(57)【要約】      （修正有）【課題】ＤＮＡ合成酵素阻害活性を有する化合物、該化合物を有効成分として含有する医薬組成物（ＤＮＡ合成酵素阻害剤、抗がん剤及び抗炎症剤）の提供。【解決手段】一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有するＤＮＡ合成酵素阻害剤。2015054842.tif 000030前記化合物の代表例としてはプルンバギン（５−ヒドロキシ−２−メチル−１，４−ナフトキノン）のカルボン酸エステルがある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
2015054842.tif 000026
［式中、Ｒ１は炭化水素基を示し、Ｒ２は水素又は炭化水素基（当該炭化水素基は、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アルコキシ基、アシロキシ基、アルコキシカルボニル基、アルキルアミノ基、及びジアルキルアミノ基からなる群より選択される少なくとも１種の基で置換されていてもよい）を示し、Ｒ３は炭化水素基（当該炭化水素基は、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アルコキシ基、アシロキシ基、アルコキシカルボニル基、アルキルアミノ基、及びジアルキルアミノ基からなる群より選択される少なくとも１種の基で置換されていてもよい）を示し、ｎは１〜４の整数を示す。］
で表される化合物を有効成分として含有するＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【請求項２】
一般式（２）：
【化２】
2015054842.tif 000027
［式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は前記に同じであり、ｍは０〜３の整数を示す。］
で表される化合物を有効成分として含有する請求項１に記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【請求項３】
Ｒ１がＣ１〜４０の炭化水素基である請求項１又は２に記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【請求項４】
Ｒ２が水素である請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【請求項５】
一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有する抗がん剤。
【請求項６】
一般式（１）において、Ｒ１がＣ１〜１５の直鎖若しくは分枝状の飽和炭化水素基又はＣ１〜４０の直鎖若しくは分枝状の不飽和炭化水素基である請求項５に記載の抗がん剤。
【請求項７】
一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有する抗炎症剤。
【請求項８】
一般式（１）において、Ｒ１がＣ３〜４０の直鎖又は分枝状の炭化水素基である請求項７に記載の抗炎症剤。
【請求項９】
一般式（１）で表される化合物を食品に配合してなる食品組成物。
【請求項１０】
一般式（３）：
【化３】
2015054842.tif 000028
［式中、Ｒ１ａはＣ３以上の炭化水素基を示し、Ｒ２、Ｒ３、及びｎは前記に同じ。］
で表される化合物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の一般式（３）で表される化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の一般式（３）で表される化合物の製造方法であって、一般式（４）：
【化４】
2015054842.tif 000029
［式中、Ｒ２、Ｒ３、及びｎは前記に同じ。］
で表される化合物と一般式（６）：
Ｒ１ａ−ＣＯＯＨ        （６）
（式中、Ｒ１ａは前記に同じ。）
で表される化合物又はその誘導体を反応させることを特徴とする製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ合成酵素阻害作用を有する化合物とその利用に関する。この化合物は、ＤＮＡ合成酵素阻害剤として、例えば、抗がん剤、抗炎症剤等として利用し得る。
【背景技術】
【０００２】
真核生物のＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）は、これまでα、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、ι、κ、λ、μ、σ及びTdT（ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ）、Rev1の１５種類の分子種が知られている。これらのＤＮＡ合成酵素群は、細胞の増殖、分裂、分化などに関与しているが、α型はＤＮＡ複製、β型、λ型及びTdTは修復と組換え、δ型及びε型は複製と修復の双方、ζ〜κ型は修復を担うといった具合にタイプによって異なる機能を有することが知られている。
【０００３】
このようにＤＮＡ合成酵素は細胞の増殖等に関与することから、その酵素活性を阻害するＤＮＡ合成酵素阻害剤は、例えば、がんに対してがん細胞の増殖抑制作用を示し、エイズに対してＨＩＶ由来逆転写酵素に対する阻害作用を示し、また、免疫疾患に対して抗原に対する特異的抗体産生を抑制する免疫抑制作用を示すことが考えられる。このため、ＤＮＡ合成酵素阻害剤を用いたがん、エイズ等のウイルス疾患、免疫疾患の予防・治療に効果のある医薬品の開発が期待されている。
【０００４】
近年、ビタミンＫ３にＤＮＡ合成酵素γに対する選択的阻害活性があることが見出されている（非特許文献１）。また、ビタミンＫ３の誘導体であるジュグロン（Juglone；５−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン）やそのエステルが強いＤＮＡ合成酵素阻害活性及びヒト大腸がん細胞（HCT116）増殖抑制活性があることが見出されている（特許文献１、非特許文献２）。
【０００５】
また、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）等の長鎖不飽和脂肪酸がＤＮＡ合成酵素を阻害することが報告されている（特許文献２、非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−２０１６００号公報
【特許文献２】特開平９−２０６５７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Mizushina et al, Cancer Sci., (2008) 99, p1040-1048
【非特許文献２】日本栄養・食糧学会 第４９回近畿支部大会講演要旨集 ２０１０年１０月１日発行 ｐ２８、講演番号Ａａ３
【非特許文献３】Mizushina et al, Biochim. Biophys. Acta., (1996) 1308, p256-262
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＤＮＡ合成酵素阻害活性を有する化合物、該化合物を有効成分として含有する医薬組成物（ＤＮＡ合成酵素阻害剤、抗がん剤及び抗炎症剤）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、プルンバギンの５位の水酸基がアシル化された化合物（以下、「アシルプルンバギン」と表記する場合もある）、及びその誘導体が、優れたＤＮＡ合成酵素阻害活性を有することを見出した。さらに、このアシルプルンバギン及びその誘導体のＤＮＡ合成酵素阻害活性は、プルンバギン単独又は該アシル基の原料となるカルボン酸化合物単独の阻害活性と比べて顕著に優れていることを確認した。また、このアシルプルンバギン及びその誘導体は抗炎症活性及び抗アレルギー活性を有することをも見出した。かかる知見に基づきさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は下記化合物を有効成分として含むＤＮＡ合成酵素阻害剤、抗がん剤、抗炎症剤、及び抗アレルギー剤、さらにはこれらの剤として有用な化合物を提供する。
【００１１】
項１．
一般式（１）：
【００１２】
【化１】
2015054842.tif 000002
【００１３】
［式中、Ｒ１は炭化水素基を示し、Ｒ２は水素又は炭化水素基（当該炭化水素基は、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アルコキシ基、アシロキシ基、アルコキシカルボニル基、アルキルアミノ基、及びジアルキルアミノ基からなる群より選択される少なくとも１種の基で置換されていてもよい）を示し、Ｒ３は炭化水素基（当該炭化水素基は、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アルコキシ基、アシロキシ基、アルコキシカルボニル基、アルキルアミノ基、及びジアルキルアミノ基からなる群より選択される少なくとも１種の基で置換されていてもよい）を示し、ｎは１〜４の整数を示す。］
で表される化合物を有効成分として含有するＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【００１４】
項２．
一般式（２）：
【００１５】
【化２】
2015054842.tif 000003
【００１６】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は前記に同じであり、ｍは０〜３の整数を示す。］
で表される化合物を有効成分として含有する項１に記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【００１７】
項３．
Ｒ１がＣ１〜４０の炭化水素基である項１又は２に記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【００１８】
項４．
Ｒ２が水素である項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【００１９】
項５．
一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有する抗がん剤。
【００２０】
項６．
一般式（１）において、Ｒ１がＣ１〜１５の直鎖若しくは分枝状の飽和炭化水素基又はＣ１〜４０の直鎖若しくは分枝状の不飽和炭化水素基である項５に記載の抗がん剤。
【００２１】
項７．
一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有する抗炎症剤。
【００２２】
項８．
一般式（１）において、Ｒ１がＣ３〜４０の直鎖又は分枝状の炭化水素基である項７に記載の抗炎症剤。
【００２３】
項９．
一般式（１）で表される化合物を食品に配合してなる食品組成物。
【００２４】
項１０．
一般式（３）：
【００２５】
【化３】
2015054842.tif 000004
【００２６】
［式中、Ｒ１ａはＣ３以上の炭化水素基を示し、Ｒ２、Ｒ３、及びｎは前記に同じ。］
で表される化合物。
【００２７】
項１１．
項１０に記載の一般式（３）で表される化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
【００２８】
項１２．
項１０に記載の一般式（３）で表される化合物の製造方法であって、一般式（４）：
【００２９】
【化４】
2015054842.tif 000005
【００３０】
［式中、Ｒ２、Ｒ３、及びｎは前記に同じ。］
で表される化合物と一般式（６）：
Ｒ１ａ−ＣＯＯＨ        （６）
（式中、Ｒ１ａは前記に同じ。）
で表される化合物又はその誘導体を反応させることを特徴とする製造方法。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のＤＮＡ合成酵素阻害剤は、一般式（１）で表されるように、プルンバギンとカルボン酸化合物（Ｒ１ＣＯＯＨ）を脱水縮合したエステル化合物又はその誘導体を有効成分として含有する。一般式（１）で表される化合物は、哺乳類のＤＮＡ合成酵素に対して特異的な阻害活性を示す。この阻害活性はプルンバギン単独又はカルボン酸化合物（Ｒ１ＣＯＯＨ）単独の阻害活性と比べて顕著に優れている。さらに、この化合物は、種々の臓器由来のがん細胞の増殖を抑制することができる。また、この化合物は、炎症マーカーの産生抑制活性、抗炎症活性、及び抗アレルギー活性を示す。以上より、ＤＮＡ合成酵素阻害剤、抗がん剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤等として有用である。
【００３２】
一般式（１）で表される化合物は、投与しても体重減少を引き起こさない。そのため、副作用の少ない抗がん剤、抗炎症剤、又は抗アレルギー剤として期待できる。
【００３３】
一般式（１）で表される化合物は、経口投与によっても効果を発揮することが可能である。
【００３４】
一般式（１）で表される化合物は、上記の薬剤を探索するためのリード化合物として有用である。また、上記の活性を有することを利用して生化学試薬として用いることもできる。また、食品に配合して食用組成物として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】試験例１のＤＮＡ合成酵素に対する各試験化合物の阻害活性を示す。
【図２】試験例２のヒト大腸がん細胞に対する各試験化合物の増殖抑制活性を示す。
【図３】試験例３の各試験化合物の腫瘍抑制活性を示す。
【図４】試験例３の各試験化合物の体重に与える影響評価を示す。
【図５】試験例４のＴＮＦ−α産生に対する各試験化合物の抑制活性を示す。
【図６】試験例５のマウス耳を用いた各試験化合物の抗炎症活性を示す。
【図７】試験例５のマウス耳を用いた、アシルジュグロンとアシルプルンバギンの抗炎症活性を示す。
【図８】試験例６の、アシルジュグロンとアシルプルンバギンの抗アレルギー活性を示す。
【図９】試験例７のアシルジュグロンとアシルプルンバギンの安定性の評価結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３７】
本発明のＤＮＡ合成酵素阻害剤は、一般式（１）：
【００３８】
【化５】
2015054842.tif 000006
【００３９】
で表される化合物を有効成分として含有する。
【００４０】
一般式（１）で表される化合物において、Ｒ１は炭化水素基を示す。
【００４１】
Ｒ１で示される炭化水素基としては、炭素数（以下「Ｃ」と表記する）１〜５０、好ましくはＣ１〜４０、より好ましくはＣ１〜３０、特に好ましくはＣ１〜２５の炭化水素基である。また、炭化水素基は、直鎖状、分岐状又は環状のいずれでもよい。
【００４２】
直鎖状又は分岐状の飽和炭化水素基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペンタデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−ヘプタデシル、ｎ−オクタデシル、ｎ−ノナデシル、ｎ−イコシル、ｎ−ヘンイコシル、ｎ−ドコシル、ｎ−トリコシル、ｎ−テトラコシル等のＣ１〜３０（好ましくはＣ１〜２５）の直鎖状又は分岐状のアルキル基が挙げられる。
【００４３】
直鎖状又は分岐状の不飽和炭化水素基としては、分子内に不飽和結合（二重結合及び／又は三重結合）を有する炭化水素基であり、例えば、上記の直鎖状又は分岐状の飽和炭化水素基のうち、Ｃ２以上の直鎖状又は分岐状の飽和炭化水素基において不飽和結合を１個以上（好ましくは、１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜８個、特に好ましくは１〜６個）有する基が挙げられる。不飽和結合としては、二重結合が好ましい。
【００４４】
環状の飽和炭化水素基としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等のＣ３〜１０のシクロアルキル基が挙げられる。
【００４５】
環状の不飽和炭化水素基としては、例えば、上記の環状の飽和炭化水素基において不飽和結合を１個以上（好ましくは、１〜３個、より好ましくは１〜２個）有する基が挙げられる。不飽和結合としては、二重結合が好ましい。例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサンジエニル、シクロヘプテニル、フェニル基、ナフチル等が挙げられる。
【００４６】
Ｒ１で示される炭化水素基のうち、Ｃ１〜４０の直鎖又は分枝状の飽和又は不飽和の炭化水素が好ましく、この中でも直鎖状の不飽和炭化水素がさらに好ましい。具体的には、Ｃ１〜３０（好ましくはＣ８〜３０、より好ましくはＣ１０〜２５、さらに好ましくはＣ１５〜２３、よりさらに好ましくはＣ１７〜２１）の直鎖アルケニル基が挙げられる。直鎖アルケニル基中の二重結合の数は、例えば１〜８個、好ましくは１〜６個である。
が挙げられる。
【００４７】
抗がん活性がより高いという観点から、Ｒ１で示される炭化水素基としては、好ましくはＣ１〜１５の直鎖若しくは分枝状の飽和炭化水素又はＣ１〜４０の直鎖若しくは分枝状の不飽和炭化水素が挙げられ、より好ましくはＣ１〜１１の直鎖アルキル基、又は二重結合を１〜８個有するＣ８〜３０の直鎖アルケニル基が挙げられ、さらに好ましくはＣ１〜８の直鎖アルキル基、又は二重結合を１〜６個有するＣ１０〜２５の直鎖アルケニル基が挙げられ、よりさらに好ましくはＣ１〜５の直鎖アルキル基、又は二重結合を１〜２個有するＣ１２〜Ｃ１８の直鎖アルケニル基が挙げられる。
【００４８】
抗炎症活性がより高いという観点から、Ｒ１で示される炭化水素基としては、好ましくはＣ３〜４０の直鎖又は分枝状の炭化水素基が挙げられ、より好ましくはＣ５〜３０の直鎖状の炭化水素基が挙げられ、さらに好ましくはＣ５〜２５の直鎖状の炭化水素基が挙げられ、よりさらに好ましくはＣ８〜２０の直鎖アルキル基、又は二重結合を１〜８個（好ましくは１〜６個）有するＣ２０〜２５の直鎖アルケニル基が挙げられる。
【００４９】
Ｒ１で示される炭化水素基のうち、特に好ましい具体例は下記式の通りである。式中、二重結合の立体はシス体及び／又はトランス体のいずれも包含するが、全てシス体が好ましい。
【００５０】
−ＣＨ３ （酢酸エステル）
−ＣＨ２ＣＨ３ （プロピオン酸エステル）
−（ＣＨ２）４ＣＨ３（カプロン酸エステル）
−（ＣＨ２）１０ＣＨ３（ラウリン酸エステル）
−（ＣＨ２）１６ＣＨ３（ステアリン酸エステル）
−（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３（オレイン酸エステル）
−（ＣＨ２）７（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）２（ＣＨ２）３ＣＨ３（リノール酸エステル）
−（ＣＨ２）７（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）３ＣＨ３（リノレン酸エステル）
−（ＣＨ２）３（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）５ＣＨ３（EPAエステル）
−（ＣＨ２）２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）６ＣＨ３（DHAエステル）。
【００５１】
そのうち、抗がん活性がより高いという観点からは、
−（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３（オレイン酸エステル）
が特に好ましく、抗炎症活性がより高いという観点からは、
−（ＣＨ２）２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）６ＣＨ３（DHAエステル）
が特に好ましい。
【００５２】
一般式（１）で表される化合物において、Ｒ２は水素又は炭化水素基（当該炭化水素基は、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アルコキシ基、アシロキシ基、アルコキシカルボニル基、アルキルアミノ基、及びジアルキルアミノ基からなる群より選択される少なくとも１種の基で置換されていてもよい）を示す。
【００５３】
Ｒ２で示される炭化水素基としては、Ｃ１〜８の飽和又は不飽和の炭化水素基、好ましくはＣ１〜６の飽和又は不飽和の炭化水素基、さらに好ましくはＣ１〜４の飽和又は不飽和の炭化水素基、よりさらに好ましくはＣ１〜２のアルキル基である。炭化水素基は直鎖状、分枝状のいずれでもよい。Ｒ２で示される炭化水素基は置換されていない方が好ましい。
【００５４】
Ｒ２で示される炭化水素基の置換基の数としては、１〜４、好ましくは１〜３、より好ましくは１〜２である。
【００５５】
Ｒ２で示される炭化水素基の置換基のうち、アルコキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基の炭素数としては、Ｃ１〜８、好ましくはＣ１〜６である。
【００５６】
Ｒ２で示される炭化水素基の置換基のうち、アシロキシ基、アルコキシカルボニル基の炭素数としては、Ｃ２〜９、好ましくはＣ２〜７である。
【００５７】
Ｒ２は好ましくは水素である。
【００５８】
一般式（１）で表される化合物において、Ｒ３は炭化水素基（当該炭化水素基は、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アルコキシ基、アシロキシ基、アルコキシカルボニル基、アルキルアミノ基、及びジアルキルアミノ基からなる群より選択される少なくとも１種の基で置換されていてもよい）を示す。
【００５９】
Ｒ３で示される炭化水素基の具体例、好ましい態様等についてはＲ２と同様である。
【００６０】
一般式（１）中、Ｒ１（ＣＯ）Ｏ−で表される基の置換数を示すｎとしては、１〜４、好ましくは１〜２、より好ましくは１である。置換位置としては、５〜８位の少なくとも１つ、好ましくは５位及び８位の少なくとも１つ、より好ましくは５位である。
【００６１】
一般式（１）で表される化合物のうち、Ｒ１（ＣＯ）Ｏ−で表される基が５位に置換している一つの好ましい態様として、一般式（２）：
【００６２】
【化６】
2015054842.tif 000007
【００６３】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は前記に同じであり、ｍは０〜３の整数を示す。］
で表される化合物が挙げられる。この一般式（２）で表される化合物は、上記一般式（１）で表される化合物に包含される。
【００６４】
一般式（２）中、Ｒ１（ＣＯ）Ｏ−で表される基の置換数を示すｍとしては、０〜３、好ましくは０〜１、より好ましくは０である。置換位置としては、６〜８位の少なくとも１つ、好ましくは８位である。
【００６５】
さらに、一般式（１）で表される化合物のうち、他の好ましい態様として、一般式（３）：
【００６６】
【化７】
2015054842.tif 000008
【００６７】
［式中、Ｒ１ａはＣ３以上の炭化水素基を示し、Ｒ２、Ｒ３、及びｎは前記に同じ。］
で表される化合物が挙げられる。この一般式（３）で表される化合物は、上記一般式（１）で表される化合物に包含される。
【００６８】
Ｒ１ａで示されるＣ３以上の炭化水素基としては、上記一般式（１）で表される化合物のＲ１で示される炭化水素基からＣ１及びＣ２の炭化水素基を除いたものが挙げられる。好ましくはＣ４〜５０、より好ましくはＣ５〜４０の炭化水素基である。
【００６９】
一般式（１）で表される化合物は、例えば、次のように一般式（４）：
【００７０】
【化８】
2015054842.tif 000009
【００７１】
［式中、Ｒ２、Ｒ３、及びｎは前記に同じ。］
で表される化合物と一般式（５）：
Ｒ１−ＣＯＯＨ        （５）
［式中、Ｒ１は前記に同じ。］
で表される化合物又はその誘導体を反応させて製造することができる。
【００７２】
一般式（４）で表される化合物と一般式（５）で表される化合物又はその誘導体との反応は以下の反応方法を用いることができる。
【００７３】
なお、一般式（５）で表される化合物の誘導体とは、後述のエステル化反応において、一般式（５）で表される化合物から誘導される反応性中間体を意味する。例えば一般式（５）で表される化合物の酸ハロゲン化物、混合酸無水物、活性エステル化合物、一般式（５）で表される化合物の２分子が脱水縮合した酸無水物等が挙げられる。
【００７４】
典型的には、一般式（５）で表される化合物を、活性化剤の存在下で、一般式（４）で表される化合物と縮合反応させて一般式（１）で表される化合物を得ることができる。活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＷＳＣ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物（ＭＮＢＡ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジンＮ−オキシド（ＤＭＡＰＯ）等が挙げられる。必要に応じ、塩基性化合物、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）等を加えてもよい、なお、ＷＳＣを活性化剤として使用する場合、反応系への１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）の添加により、反応が有利に進行する。
【００７５】
また、一般式（５）で表される化合物をハロゲン化剤（例えば、塩化オキザリル等）により酸ハロゲン化物に変換した後、塩基性化合物（例えば、ピリジン、ＤＭＡＰ等）の存在下に一般式（４）で表される化合物と反応させて一般式（１）で表される化合物を得ることができる。
【００７６】
また、一般式（５）で表される化合物をハロゲン化剤（例えば、塩化チオニル等）により一般式（５）で表される化合物が脱水縮合した酸無水物に変換した後、塩基性化合物（例えば、ピリジン、ＤＭＡＰ等）の存在下に一般式（４）で表される化合物と反応させて一般式（１）で表される化合物を得ることができる。
【００７７】
一般式（５）で表される化合物を、塩基性化合物（例えば、ピリジン、トリエチルアミン、ＤＭＡＰ等）の存在下にアルキルハロ炭酸エステル（例えば、ブロモギ酸エチル及びクロロギ酸イソブチル等）と反応させて混合酸無水物を生成し、それを一般式（４）で表される化合物と反応させて一般式（１）で表される化合物を得ることができる。
【００７８】
上記の反応は、いずれも適当な溶媒中で実施できる。溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン及び四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素；ベンゼン、トルエン及びキシレン等の芳香族炭化水素；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン及びジメトキシエタン等のエーテル；並びにそれらの混合物が挙げられる。
【００７９】
反応温度、反応時間はいずれも公知の条件を採用することが出来る。また、反応終了後の反応液から一般式（１）で表される化合物を単離及び精製する手段も公知の方法（分液、蒸留、クロマトグラフィー、再結晶等）を採用できる。
【００８０】
なお、上記の一般式（３）で表される化合物は、一般式（４）で表される化合物と一般式（６）：
Ｒ１ａ−ＣＯＯＨ （６）
（式中、Ｒ１ａは前記に同じ。）
で表される化合物又はその誘導体を反応させることにより製造することができる。一般式（６）で表される化合物又はその誘導体は、上記の一般式（５）で表される化合物又はその誘導体に包含される。ゆえに、この製造方法は、上記の一般式（４）で表される化合物と一般式（５）で表される化合物又はその誘導体から一般式（１）で表される化合物を製造する方法に包含される。
【００８１】
本発明の一般式（１）で表される化合物は、ＤＮＡ合成酵素選択的阻害作用を有することから、医薬品への利用が可能である。例えば、ＤＮＡ合成酵素阻害剤、抗がん剤、抗炎症剤等として有用である。即ち、がん、腫瘍、炎症等の予防又は治療剤として有用である。
【００８２】
本発明の化合物を体内投与する際は経口投与よりも非経口投与のいずれでもよい。本発明の化合物は経口投与であっても、血中に取り込まれ、全身を循環してその効果を発揮することができる。またリポソームなどの運搬体に封入して投与してもよい。このときがん細胞を特異的に認識する運搬体などを利用すれば、標的部位（病変部位）に本発明の化合物を効率よく運ぶことができ効果的である。
【００８３】
本発明の化合物を有効成分とする抗がん剤および抗炎症剤は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬組成物となし、動物およびヒトに投与することができる。医薬組成物の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。
【００８４】
本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤としての経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明の化合物の配合量は特に限定されるものではなく適宜設計できる。この種の製剤には本発明の化合物の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。
【００８５】
ここに、結合剤としてデンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等を例示できる。崩壊剤としてはデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等を例として挙げることができる。界面活性剤の例としてラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等を挙げることができる。滑沢剤では、タルク、ロウ類、水素添加植物油、蔗糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等を例示できる。流動性促進剤では、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等を例として挙げることができる。また、本発明の化合物は懸濁液、エマルション剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有させてもよい。
【００８６】
非経口剤として本発明の所望の効果を発現せしめるには、患者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、通常、成人で本発明の化合物の重量として１日あたり１〜６０ｍｇの静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射が適当である。この非経口投与剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。さらに必要に応じて、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤を加えてもよい。これら製剤中の本発明の化合物の配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。その他の非経口剤の例として、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、これらも常法に従って製造される。
【００８７】
また、本発明の化合物は、医薬品への利用以外に、食品への利用が可能である。例えば、飲食品へ添加・配合することにより抗がん効果、抗発がん効果、あるいは抗炎症効果をもった食用組成物（例えば、健康食品等）として利用することも可能である。
【００８８】
即ち、本発明の化合物は、これをそのまま液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキー等に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品等として利用できる。
【００８９】
なお、ヒトと他の哺乳類のＤＮＡ合成酵素の構造は殆ど同じであるため、本発明のＤＮＡ合成酵素阻害剤は、ヒト以外の哺乳類由来のＤＮＡ合成酵素阻害剤としても利用可能である。
【００９０】
また、本発明の化合物は、さらに上記の薬剤の開発過程におけるリード化合物として利用することもできる。本発明の化合物をリードとして、ＤＮＡ合成酵素に対する阻害活性を調べることにより、抗がん剤または抗炎症剤の候補化合物の効率的なスクリーニングが期待できる。本発明には、このようなスクリーニング方法も含まれる。なお、本スクリーニング方法において、ＤＮＡ合成酵素に対する阻害活性を調べる方法は実施例記載の方法に限定されるものではなく、公知の試験方法の中から適した方法を選択すればよい。
【実施例】
【００９１】
次に、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００９２】
融点 (mp) は（株）ヤナコ機器開発研究所 微量融点測定装置 MP-J3 型で測定した。なお融点は未補正である。核磁気共鳴 (NMR) スペクトルは Bruker Avance 400 (1H, 400 MHz; 13C, 100 MHz) で測定した。化学シフト値 (δ) は 1H はテトラメチルシランを、13C は重クロロホルムを内部標準として ppm で、カップリング定数 (J) は Hz で表示した。ピーク多重度は以下のように略記した: s, singlet; brs, broad singlet; d, doublet; t, triplet; q, quartet; quin, quintet; m, multiplet; brm, broad multiplet。赤外吸収 (IR) スペクトルは Horiba FT-210 spectrometer で測定し、cm-1 で表示した。高分解能質量分析 (HRMS) には日本電子 JMS 700 MStation (高速原子衝突法, FAB)、またはフーリエ変換サイクロトロン共鳴質量分析計Bruker solariX (FT-ICR-MS) (エレクトロスプレーイオン化-レーザー脱離イオン化, ESI-LDI) を使用した。
【００９３】
重クロロホルム (CDCl3) は 99.8% atm% D のもの (Cambridge Isotope Laboratories, Inc. +0.05% v/v% TMS) を使用した。重 DMSO は99.9% atm% D のもの (Cambridge Isotope Laboratories, Inc. +0.05% v/v% TMS) を使用した。
【００９４】
合成例１：５−アセトキシ−２−メチル−１，４−ナフトキノン（3a，プルンバギン 酢酸エステル）の合成
【００９５】
【化９】
2015054842.tif 000010
【００９６】
プルンバギン (107 mg, 0.57 mmol) にピリジン (1.0 mL) と無水酢酸 (0.5 mL) を混合し、室温で四時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー (n-ヘキサン : 酢酸エチル = 3:1) にて精製し、3a (118 mg, 90%) を黄色固体として得た。
Yellow solid; mp 118-124℃; IR (KBr) 3049, 2987, 2966, 2927, 1761, 1662, 1593, 1431, 1375, 1365, 1271, 1203, 1024, 910, 785 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.06 (dd, J = 8.0 Hz, 0.8 Hz, 1H), 7.73 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.36 (dd, J = 8.0 Hz, 0.8 Hz, 1H), 6.71 (q, J = 1.2 Hz, 1H), 2.45 (s, 3H), 2.17 (d, J = 1.2 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 184.8, 183.6, 169.4, 149.2, 146.9, 136.8, 134.4, 133.8, 129.4, 125.1, 123.4, 21.1, 16.0;HRMS (FAB) calcd for C13H10O4Na ([M+Na]+) 253.0477, found 253.0482.。
【００９７】
合成例２：５−プロパノイルオキシ−２−メチル−１，４−ナフトキノン（3b，プルンバギン プロピオン酸エステル）の合成
【００９８】
【化１０】
2015054842.tif 000011
【００９９】
プルンバギン (52 mg, 0.28 mmol) とプロピオン酸 (30 μL, 0.41 mmol) をジクロロメタン (3.0 mL) に溶解し、トリエチルアミン (96 μL, 0.69 mmol) 、2-メチル-6-ニトロ安息香酸無水物(2-methyl-6-nitrobenzoic anhydride, MNBA) (143 mg, 0.41 mmol) 、4-ジメチルアミノピリジン (4-dimethylamnopyridine DMAP) (3.4 mg, 0.03 mmol) を加えて室温で二時間撹拌した。水を加えて反応を終了させ、クロロホルムにより抽出した。分離した有機層は飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー (n-ヘキサン : 酢酸エチル = 5:1) にて精製し、3b (60 mg, 89%) を黄色固体として得た。
Yellow solid; mp 113-114℃; IR (KBr) 3076, 3043, 2981, 2937, 1766, 1662, 1630, 1591, 1358, 1265, 1194, 1132, 1080, 1024, 904, 881, 781 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.06 (dd, J = 8.0 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.74 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.36 (dd, J = 8.0 Hz, 1.2 Hz, 1H), 6.71 (q, J = 1.2 Hz, 1H), 2.77 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 2.16 (d, J= 1.2 Hz, 3H), 1.32 (t, J = 7.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 184.8, 183.6, 172.8, 149.3, 146.8, 136.9, 134.4, 133.8, 129.4, 125.0, 123.5, 27.6, 16.0, 8.7; HRMS (FAB) calcd for C14H12O4Na ([M+Na]+) 267.0633, found 267.0639.。
【０１００】
合成例３：５−ヘキサノイルオキシ−２−メチル−１，４−ナフトキノン（3c，プルンバギン カプロン酸エステル）の合成
【０１０１】
【化１１】
2015054842.tif 000012
【０１０２】
プルンバギン (100 mg, 0.53 mmol) とカプロン酸 (100 μL, 0.80 mmol) をジクロロメタン (5.0 mL) に溶解し、トリエチルアミン (185 μL, 1.33 mmol)、MNBA (274 mg, 0.80 mmol)、DMAP (6.7 mg, 0.05 mmol) を加えて室温で二時間撹拌した。水を加えて反応を終了させ、クロロホルムにより抽出した。分離した有機層は飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー (n-ヘキサン : 酢酸エチル = 6:1) にて精製し、3c (102 mg, 68%) を黄色結晶として得た。
Yellow crystal; mp 45-47 ℃; IR (KBr) 3086, 2958, 2929, 2871, 1766, 1664, 1631, 1595, 1454, 1362, 1267, 1234, 1138, 1105, 912, 891, 791 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.99 (dd, J = 8.0 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.65 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.28 (dd, J = 8.0 Hz, 1.2 Hz, 1H), 6.64 (q, J = 1.2 Hz, 1H), 2.66 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.09 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.75 (quin, J = 7.6 Hz, 2H), 1.41-1.28 (m, 4H), 0.87 (t, J = 7.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ184.9, 183.6, 172.2, 149.4, 146.8, 136.9, 134.4, 133.8, 129.5, 125.0, 123.6, 34.2, 31.3, 24.1, 22.4, 16.1, 14.0; HRMS (FAB) calcd for C17H18O4Na ([M+Na]+) 309.1103, found 309.1099.。
【０１０３】
合成例４：５−ドデカノイルオキシ−２−メチル−１，４−ナフトキノン（3d，プルンバギン ラウリン酸エステル）の合成
【０１０４】
【化１２】
2015054842.tif 000013
【０１０５】
プルンバギン (53 mg, 0.28 mmol) とラウリン酸 (85 mg, 0.43 mmol) をジクロロメタン (4.0 mL) に溶解し、トリエチルアミン (100 μL, 0.72 mmol) と MNBA (147 mg, 0.43 mmol) と DMAP (3.5 mg, 0.03 mmol) を加えて室温で一晩撹拌した。水を加えて反応を終了させ、クロロホルムにより抽出した。分離した有機層は飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー (n-ヘキサン : 酢酸エチル = 9:1) にて精製し、3d (90 mg, 86%) を黄色結晶として得た。
Yellow crystal; mp 41-42℃; IR (KBr) 2922, 2850, 1755, 1654, 1632, 1593, 1464, 1358, 1271, 1230, 1188, 1144, 939, 918, 893, 787 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.02 (dd, J = 8.0 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.73 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 8.0 Hz, 1.2 Hz, 1H), 6.71 (q, J = 1.2 Hz, 1H), 2.73 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.16 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.81 (quin, J = 7.6 Hz, 2H), 1.38-1.27 (brm, 16H), 0.88 (t, J = 7.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ184.9, 183.6, 172.2, 149.4, 146.8, 136.9, 134.4, 133.8, 129.5, 125.0, 123.6, 34.2, 31.9, 29.6 (2C), 29.5, 29.3, 29.3, 29.2, 24.4, 22.7, 16.1, 14.1; HRMS (ESI-LDI) calcd for C22H30O4Na ([M+Na]+) 393.2036, found 393.2032.。
【０１０６】
合成例５：５−オクタデカノイルオキシ−２−メチル−１，４−ナフトキノン（3e，プルンバギン ステアリン酸エステル）の合成
【０１０７】
【化１３】
2015054842.tif 000014
【０１０８】
プルンバギン (102 mg, 0.54 mmol) とステアリン酸 (231 mg, 0.81 mmol) をジクロロメタン (5.0 mL) に溶解し、トリエチルアミン (189 μL, 1.36 mmol) と MNBA (280 mg, 0.81 mmol) と DMAP (6.6 mg, 0.05 mmol) を加えて室温で一晩撹拌した。水を加えて反応を終了させ、クロロホルムにより抽出した。分離した有機層は飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー (n-ヘキサン : 酢酸エチル = 10:1) にて精製し、3e (139 mg, 56%) を黄色固体として得た。
Yellow solid; mp 67-70 ℃; IR (KBr) 2921, 2850, 1759, 1660, 1593, 1541, 1514, 1471, 1273, 1142, 1105, 893, 787 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.99 (dd, J = 8.0 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.65 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.27 (dd, J = 8.0 Hz, 1.2 Hz, 1H), 6.63 (q, J = 1.2 Hz, 1H), 2.66 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.09 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.74 (quin, J = 7.6 Hz, 2H), 1.31-1.19 (brm, 28H), 0.81 (t, J = 7.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ184.9, 183,6, 172.2, 149.4, 146.8, 136.9, 134.4, 133.8, 129.5, 125.0, 123.6, 34.2, 31.9, 29.7 (5C), 29.6 (2C), 29.6, 29.5, 29.3, 29.2, 29.2, 24.4, 22.7, 16.0, 14.1; HRMS (FAB) calcd for C29H42O4 Na ([M+Na]+) 477.2981, found 447.2988.。
【０１０９】
合成例６：５−｛（Ｚ）−オクタデセノイルオキシ｝−２−メチル−１，４−ナフトキノン（3f，プルンバギン オレイン酸エステル）の合成
【０１１０】
【化１４】
2015054842.tif 000015
【０１１１】
プルンバギン (100 mg, 0.53 mmol) とオレイン酸 (0.25 mL, 0.78 mmol) をジクロロメタン (5.0 mL) に溶解し、トリエチルアミン (186 μL, 1.33 mmol) と MNBA (275 mg, 0.80 mmol) と DMAP (6.5 mg, 0.05 mmol) を加えて室温で一晩撹拌した。水を加えて反応を終了させ、クロロホルムにより抽出した。分離した有機層は飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー (n-ヘキサン : 酢酸エチル = 20:1) にて精製し、3f (166 mg, 69%) を黄色液体として得た。
Yellow oil; IR (neat) 3005, 2925, 2854, 1770, 1664, 1595, 1462, 1356, 1271, 1190, 1107, 895, 783 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.06 (dd, J = 8.0 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.72 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.34 (dd, J = 8.0 Hz, 1.2 Hz, 1H), 6.70 (q, J = 1.2 Hz, 1H), 5.40-5.35 (m, 2H), 2.73 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.16 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 2.06-1.97 (brm, 4H), 1.81 (quin, J = 7.6 Hz, 2H), 1.47-1.27 (brm, 20H), 0.88 (t, J = 7.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 184.9, 183.6, 172.1, 149.3, 146.8, 136.9, 134.4, 133.8, 130.0, 129.7, 129.5, 125.0, 123.6, 34.2, 31.9, 29.8, 29.7, 29.6, 29.6, 29.5, 29.3, 29.2, 29.1, 27.2, 24.4, 22.7, 22.7, 16.1, 14.1; HRMS (FAB) calcd for C29H40O4Na ([M+Na]+) 475.2824, found 475.2821.。
【０１１２】
合成例７：５−リノレオイルオキシ−２−メチル−１，４−ナフトキノン（3g，プルンバギン リノール酸エステル）の合成
（１）リノレオイルクロリド（2g）の合成
【０１１３】
【化１５】
2015054842.tif 000016
【０１１４】
リノール酸 (110 mg, 0.39 mmol) をジクロロメタン (3.0 mL) に溶解し、オキザリルクロリド (100 μL, 1.16 mmol) を加えた後、室温、窒素雰囲気下で撹拌した。反応の追跡は、反応液をピリジン : メタノール = 1:1 溶液で少量クエンチし、リノール酸のメチルエステルを TLC 上で確認することにより追跡した。四時間後、溶媒を減圧留去して油状残渣を得た。残渣の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
（２）プルンバギン リノール酸エステル（3g）の合成
【０１１５】
【化１６】
2015054842.tif 000017
【０１１６】
2g (117 mg, 0.39 mmol) とプルンバギン (34 mg, 0.18 mmol) とピリジン (1.0 mL) を混合し、DMAP (2.2 mg, 0.02 mmol) を加えて室温、窒素雰囲気下で二時間撹拌した。溶媒を減圧留去して反応を停止し、クロロホルムにより抽出した。分離した有機層は飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー (n-ヘキサン : トルエン = 1:10) にて精製し、3g (31.9 mg, 39%) を黄色液体として得た。
Yellow oil; IR (neat) 3008, 2927, 2854, 1768, 1664, 1595, 1462, 1358, 1271, 1190, 1009, 1026, 982, 895, 783 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.06 (dd, J = 8.0 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.73 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 8.0 Hz, 1.2 Hz, 1H), 6.71 (q, J = 1.2 Hz, 1H), 5.42-5.33 (m, 4H), 2.78 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.73 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.16 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 2.08-2.03 (m, 4H), 1.81 (quin, J = 7.6 Hz, 2H), 1.36-1.26 (m, 14H), 0.94-0.86 (m, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 184.9, 183.6, 172.2, 149.3, 146.8, 136.9, 134.4, 133.8, 130.2, 130.1, 129.5, 128.0, 127.9, 125.0, 123.5, 34.2, 32.5, 31.5, 29.6, 29.5, 29.3, 29.2, 29.1, 27.2, 25.6, 24.4, 22.6, 16.1, 14.1; HRMS (FAB) calcd for C29H38O4Na ([M+Na]+) 473.2668, found 473.2666.。
【０１１７】
合成例８：５−リノレノイルオキシ−２−メチル−１，４−ナフトキノン（3h，プルンバギン リノレン酸エステル）の合成
（１）リノレノイルクロリド（2h）の合成
【０１１８】
【化１７】
2015054842.tif 000018
【０１１９】
α-リノレン酸 (200 mg, 0.72 mmol) をジクロロメタン (6.0 mL) に溶解し、オキザリルクロリド (200 μL, 2.33 mmol) を加えた後、室温、窒素雰囲気下で撹拌した。反応の追跡は、反応液をピリジン : メタノール = 1:1 溶液で少量クエンチし、α-リノレン酸のメチルエステルを TLC 上で確認することにより追跡した。四時間半後、溶媒を減圧留去して油状残渣を得た。残渣の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
（２）プルンバギン リノレン酸エステル（3h）の合成
【０１２０】
【化１８】
2015054842.tif 000019
【０１２１】
2h (213 mg, 0.72 mmol) とプルンバギン (25 mg, 0.13 mmol) とピリジン (1.0 mL) を混合し、DMAP (1.6 mg, 0.01 mmol) を加えて室温、窒素雰囲気下で一晩撹拌した。溶媒を減圧留去して反応を停止し、クロロホルムにより抽出した。分離した有機層は飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー (n-ヘキサン : 酢酸エチル = 20:1) にて精製し、3h (32 mg, 54%) を黄色液体として得た。
Yellow oil; IR (neat) 3010, 2927, 2856, 1768, 1664, 1595, 1462, 1358, 1271, 1107, 974, 912, 783 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.05 (dd, J = 7.6 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.71 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.34 (dd, J = 7.6 Hz, 1.2 Hz, 1H), 6.70 (q, J = 1.2 Hz, 1H), 5.41-5.33 (m, 6H), 2.83-2.71 (m, 6H), 2.16 (d, J= 1.2 Hz, 3H), 2.12-2.00 (m, 4H), 1.81 (quin, 2H), 1.48-1.30 (brm, 8H), 0.98 (t, J = 7.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ184.9, 183.6, 172.2, 149.4, 146.8, 136.9, 134.4, 133.8, 132.0, 130.3,  130.0, 128.2 (2C), 127.7, 127.1, 125.0, 123.6, 34.2, 29.6, 29.2, 29.1, 27.2, 25.6, 25.5, 25.5, 24.4, 20.5, 16.1, 14.3; HRMS (FAB) calcd for C29H39O4([M+H]+) 449.2692, found 449.2694.。
【０１２２】
合成例９：５−エイコサペンタエノイルオキシ−２−メチル−１，４−ナフトキノン（3i，プルンバギン EPAエステル）の合成
（１）エイコサペンタノイルクロリド（2i）の合成
【０１２３】
【化１９】
2015054842.tif 000020
【０１２４】
エイコサペンタエン酸 (EPA) (194 mg, 0.64 mmol) をジクロロメタン (6.0 mL) に溶解し、オキザリルクロリド (200 μL, 2.33 mmol) を加えた後、室温、窒素雰囲気下で撹拌した。反応の追跡は、反応液をピリジン : メタノール = 1:1 溶液で少量クエンチし、EPAのメチルエステルを TLC 上で確認することにより追跡した。三時間後、溶媒を減圧留去して油状残渣を得た。残渣の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
（２）プルンバギンEPAエステル（3i）の合成
【０１２５】
【化２０】
2015054842.tif 000021
【０１２６】
2i (206 mg, 0.64 mmol) とプルンバギン (20 mg, 0.10 mmol) とピリジン (1.0 mL) を混合し、DMAP (1.3 mg, 0.01 mmol) を加えて室温、窒素雰囲気下で四時間撹拌した。溶媒を減圧留去して反応を停止し、クロロホルムにより抽出した。分離した有機層は飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー (n-ヘキサン : 酢酸エチル = 20:1) にて精製し、3i (40 mg, 80%) を黄色液体として得た。
Yellow oil; IR (neat) 3012, 2962, 1768, 1664, 1595, 1446, 1358, 1271, 1190, 1126, 897, 783, 717 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.06 (dd, J = 7.6 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.72 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.34 (dd, J = 7.6 Hz, 1.2 Hz, 1H), 6.70 (q, J = 1.2 Hz, 1H), 5.50-5.35 (m, 10H), 2.90-2.72 (m, 10H), 2.27 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 2.16 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 2.08 (quin, J = 7.6 Hz, 2H), 1.90 (quin, J = 7.6 Hz, 2H), 0.97 (t, J = 7.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 184.8, 183.6, 171.9, 149.3, 146.8, 136.9, 134.4, 133.8, 132.0, 129.4, 129.0, 128.9, 128.5, 128.3, 128.2, 128.1, 128.1, 127.8, 127.0, 125.0, 123.5, 33.6, 26.6, 25.6, 25.6, 25.6, 25.5, 24.3, 20.5, 16.1, 14.3; HRMS (ESI-LDI) calcd for C31H36O4Na ([M+Na]+) 495.2506, found 495.2505.。
【０１２７】
合成例１０：５−ドコサヘキサエノイルオキシ−２−メチル−１，４−ナフトキノン（3j，プルンバギン DHAエステル）の合成
（１）ドコサヘキサエノイルクロリド（2j）の合成
【０１２８】
【化２１】
2015054842.tif 000022
【０１２９】
ドコサヘキサエン酸 (DHA) (210 mg, 0.64 mmol) をジクロロメタン (6.0 mL) に溶解し、オキザリルクロリド (200 μL, 2.33 mmol) を加えた後、室温、窒素雰囲気下で撹拌した。反応の追跡は、反応液をピリジン : メタノール = 1:1 溶液で少量クエンチし、EPAのメチルエステルを TLC 上で確認することにより追跡した。三時間後、溶媒を減圧留去して油状残渣を得た。残渣の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
（２）プルンバギン DHAエステル（3j）の合成
【０１３０】
【化２２】
2015054842.tif 000023
【０１３１】
2j (222 mg, 0.64 mmol) とプルンバギン (20 mg, 0.11 mmol) とピリジン (1.0 mL) を混合し、DMAP (1.3 mg, 0.01 mmol) を加えて室温、窒素雰囲気下で三時間撹拌した。溶媒を減圧留去して反応を停止し、クロロホルムにより抽出した。分離した有機層は飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー (n-ヘキサン : 酢酸エチル = 20:1) にて精製し、3j (39 mg, 70%) を黄色液体として得た。
Yellow oil; IR (KBr) 3012, 2964, 2927, 2875, 1768, 1662, 1595, 1358, 1271, 1190, 1128, 1026, 980, 897, 723, 714 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.06 (dd, J = 8.0 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.73 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 8.0 Hz, 1.2 Hz, 1H), 6.71 (q, J = 1.2 Hz, 1H), 5.34 (m, 12H), 2.92-2.73 (m, 12H), 2.59 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.16 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 2.07 (quin, J = 7.2 Hz, 2H), 0.97 (t, J= 0 .4 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 184.8, 183.6, 171.5, 149.3, 146.8, 136.9, 134.4, 133.8, 132.0, 129.5, 129.4, 128.5, 128.2 (2C), 128.2, 128.1, 128.1, 128.1, 127.8, 127.8, 127.0, 125.1, 123.5, 34.1, 25.6, 25.6, 25.6, 25.6, 25.5, 22.4, 20.5, 16.1, 14.3; HRMS (ESI-LDI) calcd for C33H38O4Na ([M+Na]+) 521.2662, found 521.2661.。
【０１３２】
試験例１（ＤＮＡ合成酵素に対する阻害活性の評価；in vitro）
ＤＮＡ合成酵素は鋳型となるＤＮＡが存在している場合のみ、４種の前駆体すなわち４種のデオキシヌクレオシド３リン酸〔デオキシアデノシン３リン酸(以下ｄＡＴＰと略)、デオキシグアノシン３リン酸(以下ｄＧＴＰと略)、デオキシシチジン３リン酸(以下ｄＣＴＰと略)、デオキシチミジン３リン酸（以下ｄＴＴＰと略）〕を基質としてＤＮＡを合成する。このことを利用してＤＮＡ合成酵素活性は合成ＤＮＡ（ｐｏｌｙ(ｄＡ）／ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８）を鋳型プライマーとし、基質中のｄＴＴＰを３Ｈラベルしておくとポリメラーゼの重合反応により3Ｈ−ｄＴＴＰがＤＮＡ鎖のチミン残基として取り込まれる。このＤＮＡ鎖をＤＥＡＥ−セルロース（ジエチルアミノエチル−セルロース）濾紙に吸着させる。この吸着されたＤＮＡ鎖の放射比活性がＤＮＡ合成酵素活性となる。このとき、阻害の有無は試験物質によりＤＮＡ合成酵素の重合反応が阻害された時、ＤＮＡ鎖への基質の取り込みが少なくなったり全くなくなるため、放射能活性が低下することから判断される。
【０１３３】
（１）材料の調製
ＤＮＡ合成酵素として、哺乳類のＤＮＡ合成酵素｛A-ファミリー（ヒトＤＮＡ合成酵素γ）、B-ファミリー（子牛ＤＮＡ合成酵素α，ヒトＤＮＡ合成酵素δ，ヒトＤＮＡ合成酵素ε）、X-ファミリー（ラットＤＮＡ合成酵素β，ヒトＤＮＡ合成酵素λ，ヒトＤＮＡ合成酵素μ，子牛ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（TdT））、Y-ファミリー（ヒトＤＮＡ合成酵素η，マウスＤＮＡ合成酵素ι，ヒトＤＮＡ合成酵素κ）｝、植物のＤＮＡ合成酵素｛カリフラワーＤＮＡ合成酵素α，イネＤＮＡ合成酵素λ｝、及び原核生物のＤＮＡ合成酵素｛大腸菌ＤＮＡ合成酵素I，Taq ＤＮＡ合成酵素，T4 ＤＮＡ合成酵素｝を使用した。他のＤＮＡ代謝酵素として、子牛プライマーゼ、HIV-1逆転写酵素、T7 ＲＮＡ合成酵素、T4ポリヌクレチド・キナーゼ、及び牛ＤＮＡ分解酵素Iを使用した。
【０１３４】
各ＤＮＡ合成酵素は、公知の方法に従って合成したもの、或いは市販品を用いた。具体的には、例えば次のとおりである。子牛ＤＮＡ合成酵素αは、公知文献（Tamai et al., Biochim.Biophys.Acta, 1988, 950, 263）に記載の方法に従って、子牛胸腺から免疫アフィニティーカラムクロマトグラフィーによって精製した。ラットＤＮＡ合成酵素βは、公知文献（Date et al., Biochemistry 1988, 27, 2983）に記載の方法に従って、組換えタンパクとして大腸菌のJMpβ5株から精製した。ヒトＤＮＡ合成酵素γは、コーディング領域をpFastBac(Invitrogen Japan K.K., Tokyo Japan)に組み込み、ヒスチジンタグを連結したリコンビナントタンパクとして、BAC-TO-BAC HT Baculovirus Expression System(Life Technologies, MD, USA)を使用して発現させ、公知文献（Umeda et al., Eur.J.Biochem. 2000, 267, 200）に記載の方法に従って、ProBoundresin(Invitrogen Japan K.K., Tokyo Japan)を使用して精製した。ヒトＤＮＡ合成酵素δ及びHuman polεは、抹消血がん細胞（Molt-4）の核画分を、ＤＮＡ合成酵素δの2番目のサブユニット又はＤＮＡ合成酵素εのアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって、公知文献（Ohige et al., Protein Expr.Purif. 2004, 35, 248）に記載の方法に従って精製した。ヒトＤＮＡ合成酵素ηは、C末端にHis6タグを連結したリコンビナントタンパク（アミノ酸番号1〜511）として大腸菌の細胞中で発現させ、公知文献（Kusumoto et al., Genes Cells 2004, 9, 1139）に記載の方法に従って精製した。マウスＤＮＡ合成酵素ιは、C末端にHis6タグを連結したリコンビナントタンパクとして、Ni-NTAカラムクロマトグラフィーによって、公知文献（McDonald et al., J. Exp. Med. 2003, 198, 635）に記載の方法に従って精製した。ヒトＤＮＡ合成酵素κは、C末端にHis6タグを連結したリコンビナントタンパク（アミノ酸番号1〜560）として、大腸菌の細胞中で発現させ、公知文献（Ohashi et al., Genes Cells 2004, 9, 523）に記載の方法に従って精製した。ヒトＤＮＡ合成酵素λは、ヒスチジンタグを連結したリコンビナントタンパクとして、公知文献（Shimazaki et al., Genes Cells 2000, 7, 639）に記載の方法に従って大腸菌の細胞中で過剰発現させ、精製した。カリフラワーＤＮＡ合成酵素αは、公知文献（Sakaguchi et al., 1980, 5, 323）に記載の方法に従って精製した。子牛プライマーゼ活性は子牛ＤＮＡ合成酵素αを使用した。牛ＤＮＡ分解酵素Iは、Stratagene Cloning Systems(La Jolla, CA, USA)から得た。大腸菌ＤＮＡ合成酵素I及びHIV-1逆転写酵素は、Worthington Biochemical Corp.(Freehold, NJ, USA)から購入した。Taq ＤＮＡ合成酵素、T4 ＤＮＡ合成酵素、T7 ＲＮＡ合成酵素、及びT4 ポリヌクレオチド・キナーゼは、タカラバイオから購入した。
【０１３５】
（２）酵素阻害活性の測定
（２‐１）DNA合成酵素阻害活性の測定
反応液の調製
子牛ＤＮＡ合成酵素α、ラットＤＮＡ合成酵素β、ヒトＤＮＡ合成酵素η、マウスＤＮＡ合成酵素ι、ヒトＤＮＡ合成酵素κ、カリフラワーＤＮＡ合成酵素α、大腸菌ＤＮＡ合成酵素I、Taq ＤＮＡ合成酵素、及びT4 ＤＮＡ合成酵素については、公知文献（Mizushina et al., Biochim.Biophys.Acta 1996, 1308, 256、及びMizushina et al., Biochim. Biophys. Acta 1997, 1336, 509）の記載に従って、反応液を調製した。ヒトＤＮＡ合成酵素γ、ヒトＤＮＡ合成酵素δ、ヒトＤＮＡ合成酵素ε、及びヒトＤＮＡ合成酵素λについては、公知文献（Umeda et al., Eur.J.Biochem. 2000, 267, 200、及びOgawa et al. Jpn.J.Cancer Res. 1998, 89, 1154）の記載に従って、試験用の反応液を調製した。子牛ＤＮＡ合成酵素α用反応液を一例として下記に示す。
＜子牛ＤＮＡ合成酵素α用反応液＞
トリス塩酸緩衝液（pH7.5）：50mM
ジチオスレイトール（DTT）：1mM
塩化マグネシウム：5mM
グリセリン：15％（v/v）
poly（dA）/：10μg/ml
oligo18（dT）：5μg/ml
トリチウムでラベルしたデオキシチミジン3リン酸(3H-dTTP）を含むdTTP：10μM（100cpm/pmol）
阻害活性の測定
16μlの酵素溶液と、試験化合物をDMSOに溶解した液４μlを混合したもの8μlを、上記「反応液の調製」に記載の反応液16μlに加えた。該混合液を37℃で60分間（Taq ＤＮＡ合成酵素については74℃で60分間）でインキュベートした。インキュベート後各試験液18μlをDEAE-セルロースろ紙に吸着させ、このろ紙を5％（w/v）Na2HPO4、水、エタノールで洗浄した。この洗浄条件では10ヌクレオチド以上のポリマーはろ紙に吸着される。次いで、風乾してトルエンシンチレータを入れたバイアルに沈め、液体シンチレーションカウンタで放射線量を測定した。その測定結果により酵素反応の阻害率を以下の式で求めた。
【０１３６】
阻害率(％）＝(1−試験溶液の比活性(cpm)／対照溶液の比活性(cpm))×100
試験化合物の各種濃度における阻害率を基に、50％阻害濃度（IC50）（μM）を求めた。
【０１３７】
（２‐２）その他のDNA代謝酵素阻害活性の測定
その他のＤＮＡ代謝酵素（子牛プライマーゼ、HIV-1逆転写酵素、T7 ＲＮＡ合成酵素、マウスIMP脱水素酵素（II型）、T4 ポリヌクレオチド・キナーゼ、及び牛ＤＮＡ分解酵素I）の活性の測定は、公知文献（Tamiya et al., Biochem.Mol.Biol.Int. 1997, 41, 1179、Nakayama et al., J.Biochem.(Tokyo)1985, 97, 1385、Mizushina et al., Biochimie 2007, 89, 581、Soltis et al., J.Biol.Chem.1982, 257, 11332、及びLu et al., J.Biol.Chem. 1991, 266, 21060）に記載の方法により行い、試験化合物のこれらの酵素に対する阻害率を測定し、50％阻害濃度（IC50）（μM）を求めた。
【０１３８】
（２‐３）結果
上記方法で試験化合物の濃度１０μＭで測定した哺乳類ＤＮＡ合成酵素α、γ、κ、及びλの阻害活性を図１に示す。図１中、グラフの棒が短いほど阻害作用が強いことを示している。
【０１３９】
図１に示されるように、アシルプルンバギンはプルンバギンよりも強いＤＮＡ合成酵素阻害活性を発揮した。ＤＮＡ合成酵素κ及びλに対して最も強い阻害活性を発揮したのはプルンバギンDHAエステルであった。一方、ＤＮＡ合成酵素α及びγに対して最も強い阻害活性を発揮したのはプルンバギンオレイン酸エステル及びプルンバギンDHAエステルであった。
【０１４０】
さらに、プルンバギン オレイン酸エステルの、種々のＤＮＡ合成酵素及びＤＮＡ代謝系酵素に対する阻害活性（50％阻害濃度）を表１に示す。
【０１４１】
【表１】
2015054842.tif 000024
【０１４２】
表１に示されるように、プルンバギンオレイン酸エステルは、哺乳類のＤＮＡ合成酵素の全ての分子種に対して阻害活性を発揮した。一方、植物や原核生物由来のＤＮＡ合成酵素やその他のＤＮＡ代謝系酵素に対しては阻害活性を発揮しなかった。このことから、プルンバギンオレイン酸エステルに代表されるアシルプルンバギン及びその誘導体は、哺乳類のＤＮＡ合成酵素を選択的に阻害することが示唆された。
【０１４３】
試験例２（がん細胞の増殖抑制活性の評価；in vitro）
本試験に用いたがん細胞（HCT116 (大腸がん)、A549 (肺がん)、DU145 (前立腺がん)、HeLa (子宮がん)、HepG2 (肝臓がん)、HT-29 cells (大腸がん)、MCF-7 (乳がん)、PANC-1 (膵臓がん)、及びPC3 (前立腺がん)）は、ATCC（American Type Culture Collection）から購入した。培地は、各細胞に適した公知の培地を用いた。例えば、HCT116の培地としては、McCoy’s5A-DMEM培地に牛胎児血清10％(v/v)を添加したものを用いた。培養は5％ CO2インキュベーターにて37℃で行った。上記に示した培地に試験物質を溶解した。ただし、これらは一度ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、上記の培地中に1% DMSO濃度になるように溶かした。本試験のための培養は、96穴マイクロプレートで実施した。各ウェルに1.0×104個の細胞を播種し、１つの試験濃度に対し5ウェルずつ与えた。またポジティブコントロールとして、培地に1％のDMSO（試験物質が存在しない）を含むものを用いた。試験物質を添加後は、5％ CO2インキュベーター内、37℃で24時間培養した。そして、各試験区の細胞生存率をＷＳＴ−１法で判定した。すなわち、上記24時間後テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１を添加し、さらに4時間培養した。生細胞による還元を経て生産するホルマザン量が生細胞数に比例するとみなし、450 nmの光学密度(O.D.)で定量した。細胞生存率は次の式により算出した。
【０１４４】
細胞生存率(%) = 試験区のO.D. [450 nm] / 対照区のO.D. [450 nm]
（参考文献）
Ｉｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．（１９９６）１９，ｐ１５１８−１５２０
試験化合物の各種濃度における生存率を基に、50％増殖抑制濃度（LD50）（μM）を求めた。
【０１４５】
上記方法で試験化合物の濃度１００μＭで測定したヒト大腸がん細胞（HCT116 cells）の増殖抑制活性を図２に示す。図２中、グラフの棒が短いほど阻害作用が強いことを表している。
【０１４６】
図２より、脂肪酸はヒト大腸がん細胞の増殖に影響しないことが分かった。アシルプルンバギンは、プルンバギン単独より強いがん細胞増殖抑制活性を示した。最も強いがん細胞増殖抑制活性を示したものは、プルンバギンオレイン酸エステルであった。試験例１のＤＮＡ合成酵素α及びγ阻害活性とヒト大腸がん増殖抑制活性には類似の傾向が見られた。アシルプルンバギンは、抗がん剤として有効である。
【０１４７】
さらに、プルンバギン オレイン酸エステルの、種々の臓器由来のがん細胞に対する阻害活性（50％増殖抑制濃度）を表２に示す。
【０１４８】
【表２】
2015054842.tif 000025
【０１４９】
表２に示されるように、プルンバギンオレイン酸エステルは、種々の臓器由来のがん細胞に対して増殖抑制活性を発揮した。このことから、プルンバギンオレイン酸エステルに代表されるアシルプルンバギン及びその誘導体は、由来を問わず多様ながん細胞に対して増殖抑制活性を発揮することが示唆された。
【０１５０】
試験例３（抗腫瘍活性の評価；in vivo）
試験化合物の抗腫瘍活性を評価した。具体的には次のように行った。ヒト結腸がん細胞であるHT-29を1×107cells/100μLになるように生理食塩水に混合した。該混合液100μLを、ヌードマウス（6週齢のBALB/c Slc-nu/nu）の背中に注入して、腫瘍が100mm3程度になるまで経過観測した。試験化合物を溶かしたPBS 100μLを、ヌードマウス1kg当たり5mgの投与量になるように、腫瘍局所に1日おきに全15回投与した。腫瘍の大きさ（縦、横、高さ）をノギスを用いて測定し、該測定値に基いて腫瘍体積を算出した。同時にマウスの体重も測定した。試験化合物投与後の腫瘍体積増加曲線を図３に示し、体重の変化を図４に示す。
【０１５１】
図３に示されるように、プルンバギンオレイン酸エステル（C18:1-プルンバギン）は腫瘍体積の増加を抑制した。この抑制の程度は、類似の化合物であるジュグロンオレイン酸エステル（C18:1-ジュグロン）よりも高かった。また、図４に示されるように、プルンバギンオレイン酸エステルの投与は、マウスの体重には影響を与えなかった。このことから、副作用が少ないことが示唆された。
【０１５２】
試験例４（TNF-α産生抑制活性の評価；in vivo）
試験化合物の、TNF-α（炎症マーカー）の産生抑制活性を評価した。具体的には次のように行った。まず、RAW264.7細胞（マウスマクロファージ様細胞）をDMEM培地中で37℃、24時間培養した。培地を1、5又は10μMの被検化合物を含むDMEM培地に交換し、37℃、30分間インキュベーションした。次に100 ng/mlのLPSを含む培地に交換し、37℃、24時間インキュベーションした。その後、LPSによって誘導されたTNF-αの量を、ELISAの系で測定した（n=5）。測定は、市販のキット（Bioscience製）を用いて測定した。陰性コントロールは、LPSを添加しない系とした。試験化合物を加えないサンプルのTNF-α産生量を100％とし、陰性コントロールのTNF-α産生量を0％として、TNF-α産生率（％）を算出した。上記方法で試験化合物の濃度５μＭで測定したTNF-α産生率を図５に示す。図５中、グラフの棒が短いほど試験化合物による産生抑制活性が強いことを表している。
【０１５３】
図５に示されるようにン、アシルプルンバギンはTNF-α産生抑制活性を発揮した。特に、プルンバギンDHAエステルが最も強い抑制活性を発揮した。
【０１５４】
試験例５（マウス耳を用いた抗炎症活性の評価；in vivo）
次の手順で、TPA（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate）誘発マウス耳介浮腫抑制試験の測定を行った。マウスの片方の耳に試験物質 (500 μg) を塗布し、30分後に両耳にTPA (0.5 μg) を塗布した。7時間後に試験物質処理の耳介重量と試験物質未処理の耳介重量を測定した。マウスの匹数は6匹とした。試験物質未処理のコントロール群の耳介肥厚率を100% とし、試験物質未処理の耳介肥厚率、すなわち抗炎症活性を次のように算出した。
【０１５５】
抗炎症活性 (%) ＝ ([TPA 塗布耳介重量] − [試験物質 ＋ TPA 塗布耳介重量])／([TPA 塗布耳介重量] − [試験物質未処理の耳介重量]) × 100
（参考文献）
Ｇｓｃｈｗｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．（１９８４）２５，ｐ１７７−１８５
試験化合物の抗炎症活性を図６及び７に示す。図６及び７中、グラフの棒が長いほど強い抗炎症活性を示す。
【０１５６】
図６より、アシルプルンバギンは、脂肪酸単独やプルンバギン単独よりも強い抗炎症活性を示した。最も強い抗炎症活性を示したものは、プルンバギンDHAエステルであった。試験例１のＤＮＡ合成酵素κ及びλ阻害活性と、抗炎症活性には類似の蛍光が見られた。アシルプルンバギンは抗炎症剤として有効である。また、図７より、プルンバギンDHAエステル（C22:6-プルンバギン）は、類似の化合物であるジュグロンDHAエステル（C22:6-ジュグロン）、及び公知の抗炎症剤であるグリチルレチン酸よりも高い抗炎症活性を示した。
【０１５７】
試験例６（抗アレルギー活性の評価；in vivo）
抗アレルギー活性の指標となる、マウス受身皮膚アナフィラキシー反応（PCA反応）阻害活性を測定した。Anti-dinitrophenyl (DNP)・IgE抗体を含む抗血清をマウスの両耳の耳介に皮内注射し2時間後、コントロール群には生理食塩水、サンプル群には生理食塩水に懸濁させた試験化合物（100mg/kg）をゾンデにより強制経口投与した。サンプル投与2時間後に2％エバンスブルー（EB）色素溶液を含むDNP-ヒト血清アルブミン（2mg/mL）を尾静脈より注射し、30分後に耳介を切断して片耳ずつ重量を測定し、1N KOHに入れて37℃で一晩おいてEBを溶かした。EB量を吸光度（620nm）で測定し、EBの標準曲線（検量線）より漏出したEB量を算出した。本実験系では、耳の色素量が少ない程、アレルギー反応が抑えられていることを示す。算出EB量に基いて、下記式に従ってPCA反応阻害率を求めた。
【０１５８】
PCA反応阻害率（％）＝［１−｛（サンプル群の算出EB量−EBを注射していない群の算出EB量）／（コントロール群の算出EB量−EBを注射していない群の算出EB量）｝］×１００
試験化合物のPCA反応阻害率を図８に示す。図８中、グラフの棒が長いほど強いPCA反応阻害活性（抗アレルギー活性）を示す。
【０１５９】
図８より、プルンバギンDHAエステル（C22:6-プルンバギン）は、類似の化合物であるジュグロンDHAエステル（C22:6-ジュグロン）、及び公知の抗アレルギー剤であるトラニストよりも高い抗アレルギー活性を示した。
【０１６０】
試験例７（アシルプルンバギンの安定性の評価；in vitro）
生体内には酵素反応により生じた様々な高反応性代謝物（アミノ酸等）が存在し、それらが薬物と反応して薬物を不安定化すると考えられている。そこで、このような高反応性代謝物としてジメチルアミノピリジンの存在下でのアシルプルンバギンの安定性を評価した。具体的には次のように行った。プルンバギンDHAエステルとジュグロンDHAエステルを、ジクロロメタン中、ジメチルアミノピリジン（0.1当量）で、10分間撹拌した。撹拌後の溶液の状態を観察した。撹拌後の溶液の写真を図９に示す。
【０１６１】
撹拌前、プルンバギンDHAエステル溶液及びジュグロンDHAエステル溶液は共に黄色透明であった。しかし、図９に示されるように、撹拌後、プルンバギンDHAエステル溶液（右側）は黄色透明を保っていたのに対して、ジュグロンDHAエステル溶液（左側）は黒褐色に変化していた。これは、ジュグロンDHAエステル溶液中で、撹拌後に不溶性固体が析出したことを示唆する。これらの結果より、プルンバギンDHAエステル溶液は、ジュグロンDHAエステルに比べて、生体内における安定性が高いことが示唆された。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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