(57)【要約】      （修正有）【課題】少なくとも２つの異なる大きさの細胞型を含む細胞材料の懸濁液を、回転膜分離器を用いて分離する方法の提供。【解決手段】膜を通過することによって分離される細胞型を選択し、懸濁液中の選択された細胞型の濃度を決定し、懸濁液の流入量を選択し、懸濁液中の選択された細胞型の１以上の濃度と相対的なサイズに関係して回転膜分離器の回転数を選択し、選択された回転数で回転膜分離器を回転させて選択された細胞型が多孔膜に隣接したせん断場領域に侵入し、懸濁液を回転膜分離器に流す。懸濁液は赤血球、白血球、血小板、血漿を含み、回転膜分離器は予め定められた公称孔径を有し、選択された細胞型は赤血球であり、公称孔径が４μｍであり、初期設定された回転数が３０００ｒｐｍである方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
回転膜分離器を用いて、少なくとも２つの異なる大きさの細胞型を含む細胞材料の懸濁液を分離する方法であって、工程は
ａ）膜を通過することによって分離される細胞型を選択すること、
ｂ）懸濁液中の各細胞型の濃度を決定すること、
ｃ）懸濁液の流入量を選択すること、
ｄ）懸濁液中の選択された細胞型の濃度と相対的なサイズの一以上に直接関連する回転膜分離器の回転数を選択すること、
ｅ）回転膜分離器を選択された回転数で回転させること、
ｆ）回転分離器に懸濁液を流すこと
を含む、方法。
【請求項２】
スピナーの回転数は、濃度がより高く、および／または、相対的なサイズがより大きければ、より高くより速い回転数が選択され、濃度がより低くまたは相対的なサイズがより小さければ、より低くより遅い回転数が選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
回転膜分離器内に形成されるせん断場内において細胞材料の細胞型による分離しやすさを高めるために、懸濁液は、分離の前に希薄される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
回転膜分離器は、さらに、初期設定された回転数を有し、初期設定された速度から選択された速度まで回転数を調節する、請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
懸濁液は、赤血球と白血球と血小板と血漿とを含み、回転膜分離器は予め定められた公称孔径を有し、選択された細胞型は赤血球である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
公称孔径が４μｍであり、初期設定された回転数が３０００ｒｐｍである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
回転膜分離器を用いて少なくとも２種類の細胞型を含む細胞材料の懸濁液を分離する方法であって、
回転膜分離器は、略円筒形状のハウジングと、内壁と、ハウジングの内部に設置されて外壁を有する内側部材とを備え、ハウジングの内壁および／または内側部材の外壁は、環状の隙間またはハウジングまたは内側部材との対向面から離間された多孔膜を含んで環状の隙間を定義し、ハウジングと内側部材は相対的に回転可能であり、ハウジングと内側部材の相対的な回転は、隙間において、ハウジングの内壁と内側部材の外壁に隣接する位置においてより大きい力が生じるせん断場を形成し、工程は、
ａ）膜を通過することによって分離される細胞型を選択すること、
ｂ）懸濁液中の各細胞型の濃度を決定すること、
ｃ）懸濁液の流入量を選択すること、
ｄ）懸濁液中の選択された細胞型の濃度と相対的なサイズの一以上に直接関連する回転膜分離器の回転数を選択すること、
ｅ）回転膜分離器を選択された回転数で回転させ、選択された細胞型が多孔膜に隣接する領域に侵入すること、
ｆ）回転分離器に懸濁液を流すこと、
を含む、方法。
【請求項８】
スピナーの回転数は、より高い濃度および／またはより小さい相対的なサイズでは、より高いまたは速い回転数が選択され、より低い濃度および／またはより大きな相対的なサイズではより低い／遅い回転数が選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
懸濁液は、回転膜分離器内に形成されるせん断場内において細胞材料の細胞型による分離しやすさを高めるために、懸濁液を分離の前に希薄する請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
初期設定された回転数を有し、初期設定された速度から選択された速度まで回転数を調節する回転膜分離器を含む、請求項７から請求項９までのいずれか１項に記載のろ過方法。
【請求項１１】
懸濁液は赤血球、白血球、血小板、血漿を含み、回転膜分離器は予め定められた公称孔径を有し、選択された細胞型は赤血球である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
公称孔径が４μｍであり、初期設定された回転数が３０００ｒｐｍである、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、回転膜分離を用いて全血の細胞成分を分離する方法に関し、より特定的には、膜の公称孔径の大きさに直ちに依存しない、選択された細胞成分を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
回転多孔膜分離器は、全血の細胞成分から血漿を分離するために用いられてきた。周知の血漿搬出装置は、イリノイ州レイクズーリックのフェンウォール  インコーポレイテッドが販売するＰｌａｓｍａｃｅｌｌ−Ｃ分離器である。回転膜分離器の詳細な説明はシェーンドーファーの米国特許第５１９４１４５号においてなされており、これは本願に参照として組み込まれる。この特許は、静止シェル内に配置された内側の採集システムを有する、膜で覆われたスピナーを記載する。血液は、スピナーとシェルの間の環状空間または隙間へ供給される。血液はシェルの縦軸に沿って出口区域に移動し、血漿は膜を通ってシェルの外の採集バッグ中へ通過する。残留する血液成分は、スピナーとシェルの間の出口区域に移動し、その後、典型的には提供者に戻される。
【０００３】
回転膜分離器は、主として回転膜とシェルの間の隙間に誘発された独特の流れパターン（テイラー渦）のため、優れた血漿ろ過流量を提供することが見出されている。テイラー渦は、主として血球などの細胞成分が膜上に沈着し、そして膜を汚染または詰まらせることから保護するのに役立つ。
【０００４】
膜ろ過法においては、ろ液の特性は、主に、膜の公称孔径と残渣の細胞成分との大きさの差に依存する。回転膜法によって血漿搬出するためには、公称孔径は典型的には約０．６５μｍであり、血漿は膜を通過するが、一方、血液細胞成分の大半、すなわち白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）および血小板（ＰＬＴ）は残渣となる。この残渣は、回転膜とハウジングとの隙間に残り、その後、スピナーのハウジングを出る。従って、ＷＢＣ、ＲＢＣ、ＰＬＴを互いに分離するためには、残渣を、異なる公称孔径、例えば、ＲＢＣは通過させＷＢＣは通過させない４．０〜５．０μｍの膜を有する分離装置に再び通すことが必要である。
【０００５】
本開示の方法によって、分離される細胞の種類が単に膜の公称孔径に依存するのではない、回転膜分離器を用いた様々な血液成分の分離方法が提供される。従って、単一の回転膜分離器を用いて、異なる細胞生成物が獲得され得る。
【発明の概要】
【０００６】
本願の主題は、多様な組み合わせによって用いられ得るいくつかの局面を有し、１以上の具体的な実施形態の開示は、開示と記載の目的のためであり、限定ではない。この概要は、この主題のいくつかの局面にのみ集中しており、さらなる局面は、以下の図面と、より詳細な説明とにおいて開示される。
【０００７】
回転膜分離器を用いて、少なくとも２つの異なる大きさの細胞型を含む細胞材料の懸濁液を分離するための方法が提供される。回転膜分離器は略円筒形状のハウジングを備え、ハウジングは内壁と、ハウジングの内部に設置されて外壁を有する内側部材とを含む。ハウジングの内壁および／または内側部材の外壁は、ハウジングの対向壁または内側部材の表面から離間して配置される多孔膜を含み、環状の隙間をそれらの間に定義する。ハウジングと内側部材は、相対的に回転可能であり、そのため、ハウジングと内側部材との相対的な回転は、隙間に、せん断場を生じる。せん断場は、ハウジングの内壁と内側部材の外壁の近辺でより高い力となる力の勾配を有する。
【０００８】
１つの局面に従えば、この方法は、膜を通過することによって分離される細胞型を選択することと、選択された細胞型の懸濁液中の濃度を決定することと、懸濁液の流入量を選択することと、一以上の選択された懸濁液中の細胞型の濃度と相対的なサイズに関連して回転膜分離器の回転数を選択することと、選択された回転数において回転膜分離器を回転させて、選択された細胞型が多孔膜に隣接したせん断場の領域に侵入するようにすることと、懸濁液を回転膜分離器を通して流すことを含む。
【０００９】
さらなる局面においては、この方法は回転数を選択することを含み、選択された細胞型がより高い濃度および／または相対的なサイズがより小さいものであれば、よい高い／より速い回転数を選択し、また、より低い濃度および／または相対的なセルのサイズがより大きいものであれば、より小さい／遅い回転数を選択する。
【００１０】
別の局面においては、この方法は、回転膜分離器内に形成されるせん断場内において細胞材料の細胞型による分離しやすさを高めるために、分離の前に懸濁液を希薄することを含む。
【００１１】
さらなる局面においては、この方法はさらに、初期設定された回転数を有し、初期設定された速度から選択された速度まで回転数を調節する回転膜分離器を含む。
【００１２】
特定の応用においては、懸濁液は、赤血球と白血球と血小板と血漿とを含み、回転膜分離器は予め定められた４．０〜５．０μｍの公称孔径を有し、選択された細胞型は赤血球であり、初期設定された回転数は３０００ｒｐｍである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本主題のこれらおよび他の特徴は、以下の詳細な説明と図面に示されている。
【図１】詳細を示すために一部を除去した回転膜分離器の一部断面斜視図である。
【図２】図１に示す回転膜分離器の縦断面図である。
【図３】隙間におけるせん断場と、せん断場における細胞成分の、大きさに基づく相対的な拡散を示す概略図である。
【図４】３つの源型（ｄＲＢＣ，ｄＢＣ，ＭＮＣ）に応じて５つの異なる、可能性のある具体的に特定された細胞成分の減量手順の概略を示す表である。
【図５】ｄＲＢＣ生成物について、標的とされた特定の細胞成分についての本願の手順の概略を示す表である。
【図６】ｄＢＣ生成物について、標的とされた特定の細胞成分についての本願の手順の概略を示す表である。
【図７】ＭＮＣ生成物について、標的とされた特定の細胞成分についての本願の手順の概略を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示に従った方法のより詳細な説明が以下に述べられる。特定の方法の以下の説明は例示を意図しており、すべての可能な変形または応用を網羅するものではないことが理解されるべきである。このため開示の範囲は限定を意図せず、そして当業者に発生するであろう変形または具体例を包含することと理解されるべきである。
【００１５】
図１および２へ転ずると、一般に１０で指定した回転膜血液分離もしくは分画システムが示されている。そのようなシステム１０は、個々のヒトドナーから得た全血から血漿を抽出するために典型的に使用される。しかしながら以下に詳細に説明するように、装置は血液細胞成分の単離にも用いられ得る。理解を容易にするため、血液分離装置および付属する駆動ユニットのみを示すが、そのような分離器は採集バッグ、食塩水またはＡＣＤのような添加剤のバッグ、返還バッグ、チューブ等を含んでいる使い捨てシステムの一部を形成すること、および装置の作動のための関連する制御および編成システムが存在することを理解すべきである。
【００１６】
システム１０は、縦の垂直中心軸のまわりに同心的に配置された一般に円筒形のハウジング１２を含んでいる。内側部材１４は中心軸と同心に取り付けられる。ハウジングと内側部材は相対的に回転可能である。図示した好ましい具体例では、ハウジングは静止し、そして内側部材は円筒形のハウジング１２内で同心的に回転可能な回転スピナーである。血液流路の境界は一般にハウジング１２の内表面と回転スピナー１４の外表面の間の隙間１６によって区切られる。ハウジングとスピナーの間の間隔はしばしばせん断隙間と称される。典型的なせん断隙間は約０．０２５〜０．０５０インチ（０．０６７〜０．１２７ｃｍ）であることができ、そして例えばスピナーとハウジングの軸が一致している場合、軸に沿って均一な寸法であり得る。
【００１７】
せん断隙間は軸方向に沿って変化することもでき、例えば溶血を制限するため好ましくは流れ方向に増大する隙間幅になっている。そのような隙間幅は、約０．０２５ないし約０．０７５インチ（０．０６〜０．１９ｃｍ）の範囲であることができる。例えば、ハウジングとローターの軸を一致させ、ハウジングの内表面の直径を一定に保ちながらローターの直径を軸方向（流れ方向）に減少させるか、またはローターの直径を一定に保ちながらハウジングの直径を増大させるか、または両方の表面の直径を変化させることができる。例えば、隙間幅は隙間の上流または入口端において約０．０３５インチ（約０．０８８ｃｍ）とし、そして隙間の下流端または末端において約０．０５９インチ（約０．１５ｃｍ）とすることができる。隙間幅はローターの外径および／または対面するハウジング表面の内径を変えることによって変化させることもできる。隙間幅は直線的にまたは段階的に、または望んだ他の態様で変化させることができる。いずれの場合でも、隙間の幅寸法は、好ましくは所望の相対的回転数となるように選ばれる。テイラー渦のようなテイラー・クエット流が隙間の中に創出され、そして溶血が制限される。
【００１８】
全血は入口導管２０から、スピナー１４の上端のまわりの円周に対して接線方向の流路中の血液流入口区域中へ全血を導く入口オリフィス２２を通って導入される。円筒形ハウジングの底端において、ハウジングの内壁は出口オリフィス３４を含んでいる。
【００１９】
円筒形ハウジング１２は端部ボス４２を有する上端キャップ４０と、そして中心軸と同心の血漿出口オリフィス４６で終わっている底端ハウジング４４で完成されており、該ボス４２の壁は非磁性である。
【００２０】
スピナー１４は上端キャップ４０と底端ハウジング４４の間に回転自在に装荷される。スピナー１４は成形されたマンドレルもしくはローター５０を含み、その外表面は環状ランド５４によって分離されている離間した円周方向溝５２の列を形成するように成形されている。円周方向溝５２によって区切られた表面チャンネルは縦方向の溝５６によって相互接続されている。マンドレル５０の各端部において、これら溝５６は中央オリフィスもしくはマニホールド５８と連通している。
【００２１】
図示した具体例においては、回転スピナー１４の表面は、少なくとも部分的に、そして好ましくは実質上もしくは全体に、円筒形の多孔質膜６２によって覆われている。システム１０が血漿搬出に用いられるのであれば、膜６２は典型的には公称６ミクロンのポアサイズを有するが、しかし以下に説明するように、血液細胞成分を単離し分離するために望まれるのであれば、他のポアサイズを使用することができる。ここで記載する洗浄方法に有用な膜は、繊維状メッシュ膜、キャスト膜、トラックエッチド膜または当業者に知られているであろう他のタイプの膜である。
【００２２】
回転スピナーは、片方では端部キャップ４０中に押し込まれ、そして回転スピナー１４の一部を形成する端部シリンダー６６中の円筒形軸受表面６５中に座着されたピン６４のまわりを回転するように上端キャップ中に装荷される。内側スピナーまたは外側ハウジングは任意の適当な回転駆動器具もしくはシステムによって回転させることができる。図示するように、端部シリンダー６６はスピナー１４の間接駆動に使用される磁性材料のリング６８によって部分的に囲まれている。ハウジング１２の外部の駆動モーター７０は、少なくとも一対の内側永久磁石７４を含んでいる環状磁気駆動部材７２を回転させるように連結される。環状駆動部材７２が回転するとき、ハウジング内側のリング６８とハウジング外側の磁石７４の間の磁気誘引がスピナー１４を外部駆動へロックし、スピナー１４を回転せしめる。
【００２３】
回転スピナー１４の下端において、中央出口オリフィス５８は中心軸と同心の端部軸受７８中の中央ポア７６と連通している。中央開口８２の下縁を形成する内側ショルダー８０によって端部軸受座が形成される。中央開口８２は血漿出口オリフィス４６と連通している。もしハウジングの内側対面表面が膜によって完全にまたは部分的に覆われていれば、流体採集もしくはマニホールドを膜の下に設置し、血漿を採集し、そしてハウジング出口（図示せず）を通ってそれを誘導することができる。
【００２４】
本開示に従えば、回転膜分離器を用いる分離方法では、膜の公称孔径が選択され、膜とハウジングとの隙間のせん断場の勾配は、残留すべき細胞成分が膜を通過して輸送されないように、かつ、選択された細胞成分が膜を通過するように、細胞成分が拡散するように操作される。より特定的には、せん断勾配はハウジングに対する膜の相対的な回転数を、膜を通過させる懸濁液中の細胞型の１以上の濃度と相対的なサイズに関連して変化させることによって制御される。より高い濃度および／またはより小さい相対的なサイズはより高い／速い回転数を選択させ、より低い濃度および／またはより大きい相対的なサイズは低い／遅い回転数を選択させる。
【００２５】
図３に示すように、膜１００がハウジング１０２に対して相対的に回転させられている時、せん断勾配１０４が隙間１０６を横切って形成される。最も高いせん断力（最も長い力線によって表わされる）は膜とハウジングの表面に接して現れ、せん断力は、理論的には隙間の中央または中間でゼロまで減少する。全血の主な細胞成分は、大きさは最も大きなものからも小さいものまであり、白血球、赤血球、血小板である。成熟した通常の赤血球（それは核を持たず、形は典型的に円板状である）は、直径が約７μｍ、厚みが約２μｍである。白血球は、完全な球状ではないが、外径は最低約４．５μｍから約２０μｍであり、典型的には、３．８μｍ〜４μｍかそれより大きい核を有する。血小板は、円板形状であり、典型的には直径が２〜３μｍである。血液細胞成分の懸濁液が隙間に導入されると、細胞は、せん断場における存在が最小となるように拡散する。具体的には、白血球は最も大きいので、最も大きなせん断力に曝され、隙間の中央に押しやられる。赤血球は、次に大きいので、白血球によって既に塞がっていないところまで、隙間の中央に向かって押しやられる。血小板は、中央に押しやる最も小さい力を受け、この力は既にこの空間を占めているより大きな細胞によって相殺されるであろう。
【００２６】
膜の孔の形状と大きさは、孔どうしの間の間隔と同様、通過される細胞成分の特性によって選択され、異なる細胞型の相対的な変形能が考慮される。例えば、赤血球は、相対的に白血球よりも変形しやすく、白血球よりも速く変形し、白血球よりも小さい力で変形することが知られている。そこで、４．０μｍ〜５．０μｍの公称孔径が膜に選択されると、白血球は残留し、赤血球と血小板は膜を通過する。従って、膜の回転数を適切に選択することによって、血小板および／または赤血球の大半は、白血球から分離され得る。例えば、白血球、赤血球と血小板の懸濁液が回転膜分離器の隙間に導入されて、回転数が選択されると、白血球と赤血球は隙間の中央に維持され、最初に血小板（そして極小の赤血球）が膜を通過する。その後、回転数は赤血球が膜に侵入するように調整され（減速され）、膜を通過することによって赤血球の大半が白血球から分離され、白血球は隙間内に維持される。懸濁液中の様々な細胞成分の相対濃度に依存して、懸濁液は（例えば生理食塩水によって）より低い濃度に希釈され、せん断場に曝された時の細胞型による細胞成分の分離し易さを高められる。このようにして、適切に制御された、単一の回転膜分離器が、白血球、赤血球、血小板の濃縮を得るために使用され得る。
【００２７】
この方法は、さらに有利には、白血球の減量または除去（白血球は残留し、赤血球と血小板は膜を通過する）や、血小板の除去（白血球と赤血球は残留し、血小板は膜を通過する）や、白血球の除去（白血球が残留し、赤血球と血小板は膜を通過する）、洗浄操作（原料製品内に全ての細胞が保持されている間、上澄みが新しい媒体と入れ替えられる）や、白血球／赤血球の細胞懸濁液や赤血球／血小板の細胞懸濁液からの単一の細胞型生成物の単離など、様々な「シングルパス」の分離手順に使用され得る。
【００２８】
特に、本開示に従った方法によれば、回転膜分離器を用いて、選択された細胞成分を選択的に分離するために、３つの変数を制御する。すなわち、流入流量、原料生成物組成、そして膜の回転数である。様々なシングルパス手順を確立するために、試験が実施された。表４に示すような、５つの異なる減少手順は、３つの異なる原料型、すなわち、希釈された赤血球（ｄＲＢＣ）、希釈されたバフィコート（ｄＢＣ）、そして単核細胞（ＭＮＣｓ）に応じて確立された。５つの確認された手順は、単に全てのあり得る手順の部分集合であり、説明のために示されているのであって、制限するためではないことが理解されるべきである。
【００２９】
手順は、上述のように、公称孔径が４．０μｍのＰＣＴＥ膜を用いて回転膜分離器を用いて確立された。手順における流量と回転数の確立において、様々な細胞成分の最小の保持水準が設定された。流量は、２０００ｒｐｍより低い速度では白血球残留の因子となることが決定され、白血球の残留は、５０ｍＬ／分の流量で最高に、１５０ｍＬ／分の流量で最低になる。流量は、２５０ｒｐｍより低い回転数では赤血球の残留の因子となり、流量が少ない場合には（白血球と同様）赤血球の残量はより高くなる。血小板は、白血球や赤血球とは異なるふるまいをする。流量や回転数は血小板の残量に影響を与えず、残量は約２０％である。図５，６，７は、ｄＲＢＣ、ｄＢＣ、ＭＮＣといった具体的な標的細胞成分の概略の手順を示し、具体的な標的細胞と混在物、細胞型による残留パーセンテージ、流量、そして回転数を示している。
【００３０】
従って、上述の説明からわかるように、本開示はいくつかの異なる局面を有し、添付された図面と上述の説明に示された具体的な方法と装置に限定されない。これらの概念の変形例は、本開示の範囲から逸脱しないでこの方法と装置を実施するために具体化され得る。
【００３１】
上述されたこの主題の局面においては、単独で、または、１以上の他の局面と組み合わせて有益となり得る。前述の説明を制限することなく、本主題のひとつの局面が提供される。一つの局面に従えば、この方法は、この方法は、膜を通過することによって分離される細胞型を選択することと、選択された細胞型の懸濁液中の濃度を決定することと、懸濁液の流入量を選択することと、一以上の選択された懸濁液中の細胞型の濃度と相対的なサイズに関連して回転膜分離器の回転数を選択することと、選択された回転数において回転膜分離器を回転させて、選択された細胞型が多孔膜に隣接したせん断場の領域に侵入するようにすることと、懸濁液を回転膜分離器を通して流すことを含む。
【００３２】
さらなる局面においては、この方法は、回転数を選択して選択された細胞型のより高い濃度および／またはより小さい相対的なサイズが、結果として、よい高い／より速い回転数の選択になり、また、より低い濃度および／またはより大きい相対的なセルのサイズが、結果としてより小さい／遅い回転数の選択になることを含む。
【００３３】
別の局面においては、この方法は、回転膜分離器内に形成されるせん断場内において細胞材料の細胞型による分離しやすさを高めるために、懸濁液を分離の前に希薄する。
【００３４】
さらなる局面においては、この方法はさらに、初期設定された回転数を有する回転膜分離器を含み、回転数は、初期設定された速度から選択された速度まで調整される。
【００３５】
特定の応用においては、懸濁液は赤血球、白血球、血小板および血漿を含み、回転膜分離器は公称孔径が４．０〜５．０μｍであり、選択された細胞型は赤血球であり、初期設定された回転数は３０００ｒｐｍである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【外国語明細書】
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