(57)【要約】【課題】  簡易な方法により純度の高いウイルス様粒子を得る手段を提供する。【解決手段】  ウイルスの核酸配列を含むバキュロウイルスベクターによって昆虫細胞を形質転換し、その昆虫細胞を培養することにより、ウイルス様粒子を含む培養物を製造する方法であって、前記昆虫細胞の生存率が10％以下になるまで培養を継続した後、培養物を得ることを特徴とするウイルス様粒子を含む培養物の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスの核酸配列を含むバキュロウイルスベクターによって昆虫細胞を形質転換し、その昆虫細胞を培養することにより、ウイルス様粒子を含む培養物を製造する方法であって、前記昆虫細胞の生存率が10％以下になるまで培養を継続した後、培養物を得ることを特徴とするウイルス様粒子を含む培養物の製造方法。
【請求項２】
昆虫細胞の培養期間が、5日以上であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
ウイルスが、カリシウイルス科に属するウイルスであることを特徴とする請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
ウイルスが、ノロウイルスであることを特徴とする請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項５】
ウイルスの核酸配列が、ノロウイルスの構造タンパク質VP1をコードする核酸配列であることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系を利用してウイルス様粒子を含む培養物を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ノロウイルスは、ヒトに対して嘔吐、下痢などの急性胃腸炎を引き起こすウイルスであり、カキなどの摂食による食中毒の原因になるほか、ヒトの糞便や吐瀉物などを介して経口的に感染する。
【０００３】
ノロウイルスゲノムの構造タンパク質領域をバキュロウイルスベクターに組み込み、昆虫細胞で発現させると、ウイルス様粒子（VLP）と呼ばれるウイルス粒子と類似した粒子が形成されることが知られている。VLPはウイルス粒子と外観上類似しているが内部にはウイルスゲノムを持たず、感染性を示さない。
【０００４】
最近、このVLPを抗原としたノロウイルスワクチンが開発され、特許出願も行われている（特表2010-505766号公報、特表2011-530295号公報）。このようなノロウイルスワクチンの製造には、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系を利用し、VLPを効率的に生産できることが重要である。
【０００５】
従来、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系を利用してタンパク質を生産する場合、培養開始から3日目ぐらいに細胞を回収し、破砕、抽出を行い、細胞抽出液からタンパク質を精製していた。例えば、特許文献１には、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンをバキュロウイルス−昆虫細胞発現系を利用して生産する方法が記載されているが、培養開始から72時間後に細胞を回収し、界面活性剤の存在下で細胞ペレットをホモジナイザーで破壊している（Example 5）。
【０００６】
細胞をより長期間培養すると、細胞が死滅し、内容物が培養液に放出されるので、細胞の破砕処理を省略することが可能になる。しかし、死滅した細胞から放出されるタンパク質分解酵素が目的のタンパク質を分解してしまう可能性があるため、このような長期間の培養は行われていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開WO96/37624
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述した従来の方法に従ってVLPを生産した場合、VLPを採取するために細胞の破砕処理を行わなければならない。しかし、破砕処理時には界面活性剤を使用するが、これがVLPの構造に悪影響を及ぼす可能性がある。また、破砕処理自体も煩雑な処理である。
【０００９】
本発明は、このような従来のVLPの生産方法の問題を解消し、より効率的なVLPの生産手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、死滅した細胞から放出されるタンパク質分解酵素が存在する条件下においても、VLPはその酵素の作用をほとんど受けないことを見出した。これにより、細胞の長期間の培養が可能になり、破砕処理を行うことなく、VLPを採取することができるようになる。
【００１１】
また、細胞を長期間培養した場合、死滅した細胞から放出されるタンパク質分解酵素により、夾雑タンパク質が分解され、培養上清中のVLPの純度が高くなることも見出した。
【００１２】
本発明は、以上のような知見に基づき、完成されたものである。
【００１３】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（５）を提供するものである。
（１）ウイルスの核酸配列を含むバキュロウイルスベクターによって昆虫細胞を形質転換し、その昆虫細胞を培養することにより、ウイルス様粒子を含む培養物を製造する方法であって、前記昆虫細胞の生存率が10％以下になるまで培養を継続した後、培養物を得ることを特徴とするウイルス様粒子を含む培養物の製造方法。
（２）昆虫細胞の培養期間が、5日以上であることを特徴とする（１）に記載の製造方法。
（３）ウイルスが、カリシウイルス科に属するウイルスであることを特徴とする（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）ウイルスが、ノロウイルスであることを特徴とする（１）又は（２）に記載の製造方法。
（５）ウイルスの核酸配列が、ノロウイルスの構造タンパク質VP1をコードする核酸配列であることを特徴とする（４）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の製造方法では、細胞の破砕処理を行うことなく、VLPを得ることができるので、破砕処理時に使用される界面活性剤の影響を排除することができる。また、培養の過程で、宿主細胞由来のタンパク質なども分解されるので、純度の高いVLPを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】培養期間の異なるサンプルの電気泳動の結果を示す写真。
【図２】培養細胞の生細胞数と総細胞数の経時的変化を示す図。横軸がバキュロウイルス播種時からの日数、縦軸が細胞数を表す。
【図３】培養細胞の細胞径の経時的変化を示す図。横軸がバキュロウイルス播種時からの日数、縦軸が細胞径を表す。
【図４】培養細胞の生存率の経時的変化を示す図。横軸がバキュロウイルス播種時からの日数、縦軸が生存率を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明のウイルス様粒子を含む培養物の製造方法は、ウイルスの核酸配列を含むバキュロウイルスベクターによって昆虫細胞を形質転換し、その昆虫細胞を培養することにより、ウイルス様粒子を含む培養物を製造する方法であって、前記昆虫細胞の生存率が10％以下になるまで培養を継続した後、培養物を得ることを特徴とするものである。
【００１８】
使用するウイルスの種類は特に限定されず、例えば、正20面体を形成するノンエンベロープウイルスなどを使用することができる。このようなウイルスとしては、サーコウイルス、パルボウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ピコルナウイルス、アストロウイルス、ビルナウイルス、レオウイルス、ヘペウイルス、ノダウイルス、アネロウイルス、カリシウイルスなどを例示できる。これらの中では、カリシウイルス（カリシウイルス科に属するウイルス）を使用することが好ましい。最も好ましいウイルスは、ノロウイルスである。
【００１９】
本発明においてノロウイルスとは、カリシウイルス科ノロウイルス属に属するウイルスを意味する。現在、ノロウイルス属に属するウイルスは、ノーウォークウイルス(Norwalk virus)だけであるが、今後、この属に属するウイルスが新たに見つかれば、そのウイルスも本発明における「ノロウイルス」に含まれる。
【００２０】
本発明においてウイルス様粒子とは、ウイルスの外殻のみ持ち、内部にはウイルスゲノムを持たない中空の粒子をいう。
【００２１】
培養の継続は、昆虫細胞の生存率が10％以下になるまで行えばよいが、より低い生存率、例えば、9％以下、7％以下、5％以下、3％以下、又は1％以下になるまで培養を継続してもよい。生存率の測定は、トリパンブルー染色法、アラマーブルー染色法、MTT法などによって行うことができる。また、細胞の生死を自動的に分析する装置も市販されているので、そのような装置を用いて生存率の測定を行ってもよい。
【００２２】
具体的な培養期間は、細胞の生存率に応じて決めればよいが、通常、培養開始（バキュロウイルスの播種時）から5日目ほどで生存率は10％以下になるので、5日間以上培養するのが好ましい。但し、より低い生存率になるように、6日以上、7日以上、8日以上培養してもよい。培養期間の上限は特に制限されないが、10日以内とするのが好ましい。
【００２３】
従来の方法では、培養後、培養物から細胞を回収し、その細胞の破砕、抽出を行い、細胞抽出液から目的のタンパク質（VLP）を得ていたが、本発明においては、VLPが培養物中に放出されているので、細胞の破砕、抽出処理を行わなくても、VLPを得ることができる。
【００２４】
本発明の製造方法は、上記の培養期間及び破砕処理が不要な点以外は、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系を用いて特定タンパク質を生産する公知の方法（例えば、国際公開WO96/37624に記載の方法）と同様に行うことができる。
【００２５】
使用するウイルスの核酸配列は、VLPを形成できるものであれば特に限定されない。例えば、ノロウイルスであれば、VP1をコードする核酸配列を使用できる。また、ノロウイルスの場合、VP1をコードする核酸配列だけでなく、VP2をコードする核酸配列も使用してもよい。
【００２６】
使用するウイルスの核酸配列は、GenBankなどのデータベース上で公表されている。例えば、ノロウイルスに関しては、ノーウォークウイルス株についてはM87661、サウザンプトンウイルス株についてはL07418、デザートシールドウイルス株についてはU04469、チバウイルス株についてはAB042808、ハワイウイルス株についてはU07611、スノーマウンテンウイルス株についてはU70059、メリーランドウイルス株についてはAY032605、セトウイルス株についてはAB031013、キャンバーウェル株についてはAF145896、ローズデールイルス株についてはX86557、グリムズビーウイルス株についてはAJ004864、メキシコウイルス株についてはU22498、ヒューストンウイルス株についてはAY502023、パリスアイランド株についてはAY652979などの番号で配列が登録されている。
【００２７】
バキュロウイルスベクターとしては、例えば、pFastBacベクター(Invitrogen)、BD BaculoGold (BD Biosciences)などを用いることができる。
【００２８】
昆虫細胞としては、例えば、Sf9細胞、HighFive細胞などを用いることができる。
【００２９】
形質転換した昆虫細胞の培養は、昆虫細胞の培養に一般的に適用される培養法に従って行うことができる。培地としては、例えば、PSFM培地、SF900II培地、SF900III培地などを用いることができる。培養時の温度は、20〜30℃とするのが好ましく、26〜28℃とするのが更に好ましい。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３１】
〔実施例１〕  細胞の培養
（１）実験方法
1 組換えバキュロウイルスの作製
GII-4に分類されるノロウイルスのウイルス株（タンペレ大学の入院患者から採取）のVP1（アミノ酸配列を配列番号１に示す。）をコードするcDNAをトランスファープラスミドpFastBac（Invitrogen）に組み込んだ。次にcDNAを組み込んだトランスファープラスミドを、バキュロウイルスゲノムDNAを保持する大腸菌であるDH10Bac（Invitrogen）に導入し、相同組換えによってノロウイルスVP1をコードするcDNAをバキュロウイルスゲノムDNAに組み込んだ。大腸菌からバキュロウイルスゲノムDNAを抽出精製し、昆虫細胞（expresSF+細胞、Protein Sciences）に導入して培養した。この培養上清から組換えバキュロウイルスを得た。
【００３２】
2 GII-4 VP1発現のための培養
組換えバキュロウイルを昆虫細胞（expresSF+細胞）（1x106/mL）にMOI=1となるように播種した。expresSF+細胞の培養は、培地としてPSFM培地を用い、27℃で行った。組換えバキュロウイル播種後1日毎に培養液を1mL分取し、5000×g, 5分間遠心分離し、培養上清と細胞ペレットに分けた。
【００３３】
3 電気泳動
培養上清には250μLの5×DB(300mmol/L Tris-HCl pH6.8, 50% glycerol, 10% SDS, 0.5% BromoPhenolBlue, 500mmol/L DTT)を混合した。細胞ペレットは1×DB(5×DBを蒸留水で5倍希釈したもの)1250μLに溶解した。両者を95℃5分間加熱後、10μLを1レーンにアプライし、200V、 35分間電気泳動した。
【００３４】
泳動後のゲルを固定液(25% Methanol, 10% 酢酸, 10% Trichrolo acetic acid(TCA))に浸して5分間振盪し、その後CBB染色液(0.1% CBB, 7.7mmol/L Ethanol, 1.75mmol/L Acetic acid)に浸して1時間振盪して染色した後、脱色液(10% 酢酸)で一晩脱色した。ゲル画像はスキャナを用いて取得した。分子量マーカーはSeeBlue prestained standard (Invitrogen)を使用した。
【００３５】
（２）実験結果
図１に電気泳動の結果を示す。図中の「dpi」はdays post infectionの略で、播種後培養何日目のサンプルかを示す。左から2番目GII-4 500ngのレーンは、精製したGII-4 VP1を1×DBで希釈し、50ng/μLとしたものを10μLアプライしたものを示す。
【００３６】
図に示すように、培養日数の経過に伴い、培養上清中のGII-4 VP1（6万Da付近のバンド）の量が増加した一方、細胞ペレット中のGII-4 VP1の量は減少した。これは、培養日数の経過に伴い、死滅する細胞が増加し、培養上清中に放出されるVLPが増大したことを示していると考えられる。このことから、5日間程度培養すれば、細胞の破砕処理をしなくても、十分な量のVLPを得られると考えられる。
【００３７】
また、培養6日目の培養上清には多量のGII-4 VP1が含まれていることから、GII-4 VP1は、死滅した細胞から放出されるタンパク質分解酵素の作用をほとんど受けていないと考えられる。
【００３８】
更に、各レーンに含まれる全バンドのシグナル強度の合計に対するGII-4 VP1（6万Da付近のバンド）のシグナル強度の比率をデンシトメーターを用いて測定すると、培養3日目の細胞ペレットでは28%だったのに対し、培養6日目の培養上清では62%であり、培養6日目の培養上清の方が、培養3日目の細胞ペレットよりも不純物が少なかった。
【００３９】
〔実施例２〕  細胞の生存率等の測定
バイオリアクターを用いてexpresSF+細胞を培養した。培地はPSFM培地を用い、培養時の温度は27℃とした。GII-4 VP1発現バキュロウイルスを、播種する直前、及び播種後1から6日目に培養液を採取し、生死細胞オートアナライザー(Vi-CELL XR, ベックマン・コールター)を用いて生細胞数、総細胞数、細胞径、生存率を計測した。
【００４０】
図２に生細胞数と総細胞数の経時的変化、図３に細胞径の経時的変化、図４に生存率の経時的変化を示す。
【００４１】
これらの図に示すように、培養開始から３日目以降になると急激に細胞の生存率が低下する。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、ノロウイルスなどのウイルスに対するワクチンの生産に有用な技術なので、製薬などの産業分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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