(57)【要約】【課題】プリン系物質の製造法を提供する。【解決手段】変異型ｙｇｇＢ遺伝子を保持するように改変されたプリン系物質生産能を有するエシェリヒア属細菌、バチルス属細菌、またはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスを培地で培養し、該培地よりプリン系物質を採取することにより、プリン系物質を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリン系物質生産能を有する細菌であって、
エシェリヒア属細菌、バチルス属細菌、またはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスであり、
変異型ｙｇｇＢ遺伝子を保持するように改変されており、
前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子は、前記細菌のプリン系物質生産能を向上させる変異を有するｙｇｇＢ遺伝子である、細菌。
【請求項２】
前記変異が、以下の（１）〜（３）からなる群より選択される、請求項１に記載の細菌：
（１）野生型ＹｇｇＢタンパク質の４１９〜５３３位のアミノ酸残基をコードする領域における変異；
（２）野生型ＹｇｇＢタンパク質の膜貫通領域をコードする領域における変異；および
（３）それらの組み合わせ。
【請求項３】
前記変異（１）が、野生型ＹｇｇＢタンパク質の４１９〜５３３位のアミノ酸残基をコードする領域への塩基配列の挿入である、請求項２に記載の細菌。
【請求項４】
前記変異（１）が、野生型ＹｇｇＢタンパク質の４１９〜５３３位に存在するプロリン残基を他のアミノ酸に置換する変異である、請求項２に記載の細菌。
【請求項５】
前記膜貫通領域が、野生型ＹｇｇＢタンパク質の１〜２３位、２５〜４７位、６２〜８４位、８６〜１０８位、および１１０〜１３２位のアミノ酸残基から選択される、請求項２〜４のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項６】
前記変異（２）が、フレームシフト変異およびナンセンス変異を伴わない、請求項２〜５のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項７】
前記変異（２）が、以下の（２ａ）〜（２ｄ）からなる群より選択される、請求項２〜６のいずれか１項に記載の細菌：
（２ａ）野生型ＹｇｇＢタンパク質の１４位のロイシン残基と１５位のトリプトファン残基との間に１又は数個のアミノ酸が挿入される変異；
（２ｂ）野生型ＹｇｇＢタンパク質の１００位のアラニン残基を他のアミノ酸に置換する変異；
（２ｃ）野生型ＹｇｇＢタンパク質の１１１位のアラニン残基を他のアミノ酸に置換する変異；および
（２ｄ）それらの組み合わせ。
【請求項８】
前記１４位のロイシン残基と１５位のトリプトファン残基との間に、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕが挿入される、請求項７に記載の細菌。
【請求項９】
前記１００位および／または１１１位のアラニン残基が、スレオニンに置換される、請求項７または８に記載の細菌。
【請求項１０】
前記野生型ＹｇｇＢタンパク質が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細菌：
（Ａ）配列番号９、１１、１３、または１５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号９、１１、１３、または１５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、
メカノセンシティブチャネルとして機能するタンパク質。
【請求項１１】
プリン系物質の生合成に関与する酵素の活性が増大するように改変されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項１２】
前記プリン系物質が、イノシン、キサントシン、グアノシン、およびアデノシンからなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項１３】
前記プリン系物質が、イノシン酸、キサンチル酸、およびグアニル酸からなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項１４】
エシェリヒア・コリである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項１５】
バチルス・サブチリスまたはバチルス・アミロリケファシエンスである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項１６】
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスである、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の細菌。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の細菌を培地で培養し培地にプリン系物質を蓄積すること、および該培地より該プリン系物質を回収すること、を含むプリン系物質の製造法。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の細菌を培地で培養し培地にプリンヌクレオシドを蓄積すること、および該培地よりプリンヌクレオシドを回収すること、を含むプリンヌクレオシドの製造法。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の細菌を培地で培養し培地にプリンヌクレオチドを蓄積すること、および該培地よりプリンヌクレオチドを回収すること、を含むプリンヌクレオチドの製造法。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の細菌を培地で培養し培地にプリンヌクレオシドを蓄積すること、該プリンヌクレオシドをリン酸化しプリンヌクレオチドを生成すること、および該プリンヌクレオチドを回収すること、を含むプリンヌクレオチドの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌を用いたプリン系物質の発酵生産法に関する。プリン系物質は、調味料や医薬品等の成分またはその原料として、産業上有用である。
【背景技術】
【０００２】
プリンヌクレオシドやプリンヌクレオチド等のプリン系物質は、通常、アデニン栄養要求性株を用いた発酵によって工業的に生産される。このような株には、さらに、プリンアナログやスルファグアニジン等の薬剤に対する耐性が付与されていてもよい。プリンヌクレオシドの発酵生産に用いられる株としては、例えば、バチルス（Bacillus）属に属する株（特許文献１〜８）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）（コリネバクテリウム（Corynebacterium））属に属する株（特許文献９〜１０、非特許文献１）、およびエシェリヒア（Escherichia）属に属する株（特許文献１１）が知られている。
【０００３】
栄養要求性株や薬剤耐性株等の変異株は、典型的には、ＵＶ照射またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）処理によって突然変異を誘発し、適当な選択培地を用いて所望の表現型を有する変異株を選択することにより取得できる。
【０００４】
また、遺伝子工学技術を利用したプリンヌクレオシド生産株の育種も行われている。例えば、バチルス属細菌（特許文献１２〜２１）、ブレビバクテリウム（コリネバクテリウム）属細菌（特許文献２２）、およびエシェリヒア属細菌（特許文献１１）について、遺伝子工学技術によるプリンヌクレオシド生産能の付与または増強が行われている。具体的には、例えば、プリンヌクレオシドの生合成に関与する酵素の細胞内の活性を増強することや、プリンヌクレオシドの生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることにより、プリンヌクレオシド生産能を付与または増強することができる（特許文献１１）。
【０００５】
コリネ型細菌のyggB遺伝子は、エシェリヒア・コリのyggB遺伝子のホモログであり（非特許文献２、３）、メカノセンシティブチャネル（mechanosensitive channel）をコードする（非特許文献４、５）。コリネ型細菌においては、yggB遺伝子の発現を増大させることにより、または特定の変異を有する変異型yggB遺伝子を保持させることにより、グルタミン酸生産能が向上することが知られている（特許文献２３）。
【０００６】
しかしながら、yggB遺伝子とプリンヌクレオシドやプリンヌクレオチド等のプリン系物質生産との関連は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公昭３８−２３０３９号公報（１９６３）
【特許文献２】特公昭５４−１７０３３号公報（１９７９）
【特許文献３】特公昭５５−２９５６号公報（１９８０）
【特許文献４】特公昭５５−４５１９９号公報（１９８０）
【特許文献５】特開昭５６−１６２９９８号公報（１９８１）
【特許文献６】特公昭５７−１４１６０号公報（１９８２）
【特許文献７】特公昭５７−４１９１５号公報（１９８２）
【特許文献８】特開昭５９−４２８９５号公報（１９８４）
【特許文献９】特公昭５１−５０７５号公報（１９７６）
【特許文献１０】特公昭５８−１７５９２号公報（１９７２）
【特許文献１１】国際公開第９９／０３９８８号パンフレット
【特許文献１２】特開昭５８−１５８１９７号公報（１９８３）
【特許文献１３】特開昭５８−１７５４９３号公報（１９８３）
【特許文献１４】特開昭５９−２８４７０号公報（１９８４）
【特許文献１５】特開昭６０−１５６３８８号公報（１９８５）
【特許文献１６】特開平１−２７４７７号公報（１９８９）
【特許文献１７】特開平１−１７４３８５号公報（１９８９）
【特許文献１８】特開平３−５８７８７号公報（１９９１）
【特許文献１９】特開平３−１６４１８５号公報（１９９１）
【特許文献２０】特開平５−８４０６７号公報（１９９３）
【特許文献２１】特開平５−１９２１６４号公報（１９９３）
【特許文献２２】特開昭６３−２４８３９４（１９８８）
【特許文献２３】特開２００７−０９７５７３
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Agric. Biol. Chem., 42, 399（1978）
【非特許文献２】FEMS Microbiol Lett. 2003 Jan 28;218(2):305-9.
【非特許文献３】Mol Microbiol. 2004 Oct;54(2):420-38.
【非特許文献４】EMBO J. 1999, 18(7):1730-7
【非特許文献５】Biosci. Biotechnol. Biochem., 74(12), 2546-2549, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、細菌のプリン系物質生産能を向上させる新規な技術を開発し、効率的なプリン系物質の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、特定の変異を有する変異型yggB遺伝子を保持するように細菌を改変することによって、細菌のプリン系物質生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
プリン系物質生産能を有する細菌であって、
エシェリヒア属細菌、バチルス属細菌、またはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスであり、
変異型ｙｇｇＢ遺伝子を保持するように改変されており、
前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子は、前記細菌のプリン系物質生産能を向上させる変異を有するｙｇｇＢ遺伝子である、細菌。
［２］
前記変異が、以下の（１）〜（３）からなる群より選択される、前記細菌：
（１）野生型ＹｇｇＢタンパク質の４１９〜５３３位のアミノ酸残基をコードする領域における変異；
（２）野生型ＹｇｇＢタンパク質の膜貫通領域をコードする領域における変異；および
（３）それらの組み合わせ。
［３］
前記変異（１）が、野生型ＹｇｇＢタンパク質の４１９〜５３３位のアミノ酸残基をコードする領域への塩基配列の挿入である、前記細菌。
［４］
前記変異（１）が、野生型ＹｇｇＢタンパク質の４１９〜５３３位に存在するプロリン
残基を他のアミノ酸に置換する変異である、前記細菌。
［５］
前記膜貫通領域が、野生型ＹｇｇＢタンパク質の１〜２３位、２５〜４７位、６２〜８４位、８６〜１０８位、および１１０〜１３２位のアミノ酸残基から選択される、前記細菌。
［６］
前記変異（２）が、フレームシフト変異およびナンセンス変異を伴わない、前記細菌。［７］
前記変異（２）が、以下の（２ａ）〜（２ｄ）からなる群より選択される、前記細菌：（２ａ）野生型ＹｇｇＢタンパク質の１４位のロイシン残基と１５位のトリプトファン残基との間に１又は数個のアミノ酸が挿入される変異；
（２ｂ）野生型ＹｇｇＢタンパク質の１００位のアラニン残基を他のアミノ酸に置換する変異；
（２ｃ）野生型ＹｇｇＢタンパク質の１１１位のアラニン残基を他のアミノ酸に置換する変異；および
（２ｄ）それらの組み合わせ。
［８］
前記１４位のロイシン残基と１５位のトリプトファン残基との間に、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕが挿入される、前記細菌。
［９］
前記１００位および／または１１１位のアラニン残基が、スレオニンに置換される、前記細菌。
［１０］
前記野生型ＹｇｇＢタンパク質が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質である、前記細菌：
（Ａ）配列番号９、１１、１３、または１５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号９、１１、１３、または１５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、メカノセンシティブチャネルとして機能するタンパク質。
［１１］
プリン系物質の生合成に関与する酵素の活性が増大するように改変されている、前記細菌。
［１２］
前記プリン系物質が、イノシン、キサントシン、グアノシン、およびアデノシンからなる群より選択される、前記細菌。
［１３］
前記プリン系物質が、イノシン酸、キサンチル酸、およびグアニル酸からなる群より選択される、前記細菌。
［１４］
エシェリヒア・コリである、前記細菌。
［１５］
バチルス・サブチリスまたはバチルス・アミロリケファシエンスである、前記細菌。
［１６］
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスである、前記細菌。
［１７］
前記細菌を培地で培養し培地にプリン系物質を蓄積すること、および該培地より該プリン系物質を回収すること、を含むプリン系物質の製造法。
［１８］
前記細菌を培地で培養し培地にプリンヌクレオシドを蓄積すること、および該培地よりプリンヌクレオシドを回収すること、を含むプリンヌクレオシドの製造法。
［１９］
前記細菌を培地で培養し培地にプリンヌクレオチドを蓄積すること、および該培地よりプリンヌクレオチドを回収すること、を含むプリンヌクレオチドの製造法。
［２０］
前記細菌を培地で培養し培地にプリンヌクレオシドを蓄積すること、該プリンヌクレオシドをリン酸化しプリンヌクレオチドを生成すること、および該プリンヌクレオチドを回収すること、を含むプリンヌクレオチドの製造法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、細菌のプリン系物質生産能を向上させることができ、プリン系物質を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、「特定の変異」を有する変異型yggB遺伝子を保持するように改変された、プリン系物質生産能を有する細菌である。「特定の変異」については後述する。
【００１５】
＜１−１＞プリン系物質生産能を有する細菌
本発明において、「プリン系物質生産能を有する細菌」とは、培地で培養したときに、目的とするプリン系物質を生成し、回収できる程度に培地に蓄積する能力を有する細菌をいう。プリン系物質生産能を有する細菌は、非改変株よりも多い量の目的とするプリン系物質を培地に蓄積することができる細菌であってよい。「非改変株」とは、変異型yggB遺伝子を保持しない対照株をいい、例えば、野生株または親株であってよい。また、プリン系物質生産能を有する細菌は、例えば、０．１ｍＭ以上、０．５ｍＭ以上、１ｍＭ以上、または２ｍＭ以上の量の目的とするプリン系物質を培地に蓄積することができる細菌であってもよい。
【００１６】
プリン系物質としては、プリンヌクレオシドおよびプリンヌクレオチドが挙げられる。プリンヌクレオシドとしては、イノシン、グアノシン、キサントシン、およびアデノシンが挙げられる。プリンヌクレオチドとしては、プリンヌクレオシドの５’−リン酸エステルが挙げられる。プリンヌクレオシドの５’−リン酸エステルとしては、イノシン酸（イノシン−５’−リン酸エステル；ＩＭＰ）、グアニル酸（グアノシン−５’−リン酸エステル；ＧＭＰ）、キサンチル酸（キサントシン−５’−リン酸エステル；ＸＭＰ）、およびアデニル酸（アデノシン−５’−リン酸エステル；ＡＭＰ）が挙げられる。本発明の細菌は、１種のプリン系物質の生産能を有していてもよく、２種またはそれ以上のプリン系物質の生産能を有していてもよい。本発明の細菌は、例えば、１種またはそれ以上のプリンヌクレオシドの生産能を有していてもよい。本発明の細菌は、例えば、１種またはそれ以上のプリンヌクレオチドの生産能を有していてもよい。
【００１７】
本発明の細菌は、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、またはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）である。
【００１８】
エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類される細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Neidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biolo
gy, Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、プロトタイプの野生株K12由来のエシェリヒア・コリW3110（ATCC 27325）やエシェリヒア・コリMG1655（ATCC 47076）が挙げられる。
【００１９】
バチルス属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりバチルス属に分類される細菌が挙げられる。バチルス属細菌としては、例えば、下記のような種が挙げられる。
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）
バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）
バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）
バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）
バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）
バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymixa）
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）
【００２０】
バチルス・サブチリスとして、具体的には、例えば、バチルス・サブチリス168 Marburg株（ATCC 6051）やバチルス・サブチリスPY79株（Plasmid, 1984, 12, 1-9）が挙げられる。バチルス・アミロリケファシエンスとして、具体的には、例えば、バチルス・アミロリケファシエンスT株（ATCC 23842）やバチルス・アミロリケファシエンスN株（ATCC 23845）が挙げられる。
【００２１】
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスとしては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりコリネバクテリウム・アンモニアゲネスに分類される細菌が挙げられる。コリネバクテリウム・アンモニアゲネスには、従来ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスに分類されていた細菌も含む。コリネバクテリウム・アンモニアゲネスとして、具体的には、例えば、以下の菌株が挙げられる。
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ATCC-6872
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス  アデニン漏出型変異株（Leaky Mutant）（Agr.
Bio. Chem., Vol.47(5), p1035-1041, 1983, (KY13102, KY13171, KY13184)）
【００２２】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００２３】
本発明の細菌は、本来的にプリン系物質生産能を有するものであってもよく、プリン系物質生産能を有するように改変されたものであってもよい。プリン系物質生産能を有する細菌は、例えば、上記のような細菌にプリン系物質生産能を付与することにより、または、上記のような細菌のプリン系物質生産能を増強することにより、取得できる。
【００２４】
プリン系物質生産能の付与または増強は、従来、バチルス属細菌やエシェリヒア属細菌等のプリン系物質生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる。
【００２５】
例えば、プリン系物質生産能は、アデニン要求性等の栄養要求性を付与することにより、またはさらにプリンアナログやスルファグアニジン等の薬剤に対する耐性を付与するこ
とにより、付与または増強することができる（特公昭38-23099、特公昭54-17033、特公昭55-45199、特公昭57-14160、特公昭57-41915、特公昭59-42895、US2004-0166575A参照）。プリン系物質生産能を有する栄養要求性株や薬剤耐性株等の変異株は、親株または野生株を突然変異処理に供し、適当な選択培地を用いて所望の表現型を有する変異株を選択することにより取得できる。突然変異処理としては、例えば、Ｘ線の照射、紫外線の照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【００２６】
また、プリン系物質生産能は、プリン系物質の生合成に関与する酵素の細胞内の活性を増強することにより、付与または増強することができる。１種の酵素の活性を増強してもよく、２種またはそれ以上の酵素の活性を増強してもよい。酵素活性を増強する手法については後述する。酵素活性の増強は、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現が増強されるように細菌を改変することにより行うことができる。遺伝子の発現を増強する手法は、WO00/18935号パンフレットや欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。
【００２７】
プリンヌクレオチドは、ホスホリボシルピロリン酸（phosphoribosylpyrophosphate；ＰＲＰＰ）を中間体として生合成される。プリンヌクレオシドは、プリンヌクレオチドが脱リン酸化されることにより生合成される。これらプリン系物質の生合成に関与する酵素としては、例えば、ＰＲＰＰシンセターゼ（PRPP synthetase）（prs）やプリンオペロンにコードされるタンパク質が挙げられる。なお、カッコ内は、その酵素をコードする遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。ただし、遺伝子名（遺伝子の略記号）は一例であり、生物種によっては、遺伝子名が異なる場合や、該当する遺伝子を有していない場合があり得る。
【００２８】
プリンオペロンとしては、例えば、バチルス・サブチリスのpurEKBCSQLFMNHDオペロン（Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein,
ASM Press, Washington D.C., 2002）やエシェリヒア・コリのpurレギュロン（Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）が挙げられる。例えば、プリンオペロンの発現をまとめて増強してもよく、プリンオペロンに含まれる遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現を増強してもよい。
【００２９】
これらの中では、例えば、ＰＲＰＰシンセターゼ（PRPP synthetase）（prs）およびＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ（PRPP amidotransferase）（purF）から選択される１またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。
【００３０】
なお、例えば、プリン系物質の生合成に関与する酵素がフィードバック阻害や発現抑制等の負のレギュレーションを受けている場合は、そのレギュレーションを低減又は解除することにより、酵素活性を増強し、プリン系物質生産能を向上させることができる（WO99/003988）。
【００３１】
プリンオペロンの発現は、purR遺伝子にコードされるプリンリプレッサーにより抑制される。よって、プリンオペロンの発現は、例えば、プリンリプレッサーの活性を低下させることにより、増強することができる（米国特許第6,284,495号）。プリンリプレッサーの活性は、例えば、プリンリプレッサーをコードするpurR遺伝子を破壊することにより、低下させることができる（米国特許第6,284,495号）。また、プリンオペロンの発現は、プロモーター下流に位置するterminator-antiterminator配列（アテニュエーター配列ともいう）に制御されている（Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274−8287、Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1988, 263, 10894−1
0902、Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Bacteriol., 1989, 171, 2136−2141）。よって、プリンオペロンの発現は、例えば、アテニュエーター配列を欠損させることにより、増強することができる。アテニュエーター配列の欠損は、後述する遺伝子の破壊と同様の手法により行うことができる。
【００３２】
ＰＲＰＰシンセターゼは、ＡＤＰによるフィードバック阻害を受ける。よって、例えば、ＡＤＰによるフィードバック阻害が低減又は解除された脱感作型ＰＲＰＰシンセターゼをコードする変異型ＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子を細菌に保持させることにより、ＰＲＰＰシンセターゼ活性を増強し、プリン系物質生産能を向上させることができる（WO99/003988）。脱感作型ＰＲＰＰシンセターゼとしては、野生型ＰＲＰＰシンセターゼの128位のAsp(D)がAla(A)に置換される変異を有するものが挙げられる（S. G. Bower et al., J. Biol. Chem., 264, 10287 (1989)）。
【００３３】
ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼは、ＡＭＰおよびＧＭＰによるフィードバック阻害を受ける。よって、例えば、ＡＭＰおよび／またはＧＭＰによるフィードバック阻害が低減又は解除された脱感作型ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードする変異型ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝子を細菌に保持させることにより、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ活性を増強し、プリン系物質生産能を向上させることができる（WO99/003988）。脱感作型ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼとしては、野生型ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼの326位のLys(K)がGln(Q)に置換される変異を有するものや、野生型ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼの326位のLys(K)がGln(Q)に置換され、且つ410位のPro(P)がTrp(W)に置換される変異を有するものが挙げられる（G. Zhou et al., J. Biol. Chem., 269, 6784 (1994)）。
【００３４】
また、プリン系物質生産能は、プリン系物質の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることにより、付与または増強することができる（WO99/003988）。１種の酵素の活性を低下させてもよく、２種またはそれ以上の酵素の活性を低下させてもよい。なお、ここでいう「プリン系物質の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素」には、プリン系物質の分解に関与する酵素も含まれる。酵素活性を低下させる手法については後述する。
【００３５】
プリン系物質の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（purine nucleoside phosphorylase）（deoD, pupG）、サクシニル−ＡＭＰシンターゼ（succinyl-AMP synthase）（purA）、アデノシンデアミナーゼ（adenosine deaminase）（add）、イノシン−グアノシンキナーゼ（inosine-guanosine kinase）（gsk）、ＧＭＰレダクターゼ（GMP reductase）（guaC）、６−ホスホグルコン酸デヒドラーゼ（6-phosphogluconate dehydrase）（edd）、ホスホグルコースイソメラーゼ（phophoglucose isomerase）（pgi）、アデニンデアミナーゼ（adenine deaminase）（yicP）、キサントシンホスホリラーゼ（xanthosine phosphorylase）（xapA）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ（guaB）が挙げられる。活性を低下させる酵素は、目的のプリン系物質の種類等に応じて選択してよい。
【００３６】
また、プリン系物質生産能は、フルクトースビスフォスファターゼ（fructose 1,6-bisphosphatase）（fbp）の活性を低下させることにより、付与または増強することができる（WO2007/125782）。
【００３７】
また、プリン系物質生産能は、プリン系物質の取り込みに関与するタンパク質の活性を低下させることにより、付与または増強することができる（WO99/003988）。例えば、プリンヌクレオシドの取り込みに関与するタンパク質としては、ヌクレオシドパーミアーゼ（nucleoside permiase）（nupG）が挙げられる（WO99/003988）。
【００３８】
また、プリン系物質生産能は、プリン系物質の排出に関与するタンパク質の活性を増強することにより、付与または増強することができる。例えば、プリンヌクレオシドの排出に関与するタンパク質としては、rhtA（ybiF）遺伝子（ロシア国特許第2239656号）、yijE遺伝子（ロシア国特許第2244003号）、ydeD遺伝子（ロシア国特許第2244004号）、yicM遺伝子（ロシア国特許第2271391号）、ydhL遺伝子（特表2007-530011）、nepI遺伝子（FEMS Microbiology Letters, Volume 250, Issue 1, pages 39-47, September 2005）にコードされるタンパク質が挙げられる。
【００３９】
また、イノシン酸生産能は、Ｌ−グルタミンのアナログに対する耐性とプロリンのアナログに対する耐性とを細菌に付与することにより、付与または増強することができる（特開2004-516833）。Ｌ−グルタミンのアナログとしては、アザセリンや６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン（ＤＯＮ）が挙げられる。プロリンのアナログとしては、３，４−デヒドロプロリン、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸、（Ｓ）−２，２−ジメチル−４−オキサゾリドカルボン酸、（Ｓ）−５，５−ジメチル−４−チアゾリドカルボン酸、（４Ｓ，２ＲＳ）−２−エチル−４−チアゾリジン−カルボン酸、（２Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−２−ピロリン−カルボン酸、２−ピペリジンカルボン酸、及び２，５−ピロリジンジオンが挙げられる。
【００４０】
また、キサンチル酸生産能は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammmoniagenes）を中心とするコリネ型細菌のキサンチル酸生産菌の育種に用いられる方法により、付与または増強することができる。そのような方法としては、例えば、PRPP amidotransferase活性の増強（特開平8-168383）、脂肪族アミノ酸に対する耐性の付与（特開平4-262790）、デヒドロプロリンに対する耐性の付与（韓国特許公開公報2003-56490）が挙げられる。
【００４１】
上記のようなプリン系物質生産能を付与または増強する手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【００４２】
エシェリヒア属に属するヌクレオシド生産株として、具体的には、例えば、Escherichia coli FADRaddedd/pKFpurFKQ株が挙げられる（WO99/003988）。同株は、Escherichia coli W3110株から、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードするpurF遺伝子、プリンリプレッサーをコードするpurR遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするdeoD遺伝子、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするpurA遺伝子、アデノシンデアミナーゼをコードするadd遺伝子、および６−ホスホグルコネートデヒドラーゼをコードするedd遺伝子を破壊し、ＧＭＰによるフィードバック阻害が低減された脱感作型ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ（K326Q）をコードするpurFKQ遺伝子が搭載されたプラスミドpKFpurFKQを導入することにより得られた株である（WO99/003988）。
【００４３】
バチルス属に属するイノシン生産株として、具体的には、例えば、以下のようなものが挙げられる。
Bacillus subtilis KMBS16株（米国特許出願公開第2004-0166575号）
Bacillus subtilis KMBS16-1株（ロシア国特許第2239656号）
Bacillus subtilis KMBS310株（特開2007-117078）
Bacillus subtilis TABS133株（WO2007/125782）
Bacillus subtilis AJ12707株（FERM P-12951）（特願昭61-13876号公報）
Bacillus subtilis AJ3772株（FERM P-2555）（特願昭62-014794号公報）
Bacillus subtilis NA-6011株（FERM BP-291）（米国特許第4,701,413号）
Bacillus subtilis NA-6012株（FERM BP-292）（米国特許第4,701,413号）
Bacillus subtilis G1136A株（Bacillus amyloliquefaciens AJ1991株）（VKPM B-8994）
（米国特許第3,575,809号）
Bacillus pumilus Gottheil 3218株（ATCC 21005）（米国特許第3,616,206号）
Bacillus pumilus NA-1102株（FERM BP-289）
Bacillus amyloliquefaciens AS115-7株（VKPM B-6134）（ロシア国特許第2003678号）
【００４４】
KMBS16株は、Bacillus subtilis trpC2株から、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするpurA遺伝子、プリンリプレッサーをコードするpurR遺伝子、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするdeoD遺伝子を破壊することにより得られた株（purA::erm, purR::spc, deoD::kan）である（米国特許出願公開第2004-0166575号）。KMBS16-1株は、KMBS16株のpurA::erm変異をpurA::cat変異に置換した株である。KMBS310株は、Bacillus subtilis 168 Marburg株（ATCC 6051）から、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするpurA遺伝子、プリンリプレッサーをコードするpurR遺伝子、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするpupG遺伝子を破壊し、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ（guaB）活性を低下させ、プリンオペロンのプロモーター領域およびＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子（prs）のＳＤ配列を改変することにより得られた株である。
【００４５】
バチルス属に属するグアノシン生産株として、具体的には、例えば、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ活性を増強したバチルス属細菌（特開平3-58787）や、プリンアナログ耐性遺伝子またはデコイニン耐性遺伝子を搭載したベクターをアデニン要求性変異株に導入したバチルス属細菌（特公平4-28357）が挙げられる。
【００４６】
また、プリンヌクレオチド生産能を有する細菌として、以下のような細菌が挙げられる。イノシン酸生産菌としては、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス CJIP009（KCCM-10226）（特開2004-516833）や、ホスファターゼ活性が弱化したバチルス・ズブチリスのイノシン生産株（Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805；
Fujimoto, M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259）が挙げられる。グアニル酸生産菌としては、例えば、アデニン要求性を示し、且つ、デコイニンまたはメチオニンスルホキシドに耐性を有するバチルス属のグアニル酸生産株が挙げられる（特公昭56-12438号公報）。
【００４７】
なお、上記のプリン系物質生産菌の育種に使用される遺伝子は、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。例えば、プリン系物質生産菌の育種に使用される遺伝子は、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。遺伝子やタンパク質のバリアントについては、後述するyggB遺伝子およびYggBタンパク質のバリアントに関する記載を準用できる。
【００４８】
＜１−２＞タンパク質の活性を増大させる手法
以下に、タンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
【００４９】
「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の活性が野生株や親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）またはタンパク質の量を意味してもよい。タンパク質の活性は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上
に上昇してよい。また、「タンパク質の活性が増大する」とは、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することを含む。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、細菌が本来有する標的のタンパク質の活性を低下させた上で、好適な同タンパク質を導入してもよい。
【００５０】
タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成される。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を有さない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。
【００５１】
遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【００５２】
遺伝子のコピー数の増加は、宿主細菌の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、プリン系物質生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。相同組み換えは、例えば、Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)法（Datsenko,
K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、またはファージを用いたtransduction法により行うことができる。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。
【００５３】
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
【００５４】
また、遺伝子のコピー数の増加は、標的遺伝子を含むベクターを宿主細菌に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主細菌で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主細菌を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する細菌のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主細菌の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌において自律複製可能なベクタ
ーとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUB110、pC194、pE194が挙げられる。コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等のコリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11が挙げられる。
【００５５】
遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の細菌で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
【００５６】
また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。
【００５７】
導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい。
【００５８】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるT7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、thrプロモーター、trcプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスを用いる場合には、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl.Microbiol.Biotechnolo., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tufプロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）等のプロモーターを用いることができる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レ
ポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【００５９】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5’-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
【００６０】
本発明においては、プロモーター、ＳＤ配列、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことができる。
【００６１】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。エシェリヒア・コリ等において、ｍＲＮＡ分子の集団内に見出される６１種のアミノ酸コドン間には明らかなコドンの偏りが存在し、あるｔＲＮＡの存在量は、対応するコドンの使用頻度と直接比例するようである（Kane, J.F., Curr. Opin. Biotechnol., 6(5), 494-500 (1995)）。すなわち、過剰のレアコドンを含むｍＲＮＡが大量に存在すると翻訳の問題が生じうる。近年の研究によれば、特に、ＡＧＧ／ＡＧＡ、ＣＵＡ、ＡＵＡ、ＣＧＡ、又はＣＣＣコドンのクラスターが、合成されたタンパク質の量および質の両方を低下させ得ることが示唆されている。このような問題は、特に異種遺伝子の発現の際に生じうる。よって、遺伝子の異種発現を行う場合等には、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。
【００６２】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
【００６３】
上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【００６４】
また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の低減および解除も含まれる。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処理し、ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
【００６５】
形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53,
159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979.Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。
【００６６】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【００６７】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。
【００６８】
遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【００６９】
タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【００７０】
上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、任意のタンパク質、例えばプリン系物質の生合成に関与する酵素、の活性増強や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現増強に利用できる。
【００７１】
＜１−３＞タンパク質の活性を低下させる手法
以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
【００７２】
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）またはタンパク質の量を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性は、非改変株と比較して低下していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００７３】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成される。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００７４】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーターやシャインダルガノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。
【００７５】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
【００７６】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the Na
tional Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【００７７】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子やプリン系物質生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【００７８】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【００７９】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【００８０】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【００８１】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【００８２】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００８３】
タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％
以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００８４】
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【００８５】
上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、任意のタンパク質、例えばプリン系物質の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素、の活性低下や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現低下に利用できる。
【００８６】
＜１−４＞変異型yggB遺伝子の導入
本発明の細菌は、変異型yggB遺伝子を保持するように改変されている。本発明の細菌は、プリン系物質生産能を有する細菌を、変異型yggB遺伝子を保持するように改変することによって得ることができる。また、本発明の細菌は、変異型yggB遺伝子を保持するように細菌を改変した後に、プリン系物質生産能を付与することによっても得ることができる。本発明において、本発明の細菌を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
【００８７】
以下、yggB遺伝子およびYggBタンパク質について説明する。yggB遺伝子は、メカノセンシティブチャネル（mechanosensitive channel）をコードする遺伝子である。本発明において、後述する「特定の変異」を有するyggB遺伝子を変異型yggB遺伝子、それによりコードされるタンパク質を変異型YggBタンパク質ともいう。また、本発明において、後述する「特定の変異」を有さないyggB遺伝子を野生型yggB遺伝子、それによりコードされるタンパク質を野生型YggBタンパク質ともいう。なお、YggBタンパク質にあっては、yggB遺伝子における「特定の変異」により引き起こされるアミノ酸配列の変化を「特定の変異」ともいう。
【００８８】
野生型yggB遺伝子としては、例えば、コリネ型細菌のyggB遺伝子が挙げられる。コリネ型細菌のyggB遺伝子として、具体的には、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13869株、Corynebacterium glutamicum ATCC13032株、Corynebacterium glutamicum ATCC14967株、コリネバクテリウム・メラセコーラ（Corynebacterium melassecola）ATCC17965株のyggB遺伝子が挙げられる。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のyggB遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_003450 (VERSION NC_003450.3 GI:58036263)として登録されているゲノム配列中、1336092〜1337693位の配列の相補配列に相当する。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のyggB遺伝子は、Cgl1270と同義である。また、Corynebacterium glutamicum ATCC13032のYggBタンパク質は、GenBank accession NP_600492(version NP_600492.1 GI:19552490、locus_tag="NCgl1221")として登録されている。これらのyggB遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号８、１０、１２、および１４に示す。また、これらのyggB遺伝子がコードするYggBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９、１１、１３、および１５に示す。また、これらのYggBタンパク質の保存配列を配列番号１６に示す。
【００８９】
また、野生型YggBタンパク質は、後述する「特定の変異」を有さず、且つ、YggBタンパク質としての機能を有する限り、上記YggBタンパク質のバリアントであってもよい。なお、そのようなバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。保存的バリアントとしては、例えば、上記YggBタンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。本発明において、「YggBタンパク質としての機能を有する」とは、例えば、メカノセンシティブチャネル（mechanosensitive channel）として機能することであってよい。また、「YggBタンパク質としての機能を有する」とは、例えば、コリネ型細菌において発現を上昇させたときにコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産能を向上させる性質を有することであって
もよい（特開2007-097573）。
【００９０】
また、野生型yggB遺伝子は、上記YggBタンパク質やその保存的バリアントをコードする限り、上記yggB遺伝子のバリアントであってもよい。
【００９１】
上記YggBタンパク質のホモログをコードする遺伝子は、例えば、上記のコリネ型細菌のyggB遺伝子（配列番号８、１０、１２、または１４）を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、上記YggBタンパク質のホモログをコードする遺伝子は、例えば、コリネ型細菌の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
【００９２】
野生型YggBタンパク質は、後述する「特定の変異」を有さず、且つ、YggBタンパク質としての機能を有する限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても良い。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。
【００９３】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する細菌の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００９４】
さらに、野生型YggBタンパク質は、後述する「特定の変異」を有さず、且つ、YggBタンパク質としての機能を有する限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
【００９５】
野生型YggBタンパク質は、例えば、上記コリネ型細菌のYggBタンパク質の保存配列を有するのが好ましい。よって、保存的変異は、例えば、上記コリネ型細菌のYggBタンパク質において保存されていないアミノ酸残基において生じるのが好ましい。具体的には、例えば、野生型YggBタンパク質の、以下のアミノ酸残基から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基において、保存的変異が生じてよい。なお、野生型YggBタンパク質におけるアミノ酸残基の位置は、後述するように相対的なものである。
48位のGlu（好ましくはArgによる置換）
275位のAsp（好ましくはSerによる置換）
298位のGlu（好ましくはAlaによる置換）
343位のAla（好ましくはValによる置換）
396位のPhe（好ましくはIleによる置換）
438位のSer（好ましくはGlyによる置換）
445位のVal（好ましくはAlaによる置換）
454位のAla（好ましくはValによる置換）
457位のPro（好ましくはSerによる置換）
474位のSer（好ましくはAspによる置換）
517位のVal（好ましくは欠失）
518位のGlu（好ましくは欠失）
519位のAla（好ましくは欠失）
520位のPro（好ましくは欠失）
【００９６】
また、野生型yggB遺伝子は、後述する「特定の変異」を有さず、且つ、YggBタンパク質としての機能を有するタンパク質をコードする限り、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【００９７】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００９８】
また、野生型yggB遺伝子は、上記のような野生型YggBタンパク質をコードする限り、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、野生型yggB遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
【００９９】
なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、プリン系物質の生合成に関与する酵素等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
【０１００】
変異型YggBタンパク質は、上述したような野生型YggBタンパク質のアミノ酸配列において、後述する「特定の変異」を有する。
【０１０１】
すなわち、言い換えると、変異型YggBタンパク質は、後述する「特定の変異」を有する以外は、上述したコリネ型細菌のYggBタンパク質やその保存的バリアントであってよい。
【０１０２】
具体的には、例えば、変異型YggBタンパク質は、後述する「特定の変異」を有する以外は、配列番号９、１１、１３、または１５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
【０１０３】
また、具体的には、例えば、変異型YggBタンパク質は、後述する「特定の変異」を有する以外は、配列番号９、１１、１３、または１５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
【０１０４】
また、具体的には、例えば、変異型YggBタンパク質は、後述する「特定の変異」を有する以外は、配列番号９、１１、１３、または１５に示すアミノ酸配列に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
【０１０５】
また、言い換えると、変異型YggBタンパク質は、上述したコリネ型細菌のYggBタンパク質において、後述する「特定の変異」を有し、且つ、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに保存的変異を含むバリアントであってよい。
【０１０６】
具体的には、例えば、変異型YggBタンパク質は、配列番号９、１１、１３、または１５に示すアミノ酸配列において、後述する「特定の変異」を有し、且つ、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
【０１０７】
変異型yggB遺伝子は、上記のような変異型YggBタンパク質をコードする限り、特に制限されない。
【０１０８】
以下、変異型yggB遺伝子が有する「特定の変異」について説明する。
【０１０９】
「特定の変異」は、上述したような野生型YggBタンパク質のアミノ酸配列を変化させ、細菌のプリン系物質生産能を向上させる変異であれば、特に制限されない。「細菌のプリン系物質生産能を向上させる」とは、変異型yggB遺伝子を保持するよう改変されたエシェリヒア属細菌、バチルス属細菌、またはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスが、非改変株よりも多い量のプリン系物質を生産できることをいう。「非改変株」とは、変異型yggB遺伝子を保持しない対照株をいい、例えば、野生株または親株であってよい。「非改変株よりも多い量のプリン系物質を生産する」とは、プリン系物質の生産量が非改変株と比較して増大する限り特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、１．０５倍以上、好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、特に好ましくは１．３倍以上の量のプリン系物質を生産することであってよい。
【０１１０】
ある変異が細菌のプリン系物質生産能を向上させる変異であるかどうかは、例えば、エシェリヒア属、バチルス属、またはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスに属する菌株を基に当該変異を有するYggBタンパク質をコードする遺伝子を保持するよう改変された株を作製し、該改変株を培地で培養した際に生産されるプリン系物質の量を定量し、改変前の株（非改変株）を培地で培養した際に生産されるプリン系物質の量と比較することで確認することができる。
【０１１１】
「特定の変異」として、具体的には、例えば、以下のような変異が挙げられる（特開2007-097573）。
【０１１２】
（１）C末端側変異
C末端側変異は、野生型yggB遺伝子中の、野生型YggBタンパク質の419〜533位（配列番号１３においては419〜529位）のアミノ酸残基をコードする領域における変異である。C末端側変異は、同領域中の１またはそれ以上の箇所に導入されてよい。C末端側変異により引き起こされるアミノ酸配列の変化の種類は特に制限されない。C末端側変異は、例えば、アミノ酸残基の置換（ミスセンス変異）、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失、ストップコドンの出現（ナンセンス変異）、フレームシフト変異、またはそれらの組み合わせを引き起こすものであってよい。C末端側変異としては、例えば、インサーションシーケンス（以下、「IS」ともいう）やトランスポゾン等の塩基配列の挿入が好ましい。
【０１１３】
（１−１）塩基配列の挿入
C末端側変異としては、例えば、野生型YggBタンパク質の419位のバリン残基をコードする箇所に塩基配列が挿入される変異（2A-1型変異）が挙げられる。2A-1型変異は、例えば、野生型YggBタンパク質の419〜533位のアミノ酸残基の一部または全部の欠失または置換を引き起こすものであってよい。2A-1型変異を有する変異型yggB遺伝子として、具体的には、例えば、配列番号８の1255位の「G」の次にＩＳが挿入され、元の野生型YggBタンパク質（配列番号９）よりも短い全長423アミノ残基の変異型YggBタンパク質をコードするyggB遺伝子が挙げられる（特開2007-222163）。
【０１１４】
（１−２）プロリンの置換
C末端側変異としては、例えば、野生型YggBタンパク質の419〜533位に存在するプロリン残基を他のアミノ酸に置換する変異も挙げられる。そのようなプロリン残基としては、野生型YggBタンパク質の４２４位、４３７位、４５３位、４５７位、４６２位、469位、484位、489位、497位、515位、529位（配列番号１３においては525位）、および533位（配列番号１３においては529位）のプロリン残基が挙げられる。中でも、424位および／または437位のプロリン残基を他のアミノ酸に置換するのが好ましい。
【０１１５】
「他のアミノ酸」は、プロリン以外の天然型アミノ酸であれば特に制限されない。「他のアミノ酸」としては、Lys、Glu、Thr、Val、Leu、Ile、Ser、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、Met、Phe、Trp、Tyr、Gly、Ala、Hisが挙げられる。
【０１１６】
例えば、424位のプロリン残基は、好ましくは疎水性アミノ酸（Ala、Gly、Val、Leu、またはIle）に置換されてよく、より好ましくは分岐鎖アミノ酸（Leu、Val、またはIle）に置換されてよい。424位のプロリン残基をロイシンに置換する変異としては、配列番号１４の1271位の「C」を「T」に置換する変異（66型変異）が挙げられる。
【０１１７】
また、例えば、437位のプロリン残基は、好ましくは側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（Thr、Ser、またはTyr）に置換されてよく、より好ましくはSerに置換されてよい。437位のプロリン残基をSerに置換する変異としては、配列番号８の1309位の「C」を「T」に置換する変異（22型変異）が挙げられる。22型変異は、例えば、配列番号８の1624位の「C」を「T」に置換する変異を伴ってもよい。
【０１１８】
（２）膜貫通領域の変異
YggBタンパク質は、５個の膜貫通領域を有していると推測される。膜貫通領域はそれぞれ、野生型YggBタンパク質の1〜23位（第１膜貫通領域）、25〜47位（第２膜貫通領域）、62〜84位（第３膜貫通領域）、86〜108位（第４膜貫通領域）、110〜132位（第５膜貫通領域）のアミノ酸残基に相当する。膜貫通領域の変異は、野生型yggB遺伝子中の、これら膜貫通領域をコードする領域における変異である。膜貫通領域の変異は、同領域中の１またはそれ以上の箇所に導入されてよい。膜貫通領域の変異は、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入、又は逆位を引き起こすものであって、且つ、フレームシフト変異およびナンセンス変異を伴わないものが好ましい。「１若しくは数個」とは、好ま
しくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【０１１９】
（２−１）第１膜貫通領域の変異
第１膜貫通領域の変異としては、例えば、野生型YggBタンパク質の14位のロイシン残基と15位のトリプトファン残基との間に１又は数個のアミノ酸が挿入される変異が挙げられる。１又は数個のアミノ酸としては、例えば、Cys-Ser-Leuが挙げられる。このような変異を有する変異型yggB遺伝子として、具体的には、例えば、配列番号８の44位の「G」の次にTTCATTGTGが挿入されたyggB遺伝子（A1型変異）が挙げられる。この変異型yggB遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードする変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号６および７に示す。
【０１２０】
（２−２）第４膜貫通領域の変異
第４膜貫通領域の変異としては、例えば、野生型YggBタンパク質の100位のアラニン残基を他のアミノ酸に置換する変異が挙げられる。「他のアミノ酸」は、アラニン以外の天然型アミノ酸であれば特に制限されない。「他のアミノ酸」としては、Lys、Glu、Thr、Val、Leu、Ile、Ser、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、Met、Phe、Trp、Tyr、Gly、His、Proが挙げられる。100位のアラニン残基は、好ましくは側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（Thr、Ser、またはTyr）に置換されてよく、より好ましくはThrに置換されてよい。このような変異を有する変異型yggB遺伝子として、具体的には、例えば、配列番号８の298位の「G」が「A」に置換されたyggB遺伝子（19型変異）が挙げられる。
【０１２１】
（２−３）第５膜貫通領域の変異
第５膜貫通領域の変異としては、例えば、野生型YggBタンパク質の111位のアラニン残基を他のアミノ酸に置換する変異が挙げられる。「他のアミノ酸」は、アラニン以外の天然型アミノ酸であれば特に制限されない。「他のアミノ酸」としては、Lys、Glu、Thr、Val、Leu、Ile、Ser、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、Met、Phe、Trp、Tyr、Gly、His、Proが挙げられる。111位のアラニン残基は、好ましくは側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（Thr、Ser、またはTyr）に置換されてよく、より好ましくはThrに置換されてよい。このような変異を有する変異型yggB遺伝子として、具体的には、例えば、配列番号８の332位の「C」が「T」に置換されたyggB遺伝子（L30型変異）や配列番号１２の331位の「G」が「A」に置換されたyggB遺伝子（8型変異）が挙げられる。変異型yggB遺伝子（L30型変異）の塩基配列および同遺伝子がコードする変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４および５に示す。
【０１２２】
本発明において、「野生型YggBタンパク質のＸ位のアミノ酸残基」とは、特記しない限り、配列番号９におけるＸ位に相当するアミノ酸残基を意味する。なお、アミノ酸配列における「Ｘ位」とは、同アミノ酸配列のN末端からＸ番目を意味し、N末端のアミノ酸残基が１位のアミノ酸残基である。すなわち、上記アミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、または付加などによってその位置は前後することがある。例えば、「野生型YggBタンパク質の419位のアミノ酸残基」とは、配列番号９における419位に相当するアミノ酸残基を意味し、419位よりもN末端側の１アミノ酸残基が欠失している場合は、N末端から418番目のアミノ酸残基が「野生型YggBタンパク質の419位のアミノ酸残基」であるものとする。また、419位よりもN末端側に１アミノ酸残基挿入されている場合は、N末端から420番目のアミノ酸残基が「野生型YggBタンパク質の419位のアミノ酸残基」であるものとする。
【０１２３】
任意のアミノ酸配列において、どのアミノ酸残基が「配列番号９におけるＸ位に相当するアミノ酸残基」であるかは、当該任意のアミノ酸配列と配列番号９のアミノ酸配列とアライメントを行うことにより決定できる。アライメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソ
フトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。
【０１２４】
変異型yggB遺伝子は、野生型yggB遺伝子を上述の「特定の変異」を有するよう改変することにより取得できる。ＤＮＡの改変は公知の手法により行うことができる。具体的には、例えば、ＤＮＡの目的部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T.
A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、変異型yggB遺伝子は、化学合成によっても取得できる。
【０１２５】
以下、変異型yggB遺伝子を有するように細菌を改変する手法について説明する。
【０１２６】
変異型yggB遺伝子を有するように細菌を改変することは、変異型yggB遺伝子を細菌に導入することにより達成できる。また、変異型yggB遺伝子を有するように細菌を改変することは、自然変異や変異原処理により細菌が有するyggB遺伝子に変異を導入することによっても達成できる。
【０１２７】
変異型yggB遺伝子を細菌に導入する手法は特に制限されない。本発明の細菌において、変異型yggB遺伝子は、同細菌で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、yggB遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。例えば、コリネ型細菌のyggB遺伝子のプロモーターを利用してもよい。エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌で機能するプロモーターとして、具体的には、例えば、T7プロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌で機能するプロモーターとして、具体的には、例えば、spacプロモーター、xylプロモーター、glvプロモーター、P43プロモーター、およびP2プロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。本発明の細菌において、変異型yggB遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律増殖するベクター上に存在していてもよく、染色体上に組み込まれていてもよい。本発明の細菌は、変異型yggB遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピー有していてもよい。本発明の細菌は、１種類の変異型yggB遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類の変異型yggB遺伝子を有していてもよい。変異型yggB遺伝子の導入は、例えば、上述した遺伝子のコピー数を増加させる手法と同様に行うことができる。
【０１２８】
本発明の細菌は、野生型yggB遺伝子を有していてもよく、有していなくともよい。なお、yggB遺伝子は、例えば、エシェリヒア・コリにおいてはmscS遺伝子、バチルス・サブチリスにおいてはyfkC遺伝子、とも呼ばれている。
【０１２９】
野生型yggB遺伝子を有さない細菌は、染色体上の野生型yggB遺伝子を破壊することによ
り取得できる。野生型yggB遺伝子の破壊は、例えば、上述した遺伝子を破壊する手法により行うことができる。具体的には、例えば、野生型yggB遺伝子のコード領域の一部または全部を欠損させることにより野生型yggB遺伝子を破壊できる。
【０１３０】
また、染色体上の野生型yggB遺伝子を変異型yggB遺伝子で置換することにより、野生型yggB遺伝子を有さず、且つ、変異型yggB遺伝子を有するように改変された細菌を取得できる。このような遺伝子置換を行う方法としては、例えば、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【０１３１】
＜２＞プリン系物質の製造法
本発明の細菌を利用して、プリン系物質を発酵生産することができる。すなわち、本発明は、本発明の細菌を培地で培養し培地にプリン系物質を蓄積すること、および該培地より該プリン系物質を回収すること、を含むプリン系物質の製造法を提供する。本発明においては、１種のプリン系物質が製造されてもよく、２種またはそれ以上のプリン系物質が製造されてもよい。本発明においては、例えば、１種またはそれ以上のプリンヌクレオシドが製造されてもよい。本発明においては、例えば、１種またはそれ以上のプリンヌクレオチドが製造されてもよい。
【０１３２】
使用する培地は、本発明の細菌が増殖でき、目的のプリン系物質が生産される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、細菌の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、使用する細菌の種類や製造するプリン系物質の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【０１３３】
炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類、グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
【０１３４】
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
【０１３５】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
【０１３６】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いても
よい。
【０１３７】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【０１３８】
また、生育に核酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。例えば、サクシニル−ＡＭＰシンターゼ遺伝子（purA）の欠損株等のアデニン要求性変異株の培養には、アデニンやそれを含有する有機成分を用いることができる。
【０１３９】
培養条件は、本発明の細菌が増殖でき、目的のプリン系物質が生産される限り、特に制限されない。培養は、例えば、細菌の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。培養条件は、使用する細菌の種類や製造するプリン系物質の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【０１４０】
培養は、液体培地を用いて好気的に行うことができる。培養は、具体的には、通気培養または振盪培養で行うことができる。培養温度は、例えば、２０〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃であってよい。培地のｐＨは、例えば、５〜８に調整されてよい。ｐＨ調整には、無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、またはアンモニアガス等を使用することができる。培養期間は、例えば、１５時間〜９０時間であってよい。培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。また、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。このような条件下で本発明の細菌を培養することにより、培地中にプリン系物質が蓄積する。
【０１４１】
プリン系物質が生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
【０１４２】
生成したプリン系物質の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、および晶析法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。回収されるプリン系物質は、プリン系物質以外に、細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。プリン系物質は、所望の程度に精製されていてよい。プリン系物質の純度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。
【０１４３】
＜３＞プリンヌクレオチドの製造法
本発明の細菌によりプリンヌクレオシドが生産される場合、該プリンヌクレオシドを利用して、プリンヌクレオチドを製造することができる。すなわち、本発明は、プリンヌクレオシド生産能を有する本発明の細菌を培地で培養し培地にプリンヌクレオシドを蓄積すること、該プリンヌクレオシドをリン酸化しプリンヌクレオチドを生成すること、および
該プリンヌクレオチドを回収すること、を含むプリンヌクレオチドの製造法を提供する。
【０１４４】
プリンヌクレオチドとしては、プリンヌクレオシドの５’−リン酸エステルが挙げられる。プリンヌクレオシドの５’−リン酸エステルとしては、イノシン酸（イノシン−５’−リン酸エステル；ＩＭＰ）、グアニル酸（グアノシン−５’−リン酸エステル；ＧＭＰ）、キサンチル酸（キサントシン−５’−リン酸エステル；ＸＭＰ）、およびアデニル酸（アデノシン−５’−リン酸エステル；ＡＭＰ）が挙げられる。この方法においては、使用するプリンヌクレオシドに対応するプリンヌクレオチドが生成する。すなわち、例えば、イノシンからはイノシン酸を、グアノシンからはグアニル酸を、キサントシンからはキサンチル酸を、アデノシンからはアデニル酸を、それぞれ製造できる。本発明においては、１種のプリンヌクレオチドが製造されてもよく、２種またはそれ以上のプリンヌクレオチドが製造されてもよい。
【０１４５】
プリンヌクレオシドは、培地に含まれたままリン酸化に供してもよく、培地から回収してからリン酸化に供してもよい。また、プリンヌクレオシドは、適宜前処理を行ってからリン酸化に供してもよい。前処理としては、例えば、精製、希釈、濃縮、結晶化、乾燥、破砕、溶解等が挙げられる。これらの前処理は、適宜組み合わせて行ってもよい。例えば、プリンヌクレオシドを含有する培養液をそのまま、あるいは所望の程度に精製して、リン酸化に供してよい。
【０１４６】
プリンヌクレオシドをリン酸化する手法は特に制限されない。リン酸化は、例えば、公知の手法により行うことができる。
【０１４７】
リン酸化は、例えば、化学的に行うことができる。化学的リン酸化は、塩化ホスホリル（POCl3）等のリン酸化剤を使用して行うことができる（Yoshikawa et. al., Studies of
phosphorylation, III, Selective phosphorylation of unprotected nucleosides, Bull. Chem. Soc. Jpn., 1969, 42: 3505-3508）。
【０１４８】
リン酸化は、例えば、微生物または酵素を利用して行うことができる。すなわち、プリンヌクレオシドおよびリン酸供与体に、ヌクレオシド−５'−リン酸エステルを生成する能力を有する微生物を作用させることにより、プリンヌクレオチドを生成することができる（特開平07-231793）。また、プリンヌクレオシドおよびリン酸供与体に、リン酸化酵素を作用させることにより、プリンヌクレオチドを生成することができる。
【０１４９】
ヌクレオシド−５'−リン酸エステルを生成する能力を有する微生物として、具体的には、例えば、以下のようなものが挙げられる（特開平07-231793）。
エシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae）JCM 1650
セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）ATCC 33105
クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）IFO 14939（ATCC 33531）
クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）IFO 3318（ATCC 8724）
クレブシエラ・テリゲナ（Klebsiella terrigena）IFO 14941（ATCC 33257）
モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）IFO 3168
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）IFO 12010
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）IFO 13534（ATCC 13048）
クロモバクテリウム・フラビアタイル（Chromobacterium fluviatile）IAM 13652
クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）IFO 12614
セデシア・ラパゲイ（Cedecea lapagei）JCM 1684
セデシア・ダビシエ（Cedecea davisiae）JCM 1685
セデシア・ネテリ（Cedecea neteri）JCM 5909
【０１５０】
リン酸化酵素としては、例えば、ホスファターゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ヌクレオシドホスホトランスフェラーゼが挙げられる。リン酸化酵素は、精製されたものであってもよく、そうでなくてもよい。例えば、リン酸化酵素を生産する微生物の培養物、該培養物から分離した培養上清、該培養物から分離した菌体、該微生物の菌体処理物、それらの部分精製物、等のリン酸化酵素を含有する画分をリン酸化酵素として利用してもよい。
【０１５１】
ヌクレオシドキナーゼとしては、例えば、イノシングアノシンキナーゼが挙げられる。イノシングアノシンキナーゼを利用する方法として、具体的には、例えば、エシェリヒア・コリのイノシングアノシンキナーゼをコードする遺伝子を導入したエシェリヒア属細菌を用いるプリンヌクレオチドの製造法（WO91/08286）や、エキシグオバクテリウム・アセチリカムのイノシングアノシンキナーゼをコードする遺伝子を導入したコリネバクテリウム・アンモニアゲネスを用いたプリンヌクレオチドの製造法（WO96/30501）が挙げられる。
【０１５２】
ホスファターゼとしては、例えば、酸性ホスファターゼが挙げられる。酸性ホスファターゼとしては、例えば、特開2002-000289に開示されているものが挙げられる。また、好ましい酸性ホスファターゼとしては、例えば、ヌクレオシドに対する親和性が上昇した変異型酸性ホスファターゼ（特開平10-201481）、ヌクレオチダーゼ活性が低下した変異型酸性ホスファターゼ（WO96/37603）、リン酸エステル加水分解活性が低下した変異型酸性ホスファターゼ（特開2001-245676）が挙げられる。
【０１５３】
リン酸供与体としては、例えば、ポリリン酸、フェニルリン酸、アセチルリン酸、カルバミルリン酸、ＡＴＰ、ｄＡＴＰ（デオキシＡＴＰ）が挙げられる。ポリリン酸としては、例えば、ピロリン酸、トリポリリン酸、トリメタリン酸、テトラメタリン酸、ヘキサメタリン酸が挙げられる。リン酸供与体は、いずれもフリー体もしくはその塩、またはそれらの混合物であってよい。塩としては、例えば、ナトリウム塩やカリウム塩が挙げられる。リン酸供与体は、用いる微生物やリン酸化酵素の種類等に応じて適宜選択することができる。また、ＡＴＰやｄＡＴＰをリン酸供与体として用いる場合、それらの再生系を併用することもできる（WO91/08286、WO96/30501）。
【０１５４】
プリンヌクレオチドが生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
【０１５５】
生成したプリンヌクレオチドの回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、および晶析法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。回収されるは、プリンヌクレオチド以外に、リン酸化酵素、リン酸供与体、細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。プリンヌクレオチドは、所望の程度に精製されていてよい。プリンヌクレオチドの純度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。
【実施例】
【０１５６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【０１５７】
実施例：変異型yggB遺伝子導入株を用いたイノシン生産
本実施例では、変異型yggB遺伝子を導入したE. coliのイノシン生産株を用いてイノシン生産を行い、変異型yggB遺伝子がイノシン生産に与える影響について評価した。
【０１５８】
＜１＞E. coli イノシン生産株FADRaddedd/pMWpurFKQ株の構築
E. coli FADRaddedd株（WO99/003988）を親株として、イノシン生産株を構築した。FADRaddedd株は、E. coli W3110株から、purF（アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ）、purA（アデニロサクシネートシンセターゼ）、deoD（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）、purR（プリン合成リプレッサー）、add（アデノシンデアミナーゼ）、edd（ホスホグルコネートデヒドラターゼ）遺伝子を破壊することにより得られた株である。FADRaddedd株に、フィードバック阻害が解除された脱感作型アミドホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする変異型purF遺伝子を導入し発現させることで、高効率にイノシンを産生する株の構築が可能である（WO99/003988）。そこで、FADRaddedd株に、変異型purF遺伝子を発現するプラスミドpMWpurFKQ（欧州特許公開1170370号に記載）をエレクトロポレーション法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197 (1997)）により導入した。得られた形質転換体のうちの一つをFADRaddedd/pMWpurFKQとした。
【０１５９】
＜２＞変異型yggB遺伝子発現プラスミドの構築
コリネ型細菌の変異型yggB遺伝子をエシェリヒア属細菌にて発現させるためのプラスミド、pSTV-yggB(BL2)およびpSTV-yggB(BL3)、を以下の手順で構築した。
【０１６０】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株（Corynebacterium glutamicum ATCC13869）より構築されたyggB遺伝子にL30型変異を有する株およびyggB遺伝子にA1型変異を有する株（特開2007-97573）より、それぞれ染色体ＤＮＡを抽出した。抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１（primer A；5'-gctaagcttctaaggaggtcttggctcatg-3'）および配列番号２（primer B；5'-gtaggatcctgggacacgtctgtaatcagc-3'）に示すプライマーを用いたPCR法（変性98℃-10秒、アニーリング60℃-15秒、伸長反応68℃-78秒、30サイクル、TaKaRa PCR Thermal cycler PERSONAL（タカラバイオ株式会社））により、各変異型yggB遺伝子を含む約1.6 kbのDNA断片を増幅した。PCR反応には、GXL polymerase（タカラバイオ社製）を使用した。なお、プライマーは、変異型yggB遺伝子の翻訳開始コドンより上流のリボソーム結合配列（SD配列）を含む領域を増幅するよう設計した。同プライマーを用いたＰＣＲにより得られるyggB遺伝子とSD配列を含む増幅断片の塩基配列を配列番号３に示す（ただし、同配列に示すyggB遺伝子は野生型である）。各増幅断片を精製した後、両端に形成された制限酵素部位をBam HIおよびHind IIIで消化した。消化した各増幅断片と、同じく制限酵素Bam HIおよびHind IIIで消化した約3.0kbのpSTV29ベクター（タカラバイオ社製）の断片とを、DNA Ligation Kit ver.2.1（タカラバイオ社製）を用いて連結した。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（E.coli JM109 competent cells、タカラバイオ社製）を形質転換し、50 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを、50 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB液体培地に接種し、37℃で一晩振盪培養した。各培養液から、アルカリ−SDS法にてプラスミドDNAを抽出した。制限酵素での消化および塩基配列の決定によりプラスミドの構造を確認して、pSTV-yggB(BL2)およびpSTV-yggB(BL3)を得た。pSTV-yggB(BL2)はL30型変異を有する変異型yggB遺伝子の発現プラスミド、pSTV-yggB(BL3)はA1型変異を有する変異型yggB遺伝子の発現プラスミドである。変異型yggB遺伝子（L30型変異）は、配列番号８の332位の「C」が「T」に置換されたyggB遺伝子であり、配列番号９の111位のアラニン残基がバリンに置換されたYggBタンパク質をコードする。変異型yggB遺伝子（L30型変異）の塩基配列および同遺伝子がコードする変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４および５に示す。変異型yggB遺伝子（A1型変異）は、配列番号８の44位の「G」の次にTTCATTGTGが挿入されたyggB遺伝子であり、配列番号９の14位のロイシン残基と15位のトリプトファン残基との間にCys-Ser-Leuが挿入されたYggBタンパク質をコードする。変異型yggB遺伝子（A1型変異）の塩基配列および同遺伝子がコードする変異型YggBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号６および７に示す。いずれのプラスミドにおいても、pSTV29ベクターが持つlacプロモーターの転写方向に対して、変
異型yggB遺伝子の転写方向が同じ向きになるように同遺伝子が配置されている。
【０１６１】
＜３＞E. coli イノシン生産株FADRaddedd/pMWpurFKQ株へのpSTV-yggB(BL2)およびpSTV-yggB(BL3)の導入
上記のようにして得られたpSTV-yggB(BL2)およびpSTV-yggB(BL3)、ならびに対照としてのpSTV29ベクターを、それぞれ、2×TSS法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2172 (1989)）によりE. coli イノシン生産株FADRaddedd/pMWpurFKQに導入した。得られた形質転換体のうちそれぞれ一つを、FADRaddedd/pMWpurFKQ/pSTV-yggB(BL2)、FADRaddedd/pMWpurFKQ/pSTV-yggB(BL3)、FADRaddedd/pMWpurFKQ/pSTV29とした。
【０１６２】
＜４＞イノシン生産
上記のようにして得られた株を、それぞれ、抗生物質を含むLB培地（トリプトン10 g/L、酵母エキス10 g/L、NaCl 10 g/L、カナマイシン25 mg/L、クロラムフェニコール5 0mg/L）プレート上にまんべんなく塗布し、37℃で一晩培養した。1/6プレート分の菌体を、500 mL容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mLに接種して37℃で24時間培養した（シード培養）。波長660 nmでの吸光度が1.0となるよう、シード培養液の一部を20 mLの新しい発酵培地に加え、37℃でメイン培養を行った。メイン培養開始後3時間おきに24時間目までサンプリングし、培養液中に含まれる残糖量とイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した。結果を表１に示す。対照のpSTV29ベクター保持株と比較して、pSTV-yggB(BL2)導入株およびpSTV-yggB(BL3)導入株において有意なイノシン生産量の向上が認められた。
【０１６３】
[発酵培地組成]
グルコース                                  40 g/L
(NH4)2SO4                                   16 g/L
KH2PO4                                       1 g/L
MgSO4・7H2O                                  1 g/L
FeSO4・7H2O                               0.01 g/L
MnSO4・5H2O                               0.01 g/L
酵母エキス                                   8 g/L
カナマイシン                                25 mg/L
クロラムフェニコール                        50 mg/L
イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド   0.1 M
炭酸カルシウム                              30 g/L
【０１６４】
【表１】
2015029474.tif 000002
【０１６５】
〔配列表の説明〕
配列番号１、２：プライマー
配列番号３：yggB遺伝子とSD配列を含む断片の塩基配列
配列番号４：Corynebacterium glutamicum 2256（ATCC13869）の変異型yggB遺伝子（BL2）の塩基配列
配列番号５：Corynebacterium glutamicum 2256（ATCC13869）の変異型yggB遺伝子（BL2）がコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６：Corynebacterium glutamicum 2256（ATCC13869）の変異型yggB遺伝子（BL3）の塩基配列
配列番号７：Corynebacterium glutamicum 2256（ATCC13869）の変異型yggB遺伝子（BL3）がコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８：Corynebacterium glutamicum 2256（ATCC13869）のyggB遺伝子の塩基配列
配列番号９：Corynebacterium glutamicum 2256（ATCC13869）のYggBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のyggB遺伝子の塩基配列
配列番号１１：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のYggBタンパク質のアミノ酸配列配列番号１２：Corynebacterium glutamicum ATCC14967のyggB遺伝子の塩基配列
配列番号１３：Corynebacterium glutamicum ATCC14967のYggBタンパク質のアミノ酸配列配列番号１４：Corynebacterium melassecola ATCC17965のyggB遺伝子の塩基配列
配列番号１５：Corynebacterium melassecola ATCC17965のYggBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１６：コリネ型細菌の野生型YggBタンパク質の保存配列
【配列表】
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