(57)【要約】【課題】本発明は、外来遺伝子が染色体に組み込まれていないＥＳ様細胞を、簡便にかつ効率的に製造するためのベクターを提供することを目的とする。【解決手段】染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いて、体細胞からＥＳ様細胞を作製する方法を見出した。上記作製されたＥＳ様細胞は、外来遺伝子が染色体に組み込まれていないため、本細胞を利用した試験、研究に好都合であるばかりでなく、疾病の治療においても、免疫拒絶の問題や倫理面の問題を回避できる可能性がある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のリプログラミングにおいて遺伝子を導入するための方法であって、染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いて細胞に該遺伝子を導入することを特徴とする方法。
【請求項２】
リプログラミングが多能性幹細胞の誘導である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該遺伝子が下記（１）〜（８）からなる群より選択される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子
【請求項８】
染色体非組み込み型ウイルスベクターを含む、細胞のリプログラミングにおける遺伝子導入に用いるための組成物。
【請求項９】
リプログラミングが多能性幹細胞の誘導である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
該遺伝子が下記（１）〜（８）からなる群より選択される、請求項８から１３のいずれかに記載の組成物。
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子
【請求項１５】
染色体非組み込み型ウイルスベクターの、分化した細胞のリプログラミングのための薬剤の製造における使用。
【請求項１６】
リプログラミングが、分化した細胞からの多能性幹細胞の誘導である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項１８】
RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
ベクターが、下記（１）〜（８）からなる群より選択される初期化因子をコードする遺伝子を少なくとも搭載する、請求項１５から２０のいずれかに記載の使用。
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子
【請求項２２】
下記（１）〜（８）からなる群より選択される遺伝子を搭載する、染色体非組み込み型ウイルスベクター。
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子
【請求項２３】
染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２６】
パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
リプログラムされた細胞の製造方法であって、分化した細胞に少なくとも一つの染色体非組み込み型ウイルスベクターを接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
リプログラムされた細胞が人工多能性幹細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該ベクターが、核初期化因子をコードする遺伝子を少なくとも一つ搭載する、少なくとも一つの染色体非組み込み型ウイルスベクターである、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
該遺伝子が、下記（１）〜（８）からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子
【請求項３１】
細胞内で、少なくともOct遺伝子、Klf遺伝子およびSox遺伝子の３種、あるいは少なくともOct遺伝子、Sox遺伝子、Nanog遺伝子、Lin28遺伝子の４種が内在性または外来性に発現するようにベクターが組み合わされる、請求項２７から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
細胞内で、少なくともOct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子およびMyc遺伝子の４種が内在性または外来性に発現するようにベクターが組み合わされる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、請求項２７から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項２７から３６のいずれかに記載の方法により製造された細胞を分化させる工程をさらに含む、分化した細胞の製造方法。
【請求項３８】
請求項２７から３７のいずれかに記載の方法により製造された細胞。
【請求項３９】
リプログラミングの工程によりベクターが染色体に組み込まれていない、請求項３８に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リプログラムされた細胞の製造方法、該方法により製造された細胞、および該方法において用いられる組成物等に関する。特に本発明は、分化した体細胞から、多能性幹細胞を製造する方法とその方法により調製された多能性幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は哺乳動物胚盤胞の内部細胞塊より樹立した幹細胞であり、すべての細胞へと分化する能力（分化多能性）を維持したまま、無限に増殖させることができる。この特性から、ＥＳ細胞から大量に誘導、調製した心筋細胞や神経細胞を心筋梗塞やパーキンソン病患者に移植して治療する幹細胞療法が期待されている。また、病理、薬理の基礎研究や、創薬での開発ツールとしての利用も期待されている。しかしこのＥＳ細胞にはヒト受精卵を利用し、犠牲にするという倫理的問題が存在する。また限られたドナー受精卵の組織適合抗原が患者と一致しないという免疫拒絶の問題もある。一方、生体の各組織には神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞などの組織幹細胞が存在する。組織幹細胞は受精卵を使わないので倫理的問題が少なく、または無く、また患者自身の細胞が使えるので免疫拒絶反応も回避することができる。しかし組織幹細胞はその性質が必ずしも明らかでないため単離が難しく、数もきわめて少ない。増殖能や分化能もＥＳ細胞に比べると比べものにならないほど限られている。組織幹細胞や分化細胞等の体細胞を何らかの手段により高い増殖能と分化多能性を有するＥＳ細胞に類似した細胞（ＥＳ様細胞と称す）に変換することができたなら、このＥＳ様細胞は臨床応用等にとって理想的な幹細胞となる。
【０００３】
具体的には、哺乳動物の細胞、特に患者の体細胞（皮膚、胃や肺などの組織、血液細胞など）を採取し、培養したこれら細胞を核初期化因子（nuclear reprogramming factors）（核初期化 (nuclear reprogramming) を誘導する因子）で刺激してＥＳ様細胞（「人工多能性幹細胞」、「誘導多能性幹細胞（iPS細胞）」又は「胚性幹細胞様細胞」と呼ばれる場合もある）を作製する。この作製したものをそのまま、もしくは細胞バンクとして蓄え、幹細胞として臨床応用する、或は薬理、病理を含む基礎研究に使用することが期待される（特許文献１）。また患者から樹立した人工多能性幹細胞を用い薬効確認実験を行うことも可能である。
【０００４】
核初期化因子（nuclear reprogramming factors）としては、例えば、Oct遺伝子、Klf遺伝子、Myc遺伝子、Sox遺伝子、Nanog遺伝子、Lin28遺伝子、TERT遺伝子、及びSV40 LargeT遺伝子などが挙げられる（特許文献２、非特許文献１〜７）。
【０００５】
例えば、下記４つの組換えウイルスベクターを用いて、上記体細胞から上記ＥＳ様細胞が作製することができることが知られている（非特許文献１〜７）。上記作製されたＥＳ様細胞は、臨床的に利用される場合には免疫拒絶の問題や倫理面の問題を回避できる可能性がある。
（1）Oct3/4遺伝子を含むガンマレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクター（以下、これらを合わせて「レトロウイルスベクター」と総称する）
（2）Klf4遺伝子を含むレトロウイルスベクター
（3）c-Myc遺伝子を含むレトロウイルスベクター
（4）Sox2遺伝子を含むレトロウイルスベクター
【０００６】
上記特許文献、非特許文献は以下の通りである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開ＷＯ2005/080598
【特許文献２】国際公開ＷＯ2007/069666
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-872
【非特許文献２】Science. 2007 Dec 21;318(5858):1917-1920
【非特許文献３】Nat Biotechnol. 2008 Jan;26(1):101-106
【非特許文献４】Science. 2007 Dec 21;318(5858):1920-1923
【非特許文献５】Nature. 2008 Jan 10;451(7175):141-146
【非特許文献６】PNAS. 2008 Feb 26;105(8):2883-2888
【非特許文献７】Cell. 2008 Apr 18;133(2):250-264
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、上記レトロウイルスベクターを用いて作製したＥＳ様細胞は、宿主染色体へのベクターのインテグレーションにより染色体が構造的に改変されていることに注目しなくてはならない。予期せぬ染色体機能異常を来たしている可能性があり、特に癌細胞化する恐れがある。原因としては、レトロウイルスベクターを用いたことである。レトロウイルスベクターを用いる場合、導入した細胞の染色体にベクターがランダムに組み込まれることにより、染色体内のがん抑制遺伝子を不活性化したり、挿入部位に隣接するがん化に関与する遺伝子を活性化したりする危険性があるためである（実験医学 Vol.26 Ｎｏ.５（増刊）：pp. 35-40, 2008）。また、それ以外の遺伝子あるいはその遺伝子の発現を修飾する遺伝子に組込まれた場合も、予期せぬ性質の細胞に変化する可能性がある。更には、最近染色体のいわゆる非暗号化領域も一定の染色体機能を担っているとされているので、非暗号化領域へのレトロウイルスベクターの組み込みがもたらす好ましからぬ結果も考慮する必要がある。加えて、ベクターが多能性幹細胞の分化に関与する遺伝子に挿入した場合には、幹細胞を分化させて得られる細胞を用いての治療や研究が、分化が行われないことにより、細胞が得られないために実施できないという可能性もある。このように、従来法による細胞リプログラミングでは、得られたＥＳ様細胞を用いる治療に安全性の問題が残る他、患者から樹立したＥＳ様細胞を用いての薬効、病態解析においても、染色体内に外来遺伝子が挿入されることによる、本来細胞で機能している遺伝子の不活性化や活性化による影響についても考慮しなくてはならず、かつその解析は極めて困難な作業となる。またレトロウイルスベクターを用いた場合、同一の研究者でも、そのロットごとに、また、異なる作製者が同じプロトコールで作製しても、確立されるＥＳ様細胞は染色体内の異なった箇所にレトロウイルスベクターが挿入されることになるため、人工多能性幹細胞の均一性について保証が出来ないという問題も存在する。
【００１０】
本発明はこのような事情を根本的に解決することを意図してなされたもので、外来遺伝子が染色体に組み込まれていないＥＳ様細胞、つまり染色体非組換えＥＳ細胞を簡便にかつ効率的に製造する方法を提供する。また本発明は、該方法においてリプログラミングを誘導するために有用な遺伝子導入組成物を提供する。また、本発明は、本発明の方法により得られた多能性幹細胞を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、染色体非組み込み型ベクターを用いることにより、外来遺伝子が染色体に組み込まれていない多能性幹細胞を製造できることを見出した。
すなわち本発明は、染色体非組み込み型ベクターを用いた多能性幹細胞の製造方法、および本発明の方法により作製されたＥＳ様細胞等に関し、より具体的には請求項の各項に記載の発明に関する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の２つまたはそれ以上の任意の組み合わせからなる発明も、本明細書において意図された発明である。すなわち本発明は、
〔１〕細胞のリプログラミングにおいて遺伝子を導入するための方法であって、染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いて細胞に該遺伝子を導入することを特徴とする方法、
〔２〕リプログラミングが多能性幹細胞の誘導である、〔１〕に記載の方法、
〔３〕染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、〔１〕または〔２〕に記載の方法、
〔４〕RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、〔３〕に記載の方法、
〔５〕マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〔４〕に記載の方法、
〔６〕パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔５〕に記載の方法、
〔７〕該遺伝子が下記（１）〜（８）からなる群より選択される、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の方法、
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子
〔８〕染色体非組み込み型ウイルスベクターを含む、細胞のリプログラミングにおける遺伝子導入に用いるための組成物、
〔９〕リプログラミングが多能性幹細胞の誘導である、〔８〕に記載の組成物、
〔１０〕染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、〔８〕または〔９〕に記載の組成物、
〔１１〕RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、〔１０〕に記載の組成物、
〔１２〕マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〔１１〕に記載の組成物、
〔１３〕パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔１２〕に記載の組成物、
〔１４〕該遺伝子が下記（１）〜（８）からなる群より選択される、〔８〕から〔１３〕のいずれかに記載の組成物、
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子
に関する。また本発明は、
〔１〕リプログラムされた細胞の製造方法であって、分化した細胞に少なくとも一つの染色体非組み込み型ウイルスベクターを接触させる工程を含むことを特徴とする方法、
〔２〕リプログラムされた細胞が人工多能性幹細胞である、〔１〕に記載の方法、
〔３〕該ベクターが、核初期化因子をコードする遺伝子を少なくとも一つ搭載する、少なくとも一つの染色体非組み込み型ウイルスベクターである、〔１〕または〔２〕に記載の方法、
〔４〕該遺伝子が、下記（１）〜（８）からなる群より選択される、〔３〕に記載の方法、
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子
〔５〕細胞内で、少なくともOct遺伝子、Klf遺伝子およびSox遺伝子の３種、あるいは少なくともOct遺伝子、Sox遺伝子、Nanog遺伝子、Lin28遺伝子の４種が内在性または外来性に発現するようにベクターが組み合わされる、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法、
〔６〕細胞内で、少なくともOct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子およびMyc遺伝子の４種が内在性または外来性に発現するようにベクターが組み合わされる、〔５〕に記載の方法、
〔７〕染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の方法、
〔８〕RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、〔７〕に記載の方法、
〔９〕マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〔８〕に記載の方法、
〔１０〕パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔９〕に記載の方法、
〔１１〕〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載の方法により製造された細胞を分化させる工程をさらに含む、分化した細胞の製造方法、
〔１２〕〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の方法により製造された細胞、
〔１３〕リプログラミングの工程によりベクターが染色体に組み込まれていない、〔１２〕に記載の細胞、
〔１４〕染色体非組み込み型ウイルスベクターを発現ベクターとして含む、細胞のリプログラミングに用いるための組成物、
〔１５〕リプログラミングが、分化した細胞からの多能性幹細胞の誘導である、〔１４〕に記載の組成物、
〔１６〕染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、〔１４〕または〔１５〕に記載の組成物、
〔１７〕RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、〔１６〕に記載の組成物、
〔１８〕マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〔１７〕に記載の組成物、
〔１９〕パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔１８〕に記載の組成物、
〔２０〕ベクターが、下記（１）〜（８）からなる群より選択される初期化因子をコードする遺伝子を少なくとも搭載する、〔１４〕から〔１９〕のいずれかに記載の組成物、
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子
〔２１〕染色体非組み込み型ウイルスベクターの、分化した細胞のリプログラミングのための薬剤の製造における使用、
〔２２〕リプログラミングが、分化した細胞からの多能性幹細胞の誘導である、〔２１〕に記載の使用、
〔２３〕染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、〔２１〕または〔２２〕に記載の使用、
〔２４〕RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、〔２３〕に記載の使用、
〔２５〕マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〔２４〕に記載の使用、
〔２６〕パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔２５〕に記載の使用、
〔２７〕ベクターが、下記（１）〜（８）からなる群より選択される初期化因子をコードする遺伝子を少なくとも搭載する、〔２１〕から〔２６〕のいずれかに記載の使用、
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子、
に関する。また本発明は、
〔１〕下記（１）〜（８）からなる群より選択される遺伝子を搭載する、染色体非組み込み型ウイルスベクター、
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子
〔２〕染色体非組み込み型ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである、〔１〕に記載のベクター、
〔３〕RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、〔２〕に記載のベクター、
〔４〕マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〔３〕に記載のベクター、
〔５〕パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔４〕に記載のベクター、に関する。
【００１２】
なお、本明細書に記載した任意の発明要素およびその任意の組み合わせは、本明細書に意図されている。また、それらの発明において、本明細書に記載の任意の要素またはその任意の組み合わせを除外した発明も、本明細書に意図されている。また本発明に関して、明細書中に記載されたある特定の態様は、それを開示するのみならず、その態様を含むより上位の本明細書に開示された発明から、その態様を除外した発明も開示するものである。
【発明の効果】
【００１３】
以上説明したように、本発明に係る方法により作製された細胞は、外来遺伝子が染色体に組み込まれていないため、本細胞を利用した試験、研究に好都合であるばかりでなく、疾病の治療においても免疫拒絶の問題や倫理面の問題を回避でき、さらに遺伝毒性に基づく癌化の危険性、染色体機能変化による予期せぬ副作用、細胞の性質の変化を回避できることが期待される。さらに本発明の方法によれば、成人皮膚細胞を含む所望の細胞種から、レトロウイルスを用いた従来の方法に比べ有意に高い効率（例えば約10倍）で多能性幹細胞を誘導することが可能である。さらにレトロウイルスを用いた従来の方法は、例え全く同じプロトコールで細胞を作製したとしても、確立されるＥＳ様細胞は染色体内の異なった箇所にレトロウイルスベクターが挿入されることになるため、人工多能性幹細胞の均一性は保証されないのに対し、本発明の方法ではベクターは染色体に挿入されないことから、遺伝的により均一な細胞を安定して作製することが可能である。またレトロウイルスは一般に指向性が強く、例えば現在一般的な初期化方法に使われているecotropic（同種指向性）レトロウイルスベクターでは、レトロウイルス受容体の存在もしくは外部導入が初期化に先立って必要となり、それが発現していない動物種での人工多能性幹細胞の樹立を難しくしていた。これに対して本発明の方法は、幅広い動物種（哺乳動物全般）に応用が可能であり、例えばサルやブタなどの疾患モデル動物として需要が大きい生物種への応用も可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に係る方法により得られた細胞の形態を示す写真である。上段の中央および右のパネルは、ベクター導入後２３日のコロニーを表す。下段のパネルは継代後のコロニーを表す。
【図２】本発明に係る方法により得られた細胞のアルカリフォスファターゼによる染色による結果である。
【図３】本発明に係る方法により得られた細胞の細胞内での特定遺伝子の発現量を示した結果である。アルカリホスファターゼ陽性のコロニー群（ALP(+)）から調製したmRNA（パネル(a)）および単一のコロニーから調製したmRNA（パネル(b)）を用いたRT-PCRの結果を示す。これらの細胞では、Oct3/4、Sox2、Klf4、およびc-Mycの発現が認められたのに加え、ＥＳ細胞マーカーであるNanogの発現も観察された（パネル(a)および(b)）。また、単一クローンから継代した細胞には、無限増殖能を示すテロメラーゼの活性化指標であるhTERTの発現が認められた（パネル(b)）。BJ：ベクターを導入していない細胞。NCCIT：胎児性カルシノーマ細胞 (ポジティブコントロール)。対照はテンプレートDNA無しのネガティブコントロールである。
【図４】本発明に係る方法により得られた細胞のＥＳマーカーの発現を示した結果である。BJ：ベクターを導入していない細胞。NCCIT：胎児性カルシノーマ細胞 (ポジティブコントロール)。対照はテンプレートDNA無しのネガティブコントロールである。
【図５】本発明に係る方法により得られた細胞のテロメラーゼ活性を検出した結果である。
【図６】本発明に係る方法により得られた細胞の多分化能を示した結果である。胚様体形成実験の結果を示した。
【図７】本発明に係る方法により得られた細胞の多分化能(in vitro)を示した結果である。ヒトBJ細胞より本発明のベクターにより誘導したウイルスフリーの誘導多能性幹（iPS）細胞のin vitroにおける中胚葉（心筋、血球細胞）、外胚葉（TH陽性ドーパミン産生ニューロン）、内胚葉（Sox17陽性細胞およびPDX1陽性膵β細胞）由来の有用細胞への分化を示す。
【図８】本発明に係る方法により得られた細胞の多分化能 (in vivo) を示した結果である。ヒトBJ細胞より本発明のベクターにより誘導したウイルスフリーのiPS細胞HNLs, HNL1を免疫不全マウスの皮下に投与して作製された奇形腫。a:多様な分化組織  b: 軟骨および分泌細胞（黒矢印）  c: 骨組織  d: 分泌組織（黒矢印）および神経上皮より分化した網膜様組織（白矢印）  e: 移行上皮組織（中央）  f: 硬骨および骨髄様組織（白矢印）  g: 消化管様組織  h: 球形組織  i: 心筋様組織
【図９】本発明に係る方法により得られた細胞のエピジェネティクスを示した結果である。  a: ヒトES細胞特異的プロモーター領域の活性化状態を、それぞれOct3/4とNanogについてバイサルファイトシークエンス法にて解析した。活性化した脱メチル化領域を白い丸で、メチル化領域を黒い丸で示した。親株ヒト新生児包皮細胞BJ由来のSeV-iPSクローンHNL1およびHNLs、ヒト成人皮膚細胞HDF由来のSeV-iPSクローン7H5について解析を行った。SeV-iPS細胞はいずれも両領域において、該当プロモータの活性化が認められた。  b: ヒトBJ細胞よりSeVにより誘導したウイルスフリーiPS細胞HNL1について、マイクロアレイにて遺伝子発現解析を行い、親株であるBJ細胞およびヒトES細胞H9株との比較を行った。rにて相関係数を示した。その結果、すでに報告のあるレトロウイルスより誘導されたヒトiPS細胞HDF-iPSよりも、外来遺伝子フリーになったSeV-iPSは、よりヒトES細胞H9株に近いプロファイルを示した(相関係数r=0.9789)。
【図１０】導入外来遺伝子およびセンダイウイルス(SeV)ベクターの細胞増殖を通した除去。導入外来遺伝子およびセンダイウイルス(SeV)ベクターが、細胞増殖と共に希釈・除去されることを示した図である。(A) 新生児細胞 (BJ) 由来もしくは成人細胞 (HDF) 由来のSeV-iPS細胞 (18＋c-Mycを用いたBJ由来クローン: 4BJ1, B1; HDF由来クローン：7H5、HNL-c-Mycを用いたBJ由来クローン：HNLs, HNL1〜6, HNLp) 中における導入外来遺伝子の発現減少を、ベクター部分の配列を認識するプライマーを用いたRT-PCRにて経時的に測定した（Pは継代数を表す）。継代が進むにつれ、４つの導入初期化因子が3つ、２つと減少していく現象が認められた。18＋位に外来遺伝子を導入した場合は、c-Mycが最初に除去され、HNL位にc-Mycを導入した場合は、c-Mycが最後まで残る傾向が認められ、４つのベクターの間で組合せにより、一定の複製優位性があることが示唆された。また、HNL-c-Mycで誘導したクローンHNLsとHNL1においては外来遺伝子が完全にフリーになっていた。(B) iPS細胞内のSeVゲノムの経時的減少。Aと同様に各iPS細胞クローンにおけるSeVゲノムの経時的減少を定量RT-PCRにて測定した。その結果、SeVゲノムは定量PCRでも継代と共に減少する事が確認され、HNL1とHNLsクローンにおいてはSeVゲノムの消失が明らかになった。(C) iPS細胞内のSeV蛋白質の消失。A, Bで確認されたSeV由来遺伝子のHNL1およびHNLsにおける消失は、抗SeV抗体によるウェスタンブロットでも確認され、ゲノムのみならずSeV由来蛋白質も消失していることが確認された。
【図１１】抗ウイルス蛋白質抗体によるウイルスベクター陰性細胞集団の回収。（上パネル）iPSコロニー内でのウイルスベクター希釈を示す。SeV-iPS細胞コロニーの抗HN抗体による染色により、コロニー内にはSeV陽性細胞と陰性細胞が混在しており、左の模式図に示した通り、ウイルス粒子の少ない部分を選択することにより、陰性集団を回収することが可能であることが示唆された（P：継代数）。（下パネル）実際に、SeV感染細胞表面に現れるHN抗原を指標に、抗HN抗体によりSeV陽性細胞を除去することが可能であった。SeV-iPS細胞集団(c-Myc/SeVが残存する株：HNLp4 parent)を抗HN抗体と反応させ、IMag (BD)マグネットビーズに結合させ、その陰性フラクションを回収し、RT-PCRにてSeV陰性になっていることを確認した(HNL4p-)。また、SeV陽性集団を濃縮することも可能であった（HNL4p+）。
【図１２】新温度感受性株(TS)の特性。実施例１で使用したTS株は、37℃での細胞毒性は少ないが、搭載されたGFP蛋白の発現は、35℃から39℃までシフトしても変化は比較的少ない (対照 TS/ΔF)。しかし、新たに構築したTS7（Y942H, L1361C, L1558I）は38℃以上でのGFPの発現は認められず、TS13 (P2, L1558I) では37℃での発現が35℃に比べ低く、TS15 (P2, L1361C, L1558I) では、37℃では殆どGFPの発現が見られない。
【図１３】温度感受性株TS7, TS13, TS15/ΔF/SeVを利用したヒトiPS細胞誘導とウイルス除去。A. TS7, TS13もしくはTS15のHNL位（HN遺伝子とL遺伝子の間）にc-Mycを搭載したΔF/TS/SeVと、Oct3/4, Sox2, Klf4をTSに搭載したΔF/TS/SeVを、新生児包皮細胞BJに同時感染させ、ヒトiPS細胞を誘導した。単離されたiPS細胞は、A. RT-PCRの結果、半数以上が外来遺伝子フリーになり、B. 外来遺伝子フリーのiPS細胞クローン中のSeV蛋白質を確認したところ、蛋白レベルでも完全にウイルスフリーになっていた。（4BJ1およびB1: SeV発現iPS細胞、対照: SeV感染LLC-MK2細胞）。
【図１４】温度感受性株TS7, TS13, TS15/ΔF/SeVにより誘導されたヒトiPS細胞のESマーカー発現。図１３に示した実験において外来遺伝子およびウイルスフリーが確認されたiPS細胞クローンについて、ESマーカーの発現を、RT-PCRによって確認した。すべてのウイルスフリーのiPS細胞において、調べたESマーカーすべての発現が認められた。
【図１５】他のSeVベクターや初期化因子によって誘導されるSeV-iPS細胞。(A) 実施例１で用いたTS ΔF/SeVとは異なるベクター骨格である、Lm (Y1214F) ΔF/ SeVにOct3/4, Sox2, Oct4, Nanogを搭載し、iPS細胞誘導を行ったところ、アルカリホスファターゼ(ALP)陽性のES様細胞コロニーが得られた。(B) Thomsonの４因子 (Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28 ΔF/ TS/ SeV) によるiPS細胞誘導。Yamanakaの４因子（Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc）（左パネル）以外でも、Thomsonの４因子(Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28 ΔF/ TS/ SeV) （右パネル）により iPS細胞が誘導された。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１６】
本発明は、染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いて分化した細胞のリプログラミングを誘導する方法、特に体細胞から多能性幹細胞を製造する方法を提供する。この方法は、例えば導入したい核初期化因子（nuclear reprogramming factor(s)）をコードする遺伝子を保持する染色体非組み込み型ウイルスベクターを、体細胞等の分化した細胞に接触させる工程を含む方法である。より具体的には本発明は、細胞のリプログラミングにおいて遺伝子を導入するための方法であって、その必要のある細胞に、染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いて該遺伝子を導入する方法、およびそのための染色体非組み込み型ウイルスベクターを含む組成物を提供する。本発明において多能性幹細胞とは、動物の胚盤胞期の胚の内部細胞塊より作られる幹細胞またはそれと類似した表現型を有する細胞を言う。具体的には、本発明において誘導される多能性幹細胞は、ＥＳ様細胞の指標であるアルカリホスファターゼを発現する細胞である。また好ましくは、多能性幹細胞は、培養することにより、細胞質に比べ核の比率が高い細胞からなる扁平なコロニーを形成する。培養は、適宜フィーダーと共に培養してよい。またMEFなどの培養細胞が数週間で増殖が停止するのに対し、多能性幹細胞は長期間の継代が可能であり、例えば３日ごとの継代で１５回以上、好ましくは２０回以上、２５回以上、３０回以上、３５回以上、または４０回以上継代しても、増殖性が失なわれないことにより確認することができる。また多能性幹細胞は、好ましくは内在性のOct3/4またはNanog、より好ましくはその両方を発現する。また多能性幹細胞は、好ましくはTERTを発現し、テロメラーゼ活性（テロメリックリピート配列を合成する活性）を示す。また多能性幹細胞は、好ましくは三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に分化する能力（例えばテラトーマ形成および／または胚様体形成において）を持つ。より好ましくは、多能性幹細胞は、胚盤胞に移植することにより生殖系列キメラを生成する。Germline transmissionが可能な多能性幹細胞は、germline-competentな多能性幹細胞と言う。これらの表現型の確認は、周知の方法により実施することができる（WO2007/69666; Ichisaka T et al., Nature 448(7151):313-7, 2007）。
【００１７】
また本発明において分化したとは、例えば多能性幹細胞よりも分化していることを言い、複数の細胞系列に分化する能力をまだ持っている状態（例えば体性幹細胞など）、および最終分化した状態を含む。分化した細胞とは、多能性幹細胞から由来する（多能性幹細胞以外の）細胞である。分化した細胞は、例えば三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に分化する能力を持たないものであってよい。このような細胞は、初期化（reprogramming）されなければ三胚葉を形成する能力を持たない。また分化した細胞は、例えば自身が属する胚葉型以外の細胞を生成できない細胞であってよい。分化した細胞は体細胞であってよく、例えば生殖細胞以外の細胞であってよい。
【００１８】
本発明において初期化（reprogramming）とは、ある細胞の分化状態を、それより未分化な状態にすることを言い、例えば分化した細胞が脱分化すること、例えば分化多能性を持たない細胞から持つ細胞、例えば多能性幹細胞を誘導することが含まれる。また本発明において脱分化とは、ある細胞を、より未熟な（例えば未分化な）状態にすることを言う。脱分化とは、ある細胞が分化して来た最初または途上の状態に戻すことであってよい。また脱分化とは、自身が属する胚葉型以外の細胞を生成できない細胞から、他の胚葉の細胞にも分化できる状態になることであってよい。脱分化には、例えば三胚葉分化能を持たない細胞が、三胚葉分化能を獲得することが含まれる。また脱分化には、多能性幹細胞の生成が含まれる。
【００１９】
また本発明において体細胞とは、例えば多能性幹細胞以外の細胞である。体細胞には、例えば多細胞生物を構成する細胞のうち多能性幹細胞以外の細胞、およびその培養細胞が含まれる。体細胞には、例えば体性幹細胞および最終分化した細胞が含まれる。
【００２０】
本発明においてウイルスベクターは、当該ウイルスに由来するゲノム核酸を有し、該核酸に導入遺伝子を組み込むことにより、該遺伝子を発現させることができるベクターである。また本明細書において多能性幹細胞を製造するための染色体非組み込み型ウイルスベクターとは、ウイルスに由来し、遺伝子を標的細胞に導入することができるウイルスベクターであって、導入された遺伝子が宿主の染色体（核由来染色体）に組み込まれる危険性のない運搬体のことをいう。外来遺伝子を保持する様な染色体非組み込み型ウイルスベクターを構築することによって、本発明で用いる組換え非組み込み型ウイルスベクターを得ることができる。また本発明においてウイルスベクターには、感染ウイルス粒子の他、ウイルスコア、ウイルスゲノムとウイルス蛋白質との複合体、または非感染性ウイルス粒子などからなる複合体であって、細胞に導入することにより搭載する遺伝子を発現する能力を持つ複合体が含まれる。例えばRNAウイルスにおいて、ウイルスゲノムとそれに結合するウイルス蛋白質からなるリボヌクレオ蛋白質（ウイルスのコア部分）は、細胞に導入することにより細胞内で導入遺伝子を発現することができる（WO00/70055）。細胞への導入は、適宜トランスフェクション試薬等を用いて行えばよい。このようなリボヌクレオ蛋白質（RNP）も本発明においてウイルスベクターに含まれる。
【００２１】
本発明において、宿主の染色体に組み込まれる危険性がないとは、ウイルスベクターを導入した場合に、宿主染色体に組み込まれる頻度が十分に低いことを言う。好ましくは、宿主の染色体への組み込み頻度は、例えばヒト線維肉腫由来細胞株 HT1080 (ATCC CCL121）に10 PFU/cellで感染させた場合に 5×10-4 以下であり、より好ましくは 10-4 以下であり、より好ましくは 10-5 以下であり、より好ましくは 10-6 以下であり、より好ましくは 10-7 以下である。本発明において用いられる非組み込み型ウイルスベクターは、特にRNAウイルスが好ましい。本発明においてRNAウイルスとは、RNAゲノムを有し、ライフサイクルにおいてDNAのフェーズを持たないウイルスを言う。本発明においてRNAウイルスは、逆転写酵素を持たない（すなわちレトロウイルスは含まれない）。すなわちウイルス増殖において、ウイルスゲノムはDNAを介さずに、RNA依存性RNAポリメラーゼにより複製される。RNAウイルスはDNAフェーズを持たないため、RNAウイルスベクターを用いることにより、宿主染色体への組み込みのリスクを最小限に抑えることが可能となる。RNAウイルスには、一本鎖RNAウイルス（プラス鎖RNAウイルスおよびマイナス鎖RNAウイルスを含む）、および二本鎖RNAウイルスを含む。またエンベロープを有するウイルス（エンベロープウイルス；enveloped viruses）およびエンベロープを有さないウイルス（非エンベロープウイルス；non-enveloped viruses）を含むが、好ましくはエンベロープウイルスに由来するベクターが用いられる。本発明においてRNAウイルスには、具体的には以下の科に属するウイルスが含まれる。
ラッサウィルスなどのアレナウイルス科（Arenaviridae）
インフルエンザウイルスなどのオルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）
SARSウイルスなどのコロナウイルス科（Coronaviridae）
風疹ウイルスなどのトガウイルス科（Togaviridae）
ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、センダイウイルス、RSウイルスなどのパラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）
ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスなどのピコルナウイルス科（Picornaviridae）
マールブルグウイルス、エボラウイルスなどのフィロウイルス科（Filoviridae）
黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルス、G型肝炎ウイルスなどのフラビウイルス科（Flaviviridae）
ブンヤウイルス科（Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, および Phlebovirus属等を含む）
狂犬病ウイルスなどのラブドウイルス科（Rhabdoviridae）
レオウイルス科（Reoviridae）
【００２２】
本発明において用いられる染色体非組み込み型ウイルスベクターは、例えば、マイナス鎖RNAウイルスベクターである。マイナス鎖RNAウイルスベクターとは、マイナス鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖に対するアンチセンス鎖）のRNAをゲノムとして含むウイルスからなるベクターである。マイナス鎖RNAはネガティブ鎖RNAとも呼ばれる。本発明において例示として掲げられるマイナス鎖RNAウイルスとして、特に一本鎖マイナス鎖RNAウイルス（非分節型（non-segmented）マイナス鎖RNAウイルスとも言う）が挙げられる。「一本鎖ネガティブ鎖RNAウイルス」とは、一本鎖ネガティブ鎖［すなわちマイナス鎖］RNAをゲノムに有するウイルスを言う。このようなウイルスとしては、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, および Pneumovirus属等を含む）、ラブドウイルス（Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus, および Ephemerovirus属等を含む）、フィロウイルス（Filoviridae）などの科に属するウイルスが含まれ、分類学上モノネガウイルス目(Mononegavirales)に属している（ウイルス  第57巻  第１号、pp29-36、2007; Annu. Rev. Genet. 32, 123-162, 1998; Fields virology fourth  edition, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1305-1340,2001; Microbiol. Immunol. 43, 613-624, 1999; Field Virology, Third  edition pp1205-1241 1996）。
【００２３】
本発明において例示として掲げられるマイナス鎖RNAウイルスベクターとしては、パラミクソウイルスベクターが挙げられる。パラミクソウイルスベクターは、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ウイルスに由来するウイルスベクターである。例えばパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ウイルスのセンダイウイルス(Sendai virus)を挙げることができる。他の例としては、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)、おたふくかぜウイルス(Mumps virus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、RSウイルス(Respiratory syncytial virus)、牛疫ウイルス(rinderpest virus)、ジステンパーウイルス(distemper virus)、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）、ヒトパラインフルエンザウイルス1,2,3型、オルトミクソウイルス科 (Orthomyxoviridae)のインフルエンザウイルス(Influenza virus)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)の水疱性口内炎ウイルス(Vesicular stomatitis virus)、狂犬病ウイルス(Rabies virus)等が挙げられる。
【００２４】
本発明において用い得るウイルスをさらに例示すれば、例えば Sendai virus (SeV)、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)、phocine distemper virus (PDV)、canine distemper virus (CDV)、dolphin molbillivirus (DMV)、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)、rinderpest virus (RPV)、Hendra virus (Hendra)、Nipah virus (Nipah)、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)、simian parainfluenza virus 5 (SV5)、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)、human parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)、mumps virus (Mumps)、およびNewcastle disease virus (NDV) などが含まれる。より好ましくは、Sendai virus (SeV)、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)、phocine distemper virus (PDV)、canine distemper virus (CDV)、dolphin molbillivirus (DMV)、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)、rinderpest virus (RPV)、Hendra virus (Hendra)、および Nipah virus (Nipah) からなる群より選択されるウイルスが挙げられる。
【００２５】
本発明において用いられるベクターは、例えば、パラミクソウイルス亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモルビリウイルス属を含む）に属するウイルスまたはその誘導体であり、例えばレスピロウイルス属（genus Respirovirus）（パラミクソウイルス属（Paramyxovirus）とも言う）に属するウイルスまたはその誘導体である。誘導体には、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、および化学修飾されたウイルス等が含まれる。本発明を適用可能なレスピロウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（HPIV-1）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（HPIV-3）、ウシパラインフルエンザウイルス３型（BPIV-3）、センダイウイルス(Sendai virus; マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼ばれる)、およびサルパラインフルエンザウイルス10型（SPIV-10）などが含まれる。
【００２６】
本発明で例示として掲げられるマイナス鎖RNAウイルスとしては、より具体的にはセンダイウイルスが挙げられる。野生型センダイウイルスのゲノムは、3'の短いリーダー領域に続き、ヌクレオキャプシド（N）遺伝子、ホスホ（P）遺伝子、マトリックス（M）遺伝子、フュージョン（F）遺伝子、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ（HN）遺伝子、およびラージ（L）遺伝子、及び短い5'トレイラー領域をこの順序で含んでいる。野生型ウイルスに相当する組み換えベクターや、様々な変異型ベクターの作製が既に知られている。さらには、そのエンベロープを除いたRNPのみでも遺伝子導入が可能であることが示されている（WO00/70055）。よって、RNPによるリプログラミングも本発明に含まれる。他のウイルスのRNPについても同様である。
【００２７】
本発明における染色体非組み込み型ウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。つまり、当該ウイルスは、目的とするリプログラミングを誘導できる限り、天然から単離されたウイルスと同様の構造を持つウイルスベクターであっても、遺伝子組み換えにより人為的に改変したウイルスであってもよい。例えば、野生型ウイルスが持ついずれかの遺伝子に変異や欠損があるものであってよい。また、DI粒子（J.Virol. 68: 8413-8417, 1994）などの不完全ウイルスを用いることも可能である。例えば、ウイルスのエンベロープ蛋白質または外殻蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子に変異または欠損を有するウイルスを好適に用いることができる。このようなウイルスベクターは、例えば感染細胞においてはゲノムを複製することはできるが、感染性ウイルス粒子を形成できないウイルスベクターである。このような複製能欠損型のウイルスベクターは、周囲に感染を拡大する懸念がないので安全性が高い。例えば、F、H、HN、またはGなどのエンベロープ蛋白質またはスパイク蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが含まれていないマイナス鎖RNAウイルスを用いることができる （WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。ゲノム複製に必要な蛋白質（例えば N、P、およびL蛋白質）をゲノムRNAにコードしていれば、感染細胞においてゲノムを増幅することができる。欠損型ウイルスを製造するには、例えば、欠損している遺伝子産物またはそれを相補できる蛋白質をウイルス産生細胞において外来的に供給する（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。また、欠損するウイルス蛋白質を完全に相補することなく、非感染性のウイルス粒子（VLP）としてウイルスベクターを回収する方法も知られている（WO00/70070）。また、ウイルスベクターをRNP（例えば N、L、P蛋白質、およびゲノムRNAからなるRNP）として回収する場合は、エンベロープ蛋白質を相補することなくベクターを製造することができる。
【００２８】
また、変異型のウイルス蛋白質遺伝子を搭載するウイルスベクターを用いることも好ましい。本発明は、特にウイルス遺伝子に変異および／または欠失を有するRNAウイルスベクターを用いた、リプログラミングにおける遺伝子導入方法、およびリプログラムされた細胞の製造方法を提供する。例えば、エンベロープ蛋白質や外殻蛋白質において弱毒化変異や温度感受性変異を含む多数の変異が知られている。これらの変異蛋白質遺伝子を有するRNAウイルスを本発明において好適に用いることができる。本発明において望ましくは、細胞傷害性を減弱したベクターを用い得る。細胞傷害性は、例えば細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出を定量することにより測定することができる。例えば細胞傷害性が野生型に比べ有意に減弱化したベクターを用いることができる。細胞傷害性の減弱化の程度は、例えばHeLa（ATCC CCL-2）またはサルCV-1（ATCC CCL 70）にMOI 3で感染させて３日間培養した培養液中のLDH放出量が野生型に比べ有意に低下したもの、例えば20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、または50％以上低下したベクターを用いることができる。また細胞傷害性を低下させる変異には、温度感受性変異も含まれる。温度感受性変異とは、低温 (例えば30℃ないし32℃) に比べ、ウイルス宿主の通常の温度（例えば37℃ないし38℃）において有意に活性が低下する変異のことである。このような、温度感受性変異を持つ蛋白質は、許容温度（低温）下でウイルスを作製することができるので便利である。本発明において有用な温度感受性変異を持つウイルスベクターは、例えば培養細胞において30℃で感染させた場合に比べ、37℃で感染させた場合に、増殖速度または遺伝子発現レベルが、少なくとも1/2以下、好ましくは1/3以下、より好ましくは1/5以下、より好ましくは1/10以下、より好ましくは1/20以下である。
【００２９】
本発明において用いられる染色体非組み込み型ウイルスベクターは、リプログラミングを阻害せず、リプログラミング因子によるリプログラミングを誘導できる限り野生型でもよく、また、好ましくは少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２、３、４、５、またはそれ以上のウイルス遺伝子に欠失または変異を有する。欠失と変異は、各遺伝子に対して任意に組み合わせ導入してよい。ここで変異とは、機能低下型の変異または温度感受性変異であってよく、少なくとも37℃において、野生型に比べウイルスの増殖速度または搭載遺伝子の発現レベルを好ましくは1/2以下、より好ましくは1/3以下、より好ましくは1/5以下、より好ましくは1/10以下、より好ましくは1/20以下に低下させる変異である。このような改変ウイルスベクターを用いることは、特に多能性幹細胞の誘導には重要であり得る。例えば本発明において好適に用いられるマイナス鎖RNAウイルスベクターは、少なくとも２つのウイルス遺伝子が、欠失または変異している。このようなウイルスには、少なくとも２つのウイルス遺伝子が欠失しているもの、少なくとも２つのウイルス遺伝子が変異しているもの、少なくとも１つのウイルス遺伝子が変異しており少なくとも１つのウイルス遺伝子が欠失しているものが含まれる。変異または欠失している少なくとも２つのウイルス遺伝子は、好ましくはエンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子である。例えばF遺伝子を欠失し、Mおよび／またはHN (またはH) 遺伝子をさらに欠失するか、Mおよび／またはHN (またはH) 遺伝子に変異（例えば温度感受性変異）をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。また、例えばF遺伝子を欠失し、MまたはHN (またはH) 遺伝子をさらに欠失し、残るMおよび／またはHN (またはH) 遺伝子に変異（例えば温度感受性変異）をさらに有するベクターも、本発明において好適に用いられる。本発明において用いられるベクターは、より好ましくは、少なくとも３つのウイルス遺伝子（好ましくはエンベロープ構成蛋白質をコードする少なくとも３つの遺伝子）が、欠失または変異している。このようなウイルスベクターには、少なくとも３つの遺伝子が欠失しているもの、少なくとも３つの遺伝子が変異しているもの、少なくとも１つの遺伝子が変異しており少なくとも２つの遺伝子が欠失しているもの、少なくとも２つの遺伝子が変異しており少なくとも１つの遺伝子が欠失しているものが含まれる。より好ましい態様を挙げれば、例えばF遺伝子を欠失し、MおよびHN (またはH) 遺伝子をさらに欠失するか、MおよびHN (またはH) 遺伝子に変異（例えば温度感受性変異）をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。また例えばF遺伝子を欠失し、MあるいはHN (またはH) 遺伝子をさらに欠失し、残るMあるいはHN (またはH) 遺伝子に変異（例えば温度感受性変異）をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。このような変異型のウイルスは、公知の方法に従って作製することが可能である。
【００３０】
例えば、マイナス鎖RNAウイルスのM遺伝子の温度感受性変異としては、センダイウイルスのM蛋白質における69位（G69）、116位（T116）、および183位（A183）からなる群より任意に選択される部位または他のマイナス鎖RNAウイルスM蛋白質の相同な部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al., J.Virol. 2003, 77: 3238-3246）。他のマイナス鎖RNAウイルスM蛋白質の相同な部位のアミノ酸は容易に同定できるが、具体的に示せば、例えばSeV M蛋白質のG69に相当するM蛋白質の相同部位としては、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)（括弧は略称）であればG69、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3) であればG73、phocine distemper virus (PDV)およびcanine distemper virus (CDV)であればG70、dolphin molbillivirus (DMV)であればG71、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)、およびrinderpest virus (RPV)であればG70、Hendra virus (Hendra)およびNipah virus (Nipah)であればG81、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)であればG70、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)およびhuman parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)であればE47、mumps virus (Mumps)であればE72が挙げられる（文字と番号はアミノ酸とその位置を表す）。また、SeV M蛋白質のT116に相当する各M蛋白質の相同部位としては、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)であればT116、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)であればT120、phocine distemper virus (PDV)およびcanine distemper virus (CDV)であればT104、dolphin molbillivirus (DMV)であればT105、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)およびrinderpest virus (RPV)であればT104、Hendra virus (Hendra)およびNipah virus (Nipah)であればT120、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)およびsimian parainfluenza virus 5 (SV5)であればT117、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)およびhuman parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)であればT121、mumps virus (Mumps)であればT119、Newcastle disease virus (NDV)であればS120が挙げられる。SeV M蛋白質のA183に相当する各M蛋白質の相同部位としては、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)であればA183、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)であればF187、phocine distemper virus (PDV)およびcanine distemper virus (CDV)であればY171、dolphin molbillivirus (DMV)であればY172、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)およびrinderpest virus (RPV)であればY171、Hendra virus (Hendra)およびNipah virus (Nipah)であればY187、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)であればY184、simian parainfluenza virus 5 (SV5)であればF184、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)およびhuman parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)であればF188、mumps virus (Mumps)であればF186、Newcastle disease virus (NDV)であればY187が挙げられる。ここに挙げたウイルスにおいて、それぞれのM蛋白質に上記の３つの部位のいずれか、好ましくは任意の２部位の組み合わせ、さらに好ましくは３つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異M蛋白質をコードするゲノムを有するウイルスは、本発明において好適に用いられる。
【００３１】
アミノ酸変異は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましく、例えばBLOSUM62マトリックス（Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）の値が３以下、好ましくは２以下、より好ましくは１以下、より好ましくは０以下のアミノ酸に置換する。具体的には、センダイウイルスM蛋白質のG69、T116、およびA183あるいは他のウイルスM蛋白質の相同部位を、それぞれGlu (E)、Ala (A)、およびSer (S) へ置換することができる。また、麻疹ウイルス温度感受性株 P253-505（Morikawa, Y. et al., Kitasato Arch. Exp. Med. 1991: 64; 15-30）のM蛋白質の変異と相同な変異を利用することも可能である。変異の導入は、例えばオリゴヌクレオチド等を用いて、公知の変異導入方法に従って 実施すればよい。
【００３２】
また、HN（またはH）遺伝子の温度感受性変異としては、例えばセンダイウイルスのHN蛋白質の262位（A262）、264位（G264）、および461位（K461）からなる群より任意に選択される部位または他のマイナス鎖RNAウイルスM蛋白質の相同な部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al., J.Virol. 2003, 77: 3238-3246）。３つの部位のいずれか１つ、好ましくは任意の２部位の組み合わせ、さらに好ましくは３つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異HN蛋白質をコードするゲノムを有するウイルスは、本発明において好適に用いられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。好ましい一例を挙げれば、センダイウイルス HN蛋白質のA262、G264、およびK461あるいは他のウイルスHN蛋白質の相同部位を、それぞれThr (T)、Arg (R)、およびGly (G) へ置換する。また、例えば、ムンプスウイルスの温度感受性ワクチン株 Urabe AM9を参考に、HN蛋白質の464及び468番目のアミノ酸に変異導入することもできる（Wright, K. E. et al., Virus Res. 2000: 67; 49-57）。
【００３３】
またマイナス鎖RNAウイルスは、P遺伝子および／またはL遺伝子に変異を有していてもよい。このような変異としては、具体的には、SeV P蛋白質の86番目のGlu（E86）の変異、SeV P蛋白質の511番目のLeu（L511）の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウイルスP蛋白質の相同部位の置換が挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、86番目のアミノ酸のLysへの置換、511番目のアミノ酸のPheへの置換などが例示できる。またL蛋白質においては、SeV L蛋白質の1197番目のAsn（N1197）および／または1795番目のLys（K1795）の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウイルスL蛋白質の相同部位の置換が挙げられ、上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、1197番目のアミノ酸のSerへの置換、1795番目のアミノ酸のGluへの置換などが例示できる。P遺伝子およびL遺伝子の変異は、持続感染性、２次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることができる。さらに、エンベロープ蛋白質遺伝子の変異および／または欠損を組み合わせることで、これらの効果を劇的に上昇させることができる。またL遺伝子は、SeV L蛋白質の1214番目のTyr（Y1214）および／または1602番目のMet（M1602）の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウイルスL蛋白質の相同部位の置換が挙げられ、上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、1214番目のアミノ酸のPheへの置換、1602番目のアミノ酸のLeuへの置換などが例示できる。以上に例示した変異は、任意に組み合わせることができる。
【００３４】
例えば、SeV M蛋白質の少なくとも69位のG、116位のT、及び183位のA、SeV HN蛋白質の少なくとも262位のA，264位のG，及び461位のK、SeV P蛋白質の少なくとも511位のL、SeV L蛋白質の少なくとも1197位のN及び1795位のKが、それぞれ他のアミノ酸に置換されており、かつF遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクター、他のマイナス鎖RNAウイルスの各相同蛋白質において、相同の部位に置換変異を有し、F遺伝子を欠損または欠失するF遺伝子欠損または欠失ベクター、ならびに、細胞傷害性がこれらと同様またはそれ以下、および/または温度感受性がこれらと同様またはそれ以上のF遺伝子欠損または欠失マイナス鎖RNAウイルスベクターは、本発明において核初期化因子（nuclear reprogramming factors）を発現させるために特に好適である。具体的な置換例を例示すれば、例えばM蛋白質についてはG69E，T116A，及びA183Sの置換を、HN蛋白質についてはA262T，G264，及びK461Gの置換を、P蛋白質についてはL511Fの置換を、そしてL蛋白質についてはN1197S及びK1795Eの置換を挙げることができる。核初期化因子（nuclear reprogramming factors）をコードする遺伝子は、例えばマイナス鎖RNAゲノムの最も上流（3'側）に配置することができる（例えばN遺伝子の3'側）。但しMyc遺伝子に関してはそれ以外の位置、例えばマイナス鎖RNAゲノムの後方、すなわちより5'側に配置してもよい。例えば、HN遺伝子とL遺伝子の間に挿入することができる。
【００３５】
また、L蛋白質の変異としては、SeV L蛋白質の942位（Y942）、1361位（L1361）、および1558位（L1558）から任意に選択される部位のアミノ酸の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウイルスL蛋白質の相同部位の置換も挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、942番目のアミノ酸のHisへの置換、1361番目のアミノ酸のCysへの置換、1558番目のアミノ酸のIleへの置換などが例示できる。特に少なくとも942位または1558位が置換されたL蛋白質を好適に用いることができる。例えば1558位に加え、1361位も他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質も好適である。また、942位に加え、1558位および/または1361位も他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質も好適である。これらの変異により、L蛋白質の温度感受性を上昇させることができる。
またP蛋白質の変異としては、SeV P蛋白質の433位（D433）、434位（R434）、および437位（K437）から任意に選択される部位のアミノ酸の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウイルスP蛋白質の相同部位の置換が挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、433番目のアミノ酸のAla (A) への置換、434番目のアミノ酸のAla (A) への置換、437番目のアミノ酸のAla (A) への置換などが例示できる。特にこれら３つの部位全てが置換されたP蛋白質を好適に用いることができる。これらの変異により、P蛋白質の温度感受性を上昇させることができる。
【００３６】
SeV P蛋白質の少なくとも433位のD、434位のR、および437位のKの３箇所が、他のアミノ酸に置換された変異P蛋白質、およびSeV L蛋白質の少なくとも1558位のLが置換された変異L蛋白質（好ましくは少なくとも1361位のLも他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質）をコードする、F遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクター、および他のマイナス鎖RNAウイルスにおいて相同部位が変異しているF遺伝子欠損または欠失ベクター、ならびに、細胞傷害性がこれと同様またはそれ以下、および/または温度感受性がこれと同様またはそれ以上のF遺伝子を欠損または欠失するマイナス鎖RNAウイルスベクターも、本発明において好適に用いられる。各ウイルス蛋白質は、上記の変異以外に他のアミノ酸（例えば10以内、5以内、4以内、3以内、2以内、または1アミノ酸）に変異を有していてもよい。上記に示した変異を有するベクターは高い温度感受性を示すので、リプログラミングが完了した後、細胞をやや高温（例えば37.5〜39℃、好ましくは38〜39℃、または38.5〜39℃）で培養することにより、ベクターを簡便に除去することができる。核初期化因子（nuclear reprogramming factors）は、適宜ゲノムの適当な位置に挿入され得るが、例えばゲノムの最上流（3'側）に挿入される（例えばNP遺伝子の3'側）。Myc遺伝子は、例えばマイナス鎖RNAウイルスのゲノムの中央よりも5'端側（真中の遺伝子よりも5'端側）、例えばL遺伝子の5'側または3'側、特にL遺伝子の3’側（例えばHN-L間）に挿入してもよい。
【００３７】
ベクターの細胞傷害性は、例えば細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出を定量することにより測定することができる。具体的には、例えばHeLa（ATCC CCL-2）またはサルCV-1（ATCC CCL 70）にMOI 3で感染させて３日間培養した培養液中のLDH放出量を測定する。LDH放出量が少ないほど細胞傷害性は低い。また温度感受性は、ウイルス宿主の通常の温度（例えば37℃ないし38℃）におけるウイルスの増殖速度または搭載遺伝子の発現レベルを測定することにより決定することができる。変異を有さないものに比べ、ウイルスの増殖速度および/または搭載遺伝子の発現レベルが低下するほど、温度感受性は高いと判断される。
【００３８】
またエンベロープウイルスを用いる場合は、ウイルスが本来持つエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むウイルスを使用してもよい。例えば、ウイルス製造の際に、所望の外来性エンベロープ蛋白質をウイルス産生細胞で発現させることにより、これを含むウイルスを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はなく、哺乳動物細胞への感染能を付与する所望の接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質が用いられる。具体的には、例えば水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus; VSV）のG蛋白質（VSV-G）を挙げることができる。VSV-G蛋白質は、任意のVSV株に由来するものであってよく、例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981)）由来のVSV-G蛋白を用いることができるが、これに限定されない。本発明において例示として掲げられるマイナス鎖RNAウイルスは、他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質を任意に組み合わせて含むことができる。
【００３９】
核初期化因子（nuclear reprogramming factors）を持つ組換えRNAウイルスの再構成は公知の方法を利用して行えばよい。本発明の例示として掲げるマイナス鎖RNAウイルスとしては、具体的な手順として、典型的には、（ａ）マイナス鎖RNAウイルスゲノムRNA（マイナス鎖）またはその相補鎖（プラス鎖）をコードするcDNAを、ウイルス粒子形成に必要なウイルス蛋白質（N、P、およびL）を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）生成したウイルスを含む培養上清を回収する工程、により製造することができる。粒子形成に必要なウイルス蛋白質は、転写させたウイルスゲノムRNAから発現されてもよいし、ゲノムRNA以外からトランスに供給されてもよい。例えば、N、P、およびL蛋白質をコードする発現プラスミドを細胞に導入して供給することができる。ゲノムRNAにおいて粒子形成に必要なウイルス遺伝子が欠損している場合は、そのウイルス遺伝子をウイルス産生細胞で別途発現させ、粒子形成を相補する。ウイルス蛋白質やRNAゲノムを細胞内で発現させるためには、該蛋白質やゲノムRNAをコードするDNAを宿主細胞で機能する適当なプロモーターの下流に連結したベクターを宿主細胞に導入する。転写されたゲノムRNAは、ウイルス蛋白質の存在下で複製され、感染性ウイルス粒子が形成される。エンベロープ蛋白質などの遺伝子を欠損する欠損型ウイルスを製造する場合は、欠損する蛋白質またはその機能を相補できる他のウイルス蛋白質などをウイルス産生細胞において発現させる。
【００４０】
例えば、本発明の例示としてのマイナス鎖RNAウイルスの製造は、以下の公知の方法を利用して実施することができる（WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; WO03/025570； WO2005/071092; WO2006/137517; WO2007/083644; WO2008/007581; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997、Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 及び Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33-38、Li, H.-O. et al., J. Virol. 2000: 74; 6564-6569）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含むマイナス鎖RNAウイルスをDNAから再構成させることができる。
【００４１】
プラス (+) 鎖RNAウイルスの製造方法としては、以下の例が挙げられる。
１）コロナウイルス
Enjuanes L, Sola I, Alonso S, Escors D, Zuniga S.
Coronavirus reverse genetics and development of vectors for gene expression.
Curr Top Microbiol Immunol. 2005;287:161-97. Review.
２）トガウイルス
Yamanaka R, Zullo SA, Ramsey J, Onodera M, Tanaka R, Blaese M, Xanthopoulos KG.
Induction of therapeutic antitumor antiangiogenesis by intratumoral injection of genetically engineered endostatin-producing Semliki Forest virus.
Cancer Gene Ther. 2001 Oct;8(10):796-802.
Datwyler DA, Eppenberger HM, Koller D, Bailey JE, Magyar JP.
Efficient gene delivery into adult cardiomyocytes by recombinant Sindbis virus.
J Mol Med. 1999 Dec;77(12):859-64.
３）ピコルナウイルス
Lee SG, Kim DY, Hyun BH, Bae YS.
Novel design architecture for genetic stability of recombinant poliovirus: the manipulation of G/C contents and their distribution patterns increases the genetic stability of inserts in a poliovirus-based RPS-Vax vector system.
J Virol. 2002 Feb;76(4):1649-62.
Mueller S, Wimmer E.
Expression of foreign proteins by poliovirus polyprotein fusion: analysis of genetic stability reveals rapid deletions and formation of cardioviruslike open reading frames.
J Virol. 1998 Jan;72(1):20-31.
４）フラビウイルス
Yun SI, Kim SY, Rice CM, Lee YM.
Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus.
J Virol. 2003 Jun;77(11):6450-65.
Arroyo J, Guirakhoo F, Fenner S, Zhang ZX, Monath TP, Chambers TJ.
Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE).
J Virol. 2001 Jan;75(2):934-42.
５）レオウイルス
Roner MR, Joklik WK.
Reovirus reverse genetics: Incorporation of the CAT gene into the reovirus genome.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 3;98(14):8036-41. Epub 2001 Jun 26.
その他のRNAウイルスの増殖方法および組み換えウイルスの製造方法については、ウイルス学実験学 各論、改訂二版（国立予防衛生研究所学友会編、丸善、1982）を参照のこと。
【００４２】
上記の染色体非組み込み型ウイルスベクターには、適宜、細胞のリプログラミングのための遺伝子を搭載させることができる。搭載する遺伝子は、分化した細胞からの多能性幹細胞などの種々の幹細胞の誘導等に関与する所望の遺伝子であってよい。例えばそれらのリプログラミングに必須の遺伝子、またはリプログラミングの効率を上昇させる遺伝子を搭載させることができる。すなわち本発明は、本発明の染色体非組み込み型ウイルスベクターの、細胞のリプログラミングにおいて遺伝子を導入するための使用、そして、細胞においてリプログラミング因子を発現させ、該細胞のリプログラミングを誘導するための使用を提供する。また本発明は、本発明の染色体非組み込み型ウイルスベクターを含む、細胞のリプログラミングにおいて遺伝子を導入するための剤（導入剤、遺伝子導入剤）、細胞においてリプログラミング因子を発現させるための剤を提供する。また本発明は、本発明の染色体非組み込み型ウイルスベクターを含む、細胞においてリプログラミング因子を発現させ、該細胞のリプログラミングを誘導するための剤に関する。また本発明のベクターは、細胞の核初期化を行う際に、所望の遺伝子を該細胞において発現させるためにも有用である。１つまたはそれ以上の核初期化因子（a nuclear reprogramming factor）をコードする遺伝子を搭載する非組み込み型ウイルスベクターは、本発明に従い、細胞のリプログラミングのために利用することができる。本発明は、医学的用途および非医学的用途のために用いることができ、メディカルおよびノンメディカルの態様において有用である。例えば本発明は、治療、手術、および/または診断、あるいは非治療、非手術、および/または非診断の目的に用いることができる。
【００４３】
本発明において核初期化因子（a nuclear reprogramming factor）とは、単独で、または複数の因子と共同して、ある細胞の分化状態をより未分化な状態に誘導するために用いられる遺伝子またはその産物を言い、例えば分化した細胞の脱分化を誘導するために用いられる遺伝子またはその産物が含まれる。本発明において核初期化因子（a nuclear reprogramming factor）には、核の初期化（reprogramming）に必須の因子、および核初期化の効率を上昇させる補助的な因子（補助因子）が含まれる。本発明においては、核初期化（nuclear reprogramming）に用いるための所望の遺伝子をベクターに搭載してよい。例えば多能性幹細胞の製造に用いるための遺伝子を搭載することができる。多能性幹細胞を誘導するための核初期化因子（nuclear reprogramming factors）としては、具体的には、例えばＥＳ細胞や初期胚などで発現するが、分化した多くの体細胞では発現しないか、発現が低下する遺伝子（ＥＳ細胞特異的遺伝子など）を用いることができる。このような遺伝子は、好ましくは転写因子や核蛋白質等をコードする遺伝子である。核初期化遺伝子（nuclear reprogramming factors）を同定する方法は既に知られており（WO2005/80598）、実際、この方法を用いて同定された遺伝子は、多能性幹細胞へのreprogrammingに有用であることが示されている（WO2007/69666）。
【００４４】
そのような遺伝子の例を挙げれば、DPPA5 (developmental pluripotency associated 5, ES cell specific gene 1 (ESG1); accession numbers NM_001025290, NM_025274, XM_236761）、F-box protein 15 (Fbx15, NM_152676, NM_015798)、Nanog（NM_024865, AB093574）、ECAT1（ES cell associated transcript 1； AB211062, AB211060）、ERAS（ES cell expressed Ras; NM_181532, NM_181548)、DNMT3L（DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3-like; NM_013369, NM_019448)、ECAT8 （AB211063, AB211061）、GDF3（growth differentiation factor 3; NM_020634, NM_008108）、SOX15（SRY (sex determining region Y)-box 15; NM_006942, NM_009235）、DPPA4（developmental pluripotency associated 4; NM_018189, NM_028610）、DPPA2（NM_138815, NM_028615）、FTHL17（ferritin, heavy polypeptide-like 17; NM_031894, NM_031261）、SALL4（sal-like 4; NM_020436, NM_175303）、Oct3/4（POU5F1とも呼ばれる; NM_002701, NM_203289, NM_013633, NM_001009178）、Sox2（NM_003106, NM_011443, XM_574919）、Rex-1（ZFP42 (zinc finger protein 42 homolog); NM_174900, NM_009556）、Utf1（undifferentiated embryonic cell transcription factor 1; NM_003577, NM_009482）、TCL1A（T-cell leukemia/lymphoma 1A; NM_021966, NM_009337）、DPPA3（Stellaとも呼ばれる, NM_199286, NM_139218, XM_216263)、KLF4（Kruppel-like factor 4; NM_004235, NM_010637）、cateninβ1（cadherin-associated protein beta 1; NM_001904, NM_007614; S33Y変異体を含む）、c-Myc（NM_002467, NM_010849; T58A変異体を含む）、STAT3（signal transducer and activator of transcription 3; NM_139276, NM_213659）、GRB2（growth factor receptor-bound protein 2; NM_002086, NM_008163）、ならびにこれらの遺伝子が属するファミリーの他のメンバーの遺伝子などが挙げられる。これらの遺伝子は、細胞に導入することにより多能性幹細胞を誘導できることが示されている（WO2007/69666）。従って、これらの遺伝子のいずれかを搭載する染色体非組み込み型ウイルスベクター、例えばRNAウイルスベクターは、本発明において細胞の脱分化の誘導に用いるために有用であり、特に多能性幹細胞の誘導に好適に用いることができる。これらの遺伝子は、１つずつ別のベクターに組み込んでもよいし、複数の遺伝子をまとめて１つのベクターに組み込むこともできる。また、それぞれの遺伝子を一種類のベクターに組み込んでもよく、あるいは異なる種類のベクター（染色体組み込み型ウイルスベクターおよび／または非ウイルスベクターを含む）を、染色体非組込み型ウイルスベクターと組み合わせて用いてもよい。また個々のウイルスベクターは、別々にパッケージされており使用時に組み合わせて用いることができる。あるいは搭載する遺伝子が異なる複数のウイルスベクターを、予めまとめてキットとしたり、混合して組成物としてもよい。また、これらの遺伝子の任意の組み合わせ（または全て）を含む、１つまたはそれ以上の非組み込み型ウイルスベクター、および該ベクターを含むキットまたは組成物も、細胞のリプログラミング、特に多能性幹細胞の製造において好適に用いることができる。組成物の場合は、ベクターは適宜滅菌水、ｐＨ緩衝液、生理的食塩水、培養液等の中に混合されていてよい。尚、これらの系は、核初期化遺伝子の一部または大部分をその発現産物であるタンパク質に置き換えることもできる。すなわち本発明の組成物およびキットは、少なくとも一つの染色体非組み込み型ウイルスベクターを含む限り、リプログラム因子を発現する他のベクター（染色体組込み型ウイルスベクターおよび／または非ウイルスベクター）および／またはリプログラムを誘導する化合物、蛋白質等を含んでもよい。リプログラミングに必要な因子は、その全てを染色体非組み込み型ウイルスベクターから発現させてもよく、あるいは一部のみを染色体非組み込み型ウイルスベクターから発現させ、その他を他のベクターおよび／または化合物（例えば蛋白質や低分子化合物）により供給してもよい。また、本発明のリプログラムされた細胞の製造方法は、全ての遺伝子導入を染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いて行う方法に限定されない。すなわち本発明の方法は、少なくとも一つの染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いればよく、リプログラム因子を発現する他のベクター（染色体組込み型ウイルスベクターおよび／または非ウイルスベクター）および／またはリプログラムを誘導する化合物等を併用することが含まれる。
【００４５】
本発明は、染色体非組み込み型ウイルスベクターを発現ベクターとして含む、細胞のリプログラミングに用いるための組成物に関する。また本発明は、染色体非組み込み型ウイルスベクターの、分化した細胞のリプログラミングに用いるための使用に関する。例えば本発明は、染色体非組み込み型ウイルスベクターの使用であって、細胞のリプログラミングにおいてその必要がある細胞に遺伝子を導入するための使用を提供する。また本発明は、細胞のリプログラミングにおいて遺伝子を導入するための方法であって、染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いて、その必要がある細胞に該遺伝子を導入する方法に関する。また本発明は、染色体非組み込み型ウイルスベクターを含む、細胞のリプログラミングにおける遺伝子導入に用いるための組成物、細胞のリプログラミングにおける遺伝子導入に用いるための剤（細胞のリプログラミングにおける遺伝子導入に用いるための導入剤、細胞のリプログラミングにおける遺伝子導入剤）にも関する。また本発明は、染色体非組み込み型ウイルスベクターの使用であって、細胞のリプログラミングにおいてその必要がある細胞に遺伝子を導入するための薬剤の製造における使用にも関する。また本発明は、染色体非組み込み型ウイルスベクターを含む、細胞のリプログラミングに用いるための遺伝子導入剤（遺伝子発現剤、または発現ベクター）を提供する。また本発明は、染色体非組み込み型ウイルスベクターを含む、リプログラミング遺伝子導入剤（遺伝子発現剤、または発現ベクター）を提供する。また本発明は、染色体非組み込み型ウイルスベクターを含む、核初期化因子（a nuclear reprogramming factor）発現剤（核初期化遺伝子 (a nuclear reprogramming gene) 導入剤、核初期化遺伝子 (a nuclear reprogramming gene) 発現ベクター）を提供する。また本発明は、核初期化因子（a nuclear reprogramming factor）をコードする染色体非組み込み型ウイルスベクターを含む、多能性幹細胞誘導剤および多能性幹細胞誘導補助剤を提供する。また本発明は、染色体非組み込み型ウイルスベクターの、分化した細胞のリプログラミングのための使用を提供する。また本発明は、染色体非組み込み型ウイルスベクターの、分化した細胞のリプログラミングのための薬剤、試薬および／または医薬の製造における使用を提供する。また本発明は、染色体非組み込み型ウイルスベクターの、分化した細胞の核初期化因子（a nuclear reprogramming factor）導入剤の製造における使用にも関する。
【００４６】
ここでリプログラミングは、例えば分化した細胞からの多能性幹細胞の誘導であってよい。ベクターは、リプログラミングのための因子をコードする遺伝子を組み込んで使用される。リプログラミング因子をコードする遺伝子としては、例えば上記、あるいは以下に例示した因子のいずれかをコードする遺伝子が挙げられる。
【００４７】
なお、導入する因子は、リプログラムしたい細胞の由来に合わせて適宜選択すればよく、ヒト由来であっても、その他の哺乳動物由来、例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等の霊長類由来であってもよい。また、遺伝子および蛋白質の配列は必ずしも野生型の配列でなくてもよく、リプログラミングを誘導できる限り、いかなる変異を有していてもよい。実際に、変異型遺伝子を用いて多能性幹細胞を作製した例が知られている（WO2007/69666）。例えば、１または少数（例えば数個、３個以内、５個以内、１０個以内、１５個以内、２０個以内、２５個以内）のアミノ酸が付加、欠失、置換、および／または挿入されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、リプログラミングを誘導できる遺伝子は、本発明において使用することができる。また生物学的活性（リプログラミングの誘導能）を維持している限り、例えばＮ末端および／またはＣ末端の１〜数残基（例えば２、３、４、５、６、１０、１５または２０残基）のアミノ酸が欠失または付加されたポリペプチド、及び１〜数残基（例えば２、３、４、５、６、１０、１５または２０残基）のアミノ酸が置換されたポリペプチドなども使用できる。使用し得るバリアントとしては、例えば天然の蛋白質の断片、アナログ、派生体、及び他のポリペプチドとの融合蛋白質（例えば異種シグナルペプチドまたは抗体断片を付加したもの等）が含まれる。具体的には、野生型のアミノ酸配列の１またはそれ以上のアミノ酸を置換、欠失、および／または付加した配列を含み、野生型蛋白質と同等の生物学的活性（例えばリプログラミングを誘導する活性）を有するポリペプチドが含まれる。野生型蛋白質の断片を用いる場合は、通常、野生型ポリペプチド（分泌蛋白質の場合は成熟型の形態）の70％以上、好ましくは80%以上、85%以上、より好ましくは90％以上、95％以上または98％以上の連続領域を含む。
【００４８】
アミノ酸配列のバリアントは、例えば天然のポリペプチドをコードするDNAに変異を導入することにより調製することができる（Walker and Gaastra, eds. Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York, 1983); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492, 1985 ; Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382, 1987; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.), 1989; U.S. Pat. No. 4,873,192）。生物学的活性に影響を与えないようにアミノ酸を置換するためのガイダンスとしては、例えばDayhoffら（Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), 1978）が挙げられる。
【００４９】
改変されるアミノ酸数に特に制限はないが、例えば天然の成熟型ポリペプチドの全アミノ酸の30％以内、好ましくは25％以内、より好ましくは20％以内、より好ましくは15％以内、より好ましくは10％以内、5％以内、または3％以内であり、例えば15アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは8アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、より好ましくは3アミノ酸以内である。アミノ酸を置換する場合は、側鎖の性質が似たアミノ酸に置換することにより蛋白質の活性を維持することが期待できる。このような置換は、本発明において保存的置換という。保存的置換は、例えば塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸 (例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸 (例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸 (例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸 (例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族アミノ酸 (例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などの各グループ内のアミノ酸間の置換などが挙げられる。また、例えば、BLOSUM62置換マトリックス（S. Henikoff and J.G. Henikoff, Proc. Acad. Natl. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992）において、正の値の関係にあるアミノ酸間の置換が挙げられる。
【００５０】
改変された蛋白質は、野生型蛋白質のアミノ酸配列と高いホモロジーを示す。高いホモロジーとは、例えば70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、93%以上、95%以上、または96%以上の同一性を有するアミノ酸配列である。アミノ酸配列の同一性は、例えばBLASTPプログラム（Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990）を用いて決定することができる。例えばNCBI（National Center for Biothchnology Information）のBLASTのウェブページにおいて、デフォルトのパラメータを用いて検索を行うことができる（Altschul S.F. et al., Nature Genet. 3:266-272, 1993; Madden, T.L. et al., Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul S.F. et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Zhang J. & Madden T.L., Genome Res. 7:649-656, 1997）。例えば２つの配列の比較を行うblast2sequencesプログラム（Tatiana A et al., FEMS Microbiol Lett. 174:247-250, 1999）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、例えば天然型サイトカイン（分泌後の成熟型の形態）のアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算する。具体的には、野生型蛋白質 (分泌蛋白質の場合は成熟型) の全アミノ酸数における一致するアミノ酸数の割合を計算する。
【００５１】
また遺伝子は、コードされるアミノ酸配列を変えないようにサイレント変異を導入することができる。特にAT richな遺伝子においては、5個以上の連続したAまたはTの塩基について、コードされるアミノ酸配列を変えないようにGまたはCに置換することにより、安定して遺伝子の高発現を得ることができる。
【００５２】
また改変蛋白質あるいはリプログラミングに用いるタンパク質は、野生型蛋白質をコードする遺伝子のコード領域の一部または全部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質であって、野生型蛋白質と同等の活性（リプログラミングを誘導する活性）を有する蛋白質が挙げられる。ハイブリダイゼーションにおいては、例えば野生型蛋白質遺伝子のコード領域の配列またはその相補配列を含む核酸、またはハイブリダイズの対象とする核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にハイブリダイズするかを検出することにより同定することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えば 5xSSC、7%(W/V) SDS、100 micro-g/ml 変性サケ精子DNA、5xデンハルト液（１xデンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、及び0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、60℃、好ましくは65℃、より好ましくは68℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度で2xSSC中、好ましくは1xSSC中、より好ましくは0.5xSSC中、より好ましくは0.1xSSC中で、振蘯しながら２時間洗浄する条件である。
【００５３】
細胞のリプログラミングを誘導するために特に好ましい遺伝子を例示すれば、F-box protein 15 (Fbx15, NM_152676, NM_015798)、Nanog（NM_024865, AB093574）、ERAS（ES cell expressed Ras; NM_181532, NM_181548)、DPPA2（NM_138815, NM_028615）、Oct3/4（POU5F1とも呼ばれる; NM_002701, NM_203289, NM_013633, NM_001009178）、Sox2（NM_003106, NM_011443, XM_574919）、TCL1A（T-cell leukemia/lymphoma 1A; NM_021966, NM_009337）、KLF4（Kruppel-like factor 4; NM_004235, NM_010637）、cateninβ1（cadherin-associated protein beta 1; NM_001904, NM_007614; S33Y変異体を含む）、およびc-Myc（NM_002467, NM_010849; T58A変異体を含む）、ならびにこれらの遺伝子が属するファミリーの他のメンバーの遺伝子などが挙げられる。これらの遺伝子を導入した場合、誘導多能性幹細胞の形態を示したコロニーの割合は、次に述べる４種類の遺伝子（Oct3/4、Sox2、KLF4、およびc-Myc）の導入の場合よりも高いことが報告されている（WO2007/69666）。従って、これらのいずれかを搭載する染色体非組み込み型ウイルスベクターは、本発明において細胞のリプログラミングの誘導に用いるために有用であり、特に、多能性幹細胞の誘導に好適に用いることができる。個々のウイルスベクターは、使用時に組み合わせて用いることができる。また予めまとめてキットとしたり、混合して組成物としてもよい。また、これらの遺伝子の任意の組み合わせ（または全て）を含む、１つまたはそれ以上の染色体非組み込み型ウイルスベクター、および該ベクターを含むキットまたは組成物も本発明に含まれる。
【００５４】
中でも、多能性幹細胞の誘導に特に好ましい遺伝子の組み合わせの１つは、Sox遺伝子、KLF遺伝子、Myc遺伝子、およびOct遺伝子の４種類の遺伝子を少なくとも含む組み合わせである（Takahashi, K. and Yamanaka S., Cell 126, 663-676, 2006; Lowry WE et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8):2883-8, 2008; Masaki, H. et al., Stem Cell Res. 1:105-115, 2008; WO2007/69666）。ここでSox蛋白質、KLF蛋白質、Myc蛋白質、およびOct蛋白質、ならびにそれらの遺伝子とは、それぞれSoxファミリー、KLFファミリー、Mycファミリー、およびOctファミリーに属するメンバーの蛋白質および遺伝子を言う。これらの４つのファミリーのメンバーをそれぞれ１つ以上発現するように調整することで、分化した様々な細胞から多能性幹細胞を誘導できることが報告されている。例えばSoxファミリーの遺伝子については、Sox1、Sox2、Sox3、Sox15、Sox17 のいずれの遺伝子を用いても、多能性幹細胞を誘導できることが報告されている（WO2007/69666）。またKLFファミリーについても、KLF4でもKLF2でも多能性幹細胞を誘導できた（WO2007/69666）。Mycファミリーについても、野生型c-Mycのみならず、T58A変異体や、N-Myc、L-Mycでも多能性幹細胞を誘導できた（WO2007/69666; Blelloch R. et al., Cell Stem Cell, 1: 245-247, 2007）。このように、ファミリーの遺伝子を様々に選択して使用することが可能であるので、上記の４種のファミリー遺伝子を適宜選択して、リプログラミングを誘導することができる。
【００５５】
例えば野生型c-MycはセンダイウイルスベクターなどのRNAウイルスベクターからの発現量が少ないことが判明した。しかし野生型c-Mycに、a378g、t1122c、t1125c、a1191g、および a1194g から選択される１つ以上、好ましくは２以上、３以上、４以上、または５つ全ての変異を導入することにより、ベクターから遺伝子を安定して高発現させることが可能となる。本発明においては、例えば配列番号45に示した改変型c-Myc遺伝子を好適に用いることができる。遺伝子のベクター中の挿入位置は所望の部位を選択することができる。
【００５６】
例えばMyc遺伝子は、マイナス鎖RNAゲノムの後方（5'側）、すなわちゲノム上に配置される複数の蛋白質コード配列において、3'側から数えるよりも5'側から数えた方が早い位置に配置してもよい（実施例参照）。Myc遺伝子は、例えば最も5'側（すなわち5'側から1番目）、あるいは5'側から2または3番目に配置することができる。Myc遺伝子は、例えばゲノムの5'側から2番目、具体的には、ゲノムの最も5'側にL遺伝子があり、その次にHN遺伝子がある場合に、その間に配置してもよい。Myc遺伝子は、コードされるアミノ酸配列を変えないように適宜サイレント変異を導入し、連続したAまたはTの塩基配列を置換することができる。
【００５７】
Myc遺伝子をマイナス鎖RNAゲノムの後方（5'側）の配置したマイナス鎖RNAウイルスベクターは、他の核初期化因子をコードするマイナス鎖RNAウイルスベクターと組み合わせて用いることができる。この場合、他の核初期化因子をコードするマイナス鎖RNAウイルスベクターにおいては、それらの核初期化因子は、それぞれのベクターのマイナス鎖RNAゲノムにおいて前方（3'側）、すなわちゲノム上に配置される複数の蛋白質コード配列において、5'側から数えるよりも3'側から数えた方が早い位置に配置することができる。例えば最も3'側（すなわち3'側から1番目）、あるいは3'側から2または3番目に配置してよい。例えば、Myc以外の核初期化因子をコードする遺伝子（例えばOct遺伝子、Klf遺伝子およびSox遺伝子）は、それぞれのマイナス鎖RNAウイルスベクターにおいて、ゲノムの5'側から1番目または2番目、より好ましくは1番目に配置される。具体的には、ゲノムのNP遺伝子の3'側の、最も3'端側に核初期化因子をコードする遺伝子を配置することができる。
【００５８】
リプログラミングが完了した細胞のコロニーからは、ベクターが除去された細胞を適宜選択することができる。例えばベクターが自然除去された細胞を選択すればよい。このために、例えばウイルスベクターに特異的な抗体（例えば抗HN抗体）でネガティブ選択を行うことができる。また、温度感受性ベクターを用いた場合は、高温（例えば37.5〜39℃、好ましくは38〜39℃、または38.5〜39℃）で培養することによりベクターを簡便に除去することができる。
【００５９】
具体的には、KLFファミリーとしては、Klf1（NM_006563, NM_010635）、Klf2（NM_016270, NM_008452）、Klf4（NM_004235, NM_010637）、Klf5（NM_001730, NM_009769）が含まれ、Mycファミリーとしては、c-Myc（NM_002467, NM_010849, T58A変異体を含む）、N-Myc（NM_005378, NM_008709）、L-Myc（NM_005376, NM_005806）が含まれ、Octファミリーとしては、Oct1A（NM_002697, NM_198934）、Oct3/4（NM_002701, NM_203289, NM_013633, NM_001009178）、Oct6（NM_002699, NM_011141）が含まれ、Soxファミリーとしては、Sox1（NM_005986, NM_009233）、Sox2（NM_003106, NM_011443, XM_574919）、Sox3（NM_005634, NM_009237）、Sox7（NM_031439, NM_011446）、Sox15（NM_006942, NM_009235）、Sox17（NM_022454, NM_011441）、Sox18（NM_018419, NM_009236）が含まれる。これらの遺伝子のいずれかを搭載する染色体非組み込み型ウイルスベクターは、本発明において細胞の脱分化の誘導に用いるために有用であり、特に多能性幹細胞の誘導に好適に用いることができる。
【００６０】
なお、Mycファミリーの遺伝子は多能性幹細胞の誘導に必須ではなく、Mycファミリー遺伝子を除く３つのファミリーの遺伝子だけでも多能性幹細胞は誘導できる（Nakagawa M. et al., Nat Biotechnol. 26(1):101-6, 2008; Wering M. et al., Cell Stem Cell 2(1):10-2, 2008；実施例５）。Myc遺伝子を発現させない場合、例えばp53 siRNAおよびUTF1により多能性幹細胞の誘導効率を有意に上昇させることがでいる（Y. Zhao et al., Cell Stem Cell, 3 (5): 475-479, 2008; N. Maherali, and K. Hochedlinger, Cell Stem Cell, 3 (6): 595-605, 2008）。また、KLFファミリーの遺伝子を除く３つのファミリーの遺伝子だけでも多能性幹細胞を誘導できることが報告されている（Park IH et al., Nature, 451(7175):141-6, 2008）。また、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（BIX-01294; Kubicek, S. et al., Mol. Cell 25, 473-481, 2007）を併用することにより、胎児由来のNPCからKlf遺伝子、Sox遺伝子、およびMyc遺伝子の３つの遺伝子のみで多能性幹細胞を誘導できることが報告されている（Shi Y et al., Cell Stem Cell, 2(6):525-8, 2008）。従って、Sox遺伝子、KLF遺伝子、およびOct遺伝子の各遺伝子のいずれか、あるいはSox遺伝子、Myc遺伝子、およびOct遺伝子の各遺伝子のいずれか、あるいはSox遺伝子、Myc遺伝子、およびKlf遺伝子の組み合わせを搭載する１つまたは複数の染色体非組み込み型ウイルスベクターは、本発明において細胞のリプログラミングの誘導に用いるために特別に有用であり、多能性幹細胞の誘導に好適に用いることができる。それぞれの遺伝子をコードするウイルスベクターは別々に単体として準備されてもよい。それらは、使用時に組み合わせて用いることができる。また任意の組み合わせまたは全てをまとめてキットとしたり、混合して組成物としてもよい。また本発明は、これらの遺伝子の任意の組み合わせ（または全て）を含む、１つまたはそれ以上の染色体非組み込み型ウイルスベクター、および該ベクターを含むリプログラミングのためのキットまたは組成物にも関する。更には、このキットに含まれる一部の組換えベクターは、相当の機能を有するタンパク質、合成化合物などに置き換えることも可能である。
【００６１】
なお、もともとの分化した細胞において、上記の遺伝子のうち１つまたは幾つかが、例えば内在的に既に発現している場合は、その遺伝子の導入を省略することができる。例えば神経前駆細胞（neural progenitor cells (NPCs)）は内因性のSoxファミリー遺伝子を発現しているので、Oct3/4およびKlf4の導入だけで多能性幹細胞を誘導できた（Shi Y et al., Cell Stem Cell, 2(6):525-8, 2008）。また、Oct4, Sox2, Esrrb (estrogen-related receptor beta, NM_004452.2, NP_004443.2, NM_011934.3, NP_036064.2) の3遺伝子を用いてマウス胎仔線維芽細胞（MEF）から多能性幹細胞を誘導できることが報告されており、Esrrb は Klf の機能を補完できることが示唆されている（Feng, B. et al., Nat Cell Biol. 11(2):197-203, 2009）。またヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（BIX-01294）とカルシウムイオンチャンネルアゴニスト（BayK8644）を組み合わせることにより、Oct3/4およびKlf4の導入だけで胚線維芽細胞から多能性幹細胞を誘導できる（Shi Y et al., Cell Stem Cell, 3(5):568-574, 2008）。また成体マウス脳由来の神経幹細胞（neural stem cells; NSCs）を用いた実験においては、Oct3/4およびKlf4の組み合わせのみならず、Oct3/4およびc-Mycの２因子の遺伝子のみを導入することでも多能性幹細胞を誘導できることが報告されている（Kim, J.B. et al., Nature, doi:10.1038/nature07061; Published online 29 June 2008; Nature. 2008, 454(7204):646-50）。また培養期間を調整することにより、Oct4のみでも多能性幹細胞を誘導することができる（Jeong Beom Kim et al., Cell, 136(3): 411-419, 2009）。リプログラミング因子をコードする染色体非組み込み型ウイルスベクターは、適宜、必要なものだけを使用してもよい。また、内在性のリプログラミング因子の内在性の発現が、別の遺伝子の発現または化合物処理等により誘導されるのであれば、当該別の遺伝子を発現するベクターの導入や化合物処理を組み合わせて、それだけでは誘導できないリプログラミング因子をコードする染色体非組み込み型ウイルスベクターのみを導入してもよい。本発明において、少なくともOct遺伝子、Klf遺伝子およびSox遺伝子の３種、少なくともOct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子およびMyc遺伝子の４種、あるいは少なくともOct遺伝子、Sox遺伝子、Nanog遺伝子、Lin28遺伝子の４種が内在性または外来性に発現するようにベクターを組み合わせるとは、例えばあるリプログラミング因子が自然の状態で内在性に発現している状態だけでなく、他の遺伝子を発現するベクターの導入や化合物、蛋白質処理等により、内在性のリプログラミング因子の発現を誘導できる場合に、その処理を組み合わせて、不足する因子のみを外来的に発現するように染色体非組み込み型ウイルスベクターを組み合わせる場合を包含する。
【００６２】
また、上記４種類または３種類の組み合わせ以外に、Oct遺伝子、Sox遺伝子、NANOG遺伝子（NM_024865, AB093574）、および LIN28遺伝子 (NM_024674) の４種類の各遺伝子を含む組み合わせも、多能性幹細胞の誘導に有用である（Yu J. et al., Science, 318(5858):1917-20, 2007）。また、これらにMyc遺伝子およびKLF遺伝子をさらに組み合わせたものも好適である（Liao J et al., Cell Res. 18(5):600-3, 2008）。これらのいずれかの遺伝子を搭載する染色体非組み込み型ウイルスベクターは、本発明において細胞の脱分化の誘導に用いるために特に有用であり、多能性幹細胞の誘導に好適に用いることができる。これらの遺伝子の任意の組み合わせ（または全て）を含む、１つまたはそれ以上の染色体非組み込み型ウイルスベクター、および該ベクターを含むキットまたは組成物も、細胞のリプログラミング、特に多能性幹細胞の製造において好適に用いることができる。なお上記と同様に、対象とする細胞が既にこれらの遺伝子のうち一部を発現している場合には、その遺伝子を発現するベクターは導入してもしなくてもよい。更には、このキットに含まれる一部の組換えベクターは、相当の機能を有するタンパク質、合成化合物などに置き換えることも可能である。
【００６３】
以上に記載した遺伝子の組み合わせに、さらに別の遺伝子を組み合わせて、リプログラミングの誘導効率を上昇させることもできる。このような遺伝子としては、TERT（NM_198253, NM_009354）および／またはSV40 large T antigen（NC_001669.1, Fiers,W. (05-11-1978) Nature 273:(5658)113-120）が挙げられる（Park IH. et al., Nature, 451(7175):141-6, 2008）。また、HPV16 E6、HPV16 E7、Bmil（NM_005180, NM_007552）からなる群より選択される１つ以上の遺伝子をさらに組み合わせてもよい。また、Fbx15（Mol Cell Biol. 23(8):2699-708, 2003）、Nanog（Cell 113: 631-642, 2003）、ERas（Nature 423, 541-545, 2003）、DPPA2（Development 130: 1673-1680, 2003）、TCL1A（Development 130: 1673-1680, 2003）、β-Catenin（Nat Med 10(1): 55-63, 2004）からなる群より選択される１つまたは任意の組み合わせを発現させてもよい。さらに、ECAT1（AB211062, AB211060）、DPPA5 (NM_001025290, NM_025274, XM_236761）、DNMT3L（NM_013369, NM_019448)、ECAT8 （AB211063, AB211061）、GDF3（NM_020634, NM_008108）、SOX15（NM_006942, NM_009235）、DPPA4（NM_018189, NM_028610）、FTHL17（NM_031894, NM_031261）、SALL4（NM_020436, NM_175303）、Rex-1（NM_174900, NM_009556）、Utf1（NM_003577, NM_009482）、DPPA3（NM_199286, NM_139218, XM_216263)、STAT3（NM_139276, NM_213659）、および GRB2（NM_002086, NM_008163）からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を組み合わせてもよい。これらの遺伝子を付加的に発現させることで、多能性幹細胞の誘導を促進し得る（WO2007/69666）。成熟Ｂ細胞を対象とする場合は、例えば骨髄球系転写因子C/EBPα（CCAAT/enhancer-binding-protein α）（NM_004364）を異所発現させるか、あるいはＢ細胞系転写因子Pax5（paired box 5; NM_016734）の発現を抑制してリプログラミングを促進することができる（Hanna J, Cell. 133(2):250-64, 2008）。これらの因子も、本発明における染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いて発現させることができる。更には、このキットに含まれる一部の組換えベクターは、相当の機能を有するタンパク質、合成化合物などに置き換えることも可能である。
【００６４】
また、上記の因子を発現させる以外にも、例えば化合物の添加を組み合わせることでリプログラミングの効率を向上させることができる。例えば、bFGF（basic fibroblast growth factor）および／またはSCF（stem cell factor）は多能性幹細胞の誘導を促進し、さらに多能性幹細胞の誘導におけるc-Mycの機能を代替することができる（WO2007/69666）。またMAPキナーゼ阻害剤（PD98056）も、よりＥＳ細胞に近い多能性幹細胞の樹立等に有用である（WO2007/69666）。また、DNAメチル化酵素（Dnmt）阻害剤および／またはヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤により、多能性幹細胞の誘導効率が改善することが報告されている（Huangfu D et al., Nat Biotechnol. (Published online: 22 June 2008, doi:10.1038/nbt1418); Nat. Biotechnol. 26, 795-797 (2008)）。例えばHDAC（VPA）を併用することにより、Oct4とSox2の2遺伝子のみの導入により多能性幹細胞を誘導することができる（Huangfu, D. et al., Nat Biotechnol. 2008 26(11):1269-75）。本発明のベクターは、これらの遺伝子またはその一部の遺伝子を発現させるための剤として有用である。Dnmt阻害剤としては、例えば5-アザシチジン等、HDAC阻害剤としては、例えばスベロイラニリド・ハイドロザミック酸（SAHA）、トリコスタチンA（TSA）、バルプロ酸（VPA）等が有用である。また5-アザシチジンを用いる場合、グルココルチコイド（デキサメタゾン）を併用することにより効率を上昇させることができる。
【００６５】
細胞をリプログラミングさせるには、上記の組み合わせのベクター等を細胞に導入する。複数のベクターおよび／または化合物を組み合わせて導入する場合、導入は同時に行うことが好ましく、具体的には、最初のベクターまたは化合物等を添加してから４８時間以内、好ましくは３６時間以内、より好ましくは２４時間以内、１８時間以内、１２時間以内、１０時間以内、８時間以内、６時間以内、３時間以内、２時間以内、または１時間以内にリプログラミング因子をコードする全てのベクターおよび／または化合物の添加を完了することが好ましい。ベクターの用量は適宜調製することができるが、好ましくはMOI 0.3〜100、より好ましくはMOI 0.5〜50、より好ましくはMOI 1〜30、より好ましくはMOI 1〜10、より好ましくはMOI 1〜5、より好ましくはMOIを約３で感染させる。誘導された多能性幹細胞は、ＥＳ細胞とよく似た扁平なコロニーを形成し、アルカリホスファターゼを発現する。また誘導された多能性幹細胞は、未分化細胞マーカーであるNanog、Oct4、および／またはSox2等を発現してよい。また誘導された多能性幹細胞は、好ましくはTERTを発現および/またはテロメラーゼ活性を示す。本発明は、アルカリホスファターゼを発現し、好ましくは未分化細胞マーカーであるNanogおよび/またはTERTをさらに発現する細胞の製造方法、および該細胞の製造および該細胞を誘導する薬剤の製造における染色体非組み込み型ウイルスベクターの使用にも関する。
【００６６】
本発明によれば、成人皮膚細胞および新生児包皮細胞を含む所望の細胞から多能性幹細胞のコロニーを、例えば0.3×10-5 以上、0.5×10-5 以上、0.8×10-5 以上、または1×10-5 以上（例えば1.7×10-5 〜 2.4×10-3）の出現率で、好ましくは1.5×10-5 以上、1.7×10-5 以上、2.0×10-5 以上、2.5×10-5 以上、3×10-5 以上、4×10-5 以上、5×10-5 以上、8×10-5 以上、1×10-4 以上、2×10-4 以上、3×10-4 以上、5×10-4 以上、8×10-4 以上、1×10-3 以上、1.5×10-3 以上、2×10-3 以上、または 2.3×10-3 以上の出現率で誘導することができる。
【００６７】
リプログラミングを誘導する対象となる分化した細胞は、特に限定はなく、所望の体細胞等を用いることができる。体細胞からの多能性幹細胞の生成は、マウス胎児由来の細胞からのみならず、成体マウスの尾部から採取した分化した細胞や、肝細胞および胃粘膜細胞からでも可能であることが示されており、細胞型や分化状態によらないことが示唆される（WO2007/069666; Aoi T. et al., Science [Published Online February 14, 2008]; Science. 2008; 321(5889):699-702）。またヒトにおいても、成人の顔皮膚由来線維芽細胞、成人滑膜細胞、新生児包皮由来線維芽細胞、成人間葉系幹細胞、成人の手のひらの皮膚細胞、胎児細胞等の多様な細胞から、多能性幹細胞が誘導できることが確認されている（Takahashi K et al. (2007) Cell 131: 861-872; Park IH et al., Nature, 451(7175):141-6, 2008）。また、膵臓β細胞やBリンパ球のような最終分化した細胞からも、同様に多能性幹細胞が誘導できることが報告されている（Stadtfeld M et al., Curr Biol. 2008 May 21. [PubMed, PMID: 18501604]; Curr Biol. 2008;18(12):890-4; Hanna J. et al., Cell. 133(2):250-64, 2008）。これらの知見は、多能性幹細胞の誘導が、元になる細胞によらないことを示唆している。これらの所望の体細胞からの多能性幹細胞の誘導において、本発明の方法を適用することができる。具体的には、リプログラミングの対象となる分化した細胞としては、線維芽細胞、滑膜細胞、口腔または胃などの粘膜細胞、肝細胞、骨髄細胞、歯胚細胞、その他の所望の細胞が含まれる。また細胞は、例えば胚、胎児、新生児、子供、成人または老人の細胞に由来してよい。また、動物の由来は特に制限はなく、ヒトおよび非ヒト霊長類（サルなど）、マウス、ラットなどのげっ歯類、およびウシ、ブタ、ヤギなどの非げっ歯類を含む哺乳動物等が含まれる。
【００６８】
本発明の方法により製造された細胞は、様々な組織や細胞に分化させるために有用であり、所望の試験、研究、診断、検査、治療等において用いることができる。例えば誘導した幹細胞は、幹細胞療法において利用されることが期待される。例えば患者から採取した体細胞を用いて初期化（reprogramming）を誘導し、その後、分化誘導して得られる体性幹細胞やその他の体細胞を患者に移植することができる。細胞の分化誘導の方法は特に限定されず、例えばレチノイン酸処理や、様々な増殖因子・サイトカイン処理、ホルモンによる処理により分化を誘導することができる。また得られた細胞は、所望の薬剤や化合物の効果を検出するために使用することができ、これを通して薬剤や化合物のスクリーニングを実施することが可能である。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。また、本明細書中に引用された文献およびその他の参照は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。
【００７０】
<本発明で用いた外来遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターの作製>
本発明で用いた外来遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターの作製方法を以下に示す。特に断らない限り、外来遺伝子の導入にはこのベクターを用いた。尚、下記SeV18+/TSΔFとは、M蛋白質にG69E，T116A，及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T，G264，及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである（WO2003/025570）。このベクターは、NP遺伝子の上流（ゲノムの3'側；「18+位」とも言う）に導入遺伝子挿入部位（NotI部位）を有する。
【００７１】
（１）c-Myc遺伝子、Sox2遺伝子、KLF4遺伝子、及びOct3/4遺伝子の単離のためのcDNAライブラリーの作製
c-Myc遺伝子、Sox2遺伝子、KLF4遺伝子、及びOct3/4遺伝子を単離するために、Jurkat細胞からトータルRNAを抽出した。1.0×106（個）細胞のJurkat細胞（Schneider U et al (1977) Int J Cancer 19 (5): 621-6）を8000rpm室温で1分間遠心して集めた。細胞溶解緩衝液(10 mM Tris-HCl(pH7.5), 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.65 % NP-40)を200μl 添加し、ピペッティング後、ボルテクスにより懸濁した。6000rpm、で3分間遠心分離し、上清を別の1.5mlエッペンドルフチューブに移し、200μlの抽出緩衝液を添加した。ボルテクスで十分に懸濁した後、400μlのフェノール/クロロフォルム/イソアミルアルコール(25:24:1)を添加し、さらにボルテクスにより十分懸濁した。15000rpm、4℃、5分間遠心分離を行い、上清を別の1.5mlエッペンドルフチューブに移し、400μlのイソプロパノールを添加し、ボルテクスにより十分に懸濁後、-20℃にて30分間冷やした。15000rpm、4℃、15分間遠心分離を行い、上清を除き、沈殿物に70%エタノールを1ml添加し、ボルテクスにより懸濁後、15000rpm、4℃、5分間遠心分離を行った。上清を除き室温で乾燥後、100μlのヌクレアーゼフリー水に溶解し、Jurkat細胞のトータルRNA溶液を得た。
KLF4遺伝子を単離するために、ヒト胎児腎細胞由来の293T/17細胞（Human embryonic kidney subclone 17, ATCC CRL-11286, Pear, W. S. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8392-8396）より上記と同じ方法でトータルRNAを回収した。
Oct3/4遺伝子を単離するために、ヒト胚性癌細胞のNCCIT細胞（ATCC number CRL-2073; Damjanov I, et al., Lab. Invest. 1993, 68(2):220-32）より上記と同じ方法でトータルRNAを回収した。
【００７２】
回収したトータルRNAからSuperScript III Reverse Transcriptase（インビトロジェン カタログ番号18080-044）を用いてcDNAを合成した。トータルRNA 1μgをランダムヘキサマー100ng、10mM dNTP 混合液1μlおよびヌクレアーゼフリー水で13μlとした。65℃で5分間、熱処理し氷上に1分間置き冷却した。次に、5xFirst-Strand Bufferを4μl、0.1M DTTを1μl、RNaseOUTを1μlそしてSuperscript III RTを1μl添加し、ピペッティングで混合後、スピンダウンし、25℃を5分間、50℃を60分間、70℃を15分間反応させた。TE(pH8.0)を180μl添加し、cDNAライブラリーとした。
【００７３】
（２）ヒト転写因子c-Mycの単離およびc-Mycを搭載したセンダイウイルスベクタープラスミドの構築
JurkatのcDNAライブラリーからPrimeStar（商標） HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いてc-Myc -21F（5’-AACCAGCAGCCTCCCGCGACG-3’(配列番号：1)）およびc-Myc 1930R（5’-AGGACATTTCTGTTAGAAGGAATCG-3’(配列番号：2)）のプライマーによりPCR（94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分を40サイクル→72℃-7分）を行った。このPCR産物をTEを用いて100倍希釈後、1μlをc-Myc-F（5’-GATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACC-3’(配列番号：3)）およびc-Myc-R（5’-GTTACGCACAAGAGTTCCGTAGCTG-3’(配列番号：4)）のプライマーを使用して、PCRを行った。PCR産物を1％アガロースゲル電気泳動により分離し、約1.3 kbpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Cat. No. 28706) で精製した。pCAGGS-BSX (WO2005/071092) のSwaIサイトにクローニングし、シークエンスを行い配列の正しいクローンを選択し、pCAGGS-BSX-c-Mycを得た。次に、pCAGGS-BSX-c-Mycを鋳型にして、NotI-c-Myc F（5’-ATTGCGGCCGCATGCCCCTCAACGTTAGCTTCAC-3’(配列番号：5)）およびNotI-c-Myc R（5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTACGCACAAGAGTTCCGTAGCTGTTCAAGTTTGTGTTTC-3’(配列番号：6)）のプライマーでPCRを行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、その後Not I消化（37℃で3時間）を行った。Qiaquick PCR Purification kit (キアゲン、カタログ番号28106)を用いて精製し、ブルースクリプトプラスミドベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより遺伝子配列を確認し、配列の正しいクローンを選択しpBS-KS-c-Mycを得た。pBS-KS-c-MycをNot Iで消化（37℃で3時間）し、1％アガロースゲル電気泳動により分離し、約1.5k bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (キアゲン、 カタログ番号28706) で精製した。このc-Myc遺伝子を含むNot I断片を、センダイウイルスベクター（SeV18+/TSΔF）のアンチゲノムをコードするpSeV18+/TSΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV18+c-Myc/TSΔFを得た。
【００７４】
（３）ヒト転写因子SOX2遺伝子の単離およびSOX2遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクタープラスミドの構築
JurkatのcDNAライブラリーからPrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いてSOX2-64F（5’- CAAAGTCCCGGCCGGGCCGAGGGTCGG-3’(配列番号：7)）およびSOX2-1404R（5’- CCCTCCAGTTCGCTGTCCGGCCC-3’(配列番号：8)）のプライマーによりPCR（94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分を40サイクル→72℃-7分）を行った。このPCR産物をTEを用いて100倍希釈後、1μlをSox2-F（5’-GATGTACAACATGATGGAGACGGAGC-3’(配列番号：9)）および、Sox2-R（5’-GTCACATGTGTGAGAGGGGCAGTG-3’(配列番号：10)）のプライマーを使用して、PCRを行った。PCR産物を1％アガロースゲル電気泳動により分離し、約0.95 k bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Cat. No. 28706) で精製した。pCAGGS-BSXのSwaIサイトにクローニングし、シークエンスを行い配列の正しいクローンを選択し、pCAGGS-BSX-SOX2を得た。次に、pCAGGS-BSX-SOX2を鋳型にして、Not I Sox-2F（5’-ATTGCGGCCGCATGTACAACATGATGGAGACG-3’(配列番号：11)）およびNot I Sox-2R（5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATGGCCGTG-3’(配列番号：12)）のプライマーでPCRを行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、その後Not I消化（37℃で3時間）を行った。Qiaquick PCR Purification kit (キアゲン、カタログ番号28106)を用いて精製し、ブルースクリプトプラスミドベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより遺伝子配列を確認し、配列の正しいクローンを選択しpBS-KS-Sox2を得た。pBS-KS-Sox2をNot Iで消化（37℃で3時間）し、1％アガロースゲル電気泳動により分離し、約1k bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (キアゲン、カタログ番号28706) で精製した。このSox2遺伝子を含むNot I断片をpSeV18+/TSΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV18+Sox2/TSΔFを得た。
【００７５】
（４）ヒト転写因子KLF4遺伝子の単離およびKLF4遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクタープラスミドの構築
JurkatのcDNAライブラリーからPrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いてKIF-4 -35F（5’-CCACATTAATGAGGCAGCCACCTGGC-3’(配列番号：13)）およびKIF-4 1772R（5’-GCAGTGTGGGTCATATCCACTGTCTG-3’(配列番号：14)）のプライマーによりPCR（94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分を40サイクル→72℃-7分）を行った。このPCR産物をTEを用いて100倍希釈後、1μlをKIF4-F（5’-GATGGCTGTCAGCGACGCGCTGCTCCC-3’(配列番号：15)）およびKIF4-R（5’-GTTAAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGCGAG-3’(配列番号：16)）のプライマーを使用して、PCRを行った。PCR産物を1％アガロースゲル電気泳動により分離し、約1.4 k bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Cat. No. 28706) で精製した。pCAGGS-BSXのSwaIサイトにクローニングし、pCAGGS-BSX-KLF4#19を得た。シークエンスの結果、pCAGGS-BSX-KLF4#19は1箇所にサイレント変異（c19t）が認められた。そこで、pCAGGS-BSX-KLF4#19を鋳型にして、NotI-KIF4-F（5’-ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3’(配列番号：17)）およびNotI-KIF4-R（5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGCGAGGTGGTC-3’(配列番号：18)）のプライマーでPCRを行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、pCAGGS-BSXのSwaIサイトにクローニングした。シークエンスの確認を行い配列の正しいクローンを選択し、pCAGGS-BSX-KLF4を得た。次に、pCAGGS-BSX-KLF4を鋳型にして、NotI-KIF4-F（5’-ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3’(配列番号：17)）およびNotI-KIF4-R（5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGCGAGGTGGTC-3’(配列番号：18)）のプライマーでPCRを行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、その後Not I消化（37℃で3時間）を行った。Qiaquick PCR Purification kit (キアゲン、カタログ番号28106)を用いて精製し、ブルースクリプトプラスミドベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより遺伝子配列を確認し、配列の正しいクローンを選択しpBS-KS-KLF4を得た。pBS-KS-KLF4をNot Iで消化（37℃で3時間）し、1％アガロースゲル電気泳動により分離し、約1.5k bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (キアゲン、カタログ番号28706) で精製した。このKLF4遺伝子を含むNot I断片をpSeV18+/TSΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV18+KLF4/TSΔFを得た。
【００７６】
（５）ヒト転写因子Oct3/4遺伝子の単離およびOct3/4遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクタープラスミドの構築
NCCITのcDNAライブラリーからPrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いてOct-3 -28F（5’-CACCATGCTTGGGGCGCCTTCCTTCC-3’(配列番号：19)）およびOCT3/4 R301（5’-CATCGGAGTTGCTCTCCACCCCGAC-3’(配列番号：20)）のプライマー、OCT3/4 F192（5’-CCCGCCGTATGAGTTCTGTGG-3’(配列番号：21)）およびNotI-Oct-3/4R-DPN（5’-GCCGCGGCCGCGTTATCAGTTTGAATGCATGGGAGAGCCCAG-3’(配列番号：22)）のプライマーによりPCR（94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-1分を35サイクル→72℃-7分）を行いOct3/4を２つの領域に分けて増幅した。これら２つのPCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、キットに付属の溶出液100μlに溶出した。溶出液をTEを用いて50倍に希釈した。これらのPCR産物1μlを混合し、 Not I-Oct-3/4F（5’-GCCGCGGCCGCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3’(配列番号：23)）およびNot I-Oct-3/4R-DPN（5’-GCCGCGGCCGCGTTATCAGTTTGAATGCATGGGAGAGCCCAG-3’(配列番号：22)）のプライマーを使用して、PCRを行った（94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-1.5分を35サイクル→72℃-7分）。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、pCAGGS-BSXのSwaIサイトにクローニングし、シークエンスを行い配列の正しいクローンを選択しpCAGGS-BSX-Oct3/4を得た。次に、pCAGGS-BSX-Oct3/4を鋳型にして、Not I-Oct-3/4F（5’-GCCGCGGCCGCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3’(配列番号：23)）およびNot I-Oct-3/4R（5’- GCCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGCCCAGAGTGGTGAC-3’(配列番号：24)）のプライマーでPCR  (94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分を25サイクル→72℃-7分)を行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、その後Not I消化（37℃で2時間）を行った。Qiaquick PCR Purification kit (キアゲン、カタログ番号28106)を用いて精製し、Oct3/4遺伝子を含むNot I断片をpSeV18+/TSΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV18+Oct3/4/TSΔFを得た。
【００７７】
（６）ヒト転写因子を搭載したセンダイウイルスベクターの作製
トランスフェクションの前日に６ウェルプレートに１ウェル当たり106細胞の293T/17細胞を播種し、37℃のCO2インキュベーター（5％CO2条件下）で培養した。その293T/17細胞にpCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-T7, pCAGGS-F5R (WO2005/071085) および上記で示したヒト転写因子を搭載したセンダイウイルスベクタープラスミド（pSeV18+c-Myc/TSΔFまたはpSeV18+Sox2/TSΔFまたはpSeV18+KLF4/TSΔFまたはpSeV18+Oct3/4/TSΔF）をそれぞれ0.5μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μg, 0.5μg および5.0μgを混合し、TransIT-LT1 (Mirus)を15μl使用してトランスフェクションを行った。37℃のCO2インキュベーターで２日間培養した。その後、センダイウイルスの融合タンパク質（Fタンパク質）を発現する細胞LLC-MK2/F/A (Li, H.-O. et al., J. Virology 74. 6564-6569 (2000), WO00/70070) を１ウェル当たり106細胞の割合でトランスフェクションを行った293T/17細胞に重層し、37℃のCO2インキュベーターで１日間培養した。翌日、細胞の培養液を除き、ペニシリンストレプトマイシンを添加したMEM培地（以下PS/MEM）1mlで細胞を１度洗浄し、2.5 μg/mlのトリプシンを含むPS/MEM培地（以下Try/PS/MEMとする）を１ウェル当たり1ml添加し、32℃のCO2インキュベーターで２日間培養した。３〜４日毎に培地交換を行いながら、場合によっては、LLC-MK2/F/A細胞で継代を行いながら培養を継続した。培養上清の一部を赤血球凝集分析によりベクター回収の有無を確認し、十分な赤血球凝集反応が得られた後に培養上清を回収した。回収した培養上清よりQIAamp Viral RNA Mini Kit （キアゲン カタログ番号52906）を用いてRNAを回収し、搭載した転写因子の領域を標的にRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物はシークエンスにより正しい塩基配列であることを確認し、下記（a）から（d）のベクターを作製できた。
（a）Oct3/4遺伝子を保持するF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（以下「SeV18+Oct3/4／TSΔFベクター」という。）
（b）Sox2遺伝子を保持するF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（以下「SeV18+ Sox2／TSΔFベクター」という。）
（c）Klf4遺伝子を保持するF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（以下「SeV18+ Klf4／TSΔFベクター」という。）
（d）c-Myc遺伝子を保持するF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（以下「SeV18+ c-Myc／TSΔFベクター」という。）
【００７８】
<実施例１>  外来遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターによるＥＳ様細胞の作製
先ず、ヒト新生児包皮由来線維芽細胞(BJ)( ATCC（http://www.atcc.org）, CRL-2522) （ヒト成人皮膚由来線維芽細胞HDF(Applications, Inc. 106-05A-1388; 36歳成人白人女性頬由来), ヒト胎児肺細胞由来線維芽細胞（MRC5；ATCC, CCL-171）8.0x 105（個）を DMEM (GIBCO-BRL, 11995), 10 % FBS (GIBCO-BRL) 中で一日37℃、0.5 %  CO2インキュベータにて培養した （DMEM (GIBCO-BRL, 11995), 10 % FBS (GIBCO-BRL)）。
培養後、MOI=3の濃度の下記（a）〜（d）のベクターを上記培養した細胞に投与した。
（a）SeV18+ Oct3/4／TSΔFベクター
（b）SeV18+ Sox2／TSΔFベクター
（c）SeV18+ Klf4／TSΔFベクター
（d）SeV18+ c-Myc／TSΔFベクター
上記ベクターを投与後、翌日に培地交換を行った（DMEM(GIBCO-BRL, 11995), 10 % FBS (GIBCO-BRL)）。
その後、７日〜８日間、37℃、0.5 % CO2インキュベータにて培養した。その後、ゼラチンコート10cm培養皿に用意したマイトマイシン処理済みフィーダー細胞(例えばMEF) 5.0×105（個）に対し、0.25 %トリプシンで剥がした上記導入細胞の5.0×104（個）から1.0×106（個）をその上で培養した。翌日、DMEM, 10 % FBSから霊長類ＥＳ用培地（ReproCell社, RCHEMD001）（4 ng/ml になるようbFGFを添加した）に培地交換し、3 % CO2インキュベータで培養した。培地交換は毎日もしくは二日に一度行った。培地はフィーダー細胞のコンディションドメディウムでも構わない。
コロニーは数日後から現れ、ほぼ２０日程度培養することで、ヒトＥＳ細胞様のコロニーが出現した（図１；BJ由来）。
図１の写真を見ると、誘導前の線維芽細胞(BJ)と明らかに異なる、ヒトＥＳ細胞に見られるのと同様の扁平なコロニーが見られた（実験医学 Vol.26, No.5 (増刊): pp. 35-40, 2008）。このコロニーは、ピックアップし、新しいフィーダー細胞上で培養し、ＥＳ細胞様剥離液で剥がし（トリプシン、コラゲナーゼ混合：ReproCell社、RCHETP002）継代し、増殖することが可能であった。
上記初期化実験により得られた細胞が、ＥＳ細胞の特徴である未分化マーカーを発現しているか否かを明らかにするために、更に下記実験を行った。
【００７９】
<実施例２>  上記初期化実験により得られた細胞についてのアルカリホスファターゼ染色
ＥＳ細胞の未分化マーカーであるアルカリホスファターゼの活性をNBCT/BCIP（PIERCE, NBT/BCIP, 1-Step, # 34042）にて染色すると、アルカリホスファターゼ陽性の青色に染まったコロニーが観察された（図2）。
【００８０】
<実施例３>  上記培養により得られた細胞の細胞内での特定遺伝子の発現量の検証
上記実施例２で示したアルカリホスファターゼ陽性の複数のコロニー（ALP(+）)をまとめてRNAを抽出した（図３(a)のALP(+））。ランダムプライマーにて逆転写反応を行い、それぞれのプライマーでPCRを行った（図３(a)）。プライマー配列は、Oct3/4については Fw：5'-GATCCTCGGACCTGGCTAAGC-3'（配列番号：25）および Rv：5'-GCTCCAGCTTCTCCTTCTCCAGC-3'（配列番号：26）、Sox2については Fw：5'-AGCGCTGCACATGAAGGAGCACC-3'（配列番号：27）および Rv：5'-ATGCGCTGGTTCACGCCCGCGCCCAGG-3'（配列番号：28）、KLF4については Fw：5'-GCTGCACACGACTTCCCCCTG-3'（配列番号：29）および Rv：5'-GGGGATGGAAGCCGGGAGGAAGCGG-3'（配列番号：30）、c-mycについては Fw：5'-TCTCAACGACAGCAGCTCGC-3'（配列番号：31）および Rv：5'-CAGGAGCCTGCCTCTTTTCCACAGA-3'（配列番号：32）、Nanogについては Fw：5'-TACCTCAGCCTCCAGCAGAT-3'（配列番号：33）および Rv：5'-TGCGTCACACCATTGCTATT-3'（配列番号：34）、β-アクチンについては Fw：5'-CAACCGCGAGAAGATGAC-3'（配列番号：35）および Rv：5'-AGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'（配列番号：36）を用いた。
また単一のＥＳ様細胞コロニーを単離し、上記と同様の方法によりRT-PCRを行った（図３(b)の4BJ-1iPS）。このとき、プライマー Fw: 5'-tgcccggacctccatcagagccag-3'（配列番号：37）および Rv: 5'-tcagtccaggatggtcttgaagtctg-3’（配列番号：38）を用いてhTERTの発現も検出した。
【００８１】
誘導前の線維芽細胞(BJ)では認められなかった導入遺伝子の発現が認められ（Oct3/4, Sox2, Klf4）、c-Mycの発現も増大していた。また、ＥＳ細胞のマーカーであるNanogの発現も、陽性コントロールである胎児性カルシノーマ細胞(NCCIT)のように発現誘導されていることが認められた（図３(a)のALP(+））。Nanogは新規に同定されたホメオドメインタンパク質（Cell, Vol. 113, 631-642, 2003）であり、ＥＳ細胞やＥＧ細胞などの多能性幹細胞や初期胚に特異的に発現し、多能性と自己複製能維持のシグナル伝達系に関与している。また単一コロニー由来の細胞においても、未分化ＥＳ細胞のマーカー遺伝子発現が認められ、また無限増殖能を示すテロメラーゼの活性化指標であるhTERTの発現が認められた（図３(b)の4BJ-1iPS）。以上の通り、単離したコロニーの細胞は多能性幹細胞であることが支持された。
【００８２】
<実施例４>  変異型c-Mycを用いた誘導性多能性幹細胞の作製
サイレント変異導入ヒト転写因子c-Myc（以下c-rMycとする）の作製
pBS-KS-c-Mycを鋳型にして、PrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A) を用いて変異導入用の６種類のプライマー（c-rMyc1-F（5'-CGGACGACGAGACCTTCATCAAGAACATCATCATCCAGGACTG-3' (配列番号：39)）、c-rMyc1-R（5'-CAGTCCTGGATGATGATGTTCTTGATGAAGGTCTCGTCGTCCG-3' (配列番号：40)）、c-rMyc2-F（5'-GAACGAGCTAAAACGGAGCTTCTTCGCCCTGCGTGACCAGATCC-3' (配列番号：41)）、c-rMyc2-R（5'-GGATCTGGTCACGCAGGGCGAAGAAGCTCCGTTTTAGCTCGTTC-3' (配列番号：42)）、c-rMyc3-F（5'-CCCAAGGTAGTTATCCTTAAGAAGGCCACAGCATACATCCTGTC-3' (配列番号：43)）およびc-rMyc3-R（5'-GACAGGATGTATGCTGTGGCCTTCTTAAGGATAACTACCTTGGG-3' (配列番号：44)））を入れ、PCR（94℃-3分→98℃-30秒、55℃-30秒、72℃-6分を25サイクル→72℃-7分）を行った。PCR産物をDpn Iで37℃、2時間処理した。この反応液5μl大腸菌DH5α（ToYoBo Code No. DNA-903）を用いてトランスフォーメーションを行った。１６個の大腸菌のコロニーをピックアップし、ミニプレップを行い、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pBS-KS-c-rMycを得た。pBS-KS-c-rMycをNot Iで消化（37℃で3時間）し、1％アガロースゲル電気泳動により分離し、約1.5k bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (キアゲン、カタログ番号28706) で精製した。このc-rMyc遺伝子を含むNot I断片をpSeV(HNL)/TSΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV(HNL)-c-rMyc/TSΔFを得た。c-rMycの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号：45および46に示した。c-rMycは、a378g、t1122c、t1125c、a1191g、および a1194gの変異を有する。
【００８３】
pSeV(HNL)/TSΔFの構築は以下の通りに行った。Litmus SalINheIfrg PmutMtsHNts ΔF-GFP（国際公開番号:WO2003/025570）を基にdel GFP-Pac F （5’-GAGGTCGCGCGTTAATTAAGCTTTCACCTCAAACAAGCACAGATCATGG-3’(配列番号：47)）およびdel GFP-Pac R (5’-GCATGTTTCCCAAGGGGAGAGTTAATTAACCAAGCACTCACAAGGGAC-3’(配列番号：48))でPCR（94℃-1分→94℃-30秒、55℃-1分、68℃-22分を30サイクル→68℃-7分）を行った。PCR産物をPac I処理、Dpn I処理を連続的に行い、その産物をライゲーション（セルフライゲーション）して、シークエンスを行い配列の正しいGFP遺伝子が除かれたプラスミドを選択し、Litmus SalINheIfrg PmutMtsHNts ΔF-GFP delGFPを得た。このLitmus SalINheIfrg PmutMtsHNts ΔF-GFP delGFPを鋳型にしてHNLNOTI-F：5’-GGGTGAATGGGAAGCGGCCGCTAGGTCATGGATGG-3’(配列番号：49) およびHNLNOTI-R：5’-CCATCCATGACCTAGCGGCCGCTTCCCATTCACCC-3’(配列番号：50) を用いてPCR（94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-12分を25サイクル→72℃-7分）を行った。PCR産物をDpn I処理後、この反応液20μlを大腸菌DH5α（ToYoBo Code No. DNA-903）を用いてトランスフォーメーションを行った。6個の大腸菌のコロニーをピックアップし、ミニプレップを行い、NotI消化によりNotI配列の導入されたプラスミドを選択し、次にシークエンスにより配列の正しいクローンを選択しLitmus SalINheIfrg PmutMtsHNts (HNL)-dFを得た。次にこのLitmus SalINheIfrg PmutMtsHNts (HNL)-dFをSal IおよびNheIで消化して回収したフラグメントとL遺伝子に二カ所の変異を有するプラスミドpSeV/ΔSalINheIfrg Lmut（国際公開番号:WO2003/025570）をSalI/NheIで消化して回収したフラグメントをライゲーションして、pSeV(HNL)/TSΔFを得た。このベクターは、SeV18+/TSΔFと同じウイルス蛋白質をコードし、HN遺伝子およびL遺伝子の間に導入遺伝子挿入部位（NotI部位）を有する。
【００８４】
c-rMycを搭載したセンダイウイルスベクター（SeV(HNL)-c-rMyc/TSΔFベクター）の回収
トランスフェクションの前日に６ウェルプレートに１ウェル当たり106細胞の293T/17細胞を播種し、37℃のCO2インキュベーター（5％CO2条件下）で培養した。その293T/17細胞にpCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-T7, pCAGGS-F5Rおよび上記で示したヒト転写因子c-rMycを搭載したセンダイウイルスベクタープラスミドpSeV(HNL)-c-rMyc/TSΔFをそれぞれ0.5μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μg, 0.5μgおよび5.0μgを混合し、TransIT-LT1 (Mirus) を15μl使用してトランスフェクションを行った。37℃のCO2インキュベーターで2日間培養した。その後、センダイウイルスの融合タンパク質（Fタンパク質）を発現する細胞LLC-MK2/F/Aを1ウェル当たり106細胞の割合でトランスフェクションを行った293T/17細胞に重層し、37℃のCO2インキュベーターで１日間培養した。翌日、細胞の培養液を除き、ペニシリンストレプトマイシンを添加したMEM培地（以下PS/MEM）1 mlで細胞を一度洗浄し、2.5μg/mlのトリプシンを含むPS/MEM培地（以下Try/PS/MEMとする）を１ウェル当たり1 ml添加し、32℃のCO2インキュベーターで２日間培養した。３〜４日毎に培地交換を行いながら、場合によっては、LLC-MK2/F/A細胞で継代を行いながら培養を継続した。培養上清の一部を赤血球凝集分析によりベクター回収の有無を確認し、十分な赤血球凝集反応が得られた後に培養上清を回収した。回収した培養上清よりQIAamp Viral RNA Mini Kit（キアゲン カタログ番号52906）を用いてRNAを回収し、搭載したc-rMycの領域を標的にRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物はシークエンスにより正しい塩基配列であることを確認し、SeV(HNL)-c-rMyc/TSΔFベクターを得た。
【００８５】
<実施例５>  初期化因子搭載センダイウイルスベクターによるiPS誘導効率
初期化因子搭載センダイウイルスベクターによるiPS誘導効率を表に示した。フィーダー細胞に載せるセンダイウイルス感染細胞数に対し、ＥＳ様コロニーの出現数を示している。実験は、ベクターとして上記のc-rMyc搭載ベクターも用いた以外は実施例１と同様に行った。初期化因子Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycのうち、ベクターのHNL部位に搭載した改変型c-Myc (c-rMyc) を用いた場合に最大のコロニー出現数が得られた。これはレトロウイルスベクターを用いた誘導効率に比べ約１０倍高い効率である。また、Myc無しの３因子でもセンダイウイルスベクターによるiPS誘導が可能であった。さらに、ヒト新生児包皮由来細胞（BJ）のみならず、ヒト成人皮膚由来細胞HDFからもセンダイウイルスベクターによりiPSの誘導がBJと類似の効率で可能であった。この結果は、本発明の方法が高効率でiPS細胞を誘導できる、従来に比較して簡易な方法であることを示している。
【表１】
2015164434.tif 000002
【００８６】
<実施例６>  iPS細胞のＥＳマーカー発現
初期化因子搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞のＥＳマーカーの発現を確認した。iPS細胞の誘導は、ベクターとして上記のc-rMyc搭載ベクターも用いた以外は実施例１と同様に行った。それぞれＥＳ細胞様コロニーをステムセルナイフ（日本医化器械）を用いて顕微鏡下で単離し、継代した。それぞれの株からRNAを抽出し、RT反応およびPCRを図３同様に行った。ＥＳ細胞マーカーであるOct3/4, NanogおよびTert, ほか８遺伝子: GDF3, TDGF1, Zfp42, Sal4F, Dmmt3b, CABRB3, CYP26A1, FoxD3（Adewumi, O. et al, Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25, 803-816, 2007）の発現および初期化因子Sox2, Klf4, c-Mycの発現をRT-PCRで確認した。方法は実施例３の通りである。５つすべてのクローンに於いて、すべてのマーカーの発現が確認された（図４）。
なお使用した各プライマーは以下の通りである。TERTについてはTERT F2847（TGCCCGGACCTCCATCAGAGCCAG (配列番号：37)）およびTERT R3399（TCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTCTG (配列番号：38)）、GDF3についてはGDF3 F（GGCGTCCGCGGGAATGTACTTC (配列番号：51)）およびGDF3 R（TGGCTTAGGGGTGGTCTGGCC (配列番号：52)、TDGF1についてはTDGF1-F1（ATGGACTGCAGGAAGATGGCCCGC (配列番号：53)）およびTDGF1-R567（TTAATAGTAGCTTTGTATAGAAAGGC (配列番号：54)）、Zfp42についてはZfp42-F1（ATGAGCCAGCAACTGAAGAAACGGGCAAAG (配列番号：55)）およびZfp42-R933（CTACTTTCCCTCTTGTTCATTCTTGTTCG (配列番号：56)）、Sall4についてはSall4 F（AAACCCCAGCACATCAACTC (配列番号：57)）およびSall4 R（GTCATTCCCTGGGTGGTTC (配列番号：58)）、Dmmt3bについてはDnmt3b F（GCAGCGACCAGTCCTCCGACT (配列番号：59)）およびDnmt3b R（AACGTGGGGAAGGCCTGTGC (配列番号：60)）、GABRB3についてはGABRB3 F（CTTGACAATCGAGTGGCTGA (配列番号：61)）およびGABRB3 R（TCATCCGTGGTGTAGCCATA (配列番号：62)）、CYP26A1についてはCYP26A1 F（AACCTGCACGACTCCTCGCACA (配列番号：63)）およびCYP26A1 R（AGGATGCGCATGGCGATTCG (配列番号：64)）、FOXD3についてはFoxD3-F418（GTGAAGCCGCCTTACTCGTAC (配列番号：65)）およびFoxD3-R770（CCGAAGCTCTGCATCATGAG (配列番号：66)）、SeV-Oct3/4についてはF6（ACAAGAGAAAAAACATGTATGG (配列番号：67)）およびOCT3/4 R259（GAGAGGTCTCCAAGCCGCCTTGG (配列番号：68)）、SeV-Sox2についてはSox2-F294（AGCGCTGCACATGAAGGAGCACC (配列番号：27)）およびR150（AATGTATCGAAGGTGCTCAA (配列番号：69)）、SeV-Klf4についてはF6（ACAAGAGAAAAAACATGTATGG (配列番号：67)）およびKIF4-R405（CGCGCTGGCAGGGCCGCTGCTCGAC (配列番号：70)）、SeV-c-MycについてはF6（ACAAGAGAAAAAACATGTATGG (配列番号：67)）およびc-rMyc406（TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG (配列番号：71)）、c-Myc/HNLについてはF8424（TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG (配列番号：72)）およびc-rMyc406（TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG (配列番号：71)）。
【００８７】
<実施例７>  iPS細胞のテロメラーゼ活性
初期化因子搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞の無限増殖能を確認するため、テロメラーゼ活性の測定を行った。iPS細胞の誘導は、ベクターとして上記のc-rMyc搭載ベクター(HNLと表記)も用いた以外は実施例１と同様に行った。テロメラーゼ活性の検出には、TRAPEZE（商標） Telomerase Detection Kit (CHEMICON Cat. No. S7700) を使用した。細胞を回収し、キットに付属の1X CAPS Lysis bufferを200μl添加し、ピペッティングにより懸濁した。氷上で30分間培養し、冷却微量遠心機にて４℃で12000rpm 20分間遠心を行った。上清160μlを別のエッペンドルフチューブに移し、この細胞溶解液のタンパク質濃度を測定した。アッセイを行う前に細胞溶解液の１μgタンパク質に相当する量をエッペンドルフチューブに採り、85℃で10分間熱処理を行った。熱処理を行ったサンプル、熱処理を行っていないサンプル１μgをTRAPアッセイに使用した。各アッセイ当たり、10X TRAP Reaction Buffer 5.0μL, 50X dNTP Mix 1.0μL, TS Primer 1.0μL, TRAP Primer Mix 1.0μL, H2O+細胞溶解液（1μgタンパク質）=40.6μL, Taq Polymerase 0.4μLの割合で反応液を調製し、PCR（30℃-30分、94℃-30秒、59℃-30秒、72℃-60秒を30サイクル）を行った。PCR反応液に6Xローディングダイを添加し、10%または12.5％のポリアクリルアミドゲルに20μLアプライし、電気泳動を行いエチジウムブロマイドにより染色を行った。
すべてのiPSクローンに於いてテロメラーゼ活性が認められ、対照である親株のBJ, HDFおよび熱処理後のiPS細胞では活性が認められなかった（図５）。
【００８８】
<実施例８>  iPS細胞の多分化能
初期化因子搭載センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞の多分化能を確認するため、in vitroの胚様体形成実験を行った。iPS細胞の誘導は実施例１と同様に行った。３つのiPSクローン4BJ1, B1（BJ由来）、および7H5（HDF由来）コロニーをコラゲナーゼIV (Invitrogen, 17104-019)でシャーレから剥がし、細胞塊をMPCコートのウェル(Nunc, 145383)に移しRPMI1640, 10 % FBSにて数日間浮遊培養を行い、胚様体の形成を顕微鏡下で確認した。センダイウイルスベクター誘導iPSは分化能を持っており、いずれのiPSも胚様体を形成し、７日目ではさらに分化の進んだ、多数の嚢胞状の胚様体が認められた（図６）。
【００８９】
センダイウイルスベクターにより誘導されたiPS細胞（SeV-iPS）の三胚葉への多分化能をさらに示すため、in vitroにて心筋細胞（中胚葉）、ドーパミン産生ニューロン（外胚葉）、膵細胞（内胚葉）への分化誘導を確認した。SeV-iPSのうちSeVベクターが除去されたクローンを1 mg/mlコラゲナーゼIVでfeeder細胞から剥離し、心筋細胞誘導の場合は、NPCコートプレート上で0.1 mMビタミンC存在下、DMEM, 20 % FBSにて６日間浮遊培養し、胚様体形成の後、0.1 %ゼラチンコートプレート上に移し1週間培養すると、拍動する心筋が得られた (Takahashi, T. et.al., Circulation 107, 1912-1916, 2003)。ドーパミン産生ニューロンの場合は、同様にiPS細胞を分離後、0.1 %ゼラチンコートプレート上のコンフルエントなPA6フィーダー細胞 (RIKEN BRC) 上に播種し、2 mM L-グルタミンと非必須アミノ酸と2-メルカプトエタノールを終濃度1 x 10-4 M加えた10 % KSR, GMEM培地 (Invitrogen) にて16日間培養し、10 %ホルマリン溶液で細胞を固定後、抗βIII tubulin抗体 (SantaCruz; 2G10) 染色と抗Tyrosine Hydroxilase抗体（Chemicon; P07101）染色でドーパミン産生ニューロンであることを確認した (Kawasaki, H. et al., Neuron 28, 31-40 (2000))。膵臓細胞の場合は、MMC処理MEF feeder細胞上でSeV-iPS細胞をRPMI1640, 2 % FBS培地、100 ng/mlアクチビンA (R&D Systems) 存在下で４日間培養し、さらにN2とB27 supplements、2 mM L-グルタミン、非必須アミノ酸、2-メルカプトエタノール 1 x 10-4 Mと0.5 mg/mlのBSA (Invitrogen) を加えたDMEM/F12培地で８日間培養を行った。10 %ホルマリン溶液で固定した細胞は、抗PDX抗体 (R&D Systems; AF2419)、抗SOX17抗体 (R&D Systems; 245013) 染色でそれぞれ膵β細胞と内胚葉系細胞を確認した (D’Amour, K.A. et al., Nat. Biotechnol. 23, 1534-1541 (2005))。(図７)
【００９０】
またin vitroでの多分化能は免疫不全マウスへのテラトーマ形成で確認を行った。SeV-iPS細胞はSCIDマウス皮下に接種し、約１ヶ月後に腫瘤形成を確認し、約2ヶ月後に検体を回収し、10 %ホルマリン固定後、パラフィン包埋し、組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色を行い、三胚葉分化を確認した。(図８)
【００９１】
<実施例９>  iPS細胞のプロモーター解析
ES細胞で発現する遺伝子プロモーターOct3/4とNanogのiPS細胞における活性化状況について、以下のバイサルファイトシークエンス法によりメチル化解析を行った。その結果、対照の親株BJおよびHDFではOct3/4プロモーター (-2330〜-2110領域) およびNanogプロモーター (-685〜-120領域) のメチル化が多く認められたが、SeV-iPS細胞の各クローンに於いては、多くの脱メチル化が認められ、SeV-iPS細胞はES細胞同様にOct3/4とNanogプロモーターの活性化が起きている事が明らかになった (図９)。
【００９２】
（バイサルファイトシークエンス法）
iPS細胞よりQIAamp DNA Mini Kit (50)（キアゲン、カタログ番号：51304）を用いて、キットのプロトコールに従いゲノムDNAを抽出した。次に、抽出したゲノムDNA 1μgを基にしてBisulFast DNA Modification Kit for Methylated DNA Detection（東洋紡、カタログ番号：MDD-101）を用いて、キットのプロトコールに従いバイサルファイト修飾を行った。バイサルファイト修飾ゲノムDNAを鋳型としてOct3/4遺伝子、Nanog遺伝子のプロモーター領域を標的として特異的プライマーを用いてPCRを行った。PCR産物をアガロースゲル電気泳動にて分離し、目的バンドをQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン、カタログ番号：28704）にて精製した。精製したPCR産物は、pGEM-T Easy Vector System I（プロメガ、カタログ番号：A1360）を用いて、キットのプロトコールに従い、TA-クローニングを行った。次に、Oct3/4遺伝子、Nanog遺伝子のプロモーター領域を標的とした特異的プライマーを用いてコロニーPCRを行った。アガロースゲル電気泳動を行いバンドサイズの正しいクローンを約10クローン選択した。そのクローンについて、ミニプレップによりプラスミドDNAを抽出し、T7プライマー、SP6プライマーを用いてシークエンスを行った。バイサルファイト修飾後の標的配列との比較を行いプロモーター領域のメチル化状態を評価した。
【００９３】
Oct3/4遺伝子プロモーター領域増幅用およびコロニーPCR用プライマー（J. Biol. Chem., 2005, Vol. 280, 6257-6260）
mOct4-5F: 5’-AATAGATTTTGAAGGGGAGTTTAGG-3’（配列番号：73）
mOct4-5R: 5’-TTCCTCCTTCCTCTAAAAAACTCA-3’（配列番号：74）
Nanog遺伝子プロモーター領域増幅用およびコロニーPCR用プライマー（Stem cell Research, Vol. 1, 105-115; Cell, 2007, Vol. 131, 861-72）
Nanog-z1-L: 5’-GGAATTTAAGGTGTATGTATTTTTTATTTT-3’（配列番号：75）
mehNANOG-F1-AS: 5’-AACCCACCCTTATAAATTCTCAATTA-3’（配列番号：76）
シークエンス用のプライマー
T7: 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’（配列番号：77）
SP6: 5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’（配列番号：78）
使用キット
バイサルファストディ-エヌエ-モディフィケーションキットフォーメチレイテットディーエヌエーディテクション
BisulFast DNA Modification Kit for Methylated DNA Detection
（東洋紡、カタログ番号：MDD-101）
【００９４】
<実施例１０>  iPS細胞の遺伝子発現解析
センダイウイルスベクターにより誘導したiPS細胞（SeV-iPS細胞）の遺伝子発現プロファイルを親株BJ細胞、ヒトES細胞および、すでに樹立されたヒトiPS細胞 (GSM241846; Takahashi, K. et al., Cell, 131, 1-12, 2007) と比較した。SeV-iPSとBJ細胞のトータルRNAはRNeasy Mini Kit (Qiagen) を用いて抽出し、Agilent社Quick Amp Labeling Kitを用いてcDNAからCyanine色素標識cRNAを合成し、Agilent社Gene Expression Hybridization Kitを用いてWhole Human Genome Oligo Microarray (4 x 44K) 上で１７時間ハイブリダイズし、洗浄後、Agilent Microarray Scanner でDNAマイクロアレイのイメージを読み取り、Feature Extraction Software (v.9.5.3.1) にて各スポットの蛍光シグナルを数値化し、解析を行った。チップの総probe数は重複を除き、41078 probeを解析対象として行った（バイオマトリックス研究所）。対照の遺伝子発現情報はGEO DetaSetsから取得しSeV-iPS細胞の遺伝子発現と比較した：ヒトES細胞hES-H9 (GSM194390; Teser P. J., et al, Nature 448, 196-199, 2007)、およびヒトiPS細胞はHDFより誘導されたhiPS (GSM241846; Takahashi, K. et al., Cell, 131, 1-12, 2007)。その結果、SeV-iPSとBJとはr=8732, ヒトES細胞とはr=0.9658、ヒトiPS細胞とはr=0.9580の相関があり、ES細胞に発現するNanog, Sox2, Oct3/4遺伝子はSeV-iPSに発現し、BJとは非相関していたが、SeV-iPSとそれぞれヒトES細胞もしくはヒトiPS細胞とは相関線上にあり、完全に一致していた（図９）。
【００９５】
<実施例１１>  温度依存不活化変異導入ベクターの作製
(ベクターの作製方法)
温度依存不活化変異導入センダイウイルスベクター作製用プラスミドの構築
Litmus SalINheIfrg PmutMtsHNts ΔF-GFP（WO2003/025570）を基にL Y942H-F（5’- CAAATGTTGGAGGATTCAACCACATGTCTACATCTAGATG-3’(配列番号：79)）、L Y942H-R (5’- CATCTAGATGTAGACATGTGGTTGAATCCTCCAACATTTG-3’(配列番号：80))の組み合わせ、およびL Y942H-F、L Y942H-R、P2-F（5'- CATCACAGCTGCAGGTGGCGCGACTGACAAC -3' (配列番号：81)）、P2-R（5’- GTTGTCAGTCGCGCCACCTGCAGCTGTGATG -3’ (配列番号：82)）の組み合わせでPCR（94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-11分を25サイクル→72℃-7分）を行った。PCR産物をDpn Iで37℃で1時間消化し、この反応液20μlを大腸菌DH5α（ToYoBo Code No. DNA-903）を用いてトランスフォーメーションを行った。出てきたコロニーを拾って、ミニプレップ後、シークエンスを行い配列の正しいクローンを選択し、それぞれLitmus38TSΔF-GFP-LY942HおよびLitmus38TSΔF-GFP-P2LY942Hを得た。
【００９６】
Litmus38TSΔF-GFP-P2LY942HをStuI消化後、アガロースゲル電気泳動にて分離し、1.9kbpのバンドを切り出し精製した。Litmus SalINheIfrg PmutMtsHNts ΔF-GFPをStuI消化後、アガロースゲル電気泳動にて分離し、9.8kbpのバンドを切り出し精製した。これら精製した2つの断片をライゲーションし、Litmus38TSΔF-GFP-P2を得た。
【００９７】
Litmus38TSΔF-GFP-P2LY942HをNcoI消化後、アガロースゲル電気泳動にて分離し、7.1kbpのバンドを切り出し精製した。Litmus SalINheIfrg PmutMtsHNts ΔF-GFP delGFPをNcoI消化後、アガロースゲル電気泳動で分離し、3.7kbpのバンドを切り出し、精製した。これらの精製したバンドを用いてライゲーションを行いコロニーPCRおよびNcoI-PacI二重消化にて構造を確認し、Litmus38TSΔF-P2LY942HΔGFPを得た。
【００９８】
pSeV(HNL)/TSΔFをNcoI消化後、アガロースゲル電気泳動にて分離し、3.7kbpのバンドを切り出し、精製した。このバンドと上記、Litmus38TSΔF-GFP-P2LY942Hの7.1kbpのNcoI断片とライゲーションし、Litmus38TSΔF-P2LY942H(HNL)ΔGFPを得た。
【００９９】
Litmus38TSΔF-GFP-P2をNcoI消化後、アガロースゲル電気泳動にて分離し、7.1kbpのバンドを切り出し、精製した。このバンドと上記のLitmus SalINheIfrg PmutMtsHNts ΔF-GFP delGFPの NcoI消化精製断片（3.7kbp）またはpSeV(HNL)/TSΔFのNcoI消化精製断片（3.7kbp）、をライゲーションし、それぞれLitmus38TSΔF-P2ΔGFP、Litmus38TSΔF-P2(HNL)ΔGFPを得た。
【０１００】
pSeV/ΔSalINheIfrg Lmut（WO2003/025570）を鋳型として、L L1361C-F（5’- GGTTCCTTAGGGAAGCCATGTATATTGCACTTACATCTTA -3’(配列番号：83)）およびL L1361C-R (5’- TAAGATGTAAGTGCAATATACATGGCTTCCCTAAGGAACC -3’(配列番号：84))の組み合わせ、L L1558I-F（5’- CCTGTGTATGGGCCTAACATCTCAAATCAGGATAAGATAC -3’(配列番号：85)）およびL L1558I-R (5’- GTATCTTATCCTGATTTGAGATGTTAGGCCCATACACAGG -3’(配列番号：86))の組み合わせ、そして、L L1361C-F、 L L1361C-R、 L L1558I-FおよびL L1558I-Rの組み合わせ、でPCR（94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-9分を25サイクル→72℃-7分）を行った。PCR産物をDpn Iで37℃で1時間消化し、この反応液20μlを大腸菌DH5α（ToYoBo Code No. DNA-903）を用いてトランスフォーメーションを行った。出てきたコロニーを拾って、ミニプレップ後、シークエンスを行い配列の正しいクローンを選択し、それぞれpSeV/TSΔF-Linker L1361C、pSeV/TSΔF-Linker L1558I、pSeV/TSΔF-Linker L1361CL1558Iを得た。
【０１０１】
Litmus38TSΔF-P2LY942H(HNL)ΔGFPおよびpSeV/TSΔF-Linker L1361CL1558IをそれぞれSalI-NheI消化後、アガロースゲル電気泳動により分離し、それぞれ8.0kbp、8.3kbpのバンドを切り出し精製した。これらの精製断片のライゲーションを行いpSeV(HNL)/TS8ΔFを得た。
【０１０２】
pSeV(HNL)/TS8ΔFおよびpSeV(HNL)/TSΔFをNotI-XhoI消化後、アガロースゲル電気泳動により分離し、それぞれ4.9kbp、11.4kbpのバンドを切り出し精製した。これらの精製断片のライゲーションを行いpSeV(HNL)/TS7ΔFを得た。pSeV(HNL)/TS7ΔFベクターのNot Iサイトに、pBS-KS-c-rMycより NotI消化により、切り出し、精製したc-rMyc遺伝子を含むNot I断片を導入し、pSeV(HNL)-c-rMyc/TS7ΔFを得た。
【０１０３】
Litmus38TSΔF-P2LY942HΔGFPおよびpSeV/TSΔF-Linker L1361CL1558IをそれぞれSalI-NheI消化後、アガロースゲル電気泳動により分離し、それぞれ8.0kbp、8.3kbpのバンドを切り出し精製した。これらの精製断片のライゲーションを行いpSeV18+BSSHII/TS8ΔFを得た。このpSeV18+BSSHII/TS8ΔFおよびpSeV18+Oct3/4/TSΔFをそれぞれAatII-SphIで消化し、15.2kbpおよび2.3kbpのバンドを切り出し精製した。これらの精製断片のライゲーションを行いpSeV18+Oct3/4/TS8ΔFを得た。pSeV18+Oct3/4/TS8ΔFおよびpSeV18+/TSΔFをそれぞれPacI-SphI消化後、アガロースゲル電気泳動により分離し、それぞれ13.3kbp、4.2kbpのバンドを切り出し精製した。これらの精製断片のライゲーションを行いpSeV18+Oct3/4/TS7ΔFを得た。次にpSeV18+Oct3/4/TS7ΔFをNotI消化し、アガロースゲル電気泳動により分離後、16.4kbpのバンドを切り出し精製した。この精製物と前出のpBS-KS-Sox2、pBS-KS-KLF4、pBS-KS-c-rMycよりNotI消化により、切り出し、精製したSox2、KLF4、c-rMyc遺伝子を含むNot I断片をそれぞれライゲーションし、pSeV18+Sox2/TS7ΔF、pSeV18+KLF4/TS7ΔF、pSeV18+c-rMyc/TS7ΔFを得た。
【０１０４】
Litmus38TSΔF-P2(HNL)ΔGFPおよびpSeV/TSΔF-Linker L1361CをそれぞれSalI-NheI消化後、アガロースゲル電気泳動により分離し、それぞれ8.0kbp、8.3kbpのバンドを切り出し精製した。これらの精製断片のライゲーションを行いpSeV(HNL)/TS14ΔFを得た。このpSeV(HNL)/TS14ΔFのNot IサイトにpBS-KS-c-rMycより NotI消化により、切り出し、精製したc-rMyc遺伝子を含むNot I断片を導入し、pSeV(HNL)-c-rMyc/TS14ΔFを得た。
【０１０５】
Litmus38TSΔF-P2(HNL)ΔGFPおよびpSeV/TSΔF-Linker L1558IをそれぞれSalI-NheI消化後、アガロースゲル電気泳動により分離し、それぞれ8.0kbp、8.3kbpのバンドを切り出し精製した。これらの精製断片のライゲーションを行いpSeV(HNL)/TS13ΔFを得た。このpSeV(HNL)/TS13ΔFのNot IサイトにpBS-KS-c-rMycより NotI消化により、切り出し、精製したc-rMyc遺伝子を含むNot I断片を導入し、pSeV(HNL)-c-rMyc/TS13ΔFを得た。
【０１０６】
Litmus38TSΔF-P2(HNL)ΔGFPおよびpSeV/TSΔF-Linker L1361CL1558IをそれぞれSalI-NheI消化後、アガロースゲル電気泳動により分離し、それぞれ8.0kbp、8.3kbpのバンドを切り出し精製した。これらの精製断片のライゲーションを行いpSeV(HNL)/TS15ΔFを得た。このpSeV(HNL)/TS15ΔFのNot IサイトにpBS-KS-c-rMycより NotI消化により、切り出し、精製したc-rMyc遺伝子を含むNot I断片を導入し、pSeV(HNL)-c-rMyc/TS15ΔFを得た。
【０１０７】
Litmus38TSΔF-P2ΔGFPおよびpSeV/TSΔF-Linker L1361CをそれぞれSalI-NheI消化後、アガロースゲル電気泳動により分離し、それぞれ8.0kbp、8.3kbpのバンドを切り出し精製した。これらの精製断片のライゲーションを行いpSeV18+BSSHII/TS14ΔFを得た。このpSeV18+BSSHII/TS14ΔF AatII-SphIで消化し、15.2kbpのバンドを切り出し精製した。この精製断片と前出のpSeV18+Oct3/4/TSΔFのAatII-SphI断片（2.3kbp）をライゲーションし、pSeV18+Oct3/4/TS14ΔFを得た。次にpSeV18+Oct3/4/TS14ΔFをNotI消化し、アガロースゲル電気泳動により分離後、16.4kbpのバンドを切り出し精製した。この精製物と前出のpBS-KS-Sox2、pBS-KS-KLF4、pBS-KS-c-rMycよりNotI消化により、切り出し、精製したSox2、KLF4、c-rMyc遺伝子を含むNot I断片をそれぞれライゲーションし、pSeV18+Sox2/TS14ΔF、pSeV18+KLF4/TS14ΔF、 pSeV18+c-rMyc/TS14ΔFを得た。
【０１０８】
Litmus38TSΔF-P2ΔGFPおよびpSeV/TSΔF-Linker L1558IをそれぞれSalI-NheI消化後、アガロースゲル電気泳動により分離し、それぞれ8.0kbp、8.3kbpのバンドを切り出し精製した。これらの精製断片のライゲーションを行いpSeV18+BSSHII/TS13ΔFを得た。このpSeV18+BSSHII/TS13ΔF AatII-SphIで消化し、15.2kbpのバンドを切り出し精製した。この精製断片と前出のpSeV18+Oct3/4/TSΔFのAatII-SphI断片（2.3kbp）をライゲーションし、pSeV18+Oct3/4/TS13ΔFを得た。次にpSeV18+Oct3/4/TS13ΔFをNotI消化し、アガロースゲル電気泳動により分離後、16.4kbpのバンドを切り出し精製した。この精製物と前出のSox2、KLF4、c-rMyc遺伝子を含むNot I断片をそれぞれライゲーションし、pSeV18+Sox2/TS13ΔF、pSeV18+KLF4/TS13ΔF、 pSeV18+c-rMyc/TS13ΔFを得た。
【０１０９】
Litmus38TSΔF-P2ΔGFPおよびpSeV/TSΔF-Linker L1361CL1558IをそれぞれSalI-NheI消化後、アガロースゲル電気泳動により分離し、それぞれ8.0kbp、8.3kbpのバンドを切り出し精製した。これらの精製断片のライゲーションを行いpSeV18+BSSHII/TS15ΔFを得た。このpSeV18+BSSHII/TS15ΔF AatII-SphIで消化し、15.2kbpのバンドを切り出し精製した。この精製断片と前出のpSeV18+Oct3/4/TSΔFのAatII-SphI断片（2.3kbp）をライゲーションし、pSeV18+Oct3/4/TS15ΔFを得た。次にpSeV18+Oct3/4/TS15ΔFをNotI消化し、アガロースゲル電気泳動により分離後、16.4kbpのバンドを切り出し精製した。この精製物と前出のSox2、KLF4、c-rMyc遺伝子を含むNot I断片をそれぞれライゲーションし、pSeV18+Sox2/TS15ΔF、pSeV18+KLF4/TS15ΔF、 pSeV18+c-rMyc/TS15ΔFを得た。
Litmus38TSΔF-P2(HNL)ΔGFPおよびpSeV/ΔSalINheIfrg LmutをそれぞれSalI-NheI消化後、アガロースゲル電気泳動により分離し、それぞれ8.0kbp、8.3kbpのバンドを切り出し精製した。これらの精製断片のライゲーションを行いpSeV(HNL)/TS12ΔFを得た。このpSeV(HNL)/TS12ΔFのNot IサイトにpBS-KS-c-rMycより NotI消化により、切り出し、精製したc-rMyc遺伝子を含むNot I断片を導入し、pSeV(HNL)-c-rMyc/TS12ΔFを得た。
【０１１０】
Litmus38TSΔF-P2ΔGFPおよびpSeV/ΔSalINheIfrg LmutをそれぞれSalI-NheI消化後、アガロースゲル電気泳動により分離し、それぞれ8.0kbp、8.3kbpのバンドを切り出し精製した。これらの精製断片のライゲーションを行いpSeV18+BSSHII/TS12ΔFを得た。このpSeV18+BSSHII/TS12ΔF AatII-SphIで消化し、15.2kbpのバンドを切り出し精製した。この精製断片と前出のpSeV18+Oct3/4/TSΔFのAatII-SphI断片（2.3kbp）をライゲーションし、pSeV18+Oct3/4/TS12ΔFを得た。次にpSeV18+Oct3/4/TS12ΔFをNotI消化し、アガロースゲル電気泳動により分離後、16.4kbpのバンドを切り出し精製した。この精製物と前出のSox2、KLF4、c-rMyc遺伝子を含むNot I断片をそれぞれライゲーションし、pSeV18+Sox2/TS12ΔF、pSeV18+KLF4/TS12ΔF、pSeV18+c-rMyc/TS12ΔFを得た。
【０１１１】
(温度依存不活化変異導入F遺伝子欠失型センダイウイルスベクターの回収)
トランスフェクションの前日に6ウェルプレートに1ウェル当たり106細胞の293T/17細胞を播種し、37℃のCO2インキュベーター（5％CO2条件下）で培養した。その293T/17細胞にpCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-T7, pCAGGS-F5R (WO2005/071085) および上記で示したヒト転写因子を搭載した温度依存不活化変異導入F遺伝子欠失型センダイウイルスベクタープラスミドをそれぞれ0.5μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μgおよび5.0μgを混合し、TransIT-LT1 (Mirus) を15μl使用してトランスフェクションを行った。37℃のCO2インキュベーターで2から3日間培養した。その後、センダイウイルスの融合タンパク質（Fタンパク質）を発現する細胞LLC-MK2/F/Aを1ウェル当たり106細胞の割合でトランスフェクションを行った293T/17細胞に重層し、37℃のCO2インキュベーターで1日間培養した。翌日、細胞の培養液を除き、ペニシリンストレプトマイシンを添加したMEM培地（以下PS/MEM）1mlで細胞を1度洗浄し、2.5μg/mlのトリプシンを含むPS/MEM培地（以下Try/PS/MEMとする）を1ウェル当たり1ml添加し、32℃のCO2インキュベーターで培養した。3〜4日毎に培地交換を行いながら、場合によっては、LLC-MK2/F/A細胞で継代を行いながら培養を継続した。培養上清の一部を赤血球凝集分析によりベクター回収の有無を確認し、十分な赤血球凝集反応が得られた後に培養上清を回収した。回収した培養上清よりQIAamp Viral RNA Mini Kit （キアゲン カタログ番号52906）を用いてRNAを回収し、搭載した遺伝子の領域を標的にRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物はシークエンスにより正しい塩基配列であることを確認し、各種ヒト転写因子を搭載した温度依存不活化変異導入F遺伝子欠失型センダイウイルスベクターを得た。
【０１１２】
<実施例１２>  ベクターの除去
SeV-iPS細胞からSeVベクターが自然除去するコロニーが得られた。また温度感受性ベクターを使ってiPSを37℃で誘導したのち39℃に温度シフトするとセンダイウイルス陰性クローンが得られた。さらに、SeVに感染する事で細胞表面に発現するHN抗原を指標にし、抗HN抗体でネガティブセレクションすることで、SeVネガティブなクローンが得られた。
【０１１３】
１．自然脱落
SeV-iPS細胞を継代培養するとベクターが自然に除去された細胞が増えていった。SeV-iPS細胞コロニーからRNAを抽出し、RT-PCRを行い、SeV由来の外来遺伝子発現を確認すると、18+の位置（ゲノムの最も3'側であるNP遺伝子の3'側）にSeV-Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc (c-rMycおよびc-Myc) を挿入した場合（それぞれSeV18+Oct3/4／TSΔF、SeV18+Sox2／TSΔF、SeV18+Klf4／TSΔF、SeV18+c-Myc／TSΔF (またはSeV18+c-rMyc／TSΔF)）、外来遺伝子は細胞分裂に伴い希釈され、これらのうち１種類もしくは２種類の発現に減っていくことが多く、野生型c-Mycは複製の劣位から一番最初に除去された。またHNLの位置にc-rMycを挿入した場合（HNL-c-rMyc／TSΔF）は、18+の位置に目的因子を挿入したベクターに対する複製優位性から、Myc遺伝子を搭載したベクターのみ残存することが多く、さらに導入された外来性初期化因子がすべて完全に除去されたクローンも得られた。RT-PCRのみならず、蛋白レベルでも完全に除去されていることが抗SeV-NP抗体によるウェスタンブロットで示された（図１０）。RT-PCRのプライマーは実施例６に示した通りである。
【０１１４】
２．抗HN抗体による除去
SeVベクターは細胞分裂による希釈と継代により、自然に減少していくが、積極的にSeVベクターネガティブ細胞を集めることも可能である。SeVに感染する事で細胞表面に発現するHN抗原を指標にし、抗HN抗体によりSeVベクターの除去クローンが取得可能である。コラゲナーゼIVとトリプシン処理、懸濁操作により小さな細胞集団にした細胞に、抗HNモノクローナル抗体(IL4.1)を氷上で３０分間反応させ、培地で洗浄後、２次抗体として例えばマグネットビーズに結合した抗マウスIgG1抗体（Anti-Mouse IgG1 Particles, BD）を同様に氷上で３０分間反応させ、磁石 (IMagnet Cell Separation Magnet, BD) に非結合画分を集めた（ネガティブセレクション）。その結果、SeVベクターの発現が減弱した細胞集団が得られ、同操作を繰り返すことによりベクターネガティブなiPS細胞が得られた（図１１）。またFACSにより抗HN抗体陰性集団を集める事も可能である。
【０１１５】
３．温度感受性ベクターによるSeV除去技術
TS 7：L (Y942H/L1361C/L1558I)
TS 13：P(D433A/R434A/K437A), L(L1558I)
TS 14：P(D433A/R434A/K437A), L(L1361C)
TS 15：P(D433A/R434A/K437A), L(L1361C/L1558I)
これらの変異をSeV18+/TSΔFベクターに導入した。これらのベクターは温度感受性であり、温度シフトにより複製が阻害される。すなわち、搭載された遺伝子は３２℃で最も高く発現し、３５〜３６℃でも発現し、３７℃で発現がやや弱く、３８．５℃もしくは３９℃で発現しない。
これらのベクターに初期化因子を同様（以前の記述）に搭載し、３７℃でiPSを誘導し、iPS細胞が作製された後に温度シフトを行い、容易にSeVの除去を行うことができた。
【０１１６】
４．HNL-Myc複製優位性
１で示した通り、SeV-18+Oct3/4, Klf4, Sox2とSeV-HNL-c-rMycの組合せでiPS誘導を行った場合、c-rMyc遺伝子がHNとLの間に挿入されているSeV-HNL-c-rMycが、18+の位置（NP遺伝子の上流）に挿入した他の因子をもつSeVベクターに対して複製に有利であり、かつc-Mycが細胞増殖に有利であるという性質から、SeVに搭載した４因子のうちSeV-HNL-c-rMycだけが最後に残存した。またSeV-HNL-c-rMycで誘導したSeV-iPS細胞は、増殖能が優れているためクローンとして樹立しやすく、かつ最後に残ったベクターは１つだけであり、それも自然除去されやすかった。従って、温度感受性株を使った温度シフトによる除去を行うためには、HNL-c-rMycだけを温度感受性にすればよく、実際、最後に残ったHNL-c-rMycベクターは、温度シフトによって除去することができた（図１２、１３）。
【０１１７】
５．温度感受性SeVベクターによるベクター除去容易なiPS細胞の作製
上記TS7、TS13もしくはTS15のHN-Lの間にc-rMyc遺伝子を挿入したベクター（TS7ΔF、TS13ΔF、TS15ΔF）と、18+の位置にOct3/4, Klf4, Sox2をそれぞれ挿入したTSベクターを用いて線維芽細胞（BJ細胞）よりiPS誘導を行うと、上述のSeV-HNL-Myc複製優位により、温度感受性のSeV-HNL-Mycだけが残る。また温度感受性株は３７℃での発現が弱いために、SeV-HNL-Mycだけになった場合、速やかに残存する最後のベクターも除去される。
このようにしてiPS誘導を行うと、TS/18+ Oct3/4, Sox2, Klf4／TSΔFと、TS13ΔF/HNL-c-rMycの組合せの場合、4/6クローンが、またTS15ΔF/HNL-c-rMycの組合せの場合、3/6のクローンが、TS7ΔF/HNL-c-rMycの場合、2/12のクローンが、誘導後１ヶ月以内にSeVベクター陰性となった（図１３）。得られたSeV陰性クローンはすべてヒトES細胞特異的マーカーを発現していた（図１４）。
この方法により、容易に染色体を傷つけず、かつSeV陰性な、無傷のiPS細胞を得る事が出来た。
【０１１８】
<実施例１３>
上記TS ΔFベクター以外にも、実施例１２の５にてTS7ΔF、TS13ΔF、TS15ΔFに初期化因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)を載せてiPS細胞の誘導が可能であったが、別のΔFベクターバックボーンL変異体Y1214F（WO2008/096811）を用いても、同様にiPS細胞を誘導できることを以下のように確認した。
(LmΔF/SeVの構築)
プラスミド構築
pSeV18+LacZ/ΔF-1214（WO2008/096811）をNotIで消化後、精製した。そして、ライゲーションを行いLacZ遺伝子の入っていないプラスミドを選択し、pSeV18+/ΔF-1214を得た（「Lm(Y1214F) ΔF/SeV」または単に「LmΔF/SeV」とも表記する）。次にpSeV18+/ΔF-1214をNotIで消化後精製し、前出の初期化４因子Oct3/4, Klf4, Sox2およびc-rMycのNotI断片をそれぞれ搭載し、ウイルスベクター作成用のプラスミドpSeV18+Oct3/4/ΔF-1214、pSeV18+Sox2/ΔF-1214、pSeV18+KLF4/ΔF-1214、pSeV18+c-rMyc/ΔF-1214を構築した。
【０１１９】
LmΔF/SeVセンダイウイルスベクターの回収
トランスフェクションの前日に6ウェルプレートに1ウェル当たり106細胞の293T/17細胞を播種し、37℃のCO2インキュベーター（5％CO2条件下）で培養した。その293T/17細胞にpCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-T7, pCAGGS-F5R (WO2005/071085)および上記で示したヒト転写因子を搭載したLmΔF/SeVセンダイウイルスベクタープラスミドをそれぞれ0.5μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μgおよび5.0μgを混合し、TransIT-LT1 (Mirus)を15μl使用してトランスフェクションを行った。37℃のCO2インキュベーターで2から3日間培養した。その後、センダイウイルスの融合タンパク質（Fタンパク質）を発現する細胞LLC-MK2/F/Aを1ウェル当たり106細胞の割合でトランスフェクションを行った293T/17細胞に重層し、37℃のCO2インキュベーターで1日間培養した。翌日、細胞の培養液を除き、ペニシリンストレプトマイシンを添加したMEM培地（以下PS/MEM）1 mlで細胞を1度洗浄し、2.5μg/mlのトリプシンを含むPS/MEM培地（以下Try/PS/MEMとする）を1ウェル当たり1ml添加し、32℃のCO2インキュベーターで培養した。3〜4日毎に培地交換を行いながら、場合によっては、LLC-MK2/F/A細胞で継代を行いながら培養を継続した。培養上清の一部を赤血球凝集分析によりベクター回収の有無を確認し、十分な赤血球凝集反応が得られた後に培養上清を回収した。回収した培養上清よりQIAamp Viral RNA Mini Kit （キアゲン カタログ番号52906）を用いてRNAを回収し、搭載した遺伝子の領域を標的にRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物はシークエンスにより正しい塩基配列であることを確認し、各種ヒト転写因子を搭載したLmΔF/SeVセンダイウイルスベクターを得た。
【０１２０】
LmΔF/SeVに初期化４因子Oct3/4, Klf4, Sox2およびc-rMyc（TSΔF）を同様に18+の位置に搭載し、ウイルスベクターを作製した。
ヒト線維芽細胞BJに４因子搭載LmΔF/SeVを感染させ、TSΔF SeVベクターと同様にiPS誘導を行った結果、TSΔF/SeVを用いた場合と同様、iPS様コロニーが出現し、ESマーカーであるALPを発現していた（図１５A）。このことは、ひとつのベクターに限らずセンダイウイルスベクターの他の骨格でもiPS誘導可能であることを示す。
【０１２１】
<実施例１４>  フィーダーフリーのiPS誘導法
センダイウイルスベクターによる初期化因子発現が高いため、従来のフィーダー細胞上で誘導する方法だけでなく、フィーダーフリーでも誘導可能である。初期化因子搭載SeVを感染後１５日まではそのままプラスチックシャーレ上で誘導し、iPS様コロニーが出現した頃から培養液をDMEM/10 % FBSからES細胞用の培地に変更し、コロニーが十分な大きさになった後、collagenase IVでシャーレから剥離し、新しいフィーダー細胞上にまき直し、iPS細胞を樹立できた。
【０１２２】
<実施例１５>  Thomsonの4因子(Oct3/4, Sox2, Lin28, Nanog)によるiPS誘導
Yamanakaの４因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)（Takahashi, K. and Yamanaka S., Cell 126, 663-676, 2006）以外に、Thomsonの4因子(Oct3/4, Sox2, Lin28, Nanog)（Yu J et al., Science. 2007, 318(5858):1917-20）をTSΔF/SeVに搭載しても、ヒト線維芽細胞からiPS細胞誘導が可能であった（図１５B）。以下に、NanogおよびLin28ベクターの構築例を示した。
【０１２３】
（１）ヒト転写因子Nanogの単離およびNanogを搭載したセンダイウイルスベクタープラスミドの構築およびNanogを搭載したセンダイウイルスベクターの作製
NCCIT細胞のcDNAライブラリーからPrimeStar(商標) HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A) を用いてNANOF-F（5’-CCACCATGAGTGTGGATCCAGCTTGTCC-3’(配列番号：87)）およびNANOF-R（5’-CTCACACGTCTTCAGGTTGCATGTTC-3’(配列番号：88)）のプライマーによりPCRを行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106) を用いて精製した。ブルースクリプトプラスミドベクターのEco RVサイトにクローニングし、シークエンスにより遺伝子配列を確認し、配列の正しいクローンを選択しpBS-KS-Nanogを得た。
【０１２４】
次に、pBS-KS-Nanogを鋳型にして、NotI-Nanog-F（5’-GCGCGGCCGCACCACCATGAGTGTGGATCCAGCTTGTCC-3’(配列番号：89)）およびNotI-Nanog-R（5’-GCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACACGTCTTCAGGTTGCATGTTCATGGAGTAGTTTAG-3’(配列番号：90)）のプライマーでPCRを行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106) を用いて精製し、その後Not I消化を行った。Qiaquick PCR Purification kit (キアゲン、カタログ番号28106)を用いて精製し、pSeV18+/TSΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV18+Nanog/TSΔFを得た。このプラスミドを用いて前出の方法にてNanog遺伝子を保持するF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（以下「SeV18+ Nanog／TSΔFベクター」という。）
【０１２５】
（２）ヒトLin 28の単離およびNanogを搭載したセンダイウイルスベクタープラスミドの構築およびLin 28を搭載したセンダイウイルスベクターの作製
NCCIT細胞のcDNAライブラリーからPrimeStar(商標) HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いてLIN28-F（5’-CCACCATGGGCTCCGTGTCCAACCAGC-3’(配列番号：91)）およびLIN28-R（5’-GTCAATTCTGTGCCTCCGGGAGC-3’(配列番号：92)）のプライマーによりPCRを行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、ブルースクリプトプラスミドベクターのEco RVサイトにクローニングし、シークエンスにより遺伝子配列を確認し、配列の正しいクローンを選択しpBS-KS-Lin28を得た。次に、pBS-KS-Lin 28を鋳型にして、NotI-Lin28-F（5’- GCGCGGCCGCACCACCATGGGCTCCGTGTCCAACCAGC-3’(配列番号：93)）およびNotI-Lin28-R（5’- GCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAATTCTGTGCCTCCGGGAGCAGGGTAGGGCTGTG-3’(配列番号：94)）のプライマーでPCRを行った。PCR産物はQiaquick PCR Purification kit (キアゲンCat. No. 28106)を用いて精製し、その後Not I消化を行った。Qiaquick PCR Purification kit (キアゲン、カタログ番号28106)を用いて精製し、pSeV18+/TSΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV18+Lin 28/TSΔFを得た。このプラスミドを用いて前出の方法にてLin 28遺伝子を保持するF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（「SeV18+ Lin 28／TSΔFベクター」という。）
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明により、宿主細胞の染色体に遺伝子を組み込むことなく、ＥＳ様細胞（多能性幹細胞）を製造することが可能となった。得られたＥＳ様細胞は、外来遺伝子が染色体に組み込まれていないため、本細胞を利用した試験、研究に好都合であるばかりでなく、疾病の治療においても免疫拒絶の問題や倫理面の問題を回避でき、さらに遺伝毒性に基づく癌化の危険性を回避することが期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年7月9日(2015.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のリプログラミングにおいて遺伝子を導入するための方法であって、１または複数のセンダイウイルスベクターを用いて該遺伝子を導入することを特徴とする方法。
【請求項２】
リプログラミングが多能性幹細胞の誘導である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
センダイウイルスベクターが、エンベロープ蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子を欠損または欠失する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該遺伝子が下記（１）〜（８）からなる群より選択される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子
【請求項５】
少なくともOct遺伝子、Klf遺伝子およびSox遺伝子の３種、あるいは少なくともOct遺伝子、Sox遺伝子、Nanog遺伝子、Lin28遺伝子の４種が内在性または外来性に発現するように導入する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
センダイウイルスベクターが温度感受性ベクターである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
センダイウイルスベクターがL遺伝子に温度感受性変異を有する、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
多能性幹細胞の誘導後に該細胞を37.5〜39℃で培養して該ベクターを除去することをさらに含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
１または複数のセンダイウイルスベクターを含む、細胞のリプログラミングにおける遺伝子導入に用いるための組成物。
【請求項１０】
リプログラミングが多能性幹細胞の誘導である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
センダイウイルスベクターが、エンベロープ蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子を欠損または欠失する、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
該遺伝子が下記（１）〜（８）からなる群より選択される、請求項９から１１のいずれかに記載の組成物。
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子
【請求項１３】
該遺伝子が（a）Oct遺伝子、Klf遺伝子、およびSox遺伝子、（b）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、およびMyc遺伝子、あるいは（c）Oct遺伝子、Sox遺伝子、Nanog遺伝子、およびLin28遺伝子のセットを少なくとも含む、請求項９から１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
センダイウイルスベクターが温度感受性ベクターである、請求項９から１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
１または複数のセンダイウイルスベクターを含む、細胞のリプログラミングにおける遺伝子導入に用いるためのキット。
【請求項１６】
リプログラミングが多能性幹細胞の誘導である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
センダイウイルスベクターが、エンベロープ蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子を欠損または欠失する、請求項１５または１６に記載のキット。
【請求項１８】
該遺伝子が下記（１）〜（８）からなる群より選択される、請求項１５から１７のいずれかに記載のキット。
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子
【請求項１９】
該遺伝子が（a）Oct遺伝子、Klf遺伝子、およびSox遺伝子、（b）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、およびMyc遺伝子、あるいは（c）Oct遺伝子、Sox遺伝子、Nanog遺伝子、およびLin28遺伝子のセットを少なくとも含む、請求項１５から１８のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
センダイウイルスベクターが温度感受性ベクターである、請求項１５から１９のいずれかに記載のキット。
【請求項２１】
分化した細胞のリプログラミングのための薬剤の製造における、１または複数のセンダイウイルスベクターの使用。
【請求項２２】
リプログラミングが、分化した細胞からの多能性幹細胞の誘導である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
センダイウイルスベクターが、エンベロープ蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子を欠損または欠失する、請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２４】
ベクターが、下記（１）〜（８）からなる群より選択される初期化因子をコードする遺伝子を少なくとも搭載する、請求項２１から２３のいずれかに記載の使用。
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子
【請求項２５】
少なくともOct遺伝子、Klf遺伝子およびSox遺伝子の３種、あるいは少なくともOct遺伝子、Sox遺伝子、Nanog遺伝子、Lin28遺伝子の４種が内在性または外来性に発現するように導入する多能性幹細胞の誘導のための薬剤の製造における使用である、請求項２１から２４のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
センダイウイルスベクターが温度感受性ベクターである、請求項２１から２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
多能性幹細胞の誘導後に細胞を37.5〜39℃で培養して該ベクターを除去することをさらに含む多能性幹細胞の誘導のための薬剤の製造における使用である、請求項２１から２６のいずれかに記載の使用。
【請求項２８】
下記（１）〜（８）からなる群より選択される遺伝子を搭載する請求項１〜６のいずれかに記載の方法に用いるためのセンダイウイルスベクター。
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子
【請求項２９】
センダイウイルスベクターが、エンベロープ蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子を欠損または欠失する、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
センダイウイルスベクターが温度感受性ベクターである、請求項２８または２９に記載のベクター。
【請求項３１】
該センダイウイルスベクターが、（a）Oct遺伝子、Klf遺伝子、およびSox遺伝子、（b）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、およびMyc遺伝子、あるいは（c）Oct遺伝子、Sox遺伝子、Nanog遺伝子、およびLin28遺伝子のセットを搭載する１または複数のベクターである、請求項２８から３０のいずれかに記載のベクター。
【請求項３２】
リプログラムされた細胞の製造方法であって、核初期化因子をコードする１または複数のセンダイウイルスベクターを細胞に導入する工程、および該細胞を培養して多能性幹細胞を誘導する工程、を含む方法。
【請求項３３】
リプログラムされた細胞が人工多能性幹細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
センダイウイルスベクターが、エンベロープ蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子を欠損または欠失する、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
ベクターが、下記（１）〜（８）からなる群より選択される初期化因子をコードする遺伝子を少なくとも搭載する、請求項３２から３４のいずれかに記載の方法。
（１）Oct遺伝子
（２）Klf遺伝子
（３）Myc遺伝子
（４）Sox遺伝子
（５）Nanog遺伝子
（６）Lin28遺伝子
（７）SV40 LargeT抗原遺伝子
（８）TERT遺伝子
【請求項３６】
少なくともOct遺伝子、Klf遺伝子およびSox遺伝子の３種、あるいは少なくともOct遺伝子、Sox遺伝子、Nanog遺伝子、Lin28遺伝子の４種が内在性または外来性に発現するように導入する、請求項３２から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
センダイウイルスベクターが温度感受性ベクターである、請求項３２から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
多能性幹細胞の誘導後に細胞を37.5〜39℃で培養して該ベクターを除去することをさらに含む、請求項３２から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
請求項３２から３８のいずれかに記載の方法により製造された細胞を分化させる工程をさらに含む、分化した細胞の製造方法。