(57)【要約】【課題】血液適合性物品および当該物品を作製する方法を提供する。【解決手段】方法は、基板を設けることと、基板上に粗い表面を形成することとを含む。粗い表面は、各々が約５０ｎｍ未満の曲率半径を有する複数の三次元に湾曲した特徴を含む。表面は、基板が血液に露出した際に基板上での血液凝固活性を制限しかつ表面に付着する血小板の数を制限するように、単位面積当たり十分な濃度の特徴を含む。【選択図】図１Ａ
2015066450.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液適合性物品を作製する方法であって、
基板を設けることと、
各々が約５０ｎｍ未満の曲率半径を有する複数の三次元に湾曲した特徴を含む粗い表面を、前記基板上に形成することとを含み、
前記表面は、前記基板が血液に露出した際に前記基板上での血液凝固活性を制限しかつ前記表面に付着する血小板の数を制限するように、単位面積当たり十分な濃度の特徴を備える、方法。
【請求項２】
前記三次元に湾曲した特徴は実質的に半球状である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粗い表面は前記基板上の被覆を含み、前記被覆は前記特徴を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記特徴はナノ粒子を含み、前記被覆中の前記ナノ粒子の充填率は少なくとも約５０％である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記特徴は直径が約１００ｎｍ未満のナノ粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記被覆を形成することは、前記基板の前記表面上に前記ナノ粒子を回転塗布すること、前記表面上に前記ナノ粒子を浸漬被覆すること、前記表面上に前記ナノ粒子を噴霧被覆すること、前記表面上に前記ナノ粒子を沈殿させること、および溶射熱分解によって前記ナノ粒子を堆積させること、のうちの１つ以上を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記被覆を形成することは、前記基板上にナノインプリントすることによって前記特徴を形成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
医療機器は移植可能な医療機器である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
医療機器は、患者の体外で血液に露出されるように構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記表面のＲＭＳ粗さは約１０ｎｍ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
血液適合性物品であって、
各々が約５０ｎｍ未満の曲率半径を有する複数の三次元に湾曲した特徴を含む粗い表面を有する基板を含み、
前記表面は、前記基板が血液に露出した際に前記基板上での血液凝固活性を制限しかつ前記表面に付着する血小板の数を制限するように、単位面積当たり十分な濃度の特徴を備える、血液適合性物品。
【請求項１２】
前記特徴は実質的に半球状である、請求項１１に記載の血液適合性物品。
【請求項１３】
前記粗い表面は前記基板上の被覆を含み、前記被覆は前記特徴を含む、請求項１１に記載の血液適合性物品。
【請求項１４】
前記特徴はナノ粒子を含み、前記被覆中の前記ナノ粒子の充填率は少なくとも約５０％である、請求項１３に記載の血液適合性物品。
【請求項１５】
前記特徴は直径が約１００ｎｍ未満のナノ粒子である、請求項１１に記載の血液適合性物品。
【請求項１６】
前記基板は医療機器または医療機器の一部である、請求項１１に記載の血液適合性物品。
【請求項１７】
前記特徴の前記濃度は、第１２因子または凝固と関連付けられるタンパク質の１つ以上の前記基板への吸着を制限する、請求項１１に記載の血液適合性物品。
【請求項１８】
制限された前記凝固活性は、前記基板の前記表面でのフィブリン塊の形成を抑制する、請求項１１に記載の血液適合性物品。
【請求項１９】
前記特徴の前記濃度は、前記基板に吸着される血小板の活性化を制限する、請求項１１に記載の血液適合性物品。
【請求項２０】
前記表面のＲＭＳ粗さは約１０ｎｍ未満である、請求項１１に記載の血液適合性物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
この出願は、２０１３年９月３０日に出願された米国特許出願連続番号第６１／８８４，９５６号の優先権を主張し、その全内容がここに引用により援用される。
【０００２】
発明の分野
発明は、血液適合性表面、たとえばナノ粒子から形成される血液適合性表面に関する。
【背景技術】
【０００３】
血液透析膜、人工血管、心臓弁、バイオセンサ、血管ステント、および他の医療機器などの医療機器がさまざまな病状の治療のためにしばしば用いられる。しかしながら、医療機器などの異物が患者の血液に触れると、血栓病、炎症、および繊維症を含む一連の好ましくない生物学的反応が引起される可能性がある。これらの反応は患者にとって有害である可能性があり、移植された医療機器の不具合を生じる可能性がある。
【０００４】
これらの好ましくない生物学的反応を制限するため、そのような医療機器に血液適合性材料を用いることができる。血液適合性材料は血液凝固系の活性化を制限し、材料に対する血小板の付着を低減するまたは防止する。機器の血液適合性を向上させるために医療機器に表面処理を施すことができる。たとえば、自己組織化単分子膜、ポリエチレンオキシド、ヘパリン、双極性イオンポリマー、およびダイヤモンドなどの無機被覆を医療機器の表面に塗布することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明は、直径が約１００ｎｍ未満のナノ粒子から形成される被覆などの高曲率の表面が血液適合性を呈するという発見に少なくとも部分的に基づいている。たとえば、ナノ粒子から形成される被覆などの高曲率の血液適合性表面は、血液適合性表面の近傍での血液の固有の凝固活性を制限する。さらに、高曲率の血液適合性表面は表面に対する血小板の吸着を制限する。場合によっては、医療機器が患者の血液に触れると、医療機器の表面上での血液の凝固および機器に対する血小板の付着などの好ましくない生物学的反応が起こる可能性がある。医療機器を高曲率の血液適合性表面で覆うことによって、そのような好ましくない生物学的反応を軽減することができる。
【０００６】
一般的な局面では、本明細書中に記載のような血液適合性物品を作製する方法は、基板を設けることと、基板の上に粗い表面を形成することとを含む。粗い表面は、たとえば５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５ｎｍなどの約５０ｎｍ未満の曲率半径を各々が有する複数の三次元に湾曲した特徴を含む。表面は、基板が血液に露出された際に基板上での血液凝固活性を制限するようにかつ表面に付着する血小板の数を制限するように、単位面積当たり十分な濃度の特徴を含む。
【０００７】
実施形態は以下の特徴のうち１つ以上を含むことができる。三次元に湾曲した特徴は実質的に半球状であり得る。粗い表面は基板上に被覆を含むことができ、被覆は特徴を含むことができる。特徴はナノ粒子を含むことができ、被覆中のナノ粒子の充填率は、少なくとも約５０％、たとえば少なくとも約６０％または少なくとも約７０％であり得る。特徴は、直径が約１００ｎｍ未満のナノ粒子であり得る。ナノ粒子の直径は、約８５ｎｍ未満、たとえば約１２ｎｍから約８５ｎｍの間、たとえば１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０ｎｍであり得る。ナノ粒子の直径は動的光散乱法で測定されるようなナノ粒子の平均粒子径であり得る。たとえば、ナノ粒子は、セラミックナノ粒子、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、およびポリマーナノ粒子のうち１つ以上を含むことができる。
【０００８】
被覆を形成することは、たとえば医療機器または血液容器（blood container）などの基板の表面に対するナノ粒子の回転塗布を含むことができる。ナノ粒子の回転塗布は、エタノールなどのアルコール中のナノ粒子の懸濁液の回転塗布を含むことができる。被覆を形成することは、たとえば回転塗布されたナノ粒子が一旦基板に付着した際に当該ナノ粒子をアニールすることを含むことができる。被覆を形成することは、基板の表面上にナノ粒子を浸漬被覆すること、表面上にナノ粒子を噴霧被覆すること、表面上にナノ粒子を沈殿させること、および溶射熱分解によってナノ粒子を堆積させること、のうちの１つ以上を含むことができる。被覆を形成することは、基板上にナノインプリントすることによって特徴を形成することを含むことができる。特徴を生体適合性材料から形成することもできる。
【０００９】
基板は、たとえば、外科用機器、移植可能機器、血液ポンプ、血液容器、または血液輸送のための導管など、医療機器、または移植可能な医療機器など医療機器の一部であり得る。医療機器は、患者の体外でまたは患者内で血液に露出されるように構成され得る。方法は、インビボで（たとえば患者内で）またはエクスビボで（たとえば患者の体外で）行なわれ得る。
【００１０】
表面のＲＭＳ（root mean square：二乗平均平方根）粗さは、約１０ｎｍ未満、たとえば約５ｎｍ未満、たとえば０．５ｎｍから１０ｎｍの間であり得る。
【００１１】
別の一般的な局面では、本明細書中に記載のような血液適合性物品は、粗い表面を有する基板を含む。粗い表面は、約５０ｎｍ未満、たとえば５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５ｎｍの曲率半径を各々が有する複数の三次元に湾曲した特徴を含む。表面は、基板が血液に露出された際に基板上での血液凝固活性を制限するようにかつ表面に付着する血小板の数を制限するように、単位面積当たり十分な濃度の特徴を含む。
【００１２】
実施形態は以下の特徴のうち１つ以上を含むことができる。特徴は実質的に半球状であり得る。粗い表面は基板上の被覆を含むことができ、被覆は特徴を含む。特徴はナノ粒子を含むことができ、被覆中のナノ粒子の充填率は、少なくとも約５０％、たとえば少なくとも約６０％または少なくとも約７０％であり得る。特徴は、直径が約１００ｎｍ未満、たとえば約８５ｎｍ未満、たとえば約１２ｎｍから約８５ｎｍの間、たとえば１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０ｎｍのナノ粒子であり得る。ナノ粒子の直径は、動的光散乱法によって測定されるようなナノ粒子の平均粒子径であり得る。
【００１３】
被覆は、セラミック、金属、金属酸化物、もしくはポリマー材料であり得るかもしくはこれを含むことができる、またはこれらの材料のうち１つ以上の混合物であり得るかもしくはこれを含むことができる。被覆は無毒であるおよび／または生体適合性であることができる。
【００１４】
基板は医療機器または医療機器の一部であることができる。
特徴の濃度は、凝固と関連付けられる１つ以上のタンパク質の基板に対する吸着を制限することができる。たとえば、特徴の濃度は、基板に対する第１２因子の吸着を制限することができる。たとえば、制限された凝固活性は、基板の表面でのフィブリン塊の形成を抑制することができる。特徴の濃度は基板上に吸着される血小板の活性化を制限することができる。表面のＲＭＳ粗さは、約１０ｎｍ未満、たとえば約５ｎｍ未満、たとえば０．５ｎｍから１０ｎｍの間であり得る。
【００１５】
「血液適合性」という用語は、材料が、材料の近傍での血液凝固系の活性化を制限する、および材料に対する血小板の付着を防止する能力を指す。
【発明の効果】
【００１６】
本明細書中に記載の血液適合性表面は多数の利点を有する。たとえば、患者の血液に触れる医療機器は、血液適合性表面で処理されるかまたは製造されて、そのような医療機器の使用と関連付けられる好ましくない生物学的反応を低減することができる。血液適合性表面は、医療機器と血液との間の障壁となって、こうしてより幅広い範囲の材料を医療機器自体に利用可能にすることができる。たとえば、血液適合性被覆または表面を呈するまたはこれで処理される医療機器は、それらの材料が血液適合性被覆または表面がなくては生体適合性でない場合でも、安価で、容易に利用可能で、または加工が容易な材料から形成可能である。
【００１７】
他に定義されなければ、本明細書中で用いるすべての技術的および科学的用語は、この発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載のものと同様のまたは均等の方法および材料を本発明の実践および試験で用いることができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、および他の文献の全体が引用により援用される。競合する場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は例示のみのものであり、限定的であることを意図しない。
【００１８】
発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明からおよび請求項から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】ナノ粒子から形成される血液適合性被覆の図である。
【図１Ｂ】高曲率の血液適合性被覆の図である。
【図２】凝固カスケードのフローチャートである。
【図３】移植された医療機器の図である。
【図４Ａ】平均直径が異なるナノ粒子の血液適合性被覆の原子間力顕微鏡画像である。
【図４Ｂ】平均直径が異なるナノ粒子の血液適合性被覆の原子間力顕微鏡画像である。
【図４Ｃ】平均直径が異なるナノ粒子の血液適合性被覆の原子間力顕微鏡画像である。
【図４Ｄ】平均直径が異なるナノ粒子の血液適合性被覆の原子間力顕微鏡画像である。
【図５Ａ】ナノ粒子の血液適合性被覆の走査電子顕微鏡画像である。
【図５Ｂ】ナノ粒子の血液適合性被覆の走査電子顕微鏡画像である。
【図５Ｃ】ナノ粒子の血液適合性被覆の走査電子顕微鏡画像である。
【図５Ｄ】ナノ粒子の血液適合性被覆の走査電子顕微鏡画像である。
【図５Ｅ】ナノ粒子の血液適合性被覆の走査電子顕微鏡画像である。
【図５Ｆ】ナノ粒子の血液適合性被覆の走査電子顕微鏡画像である。
【図６Ａ】５０ｎｍのナノ粒子の血液適合性被覆についてのＧＩＳＡＸＳ（微小角入射Ｘ線小角散乱）画像である。
【図６Ｂ】５０ｎｍのナノ粒子の血液適合性被覆についてのＧＩＳＡＸＳスペクトルの図である。
【図６Ｃ】１２ｎｍのナノ粒子の血液適合性被覆についてのＧＩＳＡＸＳ画像である。
【図６Ｄ】１２ｎｍのナノ粒子の血液適合性被覆についてのＧＩＳＡＸＳスペクトルの図である。
【図７Ａ】粒子径および濃度の関数としての、懸濁液中のナノ粒子についての固有の凝固活性の時間依存性のプロットである。
【図７Ｂ】粒子径および濃度の関数としての、懸濁液中のナノ粒子についての固有の凝固活性の時間依存性のプロットである。
【図７Ｃ】粒子径および濃度の関数としての、懸濁液中のナノ粒子についての固有の凝固活性の時間依存性のプロットである。
【図７Ｄ】粒子径および濃度の関数としての、懸濁液中のナノ粒子についての固有の凝固活性の時間依存性のプロットである。
【図８】ナノ粒子径の関数としての、懸濁液中のナノ粒子についての固有の凝固活性のプロットである。
【図９】ナノ粒子径および濃度の関数としての、懸濁液中のナノ粒子についての固有の凝固活性のプロットである。
【図１０Ａ】９０分間の定温放置後の、大きさが異なるナノ粒子の血液適合性被覆に対する固有の凝固活性のプロットである。
【図１０Ｂ】１８０分間の定温放置後の、大きさが異なるナノ粒子の血液適合性被覆に対する固有の凝固活性のプロットである。
【図１０Ｃ】３００分間の定温放置後の、大きさが異なるナノ粒子の血液適合性被覆に対する固有の凝固活性のプロットである。
【図１１Ａ】大きさが異なるナノ粒子の血液適合性被覆に付着した血小板の光学顕微鏡画像である。
【図１１Ｂ】大きさが異なるナノ粒子の血液適合性被覆に付着した血小板の光学顕微鏡画像である。
【図１１Ｃ】大きさが異なるナノ粒子の血液適合性被覆に付着した血小板の光学顕微鏡画像である。
【図１１Ｄ】大きさが異なるナノ粒子の血液適合性被覆に付着した血小板の光学顕微鏡画像である。
【図１１Ｅ】大きさが異なるナノ粒子の血液適合性被覆に付着した血小板の光学顕微鏡画像である。
【図１１Ｆ】大きさが異なるナノ粒子の血液適合性被覆に付着した血小板の光学顕微鏡画像である。
【図１２】大きさが異なるナノ粒子の血液適合性被覆に付着した血小板の数のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
本明細書中に記載するように、直径またはたとえば幅などの最も幅広の寸法が約１００ｎｍ未満であるナノ粒子などの特徴から形成される高曲率の表面は血液適合性を呈する。たとえば、高曲率の血液適合性表面は、表面の近傍での血液の固有の凝固活性を制限して、こうして被覆または表面でのフィブリン塊の形成を防止することができる。さらに、高曲率の血液適合性表面は血小板の付着を制限して、こうして表面での血小板血栓および／または塊の形成を防止することができる。
【００２１】
場合によっては、医療機器が患者の血液に触れると、血液凝固および／または血小板の集積などの好ましくない生物学的反応が起こる可能性がある。高曲率の血液適合性表面で医療機器を被覆することにより、またはそのような表面を有するそのような機器を形成することにより、これらの好ましくない生物学的反応を軽減することができる。
【００２２】
血液適合性被覆の構造および製作
図１Ａおよび図１Ｂを参照して、１つの実施形態では、基板１４上の血液適合性被覆１０は、ほぼ半球状である三次元に湾曲した特徴などの高曲率を有する特徴（すなわち曲率半径が小さい材料）を含む。たとえば、図１Ａに示されるように、血液適合性被覆１０は、基板１４上に配設されるナノ粒子１２から形成され得る。異なる例では、ナノ粒子１２の直径は、約１００ｎｍ未満、たとえば約８５ｎｍ未満であり得る。たとえば、さまざまな例では、ナノ粒子１２の直径は、約４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、８５、９０、または９５ｎｍであり得る。例によっては、血液適合性被覆１０の二乗平均平方根（ＲＭＳ）粗さは約１０ｎｍ未満、または約０．５ｎｍから約１０ｎｍの間である。
【００２３】
ナノ粒子１２は生体適合性材料から形成可能である。例によっては、ナノ粒子１２は、シリカ（ＳｉＯ２）、二酸化チタン（ＴｉＯ２）、ジルコニア（ＺｒＯ２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、または生体適合性セラミックなどの別のセラミックなどのセラミック材料から形成され得る。場合によっては、ナノ粒子１２は、たとえば溶液系合成手順によって製作可能である。場合によっては、たとえば、気相成長プロセス、溶射熱分解手法、化学沈殿手法、またはナノ粒子の成長に対する別の手法でナノ粒子１２を基板１４の表面上に成長させることができる。例によっては、ナノ粒子１２は、生体適合性ポリマーなどのポリマーから形成可能である。たとえば、ナノ粒子１２を形成するのに、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリアクリレート誘導体、セルロース、およびキチンを用いることができる。
【００２４】
例によっては、血液適合性被覆１０中のナノ粒子１２は、ファンデルワールス相互作用、静電相互作用、水素結合、または別の種類の化学的相互作用などの化学的相互作用を介して互いと相互作用することができる。例によっては、ナノ粒子１２は、官能化されてともに結合してナノ粒子の架橋ネットワークを形成することができる。たとえば、ナノ粒子１２は、他のナノ粒子１２または他のリガンドの末端基と結合することができる末端基を有するリガンドで官能化され得る。
【００２５】
基板１４は、所望の機能または性質を与える任意の材料であり得る。たとえば、基板１４は、患者の体の中に移植される医療機器または体外で血液を扱う医療機器であり得る。たとえば、被覆１０が冠動脈ステントに適用される場合、基板１４は冠動脈ステントの材料であり得る。例によっては、基板１４は、ナノ粒子１２を基板１４に化学的に結合するように官能化され得る。たとえば、基板１４は、シリカナノ粒子に共有結合することができるシロキサン末端分子で官能化され得る。
【００２６】
例によっては、エタノールなどのアルコール中のナノ粒子１２の分散液を基板１４上に回転塗布することによって、ナノ粒子１２の血液適合性被覆１０を形成することができる。たとえば、エタノール中のナノ粒子１２の分散液を基板１４上に回転塗布することができる。例によっては、エタノールなどのアルコール中のナノ粒子１２の分散液の中に基板１４を浸漬被覆することによって、ナノ粒子１２の被覆１０を形成することができる。例によっては、回転塗布または浸漬被覆の後に続いて被覆１０をアニールして、たとえば被覆１０中のナノ粒子１２同士の間の化学的相互作用（たとえばファンデルワールス結合）を促進することができる。
【００２７】
ナノ粒子１２の被覆１０の厚みは、１ｍｍ未満、たとえば約５００ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約２５ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満であり得る。たとえば、約２層のナノ粒子１２から被覆１０を形成することができ、そのため、被覆１０の厚みはナノ粒子１２の直径の約２倍であり得る。２層未満のナノ粒子１２から形成される被覆１０は基板１４の露出区域を有する可能性があり、これは血液適合性被覆１０の有効性を低減してしまう。被覆１０が厚すぎる（たとえば約１ｍｍよりも厚い）と、被覆１０は容易に割れてしまう可能性がある。
【００２８】
ナノ粒子１２の被覆１０の厚みは、エタノール中のナノ粒子１２の濃度、回転塗布の回転数、回転塗布器の加速、回転塗布の繰返し数、および他のパラメータなどのプロセスパラメータを変えることによって制御可能である。たとえば、エタノール中のナノ粒子の重量パーセント濃度は、約０．０５重量％〜約１０重量％の範囲、たとえば約１．３重量％、約３．０重量％、または約４．０重量％であり得る。回転塗布の回転数は、約１００ｒｐｍ〜約１００００ｒｐｍの範囲、たとえば約１０００ｒｐｍ、約２０００ｒｐｍ、または約３０００ｒｐｍであり得る。回転塗布器の加速は約４００ｒｐｍ／秒〜４０００ｒｐｍ／秒の範囲であり得る。
【００２９】
被覆１０中のナノ粒子１２は密に詰められる。たとえば、被覆１０中の充填率（すなわち、ナノ粒子１２が占める被覆１０中の空間の割合）は、少なくとも約５０％、たとえば少なくとも約６０％、６５％、または７０％である。
【００３０】
例によっては、ナノ粒子１２の血液適合性被覆１０の形成に対する他の手法を用いることができる。場合によっては、ナノ粒子１２を基板１４上に噴霧被覆することができる。場合によっては、たとえば気相成長プロセスで基板１４上に直接にナノ粒子１２を成長させることができる。場合によっては、ナノ粒子の被覆の形成に対するラングミュアー−ブロジェット手法、溶媒中の分散液からのナノ粒子のレイヤバイレイヤ成長（layer-by-layer deposition）、噴霧熱分解手法、化学沈殿手法、または別の手法によって表面上にナノ粒子１２を配設することができる。ラングミュアー−ブロジェット法では、適切な界面活性剤を有する有機溶媒中のナノ粒子の分散液が水表面に広げられて水表面上にナノ粒子の膜を作る。ナノ粒子の膜は水表面から固体表面に移される。レイヤバイレイヤ法では、正に荷電したナノ粒子分散液および負に荷電したナノ粒子分散液が調製される。基礎となる基板が正に荷電される場合、基板は負に荷電した粒子分散液の中に浸漬され、次に正に荷電された粒子分散液の中に浸漬される。ナノ粒子は電気力によって基礎となる基板の上に堆積される。噴霧熱分解手法では、適切な条件下で熱を用いて基板に対して前駆体溶液が噴霧される。化学沈殿では、基板は前駆体溶液の底に置かれる。ナノ粒子は酸化還元反応などの反応によって前駆体溶液から作り出され、基板の上に直接に沈殿される。
【００３１】
図１Ｂを参照して、実施形態によっては、血液適合性表面２０は、基板２６の表面２４上に、出っ張りまたは山および谷などの三次元の高度に湾曲した特徴を含むことができる。特徴はほぼ半球状であり得る。たとえば、特徴２２の曲率半径は、５０ｎｍ未満、たとえば４２．５ｎｍ未満であり得る。たとえば、一例では、特徴２２の曲率半径は、約２、３、４、５、６、７、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｍであり得る。
【００３２】
表面２０は、基板２６の表面２４をエッチング（たとえばウェットエッチングまたはプラズマエッチング）して、表面２４上に出っ張りまたは山および谷などの高度に湾曲したナノ構造２２を形成することによって形成され得る。たとえば、最大曲率半径が約５０ｎｍ未満または約４２．５ｎｍ未満である表面特徴を表面にエッチングすることができる。例によっては、血液適合性被覆２０のＲＭＳ粗さは約１０ｎｍ未満、または約０．５ｎｍから約１０ｎｍの間である。
【００３３】
基板の材料をエッチングするのに、たとえば基板の材料を異方性エッチングするのに、ウェットエッチ用化学物質またはプラズマエッチ用化学物質を選択することができる。場合によっては、シリカをエッチングすることができる化学物質を用いたウェット化学エッチングを用いてナノ構造化ＳｉＯ２表面を形成することができる。シリカをエッチングすることができるウェットエッチ用化学物質の例は、たとえば、水酸化カリウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、エチレンジアミンピロカテコール、およびフッ化水素酸を含む。場合によっては、シリカをエッチングすることができる化学物質を用いたプラズマエッチングを用いてナノ構造化ＳｉＯ２表面を形成することができる。シリカをエッチングすることができるプラズマエッチ用化学物質の例は、たとえば、フッ化水素酸、および（フッ化アンモニウムとフッ化水素酸とを含む）バッファリングされた酸化物エッチを含む。他のウェットエッチまたはプラズマエッチ用化学物質を用いて他の組成の基板をエッチングすることができる。
【００３４】
場合によっては、エッチングされたまたは機械加工されたナノ構造化基板を医療機器に適用することができる。場合によっては、医療器の表面それ自体が、高度に湾曲したナノ構造が直接に医療機器の上に形成されるようにエッチングまたは機械加工される基板であり得る。
【００３５】
いくつかの実施形態では、薄膜に約１０ｎｍ未満または約０．５ｎｍから約１０ｎｍの間のＲＭＳ粗さなどの高度な粗さをもたせる堆積条件下で材料の薄膜を基板の上に堆積することによって、血液適合性被覆を形成することができる。たとえば、最大曲率半径が約５０ｎｍ未満または約４２．５ｎｍ未満である表面特徴に相関する粗さを有する表面を生じるように堆積条件を制御することができる。場合によっては、そのような薄膜を医療機器の表面に直接に堆積することができる。
【００３６】
高度に湾曲したナノ構造を有する表面を形成するのに他の製作手法も用いることができる。例によっては、基板を機械加工して基板の表面上にナノ構造を形成することができる。例によっては、ナノ構造化特徴を含む型からナノ構造化表面を形成することを含むナノインプリント手法を用いて機器を形成することができる。たとえば、電子線リソグラフィもしくは他のリソグラフィ技術を用いて、または既存のナノ粒子層から型を形成することによって、ナノ構造化特徴を有する型を形成することができる。高曲率のポリマー表面は、ナノ構造化型に基づく熱または光ナノインプリントリソグラフィ（ＮＩＬ）を用いて製作することができる。熱ＮＩＬの場合、熱可塑性ポリマー膜を基板の上に形成し、適切な圧力で型を押圧して試料と接触させる。ポリマーのガラス転移温度よりも高く加熱されると、型上のパターンが軟化した熱可塑性ポリマー膜の中に押込まれる。冷却の後、試料から型を外すと、パターンが基板上に残る。光ＮＩＬの場合、光硬化性ポリマー液体レジストが試料基板および型に塗布される。型および基板がともに押圧された後に、レジストがＵＶ光で硬化されて固体となる。型を外した後、同様のパターン転写プロセスを用いて、レジスト中のパターンを下にある材料に転写することができる。
【００３７】
血液適合性被覆および表面の使用
血液適合性被覆は、異物が対象の体内の血液に触れる際にまたは対象の血液が体外に位置する機器を通る際に起こる好ましくない生物学的反応のレベルを低減するのを助けることができる。図２に示されるように、医療機器などの異物が血液に触れると（２００）、（凝固カスケードと称される）タンパク質分解反応のカスケードに係る固有の血液凝固経路が活性化され、その結果、異物においてフィブリン塊の形成が生じてしまう。特に、第１２因子（ＦＸＩＩと称される）が異物の表面に吸着し（２０４）、変性して、こうして第１２ａ因子（ＦＸＩＩａと称される）に活性化される（２０６）。たとえば、親水性または負に荷電した表面はしばしば、ＦＸＩＩの変性および活性化のための高度に活性の材料である。固有の血液凝固カスケードは、ＦＸＩＩａへのＦＸＩＩの活性化の後に始まり（２０８）、これは究極的にトロンビン生成（２１０）という結果となるが、これはフィブリノゲンをフィブリンに変化させて異物の近傍でフィブリン塊の形成を生じさせる（２１２）物質である。さらに、たとえば血液中への異物の導入の数分内に血小板が異物に付着する（２１４）可能性がある。付着した血小板は活性化され得（２１６）、異物の領域に血小板血栓の形成を生じる（２１８）。
【００３８】
血液適合性表面の存在は、表面に露出される血液中の固有の凝固活性の度合いを低減することができる。すなわち、ＦＸＩＩが血液適合性被覆に吸着する能力は、ＦＸＩＩが同じ組成の平らな表面に吸着する能力よりも低く、そのため、固有の凝固カスケードは血液適合性表面の存在下では弱められ得る。血液適合性被覆による凝固カスケードの低減された活性は、次に、被覆の近傍でのフィブリン塊の形成を制限することができる。
【００３９】
さらに、血液適合性表面の存在下では血小板の付着も低減することができる。すなわち、血小板が血液適合性表面に付着する能力は血小板が同じ組成の平らな表面に付着する能力よりも低く、そのため血液適合性表面の存在下では血小板の付着の度合いを低減することができる。血液適合性表面に対する低減された血小板付着は、次に、表面での血小板血栓の形成を制限することができる。
【００４０】
理論によって拘束されなければ、血液適合性表面上でのＦＸＩＩの制限された変性は、表面の高い表面曲率（たとえば、血液適合性表面を形成するナノ粒子または表面特徴の高い曲率）によると考えられる。さらに、血液適合性表面上での血小板の制限された変性も表面の高い表面曲率によるものである。すなわち、任意の組成の高曲率の表面は、表面上の高度に湾曲した特徴の（単位面積当たりの）濃度が十分に高ければ、ＦＸＩＩ変性および血小板付着を制限することができる。そのような高曲率表面はこのように、フィブリン塊および血小板血栓の形成を大幅に低減することができる。たとえば、ＳｉＯ２ナノ粒子から形成される表面などの高曲率の表面は、表面の材料（ＳｉＯ２）がそれ自体血液適合性材料でなくても、血液適合性であり得る。
【００４１】
図３を参照して、いくつかの実施形態では、被覆１０を移植可能医療機器３０のための被覆として適用可能である。たとえば、移植可能医療機器３０を、たとえば移植前の浸漬被覆によって被覆１０で被覆することができる。図３の例では、移植可能医療機器３０は人工股関節であるが、被覆１０は、他の人工関節、人工血管、ステント、移植蝸牛刺激装置、ペースメーカー、移植可能除細動器、骨ねじおよび骨プレート、冠動脈ステント、他の移植可能医療機器などの他の移植可能医療機器に適用可能である。医療機器３０が患者の体３２内に移植されると、被覆１０の血液適合性は、移植に関連の炎症および／または血液塊の形成などの、好ましくない生物学的反応の発生および深刻度を低減することができる。さらに、被覆１０は移植された医療機器３０と体３２との間の障壁となることができ、こうして、移植医療機器３０用により幅広い範囲の材料が利用可能になり得る。たとえば、移植可能医療機器３０を、安価で、容易に利用可能で、血液適合性でない、および／または生体適合性でない材料から形成することができる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、被覆１０を、体外で血液を扱う医療機器のための被覆として適用可能である。たとえば、被覆１０は、透析機材内の被覆、献血および輸血機材、ならびに体外で血液を扱う、たとえば中に入れるまたは移送する他の医療機器として適用可能である。被覆１０の血液適合性は、医療機器が扱う血液中の血液塊または他の好ましくない反応の発生または深刻度を低減することができる。さらに、被覆１０は医療機器と機器が扱う血液との間の障壁となることができ、こうして医療機器用により幅広い範囲の材料が利用可能になり得る。
【実施例】
【００４３】
以下の実施例で発明をさらに説明するが、これは請求項に記載される発明の範囲を限定するものではない。
【００４４】
以下の実施例は、ナノ粒子の血液適合性被覆の製作に対する手法を示す。実施例はさらに、ナノ粒子の懸濁液中でのおよびナノ粒子の血液適合性被覆上での固有の凝固活性を実証する。実施例は、ナノ粒子の血液適合性被覆に対する血小板の付着も実証する。
【００４５】
実施例１−ナノ粒子の血液適合性被覆の調製
さまざまな大きさのシリカナノ粒子の血液適合性被覆をＳｉウェハ基板上に製作した。水中の５ｍＬのシリカナノ粒子分散液（さまざまな大きさおよび製造者；表１を参照）を、４４．５ｍＬのエタノール中の０．５ｍＬのＨＣｌ（水性）の強く攪拌された溶液に加えた。水中の１２ｎｍ、２２ｎｍ、５０ｎｍ、および８５ｎｍのナノ粒子の濃度は４０重量％であり、水中の７ｎｍのナノ粒子の濃度は３０重量％であり、４ｎｍのナノ粒子の濃度は１５重量％であった。エタノール中の各々のナノ粒子分散液を、１０Ｋ分子量分離透析膜（フィッシャーサイエンティフィック（Fisher Scientific））の中に置き、エタノールに対して数回透析した。
【００４６】
【表１】
2015066450.tif 000003
【００４７】
１ｃｍ２片のＳｉウェハを基板として用いた。基板をアセトンおよびエタノール中で超音波処理し、窒素流下で乾燥させ、酸素プラズマで１０分間処理した。酸素プラズマ処理の直後に、エタノール中の各々の透析済ナノ粒子分散液を３０００ｒｐｍで１６０秒間基板上に回転塗布した。被覆した基板を１００℃で１０分間アニールしてＤＩ水およびエタノールで濯いだ。
【００４８】
各々のナノ粒子被覆の屈折率を偏光解析法で測定したところ、約１．３１であった。この屈折率は約６８％の充填率（すなわち、ナノ粒子が被覆中の空間の約６８％を占める）に相当し、このことは、被覆中のナノ粒子が密に詰まっていることを示す。偏光解析法は、ストークス偏光解析器（Stokes Ellipsometer）ＬＳＥ（ガートナー（Gaertner）（登録商標）、サイエンティフィックコーポレイション（Scientific Corporation）、イリノイ州スコーキ）を用いて行なった。
【００４９】
ナノ粒子被覆の厚みは、エタノール中のナノ粒子の濃度および回転塗布の回転数などのパラメータを変えることによって変更することができる。各々のナノ粒子被覆の厚みの偏光解析測定を各被覆中の９つの点で行なって被覆の均一性を定量化した。さまざまなナノ粒子径、濃度、および回転数について得られた被覆の厚みを表２に示す。一般的に、各ナノ粒子被覆毎の９つの測定値は互いから約１ｎｍ内にあり、これは高度に均一な厚みを示す。
【００５０】
【表２】
2015066450.tif 000004
【００５１】
図４Ａから図４Ｄを参照して、それぞれ８５ｎｍ、５０ｎｍ、２２ｎｍ、および１２ｎｍ径のナノ粒子の血液適合性被覆について原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を取得した。これらのＡＦＭ画像は、血液適合性被覆の各々を形成するナノ粒子が実質的に大きさが均一であることを示す。
【００５２】
各々の被覆の二乗平均平方根（ＲＭＳ）粗さもＡＦＭで測定した。各々の被覆の５００ｎｍ×５００ｎｍの面積についてのＲＭＳ粗さの値を表３に列挙する。ＲＭＳ粗さは、ナノ粒子の直径が小さくなるにつれて単調に減少し、このことは、被覆を形成するナノ粒子の大きさを制御することによって血液適合性被覆の表面トポロジーを制御可能であることを示唆する。ＡＦＭ画像化および測定は、ＤＩ−３００原子間力顕微鏡（ビーコ（Veeco）、ニューヨーク州プレーンビュー）を用いて、タッピングモードで行なった。
【００５３】
【表３】
2015066450.tif 000005
【００５４】
図５Ａ−図５Ｆは、公称直径が８５ｎｍ、５０ｎｍ、２２ｎｍ、１２ｎｍ、７ｎｍ、および４ｎｍのナノ粒子の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。ＳＥＭを用いて、ナノ粒子被覆の厚みおよびナノ粒子の実際の直径を特徴付けた。これらの値を表３に示す。一般的に、ナノ粒子の実際の直径は、ナノ粒子の公称直径（すなわち、製造者が提供するような直径）よりもわずかに大きかった。以下の実施例では、ナノ粒子の述べられる直径はナノ粒子の公称直径である。Ｓ−５２００走査電子顕微鏡（株式会社日立ハイテクノロジーズ、日本、東京）を用いて、電界放出ＳＥＭ画像化および測定を行なった。
【００５５】
微小角入射Ｘ線小角散乱（ＧＩＳＡＸＳ）を用いて、ナノ粒子被覆の形態および組織を調査した。高輝度光化学研究センターのスプリング８シンクロトロンでビームラインＢＬ０３ＸＵを用いて１２．４ｋｅＶおよび８．３ｋｅＶでＸ線を生成した。ナノ粒子被覆試料から２３３０ｍｍの所に位置決めした電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（１３４４×１０２４画素、６３μｍ／画素）を用いて、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）パターンを検出した。角度スケールの較正は、コラーゲン標準試料（ｄ間隔：６５．３ｎｍ）を用いて行なった。ＧＩＳＡＸＳは、シリコン基板の臨界角よりも大きな入射角（１２．４ｋｅＶでαc＝０．１°）で行なった。
【００５６】
図６Ａおよび図６Ｂは、５０ｎｍのナノ粒子の血液適合性被覆についてのＧＩＳＡＸＳ画像およびスペクトルをそれぞれ示す。図６Ｃおよび図６Ｄは、１２ｎｍのナノ粒子の血液適合性被覆についてのＧＩＳＡＸＳ画像およびスペクトルをそれぞれ示す。実験で観察されたＧＩＳＡＸＳスペクトル６０、６２、およびシミュレーションされたＧＩＳＡＸスペクトル６４、６６が示される。ＧＩＳＡＸＳスペクトルは、鮮明な面内ブラッグピークを提示し、これは被覆中の高秩序のナノ粒子を示す。ピークの位置を用いて被覆中のナノ粒子の直径を算出することができる。これらの算出結果を表４に示す。面内では、１２ｎｍ以上のナノ粒子についてのより高いｑｘ値で付加的な回折が観察され、これはナノ粒子による散乱を示す。
【００５７】
【表４】
2015066450.tif 000006
【００５８】
実施例２−ナノ粒子の懸濁液中での凝固活性
大きさが異なるシリカナノ粒子の懸濁液中の時間依存性固有血液凝固活性を評価した。平らなＳｉＯ２ガラスを対照試料として用いた。凝血原（すなわち、ナノ粒子または平らなガラス）の表面に対するＦＸＩＩ吸着は凝固カスケードの誘因であるため、固有の凝固活性は凝血原の表面積に依存する。このため、固有血液凝固活性も懸濁液中のシリカナノ粒子の合計表面積の関数として評価した。
【００５９】
溶液中の固有凝固活性の評価のためのナノ粒子試料を調製するため、１０ｍＬの０．１ＭのトリスＨＣｌ、０．６ｍＬの５ＮのＮａＣｌ（水性）、０．４ｍＬの０．５ＭのＣａＣｌ２（水性）、０．５ｍＬの２ｍＭのホスファチジルセリン（水性）（シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich））、０．４ｍＬの５ｍＭのＳ−２２３８（水性）（クロモジェニックス（Chromogenix）、イタリア、ミラノ）、および０．５ｍＬのヒト血漿（血漿対照Ｎ（Plasma Control N）、ジーメンスヘルスケア（Siemens Healthcare）、ペンシルベニア州マルバーン）から試料溶液を形成した。
【００６０】
所望の大きさ（４ｎｍ、７ｎｍ、１２ｎｍ、２２ｎｍ、５０ｎｍ、および８５ｎｍの直径）のシリカナノ粒子の分散液を所望の濃度で加えて、ナノ粒子の所望の合計表面積を達成した。試料の合計容積が１８ｍＬになるまでＤＩ水を加えた。試料の１８０μＬのアリコートを生物学的に不活性のＭＰＣポリマー（ポリ２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）被覆９６ウェルプレート（リピジュア（登録商標）コートＳ−Ｆ９６、日油株式会社、日本、東京）の中に注いで、３７℃で少なくとも４５０分間までの間定温放置し、試料との接触によるトロンビンの生成を可能にした。定温放置の後、４０５ｎｍでの各試料の吸収率をマイクロプレートリーダで測定し、生成されたトロンビンの量を定量化し、これを凝固活性の尺度として用いた。
【００６１】
平らなガラスの対照試料を調製するため、ガラスのカバースリップをアセトンおよびエタノール中で超音波処理し、窒素流下で乾燥させた。基板を（ナノ粒子を含まない）試料溶液中に定温放置し、上述のように評価した。
【００６２】
図７Ａ−図７Ｄは、さまざまな大きさのナノ粒子についての、ならびに１８０μＬのアリコート（図７Ａ）中のナノ粒子の合計表面積が０．４ｃｍ２、ナノ粒子の合計表面積が２ｃｍ２（図７Ｂ）、ナノ粒子の合計表面積が４ｃｍ２（図７Ｃ）、およびナノ粒子の合計表面積が１０ｃｍ２（図７Ｄ）である試料についての固有凝固活性の時間依存性を示す。「平らな」試料は、表面積が０．４ｃｍ２である平らなガラス基板である。縦軸は定温放置後の４０５ｎｍでの光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を示し、これは生成されるトロンビンの量に対応し、凝固活性を示す。
【００６３】
表面積がナノ粒子の０．４ｃｍ２（図７Ａ）である場合、平らなガラスのみが固有血液凝固系を活性化した一方で、ナノ粒子はほとんど不活性であった。より大きな表面積については、凝固系の活性化は、より大きなナノ粒子についてより顕著となった。表面積が最も大きい（１０ｃｍ２のナノ粒子；図７Ｄ）については、ナノ粒子のすべてが固有の凝固系のいくらかの活性化を示した。すなわち、より小さなナノ粒子は、より大きなナノ粒子よりも高度に固有の血液凝固の活性化を抑制することができる。
【００６４】
３７℃での定温放置の６時間（３００分）後のナノ粒子の表面積が２ｃｍ２および４ｃｍ２であるナノ粒子の固有の凝固活性も測定した。ＭＰＣポリマー被覆ウェルプレートを、その生物学的に不活性の性質により、対照として用いた。
【００６５】
図８の棒グラフに示されるように、定温放置の５時間後の固有の凝固活性はナノ粒子の大きさに対する明確な依存性を有し、固有の凝固活性はナノ粒子の大きさの減少とともに低くなった。縦軸は４０５ｎｍでのＯ．Ｄ．を示す。表面積が２ｃｍ２での最も小さなナノ粒子（４ｎｍ、７ｎｍ、および１２ｎｍ）の固有の凝固活性は一般的に、生物学的に不活性のＭＰＣ対照試料にほぼ匹敵する。
【００６６】
図９のグラフに示されるように、９０分間の定温放置後の固有の凝固活性をナノ粒子径および濃度の関数として測定した。縦軸は４０５ｎｍでのＯ．Ｄ．を示す。各々のナノ粒子の大きさは凝固活性の活性化についての対応するしきい値濃度を有し、これは、固有の凝固経路が、臨界量のＦＸＩＩが凝血促進性表面に吸着されてＦＸＩＩａに活性化された後でのみ活性化されることを示唆する。このしきい値濃度はナノ粒子の大きさの減少とともにより高くシフトするが、これはより大きなナノ粒子が所与のナノ粒子濃度についてより多くのＦＸＩＩを活性化することを示唆する。すなわち、より低い曲率（より大きな直径）の表面は凝固系の活性がより高い。これらの結果は、平らなガラスが、試験された最大のナノ粒子すらよりも活性が高いことを示した図６Ａ−図６Ｄの結果と整合する。
【００６７】
ゼータサイザーナノ（Zetasizer Nano）（マルバーンインスツルメンツリミテッド（Malvern Instrument Ltd.）、英国、ウスターシャー）を用いて流体力学測定を行なって、以上の実験で用いたナノ粒子懸濁液中のナノ粒子の凝集体の大きさを求めた。以下の表５はｐＨ９．０およびｐＨ７．４での各々の公称ナノ粒子直径毎の平均粒子径をそれぞれ示す。ｐＨ９．０の水中では、シリカナノ粒子は、４ｎｍ直径の粒子を除き、粒子間の電気斥力により、ほとんど単一の粒子として分散される。すなわち、シリカナノ粒子の平均粒子径はナノ粒子の公称直径とほとんど同じである。ｐＨ＝７．４の溶媒中では、すべての大きさのナノ粒子が凝集する。公称ナノ粒子直径の増大に伴う凝集体の大きさの増大は単調ではなかった。このため、ナノ粒子直径に対する凝固活性の依存性を示す以上の結果は、凝固活性はナノ粒子凝集体の大きさに依存するが、むしろ凝集活性は表面上の特徴（すなわち血液適合性被覆中のナノ粒子）の表面曲率に依存することを必ずしも示唆するものではない。
【００６８】
【表５】
2015066450.tif 000007
【００６９】
実施例３−高曲率の血液適合性被覆上での凝固活性
さまざまな大きさのナノ粒子から形成される高曲率の血液適合性被覆で被覆された基板上での固有血液凝固活性を特徴付けた。平らなＳｉＯ2基板および生物学的に不活性のＭＰＣポリマー基板を対照試料として用いた。
【００７０】
シリカナノ粒子の血液適合性被覆を実施例１に記載のように調製して、血液適合性ナノ粒子被覆で５ｍｍφのカバーガラスの両側を被覆した。平らなＳｉＯ2基板を実施例２に記載のように調製した。
【００７１】
１０ｍＬの０．１ＭのトリスＨＣｌ、０．６ｍＬの５ＮのＮａＣｌ（水性）、０．４ｍＬの０．５ＭのＣａＣｌ２（水性）、０．５ｍＬの２ｍＭのホスファチジルセリン（水性）、０．４ｍＬの５ｍＭのＳ−２２３８（水性）、および０．５ｍＬのヒト血漿から試料溶液を形成した。実施例１に記載の手法に従って、５ｍｍ×５ｍｍのガラスのカバースリップをナノ粒子で被覆して、ＭＰＣ被覆９６ウェルプレートの中に置いた。試料の１８０μＬのアリコートを各々のカバースリップの上に注いで、３７℃で少なくとも３００分までの間定温放置して、基板との接触によるトロンビンの生成を可能にした。定温放置の後、４０５ｎｍでの各試料の吸収率をマイクロプレートリーダで測定し、生成されたトロンビンの量を定量化し、これを凝固活性の尺度として用いた。
【００７２】
図１０Ａ−図１０Ｃの棒グラフを参照して、（４０５ｎｍでの光学濃度として測定される）ナノ粒子被覆上での凝固活性が、９０分の定温放置（図１０Ａ）、１８０分の定温放置（図１０Ｂ）、および３００分の定温放置（図１０Ｃ）の後に、特徴付けられた。縦軸は４０５ｎｍでのＯ．Ｄ．を示す。これらの結果は、凝固活性が被覆の曲率（すなわち被覆中のナノ粒子の直径）に依存することを示す。９０分の定温放置（図１０Ａ）の後、平らなガラスはほぼ飽和レベルまで凝固を活性化した一方で、ナノ粒子で被覆された表面は凝固系をほとんど活性化しなかった。これらのデータは、ナノ粒子で被覆された表面が平らな表面よりも固有の凝固についてより活性が低いことを示唆する。追加の定温放置の後、凝固系は、図１０Ｂおよび図１０Ｃに示されるように、ナノ粒子で被覆された表面によって徐々にさらに活性化された。一般的に、平らなガラス上よりも、高曲率の表面（すなわち小さなナノ粒子の被覆）上でより低い凝固活性が生じた。凝固活性は、調査した被覆のうち最も低い凝固活性を実証した２２ｎｍ直径のナノ粒子の被覆までナノ粒子の大きさを小さくするにつれて低くなった。さらにより小さなナノ粒子は増大した凝固活性を示したが、その活性は平らなガラス上での凝固活性よりも低かった。
【００７３】
表面上での凝固活性についての結果は、ナノ粒子の懸濁液中での凝固活性についての結果（実施例２）とはいくぶん異なっている。特に、ナノ粒子の懸濁液中での凝固活性はナノ粒子の大きさが小さくなるにつれて連続的に低くなった一方で、２２ｎｍ直径のナノ粒子被覆について凝固活性の極小値が観察された。血液適合性被覆中のナノ粒子は密に詰められ（実施例１）、およびしたがって被覆中のナノ粒子同士の間の距離は非常に短い。４ｎｍ直径のナノ粒子などの非常に小さなナノ粒子から形成される被覆については、ナノ粒子同士の間の距離は、凝固活性に係るタンパク質（たとえばＦＸＩＩ）の大きさよりも小さいものであり得る。理論によって拘束されなければ、タンパク質は、非常に小さなナノ粒子から形成される被覆を本質的に平らな表面として認識することがあり、したがってそのようなナノ粒子被覆上での凝固活性を増大させる可能性があると考えられる。
【００７４】
実施例４−高曲率の血液適合性被覆上での血小板付着
ナノ粒子被覆が血小板付着を防止する能力を特徴付けるため、さまざまな大きさのシリカナノ粒子被覆で被覆された基板を血小板の存在下で定温放置した。平らなＳｉＯ２基板および生物学的に不活性のＭＰＣポリマー基板を対照試料として用いた。各々の基板上に吸着した血小板の数および形態を特徴付けた。
【００７５】
シリカナノ粒子被覆を有する基板および平らなＳｉＯ２基板を実施例３に記載のように１ｃｍ２のシリコンウェハ上に調製した。平らなＭＰＣポリマー被覆表面を調製するため、１ｃｍ２のＳｉウェハをアセトンおよびエタノール中で超音波処理し、窒素流下で乾燥させた。次に基板を酸素プラズマで１０分間処理した。エタノール中の０．５重量％のＭＰＣポリマー（リピジュア（登録商標）−ＣＭ５２０６、日油株式会社、日本、東京）を基板上に回転塗布し（３０００ｒｐｍ、１６０秒）、周囲条件下で乾燥させた。
【００７６】
クエン酸加プール全血（バイオリクラメーションインク（Bioreclamation Inc.）、ニューヨーク州ウエストベリー）を３００Ｇで１０分間遠心分離し、上澄みを多血小板血漿（ＰＲＰ）として回収した。５％のＣＯ２の条件下で３７℃で３時間、ＭＰＣポリマー被覆２４ウェルプレート（リピジュア（登録商標）コートＳ−Ｆ２４、日油株式会社、日本、東京）上に、１ｍＬのＰＲＰとともに基板を定温放置した。基板を０．１Ｍのリン酸緩衝液で濯ぎ、一般的な手順に従って固定した。各々の基板上の吸着された血小板を光学顕微鏡で観察し、１００μｍ×１００μｍの面積当たりの血小板の数を数えた。
【００７７】
図１１Ａ−図１１Ｆは、４ｎｍの直径（図１１Ａ）、１２ｎｍの直径（図１１Ｂ）、２２ｎｍの直径（図１１Ｃ）、および８５ｎｍの直径（図１１Ｄ）のナノ粒子の被覆を有する表面に付着した血小板の光学顕微鏡画像（目盛：２０μｍ）を示す。平らなＳｉＯ２基板（図１１Ｅ）および平らなＭＰＣポリマー被覆（図１１Ｆ）に付着した血小板も示す。２２ｎｍ（図１１Ｃ）、５０ｎｍ、および８５ｎｍ（図１１Ｄ）の直径のナノ粒子の被覆が吸着した血小板は、より小さなナノ粒子の被覆が吸着した血小板よりも少ない。さらに、より大きなナノ粒子上に吸着した血小板は、より小さなナノ粒子上に吸着したものよりも、より丸い形態を有した。丸い血小板は血小板の最も活性化しなかった形態である。このため、これらの光学顕微鏡画像は、大きなナノ粒子上に吸着した血小板が大きく活性化されていないことを示し、これは血液の塊が大きなナノ粒子の被覆上に形成しないかもしれないことを示唆する。
【００７８】
図１２は、各ナノ粒子被覆毎のおよび２つの対照試料についての１００μｍ×１００μｍの面積に吸着した血小板の数のプロットを示す。平らなＳｉＯ２試料に吸着した血小板の数は、ナノ粒子被覆のうちのいずれに吸着した血小板の数よりも多かったが、このことは、８５ｎｍ以下の直径のシリカナノ粒子が平らなＳｉＯ２よりも有効に血小板の付着を防止することを示す。ナノ粒子の大きさは血小板の付着に確かに影響する。７ｎｍ直径のナノ粒子の被覆は吸着した血小板が最も多く、８５ｎｍ直径のナノ粒子の被覆は吸着した血小板が最も少なかった。さらに、８５ｎｍ直径のナノ粒子被覆は、高度に血液適合性の材料であるＭＰＣポリマーよりも吸着した血小板が少なかった。
【００７９】
他の実施形態
発明をその詳細な説明と関連して説明したが、以上の説明は例示を意図するものであり、添付の請求項の範囲によって規定される発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。他の局面、利点、および変形例が以下の請求項の範囲内に入る。
【符号の説明】
【００８０】
１０  血液適合性被覆、１２  ナノ粒子、１４  基板、２０  血液適合性表面、２２  特徴、２６  基板。
【図１Ａ】
2015066450.tif 000008
【図１Ｂ】
2015066450.tif 000009
【図２】
2015066450.tif 000010
【図３】
2015066450.tif 000011
【図６Ｂ】
2015066450.tif 000012
【図６Ｄ】
2015066450.tif 000013
【図４Ａ】
2015066450.tif 000014
【図４Ｂ】
2015066450.tif 000015
【図４Ｃ】
2015066450.tif 000016
【図４Ｄ】
2015066450.tif 000017
【図５Ａ】
2015066450.tif 000018
【図５Ｂ】
2015066450.tif 000019
【図５Ｃ】
2015066450.tif 000020
【図５Ｄ】
2015066450.tif 000021
【図５Ｅ】
2015066450.tif 000022
【図５Ｆ】
2015066450.tif 000023
【図６Ａ】
2015066450.tif 000024
【図６Ｃ】
2015066450.tif 000025
【図７Ａ】
2015066450.tif 000026
【図７Ｂ】
2015066450.tif 000027
【図７Ｃ】
2015066450.tif 000028
【図７Ｄ】
2015066450.tif 000029
【図８】
2015066450.tif 000030
【図９】
2015066450.tif 000031
【図１０Ａ】
2015066450.tif 000032
【図１０Ｂ】
2015066450.tif 000033
【図１０Ｃ】
2015066450.tif 000034
【図１１Ａ】
2015066450.tif 000035
【図１１Ｂ】
2015066450.tif 000036
【図１１Ｃ】
2015066450.tif 000037
【図１１Ｄ】
2015066450.tif 000038
【図１１Ｅ】
2015066450.tif 000039
【図１１Ｆ】
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【図１２】
2015066450.tif 000041
【外国語明細書】
2015066450000001.pdf