(57)【要約】【課題】細胞を播種したハイドロゲルファイバを、３次元の複雑形状を有した細胞足場上に、多層細胞構造上に、巻き取りを、短時間かつ簡便に自動化するためのリーリング・ファイバ・システムを提供する。【解決手段】リーリング・ファイバ・システムは、複数の細胞を包埋するハイドロゲルファイバを、３次元足場を回転させることで巻き取り、３次元足場上に細胞の播種を自動的に行うための方法及び装置である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を包埋したハイドロゲルファイバを、
３次元細胞足場上に巻きる取るための
ハイドロゲルファイバを格納するためのファイバストックと
ハイドロゲルファイバを足場に対して位置決めするためのファイバ
ハイドロゲルファイバを位置決めするための位置決めステージ
３次元足場を回転させるためのローテータ
を備え、
前記のローテータを用いて、３次元細胞足場に対して、ハイドロゲルファイバを巻き取ることができることを特徴とする装置。
【請求項２】
ハイドロゲルファイバの巻きつけは、
３次元細胞足場を回転させ
複数のハイドロゲルファイバを連続的に
巻き取ることが出来ることを特徴とする。
【請求項３】
前記ファイバストックは
細胞包埋型のハイドロゲルファイバを
細胞を生きた状態を保ち
ファイバに対して、ハイドロゲルファイバを供給することが
できることを特徴とする請求項１記載のファイバストック。
【請求項４】
前記ファイバは
ハイドロゲルファイバにダメージを与えずに
ローテータに対し一定角度で設置することが
できることを特徴とする請求項１記載のファイバ。
【請求項５】
前記位置決めステージは
ファイバストック・ファイバを一体で
３次元足場に対して位置決めすることが
できることを特徴とする請求項１記載の位置決めステージ。
【請求項５】
前記ローテータは
３次元細胞足場を回転させ、
ファイバから供給されたハイドロゲルファイバを
３次元細胞足場上に巻き取ることが
できることを特徴とする請求項１記載のローテータ。
【請求項７】
請求項１、２のいずれか１項に記載のファイバストックと、
前記１、３のいずれか１項に記載のファイバと、
前記１、４のいずれか１項に記載の位置決めステージと、
前記１、４のいずれか１項に記載のローテータと、
のいずれか、もしくは全てを備え、
前記ハイドロゲルファイバを３次元足場上に自動的に巻き取るための方法及び装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、リーリング・ファイバ・システムと呼ぶ、細胞を包埋したハイドロゲルファイバを、細胞足が状に巻き取るための、ファイバストック・ファイバ・ファイバの位置決めステージ・細胞足場上のローテータからなる機構の方法及び装置に関する。【０００２】このリーリング・ファイバ・システムは、ファイバストック・ファイバ・ファイバの位置決め・細胞足場上のローテータのうち、いずれかもしくは全て、がら成る。【０００３】従来まで３次元的な形状に対して細胞を播種することは困難であったが、本発明のリーリング・ファイバ・システムを用いることで、３次元細胞足場上に、短時間かつ細胞を簡便に播種することができる。【０００４】また、本発明のリーリング・ファイバ・システムを用いることで、ハイドロゲルファイバを多層に巻きつけていく事により、異なる細胞を細胞足場上に、短時間かつ細胞を簡便に播種することができる。【０００５】また、本発明のリーリング・ファイバ・システムを用いることにより、複雑な形状の３次元足場に対しても、巻きつけ方向を制御することにより、短時間かつ簡便に細胞を播種することができる。
【背景技術】
【０００５】特許文献１では、三面張り水路やため池等の水場環境に容易に設置することが出来、その設置に伴い、対象とする水場環境に、水質や景観の改善効果をもたらすだけでなく、生物多様性の向上も見込んだシステムのために、充填剤として、現場発生土にゼオライトとハイドロゲルを混合したものを用いることを特徴としており、本研究で発明した細胞を包埋したハイドロゲルファイバを細胞足場上に固定するための方法及び装置とは異なる。【０００６】特許文献２では、コンタクトレンズ用のモールドを充填し組み立てるための装置を提供するために、前面湾曲モールドは降下自在な透明材料、たとえば重合可能なハイドロゲルが充填し、後面湾曲モールドと結合させ、充填し組み立てるための装置であり、本研究で発明した細胞を包埋したハイドロゲルファイバを細胞足場上に固定するための方法及び装置とは異なる。【０００７】特許文献３では、後部筺体と、前部筺体と、機械的インターロックと、ノズル組み立て体とを含むアプリケータにより、硬膜、ヘルニア修復における腹部組織、脊椎近くの組織、肺組織、腸組織、および任意の内臓組織にハイドロゲル処方を適用するための方法であり、本研究で発明した細胞を包埋したハイドロゲルファイバを細胞足場上に固定するための方法及び装置とは異なる。【０００８】特許文献４では、ハイドロゲルを、皮膚表面に接着し、電流を導き、かつ、皮膚内に前記活性物質を放出するように適合させるためのデバイスおよび方法に関するものであり、本研究で発明した細胞を包埋したハイドロゲルファイバを細胞足場上に固定するための方法及び装置とは異なる。【０００９】特許文献５では、活性物質の制御された皮膚内デリバリーのためのデバイス及び方法として、手動および／または高速で行われる自動接着用途用の原材であり、この原材は、その接着面に硬化性の前塗付型接着剤またはシーラント組成物を有し、この組成物のキュラティブが早発の放出を防ぐキャリアーの成分としてハイドロゲルを用いるものであり、本研究で発明した細胞を包埋したハイドロゲルファイバを細胞足場上に固定するための方法及び装置とは異なる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許公開２００７−２０９９６９
【特許文献２】特許公開平９−１９９７２
【特許文献３】特許公表２０１１−５２７６０７
【特許文献４】特許公表２００８−５３７７５４
【特許文献５】特許公表２００５−５０６１５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】三次元細胞組織内に血管網を構築する技術としては、作製した組織内部に血管内皮細胞を播種し、毛細血管網を構築する手法などがこれまでに提案されている。【００１２】しかし、心臓や肝臓といった大規模な三次元細胞組織を構築するためには、毛細血管網に繋がるより径の大きな血管を三次元的に構築する必要性がある【００１３】現在、中・大口径（直径６ｍｍ〜３０ｍｍ）のサイズの血管では、人工血管技術による再建方法が確立され、臨床応用されている。【００１４】しかし、毛細血管とそれらの血管をつなぐための小口径血管においては臨床応用が可能な完成度のモデルは作製されていない。また、組織工学の分野では意図した形状の組織を作製することも重要となるため、任意の形状の血管網が構築できれば、従来作製されていた三次元細胞組織よりも大きな構造体を作製することが可能になると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねてきた結果、次なる構成の本発明に想到した。
本発明は、リーリング・ファイバ・システムと呼ぶ、細胞を包埋したハイドロゲルファイバを、細胞足が状に巻き取るための、ファイバストック・ファイバ・ファイバの位置決めステージ・細胞足場上のローテータからなる機構の方法及び装置を考案した。【００１６】このリーリング・ファイバ・システムは、ファイバストック・ファイバ・ファイバの位置決め・細胞足場上のローテータのうち、いずれかもしくは全て、から成る。【００１７】従来まで３次元的な形状に対して細胞を播種することは困難であったが、本発明のリーリング・ファイバ・システムを用いることで、３次元細胞足場上に、短時間かつ細胞を簡便に播種することができる。【００１８】また、本発明のリーリング・ファイバ・システムを用いることで、ハイドロゲルファイバを多層に巻きつけていく事により、異なる細胞を細胞足場上に、短時間かつ細胞を簡便に播種することができる。【００１９】また、本発明のリーリング・ファイバ・システムを用いることにより、複雑な形状の３次元足場に対しても、巻きつけ方向を制御することにより、短時間かつ簡便に細胞を播種することができる。【００２０】
【発明の効果】
【００２１】たとえば、毛細血管網に繋がる直径６ｍｍ以下の小口径血管の作製を目指す。生体内の血管と同等の機能を持つ小口径血管を作製するために必要な主な条件を以下に示す。１）任意形状：単純な円筒のみでなく、分岐構造などの複雑な形状を有する血管を作製できること。２）均一性：生分解性足場に重力などの影響を受けず均一に細胞を播種すること。３）共培養：生体内の血管と同じく層状に異種細胞を配置すること。以上三つの条件を満たした小口径人工血管の作製を可能とする技術である。【００２２】
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明のリーリング・ファイバ・システムの構成を示す。
【図２】図２は、リーリング・ファイバ・システムを用いた多層血管構造の構築の模式図を示す。
【図３】図３は、本発明のリーリング・ファイバ・システムを用いたハイドロゲルファイバ巻取の実験装置を示す。
【図４】図４は、本発明のリーリング・ファイバ・システムを用いて細胞足場に播種した細胞を培養した後、生死判別のための蛍光染色を行った結果を示す。
【図５】図５は、本発明のリーリング・ファイバ・システムを用いて、異なる２種の細胞を包埋する２本のハイドロゲルを細胞足場に巻き付けたときの実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】図１に本発明のリーリング・ファイバ・システムの構成を示す。このシステムは、細胞を包埋したハイドロゲルファイバ（１及び２）、細胞足場（３）、細胞足場（３）を回転させるためのローテータ（４）、ハイドロゲルファイバを細胞足場（３）へ供給するためのファイバストック（５）、ファイバの位置決めステージ（６）からなる。
【００２５】図２に本発明のリーリング・ファイバ・システムを用いた多層血管構造の構築の模式図を示す。血管構造は三種の異なる細胞が層状に重なることにより構成されている。本発明のリーリング・ファイバ・システムを用いると、細胞足場（３）の外側に異なる細胞を包埋したハイドロゲルファイバを重ねて巻くことで血管と同様の多層構造を構築することが可能になる。例えば、ハイドロゲルファイバＡ（１）として平滑筋細胞を包埋するハイドロゲルファイバを用い、ハイドロゲルＢ（２）として繊維芽細胞を包埋するハイドロゲルファイバを用いることで、血管の中膜及び外膜を模した細胞構造を構築することができる。さらに、細胞足場（３）の内側に血管内皮細胞を播種すると、血管の内膜を含む血管を模した細胞の三層構造を構築することが可能である。
【００２６】図３に本発明のリーリング・ファイバ・システムを用いたハイドロゲルファイバ巻取の実験装置を示す。この実験では、赤色と青色に染色された２本のハイドロゲルファイバを用いて実験を行った。図３（ａ）に示すように、２本のハイドロゲルファイバはそれぞれのファイバストック（５）から細胞足場（３）へと供給した。細胞足場（３）はローテータ（４）によって２７０ｒｐｍの速度で回転させ、ハイドロゲルファイバの巻取を行った。また、位置決めステージ（６）は毎秒１ｍｍの速度で動かした。実験では、まず赤色のハイドロゲルファイバを細胞足場（３）へと巻き付け、その上に青色のハイドロゲルファイバを巻き付けた。その結果、図３（ｂ）に示すように、赤色のファイバの上に青色のファイバが巻き付いた２層構造の作製を実現し、血管構造を模倣した細胞播種実現の可能性を示した。
【００２７】図４は、本発明のリーリング・ファイバ・システムを用いて細胞足場に播種した細胞の生存率確認結果である。この実験では、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて実験を行った。細胞を包埋するハイドロゲルファイバを円筒形状の細胞足場（３）に巻き付けた後、周りを寒天でコーティングし、ハイドロゲルファイバをアルギン酸リアーゼによって溶かし、細胞の培養を行った。培養後、生細胞のみ緑色の蛍光を発するようになる蛍光染色液カルセイン−ＡＭと、死細胞のみ赤色の蛍光を発するようになる蛍光染色液プロピジウムイオダイドを用いて細胞の蛍光染色を行った。その結果、９０％以上の細胞が緑色の蛍光を発しており、生存していることが確認できた。また、この実験結果より、本提案手法による細胞足場（３）への細胞播種が可能であることを確認した。
【００２８】図５は、本発明のリーリング・ファイバ・システムを用いて、異なる２種の細胞を包埋する２本のハイドロゲルを細胞足場に巻き付けた実験結果である。この実験では、細胞Ａ（７）として平滑筋細胞を、細胞Ｂ（８）として繊維芽細胞を用い、平滑筋細胞を包埋するハイドロゲルファイバＡ（１）と繊維芽細胞を包埋するハイドロゲルファイバＢ（２）を用いて実験を行った。ここで、平滑筋細胞、繊維芽細胞はそれぞれｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ、ｐＣＭＶ−ＤｓＲｅｄを遺伝子導入することで緑色と赤色の蛍光をそれぞれ発するようにした。細胞足場（３）にハイドロゲルファイバＡ（１）とハイドロゲルファイバＢ（２）を巻き付けた後の明視野観察結果を図５（ａ）に、赤色の蛍光で細胞Ｂ（８）である繊維芽細胞のみを観察した結果を図５（ｂ）に、緑色の蛍光で細胞Ａ（７）である平滑筋細胞のみを観察した結果を図５（ｃ）に、図５（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の画像を全て重ね合わせた結果を図５（ｄ）に示す。その結果、細胞足場上で２つの異なる細胞が層状に重なった構造をとっていることを確認し、本提案手法による細胞多層構造の構築が可能であることを確認した。
【符号の説明】
【００２９】１  ハイドロゲルファイバＡ
２  ハイドロゲルファイバＢ
３  細胞足場
４  ローテータ
５  ファイバストック
６  位置決めステージ
７  細胞Ａ
８  細胞Ｂ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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