(57)【要約】【課題】血栓の量及び血栓の強度や安定性といった質を総合的に且つ定量的に評価するための技術を提供する。【解決手段】測定方法は、マイクロチップに設けられた流路に血液を流すと共に当該流路において血栓の形成を誘発させ、血液を測定する測定方法であって、流路への血液の流入圧力を時間経過と対応付けて記憶するステップと、流路をカメラで撮像し、得られた画像を時間経過と対応付けて記憶する撮像ステップと、記憶されている画像から所定の範囲における血栓の量を算出し、時間経過と対応付けて記憶する血栓量測定ステップとをコンピュータが実行する。【選択図】図１
2015090293.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロチップに設けられた流路に血液を流すと共に当該流路において血栓の形成を誘発させ、前記血液を測定する測定方法であって、
前記流路への前記血液の流入圧力を時間経過と対応付けて記憶装置に記憶させるステップと、
前記流路をカメラで撮像し、得られた画像を前記時間経過と対応付けて前記記憶装置に記憶させる撮像ステップと、
記憶させた画像から所定の範囲における血栓の量を算出し、前記時間経過と対応付けて記憶する血栓量測定ステップと、
をコンピュータが実行する測定方法。
【請求項２】
前記撮像ステップにおいて、前記カメラを前記流路とほぼ平行又はほぼ垂直に移動させ、撮像対象領域の少なくとも一部が重複した複数の画像を撮像し、
前記複数の画像を合成するステップをさらに実行し、
前記血栓量測定ステップにおいて、合成された後の画像に基づいて前記所定の範囲における血栓の量を算出する
請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
マイクロチップに設けられた流路に血液を流すと共に当該流路において血栓の形成を誘発させ、前記血液を測定する測定装置であって、
前記流路への前記血液の流入圧力を時間経過と対応付けて記憶装置に記憶させる圧力取得部と、
前記流路をカメラで撮像し、得られた画像を前記時間経過と対応付けて前記記憶装置に記憶させる画像取得部と、
記憶させた画像から所定の範囲における血栓の量を算出し、前記時間経過と対応付けて前記記憶装置に記憶させる血栓量測定部と、
を備える測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液を測定する測定方法及び測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈における血栓形成（白色血栓）又は一次止血において、血小板の活性化及び凝集は中心的機能を果たす。
【０００３】
血小板は血管が障害を受けた場合に、血管内皮細胞下に存在するコラーゲンに対し、直接的、非直接的に結合する。血流の緩やかな環境下（低ずり応力下）ではGPVIなどコラーゲン受容体により直接的な結合が主となり、血流の早い環境下（高ずり応力下）ではコラーゲンにvWFが結合し、vWFに対し血小板のGPIbα受容体が結合することで間接的にコラーゲンに結合する。コラーゲンとの直接的、間接的相互作用は血小板を活性化し、この刺激により濃染顆粒及びα顆粒からADP,セロトニンなど様々な血小板活性化物質が放出される。
【０００４】
これら放出された血小板活性化因子は自己の血小板及び周囲の血小板を活性化させる。活性化を受けた血小板はフィブリノゲン受容体であるGPIIb/IIIaが活性化型に構造変化を受け、フィブリノゲンに対し高親和性型となる。２量体であるフィブリノゲンを介して活性化血小板が次々架橋を受け血小板凝集を形成する。
【０００５】
従来、所定の血液を、血小板易接着面を備えたキャピラリーを通過させ、該血液のキャピラリー内での挙動を観察又は測定することによって、血小板の機能を検査する技術が提案されている（例えば、特許文献１）。
【０００６】
また、血小板表面に存在する膜糖蛋白ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａやＧＰ  Ｉｂａｌｐｈａに対するモノクローン抗体をＦＩＴＣ等により蛍光標識し、赤血球を含む全血の血液中に混入した試料血液を、損傷血管壁を模擬するコラーゲンやｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）などのマトリックスを上面に塗布などして固相化したガラス板２２を用いたフローチャンバー２０に流しながら、共焦点顕微鏡装置を用いて、血小板の３次元形態を、動画像として撮像する技術も提案されている（例えば、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０１８８３３号パンフレット
【特許文献２】特開２００４−２５１６３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来提案されている技術は、流路（キャピラリー、フローチャンバー）の一部の画像を撮像するものであり、また、ユーザによる観測を支援するためのものであった。例えば特許文献２には、Ｚ方向（光軸方向）に対物レンズを移動させて撮像した複数のフレームを合成等し、三次元的なイメージングを実現する旨が記載されている。しかしながら、血栓の量及び血栓の強度や安定性といった質を総合的に且つ定量的に評価することはできなかった。
【０００９】
よって、本発明は、血栓の量及び血栓の強度や安定性といった質を総合的に且つ定量的に評価するための技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る測定方法は、マイクロチップに設けられた流路に血液を流すと共に当該流路において血栓の形成を誘発させ、血液を測定する測定方法であって、流路への血液の流入圧力を時間経過と対応付けて記憶するステップと、流路をカメラで撮像し、得られた画像を時間経過と対応付けて記憶する撮像ステップと、記憶されている画像から所定の範囲における血栓の量を算出し、時間経過と対応付けて記憶する血栓量測定ステップとをコンピュータが実行する。
【００１１】
このようにすれば、血液の流入圧力及び所定の範囲における血栓の量を、それぞれ時間経過と対応付けて記憶させることができるため、ユーザは、これらに基づく総合的且つ定量的な評価が可能となる。すなわち、血栓の量及び血栓の強度や安定性といった質を総合的に且つ定量的に評価するための技術を提供することができる。
【００１２】
さらに、撮像ステップにおいて、カメラを流路と平行に移動させ、撮像対象領域の少なくとも一部が重複した複数の画像を撮像し、複数の画像を合成するステップをさらに実行し、血栓量測定ステップにおいて、合成された後の画像に基づいて流路における血栓の量の割合を算出するようにしてもよい。このようにすれば、血管を模擬した流路の観察領域を拡張することができるとともに、局所的な画像に基づいて血栓の量を測定する場合よりも再現性のある測定値が得られ、正確な分析を行うことができるようになる。
【００１３】
また、本発明に係る処理を実行する装置を提供するようにしてもよいし、本発明に係る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを提供するようにしてもよい。
【００１４】
なお、プログラムは、コンピュータが読み取り可能な記録媒体に記録されていてもよい。ここで、コンピュータが読み取り可能な記録媒体とは、データやプログラム等の情報を電気的、磁気的、光学的、機械的、または化学的作用によって蓄積し、コンピュータから読み取ることができる記録媒体をいう。このような記録媒体のうち、コンピュータから取り外し可能なものとしては、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、光ディスク、フラッシュメモリ、磁気テープ等がある。また、コンピュータに固定された記録媒体としては、ＨＤＤ（Hard Disk Drive）、ＳＳＤ（Solid State Drive）、ＲＯＭ（Read Only Memory）等がある。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、血栓の量及び血栓の強度や安定性といった質を総合的に且つ定量的に評価するための技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】血液測定装置の一例を示す模式図である。
【図２Ａ】第１の例に係るマイクロチップの第１の基板を示す模式図である。
【図２Ｂ】第１の例に係るマイクロチップの第２の基板を示す模式図である。
【図２Ｃ】第１の例に係るマイクロチップを示す模式図である。
【図３Ａ】第２の例に係るマイクロチップの第１の基板を示す模式図である。
【図３Ｂ】第２の例に係るマイクロチップの第２の基板を示す模式図である。
【図３Ｃ】第２の例に係るマイクロチップを示す模式図である。
【図４】情報処理部の一例を示す機能ブロック図である。
【図５Ａ】第１の例に係るマイクロチップ上の撮像範囲を説明するための図である。
【図５Ｂ】第２の例に係るマイクロチップ上の撮像範囲を説明するための図である。
【図６】コンピュータの一例を示す装置構成図である。
【図７】記録処理の一例を示す処理フロー図である。
【図８】解析処理の一例を示す処理フロー図である。
【図９Ａ】画像データの合成を説明するための図である。
【図９Ｂ】画像データの合成を説明するための図である。
【図９Ｃ】画像データの合成を説明するための図である。
【図１０】画像データの合成の他の例を示す図である。
【図１１】画像データの合成の他の例に係る１フレームを示す図である。
【図１２】実施例１に係る血液の圧力変化を示すグラフである。
【図１３】実施例１に係る合成画像の一例を示す図である。
【図１４】実施例２に係る血液の圧力変化を示すグラフである。
【図１５】実施例２に係るコントロール血液の画像の一例を示す図である。
【図１６】実施例２に係るアスピリン添加血液の画像の一例を示す図である。
【図１７】実施例２に係るＯＳ−１添加血液の画像の一例を示す図である。
【図１８】実施例２に係るコントロール血液の合成画像の一例を示す図である。
【図１９】実施例２に係るアスピリン添加血液の合成画像の一例を示す図である。
【図２０】実施例２に係るＯＳ−１添加血液の合成画像の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、図面を参照して、本発明を実施するための形態について説明する。なお、本実施形態の構成は例示であり、本発明は以下の構成には限定されない。なお、本実施形態において、「血液」とは、全血及び多血小板血漿を含む。
【００１８】
＜血液測定装置のシステム構成＞
図１は、本実施形態に係る血液測定装置１の一例を示す模式図である。図１の血液測定装置１は、リザーバ１０１と、ポンプ１０２と、圧力センサ１０３と、カメラ１０４と、駆動装置１０５と、情報処理部１０６と、排出管１０７とを備え、所定の位置にマイクロチップ２を載置することができる。マイクロチップ２は、血管を模擬した流路（「キャピラリー」とも呼ぶ）２０１、流入口２１１、流出口２１２等を備える。
【００１９】
リザーバ１０１は、抗凝固処理された血液を収容する血液収容部である。また、リザーバ１０１は、マイクロチップ２の流入口２１１と接続される。ポンプ１０２は、リザーバ１０１と接続される。ポンプ１０２は、リザーバ１０１の上層にミネラルオイルを圧入し、リザーバ１０１の下層からマイクロチップ２へ血液を流入させる。
【００２０】
圧力センサ１０３は、例えばステンレスやシリコンのダイヤフラムを用いた電子式の圧力センサである。また、圧力センサ１０３は、リザーバ１０１からポンプ１０２への経路に接続され、リザーバ１０１へのミネラルオイルの流入圧力を測定することができる。リザーバ１０１へのミネラルオイルの流入圧は、すなわち、マイクロチップ２への血液の流入圧といえる。また、圧力センサ１０３は情報処理部１０６と接続されており、情報処理部１０６は測定された流入圧を記憶装置に記録することができる。
【００２１】
カメラ１０４は、顕微鏡装置を備えたＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラ等の撮
像装置であり、静止画又は動画を撮像することができる。本実施形態に係るカメラ１０４は、いわゆるエリアセンサカメラである。また、カメラ１０４は、マイクロチップ２の流路２０１の顕微鏡写真又は顕微鏡動画を撮像する。なお、カメラ１０４は、マイクロチップ２を鉛直上方から撮像するようにしてもよいし、マイクロチップ２を鉛直下方から撮像するようにしてもよい。また、任意の位置に光源（図示せず）を設けるようにしてもよい。
【００２２】
駆動装置１０５は、例えばサーボモータ等のアクチュエータであり、カメラ１０４の位置を移動させる。駆動装置１０５は、例えば、マイクロチップ２と平行に、且つ流路にほ
ぼ沿って（すなわち、血液の流動方向にほぼ沿って）又は流路とほぼ垂直な方向に沿って（すなわち、流路の幅方向に沿って）カメラ１０４を移動させ、カメラ１０４の撮像位置を変更することができる。
【００２３】
情報処理部１０６は、プロセッサ、記憶装置、入出力装置等を備えるコンピュータであり、圧力センサ１０３及びカメラ１０４と接続される。また、情報処理部１０６は、圧力センサ１０３により測定された血液の流入圧を経時的に記録したり、カメラ１０４を移動させつつ撮像した複数の画像（「フレーム」とも呼ぶ）を合成してカメラ１０４の撮像範囲の大きさを超える画像を生成したり、撮像された画像に含まれる血栓の面積を算出したりする。
【００２４】
排出管１０７は、マイクロチップ２の流出口２１２と接続され、血液測定装置１の外に血液を排出する。
【００２５】
次に、図２Ａから図３Ｃを用いて、マイクロチップ２を説明する。図２Ａから図２Ｃは、マイクロチップ２の第１の例を示す模式図である。図２Ａは、マイクロチップ２の流路２０１となる溝が表面に形成された第１の基板２００の一例を示す平面図である。溝の断面形状は、凹字状、Ｕ字状、Ｖ字状等任意である。血小板凝集塊は脆いため、圧力上昇を測定するためには溝の深さは１０〜２００μｍ以下であることが望ましい。また、溝の幅は１０μｍ〜３ｍｍであることが好ましい。また、流路２０１の少なくとも一部には、コラーゲン及び組織トロンボプラスチンといった血液の凝固因子をコーティングすることで血小板易接着面２０２（凝固因子コート部）が形成される。具体的には、凝固因子は、例えば図２Ａに示す様に流路２０１の中央付近に塗布される。なお、血小板易接着面は流路２０１の全長に及んでもよい。
【００２６】
図２Ｂは、マイクロチップ２の流入口２１１および流出口２１２となる貫通孔が設けられた第２の基板２１０の一例を示す平面図である。流入口２１１となる貫通孔および流出口２１２となる貫通孔の位置は、第１の基板２００と積層されたときに、それぞれ、第１の基板２００上の、流路２０１の第１の端部に相当する位置、流路２０１の第２の端部に相当する位置となっている。
【００２７】
図２Ｃは、第１の基板２００と第２の基板２１０が積層されたマイクロチップ２の一例を示す平面図である。流路２０１の端部には、流入口２１１及び流出口２１２が位置している。なお、破線は、流路２０１がマイクロチップ２の内部に存在することを示す。そして、流路２０１には凝固因子が塗布された血小板易接着面２０２が設けられている。
【００２８】
図３Ａから図３Ｃは、マイクロチップ２の第２の例を示す模式図である。図３Ａは、マイクロチップ２の流路２０１となる溝が表面に形成された第１の基板２００の一例を示す平面図である。溝の断面形状は、凹字状、Ｕ字状、Ｖ字状等任意である。血小板凝集塊は脆いため、圧力上昇を測定するためには溝の深さは１０〜２００μｍ以下であることが望ましい。また、溝の幅は１０μｍ〜３ｍｍであることが好ましい。
【００２９】
そして、流路２０１の第１の端部（流入口側端部）と第２の端部（流出口側端部）の間の一部には、血液の流れる方向に沿って延在する複数の流路分割壁２０３が設けられ、該流路の幅を複数に分割する流路分割部２０４を形成する。すなわち、流路分割部２０４には、複数の流路分割壁２０３が櫛状に設けられている。
【００３０】
また、流路分割壁２０３の間隔は200μｍ以下であることが望ましい。幅が200μｍ以下であれば血小板凝集塊が形成された場合、高血流、高ずり応力下においても血流に飛ばされず内部圧力を上昇させることが可能である。また、流路分割部２０４において、流路２
０１の幅は流路分割壁２０３によって５つ以上に分割されていることが望ましい。すなわち、流路の幅が５本以上に分割されていれば、各分割流路の閉塞が平均化され、バラツキの少ないデータが得られやすい。第２の例に係るマイクロチップ２は、２５の流路分割壁２０３を有するものとする。
【００３１】
なお、流路分割壁２０３の形状は、流路２０１の幅を複数に分割できさえすれば特に制限されない。また、流路分割壁２０３は、血小板凝集塊の接着性を向上させるため、表面粗さ（中心線平均表面粗さ：Ra）が１０〜２００ｎｍになるような処理を施すようにしてもよい。
【００３２】
また、健常人の血液をマイクロチップの流路に一定の速度で流して流路分割部に血小板凝集塊を形成させたとき、血液の流入圧は約８０ｋPaまで上昇する。よってマイクロチップの耐圧性は８０ｋPa以上であることが好ましい。
【００３３】
なお、流路分割部２０４の上流、すなわち、流路分割壁２０３と第１の端部（流入口側端部）の間の一部には、流路の幅方向に所定の間隔で複数の柱状体（図示せず）が設置されていてもよい。複数の柱状体は、不純物流入防止部として働く。柱状体同士の間隔（隙間の長さ）は、血液は通過できるが、不純物は通過できない長さであればよいが、１０〜２００μｍが好ましい。柱状体の形状は特に制限されず、円柱、多角柱などが挙げられる。
【００３４】
図３Ｂは、マイクロチップ２の流入口２１１および流出口２１２となる貫通孔が設けられた第２の基板２１０の一例を示す平面図である。流入口２１１となる貫通孔および流出口２１２となる貫通孔の位置は、第１の基板２００と積層されたときに、それぞれ、第１の基板２００上の、流路２０１の第１の端部に相当する位置、流路２０１の第２の端部に相当する位置となっている。また、第２の基板２１０の裏面の、第１の基板２００と積層されたときに第１の基板２００上の流路分割壁２０３に被せられる位置に、コラーゲンのような血液の凝固因子をコーティングすることで血小板易接着面２０２（凝固因子コート部）が形成される。具体的には、コラーゲンは、図３Ｃに示す様に、流路分割壁２０３に被せられる位置に、安全を見て広幅に塗布される。なお、血小板易接着面は流路の全長に及んでもよい。
【００３５】
図３Ｃは、第１の基板２００の溝と第２の基板２１０の血小板易接着面２０２が内側になるように、第１の基板２００と第２の基板２１０が積層されたマイクロチップ２の一例を示す平面図である。破線は、流路２０１がマイクロチップ２の内部に存在することを示す。
【００３６】
マイクロチップ２の材質は、金属、ガラスやプラスチック、シリコーン等が好ましい。また、血液観測（特に画像解析）に使用する観点からは透明な材質が好ましい。さらに、回路を形成する観点からはプラスチックが好ましく、透明なプラスチックが特に好ましい。材質をＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等のシリコーン製とした場合には、基板同士の密着性に優れるため、第１の基板と第２の基板を接着剤などを用いずに圧着することで積層できる。ただし、マイクロチップ２の内部に高い圧力がかかる場合は、接着剤を用いることが好ましい。また、ポリ２−メトキシエチルアクリレート（ＰＭＥＡ）によっても簡便かつ効果的に意図しない部位での血液凝固を抑制する事が可能である。なお、マイクロチップの基板に設けられる溝や穴は、刃物やレーザー光線で形成することもできるが、マイクロチップ２の材質がプラスチックである場合は、射出成型で形成することもできる。射出成型で形成すれば、一定品質のマイクロチップが効率よく作成できる点で好ましい。
【００３７】
血液測定装置１によれば、流入圧力をポンプ１０２に接続された圧力センサ１０３によって測定することで、定量的な血液測定が可能となる。また、マイクロチップ２の流路２０１における血小板の活性化（血小板の粘着・凝集など）や、これに伴う流路２０１の閉塞をカメラ１０４で観察することでも血液測定を行うことができる。さらに、血液の流路２０１の通過時間または通過量を測定することによっても血液測定を行うことができる。
【００３８】
流路２０１の血小板活性化を撮影することによる視覚的評価、及び圧力上昇による血小板活性化の定量的検査の併用は、血液の状態を総合判断する上で重要である。例えば、DIC等の病態において血小板が生体内で既に活性化を受けるとともに血小板が消耗し著しく
減少しているケースにおいては、圧力上昇や閉塞時間は遅延される。そのようなケースにおいても、流路２０１をカメラ１０４により撮影することで、検査開始直後から血小板易接着面２０２への血小板の粘着及び凝集の上昇などを確認することができ、患者の血小板の状態を総合的に判断することが可能となる。
【００３９】
具体的には、本実施形態に係る血液測定装置１によれば、流入圧の経時的変化と血栓の面積の経時的変化とを記録及び出力することができる。ここで、血栓の面積は、血栓の量を表すものといえる。また、流入圧は、血栓の量だけでなく、強度や安定性といった血栓の質を表すものといえる。これらの変化を総合的に判断することで、例えば（１）血栓の安定性を低下させる薬剤や疾患、（２）血栓による塞栓症を防ぐ薬剤や疾患、及び（３）血栓形成そのものが抑制される薬剤や疾患を詳細に評価できるようになる。また、本実施形態に係る血液測定装置１は、カメラを移動させつつ撮影した複数の画像を平面的に合成し、広範囲が撮像された合成画像（いわゆるパノラマ画像）を生成する。このようにすれば、局所的な画像に基づいて血栓の量を測定するよりも再現性のある測定値が得られ、正確な分析を行うことができるようになる。
【００４０】
図４は、情報処理部１０６の一例を示す機能ブロック図である。図４の情報処理部１０６はいわゆるコンピュータであり、流入圧取得部１０６１と、情報記憶部１０６２と、画像取得部１０６３と、画像合成部１０６４と、面積算出部１０６５と、情報出力部１０６６とを有する。
【００４１】
流入圧取得部１０６１は、圧力センサ１０３が測定した圧力（流入圧）を取得し、情報記憶部１０６２に記憶させる。このとき、圧力値と時間経過とが対応付けられて記憶される。ここで、時間経過とは、測定した日時を示す情報であってもよいし、例えば処理開始時点など所定の基準時点からの経過時間であってもよい。
【００４２】
画像取得部１０６３は、カメラ１０４が撮像した画像データを取得し、情報記憶部１０６２に記憶させる。画像データも、時間経過と対応付けられて記憶される。ここで、カメラ１０４は、所定の周期で静止画又は動画を撮像する。なお、本実施の形態では、動画に含まれる複数のフレームの各々を画像（静止画）として扱う。また、駆動装置１０５がカメラ１０４の位置を移動させつつ、カメラ１０４が複数の画像データを生成する。例えば、第１の例に係るマイクロチップ２の場合、図５Ａの太線で示した領域１０４１が１つの画像データに収まる撮像範囲であるとする。このとき、カメラ１０４を流路２０１に沿って移動させながら、ハッチングの施された領域の画像データを継続的（周期的）に撮像する。また、第２の例に係るマイクロチップ２の場合、図５Ｂの太線で示した領域１０４１が１つの画像データに収まる撮像範囲であるとする。このとき、カメラ１０４を流路２０１の幅方向に沿って移動させながら、ハッチングの施された領域の画像データを継続的（周期的）に撮像する。また、ハッチングが施された領域をカバーする複数の画像データは、処理開始時点を基準として例えば１〜３分の周期で撮像する。このようにすれば、継続的に撮像された画像に基づいて、形成される血栓の経時的な変化を解析することができるようになる。
【００４３】
画像合成部１０６４は、被写体（「被撮像物」とも呼ぶ）であるマイクロチップ２の流路２０１の位置が少なくとも一部重なっている画像を処理対象として複数の画像を合成し、情報記憶部１０６２に記憶させる。なお、画像の合成方法は特に限定されないが、画素正規化相互相関方法で行うことが望ましい。各画像が所定の割合（例えば、約３分の１以上、好ましくは４分の３程度）重なるようにカメラを移動させつつ静止画を撮影し、合成する事も可能である。また、動画のフレームを合成する場合は、カメラの移動速度と単位時間あたりに撮影されるフレーム数（フレームレート）に基づいて、予めフレーム毎の移動距離を推定できる。よって、合成する画像が所定の割合程度重なるようにフレームを抽出し、画素正規化相互相関法を適用することも可能である。また、合成画像も、時間経過と対応付けられて記憶される。なお、合成画像は複数の画像を含むため、例えば最も早く撮像された画像の日時又は経過時間を時間経過として記憶させる。画像合成部１０６４は、図５Ａ及び図５Ｂにおけるハッチングの施された領域を表す合成画像を生成する。
【００４４】
面積算出部１０６５は、合成された画像から血栓を特定し、血栓が撮像されている領域の面積を算出し、情報記憶部１０６２に記憶させる。なお、面積は、合成画像又は時間経過と対応付けて記憶される。ここで、被撮像物であるマイクロチップ２の流路２０１には、赤色の血液領域と白色の血栓（白色血栓）領域とが撮像されている。面積算出部１０６５は、例えば、所定の閾値（２値化レベル）に基づいて画像の輝度が不連続な部分をエッジとして抽出し、血栓が撮像されている領域を特定するようにしてもよい。本実施形態に係るマイクロチップ２は、流路の端が黒く撮像される。流路の端にできる影（黒）の部分で明暗のギャップが発生するので、画像の解析において流路と白色血栓の境界を識別するために有効である。血栓の面積は、絶対的な値を算出するようにしてもよいし、流路全体に占める血栓の領域の割合を算出するようにしてもよい。血栓の面積は、例えば画像に含まれるピクセル数に基づいて算出する。このようにすれば、ユーザが画像を観察できるだけでなく、定量的な測定を行うことができるようになる。
【００４５】
また、情報出力部１０６６は、情報記憶部１０６２から情報を読み出し出力する。出力される情報は、圧力値の変化を示す情報及び血栓の面積の変化を示す情報である。また、流路の合成画像を表示するようにしてもよい。ユーザは、出力された情報に基づいて疾患や薬効を評価することができる。
【００４６】
図４に示した血液測定装置１は、例えば、コンピュータが所定のプログラムを実行することにより実現される。
【００４７】
＜装置構成＞
図６は、コンピュータの一例を示す装置構成図である。情報処理部１０６は、図６に示すようなコンピュータである。コンピュータは、ＣＰＵ（Central Processing Unit）１
００１、主記憶装置１００２、外部記憶装置１００３、通信ＩＦ（Interface）１００４
、入出力ＩＦ（Interface）１００５、ドライブ装置１００６、通信バス１００７を備え
ている。ＣＰＵ１００１は、プログラム（「ソフトウェア」又は「アプリケーション」とも呼ぶ）を実行することにより本実施の形態に係る処理等を行う。主記憶装置１００２は、ＣＰＵ１００１が読み出したプログラムやデータをキャッシュしたり、ＣＰＵの作業領域を展開したりする。主記憶装置は、具体的には、ＲＡＭ（Random Access Memory）やＲＯＭ（Read Only Memory）等である。外部記憶装置１００３は、ＣＰＵ１００１により実行されるプログラムや、本実施の形態で用いる情報などを記憶する。外部記憶装置１００３は、具体的には、ＨＤＤ（Hard-disk Drive）やＳＳＤ（Solid State Drive）、フラッシュメモリ等である。主記憶装置１００２や外部記憶装置１００３は、情報処理部１０６の情報記憶部１０６２として働く。通信ＩＦ１００４は、他のコンピュータとの間でデータを送受信する。通信ＩＦ１００４は、具体的には、有線又は無線のネットワークカード
等である。入出力ＩＦ１００５は、入出力装置と接続され、ユーザから入力を受け付けたり、ユーザへ情報を出力したりする。入出力装置は、具体的には、キーボード、マウス、ディスプレイ、各種センサ又はタッチパネル、圧力センサ１０３、カメラ１０４等である。ドライブ装置１００６は、磁気ディスク、光磁気ディスク、光ディスク等の記憶媒体に記録されたデータを読み出したり、記憶媒体にデータを書き込んだりする。以上のような構成要素が、通信バス１００７で接続されている。なお、これらの構成要素は複数設けられていてもよいし、一部の構成要素（例えば、通信ＩＦ１００４、ドライブ装置１００６）を設けないようにしてもよい。また、入出力装置はコンピュータと一体に構成されていてもよい。そして、ドライブ装置１００６で読み取り可能な可搬性の記憶媒体や、フラッシュメモリのような可搬性の外部記憶装置１００３、通信ＩＦ１００４などを介して、本実施の形態で実行されるプログラムが提供されるようにしてもよい。そして、ＣＰＵ１００１がプログラムを実行することにより、上記のようなコンピュータを、情報処理部１０６として働かせる。
【００４８】
＜記録処理＞
図７は、情報処理部１０６が行う記録処理の一例を示す処理フローである。情報処理部１０６の流入圧取得部１０６１は、圧力センサ１０３から継続的に圧力値を示すデータを受信し、情報記憶部１０６２に記憶させる（図７：Ｓ１）。また、情報処理部１０６の画像取得部１０６３は、所定の周期でカメラ１０４から画像データを取得し、情報記憶部１０６２に記憶させる（Ｓ２）。画像データは、例えば１〜３分毎に撮像が開始される。また、例えば図２に示した第１の例に係るマイクロチップ２の場合、流路２０１に沿ってカメラ１０４を平行移動させつつ継続的に画像を撮像する。図３に示した第２の例に係るマイクロチップ２の場合、流路２０１に垂直な方向（流路２０１の幅方向）に沿ってカメラ１０４を平行移動させつつ継続的に画像を撮像する。なお、Ｓ１及びＳ２は便宜的に順序をつけて説明したが、並行して（すなわち、マルチタスクで）実行するようにしてもよい。その後、情報処理部１０６は、処理を終了するか否か判断する（Ｓ３）。例えば、ユーザから入出力ＩＦを介して処理の終了が指示された場合、処理の開始から所定の時間が経過した場合、リザーバ１０１から血液の残量がなくなった場合等に処理を終了すると判断される。処理を終了すると判断された場合（Ｓ３：ＹＥＳ）、記録処理は終了される。一方、処理を終了しないと判断された場合（Ｓ３：ＮＯ）、Ｓ１に遷移して処理を繰り返す。
【００４９】
＜解析処理＞
図８は、情報処理部１０６が行う解析処理の一例を示す処理フローである。まず、情報処理部１０６の画像合成部１０６４は、画像を合成して情報記憶部１０６２に記憶させる（図８：Ｓ１１）。画像合成部１０６４は、被撮像物である流路２０１の位置が少なくとも一部重なっている画像を処理対象として複数の画像を合成し、情報記憶部１０６２に記憶させる。合成画像は、時間経過を示す情報と対応付けられて記憶される。本ステップに係る合成画像は、周期的に撮像された画像群の各々について生成される。よって、複数の合成画像に含まれる血栓の経時的変化から、血栓の量の増減がわかる。
【００５０】
画像の合成は、例えば図９Ａ及び図９Ｂのように一部の領域が重なるように撮影された画像を、画素正規化相互相関によって、図９Ｃのように画像の特徴の一致する部分を重ねて連結することにより行う。図９Ａから図９Ｃは、第１の例に係るマイクロチップ２を対象として、流路２０１の血流方向に沿って撮像された画像の例である。動画を撮影する場合は、カメラの移動速度と移動距離及び動画のフレーム数から、フレーム毎の移動距離を推定し、各フレームが所定割合程度重なるようにフレームを抽出することで、簡便且つ迅速に動画より連結した画像を作成することが可能である。このような連結を繰り返すことにより、流路の広範囲を観察できる合成画像が得られる。
【００５１】
また、第２の例に係るマイクロチップ２の場合は、流路２０１の幅方向に沿って撮像された複数の画像データを合成する。図１０に、第２の例に係るマイクロチップ２の場合の合成画像の一例を示す。図１０の例では、流路２０１に設けられた流路分割壁２０３の一端（血流方向の終端）がほぼ中心となるように、流路２０１の一部が撮像されている。なお、第１の例に係るマイクロチップ２の場合と同様に、血液部分と血栓部分との境界の形状に基づいて画像データを合成することができる。図１１は、実際に撮影された動画の１フレームである。この様に、動画では局所の血栓形成を詳細に観察することができる。また、図１０のように合成した画像で、全体の血栓形成の程度を確認することができる。局所の観察と全体の観察とにより、詳細な血栓形成の解析が可能となる。
【００５２】
次に、面積算出部１０６５は、合成された画像から血栓を特定し、血栓が撮像されている領域の面積を算出し、情報記憶部１０６２に記憶させる（Ｓ１２）。なお、面積は、合成画像又は時間経過と対応付けた記憶される。ここで、被撮像物であるマイクロチップ２の流路２０１には、赤色の血液領域と白色の血栓（白色血栓）領域とが撮像されている。面積算出部１０６５は、例えば、画像の輝度が不連続な部分をエッジとして抽出し、血栓が撮像されている領域を特定するようにしてもよい。血栓の面積は、絶対的な値を算出するようにしてもよいし、流路全体に占める血栓の領域の割合を算出するようにしてもよい。血栓の領域の割合は、例えば、流路全体のピクセル数に占める白色のピクセル数の割合として算出する。なお、流路の端部は、ＣＣＤカメラによって黒色の領域として撮像されるため、当該黒色の領域の内部を対象として面積を算出する。
【００５３】
そして、情報出力部１０６６は、情報記憶部１０６２から情報を読み出し出力する（Ｓ１３）。出力される情報は、圧力値の変化を示す情報及び血栓の面積の変化を示す情報である。また、流路の合成画像を表示するようにしてもよい。ユーザは、出力された情報に基づいて疾患や薬効を評価することができる。例えば、圧力値は、縦軸に圧力値、横軸に経過時間をとったグラフを描画して出力される。また、同一のグラフ上に血栓の面積の変化を表す折れ線グラフを重畳して表示してもよい。また、グラフ上の位置をカーソル等でポイントすることにより、当該位置に対応する経過時間における流路の合成画像を表示するようにしてもよい。
【００５４】
このような解析処理によれば、ユーザによる疾患及び薬効の評価を支援することができる。特に本実施形態では合成画像を用いて血栓の量を測定するため、局所的な画像に基づいて血栓の量を測定する場合よりも再現性のある測定値が得られ、正確な分析を行うことができるようになる。次に、疾患及び薬効の評価について説明する。
【００５５】
＜疾患及び薬効の評価＞
コラーゲンと組織因子をコートしたキャピラリーに、血液凝固第１２因子の阻害剤であるコーントリプシンインヒビター（CTI）を添加した血液を流し、フィブリンと血小板か
らなる混合白色血栓を形成させる。血液にGpIIb/IIIa受容体を抑制するアブシキマブ(Abciximab)を添加すると、血栓形成そのものが抑制されるため、濃度依存的に圧力上昇の開
始が遅延され、それに伴い圧力下部面積も抑制される。血栓形成自身が抑制されている為に、血栓面積も著しく抑制を受ける。
【００５６】
一方、血栓溶解剤であるt-PAを添加した血液を用いた場合には、血栓が形成され、圧力上昇は開始されるものの、その後、持続的な圧力上昇は起きない。よって、圧力上昇開始は大きく変化せず、圧力の下部面積が低下する。しかし、血栓面積の低下は限定的である。
また、VWF−GPIｂalphaとの結合が阻害される場合には、特に高ズリ応力下における血
栓形成が阻害を受け、キャピラリーの最終閉塞が特異的に阻害を受ける。例えば、フォンビルブランド病やべルナード症候群といった先天性の出血性疾患がこの場合に該当する。
この場合には、圧力上昇開始と圧力下部面積は共に延長されるために、アブシキマブと似た圧力データの抑制パターンが測定される。
【００５７】
しかしながら、アブシキマブは血栓面積を大きく抑制するのに対し、VWF-GPIbalpha阻
害時の血栓面積の低下は軽度である。このように圧力または血栓面積のみの解析では見分けることが困難な疾患や薬剤効果を、圧力及び血栓面積の解析を組み合わせる血液測定装置１を用いて識別・評価することが可能となる。
【００５８】
また、凝集抑制作用のあるアスピリンや、血栓溶解作用のあるｔ−ＰＡ等、血栓の強度や安定性を低下させる薬剤を用いた場合は、最大圧力が低下するが、血栓の面積の変化は少ない。また、ＶＷＤ（von Willebrand disease：ＶＷＦ（von Willebrand factor）欠
乏症）のように血栓形成による最終閉塞が強く抑制される疾患の場合は、圧力上昇開始が著しく遅延するが、血栓の面積の変化は少ない。また、GPIIb/IIIa阻害剤や血小板無力症（GP-2欠損症）等の血栓形成そのものが著しく阻害を受ける薬剤や疾患の場合は、圧力上昇開始及び血栓の面積の両者が著しく抑制される。
【００５９】
なお、薬効には個人差がある。例えば、複数の健常人、複数のアスピリン内服患者、並びに複数のアスピリン及びクロピドグレル併用者のそれぞれについて、流入圧（流路内圧）の経時的変化を観察した場合、アスピリン抵抗性のある患者及び抗血小板薬抵抗性のある患者の場合、流入圧はほとんど変化しない（下がらない）。
【００６０】
血液測定装置１は、流入圧及び血栓の面積をそれぞれ時間経過と対応付けて記憶し、出力することができる。すなわち、ユーザによる疾患又は薬効の詳細な評価を支援することができる。なお、圧力上昇開始の時間や、最大圧力、血栓の面積といったパラメータについて所定の閾値を予め設定しておき、疑われる疾患や薬効の有無を、測定された値と閾値とに基づいて血液測定装置１の情報処理部１０６が判断及び出力するようにしてもよい。
【実施例】
【００６１】
［実施例１］
幅３００μｍ、深さ８０μｍ、長さ１．５ｃｍのキャピラリーに、タイプIコラーゲン
（新田ゼラチン株式会社製）及び組織トロンボプラスチン（シスメックス株式会社製）をコートした。そして、キャピラリーに、ＣＴＩ（５０μｇ／ｍｌ）を添加した血液を、３０分間、４μｌ／ｍｉｎの流速でかん流し、血栓による圧力閉塞を連続的に測定した。
【００６２】
図１２は、血液サンプルをかん流した時の圧力パターンを示すグラフである。実線で示す（１）は、薬剤を添加しないコントロール血液の場合の圧力変化を示している。破線で示す（２）は、アブシキマブ（６μｇ／ｍｌ）を添加した血液サンプルをかん流した時の圧力変化を示している。一点鎖線で示す（３）は、ｔ−ＰＡ（６０００ＩＵ／ｍｌ）を添加した血液サンプルをかん流した時の圧力変化を示している。二点鎖線で示す（４）は、ＧＰＩｂ阻害剤：ＯＳ−１（１６００ｎＭ）を添加した血液サンプルをかん流した時の圧力変化を示している。
【００６３】
コントロール血液（１）と比較して圧力波形を解析すると、（２）及び（４）は、圧力上昇が完全に抑制され、非常に似た圧力パターンをとることがわかる。一方、（３）は、圧力上昇開始は大きく変化せず、その後、血栓崩壊によって圧力上昇速度が抑制されていることがわかる。
【００６４】
また、血栓面積を算出するため、カメラを０．２ｍｍ／秒の速度でキャピラリーに沿って移動させ、コラーゲン及び組織トロンボプラスチンのコーティング部分の動画を撮影した。なお、動画のフレームレートは、２９．２フレーム／秒とした。また、撮影の周期は
３分ごととした。そして、撮影した動画から、１フレーム毎に静止画を抽出し、画素単位で正規化相関によって静止画を合成画像として再構成した。図１３は、測定開始６分後の合成画像の一例である。このような合成画像から、キャピラリー外領域を除き、キャピラリー内部分に関して閾値として設定した２値化レベルにて白色血栓部分の縁辺を抽出した。その後、キャピラリー内全体における白色血栓の割合を算出し、血栓面積とした。図１２と同様の血液サンプル（１）から（４）について、測定開始６分後の血栓面積の割合を表１に示す。
【００６５】
【表１】
2015090293.tif 000003
表１からわかるように、（２）は血栓面積が著しく抑制されているが、（３）及び（４）は血栓面積の低下が限定的である。一方、図１２からわかるように、圧力上昇では（２）及び（４）の区別がつかない。また、表１に示すように、血栓面積では、（３）及び（４）の区別が付きにくい。しかし、血液測定装置１によれば、血栓による圧力測定及び血栓面積算出を組み合わせて、定量的に且つ総合的に評価することができ、血栓の特徴を詳細に解析する事が可能となった。すなわち、本システムでは、血栓強度と、血栓量とを用いることによって、ユーザは、上記の血液サンプル（１）から（４）を区別できるようになった。
【００６６】
［実施例２］
実施例２では、幅２ｍｍ、深さ４０μｍのキャピラリーに、流路分割部として、幅４０μｍの流路を等間隔に２５本、櫛状に設置した。また、流路分割部にはコラーゲンをコートした。そして、１８ｕｌ／ｍｉｎの流速で５０μｇ／ｍｌのヒルジンを添加した血液をかん流させた。図１４は、血液サンプルをかん流した時の圧力パターンを示すグラフである。図１４において実線で示した血液サンプル（１）は、添加なしのコントロール血液の圧力変化を示している。破線で示した血液サンプル（２）は、アスピリン（２００ｕｇ／ｍｌ）添加血液である。一点鎖線で示した血液サンプル（３）は、ＯＳ−１（１００ｎＭ）添加血液の圧力波形である。図１４に示すように、アスピリン（２）とＯＳ−１（３）の場合は、コントロール血液（１）の場合よりも圧力の上昇が抑制された。
【００６７】
また、３０秒ごとに、キャピラリーの血流に垂直な方向に０．２ｍｍ／秒の速度でカメラを移動させつつ、櫛部分を対象として動画を撮影した。なお、動画のフレームレートは、２９．２フレーム／秒とした。また、動画から、１フレーム毎に静止画を抽出し、画素単位で正規化相関によって合成画像を再構成した。
【００６８】
図１５は、測定開始３分後のコントロール血液（１）を撮影した画像である。図１６は、測定開始３分後のアスピリン添加血液（２）を撮影した画像である。図１７は、測定開始３分後のＯＳ−１添加血液（３）を撮影した画像である。また、図１８から図２０は、それぞれ血液サンプル（１）から（３）の合成画像である。
【００６９】
画像を解析すると、コントロール血液（１）及びアスピリン添加血液（２）では、キャ
ピラリー全体に血小板血栓が形成され、明確な違いは見られないことがわかる。また、ＯＳ−１添加血液（３）の合成画像からは、血栓の状態の詳細が分かりにくい。ＯＳ−１添加血液（３）に関しては、合成前の動画を解析することにより、血栓が形成されるが最終的なキャピラリーの閉塞が抑制されていることが分かる。
【００７０】
このように、本システムでは、拡大した局所の血栓の画像又は動画と、キャピラリー全体の合成画像とを用いることによって、ユーザは血栓形成の特徴を把握することができるようになった。また、圧力波形と組み合わせることで、詳細な抗血小板薬の作用機序や疾患の特徴を識別する事が可能となった。
【００７１】
＜その他＞
なお、キナクリン等によって血小板を蛍光標識して解析することもでき、その場合、蛍光発色による単位面積あたりの輝度を画像解析で測定することで測定結果を数値化し、データとして取得することが可能である。
【００７２】
また、マイクロチップ２は図示していないヒーターの上に載置するようにしてもよい。ヒーターによってマイクロチップ２を３７℃程度に加温すれば、生体内に近い条件で測定処理を行うことができる。
【００７３】
上記の実施形態では、血液部分と血栓部分との境界の形状に基づいて画像データを合成するものと説明したが、画像データの合成はこのような方法には限定されない。例えば、血栓があまり発生しない場合、合成の基準となる特徴の変化がはっきりと表れないこともある。駆動装置１０５によりカメラ１０４が移動させられる速度と画像データを撮像する周期とに基づいて、画像データ間の対応する位置を特定し、画像データを合成するようにしてもよい。
【符号の説明】
【００７４】
１      血液測定装置
１０１      リザーバ
１０２      ポンプ
１０３      圧力センサ
１０４      カメラ
１０５      駆動装置
１０６      情報処理部
１０７      排出管
２      マイクロチップ
２００      第１の基板
２０１      流路
２０２      血小板易接着面
２０３      流路分割壁
２０４      流路分割部
２１０      第２の基板
２１１      流入口
２１２      流出口
【図１】
2015090293.tif 000004
【図２Ａ】
2015090293.tif 000005
【図２Ｂ】
2015090293.tif 000006
【図２Ｃ】
2015090293.tif 000007
【図３Ａ】
2015090293.tif 000008
【図３Ｂ】
2015090293.tif 000009
【図３Ｃ】
2015090293.tif 000010
【図４】
2015090293.tif 000011
【図５Ａ】
2015090293.tif 000012
【図５Ｂ】
2015090293.tif 000013
【図６】
2015090293.tif 000014
【図７】
2015090293.tif 000015
【図８】
2015090293.tif 000016
【図９Ａ】
2015090293.tif 000017
【図９Ｂ】
2015090293.tif 000018
【図９Ｃ】
2015090293.tif 000019
【図１０】
2015090293.tif 000020
【図１２】
2015090293.tif 000021
【図１１】
2015090293.tif 000022
【図１３】
2015090293.tif 000023
【図１４】
2015090293.tif 000024
【図１５】
2015090293.tif 000025
【図１６】
2015090293.tif 000026
【図１７】
2015090293.tif 000027
【図１８】
2015090293.tif 000028
【図１９】
2015090293.tif 000029
【図２０】
2015090293.tif 000030