(57)【要約】【課題】新規なポリペプチドの結晶形を提供する。【解決手段】配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの新規な結晶形に関する。さらにこれらの結晶形を含有する医薬組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの結晶。
【請求項２】
粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角度（２θ）：３．４°±０．２°、４．７°±０．２°、６．９°±０．２°、７．５°±０．２°および８．６°±０．２°にピークを有する、請求項１記載の結晶。
【請求項３】
粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角度（２θ）：３．４°±０．２°、４．７°±０．２°、５．６°±０．２°、６．９°±０．２°、７．５°±０．２°、８．６°±０．２°、１８．２°±０．２°、１８．４°±０．２°、２０．７°±０．２°および２２．９°±０．２°にピークを有する、請求項１記載の結晶。
【請求項４】
図１に実質的に一致する粉末Ｘ線回折スペクトルにより特徴付けられる、請求項１記載の結晶。
【請求項５】
粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角度（２θ）：３．９°±０．２°、６．０°±０．２°、８．２°±０．２°、１８．５°±０．２°および２４．５°±０．２°にピークを有する、請求項１記載の結晶。
【請求項６】
粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角度（２θ）：３．９°±０．２°、６．０°±０．２°、８．２°±０．２°、１１．５°±０．２°、１６．１°±０．２°、１８．５°±０．２°、２２．９°±０．２°、２４．５°±０．２°、２７．０°±０．２°および２８．１°±０．２°にピークを有する、請求項１記載の結晶。
【請求項７】
図２に実質的に一致する粉末Ｘ線回折スペクトルにより特徴付けられる、請求項１記載の結晶。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の結晶を含む医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の結晶の製造方法。
【請求項１０】
酢酸アンモニウムおよびアセトニトリルの混合液中に、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを溶解させた溶解液に、酢酸水溶液を添加して結晶化を行う工程、を含む、請求項１から７のいずれかに記載の結晶を調製する方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに記載の結晶を溶解させた水溶液を凍結乾燥する工程を含む凍結乾燥製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリペプチドの結晶およびその組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、ＭＰＨＯＳＰＨ１（Ｈｕｍａｎ  Ｍ−ｐｈａｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  １）に由来するＩＹＮＥＹＩＹＤＬ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが癌ワクチンの有効成分として有用であることが開示されている。この特許文献１では、このポリペプチドの結晶の存在を示唆する記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００８／０４７４７３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、熱力学的な安定性に優れ、医薬原体として有用なポリペプチドの結晶を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意研究の結果、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、Ａ型およびＢ型の二つの結晶型が存在することを見出し、さらに配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＡ型結晶（以下において、「本発明の結晶」ともいう）がそのＢ型結晶に比べてより熱力学的に、また光照射に対して安定であることを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下に関する。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの結晶。
（２）粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角度（２θ）：３．４°±０．２°、４．７°±０．２°、６．９°±０．２°、７．５°±０．２°および８．６°±０．２°にピークを有する、上記（１）記載の結晶。
（３）粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角度（２θ）：３．４°±０．２°、４．７°±０．２°、５．６°±０．２°、６．９°±０．２°、７．５°±０．２°、８．６°±０．２°、１８．２°±０．２°、１８．４°±０．２°、２０．７°±０．２°および２２．９°±０．２°にピークを有する、上記（１）記載の結晶。
（４）図１に実質的に一致する粉末Ｘ線回折スペクトルにより特徴付けられる、上記（１）記載の結晶。
(５)粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角度（２θ）：３．９°±０．２°、６．０°±０．２°、８．２°±０．２°、１８．５°±０．２°および２４．５°±０．２°にピークを有する、上記（１）記載の結晶。
(６)粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、回折角度（２θ）：３．９°±０．２°、６．０°±０．２°、８．２°±０．２°、１１．５°±０．２°、１６．１°±０．２°、１８．５°±０．２°、２２．９°±０．２°、２４．５°±０．２°、２７．０°±０．２°および２８．１°±０．２°にピークを有する、上記（１）記載の結晶。
(７) 図２に実質的に一致する粉末Ｘ線回折スペクトルにより特徴付けられる、上記（１）記載の結晶。
（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の結晶を含む医薬組成物。
（９）癌の予防若しくは治療のために用いられる、上記（８）記載の医薬組成物。
（１０）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の結晶を投与する工程を含む、癌の予防若しくは治療方法。
（１１）癌の予防若しくは治療に用いられる医薬組成物を製造するための、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の結晶の使用。
（１２）癌の予防若しくは治療するための、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の結晶。
【０００７】
さらに、以下の発明も本発明の範囲内に包含される。
（１３）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の結晶の製造方法。
（１４）酢酸アンモニウムおよびアセトニトリルの混合液中に、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを溶解させた溶解液に、酢酸水溶液を添加して結晶化を行う工程、
を含む、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の結晶を調製する方法。
（１５）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の結晶を溶解させた水溶液を凍結乾燥する工程を含む凍結乾燥製剤の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の結晶は、医薬原体として有用である。すなわち、本発明の結晶を含有する医薬組成物は、癌の治療剤または予防剤として非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＡ型結晶の粉末Ｘ線回折スペクトル。横軸は２θ（°）で、縦軸は強度（Ｃｏｕｎｔ）を表す。
【図２】配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＢ型結晶の粉末Ｘ線回折スペクトル。横軸は２θ（°）で、縦軸は強度（Ｃｏｕｎｔ）を表す。
【図３】配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアモルファス、Ａ型結晶（ＦｏｒｍＡ）、Ｂ型結晶（ＦｏｒｍＢ）の４０℃密栓保存後のＨＰＬＣチャートを示す。横軸は時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）で、縦軸は強度（Ａｕ）を表す。
【図４】配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアモルファス、Ａ型結晶（ＦｏｒｍＡ）、Ｂ型結晶（ＦｏｒｍＢ）の光照射後のＨＰＬＣチャートを示す。横軸は時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）で、縦軸は強度（Ａｕ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、特許文献１にも記載されているポリペプチドであり、該ポリペプチドを含有する医薬組成物は癌の治療に非常に有用である。配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの粗化合物は、特許文献１などに記載の方法によって調製することができる。
【００１１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの結晶の一つの形態であるＡ型結晶は、粉末Ｘ線回折において、３．４°±０．２°、６．９°±０．２°および７．５°±０．２°（２θ）において、特徴的なピークを有する。さらに、強度の強いピークとして、４．７°±０．２°および８．６°±０．２°（２θ）が挙げられる。このＡ型結晶は、Ｂ型結晶に特徴的なピークである６．０°±０．２°、８．２°±０．２°（２θ）のピークを有さない。
【００１２】
また、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＡ型結晶は、図１に実質的に一致する粉末Ｘ線回折スペクトルにより特徴付けられる。
【００１３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの結晶のもう一つの形態であるＢ型結晶は、粉末Ｘ線回折において、３．９°±０．２°、６．０°±０．２°、８．２°±０．２°、１８．５°±０．２°および２４．５°±０．２°（２θ）において、特徴的なピークを有する。
【００１４】
また、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＢ型結晶は、図２に実質的に一致する粉末Ｘ線回折スペクトルにより特徴付けられる。
【００１５】
なお、別に言及がなければ、本明細書中および特許請求の範囲記載の数値はおおよその値である。数値の変動は、装置キャリブレーション、装置エラー、物質の純度、結晶サイズ、サンプルサイズ、その他の因子に起因する。
【００１６】
本明細書中で用いる「結晶」とは、秩序だった長い範囲の分子構造を有する物質を意味する。結晶形態の結晶化度は、例えば、粉末Ｘ−線回折、水分吸着、示差、熱量分析、溶液比色、溶解特性を含めた多くの技術によって測定することができる。
【００１７】
粉末Ｘ−線回折（ＸＲＰＤ）
結晶性有機化合物は、３次元空間に周期的に配列された多数の原子よりなる。構造周期性は、通例、ほとんどの分光学的プローブ（例えば、Ｘ線回折、赤外スペクトル、ラマンスペクトルおよび固体ＮＭＲ）によって明確に区別可能な物理的特性を発現する。Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）は、固体の結晶性を測定するための最も感度の良い分析法のうちの１つである。Ｘ線が結晶に照射されると、結晶格子面で反射し、互いに干渉しあい、ブラッグ則よって予測される条件を満たす方向の回折線のみ強度が増大し、それ以外は打ち消しあって観測されない。一方、非晶質固体については広範囲の秩序だった回折線は認められない。非晶質固体は、通常、反復する結晶格子の広い範囲の秩序が不存在であるため、ハローパターンと呼ばれるブロードなＸＲＰＤパターンを示す。
【００１８】
本発明の結晶の結晶形態は、区別可能な粉末Ｘ線回折プロフィールを有する。例えば、本発明の結晶の結晶形態（Ａ型）は、特徴的な回折ピークの存在によって異なる形態（Ｂ型結晶やアモルファス）と区別することができる。本明細書中で用いる特徴的な回折ピークは、観察された回折パターンから選択されるピークである。好ましくは、特徴的なピークは、回折パターンにおける約２０本、より好ましくは約１０本、最も好ましくは約５本から選択される。
【００１９】
一般に、粉末Ｘ線回折における回折角度（２θ）は±０．２°の範囲内で誤差が生じ得るので、上記の回折角度の値は±０．２°程度の範囲内の数値も含むものとして理解される必要がある。したがって、粉末Ｘ線回折におけるピークの回折角度が完全に一致する結晶だけでなく、ピークの回折角度が±０．２°程度の誤差で一致する結晶も本発明に含まれる。
【００２０】
一般に、以下の表及び図において表示されるピークの相対強度は、多くの因子、例えばＸ線ビームに対する結晶の配向効果、分析される物質の純度又はサンプルの結晶化度によって変動し得ることが知られている。また、ピーク位置についても、サンプル高の変動に基づいてシフトし得る。さらに、異なる波長を使用して測定するとブラッグ式（ｎλ=２ｄｓｉｎθ）に従って異なるシフトが得られるが、このような別の波長の使用により得られる別のＸＲＰＤパターンも、本発明の範囲に含まれる。
【００２１】
本発明の結晶は、癌を治療または予防において有用である。本発明の結晶は単独で使用してもよく、他のポリペプチドと組み合わせて使用しても良い。
【００２２】
本発明の結晶は、医薬上許容される担体と組み合わせることができる。担体としては、ミネラルオイルなどの油類、多糖類、単糖類、疎水化多糖類、アミノ酸、アルブミン等が使用できる。本発明の結晶は、エマルション製剤、凍結乾燥製剤、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤等として使用できる。エマルション製剤を調製するには、例えば国際公報２０１３／１３３２０９号に記載されている装置を用いて調製ができる。
【００２３】
本発明の結晶は、免疫応答が効果的に成立するように、従来からワクチン投与に用いられることが知られているアジュバントと組み合わせて投与してもよい。適切なアジュバントは、文献 （Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＡＧ．  （１９９４）  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ７：２７７−８９） に記載されている。例えば、ＣｐＧやＰｏｌｙ  ＩＣなどのＴｏｌｌ様受容体のアゴニスト、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン等が使用できる。
【００２４】
本発明の結晶は、癌治療用ワクチンとして使用可能である。ワクチンとしての投与方法は、特に限定されないが、適当な非経口経路、例えば静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入または筋肉内の経路を介して注射、または点鼻薬等の形態での粘膜経路を介する方法などにより投与することが望ましい。
【００２５】
本発明の結晶は、通常、上記の本発明の結晶を含む有効成分、医薬上許容される担体およびアジュバントを別個に製剤したキットとしてもよい
【００２６】
本発明の結晶の投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜決定することができるが、通常は医薬組成物中のペプチドまたは誘導体の量は、０．１  ｍｇ／回  〜  ５  ｍｇ／回程度の量を投与する。投与は２〜２０回行うのが適当である。投与間隔は１〜１２週間から選択する。
【００２７】
本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明する。これらの実施例は本発明を限定するものではない。数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証する努力をしているが、いくらかの誤差および偏差は考慮されるべきである。特に示さなければ、％は成分の重量％および組成物の全重量の重量％である。圧力は大気圧かまたはそれに近い圧力である。本明細書で使用する他の略語は以下のように定義される：ｇはグラム、Ｌはリットル、ｍｇはミリグラム、ｍＬはミリリットル。
【実施例１】
【００２８】
Ａ型結晶の製造法
【化１】
2015157791.tif 000002
【００２９】
通常の固相合成法により製造された配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドの粗化合物Ａ ５．１９ｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド４５ ｍＬに溶解し、０．５ｗｔ％酢酸アンモニウム水溶液３２５ ｍＬを添加後、１ｗｔ％アンモニア水４４ｍＬでｐＨ９とし、水８８ｍLを加えて粗化合物Ａ溶液とした。この溶液を用いて、カラム精製（移動相Ａ：０．５ｗｔ％酢酸アンモニウム水溶液、移動相Ｂ：アセトニトリル、カラム担体：ＯＤＳ Ｃ１８）を実施し、得られたカラム溶出液を水１１３２ｇと酢酸１７０ｍＬの混液に滴下した。滴下終了後、２時間撹拌熟成し、冷蔵下で終夜保存した。保存後、懸濁液の体積がおよそ１/２０になるまでろ過脱液し、得られた濃縮懸濁液を０．３％酢酸水５００ｍＬで４回洗浄した。得られた濃縮懸濁液に酢酸１５ｍＬおよび水９．２ｍＬを添加し、室温で１０時間撹拌した。室温下で終夜保存し、さらに室温で８時間撹拌後、凍結乾燥することで、式（Ｉ）で示される化合物のＡ型晶を３．１１ｇ得た。
【００３０】
Ｂ型結晶の製造法
【化２】
2015157791.tif 000003
【００３１】
通常の固相合成法により製造された配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドの粗化合物Ａ ５．１９ｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド４５ ｍＬに溶解し、０．５ｗｔ％酢酸アンモニウム水溶液３２５ ｍLを添加後、１ｗｔ％アンモニア水４４ｍＬでｐＨ９とし、水８８ｍＬを加えて粗化合物Ａ溶液とした。この溶液を用いて、カラム精製（移動相Ａ：０．５ｗｔ％酢酸アンモニウム水溶液、移動相Ｂ：アセトニトリル、カラム担体：ＯＤＳ Ｃ１８）を実施し、得られたカラム溶出液を水１１３２ｇと酢酸１７０ｍＬの混液に滴下した。滴下終了後、２時間撹拌熟成し、冷蔵下で終夜保存した。保存後、懸濁液の体積がおよそ１/２０になるまでろ過脱液し、得られた濃縮懸濁液を０．３％酢酸水５００ｍＬで４回洗浄した後、凍結乾燥することで、式（ＩＩ）で示される化合物のＢ型晶を３．６４ｇ得た．
【実施例２】
【００３２】
粉末Ｘ線回折パターンの測定
日本薬局方の一般試験法に記載された粉末Ｘ線回折測定法に従い、上記化合物のアモルファス、Ａ型晶およびＢ型晶の粉末Ｘ線回折測定を行った。測定条件を以下に示す。
【００３３】
（装置）
リガク社製  ＭｉｎｉＦｌｅｘ６００
（操作方法）
試料について、以下の条件で測定を行った。
測定法：集中法
光源の種類：Ｃｕ管球
使用波長：ＣｕＫα線
管電流：１５ｍＡ
管電圧：４０Ｋｖ
試料プレート：シリコン無反射板
【００３４】
測定結果を以下の表および図に示す。なお、図１は式（Ｉ）で示される化合物のＡ型晶、図２は式（ＩＩ）で示される化合物のＢ型晶のチャートを表している。また、以下の表１は式（Ｉ）で示される化合物のＡ型晶の粉末Ｘ線回折ピークを示している。回折角度（２θ）：３．４、４．７、６．９、７．５および８．６のピークが式（Ｉ）で示される化合物のＡ型晶として特に特徴的であることがわかる。
【００３５】
【表１】
2015157791.tif 000004
【００３６】
以下の表２は式（ＩＩ）で示される化合物のＢ型晶の粉末Ｘ線回折ピークを示している。回折角度（２θ）：３．９、６．０、８．２、１８．５および２４．５のピークが式（ＩＩ）で示される化合物のＢ型晶として特に特徴的であることがわかる。
【００３７】
【表２】
2015157791.tif 000005
【実施例３】
【００３８】
結晶の固体安定性試験  式（Ｉ）で示される化合物のＡ型結晶および式（ＩＩ）で示される化合物のＢ型結晶ならびにアモルファス約７０ｍｇをＰＴＦＥライナー付のポリプロピレン製栓付３０ｍＬ褐色硝子容器に正確に秤取した。当該容器を閉栓後、パラフイルムを巻き、４０℃で、３か月間保存した。４０℃で保存したサンプルを４０℃密栓保存品という。
【００３９】
式（Ｉ）で示される化合物のＡ型結晶および式（ＩＩ）で示される化合物のＢ型結晶ならびにアモルファス約１５０ｍｇをガラス製シャーレに正確に秤取して薄く均一な状態とした。ポリ塩化ビニリデン製ラップでシャーレを覆い、２５℃で、累積照度として１２１．６万ｌｘ・ｈｒのＤ６５ランプ光を照射した。このサンプルを光照射品という。
【００４０】
以下の条件下のＨＰＬＣ法で面積百分率法により類縁物質の量を測定した。
ＨＰＬＣ条件
カラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ  ＲＰ−Ａｍｉｄｅ（３μｍ  ４．６ｘ１５０ｍｍ）
カラム温度：４５℃
ＵＶ検出波長：２２０ｎｍ
移動相：［Ａ］０．１％リン酸水、［Ｂ］アセトニトリル/メタノール（１０／９０）を以下のようにグラジエントした。
流速：０．７ｍＬ／分
【００４１】
【表３】
2015157791.tif 000006
【００４２】
結果
式（Ｉ）で示される化合物のＡ型結晶の、保存前、４０℃密栓保存品及び光照射品の類縁物質の量を表４に示した。
式（ＩＩ）で示される化合物のＢ型結晶の、保存前、４０℃密栓保存品及び光照射品の類縁物質の量を表５に示した。
アモルファスの、保存前、４０℃密栓保存品及び光照射品の類縁物質の量を表６に示した。
式（Ｉ）で示される化合物のＡ型結晶、式（ＩＩ）で示される化合物のＢ型結晶及びアモルファスの、４０℃密栓保存品のクロマトグラムを図３に示した。
式（Ｉ）で示される化合物のＡ型結晶、式（ＩＩ）で示される化合物のＢ型結晶及びアモルファスの、光照射品のクロマトグラムを図４に示した。
表４、表５及び表６に示した保持時間は保存前を分析した時のものである。表４における保持時間１４．４分、２８．８分、３０．７分、３２．２分は、それぞれ表５における１４．３分、２８．９分、３０．６分、３２．２分、表６における１４．３分、２８．９分、３０．６分、３２．２分と同一成分である。
【００４３】
【表４】
2015157791.tif 000007
【００４４】
【表５】
2015157791.tif 000008
【００４５】
【表６】
2015157791.tif 000009
【００４６】
アモルファスに比べ、式（Ｉ）で示される化合物のＡ型晶および式（ＩＩ）で示される化合物のＢ型晶は、総類縁および光照射による類縁物質の増加割合が非常に少なく、さらに表３で示した保持時間１４．４分、３０．７分及び３２．２分の個々の類縁物質の増加割合も小さい。アモルファスに比べ、Ａ型晶およびＢ型晶が非常に安定であることを確認した。なお、Ａ型晶とＢ型晶を比較すると、Ａ型晶が総類縁および光照射などからより安定である。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明である配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＡ型結晶は、医薬原体として重要である。また、この結晶を含有する医薬組成物は、癌の治療剤または予防剤として有用である。
【図１】
2015157791.tif 000010
【図２】
2015157791.tif 000011
【図３】
2015157791.tif 000012
【図４】
2015157791.tif 000013
【配列表】
2015157791000001.app