(57)【要約】      （修正有）【課題】ＥｐｈＡ３に対する抗体を用いた、白血病及び慢性骨髄増殖性疾患の治療方法の提供。【解決手段】細胞表面上にＥｐｈＡ３を発現する骨髄増殖性疾患細胞を殺傷する方法であって、該細胞を抗ＥｐｈＡ３抗体と接触させる段階を含み、該抗体がＥｐｈＡ３を活性化し、かつ抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する方法。並びに、骨髄増殖性疾患を有し、かつ細胞表面上にＥｐｈＡ３を発現する骨髄増殖性疾患細胞を有する患者に治療有効量の抗ＥｐｈＡ３抗体を投与する段階を含む治療方法。【選択図】図２
2015231994.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患細胞を殺傷する方法であって、該細胞を抗EphA3抗体と接触させる段階を含み、該抗EphA3抗体が(i) EphA3を活性化し、かつ(ii) 抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を誘導する、前記方法。
【請求項２】
骨髄増殖性疾患を有し、かつ細胞表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患細胞を有する患者を治療する方法であって、治療有効量の抗EphA3抗体を該患者に投与する段階を含み、該抗EphA3抗体が(i) EphA3を活性化し、かつ(ii) ADCCを誘導する、前記方法。
【請求項３】
骨髄増殖性疾患細胞が慢性骨髄増殖性疾患(CMPD)細胞である、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項４】
CMPD細胞がBCR-ABL陰性CMPD細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
CMPD細胞がCML細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項６】
少なくとも1つの付加的な治療薬を投与する段階をさらに含み、該少なくとも1つの付加的な治療薬が化学療法薬である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
化学療法薬がメシル酸イマチニブ、ニロチニブ、またはダサチニブである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
抗体がヒト重鎖のγ-1またはγ-3定常領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
抗体が低フコシル化されている、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
抗EphA3抗体がEphA3に対する結合においてmab IIIA4と競合する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
抗EphA3抗体が組換え抗体またはキメラ抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
抗EphA3抗体がヒト抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
抗EphA3抗体がモノクローナル抗体である、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
抗EphA3抗体がポリクローナル抗体である、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
抗体がmAb IIIA4のVH領域のCDR3およびVL領域のCDR3を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
抗EphA3抗体がmAb IIIA4のVH領域およびVL領域のCDR1、CDR2、およびCDR3を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患細胞を殺傷する方法であって、該細胞を、EphA3を活性化するかまたはADCCを誘導する抗EphA3抗体と接触させる段階を含み、該骨髄増殖性疾患細胞が急性骨髄性白血病(AML)細胞または骨髄異形成症候群(MDS)細胞である、前記方法。
【請求項１８】
骨髄増殖性疾患を有し、かつ細胞表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患細胞を有する患者を治療する方法であって、治療有効量の抗EphA3抗体を該患者に投与する段階を含み、該抗EphA3抗体がEphA3を活性化するかまたはADCCを誘導し、該骨髄増殖性疾患がAMLまたはMDSである、前記方法。
【請求項１９】
骨髄増殖性疾患細胞がAML細胞である、請求項17または請求項18記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも1つの付加的な治療薬を投与する段階をさらに含み、該少なくとも1つの付加的な治療薬が、単独であるかまたはダウノルビシンと併用したシトシンアラビノシドである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
抗体がEphA3を活性化する、請求項17または請求項18記載の方法。
【請求項２２】
抗体がヒト重鎖定常領域を含む、請求項17〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
抗EphA3抗体がEphA3結合においてmAb IIIA4と競合する、請求項17〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
抗体が(Fab')2である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
抗EphA3抗体が組換え抗体またはキメラ抗体である、請求項17〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
抗EphA3抗体がヒト抗体である、請求項17〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
抗EphA3抗体がポリクローナル抗体である、請求項17〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
抗EphA3抗体がモノクローナル抗体である、請求項17〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
抗EphA3抗体がFab、Fab'、またはFvを含む多価抗体である、請求項17〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
抗EphA3抗体がmAb IIIA4のVH領域およびVL領域を含む、請求項17〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
抗EphA3抗体がmAb IIIA4のVH領域およびVL領域のCDR1、CDR2、およびCDR3を含む、請求項17〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
抗体がmAb IIIA4のVH領域のCDR3およびVL領域のCDR3を含む、請求項17〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
抗EphA3抗体がADCCを誘導する、請求項17〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
抗体がEphA3に対するエフリンA5リガンドの結合を阻止する、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
抗体が低フコシル化されている、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
抗体がヒトのγ-1またはγ-3定常領域を有する、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
抗体がEphA3に対するエフリンA5リガンドの結合を阻止する、請求項33記載の方法。
【請求項３８】
ヒト重鎖定常領域がγ-2またはγ-4領域である、請求項22〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
AML患者またはMDS患者が抗EphA3抗体による治療の候補であると判定する方法であって、
該患者に由来する骨髄増殖性疾患細胞を含む試料を提供する段階；および
該骨髄増殖性疾患細胞におけるEphA3の発現を検出する段階
を含む、前記方法。
【請求項４０】
EphA3が芽細胞において検出される、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
EphA3が幹細胞において検出される、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
EphA3が芽細胞および幹細胞の双方において検出される、請求項39記載の方法。
【請求項４３】
EphA3の発現を検出する段階が、細胞表面上のタンパク質発現を検出する段階を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４４】
EphA3の発現を検出する段階が、EphA3 RNAレベルを検出する段階を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４５】
EphA3 RNAレベルを検出する段階が増幅反応を行う段階を含む、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
増幅反応がRT-PCRを含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
CMPD患者が抗EphA3抗体による治療の候補であると判定する方法であって、
該患者に由来する新生物幹細胞を含む試料を提供する段階、および
該新生物幹細胞によるEphA3の発現を検出する段階
を含む、前記方法。
【請求項４８】
EphA3+骨髄増殖性細胞を伴う骨髄増殖性疾患を有する患者の治療の有効性をモニターする方法であって、該骨髄増殖性疾患がAMLまたはMDSであり、
骨髄増殖性疾患の治療処置後に、該患者から骨髄増殖性疾患幹細胞および/または芽細胞を含む試料を採取する段階；ならびに
該骨髄増殖性疾患幹細胞および/または芽細胞におけるEphA3の発現を検出する段階
を含む、前記方法。
【請求項４９】
EphA3を発現する新生物骨髄増殖性疾患幹細胞を有するCMPD患者の治療の有効性をモニターする方法であって、
CMPDの治療処置後に、該患者から新生物幹細胞を含む試料を採取する段階；および
該幹細胞におけるEphA3の発現を検出する段階
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2009年3月6日に出願した米国特許仮出願第61/158,285号および2009年4月9日に出願した米国特許仮出願第61/168,130号の恩典を主張し、これらの出願は参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Eph受容体チロシンキナーゼ(Eph)は、チロシン残基においてタンパク質をリン酸化するキナーゼである受容体チロシンキナーゼ(RTK)の大きな群に属する。Ephおよびそれらの膜結合型エフリンリガンド(エフリン)は、細胞の位置決めおよび組織の組織化を制御する(非特許文献１／Poliakov, et al., Dev Cell 7:465-80, 2004)。他の受容体チロシンキナーゼとは対照的に、Eph受容体の活性化は、リガンド結合および二量体化を必要とするばかりでなく、予め形成されたリガンドオリゴマーを必要とする。したがって、Eph受容体のチロシンリン酸化は、クラスター形成型または膜結合型のエフリンリガンドの提示を必要とする(非特許文献２／Davis et al., Science 266:816-819, 1994)。機能的でかつ生化学的なEph応答は、より高度なリガンドオリゴマー形成状態で起こる(非特許文献３／Stein et al., Genes Dev 12:667-678, 1998)。
【０００３】
数あるパターン形成機能の中でも特に、種々のEphおよびエフリンは、血管発生において役割を果たすことが示されている。成体において、ある種のエフリンおよびそれらの受容体が調節解除されて再出現することが、腫瘍の浸潤、転移、および新血管新生に寄与することも認められている。例えば、ドミナントネガティブな可溶性EphA2またはA3タンパク質は、インビトロにおいてエフリン誘導性の内皮細胞機能に及ぼす効果、ならびにインビボにおいて腫瘍の血管新生および進行に及ぼす効果を示す(非特許文献４／Nakamoto,. et al., Microsc Res Tech 59:58-67, 2002；非特許文献５／Brantley-Sieders, et al., Curr Pharm Des 10:3431-42, 2004；非特許文献６／Brantley, et al. Oncogene 21:7011-26, 2002；非特許文献７／Cheng, et al. Neoplasia 5:445-56, 2003；および非特許文献８／Dobrzanski, et al. Cancer Res 64:910-9, 2004)。さらに、Ephファミリーメンバーは、多種多様なヒト固形腫瘍に由来する腫瘍細胞で過剰発現することが見出されている(非特許文献９／Brantley-Sieders, et al., Curr Pharm Des 10:3431-42, 2004；非特許文献１０／Marme, Ann Hematol 81 Suppl 2:S66, 2002；および非特許文献１１／Booth, et al., Nat Med 8:1360-1, 2002)。
【０００４】
Epha3はまた、移行期および急性転化期の慢性骨髄性白血病(CML)患者のCD34+細胞で活性化され、過剰発現することも報告されている(非特許文献１２／Cilloni et al., American Society of Hematology, Abstract 1092, 2008(2008年11月14日にオンラインで利用可能))。Cilloniらは、初代CML細胞またはEphA3をトランスフェクトした正常細胞を、彼らが遮断抗体と称する特異的モノクローナル抗体と共にインキュベートした場合に、該抗体が初代細胞およびトランスフェクト細胞において増殖の有意な減少を誘導し、コロニーの成長を減少させ、かつ接着特性の変化を誘導することを報告した。該抗体は、正常対照細胞においても、慢性期のCML患者に由来する細胞においても、有意な変化を全く誘導しなかった。
【０００５】
EphA3が他の骨髄増殖性疾患における治療標的であるという報告は、これまでなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Poliakov, et al., Dev Cell 7:465-80, 2004
【非特許文献２】Davis et al., Science 266:816-819, 1994
【非特許文献３】Stein et al., Genes Dev 12:667-678, 1998
【非特許文献４】Nakamoto,. et al., Microsc Res Tech 59:58-67, 2002
【非特許文献５】Brantley-Sieders, et al., Curr Pharm Des 10:3431-42, 2004
【非特許文献６】Brantley, et al. Oncogene 21:7011-26, 2002
【非特許文献７】Cheng, et al. Neoplasia 5:445-56, 2003
【非特許文献８】Dobrzanski, et al. Cancer Res 64:910-9, 2004
【非特許文献９】Brantley-Sieders, et al., Curr Pharm Des 10:3431-42, 2004
【非特許文献１０】Marme, Ann Hematol 81 Suppl 2:S66, 2002
【非特許文献１１】Booth, et al., Nat Med 8:1360-1, 2002
【非特許文献１２】Cilloni et al., American Society of Hematology, Abstract 1092, 2008
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明は、慢性骨髄性白血病(CML)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、若年性骨髄単球性白血病(JMML)、骨髄異形成症候群(MDS)、真性赤血球増加症(PV)、本態性血小板血症(ET)、または特発性骨髄線維症(IM)を有する患者から得られた骨髄および末梢血試料中の、新生物骨髄幹細胞を含む新生物骨髄細胞が、細胞表面上にEphA3タンパク質を発現する、ならびにそのような細胞が、活性化抗EphA3抗体またはADCCを誘導する抗体を用いて殺傷され得るという発見に一部基づいている。
【０００８】
1つの局面において、本発明は、AML細胞、MDS細胞、CMML細胞、JMML細胞、CML細胞、PV細胞、ET細胞、またはIM細胞を殺傷する方法であって、該細胞を抗EphA3抗体と接触させる段階を含む方法を提供する。1つの局面において、本発明は、AML、CCML、JMML、MDS、CML、PV、ET、またはIMを有する患者を治療する方法であって、抗EphA抗体を該患者に投与する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様において、抗EphA3抗体はEphA3を二量体化する。いくつかの態様において、抗EphA3抗体はEphA3を活性化し、アポトーシスにより標的細胞を殺傷する。いくつかの態様において、抗EphA3抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を誘導することにより標的細胞を殺傷する。いくつかの態様において、本発明は、表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患細胞を殺傷する方法であって、該細胞を抗EphA3抗体と接触させる段階を含み、該抗EphA3抗体が(i) EphA3を活性化し、かつ(ii) 抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を誘導する方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、骨髄増殖性疾患を有し、かつ細胞表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患細胞を有する患者を治療する方法であって、治療有効量の抗EphA3抗体を該患者に投与する段階を含み、該抗EphA3抗体が(i) EphA3を活性化し、かつ(ii) ADCCを誘導する方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患細胞を殺傷する方法であって、該細胞を、EphA3を活性化するかまたはADCCを誘導する抗EphA3抗体と接触させる段階を含み、該骨髄増殖性疾患細胞が急性骨髄性白血病(AML)細胞または骨髄異形成症候群(MDS)細胞である方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、骨髄増殖性疾患を有し、かつ細胞表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患細胞を有する患者を治療する方法であって、治療有効量の抗EphA3抗体を該患者に投与する段階を含み、該抗EphA3抗体がEphA3を活性化するかまたはADCCを誘導し、該骨髄増殖性疾患がAMLまたはMDSである方法を提供する。
【０００９】
いくつかの態様において、本発明の方法において使用するための抗EphA3抗体は、組換え抗体またはキメラ抗体である。いくつかの態様において、抗EphA3抗体はヒト抗体である。抗EphA3抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよい。いくつかの態様において、抗EphA3抗体は、Fab、Fab'、またはFvを含む多価抗体である。いくつかの態様において、該抗体はF(ab')2である。いくつかの態様において、抗EphA3抗体は、EphA3結合においてmAb IIIA4と競合する。いくつかの態様において、該抗体はmAb IIIA4と同じエピトープに結合する。典型的な態様において、該抗体は、EphA3に対するエフリンリガンド結合、例えばエフリンA5結合を阻止しない。いくつかの態様において、抗EphA3抗体はmAb IIIA4のVH領域およびVL領域を含む。いくつかの態様において、抗EphA3抗体は、mAb IIIA4のVH領域およびVL領域のCDR1、CDR2、およびCDR3を含む。いくつか態様において、該抗体は、mAb IIIA4のVH領域のCDR3およびVL領域のCDR3を含む。いくつかの態様において、該抗体はADCCを誘導する。したがっていくつかの態様において、該抗体は活性アイソタイプを有する、例えば該抗体は、γ-1またはγ-3領域であるヒト重鎖定常領域を有する。いくつかの態様において、該抗体はADCCを誘導しない、例えば該抗体は、γ-2またはγ-4領域であるヒト重鎖定常領域を有する。
【００１０】
本発明との関連において、「EphA3を活性化するかまたはADCCを誘導する抗EphA3抗体」とは、(i) EphA3を活性化する、(ii) ADCCを誘導する、または(iii) 活性化しかつADCCを誘導する抗体を指す。
【００１１】
本発明のいくつかの態様において、骨髄増殖性疾患患者は、本明細書に記載する抗EphA3抗体で治療され、また該疾患の別の治療薬による治療を受ける。したがっていくつかの態様において、前記方法は、1つまたは複数の付加的な治療薬を投与する段階を含む。例えば、骨髄増殖性疾患がCMLである場合には、付加的な治療薬には、メシル酸イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、または別の化学療法薬が含まれる。骨髄増殖性疾患がAMLである場合には、付加的な治療薬は、単独であるかまたはダウノルビシンと併用したシトシンアラビノシドであってよい。
【００１２】
正常な骨髄芽細胞および幹細胞は、細胞表面上にEphA3を発現しない。したがってさらなる局面において、本発明は、抗EphA3抗体による治療の候補である骨髄増殖性疾患を有する患者を同定する方法であって、該患者に由来する骨髄芽細胞および/または幹細胞によるEphA3発現を検出する段階を含む方法を提供する。
【００１３】
いくつかの態様において、本発明は、AML患者またはMDS患者が抗EphA3抗体による治療の候補であると判定する方法であって、該患者に由来する骨髄増殖性疾患細胞を含む試料を提供する段階；および該骨髄増殖性疾患細胞におけるEphA3の発現を検出する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、CMPD患者が抗EphA3抗体による治療の候補であると判定する方法であって、該患者に由来する新生物幹細胞を含む試料を提供する段階；および該新生物幹細胞によるEphA3の発現を検出する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、EphA3+骨髄増殖性細胞を伴う骨髄増殖性疾患を有する患者の治療の有効性をモニターする方法であって、該骨髄増殖性疾患がAMLまたはMDSであり、骨髄増殖性疾患の治療処置後に、該患者から骨髄増殖性疾患幹細胞および/または芽細胞を含む試料を採取する段階；ならびに該骨髄増殖性疾患幹細胞および/または芽細胞におけるEphA3の発現を検出する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、EphA3を発現する新生物骨髄増殖性疾患幹細胞を有するCMPD患者の治療の有効性をモニターする方法であって、CMPDの治療処置後に、該患者から新生物幹細胞を含む試料を採取する段階；および該幹細胞におけるEphA3の発現を検出する段階を含む方法を提供する。
【００１４】
EphA3発現は、一般に公知の技法を用いて検出することができる。したがっていくつかの態様において、EphA3の発現を検出する段階は、例えばフローサイトメトリーを用いて、細胞表面上のタンパク質発現を検出する段階を含む。いくつかの態様において、EphA3の発現を検出する段階は、例えばRT-PCRなどの増幅反応を用いて、EphA3 RNAレベルを検出する段階を含む。
【００１５】
本発明はさらに、骨髄増殖性疾患を有する患者を治療する際に使用するための、本明細書に記載する抗EphA3抗体を含む薬学的組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】白血病幹細胞に対する改変ヒト抗EphA3抗体の結合を示すデータを提供する。フローサイトメトリー解析のために、AML初代骨髄細胞を改変ヒト抗EphA3抗体またはIgG1対照およびFITC結合抗ヒトIgG；PE結合抗CD34抗体；PEcy5結合抗CD38抗体；ならびにAPC結合抗CD123抗体で染色した(50,000イベント/試料)。A) CD34解析のためのアイソタイプ対照ゲート化。(B) 抗EphA3および抗CD34で染色した試料。(C) CD34およびCD38について染色した試料(R2はCD34+ CD38-細胞を示す)。(D) CD34+ CD38-細胞におけるEphA3およびCD123発現の同定(R2ゲート)。
【図２】改変ヒト抗EphA3抗体によるCD16媒介性ADCC活性の誘導を示すデータを提供する。本態性血小板血症に罹患している患者に由来する末梢血単核細胞を標的として使用した。表示の濃度の抗EphA3抗体の存在下で、正常個体に由来するPBMCエフェクター細胞を200:1のエフェクター:標的比で添加した。Fc媒介性エフェクター機能を阻害するために抗CD16抗体の存在下で(丸)、またはCD16阻止抗体の非存在下で(三角)、16時間後のLDH放出を測定することによりADCC活性を解析した。
【図３】α 1,6フコースが欠損している改変ヒト抗EphA3抗体(IgG1k)によって示されるADCC活性の上昇を示すデータを提供する。LK63標的細胞を、表示の濃度のフコシル化抗EphA3抗体(斜線バー)、またはキフネシン処理細胞により産生されたα1,6フコースが欠損している抗体(ベタ塗りのバー)と共にインキュベートした。PBMCエフェクター細胞を100:1のエフェクター:標的比で添加して16時間置き、LDH放出を測定することによりADCC活性を判定した。
【図４】ヒト改変抗体のアポトーシス活性を示すデータを提供する。CML患者由来の骨髄細胞(フローサイトメトリーにより98%がEphA3+)を、表示の濃度のヒト改変抗EphA3抗体またはIgG1対照抗体と共に96ウェルマイクロタイターウェル中(2×105個細胞/ウェル)で24時間インキュベートした。次いで、細胞をアネキシンV-FITCおよびヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーにより解析した。アポトーシスを起こしている細胞(アネキシンV陽性)の割合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用する「骨髄増殖性疾患」とは、慢性骨髄増殖性疾患(CMPD)として分類される特定の慢性骨髄増殖性疾患；急性骨髄性白血病(AML)；骨髄異形成症候群(MDS)；慢性骨髄単球性白血病(CMML)；および若年性骨髄単球性白血病(JMML)を指す。したがって本発明との関連において、「骨髄増殖性疾患」とは、慢性骨髄性白血病(CML)；真性赤血球増加症(PV)；本態性血小板血症(ET)；原発性骨髄線維症とも称される特発性骨髄線維症(IM)；AML；MDS；CMML；およびJMMLを指す。「JMML」という用語は、若年性慢性骨髄性白血病(JCML)、乳児慢性骨髄単球性白血病、および乳児モノソミー7症候群と称されるすべての診断を包含する。骨髄増殖性疾患は、例えば世界保健機関(WHO)基準、フランス-アメリカ-イギリス(FAB)分類システム、国際予後判定システム(IPSS)等といった公知の基準を用いて診断することができる。2008 WHO分類では、CMPDは骨髄増殖性新生物(MPN)と称される。骨髄増殖性疾患は、特定の変異の存在を特徴とする場合が多い。例えば、CMLはBCR-ABLの存在を特徴とする。PV、ET、およびIMは、これらの疾患がBCR-ABLを有さないという理由で、「非BCR-ABL」(本明細書では、「BCR-ABLマイナス」または「BCR-ABL陰性」とも称される)CMPDである。しかしながら、BCR-ABL陰性疾患は、CMLでは稀であるJAK2変異の存在を特徴とする場合が多い。
【００１８】
本明細書で使用する「骨髄幹細胞」または「幹細胞」という用語は、CD34+、CD123+、およびCD38-として特徴づけられる造血幹細胞である。
【００１９】
「骨髄増殖性疾患細胞」という用語は、骨髄増殖性疾患に特有である新生物骨髄細胞を指す。本用語は、例えば骨髄異形成症候群に特有である骨髄細胞のような、まだ悪性であると見なされ得ない骨髄細胞、および悪性急性白血病細胞のような悪性細胞を包含する。本用語は、芽細胞および幹細胞の双方を包含する。
【００２０】
本明細書で使用する「癌細胞」または「腫瘍細胞」という用語は、新生物細胞を指すものとして交換可能に用いられる。本用語は、良性および悪性である癌細胞を含む。新生物形質転換は、腫瘍細胞の由来元の細胞型に対する腫瘍細胞の表現型変化を伴う。この変化には、接触阻害の喪失、形態変化、および異常増殖が含まれ得る（Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3rd edition, 1994)を参照されたい）。
【００２１】
本発明との関連における「癌の増殖を阻害すること」とは、増殖を遅延させること、および/または骨髄増殖性疾患を有する患者の癌細胞負荷を減少させることを指す。したがって、「癌の増殖を阻害すること」は癌細胞を殺傷することを含む。
【００２２】
本明細書で使用する「EphA3」は、Eph受容体A3を指す。この受容体は、「ヒト胚キナーゼ」、「hek」、「eph様チロシンキナーゼ1」、「etk1」、または「tyro4」とも称されている。EphA3は、タンパク質-チロシンキナーゼファミリーのエフリン受容体サブファミリーに属する。EPHおよびEPH関連受容体は、発生事象の媒介に関連づけられている。EPHサブファミリーの受容体は、典型的に、単一のキナーゼドメイン、ならびにCysリッチドメインおよび2つのフィブロネクチンIII型反復を含む細胞外ドメインを有する。エフリン受容体は、それらの細胞外ドメイン配列の類似性、ならびにエフリン-Aおよびエフリン-Bリガンドとの結合に関するそれらの親和性に基づいて、2つの群に分類される。EphA3はエフリン-Aリガンドと結合する。EphA3の核酸配列およびタンパク質配列は公知である。例示的なヒトEphA3アミノ酸配列は、アクセッション番号(EAW68857)に基づいて入手可能である。
【００２３】
本発明の目的のため、EphA3の「活性化」は、EphA3のリン酸化およびアポトーシスを引き起こす。EphA3を活性化する抗体または「活性化抗体」は、EphA3のリン酸化およびアポトーシスを引き起こし、したがって本発明との関連においてアゴニストと見なされる。EphA3は二量体化により活性化され得、それによってアポトーシスが起こる。いくつかの態様において、EphA3を活性化する抗体は、EphA3への結合においてmAb IIIA4と競合する。典型的に、「活性化」抗体は、アミノ酸残基131、132、および136が結合に重要であるリガンド結合ドメイン(EphA3のアミノ酸29〜202)に結合する。いくつかの態様において、活性化抗体は、ヒトEphA3タンパク質のリガンド結合ドメイン内の残基131、132、および136を含む部位に結合する。
【００２４】
本発明において、「EphA3抗体」または「抗EphA3抗体」は互換的に用いられ、EphA3に特異的に結合する抗体を指す。いくつかの態様において、抗体は、EphA3を二量体化し得る。本用語は、エフリンリガンド(例えば、エフリン-A5)結合の存在下においてEphA3に結合する抗体、およびリガンド結合部位に結合する抗体を包含する。
【００２５】
「エフリンリガンドの結合の存在下においてEphA3に結合するEphA3抗体」とは、エフリン-A5などのエフリンリガンドのEphA3に対する結合を有意に妨げない抗体を指す。EphA3およびエフリンリガンド、例えばエフリン-A5を含む結合反応物中にそのような抗体が存在すると、EphA3に対するエフリンリガンド結合は約30%未満、典型的には20%または10%未満減少する。
【００２６】
「mAb IIIA4」という用語は、EphA3をアフィニティー単離するために、元々LK63ヒト急性プレB白血病細胞に対して産生されたモノクローナル抗体IIIA4を指す(Boyd, et al. J Biol Chem 267:3262-3267, 1992)。mAb IIIA4は、天然EphA3球状エフリン結合ドメインに結合する(例えば、Smith, et al., J. Biol. Chem 279:9522-9531, 2004)。これは、アクセッション番号91061920の下で、欧州動物細胞培養収集機関(European Collection of Animal Cell Cultures)に寄託されている(例えば、欧州特許第EP0590030号を参照されたい)。
【００２７】
本明細書で使用する「活性アイソタイプを有する抗体」とは、免疫エフェクター細胞上に存在するFc受容体に結合するヒトFc領域を有する抗体を指す。「活性アイソタイプ」には、IgG1、IgG3、IgM、IgA、およびIgEが含まれる。本用語は、Fcエフェクター機能を調節する変異、またはそのように調節する糖組成および/もしくはグリコシル化レベルに対する変化などの修飾を含むヒトFc領域を有する抗体を包含する。
【００２８】
「Fc領域」とは、第1定常領域免疫グロブリンドメインを除いた抗体の定常領域を指す。したがって、Fcとは、IgA、IgD、およびIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにIgEおよびIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインの可動性ヒンジN末端を指す。IgAおよびIgMの場合、FcはJ鎖を含み得る。IgGの場合、Fcは免疫グロブリンドメインCγ2およびCγ3、ならびにCγ1とCγとの間のヒンジを含む。Fc領域の境界は変化し得るが、ヒトIgG重鎖Fc領域は通常、そのカルボキシル末端に残基C226またはP230を含むよう規定され、その際、番号付けはKabatらによるEU指数(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service、バージニア州、スプリングフィールド)に従うことが、当技術分野において理解されている。「Fc領域」という用語は、単離体としてのこの領域を指す場合もあれば、または抗体もしくは抗体断片との関連におけるこの領域を指す場合もある。「Fc領域」は、Fc領域の天然の対立遺伝子変種、およびエフェクター機能を調節する修飾を含む。Fc領域はまた、生物学的機能に変化をもたらさない変種も含む。例えば、生物学的機能を実質的に喪失させることなく、免疫グロブリンのFc領域のN末端またはC末端から1つまたは複数のアミノ酸を欠失させることができる。このような変種は、活性に最小の影響を及ぼすように、当技術分野で公知の一般規則に基づいて選択することができる(例えば、Bowie, et al., Science 247:306-1310, 1990を参照されたい)。
【００２９】
本明細書で使用する「抗体」とは、結合タンパク質として機能的に定義され、かつ抗体を産生する動物の免疫グロブリンコード遺伝子のフレームワーク領域に由来すると当業者によって認識されるアミノ酸配列を含むとして構造的に定義されるタンパク質である。抗体は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなり得る。認識されている免疫グロブリン遺伝子にはκ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類され、これらはそれぞれ免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを規定する。
【００３０】
典型的な免疫グロブリン(抗体)構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は2つの同じポリペプチド鎖対からなり、各対は1本の「軽」鎖(約25 kD)および1本の「重」鎖(約50〜70 kD)を有する。各鎖のN末端は、主に抗原認識を担う約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。
【００３１】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、結合特異性を保持する抗体断片も含む。例えば、いくつかの十分に特徴づけられた抗体断片が存在する。したがって、例えば、ペプシンはヒンジ領域内のジスルフィド結合のC末端で抗体を消化して、それ自体ジスルフィド結合によってVH-CH1に結合している軽鎖であるFabの二量体、F(ab)'2を生じる。F(ab)'2を穏和な条件下で還元してヒンジ領域内のジスルフィド結合を切断し、それによりF(ab')2二量体からFab'単量体に変換することができる。Fab'単量体は、本質的にヒンジ領域の部分を伴うFabである(他の抗体断片のより詳細な説明については、Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)を参照されたい)。無傷の抗体の消化に関して様々な抗体断片が規定されるが、当業者は、化学的にまたは組換えDNA方法論を用いることによりそのような断片を新規に合成できることを理解するであろう。したがって、本明細書で使用する抗体という用語はまた、全抗体の修飾によって生じるか、または組換えDNA方法論を用いて合成される抗体断片を含む。
【００３２】
抗体には、可変重鎖領域と可変軽鎖領域が共に結合して(直接またはペプチドリンカーを介して)、連続したポリペプチドを形成する一本鎖Fv抗体(sFvまたはscFv)のような一本鎖抗体(単一のポリペプチド鎖として存在する抗体)を含む、VH-VL二量体が含まれる。一本鎖Fv抗体は、直接結合しているか、またはペプチドコードリンカーによって結合しているVHコード配列およびVLコード配列を含む核酸から発現され得る、共有結合したVH-VLである(例えば、Huston, et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)。VHとVLは単一ポリペプチド鎖として互いに結合しているが、VHドメインおよびVLドメインは非共有結合によって会合する。または、抗体は別の断片であってもよい。他の断片もまた、例えば組換え技法を用いて、可溶性タンパク質として、またはディスプレイ法から得られる断片として作製することができる。抗体には、二抗体(diantibody)およびミニ抗体も含まれ得る。本発明の抗体は、ラクダ科動物に由来する抗体のような重鎖二量体も含まれる。本発明の目的のために、抗体は、ADCCによって、骨髄増殖性細胞の表面上に存在するEphA3を活性化し得る形態、または骨髄増殖性細胞を死滅させ得る形態で使用する。したがってある態様において、抗体は、二量体である。別の態様においては、抗体は活性アイソタイプを有する単量体型である。他の態様において、抗体は、EphA3を架橋し得る多価型、例えば三価または四価型である。
【００３３】
本明細書で使用する「V領域」とは、B細胞分化の際の重鎖および軽鎖のV領域遺伝子の再編成の結果としてVセグメントに付加されるセグメントであるCDR3およびフレームワーク4を含めた、フレームワーク1、CDR1、フレームワーク2、CDR2、およびフレームワーク3のセグメントを含む抗体可変領域ドメインを指す。
【００３４】
本明細書で使用する「相補性決定領域(CDR)」とは、軽鎖および重鎖の可変領域によって確立される4つの「フレームワーク」領域を中断する、各鎖における3つの超可変領域を指す。CDRは主に、抗原のエピトープに対する結合を担う。各鎖のCDRは典型的に、N末端から順に番号付けしてCDR1、CDR2、およびCDR3と称され、典型的に、特定のCDRが位置する鎖によっても特定される。したがって、VH CDR3はそれが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、VL CDR1はそれが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するCDR1である。
【００３５】
異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成成分である軽鎖および重鎖のフレームワーク領域が組み合わさったものであり、三次元空間にCDRを配置し、整列させるように働く。
【００３６】
CDRおよびフレームワーク領域のアミノ酸配列は、例えば、Kabat, Chothia, international ImMunoGeneTics database(IMGT)、およびAbM(例えば、Johnson et al.、前記；Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917；Chothia C. et al., 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-883；Chothia C. et al., 1992, structural repertoire of the human VH segments J. Mol. Biol. 227, 799-817；Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol 1997, 273(4)を参照されたい)といった当技術分野で周知の種々の定義を用いて決定することができる。抗原結合部位の定義は、以下の文献にも記載されている：Ruiz et al., IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000)；およびLefranc,M.-P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. Jan 1;29(1):207-9 (2001)；MacCallum et al, Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol., 262 (5), 732-745 (1996)；およびMartin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989)；Martin, et al, Methods Enzymol., 203, 121-153, (1991)；Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992)；およびRees et al, In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996)。
【００３７】
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続したアミノ酸から、またはタンパク質の三次折りたたみによって隣接した非連続アミノ酸から形成され得る。連続したアミノ酸から形成されるエピトープは典型的に、変性溶媒に曝露されても保持されるが、三次折りたたみによって形成されたエピトープは典型的に、変性溶媒による処理で失われる。エピトープは典型的に、独特の空間的高次構造中に少なくとも3アミノ酸、より一般的には少なくとも5または8〜10アミノ酸を含む。エピトープの空間的高次構造を決定する方法には、例えば、x線結晶解析および2次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)を参照されたい。
【００３８】
本明細書で使用する「キメラ抗体」とは、(a) 定常領域またはその一部が改変、置換、または交換され、その結果として抗原結合部位(可変領域)が、異なるもしくは改変されたクラス、エフェクター機能、および/もしくは種の定常領域、または例えば酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物等といったキメラ抗体に新たな特性を付与する完全に異なる分子に結合しているか；または(b) 可変領域またはその一部が、異なるもしくは改変された抗原特異性を有する可変領域もしくはその一部で；または別の種由来もしくは別の抗体クラスもしくはサブクラス由来の対応する配列で改変、置換、または交換された免疫グロブリン分子を指す。
【００３９】
本明細書で使用する「ヒト化抗体」とは、ドナー抗体由来のCDRが人フレームワークに移植された免疫グロブリン分子を指す。ヒト化抗体はまた、フレームワーク配列内にドナー起源の残基を含み得る。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含み得る。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されたCDRまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含む場合がある。ヒト化は、「超ヒト化(superhumanizing)」抗体(Tan et al., J. Immunol. 169: 1119, 2002)および「表面再処理(resurfacing)」(例えば、Staelens et al., Mol. Immunol. 43: 1243, 2006；およびRoguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 969, 1994)などの技法を含む、当技術分野で公知の方法(例えば、Jones et al., Nature 321:522-525; 1986；Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988；Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988)；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992；米国特許第4,816,567号)を用いて行うことができる。
【００４０】
本発明との関連における「HUMANEERED(商標)」抗体とは、参照抗体の結合特異性を有する改変ヒト抗体を指す。本発明において使用するための改変ヒト抗体は、ドナー免疫グロブリンに由来する最小配列を含む免疫グロブリン分子を有する。いくつかの態様において、改変ヒト抗体は、参照抗体のCDR3領域に由来する最小必須結合特異性決定基のみを保持し得る。典型的に、改変ヒト抗体は、参照抗体の重鎖のCDR3領域による結合特異性決定基(BSD)をコードするDNA配列をヒトVHセグメント配列に結合し、参照抗体由来の軽鎖のCDR3 BSDをコードするDNA配列をヒトVLセグメント配列に結合することによって改変される。「BSD」とは、CDR3-FR4領域、または結合特異性を媒介するこの領域の一部を指す。したがって、結合特異性決定基は、CDR3-FR4、CDR3、CDR3の最小必須結合特異性決定基(これは、抗体のV領域中に存在する場合に結合特異性を付与する、CDR3よりも小さな任意の領域を指す)、Dセグメント(重鎖領域に関する)、または参照抗体の結合特異性を付与するCDR3-FR4の他の領域であってよい。ヒト抗体を改変する方法は、米国特許出願公開第20050255552号および米国特許出願公開第20060134098号に提供されている。
【００４１】
本明細書で使用する「ヒト」抗体という用語は、実質的にヒトである、すなわちヒト免疫系に由来するFR領域、および多くの場合にCDR領域を有する抗体を指す。したがって、本用語は、「HUMANEERED(商標)」抗体、ならびにヒト免疫系で再構成されたマウスから単離された抗体、およびディスプレイライブラリーから単離された抗体を含む。
【００４２】
「低フコシル化」抗体調製物とは、α1,6-フコースの平均含量が、天然IgG抗体調製物中に見出されるα1,6-フコースの平均含量の50%未満である抗体調製物を指す。当技術分野において理解されるように、「低フコシル化」は抗体の集団に関して用いられる。
【００４３】
「無フコシル化」抗体は、IgG重鎖のCH2ドメインに付着するα1,6-フコースを欠いている。
【００４４】
核酸の部分に関して使用する場合の「異種の」という用語は、核酸が、天然では相互にこれと同じ関係で通常見出されない2つまたはそれ以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、このような核酸は典型的に組換えにより作製され、例えば新たな機能的核酸を創出するように配置された無関係の遺伝子由来の2つまたはそれ以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質とは、天然では相互にこれと同じ関係で見出されない2つまたはそれ以上のサブ配列を指すことが多い。
【００４５】
例えば細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクターに関して使用する場合の「組換え体」という用語は、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが異種核酸もしくは異種タンパク質の導入または天然核酸もしくは天然タンパク質の変更により改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は天然(非組換え)型の細胞内に見出されない遺伝子を発現するか、または天然遺伝子を発現するがこれが別の方法で異常に発現される、低発現される、もしくは全く発現されない。本明細書における「組換え核酸」という用語は、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いて、一般的に核酸の操作により最初にインビトロで形成された、天然に通常見出されない形態の核酸を意味する。このようにして、異なる配列の機能的な連結が達成される。したがって、通常は結合していないDNA分子を連結することによってインビトロで形成された線状形態の単離核酸または発現ベクターはいずれも、本発明の目的に関して組換え体とみなされる。組換え核酸を作製し、宿主細胞または生物体に再導入すると、これは非組換え的に、すなわちインビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製する。しかし、このような核酸は、組換えにより作製されると続いて非組換え的に複製するが、それでもなお本発明の目的に関して組換え体とみなされることが理解される。同様に、「組換えタンパク質」とは、組換え技法を用いて、すなわち上記の組換え核酸の発現を通して作製されたタンパク質である。
【００４６】
タンパク質またはペプチドに言及する場合の、抗体に「特異的に(または選択的に)結合する」または「〜と特異的に(または選択的に)免疫反応性である」という語句は、関心対象のたんぱく質に抗体が結合する結合反応を指す。本発明との関連において、抗体は典型的に、他の抗原に対するその親和性よりも少なくとも100倍優れた親和性でEphA3に結合する。
【００４７】
「平衡解離定数(KD)」という用語は、会合速度定数(Ka、時間-1、M-1)で除した解離速度定数(kd、時間-1)を指す。平衡解離定数は、当技術分野における任意の公知の方法を用いて測定することができる。本発明の抗体は高親和性抗体である。このような抗体は、500 nMよりも優れた、多くの場合には50 nMまたは10 nMよりも優れた親和性を有する。したがっていくつかの態様において、本発明の抗体は、500 nM〜100 pMの範囲、または50もしくは25 nM〜100 pMの範囲、または50もしくは25 nM〜50 pMの範囲、または50 nMもしくは25 nM〜1 pMの範囲の親和性を有する。
【００４８】
本明細書において使用する「癌治療薬」とは、癌患者に治療有効用量で投与した場合に、疾患および疾患に伴う合併症の症状を治癒するか、または少なくとも部分的に停止させる薬剤を指す。
【００４９】
2つまたはそれ以上のポリペプチド(または核酸)配列との関連における「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、以下に記載する初期設定パラメータでBLASTもしくはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを用いて、または手動アライメントおよび目視検査により測定した場合に(例えば、NCBIウェブサイトを参照されたい)、同一であるかまたは特定の割合のアミノ酸残基(またはヌクレオチド)が同一である(すなわち、比較領域または指定領域にわたって最大限の一致を得るために比較およびアライメントした場合の、特定領域にわたる約60%の同一性、好ましくは70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の同一性)2つまたはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。そのような配列は、その時「実質的に同一である」と称される。「実質的に同一である」配列には、欠失および/または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列、ならびに天然の、例えば多型または対立遺伝子変種、および人為的変種もまた含まれる。以下に記載するように、好ましいアルゴリズムはギャップ等について説明し得る。好ましくは、タンパク質配列同一性は、少なくとも約25アミノ酸長の領域にわたり、またはより好ましくは50〜100アミノ酸長の領域にわたり、またはタンパク質の全長にわたり存在する。
【００５０】
本明細書で使用する「比較領域」には、2つの配列を最適にアライメントした後に、同じ数の連続位置の参照配列に対して1つの配列を比較することができる、典型的に20〜600、一般的には約50〜約200、より一般的には約100〜約150からなる群より選択される数の連続位置のうちの1つのセグメントに対する言及が含まれる。比較のための配列のアライメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Dr., Madison, WI)により、または手動アライメントおよび目視検査(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)を参照されたい)によって行うことができる。
【００５１】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例には、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)、およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されているBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムが含まれる。本発明の核酸およびタンパク質のパーセント配列同一性を決定するには、BLASTおよびBLAST 2.0を本明細書に記載されるパラメータで使用する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、初期設定としてワード長(W) 11、期待値(E) 10、M＝5、N＝-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、BLASTPプログラムでは、初期設定としてワード長3、および期待値(E) 10、およびBLOSUM62スコア行列(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照されたい)アライメント(B) 50、期待値(E) 10、M＝5、N＝-4、ならびに両鎖の比較を使用する。
【００５２】
2つのポリペプチドが実質的に同一であることの指標は、第1ポリペプチドが、第2ポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば2つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは典型的に第2ポリペプチドと実質的に同一である。
【００５３】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態において見出される通常それに付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。純度および均一性は典型的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を用いて決定する。調製物中に存在する主な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。いくつかの態様における「精製された」という用語は、タンパク質が電気泳動ゲルで本質的に1本のバンドを生じることを表す。好ましくは、これは、タンパク質が少なくとも85%純粋、より好ましくは少なくとも95%純粋、最も好ましくは少なくとも99%純粋であることを意味する。
【００５４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、天然アミノ酸ポリマー、修飾残基を含むもの、および非天然アミノ酸ポリマーばかりでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００５５】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、例えば、α炭素に水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基が結合している、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
【００５６】
アミノ酸は、本明細書中では、IUPAC-IUB生化学命名委員会により推奨されている一般に知られている3文字記号または1文字記号により参照され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に是認されている1文字コードにより参照され得る。
【００５７】
「保存的修飾変種」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関する保存的修飾変種とは、同一または本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を指すが、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一のまたは関連する配列、例えば天然の連続した配列を指す。遺伝暗号の縮重により、数多くの機能的に同一である核酸が大部分のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによりアラニンが指定されるすべての位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、コドンを記載の対応するコドンの別のものに変更することができる。このような核酸の変化は「サイレント変化」であり、これは保存的修飾変種の1種である。ポリペプチドをコードする本明細書内のすべての核酸配列は、核酸のサイレント変化も表す。当業者は、特定の状況において、核酸内の各コドン(通常メチオニンに対する唯一のコドンであるAUGおよび通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く)を修飾して、機能的に同一である分子を得ることができることを認識するであろう。したがって、多くの場合、発現産物に関して記載された配列では、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変化が暗に意味されるが、実際のプローブ配列に関してはそのようなことはない。
【００５８】
アミノ酸配列に関して、コードされる配列内の単一アミノ酸またはほんの小数のアミノ酸を変化、付加、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、その変化によって化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じる場合に「保存的修飾変種」であることを、当業者は認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。このような保存的修飾変種は、本発明の多型変種、種間相同体、および対立遺伝子に付加されるものであり、これらを排除するものではない。典型的な相互の保存的置換：1) アラニン(A)、グリシン(G)；2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；4) アルギニン(R)、リジン(K)；5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；7) セリン(S)、スレオニン(T)；および8) システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい)。
【００５９】
「1つの(a)」または「1つの(an)」という用語は、特記しない限り「1つまたは複数」を意味することが意図される。
【００６０】
序論
本発明は、骨髄増殖性疾患を有する患者におけるEphA3を発現している新生物芽細胞および/または新生物幹細胞が、EphA3を発現している該骨髄増殖性疾患細胞を、活性化抗体および/またはADCCを誘導する抗体と接触させることにより殺傷され得るという発見に一部基づいている。したがって1つの局面において、本発明は、CML、PV、ET、IM、AML、MDS、CMML、またはJMML患者を治療する方法であって、活性化抗EphA3抗体を該患者に投与する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様において、本発明の方法は、ADCCを誘導する抗EphA3抗体をCML、PV、ET、IM、AML、MDS、CMML、またはJMML患者に投与する段階を含む。いくつかの態様において、CML、PV、ET、IM、AML、MDS、CMML、またはJMML患者に投与される抗EphA3抗体は、(i) 活性化抗EphA3抗体であり、かつ(ii) ADCCを誘導する。
【００６１】
いくつかの態様において、本発明において使用するための抗EphA3抗体は、エフリン、例えばエフリン-A5に対するEphA3の結合を阻止しない。いくつかの態様において、該抗体はEphA3を二量体化する。いくつかの態様において、該抗体はEphA3を架橋する。いくつかの態様において、該抗体はEphA3への結合においてmAb IIIA4と競合する、例えばそのような抗体はMab IIIA4と同じエピトープに結合し得る。いくつかの態様において、該抗体は活性アイソタイプを有し、この場合、免疫エフェクター細胞上に存在するFc受容体に重鎖定常ドメインが結合して、ADCCを引き起こし得る。
【００６２】
抗EphA3抗体
本発明の抗EphA3抗体は、EphA3タンパク質もしくは断片に対して産生させることができ、または組換えにより作製することもできる。数多くの技法を用いて、抗体結合特異性を決定することができる。例えば、抗体の特異的免疫反応性を決定するために使用できる免疫測定法の形式および条件の記載については、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)を参照されたい。
【００６３】
いくつかの態様において、抗EphA3抗体はポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に公知である(例えば、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory manual (1988); Methods in Immunology)。ポリクローナル抗体は、免疫剤および必要に応じてアジュバントを1回または複数回注射することによって、哺乳動物において産生させることができる。免疫剤には、EphA3受容体タンパク質またはその断片が含まれる。
【００６４】
いくつかの態様において、抗EphA3抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、Kohler & Milstein, Nature 256:495 (1975)によって記載されているようなハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法では、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生し得るリンパ球を誘発するために、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物に典型的に免疫剤を免疫化する。または、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。
【００６５】
ヒトモノクローナル抗体は、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991))を含む、当技術分野で公知の種々の技法を用いて作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の調製には、ColeらおよびBoernerらの技法も利用できる(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, p. 77 (1985)、およびBoerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991))。同様に、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているトランスジェニック動物、例えばマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって、ヒト抗体を作製することもできる。抗原投与するとヒト抗体の産生が認められるが、これは、遺伝子再編成、構築、および抗体レパートリーを含め、すべての点でヒトにおいて見られるものとよく似ている。このアプローチは、例えば、米国特許第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号、および以下の科学論文：Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature 368:812-13 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996)；Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)に記載されている。
【００６６】
いくつかの態様において、抗EphA3抗体はキメラまたはヒト化モノクローナル抗体である。前記の通り、ヒト化型の抗体は、ヒト抗体のCDRが、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種のCDRによって置換されているキメラ免疫グロブリンである。
【００６７】
本発明において使用する抗体は多くの形式であってよい。いくつかの態様において、抗体は、Fc領域、例えばヒトFc領域を含み得る。例えば、このような抗体には、EphA3と結合し、かつ活性アイソタイプを有するIgG抗体が含まれる。いくつかの態様において、抗体は、活性化断片（たとえば、それはEphA3を二量体化し得る）を含み得、またはFab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、または単一ドメイン抗体(「dAb」)などの、抗体の誘導体を含み得る。たとえば、いくつかの態様において、抗体はF(ab')2であってもよい。本発明において使用することができる抗体のその他の例示的な態様には、活性化ナノボディまたは活性化ラクダ科動物抗体が含まれる。このような抗体はさらに、当業者に周知の方法によって組換えにより操作することができる。上記の通り、このような抗体は公知の技法を用いて作製することができる。当業者によって理解される通り、いくつかの態様では、抗体が一価であり得る形式、例えばFvまたはFab形式である場合、該抗体は三価または四価抗体などの多価抗体として使用され得る。多価抗体を作製する方法は公知である（King et al., Cancer Res. 54:6176-6185, 1994を参照されたい)。
【００６８】
多くの態様において、本発明において使用するための抗体は、例えば免疫エフェクター細胞上に存在するFc受容体に結合するといったエフェクター機能を有するFc定常領域を有する。例示的な「エフェクター機能」には、C1q結合；補体依存性細胞傷害；Fc受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)；食作用；細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)の下方制御等が含まれる。このようなエフェクター機能は一般に、Fc領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、公知のアッセイ法を用いて評価することができる(例えば、以下に引用する参考文献を参照されたい)。
【００６９】
活性アイソタイプを有し、マクロファージ、単球、好中球、およびNK細胞などのエフェクター細胞上のFc受容体に結合する抗EphA3抗体は、ADCCによる細胞死を誘導し得る。
【００７０】
Fc領域は、天然IgG1、またはIgG3、IgM、IgA、およびIgEを含むその他の活性アイソタイプに由来し得る。「活性アイソタイプ」には、Fc領域が、Fc受容体に対する結合を増大させるため、またはさもなくば抗体の効力を向上させるための修飾を含む抗体が含まれる。このようなFc定常領域は、Fc受容体に対する結合を増大させる変異、そのように増大させるグリコシル化レベルに対する変化等の修飾を含み得る。Fc領域を修飾する多くの方法が当技術分野で公知である。例えば、米国特許出願公開第20060039904号は、1つまたは複数のFcリガンド(例えば、FcγR、C1q)に対する結合親和性の修飾を含む、エフェクター機能が強化されたFc受容体の変種を記載している。さらに、このようなFc変種は、変化した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)および/または補体依存性細胞傷害(CDC)活性を有する。その他のFc変種には、Ghetie et al., Nat Biotech. 15:637-40, 1997；Duncan et al, Nature 332:563-564, 1988；Lund et al., J. Immunol 147:2657-2662, 1991；Lund et al, Mol Immunol 29:53-59, 1992；Alegre et al, Transplantation 57:1537-1543, 1994；Hutchins et al., Proc Natl. Acad Sci USA 92:11980-11984, 1995；Jefferis et al, Immunol Lett. 44:111-117, 1995；Lund et al., FASEB J 9:115-119, 1995；Jefferis et al, Immunol Lett 54:101-104, 1996；Lund et al, J Immunol 157:4963-4969, 1996；Armour et al., Eur J Immunol 29:2613-2624, 1999；Idusogie et al, J Immunol 164:4178-4184, 200；Reddy et al, J Immunol 164:1925-1933, 2000；Xu et al., Cell Immunol 200:16-26, 2000；Idusogie et al, J Immunol 166:2571-2575, 2001；Shields et al., J Biol Chem 276:6591-6604, 2001；Jefferis et al, Immunol Lett 82:57-65. 2002；Presta et al., Biochem Soc Trans 30:487-490, 2002；Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005-4010, 2006；米国特許第5,624,821号；第5,885,573号；第5,677,425号；第6,165,745号；第6,277,375号；第5,869,046号；第6,121,022号；第5,624,821号；第5,648,260号；第6,194,551号；第6,737,056号；第6,821,505号；第6,277,375号；第7,335,742号；および第7,317,091号；ならびにPCT公開WO 94/2935；WO 99/58572；WO 00/42072；WO 02/060919、およびWO 04/029207によって開示されているものが含まれる。
【００７１】
いくつかの態様では、Fc領域のグリコシル化を修飾することができる。例えば、修飾は、例えば抗体配列内の1つまたは複数のグリコシル化部位を変化させることによる非グリコシル化であってよい。このようなアプローチは、米国特許第5,714,350号および第6,350,861号においてさらに詳述されている。また、フコシル残基の量が減少した低フコシル化Fc変種、または二分岐GlcNAc構造が増加したFc変種など、グリコシル化の型が変化したFc領域を作製することもできる。このような糖質修飾は、例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞内で抗体を発現させることによって達成することができる。酵母および植物を含む、グリコシル化機構が変化した細胞は当技術分野において記載されており、これを宿主細胞として使用し、そこで本発明の組換え抗体を発現させて、グリコシル化が変化した抗体を産生させることができる。グリコシル化を修飾するための技法には、例えば、Umana et al, Nat. Biotechnol 17:176-180, 1999；Davies, et al., Biotechnol. Bioeng. 74:288-294, 2001；Shields et al, J Biol Chem 277:26733-26740, 2002；Shinkawa et al., J Biol Chem 278:3466-3473, 2003；Niwa et al. Clinc. Cancer Res. l-:6248-6255, 2004；Presta et al., Biochem Soc Trans 30:487-490, 2002；Kanda et al, Glycobiology 17:104-118, 2006；米国特許第6,602,684号；第6,946,292号；および第7,214,775号；米国特許出願公開第20070248600号；第20070178551号；第20080060092号；第20060253928号；PCT公開WO 00/61739；WO 01/292246；WO 02/31114；およびWO 02/30954；ならびにPotillegent(商標)技術(Biowa, Inc. ニュージャージー州、プリンストン)；およびGlycoMAb(商標)グリコシル化操作技術(GLYCART biotechnology AG、スイス、チューリッヒ)に開示されているものが含まれる。低フコシル化抗体の調製において、通常は抗体分子の少なくとも50〜70％が、しばしば少なくとも抗体の80％が、または少なくとも抗体の90％が、フコースを失う。
【００７２】
本発明のいくつかの態様では、例えば抗体が反復投与に適するように、抗体をさらに操作して免疫原性を低減させる。免疫原性が低減した抗体を作製する方法には、ヒト化およびヒューマニア化（humaneering）手順、ならびに例えば1つまたは複数のフレームワーク領域において抗体をさら操作して、T細胞エピトープを除去する脱免疫化などの改変技法が含まれる。
【００７３】
いくつかの態様において、抗体はHUMANEERED（商標）抗体である。HUMANEERED（商標）抗体は、参照抗体の重鎖のCDR3領域による結合特異性決定基(BSD)をコードするDNA配列をヒトVHセグメント配列に結合し、参照抗体由来の軽鎖のCDR3 BSDをコードするDNA配列をヒトVLセグメント配列に結合することによって得られる、参照抗体の結合特異性を有する操作されたヒト抗体である。このような抗体の産生方法は、米国特許出願公開第20050255552号および米国特許出願公開第20060134098号に提供されている。
【００７４】
抗体をさらに脱免疫化して、抗体のV領域から1つまたは複数の予測T細胞エピトープを除去することができる。このような手順は、例えばWO 00/34317に記載されている。
【００７５】
いくつかの態様において、可変領域はヒトV遺伝子配列からなる。例えば、可変領域配列は、ヒト生殖系列V遺伝子配列と少なくとも80%の同一性、または少なくとも85%もしくは少なくとも90%、またはそれ以上の同一性を有し得る。
【００７６】
本発明において使用する抗体は、ヒト定常領域を含み得る。軽鎖の定常領域は、ヒトκまたはλ定常領域であってよい。重鎖定常領域は多くの場合、γ鎖定常領域、例えばγ-1またはγ-3定常領域である。
【００７７】
例えば抗体が断片であるいくつかの態様では、例えばインビボでの半減期の延長をもたらすために、ポリエチレングリコール(PEG化)または血清アルブミンなどの別の分子に抗体を結合させることができる。抗体断片のPEG化の例は、Knight et al., Plateles 15:409, 2004(アブシキシマブについて)；Pedley et al., Br. J. Cancer 70:1126, 1994(抗CEA抗体について)；およびChapman et al., Nature Biotech. 17:780, 1999に提供されている。
【００７８】
抗体特異性
本発明において使用するための抗体は、ADCCにより、EphA3を活性化し、および／またはEphA3+を死滅させる。本発明との使用に適した例示的な抗体は、mAb IIIA4の結合特異性を有する抗体である。モノクローナル抗体mAb IIIA4は、天然EphA3球状エフリン結合ドメインに結合する(Smith, et al., J. Biol. Chem. 279:9522-9531, 2004；およびVearing et al., Cancer Res. 65:6745-6754, 2005)。EphA3表面に対する高親和性mAb IIIA4結合は、EphA3とのエフリン-A5相互作用の全体的な親和性にほとんど影響を及ぼさない。
【００７９】
いくつかの態様では、EphA3に対する結合においてmAb IIIA4と競合するか、またはmAb IIIA4と同じエピトープと結合するモノクローナル抗体を使用する。いくつの競合結合アッセイ法のいずれかを用いて、同じ抗原に対する結合における2つの抗体間の競合を測定することができる。例えば、この目的にサンドイッチELISAアッセイ法を用いることができる。例示的なアッセイ法では、ウェルの表面を被覆するために捕獲抗体を使用することによって、ELISAを行う。次に、飽和濃度未満のタグ化抗原を捕獲表面に添加する。このタンパク質は、特異的な抗体:抗原相互作用を介して抗体に結合する。洗浄後、検出可能部分に結合している第2抗体をELISAに添加する。この抗体が捕獲抗体と同じ抗原上の部位に結合するか、またはその部位への結合を妨げるのであれば、この部位はもはや結合に利用できないため、この抗体は標的タンパク質に結合することができない。しかしながら、この第2抗体が抗原上の異なる部位を認識するのであれば、この抗体は結合することができる。結合は、結合している検出可能な標識の量を定量することによって検出することができる。バックグラウンドは、単一の抗体を捕獲抗体および検出抗体の両方として用いることによって規定され、最大シグナルは、抗原特異的抗体で捕獲し、抗原上のタグに対する抗体で検出することによって確立することができる。参照としてバックグラウンドおよび最大シグナルを用いることによって、抗体を対様式で評価して、特異性を決定することができる。特定の抗体が別の抗体と同じエピトープを認識する能力は、典型的にこのような競合アッセイ法によって決定される。
【００８０】
上記のアッセイ法のいずれかを用いて、第1抗体の存在下で、抗原に対する第2抗体の結合が少なくとも30%、通常少なくとも約40%、50%、60%、または75%、多くの場合少なくとも約90%減少する場合に、第1抗体は第2抗体の結合を競合的に阻害するとみなされる。
【００８１】
いくつかの態様において、抗体はmAb IIIA4と同じエピトープに結合する。IIIA4およびヒト改変誘導体のエピトープは、EphA3のN末端球状リガンド結合ドメイン(以下の部分的ヒトEphA3配列中のアミノ酸29〜202)内に存在する：
2015231994.tif 000003
【００８２】
IIIA4抗体は、受容体に対するエフリンA5の結合に隣接して結合するが、これを実質的に妨げない。抗体IIIA4のエピトープは、部位特異的変異誘発を用いて、Smith et al., J. Biol. Chem. 279: 9522, 2004によりさらに特徴づけられている。この解析において、132位のグリシンのグルタミン酸への変異(G132E)により、IIIA4への結合が消失する。バリン133のグルタミン酸への変異(V133E)により、IIIA4抗体へのEphA3の結合がおよそ1/100に減少する。その後、本発明者らにより、アルギニン136もまたエピトープの一部であることが観察された。ラットの高度に保存されたEphA3タンパク質の配列においてこの残基をロイシンに変更する(R136L)。ラットEphA3は、IIIA4とも、IIIA4のヒト改変誘導体とも結合しない。したがって、G132、V133、およびR136(上記配列において太字および下線で表示)は、IIIA4エピトープ内の重要なアミノ酸である。
【００８３】
結合親和性
いくつかの態様において、本発明との使用に適した抗体は、ヒトEphA3に対して高親和性結合を有する。本発明の目的のため、抗体の解離定数(KD)が＜約10 nM、例えば約5 nM、または約2 nM、または約1 nM、またはそれ未満である場合に、抗体と抗原との間に高親和性結合が存在する。当業者に周知のように、表面プラズモン共鳴アッセイ法、飽和アッセイ法、またはELISAもしくはRIAなどの免疫測定法などの種々の方法を用いて、抗体のその標的抗原に対する結合親和性を決定することができる。結合親和性を決定するための例示的な方法は、Krinner et al., (2007) Mol. Immunol. Feb;44(5):916-25. (Epub 2006 May 11)に記載されているように、CM5センサーチップを使用するBIAcore(商標) 2000装置(Biacore AB、ドイツ、フライブルク)での表面プラズモン共鳴解析によるものである。
【００８４】
抗EphA3抗体は、EphA3の任意の領域に結合し得る。いくつかの態様において、抗EphA3抗体はEphA3を活性化する。多くの場合、該抗体はEphA3を二量体化する。いくつかの態様において、該抗体はEphA3をクラスター化する。いくつかの態様では、IgG1、IgG3、IgM、IgA、またはIgEなどの活性アイソタイプを有し、ADCCを介して骨髄増殖性疾患細胞に対して細胞傷害性である抗EphA3抗体を使用することもできる。本発明において使用するための抗体はまた、架橋またはさもなくば多量体化して多価抗体を形成する単量体の形態を含む多価であってもよい。
【００８５】
いくつかの態様では、本発明において使用する抗体は、EphA3に対する結合においてEphA3リガンドと競合しないが、他の態様では、本発明において使用するためのEphA3抗体は、エフリン、例えばエフリン-A5などのEphA3リガンドのEphA3に対する結合と競合し得る。EphA3に対する結合においてリガンドと競合する抗体は、上記の技法を用いて同定することができ、この場合、競合解析には、もう一方の抗体の代わりにエフリン-A5などのエフリンリガンドを使用する。
【００８６】
例示的な態様において、抗EphA3抗体はmAb IIIA4のVL領域およびVH領域を含む。他の態様において、抗EphA3抗体はmAb IIIA4のCDR1、2、および3を含む。いくつかの態様おいて、抗EphA3抗体はmAb IIIA4のCDR3を含む。表1は、mAb IIIA4と同じエピトープに結合する抗体のCDR配列(Kabatの番号付けに従って規定される)を提供する。EphA3抗原に対する親和性はELISAによって決定した。したがって本発明の抗体はまた、表1に示す重鎖および/または軽鎖のCDRを有し得る。
【００８７】
（表１）
2015231994.tif 000004
【００８８】
本発明において使用するための本明細書に記載する抗体は、関心対象の特徴について公知のアッセイ法を用いて同定することができる。したがって、EphA3を活性化する能力に関して(例えば、実施例に記載されるようなアポトーシスアッセイ法を用いる)、ADCCを誘導する能力に関して(例えば、実施例に記載されるようなADCCアッセイ法を用いる)、ならびに上記のアッセイ法を用いて結合特異性および親和性に関してスクリーニングすることにより、抗体を同定することができる。
【００８９】
非抗体EphA3結合剤
EphA3に結合し、EphA3受容体を二量体化し、または活性化する他のタンパク質を、白血病またはCMPDを有する患者に投与することもできる。このようなタンパク質には、可溶性エフリンA5-Fcタンパク質が含まれる。
【００９０】
その他のEphA3結合剤には、EphA3と結合する骨格タンパク質が含まれる。したがって、EphA3結合剤は、抗体と類似の様式で抗原を標的とし、これに結合する「抗体模倣体」であってよい。抗体模倣体を使用する場合、模倣体の形態は、それがEphA3を二量体化するものである。例えば、抗体模倣体は二量体化、若しくは多価形式で使用され得る。
【００９１】
ある種の抗体模倣体は、抗体の可変領域のための代替タンパク質フレームワークとして、非免疫グロブリンタンパク質骨格を使用する。例えば、Ku et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6552-6556, 1995)は、シトクロムb562のループのうちの2つを無作為化し、ウシ血清アルブミンに対する結合について選択した、シトクロムb562に基づく抗体の代替物を開示している。個々の変異体は、抗BSA抗体と同様にBSAと選択的に結合することが見出された。
【００９２】
米国特許第6,818,418号および第7,115,396号は、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン様タンパク質骨格および少なくとも1つの可変ループを特色とする抗体模倣体を開示している。Adnectinとして知られるこれらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、任意の標的化リガンドに対する高い親和性および特異性を含め、天然抗体または改変抗体と同じ特徴の多くを示す。これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造は、IgG重鎖の可変領域の構造と類似している。したがって、これらの模倣体は、天然抗体と性質および親和性が類似している抗原結合特性を示す。さらに、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、抗体および抗体断片を上回るある種の利点を示す。例えば、これらの抗体模倣体は、天然折りたたみの安定性をジスルフィド結合に依存せず、よって通常では抗体を分解する条件下で安定している。加えて、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造はIgG重鎖の構造と類似しているため、インビボにおける抗体の親和性成熟の過程に類似したループの無作為化およびシャフリングの過程をインビトロで利用することができる。
【００９３】
Beste et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:1898-1903, 1999)は、リポカリン骨格に基づく抗体模倣体(Anticalin(登録商標))を開示している。リポカリンは、βバレルとタンパク質の末端における4つの超可変ループから構成される。ループがランダム突然変異誘発に供され、例えばフルオレセインとの結合について選択された。変種3つがフルオレセインとの特異的結合を示し、変種1つが抗フルオレセイン抗体と類似の結合を示した。さらなる解析から、無作為化の位置はすべて異なることが明らかになり、Anticalin(登録商標)が抗体の代替物として使用するのに適していることが示された。したがって、Anticalin(登録商標)は典型的に160〜180残基の小さな一本鎖ペプチドであり、生成コストの削減、貯蔵安定性の増加、および免疫学的反応の低下を含め、抗体を上回るいくつかの利点を提供する。
【００９４】
米国特許第5,770,380号は、カリックスアレーンの強固な非ペプチド有機骨格を、結合部位として用いる複数の可変ペプチドループと付着させて使用する合成抗体模倣体を開示している。ペプチドループはすべて、互いに、カリックスアレーンの幾何学的に同じ側から突出している。この幾何学的高次構造のために、すべてのループが結合に利用でき、リガンドに対する結合親和性が増加する。しかし、他の抗体模倣体と比較して、カリックスアレーンベースの抗体模倣体は全くペプチドだけからなるわけではなく、したがってプロテアーゼ酵素による攻撃に強い。この骨格は純粋にペプチド、DNA、またはRNAからなるわけではなく、この抗体模倣体が極端な環境条件において比較的安定であり、寿命が長いことを意味している。さらに、カリックスアレーンベースの抗体模倣体は比較的小さいため、免疫原性反応を生じる可能性が低い。
【００９５】
Murali et al. (Cell Mol Biol 49:209-216, 2003)は、抗体を縮小してより小さなペプチド模倣体にする方法論を記載しており、この模倣体は「抗体様結合ペプチド模倣体」(ABiP)と命名され、これもまた抗体の代替物として有用であり得る。
【００９６】
WO 00/60070は、CTL4A様βサンドイッチ構造を有するポリペプチド鎖を開示している。このペプチド骨格は、βストランドを6つ〜9つ含み、ポリペプチドβループのうちの2つまたはそれ以上が、抗原結合断片などの他の分子に対する結合ドメインを構成する。骨格の基本設計はヒト起源のものであり、したがって免疫応答を誘導するリスクが低くなる。βサンドイッチ骨格は、この分子が第2の非免疫グロブリンジスルフィド架橋を含むために、標準的な抗体と比較した場合に、インビボにおいて、向上した安定性および薬物動態学的特性を有し得る。抗原結合ドメインを単一ペプチド鎖の逆末端に位置づけることができるため、βサンドイッチにより二重特異性単量体分子の設計も容易になる。
【００９７】
非免疫グロブリンタンパク質フレームワークに加えて、RNA分子および非天然オリゴマーを含む化合物においても抗体特性が模倣されている(例えば、プロテアーゼ阻害剤、ベンゾジアゼピン、プリン誘導体、およびβターン模倣体)。したがって、非抗体EphA3結合剤にはこのような化合物も含まれ得る。
【００９８】
いくつかの態様において、本発明において使用するEphA3結合剤は、EphA3に対する結合においてmAb IIIA4と競合する。このような結合剤は、本明細書に記載する例示的な競合アッセイ法などの公知のアッセイ法を用いて同定することができる。
【００９９】
抗EphA3による治療の候補である患者の同定
本発明はまた、骨髄増殖性疾患を有する患者が抗EphA3抗体による治療の候補であるかどうかを判定する方法を提供する。本方法は、患者由来の骨髄増殖性疾患細胞におけるEphA3の発現を検出する段階を含む。いくつかの態様において、EphA3の発現は芽細胞において検出される。いくつかの態様において、EphA3発現は幹細胞において検出される。いくつかの態様において、EphA3発現は芽細胞および幹細胞の双方において検出される。
【０１００】
いくつかの態様では、骨髄増殖性疾患患者からの血液試料、例えば血清または血漿試料を、(例えば、骨髄増殖性疾患を有さない正常患者と比較した)可溶性EphA3のレベルの上昇について評価して、該患者が抗EphA3抗体による治療の候補であるかどうかを判定することができる。いくつかの態様では、患者において可溶性EphA3のレベルを測定して、抗EphA3抗体による治療の有効性をモニターすることができる。可溶性EphA3は、例えばELISAなどの公知の免疫測定法を用いて検出することができる。
【０１０１】
EphA3発現は、当技術分野で周知の方法を用いて検出することができる。多くの場合、免疫学的アッセイ法を用いて、EphA3タンパク質のレベルを検出することができる。免疫学的アッセイ法には、ELISA、蛍光活性化細胞選別等が含まれる。あるいは、EphA3をコードするmRNAのレベルを検出することによって、EphA3発現を検出することもできる。多くの場合、例えばRT-PCRなどの核酸増幅法を使用して、RNAの量を定量する。
【０１０２】
EphA3発現を評価するため、骨髄増殖性疾患細胞を含む試料を患者から採取する。試料は末梢血試料である場合が多いが、例えば骨髄試料などの他の適切な試料を解析してもよい。
【０１０３】
骨髄増殖性疾患細胞を含む試料中に存在する芽細胞、幹細胞、またはその双方がEphA3を発現する場合に、患者を抗EphA3抗体による治療の候補であると見なす。したがって、本明細書で使用する「EphA3+患者」とは、例えば造血障害を有さない患者などの正常対照に由来する細胞に対して、骨髄増殖性疾患細胞においてEphA3発現を示す患者である。
【０１０４】
骨髄増殖性疾患の治療
1つの局面において、本発明の方法は、AML、CML、PV、ET、IM、MDS、CMML、またはJMMLを有し、かつ細胞表面上にEphA3を発現する新生物骨髄増殖性疾患細胞を有する患者に、抗EphA3剤、典型的には抗EphA3抗体を投与する段階を含む。いくつかの態様では、新生物骨髄幹細胞(CD34+、CD123+、およびCD38-を特徴とする)がEphA3を発現する患者に、抗体などの抗EphA3剤を投与する。本発明に従って、抗EphA3剤、例えば抗EphA3で治療されるAML患者などの患者は、したがって、EphA3を発現する造血幹細胞および芽細胞の双方を有する。本明細書に記載する方法および組成物を用いて治療される他の患者は、芽細胞においてのみEphA3を発現し得る。さらなる他の患者は、幹細胞においてのみEphA3を発現し得る。いくつかの態様において、抗EphA3抗体で治療される患者は、表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患芽細胞を有するAMLまたはMDS患者である。
【０１０５】
白血病および骨髄増殖性疾患幹細胞は、フローサイトメトリーを用いる免疫表現型同定などの一般的に用いられる技法により、またはインビトロ細胞培養技法もしくはインビボ移植実験により同定することができる。
【０１０６】
幹細胞は、自己再生能を有する細胞として機能的にさらに定義され得る多能性前駆細胞である(例えば、Reya et al., Nature 414:105-111, 2001、およびその中で引用されている参考文献を参照されたい)。このことは、例えば、照射した骨髄間質フィーダー細胞上で細胞を培養する長期培養開始細胞(LTC-IC)アッセイにおいて実証され得る。このアッセイでは、長期間(例えば、少なくとも5週間)にわたりコロニーを連続して移行させる能力によって、幹細胞の存在が明らかにされる(例えば、Guan and Hogge (2000) Leukemia 14: 2135)。連続的移行アッセイは、幹細胞由来コロニーを、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン-3(IL-3)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、およびエリスロポエチン(EPO)の組み合わせなどの増殖因子の存在下で、メチルセルロース中で培養することによって実施することもできる。
【０１０７】
幹細胞を同定するためのインビボ移植は、免疫系が欠損しているマウス(SCID/NODマウス)において、連続移植により継代することによって実施する(van Rhenen et al., Clin. Cancer. Res. 11: 6520-6527, 2005)。
【０１０８】
フローサイトメトリー解析において、白血病または慢性骨髄増殖性疾患(CMPD)幹細胞は典型的に、CD34陽性、CD38陰性細胞区画中に存在する(しかしながら、AML症例のおよそ10%はCD34陰性である)。白血病またはCMPD幹細胞は、CD123陽性細胞としてCD38陰性細胞区画中に同定され得るが(Jordan et al., Leukemia 14: 1777-1784, 2000)、CD117、CD45RA、またはCD133の存在を含む他のマーカーを用いて、幹細胞を同定してもよい。
【０１０９】
芽細胞は、顆粒球生成に関与し得る単能性細胞である。芽細胞は、通常のヒトの単核および多形核血液細胞よりも大きな細胞であり、血液スメアの顕微鏡観察により、または単球および顆粒球と比較した高い前方散乱(FSC)および側方散乱(SSC)に基づいてフローサイトメトリー解析により、同定することができる。
【０１１０】
様々な薬物送達系において使用するために、抗EphA3組成物を製剤化することができる。適切な製剤化のために、生理的に許容される1つまたは複数の賦形剤または担体もまた、組成物中に含めることができる。本発明において使用するのに適した製剤は、Remington's: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Philadelphia, PA. Lipponcott Williams & Wilkins, 2005に見出される。薬物送達の方法の簡潔な総説については、Langer, Science s249: 1527-1533 (1990)を参照されたい。
【０１１１】
本発明の方法において使用するための抗EphA3抗体は、注射用滅菌等張水溶液など、患者への注射に適した溶液として提供する。許容される担体に、抗EphA3抗体を適切な濃度で溶解または懸濁する。いくつかの態様において、担体は水性であり、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等である。組成物は、pH調製剤および緩衝剤、浸透圧調整剤等のような、おおよその生理的状態に必要とされる補助的な薬学的物質を含み得る。
【０１１２】
本発明の薬学的組成物は、疾患または疾患およびその合併症の症状を少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で、骨髄増殖性疾患を有する患者に投与する。これを達成するのに適した量を「治療有効用量」と定義する。治療有効用量は、治療に対する患者の反応をモニターすることにより決定する。治療有効用量を示す典型的な基準は、疾患に応じて当技術分野で公知である。例えば、治療効果は、血液や骨髄における特定の骨髄増殖疾患の特徴である骨髄細胞異常が減少することによって示され得る。
【０１１３】
抗EphA3抗体の用量は、患者に効果的な治療を提供するように選択され、約0.1 mg/kg体重〜約25 mg/kg体重の範囲、または約1 mg〜約2 g/患者の範囲である。用量は多くの場合、約0.5 mg/kgもしくは約1 mg/kg〜約10 mg/kg、またはおよそ約50 mg〜約1000 mg/患者の範囲である。いくつかの態様において、抗体は、約0.1 mg/kg体重未満の量、例えば約20 mg/患者もしくはそれ未満の量で投与する。用量は、抗体の薬物動態(例えば、循環中の抗体の半減期)および薬力学的反応(例えば、抗体の治療効果の持続)に応じて、1日に1回〜3ヵ月ごとに1回の範囲であり得る適切な頻度で繰り返すことができる。インビボ半減期が約7日〜約25日である抗体または修飾抗体断片のいくつかの態様では、抗体の投薬を1週間に1回〜3ヵ月ごとに1回繰り返す。他の態様では、抗体を1ヵ月に約1回投与する。
【０１１４】
有効な投与量は、年齢、体重、性別、投与経路等の他の要因を含め、疾患の重症度および患者の健康の全般的状態に依存する。患者により必要とされかつ許容される投与量および頻度に応じて、抗EphA3抗体の単回投与または複数回投与を施与することができる。いずれにしても、本方法は、骨髄増殖性疾患を効果的に治療するために十分量の抗EphA3抗体を提供する。
【０１１５】
例えばEphA3を二量体化または活性化する抗EphA3抗体または抗EphA3アゴニスト結合剤は、骨髄増殖性疾患を治療するための1つまたは複数の付加的な治療薬と併用することができる。抗EphA3結合剤と併用して投与することができる治療薬には、MYLOTARG(登録商標)(注射用ゲムツズマブオゾガマイシン)などの化合物；メシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))、ニロチニブ(TASIGMNA(登録商標))、およびダサチニブ(SPRYCEL(登録商標))などのチロシンキナーゼ阻害剤；インターフェロン-α、ならびに様々な化学療法薬が含まれる。
【０１１６】
いくつかの態様では、患者由来の白血病幹細胞がEphA3を発現する慢性骨髄性白血病を有する患者を治療するために、抗EphA3活性化抗体を1つまたは複数の付加的な治療薬と併用することができる。このような治療薬には、様々な化学療法薬およびメシル酸イマチニブ(GLEEVEC(登録商標))が含まれる。
【０１１７】
いくつかの態様では、急性骨髄性白血病を治療するために、例えば活性化抗体などの抗EphA3抗体を1つまたは複数の付加的な治療薬と併用することができる。このような治療薬には、単独である、およびダウノルビシンと併用したシトシンアラビノシドが含まれる。
【０１１８】
いくつかの態様では、BCR-ABL陰性CMPDを有する患者を治療するために、抗EphA3活性化抗体を1つまたは複数の付加的な治療薬と併用することができる。このような阻害剤には、当技術分野で公知であり、かつ臨床評価を受けているJAK2阻害剤が含まれる。
【０１１９】
患者は、併用療法としてこれらの付加的な治療薬の1つまたは複数を投与され得る。あるいは、患者は、付加的な治療薬で連続して治療されてもよい。
【０１２０】
いくつかの態様では、抗EphA3活性化抗体を、骨髄移植を受けた患者に投与する。
【０１２１】
いくつかの態様において、抗EphA3抗体または他の活性化EphA3結合剤は、これらに限定されないが、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、または腹腔内経路を含む任意の適切な経路を介して、注射または注入により投与する。いくつかの態様では、抗EphA3抗体を注射用生理食塩水溶液に希釈してから、患者に投与する。抗体は、例えば、15分〜2時間という時間をかけて静脈内注入により投与する。
【０１２２】
以下の実施例は説明のためのみに提供するものであって、限定のために提供するものではない。当業者は、本質的に同様の結果を得るために変更または修正することができる、重要ではない種々のパラメータを容易に理解するであろう。
【実施例】
【０１２３】
実施例
実施例1. 表面上にEphA3を発現するCMPDおよび白血病の同定
フローサイトメトリーを使用して、骨髄増殖性疾患と診断された患者に由来する腫瘍細胞の表面上のEphA3の発現を評価した。末梢血(バフィーコート細胞調製物；末梢血単核細胞(PBMC))または骨髄穿刺液から単離された細胞を、Fc受容体結合をブロッキングするための1μg標準IgG(ラットIgG；US Biologicalまたは抗FcR抗体)を添加したフローサイトメトリー緩衝液(PBS、2 mM EDTA、2%ウシ胎仔血清、0.05%アジカナトリウム)中に、1×106個細胞/0.1 mlで懸濁した。抗EphA3抗体または陰性対照ヒトIgG1を5μg/mlで添加し、氷上で20分間インキュベートした。フローサイトメトリー緩衝液で希釈し、1000 rpmで5分間遠心分離することにより、細胞を洗浄した。細胞ペレットを、フローサイトメトリー緩衝液で希釈したFITC結合ヤギF(ab)'2抗ヒトIgG抗体(Caltag)(1:20)中に再懸濁し、氷上で20分間インキュベートした。細胞を遠心分離により一度洗浄し、1:1000に希釈したヨウ化プロピジウム(Sigma)を含むフローサイトメトリー緩衝液中に再懸濁した。ヨウ化プロピジウムを排除する生細胞をフローサイトメトリーにより解析して、陰性対照抗体で染色した細胞と比較してEphA3発現細胞を同定した。
【０１２４】
表2は、ある割合の急性および慢性骨髄性白血病、ならびに特発性骨髄線維症および本態性血小板血症を含む骨髄増殖性疾患の末梢血単核細胞において、EphA3が細胞表面上で検出可能であることを示す。
【０１２５】
（表２）フローサイトメトリーによって検出される表面EphA3に関する骨髄および末梢血(PBMC)試料のフローサイトメトリースクリーニングの概要
2015231994.tif 000005
*細胞の少なくとも5%が、アイソタイプ対照抗体で染色された試料における蛍光強度よりも高い免疫蛍光を示した場合に、試料を陽性と定義する
【０１２６】
AMLにおける白血病幹細胞もまた、表面EphA3発現について評価した。AML患者からの骨髄由来細胞を、CD34、CD38、およびCD123に対する抗体で染色して、白血病幹細胞集団を同定した(CD34陽性、CD123陽性、およびCD38陰性を特徴とする)。PE結合抗CD34抗体；PEcy5結合抗CD38抗体；およびAPC結合抗CD123抗体を、フローサイトメトリー解析に使用した(50,000イベント/試料)。CD34、CD38でゲートをかけた細胞に対する、EphA3に特異的なヒト改変抗体の結合を図1に示す。CD123陽性(CD34陽性かつCD38陰性)白血病幹細胞のすべてが、EphA3発現について陽性であった。
【０１２７】
EphA3は、正常な造血系CD34陽性幹細胞では検出され得なかった(データは示さず)。さらに、EphA3に対する抗体は、インビトロコロニー形成アッセイにおいて正常な造血を妨げなかった。
【０１２８】
実施例2. 抗EphA3抗体が骨髄増殖性疾患細胞のアポトーシスを誘導する能力の評価
本実施例は、抗EphA3抗体が骨髄増殖性疾患細胞においてアポトーシスを誘導したことを実証する。
【０１２９】
EphA3に結合する改変ヒト活性化抗体を、骨髄増殖性疾患に罹患している患者または個体から単離された初代細胞においてインビトロでアポトーシスを誘導する能力について評価した。細胞を、96ウェル「U」底プレート中の0.1 ml培養液(10%ウシ胎仔血清を添加したRPMI640)中に、2.5×105個細胞/ウェルで播種した。抗EphA3抗体またはヒトIgG1アイソタイプ対照抗体を、最終濃度が10μg/ml〜1 ng/mlとなるように添加し、このプレートを組織培養インキュベーター中で37℃および5%二酸化炭素にて24時間インキュベートした。アポトーシス誘導の陽性対照として、別個の細胞試料をカンプトテシン(10μM；Calbiochem)と共にインキュベートした。インキュベーションの終了後、細胞を回収し、1000 rpmで5分間遠心分離することにより洗浄し、次に5μl FITC結合アネキシンV(BD Pharmingen、component no. 51-65874X)および5μlヨウ化プロピジウム(component no.51-66211E)を含む0.1 mlの1×アネキシンV結合緩衝液(BD Pharmingen、Cat # 556547、component no.51-66121E)中で、室温、暗下で15分間インキュベートした。400μlの1×結合緩衝液を各チューブに添加し、アネキシンVで染色されるアポトーシス細胞をフローサイトメトリーにより同定した。図4は、ヒト改変抗体のアポトーシス活性を示すデータを提供する。
【０１３０】
表3に示す結果は、前記抗体が、カンプトテシンに匹敵するレベルで、いくつかの試料においてアポトーシスを誘導したことを実証する。わずかな割合の細胞のみがEphA3を発現する試料では、抗EphA3抗体は同様にわずかな割合の細胞においてアポトーシスを誘導し、アポトーシスの誘導がEphA3陽性細胞に特異的であることが示唆される。
【０１３１】
（表３）EphA3に結合する改変ヒト活性化抗体によるアポトーシスの誘導(PB、末梢血；BM、骨髄)
2015231994.tif 000006
【０１３２】
実施例3. 抗EphA3抗体が骨髄増殖性疾患細胞においてADCCを誘導する能力の評価
α 1,6-フコースが欠損している抗EphA3抗体の調製
記載されるように、組換え改変ヒト抗EphA3抗体(IgG1k)を発現するCHO細胞を、2μg/mlキフネシンを含むCHO-SFM II培地(Invitrogen)中で培養して、α 1,6-フコースが欠損している改変グリコシル化パターンを有する抗体を作製した(Zhou et al., Biotechnol. Bioeng. 99:652-665, 2008)。プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製した抗体は、タンパク質ブロットにおいてレンズマメ(Lens culinaris)レクチン(Sigma)の結合により測定されるα 1,6-フコースのレベルの有意な低下を示し、この糖成分を含む抗体分子は10%未満であった。
【０１３３】
ADCCアッセイ
標準的な技法に従って、ヒトPBMCエフェクター細胞を、Ficoll-hypaque密度分離によりバフィーコート試料から単離した。白血病または骨髄増殖性疾患を有する患者からの骨髄または末梢血に由来する初代単核細胞を、ADCCアッセイにおける標的細胞として使用した。PBMCについて、腫瘍標的細胞をヒトエフェクター細胞と共に、100:1または200:1のエフェクター:標的比で16時間インキュベートした。死細胞から放出された乳酸脱水素酵素(LDH)をCytoTox 96アッセイ(Promega)により測定した。本アッセイにおいて、エフェクター細胞の非存在下における標的細胞と抗体のインキュベーションは、検出可能な細胞傷害性を示さなかった。
【０１３４】
ヒト本態性血小板血症細胞の殺傷が、PBMCエフェクター細胞の存在下で抗EphA3抗体(IgG1k)によって誘導された代表的なADCCアッセイの結果を図2に示す。該抗体は、本アッセイにおいて強力なADCC活性を示した。CD16に対する抗体を含めると抗EphA3抗体の細胞傷害活性は抑制され、ADCCがCD16受容体(FcRIII)によって媒介されることが示唆される。抗CD16抗体(BD Pharmingen)は、5μg/mlの濃度で添加した。
【０１３５】
α 1,6フコースが欠損している抗体調製物を、ADCCアッセイにおいてフコシル化抗体と比較して評価した。図3に示したアッセイでは、プレB細胞白血病に由来する細胞株LK63を標的として使用した。α 1,6フコースが欠損している抗体は、本アッセイにおいてフコシル化抗体よりも有意に強力であった。ADCC活性は低レベルの脱フコシル化抗体(0.1 ng/ml)で検出され、その濃度ではフコシル化抗体は検出可能なADCC活性を示さなかった。
【０１３６】
表4に示したように、改変ヒト抗EphA3抗体はまた、AML患者からの骨髄試料に由来する初代ヒト腫瘍細胞に対して強力なADCC活性を示し、また真性赤血球増加症患者の末梢血中のEphA3陽性細胞に対してADCC活性を示した。
【０１３７】
（表４）白血病または骨髄増殖性疾患を有する患者からの細胞に対する改変ヒト抗EphA3抗体のADCC活性(PB、末梢血；BM、骨髄)
2015231994.tif 000007
表5は、AMLおよび骨髄異形成症候群患者からの骨髄穿刺液に由来するより幅広い一連の初代試料によるEphA3発現細胞の細胞表現型に関するデータを要約し、アポトーシスの直接的な誘導、またはエフェクター細胞媒介性のADCC活性のいずれかにより抗EphA3抗体によって殺傷された各試料中の細胞の割合を示す。これらの試料において、CD123+ CD34+ CD38-白血病幹細胞(LSC)が同定され得る各症例では、これらLSCの100%がEphA3発現についても陽性であった。試料の大部分において、改変ヒト抗EphA3抗体によって媒介されるADCCまたはアポトーシスのいずれかにより殺傷された細胞の割合と、フローサイトメトリーによりEphA3について陽性であると検出された細胞の割合の間には良好な相関が存在し、EphA3発現細胞に対する該抗体の特異性が示唆される。
【０１３８】
（表５）悪性芽細胞および白血病幹細胞におけるEphA3の発現の概要：
ヒト改変抗体は、2つの独立した機構によりEphA3+細胞を殺傷する。
2015231994.tif 000008
【０１３９】
本明細書において引用した出版物、特許出願、アクセッション番号、およびその他の参考文献はすべて、個々の出版物または特許出願が詳細にかつ個別に参照により組み入れられることが示されるがごとく、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
2015231994.tif 000009
【図２】
2015231994.tif 000010
【図３】
2015231994.tif 000011
【図４】
2015231994.tif 000012
【配列表】
2015231994000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月16日(2015.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患細胞を殺傷する方法であって、該細胞を抗EphA3抗体と接触させる段階を含み、該抗EphA3抗体が(i) EphA3を活性化し、かつ(ii) 抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を誘導する、前記方法。
【請求項２】
骨髄増殖性疾患を有し、かつ細胞表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患細胞を有する患者を治療する方法であって、治療有効量の抗EphA3抗体を該患者に投与する段階を含み、該抗EphA3抗体が(i) EphA3を活性化し、かつ(ii) ADCCを誘導する、前記方法。
【請求項３】
表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患細胞を殺傷する方法であって、該細胞を、EphA3を活性化するかまたはADCCを誘導する抗EphA3抗体と接触させる段階を含み、該骨髄増殖性疾患細胞が急性骨髄性白血病(AML)細胞または骨髄異形成症候群(MDS)細胞である、前記方法。
【請求項４】
骨髄増殖性疾患を有し、かつ細胞表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患細胞を有する患者を治療する方法であって、治療有効量の抗EphA3抗体を該患者に投与する段階を含み、該抗EphA3抗体がEphA3を活性化するかまたはADCCを誘導し、該骨髄増殖性疾患がAMLまたはMDSである、前記方法。
【請求項５】
AML患者またはMDS患者が抗EphA3抗体による治療の候補であると判定する方法であって、
該患者に由来する骨髄増殖性疾患細胞を含む試料を提供する段階；および
該骨髄増殖性疾患細胞におけるEphA3の発現を検出する段階
を含む、前記方法。
【請求項６】
CMPD患者が抗EphA3抗体による治療の候補であると判定する方法であって、
該患者に由来する新生物幹細胞を含む試料を提供する段階、および
該新生物幹細胞によるEphA3の発現を検出する段階
を含む、前記方法。
【請求項７】
EphA3+骨髄増殖性細胞を伴う骨髄増殖性疾患を有する患者の治療の有効性をモニターする方法であって、該骨髄増殖性疾患がAMLまたはMDSであり、
骨髄増殖性疾患の治療処置後に、該患者から骨髄増殖性疾患幹細胞および/または芽細胞を含む試料を採取する段階；ならびに
該骨髄増殖性疾患幹細胞および/または芽細胞におけるEphA3の発現を検出する段階
を含む、前記方法。
【請求項８】
EphA3を発現する新生物骨髄増殖性疾患幹細胞を有するCMPD患者の治療の有効性をモニターする方法であって、
CMPDの治療処置後に、該患者から新生物幹細胞を含む試料を採取する段階；および
該幹細胞におけるEphA3の発現を検出する段階
を含む、前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明はさらに、骨髄増殖性疾患を有する患者を治療する際に使用するための、本明細書に記載する抗EphA3抗体を含む薬学的組成物を提供する。
[本発明1001]
細胞表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患細胞を殺傷する方法であって、該細胞を抗EphA3抗体と接触させる段階を含み、該抗EphA3抗体が(i) EphA3を活性化し、かつ(ii) 抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を誘導する、前記方法。
[本発明1002]
骨髄増殖性疾患を有し、かつ細胞表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患細胞を有する患者を治療する方法であって、治療有効量の抗EphA3抗体を該患者に投与する段階を含み、該抗EphA3抗体が(i) EphA3を活性化し、かつ(ii) ADCCを誘導する、前記方法。
[本発明1003]
骨髄増殖性疾患細胞が慢性骨髄増殖性疾患(CMPD)細胞である、本発明1001または本発明1002の方法。
[本発明1004]
CMPD細胞がBCR-ABL陰性CMPD細胞である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
CMPD細胞がCML細胞である、本発明1003の方法。
[本発明1006]
少なくとも1つの付加的な治療薬を投与する段階をさらに含み、該少なくとも1つの付加的な治療薬が化学療法薬である、本発明1005の方法。
[本発明1007]
化学療法薬がメシル酸イマチニブ、ニロチニブ、またはダサチニブである、本発明1006の方法。
[本発明1008]
抗体がヒト重鎖のγ-1またはγ-3定常領域を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1009]
抗体が低フコシル化されている、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
抗EphA3抗体がEphA3に対する結合においてmab IIIA4と競合する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
抗EphA3抗体が組換え抗体またはキメラ抗体である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
抗EphA3抗体がヒト抗体である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
抗EphA3抗体がモノクローナル抗体である、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
抗EphA3抗体がポリクローナル抗体である、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1015]
抗体がmAb IIIA4のVH領域のCDR3およびVL領域のCDR3を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1016]
抗EphA3抗体がmAb IIIA4のVH領域およびVL領域のCDR1、CDR2、およびCDR3を含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患細胞を殺傷する方法であって、該細胞を、EphA3を活性化するかまたはADCCを誘導する抗EphA3抗体と接触させる段階を含み、該骨髄増殖性疾患細胞が急性骨髄性白血病(AML)細胞または骨髄異形成症候群(MDS)細胞である、前記方法。
[本発明1018]
骨髄増殖性疾患を有し、かつ細胞表面上にEphA3を発現する骨髄増殖性疾患細胞を有する患者を治療する方法であって、治療有効量の抗EphA3抗体を該患者に投与する段階を含み、該抗EphA3抗体がEphA3を活性化するかまたはADCCを誘導し、該骨髄増殖性疾患がAMLまたはMDSである、前記方法。
[本発明1019]
骨髄増殖性疾患細胞がAML細胞である、本発明1017または本発明1018の方法。
[本発明1020]
少なくとも1つの付加的な治療薬を投与する段階をさらに含み、該少なくとも1つの付加的な治療薬が、単独であるかまたはダウノルビシンと併用したシトシンアラビノシドである、本発明1019の方法。
[本発明1021]
抗体がEphA3を活性化する、本発明1017または本発明1018の方法。
[本発明1022]
抗体がヒト重鎖定常領域を含む、本発明1017〜1020のいずれかの方法。
[本発明1023]
抗EphA3抗体がEphA3結合においてmAb IIIA4と競合する、本発明1017〜1038のいずれかの方法。
[本発明1024]
抗体が(Fab')2である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1025]
抗EphA3抗体が組換え抗体またはキメラ抗体である、本発明1017〜1023のいずれかの方法。
[本発明1026]
抗EphA3抗体がヒト抗体である、本発明1017〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
抗EphA3抗体がポリクローナル抗体である、本発明1017〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
抗EphA3抗体がモノクローナル抗体である、本発明1017〜1026のいずれかの方法。
[本発明1029]
抗EphA3抗体がFab、Fab'、またはFvを含む多価抗体である、本発明1017〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
抗EphA3抗体がmAb IIIA4のVH領域およびVL領域を含む、本発明1017〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
抗EphA3抗体がmAb IIIA4のVH領域およびVL領域のCDR1、CDR2、およびCDR3を含む、本発明1017〜1029のいずれかの方法。
[本発明1032]
抗体がmAb IIIA4のVH領域のCDR3およびVL領域のCDR3を含む、本発明1017〜1029のいずれかの方法。
[本発明1033]
抗EphA3抗体がADCCを誘導する、本発明1017〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
抗体がEphA3に対するエフリンA5リガンドの結合を阻止する、本発明1033の方法。
[本発明1035]
抗体が低フコシル化されている、本発明1033の方法。
[本発明1036]
抗体がヒトのγ-1またはγ-3定常領域を有する、本発明1033の方法。
[本発明1037]
抗体がEphA3に対するエフリンA5リガンドの結合を阻止する、本発明1033の方法。
[本発明1038]
ヒト重鎖定常領域がγ-2またはγ-4領域である、本発明1022〜1032のいずれかの方法。
[本発明1039]
AML患者またはMDS患者が抗EphA3抗体による治療の候補であると判定する方法であって、
該患者に由来する骨髄増殖性疾患細胞を含む試料を提供する段階；および
該骨髄増殖性疾患細胞におけるEphA3の発現を検出する段階
を含む、前記方法。
[本発明1040]
EphA3が芽細胞において検出される、本発明1039の方法。
[本発明1041]
EphA3が幹細胞において検出される、本発明1039の方法。
[本発明1042]
EphA3が芽細胞および幹細胞の双方において検出される、本発明1039の方法。
[本発明1043]
EphA3の発現を検出する段階が、細胞表面上のタンパク質発現を検出する段階を含む、本発明1039の方法。
[本発明1044]
EphA3の発現を検出する段階が、EphA3 RNAレベルを検出する段階を含む、本発明1039の方法。
[本発明1045]
EphA3 RNAレベルを検出する段階が増幅反応を行う段階を含む、本発明1044の方法。
[本発明1046]
増幅反応がRT-PCRを含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
CMPD患者が抗EphA3抗体による治療の候補であると判定する方法であって、
該患者に由来する新生物幹細胞を含む試料を提供する段階、および
該新生物幹細胞によるEphA3の発現を検出する段階
を含む、前記方法。
[本発明1048]
EphA3+骨髄増殖性細胞を伴う骨髄増殖性疾患を有する患者の治療の有効性をモニターする方法であって、該骨髄増殖性疾患がAMLまたはMDSであり、
骨髄増殖性疾患の治療処置後に、該患者から骨髄増殖性疾患幹細胞および/または芽細胞を含む試料を採取する段階；ならびに
該骨髄増殖性疾患幹細胞および/または芽細胞におけるEphA3の発現を検出する段階
を含む、前記方法。
[本発明1049]
EphA3を発現する新生物骨髄増殖性疾患幹細胞を有するCMPD患者の治療の有効性をモニターする方法であって、
CMPDの治療処置後に、該患者から新生物幹細胞を含む試料を採取する段階；および
該幹細胞におけるEphA3の発現を検出する段階
を含む、前記方法。