(57)【要約】【課題】マルチプレックス配列決定反応において、核酸鋳型の完全性および同定を維持するための方法を提供すること。【解決手段】特定の実施形態では、本発明の方法は、鋳型核酸を得るステップと、配列識別子の対を上記鋳型へと組み込むステップと、上記鋳型を配列決定するステップとを包含する。本発明は、誤差が結果に重大な影響を及ぼしうるマルチプレックス次世代配列決定の適用においてとりわけ有用であるが、また、タンパク質検出アッセイを含めた広範な検出アッセイにわたっても適用可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１１年４月７日に出願された米国仮特許出願第１３／０８１，６６０号（この米国仮特許出願は、２０１０年１２月２３日に出願された米国特許出願第６１／４２６，８１７号の利益および優先権を主張する）の利益および優先権を主張し、これらの出願の各々の全体の内容は本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に、マルチプレックス配列決定反応における核酸鋳型の完全性および同定を維持するための方法に関する。
【０００３】
本発明は一般に、マルチプレックス配列決定反応における核酸鋳型の完全性および同定を維持するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
合成による配列決定は、ヌクレオチドの、鋳型／プライマー二重鎖への、鋳型に依存する付加を伴う。ヌクレオチドの付加はポリメラーゼ酵素により媒介され、付加されたヌクレオチドは、それらの検出を容易とするために標識されうる。個別のＤＮＡまたはＲＮＡについてのハイスループットの配列情報を得るために、単一分子の配列決定が用いられている。試料をマルチプレックス処理する、すなわち、異なる患者試料をプールする能力は、費用を軽減し、合成による配列決定プラットフォームのスループットを増大させるために重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
マルチプレックス配列決定反応にそれ自体存在する１つの問題は、配列決定プロセスの全体で、試料の正確な同定を維持することである。残念ながら、試料調製の段階は、その後の配列決定反応に誤差を導入することが多い。例えば、鋳型分子は、基材上で物理的に重複し、場合によっては、検出可能な誤ったシグナルを結果としてもたらす。高精度を要求するいかなる配列決定プロセスでも、このような誤差は、結果に対して重大な影響を及ぼしうる。次世代の配列決定は、典型的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるライブラリーの生成；核酸鋳型の固体支持体上の物理的に異なる場所へのアレイ化（および鋳型の、空間的に局所化されたクラスターへの任意選択のクローン増幅）；および合成による配列決定反応それ自体を伴う。誤差は、異なる患者試料の分子重複を結果としてもたらす、ライブラリーの生成ステップ、アレイ化するステップ、および増幅ステップにおいて発生し得る。例えば、ヘテロ二重鎖、すなわち、異なる試料に由来する鋳型鎖の不適正な対合は、マルチプレックス処理された試料の増幅の間に形成されうる。プロセスの最初の３つのステップのうちのいずれかにおける分子重複は、配列決定データの、間違った患者試料への割当てをもたらしうる。他の誤差は、誤ったシグナル検出を結果としてもたらす、不完全な増幅、迷標識されたプライマー、および他の供給源に起因して導入される可能性がある。単一分子の配列決定プロトコールでは、このような誤差が、結果に対して重大な影響を及ぼしうる。したがって、このような手順において誤差を低減するかまたは消失させるための方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
本発明は一般に、分子検出アッセイの結果を検証し、試料調製でもたらされる誤差の検出を可能とするための方法を提供する。本発明は、核酸の配列決定、タンパク質の検出、ならびに被検体の存在および／または量の正確な測定を必要とする他の方法に適用可能である。本発明は、対象の被検体が検出される場合に限り識別子が存在するように、対象の被検体と独自に（ｕｎｉｑｕｅｌｙ）結合する２つ以上の識別子を使用する。このようにして、検出される被検体と結合する２つ以上の独立マーカーの同時検出を必要とすることにより、偽陽性および／または偽陰性の結果を回避する。
【０００７】
本発明は、誤差が結果に重大な影響を及ぼしうるマルチプレックス次世代配列決定の適用においてとりわけ有用であるが、また、タンパク質検出アッセイを含めた広範な検出アッセイにわたっても適用可能である。本発明は、検出される被検体と独自に結合する核酸バーコードなど、２つ以上の識別子を用いることに基づいている。例えば、配列決定適用では、それらが対象の配列を挟むように、バーコード対を配置する。識別子は、挟み込む識別子対の存在によって有効な配列データが確認されるように、試料に対して独自のものである。これに対して、識別子を１つしか含有しないか、または不正確な対（すなわち、同じ鋳型と結合しない識別子の１または複数の対）を含有する鋳型は、解析から除外される。したがって、本発明の方法は、マルチプレックス配列決定反応において、試料の完全性が維持されるかどうかを決定し、配列データの間違った試料への割当てを防止することを可能とする。
【０００８】
他の適用では、２つ以上の核酸タグが、タンパク質または他の対象の被検体と結合する。配列タグの同定により、タンパク質検出の精度を確認する。本発明のこの実施形態では、配列が公知の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドへと連結される抗体などの結合剤によりタンパク質を捕捉する。捕捉されたタンパク質の同定は、結合剤と独自に結合するタグを配列決定することにより確認する。両方の配列タグの存在により、標的タンパク質の捕捉を検証する。
【０００９】
タンパク質の検出では、識別子にはまた、対象のタンパク質に特異的に結合する、検出可能な標識、抗体、糖タンパク質を含めた他のタンパク質、ビタミン、ステロイド、ウイルス粒子なども含まれうる。識別子の検出により、対象のタンパク質が見出されたことが検証される。
【００１０】
核酸の配列決定では、好ましい識別子が核酸バーコードである。バーコードは、任意の適切な長さ（例えば、約２〜約５０ヌクレオチド）であることが可能であり、任意の数のバーコード配列を用いることができる。好ましくは、バーコードは、配列決定される鋳型またはその部分を挟む対で存在する。任意の所与の鋳型と結合するバーコード対が独自のものであるのに対し、個別のバーコード配列は、対が２つの異なる試料にわたり用いられない限り、複数の鋳型と共に用いることができる。状況によっては、バーコード処理された２つを超える配列または他の識別子を用いることが可能であり、好ましい場合もあるが、本発明は、識別子分子対を用いて説明される。好ましい構成では、特定の試料に由来する各鋳型が、同じ独自のバーコード配列対と結合する。対は、理想的には配列決定される鋳型の領域を挟む。したがって、対は、対象の領域と隣接する場合もあり、スペーサー（鋳型における介在配列または挿入されたスペーサー配列を含めた）により、または天然に存在する配列により対象の領域から隔てられる場合もある。核酸結合タンパク質、光学的標識、ヌクレオチド類似体、および当技術分野で公知の他の識別子などの他の識別子を、本発明による識別子として用いることができる。
【００１１】
ある態様では、本発明の方法は、鋳型核酸を得るステップと、配列識別子対を鋳型へと組み込むステップと、鋳型を配列決定するステップとを伴う。本発明の方法は、鋳型を基材へと直接的または間接的に付着させるステップをさらに包含しうる。鋳型は、基材への付着の前に増幅することもでき、それを基材に付着させた後で、基材上で増幅することもできる。具体的な実施形態では、鋳型を、それを基材に付着させた後で増幅する。他の実施形態では、鋳型を、それを基材に付着させる前に増幅し、その後、それを基材に付着させた後でもまた増幅する。
【００１２】
識別子は、鋳型のどこに組み込むこともできる。例えば、第１の識別子は、鋳型の５’端へと組み込むことができ、第２の識別子は、鋳型の３’端へと組み込むことができる。第１および第２の識別子は、識別子の各セットが、特定の試料（例えば、特定の患者または患者群から得られる材料）と相互関連するようにデザインし、試料の識別および／または検証を可能とする。第１および第２の識別子は、識別および／または検証しようとする試料または副次試料に関して、組合せが独自である限りにおいて、同じ場合もあり、異なる場合もある。
【００１３】
識別子を鋳型へと組み込んだ後で、鋳型を配列決定する。配列決定は、当技術分野で公知の任意の方法によることができる。合成による配列決定とは、次世代の手順において用いられる一般的な技法であり、本発明と共に良好に機能する。しかし、ライゲーションによる配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ゲルベースの技法などを含む他の配列決定法も用いることができる。一般に、配列決定するステップは、プライマーを鋳型とハイブリダイズさせて、鋳型／プライマーの二重鎖を形成するステップと、検出可能に標識されたヌクレオチドの存在下、ポリメラーゼが鋳型依存的な様式でプライマーにヌクレオチドを付加することを可能とする条件下で、二重鎖をポリメラーゼと接触させるステップとを伴う。検出可能な標識からのシグナルを用いて組み込まれた塩基を同定し、鋳型におけるヌクレオチドの直線的な順序を決定するために、これらのステップを逐次的に反復する。例示的な検出可能な標識には、放射性標識、蛍光標識、酵素標識などが含まれる。具体的な実施形態では、検出可能な標識が、蛍光標識など、光学的に検出可能な標識でありうる。例示的な蛍光標識には、シアニン、ローダミン、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｅｎ）、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、ａｌｅｘａ、またはコンジュゲートされた多重色素が含まれる。
【００１４】
配列を検出し、バーコードを同定するための多数の技法が公知であり、一部については以下に例示する。しかし、配列データを検出し、まとめるための的確な手段が、本明細書で記載される本発明の機能に影響を及ぼすことはない。
【００１５】
検出される被検体が核酸でない場合も、識別子はやはり、被検体結合部分と結合する核酸バーコードでありうる。次いで、バーコードの配列決定により、被検体の検出を検証する（すなわち、検出を検証するためには、結合剤と結合する２つ以上のバーコードの存在を検出しなければならない）。タンパク質の検出では、識別子はまた、検出すべきタンパク質の一次構造の一部でもありうる。この実施形態では、タンパク質のアミノ酸配列を決定する（例えば、質量分析またはエドマン分解によって）。タンパク質の同一性を検証するためには、埋め込まれたアミノ酸配列識別子を、アミノ酸配列に存在させなければならないことになる。
本願は一実施形態において例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
マルチプレックス配列決定反応において、核酸鋳型の完全性を検証するための方法であって、
鋳型核酸を得るステップと、
少なくとも２つの配列識別子を該鋳型へと組み込むステップと、
該鋳型を配列決定するステップと
を含む方法。
（項目２）
第１の識別子を、前記鋳型の５’部分へと組み込み、第２の識別子を、該鋳型の３’部分へと組み込む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記識別子を組み込んだ後で、前記鋳型が、５’から３’の順で以下の構成：第１の公知の配列、第１のバーコード配列、第２の公知の配列、標的ポリヌクレオチド配列、第３の公知の配列、第２のバーコード配列、および第４の公知の配列、を有する、項目２に記載の方法。
（項目４）
第１の識別子を、前記鋳型の５’端へと組み込み、第２の識別子を、該鋳型の３’端へと組み込む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記第１および第２の識別子が同じである、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記第１および第２の識別子が異なる、項目２に記載の方法。
（項目７）
配列決定するステップの前に、前記鋳型を基材に付着させる、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記鋳型を前記基材に直接的に付着させる、項目２に記載の方法。
（項目９）
前記鋳型を前記基材に間接的に付着させる、項目２に記載の方法。
（項目１０）
前記鋳型を増幅するステップをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目１１）
配列決定するステップが、合成によって配列決定するステップである、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記合成によって配列決定するステップが、合成によって単一分子を配列決定するステップである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
配列決定するステップが、
プライマーを前記鋳型とハイブリダイズさせて、鋳型／プライマーの二重鎖を形成するステップと、
少なくとも１つの検出可能に標識されたヌクレオチドの存在下、ポリメラーゼ酵素が鋳型依存的な様式で該プライマーにヌクレオチドを付加することを可能とする条件下で、該二重鎖を該ポリメラーゼと接触させるステップと、
組み込まれた標識ヌクレオチドからのシグナルを検出するステップと、
該接触させるステップおよび該検出するステップを少なくとも１回逐次的に反復するステップと
を含み、ここで、組み込まれた標識ヌクレオチドの逐次的な検出により、前記核酸の配列を決定する、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記検出可能に標識されたヌクレオチドが、光学的に標識されたヌクレオチドである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記光学的に標識されたヌクレオチドが、蛍光標識されたヌクレオチドである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記識別子の対が、前記鋳型に付着した第１のバーコード配列および第２のバーコード配列である、項目１に記載の方法。
（項目１７）
第１のバーコード配列を、前記鋳型の５’端に付着させ、第２のバーコード配列を、該鋳型の３’端に付着させる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記第１のバーコード配列および前記第２のバーコード配列が同じである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記第１のバーコード配列および前記第２のバーコード配列が異なる、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
核酸を解析するための方法であって、
核酸鋳型を得るステップと、
バーコード配列の対を該鋳型に付着させるステップと、
該鋳型を配列決定するステップと
を含む方法。
（項目２１）
第１の識別子を、前記鋳型の５’部分へと組み込み、第２の識別子を、該鋳型の３’部分へと組み込む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記バーコード配列の対を付着させた後で、前記鋳型が、５’から３’の順で以下の構成：第１の公知の配列、第１のバーコード配列、第２の公知の配列、標的ポリヌクレオチド配列、第３の公知の配列、第２のバーコード配列、および第４の公知の配列、を有する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
第１の識別子を、前記鋳型の５’端へと組み込み、第２の識別子を、該鋳型の３’端へと組み込む、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
配列決定するステップの前に、前記鋳型を基材に付着させる、項目２０に記載の方法。（項目２５）
前記鋳型を前記基材に直接的に付着させる、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記鋳型を前記基材に間接的に付着させる、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記鋳型を増幅するステップをさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目２８）
配列決定するステップが、合成によって配列決定するステップである、項目２０に記載の方法。
（項目２９）
前記合成によって配列決定するステップが、合成によって単一分子を配列決定するステップである、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
配列決定するステップが、
プライマーを前記鋳型とハイブリダイズさせて、鋳型／プライマーの二重鎖を形成するステップと、
少なくとも１つの検出可能に標識されたヌクレオチドの存在下、ポリメラーゼ酵素が鋳型依存的な様式で該プライマーにヌクレオチドを付加することを可能とする条件下で、該二重鎖を該ポリメラーゼと接触させるステップと、
組み込まれた標識ヌクレオチドからのシグナルを検出するステップと、
該接触させるステップおよび該検出するステップを少なくとも１回逐次的に反復するステップと
を含み、ここで、組み込まれた標識ヌクレオチドの逐次的な検出により、前記核酸の配列を決定する、項目２０に記載の方法。
（項目３１）
前記検出可能に標識されたヌクレオチドが、光学的に標識されたヌクレオチドである、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記光学的に標識されたヌクレオチドが、蛍光標識されたヌクレオチドである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記第１のバーコード配列および前記第２のバーコード配列が同じである、項目２３に記載の方法。
（項目３４）
前記第１のバーコード配列および前記第２のバーコード配列が異なる、項目２３に記載の方法。
（項目３５）
核酸を解析するための方法であって、
核酸鋳型を得るステップと、
第１のバーコード配列を該鋳型の５’部分に付着させ、第２のバーコード配列を該鋳型の３’部分に付着させるステップと、
該鋳型を増幅するステップと、
該鋳型を配列決定するステップと
を含む方法。
（項目３６）
前記第１のバーコード配列および前記第２のバーコード配列を付着させた後で、前記鋳型が、５’から３’の順で以下の構成：第１の公知の配列、第１のバーコード配列、第２の公知の配列、標的ポリヌクレオチド配列、第３の公知の配列、第２のバーコード配列、および第４の公知の配列、を有する、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
第１の識別子を、前記鋳型の５’端へと組み込み、第２の識別子を、該鋳型の３’端へと組み込む、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
増幅するステップの前に、前記鋳型を固体支持体に固定化する、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
前記第１のバーコード配列および前記第２のバーコード配列が同じである、項目３５に記載の方法。
（項目４０）
前記第１のバーコード配列および前記第２のバーコード配列が異なる、項目３５に記載の方法。
（項目４１）
配列決定するステップが、
プライマーを前記鋳型とハイブリダイズさせて、鋳型／プライマーの二重鎖を形成するステップと、
少なくとも１つの検出可能に標識されたヌクレオチドの存在下、ポリメラーゼ酵素が鋳型依存的な様式で該プライマーにヌクレオチドを付加することを可能とする条件下で、該二重鎖を該ポリメラーゼと接触させるステップと、
組み込まれた標識ヌクレオチドからのシグナルを検出するステップと、
該接触させるステップおよび該検出するステップを少なくとも１回逐次的に反復するステップと
を含み、ここで、組み込まれた標識ヌクレオチドの逐次的な検出により、前記核酸の配列を決定する、項目３５に記載の方法。
（項目４２）
被検体の検出を検証するための方法であって、該被検体と独自に結合する２つ以上の識別子の存在を検出するステップを含む方法。
（項目４３）
前記識別子が核酸配列タグである、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記配列タグが、前記被検体に結合する部分と結合する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記被検体がタンパク質である、項目４２に記載の方法。
（項目４６）
前記識別子がペプチドである、項目４５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、分子重複がいかに見かけでは高品質であるが、不正確な配列データをもたらしうるかを示す一連の図面である。
【図２】図２は、本発明の方法が、マルチプレックス配列決定反応の過程で、患者の試料の完全性が維持されたかどうかの検出を、解析でいかにして可能とするかを図解する一連の図面である。
【図３】図３は、本発明の方法により、マルチプレックス配列決定反応における偽陽性が劇的に低減されることを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
本発明の方法は、マルチプレックス配列決定反応において核酸鋳型の完全性を検証し、維持することに関する。本発明の方法は、鋳型核酸を得るステップと、配列識別子の対を鋳型へと組み込むステップと、鋳型を配列決定するステップとを伴う。
【００１８】
ここで、分子重複が、いかに見かけでは高品質であるが、不正確な配列データをもたらしうるかについての一例を図解する一連の図面を示す図１を参照する。パネル１は、２つの患者試料であるＡおよびＢに由来する核酸ライブラリーのプール化（ｐｏｏｌｉｎｇ）を示す。各鋳型は、その患者に由来する遺伝子断片（例えば、ＧＡ）、およびその患者に特異的な分子バーコード（例えば、Ａ）を有する。パネル１に示す通り、患者Ａの試料に由来する核酸は、バーコードＡおよび遺伝子断片ＧＡを包含し、患者Ｂの試料に由来する核酸は、バーコードＢおよび遺伝子断片ＧＢを包含する。
【００１９】
パネル２は、プール化の後、次に、試料を、フローセル上の別々の場所において、プライマーとハイブリダイズさせることを示す。この図では、患者Ａに由来する核酸および患者Ｂに由来する核酸が、固体支持体のクラスター半径内に固定される。増幅プロセスが開始されると、固体支持体に付着したプライマーが、各鋳型において伸長する。１つの場合（患者Ａの核酸鋳型）では、プライマーが鋳型の全長にわたり伸長する。他の場合（患者Ｂの核酸鋳型）では、プライマーが、バーコードＢの配列および共通のプライミング配列は組み込むが、患者Ｂの核酸鋳型に由来する遺伝子断片配列ＧＢは組み込まず、部分的に伸長する。
【００２０】
パネル３は、不適正な分子重複の例を示す。伸長の後、別の増幅サイクルのために二重鎖を変性させ、再アニーリングさせる。この例は、患者Ａの核酸鋳型と患者Ｂの核酸鋳型との間のヘテロ二重鎖の形成を介する不適正な分子重複を示す。この例では、鎖ｉが鎖ｉｉとハイブリダイズして、橋架けを形成する。各鎖のバーコード領域は相補的でないが、バーコードの両側における共通のプライミング配列の量のために、鎖はやはりハイブリダイズする。結果として、ポリメラーゼは、鎖ｉｉを伸長させ、患者Ａの遺伝子断片を、患者Ｂのバーコードを含有する鎖へとコピーする。キメラ分子が形成された。
【００２１】
パネル４は、この分子重複の結果を示す。鎖ｉｉは、患者Ｂのバーコードを含有するが、患者Ａの遺伝子断片を含有する。配列決定プロセスの間に、患者Ａの配列データは、患者Ｂと不適正かつ不正確に関連する。キメラ分子が増幅プロセスの早期に形成されれば、それが、増幅産物のクラスターにおいて優位を占め得、均一のクローン性キメラクラスターがもたらされ得る。配列決定の間に、これは、高品質のシグナルを与えるが、データは、間違ったバーコードと関連するため、間違った試料に割り当てられる。
【００２２】
ここで、本発明の方法が、マルチプレックス配列決定反応の間に、患者の試料の完全性が維持されたかどうかの検出を、解析でいかにして可能とするかについて図解する一連の図面を示す図２を参照する。パネル１は、２つの患者試料であるＡおよびＢに由来する核酸ライブラリーのプール化を示す。各鋳型は、その患者に由来する遺伝子断片（例えば、ＧＡ）、およびその患者に特異的な（第１および第２の）配列識別子の対（例えば、Ａ１およびＡ２）を有する。
【００２３】
第１および第２の識別子は、識別子の各セットが特定の患者と相互関連して、患者試料を識別することが可能となるようにデザインする。第１および第２の識別子は同じでありうる。代替的には、第１および第２の識別子は異なりうる。特定の実施形態では、識別子の対は、鋳型に付着している第１および第２のバーコード配列である。バーコード配列は、第１のバーコード配列を鋳型の５’端に付着させ、第２のバーコード配列を鋳型の３’端に付着させるように、鋳型に付着させることができる。第１および第２のバーコード配列は、同じ場合もあり、異なる場合もある。
【００２４】
この図では、配列識別子は、バーコード配列の対である。この図はまた、バーコード配列が各鋳型の遺伝子断片を挟むように、バーコード配列の対を、鋳型の５’端および３’端で核酸鋳型に付着させることも示す。パネル１に示す通り、プールは、遺伝子断片ＧＡを挟むバーコード配列Ａ１およびＡ２を有する核酸鋳型である患者Ａの試料を包含し、また、バーコード配列Ｂ１およびＢ２ならびに遺伝子断片ＧＢを有する核酸鋳型である患者Ｂの試料も包含する。
【００２５】
パネル２は、プール化の後、試料を、次に、フローセル上の別々の場所において、プライマーとハイブリダイズさせることを示す。この図では、患者Ａに由来する核酸および患者Ｂに由来する核酸が、固体支持体のクラスター半径内に固定される。増幅プロセスが開始されると、固体支持体に付着したプライマーが、各鋳型において伸長する。１つの場合（患者Ａの核酸鋳型）では、プライマーが鋳型の全長にわたり伸長する。他の場合（患者Ｂの核酸鋳型）では、プライマーが、バーコードＢ２の配列および共通のプライミング配列は組み込むが、患者Ｂの核酸鋳型に由来する遺伝子断片配列ＧＢまたはバーコードＢ１の配列は組み込まず、部分的に伸長する。
【００２６】
パネル３は、不適正な分子重複の例を示す。伸長の後、別の増幅サイクルのために二重鎖を変性させ、再アニーリングさせる。この例は、患者Ａの核酸鋳型と患者Ｂの核酸鋳型との間のヘテロ二重鎖の形成を介する不適正な分子重複を示す。この例では、鎖ｉが鎖ｉｉとハイブリダイズして、橋架けを形成する。各鎖のバーコード領域であるＡ２とＢ２とは相補的でないが、バーコードの両側における共通のプライミング配列の量のために、鎖はやはりハイブリダイズする。結果として、ポリメラーゼは、鎖ｉｉを伸長させ、患者Ａの遺伝子断片をコピーする。しかし、２つのバーコードの場合、患者Ｂのバーコードのうちの１つ（Ｂ２）だけが、コピーされる鎖に含有される。他のバーコードは、患者Ａのバーコード配列のうちの１つ（Ａ１）となる。図１の例とは異なり、この例で形成されるキメラ分子は、患者Ａに由来する１つのバーコード配列（Ａ１）と、患者Ｂに由来する１つのバーコード配列（Ｂ２）とを包含する。
【００２７】
パネル４は、この分子重複の結果を示す。鎖ｉｉは、患者Ａの遺伝子断片を含有する一方で、それは、患者Ｂのバーコードのうちの１つだけ（Ｂ２）を含有する。他のバーコードは、患者Ａのバーコード配列のうちの１つ（Ａ１）となる。それ自体における各バーコード配列は、有効なバーコード配列である一方で、２つのバーコード配列は一緒になっても有効なバーコード配列対を形成しない。配列決定プロセスの間、これは、高品質のシグナルをもたらすが、データ解析においては、データが有効でないバーコード配列対を含有する、すなわち、バーコード配列Ａ１がバーコード配列Ｂ２と共に認められるべきでなく、よって、交差が生じたことが公知となるため、分子は、有効でないと認識される。したがって解析では、患者の試料の完全性が維持されなかったことが決定され、次いで、データを最終解析から除外することができる。
【００２８】
図３は、本発明の方法により、マルチプレックス配列決定反応における偽陽性が劇的に低減されることを示すグラフである。２つの試料調製手順は、本明細書で記載される配列決定反応を実行する前に実施した。第１の試料調製では、プール化し、次いで配列決定する前に、単一のバーコード配列だけを、異なる試料に由来する鋳型分子に付着させた。第２の試料調製では、プール化し、次いで配列決定する前に、２つのバーコード配列を、異なる試料に由来する鋳型分子に付着させた。
【００２９】
図３におけるデータは、鋳型分子１つあたり単一のバーコード配列だけを用いる場合、分子重複は、見かけでは高品質であるが、不正確な配列データをもたらしうることを示す（ひし形の点）。単一のバーコード配列を試料Ａに由来する核酸に付着させ、異なる単一のバーコード配列を試料Ｂに由来する核酸に付着させた。次いで、各試料（ＡおよびＢ）に由来する、バーコード処理された鋳型をプールした。プール化の後、試料を、次に、フローセル上の別々の場所において、プライマーとハイブリダイズさせた。任意の特定の理論または作用機構により限定されずに述べると、図３におけるデータは、試料Ａに由来する核酸および試料Ｂに由来する核酸が、固体支持体のクラスター半径内に固定されたことを示唆する。増幅プロセスが開始されると、固体支持体に付着したプライマーが、各鋳型において伸長した。場合によっては、プライマーが、バーコードＢの配列および共通のプライミング配列は組み込んだが、試料Ｂの遺伝子断片配列は組み込まず、部分的に伸長した。
【００３０】
伸長の後、別の増幅サイクルのために二重鎖を変性させ、再アニーリングさせた。ある場合には、試料Ａの核酸鋳型と試料Ｂの核酸鋳型との間のヘテロ二重鎖が形成された。各鎖のバーコード領域は相補的でないが、バーコードの両側における共通のプライミング配列の量のために、鎖はやはりハイブリダイズした。結果として、ポリメラーゼは鎖を伸長させ、試料Ａの遺伝子断片を、試料Ｂのバーコードを含有する鎖上へとコピーした。キメラ分子が形成された。配列決定プロセスの間、試料Ａの配列データは、試料Ｂと不適正かつ不正確に関連した。キメラ分子が増幅プロセスの早期に形成されたので、それは、増幅産物のクラスターにおいて優位を占め、均一のクローン性キメラクラスターがもたらされた。配列決定の間、これは、高品質のシグナルを与えたが、データは、それが間違ったバーコードと関連したため、間違った試料に割り当てられた。図３のひし形の点を参照されたい。
【００３１】
図３はまた、本発明の方法により、マルチプレックス配列決定反応における偽陽性が劇的に低減されることを示すデータも提供する（四角形の点）。バーコード配列の対（Ａ１およびＡ２ならびにＢ１およびＢ２）を、２つの異なる試料である試料ＡおよびＢに由来する核酸に付着させた。バーコード配列が各鋳型の遺伝子断片を挟むように、バーコード配列の対を、各鋳型の５’端および３’端で核酸鋳型に付着させた。
【００３２】
次いで、各試料（ＡおよびＢ）に由来する、バーコード処理された鋳型をプールした。プール化の後、試料を、次に、フローセル上の別々の場所において、プライマーとハイブリダイズさせた。任意の特定の理論または作用機構により限定されずに述べると、図３におけるデータは、試料Ａに由来する核酸および試料Ｂに由来する核酸が、固体支持体のクラスター半径内に固定されたことを示唆する。増幅プロセスが開始されると、固体支持体に付着したプライマーが、各鋳型において伸長した。特定の場合には、プライマーが、バーコードＢ２の配列および共通のプライミング配列は組み込むが、試料Ｂの核酸鋳型に由来する遺伝子断片配列およびバーコードＢ１の配列は組み込まず、部分的に伸長した。
【００３３】
伸長の後、別の増幅サイクルのために二重鎖を変性させ、再アニーリングさせた。この例では、試料Ａに由来する鋳型と試料Ｂに由来する鋳型とがハイブリダイズして、橋架けを形成した。各鎖のバーコード領域であるＡ２とＢ２とは相補的でなかったが、バーコードの両側における共通のプライミング配列の量のために、鎖はやはりハイブリダイズした。結果として、ポリメラーゼは、鎖を伸長させ、試料Ａの遺伝子断片をコピーした。しかし、２つのバーコードの場合、試料Ｂのバーコードのうちの１つ（Ｂ２）だけが、コピーされる鎖に含有された。他のバーコードは、試料Ａのバーコード配列のうちの１つ（Ａ１）であった。単一のバーコード増幅反応とは異なり、この増幅反応で形成されるキメラ分子は、試料Ａに由来する１つのバーコード配列（Ａ１）と、試料Ｂに由来する１つのバーコード配列（Ｂ２）とを包含した。
【００３４】
それ自体における各バーコード配列は、有効なバーコード配列である一方で、２つのバーコード配列は一緒になっても有効なバーコード配列対を形成しなかった。配列決定プロセスの間、これは、高品質のシグナルをもたらしたが、データ解析においては、データが有効でないバーコード配列対を含有する、すなわち、バーコード配列Ａ１がバーコード配列Ｂ２と共に認められるべきでなく、よって、交差が生じたことが公知となるため、分子は、有効でないと認識された。したがって解析では、患者の試料の完全性が維持されなかったことが決定され、データを最終解析から除外した（図３における四角形の点）。したがって、本明細書におけるデータは、本発明の方法により、交差率が劇的に低減することを示す。交差率が高ければ、偽陽性および／または偽陰性が生じる可能性がより高くなる。
【００３５】
以下の節では、バーコード配列の一般的な検討項目、バーコード配列の核酸鋳型への付着、および核酸の配列決定、例えば、鋳型の検討項目、合成による配列決定において有用なポリメラーゼ、表面の選択、反応条件、シグナルの検出および解析について論じる。
【００３６】
核酸鋳型
核酸鋳型は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を包含する。核酸鋳型は、合成の場合もあり、天然に存在する供給源に由来する場合もあり、合成配列および天然配列の両方を包含する場合もあり、ＰＣＲ産物を包含する場合もある。一実施形態では、核酸鋳型分子を、タンパク質、脂質、および鋳型以外の核酸など、他の多様な成分を含有する生物学的試料から単離する。核酸鋳型分子は、動物、植物、細菌、真菌、または他の任意の細胞生物から得られる任意の細胞材料から得ることができる。本発明において用いるための生物学的試料には、ウイルス粒子またはウイルス調製物が含まれる。核酸鋳型分子は、生物から直接得ることもでき、生物から得られる生物学的試料、例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、糞便、および組織から得ることもできる。任意の組織標本または体液標本は、本発明において用いるための核酸の供給源として用いることができる。核酸鋳型分子はまた、初代細胞培養物または細胞系などの培養細胞からも単離することができる。そこから鋳型核酸を得る細胞または組織は、ウイルスまたは他の細胞内病原体に感染している可能性がある。試料はまた、生物学的標本から抽出される全ＲＮＡの場合もあり、ｃＤＮＡライブラリーの場合もあり、ウイルスＤＮＡの場合もあり、ゲノムＤＮＡの場合もある。
【００３７】
生物学的試料から得られる核酸は、典型的に、解析に適する断片を生成させるように断片化する。一実施形態では、生物学的試料に由来する核酸を、音波処理により断片化する。核酸鋳型分子は、２００３年１０月９日に公開された米国特許出願公開第ＵＳ２００２／０１９０６６３Ａ１号において記載されている通りに得ることができる。一般に、核酸は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２８０〜２８１頁（１９８２年）により記載されている技法などの多様な技法により、生物学的試料から抽出することができる。一般に、個別の核酸鋳型分子は、約１塩基〜約２０ｋｂでありうる。核酸分子は、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、一本鎖領域を伴う二本鎖（例えば、ステム構造およびループ構造）の場合もある。
【００３８】
本明細書で記載される生物学的試料は、洗浄剤または界面活性剤の存在下でホモジナイズすることもでき、分画することもできる。緩衝液中の洗浄剤の濃度は、約０．０５％〜約１０．０％でありうる。洗浄剤の濃度は、溶液中で洗浄剤を可溶性に維持する最大量でありうる。好ましい実施形態では、洗浄剤の濃度は、０．１％〜約２％である。洗浄剤、特に、変性作用のない弱い洗浄剤は、試料を可溶化させるように作用しうる。洗浄剤は、イオン性の場合もあり、非イオン性の場合もある。非イオン性洗浄剤の例には、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘシリーズ（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００  ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ＝９〜１０；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００Ｒ；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、ｘ＝７〜８）などのトリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレン（９）ドデシルエーテル、ジギトニン、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ６３０オクチルフェニルポリエチレングリコール、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（ベータＯＧ）、ｎ−ドデシル−ベータ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート、ポリドカノール、ｎ−ドデシルベータ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）、ＮＰ−４０ノニルフェニルポリエチレングリコール、Ｃ１２Ｅ８（オクタエチレングリコールｎ−ドデシルモノエーテル）、ヘキサエチレングリコールモノ−ｎ−テトラデシルエーテル（Ｃ１４ＥＯ６）、オクチル−ベータ−チオグルコピラノシド（オクチルチオグルコシド、ＯＴＧ）、Ｅｍｕｌｇｅｎ、およびポリオキシエチレン１０ラウリルエーテル（Ｃ１２Ｅ１０）が含まれる。イオン性洗浄剤（アニオン性洗浄剤またはカチオン性洗浄剤）の例には、デオキシコレート、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）が含まれる。本発明の精製スキームではまた、Ｃｈａｐｓ、双性イオン（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎ）  ３−１４、および３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネートなどの両性イオン性試薬も用いることができる。また、別の洗浄剤または界面活性剤を伴うかまたは伴わずに尿素を添加しうることも想定される。
【００３９】
溶解溶液またはホモジネーション溶液はさらに、還元剤などの他の剤も含有してもよい。このような還元剤の例には、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ベータ−メルカプトエタノール、ＤＴＥ、ＧＳＨ、システイン、システアミン、トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、または亜硫酸の塩が含まれる。
【００４０】
バーコード配列
特定の実施形態では、配列識別子は、核酸鋳型に付着しているかまたはこれに組み込まれているバーコード配列である。バーコード配列は、第１のバーコード配列を鋳型の５’端に付着させ、第２のバーコード配列を鋳型の３’端に付着させるように、鋳型に付着させることができる。第１および第２のバーコード配列は、同じ場合もあり、異なる場合もある。バーコード配列は、配列決定される標的を包含する鋳型の隣接領域へと組み込むことができる。
【００４１】
バーコード配列のセットをデザインするための例示的な方法およびバーコード配列を付着させるための他の方法は、それらの各々の内容が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１３８，０７７号；同第６，３５２，８２８号；同第５，６３６，４００号；同第６，１７２，２１４号；同第６２３５，４７５号；同第７，３９３，６６５号；同第７，５４４，４７３号；同第５，８４６，７１９号；同第５，６９５，９３４号；同第５，６０４，０９７号；同第６，１５０，５１６号；同第ＲＥ３９，７９３号；同第７，５３７，８９７号；同第６１７２，２１８号；および同第５，８６３，７２２号において示されている。
【００４２】
バーコード配列は一般に、その配列を配列決定反応において有用とする、具体的な特徴を包含する。例えば、バーコード配列は、バーコード配列内のホモポリマー領域、すなわち、ＡＡまたはＣＣＣなど、列をなす２つ以上の同じ塩基が最小限であるかまたはこれを有さないようにデザインすることができる。バーコード配列はまた、それらが配列決定される標的領域に重複しないようにデザインすることもでき、標的と同一な配列を含有するようにデザインすることもできる。
【００４３】
第１および第２のバーコード配列は、各対の配列が特定の試料と相互関連して、試料を識別および検証することが可能となるようにデザインする。バーコード配列のセットをデザインする方法は、例えば、その内容が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｂｒｅｎｎｅｒら（米国特許第６，２３５，４７５号）において示されている。特定の実施形態では、バーコード配列が、約２ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドの範囲にあり、好ましくは約４ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチドの範囲にある。バーコード配列は、鋳型核酸と共に配列決定されるか、または別個の読取りにおいて配列決定されうるので、オリゴヌクレオチド長は、付着した鋳型核酸からの最長の読取りを可能とするように、最小限の長さとすべきである。一般に、バーコード配列は、少なくとも１つの塩基だけ鋳型核酸分子から隔てられる。
【００４４】
本発明の方法は、バーコード配列を、鋳型核酸に付着させるステップを包含する。鋳型核酸は、多様な機械的方法、化学的方法、および／または酵素的方法を用いて、所望される長さ、例えば、一般に１００〜５００塩基もしくはそれより長い塩基へと断片化または切断することができる。ＤＮＡは、音波処理によりランダムに切断することもでき、ＤＮアーゼまたは１もしくは複数の制限酵素、トランスポザーゼ、あるいはニッキング酵素に曝露することもできる。ＲＮＡは、ＲＮアーゼ、熱に加えてマグネシウムへの短時間の曝露により断片化することもでき、切断により断片化することもできる。ＲＮＡは、断片化の前にｃＤＮＡへと転換することもでき、断片化の後でｃＤＮＡへと転換することもできる。
【００４５】
バーコード配列は、当技術分野で公知の方法を用いて鋳型と統合する。バーコード配列は、例えば、リガーゼ、ポリメラーゼ、Ｔｏｐｏクローニング（例えば、トポイソメラーゼ酵素を用いるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのトポイソメラーゼベクタークローニングシステム）、または化学的ライゲーションもしくは化学的コンジュゲーションを用いて鋳型と統合する。リガーゼとは、オリゴヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を、鋳型核酸分子へとライゲーションすることが可能な任意の酵素でありうる。適切なリガーゼには、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴ４  ＲＮＡリガーゼ（このようなリガーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから市販されている）が含まれる。当技術分野では、リガーゼを用いる方法が周知である。ポリメラーゼとは、ヌクレオチドを鋳型核酸分子の３’末端および５’末端へと付加することが可能な任意の酵素でありうる。バーコード配列は、ＰＣＲ反応を介し、ＰＣＲプライマーの一部として組み込むことができる。
【００４６】
ライゲーションは、平滑末端の場合もあり、突出末端の使用を介する場合もある。特定の実施形態では、断片化の後、平滑末端を形成するために、断片の末端を修復することもでき、トリミングする（例えば、エクソヌクレアーゼを用いて）こともでき、充填する（例えば、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて）こともできる。平滑末端を生成させたら、末端をポリメラーゼおよびｄＡＴＰで処理して、断片の３’端および５’端への鋳型に依存しない付加を形成し、これにより単一のＡ突出をもたらすことができる。Ｔ−Ａクローニングと称する方法においてこの単一のＡを用いて、断片の、５’端からの単一のＴ突出とのライゲーションを導く。
【００４７】
代替的には、制限消化後の制限酵素により放置された突出の可能な組合せは公知であるため、末端は、そのまま、すなわち、不揃いの末端として放置することができる。特定の実施形態では、相補的な突出末端を伴う二本鎖オリゴヌクレオチドが用いられる。
【００４８】
表面付着
本発明の方法は、バーコード処理された核酸鋳型を、固体支持体に付着または固定化するステップを包含することができる。このような方法は、例えば、それらの各々の内容が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｓａｂｏｔら（米国特許出願第２００９／０２２６９７５号）、Ａｄｅｓｓｉら（米国特許第７，１１５，４００号）、およびＫａｗａｓｈｉｍａら（米国特許出願第２００５／０１００９００号）において記載されている。
【００４９】
本明細書で用いられる「固定化された」という用語は、共有結合的結合（複数可）または非共有結合的結合（複数可）を介する固体支持体への直接的付着または間接的付着を包含することを意図する。本発明の特定の実施形態では、共有結合的付着を用いうるが、一般に要求される全てのことは、鋳型が支持体における固定化を維持することである。典型的に、３’端が酵素的伸長に利用可能であり、配列の少なくとも一部を相補的な配列へとハイブリダイズさせることが可能であるように、オリゴヌクレオチドを固定化する。固定化は、表面に付着したオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを介して生じうる。代替的には、固定化は、上記で示した共有結合的付着など、塩基対合によるハイブリダイゼーション以外の手段により生じうる。
【００５０】
本発明において用いられる基材または支持体には、ラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレン表面、ポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、ガラス表面、およびシリコンウェハーが含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、固体支持体には、例えば、ポリヌクレオチドなどの分子への共有結合的付着を可能とする反応性基を含めた中間材料の層またはコーティングを適用することにより機能化された不活性基材または不活性マトリックスが含まれうる。
【００５１】
増幅
特定の実施形態では、本発明の方法は、鋳型を配列決定するステップの前に、バーコード処理された核酸鋳型を増幅するステップを包含する。このような方法は、例えば、それらの各々の内容が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｓａｂｏｔら（米国特許出願第２００９／０２２６９７５号）、Ａｄｅｓｓｉら（米国特許第７，１１５，４００号）、およびＫａｗａｓｈｉｍａら（米国特許出願第２００５／０１００９００号）において記載されている。
【００５２】
プライマーオリゴヌクレオチドまたは増幅配列は、増幅反応のプライマーアニーリングステップにおいて遭遇する条件下で、増幅される一本鎖ポリヌクレオチド配列に特異的にアニーリングすることが可能なポリヌクレオチド配列である。本明細書では、一般に、核酸、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドという用語が互換的に用いられる。別段に特別に示されない限り、異なる用語は、サイズ、配列、または他の特性の任意の特定の差違を表すことを意図しない。記載の明確さのために述べると、これらの用語は、複数の分子種を包含する特定の方法または組成物について記載する場合、１つの分子種を別の分子種から識別するのに用いることができる。
【００５３】
加えて、プライマーは、例えば、プライマーの固体支持体への共有結合的付着を容易とする、ヌクレオチド以外の化学改変も包含しうる。ある化学改変は、それら自体、プライマーとしての分子の機能を改善する場合もあり、プライマー（またはこれに由来する伸長したポリヌクレオチド鎖）の固体支持体からの切断を可能とする切断部位をもたらすことなど、他の一部の有用な機能性をもたらす場合もある。有用な化学改変はまた、改変が除去されまたは逆にされるまでハイブリダイゼーションまたはプライマーの伸長を防止する可逆的改変ももたらしうる。同様に、本発明に従い表面に付着した他の分子は、分子機能の特定の化学的活性を変化させる、切断可能なリンカー部分およびまたは可逆的改変も包含しうる。
【００５４】
本明細書で示される方法において用いられる複数のオリゴヌクレオチドは、捕捉オリゴヌクレオチドとして機能する種を包含しうる。捕捉オリゴヌクレオチドは、鋳型特異的な部分、すなわち、増幅される一本鎖ポリヌクレオチド分子など、対象の一本鎖ポリヌクレオチド分子におけるプライマー結合の配列とアニーリングすることが可能なヌクレオチド配列を包含しうる。プライマー結合配列とは一般に、公知の配列であり、したがって、一本鎖ポリヌクレオチド分子の公知の配列領域と相補的である。捕捉オリゴヌクレオチドは、捕捉配列と増幅配列とを包含しうる。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドは、同じ基材に付着している増幅プライマーより長く、この場合、捕捉配列の５’端は、増幅プライマーのうちの１つと同じ配列を有する領域を含みうる。鋳型の３’端など、鋳型の部分は、捕捉配列の３’と相補的でありうる。鋳型の５’端は、鋳型をコピーしたら、コピーが固定化された増幅プライマーとハイブリダイズしうるように、増幅プライマーのうちの１つと同一な配列を含む領域を含有しうる。したがって、本明細書で示される方法において有用なオリゴヌクレオチド種は、捕捉配列、増幅配列、またはこれらの両方を有しうる。逆に、オリゴヌクレオチド種は、捕捉配列、増幅配列、またはこれらの両方を欠く場合もある。このようにして、オリゴヌクレオチド種のハイブリダイゼーション特異性は、本方法の特定の適用のために調整することができる。
【００５５】
プライマー結合配列の長さは、ポリヌクレオチド鋳型分子の公知の配列の長さと同じである必要はなく、より短い場合もあり、特に、１６〜５０ヌクレオチド、より特定すれば、１６〜４０ヌクレオチド、さらにより特定すれば、２０〜３０ヌクレオチドの長さでありうる。プライマーオリゴヌクレオチドの所望される長さは、多くの因子に依存する。しかし、プライマーは、典型的には、プライマー結合配列以外の配列とアニーリングする可能性が極めて低いように、十分に長い（複雑である）。したがって、鋳型配列を挟む公知の配列は、プライマー結合部分および捕捉配列、バーコード配列、またはこれらの組合せなどの他の部分を包含しうる。
【００５６】
本発明の特定の実施形態では、プライマーの一部が遊離してその同種の鋳型とアニーリングし、３’ヒドロキシル基が遊離してプライマーの伸長において機能するように、固相増幅のための増幅プライマーを、プライマーの５’端において、またはその近傍において、固体支持体へと共有結合的に付着させることにより固定化する。
【００５７】
選択される付着化学反応は典型的に、固体支持体の性質およびそれに適用される任意の機能化または誘導体化に依存する。核酸についての実施形態の場合、プライマーそれ自体は、付着を容易とするためのヌクレオチド以外の化学改変でありうる部分を包含しうる。例えば、プライマーは、５’端におけるホスホロチオエートまたはチオホスフェートなど、硫黄含有求核試薬（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）を包含しうる。固体により支持されたポリアクリルアミドヒドロゲルの場合、この求核試薬は、ヒドロゲル中に存在するブロモアセトアミド基に結合しうる。一実施形態では、プライマーを固体支持体に付着させる手段が、重合したアクリルアミドおよびＮ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を含むヒドロゲルへのＳｔホスホロチオエート付着を介する。
【００５８】
固定化されたオリゴヌクレオチドの一様で均一に分布した層は、オリゴヌクレオチド種の溶液を固体支持体へとカップリングさせること（グラフトすること）により形成することができる。溶液は、オリゴヌクレオチドの均一の集団を含有しうるが、典型的には、異なるオリゴヌクレオチド種の混合物を含有する。混合物は、例えば、少なくとも２つ、３つもしくはそれより多くのオリゴヌクレオチドの異なる種を包含しうる。したがって、溶液へと曝露される各表面は、溶液と反応して、曝露される固体支持体の全体にわたり一様な密度の固定化された配列を創出する。固定化された異なる配列の混合物を有する表面部分それ自体を、固定化された同じ配列の混合物を有する表面の領域により取り囲むことができる。増幅オリゴヌクレオチドの適切な密度は、少なくとも１フェムトモル／ｍｍ２（１ｃｍ２当たり６×１０１０個）、またはより最適化すれば、少なくとも１０フェムトモル／ｍｍ２（１ｃｍ２当たり６×１０１１個）である。捕捉オリゴヌクレオチドの密度を制御して、最適のクラスター密度である１ｃｍ２当たりのクラスター１０６〜１０９個および最適のクラスター輝度を与えることができる。増幅オリゴヌクレオチド種に対する捕捉オリゴヌクレオチド種の比は、所望されるクラスターの密度および輝度に応じて、少なくとも１：１００、１：１０００、または１：１０００００が含まれるがこれらに限定されない任意の所望される値でありうる。核酸以外の分子を表面に付着させる実施形態では、他の分子種の同様の密度または比も用いることができる。
【００５９】
特定の実施形態では、鋳型分子の各クラスターについて、一本鎖ポリヌクレオチド鋳型分子の相補的なコピーを、ハイブリダイゼーションにより固体支持体に付着させる。当技術分野では、ワトソン−クリック塩基対合を介して相補的な配列の間で安定的な二重鎖を形成するためのハイブリダイゼーション法が公知である。固定化された捕捉オリゴヌクレオチドは、一本鎖鋳型ポリヌクレオチド分子の領域または鋳型特異的な部分と相補的な配列の領域を包含しうる。次いで、ヌクレオチドを逐次的に付加することにより捕捉配列を伸長させて、捕捉オリゴヌクレオチドを介して固体支持体に付着した一本鎖ポリヌクレオチド配列の相補的なコピーを生成させる伸長反応を実行することができる。支持体に固定化されていない一本鎖ポリヌクレオチド配列は、変性条件下で相補的な配列から分離し、例えば、洗浄することにより除去することができる。
【００６０】
核酸の鎖に言及して用いられる場合の「〜を分離する（ｓｅｐａｒａｔｅ）」および「〜を分離すること（ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ）」という用語は、例えば、一本鎖ポリヌクレオチド配列とその相補体とのワトソン−クリックＤＮＡ二重鎖内で相互作用するＤＮＡ塩基の物理的解離を指す。これらの用語はまた、これらの鎖の物理的分離も指す。したがって、この用語は、別のプライマーオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を、二重鎖の鎖のうちの１つとアニーリングさせることを可能とする状況を創出するプロセスを指す場合がある。第１の伸長反応の後、二重鎖は、単一の５’付着を介して固定化され、よって、鎖の分離は、表面からの鎖のうちの１つの喪失を結果としてもたらしうる。二重鎖の両方の鎖を固定化した場合、鎖の分離とは、二重鎖が２つの固定化された一本鎖へと転換されることを意味する。
【００６１】
本発明の一態様では、増幅プライマーのうちの１または複数を改変して、一本鎖ポリヌクレオチド分子の領域または鋳型特異的な部分のハイブリダイゼーションを防止することができる。代替的に、または加えて、増幅プライマーのうちの１または複数を改変して、１または複数の伸長反応の間のプライマーの伸長を防止し、したがってハイブリダイズした鋳型のコピーを防止することも可能である。これらの改変は、一時的な場合もあり、永続的な場合もある。
【００６２】
一般に、捕捉配列は、複数の増幅オリゴヌクレオチドと同じ配列の領域を包含する。伸長した固定化鋳型のコピーの３’端が、増幅プライマーのうちの１つとハイブリダイズし、伸長したら、結果として得られる二重鎖は、両端で固定化され、捕捉オリゴヌクレオチド配列における塩基の全てがコピーされる。したがって、捕捉オリゴヌクレオチドは、両方の増幅プライマー配列に加えて、鋳型の末端と相補的なさらなる配列も包含しうる。典型的に、鋳型の末端と相補的な配列は、増幅プライマーのうちのいずれにも存在しない。代替的には、増幅プライマーは、一本鎖鋳型の末端と相補的な配列を含有しうるが、増幅プライマーを可逆的に遮断して、特定の増幅プロセスにおける第１の伸長ステップなど、１または複数の伸長ステップの間のハイブリダイゼーションおよび／または伸長を防止することもできる。
【００６３】
本発明の一態様によれば、増幅プライマーのうちの１または複数は、鋳型のハイブリダイゼーションもしくは伸長またはこれらの両方のいずれかに対して可逆的遮断として作用する改変を包含しうる。非限定的な例を目的として述べると、このような改変は、増幅プライマーと相補的なヌクレオチドのさらなる配列の存在でありうる。このさらなる配列は、増幅プライマーの一部に存在することが可能であり、したがって、分子内ヘアピン二重鎖またはプライマーの伸長を防止する３’遮断基として作用する。代替的には、さらなる配列は、増幅プライマーとハイブリダイズする別個のオリゴヌクレオチドにおいて見出すこともできる。このような改変の具体的な特徴は、改変されたプライマーオリゴヌクレオチドの機能性が回復され、方法の後のステップの間の、プライマーがハイブリダイゼーションおよび伸長を経ることが可能なように、それを除去することもでき、変化させることもでき、逆にすることもできることである。他の例の間では、遮断基が、酵素的に除去されうる３’リン酸部分など、小さな化学種の場合もあり、プライマーの３’端がハイブリダイゼーション（およびこれによる伸長）できないように、塩基性ヌクレオチドである場合もあり、例えば、特定の配列を選択的に切断する制限エンドヌクレアーゼまたはウラシルデオキシリボヌクレオチドもしくは８−オキソグアニンなどの外因性塩基を有するオリゴヌクレオチドを選択的に切断するデグリコシラーゼを用いて、固定化された鎖から選択的に切り出しうるヌクレオチド配列の場合もある。
【００６４】
一実施形態では、３つの種類のオリゴヌクレオチド（例えば、捕捉配列、フォワードプライマー、およびリバースプライマーを含む）のうちの複数を、固体支持体に固定化する。代替的には、３つのオリゴヌクレオチドは、フォワード増幅、遮断されるフォワード増幅、および遮断されないフォワードプライマーが捕捉配列として作用する、リバース増幅であることも可能である。
【００６５】
一本鎖ポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの一本鎖形態に由来している場合もあり、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）形態（例えば、ゲノムＤＮＡ断片、ＰＣＲ産物、および増幅産物など）に由来している場合もある。したがって、一本鎖ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド二重鎖のセンス鎖の場合もあり、アンチセンス鎖の場合もある。当技術分野では、標準的な技法を用いる本発明の方法において用いるのに適する一本鎖ポリヌクレオチド分子を調製する方法が周知である。主要なポリヌクレオチド分子の正確な配列は、本明細書で示される方法の異なるステップにおいて公知の場合もあり、公知でない場合もある。二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖領域が利用可能であり、捕捉オリゴヌクレオチド配列と少なくとも部分的に相補的である限りにおいて、二本鎖ポリヌクレオチド分子を、一本鎖ポリヌクレオチド分子について本明細書で説明した固定化された捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせうることが理解される。
【００６６】
本明細書では、二本鎖分子構築物のうちの一方の鎖を単離するための例示的な方法が記載される。配列が未知の試料を断片化し、その断片の両端にバーコード配列を付着させることができる。次いで、各断片の末端にアダプターを付着させる。アダプターのうちの一方の鎖は、表面に固定化するための部分、例えば、ストレプトアビジンの表面へと捕捉されうるビオチンを含有しうる。アダプターは、例えば、その内容が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、同時係属出願であるＵＳ２００７／０１２８６２４において記載されている、ミスマッチアダプターでありうる。そのうちの１つがビオチン改変を保有する増幅プライマーの対を用いるミスマッチアダプターまたは分岐型アダプターの増幅とは、各二重鎖のうちの一方の鎖がビオチン改変を保有することを意味する。ストレプトアビジン表面への鎖の固定化とは、ビオチニル化されていない鎖を、単に、変性／鎖の分離により溶出させうることを意味する。溶出した構築物は、一本鎖形態にあって、ハイブリダイゼーション条件へと曝露されると、固定化された捕捉配列に対してハイブリダイズさせるのに用いることができ、それは、伸長させ得る。
【００６７】
特定の実施形態では、一本鎖ポリヌクレオチド分子がＤＮＡ分子である。より特定すれば、一本鎖ポリヌクレオチド分子は、ゲノムＤＮＡ分子、またはイントロン配列およびエクソン配列（コード配列）の両方のほか、プロモーター配列およびエンハンサー配列などの非コード制御配列も包含するそれらのアンプリコンを表す。なおさらにより特定すれば、一本鎖ポリヌクレオチド分子は、ヒトゲノムＤＮＡ分子またはそれらのアンプリコンである。
【００６８】
特定の実施形態では、一本鎖標的ポリヌクレオチド分子は、公知の配列の少なくとも２つの領域を有する。さらにより特定すれば、一本鎖ポリヌクレオチド分子の５’末端および３’末端は、一本鎖ポリヌクレオチド分子が、
５’［公知の配列Ｉ］−［バーコード配列］−［公知の配列ＩＩ］−［標的のポリヌクレオチド配列］−［公知の配列ＩＩＩ］−［バーコード配列］−［公知の配列ＩＶ］−３’という構造をとるように、公知の配列の領域を有する。
【００６９】
典型的に、「公知の配列Ｉ」、「公知の配列ＩＩ」、「公知の配列ＩＩＩ」、および「公知の配列ＩＶ」は、２０を超えるか、または４０を超えるか、または５０を超えるか、または１００を超えるか、または３００を超える連続ヌクレオチドからなる。４つの配列の正確な長さは、同一な場合もあり、同一でない場合もある。プライマー結合配列は一般に、公知の配列であり、したがって、特に、一本鎖ポリヌクレオチド分子の「公知の配列Ｉ」、「公知の配列ＩＩ」、「公知の配列ＩＩＩ」、および「公知の配列ＩＶ」内の配列と相補的である。プライマー結合配列の長さは、公知の配列Ｉ〜ＩＶの長さと同じである必要はなく、より短い場合もあり、特に、１６〜５０ヌクレオチド、より特定すれば、１６〜４０ヌクレオチド、さらにより特定すれば、２０〜３０ヌクレオチドの長さでありうる。公知の配列Ｉ〜ＩＶは、互いに同じの場合もあり、異なる場合もある。
【００７０】
当技術分野では、ワトソン−クリック塩基対合により相補的な配列の間で安定的な二重鎖を形成するためのハイブリダイゼーション法が公知である。一本鎖ポリヌクレオチドの鋳型分子の領域または部分は、固定化された捕捉配列のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的でありうる。増幅オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションおよび／もしくは伸長を防止するように改変されるか、または鋳型鎖の公知の末端と非相補的なので、ハイブリダイゼーションおよび伸長が可能なのは捕捉配列だけとなる。次いで、伸長反応であって、ヌクレオチドを逐次的に付加することにより捕捉配列プライマーを伸長させて、捕捉配列オリゴヌクレオチドを介して固体支持体に付着した一本鎖鋳型ポリヌクレオチドの相補的なコピーを生成させる伸長反応を実行することができる。支持体に固定化されていない一本鎖鋳型ポリヌクレオチド配列は、変性条件下で相補的な配列から分離することができ、例えば、洗浄することにより除去することができる。したがって、表面における個別の捕捉配列オリゴヌクレオチド間の距離により一本鎖鋳型ポリヌクレオチドの密度が制御され、よって、また、表面において後に形成されるクラスターの密度も制御される。
【００７１】
改変されたフォワードプライマーオリゴヌクレオチドが遮断され、伸長することが不可能な特定の実施形態では、一般に増幅プライマーオリゴヌクレオチドの全てが、一本鎖鋳型ポリヌクレオチドとハイブリダイズする。伸長反応を実行する場合は、ヌクレオチドを逐次的に付加することにより、改変されていないフォワード捕捉プライマーオリゴヌクレオチドだけを伸長させて、改変されていないフォワードプライマーオリゴヌクレオチドを介して固体支持体に付着した一本鎖鋳型ポリヌクレオチドの相補的なコピーを生成させる。支持体とハイブリダイズしていない一本鎖鋳型ポリヌクレオチド配列は、変性条件下で、伸長していない遮断されたフォワードプライマーオリゴヌクレオチドから分離し、例えば、ホルムアミドなどの化学的変性剤による洗浄によって除去することができる。したがって、表面における個別の改変されていないフォワードプライマーオリゴヌクレオチド間の距離により一本鎖鋳型ポリヌクレオチドの密度が制御され、よって、また、表面において後に形成されるクラスターの密度も制御される。
【００７２】
相補的な一本鎖鋳型ポリヌクレオチドを付着させた後、改変／遮断されたプライマーを処理して、それらが改変されていないフォワードプライマーオリゴヌクレオチドと機能的に同等となるように、改変を逆にするか、除去するか、または変化させることができる。例えば、別個のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより形成される場合、二本鎖構造物は、変性させることにより、例えば、加熱することにより、またはアルカリ溶液で処理するかのいずれかにより、除去することができる。代替的には、ハイブリダイズさせたポリヌクレオチドを共有結合的に連結する場合、酵素的消化を用いて鎖を配列選択的に切断した後に変性させうる。当技術分野では、二本鎖構造物を除去するためのこのような方法が公知であり、当業者にも明らかである（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１年））。
【００７３】
本発明の一実施形態では、当技術分野で公知のライゲーション法（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、前出）を用いて固体支持体へと固定化された二本鎖プライマーへのライゲーションにより、一本鎖鋳型ポリヌクレオチド分子を固体支持体に付着させることができる。このような方法では、ＤＮＡリガーゼなど、リガーゼ酵素を使用して、２つのポリヌクレオチド鎖の末端の接合を実施または触媒し、この場合、共有結合的連結が形成されるように、一本鎖鋳型ポリヌクレオチド分子とプライマーオリゴヌクレオチドとをライゲーションする。この文脈において、「接合」とは、以前には共有結合的に連結されていなかった２つのポリヌクレオチド鎖の共有結合的連結を意味する。したがって、本発明の目的はまた、それらが一本鎖鋳型ポリヌクレオチドにライゲーションすることが不可能であるように、プライマーオリゴヌクレオチドのサブセットの３’端を改変することによっても達成することができる。非限定的な例を目的として述べると、酵素である末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）による２’３’ジデオキシＡＭＰ（ジデオキシＡＭＰ）の付加は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼが、処理された分子をまとめてライゲーションすることを、有効に防止する。
【００７４】
代替法は、二重鎖としての捕捉配列および一本鎖としての増幅配列を有するものとなろう。一本鎖を捕捉二重鎖へとライゲーションすると（遊離の５’ホスフェートを保有する、唯一の固定化された種となろう）、固定化された鎖の３’端を上記の通りに伸長させることができる。ハイブリダイズさせた鋳型配列を変性させたら、固定化された鎖の増幅を、記載の通りに進行させることができる。一本鎖を付着させる他のこのような方法は、他の当業者には明らかである。
【００７５】
本発明の特定の実施形態による次のステップでは、一本鎖ポリヌクレオチド分子が増幅プライマーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして、橋架け構造物の形態で複合体を形成するように、適切な条件を、固定化された一本鎖ポリヌクレオチド分子および複数の増幅プライマーオリゴヌクレオチドに適用する。当技術分野では、中和緩衝液および／またはハイブリダイズ緩衝液など、適切な条件が周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９９８年）を参照されたい）。次いで、中和緩衝液および／またはハイブリダイズ緩衝液を除去することができる。
【００７６】
次に、伸長に適する条件を適用することにより、伸長反応を実施する。ヌクレオチドを逐次的に付加することにより複合体のプライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて、一本鎖ポリヌクレオチド分子と相補的な伸長産物を生成させる。各鎖が固定化されるように、結果として得られる二重鎖を両方の５’端で固定化する。
【００７７】
当技術分野では、ポリメラーゼ活性を有する酵素を含む伸長用緩衝液／溶液など、適切な条件が周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照されたい）。特定の実施形態では、伸長用緩衝液にｄＮＴＰを組み入れることができる。さらなる実施形態では、伸長用緩衝液の前にｄＮＴＰを付加しうる。この橋架け増幅技法は、例えば、それらの内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｄｅｓｓｉら（米国特許第７，１１５，４００号）、およびＫａｗａｓｈｉｍａら（米国特許出願第２００５／０１００９００号）に記載されている通りに実行することができる。
【００７８】
本発明において用いうるポリメラーゼ活性を有する酵素の例は、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ）、多様な熱安定細菌に由来する熱安定ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼなど）のほか、それらの遺伝子改変誘導体（ＴａｑＧｏｌｄ、ＶＥＮＴｅｘｏ、またはＰｆｕ  ｅｘｏ）である。また、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の組合せを用いて、伸長産物を生成させることもできる。特に、酵素は、鎖置換活性を有し、より特定すれば、酵素は、約７〜約９のｐＨ、特に、ｐＨ７．９〜ｐＨ８＋において活性となり、さらにより特定すれば、酵素は、ＥｓｔまたはＫｌｅｎｏｗである。
【００７９】
用いられるヌクレオシド三リン酸分子は、典型的に、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰであるか、またはリボヌクレオシド三リン酸、例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰである。ヌクレオシド三リン酸分子は、天然に存在するものであっても、天然に存在しないものであってもよい。
【００８０】
ハイブリダイゼーションステップおよび伸長ステップの後、支持体および付着した核酸を変性条件にかけることができる。一般に、変性用緩衝液の流入により伸長用緩衝液が除去されるように、フローセルを用いることができる。当技術分野では、適切な変性用緩衝液が周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照されたい）。例を目的として述べると、ｐＨの変更および低イオン強度の溶液は、実質的に等温温度で核酸を変性させうることが公知である。ホルムアミドおよび尿素は、核酸の塩基と新たな水素結合を形成して、ワトソン−クリック塩基対合をもたらす水素結合を破壊する。特定の実施形態では、ホルムアミドの濃度は、５０％以上である。これらは、一本鎖核酸分子を結果としてもたらす。所望の場合、鎖は、塩濃度が極めて低く（例えば、０．０１Ｍ未満のカチオン性条件）、ｐＨが高い（＞１２）溶液で処理することにより分離することもでき、カオトロピック塩（例えば、塩酸グアニジン）を用いることにより分離することもできる。特定の実施形態では、強塩基を用いる。強塩基とは、酸塩基反応における微弱酸を脱プロトン化することが可能な塩基性化合物である。塩基の強度は、そのｐＫｂ値により示され、ｐＫｂ値が約１未満である化合物を強塩基と称し、これは当業者に周知である。特定の実施形態では、強塩基が、０．０５Ｍ〜０．２５Ｍ、特に、０．１Ｍの濃度で用いられる水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液である。
【００８１】
上記で説明したハイブリダイゼーションステップ、伸長ステップ、および変性ステップの後、第１の核酸が、第１の鋳型である一本鎖ポリヌクレオチド分子（最初に固定化された）であり、第２の核酸が、固定化されたプライマーオリゴヌクレオチドのうちの１つから伸長する、これと相補的な核酸である、２つの固定化された核酸を存在させる。次いで、支持体を、ハイブリダイゼーション、伸長、および変性のさらなるサイクルにかけることにより、元の固定化された一本鎖ポリヌクレオチド分子および固定化されて伸長して形成されたプライマーオリゴヌクレオチドの両方とも、さらなる増幅ラウンドを開始することが可能である。
【００８２】
増幅法の各ステップの間に任意選択の洗浄するステップを実施することが有利でありうる。例えば、ポリメラーゼ酵素を有さずｄＮＴＰを有するかまたは有さない伸長用緩衝液を固体支持体に適用してから、これを除去し、完全な伸長用緩衝液で置き換えることができる。
【００８３】
このような増幅のさらなるラウンドを用いて、一本鎖ポリヌクレオチド配列およびその相補的な配列の複数の固定化されたコピーを含む核酸コロニーまたは核酸クラスターを生成させることができる。
【００８４】
一本鎖ポリヌクレオチド分子の最初の固定化とは、一本鎖ポリヌクレオチド分子が、この一本鎖ポリヌクレオチド分子の全長の距離内に位置するプライマーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしうることを意味する。範囲外である他の表面結合プライマーは、このポリヌクレオチドとハイブリダイズしない。したがって、形成される核酸コロニーまたは核酸クラスターの境界は、最初の一本鎖ポリヌクレオチド分子が固定化された場所の周囲の比較的局所的な領域に限定される。
【００８５】
さらなるラウンドの増幅、すなわち、さらなるラウンドのハイブリダイゼーション、伸長、および変性を実行することにより、一本鎖ポリヌクレオチド分子およびその相補体のより多くのコピーを合成したら、発生する核酸コロニーまたは核酸クラスターの境界をさらに拡張することが可能となるが、形成されるコロニーの境界は、やはり、最初の一本鎖ポリヌクレオチド分子が固定化された場所の周囲の比較的局所的な領域に限定される。例えば、増幅された各クラスターのサイズは、０．５〜５ミクロンでありうる。
【００８６】
したがって、本発明の方法により、複数の単一の固定化された一本鎖ポリヌクレオチド分子からの複数の核酸コロニーの発生が可能となり、固体支持体の表面にグラフトするのに用いられる改変された捕捉オリゴヌクレオチド／増幅オリゴヌクレオチドの比率を変化させることにより、これらのコロニーの密度を制御しうることを認めることができる。
【００８７】
一実施形態では、ハイブリダイゼーションステップ、伸長ステップ、および変性ステップの全てを、同じ温度、実質的な等温温度で実行する。例えば、温度は、３７℃〜約７５℃、特に、５０℃〜７０℃、さらにより特定すれば、６０℃〜６５℃である。特定の実施形態では、実質的な等温温度が、所望されるポリメラーゼの最適温度でありうる。
【００８８】
特定の態様では、本発明の第１の態様による方法を用いて、米国特許第７，１１５，４００号、ＵＳ２００５／０１００９００Ａ１、ＷＯ００／１８９５７、およびＷＯ９８／４４１５１（それらの内容が参照により本明細書に組み込まれる）において記載されているアレイと類似する、クラスター化された核酸コロニーのアレイを、固相増幅を介して調製する。
【００８９】
さらに別の態様では、複数の捕捉配列および２つを超える増幅配列、例えば、少なくとも３つまたは４つもしくはそれより多くの異なる増幅プライマー配列を、固体支持体にグラフトすることができる。このようにして、ライブラリー間で異なる共通の配列を有する複数のライブラリーであれば、例えば、２例の異なる患者から調製されたライブラリーなどのクラスターを調製するのに使用することができる。クラスターは、空間では重複しうるが、鋳型の末端間における差違のために、それらは、交互に配列決定することが可能であろう。例えば、２つの異なる試料は、２つの異なる捕捉配列を用いて捕捉することができる。これらは、同じ２つの増幅プライマーから増幅することができる。試料は、２つの異なる配列決定プライマーをハイブリダイゼーションさせるための部位として用いられうる２つの異なる捕捉配列のために差別化することができる。これにより、異なる捕捉配列の使用は、異なる配列決定プライマーを用いて試料をインデックス化する方法をもたらす。
【００９０】
本発明の方法により形成されるクラスター化されたアレイは、マイクロアレイなどの秩序付けられたアレイ上で通常実行される適用において用いるのに適する。非限定的な例を目的として述べると、このような適用には、ハイブリダイゼーション解析、遺伝子発現解析、タンパク質結合解析、配列決定、遺伝子型解析、核酸メチル化解析などが含まれる。クラスター化されたアレイは、例えば、蛍光ＲＮＡによるハイブリダイゼーションまたは蛍光標識されたタンパク質を用いる結合研究など、下流における適用に用いる前に配列決定することができる。
【００９１】
配列決定法
本発明はまた、固相増幅により生成させた、増幅された核酸を配列決定する方法も包含する。したがって、本発明は、核酸を配列決定する方法であって、上記のとおり固相増幅を用いて核酸鋳型のプールを増幅するステップと、核酸の配列決定反応を実行して、固相増幅反応により生成させた、少なくとも１つの増幅された核酸鎖の全体または一部の配列を決定するステップとを含む方法を提供する。
【００９２】
配列決定は、任意の適切な配列決定技法を用いて実行することができる。特に有用な方法は、５’から３’への方向にポリヌクレオチド鎖の合成を結果としてもたらす、３’遊離ヒドロキシル基にヌクレオチドを逐次付加する方法である。付加されるヌクレオチドの性質は、各ヌクレオチド付加の後で決定することもでき、配列決定プロセスの終了時点で決定することもできる。また、ライゲーションによる配列決定を用いる配列決定技法であって、全ての隣接塩基が配列決定されるわけではない配列決定技法、および塩基が表面における鎖へと付加されるのではなくて表面における鎖から除去される大規模並列処理特徴配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）などの技法も、本発明の範囲内にある。
【００９３】
配列決定反応の開始点は、配列決定プライマーを固相増幅反応の産物へとアニーリングすることによりもたらしうる。これに関連して、鋳型ライブラリーの形成の間に付加されるアダプターのうちの一方または両方は、配列決定プライマーを、ゲノム全体または鋳型ライブラリーの固相増幅に由来する増幅産物へとアニーリングすることを可能とするヌクレオチド配列を包含しうる。
【００９４】
フォワード増幅プライマーおよびリバース増幅プライマーの両方を固体表面に共有結合的に固定化する固相増幅反応の産物は、両方の鎖が５’端において固体支持体に付着している、固定化されたポリヌクレオチド鎖と固定化された相補鎖との対をアニーリングさせることにより形成されたいわゆる橋架け構造物である。従来の配列決定プライマーの、固定化された鎖のうちの１つとのハイブリダイゼーションは、標準的なハイブリダイゼーション条件下における、この鎖の、その固定化された相補鎖へのアニーリングと比較して好ましくないので、このような橋架け構造物を含むアレイは、典型的な核酸の配列決定技法には非効率的な鋳型をもたらす。
【００９５】
核酸を配列決定するのにより適切な鋳型をもたらすためには、少なくとも部分的に一本鎖である鋳型を生成させるために、橋架け構造物における固定化された鎖のうちの１つの実質的に全部または少なくとも一部を除去または置き換えることが有利でありうる。したがって、一本鎖である鋳型の部分は、配列決定プライマーへのハイブリダイゼーションに利用可能であろう。本明細書では、「橋架けされた」二本鎖核酸構造物における一方の固定化された鎖の全部または一部を除去するプロセスを、直鎖化と称する場合があり、これについては、その内容が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＷＯ０７０１０２５１においてさらに詳細に記載されている。
【００９６】
橋架けされた鋳型構造物は、一方または両方の鎖を制限エンドヌクレアーゼで切断することにより直鎖化することもでき、一方の鎖をニッキングエンドヌクレアーゼで切断することにより直鎖化することもできる。とりわけ、化学的切断（例えば、過ヨウ素酸（ｐｅｒｉｏｄａｔｅ）によるジオール結合の切断）、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＮＥＢ製の「ＵＳＥＲ」；型番：Ｍ５５０５Ｓ）での切断による無塩基部位の切断、または熱もしくはアルカリへの曝露による切断、デオキシリボヌクレオチドを他の形で含む増幅産物へと組み込まれたリボヌクレオチドの切断、光化学的切断、またはペプチドリンカーの切断を含めた他の切断法も、制限酵素またはニッキング酵素への代替法として用いることができる。
【００９７】
切断ステップの後、切断のために用いられた方法に関わらず、切断された鎖（複数可）の固体支持体に付着していない部分（複数可）を除去するために、切断反応の産物を変性条件にかけることができる。適切な変性条件、例えば、水酸化ナトリウム溶液、ホルムアミド溶液、または熱は、標準的な分子生物学のプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）を参照することにより、当業者には明らかである。変性の結果として、部分的または実質的に一本鎖である配列決定鋳型の生成がもたらされる。次いで、配列決定プライマーを、鋳型の一本鎖部分とハイブリダイゼーションさせることにより、配列決定反応を開始することができる。
【００９８】
したがって、本発明は、核酸の配列決定反応が、配列決定プライマーを、直鎖化された増幅産物の一本鎖領域へとハイブリダイズさせるステップと、１または複数のヌクレオチドを、配列決定される増幅鋳型鎖の領域と相補的なポリヌクレオチド鎖へと逐次的に組み込むステップと、組み込まれたヌクレオチド（複数可）のうちの１または複数に存在する塩基を同定するステップと、これにより、鋳型鎖の領域の配列を決定するステップとを含む方法を包含する。
【００９９】
本発明に従い用いられうる１つの配列決定法は、例えば、その内容が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＷＯ０４０１８４９７、ＵＳ２００７／０１６６７０５Ａ１および米国特許第７，０５７，０２６号において記載されている、除去可能な３’遮断物を有する改変ヌクレオチドの使用に依拠する。改変ヌクレオチドを、配列決定される鋳型の領域と相補的な、成長しつつあるポリヌクレオチド鎖へと組み込んだら、さらなる配列の伸長を方向付ける遊離３’−ＯＨ基が利用可能でなくなり、したがって、ポリメラーゼがさらなるヌクレオチドを付加することは可能でなくなる。成長しつつある鎖へと組み込まれた塩基の性質を決定したら、３’遮断物を除去して、次のヌクレオチドの逐次的な付加を可能とすることができる。これらの改変ヌクレオチドを用いて誘導された産物を順序づけることにより、ＤＮＡ鋳型のＤＮＡ配列を推定することが可能である。改変ヌクレオチドの各々が、それに付着した異なる標識を有し、特定の塩基に対応し、各組込みステップの間に付加される塩基間における識別を容易とすることが公知である場合は、このような反応を単一の実験で行うことができる。代替的には、改変ヌクレオチドの各々を別個に含有する別々の反応を実行することもできる。
【０１００】
改変ヌクレオチドは、それらの検出を容易とするための標識を保有しうる。例えば、蛍光標識を、改変ヌクレオチドの検出のために用いることができる。したがって、各ヌクレオチドの種類は、例えば、その内容が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれるＷＯ０７１３５３６８において記載されている、異なる蛍光標識を保有しうる。しかし、検出可能な標識は、蛍光標識である必要はない。組み込まれたヌクレオチドの検出を可能とする任意の標識を用いることができる。
【０１０１】
蛍光標識されたヌクレオチドを検出するための一方法は、標識ヌクレオチドに特異的な波長のレーザー光の使用、または他の適切な照光供給源の使用を含む。ヌクレオチド上の標識に由来する蛍光は、ＣＣＤカメラまたは他の適切な検出手段により検出することができる。クラスター化されたアレイの画像を記録するのに適する機器は、その内容が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれるＷＯ０７１２３７４４において記載されている。
【０１０２】
ヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖への逐次的な組込みに依拠する、本質的に任意の配列決定法を用いうるので、本発明は、上記で概観された配列決定法の使用に限定されることを意図するものではない。適切な代替技法には、例えば、Ｒｏｃｈｅ／４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら（２００５年）、Ｎａｔｕｒｅ、４３７巻：３７６〜３８０頁；米国特許第６，２７４，３２０号；同第６，２５８，５６８号；同第６，２１０，８９１号）、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ｓｏｌｉｄ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）製のＳＯＬｉＤシステム、およびＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（ｗｗｗ．ｉｏｎｔｏｒｒｅｎｔ．ｃｏｍ）製のシークエンサーが含まれる。
【０１０３】
参照による組込み
特許、特許出願、特許公開、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなど、他の文献に対する参照および引用は、本開示の全体において行った。このような文献の全ては、全ての目的のために、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
同等物
本発明は、その精神またはその本質的な特徴から逸脱しない限りにおいて、他の特定の形態においても実施することができる。したがって、前出の実施形態は、全ての点において、本明細書で記載される本発明について、限定的であるものではなく、例示的であると考えられるものとする。
【図１】
2015231383.tif 000002
【図２】
2015231383.tif 000003
【図３】
2015231383.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成27年8月28日(2015.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチプレックス配列決定反応において、核酸鋳型の完全性を検証するための方法であって、
鋳型核酸を得るステップと、
少なくとも２つの配列識別子を該鋳型へと組み込むステップと、
該鋳型を配列決定するステップと
を含み、
ここで、第１の識別子を、該鋳型の５’部分へと組み込み、第２の識別子を、該鋳型の３’部分へと組み込み、
ここで、該識別子を組み込んだ後で、該鋳型が、５’から３’の順で以下の構成：第１の既知の配列、第１のバーコード配列、第２の既知の配列、標的ポリヌクレオチド配列、第３の既知の配列、第２のバーコード配列、および第４の既知の配列、を有し、
ここで、該第１および第２の識別子が異なる、
方法。
【請求項２】
第１の識別子を、前記鋳型の５’端へと組み込み、第２の識別子を、該鋳型の３’端へと組み込む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列決定するステップの前に、前記鋳型を基材に付着させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記鋳型を前記基材に直接的に付着させる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記鋳型を前記基材に間接的に付着させる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記鋳型を増幅するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
配列決定するステップが、合成によって配列決定するステップである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記合成によって配列決定するステップが、合成によって単一分子を配列決定するステップである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
配列決定するステップが、
プライマーを前記鋳型とハイブリダイズさせて、鋳型／プライマーの二重鎖を形成するステップと、
少なくとも１つの検出可能に標識されたヌクレオチドの存在下、ポリメラーゼ酵素が鋳型依存的な様式で該プライマーにヌクレオチドを付加することを可能とする条件下で、該二重鎖を該ポリメラーゼと接触させるステップと、
組み込まれた標識ヌクレオチドからのシグナルを検出するステップと、
該接触させるステップおよび該検出するステップを少なくとも１回逐次的に反復するステップと
を含み、ここで、組み込まれた標識ヌクレオチドの逐次的な検出により、前記核酸の配列を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出可能に標識されたヌクレオチドが、光学的に標識されたヌクレオチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記光学的に標識されたヌクレオチドが、蛍光標識されたヌクレオチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１および第２の識別子が、前記鋳型に付着した第１のバーコード配列および第２のバーコード配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
第１のバーコード配列を、前記鋳型の５’端に付着させ、第２のバーコード配列を、該鋳型の３’端に付着させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
核酸を解析するための方法であって、
核酸鋳型を得るステップと、
バーコード配列の対を該鋳型に付着させるステップと、
該鋳型を配列決定するステップと
を含み、
ここで、第１の識別子を、該鋳型の５’部分へと組み込み、第２の識別子を、該鋳型の３’部分へと組み込み、
ここで、該バーコード配列の対を付着させた後で、該鋳型が、５’から３’の順で以下の構成：第１の既知の配列、第１のバーコード配列、第２の既知の配列、標的ポリヌクレオチド配列、第３の既知の配列、第２のバーコード配列、および第４の既知の配列、を有し、
該第１および第２の識別子が異なる、
方法。
【請求項１５】
第１の識別子を、前記鋳型の５’端へと組み込み、第２の識別子を、該鋳型の３’端へと組み込む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
配列決定するステップの前に、前記鋳型を基材に付着させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記鋳型を前記基材に直接的に付着させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記鋳型を前記基材に間接的に付着させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記鋳型を増幅するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
配列決定するステップが、合成によって配列決定するステップである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記合成によって配列決定するステップが、合成によって単一分子を配列決定するステップである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
配列決定するステップが、
プライマーを前記鋳型とハイブリダイズさせて、鋳型／プライマーの二重鎖を形成するステップと、
少なくとも１つの検出可能に標識されたヌクレオチドの存在下、ポリメラーゼ酵素が鋳型依存的な様式で該プライマーにヌクレオチドを付加することを可能とする条件下で、該二重鎖を該ポリメラーゼと接触させるステップと、
組み込まれた標識ヌクレオチドからのシグナルを検出するステップと、
該接触させるステップおよび該検出するステップを少なくとも１回逐次的に反復するステップとを含み、ここで、組み込まれた標識ヌクレオチドの逐次的な検出により、前記核酸の配列を決定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出可能に標識されたヌクレオチドが、光学的に標識されたヌクレオチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記光学的に標識されたヌクレオチドが、蛍光標識されたヌクレオチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
核酸を解析するための方法であって、
核酸鋳型を得るステップと、
第１のバーコード配列を該鋳型の５’部分に付着させ、第２のバーコード配列を該鋳型の３’部分に付着させるステップと、
該鋳型を増幅するステップと、
該鋳型を配列決定するステップと
を含み、
ここで、該第１のバーコード配列および該第２のバーコード配列を付着させた後で、該鋳型が、５’から３’の順で以下の構成：第１の既知の配列、第１のバーコード配列、第２の既知の配列、標的ポリヌクレオチド配列、第３の既知の配列、第２のバーコード配列、および第４の既知の配列、を有し、
ここで、該第１および第２のバーコード配列が異なる、
方法。
【請求項２６】
第１の識別子を、前記鋳型の５’端へと組み込み、第２の識別子を、該鋳型の３’端へと組み込む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
増幅するステップの前に、前記鋳型を固体支持体に固定化する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
配列決定するステップが、
プライマーを前記鋳型とハイブリダイズさせて、鋳型／プライマーの二重鎖を形成するステップと、
少なくとも１つの検出可能に標識されたヌクレオチドの存在下、ポリメラーゼ酵素が鋳型依存的な様式で該プライマーにヌクレオチドを付加することを可能とする条件下で、該二重鎖を該ポリメラーゼと接触させるステップと、
組み込まれた標識ヌクレオチドからのシグナルを検出するステップと、
該接触させるステップおよび該検出するステップを少なくとも１回逐次的に反復するステップと
を含み、ここで、組み込まれた標識ヌクレオチドの逐次的な検出により、前記核酸の配列を決定する、請求項２５に記載の方法。