(57)【要約】【課題】本発明は、簡単な操作で迅速かつ高感度に検査を行うことが可能な微生物夾雑物検査用容器、微生物夾雑物検査キットおよび微生物夾雑物検査方法を提供することを主目的とする。【解決手段】本発明は、微生物夾雑物の検査に用いられる微生物夾雑物検査用容器であって、流体入口および流体出口を有する容器本体と、上記容器本体内に収納された試薬と、上記流体入口および上記流体出口を密閉する密閉部材とを有し、上記容器本体が積層可能であり、上記流体入口と上記流体出口とが気密嵌合可能であることを特徴とする微生物夾雑物検査用容器を提供することにより、上記課題を解決する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物夾雑物の検査に用いられる微生物夾雑物検査用容器であって、
流体入口および流体出口を有する容器本体と、
前記容器本体内に収納された試薬と、
前記流体入口および前記流体出口を密閉する密閉部材と
を有し、前記容器本体が積層可能であり、前記流体入口と前記流体出口とが気密嵌合可能であることを特徴とする微生物夾雑物検査用容器。
【請求項２】
前記容器本体内に設けられ、前記試薬を固定する固定部を有することを特徴とする請求項１に記載の微生物夾雑物検査用容器。
【請求項３】
前記微生物夾雑物がエンドトキシンまたは（１→３）−β−Ｄ−グルカンであり、前記試薬がライセート試薬、エンドトキシン標準品、（１→３）−β−Ｄ−グルカン標準品、発色合成基質または蛍光基質、あるいはライセート試薬と発色合成基質または蛍光基質との混合物であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微生物夾雑物検査用容器。
【請求項４】
請求項１から請求項３までのいずれかに記載の微生物夾雑物検査用容器を有することを特徴とする微生物夾雑物検査キット。
【請求項５】
前記微生物夾雑物検査用容器として、ライセート試薬が収納された第１微生物夾雑物検査用容器と、エンドトキシン標準品または（１→３）−β−Ｄ−グルカン標準品が収納された第２微生物夾雑物検査用容器、および、発色合成基質または蛍光基質が収納された第３微生物夾雑物検査用容器の少なくともいずれか一方とを有することを特徴とする請求項４に記載の微生物夾雑物検査キット。
【請求項６】
光学検出器をさらに有することを特徴とする請求項４または請求項５に記載の微生物夾雑物検査キット。
【請求項７】
請求項４から請求項６までのいずれかに記載の微生物夾雑物検査キットを用いて微生物夾雑物を検査する微生物夾雑物検査方法であって、
前記微生物夾雑物検査キットが、微生物夾雑物検査用容器として、第１試薬が収納された第１微生物夾雑物検査用容器を少なくとも有し、
前記第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口から容器本体内に液体試料を導入する第１工程を少なくとも有する反応工程と、
前記反応工程後、前記液体試料中の微生物夾雑物を光学的に測定する測定工程と
を有することを特徴とする微生物夾雑物検査方法。
【請求項８】
前記第１試薬がライセート試薬であり、前記第１工程では、前記容器本体内に前記液体試料を導入した後、前記液体試料中の微生物夾雑物および前記ライセート試薬を反応させることを特徴とする請求項７に記載の微生物夾雑物検査方法。
【請求項９】
前記微生物夾雑物検査キットが、前記微生物夾雑物検査用容器として、第２試薬が収納された第２微生物夾雑物検査用容器をさらに有し、
前記第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体上に前記第２微生物夾雑物検査用容器の容器本体が積層され、前記第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口および前記第２微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体出口が気密嵌合された積層容器を用いることを特徴とする請求項７または請求項８に記載の微生物夾雑物検査方法。
【請求項１０】
前記第２試薬がエンドトキシン標準品または（１→３）−β−Ｄ−グルカン標準品であることを特徴とする請求項９に記載の微生物夾雑物検査方法。
【請求項１１】
前記微生物夾雑物検査キットが、前記微生物夾雑物検査用容器として、第３試薬が収納された第３微生物夾雑物検査用容器をさらに有し、
前記第３微生物夾雑物検査用容器の容器本体上に前記第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体が積層され、前記第３微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口および前記第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体出口が気密嵌合された積層容器を用いることを特徴とする請求項７から請求項１０までのいずれかに記載の微生物夾雑物検査方法。
【請求項１２】
前記第１試薬がライセート試薬であり、前記第３試薬が発色合成基質または蛍光基質であり、
前記第１工程では、前記容器本体内に前記液体試料を導入した後、前記液体試料中の微生物夾雑物および前記ライセート試薬を反応させ、
前記反応工程が、前記第１工程後に、前記微生物夾雑物を含む前記ライセート試薬と前記発色合成基質または蛍光基質とを反応させる第２工程を有することを特徴とする請求項１１に記載の微生物夾雑物検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドトキシン、リポ多糖、（１→３）−β−Ｄ−グルカン等の微生物夾雑物の検査に用いられる微生物夾雑物検査用容器、微生物夾雑物検査キットおよび微生物夾雑物検査方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在する物質であり、発熱性等の種々の生物活性を有している。そのため、医薬品や医療用具がエンドトキシンで汚染された場合、ごく微量でも重篤な結果を招くことがあり、これらのエンドトキシン汚染量は厳密に管理されなければならない。
【０００３】
エンドトキシン検出試験には定性試験および定量試験があり、定性試験としてはゲル化法、定量試験としては比濁法、比色法、蛍光法が一般に知られている。いずれの方法においても、正確な検査を行うには煩雑な手順や長時間を要する。そのため、簡便な操作で迅速に検査を行うことが求められている。
【０００４】
例えば特許文献１には、エンドトキシン検査に必要な試薬がすべて封入された板状のカートリッジが提案されている。このようなカートリッジを用いることで、簡単な操作で迅速に検査を行うことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００７−５０１０２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に記載の板状のカートリッジには試薬が既に封入されているため、カートリッジ毎に検出感度が予め決められている。しかしながら、カートリッジ毎に検出感度のばらつきがあることから、エンドトキシンが検出されなかった場合において、カートリッジの検出感度が低いために検出できなかったのか、エンドトキシンが無いのかが判断できない場合がある。そのため、液体試料中のエンドトキシンが極微量である場合には、複数のカートリッジを用いて繰り返し検査を行わなければならない場合があり、エンドトキシン検査が煩雑になるという問題があった。
【０００７】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、簡単な操作で迅速かつ高感度に検査を行うことが可能な微生物夾雑物検査用容器、微生物夾雑物検査キットおよび微生物夾雑物検査方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は、微生物夾雑物の検査に用いられる微生物夾雑物検査用容器であって、流体入口および流体出口を有する容器本体と、上記容器本体内に収納された試薬と、上記流体入口および上記流体出口を密閉する密閉部材とを有し、上記容器本体が積層可能であり、上記流体入口と上記流体出口とが気密嵌合可能であることを特徴とする微生物夾雑物検査用容器を提供する。
【０００９】
本発明によれば、微生物夾雑物検査に使用される試薬が微生物夾雑物検査用容器に収納されているため、本発明の微生物夾雑物検査用容器を用いることにより簡単な操作で迅速に微生物夾雑物検査を行うことが可能である。また本発明によれば、試薬は容器本体内に収納されており、容器本体は積層可能であるため、目的に応じて試薬の種類や試薬の濃度等をカスタマイズできる。例えばエンドトキシン検査の場合、ライセート試薬が収納された容器本体を積層することでライセート試薬の濃度を高くし、エンドトキシンの検出感度を高めることも可能になる。
【００１０】
本発明の微生物夾雑物検査用容器は、上記容器本体内に設けられ、上記試薬を固定する固定部を有していてもよい。試薬を容器本体内に容易に固定することが可能になる。
【００１１】
また本発明においては、上記微生物夾雑物がエンドトキシンまたは（１→３）−β−Ｄ−グルカンであり、上記試薬がライセート試薬、エンドトキシン標準品、（１→３）−β−Ｄ−グルカン標準品、発色合成基質または蛍光基質、あるいはライセート試薬と発色合成基質または蛍光基質との混合物であることが好ましい。
【００１２】
また本発明は、上述の微生物夾雑物検査用容器を有することを特徴とする微生物夾雑物検査キットを提供する。
【００１３】
本発明によれば、上述の微生物夾雑物検査用容器を有するため、本発明の微生物夾雑物検査キットを用いることにより簡単な操作で迅速に微生物夾雑物検査を行うことが可能である。また本発明によれば、目的に応じて試薬の種類や試薬の濃度等をカスタマイズでき、例えば微生物夾雑物の検出感度を高めることも可能になる。
【００１４】
本発明の微生物夾雑物検査キットは、上記微生物夾雑物検査用容器として、ライセート試薬が収納された第１微生物夾雑物検査用容器と、エンドトキシン標準品または（１→３）−β−Ｄ−グルカン標準品が収納された第２微生物夾雑物検査用容器、および、発色合成基質または蛍光基質が収納された第３微生物夾雑物検査用容器の少なくともいずれか一方とを有することが好ましい。複数種類の微生物夾雑物検査用容器を組み合わせて用いることにより、目的に応じて微生物夾雑物検査キットの構成をカスタマイズすることができる。
【００１５】
また本発明の微生物夾雑物検査キットは、光学検出器をさらに有していてもよい。微生物夾雑物を光学的に測定することができる。
【００１６】
また本発明は、上述の微生物夾雑物検査キットを用いて微生物夾雑物を検査する微生物夾雑物検査方法であって、上記微生物夾雑物検査キットが、微生物夾雑物検査用容器として、第１試薬が収納された第１微生物夾雑物検査用容器を少なくとも有し、上記第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口から容器本体内に液体試料を導入する第１工程を少なくとも有する反応工程と、上記反応工程後、上記液体試料中の微生物夾雑物を光学的に測定する測定工程とを有することを特徴とする微生物夾雑物検査方法。
【００１７】
本発明によれば、上述の微生物夾雑物検査キットを用いるため、簡単な操作で迅速に微生物夾雑物検査を行うことが可能である。また、例えばエンドトキシン検査の場合、ライセート試薬の感度を確認するための測定をエンドトキシン標準品を用いて簡単に行うことも可能である。また本発明によれば、目的に応じて試薬の種類や試薬の濃度等をカスタマイズでき、例えば微生物夾雑物の検出感度を高めることも可能である。
【００１８】
上記発明においては、上記第１試薬がライセート試薬であり、上記第１工程では、上記容器本体内に上記液体試料を導入した後、上記液体試料中の微生物夾雑物および上記ライセート試薬を反応させてもよい。
【００１９】
また本発明においては、上記微生物夾雑物検査キットが、上記微生物夾雑物検査用容器として、第２試薬が収納された第２微生物夾雑物検査用容器をさらに有し、上記第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体上に上記第２微生物夾雑物検査用容器の容器本体が積層され、上記第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口および上記第２微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体出口が気密嵌合された積層容器を用いることが好ましい。複数種類の微生物夾雑物検査用容器を組み合わせて用いることにより、目的に応じた微生物夾雑物の検査が可能になる。
【００２０】
上記の場合、上記第２試薬がエンドトキシン標準品または（１→３）−β−Ｄ−グルカン標準品であってもよい。
【００２１】
また本発明においては、上記微生物夾雑物検査キットが、上記微生物夾雑物検査用容器として、第３試薬が収納された第３微生物夾雑物検査用容器をさらに有し、上記第３微生物夾雑物検査用容器の容器本体上に上記第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体が積層され、上記第３微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口および上記第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体出口が気密嵌合された積層容器を用いることも好ましい。複数種類の微生物夾雑物検査用容器を組み合わせて用いることにより、目的に応じた微生物夾雑物の検査が可能になる。
【００２２】
上記の場合、上記第１試薬がライセート試薬であり、上記第３試薬が発色合成基質または蛍光基質であり、上記第１工程では、上記容器本体内に上記液体試料を導入した後、上記液体試料中の微生物夾雑物および上記ライセート試薬を反応させ、上記反応工程が、上記第１工程後に、上記微生物夾雑物を含む上記ライセート試薬と上記発色合成基質または蛍光基質とを反応させる第２工程を有していてもよい。微生物夾雑物を高感度に検出することが可能になる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は、目的に応じて試薬の種類や試薬の濃度等をカスタマイズでき、簡単な操作で迅速かつ高感度に微生物夾雑物検査を行うことが可能であるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の微生物夾雑物検査用容器の一例を示す概略平面図および断面図である。
【図２】本発明の微生物夾雑物検査用容器の他の例を示す概略平面図および断面図である。
【図３】本発明の微生物夾雑物検査用容器の他の例を示す概略平面図および断面図である。
【図４】本発明の微生物夾雑物検査用容器の他の例を示す概略平面図および断面図である。
【図５】本発明の微生物夾雑物検査用容器の使用方法の一例を示す概略平面図および断面図である。
【図６】本発明の微生物夾雑物検査用容器の使用方法の他の例を示す概略平面図および断面図である。
【図７】本発明における光学検出器の一例を示す模式図である。
【図８】本発明における光学検出器の他の例を示す模式図である。
【図９】本発明の微生物夾雑物検査キットの使用方法の一例を示す概略平面図および断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の微生物夾雑物検査用容器、微生物夾雑物検査キットおよび微生物夾雑物検査方法について詳細に説明する。
【００２６】
Ａ．微生物夾雑物検査用容器
本発明の微生物夾雑物検査用容器は、微生物夾雑物の検査に用いられる微生物夾雑物検査用容器であって、流体入口および流体出口を有する容器本体と、上記容器本体内に収納された試薬と、上記流体入口および上記流体出口を密閉する密閉部材とを有し、上記容器本体が積層可能であり、上記流体入口と上記流体出口とが気密嵌合可能であることを特徴とするものである。
【００２７】
本発明の微生物夾雑物検査用容器について図面を参照して説明する。
図１（ａ）は本発明の微生物夾雑物検査用容器の一例を示す概略平面図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ−Ａ線断面図、図１（ｃ）は図１（ａ）のＢ−Ｂ線断面図である。また、図１（ｄ）は図１（ａ）〜（ｃ）に示す容器本体が積層された場合の一例を示す概略断面図である。なお、図１（ａ）において密閉部材は省略されている。
図１（ａ）〜（ｃ）に示すように、微生物夾雑物検査用容器１は、流体入口３および流体出口４を有する容器本体２と、容器本体２内に設けられ、試薬１０を固定する固定部７と、容器本体２内に収納され、固定部７に固定された試薬１０と、容器本体２全体を密封包装する袋状の密閉部材５とを有している。固定部７は容器本体２と一体に形成されており、十字状の形状を有している。また、図１（ｄ）に示すように、容器本体２（２ａ、２ｂ）は積層可能であり、容器本体２（２ａ、２ｂ）の流体入口と流体出口とは気密嵌合可能である。
【００２８】
ここで、「容器本体が積層可能である」とは、一の容器本体の流体入口と他の容器本体の流体出口とが気密嵌合することにより複数の容器本体が積層することをいう。
また、「流体入口と流体出口とが気密嵌合可能である」とは、複数の容器本体を積層した際に流体入口と流体出口との間に隙間がなく、気体の流通を妨げるように流体入口と流体出口とが嵌合することをいう。
【００２９】
図２（ａ）は本発明の微生物夾雑物検査用容器の他の例を示す概略平面図であり、図２（ｂ）は図２（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。また、図２（ｃ）、（ｄ）は図２（ａ）、（ｂ）に示す容器本体が積層された場合の一例を示す概略断面図である。なお、図２（ａ）において密閉部材は省略されている。
図２（ａ）、（ｂ）に示すように、微生物夾雑物検査用容器１は、流体入口３および流体出口４を有する容器本体２と、容器本体２内に収納され、試薬１０を含浸させた不織布８と、容器本体２全体を密封包装する袋状の密閉部材５とを有している。不織布８は試薬１０を固定する固定部の一つである。また、図２（ｃ）、（ｄ）に示すように、容器本体２（２ａ、２ｂ、２ｃ）は積層可能であり、容器本体２（２ａ、２ｂ、２ｃ）の流体入口と流体出口とは気密嵌合可能である。
【００３０】
図３（ａ）は本発明の微生物夾雑物検査用容器の他の例を示す概略平面図であり、図３（ｂ）は図３（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。また、図３（ｃ）は図３（ａ）、（ｂ）に示す容器本体が積層された場合の一例を示す概略断面図である。なお、図３（ａ）において密閉部材は省略されている。
図３（ａ）、（ｂ）に示すように、微生物夾雑物検査用容器１は、流体入口３および流体出口４を有する容器本体２と、容器本体２内に収納された試薬１０と、流体入口３を密閉するシート状の第１密閉部材６ａと、流体出口４を密閉するシート状の第２密閉部材６ｂとを有している。試薬１０は容器本体２の内壁の段差にリング状に固定されている。また、図３（ｃ）に示すように、容器本体２（２ａ、２ｂ）は積層可能であり、容器本体２（２ａ、２ｂ）の流体入口と流体出口とは気密嵌合可能である。
【００３１】
図４（ａ）は本発明の微生物夾雑物検査用容器の他の例を示す概略平面図であり、図４（ｂ）は図４（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。また、図４（ｃ）は図４（ａ）、（ｂ）に示す容器本体に図２（ａ）、（ｂ）に示す容器本体が積層された場合の一例を示す概略断面図である。なお、図４（ａ）において密閉部材は省略されている。
図４（ａ）、（ｂ）に示す微生物夾雑物検査用容器１は、複数の容器本体２が連結されたものである。各容器本体２は流体入口３および流体出口４を有し、流体入口３および流体出口４は複数の容器本体２全体を密封包装する袋状の密閉部材５で密閉されており、各容器本体２内には試薬１０を含浸させた不織布８が収納されている。また、図４（ｃ）に示すように、複数の容器本体２が連結されている場合でも、容器本体２（２ａ、２ｂ）は積層可能であり、容器本体２（２ａ、２ｂ）の流体入口と流体出口とは気密嵌合可能である。
【００３２】
図５（ａ）〜（ｃ）は本発明の微生物夾雑物検査用容器の使用方法の一例を示す模式図であり、図４（ａ）〜（ｃ）に示す微生物夾雑物検査用容器の使用方法の一例を示す。図５（ａ）は概略平面図、図５（ｂ）は図５（ａ）のＣ−Ｃ線断面図、図５（ｃ）は図５（ａ）のＤ−Ｄ線断面図である。この例においてはエンドトキシン検査を示す。
図５（ａ）〜（ｃ）に示すように、治具であるプレート２１内には流路２２が設けられており、流路２２の一方の片端に配置された挿入口２４に本発明の微生物夾雑物検査用容器の容器本体２ａ、２ｂを嵌合する。容器本体２ａ内には試薬１０ａとしてライセート試薬が収納され、容器本体２ｂ内には試薬１０ｂとしてエンドトキシン標準品が収納されている。ライセート試薬が収納された容器本体２ａのみを配置した流路２２は試料検査用ライン２２ａであり、ライセート試薬が収納された容器本体２ａとエンドトキシン標準品が収納された容器本体２ｂとを積層した流路２２は添加回収測定用ライン２２ｂである。流路２２の途中には検出部２３が設けられており、流路２２の他方の片端には図示しないがポンプが取り付けられている。
【００３３】
液体試料中のエンドトキシンを検査する際には、まず、試料検査用ライン２２ａでは容器本体２ａに液体試料を導入し、添加回収測定用ライン２２ｂでは容器本体２ｂに液体試料を導入する。試料検査用ライン２２ａでは容器本体２ａ内で液体試料がライセート試薬を溶解し、流路２２に導入される。添加回収測定用ライン２２ｂでは容器本体２ｂ内で液体試料がエンドトキシン標準品を溶解した後、容器本体２ａ内でライセート試薬を溶解し、流路２２に導入される。この際、流路２２の他方の片端に取り付けられたポンプで陰圧を付与することで、液体試料を移動させることができる。次に、ポンプで陰圧を付与して、液体試料を検出部２３まで移動させる。検出部２３では液体試料の光学特性の変化を検出することができる。この例においては、エンドトキシンの存在下で液体試料およびライセート試薬の混合物の凝固反応が生じゲル化するので、ゲル化に伴う濁度の変化を測定することにより、エンドトキシンを検出するまたはエンドトキシン濃度を測定することができる。
【００３４】
図６（ａ）〜（ｃ）は本発明の微生物夾雑物検査用容器の使用方法の他の例を示す模式図であり、図４（ａ）〜（ｃ）に示す微生物夾雑物検査用容器の使用方法の他の例を示す。図６（ａ）は概略平面図、図６（ｂ）は図６（ａ）のＣ−Ｃ線断面図、図６（ｃ）は図６（ａ）のＤ−Ｄ線断面図である。この例においてはエンドトキシン検査を示す。
図６（ａ）〜（ｃ）に示すように、治具であるプレート２１内には流路２２が設けられており、流路２２の一方の片端に配置された挿入口２４に本発明の微生物夾雑物検査用容器の容器本体２ａ、２ｂ、２ｃを嵌合する。容器本体２ａ内には試薬１０ａとして発色合成基質または蛍光基質が収納され、容器本体２ｂ内には試薬１０ｂとしてライセート試薬が収納され、容器本体２ｃ内には試薬１０ｃとしてエンドトキシン標準品が収納されている。発色合成基質または蛍光基質が収納された容器本体２ａとライセート試薬が収納された容器本体２ｂとを積層した流路２２は試料検査用ライン２２ａであり、発色合成基質または蛍光基質が収納された容器本体２ａとライセート試薬が収納された容器本体２ｂとエンドトキシン標準品が収納された容器本体２ｃとを積層した流路２２は添加回収測定用ライン２２ｂである。流路２２の途中には検出部２３が設けられており、流路２２の他方の片端には図示しないがポンプが取り付けられている。
【００３５】
液体試料中のエンドトキシンを検査する際には、まず、試料検査用ライン２２ａでは容器本体２ｂに液体試料を導入し、添加回収測定用ライン２２ｂでは容器本体２ｃに液体試料を導入する。試料検査用ライン２２ａでは容器本体２ａ内で液体試料がライセート試薬を溶解した後、容器本体２ａ内で発色合成基質または蛍光基質を溶解し、流路２２に導入される。添加回収測定用ライン２２ｂでは容器本体２ｃ内で液体試料がエンドトキシン標準品を溶解した後、容器本体２ｂ内でライセート試薬を溶解し、容器本体２ａ内で発色合成基質または蛍光基質をさらに溶解し、流路２２に導入される。この際、流路２２の他方の片端に取り付けられたポンプで陰圧を付与することで、液体試料を移動させることができる。次に、ポンプで陰圧を付与して、液体試料を検出部２３まで移動させる。検出部２３では液体試料の光学特性の変化を検出することができる。この例においては、発色合成基質の場合、エンドトキシンによりライセート試薬中の凝固酵素が活性化され、活性化された凝固酵素の作用により発色合成基質から発色基が遊離されるので、発色基の量を吸光度または透過率で測定することにより、エンドトキシンを検出するまたはエンドトキシン濃度を測定することができる。また、蛍光基質の場合、エンドトキシンによりライセート試薬中の凝固酵素が活性化され、活性化された凝固酵素の作用により蛍光基質から蛍光基が遊離されるので、蛍光基の量を蛍光度で測定することにより、エンドトキシンを検出するまたはエンドトキシン濃度を測定することができる。
【００３６】
本発明によれば、微生物夾雑物検査に使用される試薬が微生物夾雑物検査用容器に収納されているため、本発明の微生物夾雑物検査用容器を用いることにより簡単な操作で迅速に微生物夾雑物検査を行うことが可能である。
【００３７】
また、従来の微生物夾雑物検査においては板状のカートリッジに必要な試薬がすべて封入されていたため、検査対象に応じてカートリッジを適宜選択する必要があったが、本発明においては試薬は容器本体内に収納されており、容器本体は積層可能であるため、検査対象に応じて試薬の種類や試薬の濃度等を適宜調整することができる。すなわち、目的に応じて試薬や検査用器具をカスタマイズできる。
【００３８】
例えばエンドトキシン検査の場合、ライセート試薬が収納された容器本体を積層し、積層数を変えることで、ライセート試薬の濃度を調整することができる。
ここで、例えばライセート試薬の濃度が高くなるほど、エンドトキシンの検出感度が高くなる。そのため、例えば上記のようにライセート試薬が収納された容器本体の積層数を変えてライセート試薬の濃度が低いものとライセート試薬の濃度が高いものとを同時に測定することで、エンドトキシンの検出感度を高めることができ、また効率的にエンドトキシンの検査を行うことができる。したがって、液体試料中のエンドトキシンが極微量である場合においても、高感度にエンドトキシン検査を行うことができる。
これに対し、従来の板状のカートリッジではカートリッジ内に試薬がすべて封入されているため、カートリッジ毎に検出感度があらかじめ決められている。また、カートリッジ毎に検出感度のばらつきがある。そのため、エンドトキシンが検出されなかった場合でも、再度検査を行わなければならない場合があり、検査が煩雑になる。
【００３９】
また例えば、図５においては４本の流路２２のうち２本を試料検査用ライン２２ａ、他の２本を添加回収測定用ライン２２ｂとしているが、容器本体の積層の組み合わせを変更することで、４本の流路のすべてを試料検査用ラインとしたり、１本の流路のみを添加回収測定用ラインとしたりすることができ、検査対象に応じて使用者が検査用器具の構成を容易にカスタマイズできる。
また例えば、図５ではライセート試薬が収納された容器本体２ａとエンドトキシン標準品が収納された容器本体２ｂとを積層しているのに対し、図６では発色合成基質または蛍光基質が収納された容器本体２ａとライセート試薬が収納された容器本体２ｂとエンドトキシン標準品が収納された容器本体２ｃとを積層しており、エンドトキシンの検出方法に応じて使用者が使用する試薬を容易にカスタマイズできる。
これに対し、従来の板状のカートリッジでは、カートリッジ内に試薬がすべて封入されているため、使用者がカートリッジの構成をカスタマイズすることはできない。
【００４０】
また、例えばエンドトキシン検査の場合、エンドトキシン標準品を用いたライセート試薬の表示感度確認試験（ライセート試薬の感度の確認）や、エンドトキシン標準品を用いた検量線の作成、エンドトキシン標準品を用いた反応干渉因子試験（エンドトキシン濃度を測定する液体試料にＬＡＬ反応を抑制する因子が含まれていないかの検定）等、試料の調製が煩雑である。これに対し本発明においては、積層可能な微生物夾雑物検査用容器を組み合わせて用いることができ、また複数の試料を同時に測定することもできるので、簡便かつ正確な測定が可能になる。
【００４１】
本発明の微生物夾雑物検査用容器は、微生物夾雑物の検査に用いられるものである。微生物夾雑物としては、エンドトキシン、リポ多糖、（１→３）−β−Ｄ−グルカンを例示することができる。
エンドトキシンとしては、各種グラム陰性菌、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ等のリポ多糖が挙げられる。
【００４２】
例えばエンドトキシン検査においては、リポ多糖や（１→３）−β−Ｄ−グルカンで陽性になる場合がある。一方、深在性真菌症の検査においては、（１→３）−β−Ｄ−グルカンを検出する場合のＬＡＬ反応と類似酵素の反応とでは逆にエンドトキシンで陽性になる場合がある。また、生理食塩や医薬品のエンドトキシン検査においては、一部の医薬品がＬＡＬ反応の抑制物質として働くことも考慮し、局方では検量線を含むライセート試薬の感度の確認および検体自体に抑制反応がないかの確認を行っている。そのため、本発明のように、積層可能な微生物夾雑物検査用容器を組み合わせて用いることができ、また複数の試料を同時に測定することができるのは有用である。
【００４３】
以下、本発明の微生物夾雑物検査用容器における各構成について説明する。
【００４４】
１．容器本体
本発明における容器本体は、流体入口および流体出口を有するものであり、積層可能で、流体入口および流体出口が気密嵌合可能であるものである。
【００４５】
容器本体の形状としては、流体入口および流体出口を有し、積層可能で、流体入口および流体出口が気密嵌合可能な形状であれば特に限定されるものではなく、例えば筒状、カップ状等とすることができる。
容器本体の流体入口および流体出口は気密嵌合可能であることから、通常、流体出口の外径と流体入口の内径とは等しい。これにより、一の容器本体の流体出口を他の容器本体の流体入口に隙間なく挿入できる。
また、容器本体に液体試料を導入した後はポンプによる陰圧によって液体試料を移動させることから、通常、流体入口および流体出口は容器本体の両端にそれぞれ配置される。
【００４６】
容器本体の材質は、所定の形状を有する容器本体を形成可能なものであればよく、例えば樹脂を挙げることができる。容器本体は透明、半透明、不透明のいずれであってもよいが、試薬および液体試料を視認しやすいことから、透明または半透明であることが好ましい。
【００４７】
容器本体の内壁には、試薬を固定するために段差や突起が設けられていてもよい。図２に例示するように、容器本体２の内壁に段差があることで、固定部として不織布８を配置したり、図３に例示するように容器本体２の内壁の段差に試薬１０を固定したりすることができる。
また、これらの段差や突起は、容器本体を積層したり、流体入口および流体出口を気密嵌合したりするために設けられているものであってもよい。
【００４８】
本発明の微生物夾雑物検査用容器は、図１〜図３に例示するように１個の容器本体２を有するものであってもよく、図４に例示するように複数個の容器本体２が連結されたものであってもよい。
【００４９】
２．密閉部材
本発明における密閉部材は、上記容器本体の流体入口および流体出口を密閉するものである。
密閉部材としては、流体入口および流体出口を密閉できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば図１（ｂ）、図２（ｂ）、図４（ｂ）に示すような容器本体２全体を密封包装する袋状の密閉部材５であってもよく、図３（ｂ）に示すようなシート状の密閉部材（第１密閉部材６ａ、第２密閉部材６ｂ）であってもよい。また、図示しないが流体出口には突起を折ることにより開封可能な密閉部材が配置されていてもよい。流体出口を密閉したまま容器本体内で液体試料と試薬とを反応させる場合には、反応後に容易に剥離できることから、シート状の密閉部材が好ましく用いられる。
密閉部材の材質としては、流体入口および流体出口を密閉できるものであれば特に限定されるものではなく、密閉部材の形状等に応じて異なるが、例えば樹脂、アルミニウム箔等の金属箔、ゴム等を挙げることができる。
【００５０】
また、密閉部材は除去可能なものであってもよい。本発明の微生物夾雑物検査用容器を使用する際に、例えば袋状の密閉部材の場合は密閉部材を開封し容器本体を取り出して使用したり、シート状の密閉部材の場合は容器本体から密閉部材を剥離して使用したりすることができる。また、突起を折ることにより開封可能な密閉部材の場合には、突起を折って容器本体を使用することができる。
また、シート状の密閉部材の場合、密閉部材は、ある程度の強度を有し、針等を容易に貫通させることができるものであってもよい。この場合、密閉部材は二重シートになっており、外側のシートを剥離して内側のシートに針等を貫通させて使用してもよい。
【００５１】
３．固定部
本発明の微生物夾雑物検査用容器は、上記容器本体内に設けられ、試薬を固定する固定部を有していてもよい。
固定部の形状としては、試薬を固定可能であり、固定部が形成されていても流体入口から流体出口まで液体試料を通過させることができる形状であれば特に限定されるものではなく、例えば図１（ａ）に示すような十字状、図２（ａ）に示すようなメッシュ状を挙げることができる。
固定部の材質は、固定部の形状等に応じて適宜選択される。例えば図１に示すような十字状の固定部７の場合、固定部の材質としては容器本体と同様に樹脂を挙げることができる。この場合、固定部の形成が容易であることから、固定部は容器本体と一体に形成されていることが好ましい。また例えば図２に示すように固定部として不織布８を用いることもできる。不織布は試薬を含浸させて用いられる。
【００５２】
４．試薬
本発明において、試薬は上記容器本体内に収納される。
本発明に用いられる試薬としては、検査する微生物夾雑物の種類に応じて適宜選択される。例えばエンドトキシンまたは（１→３）−β−Ｄ−グルカンの検査の場合、試薬としては、ライセート試薬、エンドトキシン標準品、（１→３）−β−Ｄ−グルカン標準品、発色合成基質または蛍光基質、あるいはライセート試薬と発色合成基質または蛍光基質との混合物が挙げられる。
【００５３】
ライセート試薬としては、カブトガニの血球抽出成分（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ；ＬＡＬ）により調製されたものを用いることができる。また、ライセート試薬として、生体由来成分から単離精製されたファクターＣ等（ファクターＣ、ファクターＧ、凝固酵素等）や遺伝子組換え技術によって作製された組換えファクターＣ等を適宜使用して調製した「ＬＡＬの同等物」を用いることもできる。
【００５４】
エンドトキシン標準品は、ライセート試薬の感度を確認する上で、日本薬局方が定めた定量保証のエンドトキシンであり、例えば医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス財団や、エンドトキシン検出試薬メーカーである生化学工業、和光純薬、ロンザ等から入手することができる。
【００５５】
（１→３）−β−Ｄ−グルカン標準品は、日本薬局方の定めはないが、体外診断薬測定キットを販売している日水製薬、和光純薬、マルハニチロから入手することができる。標準品としては、体外診断薬測定キットの特性に合せた、パキマン、カードランまたはレンチナン由来の標準品を使用することができる。
【００５６】
発色合成基質および蛍光基質としては、ライセート試薬中の凝固酵素の作用によって発色基または蛍光基を遊離することができる合成基質であれば特に限定されるものではなく、例えばパラニトロアニリン発色団を含むものを挙げることができ、具体的にはアセテート−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ等が挙げられる。アセテート−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡの場合、凝固酵素によってｐＮＡ（パラニトロアニリン）基を遊離する。
また、例えば、米国特許第５，３１０，６５７号に記載されている一般式：Ｒ１−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ｂ−Ｒ２で表される発色合成基質や蛍光基質を挙げることができる。ここで、Ｒ１は、水素、ブロックしている芳香族炭化水素またはアシル基を表し、Ａ１は、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＬｅｕから選択されるＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸を表し、Ａ２は、ＧｌｕまたはＡｓｐを表し、Ａ３は、ＡｌａまたはＣｙｓを表し、Ａ４は、Ａｒｇを表し、Ｂは、エステルおよびアミドから選択される連結を表し、Ｒ２は、Ｂ連結を介してアルギニンにＣ末端に共有結合される発色基または蛍光基を表す。
また、米国特許第４，１８８，２６４号に記載されている配列：Ｒ１−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｒ２におけるＬ−アミノ酸からなる構造を有するペプチド基質を挙げることができる。ここで、Ｒ１は、Ｎ−ブロックされたアミノ酸を表し、Ｒ２は、凝固酵素による加水分解によって遊離されて、発色化合物ＨＲ２を生じる基である。さらに、米国特許第４，５１０，２４１号に記載されている発色性ペプチド基質を挙げることができる。この発色性ペプチド基質はＧｌｙ部分がＡｌａまたはＣｙｓによって配列中で置換されたものである。
さらに、例えば、ジニトロフェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン等の発色団を含むものや、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン、４−メトキシ−２−ナフチルアミン等の発色団を含むものも挙げられる。
【００５７】
また、本発明の微生物夾雑物検査用容器が、図４に例示するように複数個の容器本体２が連結されたものである場合には、事前に調製された試薬の組み合わせを用いることができる。例えば、検量線作成用の濃度の異なる３種類以上のエンドトキシン標準品の組み合わせや、感度を変化させるための濃度が異なる複数種類のライセート試薬の組み合わせ、また濃度が異なる複数種類のライセート試薬とそれに対応した濃度の発色合成基質または蛍光基質との組み合わせ等を用いることができる。
【００５８】
５．その他の構成
本発明の微生物夾雑物検査用容器には、図４（ｂ）に例示するように容器本体２を固定するための係合部１１が形成されていてもよい。例えば、図５および図６に示すように治具としてプレート２１を用いる場合、係合部１１によって容器本体２ａをプレート２１に固定することができる。
係合部は、通常、容器本体と一体に形成される。
【００５９】
６．使用方法
本発明の微生物夾雑物検査用容器の使用方法について説明する。
図５（ａ）〜（ｃ）および図７を例に挙げて説明する。この例においてはエンドトキシン検査を示す。まず、図４（ａ）、（ｂ）に例示する微生物夾雑物検査用容器１を１個と、図２（ａ）、（ｂ）に例示する微生物夾雑物検査用容器１を２個準備する。図４（ａ）、（ｂ）に例示する微生物夾雑物検査用容器１には試薬１０としてライセート試薬が収納されている。また、図２（ａ）、（ｂ）に例示する微生物夾雑物検査用容器１には試薬１０としてエンドトキシン標準品が収納されている。次いで、図示しないがこれらの微生物夾雑物検査用容器１において袋状の密閉部材５を開封して容器本体２を取り出し、図５（ａ）〜（ｃ）に例示するようにプレート２１内に設けられた流路２２の一方の片端に配置された挿入口２４に、ライセート試薬（試薬１０ａ）が収納された容器本体２ａと、エンドトキシン標準品（試薬１０ｂ）が収納された容器本体２ｂとを順に積層する。次に、図７に例示する光学検出器３０の挿入口３１に、プレート２１を検出部２３側から挿入する。
【００６０】
次に、図示しないが、試料用ライン２２ａでは最上段の容器本体２ａに液体試料を導入する。また、添加回収測定用ライン２２ｂでは最上段の容器本体２ｂに液体試料を導入する。そして、光学検出器３０に備えられ、流路２２の他方の片端に取り付けられたポンプ（図示なし）により吸引すると、試料用ライン２２ａでは液体試料がライセート試薬（試薬１０ａ）を溶解して容器本体２ａを通過し、混合物が流路２２を通って検出部２３まで移動する。添加回収測定用ライン２２ｂでは液体試料が容器本体２ｂ、２ａを順に通過してエンドトキシン標準品（試薬１０ｂ）、ライセート試薬（試薬１０ａ）を順次溶解し、混合物が流路２２を通って検出部２３まで移動する。ポンプは例えばプランジャーポンプであり、吸引および排出によって混合物を往復させ、液体試料および試薬の混合および溶解を行うことができる。また、この検出器２３は光学セルである。
【００６１】
具体的には、ライセート試薬が液体試料に溶解すると、液体試料中に存在するエンドトキシンがライセート試薬とカスケード反応を起こして凝固酵素を活性化する（ＬＡＬ反応、凝固酵素の活性化反応）。そして、活性化された凝固酵素により凝固タンパク質（コアギュロゲン）が加水分解され、ゲルが生成する。
【００６２】
次に、光学検出器３０を用いて、ゲル化に伴う濁度を測定し、液体試料中のエンドトキシンを検出するまたはエンドトキシン量を算出する。
図７に例示する光学検出器３０は、プレートの挿入口３１と、操作部３２と、表示部３３とを備えている。光学検出器３０では、濁度は光学検出器３０が備える光学系により測定および解析され、結果が表示部３３に表示される。
【００６３】
次に、図６（ａ）〜（ｃ）および図７を例に挙げて説明する。この例においてはエンドトキシン検査を示す。まず、図４（ａ）、（ｂ）に例示する微生物夾雑物検査用容器１を１個と、図２（ａ）、（ｂ）に例示する微生物夾雑物検査用容器１を６個準備する。図４（ａ）、（ｂ）に例示する微生物夾雑物検査用容器１には試薬１０として発色合成基質または蛍光基質が収納されている。また、図２（ａ）、（ｂ）に例示する微生物夾雑物検査用容器１のうち、２個には試薬１０としてエンドトキシン標準品が収納され、４個には試薬１０としてライセート試薬が収納されている。次いで、図示しないがこれらの微生物夾雑物検査用容器１において袋状の密閉部材５を開封して容器本体２を取り出し、図６（ａ）〜（ｃ）に例示するようにプレート２１内に設けられた流路２２の一方の片端に配置された挿入口２４に、発色合成基質または蛍光基質（試薬１０ａ）が収納された容器本体２ａと、ライセート試薬（試薬１０ｂ）が収納された容器本体２ｂと、エンドトキシン標準品（試薬１０ｃ）が収納された容器本体２ｃとを順に積層する。次に、図７に例示する光学検出器３０の挿入口３１に、プレート２１を検出部２３側から挿入する。
【００６４】
次に、図示しないが、試料用ライン２２ａでは最上段の容器本体２ｂに液体試料を導入する。また、添加回収測定用ライン２２ｂでは最上段の容器本体２ｃに液体試料を導入する。そして、光学検出器３０に備えられ、流路２２の他方の片端に取り付けられたポンプ（図示なし）により吸引すると、試料用ライン２２ａでは液体試料が容器本体２ｂ、２ａを順に通過してライセート試薬（試薬１０ｂ）、発色合成基質または蛍光基質（試薬１０ａ）を順次溶解し、混合物が流路２２を通って検出部２３まで移動する。また、添加回収測定用ライン２２ｂでは液体試料が容器本体２ｃ、２ｂ、２ａを順に通過してエンドトキシン標準品（試薬１０ｃ）、ライセート試薬（試薬１０ｂ）、発色合成基質または蛍光基質（試薬１０ａ）を順次溶解し、混合物が流路２２を通って検出部２３まで移動する。この検出器２３は光学セルである。
【００６５】
具体的には、ライセート試薬が液体試料に溶解すると、液体試料中に存在するエンドトキシンがライセート試薬とカスケード反応を起こして凝固酵素を活性化する（ＬＡＬ反応、凝固酵素の活性化反応）。また、発色合成基質または蛍光基質が液体試料に溶解すると、活性化された凝固酵素が発色合成基質または蛍光基質に作用し、発色基または蛍光基が遊離される（遊離反応）。
【００６６】
次に、光学検出器３０を用いて、発色基による発色または蛍光基による蛍光を測定し、液体試料中のエンドトキシンを検出するまたはエンドトキシン量を算出する。例えば発色基の量を吸光度または透過率で測定したり、蛍光基の量を蛍光度で測定したりすることで、エンドトキシンを検出するまたはエンドトキシン量を算出することができる。
図７に例示する光学検出器３０では、発色または蛍光は光学検出器３０が備える光学系により測定および解析され、結果が表示部３３に表示される。
【００６７】
また、図５および図６に示す例においては治具としてプレート２１を用いたが、光学検出器に容器本体を直接挿入することも可能である。
図２（ｃ）、（ｄ）および図８を例に挙げて説明する。この例においてはエンドトキシン検査を示す。まず、図２（ａ）、（ｂ）に例示する微生物夾雑物検査用容器１を１０個準備する。１０個の微生物夾雑物検査用容器１のうち、２個には試薬１０としてエンドトキシン標準品が収納され、４個には試薬１０としてライセート試薬が収納され、４個には試薬１０として発色合成基質または蛍光基質が収納されている。次いで、図示しないがこれらの微生物夾雑物検査用容器１において密閉部材５を開封して容器本体２を取り出し、図８に例示する光学検出器３０の挿入口に、図２（ｃ）、（ｄ）に示すように、発色合成基質または蛍光基質（試薬１０ａ）が収納された容器本体２ａと、ライセート試薬（試薬１０ｂ）が収納された容器本体２ｂと、エンドトキシン標準品（試薬１０ｃ）が収納された容器本体２ｃとを順に積層する。発色合成基質または蛍光基質（試薬１０ａ）が収納された容器本体２ａとライセート試薬（試薬１０ｂ）が収納された容器本体２ｂとを積層したものは試料検査用であり、発色合成基質または蛍光基質（試薬１０ａ）が収納された容器本体２ａとライセート試薬（１０ｂ）が収納された容器本体２ｂとエンドトキシン標準品（試薬１０ｃ）が収納された容器本体２ｃとを積層したものは添加回収測定用である。
【００６８】
次に、図示しないが、試料用では最上段の容器本体２ｂに液体試料を導入する。また、添加回収測定用では最上段の容器本体２ｃに液体試料を導入する。そして、光学検出器３０に備えられ、挿入口３１に取り付けられたポンプ（図示なし）により吸引すると、試料用では液体試料が容器本体２ｂ、２ａを順に通過してライセート試薬（試薬１０ｂ）、発色合成基質または蛍光基質（試薬１０ａ）を順次溶解し、混合物が光学検出器３０に導入される。また、添加回収測定用ライン２２ｂでは液体試料が容器本体２ｃ、２ｂ、２ａを順に通過してエンドトキシン標準品（試薬１０ａ）、ライセート試薬（試薬１０ｂ）、発色合成基質または蛍光基質（試薬１０ａ）を順次溶解し、混合物が光学検出器３０に導入される。このとき、上述したように、ＬＡＬ反応（凝固酵素の活性化反応）および遊離反応が起こる。
【００６９】
次に、光学検出器３０を用いて、発色基による発色または蛍光基による蛍光を測定し、液体試料中のエンドトキシンを検出するまたはエンドトキシン量を算出する。
図８に例示する光学検出器３０は、挿入口３１と、操作部３２と、表示部３３とを備えている。光学検出器３０では、発色または蛍光は光学検出器３０が備える光学系により測定および解析され、結果が表示部３３に表示される。
【００７０】
本発明の微生物夾雑物検査用容器を使用する際には、治具を用いてもよく用いなくてもよいが、中でも治具を用いることが好ましい。光学検出器が液体試料や試薬で汚染されるのを抑制することができるからである。
【００７１】
また、本発明の微生物夾雑物検査用容器を用いて微生物夾雑物を検査する際には、容器本体を光学検出器に設置した後に液体試料を容器本体に導入し、液体試料中の微生物夾雑物および試薬を反応させてもよく、容器本体を光学検出器に設置する前に液体試料を容器本体に導入し、容器本体内で液体試料中の微生物夾雑物および試薬を反応させた後、容器本体を光学検出器に設置してもよい。
後者の場合、図３（ｂ）に例示するように流体出口４がシート状の第２密閉部材６ｂで密閉されていることが好ましい。第２密閉部材を剥離することなく、流体入口から液体試料を導入し、容器本体内で液体試料中の微生物夾雑物および試薬を反応させることができる。この場合、容器本体を光学検出器に設置する際に流体出口に配置された第２密閉部材を剥離する。
【００７２】
また、微生物夾雑物の検査に際して、測定中の容器本体への微生物夾雑物の混入を防ぐために、密閉部材を剥離する場合には、密閉部材を剥離して液体試料を導入した後、最上段の容器本体の流体入口に蓋を配置してもよい。また、最上段の容器本体の流体入口に配置された密閉部材を剥離せずに、注射針等を密閉部材に貫通させて液体試料を導入してもよい。さらに、最上段の容器本体の流体入口に配置された密閉部材が二重シートである場合には、外側のシートを剥離した後に内側のシートに注射針等を貫通させて液体試料を導入してもよい。
【００７３】
Ｂ．微生物夾雑物検査キット
本発明の微生物夾雑物検査キットは、上述の微生物夾雑物検査用容器を有することを特徴とするものである。
【００７４】
本発明によれば、上述の微生物夾雑物検査用容器を有するため、本発明の微生物夾雑物検査キットを用いることにより簡単な操作で迅速に微生物夾雑物検査を行うことが可能である。また本発明においては、目的に応じて試薬の種類や試薬の濃度等をカスタマイズできる。例えばエンドトキシン検査の場合、ライセート試薬が収納された第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体を積層することでライセート試薬の濃度を高くし、エンドトキシンの検出感度を高めることもできる。
【００７５】
以下、本発明の微生物夾雑物検査キットにおける各構成について説明する。
【００７６】
１．微生物夾雑物検査用容器
本発明の微生物夾雑物検査キットは、例えばライセート試薬、エンドトキシン標準品、（１→３）−β−Ｄ−グルカン標準品、発色合成基質または蛍光基質、あるいはライセート試薬と発色合成基質または蛍光基質との混合物が収納された微生物夾雑物検査用容器を有する。微生物夾雑物検査用容器としては、例えばエンドトキシン検査の場合、ライセート試薬が収納された第１微生物夾雑物検査用容器、エンドトキシン標準品が収納された第２微生物夾雑物検査用容器、および、発色合成基質または蛍光基質が収納された第３微生物夾雑物検査用容器を挙げることができる。これらの微生物夾雑物検査用容器の組み合わせは、目的や微生物夾雑物の検出方法に応じて適宜選択される。例えばエンドトキシン検査の場合、ライセート試薬が収納された第１微生物夾雑物検査用容器とエンドトキシン標準品が収納された第２微生物夾雑物検査用容器とを組み合わせて用いる場合には添加回収測定用とすることができ、液体試料を検査すると同時にエンドトキシンの添加回収率を測定し反応干渉因子試験を行うことが可能になる。また、ライセート試薬が収納された第１微生物夾雑物検査用容器と発色合成基質または蛍光基質が収納された第３微生物夾雑物検査用容器とを組み合わせて用いる場合には、比色法や蛍光法によるエンドトキシンの検査が可能であり、検出感度を高めることができる。
【００７７】
また、微生物夾雑物検査用容器の数は１個であってもよく複数個であってもよい。また、微生物夾雑物検査用容器において容器本体は１個であってもよく、複数個の容器本体が連結されていてもよい。微生物夾雑物検査用容器の数および微生物夾雑物検査用容器における容器本体の数は、目的や微生物夾雑物の検出方法に応じて適宜選択される。
【００７８】
なお、微生物夾雑物検査用容器については、上記「Ａ．微生物夾雑物検査用容器」に詳しく記載したので、ここでの説明は省略する。
【００７９】
２．治具
本発明の微生物夾雑物検査キットは、治具をさらに有することが好ましい。上述のように、光学検出器が液体試料や試薬で汚染されるのを抑制することができるからである。
治具としては、液体試料をポンプにより吸引する際に、容器本体を保持することができ、流路を形成することができるものであれば特に限定されるものではない。例えば図５および図６に示すような流路２２を備えるプレート２１が挙げられる。治具には、通常、光学セルである検出部が備えられている。
プレート等の治具の材質としては、流路を備える治具を形成可能なものであれば特に限定されるものではなく、例えば樹脂等が挙げられる。検出部は光学セルであることから少なくとも透明または半透明である必要がある。
プレート等の治具には、図５（ｃ）および図６（ｃ）に例示するように容器本体２に形成された係合部１１と係合する係合部２６が形成されていてもよい。
【００８０】
治具は、通常、上記微生物夾雑物検査用容器の容器本体を配置する挿入口を有している。治具の挿入口の形状としては、上記微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体出口と嵌合可能な形状であれば特に限定されるものではない。
【００８１】
また、プレート等の治具の流路には、図９（ｂ）、（ｃ）に例示するように挿入口２４および検出部２３の間に試薬２５が配置されていてもよい。試薬の配置としては、挿入口および検出部の間であればよく、例えば図９（ｂ）に示すように挿入口２４付近であって容器本体２ａ、２ｂの下部に試薬２５を配置することができる。なお、図９については後述するので、ここでの説明は省略する。
プレート等の治具の流路に配置される試薬としては、例えば発色合成基質または蛍光基質、あるいはライセート試薬と発色合成基質または蛍光基質との混合物が挙げられる。なお、発色合成基質、蛍光基質およびライセート試薬については、上述のものと同様である。
【００８２】
３．光学検出器
本発明の微生物夾雑物検査キットは、光学検出器をさらに有していてもよい。微生物夾雑物検査用容器と光学検出器とを組み合わせることにより、微生物夾雑物検査システムを構築することができ、微生物夾雑物の検査を簡便かつ迅速に行うことができる。
光学検出器としては、エンドトキシンの検出方法、例えば比濁法、比色法、蛍光法等に応じて適宜選択されるものであり、具体的には分光光度計、蛍光測定器、ルミノメーター等を挙げることができる。
また、光学検出器において、測定波長としては、微生物夾雑物の検出方法ならびに使用する発色合成基質または蛍光基質に応じて適宜選択されるものであり、例えば約２００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲内、好ましくは約３５０ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲内における波長に設定することができる。
【００８３】
また、光学検出器には、通常、液体試料を吸引するポンプが備えられている。ポンプとしては、定量の液体を吸引および排出することができ、吸引および排出によって液体試料および試薬の混合および溶解が可能なものであることが好ましい。例えばプランジャーポンプ、ダイヤフラムポンプ、ピストンポンプ等を用いることができる。プランジャーポンプはプランジャーの往復運動により液体を輸送するものであり、定量の液体を吸引および排出することにより、液体試料および試薬の混合および溶解が可能である。
【００８４】
４．使用方法
本発明の微生物夾雑物検査キットの使用方法について説明する。
本発明の微生物夾雑物検査キットの使用方法の一例としては、上述の微生物夾雑物検査用容器の使用方法と同様とすることができる。
【００８５】
図９（ａ）〜（ｃ）は本発明の微生物夾雑物検査用容器キットの使用方法の他の例を示す模式図である。図９（ａ）は概略平面図、図９（ｂ）は図９（ａ）のＣ−Ｃ線断面図、図９（ｃ）は図９（ａ）のＤ−Ｄ線断面図である。この例においてはエンドトキシン検査を示す。
まず、図４（ａ）、（ｂ）に例示する微生物夾雑物検査用容器１を１個と、図２（ａ）、（ｂ）に例示する微生物夾雑物検査用容器１を２個準備する。図４（ａ）、（ｂ）に例示する微生物夾雑物検査用容器１には試薬１０としてライセート試薬が収納されている。また、図２（ａ）、（ｂ）に例示する微生物夾雑物検査用容器１には試薬１０としてエンドトキシン標準品が収納されている。次いで、図示しないがこれらの微生物夾雑物検査用容器１において密閉部材５を開封して容器本体２を取り出し、図９（ａ）〜（ｃ）に例示するようにプレート２１内に設けられた流路２２の一方の片端に配置された挿入口２４に、ライセート試薬（試薬１０ａ）が収納された容器本体２ａと、エンドトキシン標準品（試薬１０ｂ）が収納された容器本体２ｂとを順に積層する。図９（ｂ）、（ｃ）に例示するプレート２１の流路２２には試薬２５として発色合成基質または蛍光基質が配置されている。次に、図７に例示する光学検出器３０の挿入口３１に、プレート２１を検出部２３側から挿入する。
【００８６】
次に、図示しないが、試料用ライン２２ａでは最上段の容器本体２ａに液体試料を導入する。また、添加回収測定用ライン２２ｂでは最上段の容器本体２ｂに液体試料を導入する。そして、光学検出器３０に備えられ、流路２２の他方の片端に取り付けられたポンプ（図示なし）により吸引すると、試料用ライン２２ａでは液体試料が容器本体２ａを通過してライセート試薬（試薬１０ａ）を溶解し、混合物が流路２２に導入されて発色合成基質または蛍光基質（試薬２５）を溶解し、流路２２を通って検出部２３まで移動する。また、添加回収測定用ライン２２ｂでは液体試料が容器本体２ｂ、２ａを順に通過してエンドトキシン標準品（試薬１０ｂ）、ライセート試薬（試薬１０ａ）を順次溶解し、混合物が流路２２に導入されて発色合成基質または蛍光基質（試薬２５）を溶解し、流路２２を通って検出部２３まで移動する。
このとき、上述したように、ＬＡＬ反応（凝固酵素の活性化反応）および遊離反応が起こる。
次に、光学検出器３０を用いて、発色基による発色または蛍光基による蛍光を測定し、液体試料中のエンドトキシンを検出するまたはエンドトキシン量を算出する。
【００８７】
なお、本発明の微生物夾雑物検査キットの使用方法のその他の点については、上述の微生物夾雑物検査用容器の使用方法と同様とすることができるので、ここでの説明は省略する。
【００８８】
また、本発明の微生物夾雑物検査キットは、例えば１種類の液体試料を検査するものであってもよく、１種類の液体試料を複数回同時に検査するものであってもよく、複数種類の液体試料を同時に検査するものであってもよく、液体試料を検査すると同時にエンドトキシンの添加回収率を測定し反応干渉因子試験を行うものであってもよい。
【００８９】
また、微生物夾雑物を検査するに際しては、事前に調製された試薬の組み合わせを用いることができる。例えば、検量線作成用の濃度が異なる３種類以上のエンドトキシン標準品の組み合わせや、感度を変化させるための濃度が異なる複数種類のライセート試薬の組み合わせ、また濃度が異なる複数種類のライセート試薬とそれに対応した濃度の発色合成基質または蛍光基質との組み合わせ等を挙げることができる。
【００９０】
Ｃ．微生物夾雑物検査方法
本発明の微生物夾雑物検査方法は、上述の微生物夾雑物検査キットを用いて微生物夾雑物を検査する微生物夾雑物検査方法であって、上記微生物夾雑物検査キットが、微生物夾雑物検査用容器として、第１試薬が収納された第１微生物検査用容器を少なくとも有し、上記第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口から容器本体内に液体試料を導入する第１工程を少なくとも有する反応工程と、上記反応工程後、上記液体試料中の微生物夾雑物を光学的に測定する測定工程とを有することを特徴とする。
【００９１】
本発明によれば、上述の微生物夾雑物検査キットを用いるため、簡単な操作で迅速に微生物夾雑物検査を行うことが可能である。また本発明においては、目的に応じて試薬の種類や試薬の濃度等をカスタマイズできる。例えばエンドトキシン検査の場合、ライセート試薬が収納された第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体を積層することでライセート試薬の濃度を高くし、エンドトキシンの検出感度を高めることもできる。
【００９２】
本発明においては、例えば第１試薬が収納された第１微生物夾雑物検査用容器の他に、第２試薬が収納された第２微生物夾雑物検査用容器や、第３試薬が収納された第３微生物夾雑物検査用容器を用いてもよい。
例えば、第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体上に第２微生物夾雑物検査用容器の容器本体が積層され、第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口および第２微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体出口が気密嵌合された積層容器を用いたり、第３微生物夾雑物検査用容器上に第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体が積層され、第３微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口および第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体出口が気密嵌合された積層容器を用いたり、第３微生物夾雑物検査用容器上に第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体および第２微生物夾雑物検査用容器の容器本体が順に積層され、第３微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口および第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体出口が気密嵌合され、第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口および第２微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体出口が気密嵌合された積層容器を用いたりすることができる。
【００９３】
例えばエンドトキシン検査の場合、上記「Ｂ．微生物夾雑物検査キット」に記載したように、ライセート試薬が収納された第１微生物夾雑物検査用容器や、エンドトキシン標準品が収納された第２微生物夾雑物検査用容器、発色合成基質または蛍光基質が収納された第３微生物夾雑物検査用容器を用いることができる。
具体的には、第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体上に第２微生物夾雑物検査用容器の容器本体が積層され、第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口および第２微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体出口が気密嵌合された積層容器を用いたり、第３微生物夾雑物検査用容器上に第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体および第２微生物夾雑物検査用容器の容器本体が順に積層され、第３微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口および第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体出口が気密嵌合され、第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口および第２微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体出口が気密嵌合された積層容器を用いたりすることで、添加回収測定用とすることができる。
また、第３微生物夾雑物検査用容器の容器本体上に第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体が積層され、第３微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口および第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体出口が気密嵌合された積層容器を用いることで、比色法や蛍光法によるエンドトキシン検査を行うことができる。
【００９４】
本発明の微生物夾雑物検査方法における反応工程および測定工程は、微生物夾雑物検査キットの構成や微生物夾雑物の検出方法等に応じて適宜調整される。
【００９５】
以下、本発明の微生物夾雑物検査方法における各工程について説明する。
【００９６】
１．反応工程
本発明における反応工程は、第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口から容器本体内に液体試料を導入する第１工程を少なくとも有する。
第１微生物夾雑物検査用容器にはライセート試薬が収納されていてもよく、第１工程では、液体試料中の微生物夾雑物およびライセート試薬を反応させてもよい。
【００９７】
また、反応工程は、微生物夾雑物を含むライセート試薬と発色合成基質または蛍光基質とを反応させる第２工程を有していてもよい。微生物夾雑物を高感度に検出することが可能になる。
【００９８】
以下、反応工程における各工程について説明する。
【００９９】
（１）第１工程
本発明における第１工程では、第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口から容器本体内に液体試料を導入する。
第１微生物夾雑物検査用容器にはライセート試薬が収納されていてもよく、第１工程では、液体試料中の微生物夾雑物およびライセート試薬を反応させてもよい。例えばエンドトキシン検査の場合、第１工程では、液体試料中に存在するエンドトキシンがライセート試薬とカスケード反応を起こして凝固酵素を活性化する（ＬＡＬ反応、凝固酵素の活性化反応）。そして、後述の第２工程を行わない場合には、活性化された凝固酵素により凝固タンパク質（コアギュロゲン）が加水分解され、ゲルが生成する。
【０１００】
凝固酵素を確実に活性化するために、必要に応じて容器本体を加熱してもよい。加熱温度としては例えば約３７℃にすることができる。加熱方法としては、例えば光学検出器が加熱手段を備えており、光学検出器で加熱してもよく、光学検出器とは別の加熱装置により容器本体を加熱してもよい。本発明においては容器本体を加熱するため、従来の板状のカートリッジを加熱するよりも容易に加熱を行うことができる。
【０１０１】
第１微生物夾雑物検査用容器の容器本体の流体入口から容器本体内に液体試料を導入する方法としては、微生物夾雑物検査キットの構成に応じて異なる。なお、詳しくは上記「Ａ．微生物夾雑物検査用容器  ６．使用方法」に記載したので、ここでの説明は省略する。
【０１０２】
（２）第２工程
本発明における第２工程では、微生物夾雑物を含むライセート試薬と発色合成基質または蛍光基質とを反応させる。
第２工程では、上記第１工程にて活性化された凝固酵素が発色合成基質または蛍光基質に作用し、発色基または蛍光基が遊離する（遊離反応）。
【０１０３】
遊離反応を確実に行うために、必要に応じて加熱を行ってもよい。この際、図６に例示するように発色合成基質または蛍光基質（試薬１０ａ）が容器本体２ａ内に収納されている場合には容器本体２ａを加熱し、図９に例示するように発色合成基質または蛍光基質（試薬２５）がプレート２１の流路２２に配置されている場合にはプレート２１を加熱すればよい。加熱温度としては例えば約３７℃にすることができる。加熱方法としては、例えば光学検出器が加熱手段を備えており、光学検出器で加熱してもよく、光学検出器とは別の加熱装置により加熱してもよい。容器本体を加熱する場合には、プレートを加熱する場合と比較して、容易に加熱を行うことができる。
【０１０４】
微生物夾雑物検査キットにおける発色合成基質または蛍光基質の配置としては、容器本体内であってもよく、治具の流路であってもよい。なお、詳しくは上記「Ａ．微生物夾雑物検査用容器  ６．使用方法」および「Ｂ．微生物夾雑物検査キット」に記載したので、ここでの説明は省略する。
【０１０５】
２．測定工程
本発明における測定工程は、上記反応工程後、上記液体試料中の微生物夾雑物を光学的に測定する工程である。
微生物夾雑物を光学的に測定する方法としては、例えばエンドトキシン検査の場合、一般的なエンドトキシンの検出方法を適用することができ、例えば比濁法、比色法、蛍光法等が挙げられる。
エンドトキシンを光学的に測定する際の測定波長としては、エンドトキシンの検出方法ならびに使用する発色合成基質または蛍光基質に応じて適宜選択されるものであり、例えば約２００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲内、好ましくは約３５０ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲内における波長とすることができる。
（１→３）−β−Ｄ−グルカンやリポ多糖の検査の場合も、上記エンドトキシンの検出方法と同様の方法により測定可能である。
微生物夾雑物を光学的に測定する際には、通常、光学検出器が用いられる。なお、光学検出器については、上記「Ａ．微生物夾雑物検査用容器  ６．使用方法」および「Ｂ．微生物夾雑物検査キット」に記載したので、ここでの説明は省略する。
【０１０６】
本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。
【実施例】
【０１０７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【０１０８】
［実施例１］
（微生物夾雑物検査用容器の作製）
微生物夾雑物検査用容器の作製にはピペットチップを用いた。
オートピペットの２００μＬチップを超音波カッターでピペット本体と嵌合する補強梁のついた部分とストレートな円錐部で切り離し、この円錐部を容器本体とした。
【０１０９】
（治具の準備）
治具には、図９に示すような、流路にライセート試薬および発色合成基質の混合物が配置されたプレートを用いた。
【０１１０】
（エンドトキシン検査）
まず、容器本体の先端部を下にして、容器本体の内部にエンドトキシンフリーな大塚製薬の注射水３７．５μＬをシリンジで入れ、注射水が先端約１／３の位置に留まったのを確認してプレートの挿入口に配置した。
また、日本薬局方エンドトキシン標準品を注射水で１０万倍に希釈し、これを１２．５μＬシリンジで別の容器本体へ分取した。次に、さらに別の容器本体に注射水２５μＬをシリンジ分取し、エンドトキシン標準品が入った容器本体の上から注射水が入った容器本体を静かに篏合させ、同じくプレートの挿入口に配置した。
プレートに取り付けられたプランジャーポンプで吸引および排出し、容器本体の液体をプレートの検出部まで移動させた。
室温で３０分後、注射水、ライセート試薬および発色合成基質のみが入った検出部では着色が観察されなかったが、さらにエンドトキシン標準品が入った検出部では着色が観察された。
【０１１１】
［実施例２］
（微生物夾雑物検査用容器の作製）
実施例１と同様にして、２００μＬのチップを加工し、容器本体を作製した。
【０１１２】
（治具の準備）
治具には、図９に示すような、流路にライセート試薬および発色合成基質の混合物が配置されたプレートを用いた。
【０１１３】
（エンドトキシン検査）
日本薬局方エンドトキシン標準品を注射水で１０，０００ＥＵ／ｍＬに溶解し、注射水での１０倍希釈を５段階繰り返し、０．１ＥＵ／ｍＬに調整した。さらに、４倍希釈を２回行い、０．０２５ＥＵ／ｍＬと０．００６２５ＥＵ／ｍＬに調整した。
容器本体に０．１ＥＵ／ｍＬ、０．０２５ＥＵ／ｍＬ、０．００６２５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン溶液２５μＬをそれぞれシリンジ分取し、プレートの挿入口に配置した。
プレートに取り付けられたプランジャーポンプで吸引および排出して、反応を開始し、容器本体の液体をプレートの検出部まで移動させた。３７℃で加温した光学検出器内で３０分間のカイネティックな被色変化データを入手し、検量線とした。
【符号の説明】
【０１１４】
１  …  微生物夾雑物検査用容器
２、２ａ、２ｂ、２ｃ  …  容器本体
３  …  流体入口
４  …  流体出口
５  …  密閉部材
６ａ  …  第１密閉部材
６ｂ  …  第２密閉部材
７  …  固定部
８  …  不織布
１０、１０ａ、１０ｂ、１０ｃ、２５  …  試薬
３０  …  光学検出器
【図１】
2015155840.tif 000003
【図２】
2015155840.tif 000004
【図３】
2015155840.tif 000005
【図４】
2015155840.tif 000006
【図５】
2015155840.tif 000007
【図６】
2015155840.tif 000008
【図７】
2015155840.tif 000009
【図８】
2015155840.tif 000010
【図９】
2015155840.tif 000011