(57)【要約】【課題】被検出物質の抗原の濃度が低いときにも十分にこれを検出することのできる高感度化を達成し、検査時間を遅らせることなく、更に偽陽性反応を引き起こさない、イムノクロマト用展開液の提供。【解決手段】１ｗｔ％粘度が０．１ｃＰ以上３００ｃＰ以下の水溶性多糖類を０．００１ｗｔ％以上２０．００ｗｔ％以下で含み、かつ、平均粒子径が１ｎｍ以上６０ｎｍ以下の担体で標識化された検出試薬を含むイムノクロマト用展開液。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１ｗｔ％粘度が０．１ｃＰ以上３００ｃＰ以下の水溶性多糖類を０．００１ｗｔ％以上２０．００ｗｔ％以下で含み、かつ、平均粒子径が１ｎｍ以上６０ｎｍ以下の担体で標識化された検出試薬を含むイムノクロマト用展開液。
【請求項２】
前記水溶性多糖類は、水溶性セルロース誘導体である、請求項１に記載の展開液。
【請求項３】
前記水溶性セルロース誘導体は、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースからなる群から選ばれる、請求項２に記載の展開液。
【請求項４】
前記担体は、コロイド状金属粒子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の展開液。
【請求項５】
前記コロイド状金属粒子は、金コロイド粒子である、請求項４に記載の展開液。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の展開液を含む、イムノクロマトキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫測定法の１つであるイムノクロマト法において、移動相を構成する展開液に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原とこれに対する抗体による特異的反応を利用して特定の抗原又は抗体よりなる被検出物質を検出する免疫測定法として、標識物質により標識化した抗体又は抗原を免疫反応により試料中の被検出物質に結合させ、この結合状態にある標識物質等を測定する方法が知られており、標識物質として放射性同位元素を用いる放射免疫測定法、酵素を用いる酵素免疫測定法、蛍光物質を用いる蛍光免疫測定法なども採用されている。
これらの免疫測定法では、被検出物質と標識物質により標識化した抗体等との反応工程、被検出物質と結合状態にある標識物質と結合状態にない標識物質との分離工程が必要となるが、これらの工程を、クロマトグラフィーの原理を応用して、固定相とそれに接して連続的に流れる移動相からなる系で行う方法として、イムノクロマト法が知られている。
【０００３】
免疫測定の形式には、サンドイッチ形式又は競合形式等が知られているが、典型例としては、イムノクロマト法によるサンドイッチ形式で、例えば、試料中の抗原よりなる被検出物質を検出する場合には、以下のような操作が行われる。
（１）被検出物質である抗原に特異的に結合する抗体を固定化試薬とし、この固定化試薬をクロマトグラフ媒体の所定の部位に所定の形で塗布すること等により、クロマトグラフ媒体の任意の位置に反応部位を形成する。
（２）一方、被検出物質と特異的に結合する抗体を検出試薬とし、この検出試薬を酵素等の標識物質により標識する、又は、検出試薬を担体等の標識物質に感作することにより、標識化した検出試薬を調製する。
（３）移動相を構成する展開液を、被検出物質を含む試料及び標識化した検出試薬と共に、固定相であるクロマトグラフ媒体上を展開させる。
【０００４】
以上の操作により、クロマトグラフ媒体に形成された反応部位において、被検出物質である抗原が、反応部位に固定した固定化試薬である抗体と結合することにより捕捉されると共に、この抗原と、標識化した検出試薬である抗体とによって抗原−抗体反応が生ずる結果、当該反応部位においては固定化試薬（固定化した抗体）−被検出物質（抗原）−検出試薬（標識化した抗体）の三者のサンドイッチ型結合体が生成し、試料中に被検出物質が存在するときに反応部位に間接的に標識物質が結合することによって所定のシグナルが現れ、これによって被検出物質の検出を行うことができる。
【０００５】
このようなイムノクロマト法は、操作が簡便であり、短時間で測定可能であることから、臨床検査や研究室における測定試験等で広く利用されている。イムノクロマト法の標識物質には、一般に酵素や担体（以下、担体という。）が用いられているが、特別な操作を必要とせず、視覚的に検出することができる担体が、簡便性の点から多く使用されている。担体としては、一般に、金コロイド粒子又は着色ラテックス粒子が用いられている。本発明者らは、担体として着色セルロースナノ微粒子も報告している（特許文献１）。
【０００６】
近年、インフルエンザ等の感染症に対しては、早期発見、早期治療が重要とされており、低い抗原濃度（初期感染時）でも検出できる高感度のイムノクロマトキットの開発が期待されている。しかし、担体を標識物質に用いる場合、酵素を標識物質に用いた場合に比べて、反応部位に検出されるシグナルが弱く、早期発見をするための十分な感度が得られないという問題点もあった。ここで、上記問題点を解決するために、本発明者らは、着色セルロース微粒子をイムノクロマトキットに使用することで、偽陽性反応を抑制しながら高感度を達成できることを報告している。ここで、インフルエンザ等の用途に使用する場合、着色セルロース微粒子で十分な感度は得られているが、ＰＣＲ法や酵素免疫測定法等は、イムノクロマト法の感度の１００倍であるとの報告もあり、イムノクロマトキットの汎用性拡大のために、更なる高感度が求められている。また、一般的には、感度と偽陽性反応には、比例関係が存在しており、単純に高感度化を達成したとしても、偽陽性反応も出てしまうというケースが多く、こうなるとイムノクロマトキットとしては使用できなくなってしまう。従って、高感度化と偽陽性反応の抑制の両立が、ポイントになる。
【０００７】
高感度を目的として、イムノクロマト法における展開液に、感度増強剤が、適宜、添加されていることがある。感度増強剤添加の狙いとしては、粘度を上昇させて、検査時間を遅延させることによる高感度化とクロマトグラフ媒体中で担体を軟凝集させることによる高感度化がある。ここで、増粘度目的で、感度増強剤を使用すると、当然、検査時間が遅延してしまい、更には、測定結果の再現性を低下も引き起こしていた。
【０００８】
これら問題点に対して、展開液の粘性を増大させずに、高感度化を達成するために担体同士を適度に軟凝集させる方法が知られている。これは、担体同士が、相互に引き寄せて結合するために、クロマトグラフ媒体の反応部位において、視覚的に検出される陽性シグナルが増幅されるというものである。例えば、酸素原子含有極性基を有するビニル系水溶性ポリマーを使用すること（特許文献２）、被検出物質以外の成分の非特異的吸着を防止するために、被検出物質を含む試験液にイオン性界面活性剤又はグリシン誘導体を添加すること（特許文献３及び４）、又は、感度増強剤としてホスホベタイン構造を有する基を側鎖に有するポリマーを使用すること（特許文献５）等が提案されている。また、特許文献６では、金コロイド粒子と酸素原子含有極性基を有するビニル系水溶性ポリマーを組み合わせることで、高感度化を達成できると報告されているが、十分な感度増強効果が得られていない。以上の報告で、十分な感度が得られていない原因としては、感度増強剤として使用している合成系ポリマーが、これら平均粒子径範囲の担体との親和性が良くなく、更に、これら添加している合成系ポリマーの粘度が高すぎて、感度増強剤として機能しきれていない可能性が考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０６２１５７Ａ１号明細書
【特許文献２】特開平５−１３３９５６号公報
【特許文献３】特開２００５−２９１７８３号公報
【特許文献４】特開２００５−２９１７８０号公報
【特許文献５】特開２００３−３４４４１３号公報
【特許文献６】特開２０１０−１９７８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明が解決しようとする課題は、上記従来技術の問題点に鑑み、被検出物質の抗原の濃度が低いときにも十分にこれを検出することのできる高感度化を達成することができ、検査時間を遅らせることなく、更に偽陽性反応を引き起こさない、クロマトグラフ用展開液を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討し実験を重ねた結果、イムノクロマト法の被検出物質の測定において、特定の粘度範囲の水溶性多糖類の存在下で、特定の平均粒子径範囲の担体と組み合わせることで初めて、偽陽性反応を抑制しながら高感度化に検出できることを見出し、かかる知見に基づき、本発明を完成するに至ったものである。すなわち、本発明で使用する担体の平均粒子径に、感度増強剤を単純に使用すると、凝集し易くなってしまい、高感度が発現しないどころか、偽陽性反応が発生してしまう。そこで、ある一定粘度以下の水溶性多糖類を使用することによって偽陽性反応を起こすことなく、感度増強効果が発現することを、本発明者らは初めて発見した。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のとおりのものである。
［１］１ｗｔ％粘度が０．１ｃＰ以上３００ｃＰ以下の水溶性多糖類を０．００１ｗｔ％以上２０．００ｗｔ％以下で含み、かつ、平均粒子径が１ｎｍ以上６０ｎｍ以下の担体で標識化された検出試薬を含むイムノクロマト用展開液。
【００１３】
［２］前記水溶性多糖類が、水溶性セルロース誘導体である、前記［１］に記載の展開液。
【００１４】
［３］前記水溶性セルロース誘導体は、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースからなる群から選ばれる、前記［２］に記載の展開液。
【００１５】
［４］前記担体は、コロイド状金属粒子である、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の展開液。
【００１６】
［５］前記コロイド状金属粒子は、金コロイド粒子である、前記［４］に記載の展開液。
【００１７】
［６］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の展開液を含む、イムノクロマトキット。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の特定の水溶性多糖類を含み、かつ、特定の担体で標識化された検出試薬を用いる展開液を、クロマトグラフ媒体に使用することにより、検査時間を遅らせることなく、偽陽性反応を抑制しつつ、高感度化を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施形態に係るイムノクロマトキットの一例の平面図及び断面図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明について、詳細に説明する。
本発明の展開液とは、クロマトグラフ媒体において、移動相を構成する液体であって、固定相であるクロマトグラフ媒体を、被検出物質を含む試料及び標識化した検出試薬と共に移動するものとして定義する。本発明においては、各種成分を含んだ展開液を、検査時に滴下してもよいし、又は、クロマトグラフ媒体中に展開液の各種成分を含ませておいてから試料溶液を展開してもよい。展開液の使用方法は、限定されるものではなく、用途に応じて選択すればよい。
【００２１】
本発明の展開液は、１ｗｔ％粘度が０．１ｃＰ以上３００ｃＰ以下の水溶性多糖類を、０．００１ｗｔ％以上２０．００ｗｔ％以下で含む。１ｗｔ％粘度が０．１ｃP未満である水溶性多糖類は、本発明の展開液に用いても感度増強効果はみられない。用いる水溶性多糖類の粘度の下限は、好ましくは０．２ｃＰ以上で、より好ましくは、０．５ｃＰ以上である。また１ｗｔ％粘度が３００ｃＰをこえる水溶性多糖類を使用しようとすると、展開液が高粘度になりすぎて、クロマトグラフ媒体に使用した時に展開不良や、また検出時間遅延を引き起こしてしまう。用いる水溶性多糖類の粘度の上限は、好ましくは２５０ｃＰ以下で、より好ましくは、２００ｃＰ以下である。
【００２２】
ここで、水溶性多糖類の水溶性とは、１気圧２０℃で、１０００ｇの純水に対して、０．１ｇの多糖類を混合させて、当該混合液が均一な外観を維持しており、沈殿物を生じていないものを言う。また、水溶性多糖類の種類については、何ら限定されるものではないが、例えば、デンプン、グリコーゲン、水溶性セルロース誘導体、キチン誘導体、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、ペクチン、キシログルカン、グルコマンナン、ポリデキストロース、アルギン酸、イヌリン、グアーガム、キサンタンガム、タマリンドガム、カードラン、コンドロイチン、フコダイン、プルラン等が挙げられるが、イムノクロマトキットにおける高感度化及び偽陽性反応抑制の観点から、水溶性セルロース誘導体が特に好適である。水溶性多糖類が、本発明に効果がある理由は明確になっていないが、豊富な水酸基を有している多糖類分子が、絶妙な親疎水性を持ち合わせているため、本発明の担体同士の軟凝集状態を構成できているものと考えられる。ここで、水溶性セルロース誘導体としては、例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシエチルセルロース（ＣＥＣ）、カルボキシプロピルセルロース等のカルボキシル基を有する水溶性セルロース誘導体、硫酸セルロース、リン酸セルロース等の酸性基を有する水溶性セルロース誘導体、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース等のヒドロキシアルキル基を有する水溶性セルロース誘導体、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース、プロピルセルロース、メチルエチルセルロース等のアルキル化されたセルロース誘導体が挙げられ、更にこれらのナトリウム塩やカリウム塩等のアルカリ金属塩や、カルシウム塩やマグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩も含まれる。この中で、特に限定されることはないが、取り扱い性の観点から、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）が好ましい。また、これら水溶性セルロース誘導体は、２種類以上の置換基を持ち合わせていてもよい。但し、イムノクロマトキットとしての感度を向上させるために、２種類以上の水溶性多糖類を混合して用いてもかまわない。以下、好ましい水溶性多糖類の一例を示す。
【００２３】
本発明の展開液に有効なＣＭＣは、置換度が０．２以上２．５以下である。置換度が、０．２未満であると、ＣＭＣが水に溶けにくくなるため、均一に展開液に分散しなくなり、その結果、クロマトグラフ媒体に使用した時に展開液の展開不良や、偽陽性反応を引き起こしてしまったり、また、クロマトグラフ媒体のバックグラウンドが悪くなったりする。ここで、クロマトグラフの媒体のバックグラウンドが汚れてしまうと、検出の判定が困難になるので好ましくない。ＣＭＣの水溶性の観点から、好ましい置換度の下限値は、０．３以上、より好ましい置換度は０．４以上である。また、置換度が２．５を超えるＣＭＣは、コスト上、好ましくない。従って、好ましくは、置換度の上限値が２．２以下で、より好ましくは置換度が１．８以下である。尚、ＣＭＣの構造や置換度は、ＩＲのＡＴＲ法で測定することで算出したり、また、重水に溶解させて１３Ｃ−ＮＭＲで測定して算出したりしてもよい。
【００２４】
本発明の展開液に有効なＭＣは、置換度が０．５以上２．５以下である。置換度が、０．５未満であると、ＭＣが水に溶けにくくなるため、ＭＣが均一に展開液に分散しなくなり、その結果、クロマトグラフ媒体に使用した時に展開液の展開不良や、偽陽性反応を引き起こしてしまったり、また、クロマトグラフ媒体のバックグラウンドが悪くなったりする。ＭＣの水溶性の観点から、好ましい置換度の下限値は０．６以上、より好ましい置換度は０．７以上である。また、置換度が２．５を超えるＭＣは、コスト上、好ましくない。従って、ＭＣの置換度の上限値は、好ましくは２．４以下、より好ましくは置換度が２．３以下である。尚、ＭＣの置換度は、ＩＲのＡＴＲ法で測定することで算出したり、また、重水に溶解させて１３Ｃ−ＮＭＲで測定して算出したりしてもよい。
【００２５】
本発明の展開液に有効なＨＰＭＣは、メチル基の置換度が０．５以上２．５以下、ヒドロキシプロピル基の置換度が、０．０１以上０．５０以下である。メチル基の置換度が、０．５未満であると、ＨＰＭＣが水に溶けにくくなるため、ＨＰＭＣが均一に展開液に分散しなくなり、その結果、クロマトグラフ媒体に使用した時に展開液の展開不良や、偽陽性反応を引き起こしてしまったり、また、クロマトグラフ媒体のバックグラウンドが悪くなったりする。ＨＰＭＣの水溶性の観点から、好ましい置換度の下限値は、０．６以上、より好ましい置換度は０．７以上である。また、置換度が２．５を超えるＨＰＭＣは、コスト上、好ましくない。従って、好ましくは、メチル基の置換度の上限値が２．４以下、より好ましくは置換度が２．３以下である。更に、ヒドロキシプロピル基の置換度が、０．０１未満であると、展開液の粘度が安定しないため、好ましくない。好ましいヒドロキシプロピル基の置換度の下限値は、０．０２以上、より好ましくは０．０３以上である。ヒドロキシプロピル基の置換度が、０．５０を上回るＨＰＭＣを製造しようとすると、副反応（ヒドロキシプロピル基にメチル基置換）が進行してしまい、粘度等の品質が安定しないため好ましくない。好ましいヒドロキシプロピル基の置換度の上限値は、０．４０以下、より好ましくは、０．３０以下である。ＨＰＭＣの重合度が２０未満であると、展開液をクロマトグラフ媒体に使用した際に、感度が上昇しない。尚、ＨＰＭＣの置換度は、ＩＲのＡＴＲ法で測定することで算出したり、また、重水に溶解させて１３Ｃ−ＮＭＲで測定して算出したりしてもよい。また、クロマトグラフ媒体に含まれている水溶性多糖類の構造が不明である場合、媒体を純水で洗浄し、１３Ｃ−ＮＭＲにより測定を行い、水溶性多糖類の構造特定することができる。
【００２６】
水溶性多糖類の含有量が、０．００１ｗｔ％未満であると、水溶性多糖類の増感効果が発現せず、高感度が達成できない。水溶性多糖類の含有量の下限は、好ましくは０．００２ｗｔ％以上、より好ましくは０．００３ｗｔ％以上である。また、含有量が２０．００ｗｔ％を超えると、展開液が高粘度になりすぎて、クロマトグラフ媒体に使用した時に展開不良や、偽陽性反応、また検出時間遅延を引き起こしてしまう。含有量の上限として、好ましくは１０．００ｗｔ％以下、より好ましくは５．０００ｗｔ％以下である。水溶性多糖類の含有量が不明である場合、測定方法としては、例えば、イムノクロマトキットのクロマトグラフ媒体を純水で洗浄後、洗浄液を濃縮し、１Ｈ−ＮＭＲ又は１３Ｃ−ＮＭＲで多糖由来のピークを測定するか、洗浄液を乾燥させ、固形分をＩＲで測定し、多糖由来のピークを測定する方法があるが、いずれでも構わない。
【００２７】
本発明の展開液に使用される担体は、粒子径が１ｎｍ以上６０ｎｍ以下である。通常、この平均粒子径の範囲で、単純に水溶性多糖類と組み合わせても、偽陽性反応が発生してしまうため、到底イムノクロマトキットとしては使用できない。単に、この平均粒子径の範囲の担体と、水溶性多糖類を組み合わせたとしても、凝集が進みすぎてしまい、クロマトグラフ媒体中で詰まったり、検査時間の遅延が発生してしまったりする。本発明においては、この担体の平均粒子径の範囲で、所定の低粘度性の水溶性多糖類を組み合わせることによって、偽陽性反応を抑制しつつ、高感度を達成することができる。ここで、担体の平均粒子径が小さすぎると、高感度が発現しない等の問題が生じるため、平均粒子径のコントロールが重要である。平均粒子径が１ｎｍ以下になると、粒子同士が凝集しすぎてしまい、クロマトグラフ媒体に使用した時に目詰まりを起こしてしまったり、検査時間の遅延を招いてしまったりする。高感度と、目詰まりをしない展開性を両立するための平均粒子径の下限値は、好ましくは３ｎｍ以上、更に好ましくは５ｎｍ以上である。また、上限値は、好ましくは５５ｎｍ以下であり、更に好ましくは５０ｎｍ以下である。但し、イムノクロマトキットとしての感度を向上させるために、２種類以上の平均粒子径の担体を混合して用いても構わない。
【００２８】
本発明の担体とは、被検出物質の存在を視覚的に判定するのに適した標識物質であり、目視による判定を容易にするためには、有色であることが好ましく、例えば、コロイド状金属粒子や、着色ラテックス粒子、蛍光ラテックス粒子、染料を含んだセルロース微粒子（着色セルロース微粒子）、蛍光色素化合物を含んだセルロース微粒子（蛍光セルロース微粒子）等が挙げられる。いずれの粒子でも構わないが、例えば、コロイド状金属粒子が好適である。コロイド状金属粒子としては、例えば、金コロイド粒子、白金コロイド粒子、パラジウムコロイド粒子、銀コロイド粒子、銅コロイド粒子、ニッケルコロイド粒子、インジウムコロイド粒子が挙げられ、いずれを用いてもよい。金コロイド粒子は、水溶性多糖類の水酸基との親和性により、クロマトグラフ媒体を展開する上で、水溶性多糖類と最適な分散状態の溶液構造をつくる。そのため、この展開液を展開した時に、凝集や目詰まりによる展開不良、偽陽性反応を起こすことなく、高感度化を達成することができる。
【００２９】
本発明で使用する担体の平均粒子径とは、担体が液体に分散した分散液を粒子粒度分布測定装置で測定することによって得たものを指す。さらに平均粒子径は測定値の体積平均メジアン径の値を指す。粒度分布測定装置には各種の測定原理を応用したものがあるが、本発明では、動的光散乱法による粒度分布測定装置を用いる。後述するように、実施例では日機装社製の「ナノトラック粒度分布測定装置ＵＰＡ−ＥＸ１５０」を用いた。また、得られた体積換算粒径分布の標準偏差を平均粒子径で割った値がＣＶ値（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎの略）であり、担体の均一性を表す指標として用いられる。
【００３０】
担体のＣＶ値は特に規定されるものではない。但し、診断薬として用いる場合は４０％以下が好ましい。ＣＶ値が４０％を超えると、検査対象物の量と平均粒子径変化の不安定性が無視できなくなり、測定の正確性に悪影響が出る。より好ましくは３５％以下であり、更に好ましくは３０％以下である。また、ここでＣＶ値を低くすることは可能であるが、生産性の観点から、低すぎるのは好ましくない。ＣＶ値は、より好ましくは１％以上であり、更に好ましくは３％以上である。
これら担体は、物理吸着を介して担体以外の成分を担持させて利用することもできる。担体以外の成分を担持させることにより、担体にはない機能を持った微粒子を調製することが可能である。
【００３１】
本発明の展開液に使用する担体に担持させる成分とは、担体以外の様々な物質を指し、その種類は特に限定されない。それらの一例としては、界面活性剤、無機微粒子、有機微粒子、生体材料、染料、イオン性物質、水溶性低分子、水溶性高分子、ブロッキング剤、等が挙げられるがそれらに限定されるものではない。本発明における担体に担持させる生体材料とは生体から得られる様々な材料を指し、その種類は特に限定されない。それらの一例としては、コラーゲン、ゼラチン、フィブロイン、へパリン、ヒアルロン酸、デンプン、キチン、キトサン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、脂肪酸、テルペノイド、カロテノイド、テトラピロ−ル、補因子、ステロイド、フラボノイド、アルカノイド、ポリケチド、配糖体、酵素、抗体、抗原、ＣＭＣ、ＣＥＣ、ＭＣなどが挙げられる。それらを担体に担持させることで、担体の生体適合性の向上、各種バイオアッセイや診断薬としての利用、等が可能となる。
【００３２】
本発明における被検出物質とは、免疫血清検査、血液検査、細胞検査、遺伝子検査、などの検査などにおける測定対象を指しその種類は特に限定されない。例えば、癌マーカー、ホルモン、感染症、自己免疫、血漿蛋白、ＴＤＭ、凝固・線溶、アミノ酸、ペプチド、蛋白、遺伝子、細胞、などが挙げられる。より具体的には、ＣＥＡ、ＡＦＰ、フェリチリン、β２マイクロ、ＰＳＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＢＦＰ、エラスターゼ１、ペプシノーゲン１・２、便潜血、尿中β２マイクロ、ＰＩＶＫＡ−２、尿中ＢＴＡ、インスリン、Ｅ３、ＨＣＧ、ＨＰＬ、ＬＨ、ＨＣＶ抗原、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体、ＨＴＬＶ−１抗体、ＨＩＶ抗体、トキソプラズマ抗体、梅毒、ＡＳＯ、Ａ型インフルエンザ抗原、Ａ型インフルエンザ抗体、Ｂ型インフルエンザ抗原、Ｂ型インフルエンザ抗体、ロタ抗原、アデノウィルス抗原、ロタ・アデノウィルス抗原、Ａ群レンサ球菌、Ｂ群レンサ球菌、カンジダ抗原、ＣＤ菌、クリプトロッカス抗原、コレラ菌、髄膜炎菌抗原、顆粒菌エラスターゼ、ヘリコバクターピロリ抗体、Ｏ１５７抗体、Ｏ１５７抗原、レプトスピラ抗体、アスペルギルス抗原、ＭＲＳＡ、ＲＦ、総ＩｇＥ、ＬＥテスト、ＣＲＰ、ＩｇＧ，Ａ，Ｍ、ＩｇＤ、トランスフェリン、尿中アルブミン、尿中トランスフェリン、ミオグロビン、Ｃ３・Ｃ４、ＳＡＡ、ＬＰ（ａ）、α１−ＡＣ、α１−Ｍ、ハプトグロビン、マイクロトランスフェリン、ＡＰＲスコア、ＦＤＰ、Ｄダイマー、プラスミノーゲン、ＡＴ３、α２ＰＩ、ＰＩＣ、ＰＡＩ−１、プロテインＣ、凝固第Ｘ３因子、ＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸、ＧＨｂＡ１ｃ、各種抗原、各種抗体、各種ウィルス、各種菌、各種アミノ酸、各種ペプチド、各種蛋白質、各種ＤＮＡ、各種細胞、等が挙げられる。
【００３３】
本発明における被検出物質と特異的に相互作用する物質とは、上記被検出物質に対し、選択的に吸着や結合を行う物質を指し、その種類は特に限定されない。例えば、抗原、抗体、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、塩基配列、などが挙げられる。特に、抗体を用いた場合は免疫血清検査における各種抗原の存在を検出することが可能になる。例えば、抗体を用いる場合であれば、その由来も特に限定されず、またポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらを用いても構わない。
【００３４】
本発明の展開液の溶媒としては、通常、水を使用するが、有機溶剤を使用してもよい。有機溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロピルアルコール、２−プロピルアルコール、１−ブタノール、２−ブタノール、１−ヘキサノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン等、これらの混合物が挙げられるが、何ら限定されるものではない。
本発明の展開液は、非イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。非イオン性界面活性剤としては、特に限定はされないが、ポリオキシエチレン系界面活性剤の好ましい例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（商品名「Ｔｗｅｅｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（商品名「Ｔｒｉｔｏｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−ノニルフェニルエーテル（商品名「ＴｒｉｔｏｎＮ」シリーズ）等を挙げることができ、より具体的には、「Ｔｗｅｅｎ」シリーズでは、特にＴｗｅｅｎ−２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ−４０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ−６０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ−８０（商品名）、「Ｔｒｉｔｏｎ」シリーズでは、特にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（商品名）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０２（商品名）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１６５（商品名）、ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５（商品名）、「ＴｒｉｔｏｎＮ」シリーズでは、特にＴｒｉｔｏｎＮ−１０１（商品名）、ＴｒｉｔｏｎＮ−１１１（商品名）、ＴｒｉｔｏｎＮ−１５０（商品名）等を挙げることができる。非イオン性界面活性剤は、単独でも２種以上を混合して用いることもできる。上記した非イオン性界面活性剤の含有量は、特に限定されないが、高感度化の観点から、組成物全体の重量に対し、好ましくは０．００１％以上で、より好ましくは０．００２％以上である。また、上限値は特にないが、好ましくは１０％以下の範囲であり、更に好ましくは５％以下である。
【００３５】
特許文献６には、ビニル系水溶性ポリマー存在下で、界面活性剤が担体の結合助剤となることで、感度増強効果が得られるとの記載があるが、本発明では、界面活性剤の添加は必須ではない。界面活性剤を使用できないイムノクロマト法も存在しており、例えば、競合免疫測定法のように分子量の小さな物質を測定する場合は、少量の界面活性剤を添加した場合でも感度の低下を招いてしまうため、界面活性剤の添加は致命的である。それに対して、本発明の水溶性多糖類を用いた系は、界面活性剤を添加することなく、感度増強効果が得られるため、検出する物質に適宜対応ができる。
【００３６】
本発明の展開液は、緩衝剤を含有することが好ましい。緩衝剤の好ましい例としては、リン酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝剤等を挙げることができる。これらの緩衝剤に、特に限定されるものではなく、被検出物質の種類、性質、濃度、などに応じて適宜調整して使用することが可能である。高感度化の観点から、好ましくは０．００１％以上、より好ましくは０．００２％以上である。また、上限としては、１０％以下が好ましく、より好ましくは３．０％以下である。これら単体で使用してもよいし、数種類を組み合わせて使用してもよい。
【００３７】
本発明の展開液は、例えば１種類以上の安定化剤、溶解補助剤等を含んでいてもよい。該安定化剤、溶解補助剤等としては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スクロース、カゼイン、アミノ酸類などを挙げることができるが、カゼインが好ましい。
本発明の展開液のｐＨとしては、例えば、精製水のｐＨや、ｐＨ４．０以上１２．０以下の低濃度緩衝液が挙げられる。低濃度緩衝液のｐＨとしては、感度の観点から、ｐＨ４．５以上が好ましく、より好ましくはｐＨ５．０以上である。他方、ｐＨの上限値は、好ましくはｐＨ１１．０以下、より好ましくはｐＨ１０．０以下である。
【００３８】
本発明のイムノクロマトキットとして、その構造には特に制限はないが、本実施形態のイムノクロマトキットは、構造的には典型的なものである。例えば、図１に示すように、サンプルパッド１、コンジュゲートパッド２、試薬固定化クロマトグラフ媒体３、及び吸収パッド４の並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端を隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくは、バッキングシート５上に）貼付することで作製することができる。また、テストラインとは、試薬固定化クロマトグラフ媒体上の抗体が固定化されている位置に測定試料が到達して検出されるライン（図１中６の位置に現れる）をいい、また、コントロールラインとは、同媒体上にコントロール捕捉試薬が固定化されている位置に測定試料が到達して検出されるライン（図１中７の位置に現れる）をいう。
【００３９】
本発明のイムノクロマトキットによる診断方法は、少量の試料液を試料添加部に添加することにより行われる。試料液として限定はされないが、例えば、主として生体試料、即ち、血液、血清、血祭、尿、唾液、髄液、汗、涙、羊水、乳頭分泌液、鼻汁、疾、鼻腔又は咽頭拭い液、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び糞便からの抽出物、その他化学物質等を用いる。添加された試料液は、サンプルパッド、コンジュゲートパッドを通過し、クロマトグラフ媒体中を毛細管現象により長手方向に移動し、テストライン、コントロールライン部を通って、吸収パッドに吸収される。試料液中の被検出物質は、抗原−抗体反応を利用して、ライン部を通過する際に、クロマトグラフ媒体上のテストライン部に捕捉される。イムノクロマト法による検査では、規定された反応時間の間にクロマトグラフ媒体のテストライン部に捕捉された被検出物質の量を、担体に由来する着色の強度を指標として目視により判定する。
【００４０】
以下、クロマトグラフ媒体に使用する部材について、詳細に説明する。
本発明のクロマトグラフ媒体は、毛管現象を示す微細多孔性物質からなる不活性のものであって、使用される検出試薬、固定化試薬、被検出物質などと反応しないものであり、短時間での判定で十分な感度が得られる展開速度を有していれば、特にその素材が限定されるものではない。
本発明において、クロマトグラフ媒体としては、ニトロセルロース、シリカ、チタニア、ジルコニア、セリア、アルミナ等のセラミック微粒子又は有機高分子の微粒子、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン又は酢酸セルロース等のセルロース誘導体等で構成される繊維状又は不織布繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。微粒子はそれ自体が多孔性でなくとも、充填された状態では微粒子間に空隙が生じクロマトグラフ媒体として機能する。好ましくはセルロース誘導体やナイロンの膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等であり、より好ましくはニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル（ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物）膜、ナイロン膜、濾紙である。
【００４１】
本発明の実施に供されるクロマトグラフ媒体の形態及び大きさは特に制限されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。操作をより簡便にするためには、反応部位が表面に形成されているクロマトグラフ媒体の裏面に、プラスチックなどからなる支持体（バッキングシート）を設けることが好ましい。この支持体の性状は特に制限されるものではないが、目視判定によって測定結果の観察を行う場合には、支持体は、標識物質によりもたらされる色彩と類似しない色彩を有するものであることが好ましく、通常、無色又は白色であることが好ましい。
【００４２】
本発明において用いるクロマトグラフ媒体上には、被検出物質と特異的に結合する物質、例えば、抗体が固定化試薬として任意の位置に固定化された反応部位が形成される。固定化試薬をクロマトグラフ媒体に固定化する方法としては、固定化試薬をクロマトグラフ媒体に物理的又は化学的手段により直接固定化する方法がある。直接的に固定化する方法として、物理吸着を利用してもよいし、共有結合によってもよい。一般にクロマトグラフ媒体がニトロセルロース膜又は混合ニトロセルロースエステル膜の場合、物理吸着を行うことができる。前記クロマトグラフ媒体における前記抗体固定化部（判定部）の形状としては局所的に捕捉用抗体が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられるが、ライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
【００４３】
固定化試薬を固定化した後、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、クロマトグラフ媒体に、公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。一般にブロッキング処理は、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質が好適に用いられる。かかるブロッキング処理後に、必要に応じて、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＳＤＳ等の界面活性剤を１つ又は２つ以上組み合わせて洗浄してもよく、また何も処理しなくてもよい。
【００４４】
クロマトグラフ媒体の作製法としては、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、試薬固定化クロマトグラフ媒体、吸収パッドの並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端を隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート上に）貼付することで作製することができる。これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、本実施形態では、サンプルパッドとしてＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、コンジュゲートパッドとしてＧｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）のガラスファイバーのパッド、メンブレンとしてＨｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓメンブレン（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のニトロセルロースメンブレン、吸収パッドとしてＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）のセルロースメンブレン、粘着剤付きバッキングシートとして、ＡＲ９０２０（商品名、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いたが、これに限定されるものではなく、適宜用途に応じて選択することができる。ここで、本実施形態では、コンジュゲートパッドの処理時に熱乾燥法で主に採用しているが、これに限定されるものではなく、凍結乾燥法を用いてもよい。凍結乾燥法を用いると、ラインが発現し、感度が安定するまでの時間が短くなることも確認されており、検査時間の短縮を目的とした場合、コンジュゲートパッドの処理時に凍結乾燥法を採用してもよい。また、本実施形態では、メンブレンとして使用するＨｉ−Ｆｌｏｗ  ＰｌｕｓメンブレンのＨＦ１２０を使用したが、展開液の粘度に応じて、ＨＦ０７５、ＨＦ１２０、ＨＦ１３５、ＨＦ１８０、ＨＦ２４０のいずれを用いても構わない。本発明における水溶性多糖類は、クロマトグラフ媒体中のサンプルパッド、コンジュゲートパッド、試薬固定化クロマトグラフ媒体、吸収パッドのいずれに含まれていてもよい。
【００４５】
発色の程度の判定は、目視以外に、例えば、イムノクロマトリーダーＣ１００６６（商品名、浜松フォトニクス社製）、プレテスターＲＭ−４０５、プレテスターＲＭ−５０５（いずれも商品名、和光純薬工業社製）等の尿試験紙用のテスター、例えば、デンシトメーター等を用いて、また、写真撮影後の画像解析を用いて行ってもよい。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例などにより限定されるものでないことはいうまでもない。尚、実施例中の主な測定値は以下の方法で測定した。
【００４７】
＜水溶性多糖類の粘度測定方法＞
共栓付３００ｍｌ三角フラスコに２．２ｇの試料を精密に計量し、２１７．８ｇの純水を加えた。混合溶液を一夜間放置後、マグネチックスターラーで約５分間かきまぜ、完全な溶液とした後、コーンプレートタイプの粘度計（東機産業社製、ＴＶ−２５Ｌ型）で粘度測定を行った。
【００４８】
＜展開液中の水溶性多糖類の含有量の算出方法＞
本発明の展開液は、前記したように、クロマトグラフ媒体において、移動相を構成する液体であって、固定相であるクロマトグラフ媒体を、被検出物質を含む試料及び標識化した検出試薬と共に移動するものとして定義される。そのため、本発明の展開液中の含有量は、大きく３つの算出方法に分けられる。
（１）滴下する溶液に水溶性多糖類が含まれる場合
クロマトグラフ媒体に滴下する溶液に水溶性多糖類が含まれる場合は、滴下する溶液量をＡとし、溶液に溶解している水溶性多糖類の重量をＢとして、含有量を下記式（１）により算出した：
水溶性多糖類の含有量（％）＝Ｂ（水溶性多糖類の重量）／Ａ（滴下する溶液量）．．．式（１）
【００４９】
（２）クロマトグラフ媒体に水溶性多糖類が含まれる場合
クロマトグラフ媒体に予め水溶性多糖類が含まれており、その後に展開するための溶液を滴下する場合は、滴下する溶液量をＡとし、１クロマトグラフ媒体中に含まれている水溶性多糖類の重量をＣとして、含有量を下記式（２）により算出した：
水溶性多糖類の含有量（％）＝Ｃ（媒体に含まれている水溶性多糖類の重量）／Ａ（滴下する溶液量）．．．式（２）
【００５０】
（３）クロマトグラフ媒体に水溶性多糖類が含まれているが、含ませている水溶性多糖類の重量が不明である場合
クロマトグラフ媒体を所定量の純水で洗浄し、ＦＴ−ＮＭＲ（Ａｖａｎｃｅ社製、４００ＭＨｚ）で、１３Ｃ−ＮＭＲにより測定を行い、水溶性多糖類の構造と含有量を算出した。
【００５１】
＜担体の平均粒子径の測定、及びＣＶ値の算出方法＞
担体の分散液を、日機装株式会社製粒度分布計マイクロトラックを用いて、粒度分布測定を実施し、平均粒子径を測定した。尚、ＣＶ値は下記式（３）により算出した。また、測定は、測定時間３０秒で、積算回数９９回で実施した。
ＣＶ値（％）＝（粒度分布測定装置より求めた体積粒度分布における標準偏差）／（粒度分布測定装置より求めた体積平均メジアン径）×１００．．．式（３）
【００５２】
＜感度の判定基準＞
反応部位におけるテストラインの赤い線を非常に明確に確認できるものを「＋＋＋」、赤い線を明確に確認できるものを「＋＋」、赤い線を確認できるものを「＋」、赤い線は確認できるが、非常に色が薄いものを「±」、赤い線を確認できないものを「−」とした。
【００５３】
（１）ＣＭＣの検討
［実施例１］
１．標識物質溶液の作製
担体として金コロイド粒子懸濁液（粒子濃度０．００６ｗｔ％、平均粒子径４０ｎｍ）２５００μｌに、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）を６００μｌ加え、更に抗ｈＣＧ-αマウス抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製、モノクローナル抗体）の０．１％水溶液を２００μｌ加えて、ボルテックスで攪拌する。続いて、２５℃で１０分間、温調しながら攪拌した。上記懸濁液に１％のＰＥＧ水溶液を３００ｕｌ、１０％のＢＳＡ水溶液（ｐＨ９．０、５０ｍＭホウ酸含有）を６００ｕｌ添加し、ボルテックスで攪拌した。その後、遠心分離操作（１００００ｇ、３０分間）を行い、上澄み液を除去した。その残渣に、１％ＢＳＡ水溶液（０．０５％ＰＥＧ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．２、２０ｍＭトリス含有）を１１０００ｕｌ添加し、ボルテックスで撹拌した。その後、遠心分離操作（１００００ｇ、３０分間）を行い、上澄み液を除去した。その残渣に、１％ＢＳＡ水溶液（０．０５％ＰＥＧ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．２、２０ｍＭトリス含有）を９００ｕｌ添加し、超音波処理を３０秒間行った。
【００５４】
２．コンジュゲートパッドの処理
１で調製した懸濁液９００μｌに、スクロースを９０ｍｇを加え、ボルテックスで攪拌し、超音波で３０秒間処理した。その後、Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）１０ｍｍ×３００ｍｍに塗布して、５０℃で６０分間乾燥させた。
【００５５】
３．サンプルパッドの処理
サンプルパッド用の処理用水溶液（２％ＢＳＡ、２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．２）を調製し、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）１７ｍｍ×３００ｍｍに塗布して、５０℃で６０分間乾燥させた。
【００５６】
４．メンブレンの処理
ニトロセルロース膜（ミリポア社製、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  ＨＦ１２０、メンブレン  ）２５ｍｍ×３００ｍｍに、抗体塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社製）を用いて、テストラインとして６６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で、０．０５％になるように希釈した抗ｈＣＧ-βマウス抗体（ＭｅｄｉｘＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製、モノクローナル抗体）を塗布した。次いで、コントロールラインとして、６６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で、０．０５％になるように希釈した抗マウス−ウサギ抗体（Ｄａｃｏ社製、ポリクローナル抗体）を塗布した。その後３７℃で、３０分間乾燥させた。
【００５７】
５．クロマトグラフ媒体の作製
バッキングシートから成る基材に、上記サンプルパッド、コンジュゲートパッド、メンブレン、そして、担体を吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。最後に、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、クロマトグラフ媒体を作製した。
【００５８】
６．測定
上記のように作製したクロマトグラフ媒体を用いて、以下の方法で試料中のｈＣＧ抗源の存在の有無を測定した。０．５重量％Ｔｗｅｅｎ−２０、１．０重量％ＢＳＡ水溶液と６６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）から成る展開液を陰性検体試料とし、ここにｈＣＧ抗体（Ｓｐｉｐａｃ社製）で各々の抗原濃度に調整したものを陽性検体試料とし、１ｗｔ％のＣＭＣ水溶液（セロゲン６Ａ、第一工業製薬社製、置換度０．７５、重合度２５０）を１５ｍｇ加え、各々の試料を１５０μｌ分、クロマトグラフ媒体のサンプルパッド上に載せて展開させ、１５分後に目視判定をした。その結果、抗原濃度０．２５ｍＩＵ／ｍｌまで検出することができ、偽陽性反応も発生しなかった。結果を以下の表１に示す。
【００５９】
［実施例２〜６］
実施例１の「６．測定」での、展開液中のＣＭＣ濃度を変更した以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。その結果、いずれも偽陽性反応が発生することなく、高感度を達成することができた。結果を以下の表１に示す。
【００６０】
［実施例７〜１５］
実施例１の「６．測定」での、ＣＭＣの置換度、粘度を変更した以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。その結果、いずれも偽陽性反応が発生することなく、高感度を達成することができた。結果を以下の表１に示す。
【００６１】
［実施例１６〜１８］
実施例１の「１．標識物質溶液の作製」での、金コロイド粒子の平均粒子径を変更した以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。その結果、いずれも偽陽性反応が発生することなく、高感度を達成することができた。結果を以下の表１に示す。
【００６２】
［実施例１９］
実施例１の「３．サンプルパッドの処理」と「６．測定」で、Ｔｗｅｅｎ−２０を使用しない以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。その結果、いずれも偽陽性反応が発生することなく、高感度を達成することができた。結果を以下の表１に示す。
【００６３】
［実施例２０と２１］
実施例１の「６．測定」で、ＣＭＣを添加せずに、「２．コンジュゲートパッドの処理」で試験実施時にＣＭＣを各濃度になるように添加した以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。その結果、いずれも偽陽性反応が発生することなく、高感度を達成することができた。結果を以下の表１に示す。
【００６４】
［実施例２２と２３］
実施例１の「６．測定」で、ＣＭＣを添加せずに、「２．コンジュゲートパッドの処理」で試験実施時にＣＭＣを各濃度になるように添加し、かつ、乾燥方法として凍結乾燥を用いた以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。その結果、いずれも偽陽性反応が発生することなく、高感度を達成することができた。結果を以下の表１に示す。興味深いことに、実施例２２と２３では、キットの目視判定時、他の実施例よりも早く安定化し、５分間でラインが発現し、更には感度も安定していた。
【００６５】
［比較例１］
実施例１の「６．測定」での、ＣＭＣを添加しない以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。その結果、感動増強効果は得られなかった。結果を以下の表１に示す。
【００６６】
［比較例２〜６］
実施例１の「６．測定」で、ＣＭＣ濃度、置換度、粘度を変更した以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。結果を以下の表１に示す。比較例２では、ＣＭＣの濃度が低すぎて、感度増強効果が見られなかった。比較例３では、展開液中のＣＭＣ濃度が高すぎて、高粘度になってしまい、クロマトグラフ媒体中で全く展開しなかった。比較例４では、展開液に均一に溶解しなかったためか、クロマトグラフ媒体中で目詰まりを起こしており、また、バックグラウンドが汚かった。比較例５では、ＣＭＣの粘度が低すぎるためか、高感度化の効果が見られなかった。比較例６では、粘度が高すぎるために、高粘度になってしまい、目詰まりを起こしており、バックグラウンドが汚かった。
【００６７】
［比較例７］
実施例１の「１．標識物質溶液の作製」での、金コロイド粒子の平均粒子径を変更した以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。結果を以下の表１に示す。金コロイド粒子の平均粒子径が小さい比較例７では、感度が低かった。
【００６８】
【表１】
2015001395.tif 000002
【００６９】
（２）他の水溶性セルロース誘導体の検討
［実施例２４〜２６］
実施例１の「６．測定」で、ＣＭＣは使用せず、代わりにＭＣを各種濃度になるように、添加した以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。その結果、いずれも偽陽性反応が発生することなく、高感度を達成することができた。結果を以下の表２に示す。
【００７０】
［実施例２７〜３０］
実施例１の「６．測定」で、ＣＭＣは使用せず、代わりに、各種置換度及び粘度のＭＣを、添加した以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。その結果、いずれも偽陽性反応が発生することなく、高感度を達成することができた。結果を以下の表２に示す。
【００７１】
［実施例３１〜３３］
実施例１の「６．測定」で、展開液にＣＭＣは使用せず、代わりにＨＰＭＣを各種濃度になるように、添加した以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。その結果、いずれも偽陽性反応が発生することなく、高感度を達成することができた。結果を以下の表２に示す。
【００７２】
［実施例３４〜３７］
実施例１の「６．測定」で、ＣＭＣは使用せず、代わりに、各種置換度及び粘度のＨＰＭＣを、添加した以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。その結果、いずれも偽陽性反応が発生することなく、高感度を達成することができた。結果を以下の表２に示す。
【００７３】
［実施例３８と３９］
実施例１の「６．測定」で、ＣＭＣは使用せず、代わりにＣＥＣを各種濃度になるように、添加した以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。その結果、いずれも偽陽性反応が発生することなく、高感度を達成することができた。結果を以下の表２に示す。
【００７４】
［比較例８〜１０］
実施例１の「６．測定」で、ＭＣ濃度、置換度を変更した以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。結果を以下の表２に示す。比較例８では、ＭＣの濃度が低すぎて、感度上昇の効果が見られなかった。比較例９では、展開液中のＭＣ濃度が高すぎて、粘度が上昇しすぎたため、クロマトグラフ媒体中で全く展開しなかった。比較例１０では、展開液に均一に溶解せず、クロマトグラフ媒体中で目詰まりを起こしており、またバックグラウンドも汚かった。
【００７５】
［比較例１１〜１３］
実施例１の「６．測定」での、ＨＰＭＣ濃度、置換度を変更した以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。結果を以下の表２に示す。比較例１１では、ＨＰＭＣの濃度が低すぎて、感度上昇の効果が見られなかった。比較例１２では、展開液中のＨＰＭＣ濃度が高すぎて、粘度が上昇しすぎたため、クロマトグラフ媒体中で全く展開しなかった。比較例１３では、展開液に均一に溶解せず、クロマトグラフ媒体中で目詰まりを起こしており、またバックグラウンドも汚かった。
【００７６】
［比較例１４、１５］
実施例１の「６．測定」で、ＣＭＣは使用せず、代わりに各種水溶性合成ポリマーとして、ポリビニルピロリドン（１０、４０Ｔ、いずれも商品名、東京化成工業社製をそれぞれ添加した以外は全て同じ条件でクロマトグラフ媒体を作製し、展開試験を実施した。結果を以下の表２に示す。比較例１４と１５でポリビニルピロリドンを用いた場合、感度の低下が見られた。
【００７７】
【表２】
2015001395.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の所定の水溶性多糖類を含む、所定の担体で標識化された検出試薬を用いるイムノクロマト法における展開液は、界面活性剤の有無に拘わらず、生体試料中に含まれる被検出物質を、偽陽性反応を抑制しつつ高感度に検出できるので、臨床検査等における免疫測定法に好適に利用することができる。
【符号の説明】
【００７９】
１    サンプルパッド
２    コンジュゲートパッド
３    試薬固定化クロマトグラフ媒体
４    吸収パッド
５    バッキングシート（支持体）
６    テストライン
７    コントロールライン
【図１】
2015001395.tif 000004