(57)【要約】      （修正有）【課題】５５〜８０％の中オレイン酸の範囲におけるオレイン酸レベル、および８％未満の飽和脂肪酸レベルを有する大豆種子を生成する遺伝子組み換え大豆。【解決手段】遺伝子組換え大豆植物ＭＯＮ８７７０５をｐＭＯＮ９５８２９に由来するＤＮＡ断片での大豆細胞のアグロバクテリウム媒介形質転換により生成した大豆植物。ｐＭＯＮ９５８２９は２つの植物形質転換Ｔ−ＤＮＡを含み、その一方はＦＡＤ２及びＦＡＴＢ遺伝子のＲＮＡｉベースの抑制を引き起こすような逆方向反復配列で設計されており、本組換え体に特徴的であるヌクレオチド配列の存在を検出する方法、使用するプローブ及びプライマー。【選択図】図１
2015144602.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、２および１８よりなる群から選択される配列であるか、または該配列に相補的である配列を有するポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子を含む大豆植物。
【請求項２】
植物器官が、配列番号：１、２および１８よりなる群から選択される配列であるか、または該配列に相補的である配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１記載の大豆植物の植物器官。
【請求項３】
後代が、配列番号：１、２および１８よりなる群から選択される配列であるか、または該配列に相補的である配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１記載の大豆植物の後代。
【請求項４】
約５５〜８０％のオレイン酸および８％未満の飽和脂肪酸を含む油組成物を有する種子を生成できる大豆植物であって、該油組成物についての遺伝的決定基が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９２４１を有する大豆から得られる該大豆植物。
【請求項５】
大豆事象ＭＯＮ８７７０５を含む植物と、大豆事象ＭＯＮ８７７０５を欠く大豆植物とを交配して、該大豆事象ＭＯＮ８７７０５および改変された脂肪酸レベルを含む植物を得ることを含む、改変された脂肪酸レベルを含む大豆植物を生成する方法であって、該事象を含む種子の代表的試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９２４１下寄託されたことを特徴とする該方法。
【請求項６】
大豆事象ＭＯＮ８７７０５を含む大豆変種を生成する方法であって、大豆事象ＭＯＮ８７７６９を該変種に戻し交配すことを含み、ここに、該事象を含む種子の代表的試料は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９２４１下で寄託されたことを特徴とする該方法。
【請求項７】
請求項１に記載の大豆植物の種子から得た油組成物。
【請求項８】
食用油、サラダ油、ショートニング、レシチン、無毒性プラスチック、印刷用インク、滑沢剤、ワックス、作動液、電気的変圧器流体、溶剤、化粧品、ヘアケア製品およびバイオディーゼルよりなる群から選択される請求項７記載の油に由来した商品。
【請求項９】
配列番号：１、２および１８下でリストされた配列よりなる群から選択されるものであるか、またはそのものに相補的である配列を有するポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子。
【請求項１０】
配列番号：１および配列番号：２よりなる群から選択される少なくとも約１１〜約２０の連続ヌクレオチドを含む単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１１】
配列番号：１、２および１８下でリストされた配列よりなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む大豆細胞のゲノム。
【請求項１２】
生物学的試料中の大豆事象ＭＯＮ８７７０５ ＤＮＡの存在を検出する方法であって、
ｉ．配列番号：１および配列番号：２ならびにそれらの相補体よりなる群から選択される配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号：１および配列番号：２ならびにそれらの相補体よりなる群から選択される配列を含まない大豆植物ゲノムＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしないプローブと、試料とを接触させ；
ｉｉ．試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に付し；次いで
ｉｉｉ．該試料に対するプローブの結合を検出することを含み、ここに、結合は、該試料中の該ＤＮＡの存在に特徴的である
ことを特徴とする該方法。
【請求項１３】
該ＤＮＡプライマー対が、配列番号：３および配列番号：５またはそれらの相補体の少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該ＤＮＡプライマー対が、配列番号５および配列番号：４、またはそれらの相補体の少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
該ＤＮＡプライマー対が、配列番号：５またはそれらの相補体の少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、ここに、一方のプライマーは配列５’〜配列番号：１８に由来し、他方のプライマーは、配列３’〜 配列番号：１８に由来することを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
配列番号：１、２および１８よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の存在を検出することを含む、生物学的試料中の大豆事象ＭＯＮ８７７０５の存在に特徴的なヌクレオチド配列の存在を検出する方法であって、
該生物学的試料は、大豆ミール、大豆粉末、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織状大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白加水分解物およびホイップトッピングよりなる群から選択されることを特徴とする該方法。
【請求項１７】
配列番号：１、２および１８下で示された１以上の配列の検出に基づいて設計されたヌクレオチド成分を含む、大豆試料中の大豆遺伝子組換え事象ＭＯＮ８７７０５の存在または不存在を検出するためのキット。
【請求項１８】
生物学的試料中の大豆事象ＭＯＮ８７７０５の存在を検出するために用いる請求項１７記載のキットであって、
ｉ．試料とＤＮＡプライマー対とを接触させ；
ｉｉ．核酸増幅反応を行い、それにより、アンプリコンを生成し；次いで
ｉｉｉ．該アンプリコンを検出し、ここに、該アンプリコンは、配列番号：１、２および１８下でリストされた１以上の配列を含む
ことを特徴とする該キット。
【請求項１９】
該ＤＮＡプライマー対が、配列番号：３および配列番号：５に由来するヌクレオチド配列を含む請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
該ＤＮＡプライマー対が、配列番号：５および配列番号：４に由来するヌクレオチド配列を含む請求項１８記載のキット。
【請求項２１】
該ＤＮＡプライマー対が、配列番号：５のヌクレオチド配列を含み、ここに、一方のプライマーは配列５’〜 配列番号：１８に由来し、他方のプライマーは、配列３’〜 配列番号：１８に由来することを特徴とする請求項１８記載のキット。
【請求項２２】
配列番号：１、２および１８よりなる群から選択されるＤＮＡ分子を有する組成物であって、大豆ミール、大豆粉末、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織状大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白加水分解物およびホイップトッピングよりなる群から選択される商品である該組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え大豆事象ＭＯＮ８７７０５ならびにその植物器官および種子に関する。この事象は、改変された脂肪酸レベルを含む油組成物を示す。また、本発明は、生物学的試料中の大豆事象の存在を検出する方法に関し、かかるようにできるヌクレオチド配列を提供する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００８年９月２９日付けで出願した米国仮出願シリアル番号第６１／１００，８５９号の利益を主張する。
【０００３】
（配列表の取込み）
サイズが５０，９９５バイト（ＭＳ−ＤＯＳにおける測定）であって、２００９年９月２２日に作成されたファイル名「５６０４７−００００ＷＯ＿ｓｅｑｌｉｓｔ．ｐｄｆ」を含む、添付書類Ｃ／ＳＴ．２５テキスト形式の配列表のコピーをＥＦＳウェブを介してここに電子的に提出し、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
【背景技術】
【０００４】
大豆は、重要な作物であって、世界の多数の地域の主要な食料源である。生物工学の方法は、農業形質の改良および生成物の品質のために大豆に適用されている。１つのかかる品質形質は改変された脂肪酸レベルを含むダイズ油である。
【０００５】
性的交配の後代が注目する導入遺伝子／ゲノムＤＮＡを含むかを決定するために、特定の植物の導入遺伝子／ゲノムＤＮＡの存在を検出できることは有利であろう。加えて、組換え体作物植物に由来する食品の市販前承認および標識化を要求する規則に従う場合に、特定の植物を検出する方法は有用であろう。
【０００６】
ダイズ油は、特定の市場に利益を創製するように種々の育種方法により改変されてきた。しかしながら、サラダ油、食用油およびフライ油の消費者のごとき主要なダイズ油ユーザー、ならびにバイオディーゼルおよびバイオルーブ市場のごとき産業市場に広範囲に有益であるダイズ油は、入手可能ではない。従前のダイズ油は、余りにも高価であるか、あるいは酸化安定性、良好なフライ食品風味、または飽和脂肪含量のごとき重要な食物品質特性、または適切な一酸化窒素放出または寒冷耐性もしくは低温フローのごとき重要なバイオディーゼル特性を欠いていた。
【０００７】
ダイズ油は典型的には約２０％のオレイン酸を含む。オレイン酸は１つの二重結合を有するが、依然として高温で比較的安定であり、高レベルのオレイン酸を含む油は、料理および加温が必要な場合の他のプロセスに適している。最近、オレイン酸が高密度リポタンパク（「ＨＤＬ」）のレベルに影響することなく、低密度リポタンパク質（「ＬＤＬ」）の血中レベルを低下させるようであるため、高オレイン油の消費の増加が勧められている。しかしながら、オレイン酸が高温にて分解する場合に、ネガティブな香り化合物を創製し、リノール酸の酸化によって創製されたポジティブな香りを減少させるために、オレイン酸レベルのいくらかの制限が望ましい。Ｎｅｆｆら，  ＪＡＯＣＳ，  ７７：１３０３−１３１３  （２０００）；  Ｗａｒｎｅｒら，  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ４９：８９９−９０５  （２００１）。かくして、フライ油およびフライ食品のごとき食物適用における不快なにおいを制限するために、６５〜８５重量％またはそれ未満であるオレイン酸レベルを持つ油を使用することが好ましい。他の好ましい油は、酸化安定性を改善するために５５重量％を超えるオレイン酸レベルを有する。
【０００８】
多数の油適用について、８重量％未満または約２〜３重量％未満でさえの飽和脂肪酸レベルは望ましい。ダイズ油は典型的には約１６〜２０％の飽和脂肪酸：１３〜１６％のパルミチン酸塩および３〜４％のステアリン酸塩を含有する（一般的には、Ｇｕｎｓｔｏｎｅら，  Ｔｈｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，  Ｌｏｎｄｏｎ  （１９９４）を参照）。飽和脂肪酸は多数の適用に望ましくない高融点を有する。原料または燃料として用いる場合、飽和脂肪酸は低温で曇りを引き起こし、燃料に流動点および目詰まり点のごとき貧弱な低温フロー特性を与える。低飽和脂肪酸レベルを含む油生成物は、それらが、より健康なものと認められる、および／またはＦＤＡのガイドラインに従う「飽和脂肪無し」と分類され得るために、消費者および食品産業によって好ましいかもしれない。加えて、低飽和油は、サラダ油のごとき食物適用のための油に不凍を施す必要性を低減または消失させる。バイオディーゼルおよび潤滑適用において、低飽和脂肪酸レベルを持つ油は、低温フロー特性の改善を与え、低温にて曇らない。
【０００９】
中オレイン酸および低飽和含量を持つ種子を生成する大豆系は、望ましいであろう。本明細書に開示された方法は、５５〜８０％の中オレイン酸の範囲におけるオレイン酸レベル、および８％未満の飽和脂肪酸レベルを有する大豆種子の生成を可能にする。
【００１０】
植物中の外来遺伝子の発現は、恐らく、クロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）または組込み部位に近い転写調節要素（例えば、エンハンサー）の近接によりそれらの染色体の位置によって影響を受けることが知られている（Ｗｅｉｓｉｎｇら，１９８８  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ  ２２：４２１−４７７）。この理由のために、注目する導入された遺伝子の最適な発現により特徴付けられた事象を同定するために多数の事象をスクリーニングすることがしばしば必要である。例えば、事象中の導入された遺伝子の発現のレベルにおける広範囲の変動が存在し得ることが、植物および他の生物体において観察されている。また、導入された遺伝子構築体中に存在する転写調節要素から期待されるパターンに対応しないかもしれない、空間的または時間的のパターンの発現における差、例えば、種々の植物組織における導入遺伝子の相対的な発現の差が存在し得る。この理由のために、異なる数百〜数千の事象を生成し、商業目的のための所望の導入遺伝子発現のレベルまたはパターンを有する単一の事象につき事象をスクリーニングすることが一般的である。導入遺伝子発現の所望のレベルまたはパターンを有する事象は、従来の育種方法を用いる性的外交配によって導入遺伝子を他の遺伝的背景に遺伝子移入するのに有用である。かかる交配の後代は、元来の形質転換体の導入遺伝子表現特性を維持する。この戦略は、特定の地域の栽培条件に適切に適合する多数の変種の信頼できる形質発現を保証するために用いられる。
【００１１】
核酸プローブを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡハイブリダイゼーションのごとき、いずれのよく知られた核酸検出方法によっても導入遺伝子の存在を検出することは可能である。これらの検出方法は、一般的には、プロモーター、ターミネーター、標識遺伝子等のごとき頻繁に用いる遺伝子要素に集中する。結果的には、かかる方法は、挿入ＤＮＡ（「フランキングＤＮＡ」）に隣接する染色体ＤＮＡの配列が知られていない限りは、異なる事象、特に、同一のＤＮＡ構築体を用いて生成したものを区別するのに有用ではないかもしれない。事象特異的なＰＣＲアッセイは、例えば、Ｔａｖｅｒｎｉｅｒｓら  （Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ５３：  ３０４１−３０５２，  ２００５）により言及され、ここに、遺伝子組換えトウモロコシ系Ｂｔ１１、Ｂｔ１７６およびＧＡ２１、およびキャノーラ事象ＧＴ７３についての事象特異的な追跡システムが実証されている。この研究において、事象特異的なプライマーおよびプローブは、各事象のゲノム／導入遺伝子結合の配列に基づいて設計された。また、遺伝子組換え植物事象に特異的なＤＮＡ検出方法は、米国特許第６，８９３，８２６号；第６，８２５，４００号；第６，７４０，４８８号；第６，７３３，９７４号；第６，６８９，８８０号；第６，９００，０１４号および第６，８１８，８０７号に記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、改変された脂肪酸レベルを含む油組成物を含む遺伝子組換え大豆（Glycine max）植物ＭＯＮ８７７０５、および大豆植物ＭＯＮ８７７０５のＤＮＡ構築体、ならびに大豆ＭＯＮ８７７０５およびその後代における導入遺伝子／ゲノムの挿入領域の検出に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ＭＯＮ８７７０５と指定された遺伝子組換え大豆植物、および受入番号ＰＴＡ−９２４１で米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託された種子を有する大豆事象ＭＯＮ８７７０５と判別不能なその後代（かかる後代が、挿入された遺伝子組換えＤＮＡに対応する少なくとも１つの対立遺伝子も含む範囲まで）を含む。本発明のもう一つの態様は、大豆事象ＭＯＮ８７７０５の後代植物または種子、あるいはその植物および種子の再生可能な器官である。また、本発明は、限定されるものではないが、花粉、胚珠、花、苗条、根、茎、葉、鞘、種子および分裂組織を含めた大豆事象ＭＯＮ８７７０５の植物器官を含む。油、ミール、粉末、食物製品、蛋白サプリメント、およびＭＯＮ８７７０５に対応する大豆植物が収穫された圃場内に残存しているバイオマスのごときＭＯＮ８７７０５のゲノムおよびＭＯＮ８７７０５からの生成物に含まれる新規な遺伝子組成物は、本発明の態様である。
【００１４】
本発明は、約５５〜８０重量％のオレイン酸および８重量％未満の飽和脂肪酸を含む油組成物を有する種子を生成できる大豆植物を提供し、ここに、該油組成物についての遺伝的決定基は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９２４１を有する大豆から入手可能である。
【００１５】
本発明の１つの態様により、組成物および方法は、ＭＯＮ８７７０５と指定された新規な大豆植物からの導入遺伝子／ゲノムの挿入領域の存在を検出するために提供される。配列番号１（配列番号６［Ｆ］の第３４４９〜３４６８位に対応する［Ａ］、図２］）、配列番号：２（配列番号６［Ｆ］の第１０７００〜１０７１９位に対応する［Ｂ］、図２）および配列番号：１８（配列番号６［Ｆ］の第９２６６〜９３７１位に対応する、図２）およびその相補体よりなる群から選択されるＭＯＮ８７７０５の少なくとも１つの結合配列を含むＤＮＡ配列が提供され；ここに、結合配列は、ゲノムに挿入された異種のＤＮＡにて大豆細胞ゲノムＤＮＡに連結するポイントにわたるヌクレオチド配列であり、大豆ＤＮＡを含有する生物学的試料におけるこの配列の検出は、該試料中の大豆事象ＭＯＮ８７７０５ＤＮＡの存在に特徴的である（図２）。かかる結合配列は、配列番号１、２、１８下でリストされた配列およびその相補体の少なくとも１つを含むことができる。これらのＤＮＡ分子を含む大豆植物、その植物からの大豆種子およびその植物の後代は、本発明の態様である。
【００１６】
大豆事象ＭＯＮ８７７０５からの新規な導入遺伝子／ゲノムの挿入領域、配列番号３［Ｃ］、配列番号：４［Ｄ］および配列番号：５［Ｅ］または配列番号：１［Ａ］および配列番号：２［Ｂ］を含むＤＮＡ配列（図２参照）は、本発明の態様である。また、これらの分子を含む大豆植物、種子および後代は本発明の態様である。
【００１７】
本発明のもう一つの態様により、ＤＮＡ検出方法における使用のための２つのＤＮＡ分子が提供され、ここに、第１のＤＮＡ分子は、配列番号：５のＤＮＡ分子の導入遺伝子領域のいずれかの部分の少なくとも１１個以上、少なくとも１２個以上または少なくとも１３個以上の隣接するポリヌクレオチド、ならびに、配列番号：３の５’フランキング大豆ゲノムＤＮＡ領域のいずれかの部分の同様の長さのＤＮＡを含み、一緒に用いられる場合のこれらのＤＮＡは、アンプリコンを生成するＤＮＡ増幅方法におけるＤＮＡプライマーとして有用である。ＤＮＡ増幅方法におけるこれらのＤＮＡプライマーを使用して生成されたアンプリコンは、そのアンプリコンが配列番号：１を含有する場合に大豆事象ＭＯＮ８７７０５に特徴的である。配列番号：３および配列番号：５のいずれかの部分に相同的または相補的なＤＮＡプライマーによって生成されたいずれのアンプリコン、および配列番号：１を含むいずれのアンプリコンも、本発明の態様である。
【００１８】
本発明のもう一つの態様により、ＤＮＡ検出方法における使用のための２つのＤＮＡ分子が提供され、ここに、第１のＤＮＡ分子は、配列番号：５のＤＮＡ分子の導入遺伝子領域のいずれかの部分の少なくとも１１個以上の隣接するポリヌクレオチド、および配列番号：４の３’フランキング大豆ゲノムＤＮＡのいずれかの部分の同様の長さのＤＮＡ分子を含み、これらのＤＮＡ分子は、ＤＮＡ増幅方法におけるＤＮＡプライマーとして有用である。ＤＮＡ増幅方法におけるこれらのＤＮＡプライマーを用いて生成したアンプリコンは、そのアンプリコンが配列番号：２を含む場合に大豆事象ＭＯＮ８７７０５に特徴的である。配列番号：４および配列番号：５のいずれかの部分に相同的または相補的なＤＮＡプライマーにより生成されたいずれのアンプリコン、および配列番号：２を含むいずれのアンプリコンも、本発明の態様である。
【００１９】
本発明のもう一つの態様により、ＤＮＡ検出方法における使用のための２つのＤＮＡ分子が提供され、ここに、第１のＤＮＡ分子は、配列番号：５のＤＮＡ分子の導入遺伝子領域のいずれかの部分の少なくとも１１個以上の隣接するポリヌクレオチドまたはそれらの相補体を含み、一方のプライマーは、配列５’〜配列番号：１８に由来し、他方は、配列３’〜配列番号：１８に由来し、これらのＤＮＡ分子は、ＤＮＡ増幅方法におけるＤＮＡプライマーとして有用である。ＤＮＡ増幅方法におけるこれらのＤＮＡプライマーを用いて生成されたアンプリコンは、そのアンプリコンが配列番号：１８を含有する場合に大豆事象ＭＯＮ８７７０５に特徴的である。配列番号：５のいずれかの部分に相同的または相補的なＤＮＡプライマーにより生成されたいずれのアンプリコンおよび配列番号：１８を含むいずれのアンプリコンも本発明の態様である。
【００２０】
本発明のもう一つの態様により、試料中の大豆事象ＭＯＮ８７７０５に対応するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。かかる方法は：（ａ）ＤＮＡを含む試料と、大豆事象ＭＯＮ８７７０５からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応に用いた場合に大豆事象ＭＯＮ８７７０５に特徴的であるアンプリコンを生成するプライマーセットとを接触させ；（ｂ）核酸増幅反応を行ない、それによりアンプリコンを生成し；次いで、（ｃ）該アンプリコンが配列番号：１、２および１８下でリストされた１以上の配列を含むアンプリコンを検出することを含む。
【００２１】
本発明のもう一つの態様は、ＭＯＮ８７７０５の大豆植物もしくは種子、またはＭＯＮ８７７０５のその植物もしくは種子の事象を含む生成物であり、ここに、そのゲノムＤＮＡは、配列番号：３の約１〜３４５８位のヌクレオチド配列、配列番号：５の約１〜７２５１位のヌクレオチド配列および配列番号：４の約１〜２５１５位のヌクレオチド配列（そのコンティグは配列番号：６として表される）、およびその相補体より実質的になるＤＮＡ分子を含む。本発明のさらなる態様は、ＭＯＮ８７７０５の大豆植物もしくは種子、またはその植物もしくは種子に由来する生成物であり、ここに、そのゲノムＤＮＡは、配列番号：６の約１〜１３２２４位のヌクレオチド配列およびその相補体より実質的になるＤＮＡ分子を含む。ＭＯＮ８７７０５の大豆植物もしくは種子、またはその植物もしくは種子に由来する生成物は、その大豆植物もしくは種子または生成物から単離される場合に、配列番号：１、２または１８を組み込むＤＮＡおよびその相補体を含む。本発明の一の態様において、ＤＮＡ分子は、大豆事象ＭＯＮ８７７０５を含有する。もう一つの態様において、大豆事象ＭＯＮ８７７０５を含む、２コピーのＤＮＡ分子が、その大豆植物に存在する。もう一つの態様において、大豆事象ＭＯＮ８７７０５を含む１コピーのＤＮＡ分子が、その大豆植物に存在する。
【００２２】
本発明のもう一つの態様は、ＭＯＮ８７７０５の大豆植物もしくは種子、またはその植物もしくは種子の事象を含む生成物であり、ここに、その大豆植物もしくは種子または生成物から単離された場合のゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ増幅方法におけるアンプリコンを生成し、該アンプリコンは、配列番号：１、２および１８よりなる群からの少なくとも１つの配列を含む。
【００２３】
もう一つの態様において、大豆植物の種子は、容器に入れることもできる。本明細書に用いた容器は、かかる種子を保持できるいずれかの物である。容器は、約５００、１，０００、５，０００または２５，０００個を超える種子を含み、ここに、その種子の少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％または１００％は、本発明の植物に由来する。また、本発明は、約１０，０００個、より好ましくは２０，０００個、さらにより好ましくは４０，０００個を超える種子の容器を提供し、約１０％、より好ましくは約２５％、より好ましくは約５０％、さらにより好ましくは約７５％または９０％を超える種子は、本発明の植物に由来する種子である。また、本発明は、約１０ｋｇ、より好ましくは約２５ｋｇ、さらにより好ましくは約５０ｋｇを超える種子の容器を提供し、約１０％、より好ましくは約２５％、より好ましくは約５０％、さらにより好ましくは約７５％または９０％を超える種子は、本発明の植物に由来する種子である。
【００２４】
本発明のもう一つの態様は、生物学的試料中の大豆遺伝子組換え事象ＭＯＮ８７７０５の存在または不存在を検出する方法を提供し、この方法は、ａ）該試料からＤＮＡを抽出し；次いで、ｂ）配列番号：１、２または１８下に示されたものに対応する配列を有するポリヌクレオチドの存在または不存在をアッセイし、それにより、該試料中の大豆事象ＭＯＮ８７７０５の存在または不存在を確認できる。
【００２５】
本発明のもう一つの態様において、試料中のＭＯＮ８７７０５事象に対応するＤＮＡの存在を検出する方法は：（ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１および配列番号：２ならびにそれらの相補体よりなる群から選択される配列とハイブリダイズし、かつそのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１および配列番号：２を含まない大豆植物ＤＮＡとハイブリダイズしないプローブと、試料とを接触させ；（ｂ）試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に付し；次いで、（ｃ）該試料に対するプローブの結合を検出し；ここに、結合が該試料における該ＤＮＡの存在に特徴的であることを含む。本発明のもう一つの態様は、生物学的試料中の大豆事象ＭＯＮ８７７０５の存在の検出における使用のために長さが約１１〜約２０個の連続ヌクレオチドを含むプローブであり、ここに、該連続ヌクレオチドは、配列番号：１および配列番号：２ならびにそれらの相補体よりなる群から選択される。プローブは、デオキシリボ核酸、リボ核酸またはヌクレオチドアナログであり得る。プローブは、少なくとも１つのフルオロフォアで標識し得る。
【００２６】
本発明のもう一つの態様は、大豆事象ＭＯＮ８７７０５の後代の接合状態を決定する方法であり、この方法は、（ａ）プライマーセットＳＱ２１９２８（配列番号：１１）、ＳＱ２０９０１（配列番号：１２）、および大豆事象ＭＯＮ８７７０５からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応において用いた場合に、第１のアンプリコンを生成し、大豆事象ＭＯＮ８７７０５に特徴的である、プライマーＳＱ２１９２８およびＳＱ２０９０１、ならびに６ＦＡＭ（商標）標識プライマー／プローブＰＢ１０１６４の組合せからの蛍光シグナルを放出するプローブ６ＦＡＭ（商標）標識ＰＢ１０１６４（配列番号：１３）と、大豆ＤＮＡを含む試料とを接触させ、（ｂ）核酸増幅反応を行ない、それにより、第１のアンプリコンを生成し；次いで、（ｃ）該第１のアンプリコンを検出し；次いで、（ｄ）大豆ＤＮＡを含む試料と、プライマーセットのＳＱ２１９２８（配列番号：１１）およびＳＱ２１９０５（配列番号：１５）、ならびに大豆植物からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応に用いた場合に、第２のアンプリコンを生成し、大豆事象ＭＯＮ８７７０５と同定した導入遺伝子挿入の大豆ゲノム領域に相同的な野生型大豆ゲノムＤＮＡに特徴的である蛍光シグナルを放出するＶＩＣ（商標）標識ＰＢ１０３３５（配列番号：１４）とを接触させ；（ｅ）核酸増幅反応を行い、それにより、第２のアンプリコンを生成し；次いで、該第２のアンプリコンを検出し；次いで、（ｇ）試料中の第１および第２のアンプリコンを比較し、ここに、双方のアンプリコンの存在は、その試料が導入遺伝子挿入につきヘテロ接合性であることを示すことを含む。
【００２７】
本発明のもう一つの態様は、大豆事象ＭＯＮ８７７０５の後代の接合状態を決定する方法であり、この方法は、（ａ）大豆ＤＮＡを含む試料と、プライマーセットＳＱ２１９２８（配列番号：１１）、ＳＱ２０９０１（配列番号：１２）、および大豆事象ＭＯＮ８７７０５からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応に用いた場合に大豆事象ＭＯＮ８７７０５に特徴的であるプライマーＳＱ２１９２８およびＳＱ２０９０１の組合せから第１のアンプリコンを生成するＳＱ２１９０５（配列番号：１５）とを接触させ；（ｂ）核酸増幅反応を行ない、それにより、第１のアンプリコンを生成し；次いで、（ｃ）該第１のアンプリコンを検出し；次いで、（ｄ）大豆ＤＮＡを含む試料と、ＳＱ２１９２８およびＳＱ２１９０５、ならびに大豆植物からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応に用いた場合に、大豆事象ＭＯＮ８７７０５と同定された導入遺伝子挿入の大豆ゲノム領域に相同性の野生型大豆ゲノムＤＮＡに特徴的であるプライマーＳＱ２１９２８およびＳＱ２１９０５の組合せから第２のアンプリコンを生成するものとを接触させ；（ｅ）核酸増幅反応を行ない、それにより、第２のアンプリコンを生成し、次いで、（ｆ）該第２のアンプリコンを検出し；次いで、（ｇ）試料中の第１および第２のアンプリコンを比較し、ここに、双方のアンプリコンの存在は、その試料が導入遺伝子挿入にヘテロ接合性であることを示すことを含む。
【００２８】
また、本発明は、配列番号：１、２および１８よりなる群から選択されるＤＮＡ分子を有する組成物を提供し、ここに、該組成物は、大豆ミール、大豆粉末、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織状大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白加水分解物およびホイップトッピングよりなる群から選択される商品である。
【００２９】
本発明のもう一つの態様は、生物学的試料中の大豆事象ＭＯＮ８７７０５の存在に特徴的なヌクレオチド配列の存在を検出する方法であって、この方法は、ヌクレオチド配列の存在を検出することを含み、ここに、該配列は、配列番号：１、２および１８よりなる群から選択され、該生物学的試料は、大豆ミール、大豆粉末、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織状大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白加水分解物およびホイップトッピングよりなる群から選択される。
【００３０】
配列番号：１、２および１８下で示された１以上の配列の検出に基づいて設計されたヌクレオチド成分を含む、大豆試料中の大豆事象ＭＯＮ８７７０５の検出用キットが提供される。配列番号：３、４または５から設計されたプライマーを用いる、大豆事象ＭＯＮ８７７０５の検出用キットが提供される。該キットを用いて生成されたアンプリコンは、アンプリコンが配列番号：１、２および１８下でリストされた１以上のヌクレオチド配列を含む場合にＭＯＮ８７７０５に特徴的である。
【００３１】
本発明のもう一つの態様は、改変された脂肪酸レベルを含む大豆植物を生成する方法であり、この方法は、大豆事象ＭＯＮ８７７０５を含む植物と大豆事象ＭＯＮ８７７０５を欠く大豆植物とを交配させて、該大豆事象ＭＯＮ８７７０５および改変された脂肪酸レベルを含む植物を得ることを含み、ここに、該事象を含む種子の代表的試料は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９２４１下で寄託された。
【００３２】
また、大豆事象ＭＯＮ８７７０５を含む大豆変種を生成する方法が提供され、この方法は、該変種に大豆事象ＭＯＮ８７７６９を戻し交配し、ここに、該事象を含む種子の代表的試料は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９２４１下寄託された。
【００３３】
本発明のもう一つの態様は、約５５〜８０％のオレイン酸および８％未満の飽和脂肪酸を含む油組成物を有する種子を生成できる大豆植物であり、ここに、該油組成物用の遺伝的決定基は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９２４１を有する大豆から入手可能である。また、その大豆植物からの種子から得られた油組成物および、食用油、サラダ油、ショートニング、レシチン、無毒性プラスチック、印刷用インク、滑沢剤、ワックス、作動液、電気的変圧器流体、溶剤、化粧品、ヘアケア製品およびバイオディーゼルよりなる群から選択される油から由来した商品が提供される。
【００３４】
本発明の油は他の油と混合し得る。１つの態様において、本発明の植物から生成されたか、または本発明の方法によって生成された油は、いずれかの生成物の油成分の容積または重量で０．５％、１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％または９０％を超えて含まれる。もう一つの態様において、油調製物を混合でき、その混合物の１０容積％、２５容積％、３５容積％、５０容積％または７５容積％を超えて含むことができる。本発明の植物から生成された油は、１またはそれを超える有機溶媒または石油蒸留物と混合できる。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、配列番号：１、２および１８下でリストされた配列よりなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む大豆細胞のゲノムである。
【００３６】
本発明のもう一つの態様は、ＭＯＮ８７７０５の大豆植物もしくは種子、または種子後代、あるいはＭＯＮ８７７０５のその植物もしくは種子に由来する生成物である。植え付けまたは商品を調製するための販売用種子は、本発明の態様である。かかる商品は、限定されるものではないが、全体または加工された大豆種子、動物食料、植物油、ミール、粉末、無毒性プラスチック、印刷用インク、滑沢剤、ワックス、作動液、電気的変圧器流体、溶剤、化粧品、ヘアケア製品、豆乳、ソイナッツバター、納豆、テンペ、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織状大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白加水分解物、ホイップトッピング、料理油、サラダ油、ショートニング、レシチン、食用の全大豆（生、ローストまたは枝豆として）、豆乳、大豆ヨーグルト、大豆チーズ、豆腐、ゆばおよびバイオディーゼルを含む。
本発明の前記の態様および他の態様は、以下の詳細な記載からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】大豆植物ＭＯＮ８７７０５を生成するために用いた、バイナリー形質転換ベクターｐＭＯＮ９５８２９の地図。
【図２】大豆事象ＭＯＮ８７７０５のゲノム中の遺伝子組換え挿入物の構造化；［Ａ］は、配列番号：３と配列番号：５との間の結合部を形成する配列番号：１の相対的位置に対応する；［Ｂ］は、配列番号：４と配列番号：５との間の結合部を形成する配列番号：２の相対的位置に対応する；［Ｃ］は、配列番号：３の相対的位置に対応し、その大豆ゲノム配列は、事象ＭＯＮ８７７０５におけるゲノムへ組み込まれた発現カセットの任意に割当／指定された５’終端に隣接する；［Ｄ］は、配列番号：４の相対的位置に対応し、その大豆ゲノム配列は、事象ＭＯＮ８７７０５におけるゲノムへ組み込まれた発現カセットの任意に割当／指定された３’終端に隣接する；［Ｅ］は、配列番号：５を含む種々の要素を表し、事象ＭＯＮ８７７０５のゲノムに挿入された発現カセットの配列である；また、［Ｆ］は、左から右に図中で表わされるように、配列番号：３、配列番号、５および配列番号：４を含む隣接する配列を表し、ここに、配列番号：１および配列番号：２は、前記のごとく組み込まれ、これらの配列は、事象ＭＯＮ８７７０５におけるゲノムに存在する。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
（配列の簡単な記載）
配列番号：１−  大豆ゲノムＤＮＡと組込みＴ−ＤＮＡとの間の５’左境界結合部を表す２０個のヌクレオチド配列。この配列は、配列番号：６の第３４１３〜３４３２位に対応する。加えて、配列番号：１（図２の［Ａ］）は、配列番号：３の第３４３２〜３４２２位に対応するヌクレオチド配列であり（［Ｃ］、図２参照）、配列番号：５の第１〜１０位に対応する組込みＴ−ＤＮＡの５’左境界である（［Ｅ］、図２参照）。
【００３９】
配列番号：２−  組込みＴ−ＤＮＡと大豆ゲノムＤＮＡとの間の３’左境界結合部を表す２０個のヌクレオチド配列。この配列は、配列番号：６の第１０６６４〜１０６８３位に対応する。加えて、配列番号：２（［Ｂ］、図２参照）は、配列番号：５の第７２４２〜７２５１位に対応するヌクレオチド配列であり（［Ｅ］、図２参照）、配列番号：４の第１〜１０位に対応する３’フランキング配列である（［Ｄ］、図２参照）。
【００４０】
配列番号：３−  Ｔ−ＤＮＡ挿入までのＭＯＮ８７７０５の挿入ＤＮＡに隣接する５’配列。
配列番号：４−  Ｔ−ＤＮＡ挿入までのＭＯＮ８７７０５の挿入ＤＮＡに隣接する３’配列。
配列番号：５−  組込み後の残りの境界配列を含めた、挿入Ｔ−ＤＮＡの配列。
【００４１】
配列番号：６−  ＭＯＮ８７７０５の挿入ＤＮＡに隣接する５’配列（配列番号：３）、組込み発現カセットの配列（配列番号：５）、およびＭＯＮ８７７０５の挿入ＤＮＡに隣接する３’配列（配列番号：４）のコンティグを表わす１３１８８ｂｐのヌクレオチド配列。
【００４２】
配列番号：７−  ｐＭＯＮ９５８２９  Ｔ−ＤＮＡの共同組込みからＭＯＮ８７７０５中で組み立てた、ａｒｏＡ−ＣＰ４発現カセットおよびＦＡＤ２−１Ａ／ＦＡＴＢ抑制カセットを表わす６５８３ｂｐのヌクレオチド配列。
【００４３】
配列番号：８−  ＭＯＮ８７７０５事象を同定するために用いたプライマーＳＱ２０１２９。プライマーＳＱ２０１２９は、配列番号：６の第１０６４５〜１０６６３位に対応する３’左境界に近接する挿入Ｔ−ＤＮＡの３’における領域に対応する。
プライマーＳＱ２０１２９およびＳＱ２０１３０の組合せを用いて生成されたＰＣＲ  アンプリコンは、事象ＭＯＮ８７７０５の存在に陽性である。
【００４４】
配列番号：９−  ＭＯＮ８７７０５を同定するために用いたプライマーＳＱ２０１３０。プライマーＳＱ２０１３０は、配列番号：６の第１０６８８〜１０７０７位に対応するＴ−ＤＮＡ挿入境界の領域３’に相補的である。プライマーＳＱ２０１２９およびＳＱ２０１３０の組合せを用いて生成されたＰＣＲアンプリコンは、事象ＭＯＮ８７７０５の存在に陽性である。
【００４５】
配列番号：１０−  ＭＯＮ８７７０５の事象を同定するために用いたプローブＰＢ１００４３。このプローブは、その配列が配列番号：６の第１０６６６〜１０６８６位に対応する、６ＦＡＭ（商標）標識された合成オリゴヌクレオチドである。６ＦＡＭ（商標）標識されたプローブＰＢ１００４３と組み合わせたプライマーＳＱ２０１２９およびＳＱ２０１３０を用いる増幅反応における蛍光シグナルの放出は、事象ＭＯＮ８７７０５に特徴的である。
【００４６】
配列番号：１１−  ＭＯＮ８７７０５の事象を同定するために用いたプライマーＳＱ２１９２８。プライマーＳＱ２１９２８は、配列番号：６の第１０６７５〜１０６９９位に対応するＴ−ＤＮＡ挿入境界の領域３’に相補的である。プライマーＳＱ２０９０１およびＳＱ２１９２８の組合せを用いて生成されたＰＣＲアンプリコンは、事象ＭＯＮ８７７０５の存在に陽性である。また、プライマーＳＱ２１９２８は、ＭＯＮ８７７０５事象の接合状態を決定するために用いる。６ＦＡＭ（商標）標識されたプローブＰＢ１０３３５ならびにプライマーＳＱ２１９２８およびＳＱ２１９０５を用いるＰＣＲアンプリコンの検出および蛍光シグナルの放出は、接合状態アッセイにおける野性型の存在に陽性である。１８塩基対のその配列は、配列番号：６の第１０５３〜１０７０位に対応し、残りの７塩基対は、ＭＯＮ８７７０５事象の生成において喪失した配列番号：１７に示された野性型配列の４０塩基対の領域における７塩基対に対応する。
【００４７】
配列番号：１２−  ＭＯＮ８７７０５事象を同定するために用いたプライマーＳＱ２０９０１。プライマーＳＱ２０９０１は、配列番号：６の第１０６２４〜１０６４７位に対応する３’左境界に近接する挿入Ｔ−ＤＮＡの３’における領域に対応する。プライマーＳＱ２１９２８およびＳＱ２０９０１の組合せから生成されたＰＣＲアンプリコンは、事象ＭＯＮ８７７０５の存在に陽性である。
【００４８】
配列番号：１３−  ＭＯＮ８７７０５事象を同定するために用いたプローブＰＢ１０１６４。このプローブは、その配列が配列番号：６の第１０６５１〜１０６７０位に対応する６ＦＡＭ（商標）標識された合成オリゴヌクレオチドである。６ＦＡＭ（商標）標識されたプローブＰＢ１０１６４と組み合わせたプライマーＳＱ２１９２８およびＳＱ２０９０１を用いる増幅反応における蛍光シグナルの放出は、事象ＭＯＮ８７７０５に特徴的である。
【００４９】
配列番号：１４−  ＭＯＮ８７７０５事象の接合状態を決定するために用いたプローブＰＢ１０３３５。このプローブは、その配列が野生型ゲノムＤＮＡの領域に対応するＶＩＣ（商標）標識された合成オリゴヌクレオチドである。プライマーＳＱ２１９２８およびＳＱ２１９０５を用いて生成されたＰＣＲアンプリコンは、事象ＭＯＮ８７７０５についての接合状態アッセイにおける野生型対立遺伝子の存在に陽性であるプローブＰＢ１０３３５を用いる蛍光シグナルの放出を生じる。この配列は、事象ＭＯＮ８７７０５事象の生成において喪失した配列番号：１７としてリストされた４０塩基対の野性型配列の第１２〜３１位に対応する。
【００５０】
配列番号：１５−  ＭＯＮ８７７０５事象の接合状態を決定するために用いたプライマーＳＱ２１９０５。６ＦＡＭ（商標）標識されたプローブＰＢ１０３３５ならびにプライマーＳＱ２１９２８およびＳＱ２１９０５を用いるＰＣＲアンプリコンの検出は、接合状態アッセイにおける野性型の存在に陽性である。１６塩基対の配列は配列番号：６の第１０３７〜１０５２位に対応するが、このプライマーは、ＭＯＮ８７７０５事象の生成において喪失した配列番号：１６としてリストされた４０塩基対領域の野生型配列に１０塩基対を継続する。
【００５１】
配列番号：１６−  タンデム反復配列（配列番号：１７）および５’ゲノム配列の結合部にて喪失した４０塩基対の配列。この配列は野性型で見出され、配列番号：６における塩基対１０５２および１０５３間に位置し、ＭＯＮ８７７０５事象の生成中に喪失しなかったであろう。また、ＭＯＮ８７７０５事象の生成にゲノム配列の重複により、末端の１２塩基の配列は、配列番号：６の第１０６７０〜１０６８１位に位置するが、残りの２８塩基対は、ＭＯＮ８７７０５事象に完全に不存在であり、従って、接合状態についてのアッセイ中に野性型を同定するために利用し得る。
【００５２】
配列番号：１７−  この２３７０ｂｐの配列は、ＭＯＮ８７７０５事象の生成に際して重複させたようである野性型ゲノム配列の一部分である。この領域の重複は、第１０５３〜３４２２位に対応し、配列番号：６の第１０６８２〜１３０５１位にほとんど同一である。この領域のＤｕｐｌｉｃａｔｅ Ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｅｒ（商標）ベースのクローンは、３’終端および大豆ゲノム配列に比較した場合、挿入物の５’終端に位置した繰り返しにおける２つのミスマッチを共有した。その重複（配列番号：１６）の５’終端に見出された欠失と共に、５’反復における２つの改変された塩基は、さらに、第１０５３〜３４２２位に対応するタンデム配列が新しく生成された配列であり、一方、第１０６８２〜１３０５１位に対応する配列が元来の野性型配列であることに導く。
【００５３】
配列番号：１８−  この１０６ｂｐの配列は、事象ＭＯＮ８７７０５を与える２つのｐＭＯＮ９５８２９ Ｔ−ＤＮＡの共同組込みに際して生成された右境界から右境界結合部にわたる。それは、逆方向反復配列の各アームからのものである２０塩基の抑制標的ＦＡＴＢで始まって終了し、ＭＯＮ８７７０５事象で見出された配列の組込みにおいて生成された残りの境界配列および挿入配列を含む。この配列は、配列番号：６の第９２３０〜９３３５位に対応する。この配列は、２つのＴ−ＤＮＡのｉｎ ｖｉｖｏアセンブリーのランダムな性質により、抑制カセット内に位置するが、その配列の組合せはＭＯＮ８７７０５事象に特有である。
【００５４】
配列番号：１９−  そのＧｅｎｏｍｅｗａｌｋｅｒ（商標）誘導の５’隣接伸長の増幅用のＡＰ２と組み合わせた第２（入れ子）ＰＣＲに用いたプライマー２４８９４。この配列は、配列番号：６の第３７２２〜３７４８位に対応する。
【００５５】
配列番号：２０−  そのＧｅｎｏｍｅｗａｌｋｅｒ（商標）誘導の５’隣接伸長の増幅のためにＡＰ１と組み合わせた一次ＰＣＲに用いるプライマー２４８９５。この配列は、配列番号：６の第３７９８〜３８２７位に対応する。
【００５６】
（詳細な記載）
以下の定義および方法は、本発明をより良好に定義し、本発明の実施において当業者を導くために提供される。特記しない限りは、用語は、関連技術分野における当業者による通常の使用に従い理解されるものである。また、分子生物学における通常の用語の定義は、Ｒｉｅｇｅｒら，  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，  ５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１；  およびＬｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９４に見出すことができる。
【００５７】
本明細書に用いた「大豆」なる用語は、ダイズ（Ｇｌｙｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）を意味し、野生大豆種ならびに、種間の育種を可能とするツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｏｊａ）に属するそれらの植物を含めて大豆で育種できる全植物変種を含む。
【００５８】
「グリホサート」とは、Ｎ−ホスホノメチルグリシンおよびその塩をいう。Ｎ−ホスホノメチルグリシンは、広範囲の植物種に対して活性を有するよく知られた除草剤である。
【００５９】
「不飽和化酵素」は、モノもしくはポリ不飽和脂肪酸、またはその前駆体を生成する１以上の脂肪酸の連続する炭素間の二重結合の形成を不飽和化または触媒できるポリペプチドをいう。特に注目されるのは、オレイン酸のリノール酸へのまたはリノール酸のα−リノレン酸への転換を触媒できるポリペプチドであり、それは第１２または１５位にて不飽和化する酵素を含む。不飽和化酵素活性を有する特定のポリペプチドの選定についての考慮は、限定されるものではないが、ポリペプチドのｐＨ至適、ポリペプチドが速度制限の酵素またはその成分であるか、用いる不飽和化酵素が所望のＰＵＦＡの合成に必須か、および／または共同因子がポリペプチドによって必要とされるかを含む。その発現されたポリペプチドは、むしろ宿主細胞中のその位置の生化学的環境と適合する特性を有する。例えば、ポリペプチドは基質につき競合しなければならないかもしれない。また、内因性不飽和化酵素は、遺伝子抑制の標的であり得る。
【００６０】
「チオエステラーゼ」は、特にチオール基にて（水の存在下でエステル結合を酸およびアルコールに分割する）分子のチオエステル結合を加水分解できるポリペプチドをいう。特に注目されるのは、アシル-アシル担体蛋白（アシル−ＡＣＰ）、特に、ステアロイル−ＡＣＰおよびパルミトイル−ＡＣＰ基質に含まれたチオエステル結合の加水分解を触媒できるポリペプチドである。かかる加水分解は、遊離脂肪酸およびＡＣＰを生成し、それにより、色素体に位置する植物の脂肪酸生合成を終了させ、細胞質への搬出のための脂肪酸を準備する。チオエステラーゼ活性を有する特定のポリペプチドの選定についての考慮は、限定されるものではないが、ポリペプチドのｐＨ至適、ポリペプチドが速度制限の酵素またはその成分であるか、用いるチオエステラーゼが、飽和脂肪酸の生成の増加に必須であるかを含む。発現されたポリペプチドは、好ましくは、宿主細胞におけるその位置の生化学的環境と適合する特性を有する。例えば、ポリペプチドは、基質につき競合しなければならないかもしれない。また、内因性チオエステラーゼは、遺伝子抑制の標的であり得る。
【００６１】
「商品」とは、大豆またはダイズ油に由来した材料を含み、消費者に販売されるいずれかの生成物をいう。加工された大豆は、世界中でタンパク質食料および植物油の最大の源である。大豆植物ＭＯＮ８７７０５を用いて、大豆から典型的に獲得した商品を製造できる。ＭＯＮ８７７０５の大豆は、ミール、粉末、または油に加工でき、ならびに動物食料中のタンパク質または油源として陸生および水生動物の双方に用いることができる。ＭＯＮ８７７０５からの大豆およびダイズ油は、多数の異なる生成物、限定されるものではないが、無毒性プラスチック、印刷用インク、滑沢剤、ワックス、作動液、電気的変圧器流体、溶剤、化粧品およびヘアケア製品の製造に用いることができる。ＭＯＮ８７７０５の大豆および油は、豆乳、ソイナッツバター、納豆およびテンペのごとき全大豆から調製された種々の大豆食品、ならびに大豆ミール、大豆粉末、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織状大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白加水分解物、ホイップトッピング、料理油、サラダ油、ショートニング、およびレシチンを含めた加工大豆およびダイズ油から調製された種々の大豆食品に用いるのに適当であることができる。また、全大豆は食用であり、消費者に生、ローストまたは枝豆として典型的に販売される。浸漬および粉砕することにより典型的に製造される豆乳を、他の加工、スプレー乾燥なくして消費し得るか、または大豆ヨーグルト、大豆チーズ、豆腐またはゆばを形成するように加工し得る。
【００６２】
ＭＯＮ８７７０５の油を用いて、バイオディーゼルを調製できる。従来のディーゼルエンジンにおけるバイオディーゼルの使用の結果、石油ディーゼル燃料に比較して、硫酸塩、一酸化炭素および微粒子のごとき汚染物質の実質的な低下を生じ、スクールバスにおける使用は、有毒ディーゼル排気に対する曝露を大幅に低減できる。バイオディーゼルは、大豆油を抽出、濾過および精製して、遊離脂肪およびリン脂質を除去し、次いで、メタノールで油をエステル転移反応させて、脂肪酸のメチルエステルを形成することにより典型的には得られる（例えば、米国特許第５，８９１，２０３号を参照）。得られた大豆メチルエステルを一般的に「バイオディーゼル」という。ＭＯＮ８７７０５に由来する油を、例えば、アセタールと油を混合することにより、メチルエステルの形成なくして、ディーゼル燃料として用いることもできる（米国特許第６，０１３，１１４号参照）。該油を調製するために用いたＭＯＮ８７７０５の種子は、本発明の方法により同定できる。ＭＯＮ８７７０５事象の種子あるいはそのいくらかまたはすべてがＭＯＮ８７７０５である種子の混合物からの精製された油が、相対的に、テストに利用可能なＤＮＡを有しないであろうことが予期される。しかしながら、油が抽出された種子は、該油を調製するのに用いた種子の集合内でＭＯＮ８７７０５事象の存在を同定する本発明の方法で特徴付けることができる。また、該油を調製するために用いたプロセスからの植物廃棄物は、本発明の方法を用いて、該油を調製するために加工された種子の混合物内でＭＯＮ８７７０５の存在を同定することができる。同様に、商品の調製後に残されたか、または大豆種子の収穫後に残された植物残渣は、該商品を調製するのに用いた原料内でＭＯＮ８７７０５事象を同定する本発明の方法により特徴付けることができる。
【００６３】
また、本発明は、ＭＯＮ８７７０５の混合されたまたは混合されていないダイズ油を含む。かかる油は、他の油と混合し得る。好ましい具体例において、本発明の植物から生成されたか、または本発明の方法によって生成された油は、いずれかの生成物の油成分の容積または重量で０．５％、１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％または９０％を超えて含まれる。もう一つの具体例において、油調製物は混合でき、容積で混合物の１０％、２５％、３５％、５０％または７５％を超えて含むことができる。本発明の植物から生成された油は、１以上の有機溶媒または石油蒸留物と混合できる。
【００６４】
遺伝子組換え「事象」は、異種のＤＮＡ、すなわち、注目する導入遺伝子を含む核酸構築体での植物細胞の形質転換、植物のゲノム中への導入遺伝子の挿入に起因する植物の集団の再生、および特定のゲノム位置への挿入により特徴付けられた特定の植物の選択によって生成される。「事象」なる用語は、異種のＤＮＡを含む元来の形質転換体および形質転換体の後代をいう。また、「事象」なる用語は、形質転換体およびもう一つの変種間の性的外交配によって生成された後代をいい、ここに、その後代は異種のＤＮＡを含む。反復親への戻し交配の反復後にさえ、元来の形質転換からの挿入ＤＮＡおよびフランキングＤＮＡは、同一染色体の位置での交配の後代に存在し得る。また、「事象」なる用語は、挿入ＤＮＡ（例えば、自家受粉に起因する元来の形質転換体および後代）を含む１つの親系、および挿入ＤＮＡを含まない親系の性的交配の結果として、注目される導入遺伝子を含む挿入ＤＮＡを受け取る子孫に形質転換されることが期待されるであろう、その挿入ＤＮＡおよび挿入ＤＮＡに直ちに隣接しているフランキングゲノム配列を含む元来の形質転換体からのＤＮＡをいう。本発明は、ＭＯＮ８７７０５に由来した事象ＭＯＮ８７７０５ ＤＮＡ、植物細胞、組織、種子および加工生成物に関する。
【００６５】
また、２種の異なる遺伝子組換え植物、または遺伝子組換え植物および野生型植物を交配して、２つの独立して分離して追加された外来性遺伝子を含む子孫を生成できると理解されるべきである。その子孫はその遺伝子にホモ接合性またはヘテロ接合性であることができる。適当な後代の自家受粉は、双方の追加された外来性遺伝子にホモ接合性である植物を生成できる。また、親植物への戻し交配および非遺伝子組換え植物との外交配は、栄養繁殖であるので考えられる。異なる形質および作物に一般的に用いられる他の育種方法の記載は、いくつかの参考文献のうちの１つ、例えば、Ｆｅｈｒ，  ｉｎ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｗｉｌｃｏｘ  Ｊ．  ｅｄ．，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ  （１９８７）  に見出すことができる。
【００６６】
本明細書に用いた「単離されたＤＮＡ分子」を参照する場合に、そのＤＮＡ分子は、単独または他の組成物と組み合わせて存在するものであるが、その自然環境内にないものであることを意図する。例えば、大豆ゲノムのＤＮＡ内で天然に見出されるコード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモーター配列、転写終結配列等は、それらが大豆ゲノム内にある限りは、大豆ゲノムから単離されると考えられない。しかしながら、これらの各成分およびこれらの成分のサブ部分は、構造および成分が大豆ゲノム内にない限りは、この開示の範囲内で「単離された」であろう。この開示の目的で、いずれかの遺伝子組換えヌクレオチド配列、すなわち、大豆植物事象ＭＯＮ８７７０５の細胞のゲノムに挿入されたＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＭＯＮ８７７０５事象が生起する大豆細胞を形質転換するのに用いるプラスミド内にそれが存在するか、事象ＭＯＮ８７７０５のゲノム内で、事象ＭＯＮ８７７０５に由来した組織、後代、生物学的試料または商品に検出可能な量で存在するかに拘らず単離されたヌクレオチド配列であると考えられる。ヌクレオチド配列またはそれに由来するいずれの断片も、そのＤＮＡ分子が細胞もしくは組織、または植物または種子または植物器官からのホモジネートから抽出できるか、または細胞もしくは組織、または植物または種子または植物器官からのホモジネートから抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡからのアンプリコンとして生成できるならば、単離されるか、または単離可能であると考えられ、そのいずれもが、事象ＭＯＮ８７７０５に由来したかかる物質に由来する。その点において、配列番号：１、２および１８に記載の結合配列、ならびにこれらの結合配列をさらに含む事象ＭＯＮ８７７０５に由来したヌクレオチド配列は、これらの配列が、事象ＭＯＮ８７７０５の細胞のゲノム内に存在するか、事象ＭＯＮ８７７０５に由来する組織、後代、生物学的試料または商品に検出可能な量において存在するかに拘らず、単離されるかまたは単離可能であると考えられる。
【００６７】
また、本発明のＤＮＡ分子は、組換え体ＤＮＡ分子であり得る。本明細書に用いた組換え体なる用語は、いずれかの剤（例えば、ＤＮＡ、ペプチド等）、すなわち、または如何に間接的であろうとも、核酸分子のヒトの操作からの結果を意味する。
【００６８】
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはリポーター分子、例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤または酵素が付着した単離された核酸である。かかるプローブは、標的核酸の鎖、本発明の場合には大豆事象ＭＯＮ８７７０５からのＤＮＡを含む大豆植物または試料からであろうとも、その事象からのゲノムＤＮＡの鎖に相補的である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけではなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するポリアミドおよび他のプローブを含み、かかる結合を用いて、その標的ＤＮＡ配列の存在を検出できる。
【００６９】
「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニーリングされて、プライマーおよび標的ＤＮＡ鎖間のハイブリッドを形成し、次いで、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される単離された核酸である。本発明のプライマー対とは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の通常の核酸増幅方法によって標的核酸配列の増幅のためのそれらの使用をいう。
【００７０】
プローブおよびプライマーは、一般的には、長さが１１個以上のヌクレオチド、好ましくは１５個以上のヌクレオチド、より好ましくは１８個以上のヌクレオチド、より好ましくは２０個以上のヌクレオチド、より好ましくは２４個以上のヌクレオチド、および最も好ましくは、３０個以上のヌクレオチドである。かかるプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンジー・ハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本発明によるプローブおよびプライマーは、標的配列との完全な配列類似性を有するが、その標的配列とは異なり、標的配列にハイブリダイズする能力を保持するプローブを通常の方法により設計し得る。
【００７１】
プローブおよびプライマーを調製および使用する方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  ｖｏｌ．  １−３，  Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９  （以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  １９８９」）；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｕｓｕｂｅｌら編，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９２  （定期更新）  （以下、  「Ａｕｓｕｂｅｌら，  １９９２」）；  およびＩｎｎｉｓら，  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：    Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  １９９０に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  （Ｖｅｒｓｉｏｎ  ０．５，  ｃ  １９９１，  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）のごときその目的を意図されたコンピュータープログラムを用いることにより公知の配列から誘導できる。
【００７２】
本明細書に開示されたフランキングＤＮＡおよび挿入配列に基づいたプライマーおよびプローブを用いて、通常の方法、例えば、かかる配列を再クローニングおよび配列決定することにより開示されたハイブリダイズを確認（および必要ならば、修正）することができる。
【００７３】
本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする。いずれの通常の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法も用いて、試料中の遺伝子組換え事象からのＤＮＡの存在を同定できる。核酸分子またはその断片は、ある種の状況下で他の核酸分子に特異的にハイブリダイズできる。本明細書に用いた２つの核酸分子は、その２つの分子が逆平行二本鎖の核酸構造を形成できるならば、相互に特異的にハイブリダイズできると言われる。核酸分子は、それらが完全な相補性を示すならば、もう一つの核酸分子の「相補体」であると言われる。本明細書に用いた分子は、その分子の１つのすべてのヌクレオチドが他方のヌクレオチドに相補的である場合に「完全な相補性」を示すと言われる。２つの分子は、それらが少なくとも通常の「低ストリンジェンシー」条件下でそれらが相互にアニーリングされたままとすることを可能とするのに十分な安定性を持って相互にハイブリダイズできるならば、「最小に相補的である」と言われる。同様に、それらの分子は、それらが通常の「高ストリンジェンシー」条件下でそれらが相互にアニーリングされたままとすることを可能とするのに十分な安定性を持って相互にハイブリダイズできるならば、「相補的」であると言われる。通常のストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  １９８９，  および  Ｈａｙｍｅｓら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ  （１９８５）により記載されている。従って、完全な相補性からの逸脱は、かかる逸脱が二本鎖構造を形成する分子の能力を完全に除外しない限りは、許される。核酸分子がプライマーまたはプローブとして機能するために、使用した特定の溶媒および塩の濃度下で二本鎖構造を形成できる配列において十分に相補性であることだけが必要である。
【００７４】
本明細書に用いた、実質的に相同性の配列は、高ストリンジェンシー条件下でそれが比較されるべき核酸配列の相補体に特異的にハイブリダイズするであろう核酸配列である。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃の６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）に続けて、５０℃の２．０×ＳＳＣの洗浄は、当業者に知られているか、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９），  ６．３．１−６．３．６に見出すことができる。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃の約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃の約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまでから選択できる。加えて、洗浄工程における温度は、室温、約２２℃の低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件に増加できる。温度および塩の双方は変更でき、または温度もしくは塩濃度のいずれかを一定に保持し、他方の変数を変化させ得る。ある具体例において、本発明の核酸は、適度にストリンジェントな条件下、例えば、約２．０×ＳＳＣおよび６５℃で、配列番号：１および２に記載された１以上の核酸分子またはその相補体あるいはいずれかの断片に特異的にハイブリダイズするであろう。特に好ましい具体例において、本発明の核酸は、高ストリンジェンシー条件下、配列番号：１および２に記載された１以上の核酸分子またはその相補体あるいはいずれかの断片に特異的にハイブリダイズするであろう。本発明の１つの態様において、本発明のマーカー核酸分子は、配列番号：１および２に記載された１以上の核酸分子またはその相補体あるいはいずれかの断片を有する。本発明のもう一つの態様において、本発明のマーカー核酸分子は、配列番号：１および２に記載された１以上の核酸分子またはその相補体あるいはいずれかの断片と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列同一性を共有する。本発明のもう一つの態様において、本発明のマーカー核酸分子は、配列番号：１および２に記載された１以上の核酸分子またはその相補体あるいはいずれかの断片と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列同一性を共有する。配列番号：１および２は、単純な配列反復ＤＮＡマーカー解析につきＤＮＡ  ｍａｒｋｅｒｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ａｎｄ  ｏｖｅｒｖｉｅｗｓ：  （１９９７）  １７３−１８５，  Ｃｒｅｇａｎら編，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  ＮＹ（その全てをここに出典明示して本明細書の一部とみなす）に記載された方法に同様の遺伝的交雑の子孫を同定するための植物育種方法におけるマーカーとして用い得る。標的ＤＮＡ分子へのプローブのハイブリダイゼーションは、当業者に知られた多数の方法によって検出でき、これらは、限定されるものではないが、蛍光性タグ、放射性タグ、抗体ベースのタグおよび化学発光タグを含むことができる。
【００７５】
特定の増幅プライマー対を用いる標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる）について、「ストリンジェントな条件」は、プライマー対が標的核酸配列にだけにハイブリダイズすることを可能にする条件であり、ここに、この標的核酸配列に、対応する野生型配列（またはその相補体）を有するプライマーが、ＤＮＡ熱増幅反応において、好ましくは、ユニークな増幅生成物のアンプリコンを生成するために結合するであろう。
【００７６】
「（標的配列）に特異的」なる用語は、プローブまたはプライマーが、標的配列を含む試料中の標的配列にだけ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション下でハイブリダイズすることを示す。
【００７７】
本明細書に用いた「増幅されたＤＮＡまたはアンプリコン」とは、核酸テンプレートの一部である標的核酸配列の核酸増幅の生成物をいう。例えば、性的交配に起因する大豆植物が本発明の大豆植物からの遺伝子組換え事象ゲノムＤＮＡを含むかどうかを決定するために、大豆植物組織試料から抽出されたＤＮＡは、挿入された異種のＤＮＡの挿入部位に隣接する植物のゲノム中のフランキング配列に由来したプライマー、およびその事象ＤＮＡの存在に特徴的であるアンプリコンを生成するための挿入された異種のＤＮＡに由来した第２のプライマーを含むプライマー対を用いる核酸増幅方法に付すことができる。アンプリコンは、ある長さであり、その事象に特徴的でもある配列を有する。アンプリコンは、プライマー対＋１つのヌクレオチド塩基対、好ましくは＋約５０個のヌクレオチド塩基対、より好ましくは＋約２５０個のヌクレオチド塩基対、さらにより好ましくは＋４５０個のヌクレオチド塩基対の組み合わせた長さからの長さの範囲にあり得る。あるいは、プライマー対は、全挿入物ヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成するように挿入されたＤＮＡの両側にてフランキング配列に由来することができる。植物ゲノム配列に由来したプライマー対のメンバーは、挿入されたＤＮＡ分子からある距離にて位置でき、この距離は、１個のヌクレオチド塩基対から約２０，０００個のヌクレオチド塩基対までの範囲にあることができる。「アンプリコン」なる用語の使用は、ＤＮＡの熱増幅反応において形成し得るプライマー二量体を特に除外する。
【００７８】
核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含めた、当該技術分野において知られた種々の核酸増幅方法のいずれによっても達成できる。種々の増幅方法は、当該技術分野において知られており、特に、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号ならびにＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｅｄ．  Ｉｎｎｉｓら，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  １９９０に記載されている。ＰＣＲ増幅方法は、２２ｋｂまでのゲノムＤＮＡおよび４２ｋｂまでのバクテリオファージＤＮＡを増幅するために開発された（Ｃｈｅｎｇら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：５６９５−５６９９，  １９９４）。ＤＮＡ増幅の技術分野において知られたこれらの方法ならびに他の方法は、本発明の実施において用い得る。ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９２４１として寄託された種子試料を含む大豆事象ＭＯＮ８７７０５からの異種のＤＮＡ挿入物の配列またはフランキング配列は、本明細書に提供された配列に由来するプライマーを用いてその事象からかかる配列を増幅するのに続いて、そのＰＣＲアンプリコンまたはそのクローニングされたＤＮＡの標準的なＤＮＡ配列決定により確認できる。
【００７９】
これらの方法によって生成されたアンプリコンは、複数の技術によって検出し得る。かかる１つの方法は、隣接するフランキングゲノムＤＮＡ配列および挿入されたＤＮＡ配列の双方をオーバーラップさせるＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計されているＧｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  （Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，ら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２２：４１６７−４１７５，  １９９４）である。そのオリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェルに固定化する。（挿入された配列における１つのプライマーおよび隣接したフランキングゲノム配列における１つのプライマーを用いた）注目する領域のＰＣＲ後に、一本鎖ＰＣＲ生成物を固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼおよび期待された次の塩基に特異的な標識されたｄｄＮＴＰを用いて、単一塩基伸長反応のためのテンプレートとして機能できる。読み取りは、蛍光性またはＥＬＩＳＡべースであり得る。シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一塩基伸長の成功により挿入物／フランキング配列の存在を示す。
【００８０】
もう一つの方法は、Ｗｉｎｇｅ  （Ｉｎｎｏｖ．  Ｐｈａｒｍａ．  Ｔｅｃｈ．  ００：１８−２４，  ２０００）によって記載されたピロシーケンス（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技術である。この方法において、隣接するゲノムＤＮＡおよび挿入物ＤＮＡ結合部をオーバーラップさせるオリゴヌクレオチドが設計される。そのオリゴヌクレオチドは、注目する領域からの一本鎖のＰＣＲ生成物にハイブリダイズされ（挿入された配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列の１つのプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホスルファートおよびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。ｄＮＴＰは個々に加えられ、その組み込みの結果、光シグナルが測定される。光シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一または多重の塩基伸長の成功により導入遺伝子挿入物／フランキング配列の存在を示す。
【００８１】
Ｃｈｅｎら，  （Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ９：４９２−４９８，  １９９９）によって記載された蛍光偏光法は、本発明のアンプリコンを検出するために用いることができる方法である。この方法を用いて、ゲノムのフランキングおよび挿入されたＤＮＡ結合部をオーバーラップさせるオリゴヌクレオチドは設計される。このオリゴヌクレオチドは注目する領域からの一本鎖のＰＣＲ生成物にハイブリダイズされ（挿入ＤＮＡにおける１つのプライマーおよびフランキングゲノムＤＮＡ配列における１つのプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。単一塩基伸長の結果、ｄｄＮＴＰの組み込みを生じる。組み込みは、蛍光測定器を用いて偏光の変化として測定できる。偏光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一塩基伸長の成功による導入遺伝子挿入物／フランキング配列の存在を示す。
【００８２】
ＴａｑＭａｎ（商標登録）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）は、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量する方法として記載され、製造者により提供された指示において十分に理解されている。略言すると、ゲノムフランキングおよび挿入物ＤＮＡ結合部をオーバーラップさせるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入物ＤＮＡ配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列における１つのプライマー）が熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環する。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、蛍光性部分がＦＲＥＴプローブ上の消光部分から離れて切断および遊離する。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によりフランキング／導入遺伝子挿入物配列の存在を示す。
【００８３】
分子標識（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ）は、Ｔｙａｎｇｉら  （Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３０８，  １９９６）に記載された配列検出に用いるために記載されている。略言すると、フランキングゲノムおよび挿入物ＤＮＡ結合部をオーバーラップさせるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブのユニークな構造の結果、それは蛍光性および消光部分を隣接に保つ二次構造を含む。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入物ＤＮＡ配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列における１つのプライマー）が、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環する。ＰＣＲ増幅の成功に続いて、標的配列へのＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、蛍光シグナルの生成を生じる蛍光性および消光部分のプローブ二次構造および空間的分離を除去する。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功により、フランキング／導入遺伝子挿入物配列の存在を示す。
【００８４】
マイクロフルイディクス（米国特許公開第２００６０６８３９８号、米国特許第６，５４４，７３４号）のごとき他の記載された方法は、ＤＮＡ試料を分離および増幅する方法および装置を提供する。光学色素を特異的なＤＮＡ分子を検出および定量するために用いる（ＷＯ／０５０１７１８１）。特定のＤＮＡ分子を結合し、次いで、検出できるＤＮＡ分子またはナノビーズの検出のための電子センサーを含むナノチューブ装置（ＷＯ／０６０２４０２３）。
【００８５】
ＤＮＡ検出キットは、本明細書に開示された組成物、およびＤＮＡ検出の当該技術分野においてよく知られた方法を用いて構築できる。キットは、試料中の大豆事象ＭＯＮ８７７０５ ＤＮＡの同定に有用であり、適切な事象ＤＮＡを含む大豆植物を育種する方法に適用できる。キットは、配列番号：１〜配列番号：５に相同性または相補的であるＤＮＡプライマーまたはプローブ、あるいはＤＮＡのその導入遺伝子遺伝子要素に含まれたＤＮＡに相同的または相補的なＤＮＡプライマーまたはプローブを含み得る。これらのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ増幅反応において、またはＤＮＡハイブリダイゼーション法におけるプローブとして用いることができる。ＭＯＮ８７７０５大豆ゲノムに含まれたゲノムＤＮＡおよび導入遺伝子遺伝子要素の配列は、図２に示され；Ｔ−ＤＮＡに含まれた導入遺伝子遺伝子要素は以下のように構築される：第１のＴ-ＤＮＡは、オクトピン左境界配列で始まり、続いて、ゴマノハグサ・モザイク・ウィルス（ＦＭＶ）からの３５Ｓエンハンサー、およびシロイヌナズナＴｓｆ１遺伝子からのプロモーター、イントロンおよびリーダー配列を含む第１の人工遺伝子、これは最適化されたａｒｏＡ−ＣＰ４に融合したＳｈｋＧ輸送ペプチドの上流にあり、これは、エンドウマメからのＲｂｃＳ２（Ｅ９）遺伝子の３’ＵＴＲの上流にあり、続いて、ベータ−コングリシニン遺伝子のダイズ７Ｓアルファプライムサブユニットからのプロモーターおよびリーダー配列を含む第２のカセット、これはダイズＦＡＤ２およびＦＡＴＢ遺伝子に相同性の配列を含む逆方向反復配列のセンス半分の上流にあり、該センスはノパリン右境界配列の上流にある。第２のＴ-ＤＮＡは、ノパリン右境界配列で始まり、これはダイズＦＡＤ２およびＦＡＴＢ遺伝子に相同性の配列を含む逆方向反復配列のアンチセンス半分の上流にあり、該アンチセンスはＧｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ（海島綿）Ｈ６遺伝子の３’ＵＴＲの上流にあり、該ＵＴＲはオクトピン左境界配列の上流にある。これらの配列に由来するプライマー分子は、配列番号：３および配列番号：４に示す事象ＭＯＮ８７７０５の導入遺伝子挿入物にフランキングするゲノムに由来するＤＮＡプライマー分子をさらに含むプライマーセットの一部として用いることができる。
【００８６】
本発明は、配列番号：１、２および１８よりなる群から選択される配列であるか、または該配列に相補的である配列を有するポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子を含む大豆植物を含む。もう一つの態様において、本発明は、大豆植物器官を含み、ここに、その植物器官は、配列番号：１、２および１８よりなる群から選択される配列であるか、または該配列に相補的である配列を有するポリヌクレオチドを含む。もう一つの態様において、本発明は、大豆植物の後代を含み、その後代は、配列番号：１、２および１８よりなる群から選択される配列であるか、または該配列に相補的である配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００８７】
また、本発明は、約５５〜８０％のオレイン酸および８％未満の飽和脂肪酸を含む油組成物を有する種子を生成できる大豆植物を含み、ここに、該油組成物についての遺伝的決定基は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９２４１を有する大豆から入手可能である。もう一つの態様において、本発明は、大豆事象ＭＯＮ８７７０５を含む植物と大豆事象ＭＯＮ８７７０５を欠く大豆植物とを交配させて、該大豆事象ＭＯＮ８７７０５および改変された脂肪酸レベルを含む植物を得ることを含み、ここに、該事象を含む種子の代表的試料はＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９２４１下で寄託された。また、さらなる態様において、本発明は、大豆事象ＭＯＮ８７７６９を大豆変種に戻し交配することを含む大豆事象ＭＯＮ８７７０５を含む大豆変種を生成する方法を含み、ここに、該事象を含む種子の代表的試料は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９２４１下で寄託された。
【００８８】
また、本発明は、配列番号：１、２および１８よりなる群から選択される配列であるか、または該配列に相補的である配列を有するポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子を含む種子から得られた油組成物を含む。もう一つの態様において、本発明は、食用油、サラダ油、ショートニング、レシチン、無毒性プラスチック、印刷用インク、滑沢剤、ワックス、作動液、電気的変圧器流体、溶剤、化粧品、ヘアケア製品およびバイオディーゼルよりなる群から選択される油組成物に由来する商品を含む。
【００８９】
また、本発明は、配列番号：１、２および１８よりなる群から選択される配列であるか、または該配列に相補的である配列を有するポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子を含む。もう一つの態様において、本発明は、配列番号：１および配列番号：２よりなる群から選択される少なくとも約１１個〜約２０個の連続ヌクレオチドを含む、単離されたＤＮＡ分子を含む。
【００９０】
また、本発明は、配列番号：１、２および１８下にリストされた配列よりなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む大豆細胞のゲノムを含む。
【００９１】
もう一つの態様において、本発明は、生物学的試料中の大豆事象ＭＯＮ８７７０５ ＤＮＡの存在を検出する方法であって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１および配列番号：２ならびにそれらの相補体よりなる群から選択される配列とハイブリダイズし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１および配列番号：２ならびにそれらの相補体よりなる群から選択される配列を含まない大豆植物ゲノムＤＮＡとハイブリダイズしないプローブと、その試料とを接触させ；その試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に付し；次いで、その試料に対するプローブの結合を検出し；ここに、結合は、試料中の該ＤＮＡの存在に特徴的であることを含む該方法を含む。
【００９２】
もう一つの態様において、本発明は、生物学的試料中の大豆事象ＭＯＮ８７７０５の存在に特徴的なヌクレオチド配列の存在を検出する方法であって、配列番号：１、２および１８よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の存在を検出することを含み、ここに、該生物学的試料は、大豆ミール、大豆粉末、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織状大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白加水分解物およびホイップトッピングよりなる群から選択されることを含む該方法を含む。
【００９３】
また、本発明は、配列番号：１、２および１８下で示された１以上の配列の検出に基づいて設計したヌクレオチド成分を含む大豆試料中の遺伝子組換え事象ＭＯＮ８７７０５の存在または不存在の検出用キットを含む。また、もう一つの態様において、本発明は、配列番号：１、２および１８よりなる群から選択されるＤＮＡ分子を有する組成物を含み、ここに、該組成物は、大豆ミール、大豆粉末、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織状大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白加水分解物およびホイップトッピングよりなる群から選択される商品である。
【００９４】
以下の実施例は、本発明のある種の好ましい具体例の例を示すために含める。以下の実施例において開示された技術が、本発明者が本発明の実施に良好な機能を見出したアプローチを表し、かくして、その実施についての好ましい様式の例を含むと考えることができることは、当業者により理解されるであろう。しかしながら、本開示に徴して、当業者ならば、多数の変更を開示された特定の具体例になすことができ、依然として、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似する結果を得ることができることを理解するであろう。
【実施例】
【００９５】
実施例１：ｐＭＯＮ９５８２９での大豆Ａ３５２５の形質転換および事象選択
遺伝子組換え大豆植物ＭＯＮ８７７０５をｐＭＯＮ９５８２９（図１）に由来するＤＮＡ断片での大豆細胞のアグロバクテリウム媒介形質転換により生成した。バイナリー植物形質転換ベクターｐＭＯＮ９５８２９は２つの植物形質転換Ｔ−ＤＮＡを含む。各Ｔ−ＤＮＡは、Ｔ−ＤＮＡの末端にて、右境界（ＲＢ）および左境界（ＬＢ）配列によって隣接してはさまれる。ＭＯＮ８７７０５の形質転換後スクリーニングは、２つのカセット挿入を生成する２つのＴ−ＤＮＡの右境界ないし右境界共同組込みを同定し、一方のＴ−ＤＮＡは、グリホサート耐性を与えるアグロバクテリウムチュメファシエンスからのａｒｏＡ−ＣＰ４遺伝子を発現するように設計され、他方は、内因性のＦＡＤ２およびＦＡＴＢ遺伝子（配列番号：７）のＲＮＡｉベースの抑制を引き起こすような逆方向反復配列で設計されている。逆方向反復配列構造はｐＭＯＮ９５８２９で見出されていないが、２つのＴ−ＤＮＡのＲＢないしＲＢの共同組込みで形成される。この組込み配置は、発現および抑制カセットの双方を含む単一の遺伝子組換えの遺伝子座を生じ、残余の左境界配列（図２）によって隣接してはさまれる。ＲＢ：ＲＢ組込み部位にて生成されたユニークな配列は、配列番号：１８下でリストされる。
【００９６】
Ｔ−ＤＮＡは以下のように構築される：第１のＴ−ＤＮＡはオクトピンＬＢ配列で始まり、続いて、ゴマノハグサ・モザイク・ウィルス（ＦＭＶ）からの３５Ｓエンハンサー、シロイヌナズナＴｓｆ１遺伝子からのプロモーター、イントロンおよびリーダー配列を含む第１の人工遺伝子、これは、最適化されたａｒｏＡ−ＣＰ４に融合したＳｈｋＧ輸送ペプチドの上流にあり、これは、エンドウマメからのＲｂｃＳ２（Ｅ９）遺伝子の３’ＵＴＲの上流にあり、続いて、ベータ−コングリシニン遺伝子のダイズ７Ｓアルファプライムサブユニットからのプロモーターおよびリーダー配列を含む第２のカセット、これはダイズＦＡＤ２およびＦＡＴＢ遺伝子に相同性の配列を含む逆方向反復配列のセンス半分の上流にあり、該センスはノパリンＲＢ配列の上流にある。第２のＴ−ＤＮＡは、ノパリンＲＢ配列から始まり、これは、ダイズＦＡＤ２およびＦＡＴＢ遺伝子に相同性の配列を含む逆方向反復配列のアンチセンス半分の上流にあり、これは、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ（海島綿）Ｈ６遺伝子の３’ＵＴＲの上流にあり、該ＵＴＲはオクトピンＬＢ配列の上流にある。
【００９７】
ｐＭＯＮ９５８２９で形質転換された外植片は、アグロバクテリウムチュメファシエンス媒介形質転換を介して得た。植物は形質転換された組織から再生された。約９５５個のＲ０形質転換の事象を生成し、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）によって２つのＴ−ＤＮＡの存在につきテストした。加えて、ＲＢ：ＲＢ配置を同定するように設計したＰＣＲを用いて、適切に組み立てられた候補事象を選択した。Ｔ−ＤＮＡの適切な共同組込みを示すＲ０事象を自家受粉して、Ｒ１種子を生成した。Ｒ１種子の脂肪酸組成は、ＦＡＭＥ−ＧＣ分析によって決定した。これらの分析に基づいて、４８個の事象をＲ２生成に進めた。複数コピーの事象の分離および発現型の特徴付けは、Ｒ３生成により候補事象プールを１１の事象まで狭くする。
【００９８】
所望ではないベクター配列のコピー数、カセットの無傷さ、遺伝子座および不存在を確認するように設計した詳細なサザン分析を行った。また、引き続いての世代において、圃場性能特性ならびに、残りの事象についての挿入部位のフランキング配列を決定した。一つの後代系で命名された事象ＭＯＮ８７７０５を、その全体的な脂肪酸組成プロフィール（表１）、農学的な効率および分子特性に基づいて選択した。
【００９９】
【表１】
2015144602.tif 000003
【０１００】
実施例２：逆ＰＣＲを用いるフランキング配列の単離
ＭＯＮ８７７０５におけるＴ−ＤＮＡ挿入のフランキング配列を、Ｏｃｈｍａｎら，  １９９０  （ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）  に記載された逆ＰＣＲを用いて、およびＴＡＩＬ  （Ｔｈｅｒｍａｌ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ＩｎｔｅｒＬａｃｅｄ）ＰＣＲにより決定した。植物ゲノムＤＮＡを野生型Ａ３５２５および温室条件下で生育された組織からの遺伝子組換え系の双方から単離した。凍結した葉組織を液体窒素または機械的粉砕で乳鉢および乳棒によって粉砕した。２２ｍｌの容積の抽出緩衝剤を約１ｇの粉砕した葉組織に添加し、６５℃にて１時間インキュベートした。ＣＴＡＢ抽出緩衝剤は、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、２％  ＣＴＡＢ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１００ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０よりなった。使用の直前に、０．０２％ベータ−メルカプトエタノールおよび０．５ｍｇのＲＮアーゼＡを抽出緩衝剤に添加した。試料を１２ｍＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液で抽出し、次いで、４℃にて１０分間、４０００×Ｇで遠心した。上清を新しいチューブに移し、ＤＮＡを１５ｍＬのイソプロパノールで沈殿させた。４０００×Ｇにて１０分間の遠心分離後に、ペレットを５ｍＬの７０％エタノールで洗浄した。４０００×Ｇでの５分間の最終遠心を行い；ペレットを空気乾燥させ、次いで、３００μＬの水に再懸濁させた。
【０１０１】
ＤＮＡのアリコートをＴＡＩＬ  ＰＣＲに付し、挿入部位に隣接する配列の領域を単離し配列決定した。加えて、ＤＮＡのアリコートをＴ−ＤＮＡの制限分析に基づいて選択した制限エンドヌクレアーゼで消化した。制限酵素断片の自己連結後、Ｔ−ＤＮＡの５’および３’終端から離れて伸びる配列を増幅するＴ−ＤＮＡ配列から設計されたプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ生成物はアガロースゲル電気泳動によって分離し、ＱＩＡＧＥＮゲル精製キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）を用いて精製した。引き続いての生成物を標準的な配列決定プロトコールを用いて直接的に配列決定した。
【０１０２】
Ｔ−ＤＮＡの５’終端から離れて伸びる最初のフランキング配列の伸長をＧｅｎｏｍｅｗａｌｋｅｒ（商標）キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）を用いて行った。標準的なプロトコール条件を用い、配列番号：１９および配列番号：２０と示されるプライマーを、供給したＡＰ１およびＡＰ２プライマーと共にネステッドＰＣＲに用いた。反応を繰り返して試行し、生成物を標準的な配列決定プロトコールを用いてクローニングし、直接的に配列決定した。配列を繰り返して試行した先のゲノム配列および３’フランキング配列に比較して、ＰＣＲ由来の誤差からの実際の多形性を決定した。明らかにＭＯＮ８７７０５事象の生成で生じた染色体重複が存在する。この領域の重複（配列番号：１７）は配列番号：６の第１０５３〜３４２２位に対応し、配列番号：６の第１０６８２〜１３０５１位にほとんど同一である。発明者らは、その挿入物の５’終端に位置する繰り返しとその挿入物の３’終端からの繰り返しとの間に２つの多形性が存在することを決定し、挿入物のその３’終端は、元来のゲノム配列に対応した。
【０１０３】
これらの方法を用いて、挿入の同定された５’フランキング配列を配列番号：３として示し（図２を参照）、３’フランキング配列を配列番号：４として示した（図２を参照）。Ａ３５２５ゲノムＤＮＡに完全に組み込まれたｐＭＯＮ９５８２９からの挿入されたカセット部分（配列番号：７）を配列番号：５として示す（図２を参照）。
【０１０４】
単離された配列をＴ−ＤＮＡ配列に比較して、フランキング配列および共同単離されたＴ−ＤＮＡ断片を同定した。発現カセットの存在の確認は、推定されたフランキング配列データおよび公知のＴ−ＤＮＡ配列に基づいて設計したプライマーでのＰＣＲにより達成した。Ｔ−ＤＮＡが形質転換された系に組み込まれた同一領域に対応するＡ３５２５野性型配列を、ＭＯＮ８７７０５におけるフランキング配列から設計したプライマーを用いて単離した。ＭＯＮ８７７０５中のフランキング配列およびＡ３５２５野性型配列を複数のヌクレオチドおよびタンパク質データベースに対して解析した。この情報を用いて、植物ゲノムに対する導入遺伝子の関係を検討し、挿入部位整合性を調べた。フランキング配列および野性型配列を用いて、その事象を同定するために用いたＴａｑＭａｎエンドポイントアッセイ用プライマーを設計し、実施例３に記載した接合状態を決定した。
【０１０５】
実施例３：事象特異的なエンドポイントＴａｑＭａｎおよび接合状態アッセイ
試料中の事象ＭＯＮ８７７０５を同定するために用いた方法は、事象特異的なエンドポイントＴａｑＭａｎ  ＰＣＲアッセイであり、それについての条件の例を表２および表３に記載する。エンドポイントアッセイに用い得る第１のセットのＤＮＡプライマーは、プライマーＳＱ２０１２９（配列番号：８）、ＳＱ２０１３０（配列番号：９）および６ＦＡＭ（商標）標識プライマーＰＢ１００４３（配列番号：１０）である。エンドポイントアッセイに用い得る第２のセットのＤＮＡプライマーは、プライマーＳＱ２１９２８（配列番号：１１）、ＳＱ２０９０１（配列番号：１２）および６ＦＡＭ（商標）標識プライマーＰＢ１０１６４（配列番号：１３）である。６ＦＡＭ（商標）は、そのＤＮＡプライマーに結合したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）の蛍光色素生成物である。ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢ（Ｍｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ）プローブについて、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性は、フルオロフォアと消光剤との間で５’−終端からプローブを切断する。標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズした場合、消光剤およびフルオロフォアが、蛍光シグナルを生成するのに十分に分離する。
【０１０６】
ＰＢ１００４３（配列番号：１０）と共に記載されたごとく用いた場合のＳＱ２０１２９（配列番号：８）およびＳＱ２０１３０（配列番号：９）は、事象ＭＯＮ８７７０５  ＤＮＡに特徴的であるＤＮＡアンプリコンを生成する。ＰＢ１０１６４（配列番号：１３）と共に記載されたごとく用いた場合のＳＱ２１９２８（配列番号：１１）およびＳＱ２０９０１（配列番号：１２）は、事象ＭＯＮ８７７０５  ＤＮＡにも特徴的であるＤＮＡアンプリコンを生成する。これらの分析のための対照は、事象ＭＯＮ８７７０５  ＤＮＡを含むことが知られた大豆からの陽性対照、非遺伝子組換え大豆からの陰性対照、およびテンプレートＤＮＡを含まない陰性対照を含むであろう。同様のアッセイは配列番号：１８につき設計できる。
【０１０７】
これらのアッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ，  ＭＪ  Ｅｎｇｉｎｅ，  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９７００またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  サーモサイクラーで用いるために最適化する。事象ＭＯＮ８７７０５  ＤＮＡを同定するアンプリコンを生成する他の方法および装置は、当業者に公知であり得る。
【０１０８】
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ、ＭＪ  Ｅｎｇｉｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９７００、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００またはＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２２５  サーマルサイクラーにおけるＤＮＡ増幅を以下の循環パラメーターを用いて行う。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  またはＭＪ  ＥｎｇｉｎｅにおいてそのＰＣＲを試行する場合、このサーモサイクラーは計算されたモードで試行されるべきである。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９７００においてそのＰＣＲを試行する場合、このサーモサイクラーは最大に設定されたランプ速度で試行される。
【０１０９】
【表２】
2015144602.tif 000004
【０１１０】
【表３】
2015144602.tif 000005
【０１１１】
試料中の事象ＭＯＮ８７７０５についての接合状態の決定を事象特異的な接合状態エンドポイントＴａｑＭａｎ  ＰＣＲアッセイを用いて行い、これについての条件の例は、表４および表５に記載する。接合状態アッセイに用いたＤＮＡプライマーは、プライマーＳＱ２０９０１（配列番号：１２）、ＳＱ２１９２８（配列番号：１１）、ＳＱ２１９０５（配列番号：１５）、６ＦＡＭ（商標）標識プライマーＰＢ１０１６４（配列番号：１３）およびＶＩＣ（商標）標識プライマーＰＢ１０３３５（配列番号：１４）である。６ＦＡＭ（商標）およびＶＩＣ（商標）は、そのＤＮＡプライマーに結合したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）の蛍光色素生成物である。
【０１１２】
ＰＢ１０１６４（配列番号：１３）と共にこれらの反応方法に用いる場合のＳＱ２０９０１（配列番号：１２）およびＳＱ２１９２８（配列番号：１１）は、事象ＭＯＮ８７７０５ ＤＮＡに特徴的なＤＮＡアンプリコンを生成する。この分析についての対照は、事象ＭＯＮ８７７０５ ＤＮＡを含む大豆からの陽性対照、非遺伝子組換え大豆からの陰性対照、およびテンプレートＤＮＡを含んでいない陰性対照を含むべきである。ＰＢ１０３３５（配列番号：１４）と共にこれらの反応方法に用いる場合のＳＱ２１９２８（配列番号：１１）およびＳＱ２１９０５（配列番号：１５）は、野性型対立遺伝子に特徴的であり、その全体において配列番号：１６を含むＤＮＡアンプリコンを生成する。ヘテロ接合性は、プローブＰＢ１０１６４およびＰＢ１０３３５の双方からの蛍光シグナルの放出によって示された双方のアンプリコンの存在によって決定する。
【０１１３】
これらのアッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ、ＭＪ  Ｅｎｇｉｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９７００またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  サーモサイクラーでの使用に最適化される。事象ＭＯＮ８７７０５  ＤＮＡを同定するアンプリコンを生成する当業者に知られた他の方法および装置は、当該技術分野の技術内にある。
【０１１４】
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ、ＭＪ  Ｅｎｇｉｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９７００、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００またはＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２２５  サーマルサイクラーにおけるＤＮＡ増幅は、以下の循環パラメーターを用いて行う。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ＧｒａｄｉｅｎｔまたはＭＪ  ＥｎｇｉｎｅにおいてＰＣＲを試行する場合、そのサーモサイクラーは計算されたモードにおいて試行されるべきである。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９７００においてＰＣＲを試行する場合、そのサーモサイクラーは、最大に設定されたランプ速度で試行する。
【０１１５】
【表４】
2015144602.tif 000006
【０１１６】
【表５】
2015144602.tif 000007
【０１１７】
実施例４：所与の大豆試料中の事象ＭＯＮ８７７０５の同定
以下の実施例は、所与の大豆試料中のＭＯＮ８７７０５事象の存在または不存在を同定し得る方法を記載する。
ＤＮＡ事象プライマー対を用いて、大豆事象ＭＯＮ８７７０５に特徴的なアンプリコンを生成する。ＭＯＮ８７７０５に特徴的なアンプリコンは、少なくとも１つの結合配列：配列番号：１、配列番号：２または配列番号：１８を含む。配列番号：１（図２）は、５’フランキング配列（配列番号：６の第３４１３〜３４２２位、図２参照）および挿入の組込み境界（配列番号：６の第３４２３〜３４３３位、図２参照）の結合部に対応するヌクレオチド配列である。配列番号：２（図２を参照）は、挿入の組込み境界（配列番号：６の第１０６６４〜１０６７３位、図２参照）および３’フランキング配列（配列番号：６の第１０６７４〜１０６８３位、図２参照）の結合部に対応するヌクレオチド配列である。配列番号：１８は、事象ＭＯＮ８７７０５を得るために２つのｐＭＯＮ９５８２９ Ｔ−ＤＮＡの共組込みに際して生成された右境界から右境界結合部（配列番号：６の第９２３０〜９３３５位）に対応するヌクレオチド配列である。
【０１１８】
ＭＯＮ８７７０５に特徴的なアンプリコンを生成する事象プライマー対は、フランキング配列および挿入されたカセットに基づいたプライマー対を含む。配列番号：１の少なくとも１１のヌクレオチドが見出される特徴的なアンプリコンを得るために、配列番号：３の塩基１〜３４４８に基づいた順方向プライマーおよび配列番号：５の第１０〜７２５１位に基づいた逆方向プライマーを設計するであろう。配列番号：２の少なくとも１１のヌクレオチドが見出される特徴的なアンプリコンを得るために、挿入されたカセット配列番号：５の第１〜７２４１位に基づいた順方向プライマー、および３’フランキング配列の配列番号：４の塩基１０〜２５１５に基づいた逆方向プライマーを設計する。実際の目的のために、制限されたサイズ範囲、好ましくは、２００〜１０００塩基のアンプリコンを生成するプライマーを設計するであろう。より小さなサイズのアンプリコンは、一般的に、ＰＣＲ反応においてより確実に生成され、より短いサイクル時間を可能とし、容易に分離でき、アガロースゲル上で視覚化でき、またはエンドポイントＴａｑＭａｎ様アッセイにおける使用に適応できる。加えて、該プライマー対を用いて生成されたアンプリコンは、ベクターにクローニングでき、増殖、単離および配列決定できるか、または当該技術分野において良好に確立された方法で直接的に配列決定できる。ＭＯＮ８７７０５またはその後代に特徴的なアンプリコンを生成するためのＤＮＡ増幅方法に有用である、配列番号：３および配列番号：５または配列番号：４および配列番号：５の組合せから誘導されたいずれのプライマー対も、本発明の態様である。ＭＯＮ８７７０５またはその後代に特徴的なアンプリコンを生成するためのＤＮＡ増幅方法に有用である、配列番号：３の少なくとも１１個の隣接するヌクレオチドを含むいずれの単一の単離されたＤＮＡポリヌプライマー分子も、本発明の態様である。ＭＯＮ８７７０５またはその後代に特徴的なアンプリコンを生成するためのＤＮＡ増幅方法に有用である、配列番号：４の少なくとも１１個の隣接するヌクレオチドを含むいずれの単一の単離されたＤＮＡポリヌプライマー分子も、本発明の態様である。ＭＯＮ８７７０５またはその後代に特徴的なアンプリコンを生成するためのＤＮＡ増幅方法に有用である、配列番号：５の少なくとも１１個の隣接するヌクレオチドを含むいずれの単一の単離されたＤＮＡポリヌプライマー分子も、本発明の態様である。
【０１１９】
この分析のための増幅条件の一例を表６および表７に例示する。しかしながら、これらの方法および、配列番号：３または配列番号：４に相同的または相補的なＤＮＡプライマーまたはＭＯＮ８７７０５に特徴的なアンプリコンを生成するＭＯＮ８７７０５の導入遺伝子挿入物（配列番号：５）に含まれた遺伝子要素のＤＮＡ配列の使用のいずれの変更も、当該技術分野内にある。特徴的なアンプリコンは、配列番号：１、２および１８下でリストされた少なくとも１つの導入遺伝子／ゲノム結合部ＤＮＡ、またはその実質的な部分に相同的または相補的なＤＮＡ分子を含む。
【０１２０】
事象ＭＯＮ８７７０５植物組織試料についての分析は、事象ＭＯＮ８７７０５からの陽性組織対照、事象ＭＯＮ８７７０５ではない大豆植物からの陰性対照、例えば、限定されるものではないが、Ａ３５２５、および大豆ゲノムＤＮＡを含まない陰性対照を含むであろう。内因性の大豆ＤＮＡ分子を増幅するプライマー対は、ＤＮＡ増幅条件についての内部対照として機能するであろう。さらなるプライマー配列は、ＤＮＡ増幅方法の技術分野における当業者により、配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５から選択でき、表６および表７に示した方法によるアンプリコンの生成につき選択された条件は異なることもでき、結果的に、事象ＭＯＮ８７７０５ ＤＮＡに特徴的なアンプリコンを生じ得る。表６および表７の方法に対する変更を含むこれらのＤＮＡプライマー配列の使用は、本発明の範囲内にある。ＭＯＮ８７７０５に特徴的である配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５に由来する少なくとも１つのＤＮＡプライマー配列によって生成されたアンプリコンは、本発明の態様である。
【０１２１】
ＤＮＡ増幅方法において用いた場合、ＭＯＮ８７７０５またはその後代に特徴的なアンプリコンを生成する、配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５に由来する少なくとも１つのＤＮＡプライマーを含むＤＮＡ検出キットは、本発明の態様である。大豆植物または種子（そのゲノムは、ＤＮＡ増幅方法においてテストされた場合にＭＯＮ８７７０５に特徴的なアンプリコンを生成する）は、本発明の態様である。ＭＯＮ８７７０５アンプリコンについてのアッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ、ＭＪ  Ｅｎｇｉｎｅ、  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９７００またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  サーモサイクラー、あるいは表７に示したＭＯＮ８７７０５に特徴的なアンプリコンを生成するために用いることができるいずれかの他の増幅システムを用いて行うことができる。
【０１２２】
【表６】
2015144602.tif 000008
【０１２３】
【表７】
2015144602.tif 000009
【０１２４】
前記に開示され、特許請求の範囲に引用された大豆事象ＭＯＮ８７７０５の種子の寄託は、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ．  ２０１１０）でのブダペスト条約下でなした。ＡＴＣＣ受入番号はＰＴＡ−９２４１である。この寄託は、３０年、または最後の請求後５年の期間の寄託、あるいは特許の有効期間のいずれか長い期間維持され、その期間に必要ならば交換されるであろう。
【０１２５】
本発明の原理を例示または記載してきたが、当業者には、かかる原理から逸脱することなく本発明の構成や詳細を変更できることは明らかであろう。発明者らは、添付した特許請求の範囲内にある精神および範囲にあるすべての変更を特許請求する。
【図１】
2015144602.tif 000010
【図２】
2015144602.tif 000011
【配列表】
2015144602000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月22日(2015.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中の大豆事象ＭＯＮ８７７０５ＤＮＡの存在を検出する方法であって、
ｉ．ＤＮＡを含む生物学的試料を得ること；
ｉｉ．配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１８、およびそれらの相補体からなる群から選択される配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１８およびそれらの相補体からなる群から選択される配列を含まない大豆植物ゲノムＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない核酸配列を有する第一のプライマー、および配列番号：５の少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを含む第二のプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施してアンプリコンを生成すること；および
ｉｉｉ．該ＰＣＲで生成した該アンプリコンを検出すること、
を含み、
該アンプリコンの検出が、該生物学的試料中の該大豆事象ＭＯＮ８７７０５の存在に特徴的である、方法。
【請求項２】
該アンプリコンが、配列番号：１、ならびに配列番号：３および配列番号：５またはそれらの相補体の少なくとも１１個の連続ヌクレオチド、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該アンプリコンが、配列番号：２、ならびに配列番号：５および配列番号：４またはそれらの相補体の少なくとも１１個の連続ヌクレオチド、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該アンプリコンが、配列番号：１８、および配列番号：５の少なくとも１１個の連続ヌクレオチド、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該検出が、蛍光または蛍光消光による、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該生物学的試料が、大豆ミール、大豆粉末、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織状大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白加水分解物およびホイップトッピングからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該第二のプライマーが、配列番号：６の少なくとも１１個の連続ヌクレオチド、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
配列番号：１３、１４、および１５からなる群から選択される蛍光プライマーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
配列番号：１、配列番号：２、および配列番号：１８からなる群から選択される２つ以上の配列からなるＤＮＡ分子、および
大豆ミール、大豆粉末、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織状大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白加水分解物、ホイップトッピング、全大豆種子、加工大豆種子、動物食料、豆乳、ソイナッツバター、納豆、テンペ、食用の全大豆、ローストした全大豆、枝豆、大豆ヨーグルト、大豆チーズ、豆腐、ゆば、およびバイオマスからなる群から選択される材料、
を含む、組成物。
【請求項１０】
事象ＭＯＮ８７７０５を含む大豆植物の種子であって、該植物が配列番号：１、２、および１８またはそれらに相補的な配列を有するポリヌクレオチドを含む異種ＤＮＡを含み、該配列番号：１および２は、該異種ＤＮＡが該大豆植物のゲノムに挿入された点にわたる結合配列である、種子。
【請求項１１】
該種子が配列番号：６またはその相補体と実質的に相同である配列を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の種子。
【請求項１２】
該種子が配列番号：６またはそれに相補的な配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の種子。
【請求項１３】
請求項１０に記載の大豆から得られる商品であって、該商品が、大豆ミール、大豆粉末、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織状大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白加水分解物、ホイップトッピング、全大豆種子、加工大豆種子、動物食料、豆乳、ソイナッツバター、納豆、テンペ、食用の全大豆、ローストした全大豆、枝豆、大豆ヨーグルト、大豆チーズ、豆腐、ゆば、食用油、サラダ油、ショートニング、レシチン、無毒性プラスチック、印刷用インク、滑沢剤、ワックス、作動液、電気的変圧器流体、溶剤、化粧品、ヘアケア製品およびバイオディーゼルからなる群から選択される、商品。
【外国語明細書】
2015144602.tif 000012
2015144602.tif 000013
2015144602.tif 000014
2015144602.tif 000015
2015144602.tif 000016
2015144602.tif 000017
2015144602.tif 000018
2015144602.tif 000019
2015144602.tif 000020
2015144602.tif 000021
2015144602.tif 000022
2015144602.tif 000023
2015144602.tif 000024
2015144602.tif 000025
2015144602.tif 000026
2015144602.tif 000027
2015144602.tif 000028
2015144602.tif 000029
2015144602.tif 000030
2015144602.tif 000031
2015144602.tif 000032
2015144602.tif 000033
2015144602.tif 000034
2015144602.tif 000035
2015144602.tif 000036
2015144602.tif 000037
2015144602.tif 000038
2015144602.tif 000039
2015144602.tif 000040
2015144602.tif 000041
2015144602.tif 000042
2015144602.tif 000043
2015144602.tif 000044
2015144602.tif 000045
2015144602.tif 000046
2015144602.tif 000047
2015144602.tif 000048
2015144602.tif 000049
2015144602.tif 000050
2015144602.tif 000051
2015144602.tif 000052
2015144602.tif 000053
【配列表】
2015144602000002.app