(57)【要約】【課題】特定のＭａｆａ遺伝子タイプを有するカニクイザル個体を迅速かつ簡便に選抜することを可能とするＤＮＡタイピング方法を提供すること。【解決手段】以下のステップを含むカニクイザルＭａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピング方法。（１）カニクイザルｃＤＮＡ塩基配列におけるＭａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ遺伝子のエクソン２領域からエクソン４領域、Ｍａｆａ−ＤＲＢ，Ｍａｆａ−ＤＱＡ１，Ｍａｆａ−ＤＱＢ１，Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＡ１遺伝子のエクソン１領域からエクソン３領域を同一のＰＣＲ条件にてＰＣＲ増幅させるためのプライマーセットを準備するステップ；（２）Ｍａｆａ−Ａ、Ｍａｆａ−Ｂ、Ｍａｆａ−ＤＲＢ、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のプライマーセットを用いて、被検試料（ＲＮＡ）から合成したｃＤＮＡを鋳型として、１本あるいは３本の容器内で同一のＰＣＲ条件にてＰＣＲを行うことにより増幅するステップ（ここで、１本の容器で行う場合は、１つの容器内で全てのプライマーセットを用いる。また、３本の容器で行う場合は、第１の容器ではＭａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂのプライマーセットを用い、第２の容器ではＭａｆａ−ＤＲＢのプライマーセットを用い、第３の容器ではＭａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のプライマーセットを用いる）；（３）ＰＣＲ産物の塩基配列を決定するステップ；及び（４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含むカニクイザルＭａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピング方法。
（１）カニクイザルｃＤＮＡ塩基配列におけるＭａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ遺伝子のエクソン２領域からエクソン４領域、Ｍａｆａ−ＤＲＢ，Ｍａｆａ−ＤＱＡ１，Ｍａｆａ−ＤＱＢ１，Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＡ１遺伝子のエクソン１領域からエクソン３領域を同一のＰＣＲ条件にてＰＣＲ増幅させるためのプライマーセットを準備するステップ；
（２）Ｍａｆａ−Ａ、Ｍａｆａ−Ｂ、Ｍａｆａ−ＤＲＢ、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のプライマーセットを用いて、被検試料（ＲＮＡ）から合成したｃＤＮＡを鋳型として、１本あるいは３本の容器内で同一のＰＣＲ条件にてＰＣＲを行うことにより増幅するステップ（ここで、１本の容器で行う場合は、１つの容器内で全てのプライマーセットを用いる。また、３本の容器で行う場合は、第１の容器ではＭａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂのプライマーセットを用い、第２の容器ではＭａｆａ−ＤＲＢのプライマーセットを用い、第３の容器ではＭａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のプライマーセットを用いる）；
（３）ＰＣＲ産物の塩基配列を決定するステップ；及び
（４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップ。
【請求項２】
Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂのプライマーセットが配列番号１及び２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｍａｆａ−ＤＲＢのプライマーセットが配列番号３及び４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１のプライマーセットが配列番号５及び６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１のプライマーセットが配列番号７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１のプライマーセットが配列番号９及び１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｍａｆａ−ＤＰＢ１のプライマーセットが配列番号１１及び１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＣＲ条件が、９５〜９８℃で１０〜２０秒間、５５〜６５℃で３０〜６０秒間、６５〜７２℃で３０〜６０秒間の３ステップを１工程として、これを３０〜４０回繰り返す条件である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号１及び２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【請求項５】
配列番号：３及び４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−ＤＲＢ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【請求項６】
配列番号５及び６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【請求項７】
配列番号７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【請求項８】
配列番号９及び１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【請求項９】
配列番号１１及び１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−ＤＰＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【請求項１０】
配列番号１から１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる、Ｍａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【請求項１１】
請求項１０に記載のプライマーセット、及びＤＮＡポリメラーゼを含む、Ｍａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピング用キット。
【請求項１２】
請求項１から３の何れか１項に記載の方法により、被検試料に含まれるカニクイザルＭａｆａ遺伝子のＤＮＡをタイピングし、その結果に基づいて特定のＭａｆａ遺伝子を有するカニクイザルを選別する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイスループットＤＮＡシークエンサーを用いたカニクイザルＭＨＣ遺伝子のマルチプレックスＤＮＡタイピング方法、及びそれに用いるプライマーセットに関する。さらに本発明は、上記したマルチプレックスＤＮＡタイピング方法を用いて特定のＭａｆａ遺伝子（カニクイザルのＭＨＣ遺伝子）を有するカニクイザルを選別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）は、病原体等の外来タンパク質由来ペプチド、および自己タンパク質由来ペプチドをＴ細胞に提示することにより免疫応答の誘導に深く関わっている。カニクイザルのＭＨＣであるＭａｆａ（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）では、主なものとして５種類の抗原が知られている。ほぼすべての細胞で発現しているクラスＩ抗原（Ｍａｆａ−Ａ，Ｍａｆａ−Ｂ）と、主として免疫系の細胞で発現しているクラスＩＩ抗原（Ｍａｆａ−ＤＲ，Ｍａｆａ−ＤＱ，Ｍａｆａ−ＤＰ）である。
【０００３】
ＭＨＣクラスＩ抗原は高度な多型性を示すα鎖と多型性がほとんど無いβ２−ミクログロブリンからなり、ＭＨＣクラスＩＩ抗原は高度な多型が存在するβ鎖と比較的多型性が少ないα鎖から成る（図１参照）。クラスＩ分子のα鎖はＭａｆａ−Ａ，Ｍａｆａ−Ｂの各遺伝子にコードされ、クラスＩＩ抗原のβ鎖はＭａｆａ−ＤＲＢ，Ｍａｆａ−ＤＱＢ１，Ｍａｆａ−ＤＰＢ１、α鎖はＭａｆａ−ＤＲＡ１，Ｍａｆａ−ＤＱＡ１，Ｍａｆａ−ＤＰＡ１遺伝子にコードされている（図２参照）。
【０００４】
遺伝子レベルでは、ＭａｆａクラスＩ抗原ではα鎖をコードしている遺伝子のエクソン２とエクソン３が高度な多型性を示し、ＭａｆａクラスＩＩ抗原ではβ鎖をコードしている遺伝子のエクソン２が高度な多型性を示す。
【０００５】
Ｍａｆａをコードしている遺伝子領域の染色体位置は不明であるが、ヒトのＭＨＣ領域であるヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）遺伝子領域を参照した場合、テロメア側からセントロメア側に向けて、クラスＩ領域（Ｍａｆａ−Ａ，Ｍａｆａ−Ｂ等）、クラスＩＩＩ領域、クラスＩＩ領域（Ｍａｆａ−ＤＲＡ，Ｍａｆａ−ＤＲＢ，Ｍａｆａ−ＤＱＡ１，Ｍａｆａ−ＤＱＢ１，Ｍａｆａ−ＤＰＡ１，Ｍａｆａ−ＤＰＢ１等）の順に並び、多くの遺伝子が非常に高い密度でコードされている（図３と図４参照）。クラスＩＩＩ領域にはＭＨＣ遺伝子は存在せず、補体成分や腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）等の遺伝子が存在している。
【０００６】
Ｍａｆａ−Ａ抗原のα鎖をコードするＭａｆａ−Ａ遺伝子座位には、少なくとも５種類の構造多型が確認されている（図５参照）。Ｍａｆａ−ＤＲ抗原のβ鎖をコードするＭａｆａ−ＤＲＢ遺伝子座位には、少なくとも２０種類の構造多型が確認されている（図６参照）。一方、Ｍａｆａ−Ｂ抗原のα鎖をコードするＭａｆａ−Ｂ遺伝子座位にも、数多くの構造多型が確認されている（非特許文献１）。
【０００７】
各ＭＨＣ遺伝子のエクソンには複数の多型性に富む領域（多型領域）が存在し、ある多型領域の塩基配列（アミノ酸配列）が、複数のＭＨＣ対立遺伝子（ＭＨＣアリル）に共通であることも多い。すなわちＭＨＣアリルは複数の多型領域の組み合わせにより規定される。ＭＨＣクラスＩ抗原ではエクソン内の多型領域のみならず、同一の塩基配列をもつエクソン２あるいはエクソン３が複数のアリルに共通であることもある。
【０００８】
ＭＨＣには高度な多型が存在するためＭＨＣアリルの種類が極めて多いことも知られ、それらの表記法も決められている。即ち、ＭＨＣ型の系統を判別する第１区域、同一系統内でアミノ酸置換を伴うアリルを判別する第２区域、アミノ酸変異を伴わない塩基置換が認められるアリルを判別する第３区域、及びＭＨＣ分子をコードする遺伝子領域外（イントロン）での塩基置換を伴うアリルを判別する第４区域である（図７参照）。
この分類法に基づいた場合、１２６９種類のＭａｆａアリルがこれまでに登録されている（図４参照）。
【０００９】
ヒトの場合、移植の際のドナーとレシピエントとの間のＨＬＡ型を一致させることは拒絶反応回避のために重要な要素となっている。また、特定のＨＬＡ型が自己免疫疾患、アレルギー性疾患、がん、造血幹細胞移植に伴う移植片対宿主（ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｏｓｔ；ＧＶＨ）病、ウイルス感染症における防御と重症化、さらには薬剤副作用に関連するなど数多くの医学的に重要な知見が報告されている。よって、Ｍａｆａ型の多型情報を知ることは、カニクイザルを用いた再生医療研究、細胞や組織移植研究、がん治療薬開発およびワクチン開発研究における基礎研究を臨床研究に結び付けるための重要な要素になる。従って、ＭＨＣタイピングを正確かつ高精度に実施することが臨床的にも極めて重要である。
【００１０】
他方、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の樹立が報告されて以来、ｉＰＳ細胞の臨床応用研究がさかんに行われている。ｉＰＳ細胞の臨床応用研究においては、ｉＰＳ細胞から分化誘導した細胞を生体に移植する研究が必須である。ｉＰＳ細胞から分化誘導した細胞の生体への移植研究においては、ヒトへの移植に先立ってカニクイザルへの移植実験を行うことが一般的である。ｉＰＳ細胞から分化誘導した細胞をカニクイザルに移植する際には、拒絶反応を回避するためには、移植細胞と同じＭＨＣ遺伝子型を有するカニクイザルを予め選別しておき、このカニクイザルに細胞を移植することが必要である。移植が成功することによって、はじめて移植ｉＰＳ細胞の有効性や副作用を明らかにすることができる。
【００１１】
従来、Ｍａｆａ遺伝子におけるＤＮＡタイピング法には、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）に基づくＳＢＴ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｙｐｉｎｇ）法やＰＣＲ産物のサブクローニングにより得られるクローンの塩基配列を決定すること（サブクローニング法）により進められてきた。非特許文献１では、１３５個体の血縁関係のある個体のＭａｆａ−Ｂ遺伝子座位の多型解析を行い、数多くの新規アリルを同定したこと、そしてＭａｆａ−Ｂ遺伝子座位に構造多型を同定したことが記載されている。従来のＳＢＴ法では、多型領域の染色体上のシス・トランスの位置関係を正確に決めることができないこともあるため、フェーズ・アンビギュイティ（ｐｈａｓｅ  ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）が生じ、高精度なＤＮＡタイピングが難しい場合があった。とりわけＭａｆａ−Ａ，  Ｍａｆａ−Ｂ及びＭａｆａ−ＤＲＢ遺伝子座位では構造多型が観察されるため、この方法の使用は不可能であった。また、カニクイザルのＭＨＣ領域には、発現しているＭａｆａ遺伝子の他に多数の偽遺伝子が位置することから、ＤＮＡを使用したＤＮＡタイピングも困難であった。さらにサブクローニング法では、多数のサンプルを迅速にタイピングできないという短所もあった。従って、従来のＤＮＡタイピング法では、アリルの検出を見逃す可能性があった。
【００１２】
特許文献１には、ヒトＭＨＣであるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の遺伝子のＤＮＡタイピング方法及びキットが記載されている。具体的には、特許文献１には、（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ，ＨＬＡ−ＤＱＡ１，ＨＬＡ−ＤＱＢ１，ＨＬＡ−ＤＰＡ１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにＨＬＡ−ＤＲＢ１のエクソン２及び３’側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備するステップ；（２）前記プライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅するステップ；（３）ＰＣＲ増幅された産物の塩基配列を決定するステップ；及び（４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、ＨＬＡのＤＮＡタイピング方法が記載されている。特許文献１に記載の発明は、フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除した高精度のＤＮＡタイピング方法及びキットを提供することを課題とするものであり、長いＰＣＲ産物をシークエンシングする手法を採用している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１３／０１１７３４Ａ１
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｏｔｔｉｎｇ  Ｎ．等、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，第６１巻、７４５−７５３頁、２００９
【特許文献２】Ｗｉｓｅｍａｎ  Ｒ．Ｗ．等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１５巻、１３２２−１３２７頁（２００９年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、各Ｍａｆａ遺伝子におけるプライマーの設計、各Ｍａｆａ遺伝子のＰＣＲ条件（アニーリング温度）を設定すること、その条件に基づいたＭａｆａ−Ａ、Ｍａｆａ−Ｂ、Ｍａｆａ−ＤＲＢ、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のマルチプレックスＰＣＲ法を開発することにより、特定のＭａｆａ遺伝子タイプを有するカニクイザル個体を迅速かつ簡便に選抜することを可能とするＤＮＡタイピング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、ＭａｆａクラスＩ抗原であるＭａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ、ＭａｆａクラスＩ抗原であるＭａｆａ−ＤＲＢ、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１について、それらのＭａｆａ遺伝子を特異的に、かつ同一のアニーリング温度で増幅しうるＰＣＲプライマーを設計すること、１台のＰＣＲ装置で１度に上記のＭａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピングを可能とする好適なＰＣＲ条件を設定すること、その条件に基づいて３本の容器（（容器１：Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ）、（容器２：Ｍａｆａ−ＤＲＢ）、（容器３：Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１））のみでＰＣＲできるマルチプレックスＰＣＲ法を開発すること、並びにハイスループットシークエンシング技術を駆使することにより、本発明を完成するに至った。
【００１７】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］  以下のステップを含むカニクイザルＭａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピング方法。
（１）カニクイザルｃＤＮＡ塩基配列におけるＭａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ遺伝子のエクソン２領域からエクソン４領域、Ｍａｆａ−ＤＲＢ，Ｍａｆａ−ＤＱＡ１，Ｍａｆａ−ＤＱＢ１，Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＡ１遺伝子のエクソン１領域からエクソン３領域を同一のＰＣＲ条件にてＰＣＲ増幅させるためのプライマーセットを準備するステップ；
（２）Ｍａｆａ−Ａ、Ｍａｆａ−Ｂ、Ｍａｆａ−ＤＲＢ、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のプライマーセットを用いて、被検試料（ＲＮＡ）から合成したｃＤＮＡを鋳型として、１本あるいは３本の容器内で同一のＰＣＲ条件にてＰＣＲを行うことにより増幅するステップ（ここで、１本の容器で行う場合は、１つの容器内で全てのプライマーセットを用いる。また、３本の容器で行う場合は、第１の容器ではＭａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂのプライマーセットを用い、第２の容器ではＭａｆａ−ＤＲＢのプライマーセットを用い、第３の容器ではＭａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のプライマーセットを用いる）；
（３）ＰＣＲ産物の塩基配列を決定するステップ；及び
（４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップ。
【００１８】
［２］  Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂのプライマーセットが配列番号１及び２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｍａｆａ−ＤＲＢのプライマーセットが配列番号３及び４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１のプライマーセットが配列番号５及び６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１のプライマーセットが配列番号７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１のプライマーセットが配列番号９及び１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｍａｆａ−ＤＰＢ１のプライマーセットが配列番号１１及び１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、［１］  に記載の方法。
［３］  ＰＣＲ条件が、９５〜９８℃で１０〜２０秒間、５５〜６５℃で３０〜６０秒間、６５〜７２℃で３０〜６０秒間の３ステップを１工程として、これを３０〜４０回繰り返す条件である、［１］  又は［２］に記載の方法。
【００１９】
［４］  配列番号１及び２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
［５］  配列番号：３及び４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−ＤＲＢ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
［６］  配列番号５及び６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【００２０】
［７］  配列番号７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
［８］  配列番号９及び１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
［９］  配列番号１１及び１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−ＤＰＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
【００２１】
［１０］  配列番号１から１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる、Ｍａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
［１１］  ［１０］に記載のプライマーセット、及びＤＮＡポリメラーゼを含む、Ｍａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピング用キット。
［１２］  ［１］から［３］の何れかに記載の方法により、被検試料に含まれるカニクイザルＭａｆａ遺伝子のＤＮＡをタイピングし、その結果に基づいて特定のＭａｆａ遺伝子を有するカニクイザルを選別する方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の方法は１分子からのＭａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピングに必要な全塩基配列が得られるので、アリルの検出を見逃す可能性を軽減させ、且つシス・トランスの位置関係不明なフェーズ・アンビギュイティの認められないＤＮＡタイピング法であり、例えば、移植の際のドナーとレシピエントとの間における高精度なＭａｆａ型の一致が実現される。本発明では、１台のＰＣＲ増幅装置で１度にすべてのＭａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピングを可能とする好適なＰＣＲ条件を設定することから、操作上の迅速化及び簡便化が実現される。さらに本発明では、Ｍａｆａ−Ａ、Ｍａｆａ−Ｂ、Ｍａｆａ−ＤＲＢ、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のマルチプレックスＰＣＲ法を提供することから、ドナーとレシピエントとの間のＭａｆａ型の高精度かつ迅速なＤＮＡタイピングが実現される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Ｍａｆａ遺伝子領域を示す図である。Ｗａｔａｎａｂｅ  Ａ．等、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、８９巻、４０２−４１２頁、２００７年から引用した。
【図２】ＭＨＣクラスＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫  監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第３５頁から引用した。
【図３】ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫  監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第４６頁〜第４７頁から引用した。
【図４】代表的なMHC遺伝子のゲノム構成と多型性を示す図である。代表的なヒトとカニクイザルにおけるMHC遺伝子の種類とMHC領域における大まかな位置を記した。括弧はそれぞれの遺伝子に同定されているアリル数を示す。ヒトのアリル情報は、ＩＭＧＴ／ＨＬＡ  ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)、カニクイザルのアリル情報は、ＩＰＤ−ＭＨＣ  ＤａｔａｂａｓｅのＶｅｒｓｉｏｎ  １．７．０ (http://www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/nhp/nomen_mafa.html) をそれぞれ参照した。
【図５】Ｍａｆａ−Ａ遺伝子座位における構造多型を示す図である。Ｏｔｔｉｎｇ  Ｎ．等、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、５９巻、３６７−３７５頁、２００７年から引用した。
【図６】Ｍａｆａ−ＤＲＢ遺伝子座位における構造多型を示す図である。Ｂｌａｎｃｈｅｒ  Ａ．等、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、６４巻、６０５−６１４頁、２０１２年から引用した。
【図７】Ｍａｆａアリルの分類法を示す図である。ＩＰＤ−ＭＨＣ  ＤａｔａｂａｓｅのＶｅｒｓｉｏｎ  １．７．０ (http://www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/nhp/nomen_mafa.html)から引用した。
【図８】実施例１で増幅したＭａｆａ遺伝子のＰＣＲ増幅状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。
【図９】実施例１で得られたリード数とＤＮＡ断片の長さとの関係を示す図である。
【図１０】実施例２にて実施したリード配列のホモロジー検索自動化のフローチャートを示す図である。ステップ１（自動化）：次世代シークエンサーから出力された塩基配列データ（リード配列）とカニクイザルの既知MHCアリル配列とのBLAT解析を行うことにより、以後の解析に使用できるリード配列を選択する。ステップ２ （自動化）：使用できるリード配列をForward側からのリード配列群とReverse側からのリード配列群に分け、それぞれについてカニクイザルの既知MHCアリル配列とのBLAT解析を行い、アリル候補を抽出する。ステップ３ （自動化）：Forward側とReverse側から抽出した    アリル候補のうち、共通に有するものを最終アリル候補とする。ステップ４（マニュアル）：最終アリル候補に対して、個別に GS Reference Mapper ソフトウェアでマッピングし、アルゴリズムの異なる方法でも最終アリル候補を確認した後、その個体の持つアリルを確定する。
【図１１】実施例２にて判定されたＭａｆａ−Ａアリルを示す図である。ＮＤは既知情報では観察されているが、本実施例では観察されなかったアリルを示す。
【図１２】実施例２にて判定されたＭａｆａ−Ｂアリルを示す図である。ＮＤは既知情報では観察されているが、本実施例では観察されなかったアリルを示す。
【図１３】実施例２にて判定されたＭａｆａ−ＤＲＢアリルを示す図である。
【図１４】実施例２にて判定されたＭａｆａ−ＤＱＡ１及びＭａｆａ−ＤＱＢ１アリルを示す図である。
【図１５】実施例２にて判定されたＭａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１アリルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明のＤＮＡタイピング方法をステップ毎に詳細に説明する。
（１）プライマーセット準備ステップ
本発明のＤＮＡタイピング方法においては、まず、Ｍａｆａ−Ａ、Ｍａｆａ−Ｂ、Ｍａｆａ−ＤＲＢ、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１の各遺伝子のエクソン内に各々特異的にアニールするプライマーセットを準備する。
【００２５】
Ｍａｆａ遺伝子が存在する領域を含む部分的なゲノム塩基配列は既に解明されており、その遺伝子構造及び発現産物（ＭＨＣ抗原）の構造との関連も知られている（図２と図３参照）。
即ち、古典的ＭＨＣクラスＩ抗原を規定するＭａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ遺伝子は８個のエクソンを含む（図２参照）。エクソン２、３及び４において多型領域が多数存在することも知られている。また、古典的ＭＨＣクラスＩＩ抗原を規定するＭａｆａ−ＤＲ，Ｍａｆａ−ＤＱ及びＭａｆａ−ＤＰはα鎖とβ鎖から構成され、それぞれの遺伝子は５個又は６個のエクソンを含む（図３参照）。エクソン２及び３において多型領域が多数存在することも知られている。
【００２６】
本発明では、これら古典的クラスＩ抗原（Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ）ならびに古典的クラスＩＩ抗原（Ｍａｆａ−ＤＲＢ１、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ-ＤＰＢ１）におけるエクソンの多型領域を挟み込むようにしてＰＣＲ増幅できるプライマーセットを調製し、それを用いてＰＣＲ増幅したＰＣＲ産物を後述するハイスループットシークエンシングに供するので、フェーズ・アンビギュイティ等の不確実さを排除でき、正確にアリルを検知することができる。
【００２７】
本発明では、各Ｍａｆａ遺伝子のＰＣＲの際のアニーリング温度を同一にすることにより、１台のＰＣＲ装置で同時にＰＣＲを行うことができる。
本発明では、マルチプレックスＰＣＲ法によりＭａｆａ−Ａ、Ｍａｆａ−Ｂ、Ｍａｆａ−ＤＲＢ、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のＰＣＲを３本の容器内で反応させることができる。
【００２８】
具体的には、下記表１に掲げるＰＣＲプライマーセットを調製する。
表１における配列番号１及び２は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＭａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、カニクイザルの伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−Ａ１＊０５２：０２やＭａｆａ−Ｂ＊０９５：０１の塩基配列）において、Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ遺伝子のエクソン２〜エクソン４領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００２９】
配列番号１は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−Ａ１＊０５２：０２の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＡＭ９４３３６１）における第１７１番目から第１９１番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号２は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−Ａ１＊０５２：０１の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＡＭ９４３３６１）における第６６５番目から第６８５番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５１５塩基（ｂｐ）である。
【００３０】
表１における配列番号３と４は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＭａｆａ−ＤＲＢ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＲＢ１＊１０：０７の塩基配列）において、Ｍａｆａ−ＤＲＢ遺伝子のエクソン１〜エクソン３領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３１】
配列番号３は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＲＢ１＊１０：０７の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＤＱ３８１７４３）における第１７１番目から第１９１番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号４は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＲＢ１＊１０：０７の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＤＱ３８１７４３）における第１５番目から第４３４番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは４２０ ｂｐである。
【００３２】
表１における配列番号５と６は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖であるＭａｆａ−ＤＱＡ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＱＡ１＊０１：０７：０１の塩基配列）において、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１遺伝子のエクソン１〜エクソン３領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３３】
配列番号５は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＱＡ１＊０１：０７：０１の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＨＭ５７９９８９３）における第５番目から第２２番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号６は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＱＡ１＊０１：０７：０１の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＨＭ５７９９８９３）における第４２２番目から第４３９番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは４３５ ｂｐである。
【００３４】
表１における配列番号７と８は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＭａｆａ−ＤＱＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＱＢ１＊０６：０８の塩基配列）において、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１遺伝子のエクソン１〜エクソン３領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３５】
配列番号７は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＱＢ１＊０６：０８の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＥＦ２０８８２２）における第５５番目から第７２番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号８は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＱＢ１＊０６：０８の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＥＦ２０８８２２）における第４３３番目から第４５０番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは３９６ ｂｐである。
【００３６】
表１における配列番号９と１０は、はＭＨＣクラスＩＩα鎖であるＭａｆａ−ＤＰＡ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＰＡ１＊０２：０５の塩基配列）において、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１遺伝子のエクソン１〜エクソン３領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３７】
配列番号９は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＰＡ１＊０２：０５の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＡＭ９４３６３３）における第１９番目から第３６番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号１０は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＰＡ１＊０２：０５の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＡＭ９４３６３３）における第４０８番目から第４２５番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは４０７ ｂｐである。
【００３８】
表１における配列番号１１と１２は、はＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＭａｆａ−ＤＰＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＰＢ１＊１５：０４の塩基配列）において、Ｍａｆａ−ＤＰＢ１遺伝子のエクソン１〜エクソン３領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
【００３９】
配列番号１１は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＰＢ１＊１５：０４の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＡＭ９４３６３４）における第１０３番目から第１２０番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号１２は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＰＢ１＊１５：０４の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＡＭ９４３６３４）における第４２４番目から第４４１番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは３３９ ｂｐである。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
表１に記載のプライマーは、当該分野で通常用いられている手法により調製することができる。また、表１に記載したプライマーセットは最も好ましい例を示したものであり、本発明の方法においては、Ｍａｆａの多型領域を上流側及び下流側から挟み込む位置にアニーリング可能なセンス（Ｓｅｎｓｅ）側プライマーとアンチセンス（Ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）側プライマーとのセットであれば同様に使用することができる。
【００４２】
（２）ＰＣＲ増幅ステップ
本発明の方法では、前記ステップ（１）で準備したプライマーの５‘側に、４０  ｍｅｒからなるハイスループットシークエンシング用アダプターをコードする塩基配列と１０  ｍｅｒからなるバーコードをコードする塩基配列を付加させたアンプリコンシークエンシング用のプライマーを設計し、それらを用いて、被検試料（伝令ＲＮＡ；ｍＲＮＡ）のＰＣＲを実施する。
バーコード配列をプライマーに組み込むことにより、１回のハイスループットシークエンシングにて数十サンプルの処理ができる。
ＰＣＲ増幅反応は、通常のプロトコールに従って実施される。具体的には次の通りである。
【００４３】
１．被検試料の形態に応じて、当該試料からｍＲＮＡを抽出する。
２．抽出したｍＲＮＡを定量し、逆転写反応により相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ；ｃＤＮＡ）を調製する。
３．適宜プライマー濃度を設定して反応液を調製する。
４．反応条件を設定してＰＣＲを実施する。反応条件は、例えば、熱変性ステップ（通常は９２〜９８℃）、アニーリングステップ（通常は５０〜７０℃）、及び伸長ステップ（通常は６５〜７８℃）とすることができる。
５．得られたＰＣＲ産物を精製し、（３）の塩基配列決定ステップに供する。
【００４４】
本発明の方法では、前記アニーリングステップの温度を約５５〜６０℃とするのが好ましい。約５５〜６０℃でアニーリングさせることにより、Ｍａｆａアリルを等比率で（均一に）生成させることができる。
【００４５】
上記した条件に基づいて３本の容器（（容器１：Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ）、（容器２：Ｍａｆａ−ＤＲＢ）、（容器３：Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１））のみでＰＣＲできるマルチプレックスＰＣＲを実施する。このステップは、１台のＰＣＲ装置で同時にＰＣＲすることができる。
【００４６】
（３）塩基配列決定ステップ。
次に、前記ステップ（２）で生成されたＰＣＲ産物（増幅ＤＮＡ）の塩基配列を決定する。このステップは、いわゆるハイスループットシークエンシング（あるいは超高速シークエンシング、大量並列シークエンシング）と呼ばれている手法を用いて実施するのが好ましい。ハイスループットシークエンシングに関しては、例えば、「実験医学」第２７巻、第１号、２００９年（羊土社）等を参照できる。
本明細書では、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）の４５４  ＧＳシステムに基づいて配列決定する方法を以下に記載する。なお、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のゲノムシークエンサーＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭシステム及びイルミナ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）のＭｉＳｅｑシステムも同様に塩基配列決定が可能である。
【００４７】
１．増幅ＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ断片にした後、アダプターを介してビーズに結合させる。得られたビーズを油中水型エマルジョンに包み込む（１ビーズに１つのＤＮＡ断片が結合したマイクロリアクター環境が形成される）。
２．エマルジョンＰＣＲ反応を実施し、各ビーズ上に各ＤＮＡ断片のコピーを形成させる（各ＤＮＡ断片は各々のマイクロリアクター内でクローナルに増幅されるので、他の配列との競合もなく、多数の断片の増幅が同時に並列的に実施できる）。ついで、エマルジョンを破壊して増幅されたＤＮＡ断片を有するビーズを回収する。
３．ビーズを濃縮し、ピコタイターウェルにローディングする（１ウェルに１個のビーズが入るサイズである）。
４．各々のビーズについて、ポリメラーゼが酵素反応するときに生じるピロリン酸を、ルシフェラーゼによる蛍光反応で検出し、発光の強度とパターンからＤＮＡの塩基配列を決定する。４種類の核酸（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を一定の順序で加える、添加した核酸に応じた化学発光パターンを記録し、そのシグナル強度と位置情報との組み合わせにより塩基配列を決定する。
【００４８】
（４）データベースとのホモロジー検索を実施するステップ
次いで、前記ステップ（３）で得られるｓｆｆ  ｆｉｌｅをバーコード毎に分類した後、既知のＭａｆａアリルの塩基配列データベースのデータと比較することにより、被検試料に含まれていたｍＲＮＡの第３区域レベルのＭａｆａアリルが決定される。
【００４９】
本発明の方法は、前記表１に記載したプライマーセットを代表例とする。ＭａｆａクラスＩ及びＭａｆａクラスＩＩの各遺伝子全領域を挟み込む位置にプライマーを設定し、ほぼ全領域に渡って増幅したＤＮＡの配列決定をすることに特徴を有し、それによってアンビギュイティを排除することができる。
【００５０】
さらに、本発明によれば、上記した本発明によるニクイザルＭａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピング方法により、被検試料に含まれるカニクイザルＭａｆａ遺伝子のＤＮＡをタイピングし、その結果に基づいて特定のＭａｆａ遺伝子を有するカニクイザルを選別する方法が提供される。例えば、ｉＰＳ細胞から分化誘導した細胞をカニクイザルに移植する際には、拒絶反応を回避するために、本発明のＤＮＡタイピング方法により移植細胞と同じＭＨＣ遺伝子型を有するカニクイザルを予め選別しておき、このカニクイザルに細胞を移植することができる。
【００５１】
以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
（実施例１）
［実験目的］
本発明にて設定したマルチプレックス法にてＰＣＲ産物の増幅状況を確認するために、複数のｃＤＮＡサンプルを用いてＰＣＲ産物の塩基配列決定を行うことを目的にした。
【００５３】
［実験方法］
Ｍａｆａアリルの不明な２０個体の末梢白血球から抽出したｍＲＮＡサンプルを用いた。このｍＲＮＡを鋳型として、逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、本発明にて設定したＰＣＲ条件にて、各Ｍａｆａ遺伝子を３本の容器（（容器１：Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ）、（容器２：Ｍａｆａ−ＤＲＢ）、（容器３：Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１））に分けてＰＣＲを実施した。
【００５４】
（１）ＰＣＲにはＫＯＤ  ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）酵素を用いた。すなわち、１μＬのｃＤＮＡ溶液に、反応液全体に対しての終濃度を０．１２５〜０．３７５ｐｍｏｌ／μＬに調整した量のＰＣＲプライマー（表１に記載したプライマー（配列番号１から１２）を使用した）、各酵素のプロトコールに準じたＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ及びＰＣＲ用酵素を加え、反応液の全量を滅菌水にて２０  μＬに調整した。
【００５５】
（２）これを９４度で２分間の保温後、続いて９８度で１０秒間、５８度で４５秒間、６８度で３０秒間の３ステップを１工程として、これを３５回繰り返した。なお、このＰＣＲ増幅にはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  （ライフテクノロジーズ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。一部のサンプルにおける泳動像を図８に示した。
【００５６】
（３）ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
１．ＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭｐｕｒｅ  ＸＰの標準プロトコールにしたがって精製した。
２．ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準プロトコールにしたがって濃度を測定した。
３．精製したＰＣＲ産物をそれぞれ容器１は５．００Ｅ＋０７  ｍｏｌ／μＬ、容器２は１．００Ｅ＋０７  ｍｏｌ／μＬ、容器３は２．８０Ｅ＋０７  ｍｏｌ／μＬの分子量に調整し、ＤＮＡ断片を等量の割合で混合した。
４．混合したＤＮＡ断片を鋳型として、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）の標準プロトコールにしたがって、エマルジョンＰＣＲ、シークエンシングをおこない、塩基配列を得た。
５．出力された塩基配列データをＭａｆａリファレンスに対して、ｍｉｎｉｍｕｍ  ｓｃｏｒｅ  １００，  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ９８％の条件にて相同性検索（Ｂｌａｔ解析）を行い、短いリード等や使用できないようなリードを除いた。その後、各Ｍａｆａ遺伝子由来のＤＮＡ断片長とリード数とを示す図を作成した（図９）。
【００５７】
［結果及び考察］
ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、（１）Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ、（２）Ｍａｆａ−ＤＲＢ、（３）Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のいずれのＰＣＲ産物においても目的の分子量の位置に増幅産物が得られた（図８）。さらに、３本の容器内のＰＣＲ産物を混合し、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）によりＰＣＲ産物の塩基配列を決定した結果、計１３０，２３５（１７２−１９１）の塩基配列が得られ、各Ｍａｆａ遺伝子由来のリード配列が目的の分子量の位置に観察された（図９）。この際、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のリード数は全リードの８〜１０％、Ｍａｆａ−ＤＲＢは１０〜１５％、Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂは５０〜５５％であったことから、３本の容器からのＤＮＡ断片の混合比は最適であると考えられ、構造多型の観察されるＭａｆａ−Ａ、Ｍａｆａ−Ｂ及びＭａｆａ−ＤＲＢでも十分にＤＮＡタイピングが可能であるリード数であると考えられた。
【００５８】
（実施例２）
［実験目的］
本発明にて設定したマルチプレックス法がＭａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピングに好適であることを裏付けるために、複数のｃＤＮＡサンプルを用いてＰＣＲ産物の塩基配列決定を行うことを目的にした。
【００５９】
［実験方法］
従来のＳＢＴ法やサブクローニング法にてＭａｆａアリルが明確な２０個体の末梢白血球から抽出したｍＲＮＡサンプルを用いた。このｍＲＮＡを鋳型として、逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、本発明にて設定したＰＣＲ条件ならびに３本のチューブ（（容器１：Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ）、（容器２：Ｍａｆａ−ＤＲＢ）、（容器３：Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１））に分けてＰＣＲを実施した。
【００６０】
（１）ＰＣＲにはＫＯＤ  ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）酵素を用いた。すなわち、１  μＬのｃＤＮＡ溶液に、反応液全体に対しての終濃度を０．１２５〜０．３７５  ｐｍｏｌ／μＬに調整した量のＰＣＲプライマー（表１に記載したプライマー（配列番号１から１２）を使用した）、各酵素のプロトコールに準じたＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ及びＰＣＲ用酵素を加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
【００６１】
（２）これを９４度で２分間の保温後、続いて９８度で１０秒間、５８度で４５秒間、６８度で３０秒間の３ステップを１工程として、これを３５回繰り返した。なお、このＰＣＲ増幅にはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  （ライフテクノロジーズ）を用いた。
【００６２】
（３）ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
１．ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）の標準プロトコールにしたがって精製した。
２．ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準プロトコールにしたがって濃度を測定した。
３．精製したＰＣＲ産物をそれぞれ容器１は５．００Ｅ＋０７  ｍｏｌ／μＬ、容器２は１．００Ｅ＋０７  ｍｏｌ／μＬ、容器３は２．８０Ｅ＋０７  ｍｏｌ／μＬの分子量に調整し、ＤＮＡ断片を等量の割合で混合した。
４．混合したＤＮＡ断片を鋳型として、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）の標準プロトコールにしたがって、エマルジョンＰＣＲ、シークエンシングをおこない、塩基配列を得た。
５．出力された塩基配列データをＭａｆａリファレンスに対して、ｍｉｎｉｍｕｍ  ｓｃｏｒｅ  １００，  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ９８％の条件にて相同性検索（Ｂｌａｔ解析）を行い、短いリード等や使用できないようなリードを除いた。
６．５．にて抽出されたリードについて５‘末端側からのリードと３’末端側からのリードに分け、それぞれのリードについてＢｌａｔ解析を実施し、アリル候補を抽出する。これらで選択されたアリル候補のうち、５‘末端側と３‘末端側の両末端で共通に選択されたアリルを最終アリル候補とした。５〜６の過程についてはスクリプトを作成し、これを用いて自動化を図った（図１０）。
７．最終アリル候補に対して、個別にＧＳ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｐｐｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）でマッピングし、マッピング状況を確認してアリルを確定した。
【００６３】
［結果及び考察］
ＰＣＲ産物を等量ずつ混合し、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）によりＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、Ｍａｆａタイピングをおこなった。その結果、数アリルにおいては極めて遺伝子発現量が低いことが原因で本実施例では観察されなかったが、それら以外は既知情報と矛盾なくＭａｆａアリルが判定された（図１１〜図１５）。これらのアリル情報からハプロタイプにおいても既知情報と矛盾が無かった（表２）。したがって、本発明のＰＣＲ法とマルチプレックス法は、フェーズ・アンビギュイティのないＤＮＡタイピングを可能とするとともに、ＰＣＲの煩雑な操作の簡素化や迅速化に役立つ優れたツールであると考えられた。
【００６４】
【表２】
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【図１】
2015027283.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2015027283.tif 000015
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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