(57)【要約】【課題】培養条件下で組織片の機能を長期間維持できる方法および組織片培養デバイスを提供する。【解決手段】器官の機能を発現し得る組織片の前記機能を発現させ維持する方法であって、前記組織片を培養室に収容し、前記培養室と隔離材を介して接する流路に培養液を流通させる工程を有し、前記隔離材が、多孔質膜、または相互に間隔をあけて配置された複数の壁材から構成されるスリット部であり、前記培養室が、前記隔離材から４００μｍ以下の領域内に設けられていることを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
器官の機能を発現し得る組織片の前記機能を発現させ維持する方法であって、
前記組織片を培養室に収容し、前記培養室と隔離材を介して接する流路に培養液を流通させる工程を有し、
前記隔離材が、多孔質膜、または相互に間隔をあけて配置された複数の壁材から構成されるスリット部であり、
前記培養室が、前記隔離材から４００μｍ以下の領域内に設けられていることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法に用いられる組織片培養デバイスであって、
器官の機能を発現し得る組織片を収容する培養室と、
培養液を流通させる流路と、
隔離材と、
を備え、
前記隔離材が、多孔質膜、または相互に間隔をあけて配置された複数の壁材から構成されるスリット部であり、
前記培養室と前記流路とが、前記隔離材を介して接しており、
前記培養室が、前記隔離材から４００μｍ以下の領域内に設けられている組織片培養デバイス。
【請求項３】
透明基板と、培養室形成用の切欠き部が設けられた第一の層と、前記多孔質膜と、流路形成用の溝が設けられた第二の層とがこの順で積層したデバイス本体を備え、
前記多孔質膜は、前記切欠き部と前記溝とを区画するように配置され、
前記透明基板と前記切欠き部と前記多孔質膜とで囲まれた空間が前記培養室とされ、前記多孔質膜または前記第二の層と前記溝とによって囲まれた空間が前記流路とされている、請求項２に記載の組織片培養デバイス。
【請求項４】
前記デバイス本体は、前記透明基板側を下側にして配置され、
前記第二の層に、前記流路に培養液を供給する培養液導入路と、前記流路から培養液を排出する培養液排出路とが形成され、
前記培養液導入路および前記培養液排出路がそれぞれ前記デバイス本体の上面に開口し、
前記培養液導入路の開口に、培養液を収容するタンクが取り付けられ、前記培養液排出路の開口に吸引ポンプが接続されている、請求項３に記載の組織片培養デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、器官の機能を発現し得る組織片の機能を発現させ維持する方法、および該方法に用いられる組織片培養デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体から取り出した組織片を器官培養法により培養することが行われている。例えば器官培養法によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ精子形成の試みは、器官培養法の草創期からなされており、１９３７年には新生仔マウス精巣組織片を凝血塊上で培養して、減数分裂パキテン期までの分化が進行したとの報告がある。
器官培養法としては主に、気層液層境界部培養法（Ｇａｓ−ｌｉｑｕｉｄ  ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ法）と旋回培養法の２つが知られている。これらの方法は、１９５０〜１９６０年代に開発され、応用されてきた。
しかし、従来の器官培養法は、生体から切り出した組織片の形態や機能を維持できる期間が短く、数日からせいぜい２〜３週間である。また、組織片の機能の発現も充分とはいえない。例えば前記のような新生仔マウス精巣組織片の培養を気層液層境界部培養法で行った場合、精子形成の進行はやはりパキテン期までであった。
【０００３】
非特許文献１には、気層液層境界部培養法を応用したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの精子形成の促進に有効な方法として、培養液に半分程度浸漬したアガロースゲルの台の上に新生仔マウス精巣組織片を載せて培養すること、その際、培養液に、従来頻用されている牛胎仔血清（ＦＢＳ）の代わりにＫｎｏｃｋＯｕｔ（登録商標）  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）を添加すること、が提案されている。この方法によれば、新生仔マウス精巣組織片から精子を産生させ、顕微授精で産仔を得ることに成功したことが報告されている。また、精子形成を１〜２か月維持できたことも報告されている。
【０００４】
一方、１９９０年代からＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）技術を用いてマイクロ流体デバイスという流路系をもった培養システムが工学分野において開発されている。
非特許文献２や特許文献１では、マイクロメーターオーダーの微細な流路を作製し、該流路上に細胞を培養する空間を設け、該流路と該空間との間に細胞の足場となる多孔質膜を配置したデバイスが提案されている。該流路に２種以上の培養液を多層流として流通させると、各培養液が多孔質膜を介して流路上の空間内に供給され、該空間内の物質分布を時間的にも空間的にも制御し、細胞の分化等を制御できるとされている。しかし、組織片の培養については検討されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔ．Ｓａｔｏ，Ｋ．Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ａ．Ｇｏｈｂａｒａ，Ｋ．Ｉｎｏｕｅ，Ｎ．Ｏｇｏｎｕｋｉ，Ａ．Ｏｇｕｒａ，Ｙ．Ｋｕｂｏｔａ，Ｔ．Ｏｇａｗａ, “Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  оｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｐｅｒｍ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｔｅｓｔｅｓ”, Ｎａｔｕｒｅ，ＶＯＬ  ４７１，ｐｐ．５０４−５０８, ２４  ＭＡＲＣＨ  ２０１１
【非特許文献２】Ｊ．Ｋａｗａｄａ，Ｈ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｈ．Ａｋｕｔｓｕ，Ｙ． Ｓａｋａｉ，Ｔ．Ｆｕｊｉｉ，“Ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ”, Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，ｖｏｌ．１２，ｎｏ．２１，ｐｐ．４５０８−４５１５，２０１２
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−１４７３８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
細胞培養法と器官培養法とは性質が大きく異なっており、意義や応用方法もおのずと異なっている。
器官培養法と細胞培養法と比べた場合、器官培養法は、臨床応用に際して幾つかの強みがある。例えば、精巣生検で得られる検体をそのまま器官培養に供することができる。すなわち、生検検体から精子や精子幹細胞を取り分ける操作が省略できる。臨床現場においてはこの簡便さが強みになると考えられる。しかし、器官培養法は、前記のとおり、短時間しか組織片の機能を維持できないという弱点がある。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、培養条件下で組織片の機能を長期間維持できる方法および組織片培養デバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下の態様を有する。
［１］器官の機能を発現し得る組織片の前記機能を発現させ維持する方法であって、
前記組織片を培養室に収容し、前記培養室と隔離材を介して接する流路に培養液を流通させる工程を有し、
前記隔離材が、多孔質膜、または相互に間隔をあけて配置された複数の壁材から構成されるスリット部であり、
前記培養室が、前記隔離材から４００μｍ以下の領域内に設けられていることを特徴とする方法。
［２］［１］に記載の方法に用いられる組織片培養デバイスであって、
器官の機能を発現し得る組織片を収容する培養室と、
培養液を流通させる流路と、
隔離材と、
を備え、
前記隔離材が、多孔質膜、または相互に間隔をあけて配置された複数の壁材から構成されるスリット部であり、
前記培養室と前記流路とが、前記隔離材を介して接しており、
前記培養室が、前記隔離材から４００μｍ以下の領域内に設けられている組織片培養デバイス。
［３］透明基板と、培養室形成用の切欠き部が設けられた第一の層と、前記多孔質膜と、流路形成用の溝が設けられた第二の層とがこの順で積層したデバイス本体を備え、
前記多孔質膜は、前記切欠き部と前記溝とを区画するように配置され、
前記透明基板と前記切欠き部と前記多孔質膜とで囲まれた空間が前記培養室とされ、前記多孔質膜または前記第二の層と前記溝とによって囲まれた空間が前記流路とされている、［２］に記載の組織片培養デバイス。
［４］前記デバイス本体は、前記透明基板側を下側にして配置され、
前記第二の層に、前記流路に培養液を供給する培養液導入路と、前記流路から培養液を排出する培養液排出路とが形成され、
前記培養液導入路および前記培養液排出路がそれぞれ前記デバイス本体の上面に開口し、
前記培養液導入路の開口に、培養液を収容するタンクが取り付けられ、前記培養液排出路の開口に吸引ポンプが接続されている、［３］に記載の組織片培養デバイス。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、培養条件下で組織片の機能を長期間維持できる方法および組織片培養デバイスを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の第一実施形態のデバイス１００の上面図である。
【図２】デバイス１００使用時における、図１のＩＩ−ＩＩ断面図である。
【図３】図２中の点線丸印で囲んだ部分の拡大図である。
【図４】図１のＩＶ−ＩＶ断面の一部を示す部分断面図である。
【図５】本発明の第二実施形態のデバイス２００の側面図である。
【図６】デバイス２００を構成する層５３の上面図である。
【図７】図６のＶＩＩ−ＶＩＩ断面の一部を示す部分断面図である。
【図８】デバイス２００のスリット部６１を溝５側から見た部分断面図である。
【図９】デバイス１００の変形例を説明する部分断面図である。
【図１０】試験例１で培養した組織片の培養２８日目の時点の倒立顕微鏡像である。
【図１１】比較例１にてアガロースゲル上で培養した精巣組織片のＧＦＰ  Ｇｒａｄｅ  Ｇ１〜Ｇ６それぞれの段階の蛍光顕微鏡像である。
【図１２】実施例１および比較例１の結果を示すグラフである。
【図１３】比較例２で作製したポリマー層の貫通孔７３周辺の部分上面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の方法は、器官の機能を発現し得る組織片の前記機能を発現させ維持する方法であって、
前記組織片を培養室に収容し、前記培養室と多孔質膜を介して接する流路に培養液を流通させる工程を有し、
前記培養室が、前記多孔質膜から４００μｍ以下の領域内に設けられていることを特徴とする。
【００１３】
培養室に組織片を収容し、流路に培養液を流通させると、流路と培養室との間で、多孔質膜を介して物質交換が行われる。すなわち、流路を流通する培養液中の成分（栄養素、酸素等）が培養室内へ供給され、培養室内の組織片からの老廃物が流路側へ排出される。これにより、培養室内の組織片の培養が行われる。
【００１４】
本発明において、「機能を発現させ維持する」とは、培養室に収容する時点で既に機能を発現している組織片に、その状態（機能が発現している状態）を維持させること、および培養室に収容する時点では機能を発現していない組織片に、機能を発現させ、その状態を維持させること、の両方を包含する。
【００１５】
「器官」とは、動物、植物等の多細胞生物の体を構成し、一定の形態と生理機能を営むものの総称である。
「器官の機能」とは、器官が本来備えている働きを意味する。例えば器官が精巣である場合、器官の機能には、精子を形成する働きが含まれる。
【００１６】
「器官の機能を発現し得る組織片」は、器官の機能を発現するために必要な構造単位を含む。構造単位は、典型的には、複数種の構造体を含む。構造単位を構成する構造体の種類および数は器官によって異なる。例えば精巣の場合、構造単位は、精細管と間質とを含む。精細管のみでは、培養条件下で精子形成能を長期間維持することは困難である。精巣において間質は、複数の精細管の間を埋めている。間質には血管（動脈、静脈、毛細血管）や複数種の細胞が存在し、精子形成をサポートしている。
【００１７】
本発明の方法は、例えば、以下の組織片培養デバイス（以下、単にデバイスともいう。）を用いて行うことができる。該デバイスの培養室に組織片を収容し、流路に培養液を流通させることにより本発明の方法を実施できる。
器官の機能を発現し得る組織片を収容する培養室と、
培養液を流通させる流路と、
多孔質膜と、
を備え、
前記培養室と前記流路とが、前記多孔質膜を介して接しており、
前記培養室が、前記多孔質膜から４００μｍ以下の領域内に設けられているデバイス。
【００１８】
以下、本発明の方法およびデバイスについて、添付の図面を用い、実施形態を示して説明する。ただし本発明は以下の実施形態に限定されない。
【００１９】
≪第一実施形態≫
＜第一実施形態のデバイス＞
図１〜４を用いて、本発明の第一実施形態のデバイス１００を説明する。
図１は、デバイス１００の上面図である。図２は、デバイス１００使用時における、図１のＩＩ−ＩＩ断面図である。図３は、図２中の点線丸印で囲んだ部分の拡大図である。図４は、図１のＩＶ−ＩＶ断面の一部を示す部分断面図である。
【００２０】
デバイス１００は、デバイス本体１と、培養液を収容するタンク９と、管３５と、チューブ２５と、図示しない吸引ポンプとを備える。
デバイス本体１は、透明基板１１と、第一の層１３と、多孔質膜７と、第二の層１５とがこの順に積層したものである。
【００２１】
第一の層１３は、矩形状の切欠き部３を有している。切欠き部３は、Ｗ１の幅でＩＶ−ＩＶ方向に延在している。
第二の層１５は、第一の層１３側に、溝５を有している。溝５は、Ｗ２の幅でＩＩ−ＩＩ方向に延在している。
溝５の中間部と切欠き部３の一端側は平面視で重なる位置とされている。
多孔質膜７は、切欠き部３と溝５とを区画するように配置されている。
多孔質膜７は、第一の層１３上の、デバイス１００を積層方向から観察した時に溝５と重なる部分とその周辺を覆うように配置されており、第一の層１３の一部は、第二の層１５と直接接している。
【００２２】
したがって、デバイス本体１内には、透明基板１１と切欠き部３と多孔質膜７とで囲まれた空間と、多孔質膜７または第二の層１５と溝５とによって囲まれた空間とが形成されている。
デバイス本体１においては、透明基板１１と切欠き部３と多孔質膜７とで囲まれた空間のうち、溝５の下側の部分（デバイス１００を積層方向から観察した時に溝５と重なる部分）が培養室Ｓ１とされ、残りの部分が、培養室Ｓ１に組織片を導入するための組織片導入路Ｓ２とされている。また、多孔質膜７または第二の層１５と溝５とによって囲まれた空間が、培養液を流通させる流路Ｓ３とされている。
図３には、培養室Ｓ１に組織片３１が導入された状態を示している。
【００２３】
第二の層１５の、溝５の両端上の位置にはそれぞれ、デバイス本体１の上面に開口する貫通孔２１、２３が設けられている。貫通孔２１、２３はそれぞれ、流路Ｓ３に培養液を供給する培養液導入路、流路Ｓ３から培養液を排出する培養液排出路とされている。
貫通孔２１の開口には、培養液を収容するタンク９が取り付けられ、貫通孔２３の開口には、チューブ２５を介して、図示しない吸引ポンプが接続されている。これにより、吸引ポンプを作動させたときに、タンク９内に収容された培養液を貫通孔２１から流路Ｓ３に導入し、流路Ｓ３を流通させ、貫通孔２３から排出できるようになっている。
【００２４】
第二の層１５の、切欠き部３の組織片導入路Ｓ２側（培養室Ｓ１とは反対側）の末端上の位置には、デバイス本体１の上面に開口する貫通孔３３が設けられている。貫通孔３３の開口には、円筒状の管３５が取り付けられている。
管３５は必須ではないが、管３５を設けることにより、管３５、貫通孔３３および組織片導入路Ｓ２を介して、または必要に応じて管３５、貫通孔３３および組織片導入路Ｓ２内に挿入されるチューブ等の器具を介して、培養室Ｓ１に組織片を導入（または培養室Ｓ１から組織片を回収）することが容易になっている。
管３５の上端は、キャップ等により封止できるようになっている。通常、管３５の上端を封止した状態で培養が行われる。培養中、必要に応じて、管３５の上端を開放し、組織片を追加することもできる。
管３５は、培養時に組織片の足場または固定材として、コラーゲンゲル、マトリゲル、アガロースゲル等を培養室Ｓ１内に供給するためにも利用できる。
管３５は、組織片の導入前、組織片の導入と同時、組織片の導入後等において、培養室Ｓ１内に、各種細胞や、成長因子などの液性因子の徐放剤を投入するためにも利用できる。
【００２５】
（培養室）
培養室Ｓ１は、多孔質膜７から４００μｍ以下の領域内に設けられる。すなわち、培養室Ｓ１の高さＤ１は、４００μｍ以下である。培養室Ｓ１が設けられるのは、多孔質膜７から４００μｍ以下の領域内が好ましく、３００μｍ以下の領域内がより好ましく、２００μｍ以下の領域内がさらに好ましい。
培養室Ｓ１を前記の領域内に設けることにより、培養室Ｓ１内で培養する組織片の機能を長期間維持することができる。一方、前記の領域外にある組織片の機能を長期間維持することは難しく、後述する試験例１に示すように、短期間で壊死に陥る懸念がある。
【００２６】
機能維持の観点では、培養室Ｓ１の高さＤ１は低いほど好ましいが、高さＤ１が低くなると、培養室Ｓ１内に収容する組織片が薄くなる。組織片が薄くなると、組織片が機能を充分に発現しないおそれがある。
培養室Ｓ１の高さＤ１の下限値は、培養する組織片の最小構造単位に依存するので一概には言えないが、精巣組織片の場合は、精細管の直径が最小でも１００μｍであるため、培養室Ｓ１の高さＤ１は、１００μｍ以上が好ましく、１５０μｍ以上がより好ましい。
【００２７】
培養室Ｓ１は、溝５と切欠き部３とが平面視で重なる位置に設けられており、ＩＩ−ＩＩ方向における培養室Ｓ１の長さは切欠き部３の幅Ｗ１であり、ＩＶ−ＩＶ方向における培養室Ｓ１の長さは溝５の幅Ｗ２である。
幅Ｗ１、幅Ｗ２はそれぞれ、培養室Ｓ１に収容する組織片が収容可能な大きさであればよく、組織片の大きさに応じて適宜設定できる。
培養室Ｓ１の体積は、培養室Ｓ１に収容される組織片の体積に対し、１００〜２００体積％が好ましく、１００〜１５０体積％がより好ましい。培養室の体積が前記範囲の下限値以上であると、組織片への空間的圧迫がなく物理的な条件が良好で、前記範囲の上限値以下であると、自己分泌した増殖因子の拡散を抑制することができることから化学的な条件が良好である。
【００２８】
（流路）
流路Ｓ３の高さＤ２、つまり溝５の深さは、特に限定されないが、５０〜１０００μｍが好ましく、１００〜５００μｍがより好ましい。流路Ｓ３の高さＤ２が前記範囲の下限値以上であると必要十分な栄養素の供給や代謝物の除去が良好で、前記範囲の上限値以下であると余剰な培養液の削減ができる。
流路Ｓ３の幅は、溝５の幅、すなわちＷ２である。
【００２９】
（多孔質膜）
「多孔質膜」とは、当該膜を貫通する細孔を多数有する固体の膜である。
多孔質膜７の孔径（細孔の孔径）は、０．４〜５０μｍが好ましく、１〜３０μｍがより好ましく、５〜２０μｍがさらに好ましく、１０〜２０μｍが特に好ましい。多孔質膜７の孔径が前記範囲の下限値以上であると、多孔質膜７を介した物質交換が良好に行われる。多孔質膜７の孔径が前記範囲の上限値以下であると、多孔質膜７を通過した培養液の流れによる組織片のダメージが生じにくく、組織片の機能を維持しやすい。
多孔質膜７の孔径は、電子顕微鏡（ＳＥＭ）、レーザー顕微鏡等により測定できる。
【００３０】
多孔質膜７の空隙率は、１〜１５％が好ましく、５〜１０％がより好ましい。多孔質膜７の空隙率が前記範囲の下限値以上であると、多孔質膜７を介した物質交換が良好に行われる。多孔質膜７の空隙率が前記範囲の上限値以下であると、多孔質膜７を通過した培養液の流れによる組織片のダメージが生じにくく、組織片の機能を維持しやすい。
【００３１】
多孔質膜７の厚さは、１〜２００μｍが好ましく、５〜３０μｍがより好ましい。多孔質膜７の厚さが前記範囲の上限値以下であると、物質交換が良好に行われる。多孔質膜７の厚さが前記範囲の下限値以上であると、多孔質膜７を通過した培養液の流れによる組織片のダメージが生じにくく、組織片の機能を維持しやすい。
【００３２】
多孔質膜７の材質としては特に限定されず、従来、多孔質膜７の材料として用いられているものと同様であってよい。具体的には、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン（以下、ＰＴＦＥという）等が挙げられる。
多孔質膜７としては、Ｗｈａｔｍａｎ社等から販売されている市販品を利用できる。
【００３３】
（透明基板）
透明基板１１を構成する材料は、透明材料であれば特に限定されない。
透明材料は可視光を透過する材料である。透明材料としては、例えばポリジメチルシロキサン（以下、ＰＤＭＳという）等のシリコーンゴム、ポリスチレン、アクリル樹脂等の透明樹脂材料、ガラス、ゲル（コラーゲンやゼラチンなど）等が挙げられる。
透明基板１１は、デバイス１００の使用時に組織片と接触することから、組織片の機能発現および維持に影響しない材料を用いることが好ましい。
培養室Ｓ１内の観察のしやすさ、デバイスの強度、汚れにくさ等の観点では、透明基板１１を構成する材料としては、ガラスが好ましい。
デバイス１００外の大気中の酸素を培養室Ｓ１内に供給する観点では、透明基板１１を構成する材料としては、酸素透過性を有する材料が好ましい。酸素透過性を有する材料については後で詳しく説明する。
透明基板１１の厚さは特に限定されず、強度、透明性等のバランスを考慮して適宜設定できる。透明基板１１がガラス板の場合、その厚さは０．１〜２．０ｍｍ程度が好ましく、高倍率かつＮＡの高い対物レンズを利用する共焦点顕微鏡などを用いて詳細な組織片画像を取得するためには０．１５〜０．２０ｍｍ程度がより好ましい。
【００３４】
（第一の層）
第一の層１３を構成する材料としては、前述の形状に加工可能な材料であれば特に限定されず、例えばマイクロ流路構造の形成等に用いられている公知の材料のなかから適宜選択できる。
第一の層１３を構成する材料は、透明材料でもよく、それ以外の材料でもよい。培養室Ｓ１内を観察しやすい点で、透明材料が好ましい。透明材料としては前記と同様のものが挙げられる。透明材料以外の材料としては金属、Ｓｉ等が挙げられる。
第一の層１３を構成する材料は、透明基板１１と同様に、組織片の機能発現および維持に影響しない材料が好ましい。また、デバイス１００外の大気中の酸素を培養室Ｓ１内に供給する観点では、酸素透過性を有する材料が好ましい。
酸素透過性を有する材料としては、既知の任意の酸素透過性材料が使用可能であり、例えば、酸素透過性コンタクトレンズなどに用いられている生体適合性の酸素透過性材料等が挙げられる。生体適合性の酸素透過性材料として具体的には、シリコーンゴムが挙げられる。特に、生体適合性を有するとともに、透明性および酸素透過性を有し、さらに安価な材料であることから、ＰＤＭＳが好ましい。
第一の層１３の厚さは、培養室Ｓ１の高さＤ１と同じである。
【００３５】
（第二の層）
第二の層１５を構成する材料としては、第一の層１３を構成する材料と同様のものが挙げられる。好ましい態様も同様である。
【００３６】
（デバイスの製造方法）
デバイス１００は、透明基板１１と第一の層１３と多孔質膜７と第二の層１５とをこの順に積層してデバイス本体１を作製し、得られたデバイス本体１の貫通孔２１にタンク９を取り付け、貫通孔２３にチューブ２５を介して吸引ポンプを接続し、必要に応じて貫通孔３３に管３５を取り付けることにより製造できる。
第一の層１３、第二の層１５はそれぞれ、従来、マイクロリアクター等の流路構造を有するマイクロデバイスの製造に用いられている方法など、公知の微細加工法を利用して製造できる。該微細加工法としては、例えばリソグラフィー法、エッチング法、切削、射出成型、３Ｄプリンティング等が挙げられる。
【００３７】
リソグラフィー法を用いた製造方法の一例を挙げると、以下の工程（１）〜（５）を行うことにより第一の層１３を作製できる。
（１）まず、基板上に、スピンコーティングによりフォトレジストを塗布してフォトレジスト層を形成する。
（２）フォトレジスト層に対し、切欠き部３（培養室Ｓ１および組織片導入路Ｓ２）に対応するパターンのマスクを介して露光し、現像することにより、フォトレジスト層をパターニングする。
（３）パターニングされたフォトレジスト層（鋳型）上に、ＵＶ硬化型または熱硬化型ポリマーのプレポリマーを塗布してプレポリマー層を形成する。
（４）プレポリマー層にＵＶを照射または加熱して硬化させてポリマー層とする。
（５）ポリマー層を剥離する。
工程（２）では、パターニングにより、フォトレジスト層の一部が除去され、基板上に、切欠き部３に対応する形状のフォトレジスト層が残る。そのため、次の工程（３）で形成するプレポリマー層の厚さを、フォトレジスト層の厚さと同じかそれよりも薄くした場合、工程（５）で得られるポリマー層は、切欠き部３を有しており、そのまま第一の層１３として使用できる。
【００３８】
前記の工程（２）にて溝５に対応するパターンのマスクを使用し、工程（３）にて形成するプレポリマー層の厚さを、フォトレジスト層の厚さよりも厚くする以外は前記と同様にして工程（１）〜（５）を行うと、片面に溝５が形成されたポリマー層が得られる。そのため、このようにしてポリマー層を得た後、さらに、該ポリマー層に、貫通孔２１、２３、３３を開けることにより、第二の層１５を作製できる。
【００３９】
透明基板１１と第一の層１３と多孔質膜７と第二の層１５との積層は、プラズマボンディング法、溶着、圧着、治具を利用した保定法等により行うことができる。
なお、培養室Ｓ１および組織片導入路Ｓ２に対応する凹部が片面に形成されたポリマー層を第二の層１５と同様にして作製し、透明基板１１および第一の層１３を一体成形してもよい。
また、第二の層１５は、溝５に対応する切欠き部および貫通孔３３に対応する貫通孔を有する層と、貫通孔２１、２３、３３それぞれに対応する貫通孔を有する層とを貼り合わせて作製してもよい。この場合、溝５に対応する切欠き部および貫通孔３３に対応する貫通孔を有する層は、第一の層１３と同様にして、溝５に対応する切欠き部を有する層を作製し、貫通孔をあけることにより作製できる。
【００４０】
＜第一実施形態の方法＞
本発明の第一実施形態の方法は、前記のデバイス１００を使用して行われる。
本発明の第一実施形態の方法は、例えば以下の工程（Ｉａ）〜（Ｉｂ）を含む。
（Ｉａ）デバイス１００のタンク９内および流路Ｓ３内に培養液を満たし、培養室Ｓ１内に組織片を導入する工程、
（Ｉｂ）貫通孔２３にチューブ２５を介して接続した図示しない吸引ポンプを作動させることによりタンク９内の培養液を流路Ｓ３に流通させ、培養室Ｓ１内の組織片を培養する工程。
【００４１】
工程（Ｉａ）：
組織片は、動物、植物等の多細胞生物の器官の機能を発現し得るものであれば特に限定されない。再生医療や薬物応答・毒性試験への応用を考慮した場合には、動物の器官の機能を発現し得る組織片が好ましく、哺乳動物の器官の機能を発現し得る組織片が好ましい。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ウシ、ブタ等が挙げられる。
器官としては、精巣、卵巣、副腎、下垂体、皮膚、乳腺、唾液腺、甲状腺、副甲状腺、胸腺、脳、神経組織、リンパ節、心臓、肺、骨、肝臓、脾臓、膵臓、小腸、大腸、腎臓、前立腺、膀胱、精嚢、子宮、膣、卵管、胎盤等が挙げられる。これらの中では、配偶子産生というその機能が明確である点で、精巣、卵巣等が好ましい。
組織片は、生体から器官の一部または全部を採取して得られたものであってもよく、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）等から再構成されたものであってもよい。
組織片の体積は、器官の機能を発現し得る限り特に限定されないが、組織片の大きさが大きいほど、機能を長期間維持しやすい傾向がある。例えば精巣組織片の場合、その大きさは、少なくとも１００μｍ×５００μｍ×５００μｍであることが好ましい。
【００４２】
組織片の培養室Ｓ１への導入は、管３５、貫通孔３３および組織片導入路Ｓ２から行われる。このとき、組織片とともに培養液を導入してもよい。
組織片は、管３５、貫通孔３３および組織片導入路Ｓ２に直接導入してもよく、管３５、貫通孔３３および組織片導入路Ｓ２内にチューブやシリンジ等の器具を挿入し、該器具を用いて導入してもよい。
組織片の導入後は、通常、管３５の上端をキャップ等により封止し、その状態で培養が行われる。培養途中に組織片を追加することも可能である。
組織片の導入前、組織片の導入と同時、組織片の導入後等において、組織片の足場または固定材として、コラーゲンゲル、マトリゲル、アガロースゲル等を培養室Ｓ１内に供給してもよい。
組織片の導入前、組織片の導入と同時、組織片の導入後等において、培養室Ｓ１内に、各種細胞や、成長因子などの液性因子の徐放剤を投入してもよい。
【００４３】
培養液の組成は、培養する組織片の種類等に応じて適宜設定できる。
組織片が精巣組織片である場合、培養液としては、αＭＥＭ（ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）等の標準的な培養液にＫｎｏｃｋＯｕｔ（登録商標）  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、もしくはアルブミン製剤であるＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）を添加したものが好ましい。ＫＳＲやＡｌｂｕＭＡＸを添加した培養液を用いることで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの完全な精子形成が可能となる。
【００４４】
工程（Ｉｂ）：
デバイス本体１の貫通孔２３に接続した吸引ポンプを作動させると、タンク９内の培養液が貫通孔２１から流路Ｓ３に供給され、流路Ｓ３を流通し、貫通孔２３から排出される。
培養液の流通時、培養室Ｓ１内は培養液（組織片の収容時に組織片とともに供給された培養液や多孔質膜７を通過して流入した培養液）で満たされており、拡散によって、流路Ｓ３内の培養液中の成分（栄養素、酸素等）が培養室Ｓ１内に供給され、また、培養室Ｓ１内の培養液中の成分（組織片からの老廃物等）が流路Ｓ３側に排出される。
そのため、流路Ｓ３に培養液を流通させることで、組織片を培養できる。また、このように組織片の培養を行うことで、組織片の機能を長期間維持できる。
培養温度、流路Ｓ３内での培養液の流速等の培養条件は、培養する組織片の種類、大きさ等に応じて適宜設定できる。
【００４５】
工程（Ｉｂ）中、必要に応じて、培養室Ｓ１内の組織片の観察を行ってもよい。例えば倒立顕微鏡を用いて、デバイス本体１の透明基板１１側から組織片の状態（形態、壊死の有無等）を観察できる。組織片が精巣組織片である場合、共焦点顕微鏡等によって、より詳細な精子形成の進行状態を観察できる。
【００４６】
（作用効果）
以上説明した本発明の第一実施形態の方法においては、前記のように組織片の培養を行うことにより、組織片の機能を、従来よりも長期間維持できる。
例えば精巣組織片の場合、一般的な気層液層境界部培養法では、気層と培養液との境界部に組織片を置くことで栄養素と酸素の供給を図っているが、数日から２〜３週間で精子形成能が失われる。その改良法である非特許文献１の方法でも１〜２か月しか機能を維持できない。対して本発明の第一実施形態の方法によれば、それよりも長く、例えば４か月以上、さらには６か月以上にわたり、精子形成能を維持できる。
これは、多孔質膜から所定の領域内では、生体内の血流に対応するような培養液の送液効果が得られ、生体内での毛細血管と間質液との間での物質交換（栄養素や酸素の供給、老廃物の排出）に類似した物質交換が行われること、培養室Ｓ１と流路Ｓ３とが多孔質膜７によって区画されているため、組織片が、培養液の流れによるせん断応力などの機械的な刺激を受けにくいこと、等が影響していると考えられる。
実際、本発明者らは、精巣組織片を流路内に配置した状態（培養液の流れにさらされる状態）で培養を行うと、機能が短時間で低下することを確認している（後述の比較例２）。
【００４７】
なお、ミクロン単位の流体操作を目指したデバイスとして、マイクロメーターオーダーの流路が設けられたマイクロ流体デバイスが知られており、マイクロ流体デバイスの細胞培養への応用はこれまで試みられている。例えば前述の非特許文献２や特許文献１では、微細な流路と、その上に多孔質膜を介して配置された空間とを備えるデバイスを用い、前記空間内で細胞を培養することが提案されている。
しかし、このようなデバイスの組織片培養（器官培養）への応用については想定されていなかった。これは、従来、組織片培養の場合、細胞培養とは異なり、形態や機能を維持できる期間が大幅に短いことが知られていること、組織片の形態や機能の維持には生体内の様々なメカニズムが関与しておりｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再現は難しいと考えられていること、組織片培養で培養される組織片の大きさがミリ単位以上になること、等によるためであった。
したがって、組織片を、培養液の流路と多孔質膜で分けた空間に置くだけで、組織片の機能を前述のように長期間維持できるとの効果は、予想外の驚くべき効果といえる。
【００４８】
デバイス１００にあっては、デバイス本体１の培養室Ｓ１の下側は透明基板１１である。すなわちデバイス本体１の培養室Ｓ１の下側は透明である。そのため、組織片の培養時に、デバイス本体１の下側から培養室Ｓ１内を観察しやすい。例えば倒立顕微鏡で観察する場合に、鮮明な像が得られやすい。
第二の層１５および多孔質膜７が透明である場合、デバイス本体１の上側から培養室Ｓ１内を観察することが可能であり、この場合は、培養室Ｓ１の下側が透明でなくてもよい。しかし、デバイス本体１の上側から観察する場合、間に多孔質膜７が介在すること、デバイス本体１の上面にタンク９が配置されていること等から、倒立顕微鏡から培養室Ｓ１までの距離が長く、鮮明な像が得られにくい。そのため、デバイス本体１の培養室Ｓ１の下側が透明であることが好ましい。
【００４９】
デバイス１００にあっては、貫通孔２１にタンク９を設置し、貫通孔２３に接続した吸引ポンプによってタンク９内の培養液を流路Ｓ３に流通させるように構成されているため、組織片の培養を長期間継続しやすい。
従来、マイクロ流路デバイスを用いた潅流培養では一般的に、培養液を収容したタンクから、ペリスタティックポンプ等の送液ポンプを使用して、マイクロ流路デバイス内に培養液を供給している。この場合、送液時に培養液に気泡が混入しやすい。マイクロ流路デバイスの上流側にバブルトラップを設ける等の対策はとられているが、気泡を完全には防止できない。培養液に気泡が混入すると、流れが阻害されたり、組織と気泡が直接接触した部位での培養液の供給が滞り、組織片へのダメージ等の問題が生じやすい。
デバイス１００のように流路Ｓ３の下流側に配置された吸引ポンプを使用して培養液を流通させると、前記のような問題が生じにくい。また、タンクに培養液を補充する際に気泡が混入しても容易に脱気できる。そのため、長期間の組織培養を良好に行うことができる。
【００５０】
≪第二実施形態≫
＜第二実施形態のデバイス＞
図５〜７を用いて、本発明の第二実施形態のデバイス２００を説明する。なお、以下に示す実施形態において、第一実施形態に対応する構成要素には同一の符号を付してその詳細な説明を省略する。
図５は、デバイス２００の側面図である。図６は、デバイス２００を構成する第一の層５３の上面図である。図７は、図６のＶＩＩ−ＶＩＩ断面の一部を示す部分断面図である。図８は、デバイス２００のスリット部６１を溝５側から見た部分断面図である。
デバイス２００は、流路Ｓ３の横に培養室Ｓ１を設け、それらの間をスリット部で区画したものである。
【００５１】
デバイス２００は、デバイス本体２と、培養液を収容するタンク９と、管３５と、チューブ２５と、図示しない吸引ポンプとを備える。
デバイス本体２は、透明基板１１と、層５３とが積層したものである。
【００５２】
層５３は、透明基板１１側に、流路形成用の溝５と、組織片導入路および培養部の形成用の広幅の溝６３とを有する。溝６３の一端の一部は溝５の中間部に合流している。溝５と溝６３との合流部分にスリット部６１が設けられており、スリット部６１によって溝５と溝６３とが区画されている。
【００５３】
したがって、デバイス本体２内には、透明基板１１と溝５とスリット部６１とで囲まれた空間と、透明基板１１と溝６３とスリット部６１とで囲まれた空間とが形成されている。
デバイス本体２においては、透明基板１１と溝５とスリット部６１とで囲まれた空間が、培養液を流通させる流路Ｓ３とされている。また、透明基板１１と溝６３とスリット部６１とで囲まれた空間のうち、スリット部６１からの距離が４００μｍ以内の領域が培養室Ｓ１とされ、残りの領域が、培養室Ｓ１に組織片を導入するための組織片導入路Ｓ２とされている。
【００５４】
層５３の、溝５の両端の位置にはそれぞれ、デバイス本体２の上面に開口する貫通孔２１、２３が設けられている。貫通孔２１、２３はそれぞれ、流路Ｓ３に培養液を供給する培養液導入路、流路Ｓ３から培養液を排出する培養液排出路とされている。
貫通孔２１の開口には、培養液を収容するタンク９が取り付けられ、貫通孔２３の開口には、チューブ２５を介して、図示しない吸引ポンプが接続されている。
層５３の、溝６３のスリット部６１側とは反対側の末端の位置には、デバイス本体２の上面に開口する貫通孔３３が設けられている。貫通孔３３の開口には、円筒状の管３５が取り付けられている。
【００５５】
培養室Ｓ１が設けられる領域の好ましい範囲は第一実施形態と同様である。
溝６３の深さＤ３は、培養室Ｓ１の高さとなる。前記のとおり、培養室Ｓ１の高さの下限値は、培養する組織片の最小構造単位に依存するので一概には言えないが、精巣組織片の場合は、精細管の直径が最小でも１００μｍであるため、溝６３の深さＤ３は、１００μｍ以上が好ましく、１５０μｍ以上がより好ましい。
溝６３の深さＤ３の上限は、組織片の機能の発現および維持の観点では特に限定されず、培養する組織片の大きさに応じて適宜設定できる。ただし、溝６３を深くして培養室Ｓ１を大きくしようとすると、スリット部６１を介して培養室Ｓ１に接する流路Ｓ３の高さ、つまり溝５の深さも深くなる。溝５が深くなると、培養液の使用量が多くなる。そのため、培養液量節約の観点では、溝６３の深さＤ３は、１０００μｍ以下が好ましく、５００μｍ以下がより好ましい。
溝６３の、溝５との合流部分の幅Ｗ３は、培養室Ｓ１に収容する組織片が収容可能な大きさであればよく、組織片の大きさに応じて適宜設定できる。
【００５６】
溝５の幅Ｗ４の好ましい範囲は、第一実施形態の溝５の深さ（流路Ｓ３の深さＤ２）の好ましい範囲と同様である。
溝５の深さは、溝６３の深さＤ３と同じである。
なお、溝６３の深さＤ３と溝５の深さとが異なっていてもよい。例えば後述の製造例１の手順を応用すれば、溝６３と溝５をそれぞれ異なる深さで形成することができる。この場合、物質交換の観点から、溝６３の深さＤ３が、溝５の深さよりも浅いことが好ましい。溝６３の深さＤ３が溝５の深さよりも浅い場合、培養液量節約の観点から、溝６３の深さＤ３と、溝５の深さとの差が少ないほど好ましい。
層５３を構成する材料としては、第一の層１３を構成する材料と同様のものが挙げられる。好ましい態様も同様である。
【００５７】
（スリット部）
図８に、デバイス２００のスリット部６１を溝５側から見た部分断面図を示す。
図８に示すように、層５３の溝５が溝６３に合流する位置では、層５３の透明基板１１側に、溝５と溝６３とを連通させる複数の溝６７が等間隔で形成されている。これら複数の溝６７に挟まれた部分が、相互に間隔をあけて配置された複数の壁材６１ａとなっている。
【００５８】
溝６７の深さＤ４は、溝６３の深さＤ３と同じである。
また、溝６７の深さＤ４は、壁材６１ａの幅Ｗ６より大きくされている。そのため、溝６７は、培養液の流通方向（溝５の延在方向）と直交する状態で交差するスリットとなっている。
【００５９】
溝６７の幅（隣り合う壁材６１ａの間の間隔）Ｗ７は、０．４〜５０μｍが好ましく、１〜３０μｍがより好ましく、５〜２５μｍがさらに好ましく、１０〜２０μｍが特に好ましい。幅Ｗ７が前記範囲の下限値以上であると、スリット部６１を介した物質交換が良好に行われる。幅Ｗ７が前記範囲の上限値以下であると、スリット部６１を通過した培養液の流れによる組織片のダメージが生じにくく、組織片の機能を維持しやすい。
【００６０】
壁材６１ａの幅（隣り合う溝６７の間の間隔）Ｗ６は、５〜４００μｍが好ましく、１０〜２００μｍがより好ましく、２０〜１００μｍが特に好ましい。幅Ｗ６、つまりスリット間の距離が前記範囲の下限値以上であると、スリット部６１を通過した培養液の流れによる組織片のダメージが生じにくく、組織片の機能を維持しやすい。幅Ｗ６が前記範囲の上限値以下であると、スリット部６１を介した物質交換が良好に行われる。
幅Ｗ６と幅Ｗ７との比（Ｗ６：Ｗ７）は、良好な物質交換と組織片へのダメージの抑制の観点から、１００：１〜１：１の範囲内であることが好ましく、２０：１〜２：１の範囲内がより好ましい。
【００６１】
スリット部６１の厚さ（溝５の延在方向に対して直交する方向における壁材６１ａおよび溝６７の幅）Ｗ５は、１〜２００μｍが好ましく、３〜５０μｍがより好ましく、５〜３０μｍが特に好ましい。スリット部６１の厚さＷ５が前記範囲の上限値以下であると、物質交換が良好に行われる。スリット部６１の厚さＷ５が前記範囲の下限値以上であると、スリット部６１を通過した培養液の流れによる組織片のダメージが生じにくく、組織片の機能を維持しやすい。
【００６２】
（デバイスの製造方法）
デバイス２００は、透明基板１１と層５３とを積層してデバイス本体２を作製し、得られたデバイス本体１の貫通孔２１にタンク９を取り付け、貫通孔２３にチューブ２５を介して吸引ポンプを接続し、必要に応じて貫通孔３３に管３５を取り付けることにより製造できる。
層５３は、従来、マイクロリアクター等の流路構造を有するマイクロデバイスの製造に用いられている方法など、公知の微細加工法を利用して製造できる。該微細加工法としては、例えばリソグラフィー法、エッチング法、切削、射出成型、３Ｄプリンティング等が挙げられる。例えば、前記の工程（２）にて溝５、溝６３および溝６７に対応するパターンのマスクを使用する以外は第二の層１５の作製と同様の操作で層５３を作製できる。
なお、上記に列記した方法を用いれば、必要に応じて、溝５、溝６３および溝６７をそれぞれ独立して所望の深さで形成することができる。
透明基板１１と層５３との積層は、プラズマボンディング法、溶着、圧着、治具を利用した保定法等により行うことができる。
【００６３】
＜第二実施形態の方法＞
本発明の第二実施形態の方法は、前記のデバイス２００を使用して行われる。
本発明の第二実施形態の方法は、例えば以下の工程（ＩＩａ）〜（ＩＩｂ）を含む。
（ＩＩａ）デバイス２００のタンク９内および流路Ｓ３内に培養液を満たし、培養室Ｓ１内に組織片を導入する工程、
（ＩＩｂ）貫通孔２３にチューブ２５を介して接続した図示しない吸引ポンプを作動させることによりタンク９内の培養液を流路Ｓ３に流通させ、培養室Ｓ１内の組織片を培養する工程。
【００６４】
工程（ＩＩａ）、工程（ＩＩｂ）はそれぞれ、デバイス１００の代わりにデバイス２００を用いる以外は、工程（Ｉａ）、（Ｉｂ）と同様にして行うことができる。
【００６５】
以上、本発明の方法およびデバイスについて、第一実施形態〜第二実施形態を示して説明したが、本発明は上記実施形態に限定されない。上記実施形態における各構成およびそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。
【００６６】
例えば、第一実施形態では、培養室Ｓ１を４つ設けているが、デバイス本体１内の培養室は１〜３つでもよく５つ以上でもよい。第二実施形態においても同様である。
多孔質膜７として四角形状のものを示したが、多孔質膜７は少なくとも切欠き部３と溝５とが重なる部分の全体を覆うものであれば、その形状や大きさは特に限定されない。
透明基板１１および第一の層１３を別々に作製する例を示したが、透明基板１１および第一の層１３を一体成形してもよい。
培養室Ｓ１の上側に多孔質膜７および流路Ｓ３が配置された例を示したが、培養室Ｓ１の下側に多孔質膜および流路が配置されてもよい。また、培養室Ｓ１の上側および下側の両方にそれぞれ多孔質膜および流路が配置されてもよい。
【００６７】
図９に、デバイス１００の変形例を示す。この例のデバイス１１０は、培養室Ｓ１の上側および下側の両方にそれぞれ多孔質膜および流路が配置されたものである。図９は、培養室Ｓ１の位置におけるデバイス１１０のＩＶ−ＩＶ断面の一部を示す部分断面図である。
デバイス１１０は、第三の層１７と多孔質膜７Ａと第一の層１３と多孔質膜７と第二の層１５とがこの順に積層したものである。
第三の層１７は、第一の層１３側の表面に、流路形成用の溝５Ａを有する。
多孔質膜７Ａは、多孔質膜７と同様である。
【００６８】
デバイス本体１Ａにおいては、多孔質膜７Ａと第一の層１３の切欠き部３と多孔質膜７とで囲まれた空間が、培養室Ｓ１および組織片導入路Ｓ２とされている。また、多孔質膜７または第一の層１３と溝５とで囲まれた空間が流路Ｓ３とされているほか、多孔質膜７Ａまたは第一の層１３と溝５Ａとで囲まれた空間が流路Ｓ４とされている。
【００６９】
デバイス１１０において、第一の層１３の厚さ、すなわち培養室Ｓ１の高さＤ５は、培養室Ｓ１の上側および下側の両方にそれぞれ多孔質膜および流路が配置されていることから、８００μｍ以下である。すなわち、培養室Ｓ１は、多孔質膜から４００μｍ以下の領域内に設けられていればよいため、培養室Ｓ１の上側および下側の両方に多孔質膜が配置されているこの例においては、培養室Ｓ１の高さを８００μｍ（４００μｍ×２）までとることができる。
【００７０】
第二実施形態において、培養室の左右に、隔離材を介して流路を配置してもよい。この場合、左右の隔離材の間の距離を８００μｍ以下とすると、左右の隔離材の間を全て培養室として利用できる。
流路の左右に、隔離材を介して培養室を配置してもよい。
培養室の上側および下側のいずれか一方または両方に、隔離材を介して流路を配置してもよい。
【００７１】
複数の隔離材を備える場合、複数の隔離材はそれぞれ同じでもよく異なってもよい。
例えば複数の隔離材の一部を多孔質膜とし、残りをスリット部としてもよい。
また、デバイス１１０のように、多孔質膜を介して培養室に接する流路を複数備える場合、各流路と培養室とを区画する多孔質膜はそれぞれ同じでも異なってもよい。例えば孔径等が異なっていてもよい。
また、スリット部を介して培養室に接する流路を複数備える場合、各流路と培養室とを区画するスリット部はそれぞれ同じでも異なってもよい。例えば壁材の幅や間隔が異なっていてもよい。
隔離材を介して培養室に接する流路を複数備える場合、各流路に流通させる培養液の組成や流速は同じでも異なってもよい。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。ただし本発明は該実施例に限定されるものではない。
【００７３】
＜製造例１＞
図１〜４に示す構成のデバイス１００を以下の手順で製造した。
まず、シリコン基板を用意し、該シリコン基板上に、スピンコーティングによりフォトレジスト（商品名「ＳＵ−８  ２１００」；マイクロケム社製）を塗布し、ベークしてフォトレジスト層を形成した。次いで、切欠き部３（培養室Ｓ１および組織片導入路Ｓ２）のパターンのマスクを介して露光、現像を行い、フォトレジスト層にマスクのパターンを転写した。該フォトレジスト層（鋳型）上に、未硬化のＰＤＭＳを塗布してポリマー層を形成し、ＵＶ照射により硬化させた。硬化後、ポリマー層を剥離して、切欠き部３を有する第一の層１３（外径：長径×短径×厚さ＝７６ｍｍ×３２ｍｍ×１６０μｍ、培養室Ｓ１：幅Ｗ１×幅Ｗ２×高さ＝２ｍｍ×４ｍｍ×１６０μｍ、組織片導入路Ｓ２：幅×長さ×高さ＝４ｍｍ×８ｍｍ×１６０μｍ）を得た。
【００７４】
マスクを溝５（流路Ｓ３）のパターンのものに変更した以外は前記と同じ操作を行い、片面に溝５を形成したポリマー層を得た。該ポリマー層に貫通孔２１、２３、３３を開けて第二の層１５（外径：長径７６ｍｍ×短径３２ｍｍ×厚さ２ｍｍ、流路Ｓ３（溝５）：幅×長さ×深さ＝２ｍｍ×２０ｍｍ×３００μｍ）を得た。
【００７５】
孔径１０μｍ、空隙率７．６％、厚さ１０μｍの多孔質膜（ｗｈａｔｍａｎ社製「ｔｒａｃｋ  ｅｔｃｈ  ｍｅｍｂｒａｎｅ」、材質：ポリカーボネート）にアミノシランでコーティングした。これを多孔質膜７とした。
透明基板１１として、ガラス板（厚さ１．２ｍｍスライドガラス）を用意した。
第一の層１３、第二の層１５、多孔質膜７および透明基板１１それぞれの表面をＯ２プラズマ処理した。その後、透明基板１１と第一の層１３と多孔質膜７と第二の層１５とをこの順に配置し、プラズマボンディング法による共有結合で接着してデバイス本体１を得た。
得られたデバイス本体１の貫通孔２１にタンクを取り付け、貫通孔２３にチューブ２５を介して吸引ポンプを接続し、貫通孔３３に管３５を取り付けてデバイス１００を作製した。
【００７６】
＜試験例１＞
本試験は、多孔質膜からの距離が組織片に与える影響を評価する目的で実施した。
【００７７】
（試験方法）
デバイス：
図５〜８に示す構成のデバイス２００を以下の手順で製造した。
まず、製造例１における第二の層１５の作製条件のうち、マスクを変更した以外は同じ操作を行い、片面に溝５、溝６３および溝６７を形成したポリマー層を得た。該ポリマー層の所定の位置に３つの貫通孔２１、２３、３３を設けて層５３を得た。
この例では、溝５の幅Ｗ４×深さは５００μｍ×１４０μｍとし、溝６３の幅×深さＤ３は３〜７ｍｍ×１４０μｍとし、溝６７の深さＤ４×幅Ｗ７×厚さＷ５は１４０μｍ×２５μｍ×１００μｍとし、溝６間の間隔（壁材６１ａの幅）Ｗ６は５０μｍとした。溝５と溝６３との合流部分の幅Ｗ３は５ｍｍとした。
次に、透明基板１１として、ガラス板（厚さ１．２ｍｍスライドガラス）を用意した。
層５３および透明基板１１それぞれの表面をＯ２プラズマ処理した。その後、透明基板１１と層５３とをこの順に配置し、プラズマボンディング法による共有結合で接着してデバイス本体２を得た。
得られたデバイス本体２の貫通孔２１にタンクを取り付け、貫通孔２３にチューブを介して吸引ポンプを接続し、貫通孔３３に管３５を取り付けてデバイス２００を作製した。
【００７８】
組織片の調製：生後３．５日齢マウスの生体から精巣および精巣上体を一塊のまま摘出した。白膜をはがして精巣上体をはずし、精巣のみとした。精巣を１ｍｍ×１ｍｍ程度の大きさに分割して精巣組織片を得た。
【００７９】
培養方法：作製したデバイス２００のタンク９に培養液を入れ、流路Ｓ３（透明基板１１と溝５とで囲まれた空間）を培養液で満たした。また、得られた組織片を、管３５から、透明基板１と溝６３とで囲まれた空間内に導入し、スリット部６１に接するまで押し込んだ。
次に、デバイス２００のデバイス本体２をタンク９ごと３４℃のインキュベーター内に入れた。吸引ポンプはインキュベーターの外部に配置した。続いて吸引ポンプを作動させ、流路Ｓ３に培養液を緩徐に流通させながら組織片の培養を行った。
培養液としてはαＭＥＭ＋４％ＡｌｂｕＭＡＸを使用した。
流路Ｓ３内での培養液の流速は０．０５μＬ／分とした。
培養期間中、数日ごとにデバイスをインキュベーターから取り出し、倒立顕微鏡によりデバイス本体２の下側からデバイス本体２内の組織片を観察した。
【００８０】
（試験結果および考察）
培養開始から２８日間経過した時点それぞれにおけるデバイス本体２内の組織片の顕微鏡像を図１０に示す。図１０中の矢印は、培養液用の流路に流通させた培養液の流れを示し、双方向矢印は、スリットから４００μｍの距離を示す。
図１０に示すとおり、組織片のうち、スリットの位置から４００μｍ以内にある部分は、精巣組織の構造が維持されていたが、スリットからの距離が４００μｍを超えている部分は壊死に陥っていた。
【００８１】
＜実施例１＞
新生仔期（０．５日齢）のＡｃｒ−ＧＦＰトランスジェニックマウスの生体から精巣および精巣上体を一塊のまま摘出した。白膜をはがして精巣上体をはずし、精巣のみとした。この日齢のマウスの精巣は十分に小さいため分割せずにそのまま培養に供した。
Ａｃｒ−ＧＦＰトランスジェニックマウスは、精子形成の途中の生殖細胞においてＧＦＰ遺伝子が発現し、そのＧＦＰタンパク質が精子の先体部分に集簇して発色するマウスであり、筑波理研・バイオリソースセンターより入手した。
組織片（精巣）の培養は、製造例１で製造したデバイス１００を用いて、以下の手順で行った。
【００８２】
製造例１で作製したデバイス１００のタンク９に培養液を入れ、流路Ｓ３を培養液で満たした。また、得られた組織片を、管３５から組織片導入路Ｓ２に導入し、培養室Ｓ１に送り込んだ。
次に、デバイス１００のデバイス本体１をタンク９ごと３４℃のインキュベーター内に入れた。吸引ポンプはインキュベーターの外部に配置した。続いて吸引ポンプを作動させ、流路Ｓ３に培養液を緩徐に流通させながら組織片の培養を行った。
培養液としてはαＭＥＭ＋４％ＡｌｂｕＭＡＸを使用した。
流路Ｓ３内での培養液の流速は０．０５μＬ／分とした。
【００８３】
培養期間中、数日ごとにデバイスをインキュベーターから取り出し、倒立顕微鏡によりデバイス本体１の下側から培養室Ｓ１内の組織片を観察した。また、精子形成の進行具合の指標であるＧＦＰ  Ｇｒａｄｅを、蛍光顕微鏡により測定した。
【００８４】
＜比較例１＞
新生仔期（０．５日週齢）のＡｃｒ−ＧＦＰトランスジェニックマウスの生体から精巣および精巣上体を一塊のまま摘出した。白膜をはがして精巣上体をはずし、精巣のみとした。精巣が小さいため分割せずにそのまま培養液に半分程度浸漬したアガロースゲルの台の上にのせて培養した。培養液としては、実施例１で用いたのと同じものを使用した。
培養期間中、数日ごとにデバイスをインキュベーターから取り出し、倒立顕微鏡により組織片（精巣）を観察した。また、精子形成の進行具合の指標であるＧＦＰ  Ｇｒａｄｅを前記と同様にして測定した。
【００８５】
ＧＦＰ  Ｇｒａｄｅは、培養している精巣組織内において精子形成を生じている部分の全体における比率（蛍光顕微鏡像において蛍光が観察される部分（＝精子形成が生じている部分）の面積が占める割合（％））を以下の基準で６段階に分けて半定量化した指標である。
Ｇ１：精子形成が生じている部分の比率が１０％以下。
Ｇ２：精子形成が生じている部分の比率が１０％超３０％以下。
Ｇ３：精子形成が生じている部分の比率が３０％超５０％以下。
Ｇ４：精子形成が生じている部分の比率が５０％超７０％以下。
Ｇ５：精子形成が生じている部分の比率が７０％超９０％以下。
Ｇ６：精子形成が生じている部分の比率が９０％超。
ただし、比較例１のように組織片をアガロースゲル上に乗せて培養する際には、組織の中央部には酸素・栄養素の供給および老廃物の排除が不十分なために精子形成は期待できない。そのため比較例１では、組織片の辺縁から４００μｍ以内の部分に限定して評価を行った。
図１１に、比較例１にてアガロースゲル上で培養した精巣組織片のＧＦＰ  ＧｒａｄｅのＧ１〜Ｇ６それぞれの段階の蛍光顕微鏡像を示す。
【００８６】
実施例１および比較例１におけるＧＦＰ  Ｇｒａｄｅの測定結果から、横軸に培養日数（日）、縦軸にＧＦＰ  Ｇｒａｄｅの値をとったグラフを作成した。該グラフを図１２に示す。図１２中の点線は実施例１の結果、実線は比較例１の結果を示す。
図１２に示すとおり、比較例１では、培養期間が２か月を超えた頃からＧＦＰ  Ｇｒａｄｅの値が低下し、８６日経過時点でほぼゼロになった。
対して実施例１では、培養期間が１か月を超えた頃からＧＦＰ  Ｇｒａｄｅの値が比較例１を上回り、６か月経過時点でもＧＦＰ  Ｇｒａｄｅが高い値を示しており、精巣臓器の機能を発現・維持する能力が極めて高いことが確認できた。
【００８７】
＜比較例２＞
まず、製造例１における第二の層１５の作製条件のうち、マスクを変更した以外は同じ操作を行い、片面に溝を有し、３つの貫通孔を有するポリマー層を得た。
図１３に、該ポリマー層の溝の周辺の部分上面図を示す。該ポリマー層においては、直線状の溝７１（幅×高さ（深さ）＝１ｍｍ×５００μｍ）の中間部の２ヶ所にそれぞれスリット部７５が形成されている。スリット部７５は、高さが１５０μｍ、培養液の流通方向に対して直交する方向における幅が２００μｍ、培養液の流通方向における幅が１０００μｍの壁材が、２００μｍの間隔をあけて配列した構造とした。２ヶ所のスリット部７５の間に円形の貫通孔７３（直径２ｍｍ×２ｍｍ）が設けられている。また、溝７１の上流側末端および下流側末端のそれぞれに図示しない貫通孔が設けられている。
【００８８】
次に、ガラス板（厚さ１．２ｍｍスライドガラス）を用意した。ポリマー層およびガラス板それぞれの表面をＯ２プラズマ処理した。その後、ポリマー層の、溝が設けられている側の面にガラス板を重ね、プラズマボンディング法により接着してデバイス本体を得た。
得られたデバイス本体の、溝７１の上流側末端の貫通孔にタンクを取り付け、下流側末端の貫通孔にチューブを介して吸引ポンプを接続してデバイスを作製した。
該デバイスにおいては、ガラス板と溝７１または貫通孔７３とで囲まれた空間が流路とされ、流路の一部（ガラス板と貫通孔７３とで囲まれた部分）が培養部を兼ねている。
【００８９】
得られたデバイスを用い、実施例１と同様にして得た組織片（精巣）を培養した。培養は、以下の手順で行った。
作製したデバイスのタンクに培養液を入れ、流路を培養液で満たした。また、貫通孔７３から組織片を流路内に導入し、貫通孔７３の開口を、ガラス板で塞いだ。
次に、デバイスのデバイス本体をタンクごと３４℃のインキュベーター内に入れた。吸引ポンプはインキュベーターの外部に配置した。続いて吸引ポンプを作動させ、流路に培養液を緩徐に流通させながら組織片の培養を行った。
培養液としてはαＭＥＭ＋４％ＡｌｂｕＭＡＸを使用した。
流路のうち、ガラス板と溝７１とで囲まれた部分での培養液の流速は０．０５μＬ／分とした。
【００９０】
培養期間中、数日ごとにデバイスをインキュベーターから取り出し、倒立顕微鏡によりデバイス本体の下側から流路内の組織片を観察した。また、精子形成の進行具合の指標であるＧＦＰ  Ｇｒａｄｅを、蛍光顕微鏡により測定した。
その結果、ＧＦＰの発現は限局して弱く（ＧＦＰ  Ｇｒａｄｅ１〜２）、培養期間が５０日間を超えた頃にはＧＦＰ  Ｇｒａｄｅがほぼゼロになった。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
上記のように組織片の機能を長期間維持できることから、本発明の方法は、様々な用途に応用できる。応用例として、例えば以下の例が挙げられる。
・精巣生検から得た精巣組織片を用いた、精子形成不全の患者の病態診断や治療（精子産生）。
・卵巣生検から得た卵巣組織片を用いた、体外での成熟卵の産生。
・組織片を用いた、新薬開発の際の毒性試験。
・がん細胞を含む組織片を用いた、抗がん剤の効果判定。
また、本発明のデバイスは、精巣組織片等の様々な組織片の培養に利用でき、実験器具として汎用性がある。
【符号の説明】
【００９２】
１  デバイス本体
２  デバイス本体
３  切欠き部
５  溝
７  多孔質膜
９  タンク
１１  透明基板
１３  第一の層
１５  第二の層
１７  第三の層
２１  貫通孔
２３  貫通孔
２５  チューブ
３１  組織片
３３  貫通孔
３５  管
５３  層
６１  スリット部
６１ａ  壁材
６３  溝
６７  溝
１００  デバイス
１１０  デバイス
２００  デバイス
Ｓ１  培養室
Ｓ２  組織片導入路
Ｓ３  流路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１０】
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【図１１】
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