(57)【要約】【課題】構造安定性が向上した改変タンパク質及びその製造方法などを提供する。【解決手段】本発明の改変タンパク質は、タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸が当該アミノ酸とは異なるアミノ酸誘導体に置換されている改変タンパク質であって、当該アミノ酸誘導体への置換によりタンパク質の内部又は表面にある隙間が充填され、構造安定性が向上される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸が当該アミノ酸とは異なるアミノ酸誘導体に置換されている改変タンパク質であって、当該アミノ酸誘導体への置換によりタンパク質の内部又は表面にある隙間が充填され、構造安定性が向上されることを特徴とする、改変タンパク質。
【請求項２】
前記アミノ酸は非ハロゲン化アミノ酸であり、前記アミノ酸誘導体はクロロアミノ酸、ブロモアミノ酸、及びヨードアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのハロゲン化アミノ酸であることを特徴とする、請求項１に記載の改変タンパク質。
【請求項３】
前記ハロゲン化アミノ酸は、ハロゲン化チロシン、ハロゲン化フェニルアラニン、ハロゲン化ヒスチジン、及びハロゲン化トリプトファンからなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする、請求項２に記載の改変タンパク質。
【請求項４】
前記ハロゲン化アミノ酸は、ハロゲン化チロシンであることを特徴とする、請求項３に記載の改変タンパク質。
【請求項５】
前記アミノ酸は、対応するアミノ酸誘導体に置換されていることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載の改変タンパク質。
【請求項６】
前記構造安定性は、熱力学的安定性、モルテン・グロビュール状態の安定性、プロテアーゼに対する安定性、熱変性に対する安定性、低温変性に対する安定性、酸変性に対する安定性、アルカリ変性に対する安定性、圧力変性に対する安定性、及び変性剤による変性に対する安定性から選ばれる１つ又は複数であることを特徴とする、請求項１〜５の何れか１項に記載の改変タンパク質。
【請求項７】
構造安定性が向上した改変タンパク質を製造する方法であって、
タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸が当該アミノ酸とは異なるアミノ酸誘導体に置換されている改変タンパク質を生成する工程であって、当該アミノ酸誘導体への置換によりタンパク質の内部又は表面にある隙間が充填される改変タンパク質を用意する改変タンパク質用意工程を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項８】
前記アミノ酸は非ハロゲン化アミノ酸であり、前記アミノ酸誘導体はクロロアミノ酸、ブロモアミノ酸、及びヨードアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのハロゲン化アミノ酸であることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ハロゲン化アミノ酸は、ハロゲン化チロシン、ハロゲン化フェニルアラニン、ハロゲン化ヒスチジン、及びハロゲン化トリプトファンからなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記ハロゲン化アミノ酸は、ハロゲン化チロシンであることを特徴とする、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記アミノ酸は、対応するアミノ酸誘導体に置換されていることを特徴とする、請求項７〜１０の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記改変タンパク質用意工程の後に、
前記改変タンパク質の構造安定性を、前記アミノ酸誘導体への置換前のタンパク質の構造安定性と比較する比較工程と、
前記アミノ酸誘導体への置換前のタンパク質と比較して構造安定性が向上した改変タンパク質を選択する選択工程とを含むことを特徴とする、請求項７〜１１の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記改変タンパク質用意工程の前に、
前記アミノ酸誘導体への置換前のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列情報又は前記タンパク質のアミノ酸配列情報を用いる配列情報利用工程を含むことを特徴とする、請求項７〜１２の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記改変タンパク質用意工程の前に、
前記アミノ酸誘導体への置換前のタンパク質の立体構造情報を取得する立体構造情報取得工程と、
前記立体構造情報に基づいて、前記アミノ酸誘導体への置換前のタンパク質の内部又は表面にある隙間を特定する隙間特定工程と、
前記隙間に接するアミノ酸のうちの少なくとも１つを、アミノ酸誘導体に置換したアミノ酸配列を取得するアミノ酸配列取得工程とを含むことを特徴とする、請求項７〜１３の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記改変タンパク質用意工程では、アミノ酸誘導体への置換前のタンパク質の所望のアミノ酸に対応する位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を有する、改変タンパク質をコードする遺伝子を、（ｉ）前記アミノ酸誘導体と、（ｉｉ）前記ナンセンス変異又はフレームシフト変異を認識するサプレッサーｔＲＮＡと、（ｉｉｉ）前記サプレッサーｔＲＮＡを前記アミノ酸誘導体によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素との存在下に、細胞内又は無細胞タンパク質合成系で発現させることを特徴とする、請求項７〜１４の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記遺伝子はナンセンス変異を有することを特徴とする、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記ナンセンス変異は、アンバー（ＵＡＧ）変異であることを特徴とする、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸を当該アミノ酸とは異なるアミノ酸誘導体に置換する工程を含み、当該アミノ酸誘導体への置換によりタンパク質の内部又は表面にある隙間が充填されることを特徴とする、タンパク質の構造安定性の向上方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構造安定性が向上した改変タンパク質及びその製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、食品、医薬品、化成品、廃棄物処理、及びバイオマス利用など様々な分野で応用されている。タンパク質がこのような工業分野で利用される場合、その利用環境の物理的・化学的条件（例えば、温度又はｐＨなど）において安定して機能を発揮することが求められる。このため、例えば高温条件下でも十分な触媒活性を示す酵素や、長期間安定して所望の活性を発現するタンパク質の開発などが行われている。
【０００３】
このような産業利用を目的とする酵素やタンパク質の物理的・化学的特性の改質方法の１つとして、高温環境下に生存する好熱性微生物から耐熱性を有する酵素を取得する方法が挙げられる。好熱性微生物は５５℃以上で生育するものであり、中には１２０℃以上でも生存可能な細菌も報告されている。このような好熱性微生物が有するタンパク質は、その生物が生存できる温度において、良好に機能を発揮する。また、好熱性微生物から同定されたタンパク質の遺伝子を大腸菌などの常温で生育する生物に組み込んで大量生産する方法も一般的である。
【０００４】
或いは、非特許文献１に開示されるように、天然に生存する生物由来のタンパク質のアミノ酸を別のアミノ酸に置き換えることによって、タンパク質の安定性を高める方法が知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】C. O'Fagain, Methods Mol. Biol. 681, 103-136 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、好熱性微生物から酵素やタンパク質を取得する方法は、必ずしも所望の機能を有する類似のタンパク質を有していないことがあるという点で限界がある。
【０００７】
また、常温で生存する生物由来のタンパク質のアミノ酸を別のアミノ酸に置き換える方法では、ランダムに変異を加えるため、構造が安定した好ましい変異タンパク質が作製されない虞がある上、非効率的である。
【０００８】
そのため、様々な酵素やタンパク質において、所望の物理的・化学的特性を得るために、構造安定性を向上させる新たな方法の開発が望まれる。
【０００９】
本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、構造安定性が向上した改変タンパク質及びその製造方法などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、上記の課題を解決するために以下のものを提供する。
（１）タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸が当該アミノ酸とは異なるアミノ酸誘導体に置換されている改変タンパク質であって、当該アミノ酸誘導体への置換によりタンパク質の内部又は表面にある隙間が充填され、構造安定性が向上されることを特徴とする、改変タンパク質。
（２）前記アミノ酸は非ハロゲン化アミノ酸であり、前記アミノ酸誘導体はクロロアミノ酸、ブロモアミノ酸、及びヨードアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのハロゲン化アミノ酸であることを特徴とする、（１）に記載の改変タンパク質。
（３）前記ハロゲン化アミノ酸は、ハロゲン化チロシン、ハロゲン化フェニルアラニン、ハロゲン化ヒスチジン、及びハロゲン化トリプトファンからなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする、（２）に記載の改変タンパク質。
（４）前記ハロゲン化アミノ酸は、ハロゲン化チロシンであることを特徴とする、（３）に記載の改変タンパク質。
（５）前記アミノ酸は、対応するアミノ酸誘導体に置換されていることを特徴とする、（１）〜（４）の何れかに記載の改変タンパク質。
（６）前記構造安定性は、熱力学的安定性、モルテン・グロビュール状態の安定性、プロテアーゼに対する安定性、熱変性に対する安定性、低温変性に対する安定性、酸変性に対する安定性、アルカリ変性に対する安定性、圧力変性に対する安定性、及び変性剤による変性に対する安定性から選ばれる１つ又は複数であることを特徴とする、（１）〜（５）の何れかに記載の改変タンパク質。
（７）構造安定性が向上した改変タンパク質を製造する方法であって、
タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸が当該アミノ酸とは異なるアミノ酸誘導体に置換されている改変タンパク質を生成する工程であって、当該アミノ酸誘導体への置換によりタンパク質の内部又は表面にある隙間が充填される改変タンパク質を用意する改変タンパク質用意工程を含むことを特徴とする、製造方法。
（８）前記アミノ酸は非ハロゲン化アミノ酸であり、前記アミノ酸誘導体はクロロアミノ酸、ブロモアミノ酸、及びヨードアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのハロゲン化アミノ酸であることを特徴とする、（７）に記載の製造方法。
（９）前記ハロゲン化アミノ酸は、ハロゲン化チロシン、ハロゲン化フェニルアラニン、ハロゲン化ヒスチジン、及びハロゲン化トリプトファンからなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする、（８）に記載の製造方法。
（１０）前記ハロゲン化アミノ酸は、ハロゲン化チロシンであることを特徴とする、（９）に記載の製造方法。
（１１）前記アミノ酸は、対応するアミノ酸誘導体に置換されていることを特徴とする、（７）〜（１０）の何れかに記載の製造方法。
（１２）前記改変タンパク質用意工程の後に、
前記改変タンパク質の構造安定性を、前記アミノ酸誘導体への置換前のタンパク質の構造安定性と比較する比較工程と、
前記アミノ酸誘導体への置換前のタンパク質と比較して構造安定性が向上した改変タンパク質を選択する選択工程とを含むことを特徴とする、（７）〜（１１）の何れかに記載の製造方法。
（１３）前記改変タンパク質用意工程の前に、
前記アミノ酸誘導体への置換前のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列情報又は前記タンパク質のアミノ酸配列情報を用いる配列情報利用工程を含むことを特徴とする、（７）〜（１２）の何れかに記載の製造方法
（１４）前記改変タンパク質用意工程の前に、
前記アミノ酸誘導体への置換前のタンパク質の立体構造情報を取得する立体構造情報取得工程と、
前記立体構造情報に基づいて、前記アミノ酸誘導体への置換前のタンパク質の内部又は表面にある隙間を特定する隙間特定工程と、
前記隙間に接するアミノ酸のうちの少なくとも１つを、アミノ酸誘導体に置換したアミノ酸配列を取得するアミノ酸配列取得工程とを含むことを特徴とする、（７）〜（１３）の何れかに記載の製造方法。
（１５）前記改変タンパク質用意工程では、アミノ酸誘導体への置換前のタンパク質の所望のアミノ酸に対応する位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を有する、改変タンパク質をコードする遺伝子を、（ｉ）前記アミノ酸誘導体と、（ｉｉ）前記ナンセンス変異又はフレームシフト変異を認識するサプレッサーｔＲＮＡと、（ｉｉｉ）前記サプレッサーｔＲＮＡを前記アミノ酸誘導体によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素との存在下に、細胞内又は無細胞タンパク質合成系で発現させることを特徴とする、（７）〜（１４）の何れかに記載の製造方法。
（１６）前記遺伝子はナンセンス変異を有することを特徴とする、（１５）に記載の製造方法。
（１７）前記ナンセンス変異は、アンバー（ＵＡＧ）変異であることを特徴とする、（１６）に記載の製造方法。
（１８）タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸を当該アミノ酸とは異なるアミノ酸誘導体に置換する工程を含み、当該アミノ酸誘導体への置換によりタンパク質の内部又は表面にある隙間が充填されることを特徴とする、タンパク質の構造安定性の向上方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る改変タンパク質は構造安定性が向上している。また、本発明に係る改変タンパク質の製造方法によれば、構造安定性が向上した改変タンパク質を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施例における、タンパク質の部位特異的変異と熱安定性との関係を示す図である。加熱後に保持された活性が、野生型ＧＳＴ及びハロゲン化ＧＳＴについて示されている。ｗｔＧＳＴ、７ｃＧＳＴ、３ｂＧＳＴ及び３ｃＧＳＴに対する変異は、括弧内において、変異があった位置及び変異後のアミノ酸［チロシン（ｙ）、ブロモチロシン（ｂ）及びクロロチロシン（ｃ）］によって示されている。
【図２】本発明の実施例における、ｗｔＧＳＴ（四角、破線）、７ｂＧＳＴ−１（丸、実線）及び７ｃＧＳＴ−１（三角、点線）の化学変性剤（尿素）に対するアンフォールディング曲線を示す図である。フォールディングしていない分子の割合を尿素の濃度に対してプロットしている。
【図３】本発明の実施例における、７ｂＧＳＴ−１二量体の結晶構造を示す図である。（ａ）側面図。（ｂ）上面図。組み込まれた３−ブロモチロシンの側鎖はスティックモデルによって示されている。結合したグルタチオン分子もスティックモデルで示されている。実施例中に言及されている二次構造には番号を付している。
【図４】本発明の実施例における、ハロゲン化チロシンによる安定化に関する構造的な洞察を示す図である。（ａ）ドメインＩを描写した結晶構造の一部。ドメインＩ中の臭素化されたチロシン（Ｈａｌ３２、Ｈａｌ５６及びＨａｌ７３）の側鎖はスティックモデルによって表されており、臭素のファンデルワールス半径は球によって表されている。ハロゲンに接している残基はスティックモデルによって表されている。ハロゲン化チロシンと結合しているアミノ酸残基はスティックモデルによって示されており、点線は相互作用を示している。一番左のらせんは他の単量体ユニットに属している。（ｂ）Ｈａｌ５７周辺の結晶構造の一部。Ｈａｌ５７の側鎖及び臭素に接している４つのアミノ酸残基はスティックモデルで示されている。臭素原子はチロシン環に結合する２つの置換基のうち右側に示されている方である。２ＦｏＦｃマップはＨａｌ５７周辺に示されている。
【図５】本発明の実施例における、３−ブロモチロシン（ａ、ｃ）、３−クロロチロシン（ｂ、ｄ）及びハロゲンに隣接するアミノ酸残基を示す結晶構造の一部を示す図である。ファンデルワールス半径は、臭素原子及び塩素原子は球によって示されており、Ｌｙｓ３９及びＬｙｓ４３の側鎖については立体的な表面によって示されている（ａ、ｂ）。ハロゲン化チロシン（Ｈａｌ３２及びＨａｌ７３）の側鎖及び他の残基は、スティックモデルによって示されている。
【図６】本発明の実施例における、５７番目の位置の３−クロロチロシン（Ｈａｌ５７）及び塩素原子に隣接する残基を示す結晶構造の一部を示す図である。Ｈａｌ５７、Ｐｒｏ２、Ｌｅｕ４、Ｌｅｕ２０及びＴｙｒ２７の側鎖は、スティックモデルによって示されている。２ＦｏＦｃマップはＨａｌ５７周辺に示されている。
【図７】タンパク質の内部又は表面にある隙間をハロゲン原子で充填することによって、アミノ酸側鎖同士が相互作用を形成し、それによって構造安定性が向上する概念図である。（ａ）充填されている場合。（ｂ）充填されていない場合。
【図８】本発明の実施例における、野生型ＡｚｏＲ（四角）及び３つの選択された位置において臭素化された変異体（丸）の、化学変性剤（尿素）に対するアンフォールディング曲線を示す図である。フォールディングしていない分子の割合を尿素の濃度に対してプロットしている。
【図９】本発明の実施例における、３−ブロモチロシンの組み込みによるアゾレダクターゼ（ＡＺＲ）の耐熱性の増加を示す図である。７８℃（ａ）及び８０℃（ｂ）で１０分間加熱した後でも活性が維持されることが、野生型酵素（ｗｔ）及び臭素化された変異体において示されている。臭素化された位置は括弧内に示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
〔改変タンパク質〕
本発明に係る改変タンパク質は、タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸が当該アミノ酸とは異なるアミノ酸誘導体に置換されている改変タンパク質であって、当該アミノ酸誘導体への置換によりタンパク質の内部又は表面にある隙間が充填され、構造安定性が向上される。
【００１４】
本発明におけるタンパク質（以下、「元のタンパク質」と記載することもある）は、その機能は特に限定されず、例えば、酵素、ホルモン及び抗体などの生理活性物質、並びに構造タンパク質など、あらゆる機能のタンパク質又はペプチドであってよい。また、タンパク質の由来は、特に限定されず、真正細菌、古細菌、真核生物、及びウイルスなどの何れに由来するものであってもよい。また、本発明に係る改変タンパク質は、例えば、蛍光タンパク質、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグなどの標識タンパク質；その他の機能性タンパク質；などと融合タンパク質を構成するものであってもよい。
【００１５】
アミノ酸誘導体に置換されている「アミノ酸」とは、２０種類の天然型アミノ酸（通常、生物のタンパク質合成に使われるアミノ酸）及びアミノ酸誘導体を指す。「アミノ酸誘導体」には、セレノシステイン、ピロリシン、天然型アミノ酸と化学構造が異なるがアミノ酸の基本骨格を有する非天然型アミノ酸、及び天然型アミノ酸と共通した部分構造を持つ分子、例えば、天然型アミノ酸を構成するアミノ基が水酸基、ヒドロキシアミノ基、メチルアミノ基、チオール基、セレノール基に置換された分子、アミノ酸を構成するカルボキシル基がリン酸基、スルホ基、チオカルボキシル基、又はセレノカルボキシル基に置換された分子などが包含される。非天然型アミノ酸としては、例えば、４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−チロシン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、及び硫酸チロシンなどのチロシン誘導体が挙げられる。非天然型アミノ酸としてさらに、チロシン誘導体以外にも、アジドアラニン、アジドホモアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、４−アミノトリプトファン、７−アザトリプトファン、６−メチルトリプトファン、アセチルリジン、ε−ボクリジン、ε−メチルリジン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、スチリルアラニン、ジフェニルアラニン、チアゾリルアラニン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、アントリルアラニン、２−アミノ−５−ヘキシノイン酸、フリルアラニン、ベンゾチエニルアラニン、チエニルアラニン、アリルグリシン、プロパルギルグリシン、ホスホリルセリン、ホスホリルトレオニン、及び２，３−ジアミノプロピオン酸などが挙げられる。
【００１６】
アミノ酸と置換されている「アミノ酸誘導体」としては、上述のアミノ酸誘導体の他、クロロアミノ酸、ブロモアミノ酸、及びヨードアミノ酸からなる群より選択されるハロゲン化アミノ酸が挙げられる。アミノ酸と置換されている「アミノ酸誘導体」は、セレノシステイン、ピロリシン、又は非天然アミノ酸であることが好ましく、ハロゲン化アミノ酸であることがより好ましく、クロロアミノ酸、ブロモアミノ酸、及びヨードアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのハロゲン化アミノ酸であることがさらに好ましい。
【００１７】
本発明に係る改変タンパク質の好ましい一態様において、元のタンパク質のアミノ酸は、性質の類似したアミノ酸誘導体に置換されている。「性質の類似した」とは、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸誘導体におけるアミノ酸とが互いに、電荷、及び極性等の少なくとも１つが似ていることを指す。例えば、酸性アミノ酸が酸性アミノ酸の誘導体に置換されていること、塩基性アミノ酸が塩基性アミノ酸の誘導体に置換されていること、中性アミノ酸が中性アミノ酸の誘導体に置換されていること、等が挙げられる。アミノ酸が互いに性質の類似している場合には、元のタンパク質における当該アミノ酸の役割（例えば、他のアミノ酸残基との相互作用）を維持し得る。さらに具体的には例えば、以下の（ａ）〜（ｆ）の何れかの置換が生じていること等が挙げられる。
（ａ）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸の誘導体への置換。
（ｂ）リシン、アルギニン、ヒスチジン、及びピロリシン及びからなる群から選択されるアミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸の誘導体への置換。
（ｃ）アスパラギン、及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸の誘導体への置換。
（ｄ）アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸の誘導体への置換。
（ｅ）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、及びプロリンからなる群から選択されるアミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸の誘導体への置換。
（ｆ）セリン、スレオニン、及びセレノシステインからなる群から選択されるアミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸の誘導体への置換。
【００１８】
本発明に係る改変タンパク質のより好ましい一態様において、元のタンパク質のアミノ酸は、対応するアミノ酸誘導体に置換されている。「対応するアミノ酸誘導体に置換されている」とは、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸誘導体におけるアミノ酸の種類が同じであることを指す。例えば、チロシンがチロシン誘導体に置換されているものが挙げられる。アミノ酸の種類が同じである場合には、元のタンパク質における当該アミノ酸の役割（例えば、他のアミノ酸残基との相互作用）をさらに維持し得る。対応するアミノ酸からアミノ酸誘導体に置換されている場合、当該アミノ酸及びアミノ酸誘導体におけるアミノ酸の種類として好ましくは、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、及びトリプトファンである。これらのアミノ酸は、側鎖に芳香環を有しており、タンパク質において他のアミノ酸残基と相互作用をし易い傾向にあるからである。当該アミノ酸及びアミノ酸誘導体におけるアミノ酸の種類としてより好ましくは、チロシン及びフェニルアラニンであり、特に好ましくは、チロシンである。チロシンは側鎖にベンゼン環及び水酸基の両方を有しているからである。
【００１９】
本発明に係る改変タンパク質は、非ハロゲン化アミノ酸からハロゲン化アミノ酸に置換されていることが好ましく、対応する非ハロゲン化アミノ酸からハロゲン化アミノ酸に置換されていることが好ましい。好ましいハロゲン化アミノ酸は、ハロゲン化による効果がより発揮され易い傾向にあることから、ハロゲン化チロシン、ハロゲン化フェニルアラニン、ハロゲン化ヒスチジン、及びハロゲン化トリプトファンである。より好ましいハロゲン化アミノ酸は、ハロゲン化チロシンであり、さらに好ましいハロゲン化アミノ酸は、クロロチロシン、ブロモチロシン、及びヨードチロシンであり、よりさらに好ましいハロゲン化アミノ酸は、３−クロロチロシン、３−ブロモチロシン、及び３−ヨードチロシンである。
【００２０】
１つのハロゲン化アミノ酸において、ハロゲン化されている箇所は、１箇所であってもよいし、複数個所であってもよい。ハロゲン化アミノ酸におけるハロゲン化されている位置は特に限定されないが、アミノ酸の側鎖であることが好ましい。また、水素結合に関与し得るヒドロキシル基及びアミノ基、並びにジスルフィド結合に関与し得るチオール基以外であることがより好ましい。アミノ酸がチロシンである場合、ハロゲン化される位置は特に限定されないが、ベンゼン環上であることが好ましく、ベンゼン環の２位又は３位であることが好ましく、３位であることがより好ましい。
【００２１】
改変タンパク質において、アミノ酸誘導体は、タンパク質の内部又は表面にある隙間を充填している。「タンパク質の内部又は表面にある隙間」とは、元のタンパク質を構成する複数のアミノ酸残基によって形成される空間を指し、タンパク質が多量体である場合には、サブユニット同士の接触面に形成された空間も包含される。当該空間は並んだアミノ酸残基同士（例えば、５０番目、５１番目、５２番目のアミノ酸残基）で形成されてもよいし、並んでいないアミノ酸残基同士（例えば、５番目、２０番目、５５番のアミノ酸残基）で形成されてもよい。「充填する」とは、「隙間の一部又は大部分を占めるように原子を配置する」を指す。本発明者らは、図７に示すように、タンパク質の内部又は表面の隙間をハロゲン原子で充填することにより、近接するアミノ酸残基同士の相互作用を強化し、それによって構造安定性が向上することを見出している。
【００２２】
塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子のファンデルワールス半径は、それぞれ、１．７５Å、１．８５Å及び１．９８Åである。ハロゲン化アミノ酸を含んでいる場合、各ハロゲンは、当該ハロゲンのファンデルワールス半径±０．２Åの隙間を効果的に充填する。そのため、直径が１．７５Å±０．２Å、１．８５Å±０．２Å又は１．９８Å±０．２Åの球が入る大きさの隙間であって、且つ、この距離を塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が埋めることによって隙間にある別のアミノ酸残基と近接するような（例えば、４〜５Å）隙間に存在している非ハロゲン化アミノ酸が、ハロゲン化アミノ酸に置き換わっていることが好ましい。また、隙間の大きさに応じて、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子の中から適宜選択することもできる。
【００２３】
本発明の改変タンパク質は構造安定性が向上している。「構造安定性が向上する」とは、本発明の改変タンパク質の構造安定性と、アミノ酸誘導体への置換前のタンパク質（元のタンパク質）の構造安定性とを比較したときに、本発明の改変タンパク質の構造安定性が向上していることを意味する。「元のタンパク質」は、野生型タンパク質であってもよいし、変異体タンパク質であってもよい。そのため、「元のタンパク質」は、野生型よりも既に構造安定性が向上している変異体タンパク質であってもよい。
【００２４】
構造安定性の指標及び向上の程度は特に限定されない。構造安定性の指標としては、例えば、熱力学的安定性、モルテン・グロビュール状態の安定性、プロテアーゼに対する安定性、熱変性に対する安定性、低温変性に対する安定性、酸変性に対する安定性、アルカリ変性に対する安定性、圧力変性に対する安定性、及び変性剤による変性に対する安定性などが挙げられる。本発明の改変タンパク質は、少なくとも１つの指標について構造安定性が向上していればよい。すなわち、「構造安定性が向上する」とは、本発明の改変タンパク質の構造安定性と、元のタンパク質の構造安定性とを比較したときに、上記構造安定性の指標の少なくとも１つが向上していることを意味する。
【００２５】
タンパク質の構造安定性が向上しているか否かの確認方法は特に限定されない。熱力学的安定性は、例えば、二次構造又は三次構造が変化する温度（Ｔｍ）の変化を円偏光二色性スペクトル測定器、蛍光光度計、又は熱量計などを用いて決定することによって確認することができる。モルテン・グロビュール状態の安定性は、ＮＭＲなどの方法によって確認することができる。プロテアーゼに対する構造安定性は、例えば、キモトリプシンなどのプロテアーゼを限定分解条件下で反応させ、分解産物の割合をＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの方法で比較することによって確認することができる。熱変性に対する安定性及び低温変性に対する安定性は、示差走査熱量計など方法によって確認することができる。酸変性に対する安定性及びアルカリ変性に対する安定性は、例えば、各ｐＨにおける構造変化を円偏光二色性スペクトル測定器又は蛍光光度計などを用いて測定することによって確認することができる。圧力変性は、赤外分光光度計など方法によって確認することができる。変性剤による変性に対する安定性は、例えば、変性剤に晒す前後の酵素活性の変化を比較する（残存活性測定）こと、又は、構造の変化を物理化学的に測定することによって確認することができる。また、タンパク質の構造安定性が向上しているか否かは、上述の方法で実際に測定する場合に限らず、コンピュータで計算して比較してもよい。
【００２６】
一実施形態において、構造安定性は、熱力学的安定性、モルテン・グロビュール状態の安定性、プロテアーゼに対する安定性、熱変性に対する安定性、低温変性に対する安定性、酸変性に対する安定性、アルカリ変性に対する安定性、圧力変性に対する安定性、及び変性剤による変性に対する安定性から選ばれる１つ又は複数である。
【００２７】
本発明に係る改変タンパク質は、構造安定性が向上しているため、食品、医薬品、化成品、廃棄物処理、及びバイオマス利用など様々な分野において、所望の条件下で安定に機能を発揮するタンパク質として利用することができる。
【００２８】
〔改変タンパク質の製造方法〕
本発明に係る改変タンパク質の製造方法は、構造安定性が向上した改変タンパク質を製造する方法であって、タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸が当該アミノ酸とは異なるアミノ酸誘導体に置換されている改変タンパク質を生成する工程であって、当該アミノ酸誘導体への置換によりタンパク質の内部又は表面にある隙間が充填される改変タンパク質を用意する改変タンパク質用意工程を含む。
【００２９】
改変タンパク質の説明は上述のとおりである。また、「アミノ酸」、「アミノ酸誘導体」、「タンパク質の内部又は表面にある隙間」及び「充填する」の定義は上述のとおりである。
【００３０】
タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸をアミノ酸誘導体に置換する方法は特に限定されない。一例として、元のタンパク質の所望のアミノ酸に対応する位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を有する、改変タンパク質をコードする遺伝子を、（ｉ）前記アミノ酸誘導体と、（ｉｉ）前記ナンセンス変異又はフレームシフト変異を認識するサプレッサーｔＲＮＡと、（ｉｉｉ）前記サプレッサーｔＲＮＡを前記アミノ酸誘導体によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素との存在下に、細胞内又は無細胞タンパク質合成系で発現させる方法が挙げられる。この方法は、所望の位置に所望のアミノ酸誘導体を導入することができるため好ましい。
【００３１】
ナンセンス変異又はフレームシフト変異を認識するサプレッサーｔＲＮＡは、２０種類の天然型アミノ酸に対応するコドン以外の遺伝暗号に対して特異的に対合するアンチコドンを有している。サプレッサーｔＲＮＡのアンチコドンは、アンバー（ＵＡＧ）コドン、オーカー（ＵＡＡ）コドン及びオパール（ＵＧＡ）コドンからなるナンセンスコドンの何れかに対合する配列を有するナンセンス・サプレッサーｔＲＮＡ、又は、４塩基以上（好ましくは４若しくは５塩基）の塩基からなるコドン（フレームシフトコドン）に対合する配列を有するフレームシフト・サプレッサーｔＲＮＡである。サプレッサーｔＲＮＡは、ナンセンス・サプレッサーｔＲＮＡであることが好ましい。なかでも、サプレッサーｔＲＮＡは、ＵＡＧ（アンバーコドン）に対合するアンチコドンを有するものであることが好ましい。その理由の１つは、オパールコドンは低い効率でトリプトファンに翻訳されることがあり、このコドンを用いたときアミノ酸誘導体とトリプトファンとの２種類のアミノ酸に翻訳される虞があるからである。もう１つの理由は、アンバーコドンは３字目にＧを持つからである。コドン３字目とアンチコドン１字目の塩基対形成は比較的不安的であり、この位置に安定なＧＣ塩基対を形成することは、サプレッサーｔＲＮＡがＵＡＧコドンをアミノ酸誘導体に効率よく翻訳する上で有利になるからである。したがって、改変タンパク質をコードする遺伝子は、元のタンパク質の所望のアミノ酸に対応する位置にナンセンス変異を有することが好ましく、アンバー変異を有することがより好ましい。
【００３２】
また、サプレッサーｔＲＮＡのアンチコドンは、非天然の塩基を含むものであってもよい。この場合には、その非天然塩基と特異的に塩基対を形成することができる別種の非天然塩基をコドンの対応する位置に導入する。このような非天然塩基のペアとしては、イソグアニンとイソシトシン、キサントシンとジアミノピリミジン、２−アミノ−イミダゾ［１，２−ａ］−１，３，５−トリアジン−４（８Ｈ）−オンと６−アミノ−５−ニトロ−２（１Ｈ）−ピロリドン、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリンと２−オキソピリジン、５−アミノ−７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基と２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基、５−アミノ−７−（２−チエニル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基と２−ニトロ−１Ｈ−ピロール−１−イル基などが挙げられる。したがって、改変タンパク質をコードする遺伝子は、元のタンパク質の所望のアミノ酸に対応する位置に非天然塩基を有していてもよい。
【００３３】
このようなサプレッサーｔＲＮＡは、公知の方法に基づいて作製することができる（参考文献：A., Belagaje U. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5813-5817 (1982)、Laski F. A. et al., EMBO J 3:2445-2452 (1984)、及びCapone J. P. et al., EMBO J 4:213-221 (1985)など）。
【００３４】
上述のサプレッサーｔＲＮＡをアミノ酸誘導体によってアシル化するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、アミノ酸誘導体を認識し、且つサプレッサーｔＲＮＡを特異的に認識して、当該アミノ酸誘導体が結合したサプレッサーｔＲＮＡを生成させることができるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素である。
【００３５】
このようなアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、天然型アミノ酸に対応する既知のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の所定の位置に変異を導入することによって取得することができる。天然型アミノ酸に対応する既知のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、アミノアシルｔＲＮＡを合成するに際して、まず、アミノ酸を特異的に認識してＡＭＰを付加することで活性化する。既知のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素については、アミノ酸の特異的な認識に寄与する部位が知られており、当該部位に変異を導入することによってその特異性を変化させることができる。このような知見に基づけば、天然型アミノ酸に対する特異性を低減して、当該天然型アミノ酸に類似するアミノ酸誘導体に対する特異性を高めるような変異を導入することができる。このように、既知のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素における所定の部位に変異を導入することによって、所望の特異性を有するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を作製することができる。
【００３６】
このようなアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、原核生物及び真核生物タイプのいずれを由来としてもよいが、原核生物に由来するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の一例としては、３−ヨード−Ｌ−チロシン（アミノ酸誘導体）に対する特異性がチロシン（天然型アミノ酸）に対する特異性に比べて高められたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（変異体ＴｙｒＲＳと称する）が挙げられる。変異体ＴｙｒＲＳは、例えば、参考文献：T. Mukai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 411, 757-761 (2011)に記載されており、この文献に記載の変異体ＴｙｒＲＳは、３−ヨード−Ｌ−チロシン、３−ブロモ−Ｌ−チロシン、及び３−クロロ−Ｌ−チロシンに対する特異性がチロシンに対する特異性に比べて高められている。また、変異体ＴｙｒＲＳは、参考文献：Kiga, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 9715-9723 (2002)等にも記載されている。
【００３７】
また、その他の原核生物に由来するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素としては、例えば、参考文献：Chin, J. W. et al., Science 301, 964-967 (2003)に記載されたもの、及び参考文献：Deiters, A. et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 11782-11783 (2003)に記載されたものが挙げられる。
【００３８】
一方、真核生物タイプに由来するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素としては、例えば、参考文献：Santoro, S. W. et al., Nature Biotechnol. 20, 1044-1048 (2002)に記載されたもの、及び参考文献：Wang, L. et al.,Science, 292, 498-500 (2001)に記載されたものが挙げられる。
【００３９】
なお、このようなアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を製造する方法は、公知の遺伝子操作技術により容易に行うことができる。例えば、部位特異的変異導入法と呼ばれる手法により、或いは、部位特異的変異導入法を実施するための市販のキットを使用して変異体をコードする遺伝子を製造することができる。
【００４０】
改変タンパク質をコードする遺伝子を細胞内で発現させる場合、宿主細胞は、原核細胞及び真核細胞の何れであってもよい。原核細胞としては、例えば、大腸菌、及び枯草菌などが挙げられる。真核細胞としては、酵母、ＣＨＯ、及びＨＥＫなどが挙げられる。
【００４１】
改変タンパク質をコードする遺伝子を細胞内で発現させる場合、サプレッサーｔＲＮＡ及びアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、上記宿主細胞内で製造することが好ましい。すなわち、サプレッサーｔＲＮＡをコードする遺伝子及びアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を、宿主細胞が保持していることが好ましい。なお、宿主細胞が保持しているサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子及びアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素遺伝子は、それぞれ、内因性であってもよいし、公知の遺伝子導入法によって導入された外因性のものであってもよい。
【００４２】
改変タンパク質をコードする遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させる場合、いわゆる無細胞タンパク質合成系を用いればよい。無細胞タンパク質合成系とは、タンパク質の翻訳に必要なタンパク質因子を細胞抽出液として取り出し、試験管内でこの反応を再構成することで目的とするタンパク質を合成させる系である。様々な生物種に由来する細胞抽出液を利用して無細胞タンパク質合成系を構成することができ、例えば、大腸菌及び好熱性細菌などの細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞及び出芽酵母などの抽出液を用いることができる。大腸菌の抽出液としては、例えば、参考文献：Zubay et al., Ann. Rev. Genet. Vol.7, pp.267-287 (1973)、又は参考文献：Pratt, J.M. et al., Transcription and Translation - A Practical Approach, (1984), pp. 179-209, Henes, B.D. et al. eds., IRL Press, Oxfordに記載された方法によって調製されたＳ３０抽出液を用いることができる。
【００４３】
改変タンパク質をコードする遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させる場合、サプレッサーｔＲＮＡ及びアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、当該無細胞タンパク質合成系で製造されたものであってもよいし、別途製造して当該無細胞タンパク質合成系に加えたものであってもよい。
【００４４】
本発明に係る改変タンパク質の製造方法では、上述の改変タンパク質用意工程の後に、上述の改変タンパク質の構造安定性を、元のタンパク質の構造安定性と比較する比較工程と、元のタンパク質と比較して構造安定性が向上した改変タンパク質を選択する選択工程とを含んでいてもよい。
【００４５】
比較工程において比較する構造安定性の指標は、特に限定されないが、例えば、上述の構造安定性の指標の少なくとも１つについて比較を行う。比較する方法は、上述の「タンパク質の構造安定性が向上しているか否かの確認方法」として記載した方法で行えばよい。選択工程における構造安定性の向上の程度は、特に限定されず、所望の基準を設ければよい。
【００４６】
本発明に係る改変タンパク質の製造方法では、上述の改変タンパク質用意工程の前に、元のタンパク質の立体構造情報を取得する立体構造情報取得工程と、当該立体構造情報に基づいて、元のタンパク質の内部又は表面にある隙間を特定する隙間特定工程と、当該隙間に接するアミノ酸のうちの少なくとも１つを、アミノ酸誘導体に置換したアミノ酸配列を取得するアミノ酸配列取得工程とを含んでいてもよい。なお、立体構造情報取得工程、隙間特定工程及びアミノ酸配列取得工程は必ずしも必須ではなく、元のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列情報又はアミノ酸配列情報を用いる配列情報利用工程に基づいて改変タンパク質の設計を行うことも可能である。
【００４７】
立体構造情報取得工程では、改変したい元のタンパク質の立体構造の情報を取得する。立体構造情報は、実験的構造決定法によって決定されたものであってもよいし、計算科学的構造推定法によって決定されたものであってもよい。実験的構造決定法では、例えば、一般的な立体構造解析法を用いることができ、例えば、タンパク質のＸ線結晶構造解析による解析方法、並びに、ＮＭＲによる解析方法などが挙げられる。計算科学的構造推定法では、ソフトウェアを用いて、二次元的なアミノ酸配列から三次元の立体構造を推定する方法、及び、アミノ酸配列が類似する他のタンパク質の立体構造に基づいて立体構造を推定する方法などが挙げられる。アミノ酸配列は、シークエンシングで決定したものであってもよいし、遺伝子配列から推定したものであってもよい。遺伝子配列、アミノ酸配列、及びアミノ酸配列が類似する他のタンパク質の立体構造情報として、Protein Data Bankなどのデータベースで公開されているものを利用することもできる。立体構造を推定するソフトウェアは、DALI、及びSWISS-MODELなど、オンラインで利用できるものを用いてもよい。立体構造情報の取得は、上述の方法で自ら決定あるいは推定してもよいし、他者が決定あるいは推定した立体構造情報をMolecular Modeling Database（MMDB）などのデータベースから取得してもよい。
【００４８】
隙間特定工程では、元のタンパク質の立体構造情報に基づいて、元のタンパク質の内部又は表面にある隙間を特定する。隙間の特定は通常コンピュータ上で行い、例えば、原子の位置及びファンデルワールス半径から、隙間を特定することができる。この際、隙間の大きさを測定し、その大きさに適切なアミノ酸誘導体の種類を決定してもよい。
【００４９】
アミノ酸配列取得工程では、隙間に接するアミノ酸のうちの少なくとも１つを、アミノ酸誘導体に置換したアミノ酸配列を取得する。置換するアミノ酸は、酵素活性部位及び基質認識部位以外に位置するアミノ酸であることが好ましい。酵素活性部位及び基質認識部位の位置は、元のタンパク質の立体構造情報に基づいて容易に決定することができる。そのため、置換するアミノ酸の位置は容易に決定することができる。ここで取得されたアミノ酸配列は、改変タンパク質のアミノ酸配列である。改変タンパク質用意工程では、このアミノ酸配列に基づいて改変タンパク質を用意する。
【００５０】
本発明の製造方法は、タンパク質の種類によらず適用でき、広く汎用性を有する。そのため、本発明の製造方法に基づけば、所望のタンパク質について、構造安定性が向上した改変タンパク質を製造することができる。
【００５１】
〔タンパク質の構造安定性の向上方法〕
本発明に係るタンパク質の構造安定性の向上方法は、タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸を当該アミノ酸とは異なるアミノ酸誘導体に置換する工程を含み、当該アミノ酸誘導体への置換によりタンパク質の内部又は表面にある隙間が充填される。
【００５２】
タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸をアミノ酸誘導体に置換する方法は特に限定されないが、例えば、上記で例示した方法が挙げられる。
【００５３】
〔その他〕
（改変タンパク質のスクリーニング方法）
本発明ではまた、構造安定性が向上した改変タンパク質をスクリーニングする方法であって、
タンパク質を構成する少なくとも１つのアミノ酸が当該アミノ酸とは異なるアミノ酸誘導体に置換されている改変タンパク質を生成する工程であって、当該アミノ酸誘導体への置換によりタンパク質の内部又は表面にある隙間が充填される改変タンパク質を用意する改変タンパク質用意工程と、
前記改変タンパク質の構造安定性を、前記アミノ酸誘導体への置換前のタンパク質の構造安定性と比較する比較工程と、
前記アミノ酸誘導体への置換前のタンパク質と比較して構造安定性が向上した改変タンパク質を選択する選択工程とを含む、スクリーニング方法が提供される。
【００５４】
各工程については上述のとおりである。このスクリーニング方法を用いれば、構造安定性がより向上した改変タンパク質をスクリーニングすることができる。なお、スクリーニング方法は、改変タンパク質用意工程の前に、上述の立体構造情報取得工程、隙間特定工程及びアミノ酸配列取得工程をさらに含んでいてもよく、また、改変タンパク質用意工程の前に、上述の配列情報利用工程のみを含んでいてもよい。
【００５５】
（改変タンパク質の設計方法）
本発明ではさらに、構造安定性が向上した改変タンパク質を設計する方法であって、
元のタンパク質の立体構造情報を取得する立体構造情報取得工程と、
前記立体構造情報に基づいて、前記元のタンパク質の内部又は表面にある隙間を特定する隙間特定工程と、
前記隙間に接するアミノ酸のうちの少なくとも１つを、当該アミノ酸とは異なるアミノ酸誘導体に置換したアミノ酸配列を取得するアミノ酸配列取得工程とを含む、設計方法が提供される。
【００５６】
各工程については上述のとおりである。この設計方法を用いれば、構造安定性が向上した改変タンパク質を容易に設計することができる。なお、元のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列情報又はアミノ酸配列情報を用いる配列情報利用工程に基づいて改変タンパク質の設計を行う設計方法も可能である。
【００５７】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００５８】
〔方法〕
＜タンパク質の用意及び耐熱性アッセイ＞
３−ヨードチロシン、３−ブロモチロシン及び３−クロロチロシンを含むSchistosoma japonicum（日本住血吸虫）由来のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）変異体及びEscherichia coli（大腸菌）由来のアゾレダクターゼ（ＡｚｏＲ）変異体を、参考文献：T. Mukai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 411, 757-761 (2011)に記載の方法に従って、大腸菌BW25113-based RFzero株又はBL21(DE3)-based RFzero株を用いて合成した。ＧＳＴのＮ末端にＴ７タグを付加した。また、ＡｚｏＲのＣ末端に６つのヒスチジン残基を含むＨｉｓタグを付加した。タグを付加したＧＳＴのアミノ酸配列を配列番号１に示す。また、タグを付加したＡｚｏＲのアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＧＳＴのＮ末端のタグの最後の残基はチロシンであり、この残基を−１と番号付けした。
【００５９】
ＧＳＴ変異体をGST SpinTrapカラム（GE Healthcare Life Sciences社製）を用いて精製し、次いで、２８０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）が０．４となる濃度で、バッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１０ｍＭ  グルタチオン）に溶解した。ＡｚｏＲ変異体をHis SpinTrapカラム（GE Healthcare Life Sciences社製）を用いて精製し、次いで、ＯＤ２８０が０．３となる濃度で、バッファーＢ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，２５０ｍＭ  イミダゾール）に溶解した。これらの溶液に同量のグリセロールを混合し、Veritiサーマルサイクラー（Biosystems社製）を用いて加熱処理した。ＧＳＴの比活性は、GST Detection Module kit（GE Healthcare Life Sciences社製）を用いて、取扱説明書に従って測定し、光度計ARVO X3（Perkin Elmer社製）を用いて３４０ｎｍにおけるＯＤを測定した。ＡｚｏＲの比活性は、ＡｚｏＲ溶液（５μＬ）に１００μＬのバッファーＣ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．５），６０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＮＡＤＨ，０．１ｍＭ  テトラゾールＷＳＴ−０８）を混合し、室温で５分間インキュベートすることによって測定した。１００μＬの０．１Ｍ  酢酸を添加して反応を止め、ＯＤ４５０を測定した。
【００６０】
＜熱力学的解析＞
円二色性（ＣＤ）スペクトルを、円二色性分散計Jasco J-805（日本分光株式会社製）を用いて測定した。スキャン速度はバンド幅１ｎｍで１００ｎｍ／分とした。４回の測定の平均を記録した。２３℃で２２２ｎｍにおけるＣＤシグナルを記録することによって、尿素による可逆的なアンフォールディングの曲線を得た。ＧＳＴについてのアンフォールディング実験は、０．１Ｍ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）中で行った。ＡｚｏＲについてのアンフォールディング実験は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）バッファー中で行った。ＧＳＴ単量体の最終濃度は５．０μＭであった。ＡｚｏＲ単量体の最終濃度は４．７４μＭであった。ストック溶液の尿素濃度は、アッベ屈折計NAR-3T（（株）アタゴ製）を用いた屈折率測定（参考文献：C. N. Pace, M. J. Scholtz, in: T. E. Creighton (ed.) Protein Structure: A Practical Approach, Oxford University Press Inc., New York, 1987, pp. 299-321）によって決定した。これらのタンパク質を、尿素（０〜８Ｍ）を含むバッファー中で１時間インキュベートした。平衡に達してから全てのＣＤ測定を行った。
【００６１】
二量体タンパク質のための直線補外法（参考文献：J. U. Bowie, R. T. Sauer, Biochemistry 28, 7139-7143 (1989)）に従って、変性曲線の数値を求めた。二量体タンパク質の変性の平衡を、Ｎ２⇔２Ｕと仮定する。この反応の平衡定数ＫＤを、以下の方程式によって、変性曲線の遷移領域の各点において算出した（参考文献：J. U. Bowie, R. T. Sauer, Biochemistry 28, 7139-7143 (1989)）。
【００６２】
ＫＤ＝［Ｕ］２／［Ｎ２］＝２Ｐｔ［ｆｄ２／（１−ｆｄ）］
ここで、Ｐｔはタンパク質単量体の濃度であり、ｆｄはフォールディングしていないタンパク質の割合である。
【００６３】
変性濃度に対するアンフォールディングのギブズ自由エネルギー（ΔＧＤ＝−ＲＴ Ｉｎ ＫＤ）は一次従属性を有すると仮定する（参考文献：J. A. Schellman, Biopolymers 17, 1305-1322 (1978)）と、ΔＧＤ＝ΔＧＤ（Ｈ２Ｏ）−ｍ［変性剤］であり、ここで、ΔＧＤ（Ｈ２Ｏ）は、変性剤の非存在下におけるフォールディングしていないタンパク質とフォールディングしているタンパク質とのギブズ自由エネルギーの差を表す。Levenberg Marquard最小二乗法アルゴリズムを採用したGraphPad Prism（Graphpad Software社製）を用いて、変性曲線を上記方程式に繰り返し当てはめることによって、コンホメーション安定性パラメータを決定した。
【００６４】
＜結晶化＞
加熱実験のために用意したハロゲン化ＧＳＴ変異体をさらに精製して、結晶化のためのサンプルを得た。固定化グルタチオンカラム（GE Healthcare社製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーから１０ｍＭ  還元型グルタチオンによって溶出された画分を集め、０．２ｍＭ  ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファーで平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ（１ｍＬ）カラムにかけた。AKTA 10Sシステム（GE Healthcare社製）を用いて、０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの勾配を利用して、これらの変異体をさらに精製した。各画分の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。次いで、集めた画分をAmiconUltra YM10（Millipore社製）を用いて、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  還元型グルタチオン及び１ｍＭ  ＴＣＥＰを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファー中で８ｍｇ／ｍＬの濃度までになるまで濃縮した。シッティングドロップ方式の蒸気拡散法によって、２９３Ｋにおいて結晶化を行った。０．３μＬのタンパク質溶液（８．２ｍｇ／ｍＬ）を０．３μＬのリザーバー溶液と混合し、Intelliプレート（Art Robbins社製）上で、１００μＬのリザーバー溶液に対して平衡化した。最初の結晶化を市販のスクリーニングキットNeXtal AmSO4 Suite（Qiagen社製）を用いて行った。最適化された条件を、０．１Ｍ  クエン酸三ナトリウム、１．３Ｍ  硫酸アンモニウム及び０．２Ｍ  硫酸リチウムのリザーバー溶液を用いて同定した。２．０Ｍ  硫酸アンモニウムを含む０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ７．０）バッファーのリザーバー溶液を用いて結晶を成長させた。六方晶系の結晶が数日以内に得られた。オイル（５０：５０  パラフィン：パラトン−Ｎ  オイル混合物）を結晶の凍結保護剤として用いた。
【００６５】
＜データコレクション、構造決定、及び分子構造精密化＞
シンクロトロン回折データを、播磨のSPring-8のビームラインBL26B2において収集した。XDS及びXDSMEソフトウェアを用いて、全てのデータを処理した。野生型ＧＳＴ（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＵＡ５）の構造をサーチモデルとして用いて、PHASERソフトウェアによる分子置換法によって最初の位相調整を行った。Cootソフトウェアを用いて最初のモデルを電子密度マップとして構築し、次いでPHENIX総合ソフトウェアを用いて精密化を行った。最終モデルの立体化学的な質をWHATIF及びMolProbityを用いて評価した。
【００６６】
＜ＦＭＯ計算＞
アブイニシオフラグメント分子軌道法（ＦＭＯ）計算を行い、以前報告されたように（参考文献：K. Yamagishi et al., J. Ster. Biochem. Mol. Biol. 121, 63-67 (2010)）、各アミノ酸残基ペアの相互作用エネルギーを決定した。ＦＭＯ計算は、変異体７ｂＧＳＴ−１及び７ｃＧＳＴ−１の結晶構造から原子座標を用いて計算した。変異体７ｂＧＳＴ−１及び７ｃＧＳＴ−１は、２１８個のアミノ酸残基（−１番目〜２１６番目）を含んでおり、ハロゲン化された７つのチロシン残基（０番目、２２番目、３２番目、５７番目、７３番目、１４１番目及び１６３番目）を含む変異体である。分子モデリングソフトウェアSYBYL-Xを用いて、欠けている水素原子を７ｂＧＳＴ−１及び７ｃＧＳＴ−１のそれぞれについて追加した。自動的に追加された水素原子の配向を、Ｔｒｉｐｏｓ力場を用いたエネルギー最小化によって最適化した。非ハロゲン化ＧＳＴ（Ｈ−ＧＳＴ（ｂ）及びＨ−ＧＳＴ（ｃ））の三次元データを、それぞれ、７ｂＧＳＴ−１及び７ｃＧＳＴ−１の構造におけるハロゲン原子を水素原子に置き換えることによって構築した。置き換えた水素原子の配向も、Ｔｒｉｐｏｓ力場を用いたエネルギー最小化によって最適化した。Ｈ−ＧＳＴ（ｂ）、Ｈ−ＧＳＴ（ｃ）、７ｂＧＳＴ−１及び７ｃＧＳＴ−１のそれぞれについてＦＭＯ計算を行った。ＦＭＯ計算において、各ＧＳＴの構造を、各アミノ酸残基のＣαの位置で、１アミノ酸残基のフラグメントに分割した。さらに、７つのチロシン残基（０番目、２２番目、３２番目、５７番目、７３番目、１４１番目及び１６３番目）及びロイシン残基（１９番目）を、各アミノ酸残基のＣγの位置で、２つのフラグメントに分割した。これらのＦＭＯ計算の全てをPAICSプログラム（参考文献：T. Ishikawa, K. Kuwata, Chem. Phys. Lett. 474, 195-198 (2009)）を用いて、cc-pVDZ基本設定でRI-MP2レベルにおいて行った。ＨＦ及びＭＰ２相関エネルギーは、それぞれ、静電気及びファンデルワールス分散の相互作用と一致した。ＦＭＯ計算に基づくアミノ酸残基ペアの相互作用エネルギー解析によって、各アミノ酸残基ペアの相互作用エネルギーを解析した。
【００６７】
＜構造データベースにおける統計解析＞
この解析で用いる原子座標をProtein Data Bankから選択した。全てのデータは、２．０Å〜２．５Åの範囲の分解能でRwork値＜０．２における単鎖タンパク質の結晶構造から得たものであり、それらの間の配列同一性は３０％未満であった。それゆえ、選択した構造の数は２，１１９個であり、その中に４８，８２４個のチロシンのメタ位が含まれていた。所定のチロシンのＣε原子（メタ位）の中心に対する球面を仮定した。１．１Å（水素原子の半径）から始めた球の半径を各ステップにおいて０．１Åずつ２．４Åになるまで増加させた。球の半径としてＣε−Ｈ結合の軸に沿って外方向に移動した球の中心を増加させた。それぞれの球について、球がタンパク質において最も近接したアミノ酸残基とファンデルワールス接触をしているか決定した。ファンデルワールス接触をしている場合、その半径を記録した。この手順を選択したタンパク質における全てのメタ位について繰り返し、記録された全ての半径について分布を決定した。
【００６８】
〔結果〕
ホモ二量体の解毒酵素であるＧＳＴにハロゲン化チロシンを組み込んだ。ヨウ素原子、臭素原子及び塩素原子は水素原子よりも大きいため、ハロゲン化ＧＳＴ変異体は元の分子よりも非常に大きい。Ｎ末端に標識した野生型ＧＳＴ（ｗｔＧＳＴ）は単量体あたり１５個のチロシンを含んでいるが、６番目のチロシンは触媒作用に重要であり、ハロゲン化チロシンに置き換えることができない。７個のチロシンに相当する位置のコドンをＵＡＧに変異させた組換え遺伝子を、大腸菌RFzero細胞に導入し、サプレッサーｔＲＮＡを用いることで、ＵＡＧを３−ヨード−Ｌ−チロシンに割り当てた（参考文献：T. Mukai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 411, 757-761 (2011)）。７個の３−ヨードチロシンを含む変異体７ｉＧＳＴをｗｔＧＳＴとほぼ同量合成した。ＵＡＧが３−ブロモ−Ｌ−チロシン又は３−クロロ−Ｌ−チロシンに割り当てたRFzero細胞を同様に作製し、７ｂＧＳＴ及び７ｃＧＳＴを合成した。これらは、７ｉＧＳＴの３−ヨード−Ｌ−チロシンが、それぞれ、３−ブロモ−Ｌ−チロシン及び３−クロロ−Ｌ−チロシンに置き換わったものである。置き換えた位置はタンパク質全体に分布しており、４個は表面（−１番目、２２番目、１４１番目及び１６３番目）、２個は内部（５７番目及び１５５番目）、１個は二量体の接触面に存在する（参考文献：M. A. McTiguea et al., J. Mol. Biol. 246, 21-27 (1995)）。７ｉＧＳＴ、７ｂＧＳＴ及び７ｃＧＳＴの活性測定を行ったところ、比活性は、ｗｔＧＳＴと比較して、それぞれ４５％、４７％及び６０％維持されていた。この結果は、大きなチロシン誘導体が、タンパク質の構造ネットワークに差支えなく組み込まれ得ることを示している。
【００６９】
ｗｔＧＳＴは、６０℃で１０分間加熱してインキュベートしたところ不活性化した。一方、７ｃＧＳＴは加熱前と比較して２０％の活性を維持していた（図１）。７ｉＧＳＴ及び７ｂＧＳＴは耐熱性を示さなかった。７ｃＧＳＴにおける個々の３−クロロチロシンの効果を調べるため、それぞれの３−クロロチロシンをチロシンに戻した。５７番目又は７３番目の塩素原子を取り除いたところ、耐熱性はほとんど消失した（図１）。これは、これらの位置における塩素化が安定化効果を有することを示す。−１番目、２２番目、１４１番目及び１６３番目における塩素化の効果は中程度かほぼ中立であった。これに対して、１５５番目の塩素原子を取り除くと、耐熱性が劇的に向上した。これは、塩素原子部分と近接のアミノ酸残基との間に、他の位置の塩素化の良好な効果をほぼ打ち消す立体障害が生じることを示唆する。７ｂＧＳＴにおける１５５番目の臭素原子を取り除いた場合も同様に、熱安定性が劇的に向上した。したがって、ハロゲン化の効果は、内部に位置する５７番目〜１５５番目では逆効果である。
【００７０】
異なる位置でのハロゲン化による相乗効果を示すために、５７番目、７３番目及び１４１番目を別々にハロゲン化した変異体と、これら３箇所を同時にハロゲン化した変異体とを比較した（図１）。３箇所を置き換えた変異体（３ｃＧＳＴ）は、１箇所を置き換えた変異体（ｗｔＧＳＴ（５７ｃ）、ｗｔＧＳＴ（７３ｃ）、ｗｔＧＳＴ（１４１ｃ））よりも、熱安定性が顕著に高かった。３箇所を同時にヨウ素化した３ｉＧＳＴ及び３箇所を同時に臭素化した３ｂＧＳＴも同様に顕著な熱安定性を示した。３ｃＧＳＴ及び３ｂＧＳＴは、３ｉＧＳＴよりも安定であった。次いで、さらなるハロゲン化が安定性を向上させるか調べた。試した位置は、内部にある２７番目、３２番目、５６番目、１０３番目、１９１番目及び１９７番目、並びに二量体の接触面に位置する１１０番目の６箇所である。３ｂＧＳＴ及び３ｃＧＳＴの３２番目をハロゲン化した変異体（３ｂＧＳＴ（３２ｂ）及び３ｃＧＳＴ（３２ｃ））では、耐熱性が顕著に向上した（図１）。一方、２７番目をハロゲン化した変異体（３ｂＧＳＴ（２７ｂ）及び３ｃＧＳＴ（２７ｃ））及び５６番目をハロゲン化した変異体（３ｂＧＳＴ（５６ｂ）及び３ｃＧＳＴ（５６ｃ））では耐熱性を失っていた。１０３番目、１１０番目及び１９１番目の位置では、ほぼ中立の効果を示し、１９７番目の位置では、中適度の不安定化を引き起こした。各位置におけるハロゲン化の安定化又は不安定化の性質は、他の位置でのハロゲン化に影響されなかった。２７番目及び３２番目の位置での反対の効果は、互いにほぼ打ち消した（図１の３ｂＧＳＴ（２７ｂ３２ｂ）及び３ｃＧＳＴ（２７ｂ３２ｂ））。一方、中立的な１９１番目でのさらなるハロゲン化は、他の位置で既にハロゲン化された変異体の耐熱性の程度を変化させなかった（図１の３ｂＧＳＴ（３２ｂ１９１ｂ）、３ｃＧＳＴ（３２ｂ１９１ｂ）、３ｂＧＳＴ（２７ｂ３２ｂ１９１ｂ）及び３ｃＧＳＴ（２７ｂ３２ｂ１９１ｂ））。
【００７１】
安定化させる位置と不安定化させる位置との違いの発見（表１）及び異なる位置での相乗効果は、複数の選択された部位に非天然アミノ酸を組み込む方法の優位性を明らかにした。最後に、最初の変異体である７ｂＧＳＴ及び７ｃＧＳＴにおける３２番目がハロゲン化され、１５５番目がハロゲン化されていない変異体（７ｂＧＳＴ−１及び７ｃＧＳＴ−１）を作製した。これらの最終的な変異体は、耐熱性が劇的に向上した（７ｂＧＳＴ−１では０％から７１％に増加した。７ｃＧＳＴでは１１％から７９％に増加した）（図１）。また、比活性が顕著に回復した（ｗｔＧＳＴと比較して、７ｂＧＳＴ−１では４７％から６７％に増加し、７ｃＧＳＴ−１では６０％から７２％に増加した）。達成した構造安定性を熱力学的解析によって評価した。化学変性剤に対するアンフォールディング曲線を測定して、アンフォールディングのギブズ自由エネルギーを決定した。ｗｔＧＳＴのΔＧ（Ｈ２Ｏ）値（２７．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）（表２）は、異なる標識がされた同じＧＳＴ種について報告された値（参考文献：W. Kaplan et al, Protein Sci. 6, 399-406 (1997)）とほぼ等しかった。７ｂＧＳＴ及び７ｃＧＳＴのアンフォールディングのプロファイルは、互いに類似しており（図２）、ΔＧ（Ｈ２Ｏ）値は、ｗｔＧＳＴよりも、それぞれ５．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ及び５．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ大きかった。
【００７２】
安定性の向上の基となるメカニズムを明らかにするため、７ｂＧＳＴ−１及び７ｃＧＳＴ−１の結晶構造（Protein Data Bankアクセッション番号：３ＷＮ９及び３ＷＮＡ）を、１．６Å及び１．９Åの分解能で決定した（図３）。構造精密化データは表３に示す。これらの構造を、報告されている野生型ＧＳＴ（参考文献：M. A. McTiguea et al., J. Mol. Biol. 246, 21-27 (1995)）（ＰＤＢアクセッション番号：１ＵＡ５）の構造と上手く重ね合わせたところ、Ｃα原子についての標準偏差は、７ｂＧＳＴ−１が０．４３Åであり、７ｃＧＳＴ−１が０．４４Åであった。Ｃα原子についての標準偏差は変異体間で０．０８９Åであった。ハロゲン部分が関係する相互作用を特徴付けるために、タンパク質の全てのアミノ酸残基ペアについての相互作用エネルギーを計算した。アブイニシオフラグメント分子軌道（ＦＭＯ）法を用いた（参考文献：K. Kitaura et al., Chem. Phys. Lett. 313, 701-706 (1999)）。相互作用エネルギーは、ファンデルワールス相互作用及び静電気相互作用にそれぞれ起因する２つの部分からなる。計算は、結晶構造及びそれらの改変した構造（ハロゲン化チロシンが実質的にチロシンに置き換わっている）について行った。同じアミノ酸残基ペアの相互作用エネルギーを２種類の構造同士で比較し、その違いをハロゲン化の効果として解釈した。
【００７３】
３２番目、５７番目及び７３番目における主要な安定化ハロゲンは、４つのストランドβシート（β１−β４）及び３つのαヘリックス（α１−α３）を含むＮ末端ドメイン（ドメインＩ）に位置している（図４の（ａ））。７ｂＧＳＴ−１及び７ｃＧＳＴ−１の結晶構造において、３２番目及び５７番目のハロゲン化チロシン（Ｈａｌ３２及びＨａｌ５７）の側鎖は、βシートの異なる側から突き出しており、βシートとαヘリックスとの間に埋もれている。Ｈａｌ３２のハロゲン部分は、Ｈａｌ３２のチロシン環とα２のＬｙｓ３９及びＬｙｓ４３の側鎖との空間を充填している（図５の（ａ）及び（ｂ））。一方、Ｈａｌ５７のハロゲン部分は、Ｈａｌ５７のチロシン環とＰｒｏ２とＬｅｕ４（β１）とＬｅｕ２０（α１）とＴｙｒ２７との空間を充填している（図４の（ｂ）及び図６）。ＦＭＯ計算から、ハロゲン化チロシンとそれらの近接するアミノ酸残基との間の相互作用がハロゲン化によって強化されることが示された（表４）。二量体の接触面に近いＨａｌ７３（α３）のハロゲン部分は、Ｈａｌ７３のチロシン環とＬｙｓ７７（α３）とＬｙｓ８６（他の単量体のα４）との隙間を充填しており（図５の（ｃ）及び（ｄ））、Ｈａｌ７３とこれらのアミノ酸残基との相互作用の強化に寄与している（表４）。野生型ＧＳＴにおいて、Ｔｙｒ７３は小さ過ぎるため、他の分子に届かない。Ｈａｌ７３は、他の単量体との新たな接触を生成することによって、分子間相互作用を強化させた。
【００７４】
ドメインＩの構造的洞察はまた、３つのハロゲン化部位を繋ぐアミノ酸残基間相互作用のネットワークを明らかにした（図４の（ａ））。Ｔｙｒ５６はＨａｌ３２とヒドロキシル基同士の水素結合を形成し、また、ペプチド結合を介して隣接するＨａｌ５７と結合しているため、Ｈａｌ３２及びＨａｌ５７はＴｙｒ５６を介して繋がっている。Ａｓｐ５９はそのカルボキシル基とＨａｌ５７及びＨａｌ７３のヒドロキシル基の水素原子との間の電気的相互作用を形成しているため、Ｈａｌ５７及びＨａｌ７３はＡｓｐ５９を介して繋がっている。これらの相互作用は、５７番目及び７３番目の位置におけるハロゲン化によって顕著に強化されている（表４）。これらの繋がりは、Ｈａｌ５３、Ｈａｌ５７及びＨａｌ７３がドメインＩを共同的に安定化することを可能にする。また、−１番目、２２番目、１４１番目及び１６３番目の位置におけるハロゲンはそれぞれ、ハロゲン化チロシンと近接するアミノ酸残基との間の相互作用を強化しており（表４）、それらの効果が上述の加熱実験において、中程度に検出されるか、あるいはほとんど検出されなかったが、おそらくタンパク質の安定性に寄与する。
【００７５】
以上のように、組み込まれたハロゲン化チロシンはタンパク質の構造において不可欠な部分である。当該ハロゲン部分は上記分子内の何もない空間を充填しており、重要なコンホメーションを変化させることなく内部がより充填された状態になることを達成した。密に充填することは好熱性タンパク質を安定化させるメカニズムの１つとして提案されている（参考文献：Y. Yamagata et al., J. Biol. Chem. 276, 11062-11071 (2001)、及び、K. Schafer et al., J. Mol. Biol. 335, 261-274 (2003)）。しかしながら、上記安定化は、数個の特定のアミノ酸の変化よりもむしろ内側の体積の全体的な減少によって達成される。選択された部位におけるチロシンのハロゲン化誘導体への置換は、タンパク質の安定化の新しい戦略を提供し得る。チロシン残基近傍の内部空間のサイズの統計解析によって、ヨウ素原子、臭素原子又は塩素原子に近いサイズの空間が最も頻繁にチロシンメタ位の近傍に生じていることが明らかになった。また、合計すると全ての位置の有意な割合（２４％）を占めている。本実施例では、チロシンがアミノ酸残基間の空間を充填し、安定的な相互作用を作り出す好ましい標的の１つであることを示している。さらに、チロシンは、ヒドロキシル基及び芳香環によって、タンパク質のネットワークに頻繁に関連しており、ハロゲン化の個々の効果を増加させる可能性がある。
【００７６】
本発明者らはアゾレダクターゼへの適用における新しい戦略を試験した。アゾレダクターゼは、環境を汚染する合成色素を処理するために開発された生物システムにおいて重要な役割を果たしている。また、アゾレダクターゼは生物燃料電池においても利用されている（参考文献：T. Sugiyama et al., Biosens. Bioelectron. 26, 452-457 (2010)）。
【００７７】
ＡｚｏＲ（大腸菌由来のアゾレダクターゼ）はホモ二量体酵素であり（参考文献：K. Ito et al., J. Biol. Chem. 281, 20567-20576 (2006)）、各単量体は７個のチロシンを含む２００アミノ酸からなる。一方、チロシンは平均でタンパク質中のアミノ酸の３．５％を占めている。ＡｚｏＲはＧＳＴに比べて耐熱性に優れ、７５℃まで加熱した後でも十分な活性を有している。さらに安定性を増加させるために、チロシンの位置を臭素化した。１０８番目、１５６番目及び１７９番目の位置における臭素化は、それぞれ耐熱性を改善し、全体的には８０℃で加熱した後でも酵素が十分な活性を有することを可能にした（図９）。熱力学的解析によって、３つの位置において臭素化された変異体は、野生型に比べて有意に安定化されることが示された（図８、変異体は丸、野生型は四角で表されている）。ΔＧ（Ｈ２Ｏ）の値における増加は２．０ｋｃａｌ／ｍｏｌであった（表５）。この結果は、ＧＳＴの例と合わせて、チロシンのハロゲン化の有用性を実証している。チロシンのハロゲン化はこれまで提案されていたアプローチ（参考文献：C. O'Fagain, Methods Mol. Biol. 681, 103-136 (2011)）とは対照的に、シンプルな安定化メカニズムを提供している。特定の翻訳機構が１００以上の非天然アミノ酸のそれぞれにおいて発達している（参考文献：C. Liu, P. G. Schultz, Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010)、及び、P. O’Donaghue, J. Ling, Y.-S. Wang, D. Soll, Nat. Chem. Biol. 9, 594-598 (2013)）。当該アミノ酸は人工的なコードにおいて適用可能である（参考文献：Mukai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 411, 757-761 (2011)、及び、M. J. Lajoie et al., Science 342, 357-360 (2013)）。可能性のあるタンパク質配列の増加された空間は、タンパク質の新しい構造及び機能を発見するために、天然及び非天然の多様性と組み合され、部位特異的突然変異誘発法、構造に基づく設計、及び進化的方法によって探求され得る。
【００７８】
【表１】
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【００７９】
【表２】
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【００８０】
【表３】
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【００８１】
【表４】
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【００８２】
【表５】
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【００８３】
【表６】
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【００８４】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明は、食品、医薬品、化成品、廃棄物処理、及びバイオマス利用など様々な分野で利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図８】
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【図９】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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