(57)【要約】【課題】肺障害を処置するために有用であることが期待される、ビフェニル化合物の新規結晶形を提供すること。【解決手段】  本発明は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの２つの結晶性遊離塩基形を提供する。本発明は、前記結晶性遊離塩基を含むまたは前記結晶性遊離塩基を使用して調製される製薬組成物；前記結晶性遊離塩基を調製するためのプロセスおよび中間体；ならびに肺障害を処置するために前記結晶性遊離塩基を使用する方法も提供する。2015003929.tif 000007【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺障害を処置するために有用であることが期待される、ビフェニル化合物の新規結晶形に関するものである。本発明は、前記結晶性化合物を含むまたはこのような化合物から調製された製薬組成物、このような結晶性化合物を調製するためのプロセスおよび中間体ならびに肺障害を処置するためにこのような化合物を使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｍａｍｍｅｎらへの特許文献１は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および喘息などの肺障害を処置するのに有用であることが期待される新規ビフェニル化合物を開示している。特に、化合物ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルは、ムスカリン受容体アンタゴニストまたは抗コリン活性を所有するとして本出願に明確に記載されている。
【０００３】
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの化学構造は、式Ｉによって表される：
【０００４】
【化１】
2015003929.tif 000002
【０００５】
式Ｉの化合物は、市販のＡｕｔｏＮｏｍソフトウェア（ＭＤＬ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して命名されている。
【０００６】
肺または呼吸障害を処置するのに有用な治療剤は、吸入により気道中に直接、好都合に投与される。この点で、ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）、定量吸入器（ＭＤＩ）およびネブライザ吸入器を含む、吸入により治療剤を投与するための複数の種類の製薬吸入デバイスが開発されてきた。このようなデバイスでの使用のための製薬組成物および製剤を調製するとき、吸湿性でも潮解性でもなく、比較的高い融点を有し、これにより材料が著しく分解することなく微粉化される、結晶形の治療剤を有することが高度に所望である。結晶性遊離塩基形の式Ｉの化合物はＡｘｔらへの特許文献２でＩ形およびＩＩ形として報告されているが、本発明の結晶性遊離塩基形は、より高い融点を含む、異なるおよび特に有用な特性を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０２０３１３３号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００７／０１１２０２７号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１態様は、６．６±０．１、１３．１±０．１、１８．６±０．１、１９．７±０．１、および２０．２±０．１の２θ値に回折ピークを備える粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基形に関する。
【０００９】
本発明の別の態様は、６．６±０．１、１３．１±０．１、１８．６±０．１、１９．７±０．１、および２０．２±０．１の２θ値に回折ピークを備える粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする；ならびに８．８±０．１、１０．１±０．１、１１．４±０．１、１１．６±０．１、１４．８±０．１、１５．２±０．１、１６．１±０．１、１６．４±０．１、１６．９±０．１、１７．５±０．１、１８．２±０．１、１９．３±０．１、１９．９±０．１、２０．８±０．１、２１．１±０．１、２１．７±０．１、および２２．３±０．１から選択される２θ値に５つ以上の追加の回折ピークを有することをさらに特徴とする、ＩＩＩ形と呼ばれる、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基に関する。
【００１０】
本発明のなお別の態様は、６．６±０．１、１３．１±０．１、１８．６±０．１、１９．７±０．１、および２０．２±０．１の２θ値に回折ピークを備える粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする；ならびに１０．６±０．１、１５．０±０．１、１６．０±０．１、１７．３±０．１、１７．７±０．１、２０．９±０．１、２１．４±０．１、２２．６±０．１、２４．６±０．１、および２７．８±０．１から選択される２θ値に５つ以上の追加の回折ピークを有することをさらに特徴とする、ＩＶ形と呼ばれる、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基に関する。
【００１１】
本発明の別の態様は、本発明の結晶性遊離塩基および製薬的に許容され得る担体を含む製薬組成物に関する。本発明のまた別の態様は、１つ以上の他の治療剤と組合された本発明の結晶性遊離塩基を含む製薬組成物に関する。したがって、１実施形態において、本発明は、（ａ）製薬的に許容され得る担体および治療的有効量の本発明の結晶性遊離塩基；ならびに（ｂ）治療的有効量の、コルチコステロイドなどのステロイド性抗炎症剤；β２アドレナリン受容体アゴニスト；ホスホジエステラーゼ−４阻害剤；またはその組合せ；から選択される薬剤を含み、結晶性遊離塩基および薬剤が共にまたは個別に製剤化される、製薬組成物に関する。薬剤が別々に製剤化されるとき、製薬的に許容され得る担体が含まれ得る。通例、本発明の結晶性遊離塩基および薬剤は治療的有効量で存在するであろう。
【００１２】
本発明の別の態様は、約４から６の範囲のｐＨを有する、本発明の結晶性遊離塩基を含む等張食塩水溶液を含む製薬組成物に関するものである。特定の実施形態において、水性ネブライザ製剤は、クエン酸緩衝剤によって約５のｐＨまで緩衝される。
【００１３】
１実施形態において、本発明は、製薬的に許容され得る担体および本発明の結晶性遊離塩基を含む製薬組成物を含有するドライパウダー吸入器を備える、薬物送達デバイスに関する。
【００１４】
式Ｉの化合物は、ムスカリン受容体アンタゴニスト活性を有する。したがって、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基は、同じ活性を有し、それゆえ喘息および慢性閉塞性肺疾患などの肺障害を処置するのに有用性を見出すことが期待される。それゆえ本発明の別の態様は、患者に治療的有効量の本発明の結晶性遊離塩基を投与することを含む、肺障害を処置する方法に関する。本発明のなお別の態様は、患者に気管支拡張を生じる量の本発明の結晶性遊離塩基を投与することを含む、患者において気管支拡張を生じる方法に関する。１実施形態において、化合物は吸入によって投与される。本発明は、患者に治療的有効量の本発明の結晶性遊離塩基を投与することを含む、慢性閉塞性肺疾患または喘息を処置する方法も提供する。本発明の別の態様は、哺乳動物に治療的有効量の本発明の結晶性遊離塩基を投与することを含む、哺乳動物においてムスカリン受容体を拮抗する方法に関する。
【００１５】
本発明は、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基形を調製するプロセスにも関する。本発明は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基を形成することを含む、式Ｉの化合物を精製するプロセスも提供する。本発明はさらに、本明細書に記載するプロセスによって調製された生成物に関する。
【００１６】
本発明は、微粉化形の式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基に；ならびに製薬的に許容され得る担体および本発明の微粉化結晶性遊離塩基を含む製薬組成物にも関する。
【００１７】
本発明は、療法でまたは医薬品として使用するための、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基形にも関する。加えて本発明は、医薬品の製造のための；とりわけ哺乳動物において肺障害を処置するまたはムスカリン受容体を拮抗する医薬品の製造のための、本発明の結晶性遊離塩基の使用に関する。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
６．６±０．１、１３．１±０．１、１８．６±０．１、１９．７±０．１、および２０．２±０．１の２θ値に回折ピークを備える粉末Ｘ線回折を特徴とする、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基。
（項目２）
８．８±０．１、１０．１±０．１、１１．４±０．１、１１．６±０．１、１４．８±０．１、１５．２±０．１、１６．１±０．１、１６．４±０．１、１６．９±０．１、１７．５±０．１、１８．２±０．１、１９．３±０．１、１９．９±０．１、２０．８±０．１、２１．１±０．１、２１．７±０．１、および２２．３±０．１から選択される２θ値に５つ以上の追加の回折ピークを有することをさらに特徴とする、項目１に記載の結晶性遊離塩基。
（項目３）
６．６±０．１、１１．４±０．１、１３．１±０．１、１６．１±０．１、１７．５±０．１、１８．２±０．１、１８．６±０．１、１９．３±０．１、１９．７±０．１、１９．９±０．１、２０．２±０．１、２０．８±０．１、２１．１±０．１、２１．７±０．１、および２２．３±０．１から選択される２θ値に回折ピークを備える粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、項目２に記載の結晶性化合物。
（項目４）
ピーク位置が図１に示されたパターンのピーク位置と実質的に一致する粉末Ｘ線回折パターンをさらに特徴とする、項目２に記載の結晶性化合物。
（項目５）
約１２５℃の融点を示す示差走査熱量測定サーモグラムをさらに特徴とする、項目２に記載の化合物。
（項目６）
図４に示されたものと実質的に一致する示差走査熱量測定サーモグラムをさらに特徴とする、項目２に記載の化合物。
（項目７）
１０．６±０．１、１５．０±０．１、１６．０±０．１、１７．３±０．１、１７．７±０．１、２０．９±０．１、２１．４±０．１、２２．６±０．１、２４．６±０．１、および２７．８±０．１から選択される２θ値に５つ以上の追加の回折ピークを有することをさらに特徴とする、項目１に記載の結晶性遊離塩基。
（項目８）
６．６±０．１、１３．１±０．１、１５．０±０．１、１７．３±０．１、１７．７±０．１、１８．６±０．１、１９．７±０．１、２０．２±０．１、２０．９±０．１、２１．４±０．１、および２２．６±０．１から選択される２θ値に回折ピークを備える粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、項目７に記載の結晶性化合物。
（項目９）
ピーク位置が図２に示されたパターンのピーク位置と実質的に一致する粉末Ｘ線回折パターンをさらに特徴とする、項目７に記載の結晶性化合物。
（項目１０）
約１１９℃の融点を示す示差走査熱量測定サーモグラムをさらに特徴とする、項目７に記載の化合物。
（項目１１）
図５に示されたものと実質的に一致する示差走査熱量測定サーモグラムをさらに特徴とする、項目７に記載の化合物。
（項目１２）
製薬的に許容され得る担体および項目１〜１１のいずれか１項に記載の化合物を含む製
薬組成物。
（項目１３）
β２アドレナリン受容体アゴニスト、ステロイド性抗炎症剤、ホスホジエステラーゼ−４阻害剤、およびその組合せから選択される薬剤をさらに含み；前記結晶形および前記薬剤が共にまたは別々に製剤化される、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
β２アドレナリン受容体アゴニストおよびステロイド性抗炎症剤を含む、項目１３に記載の組成物。
（項目１５）
微粉化形の、項目１〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
（項目１６）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルをアセトニトリルと接触させることを含む、項目２に記載の結晶性遊離塩基ＩＩＩ形を調製するプロセス。
（項目１７）
ａ）結晶性遊離塩基ＩＩＩ形の種晶を形成すること；ｂ）前記結晶性遊離塩基ＩＩＩ形をアセトニトリルに溶解させて溶液を形成すること；ｃ）および前記種晶を前記溶液に添加すること；を含む、項目７に記載の結晶性遊離塩基ＩＶ形を調製するプロセス。
（項目１８）
項目１〜１１のいずれか１項に記載の化合物を形成することを含む、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルを精製するプロセス。（項目１９）
療法での使用のための、項目１〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
（項目２０）
慢性閉塞性肺疾患もしくは喘息の処置での使用のための、または気管支拡張を生じるための、項目１９に記載の化合物。
（項目２１）
慢性閉塞性肺疾患もしくは喘息の処置のための、または気管支拡張を生じるための、医薬の製造のための、項目１〜１１のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本発明の各種の態様は、添付図面への参照により例証される。
【図１】図１は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（式Ｉの化合物）のＩＩＩ形の結晶性遊離塩基の粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを示す。ＩＩＩ形の他の特徴は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムを示す図４および熱重量分析（ＴＧＡ）トレースを示す図６に提示されている。
【図２】図２は、式Ｉの化合物のＩＶ形の結晶性遊離塩基形のＰＸＲＤパターンを示す。
【図３】図３は、ＩＩＩ形およびＩＶ形のＰＸＲＤパターンのオーバーレイを示す。ＩＶ形の他の特徴は、ＤＳＣサーモグラムを示す図５、およびＴＧＡトレースを示す図７に提示されている。
【図４】図４は、ＩＩＩ形の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムを示す。
【図５】図５は、ＩＶ形の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムを示す。
【図６】図６は、ＩＩＩ形の熱重量分析（ＴＧＡ）トレースを示す。
【図７】図７は、ＩＶ形の熱重量分析（ＴＧＡ）トレースを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基形（式Ｉ）を提供する。驚くべきことに、本発明の結晶性遊離塩基形は大気中の水分に曝露されたときでも、潮解性でないことが見出されている。加えて、本発明の結晶性遊離塩基形は、許容され得るレベルの吸湿性および許容され得る融点を有する。たとえば結晶性遊離塩基ＩＩＩ形は約１２５℃の融点を有し、結晶性遊離塩基ＩＶ形は約１１９℃の融点を有する。
【００２０】
他の使用の中でも、本発明の結晶性遊離塩基形は、肺障害を処置する有用性を有することが期待される製薬組成物を調製するのに有用である。したがって、本発明の１態様は、製薬的に許容され得る担体および治療的有効量の本発明の結晶性遊離塩基を含む製薬組成物に関する。
【００２１】
定義
本発明の化合物、組成物、方法およびプロセスについて記載するときに、以下の用語は、別途指摘されない限り、以下の意味を有する。加えて、本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、使用状況が別途明らかに指示しない限り、対応する複数形を含む。「備える、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であることが意図され、挙げられた要素以外に追加の要素があり得ることを意味する。本明細書で使用する成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表現するすべての数は、別途指摘されない限り、すべての例において「約」という用語によって修飾されていることが理解されるはずである。したがって、本明細書に記述される数は、本発明によって得ようとされる望ましい特性に応じて変動し得る概数である。少なくとも、および請求項の範囲に対する均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各数は、報告された有効数字に照らしておよび普通の丸め技法を適用することによって少なくとも解釈されるべきである。
【００２２】
ＩＩＩ形およびＩＶ形はどちらも無水遊離塩基結晶多形である。「本発明の結晶性遊離塩基」が参照されるとき、用語はＩＩＩ形およびＩＶ形を含むことが理解される。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「式を有する」または「構造を有する」という句は、制限的であることが意図されず、「含む、備える」という用語が一般に使用されるのと同じ様式で使用される。
【００２４】
「製薬的に許容され得る」という用語は、本明細書で使用されるときに生物学的にまたは別途許容され得ないわけではない材料を指す。たとえば「製薬的に許容され得る担体」という用語は、許容され得ない生物効果を引き起こすことなく、または組成物の他の構成要素と許容され得ない相互作用することなく、組成物中に組み入れられて患者に投与されることができる材料を指す。このような製薬的に許容され得る材料は通例、毒性および製造試験の要求される標準を満足しており、米国食品医薬品局によって好適な不活性成分として同定されたこのような材料を含む。
【００２５】
「治療的有効量」という用語は、それを必要とする患者に投与されるときに処置をもたらすのに十分な量、すなわち望ましい治療効果を得るために必要とされる薬物の量を意味する。たとえば肺障害を処置するための治療的有効量は、たとえば喘息もしくは慢性閉塞性肺疾患（「ＣＯＰＤ」）の症候を減少、抑制、消滅もしくは防止するために、または喘息もしくはＣＯＰＤの根底にある原因を処置するために必要とされる化合物の量である。１実施形態において、治療的有効量は、気管支拡張を生じるのに必要とされる量である。これに対して、「有効量」という用語は、必ずしも治療結果ではあり得ないが、望ましい結果を得るために十分な量を意味する。たとえばムスカリン受容体を含む系を試験するときに、「有効量」は受容体を拮抗するのに必要とされる量であり得る。
【００２６】
「処置すること」または「処置」という用語は、本明細書で使用する場合：（ａ）疾患もしくは病状が出現するのを防止すること、すなわち患者の予防処置；（ｂ）患者における疾患もしくは病状を消滅すること、または疾患もしくは病状の後退を引き起こすことなどによって、疾患もしくは病状を改善することと；（ｃ）患者における疾患または病状の発症を減速もしくは停止することなどによって、疾患もしくは病状を抑制することと；または（ｄ）患者における疾患もしくは病状の症候を緩和することと；を含む、哺乳動物（特にヒト）などの患者における疾患もしくは病状（ＣＯＰＤなど）を処置することまたは疾患もしくは病状の処置を意味する。たとえば「ＣＯＰＤを処置すること」という用語は、ＣＯＰＤが出現するのを防止すること、ＣＯＰＤを改善すること、ＣＯＰＤを抑制すること、およびＣＯＰＤの症候を改善することを含むであろう。「患者」という用語は、処置もしくは疾患防止を必要とする、または特異的疾患もしくは病状の疾患防止もしくは処置のために現在処置されている、ヒトなどのこのような哺乳動物を含むことが意図される。「患者」という用語は、本発明の化合物が評価されている試験対象またはアッセイで使用されている試験対象、たとえば動物モデルも含む。
【００２７】
合成
本発明の結晶性遊離塩基形は、下および実施例に記載されているような、ただちに利用可能な開始材料から合成されることができる。各結晶性遊離塩基形を生じるために使用できる複数の方法があるが、しかし結晶含有量ならびに結晶の晶癖（サイズおよび形状）が、一部は調製方法、ならびに溶媒組成物に基づいて変動し得ることに注目される。
【００２８】
特異的プロセス条件（すなわち結晶化温度、時間、反応物質のモル比、溶媒、圧力など）が与えられるが、別途明示されない限り、他のプロセス条件も使用できることが認識されるであろう。いくつかの例において、反応または結晶化は室温にて実行され、実際の温度測定は行われなかった。室温は実験室環境における周囲温度に一般に関連する範囲内の温度を意味するとして解釈することができ、通例、約２５℃から約５０℃の範囲内にあるであろうことが理解される。他の例において、反応または結晶化は室温にて実行され、温度は実際に測定および記録された。すべての重量、体積および等価物は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（または塩形）開始材料に関係する。
【００２９】
概して、結晶化は好適な不活性希釈剤または溶媒系において実行され、この例は、これに限定されるわけではないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、酢酸エチル、アセトニトリル、ジクロロメタン、メチルｔ−ブチルエーテルなど、およびその混合物を含む。上述のいずれの結晶化の完了時にも、沈殿、濃縮、遠心分離などのいずれの従来手段によっても、結晶性化合物を反応混合物から単離することができる。
【００３０】
本発明で用いられるビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル、ならびに２リン酸塩などのその塩は、市販の開始材料および試薬から、実施例に記載された手順を使用して、またはＭａｍｍｅｎらへの米国特許公開第２００５／０２０３１３３号およびＡｘｔらへの米国特許公開第２００７／０１１２０２７号に記載された手順を使用して、ただちに調製することができる。
【００３１】
本発明の方法に記載されたモル比は、当業者に利用可能な各種の方法によってただちに決定できる。たとえばこのようなモル比は、１Ｈ  ＮＭＲによってただちに決定することができる。代わりに元素分析およびＨＰＬＣ法を使用して、モル比を決定することができる。
【００３２】
ＩＩＩ形
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルのＩＩＩ形の結晶性遊離塩基は、エステルまたはエステルの２リン酸塩から調製することができる。
【００３３】
１実施形態において、ＩＩＩ形結晶性遊離塩基は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルをアセトニトリルと接触させることによって調製される。通例、エステルのミリグラムの、アセトニトリルの総ミリリットルに対する比は約１００：１であり、アセトニトリルは２ステップで添加される。概して、本反応は、０〜４０℃の温度範囲を反復してサイクルしながら実行される。固体は次に、真空濾過によって単離され、乾燥される。
【００３４】
別の実施形態において、ＩＩＩ形結晶性遊離塩基は、ＩＩＩ形結晶性遊離塩基の種晶およびエステルの２リン酸塩を使用して調製される。本方法は：ａ）結晶性遊離塩基ＩＩＩ形の種晶を形成すること；ｂ）ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの２リン酸塩を酢酸イソプロピルおよび水に溶解させて溶液を形成すること；ｃ）ならびに種晶を溶液に添加することを包含する。さらに明確には、エステルの２リン酸塩（１重量）は、窒素下２０±３℃にて酢酸イソプロピル（１７．５体積）および水（１０体積）中でスラリー化される。懸濁剤は５３±３℃まで加温され、１０Ｍ  ＮａＯＨ（０．５体積）が添加される。混合物はその温度にて短時間撹拌され、次に層が分離されて、塩基性水層が除去される。水（５体積）が有機層に添加され、撹拌される。層が分離され、水層が除去される。酢酸イソプロピル（１７．５体積）が添加され、約１０体積の蒸留液が常圧蒸留によって収集される。本ステップは追加の酢酸イソプロピル（１０体積）を用いて反復される。２回目の蒸留の後、透明溶液の温度を５３±３℃まで低下されて、次に酢酸イソプロピル（０．０８体積）による結晶性遊離塩基ＩＩＩ形（０．００５重量；０．５重量％）の懸濁剤を用いて種晶が添加される。得られた懸濁剤は、５３±３℃にて少なくとも２時間撹拌され、次に０．１９℃／分のおよその冷却速度にて１０±３℃まで冷却される。懸濁剤は１０±３℃にて少なくとも２時間撹拌され、次に濾過により収集される。得られた濾過ケーキは酢酸イソプロピル（２×３体積）によって洗浄され、生成物は次に乾燥されてＩＩＩ形結晶性遊離塩基を産する。
【００３５】
ＩＶ形
１実施形態において、ＩＶ形結晶性遊離塩基はＩＩＩ形結晶性遊離塩基の種晶を使用して調製される。本方法は：ａ）結晶性遊離塩基ＩＩＩ形の種晶を形成すること；ｂ）結晶性遊離塩基ＩＩＩ形をアセトニトリルに溶解させて溶液を形成すること；ｃ）および種晶を溶液に添加することを包含する。通例、種のエステルに対する重量比は、約２：２５０の範囲にある。通例、結晶性遊離塩基ＩＩＩ形のグラムの、アセトニトリルの総ミリリットルに対する比は約２：１０から３：３０の範囲内にあり、２．５：１６は１つの範囲である。アセトニトリルは通常、複数の一定分量で添加される。概して、本反応は、０〜４０℃の温度範囲を反復してサイクルしながら実行される。固体は次に、真空濾過によって単離され、乾燥される。
【００３６】
結晶特性
粉末Ｘ線回折の分野で周知であるように、粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）スペクトルの相対ピーク高さは、試料調製および機器形状に関するいくつかの因子に依存しているが、ピーク位置は実験の詳細事項に比較的非感受性である。結晶性遊離塩基ＩＩＩ形およびＩＶ形のＰＸＲＤパターンは、実施例５で記述されるように得られた。それゆえ１実施形態において、本発明の結晶性化合物は、あるピーク位置を有するＰＸＲＤパターンを特徴とする。
【００３７】
本発明の各結晶性遊離塩基形は異なるＰＸＲＤパターンを呈するが、パターンはある共通のピークを有する。それゆえ１実施形態において、本発明は、６．６±０．１、１３．１±０．１、１８．６±０．１、１９．７±０．１、および２０．２±０．１から選択される２θ値に回折ピークを備える粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基形に関する。
【００３８】
１実施形態において、結晶性遊離塩基ＩＩＩ形は、６．６±０．１、１３．１±０．１、１８．６±０．１、１９．７±０．１、および２０．２±０．１の２θ値に回折ピークを備える粉末Ｘ線回折パターンを特徴とし；ならびに８．８±０．１、１０．１±０．１、１１．４±０．１、１１．６±０．１、１４．８±０．１、１５．２±０．１、１６．１±０．１、１６．４±０．１、１６．９±０．１、１７．５±０．１、１８．２±０．１、１９．３±０．１、１９．９±０．１、２０．８±０．１、２１．１±０．１、２１．７±０．１、および２２．３±０．１から選択される２θ値に５つ以上の追加の回折ピークを有することをさらに特徴とする。別の実施形態において、結晶性遊離塩基ＩＩＩ形は、６．６±０．１、１１．４±０．１、１３．１±０．１、１６．１±０．１、１７．５±０．１、１８．２±０．１、１８．６±０．１、１９．３±０．１、１９．７±０．１、１９．９±０．１、２０．２±０．１、２０．８±０．１、２１．１±０．１、２１．７±０．１、および２２．３±０．１から選択される２θ値に回折ピークを備える粉末Ｘ線回折を特徴とする。また別の実施形態において、結晶性遊離塩基ＩＩＩ形は、ピーク位置が図１に示すピーク位置に実質的に従うＰＸＲＤパターンを特徴とする。
【００３９】
１実施形態において、結晶性遊離塩基ＩＶ形は、６．６±０．１、１３．１±０．１、１８．６±０．１、１９．７±０．１、および２０．２±０．１の２θ値に回折ピークを備える粉末Ｘ線回折パターンを特徴とし；ならびに１０．６±０．１、１５．０±０．１、１６．０±０．１、１７．３±０．１、１７．７±０．１、２０．９±０．１、２１．４±０．１、２２．６±０．１、２４．６±０．１、および２７．８±０．１から選択される２θ値に５つ以上の追加の回折ピークを有することをさらに特徴とする。別の実施形態において、結晶性遊離塩基ＩＶ形は、６．６±０．１、１３．１±０．１、１５．０±０．１、１７．３±０．１、１７．７±０．１、１８．６±０．１、１９．７±０．１、２０．２±０．１、２０．９±０．１、２１．４±０．１、および２２．６±０．１から選択される２θ値に回折ピークを備える粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする。また別の実施形態において、結晶性遊離塩基ＩＶ形は、ピーク位置が図２に示すピーク位置に実質的に従うＰＸＲＤパターンを特徴とする。
【００４０】
また別の実施形態において、本発明の結晶性遊離塩基は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムを特徴とする。ＤＳＣサーモグラムは、実施例６で記述されるように得られた。本明細書で報告する融点は、ＤＳＣ分析の間に登録された溶融開始に基づいて推定される。それゆえ１実施形態において、本発明の結晶性化合物は、そのＤＳＣサーモグラフを特徴とする。１実施形態において、結晶性遊離塩基ＩＩＩ形は、図４に見られるように、約１２３℃の吸熱熱流の開始および約１２５℃の融点を示すＤＳＣサーモグラフを特徴とする。別の実施形態において、結晶性遊離塩基ＩＶ形は、図５に見られるように、約６６℃の吸熱熱量の１つの開始、約１１９℃の吸熱熱量の第２の開始、および約１１９℃の融点を示すＤＳＣサーモグラフを特徴とする。
【００４１】
熱重量分析（ＴＧＡ）は、実施例６に記載されているように、本発明の結晶性遊離塩基形に対して行われた。それゆえ１実施形態において、結晶性遊離塩基はＴＧＡトレースを特徴とする。１実施形態において、結晶性遊離塩基ＩＩＩ形は、図６に描かれたＴＧＡトレースを特徴とする。別の実施形態において、結晶性遊離塩基ＩＶ形は、図７に描かれたＴＧＡトレースを特徴とする。
【００４２】
蒸気収着重量測定（ＧＶＳ）アセスメントは、実施例７に記載されているように、本発明の結晶性遊離塩基形に対して行われた。本発明の結晶性遊離塩基形は、許容され得るレベルの吸湿性を有する可逆性収着／脱着プロフィールを有することが証明されている。たとえば結晶性遊離塩基ＩＩＩ形は、２５℃にて０％と９０％の間の相対湿度で＜２重量／重量％の可逆性水取込みを示した。加えて、結晶性遊離塩基ＩＩＩ形は、高温および湿度への曝露時に安定であることが見出されている。
【００４３】
本発明の結晶性遊離塩基形のこれらの特性は、下の実施例でさらに例証される。
【００４４】
有用性
式Ｉの化合物はムスカリン受容体アンタゴニスト活性を所有し、およびそのため式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基形は、ムスカリン受容体によって媒介される病状、すなわちムスカリン受容体アンタゴニストによる処置によって改善される病状を処置するように有用であることが期待される。このような病状は、１例として、慢性閉塞性肺疾患（たとえば慢性および喘鳴を伴う気管支炎ならびに気腫）、喘息、肺線維症、アレルギー性鼻炎、鼻漏などの可逆性気道閉塞に関連するものを含む、肺障害または疾患を含む。ムスカリン受容体アンタゴニストによって処置することができる他の病状は、過活動膀胱または排尿筋機能亢進ならびにその症候などの尿生殖路障害；過敏性腸症候群、憩室性疾患、アカラシア、胃腸過剰運動性障害および下痢などの胃腸管障害；洞性徐脈などの心不整脈；パーキンソン病；アルツハイマー病などの認知障害；月経困難（ｄｉｓｍｅｎｏｒｒｈｅａ）；などである。
【００４５】
したがって、１実施形態において、本発明は、肺障害を処置する方法であって、患者に治療的有効量のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基を投与することを含む方法に関する。肺障害を処置するために使用されるとき、本発明の結晶性遊離塩基は通例、１日に付き複数回用量で、１日１回用量でまたは週１回用量で吸入により投与されるであろう。概して、肺障害を処置するための用量は、約１０μｇ／日から２００μｇ／日の範囲に及ぶであろう。
【００４６】
吸入によって投与されるとき、本発明の結晶性遊離塩基は通例、気管支拡張を生じる効果を有するであろう。したがって、別の実施形態において、本発明は、患者に気管支拡張を生じる方法であって、患者に気管支拡張を生じる量のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基を投与することを含む方法に関する。概して、気管支拡張を生じるための治療的有効用量は、約１０μｇ／日から２００μｇ／日の範囲に及ぶであろう。
【００４７】
１実施形態において、本発明は、慢性閉塞性肺疾患または喘息を処置する方法であって、患者に治療的有効量のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基を投与することを含む方法に関する。
【００４８】
ＣＯＰＤまたは喘息を処置するために使用されるとき、本発明の結晶性遊離塩基は通例、１日に付き複数回用量でまたは１日１回用量で吸入により投与されるであろう。概して、ＣＯＰＤまたは喘息を処置するための用量は、約１０μｇ／日から２００μｇ／日の範囲に及ぶであろう。本明細書で使用する場合、ＣＯＰＤは慢性閉塞性気管支炎および気腫を含む（たとえばＢａｒｎｅｓ，Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３４３：２６９−７８（２０００）を参照）。
【００４９】
肺障害を処置するために使用されるとき、本発明の結晶性遊離塩基は、場合により他の治療剤と組合せて投与される。したがって、特定の実施形態において、本発明の製薬組成物および方法は、治療的有効量のβ２−アドレナリン受容体アゴニスト、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、またはその組合せをさらに含む。
【００５０】
別の実施形態において、本発明の結晶性遊離塩基は、生物系、および特にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒトなどの哺乳動物においてムスカリン受容体を拮抗するのに使用される。本実施形態において、治療的有効量の本発明の結晶性遊離塩基が哺乳動物に投与される。所望ならば次にムスカリン受容体を拮抗する効果を、従来の手順および機器を使用して決定することができる。
【００５１】
ムスカリン受容体拮抗活性などの、本発明の結晶性遊離塩基の特性および有用性は、当業者に周知である各種のインビトロおよびインビボアッセイを使用して証明することができる。たとえば、代表的なアッセイは、以下の実施例でさらに詳細に記載されており、限定するのではなく例証として、（たとえばアッセイ１に記載されているような）ｈＭ１、ｈＭ２、ｈＭ３、ｈＭ４、およびｈＭ５ムスカリン受容体結合を測定するアッセイを含む。本発明の結晶性遊離塩基のムスカリン受容体拮抗活性を決定するための有用な機能アッセイは、限定するのではなく例証として、細胞内環状アデノシン１リン酸（ｃＡＭＰ）におけるリガンド媒介変化、（ｃＡＭＰを合成する）酵素アデニリルシクラーゼの活性におけるリガンド媒介変化、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳのＧＤＰとの受容体触媒交換を介した、グアノシン５’−Ｏ−（γ−チオ）３リン酸（［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ）の単離膜中への組み入れにおけるリガンド媒介変化、（たとえば蛍光連結イメージング・プレート・リーダーまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．からのＦＬＩＰＲ（登録商標）によって測定された）遊離細胞内カルシウムイオンにおけるリガンド媒介変化などを測定するアッセイを含む。例示的なアッセイは、アッセイ２に記載されている。結晶性遊離塩基は、上に挙げたアッセイのいずれか、または類似の性質のアッセイにおいてムスカリン受容体の活性化を拮抗または低下することが期待され、通例、これらの試験では約０．１から１００ナノモルの範囲に及ぶ濃度にて使用されるであろう。それゆえ上述のアッセイは、本発明の結晶性遊離塩基の治療有用性、たとえば気管支拡張活性を決定するのに有用である。
【００５２】
本発明の結晶性遊離塩基の他の特性および有用性は、当業者に周知である各種のインビトロおよびインビボアッセイを使用して証明することができる。たとえば、結晶性遊離塩基のインビボ効力は、アイントホーフェンモデルなどの動物モデルで測定することができる。簡潔には、結晶性遊離塩基の気管支拡張活性は、気道抵抗の代替尺度として通気圧を使用する麻酔された動物（アイントホーフェンモデル）において評価される。たとえばＥｉｎｔｈｏｖｅｎ（１８９２）Ｐｆｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．５１：３６７−４４５；およびＭｏｈａｍｍｅｄら（２０００）Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．１３（６）：２８７−９２、ならびにラットのアイトホーフェンモデルについて記載しているアッセイ３を参照。別の有用なインビボアッセイは、（たとえばアッセイ４に記載されているような）ラット唾液分泌抑制アッセイである。
【００５３】
製薬組成物および製剤
本発明の結晶性遊離塩基は通例、患者に製薬組成物または製剤の形で投与される。このような製薬組成物は、これに限定されるわけではないが、吸入、経口、鼻内、局所（経皮を含む）および非経口の投与方式を含む、いずれかの許容され得る投与経路によって投与され得る。しかし、本発明の結晶性遊離塩基がいったん製剤化されると、これはもはや結晶形ではない場合がある、すなわち結晶性遊離塩基は好適な担体に溶解され得ることが当業者によって理解されるであろう。
【００５４】
したがって、１実施形態において、本発明は、製薬的に許容され得る担体または賦形剤およびビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基を含む製薬組成物に関する。製薬組成物は所望ならば、他の治療剤および／または製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含有し得る。
【００５５】
本発明の製薬組成物は通例、治療的有効量のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基を活性剤として含有する。通例、このような製薬組成物は約０．０１から約３０重量％；たとえば約０．０１から約１０重量％の活性剤を含む、約０．０１から約９５重量％の活性剤を含有するであろう。
【００５６】
いずれの従来の担体または賦形剤も本発明の製薬組成物で使用され得る。特定の担体もしくは賦形剤、または担体もしくは賦形剤の組合せの選出は、特定の患者または病状もしくは疾患状態の種類を処置するために使用されている投与方式に依存するであろう。この点で、特定の投与方式のための好適な製薬組成物の調製は、十分に製薬分野の当業者の範囲内である。加えて、このような組成物の成分は、たとえばＳｉｇｍａ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ
１４５０８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  ６３１７８から市販されている。さらなる例証として、従来の製剤化技法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｈｉｔｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（２０００）；およびＨ．Ｃ．Ａｎｓｅｌら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｈｉｔｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９９９）に記載されている。
【００５７】
製薬的に許容され得る担体として役目を果たすことができる材料の代表的な例は、これに限定されるわけではないが、以下の：ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロースならびにナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張性生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝生理食塩水；クロロフルオロカーボンおよびヒドロフルオロカーボンなどの圧縮噴射ガス；ならびに製薬組成物で用いられる他の非毒性適合性物質を含む。
【００５８】
本発明の製薬組成物は通例、結晶性遊離塩基を製薬的に許容され得る担体および１つ以上の任意の成分と完全および密接に混合またはブレンドすることによって調製される。必要または所望ならば、得られた均一にブレンドされた混合物を次に、従来の手順および機器を使用して、錠剤、カプセル剤、丸剤に成形、またはキャニスター、カートリッジ、ディスペンサーなどに装入することができる。
【００５９】
１実施形態において、本発明の製薬組成物は吸入投与に好適である。吸入投与の好適な製薬組成物は通例、エアゾール剤または粉剤の形であるだろう。このような組成物は概して、ネブライザ吸入器、定量吸入器（ＭＤＩ）、ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）などの周知の送達デバイスまたは類似の送達デバイスを使用して投与される。
【００６０】
本発明の詳細な実施形態において、活性剤を含む製薬組成物は、ネブライザ吸入器を使用する吸入によって投与される。このようなネブライザデバイスは通例、活性剤を含む製薬組成物をミストとして噴霧して、患者の気道中に運ばれるようにする、高速気流を生じる。したがってネブライザ吸入器で使用するために製剤化されるとき、結晶性遊離塩基活性剤は通例、好適な担体に溶解されて溶液を形成する。好適なネブライザデバイスは、Ｒｅｓｐｉｍａｔ（登録商標）Ｓｏｆｔ  Ｍｉｓｔ（商標）吸入器（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＡＥＲｘ（登録商標）肺送達システム（Ａｒａｄｉｇｍ  Ｃｏｒｐ．）、およびＰＡＲＩ  ＬＣ  Ｐｌｕｓリユーザブルネブライザ（Ｐａｒｉ  ＧｍｂＨ）を含む。
【００６１】
ネブライザ吸入器での使用のための代表的な製薬組成物は、約０．０５μｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬの本発明の結晶性遊離塩基を含む等張性水溶液を含む。１実施形態において、水性ネブライザ製剤は等張性である。１実施形態において、このような溶液は約４〜６のｐＨを有する。特定の実施形態において、水性ネブライザ製剤は、クエン酸緩衝剤によって約５のｐＨまで緩衝される。別の特定の実施形態において、水性製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１．０ｍｇ／ｍＬの、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの遊離塩基等価物を含有する。
【００６２】
本発明の別の詳細な実施形態において、活性剤を含む製薬組成物は、ＤＰＩを使用する吸入によって投与される。このようなＤＰＩは通例、活性剤を吸息の間に患者の気流に分散された自由流動パウダーとして投与する。自由流動パウダーを達成するために、結晶性遊離塩基活性剤は通例、ラクトース、デンプン、マンニトール、デキストロース、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコリド、およびその組合せなどの好適な賦形剤を用いて製剤化される。微粉化は、結晶サイズを肺送達に好適なサイズまで減少させる一般的な方法である。通例、結晶性遊離塩基活性剤は微粉化され、好適な担体と組合されて呼吸可能なサイズの微粉化粒子の懸濁剤を形成し、「微粉化粒子」または「微粉化形」は、少なくとも約９０％の粒子が約１０μｍ未満の直径を有することを意味する。微細製粉、切刻み、圧壊、破砕、製粉、ふるい分け、粉砕、微粉砕などの粒径を減少させる他の方法も、所望の粒径を得ることができる限り使用され得る。
【００６３】
ＤＰＩでの使用のための代表的な製薬組成物は、約１μｍから約１００μｍの間の粒径を有する無水ラクトースおよび本発明の結晶性遊離塩基の微粉化粒子を含む。このようなドライパウダー製剤はたとえば、ラクトースを結晶性遊離塩基活性剤と組合せること、および次に構成要素を乾燥ブレンドすることによって作製することができる。代わりに、所望ならば、賦形剤を用いずに結晶性遊離塩基活性剤を製剤化することができる。製薬組成物は次に通例、ドライ・パウダー・ディスペンサー中に、またはドライパウダー送達デバイスでの使用のために吸入カートリッジもしくはカプセル剤の中に装入される。
【００６４】
ＤＰＩ送達デバイスの例は、Ｄｉｓｋｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ；たとえばＮｅｗｅｌｌらへの米国特許第５，０３５，２３７号を参照）；Ｄｉｓｋｕｓ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；たとえばＤａｖｉｅｓらへの米国特許第６，３７８，５１９号を参照）；Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ；たとえばＷｅｔｔｅｒｌｉｎへの米国特許第４，５２４，７６９号を参照）；Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；たとえばＨａｌｌｗｏｒｔｈらへの米国特許第４，３５３，３６５号を参照）およびＨａｎｄｉｈａｌｅｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を含む。好適なＤＰＩデバイスのさらなる例は、Ｃａｓｐｅｒらへの米国特許第５，４１５，１６２号、Ｅｖａｎｓへの同第５，２３９，９９３号、およびＡｒｍｓｔｒｏｎｇらへの同第５，７１５，８１０号、およびそこで引用された参考文献に記載されている。上述の特許の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【００６５】
本発明のまた別の詳細な実施形態において、結晶性遊離塩基活性剤を含む製薬組成物は、通例、測定された量の活性剤を、圧縮噴射ガスを使用して放出するＭＤＩを使用する吸入によって投与される。したがって、ＭＤＩを使用して投与される製薬組成物は通例、液化噴射剤による結晶性遊離塩基活性剤の溶液または懸濁剤を含む。ＣＣｌ３Ｆなどのクロロフルオロカーボン、ならびに１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４ａ）および１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパン（ＨＦＡ  ２２７）などのヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）を含む、いずれの好適な液化噴射剤も用いられ得る。オゾン層に影響を及ぼすクロロフルオロカーボンについての懸念のために、ＨＦＡを含有する製剤が概して好ましい。ＨＦＡ製剤の追加の任意の構成要素は、エタノールまたはペンタンなどの共溶媒、ならびにトリオレイン酸ソルビタン、オレイン酸、レシチン、およびグリセリンなどの界面活性剤を含む。たとえばＰｕｒｅｗａｌらへの米国特許第５，２２５，１８３号、ＥＰ  ０７１７９８７  Ａ２（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、およびＷＯ  ９２／２２２８６（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ
Ｃｏｍｐａｎｙを参照、それらの開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【００６６】
定量吸入器での使用のための代表的な製薬組成物は、約０．０１〜５重量％の本発明の遊離塩基結晶性化合物；約０〜２０重量％のエタノール；および約０〜５重量％の界面活性剤を含む；残りはＨＦＡ噴射剤である。
【００６７】
このような組成物は通例、冷却または加圧されたヒドロフルオロアルカンを結晶性遊離塩基活性剤、エタノール（存在する場合）および界面活性剤（存在する場合）を含有する好適な容器に添加することによって調製される。懸濁剤を調製するために、結晶性遊離塩基活性剤は微粉化され、次に噴射剤と組合される。製剤は次に、定量吸入器デバイスの部分を形成するエアゾールキャニスター中に装入される。ＨＦＡ噴射剤を用いた使用のために明確に開発された定量吸入デバイスの例は、Ｍａｒｅｃｋｉへの米国特許第６，００６，７４５号および同第Ａｓｈｕｒｓｔらへの６，１４３，２７７号に記載されている。代わりに懸濁製剤は、活性剤の微粉化粒子に界面活性剤のコーティングを噴霧乾燥することによって調製できる。たとえばＷＯ  ９９／５３９０１（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）およびＷＯ  ００／６１１０８（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）を参照。上述の特許および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【００６８】
吸入投薬に好適な呼吸可能な粒子、ならびに製剤およびデバイスを調製するプロセスの追加の例については、Ｇａｏへの米国特許第６，２６８，５３３号、Ｔｒｏｆａｓｔへの同第５，９８３，９５６号；Ｂｒｉｇｇｎｅｒらへの同第５，８７４，０６３号；およびＪａｋｕｐｏｖｉｃらへの同第６，２２１，３９８号；ならびにＷＯ  ９９／５５３１９（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）およびＷＯ  ００／３０６１４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  ＡＢ）を参照；その開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【００６９】
別の実施形態において、本発明の製薬組成物は経口投与に好適である。経口投与の好適な製薬組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、ロゼンジ剤、カシェ剤、糖衣錠、粉剤、顆粒剤の形で；水性もしくは非水性液体による液剤もしくは懸濁剤として；または水中油型もしくは油中水型液体乳剤として；またはエリキシル剤もしくはシロップ剤としてなどであり得て；それぞれ所定量の本発明の結晶性遊離塩基を活性成分として含有する。製薬組成物は単位投薬形で包装され得る。
【００７０】
固体投薬形（すなわちカプセル剤、錠剤、丸剤などとして）の経口投与が意図されるとき、本発明の製薬組成物は通例、活性成分としての本発明の結晶性遊離塩基ならびにクエン酸ナトリウムおよびリン酸２カルシウムなどの１つ以上の製薬的に許容され得る担体を含む。場合によりまたは代わりに、このような固体投薬形は：デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤または増量剤；カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴムなどの結合剤；グリセロールなどの保湿剤；寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、あるケイ酸塩、および／または炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；パラフィンなどの溶解遅延剤；４級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；セチルアルコールおよび／またはモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤；カオリンおよび／またはベントナイト粘土などの吸収剤；タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、および／またはその混合物などの潤滑剤；着色剤；ならびに緩衝剤も含み得る。
【００７１】
離型剤、湿潤剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および香料、保存料ならびに酸化防止剤も、本発明の製薬組成物中に存在することができる。製薬的に許容され得る酸化防止剤の例は：アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウムなどの水溶性酸化防止剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの油溶性酸化防止剤；およびクエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤などを含む。錠剤、カプセル剤、丸剤などのコーティング剤は、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、酢酸フタル酸ポリビニル（ＰＶＡＰ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸−メタクリル酸エステルコポリマー、酢酸トリメリト酸セルロース（ＣＡＴ）、カルボキシメチルエチルセルロース（ＣＭＥＣ）、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＡＳ）などの腸溶コーティングに使用されるコーティング剤を含む。
【００７２】
所望ならば本発明の製薬組成物は、１例として、変動比のヒドロキシプロピルメチルセルロース；または他のポリマーマトリクス、リポソームおよび／もしくはミクロスフェアを使用して、活性成分の低速または制御放出を提供するようにも製剤化され得る。
【００７３】
加えて、本発明の製薬組成物は、場合により乳白剤を含有し得て、製薬組成物が胃腸管のある部分において、場合により遅延方式で活性成分のみを、または活性成分を優先的に放出するように製剤化され得る。使用できる包埋組成物（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）の例は、ポリマー物質およびワックスを含む。結晶性遊離塩基活性成分は、適切な場合、１つ以上の上記の賦形剤を用いたマイクロカプセル化形であることもできる。
【００７４】
経口投与に好適な液体投薬形は、例証として、製薬的に許容され得る乳剤、マイクロエマルション、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤を含む。このような液体投薬形は通例、活性成分ならびにたとえば水または他の溶媒などの不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（とりわけ綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにその混合物などの可溶化剤および乳化剤を含む。懸濁剤は、活性成分に加えて、たとえばエトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにその混合物などの懸濁化剤を含有し得る。
【００７５】
本発明の結晶性遊離塩基は、公知の経皮送達系および賦形剤を使用して経皮投与することもできる。たとえば結晶性遊離塩基は、プロピレングリコール、モノラウリン酸ポリエチレングリコール、アザシクロアルカン−２−オンなどの浸透促進剤と混和させて、パッチまたは類似の送達系に組み入れることができる。ゲル化剤、乳化剤および緩衝剤を含む追加の賦形剤は、所望ならばこのような経皮組成物で使用され得る。
【００７６】
本発明の結晶性遊離塩基は、他の治療剤と共に同時投与することもできる。本併用療法は、共に製剤化された（たとえば単一の製剤に共に包装された）または別々に製剤化された（たとえば別々の単位投薬形として包装された）どちらかの、これらの第２の薬剤の１つ以上と組合された結晶性遊離塩基を使用することを包含する。同一製剤でまたは別々の単位投薬形で複数の薬剤を共に製剤化する方法は、当分野で周知である。「単位投薬形」という用語は、患者に投薬するのに好適な物理的に別個の単位を指し、すなわち各単位は、単独でまたは１つ以上の追加の単位と組合されてのどちらかで、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の本発明の化合物を含有する。たとえばこのような単位投薬形は、カプセル剤、錠剤、丸剤などであり得る。
【００７７】
追加の治療剤は、他の気管支拡張薬（たとえばＰＤＥ３阻害剤、アデノシン２ｂ調節因子およびβ２アドレナリン受容体アゴニスト）；抗炎症剤（たとえばコルチコステロイドなどのステロイド性抗炎症剤；非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、およびＰＤＥ４阻害剤）；他のムスカリン受容体アンタゴニスト（すなわち抗コリン作用薬（ａｎｔｉｃｈｌｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）；抗感染剤（たとえばグラム陽性およびグラム陰性抗生剤または抗ウイルス薬）；抗ヒスタミン薬；プロテアーゼ阻害剤；および求心性遮断薬（たとえばＤ２アゴニストおよびニューロキニン調節因子）から選択することができる。
【００７８】
本発明の特定の１実施形態は、（ａ）製薬的に許容され得る担体および治療的有効量の本発明の結晶性遊離塩基；ならびに（ｂ）製薬的に許容され得る担体および治療的有効量の、コルチコステロイドなどのステロイド性抗炎症剤；β２アドレナリン受容体アゴニスト；ホスホジエステラーゼ−４阻害剤；またはその組合せ；から選択される薬剤を含み、結晶性遊離塩基および薬剤が共にまたは個別に製剤化される、製薬組成物に関する。別の実施形態において、（ｂ）は、製薬的に許容され得る担体ならびに治療的有効量のβ２アドレナリン受容体アゴニストおよびステロイド性抗炎症剤である。第２の薬剤は、製薬的に許容され得る塩または溶媒和物の形で、および適切な場合、光学的に純粋な立体異性体として使用することができる。
【００７９】
本発明の結晶性遊離塩基と組合せて使用することができる代表的なβ２アドレナリン受容体アゴニストは、これに限定されるわけではないが、サルメテロール、サルブタモール、フォルモテロール、サルメファモール、フェノテロール、テルブタリン、アルブテロール、イソエタリン、メタプロテレノール、ビトルテロール、ピルブテロール、レバルブテロールなど、またはその製薬的に許容され得る塩を含む。使用することができる他のβ２アドレナリン受容体アゴニストは、これに限定されるわけではないが、ＷＯ  ０２／０６６４２２（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）に記載された３−（４−｛［６−（｛（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−［４−ヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）−フェニル］エチル｝アミノ）−ヘキシル］オキシ｝ブチル）ベンゼンスルホンアミドおよび３−（−３−｛［７−（｛（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−［４−ヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）フェニル］エチル｝−アミノ）ヘプチル］オキシ｝−プロピル）ベンゼンスルホンアミドおよび関連化合物；ＷＯ  ０２／０７０４９０（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）に記載された３−［３−（４−｛［６−（［（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−［４−ヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）フェニル］エチル｝アミノ）ヘキシル］オキシ｝ブチル）−フェニル］イミダゾリジン−２，４−ジオンおよび関連化合物；ＷＯ  ０２／０７６９３３（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）に記載された３−（４−｛［６−（｛（２Ｒ）−２−［３−（ホルミルアミノ）−４−ヒドロキシフェニル］−２−ヒドロキシエチル｝アミノ）ヘキシル］オキシ｝ブチル）−ベンゼンスルホンアミド、３−（４−｛［６−（｛（２Ｓ）−２−［３−（ホルミルアミノ）−４−ヒドロキシフェニル］−２−ヒドロキシエチル｝アミノ）ヘキシル］オキシ｝ブチル）−ベンゼンスルホンアミド、３−（４−｛［６−（｛（２Ｒ／Ｓ）−２−［３−（ホルミルアミノ）−４−ヒドロキシフェニル］−２−ヒドロキシエチル｝アミノ）ヘキシル］オキシ｝ブチル）−ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−（ｔ−ブチル）−３−（４−｛［６−（｛（２Ｒ）−２−［３−（ホルミルアミノ）−４−ヒドロキシフェニル］−２−ヒドロキシエチル｝アミノ）ヘキシル］−オキシ｝ブチル）ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（４−｛［６−（｛（２Ｓ）−２−［３−（ホルミルアミノ）−４−ヒドロキシフェニル］−２−ヒドロキシエチル｝アミノ）−ヘキシル］オキシ｝ブチル）−ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（４−｛［６−（｛（２Ｒ／Ｓ）−２−［３−（ホルミルアミノ）−４−ヒドロキシフェニル］−２−ヒドロキシエチル｝アミノ）ヘキシル］−オキシ｝ブチル）ベンゼンスルホンアミドおよび関連化合物；ＷＯ  ０３／０２４４３９（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）に記載された４−｛（１Ｒ）−２−［（６−｛２−［（２，６−ジクロロベンジル）オキシ］エトキシ｝ヘキシル）アミノ］−１−ヒドロキシエチル｝−２−（ヒドロキシメチル）フェノールおよび関連化合物；Ｍｏｒａｎらに対する米国特許第６，５７６，７９３号に記載されたＮ−｛２−［４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−��ェニルエチルアミノ）フェニル］エチル｝−（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（３−ホルムアミド−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミンおよび関連化合物；Ｍｏｒａｎらに対する米国特許第６，６５３，３２３号に記載されたＮ−｛２−［４−（３−フェニル−４−メトキシフェニル）アミノフェニル］エチル｝−（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２（１Ｈ）−キノリノン−５−イル）エチルアミンおよび関連化合物；ならびにその製薬的に許容され得る塩を含む。特定の実施形態において、β２−アドレナリン受容体アゴニストは、Ｎ−｛２−［４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニルエチルアミノ）フェニル］エチル｝−（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（３−ホルムアミド−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミンの結晶性１塩酸塩である。β２−アドレナリン受容体アゴニストは用いられるときに、製薬組成物中に治療的有効量で存在するであろう。通例、β２アドレナリン受容体アゴニストは、用量当り約０．０５μｇ〜５００μｇを提供するのに十分な量で存在するであろう。上述の特許および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【００８０】
本発明の結晶性遊離塩基と組合せて使用することができる代表的なステロイド性抗炎症剤は、これに限定されるわけではないが、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プロピオン酸フルチカゾン、６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソアンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−１７α−プロピオニルオキシ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−（２−オキソ−テトラヒドロフラン−３Ｓ−イル）エステル、ベクロメタゾンエステル（たとえば１７−プロピオン酸エステルまたは１７，２１−ジプロピオン酸エステル）、ブデソニド、フルニソリド、モメタゾンエステル（たとえばフロ酸エステル）、トリアムシノロンアセトニド、ロフレポニド、シクレソニド、プロピオン酸ブチキソコルト、ＲＰＲ−１０６５４１，ＳＴ−１２６など、またはその製薬的に許容され得る塩を含む。ステロイド性抗炎症剤は用いられるときに、組成物中に治療的有効量で存在するであろう。通例、ステロイド性抗炎症剤は、用量当り約０．０５μｇ〜５００μｇを提供するのに十分な量で存在するであろう。
【００８１】
例示的な組合せは、β２アドレナリン受容体アゴニストとしてのサルメテロール、およびステロイド性抗炎症剤としてのプロピオン酸フルチカゾンと同時投与される本発明の結晶性遊離塩基である。別の例示的な組合せは、β２アドレナリン受容体アゴニストとしてのＮ−｛２−［４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニルエチルアミノ）フェニル］エチル｝−（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（３−ホルムアミド−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミンの結晶性１塩酸塩、およびステロイド性抗炎症剤としての６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソアンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステルと同時投与される本発明の結晶性遊離塩基である。上記のように、これらの薬剤は共にまたは別々に製剤化することができる。
【００８２】
他の好適な組合せはたとえば、他の抗炎症剤、たとえばＮＳＡＩＤ（たとえばクロモグリク酸ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、ならびにテオフィリン、ＰＤＥ４阻害剤および混合ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤などのホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤）；ロイコトリエンアンタゴニスト（たとえばモンテルカスト（ｍｏｎｔｅｌｅｕｋａｓｔ））；ロイコトリエン合成の阻害剤；ｉＮＯＳ阻害剤；トリプターゼおよびエラスターゼ阻害剤などのプロテアーゼ阻害剤；ベータ−２インテグリンアンタゴニストおよびアデノシン受容体アゴニストもしくはアンタゴニスト（たとえばアデノシン２ａアゴニスト）；サイトカインアンタゴニスト（たとえばインターロイキン抗体（αＩＬ抗体）、明確にはαＩＬ−４療法、αＩＬ−１３療法、またはその組合せなどのケモカインアンタゴニスト）；またはサイトカイン合成の阻害剤を含む。
【００８３】
本発明の結晶性遊離塩基と組合せて使用することができる代表的なホスホジエステラーゼ−４（ＰＤＥ４）阻害剤または混合ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤は、これに限定されるわけではないが、シス４−シアノ−４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）シクロヘキサン−１−カルボン酸、２−カルボメトキシ−４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル）シクロヘキサン−１−オン；シス−［４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル）シクロヘキサン−１−オール］；シス−４−シアノ−４−［３−（シクロペンチルオキシ）−４−メトキシフェニル］シクロヘキサン−１−カルボン酸など、またはその製薬的に許容され得る塩を含む。他の代表的なＰＤＥ４または混合ＰＤＥ４／ＰＤＥ３阻害剤は、ＡＷＤ−１２−２８１（ｅｌｂｉｏｎ）；ＮＣＳ−６１３（ＩＮＳＥＲＭ）；Ｄ−４４１８（Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）；ＣＩ−１０１８またはＰＤ−１６８７８７（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＷＯ９９／１６７６６（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ）に記載されているベンゾジオキソール化合物；Ｋ−３４（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ）；Ｖ−１１２９４Ａ（Ｎａｐｐ）；ロフルミラスト（Ｂｙｋ−Ｇｕｌｄｅｎ）；ＷＯ９９／４７５０５（Ｂｙｋ−Ｇｕｌｄｅｎ）に記載されているフタラジノン化合物；プマフェントリン（Ｂｙｋ−Ｇｕｌｄｅｎ、現在Ａｌｔａｎａ）；アロフィリン（Ａｌｍｉｒａｌｌ−Ｐｒｏｄｅｓｆａｒｍａ）；ＶＭ５５４／ＵＭ５６５（Ｖｅｒｎａｌｉｓ）；Ｔ−４４０（Ｔａｎａｂｅ  Ｓｅｉｙａｋｕ）；およびＴ２５８５（Ｔａｎａｂｅ  Ｓｅｉｙａｋｕ）を含む。
【００８４】
本発明の結晶性遊離塩基と組合せて使用することができる代表的なムスカリンアンタゴニスト（すなわち抗コリン剤）は、これに限定されるわけではないが、アトロピン、硫酸アトロピン、酸化アトロピン、硝酸メチルアトロピン、臭化水素酸ホマトロピン、臭化水素酸ヒヨスチアミン（ｄ、ｌ）、臭化水素酸スコポラミン、臭化イプラトロピウム、臭化オキシトロピウム、臭化チオトロピウム、メタンテリン、臭化プロパンテリン、臭化メチルアニソトロピン、臭化クリジニウム、コピロレート（ロビヌル）、ヨウ化イソプロパミド、臭化メペンゾラート、塩化トリジヘキセチル（パシロン）、メチル硫酸ヘキソシクリウム、塩酸シクロペントレート、トロピカミド、塩酸トリヘキシフェニジル、ピレンゼピン、テレンゼピン、ＡＦ−ＤＸ１１６およびメトクトラミンなど、もしくはその製薬的に許容され得る塩；または塩として挙げられた化合物では、その代わりの製薬的に許容され得る塩を含む。
【００８５】
本発明の結晶性遊離塩基と組合せて使用することができる代表的な抗ヒスタミン薬（すなわちＨ１受容体アンタゴニスト）は、これに限定されるわけではないが、マレイン酸カルビノキサミン、フマル酸クレマスチン、塩酸ジフェニルヒドラミンおよびジメンヒドリナートなどのエタノールアミン；マレイン酸ピリラミン（ｐｙｒｉｌａｍｉｎｅ  ａｍｌｅａｔｅ）、塩酸トリペレナミンおよびクエン酸トリペレナミンなどのエチレンジアミン；クロルフェニラミンおよびアクリバスチンなどのアルキルアミン；塩酸ヒドロキシジン、パモ酸ヒドロキシジン、塩酸シクリジン、乳酸シクリジン、塩酸メクリジンおよび塩酸セチリジンなどのピペラジン；アステミゾール、塩酸レボカバスチン、ロラタジンまたはそのデスカルボエトキシ類似体、テルフェナジンおよび塩酸フェキソフェナジンなどのピペリジン；塩酸アゼラスチン；など、もしくはその製薬的に許容され得る塩；または塩として挙げられた化合物では、その代わりの製薬的に許容され得る塩を含む。
【００８６】
別途指摘されない限り、本発明の結晶性遊離塩基と組合せて投与される他の治療剤の例示的な好適な用量は、約０．０５μｇ／日〜１００ｍｇ／日の範囲にある。
【００８７】
以下の製剤は、本発明の代表的な製薬組成物、ならびに例示的な調製方法を例証する。１つ以上の第２の薬剤は場合により、本発明の結晶性遊離塩基（第１の活性剤）と共に製剤化することができる。代わって、第２の薬剤は別々に製剤化されて、第１の活性剤と同時にまたは連続して、共に投与することができる。たとえば、１実施形態において、単一のドライパウダー製剤は、本発明の結晶性遊離塩基および１つ以上の第２の薬剤をどちらも含むように製造することができる。別の実施形態において、１つの製剤が本発明の結晶性遊離塩基を含有するように製造され、別々の製剤が第２の薬剤を含有するように製造される。このようなドライパウダー製剤は次に、別々のブリスターパックに包装されて、単一のＤＰＩデバイスによって投与することができる。
【００８８】
吸入投与のための例示的なドライパウダー製剤
０．２ｍｇの本発明の結晶性遊離塩基は微粉化され、次に２５ｍｇのラクトースとブレンドされる。ブレンドされた混合物は次に、ゼラチン吸入カートリッジに装入される。カートリッジの内容物は、粉剤吸入器を使用して投与される。
【００８９】
ドライパウダー吸入器による投与のための例示的なドライパウダー製剤
本発明の微粉化結晶性遊離塩基（活性剤）のラクトースに対する、１：２００のバルク製剤比を有するドライパウダーが調製される。パウダーは、用量当り約１０μｇ〜１００μｇの活性剤を送達することができるドライパウダー吸入デバイスに充填される。
【００９０】
定量吸入器による投与のための例示的な製剤
５重量％の本発明の結晶性遊離塩基（活性剤）および０．１重量％のレシチンを含有する懸濁剤は、１０ｇの結晶性遊離塩基を１０μｍ未満の平均径を有する微粉化粒子として、２００ｍＬの脱塩水に溶解された０．２ｇのレシチンから形成された溶液に分散させることによって調製される。懸濁剤は噴霧乾燥され、得られた材料は１．５μｍ未満の平均直径を有する粒子に微粉化される。粒子は、加圧された１，１，１，２−テトラフルオロエタンと共にカートリッジに装入される。
【００９１】
代わって、５重量％の本発明の結晶性遊離塩基、０．５重量％のレシチン、および０．５重量％のトレハロースを含有する懸濁剤は、５ｇの結晶性遊離塩基を１０μｍ未満の平均径を有する微粉化粒子として、１００ｍＬの脱塩水に溶解された０．５ｇのトレハロースおよび０．５ｇのレシチンから形成されたコロイド状溶液に分散させることによって調製される。懸濁剤は噴霧乾燥され、得られた材料は１．５μｍ未満の平均直径を有する粒子に微粉化される。粒子は、加圧された１，１，１，２−テトラフルオロエタンと共にキャニスターに装入される。
【００９２】
ネブライザによる投与のための例示的な水性エアゾール製剤
製薬組成物は、０．５ｍｇの本発明の結晶性遊離塩基（活性剤）を、クエン酸によって酸性化された１ｍＬの０．９％塩化ナトリウム溶液に溶解させることによって調製される。混合物は、活性剤が溶解するまで撹拌および超音波処理される。溶液のｐＨは、ＮａＯＨの低速での添加によって、３から８の範囲の値（通例、約５）に調整される。
【００９３】
経口投与のための例示的な硬ゼラチンカプセル製剤
以下の成分は完全にブレンドされ、次に硬ゼラチンカプセル中に装入される：カプセル当り合計４６０ｍｇの組成物のために、２５０ｍｇの本発明の結晶性遊離塩基、２００ｍｇのラクトース（噴霧乾燥）、および１０ｍｇのステアリン酸マグネシウム。
【００９４】
経口投与のための例示的な懸濁製剤
以下の成分は混合されて、１０ｍＬの懸濁剤当り１００ｍｇの活性成分を含有する懸濁剤を形成する。
【００９５】
【表１】
2015003929.tif 000003
【００９６】
例示的な注射用製剤
以下の成分がブレンドされ、ｐＨは０．５Ｎ  ＨＣｌまたは０．５Ｎ  ＮａＯＨを使用して４±０．５に調整される。
【００９７】
【表２】
2015003929.tif 000004
【実施例】
【００９８】
以下の調製および実施例が提供されて、本発明の詳細な実施形態を例証する。しかし、これらの詳細な実施形態は、明確に指摘されない限り、本発明の範囲を決して制限することを意図されない。以下の省略形は、別途指摘されない限り以下の意味を有し、本明細書で使用され、定義されていないその他の省略形は、その標準の意味を有する：
ＡＣ  アデニリルシクラーゼ
ＢＳＡ  ウシ血清アルブミン
ｃＡＭＰ  ３’−５’環状アデノシン１リン酸
ＣＨＯ  チャイニーズハムスター卵巣
ｃＭ５  クローン化チンパンジーＭ５受容体
ＤＣＭ  ジクロロメタン
ｄＰＢＳ  ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
ＥＤＴＡ  エチレンジアミンテトラ酢酸
ＥｔＯＡｃ  酢酸エチル
ＦＢＳ  ウシ胎仔血清
ＦＬＩＰＲ  蛍光測定イメージング・プレート・リーダー
ＨＢＳＳ  ハンクス緩衝塩溶液
ＨＥＰＥＳ  ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
ｈＭ１  クローン化ヒトＭ１受容体
ｈＭ２  クローン化ヒトＭ２受容体
ｈＭ３  クローン化ヒトＭ３受容体
ｈＭ４  クローン化ヒトＭ４受容体
ｈＭ５  クローン化ヒトＭ５受容体
ＨＯＢＴ  Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィー
ＭＣｈ  メチルコリン
ＭｅＣＮ  アセトニトリル
本明細書で使用されるが、定義されていないその他の省略形は、その標準の、概して許容される意味を有する。別途記されない限り、試薬、開始材料および溶媒は、市販品供給者（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｌｕｋａなど）から購入されて、さらに精製せずに使用された。
【００９９】
調製１
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの２リン酸塩（１６ｇ）を、水（１００ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）の２相性混合物に溶解させた。ＮａＯＨ（２Ｎ、７５ｍＬ）が５分間の期間にわたって添加された。次に混合物は３０分間撹拌された。相は分離され、水相はＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）によって抽出された。合せた有機相は濃縮された。ＤＣＭ（１００ｍＬ）が添加され、混合物は蒸発乾固された。固体は乾燥器内で約４８時間乾燥されて、表題化合物（９．６ｇ）が得られた。
【０１００】
（実施例１）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基（ＩＩＩ形）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（１０２．４ｍｇ）をＭｅＣＮ（５００μＬ）に溶解させた。溶液は室温にて８０分間撹拌され、白色固体沈殿が形成された。混合物は振とう器ブロックに配置され、４８時間にわたって熱サイクル処理された（１時間ブロックで０〜４０℃）。白色で濃密な静止した固体が観察された。ＭｅＣＮ（５００μＬ）が添加され、スラリーは移動性となった。次に混合物は再度、振とう器ブロックに２時間配置された。固体は、焼結漏斗を使用して真空濾過により単離され、次に完全真空下で４０℃のピストン乾燥器に１５．５時間配置されて、７６．８５ｍｇの表題結晶性化合物を産した。
【０１０１】
（実施例２）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基（ＩＩＩ形）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの２リン酸塩（Ｃ３５Ｈ４３Ｎ５Ｏ４・２Ｈ３ＰＯ４；ＭＷ  ７９３．７５；６３２．９ｇ）は、窒素下の室温にて酢酸イソプロピル（１１．０８Ｌ）および水（６．３３Ｌ）中でスラリー化された。懸濁剤は５３±３℃まで加温され、混合物の温度を５０℃超に維持しながら、１０Ｍ  ＮａＯＨ（３１７ｍＬ）が攪拌混合物に添加された。混合物が５３±３℃にて約５分間撹拌されてから、層が沈降した。次に層が分離されて、水層が除去された。混合物の温度が５０℃超に維持されながら、水（３．１６Ｌ）が有機層に添加された。混合物が５３±３℃にて５分間撹拌されると、層が静置された。層が分離され、水層が除去された。酢酸イソプロピル（６．３３Ｌ）が添加され、次に約１０体積の蒸留液が常圧蒸留によって収集された。本ステップは追加の酢酸イソプロピル（３．２Ｌ）を用いて反復された。２回目の蒸留の後、透明溶液の温度が５３±３℃まで低下されて、次にビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル結晶性遊離塩基（ＩＩＩ形；３．２ｇ）の酢酸イソプロピル（５１ｍＬ）による懸濁剤によって種晶が添加された。得られた懸濁剤は５３±３℃にて２時間撹拌され、次に４時間にわたって１０±３℃まで冷却された。懸濁剤は１０±３℃にて少なくとも２時間撹拌され、次に固体が濾過によって収集された。得られた濾過ケーキは酢酸イソプロピル（２×１．９Ｌ）で洗浄され、生成物は真空中で５０℃にて乾燥されて、表題結晶性化合物を産した（Ｃ３５Ｈ４３Ｎ５Ｏ４；ＭＷ  ５９７．７６；３８２．５ｇ、収率８０．３％）。
【０１０２】
（実施例３）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基（ＩＩＩ形）の再結晶化
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基（ＩＩＩ形；Ｃ３５Ｈ４３Ｎ５Ｏ４；ＭＷ  ５９７．７６；３７２．５ｇ）は、窒素下２０±３℃にてトルエン（５．６Ｌ）中でスラリー化された。懸濁剤は、８２±３℃まで加温され、完全な溶解が観察されるまで本温度で維持された。溶液は次に、晶析装置容器で清澄にされて、トルエン（３７３μＬ）によるすすぎが続けられた。晶析装置容器内で固体が観察され、容器は８２±３℃まで再加熱されて溶解がもたらされ、次に５８±３℃まで冷却されて、トルエン（８μＬ）中で事前に超音波処理された（約１分間）結晶性遊離塩基（ＩＩＩ形；１．９ｇ）によって種晶が添加された。得られた懸濁剤は、５８±３℃にて少なくとも４時間静置され、次に２時間にわたって２０±３℃まで冷却された（およそ０．３３℃／分の冷却速度）。懸濁剤は２０±３℃にて少なくとも１時間撹拌され、次に固体が濾過によって収集された。得られた濾過ケーキはトルエン（２×１．２Ｌ）によって洗浄され、生成物は真空中で５２±３℃にて乾燥されて、表題結晶性化合物を産した（３４５．３ｇ、収率９２．７％）。
【０１０３】
（実施例４）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基（ＩＶ形）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（調製１に記載されたように調製；２．５ｇ）をＭｅＣＮ（１０ｍＬ）に溶解させて、粘性油性薄黄色材料を産した。追加のＭｅＣＮ（５ｍＬ）が添加されて、材料を希釈した。溶液に結晶性遊離塩基（２０ｍｇ；実施例１に記載されたように調製されたＩＩＩ形）によって種晶が添加され、室温にて９０分間撹拌された。大量の白色沈殿（小型結晶）が観察された。スラリーは偏光顕微鏡下で分析され、複屈折であることが見出された。
【０１０４】
追加のＭｅＣＮ（３ｍＬ）が添加され、スラリーがＭｅｔｚ  Ｓｙｎ１０ブロックに配置されて、８００ｒｐｍにて一晩、熱サイクル処理された（１時間ブロックで０〜４０℃）。Ｍｅｔｚ  Ｓｙｎ１０は、静止した１０位置の並列反応ステーションである。溶液／スラリーのかき混ぜは、クロス磁気撹拌棒によった。振とう器ブロックは、外部ユラボ浴によって加熱および冷却される別個の機器であった。材料は０℃にて除去された。スラリーが沈降して、白色沈殿の上に薄黄色溶液が残っているのが観察された。スラリーは撹拌され、再度、振とう器ブロックに配置されて熱サイクル処理された。材料は４０℃にて除去され、室温にて高いかき混ぜ速度にて８０分間撹拌された。スラリーは再度分析され、複屈折であることが見出された。濾過ケーキは、焼結漏斗を使用して真空濾過によって単離された。ＭｅＣＮ（３ｍＬ）が使用されて濾紙が濡らされて、濾過の前に濾過ケーキがＭｅＣＮによって洗浄された。ケーキは真空下にて４０分間脱液されて、２．３ｇの流動性白色パウダーを産した。材料は４０℃にて６５時間、ピストン乾燥器に配置され、２．２ｇの表題結晶性化合物を白色パウダー（９９．６％純度）として産した。
【０１０５】
生成物のラマンスペクトルの大部分は、ＩＩＩ形開始材料のラマンスペクトルと一致していた。しかし、３個のシフトが注目された。
【０１０６】
ＩＩＩ形 生成物
８７８  ｃｍ−１    ８８１  ｃｍ−１
７７５  ｃｍ−１    ７７２  ｃｍ−１
４８５  ｃｍ−１    ４８８  ｃｍ−１
生成物は次に、粉末Ｘ線回折、示差走査熱量測定、および熱重量分析によって分析された。生成物がＩＩＩ形開始材料とは異なる遊離塩基結晶形であることが決定され、ＩＶ形と呼ばれた。
【０１０７】
（実施例５）
粉末Ｘ線回折
結晶性遊離塩基ＩＩＩ形（実施例１より）およびＩＶ形（実施例４より）の粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンは、ＸＣｅｌｅｒａｔｏｒ検出器を装備したＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ  Ｘ’Ｐｅｒｔ  Ｐｒｏ粉末回折計（ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｒ）で取得された。取得条件は、放射線：Ｃｕ  Ｋα；発電機電圧：４０ｋＶ；発電機電流：４５ｍＡ；開始角度２．０°２θ；終了角度４０．０°２θ、ステップサイズ：０．０１６７°２θであった。ステップ当りの時間は、３１．７５０秒であった。試料は、２、３ミリグラムの試料をシリコンウェハ（ゼロ背景）プレート上に載せて、粉末薄膜を生じることによって調製された。
【０１０８】
特徴的なピーク位置および計算されたｄ間隔が下にまとめられており、これらのピークが１４％を超える相対強度を有することのみが報告される。これらはＨｉｇｈｓｃｏｒｅソフトウェアを使用して生データから計算された。ピーク位置の実験誤差は、約±０．１°２θである。相対ピーク強度は、好ましい配向のために変動するであろう。
【０１０９】
【表３】
2015003929.tif 000005
【０１１０】
結晶性遊離塩基ＩＩＩ形の代表的なＰＸＲＤパターンは図１に示されている。結晶性遊離塩基ＩＶ形の代表的なＰＸＲＤパターンは図２に示されている。
【０１１１】
（実施例６）
熱分析
結晶性遊離塩基ＩＩＩ形（実施例１より）およびＩＶ形（実施例４より）の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムは、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ熱量計を使用して得られた。試料はアルミニウム皿に秤量され、皿の蓋が上に配置されて、皿を密封することなく軽く圧着された。実験は、１０℃／分の加熱速度を使用して実行された。
【０１１２】
結晶性遊離塩基ＩＩＩ形の代表的なＤＳＣサーモグラフは図４に示されている。ＤＳＣサーモグラフは、ＩＩＩ形が１２３．１℃における吸熱熱流の開始（エンタルピー６７．７Ｊ／ｇ）を示すＤＳＣサーモグラフを特徴とすることを証明している。
【０１１３】
結晶性遊離塩基ＩＶ形の代表的なＤＳＣサーモグラフは図５に示されている。ＤＳＣサーモグラフは、ＩＶ形が小規模な吸熱および主吸熱、すなわち６５．６℃にて出現する小規模な第１の吸熱熱流の開始（エンタルピー０．８Ｊ／ｇ）および１１８．８℃にて出現する主な第２の吸熱熱流の開始（エンタルピー６６．８Ｊ／ｇ）を示すＤＳＣサーモグラフを特徴とすることを証明する。
【０１１４】
熱重量分析（ＴＧＡ）データは、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｑ５００計器を使用して得られた。試料は、開放されたアルミニウム皿内で１０℃／分の加熱速度にて２００℃まで加熱された。
【０１１５】
結晶性遊離塩基ＩＩＩ形の代表的なＴＧＡトレースは図６に示されており、試料分解前にごくわずかな重量損失が観察されたことを指摘している。結晶性遊離塩基ＩＶ形の代表的なＴＧＡトレースは図７に示されており、試料溶融前に約０．３％の重量損失が観察され、これが残留溶媒の損失と一致することを指摘している。
【０１１６】
（実施例７）
蒸気収着重量測定アセスメント
蒸気収着重量測定（ＧＶＳ）試験は、２５℃にて水蒸気散布を使用した全収着等温線の発生のためにＳｕｒｆａｃｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＤＶＳ−１計器を使用して行われた。約７ｍｇの試料サイズは、風袋を差し引いた透明で乾燥した試料メッシュ皿に配置され、内蔵天秤で秤量された。目標相対湿度（ＲＨ）は１０％刻みで、３０％〜９０％、次に９０％〜０％および０％〜３０％であった。平衡点は、０．０２ｄｍ／ｄｔ漸近線設定を使用して自動的に決定された。
【０１１７】
２５℃にて行われた結晶性遊離塩基ＩＩＩ形の試料に対するＧＶＳ試験は、材料が０％ＲＨ〜９０％ＲＨの範囲にわたって水分を吸収する傾向が低いことを証明した。試料は、２５℃にて０〜９０％のＲＨの間で＜２％重量／重量の可逆的吸水を示した。本ＧＶＳトレースは、ＩＩＩ形が広範な湿度範囲に曝露されたときに、許容され得る重量増加を有することを証明している。
【０１１８】
（実施例８）
微粉化
結晶性遊離塩基ＩＩＩ形の試料は、ＡＰＴＭ  ４”微粉装置およびレーザー光回折によって（ｂｕｙ）決定された粒径のどちらかを使用して微粉化された。
【０１１９】
【表４】
2015003929.tif 000006
【０１２０】
参考のために、投入した結晶性遊離塩基ＩＩＩ形の粒径はＸ１０＝５．５８μｍ  Ｘ５０＝１８．２μｍ、およびＸ９０＝４９．７μｍであった。微粉化は、呼吸可能なサイズ範囲の粒子を産した。微粉化は結晶性の低下を生じたが、微粉化前材料の本質的な特徴を維持した。４０℃／２０％相対湿度、４０℃／７５％相対湿度（キャップなし）、および５０℃／周囲湿度での３カ月にわたる保管後に、ＰＸＲＤでは変化が観察されなかった。
【０１２１】
結晶性遊離塩基ＩＩＩ形のＤＳＣサーモグラフは、微粉化の前後に、１２５℃にて鋭い溶融を示した。おそらく結晶化のために、８７℃にて微粉化材料に追加の小規模な熱的イベントがあった。４０℃／２０％ＲＨ、４０℃／７５％ＲＨ（露出）、および５０℃／周囲湿度での３カ月間の保管の後に、微粉化材料は１２５℃にて鋭い溶融を示し、アモルファス内容物の証拠はなかった。
【０１２２】
（実施例９）
ラクトース適合性
結晶性遊離塩基ＩＩＩ形の２つの製剤が、４０℃／２０％相対湿度（ＲＨ）、４０℃／７５％ＲＨ（キャップなし）、および５０℃／周囲湿度での３カ月にわたる安定性について評価された。０．０８重量／重量％（１０μｇ  ＤＰＩ用量）および２重量／重量％（２５０μｇ  ＤＰＩ用量）製剤は、ラクトースのみとの、またはラクトースおよび１重量／重量％のステアリン酸マグネシウムとのブレンドとして調製された。すべての製剤の安定性は、許容され得ることが見出された。
【０１２３】
（実施例１０）
ｐＨ溶解度および安定性
結晶性遊離塩基ＩＩＩ形は、ｐＨ７までの培地で良好な溶解度（およそ２ｍｇ／ｍＬを超える）を示した。水溶解度は、８．９の天然ｐＨで０．６６ｍｇ／ｍＬであった。人工肺液への溶解度は０．４６ｍｇ／ｍＬであり、４時間から２４時間の間の溶解度測定では変化は見られなかった。
【０１２４】
結晶性遊離塩基ＩＩＩ形溶液は、５０℃において、または露光下でｐＨ４からｐＨ６の緩衝液中にて７日間まで安定である。溶液は、水および生理食塩水中にて室温で遮光されて７日間安定である。
【０１２５】
アッセイ１
放射性リガンド結合アッセイ
ｈＭ１、ｈＭ２、ｈＭ３およびｈＭ４ムスカリン受容体サブタイプを発現する細胞からの膜調製
クローン化ヒトｈＭ１、ｈＭ２、ｈＭ３およびｈＭ４ムスカリン受容体サブタイプをそれぞれ安定発現するＣＨＯ株化細胞は、１０％ＦＢＳおよび２５０μｇ／ｍＬジェネティシンを補ったＨＡＭのＦ−１２から成る培地でコンフルエント近くまで培養された。細胞は５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータで培養され、ｄＰＢＳ中２ｍＭ  ＥＤＴＡによって浮上された。細胞は、６５０ｘｇにおける５分間の遠心分離によって収集され、細胞ペレットは−８０℃にて凍結保管されるか、または膜がただちに調製されるかのどちらかであった。膜調製では、細胞ペレットは溶解緩衝液に再懸濁され、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ−２１００組織破砕装置（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＡＧ；２０秒×２バースト）によってホモジナイズされた。粗膜は、４０，０００ｘｇで４℃にて１５分間遠心分離された。膜ペレットは次に再懸濁緩衝液によって再懸濁され、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織破砕装置によって再度ホモジナイズされた。膜懸濁剤のタンパク質濃度は、Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９３：２６５（１９５１）に記載された方法によって決定された。すべての膜は、一定分量で−８０℃にて凍結保管されるか、またはただちに使用された。一定分量の調製ｈＭ５受容体膜は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから直接購入されて、使用するまで−８０℃にて保管された。
【０１２６】
ムスカリン受容体サブタイプｈＭ１、ｈＭ２、ｈＭ３、ｈＭ４およびｈＭ５に対する放射性リガンド結合アッセイ
放射性リガンド結合アッセイは、９６ウェル・マイクロタイター・プレートにおいて、１０００μＬのアッセイ全量で行われた。ｈＭ１、ｈＭ２、ｈＭ３、ｈＭ４またはｈＭ５ムスカリンサブタイプのいずれかを安定発現するＣＨＯ細胞膜は、アッセイ緩衝液で以下の特異的目標タンパク質濃度（μｇ／ウェル）：ｈＭ１では１０μｇ、ｈＭ２では１０〜１５μｇ、ｈＭ３では１０〜２０μｇ、ｈＭ４では１０〜２０μｇ、およびｈＭ５では１０〜１２μｇに希釈された。膜は、アッセイプレート添加の前に、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織破砕装置を使用して短時間（１０秒）ホモジナイズされた。放射性リガンドのＫＤ値を決定するための飽和結合試験は、Ｌ−［Ｎ−メチル−３Ｈ］スコポラミンメチルクロリド（［３Ｈ］−ＮＭＳ）（ＴＲＫ６６６、８４．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を０．００１ｎＭ〜２０ｎＭの範囲に及ぶ濃度で使用して行われた。試験化合物のＫｉ値を決定するための置換アッセイは、［３Ｈ］−ＮＭＳを１ｎＭおよび１１の異なる試験化合物濃度にて用いて行われた。試験化合物は、最初に希釈緩衝液に４０μＭの濃度で溶解され、次に希釈緩衝液によって、４００ｆＭ〜４μＭの範囲に及ぶ最終濃度に５倍ずつ連続希釈された。アッセイプレートへの添加順序および体積は、以下の通りであった：０．１％ＢＳＡを有する８２５μＬアッセイ緩衝液、２５μＬ放射性リガンド、１００μＬ希釈試験化合物、および５０μＬ膜。アッセイプレートを３７℃にて６時間インキュベートした。結合反応は、０．３％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）中で予備処理されたＧＦ／Ｂガラス繊維フィルタプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）での高速濾過によって終結された。フィルタプレートは洗浄緩衝液（１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ）で３回すすがれて、未結合放射能が除去された。プレートが次に空気乾燥されて、５０μＬ  Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０液体シンチレーション液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）が各ウェルに添加された。プレートは次に、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔ液体シンチレーションカウンタ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）でカウントされた。結合データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）による非線形回帰分析によって、１部位競合モデルを使用して分析された。試験化合物のＫｉ値は、観察されたＩＣ５０値から、放射性リガンドのＫＤ値はＣｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆの等式（Ｃｈｅｎｇ  Ｙ；Ｐｒｕｓｏｆｆ  Ｗ．Ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２２（２３）：３０９９−１０８（１９７３））を使用して計算された。Ｋｉ値はｐＫｉ値に変換されて、幾何平均および９５％信頼区間が決定された。これらの要約統計量は次に、データ報告のために再度Ｋｉ値に変換された。
【０１２７】
本アッセイにおいて、より低いＫｉ値は、試験化合物が試験された受容体に対してより高い結合親和性を有することを指摘している。式Ｉの化合物は、本アッセイまたは類似のアッセイで試験されるときに、Ｍ３ムスカリン受容体サブタイプに対して約５ｎＭ未満のＫｉ値を有することが見出された。
【０１２８】
アッセイ２
ムスカリン受容体機能的効力アッセイ
ｃＡＭＰ蓄積のアゴニスト媒介阻害の遮断
本アッセイにおいて、試験化合物の機能的効力は、試験化合物がｈＭ２受容体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるフォルスコリン媒介ｃＡＭＰ蓄積のオキソトレモリン阻害を遮断する能力を測定することによって決定される。
【０１２９】
ｃＡＭＰアッセイは、ラジオイムノアッセイ形式で、１２５Ｉ−ｃＡＭＰを有するＦｌａｓｈｐｌａｔｅアデニリルシクラーゼ活性化アッセイシステム（ＮＥＮ  ＳＭＰ００４Ｂ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を製造者の説明書に従って使用して行われる。
【０１３０】
細胞は、ｄＰＢＳによって１回洗浄され、アッセイ１に記載されているようにトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ）によって浮上させる。分離された細胞は、５０ｍＬ  ｄＰＢＳ中の６５０×ｇでの５分間の遠心分離によって２回洗浄される。細胞ペレットは次に１０ｍＬ  ｄＰＢＳに再懸濁され、細胞はＣｏｕｌｔｅｒ  Ｚ１  Ｄｕａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）によってカウントされる。細胞は６５０×ｇにて５分間にわたって再度遠心分離され、刺激緩衝液に１．６×１０６〜２．８×１０６細胞／ｍＬのアッセイ濃度まで再懸濁される。
【０１３１】
試験化合物は、最初に４００μＭの濃度まで希釈緩衝液（１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（０．１％）を補ったｄＰＢＳ）で希釈され、次に希釈緩衝液によって１００μＭ〜０．１ｎＭの範囲に及ぶ最終モル濃度まで連続希釈される。オキソトレモリンは同様の方式で希釈される。
【０１３２】
ＡＣ活性のオキソトレモリン阻害を測定するために、２５μＬのフォルスコリン（ｄＰＢＳで希釈された２５μＭ最終濃度）、２５μＬの希釈オキソトレモリン、および５０μＬの細胞がアゴニスト・アッセイ・ウェルに添加される。試験化合物がオキソトレモリン阻害ＡＣ活性を遮断する能力を測定するために、２５μＬのフォルスコリンおよびオキソトレモリン（それぞれ２５μＭおよび５μＭの最終濃度、ｄＰＢＳで希釈）、２５μＬの希釈試験化合物、および５０μＬの細胞が残りのアッセイウェルに添加される。
【０１３３】
反応物は３７℃にて１０分間インキュベートされ、１００μＬの氷冷検出緩衝液の添加により停止される。プレートは密封され、室温にて一晩インキュベートされて、翌朝、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ液体シンチレーションカウンタ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）でカウントされる。産生されたｃＡＭＰの量（ｐｍｏｌ／ウェル）は、製造者のユーザマニュアルに記載されているように、試料およびｃＡＭＰ標準で観察されたカウントに基づいて計算される。データは、非線形回帰分析によって、１部位競合等式を使用してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて分析される。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆの等式を使用して、オキソトレモリン濃度応答曲線のＥＣ５０およびオキソトレモリンアッセイ濃度をそれぞれＫＤおよび［Ｌ］として用いてＫｉを計算する。ＫｉはｐＫｉ値に変換されて、幾何平均および９５％信頼区間が決定される。これらの要約統計量は次に、データ報告のために再度Ｋｉ値に変換される。
【０１３４】
本アッセイにおいて、より低いＫｉ値は、試験化合物が試験された受容体に対してより高い機能的活性を有することを指摘している。式Ｉの化合物は、本アッセイまたは類似のアッセイで試験されたときに、ｈＭ２受容体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるフォルスコリン媒介ｃＡＭＰ蓄積のオキソトレモリン阻害の遮断のために、約５ｎＭ未満のＫｉ値を有することが見出された。
【０１３５】
アゴニスト媒介［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の遮断
第２の機能的アッセイにおいて、試験化合物の機能的効力は、化合物がｈＭ２受容体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるオキソトレモリン刺激［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を遮断する能力を測定することによって決定することができる。
【０１３６】
使用時に凍結膜は解凍され、次にアッセイ緩衝液中でウェル当り５〜１０μｇのタンパク質の最終目標組織濃度で希釈される。膜は、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ−２１００組織破砕装置を使用して短時間ホモジナイズされ、次にアッセイプレートに添加される。
【０１３７】
アゴニストオキソトレモリンによる［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の刺激のためのＥＣ９０値（９０％最大応答に有効な濃度）は、各実験で決定される。
【０１３８】
試験化合物を阻害するオキソトレモリン刺激［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の能力を決定するために、以下が９６ウェルプレートの各ウェルに添加される：２５μＬの、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．４ｎＭ）を有するアッセイ緩衝液、２５μＬのオキソトレモリン（ＥＣ９０）およびＧＤＰ（３μＭ）、２５μＬの希釈試験化合物ならびに２５μＬの、ｈＭ２受容体を発現するＣＨＯ細胞膜。次にアッセイプレートを３７℃にて６０分間インキュベートする。アッセイプレートは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ９６ウェル収集装置を使用して、１％ＢＳＡ−前処理ＧＦ／Ｂフィルタで濾過される。プレートは氷冷洗浄緩衝液で３×３秒すすがれ、次に空気または真空乾燥される。Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０シンチレーション液（５０μＬ）が各ウェルに添加され、各プレートは密封されて、トップカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で放射能カウントされる。データは、非線形回帰分析によって、１部位競合等式を使用してＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて分析される。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆの等式を使用して、試験化合物の濃度応答曲線のＩＣ５０値およびアッセイにおけるオキソトレモリン濃度をそれぞれＫＤおよび［Ｌ］リガンド濃度として用いて、Ｋｉを計算する。
【０１３９】
本アッセイにおいて、より低いＫｉ値は、試験化合物が試験された受容体に対してより高い機能的活性を有することを指摘している。式Ｉの化合物は、本アッセイまたは類似のアッセイで試験されたときに、ｈＭ２受容体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるオキソトレモリン刺激［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ−結合の遮断のために、約５ｎＭ未満のＫｉ値を有することが見出された。
【０１４０】
ＦＬＩＰＲアッセイを介したアゴニスト媒介カルシウム放出の遮断
Ｇｑタンパク質に結合するムスカリン受容体サブタイプ（Ｍ１、Ｍ３およびＭ５受容体）は、受容体へのアゴニスト結合時にホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）経路を活性化する。結果として、活性化されたＰＬＣはホスファチルイノシトール２リン酸（ＰＩＰ２）をジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびホスファチジル−１，４，５−３リン酸（ＩＰ３）に加水分解して、これが次に細胞内貯蔵、すなわち小胞体および筋小胞体からカルシウム放出を発生する。ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）アッセイは、遊離カルシウムを結合するときに蛍光を発するカルシウム感受性染料（Ｆｌｕｏ−４ＡＭ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用することにより、細胞内カルシウムのこのような増加を利用する。本蛍光イベントは、ヒトＭ１およびＭ３、ならびにチンパンジーＭ５受容体でクローン化された細胞の単層からの蛍光の変化を検出するＦＬＩＰＲによってリアルタイムで測定される。アンタゴニスト効力は、アンタゴニストが細胞内カルシウムのアゴニスト媒介上昇を阻害する能力によって決定することができる。
【０１４１】
ＦＬＩＰＲカルシウム刺激アッセイでは、ｈＭ１、ｈＭ３およびｃＭ５受容体を安定発現するＣＨＯ細胞が９６ウェルＦＬＩＰＲプレートに、アッセイが行われる前の晩に播種される。播種された細胞は、Ｃｅｌｌｗａｓｈ（ＭＴＸ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）によりＦＬＩＰＲ緩衝液（カルシウムおよびマグネシウムを含まないＨＢＳＳ中の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２ｍＭ塩化カルシウム、２．５ｍＭプロベネシド）を用いて２回洗浄されて、成長培地が除去され、５０μＬ／ウェルのＦＬＩＰＲ緩衝液が残る。細胞は次に、５０μＬ／ウェルの４μＭ  ＦＬＵＯ−４ＡＭ（２×溶液が作製された）によって３７℃、５％二酸化炭素で４０分間インキュベートされる。染料インキュベーション期間の後、細胞はＦＬＩＰＲ緩衝液で２回洗浄され、５０μＬ／ウェルの最終体積が残る。
【０１４２】
アンタゴニスト効力を決定するために、オキソトレモリンの細胞内Ｃａ２＋放出の第１の用量依存性刺激が最初に決定されるので、ＥＣ９０濃度でのオキソトレモリン刺激に対するアンタゴニスト効力を後に測定することができる。細胞は最初に化合物希釈緩衝液によって２０分間インキュベートされ、ＦＬＩＰＲによって行われるアゴニスト添加が続く。オキソトレモリンのＥＣ９０値は、式ＥＣＦ＝（（Ｆ／１００−Ｆ）＾１／Ｈ）＊ＥＣ５０と併せて、下のＦＬＩＰＲ測定およびデータ整理の項で詳説される方法に従って生成される。オキソトレモリンのＥＣ９０濃度がアンタゴニスト阻害アッセイプレートの各ウェルに添加されるように、３×ＥＣＦのオキソトレモリン濃度が刺激プレート中で調製される。
【０１４３】
ＦＬＩＰＲに使用されるパラメータは：０．４秒の照射期間、０．５ワットのレーザー強度、４８８ｎｍの励起波長、および５５０ｎｍの発光波長である。ベースラインは、アゴニスト添加前の１０秒間にわたって蛍光変化を測定することによって決定される。アゴニスト刺激の後、ＦＬＩＰＲは蛍光変化を０．５〜１秒ごとに１．５分間にわたって連続測定して、最大蛍光変化を捕捉する。
【０１４４】
蛍光変化は、各ウェルについて最大蛍光からベースライン蛍光を引いたものとして表現される。生データは、Ｓ字状用量応答の組込みモデルを使用するＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いた非線形回帰により、薬物濃度の対数に対して分析される。アンタゴニストＫｉ値は、ＫＤとしてのオキソトレモリンＥＣ５０値およびＣｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆの等式（Ｃｈｅｎｇ＆Ｐｒｕｓｏｆｆ，１９７３）によるリガンド濃度のオキソトレモリンＥＣ９０を使用してＰｒｉｓｍによって決定される。
【０１４５】
本アッセイにおいて、より低いＫｉ値は、試験化合物が試験された受容体に対してより高い機能的活性を有することを指摘している。式Ｉの化合物は、本アッセイまたは類似のアッセイで試験されたときに、ｈＭ３受容体を安定に発現するＣＨＯ細胞におけるアゴニスト媒介カルシウム放出の遮断のために、約５ｎＭ未満のＫｉ値を有することが見出された。
【０１４６】
アッセイ３
ラット・アイントホーフェン・アッセイ
本インビボアッセイが使用されて、ムスカリン受容体アンタゴニスト活性を呈する試験化合物の気管支保護効果が影響評価される。すべての試験化合物は滅菌水で希釈されて、吸入経路（ＩＨ）を介して投薬される。ラット（スプラーグ−ドーリー、オス、２５０〜３５０ｇ）、ＬＣ  Ｓｔａｒネブライザセットから発生され、気体の混合物（５％ＣＯ２／９５％周囲空気）によって操縦されたエアゾールに曝露される。各試験化合物溶液は、マウス６匹を保持することができるパイ形状投薬チャンバにおいて１０分間の期間にわたって噴霧される。化合物の吸入後、所定の時点でアイントホーフェンアッセイが行われる。
【０１４７】
肺評価開始の３０分前に、動物をイナクチン（チオブタバルビタール、１２０ｍｇ／ｋｇＩＰ）を介して麻酔する。頸静脈に生理食塩水を充填したポリエチレンカテーテル（ＰＥ−５０）が挿入され、ＭＣｈを注入するために使用される。次に気管が切開され、１４Ｇ針によってカニューレ処置されて、肺評価の間のラットの人工呼吸に使用される。手術がいったん完了したら、２．５ｍｌの量を超えない１ｍｌ／１００ｇ体重の心拍出量、および１分当り９０拍動の速度に設定されたピストン呼吸装置を使用して、ラットに人工呼吸させる。
【０１４８】
各呼吸によって発生する圧力の変化が測定される。ベースライン値が少なくとも２．５分間にわたって収集され、次にラットは２倍ずつ漸進的に増加される気管支収縮剤ＭＣｈ（５、１０、２０、４０および８０μｇ／ｍｌ）を用いて、非累積的に攻撃される。ＭＣｈは注射器ポンプから２ｍＬ／ｋｇ／分の速度で２．５分間注入される。動物は試験完了時に安楽死させる。
【０１４９】
処置動物の人工呼吸圧の変化（ｃｍ  Ｈ２Ｏ）は、対照動物に関係するＭＣｈ応答の阻害％として表される。本アッセイにおいて、より高い阻害％は、試験化合物が気管支保護効果を有することを指摘している。式Ｉの化合物は、本アッセイにおいて１００μｇ／ｍｌの用量で試験されるとき、３５％を超える阻害、おそらく７０％を超える阻害、およびなおさらにおそらく９０％を超える阻害を呈することが期待される。
【０１５０】
１．５時間ＩＤ５０の決定
標準ムスカリンアンタゴニストは、ラット・アイントホーフェン・アッセイで投薬１．５時間後に評価された。試験された５つの標準の効力（ＩＤ５０）の順序は：イプラトロピウム（４．４μｇ／ｍｌ）＞チオトロピウム（６μｇ／ｍｌ）＞デス−メチル−チオトロピウム（１２μｇ／ｍｌ）＞グリコピロレート（１５μｇ／ｍｌ）＞ＬＡＳ−３４２３７（２４μｇ／ｍｌ）として決定された。試験化合物の効力は、投薬１．５時間後に同様に決定される。
【０１５１】
６および２４時間ＩＤ５０の決定
標準のチオトロピウムおよびイプラトロピウムも、ラット・アイントホーフェン・アッセイで投薬２４時間および／または６時間後に評価された。イプラトロピウム（１０および３０μｇ／ｍｌ）は投薬６時間後には、その１．５時間の効力と比較して３倍弱かった。本時点（６時間）で観察された活性の消失は、診療所での比較的短い作用期間と一致している。チオトロピウムは、ピーク気管支保護による緩慢な効果の開始が投薬６時間後に達成されることを示した。その６時間および２４時間の効力値は、相互から有意に異なっておらず、その１．５時間の効力と比較して約２倍強力であった。試験化合物の作用の開始、ならびに６および２４時間の効力値は同様に決定される。
【０１５２】
アッセイ４
ラット唾液分泌抑制アッセイ
ラット（スプラーグ−ドーリー、オス、２５０〜３５０ｇ）は、アッセイ３で記載されたように、投薬、麻酔およびカニューレ処置される。所定の時点および手術後に、動物は下りスロープに仰向けに頭を２０度傾斜させて配置される。事前に秤量されたガーゼパッドが動物の口内に挿入され、ムスカリンアゴニストのピロカルピン（ＰＩＬＯ）（３ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ．）が投与される。ＰＩＬＯ後の１０分間に産生された唾液は、ＰＩＬＯ前後のガーゼパッドの重量を決定することによって、重量測定法で測定される。唾液分泌抑制効果は、対照動物に関係する唾液分泌の阻害％として表される。
１、６および２４時間ＩＤ５０の決定
ラット唾液分泌抑制アッセイは、試験化合物の全身曝露を影響評価して、肺選択指数（ＬＳＩ）を計算するために開発された。標準のチオトロピウムは、本モデルにおいて投薬１時間、６時間、および２４時間後に評価された。チオトロピウムは、投薬６時間後にピロカルピン誘発唾液分泌を最も強力に阻害することが見出された。本発見は、アイントホーフェンアッセイで観察されたピーク効果と一致している。
【０１５３】
本モデルは、Ｒｅｃｈｔｅｒ，“Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｄｒｕｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ
ａｇａｉｎｓｔ  ｐｉｌｏｃａｒｐｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓａｌｉｖａｔｉｏｎ”Ａｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２４：２４３−２５４（１９９６）に記載された手順の修正版である。ビヒクルで処置された動物の唾液の平均重量は、各処置前時間に計算され、各用量の対応する処置前時間における唾液分布の阻害％が算出される。
【０１５４】
本アッセイで試験される本発明の例示的な化合物は、１００μｇ／ｍｌ未満のＩＤ５０値（２４時間にて測定）を呈することが期待され、いくつかの化合物は３０μｇ／ｍｌ未満の、いくつかは２０μｇ／ｍｌ未満の、およびいくつかのは１５μｇ／ｍｌ未満のＩＤ５０値を呈することが期待される。
【０１５５】
唾液分泌抑制ＩＤ５０の気管支保護ＩＤ５０に対する比を使用して、試験化合物の見かけの肺選択指数が算出される。概して、約５を超える見かけの肺選択指数を有する化合物が好ましい。
【０１５６】
本発明はその詳細な態様または実施形態への参照により記載されてきたが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、各種の変更が行われることができるか、または均等物が置換されることができることが当業者によって理解されるであろう。加えて、本明細書で引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、適用可能な特許法および規則によって許容される範囲で、各文書が参照により本明細書に個別に組み入れられているのと同じ範囲まで、その全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【外国語明細書】
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