(57)【要約】【課題】皮膚に塗布した皮膚外用組成物の塗膜を、角質層ごと採取し観察できる方法を提供する。【解決手段】下記（１）〜（４）の工程を有する、塗膜観察方法。（１）透孔を設けた基材と該基材の皮膚接合面側に形成された粘着部とを有する支持体を、皮膚表面に貼着する工程（２）貼着した支持体の透孔部に、支持体の非皮膚接合面側から皮膚外用組成物を塗布する工程（３）支持体を皮膚から剥離して、支持体とともに支持体に接合した角質層及び該角質層上に塗布された皮膚外用組成物の塗膜を採取する工程（４）採取された角質層上の塗膜を観察する工程【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（４）の工程を有する、塗膜観察方法。
（１）透孔を設けた基材と該基材の皮膚接合面側に形成された粘着部とを有する支持体を、皮膚表面に貼着する工程
（２）貼着した支持体の透孔部に、支持体の非皮膚接合面側から皮膚外用組成物を塗布する工程
（３）支持体を皮膚から剥離して、支持体とともに支持体に接合した角質層及び該角質層上に塗布された皮膚外用組成物の塗膜を採取する工程
（４）採取された角質層上の塗膜を観察する工程
【請求項２】
生体の皮膚に用いる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記基材の開口率が１０％以上である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記透孔の孔面積が０．８μｍ２以上、６３６２００μｍ２以下である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記基材平面の面積が０．７ｍｍ２以上、８０ｍｍ２以下である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記皮膚外用組成物が化粧料である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記工程（４）において、採取された角質層及び塗膜を支持体とともに凍結割断して、塗膜の断面を観察する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記工程（４）の観察をＸ線回折法により行う、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記工程（４）の観察を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により行う、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
下記（１）〜（３）及び（５）の工程を有する、角質層の観察方法。
（１）透孔を設けた基材と該基材の皮膚接合面側に形成された粘着部とを有する支持体を、皮膚表面に貼着する工程
（２）貼着した支持体の透孔部に、支持体の非皮膚接合面側から皮膚外用組成物を塗布する工程
（３）支持体を皮膚から剥離して、支持体とともに支持体に接合した角質層及び該角質層上に塗布された皮膚外用組成物の塗膜を採取する工程
（５）採取された角質層を観察する工程
【請求項１１】
下記（１）〜（３）の工程を有する、塗膜観察用試料の調製方法。
（１）透孔を設けた基材と該基材の皮膚接合面側に形成された粘着部とを有する支持体を、皮膚表面に貼着する工程
（２）貼着した支持体の透孔部に、支持体の非皮膚接合面側から皮膚外用組成物を塗布する工程
（３）支持体を皮膚から剥離して、支持体とともに支持体に接合した角質層及び該角質層上に塗布された皮膚外用組成物の塗膜を採取する工程
【請求項１２】
下記（１）〜（３）の工程を有する、角質層観察用試料の調製方法。
（１）透孔を設けた基材と該基材の皮膚接合面側に形成された粘着部とを有する支持体を、皮膚表面に貼着する工程
（２）貼着した支持体の透孔部に、支持体の非皮膚接合面側から皮膚外用組成物を塗布する工程
（３）支持体を皮膚から剥離して、支持体とともに支持体に接合した角質層及び該角質層上に塗布された皮膚外用組成物の塗膜を採取する工程
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の観察方法により得られた観察結果に基づいて、皮膚外用組成物の性能を評価する、皮膚外用組成物の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚表面に塗布した皮膚外用組成物の塗膜観察方法に関する。また、本発明は、皮膚外用組成物を塗布した表皮角質層の観察方法に関する。さらに、本発明は、当該方法に用いる観察用試料の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化粧品の使用感や効果の持続性は、消費者が化粧品を購入する際の重要なファクターとなる。化粧品開発において、この使用感等の評価は、主に官能評価により行われている。しかし、官能評価は、ヒトが実際に製品を使用して評価する方法であるため、評価に時間がかかり効率的でないこと、結果には評価者の主観が入るため、客観的且つ一般的な評価結果を得ることが難しいこと、等の問題がある。
【０００３】
官能評価によらない客観的な化粧料の評価方法としては、例えば、ヒトが化粧料を使用し、使用者の皮膚上で化粧料の状態を観察したり、物性を測定することが行われている。しかし、この方法は人体上で行われるため、人体への影響を考慮して観察態様や測定機器が制限される。特に、ミクロなレベルでの形態観察は難しい。
一方、採取した皮膚や化粧料を用いた方法、代替皮膚を用いた方法も提案されている。化粧料は皮膚の最上層である角質層（角層）に対して使用されるが、この角質層の状態を調べる方法として、例えば、非特許文献１や特許文献１がある。非特許文献１には、網目状グリッドを用いて角層細胞を採取し、細胞間脂質の構造解析を行うことが記載されている。特許文献１には、角層細胞の弾性率等の物性を測定する方法が提案されている。
また、化粧料の状態を調べる方法として、例えば、特許文献２には、口紅等の化粧料を植物の葉に塗布し、これを凍結割断して化粧料膜の断面を観察する方法が提案されている。また、人工皮膚や剥離した皮膚（豚皮など）の表面に化粧料を塗布して、顕微鏡により塗布膜の状態を観察することも行われている。
また、ヒト皮膚上に化粧料を塗布した後、これを採取し解析する方法として、非特許文献２がある。この方法は、皮膚上に塗布した化粧膜にレプリカ剤を滴下して硬化させた後、一定時間経過後に該レプリカ剤と化粧塗膜を皮膚から剥離して、顕微鏡によって塗膜を観察するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−９３１４４号公報
【特許文献２】特開２００５−８４００５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】G.  S.  K.  Pilgram  et  al.，  Journal  of  Microscopy，Vol.189(1)，  p.71-78，  January  1998
【非特許文献２】田中健一ほか、化粧塗膜の微視的評価法の確立と製剤開発への応用、第５１回ＳＣＣＪ研究討論会講演要旨集、日本化粧品技術者会、2002年11月19日、p.21-24
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
化粧料の使用感や効果の持続性を適切に評価するためには、使用時の状態をできるだけ維持・再現したまま、化粧料や皮膚サンプルを採取することが望まれる。そのためには、化粧料を適用する角質層を含めて化粧料塗膜を採取し観察できること、採取された試料が使用時の状態から変形や変質していないこと、化粧料塗布後の経時的な観察ができること、が好ましい。
上記非特許文献１や特許文献１は、皮膚上の化粧料を分析する方法ではない。また、上記特許文献２の方法や剥離した皮膚を用いる方法では、化粧料塗布時の状態はある程度評価できるものの、経時的な変化まで評価することは難しい。実際の化粧料はヒトの皮膚上に塗布して使用されるため、体温による塗膜の流動や皮膚表面からの水分蒸散等の影響を受け、時間の経過とともにその性状が変化するものである。また、上記非特許文献２の方法は、塗膜の経時的な変化を観察できるものの、レプリカ剤の滴下又は硬化時に塗膜の構造が変形する可能性がある。また、硬化した化粧料塗膜を皮膚から剥離する際に、剥離面の塗膜構造が破壊される、塗膜の一部が皮膚上に残存してしまい塗膜の全体構造を観察できない、といった問題が生じる。
【０００７】
本発明は、皮膚上に塗布された化粧料等の皮膚外用組成物の塗膜を、現実の使用時に極めて近い状態で観察できる方法を提供することを課題とする。具体的には、皮膚に塗布した該組成物の塗膜を、変形や変質させることなく、表皮の角質層ごと採取し観察できる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は上記課題に鑑み、皮膚外用組成物が皮膚上に塗布された状態を保ったまま皮膚角質層ごと採取し、観察する方法について鋭意検討を行った。
その結果、透孔を有する基材の片面に粘着部を設けた支持体を皮膚に貼着し、支持体の上から皮膚外用組成物を塗布することで、支持体の透孔下の皮膚に該組成物を直接塗布できること、塗布後に支持体を皮膚から剥離すると、支持体の粘着部の作用で支持体下の角質層が一緒に剥離し、剥離した角質層上に塗布された皮膚外用組成物の塗膜も一緒に採取できることを見出した。これにより、角質層との境界面の塗膜を損なうことなく、塗膜全体を採取することができた。本発明はこの知見に基づき完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記（１）〜（４）の工程を有する、塗膜観察方法に関する。
（１）透孔を設けた基材と該基材の皮膚接合面側に形成された粘着部とを有する支持体を、皮膚表面に貼着する工程
（２）貼着した支持体の透孔部に、支持体の非皮膚接合面側から皮膚外用組成物を塗布する工程
（３）支持体を皮膚から剥離して、支持体とともに支持体に接合した角質層及び該角質層上に塗布された皮膚外用組成物の塗膜を採取する工程
（４）採取された角質層上の塗膜を観察する工程
【００１０】
また、本発明は、下記（１）〜（３）及び（５）の工程を有する、角質層の観察方法に関する。
（１）透孔を設けた基材と該基材の皮膚接合面側に形成された粘着部とを有する支持体を、皮膚表面に貼着する工程
（２）貼着した支持体の透孔部に、支持体の非皮膚接合面側から皮膚外用組成物を塗布する工程
（３）支持体を皮膚から剥離して、支持体とともに支持体に接合した角質層及び該角質層上に塗布された皮膚外用組成物の塗膜を採取する工程
（５）採取された角質層を観察する工程
【００１１】
また、本発明は、前記（１）〜（３）の工程を有する、塗膜観察用試料の調製方法に関する。
また、本発明は、前記（１）〜（３）の工程を有する、角質層観察用試料の調製方法に関する。
【００１２】
さらに、本発明は、前記観察方法により得られた観察結果に基づいて、皮膚外用組成物の性能を評価する、皮膚外用組成物の評価方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、皮膚上に塗布された皮膚外用組成物の塗膜を、現実の使用時に極めて近い状態で観察できる。また、本発明の方法によれば、塗布された皮膚外用組成物が皮膚上でどのような挙動を示すかを、経時的に観察することができる。さらに、本発明の方法によれば、皮膚外用組成物が塗布された表皮角質層の状態についても観察することができる。これらの方法では、塗膜や角質層の微細構造をサブミクロンレベルで観察することが可能である。
さらに、本発明の方法によれば、現実の使用状態に近い状態を維持したまま、皮膚外用組成物の塗膜又は角質層の観察用試料を調製することができる。
さらに、本発明の方法によれば、上記塗膜又は角質層の観察結果に基づいて、皮膚外用組成物の性能を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に用いられる支持体の一例を模式的に示す図である。（ａ）は支持体を非皮膚接合面からみた平面図を、（ｂ）は支持体のＡ−Ａ断面図である。
【図２】図１の支持体をヒトの皮膚に貼着した状態を模式的に示す図である。
【図３】図２の支持体の上から、皮膚外用組成物を塗布した状態を模式的に示す図である。（ａ）はヒトの腕の内側に支持体を貼着し、その上から皮膚外用組成物を塗布した状態を、（ｂ）は（ａ）において組成物を塗布した後の支持体の断面図を、それぞれ示す。
【図４】図３の支持体を皮膚から剥離した状態を模式的に示す図である。
【図５】支持体の外縁領域と観察領域とを模式的に示す図である。
【図６】実施例で用いた基材透孔の拡大写真である。
【図７】実施例で用いた支持体の、粘着部形成工程の概略を示す図である。（ａ）は基材中心部への粘着剤を塗布する装置図、（ｂ）〜（ｄ）は（ａ）の装置の基材部分の断面図であり、（ｂ）は粘着剤塗布前の状態、（ｃ）は粘着剤塗布直後の状態、（ｄ）は粘着剤を吸引した後の状態をそれぞれ示す。
【図８】実施例で採取した塗膜試料のＸ線回折の結果を示す図である。
【図９】実施例で採取した観察用試料断面の走査型顕微鏡写真である。
【図１０】図９の塗膜部分を拡大した走査型顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の観察用試料の調製方法は、下記（１）〜（３）の工程を有する。
（１）透孔を設けた基材と該基材の皮膚接合面側に形成された粘着部とを有する支持体を、皮膚表面に貼着する工程
（２）貼着した支持体の透孔部に、支持体の非皮膚接合面側から皮膚外用組成物を塗布する工程
（３）支持体を皮膚から剥離して、支持体とともに支持体に接合した角質層及び該角質層上に塗布された皮膚外用組成物の塗膜を採取する工程
当該方法を用いることで、皮膚上に塗布した皮膚外用組成物の塗膜観察用試料、及び皮膚外用組成物が塗布された角質層観察用試料を調製することができる。本発明の方法で調製された観察用試料は、角質層を含めて塗膜を採取する方法であるため、角質層との境界面の塗膜を損なうことなく、塗布した塗膜全体を採取することができる。また、採取時に、塗膜に対し化学的或いは物理的な処理を行わないため、塗膜の変質や変形を抑えられる。さらに、支持体の粘着部を皮膚に貼着し剥離するという低侵襲な方法であるため、生体（特にヒト）からの試料採取に適している。
【００１６】
本発明の観察方法は、前記（１）〜（３）の工程の後に、下記（４）又は（５）の工程を有する。
（４）採取された角質層上の塗膜を観察する工程、又は
（５）採取された角質層を観察する工程
本発明の観察方法は、本発明の調製方法により得られた観察用試料を用いて観察を行うもので、角質層上の塗膜、角質層（角層細胞や細胞間脂質）、或いはその両方を観察することができる。また、塗膜を塗布した角質層を含めて観察でき、塗膜の変質や変形も少ないため、現実の使用時に極めて近い状態を観察することができる。また、生体に適用できる方法であるため、塗布した組成物が体温や皮膚表面からの水分蒸散等の影響を受け、時間の経過とともにその性状がどのように変化していくかを、経時的に観察することができる。さらに、観察には皮膚から剥離した後の試料を用いるため、人体への安全性に配慮した観察方法や使用機器の制限がなく、断面構造の観察、電子顕微鏡を用いた微細構造の観察が可能である。
【００１７】
本発明の評価方法は、本発明の観察方法により得られた観察結果に基づいて、皮膚外用組成物の性能を評価する。本発明の観察方法では、従来法よりも実使用状態を正確に反映した観察結果が得られるため、より精度の高い評価が可能となる。
以下、図面を適宜引用し、且つ例をもって本発明を詳細に説明する。
【００１８】
１．観察用試料の調製
１−１．基材及び支持体
［支持体］
図１に例示するように、支持体１は、透孔２を設けた基材３と、基材３の皮膚接合面（裏面）側に形成された粘着部４とを有している。
[基材]
基材に設けられる透孔は、図１に示すように複数であってもよいし、単孔であってもよい。また、透孔の平面形状としては、例えば、円形、楕円形、四角形、六角形等が挙げられるが、他の形状であってもよい。
【００１９】
皮膚外用組成物の塗布性及び塗膜や角質層の採取効率の点から、各孔の孔面積は０．８μｍ２以上が好ましく、７０μｍ２以上がより好ましく、３００μｍ２以上がさらに好ましく、７００μｍ２以上がよりさらに好ましく、６３６２００μｍ２以下が好ましく、１９６４００μｍ２以下がより好ましく、４９１００μｍ２以下がさらに好ましく、７９００μｍ２以下がよりさらに好ましい。同様の観点から、孔径は、１μｍ以上が好ましく、１０μｍ以上がより好ましく、２０μｍ以上がさらに好ましく、３０μｍ以上がよりさらに好ましく、９００μｍ以下が好ましく、５００μｍ以下がより好ましく、２５０μｍ以下がさらに好ましく、１００μｍ以下がよりさらに好ましい。
なお、本発明で孔径とは、透孔が円形の場合は直径を、楕円形の場合は長径を、四角形の場合は長辺を、六角形の場合は対辺をいう。
【００２０】
基材の開口率は、支持体の皮膚への貼着性及び塗膜や角質層の採取効率の点から、１０％以上であることが好ましく、２０％以上であることがより好ましく、５０％以上であることがさらに好ましく、９０％以下であることが好ましく、８５％以下であることがより好ましく、８０％以下であることがさらに好ましい。なお、開口率とは、基材平面において、透孔の孔面積の総和が基材平面の面積に占める割合をいう。
基材上の複数の透孔は、一定間隔で規則的に配置されていることが好ましい。この場合、孔と孔の間隔（ピッチ）は、１０μｍ以上が好ましく、２０μｍ以上がより好ましく、３０μｍ以上がさらに好ましく、１０００μｍ以下が好ましく、５００μｍ以下がより好ましく、１００μｍ以下がさらに好ましい。
【００２１】
基材の平面形状として、例えば、円形、楕円形、四角形、六角形等が挙げられるが、他の形状であってもよい。
皮膚への貼着性や皮膚外用組成物の塗布性の点から、基材平面の面積は０．７ｍｍ２以上が好ましく、４ｍｍ２以上がより好ましく、７ｍｍ２以上がさらに好ましく、１９７０ｍｍ２以下が好ましく、３２０ｍｍ２以下がより好ましく、８０ｍｍ２以下がさらに好ましい。同様の観点から、基材の直径は１ｍｍ以上が好ましく、２ｍｍ以上がより好ましく、３ｍｍ以上がさらに好ましく、５０ｍｍ以下が好ましく、２０ｍｍ以下がより好ましく、１０ｍｍ以下がさらに好ましい。ここで、基材の直径とは、基材が円形の場合は直径を、楕円形の場合は長径を、四角形の場合は長辺を、六角形の場合は対辺をいう。
皮膚への貼着性や皮膚外用組成物の塗布性の点から、基材の厚さは、１μｍ以上が好ましく、３μｍ以上がより好ましく、５μｍ以上がさらに好ましく、１００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以下がより好ましく、２０μｍ以下がさらに好ましい。
【００２２】
基材の材質は、採取した塗膜や角質層を生体に近い状態で維持できるよう、伸縮性が小さく、ヒトの皮膚表面の凹凸に適合できるようある程度の柔軟性を有するものが好ましい。また、後から塗布する皮膚外用組成物の皮膚への塗布性を向上させるため、皮膚外用組成物との親和性がよいものが好ましい。例えば、銅、金、白金、アルミニウム、ニッケル、ステンレス、チタン、モリブデン、銅合金、アルミニウム合金などが挙げられる。なかでも、銅、白金、ステンレス、チタン、銅合金、アルミニウム合金が好ましく、銅、白金、ステンレス、チタンがより好ましい。
【００２３】
基材には、皮膚外用組成物との親和性を高めるために、表面処理を施してもよい。表面処理の例としては、上記材質の基剤表面に、例えばロジウム、金、白金などの金属をコーティングする方法が挙げられる。コーティングは、金属の表面コーティングに通常用いられる方法により行うことができ、例えば、蒸着法、スパッタ法、イオンプレーティング法を用いることができる。表面にコーティングされる金属の厚さは、用いる金属の種類に応じて適宜選択することができるが、支持体剥離時にコーティング膜が剥がれない厚さとすることが好ましい。一例として、白金をコーティングする場合、１０ｎｍ程度の厚さとすることが好ましい。
また、基材に不活性ガス下で放電処理を施してもよい。不活性ガスとしては、例えば、アルゴン、クリプトン等の希ガス、窒素などを用いることができる。放電処理の条件は、処理中の圧力が２０Ｐａ以下であることが好ましく、１０Ｐａ以下であることがより好ましい。電圧は１ｋＶ以下であることが好ましく、５００Ｖ以下であることがより好ましい。処理時間は３０秒以下であることが好ましく、２０秒以下であることがより好ましい。
【００２４】
［粘着部］
支持体の粘着部は、基材の皮膚接合面側に形成される。粘着部の作用により、支持体を皮膚へ貼着でき、剥離時には皮膚表面の角質層を支持体に接合したまま採取することができる。
粘着部の厚さは、２０μｍ以下が好ましく、５μｍ以下がより好ましい。
【００２５】
粘着部の形状は、下記の観点から、基材の透孔の少なくとも一部が粘着部により閉塞されていないこと必要であり、透孔をできるだけ閉塞しないよう粘着部を形成することが好ましい。図２に示すように、支持体１は、粘着部４を設けた面（皮膚接合面）を下にして皮膚５に貼着される。このとき、粘着部４は、皮膚５の最表面に存在する角質層６と接合する。支持体貼着後、図３（ａ）に示すように、支持体１の上から（非皮膚接合面側から）皮膚外用組成物７を塗布する。皮膚外用組成物７を塗布した後の、支持体の断面状態は図３（ｂ）のようになる。なお、図３（ｂ）では、支持体１の上部及び周辺部に塗布されている皮膚外用組成物７は省略している。塗布された皮膚外用組成物７は、基材３の透孔２を通って透孔下の皮膚５（角質層６）上に塗布される。このとき、皮膚上での皮膚外用組成物の挙動を観察するためには、透孔２の下に位置する皮膚に直接皮膚外用組成物７が塗布されることが必要である。透孔２の皮膚接合面側が、粘着部４により閉塞されていると、皮膚外用組成物７を透孔内の皮膚上に塗布することができない。
【００２６】
粘着部は、粘着剤を用いて形成することができる。用いる粘着剤は、支持体を皮膚へ貼着した後、剥離できるものであればよい。具体的には、アニオン性樹脂（例えば、酢酸ビニル−クロトン酸共重合体、クロトン酸−酢酸ビニル−ネオデカン酸ビニル共重合体、クロトン酸−酢酸ビニル−プロピオン酸ビニル共重合体、酢酸ビニル−マレイン酸モノブチル−アクリル酸イソボロニル共重合体、アクリル酸オクチルアミド−アクリル酸エステル共重合体、Ｎ−ビニルピロリドン−アクリル酸エステル−（メタ）アクリル酸共重合体、（メタ）アクリル酸−（メタ）アクリル酸エステル共重合体であるアクリル樹脂アルカノールアミン液、アクリル酸エステル−メタクリル酸エステル−ジアセトンアクリルアミド−メタクリル酸共重合体、メチルビニルエーテル−マレイン酸モノアルキル共重合体）、カチオン性樹脂（例えば、ヒドロキシエチルセルロースジメチルジアリルアンモニウムクロリド、塩化Ｏ−［２−ヒドロキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロピル］ヒドロキシエチルセルロース、Ｎ−ビニルピロリドン−メタクリル酸ジメチルアミノエチル共重合体、ビニルイミダゾリウムトリクロリド−Ｎ−ビニルピロリドン共重合体、Ｎ−ビニルピロリドン−メタクリル酸ジメチルアミノエチル共重合体、Ｎ−ビニルピロリドン−アクリル酸アミノアルキル−Ｎ−ビニルカプロラクタム共重合体、Ｎ−ビニルピロリドン−メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド共重合体、Ｎ−アルキルアクリルアミド−アクリル酸−Ｎ−（アルキルアミノ）アルキルアクリルアミド−ポリエチレングリコールメタクリレート共重合体、ポリ塩化ジメチルメチレンピペリジニウム液、ジメチルジアリルアンモニウムクロリド−アクリルアミド共重合体、カチオン化グアーガム等）、ノニオン性樹脂（例えば、ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体、Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル−プロピオン酸ビニル共重合体、Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル−アミノアルキルアクリレート共重合体、酢酸ビニル−Ｎ−ビニル−５−メチル−２−オキサゾリン共重合体、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルホルムアミド、ポリビニルアセトアミド等）、両性樹脂（例えば、アクリル酸オクチルアミド−アクリル酸ヒドロキシプロピル−メタクリル酸ブチルアミノエチル共重合体、Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン−メタクリル酸エステル共重合体、アクリル酸−メタクリル酸−アクリル酸２−ヒドロキシプロピル−メタクリル酸ジメチルアミノエチル−メタクリル酸エチル−ジアセトンアクリルアミド−Ｎ−ビニルピロリドン共重合体及びそのアルカノールアミン液等）等が挙げられる。粘着部には、これらの粘着剤を１種又は２種以上用いることができる。
【００２７】
図３（ｂ）に示すように、粘着部４は塗布された皮膚外用組成物７と接触するため、粘着剤は皮膚外用組成物と親和性の少ないものが好ましい。また、皮膚外用組成物と接して溶解したり、粘着力が低下しないように、皮膚外用組成物に対し安定なものが好ましい。この観点から、粘着剤としてノニオン性樹脂又は両性樹脂が好ましく、両性樹脂がより好ましい。
【００２８】
前述のように、粘着部は基材の透孔をできるだけ塞がないように形成されることが求められる一方、皮膚外用組成物の塗布時にずれたり、剥がれたりしないだけの粘着力も要求される。
両者を実現するためには、上記粘着剤の選択に加え、粘着部の位置に変化をつけることも好ましい。例えば、図５に示すように、基材３を外縁領域８とその内側の観察領域９とにわけ、外縁領域８の皮膚接合面側全体に粘着部を形成し、観察領域９の皮膚接合面側は透孔を塞がないように粘着部を形成することが好ましい。すなわち、外縁領域８では透孔を塞ぐように一様に粘着部が形成されるため、支持体の粘着力を強化することができる。一方、中心の観察領域９では透孔が粘着部により塞がれないため、皮膚上に組成物を直接塗布できる。このような粘着部の塗り分けより、塗膜観察には支障をきたさず、支持体の皮膚への粘着力を上げることができる。
【００２９】
上記観察領域の面積は、基材平面の面積に対して、９０％以下であることが好ましく、８０％以下であることがより好ましく、１０％以上であることが好ましく、２０％以上であることがより好ましい。
また、上記観察領域の孔開口率が、５０％以上１００％以下であることが好ましく、８０％以上１００％以下であることがより好ましい。本発明において、観察領域の孔開口率は下記数式（Ｉ）により算出される。
数式（Ｉ）
観察領域の孔開口率（％）＝（観察領域中の粘着部により塞がれていない透孔の数／観察領域中の全透孔数）×１００
なお、透孔が粘着部により塞がれているか否かは、光学顕微鏡によって観察、測定できる。
【００３０】
１−２．皮膚外用組成物の塗布
［皮膚外用組成物］
皮膚外用組成物は、皮膚に製品を直接接触させて使用しうる形態の製品であれば使用できる。例えば、化粧料、医薬品を含む皮膚外用剤が挙げられる。なお、当該化粧料には、日本の薬事法上、化粧品及び医薬部外品の両方に属するものが含まれる。
本発明で用いる皮膚外用組成物は、化粧料が好ましい。化粧料としては、スキンケア化粧料（例えば、化粧水、乳液、美容液、クリーム、オイル、パック、日焼け止め）、メイクアップ化粧料（例えば、口紅、リップグロス、ファンデーション、コンシーラー）、清浄用化粧料（例えば、洗顔料、クレンジング、ボディシャンプー）、等が挙げられる。
【００３１】
皮膚外用組成物の塗布は、当該組成物を通常使用するのと同様に行うことができ、手で塗っても、専用品（ブラシ、スポンジ等）を用いてもよい。
皮膚外用組成物の塗布量は、用いる組成物の通常の使用量とすることが好ましい。例えば、スキンケア化粧料の場合は、塗布量１ｍｇ／ｃｍ２以上が好ましく、４ｍｇ／ｃｍ２以下が好ましい。メイクアップ化粧料の場合、塗布量０．２ｍｇ／ｃｍ２以上が好ましく、０．６ｍｇ／ｃｍ２以下が好ましい。特に、リキッドファンデーション等では、塗布量０．４ｍｇ／ｃｍ２以上が好ましく、０．６ｍｇ／ｃｍ２以下が好ましい。また、パウダーファンデーション等では、塗布量０．２ｍｇ／ｃｍ２以上が好ましく、０．４ｍｇ／ｃｍ２以下が好ましい。
【００３２】
１−３．塗膜の採取
皮膚外用組成物を塗布した後、皮膚から支持体を剥離する。
塗布から剥離までの時間は、観察目的に応じて適宜選択することができる。例えば、複数の支持体を用いて同時に組成物の塗布を行い、剥離を塗布直後、一定時間経過後と順次行っていくことで、塗膜の皮膚上での経時変化を調べることができる。このような経時観察を行うことで、化粧料の使用感の変化、効果の持続性、化粧崩れ等に関する情報が得られる。
【００３３】
図３及び図４に示すように、支持体１を皮膚５から剥離すると、皮膚５の最表部である角質層６の一部が、支持体１とともに皮膚５から剥離する。この時、粘着部４に接合している角質層６とともに、粘着部が形成されていない透孔２の下に位置する角質層６も剥離される。皮膚の角質層は、角層細胞が１０〜２０層ほど積層されて形成されており、表面から剥がれやすい構造となっている。このため、粘着部４に接合した角質層が剥離する際、粘着部４で囲まれた透孔２の下に位置する角質層６も一緒に剥離することができる。透孔２の下に位置する角質層６の上には、皮膚外用組成物７の塗膜が形成されている。
剥離・採取される角質層の厚さに特に制限はないが、５００ｎｍ以上が好ましい。また、支持体の角質層採取率は、１０％以上１００％以下であることが好ましく、３０％以上１００％以下であることがより好ましい。なお、支持体の角質層採取率は下記数式（ＩＩ）で算出される。
数式（ＩＩ）
角質層採取率（％）＝（支持体皮膚接合面上に採取された角質層の全面積／支持体平面の面積）×１００
【００３４】
２．塗膜及び角質層の観察
採取された皮膚外用組成物の塗膜及び角質層試料の観察方法は特に限定されず、通常の生体試料の観察や分析に用いられる手法を用いることができる。また、本発明の観察方法には、構造や形態観察のみならず、化学的性質の分析や物性の測定なども含まれる。
本発明の方法で採取された観察用試料は、塗膜及び角質層の表面観察、断面観察のいずれにも適し、また構造（形態）観察にも物性測定にも適する。
観察方法として具体的には、光学顕微鏡、透過型電子顕微鏡（TEM）、走査型電子顕微鏡（SEM）、走査型プローブ顕微鏡（SPM）、レーザー共焦点顕微鏡等による形態・構造観察；蛍光Ｘ線やエネルギー分散型Ｘ線分光法（EDX）、波長分散型Ｘ線分光法（WDX）、電子エネルギー損失分光法（Electron  Energy-Loss  Spectroscopy（EELS））による構成元素や電子構造の解析；Ｘ線回折法、電子線回折法等による微細な周期構造（例えば、角質層中の細胞間脂質のラメラ構造、皮膚外用組成物中のラメラ構造など）の解析；等を行うことができる。
中でも、塗膜及び角質層の微細構造まで観察できる点から、ＳＥＭ観察（例えば、クライオ（Cryo）ＳＥＭ、低真空ＳＥＭ）、又はＴＥＭ観察（例えば、クライオ（Cryo）ＴＥＭ）が好ましい。
【００３５】
試料は、観察や分析に適するよう、適宜加工して用いることができる。例えば、顕微鏡観察に適するよう、ミクロトーム等を用いて薄片試料を作成してもよい。また、断面観察を行う場合は、凍結切削法や凍結割断法を用いて断面試料を作成することができる。この場合、塗膜及び角質層試料を支持体ごと液体窒素等で凍結し割断することが好ましい。
以下に、Cryo−SEM及びCryo−TEMを用いた観察例を示すが、他の方法により観察を行なうこともできる。
塗膜及び角質層の断面観察を行う場合、前記工程（３）にて採取した試料を凍結させた後、ナイフで割断し、Cryo-SEM観察を行う。より微細な構造観察を行う場合は、試料凍結後、クライオミクロトームにて切削断面を露出（凍結切削法）させてCryo-SEM観察を行う。さらに微細な構造観察を行う場合は、クライオミクロトームにて切削断面を露出した後、１００ｎｍ以下程度の厚みで超薄切片を作製し、Cryo-TEM観察を行う。
また、塗膜表面の形態観察は、凍結後にCryo-SEM観察、或いは、凍結による変形が大きい場合は、凍結を行わず低真空SEMモードで観察を行う。
元素分析を行う場合は、低真空SEMモード（例えば、真空度５Ｐａ〜１５０Ｐａ程度）を用いることが好ましい。熱による試料のダメージが懸念される場合は、試料を冷却しながら元素分析を行うことが好ましく、Cryo-SEM観察条件で低真空SEMモードを実施することも好ましい。観察用の検出器としては、２次電子用検出器、低真空用２次電子用検出器、反射電子検出器などを適宜選択することができる。
【００３６】
３．皮膚外用組成物の評価
得られた観察、分析データに基づいて、皮膚外用組成物の性能を評価することができる。  例えば、皮膚外用組成物の塗膜中のネットワーク構造、ラメラ構造（板状ラメラ構造、球状ラメラ構造、及びこれらのラメラの比率など）、スポンジ様構造、配合されている無機粒子の粒径分布や分散状態、水相、油相の領域判別、皮膚外用組成物の流動性、水分の保持の状態、などを評価することができる。
また、角質層の状態、例えば、角質細胞の形状、核の有無、細胞間脂質のラメラ構造又は水分の保持状態、毛穴の大きさ等、を観察することにより、皮膚外用組成物の使用による効果を評価することができる。
【００３７】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法を開示する。
【００３８】
＜１＞  下記（１）〜（４）の工程を有する、塗膜観察方法。
（１）透孔を設けた基材と該基材の皮膚接合面側に形成された粘着部とを有する支持体を、皮膚表面に貼着する工程
（２）貼着した支持体の透孔部に、支持体の非皮膚接合面側から皮膚外用組成物を塗布する工程
（３）支持体を皮膚から剥離して、支持体とともに支持体に接合した角質層及び該角質層上に塗布された皮膚外用組成物の塗膜を採取する工程
（４）採取された角質層上の塗膜を観察する工程
【００３９】
＜２＞  生体の皮膚に用いる、＜１＞項記載の方法。
＜３＞  前記基材の開口率が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上であり、９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下である、＜１＞又は＜２＞項記載の方法。
＜４＞  前記透孔の孔面積が０．８μｍ２以上、好ましくは７０μｍ２以上、より好ましくは３００μｍ２以上、さらに好ましくは７００μｍ２以上、６３６２００μｍ２以下、好ましくは１９６４００μｍ２以下、より好ましくは４９１００μｍ２以下、さらに好ましくは７９００μｍ２以下である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の方法。
＜５＞  前記基材平面の面積が０．７ｍｍ２以上、好ましくは４ｍｍ２以上、より好ましくは７ｍｍ２以上、１９７０ｍｍ２以下、好ましくは３２０ｍｍ２以下、より好ましくは８０ｍｍ２以下である、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６＞  前記基材の厚さが１μｍ以上、好ましくは３μｍ以上、より好ましくは５μｍ以上、１００μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下、より好ましくは２０μｍ以下である、＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の方法。
＜７＞  前記皮膚外用組成物が化粧料である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の方法。
【００４０】
＜８＞  前記工程（４）において、採取された角質層及び塗膜を支持体とともに凍結割断して、塗膜の断面を観察する、＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の方法。
＜９＞  前記工程（４）の観察をＸ線回折法により行う、＜１＞〜＜８＞のいずれか１項記載の方法。
＜１０＞  前記工程（４）の観察を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により行う、＜１＞〜＜８＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞  前記ＳＥＭが、低真空ＳＥＭである、＜１０＞項記載の方法。
＜１２＞  前記ＳＥＭが、クライオＳＥＭである、＜１０＞項記載の方法。
【００４１】
＜１３＞  下記（１）〜（３）及び（５）の工程を有する、角質層の観察方法。
（１）透孔を設けた基材と該基材の皮膚接合面側に形成された粘着部とを有する支持体を、皮膚表面に貼着する工程
（２）貼着した支持体の透孔部に、支持体の非皮膚接合面側から皮膚外用組成物を塗布する工程
（３）支持体を皮膚から剥離して、支持体とともに支持体に接合した角質層及び該角質層上に塗布された皮膚外用組成物の塗膜を採取する工程
（５）採取された角質層を観察する工程
【００４２】
＜１４＞  下記（１）〜（３）の工程を有する、塗膜観察用試料の調製方法。
（１）透孔を設けた基材と該基材の皮膚接合面側に形成された粘着部とを有する支持体を、皮膚表面に貼着する工程
（２）貼着した支持体の透孔部に、支持体の非皮膚接合面側から皮膚外用組成物を塗布する工程
（３）支持体を皮膚から剥離して、支持体とともに支持体に接合した角質層及び該角質層上に塗布された皮膚外用組成物の塗膜を採取する工程
＜１５＞  下記（１）〜（３）の工程を有する、角質層観察用試料の調製方法。
（１）透孔を設けた基材と該基材の皮膚接合面側に形成された粘着部とを有する支持体を、皮膚表面に貼着する工程
（２）貼着した支持体の透孔部に、支持体の非皮膚接合面側から皮膚外用組成物を塗布する工程
（３）支持体を皮膚から剥離して、支持体とともに支持体に接合した角質層及び該角質層上に塗布された皮膚外用組成物の塗膜を採取する工程
＜１６＞  請求項１〜１３のいずれか１項記載の観察方法により得られた観察結果に基づいて、皮膚外用組成物の性能を評価する、皮膚外用組成物の評価方法。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４４】
実施例  塗膜観察用試料の調製とその観察
１．支持体の作製
基材として透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察用グリッドＧ６００ＨＨ、Ｇ６００ＴＴ、及びＨ４００（製品名、日新ＥＭ社製）を用いた。各グリッドの形状等を表１に、透孔の形状を図６に示す。
【００４５】
【表１】
2015001476.tif 000003
【００４６】
基材の片面に接着剤を塗布して粘着部を設けた。粘着剤は、接着剤原液（アクリル酸エステル系樹脂、商品名：ポリシック５４２３Ａ、三洋化成社製）を酢酸エチル（関東化学社製）で１０倍希釈したものを使用した。
直径３ｍｍの基材を、外縁領域とその内側の観察領域（直径２ｍｍ）とに分けて、下記に示すように粘着剤の塗り分けを行った。
直径４ｍｍのシリコン板上に直径３ｍｍの基材を載せた。基材の中心上に直径２ｍｍのシリコン板を載せ、基材の観察領域を覆った。直径２ｍｍのシリコン板で隠蔽されていない基材の外縁領域全体に粘着剤を均一に塗布した。酢酸エチルを揮発させた後、基材を取り出した。
次に、図７に示す手順で基材の観察領域に粘着剤を塗布した。外縁領域に粘着剤を塗布した基材３を、２枚のシリコン板１０の間に挟んだ。シリコン板１０は、直径４ｍｍで、中心に直径２ｍｍの穴があいており、基材３の外縁領域が覆われる。シリコン板１０の両端をさらに２本のナイロンチューブ１１及び１２で挟み、シリコン板１０とナイロンチューブ１１、１２がずれないように固定した。ナイロンチューブ１２をシリンジと接続した。シリンジと接続されていないナイロンチューブ１１が上となるようにチューブを垂直に立てた（図７（ａ））。ナイロンチューブ１１の穴の上部から、粘着剤１３を２μＬ滴下し、基材３の観察領域に粘着剤を塗布した（図７（ｃ））。次に、シリンジを引いて基材３の下方から空気１ｍＬを吸引することで、観察領域の透孔部に付着した粘着剤１３を除いた（図７（ｄ））。光学顕微鏡（商品名：ＥＣＬＩＰＳ６００ＰＯＬ（ＮＩＫＯＮ製）、対物レンズ：２０倍、接眼レンズ：１０倍）で測定したところ、基材観察領域の孔開口率は９９％であった。
【００４７】
２．塗膜観察用試料の調製
上記で作製した支持体を用いて、塗膜観察用試料を調製した。
被験者の前腕をハンドソープで洗浄後（ポンプ２回分、洗浄時間３０秒間）、流水で１分間洗い流し、キムタオルで水分をふき取り、採取を行う部屋で１５分間安静にした。
被験者の前腕内側に、支持体の粘着部形成面を貼り付けた後、反対の面から圧力５００ｇ／ｃｍ２で１０秒間押さえた。次いで、貼り付けた支持体の上から皮膚に２ｍｇ／ｃｍ２となるように化粧料Ａ（ソフィーナ  ジェンヌ；花王社製）を塗布した（図３（ａ））。その後、ピンセットで支持体を皮膚から剥がした。
【００４８】
３．Ｘ線回折
本発明の方法では、皮膚外用組成物を凹凸のある支持体の上から塗布するため、通常の使用態様（皮膚に直接塗布する）と比べて、支持体の構造による影響で塗膜が変形することが懸念される。また、支持体を剥離するときに受ける応力などによって、塗膜が変形することも懸念される。そこで、下記によりこの点を検証した。
上記２．で調製した塗膜観察用試料をＸ線回折により観察した。
皮膚から剥がした支持体をＸ線試料台（アルミニウム基板）に載せ、下記に示す条件でＸ線回折を行った（試料Ａ）。比較のため、化粧料ＡをＸ線試料台に直接塗布（塗布量：２ｍｇ／ｃｍ２）し、下記に示す条件でＸ線回折を行った（比較試料Ｂ）。
【００４９】
Ｘ線回折装置・条件
・装置：ＭＸＰ２１（現ブルカー・エイエックス社製）
・Ｘ線源：対向回転陰極Ｃｕ（波長１．５４Å）、電圧４０〜５０ｋＶ、電流５０〜４００ｍＡ
・測定条件：Ｘ線照射面積（２５ｍｍ×２５ｍｍ）
・試料Ａ：Ｘ線出力（２０ｋＷ）、走査速度（０．００７ｄｅｇ／ｍｉｎ）、膜測定時には膜を保持するためアルミニウム基板を用いた。
・試料Ｂ：Ｘ線出力（２ｋＷ）、走査速度（０．１ｄｅｇ／ｍｉｎ）
【００５０】
各試料のＸ線回折の結果を、２θ（０．５度〜３．５度）の範囲で図８に示す。
図８において、比較試料Ｂでは２つの回折ピークが観察され、これらは化粧料Ａ塗膜のラメラ層の間隔を示すものである。
一方、試料Ａでも、比較試料Ｂと同じ位置に２つの回折ピークが観察された。すなわち、支持体を介して化粧料を塗布した場合も、平らな基板上に塗布した場合と同じラメラ間隔が保たれ、ラメラ構造が維持されていることが確認された。このことは、本発明の方法が、観察結果に影響するほどの塗膜の変形を生じさせるものではないことを支持するものである。
【００５１】
４．クライオＳＥＭ（Ｃｒｙｏ−ＳＥＭ）観察
前記２．で調製した塗膜観察用試料の断面観察を、クライオＳＥＭにより行った。クライオＳＥＭ装置、観察条件を下記に示す。
皮膚から剥離した支持体を、速やかに液体窒素中に浸漬させ急速凍結した。液体窒素中で片刃カミソリを冷却した後、支持体の上から片刃カミソリを当て撃力を加えて支持体を割断した。液体窒素中で支持体断面が観察できる方向に試料台に固定した。クライオＳＥＭの試料台の温度が−１２０度以下になっていることを確認し、試料台をクライオＳＥＭに挿入し、氷を昇華させた。その後、温度を低下させ試料台の温度が−１００度以下になったこと確認し、観察した。
クライオＳＥＭの観察像を図９及び１０に示す。なお、図１０は、図９の塗膜部分を拡大した写真である。
【００５２】
クライオＳＥＭ装置・条件
・クライオＳＥＭ：走査型電子顕微鏡Ｓ−４３００ＳＥ／Ｎ（日立製）にクライオシステム（日立製）を装着
観察条件：加速電圧１ｋＶ、Ｇｕｎブライトネス３、昇華条件：温度−８０度５分間
使用検出器：２次電子用検出器
【００５３】
図９に示すように、試料断面には、支持体、剥離した角質層、及びその上に化粧料Ａの塗膜が観察された。さらに、図９の塗膜部分を拡大した図１０に示すように、塗膜には化粧料Ａの特徴的な構造である球晶ラメラや油滴の構造が確認された。
【符号の説明】
【００５４】
１  支持体
２  透孔
３  基材
４  粘着部
５  皮膚
６  角質層
７  皮膚外用組成物
８  外縁領域
９  観察領域
１０  シリコン板
１１、１２  ナイロンチューブ
１３  粘着剤
【図１】
2015001476.tif 000004
【図２】
2015001476.tif 000005
【図４】
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【図７】
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【図８】
2015001476.tif 000008
【図３】
2015001476.tif 000009
【図５】
2015001476.tif 000010
【図６】
2015001476.tif 000011
【図９】
2015001476.tif 000012
【図１０】
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