(57)【要約】【課題】本抗ＡＰＲＩＬ特異的抗体の組成物と、このような抗体を生物学的活性APRILの調節において、特に炎症性疾患、細胞増殖および癌の阻害において用いる方法とを提供する。【解決手段】アミノ酸配列ＩＲＳＭＰＳＨＰＤＲＡまたはＶＳＲＥＧＱＧＲＱのＡＰＲＩＬに結合する結合化合物である、ヒトＡＰＲＩＬに結合する結合化合物。【選択図】図１
2015164956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＩＲＳＭＰＳＨＰＤＲＡまたはＶＳＲＥＧＱＧＲＱのＡＰＲＩＬに結合する結合化合物である、ヒトＡＰＲＩＬに結合する結合化合物。
【請求項２】
アミノ酸配列ＳＭＰＳＨＰまたはＥＧＱのＡＰＲＩＬに結合する結合化合物である、請求項１に記載の結合化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトAPRILに結合する単離された抗体またはそのフラグメント、該抗体をコ
ードするポリヌクレオチド、および上記抗体を産生する宿主細胞に関する。抗体は、免疫細胞の増殖および／または生存の阻害、癌の処置ならびに炎症性疾患の処置のために用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
APRILはII型膜貫通タンパク質として発現されるが、殆どの他のTNFファミリーメンバーと異なり、主に分泌タンパク質として処理され、ゴルジ体で切断されて、そこでフューリン転換酵素により切断され可溶性活性型を放出する（Lopez-Fraga et al., 2001, EMBO Rep 2, 945-51,）。APRILは、タンパク質の折りたたみにおいて、多くの他のTNFファミリ
ーリガンドと同様の構造上相同性を有する非共有結合ホモ三量体として集合する（Wallweber et al., 2004, Mol Biol 343, 283-90）。APRILは、Ｂ細胞成熟抗原（BCMA）および
膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレータおよびシクロフィリンリガンドインタラクタ（TACI）の２つのTNF受容体を結合する（Kimberley et al., 2009, J Cell Physiol. 218（l）:l-8に概説される）。さらに、近年、APRILがヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）を結合することが示された（Hendriks et al., 2005, Cell Death Differ 12,
637-48）。
【０００３】
APRILは、TNFスーパーファミリーの別のメンバーである、TNFファミリーに属するＢ細
胞活性化因子（BAFFまたはBリンパ球刺激因子、BLyS）と高い相同性（３０％）を示し、
その受容体であるBCMAおよびTACIへの結合をそれと共有する。また、BAFFは、独自の受容体であるBAFF受容体を結合することが知られており、これを介してＢ細胞発育中に決定的な生存シグナルを媒介する（Kimberley et al., 2009, J Cell Physiol. 218（l）:l-8に概説される）。APRILおよびBAFFは、混合三量体を形成することが示唆されている（Roschke et al., 2002, J Immunol. 169(8):4314-21）。このような混合三量体は、関節リウマチ（RA）患者においてより高い有病率で生じることがわかった。
【０００４】
APRILは、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、Ｂ細胞、およびＴ細胞などの免
疫細胞のサブセットによって優勢に発現され、これらの多くがBAFFも発現する。さらに、APRILは破骨細胞、上皮細胞およびさまざまな腫瘍組織などの非免疫細胞によっても発現
され得る（Kimberley et al., 2009, J Cell Physiol. 218（l）:l-8に概説される）。
【０００５】
APRILの機能は、マウス遺伝モデルを用いて確立された。hAPRILトランスジェニックマ
ウスは正常に発育するが、Ｔ細胞生存の向上およびIgM抗体レベルの上昇を示した（Stein
et al., 2002, J Clin Invest 109, 1587-98）。さらに、Ｔ細胞非依存性II型反応が向
上した。加齢したhAPRILトランスジェニックマウスは、リンパ系の極端な拡大および再組織化と、ヒトB-CLLに酷似する表現型であるCD5陽性Ｂ細胞の浸潤による肥大した脾臓とを示した（Planelles et al., 2004, Cancer Cell 6, 399-408）。APRIL欠失マウスは、循
環中およびＴ細胞依存性抗原による攻撃の際に、IgAレベルが低下することがわかった（Castigli et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101, 3903-8; Varfolomeev et al., 2004, Mol Cell Biol 24, 997-1006）。次に、APRILは、BAFFと共に、CD40-CD40Lシグナリ
ングとは非依存的に、抗体のIgGおよびIgAの両方へのクラススイッチ組換（CSR）におい
て機能することが実証された（Litinskiy et al., 2002, Nat Immunol 3, 822-9）。さらに、APRILはＢ細胞維持においてBAFFほど決定的ではないことが実証されたが、Ｂ細胞シ
グナリングにおいて役割を有し、インビトロでヒトおよびマウスのＢ細胞の増殖および生存の両方を推進することが示された（Kimberley et al., 2009, J Cell Physiol. 218（l
）:l-8に概説される）。
【０００６】
APRILは、そもそも癌細胞におけるその発現に基づいて同定された（Hahne et al., 1998, J Exp Med 188, 1185-90）。高い発現レベルのAPRIL mRNAが、腫瘍細胞系のパネルな
らびに直腸などのヒト原発腫瘍およびリンパの癌腫において見られた。さらに、APRILが
トランスフェクトされたマウスの繊維芽細胞NIH-3T3は、免疫不全のマウスにおいてより
速く生育することが示された。さらに重要なことには、可溶性APRIL受容体を用いてAPRILを遮断すると、肺および直腸癌腫の腫瘍成長が阻害されることが示された（Rennert et al., 2000, J Exp Med 192, 1677-84）。
【０００７】
慢性リンパ性白血病（CLL）Ｂ細胞は、APRILおよびAPRIL受容体の両方を発現する。さ
らに、APRILは、自発的および薬剤性アポトーシスならびに刺激されたNF-κB活性化からCLL細胞を保護することが示された（Kimberley et al., 2009, J Cell Physiol. 218（l）:l-8に概説される）。９５名のCLL患者に基づく遡及的な研究により、APRILの血清中レベルの上昇が示され、これは疾患進行および全体的な患者の生存率と相関関係にあり、APRILの血清中レベルが高い患者は、予後がより不良であった（Planelles et al., 2007, Haematologica 92, 1284-5）。
【０００８】
同様に、（上昇したレベルの）APRILが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（NHL）および多発性骨髄腫（MM）において発現されることが示された（Kimberley et al., 2009, J Cell Physiol. 218（l）:l-8に概説される）。DLBCL患者（NHL）の遡及的な研究により、癌病変におけるAPRILの高発現は、不良な生存率と相関関係にあることが示された
（Schwaller et al., 2007, Blood 109, 331-8）。NHLおよびMM細胞系を用いて、APRILまたはBAFFによる処置が、NF-κB活性化および生存促進性のタンパク質のアップレギュレーションを介して生存を高めることが示された（Kimberley et al., 2009, J Cell Physiol. 218（l）:l-8に概説される）。APRILのこの生存促進の役割に従って、MM細胞は、TACI-Fcの存在下で培養されるとアポトーシスとなることが示された。BAFF受容体はアポトーシスを向上させる際の有効性がより低かったため、これにより、BAFFではなくAPRILが、こ
れらの細胞中での生存の向上の主要な要因であることが示される（Abe et al., 2006, Leukemia 20, 1313-5）。
【０００９】
APRILはまた、固体腫瘍由来の多くの細胞系において過剰発現することもわかった。実
際に、APRILは多くのこれらの細胞系のインビトロでの増殖を刺激することができた（Kimberley et al., 2009, J Cell Physiol. 218（l）:l-8に概説される）。
【００１０】
Ｂ細胞生態学におけるその役割により、APRILは多くの自己免疫性疾患においても役割
を果たしている。実際に、アタシセプト（atacicept）（市販のTACI-Fc調剤）は、既に、いくつかの自己免疫性疾患の処置のための数多くの臨床試験中である（Gatto et al., 2008, Curr Opin Investig Drugs. 9(11):1216-27に概説される）。APRILおよびBAFFの血清中レベルの上昇は、多くのSLE患者において報告されている（Koyama et al., 2005, Ann Rheum Dis 64, 1065-7）。遡及的な分析により、APRIL血清中レベルは抗二本鎖DNA抗体力価と相関関係にある傾向があることが明らかになった。APRILがSLEにおいて機能的な役割を果たしているかもしれないという証拠は、ループスを起こしやすいマウスへのTACI-Fc
融合タンパク質の効果を試験することによって得られ（Gross et al., 2000, Nature 404, 995-9）、これにより疾患の発症が防止され、生存が延ばされた。
【００１１】
さらに、関節リウマチのCIAマウスモデルにおけるTACI-FcによるAPRILおよびBAFFの阻
害により、対照と比較して、疾患の進行が防止され、かつ疾患スコアがより低くなることも分かった（Gross et al., 2001, Immunity 15, 289-302; Wang et al., 2001, Nat Immunol 2, 632-7）。また、別の関節炎モデルである、滑膜SCIDマウスキメラにおいても、T
ACI-Fcは有益な効果を示した（Seyler et al., 2005, J Clin Invest 115, 3083-92）。TACI-Fcによる処置は、滑膜組織中の胚中心の消失、Ig産生の低下およびIFNガンマの産生
の低下という結果となった。
【００１２】
炎症性関節炎の患者の滑液は、骨関節炎などの非炎症性関節炎を患う患者と比較して、APRILレベルが著しく上昇していたことが後に報告された（Stohl et al., 2006, Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 6, 351-8; Tan et al., 2003, Arthritis Rheum 48,
982-92）。
【００１３】
いくつかの研究が、より幅広い全身の免疫に基づくリウマチ疾患（現在は、シェーグレン症候群、ライター症候群、乾癬性関節炎、多発性筋炎、および強直性脊椎炎も含む）を患う患者の血清中APRILの存在に着目し、これらの患者においてAPRILレベルが著しく上昇していることが分かり、これらの疾患においてもAPRILの役割が重要であることが示唆さ
れた（Jonsson et al., 1986, Scand J Rheumatol Suppl 61, 166-9; Roschke et al., 2002, J Immunol 169, 4314-21）。
【００１４】
最後に、APRIL発現の上昇は、多発性硬化症（MS）とも結びつけられている。APRIL発現は、正常な対照と比較して、MS罹患者の星状細胞中で上昇することが分かった。このことは、記載された、神経膠芽腫および神経膠芽腫患者の血清中APRIL発現と一貫している（Deshayes et al., 2004, Oncogene 23, 3005-12; Roth et al., 2001, Cell Death Differ
8, 403-10）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
APRILは、いくつかのＢ細胞悪性腫瘍、および潜在的には、一部の固体腫瘍での生存お
よび増殖能力において決定的な役割を果たす。APRILはまた、炎症性疾患または自己免疫
におけるキープレイヤーとしても台頭する。したがって、APRILに拮抗するための戦略は
、多くのこれらの疾患に対する治療上の目標である。実際に、TACI-Fc（アタシセプト）
によりAPRILを標的とする臨床研究が、いくつかの自己免疫疾患の処置のために現在進行
中である。しかしながら、TACI-Fcは、正常なＢ細胞維持に係る因子であるBAFFも標的と
する。APRILに対して向けられる抗体は、WO9614328、WO2001／60397、WO2002／94192、WO9912965、WO2001／196528およびWO9900518に記載されている。この発明は、APRILを特異
的に標的とする抗体を記載する。この発明における抗体は、APRILのTACIへの結合を完全
に遮断し、BCMAへの結合を少なくとも部分的に遮断する。発明に従う一部の抗体は、BCMAおよびTACIの両方への結合を完全に遮断する。このような分子は、循環する可溶性APRIL
が疾患の活性および進行と相関関係にある多くの状態のための治療において有用である。APRILの発現レベルは、異なる疾患のための診断および予後マーカーとして用いられ得る
ため、これらの抗体はこのような試験にも適用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明は、ヒトAPRILに結合する単離された抗体または抗体フラグメントなどの結合化合
物を提供する。
【００１７】
一部の実施形態においては、結合化合物はTACIおよびBCMAへの結合を遮断する。一部の実施形態においては、発明のAPRIL結合化合物は、配列番号９、１０、１１、１２、１３
、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０から選ばれる１以上の抗体CDR（相補
性決定領域）を含み、さらなる実施形態においては、配列番号１２、１３、１４、１８、１９および２０のうち１以上の抗体軽鎖CDRおよび／または配列番号９、１０、１１、１
５、１６および１７のうち１以上の抗体重鎖CDRを含む。一部の実施形態においては、結
合化合物はキメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはそのフラグメントである。
【００１８】
１つの実施形態においては、発明は、抗体重鎖CDR配列番号９、１０および１１、また
はいずれかの上記の配列の変異体、ならびに抗体軽鎖CDR配列番号１２、１３および１４
、またはいずれかの上記の配列の変異体を含む、ヒトAPRILに結合する結合化合物を提供
する。
【００１９】
別の実施形態においては、発明は、抗体重鎖CDR配列番号１５、１６および１７または
いずれかの上記の配列の変異体ならびに抗体軽鎖CDR配列番号１８、１９および２０また
はいずれかの上記の配列の変異体を含む、ヒトAPRILに結合する結合化合物を提供する。
【００２０】
別の実施形態においては、発明は、配列番号５のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域および配列番号６の群から選ばれるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域を含む、ヒトAPRILに結合する結合化合物を含む。
【００２１】
さらに別の実施形態においては、発明は、配列番号７のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域を含む、ヒトAPRILに結
合する結合化合物を含む。
【００２２】
別の実施形態においては、発明は、重鎖が配列番号５の可変領域配列を有し、IgG1定常領域に連結され、また、軽鎖が配列番号６の配列を有し、κ定常領域に連結される、抗体を含む。特に、定常領域はマウスまたはヒトに由来する。より特定的には、抗体はhAPRIL.01Aである。
【００２３】
別の実施形態においては、発明は、重鎖が配列番号７の可変領域配列を有し、IgG1定常領域に連結され、また、軽鎖が配列番号８の配列を有し、κ定常領域に連結される、抗体を含む。特に、定常領域はマウスまたはヒトに由来する。より特定的には、抗体はhAPRIL.03Aである。
【００２４】
別の実施形態においては、発明は、いずれの上記の変異体も、各抗体重鎖および軽鎖可変領域の先に同定されたCDRにおいて、３つまでのアミノ酸修飾を含んでよい、ヒトAPRILに結合する結合化合物の変異体を含む。
【００２５】
別の実施形態においては、発明は、いずれの上記の変異体も、抗体重鎖および軽鎖可変領域各々中の先に同定されたCDR各々において、３つまでのアミノ酸修飾を含んでよい、
ヒトAPRILに結合する結合化合物の変異体を含む。
【００２６】
別の実施形態においては、発明は、いずれの上記の変異体も、抗体重鎖および軽鎖可変領域各々中の先に同定されたCDR配列において、３つまでのアミノ酸修飾を含んでよい、
ヒトAPRILに結合する結合化合物の変異体を含む。
【００２７】
発明はまた、APRILのヒトTACIとの結合を完全に遮断し、かつヒトBCMAとの結合を少な
くとも部分的に遮断する結合化合物も含む。
【００２８】
別の実施形態においては、発明は、APRILのヒトTACIおよびヒトBCMAとの結合を完全に
遮断する結合化合物を含む。
【００２９】
別の実施形態においては、発明は、結合化合物が約１０ｎＭ以下のKDでヒトAPRILを結
合し、約２ｎＭ以下のIC50でヒトTACIおよび／またはヒトBCMAのヒトAPRILへの結合を遮
断する、ヒトAPRILに結合する結合化合物を含む。
【００３０】
発明はまた、結合化合物が上述の抗体と同じエピトープ特異性を有する、すなわち、上述の抗体の結合エピトープにおいて競合する、ヒトAPRILに結合する結合化合物も含む。
【００３１】
一部の実施形態においては、発明は、上述の抗体のいずれかとヒトAPRIL上の結合エピ
トープにおいて競合し、約１０ｎＭ以下のKDで、ヒトAPRILを結合する結合化合物を含む
。特に、ヒトAPRIL上のエピトープは、抗体hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03A、好ましくはhAPRIL.01Aに結合するエピトープである。
【００３２】
別の実施形態においては、発明は、上述の抗体のいずれかとヒトAPRIL上の結合エピト
ープにおいて競合し、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体とほぼ同じKDで、ヒトAPRILに結合する結合化合物を含む。
【００３３】
別の実施形態においては、発明は、上述の化合物のいずれかとヒトAPRIL上の結合エピ
トープにおいて競合し、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体とほぼ同じKDでヒトAPRILに結合する結合化合物を含む。
【００３４】
別の実施形態においては、発明は、上述の抗体のいずれかとヒトAPRIL上の結合エピト
ープにおいて競合し、約２ｎＭ以下のIC50でのヒトTACIおよび／またはヒトBCMAのヒトAPRILへの結合を遮断する結合化合物を含む。
【００３５】
別の実施形態においては、発明は、随意にTLFRおよび／またはQDVTFTMGQにより支持さ
れて、立体構造のヒトAPRILエピトープSMPSHP（好ましくはIRSMPSHPDRA）に結合する結合化合物を含む。
【００３６】
さらに別の実施形態においては、発明は、随意にTFTMGQにより支持されて、立体構造のヒトAPRILエピトープVSREGQGRQに結合する結合化合物を含む。
【００３７】
一部の実施形態においては、発明の結合化合物は、キメラ抗体またはそのフラグメントである。
【００３８】
別の実施形態においては、発明の結合化合物は、ヒト抗体またはそのフラグメントである。
【００３９】
別の実施形態においては、発明の結合化合物は、ヒト化抗体またはそのフラグメントである。
【００４０】
別の実施形態においては、発明は、上記に同定されたCDRならびにヒト重鎖定常領域変
異体およびヒト軽鎖定常領域変異体を有し、各定常領域変異体は、２０個までの保存的に修飾されたアミノ酸置換を含む、好ましくはヒト化抗体である、結合化合物を含む。
【００４１】
別の実施形態においては、発明の結合化合物は、Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、F（ab'）2、二重特異性mAbまたは二重特異性抗体（diabody）フラグメントから選ばれる抗体
フラグメントである。
【００４２】
発明は、Ｂ細胞の増殖および生存を阻害する上述のような結合化合物も含む。
発明は、発明の抗APRIL結合化合物をコードする核酸も含む。発明に含まれるのは、配
列番号５から２０に包含されるアミノ酸配列のいずれか１つをコードする核酸である。さらに発明の範囲内に含まれるのは、配列番号１、２、３または４を含む核酸である。さらに、発明は、以上に記載したようなアミノ酸配列の変異体をコードする核酸も含む。
【００４３】
発明は、発明の結合化合物をコードする核酸を含む細胞および発現ベクターも含む。
さらに、発明は、（a）核酸配列が発現される条件下、発明の抗体または抗体フラグメ
ントをコードする核酸を含む宿主細胞を培地中で培養することにより、その軽鎖および重鎖可変領域を含むポリペプチドを製造するステップと、（b）宿主細胞または培地からポ
リペプチドを回収するステップとを含む、発明の結合化合物を製造する方法を含む。
【００４４】
発明は、医薬上許容されるキャリアまたは希釈剤と組合される、発明の結合化合物を含む組成物も含む。
【００４５】
発明は、治療上有効な量の発明の結合化合物を、それを必要とする被検体に投与するステップを含む、免疫細胞の増殖および／または生存を阻害する方法も含む。１つの実施形態においては、方法は癌を処置するために用いられてもよい。別の実施形態においては、方法は自己免疫疾患または炎症性疾患を処置するために用いられてもよい。
【００４６】
一部の実施形態においては、発明は、治療上有効な量の発明の結合化合物を、それを必要とする被検体に投与するステップと、該被検体に由来するサンプル中のＢ細胞増殖および／または生存をエクスビボで測定するステップとをさらに含み、Ｂ細胞の増殖および／または生存の阻害は、処置が継続されるべきであることを示す、免疫細胞の増殖および／または生存を阻害する方法を含む。
【００４７】
他の実施形態においては、発明は、治療上有効な量の発明の結合化合物を、それを必要とする被検体に投与するステップと、該被検体に由来するサンプル中のＢ細胞増殖および／または生存をエクスビボで測定するステップとをさらに含み、Ｂ細胞増殖および／または生存の上昇は、処置が成功する可能性を予測する、免疫細胞の増殖および／または生存を阻害する方法を含む。
【００４８】
発明は、細菌毒素または放射性毒素などの治療剤につなげられた、発明の抗APRIL結合
化合物を含むイムノコンジュゲートも含む。細胞毒性剤の非限定的な例には、タキソル、サイトカラシンＢ、マイトマイシン、エトポシド、およびビンクリスチンまたは他の抗代謝剤、アルキル化剤、抗生物質ならびに抗有糸分裂剤が含まれる。
【００４９】
発明は、免疫細胞に本発明の結合化合物を接触させるステップを含む、免疫細胞の増殖および／または生存を阻害する方法も含む。
【００５０】
一部の実施形態においては、方法は、第２の治療剤または処置療法を投与するステップをさらに含む。
【００５１】
一部の実施形態においては、抗APRIL結合化合物は、癌または自己免疫疾患もしくは炎
症性疾患において標準的ケアと考えられる処置と組合されることができる。このような組合せの理論的根拠は、抗APRILにより同時に上昇した免疫阻害により、標準的ケアの処置
への初期臨床応答が誘導または助長され、長続きする臨床応答および疾患の長期にわたる免疫制御が誘導されることである。
【００５２】
別の実施形態においては、本発明の結合化合物は診断上用いられる。
さらに別の実施形態においては、発明の結合化合物は、被検体に由来するサンプル中のＢ細胞増殖および／または生存をエクスビボで測定するために用いられ、Ｂ細胞の増殖および／または生存の阻害は、ここに上述されるような結合化合物による処置が継続されるべきであることを示す。
【００５３】
別の実施形態においては、発明に従う結合化合物は、ヒトAPRILに結合する単離された
抗体または抗体フラグメントである。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
「抗体」という用語は、リガンドのその受容体への結合を阻害するなど、または受容体のリガンド誘導シグナリングを阻害することによる、望ましい生物学的活性を発揮する抗体の任意の形態を指す。したがって、「抗体」は、最も広義な意味で用いられ、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、および多重特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）を包含するが、これらに限定されない。
【００５５】
「抗体フラグメント」および「抗体結合フラグメント」は、典型的には、親抗体の抗原結合または可変領域（たとえば１以上のCDR）の少なくとも一部を含む、抗体の抗原結合
フラグメントおよびアナログを意味する。抗体フラグメントは、親抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持する。典型的には、抗体フラグメントは、その活性をモルベースで表わすとき、親の結合活性の少なくとも１０％を保持する。好ましくは、抗体フラグメントは、標的に対する親抗体の結合親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％以上を保持する。抗体フラグメントの例は、Fab、Fab'、F（ab'）2、およびFvフラグメント；二重特異性抗体；直鎖状抗体（linear antibodies）；
単鎖抗体分子、たとえば、sc-Fv、ユニボディ（unibodies）（GenMabによる技術）；ナノボディ（nanobodies）（Domantisによる技術）；ドメイン抗体（Ablynxによる技術）；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。改変された抗体変異体は、Holliger and Hudson, 2005, Nat. Biotechnol. 23, 1126-1136において概説される。
【００５６】
「Fabフラグメント」は、１本の軽鎖ならびに１本の重鎖のCH1および可変領域からなる。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することはできない。
【００５７】
「Fc」領域は、抗体のCH1およびCH2ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含有する。２つの重鎖フラグメントは、２個以上のジスルフィド結合により、またCH3ドメインの
疎水的相互作用により共に保持されている。
【００５８】
「Fab'フラグメント」は、１本の軽鎖と、VHドメインおよびCH1ドメインならびにCH1ドメインとCH2ドメインとの間の領域も含有する１本の重鎖の一部とを含有するため、２つ
のFab'フラグメントの２本の重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成され、F（ab'）2分
子を形成することができる。
【００５９】
「F（ab'）2フラグメント」は、２本の軽鎖およびCH1ドメインとCH2ドメインとの間の
定常領域の一部を含有する２本の重鎖を含有するため、２本の重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、F（ab'）2フラグメントは、２本の重鎖の間のジスル
フィド結合により共に保持される２つのFab'フラグメントにより構成される。
【００６０】
「Fv領域」は、重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域はない。
「単鎖Fv抗体」（または「scFv抗体」）は、抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインが１本のポリペプチド鎖中に存在する、抗体フラグメントを指す。一般的に、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによりscFvが抗原結合に望ましい構造を形成することができる。scFvの概説については、Pluckthun、1994、「THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES」、第113巻、Rosenburg およびMoore編、Springer-Verlag、New York、第269頁から第315頁も参照。ま
た、国際特許出願公開WO88／01649、米国特許第4,946,778号および第5,260,203号を参照
。
【００６１】
「二重特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントである。フラグメントは、同じポリペプチド鎖（VH-VLまたはVL-VH）において軽鎖可変ドメイン（VL）に結び付けられた重鎖可変ドメイン（VH）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間で対合ができないほどに短いリンカーを用いることにより、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合され、２つの抗原結合部位をつくる。二重特異性抗体は、たとえばEP404,097、WO93／11161、およびHolliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448中により十分に説明されている。
【００６２】
「ドメイン抗体フラグメント」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントである。２つ以上のVH領域がペプチドリンカーにより共有結合で連結され、二価のドメイン抗体フラグメントをつくる場合もある。二価のドメイン抗体フラグメントの２つのVH領域は、同じまたは異なる抗原を標的にしてもよい。
【００６３】
ここで用いられる、抗体hAPRIL.01Aは、重鎖が配列番号５の可変領域配列を有し、IgG1定常領域に連結され、また、軽鎖が配列番号６の可変領域配列を有し、κ定常領域に連結される、マウス抗体である。抗体hAPRIL.03Aは、重鎖が配列番号７の可変領域配列を有し、IgG1定常領域に連結され、また、軽鎖が配列番号８の可変領域配列を有し、κ定常領域に連結される、マウス抗体である。
【００６４】
発明の抗体フラグメントは、たとえば、通常、重鎖間ジスルフィド結合に係るヒンジシステインの少なくとも１つが、ここに記載されるように変更される場合、ジスルフィド結合能力が低下した重鎖の二量体化（または多量体化）を可能にするために十分な定常領域の部分を含んでもよい。別の実施形態においては、たとえば、Fc領域を含む抗体フラグメントは、FcRn結合、抗体半減期調節、ADCC（抗体依存性細胞傷害毒性）機能、および／または補体結合（たとえば、抗体がADCC機能または補体結合に必要なグリコシル化プロファイルを有する場合）など、インタクトな抗体中に存在する場合、通常はFc領域に関連する生物学的機能の少なくとも１つを保持する。
【００６５】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体において、対応する配列と同一または相同する一方で、鎖の残余は、別の種に由来するか、別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体において、さらには望ましい生物学的活性を発揮する限り、該抗体のフラグメントにおいて、対応する配列と同一または相同する、抗体を指す（たとえば、米国特許第4,816,567号およびMorrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855を参照）。
【００６６】
ここで用いられる、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト（たとえばマウス）抗体およびヒト抗体からの配列を含有する抗体の形態を指す。このような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する。一般的に、ヒト化抗体は、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、かつFR領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のFR領域である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は、随意に、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部を含む。げっ歯類抗体のヒト化形態は、本質的に、親のげっ歯類抗体と同じCDR配列
を含むが、親和性を高めるため、ヒト化抗体の安定性を高めるため、または他の理由により、あるアミノ酸置換を含んでもよい。しかしながら、CDRループ交換によって、元の抗
体と同じ結合性を有する抗体を均一には得られないことから、CDRループ支持に係る残基
であるフレームワーク残基（FR）における変化をヒト化抗体中に導入して、抗原結合親和性を保ってもよいであろう（Kabat et al., 1991, J. Immunol. 147, 1709）。
【００６７】
「抗体」という用語は、「完全にヒトの」抗体、すなわち、ヒトの免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体も含む。完全にヒトの抗体は、マウス、マウス細胞、またはマウス細胞に由来するハイブリドーマで産生される場合、マウスの炭水化物鎖を含有してもよい。同様に、「マウス抗体」または「ラット抗体」は、それぞれマウスまたはラットの免疫グロブリン配列のみを含む抗体を指す。完全にヒトの抗体は、ファージディスプレイまたは他の分子生物学的方法により、ヒトにおいて、ヒト免疫グロブリン生殖系配列を有するトランスジェニック動物において、生成されてもよい。また、トランスジェニックマウスにおいて組換免疫グロブリンを作ってもよい。Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15,146-156を参照。また、AbgenixおよびMedarex技術も参照。
【００６８】
本発明の抗体は、変更されたエフェクタ機能を与えるために、Fc領域が修飾（または遮断）された抗体も含む。たとえば、米国特許第5,624,821号、WO2003／086310、WO2005／120571、WO2006／0057702、Presta, 2006, Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656を参照。このような修飾は、免疫系のさまざまな反応を向上させたり抑制するために用いることができ、診断および治療において有益な効果をもたらし得る。Fc領域の変更は、アミノ酸変更（置換、欠失および挿入）、グリコシル化または脱グリコシル、および複数のFcの追加を含む。Fcへの変化により、治療用抗体における抗体の半減期を変更させることもでき、半減期がより長くなる結果、服用の頻度が少なくなり、同時に利便性が増し、材料の使用が少なくなるであろう。Presta, 2005, J. Allergy Clin. Immunol.116, 734-35の731を
参照。
【００６９】
本発明の抗体は、たとえば、標的細胞中に補体依存性細胞毒性（CDC）または抗体依存
性細胞傷害（ADCC）を誘導する、アイソタイプIgG1の抗体など、完全なエフェクタ機能を与えるインタクトなFc領域を有する抗体も含む。
【００７０】
抗体は、保存中の抗体の安定性を改善させたり、インビボで抗体の半減期を延ばしたりする分子にコンジュゲート（たとえば、共有結合）されてもよい。半減期を延ばす分子の例は、アルブミン（たとえばヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（PEG
）である。抗体のアルブミン結合およびPEG化誘導体は、当該技術分野において周知の技
術を用いて調製することができる。たとえば、Chapman, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 531-545; Anderson and Tomasi, 1988, J. Immunol. Methods 109, 37-42; Suzuki et
al., 1984, Biochim. Biophys. Acta 788, 248-255;およびBrekke and Sandlie, 2003, Nature Rev. 2, 52-62を参照。
【００７１】
本発明において用いられる抗体は、普通、少なくとも約１０-3M、より普通には、少な
くとも１０-6M、典型的には、少なくとも１０-7M、より典型的には、少なくとも１０-8M
、好ましくは、少なくとも約１０-9M、より好ましくは、少なくとも１０-10M、最も好ま
しくは、少なくとも１０-11MのKDで結合する。たとえば、Presta, et al., 2001, Thromb. Haemost. 85, 379-389; Yang, et al., 2001, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 38, 17-23; Carnahan, et al., 2003, Clin. Cancer Res. (Suppl.) 9 3982s-3990sを参照。
【００７２】
抗体親和性は、標準的分析を用いて求めればよい。
ここで用いられる、「超可変領域」という用語は、抗原結合の要因となる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、配列アライメントにより定義される「相補性決定領域」、または「CDR」からのアミノ酸残基、たとえば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４−３４（L1）、５０−５６（L2）および８９−９７（L3）、ならびに重鎖可変ドメイン中の３１−
３５（H1）、５０−６５（H2）および９５−１０２（H3）、を含み、Kabat et al., 1991, Sequences of proteins of Immunological Interest、第５版、公衆衛生局、国立衛生
研究所、米国メリーランド州ベテスダを参照、および／または、構造的に定義されるよう
な「超可変ループ」（HVL）からの残基、たとえば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６−３
２（L1）、５０−５２（L2）および９１−９６（L3）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６−３２（H1）、５３−５５（H2）および９６−１０１（H3）、Chothia and Leskl, 1987, J. Mol. Biol. 196, 901-917を参照、を含む。「フレームワーク」、または「FR」残
基は、ここに定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００７３】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定、分離および／または回収されたものである。その自然環境の夾雑成分は、抗体の診断上または治療上の使用に干渉するであろう材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質または非タンパク質溶質を含んでもよい。一部の実施形態においては、抗体は、（１）ローリー法により求められるような抗体の９５重量％超、最も好ましくは、９９重量％超まで精製されるか、（２）スピニングカップシークエネーターの使用により、N末端または内部アミノ酸配列の少なくと
も１５個の残基を得るのに十分な程度まで精製されるか、（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いて、還元または非還元条件下でSDS-PAGEにより均質になるまで精製される。単離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換細胞内でインサイチューの抗体を含む。しかし、普段は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
【００７４】
「単離された」核酸分子は、抗体核酸の自然源において普段は会合している少なくとも１つの夾雑核酸分子から同定され分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、自然に存在する形態または状況以外のものである。したがって、単離された核酸分子は、自然細胞中に存在するような核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、たとえば、核酸分子が自然細胞とは異なる染色体位置にある場合、普段は抗体を発現する細胞中に含有される核酸分子を含む。
【００７５】
ここで用いられる、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、少量に存在してもよい自然発生する可能性のある突然変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に対して向けられ、高度に特異的である。さらに、典型的には異なる決定因子（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対して向けられる。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の特徴が、実質的に均質な抗体の集団から得られることを示し、任意の特定の方法による抗体の産生を要件とするとして解釈されるべきではない。たとえば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、Kohler et al., 1975, Nature 256, 495により最初に記載されたハイブリドーマ法により作られてもよく、または組換DNA法（たとえば、米国特許第4,816,567号を参照）により作られてもよい。「モノクローナル抗体」は、たとえば、Clackson et al., 1991, Nature 352, 624-628およびMarks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222, 581-597に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。ここで、モノクローナル抗体は、具体的には「キメラ」抗体を含む。
【００７６】
ここで用いられる、「免疫細胞」という用語は、造血由来の細胞であり、免疫応答において役割を果たす細胞を含む。免疫細胞は、Ｂ細胞およびＴ細胞のようなリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基性細胞、および顆粒球などの骨髄性細胞を含む。
【００７７】
ここで用いられる「イムノコンジュゲート」は、細菌毒素、細胞毒性薬または放射性毒素などの治療部分（moiety）にコンジュゲートされた抗APRIL抗体、またはそのフラグメ
ントを指す。毒性部分（moiety）は、当該技術分野で利用可能な方法を用いて、発明の抗体にコンジュゲートさせることができる。
【００７８】
ここで用いられる、配列「変異体」は、開示された配列と１以上のアミノ酸残基で異なるが、結果として得られる分子の生物学的活性を保持する配列を指す。
【００７９】
「保存的に修飾された変異体」または「保存的アミノ酸置換」は、当業者に公知のアミノ酸の置換を指し、結果として得られる分子の生物学的活性を変更させることなしに、一般的に行なわれればよい。当業者であれば、ポリペプチドの非本質的な領域における単一のアミノ酸置換は、一般的に、生物学的活性を実質的に変更しないことを認識している（たとえば、ワトソン（Watson）ら、遺伝子の分子生物学（Molecular Biology of the Gene）、ベンジャミン／カミングス出版社（The Benjamin／Cummings Pub. Co.）、第224頁
（第４版１９８７年）を参照）。このような例示的な置換は、以下に記載されるようなものに従って、好ましくは下記のように行なわれる。
【００８０】
【表１】
2015164956.tif 000003
【００８１】
ここで用いられる、「約」という用語は、当業者により求められるような、特定の値について許容される誤差範囲内にある値を指し、許容される誤差範囲は、値が如何にして測定または求められるか、すなわち、測定システムの限界に一部依存する。たとえば、「約」は、当該技術分野における実施当たり１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。代替的には、「約」または「から本質的になる」は、２０％までの範囲を意味し得る。さらに、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、該用語は、１桁まで、または値の５倍までを意味し得る。特定の値が出願および請求項中で与えられる場合、特に明記しない限り、「約」または「から本質的になる」の意味は、その特定の値についての許容される誤差範囲内として見なされるべきである。
【００８２】
「特異的に」結合するとは、リガンド／受容体、抗体／抗原、または他の結合対に言及する場合、タンパク質および／または他の生態の異種混合の集団における、たとえばAPRILなどのタンパク質の存在を決定し得る結合反応を示す。したがって、指定された条件下
では、特定されるリガンド／抗原は、特定の受容体／抗体に結合し、サンプルに存在する他のタンパク質には大量に結合しない。
【００８３】
「投与」および「処置」は、動物、ヒト、実験被検体、細胞、組織、器官、または生物流体に適用される場合、動物、ヒト、被検体、細胞、組織、器官、または生物流体への外来性の医薬剤、治療剤、診断用剤、または組成物の接触を指す。「投与」および「処置」は、たとえば、治療方法、薬物動態学的方法、診断方法、研究方法、および実験方法を指し得る。細胞の処置は、試薬の細胞への接触、ならびに、流体が細胞に接触している場合、流体への試薬の接触を包含する。「投与」および「処置」は、試薬、診断用の結合組成物によるか、または別の細胞による、たとえば細胞などのインビトロおよびエクスビボ処置も意味する。
【００８４】
モノクローナル抗体
ヒトAPRILへのモノクローナル抗体は、試験被検体にヒトAPRIL抗原を注入し、次に望ましい配列または機能的特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離する当該技術分野の知識および技術に従って作ることができる。
【００８５】
モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を用いて（たとえば、モノクロー
ナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）簡単に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好ましい源として作用する。一旦単離したら、DNAを発現ベクター中に配置し、次に、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、または骨髄細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得ればよい。以下、抗体の組換産生をより詳細に説明する。
【００８６】
さらなる実施形態においては、抗体または抗体フラグメントは、McCafferty et al., 1990, Nature, 348, 552-554に記載される技術を用いて生成される抗体ファージライブラ
リから単離され得る。Clackson et al., 1991, Nature, 352, 624-628およびMarks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222, 581-597には、ファージライブラリを用いた、マウスおよ
びヒト抗体の単離がそれぞれ記載されている。それ以降の刊行物には、鎖シャフリング（Marks et al., 1992, Bio／Technology, 10, 779-783）、ならびに非常に大きなファージライブラリを構築するための戦略としての組合せ感染およびインビボ組換（Waterhouse et al., 1993, Nuc. Acids. Res. 21, 2265-2266）による、高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗
体の産生が記載されている。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に実現可能な代替技術である。
【００８７】
キメラ抗体
抗体DNAは、たとえば、相同性マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメイン
をコード配列で置換するか（米国特許第4,816,567号、Morrison, et al., 1984, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81, 6851）、または非免疫グロブリン材料のコード配列のすべてもしくは一部（たとえば、タンパク質ドメイン）を免疫グロブリンコード配列に共有結合で連結させることにより、修飾されてもよい。典型的には、このような非免疫グロブリン材料で、抗体の定常ドメインが置換されるか、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に関する特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体をつくる。
【００８８】
ヒト化およびヒト抗体
ヒト化抗体は、非ヒトである源からの１以上のアミノ酸残基を有する。非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、典型的には「インポート」可変ドメイン
から取られる。ヒト化は、一般的に、ウインター（Winter）および共同研究者の方法（Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536）に従って、げっ歯類CDRまたはCDR配列でヒト抗体の対応する配列を置換することにより行なわれ得る。したがって、こ
のような「ヒト化」抗体は、実質的にインタクトとはいえないヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応する配列により置換された抗体である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部のCDR残基およびおそらく一部のFR残基が、たとえば、げっ歯類の抗体などの
非ヒト中の類似部位からの残基により置換されるヒト抗体である。
【００８９】
ヒト化抗体を作る際に用いるべき重鎖および軽鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「最良適合（best-fit）」方法に従うと、げっ歯類の抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングされる。げっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、次にヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（FR）として受入れられる（Sims et al., 1987, J. Immunol. 151, 2296; Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol. 196, 901）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体の共通配列に由来する特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に用いてもよい（Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285; Presta et al., 1993, J. Immnol. 151, 2623）。
【００９０】
抗体は、抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的性質を保持しつつヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法に従うと、ヒト化抗体は、親配列、ならびに親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いたさまざまな概念的なヒト化生成物の分析のプロセスにより調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選ばれた免疫グロブリン配列候補の有力な三次元立体構造を図示し表示するコンピュータプログラムが入手可能である。これらの表示を調べることにより、免疫グロブリン配列候補の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、免疫グロブリン候補のその抗原を結合する能力に影響する残基の分析が可能となる。このように、FR残基は、標的抗原に対するより高い親和性などの望ましい抗体特徴が達成されるように、受容体配列およびインポート配列から選ばれ、組合されることができる。一般的に、CDR残基は、抗原結合の影響に直接的、かつ最も実質的
に係る。
【００９１】
抗体のヒト化は、簡単なタンパク質工学作業である。ほぼすべてのマウス抗体が、CDR
グラフティングによりヒト化可能であり、結果的に抗原結合が保持される。Lo, Benny, K.C.編、Antibody Engineering: Methods and Protocols、第248巻、Humana Press、ニュ
ージャージー、2004年を参照。
【００９２】
代替的には、現在では、免疫化すると、内因性の免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の全レパートリを産生することが可能なトランスジェニック動物（たとえば、マウス）を生産することが可能である。たとえば、キメラおよび生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（JH）遺伝子のホモ接合体欠失の結果、内因性抗体産生が完全に阻害されることが記載されている。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖細胞系突然変異マウスに移入すると、結果的に、抗原攻撃の際にヒト抗体が産生される。たとえば、Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551; Jakobovits et al., 1993, Nature 362, 255-258; Bruggermann et al., 1993, Year in Immunology 7, 33;およびDuchosal et al., 1992, Nature 355, 258を参照。ヒト抗体は
、ファージディスプレイライブラリに由来することもできる（Hoogenboom et al., 1991,
J. Mol. Biol. 227, 381 ; Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222, 581-597; Vaughan et al., 1996, Nature Biotech 14, 309）。
【００９３】
ヒト化抗APRIL抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化をヒト化抗APRIL抗体のDNAに導入することにより、またはペプチド合成により調製される。このような変
異体は、たとえば、ヒト化抗APRIL抗体について示されるアミノ酸配列内の残基からの欠
失、および／またはそれらへの挿入、および／またはそれらの置換を含む。最終的な構築物が望ましい特徴を所有する限り、最終的な構築物に到達するためには、欠失、挿入、および置換の如何なる組合せもなされる。アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数または配置の変更など、ヒト化抗APRIL抗体の翻訳後プロセスも変更し得る。
【００９４】
突然変異導入のために好ましい位置であるヒト化抗APRIL抗体ポリペプチドのある残基
または領域の同定のために有用な方法は、Cunningham and Wells, 1989, Science 244, 1081-1085に記載されるように、「アラニン走査突然変異導入」と呼ばれる。ここでは、標的残基の残基または群が同定され（たとえば、Arg、Asp、His、Lys、およびGluなどの荷
電残基）、中性または負に荷電するアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により置き換えられて、APRIL抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼす。次に置
換に対する機能的感度を発揮するアミノ酸残基は、置換部位で、または置換部位のための、さらなるまたは他の変異体を導入することにより改良される。したがって、アミノ酸配列変異を導入する部位が予め決定されている一方で、突然変異そのものの性質を予め決定する必要はない。たとえば、所与の部位での突然変異の性能を分析するためには、標的コドンまたは領域でAla走査またはランダムな突然変異導入を行ない、発現したヒト化抗APRIL抗体の変異体を望ましい活性についてスクリーニングする。
【００９５】
普段は、ヒト化抗APRIL抗体のアミノ酸配列変異体は、重鎖または軽鎖のいずれかの元
のヒト化抗体アミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に対する同一性または相同性をここでは、最高パーセント配列同一性を達成するために、配列同一性の一部として如何なる保存的置換も考慮せずに、配列をアライメントし、必要な場合ギャップを導入した後の、ヒト化残基と同一の配列候補中のアミノ酸残基の百分率として定義される。抗体配列へのN末端、C末端、または内部伸展、欠失、もしくは挿入のいずれも配列同一性または相同性に影響を及ぼすとして解釈されない。
【００９６】
ここでヒト化抗APRIL抗体において望ましいとして同定される特徴を有する抗体は、イ
ンビトロでの阻害的生物活性または好適な結合親和性のためにスクリーニングされ得る。目的の抗体により結合されるヒトAPRIL上のBCMAまたはTACIエピトープに結合する抗体（
たとえば、APRILの結合を遮断する抗体）をスクリーニングするためには、Antibodies, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されるような慣例的なクロスブロッキングアッセイを行なうことができる。同じエピトープに結合する抗体は、このようなアッセイでクロスブロックする可能性が高いが、クロスブロッキングは、重複するエピトープ、または近傍の非重複エピトープすらで結合する抗体による抗体結合の立体障害から生じる可能性があることから、すべてのクロスブロッキング抗体がちょうど同じエピトープで必ずしも結合するわけではない。
【００９７】
代替的には、たとえばChampe et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 1388-1394に記載されるような、エピトープマッピングを行ない、抗体が目的のエピトープを結合するか否かを判断することができる。Cunningham and Wells, 1989, Science 244, 1081-1085により記載されるような、「アラニン走査突然変異導入」またはヒトAPRILにおけるアミノ酸残
基の他の何らかの形態の点突然変異導入を用いて、本発明の抗APRIL抗体についての機能
的エピトープを求めてもよい。
【００９８】
本発明の抗体と同じエピトープに結合する追加的な抗体は、たとえば、エピトープに結合するためのAPRILに対して生じさせる抗体のスクリーニングにより、またはエピトープ
配列（たとえば、BCMAまたはTACI）を含むヒトAPRILのフラグメントを含むペプチドで動
物を免疫化することにより得られてもよい。同じ機能的エピトープに結合する抗体は、受容体結合を遮断するなど、同様の生物学的活性を発揮することが期待され得、このような活性は、抗体の機能的アッセイにより確認することができる。抗体親和性は、標準的分析を用いて求めればよい。たとえば、ヒト化抗体などの好ましい結合化合物は、約１×１０-7以下、好ましくは約１×１０-8以下、より好ましくは約１×１０-9以下、最も好ましくは約１×１０-10または１×１０-11M以下ものKd値でヒトAPRILを結合する結合化合物である。
【００９９】
ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA、およびIgEを含む、任意のクラスの免疫グロブリ
ンから選ぶことができる。抗体は、好ましくはIgG抗体である。IgG1、IgG2、IgG3、およ
びIgG4を含む、IgGの如何なるアイソタイプも用いることができる。IgGアイソタイプの変異体も企図される。ヒト化抗体は、１を超えるクラスまたはアイソタイプからの配列を含んでもよい。望ましい生物学的活性を生成するための必要な定常ドメイン配列の最適化は、実施例に記載される生物学的アッセイにおいて抗体をスクリーニングすることにより容易に達成される。
【０１００】
同様に、ここでの組成物および方法においては、いずれのクラスの軽鎖も用い得る。具体的には、カッパ、ラムダ、またはその変異体が、本願の組成物および方法において有用である。
【０１０１】
発明の抗体および抗体フラグメントは、細胞毒性剤などの細胞毒性ペイロード、または99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To
、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th
、および40K、157Gd、55Mn、52Trおよび56Feのような放射性ヌクレオチドとコンジュゲートさせてもよい。このような抗体コンジュゲートは、免疫療法において、その表面上で標的（その抗体に対する抗原）を発現する細胞を選択的に標的として死滅させるために用いられてもよい。例示的な細胞毒性剤には、リシン、塩化アルカロイド、メトトレザト、シュードモナス外毒素、サポリン、ジフテリア毒素、シスプラチン、ドキソルビシン、アブリン毒素、ゲロニンおよびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が含まれる。
【０１０２】
発明の抗体および抗体フラグメントは、希土類キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ-フタルデヒド、フルオレスカミン、152Eu、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナール（luminal）標識、イソルミナール（isoluminal）標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジミウム
塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識および安定フリーラジカルなどの蛍光体を含む、蛍光性または化学発光性標識とコンジュゲートされてもよい。
【０１０３】
Hunter et al., 1962, Nature 144, 945; David et al., 1974, Biochemistry 13, 1014; Pain et al., 1981, J. Immunol. Meth. 40, 219;およびNygren, J., 1982, Histochem. and Cytochem. 30, 407に記載される方法を含む、発明の抗体分子またはタンパク質分子をさまざまな部分（moieties）にコンジュゲートさせるための当該技術分野において公知の如何なる方法を用いてもよい。抗体およびタンパク質をコンジュゲートさせるための方法は、当該技術分野のものであり、従来周知である。
【０１０４】
抗体精製
組換技術を用いる場合、抗体は、細胞内でペリプラズム空間中に産生されるか、培地中に直接分泌されることができる。抗体が、細胞内で産生される場合、第１のステップとして宿主細胞または溶解されたフラグメントのいずれかである微粒子状の壊死組織片が、たとえば、遠心分離または限外ろ過により除去される。Carter et al., 1992, Bio／Technology 10, 163-167は、大腸菌のペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。簡潔には、細胞ペーストが、酢酸ナトリウム（pH3.5）、EDTA、および
フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）の存在下、約３０分間にわたって溶かされる。細胞の壊死組織片は、遠心分離により除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、このような発現系からの上清は、一般的に、まず、たとえば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外ろ過ユニットなどの市販のタンパク質濃縮フィルタを用いて濃縮される。タンパク質分解を阻害するために、PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤が、上記のステップのいずれかに含まれてもよく、偶発的な夾雑物の生育を防止するために、抗生材料が含まれてもよい。
【０１０５】
細胞から調製された抗体組成物は、たとえば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動法、透析、および親和性クロマトグラフィを用いて精製することができ、親和性クロマトグラフィが好ましい精製技術である。プロテインAの親和性リガンドと
しての適性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンFc領域の種およびアイソタイプに依存する。プロテインAは、ヒトガンマ１、ガンマ２、またはガンマ４重鎖に基づく抗体
を精製するために用いることができる（Lindmark et al., 1983, J. Immunol. Meth. 62,
1-13）。プロテインGは、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトガンマ３に推奨される（Guss et al., 1986, EMBO J5, 1567-1575）。親和性リガンドを付着させるマトリック
スは、最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも使用可能である。制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースにより達成し得るよりも速い流速および短い処理時間を可能とする。抗体がCH3ドメインを含む場合、Bakerbond ABX（登録商標）樹脂（J.T. Baker、ニュージャージー州フィリップスバーグ）が精製に有用である。イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカクロマトグラフィ、ヘパリンセファロース（登録商標）クロマトグラフィ、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂クロマトグラフィ（ポリアスパラギン酸カラムなど）、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、および硫酸アンモニウム沈殿などの他のタンパク質精製のための技術も、回収される抗体に依存して使用可能である。
【０１０６】
１つの実施形態においては、糖タンパク質は、レクチン基質への吸着（たとえば、レクチン親和性カラム）を用いて精製されて、調剤からフコース含有糖タンパク質を除去することにより、フコースを含有しない糖タンパク質のために富化してもよい。
【０１０７】
医薬製剤
発明は、APRIL結合化合物の医薬製剤を含む。医薬または無菌組成物を調製するために
は、抗体またはそのフラグメントを医薬上許容されるキャリアまたは賦形剤と混和させる、たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)を参照。治療または診断剤の
製剤は、たとえば、凍結乾燥された粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形態の生理学的に許容されるキャリア、賦形剤、または安定剤と混合させることにより調製されてもよい（たとえば、Hardman, et al., 2001, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY;
Avis, et al. (eds.), 1993, Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications,
Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.), 1990, Pharmaceutical Dosage Forms:
Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.), 1990, Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie, 2000, Excip
ient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NYを参照）。
【０１０８】
単独でまたは免疫抑制剤と組合されて投与される抗体組成物の毒性および治療効能は、たとえば、LD50（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ50（集団の５０％において治療上有効な用量）を求めるための細胞培養または実験動物における標準的な医薬的手順により求めることができる。毒性作用と治療効果との間の用量比が治療指数であり、LD50とED50との間の比として表わされ得る。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトに用いるための用量の範囲を策定する際に用いられ得る。このような化合物の用量は、毒性がほとんどないか全くないED50を含む循環濃度の範囲内であることが好ましい。用量は、用いられる投与形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で異なってもよい。
【０１０９】
好適な投与経路は、筋肉内投与、静脈内投与、または皮下投与などの非経口投与、および経口投与を含む。
【０１１０】
医薬組成物において用いられるか、本発明の方法を実施するための抗体の投与は、経口摂取、吸入、局所適用または皮膚注射、皮下注射、腹腔内注射、非経口注射、動脈内注射、もしくは静脈内注射など、さまざまな従来のやり形で行なわれ得る。１つの実施形態においては、発明の結合化合物は静脈内投与される。別の実施形態においては、発明の結合化合物は皮下投与される。
【０１１１】
代替的には、抗体を、たとえば、しばしばデポーまたは徐放性製剤中での、作用部位への直接的な抗体の注射を介して、全身的というよりはむしろ局所的な態様で投与してもよい。さらに、抗体を標的化薬物送達系中で投与してもよい。
【０１１２】
抗体、サイトカイン、および小分子の適切な容量を選ぶ際のガイダンスが入手可能である（たとえば、Wawrzynczak, 1996, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.), 1991, Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.), 1993, Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert, et al., 2003, New Engl. J. Med. 348, 601-608; Milgrom, et al., 1999, New Engl. J. Med. 341, 1966-1973; Slamon, et al., 2001, New Engl. J. Med. 344, 783-792; Beniaminovitz, et al., 2000, New Engl. J. Med. 342, 613-619; Ghosh, et al., 2003, New Engl.
J. Med. 348, 24-32; Lipsky, et al., 2000, New Engl. J. Med. 343, 1594-1602を参
照）。
【０１１３】
適切な用量の決定は、臨床医によって、たとえば、処置に影響を及ぼすとして当該技術分野で知られるか考えられ、または処置に影響を及ぼすと予測される、パラメータまたは要因を用いて行なわれる。一般的に、用量は最適用量よりも若干少ない量から開始され、その後、何らかの否定的な副作用に対して望ましいか最適な効果が得られるまで、徐々に増やされる。重要な診断手段は、たとえば、炎症または産生される炎症性サイトカインのレベルなどの症状の手段が含まれる。
【０１１４】
好ましい用量のプロトコルは、最大用量または顕著な望ましくない副作用を回避する投与頻度に係る。１週間の全用量は、一般的に、少なくとも０．０５μg／kg体重、より一
般的には少なくとも０．２μg／kg、最も一般的には少なくとも０．５μg／kg、典型的には少なくとも１μg／kg、より典型的には少なくとも１０μg／kg、最も典型的には少なくとも１００μg／kg、好ましくは少なくとも０．２mg／kg、より好ましくは少なくとも１
．０mg／kg、最も好ましくは少なくとも２．０mg／kg、最適には少なくとも１０mg／kg、より最適には少なくとも２５mg／kg、最も最適には少なくとも５０mg／kgである（たとえ
ば、Yang, et al., 2003, New Engl. J. Med. 349, 427-434; Herold, et al., 2002, New Engl. J. Med. 346, 1692-1698; Liu, et al., 1999, J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67, 451-456; Portielji, et al., 2003, Cancer Immunol. Immunother. 52, 133-144を
参照）。たとえば、ペプチド模擬物、天然産物、または有機化学材料などの小分子治療剤の望ましい用量は、モル／kgベースで、抗体またはポリペプチドのとほぼ同じである。
【０１１５】
ここで用いられる、「阻害する」または「処置する」または「処置」は、疾患に関連する症状の発生の遅延および／または上記疾患とともに発生するか発生すると予想されるこのような症状の重症度の軽減を含む。該用語はさらに、既存の症状の改善、付加的な症状の防止、およびこのような症状の根本的な原因を改善または防止することを含む。したがって、該用語は、疾患を患う脊椎動物の被検体に対して有益な結果が授与されたことを指す。
【０１１６】
ここで用いられる、「治療上有効な量」または「有効量」という用語は、抗APRIL抗体
またはそのフラグメントが、単独またはさらなる治療剤と組合されて細胞、組織、または被検体に投与される場合に、処置されるべき疾患または状態を防止または改善するために有効な量を指す。治療上有効な用量はさらに、たとえば、関係する医学的状態の処置、治癒、防止または改善など、症状の改善が得られるか、このような状態の処置、治癒、防止または改善のペースの上昇が得られるのに十分な化合物の量を指す。単独で投与される個々の有効成分に適用される場合、治療上有効な用量は、その成分のみを指す。組合せに適用される場合、治療上有効な用量は、組合せて、連続的にまたは同時に投与されようと、治療効果が得られる有効成分の組合された量を指す。有効量の治療剤は、症状を典型的には少なくとも１０％、普通は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％低下させる。
【０１１７】
第２の治療剤との同時投与または処置のための方法は、当該技術分野において周知であり、たとえば、Hardman, et al. (eds.), 2001 , Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.), 2001, Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.), 2001,
Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA.を参照。
【０１１８】
発明の医薬組成物は、細胞毒性剤、化学療法剤、細胞静止剤、抗血管形成剤、または代謝拮抗剤、腫瘍標的化剤、免疫刺激剤もしくは免疫調節剤または細胞毒性剤、細胞静止剤、もしくはそれ以外の毒性剤にコンジュゲートされた抗体を含むがこれらに限定されない他の薬剤を含有してもよい。
【０１１９】
発明の抗体および抗体フラグメントのための治療用途
ヒトAPRILに特異的に結合する発明の抗体および抗原結合フラグメントは、APRILの活性が病状の中心であるいくつかの疾患を処置するために用いることができる。広義に言うと、これは癌、自己免疫性、炎症性疾患および潜在的に多発性の硬化症、CNS疾患を含む。
【０１２０】
癌
APRILを特異的に結合する発明の抗体または抗原結合フラグメントは、癌を処置するた
めに用いることができる。成長および生存が発明により阻害され得る好ましい癌は、APRILを発現するとして知られる如何なる癌も含み、増殖シグナルについてAPRILに依存する。このような癌の非限定的な例は、慢性リンパ性白血病（CLL）、多発性骨髄腫、ホジキン
リンパ腫ならびにバーキット（Burkitt）リンパ腫および、びまん性大細胞型Ｂ細胞リン
パ腫を含む非ホジキンリンパ腫などのいくつかのＢ細胞悪性腫瘍、また、APRIL発現が報
告されている膠芽腫などのいくつかの固体腫瘍も潜在的に含む。
【０１２１】
発明の結合化合物は、単独でまたは、化学療法試薬もしくは他の生物学剤など、他の抗癌剤と組合されて用いられてもよい。さらに、この発明は、治療抵抗性もしくは再発性の悪性腫瘍またはこれらの悪性腫瘍のいずれかに由来する転移の処置を含む。
【０１２２】
自己免疫疾患
発明の結合化合物は、APRILの発現が病状における役割を果たすとして示されたいくつ
かの自己免疫疾患を処置するために用いられてもよい。このような疾患の例は、関節リュウマチ（RA）、全身性エリテマトーデス（SLE）およびシェーグレン症候群である。さら
に、多発性硬化症患者の血清中に通常の力価より高いAPRILが認められ、さらにその星状
細胞中により高いレベルが認められた。したがって、APRILは疾患病状への貢献因子であ
り、MSにおけるAPRILの治療的遮断は有益であり得る。
【０１２３】
発明の抗体および抗体フラグメントのための非治療用途
これらの抗体のための非治療用途は、フローサイトメトリー、ウェスタンブロティング、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、免疫組織化学を含む。
【０１２４】
この発明の抗体は、セファロースカラムへの不動化を介する親和性精製試薬として用いてもよい。
【０１２５】
抗体は、たとえば特定の細胞、組織、または血清中のAPRILの発現を検出するための診
断アッセイにも有用である。診断的応用のためには、抗体は、典型的には、検出可能部分（moiety）により（直接または間接的に）標識付けされる。数多くの標識が利用可能であり、一般的に、ビオチン、蛍光色素、放射性ヌクレオチド、酵素、ヨウ素、および生合成標識のカテゴリにグループ化され得る。
【０１２６】
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイ、および免疫沈澱アッセイなどの任意の公知のアッセイ方法において使用されてもよい。Zola, Monoclonal Antibodies. A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)。
【０１２７】
抗体は、インビボ診断アッセイのために用いられてもよい。一般的に、抗体は、それを発現する抗原または細胞が免疫シンチグラフィまたは陽電子放出診断撮影を用いて局在化され得るように放射性ヌクレオチドで標識付けされる。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03Aハイブリドーマの上清のAPRIL反応性およびBCMA遮断活性を示す図である。図１Ａは、抗FLAG抗体により捕捉されたFLAG-hAPRILに結合するhAPRIL.01AおよびhAPRIL.03Aを示す図である。Aprily-5抗体は、陽性の対照として用いられた。図１Ｂは、Aprily-5ではなく、hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03Aハイブリドーマの上清がFLAG-hAPRILのBCMA-Fcへの結合を遮断することを実証する図である。
【図２】精製されたhAPRIL.01AおよびhAPRIL.03A抗体の別個の結合および受容体遮断特徴を示す図である。図２Ａは、抗FLAG抗体により捕捉された、精製されたhAPRIL.01AおよびhAPRIL.03AのFLAG-hAPRILへの結合を確認する図である。図２Ｂは、hAPRIL.03AのみがBCMA-Fcにより捕捉されたFLAG-hAPRILを結合することを示す図である。図２Ｃは、hAPRIL.01Aが、FLAG-hAPRILのBCMA-Fcへの結合を完全に遮断する一方で、hAPRIL.03Aはこの相互作用を部分的に遮断することを示す図である。図２Ｄは、hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03Aの両方が、TACI-FcとのFLAG-hAPRILを完全に遮断することを実証する図である。
【図３】hAPRIL.01A、hAPRIL.03A、および１２個の公知の市販のモノクローナル抗APRIL抗体についての受容体遮断ELISAを示す図である。これは、hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03Aが、APRILのBCMA（図３Ａ）およびTACI（図３Ｂ）への結合を遮断する能力において独自であることを図示する。
【図４Ａ】hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03AがAPRILにより促進されるＢ細胞増殖およびアイソタイプクラススイッチを遮断するが、BAFFにより媒介されるプロセスには影響を及ぼさないことを示す図である。図４Ａは、記載されるモノクローナル抗体が、Ｂ細胞の生存および増殖ならびにクラススイッチされたIgA抗体の産生などの公知のAPRIL機能を遮断することを実証するインビトロのＢ細胞アッセイである。重要なのは、両方のモノクローナル抗体が、等モル濃度で投与されたTACI-Fcよりも効果的にAPRIL活性を遮断することが実証されたことである。
【図４Ｂ】hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03AがAPRILにより促進されるＢ細胞増殖およびアイソタイプクラススイッチを遮断するが、BAFFにより媒介されるプロセスには影響を及ぼさないことを示す図である。図４Ｂは、抗体がBAFFにより促進されるＢ細胞応答に影響を及ぼさない一方で、TACI-Fcはこれらのプロセスを遮断することを示す。
【図５Ａ】Ｔ細胞非依存的なＢ細胞応答において、インビボでhAPRIL.01AおよびhAPRIL.03A（パネルＡ）またはTACI-Fc（パネルＢ）によりAPRILを標的とした結果を示す図である。トランスジェニックマウスは、NPフィコールにより攻撃され、週当たり２回hAPRIL.01A、hAPRIL.03AおよびTACI-Fcにより処置された。PBSおよびマウスIgG1は、陰性の対照として用いられた。免疫グロブリン力価（IgA、IgMおよびIgG）は、ELISAにより測定された。hAPRIL.01A、hAPRIL.03Aおよび、より低い程度でTACI-Fcは、hAPRILトランスジェニックマウスにおけるAPRILにより媒介されたＢ細胞応答を阻害し、WTよりも免疫グロブリンレベルを低下させることが可能である。
【図５Ｂ】Ｔ細胞非依存的なＢ細胞応答において、インビボでhAPRIL.01AおよびhAPRIL.03A（パネルＡ）またはTACI-Fc（パネルＢ）によりAPRILを標的とした結果を示す図である。トランスジェニックマウスは、NPフィコールにより攻撃され、週当たり２回hAPRIL.01A、hAPRIL.03AおよびTACI-Fcにより処置された。PBSおよびマウスIgG1は、陰性の対照として用いられた。免疫グロブリン力価（IgA、IgMおよびIgG）は、ELISAにより測定された。hAPRIL.01A、hAPRIL.03Aおよび、より低い程度でTACI-Fcは、hAPRILトランスジェニックマウスにおけるAPRILにより媒介されたＢ細胞応答を阻害し、WTよりも免疫グロブリンレベルを低下させることが可能である。
【図６Ａ】脾臓（パネルＡ）または腹膜腔（パネルＢ）中のＢ細胞集団上でhAPRIL.01A、hAPRIL.03AおよびTACI-FcによりAPRILを標的とした効果を示す図である。トランスジェニックマウスは、NPフィコールにより攻撃され、週当たり２回hAPRIL.01A、hAPRIL.03AおよびTACI-Fcにより処置された。PBSおよびマウスIgG1は、陰性の対照として用いられた。処置の３０日後、脾臓および腹膜腔からの細胞を採取し、フローサイトメトリーにより分析した。hAPRIL.01AまたはhAPRIL.03Aによる処置は、脾臓中のＢ細胞の（サブ）集団に影響を及ぼさなかった。対照的に、TACI-Fｃは、全Ｂ細胞集団ならびに成熟およびT2サブ集団を大きく低下させた。腹膜腔においては、TACI-FcはB1対B2細胞の比に影響を及ぼしたが、一方hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03Aは、これらのサブ集団に影響を及ぼさなかった。
【図６Ｂ】脾臓（パネルＡ）または腹膜腔（パネルＢ）中のＢ細胞集団上でhAPRIL.01A、hAPRIL.03AおよびTACI-FcによりAPRILを標的とした効果を示す図である。トランスジェニックマウスは、NPフィコールにより攻撃され、週当たり２回hAPRIL.01A、hAPRIL.03AおよびTACI-Fcにより処置された。PBSおよびマウスIgG1は、陰性の対照として用いられた。処置の３０日後、脾臓および腹膜腔からの細胞を採取し、フローサイトメトリーにより分析した。hAPRIL.01AまたはhAPRIL.03Aによる処置は、脾臓中のＢ細胞の（サブ）集団に影響を及ぼさなかった。対照的に、TACI-Fｃは、全Ｂ細胞集団ならびに成熟およびT2サブ集団を大きく低下させた。腹膜腔においては、TACI-FcはB1対B2細胞の比に影響を及ぼしたが、一方hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03Aは、これらのサブ集団に影響を及ぼさなかった。
【図７】hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03Aの可変領域配列を示す図である。図７Ａおよび図７Ｂは、それぞれhAPRIL.01Aの重鎖および軽鎖可変配列のアミノ酸配列を示す。図７Ｃおよび図７Ｄは、それぞれhAPRIL.03Aの重鎖および軽鎖可変配列のアミノ酸配列を示す。
【実施例】
【０１２９】
＜実施例１＞
抗APRIL抗体の免疫化および選択
APRIL cDNAによるマウスの免疫化
ヒトAPRILタンパク質に対する抗体を生成するために、APRILの全長オープンリーディングフレームをコードするcDNAをpCI-neoベクター（Promega、ウィスコンシン州マジソン）にサブクローン化した。得られたベクターの発現は、293細胞（American Type Culture Collection、バージニア州マナサス）へのpCI-neo-hAPRILの一過性トランスフェクション
と、マウス抗hAPRIL IgG1 Aprily-5（1:5,000）（Alexis、カリフォルニア州サンディエ
ゴ）に続き、ヤギ抗マウスIgG1-HRP（1:2,000）（Southern Biotechnology、アラバマ州
バーミンガム）による免疫ブロッティングにより調べた。
【０１３０】
メーカーの指示に従って、Helios Gene銃（BioRad、カリフォルニア州ハーキュリーズ
）およびDNAコートされた金弾丸（BioRad）を用いて遺伝子銃免疫化によりマウスを免疫
化した。簡潔には、pCI-neo-hAPRIL cDNAならびにマウスFlt3LおよびマウスGM-CSFの市販の発現ベクターにより、2:1:1の比（両方ともAldevron、ノースダコタ州ファーゴによる
）で１μm金粒子をコーティングした。金弾丸500μgをコーティングするのに合計１μgのプラスミドDNAを用いた。
【０１３１】
具体的には、７から８週齢のメスのBALB／Cマウスは、両耳に１ショットを４または５
サイクル受けることにより、遺伝子銃で耳を免疫化された。３回のDNA免疫化の後、マウ
ス血清中、ELISAによりおよそ1:3,200抗hAPRIL力価が検出された。ELISAにおいて、すべ
てのインキュベーションステップの後に、PBST（0.1％Tween20含有PBS）による洗浄ステ
ップが３回行なわれた。Maxisorp96ウェルイムノプレート（Nunc、ニューヨーク州ローチェスター）が、ウサギ抗FLAGポリクローナル抗体（PBS中50ng／ウェル）（Sigma、ミズーリ州セントルイス）により４℃で一晩コーティングされ、１０％ヤギ血清／PBSTにより室温で１時間遮断された。プレートは、CMVプロモータにより促進された分泌形態のFLAG-hAPRIL（pCR3-hAPRIL）により一過的にトランスフェクトされた293T細胞からの上清（PBS中1:4）と室温で１時間インキュベートされ、その後マウス血清希釈物および1:2,000HRPコ
ンジュゲートヤギ抗マウスIgG（Southern Biotechnology）と、室温にて各１時間ずつイ
ンキュベートされた。最終的なPBST洗浄の後、抗hAPRIL免疫反応性が、100μl OptiEIA TMB基質により視覚化された（BD Biosciences、ニュージャージー州フランクリンレイク）。反応は、100 μl 0.5 M H2SO4により停止され、吸光度が460および620ｎＭで読取られ
た。hAPRILに対する反応性を示したマウスは、最後の４回目で免疫化され、４日後に屠殺された。赤血球を枯渇させた脾臓細胞集団が、前述のように（Steenbakkers et al., 1992, J. Immunol. Meth. 152: 69-77; Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol. Rep. 19: 125-134）調製され、-140℃で凍結された。
【０１３２】
Ｂ細胞を産生する抗APRIL抗体の選択
抗APRIL抗体を産生するＢ細胞クローンを選ぶために、１．５×１０7赤血球を枯渇させた脾細胞が、抗FLAG M2抗体（Sigma）によりコーティングされた２．３×１０7Dynabeads（登録商標）M-450トシル活性化ビーズ（Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッ
ド）上での陰性パニングに２回供された。メーカーの指示に従い、500μl中１×１０8ビ
ーズ当たり50μgの抗FLAG M2抗体がコーティングされた。ビーズおよび脾細胞懸濁液は、氷上で３０分間インキュベートされ、冷たいDMEM F12／P／S／10%BCS中に再懸濁された。非結合脾細胞は、Dynal MPC（磁性粒子濃縮器）（Invitrogen）を用いてビーズから分離
された。陽性パニングについては、脾細胞は、FLAG-hAPRILに結合した抗FLAG M2によりコーティングされた２．３×１０7ビーズと氷上で３０分間インキュベートされた。ビーズ
および非結合脾細胞は、合計１２回の洗浄により上述のように分離された。
【０１３３】
抗原特異的Ｂ細胞は、Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol. Rep. 19: 125-134に記載されるとおりに培養された。簡潔には、選ばれたＢ細胞は、最終容量が、96ウェル平底組織培養プレート中200μlのDMEM F12／P／S／10%BCSとなるように、７．５％（v／v）Ｔ細胞上清および50,000個の放射された（2,500RAD）EL-4 B5栄養細胞と混合された。８日
目、上清を上述の通りにELISAによりhAPRIL反応性のためにスクリーニングした。21個のAPRIL反応性上清が同定され、APRILのBCMA-Fcとの相互作用を阻害する能力について試験された。ELISAにおいて、すべてのインキュベーションステップの後に、PBST（0.1%Tween20含有PBS）による洗浄ステップが３回行なわれた。Maxisorp96ウェルイムノプレートは、BCMA-Fc（PBS中50ng／ウェル）（R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス）により４℃で一晩コーティングされ、室温で１時間１０％ヤギ血清／PBSTにより遮断された。FLAG-hAPRILを含有する上清は、抗体を含有するＢ細胞上清と室温で１時間プレインキュベートされ
、次にBCMA-Fcによりコーティングされたプレートに室温で１時間添加された。結合され
たFLAG-hAPRILは、１μg／mlの抗FLAG BioM2-ビオチン抗体（Sigma）および1:2,000スト
レプトアビジン-HRP（Southern Biotechnology）と、室温で各１時間ずつインキュベートすることにより検出された。最後のPBST洗浄の後、APRILに結合したBCMA-Fcは、100μlのOptiEIA TMB基質（BD Biosciences）により可視化された。反応は、100μlの0.5 M H2SO4により停止され、吸光度が460および620ｎＭで読取られた。
【０１３４】
その後、８個のＢ細胞クローンが、公開された手順（Steenbakkers et al., 1992, J. Immunol. Meth. 152, 69-77; Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol. Rep. 19, 125-34）に従うミニ電気融合により不死化された。具体的には、Ｂ細胞が１０6 NS-1骨髄腫細胞と混合され、血清がDMEM F12培地による洗浄によって除去された。細胞はプロナーゼ溶液で３分間処理され、融合培地により洗浄された。電気融合は、50μlの融合チャンバ中で
、３０秒、２MHz、４００V／cmの交流電界の後、１０μs、３kV／cmの方形波高電界パル
スにより、さらに再び、３０秒、２MHz、４００V／cmの交流電界により行なわれた。チャンバの中身は、ハイブリドーマ選択性培地に移され、限界希釈条件下、９６ウェルプレート中に平板培養された。融合後１４日目、ハイブリドーマの上清は、上述のとおりにAPRIL反応性およびBCMA遮断活性のためにスクリーニングされた。hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03Aと名付けられた２つの別個の抗hAPRILハイブリドーマは、単離され、その完全性を保護
するために限定された希釈によりサブクローン化された。hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03A抗体のhAPRIL反応性およびBCMA遮断活性は、ハイブリドーマの上清により確認された（図１を参照）。
【０１３５】
＜実施例２＞
抗APRIL抗体の精製および特徴付け
ハイブリドーマを産生する抗APRILの安定化および抗APRIL抗体の精製
各ハイブリドーマについて、クローン細胞集団が、複数回の限界希釈（hAPRIL.01Aについては６回、hAPRIL.03Aについては４回）により得られた。安定ハイブリドーマは、メーカーの指示に従って、CELLineバイオリアクター（Integra-Biosciences、スイス、クール）を用いて、血清を含まない培地で培養された。７から１０日の培養の後、上清が採取され、０．２２μMニトロセルロース膜を通してろ過された。上清は、高塩結合緩衝液（1M グリシン／2M NaCl、pH9.0）中で１：１で希釈され、抗体は、プロテインG HiTrap 5mlカラム（GE Healthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ）により精製された。カラム
のPBS洗浄の後、抗体はpH２．７の０．１M グリシンにより溶出され、３M Trisにより中
和された。緩衝液は、PD-10ゲルろ過カラム（GE Healthcare）を用いてPBSに交換された
。抗体は、Amicon Ultra-15遠心式フィルタユニット（Millipore、マサチューセッツ州ビレリカ）により濃縮され、分光測定を用いて定量化された。
【０１３６】
マウスモノクローナル抗体アイソタイピング試験キット（Serotec、ノースカロライナ
州ローリー）を用いて、hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03A抗体の両方の（サブ）アイソタイプは、IgG1、カッパとして判定された。
【０１３７】
結合分析
タンパク質ベースのELISA実験が、精製されたhAPRIL.01AおよびhAPRIL.03A抗体を用い
て行なわれ、見かけ結合親和性が求められた（EC50値として報告された）。結合は、マウス抗hAPRIL IgG1 Aprily-5（Alexis）と比較された。Maxisorp 96ウェルイムノプレート
（Nunc）は、PBS中５０ng／ウェルでウサギ抗FLAGポリクローナル抗体（Sigma）またはBCMA-Fc（R&D Systems）のいずれかにより４℃で一晩コーティングされ、１０％ヤギ血清／PBSTにより室温で１時間遮断された。プレートは、PBSTにより３回洗浄され、FLAG-hAPRILを含有する上清（PBS中1:4）と室温で１時間インキュベートされた。プレートが再度PBSTにより３回洗浄され、hAPRIL.01A、hAPRIL.03A、およびAprily-5抗体と室温で１時間イ
ンキュベートされた（３重の１０倍希釈による１０μg／ml高試験(10μg/ml high test with 10-fold dilutions in triplicates)）。PBSTによる３回の洗浄の後、結合した抗体
はヤギ抗マウスIgG-HRP（1:2,000）（Southern Biotechnology）により室温で１時間検出された。プレートはPBSTで３回洗浄され、APRIL反応性がOptiEIA TMB基質（Becton Dickinson）により可視化された。最大半量の結合についての濃度が、相対的な結合親和性の尺度として報告される。FLAG-hAPRILが抗FLAG抗体により捕捉された場合（図２Ａ）、hAPRIL.01A、hAPRIL.03AおよびAprily-5についてのEC50値は、それぞれ２．２、１．４、およ
び１．７ｎＭとして算出された。FLAG-hAPRILがBCMA-Fcにより捕捉された場合（図２Ｂ）、hAPRIL.01A抗体結合は観察されず、APRIL-BCMA相互作用がhAPRIL.01Aエピトープを遮断したことが示唆された。対照的に、hAPRIL.03AのAPRIL-BCMA複合体への結合が観察された。受容体−リガンド複合体の抗体検出は、診断アッセイおよび、可溶性APRILのクリアラ
ンスに従う研究目的のために有用であると分かり得る。
【０１３８】
バイオライトインターフェロメトリー（ForteBio）による動態解析
抗体の結合特徴をさらに特徴付けるために、各々がOctetシステム（ForteBio、カリフ
ォルニア州メンロパーク）上でバイオライトインターフェロメトリーを用いてプロファイリングされて、結合キネティクスが解明され、平衡結合定数が算出された。このアッセイは、標準的アミン化学を用いて、アミン反応性バイオセンサ（ForteBio）に精製されたhAPRIL.01AおよびhAPRIL.03A抗体をカップリングすることにより行なわれた。バイオセンサに結合し、かつそれから解離する組換ヒトAPRIL（R&D Systems）は、次に、１μg／mlお
よび２μg／mlの２つの濃度で観察された。具体的には、アミン反応性バイオセンサは、0.1M MES pH = 5を含有するウェル中に２分間浸漬されることにより予め湿潤化された。次に、バイオセンサは0.1M NHS ／ 0.4M EDC混合物を用いて５分間活性化された。hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03A抗体は、バイオセンサを５μg／mLの抗体の溶液に１８分間浸漬させ
ることによりカップリングされた。バイオセンサ表面は、ｐＨ８．５の１Mエタノールア
ミンの溶液を用いて７分間クエンチされた。バイオセンサはPBS中で５分間平衡化された
。組換APRILの会合は、バイオセンサを１μg／mlまたは２μg／mlのAPRILを含有するウェル中に配置し、２０分間インターフェロメトリーをモニタリングすることにより観察された。解離は、バイオセンサをPBS中に移入させ、２０分間インターフェロメトリーシグナ
ルをモニタリングした後に測定した。観察されたオン率およびオフ率（kobsおよびkd）は、１：１結合グローバルフィットモデルを用いてフィッティングされ、平衡結合定数KDが算出された（表１を参照）。
【０１３９】
【表２】
2015164956.tif 000004
【０１４０】
受容体遮断
hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03Aの遮断能力が、精製された抗体を用いて確認された。Maxisorp 96ウェルプレートは、５０ng／ウェルでBCMA-Fc（R&D Systems）およびTACI-Fc（R&D Systems）のいずれかにより４℃で一晩コーティングされ、１０％ヤギ血清／PBSTによ
り室温で１時間遮断された。FLAG-hAPRILを含有する上清は、hAPRIL.01A、hAPRIL.03A、
およびAprily-5抗体と室温で１時間プレインキュベートされた（３重の１０倍希釈による１０μg／ml高試験(10μg/ml high test with 10-fold dilutions in triplicates)）。
プレートはPBSTで３回洗浄され、結合されたFLAG-hAPRILは、１μg／mlの抗FLAG BioM2-
ビオチン抗体（Sigma）および1:2,000ストレプトアビジン-HRP（Southern Biotechnology）と、室温で各１時間ずつインキュベートすることにより検出された。最後のPBST洗浄の後、APRILに結合したBCMA-FcがOptiEIA TMB基質（BD Biosciences）により可視化された
。図２Ｃおよび図２Ｄに示されるように、hAPRIL.01Aは、FLAG-hAPRILのBCMA-FcおよびTACI-Fcへの結合を完全に遮断するが、hAPRIL.03Aは、TACI-FcへのFLAG-hAPRILの結合を完
全に遮断する一方で、hAPRIL-BCMA-Fc相互作用を部分的にしか遮断しない。Aprily-5は、FLAG-hAPRILのBCMA-FcまたはTACI-Fcへのいずれかの結合を遮断しない。最大半量の阻害
（IC50）の濃度は、hAPRIL.01Aについては１．２、BCMA-FcおよびTACI-Fcについては０．４ｎＭとそれぞれ判定された。TACI-FcへのhAPRIL.03AについてのIｃ50は、１．３ｎＭと判定された。
【０１４１】
市販の抗体
市販の抗APRIL抗体は、表２に記載されるとおりに得られる。
【０１４２】
【表３】
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【０１４３】
hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03Aの遮断特徴が独自であるか否かを研究するために、すべての公知の市販の抗APRIL抗体が、FLAG-hAPRILのBCMA-FcおよびTACI-Fcへの相互作用の遮断能力（図３Ａおよび図３Ｂ）について試験された。受容体結合の遮断は、ELISAを用いて
研究された。ELISAプレートは、コーティング緩衝液中、１μg／mlでの50の100μlのBCMA-Fcまたは２μg／mlの濃度での100μlのTACI-Fcでコーティングされ、４℃で一晩インキ
ュベートされた。プレートは次にPBS／0.2%Tweenにより洗浄され、次にウェル当たり100
μl PBS／5% BSAで、３７℃で１時間インキュベートされた。プレートは次にPBS／0.2%Tweenで４回洗浄された。別途のプレート中で、APRILモノクローナル抗体はAPRIL上清と予
め混合され、氷上で３０分間インキュベートされた。可溶性APRILを含有する調整培地は
、１対４に希釈され、５μg／mlから開始して、２倍希釈で滴定された抗体を含有する等
容量のPBSと混合された。予めインキュベートされたミックスの100μlがELISAプレートに移され、３７℃で２時間インキュベートされた。プレートは次にPBS／0.2%Tweenで４回洗浄された。抗Flag-HRP抗体はその後1:1000の濃度でPBS中に希釈され、次にこの100μlが
各ウェルに添加され、３７℃で１時間インキュベートされた。次に、プレートはPBS／0.2%Tweenにより４回洗浄され、次にABTSの100μlが各ウェルに添加された（ABTSは、１０mlの試薬に加えて、添加する直前に作られた５μlのH2O2という比で希釈された）。発色さ
せ、次に405ｎＭでのODがELISAプレートリーダにより読取られた。ヒトIgG1が、プレートをコーティングするための対照タンパク質として用いられた。なぜなら、これがFc融合タンパク質と同じアイソタイプであり、プレートに非特異的に固着するAPRILのために制御
されているためである。図３から明らかであるように、市販の抗体のいずれもFLAG-APRILのTACI-FcまたはBCMA-Fcのいずれかへの結合を遮断することは不可能であったが、hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03Aは、TACI-FcおよびBCMA-Fcへの結合を確かに（部分的に）阻害する。
【０１４４】
種交差反応性
hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03AのマウスAPRILへの結合も、BIAcoreによって検査されたが、いずれの抗体の結合も観察されなかった。抗体はヒトAPRILのみに結合すると見られる
。
【０１４５】
＜実施例３＞
マウス抗ヒトAPRIL抗体の機能的プロファイリング
APRILへのマウスＢ細胞の応答
この発明の抗体がインビトロでAPRILを機能的に遮断することができることを示すため
に、マウスＢ細胞アッセイを用いて、Ｂ細胞における２つのAPRILにより促進される応答
である、増殖およびIgA産生を検査した。
【０１４６】
すべての細胞系が５％ＣＯ２により３７℃に維持された。マウス脾細胞および精製されたＢ細胞が、８％FCS、２mMのグルタミンおよび５０μMのベータ−メルカプトエタノールにより補足され、かつ１０μg／mlの濃度のペニシリンおよびストレプトマイシンにより
補足されたRPMI-1640（Gibco）で生育された。脾臓マウスＢ細胞は、CD45R／B220 MACSビーズ（Miltenyi Biotec、オランダ、ユトレヒト）を有する磁気活性化細胞分離（MACS）
カラムを用いて野生型マウスから単離された。細胞は、最終容量が200μlの、２×１０5
／ウェルの密度の９６ウェル円型底付きマイクロタイタプレートで培養された。すべてのアッセイについて、さまざまな形態の可溶性APRILを含有する調整培地は、使用前に発現
レベルが標準化された。増殖を測定するために、細胞は、抗IgM（Jackson ImmunoResearch）および調整培地中または１μg／mlの最終濃度の精製されたタンパク質としての可溶性APRILにより処理された。架橋抗Flagモノクローナル抗体が、１μg／mlの最終濃度でウェルに添加された。細胞は３７℃でインキュベートされ、４８時間後に、採取前、０．３μCi（0.011MBq）のトリチウム化チミジン（［6-3H］チミジン、GE Healthcare、オランダ
）で１８時間パルスした。IgA産生を測定するために、上記のとおり、マウスＢ細胞が培
養され、APRILにより処理された。６日間のインキュベーション後、上清を集め、ELISAによりIgA含有量についてアッセイされた。簡潔には、ELISAプレートは、２μg／mlの抗マ
ウスIg（Southern Biotech）によりコーティングされ、PBS／1% BSAにより遮断され、集
められた上清とインキュベートされた。結合したIgAは、次にHRPにより標識付けされた抗マウスIgA（Southern Biotech、オランダ、アイトホールン）により検出された。対照と
して、細胞は、１０μg／mlのLPS（Invivogen）に加えて１ng／mlのヒトTGFβ（Sigma-Aldrich）により処理された。図４Ａに示すとおり、hAPRIL.01A、およびより低い程度でhAPRIL.03Aは、マウス脾臓Ｂ細胞からのIgA分泌の低下により求められたとおり、APRIL誘導
クラススイッチ組換を阻害することが可能である。対照としてのTACI-Fcは、IgA分泌を阻害する一方で、マウスIgG1およびヒトIgは、脾臓Ｂ細胞からのAPRIL誘導IgA分泌に影響を及ぼさなかった。さらに、hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03Aは、APRIL誘導マウス脾臓Ｂ細胞
増殖を阻害することが実証された。抗体の特異性を確立するために、hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03AのBAFF誘導IgA分泌および増殖に対する作用が研究された。図４Ｂに示されるよ
うに、hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03AのいずれもBAFF誘導IgA分泌および増殖を阻害しなか
った一方で、対照としてのTACI-Fcは、両方のプロセスを阻害した。
【０１４７】
APRIL機能を遮断するためのインビボ実験
APRIL機能に対する抗体のインビボ遮断作用を実証するために、マウス中で、NPフィコ
ール誘導体液性応答を遮断する抗体の能力を検査した。使用したマウスは、８から１０週齢のAPRILトランスジェニック(TG)マウスおよび野生型(WT)同腹仔であり、いずれもC57BL／6背景であった。APRILトランスジェニックマウスは、導入遺伝子発現を成熟胸腺細胞および末梢Tリンパ球に導くLck遠位プロモーター下で、ヒトAPRILを発現する(Stein et al., 2002, J Clin Invest 109, 1587-98)。マウスは大学医療センターの動物施設で繁殖さ
れ、実験は施設内倫理委員会により承認された。マウスをいくつかのグループに分け、以下のように処置した。５匹のAPRIL WTマウスはPBS(200ml)により処置され、５匹のAPRIL
トランスジェニックマウスの５つの群は、hAPRIL.01A、hAPRIL.03A、またはTACI-Fc、ま
たはサブアイソタイプマッチド（subisotype-matched）対照抗体msIgGl_k(200μlのPBS中200μg／マウス)またはＰＢＳの分子により処置された。マウスの処置はNPフィコール免
疫化３日前に開始され（０日目、250μgの免疫原を腹腔内投与）、注射は週２回、２８日間継続された。１、３、７、１４および２８日目に尾の静脈から血液を集めた。抗（４−ヒドロキシ−ニトロフェニル酢酸）（ＮＰ）−特異的抗体(IgM、IgGおよびIgA)が、先に
記載されたように(Hardenberg et al., Immunol Cell Biol, 86(6), 530-4, (2008))、希釈血清（IgAについては1:100、IgGについては1:500、IgMについては1:2,000）を用いて、６回の独立したＥＬＩＳＡでアッセイされた。簡潔には、96ウェルELISAプレート(Greiner)を炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)中で5μg／mlのNP-BSA (Biosearch Technologies)により４℃で一晩コーティングされた。ウェルは1%BSAにより３７℃で１時間ブロックされ、
室温で２時間希釈血清とインキュベートした。HRPにコンジュゲートさせたアイソタイプ
特異的抗体（Southern Biotechからのヤギ抗マウスIgG、IgAおよびIgM）を出現抗体（revealing antibodies）として用いた。希釈はすべてPBS／BSA 1%／Tween 20 0.05%にて行なった。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験を用いて、TG(PBS)群対TG(hAPRIL.01A)とTG(PBS)群対TG(hAPRIL.03A)との間の統計的有意差を調べた。図５から明らかなように、hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03Aの両方が、インビボでＴ細胞非依存性Ｂ細胞応答を阻害した。TACI-Fcはこの応答の阻害がより非効率的であった。アイソタイプマッチド対照としてのPBSおよびマウスIgG１は、IgA、IgMおよびIgG抗ＮＰ応答に影響しなかった。Ｂ細胞集団上でのhAPRIL.01AおよびhAPRIL.03Aの長期的作用を検査するために、マウスを上述のように処置した。３０日目、マウスを屠殺し、脾臓および腹腔浸出腔（peritoneal exudate cavity）（PEC）をフローサイトメトリーによりＢ細胞発現について解析した。簡潔には、PEC
からの脾細胞およびリンパ球を赤血球溶解緩衝液による１回の洗浄により赤血球から分離し、次に細胞を計数した。細胞をPBS／1% BSA中で洗浄および再懸濁させ、ウェル当たり
５×１０５の密度で96ウェル円形底付きプレートに播種した。次に、細胞を推奨される濃度で、抗体B220-FITC(BD bioscience)およびCD3-APC(ebioscience)； IgD-FITC (BD bioscience)およびIgM-PE (BD bioscience); IgD-FITC (BD bioscience)、CD3-APC (ebioscience)およびCD43-PE (BD bioscience)により染色した。抗体を４０分間インキュベートし
、PBS／1% BSAで３回洗浄し、次にFACSCalibur（Becton Dickenson）を用いてフローサイトメトリーにより解析した。脾臓中のＢ２２０+Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞（ＩｇＤ+ＩｇＭint
）およびＴ２Ｂ細胞（ＩｇＤ+ＩｇＭ+）を定量化した（図６Ａを参照）。さらに、Ｂ１（ＣＤ４３+ＩｇＤint）およびＢ２（ＣＤ４３−ＩｇＤ+）サブ集団をＰＥＣ中で定量化し
た（図６Ｂを参照）。TACI-Fc処置に応答するＢ細胞の減少は、脾臓およびＰＥＣのいず
れからも明白であり、TACI-Fcの長期的投与は正常なＢ細胞集団に対して有害な作用を及
ぼす可能性が示される。これは、hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03A抗体では見られず、ＢＡＦＦでなくAPRILが病状の主要原因である場合、この発明の抗体がTACI-Fcよりも少ない副作用を示す可能性が示唆される。
【０１４８】
＜実施例４＞
抗ＡＰＲＩＬ抗体配列
免疫グロブリンcDNAのクローン化
縮重プライマーＰＣＲベース法を用いて、ハイブリドーマhAPRIL.01AおよびhAPRIL.03Aにより発現されるマウス抗体のための可変領域をコードするＤＮＡ配列を求めた。全RNA
をTRIZOL(Invitrogen)を用いて５×１０６ハイブリドーマ細胞から単離し、重鎖および軽鎖のための遺伝子特異的cDNAをメーカーの指示に従ってiScript Select cDNA合成キット(Biorad)を用いて合成した。ＶHおよびＶL遺伝子をNovagenベースＩｇプライマーセット（Novagen、カリフォルニア州サンディエゴ）およびTaqポリメラーゼ（Invitrogen）を用いてＰＣＲ増幅した。期待される増幅産物サイズである５００ｂｐに一致したすべてのＰＣＲ産物をpCR4 TOPOベクター（Invitrogen）にクローン化し、構築物をメーカーの指示に
従ってDH5a大腸菌（Invitrogen）に形質転換した。ユニバーサルＭ１３順方向および逆方向プライマーを用いて、クローンをコロニーＰＣＲによりスクリーニングし、各反応から２つのクローンがDNA配列決定解析のために選ばれた。配列は、NCBI Ig-Blast BLASTN 2.2.16（http:／／www.ncbi.nlm.nih.gov／projects／igblast／）を用いて、生殖系および再構成ＩｇＶ可変領域配列のデータベースと突き合わせてサーチした。hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03AのＢｌａｓｔ結果は、各抗体について１つのインフレームのＶH配列および１
つのインフレームのＶL配列を示した。アミノ酸配列は質量分析によって確認された。配
列は、添付の配列表、図７に開示され、表３に列挙される。
【０１４９】
【表４】
2015164956.tif 000006
【０１５０】
＜実施例５＞
ペプスキャン（Pepscan）法を用いたエピトープマッピング
ペプチドの合成およびペプスキャンスクリーニング
クレジットカード型ミニPEPSCANカード（３μｌウェルを有する４５５ウェルプレート
）を用いて、Slootstra et al. (Slootstra et al., 1996, Mol. Diversity 1, 87-96)およびTimmerman et al. (Timmerman et al., 2007, J, Mol. Recognit. 20, 283-299)により記載されるとおりに、合成直鎖およびCLIPSペプチドを合成してスクリーニングした。
抗体(hAPRIL.01AおよびhAPRIL.03A)の各ペプチドへの結合をPEPSCANベース酵素免疫測定
法（ELISA）で試験した。共有結合させたペプチドを含有する、４５５ウェルクレジット
カード型ポリプロピレンカードをサンプル（たとえば、５％ウマ血清（容量／容量）および５％オバルブミン(重量／容量）を含有するＰＢＳ溶液で希釈した１μｇ／ｍｌ抗体）
および1%Tween80（４℃、一晩）とインキュベートした。洗浄後、ペプチドを抗−抗体ペ
ルオキシダーゼ（希釈倍数１／１０００、たとえばウサギ抗マウスペルオキシダーゼ、Southern Biotech）（１時間、２５℃）とインキュベートし、その後、ペルオキシダーゼ基質を洗浄後、2，2'−アジノ−ジ−3−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸（ABTS)および2μl/ml 3%H2O2を加えた。１時間後、発色を測定した。ELISAの発色をCCDカメラおよび画
像処理システムにより定量化した。設備は、CCDカメラおよび55mmレンズ（Sony CCDビデ
オカメラXC-77RR、Nikon Micro-nikkor 55mm f／2.8レンズ）、カメラアダプター(Sony 
カメラアダプターDC-77RR)および画像処理ソフトウェアからなる。
【０１５１】
合成ペプチド
まず、合計４２２５個のCLIPSペプチドを合成した。標的配列は、１４７個のアミノ酸
を用い、lXU2.pdbによるアラインメントに従うループには下線を引いた：RAVLTQKQKKQHSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL(配列番号２１)。タンパク質
の「上（top）」側のループ：QKKQHSVLHL （配列番号２２)、ALRRGRGL (配列番号２３）
、QAQGYGVRI (配列番号２４)、QDAGVYLL (配列番号２５)、SREGQGRQETV (配列番号２６)
、FHLHQGDILSV (配列番号２７）およびタンパク質の「下（bottom）」側のループ：INATSKDDSDVTE (配列番号２８)、VLFQDVTFTMG (配列番号２９）、IRSMPSHPDRAYNSC（配列番号
３０）、IIPRARAKL（配列番号３１）、NLSPHGTFLGF (配列番号３２)。相互連結領域はほ
とんどがシートである。ここで、「上」および「下」側は、任意に選択される。以下のCLIPSトポロジーが使用された。T2 CLIPSは、２つのシステインの側鎖にカップリングして
単一のループトポロジーを形成し、一方、T3 CLIPSは、３つのシステインの側鎖にカップリングして２重のループトポロジーを形成し、一方、T2T2 CLIPSの最初のT2が２つのシステイン（Ｃ標識付け）にカップリングし、次に２番目のT2が２つのシステインにカップリングし、最後にT2T3 CLIPSは、T2が２つのシステインにカップリングし、T3が３つのシステインにカップリングする。
【０１５２】
合計２０の異なるペプチドのセットが合成された。
１９１−１（セット−１）：  完全な１４７ＡＡ標的配列を網羅する全重複35-mer配列が合成された。このセットでは、上に定義したように、異なるループが配列中に存在するとき、２つのT2 CLIPSを通して２重ループまたはシート状トポロジー中に拘束された。
【０１５３】
１９１−２（セット−２）  合計で９つのシートが同定された。すべての９×９の組合せは、２重シート立体構造を模範するように合成された。配列GSGをリンカーとして用い
た。
【０１５４】
１９１−３（セット−３）  上に説明したセット−２と同じであるが、シート長さがより短い。
【０１５５】
１９１−６（セット−４）  完全な１４７ＡＡ標的配列を網羅する全重複の直鎖状35-m
er配列が合成された。
【０１５６】
１９１−７（セット−５）  完全な１４７ＡＡ標的配列を網羅する全重複の直鎖状15-mer配列が合成された。
【０１５７】
１９１−８（セット−６ａ）  完全な１４７ＡＡ標的配列のループ領域のみを網羅する短直鎖配列（長さが異なる）が合成された。
【０１５８】
１９１−１６（セット−６ｂ）  異なるペプチドが５つの「下」ループから選ばれた。これらをT3 CLIP上へと９×９のマトリックスに組み替えて、２つの異なる長さの「下」
ループを有する２重ループ化トポロジーを形成した。
【０１５９】
１９１−１７（セット−７）  全重複の１３５個の異なる15-mer配列が、１、８および１５位のシステインと合成された。これら３つのシステインはT3 CLIPSにカップリングされた。
【０１６０】
１９１−１８（セット−９）  ６つの「上」ループの長いバージョンおよび４つの「下」ループの長いバージョンが、T3 CLIPS上で互いに組換られた。
【０１６１】
１９１−１９（セット−１０）  「上」ループ領域の６＋６＋４の異なるサイズのループがすべてT3 CLIPS上で互いに組み替えられた。
【０１６２】
１９１−２０（セット−１１、１７、１８、１９、２０）  「上」または「下」ループを広く網羅する３３個の異なる配列が、T3 CLIPS上で互いに組み替えられた。これらのペプチドのセットは、セット１１、１７、１８、１９および２０にある。この「散乱（scattering）」の理由は、カードのレイアウトのためである。
【０１６３】
１９１−２２（セット−１２）  すべての「上」および「下」ループの異なるサイズのループが、T2 CLIPS上の単一ループとして合成された。
【０１６４】
１９１−２３（セット−１３）  完全な標的タンパク質を網羅する全重複の単一ループ化15-mer配列が、T2 CLIPS上で合成された。
【０１６５】
１９１−２４（セット−１４）  「上」ループを網羅する６個の異なる9-mer配列が、
各々とT2T3 CLIPS組合せ上で６×６×６の３重ループ化マトリックスに組み替えられた。
【０１６６】
１９１−２５（セット−１５）  セット−１と同じセットの重複ペプチド。完全な１４７ＡＡ標的配列を網羅する全重複35-mer配列が合成された。このセットでは、上に定義したように、異なるループが配列中に存在するとき、T3T2 CLIPSを通して３重ループトポロジー中に拘束された。
【０１６７】
１９１−２６（セット−１６）  「下」ループを網羅する６個の異なる9-mer配列が、
各々とT2T3 CLIPS組合せ上で６×６×６の３重ループ化マトリックスに組換えられた。
【０１６８】
データ解析およびエピトープ決定
各抗体をすべての４２２５個のペプチド上で試験し、それらの結合値を順位付けした。ほとんどの上位の結合体（binders）（〜上位１％）中に明らかに繰り返し発生する配列
が、エピトープ候補としてみなされた。２つの追加的な支持解析を行なった。まず、複数の同定された箇所が１つの不連続なエピトープを形成できるかどうかを調査した。これは、相同的構造のlXU2.pdbを通して行なった。第２に、複数の同定された結合部分が、別の
部分の支持なしに認識されるかどうかを調査した。３Ｄ構造上の共局在化および非依存的認識というこれらの２つのパラメータが、立体構造かつ不連続なエピトープが同定されたことを支持するために用いられた。hAPRIL.01Aについては、IRSMPSHPDRA（配列番号３３
）に結合し、コア領域はSMPSHP（配列番号３４）であるとして判定された。TLFR（配列番号３５）および／またはQDVTFTMGQ（配列番号３６）（コア領域はVTFTM(配列番号３７)）モチーフは、hAPRIL.01Aの結合を支持することが示された。hAPRIL.03Aは、VSREGQGRQ(配列番号３８)モチーフに結合し、コア領域はEGQであることが示された。TFTMGQ(配列番号
３９)モチーフは、hAPRIL.03Aの結合を支持することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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