(57)【要約】【課題】微生物の増殖の悪化を伴うことなく、微生物のペントース資化能を向上させること、さらには、微生物を用いることにより、ペントースを含有する有機原料から有機化合物をより効率よく製造する方法を提供すること。【解決手段】有機化合物生産能およびペントース資化能を有し、かつ、イノシトール輸送体をコードする遺伝子が導入され、または該遺伝子の発現が非誘導株もしくは非改変株と比較して増強された、微生物またはその処理物を、水性媒体中でペントースを含有する有機原料に作用させることにより有機化合物を生産させる工程を有することを特徴とする有機化合物の製造方法。【選択図】図１
2015029471.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機化合物生産能およびペントース資化能を有し、かつ、イノシトール輸送体をコードする遺伝子が導入され、または該遺伝子の発現が非誘導株もしくは非改変株と比較して増強された、微生物またはその処理物を、水性媒体中でペントースを含有する有機原料に作用させることにより有機化合物を生産させる工程を有する
ことを特徴とする有機化合物の製造方法。
【請求項２】
前記微生物の、イノシトール輸送体をコードする遺伝子の発現を抑制する転写因子をコードする遺伝子の発現が非改変株と比較して低減されている
ことを特徴とする、請求項１に記載の有機化合物の製造方法。
【請求項３】
前記微生物が、イノシトールを含有する有機原料の存在下で培養されたものである
ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の有機化合物の製造方法。
【請求項４】
前記水性媒体が、イノシトールを含有する
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の有機化合物の製造方法。
【請求項５】
前記ペントースがキシロースであり、かつ、前記微生物が、さらに、キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子が導入され、もしくは該遺伝子の発現が増強されている
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の有機化合物の製造方法。
【請求項６】
前記微生物が、さらに、キシルロキナーゼをコードする遺伝子が導入され、または該遺伝子の発現が増強されている
ことを特徴とする請求項５に記載の有機化合物の製造方法。
【請求項７】
有機化合物生産能およびペントース資化能を有し、かつ、イノシトール輸送体をコードする遺伝子が導入、または該遺伝子の発現が非誘導株または非改変株と比較して増強された微生物を、ペントースを含有する有機原料の存在下で培養する
ことを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項８】
前記微生物が、イノシトールを含有する有機原料の存在下で培養されたものである
ことを特徴とする、請求項７に記載の微生物の培養方法。
【請求項９】
有機化合物生産能およびペントース資化能を有し、かつ、イノシトール輸送体をコードする遺伝子の発現が非改変株と比較して増強されたものである
ことを特徴とする、コリネ型細菌。
【請求項１０】
イノシトール輸送体をコードする遺伝子の発現を抑制する転写因子をコードする遺伝子の発現が非改変株と比較して低減されたものである
ことを特徴とする、請求項９に記載のコリネ型細菌。
【請求項１１】
前記コリネ型細菌が、さらに、キシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されたものである
ことを特徴とする、請求項９または請求項１０に記載のコリネ型細菌。
【請求項１２】
前記コリネ型細菌が、さらに、キシルロキナーゼ遺伝子が導入され、または該遺伝子の発現が増強されたものである
ことを特徴とする、請求項１１に記載のコリネ型細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペントース利用技術に関するものであり、微生物のペントース資化能を向上させる技術、その微生物を用いることによる効率的な有機化合物の製造技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖質系バイオマスを原料とした有機化合物の発酵生産プロセスは、広く利用されており、また前記プロセスを経て得られた生産物は、種々の工業原料として利用されている。
これら発酵生産プロセスの原料として使用される糖質系バイオマスとしては、サトウキビ、デンプン、テンサイ、とうもろこし、いも、キャッサバ、サトウカエデなどの可食原料に由来するものが挙げられる。
【０００３】
しかし、これらの可食原料由来の糖は、今後の世界人口増加による可食原料価格の高騰、および天候不順や気候変動による可食原料の供給不足といった懸念がある。また食料不足の際に、可食原料を食用用途と競合して工業原料に利用することに対する倫理上の批判等の懸念もある。そこで、このような懸念のない非可食原料に由来するセルロース系バイオマスの利用が注目されている。
【０００４】
セルロース系バイオマスは、農業廃棄物や木質廃棄物として多種多様かつ安価に入手可能であり、将来的な食料確保の障害とならない原料である。
セルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース、リグニンなどから構成されており、セルロースはグルコース（ヘキソース）が、ヘミセルロースはキシロースやアラビノース等のペントースが主要成分となっている。セルロース系バイオマスを原料として有機化合物を効率的に発酵生産するためには、高効率なペントース利用技術が求められている。
【０００５】
特許文献１には、アラビノーストランスポーターＡｒａＥを導入したコリネ型細菌を用いることによってキシロース消費速度を向上させ、グルコースとの同時利用も向上させたことが記載されている。
非特許文献１には、コリネ型細菌において、グルコースの取り込み経路をイノシトール輸送体ＩｏｌＴ１、ＩｏｌＴ２を介した経路に改変することによって、コハク酸生産が向上し得ることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００９／１５４１２２号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉｏｅｎｇ  Ｂｕｇｓ．，２０１１，Ｓｅｐ−Ｏｃｔ  ２（５），ｐ２９１−５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１に記載の方法は、アラビノーストランスポーターＡｒａＥを導入することによってキシロース消費速度が向上し、グルコースとの同時利用の場合の生産効率も大きく向上するものの、生産に用いる微生物の増殖が悪化するという欠点を有することが本発明者らの検討により明らかとなった。
また、非特許文献１に記載の方法は、イノシトール輸送体ＩｏｌＴ１、ＩｏｌＴ２を介した経路でグルコースを取り込むことによって、コハク酸生産が向上し得ることは記載されているが、炭素源としてペントースを使用することに関して何ら記載されていない。
【０００９】
本発明の目的は、微生物の増殖の悪化を伴うことなく、微生物のペントース資化能を向上させること、さらには、微生物を用いることにより、ペントースを含有する有機原料から有機化合物をより効率よく製造することを可能とすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、有機化合物の製造に用いる微生物においてイノシトール輸送体をコードする遺伝子を導入し、あるいは、該遺伝子の発現を増強することにより、微生物の増殖の悪化を伴うことなく、ペントース資化能が向上することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］有機化合物生産能およびペントース資化能を有し、かつ、イノシトール輸送体をコードする遺伝子が導入され、または該遺伝子の発現が非誘導株もしくは非改変株と比較して増強された、微生物またはその処理物を、水性媒体中でペントースを含有する有機原料に作用させることにより有機化合物を生産させる工程を有することを特徴とする有機化合物の製造方法。
［２］前記微生物の、イノシトール輸送体をコードする遺伝子の発現を抑制する転写因子をコードする遺伝子の発現が非改変株と比較して低減されていることを特徴とする、［１］に記載の有機化合物の製造方法。
［３］前記微生物が、イノシトールを含有する有機原料の存在下で培養されたものであることを特徴とする［１］または［２］に記載の有機化合物の製造方法。
［４］前記水性媒体が、イノシトールを含有することを特徴とする［１］〜［３］のいずれかに記載の有機化合物の製造方法。
［５］前記ペントースがキシロースであり、かつ、前記微生物が、さらに、キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子が導入され、もしくは該遺伝子の発現が増強されていることを特徴とする、［１］〜［４］のいずれかに記載の有機化合物の製造方法。
［６］前記微生物が、さらに、キシルロキナーゼをコードする遺伝子が導入され、または該遺伝子の発現が増強されていることを特徴とする［５］に記載の有機化合物の製造方法。
［７］有機化合物生産能およびペントース資化能を有し、かつ、イノシトール輸送体をコードする遺伝子が導入、または該遺伝子の発現が非誘導株または非改変株と比較して増強された微生物を、ペントースを含有する有機原料の存在下で培養することを特徴とする微生物の培養方法。
［８］前記微生物が、イノシトールを含有する有機原料の存在下で培養されたものであることを特徴とする、［７］に記載の微生物の培養方法。
［９］有機化合物生産能およびペントース資化能を有し、かつ、イノシトール輸送体をコードする遺伝子の発現が非改変株と比較して増強されたものであることを特徴とする、コリネ型細菌。
［１０］イノシトール輸送体をコードする遺伝子の発現を抑制する転写因子をコードする遺伝子の発現が非改変株と比較して低減されたものであることを特徴とする、［９］に記載のコリネ型細菌。
［１１］前記コリネ型細菌が、さらに、キシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする、［９］または［１０］に記載のコリネ型細菌。
［１２］前記コリネ型細菌が、さらに、キシルロキナーゼ遺伝子が導入、または該遺伝子の発現が増強されたものであることを特徴とする、［１１］に記載のコリネ型細菌。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、増殖の悪化を伴うことなく、微生物のペントース資化能を向上させた微生物を提供することができる。
本発明により、増殖の悪化を伴うことなく、微生物のペントース資化能を向上させた微生物の培養方法を提供することができる。
このような本発明の微生物、または本発明の培養方法を用いることにより、ペントースを含有する有機原料から有機化合物をより効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１〜３および比較例１で用いたプラスミドの構造を示す。
【図２】実施例１〜３および比較例１で用いたプラスミドの構造を示す。
【図３】実施例１〜３および比較例１で用いたプラスミドの構造を示す。
【図４】実施例１〜３および比較例１で用いたプラスミドの構造を示す。
【図５】実施例１〜３および比較例１で用いたプラスミドの構造を示す。
【図６】実施例１〜３および比較例１で用いたプラスミドの構造を示す。
【図７】実施例１〜３および比較例１で用いたプラスミドの構造を示す。
【図８】実施例１〜３および比較例１で用いたプラスミドの構造を示す。
【図９】実施例１１のコハク酸生産評価の結果を示す。
【図１０】実施例１２のコハク酸生産評価の結果を示す。
【図１１】実施例１３のコハク酸生産評価の結果を示す。
【図１２】比較例５のコハク酸生産評価の結果を示す。
【図１３】実施例１〜３および比較例１で作製した菌株の系統図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
＜本発明に用いる微生物またはその処理物＞
本発明に用いる微生物は、有機化合物生産能およびペントース資化能を有する微生物であり、かつ、イノシトール輸送体をコードする遺伝子が導入され、もしくは該遺伝子の発現が非誘導株または非改変株と比較して増強された微生物である。
【００１４】
また、本発明では前記微生物の菌体の処理物を使用することもできる。微生物の処理物としては、例えば、微生物の菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またはその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。
本発明において、「有機化合物生産能」とは、微生物を培地中で培養したときに、該微生物が該培地中に有機化合物を生成蓄積することができることをいう。
【００１５】
微生物が生産する有機化合物は、微生物が培地中に生成蓄積することができる有機化合物であれば限定されないが、具体的には、エタノール、プロパノール、ブタノール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール等のアルコール類；１，５−ペンタメチレンジアミン、１，６−ヘキサメチレンジアミン等のアミン類；酢酸、酪酸、グリコール酸、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、シス−アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸、２−オキソグルタル酸、２−オキソイソ吉草酸、グルタル酸、イタコン酸、アジピン酸、レブリン酸、キナ酸、シキミ酸、アクリル酸、メタクリル等のカルボン酸類；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、アルギニン、メチオニン、ヒスチジン、システイン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、トリプトファン等のアミノ酸類；フェノール、カテコール、ハイドロキノン等のフェノール類；安息香酸、４−ヒドロキシ安息香
酸、プロトカテク酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸等の芳香族カルボン酸類；イノシン、グアノシン等のヌクレオシド類、イノシン酸、グアニル酸等のヌクレオチド；イソブチレン、イソプレン、ブタジエン等の不飽和炭化水素化合物等が挙げられる。
【００１６】
これらの中でも、発酵生産として公知の方法を採用でき、かつ、樹脂原料として使用可能であることから、アルコール類、アミン類、カルボン酸類、フェノール類が好ましく、炭素数２〜１０の脂肪族アルコール類や、炭素数２〜１０の脂肪族カルボン酸類がより好ましい。中でも、発酵生産性の観点から、エタノール、ブタンジオール、コハク酸がさらに好ましい。
【００１７】
ここで、有機化合物生産能を有する微生物は、本来的に有機化合物生産能を有する微生物であってもよいし、育種により有機化合物生産能を付与したものでもよい。
育種により有機化合物生産能を付与する手段としては、変異処理や遺伝子組換え処理などが挙げられ、有機化合物の生合成経路における酵素遺伝子の発現強化や副生物生合成経路における酵素遺伝子の発現低減など、公知の方法を採用することができる。例えば、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等のカルボン酸生産能を付与する場合は、後述するようなラクテートデヒドロゲナーゼ活性を低減するような改変やピルビン酸カルボキシラーゼ活性を増強するような手段などが挙げられる。エタノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコール生産能を付与する場合は、後述するようなラクテートデヒドロゲナーゼ活性を低減するような改変やアルコールデヒドロゲナーゼ活性を増強するような手段などが挙げられる。
【００１８】
本発明において、「ペントース資化能」とは、微生物がペントースを炭素源として利用し、増殖または有機化合物生産することができることをいう。
微生物が炭素源として利用するペントースは、炭素源として利用可能であれば特に限定されない。具体例としては、キシロース、アラビノース、リボース、リキソース等のアルドペントース類、リブロース、キシルロース等のケトペントース等が挙げられる。
【００１９】
これらの中でも、アルドペントース類が好ましく、非可食原料として利用されるヘミセルロース系バイオマスに含まれるキシロース、アラビノースがより好ましい。中でも、ヘミセルロース系バイオマス中の含有量が多いキシロースが特に好ましい。
ここで、ペントース資化能を有する微生物は、本来的にペントース資化能を有する微生物であってもよいし、育種によりペントース資化能を付与したものでもよい。
【００２０】
育種によりペントース資化能を付与する手段としては、遺伝子組換え処理などが挙げられ、ペントース代謝経路の酵素遺伝子を導入するなどの公知の方法を採用することができる。例えば、キシロース資化能を付与する場合は、後述するようなキシロースイソメラーゼ遺伝子を導入する方法、またはキシロースリダクターゼ遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入する方法などが挙げられる。アラビノース資化能を付与する場合は、後述するようなアラビノースイソメラーゼ遺伝子およびリブロキナーゼ遺伝子およびリブロース５リン酸エピメラーゼ遺伝子を導入する方法などが挙げられる。
【００２１】
本発明で用いる微生物は、有機化合物生産能およびペントース資化能を有する微生物であれば特に限定されないが、コリネ型細菌、大腸菌、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属細菌、バスフィア（Ｂａｓｆｉａ）属細菌、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属細菌、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選択される微生物であることが好ましい。
【００２２】
その中でも、コリネ型細菌、大腸菌、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属細菌、バスフィア（Ｂａｓｆｉａ）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選ばれる少なくとも１つが好ましく、より好ましくはコリネ型細菌、大腸菌、酵母菌であり、特に好ましくはコリネ型細菌である。
【００２３】
上記コリネ型細菌は、これに分類されるものであれば特に制限されないが、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌、アースロバクター属に属する細菌などが挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｋｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）またはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に分類される細菌である。
【００２４】
本発明で使用可能なコリネ型細菌の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１、およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Ｌｉｅｌｂｌ  Ｗ，  Ｅｈｒｍａｎｎ  Ｍ，  Ｌｕｄｗｉｇ  Ｗ，  Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ  ＫＨ，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９９１，  Ｖｏｌ．４１，  ｐ２５５−２６０）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、およびその変異株ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株およびＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株と同一の株とする。
【００２５】
上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。
【００２６】
本発明で使用可能な大腸菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等が挙げられる。
本発明で使用可能なアナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属細菌としては、アナエロビオスピリラム・サクシニシプロデュセン（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）等が挙げられる
本発明で使用可能なアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、アクチノバチルス・サクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられる。
【００２７】
本発明で使用可能なマンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属細菌としては、バスフィア・サクシニシプロデュセン（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）等が挙げられる。
本発明で使用可能なバスフィア（Ｂａｓｆｉａ）属細菌としては、バスフィア・サクシニシプロデュセン（Ｂａｓｆｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）等が挙げられる。
【００２８】
本発明で使用可能なザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属細菌としては、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｙｉｓ）等が挙げられる。
本発明で使用可能なザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌としては、ザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ）等が挙げられる。
本発明で使用可能な糸状菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属等が挙げられる。このうち、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）等が挙げられ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属では、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）等が挙げられる。また、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属では、リゾパス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）等が挙げられる。
【００２９】
本発明で使用可能な酵母菌としては、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、チゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。
【００３０】
上記サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）、サッカロミセス・バイアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）等が挙げられる。
上記シゾサッカロミセス属（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。
【００３１】
上記カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）としては、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）等が挙げられる。上記ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）としては、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）等が挙げられる。
【００３２】
上記クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）としては、クルイウェロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイウェロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイウェロマイセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）等が挙げられる。
【００３３】
上記ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）等が挙げられる。
上記チゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）としては、チゴサッカロミセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）、チゴサッカロミセス・ロウキシ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）等が挙げられる。
【００３４】
上記微生物は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合若しくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組
換え株などのいずれの株であってもよい。
本発明に用いる微生物は、上述したように有機化合物生産能およびペントース資化能を有する株に、後述するようにイノシトール輸送体をコードする遺伝子を導入すること、または該遺伝子の発現が増強するように誘導または改変することによって得ることができる。
【００３５】
本発明において、「イノシトール輸送体（以下、「ＩｏｌＴ」と称することがある。）」とは、イノシトールを細胞内に取り込む活性を有するタンパク質をいい、このタンパク質をコードする遺伝子を導入、または該遺伝子の発現を増強することによって、ペントース資化能を向上させることができる。
イノシトールを細胞内に取り込む活性は、公知の方法、例えばＫｒｉｎｇｓらの方法（Ｋｒｉｎｇｓ  Ｅ，Ｋｒｕｍｂａｃｈ  Ｋ，Ｂａｔｈｅ  Ｂ，Ｋｅｌｌｅ  Ｒ，Ｗｅｎｄｉｓｃｈ  ＶＦ，Ｓａｈｍ  Ｈ，Ｅｇｇｅｌｉｎｇ  Ｌ，  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，
２００６，  Ｖｏｌ．１８８（２３），  ｐ８０５４−６１）により、イノシトール取り込み活性を測定することによって確認することができる。
【００３６】
本発明における「ＩｏｌＴをコードする遺伝子（以下、ｉｏｌＴ遺伝子とも呼ぶ）」としては、イノシトール輸送体をコードし、その発現を増強させることにより、ペントース資化能を向上させることができる遺伝子である限り特に限定されないが、例えば、コリネ型細菌由来のｉｏｌＴ１遺伝子やｉｏｌＴ２遺伝子、大腸菌由来のｉｏｌＴ遺伝子、枯草菌由来のｉｏｌＴ遺伝子やｉｏｌＦ遺伝子、酵母由来のＩＴＲ１遺伝子等が挙げられる。中でも、コリネ型細菌由来のｉｏｌＴ１遺伝子またはｉｏｌＴ２遺伝子が好ましく、配列番号１、配列番号２に示す塩基配列を含むコリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株由来の遺伝子がより好ましい（以下、それぞれｉｏｌＴ１遺伝子、ｉｏｌＴ２遺伝子とも呼ぶ）。
【００３７】
これらの遺伝子は、上記塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、または上記塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡのようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０ ．
１％ ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３８】
さらに、ｉｏｌＴ１遺伝子、ｉｏｌＴ２遺伝子は、イノシトール取り込み活性を有し、ペントース資化能を向上させられる限り、それぞれ配列番号３、配列番号４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ここで、数個とは、通常２個以上であり、一方、通常２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下であることを意味する。
【００３９】
本発明において、「ｉｏｌＴ遺伝子を導入する」とは、野生株などの非改変株を親株として、この遺伝子が導入されていることをいう。ｉｏｌＴ遺伝子を導入する手段としては、例えば、ｉｏｌＴ遺伝子を用いた遺伝子組換え法などにより、野生株や親株などの菌株を改変することによって行うことができる。具体的には、ｉｏｌＴ遺伝子をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換すること、または相同組換え法によって染色体上に該遺伝子を導入することなどが挙げられる。なお、ｉｏｌＴ遺伝子の導入にあたっては、異なる微生物、動植物由来のｉｏｌＴ遺伝子や由来は同じだが異なるｉｏｌＴ遺伝子、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株由来のｉｏｌＴ１遺伝子とｉｏｌＴ２遺伝子など、複数種類のｉｏｌＴ遺伝子を用いてもよい。
【００４０】
微生物または動植物由来のｉｏｌＴ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてイノシトール取り込み活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００４１】
上記のようにして単離されたｉｏｌＴ遺伝子を公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、ＩｏｌＴ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換することにより、ｉｏｌＴ遺伝子が導入された株を得ることができる。あるいは、相同組換えなどによって、宿主微生物の染色体ＤＮＡにＩｏｌＴをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによってもｉｏｌＴ遺伝子が導入された株を得ることができる。なお、形質転換、相同組換えは当業者に知られた通常の方法に従って行うことができる。
【００４２】
染色体上またはプラスミド上にｉｏｌＴ遺伝子を導入する場合には、適当なプロモーターを該遺伝子の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターであれば特に限定されず、ｉｏｌＴ遺伝子自身のプロモーターおよびターミネーターであってもよいし、他のプロモーターおよびターミネーターに置換してもよい。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーターおよびターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
【００４３】
以下、コリネ型細菌においてｉｏｌＴ遺伝子を導入する方法について説明する。コリネ型細菌を使用する場合、ｉｏｌＴ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でｉｏｌＴ遺伝子の発現が可能な組換えプラスミドを得ることができる。該組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株を形質転換することにより、ｉｏｌＴ遺伝子が導入されたコリネ型細菌が得られる。形質転換は、例えば、電気パルス法（Ｖｅｒｔeｓ  ＡＡ，  Ｉｎｕｉ  Ｍ，  Ｋｏｂａｙ
ａｓｈｉ  Ｍ，  Ｋｕｒｕｓｕ  Ｙ，  Ｙｕｋａｗａ  Ｈ，  Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １９９３，  Ｖｏｌ．１４４（３），  ｐ１８１−１８５）等によって行うことができる。
【００４４】
コリネ型細菌に遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。その具体例としては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報および米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、およびｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１、およびｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を挙げることができる。それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、およびｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に使用される。
【００４５】
上記組み換えプラスミドまたは染色体上への組み込みにおいて、ｉｏｌＴ遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであってもよく、用いるｉｏｌＴ遺伝子自身のプロモーターであってもよい。プロモーターを適宜選択することによっても、ｉｏｌＴ遺伝子の発現量の調節が可能である。以上、コリネ型細菌を用いる例を述べたが、他の細菌を用いる場合も同様の方法によってｉｏｌＴ遺伝子の導入を達成することができる。
【００４６】
本発明において、「ｉｏｌＴ遺伝子の発現を増強する」とは、野生株や親株などの非誘導株または非改変株と比較して、この遺伝子の発現が増強されていることをいう。ｉｏｌＴ遺伝子の発現は、非誘導株または非改変株と比較して、１．５倍以上増強されていることが好ましく、３倍以上増強されていることがより好ましい。
ｉｏｌＴ遺伝子の発現が増強されたことは、ノーザンハイブリダイゼーションや定量ＰＣＲなどによってｍＲＮＡの量を測定することなどによって確認することができる。
【００４７】
ｉｏｌＴ遺伝子の発現を増強する方法としては、例えば、親株を変異剤によって処理する方法、ｉｏｌＴ遺伝子のコピー数を高める方法、ｉｏｌＴ遺伝子のプロモーターを改変する方法、ｉｏｌＴ遺伝子の発現を抑制する転写因子をコードする遺伝子の発現を低減する方法、イノシトールを含有する有機原料を用いて培養することによってｉｏｌＴ遺伝子の発現を誘導する方法などが挙げられる。なお、ｉｏｌＴ遺伝子の発現増強にあたっては、異なる微生物、動植物由来のｉｏｌＴ遺伝子や由来は同じだが異なるｉｏｌＴ遺伝子、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株由来のｉｏｌＴ１遺伝子とｉｏｌＴ２遺伝子など、複数種類のｉｏｌＴ遺伝子を用いてもよい。さらに、上記ｉｏｌＴ遺伝子の発現を増強する方法を複数組み合わせてもよい。
【００４８】
以下、ｉｏｌＴ遺伝子の発現を増強する方法について説明する。ｉｏｌＴ遺伝子の発現が増強された株は、親株をＮ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ｉｏｌＴ遺伝子の発現が上昇した株を選択することによって得ることができる。
また、ｉｏｌＴ遺伝子の発現が増強された株は、ｉｏｌＴ遺伝子を用いて改変することによっても得ることができる。具体的には、ｉｏｌＴ遺伝子のコピー数を高めることによって達成でき、コピー数を高めることは、ｉｏｌＴ遺伝子を含むベクターで形質転換すること、または相同組換え法によって染色体上に該遺伝子を導入し、染色体上で多コピー化させることなどによって達成できる。
【００４９】
さらに、ｉｏｌＴ遺伝子の発現が増強された株は、染色体上またはプラスミド上でｉｏｌＴ遺伝子のプロモーターへ変異を導入すること、より強力なプロモーターへ置換することなどで高発現化させることによっても達成できる。
なお、ｉｏｌＴ遺伝子を含むベクターで形質転換した株、相同組換え法によって染色体上に該遺伝子を導入した株、該遺伝子のプロモーターへ変異を導入した株、より強力なプロモーターへ置換した株は、いずれも上述のｉｏｌＴ遺伝子を導入する方法と同様にして作製することができる。
【００５０】
また、ｉｏｌＴ遺伝子の発現が増強された株は、ｉｏｌＴ遺伝子の発現を抑制する転写因子をコードする遺伝子の発現を低減するように改変することによっても得ることができる。ここで、「ｉｏｌＴ遺伝子の発現を抑制する転写因子（以下、ＩｏｌＲとも呼ぶ）」とは、ｉｏｌＴ遺伝子の転写を抑制する活性を有するタンパク質をいい、このタンパク質をコードする遺伝子の発現を低減することによって、ｉｏｌＴ遺伝子の発現を増強させることができる。
【００５１】
また、「ＩｏｌＲをコードする遺伝子（以下、ｉｏｌＲ遺伝子とも呼ぶ）」としては、ＩｏｌＲをコードし、その発現を低減させることにより、ｉｏｌＴ遺伝子の発現を増強させることができる遺伝子である限り特に限定されないが、例えば、配列番号５に示す塩基配列を含むコリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株由来の遺伝子を挙げることができる。
【００５２】
この遺伝子は、上記塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、または上記塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡのようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０ ．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００５３】
さらに、ｉｏｌＲ遺伝子は、ｉｏｌＴ遺伝子の転写を抑制する活性を有する限り、配列番号６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ここで、数個とは、通常２個以上であり、一方、通常２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下であることを意味する。
【００５４】
本発明において、「ｉｏｌＲ遺伝子の発現を低減する」とは、野生株や親株などの非改変株と比較して、この遺伝子の発現が低減されていることをいう。ｉｏｌＲ遺伝子の発現は、非改変株の３０％以下に低減されていることが好ましく、１０％以下に低減されていることがより好ましい。ｉｏｌＲ遺伝子の発現は、検出限界以下に低減されていてもよい。
【００５５】
ｉｏｌＲ遺伝子の発現が低減されたことは、ノーザンハイブリダイゼーションや定量ＰＣＲなどによってｍＲＮＡの量を測定することなどによって確認することができる。
ｉｏｌＲ遺伝子の発現を低減する方法としては、例えば、親株を変異剤によって処理する方法、染色体上のｉｏｌＲ遺伝子を破壊する方法、染色体上のｉｏｌＲ遺伝子に変異を導入する方法、ｉｏｌＲ遺伝子のプロモーターを改変する方法などが挙げられる。なお、これらｉｏｌＲ遺伝子の発現を低減する方法を複数組み合わせてもよい。
【００５６】
以下、ｉｏｌＲ遺伝子の発現を低減する方法について説明する。ｉｏｌＲ遺伝子の発現が低減された株は、親株をＮ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ｉｏｌＲ遺伝子の発現が低減した株を選択することによって得ることができる。
また、ｉｏｌＲ遺伝子の発現を低減された株は、染色体上のｉｏｌＲ遺伝子を破壊することによっても得ることができる。ｉｏｌＲ遺伝子の破壊は、染色体への相同組換えによる方法や、ｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｓｃｈaｆｅｒ  Ａ，  Ｔａｕｃｈ  Ａ，  Ｊaｇｅｒ  Ｗ，  Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ  Ｊ，  Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ  Ｇ，  Ｐuｈｌｅｒ
Ａ，  Ｇｅｎｅ  １９９４  Ｖｏｌ．１４５（１），  ｐ６９−７３）によって達成できる。
【００５７】
さらに、ｉｏｌＲ遺伝子の発現を低減された株は、染色体上のｉｏｌＲ遺伝子に変異を導入し、ＩｏｌＲが有するｉｏｌＴ遺伝子の転写を抑制する活性を低減させることによっても得ることができる。ｉｏｌＲ遺伝子への変異導入は、
また、ｉｏｌＲ遺伝子の発現を低減された株は、染色体上でｉｏｌＲ遺伝子のプロモーターを改変することによっても得ることができる。具体的には、染色体上でｉｏｌＴ遺伝子のプロモーターへ変異を導入すること、より微弱なプロモーターへ置換することなどで発現を抑制することによっても達成できる。
【００５８】
以下、コリネ型細菌においてｉｏｌＲ遺伝子を破壊する方法について説明する。ｉｏｌＲ遺伝子の取得は、例えば、上記配列に基づき、合成オリゴヌクレオチドを合成し、コリネバクテリウム・グルタミカムの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行うことによってクローニングできる。染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（Ｓａｉｔｏ  Ｈ，  Ｍｉｕｒａ  Ｋ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．，  １９６３，  Ｖｏｌ．７２，  ｐ６１９−６２９、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００５９】
上記のようにして調製したｉｏｌＲ遺伝子またはその一部を遺伝子破壊に使用することができる。ただし、遺伝子破壊に用いる遺伝子は破壊対象の細菌の染色体ＤＮＡ上のｉｏｌＲ遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性（同一性）を有していればよいため、配列番号５と相同性を有する相同遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ（配列番号５の相補鎖）であれば、相同組換えは起こり得る。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００６０】
上記のような遺伝子を使用し、例えば、ｉｏｌＲ遺伝子の部分配列を欠失し、正常ＩｏｌＲタンパク質を産生しないように改変した欠失型ｉｏｌＲ遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上のｉｏｌＲ遺伝子を破壊することができる。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、直鎖状ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第６３０３３８３号明細書、または特開平０５−００７４９１号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことができ、コリネ型細菌内で複製能を持たないプラスミドとしては、エシェリヒア・コリで複製能力を持つプラスミドが好ましく、例えば、ｐＨＳＧ２９９（タカラバイオ社製）、ｐＨＳＧ３９９（タカラバイオ社製）等が挙げられる。
【００６１】
また、ｉｏｌＴ遺伝子の発現が増強された株は、イノシトールを含有する有機原料の存在下で培養することによってｉｏｌＴ遺伝子の発現を誘導することによっても得ることができる。この手段によってｉｏｌＴ遺伝子の発現を増強するにあたっては、上述のような遺伝子改変を行った菌株を用いてもよいが、そのような遺伝子改変を行っていない菌株も用いることができる。
【００６２】
本発明で使用可能なイノシトールとしては、ｉｏｌＴ遺伝子の発現が誘導可能であれば特に限定されない。具体例としては、ｃｉｓ−イノシトール、ｅｐｉ−イノシトール、ａｌｌｏ−イノシトール、ｍｙｏ−イノシトール、ｍｕｃｏ−イノシトール、ｎｅｏ−イノシトール、Ｄ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール、Ｌ−ｃｈｉｒｏ−イノシトール、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールが挙げられる。これらの中でも、自然界に多く存在し、最も一般的なｍｙｏ−イノシトールが好ましい。
【００６３】
また、イノシトールは穀物、果物などの天然の食料に多く含まれることが知られており、これらの抽出物や処理物等の有機原料を用いてもよい。具体的には、コーンスティープリカー、酵母エキスなどが挙げられる。
イノシトールを含有する有機原料の存在下で培養するにあたっては、必要に応じて、そ
の他の有機原料を添加してもよい。イノシトール以外の有機原料としては、本発明に用いる前記微生物が資化し得る炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプンまたはセルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、キシリトールまたはリビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、スクロースまたはフルクトースが好ましく、特にグルコースまたはスクロースが好ましい。
【００６４】
これらの有機原料は、単独で添加してもよいし、２種類以上を任意の組み合わせで添加してもよい。
イノシトールを含有する有機原料の存在下で培養するにあたっては、イノシトールを含む寒天培地等の固体培地で培養してもよいし、イノシトールを含む液体培地で培養してもよい。その他の培養条件については、後述するペントースを含有する有機原料を用いた培養方法と同様に行なうことができる。
【００６５】
なお、このようにして得られた菌体は、後述するペントースを含有する有機原料を用いた培養や有機化合物生産反応に供することができる。ここで、イノシトールとペントースを含有する有機原料の存在下で培養し、ｉｏｌＴ遺伝子の発現を誘導しながら増殖させてもよい。また、イノシトールとペントースを含有する有機原料を用いた有機化合物生産反応を行い、ｉｏｌＴ遺伝子の発現を誘導しながら有機化合物を製造してもよい。
【００６６】
本発明で用いる微生物は、本来的にペントース資化能を有する微生物であってもよいし、育種によりペントース資化能を付与したものでもよい。
以下、育種によりペントース利用能を付与する具体例として、キシロース利用能の付与に関する改変例とアラビノース利用能の付与に関する改変例について説明する。
キシロース資化能を付与された微生物は、上述した有機化合物生産能を有する微生物を親株として用い、該親株にキシロースイソメラーゼ（以下、ＸｙｌＡとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって得ることができる。
【００６７】
ここで、「ＸｙｌＡ活性」とは、キシロースを異性化してキシルロースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．３．１．５）をいう。ＸｙｌＡ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＧａｏらの方法（Ｇａｏ  Ｑ，  Ｚｈａｎｇ  Ｍ，  ＭｃＭｉｌｌａｎ  ＪＤ，  Ｋｏｍｐａｌａ  ＤＳ，  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００２，  Ｖｏｌ．９８（１００），  ｐ３４１−５５）により、ＸｙｌＡ活性を測定することによって確認することができる。
【００６８】
ＸｙｌＡ活性が付与または増強された株の具体的な作製方法としては、ｘｙｌＡ遺伝子をプラスミドによって導入したり、公知の相同組換え法によって染色体上に導入したりすることなどによって達成できる。
ＸｙｌＡ活性の付与または増強に用いるｘｙｌＡ遺伝子としては、ＸｙｌＡ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来の遺伝子を挙げることができる。
【００６９】
さらに、大腸菌以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のｘｙｌＡ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｙｌＡ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＸｙｌＡ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００７０】
上記のようにして単離されたＸｙｌＡをコードする遺伝子を公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、ＸｙｌＡ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換することにより、ＸｙｌＡ活性が付与または増強された株を得ることができる。あるいは、相同組換えなどによって、宿主微生物の染色体ＤＮＡにＸｙｌＡをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによってもＸｙｌＡ活性が付与または増強された株を得ることができる。なお、形質転換、相同組換えは当業者に知られた通常の方法に従って行うことができる。
【００７１】
染色体上またはプラスミド上にＸｙｌＡ遺伝子を導入する場合には、適当なプロモーターを該遺伝子の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターであれば特に限定されず、ｘｙｌＡ遺伝子自身のプロモーターおよびターミネーターであってもよいし、他のプロモーターおよびターミネーターに置換してもよい。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーターおよびターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
【００７２】
また、キシロース利用能の付与においては、ＸｙｌＡ活性の付与または増強に加えて、キシルロキナーゼ（以下、ＸｙｌＢとも呼ぶ）活性を付与または増強するように改変された微生物であってもよい。
ここで、「ＸｙｌＢ活性」とは、キシルロースをリン酸化してキシルロース５リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．１．１７）をいう。ＸｙｌＢ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＥｌｉａｓｓｏｎらの方法（Ｅｌｉａｓｓｏｎ  Ａ，  Ｂｏｌｅｓ  Ｅ，  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｂ，  Ｏｔｅｎｓｔｅｒｂｅｒｇ  Ｍ，  Ｔｈｅｖｅｌｅｉｎ  ＪＭ，  Ｓｐｅｎｃｅｒ−Ｍａｒｔｉｎｓ  Ｉ，  Ｊｕｈｎｋｅ  Ｈ，  Ｈａｈｎ−Ｈａｔｅｎｇｅｒｄａｌ  Ｂ，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０００，  Ｖｏｌ．５３，  ｐ３７６−８２）により、ＸｙｌＢ活性を測定することによって確認することができる。
【００７３】
ＸｙｌＢ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。
ＸｙｌＢ活性の付与または増強に用いるｘｙｌＢ遺伝子としては、ＸｙｌＢ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の遺伝子を挙げることができる。
【００７４】
さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のｘｙｌＢ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｙｌＢ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＸｙｌＢ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００７５】
ＸｙｌＡ活性およびＸｙｌＢ活性を付与または増強する場合、導入するｘｙｌＡ遺伝子とｘｙｌＢ遺伝子は同じ遺伝子座上に存在していてもよく、それぞれ別の遺伝子座上に存在していてもよい。２つの遺伝子が同じ遺伝子座上に存在している例としては、例えば、それぞれの遺伝子が連結して形成されたオペロンなどが挙げられる。
キシロース利用能を付与された微生物は、上述した微生物を親株として用い、該親株にキシロースリダクターゼ（以下、ＸＲとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺
伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（以下、ＸＤＨとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって得ることもできる。
【００７６】
ここで、「ＸＲ活性」とは、キシロースを還元してキシリトールを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．２１）をいう。ＸＲ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＳａｓａｋｉらの方法（Ｓａｓａｋｉ  Ｍ，  Ｊｏｊｉｍａ  Ｔ，  Ｉｎｕｉ  Ｍ，  Ｙｕｋａｗａ  Ｈ，  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０１０，  Ｖｏｌ．８６（４），  ｐ１０５７−６６）により、ＸＲ活性を測定することによって確認することができる。
【００７７】
ＸＲ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。
ＸＲ活性の付与または増強に用いるｘｒ遺伝子としては、ＸＲ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ
ｓｔｉｐｉｔｉｓ）由来のＸＹＬ１遺伝子を挙げることができる。
【００７８】
さらに、上記以外の微生物または動植物由来のｘｒ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｒ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＸＲ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００７９】
次に、「ＸＤＨ活性」とは、キシリトールを脱水素化してキシルロースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．９）をいう。ＸＤＨ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＲｉｚｚｉらの方法（Ｒｉｚｚｉ  Ｍ，  Ｈａｒｗａｒｔ  Ｋ，  Ｅｒｌｅｍａｎｎ  Ｐ，  Ｂｕｉ−Ｔｈａｈｎ  ＮＡ，  Ｄｅｌｌｗｅｇ  Ｈ，  Ｊ
Ｆｅｒｍｅｎｔ  Ｂｉｏｅｎｇ．，  １９８９，  Ｖｏｌ．６７，  ｐ２０−２４）により、ＸＤＨ活性を測定することによって確認することができる。
【００８０】
ＸＤＨ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。
ＸＤＨ活性の付与または増強に用いるｘｄｈ遺伝子としては、ＸＤＨ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）由来のＸＹＬ２遺伝子を挙げることができる。
【００８１】
さらに、上記以外の微生物または動植物由来のｘｄｈ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｄｈ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＸＤＨ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００８２】
また、キシロース利用能の付与においては、ＸＤＨ活性およびＸＲ活性の付与または増強に加えて、ＸｙｌＢ活性を付与または増強するように改変された微生物であってもよい。ＸｙｌＢ活性の付与または増強に関しては上述の通りである。
アラビノース利用能を付与された微生物は、上述した微生物を親株として用い、該親株にアラビノースイソメラーゼ（以下、ＡｒａＡとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコー
ドする遺伝子およびリブロキナーゼ（以下、ＡｒａＢとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびリブロース５リン酸エピメラーゼ（以下、ＡｒａＤとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって得ることができる。
【００８３】
ここで、「ＡｒａＡ活性」とは、アラビノースを異性化してリブロースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．３．１．４）をいう。ＡｒａＡ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＰａｔｒｉｃｋらの方法（Ｐａｔｒｉｃｋ  ＪＷ，  Ｌｅｅ
Ｎ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９６８，  Ｖｏｌ．２４３，  ｐ４３１２−１９）により、ＡｒａＡ活性を測定することによって確認することができる。
【００８４】
ＡｒａＡ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。
ＡｒａＡ活性の付与または増強に用いるａｒａＡ遺伝子としては、ＡｒａＡ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の遺伝子を挙げることができる。
【００８５】
さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のａｒａＡ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｒａＡ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＡｒａＡ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００８６】
次に、「ＡｒａＢ活性」とは、リブロースをリン酸化してリブロース５リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．１．１６）をいう。ＡｒａＢ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＬｅｅらの方法（Ｌｅｅ  Ｎ，  Ｅｎｇｌｅｓｂｅｒｇ  Ｅ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １９６２，  Ｖｏｌ．４８，  ｐ３３５−４８）により、ＡｒａＢ活性を測定することによって確認することができる。
【００８７】
ＡｒａＢ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。
ＡｒａＢ活性の付与または増強に用いるａｒａＢ遺伝子としては、ＡｒａＢ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の遺伝子を挙げることができる。
【００８８】
さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のａｒａＢ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｒａＢ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＡｒａＢ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００８９】
さらに、「ＡｒａＤ活性」とは、リブロース５リン酸を異性化してキシルロース５リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．１．３．４）をいう。ＡｒａＤ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＤｅａｎｄａらの方法（Ｄｅａｎｄａ  Ｋ
，  Ｚｈａｎｇ  Ｍ，  Ｅｄｄｙ  Ｃ，  Ｐｉｃａｔａｇｇｉｏ  Ｓ，  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １９９６，  Ｖｏｌ．６２（１２），  ｐ４４６５−７０）により、ＡｒａＤ活性を測定することによって確認することができる。
【００９０】
ＡｒａＤ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。
ＡｒａＤ活性の付与または増強に用いるａｒａＤ遺伝子としては、ＡｒａＤ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の遺伝子を挙げることができる。
【００９１】
さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のａｒａＤ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｒａＤ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＡｒａＤ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【００９２】
ＡｒａＡ活性およびＡｒａＢ活性およびＡｒａＤ活性を付与または増強する場合、導入するａｒａＡ遺伝子、ａｒａＢ遺伝子、およびａｒａＤ遺伝子は同じ遺伝子座上に存在していてもよく、それぞれ別の遺伝子座上に存在していてもよい。２つまたは３つの遺伝子が同じ遺伝子座上に存在している例としては、例えば、それぞれの遺伝子が連結して形成されたオペロンなどが挙げられる。
【００９３】
なお、本発明に用いる微生物は、ペントース利用能を付与するための改変のうちの２種類以上の改変を組み合わせて得られる細菌であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。
本発明で用いる微生物は、本来的に有機化合物生産能を有する微生物または育種により有機化合物生産能を付与したものでもよい。
【００９４】
以下、育種により有機化合物生産能を付与する具体例として、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等のカルボン酸生産に関する改変例とエタノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコール生産に関する改変例について説明する。
本発明のカルボン酸製造方法においては、ラクテートデヒドロゲナーゼ（以下、ＬＤＨとも呼ぶ）活性が低減するように改変された微生物を用いることが好ましい。ここで、「ＬＤＨ活性」とは、ピルビン酸を還元して乳酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．２７）をいう。「ＬＤＨ活性が低減された」とは、非改変株と比較してＬＤＨ活性が低下していることをいう。ＬＤＨ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＬＤＨ活性は完全に消失していてもよい。ＬＤＨ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＫａｎａｒｅｋらの方法（Ｋａｎａｒｅｋ  Ｌ，  Ｈｉｌｌ  ＲＬ，  Ｊ
Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  １９６４，  Ｖｏｌ．２３９，  ｐ４２０２−４２０６）によりＬＤＨ活性を測定することによって確認することができる。
【００９５】
ＬＤＨ活性が低減した株は、上述した微生物を親株として用い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ＬＤＨ活性が低減した株を選択することによってそれぞれ得ることができる。  また、ＬＤＨをコードする遺伝子を用いて改変してもよい。具体的には、染色体上のｌｄｈ遺伝子を破壊したり、プロモーターやシャインダルガルノ（ＳＤ）配列等
の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。
【００９６】
ＬＤＨ活性が低減した株の具体的な作製方法としては、染色体への相同組換えによる方法（特開平１１−２０６３８５号公報等参照）や、ｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｓｃｈaｆｅｒ  Ａ，  Ｔａｕｃｈ  Ａ，  Ｊaｇｅｒ  Ｗ，  Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ  Ｊ，  Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ  Ｇ，  Ｐuｈｌｅｒ  Ａ，  Ｇｅｎｅ  １９９４  Ｖｏｌ．１４５（
１），  ｐ６９−７３）等が挙げられる。
【００９７】
また、本発明のカルボン酸製造方法においては、ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、ＰＣとも呼ぶ）活性が増強するように改変された微生物であってもよい。ここで、「ＰＣ活性」とは、ピルビン酸をカルボキシル化してオキサロ酢酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：６．４．１．１）をいう。「ＰＣ活性が増強された」とは、非改変株と比較してＰＣ活性が上昇していることをいう。ＰＣ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＰＣ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＦｉｓｈｅｒらの方法（Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＨ，  Ｍａｇａｓａｎｉｋ  Ｂ，  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９８４，  Ｖｏｌ．１５８（１），  ｐ５５−６２）により、ＰＣ活性を測定することによって確認することができる。
【００９８】
ＰＣ活性が増強した株は、上述した微生物を親株として用い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ＰＣ活性が増強した株を選択することによってそれぞれ得ることができる。また、ＰＣをコードする遺伝子を用いて改変してもよい。具体的には、ｐｃ遺伝子のコピー数を高めることによって達成でき、コピー数を高めることは、プラスミドを用いたり、公知の相同組換え法によって染色体上で多コピー化させたりすることなどによって達成できる。なお、ＰＣ活性の増強は、染色体上またはプラスミド上でｐｃ遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによって高発現化させることによっても達成できる。
【００９９】
ＰＣ活性の増強に用いるｐｃ遺伝子としては、ＰＣ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の遺伝子を挙げることができる。
さらに、コリネ型細菌以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のｐｃ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｐｃ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＰＣ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【０１００】
上記のようにして単離されたＰＣをコードする遺伝子を公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、ＰＣ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換することにより、ＰＣ活性増強株を得ることができる。あるいは、相同組換えなどによって、宿主微生物の染色体ＤＮＡにＰＣをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによってもＰＣ活性増強株を得ることができる。なお、形質転換、相同組換えは当業者に知られた通常の方法に従って行うことができる。
【０１０１】
染色体上またはプラスミド上にＰＣ遺伝子を導入する場合には、適当なプロモーターを該遺伝子の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中
において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターであれば特に限定されず、ｐｃ遺伝子自身のプロモーターおよびターミネーターであってもよいし、他のプロモーターおよびターミネーターに置換してもよい。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーターおよびターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
【０１０２】
本発明のアルコール製造方法においては、カルボン酸製造方法のときと同様、ＬＤＨ活性が低減するように改変された微生物を用いることが好ましい。ＬＤＨ活性が低減した株は、上述の方法と同様にして作製することができる。
また、本発明のアルコール製造方法においては、アルコールデヒドロゲナーゼ（以下、ＡＤＨとも呼ぶ）活性が増強するように改変された微生物であってもよい。ここで、「ＡＤＨ活性」とは、アルデヒドを還元してアルコールを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．１、１．１．１．２）をいう。「ＡＤＨ活性が増強された」とは、非改変株と比較してＡＤＨ活性が上昇していることをいう。ＡＤＨ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＡＤＨ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＫｏｔｒｂｏｖａ−Ｋｏｚａｋらの方法（Ｋｏｔｒｂｏｖａ−Ｋｏｚａｋ  Ａ，  Ｋｏｔｒｂａ  Ｐ，  Ｉｎｕｉ  Ｍ，  Ｓａｊｄｏｋ  Ｊ，  Ｙｕｋａｗａ  Ｈ，  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００７，  Ｖｏｌ．７６（６），ｐ１３４７−５６）により、ＡＤＨ活性を測定することによって確認することができる。
【０１０３】
ＡＤＨ活性が増強した株は、上述のＰＣ活性を増強する方法と同様にして作製することができる。
ＡＤＨ活性の増強に用いるａｄｈ遺伝子としては、ＡＤＨ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）由来のａｄｈＢ遺伝子、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来のａｄｈＥ２遺伝子を挙げることができる。
【０１０４】
さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のａｄｈ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｄｈ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＡＤＨ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。
【０１０５】
なお、本発明に用いる微生物は、有機化合物生産能を付与するための改変のうちの２種類以上の改変を組み合わせて得られる微生物であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。
また、本発明に用いる微生物は、有機化合物生産能を付与するための改変とペントース利用能を付与するための改変を組み合わせて得られる微生物であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。
【０１０６】
＜微生物の培養方法＞
本発明の培養方法は、ペントースを含有する有機原料を炭素源として用いることを特徴とする微生物の培養方法である。本発明の培養方法によって得られた微生物は、その後、有機原料に作用させることによって有機化合物を生成させ、これを回収することができる。このときの有機原料としては、ペントースを含有する有機原料を用いてもよいし、その他の有機原料を用いてもよい。製造し得る有機化合物の種類および好ましい有機化合物の
例は上述した通りである。
【０１０７】
前記微生物を用いて本発明の培養方法を行うに当たっては、ペントースを含む寒天培地等の固体培地で培養してもよいし、ペントースを含む液体培地で培養してもよい。後述する種培養や本培養を行なうことで、有機化合物生産反応に供する前記微生物を増殖させることができる。
種培養は、本培養に供する前記微生物の菌体を調製するために行なうものである。種培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができるが、窒素源や無機塩などを含む培地であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して増殖できる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。さらに、必要に応じて、前記培地に炭素源としてペントースを含有する有機原料を添加してもよいし、グルコース等の有機原料を添加してもよい。
【０１０８】
種培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。一般的な生育至適温度とは、有機化合物の生産に用いられる条件において最も生育速度が速い温度のことを言う。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。
【０１０９】
種培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。一般的な生育至適ｐＨとは、有機化合物の生産に用いられる条件において最も生育速度が速いｐＨのことを言う。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１０であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。
また、種培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、種培養においては、通気したり攪拌したりして、酸素を供給することが好ましい。
【０１１０】
種培養後の菌体は、後述する本培養に用いることができるが、種培養については省略してもよく、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接本培養に用いてもよい。また、必要に応じて、種培養を何度か繰り返し行ってもよい。
本培養は、後述する有機化合物生産反応に供する前記微生物菌体を調製するために行なうものであり、主として菌体量を増やすことを目的とする。上述の種培養を行う場合は、種培養により得られた菌体を用いて本培養を行う。
【０１１１】
本培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができるが、窒素源や無機塩などを含む培地であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して増殖できる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、培養時の発泡を抑えるために、培地には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。
【０１１２】
また、本培養においては、炭素源としてペントースを含有する有機原料を使用する。必要に応じて、その他の有機原料を添加してもよい。本培養において使用するペントース以外の有機原料としては、前記微生物が資化して増殖し得るものであれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、スクロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、スクロース、またはフルクトースが好ましく、特にグルコースまたはスクロースが好ましい。
【０１１３】
また、前記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用され、前記発酵性糖質がサトウキビ、甜菜、サトウカエデ等の植物から搾取した糖液であるものが好ましい。
これらの有機原料は、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。
前記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、増殖を阻害しない範囲で添加するのが有利であり、培養液に対して、通常０．１〜１０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．５〜５％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で用いることができる。また、増殖に伴う前記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行ってもよい。
【０１１４】
また、本培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。
また、本培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１０であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。
【０１１５】
また、本培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、本培養においては、通気したり攪拌したりして、酸素を供給することが好ましい。
また、本培養においては、より有機化合物の製造に適した菌体の調製方法として、特開２００８−２５９４５１号公報に記載の炭素源の枯渇と充足を短時間で交互に繰り返すように培養を行う方法も用いることができる。
本培養後の菌体は、後述する有機化合物生産反応に用いることができるが、培養液を直接用いてもよいし、遠心分離、膜分離等によって菌体を回収した後に用いてもよい。
【０１１６】
＜有機化合物の製造方法＞
本発明の有機化合物の製造方法は、水性媒体中でペントースを含有する有機原料に前記微生物またはその処理物を作用させることにより、有機化合物を生産させる工程を含むことを特徴とする有機化合物の製造方法である。中でも、ペントースを含有する有機原料に前記微生物またはその処理物を作用させることにより有機化合物を生産させ、これを回収することが好ましい。製造し得る有機化合物の種類および好ましい有機化合物の例は上述した通りである。
【０１１７】
ここで、水性媒体とは、有機化合物生産反応を行なう水溶液のことであり、後述するように窒素源、無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。当該水性媒体中で、前記微生物またはその処理物と有機原料とを反応させることにより有機化合物生産反応を行なうことができる。本明細書において、水性媒体とは、反応容器に含まれる液体全てを意味する。
【０１１８】
本発明の有機化合物製造方法に前記微生物を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接用いても良いが、必要に応じて上記微生物を予め液体培地で
培養したものを用いてもよい。即ち、前記微生物を予め増殖させておいた上で、前記微生物に有機化合物を生産させてもよい。上述のように種培養や本培養を行なうことで、前記微生物を予め増殖させることができるが、このときに使用する有機原料としては、ペントースを含有する有機原料を用いてもよいし、その他の有機原料を用いてもよい。
【０１１９】
なお、種培養または本培養した微生物を反応液中で増殖させながら、ペントースを含有する有機原料と反応させることによって有機化合物を製造してもよいし、予め種培養または本培養を行なうことで増殖させた菌体を、ペントースを含有する有機原料を含む水性媒体中で有機原料と反応させることによって有機化合物を製造してもよい。
また、本発明の有機化合物製造方法においては、微生物の処理物を使用することもできる。微生物の処理物としては、例えば、微生物の菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またはその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。
【０１２０】
本発明の有機化合物製造方法においては、ペントースを含有する有機原料を使用する。必要に応じて、その他の有機原料を添加してもよい。有機化合物製造方法において使用するペントース以外の有機原料としては、前記微生物が資化して有機化合物を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプンまたはセルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、キシリトールまたはリビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、スクロースまたはフルクトースが好ましく、特にグルコースまたはスクロースが好ましい。
【０１２１】
また、前記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液または糖蜜なども使用され、具体的にはサトウキビ、甜菜またはサトウカエデ等の植物から搾取した糖液であるものが好ましい。
これらの有機原料は、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。
前記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、有機化合物の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、反応液に対して、通常５％（Ｗ／Ｖ）以上、好ましくは１０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、一方、通常３０％（Ｗ／Ｖ）以下、好ましくは２０％（Ｗ／Ｖ）以下である。また、反応の進行に伴う前記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行ってもよい。
【０１２２】
前記水性媒体としては特に限定されず、例えば、微生物を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよいが、反応液は窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して有機化合物を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、反応液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。
【０１２３】
また、水性媒体には、例えば上述した有機原料、窒素源、無機塩などのほかに、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガス（炭酸ガス）を含有させることが好ましい。炭酸イオンまたは重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムなどから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸またはこれらの塩或いは二酸化炭素ガスから供給することもできる。炭酸または重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、
炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。
【０１２４】
水性媒体中における炭酸イオンまたは重炭酸イオンの濃度は、通常１ｍＭ以上、好ましくは２ｍＭ以上、さらに好ましくは３ｍＭ以上であり、また、通常５００ｍＭ以下、好ましくは３００ｍＭ以下、さらに好ましくは２００ｍＭ以下である。二酸化炭素ガスを含有させる場合は、水性媒体１Ｌ当たり通常５０ｍｇ以上、好ましくは１００ｍｇ以上、さらに好ましくは１５０ｍｇ以上の二酸化炭素ガスを含有させることが好ましく、一方、水性媒体１Ｌ当たり通常２５ｇ以下、好ましくは１５ｇ以下、さらに好ましくは１０ｇ以下の二酸化炭素ガスを含有させることが好ましい。
【０１２５】
有機化合物生産反応中の水性媒体のｐＨは、用いる上記微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整されることが好ましい。具体的には、コリネ型細菌を用いる場合には、反応液のｐＨを、通常５．５以上、好ましくは６以上、より好ましくは６．６以上、さらに好ましくは７．１以上であり、一方、通常１０以下、好ましくは９．５以下、より好ましくは９．０以下とすることが好ましい。
【０１２６】
水性媒体のｐＨは、生産される有機化合物が酸性物質である場合には、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、アンモニア（水酸化アンモニウム）、またはそれらの混合物等を添加することによって調整することができる。生産される有機化合物が塩基性物質である場合には、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸等の有機酸、それらの混合物等を添加すること、または二酸化炭素ガスを供給することによって調整することができる。
【０１２７】
また、水性媒体に、イノシトールを含有させてもよい。これにより、ｉｏｌＴ遺伝子の発現を誘導し、発現を増強することができる。この手段によってｉｏｌＴ遺伝子の発現を増強するにあたっては、上述のような遺伝子改変を行った菌株を用いてもよいが、そのような遺伝子改変を行っていない菌株も用いることができる。ここで使用可能なイノシトールとしては、ｍｙｏ−イノシトールなど、＜本発明に用いる微生物または処理物＞に例示したものと同様である。
【０１２８】
有機化合物生産反応に用いる微生物の菌体量は、特に限定されないが、湿菌体重量として、通常１ｇ／Ｌ以上、好ましくは１０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは２０ｇ／Ｌ以上であり、一方、通常７００ｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは４００ｇ／Ｌ以下である。
有機化合物生産反応の時間は、特に限定はないが、通常１時間以上、好ましくは３時間以上であり、一方、通常１６８時間以下、好ましくは７２時間以下である。
【０１２９】
有機化合物生産反応の温度は、用いる前記微生物の生育至適温度と同じ温度で行ってもよいが、生育至適温度より高い温度で行うことが有利であり、通常２℃〜２０℃、好ましくは７℃〜１５℃高い温度で行う。具体的には、コリネ型細菌の場合には、通常３５℃以上、好ましくは３７℃以上、さらに好ましくは３９℃以上であり、一方、通常４５℃以下、好ましくは４３℃以下、さらに好ましくは４１℃以下である。有機化合物生産反応の間、常に３５℃〜４５℃の範囲とする必要はないが、全反応時間の５０％以上、好ましくは８０％以上の時間において、上記温度範囲にすることが望ましい。
【０１３０】
有機化合物生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行なうことが好ましい。ここでいう嫌気的雰囲気下は、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、二酸化炭素
ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法によって得ることができる。
本発明の有機化合物製造方法は、特段の制限はないが、回分反応、半回分反応もしくは連続反応のいずれにも適用することができる。
【０１３１】
以上のような微生物反応により、有機化合物が生成し、反応液中に蓄積させることができる。蓄積させた有機化合物は、常法に従って、反応液より回収することができる（回収工程）。具体的には、例えば、蓄積させた有機化合物がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸等のカルボン酸である場合には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化（晶析）あるいはカラムクロマトグラフィーにより精製するなどして、カルボン酸を回収することができる。蓄積させた有機化合物がエタノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコールである場合には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、蒸留等で濃縮し、その溶液を膜脱水するなどして、アルコールを回収することができる。
【実施例】
【０１３２】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
【０１３３】
［比較例１］
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株について、以下のようにして、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の増強、キシロースイソメラーゼ遺伝子およびキシルロキナーゼ遺伝子の導入を行ない、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を作製した。
【０１３４】
＜ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株を、２％グルコースを含むＡ培地［尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、蒸留水１，０００ｍＬに溶解］１０ｍＬで対数増殖期後期まで培養し、集菌した。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度のリゾチームを含む緩衝液［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ］０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合し、遠心分離（１５，０００×ｇ、２分間）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡにＴＥ緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ］５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【０１３５】
（Ｂ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株のｌｄｈ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号７および配列番号８）を用いたＰＣＲによって行った。
【０１３６】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）０
．２μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ 各々プライマー、０．２５μＭ  ｄＮ
ＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
【０１３７】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片をＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにより切断した結果、約１．０ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨと命名した。
【０１３８】
（Ｃ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの構築
上記（Ｂ）で作製したｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで切断することにより約０．２５ｋｂからなるＬＤＨのコーディング領域の内部配列を切り出した。残った約３．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ）にて平滑化し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて環状化させ、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ
Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにより切断した結果、約０．７５ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨと命名した。
【０１３９】
次に、上記ｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにて切断して生じる約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片を、０．７５%アガロースゲル電気泳動により分離、回収
し、欠損領域を含むｌｄｈ遺伝子断片を調製した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにて切断したｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）と混合し、ＤＮＡ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにより切断した結果、約０．７５ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨと命名した。ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨの構築過程を図１に示した。
【０１４０】
（Ｄ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨを用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
【０１４１】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株は、常法（Ｗｏｌｆ  Ｈｅｔａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８３，１５６（３），ｐ１１６５−７０、Ｋｕｒｕｓｕ  Ｙｅｔａｌ．，Ａｇｒｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，１９９０，５４（２），ｐ４４３−７）に従って内在性プラスミドを除去（キュアリング）し、以後の形質転換に用いた。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株の形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，１４４，ｐ１８１−５）によって行い、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン  １０ｇ、イーストエキストラクト  ５ｇ 、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、および寒天１５ｇを
蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【０１４２】
この培地上に生育した株は、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨがブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｌｄｈ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
【０１４３】
次に、上記相同組み換え株を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約１０個得た。
この様にして得られた株の中には、そのｌｄｈ遺伝子がｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ｌｄｈ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ｌｄｈ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ｌｄｈ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号９および配列番号１０）を用いて分析すると、野生型では７２０ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では４７１ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨと命名した。
【０１４４】
（Ｅ）ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の測定
上記（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株を、２％グルコースを含むＡ培地［尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、蒸留水１，０００ｍＬに溶解］に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養液を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で洗浄した。
【０１４５】
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記リン酸ナトリウム緩衝液２ｍＬに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン） にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（
１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
【０１４６】
ＬＤＨ酵素活性の測定は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ+に酸化されるのを、３４０ｎｍの吸光度変化によって検
出することで行った。反応は、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７℃にて行った。その結果、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株から調製された粗酵素液におけるＬＤＨ活性に対し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株から調製された粗酵素液におけるＬＤＨ活性は、１０分の１以下であった。
【０１４７】
＜ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の増強＞
（Ａ）コリネ型細菌用プロモーター断片の調製
コリネ型細菌で強力なプロモーター活性を有するＤＮＡ断片であるＴＺ４プロモーター（特開平７−９５８９１の配列番号４に記載のＤＮＡ断片）の取得は、上記比較例１の＜ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊＞の（Ａ）で調製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、特開平７−９５８９１の配列番号４に記載の配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１１および配列番号１２）を用いたＰＣＲによって行った。
【０１４８】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ０．２μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ 各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
【０１４９】
増幅産物の確認は、２．０％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２５０ｂｐの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ）により５’末端をリン酸化した後、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１９（タカラバイオ）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１５０】
この培地上で白色のコロニーを形成した６クローンについて、ＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。この中でＴＺ４プロモーターがｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターと逆方向に転写活性を有するように挿入されたクローンを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４と命名した。
【０１５１】
次に、ｐＵＣ／ＴＺ４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡ断片に、５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号１３および配列番号１４）から成り、両末端にそれぞれＢａｍＨＩとＰｓｔＩに対する粘着末端を有するＤＮＡリンカーを混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。本ＤＮＡリンカー
には、リボソーム結合配列（ＡＧＧＡＧＧ）およびその下流に配したクローニングサイト（上流から順に、ＰａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＡｐａＩ）が含まれている。
【０１５２】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、ＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤと命名した。
【０１５３】
この様にして構築したｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤを制限酵素ＰｓｔＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ）にて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することにより生じた約３００ｂｐのプロモーター断片を、２．０％アガロースゲル電気泳動により分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。
【０１５４】
（Ｂ）コリネ型細菌発現ベクターの構築
コリネ型細菌にて安定的に自立複製可能なプラスミドとして、ｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐ（特開平１２−９３１８３）を利用した。本プラスミドは、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４４株が保有する天然型プラスミドｐＢＹ５０３の複製領域および安定化機能を有する領域と大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ）に由来するカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌の複製領域を備える。ｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを制限酵素ＳｓｅＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ）にて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することによって調製したＤＮＡを、上記比較例１の＜ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の増強＞の（Ａ）で調製したＴＺ４プロモーター断片と混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１５５】
この培地上で生育した株をＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、該プラスミドをｐＴＺ４と命名した。
【０１５６】
（Ｃ）ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のクローニング
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株のｐｃ遺伝子の取得は、上記比較例１の＜ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１５および配列番号１６）を用いたＰＣＲによって行った。
【０１５７】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ０．２μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ 各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。
ＰＣＲ反応終了後、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を０．１μｌ加え、７２℃で３０分保温した。増幅産物の確認は、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．７ｋｂの断片を検出した。
【０１５８】
ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片をＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩにより切断した結果、約３．７ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＧＥＭ／ＭＪＰＣと命名した。
【０１５９】
ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片の塩基配列はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔおよび塩基配列解読装置３７７ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。その結果得られた塩基配列から推測されるアミノ酸配列はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株由来のＰＣと極めて高い相同性（９９．４％）を示したことから、ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来のｐｃ遺伝子であると断定した。
【０１６０】
（Ｄ）ピルビン酸カルボキシラーゼ活性増強用プラスミドの構築
上記で作製したｐＧＥＭ／ＭＪＰＣを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより生じる約３．７ｋｂからなるｐｃ遺伝子断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。このＤＮＡ断片を、同制限酵素にて切断したｐＴＺ４と混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１６１】
得られたクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩにより切断した結果、約３．７ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＭＪＰＣ１と命名した。ｐＭＪＰＣ１の構築過程を図２に示した。
【０１６２】
（Ｅ）ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子プロモーター置換用プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ｐｃ遺伝子のＮ末端領域のＤＮＡ断片の取得は、上記比較例１の＜ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１７および配列番号１８）を用いたＰＣＲによって行った。なお配列番号１８のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。
【０１６３】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ０．２μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ 各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は４分とした。
【０１６４】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、これをｐｃ遺伝子Ｎ末端断片とした。
一方、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーター断片の取得はプラスミドｐＭＪＰＣ１を鋳型とし、配列番号１９および配列番号２０に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲによって行った。なお配列番号２０のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。
【０１６５】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ０．２μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ 各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを２５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。
【０１６６】
増幅産物の確認は、１．０％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、これをＴＺ４プロモーター断片とした。
上記にて調整したｐｃ遺伝子Ｎ末端断片とＴＺ４プロモーター断片を混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結後、制限酵素ＰｓｔＩで切断し、１．０％アガロースゲル電気泳動により分離、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。このＤＮＡ断片と大腸菌プラスミドｐＨＳＧ２９９（タカラバイオ）をＰｓｔＩで切断して調整したＤＮＡと混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１６７】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩにより切断した結果、約１．０ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＭＪＰＣ１７．１と命名した。
【０１６８】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ｐｃ遺伝子の５’上流領域のＤＮＡ断片の取得は、上記比較例１の＜ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｎｏ．  ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号２１および配列番号２２）を用いたＰＣＲによって行った。
【０１６９】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ０．２μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ 各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
【０１７０】
増幅産物の確認は、１．０％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ）により５’末端をリン酸化した後、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１１９（タカラバイオ）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１７１】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを配列番号２２および配列番号２３のプライマーを用いたＰＣＲ反応に供した。このようにして挿入ＤＮＡ断片の有無を確認した結果、約０．７ｋｂの増幅産物を認めるプラスミドを選抜し、これをｐＭＪＰＣ５．１と命名した。
【０１７２】
次に上記ｐＭＪＰＣ１７．１およびｐＭＪＰＣ５．１をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断後混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結した。これを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断したＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離し、約１．７５ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。このｐｃ遺伝子の５’上流領域とＮ末端領域の間にＴＺ４プロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を、ｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）をＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断して調整したＤＮＡと混合、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１７３】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにより切断した結果、約１．７ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＭＪＰＣ１７．３と命名した。ｐＭＪＰＣ１７．３の構築過程を図３に示した。
【０１７４】
（Ｆ）ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の増強
上記比較例１の＜ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊＞の（Ｄ）で作製したブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＭＪＰＣ１７．３を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。
【０１７５】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，１４４，ｐ１８１−５）によって行い、得られた形質転換体を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース ２０ｇ、および寒天１５ｇ
を蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【０１７６】
この培地上に生育した株は、ｐＭＪＰＣ１７．３がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｐｃ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
【０１７７】
次に、上記相同組換え株を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。
【０１７８】
この様にして得られた株の中には、そのｐｃ遺伝子の上流にｐＭＪＰＣ１７．３に由来するＴＺ４プロモーターが挿入されたものと野生型に戻ったものが含まれる。ｐｃ遺伝子がプロモーター置換型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ｐｃ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーターおよびｐｃ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号２４および配列番号２５）を用いて分析すると、プロモーター置換型では６７８ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した。
【０１７９】
（Ｇ）ピルビン酸カルボキシラーゼ活性の測定
上記比較例１の＜ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の増強＞の（Ｆ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を、２％グルコースを含むＡ培地［尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、蒸留水１，０００ｍＬに溶解］に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養液を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。
【０１８０】
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記リン酸カリウム緩衝液２ｍＬに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン） にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を超遠心（１０
０，０００×ｇ，４℃，９０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
【０１８１】
ＰＣ酵素活性の測定は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、 ０．
１ｍｇ／１０ｍＬビオチン、５ｍＭ  塩化マグネシウム、５０ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、５ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  アデノシン３リン酸ナトリウム、０．３２  ｍＭ  ＮＡＤＨ、２０ｕｎｉｔｓ／１．５ｍＬリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（和光純薬、酵母由来）および粗酵素液を含む反応液中で２５℃にて反応させて行った。１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを減少させる酵素量とした。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株から調製した粗酵素液の比活性は０．１Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。一方、親株であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株から調製した粗酵素液の比活性は、本活性測定方法の検出限界以下であった。
【０１８２】
＜キシロースイソメラーゼ遺伝子およびキシルロキナーゼ遺伝子の導入＞
（Ａ）大腸菌ゲノムＤＮＡの抽出
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株をＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］１０ｍＬで対数増殖期後期まで培養し、集菌した。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度のリゾチームを含む緩衝液［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ］０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合し、遠心分離（１５，０００×ｇ、２分間）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡにＴＥ緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ］５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【０１８３】
（Ｂ）キシロースイソメラーゼ−キシルロキナーゼ遺伝子オペロンのクローニング
大腸菌ＪＭ１０９株のｘｙｌＡＢオペロンの取得は、上記比較例１の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該オペロン周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ０００９６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号２６および配列番号２７）を用いたＰＣＲによって行った。
【０１８４】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ０．５μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ 各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で３分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。
【０１８５】
増幅産物の確認は、０．９％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．０ｋｂの断片を検出した。得られたｘｙｌＡＢオペロンのＤＮＡ断片はＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製後、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで切断した。これによって生じた約２．９ｋｂのＤＮＡ断片は０．９％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ
Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてゲルから回収した。このＤＮＡ断片を、ｐＴＺ４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形
質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩにより切断した結果、約２．９ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＺｙｌＡＢ１と命名した。
【０１８６】
（Ｃ）キシロースイソメラーゼ−キシルロキナーゼ遺伝子オペロン導入用プラスミドの構築
大腸菌由来ＸｙｌＡＢオペロンをブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の染色体上ｌｄｈ遺伝子欠損部位に導入するため、ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株のｌｄｈ遺伝子の取得は、上記比較例１の＜ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号２８および配列番号２９）を用いたＰＣＲによって行った。
【０１８７】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ０．５μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ 各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭ  ｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。
【０１８８】
増幅産物の確認は、０．９％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２．１ｋｂの断片を検出した。得られたｌｄｈ遺伝子のＤＮＡ断片はＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）のＸｂａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を２５μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１８９】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩにより切断した結果、約２．２ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＫＢ−ＬＤＨ２と命名した。
【０１９０】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンの取得は、プラスミドｐＺｙｌＡＢ１を鋳型とし、配列番号３０および配列番号３１に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ） ０．５μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で２０秒、７２℃で４５秒からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分
とした。
【０１９１】
増幅産物の確認は、０．７％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．２ｋｂの断片を検出した。得られたＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンのＤＮＡ断片はＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ）により５’末端をリン酸化した後、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いてｐＫＢ−ＬＤＨ２のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０１９２】
この培地上で生育したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡの挿入断片の塩基配列はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔおよび塩基配列解読装置３７７ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。その結果得られた塩基配列（ＸｙｌＡＢオペロン）は、大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株のゲノム配列と完全に一致し、ＸｙｌＡＢオペロンに変異が入っていないことを確認し、これをｐＺｙｌＡＢ３と命名した。ｐＺｙｌＡＢ３の構築過程を図４に示した。
【０１９３】
（Ｄ）キシロースイソメラーゼ−キシルロキナーゼ遺伝子オペロンの導入
上記比較例１の＜ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の増強＞の（Ｆ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＺｙｌＡＢ３を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。
【０１９４】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，１４４，ｐ１８１−５）によって行い、得られた形質転換体を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース ２０ｇ、および
寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【０１９５】
この培地上に生育した株は、ｐＺｙｌＡＢ３がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｌｄｈ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
【０１９６】
次に、上記相同組換え株を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。
【０１９７】
この様にして得られた株の中には、そのｌｄｈ遺伝子欠損部位にｐＺｙｌＡＢ３に由来するＴＺ４プロモーターと連結されたＺｙｌＡＢオペロンが挿入されたものと親株と同じ配列に戻ったものが含まれる。ＴＺ４プロモーターと連結されたＺｙｌＡＢオペロンが挿入されたか否かの確認は、ＬＢＧ培地にて培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し
、ＴＺ４プロモーターと連結されたＺｙｌＡＢオペロンの検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーターおよびＺｙｌＡＢオペロンをＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号３２および配列番号３３）を用いて分析すると、ＴＺ４プロモーターと連結されたＺｙｌＡＢオペロンが挿入されたクローンでは４，１９６ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターと連結されたＺｙｌＡＢオペロンが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した。
【０１９８】
（Ｅ）キシロース資化試験
上記比較例１の（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を２０ｇ／Ｌキシロースを含むＭＭ寒天培地［尿素２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４−５Ｈ２Ｏ６ｍｇ、ビ
オチン ２００μｇ、チアミン ２００μｇ、寒天  １５ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］に植菌し、３０℃で３日間静置培養した。対照として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株も同様に培養した。その結果、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株はキシロースを単一炭素源とした培地において生育できることが確認された。一方、親株であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株は生育することはできなかった。
【０１９９】
［実施例１］
＜イノシトール輸送体ＩｏｌＴ１をコードする遺伝子の増強＞
（Ａ）ｉｏｌＴ１遺伝子プロモーター置換用プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ｉｏｌＴ１遺伝子の５’上流領域のＤＮＡ断片の取得は、上記比較例１の＜ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号３４および配列番号３５）を用いたＰＣＲによって行った。
【０２００】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２５μｌ、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μｌと
した。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、初めに９４℃で１分間保温した後、９８℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で１０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。
【０２０１】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、これをｉｏｌＴ１遺伝子上流領域断片とした。
一方、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーター断片の取得は、比較例１の（Ｂ）で調製したプラスミドｐＺｙｌＡＢ１を鋳型とし、配列番号３６および配列番号３７に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲによって行った。
【０２０２】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２５μｌ、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μｌと
した。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、初めに９４℃で１分間保温した後、９８℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で１０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。
【０２０３】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．３ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、これをＴＺ４プロモーター断片とした。
さらに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ｉｏｌＴ１遺伝子のＮ末端領域のＤＮＡ断片の取得は、上記比較例１の＜ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号３８および配列番号３９）を用いたＰＣＲによって行った。
【０２０４】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２５μｌ、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μｌと
した。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、初めに９４℃で１分間保温した後、９８℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で１０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。
【０２０５】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、これをｉｏｌＴ１遺伝子Ｎ末端断片とした。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ｉｏｌＴ１遺伝子の５’上流領域とＮ末端領域の間にＴＺ４プロモーターが挿入されたＤＮＡ断片の取得は、上記で得られた３つの増幅産物を鋳型とし、配列番号３４および配列番号３９の合成ＤＮＡを用いたクロスオーバーＰＣＲによって行った。
【０２０６】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２５μｌ、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μｌと
した。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、初めに９４℃で１分間保温した後、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、７２℃で１０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。
【０２０７】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．３ｋｂの断片を検出した。
得られたｉｏｌＴ１遺伝子上流へのＴＺ４プロモーター挿入断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製後、制限酵素ＳａｌＩおよびＳｐｈＩで切断した。これによって生じた約１．３ｋｂのＤＮＡ断片は０．７％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてゲルから回収した。このＤＮＡ断片を、ｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）を制限酵素ＳａｌＩおよびＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、２５μｇ／ｍＬカナマシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０２０８】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡ
を制限酵素ＳａｌＩおよびＳｐｈＩにより切断した結果、約１．３ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＩｏｌＴ１−２と命名した。ｐＩｏｌＴ１−２の構築過程を図５に示した。
【０２０９】
（Ｂ）イノシトール輸送体ＩｏｌＴ１発現増強株の作製
上記比較例１の（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＩｏｌＴ１−２を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，１４４，ｐ１８１−５）によって行い、得られた形質転換体を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース ２０
ｇ、および寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【０２１０】
この培地上に生育した株は、ｐＩｏｌＴ１−２がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｉｏｌＴ１遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
【０２１１】
次に、上記相同組換え株を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。
【０２１２】
この様にして得られた株の中には、そのｉｏｌＴ１遺伝子の上流にｐＩｏｌＴ１−２に由来するＴＺ４プロモーターが挿入されたものと野生型に戻ったものが含まれる。ｉｏｌＴ１遺伝子がプロモーター置換型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ｉｏｌＴ１遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーターおよびｉｏｌＴ１遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号４０および配列番号４１）を用いて分析すると、プロモーター置換型では１，５６２ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ１／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した。
【０２１３】
［実施例２］
＜イノシトール輸送体ＩｏｌＴ２をコードする遺伝子の増強＞
（Ａ）ｉｏｌＴ２遺伝子プロモーター置換用プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ｉｏｌＴ２遺伝子の５’上流領域のＤＮＡ断片の取得は、上記比較例１の＜ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号４２および配列番号４３）を用いたＰＣＲによって行った。
【０２１４】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２５μｌ、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μｌと
した。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ）を用い、初めに９４℃で１分間保温した後、９８℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で１０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。
【０２１５】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、これをｉｏｌＴ２遺伝子上流領域断片とした。
一方、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーター断片の取得は、比較例１の（Ｂ）で調製したプラスミドｐＺｙｌＡＢ１を鋳型とし、配列番号４４および配列番号４５に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲによって行った。
【０２１６】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２５μｌ、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μｌと
した。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、初めに９４℃で１分間保温した後、９８℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で１０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。
【０２１７】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．３ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、これをＴＺ４プロモーター断片とした。
さらに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ｉｏｌＴ２遺伝子のＮ末端領域のＤＮＡ断片の取得は、上記比較例１の＜ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号４６および配列番号４７）を用いたＰＣＲによって行った。
【０２１８】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２５μｌ、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μｌと
した。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、初めに９４℃で１分間保温した後、９８℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で１０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。
【０２１９】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、これをｉｏｌＴ２遺伝子Ｎ末端断片とした。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ｉｏｌＴ２遺伝子の５’上流領域とＮ末端領域の間にＴＺ４プロモーターが挿入されたＤＮＡ断片の取得は、上記で得られた３つの増幅産物を鋳型とし、配列番号４２および配列番号４７の合成ＤＮＡを用いたクロスオーバーＰＣＲによって行った。
【０２２０】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２５μｌ、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μｌと
した。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、初めに９４℃で１分間保温した後、９８℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で２０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。
【０２２１】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．５ｋｂの断片を検出した。
得られたｉｏｌＴ２遺伝子上流へのＴＺ４プロモーター挿入断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製後、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断した。これによって生じた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片は０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてゲルから回収した。このＤＮＡ断片を、ｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、２５μｇ／ｍＬカナマシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０２２２】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩにより切断した結果、約１．５ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＩｏｌＴ２−２と命名した。ｐＩｏｌＴ２−２の構築過程を図６に示した。
【０２２３】
（Ｂ）イノシトール輸送体ＩｏｌＴ２をコードする遺伝子の増強
上記比較例１の（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＩｏｌＴ２−２を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，１４４，ｐ１８１−５）によって行い、得られた形質転換体を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース ２０
ｇ、および寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【０２２４】
この培地上に生育した株は、ｐＩｏｌＴ２−２がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｉｏｌＴ２遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
【０２２５】
次に、上記相同組換え株を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。
【０２２６】
この様にして得られた株の中には、そのｉｏｌＴ２遺伝子の上流にｐＩｏｌＴ２−２に由来するＴＺ４プロモーターが挿入されたものと野生型に戻ったものが含まれる。ｉｏｌＴ１遺伝子がプロモーター置換型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ｉｏｌＴ２遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーターおよびｉｏｌＴ２遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号４８および配列番号４９）を用いて分析すると、プロモーター置換型では１，５７０ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性と
なった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ２／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した。
【０２２７】
［実施例３］
＜ｉｏｌＴ１遺伝子の発現を抑制する転写因子ＩｏｌＲをコードする遺伝子の破壊＞
（Ａ）ｉｏｌＲ遺伝子破壊用プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株のｉｏｌＲ遺伝子断片の取得は、上記比較例１の＜ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５０および配列番号５１）を用いたＰＣＲによって行った。
【０２２８】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ） ０．５μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、初めに９６℃で１分保温した後、９８℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で４０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。
【０２２９】
増幅産物の確認は、０．７％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。得られたｉｏｌＲ遺伝子の内部配列のＤＮＡ断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製後、制限酵素ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。これによって生じた約０．５ｋｂのＤＮＡ断片は０．７％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてゲルから回収した。このＤＮＡ断片を、大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ）を制限酵素ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し２５μｇ／ｍＬカナマシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０２３０】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩにより切断した結果、約０．５ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＤ−ＩｏｌＲ−１と命名した。ｐＤ−ＩｏｌＲ−１の構築過程を図７に示した。
【０２３１】
（Ｂ）ｉｏｌＴ１遺伝子の発現を抑制する転写因子ＩｏｌＲをコードする遺伝子の破壊上記比較例１の（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＤ−ＩｏｌＲ−１を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，１４４，ｐ１８１−５）によって行い、得られた形質転換体を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース ２０
ｇ、および寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【０２３２】
この培地上に生育した株は、ｐＤ−ＩｏｌＲ−１がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｉｏｌＲ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子が挿入されているはずである。この様にして得られたカナマイシン耐性株がそのゲノム上に存在するｉｏｌＲ遺伝子とプラスミドｐＤ−ＩｏｌＲ−１に存在する該遺伝子との間で相同組み換えを起こしたものであるか否かの確認は、配列番号２３および配列番号５２、配列番号５３および配列番号５４の合成ＤＮＡをプライマーとして用いたコロニーＰＣＲにより行った。
【０２３３】
鋳型ＤＮＡは、コロニーを５０μＬの滅菌水に懸濁した溶液を用いた。反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ  ＤＮＡポリメラーゼＶｅｒ．２（タカラバイオ）０．２μｌ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量
を１０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９８℃で１０秒、６０℃で１５秒、６８℃で５０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９８℃での保温は２分とした。
上記方法にてカナマイシン耐性菌株を分析した結果、配列番号２３および配列番号５２の組み合わせでは７６０ｂｐ、配列番号５３および配列番号５４の組み合わせでは５００ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られる株を選抜し、これをブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＩｏｌＲ／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した。
【０２３４】
［比較例２］
＜ペントーストランスポーターＡｒａＥをコードする遺伝子の導入＞
（Ａ）コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株ゲノムＤＮＡの抽出
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株を、２％グルコースを含むＡ培地［尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、蒸留水１，０００ｍＬに溶解］１０ｍＬで対数増殖期後期まで培養し、集菌した。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度のリゾチームを含む緩衝液［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ］０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合し、遠心分離（１５，０００×ｇ、２分間）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡにＴＥ緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ］５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【０２３５】
（Ｂ）ペントーストランスポーターａｒａＥ遺伝子導入用プラスミドの構築
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株由来ａｒａＥ遺伝子を、ＴＺ４プロモーターに連結させ、上記比較例１の（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の染色体上ｌｄｈ遺伝子欠損部位（既に導入済みの大腸菌由来ＸｙｌＡＢオペロン下流の位置）に導入するため、ｌｄｈ遺伝子の内部配列とｌｄｈ遺伝子の３‘下流領域を相同組換えの領域として利用した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ｌｄｈ遺伝子の内部配列の取得は、上記比較例１の＜ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５５および配列番号５６）を用いたＰＣＲによって行った。
【０２３６】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２５μｌ、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μｌと
した。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、初めに９４℃で１分間保温した後、９８℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で１０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。
【０２３７】
増幅産物の確認は、０．７％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．４ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、これをｌｄｈ遺伝子の内部配列断片とした。
次に、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーター断片の取得は、比較例１の（Ｂ）で調製したプラスミドｐＺｙｌＡＢ１を鋳型とし、配列番号５７および配列番号５８に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲによって行った。
【０２３８】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２５μｌ、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μｌと
した。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、初めに９４℃で１分間保温した後、９８℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で１０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。
【０２３９】
増幅産物の確認は、０．７％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．３ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、これをＴＺ４プロモーター断片とした。
一方、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株由来ａｒａＥ遺伝子の取得は、上記比較例２の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ４４７３７１）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５９および配列番号６０）を用いたＰＣＲによって行った。
【０２４０】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ） ２５μｌ、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μｌとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、初めに９４℃で１分保温した後、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、７２℃で２分からなるサイクルを３０回繰り返した。増幅産物の確認は、０．７％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．６ｋｂの断片を検出した。
【０２４１】
さらに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ｌｄｈ遺伝子の３‘下流領域の取得は、上記比較例１の＜ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  
Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号６１および配列番号６２）を用いたＰＣＲによって行った。
【０２４２】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２５μｌ、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μｌと
した。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、初めに９４℃で１分間保温した後、９８℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で１０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。
【０２４３】
増幅産物の確認は、０．７％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行い、これをｌｄｈ遺伝子下流領域断片とした。
ＴＺ４プロモーターに連結されたａｒａＥ遺伝子にｌｄｈ遺伝子下流領域を結合させた断片の取得は、上記で得られた３つの増幅産物を鋳型とし、配列番号５７および配列番号６２の合成ＤＮＡを用いたクロスオーバーＰＣＲによって行った。
【０２４４】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２５μｌ、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μｌと
した。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、初めに９４℃で１分間保温した後、９８℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で４０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。
【０２４５】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２．４ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。
ＴＺ４プロモーターに連結されたａｒａＥ遺伝子とその両端に相同組換えに用いる領域を含む断片の取得は、上記で得られたｌｄｈ遺伝子の内部配列断片とクロスオーバーＰＣＲの増幅産物を鋳型とし、配列番号５５および配列番号６２の合成ＤＮＡを用いたクロスオーバーＰＣＲによって行った。
【０２４６】
反応液組成は、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２５μｌ、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μｌと
した。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、初めに９４℃で１分間保温した後、９８℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で４０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。増幅産物の確認は、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２．８ｋｂの断片を検出した。
【０２４７】
得られたＤＮＡ断片（ＴＺ４プロモーターに連結されたａｒａＥ遺伝子とその両端に相同組換えに用いる領域を含む断片）は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製後、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断した。これによって生じた約３．０ｋｂのＤＮＡ断片は０．７％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてゲルから回収した。このＤＮＡ断片を、同制限酵素にて切断したｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）と混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、２５μｇ／ｍＬカナマシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【０２４８】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５ｇ／Ｌ］（２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩにより切断した結果、約３．０ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＡｒａＥ−２と命名した。ｐＡｒａＥ−２の構築過程を図８に示した。
【０２４９】
（Ｃ）ペントーストランスポーターａｒａＥ遺伝子の導入
上記比較例１の（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＡｒａＥ−２を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０，５３，１５９）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。
【０２５０】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，１４４，ｐ１８１−５）によって行い、得られた形質転換体を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース ２
０ｇ、および寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
【０２５１】
この培地上に生育した株は、ｐＩｏｌＴ２−２がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｉｏｌＴ２遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
【０２５２】
次に、上記相同組換え株を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。
【０２５３】
この様にして得られた株の中には、その染色体上ｌｄｈ遺伝子欠損部位にｐＡｒａＥ−２に由来するＴＺ４プロモーターに連結されたａｒａＥ遺伝子（ＴＺ４−ａｒａＥ）が挿入されたものと野生型に戻ったものが含まれる。ＴＺ４−ａｒａＥ導入型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ＴＺ４−ａｒａＥの検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４−ａｒａＥをＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号５７および配列番号６３）を用いて分析すると、ＴＺ４−ａｒａＥ導入型では３，２２９ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＡｒａＥ／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した。
このようにして作製した実施例１〜３、および比較例１の菌株の系統図を、図１３に示す。
【０２５４】
［実施例４］
＜ｉｏｌＴ１遺伝子増強株のｉｏｌＴ１遺伝子およびｉｏｌＴ２遺伝子の転写解析＞
実施例１の（Ｂ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ１／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株のｉｏｌＴ１遺伝子、ｉｏｌＴ２遺伝子の転写量を分析するため、以下の通りフラスコ培養を行って菌体を調製し、その後、全ＲＮＡの調製、逆転写反応、および定量ＰＣＲを実施した。
【０２５５】
（Ａ）種培養
Ａ培地［尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、蒸留水１，０００ｍＬに溶解］１，０００ｍＬを、１２１℃、２０分間で加熱滅菌し、室温まで冷やした後、２００ｍＬの三角フラスコに１５ｍＬ入れ、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を６００μｌ添加した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ１／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を接種して３０℃で８時間振とう培養した。
【０２５６】
（Ｂ）本培養
５００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬのＡ培地を入れ、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ添加した後、上記の培養で得られた培養液を、ＯＤ６６０が０．０２となるように接種し、３０℃で、１８時間振とう培養した。
【０２５７】
（Ｃ）全ＲＮＡの調製
上記（Ｂ）で調製した菌体から、ＲＮｅａｓｙ  ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）およびＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて以下の通り全ＲＮＡを調製した。
【０２５８】
上記（Ｂ）での培養後、回収した培養液を用いて、１０８〜１０９個となるよう菌体溶液を調製し、８，０００ｒｐｍ、２分間、４℃の遠心分離を行って得られた菌体を蒸留滅菌水に懸濁し、再度、８，０００ｒｐｍ、２分間、４℃の遠心分離を行った。得られた菌体は、キット付属のＲＬＴ  Ｂｕｆｆｅｒ  ６００μｌに２−メルカプトエタノール  ６μｌを添加した溶液に懸濁し、この懸濁液をＭａｇＮＡ  Ｌｙｓｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｂｅａｄｓ（Ｒｏｃｈｅ）のチューブに移し、ＭａｇＮＡ  Ｌｙｓｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて室温で６，０００ｒｐｍ、１分間破砕を行った。この菌体破砕液をゲノムＤＮＡ除去ミニスピンカラムに入れ、ＲＮｅａｓｙ  ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ付属の使用説明書に従い、全ＲＮＡの調製を行った。オプションとして、全ＲＮＡのカラム吸着後にＤＮａｓｅ  ｍｉｘ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ８０μｌを添加し、室温で１５分間静置し、ゲノムＤＮＡの分解を行った。また、最後に５０℃で保温したＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを加え、室温で１分間静置し、遠心分離にて全ＲＮＡを溶出した。
【０２５９】
（Ｄ）逆転写反応
上記（Ｃ）で調製した全ＲＮＡを鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、付属の使用説明書に従い、逆転写反応を行い、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。逆転写反応には、３００ｎｇの全ＲＮＡ、プライマーとして５０ｎｇ
／μｌ  Ｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒｓを使用した。
【０２６０】
（Ｄ）定量ＰＣＲ
定量ＰＣＲの反応は、ＳＹＢＲ  ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ）を用いて、付属の使用説明書に従って反応液を調製し、Ｌｉｇｈｔ−Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用い、初めに９５℃で１０秒間保温した後、９５℃で５秒、５５℃で５秒、６８℃で２０秒からなるサイクルを４０回繰り返した。温度変化速度はいずれも２０℃／秒とした。また、融解曲線分析を（１）９５℃、０秒、（２）６５℃、１０秒、（３）９５℃、０秒で行い、温度変化速度は（１）および（２）は２０℃／秒とし、（３）は０．１℃／秒とした。
ＰＣＲプライマーとして、ｉｏｌＴ１遺伝子の定量ＰＣＲには配列番号６４および配列番
号６５、ｉｏｌＴ２遺伝子の定量ＰＣＲには配列番号６６および配列番号６７の合成ＤＮＡを使用した。また、内部標準としては１６Ｓ  ｒＲＮＡを用い、配列番号６８および配列番号６９の合成ＤＮＡを使用した。
【０２６１】
定量分析には、Ｌｉｇｈｔ−Ｃｙｃｌｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒ．３．５（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用い、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ法により分析を行った。
【０２６２】
［実施例５］
＜ｉｏｌＴ２遺伝子増強株のｉｏｌＴ１遺伝子およびｉｏｌＴ２遺伝子の転写解析＞
実施例２の（Ｂ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ２／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を使用したこと以外は、実施例４と同様に行った。
【０２６３】
［実施例６］
＜ｉｏｌＲ遺伝子破壊株のｉｏｌＴ１遺伝子およびｉｏｌＴ２遺伝子の転写解析＞
実施例３の（Ｂ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＩｏｌＲ／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を使用したこと以外は、実施例４と同様に行った。
【０２６４】
［実施例７］
＜イノシトール培養菌株のｉｏｌＴ１遺伝子およびｉｏｌＴ２遺伝子の転写解析＞
比較例１で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株をイノシトール存在下で培養することによって菌体を調整し、ｉｏｌＴ１遺伝子、ｉｏｌＴ２遺伝子の転写量を分析するため、以下の通りフラスコ培養を行った。
種培養については、実施例４と同様に行い、本培養においては、炭素源として５０％グルコース水溶液を４ｍＬ添加する代わりに１２％ｍｙｏ−イノシトール水溶液を１６．７ｍＬ添加し、培養時間を２２．５時間とした以外は実施例４と同様に行った。
【０２６５】
全ＲＮＡの調製、逆転写反応、定量ＰＣＲについては、実施例４と同様に行った。
【０２６６】
［比較例３］
＜ｉｏｌＴ遺伝子非改変株のｉｏｌＴ１遺伝子およびｉｏｌＴ２遺伝子の転写解析＞
比較例１で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を使用したこと以外は、実施例４と同様に行った。
【０２６７】
実施例４〜７、比較例３の結果を表１に示した。ｉｏｌＴ１遺伝子およびｉｏｌＴ２遺伝子発現の数値は、比較例３に対する比を表す。
【０２６８】
【表１】
2015029471.tif 000003
【０２６９】
表１より、実施例１で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ１／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の転写解析を行った実施例４では、親株の比較例３に対してｉｏｌＴ１遺伝子の転写量が約６２倍に増加していることが確認された。
実施例２で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ２／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の転写解析を行った実施例５では、親株の比較例３に対してｉｏｌＴ２遺伝子の転写量が約１０３倍に増加していることが確認された。
【０２７０】
実施例３で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＩｏｌＲ／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の転写解析を行った実施例６では、親株の比較例３に対してｉｏｌＴ１遺伝子の転写量が約１２倍に増加していることが確認された。
比較例３と同じブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株をイノシトール存在下で培養した菌株の転写解析を行った実施例７では、グルコースで培養した比較例３に対してｉｏｌＴ１遺伝子の転写量が約６９倍、ｉｏｌＴ２遺伝子の転写量が約１０倍に増加していることが確認された。
【０２７１】
［実施例８］
＜ｉｏｌＴ１遺伝子増強株のコハク酸生産評価＞
実施例１の（Ｂ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ１／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株のコハク酸生産評価を行うため、以下の通りフラスコ培養を行って菌体を調製し、その後、コハク酸生産反応を実施した。
【０２７２】
（Ａ）種培養
Ａ培地［尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、蒸留水１，０００ｍＬに溶解］１，０００ｍＬを、１２１℃、２０分間で加熱滅菌し、室温まで冷やした後、２００ｍＬの三角フラスコに１５ｍＬ入れ、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を６００μｌ添加した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ１／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を接種して３０℃で６時間振とう培養した。
【０２７３】
（Ｂ）本培養
５００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬのＡ培地を入れ、あらかじめ滅菌した５０％グ
ルコース水溶液を４ｍＬ添加した後、上記の培養で得られた培養液を、ＯＤ６６０が０．２となるように接種し、３０℃で、１６．５時間振とう培養した。
【０２７４】
（Ｃ）コハク酸生産反応
上記（Ｂ）の本培養で得られた培養液を５，０００×ｇ、７分の遠心分離により集菌し、菌体懸濁液［硫酸マグネシウム・７水和物：１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：４００μｇ、塩酸チアミン：４００μｇ、リン酸一アンモニウム：０．８ｇ、リン酸二アンモニウム：０．８ｇ、塩化カリウム：１ｇ、蒸留水１０００ｍＬに溶解］にＯＤ６６０が４０になるように懸濁した。続いて、５０％キシロース水溶液を２ｍＬ、炭酸水素アンモニウムを１．５８ｇ、および蒸留水２３ｍＬを混合して、基質溶液を調製した。５ｍＬ反応器に前記菌体懸濁液０．５ｍＬと、基質溶液０．５ｍＬを混合し、嫌気条件下において４０℃で反応させた。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は６．７ｇ／Ｌ、キシロース濃度は７．８ｇ／Ｌであった。なお、コハク酸、キシロースの定量は、ＨＰＬＣ分析により行った。分析条件は、以下の通りである。
【０２７５】
カラム：信和加工社製  ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ  ８．０ｍｍＩＤ×３０ｃｍ
溶離液：過塩素酸６０％水溶液（１．８ｍＬ−過塩素酸／１Ｌ−Ｈ２Ｏ）
温度：６０℃
検出：ＲＩ、ＵＶ（２１０ｎｍ）
【０２７６】
［実施例９］
＜ｉｏｌＴ２遺伝子増強株のコハク酸生産評価＞
実施例２の（Ｂ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ２／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を使用したこと以外は、実施例８と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は３．５ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１２．６ｇ／Ｌであった。
【０２７７】
［実施例１０］
＜イノシトール培養菌株のコハク酸生産評価＞
比較例１で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株をイノシトール存在下で培養することによって菌体を調整し、コハク酸生産評価を行うため、以下の通りフラスコ培養を行った。
【０２７８】
種培養については、実施例８と同様に行い、本培養においては、炭素源として５０％グルコース水溶液を４ｍＬ添加する代わりに１２％ｍｙｏ−イノシトール水溶液を１６．７ｍＬ添加し、それ以外は実施例８と同様に行った。
コハク酸生産反応については、実施例８と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は１４．０ｇ／Ｌ、キシロース濃度は０．３ｇ／Ｌであった。
【０２７９】
［比較例４］
＜ｉｏｌＴ遺伝子非改変株のコハク酸生産評価＞
比較例１で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を使用したこと以外は、実施例８と同様に行った。その結果、６時間後のコハク酸蓄積濃度は２．７ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１１．８ｇ／Ｌであった。
実施例８〜１０、比較例４の結果として、反応開始６時間後のコハク酸蓄積濃度とキシロース濃度を表２に示した。
【０２８０】
【表２】
2015029471.tif 000004
【０２８１】
表２より、実施例１で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ１／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株のコハク酸生産評価を行った実施例８では、親株の比較例４に対してコハク酸生産速度が約１４８％向上した。
実施例２で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ２／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株のコハク酸生産評価を行った実施例９では、親株の比較例４に対してコハク酸生産速度が約３０％向上した。
【０２８２】
また、比較例３と同じブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株をイノシトール存在下で培養した菌株のコハク酸生産評価を行った実施例１０では、グルコースで培養した比較例４に対してコハク酸生産速度が約４１９％向上した。
以上の結果より、イノシトール輸送体をコードするｉｏｌＴ１遺伝子またはｉｏｌＴ２遺伝子の発現を増強することによって、キシロースを原料としたときのコハク酸生産速度が向上することが明らかとなった。
【０２８３】
［実施例１１］
＜ｉｏｌＴ１遺伝子増強株のワンポット反応におけるコハク酸生産評価＞
実施例１の（Ｂ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ１／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の菌体増殖とコハク酸生産を一体的に評価するため、以下の通りワンポット反応におけるコハク酸生産評価を行った。
【０２８４】
（Ａ）種培養
Ａ培地［尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、蒸留水１，０００ｍＬに溶解］１，０００ｍＬを、１２１℃、２０分間で加熱滅菌し、室温まで冷やした後、２００ｍＬの三角フラスコに１５ｍＬ入れ、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を６００μｌ添加した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ１／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を接種して３０℃で６時間振とう培養した。
【０２８５】
（Ｂ）ワンポット反応（本培養／コハク酸生産反応）
５００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬのＡ培地を入れ、あらかじめ滅菌した５０％キシロース水溶液を８ｍＬ添加した後、上記の培養で得られた培養液を、ＯＤ６６０が０．１となるように接種し、３０℃で振とう培養した。培養を開始してから２６．５時間後に炭酸水素アンモニウムを３．１６ｇ添加し、三角フラスコの口をパラフィルムで密閉、温
度を４０℃に変更して２０時間反応させた。その結果、培養を開始してから２６．５時間後のＯＤ６６０は１４．９、キシロース濃度は２０．９ｇ／Ｌ、４６．５時間後のコハク酸蓄積濃度は１８．３ｇ／Ｌ、キシロース濃度は０．０ｇ／Ｌであった。ＯＤ６６０、コハク酸蓄積濃度、キシロース濃度の推移を表したグラフを図９に示した。なお、コハク酸、キシロースの定量は下記方法によるＨＰＬＣ分析により行った。
【０２８６】
カラム：信和加工社製  ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ  ８．０ｍｍＩＤ×３０ｃｍ
溶離液：過塩素酸６０％水溶液（１．８ｍＬ−過塩素酸／１Ｌ−Ｈ２Ｏ）
温度：６０℃
検出：ＲＩ、ＵＶ（２１０ｎｍ）
【０２８７】
［実施例１２］
＜ｉｏｌＴ２遺伝子増強株のワンポット反応におけるコハク酸生産評価＞
実施例２の（Ｂ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ２／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を使用したこと以外は、実施例１１と同様に行った。その結果、培養を開始してから２６．５時間後のＯＤ６６０は１５．７、キシロース濃度は２０．５ｇ／Ｌ、４６．５時間後のコハク酸蓄積濃度は１７．２ｇ／Ｌ、キシロース濃度は０．０ｇ／Ｌであった。ＯＤ６６０、コハク酸蓄積濃度、キシロース濃度の推移を表したグラフを図１０に示した。
【０２８８】
［実施例１３］
＜イノシトール培養菌株のワンポット反応におけるコハク酸生産評価＞
比較例１で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株をイノシトール存在下で培養することによって菌体を調整し、ワンポット反応におけるコハク酸生産評価を行うため、以下の通りフラスコ培養を行った。
【０２８９】
種培養については、炭素源として５０％グルコース水溶液を６００μｌと１０％ｍｙｏ−イノシトール水溶液を３ｍＬ添加し、それ以外は実施例８と同様に行った。ワンポット反応については、実施例１１と同様に行った。その結果、培養を開始してから２６．５時間後のＯＤ６６０は１６．１、キシロース濃度は２０．６ｇ／Ｌ、４６．５時間後のコハク酸蓄積濃度は１６．８ｇ／Ｌ、キシロース濃度は０．９ｇ／Ｌであった。ＯＤ６６０、コハク酸蓄積濃度、キシロース濃度の推移を表したグラフを図１１に示した。
【０２９０】
［比較例５］
＜ａｒａＥ遺伝子導入株のワンポット反応におけるコハク酸生産評価＞
比較例２で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を使用したこと以外は、実施例１１と同様に行った。その結果、培養を開始してから２６．５時間後のＯＤ６６０は６．２、キシロース濃度は２６．５ｇ／Ｌ、４６．５時間後のコハク酸蓄積濃度は３．８ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１７．０ｇ／Ｌであった。ＯＤ６６０、コハク酸蓄積濃度、キシロース濃度の推移を表したグラフを図１２に示した。
実施例１１〜１３、比較例５の結果として、培養開始後２６．５時間のＯＤ６６０とキシロース濃度、培養開始後４６．５時間のコハク酸蓄積濃度とキシロース濃度を表３に示した。
【０２９１】
【表３】
2015029471.tif 000005
【０２９２】
表３より、実施例１で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ１／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株のワンポット反応におけるコハク酸生産評価を行った実施例１１では、比較例２で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＡｒａＥ／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を評価した比較例５に対して到達ＯＤ６６０が１４０％、コハク酸蓄積濃度が約３８２％向上した。
【０２９３】
実施例２で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩｏｌＴ２／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株のワンポット反応におけるコハク酸生産評価を行った実施例１２では、比較例２で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＡｒａＥ／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を評価した比較例５に対して到達ＯＤ６６０が１５３％、コハク酸蓄積濃度が約３５３％向上した。
【０２９４】
また、比較例１で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株をイノシトール存在下で培養した菌株のワンポット反応におけるコハク酸生産評価を行った実施例１３では、比較例２で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＡｒａＥ／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を評価した比較例５に対して到達ＯＤ６６０が１６０％、コハク酸蓄積濃度が約３４２％向上した。
【０２９５】
以上の結果より、特許文献１では、ペントーストランスポーターＡｒａＥを導入することによってキシロース消費速度が向上させているが、キシロースを炭素源とした増殖において到達ＯＤ６６０が低くなり、それによってコハク酸生産量も悪化することがわかった。一方、イノシトール輸送体をコードするｉｏｌＴ１遺伝子またはｉｏｌＴ２遺伝子の発現を増強させた場合は、そのような増殖悪化を伴うことなく、コハク酸生産量が向上することが明らかとなった。
【図９】
2015029471.tif 000006
【図１０】
2015029471.tif 000007
【図１１】
2015029471.tif 000008
【図１２】
2015029471.tif 000009
【図１３】
2015029471.tif 000010
【図１】
2015029471.tif 000011
【図２】
2015029471.tif 000012
【図３】
2015029471.tif 000013
【図４】
2015029471.tif 000014
【図５】
2015029471.tif 000015
【図６】
2015029471.tif 000016
【図７】
2015029471.tif 000017
【図８】
2015029471.tif 000018
【配列表】
2015029471000001.app