(57)【要約】【課題】糖結合体ワクチンの提供。【解決手段】本発明により、２個以上の１価の結合体の組み合わせを含む組成物が提供される。上記２個以上の１価の結合体にはそれぞれ、糖抗原に結合させられた２個以上の病原体に由来するＴ細胞エピトープを含む担体タンパク質が含まれる。本発明によってはまた、同じ担体タンパク質分子に結合させられた２個以上の抗原的に異なる糖抗原を含む多価結合体も提供される。この場合、担体タンパク質には、２個以上の病原体に由来するＴ細胞エピトープが含まれる。さらなる組成物には、１個以上の上記の１価の結合体と、１個以上の上記の多価結合体が含まれる。本発明によりさらに、上記組成物を作製するための方法と、上記組成物の使用も提供される。例としては、髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）のオリゴ糖へのＮ１９担体タンパク質の結合体が挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中で引用される全ての文献は、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
【０００２】
（技術分野）
本発明はワクチンの分野にあり、複数の病原性タンパク質に由来するＴ細胞エピトープを含む多エピトープ担体タンパク質に結合させられた２個以上の糖抗原を含む新規の組成物に関する。本発明はまた、上記組成物を作製するための方法と、上記組成物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
多価ワクチンは当該分野で公知である。１つのこのような例は、髄膜炎菌（Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の血清学的グループＡ、Ｃ、Ｙ、およびＷ１３５に由来する莢膜多糖類の４価のワクチンである。これは、かなり以前より知られており［１、２］（非特許文献１、２）、そしてヒトでの使用が許可されている。しかし、青年期および成人には有効であるが、わずかな免疫反応と短い防御期間しか誘導できず、幼児には使用できない［例えば、３］（非特許文献３）。これは、多糖類がＴ細胞依存性抗原であり、これは、一般的には、弱い免疫反応しか誘導できず、ブーストできないことが理由である。懸念は、多くの場合は、多価ワクチンの広範な使用に関して生じる。なぜなら、これらは、免疫抑制として知られている免疫機能を有意に低下させる傾向があるからである。被験体に導入される抗原の量が免疫システムが反応する能力を超えている場合には、免疫抑制が生じる場合がある。このような状態は、抗原過負荷（ａｎｔｉｇｅｎ−ｏｖｅｒｌｏａｄ）と呼ばれる。免疫抑制はまた、多価ワクチンの別の抗原成分に対する反応による、免疫系を妨げる１つの別の成分の結果としても起こり得る。この後者の形態の免疫抑制は、ワクチン干渉（ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）と呼ばれる。
【０００４】
最近の２０年間で、タンパク質担体に結合させられた細菌の莢膜多糖類を含む結合体ワクチンが開発された。例としては、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｔｙｐｅ  ｂ（Ｈｉｂ）結合体ワクチン［４］（非特許文献４）、ならびに、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する結合体ワクチン［５］（非特許文献５）と血清学的グループのＣ髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＭｅｎＣ）に対する結合体ワクチン［６］（非特許文献６）が挙げられる。
【０００５】
認可されたワクチンに使用される担体タンパク質としては、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ジフテリア毒素の非毒性ＣＲＭ１９７変異体、およびＢ群髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する外膜タンパク質複合体が挙げられる。さらなる結合させられたワクチンが医療に導入されているので、幼児にも、ワクチンそのものとして（例えば、ＴＴもしくはＤＴ）、または結合体ワクチンの中に存在する担体タンパク質としてのいずれかとして、担体タンパク質の複数回の注射を受けさせることができる。これらのタンパク質は、Ｂ細胞とＴ細胞の両方のレベルで免疫原性が高いので、担体過負荷（ｃａｒｒｉｅｒ  ｏｖｅｒｌｏａｄ）によって、感作された個体において免疫抑制を誘導する可能性がある［７］（非特許文献７）。担体によって誘導されるエピトープ抑制（ｃａｒｒｉｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｉｃ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）と呼ばれるこの現象は、担体特異的抗体および分子内での抗原性の競合が原因であると考えられている［８］（非特許文献８）。理想的には、担体タンパク質は、それ自体に対する抗体応答を誘導することなく、結合したＢ細胞エピトープ（例えば、多糖）に対する強いヘルパー効果を誘導するべきである。ほとんどの主要な組織適合性複合体クラスＩＩ分子の状況で免疫原性であるユニバーサルエピトープの使用は、この目的のための１つのアプローチである［９］（非特許文献９）。このようなエピトープは、ＴＴと他のタンパク質において同定されている。しかし、なおも、さらに改良する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｒｍａｎｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．，１９８２年，第１０巻，ｐ．３３５−３３９
【非特許文献２】Ｃａｄｏｚら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９８５年，第３巻，ｐ．３４０−３４２
【非特許文献３】ＭＭＷＲ，１９９７年，第４６巻（ＲＲ−５），ｐ．１−１０
【非特許文献４】Ｐｅｌｔｏｌａ，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，２０００年，第１３巻，ｐ．３０２−３１７
【非特許文献５】ＷｕｏｒｉｍａａおよびＫａｙｈｔｙ，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００２年，第５６巻，ｐ．１１１−１２９
【非特許文献６】Ｂａｌｍｅｒら，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２年，第５１巻，ｐ．７１７−７２２
【非特許文献７】Ｄｅｌ  Ｇｉｕｄｉｃｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９２年，第４巻，ｐ．４５４−４５９
【非特許文献８】Ｅｌｔｉｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０年，第２４９巻，ｐ．４２３−４２５
【非特許文献９】Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０００年，第１６４巻，ｐ．１６２５−１６３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、改良された糖結合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の開示）
多エピトープ担体タンパク質が、糖類と組み合わせられる担体として特に有用であることが発見されている。さらに、これらの担体タンパク質に対しては、これらが既知の病原性エピトープを多数含んでいるとしてもなお、免疫原性が低い反応しか見られないが、免疫原性反応は病原性エピトープの数に比例して大きくなると予想されることが発見されている。
【０００９】
したがって、いくつかの実施形態においては、本発明により、２個以上の１価の結合体（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上）の組み合わせを含む組成物が提供される（図１Ａを参照のこと）。個々の１価の結合体には、（ｉｉ）糖抗原に対して結合させられた（ｉ）２個以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上）の病原体に由来するＴ細胞エピトープを含む担体タンパク質が含まれる。好ましくは、個々の結合体で使用される担体タンパク質は同じである。好ましくは、担体タンパク質エピトープの少なくとも１つは、糖抗原と同じ病原体に由来するものではない。好ましくは、担体タンパク質のエピトープの全ては、糖抗原と同じ病原体に由来するものではない。
【００１０】
個々の担体タンパク質分子上に複数の結合部位が存在しているので、個々の１価の結合体の中の個々の担体タンパク質分子を、１つ以上の糖抗原分子（例えば、１個、５個、１０個、２０個、またはそれ以上）に結合させることができるが（図１Ｂ）、任意の所定の担体タンパク質に結合させられた個々の糖抗原は、好ましくは、同じ抗原的に異なる病原体に由来する。例えば、ＭｅｎＡ由来の糖抗原は、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ、およびＭｅｎＹのそれぞれに由来する抗原とは異なり、したがって、抗原的に異なる病原体といわれるが、Ｈｉｂ由来の糖抗原は、全て同じ抗原的に異なる病原体に由来する。１つの結合体において、個々の糖は、同じ抗原的に異なる病原体由来であるが、鎖の長さが異なる場合がある。
【００１１】
あるいは、いくつかの実施形態においては、本発明により、同じ担体タンパク質分子に結合させられた２個以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上）の抗原的に異なる糖抗原を含む多価結合体が提供される（図１Ｃ）。この場合は、糖抗原は、種々の抗原的に異なる病原体に由来する。したがって、例えば、このような結合体組成物においては、個々の担体タンパク質分子は、それに対して結合させられた、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ、ＭｅｎＹ、およびＨｉｂの２個以上に由来する糖抗原を有し得る。本発明によってはまた、これらの多価結合体の２個以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上）を含む組成物も提供される。
【００１２】
さらなる代案として、本発明により、上記のような１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上）の１価の結合体（単数または複数）と、１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上）の多価結合体（単数または複数）を含む組成物が提供される。
【００１３】
担体タンパク質
担体タンパク質には、２個以上のＴ細胞エピトープ（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２２個、２４個、２６個、２８個、３０個、３２個、３４個、３６個、３８個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、またはそれ以上）が含まれ得る。好ましくは、担体タンパク質には、６個以上、または１０個以上のエピトープが含まれる。より好ましくは、担体タンパク質には、１９個以上のエピトープが含まれる。個々の担体タンパク質は、特定のエピトープを１コピーしか有さない場合があり、また、特定のエピトープを１コピー以上有する場合もある。好ましくは、エピトープは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープである。好ましくは、担体タンパク質には、少なくとも１個の細菌のエピトープと、少なくとも１個のウイルスのエピトープが含まれる。好ましくは、エピトープは、自然な感染またはワクチン接種のいずれかによってヒトの集団が頻繁に曝される抗原に由来し、例えば、エピトープは、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、帯状疱疹ウイルス、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）およびライ菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）および／または連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株などに由来する熱ショックタンパク質に由来し得る。好ましくは、エピトープは、破傷風毒素（ＴＴ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳＰ（ＰｆＣｓ）、Ｂ型肝炎ウイルスのヌクレオカプシド（ＨＢＶｎｃ）、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、およびインフルエンザマトリックス（ＭＴ）から選択される。担体タンパク質に使用されるエピトープは、好ましくは、Ｐ２３ＴＴ（配列番号１）、Ｐ３２ＴＴ（配列番号２）、Ｐ２１ＴＴ（配列番号３）、ＰｆＣｓ（配列番号４）、Ｐ３０ＴＴ（配列番号５）、Ｐ２ＴＴ（配列番号６）、ＨＢＶｎｃ（配列番号７）、ＨＡ（配列番号８）、ＨＢｓＡｇ（配列番号９）、およびＭＴ（配列番号１０）から選択される。
【００１４】
好ましくは、エピトープは、スペーサーによって連結される。好ましくは、スペーサーは短い（例えば、１個、２個、３個、４個、または５個）のアミノ酸配列であり、これはエピトープではない。好ましいスペーサーには、１個以上のグリシン残基が含まれ、例えば、−ＫＧ−である。好ましくは、担体タンパク質には、担体タンパク質（例えば、配列「ＭＤＹＫＤＤＤＤ」（配列番号１２）を使用することができる）および／またはプロテアーゼ切断配列のスクリーニングに有用な免疫親和性タグである、６−Ｈｉｓテールを含むＮ末端またはＣ末端領域が含まれる。好ましくは、タンパク質分解配列は、Ｘａ因子認識部位である。
【００１５】
好ましくは、担体にはサプレッサーＴ細胞エピトープは含まれない。
【００１６】
好ましくは、担体タンパク質はＮ１９（配列番号１１）である。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の中で発現させられた、いくつかのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞ユニバーサルエピトープを有しているＮ１９と呼ばれる遺伝子操作されたタンパク質［１０］は、Ｈｉｂ多糖に結合させられると強い担体として働くことが示されている［１１］。Ｎ１９のＮ末端領域は、（ｉ）精製の間に有効に利用され得る６Ｈｉｓテール、（ｉｉ）クローニング手順の間のポジティブコロニーのスクリーニングに使用することができるウサギポリクローナル抗体によって認識されるフラッグペプチドＭｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ配列（配列番号１２）、（ｉｉｉ）タグを容易に除去するためのＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号１３）Ｘａ因子認識部位。Ｎ１９は、表１に列挙される最初の９個のエピトープと、インフルエンザマトリックスＣＤ４＋エピトープＭＴの二重（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）である。これらのエピトープは、Ｌｙｓ−Ｇｌｙスペーサーで隔てられており、これによって分子の可撓性が提供され、そして、その後のＬｙｓ残基の第１級εアミノ基への多糖の結合が可能になる。
【００１７】
ＣＤ４＋エピトープに加えて、担体タンパク質には、インターロイキン−２（ＩＬ−２）または顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳ）のような免疫調節サイトカインに由来するエピトープのような、他のペプチドまたはタンパク質断片が含まれる場合がある。
【００１８】
（表１）
【００１９】
【表１】
2015155464.tif 000002
糖抗原
好ましくは、本発明の組成物において担体タンパク質に結合させられる糖抗原は細菌の糖であり、具体的には、細菌の莢膜糖である。
【００２０】
本発明の組成物に含めることができる細菌の莢膜糖の例としては、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（血清学的グループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ、特に、４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および／または２３Ｆ）、Ｂ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｉａ型、Ｉｂ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、ＶＩＩ型、および／またはＶＩＩＩ型、例えば、参考文献２０〜２３に開示されている糖抗原）、ヘモフィルス・インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（分類できる株：ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、および／またはｆ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（例えば、ＰＡ０１、Ｏ５血清型から単離されたＬＰＳ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（例えば、血清型５および８に由来するもの）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）（３糖の反復）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）などに由来する莢膜糖が挙げられる。本発明の組成物に含めることができる他の糖類としては、グルカン（例えば、真菌のグルカン、例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）のグルカン）、および真菌の莢膜糖（例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）の莢膜に由来するもの）が挙げられる。
【００２１】
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清学的グループＡ（ＭｅｎＡ）の莢膜は、（α１→６）結合しているＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−リン酸のホモポリマーであり、Ｃ３とＣ４位置に部分的なＯ−アセチル化を有している。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清学的グループＢ（ＭｅｎＢ）の莢膜は、（α２→８）結合しているシアル酸のホモポリマーである。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清学的グループＣ（ＭｅｎＣ）の莢膜糖は、（α２→９）結合しているシアル酸のホモポリマーであり、７位および／または８位に可変のＯ−アセチル化を有している。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清学的グループＷ１３５の糖は、シアル酸−ガラクトースの２糖単位［→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→］を有しているポリマーである。これは、シアル酸の７位と９位に可変のＯ−アセチル化を有している［２４］。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清学的グループＹの糖は、２糖の反復単位にガラクトースの代わりにグルコースが含まれている［→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇｌｃ−α−（１→］ことを除いて、血清型Ｗ１３５の糖と同様である。これもまた、シアル酸の７位と９位に可変のＯ−アセチル化を有している。
【００２２】
本発明の組成物には、糖抗原の混合物が含まれる。好ましくは、組成物には、２個、３個、４個、またはそれ以上の異なる糖抗原が含まれる。抗原は、同じ病原体に由来する場合も、また、抗原的に異なる病原体に由来する場合もある。好ましくは、本発明の組成物には、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の１つ以上の血清学的グループに由来する糖抗原が含まれる。例えば、組成物には、血清学的グループＡとＣ、ＡとＷ１３５、ＡとＹ、ＣとＷ１３５、ＣとＹ、Ｗ１３５とＹ、ＡとＣとＷ１３５、ＡとＣとＹ、ＣとＷ１３５とＹ、ＡとＣとＷ１３５とＹなどに由来する糖結合体が含まれる。好ましい組成物には、血清学的グループＣとＹに由来する糖が含まれる。他の好ましい組成物には、血清学的グループＣ、Ｗ１３５、およびＹに由来する糖が含まれる。特に好ましい組成物には、血清学的グループＡ、Ｃ，Ｗ１３５、およびＹに由来する糖が含まれる。
【００２３】
混合物に、血清学的グループＡに由来する髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）の糖と、少なくとも１つの他の血清学的グループの糖が含まれる場合は、任意の他の血清学的グループの糖に対するＭｅｎＡの糖の割合（ｗ／ｗ）は１より大きい（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１、またはそれ以上）場合がある。１：１．２５と１：２．５の間の比のような、１：２から５：１の間の比が好ましい。血清学的グループに由来する糖についての好ましい比（ｗ／ｗ）Ａ：Ｃ：Ｗ１３５：Ｙは、１：１：１：１；１：１：１：２；２：１：１：１；４：２：１：１；８：４：２：１；４：２：１：２；８：４：１：２；４：２：２：１；２：２：１：１；４：４：２：１；２：２：１：２；４：４：１：２；および２：２：２：１である。
【００２４】
さらに好ましい本発明の組成物には、Ｈｉｂ糖結合体と、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の少なくとも１つの血清学的グループに由来する（好ましくは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の１つ以上の血清学的グループに由来する）糖結合体が含まれる。例えば、本発明の組成物には、Ｈｉｂ糖と、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の血清学的グループＡ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹの１つ以上（すなわち、１個、２個、３個、または４個）に由来する糖が含まれる場合がある。上記の病原体に由来する糖結合体の他の組み合わせもまた提供される。
【００２５】
本発明によってはまた、いくつかの実施形態において、担体タンパク質がそれぞれの結合体について同じではない結合体の組み合わせも提供される。
【００２６】
さらに好ましい本発明の組成物には、第１の結合体と第２の結合体が含まれる。第１の結合体は、上記の多エピトープ結合体であり、第２の結合体には、第１の結合体に使用されたものとは異なる担体タンパク質に結合させられた糖抗原が含まれる。例えば、第２の結合体は、担体ＣＲＭ１９７に結合させられた糖抗原であり得る。第２の結合体の中の糖抗原（単数または複数）は、第１の結合体の中の糖抗原（単数または複数）と同じである場合も、また、異なる場合もある。
【００２７】
莢膜糖抗原の調製
莢膜糖抗原の調製のための方法は周知である。例えば、参考文献２５には、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からの糖抗原の調製が記載されている。ヘモフィルス・インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）からの糖抗原の調製は、参考文献２６の第１４章に記載されている。肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの糖抗原と結合体の調製は当該分野で記載されている。例えば、Ｐｒｅｖｅｎａｒ（登録商標）は、７価の肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）結合体ワクチンである。Ｂ群連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）からの糖抗原の調製のためのプロセスは、参考文献２７および２８に詳細に記載されている。莢膜糖は、本明細書中のいくつかの参考文献に記載されているように、公知の技術によって精製することができる。
【００２８】
糖抗原は化学的に修飾することができる。例えば、これらは、ブロッキング基で１つ以上のヒドロキシル基を置き換えるように修飾することができる。これは、加水分解を防ぐためにアセチル基がブロッキング基で置き換えられ得る、髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）血清学的グループＡに特に有用である［２９］。このように修飾された糖類は、本発明の意味ではなおも血清学的グループＡの糖類である。
【００２９】
糖は、自然界に見られるような莢膜糖と比較して、化学的に修飾することができる。例えば、糖は、脱−Ｏ−アセチル化する（部分的または完全に）、脱−Ｎ−アセチル化する（部分的にまたは完全に）、Ｎ−プロピオン酸化する（部分的または完全に）ことなどができる。脱アセチル化は、結合の前、間、または後で起こり得るが、結合の前に起こることが好ましい。特定の糖によっては、脱アセチル化が免疫原性に栄養を与える場合も、また与えない場合もある。例えば、ＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ（登録商標）ワクチンは、脱−Ｏ−アセチル化された糖を使用するが、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（登録商標）はアセチル化されておらず、これらのワクチンはいずれも有効である。脱アセチル化などの影響は日常的に行われているアッセイによって評価することができる。
【００３０】
莢膜糖類はオリゴ糖の形態で使用することができる。これらは、都合よく、精製された莢膜多糖の断片化によって（例えば、加水分解によって）形成され、これは、通常、その後に所望される大きさの断片の精製が行われる。多糖類の断片化は、好ましくは、３０未満のオリゴ糖の最終平均重合度（ＤＰ）となるように行われる。ＤＰは都合よく、イオン交換クロマトグラフィーによって、または比色アッセイによって測定することができる［３０］。
【００３１】
加水分解が行われる場合は、加水分解物は通常、短いオリゴ糖を除去するような大きさにされる［３１］。これは種々の方法、例えば、限外濾過、その後のイオン交換クロマトグラフィーによって行うことができる。約６未満、または約６に等しい重合度のオリゴ糖は、血清学的グループＡの髄膜炎菌については除去されることが好ましく、そして約４未満のものは、血清学的グループＷ１３５およびＹについては除去されることが好ましい。
【００３２】
担体−糖結合体
本発明の結合体には、少量の遊離の（すなわち、結合させられていない）担体が含まれる場合がある。任意の担体タンパク質が、本発明の組成物の中に遊離の形態と結合させられた形態の両方で存在する場合には、結合させられていない抗体は、好ましくは、全体として、組成物中の担体タンパク質の全量の５％未満であることが好ましく、そして２（重量）％未満であることがより好ましい。
【００３３】
結合後に、遊離の糖と結合させられた糖を分離することができる。疎水性クロマトグラフィー、接線限外濾過、透析濾過などを含む多くの適切な方法が存在している（参考文献３２および３３などもまた参照のこと）。
【００３４】
任意の適切な結合反応を、必要に応じて、任意の適切なリンカーとともに使用することができる。担体への糖抗原の結合は、好ましくは、−ＮＨ２基を介する。例えば、担体タンパク質中のリジン残基またはアルギニンのリジン残基の側鎖の中にある−ＮＨ２基を介する。糖が遊離のアルデヒド基を有している場合には、これは、担体の中のアミンと反応することができ、還元的アミノ化によって結合を形成することができる。結合はまた、−ＳＨ基（例えば、システイン残基の側鎖の中のもの）を介する場合もある。あるいは、糖抗原は、リンカー分子を介して担体に結合させることもできる。
【００３５】
糖は、通常、結合の前に活性化させられるか、または機能化させられる。活性化には、例えば、ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸［３４、３５など］）のシアノ化試薬が含まれ得る。他の適切な技術では、カルボジイミド、ヒドラジド、活性なエステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵが使用される（参考文献３６の導入もまた参照のこと）。
【００３６】
リンカー
リンカー基を介する結合は、任意の公知の手順（例えば、参考文献３７および３８に記載される手順）を使用して行うことができる。１つのタイプの結合には、糖の還元的アミノ化、得られたアミノ基のアジピン酸リンカー基の一方の末端とのカップリング、その後の、アジピン酸リンカー基の他方の末端への担体タンパク質のカップリングが含まれる［３９、４０］。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド［４１］、ニトロフェニル−エチルアミン［４２］、ハロゲン化ハロアシル［４３］、グリコシドリンカー［４４］、６−アミノカプロン酸［４５］、ＡＤＨ［４６］、Ｃ４からＣ１２部分［４７］などが挙げられる。リンカーを使用する代わりとしては、直接的な結合を使用することができる。タンパク質への直接的な結合には、例えば、参考文献４８および４９に記載されているように、多糖の酸化、その後のタンパク質での還元的アミノ化が含まれ得る。
【００３７】
糖へのアミノ基の導入（例えば、末端＝Ｏ基の−ＮＨ２での置換による）、その後のアジピン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）での誘導と、担体タンパク質との反応を含むプロセスが好ましい。
【００３８】
２官能性リンカーを使用して、糖の中のアミン基へのカップリングのための第１の基と、担体へのカップリングのため（通常は、担体のアミンへのカップリングのため）の第２の基を提供することができる。
【００３９】
したがって、２官能性リンカーの中の第１の基は、糖上のアミン基（−ＮＨ２）と反応することができる。この反応には、通常、アミンの水素の吸電子置換が含まれる。２官能性リンカーの中の第２の基は、担体上のアミン基と反応することができる。この反応にも、再び、通常は、アミンの吸電子置換が含まれる。
【００４０】
糖と担体の両方との反応にアミンが関係している場合は、式Ｘ−Ｌ−Ｘの２官能性リンカーを使用することが好ましい。式中、２つのＸ基はそれぞれ同じであり、アミンと反応することができ、Ｌはリンカーの中の結合部分である。好ましいＸ基はＮ−オキシスクシンイミドである。Ｌは、好ましくは、式Ｌ’−Ｌ２−Ｌ’を有し、式中、Ｌ’はカルボニルである。好ましいＬ２基は、１個から１０個の炭素原子を含む（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０）直鎖のアルキルであり、例えば、−（ＣＨ２）４−である。
【００４１】
他のＸ基は、ＨＯ−Ｌ−ＯＨと結合するとエステルを形成するものであり、例えば、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、およびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。
【００４２】
本発明と共に使用されるさらなる２官能性リンカーとしては、アクリロイルハロゲン化物（例えば、塩化物）およびハロアクリルハライドが挙げられる。
【００４３】
リンカーは、通常、修飾された糖に対してモル過剰量で添加される。
【００４４】
結合後、遊離の糖と結合した糖を分離することができる。疎水性クロマトグラフィー、接線限外濾過、透析濾過などを含む多くの適切な方法が存在している（参考文献５０および５１などもまた参照のこと）。
【００４５】
本発明の組成物に解重合させられた糖が含まれる場合は、解重合が結合の前に行われることが好ましい。
【００４６】
さらなる抗原
本発明の組成物には、１個以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上）の、以下のようなさらなる抗原が含まれ得る：
Ａ．細菌抗原
本発明での使用に適している細菌抗原としては、タンパク質、多糖類、リポ多糖類、および細菌から単離、精製、または誘導することができる他の膜小胞が挙げられる。加えて、細菌抗原には、細菌溶解物および不活化させられた細菌処方物が含まれる場合がある。細菌抗原は、組み換え発現によって生産させることができる。細菌抗原には、好ましくは、その生活環の少なくとも１つの段階の間に細菌の表面上に露出させられるエピトープが含まれる。細菌抗原は、複数の血清型にまたがって保存されていることが好ましい。細菌抗原としては、以下に示される細菌の１種類以上に由来する抗原、ならびに、以下に示される特定の抗原の例が挙げられる。
【００４７】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）：髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）抗原には、Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ、および／またはＢのような髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の血清学的グループから精製または誘導された、タンパク質（例えば、参考文献５２〜５８に記載されているタンパク質）、糖類（多糖、オリゴ糖、またはリポ多糖を含む）、または外膜小胞［５９〜６２］が含まれ得る。髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）タンパク質抗原は、付着因子、オートトランスポータ（ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、毒素、イオン捕捉タンパク質（ｉｏｎ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、および膜結合タンパク質（好ましくは、組み込み型の外膜タンパク質）から選択することができる。参考文献６３〜７１もまた参照のこと。
【００４８】
肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）：肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原には、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する糖（多糖またはオリゴ糖を含む）および／またはタンパク質が含まれ得る。タンパク質抗原は、例えば、参考文献７２〜７７のいずれかに記載されているタンパク質から選択することができる。肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）タンパク質は、ポリヒスチジントライアド（Ｐｏｌｙ  Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  Ｔｒｉａｄ）ファミリー（ＰｈｔＸ）、コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸ短型、ＬｙｔＸファミリー、ＬｙｔＸ短型、ＣｂｐＸ短型−ＬｙｔＸ短型キメラタンパク質、肺炎球菌溶血素（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１３０、Ｓｐ１２５、またはＳｐ１３３から選択することができる。参考文献７８〜８４もまた参照のこと。
【００４９】
化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））：Ａ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）抗原には、参考文献８５または８６に記載されているタンパク質（ＧＡＳ４０を含む）、ＧＡＳ  Ｍタンパク質の断片の融合体（参考文献８７〜８９に記載されているものを含む）、フィブロネクチン結合タンパク質（Ｓｆｂ１）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）ヘム結合タンパク質（Ｓｈｐ）、およびストレプトリシンＳ（ＳａｇＡ）が含まれ得る。参考文献８５、９０、および９１もまた参照のこと。
【００５０】
モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）：モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）抗原には、参考文献９２および９３に記載されている抗原、外膜タンパク質抗原（ＨＭＷ−ＯＭＰ）、Ｃ抗原、および／またはＬＰＳが含まれる。参考文献９４もまた参照のこと。
【００５１】
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）：百日咳菌（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原には、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に由来する百日咳毒素（ＰＴ）と線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）が、状況に応じてはまた、パータクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）ならびに／またはアグルチノーゲン２および３抗原と組み合わせて含まれる。参考文献９５および９６もまた参照のこと。
【００５２】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）：黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗原には、非毒性の組み換え体緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ（例えば、ＳｔａｐｈＶＡＸ（登録商標））に対して状況に応じて結合させられた黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型および８型の莢膜多糖類、または表面タンパク質に由来する抗原、インベーシン（ｉｎｖａｓｉｎ）（ロイコシジン、キナーゼ、ヒアルロニダーゼ）、食作用による飲み込みを阻害する表面因子（被膜、プロテインＡ）、カロテノイド、カタラーゼ生産、プロテインＡ、コアグラーゼ、凝固因子、ならびに／あるいは、真核生物の細胞膜を溶解させる膜傷害毒素（状況によっては解毒されている）（溶血素、白血球毒素、ロイコシジン）が含まれる。参考文献９７もまた参照のこと。
【００５３】
表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）：表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）抗原には、スライム（ｓｌｉｍｅ）結合抗原（ＳＡＡ）が含まれる。
【００５４】
破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）（破傷風）：破傷風抗原には、好ましくは、本発明の組成物と組み合わせて／結合させて担体タンパク質として使用される、破傷風毒素（ＴＴ）が含まれる。
【００５５】
コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）（ジフテリア）：ジフテリア抗原には、ジフテリア毒素またはその解毒された変異体（例えば、ＣＲＭ１９７）が含まれる。ＡＤＰリボシル化を調節、阻害することができるか、またはＡＤＰリボシル化に関係しているさらなる抗原は、本発明の組成物との併用／同時投与／結合が想定される。これらのジフテリア抗原は、担体タンパク質として使用することができる。
【００５６】
ヘモフィルス・インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）：ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）抗原には、Ｂ型に由来する糖抗原、またはプロテインＤが含まれる［９８］。
【００５７】
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）：緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）抗原には、内毒素Ａ、Ｗｚｚタンパク質、および／または外膜タンパク質（外膜タンパク質Ｆ（ＯｐｒＦ）を含む）が含まれる［９９］。
【００５８】
レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）：細菌抗原は、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）に由来し得る。
【００５９】
Ｂ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）：（Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））抗原には、参考文献８５、および１００〜１０３に記載されているタンパク質抗原が含まれる。例えば、抗原には、タンパク質ＧＢＳ８０、ＧＢＳ１０４、ＧＢＳ２７６、およびＧＢＳ３２２が含まれる。
【００６０】
淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）：淋菌（Ｇｏｎｏｃｏｃｃａｌ）抗原には、Ｐｏｒ（またはポリン）タンパク質（例えば、ＰｏｒＢ［１０４］）、トランスフェリン結合タンパク質（例えば、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ［１０５］）、不透明タンパク質（ｏｐａｃｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、Ｏｐａ）、還元によって修飾することができるタンパク質（ｒｅｄｕｃｔｏｎ−ｍｏｄｉｆｉａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｒｍｐ）、および外膜小胞（ＯＭＶ）調製物が含まれる［１０６］。参考文献５２〜５４、および１０７もまた参照のこと。
【００６１】
クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）：クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）抗原には、血清型Ａ、Ｂ、Ｂａ、およびＣ（失明の原因であるトラコーマの治療薬）、血清型Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３（鼠径リンパ肉芽腫症に関係している）、および血清型Ｄ〜Ｋに由来する抗原が含まれる。クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）抗原にはまた、参考文献１０３、および１０８〜１１０に記載されている抗原も含まれ得、これには、ＰｅｐＡ（ＣＴ０４５）、ＬｃｒＥ（ＣＴ０８９）、ＡｒｔＪ（ＣＴ３８１）、ＤｎａＫ（ＣＴ３９６）、ＣＴ３９８、ＯｍｐＨ様（ＣＴ２４２）、Ｌ７／Ｌ１２（ＣＴ３１６）、ＯｍｃＡ（ＣＴ４４４）、ＡｔｏｓＳ（ＣＴ４７６）、ＣＴ５４７、Ｅｎｏ（ＣＴ５８７）、ＨｒｔＡ（ＣＴ８２３）、およびＭｕｒＧ（ＣＴ７６１）が含まれる。参考文献１１１もまた参照のこと。
【００６２】
梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）（梅毒）：梅毒抗原には、ＴｍｐＡ抗原が含まれる。
【００６３】
軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）（軟性下疳を引き起こす）：軟性下疳抗原には、外膜タンパク質（ＤｓｒＡ）が含まれる。
【００６４】
エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）：抗原には、３糖の反復、または参考文献１１２に提供されている他の腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）由来の抗原が含まれる。
【００６５】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）：ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）抗原には、Ｃａｇ、Ｖａｃ、Ｎａｐ、ＨｏｐＸ、ＨｏｐＹ、および／またはウレアーゼ抗原が含まれる［１１３〜１２３］。
【００６６】
スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）：抗原には、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）抗原の１６０ｋＤａのヘマグルチニンが含まれる。
【００６７】
エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）：抗原にはＬＰＳが含まれる［１２４］。
【００６８】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原は、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性大腸菌（ＥＡｇｇＥＣ）、分散接着性大腸菌（ＤＡＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、および／または腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）株に由来し得る。
【００６９】
バシラス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽菌（ａｎｔｈｒａｘ））：バシラス・アンスラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）抗原は、状況に応じて解毒され、そして、Ａ成分（致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ））から選択することができる。これらはいずれも、防御抗原（ＰＡ）として知られている共通のＢ成分を有している。参考文献１２５〜１２７を参照のこと。
【００７０】
ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）（ペスト）：ペスト抗原には、Ｆ１莢膜抗原［１２８］、ＬＰＳ［１２９］、Ｖ抗原［１３０］が含まれる。
【００７１】
ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）：結核抗原には、リポタンパク質、ＬＰＳ、ＢＣＧ抗原、状況に応じて陽イオン性脂質小胞の中に処方された抗原８５Ｂ（Ａｇ８５Ｂ）および／またはＥＳＡＴ−６の融合タンパク質［１３１］、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔｂ）イソクエン酸脱水素酵素関連抗原［１３２］、ならびに／あるいは、ＭＰＴ５１抗原［１３３］が含まれる。
【００７２】
リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）：抗原には外膜タンパク質が含まれ、これには、外膜タンパク質Ａおよび／またはＢ（ＯｍｐＢ）［１３４］、ＬＰＳ，および表面タンパク質抗原（ＳＰＡ）［１３５］が含まれる。
【００７３】
リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）：細菌抗原は、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に由来し得る。
【００７４】
クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）：抗原には、参考文献１０８、および１３６から１４１に記載されている抗原が含まれる。
【００７５】
ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）：抗原には、プロテイナーゼ抗原、具体的には、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）ＩＩのリポ多糖、Ｏ１  Ｉｎａｂａ  Ｏ−特異的多糖、ビブリオ・コレラ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）Ｏ１３９、ＩＥＭ１０８ワクチンの抗原［１４２］、および／または閉鎖帯（Ｚｏｎｕｌａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ）毒素（Ｚｏｔ）が含まれる。
【００７６】
腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）（腸チフス）：抗原には、莢膜多糖類が含まれ、好ましくは、結合体（Ｖｉ、例えば、ｖａｘ−ＴｙＶｉ）である。
【００７７】
ボレリア・バーグドルフェリー（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（ライム病）：抗原には、リポタンパク質（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣ、およびＯｓｐＤ）、他の表面タンパク質（例えば、ＯｓｐＥ関連タンパク質（Ｅｒｐｓ）、デコリン結合タンパク質（例えば、ＤｂｐＡ）、および抗原的に可変であるＶＩタンパク質（例えば、Ｐ３９およびＰ１３に関係している抗原）（組み込み型の膜タンパク質、［１４３］）、ならびに、ＶｌｓＥ抗原性バリエーションタンパク質［１４４］が含まれる。
【００７８】
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）：抗原には外膜タンパク質（ＯＭＰ）が含まれる。参考文献１４５もまた参照のこと。
【００７９】
クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）：抗原には、ＯＭＰ（ＯＭＰ  Ａを含む）、または、状況に応じて破傷風毒素に結合させられた多糖が含まれる。
【００８０】
さらなる細菌抗原は、上記の任意の莢膜抗原、糖抗原、またはタンパク質抗原であり得る。さらなる細菌抗原としてはまた、外膜小胞（ＯＭＶ）調製物も挙げることができる。加えて、抗原には、任意の上記の細菌の生のバージョン、弱毒化させられたバージョン、および／または精製されたバージョンが含まれる。本発明で使用される抗原は、グラム陰性細菌に由来する場合、および／またはグラム陽性細菌に由来する場合もある。本発明で使用される抗原は、好気性細菌に由来する場合、および／または嫌気性細菌に由来する場合もある。
【００８１】
Ｂ．ウイルス抗原
本発明での使用に適しているウイルス抗原としては、不活化（または、死滅させられた）ウイルス、弱毒化ウイルス、ウイルス成分処方物、精製されたサブユニット処方物、ウイルスから単離、精製、または誘導することができるウイルスタンパク質、ならびにウイルス様粒子（ＶＬＰ）が挙げられる。ウイルス抗原は、細胞培養物または他の基質上で増殖させられたウイルスから誘導することができる。あるいは、ウイルス抗原は、組み換えによって発現させることができる。ウイルス抗原には、好ましくは、その生活環の少なくとも１つの段階の間にウイルスの表面上に露出させられるエピトープが含まれる。ウイルス抗原は、複数の血清型または単離物にまたがって保存されていることが好ましい。ウイルス抗原には、以下に記載される１つ以上のウイルスに由来する抗原、ならびに、以下に記載される特異的な抗原の例が含まれる。
【００８２】
オルトミクソウイルス：ウイルス抗原は、オルトミクソウイルス（例えば、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、およびＣ型インフルエンザ）に由来し得る。オルトミクソウイルス抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１）、膜タンパク質（Ｍ２）、転写酵素成分（ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡ）の１つ以上を含む、ウイルスタンパク質の１つ以上から選択することができる。好ましい抗原としては、ＨＡとＮＡが挙げられる。
【００８３】
インフルエンザ抗原は、大流行間期の（年次の）ｆｌｕ株に由来し得る。あるいは、インフルエンザ抗原は、大流行を引き起こす可能性がある株（すなわち、現在流行している株のヘマグルチニンと比較して新しいヘマグルチニンを有しているインフルエンザ株、またはサル被験体において病原性であり、ヒト集団においても平行して（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌｌｙ）伝染する可能性があるインフルエンザ株、またはヒトに対して病原性であるインフルエンザ株）に由来し得る。
【００８４】
パラミクソウイルス科のウイルス：ウイルス抗原は、パラミクソウイルス科のウイルス（例えば、ニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、および麻疹ウイルス属（麻疹））に由来し得る［１４６〜１４８］。
【００８５】
ニューモウイルス：ウイルス抗原は、ニューモウイルス（例えば、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）ウシ呼吸器多核体ウイルス、マウスのニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）、およびシチメンチョウ鼻気管炎ウイルス）に由来し得る。好ましくは、ニューモウイルスはＲＳＶである。ニューモウイルス抗原は、以下のタンパク質の１つ以上から選択することができる。これには、表面タンパク質融合体（Ｆ）、糖タンパク質（Ｇ）、および小さい疎水性タンパク質（ＳＨ）、マトリックスタンパク質ＭおよびＭ２、ヌクレオキャプシドタンパク質Ｎ、Ｐ、およびＬ、ならびに非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２が含まれる。好ましいニューモウイルス抗原としては、Ｆ、Ｇ、およびＭが挙げられる。例えば、参考文献１４９を参照のこと。ニューモウイルス抗原はまた、キメラウイルスに処方することも、また、キメラウイルスから導くこともできる。例えば、キメラＲＳＶ／ＰＩＶウイルスには、ＲＳＶとＰＩＶの両方の成分が含まれ得る。
【００８６】
パラミクソウイルス：ウイルス抗原は、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス１〜４型（ＰＩＶ）、Ｍｕｍｐｓ、センダイウイルス、シミアンウイルス５、ウシパラインフルエンザウイルス、およびニューカッスル病ウイルス）に由来し得る。好ましくは、パラミクソウイルスは、ＰＩＶまたはＭｕｍｐｓである。パラミクソウイルス抗原は、以下のタンパク質の１つ以上から選択することができる：ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、融合タンパク質Ｆ１およびＦ２、核タンパク質（ＮＰ）、リンタンパク質（Ｐ）、巨大タンパク質（Ｌ）、およびマトリックスタンパク質（Ｍ）。好ましいパラミクソウイルスタンパク質としては、ＨＮ、Ｆ１、およびＦ２が挙げられる。パラミクソウイルス抗原はまた、キメラウイルスに処方することも、また、キメラウイルスから導くこともできる。例えば、キメラＲＳＶ／ＰＩＶウイルスには、ＲＳＶとＰＩＶの両方の成分が含まれ得る。市販されているｍｕｍｐｓワクチンには、生の弱毒化ｍｕｍｐｓウイルスが、１価の形態、または麻疹・風疹混合ワクチン（ＭＭＲ）との組み合わせのいずれかで含まれる。
【００８７】
モービリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）：ウイルス抗原は、モービリウイルス（例えば、麻疹）に由来し得る。モービリウイルス抗原は、以下のタンパク質の１つ以上から選択することができる：ヘマグルチニン（Ｈ）、糖タンパク質（Ｇ）、融合因子（Ｆ）、巨大タンパク質（Ｌ）、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼリンタンパク質（Ｐ）、およびマトリックス（Ｍ）。市販されている麻疹ワクチンには、生の弱毒化麻疹ウイルスが、通常は、麻疹・風疹混合ワクチン（ＭＭＲ）との組み合わせで含まれる。
【００８８】
ピコルナウイルス：ウイルス抗原は、ピコルナウイルス（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、へパルナウイルス、カーディオウイルス、およびアフトウイルス）に由来し得る。エンテロウイルス（例えば、ポリオウイルス）に由来する抗原が好ましい。参考文献１５０および１５１を参照のこと。
【００８９】
エンテロウイルス：ウイルス抗原は、エンテロウイルス（例えば、ポリオウイルス１型、２型、または３型、コクサッキーＡウイルス１型〜２２型、コクサッキーＢウイルス１型〜６型、エコーウイルス（ＥＣＨＯ）１型〜９型、１１型〜２７型、および２９型〜３４型、ならびにエンテロウイルス６８型〜７１型）に由来し得る。好ましくは、エンテロウイルスはポリオウイルスである。エンテロウイルス抗原は、好ましくは、以下のキャプシドタンパク質の１つ以上から選択される：ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ４。市販されているポリオワクチンとしては、不活化ポリオワクチン（ＩＰＶ）と、経口ポリオウイルスワクチン（ＯＰＶ）が挙げられる。
【００９０】
へパルナウイルス：ウイルス抗原は、へパルナウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ））に由来し得る。市販されているＨＡＶワクチンとしては、不活化ＨＡＶワクチンが挙げられる［１５２、１５３］。
【００９１】
トガウイルス：ウイルス抗原は、トガウイルス（例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、またはアルテリウイルス）に由来し得る。ルビウイルス（例えば、風疹ウイルス）に由来する抗原が好ましい。トガウイルス抗原は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｃ、ＮＳＰ−１、ＮＳＰＯ−２、ＮＳＰ−３、またはＮＳＰ−４から選択することができる。トガウイルス抗原は、好ましくは、Ｅ１、Ｅ２、またはＥ３から選択される。市販されている風疹ワクチンとしては、通常は、麻疹・風疹混合ワクチン（ＭＭＲ）との組み合わせでの、生の低温に適応させられたウイルスが挙げられる。
【００９２】
フラビウイルス：ウイルス抗原は、フラビウイルス（例えば、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥ）、デング熱ウイルス（１型、２型、３型、または４型）、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルス）に由来し得る。フラビウイルス抗原は、ＰｒＭ、Ｍ、Ｃ、Ｅ、ＮＳ−１、ＮＳ−２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、およびＮＳ５から選択され得る。フラビウイルス抗原は、好ましくは、ＰｒＭ、Ｍ、およびＥから選択される。市販されているＴＢＥワクチンとしては、不活化ウイルスワクチンが挙げられる。
【００９３】
ペスチウイルス：ウイルス抗原は、ペスチウイルス（例えば、ウシのウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、ブタコレラ（ＣＳＦＶ）、またはボーダー病（ＢＤＶ））に由来し得る。
【００９４】
ヘパドナウイルス：ウイルス抗原は、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）に由来し得る。ヘパドナウイルス抗原は、表面抗原（Ｌ、Ｍ、およびＳ）、コア抗原（ＨＢｃ、ＨＢｅ）から選択することができる。市販されているＨＢＶワクチンとしては、表面抗原Ｓタンパク質を含むサブユニットワクチンが挙げられる［１５３、１５４］。
【００９５】
Ｃ型肝炎ウイルス：ウイルス抗原は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に由来し得る。ＨＣＶ抗原は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ１／Ｅ２、ＮＳ３４５ポリタンパク質、ＮＳ  ３４５−コアポリタンパク質、コア、および／または非構造領域に由来するペプチドから選択することができる［１５５，１５６］。
【００９６】
ラブドウイルス：ウイルス抗原は、ラブドウイルス（例えば、リッサ・ウイルス（狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ））に由来し得る。ラブドウイルス抗原は、糖タンパク質（Ｇ）、核タンパク質（Ｎ）、巨大タンパク質（Ｌ）、非構造タンパク質（ＮＳ）から選択することができる。市販されている狂犬病ウイルスワクチンには、ヒトの２倍体細胞、またはアカゲザルの胎児の肺細胞上で増殖させられた死滅させられたウイルスが含まれる［１５７、１５８］。
【００９７】
カルシウイルス科：ウイルス抗原は、カルシウイルス科（例えば、ノーウォークウイルス、およびノーウォーク様ウイルス（例えば、ハワイウイルス、およびスノーマウンテンウイルス）に由来し得る。
【００９８】
コロナウイルス：ウイルス抗原は、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、ヒト呼吸器コロナウイルス、ニワトリ伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に由来し得る。コロナウイルス抗原は、スパイクタンパク質（Ｓ）、外膜タンパク質（Ｅ），マトリックスタンパク質（Ｍ）、ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ），および／またはヘマグルチニン−エステラーゼ糖タンパク質（ＨＥ）から選択することができる。好ましくは、コロナウイルス抗原は、ＳＡＲＳウイルスに由来する。ＳＡＲＳウイルス抗原は、参考文献１５９に記載されている。
【００９９】
レトロウイルス：ウイルス抗原は、レトロウイルス（例えば、腫瘍ウイルス、レンチウイルス、またはスプマウイルス）に由来し得る。腫瘍ウイルス抗原は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、またはＨＴＬＶ−５に由来し得る。レンチウイルス抗原は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に由来し得る。レトロウイルス抗原は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｘ、ｔａｔ、ｒｅｘ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、およびｖｐｒから選択することができる。ＨＩＶ抗原は、ｇａｇ（ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）、ｅｎｖ（ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、およびｇｐ４１）、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ミニタンパク質（好ましくは、ｐ５５ｇａｇおよびｇｐ１４０ｖ欠失）から選択することができる。ＨＩＶ抗原は、以下の株の１つ以上に由来し得る：ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４。
【０１００】
レオウイルス：ウイルス抗原は、レオウイルス（例えば、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルチウイルス）に由来し得る。レオウイルス抗原は、構造タンパク質λ１、λ２、λ３、μ１、μ２、σ１、σ２、またはσ３、あるいは、非構造タンパク質σＮＳ、μＮＳ、またはσ１ｓから選択することができる。好ましいレオウイルス抗原は、ロタウイルスに由来し得る。ロタウイルス抗原は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４（または切断産物ＶＰ５およびＶＰ８）、ＮＳＰ１、ＶＰ６、ＮＳＰ３、ＮＳＰ２、ＶＰ７、ＮＳＰ４、および／またはＮＳＰ５から選択することができる。ロタウイルス抗原としては、ＶＰ４（または切断産物ＶＰ５およびＶＰ８）、およびＶＰ７が挙げられる。
【０１０１】
パルボウイルス：ウイルス抗原は、パルボウイルス（例えば、パルボウイルスＢ１９）に由来し得る。パルボウイルス抗原は、ＶＰ−１、ＶＰ−２、ＶＰ−３、ＮＳ−１、および／またはＮＳ−２から選択することができる。好ましくは、パルボウイルス抗原はキャプシドタンパク質ＶＰ−２である。
【０１０２】
デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）：ウイルス抗原はＨＤＶ、具体的には、ＨＤＶ由来のδ−抗原に由来し得る（例えば、参考文献１６０を参照のこと）。
【０１０３】
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）：ウイルス抗原はＨＥＶに由来し得る。
【０１０４】
Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）：ウイルス抗原はＨＧＶに由来し得る。
【０１０５】
ヒトヘルペスウイルス：ウイルス抗原は、ヒトヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）に由来し得る。ヒトヘルペスウイルス抗原は、前初期タンパク質（α）、初期タンパク質（β）、および後期タンパク質（γ）から選択することができる。ＨＳＶ抗原は、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２株に由来し得る。ＨＳＶ抗原は、糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、およびｇＨ，融合タンパク質（ｇＢ）、または免疫回避タンパク質（ｇＣ、ｇＥ、またはｇＩ）から選択することができる。ＶＺＶ抗原は、コアタンパク質、ヌクレオキャプシドタンパク質、テグメントタンパク質、または外膜タンパク質から選択することができる。生の弱毒化ＶＺＶワクチンが市販されている。ＥＢＶ抗原は、初期抗原（ＥＡ）タンパク質、ウイルスキャプシド抗原（ＶＣＡ）、および膜抗原（ＭＡ）の糖タンパク質から選択することができる。ＣＭＶ抗原は、キャプシドタンパク質、外膜糖タンパク質（例えば、ｇＢおよびｇＨ）、およびテグメントタンパク質から選択することができる。
【０１０６】
パポバウイルス：抗原は、パポバウイルス（例えば、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルス）に由来し得る。パピローマウイルスには、ＨＰＶ血清１型、２型、４型、５型、６型、８型、１１型、１３型、１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４１型、４２型、４７型、５１型、５７型、５８型、６３型、および６５型が含まれる。好ましくは、ＨＰＶ抗原は、血清６型、１１型、１６型、または１８型に由来する。ＨＰＶ抗原は、キャプシドタンパク質（Ｌ１）および（Ｌ２）、またはＥ１〜Ｅ７、あるいは、それらの融合体から選択することができる。ＨＰＶ抗原は、好ましくは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に処方される。ポリオーマウイルスには、ＢＫウイルスとＪＫウイルスが含まれる。ポリオーマウイルス抗原は、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３から選択することができる。
【０１０７】
Ｃ．真菌抗原
真菌抗原は以下に記載される真菌の１種類以上に由来し得る。
【０１０８】
真菌抗原は、皮膚糸状菌（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）に由来し得る。皮膚糸状菌には、エピダーモフィートン・フロコッサム（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ  ｆｌｏｃｃｕｓｕｍ）、ミクロスポラム・オドウィニ（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ａｕｄｏｕｉｎｉ）、ミクロスポルム・カニス（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ）、ミクロスポルム・ジストルツム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｄｉｓｔｏｒｔｕｍ）、ミクロスポルム・エクイヌム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｅｑｕｉｎｕｍ）、ミクロスポルム・ギプサム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｇｙｐｓｕｍ）、ミクロスポルム・ナヌム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｎａｎｕｍ）、トリコフィートン・コンセントリカム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ）、トリコフィートン・エクイヌム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｅｑｕｉｎｕｍ）、トリコフィートン・ガリネ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｇａｌｌｉｎａｅ）、トリコフィートン・ギプセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｇｙｐｓｅｕｍ）、トリコフィートン・メグニニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｇｎｉｎｉ）、トリコフィートン・メンタログロフィテス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、トリコフィートン・クインケアナム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｑｕｉｎｃｋｅａｎｕｍ）、トリコフィートン・ルブラム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）、トリコフィートン・シェーンレイン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎｉ）、トリコフィートン・トンスランス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）、トリコフィートン・バルコサム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、トリコフィートン・バルコサム・バー・アルブム（Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ  ｖａｒ．ａｌｂｕｍ）、バー・ディスコイデス（ｖａｒ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｓ）、バー・オカラセウム（ｖａｒ．ｏｃｈｒａｃｅｕｍ）、トリコフィートン・バイオラセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、および／またはトリコフィートン・ファビフォルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｆａｖｉｆｏｒｍｅ）が含まれる。
【０１０９】
真菌病原体としては、アスペルジルス・フミガタ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルジルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルジルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルジルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルジルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルジルス・シドウィー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉ）、アスペルジルス・フラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖａｔｕｓ）、アスペルジルス・グラカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｇｌａｕｃｕｓ）、ブラストシゾマイセス・キャピタタス（Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ  ｃａｐｉｔａｔｕｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・エノラーゼ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｅｎｏｌａｓｅ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・ステラトイデア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ）、カンジダ・クセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｕｓｅｉ）、カンジダ・パラクセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｋｗｓｅｉ）、カンジダ・ルシタニエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・シュードトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ギレモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ）、クラドスポリウム・カリオニイ（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃａｒｒｉｏｎｉｉ）、コシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストマイセス・デルマチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ゲオトリカム・クラバタム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｌａｖａｔｕｍ）、ヒストプラズマ・カプスレータム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パラコシジオイデス・ブラシリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、フィチウム・インシジオサム（Ｐｙｔｈｉｕｍｎ  ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ）、ピチロスポラム・オーバル（Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｏｖａｌｅ）、サッカロマイセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、サッカロマイセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、サッカロマイセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、セドスポリウム・アピオスペラム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｐｉｏｓｐｅｒｕｍ）、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、トリコスポロン・ベイゲリ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｅｉｇｅｌｉｉ）、トキソプラズマ・ゴンディー（Ｔｏｘ��ｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、ペニシリウム・マルネフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、マラセチア種（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｓｐｐ．）、フォンセチア種（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ  ｓｐｐ．）、ワンギエラ種（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、スポロトリックス種（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｐｐ．）、バシジオボーラス種（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｐｐ．）、コニジオボーラス種（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｐｐ．）、リゾパス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．）、ムコール種（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐｐ．）、アブシジア種（Ａｂｓｉｄｉａ  ｓｐｐ．）、モルチエレラ種（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、クズマタカビ種（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、サクセネア種（Ｓａｋｓｅｎａｅａ  ｓｐｐ．）、アルテナリア種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐｐ．）、カーブラリア種（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｓｐｐ．）、ヘルミントスポリウム種（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、フサリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、アスペルジルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、モノリニア種（Ｍｏｎｏｌｉｎｉａ  ｓｐｐ．）、リゾクトニア種（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐｐ．）、パエシロマイセス種（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、ピトマイセス種（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、およびクラドスポリウム種（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）が挙げられる。
【０１１０】
真菌抗原の生産のためのプロセスは当該分野で周知である［１６１］。好ましい方法においては、可溶化させられた画分が、細胞壁が実質的に除去されているか、または少なくとも部分的に除去されている真菌細胞から得ることができる不溶性画分から抽出され、そして、不溶性画分から分離させられ、以下の工程を含むプロセスにおいて特性決定される：細胞壁が実質的に除去されているか、または少なくとも部分的に除去されている真菌細胞を得る工程；細胞壁が実質的に除去されているか、または少なくとも部分的に除去されている心筋細胞を破裂させる工程；不溶性画分を得る工程；ならびに、不溶性画分から可溶化させられた画分を抽出し、分離する工程。
【０１１１】
Ｄ．ＳＴＤ抗原
本発明の組成物には、性感染症（ＳＴＤ）に由来する１つ以上の抗原が含まれ得る。このような抗原は、ＳＴＤ（例えば、クラミジア、性器ヘルペス、肝炎（例えば、ＨＣＶ）、陰部疣贅、淋病、梅毒、および／または軟性下疳）の予防または治療を提供し得る［１６２］。抗原は、１つ以上のウイルスまたは細菌のＳＴＤに由来し得る。本発明で使用されるウイルスのＳＴＤ抗原は、例えば、ＨＩＶ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、および肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に由来し得る。本発明で使用される細菌のＳＴＤ抗原は、例えば、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ヘモフィルス・デユクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、およびストレプトコッカス・アガラクティア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）に由来し得る。これらの病原体に由来する特異的な抗原の例は上記に記載されている。
【０１１２】
Ｅ．呼吸器抗原
本発明の組成物には、呼吸器疾患を引き起こす病原体に由来する１つ以上の抗原が含まれ得る。例えば、呼吸器抗原は、オルトミクソウイルス（インフルエンザ）、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、モルビリウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、ＶＺＶ、およびコロナウイルス（ＳＡＲＳ）のような呼吸器ウイルスに由来し得る。呼吸器抗原は、呼吸器疾患を引き起こす細菌（例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ボルデテラ・パータッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ツバキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、バシラス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、およびモラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ））に由来し得る。これらの病原体に由来する特異的な抗原の例は、上記に記載されている。
【０１１３】
Ｆ．小児用ワクチン抗原
本発明の組成物には、小児である被験体での使用に適している１つ以上の抗原が含まれ得る。小児である被験体は、通常は、約３歳未満、または約２歳未満、または約１歳未満である。小児用抗原は、６ヶ月、１年、２年、または３年にわたって複数回投与され得る。小児用抗原は、小児の集団を標的とする可能性があるウイルス、および／または小児の集団が感染しやすいウイルスに由来し得る。小児用ウイルス抗原としては、以下の１つ以上に由来する抗原が挙げられる：オルトミクソウイルス（インフルエンザ）、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶおよびＭｕｍｐｓ）、モルビリウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、エンテロウイルス（ポリオ）、ＨＢＶ、コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、および水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）。小児用細菌抗原としては、以下の１つ以上に由来する抗原が挙げられる：ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、クロストリディウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）（破傷風）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）（ジフテリア）、ヘモフィルス・インフルエンザＢ型菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｔｙｐｅ  Ｂ（Ｈｉｂ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ストレプトコッカス・アガラクティーエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）。これらの病原体に由来する特異的な抗原の例は上記に記載されている。
【０１１４】
Ｇ．高齢者または免疫障害を有している個体での使用に適している抗原
本発明の組成物には、高齢者または免疫障害を有している個体での使用に適している１つ以上の抗原が含まれ得る。このような個体には、標的化される抗原に対するそれらの免疫反応を改善するためには、より高い用量で、またはアジュバント処方物で、より頻繁にワクチン接種を行う必要があり得る。高齢者または免疫障害を有している個体での使用について標的化され得る抗原としては、以下の病原体の１つ以上に由来する抗原が挙げられる：髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、クロストリディウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）（破傷風）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）（ジフテリア）、ヘモフィルス・インフルエンザＢ型菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｔｙｐｅ  Ｂ）（Ｈｉｂ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ストレプトコッカス・アガラクティーエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オルトミクソウイルス（インフルエンザ）、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶおよびＭｕｍｐｓ）、モルビリウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、エンテロウイルス（ポリオ）、ＨＢＶ、コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、および水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）。これらの病原体に由来する特異的な抗原の例は、上記に記載されている。
【０１１５】
Ｈ．思春期用ワクチンでの使用に適している抗原
本発明の組成物には、思春期の被験体での使用に適している１つ以上の抗原が含まれ得る。思春期には、先に投与された思春期用抗原のブーストが必要な場合がある。思春期に使用するに適している可能性がある思春期用抗原は、上記に記載されている。加えて、思春期は、性的行為が開始される前に防御免疫または治療免疫を確実にするために、ＳＴＤ病原体に由来する抗原を投与するための標的とされ得る。思春期に使用するに適している可能性があるＳＴＤ抗原は、上記に記載されている。
【０１１６】
Ｉ．腫瘍抗原
本発明の１つの実施形態には、腫瘍抗原またはガン抗原が含まれる。腫瘍抗原は、例えば、ペプチドを含む腫瘍抗原であり、例えば、ポリペプチド腫瘍抗原または糖タンパク質腫瘍抗原であり得る。腫瘍抗原はまた、例えば、糖を含む腫瘍抗原であり、例えば、糖脂質腫瘍抗原またはガングリオシド腫瘍抗原であり得る。腫瘍抗原はさらに、例えば、ポリペプチドを含む腫瘍抗原を発現するポリヌクレオチドを含む腫瘍抗原であり得、例えば、ＲＮＡベクター構築物またはＤＮＡベクター構築物（例えば、プラスミドＤＮＡ）であり得る。
【０１１７】
本発明の実施に適している腫瘍抗原には、多種多様の分子、例えば、（ａ）ポリペプチド（例えば、８〜２０アミノ酸の長さの範囲であり得るが、この範囲を超える長さもまた一般的である）を含む、ポリペプチドを含む腫瘍抗原、リポポリペプチド、および糖タンパク質、（ｂ）多糖類、ムチン、ガングリオシド、糖脂質、および糖タンパク質を含む、糖を含む腫瘍抗原、ならびに（ｃ）抗原性ポリペプチドを発現するポリヌクレオチドが含まれる。
【０１１８】
腫瘍抗原は、例えば、（ａ）ガン細胞に関係している全長の分子、（ｂ）欠失、付加、および／または置換された部分を有している分子を含む、そのホモログおよび修飾された形態、ならびに、（ｃ）その断片であり得る。腫瘍抗原は、組み換え形態で提供され得る。腫瘍抗原としては、例えば、ＣＤ８＋リンパ球によって認識されるクラスＩ制限抗原、またはＣＤ４＋リンパ球によって認識されるクラスＩＩ制限抗原が挙げられる。
【０１１９】
多数の腫瘍抗原が当該分野で公知であり、これには、以下が含まれる：（ａ）ガン・精巣（ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ）抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１、ならびに、ＲＡＧＥ，ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、およびＭＡＧＥファミリーのポリペプチド、例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、およびＧＡＧＥ−１２（これらは、例えば、黒色腫、肺ガン、頭頸部ガン、ＮＳＣＬＳ、乳ガン、消化管ガン、および膀胱ガンを処置するために使用することができる）、（ｂ）変異抗原、例えば、ｐ５３（種々の固形腫瘍（例えば、結腸直腸ガン、肺ガン、頭頸部ガン）に関係している）、Ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓ガン、および結腸直腸ガンに関係している）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫に関係している）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫に関係している）、カスパーゼ−８（例えば、頭頸部ガンに関係している）、ＣＩＡ  ０２０５（例えば、膀胱ガンに関係している）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、β−カテキン（例えば、黒色腫に関係している）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫に関係している）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病に関係している）、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＫＩＡ  ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ、（ｃ）過剰発現された抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、結腸直腸ガンに関係している）、ガレクチン９（例えば、ホジキン疾患に関係している）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病に関係している）、ＷＴ１（例えば、種々の白血病に関係している）、カルボン酸無水物（例えば、腎臓ガンに関係している）、アルドラーゼＡ（例えば、肺ガンに関係している）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫に関係している）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳ガン、結腸ガン、肺ガン、および卵巣ガンに関係している）、α−フェトタンパク質（例えば、肝ガンに関係している）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸ガンに関係している）、ガストリン（例えば、膵臓ガンおよび胃ガンに関係している）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳ガンおよび卵巣ガンに関係している）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞ガンに関係している）、ｐ５３（例えば、乳ガン、結腸ガンに関係している）、ならびに、癌胎児性抗原（例えば、乳ガン、肺ガン、および消化管のガン（例えば、結腸直腸ガン）に関係している）、（ｄ）共通抗原、例えば、黒色腫−メラニン形成細胞分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラニン形成細胞刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１、およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２（例えば、黒色腫に関係している）、（ｅ）前立腺関連抗原、例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２（例えば、前立腺ガンに関係している）、（ｆ）免疫グロブリンイディオタイプ（例えば、黒色腫およびＢ細胞リンパ腫に関係している）、ならびに、（ｇ）他の腫瘍抗原、例えば、以下を含むポリペプチドを含む抗原および糖を含む抗原：（ｉ）シアリルＴｎおよびシアリルＬｅｘのよ��な糖タンパク質（例えば、乳ガンおよび結腸直腸ガンに関係している）、ならびに種々のムチン；糖タンパク質は担体タンパク質にカップリングさせることができる（例えば、ＭＵＣ−１はＫＬＨにカップリングさせることができる）；（ｉｉ）リポポリペプチド（例えば、脂質部分に結合させられたＭＵＣ−１）；（ｉｉｉ）多糖類（例えば、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ合成六糖）（これは、担体タンパク質に（例えば、ＫＬＨに）カップリングさせることができる）、（ｉｖ）ガングリオシド、例えば、ＧＭ２、ＧＭ１２、ＧＤ２、ＧＤ３（例えば、脳腫瘍、肺ガン、黒色腫に関係している）（これもまた、担体タンパク質（例えば、ＫＬＨ）にカップリングさせることができる）。
【０１２０】
当該分野で公知のさらなる腫瘍抗原としては、ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原（Ｅ６およびＥ７を含む）、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎ウイルス抗原、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス抗原、ＴＳＰ−１８０、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｍｎ−２３Ｈ１、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３（ＣＡ２７．２９／ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなどが挙げられる。これら、ならびに他の細胞成分は、例えば、参考文献１６３およびその中で引用されている参考文献に記載されている。
【０１２１】
本発明のポリヌクレオチドを含む抗原には、通常、上記に列挙されたもののようなポリペプチドガン抗原をコードするポリヌクレオチドが含まれる。好ましいポリヌクレオチドを含む抗原としては、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター構築物、例えば、プラスミドベクター（例えば、ｐＣＭＶ）が挙げられる。これは、インビボでポリペプチドガン抗原を発現することができる。
【０１２２】
腫瘍抗原は、例えば、変異した細胞成分または変化した細胞成分に由来し得る。変化の後は、細胞成分は、もはやそれらの調節機能を行うことはできず、したがって、細胞は、制御されない増殖を経験し得る。変化した細胞成分の代表的な例としては、ｒａｓ、ｐ５３、Ｒｂ、ウィルムス腫瘍遺伝子によってコードされる変化したタンパク質、ユビキチン、ムチン、ＤＣＣ，ＡＰＣ、およびＭＣＣ遺伝子によってコードされるタンパク質、ならびに、ｎｅｕ、甲状腺ホルモン受容体、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体、インシュリン受容体、表皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、およびコロニー刺激因子（ＣＳＦ）受容体のような受容体または受容体様構築物が挙げられる。これら、ならびに他の細胞成分は、例えば、参考文献１６４およびその中で引用されている参考文献に記載されている。
【０１２３】
加えて、細菌抗原およびウイルス抗原を、ガンの処置のために本発明の組成物と組み合わせて使用することができる。具体的には、ガンタンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７，破傷風トキソイド、またはサルモネラ・ティフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）抗原）を、ガンの処置のために本発明の化合物と併せて／組み合わせて使用することができる。ガン抗原の併用療法は、既存の治療法と比較して高い効力と生体利用効率を示すであろう。
【０１２４】
ガン抗原または腫瘍抗原についてのさらなる情報は、例えば、参考文献１６５（例えば、表３および４）、参考文献１６６（例えば、表１）、および参考文献１６７から１８９に見ることができる。
【０１２５】
免疫化（例えば、抗原としてＡｂｅｔａを使用する）もまた、アルツハイマー病に対して使用することができる［１９０］。
【０１２６】
Ｊ．抗原処方物
本発明の他の態様においては、抗原が吸着させられている微粒子を生産する方法が提供される。この方法には以下の工程が含まれる：（ａ）（ｉ）水、（ｉｉ）界面活性剤、（ｉｉｉ）有機溶媒、および（ｉｖ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択される生体分解性ポリマーを含む混合物を分散させることによってエマルジョンを提供する工程であって、ポリマーは、通常、有機溶媒に対して約１％から約３０％の濃度で混合物中に存在し、一方、界面活性剤は、通常、約０．００００１：１から約０．１：１（より通常は、約０．０００１：１から約０．１：１、約０．００１：１から約０．１：１、または約０．００５：１から約０．１：１）の重量対重量の界面活性剤対ポリマー比で混合物中に存在する；（ｂ）エマルジョンから有機溶媒を除去する工程；ならびに（ｃ）マイクロ粒子の表面上に抗原を吸着させる工程。特定の実施形態においては、生体分解性ポリマーは、有機溶媒に対して、約３％から約１０％の濃度で存在する。
【０１２７】
本明細書中で使用されるマイクロ粒子は、滅菌することができる毒性のない生体分解性材料から作られるであろう。このような材料としては、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ＰＡＣＡ、およびポリシアノアクリレートが挙げられるが、これらに限定はされない。好ましくは、本発明で使用されるマイクロ粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）に由来し、特に、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）、またはＤ，Ｌ−ラクチドとグリコリドまたはグリコール酸のコポリマー（例えば、Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」）、あるいは、Ｄ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンのコポリマーから導かれる。マイクロ粒子は、様々な分子量を有している種々の重合性出発材料の任意のもの、およびＰＬＧのようなコポリマーの場合には、種々のラクチド：グリコリド比に由来し、その選択は、同時投与されるマクロ分子に一部依存して、主な選択項目である。これらのパラメーターは、以下により完全に議論される。
【０１２８】
さらに別の処方方法と抗原（特に腫瘍抗原）は、参考文献１９１に提供される。
【０１２９】
医学的方法および用途
一旦処方されると、本発明の組成物は被験体に直接投与することができる。処置される被験体は動物であり得る：具体的には、ヒト被験体を処置することができる。組成物は、子供および十代の若者にワクチン接種するために特に有用なワクチンとして処方することができる。これらは、全身的経路および／または粘膜経路によって投与することができる。
【０１３０】
通常、組成物は、注射可能なもの（液体溶液または懸濁液のいずれかとして）調製される；注射の前に液体媒体中の溶液または懸濁液とするために適している固体形態もまた、調製することができる。組成物の直接的な投与は、一般的には、非経口（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、または粘膜内のいずれかの注射によって、あるいは、組織の間質腔に投与される）で投与される。組成物はまた、病変内に投与することもできる。他の投与形態としては、経口および肺投与、坐剤、および経皮または経皮的塗布（例えば、参考文献１９２を参照のこと）、針、および皮下噴射機が挙げられる。投与による処置は、単回投与のスケジュールである場合も、また、複数回投与のスケジュール（ブースター投与を含む）である場合もある。
【０１３１】
本発明のワクチンは滅菌であることが好ましい。好ましくは、これらには発熱物質は含まれない。これらは好ましくは、例えば、ｐＨ６とｐＨ８の間に、一般的には、およそｐＨ７に緩衝化される。ワクチンに水酸化アルミニウム塩が含まれる場合は、ヒスチジン緩衝液を使用することが好ましい［１９３］。
【０１３２】
本発明のワクチンには、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０のようなＴｗｅｅｎ）が低濃度で（例えば、＜０．０１％）含まれる場合がある。本発明のワクチンには、特に、これらが凍結乾燥させられる場合には、糖アルコール（例えば、マンニトール）またはトレハロースが、例えば、およそ１５ｍｇ／ｍｌで含まれる場合がある。
【０１３３】
個々の抗原の最適な用量は、経験的に評価することができる。しかし、一般的には、本発明の糖抗原は、１回の投与について、０．１から１００μｇの各糖の用量で、通常は０．５ｍｌの投与容量で投与されるであろう。用量は、通常は、１回の投与あたり１つの糖について５から２０μｇである。これらの値は、糖として測定される。
【０１３４】
本発明のワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治療的（すなわち、感染後に疾患を処置するため）のいずれかであり得るが、通常は予防的である。
【０１３５】
本発明によって、医薬品の中で使用される本発明の結合体が提供される。
【０１３６】
本発明によってはまた、患者の免疫反応を惹起させる方法が提供される。この方法には、本発明の結合体を患者に投与する工程が含まれる。免疫反応は、好ましくは、髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）疾患、肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）疾患、またはインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対して防御的であり、そしてこれには、体液性免疫反応および／または細胞性免疫反応が含まれ得る。好ましくは、患者は子供である。この方法によって、髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）、肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）、またはインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対してすでに感作させられた患者において、ブースター反応を惹起させることができる。
【０１３７】
本発明によってはまた、患者において免疫反応を惹起させるための医薬品の製造における本発明の結合体の使用が提供される。この場合、上記患者は、担体に結合させられた組成物に含まれる、異なる糖抗原で予め処置されている。
【０１３８】
本発明によってはまた、患者において免疫反応を惹起させるための医薬品の製造における結合体の使用が提供される。この場合、上記患者は、異なる担体に結合させられた組成物の中に含まれる抗原と同じ糖抗原で予め処置されている。
【０１３９】
医薬品は、好ましくは、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）である。医薬品は、好ましくは、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、敗血症菌（ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）、淋菌（ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ）など）によって、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（例えば、ｏｔｉｔｉｓ  ｍｅｄｉａ、インフルエンザ気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）、ニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉｅ）、セルリティス（ｃｅｌｌｕｌｉｔｉｓ）、ペルカルディティス（ｐｅｒｉｃａｒｄｉｔｉｓ）、メニンギチス（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）など）によって、またはニューモコッカス（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、ニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）など）によって引き起こされる疾患の予防および／または処置のためのものである。したがって、細菌性髄膜炎の予防および／または処置が好ましい。
【０１４０】
ワクチンは、標準的な動物モデルにおいて試験することができる（例えば、参考文献１９４を参照のこと）。
【０１４１】
本発明によってさらに、ａ）本発明の第１の結合体、およびｂ）本発明の第２の結合体を含むキットが提供される。
【０１４２】
アジュバント
本発明の結合体は、他の免疫調節因子と組み合わせて投与することができる。具体的には、組成物には、通常、アジュバントが含まれる。本発明の組成物に使用することができるアジュバントとしては、以下を挙げることができるが、これらに限定はされない：
Ａ．無機化合物を含む組成物
本発明においてアジュバントとしての使用に適している無機化合物を含む組成物としては、無機塩（例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩）が挙げられる。このような無機組成物には、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトホスフェート）、硫酸塩などのような無機塩［例えば、参考文献１９５の第８章および第９章を参照のこと］、あるいは、種々の無機化合物の混合物（例えば、リン酸塩アジュバントと水酸化物アジュバントの混合物（状況に応じて、過剰のリン酸塩を含む））が含まれ得、化合物は任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、無定形など）をとり、そして塩（単数または複数）に吸着させられることが好ましい。無機化合物を含む組成物はまた、金属塩の粒子としても処方することができる［１９６］。
【０１４３】
アルミニウム塩が本発明の組成物に含まれる場合があり、その結果、Ａｌ３＋の用量は、１回の投与について０．２ｍｇから１．０ｍｇの間となる。
【０１４４】
典型的なリン酸アルミニウムアジュバントは、無定形のヒドロキシリン酸アルミニウムであり、０．８４から０．９２のＰＯ４／Ａｌモル比を有しており、０．６ｍｇのＡｌ３＋／ｍｌで含まれる。低用量のリン酸アルミニウムでの吸着物を、１回の投与について１つの結合体あたり５０から１００μｇのＡｌ３＋で使用することができる。リン酸アルミニウムが使用され、そしてアジュバントに対して抗原が吸着させられないことが所望される場合は、溶液中に遊離のリンイオンを含ませる（例えば、リン酸緩衝液の使用による）ことが好ましい。
【０１４５】
Ｂ．油状エマルジョン
本発明の結合体とともにアジュバントとしての使用に適している油状エマルジョン組成物としては、スクワレン−水エマルジョン、例えば、ＭＦ５９（マイクロフルイダイザーを使用して１ミクロン未満の粒子に処方された、５％のスクワレン、０．５％のＴｗｅｅｎ  ８０、および０．５％のＳｐａｎ  ８５）が挙げられる［参考文献１９５の第１０章；参考文献１９７〜１９９もまた参照のこと］。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤ（登録商標）インフルエンザウイルス３価サブユニットワクチンにおいてアジュバントとして使用されている。ＭＦ５９エマルジョンには、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液）が含まれることが有利である。
【０１４６】
組成物中での使用に特に好ましいアジュバントは１ミクロン未満の水中油エマルジョンである。本明細書中で使用に好ましい１ミクロン未満の水中油エマルジョンは、状況に応じて、様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含むスクワレン／水エマルジョンであり、例えば、４〜５％ｗ／ｖのスクワレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、および／または０．２５〜１．０％のＳｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、ならびに、状況に応じて、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含む１ミクロン未満の水中油エマルジョンである。組成物中で使用される１ミクロン未満の水中油エマルジョン、それを作製する方法、および免疫賦活剤（例えば、ムラミルペプチド）は、参考文献１９７、および２００〜２０１に詳細に記載されている。
【０１４７】
スクワレン、トコフェロール、およびＴｗｅｅｎ  ８０のエマルジョンを使用することができる。エマルジョンには、リン酸緩衝化生理食塩水が含まれ得る。これには、Ｓｐａｎ  ８５（例えば、１％）および／またはレシチンも含まれる場合がある。これらのエマルジョンには、２から１０％のスクワレン、２から１０％のトコフェロールと、０．３から３％のＴｗｅｅｎ  ８０が含まれ、スクワレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは、≦１である。なぜなら、これによってより安定なエマルジョンが提供されるからである。１つのこのようなエマルジョンは、Ｔｗｅｅｎ  ８０をＰＢＳ中に溶解させて２％の溶液とし、その後、９０ｍｌのこの溶液を（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクワレン）の混合物と混合し、その後、混合物をマイクロフルイダイズすることによって作製することができる。得られるエマルジョンは、１ミクロン未満の油滴を呈し得、例えば、１００から２５０ｎｍ、好ましくは、約１８０ｎｍの平均直径を有する。
【０１４８】
スクワレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００）のエマルジョンを使用することができる。
【０１４９】
スクワレン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ１２１」）のエマルジョンを使用することができる。エマルジョンは、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）の中に処方することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドについての有用な送達媒体であり、「ＳＡＦ−１」アジュバント中のスレオニル−ＭＤＰと共に使用されている「２０２」（０．０５％〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクワレン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。これはまた、Ｔｈｒ−ＭＤＰを伴わずに、「ＡＦ」アジュバントとして使用することもできる［２０３］（５％のスクワレン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ
Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。マイクロフルイダイズが好ましい。
【０１５０】
フロイントの完全なアジュバント（ＣＦＡ）およびフロイントの不完全なアジュバント（ＩＦＡ）もまた、アジュバントとして使用することができる。
【０１５１】
Ｃ．サポニン処方物［参考文献１９５の第２２章］
サポニン処方物もまた、本発明の結合体のアジュバントとして使用することができる。サポニンは、多種多様な植物種の皮、葉、茎、根、およびさらには花の中で見られる、ステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種グループである。キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の皮から単離されたサポニンはアジュバントとして広く研究されている。サルサパリラ（Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ）（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐａｒｉｌｌａ））、宿根カスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（ブライダルベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））、およびサボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（サボンソウ根（Ｓｏａｐ  Ｒｏｏｔ））から得られたサポニンもまた市販から入手することができる。サポニンアジュバント処方物としては、精製された処方物（例えば、ＱＳ２１）、ならびに脂質処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）が挙げられる。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）として市販されている。
【０１５２】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されている。これらの技術を使用して、特定の精製された画分が同定されており、これには、ＱＳ７，ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃが含まれる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生産方法は参考文献２０４に開示されている。サポニン処方物にはまた、ステロール（例えば、コレステロール）も含む場合がある［２０５］。
【０１５３】
サポニンとコレステロールの組み合わせを、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる特有の粒子を形成させるために使用することができる［参考文献１９５の第２３章］。ＩＳＣＯＭには、通常、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンのようなリン脂質も含まれる。任意の公知のサポニンを、ＩＳＣＯＭにおいて使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭには、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ、およびＱＨＣの１つ以上が含まれる。ＩＳＣＯＭは、参考文献２０５〜２０７にさらに記載されている。状況によっては、ＩＳＣＯＭにはさらなる界面活性剤（単数または複数）が含まれない場合もある［２０８］。
【０１５４】
サポニンをベースとするアジュバントの開発の概要は、参考文献２０９と２１０に見ることができる。
【０１５５】
Ｄ．ヴィロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）およびウイルス様粒子
ヴィロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、本発明においてアジュバントとして使用することができる。これらの構造には、一般的に、状況に応じてリン脂質と混合された、またはリン脂質と共に処方された、ウイルスに由来する１つ以上のタンパク質が含まれる。これらには、通常は、病原性はなく、複製できず、そして一般的には、自然界に存在しているウイルスゲノムは全く含まれない。ウイルスタンパク質は組み換えによって生産させることも、また、完全なウイルスから単離することもできる。ヴィロソームまたはＶＬＰでの使用に適しているこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、コアタンパク質またはキャプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄病ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（例えば、外膜タンパク質）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）に由来するタンパク質が挙げられる。ＶＬＰは、参考文献２１１〜２１６でさらに議論されている。ヴィロソームは、例えば、参考文献２１７でさらに議論されている。
【０１５６】
Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体
本発明での使用に適しているアジュバントとしては、細菌誘導体または微生物誘導体が挙げられ、例えば、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピッドＡ（Ｌｉｐｉｄ  Ａ）誘導体、免疫賦活オリゴヌクレオチド、ならびに、そのＡＤＰ−リボシル化毒素および解毒誘導体である。
【０１５７】
ＬＰＳの非毒性誘導体としては、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピッドＡの、４、５、または６アシル化鎖との混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピッドＡの好ましい「小さい粒子」の形態は、参考文献２１８に開示されている。３ｄＭＰＬのこのような「小さい粒子」は、０．２２μｍの膜を通して濾過滅菌するために十分に小さい［２１８］。他の非毒性のＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピッドＡ模倣物が挙げられ、例えば、リン酸アミノアルキルグルコサミニド誘導体（例えば、ＲＣ−５２９）である［２１９、２２０］。
【０１５８】
リピッドＡ誘導体としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のリピッドＡの誘導体が挙げられ、例えば、ＯＭ−１７４である。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献２２１および２２２に記載されている。
【０１５９】
本発明でアジュバントとして使用するために適している免疫賦活オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフ（グアノシンに結合させられたリン酸によって連結させられた非メチル化シトシンを含む２ヌクレオチドの配列）を含むヌクレオチド配列が挙げられる。二本鎖ＲＮＡ、およびパリンドロームまたはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドもまた、免疫賦活であることが示されている。
【０１６０】
ＣｐＧには、ホスホロチオエート修飾のようなヌクレオチドの修飾／アナログが含まれ得、そしてこれは、二本鎖である場合も、また、一本鎖である場合もある。参考文献２２３、２２４、および２２５には、可能なアナログ置換（例えば、グアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでの置換）が開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献２２６〜２３１でさらに議論されている。
【０１６１】
ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９（例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ）を指向させることができる［２３２］。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫反応を誘導するように特異的であり、例えば、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮであるか、またはＢ細胞応答を誘導するように特異的であり、例えば、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮである場合もある。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献２３３〜２３５で議論されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【０１６２】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識に到達できるように構築される。状況に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をそれらの３’末端に結合させて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成することができる。例えば、参考文献２３２および２３６〜２３８を参照のこと。
【０１６３】
細菌のＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体を、本発明でアジュバントとして使用することができる。好ましくは、タンパク質は、大腸菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱に不安定なエンテロトキシン、「ＬＴ」）、コレラ毒素（「ＣＴ」）、または破傷風毒素（「ＰＴ」）に由来する。粘膜アジュバントとしての解毒されたＡＤＰ−リボシル化毒素の使用は、参考文献２３９に記載されており、参考文献２４０には非経口アジュバントとしての使用が記載されている。毒素またはトキソイドは、好ましくは、ホロトキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）の形態であり、これには、ＡサブユニットとＢサブユニットの両方が含まれる。好ましくは、Ａサブユニットには、解毒変異が含まれる。好ましくは、Ｂサブユニットは変異していない。好ましくは、アジュバントは、解毒されたＬＴ変異体であり、例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２である。ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体（具体的には、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２）のアジュバントとしての使用は、参考文献２４１〜２４８に見ることができる。アミノ酸置換についての数についての言及は、参考文献２４９（その全体が引用により本明細書中に具体的に組み入れられる）に示されているＡＤＰ−リボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットのアラインメントに基づくことが好ましい。
【０１６４】
式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物、あるいはその塩もまた、アジュバントとして使用することができる：
【０１６５】
【化１】
2015155464.tif 000003
参考文献２５０において定義される場合には、例えば、「ＥＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ＥＲ８０４０５３」、「ＥＲ８０４０５８」、「ＥＲ８０４０５９」、「ＥＲ８０４４４２」、「ＥＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０４７６４」、「ＥＲ８０３０２２」、または「ＥＲ８０４０５７」、例えば：
【０１６６】
【化２】
2015155464.tif 000004
。
【０１６７】
Ｆ．ヒト免疫賦活剤
本発明においてアジュバントとしての使用に適しているヒト免疫賦活剤としては、サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［２５１］、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７［２５２］など）［２５３］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、ならびに、マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）およびＭＩＰ−１β［２５４］が挙げられる。
【０１６８】
Ｇ．生体接着因子および粘膜接着因子（Ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅｓ）
生体接着因子および粘膜接着因子もまた、本発明においてアジュバントとして使用することができる。適切な生体接着因子としては、エステル化されたヒアルロン酸マイクロスフェア［２５５］または粘膜接着因子（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類、およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体）が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明においてアジュバントとして使用することができる［２５６］。
【０１６９】
Ｈ．微粒子
微粒子もまた、本発明においてアジュバントとして使用することができる。ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）とともに、生体分解性であり非毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成された微粒子（すなわち、約１００ｎｍから約１５０μｍの直径、より好ましくは、約２００ｎｍから約３０μｍの直径、そして最も好ましくは、約５００ｎｍから約１０μｍの直径の粒子）が好ましい。これは、状況に応じて、負電荷を有している表面を有するように（例えば、ＳＤＳで）、または正電荷を有している表面を有するように（例えば、陽イオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）で）処理される。
【０１７０】
Ｉ．リポソーム（参考文献１９５の第１３章および第１４章）
アジュバントとしての使用に適しているリポソーム処方物の例は、参考文献２５７〜２５９に記載されている。
【０１７１】
Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物
本発明での使用に適しているアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる［２６０］。このような処方物には、さらに、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤がオクトキシノールと組み合わせて［２６１］、ならびに、ポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤が少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせて［２６２］含まれる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群より選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１７２】
Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ（ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］）処方物は、例えば、参考文献２６３および２６４に記載されている。
【０１７３】
Ｌ．ムラミルペプチド
本発明におけるアジュバントとしての使用に適しているムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１７４】
Ｍ．イミダゾキノロン化合物
本発明におけるアジュバントとしての使用に適しているイミダゾキノロン化合物の例としては、参考文献２６５および２６６にさらに記載されている、イミクアモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）とそのホモログ（例えば、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ  ３Ｍ」）が挙げられる。
【０１７５】
Ｎ．チオセミカルバゾン化合物
チオセミカルバゾン化合物の例、ならびに、本発明におけるアジュバントとしての使用に適している化合物全てを処方し、製造し、そしてスクリーニングする方法としては、参考文献２６７に記載されているものが挙げられる。チオセミカルバゾンは、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の生産のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。
【０１７６】
Ｏ．トリプタントリン化合物
トリプタントリン化合物の例、ならびに、本発明におけるアジュバントとしての使用に適している化合物全てを処方し、製造し、そしてスクリーニングする方法としては、参考文献２６８に記載されているものが挙げられる。トリプタントリン化合物は、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の生産のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。
【０１７７】
Ｐ．ヌクレオシドアナログ
種々のヌクレオシドアナログをアジュバントとして使用することができる。例えば、以下である（ａ）イサトラビン（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【０１７８】
【化３】
2015155464.tif 000005
およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献２６９から２７１に開示されている化合物；（ｆ）以下の式を有している化合物：
【０１７９】
【化４】
2015155464.tif 000006
式中：
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルコキシ、置換されたＣ１−６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、Ｃ６−１０アリール、置換されたＣ６−１０アリール、Ｃ１−６アルキル、または置換されたＣ１−６アルキルであり；
Ｒ３は、存在しない、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換されたＣ６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換されたヘテロシクリルであり；
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキルであるか、または互いに結合してＲ４−５のような５員環を形成する：
【０１８０】
【化５】
2015155464.tif 000007
結合は、〜〜によって示される結合で行われる
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｎ、Ｃ、Ｏ、またはＳであり；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒｃ、−Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄであり；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、またはＲ９ａであり；
式中、Ｒ９ａは：
【０１８１】
【化６】
2015155464.tif 000008
結合は、〜〜によって示される結合で行われる
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルコキシ、置換されたＣ１−６アルコキシ、−ＮＲａＲｂ、または−ＯＨであり；
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ６−１０アリールであり；
Ｒｃは、それぞれ独立して、Ｈ、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、Ｃ１−６アルキル、または置換されたＣ１−６アルキルであり；
Ｒｄは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、置換されたＣ１−６アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨ（置換されたＣ１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（置換されたＣ１−６アルキル）２、Ｃ６−１０アリール、またはヘテロシクリルであり；
Ｒｅ-は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル
、Ｃ６−１０アリール、置換されたＣ６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換されたヘテロシクリルであり；
Ｒｆは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、ホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェートであり；
ｎは、それぞれ独立して、０、１、２、または３であり；
ｐは、それぞれ独立して、０、１、または２である；
あるいは、（ｇ）（ａ）から（ｆ）のいずれかの薬学的に許容される塩、（ａ）から（ｆ）のいずれかの互変異性体、または互変異性体の薬学的に許容される塩。
【０１８２】
Ｑ．ホスフェートを含む非環式骨格に結合させられた脂質
ホスフェートを含む非環式骨格に結合させられた脂質を含むアジュバントとしては、ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４が挙げられる［２７２、２７３］：
【０１８３】
【化７】
2015155464.tif 000009
。
【０１８４】
Ｒ．低分子免疫増強物質（ＳＭＩＰ）
ＳＭＩＰとしては以下が挙げられる：
・Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロプ−２−エニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
・１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
・２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノール；
・２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エチルアセテート；
・４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン；
・Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
・１−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール；
・１−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール；
・Ｎ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン。
【０１８５】
Ｓ．プロテオソーム
１つのアジュバントは、第２のグラム陰性細菌に由来するリポ糖調製物と組み合わせた、第１のグラム陰性細菌から調製された外膜タンパク質プロテオソーム調製物である。この場合、外膜タンパク質プロテオソームとリポ糖調製物は、安定な非共有アジュバント複合体を形成する。このような複合体としては、「ＩＶＸ−９０８」が挙げられ、これは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）外膜タンパク質とリポ多糖から構成されている複合体である。これらは、インフルエンザワクチン用のアジュバントとして使用されている［２７４］。
【０１８６】
Ｔ．他のアジュバント
免疫賦活剤として作用する他の物質は、参考文献１９５および２７５に開示されている。さらに有用なアジュバント物質としては、以下が挙げられる：
・メチルイノシン５’−モノホスフェート（「ＭＩＭＰ」）［２７６］。
・ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［２７７］、例えば、以下の式を有しているもの：
【０１８７】
【化８】
2015155464.tif 000010
式中、Ｒは、水素、直鎖または分岐した、未置換または置換された、飽和または不飽和のアシル、アルキル（例えば、シクロアルキル）、アルケニル、アルキニル、およびアリール基、あるいはそれらの薬学的に許容される塩または誘導体からなる群より選択される。例としては、カスアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなどが挙げられるが、これらに限定はされない。
・γインシュリン［２７８］またはその誘導体、例えば、アルガムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）。
・参考文献２７９に開示されている化合物。
・参考文献２８０に開示されている化合物であって、これには：アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［２８１、２８２］、ヒドラフタラミド（Ｈｙｄｒａｐｔｈａｌａｍｉｄｅ）化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［２８３］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン（ｐｙｒａｚａｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）化合物、およびベンザゾール化合物［２８４］が含まれる。
・ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）［２８５］。
【０１８８】
陽イオン性脂質および（通常は、中性の）コリピッド（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）の処方物、例えば、アミノプロピル−ジメチル−ミリストレイルオキシ−プロパナミニウムブロマイド−ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン（「Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標）」）またはアミノプロピル−ジメチル−ビス−ドデシルオキシ−プロパナミニウムブロマイド−ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ」）。（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（シン−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミニウム塩を含む処方物が好ましい［２８６］。
【０１８９】
本発明にはまた、上記に記載されたアジュバントの１つ以上の態様の組み合わせも含まれ得る。例えば、以下の組み合わせを、本発明においてアジュバント組成物として使用することができる：（１）サポニンと水中油エマルジョン［２８７］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）と非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［２８８］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）と非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）とコレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）と３ｄＭＰＬとＩＬ−１２（状況に応じて、ステロールも）［２８９］；（５）例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの、３ｄＭＰＬの組み合わせ［２９０］；（６）１ミクロン未満のエマルジョンにマイクロフルイダイズされたか、またはボルテックスされてより大きな粒子の大きさのエマルジョンとされたかのいずれかである、１０％のスクワレン、０．４％のＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標）、５％のプルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含む、ＳＡＦ；（７）２％のスクワレン、０．２％のＴｗｅｅｎ  ８０と、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群より選択される１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬとＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（登録商標））を含む、Ｒｉｂｉ（登録商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；（８）１種類以上の無機塩（例えば、アルミニウム塩）とＬＰＳの非毒性誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）；ならびに、（９）１種類以上の無機塩（例えば、アルミニウム塩）と免疫賦活オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列）。
【０１９０】
定義
用語「〜を含む」には、「〜が含まれる」、さらには、「〜からなる」が含まれ、例えば、Ｘ「を含む」組成物はＸだけからなる場合も、また、場合によっては別のものが含まれる、例えば、Ｘ＋Ｙである場合もある。
【０１９１】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。本明細書中の全ての数値は、特に別の指定がなければ、「約」の条件を付けられていると考えることができる。
【０１９２】
語句「実質的に」は、「完全に」は排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合がある。必要である場合には、語句「実質的に」は、本発明の定義から除外される場合がある。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
２個以上の１価の結合体の組み合わせを含む組成物であって、前記２個以上の１価の結合体のそれぞれには、（ｉｉ）糖抗原に対して結合させられた（ｉ）２個以上の病原体に由来するＴ細胞エピトープを含む担体タンパク質が含まれている、組成物。
（項目２）
同じ担体タンパク質分子に対して結合させられた２個以上の抗原的に異なる糖抗原を含む多価結合体であって、前記担体タンパク質には、２種類以上の病原体に由来するＴ細胞エピトープが含まれている、多価結合体。
（項目３）
項目２に記載の多価結合体を２個以上含む組成物。
（項目４）
１個以上の項目２に記載の多価結合体と、１個以上の項目１に記載の１価の結合体を含む、組成物。
（項目５）
２個以上の結合体の中の担体タンパク質が同じである、項目１、３、または４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目６）
それぞれの結合体の中の単体タンパク質が同じである、項目１、３、または４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目７）
前記担体タンパク質の少なくとも１つのエピトープは、糖抗原と同じ病原体に由来するものではない、項目１、３、４、５、または６のいずれか１項に記載の結合体。
（項目８）
担体タンパク質のエピトープのいずれもが、糖抗原と同じ病原体に由来するものではない、項目１または３〜７のいずれか１項に記載の結合体。
（項目９）
前記１価の結合体の中の前記担体タンパク質の分子が、前記糖抗原の１個より多くの分子に結合させられている、項目１または４〜８のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１０）
それぞれの１価の結合体の中のそれぞれの担体タンパク質分子が、１個より多くの糖抗原分子に結合させられている、項目１または４〜８のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１１）
前記担体タンパク質に６個のエピトープが含まれている、前記項目のいずれかに記載の結合体または組成物。
（項目１２）
前記担体タンパク質に１９個のエピトープが含まれている、前記項目のいずれかに記載の結合体または組成物。
（項目１３）
前記担体タンパク質に、少なくとも１個のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープが含まれている、前記項目のいずれかに記載の結合体または組成物。
（項目１４）
前記担体タンパク質に、少なくとも１個の細菌エピトープと少なくとも１個のウイルスエピトープが含まれている、前記項目のいずれかに記載の結合体または組成物。
（項目１５）
少なくとも１個の前記担体タンパク質エピトープが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）およびライ菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）および／または連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株に由来する熱ショックタンパク質に由来する、前記項目のいずれかに記載の結合体または組成物。
（項目１６）
少なくとも１個の前記担体タンパク質エピトープが、破傷風毒素（ＴＴ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳＰ（ＰｆＣｓ）、Ｂ型肝炎ウイルスのヌクレオカプシド（ＨＢＶｎｃ）、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、およびインフルエンザマトリックス（ＭＴ）から選択される、前記項目のいずれかに記載の結合体または組成物。
（項目１７）
少なくとも１個の前記担体タンパク質エピトープが、Ｐ２３ＴＴ（配列番号１）、Ｐ３２ＴＴ（配列番号２）、Ｐ２１ＴＴ（配列番号３）、ＰｆＣｓ（配列番号４）、Ｐ３０ＴＴ（配列番号５）、Ｐ２ＴＴ（配列番号６）、ＨＢＶｎｃ（配列番号７）、ＨＡ（配列番号８）、ＨＢｓＡｇ（配列番号９）、およびＭＴ（配列番号１０）から選択される、前記項目のいずれかに記載の結合体または組成物。
（項目１８）
少なくとも１個の前記糖抗原が、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｂ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ヘモフィルス・インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、および／またはクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）に由来する、前記項目のいずれかに記載の結合体または組成物。
（項目１９）
アジュバントがさらに含まれている、前記項目のいずれかに記載の結合体または組成物。
（項目２０）
糖ではない抗原がさらに含まれている、前記項目のいずれかに記載の結合体または組成物。
（項目２１）
治療に使用される、前記項目のいずれかに記載の結合体または組成物。
（項目２２）
免疫反応を惹起させることにおいて使用される、前記項目のいずれかに記載の結合体または組成物。
（項目２３）
患者において免疫反応を惹起させるための医薬品の製造における、項目１〜２０のいずれか１項に記載の結合体または組成物の使用。
（項目２４）
患者において免疫反応を惹起させるための医薬品の製造における、項目１〜２０のいずれか１項に記載の結合体または組成物の使用であって、前記患者は、担体に結合させられた組成物の中に含まれるものとは異なる糖抗原で前処置されている、使用。
（項目２５）
患者において免疫反応を惹起させるための医薬品の製造における、項目１〜２０のいずれか１項に記載の結合体または組成物の使用であって、前記患者は、異なる担体に結合させられた組成物の中に含まれるものと同じ糖抗原で前処置されている、使用。
（項目２６）
ａ）本発明の第１の結合体、およびｂ）本発明の第２の結合体を含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】図１は、担体および糖抗原の様々な可能な組み合わせを示す。（Ａ）２つの１価の結合体。（Ｂ）１つの１価の結合体、これは、個々の担体タンパク質分子は、１つ以上の糖抗原分子に結合させることができることを示している。および（Ｃ）多価の結合体。この場合、１つ以上の抗原的に異なる糖が個々の担体タンパク質分子に結合させられている。
【図２】図２は、血清抗ＭｅｎＣ  ＩｇＧ抗体反応を示す。６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのグループを、徐々に減少する量のＮ１９−ＭｅｎＣまたはＣＲＭ−ＭｅｎＣ（２．５、０．６２５、０．１５６、および０．０３９μｇのＭｅｎＣ／用量）と０．５ｍｇの水酸化アルミニウムで３回免疫化した。血清試料を、免疫化の前（免疫化前）、およびそれぞれの免疫化の後（１回目の免疫化後、２回目の免疫化後、および３回目の免疫化後）に回収し、そしてＭｅｎＣ特異的ＩｇＧ抗体力価を定量するために個別に試験した。それぞれの点は、それぞれの時点でのそれぞれのグループの平均抗体力価（±１ＳＤ）を示す。
【図３】図３は、先に記載したように免疫化したマウスの１つの血清試料中の抗担体ＩｇＧ抗体反応を示す。マウスはいずれかの結合体中の等量のＭｅｎＣで免疫化したので、最終的な担体タンパク質の量は、ＣＲＭ−ＭｅｎＣを投与したグループとＮ１９−ＭｅｎＣを投与したグループとの間ではわずかな差しかなく、これは、２つの構築物の中での糖−対−タンパク質比のわずかな差が原因である。血清試料を、免疫化の前（免疫化前）、およびそれぞれの免疫化の後（１回目の免疫化後、２回目の免疫化後、および３回目の免疫化後）に回収し、そして担体特異的ＩｇＧ抗体を定量するために個別に試験した。それぞれの点は、それぞれの時点でのそれぞれのグループの平均抗体力価（±１ＳＤ）を示す。
【図４】図４は、徐々に減少する量のＮ１９−ＭｅｎＣまたはＣＲＭ−ＭｅｎＣ（２．５μｇ、０．６２５μｇ、０．１５６μｇ、０．０３９μｇのＭｅｎＣ／用量）と０．５ｍｇの水酸化アルミニウムで３回免疫化したマウスの血清試料中の殺菌活性を示す。免疫化の前（免疫化前）、およびそれぞれの免疫化の後（１回目の免疫化後、２回目の免疫化後、および３回目の免疫化後）に回収したプールした血清試料に由来する殺菌抗体力価を示す。結果は、５０％を上回る細菌の死滅を生じる最も高い血清稀釈率の逆数として示した。
【図５】図５は、血清抗ＭｅｎＡおよび抗ＭｅｎＣ抗体反応を示す。６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのグループを、徐々に減少する量のＮ１９−ＭｅｎＡおよびＮ１９−ＭｅｎＣで、単独でまたは一緒にのいずれかで、あるいは、ＣＲＭをベースとする結合体（０．６２５、０．１５６、および０．０３９μｇのＭｅｎＡおよび／またはＭｅｎＣ／用量）で、０．０６ｍｇのリン酸アルミニウムの存在下で３回免疫化した。血清試料を、免疫化の前（免疫化前）、およびそれぞれの免疫化の後（１回目の免疫化後、２回目の免疫化後、および３回目の免疫化後）に回収し、そして抗ＭｅｎＡ特異的ＩｇＧ抗体力価と抗ＭｅｎＣ特異的ＩｇＧ抗体力価を測定した。それぞれの点は、それぞれの時点でのそれぞれのグループの平均抗体力価（±１ＳＤ）を示す。
【図６】図６は、Ｎ１９  ４価の混合結合体ワクチンの用量増加の血清グループ特異的抗体反応に対する効果を示す。６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのグループを、徐々に減少する量のＮ１９−ＭｅｎＡＣＷＹ（実線）またはＣＲＭ−ＭｅｎＡＣＷＹ（点線）（２から０．０７４μｇの各ＭｅｎＰＳ／用量）で、アジュバントとしての０．０６ｍｇのリン酸アルミニウムの存在下で免疫化した。免疫化は、０日目、２１日目、および３５日目に行い、血清抗ＭｅｎＡ、抗ＭｅｎＣ、抗ＭｅｎＷ、および抗ＭｅｎＹ特異的ＩｇＧ抗体力価を、それぞれの免疫化の後（１回目の免疫化後、２回目の免疫化後、および３回目の免疫化後）に測定した。それぞれの点は、それぞれの時点でのそれぞれのグループの平均抗体力価（±１ＳＤ）を示す。
【図７】図７は、０．０７４μｇの各ＰＳ／用量（Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹまたはＣＲＭ−ＭｅｎＡＣＷＹ）での２回免疫化の後（２回目の免疫化後）および３回の免疫化の後（３回目の免疫化後）にマウスから得られた１つの血清の中の、グループＣおよびＷ−１３５に対する殺菌活性を示す。力価を、少なくとも５０％の細菌の死滅を生じる最も高い血清稀釈率の逆数として示した。それぞれの棒は、それぞれの時点でのグループの平均力価（±ＳＤ）を示す。
【図８】図８は、材料および方法に詳細に記載されるように、Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹまたはＣＲＭ−ＭｅｎＡＣＷＹでの免疫化の後にマウスにおいて生じた抗ＭｅｎＣ抗体の親和力プロフィールの動力学を示す。高親和力のＩｇＧ力価を、改良されたＥＬＩＳＡ法によって、プールされた血清について測定した。結果は、それぞれの免疫化の後（１回目の免疫化後、２回目の免疫化後、３回目の免疫化後）のそれぞれのグループの、７５ｍＭのＮＨ４ＳＣＮでの溶出後に結合している抗体の割合に対応する親和力指数（ＡＩ）で表す。
【図９】図９は、３回目の免疫化後に得られたプールした血清の中での、担体およびそのもとのタンパク質に対する抗体反応を示す。それぞれの点は、先に記載した３回の免疫化後のそれぞれのグループの抗体力価を示す。
【図１０】図１０は、血清抗ＭｅｎＡ抗体反応を示す。６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのグループとともに、ＣＲＭまたはＮ１９のいずれかに結合させたＭｅｎＣＷＹとともに、Ｎ１９またはＣＲＭのいずれかに結合させたＭｅｎＡを一緒に混合することによって調製した、徐々に減少する量の４価の処方物（Ｎ１９−ＭｅｎＡ＋ＣＲＭ−ＭｅｎＣＷＹ、および逆に、ＣＲＭ−ＭｅｎＡ＋Ｎ１９−ＭｅｎＣＷＹ）で３回免疫化した。対照グループには、１種類の担体を含む４価の処方物（Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹまたはＣＲＭ−ＭｅｎＡＣＷＹ）を投与した。マウスには、徐々に減少する量の４価の処方物（０．６７μｇから０．０７４μｇの各ＭｅｎＰＳ／用量）を、アジュバントとしての０．０６ｇのリン酸アルミニウムの存在下で投与した。簡単にするために、本発明者らは、最も高い（０．６７μｇ）と最も低い（０．０７４μｇ）の免疫化用量の後で得られた結果だけを報告する。
【図１１】図１１は、上記のように、徐々に減少する量の２担体処方物または１担体処方物で３回免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清殺菌活性を示す。２回目の免疫化の後（２回目の免疫化後）および３回目の免疫化の後（３回目の免疫化後）に回収したプールした血清試料による殺菌性抗体力価を測定した。結果は、５０％を越える細菌の死滅を生じる最も高い血清稀釈率の逆数として示した。
【図１２−１】図１２は、抗莢膜ＩｇＧ抗体反応を示す。ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスのグループを、Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹまたはＣＲＭ−ＭｅｎＡＣＷＹ（０．６７μｇまたは０．２２μｇの各ＭｅｎＰＳ／用量）結合体で、０．０６ｍｇのリン酸アルミニウムの存在下で２回免疫化した。血清試料を免疫化の前（免疫化前）、およびそれぞれの免疫化の後（１回目の免疫化後、および２回目の免疫化後）で回収し、そしてＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ、ＭｅｎＹ−特異的ＩｇＧ抗体力価を測定した。それぞれの点は、それぞれの時点でのそれぞれのグループの平均の抗体力価（±１ＳＤ）を示す。
【図１２−２】図１２は、抗莢膜ＩｇＧ抗体反応を示す。ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスのグループを、Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹまたはＣＲＭ−ＭｅｎＡＣＷＹ（０．６７μｇまたは０．２２μｇの各ＭｅｎＰＳ／用量）結合体で、０．０６ｍｇのリン酸アルミニウムの存在下で２回免疫化した。血清試料を免疫化の前（免疫化前）、およびそれぞれの免疫化の後（１回目の免疫化後、および２回目の免疫化後）で回収し、そしてＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ、ＭｅｎＹ−特異的ＩｇＧ抗体力価を測定した。それぞれの点は、それぞれの時点でのそれぞれのグループの平均の抗体力価（±１ＳＤ）を示す。
【図１３−１】図１３は、抗莢膜ＩｇＧ抗体反応を示す。ＢＡＬＢ／ｃ  Ｈ−２ｄ、ＢＡＬＢ／Ｂ  Ｈ−２ｂ、Ｂ１０．ＢＲ  Ｈ−２ｋ、Ｂ１０．Ｄ２Ｎ  Ｈ−２ｑ、およびＢ１０．Ｄ１  Ｈ−２ｄマウスを、Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹまたはＣＲＭ−ＭｅｎＡＣＷＹ（０．６７μｇの各ＭｅｎＰＳ／用量）で、０．０６ｍｇのリン酸アルミニウムの存在下で３回免疫化した。血清試料を免疫化の前、およびそれぞれの免疫化の後（１回目の免疫化後、２回目の免疫化後、および３回目の免疫化後）で回収し、そしてＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ、ＭｅｎＹ−特異的ＩｇＧ抗体力価を測定した。それぞれの棒は、それぞれの時点でのそれぞれのグループの１匹のマウスに対応する平均の抗体力価と記号を示す。
【図１３−２】図１３は、抗莢膜ＩｇＧ抗体反応を示す。ＢＡＬＢ／ｃ  Ｈ−２ｄ、ＢＡＬＢ／Ｂ  Ｈ−２ｂ、Ｂ１０．ＢＲ  Ｈ−２ｋ、Ｂ１０．Ｄ２Ｎ  Ｈ−２ｑ、およびＢ１０．Ｄ１  Ｈ−２ｄマウスを、Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹまたはＣＲＭ−ＭｅｎＡＣＷＹ（０．６７μｇの各ＭｅｎＰＳ／用量）で、０．０６ｍｇのリン酸アルミニウムの存在下で３回免疫化した。血清試料を免疫化の前、およびそれぞれの免疫化の後（１回目の免疫化後、２回目の免疫化後、および３回目の免疫化後）で回収し、そしてＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ、ＭｅｎＹ−特異的ＩｇＧ抗体力価を測定した。それぞれの棒は、それぞれの時点でのそれぞれのグループの１匹のマウスに対応する平均の抗体力価と記号を示す。
【図１４】図１４は、Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹまたはＣＲＭ−ＭｅｎＡＣＷＹ（０．６７μｇの各ＭｅｎＰＳ／用量）と０．０６ｍｇのリン酸アルミニウムで３回免疫化した、種々の遺伝的背景を有しているマウスの血清殺菌活性を示す。３回目の免疫化の後（３回目の免疫化後）に回収したプールした血清試料による殺菌性抗体力価を示す。結果は、５０％を越える細菌の死滅を生じる最も高い血清稀釈率の逆数として示した。
【図１５】図１５は、Ｎ１９エピトープ特異的Ｔ細胞増殖応答を示す。Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹ（６μｇのＮ１９／用量）で３回免疫化したマウスに由来する脾臓細胞を、０．９〜３０μＭの３種類の個々のペプチド（Ｐ２ＴＴ、Ｐ２３ＴＴ、Ｐ３０ＴＴ）、および０．３１２から１０μｇ／ｍｌのＮ１９タンパク質（グラフに示したように、遊離のものまたはＰＳに結合させたもの）の存在下で、インビトロでの増殖について試験した。結果を、刺激指数（ＳＩ）＝（実験のｃｐｍ／刺激していないバックグラウンドのｃｐｍ）として表した。＊＝Ｎ１９濃度は０．３１２から１０μｇ／ｍｌである。
【図１６】図１６は、Ｎ１９エピトープ特異的Ｔ細胞増殖応答を示す。Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹ（６μｇのＮ１９／用量）で２回免疫化したマウスに由来する脾臓細胞を、グラフに示したように、０．１２〜３０μＭの個々のペプチド（Ｐ２ＴＴ、Ｐ２１ＴＴ、Ｐ２３ＴＴ、Ｐ３０ＴＴ、Ｐ３２ＴＴ、ＨＡ、ＨＢｓＡｇ）および０．００４から１μＭのＮ１９の存在下で、インビトロでの増殖について試験した。結果を、刺激指数（ＳＩ）＝（実験のｃｐｍ／刺激していないバックグラウンドのｃｐｍ）として表した。＊＝Ｎ１９濃度は１から０．００４μＭである。
【図１７】図１７は、Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹで免疫化した遺伝的背景が同じであるマウス統のＴ細胞増殖応答を示す。種々のＨ−２ハプロタイプを有しているマウスの株を、Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹ（６μｇのＮ１９／用量）で、０．０６ｍｇのリン酸アルミニウムの存在下で３回免疫化した。脾臓細胞を、１．７〜１５μＭのＮ１９ペプチド（表１に列挙する）および０．１から１０μｇ／ｍｌのＮ１９タンパク質（遊離のものまたはＭｅｎＰＳに結合させたもの）の存在下で、インビトロでの増殖について試験した。結果を、刺激指数（ＳＩ）＝（実験のｃｐｍ／刺激していないバックグラウンドのｃｐｍ）として表した。＞２のＳＩをポジティブと考えた。
【図１８】図１８は、Ｐ２３ＴＴ、ＨＡ、およびＨＢｓＡｇに特異的なＴ細胞活性化を示す。増殖アッセイにおいて決定した、相同ペプチドおよびＮ１９タンパク質に対する刺激指数。３匹のマウスのグループを、ＣＦＡ中に１：１で乳化させた５０μｇの個々のペプチドを含む５０μｌの容量で尾の基部に免疫化した。７日後、リンパ節を取り出し、ＬＮ細胞を、種々の濃度の相同ペプチドまたはＮ１９タンパク質の存在下で増殖するそれらの能力について試験した。結果を、１匹のマウスの３連の培養物において得た。結果を、実験のｃｐｍ／刺激していないバックグラウンドのｃｐｍによって計算した刺激指数（ＳＩ）として表した。
【発明を実施するための形態】
【０１９４】
１．糖結合体調製物
１．１  多エピトープタンパク質Ｎ１９の発現および精製
組み換えプラスミドｐＱＥ−Ｎ１９を有している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、ＬＢ寒天プレート、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン上で３７℃でＯ／Ｎ増殖させた。その後、増殖した細菌を、５００ｍｌのＬＢ培地、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンに接種し、３７℃でＯ／Ｎ増殖させた。次いで、５００ｍｌを発酵槽の中の５Ｌの培地の中に稀釈した。増殖は最適化した条件において行った。４．２のＯＤ６００ｎｍ値が得られた時点で、多エピトープタンパク質の発現を、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソ−プロピル−チオ−ガラクトシド）の添加によって、ＯＤ６００ｎｍが７．２になるまで、３．５時間誘導した。細菌培養物の上清の２つの試料を、ＩＰＴＧの添加の前のゼロ時点（ｔ０  ＯＤ  ４．２）と、発現の終了時点（ｔｅｎｄ  ＯＤ  ７．２）で回収した。得られたペレットを試料緩衝液中に再度懸濁させ、そして様々な細菌培養物のＯＤに対応する段階希釈で、１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。細菌培養物全てを、ＪＡ１０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）の中で４℃で２０分間、５０００ｇで遠心分離した。得られた６０ｇの細胞ペレットを、５００ｍｌの溶解緩衝液（６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭのＴＣＥＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）ｐＨ８）に懸濁させ、ＲＴで１時間攪拌し、その後、３７℃で１時間インキュベートした。溶解させたタンパク質を含む上清をＪ２０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）の中でＲＴで２０分間の、１２０００ｒｐｍでの遠心分離によって回収し、そして固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＩＭＡＣ））に供した。ＩＭＡＣカラム上に試料を吸着させる前に、１ｍＭのＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロライド、Ｐｉｅｒｃｅ）を、ジスルフィド結合によってＮ１９に共有結合した混入物質が同時沈降することを回避するために添加した。これは、精製の間に不可欠であることがこれまでに示されている。溶解させた物質を、３６０ｍｌのニッケル活性化ＩＤＡ（Ｎｉｃｋｅｌ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＩＤＡ）（イミノ２酢酸）キレート化セファロースファストフロー（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））を含むＸＫ５０カラムにロードし、その後、カラムを、５倍容量の溶解緩衝液で洗浄した。次いで、グアニジン−ＨＣｌ  ６Ｍ（ｐＨ８）から１ｍＭのＴＣＥＰを含む尿素８Ｍ（ｐＨ８）３００ｍｌの勾配をかけた。カラムを３倍容量の緩衝液Ｂ（８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮＡＨ２ＰＯ４、ｐＨ７）で洗浄し、タンパク質を１８００ｍｌの、緩衝液Ｂ中の０〜２００ｍＭのイミダゾール勾配で溶出した。カラムから回収した画分を、１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ）上で定性的に分析し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質決定法（ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ）によって定量的に分析した。
【０１９５】
精製した組み換え体タンパク質を含む選択した勾配画分について陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＣ）を行った。６００ｍｌのプールした画分を、１２０ｍｌのＳＰ−セファロースファストフロー（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を含むＸＫ５０カラムにロードした。カラムを５倍容量の緩衝液Ｃ（７Ｍの尿素、２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）で洗浄し、そしてタンパク質を１３００ｍｌの、緩衝液Ｃ中の０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配で溶出させた。１２．５％のＳＡＳ−ＰＡＧＥ分析（ＢｉｏＲａｄ）によって選択した精製された組み換え体タンパク質を含む勾配画分をプールし、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロールに対して透析した。最終的なタンパク質濃度は、製造業者の説明書（Ｐｉｅｒｃｅ）にしたがってマイクロＢＣＡ法によって決定した。タンパク質を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ）上で分析した。バンドの光学密度を完全性評価（Ｉｍａｇｅ  Ｍａｓｔｅｒ  １Ｄ  Ｅｌｉｔｅ  ｖ４．００  ＬａｂＳｃａｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ）のために測定した。最終的なタンパク質調製物の内毒素のレベルを、Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｓｉｅｎａ）によるカブトガニの血球抽出物（ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ）（ＬＡＬ）の比濁時間分析法（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）によって決定した。  
【０１９６】
１．２  オリゴ糖の生産
グループＡ、Ｃ、Ｗ、Ｙの髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）の多糖を、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株から、髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）ワクチンの生産について記載されている標準的な手順（２９１）によって精製した。その後、以前に記載されている（２９２，２９３）ように、担体タンパク質に対してカップリングさせるために、精製した莢膜多糖を解重合させ、活性化させた。本発明者らは、髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）血清学的グループＣのオリゴ糖の調製のための手順を、本明細書中に簡単に記載する。精製したＭｅｎＣ莢膜多糖を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）の中で加水分解させて、平均重合度（ＤＰ）を下げた。この反応は、ＤＰが１０に達するまで、約１２時間、８０℃で行った。ＤＰは、出発多糖溶液中の全シアル酸含有量（加水分解の間は一定）と、酸化後にそれぞれの鎖の末端基から放出されるホルムアルデヒドを分析することによって、加水分解の間にオンラインで追跡することができる。この実時間ＤＰ測定によって、加水分解の終了時点の推定が可能となる。オリゴ糖を、Ｑ−セファロースＦＦイオン交換クロマトグラフィーによって大きさで分類し、これによって、より大きい分子量の多糖をカラム上に保持し、一方、低い分子量のオリゴ糖（ＤＰ＜６）を、５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．５）を用いてカラムから溶出させた。その後、所望されるオリゴ糖画分を、０．７Ｍのテトラブチルアンモニウムブロマイド（ＴＡＢ）、陽性対イオン（これは、カラムから負電荷を有しているオリゴ糖を追放する）で溶出させた。その後、生成物を、３Ｋのカットオフ膜上で水に対して濃縮／透析濾過して、過剰なＴＡＢを取り除き、そして調製物中のＭｅｎＣオリゴ糖を濃縮した。透析濾過後、保持物を回転式エバポレーション工程によって乾燥させた。その後、ＭｅｎＣオリゴ糖を還元的にアミノ化して、末端第１級アミノ基を有するオリゴ糖とした。反応混合物は、１０％のＤＭＳＯ、９０％のメタノール、５０ｍＭの酢酸アンモニウム、および１０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムから構成されており、これを、５０℃の蓋をした水浴の中で２４時間インキュベートした。その後、反応混合物を回転式エバポレーション工程に供して、その後の透析濾過工程でのシリコン管類および透析濾過膜との相互作用の可能性を避けるためにアミノ化反応混合物のメタノール含有量を減少させた。アミノ化させられたオリゴ糖を、その後、８倍要領の０．５ＭのＮａＣｌ、その後の４倍容量の２０ｍＭのＮａＣｌに対する濃縮／透析濾過によって、試薬（シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ＤＭＳＯ、メタノール）から精製した。精製されたアミノ化させられたオリゴ糖を、活性化工程のための準備において、真空下で乾燥させた。ＭｅｎＣオリゴ糖を水中に溶解させ、その後、ＤＭＳＯの混合物に対して加えた。トリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加して、オリゴ糖の第１級アミノ基と脂肪酸のジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ビス−ＮＨＳ）エステルの十分な脱プロトン化を確実にした。ビス−ＮＨＳをモル過剰量で添加して、ビス−ＮＨＳエステルの個々の分子に対して１つの���リゴ糖ポリマーの共有結合の形成に遊離に働くようにした。活性化されたオリゴ糖を、反応混合物に対するアセトンの付加によって沈殿させた。これをまた、ＤＭＳＯ、ビス−ＮＨＳエステル、およびＴＥＡからオリゴ糖を分離させるためにも使用した。沈殿を真空下で乾燥させ、重量を測定し、そして結合体に使用するまで−２０℃で保存した。
【０１９７】
他のＰＳの精製のための手順は、基本的には、反応時間および温度についての重要ではない改良を含めて、同じとした［２９４］。
【０１９８】
１．１３  髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）のオリゴ糖へのＮ１９結合
精製、大きさによる分類、および活性化の後、オリゴ糖を、続いて、Ｎ１９タンパク質への結合のために使用した［２９５］。結合実験を開始する前に、本発明者らは、予め、Ｎｉ−活性化樹脂に対する多糖類の非特異的（ａｓｐｅｃｉｆｉｃ）吸着の可能性を評価した。典型的な結合実験においては、３４３．２ｎｍｏｌのＮ１９担体タンパク質を、グアニジニウム−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４に溶解させ、そして、同じ緩衝液中に平衡化させた予めパックした５ｍｌのＮｉ−活性化セファロースファストフロー樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に吸着させた。グアニジニウム−ＨＣｌを、５０ｍｌの１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で樹脂を洗浄することによって除去し、その後、１ｍｌの、６８６４ｎｍｏｌの活性化させた髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）のオリゴ糖（ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ、またはＭｅｎＹ）を含む１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）をカラムに添加し、室温で２時間再循環させた。カラムを、５０ｍｌの１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）で洗浄して、過剰な結合していないオリゴ糖を除去した。最後に結合産物を、３００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７）、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４で溶出させ、７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。結合体を含む選択した画分をプールし、ＰＢＳに対して透析した。糖−結合体を、糖とタンパク質の含有量について分析した。ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ、およびＭｅｎＹ結合体の糖含有量を、シアル酸の決定（１４３）によって定量し、一方、ＭｅｎＡ結合体の糖含有量は、マンノサミン−１−ホスフェートクロマトグラフィーグラフィー決定法（１２１）によって定量した。タンパク質含有量は、マイクロＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって測定した。グリコシル化の程度は、糖対タンパク質の重量比から計算した。この実験において対照物とした、ＣＲＭをベースとする結合体ワクチン（ＣＲＭ−ＭｅｎＡ、ＣＲＭ−ＭｅｎＣ、ＣＲＭ−ＭｅｎＷ、ＣＲＭ−ＭｅｎＹ）は、Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｓｉｅｎａ）によって調製した。
【０１９９】
２．マウス株
特に別の指定がなければ、６匹のメスの７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスのグループを使用した。別の実験では、以下のＨ−２ハプロタイプを有している７週例のメスのマウスの遺伝的背景が同じである４種類の株を使用した：ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）と遺伝的背景が同じであるＢＡＬＢ／Ｂ（Ｈ−２ｂ）、およびＢ１０．ＢＲ（Ｈ−２ｋ）、Ｂ１０．Ｄ２Ｎ（Ｈ−２ｑ）、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）と遺伝的背景が同じであるＢ１０．Ｄ１（Ｈ−２ｄ）。マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｃａｌｃｏ，Ｉｔａｌｙ）から、またはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入した。
【０２００】
３．マウスの免疫化スケジュールおよび処方物
マウスを、以下に記載するように、０．９％のＮａＣｌ緩衝液中に稀釈した糖内容物をベースとする、１価、２価、４価、または２担体結合体ワクチンの、それぞれ０．５ｍｌの処方物と共にＮ１９またはＣＲＭ結合体を用いて、０日目、２１日目、および３５日目に皮下で免疫化した。個々の血清試料を、−１日目（免疫化前）、２０日目（１回目の免疫化後）、３４日目（２回目の免疫化後）、および４５日目（３回目の免疫化後）に採取し、使用するまで−２０℃で凍結させた。細胞によって媒介される免疫反応のセクションに記載するように、Ｔ細胞増殖を評価するためにＮ１９−結合体で免疫化したマウスから脾臓を回収した。
【０２０１】
３．１  １価の髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）Ｃ結合体ワクチン
マウスを、徐々に減少する量のＮ１９−ＭｅｎＣまたはＣＲＭ−ＭｅｎＣ（２．５から０．０３９μｇのＭｅｎＣ／用量）で、アジュバントとしての０．５ｍｇの水酸化アルミニウムの存在下で免疫化した。抗体力価を以下に詳細に記載するように測定した。
【０２０２】
Ｎ１９を含む結合体は、ＣＲＭを含む結合体よりも免疫原性が高かった（図２）。２回の免疫化の後、Ｎ１９をベースとする構築物によって３用量のＣＲＭ−ＭｅｎＣ結合体によって誘導されるよりも有意に高い力価で、血清抗ＭｅｎＣ  ＩｇＧ抗体が誘導された（例えば、０．６２５μｇでの２回目の免疫化後のＮ１９−ＭｅｎＣ対０．６２５μｇでの３回目の免疫化後のＣＲＭ−ＭｅｎＣ［Ｐ＜０．０１］；０．１５６μｇでの２回目の免疫化後のＮ１９−ＭｅｎＣ対０．１５６μｇでの３回目の免疫化後でのＣＲＭ−ＭｅｎＣ［Ｐ＜０．０５］）。加えて、３用量の後は、より少量のＮ１９結合体で、ＣＲＭ−ＭｅｎＣ結合体によって誘導されるよりも有意に高い抗ＭｅｎＣ  ＩｇＧ抗体を誘導するには十分であった（例えば、０．１５６μｇでのＮ１９−ＭｅｎＣ対０．６２５μｇでのＣＲＭ−ＭｅｎＣ［Ｐ＜０．０１］）。
【０２０３】
ＣＲＭをベースとする結合体での２回および３回の免疫化によっては、試験した最も低い用量（すなわち、０．３μｇ以下）でもなお、ＣＲＭに対する強い抗担体抗体反応が誘導された。対照的に、Ｎ１９特異的抗体反応は常に無視できる程度であり、最も高い用量（すなわち、６μｇ）でしか検出できなかった（それにもかかわらず、非常に低い力価であった）（図３）。これらの低力価のＮ１９抗体は、固相の中の破傷風トキソイドを認識することはできなかった。これらの結果は、抗Ｎ１９ポリペプチドの強いヘルパー効果が、有意なレベルの自身に対する抗体の誘導によっても、また、自然界に存在しているタンパク質に対する抗体の誘導によっても起こるものではないことを明らかに示している。
【０２０４】
ＭｅｎＣに対する防御免疫は、主に、補体の存在下で細菌を死滅させる殺菌性抗体に依存しているので、誘導された抗体の機能的活性を測定した。ＥＬＩＳＡにおいて得られた結果と一致して、図４は、Ｎ１９結合体が、ＣＲＭをベースとする結合体を用いた場合に使用した用量よりも低い免疫化用量で、細菌抗体を誘導することができたことを示している。最も高い用量のＮ１９−ＭｅｎＣ結合体での１回の免疫化後には、ＣＲＭ−ＭｅｎＣ結合体の２回の用量によって誘導されたものと同様の力価を有している殺菌性抗体が誘導されたことが注目される。少量のＮ１９−ＭｅｎＣで２回免疫化されたマウスは、ＣＲＭ−ＭｅｎＣで免疫化されたマウスよりも、高い殺菌性抗体力価を生じた。これらのＣＲＭ−ＭｅｎＣで免疫化されたマウスには、Ｎ１９結合体によって誘導されたものに匹敵する殺菌性抗体力価に達するには、３回目の用量が必要であった。したがって、Ｎ１９は、少ない投与量での少ない回数の注射の後で、ＭｅｎＣに対して実質的に機能的である活性を有している抗体を誘導することによって、ＣＲＭよりも強い担体として働くことが示された。
【０２０５】
３．２  ２価の髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）ＡＣ結合体ワクチン
マウスを、Ｎ１９−ＭｅｎＡおよびＮ１９−ＭｅｎＣで別々に、および一緒に、あるいは、ＣＲＭ−ＭｅｎＡおよびＣＲＭ−ＭｅｎＣで別々に、および一緒に（０．６２５、０．１５６、または０．０３９μｇの各ＭｅｎＰＳ／用量）、アジュバントとしての０．０６ｍｇのリン酸アルミニウムの存在下で免疫化した。抗体力価を、以下に記載するようにＥＬＩＳＡによって測定した。
【０２０６】
図５の上段のパネルに示すように、Ｎ１９またはＣＲＭ担体のいずれかを含むＭｅｎＡとＭｅｎＣ結合体を一緒に投与することによって、単独で投与した結合体のものと比較して有意な減少によって予想されるように、ＭｅｎＡに対する免疫原性が得られた（例えば、０．１５６μｇの２回目の免疫化後のＮ１９−ＭｅｎＡ対Ｎ１９−ＭｅｎＡＣ［Ｐ＜０．０５］；０．６２５μｇの３回目の免疫化後のＮ１９−ＭｅｎＡ対Ｎ１９−ＭｅｎＡＣ［Ｐ＜０．０５］；０．６２５μｇの２回目の免疫化後のＣＲＭ−ＭｅｎＡ対ＣＲＭ−ＭｅｎＡＣ［Ｐ＜０．０５］；０．１５６μｇの３回目の免疫化後のＣＲＭ−ＭｅｎＡ対ＣＲＭ−ＭｅｎＡＣ［Ｐ＜０．０５］）。それにもかかわらず、Ｎ１９またはＣＲＭ担体のいずれかを含む２価の処方物はいずれも、２回の免疫化の後、および３回の免疫化の後に、ＭｅｎＡに対して同等の（統計学的には差がない）抗体力価を誘導した。１価の結合体ワクチンおよび２価の結合体ワクチンの中のＮ１９担体は、ＭｅｎＡに対する早い抗体反応を誘導することができ、１回目の用量の後には、すでに抗体反応を惹起させたが、ＣＲＭ結合体は測定することができる程度の抗体力価を誘導することはできなかった。Ｎ１９結合体の２回の注射の後も、ＣＲＭ結合体よりも多い抗体反応を誘発する傾向があったが、最も低い投与量の１価のワクチンを投与した場合にしか、差は統計学的に有意にならなかった（例えば、０．０３９μｇでの２回目の免疫化後のＮ１９−ＭｅｎＡ対ＣＲＭ−ＭｅｎＡ［Ｐ＜０．０５］）。
【０２０７】
抗ＭｅｎＣ抗体反応を測定した（図５の下段のパネル）場合には、１価の処方物と２価の処方物を比較した場合には、２回目の用量または３回目の用量の後に力価の低下は観察されなかった。１回目の投与の後、ＣＲＭ結合体を用いて得られた１価のワクチン抗ＭｅｎＣ抗体レベルの免疫化用量の減少は破棄されたが、Ｎ１９結合体を用いた場合に得られたものは安定に維持された。２価のワクチンでの１回の免疫化の後に得られた力価を比較することによって、ＣＲＭ結合体が、実質的な抗ＭｅｎＣ抗体反応を惹起させることができないことが示されたが、Ｎ１９結合体は、用量応答性質を伴って高いレベルを誘導した。
【０２０８】
３．３  ４価の髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）ＡＣＷＹ結合体ワクチン
４価の処方物を、等しい糖量のＮ１９−ＭｅｎＡ、Ｎ１９−ＭｅｎＣ、Ｎ１９−ＭｅｎＷ、およびＮ１９−ＭｅｎＹ（Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹ）の中に一緒に混合することによって調製した。対照として、本発明者らは、凍結乾燥させられたＣＲＭ−ＭｅｎＡに対して液体ＣＲＭ−ＭｅｎＣＷＹを混合することによって使用前に処方したＣＲＭ結合体ワクチン（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｓｉｅｎａ）の臨床的グレードのロットを使用した。マウスに、徐々に減少する量の４価の処方物（２μｇから０．０７４μｇの各ＭｅｎＰＳ／用量）を、アジュバントとしての０．０６ｍｇのリン酸アルミニウムの存在下で投与した。
【０２０９】
図６は、４種類の血清学的グループの莢膜多糖の任意のものについて、および全ての投与した投与量で、Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹでの２回または３回の免疫化によって同様のＩｇＧ力価が生じたことを示す。３回の免疫化の後のＣＲＭ結合体に対する抗体反応と、わずかに２回の免疫化の後のＮ１９結合体に対する抗体反応を比較した場合には、４種類の血清学的グループの全てについて有意な差は見られなかった。２回目の用量の後、血清学的グループＡおよびＣに対する抗体力価は、Ｎ１９に結合させた場合には、ＣＲＭに結合させた場合に得られる抗体力価と比較すると有意に高かった（ＩｇＧ抗ＭｅｎＡおよび抗ＭｅｎＣ：全ての投与した投与量での２回目の免疫化後のＮ１９対ＣＲＭ：Ｐ＜０．０５）。
【０２１０】
Ｎ１９結合体は、初回免疫化の後に、４種類の多糖の全てに対する抗体生産を誘導したが、ＣＲＭ結合体は誘導しなかった。特に、ＭｅｎＣに対しては、図６のパネルＢに示すように、有意に高い抗体力価が、全ての投与した投与量でＮ１９結合体を用いて得られた（全ての投与した投与量での１回目の免疫化後のＮ１９対ＣＲＭ：［Ｐ＜０．０５］）。パネルＡおよびＣに示すＭｅｎＡおよびＭｅｎＷに対する力価は、Ｎ１９結合体を１回投与した場合には、最も高い投与量で有意に高かった（２μｇでの１回目の免疫化後のＮ１９対ＣＲＭ：［Ｐ＜０．０５］）。両方の結合体によって誘導された抗体は、大部分はＩｇＧ１であった（データは示さない）。重要なことは、本発明者らが、反応したマウスの数が、ＣＲＭ結合体で免疫化した場合よりもＮ１９結合体で免疫化した場合により多く、特に、１回目の用量の後と２回目の用量の後にそうであったことであり、一方、３回目の用量の後には、全てのマウスが反応していた（表２）。
【０２１１】
（表２  それぞれのグループの４種類のＰＳ抗原（ＭｅｎＡＣＷＹ）に対して反応したマウスの割合（％））
【０２１２】
【表２】
2015155464.tif 000011
Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹは、４種類のＭｅｎ多糖の全てに対する殺菌性抗体を誘導することにおいて非常に有効であった。特に、グループＣに対する殺菌力価は、ＣＲＭ結合体よりもＮ１９結合体の２回の用量の後に、全ての投与した投与量で有意に高かった。用量増加を行うことにより、Ｎ１９担体の効力は強まった。なぜなら、用量を制限することによって、Ｎ１９結合体は、ＣＲＭ結合体によって誘導される殺菌性抗体力価よりも、４種類の多糖の全てに対してより高い殺菌性抗体力価を誘導したからである。具体的には、最も低い用量（０．０７４μｇ）で免疫化したマウスに由来する１つの血清に対するＭｅｎＣおよびＭｅｎＷに対する殺菌力価を分析した。図７は、ＥＬＩＳＡ滴定に関しては、Ｎ１９結合体を用いて得られた血清殺菌性抗体（ＳＢＡ）力価もまた、２回の用量の後または３回の用量の後は同等であったことを示している。ＭｅｎＣに対する殺菌力価は、ＣＲＭ結合体の３回の注射の後に得られたものよりも、Ｎ１９結合体での２回の免疫化の後にすでに有意に高かった（ＳＢＡ抗ＭｅｎＣ：２回目の免疫化後のＮ１９対３回目の免疫化後のＣＲＭ：［Ｐ＜０．０５］）。Ｎ１９をベースとする結合体またはＣＲＭをベースとする結合体のいずれかを用いて得られた、２回の用量の後、または３回の用量の後のＭｅｎＷに対する殺菌力価を比較することにより、本発明者らは、Ｎ１９結合体によって有意に高い殺菌性抗体力価が誘導されたことを見出した（ＳＢＡ抗ＭｅｎＷ：２回目の免疫化後のＮ１９対ＣＲＭ：［Ｐ＜０．０５］；３回目の免疫化後のＮ１９対ＣＲＭ［Ｐ＜０．０５］）。
【０２１３】
グループＡおよびＣの抗体の機能的活性の詳細な分析を、高親和性抗体だけを測定する改良された抗原結合アッセイを使用して行った［２９６］。図８の結果は、２μｇのＮ１９結合体を用いた場合にＭｅｎＣに対して得られた抗体が、１回の用量の後に、すでに高い親和力であったことを示している。２回の免疫化が、ほぼ全ての抗体の十分な親和力の成熟を誘導するために十分であった。より少量のＮ１９結合体またはＣＲＭ結合体のいずれかで免疫化した他のグループも同様の成熟プロフィールを示したが、２回の用量の後でも、ベースラインから約５０％の高親和力の抗体までにしか増加しなかった（単純化のために、最も高い投与量と最も低い投与量で免疫化したグループだけを示す）。
【０２１４】
自身に対する抗体を誘導することに対する４種類の多糖によって共有されている担体タンパク質の影響を評価するために、本発明者らは、使用した両方の担体タンパク質に対する抗体を測定した（図９）。加えて、本発明者らは、担体に対する生じた抗体がもとのタンパク質にも結合できるかどうかを分析した。図９は、パネルＡにおいて、ＣＲＭ結合体を用いた場合に生じた抗体がＤＴ（ＣＲＭのもとのタンパク質である）を十分に認識したことを示している。反対に、Ｎ１９結合体に対する抗体は、Ｎ１９エピトープが導かれたその元のタンパク質（例えば、破傷風トキソイド（ＴＴ）およびインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ））とは交差反応しなかった。ＴＴに由来する１０個のエピトープ（５個のエピトープの２回の繰り返し）がＮ１９に含まれており、その配列の５０％以上を示すことに留意すべきである。
【０２１５】
３．４  ２担体４価髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）ＡＣＷＹ結合体ワクチン
４価の処方物を、ＣＲＭまたはＮ１９のいずれかに結合させたＭｅｎＣＷＹと共に、Ｎ１９またはＣＲＭのいずれかに結合させたＭｅｎＡを一緒に混合することによって調製した（Ｎ１９−ＭｅｎＡとＣＲＭ−ＭｅｎＣＷＹ、およびその逆ＣＲＭ−ＭｅｎＡとＮ１９−ＭｅｎＣＷＹ）。対照グループには、１つの担体を含む４価の処方物（Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹまたはＣＲＭ−ＭｅｎＡＣＷＹ）を投与した。マウスに、徐々に減少する量の４価の処方物（０．６７μｇから０．０７４μｇのそれぞれのＭｅｎ多糖／用量）を、アジュバントとしての０．０６ｍｇのリン酸アルミニウムの存在下で投与した。抗体力価を、以下に記載する方法を使用して決定した。
【０２１６】
Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹは、１回目の用量の後に、ＣＲＭをベースとするワクチンの２回の用量の後に得られた力価に匹敵する抗ＭｅｎＡ力価を生じた（図６）。さらに、Ｎ１９結合体で２回免疫化したマウスは、ＣＲＭ結合体で免疫化したマウスよりも、ＭｅｎＡに対して有意に高い殺菌力価を誘発した（図１０）。本発明者らは、Ｎ１９−ＭｅｎＡをＣＲＭ−ＭｅｎＣＷＹと同時に投与した場合、またはそれとは逆に、ＭｅｎＡ上の担体を交換した場合に、抗体反応が、特有の担体を含む４価の処方物と比較すると有意に大きかったことを観察した（例えば、０．６７μｇでの２回目の免疫化後：Ｎ１９−ＭｅｎＡ＋ＣＲＭ−ＭｅｎＣＷＹ対Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹ：［Ｐ＜０．０５］；０．６７μｇでの３回目の免疫化後：Ｎ１９−ＭｅｎＡ＋ＣＲＭ−ＭｅｎＣＷＹ対ＣＲＭ−ＭｅｎＡＣＷＹ：［Ｐ＜０．０１］；０．２２μｇでの２回目の免疫化後：ＣＲＭ−ＭｅｎＡ＋Ｎ１９−ＭｅｎＣＷＹ対ＣＲＭ−ＭｅｎＡＣＷＹ：［Ｐ＜０．００１］）。しかし、本発明者らは、２担体処方物の両方の免疫化投与量を減少させることによって、２回の免疫化の後にも、また３回の免疫化の後にも、抗ＭｅｎＡ抗体のＩｇＧ力価が有意に低下したが、それらの殺菌力価は低下しなかったことに注目した（図１０）。さらに、２担体ワクチンのいずれによっても、全ての投与量で、同等の殺菌力価が誘導された（図１１）。全ての処方物の中のＮ１９の存在によって、常に、わずかに１回の免疫化の後に抗体反応が引き起こされたが、ＣＲＭだけでは引き起こされなかったことは特筆すべきであった（図１０）。
【０２１７】
３．５  様々な遺伝的背景を有しているマウス株
予備実験において、ＢＡＬＢ／ｃとＣ５７ＢＬ／６のマウスの２つのグループを、０．６７または０．２２μｇのＮ１９−ＭｅｎＡＣＷＹまたはＣＲＭ−ＭｅｎＡＣＷＹで、０．０６ｍｇのリン酸アルミニウムと共に２回免疫化した。別の実験では、遺伝的背景が同じであるマウスの株を、上記に記載したように準備した、４価の処方物Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹまたはＣＲＭ−ＭｅｎＡＣＷＹ（０．６７μｇの各Ｍｅｎ多糖／用量）で、０．０６ｍｇのリン酸塩の存在下で３回免疫化した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを対照として使用した。
【０２１８】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて得られた上記の結果に基づいて、本発明者らは、Ｎ１９またはＣＲＭを含む４価の処方物の２種類の投与量でわずかに２回マウスを免疫化することを決定し、そして４種類の多糖に対する抗体反応を測定した（図１２）。再び、Ｎ１９が、特に、抗ＭｅｎＡ抗体を誘導することにおいて４価のワクチンの中でＣＲＭよりも強い担体として働くことが、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて明らかにされた（ＢＡＬＢ／ｃ  ０．２２μｇでの２回目の免疫化後のＮ１９対ＣＲＭ：［Ｐ＜０．００１］）。本発明者らは、Ｎ１９またはＣＲＭのいずれかを含む結合体のいずれもが、ＢＡＬＢ／ｃマウスよりもＣ５７ＢＬ／６において免疫原性が低いこと、および抗体反応がより変わりやすいことを観察した。さらに、Ｎ１９の良好な担体効果は、ＢＡＬＢ／ｃにおいて観察されたよりも、４種類の多糖の全てに対してあまり明白ではなかった。それにもかかわらず、Ｎ１９結合体は、１回目の免疫化の後にすでに、４種類の多糖の全てに対して一貫して抗体力価を誘発することができたが、ＣＲＭ結合体は誘発することはできなかった。
【０２１９】
図１３に示すように、Ｎ１９結合体およびＣＲＭ結合体は、ＢＡＬＢ／ｃ  Ｈ−２ｄ株およびＢ１０．Ｄ１  Ｈ−２ｑ株において、４種類の結合体に対してより免疫原性が高かった。一般的には、Ｎ１９をベースとする結合体で免疫化した場合には、ＣＲＭをベースとする結合体で免疫化した場合よりも、多くのマウスが反応した。ＢＡＬＢ／ｃマウスと同じハプロタイプを有しているＢ１０．Ｄ２Ｎ  Ｈ−２ｄは、Ｎ１９結合体について、ＣＲＭ結合体よりも優れたレシピエントであった。一方、ＢＡＬＢ／ｃマウスと遺伝的背景が同じであるＢＡＬＢ／Ｂ  Ｈ−２ｂは、ＣＲＭ結合体について、Ｎ１９結合体よりも優れたレシピエントであった。一方、ＣＲＭ結合体は、Ｂ１０．ＢＲ  Ｈ−２ｋにおいては４種類の多糖のいずれに対しても抗体反応を全く誘導することができなかったが、Ｎ１９結合体は誘導することができた。Ｎ１９結合体によって、免疫原性が低い株におけるごくわずかな例外を除いて、４種類の多糖に対して試験したマウス株の全てにおいて、１回目の用量の後に、実質的な抗体反応が誘発されたことが際立っている。この実験で使用した様々な遺伝的背景を有しているほとんどのマウスが、４種類の多糖に対する抗体を生じ、このことは、Ｎ１９結合体で免疫化した場合には、免疫反応についての明らかな遺伝的制限は全くないことを示している。
【０２２０】
図１４に示すように、ＥＬＩＳＡによって測定したＩｇＧ反応と一致して、Ｎ１９結合体およびＣＲＭ結合体を用いて得られた殺菌力価もまた、ＢＡＬＢ／ｃ  Ｈ−２ｄレシピエントにおいて高かった。本発明者らは、Ｎ１９結合体によって、ＢＡＬＢ／ＢマウスにおけるＭｅｎＡに対するものを除いて、試験した株の全てにおいて４種類の多糖に対して、ＣＲＭ結合体よりも高い殺菌力価が誘導されたことを観察した。血清殺菌性アッセイによる生じた抗体の機能的活性の評価によって、ＣＲＭと比較して、Ｎ１９の良好な担体効果がさらに確認できた。
【０２２１】
４．酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）プロトコール
４．１  髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）血清学的グループＡ、Ｃ、Ｗ−１３５、およびＹ多糖特異的ＩｇＧ
ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ、およびＭｅｎＹ特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の滴定を、これまでに記載されているアッセイ［２９７］にしたがって、それぞれのマウスに由来する個々の血清について行った。Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェル平底プレートを、５μｇ／ｍｌのメチル化ヒト血清アルブミンの存在下で、５μｇ／ｍｌの精製した髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清学的グループＡ，Ｃ、Ｗ、またはＹの多糖で別々に４℃で一晩コーティングした。プレートを、０．３３％のＢｒｉｊ−３５（ＰＢＳ−Ｂｒｉｊ）を含むＰＢＳで３回洗浄し、その後、５％のＦＣＳと０．３３％のＢｒｉｊ−３５（ＰＢＳ−ＦＣＳ−Ｂｒｉｊ）を含む２００μｌ／ウェルのＰＢＳで、ＲＴで１時間飽和させた。１つの血清をＰＢＳ−ＦＣＳ−Ｂｒｉｊの中に稀釈し、そして４種類の多糖に対して別々に滴定した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳ−Ｂｒｉｊで洗浄し、ＰＢＳ−ＦＣＳ−Ｂｒｉｊの中に稀釈したアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＳＡ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。結合した抗体を、ジエタノールアミン溶液中の１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニル−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＳＡ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して明らかにした。２０分間のインキュベーションの後、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。予備免疫の値は、一貫して、０．１より低いＯＤ値を生じた。結果を、プレートとプレートとの偏差を最少にするために、平行分析によって内部参照血清と比較した力価として表した。ＩｇＧ力価は、基準線アッセイ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌｉｎｅ  Ａｓｓａｙ）［２９８］を使用して計算し、ＥＵ／ｍｌの対数として表した。
【０２２２】
４．２  髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）血清学的グループＡおよびＣ多糖特異的イソ型ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ
抗ＭｅｎＡおよび抗ＭｅｎＣ特異的ＩｇＧａおよびＩｇＧ２抗体を測定するために、プレートを、ＰＢＳ中の５μｇのメチル化ヒト血清アルブミン／ｍｌと５μｇの精製したＭｅｎＡまたはＭｅｎＣ／１ｍｌで、ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡについて上記に記載したように、４℃で一晩コーティングした。その後、プレートを洗浄し、そしてＰＢＳ−ＦＣＳ−Ｂｒｉｊで、ＲＴで１時間ブロックした。血清試料を、１：１００から開始して並行して２つのプレートにまたがってＰＢＳ−ＦＣＳ−Ｂｒｉｊ中で稀釈し、そして３７℃で２時間インキュベートした。ビオチン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）を添加した。３７℃で２時間のインキュベーションの後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ）をウェルに添加し、そしてプレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを、基質であるＯ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド（Ｓｉｇｍａ）を用いて発色させた。力価を、ＯＤ  ０．５（４５０ｎｍ）での血清稀釈率の逆数として計算した。
【０２２３】
４．３  Ｎ１９−、ＴＴ−、ＨＡ−、またはＣＲＭ−、ＤＴ−特異的ＩｇＧ抗体
Ｎ１９、ＣＲＭ１９７担体タンパク質およびその元のタンパク質（その中には、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ヘモフィルス・インフルエンザ菌（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、ＨＡ）、およびジフテリアトキソイド（ＤＴ））の滴定を、以前に記載されたように［２９９、３００］、プールした血清について行った。簡単に説明すると、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を、２μｇ／ｍｌのＮ１９、ＴＴ、ＨＡ、またはＣＲＭ１９７、あるいは、５μｇ／ｍｌのＤＴ抗原を別々に含む２００μｌのＰＢＳ溶液で、４℃で一晩コーティングした。その後、プレートを洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ（１％）で、３７℃で１時間ブロックした。血清試料を、１：１００から開始してプレートにまたがってＰＢＳ−ＢＳＡ（１％）−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）の中に稀釈し、そして３７℃で２時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧとｐ−ニトロフェニル−ホスフェートを、検出のために使用した。抗原特異的抗体の存在を上記のようにして明らかにした。結果は、プレートとプレートとの偏差を最少にするために、平行分析によって内部参照血清と比較した力価として表した。
【０２２４】
４．４  髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）血清学的グループＡおよびＣのＩｇＧ抗体の親和力
髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）のグループＡおよびＣ特異的ＩｇＧ抗体の親和力を、十分に確立されている方法［３０１、３０２］にしたがって、７５ｍＭのチオシアン酸アンモニウム「ＮＨ４ＳＣＮ」をカオトロピック剤として使用して、プールした血清のＥＬＩＳＡ溶出アッセイによって評価した。アッセイの検証には、４ＭのＮＨ４ＳＣＮとのインキュベーション後の抗原の安定性の評価を含めた［３０３］。Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェル平底プレートを、５μｇ／ｍｌの精製した髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清学的グループＡおよびＣの多糖で別々に４℃で一晩コーティングした。溶液を吸引し、ウェルを、ＰＢＳ−Ｂｒｉｊで３回洗浄し、そして、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ−ＦＣＳ−Ｂｒｉｊ）で、室温で１時間ブロックした。プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ−Ｂｒｉｊ）で洗浄した。試験血清と参照血清を稀釈緩衝液ＰＢＳ−ＦＣＳ−Ｂｒｉｊの中に稀釈し、そして１つのマイクロプレートの中に、２連の２倍の段階稀釈物を準備した。３７℃で２時間のインキュベーションの後、プレートを３回洗浄した。２連のもののうちの１つの中の血清試料を、血清稀釈緩衝液ＰＢＳ−ＦＣＳ−Ｂｒｉｊの中の７５ｍＭのＮＨ４ＳＣＮと共に、室温で１５分間インキュベートした。一方、２連のうちの他方は、希釈緩衝液だけと共にインキュベートした。洗浄後、上記のＥＬＩＳＡアッセイと同様に、プレートをアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＳＡ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともにインキュベートした。７５ｍＭのＮＨ４ＳＣＮでの溶出後にプレートに結合したままである抗体の量を、１００％の結合抗体に相当する標準ＥＬＩＳＡ曲線との比較によってＥＬＩＳＡ単位で計算した。高親和力のＩｇＧ力価を、時間の関数として結合したままである抗体の割合（％）で表した。
【０２２５】
５．髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）株Ａ、Ｃ、Ｗ、およびＹに対する血清殺菌アッセイ
殺菌性抗体力価の測定に使用した方法は、以前に記載されている（９４）。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清学的グループＡ（Ｆ８２３８株）、Ｃ（１１株）、Ｗ（２４００７０株）、またはＹ（２４０５３９株）標的株を、チョコレート寒天プレート上で５％のＣＯ２を用いて３７℃で一晩増殖させた（凍結させたストックから始めた）。６００ｎｍで０．０５〜０．１の吸光度を有しているコロニーを、０．２５％のグルコースを含む７ｍｌのＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ培養液に懸濁させ、そして、５％のＣＯ２を用いて３７℃で１．５時間、震盪させながらインキュベートして、６００ｎｍで約０．２４〜０．４の吸光度に到達させた。細菌細胞懸濁液を、ＧＢＳＳ緩衝液（Ｇｅｙ’ｓ平衡化塩溶液）（ＳＩＧＭＡ）および１％のＢＳＡ（アッセイ緩衝液）中に稀釈して、およそ１０５ＣＦＵ／ｍｌとした。熱不活化（５６℃で３０分間）シングル血清またはプールした血清試料（５０μｌ）を、９６ウェル平底組織培養処理プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）において緩衝液中で２倍に段階稀釈した（４の出発稀釈の逆数）。等容量の細胞懸濁物およびプールしたベビーラビット補体（２５％）を穏やかに混合し、そして２５μｌを段階稀釈した血清に添加した。個々のウェルの最終容量は５０μｌであった。対照には、（ｉ）細菌−補体−緩衝液（補体依存性についての対照）、および（ｉｉ）熱不活化させた試験血清−細菌−緩衝液（補体依存性についての対照）。ベビーラビットの補体の添加の直後に、１０μｌの対照を、後屈（ｔｉｌｔ）法によってＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天プレート上にプレートした（０時点、ｔ０）。マイクロタイタープレートを、５％のＣＯ２を用いて３７℃で１時間、全ての血清学的グループの標的株についてインキュベートした。インキュベーション後、１０μｌのそれぞれの試料を、スポットとして、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天プレート上にプレートし、一方、１０μｌの対照を、後屈（ｔｉｌｔ）法によってプレートした（時点１、ｔ１）。寒天プレートを、５％のＣＯ２を用いて３７℃で１８時間インキュベートし、そしてｔ０およびｔ１に対応するコロニーをカウントした。ｔ１でのコロニーは、補体または血清の最終的な毒性の対照であり、そして、ｔ０でのコロニーの１．５倍を有していた。殺菌力価は、血清および補体とのインキュベーションの前（ｔ０）に存在していた標的細胞の数と比較して、≧５０％の死滅を生じる血清稀釈の逆数として表した。力価は、希釈後の少なくとも２つが≧９０％の細菌の死滅を生じた場合に、信頼できると考えた。
【０２２６】
Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｔ検定（２回の試行）を使用して、グループ間での、および様々な時点での抗体力価を比較した。＜０．０５のＰ値を統計学的に有意であると考えた。
【０２２７】
６．細胞によって媒介される免疫反応
６．１  Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹで感作させたＢＡＬＢｃマウスのＮ１９−エピトープ、Ｎ１９またはＮ１９結合体を用いたインビトロでの増殖アッセイ
Ｎ１９−結合体での免疫化によって担体−エピトープ特異的Ｔ細胞が感作させられるかどうかを評価するために、上記のように、４価のＮ１９−ＭｅｎＡＣＷＹ（約６または２μｇのタンパク質／用量）で２回または３回免疫化したマウスから、脾臓を、最後の免疫化の１０日後に取り出し、そしてＮ１９からなる１つのペプチド、または遊離のＮ１９もしくは結合させたＮ１９でのインビトロでの刺激の後に増殖するそれらの能力について試験した［３０４］。このアッセイで使用した精製したＮ１９には、干渉を起こし得る検出できるほどのＬＰＳは含まれていなかった。それぞれのマウスのグループの脾臓をプールし、そして手作業で分散させた。一旦、洗浄し、カウントした後、細胞を、平底９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＮＹ）の中で、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノール、０．１５ｍＭのＬ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ビタミン、ピルビン酸ナトリウム、および必須ではないアの混合物（ＧＩＢＣＯ  ＢＬＲ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１００×ストック溶液の１％）、ならびに５％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＲＰＭＩ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に５×１０５細胞／ウェルの密度で培養した。細胞は、０．１２から３０μＭ／ウェル（２または３倍稀釈）（約０．１５〜５０μｇ／ｍｌ）の個々のペプチド存在下で３連で培養したか、あるいは、細胞を、同じ培地の中に稀釈した０．００４から１μＭの遊離のもしくは結合させられたＮ１９の存在下で３連のウェルに添加して、全部で２００μｌ／ウェルとした。対照を、完全培養培地または１０μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡを用いて行って、細胞の増殖能力を明らかにした。プレートを５％のＣＯ２下で３７℃でインキュベートした。５日後、細胞を、０．５μＣｉの［３Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １ｍＣｉ／ｍｌストック溶液）／ウェルと共にさらに１８時間パルスし、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いて回収し、そして液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてカウントした。増殖アッセイの結果は、刺激しなかった対照培養物（バックグラウンド）の１分あたりのカウントに対する、刺激した実験培養物中での１分当たりのカウント（ｃｐｍ）の比によって計算した、刺激指数（ＳＩ）として表した。３連の培養物を平行して実行した。ＳＩ＞２をポジティブと考えた。
【０２２８】
マウスシステムでのＮ１９の強いヘルパー効果が、Ｎ１９にもともと含まれるＣＤ４＋エピトープのいずれかによって媒介されたものであるかを決定するために、Ｎ１９−ＭｅｎＡＣＷＹ（６μｇのＮ１９／用量）で２回または３回感作させたＢＡＬＢ／ｃマウスに由来する脾細胞のＴ細胞増殖を評価した。脾細胞を、様々な濃度のＮ１９ペプチド、または完全なＮ１９（遊離のもの、または多糖に結合させたもののいずれか）でインビトロで刺激した。図１５に示すように、遊離の、または結合させたＮ１９の存在下で、リンパ球は実質的に増殖した。本発明者らはまた、本発明者らの実験の全てにおいて一貫して、Ｐ２３ＴＴペプチドを用いたＴ細胞増殖も観察した（図１５および１６）。他の試験したペプチドのうち、本発明者らは、Ｐ３０ＴＴ、Ｐ３２ＴＴ、ＨＡ、およびＨＢｓＡｇによって誘導されたＴ細胞増殖を、高濃度で存在する場合にだけではあるが、観察できた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いてアッセイを行った場合には、いずれのエピトープもリンパ球の増殖を刺激することはなく、そして、Ｎ１９は最も高い濃度でのみ細胞を刺激した。
【０２２９】
さらに、本発明者らは、何らかのＭＨＣ−制限パターンが存在するかどうかを調べるために、遺伝的背景が同一であるマウスの株においてＮ１９特異的Ｔ細胞活性化を測定した。活性化は、種々の濃度の１）遊離のＮ１９、または２）多糖に結合させたＮ１９のいずれかの存在下で、あるいは、３）１つのＮ１９構成ペプチドを用いて、または４）遊離の多糖成分を用いて、様々な遺伝的背景を有しているマウスの脾臓細胞の増殖反応を測定することによって、インビトロで分析した。本発明者らは、遊離のＮ１９は全ての株においてＴ細胞活性化を誘導したが、Ｎ１９結合体は、試験した株においては様々な増殖反応を生じたことを観察した（図１７）。Ｈ−２応答に対する背景遺伝子（ＢＡＬＢまたはＢ１０）の影響を評価することにより、本発明者らは、Ｈ−２ｄハプロタイプが、様々なエピトープに特異的なＴ細胞を生じたことを観察した。Ｐ２３ＴＴエピトープのＴ細胞リコールは、２つの遺伝的には無関係なマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｈ−２ｄとＢ１０．ＢＲ  Ｈ−２ｋ）において生じた。一方、様々なＨ−２ハプロタイプを有している遺伝的背景が同じであるマウス（ＢＡＬＢまたはＢ１０）は、様々なエピトープ特異的Ｔ細胞増殖を生じ、このことは、ＭＨＣ複合体以外の遺伝的要因もまた、反応に影響を与えてることを示唆している。しかし、同じ遺伝的背景（ＢＡＬＢ）を有しているマウスは、Ｐ３０ＴＴエピトープに反応性であるＴ細胞を生じた。全体的には、複数のペプチドはそれらのＨ−２制限レベルが異なるという事実にもかかわらず、全ての株はＮ１９結合体を有している４種類の多糖の全てに対して良好な抗体反応を高めることができた。さらに、本発明者らは、４種類の多糖のいずれによっても、任意の試験した株において増殖を誘導できたことを観察し、このことは、これらがＴ細胞依存性抗原であり、担体タンパク質への結合によってそれらの特性、例えば、多糖特異的Ｔ細胞活性化を誘導する能力に影響はないことを示している。
【０２３０】
６．２  マウスエピトープ特異的Ｔ細胞増殖の評価：免疫化プロトコールおよび増殖アッセイ
９５％の純度の合成ペプチド（Ｐ２ＴＴ、Ｐ２１ＴＴ、Ｐ２３ＴＴ、Ｐ３０ＴＴ、Ｐ３２ＴＴ、ＨＡ、およびＨＢｓＡｇ）を、Ｐｒｉｍｍ  ｓ．ｒ．ｌ．（Ｉｔａｌｙ）から購入した。３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのグループに、フロイントの完全なアジュバント（ＣＦＡ）の中に乳化させた５０μｇの１つのペプチド（Ｐ２ＴＴ、Ｐ３０ＴＴ、Ｐ２３ＴＴ、Ｐ３２ＴＴ、ＨＡ、ＨＢｓＡｇ）またはＮ１９を含む５０μｌの用量／マウスで、尾の基部に皮下で免疫化した。７日後、マウスを屠殺し、鼠径リンパ節および大動脈リンパ節を取り出し、それぞれのグループのマウスに由来するものをプールし、単細胞懸濁物を調製した。細胞を、平底９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）において、完全培地（脾臓細胞について上記に記載したように、ＲＰＭＩを補充した）中で３×１０５細胞／ウェルの密度で培養した。同じ培地の中に稀釈したＮ１９または相同ペプチドを、１匹のマウスまたはプールした培養細胞について３連のウェルに、３種類の濃度（ペプチドの全てについては、１５、７．５、および３．７５ｍＭ、Ｎ１９については、１０、１、および０．１μｇ／ｍｌ）で添加した。３７℃で５％のＣＯ２での５日間のインキュベーションの後、細胞を、０．５μＣｉ［３Ｈ］チミジンで１６時間パルスし、その後、上記に記載したように回収した。クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の表面タンパク質に由来する無関係なペプチドＣＨ６０（コンピューターでは、ＨＬＡ−Ａ２に結合すると推測される）を、これらの実験でネガティブ対照として使用した。
【０２３１】
図１８は、個々のペプチドでのＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化によって、Ｐ２３ＴＴ、ＨＡ、ＨＢｓＡｇペプチド、およびＮ１９に特異的なＴ細胞応答が生じたが、無関係なＣＨ６０ペプチドについては特異的なＴ細胞応答は生じなかったことを示す。Ｐ３２ＴＴで免疫化したマウスは、同じペプチドに反応することはできなかった。アジュバント対照マウスに由来する細胞はＣｏｎＡに反応して増殖したが、いずれのペプチドにも、またＮ１９にも反応せず、これによって、ペプチドが細胞分裂促進性ではないことが示されている。ヒトエピトープであるにもかかわらず、これらの知見は、マウスのシステムにおいてもまたＮ１９の強い担体効果を説明することができる。
【０２３２】
本発明は、ほんの一例として記載されており、改良を行うことができ、なおも本発明の範囲および精神に留まることが理解されるであろう。
【０２３３】
【数１】
2015155464.tif 000012
【０２３４】
【数２】
2015155464.tif 000013
【０２３５】
【数３】
2015155464.tif 000014
【０２３６】
【数４】
2015155464.tif 000015
【０２３７】
【数５】
2015155464.tif 000016
【０２３８】
【数６】
2015155464.tif 000017
【０２３９】
【数７】
2015155464.tif 000018
【０２４０】
【数８】
2015155464.tif 000019
【０２４１】
【数９】
2015155464.tif 000020
【０２４２】
【数１０】
2015155464.tif 000021
【０２４３】
【数１１】
2015155464.tif 000022
【０２４４】
【数１２】
2015155464.tif 000023
【０２４５】
【数１３】
2015155464.tif 000024
【０２４６】
【数１４】
2015155464.tif 000025
【０２４７】
【数１５】
2015155464.tif 000026
【図１】
2015155464.tif 000027
【図２】
2015155464.tif 000028
【図３】
2015155464.tif 000029
【図４】
2015155464.tif 000030
【図５】
2015155464.tif 000031
【図６】
2015155464.tif 000032
【図７】
2015155464.tif 000033
【図８】
2015155464.tif 000034
【図９】
2015155464.tif 000035
【図１０】
2015155464.tif 000036
【図１１】
2015155464.tif 000037
【図１２−１】
2015155464.tif 000038
【図１２−２】
2015155464.tif 000039
【図１３−１】
2015155464.tif 000040
【図１３−２】
2015155464.tif 000041
【図１４】
2015155464.tif 000042
【図１５】
2015155464.tif 000043
【図１６】
2015155464.tif 000044
【図１７】
2015155464.tif 000045
【図１８】
2015155464.tif 000046
【配列表】
2015155464000001.app
【外国語明細書】
2015155464000001.pdf