(57)【要約】【課題】ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）樹脂の結晶核剤として有用な末端修飾低分子量ＰＨＡを、微生物を用いて製造することができる新規な製造方法を提供する。【解決手段】本発明に係る、重量平均分子量が５，０００〜４０，０００であり、カルボキシ末端が修飾されたＰＨＡの製造方法は、ＩＶ型のＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物をアルコールの存在下で培養するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＶ型のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有する微生物をアルコールの存在下で培養することを特徴とする、重量平均分子量が５，０００〜４０，０００であり、カルボキシ末端が修飾されたポリヒドロキシアルカン酸を製造する方法。
【請求項２】
アルコールを加えた培地で微生物を培養するものである請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記アルコールは、炭素数が１〜６の低級アルコールである請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記アルコールは、エタノールである請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記培地中のアルコール濃度は、０．０１〜５体積％である請求項２〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記カルボキシ末端がエステル化されたものである請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記カルボキシ末端が、炭素数が１〜６の低級アルキルによってエステル化されたものである請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記カルボキシ末端が、エチルエステル化されたものである請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）を少なくとも含むポリヒドロキシアルカン酸を製造するものである請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）またはポリ（３−ヒドロキシ酪酸―ｃｏ―３−ヒドロキシ吉草酸）を製造するものである請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ＩＶ型のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有する微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌である請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓである請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記ＩＶ型のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有する微生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のＩＶ型のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子、ケトチオラーゼ遺伝子、およびアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子によって形質転換されたものである請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１４】
前記形質転換された微生物が大腸菌である請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓである請求項１３または１４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重量平均分子量が５，０００〜４０，０００の低分子量であり、カルボキシ末端が修飾された低分子量ポリヒドロキシアルカン酸を、微生物を用いて製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、使用済み廃棄プラスチックによる環境問題が深刻化するにつれ、微生物の働きによって分解される生分解性プラスチックが注目を集めている。これまでに、熱可塑性の生分解性プラスチックとして、乳酸などの脂肪族ヒドロキシカルボン酸、多価アルコールや多価カルボン酸などを繰り返し単位とする（共）重合体の生分解性ポリエステル樹脂が開発されている。しかし、生分解性ポリエステル樹脂は結晶化速度が遅いという欠点を抱えている。なかでも脂肪族ヒドロキシカルボン酸の（共）重合体であるポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡと略記する。）樹脂は、結晶化速度が非常に遅い（非特許文献１）。結晶化速度が遅いと、溶融状態からの固化が遅くなりＰＨＡ樹脂の成形加工が困難になる。また、成形加工時のラインスピードなども遅くなり、生産性が低下するという弊害を招く。
【０００３】
そこで、ＰＨＡ樹脂の結晶化を促進して加工性に優れたＰＨＡ樹脂を製造するため、結晶化する際の核として作用する結晶核剤を用い、化学合成に比べて簡単で安価な微生物を利用した製造方法が提案されている。例えば、特許文献１および２には、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）や、融点の高い特定のポリ(３−ヒドロキシ酪酸−ｃｏ−３−ヒドロキシ吉草酸)（ＰＨＢＶ）、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸―ｃｏ―３−ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＢＨ）などを結晶核剤として用いる方法が開示されている。しかしながら、例えば特許文献２の実施例で用いられるＰＨＢは、融点が約１７４℃、重量平均分子量は２０万以上と非常に大きいため、ＰＨＡ樹脂に均一に分散させることが困難であり、有効な結晶核剤とは言えない。
【０００４】
そこで、より低分子量のＰＨＢを製造するため、土壌中で最も多種多様に存在するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌を用いた発酵生産技術が開発されている。例えば非特許文献２には、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＢ−４）をグルコース含有培地中で長時間培養すると、ＰＨＢの重量平均分子量が、通常の約２００万から約１４万まで低下することが報告されている。また、非特許文献３には、バチルス属細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＩＮＴ００５）由来の、ＩＶ型のＰＨＡ合成酵素遺伝子と；ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来の、β−ケトチオラーゼ遺伝子（ｐｈａＡ）およびアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（ｐｈａＢ）を大腸菌に導入し、グルコース含有培地中で培養すると、数平均分子量が４８，０００の低分子量ＰＨＢが生産されたことが報告されている。更に非特許文献４には、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＢ−４）由来の、ＰＨＡ合成酵素遺伝子（ｐｈａＣ）およびｐｈａＲと；ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来の、β−ケトチオラーゼ遺伝子（ｐｈａＡ）およびアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（ｐｈａＢ）を大腸菌に導入し、グルコース含有培地中で培養すると、より低分子量のＰＨＢ（重量平均分子量４２，０００、数平均分子量２０，０００）が生産されたことが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５６９３３８９号明細書
【特許文献２】特開平２００４−１６１８０２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ”，ｖｏｌ４，Ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ  ＩＩＩ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ，ｐ６７
【非特許文献２】Ｋ．  Ｍｉｚｕｎｏ等,  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，  ｖｏｌ９５，１３３５−１３３９（２０１０）
【非特許文献３】Ｊ．Ａｇｕｓ等，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｌｉｔｙ，  ｖｏｌ９５，２２５０−２２５４（２０１０）
【非特許文献４】Ｓ．Ｔｏｍｉｚａｗａ等，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｖｏｌ１２，２６６０−２６６６（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述した非特許文献３、４の方法によれば、分子量が低減されたＰＨＢが得られるため、これを結晶核剤として用いれば、ＰＨＡ樹脂の結晶化速度が向上することが期待される。しかし、加工性などの観点から、結晶化速度の更なる向上が求められている。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＰＨＡ樹脂の結晶化を著しく促進することができ、ＰＨＡ樹脂の結晶核剤として有用な末端修飾低分子量ＰＨＡを、微生物を用いて製造することができる新規な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＰＨＡ樹脂の結晶核剤として有用な末端修飾低分子量ＰＨＡを、化学合成に比べて簡単で安価な微生物法を用いて製造可能な方法を提供するため、鋭意検討した。その結果、ＩＶ型のＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物をアルコールの存在下で培養すれば所期の目的が達成されることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本明細書において結晶核剤とは、ＰＨＡ樹脂を結晶化する際の核として作用するものをいう。
【００１１】
上記課題を解決し得た本発明に係る、重量平均分子量が５，０００〜４０，０００であり、カルボキシ末端が修飾されたＰＨＡの製造方法は、ＩＶ型のＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物を、アルコールの存在下で培養するところに要旨を有するものである。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態において、アルコールを加えた培地で培養する。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態において、前記アルコールは、炭素数が１〜６の低級アルコールである。更に好ましくはエタノールである。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態において、前記培地中のアルコール濃度は、０．０１〜５体積％である。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、カルボキシ末端が修飾されたＰＨＡとは、前記カルボキシ末端がエステル化されたものである。より好ましくは、カルボキシ末端が炭素数１〜６の低級アルキルによってエステル化されたものであり、更に好ましくは、カルボキシ末端がエチルエステル化されたものである。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態において、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）を少なくとも含むＰＨＡを製造するものである。例えば、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）またはポリ（３−ヒドロキシ酪酸―ｃｏ―３−ヒドロキシ吉草酸）を製造するものである。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態において、前記ＩＶ型のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有する微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌である。より好ましくは、前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓである。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、前記ＩＶ型のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有する微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のＩＶ型のＰＨＡ合成酵素遺伝子、ケトチオラーゼ遺伝子、およびアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子によって形質転換されたものである。形質転換された微生物として、より好ましくは大腸菌である。また、好ましいＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、結晶核剤として極めて有用な末端修飾低分子量ＰＨＡを、簡単で安価な微生物法を用いて製造することができる。本発明の製造方法によって得られた低分子量ＰＨＡをＰＨＡ樹脂に添加することにより、当該樹脂の結晶化速度が大幅に向上し、加工性を著しく改善することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＰＨＢの合成経路を説明するための模式図である。
【図２】図２は、製造例１で使用したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＢ−４のＰＨＡ合成酵素遺伝子（ｐｈａＲ、ｐｈａＣ）発現ベクターの構成を示す図である。
【図３】図３は、比較物質であるエチル−３−ヒドロキシ酪酸と、実施例２で得られた低分子量ＰＨＡ（末端がエチルエステル化されたＰＨＢ）の1Ｈ−ＮＭＲチャートである。
【図４】図４は、図３の1Ｈ−ＮＭＲチャートを拡大した図である。
【図５】図５は、実施例２で得られた低分子量ＰＨＡ（末端がブチルエステル化されたＰＨＢ）の1Ｈ−ＮＭＲチャートである。
【図６】図６は、図５の1Ｈ−ＮＭＲチャートを拡大した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下の記載では、本発明の製造方法によって得られるものであり、結晶核剤として有用なカルボキシ末端修飾低分子量ＰＨＡと；当該カルボキシ末端修飾低分子量ＰＨＡを用いて結晶化速度が改善される、改善対象のＰＨＡ樹脂とを区別するため、特に前者のＰＨＡをｓＰＨＡと略記する場合がある。
【００２２】
はじめに、本発明の加工性改善対象であるＰＨＡ樹脂について説明する。
【００２３】
（ＰＨＡ樹脂）
ＰＨＡは、微生物が菌体内に蓄積する熱可塑性の生分解性プラスチックである。ＰＨＡとしては、例えば３−ヒドロキシアルカン酸や４−ヒドロキシアルカン酸などのモノマー成分を構成単位とするホモポリマーまたは共重合ポリマーが知られている。なかでも共重合ポリマーは、モノマー成分の組成比によって硬質から軟質の幅広い性質を発揮し得るため、広範な用途に適用することができる。なお共重合ポリマーは、一般的にはホモポリマーに比べて結晶化度が低下するという不具合があるが、本発明の結晶核剤を使用することでこの不具合を克服できるため、本発明では共重合ポリマーが好ましい。
【００２４】
ＰＨＡの共重合ポリマーとして、代表的には、下式で表されるポリ（３−ヒドロキシ酪酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）（以下、ＰＨＢＨで略記する場合がある。）が挙げられる。
【００２５】
【化１】
2015029484.tif 000002
式中、ｍ、ｎは同一または異なって、１以上の整数を表す。
【００２６】
ＰＨＢＨは、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨ）をモノマー単位とする共重合体である。３ＨＢのホモポリマーは結晶性が高く、硬くて脆い性質を有するため、応用範囲が限られているが、３ＨＨなどの他のモノマーユニットと共重合させることで、軟質性を付与させることができる。そのような共重合体であるＰＨＢＨでは、ＰＨＢＨ中に占める３ＨＨの比率を高めることで、ＰＨＢＨは結晶化度が低下し、柔軟性が向上し、同時に融点も下げられるため、応用範囲の拡大が期待できる。
【００２７】
軟質性を付与できる３ＨＨ以外のモノマーユニットとして、３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）、４−ヒドロキシ酪酸（４ＨＢ）などが挙げられる。これら３ＨＨ、３ＨＶ、４ＨＢなどのモノマーユニットは、適宜、組み合わせて３ＨＢと共重合することも可能である。本発明の加工性改善対象である、ＰＨＡの共重合ポリマーとしては、上記ＰＨＢＨのほか、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸−ｃｏ−３−ヒドロキシ吉草酸）（以下、ＰＨＢＶで略記する場合がある。）；ポリ（３−ヒドロキシ酪酸−ｃｏ−３−ヒドロキシ吉草酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）；ポリ（３−ヒドロキシ酪酸−ｃｏ−４−ヒドロキシ酪酸）などが挙げられる。本発明では、物性などの観点から、ＰＨＢＨまたはＰＨＢＶが好ましく、ＰＨＢＨがより好ましく用いられる。また、ＰＨＢＨとしては、全モノマーユニット１００モル％に占める３ＨＨの比率を、例えば３〜２０モル％、好ましくは３〜１５モル％の範囲に制御することが推奨される。本発明の結晶核剤は後述するように結晶化速度向上効果が特に優れるため、３ＨＨの割合が比較的高い場合でも、実用上、十分な結晶化促進効果が得られる。
【００２８】
（本発明の製造方法）
次に、ＰＨＡ樹脂の結晶核剤として有用な、本発明に係るカルボキシ末端修飾低分子量ＰＨＡ（ｓＰＨＡ）の製造方法を詳しく説明する。
【００２９】
本発明の製造方法は、重量平均分子量（Ｍｗ）が５，０００〜４０，０００であり、カルボキシ末端が修飾されたＰＨＡを、微生物を用いて製造する方法であって、ＩＶ型のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有する微生物をアルコールの存在下で培養するところに特徴がある。
【００３０】
ＰＨＡは種々の生合成経路によって合成されるが、詳細な説明を行なう前に、その一例として、図１に示すＰＨＢの合成経路について説明する。
【００３１】
ＰＨＢの合成には、β−ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素（ＰｈａＢ）、およびＰＨＡ合成酵素（ＰｈａＣ）の三つの酵素が関与することが知られている。これらのうちＰｈａＡは、２分子のアセチル−ＣｏＡが縮合してアセトアセチル−ＣｏＡが形成される反応を触媒する酵素である。また、ＰｈａＢは、補酵素ＮＡＤＰＨの存在下でアセトアセチル−ＣｏＡを還元し、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを形成する反応を触媒する酵素である。また、ＰｈａＣは、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを基質としてＰＨＢを合成する反応の触媒活性を有する酵素である。上述のようにＰｈａＣは、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを基質として種々のＰＨＡを合成することができるが、その基質特異性、サブユニット構造などに基づいて、Ｉ〜ＩＶ型が知られている。
【００３２】
つまり、例えばＰＨＢの場合、図１に示すように、まず、アセチル−ＣｏＡ２分子がβ−ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）の作用で縮合され、アセトアセチル−ＣｏＡとなる。続いて、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素（ＰｈａＢ）の作用により、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへとＮＡＤＰＨ依存的に還元される。最後にＰＨＢ合成酵素（ＰｈａＣ）により重合され、ＰＨＢが合成される。
【００３３】
上述したように本発明では、ＩＶ型のＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物を用いる。ＩＶ型のＰＨＡ合成酵素は、ＰｈａＣとＰｈａＲの２つのサブユニットから構成されることが知られている（例えば、前述した非特許文献４）。上記非特許文献４には、ＩＶ型のＰＨＡ合成酵素のうち、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＢ−４）由来のＰｈａＣが、ＰＨＡの分子量低減に寄与することや、培養時間と培養温度に依存してＰＨＡの分子量が低減することが記載されている。本発明者らが、ＩＶ型のＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物について詳細に検討した結果、当該微生物を、アルコールの存在下で培養すれば、所期の目的が達成されることが判明した。
【００３４】
本発明において、上記ＩＶ型のＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌が好ましく使用でき、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＩＮＴ００５がより好ましく、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＢ−４がさらに好ましい。
【００３５】
或いは、本発明においては、上記ＩＶ型のＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌以外の微生物（以下、宿主微生物と呼ぶ場合がある。）に、ＩＶ型のＰＨＡ合成酵素遺伝子（好ましくは、更にβ−ケトチオラーゼ遺伝子およびアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の１つまたは複数）を組み込んだ形質転換体を用いることもできる。
【００３６】
ここで、上記ＩＶ型のＰＨＡ合成酵素遺伝子としては、上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のＰＨＡ合成遺伝子が好ましく使用でき、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＩＮＴ００５由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子がより好ましく、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＢ−４由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子がさらに好ましい。
【００３７】
また、上記宿主微生物としては、上記ＩＶ型のＰＨＡ合成酵素遺伝子を発現させたとき、ＰＨＡを生産できる微生物であれば特に限定されないが、例えば、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）に属する微生物（例えばＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属する微生物、ＰＨＡ合成酵素の基質を供給できるように改変された微生物［例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に属する微生物］などが挙げられる。これらのうち、入手のし易さ、増殖能などを考慮すると、大腸菌が好ましく用いられる。
【００３８】
上記宿主微生物は、前述したＰＨＢの上記合成経路を考慮すれば、更に、ｐｈａＡ（β−ケトチオラーゼ遺伝子）やｐｈａＢ（アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子）を含む微生物を用いることが好ましい。
【００３９】
具体的には、上記ｐｈａＡの由来となる微生物として、例えば、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などの微生物が挙げられる。特に好ましくはラルストニア属の微生物であり、例えば、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）などが挙げられる。
【００４０】
また、上記ｐｈａＢの由来となる微生物は、前述したｐｈａＡ由来の微生物と同じものを用いることができる。具体的には、例えば、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などの微生物が挙げられる。特に好ましくはラルストニア属の微生物であり、例えば、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）などが挙げられる。
【００４１】
本発明に用いられる上記形質転換体の具体例としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＢ−４由来のＩＶ型のｐｈａＣおよびｐｈａＲと、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｐｈａＡおよびｐｈａＢの発現プラスミド（例えば、ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＹＢ４ＡＢ）を導入したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９などが挙げられる。
【００４２】
本発明では、以上で説明した微生物を、アルコールの存在下で培養する。微生物培養に用いられる一般的な炭素源としては、例えばグルコースなどの炭水化物、炭素数４以上の油脂関連物質などが用いられるが、アルコールは通常用いられない。本発明では、アルコールを炭素源としてではなく、ＰＨＡの分子量低減剤として用いる。本発明者らの検討結果によれば、ＰＨＡの生産に通常用いられる炭素源と共に、アルコールの存在下で、上記微生物を培養すれば、所望とするｓＰＨＡが得られることが判明した。ＰＨＡの結晶核剤として有用なｓＰＨＡを得るために、アルコールの存在下で上記微生物を培養することは、これまで開示されていない。
【００４３】
本発明では、炭素数が１〜６の低級アルコールの使用が好ましい。前記アルコールは、直鎖状、分岐状のいずれも含むが、直鎖状が好ましい。より好ましくは、炭素数１〜４のアルコールであり、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが挙げられる。これらは単独で使用しても良いし、二種以上を併用しても良い。工業的な利用のしやすさや汎用性などを考慮すると、更に好ましくはエタノールである。
【００４４】
本発明によれば、使用するアルコールが、ｓＰＨＡの末端のカルボン酸基に結合することで、ｓＰＨＡ末端が修飾される。例えばエタノールを用いるときは、ｓＰＨＡの末端が、実施例４に示すようにエチルエステル化される。
【００４５】
本明細書において「アルコールの存在下で培養する」とは、アルコールを培地中に添加して培養する場合（外部添加）のみならず、アルコールを外部添加せずアルコールが発生する条件下で培養する場合の両方を含む趣旨である。いずれの場合でも、所望とするｓＰＨＡを得ることができるが、好ましくは、アルコールを培地中に添加して培養する。
【００４６】
アルコールを培地中に添加して培養する場合、培地中の好ましいアルコール濃度（アルコール添加時の初期濃度を意味し、アルコールを一種類含むときは単独の濃度であり、二種類以上含むときは合計濃度である）の上限は、使用する微生物の種類などによっても相違するが、例えば５体積％以下である。アルコール添加による上記作用を有効に発揮するとの観点からのみすれば、上記アルコール濃度は高い程良いが、アルコール濃度が高くなり過ぎると、微生物の生育を阻害するようになる。より好ましくは２体積％以下であり、更に好ましくは１体積％以下である。また、培地中の好ましいアルコール濃度の下限は、０．０１体積％以上であり、より好ましくは０．０５体積％以上である。
【００４７】
なお、培養中、培地中のアルコール濃度が上記の好ましい範囲に保たれるように、経時的に培地濃度をチェックすることが好ましい。例えば、培地中のアルコール濃度が低下したときは、経時的にアルコールを補充することもできる。
【００４８】
培地中にアルコールを添加する時期は、ｓＰＨＡを生産できる限り、特に限定されず、培養の初期、中期、後期のいずれの段階でも、アルコールを添加することができる。但し、一旦、培地中にアルコールを添加した後は、引き続き、当該アルコール添加培地で培養を行なうことが好ましく、培養途中で、アルコールを含まない培地に移し換えない方が好ましい。培養途中で、アルコール非添加培地に培地を移し変えると、分子量低減効果などに問題があるためである。
【００４９】
例えば後記する実施例１のように、予め所定濃度のアルコールを添加した培地を用い、微生物の培養中、当該培地中で培養することができる。或いは、後記する実施例２のように、まず、アルコールを添加しない培地にて微生物を培養した後、当該微生物を、アルコールを添加した培地中に植え継ぎ、所望とするｓＰＨＡが得られるまで培養することもできる。
【００５０】
本発明に用いられる培地は、上記アルコールを少なくとも含み、更にｓＰＨＡの合成に必要な炭素源（アルコールを除く意味。以下、同じ。）を含むことが好ましい。
【００５１】
上記炭素源としては、ＰＨＡの生育に通常用いられるものであれば特に限定されず、例えば、グルコース、フラクトース等の糖類；酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の炭素数が６以上の脂肪酸類；或いはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体、乳酸、ヤシ油、パーム油、パーム核油（以下ＰＫＯＯ）等の植物油脂が挙げられ、それらの群より選ばれる少なくとも１種を、上記アルコールと共に用いることができる。
【００５２】
上記窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
【００５３】
また、リン供給源としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウムなどが挙げられる。
【００５４】
上記のほか、有機栄養源を培地中に添加することもできる。有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。また、培養液中に、発現プラスミドに存在する薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質（カナマイシン等）を添加しても良い。
【００５５】
すなわち、本発明では、上記栄養素を含む、一般的な培地や市販の培地に、前述した所定濃度のアルコールを添加することができる。例えば、本発明で好ましく用いられる大腸菌を宿主として得られた形質転換体を培養するための培地として、ＬＢ培地、Ｍ９培地などが挙げられる。
【００５６】
培養条件は、使用する微生物の種類や培地の組成などによっても相違するため、所望とするｓＰＨＡが生産されるように適切に制御すれば良い。
【００５７】
具体的には、使用する微生物の種類により一概には言えないが、例えばＥ．ｃｏｌｉを宿主とする組み換え微生物を使用する場合、培養温度はおおむね２０〜４０℃、培養時間はおおむね１２〜９６時間の範囲であることが好ましい。
【００５８】
（本発明の製造方法によって得られるｓＰＨＡについて）
上述した本発明の方法によって得られるｓＰＨＡは、重量平均分子量（Ｍｗ）が５，０００〜４０，０００と非常に低く、カルボキシ末端が修飾されたものである。
【００５９】
ｓＰＨＡの好ましい重量平均分子量（Ｍｗ）は、６，０００〜４０，０００であり、より好ましくは、１０，０００〜３０，０００である。Ｍｗは、例えばゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定することができる。具体的には、標準物質としてポリスチレンを用いて較正曲線を作成し、当該較正曲線から、ｓＰＨＡのＭｗ（更には、後記するＭｎ）を求めることができる。
【００６０】
上記ｓＰＨＡを構成するＰＨＡは、マトリックス樹脂との相溶性や分散性などを考慮すると、少なくともＰＨＢを含んでいることが好ましく、例えば、ＰＨＢのホモポリマーのほか、ＰＨＢＶなどの共重合ポリマーなどが挙げられる。これらのうち、ＰＨＡ樹脂の結晶核剤として作用するにはホモポリマーの方が好ましいことなどを考慮すると、ＰＨＢが好ましい。
【００６１】
上記ｓＰＨＡは、カルボキシ末端が修飾されており、好ましくはエステル化されている。アルコールの種類によってカルボキシ末端の修飾状態も変化し得る。前述したように炭素数１〜６（より好ましくは炭素数１〜４）の低級アルキルが好ましく用いられることから、カルボキシ末端は炭素数１〜６（より好ましくは炭素数１〜４）の低級アルキルでエステル化されていることが好ましい。最も好ましくは、カルボキシ末端がエチル基によりエステル化されているものである。
【００６２】
具体的には、上記ｓＰＨＡとして、ＰＨＢのカルボキシ末端が、メチルエステル化されたもの、エチルエステル化されたもの、プロピルエステル化されたもの、ブチルエステル化されたものが挙げられる。
【００６３】
上記ｓＰＨＡは、ＰＨＡ樹脂の結晶核剤として非常に有用である。適用対象となるＰＨＡ樹脂の好ましい種類は前述したとおりである。
【００６４】
以上、本発明の製造方法および上記製造方法によって得られるｓＰＨＡについて詳述した。
【００６５】
本発明は上記製造方法に特徴があり、上記製造方法によって得られたｓＰＨＡを回収する方法などは、公知の方法を採用することができる。
【００６６】
例えば、本発明において、微生物菌体からｓＰＨＡを回収する方法として以下の方法が挙げられる。まず、培養終了後、培養液から遠心分離機などで菌体を分離し、集める。得られた菌体を、蒸留水およびメタノールなどで洗浄した後、乾燥させる。このようにして得られた乾燥菌体をクロロホルムなどの有機溶剤に懸濁し、加熱することによって、目的とするｓＰＨＡを有機溶剤画分に抽出する。このｓＰＨＡを含む有機溶剤画分から、濾過などの方法により菌体成分を除去し、その濾液にヘキサンなどの貧溶媒を加えてｓＰＨＡを沈殿させる。次いで、濾過や遠心分離などの方法によって上澄み液を除去した後、乾燥することにより、所望とするｓＰＨＡを回収する。
【００６７】
このようにして回収されたｓＰＨＡの組成は、例えば、ガスクロマトグラフィ（ＧＬＣ）や核磁気共鳴法（ＮＭＲ）などの方法により分析することができる。また、上記ｓＰＨＡの重量平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）は、前述したとおり、例えば、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）などの方法により測定することができる。
【００６８】
前述したとおり、上記ｓＰＨＡはＰＨＡ樹脂の結晶核剤として非常に有用であり、ＰＨＡ樹脂の結晶化速度が向上する。
【００６９】
具体的には、上記ｓＰＨＡを、公知の方法によりＰＨＢＨやＰＨＶＨなどのＰＨＡ樹脂に添加し、溶融混練などを行なって樹脂組成物を得ると、当該樹脂組成物の結晶化速度が向上する。ＰＨＡ樹脂に対するｓＰＨＡの配合比率は、所望とするＰＨＡ樹脂の組成や結晶化速度の程度などに基づいて適切に制御すれば良いが、例えば、ＰＨＡ樹脂１００質量部に対し、ｓＰＨＡを、おおむね、０．１〜１５質量部の範囲で添加することが好ましい。
【００７０】
このようにして得られるＰＨＡ樹脂の結晶化速度は公知の方法によって測定することができる。例えば、密度測定法、ディラトメーターを用いて体積変化から測定する方法、Ｘ線回折強度より求める方法、示差走査熱量などの熱量変化から測定する方法などが挙げられる。或いは、ＩＲやＮＭＲを用いたり、偏光顕微鏡などを用いて測定することもできる。これらのうち、実際の成形を出来る限り再現できるという観点からすると、偏光顕微鏡を用いて結晶化開始時間および結晶化完了時間を測定する方法が推奨される。具体的には、ＰＨＡ樹脂の融点以上の温度（例えば、１６０℃以上）から、室温または成形機の金型温度（例えば、３０〜８０℃）までの範囲を急激に冷却して結晶化させ、結晶開始までに要する時間（結晶化開始時間）と、結晶の成長が完了するのに要する時間（結晶化完了時間）を、偏光顕微鏡を用いて測定する方法が挙げられる。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって制限されず、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００７２】
本実施例における遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８９））に記載されている方法で行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主などは、市場の供給者から購入し、その取扱説明書に従って使用することができる。なお、本実施例に用いられる酵素は、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
【００７３】
製造例１：ｓＰＨＡ生産株の作製
以下の実施例では、ｓＰＨＡ生産株として、前述した非特許文献２などに記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＢ−４を用いた。この菌株は、北九州市の土壌から単離されたＰＨＡ合成細菌であり、北九州工業高等専門学校の水野康平准教授より提供されたものである。
【００７４】
まず、上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＢ−４由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子（ｐｈａＲ、ｐｈａＣ）発現ベクター（ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＹＢ４ＡＢ）を、非特許文献４に記載の方法に準じて作製した。この発現ベクターは、上記非特許文献４に記載のｐＧＥＭ−ｐｈａＲＹＢ４ＣＹＢ４ＡＢと同じである。図２に、上記発現ベクターの構成を示す。上記発現ベクターは、ＰＨＡ合成のための目的の遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＢ−４由来のｐｈａＲＹＢ４、ｐｈａＣＹＢ４；および、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｐｈａＡＲｅ、ｐｈａＢＲｅ）によって構築されている。
【００７５】
次に、定法により、上記発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（タカラバイオ株式会社）に形質転換し、所望とするｓＰＨＡ生産株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＹＢ４ＡＢ）を作製した。
【００７６】
実施例１：ｓＰＨＡの生産（その１）
本実施例および後記する実施例２では、アルコール添加培地にて上記ｓＰＨＡ生産株を培養したときのアルコール添加による分子量低減効果を調べるため、培地へのアルコール添加時期を変えて実験を行なった。
【００７７】
本実施例では、培養の開始時からアルコールを添加した培地中で培養を行った。全培養を、このアルコール添加培地中で行なった。
【００７８】
詳細には、まず、上記製造例１で得られたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＹＢ４ＡＢを、メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノールの各アルコールを添加した２質量％グルコース含有ＬＢ培地中に１体積％の濃度で接種し、３７℃で７２時間培養した。培地中への各アルコールの添加濃度（２質量％グルコース含有ＬＢ培地に対する濃度）は、０．５体積％（５ｍＬ／Ｌ）または１体積％（１０ｍＬ／Ｌ）とした。
【００７９】
比較のため、アルコールを添加しない培地も用意し、上記と同様の培養を行った。
【００８０】
このようにして得られた各培養液を、６，０００ｒｐｍ、１０分間（４℃）の条件で遠心分離し、得られた菌体ペレットを純水に懸濁した後、再度、上記と同じ条件で遠心分離し、菌体ペレットを得た。このようにして得られた菌体ペレットを凍結乾燥し、乾燥菌体を得た。得られた乾燥菌体の重量ＤＣＷ（ｇ／Ｌ）を表１に示す。
【００８１】
次に、上記乾燥菌体からＰＨＡを抽出して精製すると共に、乾燥菌体内のＰＨＡ含量およびＰＨＡの分子量（ＭｗおよびＭｎ）を測定した。これらの抽出、精製、および測定は、前述した非特許文献４に記載の方法に準じて行なった。
【００８２】
これらの結果を表１にまとめて示す。表１には、ＰＤＩ（Ｍｗ／Ｍｎ）の結果も併記する。
【００８３】
【表１】
2015029484.tif 000003
【００８４】
表１に示すように、培養の全期間に亘って、アルコール添加培地中でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＹＢ４ＡＢを培養すると、いずれのアルコールを用いた場合にも、Ｍｗが１７，０００〜２５，０００の低分子量ｓＰＨＡが得られた。また、上記ｓＰＨＡのＭｎも８，６００〜１２，０００と低く、ＰＤＩは１．８〜２．２と、非常に狭いものであった。本実験条件下では、エタノールまたはプロパノールを１０ｍＬ／Ｌの濃度で添加した場合に、ＭｗおよびＭｎの分子量が最も小さいｓＰＨＡが得られた。
【００８５】
これに対し、アルコールを添加しない培地中で培養した場合は、得られるＰＨＡのＭｗは４２，０００であった。
【００８６】
上記結果より、培地中にアルコールを添加することにより、低分子量のｓＰＨＡが得られることが確認された。
【００８７】
実施例２：ｓＰＨＡの生産（その２）
本実施例では、培養初期はアルコールを添加せず、培養中期〜後期にかけてアルコールを添加した培地中で培養を行ったときの、アルコール添加による分子量低減効果を調べた。
【００８８】
まず、上記製造例１で得られたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｐＧＥＭ−ｐｈａＲＣＹＢ４ＡＢを、２質量％グルコース含有ＬＢ培地（アルコール添加なし）に１体積％の濃度で接種し、３７℃で２４時間培養した後、無菌的に集菌した。次に、得られた菌体を、メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノールをそれぞれ添加したＭ９培地に移し変え、更に３７℃で４８時間培養した。
【００８９】
このようにして得られた各培養液を、前述した実施例１と同じ方法で処理して乾燥菌体を得た後、乾燥菌体内のＰＨＡ含量およびＰＨＡの分子量（ＭｗおよびＭｎ、並びにＰＤＩ）を、実施例１と同様の方法により測定した。
【００９０】
これらの結果を表２に示す。
【００９１】
【表２】
2015029484.tif 000004
【００９２】
表２に示すように、本実施例のように培養途中からアルコール添加培地で培養した場合であっても、前述した実施例１と同様、いずれのアルコールを用いた場合にも、Ｍｗが１３，０００〜２５，０００の低分子量ｓＰＨＡが得られた。また、上記ｓＰＨＡのＭｎは７，０００〜１５，０００であり、ＰＤＩは１．６〜２．４と、非常に狭いものであった。本実験条件下では、プロパノールを１０ｍＬ／Ｌ、またはブタノールを５ｍＬ／Ｌの濃度で添加した場合に、ＭｗおよびＭｎの分子量が最も小さいｓＰＨＡが得られた。
【００９３】
前述した実施例１と比較すると、アルコール濃度が同じ場合、エタノールやプロパノールでは、実施例２のように培養途中からアルコールを添加して培養した方が、分子量の低減効果が高くなる傾向が見られた。
【００９４】
上記実施例１および実施例２の結果より、培地中へのアルコールの添加時期にかかわらず、アルコールの存在下で培養すれば、低分子量のｓＰＨＡが得られることが確認された。
【００９５】
実施例３：低分子量ｓＰＨＡの骨格および末端解析（その１）
本実施例では、前述した実施例２のｓＰＨＡのうち、エタノール添加培地（エタノール濃度１０ｍＬ／Ｌ）で培養して得られたｓＰＨＡについて、その骨格（繰り返し構造）およびカルボキシ末端の構造を解析した。
【００９６】
まず、上記ｓＰＨＡを１５％（ｖ／ｖ）の硫酸−メタノールで処理し、得られるヒドロキシアルカン酸のメチルエステルをガスクロマトグラフィーで分析した。その結果、３ＨＢのホモポリマーであるＰＨＢが得られていることを確認した。
【００９７】
更に上記ｓＰＨＡのカルボキシ末端の構造を以下のようにして解析した。まず、構造解析サンプルとして、０．０３％(ｖ／ｖ)ＴＭＳ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ）を含む重クロロホルム中に上記のｓＰＨＡを溶かし、０．４５μｍ径のＭｉｌｌｅｘ−ＨＶＰＶＤＦフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）にてろ過したものを用意した。
【００９８】
次に、上記サンプルについて、1Ｈ−ＮＭＲを用いてカルボキシ末端の構造を決定した。具体的には、日本電子製ＮＭＲ機器を用い、室温にて、５００ＭＨｚ、ＳＣＡＮ回数２５６回程度の条件で行った。データ解析は、ＡＣＬＩＣＥ２  ｆｏｒ  ｗｉｎｄｏｗｓ  ｖｅｒ．４を用いて行なった。比較物質としてエチル−３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ−Ｅｔ）（東京化成工業株式会社製）を用いた。
【００９９】
これらの結果を図３の（Ａ）、（Ｂ）に示す。図３の（Ａ）は、エチル−３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ−Ｅｔ）の1Ｈ−ＮＭＲの測定結果であり、図３の（Ｂ）は、上記実施例２で得られたｓＰＨＡの1Ｈ−ＮＭＲの測定結果である。図４は、図３の４．２ｐｐｍ付近の拡大図である。
【０１００】
図３（Ａ）および図４（Ａ）に示すように、エチル−３−ヒドロキシ酪酸の末端エチルエステルのメチレン（ｉE）由来のピークが４．１５ｐｐｍ付近にカルテットとして観測された。これと同様のカルテットが、上記実施例２で得られたｓＰＨＡにも確認された（図４（Ｂ）を参照）。
【０１０１】
これらの結果より、上記実施例２で得られたｓＰＨＡのうちエタノール添加培地（エタノール濃度１０ｍＬ／Ｌ）で培養して得られたｓＰＨＡは、末端がエチルエステル化されたＰＨＢであることが確認された。
【０１０２】
実施例４：低分子量ｓＰＨＡの骨格および末端解析（その２）
本実施例では、前述した実施例２のｓＰＨＡのうち、ブタノール添加培地（ブタノール濃度５ｍＬ／Ｌ）で培養して得られたｓＰＨＡについて、その骨格およびカルボキシ末端の構造を解析した。
【０１０３】
まず、前述した実施例３と同様の方法により、上記ｓＰＨＡの骨格はＰＨＢであることを確認した。
【０１０４】
更に、前述した実施例３と同様の方法により、上記ｓＰＨＡのカルボキシ末端の構造を解析した。図５は、上記ｓＰＨＡの1Ｈ−ＮＭＲの測定結果であり、図６は、図５の４．１ｐｐｍ付近の拡大図である。
【０１０５】
図６に示すように、ブチル−３−ヒドロキシ酪酸の末端ブチル基における酸素原子に隣接するメチレン（ｉb）由来のピークが４．１ｐｐｍ付近にトリプレットとして観測された。この結果より、上記実施例２で得られたｓＰＨＡのうちブタノール添加培地（ブタノール濃度５ｍＬ／Ｌ）で培養して得られたｓＰＨＡは、末端がブチルエステル化されたＰＨＢであることが確認された。
【０１０６】
実施例５：結晶化速度の解析
前述した実施例１において、エタノール（５ｍＬ／Ｌ）添加培地で培養して得られたＭｎ９，０００、Ｍｗ２０，０００のｓＰＨＢを結晶核剤として用いたときの、ＰＨＡ樹脂の結晶化速度を測定し、成形加工上効果を調べた。ここでは、ＰＨＡ樹脂としてＰＨＢＨを用い、上記ｓＰＨＢとＰＨＡ樹脂を溶融混錬して樹脂組成物（本発明例）とし、当該樹脂組成物の結晶化速度を測定した。
【０１０７】
比較のため、上記本発明例において、結晶核剤を用いないときの結晶化速度を同様に測定した（比較例１）
【０１０８】
また、結晶化速度の向上のためには結晶化剤の低分子量化が有効であることを示す目的で、比較のため、Ｍｗが６８万と非常に大きいＰＨＢを結晶核剤として用い、上記本発明例と同様にして樹脂組成物の結晶化速度を測定した（比較例２）。
【０１０９】
詳細な製造条件は以下のとおりである。
【０１１０】
（１）本発明例１について
（ＰＨＡ樹脂の製造）
ここでは、ＫＮＫ−００５株（ＵＳ７３８４７６６を参照）を用いて培養した。培養に用いた種母培地、前培養培地、ＰＨＡ生産培地の各組成は以下のとおりである。
【０１１１】
種母培地の組成
１ｗ／ｖ％のＭｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％のＢａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％のＹｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％のＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％のＫＨ２ＰＯ４を用いた（ｐＨ６．８）。
【０１１２】
前培養培地の組成
１．１ｗ／ｖ％のＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％のＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％の（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％の微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％のＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％のＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％のＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％のＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）を用いた。炭素源は、パーム油を１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。
【０１１３】
ＰＨＡ生産培地の組成
０．３８５ｗ／ｖ％のＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％のＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％の（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％の微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％のＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％のＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％のＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％のＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、０．０５ｗ／ｖ％のＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）を用いた。
【０１１４】
まず、ＫＮＫ−００５株のグリセロールストック（５０μＬ）を種母培地（１０ｍＬ）に接種して２４時間培養し、種母培養を行なった。
【０１１５】
次に、得られた種母培養液を、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％の濃度で接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨのコントロールには、１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
【０１１６】
次に、得られた前培養液を、６ＬのＰＨＢＨ生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ−１０００型）に１．０ｖ／ｖ％の濃度で接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量６．０Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールした。ｐＨのコントロールには、１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。培養は６４時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収した。次いでメタノールで洗浄した後、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。 
【０１１７】
このようにして得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍＬのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。上記菌体の残渣をろ別した後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮した。次いで、９０ｍＬのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別した後、５０℃で３時間真空乾燥した。
【０１１８】
このようにして得られた乾燥ＰＨＡ中の３ＨＨ（３−ヒドロキシヘキサノエート）の組成を、ガスクロマトグラフィーによって測定した。
【０１１９】
詳細には、まず、上記の乾燥ＰＨＡ２０ｍｇに、２ｍＬの硫酸−メタノール混液（体積比：１５：８５）と２ｍＬのクロロホルムを添加して密栓した後、１００℃で１４０分間加熱し、ＰＨＡ分解物のメチルエステル体を得た。次いで、室温まで冷却した後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生が止まるまで放置した。次に、４ｍＬのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、３０００ｒｐｍで遠心し、上清を採取した。
【０１２０】
得られた上清中に含まれる、ポリエステル分解物のモノマーユニットの組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプル１μＬを注入した。温度条件は、初発温度１００〜２００℃の範囲を８℃／分の平均速度で昇温した後、更に、２００〜２９０℃の範囲を３０℃／分の平均速度で昇温した。
【０１２１】
その結果、上記の方法で得られたＰＨＡは、前記式（２）で表されるＰＨＢＨであることが分かった。３ＨＨの組成は５．６ｍｏｌ％であった。また、ＧＰＣにより測定した上記ＰＨＢＨのＭｗは６１万であった。また、ＤＳＣで測定した上記ＰＨＢＨの融点は１４１℃ であった。詳細には、融点の測定には日立ハイテクサイエンス社の仕差走査熱量計（ＤＳＣ７０２０）を用いた。融点測定用試料約５ｍｇを精秤し、昇温速度１０℃／分で得られる吸熱ピークを融点とした。
【０１２２】
（樹脂組成物の製造）
次に、上記のようにして得られたＰＨＢＨと、前述したｓＰＨＢを用い、以下のようにして樹脂組成物を製造した。
【０１２３】
詳細には、小型２軸混錬機（レオ・ラボ社製、Ｘｐｌｏｒｅ  ＭＣ５）を用い、設定温度１６０℃、スクリュー回転数１００ｒｐｍの条件で上記ＰＨＢＨと、ｓＰＨＢを溶融混錬し、樹脂組成物を得た。配合比は、ＰＨＢＨ１００重量部に対し、ｓＰＨＢは１重量部とした。このようにして得られた樹脂組成物の樹脂温度は、Ｋ型熱電対を上記小型２軸混錬機の吐出口に挿入して測定した。その結果、樹脂温度は１６８〜１７２℃であった。上記樹脂組成物をダイスからストランド状に引き取り、ペレット状にカットした。
【０１２４】
（樹脂組成物の結晶化の評価）
次に、偏光顕微鏡を用いて、上記樹脂組成物の結晶化の程度を目視評価した。偏光顕微鏡として、ＬＩＮＫＡＭ社製の顕微鏡用急冷加熱ステージＬＫ３００Ｂを用いた。詳細には、まず、上記樹脂組成物を１９０℃で溶融させて５分間保持した。その後、６０℃に急冷した。急冷した直後から、偏光顕微鏡にて倍率４００倍で目視観察を行った。上記樹脂組成物の結晶が認められた時間を結晶開始時間とし、結晶がこれ以上成長しない時間を結晶化完了時間とした。測定はそれぞれ、３回繰り返して行い、３回の平均値を算出した。
【０１２５】
（２）比較例２について
ここでは、低分子量の結晶核剤が有効であることを示す目的で、分子量が十分に高いＰＨＢ（Ｍｗ＝６８万）を下記方法により作製し、前述した方法と同様にして樹脂組成物を作製し、結晶化を評価した。
【０１２６】
（分子量が十分に高いＰＨＢの製造）
種母培地の組成
１ｗ／ｖ％のＭｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％のＢａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％のＹｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％のＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％のＫＨ２ＰＯ４、５×１０−６ｗ／ｖ％のカナマイシンとした。
【０１２７】
前培養培地の組成
１．１ｗ／ｖ％のＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％のＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％の（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％のパームＷオレイン油、０．５ｖ／ｖ％の微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％のＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％のＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％のＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％のＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）とした。
【０１２８】
ＰＨＢ生産培地の組成
０．３８５ｗ／ｖ％のＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％のＫＨ２ＰＯ４、０・２９１ｗ／ｖ％の（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％の微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％のＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％のＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％のＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％のＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）とした。炭素源として、パーム核油を分別した低融点画分であるパーム核油オレインのみを用いた。
【０１２９】
まず、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ（旧分類：Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ或いはＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）  Ｈ１６(ＡＴＣＣ１７６９９)株のグリセロールストック（５０μＬ）を上記種母培地（１０ｍＬ）に接種して２４時間培養した後、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％の濃度で接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養した。ｐＨのコントロールには、７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
【０１３０】
次に、６ＬのＰＨＢ生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−１０００型）に、上記の前培養液を５．０ｖ／ｖ％の濃度で接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量３．６Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールした。ｐＨのコントロールには、７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。培養は約６５時間行った。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄した後、凍結乾燥し、乾燥菌体を得た。
【０１３１】
このようにして得られた乾燥菌体約１ｇに１００ｍＬのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＢを抽出した。上記菌体の残渣をろ別した後、エバポレーターで総容量が約３０ｍＬになるまで濃縮した後、約９０ｍＬのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＢをろ別した後、５０℃で３時間真空乾燥し、ＰＨＢを得た。このようにして得られたＰＨＢについて、ＧＰＣで測定したＭｗは６８万であった。また、ＤＳＣで測定した融点は１７５℃であった。
【０１３２】
これらの結果を表３にまとめて示す。
【０１３３】
【表３】
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【０１３４】
表３より、本発明の方法によって得られた低分子量ＰＢＨを用いた本発明例では、結晶化開始時間（１１秒）および結晶化完了時間（２８秒）ともに、上記低分子量を用いない比較例１に比べて短くなった。すなわち、上記低分子量ＰＨＢは、樹脂組成物の結晶化速度向上効果に優れており、ＰＨＡ樹脂の結晶核剤として非常に有用であることが分かる。
【０１３５】
これに対し、Ｍｗが６８万と分子量が非常に大きいＰＨＢを用いた比較例２では、結晶化開始時間は上記本発明例と同様、短い（１２秒）ものの、結晶化完了時間が８１秒と、非常に長くなった。これは、分子量が高くなると粘度が高くなり、ＰＨＢが均一に分散しないため、結晶化効果が不均一になったと推察される。よって、上記比較例２との対比結果からも、結晶核剤は、分子量の低いものが有効であることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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