(57)【要約】【課題】ＡＬＳの検出方法を提供する。【解決手段】被験者から採取されたＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列のうち、第２７８０番目または第３８２３番目の塩基の遺伝子変異を解析し、当該解析結果と筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）とを関連づけることを特徴とする、ＡＬＳの検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取されたＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列のうち、第２７８０番目の塩基のＧからＡへの遺伝子変異または第３８２３番目の塩基のＣからＴへの遺伝子変異を解析し、前記いずれかまたは両方の遺伝子変異があるとき、当該被験者が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している、またはＡＬＳに罹患するリスクがあると判定する、ＡＬＳの検出方法。
【請求項２】
ＡＬＳが、家族性ＡＬＳまたは孤発性ＡＬＳである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列において、第２７８０番目の塩基のＧからＡへの遺伝子変異および第３８２３番目の塩基のＣからＴへの遺伝子変異のいずれかまたは両方を含む、ＥＲＢＢ４遺伝子。
【請求項４】
ＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列のうち、第２７８０番目または第３８２３番目の塩基を含む塩基配列またはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
第２７８０番目の塩基がＡであるか、または第３８２３番目の塩基がＴである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４または５に記載のオリゴヌクレオチドを含む、筋萎縮性側索硬化症の検出用キット。
【請求項７】
候補物質の存在下または非存在下において、ＥｒｂＢ４タンパク質とニューレグリン−１とを接触させることを含む、ＥｒｂＢ４タンパク質の自己リン酸化を促進させる化合物または塩のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項７で得られる化合物または塩を含む、筋萎縮性側索硬化症の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＲＢＢ４遺伝子の変異を指標とした筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロンの変性を特徴とする壊滅的な神経学的障害であり、四肢筋、延髄性筋および呼吸筋の進行性の筋力低下や衰えを伴う。ＡＬＳ症例のうち、５〜１０％の症例が家族性ＡＬＳ（ＦＡＬＳ）であり、残りの症例は孤発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ）である。これまでに、２０を超える遺伝子がＡＬＳと関連していることが示されており（非特許文献１）、これらは白人集団における家族性ＡＬＳの７５％および孤発性ＡＬＳの１４％の主要因であることが明らかにされている（非特許文献２）。孤発性ＡＬＳ患者において同定された家族性ＡＬＳの原因遺伝子の突然変異は、浸透度が低減した突然変異または新規突然変異と考えられている。家族性ＡＬＳの原因遺伝子をさらに発見することが、家族性ＡＬＳおよび孤発性ＡＬＳの両方の分子的背景を解明するのに欠かせない。
【０００３】
一般に、家族性疾患の原因遺伝子の同定は、大家系の連鎖解析による染色体上の疾患遺伝子座の同定、およびその後の原因遺伝子のポジショナルクローニングを通じて達成されている。しかし、多くの家族性ＡＬＳ家系は、予後不良および発症年齢が遅いなどの理由で、大家系で解析をする事が困難な場合が多い。この事実は、連鎖解析を用いて染色体上の候補領域を十分に絞ることを困難にし、家族性ＡＬＳの原因遺伝子を同定するのに甚大な努力を必要とすることを意味する。近年の大量並列シーケンシング技術の開発によって、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）またはエクソーム解析による疾患遺伝子の同定への可能性が広がった。
【０００４】
しかしながら、これまでにＡＬＳの全ての原因遺伝子が明らかとなったわけではなく、原因遺伝子の明らかでないＡＬＳ患者は依然として存在するため、そのような患者の早期診断、早期治療の開始には困難が伴う。したがって、ＡＬＳの診断および治療の観点から、さらなる原因遺伝子の解明の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Al-Chalabi, A., Jones, A., Troakes, C., King, A., Al-Sarraj, S., and van den Berg, L.H. (2012). The genetics and neuropathology of amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol 124, 339-352.
【非特許文献２】Andersen, P.M. and Al-Chalabi, A. (2011). Clinical genetics of amyotrophic lateral sclerosis: what do we really know? Nat Rev Neurol 7, 603-615.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＥＲＢＢ４遺伝子の変異を指標とした筋萎縮性側索硬化症の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ＡＬＳ家系およびＡＬＳ患者から得られたＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列のうち、第２７８０番目の塩基（第927番目のアミノ酸）または第３８２３番目の塩基（第1275番目のアミノ酸）の変異がＡＬＳと関連することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  被験者から採取されたＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列のうち、第２７８０番目の塩基のＧからＡへの遺伝子変異または第３８２３番目の塩基のＣからＴへの遺伝子変異を解析し、前記いずれかまたは両方の遺伝子変異があるとき、当該被験者が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹患している、またはＡＬＳに罹患するリスクがあると判定する、ＡＬＳの検出方法。
［２］  ＡＬＳが、家族性ＡＬＳまたは孤発性ＡＬＳである、［１］に記載の方法。
［３］  ＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列において、第２７８０番目の塩基のＧからＡへの遺伝子変異および第３８２３番目の塩基のＣからＴへの遺伝子変異のいずれかまたは両方を含む、ＥＲＢＢ４遺伝子。
［４］  ＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列のうち、第２７８０番目または第３８２３番目の塩基を含む塩基配列またはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
［５］  第２７８０番目の塩基がＡであるか、または第３８２３番目の塩基がＴである、［４］に記載のオリゴヌクレオチド。
［６］  ［４］または［５］に記載のオリゴヌクレオチドを含む、筋萎縮性側索硬化症の検出用キット。
［７］  候補物質の存在下または非存在下において、ＥｒｂＢ４タンパク質とニューレグリン−１とを接触させることを含む、ＥｒｂＢ４タンパク質の自己リン酸化を促進させる化合物または塩のスクリーニング方法。
［８］  ［７］で得られる化合物または塩を含む、筋萎縮性側索硬化症の治療剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ＡＬＳの検出方法および検出キットが提供される。本発明の方法を用いることにより、ＡＬＳに特徴的な新規遺伝子変異の存在が明らかとなり、ＡＬＳ患者またはＡＬＳのリスクのある患者を簡便かつ確実に検出又は診断することができる。したがって、本発明の方法は、ＡＬＳの検出、病態理解、診断及び分子標的療法の開発に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１ａ】、指標となる家族（index family）（ｐｅｄ３１６６）の家系チャートおよび連鎖解析を示す図である。黒塗り記号は、発症した個人を示す。矢印は、発端者（proband）を示す。機密保持の目的のために、すべての発症していない兄弟姉妹は、菱形で示されている。ドットまたはアステリスクは、それぞれ、連鎖研究またはＷＧＳに含められた個人を示す。存在時または死亡時の年齢は、各個人の下に示されており、発病時の年齢は、括弧内に示されている。
【図１ｂ】指標となる家族（ｐｅｄ３１６６）のゲノム全域にわたるパラメトリック連鎖解析を示す図である。パラメトリック連鎖解析によって求めたマルチポイントＬＯＤスコアが、異なる色を用いてすべての常染色体について合成グラフ中に示されている。上のグラフは、浸透度＝１．０でのＬＯＤスコアを示し、下のグラフは、浸透度＝０．８でのＬＯＤスコアを示す。染色体２における矢じりは、ＥＲＢＢ４の遺伝子座を示す。
【図２ａ】追加のＡＬＳ患者の突然変異解析における、ＥＲＢＢ４突然変異を有する追加の家系を示す図である。突然変異データの電気泳動図が各メンバーの横に示されている。
【図２ｂ】ＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸保存を示す図である。アミノ酸Ｒ９２７およびＲ１２７５は、種の中で高度に保存されている。
【図２ｃ】本発明のＥｒｂＢ４タンパク質における突然変異の位置を示す図である。コーディングエクソンおよびタンパク質構造が示されており、ここで突然変異は、矢印によって示されている。突然変異ｐ．Ｒ９２７Ｑは、チロシンキナーゼドメイン内に存在し、これは、ＥｒｂＢ４の重要な機能を媒介する。突然変異ｐ．Ｒ１２７５Ｗは、複数のリン酸化部位の近傍におけるＣ末端ドメイン内に存在し、これは、下流のシグナル伝達経路を媒介する。
【図３】ニューレグリン−１刺激における野生型および突然変異体ＥｒｂＢ４の機能分析を示す図である。空ベクター対照、あるいは野生型（ｗｔ）または突然変異体ＨＡ−タグ付きＥｒｂＢ４（ｐ．Ｒ１１４Ｑ、ｐ．Ａ１５８Ｅ、ｐ．Ｈ３７４Ｑ、ｐ．Ｒ９２７Ｑ、もしくはｐ．Ｒ１２７５Ｗ）をコードするプラスミドをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を、ＮＲＧ−１を用いて、あるいは用いずに刺激し、ＥｒｂＢ４自己リン酸化活性を、それぞれ、ホスホ−ＥｒｂＢ４（Ｔｙｒ１２８４）（Cell Signaling、Danvers、MA、USA）およびＨＡ−タグ（Abcam、Cambridge、UK）に対する抗体を用いて、ウエスタンブロット解析によって分析した。ローディングは、抗アクチン抗体（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、USA）を用いたウエスタンブロッティングによってコントロールした。ＥｒｂＢ４突然変異体ｐ．Ｒ１１４Ｑ、ｐ．Ａ１５８Ｅ、およびｐ．Ｈ３７４Ｑを追加の対照として分析し、これらは良性の多型とみなされた。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．概要
以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、被験者から採取された、ＥｒｂＢ４タンパク質をコードする遺伝子（以下、ＥＲＢＢ４遺伝子またはＥＲＢＢ４ともいう）の塩基配列において、第２７８０番目または第３８２３番目の塩基の遺伝子変異を解析し、当該解析結果と被験者のＡＬＳ発症とを関連づけることを特徴とする、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の検出方法に関する。
【００１２】
「検出」とは、被験者のＥＲＢＢ４の変異とＡＬＳとを関連づけて、ＥＲＢＢ４変異を有する場合は、当該被験者はＡＬＳの患者である、ＡＬＳに罹患している、又はＡＬＳ発症のリスクがあるものと、推定、決定、判定又は診断することを意味する。また、検出には、ＡＬＳの発症または発症の可能性を、医療従事者以外が予備的に決定する、決定を補助する、あるいは診断を支援することも含まれる。
【００１３】
「筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）」は、運動ニューロンの変性を特徴とする壊滅的な神経学的障害であり、一般的に発病から３〜５年以内に死に至るといわれている。家族性ＡＬＳ（ＦＡＬＳ）は、ＡＬＳ症例の５〜１０％を占め、これらの原因遺伝子の同定は、ＡＬＳの分子病態を解明するのに欠かせない。
【００１４】
本発明者らは、公知の原因遺伝子の突然変異を除外した、遅発性常染色体優性ＡＬＳを有する日本人家系を同定した。同家系に対して行った、不完全浸透度を伴った遺伝の常染色体優性形式を仮定した全ゲノム配列決定およびパラメトリック連鎖解析により、ＥＲＢＢ４における突然変異ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）を見出した。
【００１５】
「ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ」は、ＥＲＢＢ４のコードＤＮＡ配列において、第２７８０番目の塩基がＧからＡに変異していることを意味する。この変異は、対応するＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列において、第９２７番目のアミノ酸がＲ（アルギニン）からＱ（グルタミン）に変異させる。このｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）突然変異は、新規の突然変異であり、ある白人家族性ＡＬＳ患者においても同突然変異を有することを見出した。
【００１６】
さらに、本発明者らは、大規模な突然変異解析により、日本人の孤発性ＡＬＳ患者における突然変異ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１２７５Ｗ）を見出した。このｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１２７５Ｗ）突然変異は、新規の突然変異である。
【００１７】
「ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ」は、ＥＲＢＢ４のコードＤＮＡ配列において、第３８２３番目の塩基がＣからＴに変異していることを意味する。この変異は、対応するＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列において、第１２７５番目のアミノ酸がＲ（アルギニン）からＷ（トリプトファン）に変異させる。
【００１８】
したがって、本発明は、ＥＲＢＢ４の第２７８０番目の塩基置換（ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（アミノ酸配列ではＲ９２７Ｑ））、または第３８２３番目の塩基置換（ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ（アミノ酸配列ではＲ１２７５Ｗ））を指標として、対象のＡＬＳ発症を評価する方法に関する。
【００１９】
本発明の突然変異は、種の中で高度に保存されたアミノ酸に生じた変異であって、有害であることが予想される。具体的にはこれらの突然変異は、ＥｒｂＢ４タンパク質のチロシンキナーゼドメイン（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）またはＣ末端ドメイン（ｐ．Ｒ１２７５Ｗ）内に位置し、いずれのドメインも受容体チロシンキナーゼとしてのＥｒｂＢ４タンパク質の必須機能を媒介する。
【００２０】
本発明者らは、機能分析により、本発明の突然変異は、ニューレグリン−１（ＮＲＧ−１）刺激における、ＥｒｂＢ４自己リン酸化の低減をもたらすことを明らかにした。
【００２１】
突然変異を有する患者の臨床症状は、明白な認知機能障害を伴わない上位運動ニューロンおよび下位運動ニューロンの両方の関与、ならびに比較的遅い進行により特徴付けられる。本発明によって、ニューレグリン−ＥｒｂＢ４経路の破壊がＡＬＳの病因に関与していることが示され、ＮＲＧまたはこれらのアゴニストを使用してＥｒｂＢ４機能を上方制御することなどの画期的なＡＬＳ治療戦略への道を開く可能性がある。
【００２２】
したがって、本発明は、ＥｒｂＢ４タンパク質、例えばＥｒｂＢ４タンパク質を発現させた細胞を、候補物質の存在下または非存在下においてニューレグリン−１で刺激することを含む、ＥｒｂＢ４タンパク質の自己リン酸化を促進させる化合物または塩のスクリーニング方法に関する。本発明のスクリーニング方法で得られる化合物または塩は、ＡＬＳの治療薬として使用し得ることが期待される。
【００２３】
２．ＥＲＢＢ４
本発明において、検出のために使用される遺伝子およびタンパク質は、ＥＲＢＢ４およびＥｒｂＢ４タンパク質である。ＥＲＢＢ４は、細胞膜貫通型のチロシンキナーゼ受容体であるＥｒｂＢ４タンパク質をコードする遺伝子である。例えば、ヒトＥＲＢＢ４は配列番号１に示されるものであり、ヒトＥｒｂＢ４タンパク質は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる。ヒトＥＲＢＢ４およびＥｒｂＢ４タンパク質の配列情報は、例えばアクセッション番号NM_005235.2、NP_005226により得ることができる。
【００２４】
３．遺伝子変異マーカー
本発明において解析の対象となるＥＲＢＢ４変異は、ＥＲＢＢ４塩基配列の第２７８０番目の塩基（配列番号１に示す塩基配列の第２７８０番目の塩基）のGからAへの変異であり、「ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ」という。ｃ．２７８０Ｇ＞Ａは、ＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列の第９２７位（配列番号２に示すアミノ酸配列の第９２７番目のアミノ酸残基）でＲ（アルギニン）からＱ（グルタミン）への置換（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）が起こる。また、本発明の別の態様において解析の対象となるＥＲＢＢ４変異は、ＥＲＢＢ４の塩基配列の第３８２３番目の塩基（配列番号１に示す塩基配列の第３８２３番目の塩基）のCからTへの変異であり、「ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ」という。ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔは、ＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列の第１２７５位（配列番号２に示すアミノ酸配列の第１２７５番目のアミノ酸残基）でＲ（アルギニン）からＷ（トリプトファン）への置換（ｐ．Ｒ１２７５Ｗ）が起こる。
【００２５】
「ＥＲＢＢ４（遺伝子）変異を有する」または「ＥＲＢＢ４（遺伝子）変異がある」には、遺伝子解析により、被験者から採取されたＥＲＢＢ４遺伝子において「ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ」および「ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ」のいずれかまたは両方が確認されることが含まれる。
【００２６】
「ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ」を有するＥＲＢＢ４遺伝子および「ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ」を有するＥＲＢＢ４遺伝子は、本発明に含まれる。また、「ｐ．Ｒ９２７Ｑ」を有するＥｒｂＢ４タンパク質および「ｐ．Ｒ１２７５Ｗ」を有するＥｒｂＢ４タンパク質も、本発明に含まれる。「ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ」を有するＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列の例を配列番号５９、「ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ」を有するＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列の例を配列番号６１、「ｐ．Ｒ９２７Ｑ」を有するＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列の例を配列番号６０、「ｐ．Ｒ１２７５Ｗ」を有するＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列の例を配列番号６２に示す。
【００２７】
表１には、配列番号１で示されるＥＲＢＢ４の塩基配列におけるｃ．２７８０Ｇ＞Ａおよびｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ変異を含むコーディング領域の塩基配列を表示する。配列番号１で示される塩基配列においてｃ．２７８０Ｇ＞Ａ変異した塩基配列、および配列番号１で示される塩基配列においてｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ変異した塩基配列も、本発明の範囲に含まれる。表1において、第２７８０番目および第３８２３番目の塩基は下線で表示し、「ｇ／ａ」は「Ｇ」から「Ａ」への変異を示し、「ｃ／ｔ」は「Ｃ」から「Ｔ」への変異を示す。本明細書では、本発明を配列番号１を例に挙げて説明するが、配列番号１以外の塩基配列で示されるＥＲＢＢ４についても、ｃ．２７８０およびｃ．３８２３に対応する箇所の突然変異を含むＥＲＢＢ４は本発明の範囲である。配列番号１以外の塩基配列で示されるＥＲＢＢ４は、例えば、本発明の突然変異以外の箇所の遺伝子の欠失、置換、付加、挿入、あるいは種差などによって配列番号１とは同一ではない塩基配列を有するＥＲＢＢ４遺伝子などが挙げられる。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
本発明において、検出の対象となるＡＬＳは、家族性ＡＬＳ(ＦＡＬＳ)または孤発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ）である。
【００３０】
ＥＲＢＢ４の上記変異は、被験者のＡＬＳを評価するためのマーカーとして利用することができる。すなわち、この変異を解析することによって、ＡＬＳであるか否かを評価することができる。
【００３１】
本発明において見出されたｃ．２７８０Ｇ＞Ａ変異およびｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ変異は、ＡＬＳの原因因子である。本発明においては、当該変異とＡＬＳとを関連づけることができる。すなわち、解析したＥＲＢＢ４の第２７８０番目の塩基がＧからＡに変異しているときは、被験者はＡＬＳを発症している、あるいはＡＬＳ発症のリスクがあると判定することができる。ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ変異を有する場合は、例えば約７５％以上の確率でALSを発症する。同様に、解析したＥＲＢＢ４の第３８２３番目の塩基がＣからＴに変異しているときは、被験者はＡＬＳを発症している、あるいはＡＬＳ発症のリスクがあると判定することができる。
【００３２】
４．変異検出法
上記変異を検出するための被験者からのゲノムサンプルは、血液、唾液、皮膚、リンパ節、骨髄等の生体試料から取得することができるが、ゲノムサンプルを採取できるものであれば、これに限定されるものではない。ゲノムDNAの抽出及び精製法は周知である。例えば、ヒトから採取した血液、唾液等の検体から、QIAmp DNA mini kit、QIAmg DNA FFPE Tissue kit (QIAGEN)、Wizard（登録商標）Genomic DNA Purification Kit（Promega）、NucleoSpin（登録商標）シリーズのキット（タカラバイオ）、などのキットを用いて抽出することができる。本発明の場合、変異がＥｒｂＢ４タンパク質のコード領域（オープンリーディングフレーム）に存在するため、ゲノムDNAの代わりにmRNAやtotal RNAを取得し、本発明のＡＬＳ検出方法に使用することもできる。
【００３３】
当業者であれば、被験者由来の遺伝子における本発明の遺伝子変異を、公知の方法および技術常識に基づいて適宜検出することができる。以下、上記の被験サンプルの遺伝子変異を検出する方法の一例を示す。
（１）PCR法を用いた検出
突然変異を検出する方法としては、公知の対立遺伝子特異的増幅方法（ＡＳＡ、ＰＡＳＡ、ＡＳＰ、ＡＲＭＳなど）を適用することができる。これらの方法は、基本的には、プライマーの３’末端にミスマッチが存在すると、ポリメラーゼによる伸長反応が阻害される。
【００３４】
PCRにより被験サンプルを増幅するには、Fidelityの高いDNAポリメラーゼ、例えば、KOD-Plus-neoポリメラーゼ（TOYOBO社）を用いることが好ましいが、これに限定されるものではない。用いるプライマーは、被験サンプル中の対象変異部分が増幅されるように、プライマーの任意の位置に遺伝子変異が含まれるように設計し合成する。増幅反応終了後は、増幅産物の検出を行い、変異の有無を判定する。
【００３５】
例えばTaqMan PCR法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴとTaq DNAポリメラーゼによるPCR反応とを利用した方法である。TaqMan PCR法で用いるアレル特異的オリゴ（TaqManプローブという)は、前記遺伝子変異情報に基づいて設計することができる。あるいは、アレル特異的プライマーを用いて増幅する際に、SyberGreen PCR法を用いて増幅産物に蛍光標識した塩基を取り込むことで、変異遺伝子の定量を行うことができる。
【００３６】
（２）塩基配列決定法による検出
本発明においては、ダイレクトシークエンシングにより変異を検出することもできる。塩基配列決定に用いるシークエンサーには、市販のHiSeqシステム、MiSeqシステム（イルミナ）、ABIシリーズ（ライフテクノロジーズ）、PGMシステム（ライフテクノロジーズ）等を用いる。
【００３７】
（３）DNAマイクロアレイによる検出
DNAマイクロアレイは、支持体上にヌクレオチドプローブが固定されたものであり、DNAチップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含む。まず、被験サンプルのポリヌクレオチドを単離し、PCRにより増幅し、蛍光レポーター基により標識する。続いて、標識化DNA/mRNA、total RNAをアレイと共にインキュベートする。次にこのアレイをスキャナーに差し込み、ハイブリダイゼーションパターンを検出する。ハイブリダイゼーションのデータは、プローブアレイに結合した（すなわち標的配列に取り込まれた）蛍光レポーター基からの発光として採集する。標的配列と完全に一致したプローブは、標的配列と一致していない部分を有するものよりも強いシグナルを生じる。アレイ上の各プローブの配列及び位置は分かっているため、相補性によって、プローブアレイと反応させた標的ポリヌクレオチドの配列を決定することができる。マイクロアレイにおいては、変異遺伝子に対応した合成プローブを用いるＡＳＯ（アレル特異的オリゴ）ハイブリダイゼーション法の原理を使用することもできる。
【００３８】
（４）インベーダー法による遺伝子変異の検出
インベーダー法は、アレル特異的オリゴと鋳型とをハイブリダイゼーションすることにより遺伝子多型を検出する方法である。この方法を本発明における変異の検出に使用することができる。インベーダー法を行うためのキットは市販されており、この方法により容易に遺伝子変異を検出することが可能である。
（５）ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法
増幅したＰＣＲ産物を制限酵素で処理し、切断の有無を確認することにより、変異を検出する方法である。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を本発明における変異の検出に使用することができる。
【００３９】
（６）本発明の変異は、上記のとおりＤＮＡレベルで検出することが可能である。本発明の遺伝子変異は、コードされるアミノ酸を変異させるため、本発明の変異はタンパク質レベルで検出することもできる。被験者から取得した血液、唾液、皮膚などの生体試料から常法に基づきタンパク質を採取し、適宜精製する。本発明のアミノ酸変異箇所または変異アミノ酸に特異的な抗体を用いて、本発明の変異を検出してもよい。あるいは、公知のタンパク質分析技術を用いて、変異を検出することができる。
【００４０】
５．オリゴヌクレオチド
本発明は、ＥＲＢＢ４配列またはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、上記に例示される変異検出方法において、ＥＲＢＢ４配列におけるｃ．２７８０Ｇ＞Ａ変異および／またはｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ変異を検出できるように設計および製造されたオリゴヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列のうち、第２７８０番目または第３８２３番目の塩基を含む塩基配列またはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、上記遺伝子変異を検出するために使用することができる。
【００４１】
例えば、作製されたオリゴヌクレオチドをプローブとして用いると、当該プローブが被験DNAにハイブリダイズしたかどうか、その有無を利用して変異を決定又は検出することができる。プローブは、例えばTaqMan（登録商標）プローブとして使用することができる。
【００４２】
本発明の一態様において、本発明は上記遺伝子変異部位を含むDNA断片に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供する。すなわち、本発明は上記遺伝子変異の部位を含む配列またはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、遺伝子変異の部位、すなわち、ｃ．２７８０またはｃ．３８２３を含むＥＲＢＢ４の正常（野生型）配列を含む。本発明のオリゴヌクレオチドを用いてＥＲＢＢ４配列の遺伝子変異を検出する際に、シグナルやスポットの強さを対照と比較することにより、被験サンプルにおける遺伝子変異の有無を検出することができる。
【００４３】
プローブは、配列番号１に示す塩基配列のうち、例えば、第３８２３番目の塩基を含み、かつ、第３８２３番目の塩基よりも上流側の塩基及び下流側の塩基を含むように設計することが好ましい。このようにして設計及び合成したプローブを、第３８２３番目の塩基がＣの配列（正常配列）にはハイブリダイズするが、第３８２３番目の塩基がＴの配列（第３８２３番目の塩基に変異を生じている配列）にはハイブリダイズしない（もしくはハイブリダイズ形成の弱い）条件でハイブリダイゼーションを行う。このようなプローブは変異を生じていない配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするため、バンドまたはシグナルの有る（もしくはシグナルの強い）場合に、第３８２３番目の塩基がＣからＴへの変異を有していないことを判断（検出）することができる。
【００４４】
また、本発明の別のプローブの態様として、変異遺伝子配列を含むプローブを設計することもできる。すなわち、本発明は上記遺伝子変異を含むDNA断片に特異的にハイブリダイズする、当該遺伝子変異を含むオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、上記遺伝子変異を含む（第２７８０番目の塩基がＡであるか、または第３８２３番目の塩基がＴである）ＥＲＢＢ４の塩基配列またはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドを含む。
【００４５】
正常配列を含む上記プローブと本態様のプローブとは、第３８２３番目の塩基がＣであるかＴであるかの点で異なる。本プローブを第３８２３番目の塩基がＴの配列（第３８２３番目の塩基に変異を生じている配列）にはハイブリダイズするが、第３８２３番目の塩基がＣの配列（野生型配列）にはハイブリダイズしない条件でハイブリダイゼーションを行う。このようなプローブは変異を生じている配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするため、バンドまたはシグナルの有る場合に第３８２３番目の塩基がＣからＴへの変異を有することを判断（検出）することができる。
【００４６】
第２７８０番目の変異についても、第３８２３番目の変異と同様にプローブを設計し、またプローブを用いて変異を検出することができる。
【００４７】
「ハイブリダイズする」とは、通常のPCRやハイブリダイゼーションの過程においてDNA対を形成することを意味する。従って、ハイブリダイズする条件は、市販のPCR試薬やハイブリダイゼーション用試薬を用いることで設定することが可能である。
【００４８】
また、本発明の別の態様において、本発明は、ＥＲＢＢ４遺伝子またはこれに相補的な配列を増幅したときに増幅断片中に前記変異部位が含まれるように作製されたオリゴヌクレオチドを提供する。変異を検出するためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを設計するときも、例えば、配列番号１に示す塩基配列のうち、第２７８０番目または第３８２３番目の塩基を含み、かつ、第２７８０番目または第３８２３番目の塩基よりも上流側の塩基及び下流側の塩基を含むように設計することができる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、上記遺伝子変異を含む（第２７８０番目の塩基がＡであるか、または第３８２３番目の塩基がＴである）ＥＲＢＢ４の塩基配列またはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドを含む。
【００４９】
PCR法の場合、増幅断片の3’末端部分が変異部位の塩基配列に相補的な配列を有するようにプライマーを作製することが好ましい。このように設計されたプライマーを用いると、鋳型となるサンプルが変異を有するか否かに応じて、サンプルとプライマーとのミスマッチが生じ、ポリメラーゼ伸長反応の成否が決まる。したがって、このようなプライマーを用いてPCR増幅を行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動などによって分析することで、サンプルである鋳型の変異を確認することができる。増幅断片の長さは特に限定されるわけではないが、例えば、数10塩基〜数100塩基である。
【００５０】
本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは、少なくとも10 merとなるように設計することが好ましく、より好ましくは10〜200 mer、さらに好ましくは15〜150 mer、最も好ましくは20〜30 merである。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば表４に示されており、c.2780G>Aを検出するためのERBB4_Ex23F1およびERBB4_Ex23R1、並びにc.3823C>Tを検出するためのERBB4_Ex28F1およびERBB4_Ex28R1を挙げることができる。
【００５１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＬＳ検出用プローブ又はＡＬＳ検出用PCRプライマーとして使用することができる。ＡＬＳの検出は、前記ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ変異またはｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ変異を指標として行われる。被験対象者からのゲノムDNAサンプルの取得法は前記のとおりである。
【００５２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、上記配列の相補鎖（相補配列）も含まれる。変異部位が塩基配列の5'端又は3'端に存在するように設計することもできるが、これに限定されず、5'又は3'端よりも内側に存在するように設計してもよい。
【００５３】
以上のように設計された本発明のオリゴヌクレオチド(例えばオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブ)は、配列番号１記載の塩基配列に基づいて、公知の手段・方法により化学合成することができるが、一般には、市販の化学合成装置を使用して合成される。なお、本発明のオリゴヌクレオチドには、予め適当な蛍光標識（例えばFAM、VIC等）を付加して作業の自動化を図ることも可能である。蛍光標識が付加されたオリゴヌクレオチドも、本発明の範囲に含まれる。
【００５４】
６．キット
本発明は、ＡＬＳを検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明を実施するために必要な１種以上の成分を含む。例えば、本発明のキットには、本発明のヌクレオチド、酵素緩衝液、dNTP、コントロール用試薬（例えば、組織サンプル、ポジティブ及びネガティブコントロール用標的オリゴヌクレオチドなど）、標識用及び／又は検出用試薬、固相支持体、説明書などが挙げられる。また本発明のキットは、必要な成分のうちの一部のみを含む部分的キットであってもよく、その場合には、ユーザーが他の成分を用意することができる。
【００５５】
本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドを支持体に固定したマイクロアレイとして提供することもできる。マイクロアレイは、支持体上に本発明のオリゴヌクレオチドが固定されたものであり、DNAチップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含む。
【００５６】
本発明のキットは、ＥＲＢＢ４の変異を含むDNA断片に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい。
【００５７】
本発明のキットにより遺伝子変異を判定する場合、例えば、疾患の診断時に血液、唾液、体腔液（胸水、腹水、髄液など）、骨髄液、腫瘍検体、およびそれらから作製された固定標本などから上記ＥＲＢＢ４を含むDNAを単離し、この単離したDNAをキット中のオリゴヌクレオチドと反応させて遺伝子型を判定する。
【００５８】
判定した遺伝子型及び遺伝子変異からＡＬＳであるか否か、又はＡＬＳのリスクを判定する。
【００５９】
７．スクリーニング方法およびＡＬＳ治療剤
ＥｒｂＢ４タンパク質は、ＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ３とホモ二量体またはヘテロ二量体を形成する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の上皮成長因子（ＥＧＦ）サブファミリーのメンバーであり、ニューレグリン（ＮＲＧ）がＥｒｂＢ４の細胞外リガンド結合ドメインに結合すると活性化される。ＥｒｂＢ４の活性化は、ＮＲＧが結合した後のチロシンキナーゼ活性の増大によって媒介され、Ｃ末端の自己リン酸化をもたらす。
【００６０】
本発明者らの機能分析により、ｐ．Ｒ９２７Ｑまたはｐ．Ｒ１２７５Ｗ変異を有する変異ＥｒｂＢ４タンパク質を発現する細胞は、野生型ＥｒｂＢ４タンパク質を発現する細胞よりも、ニューレグリン−１を介するＥｒｂＢタンパク質の活性化機能が低いことが明らかとなった。具体的には、本発明の突然変異は、ニューレグリン−１（ＮＲＧ−１）刺激における、ＥｒｂＢ４タンパク質自己リン酸化の低減に至ることが見出された。すなわち、ニューレグリン−ＥｒｂＢ４経路の破壊がＡＬＳの病因に関与していることが示された。
【００６１】
したがって、本発明は、候補物質の存在下または非存在下において、ＥｒｂＢ４タンパク質とニューレグリン−１とを接触させることを含む、ＥｒｂＢ４タンパク質の自己リン酸化を促進させる化合物または塩のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法で得られる化合物またはその塩は、ニューレグリン−ＥｒｂＢ４経路を賦活化し、ＥｒｂＢ機能を上昇制御し得る。よって、本発明のスクリーニング方法で得られる化合物または塩は、ＡＬＳの治療剤として使用し得ることが期待される。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法は、具体的には以下の工程を含むことを特徴とするものである。
(i) 候補物質の存在下または候補物質の非存在下で、ＥｒｂＢ４タンパク質とニューレグリン−１とを接触させる工程、
(ii) ＥｒｂＢ４タンパク質の自己リン酸化の程度を検出する工程、および
(iii) 得られた検出結果を指標としてＥｒｂＢ４タンパク質の自己リン酸化を促進させる物質を選択する工程。
【００６３】
上記(i)の接触工程において使用される候補物質としては、例えば、低分子もしくは高分子化合物、天然もしくは人為的に合成された各種ペプチド、タンパク質（酵素や抗体を含む）、核酸（ポリヌクレオチド(DNA、RNA)、オリゴヌクレオチド(siRNA等)、ペプチド核酸(PNA)など）等を用いることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００６４】
本発明において「塩」は、限定はされないが、例えば、ハロゲン化水素酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、及びヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩、有機酸塩、アミノ酸塩（例えば、アスパラギン酸塩、及びグルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、及びカリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム塩、及びカルシウム塩など）などが挙げられる。
【００６５】
接触工程において使用されるニューレグリン−１は、公知の配列情報および公知の方法に基づき製造することができる。あるいは市販のニューレグリン−１を使用してもよい。
【００６６】
接触工程において使用されるＥｒｂＢ４タンパク質は、公知の配列情報（例えば配列番号１および２）および公知の方法に基づき製造することができる。ＥｒｂＢ４タンパク質は、細胞に発現させた状態または可溶化した状態で使用してもよく、精製したタンパク質を使用してもよい。スクリーニング方法において使用されるＥｒｂＢ４タンパク質は、本発明の変異を含む変異型ＥｒｂＢ４タンパク質でもよいし、変異を含まない正常型（野生型）ＥｒｂＢ４タンパク質でもよい。
【００６７】
「接触」とは、ＥｒｂＢ４タンパク質およびニューレグリン−１を反応可能な状態におくこと、同一の反応系に存在させること、または同一の培養系に存在させることなどを意味する。接触工程においてＥｒｂＢ４タンパク質とニューレグリン−１とを接触させる際は、候補物質を含む適当なバッファー（例えばHEPESバッファー、Trisバッファー、PBS等）中で行うことが好ましい。あるいは、適当なバッファー中で候補物質とＥｒｂＢ４タンパク質とを混合させておき、その後ニューレグリン−１を添加するようにしてもよい。接触時の温度は、ＥｒｂＢ４タンパク質の活性が低下又は失活しない温度であればよく、限定はされないが、例えば、0〜40℃であることが好ましく、より好ましくは20〜38℃である。また、接触の時間は、限定はされないが、例えば、1〜30分であることが好ましく、より好ましくは5〜20分である。
【００６８】
(ii) のＥｒｂＢタンパク質の自己リン酸化の程度を検出する工程については、限定されないが、抗リン酸化ＥｒｂＢ４抗体（例えばTyr1284（Cell Signaling、Danvers、MA、USA））を用いたウエスタンブロッティング法やラジオアイソトープを用いた方法を利用することができる。
【００６９】
(iii)の選択工程においては、ＥｒｂＢタンパク質の自己リン酸化を促進する物質を選択するが、検出工程において検出されるリン酸化の程度が、候補物質の非存在下の場合と比較して強い場合は、使用された候補物質がＥｒｂＢ４タンパク質の自己リン酸化を促進する物質であるとして評価及び選択することができる。当該リン酸化の程度がより大きいほどほど、ＥｒｂＢタンパク質の自己リン酸化を促進する活性がより高い物質であると評価することができる。
【００７０】
本発明のスクリーニング方法は、ＥｒｂＢ４タンパク質の自己リン酸化を促進する活性を有する物質を簡易に且つ大規模にスクリーニングするために用いることができるため、ＡＬＳの治療薬開発を強力に推し進めることができる点で、極めて有用性の高いものである。
【００７１】
本発明は、上記本発明のスクリーニング方法により得られた化合物またはその塩を含む、ＡＬＳ治療用の医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物またはその塩を活性成分として含み、さらに薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。本発明の医薬組成物は、ＡＬＳ治療剤として使用することが期待される。
【００７２】
「薬学的に許容され得る担体」は、製剤において通常使用される担体であり、例えば賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、1つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。
【００７３】
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される活性成分である化合物またはその塩の種類などにより異なるが、例えば、活性成分である化合物またはその塩を、通常成人一人（体重60kg）当たり、一回につき10μgから1000mgの範囲で投与することができるが、この範囲に限定されるものではない。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７５】
［実施例１］ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）の同定
本実施例において、遅発性ＡＬＳを起こしている３人の発症した兄弟姉妹を有する日本人家族を同定した（図１ａ、表６）。
【００７６】
家族歴は、おそらく常染色体優性の遺伝であることを示した。ダイレクトヌクレオチド配列解析を使用する発端者（ＩＩ−４）の突然変異解析、マイクロアレイベース再配列決定、またはリピートプライムドＰＣＲ（ｒｅｐｅａｔ−ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ）解析により、原因遺伝子としてＳＯＤ１、ＡＬＳ２、ＤＣＴＮ１、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＡＮＧ、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ、およびＣ９ＯＲＦ７２が除外された。ＦＡＬＳの新規原因遺伝子を同定するために、この家系に対して連鎖解析と組み合わせてＷＧＳを実施した。
【００７７】
指標の家系における３人の個人（Ｉ−２、ＩＩ−３、およびＩＩ−４、図１ａ）にＷＧＳを実施した。ペアエンドＤＮＡライブラリーを生成し、製造者の指示書に従ってGAII Illumina Genome Analyzerを使用して大量並列シーケンシングにかけた。得られたショートリード配列を、Burrows-Wheeler Alignerを使用して参照ゲノム（ＮＣＢＩ３７／ｈｇ１９アセンブリー）に対して整列させた。潜在的なＰＣＲ複製物が除去された下流分析を、SAMtoolsを使用して処理した。整列されたリードを、Integrative Genomics Viewerを使用して調べた。SAMtoolsのパイルアップコマンド（pileup command）を使用してゲノム配列変異を同定し、Refseq、dbSNP135、1000ゲノム、個人ゲノムデータベース、NHLBI GO Exome Sequencing Project（NHLBI-ESP）データベース、および日本人集団における４１の全ゲノムおよび１４０８のエクソームを含有する社内変異体データベースを使用してアノテートした。
【００７８】
Ｉ−２、ＩＩ−３、およびＩＩ−４において同定された新規でアミノ酸置換を伴う非同義変異体の数は、それぞれ４１１、４０４、および３８２であった（表２）。この中には、ＦＡＬＳについての公知の原因遺伝子における新規非同義変異体は、まったく含まれなかった。これらの中で、５７の変異体が発端者および発症した兄弟姉妹の両方において同定されたが、母において同定されず、これらをさらなる解析にかけた。
【００７９】
【表２】
2015029460.tif 000003
【００８０】
ドットで示した個人（図１ａ）の遺伝子型を、ゲノム全域にわたるヒトＳＮＰアレイ６．０（Affymetrix、Santa Clara, CA, USA）を使用して同定した。0.000001の疾患対立遺伝子頻度を伴った遺伝の常染色体優性形式を仮定して、パイプラインソフトウェアSNP-HiTLinkおよびAllegroバージョン２を用いて連鎖解析およびハロタイプ再構築を行った。
【００８１】
その結果、完全浸透度を仮定したパラメトリック多点連鎖解析により、１．８の最大ＬＯＤスコアを伴って染色体１、６、および１３上に２３．６Ｍｂに及ぶ３つの遺伝子座が明らかになった（図１ｂ、浸透度＝１．０）。しかし、上記の新規非同義変異体は、候補領域においていずれも同定されなかった。
【００８２】
そのため、浸透度の低減の可能性を考慮したところ、浸透度が０．８に低減される場合、７つの追加の遺伝子座が、０．７超のＬＯＤスコアを伴って連鎖を支持することが示された（図１ｂ、浸透度＝０．８）。そして、３つのヘテロ接合性新規非同義変異体がこれらの領域内で同定され、これらの中で、v-erb-a赤芽球性白血病ウイルス発癌遺伝子同族体４（avian）（ＥＲＢＢ４［NM_001042599.1］）における変異体ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）のみが、４７７個の対照において存在しなかった（表３）。
【００８３】
【表３】
2015029460.tif 000004
【００８４】
また、浸透度をさらに低減させた場合、０を超えるＬＯＤを伴って、１９の追加の遺伝子座が同定された。これらの領域内で、７つのヘテロ接合性新規非同義変異体が同定されこれらの中で、ＯＲ２Ｄ３（NM_001004684.1）、ＦＴＣＤ（NM_206965.1）、およびＴＪＰ２（NM_001170414.2）における３つの変異体は、４７７個の対照において存在しなかった（表３）。ＯＲ２Ｄ３は、嗅覚受容体遺伝子であり、ＯＲ２Ｄ３中の突然変異アミノ酸は、保存されておらず、この突然変異は、ＰｏｌｙＰｈｅｎ−２解析によって良性として予測された。ＦＴＣＤおよびＴＪＰ２はそれぞれ、常染色体劣性グルタミン酸ホルムイミノトランスフェラーゼ欠損症（ＯＭＩＭ２２９１００）および家族性高胆汁性貧血（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌａｎｅｍｉａ）（ＯＭＩＭ６０７７４８）の原因遺伝子であり、ヘテロ接合保因者は、ＡＬＳを呈するように記述されていない。
【００８５】
以上の結果を総合すると、ＥＲＢＢ４中の変異体ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）が、最も可能性の高い病原性の突然変異であることが明らかとなった。
【００８６】
［実施例２］ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）の解析およびｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１２７５Ｗ）の同定
【００８７】
（１）ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）の解析
３６４人のＦＡＬＳ患者および８１８人の孤発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ）患者におけるＥＲＢＢ４の突然変異解析を、ABI3100シーケンシング装置およびBigDye Terminatorバージョン３．１（Applied Biosystems、Foster City, CA, USA）を使用して、ダイレクトヌクレオチド配列解析法により行った。オリゴヌクレオチドプライマーは、ExonPrimerウェブサイト(http://ihg.gsf.de/ihg/ExonPrimer.html)を使用して設計した（表４）。変異体の配列は、Takara LATaq (Takara Bio, Otsu, Shiga, Japan)を用いるゲノムＰＣＲ解析およびABI 3100 sequencer and BigDye Terminator ver3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いるサンガーシーケンシングにより確認した。ＰＣＲの条件は、以下のとおりである：95℃ 2分、続いて95℃ 30秒、60℃ 30秒、68℃ 1分からなるサイクルを35サイクル、最後に68℃ 7分の伸長ステップ。
【００８８】
【表４】
2015029460.tif 000005
2015029460.tif 000006
表４中、ERBB4_Ex23F1およびERBB4_Ex23R1がc.2780G>Aを検出するためのプライマーであり、ERBB4_Ex28F1およびERBB4_Ex28R1がc.3823C>Tを検出するためのプライマーである。
【００８９】
解析の結果、同じ突然変異ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）が、１人のカナダ人ＦＡＬＳ患者において同定された（図２ａ）。残念ながら、他の家族メンバーからのＤＮＡは、分離を確認するためには入手することができなかった。
【００９０】
（２）ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１２７５Ｗ）の同定
興味深いことに、ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１２７５Ｗ）の新規突然変異を、日本人ＳＡＬＳ患者において確認した。当該患者は、生物学的親−子孫関係がＰｌｉｎｋアルゴリズムを使用して確認された（表５）。
【００９１】
【表５】
2015029460.tif 000007
【００９２】
（３）本発明のこれらの突然変異は、４７７人の日本人対照において存在せず、４１の全ゲノムおよび１４０８のエクソームを含有する社内データベース、１０００ゲノムデータベース、または６５０３のエクソームを含有するＮＨＬＢＩ−ＥＳＰデータベース中に登録されていなかった。さらに、ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ９２７Ｑ）は、１９０人の白人対照において存在しなかった。
【００９３】
異なる民族的背景の２つの独立した家族におけるｐ．Ｒ９２７Ｑの同定により、ＡＬＳの原因突然変異としてｐ．Ｒ９２７Ｑが強く支持された。また、新規突然変異率が、１世代当たり１ヌクレオチド当たり１．２０×１０−８であり、および非同義単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）が１未満／世代であると推定されたことを考慮すると、新規突然変異の結果は、ｐ．Ｒ１２７５Ｗがおそらくこの患者におけるＡＬＳの原因突然変異であるという考えをさらに支持する。
【００９４】
本発明の２つの突然変異、すなわちＲ９２７およびＲ１２７５において置換されたアルギニン残基は、種の中で高度に保存されている（図２ｂ）。この点、本発明の突然変異は、PolyPhen-2解析によって、有害な変異であることが予想される。アミノ酸残基Ｒ９２７は、受容体チロシンキナーゼ活性に必須なＥｒｂＢ４タンパク質のチロシンキナーゼドメイン内に存在する。また、Ｒ１２７５は、下流のシグナル伝達経路を媒介する複数のリン酸化部位の近傍のＣ末端ドメイン内に位置している（図２ｃ）。
【００９５】
（４）ＥＲＢＢ４突然変異を有するこれらのＡＬＳ患者の臨床症状を表６に要約する。患者の共通の臨床的特徴には、El Escorial and Airlie House改定診断基準によって確実な、または推定されるＡＬＳとして診断された上位運動ニューロンおよび下位運動ニューロンの両方の関与、相対的に遅い進行、ならびに明らかな認知障害がまったくないことが含まれた。ｐ．Ｒ９２７Ｑ突然変異を有する患者は、浸透度がわずかに低減された、相対的に遅い発症（発病時の年齢は、６０〜７０の範囲である）を特徴とした。対照的に、ｐ．Ｒ１２７５Ｗ突然変異を有する患者は、早期の発病（年齢４５歳）を特徴とした。
【００９６】
【表６】
2015029460.tif 000008
【００９７】
［実施例３］
ＡＬＳ患者において同定された本発明の２つの突然変異が、ＥｒｂＢ４機能にどのように影響するかを判定するために、本実施例を行った。本実施例では、ＮＲＧ−１の存在下で、野生型または突然変異体（ｐ．Ｒ９２７Ｑまたはｐ．Ｒ１２７５Ｗ）のＥｒｂＢ４を発現する細胞内のＥｒｂＢ４の自己リン酸化を測定した。
【００９８】
Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）に記載されたプロトコールに従って、部位特異的突然変異によって、ＨＡタグ付きErbB4 JM-a CYT-2をコードするpBABE-puroERBB4JM-aCYT-2HAプラスミド中にＥｒｂＢ４突然変異を導入した。突然変異誘発後、すべてのコンストラクトを配列決定によって確証した。製造者の指示書に従って、FuGENE6トランスフェクション試薬（Roche、Basel、Swizerland）を使用して、ＣＯＳ−７細胞内にプラスミドを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション細胞を、一晩血清を欠乏させ、０または５０ng/mlのＮＲＧ−１（R＆D、Minneapolis、MN、USA）を用いて、３７℃で１０分間刺激した。刺激した後、細胞を溶解させ、５０μｇの全タンパク質に等価な試料を、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを通じて分離した。ＥｒｂＢ４リン酸化および全ＥｒｂＢ４発現を、それぞれ、ホスホ−ＥｒｂＢ４（Tyr1284）（Cell Signaling、Danvers、MA、USA）およびＨＡ−タグ（Abcam、Cambridge、UK）に対する抗体を用いて、ウエスタンブロッティングによって検出した。
【００９９】
その結果、２つの突然変異体ｐ．Ｒ９２７Ｑおよびｐ．Ｒ１２７５Ｗは、ＥｒｂＢ４の自己リン酸化の明確な低減を示した（図３）。
【０１００】
本実施例による遺伝学的データおよび機能的データに基づいて、本発明の２つの突然変異がＡＬＳの原因突然変異であると結論することができる。そして、本発明により、ＡＬＳ診断のためにＥＲＢＢ４遺伝子変異を検出する方法を確立することができた。この方法によりＡＬＳの早期発見、診断および治療をもたらすものであると期待される。
【０１０１】
本発明により、ＮＲＧ−１刺激におけるＥｒｂＢ４自己リン酸化の低減が、ＡＬＳの病因に関与していることが明らかになった。ＥｒｂＢ４は、ラット脊髄の大型運動ニューロンの細胞体内で特異的に発現される。ＥｒｂＢ４の欠如は、マウスにおいて胚致死性であり、これは、胚形成の間の運動ニューロン軸索誘導および経路探索の撹乱を示す。ヘテロ接合性ヌルマウスは、体重減少および運動発達遅延を示し、脳特異的条件付きノックアウトマウスは、後肢の自発運動活性および握力の低減を実証する。ＮＲＧ−１のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）アイソフォーム欠損マウス（ＣＲＤ−ＮＲＧ−１−／−）は、呼吸不全のために周産期に死亡し、検出可能な肢の運動を欠き、脊髄運動ニューロンの約６０％の喪失を示す。同様に、運動ニューロンおよび知覚ニューロン特異的条件付きＮＲＧ−１ノックアウトマウスは、出生時に死亡し、運動ニューロン軸索の顕著な退縮を示した。さらに、ＣＲＤ−ＮＲＧ−１発現レベルの減少が、疾患発症時のＦＡＬＳ患者およびＳＡＬＳ患者ならびにＳＯＤ１突然変異体マウスにおける脊髄運動ニューロン中に検出され、ＮＲＧ−ＥｒｂＢ経路の破壊が、一般に、ＡＬＳの根底をなす運動ニューロン変性に関与している可能性を高めている。
【０１０２】
本発明は、ＡＬＳ病因の新規側面をもたらすものであり、ＮＲＧまたはこれらのアゴニストを使用して、ＥｒｂＢ４機能を上方制御することなどの画期的な治療戦略を開発する道を開くことが期待される。
【配列表フリーテキスト】
【０１０３】
配列番号１：ヒトＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列（アクセッション番号NM_005235.2）。
配列番号２：ヒトＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_005226）。
配列番号３〜５８：プライマー。
配列番号５９：「ｃ．２７８０Ｇ＞Ａ」を有するヒトＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列。
配列番号６０：「ｐ．Ｒ９２７Ｑ」を有するヒトＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列。
配列番号６１：「ｃ．３８２３Ｃ＞Ｔ」を有するヒトＥＲＢＢ４遺伝子の塩基配列。
配列番号６２：「ｐ．Ｒ１２７５Ｗ」を有するヒトＥｒｂＢ４タンパク質のアミノ酸配列。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【配列表】
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