(57)【要約】【課題】被験者あたりのデータ量が少ない場合であっても、効率よくデータ量の不足を補い、検出感度を高めることにある。【解決手段】複数の被験者の中から第一被験者を選択し、前記第一被験者の変異を出力するＤＮＡ配列の解析装置であって、複数の被験者のゲノムから得られる配列データを公共データベースの参照ゲノム配列にマッピングして得られるマッピングデータ、および前記複数の被験者の血縁関係を表す家系情報を記憶する記憶手段と、前記家系情報に基づき、所定の条件の第二被験者を順次選択する家系情報分析手段と、前記第一被験者と前記第二被験者のマッピングデータを同時解析して変異を検出し、該検出された変異を前記第一被験者と前記第二被験者に共通の変異として記録するペア解析を実行するペア解析手段と、前記検出された変異から重複を除去し、前記第一被験者の変異として出力する変異決定手段と、を備える。【選択図】図２
2015219856.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の被験者の中から第一被験者を選択し、前記第一被験者の変異を出力するＤＮＡ配列の解析装置であって、
複数の被験者のゲノムから得られる配列データを公共データベースの参照ゲノム配列にマッピングして得られるマッピングデータ、および前記複数の被験者の血縁関係を表す家系情報を記憶する記憶手段と、
前記家系情報に基づき、所定の条件の第二被験者を順次選択する家系情報分析手段と、
前記第一被験者と前記第二被験者のマッピングデータを同時解析して変異を検出し、該検出された変異を前記第一被験者と前記第二被験者に共通の変異として記録するペア解析を実行するペア解析手段と、
前記検出された変異から重複を除去し、前記第一被験者の変異として出力する変異決定手段と、
を備えたことを特徴とする解析装置。
【請求項２】
前記所定の条件は前記第一被験者の両親であり、
前記家系情報分析手段は前記第一被験者の両親を前記第二被験者として選択することを特徴とする請求項１に記載の解析装置。
【請求項３】
前記所定の条件は、前記第一被験者の子供と、前記家系情報に少なくとも一人の親の存在しない任意の被験者である創始者であり、
前記家系情報分析手段は前記第一被験者の子供と前記創始者を前記第二被験者として選択することを特徴とする請求項１に記載の解析装置。
【請求項４】
前記所定の条件は、前記第一被験者の一人の親と、前記第一被験者の子供と、前記家系情報に少なくとも一人の親の存在しない任意の被験者である創始者であり、
前記家系情報分析手段は前記第一の被験者の一人の親と子供と前記創始者を前記第二被験者として選択することを特徴とする請求項１に記載の解析装置。
【請求項５】
前記所定の条件は確率 P(y)の最も大きな被験者であり、
前記家系情報分析手段は、第一被験者 x と各第二被験者の候補 y について、
前記第一被験者 x と前記第二被験者の候補 y との親縁係数を F(x, y)とし、
第一被験者の変異の集合を分割して得られる部分集合の集合であって、それぞれの部分集合がすべて同一被験者に遺伝している変異のみからなるものを V とし、
v∈Vなる第一被験者の変異の部分集合が、それまでに第一被験者を対象とするペア解析の対象となった回数を n(v)とし、
前記第一被験者 x の変異全体に占める v の変異の割合を s(v)とし、
２人の被験者のマッピングデータを用いて変異解析を行なった場合の変異検出確率を rとするとき、
新たな変異が検出される確率を P(y) = Σv∈V 2F(x, y)s(v)r(1-r)n(v) によって評価し、
前記確率 P(y) の最も大きな被験者を第二被験者として選択することを特徴とする請求項１に記載の解析装置。
【請求項６】
複数の被験者のゲノムから得られる配列データを公共データベースの参照ゲノム配列にマッピングして得られるマッピングデータを記憶する工程と、
前記複数の被験者の血縁関係を表す家系情報を記憶する工程と、
前記複数の被験者の中から前記第一被験者を選択する工程と、
前記家系情報に基づき、所定の条件の第二被験者を順次選択する工程と、
前記第一被験者と前記第二被験者のマッピングデータを同時解析して変異を検出し、該検出された変異を前記第一被験者と前記第二被験者に共通の変異として記録するペア解析を実行する工程と、
前記検出された変異から重複を除去し、前記第一被験者の変異としてデータベースを作成する工程と、
を有することを特徴とするデータベース作成方法。
【請求項７】
前記所定の条件は前記第一被験者の両親であり、
前記第二被験者を順次選択する工程は、前記第一被験者の両親を前記第二被験者として選択することを特徴とする請求項６に記載のデータベース作成方法。
【請求項８】
前記所定の条件は、前記第一被験者の子供と、前記家系情報に少なくとも一人の親の存在しない任意の被験者である創始者であり、
前記第二被験者を順次選択する工程は、前記第一被験者の子供と前記創始者を前記第二被験者として選択することを特徴とする請求項６に記載のデータベース作成方法。
【請求項９】
前記所定の条件は、前記第一被験者の一人の親と、前記第一被験者の子供と、前記家系情報に少なくとも一人の親の存在しない任意の被験者である創始者であり、
前記第二被験者を順次選択する工程は、前記第一の被験者の一人の親と子供と前記創始者を前記第二被験者として選択することを特徴とする請求項６に記載のデータベース作成方法。
【請求項１０】
前記所定の条件は確率 P(y)の最も大きな被験者であり、
前記第二被験者を順次選択する工程は、
第一被験者 x と各第二被験者の候補 y について、
前記第一被験者 x と前記第二被験者の候補 y との親縁係数を F(x, y)とし、
第一被験者の変異の集合を分割して得られる部分集合の集合であって、それぞれの部分集合がすべて同一被験者に遺伝している変異のみからなるものを V とし、
v∈Vなる第一被験者の変異の部分集合が、それまでに第一被験者を対象とするペア解析の対象となった回数を n(v)とし、
前記第一被験者 x の変異全体に占める v の変異の割合を s(v)とし、
２人の被験者のマッピングデータを用いて変異解析を行なった場合の変異検出確率を rとするとき、
新たな変異が検出される確率を P(y) = Σv∈V 2F(x, y)s(v)r(1-r)n(v) によって評価し、
前記確率 P(y) の最も大きな被験者を第二被験者として選択することを特徴とする請求項６に記載のデータベース作成方法。
【請求項１１】
公開されている既知の変異の位置およびＤＮＡ配列に基づき、共通の変異とする閾値 k を決定する工程と、
前記ペア解析を実行する工程は、前記検出された変異の配列数が前記閾値 k を超える場合に共通の変異として記録することを特徴とする請求項６に記載のデータベース作成方法。
【請求項１２】
サンガー法による処理に基づき、共通の変異とする閾値 k を決定する工程と、
ペア解析を実行する工程は、前記検出された変異の配列数が前記閾値 k を超える場合に共通の変異として記録することを特徴とする請求項６に記載のデータベース作成方法。
【請求項１３】
複数の被験者の中から第一被験者を選択し、前記第一被験者の変異を出力する計算機を含むシステムであって、
複数の被験者のゲノムから得られる配列データを公共データベースの参照ゲノム配列にマッピングして得られるマッピングデータ、前記複数の被験者の血縁関係を表す家系情報、および前記計算機の出力するデータベースを記憶する記憶装置をさらに含み、
前記計算機は、
前記記憶装置から前記マッピングデータと前記家系情報を入力して記憶する記憶手段と、
前記家系情報に基づき、所定の条件の第二被験者を順次選択する家系情報分析手段と、
前記第一被験者と前記第二被験者のマッピングデータを同時解析して変異を検出し、該検出された変異を前記第一被験者と前記第二被験者に共通の変異として記録するペア解析を実行するペア解析手段と、
前記検出された変異から重複を除去し、前記第一被験者の変異を前記データベースとして出力する変異決定手段と、
を備えたことを特徴とするシステム。
【請求項１４】
前記記憶装置と前記計算機はネットワークで接続されていることを特徴とするシステム。
【請求項１５】
前記記憶装置はリムーバブルメディアであり、前記記憶装置は前記計算機に装着されることを特徴とするシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解析装置、データベース作成方法、およびシステムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
次世代シーケンサによるＤＮＡ配列決定(Next Generation Sequencing, NGS)は，従来のサンガー法に比べて，劇的に低いコストでゲノム配列を決定することを可能とした。2001年に約１億米ドルであったゲノム配列決定のコストは，次世代シーケンサにより2013年には5,826米ドルにまで下がっている(DNA Sequencing Costs, http://www.genome.gov/sequencingcosts/)。コストが安いだけでなく，短期間で膨大な量の配列データを得ることが可能であり，一度装置を稼働させるだけで１兆塩基を超える膨大な配列データを生成することが可能な次世代シーケンサも存在する。こうした技術により，多数の被験者のゲノム配列を決定する大規模プロジェクトが実行可能となり、国内外で大規模コホート(被験者の集団)のゲノム配列を決定するプロジェクトがいくつも実行に移されている。
【０００３】
一方，次世代シーケンサにより多数の人のゲノム配列が決定されるにつれ，ゲノムの個人差として従来主要な解析対象であった一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)だけでなく，数百塩基以上の比較的長い配列が一度に変化する現象が頻繁に見られることがわかってきた。こうした変異はゲノムの構造多型(Structural Variation, SV)と呼ばれ，主要なものが、標準的なゲノム配列にない配列が見られる挿入や、逆にあるべき配列が見られない欠失である（挿入や欠失の例を図５に示す）。構造多型では，一度に変化する塩基の量が多いため，個人の形質表現型の違いやゲノムが関連する疾患に重要な役割を果たすと考えられている。構造多型の発生機構や構造多型が生体内の機能に与える効果を解析するためには，構造多型を網羅的に解析する必要がある。
【０００４】
このような解析に関して、例えば特許文献１にはＤＮＡ配列をゲノムにマッピングし、マッピングされた配列同士を比較する技術が開示されている。また、非特許文献１には多数の被験者の配列データを同時解析することにより、被験者あたりの配列データ量が少ない場合でも、複数の被験者に共通に出現する変異を検出することにより、構造多型解析を可能とする技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−１３５０５３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Handsaker et al. 2011, Discovery and genotyping of genome structural polymorphism by sequencing on a population scale, Nature Genetics 2011 Mar;43(3):269-76.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
次世代シーケンサが一度に配列決定できる長さは１００〜４００塩基程度に限られるため，構造多型のように大きなゲノムの変化を正確に捉えることは難しい。その一方で、ゲノム配列決定のコストが下がったとはいえ、大規模コホートのゲノム配列決定を行なう場合、ゲノム全体の配列決定はコストがかかるため、タンパク質を生成する遺伝子の領域等の限られた範囲だけの配列決定を行なうか、ゲノム配列全体の配列決定を行なう際に被験者当たりのデータ量を削減することが広く行なわれている。次世代シーケンサによりゲノム配列を決定する場合、解析対象の配列の３０倍以上のデータ量を得ることが望ましいが、１０倍あるいはそれ以下のデータ量しか得られない場合があり、効率よくデータ量の不足を補う技術が必要とされる。
【０００８】
これに対して、特許文献１に開示された技術は、公開データベース（ＤＢ）の配列に対する処理であって、特定の被験者集団の配列を扱うものではない。そして、効率よくデータ量の不足を補う技術ではない。また、非特許文献１に開示された技術は、多数の被験者の配列データを同時解析することにより、被験者あたりの配列データ量が少ない場合でも、複数の被験者に共通に出現する変異を検出して構造多型解析を可能とする。しかし、多数の被験者の解析が必要であるため、同じ変異を共有しない被験者のデータを多数扱うことになり、効率よくデータ量の不足を補うことができず、構造多型の検出時に偽陽性が発生しやすくなる。
【０００９】
そこで、本発明の主たる目的は、被験者あたりのデータ量が少ない場合であっても、効率よくデータ量の不足を補い、検出感度を高めることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る代表的な解析装置は、複数の被験者の中から第一被験者を選択し、前記第一被験者の変異を出力するＤＮＡ配列の解析装置であって、複数の被験者のゲノムから得られる配列データを公共データベースの参照ゲノム配列にマッピングして得られるマッピングデータ、および前記複数の被験者の血縁関係を表す家系情報を記憶する記憶手段と、前記家系情報に基づき、所定の条件の第二被験者を順次選択する家系情報分析手段と、前記第一被験者と前記第二被験者のマッピングデータを同時解析して変異を検出し、該検出された変異を前記第一被験者と前記第二被験者に共通の変異として記録するペア解析を実行するペア解析手段と、前記検出された変異から重複を除去し、前記第一被験者の変異として出力する変異決定手段と、を備えたことを特徴とする。
【００１１】
そして、例えば前記所定の条件は前記第一被験者の両親であり、前記家系情報分析手段は前記第一被験者の両親を前記第二被験者として選択することを特徴とする。
【００１２】
さらに、本発明はデータベース作成方法およびシステムとしても把握される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、被験者あたりのデータ量が少ない場合であっても、効率よくデータ量の不足を補うことができ、検出感度を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＤＮＡ配列解析装置の構成例を示す図である。
【図２】ＤＮＡ配列解析の処理の概要を示す図である。
【図３】処理シーケンスの例を示す図である。
【図４】家系情報の例を示す図である。
【図５】挿入および欠失の例を示す図である。
【図６】挿入および欠失をsplit read方式で検出する例を示す図である。
【図７】複数の被験者によるデータ量増幅の例を示す図である。
【図８】被験者が親子と共有する変異の包含関係の例を示す図である。
【図９】ペア解析手段の処理フローチャートの例を示す図である。
【図１０】家系情報分析手段の処理フローチャートの例を示す図である。
【図１１】集合から第二被験者を決定する処理フローチャートの例を示す図である。
【図１２】変異決定手段の処理フローチャートの例を示す図である。
【図１３】ペアエンドの例を示す図である。
【図１４】変異解析木の例を示す図である。
【図１５】変異解析木を更新して未発見の変異が発見される確率を計算する処理フローチャートの例を示す図である。
【図１６】創始者同士のペア解析の例を示す図である。
【図１７】変異解析木を利用した家系情報分析手段の処理フローチャートの例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下では、次世代シーケンサ配列データおよび家系情報に基づき、各被験者がもつゲノムの変異を検出する感度を向上させるのに好ましい実施の形態を説明する。実施の形態を説明に当たり、先ずは説明に用いる用語について説明する。
【００１６】
ヒトのゲノムは国際共同プロジェクトによって配列決定が行われ、得られた配列は標準的なヒトのゲノム配列として公開されている。他のモデル生物でもゲノム配列決定が実施されたものが多数存在する。このような標準的なゲノム配列を以下では参照ゲノム配列と呼ぶ。なお、この参照ゲノム配列と比べた時、被験者のゲノムには、特定の座標の１塩基が変化する一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism)、主に２〜４塩基の短い配列の繰返し回数が変化するマイクロサテライト、長い領域が同時に変化する構造多型といった様々な変異が存在し得る。以下では構造多型の検出を中心に説明するが、他の種類の変異を検出してもよい。
【００１７】
次世代シーケンサを用いることで、配列決定対象となるＤＮＡの互いに数百塩基離れた位置に存在する２か所の配列を多数得ることができる。これらの配列をペアエンドという。図１３はペアエンドの例を示す図である。互いに向かい合う２つの矢印１３０１、１３０２はペアエンドの２か所の配列を表す。２つの矢印１３０１、１３０２を結ぶ曲線１３０３はどの矢印とどの矢印とがペアエンドであるかを表す。次世代シーケンサにより得られた各配列はゲノム配列のどこの位置に由来するかを計算される。この処理はマッピングと呼ばれる当該技術分野で普通に用いられる技術である。各被験者について、与えられたすべての次世代シーケンサ配列をマッピングした結果を記録したデータを以下ではマッピングデータと呼ぶ。
【００１８】
家系情報は、被験者間の親子関係の集合であり、図４の例に示すように複数の家系図の集合により表現できる。複数となるのは被験者全員が血縁関係者とは限らないためである。家系情報において両親２人のうち少なくとも１人がデータ中に存在しない被験者は創始者と呼ばれる。なお、ここでの親子関係は生物学的な血縁関係における親子である。
【００１９】
ヒトの細胞には、両親から受け継いだ２セットの染色体が含まれており、性別により異なる性染色体を除き、同一の遺伝子が同一順序で配置されている染色体が２本ずつある。このような２本の染色体を相同染色体という。相同染色体上のそれぞれの遺伝子をアリルという。アリルの一方だけに変異がある場合、その変異はヘテロであるという。また、両方のアリルに同じ変異がある場合、その変異はホモであるという。また、変異が両親のいずれにもない突然変異で発生したものである場合、その変異はde novoであるといわれるが、de novoの変異が発生する確率は低いため、ここでは対象としない。
【００２０】
以下、代表的な実施の形態を実施例１〜３として図面を参照しつつ説明する。
【実施例１】
【００２１】
以下、実施例１を説明する。図１はＤＮＡ配列解析装置１００の構成例を示す図である。ＤＮＡ配列解析装置１００は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）１０１、主記憶装置（メモリ）１０２、補助記憶装置１０３、ユーザインタフェース部１０６を備える。このＤＮＡ配列解析装置１００は、ＬＡＮ（Local Area Network）等のネットワーク１０５を介して外部のネットワークに接続されている。主記憶装置１０２にはＣＰＵ１０１によって実行される各種のプログラムおよびこれらのプログラムをＣＰＵ１０１で実行するのに必要な各種のデータが保持されている。主記憶装置１０２は少なくとも、マッピングデータ（１）１０７−１、家系情報（１）１０８−１、およびＣＰＵ１０１で実行させることにより家系情報分析手段１０９、ペア解析手段１１０、変異決定手段１１１として機能させるプログラムが格納されたＲＡＭ（Random Access Memory）等のメモリである。これらのプログラムはまとめてＤＮＡ配列解析プログラムとなる。
【００２２】
補助記憶装置１０３はマッピングデータ（２）１０７−２と家系情報（２）１０８−２等を記録可能なＨＤＤ（Hard Disk Drive）等の記憶装置である。さらに、補助記憶装置１０３には検出された変異を記録する変異情報ＤＢ（１）１１２−１が格納される。リムーバブルメディア１０４は、ＤＮＡ配列解析装置１００に着脱可能な記憶装置であって、マッピングデータ（３）１０７−３、家系情報（３）１０８−３、変異情報ＤＢ（２）１１２−２等を記録可能なＣＤ、ＤＶＤ等の記録媒体である。ネットワーク１０５を介してマッピングデータ（４）１０７−４、家系情報（４）１０８−４、変異情報ＤＢ（３）１１２−３を格納したネットワーク接続のストレージ装置へアクセス可能としてもよい。
【００２３】
主記憶装置１０２、補助記憶装置１０３、リムーバブルメディア１０４、ネットワーク接続のストレージ装置のそれぞれが記憶するデータ、例えばマッピングデータ（１）１０７−１とマッピングデータ（２）１０７−２とマッピングデータ（３）１０７−３とマッピングデータ（４）１０７−４とは同じ内容のデータであってもよい。これらのデータは例えばＣＰＵ１０１で読み書きする場合に必要に応じて主記憶装置１０２へマッピングデータ（１）１０７−１として格納してもよいし、ＤＮＡ配列解析記憶装置１００の電源を切る場合あるいは主記憶装置１０２の空き容量が無くなった場合に主記憶装置１０２からマッピングデータ（１）１０７−１を他へコピーしてもよい。また、処理開始前に図示を省略した他の装置からリムーバブルメディア１０４のマッピングデータ（３）１０７−３あるいは外部のマッピングデータ（４）１０７−４へデータを格納し、ＤＮＡ配列解析装置１００の起動時や処理開始時にＤＮＡ配列解析装置１００内の主記憶装置１０２あるいは補助記憶装置１０３へコピーしてもよい。なお、これらのデータがどこに格納されているかが関係ない説明では代表してマッピングデータ１０７、家系情報１０８、変異情報ＤＢ１１２とする。
【００２４】
マッピングデータ１０７の内容は図１３を用いて既に説明したとおりであり、家系情報１０８の内容は図４を用いて既に説明したとおりである。変異情報ＤＢ１１２の内容は例えば図１に示すように染色体番号、変異の開始位置、変異の終了位置、変異の種類等の情報を含む内容であってもよいし、The 1000 Genomes Project （http://www.1000genomes.org)のＶＣＦ（Variant Call Format）の一部あるいはすべての情報を含む内容であってもよいし、解析における統計情報として例えば検出数等を含む内容であってもよい。ここで、図１３、図４、図１等では説明のための表現を用いたが、このような表現に限定されることなく、マッピングデータ１０７、家系情報１０８、変異情報ＤＢ１１２はＣＰＵ１０１により処理可能なデータフォーマットであればどのようなフォーマットであってもよい。ユーザインタフェース部１０６はユーザインタフェースを提供する入出力装置であり、例えばキーボード、マウス、ディスプレイ等である。
【００２５】
図２はＤＮＡ配列解析による変異解析の処理の概要を示す図であり、図３は各処理手段が協調動作する処理シーケンスの例を示す図である。図２と図３を参照しつつ、個々の処理を説明する。
【００２６】
（１）被験者を順次処理するためのループ
ＤＮＡ配列解析装置１００の処理は各被験者に適用され、それらの被験者（以下、第一被験者）がもつゲノム配列の変異を検出する。そのため、図２に示すように処理全体が被験者単位のループとなっており、ループの１回の処理では未処理の第一被験者を選択して以下に説明する処理を実行し、処理結果を出力する。
【００２７】
（２）家系情報分析手段１０９
図３に示すように家系情報１０８は予め主記憶装置１０２や補助記憶装置１０３等に保存されている。図３の例ではユーザインタフェース部１０６から入力してＣＰＵ１０１が主記憶装置１０２や補助記憶装置１０３へ保存しているが、リムーバブルメディア１０４やネットワーク１０５を介して入力してもよい。この家系情報１０８に基づき、処理中の第一被験者とともにペア解析手段１１０においてペア解析の対象となる他の一人の被験者（以下、第二被験者）を選択する。ここで、主記憶装置１０２に家系情報（１）１０２−１が削除等により無い場合は補助記憶装置１０３から家系情報（２）１０８−２を主記憶装置１０２へ読み込んでもよい。
【００２８】
（３）ペア解析手段１１０
選択した第一被験者と第二被験者を対象としてペア解析手段１１０を実行し、後述するペア解析を実行する。すなわち、マッピングデータ１０７を読み込み、変異検出し、選択した第一被験者と第二被験者とに共通の変異を出力する。ここで、主記憶装置１０２にマッピングデータ（１）１０７−１が削除等により無い場合は補助記憶装置１０３からマッピングデータ（２）１０７−２を主記憶装置１０２へ読み込んでもよい。
【００２９】
（４）変異決定手段１１１
ペア解析手段１１０の結果に基づき、第一被験者のゲノム配列の変異を決定する。すなわち、補助記憶装置１０３からペア解析結果を読み込み、ペア解析結果の重複を除去する。
【００３０】
（５）変異情報ＤＢへの書き出し
以上の処理で得られたゲノム配列の変異は、変異情報ＤＢ１１２に格納される。変異情報ＤＢ１１２の内容は図１を用いて既に説明したとおりであり、変異情報ＤＢ１１２のデータベースフォーマットとして関係データベースやＸＭＬデータベース等を使用してもよい。
【００３１】
図５はゲノム配列の構造変異のうちの欠失と挿入の例を示す図である。まず欠失について説明する。被験者のゲノム配列５０１ａ、５０２ａがあり、参照ゲノムのゲノム配列５０１ｂ、５０３、５０２ｂがある。ここで、配列５０１ａと配列５０１ｂとは同一内容の配列であり、配列５０２ａと配列５０２ｂとは同一内容の配列である。そして、黒い長方形で描かれている参照ゲノムの配列５０３が被験者のゲノム配列にない。このような配列５０３は欠失と呼ばれる。一方、被疑者のゲノム配列５０４ａ、５０６、５０５ａがあり、参照ゲノムのゲノム配列５０４ｂ、５０５ｂがあり、被験者のゲノム配列には参照ゲノム配列に存在しない配列５０６が存在する。このような配列５０６は挿入と呼ばれる。
【００３２】
図６は欠失および挿入をsplit readと呼ばれる方式（K. Ye, M. H. Schulz, Q. Long, R. Apweiler, and Z. Ning, Pindel: A pattern growth approach to detect break points of large deletions and medium sized insertions from paired-end short reads, Bioinformatics, 25(21): 2865-2871, 2009.）により、次世代シーケンサ配列に基づいて検出する例を示す図である。
【００３３】
まず、欠失の検出について説明する。欠失が存在する場合、被験者のゲノムにおいて欠失の境界の位置に由来する次世代シーケンサ配列６０２は、対応する配列が参照ゲノムでは２か所にわかれて６０３と６０４とになっている。これらは、次世代シーケンサ配列６０２のペアエンドのもう一方の配列である次世代シーケンサ配列６０１ａに対応する６０１ｂの付近にマッピングされる。このような配列が、同一の位置で複数見つかれば、その位置に欠失があると判断される。
【００３４】
次に、挿入の検出について説明する。挿入が存在する場合、被験者のゲノムにおいて挿入の境界の位置に由来する次世代シーケンサ配列６０６、６０７は、挿入された配列に相当する部分が参照ゲノムでは一部が失われる。そして、次世代シーケンサ配列６０５ａ、６０８ａに配列６０５ｂ、６０８ｂが対応し、残った部分６０９、６１０がそれぞれのペアエンドのもう一方の配列６０５ｂと配列６０８ｂの付近にマッピングされる。このような配列が、ゲノム上の特定の位置の両側で複数見つかれば、その位置に挿入があると判断される。
【００３５】
split read方式はPindel（http://gmt.genome.wustl.edu/pindel/current）と呼ばれる広く知られたソフトウェアに実装されている。他の構造多型検出方式に比べて出力される構造多型に誤りが比較的少なく、構造多型の位置も正確に計算できるという特徴があるが、その一方で、構造多型の境界位置に現れる配列が複数必要であることから、データ量が不足する場合は検出感度が不十分となってしまう。実際にシミュレーションデータを用いた計算機実験を行ったところ、相同染色体がいずれも保持しているホモの構造多型の場合、配列量がゲノム配列の５倍では感度が不十分であったが、１０倍以上では十分な検出感度が得られたとの報告がある（Yasuda T, Suzuki S, Nagasaki M, Miyano S.: ChopSticks: High-resolution analysis of homozygous deletions by exploiting concordant read pairs, BMC Bioinformatics 2012 Oct 30;13:279）。
【００３６】
被験者当たりの配列量が１０倍あっても、構造多型がヘテロ（２本の相同染色体のうち、片方だけがその構造多型をもつ）の場合、例えば図７に示すように構造多型を反映した配列データ量は５倍相当に留まってしまう。大規模な被験者集団のゲノム配列決定では、コストを削減しつつ被験者数を確保するために、被験者一人あたりの配列量が１０倍に達しない場合があり、そのような場合に被験者を個別に処理していてはsplit read方式で十分な感度を得ることができない。
【００３７】
split read方式の長所である出力される構造多型に誤りが少なく位置も正確である長所を生かしつつ、データ量が不足する場合の検出感度を補うため、血縁者の配列データを利用し、同一の変異に由来する配列を増幅する。親子であれば、ゲノム配列を半分共有するため、同一の変異を有する可能性が高い。図７は、同一の変異を有する被験者を同時解析して、データ量を増幅する例を示す図である。この図の例では、被験者１と被験者２が同一の挿入をいずれもヘテロで保有している。被験者当たり１０倍の配列量がある場合、この挿入に由来する配列量は５倍相当になってしまうため、split read方式では十分な検出感度が得られない。
【００３８】
しかし、この２人の被験者のデータを混合して同時解析すれば、この挿入に由来する配列量は１０倍相当になるため、split read方式で十分な検出感度を得ることができる。このように、２人のマッピングデータを組み合わせて解析する処理をここではペア解析と呼ぶ。また、ペア解析の感度は非常に高く、一方で誤りは少ないことを仮定する。以下では、解析対象の被験者を第一被験者、第一被験者の変異を検出するために、第一被験者とペア解析を行なう被験者を第二被験者と呼ぶ。なお、ペアではなく３人、４人といったより多くの人数で同時解析を行なうと、エラーを含む配列が増えて偽陽性の変異が多くなってしまうことから、ここではペア解析に限定する。
【００３９】
図８は第一被験者が親および子と共有する変異の包含関係の例を模式的に表した図である。第一被験者の変異は、de novoと呼ばれその被験者に突然変異で出現する稀な変異を除けば、父親または母親から遺伝したものである。したがって、父親および母親とそれぞれペア解析を行うことにより、第一被験者の変異をすべて網羅できる。両親のマッピングデータが揃っていない場合でも、子供とペア解析を行なうことにより検出できる可能性がある。複数の子供がいれば、それらの子供のそれぞれとペア解析を行なうことにより、第一被験者の大半の変異を網羅できる。
【００４０】
しかし、子供と共有していない変異８０１が常に一定の割合で存在する。そのような変異でも血縁関係がない被験者と共有する場合がある。図８において、父母の変異に重複があるのはこれが理由である。大規模な被験者集団のゲノム配列決定プロジェクトにおいては、血縁関係がない被験者が多数いるため、血縁関係がない被験者同士のペアの数は膨大である。そのため、変異の検出に必要かつ十分なペアのみを選んでペア解析する必要がある。このため、図１６に例を示すように、血縁関係がない被験者のペアは、創始者同士のペア解析１６０１に限定する。第一被験者が創始者以外であれば、両親とすべての変異を共有するため、血縁関係がない第二被験者とのペア解析が不要である。また、第一被験者が創始者の場合、創始者でない第二被験者の変異は、その第二被験者の家系の創始者のいずれかから遺伝した変異である。したがって、創始者でない第二被験者とのペア解析１６０２は、不要である。
【００４１】
図１６の例において、被験者のすべてのペアは 13C2=78 であるが、親子および創始者のペアに限定すると、7C2+2×6=33 ペアについてペア解析を行なえば済む。一般に、創始者の数が f とし、両親が揃っている被験者の数を m とすれば、ペア解析を実行すべきペアの数は fC2+2m となる。
【００４２】
図９はペア解析手段１１０の処理フローチャートの例を示す図である。図９を参照しつつ、ペア解析処理の詳細を説明する。
Ｓ９０１：入力として与えられた第一被験者および第二被験者のペア（以下、入力ペアとする）について、すでにペア解析を実行済みか判定する。
Ｓ９０２：Ｓ９０１の判定において、すでに入力ペアのペア解析を実行済みの場合、以前の解析結果をコピーして終了する。
Ｓ９０３：入力ペア２人のマッピングデータ１０７を取得する。
Ｓ９０４：Ｓ９０３で取得したマッピングデータ１０７を、すべて連結することによりマージする。
Ｓ９０５：マージされたマッピング結果を、１人データであるかのようにPindelの入力として使用し、変異を検出する。
Ｓ９０６：得られた変異には、第一被験者および第二被験者に共通の変異が入っていることが期待されるが、第二被験者のみが保有するにも関わらず、配列量がゲノム上の特定領域で多く得られた場合や、第二被験者の構造変異がホモである場合にも、検出される場合がある。このような第一被験者にない構造変異を除去するため、得られた構造変異を図６のように裏付けるＤＮＡ配列を取得する。それらの配列のうち、第一被験者に由来する配列数が予め設定された閾値ｋを超えるときのみ、その変異を第一被験者の変異として出力する。閾値を越えない場合は、見つかった変異を破棄する。
Ｓ９０７：Ｓ９０６で出力した変異を、変異決定手段１１１で利用できるようにし、次回以降ペア解析を要求されたときに、Ｓ９０２で以前の解析結果としてコピーできるようにするため保存する。
【００４３】
図１０は家系情報分析手段１０９の処理フローチャートの例を示す図である。この処理により、第一被験者とともにペア解析されるべき第二被験者が決定される。
Ｓ１００１：第一被験者の親が、マッピングデータ１０７および家系情報１０８に含まれているかを判定する。含まれている場合はＳ１００２へ遷移し、そうでない場合はＳ１００５へ遷移する。
Ｓ１００２：第一被験者と、Ｓ１００１で含まれていると判定された第一被験者の一人目の親とで、ペア解析を行うと決定する。すなわち、この一人目の親を第二被験者と決定する。
Ｓ１００３：第一被験者の親の別の一人が、マッピングデータ１０７および家系情報１０８に含まれているかを判定する。含まれている場合はＳ１００４へ遷移し、そうでない場合はＳ１００５へ遷移する。
Ｓ１００４：第一被験者と、Ｓ１００３で含まれていると判定された第一被験者の二人目の親とで、ペア解析を行うと決定する。すなわち、この二人目の親を第二被験者と決定する。
Ｓ１００５：第一被験者をｘ、第一被験者の子の集合をＳとし、図１１に示す処理を行なって、子全員とのペア解析を行うと決定する。すなわち、子全員を第二被験者と決定する。図１１の処理については後述する。
Ｓ１００６：第一被験者をｘ、全創始者の集合をＳとし、図１１に示す処理を行なって、創始者全員とのペア解析を行うと決定する。すなわち、創始者全員を第二被験者と決定する。
【００４４】
図１１は集合Ｓから第二被験者を決定する処理フローチャートの例を示す図である。集合Ｓには事前に複数の被験者の集合がセットされる。また、変数ｘは事前に第一被験者がセットされる。この処理は、Ｓ１００５とＳ１００６で使用されるため、子全員と創始者全員を第二被験者と決定する処理となり、家系情報分析手段１０９の処理の一部となる。
Ｓ１１０１：集合Ｓに第一被験者ｘが含まれている場合には、第一被験者ｘを集合Ｓから除外する。
Ｓ１１０２：集合Ｓが空集合であれば、処理を終了する。
Ｓ１１０３：集合Ｓから新たな第二被験者を一人だけ選択して変数ｙにセットし、集合Ｓから除外する。
S1104: 変数ｘ、ｙにセットされている第一被験者および第二被験者のペア解析を行うと決定する。
【００４５】
図１０、１１を用いて説明した処理により決定された第二被験者が複数の場合、その複数の第二被験者を第二被験者の集合として家系情報分析手段１０９からペア解析手段１１０へ出力し、ペア解析手段１１０では第二被験者の集合から一人ずつ抽出して第一被験者とペアを構成してもよい。また、図２、３を用いた説明とは異なるが、図１０のＳ１００２とＳ１００４および図１１のＳ１１０４のそれぞれにおいて、図９を用いて説明したペア解析を直ちに行ってもよい。
【００４６】
図１２は、第一被験者と、家系情報分析手段１０９により決定された各第二被験者とのペア解析により得られた変異のデータに基づき、第一被験者が保有するゲノムの変異を決定する変異決定手段１１１の処理フローチャートの例を示す図である。
Ｓ１２０１：ペア解析で得られた構造変異のデータをすべて連結する。この段階では、異なる第二被験者とのペア解析の結果に重複して含まれる同一の構造変異が多数存在する。
Ｓ１２０２：連結された構造変異のデータを、ゲノム上の位置に基づきソートする。
Ｓ１２０３：ソートされた構造変異のデータを走査し、ゲノム上での位置の差が、事前に与えられたパラメータである整数 w を下回り（w 塩基以内）、かつ、挿入や欠失等の変異の種類が一致しているものを同一の変異とみなして統合（マージ）する。
Ｓ１２０４：以上の処理により得られた、変異の重複が無い結果を変異情報ＤＢ１１２へ出力する。
【００４７】
以上で説明したように、被験者あたりのデータ量が少ない場合であっても、親や子という同一の変異を共有する可能性が高い被験者と解析することにより、データ量の不足を補い、検出精度を高めることができる。
【実施例２】
【００４８】
次に、ペア解析の検出感度が低いあるいは一定の確率で誤りが発生する場合にも対応可能とする実施例２について図面を参照しつつ説明する。実施例１の説明では、まず親とペア解析を行い、必要に応じて子とペア解析を行なってさらに創始者間のペアでペア解析を行なった。これは、ペア解析の感度(以下、r とする)が十分に高いことを前提とすれば、これらの組み合わせにより、データ中で変異を共有する被験者が存在する変異については検出可能と想定できるためである。しかし、検出感度 r が低い場合には、実施例１のペア解析を実施するだけでは見落としてしまう変異が存在する場合がある。そのような変異を検出するためには、親子だけでなく、祖父母や孫や兄弟姉妹といった血縁者にペア解析の対象を広げ、それぞれの変異がペア解析される回数を増やし、検出される確率を上げる必要がある。ここで、血縁者を選択する際に、未発見の変異を最も多く共有する被験者を第二被験者として選択することが重要となる。
【００４９】
一方、検出された変異が実際に被験者のゲノムに存在する確率を p とする。実施例１では親等を第二被験者とすることにより p が十分高く１に近いものとしたが、p が低い場合には、１度検出されただけの変異は誤りの可能性が高いことから、複数回検出されるまで、ペア解析を繰り返すことが望ましい。具体的には、以下の処理で、Ｎをパラメータとして与えられる整数とし、Ｎ回検出されたときに初めて第一被験者の変異として処理することが好ましい。
【００５０】
未発見の変異を最も多く共有する被験者を選択するために、各被験者について未発見の変異を保有する確率を計算する。この確率には、当該被験者と第一被験者との血縁的な近さ、すでに解析済みの変異との重複度、ペア解析が実行された回数が関連する。具体的には、ある被験者 y を第二被験者として用いる場合、第一被験者を x とすると、第一被験者と第二被験者が共通の先祖から受け継いだ変異が新たに発見される確率P(y)は、次の式で表される。
P(y) = Σv∈V 2F(x, y)s(v)r(1-r)n(v)
ここで、F(x, y)は第一被験者 x と第二被験者 y の親縁係数(x と y のアリルを選んだとき、それらが同じ祖先から遺伝により受け継がれた確率。アリルは２本の相同染色体のそれぞれにある同じ遺伝子の配列)である。なお、親縁係数は家系情報１０８に含めてもよい。V は x が持つ変異の部分集合の集合、s(v) は x の変異全体に占める v の変異の割合、n(v) は v の変異に対してこれまでに実行されたペア解析の回数である。V に属する任意の部分集合 v は、x と y のペア解析を行なう以前に、他の第二被験者とのペア解析が全く同じように適用された変異の集合とする。P(y) を計算するためには、V を求め、さらに V に属する任意の v に対してペア解析が何回適用されたかを把握する必要がある。ペア解析が何度も実行されると V は複雑になり、適切に V を計算することが難しくなる。そこで、V を計算するための処理について図面を参照しつつ説明する。
【００５１】
図１４は V を計算するために用いる変異解析木の例を示す図である。変異解析木は第一被験者の変異全体を表すノード１４０１を根とした木構造である。第二被験者とのペア解析を行なう毎に、各ノードは当該第二被験者に含まれるノード１４０２と、含まれないノード１４０３に分割される。子ノードが無いノードはリーフと呼ばれる。各ノード L には、ペア解析を実施した第二被験者が保有する変異であるか否かを表すラベル h（否定記号「¬」が無ければ保有する、あれば保有しない）、当該ノードの変異に対し実行されたペア解析の回数 n、第一被験者の変異全体に占める当該ノードの変異が占める割合 s からなる三つ組が記録される。L が三つ組(h, n, s)を持つとき、以下では L＝(h, n, s)と表記する。変異解析木において各リーフに対応する第一被験者の変異の集合が V の各要素となる。
【００５２】
図１５はペア解析を行なう毎に実行される変異解析木を更新する処理フローチャートの例を示す図である。
Ｓ１５０１：変数 X を０に初期化する。この変数 X は P(x)を計算する途中経過を格納するために用いられる。
Ｓ１５０２：変数 F に第一被験者と第二被験者の親縁係数をセットする。
Ｓ１５０３：更新前の変異解析木に存在したすべてのリーフについて、Ｓ１５０４〜Ｓ１５０７の処理を繰り返す。この繰り返しは、第一被験者の変異のすべての部分集合について、処理を行うための繰り返しである。
Ｓ１５０４：Lを未処理のリーフの１つとする。このリーフに記録されている三つ組を(h, n, s)とする。
Ｓ１５０５：L の子として２つの新たなリーフ L1 と L2 を追加する。それらに記録される三つ組は図１５に示す通りとする。
Ｓ１５０７：X に L に相当する変異が検出される確率を加える。
Ｓ１５０８：X の値を P(y)として出力する。
【００５３】
家系情報分析手段１０９として、実施例１で説明した図１０に示した処理の例の代わりに、図１５に示した処理の例により計算した P(y) を用いて第二被験者の選択を行ない、選択された第二被験者に対してペア解析を実施する。図１７にこの処理のフローチャートの例を示す。図面を参照しつつ、処理の内容を説明する。ここでは入力として、第一被験者、この第一被験者とペア解析を行なった過去の第二被験者からなる集合 S 、および血縁者でない被験者同士で同一の変異をもつ確率 B が与えられる。
Ｓ１７０１：変数 Pmaxを０に初期化する。
Ｓ１７０２：集合 S の被験者の親子で、集合 S に属さない被験者の集合を S’にセットする。
Ｓ１７０３：集合 S’が空集合か判定し、空集合であればＳ１７０８に遷移する。空集合でなければ、集合 S’の各要素について、Ｓ１７０４〜Ｓ１７０７の処理を繰り返す。
Ｓ１７０４：集合 S’から１つ要素 y を取り出し、集合 S’から要素 y を消去する。
Ｓ１７０５：図１５を用いて説明した処理により P(y) を計算するが、Ｓ１５０５の変異解析木の変更は実行しない。
Ｓ１７０６：Pmax が P(y) 未満でなければ、Ｓ１７０３へ戻り次の被験者を処理する。
Ｓ１７０７：Pmax が P(y) 未満の場合は、P(y) を新たな Pmax の値としてセットし、変数 ymax に y をセットする。
【００５４】
以上のＳ１７０３へ戻り、Ｓ１７０４〜Ｓ１７０７を繰り返す。
Ｓ１７０８：Pmax が確率 B すなわち血縁関係のない被験者が共通の変異をもつ確率より小さければ、血縁者よりも血縁者以外とペア解析を行なった方が、新しい変異の見つかる可能性が高くなる。このため、確率 B より小さい場合はＳ１７０９へ遷移し、確率 Bより小さくない場合はＳ１７１１へ遷移する。
Ｓ１７０９：未処理の創始者がいるか否かを判定して、未処理の創始者がいる場合はＳ１７１０へ遷移し、いない場合はＳ１７１１へ遷移する。
Ｓ１７１０：未処理の創始者を一人任意に選び、第二被験者とする。
Ｓ１７１１：ymaxを第二被験者とする。
Ｓ１７１２：第一被験者と第二被験者でペア解析を実施する。次の第二被験者を選ぶ準備として図１５に示した処理により変異解析木を更新する。
【００５５】
以上で説明したように、被験者あたりのデータ量が少なく、親や子という被験者を解析しても検出感度が十分に得られない場合であっても、最少人数によりデータ量の不足を補える確率を高め、検出精度を高めることができる。
【実施例３】
【００５６】
実施例１、２で説明した処理では、ペア解析における次世代シーケンサ配列数の閾値 k、変異決定手段１１１で使用する同一とみなす変異の位置の閾値 w、血縁関係のない被験者同士で変異を共有する確率 B といったパラメータを使用する。これらのパラメータの値が予め得られない場合の値の調整および推定の処理の例について説明する。
【００５７】
（１）ペア解析における次世代シーケンサ配列数の閾値 k
次世代シーケンサ配列および変異の位置情報が公開されているデータ、すなわち検出結果の判明しているデータを用いて、最も検出精度が高くなる k の値を選択する。公開情報の代わりにサンガー法等の次世代シーケンサ以外の処理で決定された変異情報と一致するように k の値を調整してもよい。
【００５８】
（２）同一とみなす変異の位置の閾値 w
上記（１）と同じく公開されているデータを解析した結果に基づき、検出される変異の位置の変動幅を求め、公開されているデータに対して正しく検出された変異の位置を含むように w の値を調整する。
【００５９】
（３）血縁関係のない被験者同士で変異を共有する確率 B
少数の創始者間でペア解析を行なう。このペア解析で検出された変異について、その変異を支持する次世代シーケンサ配列がそれぞれの被験者のマッピングデータで閾値 k を越える第１の回数を計算する。一方、やはり少数の親子の組をペア解析し、このペア解析により得られる変異の第２の数を計算する。１組の親子のペア解析では、各被験者の約半数の変異が検出される。したがって、第１の回数を第２の数の２倍の値で除算することにより、B の値を推定できる。
【００６０】
以上で説明したようにパラメータの各値が予め得られない場合であっても、各値を調整および推定できる。そして、被験者あたりのデータ量が少ない場合であっても、データ量の不足を補い、検出精度を高めることができる。
【００６１】
以上、各実施例について説明したが、以上の実施例は好ましい例を示したものであり、上記各実施例の具体的構成に限定する趣旨ではない。以上の説明の要旨を逸脱しない範囲において種々変更可能である。
【符号の説明】
【００６２】
１００  ＤＮＡ配列解析装置
１０１  ＣＰＵ
１０２  主記憶装置
１０３  補助記憶装置
１０４  リムーバブルメディア
１０５  ネットワーク
１０６  インタフェース部
１０７  マッピングデータ
１０８  家系情報
１０９  家系情報分析手段
１１０  ペア解析手段
１１１  変異決定手段
１１２  変異情報ＤＢ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2015219856.tif 000013
【図１２】
2015219856.tif 000014
【図１３】
2015219856.tif 000015
【図１４】
2015219856.tif 000016
【図１５】
2015219856.tif 000017
【図１６】
2015219856.tif 000018
【図１７】
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