(57)【要約】      （修正有）【課題】セルロース系バイオマスの酵素糖化処理を行うためにアクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼ酵素、前記β−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド、前記β−グルコシダーゼを発現するための発現ベクター、前記発現ベクターが組み込まれた形質転換体及び前記β−グルコシダーゼを用いたセルロース分解物の製造方法の提供。【解決手段】β−グルコシダーゼ活性を有し、特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド、前記アミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド又は前記アミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
からなるβ−グルコシダーゼ触媒ドメインを有する、β−グルコシダーゼ。
【請求項２】
ｐＨ３．０〜５．５、３０〜６０℃において、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドを基質としたβ−グルコシダーゼ活性を有する、請求項１に記載のβ−グルコシダーゼ。
【請求項３】
β−グルコシダーゼ触媒ドメインをコードする領域を有し、前記領域が、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドが組み込まれており、
宿主細胞において、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
【請求項６】
真核微生物である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
糸状菌である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の形質転換体内で、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを生産することを含む、β−グルコシダーゼの製造方法。
【請求項９】
請求項１若しくは２に記載のβ−グルコシダーゼ又は請求項８に記載のβ−グルコシダーゼの製造方法によって製造されたβ−グルコシダーゼと、少なくとも１種のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物。
【請求項１０】
セルロースを含む材料を、請求項１若しくは２に記載のβ−グルコシダーゼ又は請求項８に記載のβ−グルコシダーゼの製造方法によって製造されたβ−グルコシダーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産することを含む、セルロース分解物の製造方法。
【請求項１１】
前記セルロースを含む材料に、さらに少なくとも１種のその他のセルラーゼを接触させることを含む、請求項１０に記載のセルロース分解物の製造方法。
【請求項１２】
前記セルロースを含む材料に、さらに、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドロラーゼと、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼとを接触させることを含む、請求項１０に記載のセルロース分解物の製造方法。
【請求項１３】
前記セルロースを含む材料に、さらに、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドロラーゼと、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、少なくとも１種のヘミセルラーゼとを接触させることを含む、請求項１０に記載のセルロース分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来の新規β−グルコシダーゼ酵素に関する。より詳細には、新規のβ−グルコシダーゼ、当該β−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド、当該β−グルコシダーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組み込まれた形質転換体、及び当該β−グルコシダーゼを用いたセルロース分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球温暖化や大気汚染などの環境上の問題に加えて、原油価格の大幅上昇や近い将来の原油枯渇予想（ピークオイル）など輸送用エネルギー供給に関わる懸念から、近年、石油代替エネルギー開発は非常に重要な課題である。植物バイオマスやリグノセルロース等のセルロース系バイオマスは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源であり、石油代替資源として期待されている。植物バイオマスの主要構成要素は、セルロース、又はヘミセルロース等の多糖類とリグニンである。例えば、多糖類は、セルラーゼ酵素と総称されるグリコシド加水分解酵素によってグルコースやキシロースなどの単糖に加水分解された後、バイオ燃料や化成品原料として利用される。このため、バイオリファイナリー分野においては、セルロース系バイオマスの酵素糖化処理を効率よく行うために、活性の高い多種多様なセルラーゼ酵素の開発が重要である。
【０００３】
複雑な構造を持つリグノセルロースは難分解性であり、単一の酵素では分解、又は糖化が難しい。リグノセルロースの全分解には、一般的に、グリコシド加水分解酵素のエンドグルカナーゼ（セルラーゼ又はエンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．９１）、及びβ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）の３種の酵素が必要とされる。リグノセルロースの加水分解には、その他にも、ヘミセルラーゼであるキシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．８）や、他の植物細胞壁分解酵素も含めた複数の酵素の適切な配合が必要であると考えられている。
【０００４】
一方で、アクレモニウム・セルロリティカスは、糖化力の強いセルラーゼを生産する糸状菌であり、現在までに、２種類のセロビオハイドロラーゼ遺伝子、３種のβ−グルコシダーゼ遺伝子、及び７種のエンドグルカナーゼ遺伝子が単離されている（例えば、特許文献１参照。）。エンドグルカナーゼは、セルロース、又はヘミセルロース等のリグノセルロースをランダムに切断して分解し、単糖を生成するプロセスに関わるグリコシド加水分解酵素の一つである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１４８４２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、アクレモニウム・セルロリティカス由来の新規β−グルコシダーゼ酵素、当該β−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド、当該β−グルコシダーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組み込まれた形質転換体、及び当該β−グルコシダーゼを用いたセルロース分解物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、活性の高い新規なセルラーゼ酵素を開発すべく鋭意研究した結果、アクレモニウム・セルロリティカスから新規なセルラーゼ遺伝子を単離し同定することにより、本発明を完成させた。
【０００８】
［１］本発明の第一の態様は、
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
からなるβ−グルコシダーゼ触媒ドメインを有する、β−グルコシダーゼである。
［２］前記［１］のβ−グルコシダーゼは、ｐＨ３．０〜５．５、３０〜６０℃において、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシドを基質としたβ−グルコシダーゼ活性を有することが好ましい。
［３］本発明の第二の態様は、β−グルコシダーゼ触媒ドメインをコードする領域を有し、前記領域が、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなる、ポリヌクレオチドである。
［４］本発明の第三の態様は、前記［３］のポリヌクレオチドが組み込まれており、宿主細胞において、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクターである。
［５］本発明の第四の態様は、前記［４］の発現ベクターが導入されている形質転換体である。
［６］前記［５］の形質転換体は、真核微生物であることが好ましい。
［７］前記［５］の形質転換体は、糸状菌であることが好ましい。
［８］本発明の第五の態様は、前記［５］〜［７］のいずれかの形質転換体内で、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを生産する、β−グルコシダーゼの製造方法である。
［９］本発明の第六の態様は、前記［１］若しくは［２］のβ−グルコシダーゼ又は前記［８］のβ−グルコシダーゼの製造方法によって製造されたβ−グルコシダーゼと、少なくとも１種のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物である。
［１０］本発明の第七の態様は、セルロースを含む材料を、前記［１］若しくは［２］のβ−グルコシダーゼ又は前記［８］のβ−グルコシダーゼの製造方法によって製造されたβ−グルコシダーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する、セルロース分解物の製造方法である。
［１１］前記［１０］のセルロース分解物の製造方法において、前記セルロースを含む材料に、さらに少なくとも１種のその他のセルラーゼを接触させることが好ましい。
［１２］前記［１０］のセルロース分解物の製造方法においては、前記セルロースを含む材料に、さらに、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドロラーゼと、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼとを接触させることが好ましい。
［１３］前記［１０］のセルロース分解物の製造方法においては、前記セルロースを含む材料に、さらに、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドロラーゼと、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、少なくとも１種のヘミセルラーゼとを接触させることが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るβ−グルコシダーゼは、アクレモニウム・セルロリティカス由来の新規β−グルコシダーゼ酵素である。当該β−グルコシダーゼは、セルロースの加水分解活性を有するため、特にセルロース系バイオマスの酵素糖化処理に好適である。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクター、及び当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係るβ−グルコシダーゼの製造に好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１において、酵素サンプル（ＢＧＬ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図２】実施例１において、コーンストーバーを酵素調製物により糖化処理した糖化物のＨＰＬＣのクロマトグラムのうち、溶離時間１０〜１６分の画分を示した図である。
【図３】実施例１において、セロビオースを基質としたＢＧＬの酵素反応における反応前後の酵素反応液のＨＰＬＣのクロマトグラムのうち、溶離時間９〜１５分の画分を示した図である。
【図４】実施例１において、キシロビオースを基質としたＢＧＬの酵素反応における反応前後の酵素反応液のＨＰＬＣのクロマトグラムのうち、溶離時間９〜１５分の画分を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［β−グルコシダーゼ］
本発明者らは、アクレモニウム・セルロリティカスから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡから、新規なβ−グルコシダーゼをコードする遺伝子を単離及び同定し、当該遺伝子をＢＧＬ遺伝子、当該遺伝子がコードするβ−グルコシダーゼをＢＧＬとした。ＢＧＬのアミノ酸配列を配列番号１に、ＢＧＬをコードする塩基配列（ＢＧＬ遺伝子のコード領域の塩基配列）を配列番号２に、それぞれ示す。
【００１２】
一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、ＢＧＬにおいても、β−グルコシダーゼ活性を失わせることなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。
【００１３】
すなわち、本発明の第一の態様であるβ−グルコシダーゼは、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかからなるβ−グルコシダーゼ触媒ドメインを有する、β−グルコシダーゼである。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド。
【００１４】
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が欠失する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸の一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が置換する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が付加される」とは、ポリペプチド中に新たなアミノ酸が挿入されることを意味する。
【００１５】
前記（Ｂ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。各アミノ酸配列において、欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の位置は、欠失等されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが、β−グルコシダーゼ活性を有する限り、特に限定されるものではない。
【００１６】
前記（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、９２％以上１００％未満であれば特に限定されないが、９５％以上１００％未満であることが好ましく、９８％以上１００％未満であることがより好ましい。
【００１７】
なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  ｖｅｒ１１．０のＭａｘｉｍｕｍ  ｍａｔｃｈｉｎｇ機能により得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００１８】
前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＢＧＬのホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。
【００１９】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、後記の本発明の第二の態様に係るポリヌクレオチドを用いて、タンパク質発現系によって生産してもよい。また、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。
【００２０】
本発明に係るβ−グルコシダーゼは、β−グリコシド結合を含むグルカンを基質とする。本発明に係るβ−グルコシダーゼの基質としては、例えば、結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、若しくはセロビオース等のβ−１，４結合から成るグルカン、β−１，３結合とβ−１，４結合から成るグルカン、又はゲンチオビオース等のβ−１，６結合から成るグルカン等が挙げられる。
【００２１】
本発明に係るβ−グルコシダーゼは、３０〜６０℃の範囲内においてβ−グルコシダーゼ活性を示す。本発明に係るβ−グルコシダーゼとしては、β−グルコシダーゼ活性を、２０〜６０℃の範囲内において示すものが好ましく、２０〜７０℃の範囲内において示すものがより好ましく、２０〜８０℃の範囲内において示すものがさらに好ましい。また、本発明に係るβ−グルコシダーゼとしては、β−グルコシダーゼ活性の至適温度が、２５〜５５℃の範囲内にあるものが好ましく、３５〜５５℃の範囲内にあるものがより好ましく、４０〜５０℃の範囲内にあるものがさらに好ましい。
【００２２】
本発明に係るβ−グルコシダーゼ活性とは、β−グリコシド結合を含むグルカンを基質とし、前記基質を加水分解することにより単糖を生成する活性を意味する。
【００２３】
本発明に係るβ−グルコシダーゼの至適ｐＨは、反応温度に依存して変化するものの、ｐＨ２．０〜６．０の範囲内にあり、ｐＨ２．５〜５．５の範囲内にあるものが好ましく、ｐＨ２．８〜５．５の範囲内にあるものがより好ましい。本発明に係るβ−グルコシダーゼとしては、少なくともｐＨ３．０〜５．５の範囲内において、好ましくはｐＨ２．８〜６．０の範囲内において、より好ましくはｐＨ２．０〜６．０の範囲内においてβ−グルコシダーゼ活性を示すものが好ましい。
【００２４】
本発明に係るβ−グルコシダーゼは、酸性環境下でも高いβ−グルコシダーゼ活性を示す。例えば、ＰＮＰＧ（ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド）を基質とした場合には、ｐＨ３．０〜５．５の幅広い酸性環境下において高いβ−グルコシダーゼ活性を示す。本発明に係るβ−グルコシダーゼとしては、ＰＮＰＧ分解活性を、ｐＨ３．０〜５．５、３０℃で示すものが好ましく、ｐＨ３．０〜５．５、３０〜６０℃で示すものがより好ましく、ｐＨ３．０〜５．５、３０〜７５℃で示すものがさらに好ましい。
【００２５】
本発明に係るβ−グルコシダーゼは、β−グルコシダーゼ活性以外のセルロース加水分解活性を有していてもよい。その他のセルロース加水分解活性としては、セロビオハイドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、又はキシラナーゼ活性等が挙げられる。
【００２６】
本発明に係るβ−グルコシダーゼは、前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかからなるβ−グルコシダーゼ触媒ドメインのみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のβ−グルコシダーゼが有する、β−グルコシダーゼ触媒ドメイン以外の領域が挙げられる。例えば、本発明に係るβ−グルコシダーゼには、公知のβ−グルコシダーゼに対し、β−グルコシダーゼ触媒ドメインを前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素も含まれる。
【００２７】
本発明に係るβ−グルコシダーゼは、例えば、そのＮ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとして、例えば、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、又は分泌型シグナルペプチド等がある。前記β−グルコシダーゼのＮ末端又はＣ末端にシグナルペプチドを付加することにより、形質転換体中で発現させたβ−グルコシダーゼを、細胞外へ分泌させたり、細胞中の小胞体等に局在させることができる。
【００２８】
小胞体保留シグナルペプチドは、ポリペプチドを小胞体に保留させ得るペプチドであれば、特に限定されるものではなく、公知の小胞体保留シグナルペプチドを適宜用いることができる。小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。
【００２９】
また、本発明に係るβ−グルコシダーゼは、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えば前記β−グルコシダーゼのＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現又は精製において汎用されているタグを用いることができる。
【００３０】
さらに、本発明に係るβ−グルコシダーゼは、前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドに由来するβ−グルコシダーゼ活性を損なわない限り、その他の機能ドメインを有していてもよい。当該他の機能ドメインとしては、例えば、セルロース結合モジュールが挙げられる。当該セルロース結合モジュールとしては、例えば、既知のタンパク質が有するセルロース結合モジュール又はそれを適宜改変したものが挙げられる。
【００３１】
本発明に係るβ−グルコシダーゼがβ−グルコシダーゼ触媒ドメイン以外の機能ドメインを有する場合、当該他の機能ドメインは、β−グルコシダーゼ触媒ドメインの上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）にあってもよい。また、当該他の機能ドメインとβ−グルコシダーゼ触媒ドメインは、直接結合していてもよく、適当な長さのリンカー領域を介して結合していてもよい。
【００３２】
［β−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド］
本発明の第二の態様であるポリヌクレオチドは、本発明の第一の態様であるβ−グルコシダーゼをコードする。当該β−グルコシダーゼは、当該ポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。
【００３３】
具体的には、本発明の第二の態様であるポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｄ)のいずれかの塩基配列からなるβ−グルコシダーゼ触媒ドメインをコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【００３４】
なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明における塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  ｖｅｒ１１．０のＭａｘｉｍｕｍ  ｍａｔｃｈｉｎｇ機能により得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００３５】
また、本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ＮＡＴＵＲＥ  ＰＲＯＴＯＣＯＬ（ＶＯＬ．１、Ｎｏ．２、ｐ．５１８〜５２５）（Published online: 27 June 2006，doi:10.1038/nprot.2006.73）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、及び０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、４０〜６５℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。
【００３６】
前記（ｄ）の塩基配列としては、例えば、配列番号２で表される塩基配列との配列同一性が、８８％以上１００％以下の塩基配列、好ましくは９０％以上１００％以下の塩基配列、より好ましくは９３％以上１００％以下の塩基配列、さらに好ましくは９５％以上１００％以下の塩基配列が挙げられる。
【００３７】
前記（ａ）〜（ｄ)の塩基配列においては、縮重コドンは、宿主のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい。例えば、前記（ａ）の塩基配列としては、配列番号２で表される塩基配列であってもよく、配列番号２で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列（配列番号１）は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。なお、コドンの改変は、公知の遺伝子組換え技術によって行うことができる。
【００３８】
配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、アクレモニウム・セルロリティカスのＢＧＬ遺伝子のうち、β−グルコシダーゼ触媒ドメインを含む領域を遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。ＢＧＬ遺伝子の全長又はその部分領域は、例えば、自然界からアクレモニウム・セルロリティカスを含むサンプルを取得し、当該サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。
【００３９】
例えば、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、１又は２個以上の塩基を欠失、置換若しくは付加することによって人工的に合成することができる。
【００４０】
本願及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が欠失する」とは、ポリヌクレオチドを構成しているヌクレオチドの一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換する」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加される」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されることを意味する。
【００４１】
本発明の第二の態様であるポリヌクレオチドは、β−グルコシダーゼ触媒ドメインをコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、セルロース結合モジュール等のその他の機能ドメイン、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。
【００４２】
［発現ベクター］
本発明の第三の態様である発現ベクターは、前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチドが組み込まれており、宿主細胞において、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチドが、前記本発明の第一の態様のβ−グルコシダーゼを発現し得る状態で組み込まれた発現ベクターである。
【００４３】
本発明及び本願明細書において、発現ベクターとは、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、外来ＤＮＡを組込むための配列を有するＤＮＡ、及びターミネーター配列を有するＤＮＡを含むベクターである。
【００４４】
具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチド、及びターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットが発現ベクターに組み込まれていることが必要である。なお、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことができる。ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組み込みでは、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
【００４５】
当該発現ベクターとしては、大腸菌等の原核細胞へ導入されるものであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞へ導入されるものであってもよい。これらの発現ベクターとしては、それぞれの宿主に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。
【００４６】
本発明に係る発現ベクターとしては、原核細胞へ導入される発現ベクター、又は酵母や糸状菌等の真核微生物へ導入される発現ベクターが好ましく、真核微生物へ導入される発現ベクターがより好ましく、糸状菌へ導入される発現ベクターがさらに好ましく、麹菌へ導入される発現ベクターがよりさらに好ましい。原核細胞や真核微生物の発現系を使用することにより、本発明に係るβ−グルコシダーゼをより簡便に大量生産することが可能になる。また、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼ酵素は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスが元々有する酵素であるため、糸状菌等の真核微生物の発現系で発現させることによって、より天然型のβ−グルコシダーゼに近いβ−グルコシダーゼを合成することができる。
【００４７】
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチドのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組み込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された宿主生物と形質転換されていない宿主生物の選抜を容易に行うことができるためである。該薬剤耐性遺伝子として、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等がある。
【００４８】
［形質転換体］
本発明の第四の態様である形質転換体は、前記本発明の第三の態様の発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、前記本発明の第一の態様のβ−グルコシダーゼを発現させ得る。本発明に係るβ−グルコシダーゼは、大腸菌、酵母、糸状菌、又は高等植物葉緑体等、広範な発現宿主に発現させることができる。
【００４９】
発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。当該方法として、例えば、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）−カルシウム法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、及びエレクトロポレーション法、等がある。このうち、宿主が糸状菌である場合には、ＰＥＧ−カルシウム法又はアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。
【００５０】
宿主として、原核細胞、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、又は哺乳培養細胞等を用いた場合には、得られた形質転換体は、一般的には、形質転換前の宿主と同様にして、常法により培養することができる。
【００５１】
発現ベクターを導入する宿主としては、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、又は哺乳培養細胞等の真核細胞が好ましい。真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れたβ−グルコシダーゼを生産できる。特に、当該形質転換体が麹菌等の糸状菌や酵母等の真核微生物である場合には、より耐熱性に優れたβ−グルコシダーゼを比較的簡便に大量生産することができる。
【００５２】
本発明に係る形質転換体は、前記本発明の第三の態様の発現ベクターに由来する本発明に係るβ−グルコシダーゼを発現するための発現カセットが、ゲノムに組み込まれたものであってもよく、ゲノム外に独立して存在しているものであってもよい。
【００５３】
［β−グルコシダーゼの製造方法］
本発明の第五の態様であるβ−グルコシダーゼの製造方法は、前記本発明の第四の態様の形質転換体内で、β−グルコシダーゼを生産する方法である。前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組み込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係るβ−グルコシダーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内にβ−グルコシダーゼを発現させる。
【００５４】
形質転換体からβ−グルコシダーゼを抽出又は精製する方法は、β−グルコシダーゼの活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、β−グルコシダーゼを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。当該抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め当該形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、又は遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中のβ−グルコシダーゼは、塩析法、限外濾過法、又はクロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。
【００５５】
本発明に係るβ−グルコシダーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便にβ−グルコシダーゼを含む溶液を得ることができる。また、本発明に係るβ−グルコシダーゼが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中のβ−グルコシダーゼを簡便に精製することができる。
【００５６】
すなわち、本発明のβ−グルコシダーゼの製造方法は、前記本発明の第四の態様の形質転換体内で、β−グルコシダーゼを生産すること、及び所望により前記形質転換体から前記β−グルコシダーゼを抽出し精製することを含む。
【００５７】
［セルラーゼ混合物］
本発明の第六の態様であるセルラーゼ混合物は、前記本発明の第一の態様のβ−グルコシダーゼ、又は前記第五の態様のβ−グルコシダーゼの製造方法によって製造されたβ−グルコシダーゼと、少なくとも１種のその他のセルラーゼを含む。前記第五の態様のβ−グルコシダーゼの製造方法によって製造されたβ−グルコシダーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出又は精製されたものであってもよい。本発明に係るβ−グルコシダーゼを、その他のセルラーゼとの混合物としてセルロースの分解反応に用いることにより、セルロース等のβ−１，４結合を含むグルカンをより効率よく分解させることができる。
【００５８】
当該セルラーゼ混合物に含まれる前記β−グルコシダーゼ以外のその他のセルラーゼとしては、セルロースの加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。当該セルラーゼ混合物に含まれる前記β−グルコシダーゼ以外のその他のセルラーゼとしては、例えば、キシラナーゼ、若しくはβ−キシロシダーゼ等のヘミセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、又はセロビオハイドロラーゼ等が挙げられる。本発明に係るセルラーゼ混合物としては、ヘミセルラーゼとセロビオハイドロラーゼの少なくとも一方を含むものが好ましく、ヘミセルラーゼとセロビオハイドロラーゼを両方含むものがより好ましい。中でも、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、エンドグルカナーゼ、及びセロビオハイドロラーゼからなる群より選択される１種以上のセルラーゼを含むものが好ましく、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、エンドグルカナーゼ、及びセロビオハイドロラーゼを全て含むものがより好ましい。
【００５９】
［セルロース分解物の製造方法］
本発明の第七の態様であるセルロース分解物の製造方法は、本発明に係るβ−グルコシダーゼにより、セルロースを分解して分解物を得る方法である。具体的には、セルロースを含む材料を、前記本発明の第一の態様のβ−グルコシダーゼ、前記本発明の第四の態様の形質転換体、又は前記第五の態様のβ−グルコシダーゼの製造方法によって製造されたβ−グルコシダーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する。
【００６０】
セルロースを含む材料としては、セルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。当該材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、又は古紙等が挙げられる。当該セルロースを含む材料は、本発明に係るβ−グルコシダーゼと接触させる前に、破砕若しくは細断等の物理的処理、酸若しくはアルカリ等の化学処理、又は適当なバッファーへの浸漬若しくは溶解処理等を行っておくことが好ましい。
【００６１】
本発明に係るβ−グルコシダーゼによるセルロースの加水分解反応の反応条件は、当該β−グルコシダーゼがβ−グルコシダーゼ活性を示す条件であればよい。例えば、２０〜６０℃、ｐＨ４〜６で反応を行うことが好ましく、２５〜５５℃、ｐＨ４〜６で反応を行うことがより好ましい。前記加水分解反応の反応時間は、加水分解に供されるセルロースを含む材料の種類、前処理の方法、又は量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間〜１２時間の反応時間で行う前記加水分解反応をことができる。
【００６２】
セルロースの加水分解反応には、本発明に係るβ−グルコシダーゼに加えて、少なくとも１種のその他のセルラーゼを用いることも好ましい。当該その他のセルラーゼとしては、前記セルラーゼ混合物に含められるセルラーゼと同様のものを用いることができ、２０〜６０℃、ｐＨ４〜６でセルラーゼ活性を有する耐熱性セルラーゼであることが好ましい。また、当該セルロース分解物の製造方法には、前記本発明の第一の態様のβ−グルコシダーゼ、前記本発明の第四の態様の形質転換体、又は前記第五の態様のβ−グルコシダーゼの製造方法によって製造されたβ−グルコシダーゼに代えて、前記本発明の第六の態様のセルラーゼ混合物を用いてもよい。
【実施例】
【００６３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６４】
［実施例１］
（１）  ＢＧＬの麹菌発現ベクターの構築
＜アクレモニウム・セルロリティカスのゲノムＤＮＡ抽出＞
アクレモニウム・セルロリティカスＨ１株（独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センターより入手可能。受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０８、以下「Ｈ１株」と略記する。）を、ＰＤＢ寒天培地（ＰＤＡ培地（Ｄｉｆｃｏ  ＰＤＡ  ｂｒｏｔｈ使用）に１．５％（質量／容量）アガロースを添加した平板培地）上に植菌して３０℃で１週間培養した。得られた菌体を、直径５ｍｍの寒天ごと切り出してＰＤＡ培地に植菌し、３０℃、１３０ｒｐｍで浸透培養を行った。培養物を１５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離処理することによって回収した菌体を、ＰＤＡ培地による洗浄を２回繰り返すことによって、菌体サンプルを取得した。
当該菌体サンプルの入った２ｍＬ容プラスチックチューブにビーズを入れ、卓上ビーズ式破砕装置（装置名：シェイクマスター、バイオメディカルサイエンス社製）を用いて９０秒間の破砕処理を３回行い、菌体サンプルを粉末状にした後、Ｎｕｃｌｅｏｎ（ＡＭｅｒｓｈａｍ社製）を使用してＤＮＡを抽出した。
【００６５】
＜アクレモニウム・セルロリティカスのＢＧＬのゲノムＤＮＡ＞
得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に記載の配列番号４で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーとＤＮＡポリメラーゼ（製品名：ＫＯＤ−ｐｌｕｓ、東洋紡社製）を用いたＰＣＲによって、ＢＧＬをコードする配列（配列番号３）を増幅した。ＰＣＲは、９４℃、２分間を１サイクルした後、９６℃、２０秒間、次いで６０℃、３０秒間、さらに７２℃、５分間を３０サイクルすることにより行った。得られたＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＸＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【００６６】
＜アクレモニウム・セルロリティカスのＢＧＬのｃＤＮＡ配列の決定＞
前記＜アクレモニウム・セルロリティカスゲノムＤＮＡ抽出＞に記載の方法で菌体を調製した。次いで、当該菌体サンプルの入った２ｍＬ容プラスチックチューブにビーズを入れ、卓上ビーズ式破砕装置（装置名：シェイクマスター、バイオメディカルサイエンス社製）を用いて９０秒間の破砕処理を３回行い、菌体サンプルを粉末状にした後、ＩＳＯＧＥＮ II（日本ＧＥＮＥ社製）を使用してＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成キット（製品名：ＳＭＡＲＴｅｒ（商標登録）ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをシーケンス解析し、得られた配列（配列番号２）とゲノムＤＮＡ配列（配列番号３）を比較し、イントロンを決定した。
【００６７】
＜ｎｉａＤ遺伝子を含む大腸菌ベクターｐＢＲ−ｎｉａＤの調製＞
麹菌アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）  ＲＩＢ４０株（独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手。ＮＢＲＣ番号：１００９５９。以下「ＲＩＢ４０株」と略記する。）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に記載の配列番号６で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーを用いた以外は、ＢＧＬのｃＤＮＡの増幅と同様にしてＰＣＲを行い、麹菌アスペルギルス・オリゼ由来の硝酸還元酵素遺伝子ｎｉａＤのｃＤＮＡを増幅した。
得られたＰＣＲ増幅産物と大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）を制限酵素ＡｖａI及びＮｄｅIを用いて３７℃で消化した後、消化物をアガロースゲル電気泳動で分離し、目的バンドを切り出し、そのゲル片からＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出・精製することによって、ｐＢＲ３２２及びｎｉａＤのｃＤＮＡの制限酵素処理断片を得た。これらのＤＮＡ断片をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株（以下「ＪＭ１０９株」と略記する。）に形質転換した。その結果、プラスミドｐＢＲ−ｎｉａＤ（ｐＢＲ３２２の制限酵素ＡｖａI及びＮｄｅIの間にｎｉａＤのｃＤＮＡ断片が挿入されたプラスミド）が導入された形質転換体を得た。
【００６８】
＜ａｇｄＡターミネーターのｐＢＲ−ｎｉａＤへの組み込み＞
ＲＩＢ４０株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に記載の配列番号８で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号９で表される塩基配列からなるプライマーを用いた以外は、ＢＧＬのｃＤＮＡの増幅と同様にしてＰＣＲを行い、麹菌由来ａｇｄＡ遺伝子のターミネーター領域（以下、「ａｇｄＡターミネーター」ということがある。）のｃＤＮＡを増幅した。
得られたＰＣＲ増幅産物とｐＢＲ−ｎｉａＤを制限酵素ＳａｌI及びＡｖａIを用いて３７℃で消化した後、前記ｐＢＲ−ｎｉａＤの調製と同様にして、得られた消化物からｐＢＲ−ｎｉａＤ及びａｇｄＡターミネーターのｃＤＮＡの制限酵素処理断片を得、これらのＤＮＡ断片を連結してＪＭ１０９株に形質転換した。その結果、プラスミドｐＢＲ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤ（ｐＢＲ３２２−ｎｉａＤの制限酵素ＳａｌI及びＡｖａIの間にａｇｄＡターミネーターのｃＤＮＡ断片が挿入されたプラスミド）が導入された形質転換体を得た。
【００６９】
＜ｅｎｏＡプロモーターのｐＢＲ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤへの組み込み＞
ＲＩＢ４０株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に記載の配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１で表される塩基配列からなるプライマーを用いた以外は、ＢＧＬのｃＤＮＡの増幅と同様にしてＰＣＲを行い、麹菌由来ｅｎｏＡ遺伝子のプロモーター領域（以下、「ｅｎｏＡプロモーター」ということがある。）のｃＤＮＡを増幅した。
得られたＰＣＲ増幅産物とｐＢＲ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤを制限酵素ＮｈｅI及びＳａｌIを用いて３７℃で消化した後、前記ｐＢＲ−ｎｉａＤの調製と同様にして、得られた消化物からｐＢＲ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤ及びｅｎｏＡプロモーターのｃＤＮＡの制限酵素処理断片を得、これらのＤＮＡ断片を連結してＪＭ１０９株に形質転換した。その結果、プラスミドｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤ（ｐＢＲ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤの制限酵素ＮｈｅI及びＳａｌIの間にｅｎｏＡプロモーターのｃＤＮＡ断片が挿入されたプラスミド）が導入された形質転換体を得た。
【００７０】
【表１】
2015033379.tif 000002
【００７１】
＜ＢＧＬゲノムＤＮＡのｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤへの組み込み＞
まず、ｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤを制限酵素ＳｍａＩを用いて３０℃で消化した後、前記ｐＢＲ−ｎｉａＤの調製と同様にして、得られた消化物からｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤのＳｍａＩ処理断片を得た。
当該ＳｍａＩ処理断片と前記で精製されたＢＧＬをコードする配列とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結してプラスミドｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ＢＧＬ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤ（ＢＧＬ麹菌発現用ベクター）を得、当該プラスミドをＳｔｅｌｌａｒ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に形質転換し、ＢＧＬ大腸菌形質転換株を得た。得られた形質転換株を１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地で３７℃、１８０ｒｐｍで１晩培養し、培養物からＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ＢＧＬ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤを大量調製した。
【００７２】
（２）  ＢＧＬ麹菌発現用ベクターを導入した麹菌の形質転換体の作製
定法であるＰＥＧ−カルシウム法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．,ｖｏｌ．２１８，ｐ．９９〜１０４（１９８９年））により、上記プラスミドｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ＢＧＬ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤを用いて、麹菌アスペルギルス・オリゼｎｉａＤ３００株（独立行政法人酒類総合研究所より入手。）を形質転換した。ツアペクドックス（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ）培地（３％（質量／容量）デキストリン、０．１％（質量／容量）リン酸２水素カリウム、０．２％（質量／容量）塩化カリウム、０．０５％（質量／容量）硫酸マグネシウム、０．００１％（質量／容量）硫酸鉄、０．３％（質量／容量）硝酸ナトリウム）で生育できる株を選択することにより、形質転換体（ＢＧＬ麹菌形質転換株）を得た。
【００７３】
（３）  ＢＧＬ麹菌形質転換株からのＢＧＬ調製
作製したＢＧＬ麹菌形質転換株を、ツアペクドックス培地で胞子形成させ、滅菌水で胞子を回収した。５００ｍＬ容三角フラスコに入った１００ｍＬのＰＤ液体培地（２％（質量／容量）デキストリン、１％（質量／容量）ポリペプトン、０．１％（質量／容量）カザミノ酸、０．５％（質量／容量）リン酸２水素カリウム、０．０５％（質量／容量）硫酸マグネシウム、０．１％（質量／容量）硝酸ナトリウム）に最終胞子濃度１×１０４／ｍＬとなるように植菌した。３０℃で３日間の液体培養を行い、目的遺伝子産物（ＢＧＬ）を培地中に分泌発現させた。培養後の当該培養液を酵素サンプルとした。
【００７４】
当該酵素サンプル中のＢＧＬを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。酵素サンプルのＳＤＳ電気泳動は、１０−２０％のミニグラジェントゲル（ＡＴＴＯ社製）を用いて行った。酵素サンプルとＴｒｉｓ−ＳＤＳβＭＥサンプル処理液（ＡＴＴＯ社製）を１：１で混合した後に１００℃で５分間処理し、当該混合液２０μＬを泳動させた。泳動終了後、固定化したゲルをＥｚＳｔａｉｎＡＱｕａ（ＡＴＴＯ社製）で染色し、タンパク質のバンドを可視化した。その後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ  Ｐｌｕｓシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、当該ゲルの画像を取得した。取得画像をＩｍａｇｅ  Ｌａｂ  ２．０ソフトウェアにより解析し、タンパク質定量を行った。
図１に、酵素サンプル（ＢＧＬ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示す。レーン右がタンパク質分子量指標であり、レーン左が酵素サンプルである。この結果、酵素サンプルには、分子量約１４０ｋＤａのＢＧＬが含まれていることが確認できた。
【００７５】
（４）  酵素活性の測定
酵素活性はＵｎｉｔ（Ｕ）にて示す。１Ｕは、１分間に基質から生成物を１μｍｏｌ生産する酵素量であり、以下の式で定義される。
１Ｕ（μｍｏｌ／ｍｉｎ）＝［生成糖（μｍｏｌ／Ｌ）］×［反応液量（Ｌ）］／［反応時間（ｍｉｎ）］
また、タンパク質１ｍｇ当たりの比活性は、下記式により算出される。
［比活性（Ｕ／ｍｇ）］＝［Ｕｎｉｔ（Ｕ）］／［タンパク質量（ｍｇ）］
【００７６】
＜ＰＮＰＧ分解活性の測定＞
標準基質として、ＰＮＰＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用した。ＰＮＰＧ分解活性は、主にβ−グルコシダーゼ活性の指標となる。また、検量線は、１０００μｍｏｌ／Ｌ  ＰＮＰ（ｐ−ニトロフェノール）溶液を２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）で適宜希釈して調製した５点の希釈系列（０〜２００μＭ）の測定値から作成した。
具体的には、まず、１．５ｍＬ容プラスチックチューブを測定するサンプルの本数分準備し、各チューブに６１５μＬの２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と５０μＬのＰＮＰＧ溶液（３．４ｍＭ、溶媒：超純水）を加えて充分に混合した液を３０℃に調整した。次いで、各チューブに対して、１０μＬの酵素サンプルを添加して酵素反応を開始させ、反応開始から１５分経過後に、６２５μＬの０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を加えて混合して反応を停止させた。その後、各チューブから２００μＬの反応溶液を分取し、４２０ｎｍの吸光度（Ａ４２０）を測定した。吸光度測定のブランクとしては、酵素サンプルに代えて２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を添加して同様に処理したサンプルを用いた。Ａ４２０の測定値と検量線からＰＮＰ濃度を算出し、下記式により、比活性を求めた。
［比活性（Ｕ／ｍｇ）］＝（［ＰＮＰ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）］×０．００１×０．６７５／０．０１）／（１５×［タンパク質量（ｍｇ）］）
【００７７】
この結果、ＢＧＬ麹菌形質転換株に産生させたＢＧＬのＰＮＰＧ分解活性（比活性）は、１３．２Ｕ／ｍｇであった。すなわち、ＢＧＬ麹菌形質転換株に産生させたＢＧＬは、ＰＮＰＧ分解活性を有していることが確認された。
【００７８】
（５）  糖化活性の測定
測定に使用する酵素調製物は、前記（３）で調製した酵素サンプル（ＢＧＬ）と、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるセロビオハイドロラーゼと、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼと、キシラナーゼ（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ｅｎｄｏ−１，４−ｂｅｔａ−ｘｙｌａｎａｓｅ  Ａ、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＦ２４１２７）及びβ−キシロシダーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来β−ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ、耐熱性酵素研究所製）とを含有させて調製した。
まず、リグノセルロース系バイオマスであるコーンストーバーを微粉砕したものに、２５％（質量／質量）のアンモニア水を、質量比が１：２．５となるように混合して、コーンストーバー及びアンモニアを含む基質混合物を得た。次に、前記基質混合物を、８０℃の温度で８時間保持して糖化前処理を行った後、アンモニアを分離し、ｐＨ４．５に調整した。次いで、コーンストーバーの含有量が２０体積％となるように調整して、本実施例に用いる糖化前処理物を得た。この糖化前処理物に、ＢＧＬを含む酵素調製物を、コーンストーバー当たりの酵素終濃度が４．５ｍｇ／ｇ（コーンストーバー）となるように添加し、５０℃で３日間反応を行った。反応中は、１６０ｒｐｍ浸透撹拌を加えた。また、比較例として、市販のアクレモニウム属菌由来の糖化酵素混合物（商品名：アクレモニウムセルラーゼ、Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａファルマ社製）を用いて同様に反応を行った。
【００７９】
反応終了後に得られた糖化物をサンプリングチューブに分注し、１５，７６０×ｇ、４℃で１０分間遠心分離処理を行った。得られた上清を新しい１．５ｍＬ容プラスチックチューブに移し、９５℃で５分間熱処理した後、１５，７６０×ｇ、４℃で５分間遠心分離処理を行った。得られた上清は、新しい１．５ｍＬ容プラスチックチューブに移した後、０．２μｍ（１３ｍｍディスク)フィルターでろ過した。０．２ｍＬのろ液をバイアルに移し、下記の条件でＨＰＬＣ測定を行って糖を検出し、糖濃度を評価した。ＨＰＬＣの糖標準としては、グルコース及びキシロース（各和光純薬社製）を用いた。
【００８０】
糖濃度測定装置；
セパレーター：Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５（Ｗａｔｅｒｓ社製）、
ＲＩ検出器：Ｗａｔｅｒｓ  ２４１４（Ｗａｔｅｒｓ社製）、
カラム：Ｂｉｏ−ｒａｄ  ＨＰＸ−８７Ｐ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）。
糖濃度測定条件；
溶離液：超純水、
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、
カラム温度：８５℃、
検出器温度：４０℃。
【００８１】
図２に、各反応により得られた糖化物の、ＨＰＬＣにおいてＲＩ検出器で検出されたクロマトグラムのうち二糖及び単糖が溶離されていると思われる溶離時間１０〜１６分の画分を示す。図中、「酵素添加」が前記酵素調製物を添加して得た糖化物の結果であり、「酵素未添加」は前記酵素調製物を添加しない以外は同様にして処理した糖化物の結果である。
この結果、糖化物の糖濃度（グルコースとキシロースの合計濃度）は、市販の糖化酵素混合物を用いた場合には１．８２質量％であったのに対して、ＢＧＬを含む酵素調製物を用いた場合には２．７２質量％であり、約１．５倍の糖が産生された。この結果から、本発明に係るＢＧＬを他の糖化酵素と併用することによって、従来のアクレモニウム由来の糖化酵素混合物よりも糖化力の高い酵素混合物が得られることが明らかである。
【００８２】
（６）  酵素活性の測定
＜セロビオース分解活性の測定＞
前記（３）で調製した酵素サンプルを用いて、セロビオース分解活性とキシロビオース分解活性を調べた。
具体的には、まず、２本の１．５ｍＬ容プラスチックチューブに、それぞれ、２００μＬの０．０３Ｍ  セロビオース水溶液と１９０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を加えて充分に混合した後、３０℃で５分間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後の２本のチューブのうちの１本には、１０μＬの酵素サンプルを添加して酵素反応を開始させた。反応開始から９０分経過後に、当該チューブ内の溶液を９５℃、５分間加熱処理して酵素反応を停止させた（酵素反応時間：９０分間）。残りの１本には、１０μＬの酵素サンプルを添加した直後にチューブ内の溶液を９５℃、５分間加熱処理して酵素反応を停止させた（酵素反応時間：０分間）。
また、２本の１．５ｍＬ容プラスチックチューブに、２００μＬの０．０１４Ｍ  キシロビオース水溶液と１９０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を加えて充分に混合した後、３０℃で５分間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後の２本のチューブのうちの１本には、１０μＬの酵素サンプルを添加して酵素反応を開始させた。反応開始から９０分経過後に、当該チューブ内の溶液を９５℃、５分間加熱処理して酵素反応を停止させた（酵素反応時間：９０分間）。残りの１本には、１０μＬの酵素サンプルを添加した直後にチューブ内の溶液を９５℃、５分間加熱処理して酵素反応を停止させた（酵素反応時間：０分間）。
【００８３】
反応終了後の４本のチューブについて、それぞれ、１５，７６０×ｇで５分間遠心分離処理を行った。得られた上清は、新しい１．５ｍＬ容プラスチックチューブに移した後、０．２μｍ（１３ｍｍディスク)フィルターで濾過した。０．２ｍＬの濾液をバイアルに移し、前記（５）と同じ条件でＨＰＬＣ測定を行って糖を検出し、単位時間当たり生成したグルコース量（μｍｏｌ)を活性（Ｕ）とし、下記式により、単位重量当たりの比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。ＨＰＬＣの糖標準としては、グルコース及びキシロース（各和光純薬社製）を用いた。
［比活性（Ｕ／ｍｇ）］＝（［グルコース濃度（μｍｏｌ／Ｌ）］×０．４／０．０１）／（９０×［タンパク質量（ｍｇ）］）
【００８４】
図３及び４に、各反応により得られた糖化物の、ＨＰＬＣにおいてＲＩ検出器で検出されたクロマトグラムのうち二糖及び単糖が溶離されていると思われる溶離時間９〜１５分の画分を示す。図３はセロビオースを基質とした酵素反応液のＨＰＬＣチャートであり、図４はキシロビオースを基質とした酵素反応液のＨＰＬＣチャートである。
図３に示すように、セロビオースを基質とした場合には、酵素反応時間が０分間の糖化物（図中、「反応前」）と酵素反応時間が９０分間の糖化物（図中、「反応後」）を比較すると、反応前の糖化物に比べて反応後の糖化物では、溶離時間１１分付近にみられたセロビオースのピークが小さく、溶離時間１３．３分付近にみられたグルコースのピークは大きくなっており、ＢＧＬによりセロビオースがグルコースへ分解されることが確認された。ＢＧＬのセロビオース分解活性の比活性は、１．７８Ｕ／ｍｇであった。
一方で、図４に示すように、キシロビオースを基質とした場合には、酵素反応時間が９０分間の糖化物（図中、「反応後」）でも、酵素反応時間が０分間の糖化物（図中、「反応前」）と同様に溶離時間１２．３分付近のキシロビオースのピークしか観察されず、ＢＧＬによるキシロビオースの分解は確認されなかった。
この結果、セロビオースを基質とした酵素反応液のＨＰＬＣチャートから、ＢＧＬによりセロビオースがグルコースへ分解されることが確認され、セロビオース分解活性の比活性は、１．７８Ｕ／ｍｇであった。一方で、キシロビオースを基質とした酵素反応液のＨＰＬＣチャートからは、ＢＧＬによるキシロビオースの分解は確認されなかった。
【００８５】
（７）ＰＮＰＧ分解活性の温度依存性
前記（３）で調製した酵素サンプルを用いて、ＢＧＬのＰＮＰＧ分解活性の温度依存性を調べた。
具体的には、反応温度を３０、４５、又は６０℃とした以外は、前記（４）の＜ＰＮＰＧ分解活性の測定＞と同様にして酵素反応を行った後、各チューブから２００μＬの反応溶液を分取し、４２０ｎｍの吸光度（Ａ４２０）を測定し、予め求めた検量線から酵素反応後の応溶液のＰＮＰ濃度を算出した。
【００８６】
各反応液のＰＮＰ濃度の測定結果と、最もＰＮＰ濃度が高かった反応液のＰＮＰＧ分解活性を１００％とした相対活性値（％）を表２に示す。反応後の反応液中のＰＮＰ濃度は、ＢＧＬのＰＮＰＧ分解活性に依存する。表２に示すように、ＢＧＬは、３０〜６０℃の温度範囲においてＰＮＰＧ分解活性を有しており、４５℃で反応させた場合が最もＰＮＰＧ分解活性が高かった。
【００８７】
【表２】
2015033379.tif 000003
【００８８】
（８）ＰＮＰＧ分解活性のｐＨ依存性
前記（３）で調製した酵素サンプルを用いて、ＢＧＬのＰＮＰＧ分解活性のｐＨ依存性を調べた。
具体的には、ＰＮＰＧ溶液溶液に混合するバッファーとして、２００ｍＭ  ＨＣｌ−ＫＣｌバッファー（ｐＨ１．５）、クエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ３．０）、２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）、又は２００ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）を用いた以外は、前記（４）の＜ＰＮＰＧ分解活性の測定＞と同様にして酵素反応を行った後、各チューブから２００μＬの反応溶液を分取し、４２０ｎｍの吸光度（Ａ４２０）を測定し、予め求めた検量線から酵素反応後の応溶液のＰＮＰ濃度を算出した。
【００８９】
各反応液のＰＮＰ濃度の測定結果と、最もＰＮＰ濃度が高かった反応液のＰＮＰＧ分解活性を１００％とした相対活性値（％）を表３に示す。表３に示すように、ＢＧＬは、少なくともｐＨ３〜５．５の範囲内において高いＰＮＰＧ分解活性を有しており、ｐＨ３．０において最も高いＰＮＰＧ分解活性を示し、ｐＨ５．５においてもｐＨ３．０と比較して相対活性が９０％と非常に高かった。一方で、ｐＨ１．５ではＰＮＰＧ分解活性を示さず、ｐＨ８．０でもほとんどＰＮＰＧ分解活性を示さなかった。
【００９０】
【表３】
2015033379.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明に係るβ−グルコシダーゼ、及びその生産に用いられるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクター、並びに当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、例えば、セルロース系バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。
【受託番号】
【００９２】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０８
【図２】
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【図３】
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【図４】
2015033379.tif 000007
【図１】
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【配列表】
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