(57)【要約】【課題】本発明の目的は、好熱菌から採取される酵素の常温以下における酵素活性を簡便に向上させる改変技術を提供することである。【解決手段】好熱菌由来の酵素において、基質結合部位及び／又は補酵素結合部位から８Åの距離に存在するアミノ酸残基に着目してアミノ酸変異を導入することによって、低温での酵素活性が向上した改変体を効率的に取得できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
好熱菌由来の被改変酵素を変異させることにより、低温での酵素活性が向上した改変体を取得する方法であって、
工程１：好熱菌由来の被改変酵素の立体構造を分析し、該被改変酵素の基質結合部位及び／又は補酵素結合部位から８Åの距離に存在するアミノ酸配列部位を特定する工程、
工程２：前記被変異酵素のアミノ酸配列と、前記被変異酵素と同種で常温菌由来の参照酵素のアミノ酸配列とをペアワイズアライメントにより分析し、前記工程１で特定されたアミノ酸配列部位と、前記参照酵素のアミノ酸配列においてペアワイズアライメント上で対応するアミノ酸配列部位を対比して、両者間でアミノ酸残基が一致していないアミノ酸配列部位を特定する工程、
工程３：前記被変異酵素に対して、前記工程２で特定されたアミノ酸配列部位の少なくとも１つにおいてアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を行い、変異体を得る工程、及び
工程４：前記工程３で得られた変異体の中から、被変異酵素よりも低温での酵素活性が向上している変異体を選定する工程、
を含むことを特徴とする、改変体の取得方法。
【請求項２】
前記工程３におけるアミノ酸の置換、欠失、又は挿入が、前記参照酵素のアミノ酸配列において対応する部位のアミノ酸残基と同一となるように行われる、請求項１に記載の改変体の取得方法。
【請求項３】
好熱菌由来の被改変酵素が、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素である、請求項１又は２に記載の改変体の取得方法。
【請求項４】
下記(A)〜(O)のいずれかに示すポリペプチド：
(A)配列番号１に示すアミノ酸配列における７８番目がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号１に示すアミノ酸配列における２１４番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、２１６番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、２１８番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、２１９番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２２２番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、２２５番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ２２９番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(C)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(D)配列番号１に示すアミノ酸配列における３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(E)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(F)配列番号１に示すアミノ酸配列における７８番目がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列において、７８番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(G)配列番号１に示すアミノ酸配列における２１４番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、２１６番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、２１８番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、２１９番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２２２番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、２２５番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ２２９番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列において、２１４番目、２１６番目、２１８番目、２１９番目、２２２番目、２２５番目、及び２２９番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(H)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列において、２７２番目及び２７３番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(I)配列番号１に示すアミノ酸配列における３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸並びに３２５番目と３２６番目の間に挿入されるアミノ酸以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(J)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、２７２番目、２７３番目、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸並びに３２５番目と３２６番目の間に挿入されるアミノ酸以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(K)配列番号１に示すアミノ酸配列における７８番目がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列において、７８番目のアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(L)配列番号１に示すアミノ酸配列における２１４番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、２１６番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、２１８番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、２１９番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２２２番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、２２５番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ２２９番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列において、２１４番目、２１６番目、２１８番目、２１９番目、２２２番目、２２５番目、及び２２９番目のアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(M)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列において、２７２番目及び２７３番目のアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(N)配列番号１に示すアミノ酸配列における３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸並びに３２５番目と３２６番目の間に挿入されるアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(O)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、２７２番目、２７３番目、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸並びに３２５番目と３２６番目の間に挿入されるアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低温における酵素活性を向上させた好熱菌由来酵素の改変体を効率的に取得する方法に関する。また、本発明は、低温における酵素活性が向上しているサーマス・サーモフィラス由来３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の改変体に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に至適生育温度が４５℃以上の微生物は好熱菌と分類される。特に至適生育温度が８０℃以上のものを超好熱菌とも呼ぶ。好熱菌から採取される酵素群は熱安定性の面で常温菌由来酵素に比べ優れている。他方、酵素活性に係る至適温度が常温よりも高いので常温以下における酵素活性が常温菌由来の同じ酵素に比べて著しく低い場合が多い。この点が好熱菌由来酵素群の産業利用における大きな課題である。
【０００３】
そこで、従来、好熱菌由来酵素の常温域における酵素活性を向上させるべく、好熱菌由来酵素の改変体の取得がなされている。例えば、特許文献１には、超好熱菌サーモプロテウス由来グルコースデヒドロゲナーゼの１０℃以上３７℃以下における酵素活性を向上させた例が開示されている。非特許文献１及び非特許文献２には、好熱菌サーマス・サーモフィラス由来３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の３０℃以下における酵素活性を向上させた例が開示されている。
【０００４】
しかしながら、従来、好熱菌由来酵素の改変体の取得方法では、専らランダム変異導入とスクリーニングを組み合わせた方法が採用されており、目的物となる改変体の取得効率が低いという欠点がある。更に、従来、好熱菌由来酵素の改変体の取得に際して、どの位置のアミノ酸残基をどのアミノ酸残基に変更すれば常温における酵素活性を向上させ得るかという情報は得られず、効率的に、低温における酵素活性を向上させた改変体を取得する手法が確立できていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／１３７４８９
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１４、ｐ８５、２００１
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２９、ｐ４７７、２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、好熱菌から採取される酵素の常温以下における酵素活性を簡便に向上させる改変技術を提供することである。また、本発明の他の目的は、低温における酵素活性を向上させたサーマス・サーモフィラス由来３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の改変体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、好熱菌由来の酵素において、基質結合部位及び／又は補酵素結合部位から８Åの距離に存在するアミノ酸残基に着目してアミノ酸変異を導入することによって、低温での酵素活性が向上した改変体を効率的に取得できることを見出した。より具体的には、下記工程１〜４を実施することによって、低温での酵素活性が向上した改変体を効率的に取得できることを見出した。
工程１：好熱菌由来の被改変酵素の立体構造を分析し、該被改変酵素の基質結合部位及び／又は補酵素結合部位から８Åの距離に存在するアミノ酸配列部位を特定する工程、
工程２：前記被変異酵素のアミノ酸配列と、前記被変異酵素と同種で常温菌由来の参照酵素のアミノ酸配列とをペアワイズアライメントにより分析し、前記工程１で特定されたアミノ酸配列部位と、前記参照酵素のアミノ酸配列においてペアワイズアライメント上で対応するアミノ酸配列部位を対比して、両者間でアミノ酸残基が一致していないアミノ酸配列部位を特定する工程、
工程３：前記被変異酵素に対して、前記工程２で特定されたアミノ酸配列部位の少なくとも１つにおいてアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を行い、変異体を得る工程、及び
工程４：前記工程３で得られた変異体の中から、被変異酵素よりも低温での酵素活性が向上している変異体を選定する工程。
【０００９】
このように、基質結合部位及び／又は補酵素結合部位から８Å内に位置する特定のアミノ酸残基に限定して変異導入を施し、ランダム変異導入とスクリーニングに依らず、低温での酵素活性を向上させた改変体を簡便且つ効率的に取得できることは、本発明者らによって初めて明らかにされた知見である。
【００１０】
更に、本発明者らは、前記の方法に従って、サーマス・サーモフィラス由来３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素において、基質結合部位及び／又は補酵素結合部位から８Å内に位置する特定のアミノ酸残基に変異を施すことによって、低温での酵素活性が向上した改変体を取得できた。
【００１１】
本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  好熱菌由来の被改変酵素を変異させることにより、低温での酵素活性が向上した改変体を取得する方法であって、
工程１：好熱菌由来の被改変酵素の立体構造を分析し、該被改変酵素の基質結合部位及び／又は補酵素結合部位から８Åの距離に存在するアミノ酸配列部位を特定する工程、
工程２：前記被変異酵素のアミノ酸配列と、前記被変異酵素と同種で常温菌由来の参照酵素のアミノ酸配列とをペアワイズアライメントにより分析し、前記工程１で特定されたアミノ酸配列部位と、前記参照酵素のアミノ酸配列においてペアワイズアライメント上で対応するアミノ酸配列部位を対比して、両者間でアミノ酸残基が一致していないアミノ酸配列部位を特定する工程、
工程３：前記被変異酵素に対して、前記工程２で特定されたアミノ酸配列部位の少なくとも１つにおいてアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を行い、変異体を得る工程、及び
工程４：前記工程３で得られた変異体の中から、被変異酵素よりも低温での酵素活性が向上している変異体を選定する工程、
を含むことを特徴とする、改変体の取得方法。
項２．  前記工程３におけるアミノ酸の置換、欠失、又は挿入が、前記参照酵素のアミノ酸配列において対応する部位のアミノ酸残基と同一となるように行われる、項１に記載の改変体の取得方法。
項３．  好熱菌由来の被改変酵素が、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素である、項１又は２に記載の改変体の取得方法。
項４．  下記(A)〜(O)のいずれかに示すポリペプチド：
(A)配列番号１に示すアミノ酸配列における７８番目がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号１に示すアミノ酸配列における２１４番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、２１６番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、２１８番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、２１９番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２２２番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、２２５番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ２２９番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(C)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(D)配列番号１に示すアミノ酸配列における３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(E)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(F)配列番号１に示すアミノ酸配列における７８番目がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列において、７８番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(G)配列番号１に示すアミノ酸配列における２１４番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、２１６番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、２１８番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、２１９番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２２２番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、２２５番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ２２９番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列において、２１４番目、２１６番目、２１８番目、２１９番目、２２２番目、２２５番目、及び２２９番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(H)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列において、２７２番目及び２７３番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(I)配列番号１に示すアミノ酸配列における３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸並びに３２５番目と３２６番目の間に挿入されるアミノ酸以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(J)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、２７２番目、２７３番目、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸並びに３２５番目と３２６番目の間に挿入されるアミノ酸以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(K)配列番号１に示すアミノ酸配列における７８番目がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列において、７８番目のアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(L)配列番号１に示すアミノ酸配列における２１４番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、２１６番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、２１８番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、２１９番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２２２番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、２２５番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ２２９番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列において、２１４番目、２１６番目、２１８番目、２１９番目、２２２番目、２２５番目、及び２２９番目のアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(M)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列において、２７２番目及び２７３番目のアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(N)配列番号１に示すアミノ酸配列における３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸並びに３２５番目と３２６番目の間に挿入されるアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(O)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、２７２番目、２７３番目、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸並びに３２５番目と３２６番目の間に挿入されるアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド。
項５．  項１に記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
項６．  項５に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
項７．  項６に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項８．  項７に記載の形質転換体を培養する工程を含む、項１に記載のポリペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の改変体の取得方法は、ランダム変異導入とスクリーニングを必要とせず、簡便且つ効率的に、好熱菌由来の酵素の低温における酵素活性を向上させた改変体を取得することができる。従って、本発明は、耐熱性が高く保存安定性の面で優位である好熱菌由来酵素を低温で高活性を発現するよう改変し、例えば体外診断薬用途などに利用することができる。
【００１３】
更に、本発明のポリペプチドは、サーマス・サーモフィラス由来３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の所定部位にアミノ酸変異を施すことによって、低温での酵素活性が向上しており、その有用性が高められている。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】サーマス・サーモフィラス由来ＩＰＭＤＨ（ＴｔｈＩＰＭＤＨ）と大腸菌由来ＩＰＭＤＨ（ＥｃｏＩＰＭＤＨ）のペアワイズアライメント図を示す。ＴｔｈＩＰＭＤＨに示した下線部は、補酵素結合部位及び基質結合部位に位置するアミノ酸残基から８Å内に存在するアミノ酸残基を示す。
【図２】ＳＯＥ（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法の概略図を示す。
【図３】各種改変体の２５℃における比活性を比較した図を示す。本図では、ＴｔｈＩＰＭＤＨ（野生型）の比活性の値を１．００としたときの相対比をグラフ化している。
【図４】各種改変体の２５℃における比活性を比較した図示す。本図では、ＴｔｈＩＰＭＤＨ（野生型）の比活性の値を１．００としたときの相対比をグラフ化している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、配列表以外では、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現している。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
【００１６】
本明細書における「Ｆ４５Ｖ」等の表現は、アミノ酸置換の表記法である。例えば、「Ｆ４５Ｖ」とは、特定のアミノ酸配列におけるＮ末端側から４５番目のアミノ酸Ｆが、アミノ酸Ｖに置換されていることを意味する。また、本明細書における「Ｖ２７２Ａ／Ｈ２７３Ｇ」等の表現は、多重変異を意味している。例えば、「Ｖ２７２Ａ／Ｈ２７３Ｇ」とは、Ｖ２７２Ａ及びＨ２７３Ｇのアミノ酸置換を同時に導入していることを意味する。更に、本明細書における「３２６Ｇ（ＩＮＳＥＲＴＩＯＮ）」等の表現は、特定のアミノ酸配列におけるＮ末端側から３２５番目と３２６番目のアミノ酸残基の間にアミノ酸Ｇが挿入されていることを意味する。
【００１７】
また、本明細書において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプチファンが含まれる。また、「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。また、「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。また、「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
【００１８】
１．改変体の取得方法
本発明の改変体の取得方法は、好熱菌由来の酵素（被改変酵素）を変異させることにより、低温での酵素活性が向上した改変体を取得する方法である。以下、本発明の改変体の取得方法において、変異を導入する対象となる被改変酵素、変異導入部位を特定するために参照される参照酵素、各工程１〜４について詳述する。
【００１９】
被改変酵素
本発明の改変体の取得方法において、被改変酵素は、変異を導入される対象となる酵素であり、好熱菌由来の酵素が使用される。
【００２０】
本発明の改変体の取得方法は、被改変酵素の種類によらず、あらゆる酵素の改変体の取得に適用できるため、被改変酵素の種類については、低温での活性の向上が求められることを限度として、特に制限されない。本発明の改変体の取得方法において、被改変酵素の好適な例として、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと表記することもある）を要求する酵素、好ましくは補酵素としてＮＡＤを要求する脱水素酵素が挙げられる。補酵素としてＮＡＤを要求する脱水素酵素として、具体的には、具体的には、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素等が挙げられる。これらの中でも、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素については、本発明において、より一層効率的に、低温での酵素活性が向上した改変体を取得することができるので、被改変酵素として好適に使用される。
【００２１】
また、被改変酵素の由来については、好熱菌であること限度として特に制限されず、被改変酵素の種類等に応じて適宜選定すればよい。本明細書において、「好熱菌」とは、至適生育温度が４５℃以上の微生物であって、古細菌、グラム陽性真正細菌、又はグラム陰性真正細菌に属する微生物である。
【００２２】
被改変酵素の由来である好熱菌として、具体的には、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ属、Ａｃｔｉｎｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ属、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ属、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ属、Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃａｌｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｌｄｅｒｉｈａｂｉｔａｎｓ属、Ｃａｌｄｉｍｏｎａｓ属、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃｕｍ属、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒ属、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属、Ｅｘｉｌｉｓｐｉｒａ属、Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｇｅｏｒｇｅｎｉａ属、Ｈａｌｏｂａｃｕｌｕｍ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｉｇｎａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｋｏｓｍｏｔｏｇａ属、Ｋｙｒｐｉｄｉａ属、Ｌａｃｅｙｅｌｌａ属、Ｌｕｔｉｓｐｏｒａ属、Ｍａｒｉｎｉｔｏｇａ属、Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｍｅｌｇｈｉｒｉｍｙｃｅｓ属、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｎａｔｒｉａｌｂａ属、Ｏｃｅａｎｉｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ属、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐｏｌｙｃｌａｄｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ属、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ属、Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ｓｕｌｆｕｒｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｂｉｕｍ属、Ｓｕｌｆｕｒｉｓｐｈａｅｒａ属、Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ属、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｓｐｏｒａ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｆｌａｖｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ属、Ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｉｄｉｂａｃｔｅｒ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｖｕｌｃａｎｉｓａｅｔａ属、Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ属等の好熱菌が挙げられる。これらの好熱菌の中でも、より一層効率的に、低温での酵素活性が向上した改変体を取得するという観点から、好ましくはＴｈｅｒｍｕｓ属、更に好ましくはＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（サーマス・サーモフィラス）が挙げられる。
【００２３】
本発明で使用される被改変酵素は、好熱菌に由来する野生型酵素であってもよく、また好熱菌に由来する野生型酵素に変異を導入させた変異型酵素であってもよい。
【００２４】
参照酵素
本発明の改変体の取得方法において、参照酵素は、前記被改変酵素に変異を導入させる部位、導入する変異の種類等を決定する上で参照される酵素である。
【００２５】
本発明において、参照酵素は、前記被改変酵素と同種のものが使用される。ここで、「前記被改変酵素と同種」であるとは、参照酵素が、被改変酵素と酵素活性が共通しており、酵素分類上、被改変酵素と同じファミリーに属していることを意味する。例えば、被改変酵素として３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素を採用する場合であれば、参照酵素も３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素が使用される。
【００２６】
また、参照酵素において、使用する被改変酵素に対するアミノ酸配列の同一性については、前記被改変酵素と同種であることを限度として特に制限されないが、例えば、２０％以上、好ましくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上が挙げられる。ここで、「アミノ酸配列の同一性」とは、ＢＬＡＳＴ  ＰＡＣＫＡＧＥ〔ｓｇｉ３２  ｂｉｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ［ＮＣＢＩ］〕のｂｌ２ｓｅｑ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，２４７−２５０，１９９９）により得られる同一性の値を示す。パラメーターとしては、Ｇａｐ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
【００２７】
また、本発明において、参照酵素は、常温菌由来のものが使用される。本明細書において、「常温菌」とは、至適生育温度が４５℃未満の微生物であって、古細菌、グラム陽性真正細菌、グラム陰性真正細菌、又は酵母やカビを含む真核生物に属する微生物である。
【００２８】
また、参照酵素の由来については、常温菌であること限度として特に制限されず、参照酵素の種類等に応じて適宜選定すればよい。参照酵素の由来として、具体的には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属等の常温菌が挙げられる。これらの常温菌の中でも、より一層効率的に、低温での酵素活性が向上した改変体を取得するという観点から、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、更に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）が挙げられる。
【００２９】
本発明で使用される参照酵素は、常温菌に由来する野生型酵素であってもよく、また常温菌に由来する野生型酵素に変異を導入させた変異型酵素であってもよい。
【００３０】
工程１
工程１では、好熱菌由来の被改変酵素の立体構造を分析し、該被改変酵素の基質結合部位及び／又は補酵素結合部位から８Åの距離に存在するアミノ酸配列部位を特定する。
【００３１】
被改変酵素の基質結合部位及び／又は補酵素結合部位については、被改変酵素の種類毎に知られている。例えば、サーマス・サーモフィラス由来の３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素（配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；以下、ＴｔｈＩＰＭＤＨと表記することもある）であれば、基質結合部位及び補酵素結合部位は配列番号１に示すアミノ酸配列における７〜１２番目、１５番目、４１〜４２番目、６９番目〜７８番目、８５番目〜９２番目、９４番目、１０２番目、１０４番目、１３２番目〜１３４番目、１３９番目〜１４０番目、１８４番目〜１８８番目、１９６番目、２１３番目〜２１９番目、２２１番目〜２２２番目、２２５番目〜２２６番目、２２９番目、２３７〜２３８番目、２４０番目〜２４２番目、２４４番目〜２４５番目、２４８番目、２５３番目〜２５７番目、２５９番目、２６１番目、２７０番目〜２８０番目、２８４番目〜２９０番目、３２４番目〜３２７番目の領域に位置することが知られている。
【００３２】
また、タンパク質のアミノ酸配列からその立体構造情報を取得し、その立体構造を可視化して、当該タンパク質における任意の領域から指定の距離に存在するアミノ酸残基を特定する手法についても、公知である。従って、本工程１では、公知の手法に従って、被改変酵素のアミノ酸配列に基づいて、その立体構造情報を取得し、被改変酵素の立体構造を可視化して、基質結合部位及び／又は補酵素結合部位から８Åの距離に存在するアミノ酸配列部位を特定すればよい。
【００３３】
被改変酵素のアミノ酸配列に基づいて、その立体構造情報を取得するには、具体的には、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）を利用してＰＢＤファイルを取得すればよい。例えば、ＴｔｈＩＰＭＤＨは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  ＢａｎｋにおいてＩＤ：４Ｆ７Ｉとタグ付けされており、この値を該データベースに対して検索することにより、ＴｔｈＩＰＭＤＨの立体構造情報をＰＤＢファイル形式で取得することができる。
【００３４】
また、前記で得られた立体構造情報（ＰＢＤファイル）は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｄｂ  Ｖｉｅｗｅｒ  Ｖｅｒｓｉｏｎ４．１（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｄｂｖ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ／）等のソフトウェアにより出力させることにより、酵素の立体構造を可視化できる。また、該ソフトウェアを利用することにより、被改変酵素の立体構造における基質結合部位及び／又は補酵素結合部位から８Åの距離に存在するアミノ酸残基を特定することができる。
【００３５】
本明細書において、基質結合部位及び／又は補酵素結合部位から８Åの距離に存在するアミノ酸配列部位とは、被改変酵素の立体構造において、基質結合部位及び／又は補酵素結合部位を構成する少なくとも１つのアミノ酸残基のアミド結合部分（２つのアミド結合部分の内のいずれか一方）を起点として、主鎖を構成する部分（-NH-C-CO-；アミノ酸残基の側鎖を除いた部分）の全体が８Å以内の距離に含まれているアミノ酸残基の配列部位を意味する。
【００３６】
被改変酵素が酵素反応時に補酵素を要求しない場合には、本工程１において、被改変酵素の基質結合部位から８Åの距離に存在するアミノ酸配列部位を特定すればよい。また、被改変酵素が酵素反応時に補酵素を要求する場合には、被改変酵素の基質結合部位又は補酵素結合部位のいずれか少なくとも一方の部位から８Åの距離に存在するアミノ酸配列部位を特定すればよいが、より効率的に、低温での酵素活性が向上した改変体を取得するという観点から、基質結合部位と補酵素結合部位の双方の部位から８Åの距離に存在するアミノ酸配列部位を特定することが好ましい。
【００３７】
工程２
工程２では、前記被変異酵素のアミノ酸配列と、前記被変異酵素と同種で常温菌由来の参照酵素のアミノ酸配列とをペアワイズアライメントにより分析し、前記工程１で特定されたアミノ酸配列部位と、前記参照酵素のアミノ酸配列においてペアワイズアライメント上で対応するアミノ酸配列部位を対比して、両者間でアミノ酸残基が一致していないアミノ酸配列部位を特定する。
【００３８】
２つのタンパク質のアミノ酸配列のペアワイズアライメントを作成する方法については公知である。本工程２では、公知の手法に従って、前記被改変酵素のアミノ酸配列と前記参照酵素のアミノ酸配列のペアワイズアライメントを作成すればよい。ペアワイズアライメントを出力させるには、具体的には、ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  ＪａｐａｎホームページのＣｌｕｓｔａｌＷ  Ｖｅｒｓｉｏｎ２．１（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）を使用すればよい。
【００３９】
本工程２では、ペアワイズアライメントを作成した後に、前記被改変酵素のアミノ酸配列における前記工程１で特定されたアミノ酸配列部位（以下、「被改変酵素８Å領域部位」と表記することもある）と、前記参照酵素のアミノ酸配列においてペアワイズアライメント上で対応する部位（以下、「参照酵素対応部位」と表記する）を対比し、両者間でアミノ酸残基が一致していないアミノ酸配列部位を特定する。
【００４０】
具体的には、(1)被改変酵素８Å領域部位のアミノ酸残基が、参照酵素対応部位のアミノ酸残基と異なっている場合、(2)被改変酵素８Å領域部位のアミノ酸残基が、参照酵素対応部位において欠失している場合、及び(3)参照酵素対応部位のアミノ酸残基が、被改変酵素８Å領域部位において欠失している場合は、被改変酵素８Å領域部位と参照酵素対応部位の間でアミノ酸残基が一致していないアミノ酸配列部位として特定される。
【００４１】
本工程２で特定されたアミノ酸部位は、前記被改変酵素に対して変異を施すことにより、低温での酵素活性が向上する可能性が高い部位として特定される。以下、本工程２で特定されたアミノ酸配列部位を「変異候補部位」と表記することもある。
【００４２】
工程３
工程３では、前記被改変酵素に対して、変異候補部位の少なくとも１つにおいてアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を行い、改変体を得る。
【００４３】
本工程３では、変異候補部位が２以上ある場合、１つの変異酵素部位を選択して単変異を行ってもよく、また２つ以上の変異酵素部位を選択して多重変異を行ってもよい。具体的には、変異候補部位が２以上ある場合、導入する変異の数としては、変異候補部位の数、変異酵素の種類等によって異なるため一概に記載できないが、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個が挙げられる。
【００４４】
また、本工程３において、前記被改変酵素の変異候補部位に対して行われる変異は、アミノ酸の置換、欠失、又は挿入のいずれであってもよいが、低温での酵素活性が向上した改変体の取得効率を高めるという観点から、参照酵素対応部位のアミノ酸残基と同一になるように変異を導入することが好ましい。具体的には、好適な変異導入態様として、(1)変異候補部位のアミノ酸残基が、参照酵素対応部位のアミノ酸残基と異なっている場合であれば、変異候補部位のアミノ酸残基を参照酵素対応部位のアミノ酸残基に置換する、(2)変異候補部位のアミノ酸残基が、参照酵素対応部位において欠失している場合あれば、変異候補部位のアミノ酸残基を欠失させる、及び(3)参照酵素対応部位のアミノ酸残基が、変異候補部位において欠失している場合あれば、変異候補部位に参照酵素対応部位のアミノ酸残基を挿入する、等の態様が挙げられる。
【００４５】
また、タンパク質の特定部位のアミノ酸を置換、欠失、又は挿入する手法は公知であり、本工程３において、変異候補部位におけるアミノ酸の置換、欠失、又は挿入は、公知の手法に従って実施することができる。
【００４６】
工程４
工程４では、前記工程３で得られた改変体の中から、被改変酵素よりも低温での酵素活性が向上している改変体を選定する。
【００４７】
本明細書において、「被改変酵素よりも低温での酵素活性が向上している」とは、３７℃以下、好ましくは３７℃以下、より好ましくは３０℃以下、更に好ましくは１０〜２５℃の温度領域における酵素活性が、被改変酵素よりも高められていることをいう。
【００４８】
本工程４は、具体的には、前記工程３で得られた改変体と被改変酵素について、低温において酵素の比活性（酵素タンパク質重量あたりの酵素活性）を測定し、被改変酵素よりも低温での酵素の比活性が向上している改変体を選定すればよい。比活性を求める方法は、酵素の種類により異なるため、ここで一般化して記述できないが、例えば、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の場合であれば、後述する［ＩＰＭＤＨ活性の測定］の項、および［ＩＰＭＤＨ比活性の測定］の項に従って求めることができる。
【００４９】
斯して、前記工程３で得られた改変体の中から、被改変酵素よりも低温での酵素活性が向上している改変体を選定することにより、低温領域でも酵素活性を効果的に発現できる酵素の改変体を取得することができる。
【００５０】
２．ポリペプチド
本発明は、前記改変体の取得方法によって得られたポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、ＴｔｈＩＰＭＤＨの改変体であり、低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性がＴｔｈＩＰＭＤＨよりも向上している３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素である。３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素とは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+とも記述する）を補酵素とする酸化還元酵素であり、３−イソプロピルリンゴ酸とＮＡＤ+を基質とし、２−イソピル−３−オキソコハク酸とＮＡＤＨ、およびＨ+を生成する反応を触媒する、ＥＣ番号が１．１．１．８５に分類される酵素である。
【００５１】
本発明のポリペプチドの一態様として、具体的には、下記(A)〜(D)に示すポ織ペプチドが挙げられる。
(A)配列番号１に示すアミノ酸配列における７８番目がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号１に示すアミノ酸配列における２１４番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、２１６番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、２１８番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、２１９番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２２２番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、２２５番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ２２９番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(C)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(D)配列番号１に示すアミノ酸配列における３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(E)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５２】
前記(B)のポリペプチドにおいて、低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性をより一層向上させるという観点から、好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列における２１４番目がメチオニンに置換、２１６番目がイソロイシンに置換、２１８番目がアスパラギンに置換、２１９番目がアラニンに置換、２２２番目がグルタミンに置換、２２５番目がリジンに置換、且つ２２９番目がグルタミンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００５３】
前記(C)のポリペプチドにおいて、低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性をより一層向上させるという観点から、好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニンに置換、且つ２７３番目がグリシンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００５４】
前記(D)のポリペプチドにおいて、低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性をより一層向上させるという観点から、好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列における３２４番目がアルギニンに置換、３２５番目がスレオニンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシンが挿入されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００５５】
前記(E)のポリペプチドにおいて、低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性をより一層向上させるという観点から、好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、に置換、２７３番目がグリシンに置換、３２４番目がアルギニンに置換、３２５番目がスレオニンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシンが挿入されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５６】
また、本発明のポリペプチドの他の態様として、下記(F)〜(O)に示すポリペプチドが挙げられる。
(F)配列番号１に示すアミノ酸配列における７８番目がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列において、７８番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、ＴｔｈＩＰＭＤＨと比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(G)配列番号１に示すアミノ酸配列における２１４番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、２１６番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、２１８番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、２１９番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２２２番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、２２５番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ２２９番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列において、２１４番目、２１６番目、２１８番目、２１９番目、２２２番目、２２５番目、及び２２９番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、ＴｔｈＩＰＭＤＨと比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(H)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列において、２７２番目及び２７３番目以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、ＴｔｈＩＰＭＤＨと比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(I)配列番号１に示すアミノ酸配列における３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸並びに３２５番目と３２６番目の間に挿入されるアミノ酸以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、ＴｔｈＩＰＭＤＨと比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(J)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、２７２番目、２７３番目、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸並びに３２５番目と３２６番目の間に挿入されるアミノ酸以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、ＴｔｈＩＰＭＤＨと比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(K)配列番号１に示すアミノ酸配列における７８番目のアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、ＴｔｈＩＰＭＤＨと比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(L)配列番号１に示すアミノ酸配列における２１４番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、２１６番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、２１８番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、２１９番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２２２番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、２２５番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ２２９番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列において、２１４番目、２１６番目、２１８番目、２１９番目、２２２番目、２２５番目、及び２２９番目のアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、ＴｔｈＩＰＭＤＨと比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(M)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列において、２７２番目及び２７３番目のアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、ＴｔｈＩＰＭＤＨと比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(N)配列番号１に示すアミノ酸配列における３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸並びに３２５番目と３２６番目の間に挿入されるアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、ＴｔｈＩＰＭＤＨと比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(O)配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、２７３番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、３２４番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、３２５番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ３２５番目と３２６番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、２７２番目、２７３番目、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸並びに３２５番目と３２６番目の間に挿入されるアミノ酸を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、ＴｔｈＩＰＭＤＨと比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド。
【００５７】
以下、前記(F)及び(K)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における７８番目以外のアミノ酸部位を「任意改変部位」と表記することもある。また、前記(G)及び(L)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における２１４番目、２１６番目、２１８番目、２１９番目、２２２番目、２２５番目、及び２２９番目以外のアミノ酸部位を「任意改変部位」と表記することもある。また、前記(H)及び(M)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目及び２７３番目以外のアミノ酸部位を「任意改変部位」と表記することもある。更に、前記(I)及び(N)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における３２４番目及び３２５番目のアミノ酸部位並びに３２５番目と３２６番目の間に挿入されるアミノ酸部位以外を「任意改変部位」と表記することもある。また、前記(J)及び(O)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における２７２番目、２７３番目、３２４番目及び３２５番目のアミノ酸部位並びに３２５番目と３２６番目の間に挿入されるアミノ酸部位以外を「任意改変部位」と表記することもある。
【００５８】
前記(F)〜(J)のポリペプチドの任意改変部位に導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、および欠失の中から１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。前記(F)〜(J)のポリペプチドにおいて、任意改変部位に置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は複数個若しくは数個であればよく、例えば１〜１０個、好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
【００５９】
また、前記(K)〜(O)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列おいて特定のアミノ酸を除いた配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。
【００６０】
ここで、前記(K)〜(O)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列おいて特定のアミノ酸を除いた配列同一性とは、配列番号１に示すアミノ酸配列から前記任意改変部位のみを抜き出して、当該任意改変部位のみを比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ  ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２  ｂｉｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７−２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
【００６１】
また、前記(F)〜(O)のポリペプチドの任意改変部位に導入されるアミノ酸置換は、保存的置換であることが好ましい。即ち、前記任意改変部位における置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
【００６２】
前記(F)〜(O)のポリペプチドにおいて、「ＴｔｈＩＰＭＤＨと比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上している」とは、２５℃の温度条件にて３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の比活性を測定した場合に、ＴｔｈＩＰＭＤＨよりも比活性が高いことを意味する。より具体的には、２５℃の温度条件にて３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の比活性を測定した場合、ＴｔｈＩＰＭＤＨに比べて比活性が３倍以上、好ましくは５倍以上、更に好ましくは１０倍以上向上していることを指す。また、ＴｔｈＩＰＭＤＨの２５℃の温度条件における比活性は３．１Ｕ／ｍｇであるので、前記(F)〜(O)のポリペプチドの好適な例として、２５℃の温度条件における３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性の比活性が９．３Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは１０Ｕ／ｍｇ以上、更に好ましくは３０Ｕ／ｍｇ以上が挙げられる。なお、本発明において、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性は、具体的には、以下の条件にて測定される。
【００６３】
［３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性の測定］
３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性は下記試薬を用い、下記測定条件で測定する。
【００６４】
（試薬）
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  塩化マグネシウム、１００ｍＭ  塩化カリウム、４００μＭ  ３−イソプロピルリンゴ酸、５ｍＭ  ＮＡＤ+を含有する水溶液
【００６５】
（測定方法）
試薬０．９ｍＬを分光光度計用セルに入れ、２５℃で５分間以上プレインキュベートする。測定対象となるポリペプチドを所定濃度に希釈した酵素溶液０．００５ｍＬを添加してよく混合し、分光光度計で３４０ｎｍの吸光度変化を６０秒間記録し、その間の吸光度変化（ΔＯＤ）を測定する。ブランクは、酵素溶液の代わりに水を試薬に混合して上記のように吸光度変化（ΔＯＤｂｌａｎｋ）を測定する。これらの値から、下記の計算式に従って活性値を求める。
【数１】
2015164409.tif 000002
【００６６】
なお、上記計算式の９０５は試薬と酵素溶液の液量、６．２２はＮＡＤ+の分子吸光係数（ｃｍ2／マイクロモル）、５は酵素溶液の液量、１．０は分光セルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００６７】
［３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の比活性の測定］
３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の比活性は、下記測定条件で測定する。上記方法に従い酵素溶液の活性（Ｕ／ｍＬ）を求め、更に測定に使用した酵素溶液のポリペプチド濃度（ｍｇ／ｍｌ）を求める。これらの値から、以下の計算式に従って、比活性を求める。
【００６８】
【数２】
2015164409.tif 000003
【００６９】
３．前記ポリペプチドをコードしているＤＮＡ
本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」と表記することもある）は、例えば、ＴｔｈＩＰＭＤＨ（配列番号１）をコードしているＤＮＡに前記アミノ酸変異を導入することにより得ることができる。また、本発明のＤＮＡは、遺伝子の全合成法によって人工合成することもできる。
【００７０】
ここで、ＴｔｈＩＰＭＤＨをコードしているＤＮＡは、例えば、配列表の配列番号２に示される塩基配列として知られており、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＨＢ８株のゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いた定法により単離することができる。
【００７１】
塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する方法は公知であり、例えばＤＮＡの部位特異的変異導入法等が利用できる。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ：東洋紡製など）の利用等が挙げられる。
【００７２】
このようにして塩基配列に変異を導入したＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。得られた塩基配列については、例えば、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトエンジニアリング社製）又はＧＥＮＥＴＩＸ（ソフトウェア開発社製）等の塩基配列解析ソフトによる解析を行うことにより、ＤＮＡ中のＡＣＳ遺伝子のコード領域を特定することができる。
【００７３】
このようにして得られたＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。得られた塩基配列については、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトエンジニアリング社製）およびＧＥＮＥＴＩＸ（ソフトウェア開発社製）等の塩基配列解析ソフトによる解析を行うことにより、ＤＮＡ中の前記ペプチド（３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素）のコード領域を特定することができる。
【００７４】
一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、又は該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００７５】
更に、部位特異的突然変異誘発法等によって前記ポリペプチドをコードするＤＮＡの変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。なお、前記ペプチドをコードするＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、メガプライマーＰＣＲ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。
【００７６】
前記ポリペプチドをコードするＤＮＡと外来タンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡとを連結した融合タンパク質をコードするＤＮＡを作製する場合には、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡに外来タンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡを連結すればよい。前記外来タンパク質又はペプチドとしては、例えば、タンパク質精製に使用されるタンパク質又はペプチド（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、ストレプトアビジン結合ペプチドおよびヒスチジンタグ等）が挙げられる。前記ポリペプチドに対して外来タンパク質又はペプチドを連結する位置は、前記ポリペプチドと外来タンパク質又はペプチドとがそれぞれの機能又は活性を有するように適宜選択することができる。前記ポリペプチドをコードするＤＮＡに外来タンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡを連結する方法は、それぞれ精製された前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び外来タンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡを適当な制限酵素で切断して連結する方法が挙げられる。また、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡと外来タンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡのそれぞれ一部に相同な領域を持たせることにより、ＰＣＲ等を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ法又は酵母等を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ法によって両者を連結する方法であってもよい。
【００７７】
また、本発明のＤＮＡには、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、ＴｔｈＩＰＭＤＨと比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチドをコードし、前記(A)〜(D)のポリペプチドをコードしているＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが包含される。
【００７８】
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一晩保温する条件をいう。
【００７９】
ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。
【００８０】
更に、本発明のＤＮＡには、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、ＴｔｈＩＰＭＤＨと比較して低温での３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチドをコードし、前記(A)〜(D)のポリペプチドをコードしているＤＮＡに８０％以上の相同性を有するＤＮＡも包含される。当該相同性として、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上が挙げられる。
【００８１】
ここで、ＤＮＡの「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ  ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２  ｂｉｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．  Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，２４７−２５０，１９９９）により得られる同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
【００８２】
本発明のＤＮＡは、コドン利用頻度を宿主に最適化したものが好ましく、コドン利用頻度を大腸菌に最適化させたＤＮＡがより好ましい。
【００８３】
コドン利用頻度を表す指標として、各コドンの宿主最適コドン利用頻度の総計を採択すればよい。最適コドンとは、同じアミノ酸に対応するコドンのうち利用頻度が最も高いコドンと定義される。コドン利用頻度は、宿主に最適化したものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌の最適コドンの一例として以下のものが挙げられる。
Ｆ：フェニルアラニン（ｔｔｔ）、Ｌ：ロイシン（ｃｔｇ）、Ｉ：イソロイシン（ａｔｔ）、Ｍ：メチオニン（ａｔｇ）、Ｖ：バリン（ｇｔｇ）、Ｙ：チロシン（ｔａｔ）、終止コドン（ｔａａ）、Ｈ：ヒスチジン（ｃａｔ）、Ｑ：グルタミン（ｃａｇ）、Ｎ：アスパラギン（ａａｔ）、Ｋ：リジン（ａａａ）、Ｄ：アスパラギン酸（ｇａｔ）、Ｅ：グルタミン酸（ｇａａ）、Ｓ：セリン（ａｇｃ）、Ｐ：プロリン（ｃｃｇ）、Ｔ：スレオニン（ａｃｃ）、Ａ：アラニン（ｇｃｇ）、Ｃ：システイン（ｔｇｃ）、Ｗ：トリプトファン（ｔｇｇ）、Ｒ：アルギニン（ｃｇｃ）、Ｇ：グリシン（ｇｇｃ）。
【００８４】
４．組換えベクター
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクター（以下、「本発明の組換えベクター」と表記することもある）は、発現ベクターに本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
【００８５】
本発明の組換えベクターには、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーター等の制御因子が含まれる。制御因子としては、代表的にはプロモーターが挙げられるが、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。また、作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主中で作動し得る状態で連結されることをいう。
【００８６】
発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。
【００８７】
ファージとしては、例えば、後述する大腸菌を宿主とする場合には、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１等が挙げられる。
【００８８】
プラスミドとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＥＴ２１−ｃ、及びコスミドであるＳｕｐｅｒ  Ｃｏｓ  Ｉ等が挙げられる。
【００８９】
宿主としてシュードモナスを用いる場合には、グラム陰性菌用広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０、ｐＢＢＲ１２２、及びｐＣＮ５１等が挙げられる。更に、レトロウイルス及びワクシニアウイルス等の動物ウイルス、並びにバキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００９０】
５．形質転換体
本発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」と表記することもある）が得られる。
【００９１】
形質転換体の製造に使用される宿主としては、組換えベクターが安定であり、且つ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌；酵母；ＣＯＳ細胞等の動物細胞；Ｓｆ９等の昆虫細胞；アブラナ科等に属する植物体全体、植物器官（例えば、葉、花弁、茎、根及び種子等）、植物組織（例えば、表皮、師部、柔組織、木部および維管束等）、植物培養細胞等が挙げられる。これらの中でも大腸菌が好ましく、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＢＬ２１、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）、及び大腸菌ＪＭ１０９がより好ましい。
【００９２】
本発明の形質転換体は、宿主に本発明の組換えベクターを導入することによって得ることができ、宿主に組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセル用いる方法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法及びＰＥＧ法等が挙げられる。
【００９３】
本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法およびノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。
【００９４】
ＰＣＲ法よって本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かを確認する場合、例えば、形質転換体から組換えベクターを分離・精製すればよい。
【００９５】
組換えベクターの分離・精製は、例えば、宿主が細菌の場合、細菌を溶菌して得られる溶菌物に基づいて行われる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームなどの溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼ及び他の酵素並びにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。
【００９６】
更に、凍結融解およびフレンチプレス処理のような物理的破砕方法を組み合わせてもよい。溶菌物からのＤＮＡの分離・精製は、例えば、フェノール処理およびプロテアーゼ処理による除蛋白処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理並びに市販のキットを適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００９７】
ＤＮＡの切断は、常法に従い、例えば制限酵素処理を用いて行うことができる。制限酵素としては、例えば特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素を用いる。ＤＮＡと発現ベクターとの結合は、例えばＤＮＡリガーゼを用いて行う。
【００９８】
その後、分離・精製したＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲにより得られた増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。
【００９９】
また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光および酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
【０１００】
６．ポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、本発明の形質転換体を培養することによって製造することができる。
【０１０１】
本発明の形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【０１０２】
培地の栄養源としては、形質転換体の生育に必要とされるものが使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸等が挙げられる。
【０１０３】
窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物が挙げられる。
【０１０４】
炭素源及び窒素源の他に、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガンおよび亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸並びに特定のビタミンなどを必要に応じて使用してもよい。
【０１０５】
培養温度は、本発明の形質転換体が生育可能であり、且つ本発明の形質転換体が本発明のポリペプチドを産生する範囲で適宜設定し得るが、好ましくは１５〜３７℃程度である。培養は、本発明のポリペプチドが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２〜４８時間程度である。
【０１０６】
培地のｐＨは、宿主が発育し、宿主が変異型ＡＣＳ
を産生する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ５．０〜９．０程度の範囲である。
【０１０７】
本発明の形質転換体を培養し、培養液を遠心分離などの方法により培養上清または菌体を回収し、菌体は超音波およびフレンチプレスといった機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、本発明のポリペプチドを含む水溶性画分を得ることができる。
【０１０８】
また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した本発明のポリペプチドを培養液中に分泌させることもできる。
【０１０９】
上記のようにして得られた本発明のポリペプチドを含む水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、該水溶性画分中の本発明のポリペプチドを濃縮した後に精製処理に供してもよい。
【０１１０】
濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。
【０１１１】
本発明のポリペプチドの精製処理は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
【０１１２】
前記精製処理は既に公知であり、適当な文献、雑誌および教科書等を参照することで進めることができる。このようにして精製された本発明のポリペプチは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化して市場に流通させることができる。
【実施例】
【０１１３】
次に、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
【０１１４】
１．被改変酵素と参照酵素の同定
本実施例では、被改変酵素としてＴｔｈＩＰＭＤを使用し、参照酵素として大腸菌由来のＩＰＭＤＨ（以下、ＥｃｏＩＰＭＤＨとも表記する）を使用した。
【０１１５】
ＴｔｈＩＰＭＤＨのアミノ酸配列、及びＴｔｈＩＰＭＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列はすでに公知であり、その配列情報はＮＣＢＩホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ。ｇｏｖ／）より取得することができる。ＴｔｈＩＰＭＤＨのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に、該アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号２に示す。また、ＥｃｏＩＰＭＤＨのアミノ酸配列も公知であり、上述のとおり、その配列情報を取得することができる。ＥｃｏＩＰＭＤＨのアミノ酸配列を配列表の配列番号３に示す。
【０１１６】
２．被改変酵素（ＴｔｈＩＰＭＤＨ）の遺伝子の単離
サーマス・サーモフィラス  ＨＢ８株を培養し定法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号４と配列番号５のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより野生型ＴｔｈＩＰＭＤＨのＤＮＡを増幅させた。エタノール沈殿により精製した該ＤＮＡとプラスミドｐＥＴ２１ｃを夫々制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、切断された夫々のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲルからＤＮＡを精製した。精製されたＴｔｈＩＰＭＤＨのＤＮＡ断片とｐＥＴ２１ｃ断片を混合してＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡製）を使用してライゲーションさせ、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して培養し、単一コロニーからプラスミドを精製し、ＤＮＡシーケンスにより配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡをクローニングされたことが確認された。該塩基配列から、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＴｔｈＩＰＭＤＨをコードしていることも確認された。
【０１１７】
３．被改変酵素（ＴｔｈＩＰＭＤＨ）への変異導入部位の決定
補酵素ＮＡＤ+及び基質３−イソプロピルリンゴ酸と複合体を形成したＴｔｈＩＰＭＤＨの立体構造情報（ＰＤＢ  ＩＤ：４Ｆ７Ｉ）をＰＤＢホームページより取得し、該構造をＳｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒにより可視化した。補酵素ＮＡＤ+及び基質３−イソプロピルリンゴ酸と結合するアミノ酸残基から８Å内に存在するアミノ酸残基を抽出した。同時に、配列番号１に示されるＴｔｈＩＰＭＤＨのアミノ酸配列と、配列番号３に示されるＥｃｏＩＰＭＤＨのアミノ酸配列を用いてＣｌｕｓｔａｌＷによりペアワイズアライメント図を作成し、前記８Å内に存在するアミノ酸残基をマークした。結果を図１に示す。図１においては、ＴｔｈＩＰＭＤＨのアミノ酸配列における前記８Å内に存在するアミノ酸残基にアンダーバーを付している。この中で、ＴｔｈＩＰＭＤＨとＥｃｏＩＰＭＤＨの間でアミノ酸残基が異なる部分を白抜き四角でマークした。
【０１１８】
例えば、図１において、ＴｔｈＩＰＭＤＨのアミノ酸配列におけるＮ末端から７残基目〜１２残基目（「ＰＧＤＧＩＧ」）は該８Å内に存在する。一方、ＥｃｏＩＰＭＤＨのアミノ酸配列において、これと対応する部位はＴｔｈＩＰＭＤＨと同一（「ＰＧＤＧＩＧ」）であり、この領域には変異導入部位を設計しなかった。
【０１１９】
また、図１において、ＴｔｈＩＰＭＤＨのアミノ酸配列におけるＮ末端から４１残基目〜４２残基目（「ＦＧ」）は該８Å内に存在する。一方、ＥｃｏＩＰＭＤＨのアミノ酸配列において、これと対応する部位は「ＶＧ」であり、４１番目の残基が異なっていた。従って、４１番目のフェニルアラニン（Ｆ４１）をバリン（Ｖ）に変更する変異（Ｆ４１Ｖ）を導入することに決定した。
【０１２０】
更に、図１において、ＴｔｈＩＰＭＤＨのアミノ酸配列におけるＮ末端から３２４残基目〜３２７残基目（「ＰＰ−ＤＬ」）は該８Å内に存在する。一方、ＥｃｏＩＰＭＤＨのアミノ酸配列において、これと対応する部位は「ＲＴＧＤＬ」であり、３２４番目と３２５番目のアミノ酸残基、及び３２５番目と３２６番目に挿入が入る形で異なっていた。従って、３２４番目のプロリン（Ｐ）をアルギニン（Ｒ）、３２５番目のプロリンをスレオニン（Ｔ）、３２５番目と３２６番目にグリシン（Ｇ）を挿入する変異（Ｐ３２４Ｒ／Ｐ３２５Ｔ／３２６Ｇ（ＩＮＳＥＲＴＩＯＮ））を導入することに決定した。
【０１２１】
他の領域についても同様に検討し、変異導入部位を決定した。
【０１２２】
上記の検討の結果、表１に示す変異導入を夫々施すことに決定した。
【０１２３】
【表１】
2015164409.tif 000004
【０１２４】
４．被改変酵素（ＴｔｈＩＰＭＤＨ）の遺伝子への部位特異的変異導入
ＴｔｈＩＰＭＤＨ遺伝子への部位特異的変異導入は、前記表１に併記した配列番号６〜２７に示す変異導入用オリゴヌクレオチドと、配列番号２８及び配列番号２９に示す増幅用オリゴヌクレオチド、前記ＴｔｈＩＰＭＤＨ遺伝子をクローニングしたｐＥＴ２１ｃベクター（以下、ｐＥＴ２１ｃ−ＴｔｈＩＰＭＤＨとも記述する）を利用した。
【０１２５】
変異導入はＳＯＥ（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法により実施した。方法の概略を図２に示す。
【０１２６】
即ち、表１におけるｍｕｔ１遺伝子の合成は図２に示すように以下の（１）〜（３）の手順で行なった。
【０１２７】
（１）ＰＣＲ＃１
図２におけるプライマーａは、ｐＥＴ２１ｃ配列上に設計されたＴ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒであり、配列番号２８に示されるオリゴヌクレオチドである。プライマーｄは、配列表の配列番号７に示されるオリゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドは、Ｆ４１Ｖの変異を導入するように設計されている。表２に示すＰＣＲ反応溶液を準備し、９８℃：３０秒、５３℃：３０秒、７２℃：１２０秒の反応を２５サイクル実施した。増幅されたプライマーａ〜ｄ間のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲルから該ＤＮＡ断片を精製した。
【０１２８】
【表２】
2015164409.tif 000005
【０１２９】
（２）ＰＣＲ＃２
図２におけるプライマーｂは、ｐＥＴ２１ｃ配列上に設計されたＴ７  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｐｒｉｍｅｒであり、配列番号２９に示されるオリゴヌクレオチドである。プライマーｃは、配列番号６に示されるオリゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドは、Ｆ４１Ｖの変異を導入するように設計されている。表３に示すＰＣＲ反応溶液を準備し、９８℃：３０秒、５３℃：３０秒、７２℃：１２０秒の反応を２５サイクル実施した。増幅されたプライマーｃ〜ｂ間のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲルから該ＤＮＡ断片を精製した。
【０１３０】
【表３】
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【０１３１】
（３）ＰＣＲ＃３
ＰＣＲ＃１およびＰＣＲ＃２で得られたＤＮＡ断片を鋳型に、プライマーａとプライマーｂを用いて表４に示すＰＣＲ反応溶液を準備し、９８℃：３０秒、５３℃：３０秒、７２℃：１２０秒の反応を２５サイクル実施した。増幅されたプライマーｃ〜ｂ間のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲルから該ＤＮＡ断片を精製した。
【０１３２】
【表４】
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【０１３３】
ｍｕｔ２〜ｍｕｔ１１の部位特異的変異導入を施したＴｔｈＩＰＭＤＨについても、表１に示す所定の変異導入用オリゴヌクレオチドを使用し、上記（１）〜（３）の手順に従って合成した。
【０１３４】
得られたｍｕｔ１〜ｍｕｔ１１遺伝子を、夫々表５に示す組成の溶液にて制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルから精製した。
【表５】
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【０１３５】
ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで切断処理したｍｕｔ１〜ｍｕｔ１１遺伝子を夫々表６に示す組成の溶液にてライゲーション処理し、該反応溶液を大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルに添加して形質転換させ、ＬＢ寒天培地上（１．０％トリプトン、０．５％酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、１．５％寒天、０．１ｇ／ｍｌアンピシリン）で、３７℃、１８時間培養して形質転換体のコロニーを出現させた。単一コロニーをＬＢ培地に植菌し、一晩培養した後、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを精製し、シーケンスにより所望の変異が導入され、且つＰＣＲ反応による予期しない突然変異が導入されていないことを確認した。
【０１３６】
【表６】
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【０１３７】
５．ＴｔｈＩＰＭＤＨ及びその改変体の遺伝子の組換え発現と精製
実施例１で取得した野生型ＴｔｈＩＰＭＤＨ及びｍｕｔ１〜ｍｕｔ１１のプラスミドを用いて大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）を形質転換し、ＬＢ寒天培地上（１．０％トリプトン、０．５％酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、１．５％寒天、０．１ｇ／ｍｌアンピシリン）で、３７℃、１６時間培養して形質転換体のコロニーを出現させた。
【０１３８】
単一コロニーを１００ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で２４時間培養してＴｔｈＩＰＭＤＨ、及びＴｔｈＩＰＭＤＨの改変体を発現させた。遠心分離により形質転換体を集菌し、−８０℃で一度凍結した後、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．６）で懸濁した。懸濁した形質転換体を超音破砕機により破砕し、遠心分離（３０，０００ｒｐｍ、２０分）して破砕液の上清を回収し、７０℃、１５分間の熱処理に供して大腸菌由来のタンパク質を熱変性させ、さらに遠心分離して変性タンパク質を除去した上清を回収した。
【０１３９】
該上清を、予め０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．６）で平衡化したＨｉＴｒａｐＱ（ＧＥヘルスケア製）カラムへ流してＴｔｈＩＰＭＤＨ又はその改変体を吸着させ、０Ｍから１Ｍの塩化カリウムの濃度勾配によりＴｔｈＩＰＭＤＨ又はその改変体を溶出させた。ＴｔｈＩＰＭＤＨ又はその改変体の溶出画分を回収して２０％飽和となるよう硫酸アンモニウムを添加し、あらかじめ２０％飽和硫安および０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．６）で平衡化したＢｕｔｙｌ−ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムへ流してＩＰＭＤＨを吸着させ、２０％飽和硫安から０％硫安の濃度勾配により、精製されたＴｔｈＩＰＭＤＨ又はその改変体を溶出させた。
【０１４０】
精製されたＴｔｈＩＰＭＤＨ及びその改変体を夫々０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で透析し、以下の活性測定に使用する精製標品を取得した。
【０１４１】
５．各ＴｔｈＩＰＭＤＨ改変体の２５℃における活性の比較
ＴｔｈＩＰＭＤＨの改変体の低温活性を、変異を導入していないＴｔｈＩＰＭＤＨと比較するため、２５℃における活性測定を行った。測定条件は、前述する通りである。
【０１４２】
得られた結果を図３に示す。ｍｕｔ２、ｍｕｔ６、ｍｕｔ７を除く８つの改変体は、２５℃において、ＴｔｈＩＰＭＤＨ（野生型）と同程度あるいは高い比活性を示した。特に、ＴｔｈＩＰＭＤＨ（野生型）に比べて、ｍｕｔ３は３．４０倍、ｍｕｔ５は３．１６倍、ｍｕｔ９は１０．８６倍、ｍｕｔ１１は７．２０倍高い比活性を示した。
【０１４３】
ＴｔｈＩＰＭＤＨを被改変酵素としたモデル実験によって、１１種類の改変体から４種類もの改変体、即ち実に３６％もの効率で、低温における酵素活性が格段に向上した改変体の取得に成功した。広く一般に利用されるランダム変異導入とスクリーニングを組み合わせた方法では、１，０００〜３０，０００個の改変体から有望改変体を探索することが必要であるため、これほど高効率に有望改変体を取得できることは従来技術から想定されず、本発明が産業用酵素の改変方法としてきわめて優れていると結論できる。
【０１４４】
６．変異の組合せによる２５℃における活性の更なる向上
２５℃における活性が大幅に向上したｍｕｔ９とｍｕｔ１１の変異を組み合わせたｍｕｔ９／１１改変体酵素を、実施例１〜２に記載の方法により作製し、実施例３と同様に２５℃における比活性を、ＴｔｈＩＰＭＤＨ（野生型）、ｍｕｔ９、およびｍｕｔ１１と比較した。
【０１４５】
得られた結果を図４に示す。ｍｕｔ９／１１の比活性は、２５℃において、ＴｔｈＩＰＭＤＨ（野生型）に比べて１２．０倍向上しており、ｍｕｔ９及びｍｕｔ１１に比べても比活性が向上していた。
【０１４６】
以上のように、被改変酵素（ＴｔｈＩＰＭＤＨ）において、基質結合部位及び／又は補酵素結合部位から８Åの距離に存在するアミノ酸残基に着目し、参照酵素（ＥｃｏＩＰＭＤＨ）の対応する部位のアミノ酸配列を参考にして、アミノ酸変異を導入することによって、低温での酵素活性が向上した改変体を効率的に取得することができた。以上の試験では、被改変酵素としてＴｔｈＩＰＭＤＨを使用した例を示しているが、以下述べる理由から、３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素以外の種類の酵素についても、ＴｔｈＩＰＭＤＨと同様に、基質結合部位及び／又は補酵素結合部位から８Åの距離に存在するアミノ酸残基に着目して、変異を導入することによって、低温での酵素活性が向上した改変体を効率的に取得することができると考えられる。
【０１４７】
好熱菌由来の酵素は、耐熱性を備えており、構造を安定化させるために、常温菌由来の酵素に比べて分子内の疎水性相互作用及びイオン結合が強く、この傾向は酵素／補酵素／基質複合体の形成時においても同様である。常温付近において、この強固な酵素／補酵素／基質複合体は、代謝回転（酵素１分子が１秒間に基質を触媒する速度）を低下させる。故に、好熱菌由来の酵素は、常温菌由来の酵素に比べ、常温付近における比活性が低くなる。一方、好熱菌由来の酵素において、酵素と補酵素及び基質結合部位に係る（及びその周辺８Åの）アミノ酸残基を常温菌由来のアミノ酸に置換することにより、常温付近における上記の酵素／補酵素／基質複合体が不安定化され、不安定化されることが代謝回転の上昇に寄与すると考えられる。このことが、該変異法が、好熱菌由来酵素を低温活性化させるメカニズムと類推される。それ故、基質結合部位及び／又は補酵素結合部位から８Åの距離に存在するアミノ酸残基に着目して、変異を導入する方法は、好熱菌由来の酵素であって、補酵素（好ましくはＮＡＤ）を要求し、立体構造が明らかで、且つ常温菌由来の酵素の配列を比較することさえできれば、その酵素の種類によらず、低温における比活性を向上させることができると考えられる。勿論、本発明は、ここで述べたメカニズム等に限定して解釈されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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