(57)【要約】【課題】生活習慣病を改善・治療する効果を持つ有効成分を高濃度で含有する香酢精製物の製造方法を提供する。【解決手段】香酢を低級アルカノールで抽出しアルカノール抽出エキスを得る工程と、このアルカノール抽出エキスを１又は２種以上のクロマトグラフィによって分離し、【化１】2015157765.tif 000010で表されるＣｙｃｌｏ（−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−）を実質的に含有するクロマトグラフィ画分を得る工程を含む香酢精製物の製造方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
香酢を低級アルカノールで抽出しアルカノール抽出エキスを得る工程と、
前記アルカノール抽出エキスを１又は２種以上のクロマトグラフィによって分離し、
【化１】
2015157765.tif 000009
で表されるＣｙｃｌｏ（−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−）を実質的に含有するクロマトグラフィ精製画分を得る工程を含むことを特徴とする香酢精製物の製造方法。
【請求項２】
前記クロマトグラフィ精製画分を得る工程は、シリカゲルを用いたクロマトグラフィによって分離しシリカゲル分離画分を得る工程と、
前記得たシリカゲル分離画分を、逆相シリカゲルを用いたクロマトグラフィによって分離しクロマトグラフィ精製画分を得る工程とを含むことを特徴とする請求項１に記載の香酢精製物の製造方法。
【請求項３】
前記アルカノール抽出エキスを得る工程が、アルカノール抽出エキスをトリハロメタンで抽出する工程を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の香酢精製物の製造方法。
【請求項４】
前記アルカノール抽出エキスを得る工程が、香酢に有機溶媒を添加し水相を回収して脱脂する工程を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の香酢精製物の製造方法。
【請求項５】
前記低級アルカノールはエタノール又はブタノールを用いることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の香酢精製物の製造方法。
【請求項６】
前記シリカゲル分離画分を得る工程と、逆相精製画分を得る工程とは、それぞれ前記クロマトグラフィによるフラクションについてＰＰＡＲ活性化の活性を検出し、該ＰＰＡＲ活性化の活性を有する前記フラクションを回収することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の香酢精製物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生活習慣病の病態改善や予防に寄与する香酢からの精製物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
香酢（又は香醋）は、中国において古くから調味料として用いられ、主に糯米を発酵させ長期間熟成させて製造されている。香酢は、日本で一般的に用いられる酢である米酢よりもアミノ酸等の有機化合物の含有率が高く、健康食品として、近年は日本でも用いられている。この香酢から抽出したエキスを、健康状態の改善に用いる技術が研究されている。
【０００３】
例えば、本発明者らは特許文献１において、香酢又はそのエキスを有効成分として含有してなる組成物を開示している。この組成物は、香酢由来のエキスの効能を用いて、内臓脂肪の減少、脂質代謝の改善、皮膚の弾力性やハリを改善するといった美容志向の効果を期待するものである。エキスの製造方法としては、エバポレータによる約５倍濃度までの濃縮を記載している。
【０００４】
本発明者らは特許文献２において、香醋又は黒酢の低級アルカノール抽出物を有効成分として含有するペルオキシソーム増殖剤応答性受容体α及びγ活性化剤を開示している。この技術は、香醋又は黒酢の低級アルカノール抽出物に、脂肪酸酸化の刺激及び血清脂質の仲介作用に関与し糖代謝を改善するペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）αの活性化作用、並びに脂肪細胞の分化に関与し血糖値及び血中脂質の低下等をもたらすＰＰＡＲγの活性化作用が認められることから、この抽出物によってインスリン抵抗性、糖尿病、高脂血、高血圧、内臓脂肪型肥満又は脂肪肝等の生活習慣病の予防・改善・治療に有用な活性化剤を得ようとするものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−５１９５２号公報
【特許文献２】特開２００９−２４９３２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に開示の技術によれば、健康状態の改善に効果のある有効成分を特定せずにエバポレータによって濃縮し、美容製品への応用を主な目的として組成物を簡易に製造することが可能である。しかし、香酢に含有される有効成分を健康状態や病態の改善、予防に用いるためには、さらに高い有効成分の比濃度が求められる。
【０００７】
特許文献２に開示の技術によれば、香酢及び黒酢に含まれるＰＰＡＲ活性化作用を有する有効成分はこの時点では明らかになっていないため、有効成分以外の多くの成分も含んでいる抽出物を利用していた。この抽出物をＰＰＡＲ活性化剤として使用するには、多量又は高含有率で使用する必要があった。例えば、特許文献２における実験は、一般に生体内に比べて反応条件が整えられ低含有率で反応しやすい試験容器中の実験であるが、培養細胞を用いた実験において、細胞培養液に対して抽出物を０．５〜１．０％という高含有率で含有させ、その条件において活性を確認している。こうした抽出物を人体に摂取するためには、香酢、黒酢又はその抽出物をそのまま摂取する、又は食品や薬剤中に高含有率で含有させて摂取する必要があった。
【０００８】
本発明者らは、上述の抽出物や香酢に含まれるＰＰＡＲ活性化作用を有する成分をさらに精製した有効成分を得ることで、特許文献１又は２の抽出物よりも広い濃度範囲において使用することができ、有効成分濃度を上げてＰＰＡＲ活性化作用を有効に行わせることができ、又薬剤や食品への応用範囲を広くすることができるという考えのもと、研究を進めていった。そして、香酢に含有されるＰＰＡＲ活性化成分を見出し精製するために、さらに研究を進めていった。
【０００９】
本発明はこのような背景に従ってなされたものであり、その目的は、生活習慣病を改善・治療する効果を持つ有効成分を高濃度で含有する香酢精製物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の香酢精製物の製造方法は、香酢を低級アルカノールで抽出しアルカノール抽出エキスを得る工程と、アルカノール抽出エキスを１又は２種以上のクロマトグラフィによって分離し、以下の化学式（１）で表されるＣｙｃｌｏ（−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−）を実質的に含有するクロマトグラフィ精製画分を得る工程を含む。
【化１】
2015157765.tif 000002
【００１１】
この製造方法によれば、化学式（１）に示すＣｙｃｌｏ（−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−）を実質的に含有する香酢精製物が精製される。化学式（１）の化合物は、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγの活性化の作用を有する。この化合物を有効成分として含有する香酢精製物はインスリン抵抗性、糖尿病、高脂血、高血圧、内臓脂肪型肥満、及び脂肪肝などの生活習慣病を改善する効果を持つ。そのため、供給が容易な天然の素材である香酢から、生活習慣病の病態の改善に役立つ食品、薬剤等に広く応用することができる香酢精製物が製造される。
【００１２】
クロマトグラフィ精製画分を得る工程は、シリカゲルを用いたクロマトグラフィによって分離しシリカゲル分離画分を得る工程と、このシリカゲル分離画分を、逆相シリカゲルを用いたクロマトグラフィによって分離しクロマトグラフィ精製画分を得る工程とを含むことが好ましい。シリカゲルを用いたクロマトグラフィと逆相シリカゲルを用いた逆相クロマトグラフィを組み合わせることで、Ｃｙｃｌｏ（−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−）が有効に精製される。
【００１３】
アルカノール抽出エキスを得る工程が、アルカノール抽出エキスをトリハロメタンで抽出する工程を含むことが好ましい。アルカノール抽出エキスに含まれる有機化合物のうちアミノ酸やペプチド、その化合物等の成分を有効に抽出することができる。
【００１４】
アルカノール抽出エキスを得る工程が、香酢に有機溶媒を添加し水相を回収して脱脂する工程を含むことが好ましい。香酢から脂肪分を除去することで他の有機化合物を有効に精製できる。
【００１５】
低級アルカノールは、エタノール又はブタノールを用いることが好ましい。精製が有効に行われ、かつ供給が容易である。
【００１６】
前記シリカゲル分離画分を得る工程と、逆相精製画分を得る工程とは、それぞれクロマトグラフィによるフラクションについてＰＰＡＲ活性化の活性を検出し、このＰＰＡＲ活性化の活性を有するフラクションを回収することが好ましい。ＰＰＡＲ活性化の活性を有する画分を回収し、化学式（１）の物質の有する活性をもとに回収するので、ＰＰＡＲ活性化の活性を有する化学式（１）の物質を含む香酢精製物となる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、化学式（１）に示すＣｙｃｌｏ（−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−）を実質的に含有する香酢精製物が精製される。化学式（１）の化合物は、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγの活性化の作用を有する。この化合物を有効成分として含有する香酢精製物はインスリン抵抗性、糖尿病、高脂血、高血圧、内臓脂肪型肥満、及び脂肪肝などの生活習慣病を改善する効果を持つ。そのため、供給が容易な天然の素材である香酢から、生活習慣病の病態の改善に役立つ食品、薬剤等に広く応用することができる香酢精製物が製造される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の一実施例における化合物のＰＰＡＲα活性を示すグラフ図である。
【図２】本発明の一実施例における化合物のＰＰＡＲγ活性を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００２０】
香酢（香醋）は、糯米に麹を添加してアルコール発酵させ、籾殻を添加して酢酸発酵させ、水を添加して抽出し、その抽出液を一定期間熟成させたものである。香酢の種類はこの熟成の期間によって分類されていることがある。本実施形態で用いる香酢は、１年以上熟成したものが望ましい。さらに、ＰＰＡＲ活性化剤の含有量の面から、８年以上熟成したものがさらに望ましい。
【００２１】
この香酢に対して、前処理として脱脂を行い、脂肪を除去する。脱脂は適宜有機溶媒を加えて水相を回収することにより行うことができる。本実施形態では香酢と等量のヘキサンを有機溶媒として用いている。
【００２２】
ついで、回収した水相にアルカノールを加えてアルカノール相を回収することで、疎水性成分の抽出を行う。アルカノールは低級のものが好ましい。例えばエタノールやブタノールが使用できる。アルカノールは水相の１０重量％から１０００重量％程度を加えて行えるが、水相の量の半分から２倍程度が最も望ましい。得られたアルカノール相を濃縮して、アルカノール抽出エキスを得る。本実施形態では、アルカノールとして水相と等量のｎ−ブタノールを加え、アルカノール相を回収し、減圧濃縮を行ってアルカノール抽出エキスを得ている。
【００２３】
ついで、アルカノール抽出エキスにトリハロメタンを加えて有機相の抽出を行い、濃縮してトリハロメタン抽出エキスを得る。本実施形態では、アルカノール抽出エキスを純水に懸濁した後、等量のクロロホルムを加えて、有機相を抽出する操作を３回繰り返し、この有機相を減圧濃縮してトリハロメタン抽出エキスを得ている。
【００２４】
ついで、トリハロメタン抽出エキスに対してクロマトグラフィを行い、クロマトグラフィ精製画分を得る。クロマトグラフィは分子量排除、イオン交換などの吸着、順相又は逆相などを１又は複数組み合わせて適宜使用できるが、本実施形態では、シリカゲル及び逆相シリカゲルを用いた２種のクロマトグラフィによって分離を行う。まず、シリカゲルによるクロマトグラフィを行い、シリカゲル分離画分を得る。本実施形態では、トリハロメタン抽出エキスを少量のアセトンに溶解し、シリカゲルを添加し、減圧下濃縮を行ってトリハロメタン抽出エキスをシリカゲルに吸着させた後、ガラスクロマト管にシリカゲルを充填し、その上にシリカゲルに吸着させたトリハロメタン抽出エキスを充填させている。さらに、ベンゼン：アセトンの比を２０：１から１：１までの勾配とした溶出液で溶出し、フラクションに分離している。
【００２５】
この各フラクションごとにＰＰＡＲα及びγの活性測定を行い、活性画分を回収する。本実施形態では、ＰＰＡＲα又はγ―Ｇａｌ４融合タンパク質発現プラスミドをＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトとし、ルシフェラーゼ活性を測定している。この後、得られた活性画分を濃縮して、シリカゲル分離画分を得ている。
【００２６】
ついで、シリカゲル分離画分について逆相シリカゲルによるクロマトグラフィを行い、逆相精製画分を得る。本実施形態では、シリカゲル分離画分を少量のメタノールに溶解し、ガラスクロマト管に充填した逆相シリカゲルに添加し、２０％メタノールによって溶出し、フラクションに分離している。各フラクションについて、上述の活性測定を行い、活性画分を減圧濃縮して、逆相精製画分を得ている。
【００２７】
この逆相精製画分（クロマトグラフィ精製画分）には下記の化学式（２）の化合物が含まれる。
【００２８】
【化２】
2015157765.tif 000003
【００２９】
化学式（２）の物質は、結合するプロリンがＬ型及びＤ型、バリンがＬ型及びＤ型のいずれである場合も含む。具体的には、Ｌ型のプロリンとＬ型のバリンが環状に結合した化学式（３）で表される物質、Ｌ型のプロリンとＤ型のバリンが環状に結合した化学式（４）で表される物質、Ｄ型のプロリンとＬ型のバリンが環状に結合した化学式（５）で表される物質及びＤ型のプロリンとＤ型のバリンが環状に結合した化学式（６）で表される物質である場合がある。
【００３０】
【化３】
2015157765.tif 000004
【化４】
2015157765.tif 000005
【化５】
2015157765.tif 000006
【化６】
2015157765.tif 000007
【００３１】
なお、Ｌ型又はＤ型のプロリンと、Ｄ型のバリンとが環状に結合した物質は、化学式（７）のように表されることがある。
【化７】
2015157765.tif 000008
【００３２】
本実施形態の逆相精製画分（クロマトグラフィ精製画分）が含有するＣｙｃｌｏ（−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−）は、特に、上述のプロリン及びバリンのいずれもが、通常生体に存在するＬ型のアミノ酸であることが望ましい。すなわち、特に化学式（３）で表される物質であることが望ましい。
【００３３】
このクロマトグラフィ精製画分を、適宜さらに濃縮や溶解などを行って、香酢由来精製物とすることができる。
【００３４】
本実施形態のクロマトグラフィ精製画分に対して、有効成分として含有される化学式（２）の化合物の他に他の物質を添加してもよい。例えば、香酢又は黒酢に由来するエキスなどの他の成分であってもよい。食品又は医薬品等に用いられる他の物質が添加されていてもよい。こうした物質には、例えば保存料、調味料、香料、着色料又はビタミン、ミネラル若しくはアミノ酸等の栄養素等がある。
【００３５】
この実施形態の変更態様として、一般的な食品添加物、健康食品、医薬品の製造方法を適用することができる。例えば、上述の各段階で他の添加物を混合する工程、酵素処理などの反応を行う工程、アルカノール抽出エキスを他の溶媒に混合する工程、各段階での溶液を凍結乾燥や噴霧乾燥で濃縮する工程などを上述の工程に代えて、又は加えて用いることができる。
【実施例】
【００３６】
（ＰＰＡＲ活性化剤の製造）
香酢１．２Ｌに対して、等量のｎ−ヘキサンを加え水相を回収する脱脂の操作を２回行った。ついで、水相に等量の水飽和ｎ−ブタノールを加えアルカノール相（ｎ−ブタノールの相）を回収する操作を２回行い、このアルカノール相を減圧濃縮し、アルカノール抽出エキスを得た。ついで、アルカノール抽出エキスを純水２００ｍＬに懸濁した後、等量のクロロホルムを加えて、有機相を抽出する操作を３回繰り返し、この有機相を減圧濃縮して、４６００ｍｇのトリハロメタン抽出エキスを得た。このトリハロメタン抽出エキスを少量のアセトンに溶解し、６０ｇのシリカゲルを添加し、減圧下濃縮を行ってトリハロメタン抽出エキスをシリカゲルに吸着させた。一方、ガラスクロマト管（４０×２ｃｍ、１２０ｍＬ）にシリカゲルを充填し、その上にシリカゲルに吸着させたトリハロメタン抽出エキスを充填し、ベンゼン：アセトンの比を２０：１、１０：１、５：１、３：１、１：１の順番に３００ｍＬずつの溶出液で溶出し、１５０ｍＬずつのフラクションに分離した。後述する活性測定により活性が確認できたフラクション８、９及び１０を集め、シリカゲル分離画分４００ｍｇを得た。このシリカゲル分離画分を少量のメタノールに溶解した。一方、ガラスクロマト管（４０×２ｃｍ、１２０ｍＬ）に逆相シリカゲルを充填し、１０％メタノールに置換した。この管にシリカゲル分離画分を添加し、１０％メタノール９００ｍＬによって洗浄を行った後、２０％メタノールによって９００ｍＬ（４５０ｍＬで２回）溶出を行った。それぞれについて下記の活性の測定を２回行い、活性が得られた２回目の画分を減圧濃縮して、４００ｍｇの逆相精製画分（クロマトグラフィ精製画分）を得た。
【００３７】
この逆相精製画分を１Ｈ及び１３−ＮＭＲ、ＣＯＳＹ、ＰＦＧ−ＨＭＱＣ、ＰＦＧ−ＨＭＢＣ、ＤＥＰＴにより解析し、ＦＡＢ−ＭＳ及び高分解能ＦＡＢ−ＭＳによる解析も行った結果、バリンとプロリンの環状ペプチドであることが明らかになった。すなわち、化学式（２）に示す化合物が活性物質であると同定された。この化学式（２）の化合物を含む逆相精製画分を香酢精製物とした。
【００３８】
（活性測定方法）
活性の測定は、ＰＰＡＲα及びγプラスミドとして、ＰＰＡＲα又はγＧａｌ４融合タンパク質発現プラスミドｐＰＰＡＲα（γ）−Ｇａｌ４、Ｇａｌ４タンパク質結合配列の下流にルシフェラーゼ構造遺伝子を連結したｐＧａｌ４−Ｌｕｃ及び形質転換効率補正用プラスミドｐＳＥＡＰ−ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いた。６０ｍｍシャーレに、ＣＯＳ−１細胞を６×１０５ｃｅｌｌｓを蒔き、翌日に０．２５μｇのｐＰＡＲα（γ）−Ｇａｌ４、１．０μｇのｐＧａｌ４−Ｌｕｃ、及び１．０μｇのｐＳＥＡＰ−ｃｏｎｔｒｏｌベクターをｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔした。１６時間後、トリプシン処理で細胞を回収し、９６穴プレートに０．６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１２５μＬ／ｗｅｌｌ）ずつの細胞をまいた。２時間培養後試験溶液を添加し、さらに２４時間倍培養を行った。培養液２５μＬを別の９６穴プレートに回収し、分泌性アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性を測定した。又各ｗｅｌｌに１００μＬずつのルシフェラーゼ活性測定液（６０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ  ｐＨ７．８、１６ｍＭ  ｂａｓｉｃ  ＭｇＣＯ３、０．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５ｍＭ  ルシフェリン、１．５ｍＭ  ＡＴＰ、０．５ｍＭ  ＣｏＡ、０．１ｍＭ  βメルカプトエタノール）を添加し、１時間、暗室にてインキュベートした後、プレートリーダーにて発光強度を測定した。活性評価に際しては、ルシフェラーゼ活性をＳＥＡＰ活性にて補正した。ＰＰＡＲα及びγの評価系最適化においては、それぞれコントロール物質としてＷｙ１４６４３（ＷＹ）５０μＭ／Ｌ、及びトログリタゾン（Ｔｏ  １０）１０μＭ／Ｌを用いた。
【００３９】
上述の試験溶液として、香酢精製物について化学式（２）から分子量を計算し５００、２５０、１２５μＭ／Ｌとなるように調整して活性を測定した。又、コントロールとして化学合成したプロリン及びバリンを同じモル濃度となるように試験溶液として加えて比較した。この結果を、ＰＰＡＲαの活性について図１、ＰＰＡＲγの活性について図２に示す。縦軸はコントロール物質（ＷＹ、Ｔｏ）に対する活性の比である。香酢精製物は、ほぼ濃度依存でＰＰＡＲα及びγのアゴニスト活性を持ち、化学式（２）の物質であるこの画分がＰＰＡＲα及びγの活性化剤の有効成分であることが示された。又、化学式（２）の物質のジペプチドを構成する単一のアミノ酸であるプロリン及びバリンはほとんど活性がないことが示された。
【００４０】
また、この香酢精製物は、特許文献２のアルカノール抽出物が培養液中に０．５〜１％の含有量であるのに対して、少量の１２５〜５００μＭ／Ｌの含有量で活性を示している。この結果から、この香酢精製物が高い比活性を有することも示された。
【００４１】
以上述べた実施形態は全て本発明を例示的に示すものであって限定的に示すものではなく、本発明は他の種々の変形態様及び変更態様で実施することができる。従って本発明の範囲は特許請求の範囲及びその均等範囲によってのみ規定されるものである。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は生活習慣病を予防する物質の製造方法を提供するので、食品や医療に関する産業に幅広く役立つものである。
【図１】
2015157765.tif 000011
【図２】
2015157765.tif 000012