(57)【要約】【課題】ポリビニルアルコール系樹脂を分解する菌を提供すること。【解決手段】アンシロバクター属細菌及びスフィンゴピキス属細菌を共生させて用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンシロバクター属細菌及びスフィンゴピキス属細菌を含むポリビニルアルコール系樹脂の分解菌。
【請求項２】
アンシロバクター属細菌が受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６５１、スフィンゴピキス属細菌が受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６５２である請求項１記載のポリビニルアルコール系樹脂の分解菌。
【請求項３】
請求項１又は２記載の分解菌をポリビニルアルコール系樹脂に接触させることを含むポリビニルアルコール系樹脂の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリビニルアルコール(以下、ＰＶＡという)系樹脂の分解菌、及び分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＶＡ系樹脂は代表的な水溶性樹脂として広く知られており、その優れた界面活性、皮膜特性（造膜性、透明性、強度、耐油性等）、等を利用し、分散剤、乳化剤、懸濁剤、繊維加工剤、紙加工剤、接着剤、バインダー、繊維やフィルムの原料などに広く利用されている。
【０００３】
近年、環境問題への関心の高まりにより、各種化合物を環境に放出する前に分解処理し、環境への負荷を低減する技術が注目されている。特にＰＶＡ系樹脂は水溶液として使用されることが多く、ＰＶＡ系樹脂廃液の活性汚泥などによる微生物処理の検討がなされ、分解菌の探索も進められている。
【０００４】
ＰＶＡ系樹脂に対して分解能を有する微生物としては、例えば、スフィンゴモナス属細菌（例えば、特許文献１、２参照。）、コマモナス属細菌（例えば、特許文献３参照。）、ミクロバクテリウム属細菌（例えば、特許文献４参照。）、シュードモナス属細菌、アシネトバクター属細菌（例えば、特許文献５参照。）などが見出されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−２５０５２７号公報
【特許文献２】特開２００５−２７８６３９号公報
【特許文献３】特開２００６−０４２６１１号公報
【特許文献４】特開２００６−０４２６１２号公報
【特許文献５】特開２００６−１８０７０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のとおり、ＰＶＡ系樹脂の分解菌としてこれまでも多数のものが知られているが、温度やｐＨなどの環境による影響や、廃液処理時に共存する物質に関わらず、優れた分解能力を得ることができるように、特性が異なる様々な種類の分解菌を得ることが必要である。
すなわち本発明は、ＰＶＡ系樹脂に対し、優れた分解能力を有する新たな菌を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記実情に鑑み、鋭意検討した結果、それぞれ単独ではＰＶＡ系樹脂に対する分解能を有さない２種の菌を用い、これらを共生させることによってＰＶＡ系樹脂を良好に分解できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ＰＶＡ系樹脂の分解に際し、アンシロバクター属細菌及びスフィンゴピキス属細菌を共生させて用いることを特徴とするものであり、アンシロバクター属細菌及びスフィンゴピキス属細菌を含むポリビニルアルコール系樹脂の分解菌組成物である。本発明の分解菌組成物はポリビニルアルコール系樹脂用分解剤と言い換えることもできる。
また、本発明は、アンシロバクター属細菌及びスフィンゴピキス属細菌をポリビニルアルコール系樹脂に接触させる工程を含むポリビニルアルコール系樹脂の分解方法である。
なお、本明細書においては本発明の分解菌組成物を「本発明の分解菌」や「本発明細菌」ともいう。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＰＶＡ系樹脂の分解菌、及び分解方法は、各種排水、排液、土壌、河川、湖沼等の浄化処理、コンポスト処理におけるＰＶＡ系樹脂の分解・資化に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
まず、本発明で用いられる分解菌について説明する。
本発明は、ＰＶＡ系樹脂の分解菌としてアンシロバクター属細菌及びスフィンゴピキス属細菌を共生させて使用することを特徴とするものであるが、かかる細菌はいずれも広く自然界に存在するものであり、例えば土壌あるいは工場等の活性汚泥を集積培養し、その培養液を寒天培地上で分離・純化することにより、特定の菌株として単離できる。
【００１１】
本発明において用いられるアンシロバクター属細菌としては、例えば、実施例記載の方法によって単離されたアンシロバクター・ポリモルファスに近縁な菌（ＧＢＭ−Ｗ１）を挙げることができ、かかる菌（ＧＢＭ−Ｗ１）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、２０１３年７月３１日付で受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６５１として寄託されている。
【００１２】
また、本発明において用いられるスフィンゴピキス属細菌としては、例えば、実施例記載の方法によって単離されたスフィンゴピキス・テラエとスフィンゴピキス・ウマリエンシスに近縁な菌（ＧＢＭ−Ｙ１）を挙げることができ、かかる菌（ＧＢＭ−Ｙ１）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、２０１３年７月３１日付で受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６５２として寄託されている。
【００１３】
なお、これらの菌株の培養条件及び生理学的特徴を以下に記載する。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
【表２】
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【００１６】
【表３】
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【００１７】
【表４】
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【００１８】
【表５】
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【００１９】
【表６】
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【００２０】
以上の試験は、下記の文献１及び２に記載された方法および同定キット・アピ２０ＮＥ（ビオメリュー社製）により行った。
文献１；Barrow, G. I. and Feltham, R. K. A. (1993) Cowan
and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd edition. Cambridge University Press, Cambridge.
文献２；坂崎利一，吉崎悦郎，三木寛二 (1988) 新細菌培地学講座・下Ｉ＜第二版＞近代出版・東京
【００２１】
また、菌（ＧＢＭ−Ｗ１）および菌（ＧＢＭ−Ｙ１）の16S rDNA塩基配列について、BLASTを用いたアポロンDB-BA 7.0および国際塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL)に対する相同性検索を行った結果、菌（ＧＢＭ−Ｗ１）は、アンシロバクター・プリモファスの16S rDNA塩基配列に対し、相同率９９．９％の高い相同性を示し、菌（ＧＢＭ−Ｙ１）は、スフィンゴピキス・テラエの16S rDNA塩基配列に対し、相同率９９．８％、スフィンゴピキス・ウマリエンシスの16S rDNA塩基配列に対し、相同率９９．７％の高い相同性を示した。
【００２２】
なお、本発明においては、上記の細菌をそのまま用いるほかに、上記細菌を含む微生物群やそれらの菌体成分を用いることもできる。かかる菌体成分としては、アンシロバクター属及びスフィンゴピキス属に属する菌の菌体抽出物、菌体抽出液、培養液、培養瀘液等（粗酵素液）及びその濃縮または精製物が含まれる。また、上記の細菌、上記細菌を含む微生物群、又はそれらの菌体成分を既知の方法で固定化したものも用いることができる。
【００２３】
次に、本発明の分解菌によって分解可能なＰＶＡ系樹脂について説明する。
一般的にＰＶＡ系樹脂は、酢酸ビニルに代表されるビニルエステル系単量体の重合によって得られるポリビニルエステル系樹脂をケン化することにより得られるもので、ビニルアルコール単位を主構成単位とし、そのケン化度に応じて酢酸ビニル等のビニルエステル単位を有するものである。
【００２４】
またこのようなビニルアルコール単位とビニルエステル単位のみからなる未変性ＰＶＡの他に、各種変性基を有するＰＶＡ系樹脂も知られており、様々な用途で広く用いられている。かかる変性基を有するＰＶＡ系樹脂としては、ビニルエステル系樹脂の製造時に各種単量体を共重合させ、これをケン化して得られたものや、未変性ＰＶＡに後変性によって各種官能基を導入した各種変性ＰＶＡ系樹脂が挙げられる。
【００２５】
ビニルエステル系モノマーとの共重合に用いられる単量体としては、エチレンやプロピレン、イソブチレン、α−オクテン、α−ドデセン、α−オクタデセン等のオレフィン類、３−ブテン−１−オール、４−ペンテン−１−オール、５−ヘキセン−１−オール、３，４−ジヒドロキシ−１−ブテン等のヒドロキシ基含有α−オレフィン類およびそのアシル化物などの誘導体、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、無水マレイン酸、イタコン酸等の不飽和酸類、その塩、モノエステル、あるいはジアルキルエステル、アクリロニトリル、メタアクリロニトリル等のニトリル類、ジアセトンアクリルアミド、アクリルアミド、メタクリルアミド等のアミド類、エチレンスルホン酸、アリルスルホン酸、メタアリルスルホン酸等のオレフィンスルホン酸類あるいはその塩、アルキルビニルエーテル類、ジメチルアリルビニルケトン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、ビニルエチレンカーボネート、２，２−ジアルキル−４−ビニル−１，３−ジオキソラン、グリセリンモノアリルエーテル、３，４−ジアセトキシ−１−ブテン、等のビニル化合物、酢酸イソプロペニル、１−メトキシビニルアセテート等の置換酢酸ビニル類、塩化ビニリデン、１，４−ジアセトキシ−２−ブテン、ビニレンカーボネート、等が挙げられる。
【００２６】
また、後反応によって官能基が導入された変性ＰＶＡ系樹脂としては、ジケテンとの反応によるアセトアセチル基を有するもの、エチレンオキサイドとの反応によるポリアルキレンオキサイド基を有するもの、エポキシ化合物等との反応によるヒドロキシアルキル基が有するもの、あるいは各種官能基を有するアルデヒド化合物をＰＶＡとアセタール化反応させて得られたものなどを挙げることができる。
【００２７】
本発明の分解菌は、このような未変性ＰＶＡや各種変性ＰＶＡ系樹脂に対して良好な分解能を示すものである。
なお、分解菌によって分解される部位はＰＶＡ系樹脂の主鎖であって、かかる主鎖構造は未変性ＰＶＡおよび各種変性ＰＶＡ系樹脂に共通するものである。変性ＰＶＡ系樹脂においては、変性基の立体障害等が分解速度等に影響を及ぼすことも考えられる。しかしながら、本発明の実施例では、本発明の分解菌の効果を、側鎖に１，２−ジオール基を有する変性ＰＶＡ系樹脂で検証しており、本発明の分解菌がかかる変性ＰＶＡ系樹脂に対して効果的であることは、ＰＶＡ系樹脂全般に対する優れた分解能力を示すものであると推測される。
【００２８】
また、本発明で用いられる分解菌は、ＰＶＡ系樹脂の重合度やケン化度を問わず、これを分解・資化することができ、通常、重合度が２００〜５０００、特に３００〜３０００、殊に３００〜５００のものに対して好適に用いることができる。また、ケン化度に関しては、通常、６０〜１００モル％、特に８０〜９９．９モル％、殊に９８〜９９．８モル％のものに対して良好な分解能を有するものである。
変性ＰＶＡ系樹脂を分解する場合、その変性度が、通常２０モル％以下、特に１０モル％以下、殊に８モル％以下のものに対して良好な分解能を示す。
【００２９】
次に、本発明の分解菌を用いたＰＶＡ系樹脂の分解方法について説明する。
本発明の分解菌は、通常、ＰＶＡ系樹脂を微生物によって分解する様々な状況下において使用可能であり、例えば排水浄化の場合には個別発生源に本発明細菌、かかる細菌を含む微生物群又はその菌体成分を固定化した処理装置を取り付ける手段、排水処理場において本発明細菌、かかる細菌を含む微生物群又はその菌体成分を添加する手段、土壌浄化の場合には土壌に本発明細菌、かかる細菌を含む微生物群又はその菌体成分を施用する手段等が挙げられる。
また、環境浄化の場合には、自然環境の河川や湖沼に本発明細菌、かかる細菌を含む微生物群又はその菌体成分を施用する手段を採用することができる。更にＰＶＡ系樹脂を含有する製品に、予め本発明の細菌、かかる細菌を含む微生物群又はその菌体成分を配合しておいてもよい。
【００３０】
本発明の分解菌を用いてＰＶＡ系樹脂を分解する際の温度条件としては、特に限定されるものではないが、通常は５〜４０℃、特に１５〜３５℃の範囲が好適であり、かかる温度が高すぎても低すぎても分解能が低下する傾向がある。
また、分解処理時のｐＨは、通常４〜１０、特に５〜８の範囲が好ましく用いられ、ｐＨが低すぎても高すぎても分解能が低下する傾向がある。かかるｐＨの調整は、公知の手段、例えば酸性物質、あるいはアルカリ性物質の添加によって行うことができる。
更に、微生物の活性を高めるために各種無機塩あるいは有機性の栄養源を使用することも出来る。かかる有機性の栄養源としては、例えばカゼインペプトンや大豆ペプトンなどの各種蛋白質加水分解物、酵母エキス、牛肉エキス、麦芽エキスなどの各種エキス類、各種ビタミン類、ピロロキノリンキノンなどが挙げられる。
【００３１】
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
＜ＰＶＡ系樹脂（Ａ１）の製造＞
還流冷却器、攪拌機を備えた反応容器に、酢酸ビニル７６．６部(初期仕込み率４０％)、メタノール１４．２部、３，４−ジアセトキシ−１−ブテン９．２部(初期仕込み率４０%)を仕込み、アゾビスイソブチロニトリルを（対仕込み酢酸ビニル０．０６８モル％）投入し、攪拌しながら窒素気流下で温度を上昇させ、還流状態とすることで重合を開始し、その後、酢酸ビニルと３，４−ジアセトキシ−１−ブテンを１３．５時間等速滴下した。酢酸ビニルの重合率が９１％となった時点で、ｍ−ジニトロベンゼンを添加して重合を終了し、続いて、メタノール蒸気を吹き込む方法により未反応の酢酸ビニルモノマーを系外に除去し共重合体のメタノール溶液とした。
【００３３】
ついで、上記メタノール溶液をさらにメタノールで濃度５０％に希釈してニーダーに仕込み、溶液温度を３５℃に保ちながら、水酸化ナトリウムの２％メタノール溶液を共重合体中の酢酸ビニル構造単位および３，４−ジアセトキシ−１−ブテン構造単位の合計量１モルに対して１２ミリモルとなる割合で加えてケン化を行った。ケン化が進行するとともにケン化物が析出し、粒子状となった時点で濾別し、メタノールでよく洗浄して熱風乾燥機中で乾燥し、目的とするＰＶＡ系樹脂（Ａ１）を作製した。
【００３４】
得られたＰＶＡ系樹脂（Ａ１）のケン化度は、残存酢酸ビニルおよび３，４−ジアセトキシ−１−ブテンの加水分解に要するアルカリ消費量にて分析したところ、９９モル％であった。また、平均重合度は、ＪＩＳ  Ｋ  ６７２６に準じて分析を行ったところ、４７０であった。また、側鎖に１，２−ジオール成分を有する構造単位の含有量は、１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨzプロトンＮＭＲ、ｄ６−ＤＭＳＯ溶液、内部標準物質；テトラメチルシラン、５０℃）にて測定した積分値より算出したところ、６モル％であった。
【００３５】
＜ＰＶＡ液体培地の作製＞
表７に示すＡ液、Ｂ液、Ｃ液、Ｄ液を用い、表８に示す組成でこれらを混合し、ＰＶＡ液体培地を作製した。
【００３６】
【表７】
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【００３７】
【表８】
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【００３８】
＜ＰＶＡ平板培地、ＰＶＡ−ＹＥ平板培地の作製＞
Ａ液、Ｂ液、Ｃ液、Ｄ液を用い、表９に示す組成でこれらを混合し、ＰＶＡ平板培地を作製した。また、同一組成で、さらに酵母エキスＤ−３（日本製薬社製）を１ｍｇ配合したものをＰＶＡ−ＹＥ平板培地とした。
【００３９】
【表９】
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【００４０】
＜ＰＶＡ−ＹＥ液体培地、ＰＶＡ−ＰＢＭＹ液体培地の作製＞
Ａ液、Ｂ液、Ｃ液、Ｄ液を用い、表１０に示す組成でこれらを混合し、ＰＶＡ−ＹＥ液体培地を作製した。また、同一組成で、さらにポリペプトンＳ（日本製薬社製）を０．０７５ｍｇ、Ｍａｌｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）を０．０７５ｍｇ、Ｂｅｅｆ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）を０．０７５ｍｇ配合したものをＰＶＡ−ＰＢＭＹ液体培地とした。
【００４１】
【表１０】
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【００４２】
＜分解菌の集積培養＞
日本合成化学工業株式会社大垣工場（岐阜県大垣市神田町二丁目３５番地）の汚泥を採取し、上記ＰＶＡ液体培地に汚泥を接種して、２７℃で振とう培養した。培養液の濁りの増加を目視で観察し、および培養液中のＰＶＡ系樹脂濃度を下記の方法で測定した。かかる濃度の減少が認められた培養液を、再度新たなＰＶＡ液体培地に接種した。この操作を３回繰り返した。
【００４３】
＜ＰＶＡ系樹脂濃度の測定方法＞
培養液を１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上澄みを測定用試料とした。下記の表１１に示す組成の溶液を混合した後、室温で１０分間放置し、６９０ｎｍの吸光度を測定した。既知の濃度の試料を用いて作成した検量線から、培養液中のＰＶＡ系樹脂濃度を求めた。
【００４４】
【表１１】
2015029478.tif 000012
【００４５】
＜培養液中の微生物の分離＞
上記で得られた集積培養液を最大１０７倍まで希釈し、その１００μｌを、ＰＶＡ平板培地に塗布し、３０℃で培養した。
かかるＰＶＡ平板培地上に生育したコロニー４４個を釣菌して、ＰＶＡ−ＹＥ液体培地に接種し、２７℃で振とう培養した。
その中の１株について、培養３３日目に、培養液中のＰＶＡ系樹脂濃度の減少が確認された。かかる培養液を最大１０７倍まで希釈し、普通寒天培地（日水製薬社製)を用いて作成した平板培地に１００μｌを塗布、３０℃で培養した後、白色コロニーを形成する菌（ＧＢＭ−Ｗ１）と黄色コロニーを形成する菌（ＧＢＭ−Ｙ１）が認められた。
【００４６】
実施例１
普通寒天平板培地から菌（ＧＢＭ−Ｗ１）株および菌（ＧＢＭ−Ｙ１）株を1コロニーずつ分離し、それぞれＰＶＡ−ＰＢＭＹ液体培地で培養した。得られた培養液をＧＢＭ−Ｗ１：ＧＢＭ−Ｙ１＝１０：１の割合で混合後、ＰＶＡ−ＰＢＭＹ液体培地に接種して培養したところ、培養４３日目の培養上清中のＰＶＡ系樹脂量の減少率が９３．５％となり、ＰＶＡ系樹脂分解能が確認された。
【００４７】
比較例１
普通寒天平板培地から菌（ＧＢＭ−Ｗ１）株を１コロニー分離し、ＰＶＡ−ＰＢＭＹ液体培地で培養した。その結果、培養４３日目にいたるまで培養上清中のＰＶＡ系樹脂量の減少は認められなかった。
【００４８】
比較例２
普通寒天平板培地から菌（ＧＢＭ−Ｙ１）株を１コロニー分離し、ＰＶＡ−ＰＢＭＹ液体培地で培養した。その結果、培養４３日目にいたるまで培養上清中のＰＶＡ系樹脂量の減少は認められなかった。
【００４９】
これらの結果より、菌（ＧＢＭ−Ｗ１）、及び菌（ＧＢＭ−Ｙ１）は、単独ではＰＶＡ系樹脂に対する分解能を持たないが、共生させることにより、ＰＶＡ系樹脂に対する分解能が発現した。