(57)【要約】【課題】ブロッキング剤のパターニング欠陥が生じた場合であっても、細胞の分析を高精度に行うことができる細胞整列チップを提供すること。【解決手段】細胞整列チップは、基板と、前記基板上に配置されている、標的細胞を捕捉するための複数の細胞捕捉領域と、前記基板上の前記細胞捕捉領域とは異なる領域に配置されている細胞非捕捉領域とを有する。前記細胞非捕捉領域には、細胞の非特異的結合を抑制するためのブロッキング剤および色素を含有するブロッキング層が配置されている。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
前記基板上に配置されている、標的細胞を捕捉するための複数の細胞捕捉領域と、
前記基板上の前記細胞捕捉領域とは異なる領域に配置されている細胞非捕捉領域と、
を有し、
前記細胞非捕捉領域には、細胞の非特異的結合を抑制するためのブロッキング剤および色素を含有するブロッキング層が配置されている、
細胞整列チップ。
【請求項２】
前記基板は、第１の面に複数の凹部を有し、
前記細胞捕捉領域は、前記凹部内に配置され、
前記細胞非捕捉領域は、前記第１の面の前記凹部外に配置されている、
請求項１に記載の細胞整列チップ。
【請求項３】
前記色素は、蛍光色素である、請求項１または請求項２に記載の細胞整列チップ。
【請求項４】
前記蛍光色素の最大蛍光波長は、３００ｎｍ以下または９００ｎｍ以上である、請求項３に記載の細胞整列チップ。
【請求項５】
基板上に配置されている標的細胞を捕捉するための複数の細胞捕捉領域と、前記基板上の前記細胞捕捉領域とは異なる領域に配置されている細胞非捕捉領域と、を有し、前記細胞非捕捉領域には、細胞の非特異的結合を抑制するためのブロッキング剤および色素を含有するブロッキング層が配置されている、細胞整列チップを準備する工程と、
前記細胞捕捉領域に、蛍光色素で標識された標的細胞を捕捉させる工程と、
前記色素を検出することで、前記ブロッキング層の位置を検出する工程と、
前記蛍光色素に対する励起光を少なくとも前記細胞捕捉領域に照射し、前記蛍光色素から放出される蛍光を検出する工程と、
前記蛍光の検出結果から、検出された前記ブロッキング層の位置における前記蛍光の検出結果を除くことで、前記細胞捕捉領域に捕捉された前記標的細胞を標識する前記蛍光色素からの蛍光の検出結果を算出する工程と、
を含む、標的細胞の検出方法。
【請求項６】
前記基板は、第１の面に複数の凹部を有し、
前記細胞捕捉領域は、前記凹部内に配置され、
前記細胞非捕捉領域は、前記第１の面の前記凹部外に配置されている、
請求項５に記載の標的細胞の検出方法。
【請求項７】
前記色素は、前記標的細胞を標識する前記蛍光色素と最大蛍光波長が異なる蛍光色素である、請求項５または請求項６に記載の標的細胞の検出方法。
【請求項８】
前記標的細胞を標識する前記蛍光色素の最大蛍光波長は、３００ｎｍを超え、かつ９００ｎｍ未満であり、
前記ブロッキング層に含有される前記蛍光色素の最大蛍光波長は、３００ｎｍ以下または９００ｎｍ以上である、
請求項７に記載の標的細胞の検出方法。
【請求項９】
基板を準備する工程と、
前記基板上に、標的細胞を捕捉するための複数の細胞捕捉領域と、前記細胞捕捉領域とは異なる領域に位置し、かつ細胞の非特異的結合を抑制するためのブロッキング剤および色素を含有するブロッキング層を所定のパターンで配置された細胞非捕捉領域と、を形成する工程と、
を含む、細胞整列チップの製造方法。
【請求項１０】
前記色素を検出することで、前記ブロッキング層の形成パターンを確認する工程をさらに含む、請求項９に記載の細胞整列チップの製造方法。
【請求項１１】
基板上に配置されており、かつ蛍光色素で標識された標的細胞を捕捉している複数の細胞捕捉領域と、前記基板上の前記細胞捕捉領域とは異なる領域に配置されている細胞非捕捉領域と、を有し、前記細胞非捕捉領域には、細胞の非特異的結合を抑制するためのブロッキング剤および色素を含有するブロッキング層が配置されている、細胞整列チップを保持するためのホルダーと、
前記ブロッキング層の位置を検出するための光を少なくとも前記細胞捕捉領域に照射する第１光照射部と、
前記蛍光色素に対する励起光を少なくとも前記細胞捕捉領域に照射する第２光照射部と、
前記色素からの応答光を検出する第１光検出部と、
前記蛍光色素から放出される蛍光を検出する第２光検出部と、
前記第１光検出部および前記第２光検出部の検出結果に基づいて、前記細胞捕捉領域に捕捉された前記標的細胞を標識する前記蛍光色素からの蛍光の検出結果を算出する処理部と、
を有し、
前記処理部は、前記第１光検出部の検出結果から前記ブロッキング層の位置を検出し、前記第２光検出部の検出結果から、検出された前記ブロッキング層の位置における前記蛍光の検出結果を除くことで、前記細胞捕捉領域に捕捉された前記標的細胞を標識する前記蛍光色素からの蛍光の検出結果を算出する、
標的細胞の検出装置。
【請求項１２】
基板と、前記基板上に配置されている、標的細胞を捕捉するための複数の細胞捕捉領域と、前記基板上の前記細胞捕捉領域とは異なる領域に配置されている細胞非捕捉領域と、を有し、前記細胞非捕捉領域には、細胞の非特異的結合を抑制するためのブロッキング剤および色素を含有するブロッキング層が配置されている、細胞整列チップを準備する工程と、
前記色素を検出することで、前記ブロッキング層の位置を検出する工程と、
検出された前記ブロッキング層の位置と前記細胞捕捉領域とが重複する領域を検出することで、その上に前記ブロッキング層が配置されている前記細胞捕捉領域である細胞捕捉不良領域を検出する工程と、
を含む、細胞捕捉不良領域の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞整列チップおよびその製造方法、細胞整列チップを用いた標的細胞の検出方法および前記標的細胞の検出方法を行うための標的細胞の検出装置、ならびに細胞整列チップにおける細胞捕捉不良領域の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）や循環血管内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰ）、各種幹細胞など（以下「標的細胞」ともいう）は、病態に応じて血液中に存在する。たとえば、血液中を循環する癌細胞であるＣＴＣを検出することは、癌転移の早期発見の観点から非常に有用である。しかし、標的細胞は血液中に極めて稀にしか存在せず、検出することは極めて難しい。
【０００３】
そこで近年、様々な標的細胞の検出方法が提案されている。たとえば、検体中（例えば血液）に標的細胞が存在するか否かを検査する場合に、検体に由来する細胞懸濁液を、複数の凹部（以下「マイクロチャンバー」ともいう）を有する細胞整列チップに提供して、マイクロチャンバー内に細胞を収容した後、収容された各細胞を分析する方法が提案されている。しかしながら、この方法では、マイクロチャンバー外の領域に細胞が付着してしまった場合、一部の細胞についてしか分析を行うことができない。それにより、検体に含まれる全細胞を分析できない可能性がある。このようなマイクロチャンバー外の領域への細胞の付着を防止する手段として、マイクロチャンバー外の領域に表面処理を行うことが提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
特許文献１には、細胞を収容するための複数の微細穴（マイクロチャンバー）を有するプレ・バイオチップ（細胞整列チップ）が開示されている。このプレ・バイオチップでは、微細穴に細胞を収容するために、微細穴内の領域に抗体などを固定化している。また、微細穴以外の領域に細胞が付着することを防止するために、微細穴以外の領域をエチレンジアミンなどのブロッキング剤で処理している。このようにすることで、すべての細胞を微細穴に効率的に収容することができる。微細穴に収容された細胞は、蛍光色素で標識されており、蛍光顕微鏡などにより観察される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２１４８８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載のプレ・バイオチップには、ブロッキング剤のパターニングが失敗した場合に、細胞の分析を適切に行うことができないという問題がある。すなわち、プレ・バイオチップの製造時に、微細穴外の領域に加えて微細穴内の一部の領域も誤ってブロッキング剤で処理してしまった場合、微細穴内のブロッキング剤で処理されている領域には、細胞は付着しないはずである。ところが、特許文献１に記載のプレ・バイオチップでは、ブロッキング剤のパターニングに欠陥が生じているかどうかがわからないため、微細穴内からの蛍光はすべて微細穴内に収容された細胞からの蛍光であるものとして細胞の分析を行うことになる。したがって、微細穴内のブロッキング剤で処理されている領域に自家蛍光を有する異物（例えば埃や塵、気泡など）が存在する場合、細胞の分析結果が誤ったものになってしまうおそれがある。このような問題は、特にＣＴＣなどの希少な細胞の場合に顕著になる。その測定される少ない個数が重要となるため、少数であっても発光異物が存在するだけで分析結果に大きな影響を及ぼしてしまう。
【０００７】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、細胞整列チップにおいてブロッキング剤のパターニング欠陥が生じた場合であっても、細胞の分析を高精度に行うことができる、標的細胞の検出方法および検出装置を提供することを目的とする。また、本発明は、前記標的細胞の検出方法に用いられる細胞整列チップおよびその製造方法を提供することも目的とする。また、本発明は、前記細胞整列チップにおける細胞捕捉不良領域の検出方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ブロッキング剤と色素とを組み合わせてブロッキング層を形成することで上記課題を解決できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の細胞整列チップに関する。
【００１０】
［１］基板と、前記基板上に配置されている、標的細胞を捕捉するための複数の細胞捕捉領域と、前記基板上の前記細胞捕捉領域とは異なる領域に配置されている細胞非捕捉領域と、を有し、前記細胞非捕捉領域には、細胞の非特異的結合を抑制するためのブロッキング剤および色素を含有するブロッキング層が配置されている、細胞整列チップ。
［２］前記基板は、第１の面に複数の凹部を有し、前記細胞捕捉領域は、前記凹部内に配置され、前記細胞非捕捉領域は、前記第１の面の前記凹部外に配置されている、［１］に記載の細胞整列チップ。
［３］前記色素は、蛍光色素である、［１］または［２］に記載の細胞整列チップ。
［４］前記蛍光色素の最大蛍光波長は、３００ｎｍ以下または９００ｎｍ以上である、［３］に記載の細胞整列チップ。
【００１１】
また、本発明は、以下の標的細胞の検出方法に関する。
【００１２】
［５］基板上に配置されている標的細胞を捕捉するための複数の細胞捕捉領域と、前記基板上の前記細胞捕捉領域とは異なる領域に配置されている細胞非捕捉領域と、を有し、前記細胞非捕捉領域には、細胞の非特異的結合を抑制するためのブロッキング剤および色素を含有するブロッキング層が配置されている、細胞整列チップを準備する工程と、前記細胞捕捉領域に、蛍光色素で標識された標的細胞を捕捉させる工程と、前記色素を検出することで、前記ブロッキング層の位置を検出する工程と、前記蛍光色素に対する励起光を少なくとも前記細胞捕捉領域に照射し、前記蛍光色素から放出される蛍光を検出する工程と、前記蛍光の検出結果から、検出された前記ブロッキング層の位置における前記蛍光の検出結果を除くことで、前記細胞捕捉領域に捕捉された前記標的細胞を標識する前記蛍光色素からの蛍光の検出結果を算出する工程と、を含む、標的細胞の検出方法。
［６］前記基板は、第１の面に複数の凹部を有し、前記細胞捕捉領域は、前記凹部内に配置され、前記細胞非捕捉領域は、前記第１の面の前記凹部外に配置されている、［５］に記載の標的細胞の検出方法。
［７］前記色素は、前記標的細胞を標識する前記蛍光色素と最大蛍光波長が異なる蛍光色素である、［５］または［６］に記載の標的細胞の検出方法。
［８］前記標的細胞を標識する前記蛍光色素の最大蛍光波長は、３００ｎｍを超え、かつ９００ｎｍ未満であり、前記ブロッキング層に含有される前記蛍光色素の最大蛍光波長は、３００ｎｍ以下または９００ｎｍ以上である、［７］に記載の標的細胞の検出方法。
【００１３】
また、本発明は、以下の細胞整列チップの製造方法に関する。
【００１４】
［９］基板を準備する工程と、前記基板上に、標的細胞を捕捉するための複数の細胞捕捉領域と、前記細胞捕捉領域とは異なる領域に位置し、かつ細胞の非特異的結合を抑制するためのブロッキング剤および色素を含有するブロッキング層を所定のパターンで配置された細胞非捕捉領域と、を形成する工程と、を含む、細胞整列チップの製造方法。
［１０］前記色素を検出することで、前記ブロッキング層の形成パターンを確認する工程をさらに含む、［９］に記載の細胞整列チップの製造方法。
【００１５】
さらに、本発明は、以下の標的細胞の検出装置に関する。
【００１６】
［１１］基板上に配置されており、かつ蛍光色素で標識された標的細胞を捕捉している複数の細胞捕捉領域と、前記基板上の前記細胞捕捉領域とは異なる領域に配置されている細胞非捕捉領域と、を有し、前記細胞非捕捉領域には、細胞の非特異的結合を抑制するためのブロッキング剤および色素を含有するブロッキング層が配置されている、細胞整列チップを保持するためのホルダーと、前記ブロッキング層の位置を検出するための光を少なくとも前記細胞捕捉領域に照射する第１光照射部と、前記蛍光色素に対する励起光を少なくとも前記細胞捕捉領域に照射する第２光照射部と、前記色素からの応答光を検出する第１光検出部と、前記蛍光色素から放出される蛍光を検出する第２光検出部と、前記第１光検出部および前記第２光検出部の検出結果に基づいて、前記細胞捕捉領域に捕捉された前記標的細胞を標識する前記蛍光色素からの蛍光の検出結果を算出する処理部と、を有し、前記処理部は、前記第１光検出部の検出結果から前記ブロッキング層の位置を検出し、前記第２光検出部の検出結果から、検出された前記ブロッキング層の位置における前記蛍光の検出結果を除くことで、前記細胞捕捉領域に捕捉された前記標的細胞を標識する前記蛍光色素からの蛍光の検出結果を算出する、標的細胞の検出装置。
【００１７】
さらに、本発明は、以下の細胞捕捉不良領域の検出方法に関する。
【００１８】
［１２］基板と、前記基板上に配置されている、標的細胞を捕捉するための複数の細胞捕捉領域と、前記基板上の前記細胞捕捉領域とは異なる領域に配置されている細胞非捕捉領域と、を有し、前記細胞非捕捉領域には、細胞の非特異的結合を抑制するためのブロッキング剤および色素を含有するブロッキング層が配置されている、細胞整列チップを準備する工程と、前記色素を検出することで、前記ブロッキング層の位置を検出する工程と、検出された前記ブロッキング層の位置と前記細胞捕捉領域とが重複する領域を検出することで、その上に前記ブロッキング層が配置されている前記細胞捕捉領域である細胞捕捉不良領域を検出する工程と、を含む、細胞捕捉不良領域の検出方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、細胞整列チップにおいてブロッキング剤のパターニング欠陥が生じた場合であっても、細胞の分析を高精度に行うことができる。したがって、本発明によれば、血液などの検体中に極めて稀に存在する標的細胞の有無をより高精度に検査することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａは、実施の形態に係る細胞整列チップの平面図であり、図１Ｂは、図１Ａに示されるＡ−Ａ線の断面図である。
【図２】図２Ａは、マイクロチャンバーチップの平面図であり、図２Ｂは、枠体の平面図であり、図２Ｃは、天板の平面図である。
【図３】図３Ａは、マイクロチャンバーチップの部分拡大断面図であり、図３Ｂは、細胞捕捉時のマイクロチャンバーチップの部分拡大断面図である。
【図４】図４Ａは、ブロッキング層形成前の基板の部分拡大断面図であり、図４Ｂは、ブロッキング層形成後の基板の部分拡大断面図である。
【図５】図５は、実施の形態に係る標的細胞の検出装置の構成を示す図である。
【図６】図６は、実施の形態の変形例に係る細胞整列チップの断面模式図である。
【図７】図７Ａは、正常にブロッキング層が形成された後のマイクロチャンバー周辺の蛍光顕微鏡写真であり、図７Ｂは、パターニング欠陥を有するブロッキング層が形成された後のマイクロチャンバー周辺の蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００２２】
［細胞整列チップ］
図１は、本発明の一実施の形態に係る細胞整列チップ１００を示す図である。図１Ａは、細胞整列チップ１００の平面図であり、図１Ｂは、図１Ａに示されるＡ−Ａ線の断面図である。図１Ａおよび図１Ｂに示されるように、細胞整列チップ１００は、マイクロチャンバーチップ１１０、枠体１２０および天板１３０を有する。
【００２３】
図２Ａは、マイクロチャンバーチップ１１０の平面図であり、図２Ｂは、枠体１２０の平面図であり、図２Ｃは、天板１３０の平面図である。図１Ｂに示されるように、マイクロチャンバーチップ１１０、枠体１２０および天板１３０をこの順で積層することで、液体が流れる流路１２１が形成される。
【００２４】
（マイクロチャンバーチップ）
図２Ａに示されるように、マイクロチャンバーチップ１１０は、一方の面（第１の面）に複数のマイクロチャンバー１１１（凹部）が形成されている基板１１２と、基板１１２上に配置されたブロッキング層１１３とを有する。また、機能的観点からは、マイクロチャンバーチップ１１０は、標的細胞を捕捉するための複数の細胞捕捉領域１１４と、細胞捕捉領域１１４とは異なる領域に配置されている細胞非捕捉領域１１５とを有する。本実施の形態に係るマイクロチャンバーチップ１１０では、細胞捕捉領域１１４は、マイクロチャンバー１１１内に配置され、細胞非捕捉領域１１５は、基板１１２の前記一方の面（第１の面）のマイクロチャンバー１１１外に配置されている。ブロッキング層１１３は、細胞非捕捉領域１１５、すなわち基板１１２表面のマイクロチャンバー１１１外の領域に配置されている。
【００２５】
図１Ｂに示されるように、基板１１２のマイクロチャンバー１１１が形成されている面（第１の面）は、液体（例えば細胞懸濁液や洗浄液、染色液など）が流れる流路１２１の底面となる。各マイクロチャンバー１１１は、流路１２１に対して開口している。マイクロチャンバー１１１の数および配置は、特に限定されない。本実施の形態では、図２Ａに示されるように、マイクロチャンバー１１１は、流路１２１の中央部にマトリックス状に配置されている。
【００２６】
基板１１２の素材は、特に限定されない。基板１１２の素材は、マイクロチャンバー１１１内に収容される細胞の種類に応じて適宜選択されうる。たとえば、マイクロチャンバー１１１内に収容される細胞に好適な荷電状態や親水性、疎水性などを考慮して、基板１１２の素材を選択すればよい。基板１１２の素材の例には、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、環状オレフィンコポリマーなどの樹脂が含まれる。基板１１２の厚みは、必要な強度を確保できれば特に限定されず、マイクロチャンバー１１１の深さなどに応じて適宜設定されうる。
【００２７】
マイクロチャンバー１１１の形状は、１個または２個以上の細胞を収容（捕捉）することができれば特に限定されない。マイクロチャンバー１１１の形状の例には、円柱、多角柱、逆円錐台、逆多角錐台が含まれる。また、マイクロチャンバー１１１の大きさは、特に限定されず、収容される細胞の種類や各マイクロチャンバーに収容される細胞の数などに応じて適宜設定されうる。通常は、マイクロチャンバー１１１の大きさは、マイクロチャンバー１１１の底面に１０〜１５個程度の細胞が付着できる大きさであることが好ましい。たとえば、マイクロチャンバー１１１の開口径は、２０〜１５０μｍの範囲内であり、マイクロチャンバー１１１の深さは、２０〜１００μｍの範囲内である。
【００２８】
マイクロチャンバー１１１に収容される細胞の種類は、特に限定されない。マイクロチャンバーに収容される細胞の例には、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）や循環血管内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰ）、循環胎児細胞、抗原特異的Ｔ細胞、各種幹細胞などが含まれる。
【００２９】
前述のとおり、ブロッキング層１１３は、細胞非捕捉領域１１５、すなわち基板１１２表面のマイクロチャンバー１１１外の領域に配置されている。ブロッキング層１１３は、細胞の非特異的結合を防止するためのブロッキング剤と、ブロッキング層１１３の位置を外部から検出可能とするための色素とを含有する。ブロッキング層１１３は、ブロッキング剤の効果により、基板１１２への細胞の非特異的結合を抑制する。これにより、細胞は、相対的にマイクロチャンバー１１１内に収容されやすくなる。
【００３０】
図３Ａは、マイクロチャンバーチップ１１０の部分拡大断面図であり、図３Ｂは、マイクロチャンバー１１１が細胞１０を収容している時のマイクロチャンバーチップ１１０の部分拡大断面図である。図３Ａに示されるように、本実施の形態に係るマイクロチャンバーチップ１１０では、基板１１２表面のマイクロチャンバー１１１外の領域（細胞非捕捉領域１１５）にブロッキング層１１３が配置されている。図３Ｂに示されるように、マイクロチャンバー１１１内に位置する細胞捕捉領域１１４には、細胞１０が捕捉される。しかしながら、ブロッキング層１１３の形成プロセスにおいてパターニング欠陥が生じる場合がある。このような場合、ブロッキング層１１３がマイクロチャンバー１１１内に形成されてしまうことがある。その場合には、マイクロチャンバー１１１内にも細胞非捕捉領域１１５（ブロッキング層１１３）が存在することになる。このように、ブロッキング層１１３が配置されている細胞捕捉領域１１４を「細胞捕捉不良領域」ともいう。
【００３１】
ブロッキング剤の種類は、細胞の非特異的結合を抑制できれば特に限定されない。ブロッキング剤の例には、カゼイン、スキムミルク、アルブミン（ウシ血清アルブミンを含む）、ゼラチン、ポリエチレングリコールなどの高分子化合物；リン脂質、エチレンジアミンやアセトニトリルなどの低分子化合物などが含まれる。これらは、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３２】
色素は、ブロッキング層１１３の位置を外部から検出可能とするために、ブロッキング層１１３に添加される。色素は、ブロッキング剤と結合していてもよいし、ブロッキング剤と別個に添加されていてもよい。色素の種類は、特に限定されず、ブロッキング層１１３の検出方法に応じて適宜選択されうる。色素の例には、顔料や染料などの着色剤；ローダミンやＦＩＴＣ、ＡＰＣ、ＰＥ，Alexa Fluor（登録商標）などの蛍光色素、などが含まれる。蛍光色素の最大蛍光波長は、特に限定されないが、例えば３００ｎｍ以下または９００ｎｍ以上である。
【００３３】
ブロッキング層１１３の厚みは、細胞の非特異的吸着を抑制することができ、かつ外部からブロッキング層１１３を検出可能であれば特に限定されない。
【００３４】
（枠体）
図１Ｂおよび図２Ｂに示されるように、枠体１２０は、マイクロチャンバーチップ１１０と天板１３０との間に配置されている、貫通孔１２２を有する薄板である。貫通孔１２２の形状は、マイクロチャンバー１１１上に細胞懸濁液を流すことが可能であれば、特に限定されず、用途に応じて適宜選択されうる。また、枠体１２０の厚みは、特に限定されず、所望の流路１２１の高さ（深さ）に応じて適宜設定される。たとえば、枠体１２０の厚みは、５０〜５００μｍの範囲内である。流路１２１の高さを５０〜５００μｍの範囲内とすることで、細胞整列チップ１００のマイクロチャンバー１１１以外の面に付着した細胞を、流路１２１内を流れる液体の力で容易に剥離させることが可能となる。また、流路１２１内の細胞による目詰まりの発生を防止しつつ、流路１２１内の細胞懸濁液中の細胞がマイクロチャンバー１１１内に沈降するまでの時間を短縮することもできる。
【００３５】
枠体１２０の素材は、特に限定されず、公知のマイクロプレートなどと同じ素材であってもよい。枠体１２０の素材の例には、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、環状オレフィンコポリマーなどの樹脂が含まれる。また、枠体１２０は、両面に粘着性を有するシリコンシート（両面シール）などであってもよい。枠体１２０として両面シールを使用することで、マイクロチャンバーチップ１１０、枠体１２０および天板１３０を容易に固定することができる。
【００３６】
枠体１２０の貫通孔１２２の内面は、流路１２１の側面となる。そのため、枠体１２０の貫通孔１２２の内面は、細胞整列チップ１００の使用時には細胞懸濁液と接触する。したがって、枠体１２０の貫通孔１２２の内面は、必要に応じて表面処理されていてもよい。表面処理の例には、プラズマ処理、コロナ放電処理、親水性ポリマーやタンパク質、脂質などによるコーティング処理が含まれる。たとえば、枠体１２０の貫通孔１２２の内面は、細胞の非特異的結合を防止するためのブロッキング処理が施されてもよい。ブロッキング剤の例には、カゼイン、スキムミルク、アルブミン（ウシ血清アルブミンを含む）、ゼラチン、ポリエチレングリコールなどの高分子化合物；リン脂質、エチレンジアミンやアセトニトリルなどの低分子化合物などが含まれる。これらは、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３７】
（天板）
図１Ｂおよび図２Ｃに示されるように、天板１３０は、枠体１２０の上に配置されている、第１の貫通孔１３１および第２の貫通孔１３２を有する薄板である。第１の貫通孔１３１および第２の貫通孔１３２は、それぞれ、外部と連通している。第１の貫通孔１３１は、流路１２１内に液体を導入するための導入口１３１となる。第２の貫通孔１３２は、流路１２１内から液体を排出するための排出口１３２となる。通常、導入口１３１は、流路１２１の一端に連通する。また、排出口１３２は、流路１２１の他端に連通する。導入口１３１および排出口１３２の形状は、特に限定されない。また、天板１３０の厚みも、必要な強度を確保できれば特に限定されない。
【００３８】
天板１３０の素材は、特に限定されないが、蛍光顕微鏡などを用いて外部から流路１２１内を観察する観点からは、光透過性を有する素材であることが好ましい。天板１３０の素材の例には、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、環状オレフィンコポリマーなどの樹脂が含まれる。また、枠体１２０と同様に、天板１３０の流路１２１の天面となる面も表面処理（例えばブロッキング処理）されていてもよい。
【００３９】
（製造方法）
本実施の形態に係る細胞整列チップ１００の製造方法は、特に限定されない。以下、本実施の形態に係る細胞整列チップ１００の製造方法の一例について説明する。
【００４０】
本実施の形態に係る細胞整列チップ１００は、例えば、１）複数のマイクロチャンバー１１１を有する基板１１２、枠体１２０および天板１３０を準備する第１工程と、２）複数のマイクロチャンバー１１１を有する基板１１２、枠体１２０および天板１３０を積層する第２工程と、３）複数のマイクロチャンバー１１１を有する基板１１２上にブロッキング層１１３を形成する第３工程と、を行うことにより製造されうる。第２工程と第３工程とは、どちらを先に行ってもよい。また、第１〜第３工程を行った後に、ブロッキング層１１３の形成パターンを確認する工程をさらに行ってもよい。
【００４１】
第１工程では、複数のマイクロチャンバー１１１を有する基板１１２、枠体１２０および天板１３０を準備する。基板１１２にマイクロチャンバー１１１を形成する方法は、特に限定されない。基板１１２にマイクロチャンバー１１１を形成する方法の例には、金型成形法やリソグラフィ法、収束イオンビーム（ＦＩＢ）を用いる方法などが含まれる。また、マイクロチャンバー１１１が形成されたフィルムを基板１１２に貼り付けてもよいし、マイクロチャンバー１１１が既に形成された市販の基板を購入してもよい。
【００４２】
また、前述のとおり、枠体１２０は、貫通孔１２２を有し、天板１３０は、導入口１３１および排出口１３２を有する（図２Ｂおよび図２Ｃ参照）。枠体１２０に貫通孔１２２を形成する方法、ならびに枠体１２０に導入口１３１および排出口１３２を形成する方法は、特に限定されない。枠体１２０に貫通孔１２２を形成する方法ならびに天板に導入口１３１および排出口１３２を形成する方法の例には、金型形成法やリソグラフィ法、収束イオンビーム（ＦＩＢ）を用いる方法などが含まれる。
【００４３】
第２工程では、基板１１２、枠体１２０および天板１３０をこの順番で積層し、互いに固定する。これらを固定する方法は、特に限定されないが、観察やメンテナンスの観点から互いに取り外し可能に固定されることが好ましい。固定方法の例には、係合による固定、螺子を用いた固定、粘着剤を用いた固定が含まれる。前述のとおり、第２工程は、第３工程の後に行ってもよい。
【００４４】
第３工程では、基板１１２表面に、ブロッキング層１１３を所定のパターンで形成する。より具体的には、基板１１２表面のマイクロチャンバー１１１外の領域にブロッキング層１１３を形成する。これにより、ブロッキング層１１３を形成されなかった領域（マイクロチャンバー１１１内の領域）は細胞捕捉領域１１４となり、ブロッキング層１１３を形成された領域（マイクロチャンバー１１１外の領域）は細胞非捕捉領域１１５となる。図４Ａは、ブロッキング層１１３形成前の基板１１２の部分拡大断面図であり、図４Ｂは、ブロッキング層１１３形成後の基板１１２の部分拡大断面図である。
【００４５】
ブロッキング層１１３の形成方法は、特に限定されない。ブロッキング層１１３の形成方法の例には、流路法やコンタクトプイリンティング法、フォトリソグラフィ法、インクジェット法などが含まれる。たとえば、第２工程の後に第３工程を行う場合は、流路法によりブロッキング層１１３を形成することができる。この場合、ブロッキング剤および色素を含有する溶液（ブロッキング溶液）を流路１２１に導入する。このとき、ブロッキング溶液の流速が好適であれば、マイクロチャンバー１１１内に気泡が残り、マイクロチャンバー１１１外の領域のみにブロッキング層１１３が形成される。また、第２工程の前に第３工程を行う場合は、コンタクトプリンティング法やフォトリソグラフィ法、インクジェット法などによりブロッキング層１１３を形成することができる。コンタクトプリンティング法を利用する場合、別の平板にブロッキング溶液を塗布し、ある程度乾燥させて、半乾きのブロッキング層１１３を形成する。この平板を基板１１２表面に押し当てることで、ブロッキング層１１３が基板１１２表面に転写される。このとき、平板はマイクロチャンバー１１１内の領域に接触しないため、マイクロチャンバー１１１外の領域のみにブロッキング層１１３が形成される。ブロッキング溶液の濃度は、マイクロチャンバー１１１外の領域に形成できれば特に限定されない。ブロッキング溶液の濃度は、ブロッキング層１１３の形成方法に応じて適宜調整されうる。
【００４６】
任意に行われる第４工程では、ブロッキング層１１３に含まれる色素を検出することで、ブロッキング層１１３の形成パターンを確認する。たとえば、ブロッキング層１１３に顔料や染料などの着色剤が添加されている場合は、可視光を照射して反射光（応答光）を検出することで、ブロッキング層１１３の形成パターンを確認することができる。また、ブロッキング層１１３に蛍光色素が添加されている場合は、励起光を照射して蛍光（応答光）を検出することで、ブロッキング層１１３の形成パターンを確認することができる。
【００４７】
以上の手順により、本実施の形態に係る細胞整列チップ１００を製造することができる。
【００４８】
［標的細胞の検出方法］
次に、本実施の形態に係る細胞整列チップ１００を用いて、標的細胞を検出する装置および方法について説明する。
【００４９】
図５は、細胞整列チップ１００を用いて標的細胞を検出するための、標的細胞の検出装置２００の構成を示す模式図である。図５に示されるように、検出装置２００は、ホルダー２１０、第１光照射部２２０、第２光照射部２３０、光検出部２４０、および処理部２５０を有する。検出装置２００には、細胞整列チップ１００が装着される。
【００５０】
ホルダー２１０は、細胞整列チップ１００を所定の位置に保持する。また、ホルダー２１０の下には、移動部２１５が配置されている。移動部２１５は、ホルダー２１０をＸ軸方向に移動させるＸ軸移動機構２１６と、ホルダー２１０をＹ軸方向に移動させるＹ軸移動機構２１７とを有する。移動部２１５は、ホルダー２１０を水平方向（ＸＹ方向）に移動させることで、ホルダー２１０に保持された細胞整列チップ１００を水平方向（ＸＹ方向）に移動させることができる。
【００５１】
第１光照射部２２０は、ブロッキング層１１３の位置を検出するための光を、細胞整列チップ１００のマイクロチャンバー１１１を含む領域に照射する。第１光照射部２２０に用いられる光源の種類は、特に限定されず、ブロッキング層１１３が含有する色素の種類などに応じて適宜選択すればよい。光源の種類の例には、レーザーダイオードやハロゲンランプ、タングステンランプ、ＬＥＤなどが含まれる。
【００５２】
第２光照射部２３０は、標的細胞を標識した蛍光色素に対する励起光を、細胞整列チップ１００のマイクロチャンバー１１１を含む領域に照射する。第２光照射部２３０の光源の種類は、特に限定されず、蛍光色素の最大励起波長などに応じて適宜選択すればよい。ただし、細胞整列チップ１００の自家蛍光の影響を排除する観点から、励起光の波長は、長波長であることが好ましい。なお、ブロッキング層１１３に蛍光色素が含有される場合には、ブロッキング層１１３に含有される蛍光色素に対する励起光の波長、および標的細胞を標識した蛍光色素に対する励起光の波長を含む光を出射することができる、１つの光照射部（光源）と波長カットフィルターとを組み合わせることで、第１光照射部２２０および第２光照射部２３０を実現してもよい。
【００５３】
光検出部２４０は、第１光照射部２２０から照射された光による色素からの応答光、および第２光照射部２３０から照射された励起光により蛍光色素から放出される蛍光を検出する。光検出部２４０に用いられる検出器の種類は、色素からの応答光、および蛍光色素から放出される蛍光を検出することができれば特に限定されない。光検出部２４０に用いられる検出器の例には、光電子増倍管やフォトダイオードなどが含まれる。なお、本実施の形態では、１つの光検出部２４０で、色素からの応答光、および蛍光色素から放出される蛍光を検出するが、２つの光検出部で、色素からの応答光、および蛍光色素から放出される蛍光を別個に検出してもよい。この場合、検出装置２００は、色素からの応答光を検出する第１光検出部と、蛍光色素から放出される蛍光を検出する第２光検出部とを有する。
【００５４】
図５に示されるように、第１光照射部２２０から細胞整列チップ１００までの光路上には、第１レンズ２２１、ハーフミラー２２３および対物レンズ２２５が、第１光照射部２２０側から順番に配置されている。第１光照射部２２０から照射された光は、第１レンズ２２１を通過した後、ハーフミラー２２３により細胞整列チップ１００に向けて反射される。ハーフミラー２２３で反射された励起光は、対物レンズ２２５により細胞整列チップ１００のマイクロチャンバー１１１を含む領域に集光される。
【００５５】
また、第２光照射部２３０から細胞整列チップ１００までの励起光の光路上には、第２レンズ２３１、ダイクロイックミラー２３２、ハーフミラー２２３および対物レンズ２２５が、第２光照射部２３０側から順番に配置されている。第２光照射部２３０から照射された励起光は、第２レンズ２３１を通過した後、ダイクロイックミラー２３２で細胞整列チップ１００に向けて反射される。ダイクロイックミラー２３２で反射された励起光は、ハーフミラー２２３を通過した後、対物レンズ２２５により細胞整列チップ１００のマイクロチャンバー１１１を含む領域に集光される。
【００５６】
そして、細胞整列チップ１００から光検出部２４０までの光路上には、対物レンズ２２５、ハーフミラー２２３、ダイクロイックミラー２３２、フィルター２３５、ピンホール２３６および第３レンズ２３７が、細胞整列チップ１００側から順番に配列されている。色素からの応答光および蛍光色素から放出される蛍光は、対物レンズ２２５、ハーフミラー２２３、およびダイクロイックミラー２３２を通過した後、第３レンズ２３７により検出部２４０の受光面に結像される。このとき、微弱な光（例えば蛍光）を検出する場合には、必要に応じて、ダイクロイックミラー２３２と第３レンズ２３７との間にフィルター２３５およびピンホール２３６が配置されていてもよい。フィルター２３５の種類の例には、励起光カットフィルターや減光フィルターなどが含まれる。励起光カットフィルターは、励起光や外光などを遮断し、Ｓ／Ｎ比を向上させる。減光フィルターは、蛍光強度を光検出器２４０に合わせて調整する。ピンホール２３６は、励起光の焦点（マイクロチャンバー１１１内）からの蛍光以外の光を遮断し、Ｓ／Ｎ比を向上させる。ピンホール２３６の形状は、特に限定されず、例えば円形や矩形などである。ピンホール２３６の大きさは、使用する光学素子に応じて適宜設定される。
【００５７】
処理部２５０は、光検出部２４０の検出結果に基づいて、細胞捕捉領域１１４に捕捉された標的細胞を標識する蛍光色素からの蛍光の検出結果を算出する。処理機の種類の例には、演算装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどが含まれる。
【００５８】
次に、以上の構成からなる検出装置２００を使用して、標的細胞を検出する方法について説明する。
【００５９】
まず、細胞整列チップ１００を準備し、検出装置２００のホルダー２１０に設置する。
【００６０】
次いで、細胞整列チップ１００の細胞捕捉領域１１４に、蛍光色素で標識された標的細胞を捕捉させる。具体的には、細胞懸濁液を導入口１３１から流路１２１内に導入して、流路１２１内を細胞懸濁液で満たす。次いで、細胞整列チップ１００を一定時間（例えば１〜１５分間）静置する。これにより、細胞懸濁液に含まれる細胞の一部をマイクロチャンバー１１１内（細胞捕捉領域１１４上）に沈降させることができるが、残部の細胞はマイクロチャンバー１１１外（細胞非捕捉領域１１５上）に沈降してしまう。そこで、所定の送液圧を所定の時間発生させるワンショット送液工程と、送液圧を発生させない静置工程とを含む間欠送液を行い、マイクロチャンバー１１１外の細胞を移動させることで、マイクロチャンバー１１１外の細胞をマイクロチャンバー１１１内に回収する。
【００６１】
次いで、標的細胞を蛍光色素で標識するための染色液（例えば、蛍光色素で標識された抗体の溶液）を流路１２１内に導入する。これにより、マイクロチャンバー１１１内に回収された細胞を蛍光色素で標識することができる。この後、少なくとも１回は洗浄液（例えばリン酸緩衝液）を用いて、マイクロチャンバー１１１内に回収された細胞や流路１２１などを洗浄する。染色液の種類は、標的細胞の種類に応じて適宜選択される。
【００６２】
次いで、第１光照射部２２０は、マイクロチャンバー１１１を含む領域に光を照射するとともに、光検出部２４０は、ブロッキング層１１３に含有された色素による応答光を検出する。光検出部２４０の検出結果は、処理部２５０に送られる。処理部２５０は、光検出部２４０の検出結果に基づいて、ブロッキング層１１３の位置を検出する。このとき、処理結果からブロッキング層１１３の形成パターンを確認してもよい。なお、細胞整列チップ１００に細胞懸濁液を導入する前に、予めブロッキング層１１３の形成パターンの確認を行ってもよい。この場合、細胞懸濁液を導入する前に、第１光照射部２２０はマイクロチャンバー１１１を含む領域に光を照射し、光検出部２４０は応答光を検出する。処理部２５０は、検出されたブロッキング層１１３の位置と細胞捕捉領域１１４とが重複する領域を検出して、細胞捕捉不良領域を検出することもできる。
【００６３】
次いで、第２光照射部２３０は、マイクロチャンバー１１１を含む領域に、細胞を標識した蛍光色素に対する励起光を照射するとともに、光検出部２４０は、蛍光色素から放出される蛍光を検出する。光検出部２４０の検出結果は、処理部２５０に送られる。
【００６４】
次いで、処理部２５０は、光検出部２４０の検出結果に基づいて、蛍光の検出結果から、前述したブロッキング層１１３の位置における蛍光の検出結果を除く処理を行う。前述のとおり、ブロッキング層１１３の形成プロセスにおいてパターニング欠陥が生じ、ブロッキング層１１３がマイクロチャンバー１１１内に形成されてしまうことがある。しかし、ブロッキング層１１３に含有されているブロッキング剤によって、ブロッキング層１１３への細胞の付着は防止されるはずである。そのため、ブロッキング層１１３で蛍光が検出された場合、その蛍光は、自家蛍光を有する異物（例えば埃や塵、気泡など）に由来するものであると考えられる。また、前述のとおり、ブロッキング層１１３に含有されている色素によって、マイクロチャンバー１１１内のブロッキング層１１３の位置（細胞捕捉不良領域の位置）は検出することができる。したがって、仮にブロッキング層１１３のパターニング欠陥が生じたとしても、マイクロチャンバー１１１内の蛍光の検出結果から、ブロッキング層１１３の位置（細胞捕捉不良領域の位置）における蛍光の検出結果を除くことで、このような異物による影響を排除することができる。その結果として、細胞の分析を高精度に行うことができる。上記処理により、細胞捕捉領域１１４に捕捉された標的細胞を標識する蛍光色素からの蛍光を算出することができる。
【００６５】
なお、ブロッキング層１１３に含有される色素として、標的細胞を標識する蛍光色素と蛍光波長が異なる蛍光色素を用いてもよい。蛍光色素で標識された標的細胞がマイクロチャンバー１１１内に捕捉された後でも、標的細胞を標識する蛍光色素と区別してブロッキング層１１３の位置を検出することができる。たとえば、標的細胞を標識する蛍光色素の最大蛍光波長は、３００ｎｍを超え、かつ９００ｎｍ未満であり、ブロッキング層１１３に含有される蛍光色素の最大蛍光波長は、３００ｎｍ以下または９００ｎｍ以上である。
【００６６】
また、標的細胞は、蛍光波長の異なる２種以上の蛍光色素により標識されていてもよい。このようにすることで、細胞捕捉領域１１４に自家蛍光を有する不要物が存在する場合であっても、標的細胞と不要物とを区別することができる。
【００６７】
以上の構成によれば、ブロッキング層１１３のパターニング欠陥が生じた場合であっても、マイクロチャンバー１１１内における細胞捕捉領域１１４および細胞非捕捉領域１１５の位置を判別し、細胞の分析を高精度に行うことができる。
【００６８】
なお、上記実施の形態では、図１Ｂに示されるように、流路１２１を有する閉鎖系の細胞整列チップ１００について説明した。しかしながら、本発明に係る細胞整列チップは、開放系の細胞整列チップであってもよい。たとえば、マイクロチャンバーチップ１１０は、そのままの状態で本発明に係る細胞整列チップ（開放系の細胞整列チップ）として使用されうる。
【００６９】
また、上記実施の形態では、図４Ｂに示されるように、細胞捕捉領域１１４がマイクロチャンバー１１１内に配置されている細胞整列チップ１００について説明した。しかしながら、本発明に係る細胞整列チップ１００は、細胞を収容するための凹部（マイクロチャンバー）１１１を有していなくてもよい。たとえば、図６に示されるように、平板状の基板１１２上に細胞捕捉領域１１４および細胞非捕捉領域１１５を配置してもよい。この場合も、細胞非捕捉領域１１５のみにブロッキング層１１３が配置される。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【００７１】
１．細胞整列チップの作製
（１）流路法を用いた細胞整列チップの作製
基板として、一方の面に複数のマイクロチャンバー（開口径１００μｍ、深さ５０μｍ）が形成されているポリスチレン基板（厚み１ｍｍ）を準備した。基板のマイクロチャンバーが形成されている面上に、枠体としての粘着シール（厚み１００μｍ）と、天板としてのアクリル板（厚み３ｍｍ）を積層して、細胞整列チップを作製した。
【００７２】
牛血清アルブミン（ＢＳＡ；ブロッキング剤）を終濃度が０．１％となるように、ローダミン（蛍光色素）を終濃度が０．００１％となるように酢酸緩衝液に加えて、ブロッキング溶液を調製した。天板に形成されている導入口からブロッキング溶液を４０ｍＬ／分の流速で流路内に導入し、３０分静置することで、流路内のマイクロチャンバー外の領域にＢＳＡおよびローダミンを含むブロッキング層を形成した。このとき、マイクロチャンバー内には気泡が存在するため、基本的にはマイクロチャンバー内にはブロッキング層は形成されないはずである。その後、導入口から超純水を４０ｍＬ／分の流速で流路内に導入し、流路内面を洗浄した。洗浄後、天板に形成されている排出口から流路内の流体を１００ｍＬ／分の流速で２分間吸引することで、流路内面を十分乾燥させた。
【００７３】
（２）コンタクトプリンティング法を用いた細胞整列チップの作製
前述のポリスチレン基板と同面積のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）基板を前述のブロッキング溶液に３０分間浸漬した。浸漬後、ＰＤＭＳ基板を超純水で洗浄し、パターニング用スタンプとした。
【００７４】
このスタンプを、前述のポリスチレン基板のマイクロチャンバーが形成されている面上に押圧して、マイクロチャンバー外の領域にＢＳＡおよびローダミンを含むブロッキング層を転写した。このとき、基本的にはマイクロチャンバー内にはブロッキング層は転写されないはずである。この後、スタンプをポリスチレン基板から離し、ブロッキング層を乾燥させた。次いで、基板のマイクロチャンバーが形成されている面上に、枠体としての粘着シール（厚み１００μｍ）と、天板としてのアクリル板（厚み３ｍｍ）を積層して、細胞整列チップを作製した。
【００７５】
２．細胞整列チップの評価
各細胞整列チップについて、ブロッキング層内の蛍光色素からの蛍光を検出することで、ブロッキング層の位置を確認した。細胞整列チップを蛍光顕微鏡に設置し、細胞整列チップに励起光（波長５５０ｎｍ）を照射し、蛍光輝度の分布を測定した。図７Ａは、ブロッキング層が正常にパターニングされている場合のマイクロチャンバー周辺の蛍光顕微鏡写真であり、図７Ｂは、ブロッキング層が正常にパターニングされていない場合のマイクロチャンバー周辺の蛍光顕微鏡写真である。これらの写真では、ローダミン由来の蛍光が検出された領域（ブロッキング層）を黒色で示し、蛍光が検出されなかった領域（細胞捕捉領域）を白色で示している。図７Ａに示されるように、マイクロチャンバー外の輝度に対するマイクロチャンバー内の輝度が１／５以下であるマイクロチャンバーを正常チャンバーと評価した。一方、図７Ｂに示されるように、マイクロチャンバー外の輝度に対するマイクロチャンバー内の輝度が１／５より大きいチャンバーをエラーチャンバーと評価した。図７Ｂに示されるエラーチャンバーでは、マイクロチャンバー内の一部の領域にブロッキング層が形成されてしまっている。
【００７６】
３．細胞整列チップを用いた細胞の検出
エタノールを終濃度が３０％となるようにリン酸緩衝液に加え、プレウェット溶液を調製した。導入口から流路内へ１ｍＬ／分の流速でプレウェット溶液を導入して、マイクロチャンバー内の気泡を除去した。その後、導入口から流路内へ１ｍＬ／分の流速でリン酸緩衝液を導入して、流路内を洗浄した。
【００７７】
２×１０５個のヒト白血球をリン酸緩衝液に懸濁して細胞懸濁液を調製した。導入口から流路内へ１００μＬ／分の流速で細胞懸濁液を導入した。その後、１００μＬ／分の流速で０．３μＬの細胞懸濁液を送液する作業を４０回繰り返し（間欠送液）、流路内の白血球をマイクロチャンバー内に収容した。さらにその後、リン酸緩衝液を１００μＬ／分の流速で導入することで、マイクロチャンバー内の細胞を単層化した。
【００７８】
ＢＳＡを終濃度が３％となるように、１％Ｔｗｅｅｎを終濃度が３％となるようにリン酸緩衝液に加え、さらにＦＩＴＣ標識の抗ヒトＣＤ４５抗体およびHoechst（ＤＮＡに結合する蛍光色素）を加えて細胞染色溶液を調製した。導入口から流路内へ１００μＬ／分の流速で細胞染色溶液を導入し、３０分間静置した。その後、導入口から流路内へリン酸緩衝液を導入して、流路内を洗浄した。
【００７９】
マイクロチャンバー内に細胞を収容した細胞整列チップを蛍光顕微鏡に設置し、細胞整列チップに波長３５０ｎｍ（Hoechst用）および波長５００ｎｍ（ＦＩＴＣ用）の励起光を照射した。このとき、細胞整列チップの評価において、正常チャンバーの全領域、およびエラーチャンバーのうちブロッキング層が形成されていない領域では、両波長の励起光で蛍光が検出された場合には、標的細胞からの蛍光であると判定し、一方の波長の励起光のみで蛍光が検出された場合には、標的細胞ではなく不要物からの自家蛍光であると判定した。また、エラーチャンバーのうちブロッキング層が形成されている領域で検出された蛍光も、標的細胞ではなく不要物からの自家蛍光であると判定した。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明に係る細胞整列チップ、標的細胞の検出方法および標的細胞の検出装置は、例えば疾患の検査などに有用である。
【符号の説明】
【００８１】
１０  細胞
１００  細胞整列チップ
１１０  マイクロチャンバーチップ
１１１  マイクロチャンバー
１１２  基板
１１３  ブロッキング層
１１４  細胞捕捉領域
１１５  細胞非捕捉領域
１２０  枠体
１２１  流路
１２２  貫通孔
１３０  天板
１３１  導入口
１３２  排出口
２００  標的細胞の検出装置
２１０  ホルダー
２１５  移動部
２１６  Ｘ軸移動機構
２１７  Ｙ軸移動機構
２２０  第１光照射部
２２１  第１レンズ
２２３  ハーフミラー
２２５  対物レンズ
２３０  第２光照射部
２３１  第２レンズ
２３２  ダイクロイックミラー
２３５  フィルター
２３６  ピンホール
２３７  第３レンズ
２４０  光検出部
２５０  処理部
【図１】
2015190873.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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