをセットしたチューブを１２，０００ｒｐｍ、２分間で遠心した。再度、DNA elution solution  ５２μＬをカラムの中央に添加し、２分間静置後、カラムをセットしたチューブを１２，０００ｒｐｍ、２分間で遠心した。計１０４μＬの溶出液を回収した。
【０１４５】
回収した各サンプルのゲノムＤＮＡ量をＵＶスペクトル解析することで定量した。１ｎｇ／μＬになるようにゲノムＤＮＡをＴＥ（Tris EDTA）バッファーで希釈した。
【０１４６】
ＤＮＡは光路長が１ｃｍのセルで測定した時に、２６０ｎｍでの吸光度１．０が５０μｇ／ｍＬに相当するので、以下の式よりＤＮＡの濃度を算出した。
【０１４７】
ＤＮＡ濃度＝吸光度×５０μｇ／ｍＬ×希釈率
またタンパク質が２８０ｎｍに極大吸収を持ち、タンパク質の混入があると２８０ｎｍと２６０ｎｍへの吸光度の影響があることから、（２６０ｎｍの吸光度）÷（２８０ｎｍの吸光度）の値（レシオ）を算出することでＤＮＡが綺麗かどうかを判断することが出来る。この場合、１．８〜２．０の間に入ると綺麗なＤＮＡであるといえる。
【０１４８】
［リアルタイムＰＣＲでのサンプル解析］
解析に用いる遺伝子領域として、肝細胞マーカーであるα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）を選択した。クロマチンが９５％以上弛緩状態にあるハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）とクロマチンが高度に凝縮しているロドプシン（ＲＨＯ）を、それぞれリファレンス遺伝子及びコントロール遺伝子として用いた。
【０１４９】
以下の手順でリアルタイムＰＣＲのためのサンプルを調製した。
【０１５０】
・EpiQ chromatin SYBR supermixを室温で静置
・ゲノムＤＮＡサンプルとターゲットのプライマーをトリプリケートに必要な分量を準備する。軽くボルテックスして室温に保存する。
【０１５１】
・９６ウェルプレートの３つのウェルにチューブから２０μＬずつ分注する。
【０１５２】
・シーリングフィルムかキャップストリップでプレートをシールする。
【０１５３】
・プレートを遠心する。
【０１５４】
EpiQ chromatin analysis kitで提供しているリファレンス遺伝子とコントロール遺伝子のプライマーに適したプロトコルは以下の通りである。
【０１５５】
１００μＭのFwプライマー及びRvプライマーをそれぞれ２０μＬ測り取り、９６０μＬのプライマーミックス（２μＭ）を調整した。
【０１５６】
ＰＣＲ反応溶液調整
【０１５７】
【表１】
2015164420.tif 000023
【０１５８】
２ウェル分：（サンプル＋SYBR supermix）３３μＬ＋プライマーミックス  １１μＬ
１ウェルあたり  ２０μＬずつ添加
リアルタイムＰＣＲプロトコルは以下の通りである。
ステップ１：９６℃、５分
ステップ２：９６℃、１５秒
ステップ３：６０−６７℃、１分＋プレート読み取り
ステップ４：８０℃、３０秒
ステップ５：ステップ２へ、３９回繰り返し
ステップ６：溶解曲線、７０−９６℃
終了
解析に用いた遺伝子領域、リファレンス遺伝子及びコントロール遺伝子のそれぞれについて使用したFwプライマーおよびRvプライマーは以下の通りである。
AAT領域
Fw: 5’- CCTCTTGCGGCAACTCAAAGGGAGA-3’ （配列番号１）
Rv: 5’- CGACCCCCTCCTCCTTCTTGGTTCA-3’ （配列番号２）
RHO領域
Fw: 5’-AGGTCACTTTATAAGGGTCTGGGGG-3’（配列番号３）
Rv: 5’-AGTTGATGGGGAAGCCCAGCACGAT-3’ （配列番号４）
GAPDH領域
Fw: 5’-ACCTCCCATCGGGCCAATCTCAGTC-3’ （配列番号５）
Rv: 5’-GGCTGACTGTCGAACAGGAGGAGCA-3’ （配列番号６）
結果
リアルタイムＰＣＲデータ解析を図８に示す。また、共焦点レーザー顕微鏡による核局在性評価の結果を図９に示す。
【０１５９】
ＰＡＡ−ＥＤＡを緑色の蛍光を示すＦＩＴＣでラベル化し、ＤＡＰＩで核を青で染色してレーザー顕微鏡で観察したところ、細胞核内にＰＡＡ−ＥＤＡが導入されていることが観察された（図９）。
【０１６０】
細胞核内へ局在していることが確認出来たので、クロマチン弛緩効率をリアルタイムＰＣＲで解析した。凝縮クロマチンのコントロール遺伝子として、一般的に細胞では発現していないとされているロドプシン（ＲＨＯ）、弛緩クロマチンのコントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨを用い、解析領域として肝細胞マーカーであるα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）を用いた。リアルタイムＰＣＲで解析したところ、α１−アンチトリプシンの遺伝子領域においてクロマチン構造が大きく弛緩（２２→８１％）されていることが明らかとなった。
【０１６１】
実施例２：リアルタイムＰＣＲによるクロマチン弛緩率測定（ＰＶＩｍ−Ｍｅと複合化したＰＡＡ−ＥＤＡ）
（１）二元複合体の細胞核局在化およびクロマチン弛緩率
カチオン性ｐＨ応答性キャリアであるメチル化ポリビニルイミダゾール（ＰＶＩｍ−Ｍｅ／合成例３）８４μｇとＰＡＡ−ＥＤＡ（合成例１／エチレンジアミン導入率６７％）９．０ｇを複合化させた二元複合体を調製した。ＰＡＡ−ＥＤＡの代わりに当該二元複合体を用いた他は、実施例１と同様の実験を行うことにより、ＰＶＩｍ−Ｍｅ複合化ＰＡＡ−ＥＤＡの細胞核局在化及びクロマチン弛緩率について検討した。
【０１６２】
結果
リアルタイムＰＣＲデータ解析の結果を図１１に、また、共焦点レーザー顕微鏡による核局在性評価の結果を図１２に示す。
【０１６３】
図１１及び１２に示すように、メチル化ポリビニルイミダゾール（ＰＶＩｍ−Ｍｅ）とＰＡＡ−ＥＤＡの複合体は、共焦点レーザー顕微鏡観察から、細胞核内に局在化していることが確認され、リアルタイムＰＣＲによるクロマチン構造解析から、クロマチン構造弛緩が誘起されていることが確認された。
（２）二元複合体とＰＡＡ−ＥＤＡ単独の効果の比較、及びエチレンジアミン導入率による効果の差
両性高分子として、カルボキシル基を有するポリアクリル酸（ＰＡＡ）に、エチレンジアミン修飾することでカチオン基を導入したエチレンジアミン修飾ポリアクリル酸（ＰＡＡ−ＥＤＡ）（エチレンジアミン導入率５０、６７％）を合成した（合成例１）。ＰＡＡ−ＥＤＡの細胞取り込み率を向上させるため、カチオン性ｐＨ応答性キャリアであるメチル化ポリビニルイミダゾール（ＰＶＩｍ−Ｍｅ）とＰＡＡ−ＥＤＡ複合化させた二元複合体を上記（１）に記載のように調製し、実施例１と同様の実験を行った。ＰＡＡ−ＥＤＡの細胞核局在化は、共焦点レーザー顕微鏡により観察した。ＰＡＡ−ＥＤＡによるクロマチン構造の弛緩は、リアルタイムＰＣＲを用いて解析した。解析に用いた遺伝子領域は、肝細胞マーカーであるα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）を選択し、クロマチンが９５％以上弛緩状態にあるハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）とクロマチンが高度に凝縮しているロドプシン（ＲＨＯ）をコントロールとして用いた。
【０１６４】
先ず、ＰＡＡ−ＥＤＡ単独での弛緩効果を解析した。その後、二元複合体調製時のＰＶＩｍ−Ｍｅの量（ＭｅＩｍ／ＣＯＯＨ比＝Ｎ／Ｃ比の最適化と、エチレンジアミン導入率の違いによる弛緩効果の違いを検討した。
【０１６５】
ＰＡＡ−ＥＤＡが核内に送達されているかは、ＦＩＴＣで蛍光ラベル化したＰＡＡ−ＥＤＡを用い、蛍光顕微鏡で観察を行った。その結果、細胞核内でＦＩＴＣ由来の蛍光が観察でき、細胞核にＰＡＡ−ＥＤＡが導入できていることを確認した。また、エチレンジアミン導入率が高いほど効率的に核へ導入されることが分かった。
【０１６６】
次に、クロマチン構造解析を、リアルタイムＰＣＲを用いて評価した。生体内でクロマチン構造の弛緩作用がある酵素を発現するプラスミド（ＨＡＴ）／ＰＶＩｍ−Ｍｅ複合体を添加した細胞をポジティブコントロールとして用い、未処理の細胞と比較した。その結果、ＨＡＴ／ＰＶＩｍ−Ｍｅ複合体の弛緩作用は、ＡＡＴの遺伝子領域においてクロマチン弛緩率が未処理細胞と比較して約２倍であった。また、ＰＡＡ−ＥＤＡを単独で添加した実験では、ＡＡＴの遺伝子領域において、未処理細胞よりも約２．５倍程度の弛緩効果を示し、生体内酵素よりも効率的なクロマチン構造弛緩が可能であることを初めて明らかにした（データは示さない）。
【０１６７】
次に、ＰＡＡ−ＥＤＡ  核内送達を高めるため、ＰＡＡ−ＥＤＡ（ＥＤＡ６７％）／ＰＶＩｍ−Ｍｅ二元複合体を調製した。その結果、Ｎ／Ｃ＝８の条件で調製した二元複合体は、さらに高いクロマチン構造弛緩を示すことが明らかとなった。
【０１６８】
ＰＶＩｍ−ＭｅによるＰＡＡ−ＥＤＡの細胞内取り込みの促進が、クロマチンと相互作用するＰＡＡ−ＥＤＡを増やし、クロマチン構造の弛緩を誘起したと考えられる。最後に、修飾率が異なるＰＡＡ−ＥＤＡとＰＶＩｍ−Ｍｅの二元複合体でＨｅｐＧ２細胞に対して処理した結果を示す。ＥＤＡ修飾率が６７％のＰＡＡ−ＥＤＡを用いた場合に、クロマチン構造の弛緩率の向上が確認でき、修飾率の低下とともにクロマチン構造の弛緩率が低下した。これは、ＤＮＡと相互作用するカチオン部位が多いほどクロマチンへの作用効果が向上し、ＥＤＡ導入率が最も高いＰＡＡ−ＥＤＡにおいてクロマチン構造の弛緩が増大したと考えられる。
【０１６９】
実施例３：共焦点顕微鏡によるＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤ（合成例４）の細胞内導入の観察
スライドガラス上にＨｅＬａ細胞３×１０４細胞／ウェルの濃度で播種して３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベートした。８時間後に培地を交換し、ＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤ  ４５μｇ／ウェルを添加した。さらに１６時間３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベートし、培地を全て吸引した後にＰＢＳ（−）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定した後にＤＡＰＩ溶液（１万分の１希釈）により細胞核を染色した。ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、５０％グリセロールで試料をマウントし、遮光して保管した。
【０１７０】
共焦点顕微鏡観察はオリンパス社のＦＶ１０００−Ｄを用いて行い、それぞれ波長はＦＩＴＣ・ＤＡＰＩに最適化された波長により励起・観察した。
【０１７１】
結果
ＤＡＰＩで染色した細胞核の領域に、ＦＩＴＣラベル化したＰＬＤ−ＰＥＧ−ＣＤが局在していることが示された（図１４）。
【０１７２】
実施例４：共焦点顕微鏡によるＰＬＤ−ＥＤＡ−ＣＤ（合成例５）の細胞内導入の観察
スライドガラス上にＨｅＬａ細胞３×１０４細胞／ウェルの濃度で播種して３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベートした。２４時間後に培地を交換し、ＰＬＤ−ＥＤＡ−ＣＤ  ４５μｇ／ウェルを添加した。さらに２４時間３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベートし、培地を全て吸引した後にＰＢＳ（−）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、１万分の１希釈したＤＡＰＩ溶液により核を染色した。ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、５０％グリセロールで試料をマウントし、遮光して保管した。
【０１７３】
結果
ＤＡＰＩで染色した細胞核の領域に、ＦＩＴＣラベル化したＰＬＤ−ＥＤＡ−ＣＤが局在していることが示された（図１６）。
【０１７４】
実施例５：ＰＬＤ−ＣＤ（合成例６）の細胞内導入の観察とクロマチン構造弛緩評価
・共焦点顕微鏡によるＰＬＤ−ＣＤの細胞内導入の観察
スライドガラス上にＨｅＬａ細胞３×１０４細胞／ウェルの濃度で播種して３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベートした。２４時間後に培地を交換し、ＦＩＴＣ−ＰＬＤ−ＣＤ  ７５μｇ／ウェルを添加した。さらに２４時間３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベートし、培地を全て吸引した後にＰＢＳ（−）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定した後にＤＡＰＩ溶液（１万分の１希釈）により細胞核を染色した。ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、５０％グリセロールで試料をマウントし、遮光して保管した。
【０１７５】
共焦点顕微鏡観察はオリンパス社のＦＶ１０００−Ｄを用いて行い、それぞれ波長はＦＩＴＣ・ＤＡＰＩに最適化された波長により励起・観察した。
【０１７６】
結果
細胞核の領域に、ＰＬＤ−ＣＤが局在していることが示された（図２４）。ポリアニオン高分子であるＰＬＤはほとんど細胞内に取り込まれなかったが、ＰＬＤにβ−ＣＤを修飾したＰＬＤ−ＣＤの細胞内への取り込み率はＰＬＤと比べて約６倍に増加した。また、カベオラ経路阻害剤によりＰＬＤ−ＣＤの細胞内への導入が抑制されたことから、ＰＬＤ−ＣＤがカベオラ経路を経由し、核内に送達された可能性が示唆された。なお、ＣＤ修飾を行っていないＰＬＤ−ＥＤＡは核への局在が観察されなかった。
【０１７７】
・リアルタイムＰＣＲ法によるクロマチン構造弛緩評価
Chromatin Digest and Analysis ComponentsおよびAurum Total RNA Mini Kit（Bio Rad製）を使用して、ＰＬＤ−ＣＤのクロマチン構造弛緩をリアルタイムＰＣＲ法により評価した。
【０１７８】
４８ウェルプレート上にＨｅＬａ細胞を５×１０４細胞／ウェルの濃度で播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした後に培地を交換し、ＰＬＤ−ＥＤＡ  ６７μｇ／ウェル、ＰＬＤ−ＣＤ  １１７μｇ／ウェルを消化サンプル・未消化サンプルにそれぞれ添加した。さらに２４時間３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベートし、培地を全て吸引した後にＰＢＳ（−）で洗浄し、消化サンプルにはEpiQ Nuclease（キットに添付）を含むChromatin Buffer（キットに添付）を１００μＬ／ウェル、非消化サンプルにはNucleaseを含まないChromatin Buffer（キットに添付）を１００μＬ／ウェルをそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後２５μＬ／ウェルのEpiQ STOP Buffer（キットに添付）を添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。各ウェル中の細胞懸濁液は１２５μＬを採集し、３７５μＬのDNA Lysis Solution（キットに添付）と混合した。そこに２５０μＬの１００％エタノールを添加し、さらに混合した後、キットに含まれるカラムに全量を移し、１２，０００ｒｐｍで１分間の遠心操作を行った。通過液を廃棄し、Low stringency（キットに添付） ６５０μＬ／サンプルをカラムに添加して１２，０００ｒｐｍで１分間の遠心操作を行った。さらにカラムにHigh stringency（キットに添付）を６５０μＬ添加した後、同様に１２，０００ｒｐｍで１分間の遠心操作を行った。通過液を廃棄し、Low stringency（キットに添付）６５０μＬ／サンプルを添加して１２，０００ｒｐｍで１分間の遠心操作を行うステップを２回繰り返した。通過液を廃棄し、カラムを乾燥させるために１２，０００ｒｐｍで３分間の遠心操作を行った。最後に、７０℃に熱したElution solution（キットに添付）を５２μＬずつカラムに添加し、２分間室温でインキュベートした後に１２，０００ｒｐｍで２分間の遠心操作を行い、ＤＮＡを溶出させた。溶出操作を２回行った後、得られたＤＮＡ溶液はQuant-iTTM PicoGreen（登録商標） dsDNA Assay Kitで濃度定量を行い、１ｎｇ／μＬになるようにＴＥバッファーで希釈した。
【０１７９】
リアルタイムＰＣＲのプライマーはChromatin Digest and Analysis Components (Bio Rad) に含まれているもの（ＲＨＯ・ＧＡＰＤＨ）と、北海道システムサイエンスから購入したもの（ＡＬＢ・ＡＡＴ）を用いた。ＡＬＢ領域の増幅のために用いたフォワード（Fw）プライマーおよびリバース（Rw）プライマーの配列は以下の通りである。
Fw: 5’-ACACTGAGAACTAAATTGCAAACACCA-3’（配列番号７）
Rv: 5’-GGACAAACGGAGGGAAATTAGCACTAA-3’（配列番号８）
また、ＲＨＯ、ＧＡＰＤＨ、およびＡＡＴの各領域の増幅のために用いたプライマーの配列は実施例１において示したとおりである。
【０１８０】
プライマーはフォワードプライマー・リバースプライマーそれぞれ２μＭずつのプライマーミックスとして用いた。リアルタイムＰＣＲ反応液は鋳型ＤＮＡ溶液（１ｎｇ／μＬ）５μＬ、プライマーミックス（２μＬ）５μＬ、iTaq universal SYBR（キットに添付）１０μＬの計２０μＬ／ウェルで調整した。反応プロトコルは９６℃，５分→［９６℃，１５秒→６５℃，１分→蛍光検出］×４４ステップに設定し、Bio RadのCFX ConnectTM  リアルタイムＰＣＲ検出システムを用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１８１】
リアルタイムＰＣＲによる解析は８回行い、統計学的手法（スミルノフ・グラッブス検定）により、最大３つの値を棄却して最終的な平均クロマチン弛緩率を算出した。
【０１８２】
結果
ＰＬＤ−ＣＤを添加することで、ＡＬＢ領域のクロマチン弛緩率が４．８％から２０．６％へ有意に弛緩した（ｐ＜０．０５）。
【０１８３】
実施例６：ＰＬＧＡキャリア（合成例８）によるヒストンアセチル化およびヒストンメチル化制御
ヒストンＨ３Ｋ４トリメチル化酵素（ＭＬＬ５）をコードしたプラスミドＤＮＡとトリコスタチンＡを封入したＰＬＧＡキャリアは、１×１０５細胞／ウェルのヒト骨髄性白血病細胞（ＨＬ６０）に添加し、二日間インキュベートした。インキュベート終了後、ＨＬ６０細胞はＰＢＳで洗浄し、Cell Lysisを用いて細胞を溶解した。得られた細胞溶解液は、還元剤を添加した。得られたサンプルのヒストンアセチル化量およびヒストンＨ３Ｋ４トリメチル化は、ウエスタンブロット法により評価した。一次抗体は、アセチル化ヒストンＨ３Ｋ９，Ｋ１８抗体、トリメチル化ヒストンＨ３Ｋ４抗体およびβ−アクチンを使用した。二次抗体はＨＲＰ標識抗体を用いた。
【０１８４】
結果
図１８にＰＬＧＡキャリアを添加した細胞におけるヒストンアセチル化量を示す。ＰＬＧＡキャリアを添加した細胞は、ＴＳＡを添加した細胞と同様に、コントロールと比較してヒストンアセチル化量が１．５倍程度上昇していた。図１９に、ＰＬＧＡキャリアを添加した細胞におけるヒストンメチル化量を示す。ＰＬＧＡキャリアを添加した細胞は、コントロールと比較してヒストンＨ３Ｋ４トリメチル化量が１．５倍程度上昇していた。
【０１８５】
実施例７：ＰＬＧＡキャリア（合成例８）によるＨＬ６０細胞の分化制御
ヒストンＨ３Ｋ４トリメチル化酵素（ＭＬＬ５）をコードしたプラスミドＤＮＡとトリコスタチンＡを封入したＰＬＧＡキャリアは、１×１０５細胞／ウェルのヒト骨髄性白血病細胞（ＨＬ６０）に添加し、二日間インキュベートした。ＨＬ６０細胞の顆粒球への分化率は、ＮＢＴ染色によって算出した。
【０１８６】
結果
図２０にはＰＬＧＡキャリアを添加したＨＬ６０細胞の顆粒球への分化率を示す。ＴＳＡのみを添加した細胞は３５％が顆粒球へ分化していた。ＭＬＬ５のみを添加した細胞では分化は確認されなかった。一方で、ＰＬＧＡキャリアを添加した細胞は、４５％が顆粒球へ分化していた。
【０１８７】
実施例８：ポリ乳酸粒子をコアに有するカチオン性脂質キャリア（合成例９）によるヒストンアセチル化制御
ヒストンアセチル化酵素（ＣＡＦ）をコードしたプラスミドＤＮＡとトリコスタチンＡを封入したキャリアは、１×１０５細胞／ウェルのヒト骨髄性白血病細胞（ＨＬ６０）に添加し、二日間インキュベートした。インキュベート終了後、ＨＬ６０細胞はＰＢＳで洗浄し、Cell Lysisを用いて細胞を溶解した。得られた細胞溶解液は、還元剤を添加した。得られたサンプルのヒストンアセチル化量は、ウエスタンブロット法により評価した。一次抗体は、アセチル化ヒストンＨ３Ｋ９，Ｋ１８抗体およびβ−アクチンを使用した。二次抗体はＨＲＰ標識抗体を用いた。
【０１８８】
結果
図２１には、ポリ乳酸粒子をコアに有するカチオン性脂質キャリアを添加した細胞のアセチル化ヒストン量を示す。キャリアを添加した細胞は、コントロールと比較してアセチル化ヒストン量が２．５倍程度上昇していた。さらに、ＴＳＡを単独で添加した場合よりも優れたアセチル化量の向上を示した。
【０１８９】
実施例９：ポリ乳酸粒子をコアに有するカチオン性脂質キャリア（合成例９）によるＨＬ６０細胞の分化制御
ヒストンアセチル化酵素（ＣＡＦ）をコードしたプラスミドＤＮＡとトリコスタチンＡを封入したキャリアは、１×１０５細胞／ウェルのヒト骨髄性白血病細胞（ＨＬ６０）に添加し、二日間インキュベートした。ＨＬ６０細胞の顆粒球への分化率は、ＮＢＴ染色によって算出した。
【０１９０】
結果
図２２には、ポリ乳酸粒子をコアに有するカチオン性脂質キャリアを添加したＨＬ６０細胞の顆粒球への分化率を示す。キャリアを添加した細胞は２、４、８日後においてそれぞれ４２、５０、６３％が顆粒球へ分化していた。各日数において、ＴＳＡを単独で添加した場合よりも優れた分化率を示した。
【０１９１】
実施例１０：ＰＬＡコアＤＭＲＩＥ−コレステロールリポソームキャリア（合成例１０）の遺伝子発現評価
合成例１０のリポソームをルシフェラーゼレポーターベクターのプラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ３）と様々な電荷比で複合化させ１時間おき、ルシフェラーゼアッセイによりこの複合体の遺伝子発現を評価した。複合体を添加する前日にＨｅＬａ細胞を１×１０４細胞／ウェルで播種し、次の日に培地を交換し、複合体を添加した。翌日に培地を交換し、その４８時間後にcell lysisで細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ基質を加え遺伝子発現評価を発光強度によって確かめた。
【０１９２】
結果
図２３にルシフェラーゼアッセイによる遺伝子発現評価の結果を示す。キャリアはすべての電荷比で高い遺伝子発現を示した。一方、電荷比２以上においては著しい細胞毒性が見られた（データは示さない）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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