(57)【要約】      （修正有）【課題】卵巣ガン、原発性腹膜ガン、及び卵管ガンからなる群より選択されるプラチナ耐性ガンを処置するための方法の提供。【解決手段】ＨＥＲの二量体化を効果的に阻害するＨＥＲ２抗体とゲムシタビン等の代謝拮抗化学療法剤とを、それぞれ該ガンを処置するのに有効量投与することを含む方法、更にこれらとタキサン、カペシタビン、プラチナ系化学療法剤、アントラサイクリン、リポソームドキソルビシン、トポテカン、及びペメトレキセド等から選ばれる化学療法剤との組み合わせを用いる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵巣ガン、原発性腹膜ガン、および卵管ガンからなる群より選択されるプラチナ耐性ガンを処置するための方法であって、患者に、トラスツズマブよりも効果的にＨＥＲの二量体化を阻害するＨＥＲ２抗体と、代謝拮抗化学療法剤とを、それぞれ該ガンを処置するのに有効量投与することを含む方法。
【請求項２】
ＨＥＲ２抗体がＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＨＥＲ２抗体がパーツズマブである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
代謝拮抗化学療法剤がゲムシタビンである、前記請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
患者由来の腫瘍試料がＨＥＲ活性化を示す、前記請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
患者由来の腫瘍試料がＨＥＲ２活性化を示す、請求項５記載の方法。
【請求項７】
代謝拮抗化学療法剤のみで処置された患者に比較して生存の改善が結果として生じる、前記請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
代謝拮抗化学療法剤のみで処置された患者に比較して無進行生存の改善が結果として生じる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
代謝拮抗化学療法剤のみで処置された患者に比較して全生存の改善が結果として生じる、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
客観的奏功が結果として生じる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
完全寛解が結果として生じる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
部分応答が結果として生じる、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
ＨＥＲ２抗体が、約８４０mgのローディング用量に続いて、約３週間毎に約４２０mgとして投与される、前記請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
ＨＥＲ２抗体が、約３週間毎に投与される約１０５０mgの間の用量として投与される、請求項１〜１２のいずれか一項または複数項記載の方法。
【請求項１５】
ゲムシタビンが３週間サイクルの１日目および８日目に約６００mg/m2から１２５０mg/m2の間の用量で投与される、請求項４記載の方法。
【請求項１６】
代謝拮抗化学療法剤がＨＥＲ２抗体の投与の前または後に投与される、前記請求項１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
代謝拮抗化学療法剤の少なくとも１回の投与およびＨＥＲ２抗体の少なくとも１回の投与の間のタイミングが約１か月以下である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
代謝拮抗化学療法剤の少なくとも１回の投与およびＨＥＲ２抗体の少なくとも１回の投与の間のタイミングが約２週間以下である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
代謝拮抗化学療法剤およびＨＥＲ２抗体が単一製剤または別々の製剤として患者に同時投与される、請求項１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
ガンがＨＥＲ２を過剰発現しない、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
患者に第２の化学療法剤を投与することをさらに含む、前記請求項１〜２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
第２の化学療法剤が、タキサン、カペシタビン、プラチナ系化学療法剤、アントラサイクリン、リポソームドキソルビシン、トポテカン、ペメトレキセド、ビンカアルカロイド、およびＴＬＫ２８６からなる群より選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
代謝拮抗化学療法剤とＨＥＲ２抗体との組み合わせを用いた処置の結果として、患者に相乗的な、または相加的よりも大きい治療上の利益が生じる、前記請求項１〜２２のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
ゲムシタビンとＨＥＲ２抗体との組み合わせを用いた処置の結果として、患者に相乗的な、または相加的よりも大きい利益が生じる、請求項４記載の方法。
【請求項２５】
ＨＥＲ２抗体がネイキッドな抗体である、前記請求項１〜２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
ＨＥＲ２抗体がインタクトな抗体である、前記請求項１〜２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
ＨＥＲ２抗体が、抗原結合領域を含む抗体フラグメントである、請求項１〜２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
ガンが卵巣ガンである、前記請求項１〜２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
ガンが原発性腹膜ガンである、請求項１〜２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
ガンが卵管ガンである、請求項１〜２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
卵巣ガン、原発性腹膜ガン、および卵管ガンからなる群より選択されるプラチナ耐性ガンを処置するための方法であって、患者に、ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に結合するＨＥＲ２抗体とゲムシタビンとを、それぞれ該ガンの処置に有効量投与することを含む方法。
【請求項３２】
抗体が、ＨＥＲ２とＥＧＦＲまたはＨＥＲ３とのヘテロ二量体化を遮断する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
卵巣ガン、原発性腹膜ガン、および卵管ガンからなる群より選択されるプラチナ耐性ガンを処置するための方法であって、患者に、ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合するＨＥＲ２抗体とゲムシタビンとを、それぞれ該ガンの処置に有効量投与することを含む方法。
【請求項３４】
ＨＥＲ２のドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの間の結合部に結合する、請求項３３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき２００４年６月１６日に出願された仮出願６０／５８０，３３３の利益を主張している、米国特許法施行規則１．５３条（ｂ）項に基づき出願された非仮出願であり、本非仮出願の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＨＥＲの二量体化を効果的に阻害するＨＥＲ２抗体とゲムシタビンとの組み合わせを用いて、プラチナ耐性の卵巣ガン、原発性腹膜ガン、または卵管ガンを処置するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ＨＥＲ抗体
ＨＥＲファミリーのレセプターチロシンキナーゼは、細胞の成長、分化、および生存の重要な仲介物質である。このレセプターファミリーには、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ、ＢｒｂＢ１、またはＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）を含めた四つの異なるメンバーがある。
【０００４】
ｅｒｂＢ１遺伝子によってコードされるＥＧＦＲは、ヒトの悪性腫瘍の原因となると関係づけられている。特に、ＥＧＦＲの発現増加が乳ガン、膀胱ガン、肺ガン、頭部ガン、頚部ガン、および胃ガン、ならびに神経膠芽腫で観察されている。レセプターＥＧＦＲの発現増加は、同じ腫瘍細胞によるＥＧＦＲリガンドであるトランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）の産生増加としばしば関連し、その結果として自己分泌刺激経路によるレセプター活性化が生じる。Baselga and Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994)。ＥＧＦＲまたはそのリガンドであるＴＧＦ−αおよびＥＧＦに対するモノクローナル抗体は、そのような悪性腫瘍の処置における治療薬として評価されてきた。例えば、Baselga and Mendelsohn、上記; Masui et al., Cancer Research 44:1002-1007 (1984);およびWu et al., J. Clin. Invest. 95:1897-1905 (1995)を参照されたい。
【０００５】
ＨＥＲファミリーの第２のメンバーであるｐ１８５ｎｅｕは、化学処置されたラットの神経芽細胞腫由来のトランスフォーミング遺伝子産物としてもともと同定された。ｎｅｕプロトオンコジーンの活性化型は、コードされたタンパク質の膜貫通領域における（バリンからグルタミン酸への）点突然変異に起因する。ｎｅｕのヒトホモログの増幅は、乳ガンおよび卵巣ガンで観察され、予後不良と相関する（Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989); および米国特許第４，９６８，６０３号）。これまで、ｎｅｕプロトオンコジーンにおける点突然変異に類似した点突然変異は、ヒト腫瘍については報告されていない。ＨＥＲ２の過剰発現（遺伝子増幅が原因で頻繁であるが一様ではない）は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓、および膀胱のガン腫を含めたその他のガン腫でも観察されている。数ある中で、King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al, Lancet 1:765-767 (1986); Fukushige et al., Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Guerin et al., Oncogene Res., 3:21- 31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:364(1990); Weiner et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:254-257 (1990); Aasland et al., Br. J. Cancer 57:358-363 (1988); Williams et al. Pathobiology 59:46-52 (1991);およびMcCann et al., Cancer, 65:88-92 (1990)を参照されたい。ＨＥＲ２は前立腺ガンで過剰発現していることがある（Gu et al., Cancer Lett. 99:185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol. 28:827-33 (1997); Ross et al., Cancer 79:2162-70 (1997);およびSadasivan et al., J. Urol. 150:126-31 (1993)）。
【０００６】
ラットｐ１８５ｎｅｕおよびヒトＨＥＲ２タンパク質産物に対する抗体が記載されている。Drebinおよび共同研究者らは、ラットｎｅｕ遺伝子産物であるｐ１８５ｎｅｕに対する抗体を産生させた。例えば、Drebin et al., Cell 41:695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198:277-290 (1991);およびＷＯ９４／２２４７８を参照されたい。Drebin et al., Oncogene 2:273-277 (1988)は、ｐ１８５ｎｅｕの二つの異なる領域と反応する抗体の混合物が、ヌードマウスに移植した、ｎｅｕでトランスフォーメーションしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞に相乗的な抗腫瘍効果を招くと報告している。１９９８年１０月２０日に発行された米国特許第５，８２４，３１１号も参照されたい。
【０００７】
Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172 (1989)は、ヒト乳房腫瘍細胞系ＳＫ−ＢＲ−３を用いて特徴付けられたＨＥＲ２抗体の一団の発生を記載している。抗体を曝露した後に、７２時間後に単層をクリスタルバイオレットで染色することによって、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の相対的な細胞増殖を決定した。このアッセイを用いて、細胞増殖を５６%阻害した４Ｄ５と呼ばれる抗体で最大阻害が得られた。この一団のその他の抗体は、このアッセイではより少ない程度に細胞増殖が低減した。この抗体４Ｄ５は、ＨＥＲ２を過剰発現している乳房腫瘍細胞系を、ＴＮＦ−αの細胞毒性作用に対して感作することがさらに見出された。１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号も参照されたい。Hudziakらに論じられたＨＥＲ２抗体は、Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro 26(3):59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol. 11(3):117-127 (1991); Kumar et al., Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986 (1991); Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al., Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al., Cancer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al., J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994); Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465 (1996);およびSchaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)にさらに特徴付けられている。
【０００８】
組換えヒト化バージョンのマウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２、トラスツズマブ、またはHERCEPTIN（登録商標）；米国特許第５，８２１，３３７号）は、以前に大規模な抗ガン治療を受けた、ＨＥＲ２過剰発現転移性乳ガンを有する患者に臨床的に活性である（Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996））。トラスツズマブは、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現する転移性乳ガン患者の処置に、１９９８年９月２５日に食品医薬品局から販売許可を受けた。
【０００９】
種々の特性を有するその他のＨＥＲ２抗体は、Tagliabue et al., Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al., Cancer Res.51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al., Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer 53:401-408 (1993);ＷＯ９４／００１３６; Kasprzyk et al., Cancer Research 52:2771-2776 (1992);Hancock et al., Cancer Res.51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res.54:1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); 米国特許第５，７８３，１８６号;およびKlapper et al., Oncogene 14:2099-2109 (1997)に記載されている。
【００１０】
ホモロジースクリーニングの結果として、レセプターＨＥＲファミリーの２つの他のメンバー、すなわちＨＥＲ３（米国特許第５，１８３，８８４号および第５，４８０，９６８号、ならびにKraus et al., PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)）およびＨＥＲ４（ＥＰ特許出願第５９９，２７４号；Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993);およびPlowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)）を同定した。これらのレセプターの両方は、少なくとも一部の乳ガン細胞系上で増加した発現を示す。
【００１１】
これらのレセプターＨＥＲは、一般に、細胞に様々な組み合わせで見い出され、ヘテロ二量体化は、多様なＨＥＲリガンドに対する細胞応答の多様性を増加させると考えられる（Earp et al., Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)）。ＥＧＦＲは、六つの異なるリガンド、すなわち上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン、およびエピレグリンによって結合される（Groenen et al., Growth Factors 11:235-257 (1994)）。単一の遺伝子の選択的スプライシングに起因するヘレグリンタンパク質ファミリーは、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４に対するリガンドである。このヘレグリンファミリーには、アルファヘレグリン、ベータヘレグリン、およびガンマヘレグリン（Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); 米国特許第５，６４１，８６９号;およびSchaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)）;ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、グリア成長因子（ＧＧＦ）；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）；および感覚および運動神経細胞由来因子（ＳＭＤＦ）がある。総説については、Groenen et al., Growth Factors 11:235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262 (1996)、およびLee et al., Pharm. Rev. 47:51-85 (1995)を参照されたい。最近、三つの追加のＨＥＲリガンドが同定された。それらは、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４のいずれかと結合することが報告されているニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）（Chang et al., Nature 387 509-512 (1997);およびCarraway et al., Nature 387:512-516 (1997)）；ＨＥＲ４と結合するニューレグリン−３（Zhang et al., PNAS (USA) 94(18):9562-7 (1997)）；およびＨＥＲ４と結合するニューレグリン−４（Harari et al., Oncogene 18:2681-89 (1999)）である。ＨＢ−ＥＧＦ、ベータセルリン、およびエピレグリンもまたＨＥＲ４に結合する。
【００１２】
ＥＧＦおよびＴＧＦαはＨＥＲ２と結合しないが、ＥＧＦは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を刺激してヘテロ二量体を形成させ、このヘテロ二量体はＥＧＦＲを活性化して、その結果としてこのヘテロ二量体中のＨＥＲ２のリン酸基転移が生じる。二量体化および／またはリン酸基転移は、ＨＥＲ２チロシンキナーゼを活性化するようである。Earpら、上記を参照されたい。同様に、ＨＥＲ３がＨＥＲ２と同時発現すると、活性なシグナル伝達複合体が形成し、ＨＥＲ２に対する抗体はこの複合体を破壊できる（Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994)）。追加的に、ＨＥＲ２と同時発現すると、ヘレグリン（ＨＲＧ）に対するＨＥＲ３の親和性はより高い親和性状態に増大する。ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体に関しては、Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995);およびLewis et al., Cancer Res., 56:1457-1465 (1996)もまた参照されたい。ＨＥＲ４は、ＨＥＲ３と同様に、ＨＥＲ２と共に活性なシグナル伝達複合体を形成する（Carraway and Cantley, Cell 78:5-8 (1994)）。
【００１３】
卵巣ガン
卵巣ガンは、女性生殖器の悪性腫瘍による死亡の最大の原因である。米国で１年に推定２４０００人が新しく診断され、この疾患により約１３０００人が死亡する。進行した卵巣ガンを有する患者は、プラチナ系化学療法をしばしばタキサンと組み合わせて処置されることが多い。これらの薬剤が作用しなくなった後には、治療の選択肢はほとんどない。プラチナ感受性疾患を有する患者はプラチナで再処置されることが多いが、かなりの率の患者が再処置後に短い反応持続期間しか有さない。プラチナ耐性疾患を有する患者については転帰はあまり良好ではない。トポテカンは、初回またはその後の化学療法が作用しなくなった患者のために、食品医薬品局（ＦＤＡ）により許可されており、リポソームドキソルビシンは、プラチナ系およびパクリタキセル系化学療法方式の両方に抗療性である卵巣ガンを有する患者にのみ許可されている。トポテカンおよびリポソームドキソルビシンは、プラチナ耐性疾患を有する患者のそれぞれ６%および１２%の部分反応を示し、１４〜１８週間の進行のない生存の中央値を有した。最近になって、プラチナ耐性卵巣ガンに部分反応１６%を伴う有望な結果がゲムシタビンで報告され、第２選択療法としてこの薬剤の使用が増加するに至った。しかし、現存する治療法が作用しなくなった、進行卵巣ガンを有する患者のための新しく改善された治療選択肢の必要性が明らかに存在する。
【００１４】
ＥｒｂＢまたはヒト上皮成長因子レセプター（ＨＥＲ）ファミリーのレセプターチロシンキナーゼは、卵巣ガンの病因に関係づけられている。ＨＥＲシグナル伝達経路をターゲティングするために、パーツズマブ（ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４）が、他のレセプターＨＥＲとのＨＥＲ２の二量体化を阻害することにより、リガンド駆動リン酸化および活性化、ならびにＲＡＳおよびＡＫＴ経路の下流の活性化を阻害するヒト化抗体として開発された。
【００１５】
ゲムシタビンは、多様な腫瘍に使用されており、膵臓ガンおよび肺ガンへの使用の適応がある。ゲムシタビン単剤の使用に伴う最も一般的な毒性には、貧血および好中球減少症の発生率それぞれ６８%および６３%を有する血球減少症がある。別の一般的な毒性は悪心および嘔吐であり、同時発生率は６９%であり、グレードＩＩＩの発生率は１３%、グレードＩＶの発生率は１%である。下痢は、それよりも低頻度の１９%に起こる。発疹は、さらに通例は３０%に起こり、グレードＩＩＩの発生率はわずか１%である。ゲムシタビンは、重大な増加も予期されない毒性も全く有さずに、タキサン、アントラサイクリン、およびプラチナ類などの多くのその他の化学療法剤と組み合わされてきた。
【００１６】
トラスツズマブは、フェーズＩＩ試験で種々の化学療法のいくつかの組み合わせでゲムシタビンと組み合わされ、心臓毒性も予期せぬ毒性も観察されずに十分に耐容もされた。Safran et al., Proc Am. Soc. Clin. Oncol. 20:130a (2001), Miller et al., Oncology 15(2): 38-40 (2001)。トラスツズマブおよびゲムシタビンの組み合わせに関しては、Zinner et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 20:328a (2001), Nagourney et al., Breast Cancer Res. Treat. 57:116, Abstract 475 (1999), Bun et al., Proc. Am. Assoc. Canc. Res. 41:719, Abstract #4571 (2000), Konecny et al., Breast Cancer Res Treat 57: 114, Abstract 467 (1999), O'Shaugnessy et al., Sem. Oncol 2(suppl3):22-26 (2004), Sledge et al., Sem. Oncol. 2(suppl3): 19-21 (2003), Zinner et al., Lung Cancer 44(1):99-110 (2004), Gatzemeier et al., Ann of Oncol. 15:19-27 (2004)も参照されたい。
【００１７】
固形腫瘍を処置するための単剤としてのＯｍｎｉｔａｒｇのフェーズＩ試験において、進行卵巣ガンを有する被験者３人をパーツズマブで処置した。１人は持続的な部分反応を有し、追加の被験者１人は１５週間安定病態を有した。Agus et al., Proc Am Soc Clin Oncol 22: 192, Abstract 771 (2003)。
【００１８】
発明の概要
本発明は、第一の局面において、卵巣ガン、原発性腹膜ガン、および卵管ガンからなる群より選択されるプラチナ耐性ガンを処置するための方法に関するものであり、その方法は、トラスツズマブよりも効果的にＨＥＲの二量体化を阻害するＨＥＲ２抗体と、代謝拮抗化学療法剤とを、それぞれそのガンを処置するのに有効な量で患者に投与することを含む。
【００１９】
別の局面では、本発明は、卵巣ガン、原発性腹膜ガン、および卵管ガンからなる群より選択されるプラチナ耐性ガンを処置するための方法を提供し、その方法は、ＨＥＲ２上のヘテロ二量体結合部位に結合するＨＥＲ２抗体とゲムシタビンとを、それぞれそのガンを処置するのに有効な量で患者に投与することを含む。
【００２０】
なおさらなる局面では、本発明は、卵巣ガン、原発性腹膜ガン、および卵管ガンからなる群より選択されるプラチナ耐性ガンを処置するための方法に関するものであり、その方法は、ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合するＨＥＲ２抗体とゲムシタビンとを、それぞれそのガンを処置するのに有効な量で患者に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】短縮突然変異体分析および部位特異的突然変異誘発によって決定された、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）内の残基２２〜６４５（シグナル配列を含めたアミノ酸配列を図１Ａ；配列番号：１３に示す）のエピトープマッピングを示す図である（Nakamura et al., J. of Virology 67(10):6179-6191 (1993);およびRenz et al., J. Cell Biol. 125(6):1395-1406 (1994)）。ポリメラーゼ連鎖反応技法を用いて、ｃＤＮＡからＨＥＲ２−ＥＣＤの様々な短縮または点突然変異を調製した。哺乳動物発現プラスミドでのｇＤ融合タンパク質としてＨＥＲ２突然変異体を発現させた。この発現プラスミドは、挿入されたｃＤＮＡの下流に局在するＳＶ４０終止シグナルおよびポリアデニル化シグナルを有するサイトメガロウイルスプロモータ／エンハンサーを使用している。プラスミドＤＮＡを２９３細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの１日後に、１%透析ウシ胎仔血清およびそれぞれ２５μCiの３５Ｓメチオニンおよび３５Ｓシステインを含有する無メチオニン無システイン低グルコースＤＭＥＭ中で細胞を一晩代謝的にラベルした。上清を採集して、ＨＥＲ２モノクローナル抗体または対照抗体のいずれかを上清に加えて、４℃で２〜４時間インキュベーションした。複合体を沈殿させて、１０〜２０%トリシンＳＤＳグラジエントゲルに適用して、１００Vで電気泳動した。そのゲルを膜に電気ブロッティングして、オートラジオグラフィーで分析した。図１Ｂに示すように、ＨＥＲ２抗体である７Ｃ２、７Ｆ３、２Ｃ４、７Ｄ３、３Ｅ８、４Ｄ５、２Ｈ１１、および３Ｈ４は、ＨＥＲ２の様々なＥＣＤエピトープと結合する。
【図１Ｂ】短縮突然変異体分析および部位特異的突然変異誘発によって決定された、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）内の残基２２〜６４５（シグナル配列を含めたアミノ酸配列を図１Ａ；配列番号：１３に示す）のエピトープマッピングを示す図である（Nakamura et al., J. of Virology 67(10):6179-6191 (1993);およびRenz et al., J. Cell Biol. 125(6):1395-1406 (1994)）。ポリメラーゼ連鎖反応技法を用いて、ｃＤＮＡからＨＥＲ２−ＥＣＤの様々な短縮または点突然変異を調製した。哺乳動物発現プラスミドでのｇＤ融合タンパク質としてＨＥＲ２突然変異体を発現させた。この発現プラスミドは、挿入されたｃＤＮＡの下流に局在するＳＶ４０終止シグナルおよびポリアデニル化シグナルを有するサイトメガロウイルスプロモータ／エンハンサーを使用している。プラスミドＤＮＡを２９３細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの１日後に、１%透析ウシ胎仔血清およびそれぞれ２５μCiの３５Ｓメチオニンおよび３５Ｓシステインを含有する無メチオニン無システイン低グルコースＤＭＥＭ中で細胞を一晩代謝的にラベルした。上清を採集して、ＨＥＲ２モノクローナル抗体または対照抗体のいずれかを上清に加えて、４℃で２〜４時間インキュベーションした。複合体を沈殿させて、１０〜２０%トリシンＳＤＳグラジエントゲルに適用して、１００Vで電気泳動した。そのゲルを膜に電気ブロッティングして、オートラジオグラフィーで分析した。図１Ｂに示すように、ＨＥＲ２抗体である７Ｃ２、７Ｆ３、２Ｃ４、７Ｄ３、３Ｅ８、４Ｄ５、２Ｈ１１、および３Ｈ４は、ＨＥＲ２の様々なＥＣＤエピトープと結合する。
【図２Ａ】ｒＨＲＧβ１のＭＣＦ７細胞活性化に及ぼす、ＨＥＲ２モノクローナル抗体２Ｃ４および７Ｆ３の効果を示す図である。図２Ａは、２Ｃ４または７Ｆ３によるＨＲＧのチロシンリン酸化刺激の阻害についての用量反応曲線を示す。図２Ｂは、２Ｃ４または７Ｆ３による、ＭＣＦ７細胞に対する１２５ＩラベルｒＨＲＧβ１１７７−２４４の結合阻害についての用量反応曲線を示す。
【図２Ｂ】ｒＨＲＧβ１のＭＣＦ７細胞活性化に及ぼす、ＨＥＲ２モノクローナル抗体２Ｃ４および７Ｆ３の効果を示す図である。図２Ａは、２Ｃ４または７Ｆ３によるＨＲＧのチロシンリン酸化刺激の阻害についての用量反応曲線を示す。図２Ｂは、２Ｃ４または７Ｆ３による、ＭＣＦ７細胞に対する１２５ＩラベルｒＨＲＧβ１１７７−２４４の結合阻害についての用量反応曲線を示す。
【図３】ＨＥＲ２モノクローナル抗体２Ｃ４または７Ｆ３による、一連のヒト腫瘍細胞系に対する１２５ＩラベルｒＨＲＧβ１１７７−２４４の特異的結合阻害を示す図である。モノクローナル抗体対照は、ｒＨＲＧの結合を遮断しない、アイソタイプが一致するマウスモノクローナル抗体である。１００ｎＭ  ｒＨＲＧβ１の存在下で行った併行インキュベーションから、１２５ＩラベルｒＨＲＧβ１１７７−２４４の非特異的結合を決定した。１２５ＩラベルｒＨＲＧβ１１７７−２４４の非特異的結合についての値は、試験した全ての細胞系についての合計の１%未満であった。
【図４Ａ】ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞（図４Ａ）およびＳＫ−ＢＲ−３細胞（図４Ｂ）の増殖に及ぼすモノクローナル抗体２Ｃ４および４Ｄ５の効果を示す図である。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞を９６ウェルプレートに蒔き、２時間接着させた。１%血清を含有する培地中で実験を行った。ＨＥＲ２抗体または培地単独を加え、細胞を３７℃で２時間インキュベーションした。続いて、ｒＨＲＧβ１（１nM）または培地単独を加え、細胞を４日間インキュベーションした。単層を洗浄して、０．５%クリスタルバイオレットで染色／固定した。細胞の増殖を決定するために、吸光度を５４０nmで測定した。
【図４Ｂ】ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞（図４Ａ）およびＳＫ−ＢＲ−３細胞（図４Ｂ）の増殖に及ぼすモノクローナル抗体２Ｃ４および４Ｄ５の効果を示す図である。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞を９６ウェルプレートに蒔き、２時間接着させた。１%血清を含有する培地中で実験を行った。ＨＥＲ２抗体または培地単独を加え、細胞を３７℃で２時間インキュベーションした。続いて、ｒＨＲＧβ１（１nM）または培地単独を加え、細胞を４日間インキュベーションした。単層を洗浄して、０．５%クリスタルバイオレットで染色／固定した。細胞の増殖を決定するために、吸光度を５４０nmで測定した。
【図５Ａ】低／正常レベルのＨＥＲ２を発現しているＭＣＦ７細胞（図５Ａ）および高レベルのＨＥＲ２を発現しているＳＫ−ＢＲ−３細胞（図５Ｂ）における、ヘレグリン（ＨＲＧ）に依存したＨＥＲ２とＨＥＲ３との会合に及ぼすモノクローナル抗体２Ｃ４、トラスツズマブ抗体、または抗ＥＧＦＲ抗体の効果を示す図である。下記実施例２を参照されたい。
【図５Ｂ】低／正常レベルのＨＥＲ２を発現しているＭＣＦ７細胞（図５Ａ）および高レベルのＨＥＲ２を発現しているＳＫ−ＢＲ−３細胞（図５Ｂ）における、ヘレグリン（ＨＲＧ）に依存したＨＥＲ２とＨＥＲ３との会合に及ぼすモノクローナル抗体２Ｃ４、トラスツズマブ抗体、または抗ＥＧＦＲ抗体の効果を示す図である。下記実施例２を参照されたい。
【図６Ａ】インタクトなマウスモノクローナル抗体２Ｃ４（ｍｕ２Ｃ４）およびキメラ２Ｃ４  Ｆａｂフラグメントの活性を比較する図である。図６Ａは、キメラ２Ｃ４  Ｆａｂまたはインタクトなマウスモノクローナル抗体２Ｃ４による、ＭＣＦ７細胞に対する１２５Ｉ−ＨＲＧの結合阻害を示す。ＭＣＦ７細胞を２４ウェルプレートに蒔き（１×１０５個／ウェル）、約８５%の集密度になるまで２日間成長させた。Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465 (1996)に記載されているように結合実験を行った。図６Ｂは、Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465 (1996)に記載されているように行った、ＭＣＦ７細胞におけるｒＨＲＧβ１によるｐ１８０チロシンリン酸化活性化の阻害を示す。
【図６Ｂ】インタクトなマウスモノクローナル抗体２Ｃ４（ｍｕ２Ｃ４）およびキメラ２Ｃ４  Ｆａｂフラグメントの活性を比較する図である。図６Ａは、キメラ２Ｃ４  Ｆａｂまたはインタクトなマウスモノクローナル抗体２Ｃ４による、ＭＣＦ７細胞に対する１２５Ｉ−ＨＲＧの結合阻害を示す。ＭＣＦ７細胞を２４ウェルプレートに蒔き（１×１０５個／ウェル）、約８５%の集密度になるまで２日間成長させた。Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465 (1996)に記載されているように結合実験を行った。図６Ｂは、Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465 (1996)に記載されているように行った、ＭＣＦ７細胞におけるｒＨＲＧβ１によるｐ１８０チロシンリン酸化活性化の阻害を示す。
【図７Ａ】マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）（図７Ａ）および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）（図７Ｂ）（それぞれ配列番号１および２）；ヒト化２Ｃ４バージョン５７４のＶＬドメインおよびＶＨドメイン（それぞれ配列番号３および４）；ならびにヒトＶＬおよびＶＨコンセンサスフレームワーク（ｈｕｍ  κ１（軽鎖カッパ亜群Ｉ）；ｈｕｍＩＩＩ（重鎖亜群ＩＩＩ））（それぞれ配列番号５および６）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。星印により、ヒト化２Ｃ４バージョン５７４とマウスモノクローナル抗体２Ｃ４との間、またはヒト化２Ｃ４バージョン５７４とヒトフレームワークとの間に差があることを明らかにする。相補性決定部（ＣＤＲ）に括弧を付す。
【図７Ｂ】マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）（図７Ａ）および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）（図７Ｂ）（それぞれ配列番号１および２）；ヒト化２Ｃ４バージョン５７４のＶＬドメインおよびＶＨドメイン（それぞれ配列番号３および４）；ならびにヒトＶＬおよびＶＨコンセンサスフレームワーク（ｈｕｍ  κ１（軽鎖カッパ亜群Ｉ）；ｈｕｍＩＩＩ（重鎖亜群ＩＩＩ））（それぞれ配列番号５および６）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。星印により、ヒト化２Ｃ４バージョン５７４とマウスモノクローナル抗体２Ｃ４との間、またはヒト化２Ｃ４バージョン５７４とヒトフレームワークとの間に差があることを明らかにする。相補性決定部（ＣＤＲ）に括弧を付す。
【図８Ａ】実施例３においてＥＬＩＳＡにより決定された、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）へのキメラＦａｂ２Ｃ４（Ｆａｂ．ｖ１）およびいくつかのヒト化２Ｃ４変異体の結合を示す図である。
【図８Ｂ】実施例３においてＥＬＩＳＡにより決定された、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）へのキメラＦａｂ２Ｃ４（Ｆａｂ．ｖ１）およびいくつかのヒト化２Ｃ４変異体の結合を示す図である。
【図８Ｃ】実施例３においてＥＬＩＳＡにより決定された、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）へのキメラＦａｂ２Ｃ４（Ｆａｂ．ｖ１）およびいくつかのヒト化２Ｃ４変異体の結合を示す図である。
【図９】白色のＣＤＲ主鎖がラベルされた（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、モノクローナル抗体２Ｃ４のＶＬおよびＶＨドメインのリボンダイアグラムを示す図である。ヒト化の間の突然変異誘発によって（実施例３、表２参照）評価されたＶＨ側鎖も示す。
【図１０】ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、またはＨＲＧが仲介するマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）活性化に及ぼすモノクローナル抗体２Ｃ４またはトラスツズマブの効果を示す図である。
【図１１Ａ】トラスツズマブ軽鎖（配列番号：１４）およびトラスツズマブ重鎖（配列番号：１５）のアミノ酸配列をそれぞれ示す図である。
【図１１Ｂ】トラスツズマブ軽鎖（配列番号：１４）およびトラスツズマブ重鎖（配列番号：１５）のアミノ酸配列をそれぞれ示す図である。
【図１２Ａ】パーツズマブ軽鎖（配列番号：１６）およびパーツズマブ重鎖（配列番号：１７）のアミノ酸配列をそれぞれ示す図である。
【図１２Ｂ】パーツズマブ軽鎖（配列番号：１６）およびパーツズマブ重鎖（配列番号：１７）のアミノ酸配列をそれぞれ示す図である。
【図１３】ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に２Ｃ４が結合することによって活性化ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３とのヘテロ二量体化が阻止されることを概略的に示す図である。
【図１４】ＭＡＰＫおよびＡｋｔ経路とのＨＥＲ２／ＨＥＲ３の共役を示す図である。
【図１５】トラスツズマブおよびパーツズマブの活性を比較する図である。
【図１６】ＨＥＲ２の様々なドメインを概略的に示す図である。
【００２２】
好ましい態様の詳細な説明
Ｉ．  定義
「レセプターＨＥＲ」は、レセプターＨＥＲファミリーに属するレセプタータンパク質チロシンキナーゼであり、レセプターＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４、ならびに将来同定されるべき本ファミリーのその他のメンバーを含む。レセプターＨＥＲは、ＨＥＲリガンドと結合できる細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；およびリン酸化されうるいくつかのチロシン残基を保有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを一般に含むものである。レセプターＨＥＲは、「天然配列」レセプターＨＥＲまたはその「アミノ酸配列変異体」でありうる。好ましくは、レセプターＨＥＲは天然配列のヒトレセプターＨＥＲである。
【００２３】
ＨＥＲ２の細胞外ドメインは、四つのドメイン、すなわちドメインＩ（約１〜１９５のアミノ酸残基）、ドメインＩＩ（約１９６〜３２０のアミノ酸残基）、ドメインＩＩＩ（約３２１〜４８８のアミノ酸残基）、およびドメインＩＶ（約４８９〜６３２のアミノ酸残基）（シグナルペプチドを除いた残基に番号付け）を含む。Garrett et al., Mol. Cell. 11:495-505 (2003), Cho et al., Nature 421:756-760 (2003), Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)、またはPlowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993)、および本明細書の図１６を参照されたい。
【００２４】
用語「ＥｒｂＢ１」、「ＨＥＲ１」、「上皮成長因子レセプター」、および「ΕＧＦＲ」は、本明細書において相互交換可能に使用され、例えばCarpenter et al., Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)に開示されたようなＥＧＦＲを、その天然突然変異体（例えば、Humphrey et al., PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)におけるような欠失突然変異体ＥＧＦＲ)を含めて指す。ｅｒｂＢ１は、ＥＧＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子を指す。
【００２５】
表現「ＥｒｂＢ２」および「ＨＥＲ２」は、本明細書において相互交換可能に使用され、例えばSemba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985)およびYamamoto et al., Nature 319:230-234 (1986)に記載されたヒトＨＥＲ２タンパク質（ＧｅｎｅｂａｎｋアクセッションナンバーＸ０３３６３）を指す。用語「ｅｒｂＢ２」は、ヒトＥｒｂＢ２をコードする遺伝子を指し、「ｎｅｕ」は、ラットｐ１８５ｎｅｕをコードする遺伝子を指す。好ましいＨＥＲ２は天然配列のヒトＨＥＲ２である。
【００２６】
「ＥｒｂＢ３」および「ＨＥＲ３」は、例えば、米国特許第５，１８３，８８４号および第５，４８０，９６８号、ならびにKraus et al., PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)に開示されたようなレセプターポリペプチドを指す。
【００２７】
本明細書における用語「ＥｒｂＢ４」および「ＨＥＲ４」は、例えば、ＥＰ特許出願第５９９，２７４号; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993);およびPlowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)に開示されたようなレセプターポリペプチドを、例えば、１９９９年４月２２日に公表されたＷＯ９９／１９４８８に開示されたようなそのアイソフォームを含めて指す。
【００２８】
「ＨＥＲリガンド」により、レセプターＨＥＲに結合し、かつ／またはそれを活性化するポリペプチドを意味する。本明細書において特に関心対象であるＨＥＲリガンドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）（Savage et al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)）；トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）（Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)）；神経鞘腫またはケラチン細胞の自己分泌成長因子としても公知であるアンフィレグリン（Shoyab et al., Science 243: 1074-1076 (1989);Kimura et al., Nature 348:257-260 (1990);およびCook et al., Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557 (1991)）；ベータセルリン（Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993);およびSasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)）；ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991)）；エピレグリン（Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995);およびKomurasaki et al., Oncogene 15:2841-2848 (1997)）；ヘレグリン（下記参照）；ニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）（Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)）；ニューレグリン−３（ＮＲＧ−３）（Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:9562-9567 (1997)）；ニューレグリン−４（ＮＲＧ−４）（Harari et al., Oncogene 18:2681-89 (1999)）またはクリプト（cripto）（ＣＲ−１）（Kannan et al., J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335 (1997））などの天然配列のヒトＨＥＲリガンドである。ＥＧＦＲと結合するＨＥＲリガンドには、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ベータセルリン、ＨＢ−ＥＧＦ、およびエピレグリンがある。ＨＥＲ３と結合するＨＥＲリガンドには、ヘレグリンがある。ＨＥＲ４と結合できるＨＥＲリガンドには、ベータセルリン、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、ＮＲＧ−４、およびヘレグリンがある。
【００２９】
本明細書に使用する場合、「ヘレグリン」（ＨＲＧ）は、米国特許第５，６４１，８６９号またはMarchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)に開示されたようなヘレグリン遺伝子産物にコードされるポリペプチドを指す。ヘレグリンの例には、ヘレグリン−α、ヘレグリン−β１、ヘレグリン−β２、およびヘレグリン−β３（Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992);および米国特許第５，６４１，８６９号）；ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）（Peles et al., Cell 69: 205-216 (1992)）；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）（Falls et al., Cell 72:801-815 (1993)）；グリア細胞成長因子（ＧＧＦ）（Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)）；感覚および運動神経細胞由来因子（ＳＭＤＦ）（Ho et al., J. Biol. Chem. 270:14523-14532 (1995)）；γ−ヘレグリン（Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)）がある。本用語は、天然配列のＨＲＧポリペプチドのＥＧＦ様ドメインフラグメント（ＨＲＧβ１１７７−２４４）などの、そのＨＲＧポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントおよび／またはアミノ酸配列変異体を含む。
【００３０】
本明細書における「ＨＥＲ二量体」は、少なくとも二つの異なるレセプターＨＥＲを含む非共有的に会合した二量体である。二つ以上のレセプターＨＥＲを発現している細胞がＨＥＲリガンドに曝露された場合にそのような複合体が形成することがあり、免疫沈降によりその複合体を単離して、例えばSliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)に記載されているようなＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析することができる。当該ＨＥＲ二量体の例には、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、およびＨＥＲ３−ＨＥＲ４ヘテロ二量体がある。さらに、ＨＥＲ二量体は、二つ以上のレセプターＨＥＲ２を、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、またはＥＧＦＲのような異なるレセプターＨＥＲと組み合わせて含みうる。サイトカインレセプターサブユニット（例えばｇｐ１３０）などのその他のタンパク質がその二量体と会合していることがある。
【００３１】
ＨＥＲ２上の「ヘテロ二量体結合部位」は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４と二量体を形成するときにそれらの細胞外ドメイン中の領域と接触または連結するＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域を指す。その領域はＨＥＲ２のドメインＩＩに見い出される。Franklin et al., Cancer Cell 5:317-328(2004)。
【００３２】
「ＨＥＲ活性化」または「ＨＥＲ２活性化」は、任意の一つもしくは複数のレセプターＨＥＲ、またはレセプターＨＥＲ２の活性化またはリン酸化を指す。一般に、ＨＥＲ活性化は（例えば、レセプターＨＥＲにおけるチロシン残基をリン酸化しているレセプターＨＥＲの細胞内キナーゼドメインまたは基質ポリペプチドによって起こる）シグナル伝達を招く。ＨＥＲ活性化は、関心対象のレセプターＨＥＲを含むＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドによって仲介されうる。ＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドは、二量体における一つまたは複数のレセプターＨＥＲ中のキナーゼドメインを活性化することにより、一つもしくは複数のレセプターＨＥＲ中のチロシン残基のリン酸化および／またはＡｋｔもしくはＭＡＰＫ細胞内キナーゼなどの追加の基質ポリペプチド（類）中のチロシン残基のリン酸化を生じうる。
【００３３】
「天然配列」のポリペプチドは、天然由来のポリペプチド（例えばレセプターＨＥＲまたはＨＥＲリガンド）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。当該天然配列のポリペプチドを自然界から単離でき、また、組換えもしくは合成手段により産生させることができる。このように、天然配列のポリペプチドは、天然ヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、または任意のその他の哺乳動物種由来であるポリペプチドのアミノ酸配列を有しうる。
【００３４】
用語「アミノ酸配列変異体」は、天然配列のポリペプチドとある程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。通常は、アミノ酸配列変異体は天然ＨＥＲリガンドの少なくとも一つのレセプター結合ドメインまたは天然レセプターＨＥＲの少なくとも一つのリガンド結合ドメインと少なくとも約７０%の相同性を有するものであり、好ましくは、アミノ酸配列は、当該レセプターまたはリガンド結合ドメインと少なくとも約８０%、より好ましくは少なくとも約９０%相同なものである。そのアミノ酸配列変異体は、天然アミノ酸配列のアミノ酸配列内のある位置に置換、欠失、および／または挿入を有する。
【００３５】
「相同性」は、配列をアライメントして、必要ならばギャップを導入して最大率の相同性を実現させた後で、アミノ酸配列変異体中の同一な残基の率として定義される。アライメントのための方法およびコンピュータプログラムは当技術分野で周知である。一つの当該コンピュータプログラムは、米国著作権局、Washington, DC 20559に１９９１年１２月１０日にユーザ文書と共に納付された、Genentech, Inc.によって著作された「Ａｌｉｇｎ２」である。
【００３６】
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示す限りはインタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、および抗体フラグメントにわたる。
【００３７】
本明細書に使用されるような用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、モノクローナル抗体の産生時に生じる可能性のある変異体を除いて、その集団を構成する個別の抗体は同一であり、かつ／または同一のエピトープと結合する。当該変異体は一般に少量存在する。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンが混入していない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるとしてのその抗体の性質を表し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈してはならない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法により作製することができるし、また、組換えＤＮＡ法によって作製することもできる（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」は、例えばClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載された技法を用いたファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００３８】
本明細書におけるモノクローナル抗体には、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種由来の抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であるが、その鎖（類）の残りが、別の種由来または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに当該抗体のフラグメントが具体的には含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）。本明細書において関心対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常部配列を含む「霊長類化（primatized）」抗体がある。
【００３９】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の部分を含み、その部分は好ましくはその抗原結合部または可変部を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二特異性抗体（diabody）；線状抗体（linear antibody）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメント（類）から形成された多重特異性抗体がある。
【００４０】
「インタクトな抗体」は、抗原結合性可変部ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖定常ドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３とを含む抗体である。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えばヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体でありうる。好ましくは、インタクトな抗体は一つまたは複数のエフェクター機能を有する。
【００４１】
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ部（天然配列Ｆｃ部またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ部）に起因しうる生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑとの結合；補体依存性細胞毒性作用；Ｆｃレセプターとの結合；抗体依存性細胞性細胞毒性作用（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプターのダウンレギュレーション（例えばＢ細胞レセプター；ＢＣＲ）などがある。
【００４２】
重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、インタクトな抗体を異なる「クラス」に割り当てることができる。インタクトな抗体には五つの主要クラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかを「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００４３】
「抗体依存性細胞性細胞毒性作用」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞毒性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）がターゲット細胞上に結合した抗体を認識して、その後にターゲット細胞の溶解を起こす細胞介在性反応を指す。ＡＤＣＣを仲介するためのプライマリー細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現を要約したものは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の４６４頁の表３である。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されているようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを行うことができる。当該アッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞がある。または、もしくは追加的に、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を、例えばClynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されたような動物モデルでｉｎ  ｖｉｖｏ評価できる。
【００４４】
「ヒトエフェクター細胞」は、一つまたは複数のＦｃＲを発現してエフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、これらの細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現してＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞、および好中球があり、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然起源から、例えば本明細書に記載されたように血液またはＰＢＭＣから単離することができる。
【００４５】
用語「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ部に結合するレセプターを記述するために使用される。好ましいＦｃＲは天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体と結合するもの（ガンマレセプター）であり、好ましいＦｃＲには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターが、これらのレセプターのアレル変異体および選択的スプライシングされた形態を含めて挙げられる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）があり、それらは、細胞質ドメインが主に異なる類似したアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにＩＴＡＭ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）を含む。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにＩＴＩＭ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif）を含む（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15 :203-234 (1997)の総説Ｍを参照されたい）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994);およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)に総説されている。将来同定されるものを含めたその他のＦｃＲは、本明細書において用語「ＦｃＲ」で包含される。この用語は、胎児への母体IgGの輸送を担う新生児レセプターＦｃＲｎも含む（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）。
【００４６】
「補体依存性細胞毒性作用」または「ＣＤＣ」は、分子が補体の存在下でターゲットを溶解する能力を指す。補体活性化経路は、コグネイト抗原と複合体を形成した分子（例えば抗体）への補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）の結合により開始する。補体活性化を評価するために、例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)に記載されているようなＣＤＣアッセイを行うことができる。
【００４７】
「天然抗体」は、通常は２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合する一方で、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で多様である。各重鎖および軽鎖は、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）と、もう一方の末端に定常ドメインとを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられる。
【００４８】
用語「可変」は、可変ドメインのある部分が、抗体間で広範囲に配列が異なり、各特定の抗体の特定の抗原に対する結合および特異性に使用されるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたり均等に分布しているわけではない。可変性は、軽鎖および重鎖の可変ドメイン両方における超可変部と呼ばれる三つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク部（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインそれぞれは、４つのＦＲを含み、それらのＦＲは大部分がβシート立体配置を採り、三つの超可変部により連結され、これらの超可変部は、βシート構造と連結するループを形成して、場合によりこのβシート構造の一部を形成する。各鎖中の超可変部は、ＦＲによって相互に近接して保持されて、もう一方の鎖由来の超可変部と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)を参照されたい）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接には関与しないが、抗体依存性細胞性細胞毒性作用（ＡＤＣＣ）での抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００４９】
本明細書に使用する場合、用語「超可変部」は、抗原との結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変部は、一般に「相補性決定部」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、残基５０〜５６（Ｌ２）、および残基８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基３１〜３５（Ｈ１）、残基５０〜６５（Ｈ２）および残基９５〜１０２（Ｈ３）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）ならびに／または「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および残基９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｈ１）、残基５３〜５５（Ｈ２）および残基９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。「フレームワーク部」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義するような超可変部残基以外の、可変ドメインの残基である。
【００５０】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる、それぞれ単一の抗原結合部位を有する二つの同一の抗原結合フラグメントと、名前が、容易に結晶化できる能力を反映する残りの「Ｆｃ」フラグメントとを産生する。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位を有するＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じ、このフラグメントは、依然として抗原を架橋できる。
【００５１】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む、最小限の抗体フラグメントである。この領域は、密接に非共有的に会合した、一つの重鎖可変ドメインと一つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定するために、各可変ドメインの三つの超可変部が相互作用するのは、この立体配置である。まとめると、六つの超可変部は、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（すなわち抗原に対して特異的な三つの超可変部のみを含む、Ｆｖの半分）でさえも、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００５２】
Ｆａｂフラグメントもまた、軽鎖の定常ドメインと、重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体のヒンジ部由来の一つまたは複数のシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数残基が付加していることが、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書においてＦａｂ’についての呼称であり、Ｆａｂ’−ＳＨでは、定常ドメインのシステイン残基（類）が少なくとも一つの遊離チオール基を有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメント対として本来産生された。抗体フラグメントのその他の化学的カップリングも公知である。
【００５３】
任意の脊椎動物種由来である抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる二つの明らかに別個の型のうちの一つに割り当てることができる。
【００５４】
「一本鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、このＦｖポリペプチドは、このｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)を参照されたい。ＨＥＲ２抗体のｓｃＦｖフラグメントは、ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号に記載されている。
【００５５】
用語「二特異性抗体」は、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に連結した可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上のこれら二つのドメイン間で対形成できるには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインを別の鎖の相補性ドメインと対形成することを強いて、二つの抗原結合部位を生み出す。二特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に、さらに完全に記載されている。
【００５６】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、通例レシピエントの超可変部由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変部由来の残基に置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。時には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク部（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基に置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見い出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応する超可変ループのうちの全てまたは実質的に全てと、ＦＲの全てまたは実質的に全てとは、ヒト免疫グロブリン配列のものであろう。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常部も場合により含むものである。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい。
【００５７】
ヒト化ＨＥＲ２抗体には、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７、および参照により本明細書に特に組み入れられる米国特許第５，８２１，３３７号の表３に記載されるｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８またはトラスツズマブ（HERCEPTIN（登録商標））；ヒト化５２０Ｃ９（ＷＯ９３／２１３１９）および本明細書に記載されているようなヒト化２Ｃ４抗体がある。
【００５８】
本明細書の目的で、「トラスツズマブ」、「ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）」、および「ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８」は、それぞれ配列番号１４および１５の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。
【００５９】
本明細書において、「パーツズマブ」および「ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標）」は、それぞれ配列番号１６および１７の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。
【００６０】
「ネイキッドな抗体」は、（本明細書に定義されるとおり）細胞毒性部分または放射性ラベルなどの異種分子とコンジュゲーションしていない抗体である。
【００６１】
「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から同定されて、分離および／または回収された抗体である。その天然環境の混入構成要素は、その抗体についての診断的用途または治療的用途を妨害するであろう物質であり、それらには、酵素、ホルモン、およびその他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質が含まれうる。好ましい態様では、抗体は、（１）ローリー法によって決定したときに、抗体の９５重量%を超えるまで、最も好ましくは９９重量%を超えるまで精製されるか、（２）スピニングカップ（spinning cup）シークエネーターの使用により、少なくとも１５残基のＮ末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に精製されるか、または（３）クーマシーブルー染色もしくは好ましくは銀染色を用いた、還元条件もしくは非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製されるであろう。抗体の天然環境の少なくとも一つの構成要素は存在しないものであることから、単離された抗体には、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕ抗体が含まれる。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも１回の精製段階によって調製されるものである。
【００６２】
「トラスツズマブよりも効果的にＨＥＲの二量体化を阻害する」ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブよりも効果的に（例えば少なくとも約２倍効果的に）ＨＥＲ二量体を低減または除去する抗体である。好ましくは、当該抗体は、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４のＦａｂフラグメント、パーツズマブ、およびパーツズマブのＦａｂフラグメントからなる群より選択される抗体と少なくとも同じくらい効果的にＨＥＲ２の二量体化を阻害する。ＨＥＲ二量体を直接研究することにより、またはＨＥＲの二量体化を招くＨＥＲの活性化もしくは下流のシグナル伝達を評価することにより、および／または抗体のＨＥＲ２結合部位を評価することなどにより、ＨＥＲ二量体化の阻害を評価できる。トラスツズマブよりも効果的にＨＥＲ２二量体化を阻害する能力を有する抗体をスクリーニングするためのアッセイは、Agus et al., Cancer Cell 2: 127-137 (2002)ならびに本明細書の実施例１〜２および４に記載されている。ほんの一例として、例えばＨＥＲ二量体の形成阻害（例えば、Agus et al., Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図１Ａ〜Ｂ；および本明細書の実施例２を参照されたい）；ＨＥＲリガンドによるＨＥＲ二量体を発現する細胞の活性化の低減（本明細書の実施例１および例えばAgus et al., Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図２Ａ〜Ｂ）；ＨＥＲ二量体を発現する細胞に対するＨＥＲリガンドの結合の遮断（本明細書の実施例１および例えばAgus et al., Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図2E）；ＨＥＲリガンドの存在下（または不在下）でＨＥＲ二量体を発現するガン細胞（例えばＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＤ−１３４、ＺＲ−７５−１、ＭＤ−ＭＢ−１７５、Ｔ−４７Ｄ細胞）の細胞成長阻害（本明細書の実施例１および例えばAgus et al., Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図３Ａ〜Ｄ）；下流のシグナル伝達の阻害（例えば、ＨＲＧ依存性ＡＫＴリン酸化の阻害またはＨＲＧもしくはＴＧＦα依存性ＭＡＰＫリン酸化の阻害）（本明細書の実施例４および例えばAgus et al., Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図２Ｃ〜Ｄを参照されたい）を評定することによってＨＥＲ二量体化の阻害をアッセイすることができる。抗体−ＨＥＲ２結合部位を研究することによって、例えばＨＥＲ２に結合した抗体の結晶構造などの構造またはモデルを評価することによっても、その抗体がＨＥＲ二量体化を阻害するかどうか評定することができる（例えば、Franklin et al., Cancer Cell 5:317-328 (2004)を参照されたい）。
【００６３】
ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブよりも効果的に（例えば少なくとも２倍効果的に）「ＨＲＧ依存性ＡＫＴリン酸化を阻害」し、かつ／または「ＨＲＧもしくはＴＧＦα依存性のＭＡＰＫリン酸化」を阻害しうる（例としてAgus et al., Cancer Cell 2:127-137 (2002)および本明細書の実施例４を参照されたい）。
【００６４】
ＨＥＲ２抗体は、「ＨＥＲ２エクトドメインの開裂を阻害しない」抗体でありうる（Molina et al., Cancer Res. 61:4744-4749(2001)）。
【００６５】
ＨＥＲ２の「ヘテロ二量体結合部位に結合する」ＨＥＲ２抗体は、ドメインＩＩ中の残基に結合して（場合によりドメインＩおよびＩＩＩなどのＨＥＲ２細胞外ドメインのドメインのうち他のものにおける残基にも結合して）、ＨＥＲ２−ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、またはＨＥＲ２−ＨＥＲ４ヘテロ二量体の形成を少なくともある程度立体的に妨害することができる。Franklin et al., Cancer Cell 5:317-328 (2004)は、RCSB Protein Data Bank（ＩＤコードＩＳ７８）に寄託されたＨＥＲ２−パーツズマブの結晶構造を特徴づけ、その構造はＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に結合する抗体の例を例示している。
【００６６】
ＨＥＲ２の「ドメインＩＩに結合する」抗体は、ドメインＩＩ中の残基と、場合によりドメインＩおよびドメインＩＩＩなどの、ＨＥＲ２のその他のドメイン（類）中の残基と結合する。好ましくは、ドメインＩＩに結合する抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの間の結合部に結合する。
【００６７】
「卵巣」は、女性において子宮の両側に位置する二つの小さなアーモンド型の器官の一つである。
【００６８】
「卵管」または「輸卵管」は、雌性哺乳動物の卵巣から子宮に至る２本の細い管の１本である。
【００６９】
「腹膜」は、腹部などの体腔の上皮裏装である。
【００７０】
「卵巣ガン」は、一方または両方の卵巣に発現する、潜在的に生命を危うくする悪性腫瘍である。卵巣ガンの症状が出現するときまでに、卵巣腫瘍は腹部全体にガン細胞を播種するのに十分なほど大きく成長していることがある。卵巣の外側に拡大した卵巣ガン細胞は、転移性卵巣ガンと呼ばれる。卵巣腫瘍は、横隔膜、腸、および／または網（腹部にある器官を覆い、間隙を埋める脂肪層）に拡大する傾向にある。ガン細胞はリンパのチャネルおよび血流を介して他の器官に拡大することもある。本明細書において処置される卵巣ガンには、３つの原発性クラスの悪性卵巣腫瘍、すなわち上皮性腫瘍、胚細胞性腫瘍、および間質性腫瘍がある。
【００７１】
「原発性腹膜ガン」は、腹膜に発生するガンを指す。原発性腹膜ガンは、顕微鏡像、症状、拡大パターン、および予後からみて上皮性卵巣ガンに非常に類似していることがある。卵巣を除去された女性は、依然として原発性腹膜ガンに冒されるおそれがある。
【００７２】
「卵管ガン」は、卵管および／または広間膜のガンを指す。
【００７３】
「上皮性腫瘍」は、卵巣の外側を取り囲む胚上皮として公知である立方体形の細胞層に発現する。上皮性腫瘍は全ての卵巣ガンの９０%までを占める。
【００７４】
「胚細胞性腫瘍」は、卵巣の卵成熟細胞に見出される。全ての卵巣ガンの約３%を占める胚細胞性腫瘍は、ティーンエイジャーおよび若い女性に発生することが最も多い。
【００７５】
「間質性腫瘍」は、卵巣がばらばらにならないようにまとめて、女性ホルモンであるエストロゲンおよびプロゲステロンを産生する結合組織細胞から発生する。間質性腫瘍は全ての卵巣ガンの６%を占める。
【００７６】
本明細書における「腫瘍試料」は、患者の腫瘍由来であるか、またはその腫瘍由来の腫瘍細胞を含む試料である。本明細書における腫瘍試料の例には、腫瘍生検、循環腫瘍細胞、循環血漿タンパク質、腹水、腫瘍由来の、または腫瘍様性質を示す初代細胞培養物または細胞系、およびホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍試料などの保存処理された腫瘍試料があるが、それに限定されるわけではない。
【００７７】
本明細書に使用する場合の「成長阻害剤」は、細胞、特にＨＥＲ発現性ガン細胞の成長をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで阻害する化合物または組成物を指す。このように、成長阻害剤は、Ｓ期のＨＥＲ発現細胞の率を有意に低減する薬剤でありうる。成長阻害剤の例には、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤などの、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）遮断する薬剤がある。古典的Ｍ期遮断薬には、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなどのトポＩＩ阻害剤がある。Ｇ１で停止させる薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤は、Ｓ期停止にも波及する。さらなる情報は、"Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)という標題のThe Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds.、第１章、特に１３頁に見い出すことができる。
【００７８】
「成長阻害」抗体の例は、ＨＥＲ２に結合し、そしてＨＥＲ２を過剰発現しているガン細胞の成長を阻害する抗体である。好ましい成長阻害ＨＥＲ２抗体は、約０．５から３０μg/mlの抗体濃度で、細胞培養でのＳＫ−ＢＲ−３乳房腫瘍細胞の成長を、２０%よりも高く、好ましくは５０%よりも高く（例えば、約５０%から約１００%）阻害する。ここで、抗体にＳＫ−ＢＲ−３細胞を曝露した６日間後に、この成長阻害を決定する（１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号を参照されたい）。このＳＫ−ＢＲ−３細胞成長阻害アッセイは、その特許および本明細書の下記にさらに詳細に記載されている。好ましい成長阻害抗体は、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５のヒト化変異体、例えばトラスツズマブである。
【００７９】
「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡのフラグメント化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞のフラグメント化、および／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成によって決定されるようなプログラム細胞死を誘導する抗体である。この細胞は、通常、レセプターＨＥＲ２を過剰発現する細胞である。好ましくは、この細胞は腫瘍細胞、例えば、乳房細胞、卵巣細胞、胃細胞、子宮内膜細胞、唾液腺細胞、肺細胞、腎臓細胞、結腸細胞、甲状腺細胞、膵臓細胞、または膀胱細胞である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、この細胞は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＢＴ４７４細胞、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞、またはＳＫＯＶ３細胞でありうる。アポトーシスに関連する細胞事象を評価するために、様々な方法が利用できる。例えば、アネキシンの結合によって、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の移行を測定でき；ＤＮＡラダー生成によってＤＮＡのフラグメント化を評価でき；低二倍体細胞の任意の増加によってＤＮＡのフラグメント化にともなう核／クロマチンの凝縮を評価できる。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体は、ＢＴ４７４細胞を用いたアネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞と比較して約２から５０倍、好ましくは約５から５０倍、最も好ましくは約１０から５０倍のアネキシン結合の誘導を招く抗体である（以下参照）。アポトーシスを誘導するＨＥＲ２抗体の例は、７Ｃ２および７Ｆ３である。
【００８０】
「エピトープ２Ｃ４」は、抗体２Ｃ４が結合する、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。または、 エピトープマッピングを行って、その抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープ(例えば、ＨＥＲ２の約２２番残基から約５８４番残基まで、両端の残基を含めた領域における任意の一つまたは複数の残基；図１Ａ〜Ｂ参照)に結合するかどうかを評定することができる。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中のドメインＩＩ由来である残基を含む。２Ｃ４およびパーツズマブは、ドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの結合部でＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。Franklin et al., Cancer Cell 5:317-328 (2004)。
【００８１】
「エピトープ４Ｄ５」は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３）およびトラスツズマブが結合する領域である。このエピトープはＨＥＲ２の膜貫通ドメインに近接しており、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内に存在する。４Ｄ５エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane(1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。または、エピトープマッピングを行って、その抗体がＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープ（例えば、約５２９番残基から約６２５番残基まで、両端の残基を含めた領域における任意の一つまたは複数の残基；図１Ａ〜Ｂ参照）に結合するかどうかを評定することができる。
【００８２】
「エピトープ７Ｃ２／７Ｆ３」は、７Ｃ２抗体および／または７Ｆ３抗体（それぞれＡＴＣＣに寄託、以下参照）が結合する、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩ内のＮ末端の領域である。７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane(1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。または、その抗体がＨＥＲ２の７Ｃ２／７Ｆ３エピトープ(例えば、ＨＥＲ２の約２２番残基から約５３番残基までの領域中の任意の一つまたは複数の残基；図１Ａ〜Ｂ参照）に結合するかどうかを確認するために、エピトープマッピングを行うことができる。
【００８３】
「処置」は、治療的処置および予防手段または阻止手段の両方を指す。処置を必要とする者には、すでにガンを有する者およびガンを予防されるべき者が含まれる。従って、本明細書において処置されるべき患者は、ガンを有すると診断された場合もあるし、また、ガンの素因があるか、もしくはガンに感受性な場合もある。
【００８４】
用語「有効量」は、患者におけるガンを処置するために有効な薬物の量を指す。その薬物の有効量は、ガン細胞数を減少させ；腫瘍の大きさを低減し；末梢器官へのガン細胞の浸潤を阻害し（すなわちある程度減速させて、好ましくは停止させ）；腫瘍の転移を阻害し（すなわちある程度減速させて、好ましくは停止させ）；腫瘍の成長をある程度阻害し；かつ／またはガンに関連した一つもしくは複数の症状をある程度軽減することができる。薬物が成長を阻止して、かつ／または現存しているガン細胞を殺滅できる程度に、有効量は細胞増殖抑制性および／または細胞毒性でありうる。有効量は、（例えば固形腫瘍効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）またはＣＡ−１２５の変化によって測定されるような）進行のない生存期間を延長し、（部分反応（ＰＲ）または完全反応（ＣＲ）を含めた）反応を招き、全生存期間を増大させ、かつ／または（ＦＯＳＩによって評定されるような）ガンの一つもしくは複数の症状を改善することができる。
【００８５】
「全生存」は、診断または処置の時点から１年間、５年間などの所定の期間生存を維持した患者を指す。
【００８６】
「進行のない生存」は、ガンが悪化せずに生存を維持した患者を指す。
【００８７】
「客観的反応」は、完全反応（ＣＲ）または部分反応（ＰＲ）を含めた測定可能な応答を指す。
【００８８】
「完全反応」または「完全寛解」によって、処置に応答してガンの全ての徴候が消失したことを意味する。これは、ガンが治癒したことを必ずしも意味しない。
【００８９】
「部分反応」は、処置に応答した、一つもしくは複数の腫瘍もしくは病変の大きさの減少、または体内のガンの程度の減少を指す。
【００９０】
「ＨＥＲ発現ガン」は、細胞表面にＨＥＲタンパク質が存在する細胞を含むガンである。
【００９１】
「ＨＥＲ２発現ガン」は、そのガンの細胞表面に十分なレベルのＨＥＲ２を産生することにより、ＨＥＲ２抗体がそれに結合して、そのガンに関して治療効果を有することができるガンである。
【００９２】
レセプターＨＥＲを「過剰発現する」ガンは、同じ組織型の非ガン細胞に比較して、そのガンの細胞表面にＨＥＲ２などのレセプターＨＥＲをかなり高レベル有するガンである。当該過剰発現は、遺伝子増幅によって、または転写もしくは翻訳の増加によって起こることがある。レセプターＨＥＲの過剰発現を、細胞表面に存在する増加したレベルのＨＥＲタンパク質を評価することによって、診断または予後アッセイで（例えば免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）により）決定することができる。または、もしくは追加的に、例えば、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公表されたＷＯ９８／４５４７９参照）、サザンブロット、またはリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法によって、細胞中のＨＥＲをコードしている核酸のレベルを測定することができる。血清などの生体液に分散した抗原（例えばＨＥＲ細胞外ドメイン）を測定することによって、レセプターＨＥＲの過剰発現を研究することもできる（例えば、１９９０年６月１２日に発行された米国特許第４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日に公表されたＷＯ９１／０５２６４；１９９５年３月２８日に発行された米国特許第５，４０１，６３８号;およびSias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)を参照されたい）。当業者は、上記アッセイの他に様々なｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを利用できる。例えば検出可能なラベル、例えば放射性同位体で場合によりラベルした抗体に、患者の体内の細胞を曝露して、例えば放射能を外部スキャンすることにより、または抗体に予め曝露された患者から採取した生検を分析することにより、その患者における細胞に対する抗体の結合を評価することができる。
【００９３】
逆に、「レセプターＨＥＲ２を過剰発現しない」ガンは、同じ組織型の非ガン細胞に比較して正常レベルよりも高いレセプターＨＥＲ２を発現しないガンである。
【００９４】
ＨＥＲリガンドを「過剰発現する」ガンは、同じ組織型の非ガン細胞に比較して有意に高いレベルのそのリガンドを産生するガンである。当該過剰発現は、遺伝子増幅によって、または転写もしくは翻訳の増加によって起こることがある。ＨＥＲリガンドの過剰発現は、患者における、例えば腫瘍生検におけるリガンド（もしくはそれをコードする核酸）のレベルを評価することによって、または上記のＩＨＣ、ＦＩＳＨ、サザンブロット、ＰＣＲ、もしくはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイなどの様々な診断アッセイによって、診断的に決定することができる。
【００９５】
本明細書中において使用されるときの用語「細胞毒性薬」は、細胞の機能を阻害もしくは阻止し、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、および細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素活性な毒素などの毒素を、そのフラグメントおよび／または変異体を含めてを含むことを意味する。
【００９６】
「化学療法剤」は、ガンの処置に有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミド（CYTOXAN（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）、およびウレドーパ（uredopa）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロールメラミン（trimethylolomelamine）を含めたエチレンイミンおよびメチルメラミン（methylamelamine）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン（bullatacinone））；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、MARINOL（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログであるトポテカン（HYCAMTIN（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、CAMPTOSAR（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（scopolectin）、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（合成アナログＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン（ranimnustine）のようなニトロソ尿素；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリチェアミシン、特に、カリチェアミシンガンマ１ＩおよびカリチェアミシンオメガＩ１（例えば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)参照））；ジネマイシンＡを含めたジネマイシン；クロドロネートなどのビスホスフォネート；エスペラマイシン；ならびに、ネオカルチノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルチノフィリン、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含めた）ドキソルビシン（ADRIAMYCIN（登録商標））、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペ��ロマイシン、ポルフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（anti-adrenal）；フロリニン酸（frolinic acid）などの葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デホファミン（defofamine）；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, OR）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリン（verracurin）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン（anguidine））；ウレタン；ビンデシン（ELDISINE（登録商標）、FILDESIN（登録商標））：ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；パクリタキセル（TAXOL（登録商標））(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.)、パクリタキセルの無Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒアルブミン加工ナノ粒子製剤であるＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois）、およびドセタキセル（TAXOTERE（登録商標））（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）などのタキサン；クロランブシル；ゲムシタビン（GEMZAR（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどのプラチナアナログ；ビンブラスチン（VELBAN（登録商標））；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ONCOVIN（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン（leucovovin）；ビノレルビン（NAVELBINE（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジ���ルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；前記いずれかの薬学的に許容されうる塩、酸、または誘導体；ならびにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法についての略語）およびＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵおよびロイコボビンと組み合わせたオキサリプラチン（ELOXATIN（商標））を用いた処置方式についての略語）などの、前記のうち二つ以上の組み合わせがある。
【００９７】
腫瘍に及ぼすホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も本定義に含まれる。それらには、例えば、タモキシフェン（タモキシフェン（NOLVADEX（登録商標））を含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（FARESTON（登録商標））を含めた抗エストロゲンおよび選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭ）；例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（MEGASE（登録商標））、エキセメスタン（AROMASIN（登録商標））、ホルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール（RIVISOR（登録商標））、レトロゾール（FEMARA（登録商標））、およびアナストロゾール（ARIMIDEX（登録商標））などの、副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびにトロキサシタビン（troxacitabine）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）などの、接着性細胞増殖に関係づけられているシグナル伝達経路における遺伝子発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド；遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ならびに前記いずれかの薬学的に許容されうる塩、酸、または誘導体がある。
【００９８】
「代謝拮抗化学療法剤」は、代謝物に構造的に類似しているが、生産的方法で身体によって使用されることができない薬剤である。多くの代謝拮抗化学療法剤は、核酸、すなわちＲＮＡおよびＤＮＡの産生を妨害する。代謝拮抗化学療法剤の例には、ゲムシタビン(GEMZAR（登録商標）)、5-フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（XELODA（登録商標））、６‐メルカプトプリン、メトトレキサート、６−チオグアニン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アラビノシルシトシン（ＡＲＡ−Ｃ、シタラビン）（CYTOSAR-U（登録商標））、ダカルバジン（DTIC-DOME（登録商標））、アゾシトシン（azocytosine）、デオキシシトシン、ピリドミデン（pyridmidene）、フルダラビン（FLUDARA（登録商標））、クラドラビン、２−デオキシ−Ｄ−グルコースなどがある。好ましい代謝拮抗化学療法剤は、ゲムシタビンである。
【００９９】
「ゲムシタビン」または「２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン一塩酸塩（ｂ−異性体）」は、抗腫瘍活性を示すヌクレオシドアナログである。ゲムシタビンＨＣｌの実験式はＣ９Ｈ１１Ｆ２Ｎ３Ｏ４・ＨＣｌである。ゲムシタビンＨＣｌは、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）の商標でEli Lillyにより販売されている。
【０１００】
「プラチナ系化学療法剤」は、分子の構成部分としてプラチナを含有する有機化合物を含む。プラチナ系化学療法剤の例には、カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチン（oxaliplatinum）がある。
【０１０１】
「プラチナ系化学療法」により、一つまたは複数のプラチナ系化学療法剤を、場合により一つまたは複数のその他の化学療法剤と併用した治療を意味する。
【０１０２】
「プラチナ耐性」ガンにより、プラチナ系化学療法を受けている間に、そのガン患者で進行した（すなわち、その患者は「プラチナ難治性」である）か、またはその患者でプラチナ系化学療法方式を完了した１２か月以内（例えば、６か月以内）に進行したことを意味する。
【０１０３】
本明細書において使用されるときの用語「ＥＧＦＲターゲット薬」は、ＥＧＦＲに結合して、場合によりＥＧＦＲの活性化を阻害する治療剤を指す。当該薬剤の例には、ＥＧＦＲに結合する抗体および小分子がある。ＥＧＦＲに結合する抗体の例には、ＭＡｂ５７９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ８５０６）、ＭＡｂ４５５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ２２５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８５０８）、ＭＡｂ５２８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８５０９）（米国特許第４，９４３，５３３号、Mendelsohn et al.参照）、ならびにキメラ化２２５（Ｃ２２５またはセツキシマブ;ERBUTIX（登録商標））および再形状化ヒト２２５（Ｈ２２５）（ＷＯ９６／４０２１０、Imclone Systems Inc.参照）などのその異性体；ＩＩ型突然変異ＥＧＦＲと結合する抗体（米国特許第５，２１２，２９０号）；米国特許第５，８９１，９９６号に記載されているような、ＥＧＦＲと結合するヒト化抗体およびキメラ抗体；ならびにＡＢＸ−ＥＧＦなどの、ＥＧＦＲと結合するヒト抗体（ＷＯ９８／５０４３３、Abgenix参照）がある。抗ＥＧＦＲ抗体を細胞毒性薬とコンジュゲーションすることにより、免疫コンジュゲートを発生させることができる（例えば、ＥＰ６５９，４３９Ａ２、Merck Patent GmbH参照）。ＥＧＦＲに結合する小分子の例には、ＺＤ１８３９またはゲフィチニブ（IRESSA（商標）;Astra Zeneca）、ＣＰ−３５８７７４、またはエルロチニブＨＣＬ（TARCEVA（商標）;Genentech/OSI)、およびＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１;Sugen）がある。
【０１０４】
「チロシンキナーゼ阻害剤」は、レセプターＨＥＲなどの、チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をある程度阻害する分子である。当該阻害剤の例には、前項で言及されたＥＧＦＲターゲット薬、そしてTakedaから入手可能なＴＡＫ１６５などの小分子ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤、優先的にＥＧＦＲと結合するが、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲの両方を過剰発現している細胞を阻害するＥＫＢ−５６９（Wyethから入手できる）などの二重ＨＥＲ阻害剤、経口ＨＥＲ２およびＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であるＧＷ５７２０１６（Glaxoから入手できる）、ならびにＰＫＩ−１６６（Novartisから入手できる）；カネルチニブ（ＣＩ−１０３３；Pharmacia）などの汎ＨＥＲ阻害剤；Ｒａｆ−１シグナル伝達を阻害する、ISIS Pharmaceuticalsから入手できるアンチセンス剤ＩＳＩＳ−５１３２などのＲａｆ−１阻害剤；Glaxoから入手できるメシル酸イマチニブ（Gleevac（商標））などの非ＨＥＲターゲットＴＫ阻害剤；ＭＡＰＫ細胞外調節キナーゼＩ阻害剤ＣＩ−１０４０（Pharmaciaから入手できる）；ＰＤ１５３０３５、４−（３−クロロアニリノ）キナゾリンなどのキナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン、ＣＧＰ５９３２６、ＣＧＰ６０２６１、およびＣＧＰ６２７０６などのピロロピリミジン；ピラゾロピリミジン、４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン；クルクミン（ジフェルロイルメタン、４，５−ビス（４−フルオロアニリノ）フタルイミド）；ニトロチオフェン部分含有チルホスチン；ＰＤ−０１８３８０５（Warner-Lamber）；アンチセンス分子（例えば、ＨＥＲをコードする核酸に結合するもの）；キノキサリン（米国特許第５，８０４，３９６号）；トリホスチン（米国特許第５，８０４，３９６号）；ＺＤ６４７４（Astra Zeneca）；ＰＴＫ−７８７（Novartis/Schering AG）；ＣＩ−１０３３（Pfizer）などの汎ＨＥＲ阻害剤；アフィニタック（ＩＳＩＳ３５２１；Isis/Lilly）；メシル酸イマチニブ（Gleevac; Novartis）；ＰＫＩ１６６（Novartis）；ＧＷ２０１６（Glaxo SmithKline）；ＣＩ−１０３３（Pfizer）；ＥＫＢ−５６９（Wyeth）；セマキシニブ（Sugen）；ＺＤ６４７４（AstraZeneca）；ＰＴＫ−７８７（Novartis/Schering AG）；ＩＮＣ−１Ｃ１１（Imclone）；または以下の特許公報のいずれかに記載されるもの：米国特許第５，８０４，３９６号；ＷＯ９９／０９０１６（American Cyanimid）；ＷＯ９８／４３９６０（American Cyanamid）；ＷＯ９７／３８９８３（Warner Lambert）；ＷＯ９９／０６３７８（Warner Lambert）；ＷＯ９９／０６３９６（Warner Lambert）；ＷＯ９６／３０３４７（Pfizer, Inc）；ＷＯ９６／３３９７８（Zeneca）；ＷＯ９６／３３９７（Zeneca）；およびＷＯ９６／３３９８０（Zeneca）がある。
【０１０５】
「抗血管形成剤」は、血管の発生をある程度遮断または妨害する化合物を指す。抗血管形成因子は、例えば、血管形成の促進に関与する成長因子または成長因子レセプターに結合する、小分子または抗体でありうる。本明細書における好ましい抗血管形成因子は、ベバシズマブ（AVASTIN（登録商標））などの、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体である。
【０１０６】
用語「サイトカイン」は、細胞間仲介物質として別の細胞に作用する、ある細胞集団によって放出されるタンパク質についての総称である。当該サイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。これらのサイトカインの中に含まるのは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β；ミュラー管抑制物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）など）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含めたその他のポリペプチド因子である。本明細書に使用されるときの用語「サイトカイン」には、天然起源由来またはリコンビナント細胞培養物由来のタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的活性等価物が含まれる。
【０１０７】
ＩＩ．  ＨＥＲ２抗体の産生
本発明により使用される抗体の産生についての例示的な技法に関して、以下に説明する。抗体の産生に使用されるＨＥＲ２抗原は、例えば、所望のエピトープを含む、ＨＥＲ２の可溶型細胞外ドメインまたはその一部分でありうる。または、細胞表面にＨＥＲ２を発現している細胞（例えば、ＨＥＲ２を過剰発現するようにトランスフォーメーションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞；またはＳＫ−ＢＲ−３細胞などのガン細胞系、Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)参照）を使用して抗体を発生させることができる。抗体の発生に有用な他の形態のＨＥＲ２は、当業者に明らかであろう。
【０１０８】
（ｉ）  ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物に産生される。二官能剤または誘導化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を使用して、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤などの、免疫処置される種に免疫原性であるタンパク質と関連抗原をコンジュゲーションすることが有用なことがある。
【０１０９】
例えば、（それぞれウサギまたはマウスに対して）１００μgまたは５μgのタンパク質もしくはコンジュゲートを３倍量のフロイント完全アジュバントと組み合わせて、複数の部位にその溶液を皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して、動物を免疫処置する。１か月後、フロイント完全アジュバントに入れた初回量の１／５から１／１０のペプチドまたはコンジュゲートを複数の部位で皮下注射することにより、その動物に追加免疫する。７日から１４日後、その動物から採血し、そしてその血清の抗体力価をアッセイする。力価がプラトーになるまで動物に追加免疫する。好ましくは、同抗原のコンジュゲートであるが、異なるタンパク質とコンジュゲーションし、かつ／または異なる架橋試薬によりコンジュゲーションしたものを用いて、その動物を追加免疫する。タンパク質融合体として組換え細胞培養でコンジュゲートを作製することもできる。また、ミョウバンのような凝集剤を適切に使用して、免疫応答を増強させる。
【０１１０】
(ｉｉ)   モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られる。すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量存在するおそれのある可能性のある天然突然変異を除いて同一である。このように、修飾語「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物ではないとしてのその抗体の性質を示す。
【０１１１】
例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、また、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製できる。
【０１１２】
ハイブリドーマ法では、マウス、またはハムスターなどのその他の適切な宿主動物を、本明細書上記のように免疫処置して、免疫処置のために使用されたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するか、または産生できるリンパ球を誘発させる。または、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫処置できる。次に、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。
【０１１３】
このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する一つまたは複数の物質を好ましくは含有する適切な培地に接種し、成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠如しているならば、ハイブリドーマ用の培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むものであり（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。
【０１１４】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞により抗体の安定な高レベルの産生を支持し、かつＨＡＴ培地などの培地に感受性の細胞である。とりわけ好ましい骨髄腫細胞系は、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来の細胞系、ならびにAmerican Type Culture Collection, Rockville, Maryland USAから入手できるＳＰ−２細胞またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞などのマウス骨髄腫系である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984);およびBrodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【０１１５】
抗原に対するモノクローナル抗体の産生について、ハイブリドーマ細胞が成長している培地をアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）によって決定される。
【０１１６】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード解析によって決定できる。
【０１１７】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後で、限界希釈手順によりそのクローンをサブクローニングして、標準的な方法により成長させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的に適切な培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地がある。さらに、このハイブリドーマ細胞を、動物における腹水腫瘍としてｉｎ  ｖｉｖｏで成長させることができる。
【０１１８】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の抗体精製手順によって培地、腹水、または血清から適切に分離する。
【０１１９】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、当該ＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離すると、そのＤＮＡを発現ベクターの中に配置することができ、次にその発現ベクターを、E. coli細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別の状況では抗体タンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクションして、組換え宿主細胞にモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするＤＮＡを細菌に組換え発現させることに関する総説論文には、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol, 5:256-262 (1993)およびPluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)がある。
【０１２０】
さらなる態様では、モノクローナル抗体または抗体フラグメントを、McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)に記載されている技法を使用して発生した抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用した、それぞれマウス抗体およびヒト抗体の単離を記載している。それに続く刊行物は、鎖シャッフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)）ならびに非常に大規模なファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによる高親和性（nM範囲）のヒト抗体の産生を記載している（Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)）。このように、これらの技法は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法に対する実行可能な代替法である。
【０１２１】
ＤＮＡは、例えば、相同マウス配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインについてのコード配列に置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)）、または免疫グロブリンのコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てまたは一部を共有結合的に繋ぐことによって改変することもできる。
【０１２２】
典型的には、当該非免疫グロブリンポリペプチドを、抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、または、抗体の一抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換して、抗原に対する特異性を有する一つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を生み出す。
【０１２３】
（ｉｉｉ）  ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野に記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである起源からその抗体に導入された一つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入（import）」残基と称される。この残基は、典型的には「輸入」可変ドメインから取り入れられる。ヒト化は、ヒト抗体の対応配列の代わりに超可変部配列に置換することによって、Winterおよび共同研究者らの方法（Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)）に従って本質的に行うことができる。従って、当該「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に小さな配列が非ヒト種由来の対応する配列に置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部の超可変部残基と、可能性があることには一部のＦＲ残基とが、げっ歯動物抗体の類似部位に由来する残基に置換されているヒト抗体である。
【０１２４】
ヒト化抗体を作製する際に使用される、軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法により、げっ歯動物抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に、げっ歯動物の配列に最も類似しているヒト配列を、ヒト化抗体についてのヒトフレームワーク部（ＦＲ）として受け入れる（Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)）。別の方法は、特定亜群の軽鎖または重鎖の全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク部を使用する。同フレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)）。
【０１２５】
抗体が抗原に対する高い親和性および他の好都合な生物学的性質を保持してヒト化されることは、さらに重要である。この目標を実現するために、好ましい方法により、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用した、親配列および様々な概念上のヒト化産物の分析プロセスによりヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元コンフォメーション構造を図解して表示するコンピュータプログラムを利用できる。これらの表示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能に、これらの残基が果たしそうな役割を分析すること、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響する残基を分析することが可能になる。このように、ＦＲ残基を、レシピエント配列および輸入配列から選択して、組み合わせることができ、その結果、ターゲット抗原（類）に対する増大した親和性などの所望の抗体特性が実現される。一般に、超可変部残基は、抗原結合に影響することに、直接的かつ最も実質的に関与している。
【０１２６】
下記実施例３は、ＨＥＲ２と結合してレセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する例示的なヒト化ＨＥＲ２抗体の産生を記載している。本明細書において特に関心対象のヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４（もしくはそのＦａｂフラグメント）と本質的に同程度効果的にＥＧＦ、ＴＧＦ−α、および／もしくはＨＲＧが仲介するＭＡＰＫ活性化を遮断し、かつ／またはマウスモノクローナル抗体２Ｃ４（もしくはそのＦａｂフラグメント）と本質的に同程度効果的にＨＥＲ２と結合する。本明細書におけるヒト化抗体は、例えば、ヒト可変重鎖ドメインに組み込まれた非ヒト超可変部残基を含むことができ、 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記述されている可変ドメイン番号付けシステムを利用して６９Ｈ、７１Ｈ、および７３Ｈからなる群より選択される位置でフレームワーク部（ＦＲ）置換をさらに含むことができる。一態様では、ヒト化抗体は、位置６９Ｈ、７１Ｈ、および７３Ｈの二つまたは全てにＦＲ置換を含む。
【０１２７】
本明細書において関心対象の例示的なヒト化抗体は、重鎖可変ドメイン相補性決定部残基ＧＦＴＦＴＤＹＴＭＸ（Ｘは好ましくはＤまたはＳ）（配列番号：７）；ＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧ（配列番号：８）；および／またはＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹ（配列番号：９）を含み、場合により、それらのＣＤＲ残基にアミノ酸改変を含む（例えばその改変がその抗体の親和性を本質的に維持または改善する場合）。例えば、関心対象の抗体変異体は、約１個から約７個または約５個のアミノ酸置換を上記重鎖可変ＣＤＲ配列に有することがある。例えば下記のような親和性成熟によって、当該抗体変異体を調製することができる。最も好ましいヒト化抗体は、配列番号：４の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
【０１２８】
ヒト化抗体は、例えば前節の重鎖可変ドメインＣＤＲ残基に追加して、軽鎖可変ドメイン相補性決定残基  ＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡ（配列番号：１０）；ＳＡＳＹＸ１Ｘ２Ｘ３（Ｘ１は好ましくはＲもしくはＬ、Ｘ２は好ましくはＹもしくはＥ、そしてＸ３は好ましくはＴもしくはＳ）（配列番号：１１）；および／またはＱＱＹＹＩＹＰＹＴ（配列番号：１２）を含むことができる。当該ヒト化抗体は、場合により、上記ＣＤＲ残基のアミノ酸改変を含む（例えばその改変がその抗体の親和性を本質的に維持または改善する場合）。例えば、関心対象の抗体変異体は、約１個から約７個または約５個のアミノ酸置換を上記軽鎖可変ＣＤＲ配列に有することがある。例えば下記のような親和性成熟によって、当該抗体変異体を調製することができる。最も好ましいヒト化抗体は、配列番号：３の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
【０１２９】
本出願は、ＨＥＲ２と結合して、リガンドによるレセプターＨＥＲの活性化を遮断する、親和性成熟した抗体も考えている。親抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体、例えばそれぞれ配列番号３および４の軽鎖可変配列および／または重鎖可変配列をそれぞれ含むヒト化抗体（すなわち変異体５７４）でありうる。親和性成熟した抗体は、マウス２Ｃ４または変異体５７４よりも優れた親和性で（例えば、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ＥＬＩＳＡを用いて評定するとき、例えば約２または約４倍から約１００倍または約１０００倍向上した親和性で）レセプターＨＥＲ２に好ましくは結合する。置換のための例示的な重鎖可変部ＣＤＲ残基には、Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ３４、Ｈ３５、Ｈ６４、Ｈ９６、Ｈ９９、または二つ以上の組み合わせ（例えば、これらの残基の２、３、４、５、６、または７個）がある。変更のための軽鎖可変部ＣＤＲ残基の例には、Ｌ２８、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ５６、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、Ｌ９６、Ｌ９７、または二つ以上の組み合わせ（例えば、これらの残基の２から３、４、５、または約１０個まで）がある。
【０１３０】
様々な形態のヒト化抗体または親和性成熟した抗体が考えられている。例えば、ヒト化抗体または親和性成熟した抗体は、Ｆａｂなどの抗体フラグメントでありうるが、このフラグメントは、免疫コンジュゲートを発生させるために、１つまたは複数の細胞毒性薬と場合によりコンジュゲーションしている。または、ヒト化抗体もしくは親和性成熟した抗体は、インタクトなＩｇＧ１抗体などのインタクトな抗体でありうる。
【０１３１】
（ｉｖ）  ヒト抗体
ヒト化の代替として、ヒト抗体を発生させることができる。例えば、免疫処置した際に、内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の全レパートリーを産生できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが今や可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系突然変異マウスにおける抗体重鎖結合部（ＪＨ）遺伝子の同型接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を招くことが記載されている。当該生殖細胞系突然変異マウスにヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを導入する結果として、抗原による攻撃の際にヒト抗体の産生が生じるものである。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993);ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５８９，３６９号および第５，５４５，８０７号を参照されたい。
【０１３２】
または、ファージディスプレイ技法（McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)）を使用して、免疫処置されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体フラグメントをｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生することができる。この技法によると、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄなどの、糸状バクテリオファージの主または副コートタンパク質遺伝子のいずれかにフレーム内にクローニングして、ファージ粒子の表面上に機能的な抗体フラグメントとして提示させる。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むことから、その抗体の機能的性質に基づく選択は、それらの性質を示す抗体をコードする遺伝子の選択も招く。従って、そのファージは、Ｂ細胞の性質の一部を模倣する。ファージディスプレイを、様々な形式で行うことができる；それらの総説については、例えばJohnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)を参照されたい。いくつかの起源のＶ遺伝子セグメントをファージディスプレイのために使用することができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)は、免疫処置したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小規模ランダムコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫処置していないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、（自己抗原を含む）多様なアレイの抗原に対する抗体を、Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)、またはGriffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)によって記載されている技法に本質的に従って単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号も参照されたい。
【０１３３】
上記のように、ヒト抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化したＢ細胞により発生させることもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号参照）。
【０１３４】
ヒトＨＥＲ２抗体は、１９９８年６月３０日に発行された米国特許第５，７７２，９９７号および１９９７年１月３日に公表されたＷＯ９７／００２７１に記載されている。
【０１３５】
(ｖ) 抗体フラグメント
種々の技法が抗体フラグメントの産生のために開発されてきた。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992);およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照されたい）。しかし、これらのフラグメントを、今や組換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、その抗体フラグメントを、上記の抗体ファージライブラリーから単離することができる。または、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを、E.coliから直接回収して、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成させることができる（Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)）。別のアプローチにより、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントの産生のためのその他の技法は、当業者に明白であろう。他の態様では、選択した抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および第５，５８７，４５８号を参照されたい。この抗体フラグメントは、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に例えば記載される通り「線状抗体」（linear antibody）でもありうる。当該線状抗体フラグメントは、単一特異性または二重特異性でありうる。
【０１３６】
（ｖｉ）  二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＨＥＲ２タンパク質の２つの異なるエピトープに結合することができる。その他の当該抗体は、ＨＥＲ２結合部位と、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３および／またはＨＥＲ４に対する結合部位とを組み合わせることができる。または、細胞防御メカニズムをＨＥＲ２発現細胞に集中させるために、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２もしくはＣＤ３）のような、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などの、ＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）のような、白血球上のトリガー分子に結合するアームとＨＥＲ２アームを組み合わせることができる。ＨＥＲ２を発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるために、二重特異性抗体を使用することもできる。これらの抗体は、ＨＥＲ２結合アームと、細胞毒性薬（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシン（ricin）Ａ鎖、メトトレキサート、または放射性同位体ハプテン）と結合するアームとを有する。二重特異性抗体を、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０１３７】
ＷＯ９６／１６６７３は、二重特異性ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載し、米国特許第５，８３７，２３４号は、二重特異性ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩ抗体ＩＤＭ１（Osidem）を開示している。二重特異性ＨＥＲ２／Ｆｃα抗体は、ＷＯ９８／０２４６３に示されている。米国特許第５，８２１，３３７号は、二重特異性ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を教示している。ＭＤＸ−２１０は、二重特異性ＨＥＲ２−ＦｃγＲＩＩＩ Ａｂである。
【０１３８】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野において公知である。全長二重特異性抗体の従来の産生は、二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づく。ここで、その２本の鎖は異なる特異性を有する（Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな取り合わせが原因で、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、そのうち、一つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、普通はアフィニティークロマトグラフィー段階によってなされるが、その精製はかなり煩雑であり、その産物の収率は低い。類似の手順がＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１３９】
異なるアプローチにより、所望の結合特異性（抗体−抗原の結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。この融合体は、好ましくは、ヒンジ部の少なくとも部分、ＣＨ２部およびＣＨ３部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有する。これら融合体の少なくとも一つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含む第一重鎖定常部（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡと、所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡとを、別々の発現ベクターに挿入して、そして適切な宿主生物に同時トランスフェクションする。これは、等しくない比率の三つのポリペプチド鎖の構築に使用されるそれらのポリペプチド鎖が最適な収率を提供する態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互比率の調整に大きな柔軟性を提供する。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖が等しい比で発現することが高収率を招く場合、またはその比が特に重要ではない場合に、二つまたは三つ全てのポリペプチド鎖についてのコード配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１４０】
このアプローチの好ましい態様では、その二重特異性抗体は、一方のアームに第１結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２結合特異性を提供する）とから構成される。この非対称構造は、望まれていない免疫グロブリン鎖の組み合わせから所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。それは、二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することが、分離の容易な方法を提供するからである。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を発生させるさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１４１】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている別のアプローチによると、抗体分子対の間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の率を最大にすることができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含む。この方法では、第１抗体分子の界面由来の一つまたは複数の小型アミノ酸側鎖を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置換する。その大型側鎖（類）に同一または類似の大きさの代償的な「空洞」は、大型アミノ酸側鎖をより小型のアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）に置換することによって、第２抗体分子の界面に生み出される。これは、ホモ二量体などのその他の望まれない最終産物に比べてヘテロ二量体の収率を増加するためのメカニズムを提供する。
【０１４２】
二重特異性抗体は、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうちの一方をアビジンと、他方をビオチンと結合させることができる。当該抗体は、例えば、望まれていない細胞に免疫系細胞をターゲティングするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ ９１／００３６０、ＷＯ ９２／２００３７３、およびＥＰ０３０８９）提案された。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合の架橋方法を用いて作製することができる。適切な架橋剤は当技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に、いくつかの架橋技法と共に開示されている。
【０１４３】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を発生させるための技法は、文献にも記載されている。例えば、化学的結合を用いて二重特異性抗体を調製することができる。Brennan et al., Science, 229:81 (1985)は、インタクトな抗体がタンパク質分解的に開裂されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを発生する手順を記載している。これらのフラグメントを、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化して、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次に、発生したＦａｂ’フラグメントをチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次に、メルカプトエチルアミンを用いた還元により、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをＦａｂ’−チオールへと再変換し、等モル量のその他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成させる。産生した二重特異性抗体を、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
【０１４４】
最近の進歩により、E. coli由来のＦａｂ’−ＳＨフラグメントを直接回収することが容易になった。このＦａｂ’−ＳＨフラグメントを、化学的に結合して、二重特異性抗体を形成させることができる。Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各々のＦａｂ’フラグメントが、E. coliから別個に分泌され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ定方向化学的結合に供されて、二重特異性抗体を形成した。このように形成した二重特異性抗体は、レセプターＨＥＲ２を過剰発現している細胞および正常なヒトＴ細胞に結合することができ、かつヒト乳房腫瘍ターゲットに対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性をトリガーできた。
【０１４５】
組換え細胞培養物から二重特異性抗体フラグメントを直接作製して単離するための様々な技法も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生された。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって二つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。その抗体ホモ二量体は、ヒンジ部で還元されて単量体を形成し、次に、再び酸化されて抗体へテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体産生のためにも利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)によって記載された「二特異性抗体」技法は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替メカニズムを提供した。このフラグメントは、同一鎖上の二つのドメイン間で対形成できるには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、一フラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補性ＶＬドメインおよびＶＨドメインと対形成することを強いられ、それによって、二つの抗原結合部位を形成する。二重特異性抗体フラグメントを単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって作製するための別の戦略も報告されている。Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１４６】
二つを超える結合価を有する抗体が考えられている。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)。
【０１４７】
（ｖｉｉ）  その他のアミノ酸配列の改変
本明細書に記載されたＨＥＲ２抗体のアミノ酸配列の改変が考えられている。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的性質を改善することが望ましいことがある。適切なヌクレオチド変化をＨＥＲ２抗体の核酸に導入することにより、またはペプチド合成により、ＨＥＲ２抗体のアミノ酸配列変異体を調製する。当該改変には、例えば、ＨＥＲ２抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換がある。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせは、最終構築物に達するように作製されるが、ただし、その最終構築物は所望の性質を有する。そのアミノ酸変化は、グリコシル化部位の数または位置を変化させるように、ＨＥＲ２抗体の翻訳後プロセスを変更することもできる。
【０１４８】
突然変異誘発についての好ましい位置である、ＨＥＲ２抗体のある残基または領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)に記載されているような「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。本明細書において、ターゲット残基の残基または基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電した残基）が同定され、中性または陰性に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）に置換されて、アミノ酸とＨＥＲ２抗原との相互作用に影響する。次に、置換に対する機能的感受性を実証しているアミノ酸位置を、置換部位に、または置換部位の代わりに、さらなる変異体またはその他の変異体を導入することによって精密化する。このように、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されているものの、その突然変異自体の性質は、予め決定されている必要はない。例えば、所定の部位での突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発が、ターゲットコドンまたはターゲット領域に施され、そして発現したＨＥＲ２抗体変異体が、所望の活性についてスクリーニングされる。
【０１４９】
アミノ酸配列挿入には、一つの残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合体、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入がある。末端の挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有するＨＥＲ２抗体、または細胞毒性ポリペプチドに融合したＨＥＲ２抗体がある。ＨＥＲ２抗体分子のその他の挿入変異体には、ＨＥＲ２抗体のＮ末端もしくはＣ末端と、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ用）との、または抗体の血清半減期を増大させるポリペプチドとの融合体がある。
【０１５０】
別の型の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、ＨＥＲ２抗体分子中の少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基に置換されている。置換突然変異誘発について最も関心対象の部位には、超可変部があるが、ＦＲ変更も考えられている。保存的置換を、「好ましい置換」の見出しの下に表１に示す。当該置換が生物学的活性の変化を招くならば、表１に「例示的置換」と称するか、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載される、より実質的な変化を導入して、その産物をスクリーニングすることができる。
【０１５１】
【表１】
2015157831.tif 000002
【０１５２】
抗体の生物学的性質における実質的な改変は、（ａ）例えば、シートまたはヘリックスコンフォメーションのような、置換領域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）ターゲット部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さを維持することに及ぼすそれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって実現される。アミノ酸を、側鎖の性質の類似性により以下のような群に分けることができる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp.73-75, Worth Publishers, New York(1975)）：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。
【０１５３】
または、天然に存在する残基を、共通の側鎖の性質に基づいて以下の群に分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１５４】
非保存的置換は、これらのクラスのうち、一つのメンバーを別のクラスのものに交換することを必要とするものである。
【０１５５】
ＨＥＲ２抗体の適切なコンフォメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基を、一般にセリンに置換して、その分子の酸化に対する安定性を改善して、異常な架橋を阻止することもできる。逆に、システイン結合をその抗体に付加して、（特に、その抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）その安定性を改善することができる。
【０１５６】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の一つまたは複数の超可変部残基を置換することを伴う。一般に、さらなる開発のために選択された、結果として生じた変異体は、それらの発生が由来する親抗体と比較して、改善した生物学的性質を有するものである。当該置換変異体を発生させるための簡便法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を伴う。簡潔には、いくつかの超可変部部位（例えば、６から７個の部位）を突然変異させてすべての可能なアミノ置換を各部位に発生させる。このように発生した抗体変異体は、糸状ファージ粒子から一価の様式で、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として提示される。次に、ファージディスプレイされた変異体を、本明細書に開示されたように、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための候補となる超可変部部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を行って、抗原結合に重大に寄与する超可変部残基を同定することができる。または、もしくは追加的に、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体とヒトＨＥＲ２との間の接触点を同定することも有益でありうる。そのような接触残基および隣接する残基は、本明細書に詳細に述べられた技法による置換のための候補である。当該変異体がいったん発生すると、一団の変異体を本明細書に記載されたスクリーニングに供し、一つまたは複数の関連するアッセイで優れた性質を有する抗体を、さらなる開発のために選択することができる。
【０１５７】
この抗体の別の型のアミノ酸変異体は、この抗体の本来のグリコシル化パターンを変更したものである。変更によって、抗体に見出される一つもしくは複数の糖質部分を欠失させること、および／またはその抗体には存在しない一つもしくは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【０１５８】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ−結合またはＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合は、アスパラギン残基の側鎖に糖質部分が付着していることを指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に糖質部分を酵素的に付着させるための認識配列である。このように、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチドに存在することで、潜在的なグリコシル化部位が生み出される。Ｏ−結合型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの一つがヒドロキシアミノ酸に付着していることを指し、そのヒドロキシアミノ酸は、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用されうるが、最も一般にはセリンまたはトレオニンである。
【０１５９】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、好都合には、アミノ酸配列を変更することにより、そのアミノ酸配列が（Ｎ−結合型グリコシル化部位のための）上記の一つまたは複数のトリペプチド配列を含ませることによって実現される。本来の抗体の配列に（Ｏ−結合型グリコシル化部位のための）一つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基を付加するか、またはこれらに置換することによっても、変更を行うことができる。
【０１６０】
ＨＥＲ２抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の様々な方法によって調製される。これらの方法には、（天然アミノ酸配列変異体の場合）天然起源からの単離、またはＨＥＲ２抗体の以前に調製された変異体もしくは非変異体版のオリゴヌクレオチド介在性（もしくは部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発による調製があるが、それに限定されるわけではない。
【０１６１】
例えば、抗体の抗原依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を増強するためのエフェクター機能に関して、本発明の抗体を改変することが望ましいことがある。これは、抗体のＦｃ部に一つまたは複数のアミノ酸置換を導入することによって実現することができる。または、もしくは追加的に、システイン残基（類）をＦｃ部に導入することによって、この領域中の鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。このように発生したホモ二量体抗体は、改善したインターナリゼーション能ならびに／または増大した補体介在性細胞殺滅および抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有することがある。Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体を、Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。または、二つのＦｃ部を有する抗体を操作することができ、それによって、その抗体は増強した補体溶解およびＡＤＣＣ能を有しうる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照されたい。
【０１６２】
抗体の血清半減期を増大させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように、サルベージレセプター結合エピトープを抗体（特に抗体フラグメント）に組み込むことができる。本明細書中で使用されるときの用語「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期の増大を担う、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ部のエピトープを指す。
【０１６３】
（ｖｉｉｉ）  所望の性質を有する抗体についてのスクリーニング
抗体を発生させるための技法は、上に記載されている。所望に応じ、特定の生物学的特性を有する抗体をさらに選択することができる。
【０１６４】
レセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する抗体を同定するために、その抗体が、（例えば、別のレセプターＨＥＲとコンジュゲーションして、それと共に関心対象のレセプターＨＥＲがＨＥＲヘテロオリゴマーを形成する）レセプターＨＥＲを発現している細胞に対するＨＥＲリガンドの結合を遮断する能力を決定することができる。例えば、ＨＥＲヘテロオリゴマーのレセプターＨＥＲを自然発現しているか、またはそれを発現するようにトランスフェクションされた細胞を、その抗体と共にインキュベーションして、次にラベルしたＨＥＲリガンドに曝露することができる。ＨＥＲ２抗体が、ＨＥＲヘテロオリゴマー中のレセプターＨＥＲに対するリガンドの結合を遮断する能力を、次に評価することができる。
【０１６５】
例えば、ＨＥＲ２抗体によるＭＣＦ７乳房腫瘍細胞系へのＨＲＧ結合の阻害を、本質的に以下の実施例１に記載したように２４ウェルプレート形式での氷冷単層ＭＣＦ７培養物を用いて行うことができる。ＨＥＲ２モノクローナル抗体を各ウェルに加え、３０分間インキュベーションすることができる。１２５ＩラベルｒＨＲＧβ１１７７−２２４(２５pm)を次に加え、インキュベーションを４から１６時間続けることができる。用量反応曲線を準備することができ、関心対象の抗体についてＩＣ５０値を算出することができる。一態様では、レセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する抗体は、このアッセイで約５０nM以下の、より好ましくは約１０nM以下の、ＭＣＦ７細胞に対するＨＲＧ結合阻害についてのＩＣ５０を有するであろう。抗体が、Ｆａｂフラグメントなどの抗体フラグメントである場合、このアッセイにおけるＭＣＦ７細胞に対するＨＲＧの結合阻害についてのＩＣ５０は、例えば約１００nM以下、より好ましくは５０nM以下でありうる。
【０１６６】
または、もしくは追加的に、ＨＥＲ２抗体が、ＨＥＲヘテロオリゴマーに存在するレセプターＨＥＲのＨＥＲリガンド刺激性チロシンリン酸化を遮断する能力を評定することができる。例えば、レセプターＨＥＲを内因性発現しているか、またはそれらを発現するようにトランスフェクションされた細胞を、抗体と共にインキュベーションして、次に、ＨＥＲリガンド依存性チロシンリン酸化活性について抗ホスホチロシンモノクローナル(場合により検出可能なラベルとコンジュゲーションされたもの)を用いてアッセイすることができる。米国特許第５，７６６，８６３号に記載されているキナーゼレセプター活性化アッセイも、レセプターＨＥＲの活性化と抗体によるその活性の遮断とを測定するために利用できる。
【０１６７】
一態様では、本質的に以下の実施例１に記載されたように、ＨＲＧによるＭＣＦ７細胞でのｐ１８０チロシンリン酸化の刺激を阻害する抗体についてスクリーニングすることができる。例えば、ＭＣＦ７細胞を２４ウェルプレートに蒔き、ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体を各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベーションし、次に最終濃度０．２nMまでｒＨＲＧβ１１７７−２４４を各ウェルに加えることができ、インキュベーションを８分間続けることができる。培地を各ウェルから吸引し、ＳＤＳ試料バッファー(５%ＳＤＳ、２５mM  ＤＴＴ、および２５mMトリス-ＨＣｌ、ｐＨ６．８)１００μlを加えることによって反応を停止させることができる。各試料（２５μl）を、４〜１２%の勾配ゲル（Novex）で電気泳動して、次にポリビニリデンジフルオリド膜に電気泳動的に移行させることができる。抗ホスホチロシン（１μg/ml）免疫ブロットを展色させて、Ｍｒ〜１８００００での顕著な反応性バンドの強度を反射率デンシトメトリーにより定量することができる。選択された抗体は、好ましくはこのアッセイの対照の約０〜３５%まで、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化刺激を有意に阻害するであろう。反射率デンシトメトリーによって決定された、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化刺激の阻害についての用量反応曲線を準備することができ、関心対象の抗体についてのＩＣ５０を算出することができる。一態様では、レセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する抗体は、このアッセイにおいて約５０nM以下の、より好ましくは約１０nM以下の、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化刺激の阻害についてのＩＣ５０を有するであろう。抗体が、Ｆａｂフラグメントなどの抗体フラグメントである場合、このアッセイにおける、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化刺激の阻害についてのＩＣ５０は、例えば約１００nM以下、より好ましくは５０nM以下でありうる。
【０１６８】
例えば、本質的にSchaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)に記載されているように、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞に及ぼす抗体の成長阻害効果を評定することもできる。このアッセイによると、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞を、ＨＥＲ２モノクローナル抗体（１０μg/mL）で４日間処理して、クリスタルバイオレットで染色することができる。ＨＥＲ２抗体とのインキュベーションにより、モノクローナル抗体２Ｃ４によって示される効果に類似した、本細胞系に及ぼす成長阻害効果が示されうる。さらなる態様では、外因性ＨＲＧはこの阻害を有意に逆転しないであろう。好ましくは、この抗体は、外因性ＨＲＧの存在下および不在下の両方で、モノクローナル抗体４Ｄ５よりも高い程度（および場合によりモノクローナル抗体７Ｆ３よりも高い程度）、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の細胞増殖を阻害することができるであろう。
【０１６９】
一態様では、関心対象のＨＥＲ２抗体は、モノクローナル抗体４Ｄ５よりも実質的に効果的に、好ましくはモノクローナル抗体７Ｆ３よりも実質的に効果的に、実施例２に記載されたような共免疫沈降実験で決定されたように、ＭＣＦ７細胞およびＳＫ-ＢＲ-３細胞の両方においてＨＥＲ２とＨＥＲ３とのヘレグリン依存性会合を遮断することができる。
【０１７０】
増殖阻害ＨＥＲ２抗体を同定するために、ＨＥＲ２を過剰発現するガン細胞の成長を阻害する抗体についてスクリーニングすることができる。一態様では、えり抜きの成長阻害抗体は、細胞培養において約０．５から３０μg/mlの抗体濃度で約２０〜１００%だけ、好ましくは約５０〜１００%だけＳＫ−ＢＲ−３細胞の成長を阻害することができる。当該抗体を同定するために、米国特許第５，６７７，１７１号に記載されているＳＫ−ＢＲ−３アッセイを行うことができる。このアッセイによると、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１０%ウシ胎仔血清、グルタミン、およびペニシリン、ストレプトマイシンを補充したＦ１２とＤＭＥＭ培地との１：１混合物中で成長させる。ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、３５mmの細胞培養皿に細胞２００００個で（２ml／３５mmの皿）で蒔く。皿１枚あたり０．５から３０μg/mlのＨＥＲ２抗体を添加する。６日後に、未処理の細胞と比較した細胞数を、電子ＣＯＵＬＴＥＲ（商標）細胞計数機を用いて計数する。ＳＫ−ＢＲ−３細胞の成長を約２０〜１００%または約５０〜１００%だけ阻害する抗体を、成長阻害抗体として選択することができる。４Ｄ５および３Ｅ８などの成長阻害抗体についてスクリーニングするアッセイに関しては、米国特許第５，６７７，１７１号を参照されたい。
【０１７１】
アポトーシスを誘導する抗体を選択するために、ＢＴ４７４細胞を用いたアネキシン結合アッセイを利用できる。ＢＴ４７４細胞を培養して、前項に論じたように皿に接種する。次に、培地を取り除き、新鮮培地培地単独または１０μg/mlのモノクローナル抗体を含有する培地に交換する。３日間のインキュベーション期間の後に、単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理により剥離する。次に、細胞を遠心分離して、Ｃａ２＋結合バッファーに再懸濁して、細胞死アッセイについて上に論じたように試験管に分取する。次に、試験管にラベル化アネキシン（例えばアネキシンＶ-ＦＴＩＣ）（１μg/ml）を入れる。ＦＡＣＳＣＡＮ（商標）フローサイトメータおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Becton Dickinson）を使用して試料を分析できる。対照に比べて統計的に有意なレベルのアネキシン結合を誘導する抗体を、アポトーシス誘導抗体として選択する。アネキシン結合アッセイに追加して、ＢＴ４７４細胞を用いたＤＮＡ染色アッセイを利用できる。このアッセイを行うために、前の二項に記載したように関心対象の抗体で処理したＢＴ４７４細胞を、３７℃で２時間、９μg/mlのＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２（商標）と共にインキュベーションし、次に、ＭＯＤＦＩＴＬＴ（商標）ソフトウェア（Verity Software House）を用いたＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ（商標）フローサイトメータ（Coulter Corporation）で分析する。本アッセイを使用して、未処理細胞(１００%までのアポトーシス細胞)よりも２倍以上（好ましくは３倍以上）というアポトーシス細胞率の変化を誘導する抗体を、アポトーシス促進性抗体として選択することができる。７Ｃ２および７Ｆ３などの、アポトーシスを誘導する抗体についてスクリーニングするためのアッセイに関してはＷＯ９８／１７７９７を参照されたい。
【０１７２】
関心対象の抗体によって結合されるＨＥＲ２上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを実施して、その抗体が２Ｃ４またはパーツズマブなどの抗体がＨＥＲ２に結合するのを交差遮断するするかどうかを評定することができる。または、もしくは追加的に、当技術分野で公知の方法によって、エピトープマッピングを行うことができ（例えば、本明細書の図１Ａおよび１Ｂ参照）、かつ／または抗体−ＨＥＲ２構造を研究して（Franklin et al., Cancer Cell 5:317-328 (2004)）ＨＥＲ２のどのドメイン（類）がその抗体によって結合されるかを知ることができる。
【０１７３】
（ｉｘ）免疫コンジュゲート
本発明は、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素であって、そのフラグメントおよび／または変異体を含む）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）などの細胞毒性薬にコンジュゲーションした抗体を含む免疫コンジュゲートにも関するものである。
【０１７４】
当該免疫コンジュゲートの発生に有用な化学療法剤は上に記載されている。抗体と、カリチェアミシン、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、およびトリコテン（trichothene）、およびＣＣ１０６５などの一つまたは複数の小分子毒素とのコンジュゲートも本明細書に考えられている。
【０１７５】
本発明の好ましい一態様では、抗体は、一つまたは複数のメイタンシン分子（例えば、抗体１分子あたり約１から約１０個のメイタンシン分子）とコンジュゲーションしている。メイタンシンを、例えばＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換でき、それをＭａｙ−ＳＨ３に還元して改変抗体と反応させ（Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)）、メイタンシノイド−抗体免疫コンジュゲートを発生させることができる。
【０１７６】
関心対象の別の免疫コンジュゲートは、一つまたは複数のカリチェアミシン分子とコンジュゲーションしているＨＥＲ２抗体を含む。カリチェアミシンファミリーの抗生物質は、サブピコモル濃度で、２本鎖ＤＮＡ切断を産生することができる。使用されうるカリチェアミシンの構造アナログには、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ、およびθＩ１（Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342(1993)およびLode et al., Cancer Research 58:2925-2928(1998)）があるが、それに限定されるわけではない。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，７１４，５８６号；第５，７１２，３７４号；第５，２６４，５８６号；および第５，７７３，００１号も参照されたい。
【０１７７】
使用できる酵素活性毒素およびそのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Pseudomonas aeruginosa由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（modeccin）Ａ鎖、アルファ−サルシン（sarcin）、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ-Ｓ）、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、およびびトリコテセンがある。例えば、１９９３年１０月２８日に公表されたＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。
【０１７８】
本発明は、抗体と核分解活性を有する化合物（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）などのリボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考えている。
【０１７９】
放射性コンジュゲーションしたＨＥＲ２抗体の産生に種々の放射性同位体を利用できる。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体がある。
【０１８０】
抗体と細胞毒性薬とのコンジュゲートを、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（ジメチルアジポイミデートＨＣＬなど）、活性エステル類（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド類（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン（tolyene）−２，６−ジイソシアネートなど）、および二活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）のような多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製することができる。例えば、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されているように、リシン免疫毒素を調製することができる。炭素１４ラベル１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲーションするための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞毒性薬物の放出を容易にする「開裂可能なリンカー」でありうる。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Chari et al.，Cancer Research 52:127-131 (1992)）を使用することができる。
【０１８１】
または、ＨＥＲ２抗体および細胞毒性薬を含む融合タンパク質を、例えば組換え技法またはペプチド合成によって作成することができる。
【０１８２】
なお別の態様では、腫瘍の予備ターゲティングに利用するために、「レセプター」(ストレプトアビジンなど)に抗体をコンジュゲーションすることができ、ここで、抗体 -レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて除去（clearing）剤を使用して循環から未結合のコンジュゲートを除去し、次に、細胞毒性薬（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲーションしている「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【０１８３】
(ｘ)   抗体依存性酵素介在性プロドラッグ療法(ＡＤＥＰＴ)
プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５参照)を活性な抗ガン薬に変換するプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲーションすることによって、ＡＤＥＰＴにも本発明の抗体を使用することができる。例えば、ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい。
【０１８４】
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素構成要素には、より活性な細胞毒性形態に変換するようにプロドラッグに作用できる任意の酵素が含まれる。
【０１８５】
本発明の方法に有用な酵素には、ホスフェート含有プロドラッグを遊離の薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；スルフェート含有プロドラッグを遊離の薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；無毒性５−フルオロシトシンを抗ガン薬５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬物に変換するのに有用なserratiaプロテアーゼ、テルモリジン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、およびカテプシン（カテプシンＢおよびＬなど）のようなプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの変換に有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離の薬物に変換するのに有用なβ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼなどの糖質開裂酵素；β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離の薬物に変換するのに有用なβ−ラクタマーゼ；ならびにアミン性窒素でフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基を用いて誘導体化された薬物を、それぞれ遊離の薬物に変換するのに有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼがあるが、それに限定されるわけではない。または、「アブザイム」としても当技術分野において公知である酵素活性を有する抗体を使用して、本発明のプロドラッグを遊離の活性薬物に変換することができる（例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)参照）。腫瘍細胞集団にアブザイムを送達するために、抗体−アブザイムコンジュゲートを本明細書に記載したように調製することができる。
【０１８６】
本発明の酵素は、上に論じたヘテロ二官能性架橋試薬の使用などの当技術分野において周知の技法によって、ＨＥＲ２抗体に共有結合することができる。または、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域が本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結したものを含む融合タンパク質を、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ技法を使用して構築することができる（例えばNeuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)参照。
【０１８７】
（ｘｉ）  その他の抗体改変
抗体のその他の改変が本明細書において考えられている。例えば、多様な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーのうちの一つに抗体を連結することができる。例えばコアセルベーション技法もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリメタクリル酸メチルマイクロカプセル）に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル)に、またはマクロエマルションに、抗体を捕捉することもできる。このような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示されている。
【０１８８】
本明細書において開示されたＨＥＲ２抗体を、免疫リポソームとして処方することもできる。抗体を含有するリポソームを、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびに１９９７年１０月２３日に公表されたＷＯ９７／３８７３１に記載されているように、当技術分野において公知の方法により調製する。循環時間が高まったリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１８９】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって発生させることができる。所定の孔径のフィルターを通過させてリポソームを押し出して、所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントを、ジスルフィド交換反応を介して、Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲーションすることができる。場合により、化学療法剤がリポソーム内に包含される。Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989)を参照されたい。
【０１９０】
ＩＩＩ．  薬学的製剤
本発明により使用される抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を、任意選択の薬学的に許容されうる担体、賦形剤、または安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）と、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で混合することによって、保存用に調製される。許容されうる担体、賦形剤、または安定化剤は、採用される投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、これらには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール、またはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた単糖類、二糖類、およびその他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤がある。好ましい凍結乾燥ＨＥＲ２抗体製剤は、ＷＯ９７／０４８０１に記載され、参照により本明細書に特に組み入れられる。
【０１９１】
本明細書における製剤は、処置される特定の適応症に必要な一つを超える活性化合物、好ましくは相互に有害な影響を及ぼさない相補性活性を有するものも含有することがある。例えば、一製剤中に、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、または血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体（例えばＨＥＲ２上の異なるエピトープに結合する抗体）をさらに提供することが望ましいことがある。または、もしくは追加的に、組成物は、化学療法剤、細胞毒性薬、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、ＥＧＦＲターゲット薬、抗血管形成剤、および／または心臓保護剤をさらに含みうる。このような分子は、好適には、意図された目的に有効な量で組み合わせて存在する。
【０１９２】
活性成分は、例えばコアセルベーション技法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリメタクリル酸メチルマイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルションに捕捉することもできる。当該技法はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed.,(1980)に開示されている。
【０１９３】
持続性放出製剤を調製することができる。持続性放出製剤の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリックスがあり、このマトリックスは、造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続性放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、またはポリビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）などの分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸がある。
【０１９４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通して濾過することにより容易に実現される。
【０１９５】
ＩＶ．  治療のための患者のスクリーニング
本明細書における発明の好ましい態様によると、治療のために選択された患者は、ＨＥＲ（好ましくはＨＥＲ２）の活性化を示している腫瘍を有する。一態様では、ガン細胞におけるＨＥＲ（またはＨＥＲ２）活性化の程度は、同組織型の非ガン性細胞におけるレセプターの活性化レベルを有意に上回る。そのような過度の活性化は、レセプターＨＥＲの過剰発現、および／またはガン細胞におけるこのレセプターＨＥＲの活性化に利用できるＨＥＲリガンドのレベルが正常よりも高いことに起因する。そのような過度の活性化は、ガン細胞の悪性状態を引き起こし、かつ／またはそれに引き起こされうる。いくつかの態様では、そのガンは、診断または予後アッセイに供されて、レセプターＨＥＲのそのような過度の活性化を招くレセプターＨＥＲの増幅および／または過剰発現が生じているかどうかが決定されるであろう。または、もしくは追加的に、そのガンは、診断または予後アッセイに供されて、このレセプターの過度の活性化を原因とされるＨＥＲリガンドの増幅および／または過剰発現がそのガンにおいて生じているかどうかが決定されうる。当該ガンのサブセットでは、レセプターの過度の活性化は、自己分泌刺激経路に起因しうる。ＨＥＲ活性化を決定するための様々なアッセイを下にさらに詳細に説明する。
【０１９６】
（ｉ）  ＨＥＲ二量体
ＨＥＲまたはＨＥＲ２活性化を示しているとして、ＨＥＲ二量体の存在について腫瘍試料を評定することができる。当技術分野において公知の任意の方法を使用して、腫瘍におけるＥＧＦＲ−ＨＥＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３などのＨＥＲ２二量体を検出することができる。いくつかの好ましい方法を下に説明する。これらの方法は、非共有タンパク質−タンパク質相互作用を検出するか、または、さもなければ関心対象のタンパク質の間で近接していることを指示する。
【０１９７】
免疫沈降またはＥＬＩＳＡなどの免疫親和性に基づく方法を使用してＨＥＲ二量体を検出することができる。一態様では、ＨＥＲ２抗体を使用して、ＨＥＲ２を含む複合体を腫瘍細胞から免疫沈降させ、次に、免疫ブロットによりＥＧＦＲまたはＨＥＲ３の存在について、結果として生じた免疫沈殿剤を探査する。別の態様では、免疫沈降段階のためにＥＧＦＲ抗体またはＨＥＲ３抗体を使用することができ、次に、ＨＥＲ２抗体を用いて免疫沈殿剤を探査する。さらなる態様では、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２複合体またはＨＥＲ２／ＨＥＲ３複合体に特異的なＨＥＲリガンドを使用して、複合体を沈殿させることができ、次に、ＨＥＲ２の存在についてその複合体を探査する。例えば、リガンドをアビジンとコンジュゲーションして、複合体をビオチンカラムで精製することができる。
【０１９８】
ＥＬＩＳＡアッセイまたは抗体「サンドイッチ」型アッセイなどの他の態様では、ＨＥＲ２に対する抗体を固体支持体上に固定化して、腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解物と接触させ、洗浄し、次にＥＧＦＲまたはＨＥＲ３に対する抗体に曝露する。後者の抗体の結合は、直接または検出可能なラベルにコンジュゲーションした二次抗体によって検出できるが、ヘテロ二量体の存在を示す。ある態様では、ＥＧＦＲ抗体またはＨＥＲ３抗体を固定化して、ＨＥＲ２抗体を検出段階に使用する。他の態様では、ＨＥＲリガンドをＨＥＲ抗体の代わりに、またはＨＥＲ抗体と組み合わせて使用することができる。
【０１９９】
化学架橋またはＵＶ架橋を使用して、生きた細胞の表面に二量体を共有結合的に繋ぐこともできる。Hunter et al., Biochem. J., 320:847-53。化学架橋剤の例には、ジチオビス（スクシンイミジル）プロピオナート（ＤＳＰ）および３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジル）プロピオナート（ＤＴＳＳＰ）がある。一態様では、化学架橋した腫瘍細胞由来の細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ３に対する抗体を用いて免疫ブロットする。適切な分子量のスーパーシフトしたバンドは、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体を最も表していると思われる。それは、ＨＥＲ２がＥＧＦＲおよびＨＥＲ３に好ましい二量体化パートナーだからである。この結果を、ＨＥＲ２抗体を用いたその後の免疫ブロットにより確認することができる。
【０２００】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体を検出することもできる。ＦＲＥＴは、ドナーフルオロホアからアクセプターフルオロホアへのエネルギー移動に基づいてタンパク質のコンフォメーション変化およびタンパク質−タンパク質相互作用をｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出する。Selvin, Nat. Struct. Biol., 7:730-34(2000)。ドナーフルオロホアがアクセプターフルオロホアに十分近接している場合に限り、エネルギー移動が起こる。典型的なＦＲＥＴ実験では、二つのタンパク質または単一タンパク質の二つの部位を異なる蛍光プローブでラベルする。一方のプローブであるドナープローブは、特異的な波長の入射光によって高いエネルギー状態に励起する。次に、ドナープローブはそのエネルギーを第２のプローブであるアクセプタープローブに伝播し、その結果、ドナー蛍光強度の減少とアクセプター蛍光発光の増加とを生じる。エネルギー移動の程度を測定するために、ドナープローブおよびアクセプタープローブでラベルした試料でのドナーの強度を、ドナープローブのみでラベルした試料でのドナーの強度と比較する。場合により、アクセプターの強度をドナー／アクセプターおよびアクセプターのみの試料で比較する。適切なプローブは当技術分野で公知であり、それには、例えば、フルオレセインおよびロダミンなどの膜透過性色素、シアニン色素などの有機色素、ならびにランタニド原子がある。Selvin、上記。エネルギー移動を検出および測定するための方法および計装もまた、当技術分野で公知である。Selvin、上記。
【０２０１】
個別の細胞におけるタンパク質−タンパク質相互作用を検出および測定するために適した、ＦＲＥＴに基づく技法も当技術分野で公知である。例えば、ドナー光退色蛍光共鳴エネルギー移動（ｐｂＦＲＥＴ）顕微鏡観察および蛍光寿命イメージング顕微鏡観察（ＦＬＩＭ）を使用して、細胞表面レセプターの二量体化を検出することができる。 Selvin、上記；Gadella & Jovin, J. Cell Biol., 129:1543-58 (1995)。一態様では、Nagy et al., Cytometry, 32:120-131 (1998)に記載されているように「懸濁液中」または「ｉｎ  ｓｉｔｕ」のいずれかで細胞に対してｐｂＦＲＥＴを使用して、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体の形成を検出および測定する。これらの技法は、エネルギー移動が原因のドナーの蛍光寿命の減少を測定する。特定の態様では、Nagyら、上記およびBrockhoff et al., Cytometry, 44:338-48 (2001)に記載されているように、フローサイトメトリーＦｏｅｒｓｔｅｒ型ＦＲＥＴ技法（ＦＣＥＴ）を使用してＥＧＦＲ−ＨＥＲ２およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３の二量体化を研究することができる。
【０２０２】
ＦＲＥＴは、好ましくは標準的な免疫組織化学ラベル技法と共に使用される。Kenworthy, Methods, 24:289-96 (2001)。例えば、適切な蛍光色素とコンジュゲーションした抗体を、二つの異なるタンパク質をラベルするためのプローブとして使用することができる。タンパク質が相互に近接しているならば、それらの蛍光色素はＦＲＥＴのためのドナーおよびアクセプターとして作用する。標準的な手段によってエネルギー移動を検出する。フローサイトメトリー手段によって、または電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラと接続した共焦点顕微鏡観察もしくは広視野蛍光顕微鏡観察などのデジタル顕微鏡観察システムによってエネルギー移動を検出することができる。
【０２０３】
本発明の一態様では、例えば、Nagyら、上記に記載されているように、ＨＥＲ２抗体と、ＥＧＦＲ抗体またはＨＥＲ３抗体のいずれかとを二つの異なるフルオロホアで直接ラベルする。腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解物を、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体の存在下でＦＲＥＴのためのドナーおよびアクセプターとして作用する、ディファレンシャルにラベルした抗体と接触させる。または、ＨＥＲ２に対する未ラベル抗体と、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３のいずれかに対する未ラベル抗体とを、ドナーおよびアクセプターとして働くディファレンシャルにラベルした二次抗体と一緒に使用する。例えば、Brockhoffら、上記を参照されたい。エネルギー移動を検出して、それらラベルが近接していることが見出されたならば、二量体の存在が決定される。
【０２０４】
他の態様では、ＨＥＲ２に特異的なレセプターＨＥＲのリガンドと、ＨＥＲ１またはＨＥＲ３のいずれかに特異的なレセプターＨＥＲのリガンドとを蛍光ラベルして、ＦＲＥＴ研究に使用する。
【０２０５】
本発明のなお他の態様では、腫瘍細胞表面上に二量体が存在することを、標準的な直接または間接免疫蛍光技法および共焦点レーザー走査顕微鏡観察を用いて、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３のいずれかとのＨＥＲ２の共局在によって実証する。または、Zuck et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:11122-27(1999)に記載されているように、レーザ走査イメージング（ＬＳＩ）を使用して、マイクロウェルプレートなどの高スループット形式で、抗体結合およびＥＧＦＲまたはＨＥＲ３のいずれかとのＨＥＲ２の共局在を検出する。
【０２０６】
さらなる態様では、二量体構成要素の近接に依存した酵素活性を確認することによって、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２および／またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体の存在を決定する。ＨＥＲ２抗体を、ある酵素とコンジュゲーションさせ、ＥＧＦＲ抗体またはＨＥＲ３抗体を第２酵素とコンジュゲーションさせる。第１酵素に対する第１基質を加えると、その反応は、第２酵素に対する第２基質を産生する。これにより、別の分子と反応して色素などの検出可能な化合物の産生がもたらされる。別の化学物質が存在すると、第２基質が分解し、その結果、第１および第２酵素が、よって二つの抗体が近接していない限り、第２酵素との反応は阻止される。特定の態様では、グルコースオキシダーゼとコンジュゲーションしたＨＥＲ２抗体、およびホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲーションしたＨＥＲ３抗体またはＨＥＲ１抗体と、腫瘍細胞または細胞溶解物を接触させる。ＤＡＢおよびカタラーゼなどの色素前駆体と共にグルコースを反応物に加える。ＤＡＢについて染色したときの展色によって、二量体の存在を決定する。
【０２０７】
例えば、２００１年１２月６日に公表された、両方共にその全体が参照により特に組み入れられる米国特許出願２００１／００４９１０５に記載されているようなｅＴａｇ（商標）アッセイシステム（Aclara Bio Sciences, MountainView, CA）に基づく方法を用いても、二量体を検出することができる。ｅＴａｇ（商標）または「電気泳動タグ」は、蛍光基などの検出可能なレポーター部分を含む。それは、独特の電気泳動移動度を有する部分から本質的になる「移動度改変物質」も含みうる。これらの部分は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）などの所定の電気泳動条件で複合体混合物からｅＴａｇ（商標）の分離および検出を可能にする。レポーター部分と、場合により移動度改変物質とを含有するｅＴａｇ（商標）の一部を、開裂可能な連結基によって第１ターゲット結合部分に連結させて、第１結合化合物を産生する。この第１ターゲット結合部分は、核酸またはタンパク質などの特定の第１ターゲットを特異的に認識する。第１ターゲット結合部分は、いかなる方法にも限定されず、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドでありうる。好ましくは、第１ターゲット結合部分は、抗体または抗体フラグメントである。または、第１ターゲット結合部分は、レセプターＨＥＲのリガンドまたはその結合構成要素フラグメントでありうる。
【０２０８】
連結基は、酵素基質などの開裂可能な部分、または所定の条件で開裂できる任意の化学結合を好ましくは含む。第一ターゲット結合部分がそのターゲットに結合した場合、開裂剤が導入および／または活性化され、連結基が開裂し、それによってレポーター部分および移動度改変物質を含有するｅＴａｇ（商標）の一部が放出される。このように、「遊離の」ｅＴａｇ（商標）の存在は、ターゲットに対するターゲット結合部分の結合を示す。
【０２０９】
好ましくは、第２結合化合物は、開裂剤と、第２ターゲットを特異的に認識する第２ターゲット結合部分とを含む。第２ターゲット結合部分も、どのようにも限定されるわけではなく、例えば抗体もしくは抗体フラグメントまたはレセプターＨＥＲのリガンドまたは結合構成要素のリガンドフラグメントでありうる。第１結合化合物および第２結合化合物が近接しているならば、開裂剤は、第１結合化合物の連結基のみを開裂させるであろう開裂剤である。
【０２１０】
本発明の態様では、第１結合化合物は、ＨＥＲ２に対する抗体が第１ターゲット結合部分として働くｅＴａｇ（商標）を含む。第２結合化合物は、ｅＴａｇ（商標）の連結基を開裂できる開裂剤と繋がった、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３に対する抗体を含む。好ましくは、開裂剤は、連結基を開裂できるには活性化していなければならない。ＨＥＲ２に結合するｅＴａｇ（商標）、および細胞表面のＥＧＦＲまたはＨＥＲ３に結合する改変ＥＧＦＲ抗体またはＨＥＲ３抗体と、腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解物を接触させる。未結合の結合化合物を好ましくは取り除き、開裂剤を必要に応じて活性化させる。ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体が存在するならば、開裂剤は連結基を開裂して、開裂剤が連結基と近接していることが原因でｅＴａｇ（商標）を放出するであろう。次に、キャピラリー電気泳動などの、当技術分野で公知の任意の方法によって、遊離のｅＴａｇ（商標）を検出できる。
【０２１１】
一態様では、開裂剤は、連結基に作用する活性化可能な化学種である。例えば、開裂剤は、試料を露光することにより活性化することができる。
【０２１２】
別の態様では、第１ターゲット結合部分としてＥＧＦＲまたはＨＥＲ３に対する抗体を用いてｅＴａｇ（商標）を構築して、第２結合化合物をＨＥＲ２に対する抗体から構築する。
【０２１３】
なお別の態様では、二量体におけるいずれかのレセプターＨＥＲに対する結合に比較して、その二量体に特異的または優先的に結合する抗体または他の試薬を使用して、ＨＥＲ二量体を検出する。
【０２１４】
（ｉｉ）  ＨＥＲ２リン酸化
前項で論じたように、ＥＧＦＲ抗体、ＨＥＲ２抗体、またはＨＥＲ３抗体との免疫沈降の後に、場合により免疫ブロットの代替または補足として、二量体の機能的アッセイを行う。一態様では、ＨＥＲ３抗体を用いた免疫沈降に続いて、免疫沈殿剤でのレセプターチロシンキナーゼ活性についてのアッセイを行う。ＨＥＲ３は内因性チロシンキナーゼ活性を有さないことから、免疫沈殿剤中のチロシンキナーゼ活性の存在は、ＨＥＲ３がＨＥＲ２と最も会合していそうなことを示す。Graus-Porta et al., EMBO J., 16:1647-55 (1997); Klapper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:4995-5000 (1999)。ＨＥＲ２抗体を用いた免疫ブロットにより本結果を確認できる。別の態様では、ＨＥＲ２抗体を用いた免疫沈降に続いて、ＥＧＦＲのレセプターチロシンキナーゼ活性についてのアッセイを行う。本アッセイでは、免疫沈殿剤を放射性ＡＴＰ、およびＥＧＦＲによるＨＥＲ２のリン酸基転移のｉｎ  ｖｉｖｏ部位を模倣するペプチド基質と接触させる。ペプチドのリン酸化は、共免疫沈降と、よってＥＧＦＲとＨＥＲ２との二量体化を示す。レセプターチロシンキナーゼ活性アッセイは、当技術分野で周知であり、それには、例えばホスホチロシン抗体によるターゲット基質のリン酸化と、ＭＡＰＫ経路などのコグネイトシグナル伝達経路の活性化とを検出するアッセイが含まれる。
【０２１５】
レセプターＨＥＲのリン酸化を、レセプターＨＥＲ２（ＨＥＲ２）などの一つまたは複数のレセプターＨＥＲの免疫沈降およびウエスタンブロット分析によって評価できる。例えば、免疫沈降したレセプターＨＥＲ中のリン酸化したチロシン残基を検出するために抗ホスホチロシン抗体を用いて、ゲル上のホスホ−ＨＥＲ２バンドの存在によって陽性を決定する。抗ホスホチロシン抗体は、Invitrogen, Chemicon International Inc.（Temecula, CA）の子会社であるPan Vera（Madison, WI）、またはUpstate Biotechnology（Lake Placid, NY）から市販されている。バンドの不在により陰性を決定する。
【０２１６】
別の態様では、レセプターＨＥＲ２(ＨＥＲ２)のリン酸化を、ホスホ特異的ＨＥＲ２抗体（クローンＰＮ２Ａ;Thor et al., J. Clin. Oncol., 18(18):3230-3239 (2000)）を用いた免疫組織化学検査により評定する。
【０２１７】
レセプターＨＥＲのリン酸化を検出するための他の方法には、ＫＩＲＡ  ＥＬＩＳＡ  （米国特許第５，７６６，８６３号；第５，８９１，６５０号；第５，９１４，２３７号；第６，０２５，１４５号；および第６，２８７，７８４号）、質量分析（リン酸化ＨＥＲ２と非リン酸化ＨＥＲ２とのサイズを比較）、およびＨＥＲ（例えばＨＥＲ２）抗体とホスホ特異的またはホスホチロシン特異的抗体との両方を用いたｅ−ｔａｇ近接アッセイ（例えばAclara BioSciences（Mountain View, CA）から入手できるeTag（商標）アッセイキットを使用）がある。ｅＴａｇアッセイの詳細を本明細書に上記する。
【０２１８】
細胞アレイにホスホ特異的抗体を使用して、細胞試料中のシグナル伝達タンパク質のリン酸化状態を検出することもできる（ＵＳ２００３／０１９０６８９）。
【０２１９】
（ｉｉｉ）  ＨＥＲ２リガンド
腫瘍中または腫瘍と関連したＴＧＦ−αなどのＨＥＲリガンドのレベルを、公知の手順により決定することができる。そのようなアッセイは、検査する試料中のタンパク質および／またはそれをコードする核酸を検出することができる。一態様では、免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて、腫瘍中のＨＥＲリガンドのレベルを決定できる；例えば、Scher et al., Clin. Cancer Research 1:545-550 (1995)を参照されたい。または、もしくは追加的に、検査する試料中の、ＨＥＲリガンドをコードする核酸のレベルを、例えばＦＩＳＨ、サザンブロット、またはＰＣＲ技法により評価することができる。
【０２２０】
（ｉｖ）  ＨＥＲ２を過剰発現していないガン
レセプターＨＥＲ２の過剰発現によってガンを特徴づけることができるが、本出願は、ＨＥＲ２過剰発現性ではないとみなされるガンを処置するための方法をさらに提供する。  
【０２２１】
ガンにおけるＨＥＲ２発現を決定するために、様々な診断／予後アッセイを利用できる。一態様では、ＨＥＲ２の過剰発現を、例えばＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標）（Dako）を使用した、ＩＨＣにより分析できる。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイに供して、以下の通りＨＥＲ２タンパク質染色強度基準に適合させることができる：
スコア０    染色が観察されないか、または腫瘍細胞の１０%未満に膜染色が観察される。
スコア１＋  腫瘍細胞の１０%超にかすか／わずかに認知できる膜染色が検出される。これらの細胞の膜の一部だけが染色される。
スコア２＋  腫瘍細胞の１０%超に膜全体の弱から中度の染色が観察される。
スコア３＋  腫瘍細胞の１０%超に膜全体の中から強度の染色が観察される。
【０２２２】
ＨＥＲ２の過剰発現評定についてスコア０または１＋を有する腫瘍を、ＨＥＲ２を過剰発現していないと特徴づけることができ、一方、スコア２＋または３＋を有する腫瘍を、ＨＥＲ２を過剰発現していると特徴づけることができる。
【０２２３】
ＨＥＲ２を過剰発現している腫瘍を、細胞１個あたりに発現したＨＥＲ２分子のコピー数に対応する免疫組織化学スコアによって採点することができ、生化学的に決定することができる：
０＝０〜１００００コピー／細胞、
１＋＝少なくとも約２０００００コピー／細胞、
２＋＝少なくとも約５０００００コピー／細胞、
３＋＝少なくとも約２００００００コピー／細胞。
【０２２４】
チロシンキナーゼのリガンド非依存性活性化をもたらす３＋レベルでのＨＥＲ２の過剰発現（Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7159-7163 (1987)）は、乳ガンの約３０%で起こり、これらの患者では、無再発生存率および全生存率が減少している（Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989);Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987)）。
【０２２５】
または、もしくは追加的に、ＩＮＦＯＲＭ（商標）（Ventana, Arizonaが販売）またはＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（商標）（Vysis, Illinois）などのＦＩＳＨアッセイを、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織に対して行って、（もしあれば）腫瘍におけるＨＥＲ２の過剰発現の程度を決定することができる。
【０２２６】
一態様では、ガンはＥＧＦＲを発現する（かつ過剰発現しうる）ガンであろうし、当該発現を、上に言及したようなＨＥＲ２の発現を評価するための方法に関して評価することができる。
【０２２７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ診断アッセイを用いて、例えば検出すべき分子と結合し、検出可能なラベル（例えば放射性同位体）でタグを付けた（抗体などの）分子を投与して、そのラベルの局在について患者を外部からスキャンすることによって、レセプターＨＥＲまたはＨＥＲリガンドの過剰発現または増幅を評価することもできる。
【０２２８】
Ｖ．  ＨＥＲ２抗体を用いた処置
本発明によると、ＨＥＲ２抗体を使用してプラチナ耐性ガンなどの化学療法耐性ガンまたはプラチナ耐性ガンを処置できることが考えられている。そのガンは、本明細書におけるＨＥＲ２抗体がガン細胞に結合できるように、ＨＥＲ２発現細胞を一般に含む。
【０２２９】
患者は、ＨＥＲ２抗体、好ましくはパーツズマブと、代謝拮抗化学療法剤、好ましくはゲムシタビンとの組み合わせで処置される。組み合わせ投与には、別々の製剤または単一の薬学的製剤を使用した同時投与または併行投与、およびいずれかの順序の連続投与があり、ここで、好ましくは両方の（または全ての）活性薬剤が生物学的活性を同時に発揮する期間が存在する。このように、代謝拮抗化学療法剤を、ＨＥＲ２抗体の投与前または投与後に投与することができる。本態様では、代謝拮抗化学療法剤の少なくとも１回の投与と、ＨＥＲ２抗体の少なくとも１回の投与との間のタイミングは、好ましくは約１か月以下であり、最も好ましくは約２週間以下である。または、代謝拮抗化学療法剤およびＨＥＲ２抗体を単一の製剤または別々の製剤として患者に同時投与する。
【０２３０】
組み合わせを用いた処置は、ガンの徴候または症状の改善を招くであろう。例えば、当該治療は、代謝拮抗化学療法剤のみで処置された患者に比較して、生存率の改善（全生存率および／もしくは進行のない生存率）を招くことができ、かつ／または臨床的（部分もしくは完全）反応を招くことができる。さらに、代謝拮抗化学療法剤（例えばゲムシタビン）とＨＥＲ２抗体（例えばパーツズマブ）との組み合わせを用いた処置により、患者に対して相乗的な治療上の利益、または相加的よりも大きい治療上の利益が生じうる。
【０２３１】
好ましくは、投与されるＨＥＲ２抗体はネイキッドな抗体である。しかし、投与されるＨＥＲ２抗体を、細胞毒性薬とコンジュゲーションすることができる。好ましくは、その細胞毒性薬が結合している免疫コンジュゲートおよび／またはＨＥＲ２タンパク質は、細胞によってインターナリゼーションされ、それが結合するガン細胞の殺滅において免疫コンジュゲートの増加した治療有効性を招く。好ましい態様では、細胞毒性薬はガン細胞中の核酸をターゲティングまたは妨害する。当該細胞毒性薬の例には、メイタンシノイド、カリチェアミシン、リボヌクレアーゼ、およびＤＮＡエンドヌクレアーゼがある。
【０２３２】
ＨＥＲ２抗体（またはＨＥＲ２抗体の免疫コンジュゲート）および代謝拮抗化学療法剤を、例えばボーラスとしての、もしくはある時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、滑膜内、鞘内、経口、局所、または吸入経路などの公知の方法により、ヒト患者に投与する。ＨＥＲ２抗体および代謝拮抗化学療法剤を同じ投与経路によって投与してもよいが、そうしなくてもよい。抗体および代謝拮抗化学療法剤の両方の静脈内投与が好ましい。
【０２３３】
疾患の予防または処置のための、ＨＥＲ２抗体の適切な投薬量は、上に定義したような処置される疾患の種類、疾患の重症度および経過、予防または治療目的のためにＨＥＲ２抗体が投与されるかどうか、以前の治療、患者の臨床歴およびＨＥＲ２抗体に対する反応、ならびに担当の医師の判断力に依存するであろう。ＨＥＲ２抗体は一度にまたは一連の処置にわたり患者に適切に投与される。疾患の種類および重症度に応じて、約１μg/kgから５０mg/kg（例えば０．１〜２０mg/kg）のＨＥＲ２抗体は、患者に対する投与の候補となる初期投薬量であり、それは例えば一つもしくは複数の個別の投与、または連続注入のいずれかによる。一態様では、ＨＥＲ２抗体についての初回注入時間は、その後の注入時間よりも長いことがあり、例えば初回注入について約９０分間であり、（初回注入が耐容性良好であるならば）その後の注入について約３０分間である。ＨＥＲ２抗体の好ましい投薬量は、約０．０５mg/kgから約１０mg/kgの範囲内であろう。このように、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg、または１０mg/kgの一つまたは複数の用量（またはその任意の組み合わせ）を患者に投与することができる。（患者がＨＥＲ２抗体の約２から約２０回、例えば約６回の投与を受けるように）間欠的、例えば毎週または３週間毎に当該用量を投与することができる。初回の高いローディング用量の後で、１回または複数回の低用量を投与することができる。一態様では、ＨＥＲ２抗体を約８４０mgのローディング用量として投与し、その後約４２０mgを約３週間毎に投与する。別の態様では、約３週間毎に投与される約１０５０mgの用量として、ＨＥＲ２抗体を投与する。
【０２３４】
代謝拮抗化学療法剤は、それについて公知の投薬量で通常投与されるか、または代謝拮抗化学療法剤の投与に原因があるとされる薬物の組み合わせ作用または負の副作用が原因で場合により減量される。当該化学療法剤のための製剤および／または投薬スケジュールを製造業者の説明書により、または当業者により経験的に決定されたように使用することができる。当該化学療法についての製剤および投薬スケジュールは、Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。代謝拮抗化学療法剤がゲムシタビンである場合、好ましくは、ゲムシタビンは約６００mg/m2から１２５０mg/m2の間（例えば約１０００mg/m2）の用量で、例えば３週間サイクルの１日目および８日目に投与される。
【０２３５】
ＨＥＲ２抗体および代謝拮抗化学療法剤の他に、他の治療方式をそれに組み合わせることができる。例えば、第２(第３、第４など)の化学療法剤(類)を投与することができ、ここで、第２化学療法剤は別の異なる代謝拮抗化学療法剤、または代謝拮抗物質ではない化学療法剤のいずれかである。例えば、第２化学療法剤は、(パクリタキセルまたはドセタキセルなどの)タキサン、カペシタビン、またはプラチナ系化学療法剤（カルボプラチン、シスプラチン、またはオキサリプラチンなど）、アントラサイクリン（リポソームドキソルビシンを含めたドキソルビシンなど）、トポテカン、ペメトレキセド、ビンカアルカロイド（ビノレルビンなど）、およびＴＬＫ２８６でありうる。異なる化学療法剤の「カクテル」を投与することができる。
【０２３６】
ＨＥＲ２抗体と組み合わせることができる他の治療剤および代謝拮抗化学療法剤には：第２の異なるＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブなどの成長阻害性ＨＥＲ２抗体、またはＨＥＲ２過剰発現細胞のアポトーシスを誘導する、７Ｃ２、７Ｆ３、もしくはそのヒト化改変体などのＨＥＲ２抗体）；ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４などの別の腫瘍関連抗原に対する第２抗体；抗ホルモン化合物、例えばタモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物、またはアロマターゼ阻害剤；（治療に関連する任意の心筋機能不全を阻止または低減するための）心臓保護剤；サイトカイン；ＥＧＦＲターゲット薬（TARCEVA（登録商標）、IRESSA（登録商標）、またはセツキシマブなど）；抗血管形成剤(特にAVASTIN（商標）の商標でGenentechによって販売されているベバシズマブ)；チロシンキナーゼ阻害剤；ＣＯＸ阻害剤（例えばＣＯＸ−１阻害剤またはＣＯＸ−２阻害剤）；非ステロイド系抗炎症薬であるセレコキシブ（CELEBREX（登録商標））；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、Johnson and Johnsonから入手できるチピファルニブ（Tipifarnib）／ZARNESTRA（登録商標）Ｒ１１５７７７、またはSchering-Ploughから入手できるロナファルニブ（Lonafarnib）ＳＣＨ６６３３６）；オレゴボマブ（Oregovomab）（ＭｏＡｂ  Ｂ４３．１３）などの、ガン胎児タンパク質ＣＡ１２５と結合する抗体；ＨＥＲ２ワクチン（PharmexiaからのＨＥＲ２ AutoVacワクチン、またはDendreonからのＡＰＣ８０２４タンパク質ワクチン、またはGSK/CorixaからのＨＥＲ２ペプチドワクチン）；別のＨＥＲターゲティング療法（例えば、トラスツズマブ、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ＣＩ１０３３、ＧＷ２０１６など）；Ｒａｆおよび／またはｒａｓ阻害剤（例えばＷＯ２００３／８６４６７参照）；ドキシル；トペテカン（Topetecan）；タキサン；ＧＷ５７２０１６；ＴＬＫ２８６；ＥＭＤ−７２００；セロトニン拮抗薬、ステロイド、またはベンゾジアゼピンなどの、悪心を処置する薬；皮疹を予防もしくは処置する薬、または局所もしくは経口抗生物質を含めた標準的なざ瘡治療法、アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、またはメペリジンなどの解熱薬；造血成長因子などのうち任意の一つまたは複数が含まれる。
【０２３７】
上記で同時投与された任意薬剤についての適切な投薬量は、現在使用されている投薬量であり、その薬剤およびＨＥＲ２抗体の組み合わせ作用（相乗作用）により減らすことができる。
【０２３８】
上記治療方式以外に、ガン細胞の外科的除去および／または放射線療法に患者を供することができる。
【０２３９】
患者への抗体タンパク質の投与は別として、本出願は遺伝子療法による抗体の投与を考えている。抗体をコードする核酸の当該投与は、「抗体を投与する」という表現に包含される。例えば、１９９６年３月１４日に公表された、細胞内抗体を発生させるための遺伝子療法の使用に関するＷＯ９６／０７３２１を参照されたい。
【０２４０】
（場合によりベクターに含まれる）核酸を患者の細胞内にｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏで至らせるために、二つの主なアプローチがある。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために、患者に直接、通常はその抗体が必要とされる部位に核酸を注射する。ｅｘ  ｖｉｖｏ処置のために、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入して、改変された細胞を患者に直接投与するか、または例えば多孔性膜内に封入して、その多孔性膜を細胞を患者に植込む（例えば米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号参照）。生存可能な細胞に核酸を導入するために利用できる多様な技法がある。これらの技法は、核酸が培養細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または意図された宿主の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで導入されるかどうかに応じて変動する。哺乳動物細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸を導入するのに適した技法には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などがある。遺伝子のｅｘ  ｖｉｖｏ送達用に通例使用されているベクターはレトロウイルスである。
【０２４１】
現在好ましいｉｎ  ｖｉｖｏ核酸導入技法には、（アデノウイルス、Herpes simplex Iウイルス、またはアデノ随伴ウイルスなどの）ウイルスベクターおよび脂質に基づく系のトランスフェクションがある（遺伝子の脂質介在性導入に有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−Ｃｈｏｌである）。ある状況では、核酸源に、細胞表面膜タンパク質またはターゲット細胞に特異的な抗体、ターゲット細胞上のレセプターに対するリガンドなどのような、ターゲット細胞をターゲティングする薬剤を提供することが理想的である。リポソームが採用された場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞種類に親和性のキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、サイクリングにおいてインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、および細胞内局在をターゲティングして細胞内半減期を増大するタンパク質を、ターゲティングに、および／または取込みを促進するために使用することができる。レセプター介在性エンドサイトーシスの技法は、例えば、Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987);およびWagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)に記載されている。現在公知の遺伝子マーカー作成および遺伝子治療プロトコールの総説については、Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)を参照されたい。ＷＯ９３／２５６７３および本明細書に引用した参考文献も参照されたい。
【０２４２】
ＶＩ．  材料の寄託
以下のハイブリドーマ細胞系は、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC)に寄託された:
抗体の名称    ＡＴＣＣ番号                  寄託日
７Ｃ２        ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２２１５    １９９６年１０月１７日
７Ｆ３        ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２２１６    １９９６年１０月１７日
４Ｄ５        ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３  １９９０年  ５月２４日
２Ｃ４        ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２６９７    １９９９年  ４月  ８日
【０２４３】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な実施例によって例示される。明細書における全ての引用の開示は、参照により特に本明細書に組み入れられる。
【０２４４】
実施例１
モノクローナル抗体２Ｃ４の産生および特徴づけ
ＨＥＲ２の細胞外ドメインと特異的に結合するマウスモノクローナル抗体２Ｃ４、７Ｆ３、および４Ｄ５を、Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558 (1990)に記載されているように産生させた。簡潔には、Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 84:7159-7163 (1987)に記載されているように産生させたＮＩＨ３Ｔ３／ＨＥＲ２−３４００細胞（約１×１０５個のＨＥＲ２分子／細胞を発現している）を、２５mM ＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で収集して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫処置するために使用した。０、２、５、および７週目にＰＢＳ０．５mlに入れた細胞１０７個のｉ．ｐ．注射をマウスに行った。３２ＰラベルＨＥＲ２を免疫沈降する抗血清を有するマウスに、コムギ胚芽アグルチニン−セファロース（ＷＧＡ）で精製したＨＥＲ２膜抽出物のｉ．ｐ．注射を９週目および１３週目に行った。この後に、ＨＥＲ２調製物０．１mlのｉ．ｖ．注射を行って、脾臓細胞をマウス骨髄腫系Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合させた。
【０２４５】
ＥＬＩＳＡおよび放射性免疫沈降によって、ＨＥＲ２の結合についてハイブリドーマ上清をスクリーニングした。
【０２４６】
モノクローナル抗体４Ｄ５、７Ｆ３、および２Ｃ４によって結合されるＨＥＲ２エピトープを、競合結合分析により決定した（Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558 (1990)）。蛍光を定量するためにＰＡＮＤＥＸ（商標）スクリーン機を使用したインタクトな細胞に関する直接蛍光によって、抗体に関する交差遮断研究を行った。確立した手順を用いて、各モノクローナル抗体にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）をコンジュゲーションさせた（Wofsy et al., Selected Methods in Cellular Immunology, p.287, Mishel and Schiigi (eds.) San Francisco: W.J. Freeman Co. (1980)）。ＮＩＨ３Ｔ３／ＨＥＲ２−３４００細胞の集密な単層をトリプシン処理して、１回洗浄して、０．５%ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１%ＮａＮ３を含有する冷ＰＢＳに１．７５×１０６細胞/mlとなるように再懸濁した。最終濃度１%のラテックス粒子（IDC, Portland, OR）を添加して、 ＰＡＮＤＥＸ（商標）プレート膜の詰まりを低減させた。懸濁状態の細胞２０μlおよび精製モノクローナル抗体（１００μg/mlから０．１μg/ml）２０μlをＰＡＮＤＥＸ（商標）プレートのウェルに加えて、３０分間氷冷しながらインキュベーションした。２０μlに予定した希釈を行ったＦＩＴＣラベルモノクローナル抗体を各ウェルに加え、３０分間インキュベーションして、洗浄し、蛍光をＰＡＮＤＥＸ（商標）によって定量した。モノクローナル抗体は、無関係のモノクローナル抗体対照に比較して、それぞれのモノクローナル抗体がもう一方の結合を５０%以上遮断したならば、エピトープを共有するとみなされた。この実験では、モノクローナル抗体４Ｄ５、７Ｆ３、および２Ｃ４は、それぞれ、エピトープＩ、Ｇ／Ｆ、およびＦを割り当てられた。
【０２４７】
モノクローナル抗体２Ｃ４、７Ｆ３、および４Ｄ５の成長阻害特性を、乳房腫瘍細胞系ＳＫ−ＢＲ−３を用いて評価した（Hudziak et al., Molec. Cell. Biol. 9(3):1165-1172 (1989)参照）。簡潔には、０．２５%（ｖｏｌ／ｖｏｌ）トリプシンを使用することによってＳＫ−ＢＲ−３細胞を剥離させ、４×１０５細胞/mlの密度で完全培地に懸濁した。一定分量100μl（４×１０４細胞）を９６ウェル微量希釈プレートにプレーティングして、細胞を接着させ、次に、培地単独またはモノクローナル抗体を含有する培地（最終濃度５μg/ml）１００μlを加えた。７２時間後にプレートをＰＢＳ（ｐＨ７．５）で２回洗浄し、クリスタルバイオレット（０．５%メタノール溶液）で染色して、Sugarman et al., Science 230:943-945 (1985)に記載されているように相対細胞増殖について分析した。モノクローナル抗体４Ｄ５で実現された約５６%の阻害に比較して、モノクローナル抗体２Ｃ４および７Ｆ３は、それぞれ約２０%および約３８%だけＳＫ−ＢＲ−３の相対細胞増殖を阻害した。
【０２４８】
ＭＣＦ７細胞の全細胞溶解物からのＭｒ１８００００範囲のタンパク質のＨＲＧ刺激性チロシンリン酸化を阻害する能力について、モノクローナル抗体２Ｃ４、４Ｄ５、および７Ｆ３を評価した（Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996)）。ＭＣＦ７細胞は全ての公知のレセプターＨＥＲを発現するが、それは比較的低レベルであると報告されている。ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４はほぼ同一の分子サイズを有することから、全細胞溶解物をウエスタンブロット分析によって評価する場合、どのタンパク質がチロシンリン酸化されつつあるかを識別するのは不可能である。
【０２４９】
しかし、外因性に添加したＨＲＧの不在下では、これらの細胞は、使用したアッセイ条件で、Ｍｒ１８００００範囲で低レベルから検出不能レベルのチロシンリン酸化タンパク質を示すことから、これらの細胞はＨＲＧチロシンリン酸化アッセイに理想的である。
【０２５０】
ＭＣＦ７細胞を２４ウェルプレートにプレーティングして、ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体を各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベーションした。次に、各ウェルに最終濃度０．２nMまでｒＨＲＧβ１１７７−２４４を添加して、インキュベーションを８分間続けた。各ウェルから培地を慎重に吸引し、ＳＤＳ試料バッファー（５%ＳＤＳ、２５mM ＤＴＴ、および２５mMトリスＨＣｌ、ｐＨ６．８）１００μlの添加によって反応を停止させた。各試料（２５μl）を、４〜１２%勾配のゲル（Novex）で電気泳動させ、次にポリビニリデンジフルオリド膜に電気泳動的に移行させた。抗ホスホチロシン（４Ｇ１０、ＵＢＩ由来、１μg/mlで使用）免疫ブロットを展色させ、Ｍｒ〜１８００００の顕著な反応性バンドの強度を、以前に記載されたように反射率デンシトメトリーにより定量した（Holmes et al., Science 256:1205-1210 (1992); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269:14661-14665 (1994)）。
【０２５１】
モノクローナル抗体２Ｃ４、７Ｆ３、および４Ｄ５は、Ｍｒ１８０，０００でＨＲＧに誘導されるチロシンリン酸化シグナルの発生を有意に阻害した。ＨＲＧ不在下では、これらの抗体のどれもＭｒ１８００００範囲でタンパク質のチロシンリン酸化を刺激できなかった。また、これらの抗体はＥＧＦＲ（Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558 (1990)）とも、ＨＥＲ３とも、ＨＥＲ４とも交差反応しない。抗体２Ｃ４および７Ｆ３は、ＨＲＧによるｐ１８０のチロシンリン酸化刺激を対照の＜２５%まで有意に阻害した。モノクローナル抗体４Ｄ５は、ＨＲＧによるチロシンリン酸化刺激を〜５０%遮断できた。図２Ａは、反射率デンシトメトリーにより決定されたような、ＨＲＧによるｐ１８０のチロシンリン酸化刺激を２Ｃ４または７Ｆ３が阻害することについての用量反応曲線を示す。４変数適応を用いたこれらの阻害曲線の評価により、２Ｃ４および７Ｆ３についてそれぞれ２．８±０．７nMおよび２９．０±４．１nMのＩＣ５０が生じた。
【０２５２】
ＨＥＲ２抗体による、ＭＣＦ７乳房腫瘍細胞系に対するＨＥＧの結合阻害を、２４ウェルプレート形式で氷冷した単層培養を用いて行った（Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465 (1996)）。ＨＥＲ２モノクローナル抗体を各ウェルに加えて、３０分間インキュベーションした。１２５ＩラベルｒＨＲＧβ１１７７−２２４（２５pm）を加え、インキュベーションを４から１６時間続けた。図２Ｂは、ＭＣＦ７細胞に対するＨＲＧ結合を２Ｃ４または７Ｆ３が阻害することについての用量反応曲線を提供する。様々な濃度の２Ｃ４または７Ｆ３を、１２５ＩラベルｒＨＲＧβ１の存在下でＭＣＦ７細胞と共にインキュベーションし、阻害曲線を図２Ｂに示す。これらのデータの分析により、２Ｃ４および７Ｆ３についてそれぞれ２．４±０．３nMおよび１９．０±７．３nMのＩＣ５０が生じた。２Ｃ４および７Ｆ３について〜７４%の最大阻害は、チロシンリン酸化のデータと一致した。
【０２５３】
ＭＣＦ７細胞に及ぼすＨＥＲ２抗体の観察された効果が、一般的な現象であるかどうかを決定するために、ヒト腫瘍細胞系を２Ｃ４または７Ｆ３と共にインキュベーションして、１２５ＩラベルｒＨＲＧβ１の特異的結合の程度を決定した（Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465 (1996)）。本研究の結果を図３に示す。１２１ＩラベルｒＨＲＧβ１の結合は、ＨＥＲ２をほとんどまたは全く発現しないと報告された乳ガン細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４６８を除いた全ての細胞系で、２Ｃ４または７Ｆ３のいずれかによって有意に阻害されることができた。残りの細胞系は、ＨＥＲ２を発現すると報告され、ＨＥＲ２の発現レベルは、これらの細胞系の間で大きく変動する。実際に、試験された細胞系におけるＨＥＲ２の発現範囲は、２オーダーを超えて変動する。例えば、ＢＴ−２０、ＭＣＦ７、およびＣａｏｖ３はレセプターＨＥＲ２〜１０４個／細胞を発現するが、ＢＴ−４７４およびＳＫ−ＢＲ−３はレセプターＨＥＲ２〜１０６個／細胞を発現する。これらの細胞および上記データにおけるＨＥＲ２の広範囲の発現を考えると、ＨＥＲ２とＨＥＲ３またはＨＥＲ４との間の相互作用は、それ自体、原形質膜表面で行われる高親和性相互作用であったと結論された。
【０２５４】
外因性ｒＨＲＧβ１の存在下または不在下でのＭＤＡ−ＭＢ−１７５およびＳＫ−ＢＲ−３細胞に及ぼすモノクローナル抗体２Ｃ４および４Ｄ５の成長阻害効果を評定した（Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)）。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞におけるＨＥＲ２レベルは、正常な乳房上皮細胞にみられるレベルよりも４〜６倍高く、レセプターＨＥＲ２−ＨＥＲ４はＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞において構成的にチロシンリン酸化されている。ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞をＨＥＲ２モノクローナル抗体２Ｃ４および４Ｄ５（１０μg/mL）で４日間処理した。クリスタルバイオレット染色アッセイでは、２Ｃ４とのインキュベーションにより、本細胞系に及ぼす強力な成長阻害効果を示された（図４Ａ）。外因性ＨＲＧはこの阻害を有意には逆転しなかった。他方で、２Ｃ４は、ＨＥＲ２を過剰発現している細胞系ＳＫ−ＢＲ−３に対して阻害効果を示さなかった（図４Ｂ）。モノクローナル抗体２Ｃ４は、外因性ＨＲＧの存在下および不在下の両方でモノクローナル抗体４Ｄ５よりも大きな程度にＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の細胞増殖を阻害できた。４Ｄ５による細胞増殖の阻害は、ＨＥＲ２の発現レベルに依存する（Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993））。ＳＫ−ＢＲ−３細胞における最大６６%の阻害を検出することができた（図４Ｂ）。しかし、この効果を外因性ＨＲＧにより克服することができた。
【０２５５】
実施例２
ＨＲＧに依存するＨＥＲ３とのＨＥＲ２の会合はモノクローナル抗体２Ｃ４により遮断される
ＨＥＲ３がＨＥＲ２と会合する能力を共免疫沈降実験で試験した。ＭＣＦ７細胞またはＳＫ−ＢＲ−３細胞１．０×１０６個を６ウェル組織培養プレート中の、１０%ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）（成長培地）を含有するＤＭＥＭ／ＨａｍのＦ１２培地（５０：５０）に蒔き、一晩接着させた。実験開始前に血清を有さない成長培地中で細胞を２時間飢餓状態にした。
【０２５６】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を短時間洗浄し、次に、１０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）（結合バッファー）を有し０．２%w/vウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＲＰＭＩ培地に希釈し、１００nMのいずれかの表示した抗体と共に、または結合バッファー単独（対照）と共にインキュベーションした。室温で１時間後に、ＨＲＧを最終濃度５nMとなるように半数のウェルに加えた（＋）。同様の容積の結合バッファーを残りのウェルに加えた（−）。インキュベーションを約１０分間続けた。
【０２５７】
上清を吸引によって除き、０．２mM PMSF、１０μg/mlロイペプチン、および１０TU/ml アプロチニンを含有し、１０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１．０%v/v ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標）、１．０%w/v ＣＨＡＰＳを有するＲＰＭＩ（溶解バッファー）中で、細胞を溶解させた。溶解物を遠心分離によって溶けない物質から除いた。
【０２５８】
アフィニティーゲル（Affi-Prep 10, Bio-Rad）に共有結合したモノクローナル抗体を用いてＨＥＲ２を免疫沈降させた。この抗体（Ａｂ−３、Oncogene Sciences）は、細胞質ドメインのエピトープを認識する。固定化抗体約８．５μgを含有するゲルスラリー１０μlを各溶解物に添加することによって免疫沈降を行い、試料を室温で２時間混合させた。次に、遠心分離によってゲルを収集した。溶解バッファーで３回バッチ的にゲルを洗浄して未結合の材料を除いた。次にＳＤＳ試料バッファーを添加して、試料を沸騰水浴中で短時間加熱した。
【０２５９】
４〜１２%ポリアクリルアミドゲルで上清を泳動させ、ニトロセルロース膜に電気ブロッティングした。ＨＥＲ３の細胞質ドメインエピトープに対するポリクローナル抗体（ｃ−１７、Santa Cruz Biotech）でブロットを探査することによって、ＨＥＲ３の存在を評定した。化学ルミネセンス基質（ＥＣＬ、Amersham）を用いて、ブロットを可視化した。
【０２６０】
ＭＣＦ７およびＳＫ−ＢＲ−３細胞について、それぞれ図５Ａおよび５Ｂの対照レーンに示すように、細胞をＨＲＧで刺激した場合にのみ、ＨＥＲ２免疫沈降物中にＨＥＲ３が存在した。モノクローナル抗体２Ｃ４で細胞を最初にインキュベーションした場合は、ＭＣＦ７細胞ではＨＥＲ３シグナルは打ち消され（図５Ａ、レーン２Ｃ４＋）、またＳＫ−ＢＲ−３細胞では実質的に低減した（図５Ｂ、レーン２Ｃ４＋）。図５Ａ〜Ｂに示すように、モノクローナル抗体２Ｃ４は、トラスツズマブよりも実質的に効果的にＭＣＦ７細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞の両方で、ＨＥＲ３とＨＥＲ２とのヘレグリン依存性会合を遮断する。トラスツズマブとの予備インキュベーションは、ＭＣＦ７溶解物中のＨＥＲ３シグナルを減少させたが、ＳＫ−ＢＲ−３溶解物から共沈したＨＥＲ３の量にほとんどまたは全く効果を有さなかった。ＥＧＦレセプターに対する抗体（Ａｂ−１、Oncogene Sciences）を用いた予備インキュベーションは、どちらの細胞系でもＨＥＲ３がＨＥＲ２と免疫共沈する能力に効果を有さなかった。
【０２６１】
実施例３
ヒト化２Ｃ４抗体
マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の可変ドメインを、マウス／ヒトキメラＦａｂフラグメントの産生を可能にするベクターに最初にクローニングした。StratageneのＲＮＡ抽出キットを用いて製造業者のプロトコールに従って、ハイブリドーマ細胞から総ＲＮＡを単離した。可変ドメインをＲＴ−ＰＣＲで増幅して、ゲル精製し、以前に記載されたようなヒトカッパ定常ドメインおよびヒトＣＨ１ドメインを含有するｐＵＣ１１９系プラスミド誘導体に挿入した（Carter et al., PNAS(USA) 89:4285 (1992)；および米国特許第５，８２１，３３７号）。結果として得られたプラスミドを、Ｆａｂフラグメントの発現のためにE. coli １６Ｃ９株にトランスフォーメーションした。培養物の成長、タンパク質発現の誘導、およびＦａｂフラグメントの精製は以前に記載されたとおりであった（Werther et al., J. Immunol. 157:4986-4995 (1996); Presta et al., Cancer Research 57:4593-4599 (1997））。
【０２６２】
キメラ２Ｃ４の精製ＦａｂフラグメントがＭＣＦ７細胞に対する１２５Ｉ−ＨＲＧの結合を阻害して、ＭＣＦ７細胞におけるｐ１８０チロシンリン酸化のｒＨＲＧによる活性化を阻害する能力に関して、マウス親抗体２Ｃ４と比較した。図６Ａに示すように、キメラ２Ｃ４のＦａｂフラグメントは、ヒト乳ガン細胞系ＭＣＦ７上の高親和性ＨＥＲ２−ＨＥＲ３結合部位の形成を破壊するのに非常に有効である。インタクトなマウス２Ｃ４について計算した相対ＩＣ５０値は４．０±０．４nMであり、一方でFabフラグメントについての値は７．７±１．１nMである。図６Ｂに例示されるように、キメラ２Ｃ４の一価ＦａｂフラグメントはＨＲＧ依存性のＨＥＲ２−ＨＥＲ３活性化を破壊するのに非常に有効である。インタクトなマウスモノクローナル抗体２Ｃ４について計算されたＩＣ５０値は６．０±２nMであり、一方でそのＦａｂフラグメントについての値は１５．０±２nMである。
【０２６３】
キメラクローンのＤＮＡ配列決定により、ＣＤＲ残基の同定が可能になった（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)）（図７ＡおよびＢ）。オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発を使用して、以前に記載されたようなプラスミドＶＸ４に含まれる完全ヒトフレームワーク（ＶＬカッパ亜群ＩおよびＶＨ亜群ＩＩＩ）にこれらのＣＤＲ部の６個全てを導入した（Presta et al., Cancer Research 57:4593-4599 (1997)）。結果として生じた「ＣＤＲ−スワップ」由来タンパク質を上記のように発現させて精製した。二つのバージョンを比較するために結合研究を行った。簡潔には、ＮＵＮＣ  ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）プレートに、５０mM炭酸バッファー（ｐＨ９．６）中の１マイクログラム/mlのＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ；ＷＯ９０／１４３５７に記載されているように産生）を４℃で一晩被覆し、次に、室温で１時間ＥＬＩＳＡ希釈液（０．５%ＢＳＡ、０．０５%ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ）でブロッキングした。ＥＬＩＳＡ希釈液に試料を連続希釈したものをプレート上で２時間インキュベーションした。洗浄後、結合したＦａｂフラグメントをビオチン化マウス抗ヒトカッパ抗体（ＩＣＮ６３４７７１）の後でストレプトアビジンとコンジュゲーションしたホースラディッシュペルオキシダーゼ（Sigma）を用いて、基質として３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD）を使用して検出した。吸光度を４５０nmで読み取った。図８Ａに示すように、ＣＤＲ−スワップヒトＦａｂフラグメントが構築すると、全ての結合が失われた。
【０２６４】
ヒト化Ｆａｂの結合を回復させるために、テンプレートとしてＣＤＲ−スワップ由来ＤＮＡを使用して突然変異体を構築した。コンピュータ処理モデルを用いて（図９）、変更がＣＤＲコンフォメーションまたは抗体−抗原界面に影響しうる位置で、ヒトフレームワーク部残基をマウス対応物に変更するように、これらの突然変異体を設計した。突然変異体を表２に示す。
【０２６５】
【表２】
2015157831.tif 000003
【０２６６】
様々な突然変異体についての結合曲線を図８Ａ〜Ｃに示す。ＡｒｇＨ７１Ｖａｌ、ＡｓｐＨ７３Ａｒｇ、およびＩｌｅＨ６９Ｌｅｕの変更を有するヒト化Ｆａｂバージョン５７４は、本来のキメラ２Ｃ４のＦａｂフラグメントの結合まで回復した結合を有すると思われる。ヒト化抗体の結合をさらに洗練または増強するために、Ｌ２、Ｌ５４、Ｌ５５、Ｌ５６、Ｈ３５、および／またはＨ４８などの追加のＦＲおよび／またはＣＤＲ残基を改変することができる（例えば、ＩｌｅＬ２Ｔｈｒ；ＡｒｇＬ５４Ｌｅｕ；ＴｙｒＬ５５Ｇｌｕ；ＴｈｒＬ５６Ｓｅｒ；ＡｓｐＨ３５Ｓｅｒ；およびＶａｌＨ４８Ｉｌｅのように置換）。または、もしくは追加的に、ヒト化抗体の親和性および／またはその他の生物学的活性をさらに改善または洗練するために、そのヒト化抗体を親和性成熟（上記参照）させることができる。
【０２６７】
ファージ−ディスプレイ法を用いてヒト化２Ｃ４バージョン５７４を親和性成熟させた。簡潔には、ｇｅｎｅＩＩＩ融合体としてファージディスプレイベクターにヒト化２Ｃ４．５７４Ｆａｂをクローニングした。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを感染させることによってファージ粒子を誘導する場合、この融合は、Ｆａｂがファージ尾部繊維タンパク質であるｇｅｎｅＩＩＩのＮ末端に提示されることを可能にする（Baca et al., J Biol Chem. 272:10678 (1997)）。
【０２６８】
上に同定した６個のＣＤＲのそれぞれについて個別のライブラリーを構築した。これらのライブラリーでは、ＨＥＲ２に対する結合に潜在的に重大であるとコンピュータ処理モデルを使用して同定された、ＣＤＲ中のアミノ酸（図９）を、それらのコドンとして「ＮＮＳ」を含むオリゴを使用して無作為化した。次に、全てのブロッキング溶液の代わりに使用した、０．２%ＴＷＥＥＮ２０（登録商標）（ＭＰＢＳＴ）を有する、３%粉乳のＰＢＳ溶液を用いて、ＮＵＮＣ  ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）プレート上に被覆したＨＥＲ２のＥＣＤに対してこれらのライブラリーをパンニングした。３、４、および５回目のパンニングで２Ｃ４．５７４の親和性よりも高い親和性を有するファージを選択するために、競合物として洗浄段階中に可溶性ＨＥＲ２  ＥＣＤまたは可溶性Ｆａｂ２Ｃ４．５７４を添加した。洗浄時間を室温で１時間に延長した。
【０２６９】
５回のパンニングを行った後に、ファージ−ＥＬＩＳＡによって個別のクローンを再び分析した。Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル丸底組織培養プレートに個別のクローンを成長させ、ヘルパーファージの添加によってファージを誘導した。一晩成長させた後で、E. coli細胞をペレットにして、ファージを含有する上清を９６ウェルプレートに移し、そこでＭＰＢＳＴを用いて室温で１時間ファージをブロッキングした。ＨＥＲ２のＥＣＤを被覆したＮＵＮＣ  ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）プレートも上記のようにＭＰＢＳＴでブロッキングした。ブロッキングされたファージをプレート上で２時間インキュベーションした。洗浄後、ＭＰＢＳＴで１：５０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲーションした抗Ｍ１３モノクローナル抗体（Amersham Pharmacia Biotech, Inc. 27-9421-01）に続いて基質として３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用して、結合したファージを検出した。吸光度を４５０nmで読み取った。
【０２７０】
最高のシグナルを与えた各ライブラリーからのクローン４８個をＤＮＡ配列決定した。配列が最も高頻度に生じたクローンを、可溶性Ｆａｂの発現を可能にする上記のベクターにサブクローニングした。これらのＦａｂを誘導して、タンパク質を精製して、精製されたＦａｂを上記のようなＥＬＩＳＡにより結合について分析し、その結合を、初発のヒト化２Ｃ４．５７４バージョンの結合と比較した。
【０２７１】
個別のＣＤＲにおける関心対象の突然変異を同定した後で、これらの様々な組み合わせである追加の突然変異体を構築して上記のように試験した。５７４に比べて改善した結合を与えた突然変異体を表３に記載する。
【０２７２】
【表３】
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【０２７３】
以下の突然変異体も構築され、現在評価段階である：
【０２７４】
【表４】
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【０２７５】
ホモロジースキャンによって示唆される以下の突然変異体は、現在構築中である：
【０２７６】
【表５】
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【０２７７】
Ｈ３４で好ましいアミノ酸はメチオニンであろう。この位置で酸化されていることが見出されるならば、ロイシンへの変更を行うことができよう。
【０２７８】
ＡｓｎＨ５２およびａｓｎＨ５３は、結合のために強く好まれることが見出された。これらの残基をアラニンまたはアスパラギン酸に変更することで、結合が劇的に減少する。ヒトＩｇＧ１重鎖定常部を有するヒト化バージョン５７４の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインを含むインタクトな抗体が調製された（米国特許第５，８２１，３３７号参照）。インタクトな抗体はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生される。その分子を本明細書においてパーツズマブと称する。
【０２７９】
実施例４
モノクローナル抗体２Ｃ４はＭＡＰＫおよびＡｋｔキナーゼのＥＧＦ、ＴＧＦ−α、またはＨＲＧ介在性活性化を遮断する
多くの成長因子レセプターはマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を介してシグナルを伝達する。これらの二重特異性キナーゼは、シグナル伝達経路における主要な終点の一つであり、ガン細胞が分裂するのを最後にトリガーする。モノクローナル抗体２Ｃ４またはトラスツズマブがＥＧＦ、ＴＧＦ−α、またはＨＲＧによるＭＡＰＫ活性化を阻害する能力を以下のように評定した。
【０２８０】
ＭＣＦ７細胞（１０５細胞／ウェル）を１２ウェル細胞培養プレート中の血清含有培地に蒔いた。翌日、細胞培地を除き、０．１%血清を含有する新鮮培地を各ウェルに加えた。次に、その翌日にこの手順を繰り返し、アッセイの前に培地を無血清結合バッファーと交換した（Jones et al., J. Biol. Chem. 273:11667-74 (1998);およびSchaefer et al., J. Biol. Chem. 274:859-66 (1999)）。細胞を室温に平衡化させ、次に、０．５mLの２００nMトラスツズマブまたはモノクローナル抗体２Ｃ４と共に３０分間インキュベーションした。次に細胞を１nM ＥＧＦ、１nM ＴＧＦ−α、または０．２nM ＨＲＧで１５分間処理した。細胞培地を吸引して、次に１%ＤＴＴを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファー０．２mLを添加することによって反応を停止させた。以前に記載されたように、抗活性ＭＡＰＫ抗体（Promega）を用いたウエスタンブロットによりＭＡＰＫの活性化を評定した（Jones et al. J. Biol. Chem. 273:11667-74 (1998)）。
【０２８１】
図１０に示すように、モノクローナル抗体２Ｃ４は、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、およびＨＲＧが介在するＭＡＰＫ活性化をトラスツズマブよりも大きな程度に有意に遮断する。これらのデータは、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３のいずれかとの会合に使用されるＨＥＲ２表面にモノクローナル抗体２Ｃ４が結合することによって、シグナル伝達レセプター複合体の形成が阻止されることを示唆している。
【０２８２】
モノクローナル抗体２Ｃ４は、ヘレグリン（ＨＲＧ）依存性Ａｋｔ活性化を阻害することも示された。ＰＩ３キナーゼシグナル伝達経路の活性化は、細胞の生存に重要である（Carraway et al., J. Biol. Chem. 270:7111-6 (1995)）。腫瘍細胞において、ＰＩ３キナーゼ活性化は浸潤性表現型に役割を果たすことができる（Tan et al., Cancer Reearch. 59:1620-1625 (1999)）。生存経路は、セリン／トレオニンキナーゼであるＡＫＴによって主に仲介される（Bos et al., Trends Biochem Sci. 20:441-442 (1995)。ＨＥＲ２と、ＨＥＲ３またはＥＧＦＲのいずれかとの間に形成した複合体は、それぞれヘレグリンまたはＥＧＦに応答してこれらの経路を開始することができる（Olayioye et al., Mol. & Cell. Biol. 18:5042-51 (1998); Karunagaran et al., EMBO Journal.15:254-264 (1996);およびKrymskaya et al., Am. J. Physiol. 276:L246-55 (1999））。２Ｃ４とのＭＣＦ７乳ガン細胞のインキュベーションは、ヘレグリン介在性Ａｋｔ活性化を阻害する。Agus et al., Cancer Cell 2:127-137 (2002)。さらに、ヘレグリンの添加の不在下で存在する基礎レベルのＡｋｔ活性化は、２Ｃ４の添加によりさらに減少する。
【０２８３】
実施例５
プラチナ耐性ガンの治療
本実施例は、プラチナ耐性の卵巣ガン、原発性腹膜ガン、または卵管ガンを有する患者における、ゲムシタビンと組み合わせたパーツズマブの安全性、耐容性、および有効性を実証している。腫瘍がＨＥＲ２の活性化を示すマーカーを含む全ての患者において、および患者のサブセットにおいて、進行のない生存に及ぼすパーツズマブおよびゲムシタビンの効果を評価する。
【０２８４】
プラチナ系化学療法方式を受けている間に、または受けてから６か月以内に、進行した患者が本研究に適格であろう。患者を無作為化して、パーツズマブと組み合わせたゲムシタビン、またはプラセボと組み合わせたゲムシタビンのいずれかの投与を行う。本明細書において処置される患者には、研究に参加する前にプラチナ耐性疾患のための救助方式処置を以前に受けていない患者、およびプラチナ耐性疾患のための一治療方式を以前に受けた患者が含まれる。
【０２８５】
各２１日のサイクルの１日目および８日目にゲムシタビンを１０００mg/m2で投与する。ゲムシタビンを最初に３０分間かけて注入する。毒性に関して用量低減を許容する。２１日サイクルの１日目にプラセボまたはパーツズマブを投与する。パーツズマブの投与を受けるように無作為化された被験者に初回ローディング用量８４０mg（サイクル１）に続いてサイクル２以降に４２０mgを投与する。プラセボの投与を受けるように無作為化された被験者に、サイクル１およびサイクル２以降についてパーツズマブ群で投与したのと同容積のプラセボを投与する。進行した疾患を有さない被験者に１７サイクル、又は１年間まで処置を受けさせることができる。
【０２８６】
患者は、標準的なゲムシタビン用量低減を行われ、血球減少症の結果として投薬を保留（held）されるであろう。任意に保留された１日目のゲムシタビン投薬に対して、パーツズマブもまた保留されるであろう。その後の用量は、低減した用量であり、増加しないであろう。用量低減もしくは投薬保留が４回を超えて必要ならば、または投薬が３週間を超えて保留されているならば、ゲムシタビンが中止されるであろうし、担当の医師および医療モニターの承認を得て疾患が進行するまで盲験化した薬物を継続することができる。８日目のゲムシタビンの投薬が保留されたならば、８日目の投薬は省略され、その後の処置は次のサイクルと共に開始するであろう(以前のサイクルの２２日目)。
ゲムシタビンを保留して、以下の表に推奨されるように用量を減らす：
【０２８７】
【表６】
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【０２８８】
用量低減を必要とする任意の患者についてのその後の投薬は、低減した用量で行われるであろう。投薬が血球減少症の結果として３週間を超えて保留されているならば、患者は許容されない毒性を有すると推測され、ゲムシタビンが中止されるであろう。その他の追加のグレードＩＩＩまたはＩＶの毒性がないならば、盲験化した薬物の継続は医師および医療モニターの判断次第であろう。ゲムシタビンの血液毒性は、投薬速度と関係していた。合計用量にかかわらずゲムシタビンは３０分間かけて与えられるであろう。ＮＣＩ−ＣＴＣグレード２血球減少症に対するコロニー刺激剤の使用は、担当の医師の判断次第で使用することができる。
【０２８９】
単剤パーツズマブとのクロスオーバーの選択肢も提供されるであろう。次のサイクル期日にローディング用量８４０mgを投与して、２１日毎に次のサイクルで４２０mgを継続する。ガンを含む代表的な腫瘍のパラフィン包埋腫瘍標本または未染色のパラフィンスライドを得て、ＨＥＲ２のリン酸化状態について評定する。卵巣ガン患者の約２０〜４０%が検出可能なＨＥＲ２リン酸化を有しうる。
【０２９０】
サイクル２、４、６、８、１２、および１７の最後に反応を評定する。固形腫瘍効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）を使用して、臨床評価およびＣＴスキャンまたは同等物により測定可能な疾患を評定する。ＣＡ−１２５に対する変化および疾患の臨床的および放射線学的根拠により評価可能な疾患を有する被験者についての反応を評定する。最初に反応を記録した４〜８週間後に反応を確認すべきである。評価可能な被験者は、少なくとも一つの反応評定を受けたことがあり、腫瘍標本におけるＨＥＲ２リン酸化状態を決定された被験者からなるであろう。
【０２９１】
以下の転帰尺度を評定する。
【０２９２】
主要有効性評価項目
ＲＥＣＩＳＴまたはＣＡ−１２５の変化を用いて、研究者の評定によって決定された、各群の全被験者の割り付けられた研究処置の開始後の進行のない生存。
ＲＥＣＩＳＴまたはＣＡ−１２５変化を用いて研究者の評定によって決定された、以下の亜群での各群に割り付けられた研究処置の開始後の進行のない生存：
検出可能なＨＥＲ２活性化マーカーを有する被験者。
検出可能なＨＥＲ２活性化マーカーを有さない被験者。
【０２９３】
第二次有効性評価項目
客観的反応（ＰＲまたはＣＲ）
反応期間
生存期間
４か月目での進行の停止
各群および以下の亜群の全被験者においてこれらの評価項目を評定する：
検出可能なＨＥＲ２活性化マーカーを有する被験者。
検出可能なＨＥＲ２活性化マーカーを有さない被験者。
【０２９４】
可能性のある悪心および嘔吐を予防または処置するために、セロトニン拮抗薬、ステロイド、および／またはベンゾジアゼピンを患者に予備投薬することができる。可能性のある発疹を予防または処置するために、局所および／または経口抗生物質を含めた標準的なざ瘡治療法を使用できる。その他の可能性のある同時投薬は、１日目の７日前に開始して追跡期間の最終日にかけて継続した間隔で患者によって使用される、任意の処方薬の投薬または一般用医薬製剤である。注入に関連する＞３８．５℃の発熱またはその他の注入関連症状を経験する被験者を、アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、またはメペリジンで症状的に処置することができる。非実験的造血成長因子をＮＣＩ−ＣＴＣグレード２の血球減少症のために投与することができる。
【０２９５】
上記のように処置された患者は、任意の一つまたは複数の主要有効性評価項目または第二次有効性評価項目によって評価された卵巣ガン、原発性腹膜ガン、または卵管ガンの徴候または症状に改善を示すであろう。さらに、パーツズマブおよびゲムシタビンの組み合わせで上記のように処置されたプラチナ耐性患者は、ゲムシタビン単独で処置されたプラチナ耐性患者に比較して、ガンの任意の徴候または症状に大きな改善を示すであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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