(57)【要約】【課題】細胞増殖及び分化において細胞毒性を示さず、移植後も長期にわたる観察を可能にするiPS細胞の標識用試薬を開発し、その標識用試薬を用いてiPS細胞を安定かつ効率的に標識する方法を提供することである。【解決手段】モータリン結合性物質及びそれに結合する標識物質を含む人工多能性幹細胞標識用試薬を用いてiPS細胞を標識化する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるエピトープを認識し、該エピトープを含むペプチドを免疫原とする抗モータリン抗体又はその断片。
【請求項２】
前記ペプチドが配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の抗モータリン抗体又はその断片。
【請求項３】
前記抗モータリン抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の抗モータリン抗体又はその断片。
【請求項４】
モータリン結合性物質及びそれに結合する標識物質を含んでなる人工多能性幹細胞標識用試薬。
【請求項５】
前記モータリン結合性物質がモータリン及び／又はその断片に結合する抗モータリン抗体又はモータリン結合アプタマーである、請求項４に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬。
【請求項６】
前記抗モータリン抗体が請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗モータリン抗体である、請求項５に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬。
【請求項７】
二以上の異なる標識物質を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬。
【請求項８】
前記標識物質が蛍光物質、発光物質、及び常磁性体からなる群から選択される、請求項４〜７のいずれか一項に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬。
【請求項９】
前記蛍光物質が、量子ドット、フルオレセイン、ローダミン、FITC、APC、Cye3、Cye5、及びAlexa（登録商標）からなる群から選択される、請求項８に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬。
【請求項１０】
細胞内在化性を有する、請求項４〜９のいずれか一項に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬。
【請求項１１】
人工多能性幹細胞が初代培養細胞由来又は樹立細胞株由来である、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬。
【請求項１２】
請求項４〜１１のいずれか一項に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬を含む人工多能性幹細胞標識用キット。
【請求項１３】
請求項４〜１１のいずれか一項に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬を標識すべき人工多能性幹細胞に接触させる接触工程を含む人工多能性幹細胞標識方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工多能性幹細胞標識用試薬及びそれを用いた人工多能性幹細胞の標識方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工多能性幹細胞（本明細書では、しばしば「iPS細胞」と称する）の発見（非特許文献１及び２）により、それを用いた再生医療の実用化の機運が高まっている。iPS細胞は、胚性幹細胞（ES細胞）と同様に様々な組織や器官への分化が可能な万能細胞であるが、胚性幹細胞と比較して多くの利点を有している。例えば、胚性幹細胞は受精卵から樹立されるため倫理的問題を伴うのに対して、iPS細胞は体細胞からの樹立が可能であるため、そのような問題を生じない。また、胚性幹細胞は主要組織適合抗原（MHC）の相違により移植後に拒絶反応をしばしば生じるのに対して、iPS細胞は移植対象者由来の細胞から樹立されるため拒絶反応もほとんど生じることがない。
【０００３】
一方で、再生医療等におけるiPS細胞の利用は、その多くが未だ基礎研究段階にあり、臨床段階での実用化までには解決しなければ問題が数多く残されている。その1つに、移植後のiPS細胞の生体内における挙動が挙げられる。通常、iPS細胞から分化誘導される組織や器官は、生体外で培養されたものである。それ故、生体移植後のiPS細胞の定着性や安全性については十分に検証されているとは言い難い。そこで、現在ではiPS細胞由来の組織や器官を生体内に移植した後の挙動をモニタリングする重要性が高まっている。
【０００４】
前記問題を解決するために、既存の細胞標識方法を用いた研究が進められている。例えば、iPS細胞をGFPにより標識化して、その蛍光に基づき移植後のiPS細胞由来の組織や器官の挙動をモニタリングする方法が既に実験動物レベルで行われている（非特許文献３）。しかし、従来の細胞標識方法は、継代による減衰が著しく、長期観察に適していない等の問題がある。効率的で安定なiPS細胞の生体内挙動の可視化には、未だ有効な手法は開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Takahashi, K. and Yamanaka, S., 2006, Cell 126:663-676.
【非特許文献２】Takahashi K., et al., 2007, Cell 131, 862-872
【非特許文献３】Lamba D.A. et al., 2010, PLoS One, 5(1):e8763. doi: 10.1371 /journal.pone.0008763.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、細胞増殖及び分化において細胞毒性を示さず、移植後も長期にわたる観察を可能にするiPS細胞の標識用試薬を開発し、提供することである。
【０００７】
また、その標識用試薬を用いてiPS細胞を安定的かつ効率的に標識する方法を提供し、それによって生体移植後のiPS細胞の長期にわたるモニタリングを可能とすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、以前からモータリンの発現量の増加と発癌との関連性について研究をしていた。モータリンは、Hsp70ファミリーに属する熱非応答性タンパク質で、ヒトではマウスモータリン2（Wadha et al., J. Biol. Chem., 1993, 268: 22239−22242）と95％の相同性を有するモータリン（ヒトモータリン2）のみが同定されている。モータリン2は、カルシウム依存的な自己リン酸化を経て、細胞内の様々な場所で様々な分子と結合し、ミトコンドリアの輸送、細胞内輸送、シャペロニン機能、ストレス応答、腫瘍形成等の多岐にわたる関与が指摘されている（Sunil.C.Kaul, Renu Wadhwa ed. Mortalin Biology: Life, Stress and Death, Springer 2012）。
【０００９】
上記研究の過程で、本発明者らは、癌細胞に対して内在化（internalize；細胞内侵入性）機能を有する抗モータリン抗体を見出した。抗モータリン抗体は、癌細胞膜表面に高発現しているモータリンに結合することで細胞内に内在化される。このような抗モータリン抗体は、それ自身が抗体医薬として使用可能であり、さらに、免疫毒（イムノトキシン）等を腫瘍細胞に輸送する薬剤キャリアとしての使用も可能である。そこで、本発明者らは、以前に抗モータリン抗体、当該抗体を用いた癌治療用医薬組成物及び薬剤キャリア等に関する特許出願を行った（国際公開第WO2006／022344号；特開2006−89471号）。
【００１０】
また、本発明者らは、抗モータリン抗体を量子ドットとコンジュゲート化させることで、癌化細胞株のイメージングに利用可能となることを見出した（Kaul et al., Biochem. Cell Biol., 2007, 85(1):133-40）。さらに、本発明者らは、内在化機能を有するモータリン結合性物質を用いて間葉系幹細胞未分化細胞を効率よく安定に標識する方法を開発した（特開2010-117350号）。また、本発明者らは、量子ドットを担持する抗モータリン抗体が生体外、生体内の増殖、及び分化過程において毒性を呈しないことが明らにした（植村 壽公ら、第10回日本再生医療学会総会、「量子ドットの間葉系幹細胞への高効率導入法と再生医療への応用−骨・軟骨再生とリスク評価−」予稿集：再生医療増刊号、2011, vol. 10 suppl.第10回日本再生医療学会総会プログラム・抄録、p257）。
【００１１】
今回、上記課題を解決するために、本発明者らは、モータリン結合性物質を用いてiPS細胞の標識を試みた。上記抗モータリン抗体と量子ドットとをコンジュゲートし、抗モータリン抗体の内在化機能を利用してiPS細胞を標識化したところ、量子ドットを担持する抗モータリン抗体が極めて効率よくiPS細胞内に導入され、継代による減衰も少ないことが明らかとなり、iPS細胞の長期にわたる安定的な観察が可能となることを見出した。本発明は、当該知見に基づくものであって以下を提供する。
【００１２】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるエピトープを認識し、該エピトープを含むペプチドを免疫原とする抗モータリン抗体又はその断片。
（２）前記ペプチドが配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる、（１）に記載の抗モータリン抗体又はその断片。
（３）前記抗モータリン抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、（１）又は（２）に記載の抗モータリン抗体又はその断片。
（４）モータリン結合性物質及びそれに結合する標識物質を含んでなる人工多能性幹細胞標識用試薬。
（５）前記モータリン結合性物質がモータリン及び／又はその断片に結合する抗モータリン抗体又はモータリン結合アプタマーである、（４）に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬。
（６）前記抗モータリン抗体が（１）〜（３）のいずれかに記載の抗モータリン抗体である、（５）に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬。
（７）二以上の異なる標識物質を含む、（４）〜（６）のいずれかに記載の人工多能性幹細胞標識用試薬。
（８）前記標識物質が蛍光物質、発光物質、及び常磁性体からなる群から選択される、（４）〜（７）のいずれかに記載の人工多能性幹細胞標識用試薬。
（９）前記蛍光物質が、量子ドット、フルオレセイン、ローダミン、FITC、APC、Cye3、Cye5、Alexa（登録商標）、R-PE、FAM、HEX、VIC及びTAMRAからなる群から選択される、（８）に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬。
（１０）細胞内在化性を有する、（４）〜（９）のいずれかに記載の人工多能性幹細胞標識用試薬。
（１１）人工多能性幹細胞が初代培養細胞由来又は樹立細胞株由来である、（４）〜（１０）のいずれかに記載の人工多能性幹細胞標識用試薬。
（１２）（４）〜（１１）のいずれかに記載の人工多能性幹細胞標識用試薬を含む人工多能性幹細胞標識用キット。
（１３）（４）〜（１１）のいずれかに記載の人工多能性幹細胞標識用試薬を標識すべき人工多能性幹細胞に接触させる接触工程を含む人工多能性幹細胞標識方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の人工多能性幹細胞標識用試薬によれば、iPS細胞を安定的かつ効率的に標識することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の人工多能性幹細胞標識方法によって標識したMRC-5由来のiPS細胞を示す。免疫染色の反応時間0、6、18、24時間で細胞を観察した。上段は位相差観察像、下段は上段の量子ドットQdot（登録商標）655の蛍光観察像である。
【図２】図１と同じ方法で独立に行った実験結果を示す。免疫染色の反応時間0、6、8、12、18、21、24時間で観察した。１段及び3段は位相差観察像、2段及び4段は、それぞれ１段及び3段の量子ドットQdot（登録商標）655の蛍光観察像である。
【図３】実施例２で作製したマウス抗ヒトモータリン抗体のモータリンに対する免疫反応性を示すウエスタンブトッティングである。ここで使用されたマウス抗ヒトモータリン抗体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるエピトープを含む配列番号３で表されるペプチドを免疫原として得られたものである。Uはヒト骨肉腫（U2OS)細胞上清、Tはヒト正常線維芽細胞（TIG-3)上清中を示す。S1-1、S1-3、S1-7、S1-8、S70-2、S70-5、S70-6、及びS70-10は、新たに得られたハイブリドーマ由来のマウス抗ヒトモータリン抗体である。
【図４】実施例２で作製したマウス抗ヒトモータリン抗体によるヒト骨肉腫（U2OS)細胞の免疫染色結果を示す。
【図５】実施例２で作製したハイブリドーマ由来のマウス抗ヒトモータリン抗体（S1-1、S1-3、S1-7、S1-8、S70-2、S70-5、S70-6、及びS70-10）と既知抗ヒトモータリン抗体（37-6）による細胞内在化能を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．人工多能性幹細胞標識用試薬
本発明の第１の態様は、人工多能性幹細胞標識用試薬に関する。本発明の試薬は、iPS細胞を安定かつ効率的に標識することができる。
【００１６】
１−１．定義
本発明の人工多能性幹細胞標識試薬は、人工多能性幹細胞を標識するための試薬であって、モータリン結合性物質及びそれに結合する標識物質を含む。
【００１７】
本明細書に記載の人工多能性幹細胞（iPS細胞：induced pluripotent stem cells）とは、分化した体細胞に少数の遺伝子を導入することによって様々な組織や器官の細胞へのリプログラミングが可能となった細胞をいう。
【００１８】
本発明において標識対象となるiPS細胞は、適当なドナーから採取した体細胞の初代培養細胞由来、又は樹立細胞株由来のいずれであってもよい。樹立細胞株由来であれば、由来株として、例えば、ヒト樹立細胞株であるMRC-5細胞が挙げられる。iPS細胞は、いかなる胚葉系細胞にも分化誘導が可能であることから、iPS細胞の調製に用いる体細胞は、原則的には外胚葉系、内胚葉系のいずれの胚葉系細胞由来のものであってもよい。侵襲性が低く採取が容易な皮膚、髪の毛、歯肉、血液等の細胞は、本態様のiPS細胞の調製に用いる体細胞として好適である。
【００１９】
iPS細胞の調製方法については、当該分野で公知の方法に従えばよい。具体的には、例えば、ヒト多能性幹細胞の維持培養プロトコール第2版, 2010, （理化学研究所  発生・再生科学総合研究センター）等に記載されている調製方法を利用できる。
【００２０】
「モータリン」とは、前述のように、Hsp70ファミリーに属する熱非応答性タンパク質である。このタンパク質は、大腸菌のDnak、酵母のSSC1p、ラットの細胞質画分に恒常発現しているHsp70若しくはHsc70、又はラットの小胞体に存在するBiPと非常に高い相同性を有している。モータリンには、マウス由来の正常線維芽細胞の細胞質画分から単離されたモータリン1（mot-1）とマウスの不死化細胞から単離されたモータリン2（mot-2）が知られている（Wadha et al．，J．Biol．Chem．，1993，268：6615-6621；Wadha et al．，J．Biol．Chem．，1993，268：22239-22242）。ヌードマウスを用いたアッセイによれば、モータリン1の発現は細胞老化様の表現型を誘導するのに対し、モータリン2の過剰発現は細胞の悪性化を誘導する（Wadhwa et al．，J．Biol．Chem．，1998，273：29586）。なお、ヒトでは、前述したように、マウスモータリン2とアミノ酸レベルで95％の相同性を有し、同様の機能的特徴を有するヒトモータリン2のみしか単離されていない。そこで、本明細書では、原則としてモータリン2を対象とし、単にモータリンと称する場合には、特に断りのない限りモータリン2を示すこととする。
【００２１】
モータリン2は、モータリン1とカルボキシル末端の2アミノ酸のみが異なる。ヒトモータリン2は、配列番号１表される679アミノ酸からなる分子量73913ダルトンのタンパク質であり、その前駆タンパク質は46アミノ酸からなるミトコンドリア移行シグナルペプチドをN末端側に有している。
【００２２】
１−２．構成
本発明の人工多能性幹細胞標識試薬は、構成成分としてモータリン結合性物質及びそれに結合する標識物質を含む。以下、各構成成分について具体的に説明をする。
【００２３】
（１）モータリン結合性物質
本明細書において「モータリン結合性物質」とは、モータリン及び／又はその断片に結合し得る物質をいう。好ましくはモータリンと特異的に結合する物質である。ここでいう「特異的に結合する」とは、モータリン及び／又はその断片のみに結合し、それ以外のタンパク質やペプチドには実質的に結合しないことを意味する。モータリン結合性物質の例としては、限定はしないが、例えば、抗モータリン抗体又はモータリン結合アプタマーが挙げられる。以下、それぞれについて具体的に説明をする。
【００２４】
（ａ）抗モータリン抗体
本明細書における「抗モータリン抗体」とは、モータリンの全長及び／又はその断片に含まれるエピトープ（抗原決定基）を認識して免疫学的反応により結合する抗体である。エピトープは、抗体が認識して結合する構造単位であり、抗原性又は免疫原性を有する抗原の一部から構成される。抗原がペプチドであれば、エピトープは通常6〜10アミノ酸配列からなる。モータリンのアミノ酸配列中に含まれるエピトープとしては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列（LFGRAP）からなるペプチドが挙げられる。したがって、抗モータリン抗体は、このエピトープを含むペプチドを免疫原とする抗体を含む。実質的な免疫原となるペプチドの長さは特に限定しないが、下限はエピトープのみからなる6アミノ酸以上、好ましくは8アミノ酸以上、より好ましくは10アミノ酸以上であり、また上限はモータリンの全長アミノ酸（ヒトモータリン2であれば679アミノ酸）以下、好ましくは100アミノ酸以下、より好ましくは50アミノ酸以下であればよい。免疫原としてのペプチドの具体例として、例えば、配列番号３で表されるアミノ酸配列（CQDLFGRAPSKAVNPDEA）からなるペプチドが挙げられる。
【００２５】
本明細書の抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、合成抗体、及び抗体フラグメントを含む。
【００２６】
抗モータリン抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の場合、免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えば、IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及びIgY）、又は任意のサブクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2）でよい。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の作製方法は、例えば、Antibodies：A Laboratory Manual， Ed Harlow， David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988、Green, MR and Sambrook, J, (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York等に詳細に記載されている。この場合、抗原としては、全長モータリンタンパク質、又はモータリン部分ペプチドを用いることができる。
【００２７】
「組換え抗体」とは、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は多重特異性抗体をいう。「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の抗体のアミノ酸配列を組み合わせて作製される抗体で、ある抗体の定常領域（C領域）を他の抗体のC領域で置換した抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体のC領域をヒト抗体のC領域と置き換えた抗体が該当する。これによりヒト体内における当該抗体に対する免疫反応を軽減し得る。「ヒト化抗体」とは、適当なヒト抗体の可変領域（V領域）における相補性決定領域（CDR）をマウス等の非ヒトモノクローナル抗体のCDRと置換したモザイク抗体である。したがって、ヒト化抗体は、非ヒトモノクローナル抗体由来のCDR群（すなわち、CDR1、CDR2、CDR3）を、人為的にヒト抗体のFR群（すなわち、FR1、FR2、FR3、FR4）及び定常領域と組合せた構造を有する。例えば、マウス抗ヒトモータリンモノクローナル抗体のCDR群と、任意のヒト抗体のFR群及び定常領域とを組合せた抗体が該当する。このようなヒト化抗体は、CDRグラフト抗体（Nature(1986) Vol.321, 522）とも呼ばれている。「多重特異性抗体」とは、多価抗体、すなわち抗原結合部位を一分子内に複数有する抗体で、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する抗体をいう。例えば、IgGのように2つの抗原結合部位を有する抗体で、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する二重特異性抗体（Bispecific抗体）が挙げられる。
【００２８】
「合成抗体」とは、化学的に、又は組換えDNA法を用いることによって、合成した抗体をいう。例えば、組換えDNA法を用いて新たに合成された抗体が挙げられる。具体的には、例えば、単鎖抗体（scFv：single chain Fragment of variable region）（Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995, Pierce Chemical Co., Rockford, IL参照）、ダイアボディ（diabody）(Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448)、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ（tetrabody）等が挙げられる。
【００２９】
「抗体フラグメント」とは、上述した抗モータリン抗体の部分断片であって、抗モータリン抗体が有する抗原特異的結合活性と実質的に同等の活性を有するポリペプチド鎖又はその複合体をいう。例えば、抗原結合部位を少なくとも１つ包含するポリペプチド鎖又はその複合体が該当する。具体例としては、免疫グロブリンを様々なペプチダーゼで切断することによって生じる抗体断片等が挙げられる。より具体的には、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等が該当する。
【００３０】
抗モータリン抗体は、機能上の修飾がなされていてもよい。例えば、グリコシル化、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、又はPEG化が挙げられる。
【００３１】
（ｂ）モータリン結合アプタマー
「アプタマー」とは、それ自身の立体構造によって標的分子に特異的に結合して、その機能を阻害又は抑制することのできる核酸分子やペプチドをいう。「モータリン結合アプタマー」とは、モータリンを標的分子として結合するアプタマーである。本明細書におけるアプタマーは、核酸アプタマーとペプチドアプタマーに大別することができる。
【００３２】
（ｂ−１）核酸アプタマー
「核酸アプタマー」とは、核酸で構成されたアプタマーで、RNAで構成されたRNAアプタマーと、DNAで構成されたDNAアプタマーが知られるが、モータリン結合性物質を構成する核酸アプタマーは、DNA、RNA又はそれらの組合せのいずれで構成されていてもよい。RNAアプタマーは、RNAの性質に基づいて、一般に、DNAと比較して、より多くの立体構造を形成できる柔軟性を有する点で優れており、DNAアプタマーは、生体内でRNAよりも安定性が高い点において優れている。必要に応じて適切な核酸アプタマーを適宜使用すればよい。
【００３３】
核酸アプタマーは、標的分子に対する特異性及び親和性が、通常、抗体よりも高く、それ故、標的分子と特異的に直接かつ強固に結合できる。また、結合に必要な標的のアミノ酸残基数が抗体のそれと比較して少なくてもよいことから、例えば、互いに相同性の高いタンパク質群の中で特定のタンパク質の機能のみを抑制させたい場合には抗体よりも優れている。核酸アプタマーに関しては、例えば、Jaynasena S.D., 1999， Clin. Chem. 45:1628-1650を参照されたい。
【００３４】
本明細書における核酸アプタマーは、例えば、SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法を用いて試験管内選別により作製することができる。SELEX法とは、ランダム配列領域とその両末端にプライマー結合領域を有するDNA又はRNAで構成されたプールから標的分子に結合した核酸分子を選択し、回収後にその核酸分子を核酸増幅法で増幅した後、DNA分子の場合はそのまま、RNA分子の場合はRT-PCR等で得られたcDNA分子を鋳型として転写を行い、次のラウンドのプールにするという一連のサイクルを数〜数十ラウンド繰り返して、標的分子に対して、より結合力の強い分子を選択する方法である。ランダム配列領域とプライマー結合領域の塩基配列長は特に限定はしない。通常、ランダム配列領域は20〜80塩基、プライマー結合領域は、それぞれ15〜40塩基の範囲である。最終的に得られた核酸分子を核酸アプタマーとして利用する。SELEX法は、公知の方法であり、具体的な方法は、例えば、Panら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (1995) 92: 11509-11513）に準じて行えばよい。
【００３５】
（ｂ−２）ペプチドアプタマー
「ペプチドアプタマー」は、アミノ酸で構成されたアプタマーで、抗モータリン抗体と同様に、特定のモータリンの表面構造を認識して、特異的に結合する1〜6kDのペプチド分子である。ペプチドアプタマーは、ファージディスプレイ法や細胞表層ディスプレイ法を用いて製造することができる。ペプチドアプタマーの製造法は、当該分野で公知の方法に基づいて作製すればよい。例えば、Whaley,S.R., et al., 2000, Nature, 405, 665-668を参照することができる。
【００３６】
（２）標識物質
本明細書において「標識物質」とは、標識化した細胞をin vivo及び／又はin vitroで他の細胞と区別し、検出することのできる物質をいう。本発明の標識物質は、前記モータリン結合性物質のモータリン結合能を阻害又は抑制せず、標識するiPS細胞に対して細胞毒性を示さない又は細胞毒性が極めて低い物質であることが望ましい。
【００３７】
前記標識物質の例としては、蛍光物質、発光物質、常磁性体又は金コロイドが挙げられる。
【００３８】
「蛍光物質」は、基底状態にある物質が特定波長の光を吸収することによって、物質中の電子が励起され、元の基底状態に戻る際にエネルギーを蛍光として放出する性質を有する物質をいう。本発明において標識物質として用いる場合、蛍光物質は、特に限定はしないが、例えば、量子ドット、FITC（Fluorescein isothiosyanate）、APC（Allophycosyanin）、フルオレセイン、ローダミン、Cye3、Cye5、Alexa(登録商標）、R-PE (R-phycoerythrin)、FAM、HEX、VIC、又はTAMRAが挙げられる。
【００３９】
量子ドット(Quantum-dot)は、電子を量子的に閉じ込めて、3次元全ての方向からの移動を制限したナノ粒子レベルの半導体物質をいう。結晶成長や微細加工により数nm〜20nmのド・ブロイ波を有する粒子を作ると、電子の状態密度は粒径により離散化されることから、粒径に依存して異なる蛍光を発することが知られている。量子ドットは、標識物質として、長時間の励起光照射でも退色がほとんどないことから、一つのiPS細胞について複数の画像を撮影する場合には好適である。また、励起スペクトルが広範囲に及ぶため、単一励起波長（UV領域等）により発光波長の違う量子ドットを用いて同時に複数の発光を得たり、UV等の励起光を使用した場合にはストークスシフト（Stokes'shift）が大きくなるため、バックグラウンドが低く抑えられるという利点がある。
【００４０】
量子ドットの構成成分は、半導体素材で、上記の性質を有する物質であれば特に限定はしないが、コア粒子には、CdSe（セレン化カドミウム）を好ましく使用することができる。コア粒子は、例えばZnS（硫化亜鉛）等の半導体被覆層（シェル）で被覆されていてもよい。コア粒子又は被覆層は2層以上で構成されていてもよい。例えば、ZnSをCdSeで被覆した2層構造のコア粒子が該当する。量子ドットは、最外部を、例えばヘキサデシルアミン（hexadecylamine）のような保護基でキャッピングしていてもよい。量子ドットは、水中で分散しやすいようにポリマーコーティングされていてもよい。
【００４１】
量子ドットの具体例として、当技術分野で公知の量子ドットを用いることができる。例えば、Qdot（登録商標；以下同じ）525、Qdot565、Qdot585、Qdot605、Qdot655、Qdot705及びQdot800（全てlife technologies社）等を利用することができる。
【００４２】
「常磁性体」とは、磁場外では磁化されず、磁場内で磁場と同じ方向に磁化される性質を有する物質をいう。本発明において標識物質として使用する常磁生体は、生体内において有害性の低い物質が好ましい。例えば、MRI造影剤に使用される常磁生体、具体的には例えば鉄（Fe）、ガドリニウム（Gd）等が挙げられる。
【００４３】
モータリン結合性物質は、一分子に一つの標識物質を含んでいてもよいし、同一の又は異なる二以上の標識物質を含んでいてもよい。異なる二以上の標識物質を含む人工多能性幹細胞標識用試薬を使用すれば、1つの試薬でiPS細胞を多重標識（マルチカラーラベリング）することが可能となる。
【００４４】
（３）モータリン結合性物質と標識物質の結合
前記モータリン結合性物質と前記標識物質との結合（コンジュゲート化）は、モータリン結合性物質のモータリン結合能及び標識物質の検出を阻害又は抑制せず、また標識するiPS細胞に対して細胞毒性を示さない又は細胞毒性が極めて低い物質であることが望ましい。例えば、ビオチン−アビジン法、既存の化学リンカーを用いる方法、架橋剤（EDC等）を用いた架橋反応、イオン結合等が挙げられる。好ましくはビオチン−アビジン法である。例えば、抗モータリン抗体と量子ドットとの結合は、Qdot Antibody Conjugation Kit（life technologies社）等の市販の試薬やキットを用いて添付の取扱説明書に従って行うことができる。
【００４５】
（４）細胞内在化性
モータリンは、細胞膜表面に存在する膜タンパク質である。したがって、本発明の人工多能性幹細胞標識用試薬、特にその有効成分である標識物質を結合したモータリン結合性物質（以下、「標識物質担持型モータリン結合性物質」とする）を細胞内に導入する場合には、本発明の人工多能性幹細胞標識用試薬、特に標識物質担持型モータリン結合性物質が細胞内在化性を有することが好ましい。本明細書で「細胞内在化性」とは、人工多能性幹細胞標識用試薬、特に標識物質担持型モータリン結合性物質がiPS細胞表面のモータリンに結合することによって、そのiPS細胞のエンドサイトーシス機能を誘導し、細胞内に取り込まれる細胞内侵入性をいう。抗モータリン抗体の多くはこの性質を有する。細胞内侵入性は、標識物質担持型モータリン結合性物質を細胞に接触させた後に、細胞膜に透過処理を行う。次に、前記標識物質、又は標識物質担持型モータリン結合性物質を特異的に標識可能な他の物質を用いて、標識物質担持型モータリン結合性物質の局在を検出することで確認することができる。
【００４６】
１−３．効果
本発明の人工多能性幹細胞標識用試薬によれば、iPS細胞を安定的にかつ効率的に標識化でき、またiPS細胞の有する増殖能及び分化能を阻害及び抑制することなく、生体内移植後にも長期にわたって検出可能な標識用試薬を提供することができる。
【００４７】
２．薬剤取り込みキット
本発明の第２の態様は、人工多能性幹細胞標識用キットに関する。
【００４８】
２−１．構成
本発明の人工多能性幹細胞標識用キットは、第１態様に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬を必須の構成物品として含む。その他、iPS細胞の標識に用いる際に使用するバッファ及び／又は培地、人工多能性幹細胞標識用試薬に含まれる標識物質担持型モータリン結合性物質を特異的に検出可能な物質（例えば、抗モータリン結合性物質抗体）及び／又は使用説明書を選択的構成物品として含んでいてもよい。
【００４９】
２−２．効果
本発明の人工多能性幹細胞標識用キットによれば、当該キットを用いることでiPS細胞を容易に標識化することが可能となる。
【００５０】
３．人工多能性幹細胞標識方法
本発明の第３の態様は、人工多能性幹細胞標識方法に関する。本発明は、第１態様に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬を用いてiPS細胞を標識することを特徴とする。
【００５１】
３−１．方法
本発明の標識方法は、接触工程を必須工程として含む。その他、必要に応じて接触工程後のiPS細胞を培養する培養工程を含むことができる。以下、各工程について具体的に説明をする。
【００５２】
（１）接触工程
「接触工程」とは、第１態様に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬を標識すべきiPS細胞と接触させる工程である。本工程は、標識すべきiPS細胞に人工多能性幹細胞標識用試薬を接触させて該細胞を標識化する工程である。本工程は、接触によってiPS細胞内に人工多能性幹細胞標識用試薬を導入することを目的とする。
【００５３】
ここでいう「接触」とは、第1態様に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬、特に標識物質担持型モータリン結合性物質を、標識すべきiPS細胞の細胞膜表面に接触させることをいう。接触方法は、標識物質担持型モータリン結合性物質を接触できる方法であれば、特に限定はしない。例えば、iPS細胞を、人工多能性幹細胞標識用試薬を含む溶液中に浸漬する方法が挙げられる。具体的には、例えば、iPS細胞の培養液に第１態様に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬を添加するか、第１態様に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬を含むバッファ又は培地に標識すべきiPS細胞を移せばよい。
【００５４】
溶液中の人工多能性幹細胞標識用試薬の分量は、限定はしないが、好ましくは、例えば0.1〜10 mg/mL、好ましくは0.2〜0.8 mg/mLの範囲にあればよい。また、iPS細胞数は、1×104〜5×106cells/mL、好ましくは5×104〜5×105cells/mLの範囲にあればよい。
【００５５】
異なる二以上の人工多能性幹細胞標識用試薬をiPS細胞に接触させる場合、培養液、バッファ又は培地に全ての人工多能性幹細胞標識用試薬を全て加えて一度にiPS細胞に接触させることもできるし、別個に加えて順番に接触させることもできる。さらに、本発明の人工多能性幹細胞標識用試薬による標識を、慣用の細胞標識手法（蛍光、放射線、酵素等を用いる方法）と組み合わせてもよい。例えば、細胞染色に一般的に用いられているヘキスト33258、DIC等から選択される1種以上の細胞標識手法と組み合わせたり、放射性同位元素（例えば、3H、14C、35S）で標識することが可能である。
【００５６】
本発明の人工多能性幹細胞標識用試薬、特に標識物質担持型モータリン結合性物質が細胞内在化性を有さない場合で、かつそれを細胞内に導入させたい場合、当該分野で公知の方法によって人工多能性幹細胞標識用試薬、特に標識物質担持型モータリン結合性物質をiPS細胞内に導入すればよい。例えば、モータリン結合性物質が核酸アプタマーのような核酸であれば、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、DEAE−Dextran法等を用いてiPS細胞内に導入すればよい。また、Lipofectamin2000（life technologies社）のような市販の核酸導入剤を使用してもよい。このような細胞内導入方法は、Green, MR and Sambrook, J, (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York等に詳細に記載されている。一方、本発明の人工多能性幹細胞標識用試薬、特に標識物質担持型モータリン結合性物質が細胞内在化性を有する場合には、iPS細胞膜表面上のモータリンへの結合によってエンドサイトーシスが誘発されるので、単にそれぞれを接触させるだけで足りる。
【００５７】
接触時間は、人工多能性幹細胞標識用試薬の分量（濃度）、溶液中のiPS細胞数、人工多能性幹細胞標識用試薬の種類、又は人工多能性幹細胞標識用試薬の細胞内在化性の有無によって異なることから、それらの諸条件に応じて適宜定めればよい。人工多能性幹細胞標識用試薬、特に標識物質担持型モータリン結合性物質が細胞内在化性を有する場合、通常は0.5〜24時間、好ましくは3〜20時間、より好ましくは12〜18時間である。接触時間が例えば、8時間を越える場合、後述する培養工程で接触工程を継続して行ってもよく、その場合、培養期間中、接触状態を維持することができる。
【００５８】
（２）培養工程
「培養工程」は、前記接触工程後のiPS細胞を所定の条件下で培養する工程である。本工程は、接触工程後のiPS細胞の維持、回復、又は増殖を目的とする選択工程であり、必要に応じて行えばよい。
【００５９】
例えば、第１態様に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬を長時間iPS細胞と接触させる場合、人工多能性幹細胞標識用試薬を含む培地でiPS細胞を培養することにより、iPS細胞を標識すると共に維持することができる。この場合、前記接触工程と本工程を重複して行うことができる。一方、第１態様に記載の人工多能性幹細胞標識用試薬を長時間iPS細胞と接触させたくない場合には、前記接触工程においてバッファや培地中でiPS細胞を人工多能性幹細胞標識用試薬と所定の期間接触させた後、そのバッファや培地を除去、洗浄して人工多能性幹細胞標識用試薬を除いた後に、人工多能性幹細胞標識用試薬を含まない新たな培地にiPS細胞を移すことで接触工程後のiPS細胞を回復させることができる。
【００６０】
培養工程で用いる培地は、iPS細胞の培養が可能な培地であれば特に限定はしない。当該分野で公知の培地を用いればよい。例えば、イーグルMEM（Eagle Minimum Essential Medium）培地、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培地、ハムF10（Ham's Nutrient Mixture F10）培地、ハムF12（Ham's Nutrient Mixture F12）培地、M199培地、高性能改良199培地（Hight Performance Medium 199）、RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute-1640）培地又はDMEM/F12（Dulbecco's Modified Eagle Medium/ Ham's Nutrient Mixture F12）培地が挙げられる。DMEM/F12培地の場合、その混合比率は、特に制限しない。好ましくは、構成成分の重量濃度比でDMEMとF12を6：4〜4：6の範囲で混合すればよい。前記標準細胞培養用培地の具体的な組成については、当該分野で公知であり、適当な文献（例えば、ヒト多能性幹細胞の維持培養プロトコール第2版, 2010, （理化学研究所  発生・再生科学総合研究センター））に記載の組成に基づいて調製するか、又は各メーカー（life technologies, Thermo scientific, Wako Pure Chemical Industries等）の市販品を用いればよい。なお、上記培地が血清を含まない場合には、必要に応じて終濃度で1〜20％、好ましくは5〜15％、より好ましくは8〜12％、さらに好ましくは10％でFBS又はFCSを添加すればよい。
【００６１】
培養条件も、当該分野で公知の方法に準じて行えばよい。通常は、5%CO2の存在下、37℃の温度で培養する。遮光下で培養することが好ましい。
【００６２】
本発明の方法で標識されたiPS細胞における標識物質のシグナルは、当該技術分野で公知の方法及び手段を用いて検出することができる。当該方法及び手段は、人工多能性幹細胞標識用試薬の有効成分である標識物質担持型モータリン結合性物質が担持する標識物質に従う。例えば、標識物質が蛍光物質であれば、その蛍光物質の発する蛍光を、例えば、蛍光顕微鏡やプレートリーダー等の蛍光検出器を用いて検出及び定量することができる。使用する励起フィルター及び蛍光フィルター、検出条件などは、使用する標識物質（量子ドットなど）の種類に応じて適宜選択すればよい。iPS細胞を生体に移植した場合、標識物質担持型モータリン結合性物質由来のシグナルを生体外から検出する方法としては、限定はしないが、例えば、in vivoバイオイメージング法を用いることができる。例えば、Katz, M.H. et al., 2003, Cancer Res. 63: 5521-5525、Schmitt, C.A. et al., 2002, Cancer Cell, 1: 289-298, Katz, M.H. et al., 2003, J. Surg. Res., 113: 151-160等に記載の方法を用いて検出すればよい。市販のIVIS Imaging System（Caliper）やそれに類似する装置により検出してもよい。
【００６３】
３−２．効果
本発明の人工多能性幹細胞標識方法によれば、生体移植後の人工多能性幹細胞の長期にわたるモニタリングが可能となる。それにより移植医療の安全性の確認を容易にし、再生医療の発展に大きく寄与し得る。
【実施例】
【００６４】
以下に、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、以下の実施例は、本発明の一例示に過ぎず、本発明の範囲をなんら限定するものではない。
【００６５】
＜実施例１：人工多能性幹細胞標識用試薬の調製とそれを用いた人iPS細胞の標識＞
（目的）
本発明の人工多能性幹細胞標識方法によりiPS細胞を標識化する。
【００６６】
（材料と方法）
１．iPS細胞の調製
iPS細胞には、MRC-5由来のiPS細胞を用いた。iPS細胞の調製方法は、ヒト多能性幹細胞の維持培養プロトコール第2版, 2010, （理化学研究所  発生・再生科学総合研究センター）に記載の方法に従った。培養は、75cm2細胞培養フラスコ（75T）を用いた。
【００６７】
２．人工多能性幹細胞標識用試薬の調製
抗モータリン抗体の作製は、Kaulら（Kaul et al．，Biochem．Cell Biol．，2007，85（1）:133-40）及びShiotaら（Shiota et al．，Hum．Gene Ther．，2007，18（11）:1153-60）に記載の方法に従った。
【００６８】
簡単に説明すると、モノクローナル抗体作製のために、組換え発現させたヒトモータリンタンパク質全長を抗原としてマウスを免疫した。標準的なプロトコールに従いハイブリドーマを作製した（例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988を参照されたい）。抗モータリン抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、10％低IgG FBS及び1％antibiotics-antimycotics（Sigma社）を添加したRPMI1640培地（Sigma社）中で培養した。培養した培地を1200rpmにて5分間遠心し、上清を回収した。プロテインGカラム（GE Healthcare Life Science社）を取扱説明書に従い使用して抗モータリン抗体を精製した。なお、ここで得られたハイブリドーマ細胞は、Mouse hybridoma 37-6として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）［現：独立行政法人製品評価技術基盤機構（292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8  120号室）］に2009年10月13日付で寄託され、受領番号FERM AP-21854が付与されているので、それを利用することもできる。
【００６９】
標識物質にはZnSのシェルで被覆されたCdSeからなる量子ドットQdot 655（life technologies社）を用いた。この量子ドットと抗モータリン抗体との結合は、Qdot 655 Antibody Conjugation Kit（Q22021MP；life technologies社）を用いて、添付のプロトコルに従って行った。これによって、標識物質担持型モータリン結合性物質を含む本発明の人工多能性幹細胞標識用試薬を調製した。
【００７０】
３．人工多能性幹細胞標識用試薬によるiPS細胞のin vitro標識化
人工多能性幹細胞標識用試薬の原液450μLを8550μLのiPS細胞専用のGrowth Medium（ReproStem社）を用いて20倍希釈し、iPS細胞用標識用培地を標識直前に調製した。
【００７１】
上記方法により培養したiPS細胞をiPS細胞専用のGrowth Mediumで洗浄した後、前記iPS細胞用標識用培地9000μLを加え、iPS細胞表面全体を覆うように培地を広げた。直ちに5%CO2存在下、37℃にて遮光下で24時間インキュベーションを行い、反応時間0、6、8、12、18、及び24時間でiPS細胞を標識した。各インキュベーション終了後に、温めたPBSで2回洗浄して、最後に乾燥しないようにPBSを1000 μL加えた。観察直前まで5%CO2存在下、37℃でインキュベートした。その後、蛍光顕微鏡（Axiovert 200M；Carl Zeiss）で標識効率を確認した。
【００７２】
（結果）
図１及び２に結果を示す。図１及び２はいずれも同一の方法で独立にiPS細胞を標識処理した後に蛍光観察を行い、本発明の人工多能性幹細胞標識方法による細胞内標識効率を検証した結果である。図１では反応時間が0、6、18、24時間後、図２では0、6、8、12、18、21、24時間後に観察した。
【００７３】
図１及び２ともに、18〜24時間での人工多能性幹細胞標識用試薬の細胞内導入効率がよいが、図２から12〜18時間でも十分に人工多能性幹細胞標識用試薬の細胞内導入が完了していることが明らかとなった。またコロニー外よりもコロニー内に量子ドットQD655からの蛍光を発する細胞が多くみられた。細胞内標識効率は、図２の18時間の図において目視で80%以上であることを確認した。
【００７４】
したがって、本発明の人工多能性幹細胞標識方法によれば、iPS細胞を簡便かつ効率的に標識化できることが立証された。
【００７５】
＜実施例２：短ペプチドを免疫原とする抗モータリン抗体の作製＞
（目的）
配列番号２で表されるエピトープを含む比較的短いペプチドを免疫原として抗モータリン抗体を作製した。
【００７６】
（方法）
（１）免疫原の調製
配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを化学合成した後、C18カラム（250ｍｍ×4.6ｍｍ I.D.; Merck）及び溶出液として2〜90％アセトニトリル/0.05 TFA（30分）を用いて、25℃にて1.0ｍL/minの流速で完全性を確認した。
【００７７】
（２）マウス抗ヒトモータリン抗体の作製
合成ペプチドをフロイント完全アジュバントと結合させた後、抗原としてマウスに免疫した。抗体の作製方法は、基本的には実施例１に記載の方法に準じた。この方法により、マウス抗ヒトモータリン抗体を産生する8種のハイブリドーマ細胞（S1-1、S1-3、S1-7、S1-8、S70-2、S70-5、S70-6、及びS70-10）を新たに得た。
【００７８】
（３）確認
各ハイブリドーマ細胞から得られたマウス抗ヒトモータリン抗体（S1-1抗体、S1-3抗体、S1-7抗体、S1-8抗体、S70-2抗体、S70-5抗体、S70-6抗体、及びS70-10抗体）について、ウエスタンブロッティング及び免疫染色を行い、ヒト骨肉腫（U2OS)細胞上清、及びヒト正常線維芽細胞（TIG-3)上清中のモータリンに対する免疫反応性を確認した。
【００７９】
ウエスタンブロッティングは、NP-40バッファ中のU2OSと正常細胞TIG-1の細胞溶解液を10％SDS-PAGEで分析した。その後、semi-dry transfer system（Biorad社）を用いて、に分析されたゲル中のタンパク質をPVDF膜（Millipore社）にブロットした。前記各ハイブリドーマ細胞から得られたマウス抗モータリンモノクロナル抗体及びECL chemiluminescence (Amersham Pharmacia Biotech社)を用いてモータリンを検出した。具体的な方法については、Green & Sambrook, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法に従った。
【００８０】
また、免疫染色は、U2OS細胞を常法に従って染色した後、蛍光顕微鏡による蛍光強度の大きさによって確認した。具体的には、12穴プラスチックディッシュ中にカバーガラスを置き、60％コンフルエントに達するまで各ハイブリドーマ細胞から得られたマウス抗モータリンモノクロナル抗体と共にU2OS細胞を培養した。24〜48時間のインキュベーション後、冷却したPBSバッファで洗浄し、細胞をメタノール：アセトン（1：1）溶液で氷上にて5分間固定した。固定した細胞は、0.2% Triton X-100 in PBS (PBS-T)で10分間洗浄し、2% BSA in PBSで20分間ブロッキングした。抗体の内在化は、2次抗体（Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG）（Molecular Probes社）を加えて視覚化した。PBS-Tバッファで3回洗浄した後、カバーガラス上の細胞をFluoromount（Difco社）を用いてマウントした。細胞は蛍光顕微鏡Carl Zeiss microscope（Axiovert 200M：Carl Zeiss社）用いて観察した。
【００８１】
（結果）
図３にウェスタンブロットの結果を、また図４に免疫染色の結果を示す。図３においてUはU2OS細胞上清を、TはTIG-3上清を示す。図３から、配列番号２で表されるエピトープを含むペプチドを免疫原として新たに得られたハイブリドーマ由来のマウス抗モータリン抗体（S1-1抗体、S1-3抗体、S1-7抗体、S1-8抗体、S70-2抗体、S70-5抗体、S70-6抗体、及びS70-10抗体）は、いずれも正常細胞中及び癌細胞中のモータリンを検出できることが確認された。また、図４から、前記新たに得られたマウス抗モータリン抗体により、癌細胞内におけるモータリンの典型的な核周辺局在性が示され、抗体の細胞内在化能が確認された。
【００８２】
＜実施例３：短ペプチドを免疫原とする抗モータリン抗体の細胞内在化能の検証＞
（目的）
実施例２で新たに作製された短ペプチドを免疫原とするハイブリドーマ由来のマウス抗ヒトモータリン抗体と従来の抗ヒトモータリン抗体との細胞内在化活能を比較した。
【００８３】
（方法）
ハイブリドーマの培養上清又は精製した6μg/mLのigG抗体をU2OS細胞培養液に加えて5％ CO2下、37℃にて24時間培養した。続いて、細胞をメタノール：アセトン（1：1）溶液で固定し、0.2％ Triton X-100/PBS溶液で3回洗浄した。その後、二次抗体としてAlexa(登録商標)-594結合ヤギ抗マウス抗体（Molecular Probe社）を加えてインキュベートした。0.2％ Triton X-100/PBS溶液で十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡（Axiovert 200M；Carl Zeiss)で新たに作成されたマウス抗ヒトモータリン抗体を調べた。陽性対照として、全長ヒトモータリンを抗原として得られた実施例１に記載の抗モータリン抗体（37-6抗体）を用いた。
【００８４】
（結果）
図５に結果を示す。実施例２で新たに作製された抗モータリン抗体（S1-1抗体、S1-3抗体、S1-7抗体、S1-8抗体、S70-2抗体、S70-5抗体、S70-6抗体、及びS70-10抗体）は、陽性対照である実施例１で使用した37-6抗体よりも細胞内在化能が高かった。これは、配列番号２で表されるエピトープを含む比較的短いアミノ酸長のペプチドを免疫原とする方がモータリンの全長を免疫原とするよりも細胞内在化能の高い抗体が得られうることを示唆している。
【００８５】
また、実施例１では、細胞内在化能を有する37-6抗体を用いて人工多能性幹細胞標識用試薬を調製することで、iPS細胞を効率的にin vitro標識化することができた。したがって、配列番号２で表されるエピトープを含む比較的短いアミノ酸長のペプチドを免疫原として得られた抗モータリン抗体（S1-1抗体、S1-3抗体、S1-7抗体、S1-8抗体、S70-2抗体、S70-5抗体、S70-6抗体、及びS70-10抗体）を用いた場合、37-6抗体よりも効率的かつ高感度にiPS細胞を標識化できることを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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