(57)【要約】      （修正有）【課題】表皮バリア機能を向上させて健全な表皮を形成させるとともに、真皮線維芽細胞の老化を抑制させることにより、張り・弾力のある皮膚を形成しうる、副作用がなく、安全性に優れた剤及び化粧料の提供。更には、一成分で複数の肌悩みを一度に解決出来る有効成分の提供。【解決手段】百合科ワスレグサ属のヤブカンゾウ、ホンカンゾウ、ゼンテイカ（ニッコウキスゲ）、ホソバキスゲ、マンシュウキスゲ等の黄花菜の根部を乳酸菌により発酵させて得られる発酵物を有効成分として配合する細胞分化促進剤、バリア機能改善剤、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性抑制剤、ラジカル消去促進剤、及び化粧料。前記乳酸菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍであることが好ましい。【選択図】図−１
2015157770.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄花菜の根部を乳酸菌により発酵させて得られる発酵物を有効成分として配合したことを特徴とする細胞分化促進剤。
【請求項２】
黄花菜の根部を乳酸菌により発酵させて得られる発酵物を有効成分として配合したことを特徴とするバリア機能改善剤。
【請求項３】
黄花菜の根部を乳酸菌により発酵させて得られる発酵物を有効成分として配合したことを特徴とするSA-β-Gal活性抑制剤。
【請求項４】
黄花菜の根部を乳酸菌により発酵させて得られる発酵物を有効成分として配合したことを特徴とするラジカル消去促進剤。
【請求項５】
乳酸菌がLactobacillus plantarumであることを特徴とする請求項１乃至４記載の剤。
【請求項６】
黄花菜の根部を乳酸菌により発酵させて得られる発酵物を有効成分として配合したことを特徴とする化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は黄花菜の根部を乳酸菌で発酵させて得られた発酵物を有効成分とする各種剤であり、細胞分化促進効果、バリア機能改善効果、細胞老化抑制効果、SA-β-Gal活性抑制効果、DPPHラジカル消去活性効果が高い代謝物を有効成分として含有する化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願発明で用いる黄花菜は、ゆり科ワスレグサ属ヤブカンゾウ（Hemerocallis fulva var. kwanso）、ゼンテイカ（ニッコウキスゲ）（H.dumortieri var.esculenta）、ホンカンゾウ（H.fulva var.fulva）、マンシュウキスゲ（H.flava L.）、ホソバキスゲ（H.flava var.  minor）及びこれら類縁植物の総称である。市場で「黄花菜」と称して一般に流通しているのは、黄花菜の「蕾」を乾燥したもので金針菜とも言われ、中華料理では水で戻してスープの具にして食されている。黄花菜を利用した化粧料は、その使用部位を特定しない記載がある場合においても、実際に効果を確認しているのは「黄花菜」の「蕾」である。
具体的には特許文献１には抗酸化、抗炎症、美白作用のある皮膚外用組成物の記載が、特許文献２には線維芽細胞賦活作用、チロシナーゼ活性抑制作用の記載が、特許文献３には脂肪組織の分解を促進することによる痩身効果の記載が、特許文献４にはむくみ防止・改善効果、肌のひきしめ効果の記載が、特許文献５にはタンパク質糖化抑制作用によるシワ改善作用、くすみ改善作用の記載が、特許文献６にはＴｉｅ２活性化効果により、血管の正常化又は安定化によるしわ防止・改善効果の記載が示されている。しかし、これらの効果はいずれも黄花菜植物そのものの抽出物を利用した効果を記載しているものである。
一方、特許文献７には、ユリ科ワスレグサ属に属する植物をタンパク分解酵素等で処理した後、酵母で発酵させて、脱顆粒抑制作用とプロスタグランジンＥ２生成抑制作用、ラジカル消去作用が得られる発酵物を配合したことを特徴とする化粧料の例が記載されている。
【０００３】
しかし、これまでワスレグサ属植物を乳酸菌で発酵させて得られた発酵物を配合したことを特徴とした化粧料の例はない。酵母菌は、自然界では樹液、花蜜、果実などに多く生息しており、糖類を分解してアルコールと炭酸ガスを産生するため古くから、パン、ビール、ワイン、ウイスキー、みそなど、様々な食品の製造に利用されてきた。一方、乳酸菌は糖類を分解して乳酸を産生するため、野菜や豆、米や麦などの植物素材を発酵させることにより、これらの素材の味や香りに変化を与え、産生された乳酸により他の微生物の繁殖を抑えて保存性を向上させることなどに利用されてきた。
【０００４】
このように酵母菌と乳酸菌では、同じ糖類を分解しても代謝される成分は大きく異なっている。したがって、ワスレグサ植物を乳酸菌で発酵処理した場合においても、酵母菌の発酵により産生された物質とは大きく異なっているものと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−０５２１６５
【特許文献２】特開２００６−１４３６７０
【特許文献３】特開２００７−２９７３７２
【特許文献４】特開２００９−０９１３１７
【特許文献５】特開２０１１−１９５５３０
【特許文献６】特開２０１１−２０１８１１
【特許文献７】特開２００８−０５０３２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願発明の課題は副作用がなく、安全性に優れた各種剤を提供することにより、表皮バリア機能を向上させて健全な表皮を形成させるとともに、真皮線維芽細胞の老化を抑制させることにより、張り・弾力のある皮膚を形成しうる化粧料を提供することである。
付属的には、一つの有効成分で複数の肌悩みを一度に解決することが出来る有効成分を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者はかかる従来技術の問題点に鑑み、それらの問題点を解消する方法について鋭意研究を重ねた結果、黄花菜の根部を乳酸菌により発酵させて得られる発酵物を持いることにより上記課題を解決することができることを見出し、本願発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００８】
ゆり科植物の黄花菜の根部を、乳酸菌により発酵させて得られた発酵物は、発酵処理前の黄花菜根部抽出物と比較して強い細胞分化促進効果、バリア機能改善効果、細胞老化抑制効果、SA-β-Gal活性抑制効果、ラジカル消去作用を有するものであることが判明した。しかし、発酵処理を行わなかった抽出物には、細胞分化促進効果、細胞老化抑制効果、SA-β-Gal活性抑制効果、DPPHラジカル消去作用は弱く、乳酸菌で発酵処理されることにより植物中の成分が変化し、効果が増強されたと考えられた。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図−１】細胞分化の評価基準を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本願発明について詳細に説明する。
まず、本願発明の概要を説明する。
大きくは次の工程に分けられる。
（第一工程）黄花菜の根部を浸出させた浸出液を得る工程。
（第二工程）第一工程で得られた浸出液に、予め培養しておいた乳酸菌を植菌し、一定条件下で培養して発酵処理物を得る工程。
（第三工程）第二工程で得られた発酵処理物をろ過等により、発酵培養液と残渣に分ける工程。
（第四工程）第三工程で得られた残渣に更に溶媒等を加えて発酵抽出液を得る工程。
本願では、第三工程、第四工程で得られた有効物を利用する。
【００１１】
本願発明における用語は、以下のように定義する。
（１）浸出液とは、本願で用いる黄花菜の根部を精製水、エタノール等の溶媒で浸出させたものを言い、黄花菜の根部をろ過等により取り除く前の段階のものを指す。適宜熱を加えた、所謂植物抽出液も含まれる。
（２）培養前エキスとは、浸出液から黄花菜の根部をろ過等により、取り除いたものを指す。
（３）発酵処理物とは、浸出液に乳酸菌等を植菌し、一定期間培養したものを指す。
（４）発酵培養液とは、発酵処理物から、ろ過等により発酵させた根部を取り除いたものを指す。
（５）発酵抽出液とは、（４）にて取り除いた発酵済みの根部に、更に精製水などの抽出溶媒を加え、一定条件下で抽出した後、ろ過などにより残渣を取り除いたものを指す。
（６）発酵物とは、発酵培養液と発酵抽出液を合わせた総称である。
本願では、後に乳酸菌で処理した場合と酵母菌で処理した場合の比較実験を行っているが、両者を区別する為、「発酵処理物」を「乳酸菌発酵処理物」と、「発酵培養液」を「乳酸菌発酵培養液」と、「発酵抽出液」を「乳酸菌発酵抽出液」と表示する場合があるが同義である。
また、上記（１）から（６）に定義される処理を行うにあたり、乳酸菌に代えて酵母菌を使用した場合は、「酵母発酵処理物」、「酵母発酵培養液」、「酵母発酵抽出液」、「酵母発酵物」と称する。この場合において「酵母」を「酵母菌」と称する場合があるが、同義である。
【００１２】
本願発明の第一工程で用いられる黄花菜の根部は、ゆり科植物のワスレグサ属ヤブカンゾウ（Hemerocallis fulva var. kwanso）、ゼンテイカ（ニッコウキスゲ）（H.dumortieri var.esculenta）、ホンカンゾウ（H.fulva var.fulva）、マンシュウキスゲ（H.flava L.）、ホソバキスゲ（H.flava var.  minor）及びこれら類縁植物の根部を用いることが出来る。  本願で用いる根部とは、一般概念として根と称される部分全体を指し、地下茎等、地中に伸びた茎の部分を取り出して使用することも可能である。
【００１３】
本願発明の第一工程の浸出液を得る為の溶媒は、水或いは低級アルコール類（メタノール、エタノール、プロパノールなど）もしくはグリコール類（エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリンなど）又はこれらとの混液等が用いることができる。また、必要に応じて乳酸菌の増殖に必要な糖源、栄養素、微量生育因子なども添加しておくことが好ましい。黄花菜の根部と浸出液との混合比（重量比）は、黄花菜の根部の乾燥重量換算で一般に１：１〜１：１０００、好ましくは１：５〜１：１００、より好ましくは１：１０〜１：５０の範囲である。
【００１４】
本願発明の第一工程における浸出液は次のようにして得られる。
まず、浸出しようとする黄花菜の根部を前記溶媒に浸漬、または分散させる。この場合、黄花菜の根部は生のまま用いても、又予め乾燥もしくは半乾燥した上用いてもよい。又、形状としては、採取したものをそのまま用いることもできるが、細断或いは粉砕して微細化すれば、後の発酵工程において発酵効率を上げることができる。本願発明においては、当該浸出液は、浸出させた黄花菜根部を取り除かないまま、次工程である発酵工程に供する。乳酸菌を植菌して発酵させることにより、黄花菜根部の組織を乳酸菌により分解させることが出来る。これにより、従来法による抽出では抽出できなかった成分も抽出が可能となり、今までにない効果を得られる。もっとも、浸出を十分に行っている場合等においては、根部から成分を十分抽出出来ているので、黄花菜根部を取り除いて使用しても差し支えない。この場合は抽出された成分が乳酸菌により発酵されて、新たな有効成分に変換される。その意味では、通常の植物エキスに該当する状態のものであっても浸出液として利用することが出来る。
【００１５】
この黄花菜の根部を浸出させた浸出液は、このまま発酵工程に供することができる。黄花菜の根部を溶媒に浸出させるだけで十分であり、浸出時間は特段設ける必要はないが、黄花菜の腐敗など生じない程度に一定時間の浸出時間を適宜設けても良い。浸出液は、これを発酵工程に供する前に、殺菌を行って発酵の障害となる雑菌を除去することが好ましい。この場合、雑菌除去方法としては、発酵に供する黄花菜の根部を予め殺菌用エタノール等で洗浄殺菌した上、無菌水等の無菌媒体に懸濁する方法で浸出させてもよく、又黄花菜の根部を溶媒に浸出させ、浸出液を得た後、加熱殺菌する方法を用いるようにしてもよい。
加熱殺菌法としては、黄花菜を加えた発酵液を１０５〜１２１℃で１０〜２０分間加熱するオートクレーブ殺菌法や、黄花菜を加えた発酵液を８０〜９０℃に６０〜１２０分間保持することを１日１回２〜３日間繰り返す間断殺菌法が一般に用いられる。もっとも、本殺菌工程は必須工程ではない。次工程の発酵工程において障害にならなければ、本殺菌工程を省いても差し支えない。
【００１６】
本願発明の第二工程である発酵工程で用いられる菌は乳酸菌である。本願発明で用いる乳酸菌は、乳酸菌に属する菌であれば特に限定はされない。市販のヨーグルトや、また自然界からも容易に分離することができる。また、微生物分譲機関においても分譲されているため、当該菌株を購入して利用することが可能である。なお分離の方法は、特開２０１２−１０５６３９に記載の方法等により分離が可能である。
【００１７】
具体的には、例えばラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum)、ラクトバシルス  デルブルッキー（L. delbrueckii）、ラクトバシルス ブレビス（L. brevis)、ラクトバシルス カゼイ（L. casei)等のラクトバシルス（Lactobacillus）属の乳酸菌；ロイコノストック メセンテロイズ（Leuconostoc mesenteroides)、ロイコノストック シトレウム（L. citreum)等のロイコノストック（Leuconostoc）属の乳酸菌； ストレプトコッカス フェーカリス（Streptococcus faecalis)、ストレプトコッカス ピオジェネス（S. pyogenes)等のストレプトコッカス（Streptococcus）属の乳酸菌；エンテロコッカス カゼリフラバス（Enterococcus caseliflavus)、エンテロコッカス サルフレウス（E. sulfreus)等のエンテロコッカス（Enterococcus）属の乳酸菌；ラクトコッカス プランタラム（Lactococcus plantarum)、ラクトコッカス ラフィノラクティス（L. rafinolactis)等のラクトコッカス（Lactococcus）属の乳酸菌；ペディオコッカス ダムノサス（Pediococcus damnosus)、ペディオコッカス ペントサセウス（P. pentosaceus)等のペディオコッカス（Pediococcus）属の乳酸菌が挙げられる。それら乳酸菌のうちでも、得られる発酵物の有効性の観点とさらに極度の嫌気性でなく取り扱い易いという点から、ラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum)、およびラクトバシルス  デルブルッキー（Lactobacillus delbrueckii）の使用が最も好ましい。尚、Lactobacillus delbrueckii は、ヨーグルトの製造に用いられる代表的な乳酸菌であるため、市販のヨーグルトや、また自然界からも容易に分離することができる。Lactobacillus plantarumは植物性乳酸菌といわれ、漬物などに多く存在している菌で、容易に分離することができる。  
【００１８】
乳酸菌の培養培地としては、乳酸菌全体の良好な生育を示す培地として開発されたMRS培地を用いることが出来る。（MRS培地組成：ペプトン１０ｇ、牛肉エキス１０ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース２０ｇ、Tween８０ １ｇ、K2HPO4  ２ｇ、酢酸ナトリウム  ５ｇ、クエン酸二アンモニウム  ２ｇ、MgSO4・７H2O  ０．２ｇ、MnSO4・nH2O  ０．０５ｇ、精製水1L）
【００１９】
乳酸菌の合成培地の培地組成としては、最低限の炭素源と窒素源とリン源を含んでいれば良く、炭素源としては、リボース、アラビノース、キシロース、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、ラムノース等の単糖類、シュクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、セロビオース等の二糖類、またラフィノース、マルトトリオース等の三糖類を用いることができる。これらから1種以上含有していれば良い。窒素源としては、尿素、硝酸塩として硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、アンモニウム塩として硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、また、アミノ酸として、トリプトファン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、プロリン、チロシン等の窒素含有化合物を用いることができ、これらから1種以上含有していれば良い。リン源としては、リン酸塩を用いることが出来、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸アンモニウムを用いることができ、これらから1種以上含有していれば良い。
【００２０】
合成培地の基本培地としては、前記炭素源と窒素源とリン源を含んでいれば十分であるが、乳酸菌は栄養要求性が厳密であるため、その他にビタミン源、ミネラル源を追加することも必要である。ビタミン源としては、例えばビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、アスコルビン酸、ヨウ酸、シアノコバラミン、イノシトール、ニコチン酸、コリン、カルニチン、パラアミノ安息香酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等を用いることができる。ミネラル源としては、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、ナトリウム、ヨウ素、コバルト等が挙げられ、これらを供給できる具体的な成分としては、例えば、硝酸カルシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合物を用いることができる。
【００２１】
本願発明においては、上記成分を適宜組み合わせて基本培地とする。勿論、天然成分を含まない合成培地で、微生物の増殖が悪い場合には少量の天然物を組み合わせた培地で、培養することも可能である。
【００２２】
前記以外の培地組成であっても、乳酸菌が資化・増殖できる物質であれば、本願発明に適用されるのは勿論である。さらに、培地には低級アルコール類（メタノール、エタノール、プロパノールなど）もしくはグリコール類（エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリンなど）等を添加して基本培地としても良い。
【００２３】
本願発明においては、乳酸菌は、乾燥状態、または凍結状態で保存しておき、使用時において、前記基本培地等で予め培養しておく。この段階での培養は、それぞれの菌が生育出来れば常法通りで差し支えない。
【００２４】
本願発明の第二工程における、乳酸菌の植菌工程における接種量は、浸出液に対し１０８〜１０１０個／ｍＬが適量である。接種量が上記の範囲より多くなっても発酵の進行時間は殆ど変わらず、一方上記の範囲より少なくなると発酵完了までに長時間を要することとなって好ましくない。
【００２５】
発酵温度は一般に５〜５０℃の範囲、好ましくは乳酸菌の生育至適温度である２５〜４０℃の範囲である。発酵日数は、至適温度に於いて一般に３〜５０日、好ましくは７〜３５日の範囲である。発酵日数が上記の一般的範囲より短くなると発酵が十分に行われず発酵物の有効性が低下する場合がある。一方３５日を越えて長くしても有効性のそれ以上の有効性は認められなく好ましくない。発酵工程は静置で行えば十分であるが、発酵時間の短縮等の為、振とう培養、通気培養を行うことも可能である。上記条件で発酵工程を経た浸出液を発酵処理物と称す。この段階では溶媒と植物体が混在した状態である。以上の発酵処理が終ったならば、発酵を停止させる為、発酵処理物に８０〜１２０℃で１５〜１２０分程度の加熱殺菌処理を施す。
【００２６】
第三工程では、前記殺菌処理を終わった発酵処理物を、これをそのまま、或いは一般的かつ好適にはろ過或いは遠心分離などの固液分離手段によって液相を分取し、発酵培養液とする。発酵培養液はこのまま用いることが出来るが、さらに必要ならば希釈もしくは濃縮によって適宜の濃度とした上、化粧料の配合原料として供する。又、場合によっては、固液分離後の液相を、スプレードライ法、凍結乾燥法など常法に従って固体化し、さらに必要に応じて粉砕して粉末状とした上、化粧料に配合するようにしてもよい。
【００２７】
第四工程では、第三工程で分離した黄花菜の根部に、水あるいは低級アルコール（エタノール、プロパノール）、もしくはグリコール類（エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリンなど）又はこれらとの混液等を抽出溶媒として用いて加熱抽出して発酵抽出液とする。
尚、発酵抽出液を得る際の抽出温度、及び抽出時間は目的に応じて適宜調整可能であるが、殺菌処理を兼ねて抽出温度は、８０〜１２０℃、好ましくは９０℃〜１０５℃である。抽出時間は、１５〜１２０分間、好ましくは３０〜６０分間である。
【００２８】
得られた発酵物は細胞分化促進剤、バリア機能改善剤、SA-β-Gal活性抑制剤、DPPHラジカル消去剤として用いることが出来る。また、発酵物を配合してなる化粧料としては、例えば乳液、クリーム、ローション、エッセンス、パック、洗顔料などの基礎化粧料、口紅、ファンデーション、リキッドファンデーション、メイクアッププレスドパウダーなどのメイクアップ化粧料、洗顔料、ボディーシャンプー、石けんなどの清浄用化粧料、さらには浴剤等が挙げられるが、勿論これらに限定されるものではない。
【００２９】
本願発明の化粧料中に於ける発酵物の配合量は、得られた培養液の蒸発残分に換算して０．０００１〜１０質量％、好ましくは０．０１〜１質量％の範囲である。
【００３０】
本願発明の化粧料には、上記の必須成分の他に、通常化粧料に用いられる配合成分、例えば油性成分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、粉体成分、紫外線吸収剤、色素、香料等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００３１】
ここで、油性成分としては、例えばオリーブ油、ホホバ油、ヒマシ油、大豆油、米油、米胚芽油、ヤシ油、パーム油、カカオ油、メドウフォーム油、シアーバター、ティーツリー油、アボガド油、マカデミアナッツ油、植物由来スクワランなどの植物由来の油脂類；ミンク油、タートル油などの動物由来の油脂類；ミツロウ、カルナウバロウ、ライスワックス、ラノリンなどのロウ類；流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワランなどの炭化水素類；ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、ｃｉｓ−１１−エイコセン酸などの脂肪酸類；ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコールなどの高級アルコール類；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸ブチル、２−エチルヘキシルグリセライド、高級脂肪酸オクチルドデシル（ステアリン酸オクチルドデシル等）などの合成エステル類及び合成トリグリセライド類等が挙げられる。
【００３２】
界面活性剤としては，例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなどの非イオン界面活性剤；脂肪酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミン硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル燐酸塩、α−スルホン化脂肪酸アルキルエステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル燐酸塩などのアニオン界面活性剤；第四級アンモニウム塩、第一級〜第三級脂肪酸アミン塩、トリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジアルキルモルフォルニウム塩、ポリエチレンポリアミン脂肪酸アミド塩などのカチオン界面活性剤；Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシメチルアンモニオベタイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキル−Ｎ−アルキレンアンモニオカルボキシベタイン、Ｎ−アシルアミドプロピル−Ｎ′，Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−β−ヒドロキシプロピルアンモニオスルホベタインなどの両性界面活性剤等を使用することができる。
【００３３】
保湿剤としては、例えばグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコールなどのグリコール類、マルチトール、ソルビトール、キシリトール、トレハロース、グルコース等の糖類、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、ムコ多糖類（例えば、ヒアルロン酸及びその誘導体、コンドロイチン及びその誘導体、ヘパリン及びその誘導体など）、エラスチン及びその誘導体、コラーゲン及びその誘導体、加水分解シルク蛋白質、ＮＭＦ関連物質、乳酸、尿素、高級脂肪酸オクチルドデシル、フィトステロール、大豆リン脂質、イソステアリン酸コレステリル、海藻抽出物、各種アミノ酸及びそれらの誘導体等が挙げられる。
【００３４】
増粘剤としては、例えばアルギン酸、寒天、カラギーナン、フコイダン、ファーセララン等の褐藻、緑藻或いは紅藻由来成分、ペクチン、ローカストビーンガム、アロエ多糖体等の多糖類、キサンタンガム、トラガントガム、グアーガム等のガム類、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸・メタクリル酸共重合体等の合成高分子類；ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリグルタミン酸及びその誘導体、グルコシルトレハロースと加水分解水添デンプンを主体とする糖化合物等が挙げられる。
【００３５】
防腐・殺菌剤としては、例えばパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチルなどのパラオキシ安息香酸エステル類；フェノキシエタノール、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェン、塩酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、サリチル酸、エタノール、ウンデシレン酸、フェノール類、ジャーマル（イミダゾデイニールウレア）、１，２−ペンタンジオール、各種精油類、樹皮乾留物、プロポリスエキス等がある。
【００３６】
粉体成分としては、例えばセリサイト、酸化チタン、タルク、カオリン、ベントナイト、酸化亜鉛、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、無水ケイ酸、雲母、６−又は１２−ナイロンパウダー、ポリエチレンパウダー、シルクパウダー、セルロース系パウダー等がある。
【００３７】
紫外線吸収剤としては、例えばパラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルヘキシル、サリチル酸アミル及びその誘導体、パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル、桂皮酸オクチル、オキシベンゾン、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸塩、４−ターシャリーブチル−４−メトキシベンゾイルメタン、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、アロエ抽出物等がある。
【００３８】
さらに必要ならば、本発明で用いる発酵物の作用効果及び特長を損なわない範囲で、他の活性成分（美白剤、皮膚老化防止・肌荒れ改善剤、抗炎症剤等）を配合してもよく、かかるものとしては、例えば美白剤であれば、トラネキサム酸及びその誘導体、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、コウジ酸及びその誘導体、アスコルビン酸及びその誘導体、ハイドロキノン誘導体、エラグ酸及びその誘導体、レゾルシノール誘導体、胎盤抽出物、システイン、ソウハクヒ抽出物、ユキノシタ抽出物、ハマメリス抽出物、イタドリ抽出物、甘草抽出物、ゲンノショウコ抽出物、ナツメ抽出物、シャクヤク抽出物、トウキ抽出物、モモ抽出物、緑藻類、紅藻類又は褐藻類の海藻の抽出物、リノール酸及びその誘導体もしくは加工物（例えばリノール酸メントールエステルなど）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体等が、皮膚老化防止・肌荒れ改善成分であれば、動物又は魚由来のコラーゲン及びその誘導体、エラスチン及びその誘導体、セラミドなどの細胞間脂質、胎盤抽出物、ニコチン酸及びその誘導体、グリチルリチン酸及びその誘導体（ジカリウム塩等）、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、ビタミンＡ前駆体、ビタミンＡ及びその誘導体、ビタミンＥ及びその誘導体、アラントイン、α−ヒドロキシ酸類、ジイソプロピルアミンジクロロアセテート、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸、コエンザイムＱ−１０、アデノシン、α−リポ酸、ピコリン、カルニチン及びその誘導体、ゲンチアナエキス、甘草エキス、ハトムギエキス、カミツレエキス、ニンジンエキス、アロエエキスなどの生薬抽出エキス、緑藻類、紅藻類又は褐藻類の海藻の抽出物、ソウハクヒエキス、ブナ抽出物、キダチアロエ抽出物、マンネンロウ抽出物、イチョウ抽出物、スギナ抽出物、ベニバナ抽出物、オタネニンジン抽出物、セイヨウニワトコ抽出物、ハゴロモグサ抽出物、レンゲ抽出物、マンゴー抽出物、卵殻膜抽出タンパク質、デオキシリボ核酸カリウム塩、紫蘭根抽出物、ムラサキシキブ抽出物、イネ抽出物等が、又抗炎症成分であれば、例えばグアイアズレンスルホン酸ナトリウム、グアイアズレンスルホン酸エチルなどのアズレン誘導体、グリチルリチン酸ジカリウム、グリチルレチン酸ステアリルなどのグリチルリチン酸誘導体、アラントイン、カンゾウ抽出物、クジン抽出物、シャクヤク抽出物、ボタンピ抽出物、レンギョウ抽出物、リュウタン抽出物、トウキンセンカ抽出物、パセリ抽出物、オトギリソウ抽出物等が挙げられる。抗酸化剤としては、例えばスーパーオキシドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、カタラーゼなどの生体内活性酸素分解酵素、ビタミンＥ、ビタミンＤなどのビタミン類及びその誘導体、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、ユビデカキノン（ユビキノン）、ルチン、ルチングルコシド、γ−オリザノール等がある。
【００３９】
以下、本願発明における発酵物の効果試験の実施例を示す。さらに、発酵物を用いた皮膚組成物への応用処方例等について述べるが、ここに記載された実施例に限定されるものではない。なお、以下に於いて、部はすべて質量部を、又％はすべて質量％を意味する。
【００４０】
黄花菜の根部浸出液に植菌する乳酸菌の調製
乳酸菌は（独）製品評価技術基盤機構より分譲を受けたLactobacillus plantarum（NBRC  １０１９７５）を用いた。乳酸菌の培養はMRS培地にて、培地３０ｍｌに、分譲を受けた菌株の1白金耳を摂取し、３０℃にて３日間静置培養を行い、乳酸菌培養液とした。（MRS培地組成：ペプトン１０ｇ、牛肉エキス１０ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース２０ｇ、Tween８０ １ｇ、K2HPO4  ２ｇ、酢酸Na  ５ｇ、クエン酸二アンモニウム  ２ｇ、MgSO4・７H2O  ０．２ｇ、MnSO4・nH2O  ０．０５ｇ、精製水1L）
【００４１】
発酵処理物の調製
乾燥黄花菜の根部１０ｇにグルコース１ｇおよび精製水１００ｍｌを加え、室温で浸出させた。その後、１０５℃、１５分間滅菌処理を行い、浸出液を得た。冷却後前記乳酸菌培養液５ｍｌを前記浸出液に加えよく撹拌した。乳酸菌を植え付けた浸出液は３０℃にて２８日間静置培養を行い、黄花菜根部発酵処理物を得た。
【００４２】
黄花菜の根部の乳酸菌発酵物の調製
得られた発酵処理物は、発酵工程を停止させる為、１０５℃、１５分間の滅菌処理を行う。滅菌後、ろ布で培養液を絞り出す。ろ液は６,０００rpm×１０min.で遠心分離を行い、上清を取り効果試験の発酵培養液とした。さらに、ろ布に残った黄花菜の根部残渣１ｇに、精製水を１０ｍｌの割合で加え、１０５℃、１５分間滅菌抽出した。滅菌抽出後、ろ布で抽出液を絞り出し、効果試験の黄花菜根部発酵抽出液とした。また、陰性対照物として［００４２］で黄花菜を添加しない乳酸菌だけで培養を行った後、遠心分離処理を行った培養液（「無植物・発酵培養液」）を調製した。
【００４３】
本願発明における乳酸菌を用いて得られた発酵物が、酵母菌を用いて得られた発酵物より優位性があることを示す為、酵母菌を用いて同様の試験を行った。
黄花菜の根部浸出液に植菌する酵母菌の調製酵母菌は（独）製品評価技術基盤機構より分譲を受けたSaccharomyces  cereviciae（NBRC  ０３０８）を用いた。酵母菌の培養は、ＹＮＢ（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ） ｗｉｔｈ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ 合成培地にグルコースを２．０％添加した（以下、本明細書中では、YNB-SG培地と称す）培地５０ｍｌに分譲を受けた菌株の1白金耳を摂取し、２５℃にて５日間静置培養を行い、酵母菌培養液とした。
＜YNB-SG培地組成＞
硫酸アンモニウム５，０００、リン酸二水素カリウム１，０００、硫酸マグネシウム５００、塩化ナトリウム１００、塩化カルシウム１００、ビオチン０．００２、パントテン酸カルシウム０．４、葉酸０．００２、イノシトール２．０、ナイアシン０．４、パラアミノ安息香酸０．２、塩酸ピリドキシン０．４、リボフラビン０．２、塩酸チアミン０．４、ホウ酸０．５、硫酸銅０．０４、ヨウ化カリウム０．１、塩化第二鉄０．２、硫酸マンガン０．４、モリブデン酸ナトリウム０．２、硫酸亜鉛０．４、グルコース２０，０００（単位は全てｍｇ/L）。
【００４４】
酵母菌発酵処理物の調製
乾燥黄花菜の根部１０ｇにグルコース１ｇおよび精製水１００ｍｌを加え、室温で浸出させた。その後、１０５℃、１５分間滅菌処理を行い、浸出液を得た。冷却後前記酵母菌培養液５ｍｌを前記浸出液に加えよく撹拌した。酵母菌を植え付けた浸出液は２５℃にて２８日間静置培養を行い、酵母菌発酵処理物を得た。
【００４５】
黄花菜の根部の酵母菌発酵物の調製
得られた発酵処理物は、発酵工程を停止させる為、１０５℃、１５分間の滅菌処理を行う。滅菌後、ろ布で培養液を絞り出す。ろ液は６,０００rpm×１０min.で遠心分離を行い、上清を取り効果試験の黄花菜の根部の酵母菌発酵培養液とした。さらに、ろ布に残った黄花菜の根部残渣１ｇに、精製水を１０ｍｌの割合で加え、１０５℃、１５分間滅菌抽出した。滅菌抽出後、ろ布で抽出液を絞り出し、効果試験の黄花菜の根部の酵母菌発酵抽出液とした。また、陰性対照物として［００４９］［００５０］で黄花菜を添加しない酵母菌だけで培養を行った後、遠心分離処理を行った培養液を調製した。
【００４６】
＜細胞分化促進効果・バリア機能改善効果＞
バリア機能が異常な皮膚においては、未分化状態の角質細胞が多く、正常な角層が形成されなくなっている。このため、肌の炎症が起こりやすく、またその炎症により、バリア機能が異常になるという悪循環を繰り返す原因となっている。
従って、細胞分化を促進することが出来れば、バリア機能改善効果が期待出来ると考えられる。
そこで、黄花菜の根部の乳酸菌発酵物の細胞分化促進効果を確認した。
【００４７】
細胞の培養
細胞：Hacat細胞
培地：Humedia KG２ 
D-MEM （Ca濃度：１．８mM）
固定液：Mildform １０NM（和光純薬工業）
染色：０．０５％ナフトールブルーブラック溶液（９％酢酸、０．１M酢酸ナトリウム）
ヒト表皮細胞であるHacat細胞をHumedia KG2（クラボウ）培地で培養した。
細胞を１２ well plateに５０％コンフルーエント程度に植え付け培養した。翌日各試料を添加した。添加後、７２時間培養後に細胞を固定し、ナフトールブルーブラック溶液で染色し、細胞の形態を顕微鏡観察し、分化の程度を判定した。
【００４８】
細胞分化の評価
表皮細胞であるケラチノサイトは分化すると細胞同士が接着し、無定形の形を取る。一方、未分化の細胞は一つ一つの細胞が独立し、お互いに接着しないことが一般に知られている。ケラチノサイトの分化は培地内のCa濃度により促進される。［図-１］の写真のようにHacat細胞をCa濃度１．８mMのD-MEM培地で培養すると細胞は完全に分化し（評価点５番の写真に該当）、Ca濃度が低いHumedia KG２培地では細胞は未分化の状態で増殖する（評価点１番の写真に該当）。この未分化と分化状態の細胞同士の接着具合を５段階で顕微鏡による目視評価を行い、細胞分化度を評価した。細胞分化度の判定基準は［図-１］に示した基準により判定を行った。
【００４９】
［図-１］の細胞分化度評価の評価基準に基づき、各試料を添加した場合の細胞分化度の結果を［表−1］に示した。なお、細胞への発酵物の添加量は、［００４２］にて調製したものを培地に２．５％添加して実験を行った。比較例-３として黄花菜の根部の培養前エキス（以下、「黄花菜・根・培養前エキス」）、比較例-４として黄花菜を添加しないで乳酸菌だけで培養を行った後、遠心分離処理を行った培養液（以下、「無植物・発酵培養液」）、実施例-１として黄花菜の根部の発酵培養液（以下、「黄花菜・根・発酵培養液」）、実施例-２として黄花菜の根部の発酵抽出液（以下、「黄花菜・根・発酵抽出液」）の結果を示した。尚、試料内容を示す際には、同様に示している。比較例-３の黄花菜・根・培養前エキスでは、細胞分化度評点が２点でほとんど細胞分化促進効果を示さなかった。しかし、実施例-１の黄花菜・根・発酵培養液では細胞分化度評点が５点、また実施例-２として黄花菜・根・発酵抽出液の細胞分化度評点も５点を示し非常に高い細胞分化促進効果を示した。また、陰性対照として試験を行った比較例-４は、細胞分化度評点は１であり、乳酸菌の培養液だけでは細胞分化促進効果が無いことが示された。なお、比較例-２のHumedia  KG２培地で培養した未分化細胞の細胞分化度評点は１、D-MEM培地で培養した分化細胞の細胞分化度評点を5として判定した。以上の結果から、乳酸菌による発酵処理により黄花菜・根部から抽出される成分が変化し、細胞分化促進効果が高まったことがわかった。
【００５０】
【表−１】
2015157770.tif 000003
【００５１】
＜SA-β-Gal活性を抑制効果・細胞老化度改善効果＞
加齢とともに進行するハリ・弾力の低下、たるみ等の皮膚の機能低下は、細胞レベルの老化によって引き起こされている。
一方、ヒトの皮膚線維芽細胞においては細胞継代、および採取されたヒトの年齢とともに細胞中のSA-β-Gal活性（senescence-associated beta-galactosidase）が増加することが知られており、SA-β-Gal活性は細胞の老化マーカーとして使用されている。
従って、SA-β-Gal活性を抑制することが出来れば、細胞老化抑制効果が期待出来ると考えられる。
そこで、黄花菜の根部の乳酸菌発酵代謝物のSA-β-Gal活性を確認した。
【００５２】
SA-β-Gal活性の測定による細胞老化度の測定
細胞の培養
細胞：正常ヒト線維芽細胞NB1-RGB（理化学研究所）
培地：D-MEM  FBS１０％ 
正常ヒト線維芽細胞NB1-RGBを培養し、細胞培養液に過酸化水素２００μMを１日２時間添加した。これを連続で２日間繰り返すことにより、細胞老化を起こさせた。この細胞に［００４２］で調製した試料を細胞培養培地に２．５％の濃度で３日間添加した後、SA-β-Gal染色を行い、細胞の染色度合いにより細胞老化度を測定した。なお、陽性対照としてはニコチンアミドを用いた。
SA-β-Gal染色
固定液で５分間細胞を固定する。細胞をPBS（−）で洗浄後、SA-β-Gal溶液を添加して、３７℃で１６時間放置した。SA-β-Gal染色液で染色した細胞を集め、２N-NaOH溶液で溶解し、６５５nmの吸光度を測定（A値）し、SA-β-Gal活性を測定した。 溶解液の一部は、BCA法で５４０nmの吸光度を測定（B値）し、タンパク量を測定した。下記の計算式により細胞タンパク量当りのSA-β-Gal活性を求めた。
SA-β-Gal活性
＝６５５nmの吸光度値（A値）／BCA法で測定した５４０nmの吸光度値（B値）
固定液           ：ホルムアルデヒド液（試薬ホルマリン３７％濃度）５mLにPBS(−)９５mLを加える。
X-Gal溶液       ：２０mgのX-Gal（和光純薬）を１mLのDMSOに溶解する。
SA-β-Gal染色液 ：X-Galが１mg/mLの濃度になるように、下記の染色bufferに溶解する。
染色Buffer      ：４０mMクエン酸：４０mMリン酸水素二ナトリウム（１：３）で
pH６．０に調製した水溶液に以下の４試薬を溶解する。
５mMフェロシアン化カリウム  
５mMフェリシアン化カリウム
１５０mM  NaCl
２mM  MgCl2
BCA法           ：下記のC液とD液を５０：１の割合で測定直前に混合する。
２N-NaOHに溶解した細胞溶解液４０μLに、C液とD液の混合液２００μLを添加し、３７℃で３０分間反応させた後、５４０nmの吸光度を測定し、タンパク量とする。
C液  Sodium  bicinchoninate  １０ｇ
Na２CO３               ２０ｇ
Sodium  tartrate        １．６ｇ
NaOH                    ４ｇ
NaHCO３                  ９．５ｇ
精製水で溶解後、１０N-NaOHでpHを１１．２５に調整した後、１Lにする。
D液  CuSO４・５H2O             ４ｇ
精製水で１００mLとする。
【００５３】
［表-２］にSA-β-Gal活性の測定による細胞老化度の結果を示した。比較例-５の過酸化水素２００μM濃度で２時間細胞処理を２回行った細胞ではSA-β-Gal活性評点が１３．８であった。これに対して過酸化水素処理を行わなかった比較例-６の細胞では、SA-β-Gal活性評点は５．３６であった。また、比較例-７の過酸化水素処理２００μM濃度で２時間細胞処理を２回行った後、ニコチンアミドを５mM添加して培養した細胞では、SA-β-Gal活性評点は、５．６３であり、ニコチンアミド５mMの添加により、細胞老化度が抑制されていることがわかった。さらに、黄花菜・根・培養前エキスを添加した比較例-８では、SA-β-Gal活性評点が５．６１点であった。また、陰性対照として試験を行った比較例-９は、SA-β-Gal活性評点が１３．３であり、乳酸菌の培養液だけでは細胞老化抑制効果が無いことが示された。しかし、実施例-３の黄花菜・根・発酵培養液添加区ではSA-β-Gal活性評点が４．７８点、また実施例-４として黄花菜・根・発酵抽出液添加区のSA-β-Gal活性評点も２．６９点を示し非常に高い細胞老化抑制効果を示した。この結果より、乳酸菌による発酵処理により黄花菜・根から抽出される成分が変化し、細胞老化抑制効果が高まったことがわかった。
【００５４】
【表−２】
2015157770.tif 000004
【００５５】
＜ラジカル消去効果＞
細胞内で生成された活性酸素は、細胞を構成する成分に不可逆的な化学変化を引き起こすことにより細胞にダメージを与え、そのダメージが加齢とともに蓄積して細胞機能の低下を引き起こし、細胞老化につながることが知られている。
一方、DPPH（ジフェニルピクリルヒドラジル）は人工的に作られた安定なラジカルで、抗酸化剤のスクリーニング試験として一般に使用されている。
従って、DPPHラジカルを消去できる物質は、活性酸素による細胞構成成分の酸化劣化を防ぎ、細胞機能の低下を防止する効果、さらには老化抑制効果が期待できると考えられる。
そこで、黄花菜の根部の乳酸菌発酵代謝物のDPPHラジカル消去活性を確認した。
【００５６】
DPPHラジカル消去活性試験
［００４２］で調製した試料および０mM、０．３mM、０．５mM、０．７mM、１．０mM、３．０mM、５．０mM、１０mMのTrolox (６-hydroxy-２,５,７,８-tetramethylchroman-２-carboxylic acid)溶液１０μLに、下記の割合で用事調製したDPPH溶液１９０μLを加え、１５分後に５４０nmの吸光度を測定し、DPPHラジカル消去能を評価した。 濃度既知のTrolox溶液の吸光度から検量線を作成し、試料のDPPHラジカル消去能の強さをtrolox当量として表示した。 
Trolox溶液：trolox ２５mgをDMSO (Dimethyl sulfoxide)１０mlに溶解し、trolox１０mM溶液とした。
DPPH溶液
０．４mM-DPPH（１,１-Diphenyl-２-picrylhydrazyl）                  ４０
４００mM-MES buffer（２-Morpholinoethanesulfonic acid ）（PH６．１）１０
蒸留水                                                             ３０
【００５７】
【表−３】
2015157770.tif 000005
【００５８】
［表-３］にDPPHラジカル消去能の結果を示した。
黄花菜・根・発酵前エキスを添加した比較例-１０では、DPPHラジカル消去能が０．３７mM trolox当量であった。しかし、実施例-５の黄花菜・根・発酵培養液添加区では０．９４mM trolox当量、また実施例-６として黄花菜・根・発酵抽出液添加区では０．７２mM trolox当量を示し非常に高い酸化抑制効果を示した。また、陰性対照として試験を行った比較例-１１では、DPPHラジカル消去能が０．１１mM trolox当量であり、乳酸菌の培養液だけではDPPHラジカル消去活性が無いことが示された。さらに、比較対照として比較例-１２には酵母菌により黄花菜の根部を発酵処理した酵母菌発酵培養液のDPPHラジカル消去能を示した。比較例-１２のDPPHラジカル消去能は、０．３９mM trolox当量であったことから、酵母菌の発酵処理によるDPPHラジカル消去効果は低いものであることがわかった。
陰性対照として試験を行った比較例-１３のDPPHラジカル消去能が０．１３mM trolox当量であり、酵母菌の培養液だけではDPPHラジカル消去活性が無いことも示された。
この結果より、乳酸菌による発酵処理により黄花菜・根部から抽出される成分が変化し、DPPHラジカル消去活性能が高まったことが明らかとなった。
【００５９】
ヒトでの効果確認試験
被験者として、２０〜６０歳の女性１０名に１日２回（朝、夜）連続１ヵ月間、試験品と比較品のそれぞれの皮膚外用剤を使用させ、塗布部位の状態を試験前後で比較し、改善効果を調べた。本試験には、試験品として処方例７で示した皮膚外用剤を用い（実施例−７）、比較品には処方例７に示した皮膚外用剤から乳酸菌発酵物（黄花菜・根・発酵培養液、および発酵抽出液）を除き、黄花菜・根・発酵前エキスと置き換えた皮膚外用剤を作成し（比較例−１２）、その使用による効果について調べた。評価は肌の弾力に関する評価項目を表-４に、肌の潤いに関する評価項目を表-５に示す基準に従って行った。本発明の有効成分を配合した皮膚外用剤を毎日使用しながら肌の状態を塗布開始前及び１ヶ月塗布後におけるアンケートで集計し、効果の確認を行った。結果は表−６、７に示す。表中の数字は、人数を示している。表−６からも明らかなように、乳酸菌発酵物の入った試験品の皮膚外用剤では、肌の弾力評価点数が７８点を示した。一方、試験品から発酵物を除き、黄花菜・根・発酵前エキスと置き換えた比較品では、評価点数が３８点であった。この結果から明らかなように、乳酸菌の発酵物を添加することにより高い肌の弾力効果が得られることが明らかとなった。さらに、表-７より、乳酸菌発酵物の入った試験品の皮膚外用剤では、肌の潤い評価点数が８０点を示した。一方、試験品から発酵物を除き、黄花菜・根・発酵前エキスと置き換えた比較品では、評価点数が４０点であった。この結果から明らかなように、乳酸菌の発酵物を添加することにより高い肌の潤い効果が得られることが明らかとなった。
【００６０】
【表−４】
2015157770.tif 000006
【００６１】
【表−５】
2015157770.tif 000007
【００６２】
【表−６】
2015157770.tif 000008
【００６３】
【表−７】
2015157770.tif 000009
【００６４】
次に、本願発明の発酵物を配合した処方例を示すが、本願発明はこれに限定されるものでない。
【００６５】
化粧料の処方例
以下の化粧料の処方例で示す発酵処理液は、［００４２］で示した方法で調製した、各培養液、抽出液を示す。尚、「発酵培養液（黄花菜・根）」は、「黄花菜の根部の乳酸菌発酵培養液」を意味する。以下、同様に示す。
（処方例１）化粧用クリーム（質量％）
ａ）ミツロウ・・・２．０
ｂ）ステアリルアルコール・・・５．０
ｃ）ステアリン酸・・・８．０
ｄ）スクワラン・・・１０．０
ｅ）自己乳化型グリセリルモノステアレート・・・３．０
ｆ）ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．０
ｇ）発酵培養液（黄花菜・根）・・・５．０
h)  発酵抽出液（黄花菜・根）・・・５．０
i）１，３−ブチレングリコール・・・５．０
j）水酸化カリウム・・・０．３
k）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
l）精製水・・・残部
製法
ａ）〜ｆ）までを加熱溶解し、８０℃に保つ。i）〜l）までを加熱溶解し、８０℃に保ち、ａ）〜ｆ）に加えて乳化し、４０℃まで撹拌しながら冷却する。その後、ｇ）、h)を加え、攪拌し均一に溶解する。
【００６６】
化粧料の処方例
（処方例２）化粧用クリーム（質量％）
ａ）ミツロウ・・・２．０
ｂ）ステアリルアルコール・・・５．０
ｃ）ステアリン酸・・・８．０
ｄ）スクワラン・・・１０．０
ｅ）自己乳化型グリセリルモノステアレート・・・３．０
ｆ）ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．０
ｇ）発酵培養液（黄花菜・根）・・・１０．０
h)  発酵抽出液（黄花菜・根）・・・５．０
i）１，３−ブチレングリコール・・・５．０
j）水酸化カリウム・・・０．３
k）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
l）精製水・・・残部
製法
ａ）〜ｆ）までを加熱溶解し、８０℃に保つ。i）〜l）までを加熱溶解し、８０℃に保ち、ａ）〜ｆ）に加えて乳化し、４０℃まで撹拌しながら冷却する。その後、ｇ）、h)を加え、攪拌し均一に溶解する。
【００６７】
（処方例３）乳液（質量％）
ａ）ミツロウ・・・０．５
ｂ）ワセリン・・・２．０
ｃ）スクワラン・・・８．０
ｄ）ソルビタンセスキオレエート・・・０．８
ｅ）ポリオキシエチレンオレイルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．２
ｆ）発酵抽出液（黄花菜・根）・・・０．１
g)  発酵培養液（黄花菜・根）・・・１．０
h）１，３−ブチレングリコール・・・７．０
i）カルボキシビニルポリマー・・・０．２
j）水酸化カリウム・・・０．１
k）精製水・・・残部
l）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
m）エタノール・・・７．０
製法
ａ）〜ｅ）までを加熱溶解し、８０℃に保つ。h）〜ｋ）までを加熱溶解し、８０℃に保ち、ａ）〜ｅ）に加えて乳化し、５０℃まで撹拌しながら冷却する。５０℃でｆ）、g)、m）を添加し、４０℃まで攪拌、冷却する。
【００６８】
（処方例４）化粧水（質量％）
a)発酵抽出液（黄花菜・根）・・・０．０１
b)発酵培養液（黄花菜・根）・・・０．００１
c)グリセリン・・・５．０
d)ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．０
e）エタノール・・・６．０
f）香料・・・適量
g）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
h）精製水・・・残部製法
ａ）〜h）までを混合し、均一に溶解する。
【００６９】
（処方例５）化粧水（質量％）
a)発酵培養液（黄花菜・根）・・・０．００１
b)発酵抽出液（黄花菜・根）・・・１０．０
c)グリセリン・・・５．０
d)ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．０
e）エタノール・・・６．０
f）香料・・・適量
g）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
h）精製水・・・残部
製法
ａ）〜h）までを混合し、均一に溶解する。
【００７０】
（処方例６）洗顔料（質量％）
ａ）ステアリン酸・・・１２．０
ｂ）ミリスチン酸・・・１４．０
ｃ）ラウリン酸・・・５．０
ｄ）ホホバ油・・・３．０
ｅ）グリセリン・・・１０．０
ｆ）ソルビトール・・・１５．０
ｇ）１，３−ブチレングリコール・・・１０．０
ｈ）ＰＯＥ（２０）グリセロールモノステアリン酸・・・２．０
ｉ）水酸化カリウム・・・５．０
ｊ）水・・・残部
ｋ）キレート剤・・・適量
ｌ）香料・・・適量
ｍ）発酵抽出液（黄花菜・根）・・・１．０
ｎ）発酵培養液（黄花菜・根）・・・１．０
製法
ａ）〜ｈ）までを加熱溶解し７０℃に保つ。ｊ）にｉ）を溶解後ａ）〜ｈ）に加えケン化する。その後ｋ）、ｌ）を入れ攪拌しながら冷却する。５０℃でｍ）、n)を添加し、４０℃まで攪拌、冷却する。
【００７１】
（処方例７）エッセンス（質量％）
a)発酵抽出液（黄花菜・根）・・・２．０
b)発酵培養液（黄花菜・根）・・・２．０
c)カルボキシビニルポリマー・・・０．０５ 
d)L-アルギニン・・・適量 
e）グリセリン・・・５．０
f）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．０
g）エタノール・・・６．０
h）香料・・・適量
i）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
j）精製水・・・残部
製法
ｃ）をj）の一部で分散した後、d)を加えてpHを６．５に調製する。その後ａ）〜j）までを混合し、均一に溶解する。
【００７２】
尚、本願発明において浸出液、抽出液等に用いる浸出溶媒、抽出溶媒は、特段示していない場合は、すべて精製水である場合を示しているが、抽出溶媒の種類を問わず、精製水を用いた場合と同様の効果が得られた。また、黄花菜は特段示していない場合は、すべてヤブカンゾウを用いた場合を示しているが、他のゼンテイカ（ニッコウキスゲ）、ホンカンゾウ、マンシュウキスゲ、ホソバキスゲを使用した場合にも同様の効果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
以上詳述したごとく、本発明によれば、一つの有効成分により、線維芽細胞の老化が抑制され、それに伴い肌の弾力が回復し、シワ・たるみが少なくなるとともに、細胞分化促進されることにより肌理が整い、肌のバリア機能を回復させることが可能となった。
【図−１】
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