(57)【要約】【課題】本発明は、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）から単離可能な単離ポリペプチドの提供に関する。本発明はまた、１又は複数のポリペプチドを含む組成物、及びポリペプチドを作製及び使用するための方法の提供に関する。【解決手段】配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９２％の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる組成物であって、但し、該単離ポリペプチドがアミノ末端において１又は複数のさらなるアミノ酸を含む場合には、該１又は複数のさらなるアミノ酸が配列番号３９９のアミノ酸１〜２６と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の欠失又は少なくとも１つのアミノ酸の置換を含むことを条件とする、組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９２％の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる組成物であって、但し、該単離ポリペプチドがアミノ末端において１又は複数のさらなるアミノ酸を含む場合には、該１又は複数のさらなるアミノ酸が配列番号３９９のアミノ酸１〜２６と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の欠失又は少なくとも１つのアミノ酸の置換を含むことを条件とする組成物。
【請求項２】
配列番号４０８のアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる組成物であって、但し、該単離ポリペプチドがアミノ末端において１又は複数のさらなるアミノ酸を含む場合には、該１又は複数のさらなるアミノ酸が配列番号４１５のアミノ酸１〜５と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の欠失又は少なくとも１つのアミノ酸の置換を含むことを条件とする組成物。
【請求項３】
ＡＴＣＣ１９６３６又はＡＴＣＣ２５９０４から選択された黄色ブドウ球菌（S. aureus）での攻撃から動物を保護する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
医薬として許容される担体をさらに含んでなる、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９２％の配列同一性有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、配列番号４０８のアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも１つの第二のポリペプチドをさらに含んでなる請求項１又は２に記載の組成物であって、ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能である組成物。
【請求項１１】
前記第二のポリペプチドが：配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６６、配列番号３６７、配列番号３６８、配列番号３６９、配列番号３７０、配列番号３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３７５、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号４１９、配列番号４２０、配列番号４２１、配列番号４２２、配列番号４２３、配列番号４２４、配列番号４２５、配列番号４２６、配列番号４２７、配列番号４２８、又は配列番号４２９のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つの第二のポリペプチドをさらに含んでなる請求項１に記載の組成物であって、ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、該第二のポリペプチドが：配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１６、配列番号４１７、又は配列番号４１８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる組成物。
【請求項１３】
前記第二のポリペプチドが：配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１６、配列番号４１７、又は配列番号４１８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
少なくとも１つの第二のポリペプチドをさらに含んでなる請求項２に記載の組成物であって、ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、該第二のポリペプチドが：配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、又は配列番号４０７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる組成物。
【請求項１５】
前記第二のポリペプチドが：配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、又は配列番号４０７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
鉄キレート剤非含有の培地において成長させた場合に、黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離可能であり、且つ１５０ｋＤａ、１３２ｋＤａ、１２０ｋＤａ、７５ｋＤａ、５８ｋＤａ、５０ｋＤａ、４４ｋＤａ、４３ｋＤａ、４１ｋＤａ、４０ｋＤａの分子量を有する単離ポリペプチド；又はこのような単離ポリペプチドの組合せをさらに含んでなる、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１７】
対象における感染症を治療するための方法であって：
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患している又は罹患するリスクがある対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が：配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる方法。
【請求項１８】
対象における症状を治療するための方法であって：
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患している対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が：配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる方法。
【請求項１９】
対象における感染症を治療するための方法であって：
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患している又は罹患するリスクがある対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が：配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる方法。
【請求項２０】
対象における感染症を治療するための方法であって：
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患している又は罹患するリスクがある対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が：配列番号４０８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる方法。
【請求項２１】
対象における症状を治療するための方法であって：
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患している対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が：配列番号４０８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる方法。
【請求項２２】
対象における感染症を治療するための方法であって：
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患している又は罹患するリスクがある対象へ組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が：配列番号４０８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる方法。
【請求項２３】
前記組成物が、少なくとも１つの第二のポリペプチドをさらに含んでなり、
ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第二のポリペプチドが、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上における電気泳動によって決定される場合、８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が：配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６６、配列番号３６７、配列番号３６８、配列番号３６９、配列番号３７０、配列番号３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３７５、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号４１９、配列番号４２０、配列番号４２１、配列番号４２２、配列番号４２３、配列番号４２４、配列番号４２５、配列番号４２６、配列番号４２７、配列番号４２８、又は配列番号４２９のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つの第二のポリペプチドをさらに含んでなる、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が、少なくとも１つの第二のポリペプチドをさらに含んでなり、
ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、該第二のポリペプチドが：配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１６、配列番号４１７、又は配列番号４１８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第二のポリペプチドが：配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１６、配列番号４１７、又は配列番号４１８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が、少なくとも１つの第二のポリペプチドをさらに含んでなり、
ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、該第二のポリペプチドが：配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、又は配列番号４０７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第二のポリペプチドが：配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、又は配列番号４０７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物が：鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離可能であり、且つドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上における電気泳動によって決定される場合、１５０ｋＤａ、１３２ｋＤａ、１２０ｋＤａ、７５ｋＤａ、５８ｋＤａ、５０ｋＤａ、４４ｋＤａ、４３ｋＤａ、４１ｋＤａ、４０ｋＤａの分子量を有する単離ポリペプチド；又はこのような単離ポリペプチドの組合せをさらに含んでなる、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象が哺乳類である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記哺乳類がヒトである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）が黄色ブドウ球菌（S. aureus）である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
対象における感染症を治療するための方法であって：
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患している又は罹患するリスクがある対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が：配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列類似性を有する単離ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなる方法。
【請求項３５】
対象における症状を治療するための方法であって：
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患している対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が：配列番号３９７から選択されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列類似性を有する単離ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなる方法。
【請求項３６】
対象におけるコロニー形成を減少するための方法であって：
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によってコロニー形成された対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が：配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる方法。
【請求項３７】
対象において感染症を治療するための方法であって：
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患している又は罹患するリスクがある対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が：配列番号４０８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列類似性を有する単離ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなる方法。
【請求項３８】
対象における症状を治療するための方法であって：
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患している対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が：配列番号４０８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列類似性を有する単離ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなる方法。
【請求項３９】
対象におけるコロニー形成を減少するのための方法であって：
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によってコロニー形成された対象に組成物の有効量を投与する段階を含んでなり、
ここで該組成物が：配列番号４０８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含んでなる方法。
【請求項４０】
前記組成物が、少なくとも１つの第二のポリペプチドに特異的に結合する抗体をさらに含んでなり、
ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能である、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記第二のポリペプチドが、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上における電気泳動によって決定される場合、８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記第二のポリペプチドが：配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６６、配列番号３６７、配列番号３６８、配列番号３６９、配列番号３７０、配列番号３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３７５、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号４１９、配列番号４２０、配列番号４２１、配列番号４２２、配列番号４２３、配列番号４２４、配列番号４２５、配列番号４２６、配列番号４２７、配列番号４２８、又は配列番号４２９のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記組成物が少なくとも１つの第二のポリペプチドに特異的に結合する抗体をさらに含んでなり、
ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、そして該第二のポリペプチドが、配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１６、配列番号４１７、又は配列番号４１８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記第二のポリペプチドが：配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１６、配列番号４１７、又は配列番号４１８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物が、少なくとも１つの第二のポリペプチドに特異的に結合する抗体をさらに含んでなり、
ここで該第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり：該第二のポリペプチドが配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、又は配列番号４０７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記第二のポリペプチドが：配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、又は配列番号４０７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％の類似性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記組成物が：鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離可能であり、且つドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上における電気泳動によって決定される場合、１５０ｋＤａ、２９２ｋＤａ、１２０ｋＤａ、７５ｋＤａ、５８ｋＤａ、５０ｋＤａ、４４ｋＤａ、４３ｋＤａ、４１ｋＤａ、４０ｋＤａの分子量を有するポリペプチド；又はこのような単離ポリペプチドの組合せに特異的に結合する抗体をさらに含んでなる、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記対象が哺乳類である、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記哺乳類がヒトである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）が黄色ブドウ球菌（S. aureus）である、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
ポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出するためのキットであって、別々の容器中に：
配列番号４０８又は配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列類似性を有する単離ポリペプチド；及び、
ポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出する試薬、
を含んでなるキット。
【請求項５５】
前記８８ｋＤａの分子量を有する単離ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ株１９６３６によって発現される８８ｋＤａのポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも８０％類似であるマスフィンガープリントを有し、
ここで該ポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり；
５５ｋＤａの分子量を有する単離ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ株１９６３６によって発現される５５ｋＤａのポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも８０％類似のマスフィンガープリントを有し、
ここで該ポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり；
３８ｋＤａの分子量を有する単離ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ株１９６３６によって発現される３８ｋＤａのポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも８０％類似のマスフィンガープリントを有し、
ここで該ポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり；
３７ｋＤａの分子量を有する単離ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ株１９６３６によって発現される３７ｋＤａのポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも８０％類似のマスフィンガープリントを有し、
ここで該ポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり；
３６ｋＤａの分子量を有する単離ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ株１９６３６によって発現される３６ｋＤａのポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも８０％類似のマスフィンガープリントを有し、
ここで該ポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり；
３５ｋＤａの分子量を有する単離ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ株１９６３６によって発現される３５ｋＤａのポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも８０％類似のマスフィンガープリントを有し、
ここで該ポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり；
３３ｋＤａの分子量を有する単離ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ株１９６３６によって発現される３３ｋＤａのポリペプチドマスフィンガープリントと少なくとも８０％類似のマスフィンガープリントを有し、
ここで該ポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能である、請求項２４又は４１に記載の方法。
【請求項５６】
配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９２％の配列類似性を有する単離ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなる組成物であって、但し、該単離ポリペプチドがアミノ末端において１又は複数のさらなるアミノ酸を含む場合には、該１又は複数のさらなるアミノ酸が配列番号３９９のアミノ酸１〜２６と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の欠失又は少なくとも１つのアミノ酸の置換を含むことを条件とする組成物。
【請求項５７】
配列番号４０８のアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列類似性を有する単離ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなる組成物であって、但し、該単離ポリペプチドがアミノ末端において１又は複数のさらなるアミノ酸を含む場合には、該１又は複数のさらなるアミノ酸が配列番号４１５のアミノ酸１〜５と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の欠失又は少なくとも１つのアミノ酸の置換を含むことを条件とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年３月２３日に出願された米国仮出願第６１／２１０，７７２号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陽性菌は、ヒト及び動物のいずれにおいても種々の疾患を生じる生物の非常に多様な群である。ヒト及び／又は動物の健康における重大性が認識されている病原体の中には、コリネバクテリアセエ科（Corynebacteriaceae）、エンテロコッカス科（Enterococcacae）、ミクロコッカス科（Micrococcaceae）、マイコバクテリア科（Mycobacteriaceae）、ノカルジア科（Nocardiaceae）、及びペプトコッカス科（Peptococcaceae）に属する細菌が含まれ、アクチノミセス菌属（Actinomyces spp.）、ビフィズス菌属（Bifidobacterium spp.）、コリネバクテリウム菌属（Corynebacterium spp.）、エンテロコッカス菌属（Enterococcus spp.）、エリシペロスリクス菌属（Erysipelothrix spp.）、ユーバクテリウム菌属（Eubacterium spp.）、キトコッカス属（Kytococcus spp.）、ラクトバチルス菌属（Lactobacillus spp.）、ミクロコッカス菌属（Micrococcus spp.）、モビルンカス菌属（Mobiluncus spp.）、マイコバクテリア菌属（Mycobacteria spp.）、ペプトストレプトコッカス菌属（Peptostreptococcus spp.）、プロピオニバクテリウム菌属（Propionibacterium spp.）、及びブドウ球菌属（Staphylococcus spp）等の細菌が含まれる。これらの病原体は、多くの異なる動物種において多くの臨床症状を生じる。このような感染症のための治療は、歴史的にはグラム陽性生物の共通構造及び機能を攻撃する抗生物質であった。しかしながら、多くのより広範に存在するグラム陽性生物は、抗生物質の一部のクラスに対する耐性を発達させて、感染症の治療が困難である。ヒト及び食物生産動物のいずれにおける細菌疾患の治療での抗生物質の広範囲に及ぶ使用は、グラム陽性生物の多くの種の抗生物質耐性株の増殖の主たる要因である可能性が高い。従って、動物及びヒトにおけるグラム陽性生物による感染を予防又は排除する別の治療を発見することが非常に必要である。
【０００３】
農業動物におけるブドウ球菌感染症
農産業において、多数の重大な疾患がグラム陽性生物によって生じる。グラム陽性菌感染症によって生じる臨床症状の例は、乳腺炎、敗血症、肺炎、骨髄炎、髄膜脳炎、リンパ管炎、皮膚炎、生殖器感染症、子宮炎、周産期疾患、下垂体膿瘍、関節炎、滑液包炎、精巣炎、膀胱炎及び腎盂腎炎、リンパ節炎、結核、潰瘍性リンパ管炎、丹毒、蹄葉炎、チザー病、破傷風、ボツリヌス症、腸炎、悪性水腫、ブラクシー病（braxy）、桿菌性ヘモグロビン尿症、腸毒血症が含まれる。ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）は、特に農業動物の多くの異なる種に感染することができ、膨大な経済的損失を生じ得る。例えば、米国酪農業において、乳腺炎、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）によって度々生じる疾患に起因して、毎年乳牛１頭当たり約＄１８５を損出すると見積もられている。米国では９．５００万頭の乳牛が飼育されているので、乳腺炎の年間コストは約＄１８億である。これは、農家の牛乳販売の総売上げの約１０％であり、この損失の約３分の２は、準臨床的に（無症状に）感染した乳牛における牛乳の生産の減少に起因する。他の損失は、異常乳の廃棄及び抗生物質で治療された乳牛由来の乳の保留、発症した乳牛の早期差し替えコスト、選別された乳牛の売却価額の低下、薬及び獣医サービスのコスト及び人件費の増加に起因する。ウシ酪農業内のこの蔓延に加えて、グラム陽性球菌によって生じる乳腺炎はまた、ヤギ及びヒツジの間で共通する。黄色ブドウ球菌（S. aureus）によって生じるさらなる動物疾患には、ウマにおけるボトリオミセス症、家禽における化膿性滑膜炎及び骨髄炎、ウサギにおけるスナッフル、ブタにおける流産、及び子ヒツジにおけるダニ性膿血が含まれる。ブドウ球菌の他の種は、イヌ及びブタの主たる皮膚病原体である｛イヌ：（ストレプトコッカス・インターメディウス（S. intermedius）｝｛ブタ：スタフィロコッカス・ヒカス（S. hycius）｝。家禽種において、ブドウ球菌病原体は心膜炎及び敗血症を生じる。
【０００４】
ヒトにおけるブドウ球菌感染症
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）はまた、多種多様な感染症を生じるヒト病原体である。ヒト粘膜及び皮膚の共通の生着菌である、種黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）は、様々なヒト感染症を生じうる日和見病原体である。例えば、黄色ブドウ球菌（S. aureus）は、膿痂疹、せつ腫症、蜂窩織炎、及び熱傷様皮膚症候群、並びに潜在的に致命的な手術後の創傷感染症を含む一部の皮膚感染症の原因病原体である。加えて、病院内（hospital settings）での易感染性個人の黄色ブドウ球菌（S. aureus）への曝露は、結果、器官感染症、例えば肺炎、尿路感染症、骨髄炎、関節炎、菌血、及び心内膜炎を生じている。黄色ブドウ球菌（S. aureus）はまた、中毒症、最も顕著な毒素性ショック症候群及び食中毒の原因病原体である。ブドウ球菌エンテロトキシンＢによって生じる食中毒は、食物由来の疾病、特にサルモネラ症、カンピロバクター症及びリステリア症の最も一般的な原因である。ブドウ球菌の他の種はまた、ヒト疾患を生じ；表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）、スタフィロコッカス・ヘモリティカス（S. haemolyticus）及びスタフィロコッカス・ホミニス（S. hominis）は通常埋め込み医療機器に感染し、並びに腐生ブドウ球菌（S. saprophyticus）は、女性における尿路感染症と関連がある。
【０００５】
ブドウ球菌の病原性機構
ブドウ球菌は、種々の宿主組織に感染し、宿主環境に関連する制限的な資源及び活発な防御の中で生存するためにデザインされた数種類のタイプの分泌タンパク質、細胞表面発現病原性因子の産生及び代謝系を介して、免疫系を回避する。コロニー形成は、感染の確立における必須の第一段階であり；莢膜、リポテイコ酸、及びテイコ酸を含む多数の因子は、コロニー形成に寄与する共通の構成成分である。加えて、表面タンパク質、例えばブドウ球菌フィブロネクチン結合タンパク質及び骨シアロタンパク質結合タンパク質は、特異的に宿主組織構成成分に結合する。毒素は、通常ブドウ球菌病原体間で産生され、非常にダメージを与え；食中毒、毒素性ショック症候群及び剥離性皮膚状態を含む一部のヒト疾患は、細胞外分泌毒素タンパク質の直接的な結果である。単一の単離株は、２０〜３０種の異なる分泌毒素に関する遺伝子をコードする。分泌タンパク質生成物の一部は、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子、同時に、Ｔ細胞のＴ細胞受容体に非特異的に結合することができるスーパー抗原である。結合は、Ｔ細胞シグナル伝達を誘発し、高レベルの炎症誘発性因子の放出につながり、最終的に極度の免疫応答に起因する宿主のダメージを誘発する。表面上に発現される病原性因子の他のクラスは、宿主免疫系から細菌を隠す。例えば、黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞表面発現タンパク質Ａは、宿主抗体のＦｃ構成成分の結合によってオプソニン作用及び食作用を抑制する。多数のプロテアーゼ、溶血素（アルファ, ベータ, ガンマ及びデルタ）、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、及びコラゲナーゼもまた、細菌を周囲細胞からの栄養分の抽出及び宿主防御からの保護において補助する。
【０００６】
ブドウ球菌間の抗生物質耐性
ＣＤＣの推定によれば、米国において毎年ほぼ２００万人が院内感染症に罹患し、毎年９０，０００人が死亡している。これらの致命的な感染症のうち、７０％は抗生物質耐性細菌によって生じる。微生物種間の抗生物質耐性の増加は、皮膚及び粘膜生着菌、例えば黄色ブドウ球菌（S. aureus）において特に明白である。例えば、病院内から単離される大多数の黄色ブドウ球菌（S. aureus）はペニシリンに耐性を示し、５０％はまた半合成ペニシリン、例えばメチシリン、ナフシリン、及びオキサシリンに耐性を示す。ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（S. aureus））と呼ばれるこれらの単離株は、１９７０代に初めて観察され、今日病院内において深く根付いてしまっている。近年、感染した個人は病院又は医療従事者への以前の曝露がないコミュニティーにおけるＭＲＳＡ感染症のケースが存在する。この驚くべき傾向は、ＭＲＳＡを治療するために使用されるグリコペプチドであるバンコマイシンへの感受性がより低いＭＲＳＡ単離株の単離によって増強される。バンコマイシン耐性のＣＤＣの定義によれば、本当にバンコマイシンに耐性を示すことが示されている株はほとんどないが、一部のＭＲＳＡ株は、バンコマイシンに対する感受性が低下した亜集団、又はＶＩＳＡ（バンコマイシン低感受性黄色ブドウ球菌（S. aureus））から構成されると特徴付けられる。バンコマイシン耐性及びバンコマイシン低感受性株の単離は、相対的に新たに発展したものなので、病院及び／又はコミュニティー内におけるこれらの蔓延に関するデータがほとんどない。時折、バンコマイシンに対する完全な耐性を有し且つ恐らくエンテロコッカス菌属（Enterococcus spp.）から得られる耐性プラスミドを運搬するＶＲＳＡ（バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（S. aureus））もまた、ヒトから回収されている。
【０００７】
ブドウ球菌感染症の予防及び治療のためのストラテジー
複数の抗生物質に耐性を示す多数のグラム陽性病原体の出現によって、疾患から保護するための予防ワクチンの開発を目的とする研究努力が活発化されてきた。ワクチンは、免疫系からの長期記憶応答を誘発するために患者に投与されるようデザインされ、これにより将来病原体に遭遇した場合に、免疫系はより迅速且つ効率的に病原体を除去することができる。今日まで、グラム陽性病原体と関連がある多数の重度のヒト疾患、特にブドウ球菌感染症と関連がある疾患に対する広範の予防ワクチンは、利用できていない。ブドウ球菌感染症からの予防のためのワクチン開発のアプローチは、接着マトリックス分子［MSCRAMMS（Nilsson et al. 1998. J Clin Invest 101 :2640-9; Menzies et al. 2002. J Infect Dis 185:937-43; Fattom et al. 2004. Vaccine 22:880-7）］、表面ポリサッカライド（McKenney et al. 2000; McKenney et al. 1999. Science 284:1523-7; Maira-Litran et al. 2002. Infect Immun 70:4433-40; Maira-Litran et al. 2004. Vaccine 22:872-9; Maira-Litran et al. 2005. Infect Immun 73 : 6752-62）及び変異細胞外タンパク質（exoprotein）（Lowell et al. 1996. Infect Immun 64 :4686-93 ; Stiles et al. 2001. Infect Immun 69:2031-6; Gampfer et al. 2002. Vaccine 20:3675-84）を、サブユニットワクチン組成物、並びに１種の生弱毒性株（Reinoso et al. 2002. Can J Vet Res 66:285-8）及び一部のＤＮＡワクチンアプローチ（Ohwada et al. 1999. J Antimicrob Chemother 44:767-74；Brouillette et al. 2002. Vaccine 20:2348-57; Senna et al. 2003. Vaccine 21:2661-6）における抗原として認識している微生物表面の構成成分の使用を報告するものを含む。多くこれらの組成物はある程度の防御を示すにもかかわらず、様々なスタフィロコッカス・ヒカス株に対する交差防御をほとんど達成しておらず、さらに易感染性患者、院内感染に関してリスクの高い集団において実質的に免疫応答を誘発することができていない。
【０００８】
最も重度のブドウ球菌疾患は、抗原提示とは無関係に非特異的にＴ細胞を刺激する上述のスーパー抗原発熱性外毒素（SPE）によって媒介されるものである。このような疾患は、毒素性ショック症候群、剥離性皮膚疾患、及び場合により川崎症候群を含む。これらのＳＰＥ媒介される疾患に関して、活発な感染中に免疫系を追加免疫する免疫療法剤は、典型的には感染の前に投与されるワクチンよりたびたびより効果的である。ＳＰＥへの免疫応答が強力なため、治療における第一の目的として毒素活性の迅速な低下を必要とする。今日まで、黄色ブドウ球菌（S. aureus）媒介疾患における毒素中和は、数千人のヒトドナー由来の静脈内ヒト免疫グロブリン（IVIG）、精製され、濃縮されたヒト抗体製剤の投与によって最も効果的に達成されている（Takei et al. 1993. J Clin Invest 91:602-7; Stohl and Elliot. 1996. Clin Immunol Immunopathol 79:122-33）。約３０％の健康なヒト成人においてコロニーを形成する、黄色ブドウ球菌（S. aureus）の広範囲に及ぶ分布は、集団の大部分に対する高曝露率と一致し、よって、ＩＶＩＧにおける抗ブドウ球菌抗毒素抗体のレベルは毒素を中和するのにたびたび十分であり、細菌負荷が抗生物質で低下するまで免疫応答を安定化する（Schlievert, 2001. J Allergy Clin Immunol 108（4 Suppl）:S 107-110）。複数の製造者からのｒＶＩＧ製剤は、ヒト抹消血単核細胞での増殖アッセイにおいて毒素を中和し、インビトロ（in vitro）で毒素誘発ヒトＴ細胞由来Ｂ細胞の分化を抑制し（Stohl and Elliot. 1996. Clin Immunol Immunopathol 79:122-33; Stohl and Elliott. 1995. J Immunol 155:1838-50; Stohl et al. 1994. J Immunol 153:117-27）、さらにブドウ球菌エンテロトキシンＢで刺激されたＰＢＭＣにおけるＩＬ−４及びＩＬ−２分泌を減少することが示されている（Takei et al. 1993. J Clin Invest 91:602-7; Darenberg et al. 2004. Clin Infect Dis 38:836-42）。証明済みのＳＰＥを中和する能力でのＩＶＩＧ治療は、川崎症候群に対して今日推奨される治療であり、ブドウ球菌毒素性ショック症候群のための治療方法として支持される（Schlievert 2001. J Allergy Clin Immunol 108（4 Suppl）:S107-110）。外科手術中の免疫防御創傷の洗浄としてのＩＶＩＧの使用はまた、マウスで調査されてきた（Poelstra et al. 2000. Tissue Eng 6（4）:401-411）。標準的なＩＶＩＧはブドウ球菌ＳＰＥ媒介疾患の進行を制限するのに有用であるが、数千の任意抽出されたヒトドナーから産生されたヒトＩＶＩＧ製剤の安全性、有効性及び安定性は、議論の余地が残されたままである（Baker et al. 1992. N Engl J Med 327:213-9; Miller et al. 2001. J Allergy Clin Immunol 108:S91-4; Sacher, 2001. J Allergy Clin Immunol 108:S139-46; Darenberg et al. 2004. Clin Infect Dis 38:836-42）。さらに、ブドウ球菌感染症の予防におけるＩＶＩＧの利点は不確かである（Baker et al. 1992. N Engl J Med 327:213-9; Hill, H. R. 2000. J Pediatr 137:595-7; Darenberg et al. 2004. Clin Infect Dis 38:836-42）。一定のリスクがある集団においてブドウ球菌感染症を治療することにおいてＩＶＩＧの有効性を増加するために、血漿由来の、ドナー選択された、ブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭＳ凝集因子Ａ（CIfA）及びフィブリノゲン結合タンパク質Ｇ（SdrG）に対する抗体の高抗体価のポリクローナル抗ブドウ球菌ヒトＩｇＧを作製し試験したところ、出生時体重が非常に低い乳児においてブドウ球菌敗血症を予防することに成功した（Vernachio et al. 2003. Antimicrob Agents Chemother 47:3400-6; Bloom et al. 2005. Pediatr Infect Dis J 24:858-866; Capparelli et al. 2005. Antimicrob Agents Chemother 49:4121-7）。黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＣＲＡＭＭ凝集因子Ａに対して特異的なヒト化モノクローナル抗体もまた、開発されている。抗体を、ヒトフィブロネクチンに結合している黄色ブドウ球菌（S. aureus）を抑制する態様でＣＩｆＡを結合するその能力のために数千のマウス抗ＣｌｆＡ抗体のプールから選択し、続いて相同ヒト生殖系列サブグループ抗体を模倣するよう、特異的な標的残基を変異することによってヒト化した（Hall et al. 2003. Infect Immun 71:6864-70; Domanski et al. 2005. Infect Immun 73:5229-32）。特異的抗体は、動物試験においてもまた予防的防御効果が証明されているが、重度の生命を危うくする黄色ブドウ球菌（S. aureus）感染症の治療のために抗生物質との併用使用に対してデザインされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様において、本発明は、２又はそれ以上の単離ポリペプチドを含む組成物を提供する。組成物中の単離ポリペプチドは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上における電気泳動によって測定される場合、８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有する。例えば、組成物は８８ｋＤａ及び５５ｋＤａの単離タンパク質を含んでよい。一部の態様において、組成物は８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、及び３３ｋＤａの分子量を有する単離ポリペプチドを含んでよい。ポリペプチドは、鉄キレート剤を含む培地中でインキュベートさせた場合は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地で培養させた場合は単離不可能である。組成物は、動物、例えばマウス、乳牛又はヒトを、黄色ブドウ球菌（S. aureus）株、例えばＡＴＣＣ株１９６３６での攻撃（challenge）から防御する。組成物は、医薬として許容される担体をさらに含んでよく、１５０ｋＤａ、１３２ｋＤａ、１２０ｋＤａ、７５ｋＤａ、５８ｋＤａ、５０ｋＤａ、４４ｋＤａ、４３ｋＤａ、４１ｋＤａ、又は４０ｋＤａの分子量を有し、鉄キレート剤非含有の培地で成長させた場合に黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離可能な１又は複数の単離ポリペプチドをさらに含んでよい。一部の態様において、組成物のポリペプチドは、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ株１９６３６から単離されてよい。
【００１０】
一部の実施形態において、組成物の各ポリペプチドは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ株１９６３６によって発現された同一分子量ポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも８０％類似性を有するマスフィンガープリントを有し、ここでポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地で成長させた場合に単離不可能である。例えば、分子量８８ｋＤａの単離ポリペプチドは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ株１９６３６によって発現される８８ｋＤａのポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも８０％類似であるマスフィンガープリントを有し、分子量５５ｋＤａの単離ポリペプチドは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ株１９６３６によって発現される５５ｋＤａのポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも８０％類似であるマスフィンガープリントを有する。
【００１１】
他の態様において、本発明は、配列番号４０８と配列番号３９７から選択されたアミノ酸配列と、少なくとも８０％の配列類似性を有する単離ポリペプチドを含む組成物を提供する。組成物は、少なくとも１つの第二のポリペプチドをさらに含んでよく、ここで第二のポリペプチドは、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であるが、鉄キレート剤非含有培地において成長させた場合には単離不可能である。一部の場合において、第二のポリペプチドは、配列番号３５３、配列番号３６４、配列番号３７５、配列番号３８６、及び配列番号４１９から選択されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の類似性を有するアミノ酸配列を含むことができる。他の場合において、第二のポリペプチドは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって測定される場合、８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有してよい。組成物は、鉄キレート剤非含有培地で成長させた場合に黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離可能であり、且つ１５０ｋＤａ、１３２ｋＤａ、１２０ｋＤａ、７５ｋＤａ、５８ｋＤａ、５０ｋＤａ、４４ｋＤａ、４３ｋＤａ、４１ｋＤａ、４０ｋＤａの分子量を有する１又は複数の単離ポリペプチドをさらに含んでよい。
【００１２】
本発明はまた、組成物を使用するための方法を供する。一態様において、方法は、対象の感染症における治療用であり、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患している又は罹患するリスクのある対象に本発明の組成物の有効量を投与することを含む。他の態様において、方法は、対象における症状の治療用であり、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患している対象に本発明の組成物の有効量を投与することを含む。対象は、哺乳類、例えば、ヒト、ウマ、又は乳牛であってよい。ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）であってよい。
【００１３】
本発明は、さらに本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体、例えばポリクローナル抗体を使用するための方法を供する。一態様において、方法は、対象における感染症の治療用であり、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患する又は罹患するリスクのある対象に組成物の有効量を投与することを含み、ここで、組成物は少なくとも１つ、場合によって１つ以上の、本発明の単離ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む。他の態様において、方法は、対象において症状を治療するためのものであり、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患する対象に組成物の有効量を投与することを含み、ここで組成物は、少なくとも１つ、場合によって１つ以上の、本発明の単離ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む。対象は、哺乳類、例えばヒト、ウマ、又は乳牛であってよい。ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）であってよい。
【００１４】
本発明によって供される方法はまた、対象においてコロニー形成を減少するためのものである。一態様において、方法は、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によってコロニー形成された対象に本発明の組成物の有効量を投与することを含む。他の態様において、方法は、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によってコロニー形成された対象に組成物の有効量を投与することを含み、ここで組成物は少なくとも１つ、場合によって１つ以上の本発明の単離ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む。
【００１５】
本発明は、ポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出するためのキットを供する。キットは、別々の容器内の、本発明の単離ポリペプチド、及びポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出する試薬を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、鉄含有及び非含有で成長させた異種に由来する異種株の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のタンパク質の電気泳動プロファイルを示す（それぞれ、Fe及びDPで標識されたレーン）。
【図２】図２は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の相同種（homologous）及び異種攻撃後の、ワクチン接種された及びワクチン接種されていないマウス間の死亡率の違いを示す。
【図３】図３は、ワクチン接種及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６での相同種攻撃後の生存率を示しているカプラン・マイヤー生存曲線である。
【図４】図４は、ワクチン接種及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６での異種攻撃後の生存率を示しているカプラン・マイヤー生存曲線である。
【図５】図５は、受動免疫及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６での相同種攻撃後の生存率を示しているカプラン・マイヤー生存曲線である。
【図６】図６は、受動免疫及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）株１４７７での異種攻撃後の生存率を示しているカプラン・マイヤー生存曲線である。
【図７】図７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号353）を表す。
【図８】図８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号354）を表す。
【図９】図９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号355）を表す。
【図１０】図１０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号356）を表す。
【図１１】図１１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号357）を表す。
【図１２】図１２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号358）を表す。
【図１３】図１３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号359）を表す。
【図１４】図１４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号360）を表す。
【図１５】図１５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号361）を表す。
【図１６】図１６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号362）を表す。
【図１７】図１７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号363）を表す。
【図１８】図１８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号364）を表す。
【図１９】図１９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号365）を表す。
【図２０】図２０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号366）を表す。
【図２１】図２１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号367）を表す。
【図２２】図２２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号368）を表す。
【図２３】図２３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号369）を表す。
【図２４】図２４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号370）を表す。
【図２５】図２５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号371）を表す。
【図２６】図２６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号372）を表す。
【図２７】図２７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号373）を表す。
【図２８】図２８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号374）を表す。
【図２９】図２９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号375）を表す。
【図３０】図３０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号376）を表す。
【図３１】図３１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号377）を表す。
【図３２】図３２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号378）を表す。
【図３３】図３３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号379）を表す。
【図３４】図３４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号380）を表す。
【図３５】図３５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号381）を表す。
【図３６】図３６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号382）を表す。
【図３７】図３７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号383）を表す。
【図３８】図３８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号384）を表す。
【図３９】図３９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号385）を表す。
【図４０】図４０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号386）を表す。
【図４１】図４１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号387）を表す。
【図４２】図４２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号388）を表す。
【図４３】図４３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号389）を表す。
【図４４】図４４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号390）を表す。
【図４５】図４５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号391）を表す。
【図４６】図４６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号392）を表す。
【図４７】図４７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号393）を表す。
【図４８】図４８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号394）を表す。
【図４９】図４９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号395）を表す。
【図５０】図５０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号396）を表す。
【図５１】図５１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号397）を表す。
【図５２】図５２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号398）を表す。
【図５３】図５３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号399）を表す。
【図５４】図５４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号400）を表す。
【図５５】図５５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号401）を表す。
【図５６】図５６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号402）を表す。
【図５７】図５７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号403）を表す。
【図５８】図５８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号404）を表す。
【図５９】図５９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号405）を表す。
【図６０】図６０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号406）を表す。
【図６１】図６１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号407）を表す。
【図６２】図６２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号408）を表す。
【図６３】図６３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号409）を表す。
【図６４】図６４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号410）を表す。
【図６５】図６５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（SEQ BD NO:411）を表す。
【図６６】図６６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号412）を表す。
【図６７】図６７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号413）を表す。
【図６８】図６８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号414）を表す。
【図６９】図６９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号415）を表す。
【図７０】図７０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号416）を表す。
【図７１】図７１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号417）を表す。
【図７２】図７２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号418）を表す。
【図７３】図７３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号419）を表す。
【図７４】図７４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号420）を表す。
【図７５】図７５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号421）を表す。
【図７６】図７６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号422）を表す。
【図７７】図７７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号423）を表す。
【図７８】図７８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号424）を表す。
【図７９】図７９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号425）を表す。
【図８０】図８０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号426）を表す。
【図８１】図８１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号427）を表す。
【図８２】図８２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号428）を表す。
【図８３】図８３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号429）を表す。
【図８４】図８４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号430）を表す。
【図８５】図８５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号431）を表す。
【図８６】図８６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号432）を表す。
【図８７】図８７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号433）を表す。
【図８８】図８８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号434）を表す。
【図８９】図８９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号435）を表す。
【図９０】図９０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号436）を表す。
【図９１】図９１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号437）を表す。
【図９２】図９２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号438）を表す。
【図９３】図９３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号439）を表す。
【図９４】図９４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号440）を表す。
【図９５】図９５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号441）を表す。
【図９６】図９６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号442）を表す。
【図９７】図９７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号443）を表す。
【図９８】図９８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号444）を表す。
【図９９】図９９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号445）を表す。
【図１００】図１００は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号446）を表す。
【図１０１】図１０１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号447）を表す。
【図１０２】図１０２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号448）を表す。
【図１０３】図１０３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号449）を表す。
【図１０４】図１０４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号450）を表す。
【図１０５】図１０５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号451）を表す。
【図１０６】図１０６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号452）を表す。
【図１０７】図１０７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号453）を表す。
【図１０８】図１０８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号454）を表す。
【図１０９】図１０９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号455）を表す。
【図１１０】図１１０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号456）を表す。
【図１１１】図１１１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号457）を表す。
【図１１２】図１１２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号458）を表す。
【図１１３】図１１３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号459）を表す。
【図１１４】図１１４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号460）を表す。
【図１１５】図１１５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号461）を表す。
【図１１６】図１１６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号462）を表す。
【図１１７】図１１７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号463）を表す。
【図１１８】図１１８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号464）を表す。
【図１１９】図１１９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号465）を表す。
【図１２０】図１２０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号466）を表す。
【図１２１】図１２１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号467）を表す。
【図１２２】図１２２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号468）を表す。
【図１２３】図１２３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号469）を表す。
【図１２４】図１２４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号470）を表す。
【図１２５】図１２５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号471）を表す。
【図１２６】図１２６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号472）を表す。
【図１２７】図１２７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号473）を表す。
【図１２８】図１２８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号474）を表す。
【図１２９】図１２９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号475）を表す。
【図１３０】図１３０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号476）を表す。
【図１３１】図１３１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号477）を表す。
【図１３２】図１３２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号478）を表す。
【図１３３】図１３３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号479）を表す。
【図１３４】図１３４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号480）を表す。
【図１３５】図１３５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号481）を表す。
【図１３６】図１３６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号482）を表す。
【図１３７】図１３７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号483）を表す。
【図１３８】図１３８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号484）を表す。
【図１３９】図１３９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号485）を表す。
【図１４０】図１４０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号486）を表す。
【図１４１】図１４１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号487）を表す。
【図１４２】図１４２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号488）を表す。
【図１４３】図１４３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号489）を表す。
【図１４４】図１４４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号490）を表す。
【図１４５】図１４５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号491）を表す。
【図１４６】図１４６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号492）を表す。
【図１４７】図１４７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号493）を表す。
【図１４８】図１４８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号494）を表す。
【図１４９】図１４９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号495）を表す。
【図１５０】図１５０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣｌ９６３６から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号496）を表す。
【図１５１】図１５１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号497）を表す。
【図１５２】図１５２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号498）を表す。
【図１５３】図１５３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号499）を表す。
【図１５４】図１５４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号500）を表す。
【図１５５】図１５５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号501）を表す。
【図１５６】図１５６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号502）を表す。
【図１５７】図１５７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号503）を表す。
【図１５８】図１５８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号504）を表す。
【図１５９】図１５９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号505）を表す。
【図１６０】図１６０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号506）を表す。
【図１６１】図１６１は、受動免疫及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ２５９０４での相同種攻撃後の生存率を示しているカプラン・マイヤー生存曲線を表す。Ａは、ｒＭｎｔＣのワクチン接種後の静脈内攻撃；Ｂは、２×ＳＢＲＰ抽出物のワクチン接種、２×ｒＳＩＲＰ７のワクチン接種、又は３×ｒＳＩＲＰ７のワクチン接種後の腹腔内攻撃；Ｃは、ｒＳＩＲＰ７のワクチン接種後の静脈内攻撃を表す。
【図１６２】図１６２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＰ１２２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号543）を表す。
【図１６３】図１６３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号544）を表す。
【図１６４】図１６４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号545）を表す。
【図１６５】図１６５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号546）を表す。
【図１６６】図１６６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号547）を表す。
【図１６７】図１６７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号548）を表す。
【図１６８】図１６８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号549）を表す。
【図１６９】図１６９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号550）を表す。
【図１７０】図１７０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号551）を表す。
【図１７１】図１７１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号552）を表す。
【図１７２】図１７２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号553）を表す。
【図１７３】図１７３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号554）を表す。
【図１７４】図１７４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号555）を表す。
【図１７５】図１７５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号556）を表す。
【図１７６】図１７６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号557）を表す。
【図１７７】図１７７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号558）を表す。
【図１７８】図１７８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号559）を表す。
【図１７９】図１７９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号560）を表す。
【図１８０】図１８０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号561）を表す。
【図１８１】図１８１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号562）を表す。
【図１８２】図１８２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号563）を表す。
【図１８３】図１８３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号564）を表す。
【図１８４】図１８４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号565）を表す。
【図１８５】図１８５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号566）を表す。
【図１８６】図１８６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号567）を表す。
【図１８７】図１８７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号568）を表す。
【図１８８】図１８８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号569）を表す。
【図１８９】図１８９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号570）を表す。
【図１９０】図１９０は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号571）を表す。
【図１９１】図１９１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号572）を表す。
【図１９２】図１９２は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号573）を表す。
【図１９３】図１９３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号574）を表す。
【図１９４】図１９４は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号575）を表す。
【図１９５】図１９５は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号576）を表す。
【図１９６】図１９６は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号577）を表す。
【図１９７】図１９７は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号578）を表す。
【図１９８】図１９８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号579）を表す。
【図１９９】図１９９は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬから得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号580）を表す。
【図２００】図２００は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号581）を表す。
【図２０１】図２０１は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６から得られる金属制御ポリペプチドをコードしている核酸配列（配列番号582）を表す。
【図２０２】図２０２は、組換えで生成された金属制御ポリペプチドへのマウス回復期血清の結合を示しているウエスタンブロットを表す。
【図２０３】図２０３は、組換えで生成された金属制御ポリペプチドへの健康なヒト由来の血清の結合を示しているウエスタンブロットを表す。
【図２０４】図２０４は、組換えで生成された金属制御ポリペプチドへの回復期ヒト由来の血清の結合を示しているウエスタンブロットを表す。
【図２０５】図２０５は、金属制御ポリペプチドの黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＤＵ５８７５表面発現を示しているフローサイトメトリーデータである。
【図２０６】図２０６は、ｒＳＩＲＰ７のワクチン接種及びＳＩＲＰ抽出物又はｒＳＩＲＰ７での再刺激後のサイトカイン誘導を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の好適な実施形態の詳細な説明
本発明は、ポリペプチド及びポリペプチドを含む組成物を供する。本明細書で用いられる、「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸のポリマーを意味する。従って、例えば、用語、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、及び酵素は、ポリペプチドの定義内に含まれる。当該用語はまた、ポリペプチドの発現後の修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等を含む。用語ポリペプチドは、特異的な長さのアミノ酸のポリマーを含まない。ポリペプチドは、自然のソースから直接的に単離可能、又は組換え、酵素、又は化学技術を用いて調製することが可能である。自然由来のポリペプチドの場合、このようなポリペプチドは典型的には単離により得られる。
【００１８】
「単離」ポリペプチドは、その自然環境から取り出されるものである。例えば、単離ポリペプチドは、細胞質又は細胞膜から取り出されたポリペプチドであり、その自然環境におけるポリペプチド、核酸、及び他の細胞物質の大半がもはや存在しないものが挙げられる。
【００１９】
特定のソース由来の「単離可能な」ものとして特徴付けられるポリペプチドは、適当な条件下で、特定のソースによって生成されるポリペプチドであるが、例えば、当業者に周知の組換え、化学、又は酵素技術を使用して代わりのソースから得られて良い。従って、ポリペプチドを特定のソース由来の「単離可能な」ものとし特徴付けることは、ポリペプチドが得られるに違いない何か特定のソース、又はポリペプチドが得られるに違いない何か特定の条件又は工程を意味するものではない。
【００２０】
「精製された」ポリペプチドは、それらが自然に結合する他の構成成分を、少なくとも６０％、好適には少なくとも７５％、及び最も好適には少なくとも９０％含まない。例えば、化学又は組換え手段を介して、ポリペプチドが自然に生じる生物の外側で生成されるポリペプチドは、決して自然環境に存在しないので、定義上単離及び精製されたとみなす。
【００２１】
本明細書で用いられる場合、「ポリペプチド断片」は、ポリペプチドのプロテアーゼでの分解に由来するポリペプチドの一部を意味する。
【００２２】
他に特に定めない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」は、互換的に使用し、１又は２以上を意味する。用語「を含んでなる」及びこの変化形は、明細書の記載及び請求項において見られる場合、限定的な意味を有しない。本発明のポリペプチドは、分子量、マスフィンガープリント、アミノ酸配列、ポリペプチドをコードする核酸、免疫学的活性、又は２又はそれ以上のこれらの特徴の任意の組合せによって特徴付けられてよい。典型的にキロダルトン（kDa）で表されるポリペプチドの分子量は、例えば、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を含むゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、質量分析、（HPLCを含む）液体クロマトグラフィーを含む通常の方法を使用し、且つ観察又は予想されたアミノ酸配列から分子量を算出して決定することができる。他に示さない限り、分子量は、還元及び変性条件下で、約４％の濃縮用ゲルを有するＳＤＳポリアクリルアミドゲル及び約１０％の分解ゲルを使用してポリペプチドを分解することによって決定される分子量を意味する。本明細書で用いられる場合、「マスフィンガープリント」は、プロテアーゼでの分解後にポリペプチドから得られるポリペプチド断片の集団を意味する。典型的には、分解に由来するポリペプチド断片は、質量分析方法を使用して分析される。各ポリペプチド断片は、質量、又は「ｍ／ｚ比」又は「ｍ／ｚ値」と呼ばれる質量（m）対電荷（z）比によって特徴付けられる。ポリペプチドのマスフィンガープリントを生じるための方法は、慣習的なものである。このような方法の例は、実施例１３に開示する。
【００２３】
本発明のポリペプチドは、金属制御ポリペプチドであってよい。本明細書で用いられる場合、「金属制御ポリペプチド」は、高金属条件における同じ微生物の成長に比べて、低金属条件において微生物を成長させる場合に、より高レベルで微生物によって発現されるポリペプチドである。低金属及び高金属条件を明細書中に記載する。例えば、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生成される金属制御ポリペプチドの１つのクラスは、高金属条件における微生物の成長中に検出可能なレベルで発現されないが、低金属条件における成長中に検出可能なレベルで発現される。
【００２４】
低鉄条件における成長後に黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離可能な金属制御ポリペプチドの例は、８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、及び３３ｋＤａの分子量を有する。低亜鉛又は低銅条件における成長後に黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離可能な金属制御ポリペプチドの例は、１１５ｋＤａ、８８ｋＤａ、８０ｋＤａ、７１ｋＤａ、６９ｋＤａ、３５ｋＤａ、３０ｋＤａ、２９ｋＤａ、及び２７ｋＤａの分子量を有する。
【００２５】
さらなる金属制御ポリペプチドの例は、明細書中で記載されるポリペプチドの組換えで生成されたバージョンを含む。組換えで生成されたポリペプチドは、ｍＲＮＡ転写物から翻訳可能なアミノ酸配列全体を含んでよい。あるいは、組換えで生成された金属制御ポリペプチドは、翻訳可能なアミノ酸配列全体の断片又は一部を含んでよい。例えば、組換えで生成された金属制御ポリペプチドは、ポリペプチドのいずれかの末端における切断可能な配列、例えば、ポリペプチドのアミノ末端における切断可能なシグナル配列を欠如してよい。
【００２６】
したがって、金属制御ポリペプチドは、例えば、配列番号３５３、配列番号３６４、配列番号３７５、配列番号３８６、配列番号３９７、配列番号４０８、及び配列番号４１９に表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとし得る。
【００２７】
本発明はまた、金属制御されていないポリペプチドを含む。このようなポリペプチドは、金属イオン、例えば、塩化第二鉄の存在下で発現され、また低鉄条件において成長させた場合にもまた発現される。黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離可能なこのようなポリペプチドの例は、１５０ｋＤａ、１３２ｋＤａ、１２０ｋＤａ、７５ｋＤａ、５８ｋＤａ、５０ｋＤａ、４４ｋＤａ、４３ｋＤａ、４１ｋＤａ、及び４０ｋＤａの分子量を有する。
【００２８】
ポリペプチドが金属制御ポリペプチドであるかは、例えば、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を含むゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、質量分析、及びＨＰＬＣを含む液体クロマトグラフィーを含むポリペプチドの存在を比較することに有用な方法によって決定することができる。微生物の別々の培養物を高金属条件及び低金属条件下で成長させ、明細書中で記載されるように本発明のポリペプチドを単離し、各培養物に存在するポリペプチドを分解し比較する。典型的には、各培養物由来の等量のポリペプチドを使用する。好適には、約４％の濃縮用ゲル及び約１０％の分解ゲルを有するＳＤＳポリアクリルアミドゲルを使用して、還元及び変性条件下でポリペプチドを分解する。例えば、各培養物由来の総ポリペプチド３０マイクログラム（μｇ）を使用しゲルのウェルにロードしてよい。ゲルを流しポリペプチドをクーマシーブリリアントブルーで染色した後、２つのレーンを比較することができる。ポリペプチドが検出可能なレベルで発現されているかを決定する場合、培養物由来の総ポリペプチドの３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分解し、当技術分野で周知の方法を使用してクーマシーブリリアントブルーで染色する。目視可能なポリペプチドは、検出可能なレベルで発現されているとみなし、一方目視できないポリペプチドは、検出可能なレベルで発現されていないとみなす。
【００２９】
あるいは、ポリペプチドが金属制御されているかは、マイクロアレイに基づく遺伝子発現分析を使用して決定することができる。微生物の別々の培養物を高金属条件及び低金属条件下で成長させ、ＲＮＡを各培養物の細胞から抽出し、低金属条件において成長させた細胞中のＲＮＡ発現に対する、高金属条件において成長させた細胞中のＲＮＡ発現の差異を検出し且つ比較する。例えば、確立されたプロトコールを使用して、８〜１０μｇの細菌ＲＮＡから標識ｃＤＮＡを調製することができる。標識ｃＤＮＡは、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ゲノムのマイクロアレイに適用することができる。このようなマイクロアレイは、商業的に利用可能でありこのようなアレイを使用した遺伝子発現は通常行われるものである。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、免疫学的活性を有してよい。「免疫学的活性」は、動物において免疫応答を誘発するポリペプチドの能力を意味する。ポリペプチドへの免疫応答は、動物におけるポリペプチドへの細胞及び／又は抗体媒介による免疫応答の発達である。通常、免疫応答は、１又は複数の次の効果：エピトープ又はポリペプチドのエピトープに対する抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞の産生を含むが、これに限定されない。「エピトープ」は、特異的なＢ細胞及び／又はＴ細胞が応答し、これにより抗体が生成される抗原上の部位を意味する。免疫学的活性は、防御的であってよい。「防御的免疫学的活性」は、動物において、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）、例えば黄色ブドウ球菌（S. aureus）による感染症を予防又は抑制する免疫応答を誘発するポリペプチドの能力を意味する。ポリペプチドが防御的免疫学的活性を有するかは、当技術分野で周知の方法、例えば、実施例５、９、又は１２に記載の方法によって決定することができる。例えば、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドの組合せは、げっ歯類、例えばマウスをブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）での攻撃から防御する。本発明のポリペプチドは、血清活動活性（Seroactive activity）を有してよい。「血清活動活性」は、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）、例えば、黄色ブドウ球菌（S. aureus）に感染した動物由来の回復期血清に存在する抗体と反応する候補ポリペプチドの能力を意味する。一部の態様において、回復期血清は、ＡＴＣＣ単離株１９６３６、株ＳＡＡＶｌ、株２１７６、又は株１４７７に感染した動物に由来してよい。本発明のポリペプチドは、免疫調節性活性を有してよい。「免疫調節性活性」は、特定の抗原に対する免疫応答を増強する非特異的な方法で作用するポリペプチドの能力を意味する。ポリペプチドが免疫調節性活性を有するかを決定するための方法は、当技術分野で周知である。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、参照微生物によって発現されるポリペプチド、例えば、参照ポリペプチドの特徴を有してよい。特徴は、例えば、分子量、マスフィンガープリント、アミノ酸配列、又はこれらの任意の組合せを含んでよい。参照微生物は、グラム陽性、好適にはミクロコッカス科（Micrococcaceae）のメンバー、好適にはブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）、より好適には、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）としてよい。好適な株の例を表１に詳述する。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
参照微生物が黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ単離株１９６３６の場合、８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有し、そして参照微生物によって発現され且つ８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有する金属制御ポリペプチドのマスフィンガープリントと同様のマスフィンガープリントをそれぞれ有すると、候補ポリペプチドは本発明のポリペプチドとみなすことができる。好適には、このようなポリペプチドは、金属制御される。例えば、候補ポリペプチドが、８８ｋＤａの分子量を有し、且つ参照株の黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ単離株１９６３６によって生成される８８ｋＤａの金属制御ポリペプチドのマスフィンガープリントと同様のマスフィンガープリントを有する場合、本発明のポリペプチドであるとしてよい。
【００３４】
あるいは、参照微生物が黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ単離株１９６３６である場合、以下に詳述するように、配列番号３５３、配列番号３６４、配列番号３７５、配列番号３８６、配列番号３９７、配列番号４０８、又は配列番号４１９のアミノ酸配列と構造上同様であるアミノ酸配列を有するなら、候補ポリペプチドは本発明のポリペプチドであるとみなしてよい。
【００３５】
あるいは、参照微生物が黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＦ１２２である場合、アミノ酸配列を有し、以下に詳述する通り、配列番号３５４、配列番号３６５、配列番号３７６、配列番号３８７、配列番号３９８、配列番号４０９、又は配列番号４２０のアミノ酸配列と構造上同様であるなら、候補ポリペプチドは本発明のポリペプチドとみなしてよい。
【００３６】
あるいは、参照微生物が黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｍｕ５０である場合、以下に詳述する通り、配列番号３５５、配列番号３６６、配列番号３７７、配列番号３８８、配列番号３９９、配列番号４１０、又は配列番号４２１のアミノ酸配列と構造上同様であるアミノ酸配列を有するなら、候補ポリペプチドは本発明のポリペプチドとみなしてよい。
【００３７】
あるいは、参照微生物が黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＲＳＡ２５２である場合、以下に詳述する通り、配列番号３５６、配列番号３６７、配列番号３７８、配列番号３８９、配列番号４００、配列番号４１１、又は配列番号４２２のアミノ酸配列と構造上同様であるアミノ酸配列を有するなら、候補ポリペプチドは本発明のポリペプチドとみなしてよい。
【００３８】
あるいは、参照微生物が黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＷ２である場合、以下に詳述する通り、配列番号３５７、配列番号３６８、配列番号３７９、配列番号３９０、配列番号４０１、配列番号４１２、又は配列番号４２３のアミノ酸配列と構造上同様であるアミノ酸配列を有するなら、候補ポリペプチドは本発明のポリペプチドとみなしてよい。
【００３９】
あるいは、参照微生物が黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎである場合、以下に詳述する通り、配列番号３５８、配列番号３６９、配列番号３８０、配列番号３９１、配列番号４０２、配列番号４１３、又は配列番号４２４のアミノ酸配列と構造上同様であるアミノ酸配列を有するなら、候補ポリペプチドは本発明のポリペプチドとみなしてよい。
【００４０】
あるいは、参照微生物が黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＪＨ９である場合、以下に詳述する通り、配列番号３５９、配列番号３７０、配列番号３８１、配列番号３９２、配列番号４０３、配列番号４１４、又は配列番号４２５のアミノ酸配列と構造上同様であるアミノ酸配列を有するなら、候補ポリペプチドは本発明のポリペプチドとみなしてよい。
【００４１】
あるいは、参照微生物が黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＵＳＡ３００である場合、以下に詳述する通り、配列番号３６０、配列番号３７１、配列番号３８２、配列番号３９３、配列番号４０４、配列番号４１５、又は配列番号４２６のアミノ酸配列と構造上同様であるアミノ酸配列を有するなら、候補ポリペプチドは本発明のポリペプチドとみなしてよい。
【００４２】
あるいは、参照微生物が黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＣＯＬである場合、以下に詳述する通り、配列番号３６１、配列番号３７２、配列番号３８３、配列番号３９４、配列番号４０５、配列番号４１６、又は配列番号４２７のアミノ酸配列と構造上同様であるアミノ酸配列を有するなら、候補ポリペプチドは本発明のポリペプチドとみなしてよい。
【００４３】
あるいは、参照微生物が黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＮＣＴＣ８３２５である場合、以下に詳述する通り、配列番号３６２、配列番号３７３、配列番号３８４、配列番号３９５、配列番号４０６、配列番号４１７、又は配列番号４２８のアミノ酸配列と構造上同様であるアミノ酸配列を有するなら、候補ポリペプチドは本発明のポリペプチドとみなしてよい。
【００４４】
あるいは、参照微生物が黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＭＳＳＡ４７６である場合、以下に詳述する通り、配列番号３６３、配列番号３７４、配列番号３８５、配列番号３９６、配列番号４０７、配列番号４１８、又は配列番号４２９のアミノ酸配列と構造上同様であるアミノ酸配列を有するなら、候補ポリペプチドは本発明のポリペプチドとみなしてよい。
【００４５】
参照微生物が黄色ブドウ球菌（S. aureus）単離株ＳＡＡＶｌの場合、候補ポリペプチドが、８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有し、そして参照微生物によって発現され且つ８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有するポリペプチドのマスフィンガープリントとそれぞれ同様のマスフィンガープリントを有すると、候補ポリペプチドは本発明のポリペプチドとみなすことができる。好適には、このようなポリペプチドは、金属制御される。例えば、候補ポリペプチドが、分子量８８ｋＤａを有し、且つ参照株の黄色ブドウ球菌（S. aureus）単離株ＳＡＡＶｌによって生成される８８ｋＤａの金属制御ポリペプチドのマスフィンガープリントと同様のマスフィンガープリント有する場合、本発明のポリペプチドとすることができる。
【００４６】
参照微生物が黄色ブドウ球菌（S. aureus）株２１７６の場合、８８ｋＤａ、８０ｋＤａ、６５ｋＤａ、５５ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、３３ｋＤａ、又は３２ｋＤａの分子量を有し、そして参照微生物によって発現され且つ８８ｋＤａ、８０ｋＤａ、６５ｋＤａ、５５ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、３３ｋＤａ、又は３２ｋＤａの分子量を有するポリペプチドのマスフィンガープリントと同様のマスフィンガープリントをそれぞれ有すると、候補ポリペプチドを本発明のポリペプチドとみなしてよい。好適には、このようなポリペプチドは金属制御される。例えば、候補ポリペプチドが、分子量８８ｋＤａを有し、且つ参照株の黄色ブドウ球菌（S. aureus）単離株２１７６によって生成される８８ｋＤａの金属制御ポリペプチドのマスフィンガープリントと同様のマスフィンガープリントを有する場合、本発明のポリペプチドであるとしてよい。
【００４７】
参照微生物が黄色ブドウ球菌（S. aureus）株１４７７の場合、８８ｋＤａ、８０ｋＤａ、６５ｋＤａ、５５ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、３３ｋＤａ、又は３２ｋＤａの分子量を有し、そして参照微生物によって発現され且つ８８ｋＤａ、８０ｋＤａ、６５ｋＤａ、５５ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、３３ｋＤａ、又は３２ｋＤａの分子量を有するポリペプチドのマスフィンガープリントと同様のマスフィンガープリントをそれぞれ有すると、候補ポリペプチドを本発明のポリペプチドとみなしてよい。好適には、このようなポリペプチドは金属制御される。例えば、候補ポリペプチドが、分子量８８ｋＤａを有し、且つ参照株の黄色ブドウ球菌（S. aureus）単離株１４７７によって生成される８８ｋＤａの金属制御ポリペプチドのマスフィンガープリントと同様のマスフィンガープリントを有する場合、本発明のポリペプチドであるとしてよい。
【００４８】
本明細書で用いられる場合、ポリペプチドのアミノ酸配列が、参照ポリペプチドと比較して一定量の配列類似性及び／又は配列同一性を有する場合、ポリペプチドは、参照ポリペプチドと「構造上同様である」としてよい。ポリペプチドが、参照ポリペプチドの匹敵するマスフィンガープリントと比較して一定量の同一性を有しているマスフィンガープリントを示す場合、ポリペプチドはまた、参照ポリペプチドと「構造上同様である」としてよい。したがって、参照ポリペプチドと比較して、十分なレベルのアミノ酸配列同一性、アミノ酸配列類似性、マスフィンガープリント類似性、又はこれらの任意の組合せを有する場合、ポリペプチドは、参照ポリペプチドと「構造上同様である」としてよい。
【００４９】
ポリペプチド配列類似性及びポリペプチド配列同一性
２つのポリペプチドの構造上類似性は、２つのポリペプチド（例えば、明細書中に記載される候補ポリペプチド及び任意の適当な参照ポリペプチド）の残基を、これらの配列の長さに沿って同一のアミノ酸の数が最大になるように整列させることによって決定することができ；各配列におけるアミノ酸は適切な順序を維持しなければならないが、どちらか一方又は両方の配列におけるギャップは、同一のアミノ酸の数を最大になるようにするための整列化において容認される。参照ポリペプチドは、明細書中で記載されるポリペプチド又は適当なものとして既知の任意の金属制御ポリペプチドとしてよい。候補ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較されているポリペプチドである。候補ポリペプチドは、例えば微生物から単離することができる、又は組換え技術を使用して生成する、或いは化学的又は酵素的に合成することができる。
【００５０】
明細書中で他に記載して変更しない限り、ＧＣＧパッケージ（version 10.2, Madison WI）を使ったＢＥＳＴＦＩＴアルゴリズムを使用してアミノ酸配列の対比較分析を実施することができる。あるいは、ポリペプチドは、Ｔａｔｉａｎａ等によって記載され（FEMS Microbiol Lett, 174, 247-250 （1999））、且つ全米バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のウェブサイト上で利用可能な、ＢＬＡＳＴ２サーチアルゴリズムのＢｌａｓｔｐ ｐｒｏｇｒａｍを使用して比較してよい。全ＢＬＡＳＴ２サーチパラメータのためのデフォルト値を使用してよく、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ｏｐｅｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝１１，ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝１，ｇａｐ ｘ＿低下ｏｆｆ＝５０，ｅｘｐｅｃｔ＝１０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ＝３、及びｆｉｌｔｅｒ ｏｎを含む。
【００５１】
２つのアミノ酸配列の比較において、構造上類似性は、「同一性」％又は「類似性」％によって示されてよい。「同一性」は、同一のアミノ酸の存在を意味する。「類似性」は、同一のアミノ酸だけでなく保存的置換の存在を意味する。本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸の保存的置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されてよい。例えば、特に生物学的活性と直接的に関連がないタンパク質の領域において、タンパク質の活性の変化なしに、特定のサイズ又は特徴（例えば、電荷, 疎水性及び親水性）を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することができることは、タンパク質生化学の技術分野で周知である。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含む。プラスに帯電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン及びヒスチジンを含む。負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。保存的置換は、例えば、正電荷を維持するためのＬｙｓのＡｒｇへの置換及び逆の置換；負電荷を維持するためのＧｌｕのＡｓｐへの置換及び逆の置換；遊離−ＯＨを維持するためのＳｅｒのＴｈｒへの置換；及び遊離−ＮＨ2を維持するためのＧｌｎのＡｓｎへの置換を含む。同様に、ポリペプチドの機能活性、例えば、免疫学的活性を排除しない１又は複数の近接又は非近接アミノ酸の欠失又は付加を含むポリペプチドの生物学的に活性のある類似体もまた意図する。
【００５２】
したがって、本明細書で用いられる場合、本発明のポリペプチドへの言及及び／又は１又は複数の配列番号のアミノ酸配列への言及は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチドを含んでよい。
【００５３】
あるいは、本明細書で用いられる場合、本発明のポリペプチドへの言及及び／又は１又は複数の配列番号のアミノ酸配列への言及は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含んでよい。
【００５４】
従って、本発明のポリペプチドは、例えば、ポリペプチドが元々単離及び／又は同定された微生物種又は株以外の微生物種又は株から生物学的及び／又は組換えで生じる相同種ポリペプチドを含む一定の変異体を含んでよい。
【００５５】
例えば、本発明のポリペプチドは、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（PflB）として通常周知のポリペプチドを含んでよい。このポリペプチドの一形態は、配列番号３５３に示される。変異実施形態は、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、及び配列番号３６３に示される。
【００５６】
他の実施例として、本発明のポリペプチドは、通常オリゴペプチドパーミアーゼ、ペプチド結合タンパク質（oligopeptide permease, peptide-binding protein）（Opp1A）として周知のポリペプチドを含んでよい。このポリペプチドの一実施形態は、配列番号３６４に示される。変異実施形態は、配列番号３６５、配列番号３６６、配列番号３６７、配列番号３６８、配列番号３６９、配列番号３７０、配列番号３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、及び配列番号３７４に示される。
【００５７】
他の実施例として、本発明のポリペプチドは、通常シデロホア化合物ＡＢＣトランスポーター結合タンパク質（SirA）として周知のポリペプチドを含んでよい。このポリペプチドの一実施形態は、配列番号３７５に示される。変異実施形態は、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２、配列番号３８３、配列番号３８４、及び配列番号３８５に示される。
【００５８】
他の実施例として、本発明のポリペプチドは、明細書中で場合によりＳＹＮ２と呼ぶポリペプチドを含んでよい。このポリペプチドの一実施形態は、配列番号３８６に示される。変異実施形態は、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、及び配列番号３９６に示される。
【００５９】
他の実施例として、本発明のポリペプチドは、通常三価鉄ヒドロキサメート結合リポタンパク質（FhuD）として周知のポリペプチドを含んでよい。このポリペプチドの一実施形態は、配列番号３９７に示される。変異実施形態は、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、及び配列番号４０７に示される。
【００６０】
他の実施例として、本発明のポリペプチドは、明細書中で時々ＳＹＮ１と呼ぶポリペプチドを含んでよい。このポリペプチドの一実施形態は、配列番号４０８に示される。変異実施形態は、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１６、配列番号４１７、及び配列番号４１８に示される。
【００６１】
他の実施例として、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドとして周知のマンガン輸送システム膜タンパク質（manganese transport system membrane protein）（MntC）を含むことができる。このポリペプチドの一実施形態は、配列番号４１９に示される。変異実施形態は、配列番号４２０、配列番号４２１、配列番号４２２、配列番号４２３、配列番号４２４、配列番号４２５、配列番号４２６、配列番号４２７、配列番号４２８、及び配列番号４２９に示される。
【００６２】
他の実施例として、本発明のポリペプチドは、通常フェリクロームＡＢＣトランスポーターリポタンパク質（SstD）として周知のポリペプチドを含んでよい。このポリペプチドの実施形態は、配列番号５４３、配列番号５４４、配列番号５４５、配列番号５４６、配列番号５４７、配列番号５４８、配列番号５４９、配列番号５５０、配列番号５５１、及び配列番号５５２に示される。
【００６３】
他の実施例として、本発明のポリペプチドは、通常鉄化合物ＡＢＣトランスポーター（FhuD2）として周知のポリペプチドを含んでよい。このポリペプチドの実施形態は、配列番号５５３、配列番号５５４、配列番号５５５、配列番号５５６、配列番号５５７、配列番号５５８、配列番号５５９、配列番号５６０、配列番号５６１、及び配列番号５６２に示される。
【００６４】
本発明のポリペプチドはまた、１又は複数のさらなる配列を供する、例えば、抗体のカラム上でのトラップ又は使用による精製を促進する付加Ｃ末端及び／又はＮ末端アミノ酸のコード配列を付加するようにデザインされてよい。このようなタグは、例えば、ポリペプチドのニッケルカラム上での精製を可能にするヒスチジンリッチなタグを含む。このような遺伝子修飾技術及び適当な付加配列は、分子生物学分野において周知である。
【００６５】
本発明のポリペプチドはまた、Ｃ末端及び／又はＮ末端における一部のアミノ酸が欠失されるようにデザインされてよい。例えば、配列番号３６４のアミノ酸配列と配列番号３６５のアミノ酸配列との間の１つの差異が、配列番号３６４の参照ポリペプチドのアミノ酸配列に存在しない、配列番号３６５が有するＮ末端２９のアミノ酸付加である。同様の好例のＮ末端付加、典型的には約２０個のアミノ酸〜約３５個のアミノ酸付加は、例えば、参照ペプチド配列番号３５３、配列番号３６４、配列番号３７５、配列番号３８６、配列番号３９７、配列番号４０８、又は配列番号４１９のアミノ酸配列を、各参照ポリペプチドの一定の変異実施形態と比較した場合に明らかである。Ｎ末端又はＣ末端における他のアミノ酸付加及び／又は欠失が可能である。本発明のポリペプチドの「修飾」は、１又は複数の構成アミノ酸において化学的に又は酵素的に誘導体化されるポリペプチド（又はこの類似体、例えば、この断片）を含む。このような修飾は、例えば、側鎖修飾、骨格修飾、及びＮ及びＣ末端修飾、例えば、アセチル化、水酸化、メチル化、アミド化、及び炭水化物又は脂質部分の付着、補助因子等、並びにこれらの組合せを含んでよい。本発明の修飾ポリペプチドは、生物学的活性、例えば、無修飾ポリペプチドの免疫学的活性を保持する、又は低下又は増加した生物学的活性を示してよい。
【００６６】
（生物学的に活性のある類似体及びこの修飾を含む）本発明のポリペプチドは、天然由来の（自然に生じる）、組換え、及び化学的又は酵素的に合成されたポリペプチドを含む。例えば、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドを自然のソースから単離することによって、又は周知な方法による組換えで調製されてよく、例えば細菌又は他の宿主細胞における融合タンパク質としての製剤を含む。
【００６７】
参照微生物によって発現されるポリペプチドは、低金属条件下における参照微生物の成長及び明細書中に開示される工程によるポリペプチドの続く単離によって得られてよい。あるいは、参照微生物によって発現されるポリペプチドは、低金属条件において微生物を成長させる場合に高レベルで発現される遺伝子、すなわち、金属制御遺伝子を同定することによって得られてよい。金属制御遺伝子は、クローン化され且つ発現されてよく、発現金属制御ポリペプチドは、明細書中に記載の工程によって特定されてよい。候補ポリペプチドは、微生物から単離可能であるか又は微生物、好適にはグラム陽性微生物、より好適には、ミクロコッカス科（Micrococcaceae）のメンバー、好適にはブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）、より好適には黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から特定される。ポリペプチドが単離及び／又は特定可能である他のグラム陽性微生物は、コリネバクテリウム菌属（Corynebacterium spp.）、エンテロコッカス菌属（Enterococcus spp.）、エリシペロスリクス属（Erysipelothrix spp.）、キトコッカス属（Kytococcus spp.）及びミクロコッカス菌属（Micrococcus spp.）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium spp.）、及びエリシペロスリクス属（Erysipelothrix spp.）を含む。候補ポリペプチドはまた、酵素又は化学的技術を使用して生成されてよい。
【００６８】
マスフィンガープリント類似性
候補ポリペプチドは、参照微生物によって発現され、且つ分子量によって上記で言及されるポリペプチドの１つと同様の候補ポリペプチドがマスフィンガープリントを有するかを決定するために、質量分光分析によって評価されてよい。典型的には、候補ポリペプチドは、例えばゲル電気泳動によって候補ポリペプチドを分解すること及び候補ポリペプチドを含むゲル部分を切り取ることによって単離されてよい。異なる特徴に基づいてポリペプチドを分離する任意のゲル電気泳動方法を使用することができ、例えば、疎水性、ｐＩ、又はサイズに基づく１次元又は２次元ゲル電気泳動、及び液体クロマトグラフィー分離を含む。候補ポリペプチドは、例えば、プロテアーゼでの分解によって断片化することができる。好適には、リジン又はアルギニンに続くアミノ酸がプロリンである場合を除いて、プロテアーゼは、アミノ酸リジン及びアミノ酸アルギニンのカルボキシ末端側上でペプチド結合を切断することができる。このようなプロテアーゼの例は、トリプシンである。ポリペプチドのトリプシンでの分解のための方法は、通常且つ当技術分野で周知の方法である。このような方法の例は、実施例１３において開示される。
【００６９】
ポリペプチドの質量分光分析のための方法は、通常且つ当技術分野で周知の方法であり、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（MALDI-TOF MS）を含むが、これに限定されない。典型的には、候補ポリペプチドから得られるポリペプチド断片を含む混合物は、レーザーエネルギーを試料へ変換しイオン化、好適にはモノアイソトピック性、ポリペプチド断片を生成する働きをするマトリックスと混合する。使用することができるマトリックスの例は、例えば、シナピン酸又はシアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を含む。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによるポリペプチドの分析のための方法の例は、実施例１３に記載される。イオン化ポリペプチド断片は、これらのｍ／ｚ比に従って分離され、検出され強度に対するｍ／ｚ比のスペクトルが得られる。スペクトルは、候補ポリペプチドに由来するポリペプチド断片を表すｍ／ｚ値を含む。任意の所定のポリペプチドに関して、トリプシン分解に由来する各ポリペプチド断片の量は等モルであるべきである。しかしながら、トリプシン分解は常に１００％効率でなく、例えば、一部の部位がより効率的に切断されることが知られている。したがって、ｍ／ｚ値を決定するためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを使用する場合、各ｍ／ｚ値の強度は典型的には同一でない。一般的に、スペクトルは、大抵のｘ軸（すなわち、ｍ／ｚ比の値を有する軸）に渡って存在するバックグラウンドレベルのノイズを有する。このノイズのバックグラウンドレベルは実施条件及び使用される機械によって変化し、スペクトルの目視検査によって容易に特定される。
【００７０】
ｍ／ｚ値において、強度がノイズのバックグラウンドレベルの少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍である場合、通常そのｍ／ｚ値はポリペプチド断片を表すとみなされる。スペクトルは通常、人為産物、例えば、不完全な分解、過剰分解、混合物に存在する他のポリペプチド、又はポリペプチドの分解に使用されるプロテアーゼに由来する他のｍ／ｚ値を含み、例えばプロテアーゼの自己分解に由来するｍ／ｚ値が含まれる。プロテアーゼでポリペプチドを分解するこの方法は、ポリペプチドを正確に特徴付け、且つ他のポリペプチドから識別するために使用できる重要な特異性のマスフィンガープリントをもたらす方法として技術分野で認められる。
【００７１】
本発明のこの態様において、候補ポリペプチドを質量分析によって分析する場合、好適には候補ポリペプチド及び参照微生物由来のポリペプチドの双方を調製且つ分析し、これにより試料の処理及び実施条件における差異に由来する任意の潜在的な人為産物を減少する。好適には、２つのポリペプチドを調製し分析するために使用される全試薬は同一である。例えば、参照微生物由来のポリペプチド及び候補ポリペプチドは、実質的に同一の条件下で単離され、実質的に同一の条件下で断片化され、実質的に同一の条件下で同一の機械上でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって分析される。候補ポリペプチドが、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％を有しているマスフィンガープリントを示す、又は参照微生物ポリペプチドのスペクトル中に存在する実質的に全ｍ／ｚ値及び上記のノイズバックグラウンドレベルが候補ポリペプチドのスペクトル中にもまた存在する場合、参照ポリペプチドと「構造上同様である」とみなしてよい。（例えば、United States Patent Application Publication No. 2006/0233824 Alを参照されたい）。
【００７２】
他の態様において、ポリペプチドが、表２、３、４、又は５に記載される参照ポリペプチドの分子量を有し、表２、３、４、又は５に記載される参照ポリペプチドのポリペプチド断片の少なくとも特定の割合を含む亜集団を含むマスフィンガープリントを有する場合、本発明のポリペプチドとみなしてよい。例えば、本発明のポリペプチドは、８８ｋＤａのポリペプチド、及びＨＶＤＶＲ（配列番号1）、ＹＳＹＥＲ（配列番号2）、ＩＩＧＤＹＲＲ（配列番号3）、ＩＦＴＤＹＲＫ（配列番号4）、ＥＬＫＥＬＧＱＫ（配列番号5）、ＹＡＱＶＫＰＩＲ（配列番号6）、ＱＭＱＦＦＧＡＲ（配列番号7）、ＳＭＱＰＦＧＧＩＲ（配列番号8）、ＶＳＧＹＡＶＮＦＩＫ（配列番号9）、ＮＨＡＴＡＷＱＧＦＫ（配列番号10）、ＬＷＥＱＶＭＱＬＳＫ（配列番号11）、ＳＬＧＫＥＰＥＤＱＮＲ（配列番号12）、ＤＧＩＳＮＴＦＳＩＶＰＫ（配列番号13）、ＡＧＶＩＴＧＬＰＤＡＹＧＲ（配列番号14）、ＴＳＴＦＬＤＩＹＡＥＲ（配列番号15）、ＳＭＱＰＦＧＧＩＲＭＡＫ（配列番号16）、ＴＨＮＱＧＶＦＤＡＹＳＲ（配列番号17）、ＫＡＧＶＩＴＧＬＰＤＡＹＧＲ（配列番号18）、ＴＬＬＹＡＩＮＧＧＫＤＥＫ（配列番号19）、ＩＥＭＡＬＨＤＴＥＩＶＲ（配列番号20）、ＡＧＥＰＦＡＰＧＡＮＰＭＨＧＲ（配列番号21）、ＶＡＬＹＧＶＤＦＬＭＥＥＫ（配列番号22）、ＫＴＨＮＱＧＶＦＤＡＹＳＲ（配列番号23）、ＹＧＦＤＬＳＲＰＡＥＮＦＫ（配列番号24）、ＴＳＳＩＱＹＥＮＤＤＩＭＲ（配列番号25）、ＫＡＧＥＰＦＡＰＧＡＮＰＭＨＧＲ（配列番号26）、ＲＶＡＬＹＧＶＤＦＬＭＥＥＫ（配列番号27）、ＬＷＥＱＶＭＱＬＳＫＥＥＲ（配列番号28）、ＭＬＥＴＮＫＮＨＡＴＡＷＱＧＦＫ（配列番号29）、ＭＨＤＦＮＴＭＳＴＥＭＳＥＤＶＩＲ（配列番号30）、ＹＧＮＮＤＤＲＶＤＤＩＡＶＤＬＶＥＲ（配列番号31）、ＥＴＬＩＤＡＭＥＨＰＥＥＹＰＱＬＴＩＲ（配列番号32）、ＹＡＱＶＫＰＩＲＮＥＥＧＬＶＶＤＦＥＩＥＧＤＦＰＫ（配列番号33）の質量を有するポリペプチド断片の特定の割合を含むマスフィンガープリントを含む。候補ポリペプチドのマスフィンガープリントは、質量分析方法、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって決定することができる。候補ポリペプチドのマスフィンガープリントは、通常さらなるポリペプチド断片を有し、従って、表２、３、４、又は５においてポリペプチドに関して収載されるもの以外のさらなるｍ／ｚ値を有することができる。候補ポリペプチドを表２、３、４、又は５中のポリペプチドと比較する場合、候補ポリペプチドは、微生物、好適にはグラム陽性微生物、より好適には、ミクロコッカス科（Micrococcaceae）のメンバー、好適にはブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）、より好適には、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能である。他のグラム陽性微生物は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium spp.）、エンテロコッカス菌属（Enterococcus spp.）、エリシペロスリクス属（Erysipelothrix spp.）、キトコッカス属（Kytococcus spp.）、リステリア属（Listeria spp.）、、ミクロコッカス菌属（Micrococcus spp.）、及びマイコバクテリウム属（Mycobacterium spp.）、及びエリシペロスリクス属（Erysipelothrix spp.）を含む。
【００７３】
候補ポリペプチドは、明細書中に記載される工程によって低金属条件下での微生物の成長、続いてポリペプチドの単離によって得られる。あるいは、候補ポリペプチドは、候補ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの組換え発現によって得ることができる。試料処理、例えば酸化、及びカルバミドメチル誘導体の形成中にアミノ酸の修飾は偶発的に導入され得ることは当技術分野で周知である。さらに、これらのタイプの修飾は、ポリペプチド断片のｍ／ｚ値を変更する。例えば、ポリペプチド断片が酸化されたメチオニンを含む場合、ｍ／ｚ値は酸化メチオニンを含まない同一断片と比較して、１６増加するであろう。従って、注釈「酸化（M）」を有する表２、３、４、又は５のこれらのポリペプチド断片は、酸化メチオニンを含まない同一断片と比較して、１６増加したｍ／ｚ値を有する。表２、３、４、又は５のポリペプチド断片は、試料処理中に修飾され得ることが分かる。
【００７４】
ポリヌクレオチド配列類似性及びポリヌクレオチド配列同一性
本発明のポリペプチドはまた、ポリペプチドをコードする用語ポリヌクレオチドで特定されてよい。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする、又はスタンダードハイブリダイゼーション条件下で、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びこのようなポリヌクレオチド配列の補体とハイブリッド形成するポリヌクレオチドを含む。
【００７５】
本明細書で用いられる場合、本発明のポリヌクレオチドへの言及及び／又は１又は複数の配列番号の核酸配列への言及は、特定の参照ポリヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００７６】
表２．黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ単離株１９６３６から得られたポリペプチドの特徴
【００７７】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【００７８】
１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される分子量
２．ポリペプチド断片のｍ／ｚ値は、ｍ／ｚ値から１を減算することによって質量に換算できる。各質量は、プラス又はマイナス３００ｐｐｍ、或いはプラス又はマイナス１Ｄａの範囲を含む。
【００７９】
表３．黄色ブドウ球菌（S. aureus）単離株ＳＡＡＶｌから得られたポリペプチドの特徴
【００８０】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【００８１】
１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される分子量
２．ポリペプチド断片のｍ／ｚ値は、ｍ／ｚ値から１を減算することによって質量に換算できる。各質量は、プラス又はマイナス３００ｐｐｍ、或いはプラス又はマイナス１Ｄａの範囲を含む。
【００８２】
表４．黄色ブドウ球菌（S. aureus）単離株２１７６から得られたポリペプチドの特徴
【００８３】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
2015164949.tif 000020
【表４−８】
2015164949.tif 000021
【００８４】
１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される分子量
２．ポリペプチド断片のｍ／ｚ値は、ｍ／ｚ値から１を減算することによって質量に換算できる。各質量は、プラス又はマイナス４００ｐｐｍ、或いはプラス又はマイナス１Ｄａの範囲を含む。
【００８５】
表５．黄色ブドウ球菌（S. aureus）ウシ単離株１４７７から得られたポリペプチドの特徴
【００８６】
【表５−１】
2015164949.tif 000022
【表５−２】
2015164949.tif 000023
【表５−３】
2015164949.tif 000024
【表５−４】
2015164949.tif 000025
【表５−５】
2015164949.tif 000026
【００８７】
１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される分子量
２．ポリペプチド断片のｍ／ｚ値は、ｍ／ｚ値から１を減算することによって質量に換算できる。各質量は、プラス又はマイナス４３０ｐｐｍ、或いはプラス又はマイナス１Ｄａの範囲を含む。
【００８８】
本明細書において、「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を意味する。配列同一性は、同一のヌクレオチドの数が最大になるようにこれらの配列の長さに沿って２つのポリヌクレオチドの塩基を整列させること（例えば、候補配列のヌクレオチド配列と、例えば、配列番号474又は配列番号485のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列とを整列させること）によって一般的に決定され；各配列中のヌクレオチドは適切な順序を維持しなければならないが、どちらか一方又は両方の配列中のギャップは、共有ヌクレオチドの数を最大になるようにするために、配列比較において容認される。候補配列は、周知の配列、例えば、配列番号４７４又は配列番号４８５のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列と比較される配列である。例えば、２つのポリヌクレオチド配列は、Ｔａｔｉａｎａ等の、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．、１９９９；１７４：２４７〜２５０に記載され、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／のワールドワイドウェブ上で利用可能であるＢＬＡＳＴ２サーチアルゴリズムのＢｌａｓｔｎ ｐｒｏｇｒａｍを使用して比較することができる。全ＢＬＡＳＴ ２サーチパラメータのためのデフォルト値を使用してよく、ｒｅｗａｒｄ フォーマットｃｈ＝１，ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ＝−２，ｏｐｅｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５，ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝２，ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ＝５０，ｅｘｐｅｃｔ＝１０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ＝１１，及びｆｉｌｔｅｒ ｏｎが含まれる。
例えば、本発明のポリヌクレオチドは、通常ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（PflB）として周知のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。このようなポリヌクレオチドの一実施形態は、配列番号４３０に示される。変異実施形態は、配列番号４３１、配列番号４３２、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４３５、配列番号４３６、配列番号４３７、配列番号４３８、配列番号４３９、及び配列番号４４０に示される。
【００８９】
他の実施例として、本発明のポリヌクレオチドは、オリゴペプチドパーミアーゼ、ペプチド結合タンパク質（Opp1A）として周知のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。このようなポリヌクレオチドの一実施形態は、配列番号４４１に示される。変異実施形態は、配列番号４４２、配列番号４４３、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４６、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４４９、配列番号４５０、及び配列番号４５１に示される。
【００９０】
他の実施例として、本発明のポリヌクレオチドは、シデロホア化合物ＡＢＣトランスポーター結合タンパク質（SirA）として周知のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでよい。このようなポリヌクレオチドの一実施形態は、配列番号４５２に示される。変異実施形態は、配列番号４５３、配列番号４５４、配列番号４５５、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、及び配列番号４６２に示される。
【００９１】
他の実施例として、本発明のポリヌクレオチドは、明細書中でＳＹＮ２と呼ぶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでよい。このようなポリヌクレオチドの一実施形態は、配列番号４６３に示される。変異実施形態は、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号４６９、配列番号４７０、配列番号４７１、配列番号４７２、及び配列番号４７３に示される。
【００９２】
他の実施例として、本発明のポリヌクレオチドは、ＦｈｕＤとして周知のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。このようなポリヌクレオチドの一実施形態は、配列番号４７４に示される。変異実施形態は、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３、及び配列番号４８４に示される。
【００９３】
他の実施例として、本発明のポリヌクレオチドは、明細書中でＳＹＮ１と呼ぶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。このようなポリヌクレオチドの一実施形態は、配列番号４８５に示される。変異実施形態は、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、及び配列番号４９５に示される。
【００９４】
他の実施例として、本発明のポリヌクレオチドは、ＭｎｔＣとして周知のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。このようなポリヌクレオチドの一実施形態は、配列番号４９６に示される。変異実施形態は、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５０３、配列番号５０４、配列番号５０５、及び配列番号５０６に示される。
【００９５】
他の実施例として、本発明のポリヌクレオチドは、フェリクロームＡＢＣトランスポーターリポタンパク質（SstD）として周知のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。このようなポリヌクレオチドの実施形態は、配列番号５６３、配列番号５６４、配列番号５６５、配列番号５６６、配列番号５６７、配列番号５６８、配列番号５６９、配列番号５７０、配列番号５７１、及び配列番号５７２に示される。
【００９６】
他の実施例として、本発明のポリヌクレオチドは、鉄化合物ＡＢＣトランスポーター（FhuD2）として周知のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。このようなポリヌクレオチドの実施形態は、配列番号５７３、配列番号５７４、配列番号５７５、配列番号５７６、配列番号５７７、配列番号５７８、配列番号５７９、配列番号５８０、配列番号５８１、及び配列番号５８２に示される。
【００９７】
本発明はまた、微生物の全細胞製剤も供し、この中で微生物は１又は複数の本発明のポリペプチドを発現する。全細胞製剤中に存在する細胞は、好適には不活性化され、従って細胞は複製することができないが、微生物によって発現される本発明のポリペプチドの免疫学的活性は維持される。典型的には、薬剤、例えばグルタルアルデヒド、ホルマリン、又はホルムアルデヒドへの曝露によって細胞を死滅させる。
【００９８】
組成物
本発明の組成物は、明細書中で記載される少なくとも１つの単離ポリペプチド、又は１以上の（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４個の）多数のポリペプチドを含んでよい。例えば、組成物は、配列番号４０８のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド及び／又は配列番号３９７のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを含むことができる。配列類似性及び／又は同一性の特定のレベル（例えば、少なくとも80％の配列類似性, 少なくとも90％の配列同一性等）を明細書中に明確に示さない限り、特定の配列番号のアミノ酸配列への言及は、「ポリペプチド配列類似性及びポリペプチド配列同一性」との見出しのセクションにおいて記載される配列類似性のレベル及び／又は配列同一性のレベルを有する変異体を含む。
【００９９】
一部の実施形態において、組成物は、１又は複数のさらなる単離ポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態において、さらなる単離ポリペプチド又はポリペプチドは、１又は複数の金属制御ポリペプチドを含んでよい。したがって、組成物は、配列番号３５３〜配列番号４２９の１又は複数の配列及び／又は配列番号５４３〜配列番号５６２の１又は複数の配列に表されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの単離金属制御ポリペプチドを含むことができる。加えて又は代わりに、組成物は、８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有する少なくとも１つの単離金属制御ポリペプチドを含むことができる。加えて又は代わりに、組成物は、配列番号４３０〜配列番号５０６の１又は複数の配列及び／又は配列番号５６３〜配列番号５８２の１又は複数の配列に表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたアミノ酸配列を含む少なくとも１つの金属制御単離ポリペプチドを含むことができる。
【０１００】
一実施形態において、組成物は、配列番号３９７に表されるアミノ酸配列（又はこの変異体、例えば、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、若しくは配列番号４０７に表される任意の１つのアミノ酸配列）を含むポリペプチドを含む。
【０１０１】
他の実施形態において、組成物は、配列番号４０８に表されるアミノ酸配列（又はこの変異体、例えば、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１６、配列番号４１７、若しくは配列番号４１８に表される任意の１つのアミノ酸配列）を含むポリペプチドを含む。
【０１０２】
他の実施形態において、組成物は、配列番号４１９に表されるアミノ酸配列（又はこの変異体、例えば、配列番号４２０、配列番号４２１、配列番号４２２、配列番号４２３、配列番号４２４、配列番号４２５、配列番号４２６、配列番号４２７、配列番号４２８、若しくは配列番号４２９に表される任意の１つのアミノ酸配列）を含むポリペプチドを含む。
【０１０３】
他の実施形態において、組成物は、配列番号３７５に表されるアミノ酸配列（又はこの変異体、例えば、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２、配列番号３８３、配列番号３８４、若しくは配列番号３８５に表される任意の１つのアミノ酸配列）を含むポリペプチドを含む。
【０１０４】
他の実施形態において、組成物は、配列番号３８６に表されるアミノ酸配列（又はこの変異体、例えば、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、若しくは配列番号３９６に表される任意の１つのアミノ酸配列）を含むポリペプチドを含む。
【０１０５】
他の実施形態において、組成物は、配列番号３６４に表されるアミノ酸配列（又はこの変異体、例えば、配列番号３６５、配列番号３６６、配列番号３６７、配列番号３６８、配列番号３６９、配列番号３７０、配列番号３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、若しくは配列番号３７４に表される任意の１つのアミノ酸配列）を含むポリペプチドを含む。
【０１０６】
他の実施形態において、組成物は、配列番号３５３に表されるアミノ酸配列（又はこの変異体、例えば、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、若しくは配列番号３６３に表される任意の１つのアミノ酸配列）を含むポリペプチドを含む。
【０１０７】
他の実施形態において、組成物は、配列番号５４３、配列番号５４４、配列番号５４５、配列番号５４６、配列番号５４７、配列番号５４８、配列番号５４９、配列番号５５０、配列番号５５１、又は配列番号５５２に表される任意の１つのアミノ酸配列のアミノ酸配列、又はこの変異体を含むポリペプチドを含む。
【０１０８】
他の実施形態において、組成物は、配列番号５５３、配列番号５５４、配列番号５５５、配列番号５５６、配列番号５５７、配列番号５５８、配列番号５５９、配列番号５６０、配列番号５６１、又は配列番号５６２に表される任意の１つのアミノ酸配列のアミノ酸配列、又はこの変異体を含むポリペプチドを含む。
【０１０９】
一部の実施形態において、組成物は、ＳＹＮ１ポリペプチド、ＭｎｔＣポリペプチド、ＦｈｕＤポリペプチド、ＳＹＮ２ポリペプチド、ＳｉｒＡポリペプチド、Ｏｐｐ１Ａポリペプチド、及びＰｆｌｂポリペプチドから選択された２又はそれ以上のポリペプチドの組合せを含むことができる。
【０１１０】
したがって、組成物は、ＳＹＮ１ポリペプチド、ＭｎｔＣポリペプチド、ＦｈｕＤポリペプチド、ＳＹＮ２ポリペプチド、ＳｉｒＡポリペプチド、Ｏｐｐ１Ａポリペプチド、及びＰｆｌｂポリペプチドの少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つの、少なくとも５つ、少なくとも６つ、若しくは７つ全てを含む任意の組合せを含むことができる。ポリペプチドの組合せを含む好例の組成物は、表６において確認される。
【０１１１】
【表６−１】
2015164949.tif 000027
【表６−２】
2015164949.tif 000028
【表６−３】
2015164949.tif 000029
【表６−４】
2015164949.tif 000030
【０１１２】
*ｐペプチド＝ポリペプチド
「Ｘ」は、特定の組成物に含まれるポリペプチドを特定する。
【０１１３】
本明細書を通して、ＳＹＮ１ポリペプチドは、１又は複数の以下の特徴：配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１６、配列番号４１７、又は配列番号４１８のいずれか１つに表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１、配列番号４９２、配列番号４９３、配列番号４９４、配列番号４９５のいずれか１つに表される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされること、及び／又は約３３．１ｋＤａの算出分子量によって特徴付けられる。
【０１１４】
本明細書を通して、ＭｎｔＣポリペプチドは、１又は複数の以下の特徴：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される場合、３３ｋＤａの分子量を有していること、参照株黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ単離株１９６３６によって生成される３３ｋＤａの金属制御ポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも８０％類似のマスフィンガープリント、配列番号４１９、配列番号４２０、配列番号４２１、配列番号４２２、配列番号４２３、配列番号４２４、配列番号４２５、配列番号４２６、配列番号４２７、配列番号４２８、又は配列番号４２９のいずれか１つに表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号４９６、配列番号４９７、配列番号４９８、配列番号４９９、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５０３、配列番号５０４、配列番号５０５、又は配列番号５０６のいずれか１つに表される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってをコードされること、及び／又は約３４．６ｋＤａの算出分子量によって特徴付けられてよい。
【０１１５】
本明細書を通して、ＦｈｕＤポリペプチドは、１又は複数の以下の特徴：配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、又は配列番号４０７のいずれか１つに表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７、配列番号４７８、配列番号４７９、配列番号４８０、配列番号４８１、配列番号４８２、配列番号４８３又は配列番号４８４のいずれか１つに表される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされること、及び／又は約３５．４ｋＤａの算出分子量によって特徴付けられてよい。
【０１１６】
本明細書を通して、ＳＹＮ２ポリペプチドは、１又は複数の以下の特徴：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される分子量３６ｋＤａ、参照株黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ単離株１９６３６によって生成される３６ｋＤａの金属制御ポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも８０％類似のマスフィンガープリント、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、又は配列番号３９６のいずれか１つに表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号４６９、配列番号４７０、配列番号４７１、配列番号４７２、又は配列番号４７３のいずれか１つに表される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされること、及び／又は約３６．５ｋＤａの算出分子量を有することによって特徴付けられてよい。
【０１１７】
本明細書を通して、ＳｉｒＡポリペプチドは、１又は複数の以下の特徴：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される分子量３７ｋＤａ、参照株黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ単離株１９６３６によって生成される３７ｋＤａの金属制御ポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも８０％類似のマスフィンガープリント、配列番号３７５、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２、配列番号３８３、配列番号３８４、又は配列番号３８５のいずれか１つに表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号４５２、配列番号４５３、配列番号４５４、配列番号４５５、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、又は配列番号４６２のいずれか１つに表される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされること、及び／又は約３６．６ｋＤａの算出分子量を有することによって特徴付けられてよい。
【０１１８】
本明細書を通して、Ｏｐｐ１Ａポリペプチドは、１又は複数の以下の特徴：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される分子量５５ｋＤａ、参照株黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ単離株１９６３６によって生成される５５ｋＤａの金属制御ポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも８０％類似のマスフィンガープリント、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６６、配列番号３６７、配列番号３６８、配列番号３６９、配列番号３７０、配列番号３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、又は配列番号３７４のいずれか１つに表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号４４１、配列番号４４２、配列番号４４３、配列番号４４４、配列番号４４５、配列番号４４６、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４４９、配列番号４５０、又は列番号４５１のいずれか１つに表される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされること、及び／又は約５９．９ｋＤａの算出分子量によって特徴付けられる。
【０１１９】
本明細書を通して、ＰｆｌＢポリペプチドは、１又は複数の以下の特徴：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される分子量８８ｋＤａ、参照株黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ単離株１９６３６によって生成される８８ｋＤａの金属制御ポリペプチドのマスフィンガープリントと少なくとも８０％類似のマスフィンガープリント、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、又は配列番号３６３のいずれか１つに表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号４３０、配列番号４３１、配列番号４３２、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４３５、配列番号４３６、配列番号４３７、配列番号４３８、配列番号４３９、又は配列番号４４０のいずれか１つに表される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされること、及び／又は約８４．７ｋＤａの算出分子量によって特徴付けられる。
【０１２０】
他の特定の実施形態において、組成物は、ポリペプチド、例えば、直前に記載の通り特徴付けられる各ポリペプチドＭｎｔＣポリペプチド、ＦｈｕＤポリペプチド、ＳｉｒＡポリペプチド、及びＳＹＮ２ポリペプチドの組合せ（表6の組成物77）を含むことができる。
【０１２１】
一部の実施形態において、組成物は、組換えで生成される１又は複数のポリペプチドを含むことができる。例えば、組換えで生成されたＰｆｌｂポリペプチドは、組換えで生成されることに加えて、上記の通り特徴付けられてよいが、組成物は、組換えで生成されたＰｆｌｂポリペプチド、例えば、配列番号３５３に表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むことができる。これらの組成物は、１又は複数の組換えで生成されたポリペプチド、黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離された１又は複数のポリペプチド、あるいはこれらの任意の組合せを含むことができる。
【０１２２】
他の例として、組換えで生成されたＯｐｐ１Ａポリペプチドは、組換えで生成されることに加えて、上記の通り特徴付けられてよいが、組成物は、組換えで生成されたＯｐｐ１Ａポリペプチド、例えば、配列番号３６４に表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むことができる。このような組成物は、１又は複数の組換えで生成されたポリペプチド、黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離された１又は複数のポリペプチド、あるいはこれらの任意の組合せをさらに含むことができる。
【０１２３】
他の実施例として、組換えで生成されたＳｉｒＡポリペプチドは、組換えで生成されることに加えて、上記の通り特徴付けられてよいが、組成物は、組換えで生成されたＳｉｒＡポリペプチド、例えば、配列番号３７５に表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むことができる。このような組成物は、１又は複数の組換えで生成されたポリペプチド、黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離された１又は複数のポリペプチド、あるいはこれらの任意の組合せをさらに含むことができる。
【０１２４】
他の実施例として、組換えで生成されたＳＹＮ２ポリペプチドは、組換えで生成されることに加えて、上記の通り特徴付けられてよいが、組成物は、組換えで生成されたＳＹＮ２ポリペプチド、例えば配列番号３８６に表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むことができる。このような組成物は、１又は複数の組換えで生成されたポリペプチド、黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離された１又は複数のポリペプチド、あるいはこれらの任意の組合せをさらに含むことができる。
【０１２５】
他の実施例として、組換えで生成されたＦｈｕＤポリペプチドは、組換えで生成されることに加えて、上記の通り特徴付けられてよいが、組成物は、組換えで生成されたＦｈｕＤポリペプチド、例えば、配列番号３９７に表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むことができる。このような組成物は、１又は複数の組換えで生成されたポリペプチド、黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離された１又は複数のポリペプチド、あるいはこれらの任意の組合せをさらに含むことができる。
【０１２６】
他の実施例として、組換えで生成されたＳＹＮ１ポリペプチドは、組換えで生成されることに加えて、上記の通り特徴付けられてよいが、組成物は、組換えで生成されたＳＹＮ１ポリペプチド、例えば、配列番号４０８に表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むことができる。このような組成物は、１又は複数の組換えで生成されたポリペプチド、黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離された１又は複数のポリペプチド、あるいはこれらの任意の組合せをさらに含むことができる。
【０１２７】
他の実施例として、組換えで生成されたＭｎｔＣポリペプチドは、組換えで生成されることに加えて、上記の通り特徴付けられてよいが、組成物は、組換えで生成されたＭｎｔＣポリペプチド、例えば、配列番号４１９に表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むことができる。このような組成物は、１又は複数の組換えで生成されたポリペプチド、黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離された１又は複数のポリペプチド、あるいはこれらの任意の組合せ、をさらに含むことができる。
【０１２８】
一実施形態において、組換えで生成されたポリペプチドは、当該ポリペプチドの天然バージョンの免疫学的に活性な断片を意味することができる。免疫学的に活性な断片は、免疫学的に活性な断片のコア（例えば、配列番号３５３、配列番号３６４、配列番号３７５、配列番号３８６、配列番号３９７、配列番号４０８、又は配列番号４１９のアミノ酸配列）のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端へのアミノ酸付加を含んでよい。一定の実施形態において、免疫学的に活性な断片のコアのアミノ末端への任意の付加は、ポリペプチドのより長いバージョン、例えば、野生型又は他の天然形態と比較して、１又は複数のアミノ酸付加、欠失、置換（まとめると,「修飾」）、又は修飾の任意の組合せを含むことができる。したがって、例えば、免疫学的に活性な断片が配列番号３９７を含む実施形態において、配列番号３９７のアミノ末端への付加は、例えば、配列番号３９９のアミノ酸１〜２６と比較して、アミノ末端付加において少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又は少なくとも２６個の修飾を含むことができる。他の実施例として、免疫学的に活性な断片が配列番号４０８を含む実施形態において、配列番号４０８のアミノ末端への付加は、例えば、配列番号４１５のアミノ酸１〜２６と比較して、アミノ末端付加において、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５個の修飾を含むことができる。
【０１２９】
参照ポリペプチド及び異なる長さの候補ポリペプチド（例えば、参照ポリペプチドの免疫学的に活性な断片）のアミノ酸配列類似性及び／又はアミノ酸配列同一性を比較する場合、長い方のポリペプチド中のミスマッチとして寄与しているより長い長さの各アミノ酸残基をカウントしながら、類似性及び／又は同一性を長い方のポリペプチドの全長に渡って算出する。
【０１３０】
従って、一部の実施形態において、本発明の単離ポリペプチドは、配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列類似性及び／又は同一性を有するポリペプチドを含むことができ、但し、当該単離ポリペプチドがアミノ末端において１又は複数のさらなるアミノ酸を含む場合には、該１又は複数のさらなるアミノ酸が、配列番号３９９のアミノ酸１〜２６と比較して少なくとも１つのアミノ酸の欠失又は少なくとも１つのアミノ酸の置換を含むことを条件とする。
【０１３１】
他の実施形態において、本発明の単離ポリペプチドは、配列番号４０８のアミノ酸配列と少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列類似性及び／又は同一性を有するポリペプチドを含むことができ、但し、該単離ポリペプチドがアミノ末端において１又は複数のさらなるアミノ酸を含む場合には、該１又は複数のさらなるアミノ酸が、配列番号４１５のアミノ酸１〜５と比較して少なくとも１つのアミノ酸の欠失又は少なくとも１つのアミノ酸の置換を含むことを条件とする。
【０１３２】
「ポリペプチド配列類似性及びポリペプチド配列同一性」との見出しのセクションにおいて記載するように、特定の配列番号のアミノ酸配列への言及によって特定されるポリペプチドは、参照アミノ酸配列（例えば、特定の配列番号において提供されるアミノ酸配列）と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチド、及び／又は参照アミノ酸配列（例えば、特定の配列番号において提供されるアミノ酸配列）と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含むことができる。
【０１３３】
組換えで生成されたポリペプチドは、ベクターが適当な宿主細胞中に導入される場合にポリペプチドの発現が可能なベクターから発現されてよい。宿主細胞は、本発明の１又は複数の組換えで生成されたポリペプチドを生成するために構築されてよく、従って、本発明のポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む１又は複数のベクターを含むことができる。したがって、各ベクターは、本発明の１又は複数のポリヌクレオチド、すなわち、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。
【０１３４】
一定の組成物、例えば、組換えで生成されたポリペプチドを含む組成物は、最大数のポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態において、ポリペプチドの最大数は、ポリペプチドの最大総数を意味することができる。一定の組成物は、例えば、５０以下のポリペプチド、例えば、４０以下のポリペプチド、３０以下のポリペプチド、２５以下のポリペプチド、２０以下のポリペプチド、１５以下のポリペプチド、１０以下のポリペプチド、８以下のポリペプチド、７以下のポリペプチド、６以下のポリペプチド、５以下のポリペプチド、４以下のポリペプチド、３以下のポリペプチド、２以下のポリペプチド、１以下のポリペプチドを含むことができる。他の実施形態において、組換えで生成されたポリペプチドの最大数は、同様の方法で特定されてよい。さらに他の実施形態において、非組換え生成のポリペプチドの最大数は同様の方法で特定されてよい。
【０１３５】
組成物は、１つの微生物から単離可能なポリペプチドを含むことができるか、又は２又はそれ以上の微生物の組合せから単離可能である。例えば、組成物は、２又はそれ以上のブドウ球菌属（Staphylococcus spp）、あるいはブドウ球菌属（Staphylococcus spp）及びブドウ球菌属のメンバーではない異種微生物から単離可能なポリペプチドを含むことができる。本発明は、全細胞が本発明の１又は複数のポリペプチドを発現する、全細胞製剤を含んでなる組成物もまた供する。例えば、全細胞は、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp）であってよい。一態様において、組成物は２、３、４、５、又は６つの株由来の全製剤を含むことができる。
【０１３６】
任意には、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの免疫学的特性を改良するために担体ポリペプチドに共有結合又は結合されてよい。有用な担体ポリペプチドは、当技術分野で周知である。本発明のポリペプチドの化学的結合は、周知且つ通常の方法を使用して行われてよい。例えば、様々なホモ二機能性（homobifunctional）及び／又はヘテロ二機能性（heterobifunctional）架橋剤試薬、例えばビス（スルホサクシニミジル）スベリン酸塩、ビス（ジアゾベンジジン）、アジプイミド酸ジメチル、ピメリミド酸ジメチル、スベルイミド酸ジメチル、スベリン酸塩ジサクシニミジル、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホ−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホサクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホサクシニミジル４−（ｐ−マレイミド−フェニル）ブチレート及び（ｌ−エチル−３−（ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミドを使用することができる（例えば、Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, generally and Chapter 5, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, NY （1988）を参照されたい）。
【０１３７】
本発明の組成物は、任意には、医薬として許容される担体をさらに含む。「医薬として許容される」は、組成物の他の成分と適合し、且つこれらのレシピエントに有害でない、希釈剤、担体、賦形剤、塩等を意味する。典型的には、組成物は、組成物が明細書中で記載されるように使用される場合、医薬として許容される担体を含む。本発明の組成物は、抗原への免疫応答を刺激するために適当なルートを含む投与の選択されたルートに適合された種々の形態で医薬製剤中に製剤されてよい。したがって、本発明の組成物は、例えば、経口；皮内、経皮及び皮下を含む非経口；筋肉内、静脈内、腹腔内、等、並びに局所的に、例えば鼻腔内、肺内、乳房内、膣内、子宮内、皮内、経皮及び経直腸等を含む周知のルートを介して投与することができる。組成物は、動物体中に粘膜免疫、例えば分泌型ＩｇＡ抗体の産生を刺激するために、例えば（例えば、スプレー又はエアロゾルを介した）鼻又は呼吸粘膜への投与によって、粘膜表面に投与することができることが予測される。
【０１３８】
本発明の組成物はまた、持続又は遅延放出性インプラントを介して投与することができる。本発明の使用に適当なインプラントは、周知であり、例えば、Ｅｍｅｒｙ及びＳｔｒａｕｂ（WO 01/37810（2001））、並びにＥｍｅｒｙ等（WO 96/01620（1996））において開示されるものを含む。インプラントは、エアロゾル又はスプレーによって投与される十分小さなサイズで生成することができる。インプラントはまた、ナノ粒子及び微粒子を含むことができる。
【０１３９】
本発明の組成物は、明細書中で記載されるように一定の疾患を治療するために十分な量で投与する。本発明の組成物中に存在するポリペプチド又は全細胞の量は変化してよい。例えば、ポリペプチドの用量は、０．０１マイクログラム（μｇ）〜３００ｍｇ、典型的には０．１ｍｇ〜１０ｍｇとすることができる。組成物が全細胞製剤である場合、細胞は、例えば、１０2細菌／ｍｌ、１０3細菌／ｍｌ、１０4細菌／ｍｌ、１０5細菌／ｍｌ、１０6細菌／ｍｌ、１０7細菌／ｍｌ、１０8細菌／ｍｌ、又は１０9細菌／ｍｌの濃度で存在し得る。（例えば、皮下, 筋肉内等に）注射可能な組成物に関して、ポリペプチドは、投与される組成物の総量が０．５ｍｌ〜５．０ｍｌ、典型的には１．０〜２．０ｍｌとなる量で組成物中に存在してよい。組成物が全細胞製剤である場合、細胞は好適には、投与される組成物の総量が０．５ｍｌ〜５．０ｍｌ、典型的には１．０〜２．０ｍｌの量で組成物中に存在する。投与される量は、様々な因子に従って変化し、当該因子は、選択される特定のポリペプチド、動物の体重、健康状態及び年齢、ならびに投与ルートを含むがこれに限定されない。したがって、所定の単位用量形態中に含まれるポリペプチド絶対重量は、広範に変化し、因子、例えば動物の種、年齢、体重、及び健康状態、並びに投与方法によって決定されてよい。このような因子は、当業者によって決定されてよい。本発明に適当な用量の他の例は、Ｅｍｅｒｙ等（U.S. Patent 6,027,736）において開示される。
【０１４０】
製剤は、利便性のため単位用量形態で提示されてよく、医薬技術分野で周知の方法によって調製されてよい。医薬として許容される担体を有する組成物の調製の方法は、１又は複数の副成分を構成する担体と活性化合物（例えば、本発明のポリペプチド又は全細胞）を結合させる段階を含む。一般的に、製剤は、均一且つ本質的に活性な化合物を液体担体、細かく分割された固体担体、または両方と結合させ、そして、必要ならば、生成物を所望の製剤に成形することによって調製される。
【０１４１】
医薬として許容される担体を含む組成物はまた、アジュバントを含むことができる。「アジュバント」は、特定の抗原への免疫応答を増強するための非特異的な方法で機能し得る剤を意味し、したがって、アジュバントは潜在的に任意の所定の免疫化組成物において必要な抗原の量、及び／又は目的の抗原に対して適切な免疫応答を生じるために必要な注射の頻度を減少する。アジュバントは、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、乳化剤、ムラミルジペプチド、ジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDA）、アブリジン、水酸化アルミニウム、油、サポニン、アルファ−トコフェロール、ポリサッカライド、（例えば, 商標名ＥＭＵＬＳＩＧＥＮでMVP Laboratories, Ralston, Nebraskaから利用可能なものを含む）乳化パラフィン、ＩＳＡ−７０、ＲＩＢＩ及び当技術分野で周知の他の物質を含んでよい。本発明のポリペプチドが免疫調節性活性を有し、このようなポリペプチドが、直接的にＴ及び／又はＢ細胞活性として機能する、又は様々なサイトカインの合成を増強する特異的な細胞型に機能する、あるいは細胞内のシグナル伝達経路を活性化するアジュバントとして使用されることが期待される。これらのポリペプチドは、現存する組成物の防御指標を増加する免疫応答を増強することが期待される。
【０１４２】
他の実施形態において、医薬として許容される担体を含む本発明の組成物は、生物学的応答変更因子、例えば、免疫細胞に作用するＩＬ−２、ＩＬ−４及び／又はＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、及び他のサイトカインを含むことができる。免疫化組成物はまた、他の構成成分、当技術分野で周知の、例えば抗生物質、防腐剤、抗酸化剤、又はキレート剤を含むことができる。
【０１４３】
作製方法
本発明はまた、明細書中で記載されるポリペプチドを得るための方法を供する。本発明のポリペプチド及び全細胞は、ミクロコッカス科（Micrococcaceae）、好適にはブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）、より好適には黄色ブドウ球菌属（Staphylococcus aureus）のメンバーから単離可能であってよい。
【０１４４】
ポリペプチドを単離することができる他のグラム陽性微生物は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium spp.）、エリシペロスリクス属（Erysipelothrix spp.）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium spp.）、及びエリシペロスリクス属（Erysipelothrix spp.）を含む。本発明のポリペプチドを得ること及び全細胞製剤を作製するのに有用な微生物は、保管所、例えば米国培養細胞系統保存機関（American Type Culure Collection（ATCC））から購入できる。加えて、例えば微生物は、当技術分野で通常かつ周知の技術によって容易に得られる。微生物は、フィールド分離株（field isolate）としての感染した動物に由来し、本発明のポリペプチド及び／又は全細胞製剤を得るために使用する、又は、例えば、冷凍貯蔵所において、−２０℃〜−９５℃、又は−４０℃〜−５０℃で、２０％グリセロールを含有する細菌学的培地、及び他の同様の培地中で後の使用のために貯蔵してよい。
【０１４５】
本発明のポリペプチドが微生物から得ることができる場合、微生物は低金属条件下でインキュベートすることができる。本明細書で用いられる場合、用語「低金属条件」は、環境、典型的には、検出可能なレベルで微生物に金属制御ポリペプチドを発現させる量の遊離金属を含有する、細菌学的培地を意味する。本明細書で用いられる場合、用語「高金属条件」は、微生物に明細書中で記載される１又は複数の金属制御ポリペプチドを検出可能なレベルで発現させない、又は低金属条件下の金属制御ポリペプチドの発現と比較して低下したレベルでこのようなポリペプチドを発現させる量の遊離金属を含有する環境を意味する。場合によって、「高金属条件」は、金属リッチな自然環境及び／又は金属キレート剤非含有の金属リッチな培地における培養物を含むことができる。対照的に、場合によって、「低金属条件」は、以下により詳細に記載される金属キレート剤を含む培地中の培養物を含むことができる。金属は、周期表の第１〜１７族（IUPAC表記法; CAS表記法でそれぞれ、第I-A, II-A, III-B, IV-B, V-B, VI-B, VII-B, VIII, I-B, II-B, III-A, IV-A, V-A, VI-A, 及びVII-A族とも呼ばれる）に存在するものである。
【０１４６】
好適には、金属は第２〜１２族、より好適には、第３〜１２族のものである。さらにより好適には、金属は、鉄、亜鉛、銅、マグネシウム、ニッケル、コバルト、マンガン、モリブデン、又はセレン、最も好適には、鉄である。
【０１４７】
低金属条件は、通常金属キレート化合物の細菌学的培地への添加、少量の金属を含有する細菌学的培地の使用、又はこれらの組合せの結果得られる。高金属条件は、キレート剤が培地中に存在しない、金属を培地に添加する、又はこれらの組合せの場合に、通常生じる。金属キレート剤の例は、自然及び合成化合物を含む。自然化合物の例は、植物フェノール化合物、例えばフラボノイドを含む。フラボノイドの例は、銅キレート剤カテキン及びナリンゲニン、及び鉄キレート剤ミリセチン及びケルセチンを含む。合成銅キレート剤の例は、例えば、テトラチオモリブデートを、そして合成亜鉛キレート剤の例は、例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）−エチレンジアミンの例を含む。合成鉄キレート剤の例は、（当技術分野でα，α’−ビピリジルとも言及される）２，２’−ジピリジル、８−ヒドロキシキノリン、エチレンジアミン−ジ−Ｏ−ヒドロキシフェニル酢酸（EDDHA）、デスフェリオキサミンアミンメタンスルホン酸塩（デスフェロール）、トランスフェリン、ラクトフェリン、オボトランスフェリン、生物学的シデロホア、例えば、カテコラート及びヒドロキサメート、及びクエン酸塩を含む。一般的な二価カチオンキレート剤の例は、ＣＨＥＬＥＸ樹脂である。好適には、２，２’−ジピリジルが鉄キレート化のために使用される。典型的には、２，２’−ジピリジルは、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも６００μｇ／ｍｌ、又は少なくとも９００μｇ／ｍｌの濃度で培地に添加される。高レベルの２，２’−ジピリジルは、１２００μｇ／ｍｌ、１５００μｇ／ｍｌ、又は１８００μｇ／ｍｌとしてよい。
【０１４８】
黄色ブドウ球菌（S. aureus）ゲノムは、３つのＦｕｒホモログ：Ｆｕｒ、ＰｅｒＲ、及びＺｕｒをコードする。Ｚｕｒ及びＰｅｒＲタンパク質は、それぞれ主に亜鉛恒常性及び過酸化物ストレス遺伝子の制御に関与するように見えるが、Ｆｕｒタンパク質は、鉄制限に応答した一部の鉄シデロホア取り込みシステムを制御することが証明されている。Ｆｕｒタンパク質はまた、酸化ストレス耐性及び毒性に関与する。グラム陽性生物、好適には、ｆｕｒ遺伝子中に突然変異のある黄色ブドウ球菌（S. aureus）は、本発明の金属制御ポリペプチドの全てではないが多くに恒常的発現をもたらすことが期待される。グラム陽性、好適には黄色ブドウ球菌（S. aureus）におけるｆｕｒ突然変異の生成は、例えば、グラム陽性菌における遺伝子ノックアウト突然変異を生じるのに有用なトランスポゾン、化学、又は部位方向性変異原性を含む通常の方法を使用して生じることができる。
【０１４９】
微生物をインキュベートするために使用される培地及び微生物をインキュベートするために使用される培地の量は、変化させることができる。明細書中で記載される１又は複数のポリペプチドを生成する能力に関して微生物が評価されている場合、適当な量で、例えば培地１０ミリリットル〜１リットル中で微生物を成長させることができる。例えば、動物への投与における使用のためのポリペプチドを得るために微生物を成長させている場合、より多くの量のポリペプチドの単離を可能にするために微生物は発酵槽で成長させてよい。発酵槽において微生物を成長させるための方法は、当技術分野で通常且つ周知のものである。微生物の成長のために使用される条件は、好適には金属キレート剤、より好適には鉄キレート剤、例えば２，２’−ジピリジル、ｐＨ６．５〜７．５、好適には６．９〜７．１、及び温度３７℃を含む。
【０１５０】
本発明の一部の態様において、微生物は、成長後回収されてよい。回収は、微生物をより小さな容積中で濃縮すること、及び成長培地と異なる培地中で懸濁することを含む。微生物を濃縮するための方法は、当技術分野で通常且つ周知のものであり、例えば、濾過又は遠心分離を含む。典型的には、濃縮された微生物を適当な緩衝液中で懸濁する。使用することができる緩衝液の例は、ｐＨ８．５のトリス塩基（7.3グラム/リットル）を含む。任意には、最終緩衝液はまた、タンパク質分解を最小化する。これは、最終緩衝液をｐＨ８．０以上、好適には、少なくとも８．５とすること、及び／又は１又は複数のプロテアーゼ阻害剤（例えば、フェニルメタンスルホニルフッ化物）を含むことによって達成することができる。任意及び好適には、濃縮した微生物を破砕するまで−２０℃又はそれ以下で凍結させる。
【０１５１】
微生物を全細胞製剤として使用できる場合、細胞を不活性化するための通常且つ周知の方法を使用して、回収した細胞を処理してよい。あるいは、本発明のポリペプチドを調製するために微生物を使用することができる場合、例えば、沸騰、フレンチプレス、超音波処理、（例えば、リゾチームでの分解による）ペプチドグリカンの分解、又はホモジナイズを含む技術分野で通常且つ周知の化学的、物理的、又は機械的方法を使用して微生物を破砕してよい。ホモジナイズに有用である適当な装置の例は、モデルＣ５００−Ｂ ＡＶＥＳＴＨＭホモジナイザー（Avestin Inc, Ottawa Canada）である。本明細書で用いられる「破砕」は、細胞をばらばらにすることを意味する。微生物の破砕は、当技術分野で通常且つ周知の方法によって測定することができ、例えば、光学濃度の変更が含まれる。典型的には、１：１００希釈を測定する場合、透過パーセントが２０％に増加するまで、微生物を破砕に供する。物理的又は機械的方法を使用する場合、破砕中の温度は、タンパク質分解をさらに最小化するために、典型的には低く、好適には４℃で維持する。化学的方法を使用する場合、細胞破砕を最適化するために温度を上昇させてよい。化学、物理、及び機械的方法の組合せを、微生物の細胞壁を可溶化するために使用してもよい。本明細書で用いられる用語「を可溶化する」は、細胞物質（例えば、ポリペプチド, 核酸, 炭水化物）を、微生物が破砕された緩衝液の水相中に溶解すること、及び不溶性細胞物質の凝集物の形成を意味する。理論によって限定されることを意図することなく、可溶化の条件によって、例えば、遠心分離によって容易に単離可能であるほど十分に大きい不溶性凝集物中への本発明のポリペプチドの凝集がもたらされると考えられる。
【０１５２】
１又は複数の本発明のポリペプチドを含む不溶性凝集物は、当技術分野で通常且つ周知の方法によって単離されてよい。好適には、不溶性凝集物は、遠心分離によって単離されてよい。典型的には、ポリペプチド、例えば膜ポリペプチドの遠心分離は、遠心力１００，０００×ｇによって達成することができる。このような遠心力の使用は超遠心機の使用が必要であり、工程中の試料の大容積へのスケールアップはたびたび困難であり、これらのタイプの遠心機は経済的でない。明細書中で記載される方法は、大量の不溶性凝集物の産生を供することができ、連続流遠心機、例えば、遠心力４６，０００×ｇ〜６０，０００×ｇ、１７ｐｓｉにおいて流速２５０ｍｌ／分で使用することができるＴ−１Ｓｈａｒｐｉｅｓ（Alfa Laval Separations, Warminster, PA）の使用が可能である。他の大規模遠心機、例えばチューブ状ボウル型、チャンバー型、及びディスク型の構造のものを使用することができる。このような遠心機は、通常使用され且つ当技術分野で周知であり、Ｐｅｎｎｗａｌｔ、Ｗｅｓｔｆａｌｉａ及びアルファ−Ｌａｖａｌ等の製造者から購入できる。
【０１５３】
最終的に回収されたタンパク質は、当技術分野で周知の方法、例えばダイアフィルトレーション、沈殿、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、又は親和性クロマトグラフィー、又は超濾過及び例えば、ダイアフィルトレーションによるアルコール中でのポリペプチドの洗浄を使用して、洗浄且つ／又は適当な緩衝液で透析する。単離後、ポリペプチドを緩衝液中で懸濁し、低温、例えば、−２０℃又は以下で保存する。全細胞製剤を作製する本発明のこれらの態様において、微生物の成長後、薬剤、例えばグルタルアルデヒド、ホルマリン、又はホルムアルデヒドの培養物中の細胞を不活性化するのに十分な濃度での添加で微生物を死滅することができる。例えば、ホルマリンは、０．３％（体積／体積）の濃度で添加することができる。細胞を不活性化するのに十分な時間の後、例えば、ダイアフィルトレーション及び／又は遠心分離、並びに洗浄によって細胞を回収することができる。
【０１５４】
他の態様において、本発明の単離ポリペプチドは、組換えで調製されてよい。組換えで調製される場合、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、下記の実施例１４のように特定され適当な発現宿主中にクローン化されてよい。組換え発現宿主は、適当な培地中に成長させ、破砕し、上記のようにポリペプチドは単離されてよい。
【０１５５】
使用方法
本発明の態様は、本発明の組成物の使用方法を目的とする。当該方法は、動物へ本発明の組成物の有効量を投与することを含む。動物は、例えば、鳥類（例えば、ニワトリ又は七面鳥等）、ウシ属（例えば、蓄牛等）、ヤギ属（例えば, 蓄山羊等）、ヒツジ属（例えば, 蓄羊等）、ブタ（例えば, 蓄豚等）、バイソン（例えば, 野牛等）、ウマ科（例えば, ウマ等）、伴侶動物（例えば, イヌ又はネコ等）、シカ科ノメンバー（例えば, シカ, エルク, ムース, カリブー及びトナカイ等）、又はヒトであってよい。
【０１５６】
一部の態様において、方法は、二次免疫応答を増強又は刺激するための、組成物の動物へのさらなる投与（例えば、１又は複数の追加免疫投与）をさらに含んでよい。追加免疫は、組成物の最初の投与の後に、例えば、１〜８週間後に、好適には２〜４週間後に、投与することができる。続く追加免疫は、毎年１、２、３、４回又はそれ以上投与することができる。理論に限定されることを意図するものではないが、本発明の一部の態様において、動物は野外で、動物に投与された組成物のポリペプチド上に存在するエピトープと同一又は構造上関係するエピトープを有する組成物中に存在するポリペプチドを発現している微生物に曝露されるので、毎年の追加免疫は必要でないことが期待される。
【０１５７】
一態様において、本発明は、例えば動物において抗体の産生を誘発すること、又は組換え技術によって抗体を作製するための方法を目的とする。生成される抗体は、組成物中に存在する少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む。本発明のこの態様において、「有効量」は、動物において抗体の産生をもたらすことに効果的な量である。本発明の組成物中に存在するポリペプチドに特異的に結合する抗体を動物が生成したかを決定するための方法は、明細書中で記載されるように決定することができる。本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体、及びこのような抗体を含む組成物をさらに含む。
【０１５８】
当該方法は、組成物のポリペプチドが単離された微生物以外の微生物によって発現されたポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するために使用してよい。本明細書で用いられる場合、ポリペプチド「に特異的に結合する」ことができる抗体は、抗体の合成を誘発した抗原のエピトープと相互作用する、又は構造上関連のあるエピトープと相互作用する抗体である。本発明の組成物中に存在する少なくとも一部のポリペプチドは、典型的には異種及び異なる属の微生物のポリペプチド中に保存されたエピトープを含む。従って、一微生物に由来する組成物を使用して生成された抗体は、他の微生物によって発現されたポリペプチドに結合し、グラム陽性生物に対する防御のスペクトルを拡大することが期待される。抗体が特異的に結合するグラム陽性微生物の例は、ミクロコッカス科（Micrococcaceae）、好適にはブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）、より好適には黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）；ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）のメンバー、好適には、化膿性ストレプトコッカス（Streptococcus pyogenes）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、腺疫菌（Streptococcus equi）、又は減乳ストレプトコッカス（Streptococcus dysgalactiae）；及びバチルス属（Bacillus spp.）、クロストリジウム属（Clostridium spp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium spp.）、エンテロコッカス菌属（Enterococcus spp.）、エリシペロスリクス属（Erysipelothrix spp.）、リステリア属（Listeria spp.）、ミクロコッカス菌属（Micrococcus spp.）、及びマイコバクテリウム属（Mycobacterium spp.）、キトコッカス属（Kytococcus spp.）、及びエリシペロスリクス属（Erysipelothrix spp.）である。従って、本発明のポリペプチドの組成物を使用して生成された抗体は、ポリペプチドを得るオリジン、ソース及び／又は方法とは無関係な本発明のポリペプチドを同定し特徴付けるために使用してよい。
【０１５９】
本発明はまた、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチド上に存在するエピトープに構造上関連するエピトープを有するポリペプチドを発現している微生物を標的とするためのこのような抗体の使用を目的とする。抗体は化合物と共有結合することができ、化合物は、例えば、毒素であり得る。同様に、このような化合物は、微生物を標的とするために細菌シデロホアと共有結合することができる。化学的結合又は本発明の抗体、又はこの部分（例えばFab断片）の結合は、周知且つ通常の方法を使用して行うことができる。
【０１６０】
一態様において、本発明は、グラム陽性微生物、好適にはミクロコッカス科（Micrococcaceae）のメンバー、好適には、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）、より好適には黄色ブドウ球菌（S. aureus）；ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）のメンバー、好適には、化膿性ストレプトコッカス（Streptococcus pyogenes）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、腺疫菌（Streptococcus equi）、又は減乳ストレプトコッカス（Streptococcus dysgalactiae）；バチルス属（Bacillus spp.）、クロストリジウム属（Clostridium spp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium spp.）、エンテロコッカス菌属（Enterococcus spp.）、エリシペロスリクス属（Erysipelothrix spp.）、キトコッカス属（Kytococcus spp.）、リステリア属（Listeria spp.）、ミクロコッカス菌属（Micrococcus spp.）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium spp.）、及びエリシペロスリクス属（Erysipelothrix spp.）によって生じる感染症を動物、例えばヒト等において治療することもまた目的とする。本明細書で用いられる場合、用語「感染症」は、臨床的に顕在化している又は顕在化していない、動物体中のグラム陽性微生物の存在を意味する。臨床的に顕在化していないブドウ球菌属のメンバーによる感染症に罹患する動物は度々、無症候性キャリアと呼ばれる。
【０１６１】
感染症の治療は予防的とすることができ、あるいは動物が微生物に感染した後に開始されるものとすることができる。予防的である、例えば、対象が微生物に感染する前に又は任意の感染症が無症状である間に開始される治療は、感染症の「リスクがある」対象の治療と明細書中で呼ぶ。本明細書で用いられる場合、用語「リスクがある」は、実際は記載したリスクを有するかもしれない動物を意味する。したがって、典型的には、微生物による感染症の「リスクがある」動物は、例え微生物による感染症の任意の検出可能な兆候を動物がまだ顕在化していなくても、また動物が無症状の量の微生物を保有するかにかかわらず、動物が微生物に感染していると特定される及び／又は微生物に曝され得る範囲に存在する動物である。従って、動物の微生物との最初の接触前、中、又は後に、組成物の投与を実施することができる。動物の最初の微生物との接触後に開始される治療は、微生物による感染症の症状の重症度及び／又は臨床徴候の減少、完全に微生物を除去すること、及び／又は組成物を投与していない動物と比較して感染症を経験する可能性を臨床的に明らかに減少することをもたらす。当該方法は、本発明の組成物の有効量をグラム陽性微生物によって生じる感染症を有する、又は有するリスクがある動物へ投与すること、及び感染症を生じている微生物の数が減少したかを決定することを含む。本発明のこの態様において、「有効量」は、組成物を投与していない動物と比較して、動物中の特定の微生物の数を減少する、又は動物が臨床的に明らかな感染症を経験する可能性を低下する効果的な量である。感染症が減少しているかを決定するための方法と同様に、グラム陽性微生物によって感染症が生じているかを決定するのための方法は、当技術分野で通常且つ周知である。
【０１６２】
他の態様において、本発明は、グラム陽性微生物、好適にはミクロコッカス科（Micrococcaceae）のメンバー、好適にはブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）、より好適には、黄色ブドウ球菌（S. aureus）；ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）のメンバー、好適には、化膿性ストレプトコッカス（Streptococcus pyogenes）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、腺疫菌（Streptococcus equi）、又は減乳ストレプトコッカス（Streptococcus dysgalactiae）；バチルス属（Bacillus spp.）、クロストリジウム属（Clostridium spp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium spp.）、エンテロコッカス菌属（Enterococcus spp.）、エリシペロスリクス属（Erysipelothrix spp.）、キトコッカス属（Kytococcus spp.）、リステリア属（Listeria spp.）、ミクロコッカス菌属（Micrococcus spp.）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium spp.）、及びエリシペロスリクス属（Erysipelothrix spp.）による感染症によって生じる、動物における一定の疾病の１又は複数の症状或いは臨床徴候を治療するのための方法を目的とする。当該方法は、本発明の組成物の有効量を、疾病を有する又は有するリスクがある、又は疾病の症状及び／又は臨床徴候を示している動物に投与すること、及び少なくとも疾病の一症状及び／又は臨床徴候が変化したか、好適には低減されたかを決定することことを含む。微生物感染症によって生じる疾病及び／又は臨床徴候の例は、例えば、乳腺炎、敗血症、肺炎、髄膜脳炎、リンパ管炎、皮膚炎、生殖器感染症、腺疫、子宮炎、周産期疾病、下垂体膿瘍、関節炎、滑液包炎、精巣炎、膀胱炎及び腎盂腎炎、リンパ節炎、結核、潰瘍性リンパ管炎、リステリア症、丹毒、蹄葉炎、炭疽病、チザー疾病、破傷風、ボツリヌス症、腸炎、悪性水腫、ブラクシー病（braxy）、桿菌性ヘモグロビン尿症、腸毒血症、壊死性皮膚病変、及び院内感染症を含む。黄色ブドウ球菌（S. aureus）によって生じる疾病の例は、例えば、ウマにおけるボトリオミセス症、家禽における化膿性滑膜炎及び骨髄炎、ブタにおける流産、及び仔ヒツジにおけるダニ性膿血もまた含む。ストレプトコッカス属（Streptococcus spp.）によって生じる疾病の例は、例えば、咽頭炎、猩紅熱、膿痂疹、潰瘍性心内膜炎、リウマチ熱及び連鎖球菌感染後糸球体腎炎、ヒトにおける子宮頸管炎、ウマ及びブタにおける子宮頸管炎、並びにブタにおける髄膜炎及び顎膿瘍もまた含む。
【０１６３】
これらの疾病と関連がある症状及び／又は臨床徴候の治療は、予防的である、または明細書中で記載される疾病の進行後に開始することができる。本明細書で用いられる場合、用語「症状」は、微生物によって患者によって経験され、そして微生物による感染症によって生じる疾患又は疾病の主観的な証拠を意味する。本明細書で用いられる場合、用語「臨床徴候」又は「徴候」は、微生物の感染症によって生じる疾患又は疾病の客観的証拠を意味する。明細書中で言及する疾病と関連がある症状及び／又は臨床徴候、ならびにこのような症状の評価は、当技術分野で通常且つ周知である。予防的、例えば、対象が微生物によって生じる疾病の症状又は徴候を顕在化させる前に開始される治療は、当該疾病を進行する「リスクがある」対象の治療と明細書中で呼ぶ。したがって、典型的には、疾病を進行する「リスクがある」動物は、疾病に罹患していると診断されている且つ／又は動物が微生物によって生じる任意の疾病の症状又は徴候をまだ顕在化していなくても疾病を生じる微生物に曝露されそうである範囲に存在する動物である。従って、組成物の投与は、明細書中で記載される疾病の発生前、中、又は後に実施することができる。疾病の進行後に開始される治療は、疾病の一つの症状の重症度の減少、又は完全な症状の除去をもたらす。本発明のこの態様において、「有効量」は、疾患の症状の顕在化を予防する、疾患の症状の重症度を軽減する、及び／又は完全に症状を除去するのに効果的な量である。動物におけるグラム陽性微生物の感染症の治療の成功は、実施例５において開示され、本発明の組成物を投与することによって、マウスモデルにおいて黄色ブドウ球菌（S. aureus）によって生じる疾患に対する防御を証明する。当該マウスモデルは、これらの微生物によって生じるヒト疾患の研究に関して通常認容されるモデルである。動物におけるグラム陽性微生物感染症の治療の成功はまた、実施例１０〜１２に開示され、本発明の組成物を投与することによって、乳牛において黄色ブドウ球菌（S. aureus）によって生じる疾患に対する防御を供することを証明する。
【０１６４】
本発明はまた、グラム陽性微生物によるコロニー形成を減少するための方法、例えば、骨格系（例えば, 骨, 軟骨, 腱及び靭帯）、筋系（例えば, 骨格筋及び平滑筋）、循環系（例えば, 心臓, 血管, 毛細血管及び血液）、神経系（例えば, 脳, 脊髄, 及び末梢神経）、呼吸系（例えば, 鼻, 気管肺, 気管支, 細気管支, 肺胞）、消化系（例えば, 口, 唾液腺, 食道, 肝臓, 胃, 大腸及び小腸）、排泄系（例えば, 腎臓, 尿管, 膀胱及び尿道）、内分泌系（例えば, 視床下部, 下垂体, 甲状腺, 膵臓及び副腎）、生殖系（例えば, 卵巣, 卵管, 子宮, 膣, 乳腺, 精巣, 及び精嚢）、リンパ／免疫系（例えば, リンパ液, リンパ節及び管, 単核又は白血球, 例えばマクロファージ, 好中球, 単球, 好酸球, 好塩基球, 及びリンパ球, 例えばＴ細胞及びＢ細胞等）、及び特異的な細胞系（例えば, 前駆細胞, 上皮細胞, 幹細胞）等の組織を含むグラム陽性微生物の付着部位をブロックすることを供する。好適には、グラム陽性微生物は、ミクロコッカス科（Micrococcaceae）のメンバー、好適にはブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）、より好適には黄色ブドウ球菌（S. aureus）；ストレプトコッカス科（Streptooccaceae）のメンバー、好適には化膿性ストレプトコッカス（Streptococcus pyogenes）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、腺疫菌（Streptococcus equi）、又は減乳ストレプトコッカス（Streptococcus dysgalactiae）；バチルス属（Bacillus spp.）、クロストリジウム属（Clostridium spp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium spp.）、腸球菌属（Enterococus spp.）、エリシペロスリクス属（Erysipelothrix spp.）、キトコッカス属（Kytococcus spp.）、リステリア属（Listeria spp.）、ミクロコッカス菌属（Micrococcus spp.）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium spp.）、及びエリシペロスリクス属（Erysipelothrix spp.）である。
【０１６５】
動物においてコロニー形成を減少することは、予防的に実施される、又は微生物によって動物にコロニー形成された後に開始されてよい。予防的な治療、例えば、微生物によって対象にコロニー形成される前に、又は任意のコロニー形成が検出されない状態の中で開始される治療は、微生物によるコロニー形成の「リスクがある」対象の治療と明細書中で呼ぶ。したがって、典型的には、微生物によるコロニー形成の「リスクがある」動物は、動物がまだ微生物によるコロニー形成の検出可能な兆候が顕在化していなくても、また動物が微生物のサブコロニー形成数を保有するかにかかわらず、微生物によって動物にコロニー形成されたと特定されている及び／又は微生物に曝露されそうである範囲に存在する動物である。従って、動物の微生物との最初の接触の前、中、又は後で、組成物の投与を実施することができる。動物の微生物との最初の接触後に開始される治療は、組成物が投与されていない動物と比較して、微生物によるコロニー形成の程度を減少すること、完全に微生物を除去すること、及び／又は微生物によって動物にコロニー形成される可能性を減少することをもたらす。したがって、当該方法は、本発明の組成物の有効量を、グラム陽性微生物によってコロニー形成された又はコロニー形成されるリスクがある動物に投与することを含む。本発明のこの態様において、「有効量」は、微生物による動物中のコロニー形成を減少するために十分な量であり、コロニー形成を減少することは：組成物が投与されていない動物と比較して、微生物によるコロニー形成の程度を減少すること、完全に微生物を除去すること、及び／又は微生物によって動物にコロニー形成される可能性を減少することのうち、１つ又は複数を意味する。微生物による動物のコロニー形成を評価するための方法は、当技術分野で通常且つ周知である。例えば、微生物による動物の腸管のコロニー形成は、動物の糞便中の微生物の存在を測定することによって決定することができる。微生物による動物におけるコロニー形成を減少することは、微生物のヒトへの伝染を減少することが期待される。
【０１６６】
本発明の組成物は、細菌感染症に対する能動又は受動免疫を提供するために使用することができる。通常、組成物は、能動免疫を供するために動物に投与される。しかしながら、組成物は、免疫生成物、産生している動物から回収及び受動免疫を提供するために他の動物に投与することができる例えば抗体の産生を誘発するために使用することもまた可能である。免疫成分、例えば抗体は、組成物（好適には、抗体を含有する組成物）を調製するために、血清、血漿、血液、初乳等から受動免疫治療のために回収することができる。モノクローナル抗体及び／又は抗イディオタイプを含む抗体組成物はまた、周知の方法を使用して調製することができる。キメラ抗体は、ヒト由来のＨ鎖及びＬ鎖両方の定常部、マウス由来の抗原特異的な可変領域を含む（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA3 1984, 81（21）:6851-5; LoBuglio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86（11）:4220-4; Boulianne et al., Nature, 1984, 312（5995）:643-6）。ヒト化抗体は、（可変領域の）マウスの定常部及びフレームワーク（FR）をヒトの対応物と置換する（Jones et al., Nature, 1986, 321（6069）:522-5; Riechmann et al., Nature, 1988, 332（6162）:323-7; Verhoeyen et al., Science, 1988, 239（4847）: 1534-6; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA3 1989, 86（24）:10029-33; Daugherty et al., Nucleic Acids Res., 1991, 19（9）: 2471-6）。あるいは、ヒトオリジンとほぼ完全である抗体を産生するよう遺伝的に操作された一部のマウス株を使用することができ；免疫化に続いて、ヒトモノクローナル抗体の産生のためにこれらのマウスのＢ細胞を回収し不死化する（Bruggeman and Taussig, Curr. Opin. BiotechnoL, 1997, 8（4）:455-8; Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol, 1995;13（l）:65-93; Lonberg et al., Nature, 1994, 368:856-9; Taylor et al., Nucleic Acids Res., 1992, 20:6287-95）。受動抗体組成物及びこの断片、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2又はＦｖ或いはこれらの他の修飾形態は、血清、血漿、血液、初乳等の形態でレシピエントに投与されてよい。しかしながら、抗体は、後の使用のために、周知の方法を使用して、血清、血漿、血液、初乳等から、濃縮又は再構成形態、例えば洗浄液、浸透性ドレッシング及び／又は局所剤等中に単離されてもよい。受動免疫製剤は、急性全身性疾病の治療、又は母性初乳を介して適切なレベルの受動免疫を受けることができない若齢の動物の受動免疫に特に好適である。受動免疫に有用な抗体は、全身性又は局所的感染症中に、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチド上に存在するエピトープと構造上関連するエピトープを有するポリペプチドの細菌の発現を直接的に標的とすることができる様々な薬剤又は抗生物質に結合することにも有用である。
【０１６７】
動物モデル、特にマウスモデルは、本発明の組成物を実験上評価するために利用可能である。これらのマウスモデルは、ブドウ球菌属のメンバー、特に黄色ブドウ球菌（S. aureus）によって生じるヒト疾患の研究に通常容認されるモデルである。ブドウ球菌属のメンバーが動物、例えば乳牛において疾患を生じるこれらの場合において、本発明の組成物を実験上評価するために自然宿主を使用することができる。
【０１６８】
しかしながら、マウスモデルにおける防御は、組成物がブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）による感染症に対する防御を動物に与えることができるかを評価するための唯一の方法ではない。適応免疫応答は、２つの主要な応答：体液性（抗体）応答及び細胞性（Ｔ細胞）応答から成る。細菌病原体による感染症に続いて、感染部位における樹状細胞は、微生物抗原と遭遇し、シグナル伝達分子、例えば、表面受容体及び特有の細菌と関連がある保存された分子パターンに応答したサイトカインを生成する。これらのシグナルは、病原体の性質によって成形され、理想的には宿主を疾患から防御する適当な抗体及びＴ細胞応答に繋がる。一部の細菌性疾患は最初に抗体機能を介して制御される一方で、他のものは防御のためにＴ細胞応答又は抗体及びＴ細胞応答の双方を必要とする。ワクチンの生物学的な目的は、防御を提供する免疫応答を同定し、そしてヒトにおいて１又は複数のこれらの応答を再現するためのワクチンをデザインすることである。
【０１６９】
抗体は、感染症に対する防御の付与において多くの異なる機能、例えば、補体固定、オプソニン作用、中和、及び／又は凝集機能を有してよい。さらに、抗体の一部のサブクラスは、特異的な機能において他のものより良く；例えば、補体固定に関して、ヒトＩｇＧサブクラスについて次の順位が存在する：
ＩｇＧ３＞ＩｇＧｌ＞ＩｇＧ２＞ＩｇＧ４。
【０１７０】
抗体免疫学的機能は種々の方法で試験することができる。例えば、ウエスタンブロットは、分離タンパク質のサイズに基づく抗原特異的な結合を同定するために使用することができ、一方標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、血清内の抗体価についての定量的情報を生じるために使用される。抗体表面結合試験は、抗体が生体内（in vivo）で機能する潜在能力を有するかの重要な指標である、血清中の抗体がインタクト細菌の表面上の抗原を認識できるか、を決定するために使用される。したがって、当業者によって、抗体結合アッセイ、例えば、ウエスタンブロット、（例えば、ヒト抗血清を使用した）ＥＬＩＳＡ、及び／又は表面結合は、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）による感染症に対する免疫学的活性を供する特異的結合抗原と確実に関連があると認識されている（Vytvytska et al. 2002, Proteomics 2:580-590; Kuklin et al. 2006, Infect. Immun. 74（4）:2215-2223; Dryla et al. 2005, Clin. Diag. Lab. Immunol. 12（3）:387-398）。また、さらに当業者によって、アッセイ、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、又は表面結合アッセイにおける抗体結合の欠如が、アッセイされた抗原がブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）による感染症に対する免疫学的活性を提供できない、ということを意味するのではないとも認識されている（Kim HK et al. IsdA and IsdB antibody protect mice against Staphylococcus aureus abcess formation and lethal challenge. Vaccine （2010）, doi:10.1016/j.vaccine. 2010.02.097）。
【０１７１】
図２０２は、回復期のマウス血清が、少なくとも組換えで生成されたＭｎｔＣ（配列番号419）、組換えで生成されたＳＹＮ２（配列番号386）、組換えで生成されたＳｉｒＡ（配列番号375）、及び組換えで生成されたＯｐｐ１Ａ（配列番号364）に結合することを示し、結合された組換えで生成された各ポリペプチドがブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）による感染症に対する免疫学的活性を誘発することができることを示している。
【０１７２】
図２０４は、回復期のヒト血清が、組換えで生成されたＰｆｌＢ（配列番号353）、組換えで生成されたＯｐｐ１Ａ（配列番号364）、組換えで生成されたＳｉｒＡ（配列番号375）、組換えで生成されたＳＹＮ２（配列番号386）、組換えで生成されたＦｈｕＤ（配列番号397）、組換えで生成されたＳＹＮ１（配列番号408）、及び組換えで生成されたＭｎｔＣ（配列番号419）に結合することを示し、組換えで生成された各ポリペプチドがブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）による感染症に対して免疫学的活性を誘発することができることを示している。
【０１７３】
図２０５は、組換えで生成されたＦｈｕＤ（配列番号397）、組換えで生成されたＯｐｐ１Ａ（配列番号364）、及び組換えで生成されたＰｆｌＢ（配列番号353）に対して産生された抗体がブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）細胞の表面に結合することを示し、細胞結合抗体の各ポリペプチド標的は、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）による感染症に対する免疫学的活性を誘発することができることを示している。
【０１７４】
細菌の死滅レベルを決定するために抗体及び補体結合細菌がヒト又はマウス貪食細胞と結合される、オプソニン化貪食作用アッセイ（OPA）等の技術は、抗体機能を試験するために有用である。陽性ＯＰＡ結果は、マウスモデルにおいてワクチン誘発された防御と関連がある（Stranger-Jones et al. 2006, Proc. Natl. Acad. ScL 103（45）:16942-16947）。同様の酸化バーストアッセイは、抗体及び補体結合細菌との相互作用に続くフレッシュなヒト又はマウス好中球による活性酸素種（ROS）のレベルを評価するために使用できる。
【０１７５】
場合によっては、候補ポリペプチドが細胞媒介の免疫学的活性を有し、従って、抗体産生の誘発の非存在下で、候補ポリペプチドが免疫学的活性を提示するかもしれないことを決定することができる（Spellberg et al. 2008, Infect. Immun. 76（10）:4575-4580）。細胞傷害性又はＣＤ８Ｔ細胞が、様々なエフェクターメカニズムを介して最初に感染した細胞を直接的に死滅し、一方ヘルパーＣＤ４Ｔ細胞はサイトカインに関して重要なシグナル伝達を提供するよう機能する。これらのＴ細胞クラスは、産生するサイトカインに基づいてさらに細分化することができ、異なるサブクラスは異種細菌病原体に対して効果的である。Ｔ細胞は、フローサイトメトリーでこれらの表現型を評価することによって度々試験され、この中では抗体は、Ｔ細胞、例えば、活性化されたばかりのＣＤ４+Ｔ細胞、メモリーＣＤ８Ｔ細胞等の分類を可能にする特異的な表面マーカーのレベルを可視化するために使用される。さらに、サイトカイン及びＴ細胞の他の生成物はリンパ組織からＴ細胞を単離しこれらを同族抗原で再刺激することによって試験することができる。抗原の刺激後に、Ｔ細胞は、例えば、フローサイトメトリーで結合される細胞内サイトカイン染色、又は細胞上清の回収及び１５〜２５個のサイトカインを同時に測定するためのルミネックスビーズ技術の使用によって可視化されるサイトカインを産生する。
【０１７６】
図２０６は、組換えで生成されたＰｆｌＢ（配列番号353）、組換えで生成されたＯｐｐ１Ａ（配列番号364）、組換えで生成されたＳｉｒＡ（配列番号375）、組換えで生成されたＳＹＮ２（配列番号386）、組換えで生成されたＦｈｕＤ（配列番号397）、組換えで生成されたＳＹＮ１（配列番号408）、及び組換えで生成されたＭｎｔＣ（配列番号419）を含む組成物（rSERP7）が、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）による感染症に対して免疫学的活性を供することが証明されたＳＩＲＰ抽出物によって誘発されるサイトカインプロファイルと同様のサイトカインプロファイルを誘発することを示す。ｒＳＩＲＰ７組成物は、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−２、及びＧＭ−ＣＳＦの産生を誘発した。
【０１７７】
したがって、マウスモデルに加えて、当業者は、明細書中で記載される方法に相応する免疫学的活性は、任意の１又は複数の以下のもの：ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）に曝された動物由来の血清が、候補ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含有することを示しているウエスタンブロットデータ、候補ポリペプチドに特異的に結合する抗体が、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）に特異的に結合することを示している細胞表面結合アッセイ、オプソニン化貪食作用データ、及びサイトカイン誘導、と相関があると認識する。
【０１７８】
本発明の他の態様は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出するための方法を供する。これらの方法は、例えば、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を動物が有するかを検出すること、及び動物が明細書中で記載されるポリペプチドを発現している、又は明細書中で記載されるポリペプチドとエピトープを共有するポリペプチドを発現している微生物によって生じる疾病を有するかを診断することにおいて有用である。このような診断システムは、キット形態であってよい。当該方法は、混合物をもたらすために本発明のポリペプチドを含む製剤と抗体とを接触させることを含む。抗体は、生物学的試料、例えば、血液、乳、又は初乳中に存在してよい。当該方法は、ポリペプチド：抗体複合体を形成するために抗体が特異的にポリペプチドに結合することを可能にする条件下で混合物をインキュベートすることをさらに含む。本明細書で用いられる場合、用語「ポリペプチド：抗体複合体」は、抗体がポリペプチドに特異的に結合する場合に、結果として生じる複合体を意味する。本発明のポリペプチドを含む製剤は、ポリペプチド：抗体複合体の形成に適当な条件を供する試薬、例えば緩衝液もまた含む。ポリペプチド：抗体複合体は、続いて検出される。抗体の検出は、当技術分野で周知の、例えば、免疫蛍光又はペルオキシダーゼを含むことができる。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体の存在を検出するための方法は、抗体を検出するために使用されている様々なフォーマット、例えばラジオイムノアッセイ及び酵素結合免疫吸着アッセイで使用することができる。
【０１７９】
本発明はまた、特異的に本発明のポリペプチドに結合する抗体を検出するのためのキットを供する。検出される抗体は、グラム陽性微生物、より好適には、ミクロコッカス科（Micrococcaceae）のメンバー、好適には、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）、より好適には、黄色ブドウ球菌（S. aureus）；ストレプトコッカス属（Streptococcus spp.）、バチルス属（Bacillus spp.）、クロストリジウム属（Clostridium spp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium spp.）、腸球菌属（Enterococus spp.）、エリシペロスリクス属（Erysipelothrix spp.）、キトコッカス（Kytococcus spp.）、リステリア属（Listeria spp.）、ミクロコッカス菌属（Micrococcus spp.）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium spp.）、及びエリシペロスリクス属（Erysipelothrix spp.）によって生じる感染症に罹患していると思われる動物から得られてよい。
【０１８０】
キットは、少なくとも１つのアッセイに十分な量で適当なパッケージング材料中に、少なくとも１つ（例えば、１つ, 少なくとも２つ, 少なくとも３つ等）の本発明のポリペプチドを含む。任意には、他の試薬、例えば本発明の実行に必要な緩衝液及び溶液もまた含まれる。例えば、キットは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体、例えば、動物から得られる抗体に特異的に結合するようデザインされた検出可能な程度に標識された二次抗体の検出を可能にする試薬もまた含む。パッケージされたポリペプチドの使用説明書もまた、典型的に含まれる。本明細書で用いられる場合、用語「パッケージング材料」は、キットの内容物を収容するために使用される１又は複数の物理的構造を意味する。パッケージング材料は、通常無菌、混入物を含まない環境を供するために周知の方法によって構築される。パッケージング材料は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出するためにポリペプチドを使用することができることを示す標識を有してよい。さらに、パッケージング材料は、キット内の材料が抗体を検出するためにどのように使用されるかを示す説明書を含む。本明細書で用いられる場合、用語「パッケージ」は、固定された限度内でポリペプチド、及び他の試薬、例えば二次抗体を保持することができる、容器、例えばガラス、プラスティック、紙、ホイル等を意味する。したがって、例えば、パッケージは、マイクログラム量のポリペプチドが添加されたマイクロタイタープレートウェルとし得る。パッケージは、二次抗体もまた含んでよい。「使用のための説明書」は、典型的には試薬濃度又は少なくとも１つのアッセイ方法パラメータ、例えば混合される試薬及び試料の相対量、試薬／試料混合物の保持時間、温度、緩衝液条件等を記載する具体的な表現を含む。
【０１８１】
本発明は、以下の実施例によって説明される。明細書中に記載の本発明の範囲及び趣旨に従って、個々の実施例、材料、量、及び手順は、広義に解釈するべきである。
【実施例】
【０１８２】
実施例１
鉄制御タンパク質の製剤
実験室規模
鉄制限及び／又は他の程度の金属イオンキレート化の元で発現された新規タンパク質を含む、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の異種株に由来する組成物を、マウスにおける弱毒性攻撃に対する有効性に関して評価した。組成物の有効性を、次のパラメータ（1）マウスにおいて生病原性攻撃に対して相同種及び異種性防御を供する各組成物の有効性、（2）壊死性皮膚病変を低減する各組成物の有効性、及び（3）豊富及び欠乏した鉄条件中で成長させたブドウ球菌に由来する、防御を供する組成物の有効性、に関するデータを収集することによって評価した。
【０１８３】
この試験において評価した黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）株は、３種の動物種；トリ、ヒト及びウシに由来した。トリ分離株ＳＡＡＶｌは、高度の骨髄炎及び滑膜炎に罹患する七面鳥の一グループに由来するフィールド分離株であった。ウシ分離株（株1477及び株2176）は、臨床乳腺炎が高発生率である２つの異なる市販の乳牛グループから単離した。ヒト分離株は、ＡＴＣＣ（株19636）から得たもの、及び／又は臨床骨髄炎に罹患する患者に由来するものであった。
【０１８４】
適当な分離株を、３００μＭの２，２−ジピリジル（Sigma-Aldrich St. Louis, MO）を含有する２００ｍｌのトリプチックソイブロス（TSB, Difco Laboratories, Detroit, MI）中に播種することによって、各分離株のマスター種のストック（Master seed stock）を調製した。３７℃、２００ｒｐｍで６時間攪拌しながら、培養物を成長させ、１０，０００×ｇにおける遠心分離によって回収した。細菌ペレットを２０％グリセロール含有の１００ｍｌのＴＳＢブロス中に再懸濁し、無菌状態で２ｍｌの低温貯蔵バイアル（バイアル当り1ml）中に分注し、使用まで−９０℃で保存した。
【０１８５】
各マスター種のストックを展開し作用用種（working seed）とした。各マスター種分離株の１つのバイアルを、１０００μＭの２，２−ジピリジル（Sigma-Aldrich St. Louis, MO）含有の２００ｍｌのトリプチックソイブロス（TSB, Difco Laboratories, Detroit, MI）中に播種した。３７℃で６時間、２００ｒｐｍで攪拌しながら、培養物を成長させ、１０，０００×ｇでの遠心分離によって回収した。細菌ペレットを２０％グリセロールを含有する１００ｍｌのＴＳＢブロス中に懸濁し、２ｍｌの低温貯蔵バイアル無菌状態で分注し（バイアル当り1ml）、使用まで−９０℃で保存した。鉄制御膜タンパク質を含む、鉄制御膜タンパク質で濃縮された組成物の産生のために作用用種を使用した。
【０１８６】
全株を、高鉄欠乏の培地（すなわち, 非常に低レベルの遊離鉄を含有する培地）中で成長するように適応させた。これは、増加濃度の２，２−ジピリジル（300〜1600μＭ）を含有するＴＳＢ中で、細菌を継代培養することによって達成した。
【０１８７】
次の通り、細菌からタンパク質を調製した。継代培養による凍結作用用種ストックから、２５ｍｌの（1000μＭの2,2'-ジピリジルを含有する）鉄欠乏培地及び鉄豊富培地中に細菌を成長させ、続いて４００ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。１２時間のインキュベーション後、３７℃でプレインキュベートした５００ｍｌの鉄欠乏又は鉄豊富培地中に５ｍｌの各培養物を移送した。１００ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で８時間培養物をインキュベートし、続いて細胞を２０分間の１０，０００×ｇでの遠心分離によってペレット化した。細菌ペレットを１００ｍｌの無菌生理生理食塩水中で再懸濁し、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。続いてペレットを４５ｍｌのトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２（TBS; 25mMトリス, 150 mM NaCl）中で再懸濁し、生じた細菌懸濁液を９ｍｌの一定分量ずつ５個のチューブ中にそれぞれ分注した。最終量が５ユニット／ｍｌを示すように、リゾスタフィン（Sigma, St. Louis, MO）を５０ユニット含有のＴＢＳの１ミリリットルを各チューブに添加した。２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で３０分間のインキュベーションの後に、０．１ｍｇのリゾチーム（Sigma）含有の１ｍｌのＴＢＳを各チューブに添加した。続いて、２００ｒｐｍで振盪しながら、細菌懸濁液をさらに４５分間インキュベートした。次に、大きな細胞のデブリをペレット化するために、懸濁液を４℃で１２分間３０５０×ｇで遠心分離した。ペレットをかき乱すことなく吸引によって上清を回収した。続いて、２．５時間、３９，０００×ｇで上清を遠心分離した。生理食塩水を含まない、２００μｌのトリス緩衝液、ｐＨ７．２中に、タンパク質を含有する生じたペレットを再懸濁した。各分離株のタンパク質溶液を総量１ｍｌに混合し、−９０℃で保存した。
【０１８８】
黄色ブドウ球菌（S. aureus）に由来するタンパク質濃縮抽出物を、４％濃縮用ゲル及び１０％分解ゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でサイズ分画した。電気泳動のための試料を１０μｌの試料を３０μｌのＳＤＳ還元試料緩衝液（62.5mMトリス-HCL pH 6.8, 20% グリセロール, 2% SDS, 5% β-メルカプトエタノール）と混合することによって調製し、４分間煮沸した。Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＩ ｘｉ ｃｅｌｌ ｐｏｗｅｒ ｓｕｐｐｌｙ（BioRad Laboratories, Richmond, CA, model 1000/500）を使用して、４℃で１８ｍＡの一定電流で５時間試料を電気泳動した。
【０１８９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で視覚的に確認される個々のタンパク質の分子量を、標準試料としての広範囲の分子量マーカー（BioRad）を使用して、ＧＳ−８００ ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（BioRad）を使用して推定した。
【０１９０】
１６００μＭのジピリジルの存在下で成長させた場合、各分離株由来のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンは、３００μＭのジピリジルの存在下で成長させた場合の同一株と比較して、非常に異なるタンパク質発現パターンを示した。例えば、３００μＭのジピリジル中で成長させた場合、分離株ＳＡＡＶｌは金属制御タンパク質９０ｋＤａ、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、６６ＫＤａ、３６ｋＤａ、３２ｋＤａ、及び２２ｋＤａを生じ、一方１６００μＭのジピリジル中で成長させた場合、金属制御タンパク質８７．７３ｋＤａ、５４．５３ｋＤａ、３８．４２ｋＤａ、３７．３７ｋＤａ、３５．７０ｋＤａ、３４．９１ｋＤａ、及び３３．０ｋＤａを生じた。同様に、３００μＭのジピリジル中で成長させた場合、分離株１９６３６は、タンパク質４２ｋＤａ及び３６ｋＤａを生じ、一方１６００μＭジピリジル中で成長させた場合、金属制御タンパク質８７．７３ｋＤａ、５４．５３ｋＤａ、３８．４２ｋＤａ、３７．３７ｋＤａ、３５．７０ｋＤａ、３４．９１ｋＤａ、及び３３．０ｋＤａを生じた。鉄豊富培地における成長を含む全ての条件において、おそらく金属制御されていない次のタンパク質の発現が生じた：１５０ｋＤａ、１３２ｋＤａ、１２０ｋＤａ、７５ｋＤａ、５８ｋＤａ、５０ｋＤａ、４４ｋＤａ、４３ｋＤａ、４１ｋＤａ、及び４０ｋＤａ。
【０１９１】
さらに、１６００μＭのジピリジル中における黄色ブドウ球菌（S. aureus）異種株の成長は、同様のタンパク質発現パターンを生じた。トリ分離株（SAAVl）由来の鉄制御膜タンパク質の濃縮組成物は、８７．７３ｋＤａ、５４．５３ｋＤａ、３８．４２ｋＤａ、３７．３７ｋＤａ、３５．７０ｋＤａ、３４．９１ｋＤａ、及び３３．０ｋＤａの分子量のタンパク質を含んだ。ＡＴＣＣ単離株１９６３６由来のタンパク質の分子量は、トリ分離株由来のものと本質的に同一であった。いずれのウシ分離株も、１６００μＭの２，２−ジピリジルで成長させた場合、タンパク質の大部分（87.73kDa, 54.53 kDa, 37.7 kDa, 35.70 kDa, 34.91 kDa, 及び33.0 kDa）に関して、トリ及びＡＴＣＣ分離株と同様のバンド形成プロファイルを発現した。しかしながら、ウシ分離株のいずれも、トリ及びＡＴＣＣ分離株で見られる３８．４２ｋＤａタンパク質を生成せず、ウシ分離株はトリ及びＡＴＣＣ株で観察されない３つのタンパク質（80.46 kDa, 65.08 kDa, 及び31.83kDa）を発現した（図1及び表7を参照されたい）。全ての条件において、金属制御されていない次のタンパク質の発現が生じた：１５０ｋＤａ、１３２ｋＤａ、１２０ｋＤａ、７５ｋＤａ、５８ｋＤａ、５０ｋＤａ、４４ｋＤａ、４３ｋＤａ、４１ｋＤａ、及び４０ｋＤａ。
【０１９２】
表７．黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）分離株から得られる、金属制御ポリペプチドの分子量。
【０１９３】
【表７】
2015164949.tif 000031
【０１９４】
興味深いことに、細菌をリゾスタフィン／リゾチームで処理した後、精製した上清及び細菌ペレット間で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験したタンパク質プロファイルにおいて差異はなかった。抽出した細菌ペレットと上清いずれもまさにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観察された同一のタンパク質プロファイルを有した。この同一の観察は、ＡＶＥＳＴＩＮホモジナイザーを３０，０００ｐｓｉで使用して細菌細胞をばらばらにした場合にも確認された。低速度遠心分離後に得られた細菌ペレットは、４℃、３０，０００×ｇで２時間の高速遠心分離後に、精製した上清と比較したタンパク質プロファイルで同一であった。
【０１９５】
実施例２
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する免疫化組成物の製剤
実施例１に記載されるように鉄欠乏条件において成長させ調製したヒト分離株ＡＴＣＣ１９６３６及びウシ分離株１４７７由来のタンパク質を、２つのワクチン組成物を製剤するために使用した。ＡＴＣＣ分離株由来のタンパク質は、８７．７３ｋＤａ、５４．５３ｋＤａ、３８．４２ｋＤａ、３７．３７ｋＤａ、３５．７０ｋＤａ、３４．９１ｋＤａ、及び３３．０ｋＤａの分子量を有し、一方ウシ分離株は、８７．７３ｋＤａ、８０．４６ｋＤａ、６５．０８ｋＤａ、５４．５３ｋＤａ、３７．３７ｋＤａ、３５．７０ｋＤａ、３４．９１ｋＤａ、３３．０ｋＤａ、及び３１．８３の分子量を有するタンパク質を発現した。各組成物はまた、金属制御されていない次のタンパク質を含有した：１５０ｋＤａ、１３２ｋＤａ、１２０ｋＤａ、７５ｋＤａ、５８ｋＤａ、５０ｋＤａ、４４ｋＤａ、４３ｋＤａ、４１ｋＤａ、及び４０ｋＤａ。アジュバント濃度２２．５％体積／体積の０．１ｍｌの注射可能な量中に総タンパク質５０μｇの最終用量を示すように、ＩＫＡ Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ Ｔ−５０ ホモジナイジング容器（IKA, Cincinnati, OH）を使用して、各水性タンパク質懸濁液（総タンパク質500μｇ/ml）を商業的アジュバント（EMULSIGEN, MVP Laboratories, Ralston, Nebraska）中に乳化することによって、ストックワクチンを２つの株から調製した。実施例１に記載されるように、鉄豊富条件（300μＭ塩化第二鉄を追加したTSB）下で成長させたウシ分離株１４７７から、対照ワクチン接種として、タンパク質組成物を調製した。上記プロトコール中で水性タンパク質懸濁液の代わりに生理食塩水を使用することによってプラセボワクチンを調製した。
【０１９６】
実施例３
マウスへのワクチン接種
Ｈａｒｌａｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Indianapolis, IN）から入手した、体重１６〜２２グラムの７０匹（N=70）のメスＣＦ−１マウスを、等しく７個のグループに分配した（10匹のマウス/グループ）。マウスをポリカーボネートマウスケージ（Ancore Corporation, Bellmore, NY）中で飼育した。各処理グループに関して１つのケージを使用し、餌及び水を全マウスに自由に供給した。全マウスに、次のように１４日の間隔をあけて２回、０．１ｍｌの適当な組成物を腹腔内にワクチン接種した：
グループ１：プラセボワクチン接種
グループ２：鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ１９６３６タンパク質のワクチン接種
グループ３：プラセボワクチン接種
グループ４：鉄制限下で発現されたウシ１４７７タンパク質のワクチン接種
グループ５：鉄制限下で発現されたウシ１４７７タンパク質のワクチン接種
グループ６：鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ１９６３６タンパク質のワクチン接種
グループ７：ウシ１４７７ＦｅＣｌ3のワクチン接種、ここで「ウシ１４７７ＦｅＣｌ3」は３００μＭの塩化第二鉄を追加したＴＳＢ中で成長させたウシ１４７７から得られたタンパク質を意味する。
【０１９７】
実施例４
攻撃生物の調製
前記黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）株ＡＴＣＣ１９６３６及び株１４７７を攻撃生物として使用した。簡潔に言うと、（前記の）凍結ストック由来の分離株を血液寒天プレート上に画線し、３７℃で１８時間インキュベートした。１６００μＭの２，２−ジピリジル含有の５０ｍｌのトリプチックソイブロス（Difco）中で、各分離株の単独のコロニーを継代した。２００ｒｐｍで回転させながら培養物を３７℃で６時間インキュベートし、続いて細菌をペレット化するために、１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。細菌ペレットを、４℃のＴＢＳ中で遠心分離によって２度洗浄した。最終ペレットを、約２５ｍｌのＴＢＳの量で５６２ｎｍで４２％透過率（T）の光学濃度までＴＢＳ中で再懸濁し、攻撃のために使用した。攻撃の直前に、１ｍｌのこれらの細菌懸濁液を段階希釈し、そして寒天上に蒔きマウス用量当たりのコロニー形成ユニット（CFU）の数を数えた。
【０１９８】
実施例５
攻撃
２回目のワクチン接種の１４日後に、全グループ（1〜7）中のマウスに背面頸部の皮下に０．１ｍｌの適当な生物を攻撃した。次の通り、マウスの７つのグループを攻撃した：
グループ１（プラセボワクチン接種）：ＡＴＣＣ１９６３６での攻撃
グループ２（鉄制限下で発現されたATCC19636タンパク質のワクチン接種）：ＡＴＣＣ１９６３６での攻撃
グループ３（プラセボワクチン接種）：ウシ１４７７での攻撃
グループ４（鉄制限下で発現されたウシ１４７７タンパク質のワクチン接種）：ウシ１４７７での攻撃
グループ５（鉄制限下で発現されたウシ１４７７タンパク質のワクチン接種）：ＡＴＣＣ１９６３６での攻撃
グループ６（鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ１９６３６タンパク質のワクチン接種）：ウシ１４７７での攻撃
グループ７（ウシ１４７７ＦｅＣｌ3のワクチン接種）：ウシ１４７７での攻撃
【０１９９】
実施例４に記載される数え上げプロトコールによって決定されるように、攻撃のために使用した黄色ブドウ球菌（S. aureus）１９６３６の濃度は、マウス用量当り１．３５×１０8ＣＦＵであり、攻撃に使用した黄色ブドウ球菌（S. aureus）１４７７の濃度は、マウス用量当り１．６５×１０8コロニーＣＦＵであった。攻撃後７日間、罹患率、死亡率及び肉眼所見を毎日記録した。
【０２００】
ＡＴＣＣ１９６３６分離株で攻撃したマウスを比較した場合、７０％のプラセボワクチン接種したグループ１のマウスは攻撃７日以内に死亡した（表8及び図2）。これは、株１９６３６は、投与した用量レベルでマウスにおいて高い死亡率を生じることを証明した。グループ１のマウスと対照的に、攻撃後７日以内にグループ２においてわずか１０％のマウスが死亡した。これらの結果は、株１９６３６で攻撃したマウスは、１９６３６組成物のワクチン接種によって有意に防御されたことを説明する（p=0.020, フィッシャー直接検定）。さらに、死亡までの時間のデータのカプラン・マイヤー分析は、ワクチンによって相同種（homologous）攻撃に対して有意な防御が可能であることを示した（p=0.0042, ログランク検定）（図3）。さらに、グループ５においてわずか２０％のマウスが攻撃後７日以内に死亡し、これはウシ１４７７組成物がＡＴＣＣ１９６３６株での攻撃に対して有意な防御を提供することを示している（p=0.015, 死亡率に関するログランク検定）。データをカプラン・マイヤー生存曲線及びログランク検定分析した場合（図4）、死亡率に対する防御が有意であることが決定され（p=0.015, 死亡率に関するログランク検定）、株１４７７に由来するワクチン組成物が株１９６３６での攻撃に対して異種防御を供することを示している。
【０２０１】
表８．黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）での攻撃後のワクチン接種及びワクチン接種していないマウスの死亡率（ヒトＡＴＣＣ単離株１９６３６及びウシ分離株１４７７）。
【０２０２】
【表８】
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【０２０３】
*グループｌ（プラセボワクチン接種／ＡＴＣＣ１９６３６での攻撃）
*グループ２（鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ１９６３６タンパク質のワクチン接種／ＡＴＣＣ１９６３６での攻撃）
*グループ３（プラセボワクチン接種／ウシ１４７７での攻撃）
*グループ４（鉄制限下で発現されたウシ１４７７タンパク質のワクチン接種／ウシ１４７７での攻撃）
*グループ５（鉄制限下で発現されたウシ１４７７タンパク質のワクチン接種／ＡＴＣＣ１９６３６での攻撃）
*グループ６（鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ１９６３６タンパク質ワクチン接種／ウシ１４７７での攻撃）
*グループ７（ウシ１４７７ＦｅＣｌ3ワクチン接種／ウシ１４７７での攻撃）
【０２０４】
ウシ１４７７分離株で攻撃したマウスを比較する場合、プラセボワクチン接種したグループ（グループ3）において、わずか２０％のマウスが攻撃後７日以内に死亡した。しかしながら、ウシ１４７７分離株での攻撃は、グループ３の生存しているマウスの６匹（75%）において壊死性皮膚病変の進行を誘発した。これらの病変を測定し、生存しているマウス上の病変の平均サイズは１８．５ｍｍであった（表9）。対照的に、グループ４の２０％のマウスが攻撃後７日以内に死亡したが、生存しているマウスのわずか３匹（38%）において病変が進行した（平均直径, 2.7mm）。これらの結果は、ウシ株１４７７で攻撃したマウスにおいて、ウシ１４７７組成物は病変の進行に対して有意な相同性防御を提供したことを示す（p=0.009, スチューデントt検定）。さらに、グループ６においてマウスは死亡せずわずか３匹のマウス（30%）が皮膚病変を進行した（平均直径, 3.7mm）ので、ＡＴＣＣ１９６３６組成物のワクチン接種は、株１４７７での攻撃から防御した。まとめると、グループ５及び６のマウスにおける低減された死亡率及び／又は病変進行は、株１９６３６及び１４７７に由来する組成物の有意な交差防御的性質を証明した（p=0.012, 病変サイズに基づいたスチューデントt検定）。非鉄制御タンパク質と比較した組成物の有効性の証明において、グループ７において２０％のマウスが死亡し、生存したマウスの中の４匹において皮膚病変が進行した（平均直径, 15.8mm）。グループ７のマウスは、プラセボワクチン接種のグループ３と比較してほとんど病変を進行しなかったので、１４７７分離株のタンパク質のワクチン接種によるある程度の防御を証明した。しかしながら、グループ７のマウス上の皮膚病変はより頻繁に観察され、グループ４のマウス上の病変よりも直径は大きく、鉄豊富条件下で成長させた細胞から単離されたタンパク質と比べて、鉄制限下で成長させた細菌から単離されたタンパク質は同一の攻撃に対して優れた防御を供したことを示している。
【０２０５】
マウス攻撃試験において観察されるタンパク質の交差防御的性質は、実施例１に記載される黄色ブドウ球菌（S. aureus）株由来のタンパク質の同様の分子量によってサポートされる（図1）。ウシ由来の分離株に由来するタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルにおいて、特に３８．４ｋＤａのタンパク質が欠損し、３つのさらなるタンパク質が存在するという顕著な差異が存在するにも係わらず、株１４７７及びＡＴＣＣ１９６３６どちらにも由来するタンパク質は異種の防御を誘発した。これらの結果は、株１９６３６と１４７７との間の同様のタンパク質は、おそらくグループ５及び６において観察された交差防御に関与していることを示す。一方、鉄欠乏及び鉄豊富条件下で成長させた株１４７７由来のタンパク質プロファイルは、観察可能なほどに異なる。鉄欠乏条件下で単離されるそれらのタンパク質は、鉄豊富条件下で単離されるタンパク質と比較してより防御性があり、グループ７のマウスと比較したグループ４のマウスの病変進行の低下によって証明される。
【０２０６】
表９．黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＡＴＣＣ単離株19636及び／又はウシ分離株1477）での攻撃７日後のマウスにおける壊死性病変の誘発
【０２０７】
【表９】
2015164949.tif 000033
【０２０８】
*グループ１（プラセボワクチン接種／ＡＴＣＣ１９６３６での攻撃）
*グループ２（鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ１９６３６タンパク質のワクチン接種／ＡＴＣＣ１９６３６での攻撃）
*グループ３（プラセボワクチン接種／ウシ１４７７での攻撃）
*グループ４（鉄制限下で発現されたウシ１４７７タンパク質のワクチン接種／ウシ１４７７での攻撃）
*グループ５（鉄制限下で発現されたウシ１４７７タンパク質のワクチン接種／ＡＴＣＣ１９６３６での攻撃）
*グループ６（鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ１９６３６タンパク質のワクチン接種／ウシ１４７７での攻撃）
*グループ７（ウシ１４７７ＦｅＣｌ3ワクチン接種／ウシ１４７７での攻撃）
【０２０９】
実施例６
哺乳類において、組織損傷又は細菌感染症への応答が急性炎症反応をもたらすことが示されている。この応答は、炎症；膨潤、熱、疼痛及び発赤として認識される臨床徴候を生じることになる毛細血管透過性及び食作用性浸潤を増加し；放置されたままであると、死に至るかもしれない。体液性因子の活性化及びサイトカインの放出は、まとめると、生理及び生化学イベントのカスケードをもたらす急性期タンパク質応答として周知の全身性イベントを媒介する。この応答の持続時間は、全身性感染症の損傷の重症度及び規模に直接的に関係する。細菌敗血症、主な外科手術、熱傷及び他の身体上の外傷中において、血清中の多数の金属、例えば、鉄、銅、及び亜鉛のイオン濃度変化が生じることが十分に実証されている。例えば、感染症の急性期中、鉄及び亜鉛の血漿レベルの低下及び銅の血漿レベルの増加が生じる。血清中のこららのトレース金属イオンの変化は、任意の細菌感染症の重症度又は進行に直接的に影響を及ぼすかもしれない。
【０２１０】
本試験において、全身性浸潤中に発現されるかもしれない新規タンパク質の発現を再現するために、金属イオン制限の様々な条件下で、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のタンパク質の発現を試験した。本試験において評価した黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）株は、３つの異種動物；トリ（株SAAVl）、ヒト（株19636）、及びウシ（株1477及び2176）の臨床試料に由来した。簡潔に言うと、各分離株の培養物は、２００ｍｌのトリプチックソイブロス（TSB）中でマスター種のストックから調製した。３７℃、２００ｒｐｍで６時間攪拌しながら各培養物を成長させた。１０ｍｌの各培養物を、４つの金属イオンキレート剤；２，２−ジピリジル（Dp）、２−ピリジルメチル−エチレンジアミン（TPEN）、カテキン、及びナリンゲニン（いずれもSigma, St. Louis, MOから得られる）の１つを含有する５００ｍｌの欠乏ＴＳＢ中に移送した。さらに、３００μＭ濃度に調製した塩化第二鉄、塩化亜鉛及び／又は塩化銅を含有するカチオン豊富培地中で各培養物を成長させた。金属イオンキレート剤を次の濃度；２，２−ジピリジルを８００μＭ、カテキン及びナリンゲニンを３００μＭ、２−ピリジルメチル−エチレンジアミンを１００μＭの濃度で使用した。培養物を各キレート剤で８時間成長、そして培養物の２度目の継代培養をさらに１２時間した。各培養物を１２時間の間隔をあけて３回連続的継代培養した。３度目の継代,培養の終了時に、１０，０００×ｇでの２０分間の遠心分離によって各培養物を回収した。１０，０００×ｇでの遠心分離によって各培養物を２度洗浄し、４℃の２０ｍｌのトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２中で再懸濁した。
【０２１１】
各細菌ペレットを４５ｍｌのトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２（25mMトリス及び150mM NaCl）中で再懸濁し、生じた細菌懸濁液をそれぞれ５個のチューブ、計２０個のチューブ中に９ｍｌの一定分量分注した。５０ユニットのリゾスタフィン（Sigma, St. Louis, MO）を含有するＴＢＳの１ミリリットルを、最終濃度５ユニット／ｍｌを示すように各チューブに添加した。２００ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で３０分間のインキュベーション後に、０．１ｍｇのリゾチーム（Sigma）を含有するＴＢＳの１ｍｌを各チューブに添加した。続いて、２００ｒｐｍで振盪しながら細菌懸濁液をさらに４５分間インキュベートした。次に、懸濁液を４℃、３０５０×ｇで１２分間遠心分離し、大きな細胞デブリをペレット化した。ペレットをかき乱すことなく吸引によって上清を回収した。続いて、上清を３９，０００×ｇで２．５時間遠心分離した。金属制御膜タンパク質に関して濃縮された生じたペレットを、２００μｌトリス緩衝液、ｐＨ７．２中で再懸濁した。各分離株に関するタンパク質溶液を混合して総量１ｍｌとし−９０℃で保存した。
【０２１２】
鉄、亜鉛及び銅欠乏条件下で成長させたＳＡＡＶ１、１９６３６、１４７７及び２１７６黄色ブドウ球菌（S. aureus）単離株から得られるタンパク質は、金属制御ポリペプチドを含んだ。
【０２１３】
各分離株に由来する細胞抽出物を、４％濃縮用ゲル及び１０％分解ゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でサイズ分画した。１０μｌの試料を、４分間煮沸した３０μｌのＳＤＳ還元試料緩衝液（62.5mMトリス-HCL ph6.8, 20%グリセロール, 2%SDS, 5%ベータ-メルカプトエタノール）と混合することによって、電気泳動のための試料を調製した。タンパク質ＩＩ ｘｉ ｃｅｌｌ ｐｏｗｅｒ ｓｕｐｐｌｙ（BioRad Laboratories, Richmond, CA, model 1000/500）を使用して、４℃、５時間、１８ｍＡの一定電流で試料を電気泳動した。
【０２１４】
２，２’−ジピリジルの存在中の鉄制限下で成長させた同一の分離株と比較した場合に異なる全ての分離株において、亜鉛及び／又は銅キレート化の下で成長させたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンは、特有のバンド形成パターンを示した。例えば、１９６３６分離株を鉄制限下又はキレート剤２，２’−ジピリジルの存在下で成長させた場合、８７．７３ｋＤａ、５４．５３ｋＤａ、３８．４２ｋＤａ、３７．３７ｋＤａ、３５．７０ｋＤａ、３４．９１ｋＤａ及び３３．０ｋＤａの領域において特有の鉄制御タンパク質が発現された。これらのタンパク質は、分離株を塩化第二鉄の存在下で成長させた場合に下方制御された。しかしながら、亜鉛及び／又は銅キレート剤の存在下で同一の分離株を成長させた場合、鉄制限下で発現されたタンパク質と比べて新規のタンパク質；約１１５ｋＤａ、８８ｋＤａ、８０ｋＤａ、７１ｋＤａ、６９ｋＤａ、３５ｋＤａ、３０ｋＤａ、２９ｋＤａ及び２７ｋＤの分子量を有する新たなタンパク質のサブセットが発現された。さらに、培養物を亜鉛制限下以外の鉄制限又は銅制限の条件下で８７．７３ｋＤａのタンパク質が発現された。鉄制限下で発現されたタンパク質は、亜鉛制限及び／又は銅制限いずれかの下で成長させた場合、下方制御されるようだが、分離株を塩化第二鉄の存在下で成長させた場合に見られるように、完全に遮断されることはなかった。
【０２１５】
同一の分離株を鉄制限下で成長させた場合に発現されず、生物を銅制限及び／又は亜鉛制限下で成長させた場合に発現される、新規のタンパク質が存在するように思われる。様々な生化学反応を触媒する酵素を形成するために遷移金属は生物によって使用されるので、全身性感染症中に金属イオンは微生物の生存において重要な機能を果たすかもしれない。敗血症中にこれらの遷移金属の利用能において一過性の低下が生じ、生物の成長のために金属を利用できないのは、これが原因かもしれない。これらの新規のタンパク質はまた、全身性浸潤中に経験される金属イオン制限の下で細菌によって発現されるかもしれないので、新規のタンパク質は鉄制限下で成長させた現存の組成物の防御的有効性を極めて増強するかもしれない。
【０２１６】
実施例７
本発明の組成物は、大規模な商業的条件下でも生成され得る。
発酵
実施例１に記載されるような作用用種の低温貯蔵バイアル（2ml, 109CFU/rnl）を使用して、ブドウ糖（Difco）を含まず、０．１２５ｇ／１の２，２−ジピリジル（Sigma）、２．７グラムのＢｉＴｅｋ酵母抽出物（Difco）及びグリセロール（3% 体積/体積）を含有する、３７℃まで予熱した５００ｍｌのトリプチックソイブロス（TSB）中に播種した。２００ｒｐｍで攪拌しながら培養物を３７℃で１２時間インキュベートし、これを使用して２リットルの上記の培地に播種し、３７℃でさらに４時間成長させた。この培養物を使用し、１３リットルの上記の培地を充填した２０リットルのＶＥＲＴＩＳ卓上発酵槽（Virtis, Gardiner, NY）に播種した。５０％ＮａＯＨ及び１０％ＨＣＬでの自動滴定によって、ｐＨを６．９〜７．１で一定に保持した。攪拌速度を４００回転／分に調整し、培養物を３７℃で１１リットルエアー／分で通気した。１１ｍｌの消泡剤（Mazu DF 204 Chem/Serv, Minneapolis, MN）の添加によって、自動的に起泡を制御した。これらの条件下で４時間培養物を連続して成長させ、無菌状態で１５０リットルの発酵槽（W. B. Moore, Easton, PA）中に注ぎ込んだ。発酵槽を、ブドウ糖非含有の１２０リットルのトリプチックソイブロス（3,600.0 グラム）、ＢｉＴｅｋ酵母抽出物（600 グラム）、グリセロール（3,600ml）、２，２−ジピリジル（3.0グラム）及びＭａｚｕ ＤＦ２０４消泡剤（60ml）で充填した。発酵のパラメータは、次の通りであった：６０リットルのエアー／分及び平方インチ当り１０ポンド（psi）の背圧で分散させ撹拌を２２０回転／分まで増加することによって、溶存酸素（DO）を３０％＋／−１０％に維持した。５０％ＮａＯＨ及び１０％ＨＣＬでの自動滴定によって６．９〜７．１にｐＨを一定に維持し、温度を３７℃に維持した。発酵の４．５時間後に（OD540 8-9）、ブドウ糖非含有の１２００リットルのトリプチックソイブロス（36,000グラム）、ＢｉＴｅｋ酵母抽出物（6,000グラム）、グリセロール（36,000ml）、２，２−ジピリジル（30.0グラム）及びＭａｚｕ ＤＦ ２０４消泡剤（600ml）を充填した１，５００リットルのＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ発酵槽ＩＦ−１５０００に培養物を移送した。発酵のパラメータは、次の通りであった：３００〜１１００リットルのエアー／分及び平方インチ当り５ポンド（psi）の背圧で分散させ撹拌を３００回転／分まで増加することによって酸素補給し、６０％＋／−１０％に溶存酸素（DO）を維持した。発酵の進行に伴い、溶存酸素の制御において補助するために０〜９０リットル／分の酸素補給を行った。５０％ＮａＯＨ及び１０％ＨＣＬで自動滴定することによってｐＨを６．９〜７．４に一定に保持し、温度を３７℃に維持した。
【０２１７】
大発酵槽への播種の約５時間後に、ブドウ糖非含有の１８，０００グラムＴＳＢ、３，０００グラム酵母抽出物３０．０グラム、２，２−ジピリジル及び１８，０００ｍｌのグリセロールを含有する７０リットルの培地を供給することによって、培養物にさらなる栄養分を追加した。撹拌を増加しながら、供給速度を約２８リットル／時に調整した。供給の終了後、発酵をさらに４時間継続させ、発酵槽の温度を１８℃まで低下させることによって発酵を終了した（1:100希釈でOD54035-40）。
【０２１８】
回収
Ｗａｕｋｅｓｈａ Ｍｏｄｅｌ Ｕ−６０供給ポンプ（Waukesha Cherry-Burrell, Delevan, WI）に接続された、カタログ番号ＡＳ３００Ｃ５（Pall Filtron）の、３つの３０ｆｔ2アルファ３００−Ｋ オープンチャネルフィルターを備えた、Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ 接線流 Ｍａｘｉｓｅｔ−２５（Pall Filtron Corporation, Northboro, MA）を使用して細菌発酵物を濃縮し洗浄した。１２５０リットルの元々の培養物体積を、３０ｐｓｉのフィルター入口圧及び５〜６ｐｓｉの残余圧力（retentate pressure）を使用して（2.5リットル／分）５０リットルまで減少した。いずれの混入している外来性のタンパク質も、例えば分泌毒素及びプロテアーゼを含むことになる細胞外タンパク質も除去するために、トリス緩衝生理食塩水ｐＨ８．５を使用して細菌残余物（retentate）を調整して１５０リットルまで戻し、続いて５０リットルに再濃縮した。トリス緩衝生理食塩水の上昇したｐＨは、全細胞懸濁液の保存中に生じ得る多くのタンパク質分解を防止するのに役立つ。プロテアーゼ阻害剤は、上昇されたｐＨに代えて、又は加えて使用してよい。２００リットルタンク中の底部に装着した磁気駆動のミキサーを使用して、残余物を十分に混合した。残余物を無菌の４リットルのＮａｌｇｅｎｅ容器Ｎｏ．２１２２中に無菌で分注し（3.5リットル）、保存のために製造中の限界点（breaking point）として−２０℃の冷凍室の中に入れる、又はさらに処理してよい。発酵させた培養物及び最終回収物の３０ｍｌの試料を遠心分離することによって、ペレット質量を算出した。簡潔に言うと、予め重さを測定した５０ｍｌのＮａｌｇｅｎｅ ｃｏｎｉｃａｌチューブを、ＪＡ−２１ローター（Beckman Instruments, Palo Alto CA）を使用してＢｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１遠心分離機中で３９，０００×ｇで９０分間遠心分離した。運転終了後、上清を捨て、再度チューブの重さを測定した。ペレット質量を各ステージに関して計測した。発酵工程によって、ウェットペレットの質量約６０キログラムが得られた。
【０２１９】
破砕
トリス緩衝生理食塩水ｐＨ８．５中の８０キログラムの細菌細胞スラリーを、９００リットルのＴＢＳｐＨ８．５を含有する、上方にミキサー（Eastern, Model TME-1/2, EMI Incorporated, Clinton, CT）を装着した定置蒸気滅菌の１０００リットルのｊａｃｋｅｔｅｄ プロセスタンク（Lee, Model 259LU）中に無菌で移送した。２００ｒｐｍ、１８時間の連続的な混合によりバルクの細菌懸濁液を４℃まで冷却した後、ホモジナイズにより破砕した。簡潔に言うと、細菌懸濁液を含有する１０００リットルタンクはモデルＣ−５００−Ｂ ＡＶＥＳＴＩＮ ホモジナイザー（Avestin Inc, Ottawa Canda）に接続していた。第二の１０００リットルのｊａｃｋｅｔｅｄ プロセスタンク（空）をホモジナイザーに接続し、プロセスタンク中の液体はホモジナイザーを通して空のタンク中に再度移すことができ、クローズドシステムを維持しながらホモジナイズの通過を複数回可能にした。ホモジナイズ中の温度を４℃に維持した。最初の通過の開始時に、ホモジナイザー圧を３０，０００ｐｓｉまで調整して、ホモジナイザーを通してＷａｕｋｅｓｈａモデル１０ＤＯポンプ（Waukesha）を介して液体を７０ｐｓｉで循環させた（500ガロン/時）。最初の通過前に、２つのホモジナイズ前の試料をホモジナイザーから回収し、破砕程度を決定しｐＨをモニターするためにベースラインを設定した。透過率（1:100希釈での540nmにおける%T）で破砕程度をモニターし、ホモジナイズしていない試料と比較した。ホモジナイザーの通過数を最終透過パーセントが１：１００希釈で７８〜９１％Ｔ、好適には８６〜９１％を示すように標準化した。ホモジナイズ後、タンクをホモジナイザーから取り除き、４℃のチラーループ（chiller loop）上に置き、２４０ｒｐｍで混合した。
【０２２０】
タンパク質の回収
図１に説明される鉄制御タンパク質を含有する破砕した細菌懸濁液を、Ｔ−１Ｓｈａｒｐｌｅｓ（Alfa Laval Seperations, Warminster, PA）を使用して遠心分離によって回収した。簡潔に言うと、破砕した細菌ホモジネートを含有する１０００リットルのｊａｃｋｅｔｅｄプロセスタンクを、遠心力６０，０００×ｇ、１７ｐｓｉで供給速度２５０ｍｌ／分によって、１２台のＳｈａｒｐｉｅｓ中に注いだ。流出液を第二の１０００リットルのｊａｃｋｅｔｅｄプロセスタンク中にクローズド無菌ループを介して回収し、クローズドシステムを維持しながら遠心機を介して複数回通過できるようにした。遠心分離中の温度を４℃に維持した。ホモジネートを遠心機を介して８回通過させた。タンパク質の約５０％を２回目の通過後に回収し、その後ホモジネート液体を元の体積の１／３まで濃縮し、その後の６回の通過に関しては工程時間を短縮した。ホモジネートタンクを遠心機から無菌で切断し、濃縮用のＷａｕｋｅｓｈａモデルＵ３０供給ポンプに接続された２５ｆｔ2 ｓｃｒｅｅｎ−ｃｈａｎｎｅｌ ｓｅｒｉｅｓ アルファ３０Ｋ Ｃｅｎｔｒａｓｅｔｔｅフィルター（Pall Filtron）を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ 接線流フィルター アセンブリー（Millipore Corporation, Bedford, MA）に接続した。濃縮後、工程が完了するまで遠心分離を継続した。各通過後にタンパク質を回収した。タンパク質を回収し、再懸濁し、防腐剤として０．１５％のｆｏｒｍｕｌｉｎ（Sigma）を含有する５０リットルのトリス緩衝生理食塩水ｐＨ８．５中に分注した。
【０２２１】
ダイアフィルトレーション
タンパク質懸濁液を、いずれの外来性タンパク質（プロテアーゼ, 毒素, 細胞質及び代謝酵素等）も除去するためにダイアフィルトレーションによって４℃で洗浄した。簡潔に言うと、５０リットルのタンパク質を、Ｄａｙｔｏｎミキサー、Ｍｏｄｅｌ ２Ｚ８４６（Dayton Electric, Chicago, IL）を装着した底部を備えた、１５０リットルの無菌トリス緩衝生理食塩水、ｐＨ８．５を含有する２００リットルのプロセスタンク中に、１２５回転／分で回転しながら無菌で移送した。プロセスタンクを、Ｗａｕｋｅｓｈａ Ｍｏｄｅｌ Ｕ３０供給ポンプに接続された２５ｆｔ2 ｓｃｒｅｅｎ−ｃｈａｎｎｅｌ ｓｅｒｉｅｓ アルファ３０Ｋ Ｃｅｎｔｒａｓｅｔｔｅフィルター（Pall Filtron）を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ 接線流 フィルターアセンブリー（Millipore Corporation）に無菌で接続した。２００リットルのタンパク質溶液を濾過によって目的の体積リットルまで濃縮し、その後１５０リットルの無菌生理食塩水を添加した。続いて、タンパク質懸濁液を約５０リットルまで濃縮した。タンパク質濃縮物を上部に装着したミキサーを備えた５０リットルのｊａｃｋｅｔｅｄプロセスタンク中で保存し４℃で保存した。
【０２２２】
興味深いことに、破砕手段としてホモジナイズを使用した大規模工程に由来する組成物は、実施例１に記載されるより小さなスケール工程と比較すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験される場合と同様に同一のバンド形成プロファイルを形成した。これらの結果は、ＡＶＥＳＴＥＭホモジナイザーＣ５００−Ｂを使用してリゾスタフィンを細菌溶解剤として取り換えることができることを示す。この発見によって、ブドウ球菌から大量の鉄制御タンパク質を低コストで生成可能である。
【０２２３】
実施例８
マウスの過剰免疫化及びポリクローナル抗体製剤
鉄制限条件下で成長させた黄色ブドウ球菌（S. aureus）株ＡＴＣＣ１９６３６に由来するタンパク質を接種したマウスワクチンから単離された精製抗体による受動免疫は、相同種及び異種の黄色ブドウ球菌（S. aureus）での攻撃に対して防御的であった。１５匹の成体ＣＤ１マウスに実施例３に記載の通り、実施例１及び２に記載されるように鉄欠乏条件下で成長させた黄色ブドウ球菌（S. aureus）株ＡＴＣＣ１９６３６に由来するタンパク質組成物をワクチン接種した。７日の間隔をあけて３回、各ワクチン接種において５０μｇのタンパク質組成物を、マウスに腹腔内にワクチン接種した。３回目の免疫化の７日後、マウスから心穿刺によって完全に採血した。血清をプールし、標準的な硫酸アンモニウム沈殿法を使用して抗体を精製した。０．５倍量の飽和硫酸アンモニウムｐＨ７．２を添加することによって、外来性の血清タンパク質を抗体沈殿より前に最初に除去した。
【０２２４】
溶液を４℃で２４時間、１００ｒｐｍで攪拌した。溶液を３０００×ｇで３０分間再度遠心分離した。上清を回収し、最終濃度を５５％飽和状態とするために飽和硫酸アンモニウムを十分に添加することによって再度沈殿させた。溶液を１００ｒｐｍ、４℃で２４時間攪拌した。沈殿物を３０００×ｇで３０分間遠心分離した。
【０２２５】
各試料由来の最終ペレットを２ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２中で再懸濁した。続いて、５０，０００分子量カットオフ透析チューブ（Pierce, Rockford IL）を使用して沈殿した抗体を３０時間で１リットルのリン酸緩衝食塩水の交換を用いて３回透析し、硫酸アンモニウムを除去した。最初に交換した２リットルを０．０２％のアジ化ナトリウムで保存した。最後の１リットル緩衝液の交換には防腐剤を含めなかった。透析液を回収し再度３０００×ｇで３０分間遠心分離し、残存するデブリを除去した。使用前に、抗体溶液を４℃で４８時間以内保存した。注入前に無菌を確認するために、各試料を血液寒天上に蒔いた。
【０２２６】
実施例９
受動免疫及び攻撃
鉄制限中に発現された黄色ブドウ球菌（S. aureus）タンパク質に対して産生された注入抗体の防御効果を評価するために、２００μｌの注入において精製抗体製剤（グループ1）又は生理生理食塩水（グループ2）のいずれかを１５匹のマウスの２つのグループそれぞれに腹腔内に注入した。さらなる１５匹のマウスの２つのグループそれぞれに精製抗体製剤（グループ3）又は生理食塩水（グループ4）いずれかを皮下に注入した。６０分後、腹腔内に注入した１５匹のマウスの２グループに、１．３×１０8ｃｆｕの黄色ブドウ球菌（S. aureus）株１９６３６で腹腔内攻撃した。同様に、皮下注入した１５匹のマウスの２グループに、異種黄色ブドウ球菌（S. aureus）株による攻撃に対する交差防御を試験するために、１．３×１０8ｃｆｕの黄色ブドウ球菌（S. aureus）株１４７７で皮下攻撃した。死亡率及び／又は病変サイズを５日間記録し、全マウスの肝臓を屠殺後取り除き、ホモジナイズし、全身性感染症の尺度として存在する黄色ブドウ球菌（S. aureus）の数を測定するためにプレートに蒔いた。カプラン・マイヤー生存曲線（図5及び6）は、鉄制限中に発現された黄色ブドウ球菌（S. aureus）タンパク質をワクチン接種したマウス由来の抗体の注入によって提供される防御効果を示す。ＡＴＣＣ１９６３６攻撃グループに関して注入グループと対照グループとの間に有意な差は存在しないが（p=0.076, ログランク検定）、１日目に死亡した抗体注入したグループ内の１匹のマウスの肝臓を血液寒天上で培養し、攻撃生物（黄色ブドウ球菌（S. aureus））の非存在及び／又は存在を決定した。当該マウスに由来する培養物は、ブドウ球菌に関して陰性であり、血液寒プレート又は培養物培地上で成長を示さなかった。対照的に、プラセボグループ内で死亡したマウスの肝臓は、ブドウ球菌の存在に関して全て陽性であり、実際にこれらのマウスの肝臓に由来する各血液寒天プレート上で純粋培養物を得た。肝臓のデータは抗体注入したグループ内の死亡したマウスが黄色ブドウ球菌（S. aureus）感染症で死亡した可能性を排除できないが、感染症はプラセボグループ内のように全身性でなかく、マウスは他の原因で死亡していたであろう。この抗体注入したマウスの死亡を除外すると、抗体注入及びプラセボ治療間で有意な差異が得られた（p = 0.015, ログランク検定）。ＡＴＣＣ１９６３６由来のタンパク質でのワクチン接種及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）株１４７７による攻撃後に生成された抗体をマウスに注入した交差攻撃に関するデータは、防御的傾向もまた示した。攻撃後７〜１４日に、注入及び非注入グループにおける全マウスは、壊死性皮膚病変を進行し始めた。しかしながら、マウスの肉眼検査は、グループ間において観察可能な病変の形成及び病変の重症度に明白な遅れを明らかに示した。注入したマウスは、より早い病変の進行を示し重症度の高い非注入対照マウスと比較して病変をゆっくりと進行した。注入マウスは、非注入マウスより早く治癒した。これは、攻撃後２１〜３５日に明確である。攻撃後３５日におけるマウスの肉眼検査は、非注入マウスは外観が著しく酷く、より大きい瘢痕を呈することを示した。実際、非注入マウスにおいて広範囲な瘢痕組織及び／又は進行した湾曲した外観によって説明される外観の悪化��disfigurement）を、ほとんど進行させなかった注入マウスと対照的に、これらの多くの非注入マウスは正常な姿勢を保てず、外見上湾曲して見えた。全体的に、これらのデータは、黄色ブドウ球菌（S. aureus）の鉄誘発タンパク質に対して産生される抗体の腹腔内の注入が、黄色ブドウ球菌（S. aureus）感染症から防御し重症度を制限することができることを示す。
【０２２７】
実施例１０
慢性的に感染した乳牛グループにおける黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来するワクチン組成物の評価
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に起因する慢性的に多い体細胞数の病歴を有する商業的な乳牛グループを、実施例１に記載されるようにワクチン組成物の評価のために選択した。本実験的試験のワクチン有効性を判定するための基準は、１）ワクチン接種していない対照と比較した、ワクチン接種グループにおける黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）によって生じる臨床乳腺炎の低下した発症率、２）対照と比較したワクチン接種グループの体細胞数における改善（すなわち, 減少）、及び３）ワクチン接種グループの非ワクチン接種対照に対する、黄色ブドウ球菌（S. aureus）の培養物の陽性単離株の比率の低下、であった。ワクチン接種日（0日目）に血液を採取し、最初の免疫化から３週及び６週間後に再度血液を採取する。試験中、ワクチン接種後の注射部位反応又は全身性反応をモニターした。加えて、バルクのタンクの牛乳試料を培養し、ワクチン接種に培養した黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のＣＦＵの数が減少しているかを決定するために定量的に数えた。
【０２２８】
このグループのうち、慢性的に感染した泌乳している乳牛に由来する３つのブドウ球菌分離株を、実施例１に記載されるように鉄制限条件下及び非鉄制限下で成長させた。３つの分離株は、デザインしたＴＴＸ１０１、ＴＴＸ１０２、及びＴＴＸ１０３であった。分離株間でバンド形成プロファイルを比較するために、抽出した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験した。試験した分離株間で同一のバンド形成プロファイルが観察され；各分離株から作製した組成物は、８７．７３ｋＤａ、８０．４６ｋＤａ、６５．０８ｋＤａ、５４．５３ｋＤａ、３７．３７ｋＤａ、３５．７０ｋＤａ、３４．９１ｋＤａ、３３．０ｋＤａ及び３１．８３ｋＤａの分子量を有するタンパク質を含んだ。これらのタンパク質は、表７に記載したものと同一の分子量である。さらに、分離株を比較した場合、鉄が制御されていない全条件で発現されたタンパク質：１５０ｋＤａ、１３２ｋＤａ、１２０ＫＤａ、７５ｋＤａ、５８ｋＤａ、５０ｋＤａ、４４ｋＤａ、４３ｋＤａ、４１ｋＤａ、及び４０ｋＤａと同一のバンド形成プロファイルが確認された。これらの結果を、以前の観察と一致する。本試験で使用するための組成物を製造するための分離株として、ＴＴＸ１０１とデザインした１つの分離株を選択した。
【０２２９】
実施例１１
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＴＴＸ１０１）のワクチン製剤
分離株ＴＴＸ１０１を使用して、実施例１に記載されるように組成物を調製した。組成物は、鉄欠乏条件下で発現された、８７．７３ｋＤａ、８０．４６ｋＤａ、６５．０８ｋＤａ、５４．５３ｋＤａ、３７．３７ｋＤａ、３５．７０ｋＤａ、３４．９１ｋＤａ、３３．０ｋＤａ、及び３１．８３ｋＤａの分子量を有するタンパク質、並びに１５０ｋＤａ、１３２ｋＤａ、１２０ｋＤａ、７５ｋＤａ、５８ｋＤａ、５０ｋＤａ、４４ｋＤａ、４３ｋＤａ、４１ｋＤａ、及び４０ｋＤａの分子量を有する非金属制御タンパク質を含んだ。アジュバント濃度が２２．５％体積／体積である２．０ｍｌの注射可能な体積中の最終用量が８００μｇの総タンパク質を示すように、ＩＫＡ Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ Ｔ−５０ ホモジナイズ容器（IKA, Cincinnati, OH）を使用して商業的アジュバント（EMULSIGEN, MVP Laboratories, Ralston NE）中に、抽出されたタンパク質懸濁液を乳化することによって実験用ワクチンを調製するために（１ミリリットル当り400μｇの総タンパク質）、株ＴＴＸ１０１に由来する免疫化組成物を使用した。ワクチンを２１日の間隔をあけて２回皮下に投与した。
【０２３０】
実施例１２
実験デザイン及び集団ワクチン接種
最初のワクチン接種の１８日前に、試験に登録した泌乳している乳牛全て（N＝80）を黄色ブドウ球菌（S. aureus）に関して、各泌乳の乳牛に由来する個々の牛乳試料を培養することによる、標準化された好気性細菌学的培養方法によって試験した。さらに、標準方法を使用して牛群改良協会（Dairy Herd Improvement Association）によって体細胞数（SCC）を数えた。８０頭の乳牛中１４頭が臨床的に乳腺炎と診断され、黄色ブドウ球菌（S. aureus）に関して培養物陽性であった。残りの乳牛（N=66）は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）に関して陰性と判定された。８０頭の乳牛を、ワクチン接種したグループ１（N=40）及び非ワクチン接種グループ２（N=40）とデザインした２つのグループに平等に分けた。ブドウ球菌陽性と臨床的に診断された１４頭の乳牛を両方のグループに等しく分配し、各試験グループは臨床的乳腺炎に罹患する７頭の乳牛を含んだ。最初のワクチン接種前のグループ間の平均ＳＣＣは、ワクチン接種されていない対照において２０３，２１９であったのに対し、ワクチン接種グループでは２４０，４４３であった（統計的差異無し, p = 0.7）。
【０２３１】
最初のサンプリングから１８日後、グループ１中の全乳牛に、実施例１１に記載されるように２ｍｌのワクチンを右肩上部の皮下に接種した。個々の乳牛由来の体細胞を数えるために、最初のワクチン接種の１０日後、ＤＨＩＡによってこの期間に牛乳試料を採取した。牛乳試料はこの期間に、ブドウ球菌の存在を決定するための細菌学的試験をしなかった。この期間のグループ間のＳＣＣにおける差異は、１２５，２４１（ワクチン接種）に対して１９６，２９７（対照）であった。ワクチン接種グループをワクチン接種されていない対照と比較した差は、体細胞の数の３６％の差異であった。このサンプリング期間における対照グループとワクチン接種グループとのＳＣＣの差異は、統計的差異は無かった（p = 0.5）。いずれのサンプリング期間において、グループ間のＳＣＣにおける統計上の差異が欠乏したのは、乳牛個体のＳＣＣに大きなばらつきがあったからである。ワクチン接種した各乳牛の注射部位もまた同期間に試験した。試験したいずれの乳牛も、理学的検査によって注射部位に有害な組織反応を示さなかった。さらに、ワクチン接種に起因する牛乳の生産において測定可能な損失はなかった。
【０２３２】
最初のワクチン接種の２１日後、グループ１（ワクチン接種）中の全乳牛に２回目のワクチン接種又は追加免疫を行った。１回目と２回目のワクチン接種の間の期間中、両グループ（ワクチン接種及び対照）中の乳牛において、環境温度の劇的な低下に起因する乳頭損傷が進行し、乳頭の端部に病変の形成が生じ、感染した乳頭が進行しサンプリング中のブドウ球菌の単離を潜在的に増加し、これは３回目のサンプリング期間に観察された。２度目のワクチン接種の２３日後、個々の乳牛由来の体細胞数えるために、ＤＨＩＡによって牛乳試料を取り出した。黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の存在の確認のために、牛乳試料を細菌学的にもまた試験した。最初のサンプリング期間に陰性と判定された乳牛中のこの期間における黄色ブドウ球菌（S. aureus）の単離比で、劇的な増加が存在した。ワクチン接種されていない対照において、これらの乳牛の４２．９％が黄色ブドウ球菌（S. aureus）に対して陽性を示し、対照的にワクチン接種グループは、３５．５％の増加しか示さなかった。ワクチン接種されていない対照に対するワクチン接種グループの差は７．４％であった。ワクチン接種したグループにおける黄色ブドウ球菌（S. aureus）の単離比の改善は、ワクチン単独の効果に起因したと言うことは困難である。試料を得る場合に、黄色ブドウ球菌（S. aureus）による牛乳の潜在的な汚染を増加し得る乳頭損傷を有した乳牛から、クリーンな牛乳試料を得る困難性を見過ごすことはできない。それにもかかわらず、ワクチン接種グループと対照グループの間で、平均ＳＣＣにおいて有意な差が存在した。ワクチン接種したグループの平均ＳＣＣは、２２２，６７９であったのに対して、対照グループの体細胞数は４０４，２７８であった。ワクチン接種されていない対照と比較したワクチン接種グループの差異は４４．９％であった。これらのグループ間のＳＣＣにおいて確認される差異が、グループ間の黄色ブドウ球菌（S. aureus）の単離比の差異ともまた一致することについて深く考えることは興味深い。しかしながら、個々の動物間のＳＣＣの大きなばらつき及び実験動物の試料数の少なさのため、この差異は統計的差異は無かった（p=0.28）。
【０２３３】
同一期間に、ワクチン組成物によって生じている有害な組織反応に関して、各ワクチン接種した乳牛の注射部位を試験した。試験した乳牛中に、理学的検査によって注射部位に有害な反応を示したものはいなかった。ワクチン組成物は、高い組織適合性を有するように思われ、各ワクチン接種後に牛乳の生産において測定可能な損失は生じなかった。
【０２３４】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の存否のために、ＳＣＣ及び牛乳試料を測定することによって乳牛のモニターを継続している。各グループの一部の乳牛に、２回目のワクチン接種の４２日後に３回目のワクチンを接種した。見られた違いは、ワクチン組成物の使用が体細胞数を減少し黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）によって生じる感染症を制御することを支持するものであった。さらに、モニタリングには、ワクチン組成物に対する抗体価に基づく血清学検査、健康状態の改善に起因するワクチン接種した乳牛の牛乳の生産における変化、及びワクチン接種していない対照と比較したワクチン接種した動物のＳＣＣの減少を含む。さらに、弱毒性黄色ブドウ球菌（S. aureus）での攻撃後の用量応答に基づくワクチンの防御指数を検討する他の実験も行った。
【０２３５】
実施例１３
異種黄色ブドウ球菌（S. aureus）株間のタンパク質の分子量は同様であることが証明されており、マウス攻撃試験において異種の防御が観察されたので、図１の分子量と共通するタンパク質が同様のタンパク質であるかを決定しようと試みた。タンパク質を特徴付けるために選択した技術は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（MALDI-MS）であった。実施例１に記載されるＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して組成物の一部を分離し、タンパク質を可視化するためにゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。
【０２３６】
材料及び方法
切除及び洗浄。ゲルを１０分間水で２度洗浄した。試料中に存在するゲルの量を低減するために、可能な限りタンパク質バンド付近でカットすることによって、目的の各タンパク質バンドを切除した。
【０２３７】
各ゲルスライスを１×１ｍｍの立方体にカットし、１．５ｍｌのチューブ中においた。ゲル断片を水で１５分間洗浄した。洗浄段階で使用した全溶媒量は、ゲルスライス量のほぼ２倍であった。ゲルスライスを次に水／アセトニトリル（1 : 1）で１５分間洗浄した。タンパク質が銀染色されている場合、水／アセトニトリル混合物を除去し、ＳＰＥＥＤＶＡＣの真空濃縮器／乾燥機（ThermoSavant, Holbrook, NY）中でゲル断片を乾燥し、続いて下記のように還元しアルキル化した。ゲル断片がシルバー染色でない場合、水／アセトニトリル混合物を除去し、ゲル断片が白色粘着物となるまでカバーのためにアセトニトリルを添加し、その後アセトニトリルを除去した。ゲル断片を１００ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3中で再水和し、５分後、ゲル断片の体積の２倍の体積のアセトニトリルを添加した。これを１５分間インキュベートし、液体を取り除き、そしてゲル断片をＳＰＥＥＤＶＡＣ中で乾燥した。
【０２３８】
還元及びアルキル化。１０ｍＭのＤＴＴ及び１００ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3中で乾燥ゲル断片を再水和し、４５分間５６℃でインキュベートした。チューブを室温まで冷却した後、液体を取り除き、同体積の５５ｍＭのヨードアセトアミド及び１００ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3の混合物を直ちに添加した。これを暗所において３０分間室温でインキュベートした。液体を取り除き、ゲル断片が白色粘着物となるまで、カバーのためにアセトニトリルを添加し、その後アセトニトリルを取り除いた。ゲル断片を１００ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3中で再水和し、５分後、ゲル断片の体積の２倍の体積のアセトニトリルを添加した。これを１５分間インキュベートし、液体を取り除き、ゲル断片をＳｐｅｅｄ ｖａｃ中で乾燥した。ゲルをクーマシーブルーで染色し、クーマシーがまだ残っている場合、１００ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3／アセトニトリルでの洗浄を繰り返した。
【０２３９】
ゲル内の分解。ゲル断片をＳｐｅｅｄ ｖａｃ中で完全に乾燥させた。４℃の分解緩衝液（50mMのNH4HCO3, 5mM CaCl2, 12.5ナノグラム per マイクロリットル（ng/μｌ）トリプシン）中で、断片を再水和した。十分な緩衝液を、ゲル断片をカバーするために添加し、必要であればさらに添加した。ゲル断片を氷上で４５分間インキュベートし、上清を取り除き５〜２μｌのトリプシン非含有の同一緩衝液で取り換えた。これを３７℃でオーバーナイトでエアーインキュベーター内でインキュベートした。
【０２４０】
ペプチドの抽出。十分な体積の２５ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3を、ゲル断片をカバーするために添加し、（典型的には、超音波処理槽内で）１５分間インキュベートした。同一体積のアセトニトリルを添加し、（可能であれば、超音波処理槽内で）１５分間インキュベートし、そして上清を回収した。ＮＨ4ＨＣＯ3の代わりに５％のギ酸を使用して、抽出を２度繰り返した。十分な体積の５％ギ酸をゲル断片をカバーするために添加し、（典型的には、超音波処理槽内で）１５分間インキュベートした。同一体積のアセトニトリルを添加し、（典型的には、超音波処理槽内で）１５分間インキュベートし、上清を回収した。抽出物をプールし、１０ｍＭのＤＴＴを最終濃度が１ｍＭのＤＴＴとなるまで添加した。ＳＰＥＥＤＶＡＣ真空濃縮器／乾燥機中で試料を最終体積約５μｌまで乾燥させた。
【０２４１】
ペプチドの脱塩。製造者によって提案されるようにＺＩＰＴＩＰのピペットチップ（C18, Millipore, Billerica, MA）を使用して試料を脱塩した。簡潔に言うと、再構成溶液（5:95アセトニトリル:H2O, 0.1%-0.5%トリフルオロ酢酸）中で試料を再構成し、遠心分離し、ｐＨが３未満であることを確認するためにｐＨをチェックした。１０μｌの溶液１（50:50 アセトニトリル:H2O, 0.1%トリフルオロ酢酸）を吸引し、吸引した一定分量を廃棄することによって、ＺＩＰＴＩＰを水和した。これに続いて、１０μｌの溶液２（脱イオン化したH2O中の0.1%トリフルオロ酢酸）を吸引し、吸引した一定分量を廃棄した。１０μｌの試料をゆっくりチップの中に吸引し、これを試料チューブ中に排出し、これを５〜６回繰り返すことによって、試料をチップ中にロードした。１０マイクロリットルの溶液２をチップ中に吸引し、排出することによって溶液を廃棄し、この工程を洗浄のために５〜７回繰り返した。ペプチドを、２．５μｌの氷冷の溶液３（60:40, アセトニトリル:H2O, 0.1%トリフルオロ酢酸）を吸引し、排出し、続いて３回再度チップに同一の一定分量を吸引及び排出することによって溶出した。溶液をチップから排出した後、チューブをキャップし、氷上で保存した。
【０２４２】
質量分析のペプチドマッピング。ペプチドを１０μｌ〜〜３０μｌの５％ギ酸中で懸濁し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA）によって分析した。ペプチド断片の質量スペクトルを製造者の指示通りに測定した。簡潔に言うと、トリプシンによる分解に由来するペプチドを含有する試料をマトリックスのシアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸と混合し、標的へ移送し、乾燥させた。乾燥試料を質量分析計に置き、照射し、そして各イオンの飛行時間を検出し、組成物中に存在する各タンパク質のペプチドマスフィンガープリントを決定するために使用した。周知のポリペプチドは、機器を標準化するために使用した。
【０２４３】
データ分析。Ｍａｓｃｏｔ ｓｅａｒｃｈ ｅｎｇｉｎｅのペプチドマスフィンガープリントサーチ方法（Matrix Science Ltd., London, UK, and www. matrixscience.com, see Perkins et al., Electrophoresis 20, 3551-3567 （1999））を使用して、各質量スペクトルにおいて実験上観察されたペプチドの質量を、タンパク質の予測される質量と比較した。サーチパラメータは、以下を含んだ：データベース、ＭＳＤＢ又はＮＣＢＩｎｒ；分類、細菌（真正細菌）又はファーミキューテス（グラム陽性菌）；サーチのタイプ、ペプチドマスフィンガープリント；酵素、トリプシン；固定修飾、カルバミドメチル（C）又は無し；可変修飾、酸化（M）、カルバミドメチル（C）、組合せ、又は無し；質量値、モノアイソトピック；タンパク質質量、無制限；ペプチド質量許容度、±１５０ｐｐｍ〜±４３０ｐｐｍ、又は±１Ｄａ；ペプチド荷電状態、Ｍｒ；最大欠失切断、０又は１；クエリー数、２０。
【０２４４】
結果
このサーチ結果は、組成物中に存在する各タンパク質のマスフィンガープリントであり、表２、３、４、及び５に示す。
【０２４５】
実施例１４
低鉄条件下で成長させた黄色ブドウ球菌（S. aureus）のマイクロアレイに基づく遺伝子発現分析を使用した鉄制御タンパク質ファミリーの同定
マイクロアレイ分析に関して、個々のストック溶液から作製した化学的限定培地（CDM）（表10）中で細菌を培養した。
【０２４６】
表１０：黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のための化学的限定培地（CDM）
【０２４７】
【表１０−１】
2015164949.tif 000034
【表１０−２】
2015164949.tif 000035
【０２４８】
作製方法。鉄欠乏培地を作製するために、カチオン及び微量栄養素を除いて全ストック溶液を混合し、ＭｉＩＩｉＱ精製水を使用し、カチオンを添加するための十分な空隙容量を残したまま、容量フラスコ中の適当量へ移した。培地１Ｌ当り１５ｇのＣＨＥＬＥＸ樹脂を添加し、室温で少なくとも２時間撹拌する。２μｍのボトル上部フィルターを使用して、溶液を硫酸（10%）処理したガラスビンに濾過した。フィルター処理したカチオンストック溶液を添加し、最大２週間、４℃の暗所において保存した。
【０２４９】
（ウシ乳腺炎から単離した）黄色ブドウ球菌（S. aureus）株ＲＦ１２２及び（ヒト毒素性ショック症候群から単離した）ＭＳＡ５５３を使用した。いずれの分離株も、実験の使用前に第二継代の冷凍室ストックから直接的にトリプチックソイブロス寒天上に画線した。ＣＤＭは、ウシ牛乳中のもの（5mM）とほぼ等価の最終クエン酸塩濃度を含有した。鉄を含まないＣＤＭに関して、次の構成成分を混合し（0.998L 総量）、１５ｇのＣＨＥＬＥＸ樹脂（BioRad Laboratories, Hercules, CA）に添加し、続いて室温で１．５時間攪拌した：塩、グルコース、アミノ酸、ビタミン、及びヌクレオチド。続いて、硫酸処理したボトル中で２μｍのボトル上部のフィルター（Nalgene Nunc International, Rochester NY）を使用して鉄酸塩非含有の（deferrated）塩基培地を濾過し、その後微量栄養素及び１００μＭのＭｇＣｌ2（両溶液は水を含む酸処理ガラス製品中で調製した）を添加した。使用まで、ＣＤＭを４℃の暗所において保存した。
【０２５０】
単独の細菌コロニーを２５ｍｌの酸処理したガラス培養物チューブ中の３ｍｌの鉄欠乏ＣＤＭ中に播種し、３７℃のインキュベーター中で２５０ｒｐｍでオーバーナイトで振盪した。続いて、１ミリリットルの継代培養物を使用し、翌日２５００ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ内の５００ｍｌのＣＤＭ中に播種した。３７℃で２５０ｒｐｍで振盪しながら培養物をインキュベートした。ＣＤＭ＋５０μＭのＦｅＳＯ4のＯＤが１．０に達する限り（18時間対36時間）、鉄欠乏ＣＤＭ培養物を約２回取り出した。対数期の中間部（OD = 0.600）で、４×１００ｍｌの培養物一定分量を５００ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中に分配し、実験用鉄溶液の添加前に１０分間インキュベーター中で振盪した。１つのフラスコに、３００μｌのウシラクトフェリン（50 mg/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を最終濃度１５０μｇ／ｍｌとなるように添加した。他のフラスコには、５０μｌのクエン酸第二鉄（100mM）を添加した。残りの２つの対照フラスコには、追加をしなかった。５、３０、６０及び１２０分に、７．５ｍｌの培養物を回収し、β−メルカプトエタノール含有の５ｍｌのグアニジンチオシアン酸塩溶液及び０．５％ナトリウムラウリルサルコシンへ添加した。溶液を十分に混合して転写を停止し、８℃で４,０００×ｇで８分間遠心分離し；上清を捨て、エタノール／ドライアイス槽を使用して２５０μｌのトリゾール（Invitrogen）中で細胞を凍結した、続いてＲＮＡの抽出まで−８０℃で保存した。
【０２５１】
ＲＮＡ抽出のために、細胞ペレットを氷上で解凍し、７５０μｌのトリゾール（Invitrogen, Carlsbad CA）を添加した。細胞をボルテックスによって再懸濁し、スラリーを０．１ｍｍのシリカジルコニウムビーズを含有する２ｍｌのねじ口チューブに移送し、続いて繰り返しの間はアイスインキュベーションしてＢｅａｄＢｅａｔｅｒ（Biospec Products, Inc., Bartlesville, OK）中でビート３×２分間を行った。スラリーをさらに室温で２０分インキュベートし、遠心分離してビーズ及び細胞構成成分をペレット化した。４００μｌのクロロホルムを添加しインバージョン（inversion）によって混合し、室温で１０分間インキュベートし、８℃、１２，０００×ｇでチューブを８分間遠心分離した。水層を取り除き、ＲＮＡを４００μｌのイソプロパノールで沈殿させ、続いて１ｍｌの７０％エタノールで洗浄した。クリアなＲＮＡペレットを短時間風乾し、１００μｌのリボヌクレアーゼを含まないＨ2Ｏ中で再懸濁した。標準的なデオキシリボヌクレアーゼキット（Qiagen, Valencia CA）を使用してＤＮＡを分解し、続いてＲＮｅａｓｙカラム（Qiagen）上で製造者の推奨に従って精製した。最終的に、ＴｕｒｂｏのＤＮＡ非含有キット（Ambion, Austin TX）を使用して、製剤からのＤＮＡの除去を確実にした。ＲＮＡを分光光度計上で測定し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Agilent, Palo Alto CA）上で流し、マイクロアレイハイブリダイゼーションのためのｃＤＮＡの生成前に質及び量を確認した。
【０２５２】
樹立されたプロトコールに従って、マイクロアレイ分析を行った。ＲＦ１２２及びＭＳＡ５５３を含む９個の配列決定された黄色ブドウ球菌（S. aureus）のゲノム由来の翻訳領域（ORF）を表す３８４１ ７０塩基長のオリゴヌクレオチド（IUumina, San Diego CA）を特徴とするアレイは、ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｇｒｉｄ ＩＩ Ａｒｒａｙ Ｓｐｏｔｔｅｒ（BioRobotics, Cambridge UK）を使用して、Ｇａｐｓ ＩＩアミノ生理食塩水コーティングしたスライド（Corning, Acton MA）上で３通りにスポットされた。スライドを再水和し、ＵＶ交差結合しそして乾燥下で保存した。ハイブリダイゼーション前に直ちに、２５ｍｌのホルムアミド、１２．５ｍｌの２０Ｘ ＳＳＣ、１２ｍｌのｄＨ２０，５００μｌの１０％ＳＤＳ及び０．５ｇのＢＳＡから構成されるハイブリダイゼーション前緩衝液中で４２℃で１時間スライドをインキュベートした。スライドを２ＬのＭｉＩＩｉＱ水でリンスし、遠心分離によって乾燥した。試料を調製するために、８〜１０μｇ総細菌ＲＮＡを２０μｇのランダム六量体（Random hexamer）で７０℃で１０分間インキュベートし、その後Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Invitrogen）及びアミノアリルのカップルしたｄＵＴＰ（Sigma）を使用してアミノアリル取り込みによる逆転写を行った。標識ｃＤＮＡを中和し、精製し、乾燥しＣｙ３又はＣｙ５蛍光染料（Amersham Biosciences Corp., Piscataway NJ）で再懸濁し；カップリングを２時間進めた。蛍光で標識したｃＤＮＡ試料（各12μｌ）を、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを使用して洗浄し、混合し、９．８μｌのホルムアミド、６．８μｌの２０Ｘ ＳＳＣ、３．４μｌのサケの精子ＤＮＡ（10mg/ml, Invitrogen）及び１μｌの１０％ＳＤＳに添加した。試料をサーマルサイクラー中で９９．９℃で２分間インキュベートし、アレイ適用の前に冷却した。続いてプローブをアレイに適用し、ガラスカバースリップでカバーし、４２℃の水槽中でオーバーナイトでインキュベートした。インキュベーションの１２〜１６時間後に、スライドを希釈ＳＳＣ緩衝液中で十分に洗浄し、Ａｘｏｎ ４１００Ｂ Ｓｃａｎｎｅｒ及びＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Axon Instruments, Union City CA）を使用してスキャンした。標準化及びフィルタリングのために、低強度データをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Agilent Technologies, [Silicon Genetics], Palo Alto CA）へエクスポートした。スポットを全体的に標準化し、最小の（>1500）低強度値に基づいてフィルタリングし、３通りのものを平均した。各実験を２回行い、ｄｙｅ−ｓｗａｐを使用して適合している時点間で単独のスライドにそれぞれ流した。したがって、少なくとも６つのｄｙｅ−ｓｗａｐされたデータポイントを各遺伝子に関して各時点において生じ、これは少なくとも２つの生物学的複製を表している。ＥＰＣＬＵＳＴ（Jaak ViIo, EBI）及びＳｐｏｔＦｉｒｅ（SpotFire, Somerville, MA）を使用して、階層的クラスター形成（Euclidian distance, average linkage, UPGMA）及びＫ平均法クラスター形成（uncentered correlation based measured distance）によって、データをさらに分析した。遺伝子の発現が０とは有意に異なる場合、測定の全時点に渡って１つのクラスモデルを使用して、中央値合わせ（median-centered）のログ比で、マイクロアレイの有意性分析（SAM, （157））を行った。ストリンジェントなデルタ値を使用し、これにより偽陽性のパーセンテージは０と推定される。表１１はＳＡＭ分析によって同様の上方又は下方制御を示しているオペロンの概要を示しており、これは生物学的応答を検出するアレイの能力をサポートしている。
【０２５３】
表１１．黄色ブドウ球菌（S. aureus）の遺伝子発現のマイクロアレイ分析を使用して特定された、協調した転写応答を有するオペロンクラスター
【０２５４】
【表１１】
2015164949.tif 000036
【０２５５】
タンパク質の標準的なクローニングのために、標準的なポリメラーゼ連鎖反応によって黄色ブドウ球菌（S. aureus）（株ATCC19636）から抽出したＤＮＡから適当な遺伝子を増幅した。プライマーをＳｔｕｌ及びＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を組み込むようにデザインし、以下に示す。
【０２５６】
表１２．クローニングプライマー：
【０２５７】
【表１２】
2015164949.tif 000037
【０２５８】
鋳型として、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ１９６３６から抽出したＤＮＡを使用した。ＤＮＡ増幅産物をゲル電気泳動によって確認し、ＤＮＡの増幅したバンドを切除し、精製し、分解しそしてカットｐＱＥ３０−Ｘａベクターの中に連結させ、コンピテントなＸＬ−Ｉ大腸菌中に転換し、そしてアンピシリン耐性に関してスクリーニングした。コロニーＰＣＲを使用して、耐性クローンをプラスミド挿入に関してスクリーニングした。
【０２５９】
実施例１５
防御タンパク質の候補の免疫活性のスクリーニング
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析（実施例13）及び／又はマイクロアレイ及びゲノム分析（実施例14）から特定されるタンパク質の抗体反応を評価するために、２パートスクリーンを使用して個々に発現されたブドウ球菌タンパク質を評価した。急速な第一スクリーンでは、細胞を含まない大腸菌溶解物を使用して発現された少量の候補タンパク質に結合した抗体を調査するために転写活性ＰＣＲ断片を使用した。第一スクリーン由来のポジティブ候補を確認するために、第二スクリーンは、商業的ベクター（pQE30Xa, Qiagen, Valencia CA）を使用した大腸菌中のタンパク質の、標準的なＰＣＲに基づくクローニング、発現及び精製を使用した。第二スクリーンはまた、ワクチン接種及び実験法のための十分なタンパク質の産生及び精製のための各免疫反応性タンパク質の候補に対応する発現ベクターを含有する大腸菌宿主細胞のマスター種のストックを生成した。
【０２６０】
個々のＳＩＲＰ抗原を生成するためのハイスループット方法を、金属代謝に関与する黄色ブドウ球菌（S. aureus）タンパク質をコードする一部の候補遺伝子を試験するために使用した。この方法は、プロモーター、ターミネーター及びＣ末端Ｈｉｓ6タグを添加するプライマーでの２段階ＰＣＲ反応を使用して、転写活性ＰＣＲ（TAP）増幅産物を生じる。生じた転写活性増幅産物を、大腸菌細胞溶解物、アミノ酸及び緩衝液から構成される細胞を含まないインビトロ（in vitro）での転写／翻訳反応におけるタンパク質産生のための鋳型として使用した。当該２段階ＰＣＲ反応は、プライマーの第二セットにマッチするリンカー配列もまた含む目的の遺伝子に特異的なプライマーの第一セットが必要であった。ＰＣＲの第一段階のための各プライマーセットを、細胞膜中への組み込みを防止する膜プロセシングのシグナル配列を除外するようにデザインし、これらを以下に示す。
【０２６１】
表１３．ＴＡＰプライマー：
【０２６２】
【表１３】
2015164949.tif 000038
【０２６３】
１ユニットＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）、０．２μＭプライマー、２ｍＭ ｄＮＴＰ（各）、２ｍＭ最終Ｍｇ++、及び６０ｍＭトリスＳＯ4（pH8.9）及び１８ｍＭの硫酸アンモニウムに緩衝した約５ｎｇの出発ＤＮＡ鋳型を使用して、標準的な５０μｌのＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲサイクリングプロトコールは、９４℃での１分の最初の変性、続いて次の３０サイクルを含んだ：変性／９４℃／３０秒；アニール化／５５℃／３０秒；伸展／６８℃、９０秒。適当な重複部分を有する同一のプライマーを第二段階のＰＣＲ反応に利用し、これらは製造者（Genlantis）から供給された。生じたＤＮＡ ＰＣＲ生成物を、残存プライマー、塩及びＤＮＡ断片を排除するために精製し、同様の条件を使用したプロモーター及びターミネーター配列を添加するためのプライマーの標準的なセットでの第二反応のための鋳型として使用した。続いて、ＤＮＡ鋳型を精製し、大腸菌細胞を含まないＲａｐｉｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＲＴＳ １００反応ミックス（Roche）に添加し、これは１２μｌの大腸菌溶解物、１２μｌのアミノ酸、１０μｌの反応ミックス、１μｌの添加メチオニン、５μｌの再構成緩衝液及び２段階ＰＣＲ反応由来の１０μｌの精製ＤＮＡ鋳型を含有した。３０℃での５時間のインキュベーションに続いて、メタノール飽和後に１マイクロリットルの各タンパク質試料（約0.5μｇ/μｌ総タンパク質）をポリビニリデンフッ化物（PVDF）膜に適用した。ブロットをオーバーナイトで５％ＮＦＤＭ／ＴＴＢＳでブロックし、鉄制限タンパク質、増強した（IRPE）１：５００希釈した超免疫化マウス血清又は抗Ｈｉｓ6抗体（1:500）でインキュベートし、洗浄し、二次ヤギ抗マウスのアルカリフォスファターゼ（AP）複合体（1:3000）でインキュベートし、洗浄し、２０分間発色的に展開した（Bio-Rad AP color development kit）。血清反応性ポリペプチドを含有する溶解物を特定した。
【０２６４】
実施例１４に記載されるように生成されたクローンを対数期の中間部まで成長させ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、４時間成長させた。細胞をペレット化し、洗浄し、そして沸騰したＳＤＳ−ＰＡＧＥ添加緩衝液中に溶解した。未精製の溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クーマシー染色した。分離タンパク質の第二セットをＰＶＤＦ膜に移送し、ＩＲＰＥワクチンで超免疫化したマウスの、１％ＮＦＤＭ／ＴＴＢＳ中で１ ：５００に希釈した血清で免疫ブロットした。ブロットを洗浄し、アルカリフォスファターゼ（AP）結合したヤギの抗マウス二次抗体でインキュベートし、洗浄し、発色基質で展開した。
【０２６５】
実施例１６
組換えで生成されたポリペプチド由来の免疫化組成物製剤
ワクチンを製剤するための組換え黄色ブドウ球菌（S. aureus）ポリペプチドを分離するために、実施例１４に記載される大腸菌クローンを３７℃（225rpm）で対数期の中間部（OD600= 0.4-0.6）まで１Ｌのトリプチックソイブロス中で成長させ、続いて１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（IPTG）で４時間誘導した。培養物をＳｏｒｖａｌｌの遠心分離機（4000×ｇ）中で４℃で１０分間ペレット化し、精製手順の実行前に−８０℃で凍結した。続いて、過剰発現された黄色ブドウ球菌（S. aureus）のポリペプチドの溶解性に応じて、２つの異なる方法によって細菌ペレットを処理した。
【０２６６】
可溶性ポリペプチド（例えば、MntC, FhuD, SYN2, SirA,又はSYN1）に関して、細菌ペレットを２５ｍｌのＢＵＧＢＵＳＴＥＲ試薬（Novagen）中で再懸濁し、マイクロチップが取り付けられたＢｒａｎｓｏｎのｓｏｎｉｆｉｅｒ（65%デューティサイクル, 5出力）を使用して氷上での１５分の超音波処理に供した。１０分の遠心分離（4000×ｇ）によって不溶性材料を取り除いた。可溶性上清を濾過し（0.2μｍ）、製造者によって供される説明書に従って金属親和性クロマトグラフィー（Ni-NTA His-Bind, Novagen）に供した。
【０２６７】
不溶性ポリペプチド（例えば、PflB,又はOpp1A）に関して、２５ｍｌのＢＵＧＢＵＳＴＥＲ試薬（Novagen）中で細菌ペレットを再懸濁し、１０分間ロッカープラットフォーム上に置き、続いて遠心分離（15,000×ｇで12分間）に供した。生じたペレットを２０ｍｌの希釈ＢＵＧＢＵＳＴＥＲ（PBS中で1:10）を加えた１０ｍｌのＢＵＧＢＵＳＴＥＲ中に再懸濁し、遠心分離（5000×ｇで12分間）に供した。続いてペレットを２０ｍｌの希釈ＢＵＧＢＵＳＴＥＲ中で再懸濁し、遠心分離（15,000×ｇで12分間）の最終段階に供した。最終ペレットを１０ｍｌの緩衝液Ａ（0.1M NaH2PO4, 0.01トリス-HCl, 8M 尿素, pH8.0）中で再懸濁し、室温でロッキングプラットフォーム上で１０分間インキュベートした。続いて試料を遠心分離（12,000×ｇで20分間）に供し、生じた上清を製造者の提供する説明書に従って、しかしながら以下の変更を加えて、金属親和性クロマトグラフィー（Ni-NTA His-Bind, Novagen）によって分離した。カラムを荷電後、１０ｍｌの緩衝液Ａを使用して樹脂を平衡化した。ポリペプチドの結合後、カラムを１５ｍｌの緩衝液Ｂ（0.1M NaH2PO4, 0.01トリス-HCl, 8M尿素, pH6.0）で洗浄し、１５ｍｌの緩衝液Ｃ（0.1M NaH2PO4, 0.01トリス-HCl, 8M尿素, pH 4.5）を使用して溶出した。
【０２６８】
単離した組換えポリペプチドを体積１５ｍｌ中にカラムから溶出し、２Ｌのリン酸緩衝食塩水（PBS）での透析のために２０ｋＤａのカットオフ透析カセット（Pierce）中に置いた。３０時間の過程に渡る３つの緩衝液変化の後、ポリペプチドを取り除き、濾過し（0.2μｍ）、そして２０ｋＤａのカットオフＣｅｎｔｒｉｃｏｎ装置（Millipore）を使用して２〜３ｍｌの体積に濃縮した。精製されたポリペプチドの濃度を標準的なＢＣＡ方法（Pierce）を使用して測定した。
１０μｇの各ポリペプチドを混合し、体積をＰＢＳで１００μｌに調整し、免疫化組成物を形成した。
【０２６９】
実施例１７
マウスのワクチン接種
ＩＶ攻撃（試験A）
Ｈａｒｌａｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Indianapolis, IN）から入手した体重１６〜２２グラムの５０匹（N=50）のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウスを３つのグループ（10〜20マウス/グループ）に分配した。マウスをポリカーボネートマウスケージ中で飼育した（ケージ当り、N=5マウス）。全マウスに餌及び水を自由に供給した。全ワクチンを５０％ＩＦＡでアジュバントとして製剤した。次の通り１４日の間隔をあけて０．１ｍｌの適当な組成物を２回マウスの皮下にワクチン接種した：
グループ１：オボアルブミン（70μｇ/100μｌ）をワクチン接種したプラセボ（プラセボ, 20匹のマウス）。
グループ２：鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ２５９０４タンパク質（70μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの（SIRP抽出物, 20匹のマウス）。
グループ３：組換えポリペプチドＭｎｔＣ（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの（rMntC, 10匹のマウス）。
【０２７０】
ＩＰ攻撃（試験B）
Ｈａｒｌａｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Indianapolis, IN）から入手した体重１６〜２２グラムの４０匹（N=40）のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウスを、４グループに等しく分配した（10匹マウス/グループ）。ポリカーボネートマウスケージ中でマウスを飼育した（ケージ当り、N=5マウス）。餌及び水を全マウスに自由に供給した。全ワクチンをアジュバントとして５０％ＩＦＡで製剤した。次の通り、２つのワクチン接種（グループ1〜3）又は３つのワクチン接種（グループ4）を使用して、マウスの皮下に０．１ｍｌの適当な組成物を１４日の間隔をあけてワクチン接種した：
グループ１：オボアルブミン（70μｇ/100μｌ）（プラセボ）を２回ワクチン接種したプラセボ。
グループ２：鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ２５９０４タンパク質（70μｇ/100μｌ）（SIRP抽出物）を２回ワクチン接種したもの。
グループ３：組換えポリペプチドＰｆｌＢ、Ｏｐｐ１Ａ、ＳｉｒＡ、ＳＹＮ２、ＦｈｕＤ、ＳＹＮ１、及びＭｎｔＣ（各10μｇ/100μｌ, 総タンパク質70μｇ/100μｌ）を２回ワクチン接種したもの（rSIRP7（2x））。
グループ４：組換えポリペプチドＰｆｌＢ、Ｏｐｐ１Ａ、ＳｉｒＡ、ＳＹＮ２、ＦｈｕＤ、ＳＹＮ１、及びＭｎｔＣ（各10μｇ/100μｌ, 総タンパク質70μｇ/100μｌ）を３回ワクチン接種したもの（rSIRP7（3x））。
【０２７１】
ＩＣ攻撃（試験C）
Ｈａｒｌａｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Indianapolis, IN）から入手した体重１６〜２２グラムの３０匹（N=30）のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウスを、３グループ（10マウス/グループ）に等しく分配した。マウスをポリカーボネートマウスケージ中で飼育した（ケージ当り、N=5マウス）。餌及び水を全マウスに自由に供給した。次の通り、０．１ｍｌの適当な組成物を１４日の間隔をあけて２回マウスの皮下にワクチン接種した：
グループ１：オボアルブミン（70μｇ/100μｌ）（プラセボ）をワクチン接種したプラセボ。
グループ２：鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ２５９０４タンパク質（70μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの（SBRP抽出物）。
グループ３：組換えポリペプチドＰｆｌＢ、Ｏｐｐ１Ａ、ＳｉｒＡ、ＳＹＮ２、ＦｈｕＤ、ＳＹＮ１、及びＭｎｔＣ（各10μｇ/100μｌ, 総タンパク質70μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの（rSIRP7）。
【０２７２】
実施例１８
攻撃生物の製剤
ＩＶ攻撃（試験A）
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）株ＡＴＣＣ２５９０４を攻撃生物として使用した。簡潔に言うと、標準的なＴＳＢ（鉄非制限）中で成長させた凍結グリセロールストック由来のｌμｌのループを使用してＴＳＢの２０ｍｌの培養物を播種し、３７℃で１８時間インキュベートした。２．５ｍｌのこの培養物を５００ｍｌのフレッシュなＴＳＢ中に継代培養した。０．４（吸光度）の光学濃度（OD600）が達成されるまで（対数期の中間部）、培養物を２５０ｒｐｍで回転しながら３７℃で約２時間インキュベートし、続いて細胞を１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、細菌をペレット化した。細菌ペレットを遠心分離によってＰＢＳ中で４℃で洗浄した。最終ペレットを２０ｍｌのＰＢＳ中で再懸濁した。最終攻撃用量を一定分量のこの濃縮細菌培養物のＰＢＳへの添加によって調製し、４．０がＯＤ600である溶液を生じ（A）、これは約６．６７×１０8ＣＦＵ／ｍｌに相当する。攻撃の直前に、１ｍｌのこれらの細菌懸濁液を段階希釈し、寒天上に蒔き、マウス用量当りのコロニー形成ユニット（CFU）の数を数えた。
【０２７３】
ＩＰ攻撃（試験B）
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）株ＡＴＣＣ２５９０４を攻撃生物として使用した。簡潔に言うと、標準的なＴＳＢ（鉄非制限）で成長させた凍結グリセロールストック由来の細菌の１μｌのループを使用し、ＴＳＢの２０ｍｌの培養物を播種し３７℃で１８時間インキュベートした。２．５ｍｌのこの培養物を５００ｍｌのフレッシュなＴＳＢ中に継代培養した。０．４（吸光度）の光学濃度（OD600）が達成されるまで（対数期の中間部）、培養物を２５０ｒｐｍで回転しながら３７℃で約２時間インキュベートし、続いて細胞を１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、細菌をペレット化した。細菌ペレットを遠心分離によってＰＢＳ中で４℃で洗浄した。最終ペレットを２０ｍｌのＰＢＳ中で再懸濁した。最終攻撃用量を一定分量のこの濃縮細菌培養物のＰＢＳへの添加によって調製し、６．０がＯＤ600である溶液を生じ（A）、これは約３．３３×１０9ＣＦＵ／ｍｌに相当する。攻撃の直前に、１ｍｌのこれらの細菌懸濁液を段階希釈し、寒天上に蒔き、マウス用量当りのコロニー形成ユニット（CFU）の数を数えた。
【０２７４】
ＩＶ攻撃（試験C）
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）株ＡＴＣＣ２５９０４を攻撃生物として使用した。簡潔に言うと、標準的なＴＳＢ（鉄非制限）中で成長させた凍結グリセロールストック由来の細菌の１μｌのループを使用し、ＴＳＢの２０ｍｌの培養物を播種し３７℃で１８時間インキュベートした。２．５ｍｌのこの培養物を５００ｍｌのフレッシュなＴＳＢ中に継代培養した。０．４（吸光度）の光学濃度（OD600）が達成されるまで（対数期の中間部）、２５０ｒｐｍで回転しながら培養物を３７℃で約２時間インキュベートし、続いて細胞を１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、細菌をペレット化した。細菌ペレットを遠心分離によってＰＢＳ中で４℃で洗浄した。最終ペレットを２０ｍｌのＰＢＳ中で再懸濁した。最終攻撃用量を一定分量のこの濃縮細菌培養物をＰＢＳへ添加することによって調製し、４．０がＯＤ600である溶液を生じ（A）、これは約６．６７×１０8ＣＦＵ／ｍｌに相当する。攻撃の直前に、１ｍｌのこれらの細菌懸濁液を階希釈し、寒天上に蒔き、マウス用量当りのコロニー形成ユニット（CFU）の数を数えた。
【０２７５】
実施例１９
攻撃
ＩＶ攻撃（試験A）
二回目のワクチン接種の１４日後に、全グループ（1〜3）中のマウスの外側尾（lateral tail）静脈中に０．３ｍｌの適当な生物で静脈内攻撃した。マウス当り２×１０8ＣＦＵの黄色ブドウ球菌（S. aureus）株ＡＴＣＣ２５９０４で３つのグループのマウスに同様に攻撃した。攻撃後１０日間死亡率を毎日記録した。ＡＴＣＣ２５９０４分離株で攻撃したマウスを比較する場合、８０％のプラセボワクチン接種したグループ１のマウスは攻撃の１０日以内に死亡した（表14）。これは、株ＡＴＣＣ２５９０４が投与した用量レベルでマウスにおいて高い死亡率を生じたことを証明した。グループ１のマウスとは対照的に、（鉄欠乏条件での成長後に、株ATCC25904から抽出されたタンパク質, SIRP抽出物をワクチン接種した）グループ２のわずか２５％のマウスが攻撃後の１０日以内に死亡した。これらの結果は、鉄欠乏ＡＴＣＣ２５９０４に由来するタンパク質組成物のワクチン接種によって、株ＡＴＣＣ２５９０４で攻撃したマウスを有意に防御することを説明した（p=0.0006, 死亡率に関するログランク検定）。加えて、（組換えMntCポリペプチド, rMntCをワクチン接種した）グループ３のわずか５０％のマウスが、攻撃の１０日以内に死亡し、これは、組換えタンパク質によってＡＴＣＣ２５９０４株での攻撃に対する防御が提供されたことを示している（p =0.100, 死亡率に関するログランク検定）。
【０２７６】
ＩＰ攻撃（試験B）
二回目のワクチン接種の１４日後、全グループ（1〜4）中のマウスに、０．５ｍｌの適当な生物で腹腔内攻撃した。マウスの３つのグループに、マウス当り１×１０9ＣＦＵの黄色ブドウ球菌（S. aureus）株ＡＴＣＣ２５９０４で同様に攻撃した。攻撃後１０日間、死亡率を毎日記録した。
【０２７７】
ＡＴＣＣ２５９０４分離株で攻撃したマウスを比較する場合、６０％のプラセボワクチン接種したグループ１マウスは、攻撃の１０日以内に死亡した（表14）。これは、投与した用量レベルでマウスにおいて株ＡＴＣＣ２５９０４が中等度の死亡率を生じることを証明した。グループ１のマウスと対照的に、（鉄欠乏条件下で成長後に株ATCC25904から抽出されたタンパク質, SIRP抽出物をワクチン接種した）グループ２のわずか３０％のマウスが、攻撃後１０日以内に死亡した。これらの結果は、株ＡＴＣＣ２５９０４で攻撃した場合に、鉄欠乏のＡＴＣＣ２５９０４に由来するタンパク質組成物をワクチン接種したマウスは、プラセボワクチン接種したマウスの半分の割合で死亡することを説明した（p =0.143, 死亡率に関するログランク検定）。７つの組換えタンパク質の組合せをワクチン接種したマウスは、プラセボと比べて高レベルの防御を示した。（組換えポリペプチド, rSIRP7を２回ワクチン接種した）グループ３のわずか２０％のマウスが攻撃の１０日以内に死亡し、（組換えポリペプチド, rSIRP7を３回ワクチン接種した）グループ４のわずか１０％のマウスが、攻撃の１０日以内に死亡し、ＡＴＣＣ２５９０４株での攻撃に対して組換えタンパク質の３回のワクチン接種によって有意な防御が提供されることを示している（p =0.040, 死亡率に関するログランク検定）。
【０２７８】
ＩＶ攻撃（試験C）
２回目のワクチン接種の１４日後、全グループ（1〜3）のマウスの外側尾静脈に、０．３ｍｌの適当な生物で静脈内攻撃した。マウスの３グループに、２×１０8ＣＦＵの黄色ブドウ球菌（S. aureus）株ＡＴＣＣ２５９０４で同様に攻撃した。死亡率を攻撃後１０日間毎日記録した。
【０２７９】
ＡＴＣＣ２５９０４分離株で攻撃したマウスを比較する場合、プラセボワクチン接種したグループ１のマウスの９０％が、攻撃後１０日以内に死亡した（表14）。これは、株ＡＴＣＣ２５９０４が、投与した用量レベルでマウスにおいて高い死亡率を生じることを証明した。グループ１のマウスと対照的に、（鉄欠乏条件での成長後に、株ATCC25904から抽出されたタンパク質, SIRP抽出物をワクチン接種した）グループ２のわずか４０％のマウスが、攻撃後１０日以内に死亡した。これらの結果は、株ＡＴＣＣ２５９０４で攻撃したマウスは、鉄欠乏ＡＴＣＣ２５９０４に由来するタンパク質組成物のワクチン接種によって有意に防御される（p =0.0164, 死亡率に関するログランク検定）ことを説明した。さらに、（組換えポリペプチド, rSIRP7をワクチン接種した）グループ３のわずか４０％のマウスが、攻撃後１０日以内に死亡し、組換えタンパク質は、ＡＴＣＣ２５９０４株での攻撃に対して有意な防御を提供することを示した（p =0.0255, 死亡率に関するログランク検定）。
【０２８０】
結果を表１４及び図１６１に示す。
表１４．黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ分離株２５９０４での攻撃後の、ワクチン接種したマウス及びワクチン接種していないマウスの死亡率。
【０２８１】
【表１４】
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【０２８２】
実施例２０
組換えで調製したポリペプチドを使用した受動免疫
実施例１６に記載されるように調製した組換えポリペプチドの組成物をマウスにワクチン接種したことを除いて、実施例８に記載されるように、ポリクローナル抗体組成物を調製した。
【０２８３】
実施例９に記載されるように、生じた抗体組成物をマウスを受動免疫化するために使用した。免疫化したマウスを、実施例９に記載されるにように攻撃した。
【０２８４】
免疫化したマウスは、ワクチン接種していないマウス及びプラセボワクチン接種したマウスと比較して死亡率の減少を示すであろう。
【０２８５】
実施例２１
組換え生成されたポリペプチドの大規模発酵及び単離
実施例１４の組換え大腸菌のマスター種のストックを、２０００ｍｌの無菌ＲＭ培地（１リットル当り20gのカザミノ酸, 60g Na2HPO4, 30g KH2PO4, 5g NaCl 10g NH4Cl 及び100ug/ml アンピシリン）中で３７℃で８時間生物を成長させることによって調製することができる。１０，０００×ｇ、３０分間の遠心分離によって、細菌を回収することができる。培養物を遠心分離（10,000xg）によって２回洗浄することができ、２０％無菌グリセロールを含有する５００ｍｌの無菌ＲＭ培地中で最終細菌ペレットを再懸濁する。１ミリリットルの培養物を２ｍｌのｃｒｙｏｖｉａｌに移送し、−８５℃で保存する。
【０２８６】
２ｇのカザミノ酸及び０．５％グルコースを含有することを除いて、上記培地を含有する１００ｍｌの培養物フラスコに播種するために、ｃｒｙｏｖｉａｌ（1ml）の組換えマスター種のストックを使用することができる（「修飾ＲＭ培地」）。培養物を３７℃で７時間インキュベートした後、２リットルの修飾ＲＭ培地中に播種し、さらに４時間３７℃で成長させる。この培養物を使用し、カザミノ酸の最終濃度が２０ｇ／リットルとなることを除いて、２０リットルの修飾ＲＭ培地を充填した３０リットルのＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ＢＩＯＦＬＯＷ４の卓上発酵槽に播種することができる（「発酵ＲＭ培地」）。３０％ＮａＯＨ及び１０％ＨＣｌでの自動滴定によってｐＨの発酵培地を６．９〜７．２に維持する。発酵培養物を３５０回転／分で攪拌し、培養物を３７℃で１１リットル／分で通気する。起泡を０．４％のシリコン消泡剤（Antifoam-B, J. T. Baker, NJ）の添加によって自動的に制御する。これらの条件において４時間、培養物を連続して成長させた後（OD600=4.0-6.0）、培養物を、１１０リットルの発酵ＲＭ培地及び０．２％消泡剤を充填した１５０リットルの発酵槽（W. B. Moore, Easton PN）中に注ぎ込む。発酵のパラメータを次の通りとする：６５０ｒｐｍ、６０％ＤＯ、５０ｓｌｐｍ エアー、１０ｐｓｉ背圧、３７℃、及びＮａＯＨで７．２に維持したｐＨ。対数期の後半の成長に達した後（約６時間, OD600=15.0）、１５０ｕｇ／ｍｌのＩＰＴＧの添加によって組換えタンパク質を誘発する。発酵をさらに３時間成長させ、発酵槽の温度を１８℃まで低下させることによって発酵を終了する（1:100希釈でOD600 20-25）。
【０２８７】
発酵後、組換えで生成されたポリペプチドを、従来の方法によって回収する。細胞を（例えば、ホモジナイズによって）破砕し、組換えで生成されたポリペプチドが放出され、これらの一部は可溶性であり他の一部は不溶性である。
【０２８８】
可溶性ポリペプチドを接線流濾過によって濃縮し、界面活性剤で可溶化し、金属親和性クロマトグラフィーによって回収した。回収した可溶性ポリペプチドを、実施例１６において可溶性ポリペプチドの単離に関して記載されるように単離する。
【０２８９】
不溶性タンパク質を高速遠心分離によって回収する。不溶性ポリペプチドのペレットを回収し、続いて実施例１６において不溶性ポリペプチドの単離に関して記載されるように単離する。
【０２９０】
実施例２２
マウスのワクチン接種
実施例１６に記載されるように、組換えで生成されたＳｉｒＡ、ＳＹＮ２、ＦｈｕＤ、及びＭｎｔＣポリペプチドを調製し単離する。
【０２９１】
Ｈａｒｌａｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Indianapolis, IN）から入手した体重１６〜２２グラムの３０匹（N=30）のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウスを、３つのグループに等しく分配する（10マウス/グループ）。ポリカーボネートマウスケージ中でマウスを飼育する（ケージ当り、N =5マウス）。餌及び水を全マウスに自由に供給する。マウスに皮下に０．１ｍｌの適当な組成物を１４日の間隔をあけて２回次の通りワクチン接種する：
グループ１：オボアルブミン（40μｇ/100μｌ）をワクチン接種したプラセボ。
グループ２：鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ２５９０４タンパク質をワクチン接種したもの（40μｇ/100μｌ）。
グループ３：組換えポリペプチドＳｉｒＡ、ＳＹＮ２、ＦｈｕＤ、及びＭｎｔＣ（各10μｇ/100μｌ, 総タンパク質40μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
【０２９２】
実施例１９に記載されるように、マウスに攻撃する。グループ３のマウスは、グループ１のマウスと比較して死亡率の低下を示す。
【０２９３】
実施例２３
マウスのワクチン接種
実施例１６に記載されるように、組換えで生成されたＰｆｌＢポリペプチドを調製し、単離する。
【０２９４】
Ｈａｒｌａｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Indianapolis, IN）から入手した体重１６〜２２グラムの３０匹（N=30）のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウスを、３つのグループ中に等しく分配する（10マウス/グループ）。マウスをポリカーボネートマウスケージ中で飼育する（ケージ当り、N =5マウス）。餌及び水を全マウスに自由に供給する。次の通り、０．１ｍｌの適当な組成物を１４日の間隔をあけて２回マウスの皮下にワクチン接種する：
グループ１：オボアルブミン（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したプラセボ。
グループ２：鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ２５９０４タンパク質（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
グループ３：組換えポリペプチドＰｆｌＢ（各10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
【０２９５】
実施例１９に記載されるように、マウスに攻撃する。グループ３のマウスは、グループ１のマウスと比較して、死亡率の低下を示す。
【０２９６】
実施例２４
マウスのワクチン接種
実施例１６に記載されるように、組換えで生成されたＯｐｐ１Ａポリペプチドを調製し単離する。
【０２９７】
Ｈａｒｌａｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Indianapolis, IN）から入手した体重１６〜２２グラムの３０匹（N=30）のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウスを、３つのグループに等しく分配する（10マウス/グループ）。マウスをポリカーボネートマウスケージ中で飼育する（ケージ当り、N =5マウス）。餌及び水を全マウスに自由に供給する。次の通り、マウスの皮下に０．１ｍｌの適当な組成物を、１４日の間隔をあけて２回ワクチン接種する：
グループ１：オボアルブミン（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したプラセボ。
グループ２：鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ２５９０４タンパク質（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
グループ３：組換えポリペプチドＯｐｐ１Ａ（各10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
【０２９８】
実施例１９に記載されるように、マウスに攻撃する。グループ３のマウスは、グループ１のマウスと比較して死亡率の低下を示す。
【０２９９】
実施例２５
マウスのワクチン接種
実施例１６に記載されるように、組換えで生成されたＳｉｒＡポリペプチドを調製し単離する。
【０３００】
Ｈａｒｌａｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Indianapolis, IN）から入手した体重１６〜２２グラムの３０匹（N=30）のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウスを、３つのグループ（10マウス/グループ）に等しく分配する。マウスをポリカーボネートマウスケージ中で飼育する（ケージ当り、N =5マウス）。餌及び水を全マウスに自由に供給する。次の通り、マウスの皮下に０．１ｍｌの適当な組成物を１４日の間隔をあけて２回ワクチン接種する：
グループ１：オボアルブミン（10μｇ/100μｌ）ワクチン接種したプラセボ。
グループ２：鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ２５９０４タンパク質（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
グループ３：組換えポリペプチドＳｉｒＡ（各10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
【０３０１】
実施例１９に記載されるように、マウスに攻撃する。グループ３のマウスは、グループ１のマウスと比較して死亡率の低下を示す。
【０３０２】
実施例２６
マウスのワクチン接種
実施例１６に記載されるように、組換えで生成されたＳＹＮ２ポリペプチドを調製し単離する。
【０３０３】
Ｈａｒｌａｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Indianapolis, IN）から入手した体重１６〜２２グラムの３０匹（N=30）のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウスを、３つのグループ（10マウス/グループ）に等しく分配する。マウスをポリカーボネートマウスケージ中で飼育する（ケージ当り、N = 5 マウス）。餌及び水を全マウスに自由に供給する。次の通り、マウスの皮下に０．１ｍｌの適当な組成物を１４日の間隔をあけて２回ワクチン接種する：
グループ１：オボアルブミン（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したプラセボ。
グループ２：鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ２５９０４タンパク質（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
グループ３：組換えポリペプチドＳＹＮ２（各10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
【０３０４】
実施例１９に記載されるように、マウスに攻撃する。グループ３のマウスは、グループ１のマウスと比較して死亡率の低下を示す。
【０３０５】
実施例２７
マウスのワクチン接種
実施例１６に記載されるように、組換えで生成されたＦｈｕＤポリペプチドを調製し単離する。
【０３０６】
Ｈａｒｌａｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Indianapolis, IN）から入手した体重１６〜２２グラムの３０匹（N=30）のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウスを、３つのグループ（10マウス/グループ）に等しく分配する。マウスをポリカーボネートマウスケージ中で飼育する（ケージ当り、N = 5マウス）。餌及び水を全マウスに自由に供給する。次の通り、マウスの皮下に０．１ｍｌの適当な組成物を１４日の間隔をあけて２回ワクチン接種する：
グループ１：オボアルブミン（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したプラセボ。
グループ２：鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ２５９０４タンパク質（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
グループ３：組換えポリペプチドＦｈｕＤ（各10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
【０３０７】
実施例１９に記載されるように、マウスに攻撃する。グループ３のマウスは、グループ１のマウスと比較して死亡率の低下を示す。
【０３０８】
実施例２８
マウスのワクチン接種
実施例１６に記載されるように、組換えで生成されたＳＹＮ１ポリペプチドを調製し単離する。
【０３０９】
Ｈａｒｌａｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Indianapolis, IN）から入手した体重１６〜２２グラムの３０匹（N=30）のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウスを、３つのグループ（10マウス/グループ）に等しく分配する。マウスをポリカーボネートマウスケージ中で飼育する（ケージ当り、N = 5 マウス）。餌及び水を全マウスに自由に供給する。次の通り、マウスの皮下に０．１ｍｌの適当な組成物を１４日の間隔をあけて２回ワクチン接種する：
グループ１：オボアルブミン（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したプラセボ。
グループ２：鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ２５９０４タンパク質（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
グループ３：組換えポリペプチドＳＹＮ１（各10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
【０３１０】
実施例１９に記載されるように、マウスに攻撃する。グループ３のマウスは、グループ１のマウスと比較して死亡率の低下を示す。
【０３１１】
実施例２９
マウスのワクチン接種
実施例１６に記載されるように、組換えで生成されたＭｎｔＣポリペプチドを調製し単離する。
【０３１２】
Ｈａｒｌａｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Indianapolis, IN）から入手した体重１６〜２２グラムの３０匹（N=30）のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウスを、３つのグループ（10マウス/グループ）に等しく分配する。マウスをポリカーボネートマウスケージ中で飼育する（ケージ当り、N =5マウス）。餌及び水を全マウスに自由に供給する。次の通り、マウスの皮下に０．１ｍｌの適当な組成物を、１４日の間隔をあけて２回ワクチン接種する：
グループ１：オボアルブミン（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したプラセボ。
グループ２：鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ２５９０４タンパク質（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
グループ３：組換えポリペプチドＭｎｔＣ（各10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
【０３１３】
実施例１９に記載されるように、マウスに攻撃する。グループ３のマウスは、グループ１のマウスと比較して死亡率の低下を示す。
【０３１４】
実施例３０
マウスのワクチン接種
実施例１６に記載されるように、組換えで生成されたＳｓｔＤポリペプチドを調製し単離する。
【０３１５】
Ｈａｒｌａｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Indianapolis, IN）から入手した体重１６〜２２グラムの３０匹（N=30）のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウスを、３つのグループに等しく分配する（10マウス/グループ）。マウスをポリカーボネートマウスケージ中で飼育する（ケージ当り、N =5マウス）。餌及び水を全マウスに自由に供給する。次の通り、マウスの皮下に０．１ｍｌの適当な組成物を１４日の間隔をあけて２回ワクチン接種する：
グループ１：オボアルブミン（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したプラセボ。
グループ２：鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ２５９０４タンパク質（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
グループ３：組換えポリペプチドＳｓｔＤ（各10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
【０３１６】
実施例１９に記載されるように、マウスに攻撃する。グループ３のマウスは、グループ１のマウスと比較して死亡率の低下を示す。
【０３１７】
実施例３１
マウスのワクチン接種
実施例１６に記載されるように、組換えで生成されたＦｈｕＤ２ポリペプチドを調製し単離する。
【０３１８】
Ｈａｒｌａｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Indianapolis, IN）から入手した体重１６〜２２グラムの３０匹（N=30）のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウスを、３つのグループに等しく分配する（10マウス/グループ）。マウスをポリカーボネートマウスケージ中で飼育する（ケージ当り、N =5マウス）。餌及び水を全マウスに自由に供給する。次の通り、マウスの皮下に０．１ｍｌの適当な組成物を１４日の間隔をあけて２回ワクチン接種する：
グループ１：オボアルブミン（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したプラセボ
グループ２：鉄制限下で発現されたＡＴＣＣ２５９０４タンパク質（10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
グループ３：組換えポリペプチドＦｈｕＤ２（各10μｇ/100μｌ）をワクチン接種したもの。
【０３１９】
実施例１９に記載されるように、マウスに攻撃する。グループ３のマウスは、グループ１のマウスと比較して死亡率の低下を示す。
【０３２０】
実施例３２
組換えポリペプチドは、黄色ブドウ球菌（S. aureus）感染で生じる血清によって特異的に結合される。
【０３２１】
実施例４に記載されるように、黄色ブドウ球菌（S. aureus）を攻撃生物として調製し、実施例５又は１９に記載されるようにマウスに攻撃するために使用した。攻撃前のマウス又はプラセボワクチンを受け、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｎｅｗｍａｎで攻撃し回復した（回復期）マウスから血清を入手した。攻撃したマウス及び攻撃していないマウスから血液を回収し、遠心分離によって血清を得た。実施例１５に記載されるように免疫ブロット方法を使用して、血清を使用して、個々の組換えで生成されたポリペプチドの反応性を評価した。
【０３２２】
攻撃前にマウスから回収した血清は、いずれの組換えポリペプチドとも反応しなかった。黄色ブドウ球菌（S. aureus）での攻撃の結果として生成された血清中の抗体は、図２０２に示すように組換えで生成されたポリペプチドと反応した。黄色ブドウ球菌（S. aureus）の感染中に発現されるポリペプチドに対して産生される抗体は、ポリペプチドの組換えで生成された変異体を認識する。したがって、組換えポリペプチドは、例えば、黄色ブドウ球菌（S. aureus）での攻撃によって発現される免疫学的ポリペプチドの免疫学的断片に関する免疫学的置換体である。
【０３２３】
実施例３３
組換えで生成されたポリペプチド及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞から直接的に抽出された鉄制御膜ポリペプチドに対する抗体は交差反応する。
【０３２４】
実施例１６に記載されるように、組換え鉄制御ポリペプチドは発現され精製される。鉄制御膜ポリペプチドは、実施例１に記載されるように、低鉄条件で成長させた黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞から直接的に抽出される。組換えポリペプチドは、実施例１６に記載されるようにワクチン中に製剤され、実施例１７に記載されるようにマウスにワクチン接種するために使用される。実施例２に記載されるように黄色ブドウ球菌（S. aureus）抽出ポリペプチドをワクチン中に製剤し、実施例３に記載されるようにマウスにワクチン接種するために使用する。組換えポリペプチドワクチンのために、単一の組換えポリペプチドをワクチン中に製剤する。実施例１５に記載されるようにワクチン接種したマウス由来の抗血清を回収し、免疫ブロットのために使用する。
【０３２５】
組換えで生成された鉄制御ポリペプチドをワクチン接種した動物由来の抗血清は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抽出した鉄制御ポリペプチドの分離の後、抽出した鉄制御ポリペプチドとの反応を評価するためにさらに使用する。組換えポリペプチドをワクチン接種した動物由来の抗血清は、抽出したポリペプチドと組換えで生成したポリペプチドとの間に抗体エピトープが保存される、適当なＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離し抽出したポリペプチドに結合するであろう。
【０３２６】
抽出した鉄制御ポリペプチドをワクチン接種した動物由来の抗血清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる組換え鉄制御ポリペプチドの分離の後に、個々の組換えで生成した鉄制御ポリペプチドとの反応を評価するためにさらに使用する。抽出したポリペプチドをワクチン接種した動物由来の抗血清は、組換えで生成したポリペプチドと抽出したポリペプチドとの間に抗体エピトープが保存される、適当なＳＤＳ−ＰＡＧＥ−分離した組換えポリペプチドに結合するであろう。
【０３２７】
実施例３４
組換え黄色ブドウ球菌（S. aureus）タンパク質のウエスタンブロット分析
実施例１６に記載されるように、組換え黄色ブドウ球菌（S. aureus）タンパク質を調製し、続いてドデシル硫酸ナトリウムの１０％のポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜（BioRad, Hercules, CA）に移送した。個々のブロットを、（ブドウ球菌感染症が報告されていない）健康なヒトドナー又は回復期（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（S. aureus））のヒトドナー由来の血清と反応させた。
【０３２８】
各組換えのヒスチジンタグが付けられたタンパク質を同定するための対照として、各ブロットを抗ヒスチジン抗体（Rockland Immunochemicals, Inc., Gilbertsville, PA and Qiagen GmbH, Hilden, Germany）で共インキュベートし、２色分析を使用して組換えタンパク質を同定した。全ての一次抗血清を１：１０００希釈で使用し、ロッカー上で１時間インキュベートした。非結合抗体を除去するための数回のＴＢＳ＋０．０５％ツイーンでの洗浄後に、続いて膜を８００ＣＷ色素結合ヒト二次抗体（Rockland Immunochemicals, Inc., Gilbertsville, PA）、６８０色素結合マウス二次抗体（Li-cor Biosciences, Lincoln, NE）又は８００ＣＷ色素結合ウサギ二次抗体（Li-Cor Biosciences）で、製造者に推奨される希釈で、１時間、暗所においてインキュベートした。膜をさらに３〜５回、ＴＢＳ＋０．０５％ツイーンで、最後の洗浄はＴＢＳのみの中で洗浄した。オデッセイ赤外線イメージングシステム（Li-Cor Biosciences）を使用して、蛍光シグナル（680及び800）を検出した。結果を図２０３（健康）及び図２０４（回復期）に示す。
【０３２９】
実施例３５
金属制御ポリペプチドの黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＤＵ５８７５表面発現
黄色ブドウ球菌（S. aureus）株ＤＵ５８７５（cap-, spa-）を、鉄豊富条件（TSB+0.3mM 塩化第二鉄）又は鉄欠乏条件（TSB+lmM ジピリジル）で約０．６のＯＤ600まで成長させた。
【０３３０】
図２０５のパネルＡ〜Ｃにおいて、黄色ブドウ球菌（S. aureus）株ＤＵ５８７５を鉄欠乏条件で約０．７５のＯＤ600まで成長させ、凍結した。細菌を解凍し、ＰＢＳ中で洗浄し、ブロッキング段階としてＰＢＳ＋１％Ｐｉｇ ＩｇＧ＋１％ＢＳＡ中で再懸濁した。ＦｈｕＤ、Ｏｐｐ１Ａ又はＰｆｌＢに対して産生されるマウス抗血清を希釈１：１００で使用し、約２×１０6細菌を染色した。負の対照として、免疫前のマウス血清を使用した。続いて細菌をブロッキング緩衝液中で洗浄し、ＡＦ６３３結合ヤギ抗マウス二次抗体でインキュベートし、そしてフローサイトメーター上で分析した。免疫化前のマウス血清１：１００でインキュベートした細菌を、負の対照として使用した。
【０３３１】
図２０５のパネルＤでは、約２．０のＯＤ600まで鉄欠乏条件において黄色ブドウ球菌（S. aureus）株ＤＵ５８７５を成長させ、凍結した。ブロッキング段階として細菌を解凍し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ＋０．２％ Ｐｉｇ ＩｇＧ＋１％ＢＳＡ中で再懸濁した。ｒＳＩＲＰ７に対して産生されたマウス抗血清を希釈１：５０で使用し、負の対照として使用した免疫前のマウス血清で約５×１０7細菌を染色した。続いて細菌をブロッキング緩衝液中で洗浄し、ＡＦ６３３結合ヤギ抗マウス二次抗体でインキュベートし、フローサイトメーター上で分析した。
【０３３２】
このアッセイの結果は、ＳＩＲＰタンパク質に対して産生されたマウス抗体が黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞に結合することを示す。鉄欠乏条件下で成長させた細胞は、鉄豊富条件下で成長させた細胞より多くの抗体を結合し、これはＦｈｕＤ、Ｏｐｐ１Ａ、及びＰｆｌＢが低鉄条件下で高レベルで発現されており、ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）に対する免疫学的活性を誘発することができる抗原であるというさらなる証拠を供している。中央蛍光強度（MFI）の増加は、免疫前のマウス血清のＭＦＩと比較して、抗ＳＩＲＰ抗体が黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞に結合する場合に蛍光が相対的に増加することを証明する。結果を図２０５に示す。
【０３３３】
実施例３６
ルミネックスアッセイを使用し、組換えＳＩＲＰ構成成分ＰｆｌＢ（配列番号353）、Ｏｐｐ１Ａ（配列番号364）、ＳｉｒＡ（配列番号375）、ＳＹＮ２（配列番号386）、ＦｈｕＤ（配列番号397）、ＳＹＮ１（配列番号408）、及びＭｎｔＣ（配列番号419）の組合せ（rSIRP7）又はプラセボで免疫化したマウス由来の脾細胞によってサイトカイン発現を評価し、続いてＳＩＲＰＥ抽出物（SIRPE）又はｒＳＩＲＰ７で再刺激した。数個のサイトカインを再刺激上で上方制御し、そしてＳＩＲＰＥ及びｒＳＩＲＰ７再刺激によって誘発されたサイトカインプロファイルは同様であった。ｒＳＩＲＰ７又はＳＩＲＰＥ再刺激への応答における全体的なサイトカインプロファイルは、Ｔｈｌ／Ｔｈｌ７型免疫応答から期待されるものと似ており、組換えＳＩＲＰ構成成分のワクチン接種は、サイトカイン発現に基づいて測定することができる細胞の免疫応答を誘発することを証明する。
【０３３４】
方法。マウスに１４日あけて２回、５０％ＩＦＡで製剤した７０μｇの総タンパク質（OVA, SIRP抽出物, 又はrSIRP7）をワクチン接種した。ＣＤ４+Ｔ細胞単離キット及びＬＤカラム（Miltenyi Biotec, Inc., Auburn, CA）を使用して、負の選択によって脾細胞懸濁液からＣＤ４+のＴ細胞を精製した。簡潔に言うと、ビオチン標識した抗体を使用し、ＣＤ４+Ｔ細胞を除いて全細胞を標識し、続いてストレプトアビジン結合磁気ビーズを使用してこれらの細胞を混合物から磁気カラムで除去し、高精製されたＣＤ４+Ｔ細胞が残存した。
【０３３５】
ＣＤ３及びＣＤ４発現に基づいて、生じたＣＤ４+Ｔ細胞が、９５％以上純粋であるとわかった。未処理の脾細胞をマイトマイシン−Ｃで処理し、有糸分裂的に不活性な抗原提示細胞を生成した。５×１０5ＣＤ４+Ｔ細胞に添加した４×１０5のＡＰＣに刺激抗原を加え、続いて４２時間のインキュベーションを行った。標準的なアッセイパラメータを使用して、ルミネックスによって上清を分析した。図２０６に結果を示す。
【０３３６】
実施例３７
実施例１に記載される方法を使用して、複数の株（Newman, Reynolds）由来の黄色ブドウ球菌（S. aureus）抽出物を調製した。黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞を１０００μｍの２，２−ジリジルを含有する鉄制限培地（Sigma-Aldrich St. Louis, MO）又は３００μＭのＦｅＣ１3を含有する鉄豊富培地（Sigma-Aldrich St. Louis, MO）中で成長させた。
【０３３７】
鉄豊富及び鉄欠乏培養物由来の黄色ブドウ球菌（S. aureus）膜抽出物内のタンパク質を、ＩＴＲＡＱ及びＬＣＱ質量分析を使用して特定し定量化した。鉄欠乏及び鉄豊富な黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｎｅｗｍａｎ株に関する膜抽出物のアミン修飾された標識を、ＩＴＲＡＱ−８ｐｌｅｘ試薬（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）で、製造者の８Ｐｌｅｘプロトコールに従って、４０．０μｇの膜抽出物（試薬113 対 115）を使用して実施した。カチオン交換クロマトグラフィーをＭＣＸカラム（Waters Corp., Milford, MA）を使用して適用し、ＱＳＴＡＲ ＸＬ質量分析計（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）を使用したＥＳＩモードと連結したＵＬＴＩＭＡＴＥ ３０００ ＮＡＮＯＬＣシステム（Dionex Corp. Bannockburn, IL）を使用してペプチドを分離した。
【０３３８】
鉄豊富培地と比較した、鉄制限培地中で成長させた細胞によって生成された金属制御ポリペプチドの割合を測定した。割合は、タンパク質発現の相対的な測定であり、抽出物中に存在する絶対量のタンパク質を示すデータは提供しない。結果を、表１５に示す。
【０３３９】
【表１５】
2015164949.tif 000040
【０３４０】
実施例３８
好中球による活性酸素種の産生、炎症応答の兆候を測定するために、酸化バーストアッセイを使用することができる。鮮血から好中球を得るために、フレッシュなヒト血液由来の赤血球を１：１０希釈の溶解緩衝液（150mM NH4Cl, 10mM KHCO3, 1mM ニナトリウム EDTA, pH7.4）の添加によって溶解し、室温で１０分間インキュベートし、１０分間４３０×ｇで遠心分離する。チューブインバージョンによって上清を取り除き、ペレット化し、ＰＢＳで２回洗浄し、続いて５ｍｌのＲＰＭＩ−ヘペス５％ＦＣＳ＋グルタミン（完全ＲＰＭＩ）中で再懸濁し、そしてＩＳＯＴＯＮ中の１／５００希釈の細胞懸濁（10ml ISOTON中に20μｌの細胞, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA）後にＭＵＬＴＩＳＩＺＥＲ（Beckman Coulter, Inc., Brea, CA）を使用して数える。
【０３４１】
細菌の調製に関して、黄色ブドウ球菌（S. aureus）株ＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎをＴＳＢ培地中に播種し、５０ｍｌの培地中で３７℃で２０時間成長させる。この培養物から、５ｍｌを４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間ペレット化する。続いてペレットを５０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離によって再ペレット化する。洗浄段階を繰り返し、細菌ペレットを５ｍｌのＰＢＳ中で再懸濁する。細菌を理論密度１．１０9ＣＦＵ／ｍｌに調整し、細胞希釈物を寒天上に蒔き、インキュベートし翌日正確に数え上げる。
【０３４２】
血清を非働化（decomplement）するために、血清を全て５６℃で３０分間インキュベートする。血清及び細胞の混合をポリプロピレン無菌ＤＷプレート中でウェル当り最終体積５００μｌで実施する。各ウェル中に、（表16に示すように）次の試薬を順に添加し：培養物培地（RPMI-ヘペス, グルタミン, 5% FCS）、適当な濃度の生細菌、適当な希釈の血清、補体、適当な濃度のｈＰＭＮ、最後に酸化バーストのマーカーとしてＤＨＲ分子（Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA）。プレートを振盪しながら３７℃で２５分間インキュベートする。氷上で５分間プレートをインキュベートすることによって反応を停止する。
【０３４３】
【表１６】
2015164949.tif 000041
【０３４４】
フローサイトメトリー分析のために、ヒトＰＭＮをこれらのサイズ及び粒度に従って最初に同定し、続いて特異的マーカー（CD35, CD16, GRl, 等）、続いて酸化バーストマーカーの表面発現によって確認する。データは、負の対照グループと比較した、酸化バーストを誘発することができる活性化ｈＰＭＮのパーセントに関して示す（Didier, 2003 ; Ploppa, 2008）。
【０３４５】
実施例３９
オプソニン作用アッセイ
オプソニン作用アッセイ（OPA）を展開し、血清の補体依存性オプソニン活性を測定することによって、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に関する血清の機能食作用活性を推定した。ＯＰＡの概要を表１７に記載する。黄色ブドウ球菌（S. aureus）の２つの株をアッセイにおいて使用する。莢膜又はタンパク質Ａを産生しない株ＤＵ５８７５を、アッセイを最も良く制御するために使用する。莢膜及びタンパク質Ａを発現する株ＬＳＴ４ Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎを、野生型株としてアッセイ中で使用する。アッセイ中で使用する細菌の数は、エフェクター白血球のソース次第であり、濃度が１×１０5ｃｆｕ／ｍｌ〜５×１０7ｃｆｕ／ｍｌの範囲である。健康なヒトボランティア又はヒト前骨髄球性白血病株細胞、ＨＬ６０由来の白血球を食作用エフェクター細胞として使用する。表１７が示すように、アッセイ中で使用したエフェクター細胞の数は、細胞のソースに依存的である。幼齢ウサギの血清を補体のソースとして使用し、ウサギ血清の機能補体活性を最大にし、一方毒性を最小にするために、血清のロットに応じて１％〜１０％に希釈する。免疫前又は後のオプソニン活性に関して試験を行う血清を、５６℃で３０分間非働化し、希釈１：２０〜１ ：２，０００，０００でアッセイ中で試験する。食作用を黄色ブドウ球菌（S. aureus）の生菌数（cfu）によって測定する。免疫前の血清と比較して、活性化補体との組合せでのｃｆｕの有意な減少を証明する試験血清は、オプソニンだと考えられる。アッセイデータを、不等分散の片側分布を使用したスチューデントｔ検定によって分析する（Kim 2010; Stranger- Jones 2006; Dryla 2005）。
【０３４６】
【表１７】
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【０３４７】
実施例４０
（生体内（in vivo）での）免疫機構実験
他の実施例において、ワクチンタンパク質がマウスへ防御を与える免疫機構を評価する。これらの実験は、次の２つのタイプを含むことができる：（1）ワクチン攻撃実験において、特異的な免疫成分が防御に必要であるかを決定するために、遺伝子ノックアウトマウスを使用すること；及び（2）移送した成分が防御を与えるために十分であるかを試験するために、免疫化したドナーマウス由来の免疫細胞を細菌攻撃前に未処理のレシピエント中に移送する養子移植実験。
【０３４８】
遺伝子ノックアウトマウスにおけるワクチン攻撃実験を含む実施例に関して、マウスは商業的ベンダーから購入することができ、複数の十分に特徴付けられた株、例えば、Ｂ細胞ノックアウト（μＭＴ）、Ｔ細胞ノックアウト（TCRα）、及び種々のサイトカイン、例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−１α、ＴＮＦα、ＩＬ−１７等のノックアウトを含むことができる。実施例３に記載されるようにマウスを免疫化し、続いて実施例５に記載されるように黄色ブドウ球菌（S. aureus）で攻撃することができる。同一の遺伝的背景（Balb/c）を有する野生型マウスの使用により、黄色ブドウ球菌（S. aureus）に対するワクチン介在の防御に対する、ノックアウトの効果を測定するための適当な対照を提供することができる。例えば、細菌攻撃に応答して、ワクチン接種した対照マウスと比べて、ワクチン接種したＢ細胞ノックアウトマウスがより急速に死亡する、又はより多くが死亡する場合、Ｂ細胞（又はこの生成物）は黄色ブドウ球菌（S. aureus）に対するワクチン介在の防御に重要であると結論付けることができる。これらのストラテジーは、ワクチン防御への様々な免疫成分の寄与を測定する分野において標準的な実施である（Spellberg, 2008; Lin, 2009）。
【０３４９】
例えば、免疫成分の養子移植を含む場合、養子移植のための組織を生じるために実施例３に記載されるように野生型Ｂａｌｂ／ｃドナーマウスを免疫化することができる。これらのマウスは続いて二次免疫化の２〜４週間後に安楽死させ、心穿刺によって血液を回収し二次リンパ組織（リンパ節及び脾臓）を回収する。回収したリンパ節は：腋窩、上腕、腸間膜、鼠径、表層頸部、深部頸部、及び腰部リンパ節を含む。血清を、標準的な方法、例えば遠心分離に基づく血清セパレーターを使用して血液から単離し、続いて静脈内又は腹腔内注射によってレシピエントマウスの別々のセットに移し戻す。レシピエント当り１〜３匹のドナーマウスの使用は、血清の移送に関して妥当な割合であり、体積で最大０．５ｍｌ生じうる。さらに、ドナーのリンパ組織由来のＴ細胞を、当技術分野で標準的な実行方法である抗体及び磁気ビーズ濃縮技術（Miltenyi Biotec）を使用して精製することができる。これらの方法を使用して、９５〜９９％の細胞純度を達成することは典型的であり、特異的な系譜マーカーへの抗体による細胞表面タンパク質の染色及びフローサイトメトリーによって細胞を試験することによって評価される。目的の細胞集団（例えば、ＣＤ４+Ｔ細胞, ＣＤ８+Ｔ細胞, 等）を静脈内注射によってレシピエント動物に移し戻す（レシピエント当り2,000,000〜5,000,000個のＴ細胞）。レシピエントマウスにＴ細胞（又はＴ細胞のサブセット）、免疫血清又は両方を投与する。
【０３５０】
負の対照として、血清及びＴ細胞単離のためにプラセボ免疫化した動物もまた使用することができ、続いて未処理のレシピエント中に戻す。正の対照として、標準的な防御的ワクチンで免疫化したレシピエントのグループを、細菌攻撃に対する防御的有効性のベースライン評価を提供するために含めることができる。
【０３５１】
レシピエントマウスは様々な移送細胞又は血清を受けるとすぐに、実施例５に記載されるように黄色ブドウ球菌（S. aureus）で攻撃する。死亡割合及び死亡率に基づいて、様々な免疫成分のワクチン防御への相対的な寄与を評価することができる。例えば、ワクチン接種したドナー由来のＴ細胞を投与したレシピエントが正の対照と同率で攻撃から防御される場合、ワクチン介在の防御にＴ細胞は十分であると結論付けられる。この実験用ストラテジーはワクチンの免疫学的メカニズムを評価する技術分野で標準的である（Spellberg, 2008; Lin, 2009）。
【０３５２】
実施例４１
鉄取り込みアッセイの抑制
ＳＩＲＰ成分に対して産生された抗体が鉄取り込みによって細胞成長を抑制するかを評価するために、抗ＳＩＲＰ抗血清でプレインキュベートした細菌細胞を使用して、鉄取り込み／移送アッセイのブロックを行うことができる。任意の株由来の黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞をキレート化した又は鉄リッチな培地中でオーバーナイトで成長させる。細胞を同一培地中で継代培養し、対数期の中間部〜後半部まで成長させ、ペレット化しＰＢＳ中で抗ＳＩＲＰ抗血清又は対照抗血清で最大１時間インキュベートする。０．４５μＭのフィルターを使用した濾過によって細胞を回収し、続いて環境鉄を排除するためにＣｈｅｌｅｘ−１００処理最少培地中で再懸濁した。簡潔に言うと、細胞を振盪する。一方で、ニトリロ三酢酸で放射標識した55ＦｅＣｌ2（又は他の放射標識した鉄分子）と鉄ソース（例えば, フェリクローム）を混合し、数分間インキュベートする。
【０３５３】
鉄の取り込みを開始するために、１０ｍｌの鉄非含有培養物チューブ中で、少量の一定分量（例えば, 10μｌ）の放射標識した鉄混合物を細胞（1ml体積）に添加した。チューブを周期的にボルテックスし且つ膜フィルター上に濾過した一定分量をサンプリングしてインキュベートし、ＬｉＣｌで洗浄した。乾燥後、膜をシンチレーション液体中でカウントし、鉄の取り込みを定量化した。抗ＳＩＲＰ抗血清でプレインキュベートした細胞は、対照抗血清でプレインキュベートした細胞よりゆっくり鉄を取り込むに違いない（Sebulsky, 2000; Goel, 2001）。
【０３５４】
実施例４２
高収率タンパク質精製プロトコール
一部の実施例において、組換えｒＳＩＲＰを高収率方法を使用して精製した。ポリペプチドのより高い収率及び純度のために、この方法を最適化する。組換え生成されたポリペプチドを含有する細菌ペレットの再懸濁によって、２０ｍＭ トリスｐＨ９；リゾチーム（100μｇ/ml 最終）及びＭｇＣｌ2（1mM 最終）で補完した３００ｍＭ ＮａＣｌ中で当該方法を実施する。続いて、穏やかなロッキングをしながら試料を４℃で１５分間インキュベートする。１５分後、１Ｕ／ｍｌのｂｅｎｚｏｎａｓｅを添加し、試料を１時間室温でインキュベートする。遠心分離（20,000xg, 20分, 4℃）後に得られた可溶性溶解物を０．４５μｍフィルターで濾過し、ニッケル−Ｈｉｓ結合樹脂がパックされた平衡化５ｍｌの重力カラム（Novagen 69670-4, EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ）に添加する。製造者の説明書に従って、Ｎ−Ｈｉｓ6−タンパク質の精製を実施する。Ｎ−Ｈｉｓ6−タンパク質の精製を、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ カラム（GE Healthcare Bioscienes, Piscataway, NJ）を使用して終了させる。カラムを、ＢｉｏＣＡＤ ＦＰＬＣ（Applied Biosystems Inc., Foster City, CA）を使用して２０ｍＭ トリス ｐＨ９；３００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化し、１５ｍｌのタンパク質試料を流速１．５ｍｌ／分でＨｉＬｏａｄカラム上にロードする。移動相として２０ｍＭトリスｐＨ９；３００ｍＭ ＮａＣｌを使用した流速１．８ｍｌ／分でのランタイム３．５時間後に、試料を溶出する。
【０３５５】
試料中の全タンパク質の完全な溶解性を確実にするために、１５％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、８Ｍ尿素、及び２．５％３−（［３−クロアミドプロピル］ジメチルアンモニウム）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（CHAPS）を使用するＢＣＡ（Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL）手順の修飾バージョンを使用してポリペプチドを定量化する。ＢＣＡ反応フェーズ中にタンパク質の溶解性を維持するために、アッセイはまたＢＣＡ作用試薬に添加した５％ＳＤＳから成る。商品パンフレットに従って、ＢＣＡの読み取り及び分析を実施する。
【０３５６】
濃度測定分析のために、３．０μｇの最終生成物抗原を純度に関して１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥを使用して定量化し、クーマシーで染色し、そしてＯＤＹＳＳＥＹスキャナー（LiCor Biosciences, Lincoln, NE）を使用してイメージ化した。染色したゲルをスキャンし、総エリアに対する主要成分の領域を決定した。Ｅｎｄｏｔｒａｐ ｂｌｕｅ ｏｎｅ／ｅｎｄｏｓａｆｅ キット（Hyglos GmbH, Regendburg, Germany）を使用して残存内毒素を取り除いた。最終バッチをＰＢＳ保存緩衝液中１．０ｍｇ／ｍｌ〜４．０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で、−７０℃以下で適当な一定分量で保存した。
【０３５７】
明細書中に記載される全特許、特許出願、及び公報、並びに電子的に利用可能な資料（例えば, ヌクレオチド配列寄託、例えば、GenBank及びRefSeq、並びにアミノ酸配列寄託、例えば、SwissProt、PIR、PRF、PDB、並びに、GenBank及びRefSeqの注釈付翻訳領域からの翻訳等）の全ての開示内容は、参照により組み込まれている。本出願の開示内容と参照により明細書中に組み込まれる任意の文献の開示内容との間に何らかの矛盾が存在する場合、本出願の開示が優先されるべきである。上述の詳細な説明及び実施例は、単に理解の明確化のために供したものであり、これらから不必要に限定解釈してはならない。本発明は、示され且つ記載される正確且つ詳細な説明に限定されず、特許請求の範囲で特許請求する本発明には当業者にとって明らかである変形が含まれる。
【０３５８】
特に記載しない限り、明細書及び特許請求の範囲の中で使用される成分、分子量、及びその他の量を表わす数値はいずれも、用語「約」により、全ての場合において修飾されるものと解すべきである。従って、これとは反対の記載が別途ない限り、明細書及び特許請求の範囲中で説明される数値パラメータは概算値であり、本発明によって得ようとする目的の特性に応じて変化し得る。特許請求の範囲に関する均等論を制限するものではないが、最低限でも、各数値パラメータを解釈する際には、少なくとも報告値の有効桁数を考慮し、従来の端数処理の手法（rounding techniques）を用いるべきである。
【０３５９】
発明の広い範囲を規定する数値範囲及びパラメータは概算値であるが、個々の実施例に記載した数値は、可能な限り正確に報告した。しかしながら、何れの数値も、対応する試験の測定値に見られる標準偏差に応じて、必然的にある範囲を内在することになる。
【０３６０】
見出しは何れも読者の便宜のためのものであり、特に明示した場合を除いて、その見出しに続く本文の意味を限定するために用いるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２３】
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【図１２４】
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【図１２５】
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【図１２６】
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【図１２７】
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【図１２８】
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【図１２９】
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【図１３０】
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【図１３１】
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【図１３２】
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【図１３３】
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【図１３４】
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【図１３５】
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【図１３６】
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【図１３７】
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【図１３８】
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【図１３９】
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【図１４０】
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【図１４１】
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【図１４３】
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【図１４４】
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【図１４５】
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【図１４６】
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【図１４７】
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【図１４８】
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【図１４９】
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【図１５０】
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【図１５１】
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【図１５２】
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【図１５３】
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【図１５４】
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【図１５５】
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【図１５６】
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【図１５７】
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【図１５８】
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【図１５９】
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【図１６０】
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【図１６１】
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【図１６２】
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【図１６３】
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【図１６４】
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【図１６５】
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【図１６８】
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【図１６９】
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【図１７０】
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【図１７１】
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【図１７２】
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【図１７３】
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【図１７４】
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【図１７５】
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【図１７９】
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【図１８０】
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【図１８２】
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【図１８３】
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【図１８４】
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【図１８５】
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【図１８６】
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【図１８７】
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【図１８８】
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【図１８９】
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【図１９０】
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【図１９１】
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【図１９２】
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【図１９３】
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【図１９４】
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【図１９５】
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【図１９６】
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【図１９７】
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【図１９８】
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【図１９９】
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【図２００】
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【図２０１】
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【図２０２】
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【図２０３】
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【図２０４】
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【図２０５】
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【図２０６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年6月11日(2015.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９２％の配列同一性を有する第一の単離ポリペプチドであって、但し、該第一の単離ポリペプチドがアミノ末端においてさらなるアミノ酸を含む場合には、該さらなるアミノ酸が配列番号３９９のＮ末端アミノ酸１〜２６と比較して、少なくとも２つのアミノ酸修飾を含むことを条件とする、第一の単離ポリペプチド、及び
少なくとも１つの第二のポリペプチドであって、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、
８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有する、第二のポリペプチド、
を含んでなる、組成物。
【請求項２】
鉄キレート剤非含有の培地において成長させた場合に、黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離可能であり、且つ１５０ｋＤａ、１３２ｋＤａ、１２０ｋＤａ、７５ｋＤａ、５８ｋＤａ、５０ｋＤａ、４４ｋＤａ、４３ｋＤａ、４１ｋＤａ、４０ｋＤａの分子量を有する単離ポリペプチド；又はこのような単離ポリペプチドの組合せをさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患している又は罹患するリスクがある対象における感染症の治療のための医薬組成物であって、
有効量の第一の単離ポリペプチドであって、ここで該第一の単離ポリペプチドが配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９２％の配列同一性を有し、但し、該第一の単離ポリペプチドがアミノ末端においてさらなるアミノ酸を含む場合には、該さらなるアミノ酸が配列番号３９９のＮ末端アミノ酸１〜２６と比較して、少なくとも２つのアミノ酸修飾を含むことを条件とする、第一の単離ポリペプチド、及び
有効量の第二のポリペプチドであって、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有する、第二のポリペプチド、
を含んでなる、医薬組成物。
【請求項４】
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患している対象における症状の治療のための医薬組成物であって、
有効量の第一の単離ポリペプチドであって、ここで該第一の単離ポリペプチドが配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９２％の配列同一性を有し、但し、該第一の単離ポリペプチドがアミノ末端においてさらなるアミノ酸を含む場合には、該さらなるアミノ酸が配列番号３９９のＮ末端アミノ酸１〜２６と比較して、少なくとも２つのアミノ酸修飾を含むことを条件とする、第一の単離ポリペプチド、及び
少なくとも１つの第二のポリペプチドであって、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有する、第二のポリペプチド、
を含んでなる、医薬組成物。
【請求項５】
前記医薬組成物が：鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離可能であり、且つドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上における電気泳動によって決定される場合、１５０ｋＤａ、１３２ｋＤａ、１２０ｋＤａ、７５ｋＤａ、５８ｋＤａ、５０ｋＤａ、４４ｋＤａ、４３ｋＤａ、４１ｋＤａ、４０ｋＤａの分子量を有する単離ポリペプチド；又はこのような単離ポリペプチドの組合せをさらに含んでなる、請求項３又は４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患している又は罹患するリスクがある対象における感染症の治療のための医薬組成物であって、
第一のポリペプチドに特異的に結合する有効量の第一の抗体であって、ここで上記第一のポリペプチドが配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９２％の配列同一性を有し、但し、該第一のポリペプチドがアミノ末端においてさらなるアミノ酸を含む場合には、該さらなるアミノ酸が配列番号３９９のＮ末端アミノ酸１〜２６と比較して、少なくとも２つのアミノ酸修飾を含むことを条件とする、第一の抗体、及び
第二のポリペプチドに特異的に結合する有効量の第二の抗体であって、ここで第二のポリペプチドが鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有する、第二の抗体、
を含んでなる、医薬組成物。
【請求項７】
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によって生じる感染症に罹患している対象における症状の治療のための医薬組成物であって、
第一のポリペプチドに特異的に結合する有効量の第一の抗体であって、ここで上記第一のポリペプチドが配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９２％の配列同一性を有し、但し、該第一のポリペプチドがアミノ末端においてさらなるアミノ酸を含む場合には、該さらなるアミノ酸が配列番号３９９のＮ末端アミノ酸１〜２６と比較して、少なくとも２つのアミノ酸修飾を含むことを条件とする、第一の抗体、及び
第二のポリペプチドに特異的に結合する有効量の第二の抗体であって、ここで第二のポリペプチドが鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有する、第二の抗体、
を含んでなる、医薬組成物。
【請求項８】
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によってコロニー形成された対象におけるコロニー形成を減少するための医薬組成物であって、
有効量の第一の単離ポリペプチドであって、ここで上記第一の単離ポリペプチドが配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９２％の配列同一性を有し、但し、該第一の単離ポリペプチドがアミノ末端においてさらなるアミノ酸を含む場合には、該さらなるアミノ酸が配列番号３９９のＮ末端アミノ酸１〜２６と比較して、少なくとも２つのアミノ酸修飾を含むことを条件とする、第一の単離ポリペプチド、及び
有効量の少なくとも１つの第二のポリペプチドであって、鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有する、第二のポリペプチド、
を含んでなる、医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬組成物が：鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に黄色ブドウ球菌（S. aureus）から単離可能であり、且つドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上における電気泳動によって決定される場合、１５０ｋＤａ、２９２ｋＤａ、１２０ｋＤａ、７５ｋＤａ、５８ｋＤａ、５０ｋＤａ、４４ｋＤａ、４３ｋＤａ、４１ｋＤａ、４０ｋＤａの分子量を有するポリペプチド；又はこのような単離ポリペプチドの組合せに特異的に結合する抗体をさらに含んでなる、請求項６〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出するためのキットであって、別々の容器中に：
配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９２％の配列同一性を有し、但し、該単離ポリペプチドがアミノ末端においてさらなるアミノ酸を含む場合には、該さらなるアミノ酸が配列番号３９９のＮ末端アミノ酸１〜２６と比較して、少なくとも２つのアミノ酸修飾を含むことを条件とする、単離ポリペプチド；及び、
ポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出する試薬、
を含んでなるキット。
【請求項１３】
配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９２％の配列同一性を有する単離ポリペプチドに特異的に結合する第一の抗体であって、但し、該単離ポリペプチドがアミノ末端において１又は複数のさらなるアミノ酸を含む場合には、該１又は複数のさらなるアミノ酸が配列番号３９９のＮ末端アミノ酸１〜２６と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の欠失又は少なくとも１つのアミノ酸の置換を含むことを条件とする、第一の抗体、及び
第二のポリペプチドに特異的に結合する第二の抗体であって、ここで第二のポリペプチドが鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有する、第二の抗体、
を含んでなる、組成物。
【請求項１４】
ブドウ球菌属（Staphylococcus spp.）によってコロニーを形成された対象においてコロニー形成を減少するための医薬組成物であって、
第一のポリペプチドに特異的に結合する有効量の第一の抗体であって、ここで上記第一のポリペプチドが配列番号３９７のアミノ酸配列と少なくとも９２％の配列同一性を有し、但し、該第一のポリペプチドがアミノ末端においてさらなるアミノ酸を含む場合には、該さらなるアミノ酸が配列番号３９９のＮ末端アミノ酸１〜２６と比較して、少なくとも２つのアミノ酸修飾を含むことを条件とする、第一の抗体、及び
第二のポリペプチドに特異的に結合する有効量の第二の抗体であって、ここで第二のポリペプチドが鉄キレート剤を含んでなる培地においてインキュベートさせた場合に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離可能であり、そして鉄キレート剤非含有の培地中で成長させた場合に、単離不可能であり、８８ｋＤａ、５５ｋＤａ、３８ｋＤａ、３７ｋＤａ、３６ｋＤａ、３５ｋＤａ、又は３３ｋＤａの分子量を有する、第二の抗体、
を含んでなる、医薬組成物。
【外国語明細書】
2015164949000001.pdf