(57)【要約】【課題】  エイコサペンタエン酸やドコサヘキサエン酸よりも効果的なメタボリックシンドロームの治療・予防、より具体的には肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤、脂肪酸合成酵素の活性抑制剤、ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素の活性抑制剤、及びそれらを含有する脂肪肝の治療・予防に用いるための組成物を提供すること。【解決手段】  テトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩、を有効成分とする、脂肪酸合成酵素又は／及びステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素の活性抑制作用を有する肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤を調製する。特に、テトラコサヘキサエン酸−トリグリセリドを有効成分とする肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤を調製する。さらに、前記肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤を含有する脂肪肝の治療又は予防に用いるための組成物を調製する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
テトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩を有効成分とする肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤。
【請求項２】
テトラコサヘキサエン酸の誘導体がテトラコサヘキサエン酸−トリグリセリドであることを特徴とする請求項１記載の肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤。
【請求項３】
脂肪酸合成酵素の活性抑制作用を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤。
【請求項４】
ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素（Stearoyl-CoA desaturase）の活性抑制作用を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤を含有することを特徴とする、脂肪肝の治療又は予防に用いるための組成物。
【請求項６】
テトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩を有効成分とする脂肪酸合成酵素の活性抑制剤。
【請求項７】
テトラコサヘキサエン酸の誘導体がテトラコサヘキサエン酸−トリグリセリドであることを特徴とする請求項６記載の脂肪酸合成酵素の活性抑制剤。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の脂肪酸合成酵素の活性抑制剤を含有することを特徴とする、脂肪肝の治療又は予防に用いるための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤や、脂肪肝の治療又は予防に用いるための組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタボリックシンドロームは、内臓脂肪型肥満を共通の要因として、高血糖、脂質異常症、高血圧のうち２つ以上を合併して発症した状態をいう。それぞれの症状は単独でも生命を危険にさらすが、複数の症状が相乗的に作用することで、単独の症状と比較して、圧倒的に生命を危険な状態にさらす。
【０００３】
内臓脂肪型肥満の中でも、肝細胞に中性脂肪が異常に蓄積し、特に、中性脂肪の割合が肝臓重量の５％以上である状態を脂肪肝という。脂肪肝は、症状を放置することにより、肝炎、肝硬変、肝臓癌へと病状が進行することが知られている。しかも、肝臓は、糖の代謝、脂質の代謝、タンパク質の代謝等、およそ生命維持に必要な多くの重要な働きを担っており、これら病状が進行することは、生命の危機にかかわるため、脂肪肝の治療又は予防法が求められている。
【０００４】
脂肪肝の原因は、過栄養、肥満及び糖尿病であり、特にダイエットによる体重の過度の増減やアルコールの多飲であるとされる。従来、日本人は脂肪肝になりにくいと言われてきたが、食生活の欧米化に伴う肥満の増加により、脂肪肝の症状を有する割合は、成人の約２０％を占めるまでになっている。そのため、食生活の改善が脂肪肝の症状の改善に有効であることは言うまでもない。
【０００５】
脂肪肝に限らず、メタボリックシンドロームの症状の改善には、イワシやマグロ等の青魚に多く含まれる魚油、特にエイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等のω３多価不飽和脂肪酸が効果を発揮することが知られている。例えば、特表２００７−５１４７３３号公報には、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸を含む脂肪酸組成物の、ヒト又は動物の肥満、太りすぎの状態の治療及び予防のための使用が記載されている。その他にも、国際公開公報第２０１０／１３４６１４号には、ω３多価不飽和脂肪酸、その製薬学上許容しうる塩及びエステルからなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物を含む乳化組成物が、脂質異常症やメタボリックシンドロームの進行を抑制できることが記載されている。
【０００６】
脂肪肝に関しても、例えば、特開２００８−１８４４２９号公報には、魚油が肝臓トリグリセリド濃度の低下に効果的であり、脂肪肝の予防・治療剤として用いることができると記載されている。国際公開公報第２００９／８２４５７号には、エイコサペンタエン酸、その塩及びそのエステルから選ばれる少なくとも一種類からなる不飽和脂肪酸を含むことを特徴とする、非アルコール性脂肪肝炎治療薬が記載されている。また、特開２００９−１６１４８９号公報には、脂肪肝改善薬剤として、エイコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸エステル、及びその薬学的に許容される塩が記載されている。
【０００７】
本発明者らも、エイコサペンタエン酸−トリグリセリド、ドコサペンタエン酸−トリグリセリド、及びドコサヘキサエン酸−トリグリセリドをマウスに与えることによって、肝臓のトリグリセリド濃度及びコレステロール濃度が低下することを見出している（“J．Agric．Food Chem．2009，57，11047-11054”）。興味深いことに脂肪酸トリグリセリドの肝臓への蓄積抑制作用は、脂質代謝経路の最も下流に位置するドコサヘキサエン酸−トリグリセリドを与えたマウスにおいて最も強く、次いでドコサペンタエン酸−トリグリセリド、最も上流に位置するエイコサペンタエン酸−トリグリセリドを与えたマウスにおいて最も弱かった。また、血清中の脂肪酸トリグリセリド濃度に関しては、エイコサペンタエン酸−トリグリセリドを与えたマウスにおいて最も高い濃度が確認され、ドコサペンタエン酸−トリグリセリド、ドコサヘキサエン酸−トリグリセリドの順に濃度が低くなった。
【０００８】
また、血清中のアディポネクチン濃度は、ドコサヘキサエン酸−トリグリセリドを与えたマウスにおいて最も高く、次いでドコサペンタエン酸−トリグリセリド、エイコサペンタエン酸−トリグリセリドを与えたマウスにおいて最も弱かった。血中アディポネクチン濃度は内臓脂肪量に逆相関することが知られており、この結果は、前述のドコサヘキサエン酸−トリグリセリドを与えたマウスにおいて、脂肪酸トリグリセリドの肝臓への蓄積抑制作用が最も強く観察されたことを支持する。
【０００９】
しかし、上記のように、これまでメタボリックシンドロームや脂肪肝の治療や予防には、ω３多価不飽和脂肪酸が有効であることが報告されているが、そのほとんどは、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、又はその製薬学上許容しうる塩及びエステルであり、その他にはわずかにドコサペンタエン酸に関する報告があるのみであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００７−５１４７３３号公報
【特許文献２】国際公開公報第２０１０／１３４６１４号
【特許文献３】特開２００８−１８４４２９号公報
【特許文献４】国際公開公報第２００９／８２４５７号
【特許文献５】特開２００９−１６１４８９号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】J．Agric．Food Chem．2009，57，11047-11054
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ω３多価不飽和脂肪酸はメタボリックシンドロームの治療や予防に効果的であるとされている。しかし、ω３多価不飽和脂肪酸として、これまでエイコサペンタエン酸やドコサヘキサエン酸が利用されていた。本発明の課題は、エイコサペンタエン酸やドコサヘキサエン酸よりも効果的なメタボリックシンドロームの治療・予防、より具体的には肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤、脂肪酸合成酵素の活性抑制剤、ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素の活性抑制剤、及びそれらを含有する脂肪肝の治療・予防に用いるための組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従来、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等のω３多価不飽和脂肪酸は、代謝経路の下流に位置するω３多価不飽和脂肪酸が、上流に位置するω３多価不飽和脂肪酸よりもメタボリックシンドロームの症状の改善作用が強いということが知られていた。テトラコサヘキサエン酸（ＴＨＡ）は、Sprecher's Shuntの生合成経路において、β酸化によりドコサヘキサエン酸へと変換されるため、当然、ドコサヘキサエン酸の方がテトラコサヘキサエン酸よりも、メタボリックシンドロームの症状の改善作用が強いと予想された。ところが驚くべきことに、本発明者らは、テトラコサヘキサエン酸誘導体を摂取したマウスは、ドコサヘキサエン酸誘導体を摂取したマウスと比較して、有意に肝臓トリグリセリドの蓄積が抑制されるということを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）テトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩を有効成分とする肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤；
（２）テトラコサヘキサエン酸の誘導体がテトラコサヘキサエン酸−トリグリセリドであることを特徴とする上記（１）記載の肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤；
（３）脂肪酸合成酵素の活性抑制作用を有することを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤；
（４）ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素（Stearoyl-CoA desaturase）の活性抑制作用を有することを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤；
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤を含有することを特徴とする、脂肪肝の治療又は予防に用いるための組成物；
（６）テトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩を有効成分とする脂肪酸合成酵素の活性抑制剤；
（７）テトラコサヘキサエン酸の誘導体がテトラコサヘキサエン酸−トリグリセリドであることを特徴とする上記（６）記載の脂肪酸合成酵素の活性抑制剤；
（８）上記（６）又は（７）に記載の脂肪酸合成酵素の活性抑制剤を含有することを特徴とする、脂肪肝の治療又は予防に用いるための組成物
【００１５】
本発明の肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤に関する他の態様としては、肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤の調製のためのテトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩の使用や、肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤として用いるためのテトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩や、テトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩の有効量を対象に投与する肝臓トリグリセリドの蓄積抑制方法を挙げることができる。また、本発明の脂肪肝の治療又は予防に用いるための組成物に関する他の態様としては、脂肪肝の治療又は予防に用いるための組成物の調製のためのテトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩の使用や、脂肪肝の治療又は予防に用いるためのテトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩や、テトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体の有効量を対象に投与する脂肪肝の治療又は予防方法を挙げることができる。さらに、本発明のステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素の活性抑制剤に関する他の態様の発明としては、テトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩を有効成分とするステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素の活性抑制剤や、テトラコサヘキサエン酸−トリグリセリドを有効成分とするステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素の活性抑制剤や、前記ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素の活性抑制剤を含有することを特徴とする脂肪肝の治療又は予防に用いるための組成物や、ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素の活性抑制剤の調製のためのテトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩の使用や、ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素の活性抑制剤として用いるためのテトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のテトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩を有効成分とする肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤は、脂肪酸合成酵素の活性抑制作用や、ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素の活性抑制作用を有し、メタボリックシンドロームの治療又は予防剤、特に肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤として使用することができる。
【００１７】
テトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、同様の構造のドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸、又はそれらの誘導体等と比べて、より強くステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素の発現を抑制する。ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素の発現が抑制されると、生体内においてステアリン酸からオレイン酸への脂質代謝が低下する。オレイン酸は、体内に蓄積する脂肪成分中、最も大きい割合を占める脂肪酸であり、このオレイン酸の生合成が抑制されることで、結果として、内臓脂肪、特に肝臓への脂肪の蓄積が抑制される。
【００１８】
同様に、テトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、同様の構造のドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸、又はそれらの誘導体等と比べて、肝臓における脂肪酸合成酵素の活性をより強く抑制する。脂肪酸合成酵素の活性が抑制されると、生体内において脂肪酸の生合成が低下し、結果として、肝臓をはじめとする内臓への脂肪蓄積が抑制される。
【００１９】
また、テトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、同様の構造のドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸、又はそれらの誘導体等と同程度に、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ−１の発現を抑制する。一方、テトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、他の誘導体等よりも強いアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ−２の発現阻害作用を有する。
【００２０】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ−２は脂肪酸のミトコンドリア内への輸送を阻害することによって、間接的に脂肪酸のβ酸化を阻害することが知られている。そのため、テトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩が、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ−２の発現を抑制することにより、脂肪酸のβ酸化を活性化し、間接的に脂肪酸の分解を活性化するため、結果として肝臓等の内臓への脂肪蓄積を抑制する。
【００２１】
非常に興味深いことに、テトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、他の多価不飽和脂肪酸と比較し、速やかに肝臓へ移行し、β酸化によってドコサヘキサエン酸へと変換される。驚くべきことに、本発明者らは、同様の構造をしたドコサヘキサエン酸の誘導体を摂取した場合よりも、同量のテトラコサヘキサエン酸の誘導体を摂取した方が、肝臓中により多くのドコサヘキサエン酸が存在することを見出した。
【００２２】
この、テトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩に特徴的な生体中の挙動が、様々な脂質代謝に影響を与えることで、前述のようなステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素の発現抑制、脂肪酸合成酵素の活性抑制、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ−２の発現抑制といった効果を示し、それらが相乗的に作用することで、ドコサヘキサエン酸よりも効果的な肝臓へのトリグリセリド蓄積の抑制効果を奏すると考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
テトラコサヘキサエン酸は、式（Ｉ）で表される、ω３多価不飽和脂肪酸の一つである。
【００２４】
【化１】
2015027970.tif 000002
【００２５】
本発明のテトラコサヘキサエン酸の誘導体としては、該誘導体がテトラコサヘキサエン酸の骨格を有し、生体内でテトラコサヘキサエン酸に変換されるかぎり、いかなる構造も含まれるが、好適には式（II)で表されるテトラコサヘキサエン酸のエステルである。
【００２６】
【化２】
2015027970.tif 000003
【００２７】
上記式（II）中、Ｒ１は炭素数１〜３０の置換若しくは非置換のアルキル基、炭素数２〜３０の置換若しくは非置換のアルケニル基、炭素数２〜３０の置換若しくは非置換のアルキニル基、炭素数３〜３０の置換若しくは非置換のシクロアルキル基を表す。
【００２８】
前記炭素数１〜３０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、１-メチルブチル基、２-メチルブチル基、３-メチルブチル基、１，１-ジメチルプロピル基、１，２-ジメチルプロピル基、２，２-ジメチルプロピル基、３−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、１-メチルヘプチル基、２-メチルヘプチル基、３-メチルヘプチル基、４-メチルヘプチル基、１，１-ジメチルブチル基、１，２-ジメチルブチル基、１，３-ジメチルブチル基、２，２-ジメチルブチル基、２，３-ジメチルブチル基、３，３-ジメチルブチル基、３，３-ジメチルブタン−２−イル基、２，３-ジメチルブタン−２−イル基、３−ヘキシル基、２-エチルペンチル基、２-メチルペンタン−３−イル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デカニル基、ウンデカニル基、ドデカニル基、トリデカニル基、テトラデカニル基、ペンタデカニル基、ヘキサデカニル基、オクタデカニル基、ノナデカニル基、イコサニル基、ヘンイコサニル基、ドコサニル基、トリコサニル基、テトラコサニル基、トリアコンタニル基等が挙げられる。
【００２９】
前記炭素数２〜３０のアルケニル基としては、ビニル基、１−プロペニル基、アリル基、イソプロぺニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、１，３−ブタンジエニル基、１-エチルビニル基、１-メチル−１−プロペニル基、２-メチル−１−プロペニル基、２-メチル−２−プロペニル基、ペンテニル基、ペンタジエニル基、ヘキセニル基、ヘキサジエニル基、ヘキサトリエニル基、ヘプテニル基、ヘプタジエニル基、ヘプタトリエニル基、オクテニル基、オクタジエニル基、オクタトリエニル基、オクタテトラエニル基、ノネニル基、ノナジエニル基、ノナトリエニル基、ノナテトラエニル基、デセニル基、デカジエニル基、デカトリエニル基、デカテトラエニル基、デカペンタエニル基、ゲラニル基、ネロリル基、シトロネリル基、ファルネシル基、ノロリジル基、ゲラニルゲラニル基、フォトリル基、ゲラニルファルネシル基、スクワレニル基等が挙げられる。
【００３０】
前記炭素数２〜３０のアルキニル基としては、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、１，３−ブタンジイニル基、１-メチル−２−プロピニル基、ペンチニル基、ペンタジイニル基、ヘキシニル基、ヘキサジイニル基、ヘキサトリイニル基、ヘプチニル基、ヘプタジイニル基、ヘプタトリイニル基、オクチニル基、オクタジイニル基、オクタトリイニル基、オクタテトライニル基、ノニニル基、ノナジイニル基、ノナトリイニル基、ノナテトライニル基、デシニル基、デカジイニル基、デカトリイニル基、デカテトライニル基、デカペンタイニル基、ウンデシニル基、ドデシニル基、トリデシニル基、テトラデシニル基、ペンタデシニル基、ヘキサデシニル基、オクタデシニル基、ノナデシニル基、イコシニル基、ヘンイコシニル基、トリアコンチニル基等が挙げられる。
【００３１】
前記炭素数３〜３０のシクロアルキル基としては、飽和又は一部不飽和結合が存在してもよい３〜１２員のシクロアルキル基であり、単環性あるいは該単環性のシクロアルキル基が複数又はアリール基もしくは芳香族複素環基と縮合した多環性の縮合シクロアルキル基であってもよく、単環性のシクロアルキル基としては、例えば、炭素数３〜８の単環性シクロアルキル、具体的には、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロドデシル基、１−シクロヘキセニル基、１，５−シクロヘキサジエニル基等が挙げられ、多環性のシクロアルキル基としては、例えば、炭素数５〜１２の多環性シクロアルキル、具体的にはアダマンチル基、ビシクロ［３．２．１］オクチル基、ビシクロ［３．１．１］ヘプチル基等、ピナニル基、フェンシル基等のテルペン由来の多環性基等が挙げられる。
【００３２】
前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基の置換基としては、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、硫酸基、リン酸基、ニトリル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、シクロアルコキシ基、アシロキシ基等が挙げられる。
【００３３】
上記アシロキシ基としては、アセチルオキシ基、ブチロイルオキシ基、ミリストイルオキシ基、パルミトイルオキシ基、パルミトレイルオキシ基、ステアロイルオキシ基、オレオイルオキシ基、リノレオイルオキシ基、リノレノイルオキシ基、エイコサペンタエノイル基、ドコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエノイル基、テトラコサヘキサエノイル基が好ましく、エイコサペンタエノイル基、ドコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエノイル基、テトラコサヘキサエノイル基がより好ましく、テトラコサヘキサエノイル基が最も好ましい。
【００３４】
これらＲ１の中でも、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、２-アシロキシ−３−アシロキシプロピル基、２-アシロキシ−３−ホスホリルプロピル基、２-アミノ−３−ヒドロキシ−４−オクタデセニル基、アダマンチル基、ボルニル基、メンチル基、ピナニル基、フェンシル基が好ましく、エチル基、２-アシロキシ−３−アシロキシプロピル基、２-アシロキシ−３−ホスホリルプロピル基、２-アミノ−３−ヒドロキシ−４−オクタデセニル基、メンチル基がより好ましく、２-アシロキシ−３−アシロキシプロピル基が最も好ましい。すなわち、式（II）で表される化合物のうち、最も好ましい化合物は、テトラコサヘキサエン酸−トリグリセリドである。
【００３５】
式（II）で表される化合物が不斉炭素原子をもつとき、かかる化合物は、考えられ得るすべての光学異性体を含み、それら光学異性体は任意の比で使用することができる。例えば、ある光学活性化合物は、エナンチオマーでもラセミでも任意の割合のエナンチオマーの混合物でも使用することができ、不斉点が複数存在するときは、任意の割合のジアステレオマーの混合物で使用してもよい。
【００３６】
テトラコサヘキサエン酸の塩としては、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等が挙げられ、金属塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム等の各アルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩が、アンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の各塩が、有機アミン塩としては、トリエチルアミン、ピペリジン、モルホリン、トルイジン等の各塩が挙げられる。
【００３７】
また、式（II）で表される化合物の塩としては、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等が挙げられ、酸付加塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸等の各無機酸塩、及び、有機酸としてのギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、酒石酸、安息香酸等のカルボン酸類、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等のスルホン酸類、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸類が挙げられる。金属塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム等の各アルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩が、アンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の各塩が、有機アミン塩としては、トリエチルアミン、ピペリジン、モルホリン、トルイジン等の各塩が挙げられる。
【００３８】
テトラコサヘキサエン酸の誘導体の製造法の例について、以下に説明するが、これらの製造法に限定されるものではなく、また、試薬として入手可能な化合物を用いることもできる。
【００３９】
本発明の肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤として使用されるテトラコサヘキサエン酸は、例えば“Lipids，1998，33，1107-1114”に記載されるようにヒトデや魚から抽出して得ることができる。また、“Lipids，2011，46，455-461”に記載されるようにドコサヘキサエン酸エステルを原料として、合成的にテトラコサヘキサエン酸を製造することもできる。
【００４０】
テトラコサヘキサエン酸のエステルは、“Lipids，1998，33，1107-1114”に記載されるようにヒトデや魚を塩酸の存在下、エステル化を行いたいアルコールを抽出溶媒として抽出することで得ることができる。また、前記方法で得たテトラコサヘキサエン酸メチルエステルと金属アルコキシドとのエステル交換を行うことで、望みのエステルを得ることもできる。
【００４１】
また、ドコサヘキサエン酸のグリセリンエステルを製造することもできる。例えば、１−テトラコサヘキサエン酸−モノグリセリドを製造する場合、まずグリセリンをアセトニドへと導いた後にエステル化を行い、酸性条件でアセトニドを除去すればよい（反応式Ｉ）。
【００４２】
【化３】
2015027970.tif 000004
【００４３】
こうして得た１−テトラコサヘキサエン酸−モノグリセリドに、他のカルボン酸を作用させることで、１−テトラコサヘキサエン酸−２−アシルジグリセリド、１−テトラコサヘキサエン酸−３−アシルジグリセリド、１−テトラコサヘキサエン酸−２，３−ジアシルトリグリセリド等を製造することができる。
【００４４】
この他にも、２−テトラコサヘキサエン酸−モノグリセリドを製造する場合、まずグリセリンをベンジリデンアセタールへと導いた後にエステル化を行い、酸性条件でアセタールを除去すればよい（反応式II）。
【００４５】
【化４】
2015027970.tif 000005
【００４６】
こうして得た２−テトラコサヘキサエン酸−モノグリセリドを、テトラコサヘキサエン酸を用いてさらにエステル化を行うことで、テトラコサヘキサエン酸−トリグリセリドを得ることもできる。
【００４７】
当然、前記の段階的な反応でなくとも、当業者であれば、直接テトラコサヘキサエン酸とグリセリンをエステル化することで、テトラコサヘキサエン酸−トリグリセリドを容易に得ることができる。
【００４８】
グリセリンエステルに限らず、糖等の多価アルコールを有する化合物のエステルを、種々の保護基を用いることで選択的に製造することができる。このような保護基については、Green&Wuts，“PROTECTIVE GROUPS in ORGANIC SYNTHESIS” 4thed.John Wiley&Sons，Inc.を参照することができる。
【００４９】
上記エステル化法としては、テトラコサヘキサエン酸のエステルが製造できる限り、どのような方法を用いても構わないが、例えば、ＤＣＣ法等のカルボジイミドを縮合剤として用いる方法や、向山法、山口法、椎名法等のカルボン酸を活性化する方法などを利用することができる。
【００５０】
また、化学合成法だけではなく、酵素を用いてテトラコサヘキサエン酸−トリグリセリドを製造することもできる。例えば、特開平５−３３１１０５公報（特許第２５７２６９２号公報）には、ドコサヘキサエン酸とグリセリンから固定化リパーゼを用いてドコサヘキサエン酸−トリグリセリドを製造する方法が開示されている。この方法はテトラコサヘキサエン酸−トリグリセリドの製造にも利用できる。
【００５１】
テトラコサヘキサエン酸又はその誘導体の塩を取得したいとき、テトラコサヘキサエン酸又はその誘導体が塩の形で得られる場合には、そのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られる場合には、適当な有機溶媒に溶解若しくは懸濁させ、酸又は塩基を加えて通常の方法により塩を形成させればよい。
【００５２】
また、テトラコサヘキサエン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩は、水あるいは各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これら付加物も本発明の肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤や、脂肪肝の治療又は予防に用いるための組成物、あるいは、脂肪酸合成酵素の活性抑制剤として使用することができる。
【００５３】
本発明の肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤や、脂肪肝の治療又は予防に用いるための組成物、あるいは、脂肪酸合成酵素の活性抑制剤は、そのまま単独で投与することも可能であるが、各種の医薬製剤とすることが望ましく、該医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種若しくは二種以上の担体と混合し、製剤学の常法により製造することができる。
【００５４】
また、本発明の肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤や、脂肪肝の治療又は予防に用いるための組成物、あるいは、脂肪酸合成酵素の活性抑制剤は、各種治療薬と組み合わせて、医薬製剤として用いてもよい。このような治療薬としては、これらに限られないが、高血圧治療薬としてのサイアザイド系利尿薬、サイアザイド類似利尿薬、ループ利尿薬、カリウム保持性利尿薬、カルシウム拮抗薬、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、アンジオテンシン受容体拮抗薬、直接的レニン阻害薬、交感神経遮断薬、α２受容体刺激薬等が、糖尿病治療薬としてのインスリン分泌薬、ブドウ糖吸収阻害薬、インスリン抵抗性改善薬、ＧＬＰ１受容体アゴニスト、ジぺプチルペプチダーゼIV阻害薬、インスリン製剤等が、脂質代謝異常治療薬としての脂質降下薬等を挙げることができる。
【００５５】
これら医薬製剤の投与経路としては、経口投与、点滴を含む静脈内投与、静脈内投与、又は経鼻胃管、経鼻腸管、胃漏チューブ若しくは腸漏チューブを用いる強制的経腸栄養法による投与等の非経口投与などを挙げることができる。
【００５６】
剤形としては、上記投与経路に応じて適宜決定することができるが、注射剤、点滴剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散在、液剤、シロップ等に溶解した水剤、座剤等を挙げることができる。本発明の肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤や、脂肪肝の治療又は予防に用いるための組成物、あるいは、脂肪酸合成酵素の活性抑制剤は医薬用途の他、錠剤やカプセル剤のサプリメントの形態とすることもできる。また特に、嚥下することが困難な高齢者等には、口中において速やかな崩壊性を示す崩壊錠の形態や、経鼻胃管投与に適した液剤の形態が好ましい。
【００５７】
また、本発明の肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤や、脂肪肝の治療又は予防に用いるための組成物、あるいは、脂肪酸合成酵素の活性抑制剤は、食品に添加してしても良い。かかる食品としては、これらに限られるものではないが、牛乳、乳飲料、果汁飲料、清涼飲料、茶等の飲料、パン、ケーキ、クッキー等のベーカリー類、チョコレート、キャンディー、グミ、ガム等の菓子類、マヨネーズ、ドレッシング、たれや麺つゆ等の調味料、バター、マーガリン、ホイップクリーム、ゼリー、プリン、ヨーグルト等が挙げられる。
【００５８】
本発明の肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤や、脂肪肝の治療又は予防に用いるための組成物、あるいは、脂肪酸合成酵素の活性抑制剤は、ヒトの他、家畜・家禽類やペットなど獣医分野でも使用することができる。かかる治療剤等の投与の量・頻度・期間としては、当該技術分野の薬理学者や臨床医が既知の方法により決定することもできる。
【００５９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【００６０】
［テトラコサヘキサエン酸−トリグリセリドの製造例］
テトラコサヘキサエン酸−トリグリセリドを以下に示す方法で調製した。
テトラコサヘキサエン酸は、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを原料とし、“Lipids，1998，33，1107-1114”に従い調製した。このテトラコサヘキサエン酸を特開平５−３３１１０５公報の方法に従いテトラコサヘキサエン酸−トリグリセリドとした。
【００６１】
［供試動物］
試験動物として、メタボリックシンドロームモデルマウスである、ｄｂ／ｄｂマウス（オス、５週齢）を用いた。
【実施例１】
【００６２】
［ω３多価不飽和脂肪酸トリグリセリドの投与実験］
表１に示す飼料をｄｂ／ｄｂマウス及び対照マウスとしてのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに与えた。対照群として、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いたＮｏｒｍａｌ群及びｄｂ／ｄｂマウスを用いたＣｏｎｔｒｏｌ群には基準食（ＡＩＮ−７６）を与えた。また、ＡＩＮ−７６にそれぞれエイコサペンタエン酸−トリグリセリド、ドコサヘキサエン酸−トリグリセリド、及びテトラコサヘキサエン酸−トリグリセリドを加えた飼料をｄｂ／ｄｂマウスに与えた試験群を、それぞれＥＰＡ−ＴＧ群、ＤＨＡ−ＴＧ群、及びＴＨＡ−ＴＧ群とした（以下、これらを総じてω３多価不飽和脂肪酸トリグリセリド投与群、とも言う）。各群の個体数は５匹でおこなった。
【００６３】
【表１】
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１６：０−ＴＧ：パルミチン酸−トリグリセリド
１８：１−ＴＧ：オレイン酸−トリグリセリド
１８：２−ＴＧ：リノール酸−トリグリセリド
１８：３−ＴＧ：リノレン酸−トリグリセリド
ＥＰＡ−ＴＧ：エイコサペンタエン酸−トリグリセリド
ＤＨＡ−ＴＧ：ドコサヘキサエン酸−トリグリセリド
ＴＨＡ−ＴＧ：テトラコサヘキサエン酸−トリグリセリド
【００６４】
マウスは、おがくずを敷いたプラスチックケージに１匹ずつ、１２時間明暗周期（７時から１９時点灯、１９時から７時消灯）、室温２３±２℃のもとで３日間予備飼育後、４週間本飼育を行った。給餌量は上限値を設定し自由摂取させた。水は自由摂取させた。体重および摂食量は、飼育期間中、毎日測定した。本飼育最終日に９時間絶食させた後、終体重を測定し、ネンブタール麻酔下において心臓採血により屠殺を行い、肝臓および脂肪組織（白色脂肪組織：精巣周辺、腎臓周辺、腸間膜周辺）、精巣、腎臓、脾臓、心臓、筋肉、脳、副腎を摘出し、筋肉以外の重量を測定した後、液体窒素により凍結保存した。得られた血液は静置後、低速遠心分離（１，７５０×ｇ，１５分，４℃）して血清を調製した。
【００６５】
表２には、表１に示した各試験飼料のマウスに対する効果を示した。
【００６６】
【表２】
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【００６７】
健常体のＣ５７ＢＬ／６ＪのＮｏｒｍａｌ群と比較して、メタボリックシンドロームモデルマウスであるｄｂ／ｄｂマウスは、試験後体重、摂餌量、摂餌量１ｇ当の体重増加量、白色脂肪組織重量および肝臓重量において顕著に増加した。また、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、基準食（ＡＩＮ−７６）のみを与えた群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）とＡＩＮ−７６にω３多価不飽和脂肪酸トリグリセリド投与群とを比較すると、終体重、摂食量、摂食効率、白色脂肪組織重量において、ＥＰＡ−ＴＧ群ではＣｏｎｔｒｏｌ群に対して、それらの重量が増加したが、ＤＨＡ−ＴＧ群及びＴＨＡ−ＴＧ群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して、体重増加率が抑制された。一方、肝臓重量については、Ｃｏｎｔｏｒｏｌ群と比較して、ω３多価不飽和脂肪酸トリグリセリド投与群で、肝臓重量の増加が抑制されていた。
【実施例２】
【００６８】
［ω３多価不飽和脂肪酸トリグリセリドの投与による肝臓脂質蓄積量］
実施例１で摘出した、ｄｂ／ｄｂマウスの肝臓の脂質蓄積量を表３に示した。肝臓トリグリセリド濃度は、“Clinica Chimica Acta，1968，22，393-397”に記載の方法に従って測定した。肝臓コレステロール濃度は、コレステロールＥ−テストワコー（和光純薬工業(株)、大阪）を用いてコレステロールオキシダーゼ・DAOS法により測定した。また、肝臓リン脂質濃度の測定は、“Lipids，1965，1，85-86”に記載の方法に従って測定した。
【００６９】
【表３】
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【００７０】
ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、肝臓１ｇ当たりのトリグリセリド濃度はω３多価不飽和脂肪酸トリグリセリド投与群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して有意に減少していた。特にＴＨＡ-ＴＧ群は、コントロール群に対してわずか３９％のトリグリセリドを蓄積するだけであった。一方、総コレステロール濃度及びリン脂質濃度はω３多価不飽和脂肪酸トリグリセリド投与群において、ＥＰＡ−ＴＧ群＜ＤＨＡ−ＴＧ群＜ＴＨＡ−ＴＧ群の順にそれらの蓄積を抑制していたが、トリグリセリドに対する抑制効果ほど、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して顕著な効果の差を示さなかった。
【実施例３】
【００７１】
［ω３多価不飽和脂肪酸トリグリセリドの投与による肝臓脂質代謝関連酵素活性の比較］
表４には、実施例１で摘出した、ｄｂ／ｄｂマウスの肝臓中の脂質代謝関連酵素の活性を示した。脂肪酸合成酵素の活性は“Biochemical Journal，1986，235，87-90”に記載の方法に従って測定し、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）の活性は“Analytical Biochemistry，1985，151，479-486”に記載の方法に従って測定した。
【００７２】
【表４】
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【００７３】
脂肪酸合成酵素の活性はＣｏｎｔｒｏｌ群に対して、ＥＰＡ−ＴＧ群で７９％、ＤＨＡ−ＴＧ群で５４％、ＴＨＡ−ＴＧ群では４３％に抑制されていた。一方、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ活性はＣｏｎｔｒｏｌ群に対して、ω３多価不飽和脂肪酸トリグリセリド投与群で若干の活性の増大傾向がみられたものの、顕著な差はなかった。この結果から、ω３多価不飽和脂肪酸トリグリセリドによる、肝臓トリグリセリド濃度の低下作用は、脂肪酸分解酵素であるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼの活性化ではなく、脂肪酸合成酵素の活性抑制によるものと考えられる。
【実施例４】
【００７４】
［ω３多価不飽和脂肪酸トリグリセリドの投与による肝臓脂質代謝関連酵素のｍＲＮＡ発現量の比較］
表５には、実施例１で摘出した、ｄｂ／ｄｂマウスの肝臓における脂質代謝関連酵素のｍＲＮＡ発現量の比較を示した。ω３多価不飽和脂肪酸トリグリセリド投与群の各ｍＲＮＡ発現量は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の各ｍＲＮＡ発現量を１００とした相対量で示している。
【００７５】
肝臓総ＲＮＡは、肝臓０．１ｇからRNeasy Lipid Tissue Mini Kit（Qiagen）を用いて抽出した。ＤＮＡは、TaqMan Reverse Transcription試薬（Applied Biosystems）を用いて調製した。ｍＲＮＡ発現量の測定は、ABI Prism 7000（Applied Biosystems）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって行った。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ１（ＡＣＣ１）、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＣ２）は、Applied Biosystems社のAssays-on-DemandＴＭ，Gene Expression Product（ＡＣＣ１：Mm01304289_m1，ＡＣＣ２：Mm01204659_m1）を用いて検出した。ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素−１（ＳＣＤ１）の検出は、TaqMan(R)MGB probe（Applied Biosystems）を使用した。また、内部標準として１８Ｓ  ｒＲＮＡ（Assay on Demand Hs99999901_s1）を使用した。
【００７６】
【表５】
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【００７７】
肝臓において、ω３多価不飽和脂肪酸トリグリセリド投与群の脂質合成に係る酵素のｍＲＮＡ発現量は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して、総じて低下している。中でも脂肪酸合成酵素であるＡＣＣ１及びＡＣＣ２の発現量はＴＨＡ−ＴＧ群の方が、ＥＰＡ−ＴＧ群及びＤＨＡ−ＴＧ群よりも抑制されている。
【００７８】
ステアリン酸を不飽和化することによってオレイン酸を合成するステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素−１のｍＲＮＡは、ＤＨＡ−ＴＧ群の方が、ＴＨＡ−ＴＧ群よりも発現量が多かった。この結果から、ＴＨＡ−ＴＧを摂取することによって、オレイン酸の生合成が抑制されたため、ＴＨＡ−ＴＧ群は、ＥＰＡ−ＴＧ群及びＤＨＡ−ＴＧ群と比較して、肝臓へのトリグリセリドの蓄積が少なくなったと考えられる。
【実施例５】
【００７９】
［ω３多価不飽和脂肪酸トリグリセリド投与群の肝臓組織中の脂肪酸組成］
表７には、肝臓組織中の脂肪酸組成を測定した結果を表す。肝臓組織からの脂質抽出は、Ｆｏｌｃｈ法 （“The Journal of Biological Chemistry，1956，226，497-509”） で行った。料脂質約１０ｍｇをネジ口試験管にとり、そこに０．５ＮのＮａＯＨ−ＭｅＯＨ（１ｍＬ）を添加し、ミキサーで攪拌した。１００℃の湯浴中で３０秒加熱し、ミキサーで攪拌した。室温になるまで遮光放置後、１４％三フッ化ホウ素メタノール溶液（１４％ＢＦ３−ＭｅＯＨ）２ｍＬを添加し、攪拌した。１００℃の湯浴２０秒加熱し、攪拌後、４０℃前後になるまで遮光放置した。その後、ヘキサン１ｍＬを添加し、ミキサーで攪拌し、飽和食塩水３ｍＬを添加し、激しく攪拌した。上層沈静化後、上層（ヘキサン層）を回収した。ヘキサンを窒素にて乾固後、再びヘキサンを添加し、ＧＣ−ＦＩＤに供した。
【００８０】
分析条件を以下に示す。
検出器：水素炎イオン化検出器（FID）
計算機：C-R6ACHROMATOPAC（(株)島津製作所、京都）
カラム：SUPELCOOMEGAWAX320（30m×0.32mmi.d.,膜厚0.25μm）
（シグマアルドリッチジャパン合同会社、東京）
キャリアーガス：He（1ｍＬ/分）
カラム温度：175〜235℃（昇温1℃/分、235℃で20分保持）
注入口温度：250℃
検出器温度：260℃
注入方法：スプリットモード（スプリット比80：1）
注入量：1μＬ
注）脂肪酸の定性は、“日本油化学会誌，1998，47（10），937-946”とaFAMEmixturestandard（シグマアルドリッチジャパン、東京）を参考に行った。
【００８１】
【表６】
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【００８２】
上記表６中
１４：０はミリスチン酸を、
１６：０はパルミチン酸を、
１６：１はパルミトレイン酸を
１８：０はステアリン酸を、
１８：１（ｎ−９）はオレイン酸を、
１８：２（ｎ−６）はリノール酸を、
１８：３（ｎ−３）はリノレン酸を、
２０：４（ｎ−６）はアラキドン酸を、
２０：５（ｎ−３）はエイコサペンタエン酸を、
２２：５（ｎ−３）はドコサペンタエン酸を、
２２：６（ｎ−３）はドコサヘキサエン酸を、
２４：６（ｎ−３）はテトラコサヘキサエン酸を表す。
【００８３】
興味深いことに、ＴＨＡ−ＴＧ群において、肝臓組織中にはテトラコサヘキサエン酸がほとんど確認されなかった。一方、ＴＨＡ−ＴＧ群の肝臓において、餌に含まれていないドコサヘキサエン酸が、テトラコサヘキサエン酸より多く検出された。これは、テトラコサヘキサエン酸がβ酸化により、ドコサヘキサエン酸へと変換されているためと考えられる。このことは、テトラコサヘキサエン酸が、ドコサヘキサエン酸よりも早く肝臓に移行し、β酸化を受け、ドコサヘキサエン酸へと変換されていることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明によると、脂肪酸合成酵素の活性抑制作用や、ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素の活性抑制作用を有する、メタボリックシンドローム治療又は予防剤、特に肝臓トリグリセリド蓄積抑制剤を提供することが可能となる。これより、本発明は医学界、製薬業界、食品業界において有用である。