(57)【要約】      （修正有）【課題】標的化部分に融合したＩＩ型膜貫通糖蛋白質のエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステーラゼ１（ＮＰＰ１）の触媒ドメインを含む新規な融合ポリペプチドと、融合ポリペプチドをコードする核酸、核酸が組み込まれたベクター、ベクターで形質転換された宿主細胞及び融合ポリペプチドを含む医薬組成物の提供。【解決手段】ＮＰＰ１構成成分と免疫グロブリンのＦｃ領域を含む単離したＮＰＰ１融合蛋白質において、ａ）ＮＰＰ１構成成分がＮＰＰ１のシステインリッチ領域とＣ末端触媒ドメインを含み、ｂ）Ｆｃ領域がＮＰＰ１構成成分のＣ末端にあり、ｃ）ピロホスファターゼ活性、ホスホジエステラーゼ活性又はピロホスファターゼ及びホスホジエステラーゼ活性、を有する単離されたＮＰＰ１融合蛋白質。【効果】ＮＰＰ１融合蛋白質は、特発性乳児動脈石灰化症（ＩＩＡＣ）、インスリン抵抗性、低リン血くる病等の処置にも効果が期待される。【選択図】図１９
2015164427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＰＰ１構成成分と、免疫グロブリンのＦｃ領域と、を含む単離されたＮＰＰ１融合タンパク質において、ａ）前記ＮＰＰ１構成成分がＮＰＰ１のシステインリッチ領域とＣ末端触媒ドメインを含み、ｂ）前記Ｆｃ領域が前記ＮＰＰ１構成成分のＣ末端にあり、ｃ）前記単離されたＮＰＰ１融合タンパク質がピロホスファターゼ活性、ホスホジエステラーゼ活性、又は、ピロホスファターゼ及びホスホジエステラーゼ活性、を有することを特徴とする、単離されたＮＰＰ１融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のＮＰＰ１融合タンパク質において、前記融合タンパク質は組換えタンパク質であることを特徴とするＮＰＰ１融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載のＮＰＰ１融合タンパク質において、前記ＮＰＰ１構成成分は配列番号１のＰ９９〜Ｄ９２５を含むことを特徴とするＮＰＰ１融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載のＮＰＰ１融合タンパク質において、前記融合タンパク質がシグナルペプチドを含むことを特徴とするＮＰＰ１融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１に記載のＮＰＰ１融合タンパク質において、前記融合タンパク質がホモ二量体を形成することを特徴とするＮＰＰ１融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１に記載のＮＰＰ１融合タンパク質において、前記融合タンパク質がモノマーを形成することを特徴とするＮＰＰ１融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１に記載のＮＰＰ１融合タンパク質において、前記Ｆｃ領域が前記ＮＰＰ１の触媒ドメインのＣ−末端に融合していることを特徴とするＮＰＰ１融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１に記載のＮＰＰ１融合タンパク質をエンコードする単離された核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の単離した核酸を担持する複製又は発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１０年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／３４０，０６６号明細書の利益を主張する２０１１年３月１１日に出願された国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１１／０２８２３３号明細書の利益を主張する。上記の出願の教示内容全体を参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
ホモ２量体を形成するＩＩ型膜貫通糖タンパク質にエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１（ＮＰＰ１／ＥＮＰＰ１／ＰＣ−１）がある。このタンパク質は、ヌクレオチドおよびヌクレオチド糖のホスホジエステル結合、ならびにヌクレオチドおよびヌクレオチド糖のピロリン酸結合など種々の基質を切断する。ＮＰＰ１タンパク質は、ヌクレオシド５’トリホスフターゼをそれぞれ対応する一リン酸に加水分解し、さらにジアデノシンポリリン酸も加水分解する働きをする。ＮＰＰ１遺伝子の突然変異は、特発性乳児動脈石灰化症（ＩＩＡＣ）、インスリン抵抗性、低リン血症性くる病、および脊椎後縦靭帯骨化症と関連している。
【０００３】
ＩＩＡＣは、ほぼ確実に死に至る、常染色体劣性の稀な障害で、筋性動脈の内弾性板の石灰化、および血管内膜の平滑筋細胞増殖による狭窄を特徴とする。世界全体で１６０例を超えるＩＩＡＣの症例が報告されている。疾患の症状は、ほとんどの場合、乳児期初期までに現れ、本疾患は、一般に虚血性心筋症と、腎動脈狭窄症などの閉塞性動脈症の他の合併症とのため、生後６ヶ月までに死に至る。ＩＩＡＣの１２例を超える症例では、乳児期に大関節の関節周囲の石灰化も起きた。Ｒｕｔｓｃｈら（２００３）は、罹患者の生後初期の関節周囲および大動脈の自発的石灰化と、全身性のヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ活性の低下とを特徴とするＩＩＡＣにＥＮＰＰ１の突然変異が関連していることを報告した。
【０００４】
ＮＰＰ１タンパク質の異常が、ＩＩＡＣのような重篤な疾患に関与していると考えられてきたが、本疾患に冒された人に利用できる処置剤は当該技術分野において存在しない。したがって、ＩＩＡＣ、インスリン抵抗性、低リン血症性くる病および脊椎後縦靭帯骨化症を処置する効果的で安全な組成物、製剤および薬物が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、標的化部分にＮＰＰ１の切断ドメイン（すなわち、ＮＰＰ１の構成成分）を融合した融合タンパク質を含む。標的化部分は、ＮＰＰ１融合タンパク質の臨床的または生物学的に重要な部位（たとえば、石灰化の減弱を必要とする被検体の石灰化部位）へのターゲティングの効率を高める働きをする。本発明を作用（ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）に関する任意の特定の理論またはメカニズムに限定することを望むものではないが、ＮＰＰ１の構成成分は、ピロホスフェート（ＰＰｉ）の形成を促進すること、ならびに／またはピロホスフェートを切断して可溶性ホスフェート（Ｐｉ）を生成すること、ならびに／またはアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）および／もしくはアデノシンの利用率を高めることにより、石灰化を阻害する働きをすると考えられる。標的化部分は、任意の有用な位置でＮＰＰ１の構成成分のＮ末端および／またはＣ末端に結合できることを意図している。加えて、本明細書に開示されたＮＰＰ１融合タンパク質は、酵素活性、安定性またはターゲティングを向上させるためＦｃフラグメント、ＰＥＧ、ポリペプチドリンカーまたは他の追加のポリペプチドの１つまたは複数をさらに含み得る。
【０００６】
本発明の融合タンパク質は、被検体の多種多様な状態を処置するために使用することができる。本発明の融合タンパク質の投与により有益に処置することができるどのような状態も、本発明の範囲内に含まれる。たとえば、１つまたは複数の石灰化構造物を減少させるおよび／もしくはなくす、ならびに／または哺乳動物、たとえば、ヒト患者などの被検体において石灰化構造物が形成されるのを防止することにより改善し得る状態の処置は、本発明の範囲内にある。動脈閉塞などの状態は、本発明の融合タンパク質を利用することによる処置を意図している。特に有用な一実施形態では、処置対象の状態は、特発性乳児動脈石灰化症および乳児中膜石灰化症とも呼ばれる全身性乳児動脈石灰化症（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆａｎｃｙ）である。また、インスリン抵抗性、低リン血症性くる病、および脊椎後縦靭帯骨化症などの状態も、処置を意図している。
【０００７】
本発明の融合タンパク質は、以下に限定されるものではないが、細胞培養（たとえば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２０３）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））などの細菌を含む任意の有用なタンパク質発現系、ならびに以下に限定されるものではないが、哺乳動物およびトリ（たとえば、ニワトリ、ウズラ、アヒルおよびシチメンチョウ）などのトランスジェニック動物を用いて作製することができる。
【０００８】
医薬組成物（または医薬製剤）の製造は当該技術分野において周知であり、そうした医薬組成物は、本発明の融合タンパク質に応じて使用することを意図している。
【０００９】
一般に、被検体に投与される融合タンパク質の投与量は、被投与者の年齢、健康状態および体重、併用処置の種類、処置の頻度ならびに同種のものによって異なる。通常、活性成分（すなわち、融合タンパク質）の投与量は、体重１キログラム当たり約０．０００１ミリグラムから約５０ミリグラムの間とすることができる。正確な投与量、投与頻度および処置期間は、治療用タンパク質の投与の分野で熟練した医師により決定され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、野生型ＮＰＰ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。細胞質領域および膜貫通領域を下線で示す。Ｎ−グリコシル化が起こる可能性のある部位は太字で示す。イタリック体のＰＳＣＡＫＥは、システインリッチ領域を含む可溶性ＮＰＰ１の開始部分である。
【図２】図２は、標的部分が結合していないＮＰＰ１タンパク質の触媒ドメインのアミノ酸配列を示す（「ｓｓｓＮＰＰ１」）。
【図３】図３は、ＴＡＧｓｓｓＮＰＰ１のアミノ酸配列を示す。連続した８個のアスパラギン酸残基の標的化部分は、ｓｓｓＮＰＰ１のＮ末端に融合される。シグナルペプチドを下線で示し、標的化部分を太字で示す。
【図４】図４は、ｓｓｓＮＰＰ１のＣ末端に融合された連続した１０個のアスパラギン酸残基の標的化部分を含むＴＡＧｓｓｓＮＰＰ１のアミノ酸配列を示す。シグナルペプチドを下線で示し、標的化部分を太字で示す。
【図５】図５は、ＴＡＧｓｓＮＰＰ１融合タンパク質の核酸配列を示す。連続した８個のアスパラギン酸残基の標的化部分は、ｓｓＮＰＰ１のＮ末端に融合される。
【図６】図６は、ＴＡＧｓｓＮＰＰ１融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。連続した８個のアスパラギン酸残基の標的化部分は、ｓｓＮＰＰ１のＮ末端に融合される。シグナルペプチドを下線で示し、標的化部分を太字で示す。
【図７】図７は、ｓｓＮＰＰ１の核酸配列を示す。
【図８】図８は、ｓｓＮＰＰ１のアミノ酸配列を示す。シグナルペプチドを下線で示す。
【図９】図９は、ｓＮＰＰ１の核酸配列を示す。
【図１０】図１０は、ｓＮＰＰ１のアミノ酸配列を示す。シグナルペプチドを下線で示す。
【図１１】図１１は、ＴＡＧｓＮＰＰ１の核酸配列を示す。連続した８個のアスパラギン酸残基の標的化部分は、ｓＮＰＰ１のＮ末端に融合される。
【図１２】図１２は、ＴＡＧｓＮＰＰ１のアミノ酸配列を示す。連続した８個のアスパラギン酸残基の標的化部分は、ｓｓＮＰＰ１のＮ末端に融合される。シグナルペプチドを下線で示し、標的化部分を太字で示す。
【図１３】図１３は、ＴＡＧｓＮＰＰ１の核酸配列を示す。連続した８個のアスパラギン酸残基の標的化部分は、ｓＮＰＰ１のＣ末端に融合される。
【図１４】図１４は、ＴＡＧｓＮＰＰ１のアミノ酸配列を示す。連続した８個のアスパラギン酸残基の標的化部分は、ｓＮＰＰ１のＮ末端に融合される。シグナルペプチドを下線で示し、標的化部分を太字で示す。
【図１５】図１５は、リンカーペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１６】図１６は、免疫グロブリンＦｃセグメントのアミノ酸配列を示す。
【図１７】図１７は、ペプチドリンカーを介してｓｓｓＮＰＰ１のＮ末端に融合された、連続した８個のアスパラギン酸残基の標的化部分を含むＴＡＧｓｓｓＮＰＰ１のアミノ酸配列を示す。Ｆｃセグメントは、標的部分のＮ末端に融合される。シグナルペプチドを下線で示し、標的化部分を太字で示す。ペプチドリンカーをイタリック体で示す。
【図１８】図１８は、ペプチドリンカーを介してｓｓｓＮＰＰ１のＣ末端に融合された、連続した８個のアスパラギン酸残基の標的化部分を含むＴＡＧｓｓｓＮＰＰ１のアミノ酸配列を示す。Ｆｃセグメントは、ｓｓｓＮＰＰ１のＮ末端に融合される。シグナルペプチドを下線で示し、標的化部分を太字で示す。ペプチドリンカーをイタリック体で示す。
【図１９】図１９は、ＴＡＧｓＮＰＰ１コンストラクトを含む発現ベクター（すなわち、ｐＴＴ２２）を模式化したものである。ｓＮＰＰ１のＣ末端に融合した、連続した８個のアスパラギン酸残基の標的化部分。
【図２０】図２０は、ＴＡＧｓＮＰＰ１のウエスタンブロット解析を示す。還元条件；ＮＲ、非還元条件。
【図２１】図２１は、ＨＥＫ２９３細胞から産生および単離されたＴＡＧｓＮＰＰ１の酵素活性を示す。
【図２２Ａ】図２２Ａは、本明細書に記載のＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質コンストラクトの模式図を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、本明細書に記載のＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質コンストラクトの模式図を示す。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、本明細書に記載のＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質コンストラクトの模式図を示す。
【図２３】図２３は、可溶性ｓＮＰＰ１（ＷＴ）、ＴＡＧｓＮＰＰ１（ｓＮＰＰ１のＣ末端にＤ８が融合）およびｓＮＰＰ１−Ｆｃで処理したヒト大動脈平滑筋細胞の石灰化レベルを示す。
【図２４】図２４は、ＴＡＧｓＮＰＰ１コンストラクトを含む発現ベクター（すなわち、ｐＴＴ２２）を模式化したものを示す。ｓＮＰＰ１のＣ末端に融合した、連続した８個のアスパラギン酸残基（Ｄ８）の標的化部分。
【図２５】図２５は、ＴＡＧｓＮＰＰ１融合タンパク質の核酸配列を示す。
【図２６】図２６は、ＴＡＧｓＮＰＰ１融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図２７】図２７は、ｓＮＰＰ１−Ｆｃ融合コンストラクトを含む発現ベクター（すなわち、ｐＴＴ２２）を模式化したものを示す。
【図２８】図２８は、ｓＮＰＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の核酸配列を示す。
【図２９】図２９は、ｓＮＰＰ１−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、可溶性であり、ＮＰＰ１の切断された生物活性ドメイン（すなわち、ピロホスファターゼおよび／またはホスホジエステラーゼ活性のための、天然ＮＰＰ１の少なくとも１つの細胞外触媒ドメインを含むＮＰＰ１の構成成分）と、１つまたは複数の標的化部分（すなわち、「ＴＡＧ」）とを含む新規なヒトＮＰＰ１融合タンパク質を提供する。本発明のＮＰＰ１融合タンパク質は少なくとも、ピロホスファターゼおよび／またはホスホジエステラーゼ活性を行うのに不可欠なＮＰＰ１ドメインを含む。したがって、本発明は、１つまたは複数の標的化部分に融合した配列番号１のアミノ酸残基Ａ２０５からＬ５９１を含む単離された融合タンパク質を特徴とする。標的化部分は、当該技術分野において周知の方法によりＮＰＰ１の構成成分に組換えにより融合することも、化学的に結合（たとえば、共有結合、イオン結合、疎水結合およびファンデルワールス力）することもでき、標的化部分は、結合されたＮＰＰ１の構成成分が、本発明の融合タンパク質が投与された被検体において望ましい作用（たとえば、ＰＰｉなどの基質の可溶化またはＰＰｉなどの基質の形成の防止といった触媒作用）を発揮する特定の標的部位にＮＰＰ１の構成成分を誘導する。
【００１２】
ＴＡＧＮＰＰ１
本発明のＮＰＰ１融合タンパク質（「ＴＡＧＮＰＰ１」）はすべて、天然ヒトＮＰＰ１のＮ末端の細胞質膜貫通ドメインを有する。任意選択で、本発明のＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質は、Ｃ末端が切断された様々な長さの野生型ＮＰＰ１をさらに含んでもよい。全長野生型ＮＰＰ１のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００１３】
一実施形態では、融合タンパク質は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかでＴＡＧに融合した配列番号１のアミノ酸残基Ａ２０５〜Ｌ５９１（「ｓｓｓＮＰＰ１」）を含むポリペプチド（「ＴＡＧｓｓｓＮＰＰ１」）を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかでＴＡＧに融合した配列番号１のアミノ酸残基Ａ２０５〜Ｄ９２５（「ｓｓＮＰＰ１」）を含むポリペプチド（「ＴＡＧｓｓＮＰＰ１」）を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかでＴＡＧに融合した配列番号１のアミノ酸残基Ｐ９９〜Ｄ９２５（「ｓＮＰＰ１」）を含むポリペプチド（「ＴＡＧｓＮＰＰ１」）を含む。さらに、少なくとも配列番号１のアミノ酸残基Ａ２０５〜Ｌ５９１を含むｓＮＰＰ１の任意の連続したフラグメントも意図しており、このポリペプチドフラグメントは、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかでＴＡＧに融合される。
【００１４】
ＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質は、細胞培養またはトランスジェニック動物で発現させる場合、そのＮ末端にシグナルペプチド（またはリーダー配列）をさらに含むことができる。シグナルペプチドは翻訳と同時にまたは翻訳後に、ＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質を発現する細胞の細胞内オルガネラを通ってＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質の輸送を誘導することにより、ＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質の翻訳後修飾を決定する。シグナルペプチドは融合タンパク質の翻訳と同時または翻訳後の段階で切断されるため、ＴＡＧＮＮＰ１融合タンパク質は一般に、一度分泌され、分離されるとシグナルペプチドを有していないことは明らかである。したがって、ＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質をコードする核酸配列について記載する実施形態では、本発明で使用されるようなリーダー配列も意図している。たとえば、配列番号２に示すヌクレオチド配列は、その５’末端にＴＡＧＮＮＰ１のリーダー配列の例を含む。
【００１５】
本明細書に開示された融合タンパク質は各々、１つまたは複数の標的化部分（「ＴＡＧ」）を含むことを意図している。本発明によるＴＡＧの構成成分は、負電荷を持つ４個以上のアミノ酸、たとえばアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。ＴＡＧの構成成分は、負電荷を持つ一続きのアミノ酸残基、たとえば、約４〜約２０個のアミノ酸残基長のアスパラギン酸および／またはグルタミン酸とすることができる。ＴＡＧは、ＮＰＰ１の構成成分のＮ末端またはＣ末端のどちらに融合することもできる。ＴＡＧはまた、ＮＰＰ１の構成成分のＮ末端とＣ末端との両方に融合することもできる。このため、ＴＡＧｓＮＰＰ１融合タンパク質のアミノ酸配列は、たとえば、ＮＰＰ１の構成成分のＰＳＣＡＫＥ〜Ｃ末端と、ＮＰＰ１の構成成分のＮ末端および／またはＣ末端にある１つまたは複数の標的化部分（たとえば、ポリグルタミン酸タグまたはポリアスパラギン酸タグ）とを含む。ＴＡＧをＣ末端に融合させたＮＰＰ１の構成成分を含む融合タンパク質は、特に有用な実施形態である。極めて具体的な一実施形態では、図のＴＡＧｓＮＰＰ１およびＴＡＧｓｓＮＰＰ１の例示的配列に見られるような８個の一続きのアスパラギン酸を有するＴＡＧを利用する。ただし、本発明に従い、負電荷を持つアミノ酸残基を任意の有用な数（たとえば、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）で使用することができる。ＴＡＧの構成成分は、図に「Ａ」で示す。
【００１６】
本発明はまた、本明細書に記載の様々なＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。したがって、任意のＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を使用して、対応するＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質を発現する組換え分子を作製することができる。特定の実施形態では、本発明は、図２に示すような配列番号２の核酸配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００１７】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に記載するとおりの複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載するとおりの少なくとも１つのポリペプチドおよび無関係の配列を含む。特定の好ましいポリペプチドは、たとえば、融合タンパク質の２量体形成および安定性を促進することも、凝集を最小限に抑えることもできる。たとえば、この追加ポリペプチドは、血清の安定性を高める免疫グロブリンＧ１のＦｃ領域とし得る。Ｆｃセグメントの使用は、当該技術分野において周知であり、教示内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許第７，９０２，１５１号明細書；および米国特許第７，８５８，２９７号明細書に記載されている。野生型ＮＰＰ１のシステインリッチ領域（すなわち、ＰＳＣＡＫＥ〜ＮＥＰＱＣＰ；配列番号１のアミノ酸配列Ｐ９９〜Ｐ２０４）は、ＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質の２量体形成を促進するために利用することができる。
【００１８】
別の実施形態では、ＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をコンジュゲートし得る。凝集および免疫原性を最小限に抑える、タンパク質の溶解性を高める、または臨床的または生物学的に重要な所望の部位へのタンパク質のターゲティングを可能するように、他のポリペプチドを選択してもよい。
【００１９】
ＴＡＧＮＰＰ１はまた、融合タンパク質の同定、合成または精製を行いやすいように、あるいは、ＴＡＧＮＰＰ１の活性およびターゲティングを向上し得るＮＰＰ１の構成成分のネイティブな構造を保存しやすいように、適切なポリペプチドリンカーまたは他の配列に融合することもコンジュゲートすることもできる。具体的には、第１および第２のポリペプチドの構成成分を、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造に確実に折り畳まれるに足る距離で隔てるため、ペプチドリンカー配列を利用することができる。こうしたペプチドリンカー配列は、当該技術分野において周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質のＮＰＰ１の構成成分とＴＡＧの構成成分との間に組み込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、それが柔軟な伸長構造をとれること、およびそれが、ＮＰＰ１、ＴＡＧまたは本明細書に記載の他の二次的ポリペプチド（たとえば、Ｆｃ）の機能的部分と相互作用し得る二次構造をとれないことに基づき、選択してもよい。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ｈｉｓ残基、Ａｓｎ残基およびＳｅｒ残基を含む。有用なペプチドリンカーは、以下に限定されるものではないが、ポリ−Ｇｌｙ、ポリ−Ｈｉｓ、ポリ−Ａｓｎまたはポリ−Ｓｅｒを含む。さらに、他の中性に近いアミノ酸、たとえばＴｈｒおよびＡｌａもリンカー配列に使用することもできる。リンカーとして有用に利用できるアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら，Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２，１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号明細書および米国特許第４，７５１，１８０号明細書に開示されているものを含む。リンカー配列は、１〜約２０アミノ酸残基長であってもよい。好ましくは、ポリペプチドリンカーは、約８〜約１２アミノ酸長である。好ましい実施形態では、本発明に使用されるペプチドリンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５）であるが、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＨｉｓまたはＡｓｎの任意の機能的組み合わせを利用し得る。
【００２０】
融合タンパク質は、本発明のＴＡＧＮＰＰ１と一緒に無関係のポリペプチドをさらに含み得る。好ましくは無関係のポリペプチドは、臨床的または生物学的に重要な部位（たとえば、石灰化の部位）への融合タンパク質のターゲティングを向上させることができる。たとえば、骨に高親和性を有するペプチドが、教示内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許第７，３２３，５４２号明細書に記載されている。
【００２１】
ＴＡＧＮＰＰ１は、当該技術分野において周知の組換え技術または化学結合など標準的な方法を用いて調製することができる。本発明の核酸およびタンパク質の単離および特性評価に有用な技術は、当業者によく知られており、標準的な分子生物学および生化学のマニュアルを参照すれば、過度の実験を行うことなく使用するのに好適なプロトコルを選択することができる。たとえば、その内容の全体を参照により本明細書に援用するＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒを参照されたい。簡単に説明すると、ポリペプチドの構成成分をコードするＤＮＡ配列を別々に構築し、適切な発現ベクターにライゲートすることができる。たとえば、ペプチドリンカーを用いてあるいは用いずに、ＮＰＰ１の構成成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端を第２のポリペプチドの構成成分、たとえばＴＡＧ  ＰＥＧ、またはＦｃをコードするＤＮＡ配列の５’末端に配列のリーディングフレームが一致するようにライゲートする。これにより、構成成分の両方のポリペプチドの生物活性を保持する１つの融合タンパク質に翻訳することができる。ライゲートしたＤＮＡ配列は、好適な転写または翻訳調節エレメント、たとえばプロモーターに作動可能に連結する。ＤＮＡの発現に関与する調節エレメントは、ＤＮＡ配列をコードする第１のポリペプチド、たとえばシグナルペプチドをコードするリーダー配列の５’側にのみ位置する。同様に、翻訳および転写終結シグナルを終結させるのに必要な終止コドンは、第２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
【００２２】
本発明はまた、ＴＡＧＮＰＰ１変異体を包含する。好ましいＴＡＧＮＰＰ１変異体は、配列番号１のアミノ酸配列Ａ２０５〜Ｌ５９１に対して８０％、８５％、９０％、９５％、一層好ましくは９６％のアミノ酸配列同一性を有する変異体である。最も好ましいＴＡＧＮＰＰ１変異体は、配列番号１のアミノ酸配列Ａ２０５〜Ｌ５９１に対して少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を有する変異体である。
【００２３】
本発明はさらに、配列番号２またはその変異体の相補体を含むポリヌクレオチド配列に関する。さらに、本発明はさらに、ストリンジェントな条件下で配列番号２にハイブリダイズし、そのアンチセンス配列が配列番号２と８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を特徴とする。ハイブリダイゼーション条件は、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．およびＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９−４０７）およびＫｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７−５１１）に教示されているように、核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）により、規定のストリンジェントで使用することができる。
【００２４】
本発明はさらに、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドをコードする核酸配列、そのペプチド核酸（ＰＮＡ）、フラグメント、一部またはアンチセンス分子も意図している。
【００２５】
ＴＡＧＮＰＰ１およびその変異体をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは適切に選択されたストリンジェントな条件下、ＴＡＧＮＰＰ１のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるが、実質的に異なるコドン使用頻度を有するＴＡＧＮＰＰ１またはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作製すると有利となり得る。コドンは、特定のコドンが特定の原核生物宿主または真核生物宿主により利用される頻度に応じて、そのペプチドが宿主で発現する比率が高まるように選択し得る。コードされたアミノ酸配列を変化させずに、ＴＡＧＮＰＰ１およびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変化させる他の理由としては、より望ましい特性、たとえばより長い半減期を有するＲＮＡ転写物が生成されることが挙げられる。
【００２６】
本発明によりを包含される、ＴＡＧＮＰＰ１をコードする変化した核酸配列は、ＴＡＧＮＰＰ１と同じものまたは機能的に等価なものをコードするポリヌクレオチドをもたらす、様々なヌクレオチドの欠失、挿入または置換を含む。コードされたタンパク質は、サイレント変異となり、機能的に等価なＴＡＧＮＰＰ１になるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換をさらに含み得る。ＴＡＧＮＰＰ１の生物活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づき、人為的なアミノ酸置換を行い得る。たとえば、正電荷を持つアミノ酸残基にはＬｙｓおよびＡｒｇが含まれ；負電荷を持つアミノ酸残基にはＡｓｐおよびＧｌｕが含まれ；親水性が類似し、非荷電極性の頭部基を有するアミノ酸としてはＬｅｕ、ＩｌｅおよびＶａｌ；ＧｌｙおよびＡｌａ；ＡｓｐおよびＧｌｎ；ＳｅｒおよびＴｈｒ；ＰｈｅおよびＴｙｒを挙げることができる。
【００２７】
発現ベクター
ＴＡＧＮＰＰ１および適切な転写および翻訳制御エレメントをコードする配列を含む発現ベクターを構築するには、当業者によく知られている方法を使用することができる。こうした方法には、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボでの遺伝子組換えが含まれる。こうした技術は、たとえば、その教示内容の全体を参照により本明細書に援用するＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍら（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。
【００２８】
ＴＡＧＮＰＰ１をコードする配列を組み込み、発現させるには、種々の発現ベクター／宿主系を利用することができる。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）または細菌発現ベクター（たとえば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）を感染させた昆虫細胞系；または動物細胞系（たとえば、ｐＴＴ２２ベクター）が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００２９】
制御エレメントまたは調節配列は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行うベクターの非翻訳領域、すなわちエンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域を含み得る。こうしたエレメントは、その強度および特異性が異なり得る。利用するベクター系および宿主に応じて、組織特異的プロモーター、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターなど好適であればどのような転写および翻訳エレメントを使用してもよい。たとえば、細菌系にクローニングする場合、誘導性プロモーター、たとえばＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはｐＳｐｏｒｔ１（商標）プラスミド（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターおよび同種のものを使用することができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。ＴＡＧＮＰＰ１をコードする配列の複数コピーを含む細胞株を作製する必要がある場合、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適切な選択可能なマーカーと一緒に使用することができる。鳥類発現系を使用する場合、様々なＴＡＧＮＰＰ１コンストラクトの発現に好適なベクターは、教示内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許第６，７３０，８２２号明細書；米国特許第６，８２５，３９６号明細書；米国特許第６，８７５，５８８号明細書；米国特許第７，２９４，５０７号明細書；米国特許第７，５２１，５９１号明細書；米国特許第７，５３４，９２９号明細書；および米国特許出願第１１／３７６，０２３号明細書に記載されている。簡単に説明すると、鳥類発現系を利用してＴＡＧＮＰＰ１を発現させる場合、好適な卵管特異的プロモーター、たとえば、以下に限定されるものではないが、オボムコイドプロモーター、オボアルブミンプロモーター、リゾチームプロモーター、コンアルブミンプロモーター、オボムチンプロモーター、オボトランスフェリンプロモーターおよびこれらのプロモーター各々の機能部分を意図している。好適な非特異的プロモーターとして、たとえば、以下に限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＭＤＯＴプロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターおよびＳＶ４０プロモーター、ならびにこれらのプロモーター各々の機能部分を挙げることができる。本発明に有用であり得る他のプロモーターの非限定的な例には、以下に限定されるものではないが、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（たとえば、ｔｙｐｅ  １、ｔｙｐｅ  ２およびｔｙｐｅ  ３に属するＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター）、たとえばＨ１プロモーター、Ｕ６プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、ＲＮａｓｅ  ＭＰＲプロモーターおよびこれらのプロモーター各々の機能部分がある。典型的には、利用するプロモーターに応じて、本発明に使用できる機能的ターミネーター配列を選択する。
【００３０】
宿主細胞
本発明は、当該技術分野において周知であるような、たとえば、その開示内容の全体を参照により本明細書に援用する米国特許第７，５３４，９２９号明細書の、トランスジェニック鳥類（たとえば、トランスジェニックニワトリ）系で可溶性ＴＡＧＮＰＰ１を作製することを含む。標的化部分を含むあるいは含まないＮＰＰ１の構成成分（たとえば、ｓｓＮＰＰ１、ｓＮＰＰ１、ＴＡＧｓＮＰＰ１およびＴＡＧｓｓＮＰＰ１）を鳥類系（たとえば、鳥類の卵管）で作製することは、本発明の範囲内である。さらに、本明細書では、任意の有用なタンパク質発現系、以下に限定されるものではないが、トランスジェニック鳥類、トランスジェニック哺乳動物、細胞培養（たとえば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＯＳ細胞）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、トランスジェニック動物、たとえば哺乳動物および鳥類（たとえば、ニワトリ、ウズラ、アヒルおよびシチメンチョウ）、ならびにウキクサなどの植物系で産生されるＴＡＧＮＰＰ１も意図している。
【００３１】
宿主細胞株は、宿主細胞株が挿入された配列の発現を調節できるように、または発現したＴＡＧＮＰＰ１を所望の形で処理できるように選択することができる。こうしたＴＡＧＮＮＰ１のポリペプチドの修飾には、以下に限定されるものではないが、アセチル化、カルボキシル化、シアリル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が含まれる。たとえば、こうした翻訳後活性に特異的な細胞機構および特徴的なメカニズムを有するＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷ１３８などの様々な宿主細胞は、本発明の融合タンパク質の正しい修飾およびプロセシングが確実に行われるように選択することができる。また、本発明のポリペプチドを発現する宿主細胞として鳥類腫瘍細胞株も意図している。本発明に利用することができる有用な鳥類細胞株（たとえば、鳥類の卵管腫瘍細胞株）の例は、教示内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２００９／０２５３１７６号明細書に記載されている。
【００３２】
ＴＡＧＮＰＰ１の作製
ＴＡＧＮＰＰ１は、種々のよく知られた技術のいずれかを用いて作製することができる。上記のようなＤＮＡ配列によりコードされるＴＡＧＮＰＰ１は、本明細書に記載されたまたは当業者によく知られている種々の発現ベクターのいずれかを用いてＤＮＡ配列から容易に調製することができる。発現は、本発明の組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換した、または本発明の組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターをトランスフェクトした任意の適切な宿主細胞で達成することができる。最初に、市販されているフィルターを使用して、組換え融合タンパク質またはポリペプチドを培養基に分泌する好適な宿主／ベクター系の上清を濃縮することができる。濃縮後、濃縮物を好適な精製マトリックス、たとえばアフィニティーマトリックスまたはイオン交換樹脂にかけることができる。１つまたは複数の逆相ＨＰＬＣステップを利用して組換えポリペプチドをさらに精製することができる。
【００３３】
組換えタンパク質を高収率で得るには、安定発現が好ましい。ＴＡＧＮＰＰ１を安定発現する細胞株は、同一ベクターまたは別のベクターにウイルス複製起点および／または内因性発現エレメントおよび／または選択可能なマーカー遺伝子を持つ発現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクターの導入後、細胞を濃縮培地で１〜２日間増殖させてから選択培地に切り替えることができる。選択可能なマーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、選択可能なマーカーの存在により、導入された配列の発現に成功した細胞の増殖および回収が可能になる。安定形質転換細胞の耐性クローンは、細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。哺乳動物細胞株で外因性タンパク質を産生させる方法は、当該技術分野において周知である。ＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質などの異種ポリペプチドを鳥類細胞で産生させる、本発明のこうしたおよび他の態様および実施形態の説明に役立つ例は、その各々の全体を参照により本明細書に援用する、２００１年６月８日に出願され、２００２年８月８日に米国特許出願公開第２００２／０１０８１３２−Ａ１号明細書として公開された米国特許出願第０９／８７７，３７４号明細書、および２００２年９月１８日に出願された米国特許出願第１０／２５１，３６４号明細書に詳細に開示されている。鳥類腫瘍細胞株で外因性タンパク質を産生させる例は、教示内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２００９／０２５３１７６号明細書にも記載されている。
【００３４】
本発明は特に、本明細書に開示されたＴＡＧＮＰＰ１タンパク質をトランスジェニック鳥類系で作製することを意図している。特に有用な一実施形態では、本発明は、本発明に従いニワトリなどのトランスジェニック鳥類の卵管で産生させることができるＴＡＧＮＰＰ１の作製に関する。外因性タンパク質をトランスジェニック鳥類発現系で産生させる例は、教示内容全体を参照により本明細書に援用する米国特許第６，７３０，８２２号明細書にも記載されている。簡単に説明すると、ＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質をコードし、かつコードする配列の発現をニワトリ卵管で誘導する組織特異的または構成的プロモーターに作動可能に連結された核酸配列を含む上述の好適な鳥類ベクターをニワトリのステージＸの胚細胞に導入する。形質転換した胚細胞を、生きたヒナ（ｌｉｖｉｎｇ  ｃｈｉｃｋｓ）を孵化させやすい条件下でインキュベートする。生きたヒナを成熟したキメラニワトリに育て、これを非トランスジェニックニワトリと自然にまたは人工授精により交配する。トランスジェニックニワトリは、タンパク質をコードする配列が生殖系列に組み込まれたかどうかについて子孫をスクリーニングすることにより同定する。トランスジェニック子孫は、別のトランスジェニックまたは非トランスジェニックニワトリと交配して、ＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質を含む卵を産ませることができる。次いでＴＡＧＮＰＰ１を単離し、当該技術分野において周知の方法により精製する。以上のように、本発明は、トランスジェニック鳥類により作られた組換えＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質を提供する。
【００３５】
医薬組成物
本発明はまた、単離され、実質的に精製されたＴＡＧＮＰＰ１またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を特徴とする。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるそのキャリアまたは賦形剤をさらに含んでもよい。複合分子を含むこうしたキャリアを含む組成物は、教示内容全体を参照により本明細書に援用する、よく知られた従来の方法（たとえば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１４版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．を参照されたい）により製剤化される。キャリアは、希釈液を含んでもよい。一実施形態では、薬学的キャリアは液体とすることができ、融合タンパク質は溶液の形態とすることができる。薬学的キャリアはワックスとすることも、脂肪とすることも、アルコールとすることもできる。別の実施形態では、薬学的に許容されるキャリアは、粉末、凍結乾燥粉末または錠剤の形態の固体であってもよい。一実施形態では、キャリアは、リポソームまたはマイクロカプセルを含んでもよい。
【００３６】
医薬組成物は、希釈液で溶解する注射用の無菌凍結乾燥粉末の形態とし得る。希釈液は、注射用水とすることも、注射用静菌水とすることも、無菌生理食塩水とすることもできる。凍結乾燥粉末は、融合タンパク質の溶液を凍結乾燥させて乾燥形態のタンパク質を得ることにより製造することができる。当該技術分野において公知のように、凍結乾燥タンパク質は一般に、液体溶液のタンパク質より安定性が高く、有効期間も長い。
【００３７】
定義
本明細書で使用する場合、本明細書で使用する製剤、組成物または成分に関し「許容される」という用語は、処置対象の被検体の一般的な健康状態に持続的な有害作用を及ぼさないことを意味する。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「投与」または「投与すること」という用語は、処置を必要とする被検体に本発明の融合タンパク質を与えることをいう。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「変化」とは、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出することができる欠失、挿入および点突然変異など、ＴＡＧＮＰＰ１をコードするポリヌクレオチド配列の任意の変化を含む。
【００４０】
本明細書における「動物」という用語は、鳥類および哺乳動物、たとえばラット、マウスおよびヒトなど、すべての脊椎動物を含むように使用する。「動物」はまた、胚期および胎児（胎仔）期を含む全発生段階の個々の動物を含む。
【００４１】
融合タンパク質分子のアミノ酸配列を示すために「アミノ酸配列」を本明細書に記載する場合、「アミノ酸配列」および同様の用語、たとえば「ポリペプチド」または「タンパク質」は、そのアミノ酸配列を、記載されたタンパク質またはポリペプチド分子に関連する完全なアミノ酸配列に限定することを意図するものではない。
【００４２】
「鳥類」という用語は、本明細書で使用する場合、分類学上の分類鳥綱ａｖａの生物の任意の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）、亜種（ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ）または株（ｓｔｒａｉｎ）、たとえば以下に限定されるものではないが、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラスおよび走鳥類、たとえばダチョウ、エミューおよびヒクイドリのような生物をいう。この用語は、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、すなわちニワトリ（たとえば、ホワイトレグホン（Ｗｈｉｔｅ  Ｌｅｇｈｏｒｎ）、ブラウンレグホン（Ｂｒｏｗｎ  Ｌｅｇｈｏｒｎ）、バールロック（Ｂａｒｒｅｄ−Ｒｏｃｋ）、サセックス（Ｓｕｓｓｅｘ）、ニューハンプシャー（Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）、ロードアイランド（Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ）、オーストラロープ（Ａｕｓｓｔｒａｌｏｒｐ）、ミノルカ（Ｍｉｎｏｒｃａ）、アムロックス（Ａｍｒｏｘ）、カリフォルニアグレイ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｇｒａｙ）、イタリアンパートリッジカラード（Ｉｔａｌｉａｎ  Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ−ｃｏｌｏｒｅｄ））の様々な既知の系統のほか、シチメンチョウ、キジ、ウズラ、アヒル、ダチョウおよび一般に商業ベースの量で飼育される他の家禽の系統を含む。
【００４３】
特定のレトロウイルスに基づくまたは由来するレトロウイルスベクター、あるいは、特定のレトロウイルスのヌクレオチド配列に基づくレトロウイルスベクターのような「〜に基づく」または「〜に由来する」という語句は、レトロウイルスベクターのゲノムが、特定のレトロウイルスのゲノムのヌクレオチド配列の実質的な部分を含むことを意味する。その実質的な部分は、特定の遺伝子またはヌクレオチド配列、たとえばｇａｇ、ｐｏｌおよび／もしくはｅｎｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはＬＴＲをコードする配列などウイルスゲノムの他の構造または機能ヌクレオチド配列であってもよいし、あるいは、実質的に完全なレトロウイルスゲノム、たとえば、当業者の知識として本明細書の文脈から明らかなとおりレトロウイルスゲノムの大部分（たとえば、６０％超、７０％超、８０％超、または９０％超）または全部であってもよい。レトロウイルスに基づくまたは由来するレトロウイルスベクターの例として、Ｃｏｓｓｅｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）第６５巻，ｐ．３３８８−３３９４に開示されているようなＡＬＶレトロウイルスに基づくＮＬレトロウイルスベクター（たとえば、ＮＬＢ）が挙げられる。
【００４４】
「生物活性のある」という用語は、本明細書で使用する場合、天然ＮＰＰ１タンパク質のピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼの構造機能、制御機能または生化学的機能を有する融合タンパク質をいう。
【００４５】
「コンストラクト」という用語は、本明細書で使用する場合、天然の供給源から単離されたヌクレオチド配列または化学的に合成されたヌクレオチド配列、またはこれらの組み合わせの２つ以上のセグメントから構築されたＤＮＡなど直鎖状または環状ヌクレオチド配列をいう。
【００４６】
「相補的」という用語は、本明細書で使用する場合、相互に特異的相互作用を形成し得る２つの核酸分子をいう。この特異的相互作用において、２本の核酸鎖が逆極性にある場合、一方の核酸鎖内のアデニン塩基は、他方の核酸鎖内のチミンと２つの水素結合を形成することができる。また、この特異的相互作用において、２本の核酸鎖が逆極性にある場合、一方の核酸鎖内のグアニン塩基は、他方の核酸鎖内のシトシンと３つの水素結合を形成することができる。本明細書に言及するとおりの相補的核酸は、修飾塩基をさらに含んでもよく、修飾アデニンはチミンまたは修飾チミンと水素結合を形成することができ、修飾シトシンはグアニンまたは修飾グアニンと水素結合を形成することができる。
【００４７】
「欠失」とは、本明細書で使用する場合、それぞれ１つまたは複数のアミノ酸残基またはヌクレオチド残基が欠けているアミノ酸配列またはヌクレオチド配列のいずれかの変化をいう。
【００４８】
「発現した」または「発現」という用語は、本明細書で使用する場合、遺伝子の２本の核酸鎖のうちの１本の領域と少なくとも一部が相補的なＲＮＡ核酸分子が作られる遺伝子の転写をいう。「発現した」または「発現」という用語は、本明細書で使用する場合、タンパク質またはペプチドを作るためのＲＮＡの翻訳もいうことができる。
【００４９】
「発現ベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、少なくとも１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターまたはプロモーターの構成成分などの遺伝子発現制御領域を含む核酸ベクターをいう。
【００５０】
「機能部分」または「機能フラグメント」は同義で使われ、本明細書で使用する場合、ある統一体の機能の全部または一部を実行できるその統一体の部分またはフラグメントを意味する。たとえば、分子の生物学的機能部分は、全分子またはインタクト分子の生物学的機能を実行する分子の部分を意味する。たとえば、遺伝子発現制御領域の機能部分は、生体システムにおいて遺伝子発現の全部または一部を調節または制御する（たとえば、全部または一部を促進する）その遺伝子発現制御領域（たとえば、プロモーター）のフラグメントまたは部分である。機能部分は、有用であればどのような大きさでもよい。
【００５１】
「遺伝子発現制御領域」という用語は、本明細書で使用する場合、コード配列に連結され、コード配列の発現の全部または一部を調節する、たとえば、コード配列の転写の全部または一部を調節するヌクレオチド配列をいう。遺伝子発現制御領域は、天然の供給源から単離しても、または化学的に合成してもよく、適切な細胞内で転写を調節できるように核酸ベクターに組み込むこともできる。「遺伝子発現制御領域」は、ｍＲＮＡに転写され得るコード配列の末端の領域５’にある核酸配列の領域の前にあってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５２】
「異種の」、「外因性」および「外来性」という用語は、本明細書において同義で使われ、一般に生体分子、たとえば核酸またはタンパク質が、ある種の生体または生体に含まれるまたは作られる細胞、組織または他の構成成分に通常見出されないことをいう。たとえば、卵に異種または外因性のタンパク質は、卵に通常見出されないタンパク質である。本明細書で使用する場合、核酸、たとえばＤＮＡおよびＲＮＡに関する「異種の」、「外因性」および「外来性」という用語は、同義で使われ、核酸が、核酸が存在する染色体、ゲノムまたは細胞の一部として天然に存在しないこと、あるいは、核酸が自然界に存在する位置および／または量と異なる位置および／または量で見出されることをいう。それは、ゲノム、染色体または細胞に内因性の核酸でなく、ゲノム、染色体または細胞に外部から導入されていることもできる。異種ＤＮＡの例としては、遺伝子発現制御領域を含むＤＮＡ、およびＲＮＡまたはタンパク質産物などの産物をコードするＤＮＡがあるが、これに限定されるものではない。異種ＤＮＡの例には、鳥類から一度単離され、その後、たとえば、鳥類ゲノムに再導入後、使用されるような本明細書に開示された遺伝子発現制御領域またはプロモーターもあるが、これに限定されるものではない。
【００５３】
「単離された核酸」という用語は、本明細書で使用する場合、たとえば、（ａ）天然のゲノム分子の一部の配列を有するが、それが天然に存在する種においてそのゲノム分子の部分に隣接する配列の少なくとも１つに隣接していないＤＮＡ；（ｂ）得られるベクターまたはゲノムＤＮＡが核酸を採取した天然ＤＮＡと同一にならないように、ベクターまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた核酸；（ｃ）切り離された分子、たとえばｃＤＮＡ、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）もしくは化学合成により作製されたフラグメント、または制限酵素断片；（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列、および（ｅ）天然に存在しないハイブリッド配列の一部である組換えヌクレオチド配列を包含する。本発明の単離された核酸分子としては、たとえば、天然の対立遺伝子変異体のほか、ヌクレオチドの欠失、挿入、逆位または置換により修飾された核酸分子を挙げることができる。
【００５４】
「挿入」または「付加」は、本明細書で使用する場合、ＴＡＧＮＰＰ１分子と比較して１つまたは複数のアミノ酸残基またはヌクレオチド残基をそれぞれ付加することになるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の変化をいう。
【００５５】
「核酸」という用語は、本明細書で使用する場合、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの任意の直鎖状配列または連続配列、たとえばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよびこれらの誘導体をいう。説明を簡単にするため、本明細書では非天然核酸をコンストラクトという場合がある。核酸は、発現ベクター、クローニングベクター、コスミドベクターおよび形質転換ベクター、たとえば、を含む細菌プラスミドベクター、動物ウイルスベクター、たとえば、以下に限定されるものではないが、改変アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、たとえばトリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）レトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターならびに同種のもの、ならびにこれらのフラグメントを含み得る。さらに、核酸は、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）レトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターおよびこれらのフラグメントのＬＴＲであり得る。核酸はまた、ＮＬベクター、たとえばＮＬＢ、ＮＬＤおよびＮＬＡならびにこれらのフラグメント、ならびに合成オリゴヌクレオチド、たとえば化学的に合成したＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。核酸は、修飾または誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオシド、たとえば、以下に限定されるものではないが、ハロゲン化ヌクレオチド、たとえば、以下に限定されるものではないが、５−ブロモウラシル、および誘導体ヌクレオチド、たとえばビオチン標識ヌクレオチドを含み得る。
【００５６】
「核酸配列」は、本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびこれらのフラグメントまたは部分と、一本鎖でもまたは二本鎖でもよく、センス鎖でもまたはアンチセンス鎖でもよいゲノムまたは合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡとをいう。
【００５７】
「作動可能に連結された」という用語は、作動可能に連結されたと記載された構成成分がその通常の機能を発揮するように各エレメントが配置されていることをいう。コード配列に作動可能に連結された遺伝子発現制御領域またはプロモーター（たとえば、プロモーターの構成成分）は、コード配列の発現を行うことができる。制御配列は、コード配列の発現を誘導する働きをする限り、コード配列と隣接していなくてもよい。したがって、たとえば、プロモーター配列とコード配列との間に、転写されるが翻訳されない介在配列が存在することができ、このプロモーター配列もやはりコード配列に「作動可能に連結された」と見なすことができる。
【００５８】
「卵管特異的プロモーター」という用語は、本明細書で使用する場合、トリの卵管細胞内でかなりの程度まで機能的である、たとえば、主として機能的である（すなわち、卵管細胞に見られる特定のプロモーター型によりその動物で産生される転写産物の５０％超）または独占的に機能的である、すなわち、コード配列の転写を行う、プロモーターおよびプロモーターの構成成分をいう。有用な卵管特異的プロモーターの例として、以下に限定されるものではないが、オボアルブミンプロモーター、オボムコイドプロモーター、オボインヒビタープロモーター、リゾチームプロモーターおよびオボトランスフェリンプロモーターおよびこれらのプロモーターの機能部分、たとえば、プロモーターの構成成分が挙げられる。
【００５９】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」および「核酸配列」という用語は、本明細書において同義で使うことができ、以下に限定されるものではないが、コード配列、すなわち、適切な調節または制御配列の制御下に置かれたとき、インビトロまたはインビボで転写され、ポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチドまたは核酸配列；制御配列、たとえば、翻訳開始および終止コドン、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写因子結合部位、転写終結配列、上流および下流の調節ドメイン、エンハンサー、サイレンサー、転写因子が結合し、遺伝子のプロモーターの活性をプラスに変化（誘導）させるまたはマイナスに変化（抑制）させるＤＮＡ配列、および同種のものが挙げられる。本明細書に記載の用語は、長さまたは合成由来に関する限定を示唆するものではない。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、同義で使われることがあり、３個以上のアミノ酸がペプチド結合を介して連結され、連続的に配列されたアミノ酸のポリマーをいう。「ポリペプチド」という用語は、タンパク質、たとえば融合タンパク質、タンパク質のフラグメント、タンパク質のアナログ、オリゴペプチドおよび同種のものを含む。「ポリペプチド類」という用語は、核酸によりコードされた、組換え技術により作製された（たとえば、トランスジェニックトリから単離された）、または化学的に合成された、上記で定義したポリペプチドを含む。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「プロモーター」という用語は、鳥類細胞においてＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を促すのに有用なＤＮＡ配列をいう。「プロモーターの構成成分」は、それ自体で、または他のＤＮＡ配列と組み合わせて転写を行うか、または促進することができるＤＮＡ配列である。特定のプロモーターの構成成分、たとえばオボアルブミンプロモーターの構成成分、オボムコイドプロモーターの構成成分およびリゾチームプロモーターの構成成分、ならびに本明細書に開示し、特許請求する他のプロモーターおよびプロモーターの構成成分は、特定のプロモーター配列を記載するものではない。むしろ、それらは、コード配列の転写を行うまたは促進するのに有用な各プロモーターの任意の配列または配列フラグメントを包含する。たとえば、オボムコイドプロモーターの構成成分は、以下に限定されるものではないが、その全体を本明細書に援用する、２００７年５月１７日に公開された米国特許出願第１１／６４９，５４３号明細書に開示されている約１．８ｋｂ、約３．９ｋｂおよび約１０ｋｂのオボムコイドプロモーターを含む。「プロモーターの構成成分」はまた、ＲＮＡ転写を促す働きをするように再構成された遺伝子発現制御領域（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ）と、ＲＮＡ転写を促す働きをする、天然ＤＮＡ配列および／または合成ＤＮＡ配列からなるハイブリッドＤＮＡ分子とを包含し得る。
【００６２】
「組換え核酸」および「組換えＤＮＡ」という用語は、本明細書で使用する場合、真核または原核細胞に自然に見られない少なくとも２つの核酸配列の組み合わせをいう。核酸配列は、以下に限定されるものではないが、核酸ベクター、遺伝子発現調節エレメント、複製起点、発現したときに抗生物質耐性を付与するのに好適な遺伝子配列、タンパク質をコードする配列および同種のものを含んでもよい。「組換えポリペプチド」または「組換えタンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ技術によりその位置、純度または構造のいずれかが天然ポリペプチドと異なるように作製されたポリペプチドを含むことを意図している。一般に、こうした組換えポリペプチドは、自然界で通常観察される量と異なる量で細胞に存在する。
【００６３】
「ストリンジェントな条件」という用語は、本明細書で使用する場合、約Ｔｍ−５℃（プローブの融解温度（Ｔｍ）より５℃低い）からＴｍより約２０℃〜２５℃低い範囲内で起こる「ストリンジェンシー」である。当業者であれば理解するように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、同一または関連するポリヌクレオチド配列を同定または検出するために変更してもよい。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「被検体」または「患者」という用語は、哺乳動物および非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、ヒト、チンパンジー、類人猿サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモットおよび同種のものがあるが、これに限定されるものではない。非哺乳動物の例として、トリ、魚および同種のものがあるが、これに限定されるものではない。
【００６５】
「置換」は、本明細書で使用する場合、１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドで置き換えることをいう。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」という用語は、治療有効量を投与されていない対応する被検体と比較して、疾患、障害または副作用の処置、治癒、予防または回復を向上させる、または疾患または障害の進行の速度を低下させる化合物の任意の量をいう。この用語はその範囲以内に、正常な生理機能を増強するのに効果的な量も含む。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「ＴＡＧＮＰＰ１」、「融合タンパク質」、「ＴＡＧＮＰＰ１ポリペプチド」および「標的化部分に融合したＮＰＰ１の構成成分」という用語は、同義で使われる。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「処置する」、「処置すること」または「処置」という用語は、疾患または症状を緩和、寛解または軽減する、別の症状を予防する、症状の根底にある原因を軽減または予防する、疾患または状態を抑制する、疾患または状態の発生を阻止する、疾患または状態を改善する、疾患または状態を軽減させる、疾患または状態により引き起こされる状態を改善する、あるいは予防的におよび／または治療的に疾患または状態の症状を止める方法をいう。
【００６９】
ＴＡＧＮＰＰ１の「変異体」は、本明細書で使用する場合、１つまたは複数のアミノ酸により変化したアミノ酸配列をいう。好ましくは、変異体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、ペプチド化学の当業者が、ポリペプチドの二次構造およびハイドロパシー特性が実質的に変化しないと予想するとおりの、あるアミノ酸と、類似した特性を有する別のアミノ酸とを置換するものである。アミノ酸置換は一般に、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性に基づき行うことができる。たとえば、負電荷を持つアミノ酸にはＡｓｐおよびＧｌｕがあり；正電荷を持つアミノ酸にはリジンおよびアルギニンがあり；親水性値が類似し、非荷電極性の頭部基（ｕｎｃｈａｒｇｅｄ  ｐｏｌａｒ  ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐｓ）を有するアミノ酸にはＬｅｕ、ＩｌｅおよびＶａｌ；ＧｌｙおよびＡｌａ；ＡｓｐおよびＧｌｎ；ならびにＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｈｅおよびＴｙｒが含まれる。保存的変化を代表し得る他のアミノ酸のグループとして、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；（２）Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；（３）Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；（４）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；および（５）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓを挙げることができる。変異体はさらにまたは代わりに非保存的変化を含んでもよい。好ましい実施形態では、変異ポリペプチドは、５以下のアミノ酸の置換、欠失または付加だけ、または、たとえば、ＧｌｙとＴｒｐとの置換だけネイティブな配列と異なる。変異体はさらに（または代わりに）、たとえば、ＮＰＰ１の構成成分の免疫原性、二次構造およびハイドロパシー特性に最小限の影響を与えるアミノ酸の欠失または付加により修飾されていてもよい。どのアミノ酸残基を生物学的または免疫学的活性を失わせることなく置換、挿入または欠失できるかのガイダンスについては、当該技術分野において周知のコンピュータープログラムを用いて見つけることができる。
【００７０】
「ベクター」および「核酸ベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、細胞にトランスフェクトまたは形質転換して宿主細胞ゲノムとは無関係にまたは宿主細胞ゲノム内で複製することができる天然または合成の一本鎖もしくは二本鎖のプラスミドまたはウイルス核酸分子をいう。環状二本鎖ベクターは、ベクターのヌクレオチド配列に基づき適切な制限酵素で処理することにより直線化することができる。核酸は、ベクターを制限酵素で切断し、所望の断片を一緒にライゲートすることによりベクターに挿入することができる。
【００７１】
融合タンパク質に関する「部分」という用語は、本明細書で使用する場合、タンパク質のフラグメントをいう。フラグメントの大きさは、４アミノ酸残基から全アミノ酸配列から１個のアミノ酸を差し引いたアミノ酸配列までの幅があってもよい。このため、「配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも一部を含む」タンパク質は、全長ＴＡＧＮＰＰ１およびそのフラグメントを包含する。
【００７２】
「形質転換」または「トランスフェクション」は、本明細書で使用する場合、当該技術分野において周知の様々な方法を用いて外因性ＤＮＡをレシピエント細胞に入れ、変化させるプロセスをいう。形質転換は、外来性核酸配列を原核または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法に依存してもよい。この方法は、形質転換される宿主細胞に基づき選択され、以下に限定されるものではないが、エレクトロポレーション、粒子銃、ウイルス感染およびリポフェクションを含んでもよい。こうした「形質転換」細胞は、挿入されたＤＮＡが、自律複製プラスミドとしてあるいは宿主染色体の一部のとして複製することができる安定形質転換細胞を含む。形質転換細胞はさらに、挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡを限られた期間一過性に発現する細胞も含む。
【実施例】
【００７３】
本発明について以下の例によりさらに例示する。例は、説明のみを目的としたものであり、いかなる形においても本発明を限定することを意図するものではなく、そのように解釈してはならない。
【００７４】
実施例Ｉ
ｓＮＰＰ１に融合した連続した８個のアスパラギン酸を有する標的化部分を含むＴＡＧｓＮＮＰ１コンストラクトを、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用してｐＴＴ２２ベクターにライゲートした（ｐＴＴ２２−ｓＮＰＰ１．Ｄ８；図１９）。ｐＴＴ２２−ｓＮＰＰ１．Ｄ８をＨＥＫ２０３Ｅ細胞にトランスフェクトし、形質転換体を培養してＴＡＧｓＮＮＰ１を発現させた。当該技術分野において周知のように、ＴＡＧｓＮＮＰ１を培養基から単離し、部分的に精製した。精製後、ＴＡＧｓＮＰＰ１のピロホスファーゼ／ホスホジエステラーゼ活性について、チミジン（ｔｈｙｍｍｉｄｉｎｅ）５’一リン酸ｐ−ニトロフェニルエステルを加水分解するその能力を測定した。簡単に説明すると、ＴＡＧｓＮＰＰ１を５０ｍＭのトリス、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９．５で１ｎｇ／μＬに希釈した。１ｎｇ／μＬのＴＡＧｓＮＰＰ１を５０μＬ含むプレートに、１０ｍＭのチミジン５’一リン酸ｐ−ニトロフェニルエステル（Ｓｉｇｍａ（商標）、カタログ＃Ｔ４５１０）基質５０μＬを加えた。ＴＡＧｓＮＰＰ１の酵素活性は、４０５ｎｍ（吸光度）をキネティックスモードで５分間測定した。図２１に示すように、ＴＡＧｓＮＰＰ１の活性は、ＴＡＧｓＮＰＰ１を含まない対照で観察されたレベルを超えて検出された。具体的には、ＨＥＫ２０３Ｄ６から産生されたＴＡＧｓＮＰＰ１が最も高いレベルの酵素活性を示した。この結果から、標的化部分（すなわち、Ｄ８）に融合された切断型ＮＰＰ１は、そのヌクレアーゼとしての通常の機能を十分に維持していたことが強く示唆される。
【００７５】
実施例ＩＩ
この非限定的かつ予言的な例は、ＴＡＧＮＰＰ１融合タンパク質を含む製剤を投与することにより、どのように特発性乳児動脈石灰化症を処置するかを記載する。
【００７６】
患者が動脈に高レベルの石灰化を保有することを確認するために、臨床医は診断検査を使用する。ＮＰＰ１異常に関しては、Ｒｕｔｓｃｈら（２００３），Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３４：３７９−８１に記載されているように遺伝子検査を行うことができる。
【００７７】
本発明の医薬組成物は、好ましくは静脈内投与するが、ある種の環境では皮内投与、筋肉内投与または経口投与を利用する。
【００７８】
用量は、臨床医が決定し、患者の性別、年齢、健康状態および体重によって異なってもよい。適切な投与量または投与経路の判定は十分に、通常の知識を有する医師の技術の範囲内である。
【００７９】
ＴＡＧＮＰＰ１を含む製剤は、１週当たり約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇを毎週注入することができる。１０〜３０ｍｇ／ｋｇを１回投与することができる。注入期間中は、患者を詳細にモニターし、有害事象が発生した場合、適切な臨床的介入を行う。処置は、少なくとも１ヶ月または患者の生涯にわたり継続される。注入ごとに４８時間という枠を許容してもよい。注入速度を経時的に上げる注入スケジュールにすると、有害事象は減少するか、またはなくなる。乳児への注入は、以下のスケジュールに従い投与することができる：各期間を６０分間として５〜１０ｃｃ／ｈｒ。
【００８０】
一方、持続静脈内投与を所望する場合、徐放系の典型的例は、１〜１００ｍｇ／ｋｇの効果的なＴＡＧＮＰＰ１タンパク質を１日より長く持続投与し得ることを含む。
【００８１】
実施例ＩＩＩ
可溶性ＴＡＧｓＮＰＰ１−Ｄ８の精製
可溶性形態のＴＡＧｓＮＰＰ１（Ｃ末端タグ化Ｄ８）（配列番号２０および図２６を参照されたい）は、ＨＥＫ２９３コンディション培地から精製した。コンディション培地（５００ｍｌ）をヒドロキシアパタイト（ＨＡ）緩衝液Ａ（１０ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ６．８）で平衡化し、０．２μｍのＳａｒｔｏｂｒａｎ  Ｐ  Ｓｉｚｅ  ８  ＭｉｄｉＣａｐ  Ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）で濾過した。２０ｍｌのＨＡ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌカラム（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を５カラム体積（ＣＶ）の緩衝液Ａで平衡化してから、濾過したコンディション培地を３ｍｌ／ｍｉｎで充填した。カラムをＵＶベースライン（ＵＶ  ｂａｓｅｌｉｎｅ）になるまで緩衝液Ａで洗浄した。ＨＡ緩衝液Ｂ（１５０ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ６．８）、ＨＡ緩衝液Ｃ（２５０ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ６．８）およびＨＡ緩衝液Ｄ（５００ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ６．８）をそれぞれ２．５ＣＶ使用して、タンパク質を段階的に溶出しながら、５ｍｌの画分を集めた。ＨＡカラムの活性画分をプールし（５０ｍｌ）、ＷＧＡ緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．７％ＣＨＡＰＳ）で平衡化した。濾過後、６〜７ｍｇの総タンパク質（１５〜１８ｍｌ）を、５ＣＶのＷＧＡ緩衝液Ａで平衡化した１ｍｌのコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）自然落下カラム（Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｇｒａｖｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ）（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に充填した。カラムを７ＣＶのＷＧＡ緩衝液Ａで洗浄し、次いでタンパク質を５×１ｍｌのＷＧＡ緩衝液Ｂ（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのＮ−アセチルグルコサミン、０．７％ＣＨＡＰＳ緩衝液）で溶出した。ＷＧＡ緩衝液Ｂをカラムと室温で１０分間インキュベートさせてから、１ｍｌの画分を集めた。ＷＧＡカラムにより出発材料がすべて精製されるまでこのプロセスを繰り返した（合計４回）。活性画分（２９ｍｌ）をプールし、分画分子量（ＭＷＣＯ）１００，０００のＶｉｖａｓｐｉｎ−１５（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を用いて１．２ｍｌに濃縮し、同時に緩衝液をＰＢＳに交換した。
【００８２】
活性ｓＮＰＰ１−Ｄ８（ＴＡＧｓＮＰＰ１）をＨＰＬＣに基づき９１．５％に精製した。この最終プールをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したところ、非還元条件下では２量体のバンドは約２１０ｋＤに相当し、還元条件下では単量体のバンドは約１０５ｋＤに相当した。
【００８３】
実施例ＩＶ
ヒト大動脈平滑筋細胞を１×１０４細胞／ウェルで４８ウェルプレートに蒔き、標準的な条件下、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。２日後、ＤＭＥＭにＮａＰＯ４およびＡＴＰをそれぞれ３．８ｍＭおよび５０ｕＭ補充した。ｓＮＰＰ１（ＷＴ；図９）、Ｃ末端に融合した連続した８個のアスパラギン酸残基（Ｄ８）を有するＴＡＧｓＮＰＰ１（図２６）、およびｓＮＰＰ１−Ｆｃ（図２９）を１ｕｇ／ｍｌで補充した。培地は１日おきに同じものと交換した。５日後、培養液から培地を除去し、１００ｕｌの０．６ＮのＨＣｌと交換し、１６〜２０時間室温でインキュベートし、この溶液にリン酸カルシウムを溶解させた。次いでＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ製のＣａｌｃｉｕｍ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（＃７００５５０）を使用して、比色定量のカルシウム−クレゾールフタレイン反応によりカルシウムのレベルを定量した。
【００８４】
図２３に示すように、ＴＡＧｓＮＰＰ１は、石灰化の阻害をｓＮＰＰ１（ＷＴ）のそれと比較して増強したことから、ＴＡＧｓＮＰＰ１に含まれるＤ８ドメインは、石灰化部位の回復能力（ｈｏｍｉｎｇ  ａｂｉｌｉｔｙ）を増強する、および／または阻害効果を高めることが示唆される。
【００８５】
実施例Ｖ
ｓＮＰＰ１−Ｆｃの酵素活性アッセイ
１ｕｇのｓＮＰＰ１−Ｆｃ（図２９）の添加は、純度７０％を基準にした（すなわちアッセイには、約１．１μｇのｓＮＰＰ１−Ｆｃを使用した）。ＨＰＬＣサイズ排除カラム（ＳＥＣ）からは、ｓＮＰＰ１−Ｆｃが純度約７８％であることが示される。非還元ゲルでは、予想された大きさ（約２５０ｋＤ）で２量体が示された。２量体バンドは、ＤＴＴで処理すると、予想された単量体の大きさ（約１２５ｋＤ）に小さくなった。ウエスタンブロット解析から、２量体および単量体のバンドが確認された。ｓＮＰＰ１−ＦｃサンプルをＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理すると、単量体のバンドが約１２５ｋＤから予想された分子量である約１００ｋＤに小さくなり、これはｓＮＰＰ１−Ｆｃは１２のＮ−グリカン部位を含むと考えるときに想定される分子量である。純度７８％では、最終的な定量により約０．８０８ｍｇのｓＮＰＰ１−Ｆｃが得られた（２．２μｇ／ｍｌのコンディション培地）。ｓＮＰＰ１−Ｆｃの酵素活性は、当該技術分野において公知の通り決定した。
【００８６】
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【００８７】
上記の明細書の各例は、本発明の限定のためではなく本発明の説明のために提供する。実際には、本発明では本発明の範囲または精神を逸脱することなく、様々な変形、組み合わせ、付加、欠失および変更をなし得ることが当業者には明らかにあるであろう。たとえば、一実施形態の一部として図示または説明された特徴を別の実施形態で使用して、さらに別の実施形態を得ることができる。本発明は、そうした変形形態、組み合わせ、付加、削除および変更を包含することを意図している。
【００８８】
本明細書に引用する刊行物、特許、特許出願、インターネットサイトおよび受託番号／データベース配列（ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の両方を含む）はすべて、刊行物、特許、特許出願、インターネットサイトまたは受託番号／データベース配列が、本明細書に援用するために具体的に個々に示されているのと同じ程度に、すべての目的でその全体を参照により本明細書に援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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