(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞内の炭酸脱水素酵素（ＣＡ）を検出するための新規な蛍光プローブ化合物、当該蛍光プローブを用いた検出方法、及び当該プローブを含む検出キットの提供。【解決手段】式（Ｉ）で表されるスルホンアミド基含有化合物又はその塩を含む、炭酸脱水素酵素の検出用蛍光プローブ。2015231364.tif 000085【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表されるスルホンアミド基含有化合物又はその塩を含む、炭酸脱水素酵素の検出用蛍光プローブ：
【化１】
2015231364.tif 000083
【化２】
2015231364.tif 000084
〔式中、
Ａは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、又はＳｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表し（ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表す）；
Ｘ１は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又は置換されていてもよいアルキル基を表し；
Ｘ２は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又は置換されていてもよいアルキル基を表し；
Ｘ３は、カルボキシル基、スルホニル基、置換されていてもよいアルキル基又はアルコキシ基よりなる群から独立に選択される１又は２個の同一又は異なる置換基を表し；
Ｙは、それぞれ独立に水素原子、置換されていてもよいアルキル基、又はアルカノイル基を表し、ここで、Ｙは、式中のスルホンアミド基が結合するベンゼン環又はＡｒ上の炭素原子と一緒になって、Ｙが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよく；
Ａｒは、置換されていてもよいアリールを表し；
Ｒは、水素原子、ハロゲン原子、又はそれぞれ置換されていてもよいアルキル基、アルコキシ基、アミド基、アリール、及びヘテロアリールよりなる群から独立に選択される１〜４個の同一又は異なる置換基を表し：及び
Ｒ’は、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を表す。〕
【請求項２】
Ａが、酸素原子である、請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
式（Ｉ）におけるスルホンアミド基が、ベンゼン環の３位又は４位に連結している、請求項１又は２に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
Ｒが、炭素数が１〜５のハロゲン化アルキルである、請求項１〜３のいずれか１に記載の蛍光プローブ。
【請求項５】
Ｘ２が、いずれもハロゲン原子である、請求項１〜４のいずれか１に記載の蛍光プローブ。
【請求項６】
Ｘ３が、２個であり、いずれもカルボキシル基である、請求項１〜５のいずれか１に記載の蛍光プローブ。
【請求項７】
前記炭酸脱水素酵素が、ＣＡ−Ｉ又はＣＡ−ＩＸである、請求項１〜６のいずれか１に記載の蛍光プローブ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１に記載の蛍光プローブを用いる、炭酸脱水素酵素の検出方法。
【請求項９】
前記炭酸脱水素酵素と前記蛍光プローブとを生体外において接触させる工程、及び前記炭酸脱水素酵素と前記蛍光プローブとの反応による蛍光応答を観測することにより前記炭酸脱水素酵素の存在を検出する工程を含むことを特徴とする、請求項７に記載の検出方法。
【請求項１０】
蛍光イメージング手段を用いて前記蛍光応答を可視化することを特徴とする、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１に記載の蛍光プローブを含む、炭酸脱水素酵素を検出又は可視化するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内の炭酸脱水素酵素（ＣＡ）を検出するための新規な蛍光プローブ化合
物、当該蛍光プローブを用いた検出方法、及び当該プローブを含む検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
炭酸脱水素酵素（ＣＡ：Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ或いはＣａｒｂｏｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）は、胃酸分泌、水性体液及び脳脊髄液形成、膵臓の重炭酸塩分泌、中間代謝、石灰化等の様々な生理的機能を有する複数種類のサブタイプが存在する（特許文献１等）。例えば、炭酸脱水素酵素Ｉ（ＣＡ−Ｉ、ＣＡ１）は、網膜浮腫や脳浮腫の原因となる網膜や大脳の血管透過性を上げることが報告されている。また、炭酸脱水素酵素ＩＸ（ＣＡ−ＩＸ、ＣＡ９）はある種のがんにおいて発現が亢進しているタンパク質として１９９０年代に報告され、その後、低酸素環境に応じて発現が誘導されることが明らかとなっている。そのため現在、ＣＡ−ＩＸは低酸素環境のマーカー、あるいはがんのバイオマーカーとして重要と考えられている。
【０００３】
これらの炭酸脱水素酵素を検出するための最も一般的な手法は免疫染色法であるが、通常、免疫染色を行う際には組織の固定が必要なため生きたままの状態で観察を行うことは困難である。これに対し、組織の固定を必要としない蛍光色素も報告されているが、従来の染色用蛍光色素では蛍光のｏｆｆ／ｏｎが制御されていないため、生細胞イメージングにおいては細胞の洗浄操作等の前処理を行なう必要があった。特に、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングにおいては、観測対象全体に分布した蛍光色素がバックグラウンドシグナルとなるため、その排泄を待つ必要がある等、実用面において課題が残されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−１４１２８３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、炭酸脱水素酵素との結合により初めて蛍光シグナルがｏｎとなる蛍光プローブ分子を開発することにより、前処理としてプローブの洗浄操作やプローブの排泄を待つ必要がない新規な炭酸脱水素酵素検出試薬を提供することを課題とするものである。
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、キサンテン環３，６位のヘテロ原子に結合した芳香環を有するキサンテン系蛍光色素において、炭酸脱水素酵素への結合性を示すスルホンアミド基を芳香環に導入したところ、炭酸脱水素酵素との結合により選択的に当該蛍光色素の蛍光量子収率が大きく上昇することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、一態様において、
（１）以下の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表されるスルホンアミド基含有化合物又はその塩を含む、炭酸脱水素酵素の検出用蛍光プローブ：
【化１】
2015231364.tif 000002
【化２】
2015231364.tif 000003
〔式中、
Ａは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、又はＳｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表し（ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表す）；
Ｘ１は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又は置換されていてもよいアルキル基を表し；
Ｘ２は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又は置換されていてもよいアルキル基を表し；
Ｘ３は、カルボキシル基、スルホニル基、置換されていてもよいアルキル基又はアルコキシ基よりなる群から独立に選択される１又は２個の同一又は異なる置換基を表し； 
Ｙは、それぞれ独立に水素原子、置換されていてもよいアルキル基、又はアルカノイル基を表し；ここで、Ｙは、式中のスルホンアミド基が結合するベンゼン環又はＡｒ上の炭素原子と一緒になって、Ｙが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよく；
Ａｒは、置換されていてもよいアリールを表し；
Ｒは、水素原子、ハロゲン原子、又はそれぞれ置換されていてもよいアルキル基、アルコキシ基、アミド基、アリール、及びヘテロアリールよりなる群から独立に選択される１〜４個の同一又は異なる置換基を表し；及び
Ｒ’は、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を表す。〕
を提供するものである。
【０００８】
本発明は、好ましい態様において、
（２）Ａが、酸素原子である、上記（１）に記載の蛍光プローブ；
（３）式（Ｉ）におけるスルホンアミド基が、ベンゼン環の３位又は４位に連結している、上記（１）又は
（２）に記載の蛍光プローブ；
（４）Ｒが、炭素数が１〜５のハロゲン化アルキルである、上記（１）〜（３）のいずれか１に記載の蛍光プローブ；
（５）Ｘ２が、いずれもハロゲン原子である、上記（１）〜（４）のいずれか１に記載の蛍光プローブ；及び
（６）Ｘ３が、２個であり、いずれもカルボキシル基である、請求項１〜５のいずれか１に記載の蛍光プローブ。
（７）前記炭酸脱水素酵素が、ＣＡ−Ｉ又はＣＡ−ＩＸである、上記（１）〜（６）のいずれか１に記載の蛍光プローブ
を提供するものである。
【０００９】
また、別の側面において、本発明は、
（８）上記（１）〜（７）のいずれか１に記載の蛍光プローブを用いる、炭酸脱水素酵素の検出方法；
（９）前記炭酸脱水素酵素と前記蛍光プローブとを生体外において接触させる工程、及び前記炭酸脱水素酵素と前記蛍光プローブとの反応による蛍光応答を観測することにより前記炭酸脱水素酵素の存在を検出する工程を含むことを特徴とする、上記（８）に記載の検出方法；
（１０）蛍光イメージング手段を用いて前記蛍光応答を可視化することを特徴とする、上記（９）に記載の検出方法
を提供するものである。
【００１０】
更なる側面において、本発明は、
（１１）上記（１）〜（７）のいずれか１に記載の蛍光プローブを含む、炭酸脱水素酵素を検出又は可視化するためのキットを提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の蛍光プローブは、炭酸脱水素酵素と非結合時には、励起状態において電荷分離状態（ＴＩＣＴ状態）を取り蛍光量子収率が非常に低く抑えられているのに対し（蛍光ｏｆｆ）、炭酸脱水素酵素と結合することによって選択的に大きな蛍光量子収率の上昇（蛍光ｏｎ）を示すものである。従って、本発明によれば、生細胞内において洗浄操作等の前処理を行うことなく、炭酸脱水素酵素を検出することが可能であり、従来の免疫染色法やウェスタンブロットよりもより簡便に、かつ既存の炭酸脱水素酵素検出蛍光試薬よりもコントラスト良く検出することが可能となる。
【００１２】
また、構造修飾を行うことにより特定のサブタイプに特異的な蛍光プローブの設計も容易に行うことができ、キサンテン環１０位の酸素原子をケイ素原子等に置換することでマルチカラー化も可能である。開発したプローブの基礎研究上、産業上の利用価値、経済効果は極めて大きいものといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１−aは、本発明の蛍光プローブである「ＳＡＲｏｄｏｌ−１」の構造及び光物理的特性を示すものである。図１−ｂ及びｃは、それぞれ炭酸脱水素酵素（ＣＡ１又はＣＡ９）添加に伴うＳＡＲｏｄｏｌ−１の蛍光スペクトル変化及び吸収スペクトル変化を示したグラフである。
【図２】図２−aは、本発明の蛍光プローブである「ＳＡＲｏｄｏｌ−５」の構造及び光物理的特性を示すものである。図２−ｂ及びｃは、それぞれ炭酸脱水素酵素（ＣＡ１又はＣＡ９）添加に伴うＳＡＲｏｄｏｌ−５の蛍光スペクトル変化及び吸収スペクトル変化を示したグラフである。図２−ｄは、ＣＡ１の非存在化（−）及び存在化（＋）におけるＳＡＲｏｄｏｌ−５の蛍光イメージングを行った結果を示す画像である。図２−ｅは、ＳＡＲｏｄｏｌ−５の蛍光ピーク波長（５５０ｎｍ）の強度変化のＣＡ１濃度依存性をプロットしたグラフである。
【図３】図３−aは、本発明の蛍光プローブである「ＳＡＲｏｄｏｌ−１４」の構造及び光物理的特性を示すものである。図３−ｂ及びｃは、それぞれ炭酸脱水素酵素（ＣＡ１又はＣＡ９）添加に伴うＳＡＲｏｄｏｌ−１４の蛍光スペクトル変化及び吸収スペクトル変化を示したグラフである。
【図４】図４−aは、本発明の蛍光プローブである「ＢｎＳＡＲｈｏｄｏｌ−２」の構造及び光物理的特性を示すものである。図４−ｂ及びｃは、それぞれ炭酸脱水素酵素（ＣＡ１又はＣＡ９）添加に伴うＢｎＳＡＲｈｏｄｏｌ−２の蛍光スペクトル変化及び吸収スペクトル変化を示したグラフである。
【図５】図５−aは、本発明の蛍光プローブである「ＢｎＳＡＲｈｏｄｏｌ−２−ｗｓ１」の構造及び光物理的特性を示すものである。図５−ｂ及びｃは、それぞれ炭酸脱水素酵素（ＣＡ１、ＣＡ２、又はＣＡ９）添加に伴うＢｎＳＡＲｈｏｄｏｌ−２−ｗｓ１の蛍光スペクトル変化及び吸収スペクトル変化を示したグラフである。
【図６】図６は、本発明の蛍光プローブである「ＳＡＲｈｏｄｏｌ−５」を用いたＣＢＣ染色（左図）及び蛍光イメージ（右図）を示すものである。
【図７】図７は、本発明の蛍光プローブである「ＢｎＳＡＲｈｏｄｏｌ−２−ｗｓ１」によるＡ５４９細胞の共焦点蛍光イメージである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１５】
１．定義
本明細書中において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を意味する。
【００１６】
本明細書中において、「アルキル」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜２０個（Ｃ１〜２０）、炭素数３〜１５個（Ｃ３〜１５）、炭素数５〜１０個（Ｃ５〜１０）である。炭素数を指定した場合は、その数の範囲の炭素数を有する「アルキル」を意味する。例えば、Ｃ１〜８アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等が含まれる。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を1個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルコシ基、アリールアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
【００１７】
本明細書において、ある官能基について「置換基を有していてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基、ジアルキルアミノ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１８】
本明細書中において、「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有している直鎖又は分枝鎖の炭化水素基をいう。例えば、その非限定的な例として、ビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタンジエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１，３−ペンタンジエニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル及び１，４−ヘキサンジエニル）を含む。二重結合についてシス配座またはトランス配座のいずれであってもよい。
【００１９】
本明細書中において、「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有している直鎖又は分枝鎖の炭化水素基をいう。例えば、その非限定的な例として、エチニル、プロピニル、２−ブチニルおよび３−メチルブチニルなどがあるを含む。
【００２０】
本明細書中において、「シクロアルキル」は、上記のアルキルよりなる単環または多環式の非芳香環系をいう。当該シクロアルキルは、置換されていないか同一もしくは異なっても良い１以上の置換基によって置換されていることができ、単環式シクロアルキルの非限定的な例には、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチルなどがあり、多環式のシクロアルキルの非限定的な例には、１−デカリニル、２−デカリニル、ノルボルニル、アダマンチルなどが挙げられる。また、当該シクロアルキルは、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含むヘテロシクロアルキルであってもよい。ヘテロシクロアルキル環中の任意の−ＮＨは、例えば−Ｎ（Ｂｏｃ）基、−Ｎ（ＣＢｚ）基および−Ｎ（Ｔｏｓ）基としてのように保護されていてもよく、環中の窒素原子または硫黄原子が対応するＮ−オキシド、Ｓ−オキシドまたはＳ，Ｓ−ジオキシドへ酸化されたものであってもよい。例えば、単環式ヘテロシクロアルキルの非限定的な例には、ジアザパニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリジニル、１，４−ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオフェニル、ラクタムおよびラクトン等が挙げられる。
【００２１】
本明細書中において、「シクロアルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、単環または多環式の非芳香環系をいう。当該シクロアルケニルは、置換されていないか同一もしくは異なっても良い１以上の置換基によって置換されていることができ、単環式のシクロアルケニルの非限定的な例には、シクロペンテニル、シクロヘキセニルおよびシクロヘプタ−１，３−ジエニルなどがあり、多環式のシクロアルケニルの非限定的な例には、ノルボルニレニル等が挙げられる。また、当該シクロアルキルは、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含むヘテロシクロアルケニルであってもよいヘテロシクロアルケニル環中の窒素原子または硫黄原子を、対応するＮ−オキシド、Ｓ−オキシドまたはＳ，Ｓ−ジオキシドへ酸化してもよい。
【００２２】
本明細書中において、「アリール」は単環式又は縮合多環式の芳香族炭化水素基のいずれであってもよく、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含む芳香族複素環であってもよい。この場合、これを「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」と呼ぶ場合もある。アリールが単環および縮合環のいずれである場合も、すべての可能な位置で結合しうる。単環式のアリールの非限定的な例としては、フェニル基（Ｐｈ）、チエニル基（２−又は３−チエニル基）、ピリジル基、フリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ピラゾリル基、２−ピラジニル基、ピリミジニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピリダジニル基、３−イソチアゾリル基、３−イソオキサゾリル基、１，２，４−オキサジアゾール−５−イル基又は１，２，４−オキサジアゾール−３−イル基等が挙げられる。縮合多環式のアリールの非限定的な例としては、１−ナフチル基、２−ナフチル基、１−インデニル基、２−インデニル基、２，３−ジヒドロインデン−１−イル基、２，３−ジヒドロインデン−２−イル基、２−アンスリル基、インダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、１，２−ジヒドロイソキノリル基、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリル基、インドリル基、イソインドリル基、フタラジニル基、キノキサリニル基、ベンゾフラニル基、２，３−ジヒドロベンゾフラン−１−イル基、２，３−ジヒドロベンゾフラン−２−イル基、２，３−ジヒドロベンゾチオフェン−１−イル基、２，３−ジヒドロベンゾチオフェン−２−イル基、ベンゾチアゾリル基、ベンズイミダゾリル基、フルオレニル基又はチオキサンテニル基等が挙げられる。本明細書において、アリール基はその環上に任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アリール基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アリール部分を含む他の置換基（例えばアリールオキシ基やアリールアルキル基など）のアリール部分についても同様である。
【００２３】
本明細書中において、「アリールアルキル」は、上記アリールで置換されたアルキルを表す。アリールアルキルは、任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アシル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい
。アリールアルキルの非限定的な例としては、ベンジル基、２−チエニルメチル基、３−チエニルメチル基、２−ピリジルメチル基、３−ピリジルメチル基、４−ピリジルメチル基、２−フリルメチル基、３−フリルメチル基、２−チアゾリルメチル基、４−チアゾリルメチル基、５−チアゾリルメチル基、２−オキサゾリルメチル基、４−オキサゾリルメチル基、５−オキサゾリルメチル基、１−ピラゾリルメチル基、３−ピラゾリルメチル基、４−ピラゾリルメチル基、２−ピラジニルメチル基、２−ピリミジニルメチル基、４−ピリミジニルメチル基、５−ピリミジニルメチル基、１−ピロリルメチル基、２−ピロリルメチル基、３−ピロリルメチル基、１−イミダゾリルメチル基、２−イミダゾリルメチル基、４−イミダゾリルメチル基、３−ピリダジニルメチル基、４−ピリダジニルメチル基、３−イソチアゾリルメチル基、３−イソオキサゾリルメチル基、１，２，４−オキサジアゾール−５−イルメチル基又は１，２，４−オキサジアゾール−３−イルメチル基等が挙げられる。
【００２４】
同様に、本明細書中において、「アリールアルケニル」は、上記アリールで置換されたアルケニルを表す。
【００２５】
本明細書中において、「アルコキシ基」とは、前記アルキル基が酸素原子に結合した構造であり、例えば直鎖状、分枝状、環状又はそれらの組み合わせである飽和アルコキシ基が挙げられる。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、シクロプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、シクロブトキシ基、シクロプロピルメトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロプロピルエチルオキシ基、シクロブチルメチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロプロピルプロピルオキシ基、シクロブチルエチルオキシ基又はシクロペンチルメチルオキシ基等が好適な例として挙げられる。
【００２６】
本明細書中において、「アリールオキシ基」とは、前記アリール基が酸素原子を介して結合する基である。アリールオキシ基としては、例えば、フェノキシ基、２−チエニルオキシ基、３−チエニルオキシ基、２−ピリジルオキシ基、３−ピリジルオキシ基、４−ピリジルオキシ基、２−フリルオキシ基、３−フリルオキシ基、２−チアゾリルオキシ基、４−チアゾリルオキシ基、５−チアゾリルオキシ基、２−オキサゾリルオキシ基、４−オキサゾリルオキシ基、５−オキサゾリルオキシ基、１−ピラゾリルオキシ基、３−ピラゾリルオキシ基、４−ピラゾリルオキシ基、２−ピラジニルオキシ基、２−ピリミジニルオキシ基、４−ピリミジニルオキシ基、５−ピリミジニルオキシ基、１−ピロリルオキシ基、２−ピロリルオキシ基、３−ピロリルオキシ基、１−イミダゾリルオキシ基、２−イミダゾリルオキシ基、４−イミダゾリルオキシ基、３−ピリダジニルオキシ基、４−ピリダジニルオキシ基、３−イソチアゾリルオキシ基、３−イソオキサゾリルオキシ基、１，２，４−オキサジアゾール−５−イルオキシ基、又は１，２，４−オキサジアゾール−３−イルオキシ基等が例示される。
【００２７】
本明細書中において、「アルキレン」とは、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素からなる二価の基であり、例えば、メチレン、１−メチルメチレン、１，１−ジメチルメチレン、エチレン、１−メチルエチレン、１−エチルエチレン、１，１−ジメチルエチレン、１，２−ジメチルエチレン、１，１−ジエチルエチレン、１，２−ジエチルエチレン、１−エチル−２−メチルエチレン、トリメチレン、１−メチルトリメチレン、２−メチルトリメチレン、１，１−ジメチルトリメチレン、１，２−ジメチルトリメチレン、２，２−ジメチルトリメチレン、１−エチルトリメチレン、２−エチルトリメチレン、１，１−ジエチルトリメチレン、１，２−ジエチルトリメチレン、２，２−ジエチルトリメチレン、２−エチル−２−メチルトリメチレン、テトラメチレン、１−メチルテトラメチレン、２−メチルテトラメチレン、１，１−ジメチルテトラメチレン、１，２−ジメチルテトラメチレン、２，２−ジメチルテトラメチレン、２，２−ジ−ｎ−プロピルトリメチレン等が挙げられる。
【００２８】
本明細書中において、「アルケニレン」とは、直鎖状または分枝状の少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有している不飽和炭化水素からなる二価の基であり、例えば、エテニレン、１−メチルエテニレン、１−エチルエテニレン、１，２−ジメチルエテニレン、１，２−ジエチルエテニレン、１−エチル−２−メチルエテニレン、プロペニレン、１−メチル−２−プロペニレン、２−メチル−２−プロペニレン、１，１−ジメチル−２−プロペニレン、１，２−ジメチル−２−プロペニレン、１−エチル−２−プロペニレン、２−エチル−２−プロペニレン、１，１−ジエチル−２−プロペニレン、１，２−ジエチル−２−プロペニレン、１−ブテニレン、２−ブテニレン、１−メチル−２−ブテニレン、２−メチル−２−ブテニレン、１，１−ジメチル−２−ブテニレン、１，２−ジメチル−２−ブテニレン等が挙げられる。
【００２９】
本明細書中において、「アリーレン」及び「アリールアルキレン」は、それぞれ上記「アリール」及び「アリールアルキル」に基づく二価の基を意味する。同様に、「オキシアルキレン」及び「アリーレンオキシ」は、それぞれ上記「アルコキシ」及び「アリールオキシ」に基づく二価の基を意味する。
【００３０】
本明細書中において、「アルキルアミノ」及び「アリールアミノ」は、−ＮＨ２基の水素原子が上記アルキル又はアリールの１又は２で置換されたアミノ基を意味する。例えば、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ベンジルアミノ等が挙げられる。同様に、「アルキルチオ」及び「アリールチオ」は、−ＳＨ基の水素原子が上記アルキル又はアリールで置換された基を意味する。例えば、メチルチオ、エチルチオ、ベンジルチオ等が挙げられる。
【００３１】
本明細書中において用いられる「アミド」とは、ＲＮＲ’ＣＯ−（Ｒ＝アルキルの場合、アルカミノカルボニル−）およびＲＣＯＮＲ’−（Ｒ＝アルキルの場合、アルキルカルボニルアミノ−）の両方を含む。
【００３２】
本明細書中において用いられる「エステル」とは、ＲＯＣＯ−（Ｒ＝アルキルの場合、アルコキシカルボニル−）およびＲＣＯＯ−（Ｒ＝アルキルの場合、アルキルカルボニルオキシ−）の両方を含む。
【００３３】
本明細書中において、「環構造」という用語は、二つの置換基の組み合わせによって形成される場合、複素環または炭素環基を意味し、そのような基は飽和、不飽和、または芳香族であることができる。従って、上記において定義した、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、及びヘテロアリールを含むものである。例えば、シクロアルキル、フェニル、ナフチル、モルホリニル、ピペルジニル、イミダゾリル、ピロリジニル、およびピリジルなどが挙げられる。本明細書中において、置換基は、別の置換基と環構造を形成することができ、そのような置換基同士が結合する場合、当業者であれば、特定の置換、例えば水素への結合が形成されることを理解できる。従って、特定の置換基が共に環構造を形成すると記載されている場合、当業者であれば、当該環構造は通常の化学反応によって形成することができ、また容易に生成することを理解できる。かかる環構造およびそれらの形成過程はいずれも、当業者の認識範囲内である。
【００３４】
２．本発明の炭酸脱水素酵素検出用蛍光プローブ
本発明の蛍光プローブは、キサンテン系蛍光色素におけるキサンテン環３，６位のヘテロ原子に連結する芳香環を有し、当該芳香環に炭酸脱水素酵素への結合性を示すスルホンアミド基を導入した構造を有することを特徴とするものであって、一態様において、以下の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される構造を有する化合物を含むものである。
【化３】
2015231364.tif 000004
【化４】
2015231364.tif 000005
【００３５】
上記式（Ｉ）において、Ａは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、又はＳｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）をを表す。ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表す。Ｒａ及びＲｂが、アルキル基である場合、それらは１以上の置換基を有することができ、そのような置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基などを１個又は２個以上有していてもよい。Ｒａ及びＲｂは、いずれもメチル基であることが好ましい。また、場合によっては、Ｒａ及びＲｂは互いに結合して環構造を形成していてもよい。例えば、Ｒａ及びＲｂがともにアルキル基である場合に、Ｒａ及びＲｂが互いに結合してスピロ炭素環を形成することができる。形成される環は、例えば５ないし８員環程度であることが好ましい。Ａは、好ましくは、酸素原子又はＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）であり、より好ましくは酸素原子である。
【００３６】
各Ｘ１は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又は置換されていてもよいアルキル基を表す。好ましくは、いずれも水素原子である。
【００３７】
各Ｘ２は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又は置換されていてもよいアルキル基を表す。好ましくは、いずれもハロゲン原子であり、より好ましくはＣｌである。
【００３８】
Ｘ３は、カルボキシル基、スルホニル基、置換されていてもよいアルキル基又はアルコキシ基よりなる群から独立に選択される１又は２個の同一又は異なる置換基を表す。Ｘ３は、好ましくは、メチル基、エチル基、メトキシ基、スルホニル基、又はカルボキシル基であり、より好ましくは、カルボキシル基である。当該カルボキシル基は、それが結合するベンゼン環における２位又は６位の位置に存在することが好ましい。また、ベンゼン環上にカルボキシル基が２つ存在すること、すなわち、Ｘ３が、２個であり、いずれもカルボキシル基であることが好ましい。その場合、２つのカルボキシル基は、互いにパラ位の配置となることが好ましい。必ずしも理論に拘束されるものではないが、ベンゼン環上に２つのカルボキシル基を有することにより、プローブ分子が観測対象である細胞の内部にまで侵入することを抑制し、細胞膜上の存在する炭酸脱水素酵素との反応性が向上することが期待できる。
【００３９】
Ｙは、炭酸脱水素酵素への結合基であるスルホンアミド基における窒素原子上の置換基であり、各Ｙはそれぞれ独立に水素原子、置換されていてもよいアルキル基、又はアルカノイル基を表す。好ましくは、少なくとも１つは水素原子であり、より好ましくはいずれも水素原子である。Ｙがアルキル基又はアルカノイル基である場合、当該スルホンアミド基が結合するベンゼン環又はＡｒ上の炭素原子と一緒になって、それらがが結合する窒素原子を含む環構造を形成することができる。そのような環構造には、例えば、以下の構造を挙げることができる。
【００４０】
【化５】
2015231364.tif 000006
【００４１】
上記式（ＩＩ）に存在するＡｒは、置換されていてもよいアリールを表す。好ましくは、置換されていてもよいフェニルである。
【００４２】
Ｒは、水素原子、ハロゲン原子、又はそれぞれ置換されていてもよいアルキル基、アルコキシ基、アミド基、アリール、及びヘテロアリールよりなる群から独立に選択される１〜４個の同一又は異なる置換基を表す。好ましくは、Ｒは、炭素数が１〜５のハロゲン化アルキルであり、より好ましくはＣＦ３である。Ｒが水素原子以外である場合、そのベンゼン環における位置は特に限定されないが、上記式（Ｉ）中で示される２位、５位、又は６位であることが好ましい。上記式（ＩＩ）においても同様である。また、ベンゼン環上に２個以上のＲを有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
【００４３】
Ｒ’は、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を表す。好ましくは、水素原子又は炭素数が１〜５のアルキルであり、より好ましくは、水素原子である。当該Ｒ’は、後述するように、励起状態においてフェニル＝ＮＨ部位の分子内回転を阻害しない程度の嵩高さの置換基であることが望ましい。
【００４４】
上記式（Ｉ）において、スルホンアミド基は、そのベンゼン環における位置は特に限定されないが、上記式（Ｉ）中で示される３位又は４位に連結していることが好ましい。上記式（ＩＩ）においてＡｒがフェニルである場合もスルホンアミド基は、当該ベンゼン環における３位又は４位に連結していることが好ましい。
【００４５】
本発明の蛍光プローブのターゲットとなる炭酸脱水素酵素は、好ましくは、ＣＡ−Ｉ（ＣＡ１）又はＣＡ−ＩＸ（ＣＡ９）のサブタイプである。例えば、ＣＡ−Ｉに対して適切なの化合物の具体例としては、
【化３】
2015231364.tif 000007
が挙げられる。ただし、これらに限定されるものではない。
【００４６】
また、ＣＡ−ＩＸに対して適切なの化合物の具体例としては、
【化４】
2015231364.tif 000008
を挙げることができる。ただし、これらに限定されるものではない。
【００４７】
上記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される化合物には、それらの塩も含まれる。そのような塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、カルボン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、これらの塩に限定されることはない。
【００４８】
式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
【００４９】
式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
【００５０】
上記の蛍光プローブは、必要に応じて試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され得る。
【００５１】
本明細書の実施例には、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される本発明の化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されているので、当業者は本明細書の開示を参照することにより、及び必要に応じて出発原料や試薬、反応条件などを適宜選択することにより、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。
【００５２】
３．本発明の蛍光プローブを用いた炭酸脱水素酵素の検出方法
上記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で示される化合物は、その高い水溶性、高い蛍光量子収率等から、バイオイメージングに広く利用されているキサンテン系蛍光色素の骨格であるが、キサンテン環のアミノ基に結合した芳香環が存在することによって、大きく蛍光量子収率が低下し、ほぼ無蛍光性となる。すなわち、炭酸脱水素酵素と結合していない場合には、蛍光応答がＯｆｆの状態である。これに対し、炭酸脱水素酵素と結合した場合には結合選択的に大きな蛍光強度の増加（量子収率の上昇）を示すため、炭酸脱水素酵素の存在を蛍光発光として検出することができるのである。
【００５３】
かかる発光機構は、必ずしも理論に拘束されるものではないが、炭酸脱水素酵素と結合していない場合には、励起状態においてフェニル＝ＮＨ部位が分子内回転を起こすことにより、ねじれた電荷分離状態（ＴＩＣＴ状態）となるため消光した状態であるが、スルホンアミド基が嵩高い炭酸脱水素酵素と結合することによって、当該ＴＩＣＴ状態が解消されて量子収率が大きく回復すると考えられる。
【００５４】
以上の発光機構に従い、本発明の炭酸脱水素酵素の検出方法では、ｉ）炭酸脱水素酵素と蛍光プローブとを生体内又は生体外において接触させ、ｉｉ）これら炭酸脱水素酵素と蛍光プローブの結合反応による蛍光応答を観測することにより炭酸脱水素酵素の存在を検出することを特徴とする。本発明の検出方法におけるターゲットとなる炭酸脱水素酵素は、種々のサブタイプの炭酸脱水素酵素であることができるが、好ましくは、ＣＡ−Ｉ（ＣＡ１）又はＣＡ−ＩＸ（ＣＡ９）のサブタイプである。本明細書において「検出」という用語は、定量、定性など種々の目的の測定を含めて最も広義に解釈されるべきである。
【００５５】
蛍光応答を観測する手段は、広い測定波長を有する蛍光光度計を用いることができるが、前記蛍光応答を２次元画像として表示可能な蛍光イメージング手段を用いて可視化することもできる。蛍光イメージングの手段を用いることによって、蛍光応答を二次元で可視化できるため、炭酸脱水素を酵素瞬時に視認することが可能となる。蛍光イメージング装置としては、当該技術分野において公知の装置を用いることができる。
【００５６】
測定対象である炭酸脱水素酵素と蛍光プローブを接触させる手段としては、代表的には、蛍光プローブを含む溶液を試料添加、塗布、或いは噴霧することが挙げられるが、上記試料の形態や測定環境等に応じて適宜選択することが可能である。
【００５７】
本発明の蛍光プローブの適用濃度は特に限定されないが、例えば０．１〜１０μＭ程度の濃度の溶液を適用することができる。
【００５８】
本発明の蛍光プローブとしては、上記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、一般的には、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供されるが、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用すればよい。
【００５９】
４．本発明の蛍光プローブを用いた炭酸脱水素酵素の検出用キット
本発明の検出方法においては、上記蛍光プローブを含む炭酸脱水素酵素を検出又は可視化するためのキットを用いることが好ましい。当該キットにおいて、通常、本発明の蛍光プローブは溶液として調製されているが、例えば、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することもできる。
【００６０】
また、当該キットには、必要に応じてそれ以外の試薬等を適宜含んでいてもよい。例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００６２】
１．蛍光プローブの合成（式（Ｉ）で表される化合物）
以下のスキーム１〜３に従って、上記式（Ｉ）に含まれる化合物蛍光プローブ化合物（ＳＡＲｈｏｄｏｌ−１〜１７）を合成した。
【００６３】
スキーム１：ＭＯＭ保護化４，６−ジクロロ−フルオレセイントリフレートの合成
【化５】
2015231364.tif 000009
【００６４】
スキーム１における各工程の反応条件は以下のとおりである。
(a1) NaOCl, NaOH / MeOH, H2O, r.t.; (a2) (i) chloromethylmethylether, K2CO3 / DMF, r.t., (ii) NaOH / THF, H2O, reflux; (a3) Tf2O, pyridine / DCM, r.t.
【００６５】
４，６−ジクロロ−フルオレセインの合成（ａ１）
【化６】
2015231364.tif 000010
Fluorescein (1.68 g, 5.1 mmol) をMeOH (40 mL)に溶解し、NaOCl (25 mmol) を2 N NaOH水溶液 (5 mL) に溶解したものを氷冷下ゆっくり加えて室温で20分間攪拌した。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー (silica gel, 95/5 CH2Cl2/MeOH) で精製し、4,6-diCl-fluorescein (950 mg, 46 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 8.02 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.78−7.71 (2H, m), 7.24 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.01 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.71 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.68 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.56 (1H, d, J = 8.8 Hz), 5.29 (2H, s, i), 3.48 (3H, s); 13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ 170.9, 157.2, 153.3, 149.6, 136.6, 131.3, 127.9, 127.3, 126.0, 125.3, 113.8, 112.6, 109.7; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 445.0246, Found, 445.0288 (+4.2 mmu).
【００６６】
ＭＯＭ保護化４，６−ジクロロ−フルオレセインの合成（ａ２）
【化７】
2015231364.tif 000011
4,6-DiCl-fluorescein (893 mg, 2.2 mmol) をDMF (40 mL)に溶解し、chloromethylmethyleter (503 μL, 6.7 mmol) とK2CO3 (768 mg, 5.6 mmol) を氷冷下ゆっくり加えて室温で3時間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液を加え、AcOEtで抽出して有機層をNa2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去した。残渣をTHF (20 mL) / H2O (10 mL) に溶解し、2 N NaOH水溶液 (3.3 mL, 6.6 mL, 3.0 eq) を加え、1時間20分間100 ℃で加熱還流を行なった。室温に冷やした後、飽和NH4Cl水溶液、2 N HCl水溶液でpH 3に中和し、AcOEtで抽出
て有機層をNa2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去した。カラムクロマトグラフィー (silica gel, 97/3 CH2Cl2/MeOH) で精製し、MOM-protected 4,6-diCl-fluorescein (318 mg, 32 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 8.02 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.78−7.71 (2H, m), 7.24 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.01 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.71 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.68 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.56 (1H, d, J = 8.8 Hz), 5.29 (2H, s), 3.48 (3H, s); 13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ 170.9, 157.2, 153.3, 149.6, 136.6, 131.3, 127.9, 127.3, 126.0, 125.3, 113.8, 112.6, 109.7; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 445.0246, Found, 445.0288 (+4.2 mmu).
【００６７】
ＭＯＭ保護化４，６−ジクロロ−フルオレセイントリフレートの合成（ａ３）
【化８】
2015231364.tif 000012
MOM-protected 4,6-diCl-fluorescein (318 mg, 0.71 mmol) をCH2Cl2 (50 mL) に溶解し、Tf2O (234 μL, 1.4 mmol) とpyridine (230 μL, 2.9 mmol) を氷冷下ゆっくり加えて室温で3時間攪拌した。これにH2Oを加え、有機層を分離し、0.2 N HCl水溶液で洗った。Na2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー (silica gel, CH2Cl2) で精製し、MOM-protected 4,6-diCl-fluorescein triflate (350 mg, 85 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.05 (1H, d, J = 6.6 Hz), 7.78−7.67 (2H, m), 7.22 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.13 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.01 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.88 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.72 (1H, d, J = 8.8 Hz), 5.32−5.26 (2H, m), 3.50 (3H, s); 13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ 168.3, 155.0, 151.8, 148.3, 147.4, 146.7, 135.6, 130.5, 126.7, 126.0, 125.7, 125.4, 123.7, 120.7, 118.4 (q, J = 320 Hz), 117.7, 117.0, 113.2, 112.1, 111.8, 95.0, 80.9, 56.4; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 576.9739, Found, 576.9697 (−4.2 mmu).
【００６８】
スキーム２：アニリン誘導体の合成
【化９】
2015231364.tif 000013
【００６９】
スキーム２における各工程の反応条件は以下のとおりである。
(a1) 2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride, TEA / DCM, r.t.; (a2) H2, Pd/C / MeOH, r.t.; (b) MeI, K2CO3 / DMF, r.t.; (c1) 2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride, TEA / DCM, r.t.; (c2) Fe, NH4Cl / EtOH, H2O, reflux; (d1) 2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride, TEA / DCM, r.t.; (d2) H2, Pd/C / MeOH, r.t.; (e1) 
(i) SOCl2, reflux, (ii) diethylamine, DCM, r.t.; (e2) ClSO3H, 100℃; (e3) 2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride, TEA / DCM, r.t.; (f) LiAlH4 / THF, r.t.; (g1) H2SO4 / MeOH, reflux; (g2) (i) ClSO3H, 100 ℃, (ii) 2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride, TEA / DCM, r.t.; (g3) LiAlH4 / THF, r.t.; (g4) tert-butyldimethylsilyl chloride, imidazole / DMF, r.t.; (h1) ClSO3H, 100 ℃; (h2) 2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride, TEA / DCM, r.t.; (h3) LiAlH4 / THF, r.t.; (h4) tert-butyldimethylsilyl chloride, imidazole / DMF, r.t.; (i1) AcONa / Ac2O, 180 ℃; (i2) KMnO4, MgSO4・7H2O / H2O, reflux; (i3) SOCl2 / MeOH, reflux; (i4) ClSO3H, 100 ℃, (R=H or Me); (i5) 2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride, TEA / DCM, r.t., (R=H or Me); (i6) LiAlH4 / THF, r.t.; (i7) tert-butyldimethylsilyl chloride, imidazole / DMF, r.t.; (j1) 2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride, TEA / DCM, r.t.; (j2) H2, Pd/C / MeOH, r.t.; (k1) ClSO3H, 100 ℃; (k2) 2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride, TEA / DCM, r.t.; (k3) H2, Pd/C / MeOH, r.t.; (l1) ClSO3H, 100 ℃; (l2) 2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride, TEA / DCM, r.t.; (l3) H2, Pd/C / MeOH, r.t.; (m1) ClSO3H, 100 ℃; (m2) 2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride, TEA / DCM, r.t.
【００７０】
4-nitro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamideの合成 (a1) 
【化１０】
2015231364.tif 000014
4-Nitrobenzenesulfonyl chloride (532 mg, 2.4 mmol) と2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride (467 mg, 2.0 mmol) をCH2Cl2 (40 mL) に溶解し、TEA (697 μL, 5.0 mmol) を氷冷下ゆっくり加えて室温で40分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液を加え、有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (silica gel, CH2Cl2) で精製し、4-nitro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (441 mg, 58 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 8.32 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.91 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.78 (1H, br s), 6.01 (2H, s), 3.98 (2H, s), 3.69 (3H, s), 3.61 (6H, s); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 160.9, 158.6, 149.1, 146.7, 127.9, 123.8, 103.9, 90.1; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 405.0732, Found, 405.0711 (−2.1 mmu).
【００７１】
4-amino-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide の合成(a2) 
【化１１】
2015231364.tif 000015
4-Nitro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (410 mg, 1.1 mmol) と10 % Pd/C (41 mg) をMeOH (40 mL)に懸濁し、H2置換下で1時間攪拌した。Pd/Cをセライトろ過で除去し、溶媒を減圧除去し、4-amino-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (406 mg, quantative yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.41 (2H, d, J = 8.1 Hz), 6.62 (1H, br s), 6.58 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.12 (2H, s), 5.84 (2H, s), 3.78 (2H, s), 3.74 (3H, s), 3.66 (6H, s); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 160.7, 158.9, 152.2, 128.6, 125.7, 112.3, 104.8, 90.5; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 375.0991, Found, 375.0946 (−4.5 mmu).
【００７２】
4-methylamino-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamideの合成 (b)
2015231364.tif 000016
4-Amino-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (68 mg, 0.19 mmol) とK2CO3 (27 mg, 0.19 mmol) をDMF (4 mL) に溶解し、MeI (12 μL, 0.19 mmol) を添加し、室温で2時間攪拌した。K2CO3 (27 mg, 0.19 mmol)とMeI (12 μL, 0.19 mmol) を加え、さらに室温で5時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、カラムクロマトグラフィー (silica gel, CH2Cl2→95/5 CH2Cl2/MeOH) で粗精製を行い、次の反応に用いた。
【００７３】
3-chloro4-nitro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamideの合成(c1) 
【化１２】
2015231364.tif 000017
3-Chloro-4-nitrobenzenesulfonyl chloride (104 mg, 0.40 mmol) と2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride (93.6 mg, 0.40 mmol) をCH2Cl2 (15 mL) に溶解し、TEA (139 μL, 1.0 mmol) を氷冷下ゆっくり加えて室温で2時間30分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液を加え、有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、3-chloro-4-nitro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (155 mg, 93 % yield) を得た
。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.96 (1H, d, J = 2.9 Hz), 7.64 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.47 (1H, dd, J = 8.8, 2.9 Hz), 6.36 (1H, t, J = 5.9 Hz), 5.83 (2H, s), 4.41 (2H, d, J = 5.9 Hz), 3.75 (6H, s), 3.71 (3H, s); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 161.1, 158.4, 145.3, 138.7, 136.4, 132.2, 131.5, 126.1, 104.4, 89.7, 55.5, 55.3, 37.1; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+,439.0343, Found, 439.0387 (+4.4 mmu).
【００７４】
4-amino-3-chloro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamideの合成(c2)
【化１３】
2015231364.tif 000018
3-Chloro-4-nitro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (107 mg, 0.26 mmol) とFe (200 mg, 3.6 mmol) とNH4Cl (97 mg, 1.8 mmol) をEtOH (2 mL) / H2O (2 mL) に溶解し、3時間攪拌した。室温まで冷やした後、2 N NaOH水溶液で中和し、CH2Cl2で2回抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、4-amino-3-chloro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (105 mg, quantative yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 7.34 (1H, d, J = 2.6 Hz), 6.99 (1H, dd, J = 8.4, 2.6 Hz), 6.60 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.22 (1H, s), 5.90 (2H, s), 5.47 (2H, s), 3.99 (2H, s), 3.51−3.62 (9H, m); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 162.1, 159.6, 145.7, 133.6, 129.1, 123.7, 120.3, 119.2, 105.0, 90.9, 55.3, 55.6, 36.5; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+,409.0601, Found, 409.0612 (+1.1 mmu).
【００７５】
4-nitro-3-trifluoromethyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamideの合成(d1)
【化１４】
2015231364.tif 000019
4-Nitro-3-trifluoromethylbenzenesulfonyl chloride (467 mg, 2.0 mmol) と2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride (638 mg, 2.2 mmol) をCH2Cl2 (40 mL) に溶解し、TEA (697 μL, 2.5 mmol) を氷冷下ゆっくり加えて室温で3時間攪拌した。これに飽和NaHCO3水溶液を40 mL加え、室温で2時間攪拌した。飽和NH4Cl水溶液で中和し、有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、4-nitro-3-trifluoromethyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (924 mg, quantative yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 8.18 (1H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 8.14−8.09 (2H, m), 6.95 (1H, t, J = 6.6 Hz), 5.96 (2H, s), 4.25 (2H, d, J = 6.6 Hz), 3.71 (3H, s), 3.70 (6H, s); 13C NMR (75 MHz, acetone-d6): δ 162.6, 159.5, 147.0, 133.3, 127.1 (q, J = 5.18 Hz), 126.4, 123.4 (q, J = 35 Hz), 122.6 (q, J = 273 Hz), 105.0, 90.7, 55.9, 55.5, 36.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+,473.0606, Found, 473.0645 (+3.9 mmu).
【００７６】
4-amino-3-trifluoromethyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide の合成(d2)
【化１５】
2015231364.tif 000020
4-Nitro-3-trifluoromethyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (902 mg, 2.0 mmol) と10 % Pd/C (180 mg) をMeOH (100 mL)に溶解し、H2置換下で2日間攪拌した。Pd/Cをセライトろ過で除去し、溶媒を減圧除去し、4-amino-3-trifluoromethyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (791 mg, 94 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 7.61 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.49 (1H, dd, J = 8.8, 1.8 Hz), 6.78 (1H, d, J = 8.8 Hz), 5.93 (2H, s), 5.90 (1H, t, J = 5.9 Hz), 5.69 (2H, br s), 3.95 (2H, d, J = 5.9 Hz), 3.62 (3H, s), 3.58 (6H, s); 13C NMR (75 MHz, acetone-d6): δ 162.3, 159.8, 149.8, 132.6, 128.9, 127.0 (q, J = 5.6 Hz), 117.0, 1111.4 (q, J = 30 Hz), 105.7, 91.0, 55.9, 55.5, 36.5; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+,443.0865, Found, 443.0856 (−0.9 mmu).
【００７７】
2-amino-N,N-diethyl-3-trifluoromethylbenzamideの合成(e1)
【化１６】
2015231364.tif 000021
2-Amino-3-trifluoromethylbenzoic acid (308 mg, 1.5 mmol) をSOCl2 (5 mL) に溶解し、2時間加熱還流を行なった。室温まで冷やした後、溶媒を減圧除去し、CH2Cl2に溶解させた。これに氷冷下、diethylamine (155 μL, 1.5 mmol) を加え、室温で5分間攪拌した。反応溶液を飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、カラムクロマトグラフィー (silica gel, CH2Cl2→95/5 CH2Cl2/MeOH) で精製し、2-amino-N,N-diethyl-3-trifluoromethylbenzamide (254 mg, 65 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.45 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.23 (1H, d, J = 7.7 Hz), 6.76 (1H, dd, J = 7.7, 7.7 Hz), 4.71 (2H, br s), 3.38 (4H, br s), 1.19 (6H, br s); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 169.1, 142.7, 130.2, 127.1 (q, J = 5.2 Hz), 124.5 (q, J = 272 Hz), 123.0, 116.0, 114.5 (q, J = 30 Hz), 43.0, 39.2, 13.4; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 283.1034, Found, 283.0998 (+3.6 mmu).
【００７８】
4-amino-3-diethylcarbamoyl-5-trifluoromethylbenzenesulfonyl chlorideの合成(e2)
【化１７】
2015231364.tif 000022
2-Amino-N,N-diethyl-3-trifluoromethylbenzamide (127 mg, 0.49 mmol) をClSO3H (1.5 mL) に溶解し、4.5時間100 ℃で攪拌した。氷冷後、水をゆっくり加えて反応を止め、飽和NaHCO3水溶液で中和した。CH2Cl2で2回抽出し、Na2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、4-amino-3-diethylcarbamoyl-5-trifluoromethylbenzenesulfonyl chloride (88 mg, 50 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.11 (1H, d, J = 2.2 Hz), 7.88 (1H, d, J = 2.2 Hz), 5.78 (2H, br s), 3.46 (4H, br s), 1.25 (6H, t, J = 7.0 Hz); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 166.9, 148.9, 130.5, 129.7, 127.7 (q, J = 5.4 Hz), 123.2 (q, J = 273 Hz), 121.6, 114.2 (q, J = 32 Hz), 43.3, 40.1, 13.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 359.0444, Found, 359.0463 (+1.9 mmu).
【００７９】
2-amino-N,N-diethyl-3-trifluoromethyl-5-(N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)sulfamoyl)benzamideの合成(e3) 
【化１８】
2015231364.tif 000023
4-Amino-3-diethylcarbamoyl-5-trifluoromethylbenzenesulfonyl chloride (88 mg, 0.25 mmol) と2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride (57 mg, 0.25 mmol) をCH2Cl2 (30 mL) に溶解し、TEA (85 μL, 0.61 mmol) を氷冷下ゆっくり加えて室温で5分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液を加え、有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、2-amino-N,N-diethyl-3-trifluoromethyl-5-(N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)sulfamoyl)benzamide (125 mg, 96 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.60 (1H, s), 7.55 (1H, s), 5.84 (2H, s), 5.35 (1H, t, J = 6.6 Hz), 5.20 (2H, br s), 4.11 (2H, d, J = 6.6 Hz), 3.67 (3H, s), 3.62 (6H, s), 3.47−3.10 (4H, m), 1.21−1.02 (6H, m); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 167.9, 161.0, 158.2, 146.1, 129.6, 127.4, 126.8 (q, J = 5.0 Hz), 123.6 (q, J = 273 Hz), 120.8, 113.6 (q, J = 31 Hz), 104.4, 89.9, 55.3, 55.1, 43.7, 39.8, 36.1, 13.4; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 542.1549, Found, 542.1580 (+3.1 mmu).
【００８０】
4-amino-3-diethylaminomethyl-5-trifluoromethyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide の合成(f)
【化１９】
2015231364.tif 000024
2-Amino-N,N-diethyl-3-trifluoromethyl-5-(N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)sulfamoyl)benzamide (73 mg, 0.14 mmol) をTHF (6 mL) に溶解し、氷冷下、LiAlH4 (27 mg, 0.70 mmol) をゆっくり加え、室温で1時間攪拌した。これにH2O (1 mL), 15 % NaOH水溶液 (1 mL), H2O (4 mL) を順に加え室温で1時間攪拌した。セライトろ過で不溶物を除去し、溶媒を減圧除去し、カラムクロマトグラフィー (NH silica gel, 90/10 hexane/CH2Cl2 → 30/70 hexane/CH2Cl2) で精製し、4-amino-3-diethylaminomethyl-5-trifluoromethyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (36 mg, 51 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.60 (1H, s), 7.55 (1H, s), 5.84 (2H, s), 5.35 (1H, t, J = 6.6 Hz), 5.20 (2H, br s), 4.11 (2H, d, J = 6.6 Hz), 3.67 (3H, s), 3.62 (6H, s), 3.47−3.10 (4H, m), 1.21−1.02 (6H, m); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 167.9, 161.0, 158.2, 146.1, 129.6, 127.4, 126.8 (q, J = 5.0 Hz), 123.6 (q, J = 273 Hz), 120.8, 113.6 (q, J = 31 Hz), 104.4, 89.9, 55.3, 55.1, 43.7, 39.8, 36.1, 13.4; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 542.1549, Found, 542.1580 (+3.1 mmu).
【００８１】
methyl 2-amino-3-trifluoromethylbenzoateの合成(g1) 
【化２０】
2015231364.tif 000025
2-Amino-3-trifluoromethylbenzoic acid (308 mg, 1.5 mmol) をMeOH (10 mL) に溶解し、濃硫酸 (0.5 mL) を加え、20時間加熱還流を行なった。氷冷後、飽和NaHCO3水溶液で中和し、CH2Cl2で3回抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、methyl 2-amino-3-trifluoromethylbenzoate (260 mg, 79 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.05 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.59 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.66 (1H, dd, J = 8.1, 8.1 Hz), 6.47 (2H, br s), 3.88 (3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 168.0, 148.1, 135.5, 131.8 (q, J = 5.0 Hz), 124.6 (q, J = 272 Hz), 114.7, 114.6 (q, J = 30 Hz), 112.1, 51.9.
【００８２】
methyl 2-amino-3-trifluoromethyl-5-(N-(2,4,6-trimethoxybenzyl) sulfamoyl)benzoic acidの合成(g2)
【化２１】
2015231364.tif 000026
2-Amino-3-trifluoromethylbenzoate (147 mg, 0.67 mmol) をClSO3H (1.5 mL) に溶解し、2.5時間100 ℃で攪拌した。氷冷後、水をゆっくり加えて反応を止め、析出した固体をろ取し乾燥させた。得られた固体と2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride (100 mg, 0.43 mmol) をCH2Cl2 (50 mL) に溶解し、TEA (150 μL, 1.1 mmol) を氷冷下ゆっくり加えて室温で10分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液を加え、有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、カラムクロマトグラフィー (silica gel, CH2Cl2 → 90/10 CH2Cl2/MeOH) で精製し、2-amino-3-trifluoromethyl-5-(N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)sulfamoyl)benzoic acid (201 mg, 63 % yield) を得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.38 (1H, s), 7.65 (1H, s), 7.31 (2H, br s), 6.17 (1H, s), 5.82 (1H, s), 3.98 (2H, s), 3.57 (3H, s), 3.55 (6H, s); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 169.1, 162.3, 159.6, 151.2, 136.2, 132.9 (q, J = 5.0 Hz), 131.0, 128.9, 127.9, 125.1 (q, J = 273 Hz), 113.9 (q, J = 34 Hz), 105.5, 90.9, 55.9, 55.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 487.0763, Found, 487.0752 (−1.1 mmu).
【００８３】
4-amino-3-hydroxymethyl-5-trifluoromethyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)  benzenesulfonamideの合成 (g3)
【化２１】
2015231364.tif 000027
2-Amino-3-trifluoromethyl-5-(N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)sulfamoyl)benzoic acid (48 mg, 0.10 mmol) をTHF (5 mL) に溶解し、氷冷下、LiAlH4 (23 mg, 0.60 mmol) をゆっくり加え、室温で1時間攪拌した。これにH2O (0.6 mL), 15 % NaOH水溶液 (0.6 mL), H2O (2.4 mL) を順に加え室温で1時間攪拌した。セライトろ過で不溶物を除去し、溶媒を減圧除去し、4-amino-3-hydroxymethyl-5-trifluoromethyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (48 mg, quantative yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 7.58 (1H, d, J = 2.2 Hz), 7.47 (1H, d, J = 2.2 Hz), 5.95 (1H, t, J = 5.9 Hz), 5.90 (2H, s), 5.61 (2H, br s), 4.51 (2H, d, J = 4.4 Hz), 4.42 (1H, t, J = 4.4 Hz), 3.96 (2H, d, J = 5.9 Hz), 3.62 (3H, s), 3.58 (6H, s); 13C NMR (75 MHz, acetone-d6): δ 162.2, 159.7, 148.0, 131.0, 128.7, 127.6, 125.9 (q, J = 5.6 Hz), 125.6 (q, J = 272 Hz), 111.9 (q, J = 30 Hz), 105.5, 90.8, 62.9, 55.8, 50.5; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 473.0970, Found, 473.0996 (+2.6 mmu).
【００８４】
4-amino-3-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-5-trifluoromethyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamideの合成(g4)
【化２２】
2015231364.tif 000028
4-Amino-3-hydroxymethyl-5-trifluoromethyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (90 mg, 0.20 mmol) をDMF (5 mL) に溶解し、tert-butyldimethylsilyl chloride (251 mg, 1.7 mmol) と imidazole (113 mg, 1.7 mmol) を加え、室温で7時間攪拌した。これにH2Oを加えて反応を止め、CH2Cl2で2回抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させた後、カラムクロマトグラフィー (silica gel, CH2Cl2 → 95/5 CH2Cl2/MeOH) で精製し、4-amino-3-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-5-trifluoromethyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (76 mg, 67 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.68 (1H, d, J = 1.5 Hz), 7.44 (1H, d, J = 1.5 Hz), 5.87 (2H, s), 5.25−5.21 (3H, mh), 4.57 (2H, s), 4.15 (2H, d, J = 6.6 Hz), 3.71 (3H, s), 3.65 (6H, s), 0.86 (9H, s), 0.04 (6H, s); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 161.0, 158.5, 147.6, 130.3, 127.5, 126.0 (q, J = 5.2 Hz), 125.5, 124.2 (q, J = 273 Hz), 112.6 (q, J = 31 Hz), 105.1, 90.1, 64.4, 55.4, 55.1, 36.1, 25.6, 18.0, -5.5; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 587.1835, Found, 587.1875 (+4.0 mmu).
【００８５】
2-amino-5-chlorosulfonyl-3-methylbenzoic acidの合成(h1)
【化２３】
2015231364.tif 000029
2-Amino-3-methylbenzoic acid (453 mg, 3.0 mmol) をClSO3H (3 mL) に溶解し、100 ℃で2時間攪拌した。氷冷後、水をゆっくり加えて反応を止め、析出した固体をろ取、乾燥し、2-amino-5-chlorosulfonyl-3-methylbenzoic acid (606 mg, 81 % yield) を得た
。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.32 (1H, d, J = 2.9 Hz), 7.59 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.66 (1H, dd, J = 8.1, 8.1 Hz), 6.47 (2H, br s), 3.88 (3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 168.0, 148.1, 135.5, 131.8 (q, J = 5.0 Hz), 124.6 (q, J = 272 Hz), 114.7, 114.6 (q, J = 30 Hz), 112.1, 51.9.
【００８６】
methyl 2-amino-3-methyl-5-(N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)sulfamoyl)benzoic acid の合成(h2)
【化２４】
2015231364.tif 000030
2-Amino-5-chlorosulfonyl-3-methylbenzoic acid (500 mg, 2.0 mmol) と2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride (468 mg, 2.0 mmol) をCH2Cl2 (100 mL) に溶解し、TEA (696 μL, 5.0 mmol) を氷冷下ゆっくり加えて室温で15分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液を加え、有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、2-amino-3-methyl-5-(N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)sulfamoyl)benzoic acid (826 mg, quantative yield) を得た。これ以上精製を行なわず、次の反応に用いた。
【００８７】
4-amino-3-hydroxymethyl-5-methyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)  benzenesulfonamideの合成(h3)
【化２５】
2015231364.tif 000031
2-Amino-3-methyl-5-(N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)sulfamoyl)benzoic acid (741 mg, 1.8 mmol) をTHF (100 mL) に溶解し、氷冷下、LiAlH4 (412 mg, 6.0 mmol) をゆっくり加え、室温で2時間攪拌した。これにH2O (412 μL), 15 % NaOH水溶液 (412 μL), H2O (1.2 mL) を順に加え室温で1時間攪拌した。セライトろ過で不溶物を除去し、CH2Cl2を加えて有機層を2 N NaOH水溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、4-amino-3-hydroxymethyl-5-methyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (282 mg, 40 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.40 (1H, d, J = 2.2 Hz), 7.27 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.64 (1H, t, J = 5.1 Hz), 6.10 (2H, s), 5.36 (2H, br s), 5.25 (1H, t, J = 5.1 Hz), 4.42 (2H, d, J = 5.1 Hz), 3.79 (2H, d, J = 5.1 Hz), 3.74 (3H, s), 3.65 (6H, s), 2.11 (3H, s); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 160.6, 158.8, 147.3, 127.5, 125.7, 124.5, 123.7, 120.2, 104.7, 90.3, 60.8, 55.5, 55.2, 35.0, 17.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 419.1253, Found, 419.1274 (+2.1 mmu).
【００８８】
4-amino-5-methyl-3-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)- N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamideの合成(h4)
【化２６】
2015231364.tif 000032
4-Amino-3-hydroxymethyl-5-methyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (262 mg, 0.66 mmol) をDMF (5 mL) に溶解し、tert-butyldimethylsilyl chloride (200 mg, 1.3 mmol) と imidazole (90 mg, 1.3 mmol) を加え、室温で45分間攪拌した。これにH2Oを加えて反応を止め、AcOEtで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、カラムクロマトグラフィー (silica gel, CH2Cl2 → 97/3 CH2Cl2/MeOH) で精製し、4-amino-5-methyl-3-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (257 mg, 76 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.38-7.35 (2H, m), 5.96 (1H, t, J = 5.9 Hz), 4.71 (2H, br s), 4.65 (2H, s), 4.13 (1H, t, J = 5.9 Hz), 3.77 (3H, s), 3.69 (6H, s), 2.12 (3H, s), 0.91 (9H, s), 0.09 (6H, s); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 160.7, 158.4, 148.0, 128.6, 126.5, 125.5, 122.7, 121.1, 105.1, 89.8, 64.4, 55.3, 55.0, 35.9, 25.5, 17.9, 16.9, -5.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 533.2118, Found, 533.2076 (−4.2 mmu).
【００８９】
2-acetamido-3-methylbenzoic acidの合成(i1)
【化２７】
2015231364.tif 000033
2-Amino-3-methylcarboxylic acid (6.94 g, 46 mmol) とsodium acetate (4.15 g, 51 mmol) をAc2O (23.9 mL, 253 mmol) に溶解し、2時間加熱還流した。0 ℃に冷却後、水を加えて反応を止め、溶媒を減圧濃縮した。析出した固体をろ取し、冷水で洗浄し、2-acetamido-3-methylbenzoic acid (7.85 mg, 88 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.00 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.61 (1H, dd, J = 7.7, 7.7 Hz), 7.35 (1H, d, J = 7.7 Hz), 2.52 (3H, s), 2.46 (3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 160.2, 158.6, 144.7, 137.2, 135.3, 127.4, 125.8, 116.4, 21.4, 16.9.
【００９０】
2-acetamidoisophthalic acidの合成(i2)
【化２８】
2015231364.tif 000034
2-Acetamido-3-methylbenzoic acid (1.05 g, 5.4 mmol) とMgSO4・7H2O (1.34 g, 5.4 mmol) をH2O (100 mL) に溶解し、120 ℃に加熱した。KMnO4水溶液を2時間かけて滴下し、滴下後4時間攪拌した。室温まで冷やした後、不溶物をセライトろ過で除去し、溶媒を減圧濃縮した。2 N HCl水溶液で中和して析出した固体をろ取し、冷えた0.2 N HCl水溶液で洗浄し、2-acetamidoisophthalic acid (1.15 g, 95 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.07 (2H, d, J = 7.8 Hz), 7.33 (1H, t, J = 7.8 Hz), 2.16 (3H, s); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 171.9, 169.9, 137.9, 135.2, 127.3, 125.5, 23.9.
【００９１】
dimethyl 2-aminoisophthalateの合成(i3)
【化２９】
2015231364.tif 000035
2-Acetamidoisophthalic acid (2.23 g, 10 mmol) をMeOH (40 mL) に溶解し、SOCl2 (10 mL) を加え、2時間加熱還流した。室温まで冷やした後、溶媒を減圧除去し、水で再結晶を行い、dimethyl 2-aminoisophthalate (0.55 g, 26 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.14 (2H, br s), 8.14 (2H, d, J = 7.7 Hz), 6.51 (1H, t, J = 7.7 Hz), 3.84 (6H, s); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 167.9, 153.0, 137.2, 113.3, 111.4, 51.5; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 210.0764, Found, 210.0766 (−0.2 mmu).
【００９２】
2-amino-5-chlorosulfonyl-3-methoxycarbonylbenzoic acid 及び2-amino-5-chlorosulfonylisophthalic acid の混合物の合成(i4)
【化３０】
2015231364.tif 000036
Dimethyl 2-aminoisophthalate (142 mg, 0.68 mmol) をClSO3H (1 mL) に溶解し、100 ℃で4時間攪拌した。氷冷後、水をゆっくり加えて反応を止め、析出した固体をろ取、乾燥しこれ以上精製を行なわず、次の反応に用いた。
【００９３】
2-amino-3-methoxycarbonyl-5-(N-(2,4,6-trimethoxybenzyl) sulfamoyl)  benzoic acid 及び 2-amino-5-(N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)sulfamoyl)  isophthalic acidの混合物の合成 (i5)
【化３１】
2015231364.tif 000037
(i4)で得られた固体 (142 mg, 0.49 mmol) と2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride (115 mg, 0.49 mmol) をCH2Cl2 (50 mL) に溶解し、TEA (171 μL, 1.2 mmol) を氷冷下ゆっくり加えて室温で10分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液を加え、有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、白色固体を得た。これ以上精製を行なわず、次の反応に用いた。
【００９４】
4-amino-3,5-bis(hydroxymethyl)-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)  benzenesulfonamideの合成(i6)
【化３２】
2015231364.tif 000038
(i5)で得られた白色固体 (121 mg, 0.27 mmol) をTHF (20 mL) に溶解し、氷冷下、LiAlH4 (103 mg, 2.7 mmol) をゆっくり加え、室温で8時間攪拌した。これにH2O (409 μL), 15 % NaOH水溶液 (409 μL), H2O (1.2 mL) を順に加え室温で1時間攪拌した。セライトろ過で不溶物を除去し、溶媒を減圧除去し、4-amino-3,5-bis(hydroxymethyl)-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (15 mg, 5.4 % yield in 3 steps) を得た。
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 7.31 (2H, s), 5.93 (2H, s), 5.54 (1H, t, J = 5.9 Hz), 5.28 (2H, br s), 4.50 (4H, s), 4.18 (2H, br s), 3.89 (2H, d, J = 5.9 Hz), 3.64 (3H, s), 3.60 (6H, s).
【００９５】
4-amino-3,5-bis(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamideの合成(i7)
【化３２】
2015231364.tif 000039
4-Amino-3,5-bis(hydroxymethyl)-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (12.2 mg, 0.030 mmol) をDMF (5 mL) に溶解し、tert-butyldimethylsilyl chloride (94 mg, 0.62 mmol) と imidazole (85 mg, 1.3 mmol) を加え、室温で2時間攪拌した。これにH2Oを加えて反応を止め、AcOEtで抽出した。有機層を飽和NaCl水溶液で脱水しNa2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、カラムクロマトグラフィー (silica gel, CH2Cl2 → 97/3 CH2Cl2/MeOH) で精製し、4-amino-3,5-bis(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (20.3 mg, quantitative yield) を得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.39 (2H, s), 5.97 (2H, s), 5.30 (2H, br s), 4.90 (1H, t, J = 6.6 Hz), 4.65 (4H, s), 4.10 (2H, d, J = 6.6 Hz), 3.77 (3H, s), 3.68 (6H, s), 0.88 (18H, s), 0.06 (12H, s); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 161.0, 158.8, 150.1, 127.4, 126.4, 124.0, 105.6, 90.3, 64.6, 55.6, 55.3, 36.1, 25.7, 18.1, -5.3; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 663.2931, Found, 663.2945 (+1.4 mmu).
【００９６】
3-nitro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamideの合成(j1)
【化３３】
2015231364.tif 000040
3-Nitrobenzenesulfonyl chloride (467 mg, 2.0 mmol) と2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride (532 mg, 2.4 mmol) をCH2Cl2 (40 mL) に溶解し、TEA (697 μL, 5.0 mmol) を氷冷下ゆっくり加えて室温で2時間攪拌した後、飽和NaHCO3水溶液を加えて室温で30分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液を加え、有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、3-nitro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (816 mg, quantitative yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 8.36 (1H, dd, J = 8.1, 1.5 Hz), 8.33 (1H, d, J = 1.5 Hz), 8.08 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.33 (1H, t, J = 4.4 Hz), 8.33 (1H, dd, J = 8.1, 8.1 Hz), 5.94 (2H, s), 4.01 (2H, d, J = 4.4 Hz), 3.67 (3H, s), 3.59 (6H, s); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 160.8, 058.5, 147.3, 142.9, 132.4, 130.5, 126.3, 121.2, 103.6, 90.0, 55.4, 55.1; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 405.0732, Found, 405.0767 (+3.5 mmu).
【００９７】
3-amino-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamideの合成(j2)
【化３４】
2015231364.tif 000041
3-Nitro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (780 mg, 2.0 mmol) と10 % Pd/C (78 mg) をMeOH (80 mL)に溶解し、H2置換下で13時間攪拌した。Pd/Cをセライトろ過で除去し、溶媒を減圧除去し、カラムクロマトグラフィー (silica gel, 4/1 CH2Cl2/AcOEt) で精製し、3-amino-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (420 mg, 60 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 7.17 (1H, dd, J = 7.7, 7.7 Hz), 7.12 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.03 (1H, d, J = 7.7 Hz), 6.83 (1H, dd, J = 7.7, 1.8 Hz), 6.12 (2H, s), 5.83 (1H, t, J = 5.9 Hz), 5.00 (2H, br s), 4.07 (2H, d, J = 5.9 Hz), 3.77 (3H, s), 3.73 (6H, s); 13C NMR (75 MHz, acetone-d6): δ 162.2, 160.0, 149.6, 142.5, 129.9, 118.2, 115.7, 113.1, 105.8, 91.1, 556.0, 55.6, 36.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 375.0991, Found, 375.1037 (+4.6 mmu).
【００９８】
4-methyl-3-nitrobenzenesulfonyl chlorideの合成(k1)
【化３５】
2015231364.tif 000042
2-Nitrotoluene (5 g, 37 mmol) をClSO3H (25 mL) に溶解し、100 ℃で13時間攪拌した。氷冷後、水をゆっくり加えて反応を止め、析出した固体をろ取、乾燥し、4-methyl-3-nitrobenzenesulfonyl chloride (8.4 g, 98 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.62 (1H, d, J = 2.2 Hz), 8.16 (1H, d, J = 8.1, 2.2 Hz), 7.69 (1H, d, J = 8.1 Hz), 2.77 (3H, s); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 149.1, 142.9, 141.6, 134.6, 130.3, 123.6, 20.8.
【００９９】
4-methyl-3-nitro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamideの合成(k2)
【化３６】
2015231364.tif 000043
4-Methyl-3-nitrobenzenesulfonyl chloride (472 mg, 2.0 mmol) と2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride (467 mg, 2.0 mmol) をCH2Cl2 (40 mL) に溶解し、TEA (697 μL, 5.0 mmol) を氷冷下ゆっくり加えて室温で1時間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液を加え、有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、4-methyl-3-nitro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (770 mg, 97 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.21 (1H, d, J = 2.2 Hz), 7.80 (1H, d, J = 8.1, 2.2 Hz), 7.29 (1H, d, J = 8.1 Hz), 5.85 (2H, s, g), 5.42 (1H, t, J = 5.9 Hz), 4.29 (2H, d, J = 5.9 Hz), 3.73 (3H, s), 3.70 (6H, s), 2.59 (3H, s); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 161.2, 158.4, 148.3, 140.2, 137.5, 132.8, 130.7, 123.6, 104.4, 89.9, 55.5, 55.2, 36.5, 20.4.
【０１００】
3-amino-4-methyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamideの合成(k3)
【化３７】
2015231364.tif 000044
4-Methyl-3-nitro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (747 mg, 1.9 mmol) と10 % Pd/C (75 mg) をMeOH (70 mL)に溶解し、H2置換下で1時間攪拌した。Pd/Cをセライトろ過で除去し、溶媒を減圧除去し、3-amino-4-methyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (675 mg, 98 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.07 (1H, s), 7.04 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.00 (1H, d, J = 8.1 Hz), 5.95 (2H, s), 5.15 (1H, t, J = 5.9 Hz), 4.12 (2H, d, J = 5.9 Hz), 3.91 (2H, br s), 3.74 (3H, s), 3.67 (6H, s), 2.12 (3H, s); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 160.8, 158.6, 145.0, 138.0, 130.1, 126.3, 116.3, 112.6, 104.9, 90.0, 55.4, 55.1, 36.1, 17.2; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 389.1147, Found, 389.1181 
(+3.4 mmu).
【０１０１】
4-isopropyl-3-nitrobenzenesulfonyl chlorideの合成(l1)
【化３８】
2015231364.tif 000045
2-Nitroisopropylbenzene (1 g, 6.1 mmol) をClSO3H (5 mL) に溶解し、100 ℃で4時間攪拌した。氷冷後、水をゆっくり加えて反応を止め、析出した固体をろ取、乾燥し、4-isopropyl-3-nitrobenzenesulfonyl chloride (1.5 g, 94 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.37 (1H, d, J = 1.5 Hz), 8.21 (1H, d, J = 8.8, 1.5 Hz), 7.83 (1H, d, J = 8.8 Hz), 3.52 (1H, sep, J = 6.6 Hz), 1.39 (6H, d, J = 6.6 Hz); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 150.4, 149.4, 142.2, 130.1, 129.9, 122.7, 29.2, 23.2.
【０１０２】
4-isopropyl-3-nitro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamideの合成(l2)
【化３９】
2015231364.tif 000046
4-Isopropyl-3-nitrobenzenesulfonyl chloride (528 mg, 2.0 mmol) と2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride (467 mg, 2.0 mmol) をCH2Cl2 (40 mL) に溶解し、TEA (697 μL, 5.0 mmol) を氷冷下ゆっくり加えて室温で30分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液を加え、有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、4-isopropyl-3-nitro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (811 mg, 96 % yield) を得た
。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.94 (1H, d, J = 2.2 Hz), 7.79 (1H, d, J = 8.1, 2.2 Hz), 7.38 (1H, d, J = 8.1 Hz), 5.85 (2H, s), 5.52 (1H, t, J = 6.6 Hz), 4.30 (2H, d, J = 6.6 Hz), 3.72 (3H, s), 3.70 (6H, s), 3.35 (1H, sep, J = 6.6 Hz), 1.26 (6H, d, J = 6.6 Hz); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 161.0, 158.3, 148.7, 146.4, 139.7, 130.2, 127.8, 122.7, 104.4,89.9, 55.5, 55.1, 36.4, 28.7, 23.3; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 447.1202, Found, 447.1232 (+3.0 mmu).
【０１０３】
3-amino-4-isopropyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamideの合成(l3)
【化４０】
2015231364.tif 000047
4-Isopropyl-3-nitro-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (740 mg, 1.8 mmol) と10 % Pd/C (74 mg) をMeOH (70 mL)に溶解し、H2置換下で1時間攪拌した。Pd/Cをセライトろ過で除去し、溶媒を減圧除去し、3-amino-4-isopropyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (664 mg, 96 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.12−7.05 (3H, m), 5.95 (2H, s), 5.08 (1H, t, J = 5.9 Hz), 4.18 (2H, d, J = 5.9 Hz), 3.80 (2H, br s), 3.74 (3H, s), 3.69 (6H, s), 2.84 (1H, sep, J = 6.6 Hz), 1.22 (6H, d, J = 6.6 Hz); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 160.7, 158.5, 143.7, 137.6, 136.3, 125.1, 116.5, 113.4, 104.9, 89.9, 55.3, 55.0, 36.1, 27.4, 21.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 417.1460, Found, 417.1426 (−3.6 mmu).
【０１０４】
2,4-diethyl-3-nitrobenzenesulfonyl chlorideの合成(m1)
【化４１】
2015231364.tif 000048
2,6-Dimethylaniine (776 μL, 5.0 mmol) をClSO3H (3 mL) に溶解し、室温で20分間攪拌した。氷冷後、水をゆっくり加えて反応を止め、CH2Cl2で抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、得られた固体をこれ以上精製せず、次の反応に用いた。
【０１０５】
3-amino-2,4-diethyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamideの合成(m2)
【化４２】
2015231364.tif 000049
(m1)で得られた固体と2,4,6-trimethoxybenzylamine hydrochloride (166 mg, 0.71 mmol) をCH2Cl2 (30 mL) に溶解し、TEA (247 μL, 1.8 mmol) を氷冷下ゆっくり加えて室温で30分間攪拌した。これに飽和NH4Cl水溶液を加え、有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、カラムクロマトグラフィー (silica gel, CH2Cl2 → 90/10 CH2Cl2/MeOH) で精製し、3-amino-2,4-diethyl-N-(2,4,6-trimethoxybenzyl)benzenesulfonamide (68 mg, 3.3 % yield in 2 steps) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.41 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.97 (1H, d, J = 8.1 Hz), 5.97 (2H, s), 5.04 (1H, t, J = 6.6 Hz), 4.16 (2H, d, J = 6.6 Hz), 3.76 (3H, s), 3.69 (6H, s), 3.48 (2H, br s), 2.84 (2H, q, J = 7.6 Hz), 2.52 (2H, q, J = 7.6 Hz), 1.27 (3H, t, J = 7.6 Hz), 1.19 (3H, t, J = 7.6 Hz); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 160.9, 158.7, 143.1, 136.0, 132.4, 125.5, 124.8, 119.8, 105.5, 90.1, 55.5, 55.3, 36.0, 24.5, 21.1, 12.4, 12.1; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 431.1617, Found, 431.1581 (−3.6 mmu).
【０１０６】
スキーム３：蛍光プローブ化合物（ＳＡＲｈｏｄｏｌ−１〜ＳＡＲｈｏｄｏｌ−１７）の合成
【化４３】
2015231364.tif 000050
【０１０７】
スキーム３における反応条件及び手順は以下のとおりである。
(a) (i) sulfonamide-protected anilines, Cs2CO3, Pd2(dba)3, xantphos / toluene, 100 ℃, (ii) TFA, triethylsilane / DCM, r.t.
【０１０８】
シュレンク管にMOM保護fluorescein triflate誘導体 (1 eq)、各aniline誘導体 (1 eq)、Cs2CO3 (2.4 eq)、及び脱水トルエンを加えた。真空ポンプで脱気後、Pd2(dba)3 (0.1 eq) とXantphos (0.15 eq) を加え、再び脱気を行い、100 ℃で下記に示す時間、攪拌した。室温に戻した後、ろ過した溶液の溶媒を除去した。溶質をCH2Cl2 5 mLに溶解させ、triethylsilane 0.5 mLとTFA 5 mLを加え、室温で1時間攪拌した。溶媒を除去し、HPLCで精製して各SARhodol類を得た。
【０１０９】
SARhodol-１の合成
【化４４】
2015231364.tif 000051
10時間攪拌した。(18 mg, 15% yield)
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 8.25 (1H, s), 7.96 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.81−7.68 (4H, m), 7.30−7.25 (3H, m), 7.08 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.90 (1H, dd, J = 8.8, 2.2 Hz), 6.73 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.70 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.64 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.60 (1H, dd, J = 8.8, 2.2 Hz), 6.36 (2H, br s); 13C NMR (75 MHz, acetone-d6): δ 169.4, 160.6, 153.5, 153.4, 153.2, 146.6, 145.7, 136.6, 136.0, 130.8, 130.2, 130.1, 128.8, 128.0, 125.6, 125.1, 117.4, 115.4, 113.5, 113.1, 111.8, 104.7, 103.3; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 487.0964, Found, 487.0978 (+1.4 mmu).
【０１１０】
SARhodol-２の合成
【化４５】
2015231364.tif 000052
2時間攪拌した。(7.5 mg, 7.8% yield in 3 steps)
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 7.99 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.84−7.72 (4H, ml), 7.32 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.19 (2H, d, J = 9.3 Hz), 7.03 (1H, d, J = 2.4 Hz), 6.89 (1H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz), 6.78−6.75 (2H, m), 6.69−6.75 (2H, m), 6.46 (2H, br s), 3.44 (3H, s); 13C NMR (75 MHz, acetone-d6): δ 169.4, 160.4, 153.8, 153.3, 153.2, 151.8, 150.8, 136.1, 130.8, 130.1, 129.9, 128.8, 128.5, 127.8, 125.5, 124.9, 120.0, 118.4, 114.4, 113.4, 111.6, 109.5, 103.3, 83.6, 40.5; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 501.1120, Found, 501.1083 (−3.7 mmu).
【０１１１】
SARhodol-３の合成
【化４６】
2015231364.tif 000053
21時間攪拌した。(25 mg, 29% yield)
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 9.07 (1H, s), 8.13 (1H, s), 7.98 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.82 (1H, dd, J = 7.3, 7.3 Hz), 7.76−7.71 (2H, m), 7.50−7.37 (3H, m), 7.31 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.03 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.88 (1H, dd, J = 8.8, 2.2 Hz), 6.75 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.70−6.65 (2H, m), 6.62 (1H, dd, J = 8.8, 2.2 Hz), 6.57 (2H, br s); 13C NMR (75 MHz, acetone-d6): δ 169.7, 160.5, 153.8, 153.3, 153.3, 146.2, 146.1, 143.8, 136.0, 130.8, 130.7, 130.0, 129.9, 127.8, 125.4, 124.9, 122.1, 119.2, 115.8, 114.1, 113.3, 112.0, 111.3, 103.6, 103.3, 84.0; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 487.0964, Found, 487.0917 (−4.7 mmu).
【０１１２】
SARhodol-４の合成
【化４７】
2015231364.tif 000054
22時間攪拌した。(38 mg, 38% yield)
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 7.98 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.84−7.79 (3H, m), 7.75 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.71 (1H, br s), 7.40−7.34 (3H, m), 7.22 (1H, s), 6.89 (1H, s), 6.84 (1H, s), 6.75 (1H, s), 6.43 (2H, br s); 13C NMR (75 MHz, acetone-d6): δ 169.2, 156.2, 152.7, 151.5, 145.8, 142.5, 138.1, 136.5, 131.3, 129.7, 129.4, 128.6, 127.5, 125.9, 124.9, 119.6, 119.4, 117.7, 113.7, 112.1, 105.6, 104.7, 82.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 555.0184, Found, 555.0139 (−4.5 mmu).
【０１１３】
SARhodol-５の合成
【化４８】
2015231364.tif 000055
1時間30分間攪拌した。(13 mg, 16% yield)
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 9.07 (1H, br s), 8.08 (1H, d, J = 2.20 Hz), 7.98−7.95 (2H, m), 7.80 (1H, ddd, J = 7.3, 7.3, 1.5 Hz), 7.71 (1H, dd, J = 7.3, 7.3 Hz), 7.62−7.59 (2H, m), 7.29 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.14 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.98 (1H, dd, J = 8.8, 1.5 Hz), 6.76 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.72 (1H, d, J = 1.5 Hz), 6.67−6.59 (4H, m); 13C NMR (75 MHz, acetone-d6): δ 169.6, 160.5, 153.7, 153.1, 153.0, 145.2, 144.7, 137.0, 136.2, 132.0, 130.0, 127.6, 126.4 (q, J = 5.5 Hz), 125.4, 124.8, 124.7 (q, J = 272 Hz), 120.6, 118.6 (q, J = 30 Hz), 117.1, 114.6, 113.4, 111.0, 108.1, 103.2, 83.5; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 555.0838, Found, 555.0821 (−1.7 mmu).
【０１１４】
SARhodol-６の合成
【化４９】
2015231364.tif 000056
9時間攪拌した。(17 mg, 26% yield)
1H NMR (300 MHz, acetone-d6+D2O): δ 8.03 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.83 (1H, dd, J = 7.3, 7.3 Hz), 7.79 (1H, s), 7.75 (1H, dd, J = 7.3, 7.3 Hz), 7.57−7.50 (2H, m), 7.29 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.06 (1H, s), 6.89 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.73 (1H, s), 6.68 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.61−6.57 (2H, m); 13C NMR (100 MHz, acetone-d6): δ 168.6, 159.5, 152.3, 151.8, 151.6, 144.0, 138.4, 135.6, 132.8, 132.5, 130.1, 129.0, 128.9, 127.8, 126.1, 124.7, 124.0, 121.1, 115.2, 112.7, 111.8, 109.4, 105.0, 102.2, 82.7.; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 521.0574, Found, 521.0553 (−2.1 mmu).
【０１１５】
SARhodol-７の合成
【化５０】
2015231364.tif 000057
18時間攪拌した。(215 mg, 40% yield)
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 8.15 (1H, d, J = 1.8 Hz), 8.05 (1H, dd, J = 7.3, 1.8 Hz), 8.01 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.83 (1H, dd, J = 7.3, 7.3 Hz), 7.76 (1H, dd, J = 7.3, 7.3 Hz), 7.53 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.38 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.24−7.21 (2H, m), 6.96 (1H, s), 6.93 (1H, s), 6.80 (1H, s), 6.70 (2H, br s); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 168.9, 156.0, 152.7, 151.5, 144.2, 141.3, 141.2, 138.6, 136.5, 132.3, 131.4, 129.5, 129.8, 127.5, 126.4 (q, J = 5.0 Hz), 124.9, 124.7 (q, J = 272 Hz), 121.8, 121.7, 121.3, 119.9 (q, J = 31 Hz), 117.8, 115.9, 112.4, 109.2, 104.9, 82.0; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 623.0058, Found, 623.0008 (−5.0 mmu).
【０１１６】
SARhodol-８の合成
【化５１】
2015231364.tif 000058
2時間攪拌した。(16 mg, 32% yield)
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 7.99 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.89 (1H, d, J = 1.5 Hz), 7.83 (1H, dd, J = 7.34, 7.34 Hz), 7.71−7.77 (1H, m), 7.52 (1H, dd, J = 8.1,1.5 Hz), 7.45−7.42 (2H, m), 7.32 (1H, d, J = 7.3 Hz), 6.79−6.74 (3H, m), 6.68−6.61 (3H, m), 6.56 (2H, br s), 3.35 (3H, s); 13C NMR (100 MHz, acetone-d6): δ 169.5, 130.3, 153.9, 153.4, 153.4, 147.8, 143.7, 141.6, 136.0, 135.8 ,132.3, 130.7, 130.1, 129.9, 128.0, 125.4, 125.0, 121.4, 119.3, 113.6, 113.2, 111.7, 111.4, 103.3, 102.9, 84.1, 18.2; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 501.1120, Found, 501.1144 (+2.4 mmu).
【０１１７】
SARhodol-９の合成
【化５２】
2015231364.tif 000059
2時間攪拌した。(27 mg, 51% yield)
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 10.14 (1H, br s), 8.18 (1H, s), 8.02 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.81 (1H, dd, J = 7.6, 7.6 Hz), 7.73 (1H, dd, J = 7.6, 7.6 Hz), 7.69 (1H, d, J = 1.5 Hz), 7.61 (1H, dd, J = 8.3, 1.5 Hz), 7.57 (1H,d, J = 8.3 Hz), 7.33−7.32 (3H, m), 6.66−6.54 (6H, m), 3.35−3.28 (1H, m), 1.19 (6H, d, J = 6.8 Hz); 13C NMR (100 MHz, acetone-d6): δ 206.8, 168.8, 160.1, 152.1, 152.0, 148.6, 147.0, 142.4, 138.7, 135.3, 130.0, 129.1, 128.9, 127.1, 126.8, 124.7, 124.2, 121.8, 121.4, 112.9, 111.7, 109.8, 108.6, 102.3, 100.0, 27.1, 22.9, 22.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 529.1433, Found, 529.1445 (+1.2 mmu).
【０１１８】
SARhodol-１０の合成
【化５３】
2015231364.tif 000060
2時間攪拌した。(8.7 mg, 15% yield)
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 8.01−7.96 (2H, m), 7.85−7.80 (1H, m), 7.76−7.71 (1H, m), 7.40 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.29 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.69 (1H, br s), 6.60−6.55 (3H, m), 6.46 (1H, br s), 6.16 (1H, br s), 3.03 (2H, q, J = 6.9 Hz), 2.64 (2H, q, J = 7.6 Hz), 1.24−1.11 (6H, m);HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 543.1590, Found, 543.1616 (+2.6 mmu).
【０１１９】
SARhodol-１１の合成
【化５４】
2015231364.tif 000061
19時間攪拌した。(6.6 mg, 10% yield)
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 8.26 (1H, d, J = 2.2 Hz), 8.05 (1H, d, J = 2.2 Hz), 7.98 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.84−7.79 (1H, m), 7.76−7.70 (1H, m), 7.54 (1H, br s), 7.25 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.92 (2H, br s), 6.71 (1H, d, J = 1.5 Hz), 6.68−6.59 (5H, m), 3.20 (4H, br s), 1.06 (3H, t, J = 7.0 Hz), 0.66 (3H, t, J = 7.0 Hz); 13C NMR (100 MHz, acetone-d6): δ 169.5, 166.6, 160.3, 153.9, 153.4, 152.9, 147.9, 141.4, 140.9, 137.9, 135.9, 131.4, 130.7, 130.1, 129.4, 127.9, 127.7 (q, J = 30 Hz), 126.5 (q, J = 5.5 Hz), 125.3, 124.9, 124.2 (q, J = 273 Hz), 114.4, 113.3, 112.2, 111.6, 104.3, 103.3, 83.8, 43.5, 39.3, 14.0, 12.4; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 654.1522, Found, 654.1490 (−3.2 mmu).
【０１２０】
SARhodol-１２の合成
【化５５】
2015231364.tif 000062
14時間攪拌した。(3.3 mg, 7.3% yield)
1H NMR (300 MHz, CD3CN): δ 8.22 (1H, d, J = 2.2 Hz), 8.10 (1H, d, J = 2.2 Hz), 7.94 (1H, dd, J = 7.3, 1.5 Hz), 7.73 (1H, ddd, J = 7.3, 7.3, 1.5 Hz), 7.65 (1H, dd, J = 7.3, 7.3 Hz), 7.17 (1H, d, J = 7.3, Hz), 6.63 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.60 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.58 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.52 (1H, dd, J = 8.4, 2.2 Hz), 6.39 (1H, dd, J = 8.1, 2.2 Hz), 6.35 (1H, d, J = 2.2 Hz), 3.52 (2H, s), 2.44 (4H, q, J = 7.1 Hz), 0.92 (6H, t, J = 7.1 Hz);HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 640.1729, Found, 640.1749 (+2.0 mmu).
【０１２１】
SARhodol-１３の合成
【化５６】
2015231364.tif 000063
1時間攪拌した。(1.2 mg, 11% yield)
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 8.52 (1H, s), 8.19 (1H, s), 7.98 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.84−7.79 (1H, m), 7.76-7.71 (1H, m), 7.51 (1H,br s), 7.31 (1H, d, J = 7.3, Hz), 6.90 (2H, br s), 6.70 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.66-6.59 (3H, m), 6.51 (1H, dd, J = 8.5, 2.2 Hz), 6.31 (1H, d, J = 2.2 Hz), 4.71−4.67 (3H, br m);HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 585.0943, Found, 585.0956 (+1.3 mmu).
【０１２２】
SARhodol-１４の合成
【化５７】
2015231364.tif 000064
1時間40分間攪拌した。(14 mg, 33% yield)
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 7.98 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.84 (1H, br s), 7.73−7.60 (4H, m), 7.32 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.20 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.11 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.69 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.62 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.53 (1H, d, J = 8.8 Hz);HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 555.0184, Found, 555.0203 (+1.9 mmu).
【０１２３】
SARhodol-１５の合成
【化５８】
2015231364.tif 000065
2時間攪拌した。(12 mg, 42% yield)
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 8.01−7.99 (2H, m), 7.83−7.71 (3H, m), 7.65 (1H, br s), 7.30 (1H, d, J = 7.3, Hz), 6.73 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.61−6.68 (6H, m), 6.54 (1H, dd, J = 8.4, 2.2 Hz), 6.23 (1H, d, J = 2.2 Hz), 4.67 (2H, s), 2.27 (3H, s);HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 531.1226, Found, 531.1235 (+0.9 mmu).
【０１２４】
SARhodol-１６の合成
【化５９】
2015231364.tif 000066
2時間攪拌した。(2.7 mg, 33% yield)
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 8.07 (2H, s), 7.97 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.97−7.83 (1H, m), 7.75−7.70 (1H, m), 7.39 (1H, br s), 7.29 (1H, d, J = 7.3, Hz), 6.69−6.59 (6H, m), 6.48 (1H, d, J = 8.8 H), 6.23 (1H, d, J = 2.2 Hz), 4.66 (4H, s);HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 547.1175, Found, 547.1188 (+1.3 mmu).
【０１２５】
SARhodol-１７の合成
【化６０】
2015231364.tif 000067
15時間攪拌した。(trace)
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 8.03 (2H, s), 7.97 (1H, d, J = 6.6 Hz), 7.86−7.80 (1H, m), 7.77−7.72 (1H, m), 7.55 (1H, br s), 7.44 (1H, d, J = 7.3 Hz), 6.88 (1H, d, J = 7.3 Hz), 6.65 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.64 (2H, br s), 6.59 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.09 (1H, d, J = 8.8 Hz);
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 615.0396, Found, 615.0383 (−1.3 mmu).
【０１２６】
２．蛍光プローブの合成（式（ＩＩ）で表される化合物）
次いで、以下のスキーム４〜６に従って、上記式（ＩＩ）に含まれる化合物蛍光プローブ化合物（ＢｎＳＡＲｈｏｄｏｌ−２、ＢｎＳＡＲｈｏｄｏｌ−２−ｗｓ１）を合成した。
【０１２７】
スキーム４：N,N-bis(4-methoxybenzyl)-4((phenylamino)methyl) benzenesulfonamideの合成
【化６１】
2015231364.tif 000068
(a1) (i) toluene, reflux, (ii) NaBH4 / MeOH, reflux; (a2) 4-(bromomethyl)benzene-1-sulfonyl chloride, triethylamine, / DCM, r.t.
【０１２８】
bis(4-methoxybenzyl)amineの合成 (a1)
【化６２】
2015231364.tif 000069
(4-methoxyphenyl)methanamine (1.29 mL, 10 mmol) と4-methoxybenzaldehyde (1.21 mL, 10 mmol) をtoluene (6 mL) に溶解し、Dean-Stark装置で脱水しつつ2時間加熱還流した。溶媒を除去した後、残渣をMeOHに溶解し、0 oCでNaBH4 (1.13 g, 30 mmol) を加え、2時間加熱還流した。溶媒を減圧除去し、残渣をdichloromethaneに溶解し、2 N NaOHaq.とbrineで洗浄し、無水Na2SO4で脱水し、溶媒を減圧除去し、bis(4-methoxybenzyl)amine (2.49 g, 97 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.24 (1H, d, J = 8.8 Hz, b), 6.86 (1H, d, J = 8.8 Hz, a), 3.79 (6H, s, d), 3.72 (4H, s, c), 1.55 (1H, br s, e); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 158.5, 132.5, 129.3, 113.7, 55.2, 52.4; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 258.1494, Found, 258.1448 (-4.6 mmu).
【０１２９】
N,N-bis(4-methoxybenzyl)-4-((phenylamino)methyl)benzenesulfonamideの合成 (a2)
【化６３】
2015231364.tif 000070
bis(4-methoxybenzyl)amine (323 mg, 1.3 mmol) をCH2Cl2 (5 mL)に溶解し、0 oCで4-(bromomethyl)benzene-1-sulfonyl chloride (339 mg, 1.3 mmol) のCH2Cl2 (5 mL) 溶液とtriethylamine (262 mL, 1.9 mmol) を加え、室温で15分間攪拌した。溶媒を減圧除去し、カラムクロマトグラフィー (silica gel, 25/75 hexane/CH2Cl2 → CH2Cl2) で精製し、N,N-bis(4-methoxybenzyl)-4-((phenylamino)methyl)benzenesulfonamide (459 mg, 74 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ form 1: 7.77 (2H, d, J = 8.1 Hz, e), 7.49 (2H, d, J = 8.1 Hz, f), 6.94 (4H, d, J = 8.8 Hz, b), 6.75 (4H, d, J = 8.8 Hz, a), 4.49 (2H, s, g), 4.25 (4H, s, c), 3.76 (6H, s, d); form 2: 7.79 (2H, d, J = 8.1 Hz, e), 7.49 (2H, d, J = 8.1 Hz, f), 6.95 (4H, d, J = 8.8 Hz, b), 6.75 (4H, d, J = 8.8 Hz, a), 4.61 (2H, s, g), 4.25 (4H, s, c), 3.76 (6H, s, d); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ form 1: 159.0, 142.3, 140.8, 129.8, 129.6, 127.5, 127.3, 113.7, 55.2, 49.5, 31.6.; form 2: 159.0, 141.8, 140.8, 129.8, 129.1, 127.5, 127.3, 113.7, 55.2, 55.1, 49.9, 31.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 512.0507, Found, 512.0483 (-2.4 mmu).
【０１３０】
スキーム５：蛍光プローブ化合物（ＢｎＳＡＲｈｏｄｏｌ−２）の合成
【化６４】
2015231364.tif 000071
(a1) 2-(trifluoromethyl)aniline , Cs2CO3, Pd2(dba)3, Xantphos / toluene, 100 oC.; (a2) N,N-bis(4-methoxybenzyl)-4-((phenylamino)methyl)benzenesulfonamide, K2CO3 / MeCN, reflux; (a3) TFA / DCM, r.t.
【０１３１】
MOM保護CF3PhRhodolの合成 (a1)
【化６５】
2015231364.tif 000072
シュレンク管にスキーム１と同様に合成したMOM保護fluorescein triflate (102 mg, 0.20 mmol)、2-(trifluoromethyl)aniline (24.8 mL, 0.20 mmol)、Cs2CO3 (156 mg, 0.48 mmol)、及び脱水トルエンを加えた。真空ポンプで脱気後、Pd2(dba)3 (18.3 mg, 0.020 mmol) とXantphos (17.3 mg, 0.030 mmol) を加え、再び脱気を行い、100 oCで2時間攪拌した。室温に戻した後、ろ過した溶液の溶媒を除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (silica gel, CH2Cl2 → 97/3 CH2Cl2/MeOH) で精製し、MOM保護CF3PhRhodol (105 mg, 100 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.02 (1H, d, J = 6.6 Hz, g), 7.70-7.59 (3H, m, h, i, k), 7.50-7.42 (2H, m, m, n), 7.19 (1H, d, J = 7.3 Hz, j), 7.08 (1H, dd, J = 7.0, 7.0 Hz, l), 6.93-6.92 (2H, m, b, c), 6.74-6.68 (4H, m, a, d, e, f), 6.16 (1H, br s, o), 5.18 (2H, s, p), 3.46 (3H, s, q); 13C NMR (75 MHz, acetone-d6): δ 169.3, 158.8, 152.9, 152.4, 152.2, 144.8, 140.0, 134.9, 132.8, 129.7, 129.2, 129.0, 126.9 (q, J = 5.0 Hz), 126.7, 126.1, 124.9, 124.3 (q, J = 273 Hz), 121.0, 120.1 (q, J = 29 Hz), 114.1, 112.8, 112.4, 111.7, 104.4, 103.5, 94.2, 83.0, 56.1; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 520.1372, Found, 520.1328 (-4.4 mmu).
【０１３２】
保護BnSARhodol-2の合成 (a2)
【化６６】
2015231364.tif 000073
MOM保護CF3PhRhodol (13.3 mg, 0.026 mmol) とN,N-bis(4-methoxybenzyl)-4-((phenylamino)methyl)benzenesulfonamide  (18.6 mg, 0.037 mmol) とK2CO3 (10.6 mg, 0.077 mmol) をMeCN (10 mL) に溶解し、4時間過熱還流した。溶媒を減圧除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー (silica gel, 97/3 CH2Cl2/MeOH → 90/10 CH2Cl2/MeOH) で精製し、保護BnSARhodol-2 (20.2 mg, 84 % yield) を得た。
【０１３３】
BnSARhodol-2の合成 (a3)
【化６７】
2015231364.tif 000074
保護BnSARhodol-2 (20.2 mg, 0.020 mmol) をdichloromethane (3 mL) に溶解し、TFA (3 mL) を加え、室温で4時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣を逆層HPLCで精製し、BnSARhodol-2-ws1 (3.55 mg, 28 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 9.01 (1H, br s, s), 8.22 (1H, d, J = 7.8 Hz, g), 7.80-7.72 (4H, m, h, i, q), 7.67-7.64 (3H, m, k, p), 7.50 (1H, dd, J = 7.6, 7.6 Hz, m), 7.40 (1H, d, J = 7.3 Hz, j), 7.04-6.88 (5H, m, a, b, d, l, n), 6.78-6.77 (2H, m, c, f), 6.71 (2H, br s, r), 6.58 (1H, d, J = 9.3 Hz, e), 4.89 (2H, m, o); HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 645.1307, Found, 645.1288 (-1.9 mmu).
【０１３４】
スキーム６：蛍光プローブ化合物（ＢｎＳＡＲｈｏｄｏｌ−２−ｗｓ１）の合成
【化６８】
2015231364.tif 000075
(a1) tert-Butyl 2,2,2-Trichloroacetimidate, BF3・OEt2 / DCM, r.t.; (a2) NaOH / MeOH, H2O, r.t.; (a3) (i) chloromethyl methyl ether, K2CO3 / DMF, r.t., (ii) NaOH / THF, H2O, r.t.; (a4) trifluoroacetic anhydride, pyridine / DCM, r.t.; (a5) 2-(trifluoromethyl)aniline , Cs2CO3, Pd2(dba)3, Xantphos / toluene, 100 oC.; (a7) (i) N,N-bis(4-methoxybenzyl)-4-((phenylamino)methyl)benzenesulfonamide, K2CO3 / MeCN, reflux, (ii) TFA / DCM, r.t.
【０１３５】
Fluorescein-diPv-COOtBuの合成 (a1)
【化６９】
2015231364.tif 000076
6-Carboxyfluorescein dipvarate diethylamine salt (403 mg, 0.65 mmol) をCH2Cl2 (30 mL) に溶解し、tert-Butyl 2,2,2-Trichloroacetimidate  (1.99 mL, 7.4 mmol) とBF3・OEt2 (84.6 mL, 0.68 mmol) を4回に分けて加え、22時間室温で攪拌した。水で洗浄し、無水Na2SO4で脱水し、溶媒を減圧除去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー (silica gel, CH2Cl2 → 92/8 CH2Cl2/MeOH) で精製し、Fluorescein-diPv-COOtBu (198 mg, 51 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.28 (1H, d, J = 8.1 Hz, e), 8.08 (1H, d, J = 8.1 Hz, d), 7.73 (1H, s, f), 7.10 (2H, s, c), 6.82-6.81 (4H, m, a, b), 1.58 (9H, s, g), 1.36 (18H, s, h); HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 601.2438, Found, 601.2456 (+1.8 mmu).
【０１３６】
Fluorescein-COOtBuの合成 (a2)
【化７０】
2015231364.tif 000077
Fluorescein-diPv-COOtBu (182 mg, 0.30 mmol) をMeOH (7 mL) に溶解し、2 N NaOHaq. (7 mL) を加え、3分間室温で攪拌した。NH3-HCl緩衝液 (pH 3) を加え、AcOEtで抽出し、無水Na2SO4で脱水し、溶媒を減圧除去し、Fluorescein-COOtBu (161 mg, quant. yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 8.29 (1H, d, J = 8.1 Hz, d), 8.25 (1H, d, J = 8.1 Hz, e), 7.82 (1H, s, f), 7.21 (2H, d, J = 8.8 Hz, a), 7.15 (2H, d, J = 2.2 Hz, c), 6.98 (2H, dd, J = 8.8, 2.2 Hz, b), 1.45 (9H, s, g); 13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ 170.6, 167.6, 165.1, 159.5, 137.4, 134.7, 133.2, 132.6, 131.8, 130.4, 120.1, 116.8, 103.5, 93.9, 83.8, 28.3; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 433.1287, Found, 433.1330 (+4.3 mmu).
【０１３７】
MOM保護Fluorescein-COOtBuの合成 (a3)
【化７１】
2015231364.tif 000078
Fluorescein-COOtBu (151 mg, 0.35 mmol) とK2CO3 (193 mg, 1.4 mmol) をDMF (10 mL) に溶解し、chloromethyl methyl ether (317 mL, 4.4 mmol) を3回に分けて加え、5時間室温で攪拌し、K2CO3 (579 mg, 4.2 mmol) を加え、１18時間室温で攪拌した。NH3-HCl緩衝液 (pH 3) で中和し、AcOEtで抽出し、NH3-HCl緩衝液 (pH 3) で2回洗浄し、無水Na2SO4で脱水し、溶媒を減圧除去した。残渣をTHF / H2O (10 mL / 5 mL) に溶解し、2 N NaOHaq. (0.5 mL) を加え、室温で1時間攪拌した。NH3-HCl緩衝液 (pH 3) で中和し、AcOEtで抽出し、無水Na2SO4で脱水し、溶媒を減圧除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (silica gel, CH2Cl2 → 90/10 CH2Cl2/MeOH) で精製し、MOM保護Fluorescein-COOtBu (32 mg, 19 % yield) を得た。
【０１３８】
MOM保護Fluorescein-COOtBu triflateの合成 (a4)
【化７２】
2015231364.tif 000079
MOM保護Fluorescein-COOtBu (32 mg, 0.067 mmol) をCH2Cl2 (10 mL) に溶解し、triflic anhydride (22.0 mL, 0.13 mmol) とpyridine (21.7 mL, 0.27 mmol) を加え、3時間室温で攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー (silica gel, CH2Cl2) で精製し、MOM保護Fluorescein-COOtBu triflate (8.3 mg, 20 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.26 (1H, dd, J = 8.1, 1.5 Hz, h), 8.08 (1H, d, J = 8.1 Hz, g), 7.75 (1H, d, J = 1.5 Hz, i), 7.27 (1H, d, J = 2.2 Hz, f), 7.02 (1H, d, J = 2.2 Hz, c), 6.98 (1H, dd, J = 8.8, 2.9 Hz, e), 6.89 (1H, d, J = 8.8 Hz, d), 6.79 (1H, dd, J = 8.8, 2.2 Hz, b), 6.70 (1H, d, J = 8.8 Hz, a), 5.22 (2H, s, k), 3.49 (3H, s, l), 1.57 (9H, s, j); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 168.1, 163.9, 159.3, 152.6, 152.0, 151.7, 150.1, 138.7, 131.3, 130.0, 129.2, 129.0, 125.2, 124.9, 119.1, 116.9, 113.9, 111.1, 110.6, 103.8, 94.3, 82.8, 81.8, 56.3, 28.0; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 609.1042, Found, 609.1092 (+5.0 mmu).
【０１３９】
MOM保護CF3PhRhodol-COOtBuの合成 (a5)
【化７３】
2015231364.tif 000080
シュレンク管にMOM保護fluorescein triflate (7.2 mg, 0.012 mmol)、2-(trifluoromethyl)aniline (1.85 mL, 0.012 mmol)、Cs2CO3 (10 mg, 0.031 mmol)、及び脱水トルエンを加えた。真空ポンプで脱気後、Pd2(dba)3 (1.1 mg, 0.0012 mmol) とXantphos (1.6 mg, 0.0018 mmol) を加え、再び脱気を行い、100 oCで20時間攪拌した。室温に戻した後、ろ過した溶液の溶媒を除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (silica gel, CH2Cl2 → 95/5 CH2Cl2/MeOH) で精製し、MOM保護CF3PhRhodol-COOtBu (13.2 mg, quant. yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 8.17 (1H, dd, J = 8.1, 1.5 Hz, h), 7.96 (1H, d, J = 8.1 Hz, g), 7.72 (1H, d, J = 1.5 Hz, i), 7.60 (1H, d, J = 8.1 Hz, j), 7.52-7.49 (2H, m, l, m), 7.21 (1H, br s, n), 7.19-7.13 (1H, m, k), 6.84 (1H, d, J = 1.5 Hz, c), 6.80 (1H, d, J = 2.2 Hz, f), 6.71 (1H, dd, J = 8.8, 2.2 Hz, b), 6.67-6.65 (2H, m, d, e), 6.60 (1H, d, J = 8.8 Hz, a), 5.14 (2H, s, o), 3.32 (3H, s, p), 1.41 (9H, s, q); 13C NMR (100 MHz, acetone-d6): δ 168.5, 164.7, 160.1, 153.8, 153.2, 153.2, 148.1, 141.2, 139.2, 134.2, 131.7, 130.0, 130.0, 127.9, 127.9, 127.8, 127.7, 125.7, 125.5, 125.3, 124.4, 114.4, 114.0, 113.1, 111.0, 104.3, 103.9, 95.1, 83.8, 82.9, 56.3, 28.1; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 620.1896, Found, 620.1862 (-3.4 mmu).
【０１４０】
保護BnSARhodol-2-ws1の合成 (a6)
【化７４】
2015231364.tif 000081
MOM保護CF3PhRhodol-COOtBu (13.2 mg, 0.021 mmol) とN,N-bis(4-methoxybenzyl)-4-((phenylamino)methyl)benzenesulfonamide  (15.6 mg, 0.032 mmol) とK2CO3 (8.8 mg, 0.064 mmol) をMeCN (10 mL) に溶解し、4時間過熱還流した。溶媒を減圧除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー (silica gel, CH2Cl2 → 95/5 CH2Cl2/MeOH) で精製し、保護BnSARhodol-2-ws1 (19.5 mg, 90 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.24 (1H, d, J = 8.8 Hz, b), 6.86 (1H, d, J = 8.8 Hz, a), 3.79 (6H, s, d), 3.72 (4H, s, c), 1.55 (1H, br s, e); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 158.5, 132.5, 129.3, 113.7, 55.2, 52.4; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 258.1494, Found, 258.1448 (-4.6 mmu).
【０１４１】
BnSARhodol-2-ws1の合成 (a7)
【化７５】
2015231364.tif 000082
保護BnSARhodol-2-ws1 (19.5 mg, 0.019 mmol) をdichloromethane (7 mL) に溶解し、TFA (7 mL) を加え、室温で11時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣を逆層HPLCで精製し、BnSARhodol-2-ws1 (1.8 mg, 14 % yield) を得た。
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 8.37-8.35 (2H, m, g, h), 8.04 (1H, d, J = 1.5 Hz, i), 7.85 (1H, dd, J = 8.1, 1.5 Hz, j), 7.78 (1H, dd, J = 6.6, 1.5 Hz, m), 7.75-7.70 (2H, m, l, p), 7.54-7.47 (1H, m, k), 7.21 (2H, d, J = 8.1 Hz, o), 6.95-6.93 (2H, m, a, b), 6.88-6.85 (2H, m, c, q), 6.69 (1H, d, J = 9.5 Hz, d), 6.17 (1H, dd, J = 9.5, 1.5 Hz, e), 6.12 (1H, d, J = 1.5 Hz, f), 5.27-4.94 (2H, m, n);
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 689.1206, Found, 689.1200 (-0.6 mmu).
【実施例２】
【０１４２】
炭酸脱水素酵素（ＣＡ１及びＣＡ９）に対する蛍光アッセイ
実施例１で合成した蛍光プローブＳＡＲｈｏｄｏｌ−１、ＳＡＲｈｏｄｏｌ−５、及びＳＡＲｈｏｄｏｌ−１４にそれぞれ炭酸脱水素酵素（ＣＡ１及びＣＡ９）を作用させ、その蛍光アッセイを行った。紫外―可視吸光分光分析および蛍光分光分析は、Shimadzu UV-1650 (島津製作所)およびHitachi F-4500（日立製作所）を用いて行った。溶液条件は、蛍光プローブの濃度は１μＭ、１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．１）、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、及び０．１％のＤＭＳＯを含む溶液を用いた。ＣＡ１及びＣＡ９の添加に伴う吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを測定し、得られた結果を図１〜３に示す。
【０１４３】
各図１〜３のｂに示すように、いずれの蛍光プローブ化合物についても蛍光プローブ単独の場合には蛍光発光がほとんど見られなかったのに対し、炭酸脱水素酵素の存在下では蛍光強度及び量子収率の著しい増加が認められた。この結果は、本件発明の蛍光プローブ化合物によって炭酸脱水素酵素を選択的に検出できることを実証するものである。各蛍光プローブとも、特にＣＡ１に対して高い感度を示した。
【０１４４】
ＳＡＲｈｏｄｏｌ−５については、蛍光イメージングによってもＣＡ１による蛍光強度の増大が確認された（図２−ｄ）。また、蛍光ピーク波長（５５０ｎｍ）の強度変化のＣＡ１濃度依存性をプロットし、解離定数Ｋｄ（ｎＭ）を算出した結果、約１０ｎＭが得られた（図２−e）。
【０１４５】
同様に、実施例１で合成した蛍光プローブＢｎＳＡＲｈｏｄｏｌ−２及びＢｎＳＡＲｈｏｄｏｌ−２−ｗｓ１にそれぞれ炭酸脱水素酵素（ＣＡ１、ＣＡ２及びＣＡ９）を作用させ、その蛍光アッセイを行った。図４ｂ及び図５ｂに示すように、これらの蛍光プローブは、炭酸脱水素酵素の存在下で蛍光強度及び量子収率の著しい増加が認められ、特にＣＡ９に対して高い感度を有することが分かった。
【実施例３】
【０１４６】
細胞イメージング
蛍光プローブとしてＳＡＲｈｏｄｏｌ−５を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物と精製ＣＡ１タンパク質の蛍光イメージングを行った。図６に、１μＭのＳＡＲｈｏｄｏｌ−５で染色した天然ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）のＣＢＢ染色（左図）及び蛍光イメージ（右図）を示す。図中の「１」は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物と精製ＣＡ１タンパク質の混合物、「２」は精製ＣＡ１タンパク質のみ、「３」はＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物のみの場合である。図中の矢印が、検出されたＣＡ１タンパク質を示している。
【０１４７】
また、蛍光プローブとしてＢｎＳＡＲｈｏｄｏｌ−２−ｗｓ１を用いてＡ５４９細胞をアッセイした共焦点蛍光イメージ結果を図７に示す。
【０１４８】
いずれの結果も、本発明の蛍光プローブが、細胞の蛍光イメージングに適用可能であることを実証するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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