(57)【要約】【課題】投与対象部位全体への確実な骨形成促進材の充填が容易である骨形成促進材を提供すること。【解決手段】自己組織化ペプチドと水とを含み、２０℃〜４０℃の条件下で可逆的にゾル−ゲル転移可能であり、ｐＨが５．０〜８．０である、骨形成促進材。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己組織化ペプチドと水とを含み、２０℃〜４０℃の条件下で可逆的にゾル−ゲル転移可能であり、ｐＨが５．０〜８．０である、骨形成促進材。
【請求項２】
前記ゾル−ゲル転移において、ゾルからゲルへの相転移が、前記自己組織化ペプチドの自己組織化によって行われ、ゲルからゾルへの相転移が、ゲルに物理的刺激を加えることによって行われる、請求項１に記載の骨形成促進材。
【請求項３】
前記自己組織化ペプチドが、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基とを有する自己組織化ペプチドであって、
該極性アミノ酸残基として酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基を含み、
中性領域において、該酸性アミノ酸残基の電荷と該塩基性アミノ酸残基の電荷との総和が０を除く数であり、
水溶液中において自己組織化した際に該非極性アミノ酸残基のみが一方の面に配置されたβ−シート構造を形成しうる自己組織化ペプチドである、請求項１または２に記載の骨形成促進材。
【請求項４】
前記自己組織化ペプチドが、下記のアミノ酸配列からなる自己組織化ペプチドである、請求項１または２に記載の骨形成促進材。
アミノ酸配列：ａ１ｂ１ｃ１ｂ２ａ２ｂ３ｄｂ４ａ３ｂ５ｃ２ｂ６ａ４
（該アミノ酸配列中、ａ１〜ａ４は、塩基性アミノ酸残基であり；ｂ１〜ｂ６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、ただし、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１およびｃ２は、酸性アミノ酸残基であり；ｄは、疎水性アミノ酸残基である。）
【請求項５】
液体培地成分をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の骨形成促進材。
【請求項６】
生理活性物質をさらに含む、請求項１から５のいずれかに記載の骨形成促進材。
【請求項７】
細胞をさらに含む、請求項１から６のいずれかに記載の骨形成促進材。
【請求項８】
溶液またはゾルの形態で投与対象部位に投与され、該投与対象部位にてゲル化する、請求項１から７のいずれかに記載の骨形成促進材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己組織化ペプチドを含む骨形成促進材に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨損傷の治療法として、従来、自家骨あるいはチタン・ヒドロキシアパタイト等の人工骨を利用して生体自らの自然再生治癒を待つ方法、あるいは、機械的に骨組織を代替して機能的な回復を図る方法が用いられている。しかしながら、前者では自家骨採取時の患者への負担があり、後者では強度、生体適合性等の課題が存在している。
【０００３】
一方、生物学的に積極的に骨の再生を促進する手法として、近年、骨芽細胞等の培養細胞を患部に移植する手法や、患部への細胞足場の留置等が試みられている。当該細胞足場としては、例えば、ゼラチンおよびコラーゲンに代表される細胞外基質が用いられているが、ゼラチンおよびコラーゲンは、材料の供給源となる動物等により用途が限定されるという欠点がある。
【０００４】
これに対して、完全合成の自己組織化ペプチドの単独投与あるいは骨分化誘導因子との混合投与において骨再生の促進が報告されている（特許文献１、特許文献２、非特許文献１）。しかしながら、これまでに骨再生の促進が報告されている自己組織化ペプチドを含む骨形成促進材は、中性条件下では複雑な損傷形状や狭小な損傷形状を有する投与対象部位の隅々にまで均一に充填することが困難となる場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−８２１８０号公報
【特許文献２】特表２０１０−５０４９７２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１５，ｐ９０３−９１０，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、投与対象部位全体への確実な骨形成促進材の充填が容易である骨形成促進材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これまでに骨再生の促進が確認されている自己組織化ペプチドを含む骨形成促進材は、溶液またはゾル状態では酸性であることから、中性ｐＨとなるようにｐＨ置換を行い、これにより、不可逆的にゲル化させてから投与対象部位に投与される。これに対し、本発明者らは、常温および中性ｐＨ条件下でゾル−ゲル転移可能な骨形成促進材を用いれば、骨形成促進材をゾル状態で投与対象部位に注入し、その場でゲル化させることができ、これにより、投与対象部位が複雑な損傷形状や狭小な損傷形状を有している場合であっても、投与対象部位全体への確実な骨形成促進材の充填と保持が容易に行えることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明によれば、自己組織化ペプチドと水とを含み、２０℃〜４０℃の条件下で可逆的にゾル−ゲル転移可能であり、ｐＨが５．０〜８．０である、骨形成促進材が提供される。
１つの実施形態において、上記ゾル−ゲル転移において、ゾルからゲルへの相転移が、上記自己組織化ペプチドの自己組織化によって行われ、ゲルからゾルへの相転移が、ゲルに物理的刺激を加えることによって行われる。
１つの実施形態において、上記自己組織化ペプチドが、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基とを有する自己組織化ペプチドであって、該極性アミノ酸残基として酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基を含み、中性領域において、該酸性アミノ酸残基の電荷と該塩基性アミノ酸残基の電荷との総和が０を除く数であり、水溶液中において自己組織化した際に該非極性アミノ酸残基のみが一方の面に配置されたβ−シート構造を形成しうる自己組織化ペプチドである。
１つの実施形態において、上記自己組織化ペプチドが、下記のアミノ酸配列からなる自己組織化ペプチドである。
アミノ酸配列：ａ１ｂ１ｃ１ｂ２ａ２ｂ３ｄｂ４ａ３ｂ５ｃ２ｂ６ａ４
（該アミノ酸配列中、ａ１〜ａ４は、塩基性アミノ酸残基であり；ｂ１〜ｂ６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、ただし、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１およびｃ２は、酸性アミノ酸残基であり；ｄは、疎水性アミノ酸残基である。）
１つの実施形態において、上記骨形成促進材は、液体培地成分をさらに含む。
１つの実施形態において、上記骨形成促進材は、生理活性物質をさらに含む。
１つの実施形態において、上記骨形成促進材は、細胞をさらに含む。
１つの実施形態において、上記骨形成促進材は、溶液またはゾルの形態で投与対象部位に投与され、該投与対象部位にてゲル化する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、投与対象部位全体への確実な骨形成促進材の充填が容易である骨形成促進材が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】貯蔵弾性率の経時的変化を示すグラフである。
【図２】貯蔵弾性率の経時的変化を示すグラフである。
【図３】狭小空間への充填性を示す写真である。
【図４】骨形成促進材の注入から２１日後の骨損傷部位の写真である。
【図５】骨形成促進材の注入から２１日後の骨損傷部位における骨再生体積を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［Ａ．骨形成促進材］
本発明の骨形成促進材は、自己組織化ペプチドと水とを含む。本発明の骨形成促進材は、用途等に応じて、生理活性物質、細胞および／または液体培地成分をさらに含み得る。
【００１２】
本発明の骨形成促進材のｐＨは、５．０〜８．０であり、好ましくは５．５〜７．５であり、より好ましくは６．０〜７．０である。ｐＨが当該範囲内であると、自己組織化ペプチド間に本来意図される分子間相互作用を生じさせることができ、その結果、当該ｐＨ範囲内において可逆的なゾル−ゲル転移が可能となる。また、加熱時における自己組織化ペプチドの加水分解を回避し得るので、高圧蒸気滅菌等の加熱を伴う滅菌処理に供され得る。さらには、細胞障害性を低減することができる。骨形成促進材のｐＨは、溶液またはゾルの形態で測定することができる。
【００１３】
本発明の骨形成促進材は、２０℃〜４０℃の条件下で可逆的にゾル−ゲル転移可能である。当該温度条件下でゾル−ゲル転移可能であれば、例えば、室温の生体外で骨形成促進材をゾルとし、当該ゾルの形態の骨形成促進材を生体内の投与対象部位に充填して当該温度環境（ヒトの場合、通常、３７℃の環境）でゲル化させることができる。なお、本発明の骨形成促進材は少なくとも２０℃〜４０℃の条件下でゾル−ゲル転移可能であればよく、２０℃未満（例えば、４℃以上２０℃未満）または４０℃を超える（例えば、４０℃を超え５０℃以下）の条件下でも可逆的にゾル−ゲル転移可能であってよい。
【００１４】
上記ゾル−ゲル転移の説明に関して、「ゾル」とは、流動性を有するコロイドである。１つの実施形態において、ゾルは、溶液よりも流動性が増した状態である。ゾルである骨形成促進材は、代表的には、分散質として自己組織化ペプチドの繊維状分子集合体を含む。一方、「ゲル」とは、ゾルがゼリー状に固化したものである。ゲルである骨形成促進材においては、代表的には、繊維状分子集合体が相互作用を介して連結して、三次元網目構造を形成している。当該繊維状分子集合体および三次元網目構造は、顕微鏡（たとえば電子顕微鏡）観察によって確認することができる。また、「ゾル‐ゲル転移」とは、ゾルがゲルに、または、ゲルがゾルに相転移する現象をいう。
【００１５】
本発明の骨形成促進材の回転式レオメーターを用いた動的粘弾性測定における３７℃での貯蔵弾性率（Ｇ’）は、例えば６００Ｐａ以下であり、好ましくは１Ｐａ〜６００Ｐａ、より好ましくは１Ｐａ〜１５０Ｐａである。貯蔵弾性率が当該範囲内であれば、骨形成の足場としての機能と細胞をゲル内に侵入可能とする浸透性とを好適に両立することができる。また、投与対象部位に対する圧迫により止血効果を奏することができる。なお、本明細書でいう貯蔵弾性率は、周波数変化測定を行ったときの角振動数が１ラジアン／秒であるときの値を意味する。
【００１６】
本発明の骨形成促進材のゾル−ゲル転移において、ゾルからゲルへの相転移は、自己組織化ペプチドの自己組織化によって行われる。よって、ゲル形態の骨形成促進材は、自己組織化ペプチドゲルである。
【００１７】
一方、ゲルからゾルへの相転移は、代表的には、ゲルに物理的刺激を加えることによって行われる。物理的刺激としては、ゲルがゾルに相転移し得る限りにおいて任意の適切な刺激であり得る。物理的刺激の具体例としては、振動、撹拌、圧力変化等が挙げられる。より具体的には、ピペッティング；ボルテックス；超音波処理；ピペット、チューブ、注射器等からの押し出し；等のゲルに対してせん断力を付与し得る刺激が挙げられる。
【００１８】
［自己組織化ペプチド］
自己組織化ペプチドとしては、水溶液中においてペプチド分子同士の相互作用を介して自発的に集合してゲルを形成し得る任意の適切なペプチドが用いられ得る。より具体的には、水溶液中においてペプチド分子同士の相互作用を介して自発的に集合して繊維状分子集合体を形成し、当該分子集合体間の相互作用により三次元網目構造を発達させてゲルを形成し得るペプチドが好ましく用いられ得る。ペプチド分子同士の相互作用としては、例えば、水素結合、イオン間相互作用、ファンデルワールス力等の静電的相互作用および疎水性相互作用が挙げられる。
【００１９】
自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であってもよく、Ｄ−アミノ酸であってもよい。好ましくはＬ−アミノ酸である。また、天然アミノ酸であってもよく、非天然アミノ酸であってもよい。低価格で入手可能であり、ペプチド合成が容易であることから、好ましくは天然アミノ酸である。
【００２０】
自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基のｐＨ７．０における電荷の総和は、好ましくは０ではない。該電荷の総和は、より好ましくは−３〜−１または＋１〜＋３であり、さらに好ましくは−３、−２、＋２または＋３である。このように、中性領域において自己組織化ペプチドに含まれるアミノ酸残基の側鎖に由来するプラス電荷とマイナス電荷とが相殺されないことにより、ゲル形成に適した静電的引力及び斥力のバランスが保たれ、その結果として、中性領域で透明かつ安定なゲルを形成し得るからである。なお、本明細書において、「中性領域」とは、ｐＨ５．０〜８．０、好ましくはｐＨ５．５〜７．５、より好ましくはｐＨ６．０〜７．０、さらに好ましくはｐＨ７．０の領域をいう。
【００２１】
各ｐＨにおける上記自己組織化ペプチドの電荷は、例えば、レーニンジャー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）〔Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９７９〕の方法に従って算出され得る。レーニンジャーの方法は、例えば、ＥＭＢＬ  ＷＷＷ  Ｇａｔｅｗａｙ  ｔｏ  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｐｏｉｎｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ｃｇｉ／ｐｉ−ｗｒａｐｐｅｒ．ｐｌ）上で利用可能なプログラムにより行なわれ得る。
【００２２】
本発明に好ましく使用され得る自己組織化ペプチドの具体例としては、下記の式（Ｉ）のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
ａ１ｂ１ｃ１ｂ２ａ２ｂ３ｄｂ４ａ３ｂ５ｃ２ｂ６ａ４      （Ｉ）
（上記アミノ酸配列中、ａ１〜ａ４は、塩基性アミノ酸残基であり；ｂ１〜ｂ６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、ただし、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１およびｃ２は、酸性アミノ酸残基であり；ｄは、疎水性アミノ酸残基である。）
【００２３】
上記アミノ酸配列中、ａ１〜ａ４は、塩基性アミノ酸残基である。塩基性アミノ酸は、好ましくはアルギニン、リシン、またはヒスチジンであり、より好ましくはアルギニンまたはリシンである。これらのアミノ酸は、塩基性が強いからである。ａ１〜ａ４は、同一のアミノ酸残基であってもよく、異なるアミノ酸残基であってもよい。
【００２４】
上記アミノ酸配列中、ｂ１〜ｂ６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基である。疎水性アミノ酸は、好ましくはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、またはプロリンである。非電荷極性アミノ酸は、好ましくはチロシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、またはシステインである。これらのアミノ酸は、入手が容易だからである。
【００２５】
好ましくは、ｂ３およびｂ４は、それぞれ独立して任意の適切な疎水性アミノ酸残基であり、さらに好ましくはロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、またはイソロイシン残基であり、特に好ましくはロイシン残基またはアラニン残基である。
【００２６】
好ましくは、ｂ１〜ｂ６はすべて疎水性アミノ酸残基である。自己組織化ペプチドが好適にβシート構造を形成し、自己組織化し得るからである。より好ましくは、ｂ１〜ｂ６は、それぞれ独立してロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、またはイソロイシン残基であり、さらに好ましくはロイシン残基またはアラニン残基である。好ましい実施形態においては、ｂ１〜ｂ６のうちの４個以上がロイシン残基であり、より好ましくはそのうちの５個以上がロイシン残基であり、さらに好ましくは全てがロイシン残基である。
【００２７】
上記アミノ酸配列中、ｃ１およびｃ２は、酸性アミノ酸残基である。酸性アミノ酸は、好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸である。これらのアミノ酸は、入手が容易だからである。ｃ１およびｃ２は、同一のアミノ酸残基であってもよく、異なるアミノ酸残基であってもよい。
【００２８】
上記アミノ酸配列中、ｄは、疎水性アミノ酸残基である。ｄは、好ましくはアラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、またはイソロイシン残基である。
【００２９】
１つの好ましい実施形態においては、ｂ３、ｄ、ｂ４の連続する３つのアミノ酸残基のうち２つがロイシン残基であり、残りがアラニン残基である。この場合、ｂ３、ｄ、ｂ４のいずれがアラニン残基であってもよい。また、別の好ましい実施形態においては、ｂ３、ｄ、ｂ４の連続する３つのアミノ酸残基がすべてロイシン残基である。
【００３０】
式（Ｉ）のアミノ酸配列の好ましい具体例を以下に例示する。
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号１）
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＬＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号２）
ｎ−ＲＡＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号３）
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＡＲ−ｃ（配列番号４）
ｎ−ＲＡＤＬＲＬＬＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号５）
ｎ−ＲＡＤＬＲＬＬＬＲＬＤＡＲ−ｃ（配列番号６）
ｎ−ＲＬＤＬＲＡＬＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号７）
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＬＡＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号８）
【００３１】
本発明に好ましく使用され得る別の自己組織化ペプチドとしては、ＷＯ２００７／０００９７９に記載のペプチド、すなわち、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基（疎水性アミノ酸残基）とを有する自己組織化ペプチドであって、該極性アミノ酸残基として酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基を含み、中性領域において、該酸性アミノ酸残基の電荷と該塩基性アミノ酸残基の電荷との総和が０を除く数であり、水溶液中において自己組織化した際に該非極性アミノ酸残基のみが一方の面に配置されたβ−シート構造を形成しうる自己組織化ペプチドが挙げられる。
【００３２】
上記自己組織化ペプチドのなかでも、極性アミノ酸として、酸性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基と非電荷極性アミノ酸とを含むペプチドが好ましい。係る自己組織化ペプチドの好ましい具体例を以下に例示する。
ｎ−ＲＡＳＡＲＡＤＡＲＡＳＡＲＡＤＡ−ｃ（配列番号９）
ｎ−ＲＡＮＡＲＡＤＡＲＡＮＡＲＡＤＡ−ｃ（配列番号１０）
ｎ−ＲＡＡＡＲＡＤＡＲＡＡＡＲＡＤＡ−ｃ（配列番号１１）
ｎ−ＲＡＳＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＳＡ−ｃ（配列番号１２）
ｎ−ＲＡＤＡＲＡＳＡＲＡＳＡＲＡＤＡ−ｃ（配列番号１３）
ｎ−ＲＡＳＡＲＡＳＡＲＡＳＡＲＡＤＡ−ｃ（配列番号１４）
ｎ−ＲＡＳＡＲＡＤＡＲＡＳＡ−ｃ        （配列番号１５）
ｎ−ＫＡＳＡＫＡＥＡＫＡＳＡＫＡＥＡ−ｃ（配列番号１６）
ｎ−ＳＡＥＡＫＡＥＡＳＡＥＡＫＡＥＡ−ｃ（配列番号１７）
ｎ−ＫＬＳＬＫＬＤＬＫＬＳＬ−ｃ        （配列番号１８）
ｎ−ＫＬＡＬＫＬＤＬＫＬＡＬ−ｃ        （配列番号１９）
【００３３】
上記自己組織化ペプチドは、任意の適切な製造方法によって製造され得る。例えば、Ｆｍｏｃ法等の固相法又は液相法等の化学合成方法、遺伝子組換え発現等の分子生物学的方法が挙げられる。
【００３４】
上記自己組織化ペプチドは、目的等に応じて任意の適切な修飾が施されていてもよい。修飾が行われる部位は、特に限定されず、例えば、自己組織化ペプチドのＮ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基、またはその両方が挙げられる。
【００３５】
上記修飾としては、修飾後のペプチドが自己組織化能を有する範囲において任意の適切な修飾が選択され得る。例えば、Ｎ末端アミノ基のアセチル化、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化等の保護基の導入；アルキル化、エステル化、またはハロゲン化等の官能基の導入；水素添加；単糖、二糖、オリゴ糖、または多糖等の糖化合物の導入；脂肪酸、リン脂質、または糖脂質等の脂質化合物の導入；アミノ酸またはタンパク質の導入；ＤＮＡの導入；その他生理活性を有する化合物等の導入が挙げられる。修飾は１種のみ行われてもよく、２種以上を組み合わせて行ってもよい。例えば、上記自己組織化ペプチドのＣ末端に所望のアミノ酸を導入した付加ペプチドのＮ末端をアセチル化し、Ｃ末端をアミド化してもよい。
【００３６】
アミノ酸またはタンパク質が導入される場合、導入されるアミノ酸の数は、好ましくは１〜１８０であり、より好ましくは１〜５０、さらに好ましくは１〜３０、特に好ましくは１〜１０、最も好ましくは１〜５である。導入するアミノ酸残基数が１８０を超えると、自己組織化能が損なわれる場合がある。
【００３７】
本発明の骨形成促進材は、一種類のみの自己組織化ペプチドを含んでもよく、二種以上の自己組織化ペプチドを含んでもよい。
【００３８】
本発明の骨形成促進材における自己組織化ペプチドの濃度は、組成、用途等に応じて適切に設定され得る。自己組織化ペプチドの濃度は、好ましくは０．１重量％〜５．０重量％、より好ましくは０．１重量％〜１．５重量％、さらに好ましくは０．２重量％〜１．０重量％である。上記範囲の濃度であれば、本発明の効果が好適に得られ得る。
【００３９】
［水］
水としては、イオン交換水、蒸留水等の精製された水が好ましく用いられ得る。
【００４０】
本発明の骨形成促進材の含水率（％）（＝骨形成促進材中の水の重量／骨形成促進材の総重量×１００）は、例えば８０％〜９９．９％、好ましくは８５％〜９９.８％であり得る。
【００４１】
［細胞］
本発明の骨形成促進材が含み得る細胞としては、用途等に応じて任意の適切な細胞であり得る。細胞の具体例としては、歯髄幹細胞等の間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の万能細胞、破骨細胞、骨芽細胞等の骨形成に直接関与する細胞およびその前駆細胞、骨形成に関与する細胞の分化および機能発現等に関与する細胞、免疫・炎症機能に関与する細胞、細胞移動および／または分裂の制御を行っている細胞、細胞外基質の合成・分泌を行っている細胞およびその制御を行っている細胞等が挙げられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でも良く、それを継代培養したものでも良く、あるいは、それらを保存（凍結保存、低温保存）したものでも良い。細胞はまた、骨形成促進材の中で所定期間培養されていてもよく、培養期間中に他の細胞への分化あるいは脱分化がおこなわれたものでもよい。培養期間は、投与対象、細胞の種類等によって異なるが、例えば、１日〜２０日程度であり得る。
【００４２】
細胞の由来は、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、サル等であり得る。
【００４３】
［生理活性物質］
本発明の骨形成促進材が含み得る生理活性物質としては、骨もしくは軟骨の分化を誘導または促進する分化制御因子（例えば、ＴＧＦ−β）；骨形成因子；成長ホルモン；ＥＧＦ、ＦＧＦ等の細胞機能制御因子；インターフェロン、インターロイキン等の免疫または炎症関連因子；等が挙げられる。骨形成因子の具体例としては、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−９等のＢＭＰファミリーが挙げられる。これらのヒトＢＭＰは、すでにクローニングされているので、その塩基配列に基づいて遺伝子工学的手法によって得ることができる。
【００４４】
本発明の骨形成促進材における生理活性物質の濃度は、通常０．０００１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ、好ましくは０．０１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍである。当該濃度範囲であれば、生理活性物質の作用が好適に発揮されて、骨形成が促進され得る。
【００４５】
［他の添加物］
本発明の骨形成促進材は、必要に応じて任意の適切な添加物をさらに含み得る。添加物の具体例としては、ｐＨ調整剤；緩衝剤；等張化剤；塩類；アミノ酸類；ビタミン類；アルコール類；細胞培養用培地成分；蛋白質；薬物等が挙げられる。これらの添加物は、単独で用いられてもよく、二種以上を組み合わせて用いられてもよい。
【００４６】
ｐＨ調整剤としては、塩酸、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。
【００４７】
緩衝剤としては、リン酸、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等のリン酸塩；ホウ酸、ホウ砂、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウム等のホウ酸塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム等のクエン酸塩；酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸塩、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ等が挙げられる。
【００４８】
等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の塩化物；グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖；スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース等の二糖；マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール；等が挙げられる。
【００４９】
塩類としては、上記で例示した添加物以外の任意の適切な塩が用いられ得る。例えば、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が挙げられる。
【００５０】
細胞培養用培地成分としては、目的等に応じて任意の適切な液体培地成分が選択され得る。液体培地としては、例えば、イーグル培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭα）等が挙げられる。
【００５１】
上記添加物の添加量は、その目的等に応じて任意の適切な値に設定され得る。
【００５２】
［Ｂ．調製方法］
本発明の骨形成促進材の調製方法は、自己組織化ペプチドと水と任意の構成成分とを混合することを含む。これにより、溶液の形態の骨形成促進材が得られ得る。混合順は特に限定されず、目的等に応じて適切に設定される。例えば、自己組織化ペプチドを均一に分散または溶解させる観点から、細胞等の激しい撹拌に不向きな構成成分は、自己組織化ペプチドと水との混合後に添加され得る。
【００５３】
必要に応じて、自己組織化ペプチドと水と任意の構成成分との混合によって得られた溶液の形態の骨形成促進材を静置する。これにより、自己組織化ペプチドが溶液中においてペプチド分子同士の相互作用を介して自発的に集合して繊維状の分子集合体を形成し、ゾルの形態となる。さらに静置を続けることにより、当該分子集合体間の相互作用によって三次元網目構造が発達してゲルの形態となる。静置時間および静置温度は、投与対象、自己組織化ペプチドの濃度および種類等に応じて適切に設定され得る。
【００５４】
本発明の骨形成促進材の調製方法は、ろ過等の精製；高圧蒸気滅菌、放射線滅菌、乾熱滅菌等の滅菌；包装容器への分注；等の任意の工程をさらに含み得る。
【００５５】
１つの実施形態において、骨形成促進材の調製方法は、例えば、自己組織化ペプチドと水と細胞培養用培地成分と任意の他の構成成分とを混合すること、得られた混合液中に細胞（例えば、骨芽細胞、歯髄幹細胞等）を加えて懸濁すること、得られた細胞懸濁液を静置してゲル化させることを含み得る。必要に応じて、さらに、得られたゲルを細胞培養に適した条件下に配置して、細胞を培養することを含んでもよい。細胞培養に適した条件は、細胞の種類に応じて当業者が適切に設定することができる。
【００５６】
上記細胞培養工程を含む調製方法によれば、ゲル内で包埋培養された細胞を含む骨形成促進材が得られ得る。培養された細胞は、分化誘導された状態または増殖に適した状態であり得るので、このような状態の細胞を含む骨形成促進材を投与することにより、良好な骨形成が期待できる。
【００５７】
［Ｃ．使用方法］
本発明の骨形成促進材は、好ましくは溶液またはゾルの形態で投与対象部位に投与され、該投与対象部位にてゲル化して留置される。複雑または狭小な投与対象部位（例えば、骨のひび割れの間隙）の隅々まで充填し、かつ、漏れを低減する観点からは、ゾルの形態で投与し投与対象部位でゲル化させることが好ましい。もちろん、ゲルの形態の骨形成促進材を投与対象部位に投与（注入）してもよい。
【００５８】
１つの実施形態において、本発明の骨形成促進材の使用方法は、溶液またはゾルの形態の骨形成促進材を準備すること、溶液またはゾルの形態の骨形成促進材を投与対象部位に注入すること、および、投与対象部位にて骨形成促進材をゲル化させること、を含む。
【００５９】
溶液形態の骨形成促進材は、その構成成分を混合することによって得られ得る。一方、ゾル形態の骨形成促進材は、溶液形態の骨形成促進材を静置して自己組織化ペプチドの自己組織化を進行させること、または、一旦ゲル化した骨形成促進材に物理的刺激を与えることによって得られ得る。従来の骨形成促進材では、例えば特許文献２の０１７１段落に記載されているように中性ｐＨにすると急激に、かつ、不可逆的にゲル化してしまうために中性のゾルを投与対象部位に投与することは非常に困難であった。これに対し、本発明の骨形成促進材は、中性ｐＨを有し、かつ、所定の温度条件下で可逆的なゾル−ゲル転移が可能であるので、ゾルの形態で生理的環境にある投与対象部位に投与し、その場でゲル化させ、留置することが可能である。
【００６０】
物理的刺激としては、ゲルを形成する繊維状分子集合体が維持される程度の刺激が好ましい。例えば、超音波照射、ピペッティング、ボルテックス等が挙げられる。
【００６１】
骨形成促進材の投与対象部位への注入は、シリンジ、チューブ、ピペット等の任意の適切な手段を用いて行われ得る。
【００６２】
投与対象部位は通常生理的環境下であることから、投与対象部位における本発明の骨形成促進材のゲル化は、自発的に進行し得る。
【００６３】
本発明の骨形成促進材は生体分解性に優れることから、投与対象部位における骨形成に伴って経時的に分解または吸収され得る。
【００６４】
本発明の骨形成促進材は、例えば、骨組織、歯周組織等における欠損部位の修復等に用いられ得る。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００６６】
［試験例１：ゾル−ゲル転移能の評価］
自己組織化ペプチド溶液（ＳＰＧ−１７８（Ｎ末端がアセチル化され、Ｃ末端がアミド化された配列番号１のペプチド）の１重量％溶液、ｐＨ６．６０）を室温で静置してゲル化させたものを試料１として用いた。また、自己組織化ペプチド溶液（３Ｄマトリックス社製、製品名「ＰｕｒａｍａｔｒｉｘＴＭ」、Ａｃ−ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ−ＣＯＮＨ２の１重量％溶液）３００μＬに１％Ｎａ２ＣＯ３−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８２）１０００μＬを重層静置し、全体がゲル化したことを確認後、上清を除去し、これにより残ったゲル塊を試料２として用いた。なお、ｐＨは、溶液形態の試料のｐＨをポータブルｐＨメーター（堀場製作所社製、製品番号「Ｂ−７１２」）を用いて測定した。
【００６７】
試料１および２を機械的にせん断し、せん断直後からの貯蔵弾性率の変化を経時的に測定した。貯蔵弾性率の測定方法は以下のとおりである。
≪貯蔵弾性率の測定１≫
動的粘弾性測定装置である回転式レオメーター（ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、製品名「ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＲＨＥＯＭＥＴＥＲ  ＡＲ  １０００」）を用いて貯蔵弾性率Ｇ’を測定した。具体的には、以下のとおりである。まず、試料に接触させるためのジオメトリー（アルミニウム製コーン、直径２０ｍｍ、コーン角１°、ギャップ２４μｍ）と試料台を一定の温度に保つための恒温槽とをレオメーターに取り付けた。次いで、温度：３７℃、トルク：１μＮ・ｍ、周波数：１ｒａｄ／ｓの測定条件下、以下の手順で測定を行った。測定の概要は、予備せん断によりゲルに物理的な力を与えたのち、貯蔵弾性率の継時変化を観察するという内容である。
（１）ピペットを用いて５５μＬの試料をレオメーターの試料台に配置する。
（２）ジオメトリーを試料台から２４μｍのギャップまで移動させ、試料と接触させる。
（３）ジオメトリーをわずかに動かし、試料となじませる。
（４）試料からの溶媒の揮発を防止するためソルベントラップをとりつける。
（５）１０Ｐａまたは１００Ｐａでジオメトリーを３０秒間回転させることにより予備せん断を行う。
（６）約２０秒間隔で貯蔵弾性率を継時的に測定する。
【００６８】
上記予備せん断の結果、試料１のゲルは無色透明の流動体となり、その後、室温で放置することにより、継時的に弾性貯蔵率が上昇して再びゲル化した（図１参照）。このことから、試料１は常温中性条件下で可逆的なゾル−ゲル転移が可能であることがわかる。一方、試料２のゲルは、予備せん断によりゲルが崩壊し、細片ゲルの懸濁状態となった。その後、室温で放置したが、弾性貯蔵率の上昇は認められなかった（図２参照）。このことから、試料２は、常温中性条件下では可逆的にゾル−ゲル転移できないことが分かる。
【００６９】
［試験例２：充填性評価］
自己組織化ペプチド溶液（ＳＰＧ−１７８（Ｎ末端がアセチル化され、Ｃ末端がアミド化された配列番号１のペプチド）の１重量％溶液、ｐＨ６．６０）を等量の純水で希釈し、得られた希釈液を室温で静置してゲル化させたものを試料３として用いた。また、自己組織化ペプチド溶液（３Ｄマトリックス社製、製品名「ＰｕｒａｍａｔｒｉｘＴＭ」、Ａｃ−ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ−ＣＯＮＨ２の１重量％溶液）を等量の純水で希釈し、得られた希釈液（ゾル）３００μＬに１％Ｎａ２ＣＯ３−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８４）１０００μＬを重層静置し、全体がゲル化したことを確認後、上清を除去し、これにより残ったゲル塊を試料４として用いた。
【００７０】
上記試料３および４を用いて骨損傷により生じたひび割れ等の狭小部を想定したモデル系を作成し、以下のようにして充填性を評価した。
≪充填性評価≫
生物用カバーグラス（マツナミガラス製  １８ｍｍ×１８ｍｍ）を組み合わせて、開口部を有する直方体型の狭小空間（幅：０．９ｍｍ〜１．１ｍｍ、高さ：０．１２ｍｍ〜０．１７ｍｍ）を作成した。数回ピペッティングすることによってせん断処理を施した試料３および４を該開口部にそれぞれ約５０μＬ滴下し、約２０秒後の充填状態を観察した。結果を図３（ａ）および（ｂ）に示す。
【００７１】
試料３のゲルは、せん断処理によって無色透明な流動性の高いゾルになり、上記狭小空間への円滑な浸透が認められた（図３（ａ）参照）。一方、試料４のゲルは、せん断処理によりゲルが崩壊して細片ゲルの懸濁状態となり、液相成分は上記狭小空間に速やかに浸透を始めたが、ゲル細片が詰まって開口部の外側に残留した（図３（ｂ）参照）。
【００７２】
［試験例３：ペプチド濃度と貯蔵弾性率との関係評価］
自己組織化ペプチド（ＳＰＧ−１７８）の粉末を純水に添加し、自転公転撹拌装置で混和して、ペプチド濃度が異なる３種類の自己組織化ペプチド溶液（０．４重量％、０．８重量％および１．５重量％）を得た。得られた自己組織化ペプチド溶液を常温で静置して自己組織化ペプチドゲルを得た。得られたゲルの貯蔵弾性率を以下のようにして測定した。結果を自己組織化ペプチド溶液のｐＨとともに表１に示す。なお、自己組織化ペプチド溶液のｐＨは、ポータブルｐＨメーター（堀場製作所社製、製品番号「Ｂ−７１２」）を用いて測定した。
【００７３】
≪貯蔵弾性率の測定２≫
動的粘弾性測定装置である回転式レオメーター（ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、製品名「ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＲＨＥＯＭＥＴＥＲ  ＡＲ  １０００」）を用いて、試料（ゲル）の貯蔵弾性率Ｇ’を測定した。具体的には、以下のとおりである。まず、試料に接触させるためのジオメトリー（アルミニウム製コーン、直径２０ｍｍ、コーン角１°、ギャップ２４μｍ）と試料台を一定の温度に保つための恒温槽とをレオメーターに取り付けた。次いで、温度：３７℃、トルク：１μＮ・ｍ、周波数：０．５ｒａｄ／ｓ〜１００ｒａｄ／ｓの測定条件下、以下の測定手順で１つの試料について３回測定し、１ｒａｄ／ｓのときの値の平均値を貯蔵弾性率Ｇ’とした。
（１）ピペットを用いて５５μＬの試料をレオメーターの試料台に配置する。
（２）ジオメトリーを試料台から２４μｍのギャップまで移動させ、試料と接触させる。
（３）ジオメトリーをわずかに動かし、試料となじませる。
（４）ジオメトリーの動きを止めてから１５秒後（この１５秒の間に、試料からの溶媒の揮発を防止するためのソルベントトラップを取り付ける）に、測定を開始する。
【００７４】
【表１】
2015144767.tif 000002
【００７５】
［実施例１］
自己組織化ペプチド（ＳＰＧ−１７８）の０．４重量％水溶液とＭＥＭα培地とを１：１（体積比）で混和して静置することによりゲル状の骨形成促進材１を得た。
【００７６】
［実施例２］
自己組織化ペプチド（ＳＰＧ−１７８）０．４重量％水溶液と０．０００１％（ｗ／ｖ）ＢＭＰ−４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製、製品番号「３１４−ＢＰ」）含有ＭＥＭα培地とを１：１（体積比）で混和して静置することによりゲル状の骨形成促進材２を得た。
【００７７】
［実施例３］
自己組織化ペプチド（ＳＰＧ−１７８）０．４重量％水溶液とＳＤラット由来自家調整ラット歯髄幹細胞を４．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度で懸濁した０．０００１％（ｗ／ｖ）ＢＭＰ−４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製、製品番号「３１４−ＢＰ」）含有ＭＥＭα培地とを１：１（体積比）で混和して静置することによりゲル状の骨形成促進材３を得た。
【００７８】
上記骨形成促進材１〜３に関して、骨修復作用を評価した。具体的には、以下のとおりである。
（骨損傷モデルの作製）
４〜５週齢のＳＤラット（日本クレア）を全身麻酔後、頭頂部皮膚を切開し、歯科用インプラントバー５．０（テクニカ社製）を用いて頭蓋骨頭頂部中央、正中線をまたぐ位置に直径５ｍｍの貫通孔を一個体につき一か所作成した。
【００７９】
（骨損傷部位への骨形成促進材の注入）
室温において、骨形成促進材１を数回ピペッティングしてゾル化させた。得られたゾル７０μＬを上記骨損傷部位に注入した。なお、ゾルは流動性が高いために、骨損傷部位の隅々まで充填することが容易であり、充填後数分以内にゲル化して骨損傷部位に固定された。ゲル化を確認後、皮膚を縫合した。麻酔の覚醒を確認の上で、所定の動物飼育施設に移管して２１日間飼育を行った。骨形成促進材２および３についても別個体を用いて同様に骨損傷部位を作成し、充填を行った。なお、骨損傷部位を作成後、何も充填せずに皮膚縫合を行うこと以外は実施例１と同様にした試験区を設け、コントロールとした。
【００８０】
（修復度評価）
骨損傷部位への骨形成促進材の注入から２１日後にＣＯ２処理により安楽死処置を行った。頭蓋骨摘出後、実験動物用３ＤマイクロＣＴ撮影装置「Ｒ−ｍＣＴ（Ｒｉｇａｋｕ社製）」を用いて骨再生体積を測定した。注入から２１日後の骨損傷部位のＣＴスキャン画像を図４に示す。また、骨損傷部位における骨再生体積を図５に示す。
【００８１】
（結果）
図４および図５から明らかなとおり、本発明の骨形成促進材１〜３はいずれも優れた骨形成促進作用を示した。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の骨形成促進材は、研究開発や医療の分野において好適に利用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図５】
2015144767.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【配列表】
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