(57)【要約】【課題】  菌増殖を抑制し、肉芽組織形成や上皮化を促進し、かつ二次出血を抑制する創傷治癒剤を提供する。【解決手段】  ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）と水とを含む創傷治癒剤であって、円二色性スペクトル法により求められる（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合が４０〜６０％であり、（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての（Ｘ）中のアミノ酸数と全ての（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合が５〜４５％であり、（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての配列（１）中のアミノ酸数の割合が４０〜８０％である創傷治癒剤である。アミノ酸配列（Ｘ）：３種の特定の配列からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。アミノ酸配列（Ｘ’）：（Ｘ）中の特定数のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）と水とを含む創傷治癒剤であって、
円二色性スペクトル法により求められる前記タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合が４０〜６０％であり、前記タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての前記アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全ての前記アミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合が５〜４５％であり、前記タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合が４０〜８０％である創傷治癒剤。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：前記アミノ酸配列（Ｘ）中の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）若しくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列（Ｘ）中の２個のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／若しくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
【請求項２】
前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の個数と前記アミノ酸配列（Ｘ）及び前記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数との比［ＧＡＧＡＧＳ配列（１）：｛アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計｝］が１：０．１〜１：６である請求項１に記載の創傷治癒剤。
【請求項３】
前記タンパク質（Ａ）が、前記アミノ酸配列（Ｘ）の１種が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、
前記タンパク質（Ａ）中の前記ポリペプチド鎖（Ｙ）と前記ポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計個数が１〜１００個である請求項１又は２に記載の創傷治癒剤。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：前記ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸数の０．１〜２０％のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換されたポリペプチド鎖。
【請求項４】
前記タンパク質（Ａ）が、前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ）を有する請求項１〜３のいずれかに記載の創傷治癒剤。
【請求項５】
前記タンパク質（Ａ）が、（ＧＡＧＡＧＳ）7配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）2ＧＫＧＶＰ配列（６）を有するタンパク質、（ＧＡＧＡＧＳ）11配列（５）及びＧＶＧＶＰ配列（３）を有するタンパク質又は（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）3ＧＫＧＶＰ配列（２７）を有するタンパク質である請求項４に記載の創傷治癒剤。
【請求項６】
前記タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量が４０〜２００ｋＤａである請求項１〜５のいずれかに記載の創傷治癒剤。
【請求項７】
創傷治癒剤の重量を基準として、前記タンパク質（Ａ）が５〜３０重量％である請求項１〜６のいずれかに記載の創傷治癒剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創傷治癒剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
熱傷、採皮創、皮膚剥削創及び外傷性皮膚欠損創や、褥瘡性皮膚潰瘍及び糖尿病性皮膚潰瘍等の創傷を治癒するためには、創傷部を適度な湿潤環境に保ち、細胞増殖を促す環境を作り出す必要がある。そのために患部に適応される創傷被覆材として、従来、ガーゼ及び脱脂綿等が用いられている。これらは、滲出液の吸収が早い反面、細菌に感染しやすく、また、創面が乾燥してしまうと取り外す際に痛みや出血等を伴うという問題がある。また、創面を乾燥させないために、創傷被覆材と軟膏等を併用することも行われているが、滲出液の吸収が不充分となり、創面が過度に湿った状態になってしまう問題がある。
また、ガーゼ、脱脂綿及び軟膏等に代わり、適度な湿潤環境を維持するために、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ゲル（特許文献１）等の湿潤環境維持を目的とした創傷被覆材が用いられる場合がある。しかしながら、ＣＭＣゲルは滲出液等によりゲル構造を保持することが難しく、創傷部からの脱離や、菌感染の温床になる問題がある。
【０００３】
一方で、湿潤環境を保つだけでなく、肉芽組織形成や上皮化を促進する創傷治癒剤として、コラーゲンスポンジ（特許文献２）が知られている。コラーゲンスポンジは生体適合性が良いなどの特徴を有するものの、湿潤環境維持に乏しく、細菌に感染しやすい、細菌が増殖しやすい、滲出液により劣化する、及び材料が入手困難である等の問題がある。
また、熱傷や褥瘡性皮膚潰瘍等では、患部から壊死組織を除去（デブリードマン）し、止血処理を実施した後に、創傷治療剤を適用する場合がある。この時、止血処理が不十分であったり、患部を動かしたりすることで、二次的に出血（二次出血）することがある。二次出血すると、患部全体に痂皮が形成され、創傷被覆材や創傷治癒剤の効果が薄れて、治癒の遅延をもたらす問題がある。二次出血の恐れがある場合、止血効果のあるアルギン酸創傷被覆材を使用する場合があるが、効果は限定的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平０６−００９３７３号公報
【特許文献２】特開平１０−０８０４３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、菌増殖を抑制し、肉芽組織形成や上皮化を促進し、かつ二次出血を抑制する創傷治癒剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）と水とを含む創傷治癒剤であって、
円二色性スペクトル法により求められる前記タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合が４０〜６０％であり、前記タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての前記アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全ての前記アミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合が５〜４５％であり、前記タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合が４０〜８０％である創傷治癒剤。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：前記アミノ酸配列（Ｘ）中の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）若しくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列（Ｘ）中の２個のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／若しくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の創傷治癒剤は、菌増殖抑制作用があり、肉芽組織形成や上皮化促進作用に優れ、かつ二次出血を抑制するという効果を奏する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明において、タンパク質（Ａ）は、天然物からの抽出、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって得られる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。天然物からの抽出、有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、タンパク質（Ａ）を得られるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【０００９】
本発明の創傷治癒剤は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）と水とを含む創傷治癒剤であって、
円二色性スペクトル法により求められる前記タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合が４０〜６０％であり、前記タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての前記アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全ての前記アミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合が５〜４５％であり、前記タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合が４０〜８０％である創傷治癒剤である。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：前記アミノ酸配列（Ｘ）中の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）若しくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列（Ｘ）中の２個のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／若しくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
【００１０】
本発明の創傷治癒剤において、タンパク質（Ａ）がアミノ酸配列（Ｘ）及び／又はアミノ酸配列（Ｘ’）を有することにより、細胞と相互作用しやすく細胞親和性が高いことから、肉芽組織形成や上皮化促進作用を発揮することができる。
また、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合が上記範囲であることで、タンパク質（Ａ）中のアミノ酸配列（Ｘ）及び／又はアミノ酸配列（Ｘ’）の細胞親和性が高くなることから、肉芽組織形成作用や上皮化促進作用に優れる。さらに、滲出液等を吸収しても膨潤することなく、長期的にゲル構造を保持することができる。加えて、時間の経過及び熱等の刺激を加える等によりゲル化するので、創傷部が創傷治癒剤で密閉され、菌の増殖を抑制することができる。またゲル化物は、湿潤環境を維持し細胞の増殖を促すことができる。
また、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合及びタンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合が上記範囲であることで、創傷治癒剤の弾性率が皮膚の弾性率に近づく、即ち皮膚への追随性に優れたものとなることから、止血効果が高くなり患部の二次出血が抑制される。
【００１１】
本発明のタンパク質（Ａ）は、円二色性スペクトル法により求められるタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合が４０〜６０％であるタンパク質である。タンパク質の配列が同じでも、タンパク質の作製方法、タンパク質の精製方法、タンパク質を溶解させる溶媒のｐＨ及び溶媒の極性等により、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合は異なる。
タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合は、細胞親和性、細胞の増殖促進及び二次出血抑制の観点から４０〜５７．５％が好ましく、さらに好ましくは４０〜５５％である。
上記割合は、タンパク質（Ａ）をリフォールディングさせることによって増加させることができる。また、上記割合はタンパク質（Ａ）を変性剤や熱等で変性させることによって低下させることができる。
タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合は、下記測定法によって求める。
【００１２】
＜タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合の測定方法＞
タンパク質を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質の水溶液を作製する。作製したタンパク質の水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光株式会社製、「Ｊ−８２０」）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型：日本分光株式会社製）を用いてβターン構造の割合とランダムコイル構造の割合とを算出し、これらの合計をβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合とする。
【００１３】
本発明においてタンパク質（Ａ）は、下記アミノ酸配列（Ｘ）を少なくとも１個及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を少なくとも１個有するものである。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）若しくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列又はアミノ酸配列（Ｘ）中の２個のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／若しくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
なお、タンパク質（Ａ）は、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）をそれぞれ複数個有していてもよく、複数個ある場合のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、アミノ酸配列（Ｘ）とアミノ酸配列（Ｘ’）とを共に有していてもよい。
【００１４】
アミノ酸配列（Ｘ）としては、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）のゲル化能の観点から、ＶＰＧＶＧ配列（２）及び／又はＧＶＧＶＰ配列（３）が好ましい。
【００１５】
アミノ酸配列（Ｘ’）としては、具体的には、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）、ＧＫＧＲＰ配列（９）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）等が挙げられる。
アミノ酸配列（Ｘ’）は、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）のゲル化能の観点から、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（７）及び／又はＧＫＧＫＰ配列（８）である。
【００１６】
タンパク質（Ａ）は、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）のゲル化能の観点から、アミノ酸配列（Ｘ）の１種が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸数の０．１〜２０％のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換されたポリペプチド鎖。
【００１７】
ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、具体的には、（ＶＰＧＶＧ）b配列、（ＧＶＧＶＰ）c配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）d配列等が挙げられる。なお、ｂ〜ｄは、それぞれ、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数であり、２〜２００の整数である。
タンパク質（Ａ）１分子中に、ポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、ポリペプチド鎖（Ｙ）は同一でも異なっていてもよく、さらにタンパク質（Ａ）中にポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数は、ポリペプチド鎖（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数ｂ〜ｄが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、ｂ〜ｄが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよい。
ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、（ＶＰＧＶＧ）b配列及び／又は（ＧＶＧＶＰ）c配列が好ましい。
【００１８】
ポリペプチド鎖（Ｙ）は、アミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続した（上記ｂ〜ｄが２〜２００）ポリペプチド鎖であるが、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、アミノ酸配列（Ｘ）が連続する個数は２〜１００個（上記ｂ〜ｄが２〜１００）が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個（上記ｂ〜ｄが２〜５０）、特に好ましくは２〜４０個（ｂ〜ｄが２〜４０個）である。
【００１９】
また、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸数の０．１〜２０％のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換されたポリペプチド鎖であり、具体的には、アミノ酸配列（Ｘ）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ）において、アミノ酸配列（Ｘ）の一部又は全部がアミノ酸配列（Ｘ’）に置き換わったポリペプチド鎖が含まれる。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸数に対するリシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸数の合計数の割合は、タンパク質（Ａ）の水への溶解性、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、０．５〜１０％が好ましく、さらに好ましくは１〜７％である。
【００２０】
ポリペプチド鎖（Ｙ’）であるかどうかは、タンパク質（Ａ）の配列中の全てのリシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）を、他のアミノ酸［グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、プロリン（Ｐ）又はヒスチジン（Ｈ）］に置きかえたときに、ポリペプチド鎖（Ｙ）となるかによって判断する。
【００２１】
タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）とポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計個数は、タンパク質（Ａ）の水への溶解性、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜８０個であり、特に好ましくは１〜６０個である。
【００２２】
タンパク質（Ａ）中に、アミノ酸配列（Ｘ）の種類及び／又はアミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数が異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を有している場合は、それぞれを１個として数え、ポリペプチド鎖（Ｙ）の個数はその合計である。ポリペプチド鎖（Ｙ’）についても同様である。
【００２３】
タンパク質（Ａ）は、タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合が５〜４５％であるものであるが、細胞親和性の観点から、１０〜４０％が好ましく、さらに好ましくは１５〜３５％である。
タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。
【００２４】
＜タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合の測定法＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてタンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合を算出する。
タンパク質（Ａ）中の全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合（％）＝［｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝＋｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝×｛アミノ酸（Ｘ’）中のアミノ酸数｝］／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数｝×１００
【００２５】
なお、タンパク質（Ａ）が、複数種類のアミノ酸配列（Ｘ）を有している場合には、以下のようにして上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝」を求める。
まず、各種類のアミノ酸配列（Ｘ）について、「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝」を求める。その全種類についての合計値を、上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝」とする。
タンパク質（Ａ）が、複数種類のアミノ酸配列（Ｘ）に対応する複数種類のアミノ酸配列（Ｘ’）を有する場合も同様にして、上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数｝」を求める。
【００２６】
タンパク質（Ａ）において、タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合［｛タンパク質（Ａ）中のＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数×６｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数｝×１００］は４０〜８０％であるが、細胞親和性、二次出血抑制及びβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、４２．５〜７７．５％が好ましく、さらに好ましくは４５〜７５％である。
タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求める。
【００２７】
＜タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法の２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてタンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合を算出する。
タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合（％）＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数×６｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸の数｝×１００
【００２８】
タンパク質（Ａ）はＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するが、タンパク質（Ａ）の細胞親和性、二次出血抑制及びβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が連続する個数は、細胞親和性、二次出血抑制及びβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、２〜１００個が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個であり、特に好ましくは２〜２５個、最も好ましくは２〜１５である。
【００２９】
タンパク質（Ａ）が、アミノ酸配列（Ｘ）、アミノ酸配列（Ｘ’）、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）及びポリペプチド鎖（Ｓ）からなる群より選ばれる配列を合計２個以上有する場合は、これらの間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもいい。介在アミノ酸配列（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）ではないペプチド配列である。介在アミノ酸配列（Ｚ）を構成するアミノ酸数は、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個である。介在アミノ酸配列（Ｚ）として、具体的には、ＶＡＡＧＹ配列（１１）、ＧＡＡＹＹＡＡＧ配列（１２）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。
タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての介在アミノ酸配列（Ｚ）中のアミノ酸数の割合［Σ｛（介在アミノ酸配列（Ｚ）中のアミノ酸数）×（介在アミノ酸配列（Ｚ）の数）｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数｝×１００］は、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、０〜２０％が好ましく、さらに好ましくは０〜１５％であり、特に好ましくは０〜１０％である。
【００３０】
タンパク質（Ａ）は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）、アミノ酸配列（Ｘ’）及び介在アミノ酸配列（Ｚ）以外にも、両末端に末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していてもよい。タンパク質（Ａ）の両末端の構造が、ポリペプチド鎖（Ｙ）に末端アミノ酸配列（Ｔ）が結合した構造であることが好ましい。末端アミノ酸配列（Ｔ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）を有しないペプチド配列である。末端アミノ酸配列（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、細胞親和性の観点及びタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜４０個である。末端アミノ酸配列（Ｔ）として、具体的には、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（１３）等が挙げられる。
【００３１】
タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての末端アミノ酸配列（Ｔ）のアミノ酸数の割合［Σ｛（末端アミノ酸配列（Ｔ）中のアミノ酸数）×（末端アミノ酸配列（Ｔ）の数）｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数｝×１００］は、細胞親和性の観点及びタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、０〜１５％が好ましく、さらに好ましくは０〜１３％であり、特に好ましくは０〜１０％である。
【００３２】
タンパク質（Ａ）は、生物工学的手法により細菌を用いて製造することがある。このような場合、発現させたタンパク質（Ａ）の精製又は検出を容易にするために、タンパク質（Ａ）は上記末端アミノ酸配列（Ｔ）の他に、Ｎ又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９TM、ＣｒｕｚＴａｇ２２TM、ＣｒｕｚＴａｇ４１TM、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）  （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）  （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ  （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ  （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ  （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ  （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ  （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるタンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
【００３３】
タンパク質（Ａ）において、タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての介在アミノ酸配列（Ｚ）のアミノ酸数と全ての末端アミノ酸配列（Ｔ）のアミノ酸数と精製タグのアミノ酸数の合計数の割合は、二次出血抑制及びタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、０〜１５％が好ましく、さらに好ましくは０〜１３％であり、特に好ましくは０〜１０％である。
【００３４】
タンパク質（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）並びにＧＡＧＡＧＳ配列（１）及び／又はポリペプチド鎖（Ｓ）を含む場合、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）の中βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、ポリペプチド鎖（Ｙ）又はポリペプチド鎖（Ｙ’）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｓ）とが交互に化学結合していることが好ましい。
【００３５】
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数と、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の数との比［ＧＡＧＡＧＳ配列（１）：｛アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）｝］は、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、１：０．１〜１：６が好ましく、さらに好ましくは１：０．２〜１：５であり、特に好ましくは１：０．２〜１：３であり、最も好ましくは１：０．４〜１：１である。
【００３６】
タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量は、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、４０〜２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは５０〜１５０ｋＤａであり、特に好ましくは７０〜１２０ｋＤａである。
【００３７】
好ましいタンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（Ａ１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（３）であるタンパク質
（Ａ１１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質
【００３８】
（Ａ１１−１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が３個連続した（ＧＶＧＶＰ）3配列（１４）のポリペプチド鎖（Ｙ１１）の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換された（ＧＶＧＶＰ）2ＧＫＧＶＰ配列（６）（Ｙ’１１）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質
（Ａ１１−１−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が７個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）7配列（５）と（ＧＶＧＶＰ）2ＧＫＧＶＰ配列（６）とを有するタンパク質
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）7配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）2ＧＫＧＶＰ配列（６）をそれぞれ１３個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約８５ｋＤａの配列（１５）のタンパク質（ＳＥＬＰＳ１Ｋ）
（ｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）7配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）2ＧＫＧＶＰ配列（６）をそれぞれ２０個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約９５ｋＤａの配列（１６）のタンパク質（ＳＥＬＰＳ１Ｋ−２０）
（Ａ１１−１−２）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が１０個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）10配列（２５）と（ＧＶＧＶＰ）2ＧＫＧＶＰ配列（６）とを有するタンパク質
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）10配列（２５）及び（ＧＶＧＶＰ）2ＧＫＧＶＰ配列（６）をそれぞれを２０個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約１４０ｋＤａの配列（２２）のタンパク質（ＳＥＬＰＳ２Ｋ−２０）
【００３９】
（Ａ１１−２）ＧＶＧＶＰ配列（３）が４個連続した（ＧＶＧＶＰ）4配列（２６）のポリペプチド鎖（Ｙ１２）の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換された（ＧＶＧＶＰ）3ＧＫＧＶＰ配列（２７）（Ｙ’１２）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質
（Ａ１１−２−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（２６）と（ＧＶＧＶＰ）3ＧＫＧＶＰ配列（２７）とを有するタンパク質
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（２６）及び（ＧＶＧＶＰ）3ＧＫＧＶＰ配列（２７）をそれぞれ１５個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約６５ｋＤａの配列（２４）のタンパク質（ＳＥＬＰＳ４Ｋ−１５）
【００４０】
（Ａ１２−１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が１個と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質
（Ａ１２−１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が１個と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が１１個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）11配列（２８）とを有するタンパク質
（ｉ）ＧＶＧＶＰ配列（３）、（ＧＡＧＡＧＳ）11配列（２８）及びＧＡＡＹＹＡＡＧ配列（１２）をそれぞれ１３個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約９０ｋＤａの配列（２３）のタンパク質（ＳＥＬＰＳ３Ｋ−１３）
【００４１】
（Ａ２）アミノ酸配列（Ｘ）がＶＰＧＶＧ配列（２）であるタンパク質
（Ａ２１）ＶＰＧＶＧ配列（２）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ２）中のアミノ酸がＫ（リシン）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’２）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質
【００４２】
本発明の創傷治癒剤は、上記タンパク質（Ａ）及び水を含むものである。
創傷治癒剤中のタンパク質（Ａ）の含有量（重量％）は、タンパク質（Ａ）の水への溶解性、タンパク質（Ａ）のゲル化能及び創傷への適用のしやすさの観点から、創傷治癒剤の重量を基準として、５〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜３０重量％、特に好ましくは１５〜３０重量％である。
創傷治癒剤中の水の含有量（重量％）は、タンパク質（Ａ）の水への溶解性、タンパク質（Ａ）のゲル化能及び創傷への適用のしやすさの観点から、創傷治癒剤の重量を基準として、５０〜９５重量％が好ましく、さらに好ましくは５５〜９０重量％であり、特に好ましくは７０〜８５重量％である。
【００４３】
創傷治癒剤中の水としては、滅菌されたものであれば特に限定されるものではない。滅菌方法としては、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃で２０分加熱して過熱滅菌した脱イオン水等が挙げられる。
【００４４】
本発明の創傷治癒剤は、タンパク質（Ａ）及び水以外に無機塩及び／又はリン酸（塩）を含んでもよい。
無機塩としては、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。なお、本明細書においてリン酸（塩）は無機塩に含まない。
創傷治癒剤中の無機塩の含有量（重量％）は、人間の体液と浸透圧を同等にするという観点から、創傷治癒剤の重量を基準として０．５〜１．３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．７〜１．１重量％、特に好ましくは０．８５〜０．９５重量％である。
【００４５】
リン酸（塩）は、リン酸及び／又はリン酸塩を意味する。
リン酸塩としては、リン酸のアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
創傷治癒剤中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、創傷治癒の観点から、創傷治癒剤の重量を基準として０．１０〜０．３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１２〜０．２８重量％、特に好ましくは０．１４〜０．２６重量％である。
【００４６】
創傷治癒剤のｐＨは、タンパク質（Ａ）の安定性及び創傷治癒の観点から、５．０〜９．０が好ましく、さらに好ましくは６．０〜８．５である。この範囲であれば、創傷治癒剤中のタンパク質（Ａ）が変性することなく、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にでき、創傷治癒剤を用いて菌増殖を抑制し、肉芽組織形成や上皮化を促進することができる。
【００４７】
本発明の創傷治癒剤は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（創傷治癒剤の製造方法）
（１）本発明のタンパク質（Ａ）及び水を４〜２５℃で混合し、創傷治癒剤とする。水中には必要により無機塩及び／又はリン酸（塩）が含まれていてもよい。また、タンパク質（Ａ）を水に溶解させた後、必要により無機塩及び／又はリン酸（塩）を含むようにしてもよい。
【００４８】
本発明の創傷治癒剤は、タンパク質（Ａ）及び水等を混合した直後は溶液状であるが、菌増殖抑制の観点から、時間の経過、熱等の刺激を加える等により流動性が低くなりゲル化することが好ましい。また、本発明の創傷治癒剤は、溶液状のものを患部へそのまま適用してもよいし、予めゲル化させて患部に適用してもよい。
【００４９】
溶液状の創傷治癒剤を患部へ適用する場合の創傷治癒剤の温度は、タンパク質（Ａ）の熱安定性及びハンドリング性の観点から、４〜５０℃が好ましく、さらに好ましくは４〜４７．５℃、特に好ましくは２５〜４５℃、最も好ましくは３０〜４０℃である。
また、創傷治癒剤を予めゲル化させて用いる場合のゲル化させる温度は、創傷治癒剤を短時間でゲル化させる観点から、２５℃〜８０℃が好ましい。８０℃以下であると、組織再生用材料の機能を低下させずにゲル化させることができ、また、ゲル化までの時間が適度である。
【００５０】
創傷治癒剤の患部への適用方法としては、菌増殖抑制、肉芽組織形成、上皮化促進及び拘縮抑制の観点から、患部の欠損部分を埋めるように注入することが好ましい。
患部への適用方法の１例を下記に示す。
（創傷治癒剤の患部への適用方法）
（１）患部に創傷治癒剤を投与する。
（２）投与後、創傷治癒剤が患部から流出しないように、適当なドレッシングで被覆する。
【００５１】
上記（２）で使用するドレッシングの材質としては、特に限定されないが、ポリウレタン、シリコーン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリエチレン、エチレン酢酸ビニル共重合体及びナイロン等が挙げられる。
ドレッシングの形状としては、創傷治癒剤を投与後に、創傷治癒剤が患部から流出しないように被覆できれば制限なく使用できるが、フィルム状が好ましい。
【実施例】
【００５２】
以下に実施例として本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り部は重量部を意味する。
【００５３】
＜製造例１＞
［ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製］
○ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１）の生産
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰＳ１Ｋ生産株を得た。以下、このＳＥＬＰＳ１Ｋ生産株を用いて、タンパク質（Ａ）の一種である配列（１５）のＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１）を生産する方法を示す。
【００５４】
○ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１）の培養
３０℃で生育させたＳＥＬＰＳ１Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍｌフラスコ中のＬＢ培地５０ｍｌに接種した。カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加え、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）インキュベートした。培養液が濁度ＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、４０ｍｌを４２℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約２時間培養した。培養した培養液を氷上で冷却し、培養液の濁度ＯＤ６００を測定し、遠心分離にて大腸菌を集菌した。
【００５５】
○ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１）の精製
集菌した大腸菌を用い、下記１：菌体溶解、２：遠心分離による不溶性細片の除去、３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陰イオン交換クロマトグラフィー、６：限外濾過、７：凍結乾燥により大腸菌バイオマスからタンパク質を精製した。このようにして、分子質量が約８５ｋＤａの配列（１５）のタンパク質（Ａ１）の精製物であるＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）を得た。
【００５６】
１：菌体溶解
集菌した大腸菌１００ｇに対して、脱イオン水２００ｇを加えて、高圧ホモジナイザー（５５ＭＰａ）にて菌体溶解し、溶解した菌体を含む菌体溶解液を得た。その後、菌体溶解液を氷酢酸にてｐＨ４．０に調整した。
【００５７】
２：遠心分離による不溶性細片の除去
さらに菌体溶解液を遠心分離（６３００ｒｐｍ、４℃、３０分間）して、上清を回収した。
【００５８】
３：硫安沈殿
回収した上清に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解した。溶解した液に対して、同様に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解し、溶液を得た。
【００５９】
４：限外濾過
３で得た溶液を分子質量３０，０００カットの限外濾過装置（ホロファイバー：ＧＥヘルスケア製）に供した。３で得た溶液に対して、２０倍量の脱イオン水を用いて、限外濾過を実施し、限外濾過後のタンパク質を得た。
【００６０】
５：陰イオン交換クロマトグラフィー
限外濾過後のタンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解して２０ｇ／Ｌとし、陰イオン交換カラムＨｉＰｒｅｐＳＰ  ＸＬ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製）をセットしたＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（アマシャム社製）に供した。溶出液として５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、溶出画分を回収した。
【００６１】
６：限外濾過
５で得た溶液を上記「４：限外濾過」と同様にして処理し、限外濾過後のタンパク質を得た。
【００６２】
７：凍結乾燥
タンパク質を脱イオン水に溶解して３ｇ／Ｌとし、水位が１０ｍｍ以下となるようにステンレス製のバットに入れた。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス社製）に入れて、−３０℃、２４時間かけて凍結させた。凍結後、真空度が５Ｐａ以下、−３０℃で、１１０時間かけて１次乾燥、真空度が５Ｐａ以下、３０℃で、４８時間かけて２次乾燥させ、精製したＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）を得た。
【００６３】
○ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）の同定
得られたＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）を下記の手順で同定した。
抗ラビットＳＥＬＰＳ１Ｋ抗体及びＣ末端配列の６×Ｈｉｓタグに対する抗６×Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｌａｎｄ社製）を用いたウエスタンブロット法により分析した。ウエスタンブロット法の手順は下記の通りとした。見かけ分子質量８５ｋＤａの位置に、各抗体に抗体反応性を示すバンドが見られた。  また、アミノ酸分析システム（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ島津製作所製）を用いたアミノ酸組成分析より得られたＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）のアミノ酸の組成比率（実測値）と、合成遺伝子配列から推測されるＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）のアミノ酸の組成比率（理論値）を表１に示す。
これらから、ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）はＧＶＧＶＰ配列（３）が３個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）中のバリン（Ｖ）のうち１個がリシン（Ｋ）に置換された（ＧＶＧＶＰ）2ＧＫＧＶＰ配列（６）のポリペプチド鎖（Ｙ’１１）及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）が７個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）7配列（５）のポリペプチド鎖（Ｙ１１）をそれぞれ１３個有し、これらが交互に化学結合してなる配列（１５）のタンパク質であることを確認した。
【００６４】
【表１】
2015003905.tif 000002
【００６５】
＜ウエスタンブロット法＞
ウエスタンブロット用サンプル２０μＬに３×ＳＤＳ処理バッファ（１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３００ｍＭ  ジチオスレイトール、６％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．３％  ブロモフェノールブルー、及び３０％  グリセロールを含む）１０μＬを添加して９５℃で５分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料１５μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをフッ化ポリビニリデンメンブレン（以下、単に「メンブレン」ともいう）にトランスファーし、これをブロッキングバッファ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、及び５％  スキムミルクを含む）に浸漬して１時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で２分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液（一次抗体：抗ＳＥＬＰＳ１Ｋ抗体及び抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）をＴＢＳ−Ｔで５００分の１に希釈した溶液）に浸漬し、４℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液（二次抗体：ＥＣＬ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ  ｌｉｎｋｅｄ  Ｆ（ａｂ’）２  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をＴＢＳ−Ｔで２０００分の１に希釈した溶液）にメンブレンを浸漬し、３０分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、ＥＣＬ−Ａｄｖａｎｃｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により酵素反応を行った。ルミノメーターＦｏｒＥＣＬ（アマシャム社製）を用いて、高感度インスタント黒白フィルム（富士フイルム株式会社製）に感光させ、バンドを可視化した。肉眼でバンドが確認できない場合、ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）が分解吸収され、無くなったと判断した。
【００６６】
○βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合の測定
得られたＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）を用いて下記の手順でβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。
＜βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合の測定＞
ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）水溶液を作製した。作製したＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光：Ｊ−８２０）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型：日本分光株式会社製）を用いて、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を算出した。結果を表２に示す。
【００６７】
＜製造例２＞
製造例１の「ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、下記「５−２：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−２）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
５−２：リフォールディング（大希釈法）
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分をタンパク質変性剤である１０Ｍウレア溶液にて、８Ｍウレア溶液となるように調製し、１２時間、４℃で静置した。調製した溶液を透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）に投入し、溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。その後、脱イオン水を捨て、新たに溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。この操作を残り３回、計３回の透析を繰り返した後、透析膜中の溶液を回収した。
【００６８】
＜製造例３＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約９５ｋＤａの配列（１６）のＳＥＬＰＳ１Ｋ−２０タンパク質（Ａ２）をコードしたｐＰＴＳ０００２」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ２−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
【００６９】
＜製造例４＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約１４０ｋＤａの配列（２２）のＳＥＬＰＳ２Ｋ−２０タンパク質（Ａ８）をコードしたｐＰＴＳ０００８」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ８−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
【００７０】
＜製造例５＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約９０ｋＤａの配列（２３）のＳＥＬＰＳ３Ｋ−１３タンパク質（Ａ９）をコードしたｐＰＴＳ０００９」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ９−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
【００７１】
＜製造例６＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約６５ｋＤａの配列（２４）のＳＥＬＰＳ４Ｋ−１５タンパク質（Ａ１０）をコードしたｐＰＴＳ００１０」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ１０−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
【００７２】
＜比較製造例１＞
製造例１の「ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」に代えて下記「５’’：アフィニティクロマトグラフィー」とする以外は同様にして、ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−３）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
５’’：アフィニティクロマトグラフィー
「４：限外濾過」後のタンパク質を、Ｈｉｓ−ｔａｇを用いたアフィニティクロマトグラフィー（クロンテック社製、ＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｅｐ  Ｃｏｌｕｍｎｓ）にて精製し、溶出画分を回収した。
【００７３】
＜比較製造例２＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約８５ｋＤａの配列（１７）のタンパク質（Ａ３）をコードしたｐＰＴＳ０００３」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ３−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
【００７４】
＜比較製造例３＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約６０ｋＤａの配列（１８）のタンパク質（Ａ４）をコードしたｐＰＴＳ０００４」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ４−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
【００７５】
＜比較製造例４＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約１１０ｋＤａの配列（１９）のタンパク質（Ａ５）をコードしたｐＰＴＳ０００５」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ５−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
【００７６】
＜比較製造例５＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約１２５ｋＤａの配列（２０）のタンパク質（Ａ６）をコードしたｐＰＴＳ０００６」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ６−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
【００７７】
＜比較製造例６＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約５０ｋＤａの配列（２１）のタンパク質（Ａ７）をコードしたｐＰＴＳ０００７」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ７−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
【００７８】
＜比較製造例７＞
製造例１の「ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施しない以外は同様にして、ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−４）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
【００７９】
【表２】
2015003905.tif 000003
【００８０】
＜実施例１＞
ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１）を作製した。
【００８１】
＜実施例２〜６＞
実施例１において、「ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）」に代えて表３に記載のタンパク質（Ａ）を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（２）〜（６）を作製した。
【００８２】
＜比較例１〜７＞
実施例１において、「ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）」に代えて表３に記載のタンパク質（Ａ）を用いる以外は同様にして、比較用の創傷治癒剤（７）〜（１３）を作製した。
【００８３】
＜比較例８＞
カルボキシメチルセルロースゲルであるイントラサイトゲル（スミス＆ネフュー社製）を比較用の創傷治癒剤（１４）として用いた。
【００８４】
＜評価１＞
（タンパク質（Ａ）のゲル化能評価）
創傷治癒剤（１）〜（１４）を３７℃で静置し、ゲル化するまでの時間を測定した。ゲル化をしたかどうかの確認は、創傷治癒剤（１００μＬ）が入ったプラスティックチューブ容器（エッペンドルフチューブ、１．５ｍＬ）を５分毎に転倒し、溶液が垂れない場合はゲル化しているとし、溶液が垂れる場合はゲル化していないと判断した。また、ゲル化するまでに２時間以上を要する場合はゲル化しないと判断した。結果を表３に示す。
【００８５】
＜評価２＞
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの治療試験）
健常モルモット♀  ｓｔｄ  Ｈａｒｔｌｅｙ（日本エスエルシー社製）７週齢を麻酔下で除毛し、消毒したモルモット背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面１０×１０ｍｍの全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、創傷治癒剤（１）〜（１４）を各々注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間５、１０日目に検体を犠死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、病理標本（ＨＥ染色）を作製した。それぞれの創傷治癒剤について、病理標本を１１個作製した。
作製した治療期間５日目の病理標本用いて、パニキュラス（筋様膜）からの肉芽組織高をマイクロルーラーを使用して測定した。評価結果は表３に示す。なお、評価結果は病理標本１１個の平均値である。
また、治療期間１０日目の病理標本用いて、正常組織から伸長した上皮化長をマイクロルーラーを使用して測定した。評価結果は表３に示す。なお、評価結果は病理標本１１個の平均値である。
【００８６】
＜評価３＞
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの菌増殖抑制試験）
健常モルモット♀  ｓｔｄ  Ｈａｒｔｌｅｙ（日本エスエルシー社製）７週齢を麻酔下で除毛し、消毒したモルモット背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面１０×１０ｍｍの全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、緑膿菌１０6個／１創傷部となるように播種し、創傷治癒剤（１）〜（１４）を各々注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間３日目に検体を犠死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、細菌コロニー法にて細菌数を測定した。評価結果は表３に示す。
【００８７】
＜評価４＞
（ミニブタを用いた全層欠損層モデルでの二次出血スコアリング試験）
クラウン系ミニブタ（株式会社ジャパンファーム  クラウン研究所製）１０ヶ月齢を麻酔下で除毛し、消毒したミニブタ背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面（直径１７ｍｍ）の全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、創傷治癒剤（１）〜（１４）を各々注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間３日目に検体を犠死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、病理標本（ＨＥ染色）を作製した。なお、創傷治癒剤についてそれぞれ病理標本を１３個作製した。作製した病理標本について、患部全体に対する痂皮の割合を、以下の５段階の評価基準で評価し、スコアリングした。結果を表３に示す。なお、評価結果は病理標本１３個の平均値である。下記点数が低いほど、二次出血が抑制できていることを示す。
１点：患部全体に対する痂皮の割合が２０％未満
２点：患部全体に対する痂皮の割合が２０％以上４０％未満
３点：患部全体に対する痂皮の割合が４０％以上６０％未満
４点：患部全体に対する痂皮の割合が６０％以上８０％未満
５点：患部全体に対する痂皮の割合が８０％以上
【００８８】
【表３】
2015003905.tif 000004
【００８９】
表３の結果から、本発明の創傷治癒剤は、肉芽組織形成性、上皮化促進作用及び菌増殖抑制作用が比較例と同等又はそれ以上であり、創傷治癒剤として優れていることがわかる。さらに本発明の創傷治癒剤は、患部の二次出血の抑制効果が極めて高いことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明の創傷治癒剤は、菌増殖抑制効果、肉芽組織形成、上皮化促進作用に優れており、また、患部の二次出血を抑制する。したがって、熱傷、採皮創、皮膚剥削創及び外傷性皮膚欠損創等の疾患ないし創傷による患部を治癒する創傷治癒剤として有効である。
【配列表】
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