(57)【要約】【課題】木質系バイオマスやその加水分解物を原料として、発酵法によるエタノール製造技術を提供すること。【解決手段】セルラーゼを分泌生産し、さらに、キシロースも発酵できる接合菌門・接合菌綱・ケカビ目に属する糸状菌を見出した。上記の糸状菌は、セルラーゼ剤を組み合わせて、木質系バイオマスの同時糖化発酵に利用できるのみならず、上記糸状菌のみを利用する糖化発酵同時進行より木質系バイオマスの発酵処理が酵素無添加で行うことができエタノール製造時のコスト削減が可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
木質系バイオマスまたはその加水分解物に、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）、バクセラ（Ｂａｃｋｕｓｅｌｌａ）、ゴングロネリア（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ）から選ばれる糸状菌を作用させることを特徴とするエタノールの製造方法。
【請求項２】
糸状菌がセルラーゼ分泌能を有る糸状菌である請求項１に記載のエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の糸状菌を用いる木質系バイオマスまたはその加水分解物から、エタノールを製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、ブラジルやアメリカなどで行われているエタノールの製造は、トウモロコシやサトウキビから得られた６炭糖を主成分とする糖液を、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いる発酵法により行われる。トウモロコシやサトウキビは生産が容易で加工がしやすく豊富な糖が得られ、酵母は高濃度の糖存在下で優れた成長能力を持ち、エタノール生産収率も高い。しかし食料を燃料に替えるという倫理観の問題に始まり、食料としての供給の減少などの重大な問題を抱えている。このような背景から、未利用なバイオマス資源である農産廃棄物（稲わら、もみ殻など）、林産廃棄物（間伐材、廃木材）や産業廃棄物（ペーパースラッジなど）からエタノールを高収率で得る研究が進められている。
未利用なバイオマス資源である農産廃棄物からのエタノール生産は、成分であるセルロースやヘミセルロースなどを分解・発酵させてエタノールを生産する微生物が利用される。
【０００３】
しかし、これらＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを代表するエタノール発酵微生物を用いて５炭糖の代表であるキシロースからエタノール発酵は不可能であり、キシロース発酵酵母であるＣａｎｄｉｄａ  ｓｈｅａｔａｅやＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓにおいても培養が難しい、副生成物が生成する、エタノール耐性が低い、発酵阻害物質により強く発酵が阻害されるなど多くの問題を抱えている。さらに、組換え微生物（例えば、特許文献１、２）を用いた場合には、高いエタノール生産性を達成できるものの、組換え菌を使用する際の安全性の問題や倫理的問題を解決していく必要がある。
【０００４】
これらのことから、本発明者らエタノール微生物として考えられていなかった糸状菌、特にケカビの検索を行い、Ｍｕｃｏｒ属とＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属の糸状菌を用いて我が国の主要な未利用バイオマスとして稲わらからのバイオエタノール製造システムの開発を行ってきた(特許文献３)。
【０００５】
一方、Ｍｕｃｏｒ属やＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属の特定の菌株を用いて、主にトウヒに由来する森林残渣の加水分解物からエタノールを製造できることが知られている（非特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−１５８１７０
【特許文献２】特開２０１１−０３０５６３
【特許文献３】特開２０１０−０４６０２４
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Biochemical Engineering Journal, 39(2008), 383-388
【非特許文献２】Enzyme and Microbial Technology, 36(2005), 294-300
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
製紙製造事業所から排出されるペーパースラッジやスラッジテールなど製紙廃棄物は、木質系バイオマスであり、バイオマス成分である糖質(セルロースとヘミセルロース)を含み、さらに、 リグニンおよび無機分を多量に含んでいる。この成分中の糖質を有効利用し生物変換によりエタノールを製造するためには、セルロースおよびヘミセルロース成分を加水分解する酵素群の分泌と、加水分解液中の５炭糖および６炭糖ともに効率よくエタノールへ変換することが望まれる。しかし、一般の発酵瀬微生物
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、セルロース分解酵素（セルラーゼ）を分泌せず、さらに、５炭糖を資化できるものの発酵性を有しない。また、キシロース発酵酵母であるＣａｎｄｉｄａ  ｓｈｅａｔａｅやＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓは、５炭糖は発酵するもののセルラーゼ等は分泌しない。さらに、セルラーゼを多量に分泌する糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｓｅｉやＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓはエタノール発酵能を有していない。
【０００９】
そこで、近年、セルラーゼおよびキシロース代謝酵素遺伝子を組換えたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＺ．ｐａｌｍａｅ、地球環境産業技術研究機構（ＲＩＴＥ）による組換えコリネ菌などが開発されてきているが、遺伝子組換え菌であることからカルタヘナル法の適用を受けて規制が厳しく、さらに、実際の製造において拡散防止などの設備を必要とする製造施設に多大なコストが負担となり商業化されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
木質系バイオマスからの少ない工程数でエタノール生産を実用化させるためには、セルラーゼを分泌生産し、さらに、キシロースも発酵できる野性の菌株を見出すことが必要である。そこで、発明者らは、当研究室に保存している接合菌ライブラリーからセルラーゼを分泌生産すると共に、キシロースも発酵できる菌株の検索を行い、有用な糸状菌株を見出し、本発明を完成させるに至った。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明において使用される糸状菌は、接合菌門・接合菌綱・ケカビ目に属する糸状菌であり、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）、バクセラ（Ｂａｃｋｕｓｅｌｌａ）およびゴングロネリア（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ）に属する糸状菌である。具体的には、例えば以下のような種を示すことができる。
【００１２】
アブシディア・コエルレア（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｏｅｒｕｌｅａ）  
アブシディア・シリンドロスポラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ）  
アブシディア・ヒアロスポラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｈｙａｌｏｓｐｏｒａ）  
バクセラ・シリシナ（Ｂａｃｋｕｓｅｌｌａ  ｃｉｒｃｉｎａ）
ゴングロネリア・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ  ｂｕｔｌｅｒｉ）
【００１３】
上記の糸状菌は、湿気の多い有機物上に出現する、ごく普通のカビである。これら微生物の、土壌、河川、あるいは湖沼などの材料からの単離・同定法は公知である。たとえば単離および同定方法については以下のような文献を参照することができる。
カビ：”The Genera of Hyphomycetes from soil”， G.L.Barron, Baltimore, Maryland, Williams and Wilkins(1968)．
”Compendium of soil Fungi”， K.H.
Domsh, W. Gams, T. Anderson, New York, Academic Press(1980)．
【００１４】
より具体的には、以下の微生物菌株を示すことができる。
アブシディア・コエルレア（ＮＢＲＣ４０１３，４４２３）  
アブシディア・シリンドロスポラ（ＮＢＲＣ４００１）  
アブシディア・ヒアロスポラ（ＮＢＲＣ８０９２）  
バクセラ・シリシナ（ＮＢＲＣ９２３１）
ゴングロネリア・ブトレリ（ＮＢＲＣ１０１１１１）
これらの糸状菌は、野生株または変異株のいずれの株も用いることができる。また、これらの糸状菌は、単独または混合して使用することができる。
【００１５】
上記の菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）
発行の微生物カタログ第１版（２００５年）に記載されており、それぞれのアクセション番号をもとにＮＢＲＣなどのセルバンクから入手することができる。
【００１６】
上記した糸状菌は、エンド−β−グルカナーゼを分泌し、エタノールの発酵生産のみならず、セルラーゼも分泌生産することができる。
【００１７】
上記した糸状菌を作用させる木質系バイオマスとしては、廃材、間伐材、樹皮、パルプ、古紙およびそれらの加水分解物が挙げられるが、例えば、製紙工程から排出されるペーパースラッジ、スラッジテールも木質系バイオマスに含まれる。
【００１８】
上記した糸状菌のセルラーゼの分泌生産能を利用してエタノールの製造を行う場合、発酵を糖化発酵同時進行で行うシステムを構築することができる。
【００１９】
上記した糸状菌とセルラーゼ剤を用いて、同時糖化発酵によりエタノールを製造することができる。ここで用いられるセルラーゼ剤は特に限定されず、市販のセルラーゼ剤を用いればよい。セルラーゼ剤は複数組み合わせでカクテルとすることができ、例えば、アクセラーゼ・メイセラーゼ・ペクチナーゼのセルラーゼカクテルなどが挙げられる。  
【発明の効果】
【００２０】
本発明のセルラーゼの分泌能を有するエタノール発酵微生物を使用することから、同時糖化発酵においては、使用酵素の添加量の軽減に繋がり、製造コストの削減が可能である。
また、糖化発酵同時進行の場合、本発明のセルラーゼの分泌能を有するエタノール発酵微生物のみを発酵槽へ投入し、ペーパースラッジなどへの糖化と発酵を行うことから、酵素製造に係わるコストは必要としない。すなわち、本発明により、ペーパースラッジのような産業廃棄物を含む未利用木質系バイオマスからバイオ燃料として利用されているエタノールを安価に製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明について、以下の実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
【００２２】
［実施例１］
硫酸アンモニウム（０．７５％）、リン酸水素二カリウム（０．３５％）、塩化カルシウム（０．１％）、硫酸マグネシウム・７水和物（０．０７５％）、酵母エキス（０．５％）、ｐＨ７．５の液体培地に、グルコース（２％）を含む寒天プレートで、糸状菌株を２８℃で３〜５日培養した後、寒天プレートを粉砕し生理食塩液に懸濁させた。
生ペーパースラッジ（５％）を含有する上記の２５ｍＬに、上記懸濁液１ｍＬを加え、２８℃、１２０時間嫌気下で振とう培養した。
【００２３】
培養終了後、定性濾紙(Ａｄｖａｎｔｅｃ製、Ｎｏ．１３１)を用いて濾過を行うことにより菌体を除去し、各培養液の培養上清液を調製した。濾紙上に得られた菌体は、蒸留水で十分洗浄した後、９０℃で２４時間乾燥させた後、重量を測定し、乾燥菌体重量を求めた。一方、ＧＣにより、培養により得られた培養液中のエタノールを定量した。
本発明の糸状菌株のエタノールの発酵能を表１に示す。また、エタノール生産とセルラーゼ（エンド−β−グルカナーゼ）生産を表２に示す。
【００２４】
【表１】
2015065867.tif 000002
【００２５】
【表２】
2015065867.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明により、例えば、製紙業界から排出される製紙廃棄物の問題点である化石燃料の多量消費、それに伴う炭酸ガスの発生を軽減でき、さらに、備蓄性の燃料であるエタノールを安価かつ効率よく製造することが可能となる。この分野において、エタノール製造の実用化は、エタノールの発酵効率の向上とコスト削減に係っている。本発明に使用される糸状菌は、セルラーゼの分必能を有していることから、例えば、バイオマスであるペーパースラッジの発酵処理に必要な酵素添加量の軽減あるいは酵素無添加状態でエタノールを生産でき、大幅なコスト削減が可能である。