(57)【要約】【課題】  血管新生性の疾患及び病状、新生物疾患或いは増殖性疾患を治療するための、メチルフェニデート誘導体を含む治療剤及び医薬組成物を提供すること。【解決手段】メチルフェニデート誘導体を含む治療剤は、式Ｉ：（式中、ｎは、１であり、Ｒ１は、フェノキシであり；かつＲ２は、メチルである）で示される化合物、又はその塩の有効量を含む。また、メチルフェニデート誘導体を含む医薬組成物は、以下の式Ｉで示される化合物、又はその塩の有効量と、薬学的に許容される担体と、を含む。2015003932.tif 000031【選択図】      図１Ａ
2015003932.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生を阻害するための治療剤であって、
式Ｉ
【化１】
2015003932.tif 000030
（式中、ｎは、１〜５の整数であり、
Ｒ１は、それぞれ独立して、アリール、ヘテロアリール、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、カルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン、アミノ、ニトロ、スルホ、又はスルフヒドリルであり、ここで各アルキルは、ヒドロキシル、アミノ、又はスルフヒドリルで選択的に置換されており；かつ
Ｒ２は、水素又は低級アルキルである）
で示される化合物、又はその塩若しくはプロドラッグの有効量を含む、治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はメチルフェニデート誘導体の使用に関する。これらの使用は、血管新生を損害すること及び血管新生性の疾患及び病状を治療することを含む。
【背景技術】
【０００２】
メチルフェニデートは、注意欠陥のサブタイプ（以前は、注意欠陥障害又はＡＤＤとして知られていた）を含む注意力欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）と診断された子供及び成人のための治療の選択肢である。メチルフェニデートの特定の誘導体も、ＡＤＤの治療のため（特許文献１を参照）及び他の神経性の障害及び病状の治療のため（特許文献２、特許文献１、特許文献３及び特許文献４を参照）に提唱されている。
【０００３】
メチルフェニデートは緩和な中枢神経刺激剤であり、癌患者、ＡＩＤＳ患者及びその他の深刻な疾病に罹患した患者における無気力、倦怠感、認識衰退及びうつ病を治療できることが示唆されている。例えば、特許文献５、特許文献６、特許文献７及び特許文献３並びに非特許文献１及び非特許文献２を参照されたい。
【０００４】
メチルフェニデートは発癌性ではなく、かつメチルフェニデートを摂取したラット及びヒトにおいて予測された癌の罹患率よりも小さいことが報告されている。例えば、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５及び非特許文献６を参照されたい。しかしながら、メチルフェニデートがマウスにおいて発癌性であるという幾らかの根拠が存在している（非特許文献３及び非特許文献４）。更に、幾らかのタイプの腫瘍は低減されると報告されているが、別のタイプの腫瘍は増大されると報告されている。非特許文献３、非特許文献４及び非特許文献５を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６，０２５，５０２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８５９，２４９号明細書
【特許文献３】米国特許第第６，４８６，１７７号明細書
【特許文献４】国際公開第ＷＯ９９／３６４０３号パンフレット
【特許文献５】米国特許第５，９０８，８５０号明細書
【特許文献６】米国特許第６，１２７，３８５号明細書
【特許文献７】米国特許第６，３９５，７５２号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】シャルマン（Ｃｈａｌｌｍａｎ）及びリプスキー（Ｌｉｐｓｋｙ）、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．、第７５巻、７１１−７２１頁、２０００年
【非特許文献２】レオナルド（Ｌｅｏｎａｒｄ）ら、Ｈｕｍ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．、第１９巻、１５１−１８０頁、２００４年
【非特許文献３】ダニック（Ｄｕｎｎｉｃｋ）及びヘイリー（Ｈａｉｌｅｙ）、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、第１０３巻、７７−８４頁、１９９５年
【非特許文献４】米国毒物学プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ）、Ｎａｔｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ．、第４３９巻、１−２９９頁、１９９５年
【非特許文献５】ダニックら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．、第１０２巻、７７−８３頁、１９９６年
【非特許文献６】テオ（Ｔｅｏ）ら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．、第５３７巻、６７−７９頁、２００３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、メチルフェニデート誘導体を含む治療剤及び医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述の課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、血管新生を阻害するための治療剤であって、式Ｉ：
【０００９】
【化１】
2015003932.tif 000003
（式中、ｎは、１〜５の整数であり、
Ｒ１は、それぞれ独立して、アリール、ヘテロアリール、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、カルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン、アミノ、ニトロ、スルホ、又はスルフヒドリルであり、ここで各アルキルは、ヒドロキシル、アミノ、又はスルフヒドリルで選択的に置換されており；かつ
Ｒ２は、水素又は低級アルキルである）
で示される化合物、又はその塩若しくはプロドラッグの有効量を含む、治療剤、を提供する。
【００１０】
本発明は、式Ｉ：
【００１１】
【化２】
2015003932.tif 000004
で示される化合物を使用する方法を提供する（式中、ｎは、１〜５の整数であり、そしてＲ１は、それぞれ独立して、アリール、ヘテロアリール、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、カルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン、アミノ、ニトロ、スルホ又はスルフヒドリルである）。各アルキルは、選択的に、ヒドロキシル、アミノ又はスルフヒドリルで置換され得る。Ｒ２は、水素又は低級アルキルである。
【００１２】
第１の実施形態において、本発明は動物における血管新生を阻害する方法を提供する。同方法は、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの有効量を動物に投与する工程を含む。
【００１３】
第２の実施形態において、本発明は、動物において血管新生性の疾患又は病状を治療するための方法を提供する。同方法は、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療上の有効量を動物に投与する工程を含む。
【００１４】
第３の実施形態において、本発明は、動物において増殖性の疾患を治療するための方法を提供する。同方法は、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療上の有効量を動物に投与する工程を含む。
【００１５】
本発明はまた、式ＩＡの化合物を提供する。
【００１６】
【化３】
2015003932.tif 000005
上記式において、ｎは１〜５の整数であり、Ｒ１は、それぞれ独立して−Ｃ（Ｏ）−Ｒ８、−ＯＲ７又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ３の部分であり、Ｒ２は水素又は低級アルキルであり、Ｒ３は水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、Ｒ７はアリールであり、かつＲ８はシクロアルキル又はアリールである。
【００１７】
本発明は薬学的に許容される担体と、式ＩＡの化合物又はその塩若しくはプロドラッグと、を含む医薬組成物を提供する。
【００１８】
【化４】
2015003932.tif 000006
上記式において、ｎは１〜５の整数であり、Ｒ１は、それぞれ独立して−Ｃ（Ｏ）−Ｒ８、−ＯＲ７又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ３の部分であり、Ｒ２は水素又は低級アルキルであり、Ｒ３は水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、Ｒ７はアリールであり、かつＲ８はシクロアルキル又はアリールである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、メチルフェニデート誘導体を含む治療剤であって、血管新生を阻害するための治療剤及び医薬組成物を提供できた。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】２μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激された末梢血リンパ球（ＰＢＬ）培養液に対する種々の添加剤での５３０ｎｍにおける光学濃度のグラフである。
【図１Ｂ】５μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激された末梢血リンパ球（ＰＢＬ）培養液に対する種々の添加剤での５３０ｎｍにおける光学濃度のグラフである。
【図１Ｃ】２０μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激された末梢血リンパ球（ＰＢＬ）培養液に対する種々の添加剤での５３０ｎｍにおける光学濃度のグラフである。
【図２】２μｇ／ｍｌのＰＨＡで刺激されたＰＢＬ培養液に対する種々の添加剤での５３０ｎｍにおける光学濃度のグラフである。
【図３】２μｇ／ｍｌのＰＨＡで刺激されたＰＢＬ培養液に対する種々の添加剤でのＩＬ−１３の濃度のグラフである。
【図４】２μｇ／ｍｌのＰＨＡで刺激されたＰＢＬ培養液に対する種々の添加剤でのＩＦＮγの濃度のグラフである。
【図５Ａ】２μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌのＰＨＡでそれぞれ刺激されたＰＢＬ培養液に対する種々の添加剤での５３０ｎｍにおける光学濃度のグラフである。
【図５Ｂ】２μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌのＰＨＡでそれぞれ刺激されたＰＢＬ培養液に対する種々の添加剤での５３０ｎｍにおける光学濃度のグラフである。
【図６】５μｇ／ｍｌのＰＨＡで刺激されたＰＢＬ培養液に対する種々の添加剤でのＩＬ−１３の濃度のグラフである。
【図７】２μｇ／ｍｌのＰＨＡで刺激されたＰＢＬ培養液に対する種々の添加剤でのＴＮＦαの濃度のグラフである。
【図８】２μｇ／ｍｌのＰＨＡで刺激されたＰＢＬ培養液に対する種々の添加剤でのＩＬ−８の濃度のグラフである。
【図９Ａ】リポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激されたＴＨＰ−１単球培養液に対する種々の添加剤での光学濃度のグラフである。
【図９Ｂ】リポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激されたＴＨＰ−１単球培養液に対する種々の添加剤での光学濃度のグラフである。それぞれの場合において、上側の暗灰色バーはｃ−Ｊｕｎであり、下側の明灰色バーはＮＦκＢである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
一態様において、式Ｉの化合物は、本発明の実施に有用である。
【００２２】
【化５】
2015003932.tif 000007
式Ｉにおいて、ｎは、１〜５の整数である。好ましくは、ｎは、１又は２である。
【００２３】
各Ｒ１は、同一でも、異なっていてもよく、アリール、ヘテロアリール、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、カルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン、アミノ、ニトロ、スルホ又はスルフヒドリルである。各アルキルは、選択的に、ヒドロキシル、アミノ又はスルフヒドリルで置換され得る。Ｒ１は、好ましくは、アリール、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アリールオキシ又はアシルである。より好ましくは、Ｒ１は、アリール、アルキル又はシクロアルキルであり、さらにより好ましくはアリールであり、最も好ましくはフェニルである。
【００２４】
式Ｉにおいて、Ｒ２は、水素又は低級アルキルである。好ましくは、Ｒ２は−ＣＨ３である。
特定の一実施態様において、式ＩＩの化合物は、本発明において特に有用である。
【００２５】
【化６】
2015003932.tif 000008
「アシル」は、式：−Ｃ（Ｏ）−Ｒ８の部分を意味し、ここでＲ８は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル又はアリールである。
【００２６】
「アミノ」は、式：−ＮＲ４Ｒ５の部分を意味し、ここでＲ４及びＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ又はアルキルであり、好ましくは低級アルキルである。
「アルコキシ」は、式：−ＯＲ６の部分を意味し、ここでＲ６はアルキルである。アルコキシ基の例は、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）である。
【００２７】
「アルキル」は、炭素原子１〜８個を含有する一価の飽和した直鎖又は分岐鎖炭化水素を意味する。各アルキルは、選択的に、１つ以上のアミノ、ヒドロキシル又はスルフヒドリル基で置換され得る。
【００２８】
「アリール」は、環炭素原子６〜１４個の一価の単環式、二環式又は三環式の芳香族炭化水素部分を意味する。好ましくはフェニルである。
「アリールオキシ」は、式：−ＯＲ７の部分を意味し、ここでＲ７はアリールである。アリールオキシ基の例は、フェノキシである。
【００２９】
「カルボキシル」は、式：−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ３の部分を意味し、ここでＲ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル又はアリールである。
「シクロアルキル」は、環炭素原子３〜１０個の飽和した一価の単環式又は二環式の炭化水素部分を意味する。好ましくは、シクロアルキルは４〜８個の環炭素原子を含有する。最も好ましいシクロアルキルは、シクロヘキシルである。
【００３０】
「ハロゲン」は、塩素、フッ素、臭素又はヨウ素を意味する。好ましいものは、塩素又は臭素である。
「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ及びＳからそれぞれ独立して選択される１、２又は３個の環ヘテロ原子を含有し、残りの環原子がＣである、環原子５〜１２個の一価の単環式又は二環式芳香族部分を意味する。
【００３１】
「ヒドロキシル」は、−ＯＨを意味する。
「低級アルキル」は、炭素原子１〜４個を含有する飽和直鎖又は分岐鎖炭化水素を意味する。
【００３２】
「ニトロ」は−ＮＯ２を意味する。
「スルフヒドリル」は、−ＳＨを意味する。
「スルホ」は、−ＳＯ３Ｈを意味する。
【００３３】
「プロドラッグ」は、同プロドラッグが哺乳類対象に投与された場合、式Ｉの活性母剤を生体内で放出する任意の化合物を意味する。式Ｉの化合物のプロドラッグは、修飾部が生体内で開裂して親化合物を放出することができるように、式Ｉの化合物に存在する１つ以上の官能基を修飾することにより調製される。プロドラッグは、式Ｉの化合物のヒドロキシ、アミノ又はスルフヒドリル基が、生体内で開裂してそれぞれ遊離ヒドロキシル、アミノ又はスルフヒドリル基を生じることができる任意の基と結合している、式Ｉの化合物を含む。プロドラッグの例としては、エステル類（例えば、酢酸塩、ギ酸塩及び安息香酸塩の誘導体）、式Ｉの化合物のヒドロキシ官能基のカルバミン酸塩（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
「阻害する」又は「阻害すること」とは、（完全に、若しくは部分的に）低減すること、又は妨げることを意味するものとして本明細書では使用されている。
疾患又は病状を「治療する」或いは疾患又は病状の「治療」は、（１）疾患又は病状を予防すること、すなわち疾患又は病状に曝されるか、罹患しやすくなりうるが、まだ疾患又は病状の兆候を体感していない又は表していない哺乳動物において、疾患又は病状の臨床的な症状を発現させないこと、（２）疾患又は病状を阻害すること、すなわち疾患若しくは病状、又はその臨床的な症状の発現を阻止するか、又は低減させること、或いは（３）疾患又は病状を緩和すること、すなわち、疾患又は病状を治癒することを含む、疾患若しくは病状、又はその臨床的な症状を退行させることを含む。
【００３５】
「有効量」は、疾患若しくは病状を治療するため、又は効果を引き起こすために動物に投与される場合、効果を引き起こすのに十分な化合物の量を意味する。「有効量」は、化合物、疾患若しくは病状及びその重篤度、又は引き起こそうとする効果、並びに治療される動物の年齢、体重などに応じて変更可能であり、かつ変更される可能性が極めて高い。
【００３６】
本発明に有用な式Ｉの化合物を合成する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、特許文献２及び特許文献１、特許文献４、パン（Ｐａｎ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、第２６４巻、１７７−１８２頁、１９９４年、ガトリー（Ｇａｔｌｅｙ）ら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ、第５８巻、２３１−２３９頁、１９９６年、ドイチュ（Ｄｅｕｔｓｃｈ）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、第３９巻、１２０１−１２０９頁、１９９６年、タイ（Ｔｈａｉ）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、第４１巻、５９１−６０１頁、１９９８年及びウェイメント（Ｗａｙｍｅｎｔ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、第７２巻、１２６６−１２７４頁、１９９９年、クリム、ロリ（Ｋｒｉｍ，Ｌｏｒｉ）学位論文（化学博士）、２００１年、ペンシルバニア大学、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｒｏｏｍ（Ｃａｌｌ  Ｎｏ．ＱＤ００１  ２００１．Ｋ９２）、大学マイクロフィルムオーダー番号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｉｃｒｏｆｉｌｍｓ  Ｏｒｄｅｒ  Ｎｏ．）３０３１６８４、ＩＳＢＮ  ０−４９３−４４１７９−４を参照されたい。これらの完全な開示は、引用された参考文献と共に参照として本明細書に援用される。
【００３７】
本発明の化合物が１つ以上のキラル中心を含有する場合、同化合物は、エナンチオ選択的に合成することができるか、又は鏡像異性体及び／又はジアステレオマーの混合物を調製し、分離することができる。本発明の化合物、その出発材料及び／又は中間体の分離は、既知の手順、例えば、４巻の概論、Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、マンハッタン大学、ニューヨーク州リバーデール所在）及びＥｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，  Ｒａｃｅｍａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ジーン  ジャクェス（Ｊｅａｎ  Ｊａｃｑｕｅｓ）、アンドレ  コレット（Ａｎｄｒｅ  Ｃｏｌｌｅｔ）及びサムエル  エイチ．ウィレン（Ｓａｍｕｅｌ  Ｈ．Ｗｉｌｅｎ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社（ニューヨーク）発刊、１９８１年、に記載されているように実施することができる。これらの文献は、その全体が参照として本明細書に援用される。基本的に、化合物の分離は、分別結晶、蒸留又はクロマトグラフィーにより分離可能である形態をもたらす、鏡像異性的に純粋な部分の、化学的又は触媒的のいずれかの結合による、ジアステレオマーの物理的特性の差に基づいている。
【００３８】
式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩を、本発明の実施に使用することもできる。薬学的に許容される塩には、従来の非毒性の塩、例えば、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）、有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、安息香酸、サリチル酸、シュウ酸、アスコルビン酸など）又は塩基（例えば、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、Ｄ−グルコサミン又はエチレンジアミンから誘導される、薬学的に許容される金属カチオン又は有機カチオンの水酸化物、炭酸塩又は重炭酸塩）から誘導される塩が含まれる。塩は、従来の方法、例えば化合物のフリーの塩基形態を酸と反応させることにより、調製される。
【００３９】
本発明の範囲は、式Ｉの化合物それ自体の使用のみならず、その塩及びプロドラッグの使用も包含することを理解するべきである。加えて、本発明は、純粋な異性体及び同異性体の種々の混合物を含む、式Ｉの化合物並びにその塩及びプロドラッグの異性体の使用を考慮する。
【００４０】
式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩またはプロドラッグは血管新生を阻害するために使用され得る。血管新生は、体内において新たな血管が形成されるプロセスである。本明細書中において、血管新生は、新血管形成、脈管化、動脈化及び脈管形成と同じものを意味する、或いは含むものとして使用される。
【００４１】
式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩またはプロドラッグは、血管新生性の疾患又は病状を治療するために使用され得る。血管新生性の疾患又は病状は、血管新生を含む、同血管新生に起因する、同血管新生により悪化する、又は同血管新生に依存する疾患又は病状である。本発明に従って治療可能な特定の血管新生性の疾患及び病状は、新生物疾患、肥大（例えば、甲状腺ホルモンにより誘引される心臓肥大）、結合組織系疾患（関節リウマチ及びアテローム性動脈硬化）、乾癬、眼内血管新生性疾患、心臓血管系疾患、脳血管系疾患、子宮内膜症、ポリープ症、肥満、糖尿病関連疾患及び血友病性関節症を含む。式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩またはプロドラッグはまた、胚着床において必要とされる脈管化を阻害するために使用することができ、それにより受胎調節法を提供する。
【００４２】
式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩またはプロドラッグは、眼内血管新生性疾患の治療に特に有用であろう。眼内血管新生性疾患は糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後繊維増殖症及びルベオーシスを含む。式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩またはプロドラッグは、糖尿病性網膜症及び黄斑変性の治療に特に有用であろう。
【００４３】
式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩またはプロドラッグはまた、新生物疾患の治療に特に有用であろう。式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩またはプロドラッグで治療可能な新生物疾患は、悪性腫瘍（例えば、膀胱、脳、胸部、頸部、結腸、直腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、胃及び子宮の腫瘍）、腫瘍転移及び良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び発熱性肉芽腫）を含む。式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩またはプロドラッグは、脳、胸部、結腸、肝臓及び膵臓の腫瘍の治療に特に有用であり、脳（例えば、グリア芽腫）の腫瘍の治療に最も有用であろう。
【００４４】
血管新生を阻害可能であることに加えて、式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩またはプロドラッグは、細胞の増殖を阻害し、癌細胞の成長を低減し、サイトカインの産生を阻害し、Ｒａｓ及びＲＡＰ−１を阻害し、かつＮＦκＢ及びＡＰ−１の産生を阻害することが可能であることが明らかとなった。従って、式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩またはプロドラッグはまた、血管新生性の疾患及び病状、特に新生物疾患（上述の記載を参照）並びにその他の癌及びその他の増殖性疾患を含む、種々の増殖性疾患の治療に特に有用であろう。
【００４５】
式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩またはプロドラッグで治療可能な癌は、上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、リンパ腫、白血病、固形腫瘍及び血液悪性腫瘍を含む。式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩またはプロドラッグで治療可能な特定の癌は、脳腫瘍、頭部癌及び頸部癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、膀胱癌、甲状腺癌、肝癌、肺癌、骨肉腫及び皮膚癌を含む。式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩またはプロドラッグは、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、肝癌、膵臓癌、皮膚癌、リンパ腫及び白血病の治療に特に有用であろう。
【００４６】
その他の増殖性疾患は、メサンギウム細胞増殖性疾患、繊維性疾患及び過剰増殖性皮膚疾患を含む。メサンギウム細胞増殖性疾患は、メサンギウム細胞の異常な増殖により引き起こされる疾患を指す。メサンギウム細胞増殖性疾患は、糸球体腎炎、糖尿病性ネフロパシー、悪性腎硬化、血栓性微小血管症症候群及び糸球体症のような腎疾患を含む。繊維性疾患は細胞外基質の異状形成を指す。繊維性疾患の例としては、肝硬変、肺繊維症及びアテローム性動脈硬化症を含む。過剰増殖性皮膚疾患は、乾癬、皮膚癌及び表皮過剰形成を含む。
【００４７】
治療の必要な動物を治療するために、式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩又はプロドラッグを動物に投与する。好ましくは、動物は、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウマ又はヒトのような哺乳動物である。最も好ましくは、動物はヒトである。
【００４８】
本発明の化合物の有効な剤形、投与形態及び投与量は、経験的に決定され、そのような決定を行うことは、当該技術分野の技能の範囲内である。投与量が、用いられる特定の化合物、治療される疾患又は病状、疾患又は病状の重篤度、投与経路、化合物の排泄率、治療の持続時間、動物に投与される他の任意の活性成分の実体、動物の年齢、大きさ、及び種類、並びに医療及び獣医学の技術で既知の同様の要因により変更され得ることは、当業者において理解されている。一般に、本発明の化合物の適切な１日用量は、治療効果を生み出すのに有効な最低用量である化合物の量である。しかしながら、１日用量は、担当医又は獣医によって、健全な医療判断の範囲内で決定されるであろう。望ましい場合では、有効１日用量を、適切な間隔を置いて、１日を通して２、３、４、５、６回又はそれ以上の細分用量で別々に投与し得る。化合物の投与は、許容できる反応が達成されるまで、続けるべきである。
【００４９】
本発明に有用な化合物（すなわち、式Ｉの化合物、並びに薬学的に許容されるその塩及びプロドラッグ）を、経口、鼻腔内、直腸内、膣内、非経口（例えば、静脈内、髄腔内、腹腔内、皮下、又は筋肉内）、大槽内、経皮、頭蓋内、大脳内、及び局所（頬側及び舌下を含む）を含む任意の適切な投与経路によって治療のために動物患者に投与することができる。好ましい投与経路は経口投与及び局所投与である。
【００５０】
本発明に有用な化合物は単独で投与することが可能であるが、化合物を医薬製剤（組成物）として投与することが好ましい。本発明に有用な医薬組成物は、活性成分として、１つ又は複数の式Ｉの化合物又は薬学的に許容されるその塩若しくはプロドラッグを、１つ以上の薬学的に許容される担体、及び選択的に１つ以上の他の化合物、活性成分又は他の物質と混合して含む。各担体は、製剤中の他の成分と適合性があり、かつ動物に対して有害ではない意味において、「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体は当該技術分野においてよく知られている。選択される投与経路に関わりなく、本発明の化合物は、当業者に既知の従来の方法によって薬学的に許容される剤形に配合される。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」を参照されたい。
【００５１】
経口投与に適切な本発明の製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤の形態、又は水性若しくは非水性液体中の液剤若しくは懸濁剤、又は水中油型若しくは油中水型乳剤、又はエリキシル剤若しくはシロップ剤、又はパステル剤（ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアのような不活性基剤を使用する）などであり得、それぞれ活性成分として本発明に有用な１つ又は複数の化合物の所定の量を含有する。本発明に有用な化合物を、大形丸剤、舐剤又はペースト剤として投与することもできる。
【００５２】
経口投与用の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣剤、粉末剤、顆粒剤など）において、活性成分を、１つ以上の薬学的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウム若しくはリン酸二カルシウム、及び／又は以下のいずれかと混合する：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及び／又はケイ酸のような充填剤又は増量剤；（２）例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／又はアカシアのような結合剤；（３）グリセロールのような保湿剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩及び炭酸ナトリウムのような崩壊剤；（５）パラフィンのような溶液抑制剤；（６）第四級アンモニウム化合物のような吸収促進剤；（７）例えばセチルアルコール及びグリセロールモノステアレートのような湿潤剤；（８）カオリン及びベントナイト粘土のような吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びこれらの混合物のような潤滑剤；並びに（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合、医薬組成物は、緩衝剤を含むこともできる。同様の種類の固体組成物を、ラクトース又は乳糖のような賦形剤並びに高分子量ポリエチレングリコール等を使用して、軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル剤における充填剤として用いることができる。
【００５３】
錠剤は、選択的に１つ以上の補助成分と共に圧縮又は成形することによって製造することができる。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、グリコールデンプンナトリウム又は架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、界面活性剤又は分散剤を使用して調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿潤させた粉末状化合物の混合物を、適切な機械で成形することによって製造することができる。
【００５４】
錠剤及び本発明の医薬組成物の他の固体剤形、例えば糖衣剤、カプセル剤、丸剤及び顆粒剤は、選択的にコーティング剤及びシェル、例えば腸溶性コーティング及び医薬製剤技術で周知の他のコーティング剤で刻みを入れるか、調製することができる。例えば、所望の放出特性を提供するために、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを種々の割合で使用して、他のポリマーマトリクス、リポソーム及び／又はマイクロスフェアを使用して、活性成分の徐放性放出又は制御された放出を提供するように配合することもできる。これらは、例えば細菌保持フィルタを通過させる濾過により滅菌され得る。これらの組成物はまた、選択的に乳白剤を含有してもよく、活性成分のみを、又は活性成分を優先的に、胃腸管の特定の位置で、選択的に遅延的に放出する組成物であってもよい。使用できる包埋組成物の例としては、ポリマー物質及びロウが含まれる。活性成分をマイクロカプセルの形態にすることもできる。
【００５５】
本発明の化合物の経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤及びエリキシル剤が含まれる。上記活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水若しくは他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油類（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物のような当該技術分野で慣用的に使用される不活性希釈剤を含み得る。
【００５６】
不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味料、風味剤、着色剤、香料及び防腐剤のようなアジュバンドを含むこともできる。
懸濁剤は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微晶質セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカント、並びにこれらの混合物のような懸濁化剤を含有し得る。
【００５７】
本発明の一つ又は複数の化合物を眼球内に眼内注射するための医薬組成物は、液剤、乳剤、懸濁剤、粒子、カプセル、マイクロスフェア、リポソーム、マトリクス等を含む。例えば、米国特許第６，０６０，４６３号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１０１５８２号公報及び国際公開第ＷＯ２００４／０４３４８０号明細書を参照されたい。これらの文献の完全な開示は、本明細書中において参照により援用される。例えば、眼内注射用の製剤は、本発明の一つ又は複数の化合物を、一つ以上の薬学的に許容される滅菌した等張の水性液剤又は非水性液剤、懸濁剤又は乳剤と組み合わせて含み、それらは、抗酸化剤、緩衝剤、懸濁化剤、増粘剤又は粘度増強剤（例えば、ヒアルロン酸ポリマー）を含み得る。適切な水性又は非水性の担体の例としては、水、生理食塩水（好ましくは０．９％）、ブドウ糖液（好ましくは５％）、緩衝剤、ジメチルスルホキシド、アルコール及びポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）を含む。これらの組成物はまた、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のようなアジュバンドを含有し得る。加えて、注射可能な医薬形態の持続的吸収は、ポリマー及びゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤を含めることにより可能となる。注射可能なデポー製剤は、ポリラクチド−ポリグリコリドのような生分解性ポリマーから形成されたマイクロカプセルまたはマイクロスフェアに薬物を封入することにより形成される。他の生分解ポリマーの例としては、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン及びポリ無水物が含まれる。注射可能なデポー製剤は、薬物を、眼の組織と適合性を有するリポソーム（ジパルミトイルフォスファチジルコリンのような通常の成分から構成されるもの）又はマイクロエマルジョンに閉じ込めることによっても調製される。薬物と、ポリマー又は脂質との比率、特定のポリマー又は脂質の成分の性質、使用されるリポソームのタイプ、及びマイクロカプセル又はマイクロスフェアがコーティングされているか否か、に応じて、マイクロカプセル、マイクロスフェア及びリポソームからの薬物の放出速度が制御され得る。
【００５８】
本発明の化合物は、眼科用インプラントとして外科的に投与され得る。例えば、ポリビニルアルコール又はポリビニル酢酸の拡散壁を有し、かつ本発明の一つ又は複数の化合物を含有するリザーバ容器は強膜上又は強膜内に移植され得る。別の例としては、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ無水物のようなポリマーから形成されたポリマー性マトリクス又はセバシン酸のような脂質に本発明の一つ又は複数の化合物を組み入れて、強膜上、又は眼内に移植され得る。これは通常、局所麻酔を受けて角膜の後ろに形成された小さな切開部を使用して、動物に実施される。次に、マトリクスがこの切開部より挿入され、同強膜に縫合される。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態は、本発明の化合物の眼への局所投与であり、本発明の特に好ましい実施形態は、眼への適用に適した局所投与用医薬組成物である。眼への適用に適した局所投与用医薬組成物は、液剤、懸濁剤、分散剤、滴下剤、ゲル剤、ハイドロゲル剤及び軟膏剤を含む。例えば、米国特許第５，４０７，９２６号明細書、国際公開第ＷＯ２００４／０５８２８９号パンフレット、国際公開第ＷＯ０１／３０３３７号パンフレット及び国際公開第ＷＯ０１／６８０５３号パンフレットを参照されたい。これらの文献全ての開示は、本明細書において参照により援用される。
【００６０】
血管新生性の疾患又は病状の治療のために眼へ適用するのに適した局所用製剤は、水性又は非水性ベース中に本発明の一つ又は複数の化合物を含む。局所用製剤は、吸収促進剤、浸透促進剤、増粘剤、粘度増強剤、ｐＨを調節及び／又は維持する薬剤、浸透圧を調節する薬剤、保存剤、界面活性剤、緩衝剤、塩（好ましくは塩化ナトリウム）、懸濁化剤、分散剤、可溶化剤、安定化剤及び／又は等張化剤も含み得る。血管新生性の疾患又は病状の治療のために眼への適用に適した局所用製剤は、本発明の一つ又は複数の化合物の眼への吸収又は浸透を促進するために吸収又は浸透促進剤を、及び／又は、本発明の一つ又は複数の化合物の眼での滞留時間を増大させることが可能な増粘剤又は粘度増強剤を、好ましくは含んでいるであろう。例えば、国際公開第ＷＯ２００４／０５８２８９号パンフレット、国際公開第ＷＯ０１／３０３３７号パンフレット及び国際公開第ＷＯ０１／６８０５３号パンフレットを参照されたい。例示的な吸収／浸透促進剤は、メチルスルホニルメタン単独或いは、ジメチルスルホキシド、カルボン酸及び界面活性剤との組み合わせを含む。例示的な増粘剤又は粘度増強剤は、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカライドゲル、Ｇｅｌｒｉｔｅ（登録商標）、セルロース系ポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、カルボキシル含有ポリマー（例えば、アクリル酸のポリマー又はコポリマー）、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸又はそれらの塩を含む。
【００６１】
液状の剤型（例えば、液剤、懸濁剤、分散剤及び滴下剤）は、例えば、本発明の一つ又は複数の化合物を、水、生理食塩水、ブドウ糖液、グリセロール、エタノール等のようなビヒクルに溶解、分散、懸濁させて、液剤、分散剤又は懸濁剤を形成することにより調製される。所望に応じて、製剤は、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレエート等のような、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤等のような少量の非毒性の補助物質を含み得る。
【００６２】
水性の液剤及び懸濁剤は、本発明の一つ又は複数の化合物に加えて、保存剤、界面活性剤、緩衝剤、塩（好ましくは塩化ナトリウム）、等張化剤及び水を含み得る。懸濁剤が使用される場合、眼への刺激を最小限に留めるために、粒子径は１０μｍ未満とすべきである。液剤又は懸濁剤が使用される場合、眼へ送達される量は、眼からの不必要な流出を回避するために５０μｌを超えるべきではない。
【００６３】
コロイド様懸濁剤は、マイクロ粒子（即ち、マイクロスフェア、ナノスフェア、マイクロカプセル又はナノカプセルであり、マイクロスフェア及びナノスフェアは通常ポリマーマトリクスのモノリシック構造の粒子であり、その内部に製剤が捕捉されているか、吸着されているか、若しくは包含されている一方、マイクロカプセル及びナノカプセルでは、製剤は実際には封入されている）から通常形成される。これらのマイクロ粒子のサイズの上限は、約５μ乃至約１０μである。
【００６４】
眼軟膏は、鉱油、液状ラノリン、白色ワセリン、上記の成分の２つ又は３つ全ての組み合わせ、或いはポリエチレン−鉱油ゲルのような適切なベース中に本発明の一つ又は複数の化合物を含む。保存剤も選択的に包含され得る。
【００６５】
眼科用ゲル剤は、Ｃａｒｐｏｂｏｌ−９４０のような親水性ベース、又はエタノール、水及びプロピレングリコールの組み合わせ（例えば、４０：４０：２０の比率にて）中に懸濁された本発明の一つ又は複数の化合物を含む。ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はグリチルリチン酸アンモニウムのようなゲル化剤が使用される。保存剤及び／又は等張化剤が選択的に包含され得る。
【００６６】
ハイドロゲル剤は、増粘剤又は粘度増強剤として列挙されたような膨潤可能なゲル形成ポリマーを組み込むことにより形成されるが、当該技術分野において「ハイドロゲル」として参照されている製剤は、「増粘性の」液剤又は懸濁剤として参照されている製剤よりは典型的には高い粘度を有する点が異なる。そのように予め形成されたハイドロゲルに対して、眼に適用した後に当該部位にてハイドロゲルを形成するように、製剤を調製することも可能である。そのようなゲルは室温では液体であるが、体液に接触した場合のようなより高い温度ではゲルとなり、従って「熱可逆性」ハイドロゲルと定義される。この特性を与える生体適合性ポリマーは、アクリル酸ポリマー及びコポリマー、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド誘導体及びエチレンオキシドとプロピレンオキシドとのＡＢＡブロックコポリマー（簡便に「ポロキサマー」として参照され、かつビーエイエスエフ−ワイアンドット（ＢＡＳＦ−Ｗａｙｎｄｏｔｔｅ）社よりＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の商標名にて入手可能である）を含む。
【００６７】
好ましい分散剤はリポソーム製剤であり、製剤がリポソーム内に封入されている（水性のコンパートメントと脂質二重層とが交互になって形成された微小ビヒクル）。
点眼剤は、一つ以上の分散剤、可溶化剤又は懸濁化剤も含む水性又は非水性ベースとともに処方化され得る。点眼剤は、簡単な蓋付の点眼用ボトル又は特殊な形状のクロージャにより液体内容物を一滴ずつ送達するように形成されたプラスチック製のボトルにより送達され得る。
【００６８】
本発明の化合物はまた、眼内に挿入される薬剤を含浸させた固形担体により局所的に適用され得る。薬物の放出は一般的には、ポリマーの溶解又はバイオエロージョン、浸透作用又はその組み合わせにより影響を受ける。複数のマトリクス型の送達系が使用され得る。そのような送達系は、本発明の所望の化合物が含浸されているか又は浸されている親水性のソフトコンタクトレンズ、及び眼に配置された後に除去する必要のない生体分解性又は生体可溶性のデバイスを含む。これらの可溶性の眼内挿入物は、眼への適用が許容されているとともに投与されるべき本発明の化合物と適合性を有する任意の崩壊可能な物質から構成され得る。そのような物質は、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、エチルアクリレート及びビニルピロリドンのポリマー及びコポリマー並びに架橋されたポリペプチド又はキチンのような多糖類を含むが、それらに限定されるものではない。
【００６９】
本発明の化合物の別のタイプの局所投与用の剤型（即ち、眼への適用以外のもの）、又は経皮投与用の剤形としては、粉末剤、噴霧剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、パッチ剤、滴下剤及び吸入剤が含まれる。活性成分を、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体と、任意の緩衝剤と、必要であれば噴射推進剤と、混合し得る。軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤及びゲル剤は、活性成分に加えて、動物性及び植物性脂肪、油、ロウ、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、又はこれらの混合物のような賦形剤を含有し得る。粉末剤及び噴霧剤は、活性成分に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物のような賦形剤を含有することができる。噴霧剤は、付随的に、クロロフルオロ炭化水素のような慣用の噴射推進剤、並びにブタン及びプロパンのような揮発性かつ非置換の炭化水素を含有することができる。経皮パッチ剤は、本発明の化合物の身体への制御された送達を提供する更なる利点を有する。そのような剤形は、本発明の１つ又は複数の化合物を、エラストマーマトリクス材料のような適切な媒質に溶解する、分散する、そうでなければ組み込むことによって、製造することができる。吸収促進剤はまた、皮膚を透過する化合物の流動を増大するために使用され得る。その流動速度は、速度制御膜を提供すること、又は化合物をポリマーマトリクス若しくはゲルに分散することのいずれかによって、制御され得る。
【００７０】
直腸内又は膣内投与用の医薬組成物の製剤は坐剤として存在してもよく、同坐剤は、本発明の１つ又は複数の化合物を、例えば、カカオ脂、ポリエチレングリコール、坐剤用ロウ又はサリチル酸塩を含有し、かつ室温で固体であるが、体温で液体であり、従って、直腸又は膣腔内で溶融して活性化合物を放出する、適切な非刺激性賦形剤又は担体の１つ以上と混合することによって調製され得る。膣内投与に適切な本発明の製剤としては、また、当該技術分野において適切であることが知られている担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー製剤が含まれる。
【００７１】
医薬製剤は、吸入若しくは通気による投与、又は鼻腔内若しくは眼球内投与に適するものを含む。吸入による上気道（鼻）又は下気道への投与では、本発明の化合物は、空気吸入器、噴霧器、又は加圧パック、又はエアゾール噴霧薬を送達する従来の他の方法により、簡便に送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適切なガスのような適切な噴射推進剤を含み得る。加圧エアゾールの場合、投与単位は、一定量を送達するための弁を備えることにより決定することができる。
【００７２】
代替的に、吸入又は通気による投与では、組成物は、乾燥粉末の形態、例えば、本発明の化合物の１つ以上と、ラクトース又はデンプンのような適切な粉末基剤との粉末混合物の形態をとることができる。粉末組成物は、例えばカプセル若しくはカートリッジ、又は例えばゼラチン若しくはブリスターパックのような単位用量形態で存在していてもよく、同形態から粉末剤を、吸入器、空気吸入器、又は計量用量吸入器を用いて投与することができる。
【００７３】
鼻腔内投与では、本発明に有用な化合物は、例えばプラスチックボトル噴霧器又は計量用量吸入器により、鼻への滴下又は液体噴霧で投与され得る。液体噴霧剤は、加圧パックから簡便に送達される。典型的な噴霧器は、Ｍｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（ウィントロップ（Ｗｉｎｔｒｏｐ）社）及びＭｅｄｉｈａｌｅｒ（リカー（Ｒｉｋｅｒ）社）である。
【００７４】
点眼剤又は点鼻剤のような滴下剤は、１つ以上の分散剤、可溶化剤又は懸濁化剤も含む水性又は非水性の基剤とともに処方化され得る。滴下剤は、簡単な蓋付点眼剤ボトルにより、又は特殊な形状のクロージャで液体内容物を一滴ずつ送達するように適合したプラスチックボトルにより送達することができる。
【００７５】
非経口投与に適した医薬組成物は、本発明に有用な１つ又は複数の化合物を、１つ以上の薬学的に許容される滅菌された等張の水性又は非水性液剤、分散剤、懸濁液若しくは乳剤と組み合わせるか、又は使用直前に滅菌注射用液剤若しくは分散剤に再構成することができ、酸化防止剤、緩衝剤、同製剤を意図される摂取者の血液で等張にする溶質、又は懸濁化剤若しくは増粘剤を含有し得る滅菌粉末と組み合わせて含む。
【００７６】
本発明の医薬組成物にて使用され得る適切な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの適切な混合物、オリーブ油のような植物油、及びオレイン酸エチルのような注入用有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング物質の使用により、分散体の場合では必要な粒子径を維持することにより、界面活性剤の使用により、維持され得る。
【００７７】
これらの組成物はまた、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のようなアジュバンドを含有し得る。糖類、塩化ナトリウムなどのような等張剤を組成物に含めることが、望ましい場合もある。加えて、注射可能な医薬形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤を含めることにより可能となる。
【００７８】
一部の場合において、活性成分の効果を持続させるために、皮下又は筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅らせることが望ましい。このことは、水に難溶性である結晶質又は非晶質材料の液体懸濁剤を使用することによって達成され得る。従って、活性成分の吸収速度は、溶解速度によって左右され、次に結晶の大きさ及び結晶形によって左右される場合がある。代替的に、非経口投与活性成分の遅延吸収は、活性成分を油ビヒクルに溶解又は懸濁することによって達成される。
【００７９】
注射可能なデポー製剤は、ポリラクチド−ポリグリコリドのような生分解性ポリマー中に活性成分のマイクロカプセルマトリクスを形成することによって製造される。活性成分とポリマーの比率に応じて、そして用いられる特定のポリマーの性質に応じて、活性成分の放出速度を制御することができる。他の生分解ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が含まれる。注射可能なデポー製剤は、活性成分を、体組織と適合性を有するリポソーム又はマイクロエマルジョンに閉じ込めることによっても調製される。注射可能な物質を、例えば細菌保持フィルタを通過させる濾過により滅菌することができる。
【００８０】
製剤は、単位用量又は多剤用量密閉容器、例えばアンプル及びバイアル中に調製することができ、使用の直前に滅菌液体担体、例えば注射用の水の添加のみを必要とする凍結乾燥条件下で保存することができる。用時調製用の注射用液剤及び懸濁剤は、上記で記載した種類の滅菌粉末剤、顆粒剤及び錠剤から調製することができる。
【００８１】
本発明の更なる目的、利点及び新規な特徴は、以下の実施例を調べることによって、当業者に明白になるであろう。同実施例は本発明を制限することを意図していない。
【実施例１】
【００８２】
既知のアレルギーを有するヒト志願者ＧＲ２８３から全血を採取し、抗凝血薬を含有しないガラス製のバキュテナー管に入れた。この血液を凝血させ、遠心分離により血清を除去し、次に水浴中に５６℃で３０分間放置して、熱不活性化にした。ＧＲ２８３から再び全血を採取し、ヘパリンを含有するガラス製のバキュテナー管に加え、以下のようにして、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の単離に使用した。全血を室温のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７溶液に重層し、室温にて１５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離した。次に血漿とＨｉｓｔｏｐａｑｕｅとの界面の細胞を取り除き、培地（１０％熱不活性化ＧＲ２８３血清＋１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＩＭＤＭ培地）により３７℃で洗浄した。
【００８３】
培地中の式ＩＩの化合物（上記を参照すること）及びメチルフェニデート（いずれもジェフェリー  ディ．ウィンケル（Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｄ．Ｗｉｎｋｌｅｒ）博士（ペンシルバニア州フィラデルフィアのペンシルバニア大学）から入手した）を、９６ウエルプレートのウエルに加え、最終濃度が５μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、及び５０μｇ／ｍｌである式ＩＩの化合物及びメチルフェニデートを得た。式ＩＩの化合物の溶媒である滅菌１８ＭΩ水、及びデキサメタゾン（シグマ社から入手、最終濃度は１０μｇ／ｍｌの水溶液）を対照として使用した。次に、培地中のＧＲ２８３のＰＢＬをウエルに加えて、１ウエルあたりの最終濃度を１５０，０００個の細胞とし、プレートを３７℃かつ５％ＣＯ２で２４時間培養した。この培養後、培地中のフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を加えて、最終濃度２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、又は２０μｇ／ｍｌ、最終総容量２００μｌ／ウエルとし、細胞を、３７℃かつ５％ＣＯ２で更に７２時間培養した。全ての培養液をトリプリケート（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）に実施した。
【００８４】
この培養後、細胞凝集を、倒立顕微鏡に備え付けたデジタルカメラで代表的なウエルを撮影することによって調べた。式ＩＩの化合物は、５μｇ／ｍｌのＰＨＡにより誘導された細胞凝集の量を、用量依存的に低減した。式ＩＩの化合物は、おそらく、細胞表面での細胞付着分子の発現を減少させた結果、細胞凝集を弱めたのであろう。
【００８５】
細胞増殖は、２０μｌのＰｒｏｍｅｇａ細胞滴定量溶液を各ウエルに加え、プレートを更に４時間培養することによって、分析した。Ｐｒｏｍｅｇａ細胞滴定量溶液はテトラゾリウム染料を含有する溶液であり、同テトラゾリウム染料は生細胞によりホルマザン染料に還元され、この還元はウエルに存在する生細胞の数と比例する。４時間の培養後、各ウエルの５３０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）を測定した。細胞を含有していない対照液ウエルの５３０ｎｍでのＯＤを、実験ウエルのＯＤから引いた。増殖分析の結果を図１Ａ乃至Ｃに表す。図１Ａ乃至Ｃから明らかなように、式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、ＰＨＡで刺激したＰＢＬの増殖を用量依存的に有意に阻害した。メチルフェニデート（ＭＰ）は、その最高用量及び最低ＰＨＡ用量で有意な効果を示した。それ以外では、メチルフェニデートは、ＰＨＡ刺激ＰＢＬの増殖を有意に低減しなかった。
【実施例２】
【００８６】
既知のアレルギーを有するヒト志願者ＧＲ４６７から全血を採取し、実施例１で記載されたように処理して、熱不活性化血清及びＰＢＬを得た。（熱不活性化ＧＲ４６７血清を使用して作製した）培地中の式ＩＩの化合物及びメチルフェニデートを、９６ウエルプレートのウエルに加えて、最終濃度が５μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ及び２５μｇ／ｍｌである式ＩＩの化合物並びに最終濃度が１５μｇ／ｍｌであるメチルフェニデートを得た。水及びデキサメタゾン（最終濃度１０μＭ）を対照として使用した。次に、培地中のＧＲ４６７のＰＢＬをウエルに加えて、１ウエルあたりの最終濃度を１５０，０００個の細胞とし、プレートを３７℃かつ５％ＣＯ２で２４時間培養した。この培養後、ＰＨＡを加えて、最終濃度２μｇ／ｍｌ、最終総容量２００μｌ／ウエルとし、細胞を３７℃かつ５％ＣＯ２で更に７２時間培養した。全ての培養液をトリプリケートに実施した。
【００８７】
この培養後、細胞増殖を、実施例１に記載されたように決定した。結果を図２に表す。図２から明らかなように、式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、ＰＨＡで刺激しなかったものと刺激したものの両方で、ＰＢＬの増殖を有意に阻害したが、メチルフェニデートでは阻害しなかった。
【００８８】
ＰＢＬによるサイトカインの放出も、１５μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物、１５μｇ／ｍｌのメチルフェニデート又は１０μＭのデキサメタゾンを有する１ｍｌの管中に、１ｍｌあたり１．３×１０６細胞のＰＢＬを、３７℃かつ５％ＣＯ２で２４時間培養することによって測定した。この培養後、ＰＨＡを加えて、最終濃度を２μｇ／ｍｌとし、細胞を３７℃かつ５％ＣＯ２で更に９６時間培養した。全ての培養液をトリプリケートに実施した。１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を除去し、培地を収集した。
【００８９】
ＩＬ−１３は、活性化されたＴＨ２細胞により形成され、ＩＬ−１３の主たる標的はＢ細胞及び単球である。ＩＬ−１３は体液性免疫反応を刺激し、喘息の発症に関わっている。ＩＬ−１３はリンパ腫細胞株により分泌され、自己分泌増殖因子であり得る。ＩＬ−１３はまた膵臓癌において発現される。しかしながら、ＩＬ−１３は神経膠腫及び腎細胞癌のようなその他のタイプの腫瘍の成長を阻害することも報告されている。
【００９０】
ＩＦＮγは、活性化されたＴ細胞及びその他の細胞により形成される炎症誘発性サイトカインである。ＩＦＮγは好中球、内皮細胞及びマクロファージを活性化し、かつＭＨＣ分子発現の増大を引き起こす。ＩＦＮγは細胞媒介型免疫反応を推進する。ＩＦＮγは確立された腫瘍の免疫媒介型の拒絶反応において重要な役割を果たす。ＩＦＮγは幾らかの腫瘍に対しては抗増殖効果を有し、別の腫瘍に対してはアポトーシス効果を有し、血管新生性ケモカインの産生を低減し、かつ腫瘍細胞の免疫原性を高める。
【００９１】
培地へのＩＬ−１３及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の放出をＥＬＩＳＡで測定した。ＥＬＩＳＡを実施するために、ヒトＩＬ−１３及びＩＦＮγに対する抗体のマッチドペアを、それぞれピアスバイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社及びバイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）社から購入した。ＥＬＩＳＡストリップウエルプレートを、ＩＬ−１３に対する抗体１０μｇ／ｍｌ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中）及びＩＦＮγに対する抗体４μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ中）を用いて、室温で一晩被覆した。次にプレートを、ＰＢＳ中の４％ＢＳＡ溶液を使用して、１時間ブロックし、続いて１ウエルあたり５０μｌの実験培地をデュープリケートにて（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）添加した。プレートを室温で１時間培養し、次に０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０を使用して洗浄した。次にＩＬ−１３に対するビオチン化した第２の抗体の溶液４００ｎｇ／ｍｌ及びＩＦＮγに対するビオチン化した第２の抗体５００ｎｇ／ｍｌの溶液を、ブロック緩衝剤中で作製し、１ウエルあたり１００μｌを加えた。プレートを１時間培養し、再び洗浄した。Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ  ＨＲＰ（ピアスバイオテクノロジー社）接合体の１：８０００希釈液を、ブロック緩衝剤中で作製し、１００μｌをウエルに加え、培養を３０分間続けた。最終洗浄工程を実施し、その後、１００μｌのピアスバイオテクノロジーＴＭＢ基質を、各ウエルに加えた。３０分で着色し、１００μｌの０．１８Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて停止させた。ＯＤを、４５０ｎＭフィルタを有するマイクロプレートリーダを使用して決定した。
【００９２】
ＩＬ−１３の結果を図３に示す。図から明らかなように、式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、ＰＨＡにより誘導されたＩＬ−１３の放出を有意に阻害した。メチルフェニデート（ＭＰ）は、ＩＬ−１３の放出を阻害しなかった。事実、メチルフェニデートは、ＰＨＡ刺激細胞によるＩＬ−１３の放出を増加した。
【００９３】
ＩＦＮγの結果を図４に示す。図から明らかなように、式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、非刺激細胞とＰＨＡで刺激された細胞の両方において、ＩＦＮγの放出を有意に阻害した。メチルフェニデート（ＭＰ）は、非刺激細胞によるＩＦＮγの放出に対していくらかの効果があったが、ＰＨＡで刺激された細胞からのＩＦＮγの放出を有意に抑制しなかった。事実、メチルフェニデートは、ＰＨＡ刺激細胞によるＩＦＮγの放出を増加した。
【実施例３】
【００９４】
健康なヒト志願者ＧＲ１９１から全血を採取し、実施例１で記載されたように処理して、熱不活性化血清及びＰＢＬを得た。（熱不活性化ＧＲ１９１血清を使用して作製した）培地中の式ＩＩの化合物及びメチルフェニデートを、９６ウエルプレートのウエルに加えて、最終濃度が５μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌである式ＩＩの化合物並びに最終濃度が５０μｇ／ｍｌであるメチルフェニデートを得た。水、マウス神経成長因子（ＮＧＦ）（アップステートバイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社）（最終濃度２５０ｎｇ／ｍｌ）及びデキサメタゾン（最終濃度１０μＭ）を対照として使用した。次に、培地中のＧＲ１９１のＰＢＬをウエルに加えて、１ウエルあたりの最終濃度を１５０，０００個の細胞とし、プレートを３７℃かつ５％ＣＯ２で２４時間培養した。この培養後、ＰＨＡを加えて、最終濃度２μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌ、最終総容量２００μｌ／ウエルとし、細胞を３７℃かつ５％ＣＯ２で更に７２時間培養した。全ての培養液をトリプリケートに実施した。
【００９５】
この培養後、細胞増殖を、実施例１に記載されたように決定した。結果を図５Ａ及びＢに表す。図５Ａ及びＢから明らかなように、式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、ＰＨＡで刺激しなかったものと刺激したものの両方で、ＰＢＬの増殖を有意に阻害したが、メチルフェニデート（ＭＰ）は阻害しなかった。
【００９６】
ＰＢＬによるサイトカインの放出も、１５μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物又は１０μＭのデキサメタゾンを有する１ｍｌの管中に、１ｍｌあたり１×１０６個の細胞のＰＢＬを、３７℃かつ５％ＣＯ２で２４時間培養することによって測定した。この培養後、ＰＨＡを加えて、最終濃度を５μｇ／ｍｌとし、細胞を３７℃かつ５％ＣＯ２で更に７２時間培養した。全ての培養液をトリプリケートに実施した。次に細胞を１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して除去した。
【００９７】
上澄み液を収集し、上澄み液中のＩＬ−１３及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＬ−１３のＥＬＩＳＡは、実施例２に記載されたように実施した。結果を図６に表す。図６から明らかなように、式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、ＰＨＡ刺激ＰＢＬからのＩＬ−１３の放出を有意に阻害した。
【００９８】
ＴＮＦαは活性化Ｔ細胞及びその他の細胞により形成された炎症誘発性サイトカインである。ＴＮＦαは内皮細胞に接着分子を発現させ、炎症部位に免疫細胞を動員する役割を果たし得る。ＴＮＦαは多発性の固形悪性腫瘍及び血液悪性腫瘍において検出され得る。ＮＦκＢ及びＡＰ−１を介する細胞生存とカスパーゼ活性を介する細胞死との両方に対するシグナルを含む種々の異なる細胞内シグナルがＴＮＦαにより誘導される。ＮＦκＢは、細胞生存及び複数の腫瘍のタイプにおける発癌プロモータの主要な調節因子である。
【００９９】
ＴＮＦαのＥＬＩＳＡは、ピアスエンドーゲン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ）社からのマッチドペアの抗体を使用して、実施例２に記載されたように実施した（被覆抗体に対して２μｇ／ｍｌ及び第２の抗体に対して２５０ｎｇ／ｍｌ）。結果を図７に表す。図７から明らかなように、式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、ＰＨＡ刺激ＰＢＬからのＴＮＦαの放出を有意に阻害した。
【０１００】
細胞をフローサイトメトリーで更に分析した。アネキシンを使用して、死んでいる、又は死につつある細胞の集団を決定した。抗ＣＤ６９抗体を使用して、細胞活性化のレベルを確立した。Ｔ細胞レセプターαβ（ＴＣＲ）の抗体も使用した。組み換えアネキシン５（ＰＥ及びＦＩＴＣ接合体）並びに抗体は、全てカルタグ（Ｃａｌｔａｇ）社（カリフォルニア州バーリンガム所在）から購入し、製造会社の推奨に従って使用した。以下の結果が観察された。
【０１０１】
（細胞死）
ＴＣＲ陽性細胞のアネキシン染色は、５０μｇ／ｍｌ及び１５μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物により７．３％（バックグラウンド）から、それぞれ４５％及び２３％に増加し、Ｔ細胞集団における細胞死の増加を示した。５μｇ／ｍｌでのＰＨＡによる刺激は、ＴＣＲ陽性細胞のアネキシン染色を６７％に増加した。このことは、ＰＨＡがＴ細胞集団において細胞死も誘導できることを示す。細胞死は、ＰＨＡ＋１５μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物による処置の結果、僅かに減少した（ＰＨＡ及びＩＭＭ０００１ではアネキシン染色されたＴＣＲ陽性細胞は６２％であったのに対して、ＰＨＡ単独では６７％）。ＰＨＡ＋５０μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物は、アネキシン染色で見られるように、ＴＣＲ陽性サブセット細胞において８７％の細胞死を引き起こした。この結果は、式ＩＩの化合物のより高い５０μｇ／ｍｌ濃度が、Ｔ細胞の有意な細胞死を引き起こしたが、より低い１５μｇ／ｍｌ濃度では引き起こさなかったことを示す。デキサメタゾンは、ＴＣＲ陽性細胞のアネキシン染色におけるＰＨＡ誘導増加を救済し（８４％から４８％への減少）、対照化合物が適切に機能していることを実証した。
【０１０２】
（Ｔ細胞の活性化）
ＣＤ６９＋ＴＣＲ染色（活性化Ｔ細胞）は、いずれの対照（無添加、式ＩＩ化合物単独及びデキサメタゾン単独）においても検出されなかった。ＰＨＡは、ＣＤ６９＋ＴＣＲ染色を８４％に増加した。ＣＤ６９染色の増加により検出されたように、ＰＨＡのみがＴ細胞の活性化を引き起こした。ＰＨＡ刺激細胞のＣＤ６９＋ＴＣＲ染色は、５０μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物により８４％から５４％に低下し、１５μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物により６４％に低下した。デキサメタゾンは、ＰＨＡ刺激細胞のＣＤ６９＋ＴＣＲ染色を低減することに関しては、式ＩＩの化合物よりも効果が低かった。従って、式ＩＩの化合物は、Ｔ細胞活性化の減少において、強力な抗炎症剤であるデキサメタゾンよりも効果的である。
【実施例４】
【０１０３】
健康なヒト志願者ＧＲ−１９２から全血を採取し、実施例１で記載されたように処理して、熱不活性化血清及びＰＢＬを得た。次に、ＧＲ−１９２のＰＢＬを、（１０％熱不活性化ＧＲ−１９２血清を使用して作製された培地中の）１５μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物又は１０μＭのデキサメタゾンを有する１ｍｌの管中に、１ｍｌあたり１．３×１０６個の細胞を、３７℃かつ５％ＣＯ２で２４時間培養した。この培養後、ＰＨＡを加えて、最終濃度２μｇ／ｍｌを得て、細胞を３７℃かつ５％ＣＯ２で更に９６時間培養した。全ての培養液をトリプリケートに実施した。次に細胞を、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して除去し、培地を収集した。
【０１０４】
培地へのＩＬ−８の放出をＥＬＩＳＡで測定した。ＩＬ−８は炎症促進性サイトカインであり、強力な化学誘引物質であり、かつ好中球の活性化剤である。また、Ｔリンパ球及び好酸球の化学誘引物質及び活性化剤であることも報告されている。ＩＬ−８は、免疫細胞（リンパ球、好中球、単球及びマクロファージを含む）、繊維芽細胞及び上皮細胞により産生される。ＩＬ−８は強力な血管新生活性を有する。
【０１０５】
ＥＬＩＳＡを実施するために、ヒトＩＬ−８に対する抗体のマッチドペアを、ピアステクノロジー社及びバイオソース社からそれぞれ購入した。ＥＬＩＳＡストリップウエルプレートを、ＩＬ−８（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中）に対する抗体２μｇ／ｍｌを用いて室温で一晩被覆した。次にプレートを、ＰＢＳ中の４％ＢＳＡ溶液を使用して、１時間ブロックし、続いて１ウエルあたり５０μｌの実験培地をデュープリケートにて添加した。プレートを室温で１時間培養し、次に０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０を使用して洗浄した。次に、ＩＬ−８に対するビオチン化した第２の抗体１００ｎｇ／ｍｌの溶液を、ブロック緩衝剤中で作製し、１ウエルあたり１００μｌを加えた。プレートを１時間培養し、再び洗浄した。Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ  ＨＲＰ（ピアスバイオテクノロジー社）接合体の１：８０００希釈液を、ブロック緩衝剤中で作製し、１００μｌをウエルに加え、培養を３０分間続けた。最終洗浄工程を実施し、その後、１００μｌのピアスバイオテクノロジーＴＭＢ基質を、各ウエルに加えた。３０分で着色し、１００μｌの０．１８Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて停止させた。ＯＤを、４５０ｎｍフィルタを有するマイクロプレートリーダを使用して決定した。
【０１０６】
結果を図８に示す。図から明らかなように、式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、ＰＨＡにより誘導されたＩＬ−８の放出を有意に阻害した。
インフルエンザ免疫化提供者から単離され、かつ赤血球凝集素ペプチド３０７−３１９に特異的である、ＣＤ４陽性ヒトＴリンパ球細胞株（ＴＲｉＰＳ）を、前回の刺激の１８〜２０日後におよそ４×１０５個の細胞を使用して継代のために刺激した。細胞を、冷イスコーブ改変ダルベッコ最小必須培地（ＩＭＤＭ，シグマ社）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ））中で一回洗浄し、（マウス腹水から調製した）抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３の１：５００希釈物を含有する１．０ｍｌの冷ＩＭＤＭ培地に再懸濁させた。細胞を抗体と共に氷上で３０分間培養し、次にＦＢＳを含んでいない冷培地で洗浄し、培地＋５０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２（ゼノメトリックス（Ｘｅｎｏｍｅｔｒｉｘ）社）中で、支持細胞として、およそ２×１０６個の４０００Ｒ照射された健康なヒト提供者の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）と合わせた。培養を、３日目に、ＦＢＳ＋ＩＬ−２を有する新鮮なＩＭＤＭ培地を添加して延長した。培養日数は、ＯＫＴ３で刺激した日から測定した。細胞を、７日目（最大増殖）から出発して、典型的には１４日目（再刺激に対する感受性が最も高い）、そして２１日目（静止細胞が老化に近づいている）まで実験に使用することができる。
【０１０７】
活性化実験は、細胞のアリコートを採取し、温ＩＭＤＭ（３７℃）で２回洗浄することによって実施した。各々の特定の分析のために、２×１０５個の生存細胞を、１５μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物又は１０μＭのデキサメタゾンを含有する総容量が０．９ｍｌである温ＩＭＤＭ培地の中にて、３７℃で１５分間プレ培養した。次に、０．１ｍｌの温ＩＭＤＭ中に、活性化刺激剤として２×１０５個のＣＤ３／ＣＤ２８のダイナビーズ（ダイナル（Ｄｙｎａｌ）社）のアリコートを加え、培養液を３７℃で２４時間培養した。細胞を遠心分離によりペレット化した後、細胞培養液の上澄み液を採取した。
【０１０８】
サイトカイン含有物を、特異的ＩＬ−８のＥＬＩＳＡにより上記で記載したように分析した。式ＩＩの化合物は、ＴＲｉＰＳ細胞株によるＩＬ−８産生に効果がないことが見出された。
【実施例５】
【０１０９】
ＴＨＰ−１は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（カタログ番号ＴＩＢ−２０２）から入手した、単球細胞株である。ＴＨＰ−１細胞を、１ｍｌあたり２５０，０００細胞の濃度で培地（１０％ＦＣＳ及びシグマ社から入手した８ｎｇ／ｍｌのモノチオグリセロールを含有するＲＰＭＩ）中に加え、１５μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物又は１０μＭのデキサメタゾンと共に、３７℃かつ５％ＣＯ２で１時間培養した。１時間後、リポ多糖類（ＬＰＳ）（シグマ社から入手した）を培養液に加えて、最終濃度２００ｎｇ／ｍｌとし、次に細胞を更に４時間又は更に２４時間培養した。培養後、細胞を遠心分離し、上澄み液を収集した。上澄み液中のＩＬ−８及びＴＮＦαの濃度をＥＬＩＳＡで測定した。
【０１１０】
上澄み液中のＩＬ−８の濃度を、実施例４で記載されたように、ＥＬＩＳＡにより決定した。結果を下記の表１に表す。表１から明らかなように、式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、ＬＰＳ刺激単球からのＩＬ−８の放出を有意に阻害した。
【０１１１】
ＴＮＦαのＥＬＩＳＡは、実施例２に記載されたように実施した。結果を下記の表２に表す。表２から明らかなように、式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、ＬＰＳ刺激単球からのＴＮＦαの放出を有意に阻害した。
【０１１２】
【表１】
2015003932.tif 000009
【０１１３】
【表２】
2015003932.tif 000010
【実施例６】
【０１１４】
ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔリンパ球白血病細胞株をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（メリーランド州、ロックビルに所在）（カタログ番号：ＴＩＢ−１５２）から入手した。１×１０５細胞／ｍｌのジャーカット細胞を１０％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地（ＡＴＣＣ）中にて、７．５μｇ／ｍｌ又は１５μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）と共に、３７℃かつ５％ＣＯ２で、７２時間培養した。培養後、細胞をＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水にて洗浄し、三等分して、９６ウエルプレート中にて、５μＭの臭化エチジウム二量体−１（ＥＴＨ−Ｄ１）（モレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社から入手した）及び５μＭのカルセインＡＭ溶液（プロメガ社から入手した）と共に３７℃かつ５％ＣＯ２で１時間培養し、細胞の生存を分析した。各ウエルにおける蛍光を励起／発光：４８５／５３０ｎｍ及び５３０／６４５ｎｍにてプレートリーダを使用して測定した。死滅した細胞と生存細胞との相対百分率を、ＥＴＨ−Ｄ１の蛍光強度をカルセインＡＭの蛍光強度にて除することにより計算した。結果を以下の表３に示す。
【０１１５】
【表３】
2015003932.tif 000011
【実施例７】
【０１１６】
１ｍｌの内皮増殖培地−２（ＥＧＭ−２）（ケンブレックス社から入手した）中の継代４（即ち、４細胞集団倍加）のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト供給源ロット番号９７１３（ＡＴＣＣから入手した）を、内皮基礎培地−２（ＥＢＭ−２）（ケンブレックス）中の式ＩＩの化合物（ＣｐｄＩＩ）３０μｇ又はＥＢＭ−２中のメチルフェニデート（ＭＰ）の３０μｇと混合した。水（二つの試験化合物に対するビヒクル）を対照として使用し、ＰＩ３キナーゼ阻害因子、ＬＹ２９４００２（シグマ社）を５０μＭにて陽性対照として包含した。次に、ビーディーバイオサイエンシーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社（メリーランド州ロックビル所在）から入手したチューブ形成アッセイキットに含まれるプレートのウエルに、ウエル当たり１００００個の細胞を播種した。同プレートのウエルは細胞外基質タンパク質ゲルを含んでいた。チューブ形成を開始するために、ウシ胎仔血清ＦＣＳ（ＡＴＣＣ）を５％の最終濃度となるように加えた。次に、同プレートを３７℃かつ５％ＣＯ２で１８時間培養した。培養後、プレートを倒立顕微鏡に備え付けたデジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＭＴ−２；１０の位相差（ＰＣ）にて）で撮影した。
【０１１７】
血管新生性のシグナルの存在下にて内皮細胞を細胞外基質タンパク質ゲル上にて培養すると、それらは大まかには毛細血管に類似する構造を構築した。この分析に対する基礎的なチューブ形成を確立するために、ＣｐｄＩＩ及びＭＰの溶液中に存在する水と同量の水で細胞を処理した。この処理により、複数の分岐点を有する格子状の内皮細胞構築物を形成した。ＣｐｄＩＩ及びＬＹ２９４００２を使用した処理では、ウエル内での分岐及び細胞間相互作用の量は低減し、細胞は分離されたクラスターのままであった。ＭＰは内皮細胞が毛細血管に類似する構造を構築する能力に観察可能な影響を与えなかった。これらのデータは、ＣｐｄＩＩは血管新生のこの工程に干渉するが、ＭＰは干渉しないことを示している。
【実施例８】
【０１１８】
ＥＭＧ−２＋５０ｎｇ／ｍｌの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（シグマ社から入手した）中、又はＥＧＭ−２完全培地（２％ＦＣＳ、ヒドロコルチゾン、ヒト繊維芽細胞成長因子Ｂ、ＶＥＧＦ、組換えインスリン様成長因子−１、アスコルビン酸塩、ヒト上皮成長因子、ゲンタマイシン及びヘパリンを含む）（ケンブレックス社から入手した）中の継代４のＨＵＶＥＣ（ロット番号９７１３）を、９６ウエル組織培養プレートにウエル当たり５０００個の細胞にて加えた。以下の添加剤を細胞に加えた：水（ビヒクル対照）、５μｇ／ｍの式ＩＩの化合物（ＣｐｄＩＩ）；１５μｇのＣｐｄＩＩ．又は３０μｇのＣｐｄＩＩ。３７℃かつ５％ＣＯ２で４８時間培養後、細胞増殖を、実施例１で記載したように、Ｐｒｏｍｅｇａ細胞滴定量分析により評価したが、Ｐｒｏｍｅｇａ細胞滴定用試薬を加えてから２時間のみプレートを培養した点が異なる。
【０１１９】
結果を以下の表４に示す。表４から明らかなように、ＣｐｄＩＩはウエル内で検出される細胞の数を用量依存的に低減した。１５μｇ／ｍｌのＣｐｄＩＩと３０μｇ／ｍｌのＣｐｄＩＩにて見られる低減は統計的に有意であった。成長因子を含んでいないウエルは含まれていなかったので、ＣｐｄＩＩにて見られる細胞数の減少が増殖の阻害によるものであるのか、或いは細胞毒性の効果によるものであるのかに関しては決定することが不可能である。
【０１２０】
【表４】
2015003932.tif 000012
【実施例９】
【０１２１】
ＨｅｐＧ２は、ヒト肝癌細胞株であり、ＡＴＣＣから入手した。ＨｅｐＧ２細胞を、２５ｃｍ２のフラスコ内の１０％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地でコンフルエンシーに達するまで培養した。次に細胞を以下のようにトリプシン処理した。各フラスコ中の培地を吸引し、５ｍｌの０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（ケンブレックス社）と置き換えた。細胞がフラスコに吸着しなくなるまで、同細胞を顕微鏡にてモニタリングした。次に、５ｍｌのトリプシン中和溶液（ＴＮＳ）（ケンブレックス社）を各フラスコに加えて反応を停止した。細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液を吸引した。細胞を新たな培地中にて再懸濁させ、計数した。次に、１．２２×１０６細胞／ｍｌにて含有される媒地中の細胞懸濁液の４ｍｌを１ｍｌの更なる培地とともに混合した。次に、得られた細胞懸濁液をウエル当たり０．５ｍｌの量にて、２４ウエル培養プレートのウエルに加えた（約５００，０００細胞／ウエル）。細胞を以下の表５に記載したように処置して、３７℃にて５％のＣＯ２の存在下又は非存在下にて２４時間培養した。上澄み液をウエルから除去し、遠心分離を実施して崩壊堆積物を除去した。次に上澄み液についてはエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生について分析した。ＥＰＯはアール＆ディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）社（ミネソタ州ミネアポリス所在）（カタログ番号ＤＥ９００）から得られたキットを使用して、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡを測定した。
【０１２２】
結果を以下の表５に示す。表５に示されるように、ＣｐｄＩＩはＨｅｐＧ２細胞からのＥＰＯの放出を有意に阻害した。ＥＰＯの減少は、血管新生における阻害効果を有するであろう。生存細胞の分析は実施しなかったが、細胞の形態は、顕微鏡分析に基づいて正常であった。
【０１２３】
【表５】
2015003932.tif 000013
【実施例１０】
【０１２４】
継代４のＨＵＶＥＣ、ロット番号９７１３を、ＩＴＳＳ（インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸ナトリウム）（シグマ社から入手した）で補充した５００μｌのＥＧＭ−２完全培地（血清又はアスコルビン酸は含まない）中に、２０，０００細胞／ウエルで４８ウエル組織培養プレートの各ウエルに入れた。また、継代４のＨＵＶＥＣ、ヒト供給源ロット番号７０１６（ＡＴＣＣから入手した）を、ＩＴＳＳで補充した、５００μｌのＥＧＭ−２完全培地（血清又はアスコルビン酸は含まない）中に、２０，０００細胞／ウエルで４８ウエル組織培養プレートのウエルに加えた。以下の添加剤を細胞に加えた：水（ビヒクル対照）及び１５μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）。３７℃かつ５％ＣＯ２で１時間の培養後、ＬＰＳを加えて、最終濃度２００ｎｇ／ｍｌとして、細胞を３７℃かつ５％ＣＯ２で一晩培養した。この培養後、上澄み液を収集し、上澄み液中のＩＬ−８の量を、実施例４で記載されたようにＥＬＩＳＡで決定した。
【０１２５】
結果を下記の表６に示す。表６から明らかなように、Ｃｐｄ．ＩＩは、７０１６ＨＵＶＥＣによるＩＬ−８の放出を完全に排除し、９７１３ＨＵＶＥＣでは、ＩＬ−８の放出を９０％減少した。
【０１２６】
【表６】
2015003932.tif 000014
【実施例１１】
【０１２７】
継代４のＨＵＶＥＣ、ヒト供給源ロット番号８７１０（ＡＴＣＣから入手した）を、ＥＧＭ−２培地中に、５，０００細胞／ウエルで２４ウエル組織培養プレートのウエルに入れ、３７℃かつ５％ＣＯ２で７２時間培養した。次に、培地を新鮮な培地に変えて、以下の添加剤を細胞に加えた：水（ビヒクル対照）；１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ若しくは３０μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）；１５μｇ／ｍｌのメチルフェニデート（ＭＰ）；１０μＭのＬＹ２９４００２；又は１０μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）。３７℃かつ５％ＣＯ２で１時間の培養後、ＴＮＦα（ピアス社）を加えて、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとし、細胞を３７℃かつ５％のＣＯ２で更に１８時間培養した。この培養後、上澄み液を収集し、上澄み液中のＩＬ−８の量を、実施例４で記載されたようにＥＬＩＳＡで決定した。
【０１２８】
結果を下記の表７に示す。表７から明らかなように、Ｃｐｄ．ＩＩは、ＴＮＦαで刺激されたＩＬ−８の放出を用量依存的に減少するが、高い用量（３０μｇ／ｍｌ）によりいくらかの細胞死が引き起こされたことは明白であった。Ｄｅｘ及びＭＰは、ＩＬ−８の放出を僅かに減少し、ＬＹ２９４００２は、ＩＬ−８の放出を有意に減少した。
【０１２９】
【表７】
2015003932.tif 000015
【実施例１２】
【０１３０】
転写因子ＮＦκＢ（核性因子κＢ）は、免疫、急性期及び炎症性反応のメディエーターをコードする種々の遺伝子の発現の調節に関与している。ＮＦκＢは、細胞生存及び発癌プロモータの主要な調節因子である。哺乳動物においてＮＦκＢファミリーの５個のサブユニットがある：即ち、ｐ５０、ｐ６５（ＲｅＩＡ）、ｃ−Ｒｅｌ、ｐ５２及びＲｅＩＢである。ｐ５０／ｐ６５ヘテロ二量体及びｐ５０ホモ二量体は、ＮＦκＢシグナル経路で見出される最も一般的な二量体である。ＮＦκＢは、リポ多糖類のような細菌細胞壁の成分、又はＴＮＦα若しくはＩＬ−１βのような炎症性サイトカインを含む多数の刺激により活性化され得る。
【０１３１】
活性化タンパク質−１（ＡＰ−１）は、細胞周期の間に活性化して細胞生存、分化及び適応応答を促進する転写因子である。ＡＰ−１タンパク質は、増殖及び細胞周期進行に関わる多くの遺伝子の発現において役割を果たす。例えば、ｒａｓ、ｒａｓＦ、及びｍｅｋのような、増殖因子シグナル伝達経路で機能する癌遺伝子による細胞形質転換は、ＡＰ−１成分タンパク質発現の高い増加をもたらす。従って、ＡＰ−１は、悪性及び転移の際に観察される侵襲性過程を支持する遺伝子を調節する。ＡＰ−１は、ＡＴＦＩ−４、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ及びＣ／ＥＢＰを含む、構造的に関連する転写因子の大きなファミリーに属する。ＡＰ−１は、ｃ−Ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、Ｆｒａ−１、Ｆｒａ−２、ｃ−Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ及びＪｕｎＤを含む、Ｆｏｓ及びＪｕｎファミリーから誘導されるタンパク質のヘテロ二量体複合体の混合物から構成される。主に、ＡＰ−１二量体は、ＴＰＡ−応答配列（ＴＲＥ）のＤＮＡに結合する。ＡＰ−１の発現は、血清、増殖因子、ホルボールエステル、癌遺伝子、ＴＧＦ−βのサイトカイン、ＴＮＦ及びインターフェロンファミリー、ニューロン脱分極、並びに細胞ストレスのような複数の刺激により誘導される。
【０１３２】
継代５のＨＵＶＥＣ、ヒト供給源ロット番号８７５０を、２５ｃｍ２のフラスコ中のＥＧＭ−２培地でコンフルエンスまで増殖した。以下の添加剤を、フラスコ（総容量５ｍｌ／フラスコ）中にて、２％ＦＣＳ、ＧＡ１０００（ゲンタマイシン）、ヘパリン及びアスコルビン酸（全てケンブレックス社から入手した）を含有するＥＧＭ−２培地に加えた：１μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）；５μｇ／ｍｌのＣｐｄ．ＩＩ；１５μｇ／ｍｌのＣｐｄ．ＩＩ；１５μｇ／ｍｌのメチルフェニデート（ＭＰ）；又は１０μＭのＬＹ２９４００２。フラスコを３７℃かつ５％ＣＯ２で一晩培養した。この培養後、ＶＥＧＦを加えて、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとして、フラスコを更に３０分間培養した。
【０１３３】
次に、ＮＦκＢの量を、アクティブモチーフノースアメリカ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ）社（カリフォルニア州、カールスバッド所在）から入手したＴｒａｎｓＡＭ（登録商標）ＮＦκＢ  ｐ６５／ＮＦκＢ  ｐ５０転写因子アッセイキット及び核抽出キットを製造会社の使用説明書に従って使用して、決定した。要するに、細胞の核抽出液は核抽出キットを使用して調製した。次に、核抽出液を、ＴｒａｎｓＡＭ（商標）キットの９６ウエルプレートのウエルに加えた。ＮＦκＢコンセンサス結合部位を含有するオリゴヌクレオチドをウエル中に固定化し、核抽出液に含有された活性化ＮＦκＢをオリゴヌクレオチドと結合した。次に、ＮＦκＢのｐ６５又はｐ５０サブユニットに対する抗体を加え、オリゴヌクレオチドに結合したＮＦκＢ複合体を検出した。次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した第２抗体を加えて、吸光光度分析（４５０ｎｍで測定）により定量化した、比色分析の測定値を提供した。
【０１３４】
ｃ−Ｊｕｎの量を、アクティブモチーフノースアメリカ社（カリフォルニア州、カールスバッド所在）から入手したＴｒａｎｓＡＭ（登録商標）ＡＰ−１ファミリー転写因子アッセイキット及び核抽出キットを製造会社の使用説明書に従って使用して、決定した。要するに、細胞の核抽出液は核抽出キットを使用して調製した。次に、核抽出液を、ＴＰＡ応答配列（ＴＲＥ）を含有するオリゴヌクレオチドが固定化されている、９６ウエルプレートのウエルに加えた。核抽出液に含有されている活性化タンパク質−１（ＡＰ−１）二量体を、このオリゴヌクレオチドに結合し、ｃ−Ｊｕｎに特異的な抗体を使用して検出した。次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した第２抗体を加えて、吸光光度分析（４５０ｎｍで測定）により定量化した、比色分析の測定値を提供した。
【０１３５】
結果を下記の表８及び９に示す。表８から明らかなように、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ処置は、ＴｒａｎｓＡＭ分析で検出されたように、ほぼ２倍の活性化ＮＦκＢをもたらした。１５μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌでのＣｐｄ．ＩＩは、活性化ＮＦκＢの量を基礎レベルにまで低減した。表９から明らかなように、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ処置は、ｃ−Ｊｕｎの増加をもたらした。１５μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌでのＣｐｄ．ＩＩは、ｃ−Ｊｕｎの量の増加を、完全に排除した。
【０１３６】
【表８】
2015003932.tif 000016
【０１３７】
【表９】
2015003932.tif 000017
【実施例１３】
【０１３８】
継代８のヒト腸骨動脈内皮細胞（ＨＩＡＥＣ）（ＡＴＣＣから入手した；カタログ番号ＣＣ−２５４５）を、２５ｃｍ２フラスコ中のＥＧＭ−２培地でコンフルエンスまで増殖した。実験の１８時間前、培地を、０．１％ＦＣＳ＋ヘパリン、ＧＡ１０００（ゲンタマイシン）及び牛下垂体抽出液（全てケンブレックス社から入手した）を含有するＥＧＭ−２培地に代えて、細胞を静止状態にした。実験を実施するために、培地をフラスコから吸引し、続いて以下の添加剤を、フラスコ中の新鮮な培地に加えた（総容量５ｍｌ／フラスコ）：１５μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）又は１０μＭのＬＹ２９４００２。フラスコを３７℃かつ５％ＣＯ２で２時間培養した。この培養後、ＶＥＧＦ又はＴＮＦαを加えて、最終濃度を１０ｎｇ／ｍｌとし、フラスコを更に３０分間培養した。次に、ＮＦκＢの量を、実施例１２で記載されたように、アクティブモチーフノースアメリカ社（カリフォルニア州、カールスバッド所在）から入手したＴｒａｎｓＡＭ（登録商標）ＮＦκＢ  ｐ６５／ＮＦκＢ  ｐ５０転写因子アッセイキット及び核抽出キットを使用して決定した。
【０１３９】
結果を下記の表１０に示す。表１０から明らかなように、ＨＵＶＥＣのＴＮＦα処理は、ＴｒａｎｓＡＭ分析により検出されたように、活性化ＮＦκＢの量を極めて大きく増加した。１５μｇ／ｍｌのＣｐｄ．ＩＩは、活性化ＮＦκＢの量を約８２％低減した。ＶＥＧＦによる処理は、ＴＮＦαで達成された活性化ＮＦκＢの増加と同じ大きさの増加をもたらさなかったが、増加量は、Ｃｐｄ．ＩＩにより７０％低減された。
【０１４０】
【表１０】
2015003932.tif 000018
【実施例１４】
【０１４１】
１８日目のＴＲｉＰＳ細胞、１×１０６個を、何も添加しないか（「無添加（Ｎｉｌ）」）、１００，０００細胞あたり１μｌのＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（ダイナル社（ノルウェー国オスロに所在））（「ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ」）を添加するか、或いはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと１５μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）とを添加して、３７℃で３０分間培養した。培養後、細胞を細胞溶解性哺乳動物細胞抽出試薬（Ｃｅｌｌ−Ｌｙｔｉｃ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（シグマ社）で溶解した。遠心分離にてペレット細胞片にした後、上澄み液（細胞抽出液）を得た。
【０１４２】
次に細胞抽出液（上澄み液）を、製造会社の使用説明書に従って、Ｃｕｓｔｏｍ  ＡｎｔｉｂｏｄｙＡｒｒａｙ（商標）（ハイプロマトリクス（Ｈｙｐｒｏｍａｔｒｉｘ）社、マサチューセッツ州ウスターに所在）を使用して分析した。Ｃｕｓｔｏｍ  ＡｎｔｉｂｏｄｙＡｒｒａｙ（商標）は、下記に列挙されているタンパク質に対する抗体でブロットされたナイロン膜である。要するに、細胞抽出液を、室温でゆっくりと振とうしながら、デュープリケートＣｕｓｔｏｍ  ＡｎｔｉｂｏｄｙＡｒｒａｙ（商標）により２時間培養し、続いてトリス緩衝剤（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭトリス、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）により３回洗浄した。トリス緩衝剤中に、リン酸化チロシン、リン酸化セリン及びリン酸化トレオニンに特異的なＨＲＰ標識抗体を加え、アレイを２時間培養した。トリス緩衝剤でさらに３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ反応性ルミネセンス基質を加えた。アレイをＸ線フィルムに暴露して可視化した。Ｘ線フィルムの濃度測定を、走査及びコンピューター分析によって行った。結果を下記の表１１に要約した。
【０１４３】
【表１１】
2015003932.tif 000019
【実施例１５】
【０１４４】
ＭＣ／９マウス繊維芽細胞株（ＡＴＣＣから入手した、カタログ番号ＣＲＬ−８３０５）の細胞を、２５，０００細胞／ウエルで９６ウエル組織培養プレートのウエルに中に入れた。培地は、１０％ＦＣＳを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ケンブレックス社から入手した）であった。無対照ウエルは添加剤を含まなかった。残りのウエルは、２５ｎｇ／ｍｌのマウス神経成長因子（ＮＧＦ）（アップステートバイオテクノロジー社（ニューヨーク州レークプラシッドに所在）から入手した）、又は２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ及び５％のＴＳＴＩＭ（ビーディーバイオサイエンシーズ社から入手した、ラットから調製し、かつコンカナバリンＡを含有する培養補充物）のいずれかを含有した。加えて、以下の添加剤を細胞に加えた：水（ビヒクル対照）；５μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）；１５μｇ／ｍｌのＣｐｄ．ＩＩ；又は３０μｇ／ｍｌのＣｐｄ．ＩＩ。３７℃かつ５％ＣＯ２にて７２時間培養した後、細胞増殖を、実施例１で記載したように、Ｐｒｏｍｅｇａ細胞滴定量分析により評価した。結果を下記の表１２に示す。
【０１４５】
【表１２】
2015003932.tif 000020
【実施例１６】
【０１４６】
ＴＨＰ−１細胞を、１ｍｌあたり２５０，０００細胞の濃度で培地（１０％ＦＣＳ及び８ｎｇ／ｍｌのモノチオグリセロールを含有するＲＰＭＩ）の中に加え、５μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）又は１５μｇ／ｍｌのＣｐｄ．ＩＩと共に３７℃かつ５％ＣＯ２で１時間培養した。１時間後、リポ多糖類（ＬＰＳ）を培養液に加えて、最終濃度２００ｎｇ／ｍｌとして、次に細胞を更に２４時間培養した。培養後、ＮＦκＢ及びｃ−Ｊｕｎの量を、実施例１２で記載されたように決定した。ｃ−Ｆｏｓの量も、アクティブモチーフノースアメリカ社（カリフォルニア州、カールスバッド所在）から入手したＴｒａｎｓＡＭ（登録商標）ＡＰ−１ファミリー転写因子アッセイキット及び核抽出キットを製造会社の使用説明書に従って使用して、決定した。要するに、細胞の核抽出液は核抽出キットを使用して調製した。次に、核抽出液を、ＴＰＡ応答配列（ＴＲＥ）を含有するオリゴヌクレオチドが固定化されている、９６ウエルプレートのウエルに加えた。核抽出液に含有されている活性化タンパク質−１（ＡＰ−１）二量体を、このオリゴヌクレオチドに結合させ、ｃ−Ｆｏｓに特異的な抗体を使用して検出した。次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した第２抗体を加えて、吸光光度分析（４５０ｎｍで測定）により定量化した、比色分析の測定値を提供した。結果を図９Ａ及びＢに示す。
【実施例１７】
【０１４７】
１０日目のＴＲｉＰＳ細胞、１×１０６個を、１５μｇ／ｍｌの式ＩＩの化合物（Ｃｐｄ．ＩＩ）と共に３７℃で１時間培養した。次に細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ダイナル社から入手した）（１００，０００細胞あたり１μｌ）とともに３７℃で１０分間培養した。次に細胞を、（以下に記載されるＰｉｅｒｃｅ  ＥＺ−Ｄｅｔｅｃｔ活性化キットで補充された）緩和な緩衝剤で溶解して、細胞抽出液を生成した。得られた抽出液のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）分析（ピアス社）により決定し、直ぐに使用するために氷の上に置いた。
【０１４８】
プルダウンアッセイは、Ｒａｓ及びＲＡＰ−１のためにそれぞれＧＳＴ−ＲＡＦ−１−ＲＢＤ及びＧＳＴ−ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤを利用し、製造会社の使用説明書に従って、Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＺ−Ｄｅｔｅｃｔ活性化キットを使用して実施した。要するに、各抽出液からの４００μｇの総タンパク質を、組み換えタンパク質及びグルタチオン樹脂と合わせ、穏やかに振とうしながら、４℃で１時間培養した。次に樹脂を洗浄して非結合タンパク質を除去し、活性化Ｒａｓ及びＲＡＰ−１タンパク質を、還元剤を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ装填染料の存在下で沸騰することにより除去した。キットから供給される抗体を使用して、Ｒａｓ及びＲＡＰ−１のウエスタンブロットを実施して、タンパク質を可視化した。Ｘ線フィルムの濃度測定を、走査及びコンピューター分析によって行った。
【０１４９】
結果を表１３に示す。表１３から明らかなように、ＴＲｉＰＳ細胞をＣｐｄ．ＩＩと共に培養することによって、Ｒａｓタンパク質の非常に強力な阻害をもたらした。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる細胞の刺激は、予測されたほどにはＲＡＰ−１タンパク質の量を増加しなかったが、Ｃｐｄ．ＩＩは、ＲＡＰ−１も阻害したように思われる。
【０１５０】
【表１３】
2015003932.tif 000021
本発明の前述の考察は、例示及び説明の目的のために提示されている。前述の記載は、本明細書で開示されている形態に本発明を制限することを意図していない。本発明の記載は１つ以上の実施態様、並びに特定の変形及び変更の記載を含むが、その他の変形及び変更が本発明の範囲内であり、例えば、本発明の開示を理解した後では、当業者の技術及び知識の範囲内であり得る。クレームされたものの代替の、交換可能な、及び／又は同等の構造、機能、範囲又は工程を、そのような代替の、交換可能な、及び／又は同等の構造、機能、範囲又は工程が本明細書に開示されているか否かに関わらずに包含し、あらゆる特許可能な事項を公に開放することを意図しない、許容される範囲で代替的実施態様を含む権利を得ることが意図される。
【０１５１】
以下に、上記実施形態から把握できる技術思想を付記として記載する。
［付記１］
血管新生を阻害するための治療剤であって、式Ｉ
【０１５２】
【化７】
2015003932.tif 000022
（式中、ｎは、１〜５の整数であり、
Ｒ１は、それぞれ独立して、アリール、ヘテロアリール、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、カルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン、アミノ、ニトロ、スルホ、又はスルフヒドリルであり、ここで各アルキルは、ヒドロキシル、アミノ、又はスルフヒドリルで選択的に置換されており；かつ
Ｒ２は、水素又は低級アルキルである）
で示される化合物、又はその塩若しくはプロドラッグの有効量を含む、治療剤。
【０１５３】
［付記２］
血管新生性の疾患又は病状を治療するための治療剤であって、式Ｉ
【０１５４】
【化８】
2015003932.tif 000023
（式中、ｎは、１〜５の整数であり、
Ｒ１は、それぞれ独立して、アリール、ヘテロアリール、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、カルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン、アミノ、ニトロ、スルホ、又はスルフヒドリルであり、ここで各アルキルは、ヒドロキシル、アミノ、又はスルフヒドリルで選択的に置換されており；かつ
Ｒ２は、水素又は低級アルキルである）
で示される化合物、又はその塩若しくはプロドラッグの有効量を含む、治療剤。
【０１５５】
［付記３］
眼内の血管新生性の疾患及び病状を治療するための治療剤であって、式Ｉ
【０１５６】
【化９】
2015003932.tif 000024
（式中、ｎは、１〜５の整数であり、
Ｒ１は、それぞれ独立して、アリール、ヘテロアリール、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、カルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン、アミノ、ニトロ、スルホ、又はスルフヒドリルであり、ここで各アルキルは、ヒドロキシル、アミノ、又はスルフヒドリルで選択的に置換されており；かつ
Ｒ２は、水素又は低級アルキルである）
で示される化合物、又はその塩若しくはプロドラッグの有効量を含む、治療剤。
【０１５７】
［付記４］
前記眼内の血管新生性の疾患及び病状は糖尿病性網膜症である、付記３に記載の治療剤。
【０１５８】
［付記５］
前記眼内の血管新生性の疾患及び病状は黄斑変性である、付記３に記載の治療剤。
［付記６］
前記眼内の血管新生性の疾患及び病状は未熟児網膜症、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後繊維増殖症又はルベオーシスである、付記３に記載の治療剤。
【０１５９】
［付記７］
新生物疾患を治療するための治療剤であって、式Ｉ
【０１６０】
【化１０】
2015003932.tif 000025
（式中、ｎは、１〜５の整数であり、
Ｒ１は、それぞれ独立して、アリール、ヘテロアリール、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、カルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン、アミノ、ニトロ、スルホ、又はスルフヒドリルであり、ここで各アルキルは、ヒドロキシル、アミノ、又はスルフヒドリルで選択的に置換されており；かつ
Ｒ２は、水素又は低級アルキルである）
で示される化合物、又はその塩若しくはプロドラッグの有効量を含む、治療剤。
【０１６１】
［付記８］
前記新生物疾患は腫瘍である、付記７に記載の治療剤。
［付記９］
前記腫瘍は悪性腫瘍である、付記８に記載の治療剤。
【０１６２】
［付記１０］
前記腫瘍は、膀胱、脳、胸部、頸部、結腸、直腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、胃又は子宮の腫瘍である、付記９に記載の治療剤。
【０１６３】
［付記１１］
前記腫瘍は、脳、胸部、結腸、肝臓、又は膵臓の腫瘍である、付記１０に記載の治療剤。
【０１６４】
［付記１２］
前記腫瘍は脳の腫瘍である、付記１１に記載の治療剤。
［付記１３］
前記脳の腫瘍はグリア芽腫である、付記１２に記載の治療剤。
【０１６５】
［付記１４］
前記新生物疾患は腫瘍転移である、付記７に記載の治療剤。
［付記１５］
増殖性疾患を治療するための治療剤であって、式Ｉ
【０１６６】
【化１１】
2015003932.tif 000026
（式中、ｎは、１〜５の整数であり、
Ｒ１は、それぞれ独立して、アリール、ヘテロアリール、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、カルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン、アミノ、ニトロ、スルホ、又はスルフヒドリルであり、ここで各アルキルは、ヒドロキシル、アミノ、又はスルフヒドリルで選択的に置換されており；かつ
Ｒ２は、水素又は低級アルキルである）
で示される化合物、又はその塩若しくはプロドラッグの有効量を含む、治療剤。
【０１６７】
［付記１６］
前記増殖性疾患は癌である、付記１５に記載の治療剤。
［付記１７］
前記癌は上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、リンパ腫又は白血病である、付記１６に記載の治療剤。
【０１６８】
［付記１８］
前記増殖性疾患はメサンギウム細胞増殖性疾患である、付記１５に記載の治療剤。
［付記１９］
前記増殖性疾患は繊維性疾患である、付記１５に記載の治療剤。
【０１６９】
［付記２０］
前記増殖性疾患は過剰増殖性皮膚疾患である、付記１５に記載の治療剤。
［付記２１］
前記過剰増殖性皮膚疾患は皮膚癌である、付記２０に記載の治療剤。
【０１７０】
［付記２２］
Ｒ１は、それぞれ独立して、アリール、ヘテロアリール、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、アミノ、ニトロ、スルホ又はスルフヒドリルである、付記１乃至２１のいずれか一項に記載の治療剤。
【０１７１】
［付記２３］
Ｒ１は、それぞれ独立して、アリール、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アリールオキシ又はアシルである、付記１乃至２１のいずれか一項に記載の治療剤。
【０１７２】
［付記２４］
Ｒ１は、それぞれ独立して、アリール、アルキル、又はシクロアルキルである、付記１乃至２１のいずれか一項に記載の治療剤。
【０１７３】
［付記２５］
Ｒ１は、それぞれ独立して、アリールである、付記１乃至２１のいずれか一項に記載の治療剤。
【０１７４】
［付記２６］
化合物が下記：
【０１７５】
【化１２】
2015003932.tif 000027
で示される、付記１乃至２１のいずれか一項に記載の治療剤。
【０１７６】
［付記２７］
式ＩＡ：
【０１７７】
【化１３】
2015003932.tif 000028
（式中、ｎは、１〜５の整数であり、
Ｒ１は、それぞれ独立して、式−Ｃ（Ｏ）−Ｒ８、−ＯＲ７又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ３の部分であり、
Ｒ２は、水素又は低級アルキルであり、
Ｒ３は、水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ７はアリールであり、かつ
Ｒ８はシクロアルキル又はアリールである）
で示される化合物。
【０１７８】
［付記２８］
Ｒ１は、式−ＯＲ７の部分である、付記２７に記載の化合物。
［付記２９］
Ｒ７はフェニルである、付記２８に記載の化合物。
【０１７９】
［付記３０］
ｎは１又は２である、付記２７、２８又は２９に記載の化合物。
［付記３１］
式ＩＡ：
【０１８０】
【化１４】
2015003932.tif 000029
（式中、ｎは、１〜５の整数であり、
Ｒ１は、それぞれ独立して、式−Ｃ（Ｏ）−Ｒ８、−ＯＲ７又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ３の部分であり、  Ｒ２は、水素又は低級アルキルであり、
Ｒ３は、水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ７はアリールであり、かつ  
Ｒ８はシクロアルキル又はアリールである）
で示される化合物又はその塩若しくはプロドラッグと、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
【０１８１】
［付記３２］
Ｒ１は、式−ＯＲ７の部分である、付記３１に記載の医薬組成物。
［付記３３］
Ｒ７はフェニルである、付記３２に記載の医薬組成物。
【０１８２】
［付記３４］
ｎは１又は２である、付記３１、３２又は３３に記載の医薬組成物。
【図１Ａ】
2015003932.tif 000032
【図１Ｂ】
2015003932.tif 000033
【図１Ｃ】
2015003932.tif 000034
【図２】
2015003932.tif 000035
【図３】
2015003932.tif 000036
【図４】
2015003932.tif 000037
【図５Ａ】
2015003932.tif 000038
【図５Ｂ】
2015003932.tif 000039
【図６】
2015003932.tif 000040
【図７】
2015003932.tif 000041
【図８】
2015003932.tif 000042
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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