(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出、特に粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶの有用な増幅プライマー及び検出プローブ、それを用いた増幅及び検出系の提供。【解決手段】増幅及び検出系は、群を標的とする系であり、すなわち、Ａ５、Ａ６、Ａ７及びＡ９を標的とする。増幅及び検出系は、マルチプレックスでのＨＰＶの増幅ならびにリアルタイム検出を可能にし、シングルチューブアッセイにおいて少なくとも１３の潜在的に高いリスクのＨＰＶを検出することができる。さらに、リアルタイムマルチプレックス増幅において信頼できるＨＰＶの定量を可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粘膜上皮に対して発癌性であり得る少なくとも１のＨＰＶをサンプル中において検出する方法であって、前記検出は、少なくとも１のアンプリコンが、増幅プライマーを用いた増幅により、前記サンプルまたはそれらの核酸物質から作られたかどうかを決定することを含んでなり、少なくとも１のアンプリコンの生成は、粘膜上皮に対して発癌性であり得る少なくとも１のＨＰＶが前記サンプル中に存在することを示し、前記増幅プライマーは、
−Ａ６群の発癌性ＨＰＶを標的とすることが意図された少なくとも２のプライマー；
ここで、前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも１のＡ６参照鋳型配列の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適しており、前記少なくとも１のＡ６参照鋳型配列は、配列番号４２０（受付番号NC_001594.1）のＨＰＶ５６配列の４１３〜７９１位からなる断片（配列番号３３７）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ６を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片である
および／または
−Ａ５群の発癌性ＨＰＶを標的とすることが意図された少なくとも２のプライマー；
ここで、前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも１のＡ５参照鋳型配列の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適しており、前記少なくとも１のＡ５参照鋳型配列は、配列番号４２１（受付番号NC_001533.1）のＨＰＶ５１配列の６７８〜９０２位からなる断片（配列番号３２６）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ５を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片である
および／または
−Ａ９群の発癌性ＨＰＶを標的とすることが意図された少なくとも２のプライマー；
ここで、前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも１のＡ９参照鋳型配列の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適しており、前記少なくとも１のＡ９参照鋳型配列は、配列番号４２２（受付番号NC_001526.1）のＨＰＶ１６配列の２７０７〜２７９４位からなる断片（配列番号１２２）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ９を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片であるか、または、配列番号４２２（受付番号NC_001526.1）のＨＰＶ１６配列の３６００〜３８４０位からなる断片（配列番号３７７）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ９を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片である
および／または
−Ａ７群の発癌性ＨＰＶを標的とすることが意図された少なくとも２のプライマー；
ここで、前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、少なくとも１のＡ７参照鋳型配列の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適しており、前記少なくとも１のＡ７参照鋳型配列は、配列番号４２３（受付番号NC_001357.1）のＨＰＶ１８配列の１８９５〜２１０３位からなる断片（配列番号４８）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ７を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片であるか、または、配列番号４２３（受付番号NC_001357.1）のＨＰＶ１８配列の９１６〜１０４４位からなる断片（配列番号６５）であるか、もしくは、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ７を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているその保存的な細断片であるを含んでなることを特徴とする方法：
ここで、前記Ａ６、Ａ５、Ａ９およびＡ７参照鋳型配列は、少なくとも５の最も一般的なＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５の群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ（ＨＰＶ５６、５１、５８、３３、５２、３５、３１、１６、６８、３９、５９、４５および１８）のリアルタイムマルチプレックス増幅、特にそのようなＨＰＶのリアルタイムの定量的なマルチプレックス増幅を可能にするプライマーおよびアンプリコンアニーリングプローブを構築および産生するのに適した、群に基づく参照鋳型配列であるという特別な技術的特徴を有する。
【請求項２】
請求項１に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ６参照鋳型配列は、配列番号２５〜２９および３３４〜３３８の１つであり、前記Ａ６参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にするＡ６を標的とするプライマーを構築および産生するのに適した参照であるという特別な技術的特徴を有することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ５参照鋳型配列は、配列番号１〜５および３２０〜３３３の１つであり、前記Ａ５参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にするＡ５を標的とするプライマーを構築および産生するのに適した参照であるという特別な技術的特徴を有することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ９参照鋳型配列は、配列番号１２２〜２１０および３５９〜４１９の１つであり、前記Ａ９参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にするＡ９を標的とするプライマーを構築および産生するのに適した参照であるという特別な技術的特徴を有することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ７参照鋳型配列は、配列番号４６〜６７および３３９〜３５８の１つであり、前記Ａ７参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にするＡ７を標的とするプライマーを構築および産生するのに適した参照であるという特別な技術的特徴を有することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、以下のＡ９群のＨＰＶ；ＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３１のそれぞれに由来するＥ１およびＥ２遺伝子からなるＡ９標的領域に由来する少なくとも８０〜２６０ヌクレオチド、好ましくは８５〜２５０ヌクレオチド、より好ましくは８８〜２４１ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適した配列であること、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーは、１４〜３０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、その配列は、以下のＡ７群のＨＰＶ；ＨＰＶ６８、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ４５のそれぞれに由来するＥ１遺伝子からなるＡ７標的領域に由来する少なくとも１００〜２２０ヌクレオチド、好ましくは１２０〜２１５ヌクレオチド、より好ましくは１２５〜２０９ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適した配列であること
を特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載のＨＰＶ検出方法であって、
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーは、さらに、ＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ５３のＥ６およびＥ７遺伝子からなるＡ６標的領域に由来する少なくとも９０〜３９０ヌクレオチド、好ましくは９５〜３８５ヌクレオチド、より好ましくは１００〜３７９ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適していること、および／または
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーは、さらに、ＨＰＶ８２のＥ７およびＥ１遺伝子からなるＡ５標的領域に由来する少なくとも９０〜２４０ヌクレオチド、好ましくは１００〜２３０ヌクレオチド、より好ましくは１０６〜２２５ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適していること、および／または
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーは、さらに、ＨＰＶ６７のＥ１およびＥ２遺伝子からなるＡ９標的領域に由来する少なくとも８０〜２６０ヌクレオチド、好ましくは８５〜２５０ヌクレオチド、より好ましくは８８〜２４１ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適していること、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーは、さらに、ＨＰＶ８５のＥ１およびＥ２遺伝子からなるＡ７標的領域に由来する少なくとも１００〜２２０ヌクレオチド、好ましくは１２０〜２１５ヌクレオチド、より好ましくは１２５〜２０９ヌクレオチドの少なくとも１の核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適していることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のプ
ライマーは１７〜２５ヌクレオチドからなることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１の粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶは、発癌性の肛門性器ＨＰＶであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１の粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶは、発癌性の子宮頸部ＨＰＶであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のプライマーは、Ａ６群またはＡ５群またはＡ９群またはＡ７群に特異的であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅はシングルチューブマルチプレックス増幅であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅プライマーは、前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも２のプライマーを含んでなることを特徴とする方法：
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅プライマーは、前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも２のプライマーを含んでなることを特徴とする方法：
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅プライマーは、前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも２のプライマーを含んでなることを特徴とする方法：
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅プライマーは、前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも２のプライマーを含んでなることを特徴とする方法：
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマー。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅プライマーは、
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー
を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、前記少なくとも１のアンプリコンにアニールすることが意図された少なくとも１のプローブを用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅はリアルタイム増幅であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、少なくとも１のＡ６および／またはＡ５および／またはＡ９および／またはＡ７を標的とするプローブを使用することにより行われ、その配列は、前記少なくとも２のＡ６および／またはＡ５および／またはＡ９および／またはＡ７を標的とするプライマーによりそれぞれ産生される少なくとも１のアンプリコンの検出のためのプローブとして使用するのに適していることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅はリアルタイムマルチプレックス増幅であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅は定量的なリアルタイムマルチプレックス増幅であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーは、配列番号３０〜３４の少なくとも１（フォワードプライマー）および配列番号３５〜３７の少なくとも１（リバースプライマー）であることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号３８〜４０の１つもしくはそれらに相補的な配列の１つからなる少なくとも１のＡ６を標的とするプローブ、ならびに任意に少なくとも１の５’および／または３’検出標識および／またはクエンチャーもしくはレポーターを運ぶことが意図された少なくとも１のＨＰＶとは無関係なアームを用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ６を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号４１〜４５の１つまたはそれらに相補的な配列の１つであることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーは、配列番号６〜１０の少なくとも１（フォワードプライマー）および配列番号１１〜１５の少なくとも１（リバースプライマー）であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号１６〜１９の１つもしくはそれらに相補的な配列の１つからなる少なくとも１のＡ５を標的とするプローブ、ならびに任意に少なくとも１の検出標識および／またはクエンチャーもしくはレポーターを運ぶことが意図された少なくとも１のＨＰＶとは無関係のアームを用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ５を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号２０〜２４の１つまたはそれらに相補的な配列の１つであることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーは、配列番号２１１〜２３９の少なくとも１（フォワードプライマー）および配列番号２４０〜２６５の少なくとも１（リバースプライマー）であることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号２６６〜２８２の１つまたはそれらに相補的な配列の１つからなる少なくとも１のＡ９を標的とするプローブ、ならびに任意に、少なくとも１の検出標識および／またはクエンチャーもしくはレポーターを運ぶことが意図された少なくとも１のＨＰＶとは無関係のアームを用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ９を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号２８３〜３１９の１つまたはそれらに相補的な配列の１つであることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーは、配列番号６８〜７８の少なくとも１（フォワードプライマー）および配列番号７９〜８７の少なくとも１（リバースプライマー）であることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のアンプリコンが産生されたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号８８〜１０１の１つまたはそれらに相補的な配列の１つからなる少なくとも１のＡ７を標的とするプローブ、ならびに任意に、少なくとも１の検出標識および／またはクエンチャーもしくはレポーターを運ぶことが意図された少なくとも１のＨＰＶとは無関係のアームを用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記少なくとも１のＡ７を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号１０２〜１２１の１つまたはそれらに相補的な配列の１つであることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のＨＰＶ検出方法であって、前記増幅はＰＣＲであることを特徴とする方法。
【請求項３６】
Ａ６、Ａ５、Ａ９またはＡ７群の少なくとも１のＨＰＶを含有するＨＰＶ含有サンプルにおいて、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法の実行により得られるアンプリコン。
【請求項３７】
Ａ６、Ａ５、Ａ９およびＡ７群のＨＰＶを増幅するためにシングルチューブマルチプレックスにおいて使用することができるプライマーの設計において、ならびに前記増幅されたＨＰＶのリアルタイム検出のための前記シングルチューブマルチプレックスにおいて使用することができるプローブの設計において、参照鋳型配列として使用するのに適したポリヌクレオチドであって、前記参照鋳型ポリヌクレオチドは、
−Ａ６群について：配列番号４２０（受付番号NC_001594.1）のＨＰＶ５６配列の４１３〜７９１位からなる断片（配列番号３３７）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列；
−Ａ５群について：配列番号４２１（受付番号NC_001533.1）のＨＰＶ５１配列の６７８〜９０２位からなる断片（配列番号３２６）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列；
−Ａ９群について：配列番号４２２（受付番号NC_001526.1）のＨＰＶ１６配列の２７０７〜２７９４位からなる断片（配列番号１２２）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列；あるいは、配列番号４２２（受付番号NC_001526.1）のＨＰＶ１６配列の３６００〜３８４０位からなる断片（配列番号３７７）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列；
−Ａ７群について：配列番号４２３（受付番号NC_001357.1）のＨＰＶ１８配列の１８９５〜２１０３位からなる断片（配列番号４８）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列；あるいは、配列番号４２３（受付番号NC_001357.1）のＨＰＶ１８配列の９１６〜１０４４位からなる断片（配列番号６５）、もしくはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片と完全に相補的である配列から選択され、前記保存的な断片は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする群を標的とするプライマーを構築し、産生するための適切な参照鋳型配列であるという性質を保持しているヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項３７に記載の参照鋳型ポリヌクレオチドであって、Ａ６を標的とする参照鋳型配列であり、配列番号２５〜２９および３３４〜３３８の１つ、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的である配列からなることを特徴とする参照鋳型ポリヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項３７に記載の参照鋳型ポリヌクレオチドであって、Ａ５を標的とする参照鋳型配列であり、配列番号１〜５および３２０〜３３３の１つ、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的である配列からなることを特徴とする参照鋳型ポリヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項３７に記載の参照鋳型ポリヌクレオチドであって、Ａ９を標的とする参照鋳型配列であり、配列番号１２２〜２１０および３５９〜４１９の１つ、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的である配列からなることを特徴とする参照鋳型ポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項３７に記載の参照鋳型ポリヌクレオチドであって、Ａ７を標的とする参照鋳型配列であり、配列番号４６〜６７および３３９〜３５８の１つ、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的である配列からなることを特徴とする参照鋳型ポリヌクレオチド。
【請求項４２】
特にＨＰＶのＡ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、ＨＰＶ増幅に適した以下に示すプライマー：
−配列番号３０〜３４および配列番号３５〜３７のいずれか１からなる、Ａ６を標的とするプライマー；または
−配列番号６〜１０および配列番号１１〜１５のいずれか１からなる、Ａ５を標的とするプライマー；または
−配列番号２１１〜２３９および配列番号２４０〜２６５のいずれか１からなる、Ａ９を標的とするプライマー；または
−配列番号６８〜７８および配列番号７９〜８７のいずれか１からなる、Ａ７を標的とするプライマー。
【請求項４３】
特にＨＰＶのＡ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、ＨＰＶ増幅に適したプライマー系であって、
−配列番号３０〜３４の１つからなる少なくとも１のＡ６を標的とするプライマーおよび配列番号３５〜３７の１つからなる少なくとも１のＡ６を標的とするプライマー；および／または
−配列番号６〜１０の１つからなる少なくとも１のＡ５を標的とするプライマーおよび配列番号１１〜１５の１つからなる少なくとも１のＡ５を標的とするプライマー；および／または
−配列番号２１１〜２３９の１つからなる少なくとも１のＡ９を標的とするプライマーおよび配列番号２４０〜２６５の１つからなる少なくとも１のＡ９を標的とするプライマー；および／または
−配列番号６８〜７８の１つからなる少なくとも１のＡ７を標的とするプライマーおよび配列番号７９〜８７の１つからなる少なくとも１のＡ７を標的とするプライマーを含んでなるプライマー系。
【請求項４４】
特にＨＰＶのＡ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、ＨＰＶ検出に適した以下に示すプローブ：
−配列番号３８〜４０のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ６を標的とするプローブ；または
−配列番号１６〜１９のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ５を標的とするプローブ；または
−配列番号２６６〜２８２のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ９を標的とするプローブ；または
−配列番号８８〜１０１のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ７を標的とするプローブ。
【請求項４５】
特にＨＰＶのＡ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、ＨＰＶ検出に適した以下に示すビーコンプローブ：
−配列番号４１〜４５のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ６を標的とするプローブ；または
−配列番号２０〜２４のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ５を標的とするプローブ；または
−配列番号２８３〜３１９のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ９を標的とするプローブ；または
−配列番号１０２〜１２１のいずれか１もしくは前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列からなる、Ａ７を標的とするプローブ。
【請求項４６】
特にＨＰＶのＡ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される、ＨＰＶ増幅に適したプライマーおよびプローブ系であって、請求項５３に記載の少なくとも１のプライマーおよび請求項５４または５５に記載の少なくとも１のプローブを含んでなるプライマーおよびプローブ系。
【請求項４７】
請求項４３に記載の少なくとも１のプライマー系を用いて、ＨＰＶのＡ６、Ａ５、Ａ９またはＡ７群に由来する少なくとも１の核酸を増幅することにより得られるアンプリコン。
【請求項４８】
請求項３６または４７に記載の少なくとも１のアンプリコンを含んでなる増幅組成物。
【請求項４９】
以下を含んでなる、子宮頸部新形成または子宮頸癌の診断または予後のためのキット：
−請求項４３に記載の少なくとも１のプライマー系、および／または
−請求項４４または４５に記載の少なくとも１のプローブ、
−任意に、それらの使用および／またはヌクレオチドについての説明書。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、より具体的には粘膜上皮に対する向性を有するＨＰＶ（粘膜型ＨＰＶ）、さらに具体的には粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶの検出に関する。本発明は、そのために有用な増幅プライマーおよび検出プローブ、ならびにそのようなプライマーおよびプローブを設計および構築するのに適した参照鋳型配列を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、約７９００ｂｐの環状２本鎖ＤＮＡゲノムを含み、以下の３つの主な領域に組織化される：
−ウイルス複製および腫瘍性の形質転換に関与する遺伝子Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６およびＥ７を含む早期コード領域、
−ウイルスキャプシドタンパク質をコードする遺伝子Ｌ１およびＬ２を含む後期コード領域、
−ＬＲＣ（Long Control Region）と呼ばれ、Ｅ遺伝子とＬ遺伝子の間に位置する非コード制御領域。
【０００３】
ＨＰＶは、ウイルスの群を構成し、皮膚または粘膜上皮の良性および悪性病変に関与する。今日までに、１００以上の異なるＨＰＶの型が同定されている。
【０００４】
粘膜群に属する４０以上のＨＰＶ型は、肛門粘膜において検出される。  
ＨＰＶは、扁平上皮内の病変（ＳＩＬｓ）の発生における主要なリスクファクターであり、重篤度により低いグレード（ＬＳＩＬ）または高いグレード（ＨＳＩＬ）に分類される。
【０００５】
ＨＰＶは、尖圭コンジローマのような良性の病変（ＣＩＮ１）から前癌性の病変（ＣＩＮ２〜ＣＩＮ３）、インサイチュー癌および浸潤癌までの子宮頸部上皮新生物形成（ＣＩＮ）を引き起こし得る。
【０００６】
ＨＰＶは直接的に子宮頸癌に関与することが現在知られている。ＨＰＶを検出することは、ＣＩＮおよび子宮頸癌の予後に必要不可欠である。ＨＰＶの早期かつ正確な検出は、子宮頸癌からの回復に対して鍵となる因子である。
【０００７】
子宮頸部の塗抹標本内のＨＰＶウイルス負荷を増大させることにより、ＣＩＮ３および子宮頸癌のリスクが増大することも示されている。
【０００８】
肛門に感染する多くの発癌性ＨＰＶ遺伝子型は、子宮頸癌におけるそれらの出現率または罹患率に基づいて、潜在的に高いリスクのＨＰＶ遺伝子型（ＨＲ ＨＰＶ）として分類される。ＨＲ ＨＰＶの存在、残留性および／または再発は、悪い予後の指標となる。今までに、１３のＨＰＶがＨＲ ＨＰＶとされ、すなわち、ＨＰＶ５６、５１、５８、３３、５２、３５、３１、１６、６８、３９、５９、４５および１８である。最も高い罹患率を有するＨＲ ＨＰＶは、ＨＰＶ型３３、３１、１６、４５および１８である。
【０００９】
他の発癌性ＨＰＶは低いリスクのＨＰＶ（ＬＲ ＨＰＶ）であると考えられ、例えば、ＨＰＶ２、ＨＰＶ３、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１３、ＨＰＶ３２、ＨＰＶ４０、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ５７である。
【００１０】
ＨＰＶ型のＨＲまたはＬＲ群への臨床的な分類は進化しており、人によりわずかに異なる。与えられたＨＰＶのＬＲ群への分類は、このＨＰＶ型が子宮頸癌を伴うことが見出されないということを意味するにすぎない。
【００１１】
例えば、ＨＰＶ５３およびＨＰＶ６６はおそらくＨＲ ＨＰＶであると現在考えられている（van Ham et al. 2005, J. Clin. Microbiol. Vol. 43, n6, p. 2662-2667）。最初の１３のＨＲ ＨＰＶの群は、少なくとも１５のＨＰＶ型にさらに増大し得る。
【００１２】
他のＨＰＶは、発癌性ＨＰＶとして述べられてきたが、例えば、ＨＰＶ６７、ＨＰＶ８２、ＨＰＶ８５の場合のように、それらのＨＲまたはＬＲの状態の問題についての明確な決定はない。適切な検出方法は、それらの発癌性を検出することが要求される。
【００１３】
新しく、またはまだ同定されていない粘膜の発癌性ＨＰＶの型がさらに生じ得る。  
さらに、いくつかのＨＰＶの型を含むＨＰＶ多感染は、一般的な状況である：多感染は、約２０％のＨＰＶ感染のケースを説明すると考えられる。ＨＰＶ多感染の場合は、全てが発癌性のＨＰＶである、または少なくとも１の発癌性のＨＰＶおよび少なくとも１の発癌性でないＨＰＶを含んでなるＨＰＶの型が含まれてよい。ＨＰＶ多感染の場合は、全てが粘膜のＨＰＶ型であるか、または少なくとも１の粘膜型および少なくとも１の皮膚型を含むＨＰＶ型が含まれてよい。
【００１４】
また、共感染が生じる可能性もあり、少なくとも１のＨＰＶおよび少なくとも１のＨＰＶ以外のウイルスを含み、例えば、少なくとも１のＨＰＶと少なくとも１のＨＩＶとの共感染である。  
そのような多感染および／または共感染の場合は、正確なＨＰＶ検出がずっと難しくなる。
【００１５】
ＨＰＶプライマーおよびプローブは、粘膜の発癌性ＨＰＶの検出に適しており、先行技術で述べられている。
【００１６】
開発された第１の技術は、型特異的なプローブを含み、例えばサザンブロッティングまたはドットブロッティングによる型特異的なプローブと非増幅ＨＰＶゲノムの直接的なハイブリダイゼーションにより発癌性ＨＰＶを検出するように設計されている。
【００１７】
Digene Corporation, Gaithersburg, MD, USAのハイブリッド捕捉試験（ＨＣ２：登録商標）のようなシグナル増幅試験が開発された。ＨＣ２（登録商標）試験は、ＦＤＡにより認可され、現在、臨床診断のための参照試験である。
【００１８】
ＨＣ２（登録商標）システムは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイを用いた液相マイクロプレートシステムであり、標的増幅を含まない：ウイルスＤＮＡは液相において１３ＨＲ ＨＰＶを標的とするＲＮＡプローブとハイブリダイズし、形成されたハイブリッドは、抗ＤＮＡ／ＲＮＡ抗体により検出され、化学発光により可視化される。
【００１９】
ＨＣ２（登録商標）試験は、高感度な分析である。しかしながら、定性的な値のみである。ＨＣ２（登録商標）試験により評価されたウイルス負荷は、ＳＩＬのグレードの増大と共に増大せず、多ＨＰＶ感染の場合、十分に信頼できない。それ故、ＨＣ２（登録商標）試験は、定量的な分析ではない。
【００２０】
ＨＣ２（登録商標）試験は分析されるサンプルに最初に含まれるウイルス負荷を反映しないため、高いグレードの病変を有するケースを高いグレードの病変を有さないケースと区別するために、古典的な細胞診断と組み合わせることが勧められる。
【００２１】
増幅方法はその後進歩し、ＨＰＶ標的は少なくとも１のプライマー対により増幅され、産生されたアンプリコンは、この（標識された）プライマー対またはプローブにより検出される。
【００２２】
そのような先行技術のプライマーは、最初、一般的なコンセンサスプライマーとして設計され、いくつかのＨＰＶ、１３のＨＲ ＨＰＶならびに他のＨＰＶ（発癌性のＬＲ、および時には非発癌性のＨＰＶ）のいくつかを増幅することが意図されている。
【００２３】
そのようなコンセンサスプライマーは、「ユニバーサル」プライマーとも呼ばれる。これらのコンセンサスプライマーは、ＨＰＶ Ｌ１遺伝子における保存領域（例えば、MY09/MY11/HMB01プライマー、GP5+/GP6+プライマー、PGMY09/PGMY11プライマー、およびSPF1/SPF2もしくはSPF10プライマー）またはE1 ORF領域（例えばTieben et al. 1993, J. Virol. Methods 42:265-279に記載されているCPIIG/CPIプライマー）を標的にする。
【００２４】
臨床診断に適用可能なコンセンサスＰＣＲを与えるために、コンセンサスプライマー対により産生されたＨＰＶアンプリコンを検出し、分類するＨＰＶプローブが開発された。コンセンサスプライマーにより産生されたＨＰＶアンプリコンの検出は、リバースハイブリダイゼーションラインブロットアッセイまたは比色マイクロタイタープレートベースの酵素免疫測定法によりしばしば行われる。
【００２５】
そのようなコンセンサスＰＣＲ法の実例は、INNO-LiPA HPV試験(Innogenetics, Gent, Belgium)、およびAmplicor HPV試験(Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ, USA)である。
【００２６】
INNO-LiPA HPV試験は、リバースハイブリダイゼーションラインプローブアッセイであり、そのプロトタイプリサーチバージョンは、Kleter et al., 1999 (Journal of Clinical Microbiology, vol. 37, n8, p. 2508-2517)およびKleter et al. 1998 (American Journal of Pathology, vol. 153, n6, p. 1731-1739)に記載されている。
【００２７】
簡単に言うと、ＰＣＲプライマー組は、Ｌ１の開いた読み枠に由来する６５ｂｐの短いＰＣＲフラグメント（ＳＰＦ ＰＣＲ）を産生するために使用される。プロトタイプリサーチＩＮＮＯ−ＬｉＰＡプライマー組は、１０のビオチン標識されたプライマー（ＳＰＦ１０プライマー組と呼ばれる）、すなわちＳＰＦ１／２系の６のプライマー（Kleter et al. 1998に記載されている）および４の付加的なプライマー（MY09/11およびGP5+/6+）からなる。
【００２８】
ＳＰＦ１０アンプライマーは変性され、ハイブリダイゼーション条件下で、ニトロセルロース膜ストリップ上に平行線として固定化されたポリ(dT)-テールド（tailed）型特異的オリゴヌクレオチドプローブと共にインキュベートされる。プローブ片は、その後、保持されたハイブリッドの検出のために洗浄される。
【００２９】
ＩＮＮＯ-ＬｉＰＡ ＨＰＶ試験は、少なくとも２５のＨＰＶ遺伝子型の検出を可能にする（１３のＨＲ ＨＰＶ、すなわちＨＰＶ５６、５１、５８、３３、５２、３５、３１、１６、６８、３９、５９、４５、１８、ならびに他のＨＰＶ、例えば、ＨＰＶ６、１１、３４、４０、４２、４３、４４、５３、６６、７０、および７４）。それは遺伝子型決定ラインプローブアッセイであり、定性的な値である。ＩＮＮＯ-ＬｉＰＡ ＨＰＶ試験は、定量的な分析ではない。
【００３０】
Ａｍｐｌｉｃｏｒ ＨＰＶ試験は、ＰＣＲによる標的ＨＰＶ ＤＮＡの増幅を使用し、続いて１３のＨＲ ＨＰＶの検出のための核酸ハイブリダイゼーションを行う。Ａｍｐｌｉｃｏｒ ＨＰＶ試験は、Ｌ１領域内の約１６５ｂｐの配列を増幅する。プライマー組は１２のプライマーからなり、１３のＨＲ ＨＰＶの最初の群を増幅するために、一般的なコンセンサスプライマーとして設計される。増幅および変性の後、増幅されたＨＰＶ配列はマイクロウェルプレート中に分配され、Ｌ１捕捉プローブと共にインキュベートされ、ハイブリッドは比色酵素免疫測定法（アビジン-セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合体）により検出および可視化される。Ａｍｐｌｉｃｏｒ ＨＰＶ試験は、ＨＣ２（登録商標）試験と比較して高い分析特異性を有すると報告されている（偽陰性の結果がより少ない; Poljak et al. 2005, Acta Dermatoven APA, vol. 14, n4, p. 147-152を参照されたい）。
【００３１】
Ａｍｐｌｉｃｏｒ ＨＰＶ試験は感度が高いが、そのＨＰＶスペクトルは、最初にＨＲ ＨＰＶであると考えられた１３のＨＰＶに限られる。例えば、Ａｍｐｌｉｃｏｒ ＨＰＶ試験は、現在ＨＲ ＨＰＶであると考えられているＨＰＶ６６およびＨＰＶ５３を検出しない。言い換えると、Ａｍｐｌｉｃｏｒ ＨＰＶ試験は、ＨＰＶ分類または情報における変化または進化に適応するように設計されていない。  
さらに、Ａｍｐｌｉｃｏｒ ＨＰＶ試験は定量的な分析ではない。
【００３２】
これらのラインブロットまたはマイクロウェルベースの先行技術は、コンセンサスＨＰＶプライマー、すなわち予め決定された選択された発癌性ＨＰＶの組の配列アラインメントおよびこれらのコンセンサス配列の決定の結果として生じるプライマーを使用し、選択された全てのＨＰＶとの十分な類似性または同一性を有し、それらの全てとハイブリダイズする。それ故、コンセンサスプライマーは、予め決定された発癌性ＨＰＶのサブセットを増幅するように設計され、他の発癌性ＨＰＶ（新しくＨＲになったものまたは非ＨＲ発癌性ＨＰＶ）を増幅することに成功しない。
【００３３】
そのようなコンセンサスアプローチは、プライマー配列を決定する能力により制限され、これまで増大し、進化している所望の標的に十分にハイブリダイズし得る。
【００３４】
１またはいくつかの新規の発癌性ＨＰＶ株が生じた場合、そのような先行技術のコンセンサスプライマーは、誤った負の結果を与え得る。
【００３５】
また、先行技術のラインブロットまたはマイクロウェルベースの技術のいずれも定量的な性質がない一方、最近の発見は、ＨＰＶコピー数が疾患の相および／または重篤度を説明し、および／または癌遺伝子（oncogeny）の分野において診断的および／または予後の値を有することを示す。
【００３６】
実際の癌のリスクレベルまたは実際の癌のグレードにおける情報を与えられないので、定量的な性質の欠如は、臨床的な適用可能性のスペクトルを制限する。
【００３７】
さらに、これらの先行技術のコンセンサスラインブロットまたはマイクロウェルベースの技術によると、検出ステップは付加的且つ長いステップであり、増幅が起こった後、分離されたステップとして行う必要がある。
【００３８】
リアルタイムＰＣＲ増幅技術は、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８の検出のために近年開発された（Hesselink et al. 2005, Journal of Clinical Microbiology, vol. 43, n9, p. 4868-4871; Gravitt et al. 2003, Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, vol. 12, p. 477-484）。  
これらのリアルタイムＰＣＲは、ＦＲＥＴ（ライトサイクラー）に基づくか、またはＴａｑＭａｎプローブ（アプライドバイオシステムズ）を使用する。
【００３９】
先行技術のラインブロットまたはマイクロウェルベースの技術と比較すると、そのようなリアルタイムＰＣＲは、単一のステップで増幅と検出が結合され、定量化への道が開かれているという利点を有する。
【００４０】
例えば、van Duin et al. 2002 (Int. J. Cancer, vol. 98, n4, p. 590-595)では、ＨＰＶ１６の検出のための定量的なリアルタイムＰＣＲ分析について述べられている。
【００４１】
しかしながら、先行技術のリアルタイムＰＣＲプロトコルは、増幅ラン当り１のみのＨＰＶの検出、特にＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８の単独の検出に限られる。それ故、価値あるリサーチツールであるが、臨床適用可能性が非常に限られる。
【００４２】
ＨＰＶのマルチプレックスリアルタイムＰＣＲ増幅を開発するための試みがなされてきた。しかしながらこれらの試みは、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５の検出のための二重または三重のリアルタイムＰＣＲに限られる。例えば、Szuhai et al. 2001 (American Journal of Pathology, 159(5): 1651-1660)は、７つの型特異的な分子ビーコン（molecular beacon）を開示しており、いわゆる型特異的な分子ビーコンであり、すなわち、５つのＨＲ ＨＰＶ分子ビーコン（ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、４５）および２つのＬＲ ＨＰＶ分子ビーコン（ＨＰＶ６、１１）であり；Szuhai et al.の表１を参照されたい。これらの分子ビーコンはＣＰＩ／ＣＰＩＩＧ「ユニバーサル」プライマーにより産生されるアンプリコンの検出に有用であると述べられている。複合的な試みは、Szuhai et al.に開示されているが、二重または三重の分析に限られる（ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５）。著者は、「分子ビーコンＰＣＲの多重化能力は３よりも高いにもかかわらず、異なるＨＰＶ遺伝子型の数に近づけそうもない」と明示している（第１６５６頁、右欄、第２段落を参照されたい）。この理由について、著者は、型特異的な分子ビーコンはそれ自体でＨＰＶ臨床診断の問題を解決することができず、２つのステップのＨＰＶ検出および遺伝子型決定方法に到達するために、それらは一般的なプレスクリーニングＨＰＶ検出方法と組み合わせて使用されると結論付けており（例えばSzuhai et al.の図６を参照されたい）、ここでは、型特異的なＨＰＶ分子ビーコンＰＣＲは、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎの一般的なプライマーＰＣＲプレスクリーニングと組み合わせて使用されることが開示されている。
【００４３】
それ故、発明者の知識の限りでは、先行技術は、複合的に行うことができるリアルタイム増幅技術については述べておらず、または提示しておらず、一方で、単一のステップで（増幅＋検出）少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶを網羅することができる要求されるＨＰＶ検出特異性は保持している。さらに、発明者の知る限りでは、先行技術は、単一のステップ（増幅＋検出）で少なくとも５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶ（すなわち、ＨＰＶ１６、１８、４５、３１および３３）、好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶならびに他の５つの発癌性ＨＰＶを網羅することができ、且つ複合的に実行される場合であっても定量的である、いずれの定量的なリアルタイムＨＰＶ増幅技術も開示されていない。
【発明の概要】
【００４４】
本発明は、増幅によるＨＰＶの検出、より具体的には粘膜型ＨＰＶの検出、さらに具体的には粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶの検出に関する。
【００４５】
本発明は、少なくとも５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５の群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えばＨＰＶ ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ（ＨＰＶ ５６、５１、５８、３３、５２、３５、３１、１６、６８、３９、５９、４５、１８）、最も好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶおよび５の他の発癌性ＨＰＶ（ＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５）の検出を可能にする。
【００４６】
本発明は、増幅プライマー系および検出プローブ系、ならびに本発明の少なくとも１の増幅プライマー系および本発明の少なくとも１の検出プローブ系により生じる増幅−検出系（すなわちリアルタイム増幅系）に関する。
【００４７】
本発明は、本発明の増幅プライマーおよび検出プローブの生成に適した参照鋳型ＨＰＶ配列、ならびに本発明の少なくとも１の増幅プライマー系を用いたＨＰＶ核酸の増幅および任意に、本発明の少なくとも１の検出プローブ系を用いた検出により得られるアンプリコンにも関する。
【００４８】
本発明はさらに、それらの生物学的および薬学的な適用、特に診断および予後の適用、特にＣＩＮおよび子宮頸癌の分野における適用に関する。
【００４９】
本発明のＨＰＶ増幅方法は、ＨＰＶ向性および発癌性のアプローチに基づき、先行技術のアプローチとは全く異なり、全く革新的なものである。先行技術の方法が現在まで従っているグローバルコンセンサスアプローチまたは型特異的なアプローチに反して、本発明者らは、ＨＰＶ群に基づくアプローチを設計し、構築した（本発明者らにより構築された図１に示す系統樹を参照されたい）。本発明者らのＨＰＶ群に基づくアプローチによると、増幅プライマー系および検出プローブ系は、粘膜上皮に対して発癌性であり得る少なくとも１のＨＰＶ型を含んでなる各ＨＰＶ群に対して、すなわち少なくともＡ６、Ａ５、Ａ９およびＡ７の群に対して提供される。
【００５０】
実際に、本発明者らは、前記ＨＰＶ群のそれぞれの中からプライマーおよびプローブを作るのに適した適切な標的を選択し、少なくとも５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶ（すなわちＨＰＶ１６、１８、４５、３１および３３）、好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５の群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ、最も好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶおよび５の他の発癌性ＨＰＶ（ＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５）を単一のステップ（増幅＋検出）で網羅する。
【００５１】
本発明の選択された標的は、参照鋳型配列であり、プライマー（前記選択された標的の一端またはその相補的な配列にハイブリダイズする）、ならびにアンプリコンアニーリングプローブを設計および構築することを可能にし、単一のステップ（増幅＋検出）で前記ＨＰＶを網羅することを可能にする。
【００５２】
本発明の増幅プライマー系は、Ａ６またはＡ５またはＡ９またはＡ７のＨＰＶ群を標的にし、これらの群に属するＨＰＶ型をできるだけ多く増幅することが意図される。
【００５３】
本発明の検出プローブ系は、本発明の増幅系により与えられるＨＰＶの増幅により得られるアンプリコンの１つまたはいくつかを検出することを可能にする。それらは、Ａ６および／またはＡ５および／またはＡ９および／またはＡ７の群を標的とし、特に前記増幅プライマー系を用いたリアルタイムでの実行に適応する。
【００５４】
本発明の検出プローブ系は、Ａ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７の群により形成されるＨＰＶの組に属する少なくとも１のＨＰＶの一般的な検出、ならびにより正確な検出を可能にするプローブを含んでなる：例えば、
−Ａ６またはＡ５またはＡ９またはＡ７の群に属する少なくとも１のＨＰＶの検出、または
−Ａ６ＨＰＶ群またはＡ５ＨＰＶ群またはＡ９ＨＰＶ群またはＡ７ＨＰＶ群のサブセットに属する少なくとも１のＨＰＶの検出、または
−少なくとも１の特定のＨＰＶ型の検出。
【００５５】
それ故、本発明は、ＨＰＶの検出に対する正確さのレベルの優れた適応性を提供する。そのような適応性は、発明者の知る限り、これまでに得られていない。
【００５６】
本発明はさらに、Ａ６および／またはＡ５および／またはＡ９および／またはＡ７を標的とする系を提供し、本発明の少なくとも１の増幅プライマー系と本発明の少なくとも１の検出プローブ系との組み合わせの結果として得られる。
【００５７】
本発明は、特に、Ａ６またはＡ５またはＡ９またはＡ７を標的とする系を提供し、少なくとも１の本発明の増幅プライマー系および少なくとも１の本発明の検出プローブ系を含んでなり、前記少なくとも１の増幅プライマー系および前記少なくとも１の検出プローブ系は同じ群、すなわちＡ６またはＡ５またはＡ９またはＡ７を標的とする。
【００５８】
本発明の増幅プライマーおよび／または検出プローブ系のほとんどは、３以上のプライマーおよび／または２以上のプローブを含んでなる。それ故、本発明の増幅プライマーおよび／または検出プローブ系のほとんど、および特にＡ９を標的とする系、およびＡ７を標的とする系は、すでにそれ自体マルチプレックス系である。
【００５９】
本発明の非常に有利な特徴によると、本発明の群を標的とする系は、シングルチューブ増幅において一緒に使用するのに適している、すなわち、本発明は、少なくとも１のＡ６を標的とする系、および少なくとも１のＡ５を標的とする系、および少なくとも１のＡ９を標的とする系、および少なくとも１のＡ７を標的とする系をシングルチューブアッセイにおいて一緒に実行することを可能にし、それ故、マルチ-マルチプレックス、すなわち「メガプレックス」増幅および／または検出と呼ばれてよい：例えば、以下の実施例において、説明されている「メガプレックス」は１７のプライマーおよび１２のプローブを含み、特異性において有意な喪失なく、且つ反応性において有意な喪失なく、シングルチューブアッセイにおいて１７の発癌性粘膜型ＨＰＶを増幅および検出することができる。
【００６０】
それ故、前記増幅プライマー系および検出プローブ系は、リアルタイムマルチプレックス増幅に特異的に適用される。
【００６１】
発明者の知る限り、少なくとも５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶ、好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶおよび少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５の群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にする先行技術はない。
【００６２】
好都合には、本発明は、シングルチューブアッセイにおいて、少なくとも１８の発癌性粘膜型ＨＰＶ、すなわち１３のＨＲ ＨＰＶならびに５の他の発癌性ＨＰＶ（ＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５）の検出を可能にする。
【００６３】
本発明のさらなる有益な側面は、特にＨＰＶウイルス負荷定量化に適用されることである。本発明のＨＰＶ方法は、シングルチューブマルチプレックスにおける実行の場合でも特異的且つ定量的のまま行うことが可能である。
【００６４】
増幅プライマー系および検出プローブ系は、特に、リアルタイムの定量的なマルチプレックス増幅に適用され、この能力は、少なくとも１のＡ６を標的とする系、および少なくとも１のＡ５を標的とする系、および少なくとも１のＡ９を標的とする系、および少なくとも１のＡ７を標的とする系を含んでなる「メガプレックス」モードで、シングルチューブアッセイにおいて一緒に実行した場合でも保持される。
【００６５】
本発明者の知る限りにおいて、前記少なくとも５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶ、好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５の群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶおよび５の他の発癌性ＨＰＶ（ＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５）のリアルタイムの定量的なマルチプレックス増幅を可能にする先行技術はない。
【００６６】
本発明の増幅プライマー系および検出プローブ系は、全て、ＨＰＶ発癌性の群に基づくアプローチに従って設計および構築され、同一のアッセイチューブにおいて一緒に実行するのに適しているという特別な技術的特徴を有する。
【００６７】
より具体的には、それらは、少なくとも５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶ型、好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５の群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ、より好ましくは少なくとも１８の発癌性粘膜型ＨＰＶ（すなわち、少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ、および５の他の発癌性ＨＰＶ、例えば、ＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５）を網羅するリアルタイム「メガプレックス」の実行を、シングルチューブアッセイにおいて可能にし、ＨＰＶ検出の質的な精度において有意な低下を伴わない。
【００６８】
本発明の増幅プライマー系および検出プローブ系は、さらに、リアルタイム「メガプレックス」増幅を可能にするのに十分均質である特異性、Ｃｔおよび反応性のレベルを示し、それは定量的な値である。
【００６９】
本発明の群に基づくアプローチは、さらに、それらの固有の設計が突然変異誘発により生じ得る発癌性ＨＰＶ「ニューカマー」の検出に適したものになるように、増幅および／または検出系に適応性を与える。
【００７０】
本発明の群に基づくアプローチは、臨床的な診断のための使用においても適応性を与える：ユーザーにより作られるプローブ系の選択に依存し、ＨＰＶ検出における精度レベルは、Ａ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７の群により形成される組に属する少なくとも１のＨＰＶの検出を示す一般的な反応から、少なくとも１の特定のＨＰＶ型の検出を示す非常に正確な反応の範囲であってよい。本発明者の知る限りにおいて、そのような適応性は今までに得られていない。
【００７１】
本発明の群に基づくアプローチは、さらに、多感染および／または共感染の場合に精度を与えるのに適している。  
そのような達成は、先行技術のＨＰＶ検出系と比較して技術的な進歩を表すと信じる。
【００７２】
リバースプライマーを含む図中の全ての配列は、５’から３’配向で収載されている。参照ＨＰＶ配列における開始点および終結点は、増加する値の順番で与えられる。それ故：
−プライマーに関して：開始点および終結点は、プライマーの配列が対応する参照ＨＰＶ断片の開始点および終結点（フォワードプライマーの場合）、またはプライマーがアニールする参照ＨＰＶ標的断片の開始点および終結点（リバースプライマーの場合）である；
−プローブに関して：プローブおよびその相補的な配列は、少なくともシンプレックス増幅において、均等な機能を有し、開始点および終結点は、プローブの配列が対応する参照ＨＰＶ断片の配列、またはプローブがアニールする参照ＨＰＶ標的断片の配列である。
【発明の詳細な説明】
【００７３】
本発明は、先行技術とは全く異なり、真に新しいアプローチに基づく。本発明は、先行技術の欠点を克服し、特に臨床的な適用可能性、性能、信頼性および適応性の点において多数の利点を有する。
【００７４】
上記「背景技術」において述べたように、先行技術のプライマーは、必要な、または望ましい、またはできるだけ多くの粘膜ＨＰＶ配列の古典的なアラインメント（例えば１３ＨＲ ＨＰＶの直接アラインメント）により、型特異的なプライマーまたは一般的なコンセンサスプライマーとして設計される。  
それに対して、本発明のプライマーはＨＰＶ群（＝ＨＰＶ属）により設計される。
【００７５】
実際に、本発明者はＨＰＶの系統発生を分析し、図１に示す結果の系統樹を作成した。
本発明者は、粘膜上皮の発癌に関与する１つのＨＰＶサブファミリー、すなわちサブファミリーＡを選択した。彼らはさらに、ＨＰＶサブファミリーＡの代表であるＨＰＶ型の組を選択した。この代表的な組は、３５の異なるＨＰＶ型で構成され、そのうちの１８の型は少なくとも潜在的に発癌性のＨＰＶである粘膜ＨＰＶであり（すなわち、１３のＨＲとして既知の１３のＨＰＶ；２つの潜在的なＨＲ ＨＰＶであるＨＰＶ５３およびＨＰＶ６６；および発癌の可能性を有すると考えられている３つの他のＨＰＶであるＨＰＶ８２、ＨＰＶ６７およびＨＰＶ８５）、残りの１７の他のＨＰＶ型は、これまでに非発癌性ＨＰＶとして既知である（図１を参照されたい）。
【００７６】
それ故、本発明者は、粘膜上皮に向性を有し、少なくとも潜在的に発癌性のＨＰＶであるこれらのＨＰＶは、Ａ６、Ａ５、Ａ９およびＡ７の群に分類されるという結論を出した（図１を参照されたい）。より正確には、前記粘膜発癌性ＨＰＶは以下のように分類される：
−Ａ６群（ＨＰＶ６６、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５３）；
−Ａ５群（ＨＰＶ５１、ＨＰＶ８２）；
−Ａ９群（ＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ６７、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ１６）；
−Ａ７群（ＨＰＶ６８、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ８５、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ１８）。
【００７７】
「少なくとも潜在的に発癌性であるＨＰＶ」とは、前記ＨＰＶが発癌性であるとして既知である（１３ＨＲ ＨＰＶと通常呼ばれる１３のＨＰＶならびにＨＰＶ６６、ＨＰＶ５３、およびＨＰＶ８２のような他の発癌性ＨＰＶ）か、または少なくとも数人の著者により潜在的に発癌性であるとして述べられているか（例えばＨＰＶ８５）、または将来的に腫瘍粘膜に付随すると述べられることを意味する。
【００７８】
群による設計は、本発明の全ての産物により共有される特別な特徴である。  
少なくとも５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶ型、好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５の群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ型をシングルチューブ実験で網羅することに加えて、本発明により与えられる手段は、患者が有し得る特定の変種を検出する可能性がある。それ故、本発明の方法は、いずれの先行技術の方法よりもずっと安全である。
【００７９】
複数のＨＰＶ感染の場合、いくつかのＨＰＶ型が集められたサンプル中に存在する。その場合競合する効果が観察され、１つのＨＰＶ型は同じコンセンサスプライマーについてのもう１つの型と競合する。最初にプライマーが両方のＨＰＶとハイブリダイズするように設計されても、競合するＨＰＶの検出は妨害され得る。
【００８０】
本発明はさらに、特異性および感受性において損失なく、複数感染および／または共感染の場合の分析を可能にする利点を有する。
【００８１】
本発明は、増幅プライマー系および検出プローブ系、および医薬組成物、生物学的組成物、ならびに少なくとも１の前記増幅系および検出系を含んでなる検出キットに関する。本発明は、ＨＰＶ検出の方法にも関し、少なくとも１の本発明の増幅プライマー系により少なくとも１のＨＰＶ核酸断片を増幅することを含んでなり、任意に、産生されたアンプリコンを本発明の少なくとも１の検出プローブにより検出することを含んでなる。
【００８２】
本発明のＨＰＶ検出方法は、特に、ＨＰＶに関連する疾患または状態の診断、そのようなＨＰＶに関連する疾患または状態の予後またはリスク評価、そのようなＨＰＶに関連する疾患または状態の進展のモニタリング、抗ＨＰＶ薬または治療、例えば抗ＨＰＶワクチンもしくは抗ＨＰＶワクチン候補（例えば、抗ＨＰＶ１６および／または抗ＨＰＶ１８および／または抗ＨＰＶ４５ワクチン、もしくはワクチン候補）の効果のモニタリングに対して有用である。
【００８３】
前記ＨＰＶに関連する疾患または状態は、ＨＰＶに関連する疾患または状態のいずれかであり、特にＨＰＶに関する新生物形成（例えば子宮頸部上皮新形成）または子宮頸癌のような癌である。
【００８４】
本発明は、Ａ６群の発癌性ＨＰＶ、および／またはＡ５の発癌性ＨＰＶ、および／またはＡ９の発癌性ＨＰＶ、および／またはＡ７の発癌性ＨＰＶを標的とする増幅プライマー系および検出プローブ系を提供する。
【００８５】
本発明の増幅および／または検出系はマルチプレックス系であり、３以上のプライマーおよび／または２以上のプローブを含んでなる。特に、Ａ９を標的とする系およびＡ７を標的とする系の場合である。
【００８６】
各増幅プライマー系は、特異性における有意な損失なく、シングルチューブ増幅アッセイで他の群の増幅プライマー系と共に実行することができる。それ故、本発明の少なくとも１のＡ６を標的とする増幅プライマー系および本発明の少なくとも１のＡ５を標的とする増幅プライマー系および本発明の少なくとも１のＡ９を標的とする増幅プライマー系および本発明の少なくとも１のＡ７を標的とする増幅プライマー系は、特異性における有意な損失なく、シングルチューブ増幅アッセイで一緒に使用され得る。
【００８７】
各増幅プライマー系について、本発明は少なくとも１の検出プローブ系を提供し、増幅および検出系を形成する（すなわちリアルタイム増幅系）。
【００８８】
本発明の各検出プローブ系は、特異性における有意な損失なく、シングルチューブアッセイで、対応する増幅プライマー系と共に実行することができ、リアルタイムＨＰＶ増幅および検出を可能にする。
【００８９】
本発明は、以下の群を標的とする増幅および検出系を提供する：
−いくつかのＡ６を標的とする増幅および検出系
−いくつかのＡ５を標的とする増幅および検出系
−いくつかのＡ９を標的とする増幅および検出系
−いくつかのＡ７を標的とする増幅および検出系。
【００９０】
各増幅および検出系は、特異性における有意な損失なく、シングルチューブアッセイにおいて、他の群の増幅系および検出系と共に実行することができ、粘膜上皮に対する向性を有し、少なくとも潜在的に発癌性のＨＰＶであるＨＰＶのシングルチューブマルチ-マルチプレックス（または「メガプレックス」）リアルタイム増幅および検出を可能にする。
【００９１】
それ故、本発明の少なくとも１のＡ６を標的とする増幅系および検出系、ならびに本発明の少なくとも１のＡ５を標的とする増幅系および検出系、ならびに本発明の少なくとも１のＡ９を標的とする増幅系および検出系、ならびに本発明の少なくとも１のＡ７を標的とする増幅系および検出系は、特異性における有意な損失なく、シングルチューブ増幅アッセイで一緒に使用することができる。
【００９２】
本発明は、特にマルチプレックスまたはマルチ-マルチプレックスの実行に適応する系を提供する一方、シンプレックスモードでの本発明の系の実行も、もちろん本発明に包含される。
【００９３】
本発明の増幅系および検出系は、さらに、定量的なＨＰＶ増幅および検出を可能にするのに十分均質的であるＣｔおよび反応性のレベルを有する。それ故、本発明は、１以上の粘膜ＨＰＶの存在をシングルチューブアッセイで同定すること、ならびにウイルスＨＰＶ負荷を決定することを可能にする。本発明の定量的な性質は、「メガプレックス」モードで実行された場合でも保持される。
【００９４】
本発明は、群を標的とする増幅系および／または検出系、ならびに粘膜ＨＰＶの検出のためのそれらの使用に関し、前記群を標的とする増幅および／または検出系は、マルチプレックス（実際にはマルチ-マルチプレックス、すなわち「メガプレックス」）増幅およびそれらのリアルタイム検出に適しているという特別な技術的特徴を有し、それ故、これら系は、
少なくとも５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶ（すなわち、ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、
好ましくは、少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、
さらに好ましくは、５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５の群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、
さらに好ましくは、ＨＲ ＨＰＶとして既知の少なくとも１３のＨＰＶ（ＨＰＶ５６、５１、５８、３３、５２、３５、３１、１６、６８、３９、５９、４５および１８）、
より好ましくは、少なくとも１３のＨＰＶならびにＨＰＶ６６、８２、６７、８５および５３の中の少なくとも１、
さらに好ましくは、少なくとも１３のＨＰＶならびにＨＰＶ６６、８２、６７、８５および５３の中の少なくとも２、
さらに好ましくは、少なくとも１３のＨＰＶならびにＨＰＶ６６、８２、６７、８５および５３の中の少なくとも３、
最も好ましくは、少なくとも１３のＨＰＶならびにＨＰＶ６６、８２、６７、８５および５３の中の少なくとも４、特に前記１３のＨＲ ＨＰＶおよびＨＰＶ型６６、８２、６７、８５からなる少なくとも１７の粘膜ＨＰＶ、
さらに最も好ましくは、少なくとも１３のＨＰＶならびに少なくとも５のＨＰＶ型６６、８２、６７、８５、および５３のシングルチューブアッセイにおける検出を可能にする。
【００９５】
本発明の群を標的とする増幅系および／または検出系は、さらに、そのようなリアルタイム「メガプレックス」増幅を定量的にすることを可能にする特別な技術的特徴を有する。  
上述したように、本発明の増幅系および検出系は、真に新しい群に基づくアプローチに基づく。
【００９６】
実際に、先行技術の一般的なコンセンサス技術によると、プライマー（「ユニバーサル」プライマーとも呼ばれる）の設計は、増幅される全てのＨＰＶ配列、例えば１３のＨＲ ＨＰＶのアラインメント、および１３ＨＰＶのできるだけ多くを標的とするコンセンサス配列の決定により行われる。それ故、そのようなコンセンサス配列は、後期コード領域（例えば遺伝子Ｌ１）のような保存された遺伝子または領域において見られ、同様の保存された遺伝子または領域は増幅されるＨＰＶの組全体に対して選択される。
【００９７】
それに反して、本発明者はＨＰＶ群毎の設計を行った、すなわち彼らは、各ＨＰＶ群に対して適切な標的を選択した。具体的には、彼らは、初期コード領域の遺伝子、より具体的には遺伝子Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６、Ｅ７を選択した。本発明者は、各望ましいＨＰＶ群に対して特定の標的を設計した。
【００９８】
例えば、群Ａ５に対して設計されたプライマーは、遺伝子Ｅ７、Ｅ１中にそれらの標的を有し；群Ａ６に対して設計されたプライマーは、遺伝子Ｅ６、Ｅ７中にそれらの標的を有し；群Ａ７に対して設計されたプライマーは、遺伝子Ｅ１中にそれらの標的を有し；群Ａ９に対して設計されたプライマーは、遺伝子Ｅ１、Ｅ２中にそれらの標的を有する。本発明の例示的な標的は、図２Ａ（Ａ５およびＡ６群）ならびに２Ｂ（Ａ７およびＡ９群）に示されている。
【００９９】
それ故、本発明者は、Ａ５、Ａ６、Ａ７およびＡ９の群のそれぞれに対して参照鋳型配列を選択し、Ａ５参照鋳型配列は遺伝子Ｅ７およびＥ１からなる領域内にあり、Ａ６参照鋳型配列は遺伝子Ｅ６およびＥ７からなる領域内にあり、Ａ７参照鋳型配列は遺伝子Ｅ１内にあり、Ａ９参照鋳型配列は遺伝子Ｅ１およびＥ２からなる領域内にある。
【０１００】
プライマーは、前記標的（またはそれらに相補的な配列）の一端にハイブリダイズするように設計および構築され、それによりプライマー対は前記標的（またはそれらに相補的な配列）の各端にアニールする。
【０１０１】
プローブは、前記参照鋳型配列の１つにアニールするように設計および構築され、それ故、各プローブは、本発明のプライマー系により作られたアンプリコンの少なくとも１にアニールする。
【０１０２】
本発明の増幅プライマー系は、少なくとも２のプライマーを含んでなる。  
本発明の検出プローブ系は、少なくとも１のプローブを含んでなる。  
本発明の増幅プライマー系は、好ましくは、Ａ６またはＡ５またはＡ９またはＡ７の群に属するＨＰＶ、すなわち発癌性ＨＰＶを増幅する。
【０１０３】
本発明者は、さらに、Ａ５およびＡ６およびＡ７およびＡ９の群により形成されるＨＰＶの組に特異的な増幅プライマー系を作ることに成功した。これら本発明の増幅プライマー系は、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ９以外の群に属するいずれのＨＰＶも増幅しない。実際に、本発明のほとんどのプライマー系は、Ａ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７の群により形成されるＨＰＶの組に特異的である。
【０１０４】
さらに、本発明の増幅プライマー系のほとんどは、それらが標的とする群に特異的である、すなわち、本発明のほとんどのプライマー系は、Ａ６またはＡ５またはＡ９またはＡ７の群に特異的であり：与えられる増幅系のほとんどのプライマーは、他のＨＰＶ群に属するいずれのＨＰＶも増幅することなく、同じＨＰＶ群の１以上のＨＰＶを増幅する。
【０１０５】
Ａ５およびＡ６およびＡ７およびＡ９により形成されるＨＰＶの組に特異的でない本発明のプライマー系は、前記群のＨＰＶに由来しない核酸、すなわち非発癌性ＨＰＶを増幅し得る。しかしながら、そのような場合、本発明のプライマー系はこれらの非標的アンプリコンに対して非常に低い増幅効率を示す（すなわち、それらは、Ａ５および／またはＡ６および／またはＡ９および／またはＡ７の群のＨＰＶに対して得られるよりもずっと低いＰＣＲ効率を導き、それ故定量的でない）。
【０１０６】
本発明の群を標的とするプライマー系を同じ群を標的とする本発明のプローブ系と組み合わせた場合、その結果として得られる群を標的とするリアルタイム増幅系は、Ａ５およびＡ６およびＡ９およびＡ７の群により形成されるＨＰＶの組に特異的である：そのようなリアルタイム増幅系は、Ａ５またはＡ６またはＡ９またはＡ７に属さないＨＰＶを検出しない。さらに、これらリアルタイム増幅系のほとんどは、それらが標的とする群に特異的である。
【０１０７】
本発明の唯一のリアルタイム増幅は、群交叉の反応性を有する：以下の実施例において系Ｃと呼ばれている群Ａ９に対して設計されたリアルタイム増幅プライマー系は、Ａ９群の７のＨＰＶ型およびＡ６群に属する発癌性ＨＰＶであるＨＰＶ５３を検出し（ＨＰＶ５３は、潜在的にＨＲ ＨＰＶである）；しかしながら、このＡ９群の系Ｃは試験された４２のＨＰＶの中の他のいずれのＨＰＶも検出しない（ＨＰＶ５３以外のＡ６群ＨＰＶ；Ａ５群ＨＰＶ；Ａ１１群ＨＰＶ；Ａ７群ＨＰＶ；Ａ４群ＨＰＶ；Ａ３群ＨＰＶ）。  
いずれの場合にも、本発明のリアルタイム増幅系はヒト核酸であり得る核酸を検出する。
【０１０８】
Ａ６、Ａ５、Ａ９、またはＡ７の群に属するいずれかのＨＰＶを増幅することが望まれる場合、本発明の増幅プライマー系のほとんどは、実際に、２より多いプライマー、すなわち少なくとも３のプライマーを含んでなる。
【０１０９】
例えば、Ａ６またはＡ５群を標的とする増幅プライマー系は、ＨＰＶ５６および任意にＨＰＶ６６（Ａ６群について）、またはＨＰＶ５１および任意にＨＰＶ８２（Ａ５群について）を増幅するためのプライマー対のみを必要とする。しかし、Ａ９またはＡ７群を標的とするこのような増幅プライマー系は、群のＨＰＶスペクトルの完全な被覆を望む場合、Ａ９群の６または７のＨＰＶ型、またはＡ７群の５または６のＨＰＶ型を増幅しなければならない。そのような場合において、本発明のＡ９またはＡ７を標的とする増幅系は、例えば、少なくとも３または４のフォワードプライマー、および２、３、４、５、またはそれ以上のリバースプライマーを含んでよい。そのようなＡ９またはＡ７を標的とする増幅プライマー系は、それ故、それ自体既にマルチプレックス系である。
【０１１０】
もちろん、増幅されるＨＰＶの範囲を限定したい当業者は、彼／彼女が増幅したいＨＰＶの型または株に依存して、いくつかのフォワードおよび／またはリバースプライマーを選択してよい。
【０１１１】
同様に、Ａ６、Ａ５、Ａ９、またはＡ７の群に属するいずれかのＨＰＶを検出したい場合、本発明の検出プローブ系のほとんどは、実際に、１より多いプローブ、すなわち少なくとも２のプローブを含んでなる。
【０１１２】
例えば、Ａ６またはＡ５群を標的とする検出プローブ系は、ＨＰＶ５６および任意にＨＰＶ６６（Ａ６群）、またはＨＰＶ５１および任意にＨＰＶ８２（Ａ５群）を検出するためのプローブのみを必要とする。しかし、Ａ９またはＡ７群を標的とするこのような検出プローブ系は、特にＨＰＶ群の範囲の完全な被覆および同時のＨＰＶの群または型の識別が望まれる場合、検出されるＨＰＶの型または株当り１つのプローブを含んでよい。Ａ９またはＡ７を標的とする検出プローブ系は、少なくとも４もプローブ、例えば、４、５、または６のプローブを含んでなる。
【０１１３】
上述したように、本発明の全ての検出プローブ系は、リアルタイム検出に適用され、まさに同じチューブ内で対応する増幅プライマー系と共に実行することができる。
【０１１４】
以下の実施例において、本発明のいくつかのＡ６、Ａ５、Ａ９およびＡ７を標的とする増幅および／または検出系について述べている。
【０１１５】
これらの実施例において、表１２〜表８８が示されている：
−表１２〜３５：これらの表は、参照アンプリコンの配列番号および位置（これらの参照鋳型アンプリコンの配列は、最後の表の後、すなわち「特許請求の範囲」の前にも示されている）、本発明の実例となる群を標的とする系のフォワードプライマー、リバースプライマー、プローブ、ビーコンプローブを与える；
−表３５〜５０：これらの表は、本発明のプライマーおよびプローブにより示されるヌクレオチドのミスマッチの数を示し（５０のＨＰＶ型のアラインメント）；空のボックスは、整合する配列アラインメントがないことを意味する；
−表５１〜６８：本発明の検出系の特異性；
−表６９〜８２：系の反応性；
−表８３〜８８：「メガプレックス」の特異性および反応性；
−表８９：ＨＰＶゲノム配列の一覧。
【０１１６】
参照ゲノムは、各ＨＰＶ群について選択され、すなわち：
−Ａ５群：参照ゲノムは、受付番号NC_001533.1で入手可能なＨＰＶ５１のゲノム配列である、
−Ａ６群：参照ゲノムは、受付番号NC_001594.1で入手可能なＨＰＶ５６のゲノム配列である、
−Ａ７群：参照ゲノムは、受付番号NC_001357.1で入手可能なＨＰＶ１８のゲノム配列である、
−Ａ９群：参照ゲノムは、受付番号NC_001526.1で入手可能なＨＰＶ１６のゲノム配列である。
【０１１７】
以下の表において、「アドレス」という用語は、参照ゲノムにおけるヌクレオチドの位置を意味する。より正確には：
−アドレスＸを有するフォワードプライマーは、単離されたオリゴヌクレオチドであり、前記参照ゲノムにおける位置Ｘから開始する参照ゲノムの断片の配列またはそのような断片の配列の変形である配列を有する（以下の表のミスマッチ数を参照されたい）；
−アドレスＸを有するリバースプライマーは、単離されたオリゴヌクレオチドであり、前記参照ゲノムにおける位置Ｘで終結する参照ゲノムの断片の配列またはそのような断片の配列の変形に相補的な配列を有する（以下のミスマッチ数の表を参照されたい）；
−アドレスＸを有するプローブは、単離されたオリゴヌクレオチドであり、その配列は、前記参照ゲノムにおける位置Ｘから開始する参照ゲノムの断片の配列であるか、そのような断片の配列の相補的な配列であるか（この断片の配列の全長に渡って）、またはそのような断片の配列もしくはそのような相補的な断片の配列の変形（以下のミスマッチ数の表を参照されたい）。
【０１１８】
結果として、与えられた系から、アドレスＸｆを有するフォワードプライマーおよびアドレスＸｒを有するリバースプライマーからなるように選択されたプライマー対が、核酸増幅に対して好ましい条件下、その参照ＨＰＶゲノムにおいて実行された場合、このプライマー対は、前記参照ＨＰＶゲノムにおける位置Ｘｆから位置Ｘｒにわたる配列からなるアンプリコン（開始点および終結点が含まれる）を前記ＨＰＶ参照ゲノムから増幅する。
【０１１９】
核酸増幅に好ましい条件下、このプライマー対が参照ＨＰＶゲノムではないが参照ＨＰＶゲノムと同じ群に属する与えられたＨＰＶゲノムにおいて実施された場合、このプライマー対は、前記与えられたＨＰＶゲノムの断片の配列と一致し、配列アラインメントによると、前記参照ＨＰＶゲノムにおける位置Ｘｆから位置Ｘｒに渡る断片に対応するアンプリコンを前記与えられたＨＰＶゲノムから増幅する。
【０１２０】
与えられたＨＰＶゲノムの断片であり、配列アラインメントによるとＨＰＶ参照ゲノムの断片Ｂに対応する断片Ａの場合、前記断片Ａは前記断片Ｂと同じ長さを有し、前記与えられたＨＰＶゲノム内の前記断片Ａの開始点および終結点は、前記与えられたＨＰＶゲノムの断片中にあり、前記断片Ｂと同じ長さを有し、前記断片Ａは、断片Ｂの核酸配列とのグローバルアラインメントにより決定した場合、前記断片Ｂのヌクレオチド配列と比較して最も同一のスコアを与える断片であることを意味する。
【０１２１】
以下のようにも理解できる：
−アドレスＸｆおよび長さＬｆを有するフォワードプライマーは、単離されたオリゴヌクレオチドであり、前記参照ゲノムにおける位置Ｘｆから開始し、前記参照ゲノムにおけるＸｆ＋Ｌｆ−１の位置で終結する参照ゲノムの断片の配列またはそのような断片の配列の変形の配列である配列を有する（以下に示すアラインメントを参照されたい）；
−アドレスＸｒおよび長さＬｒを有するリバースプライマーは、単離されたオリゴヌクレオチドであり、前記参照ゲノムにおける位置Ｘｒ−Ｌｒ−１から開始し、位置Ｘｒで終結する参照ゲノムの断片の配列またはそのような断片の配列の変形に相補的である配列を有する（以下に示すアラインメントを参照されたい）；
−アドレスＸｐおよび長さＬｐを有するプローブは、単離されたオリゴヌクレオチドであり、その配列は、前記参照ゲノムにおける位置Ｘｐから開始し、位置Ｘｐ＋Ｌｐ−１で終結する参照ゲノムの断片の配列か、またはそのような断片の配列に相補的な配列であるか、またはそのような断片の配列もしくはそのような相補的な断片の配列の変形である（以下に示すアラインメントを参照されたい）。
【０１２２】
本発明は、少なくとも１のＨＰＶ標的の核酸増幅のための方法に関し、前記ＨＰＶは、粘膜上皮に向性を有し、少なくとも潜在的に発癌性であり、好ましくは少なくとも１の発癌性肛門性器ＨＰＶ標的であり、最も好ましくは少なくとも１の発癌性子宮頸ＨＰＶである。本発明の増幅方法は、少なくとも２のプライマーを用いて、前記少なくとも１のＨＰＶ標的から少なくとも１のアンプリコンを作るステップを含んでなる。
【０１２３】
本発明の有利な実施形態によると、本発明の増幅方法はリアルタイムマルチプレックス増幅方法であってよく、前記少なくとも２のプライマーにより作られるアンプリコンにアニールし得る少なくとも１のプローブを含んでなる。
【０１２４】
本発明は、粘膜上皮に対して向性を有し、少なくとも潜在的に発癌性のＨＰＶであり、好ましくは少なくとも１の発癌性肛門性器ＨＰＶであり、最も好ましくは少なくとも１の発癌性子宮頸ＨＰＶである、サンプル中の少なくとも１のＨＰＶを検出する方法に関する。本発明の検出方法は、本発明の核酸増幅の方法により増幅された少なくとも１の核酸ＨＰＶ標的の検出を含んでなる。
【０１２５】
本発明は、少なくとも１のアンプリコンが前記サンプルまたはその核酸から、本発明の少なくとも２の増幅プライマーおよび／または本発明の少なくとも１の増幅プライマー系により増幅されて作られたかどうかを検出することにより、粘膜上皮に対して向性を有し、少なくとも潜在的に発癌性のＨＰＶであり、好ましくは少なくとも１の発癌性肛門性器ＨＰＶであり、最も好ましくは少なくとも１の発癌性子宮頸ＨＰＶであるサンプル中の少なくとも１のＨＰＶを検出する方法に関する。
【０１２６】
少なくとも１のアンプリコンの産生は、粘膜上皮に対して向性を有し、少なくとも潜在的に発癌性のＨＰＶであり、好ましくは少なくとも１の発癌性肛門性器ＨＰＶであり、最も好ましくは少なくとも１の発癌性子宮頸ＨＰＶが前記サンプル中に存在することを示す。
【０１２７】
本発明の有利な実施形態によると、少なくとも１のアンプリコンが作られるかどうかの決定は、好ましくは少なくとも１の本発明のプローブおよび／または少なくとも１の本発明のプローブ系と共に、リアルタイムマルチプレックス増幅で行われ得る。
【０１２８】
本発明は、粘膜上皮に対して向性を有し、少なくとも潜在的に発癌性であり、好ましくは少なくとも１の発癌性肛門性器ＨＰＶであり、最も好ましくは少なくとも１の発癌性子宮頸ＨＰＶであるサンプル中の少なくとも１のＨＰＶを検出する、以下を含んでなる方法に関する：
−前記サンプルまたはその核酸物質を、前記プライマーによる少なくとも１のアンプリコンの産生に適した条件下（すなわち、検出されるべき前記少なくとも１のＨＰＶが前記サンプル中に存在する場合、前記ＨＰＶから少なくとも１のアンプリコンを前記プライマーを用いて作ることができる条件下）で、少なくとも２の本発明の増幅プライマーおよび／または少なくとも１の本発明のプライマー系と接触させることと、
−少なくとも１のアンプリコンが前記プライマーにより作られたかどうかを決定することと（例えば、少なくとも１の検出プローブを用いて、好ましくは本発明の少なくとも１のプローブおよび／または本発明の少なくとも１の検出プローブ系を含むリアルタイム増幅で）、
少なくとも１のアンプリコンの産生は、粘膜上皮に対して向性を有し、少なくとも潜在的に発癌性ＨＰＶであり、好ましくは少なくとも１の発癌性肛門性器ＨＰＶであり、最も好ましくは少なくとも１の発癌性子宮頸ＨＰＶである少なくとも１のＨＰＶが前記サンプル中に存在することを示す。
【０１２９】
「核酸物質を含有するサンプル」とは、少なくとも１の核酸を含有するサンプル、例えば、細胞培養、または動物もしくはヒト、例えば女性のヒトから集めたサンプルのような生物学的なサンプル、好ましくは子宮頸部から集めたサンプルを意味する。
【０１３０】
前記サンプルは、任意に、当業者に既知の技術によりさらに処理および／または精製され、増幅効率および／または定性的な正確性および／または定量的な正確性が改善されてよい。前記サンプルは、もっぱら、または本質的に核酸からなり、精製、単離、または化学的合成により得られる。手段は、ＤＮＡのような核酸を単離または精製したい、例えば子宮頸部の切屑からＤＮＡを単離または精製したい当業者に利用可能である（例えば、QIAamp-DNA Mini-Kit; Qiagen, Hilden, Germany）。
【０１３１】
それ故、本発明の検出方法は、
少なくとも５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶ（すなわち、ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、
好ましくは、少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、
さらに好ましくは、５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合には、Ａ６および／またはＡ５の群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、
さらに好ましくは、ＨＲ ＨＰＶとして既知の少なくとも１３のＨＰＶ（ＨＰＶ５６、５１、５８、３３、５２、３５、３１、１６、６８、３９、５９、４５および１８）、
より好ましくは少なくとも前記１３のＨＰＶならびにＨＰＶ型６６、８２、６７、８５、および５３の中の少なくとも１、
さらにより好ましくは、少なくとも前記１３のＨＰＶならびにＨＰＶ型６６、８２、６７、８５、および５３の中の少なくとも２、
さらにより好ましくは、少なくとも前記１３のＨＰＶならびにＨＰＶ型６６、８２、６７、８５、および５３の中の少なくとも３、
最も好ましくは、少なくとも前記１３のＨＰＶならびにＨＰＶ型６６、８２、６７、８５、および５３の中の少なくとも４、特に前記１３ＨＲ ＨＰＶおよびＨＰＶ型６６、８２、６７、８５からなる少なくとも１７の粘膜ＨＰＶ、
さらに最も好ましくは、少なくとも１３のＨＰＶならびに少なくとも５のＨＰＶ型６６、８２、６７、８５、および５３、のリアルタイムマルチプレックス検出、好ましくはリアルタイムの定量的なマルチプレックス検出をシングルチューブアッセイで可能にする。
【０１３２】
本発明は、本発明の検出方法、および／または本発明のプライマーおよび／またはプローブの全ての医学的、生物学的、薬学的な適用にも関する。
【０１３３】
本発明は、子宮頸部の新形成または癌の診断または予防のための方法に関し、本発明の方法、例えば患者から集めたサンプルに前記方法を実施することにより、少なくとも１のＨＰＶの存在、発生、残留性、または細胞的な広がりを決定することを含んでなり、陽性の決定は、子宮頸部の新形成もしくは癌があること、またはそのような状態もしくは疾患の一般化されたリスクがあることを示す。
【０１３４】
本発明は、抗ＨＰＶ１６および／または１８および／または４５治療、薬物、候補治療または候補薬物のような抗ＨＰＶ治療もしくは薬物、または抗ＨＰＶ候補治療もしくは薬物の効果をモニタリングするための方法にも関し、本発明の検出方法により、少なくとも１のＨＰＶの非再発、非残留、消滅、または細胞的な広がりにおける減少を導く前記治療、薬物、候補治療または候補薬物を決定することを含んでなり、それによる陽性の決定は、前記治療、薬物、候補治療または候補薬物が有効な抗ＨＰＶ薬であることを示す。
【０１３５】
本発明は、抗ＨＰＶ薬を製造する方法にも関し、該方法は、
−少なくとも１の抗ＨＰＶ候補薬物を提供することと、
−前記少なくとも１の候補抗ＨＰＶ薬を細胞培養または非ヒト動物に投与することと（前記細胞培養または動物は少なくとも１の子宮頸部の新形成または癌であるか、含んでなる）、
−前記候補抗ＨＰＶ薬が前記少なくとも１の新形成または癌の退行または消滅を引き起こすかどうかを本発明のＨＰＶ検出方法により決定することとを含んでなり；
それによる陽性の決定は、前記候補薬物が効果的な抗ＨＰＶ薬であることを示す。
【０１３６】
上述したように、本発明はＨＰＶ増幅および検出方法であって、リアルタイムおよびマルチプレックスで実行することができ、すなわち、単一の操作ステップで標的の増幅と検出を組み合わせ、特異性における有意な損失なく、単一の操作ステップで粘膜ＨＰＶの検出を可能にする方法を提供する。
【０１３７】
さらに、本発明の増幅および検出系は、リアルタイムの定量的なマルチプレックスＨＰＶ検出を可能にするのに十分に均質性があるＣｔおよび反応性のレベルを有する。
【０１３８】
本発明によると、前記増幅プライマーは以下を含んでよい：
−Ａ６群の発癌性ＨＰＶを標的とすることが意図された少なくとも２のプライマー（前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーはオリゴヌクレオチドであり、１４〜３０のヌクレオチド、好ましくは１５〜２９、より好ましくは１６〜２８、最も好ましくは１７〜２５のヌクレオチドからなり、その配列は、ＨＰＶ５６のＥ６およびＥ７遺伝子からなるＡ６を標的とする領域からの少なくとも１の９０〜３９０ヌクレオチドの核酸、好ましくは９５〜３８５ヌクレオチド、より好ましくは１００〜３７９ヌクレオチドの核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適している）、および／または
−Ａ５群の発癌性ＨＰＶを標的とすることが意図された少なくとも２のプライマー（前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーはオリゴヌクレオチドであり、１４〜３０のヌクレオチド、好ましくは１５〜２９、より好ましくは１６〜２８、最も好ましくは１７〜２５のヌクレオチドからなり、その配列は、ＨＰＶ５１のＥ７およびＥ１遺伝子からなるＡ５を標的とする領域からの少なくとも１の少なくとも９０〜２４０ヌクレオチドの核酸、好ましくは１００〜２３０ヌクレオチド、より好ましくは１０６〜２２５ヌクレオチドの核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適している）、および／または
−Ａ９群の発癌性ＨＰＶを標的とすることが意図された少なくとも２のプライマー（前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーはオリゴヌクレオチドであり、１４〜３０のヌクレオチド、好ましくは１５〜２９、より好ましくは１６〜２８、最も好ましくは１７〜２５のヌクレオチドからなり、その配列は、以下のＡ９群のＨＰＶのそれぞれのＥ１およびＥ２遺伝子：ＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ１６、好ましくは前記Ａ９群のＨＰＶのそれぞれのＥ２遺伝子からなるＡ９を標的とする領域からの少なくとも１の少なくとも８０〜２６０ヌクレオチドの核酸、好ましくは８５〜２５０ヌクレオチド、より好ましくは８８〜２４１ヌクレオチドの核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適している）、および／または
−Ａ７群の発癌性ＨＰＶを標的とすることが意図された少なくとも２のプライマー（前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーはオリゴヌクレオチドであり、１４〜３０のヌクレオチド、好ましくは１５〜２９、より好ましくは１６〜２８、最も好ましくは１７〜２５のヌクレオチドからなり、その配列は、以下のＡ７群のＨＰＶ：ＨＰＶ６８、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ４５、およびＨＰＶ１８のそれぞれのＥ１遺伝子からなるＡ７を標的とする領域からの少なくとも１の少なくとも１００〜２２０ヌクレオチドの核酸、好ましくは１２０〜２１５ヌクレオチド、より好ましくは１２５〜２０９ヌクレオチドの核酸の増幅において、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用するのに適している。
【０１３９】
前記Ａ６またはＡ５またはＡ９またはＡ７標的領域から増幅される核酸は、前記ＨＰＶにおいて、Ａ６またはＡ５またはＡ９またはＡ７参照鋳型の核酸配列にそれぞれ対応する。それ故、これらの増幅された核酸は、通常、それぞれの参照鋳型配列と高い程度の同一性を有し、例えば、前記それぞれの参照鋳型配列の全長に渡って少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。
【０１４０】
核酸とは、ここでは好ましくはＤＮＡを意味する。  
好ましくは、１つのＨＰＶ群を標的とすることが意図された少なくとも２のプライマーは、３の他の群を標的とすることが意図された少なくとも２のプライマーとは異なる。
【０１４１】
前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーは、完全に前記Ａ６群のＨＰＶ（すなわちＨＰＶ５６）のそれぞれのＥ６遺伝子内にあるか、または完全に前記Ａ６群のＨＰＶのそれぞれのＥ７遺伝子内にあるか、またはＥ６およびＥ７遺伝子と重複し、例えば、Ｅ６を標的とするフォワードプライマーおよびＥ７を標的とするリバースプライマー、もしくはその逆である。好ましくは、前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーは、Ｅ６およびＥ７遺伝子と重複する配列を標的とし、例えば、Ｅ６を標的とするフォワードプライマーおよびＥ７を標的とするリバースプライマー、もしくはその逆である。
【０１４２】
前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーは、完全に前記Ａ５群のＨＰＶ（すなわちＨＰＶ５１）のそれぞれのＥ７遺伝子内にあるか、または完全に前記Ａ５群のＨＰＶのそれぞれのＥ１遺伝子内にあるか、またはＥ７およびＥ１遺伝子と重複する配列を標的としてよく、例えばＥ７を標的とするフォワードプライマーおよびＥ１を標的とするリバースプライマー、もしくはその逆である。
【０１４３】
前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーは、完全に前記Ａ９群のＨＰＶ（すなわち少なくともＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ１６）のそれぞれのＥ１遺伝子内にあるか、または完全に前記Ａ９群のＨＰＶのそれぞれのＥ２遺伝子内にあるか、またはＥ１およびＥ２遺伝子と重複する配列を標的としてよく、例えば、Ｅ１を標的とするフォワードプライマーおよびＥ２を標的とするリバースプライマー、もしくはその逆である。以下の実施例において、系Ｃを除くＥ２遺伝子を標的とする全てのＡ９増幅系は、Ｅ１およびＥ２遺伝子と重複する標的を有する。
【０１４４】
前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーは、完全に前記Ａ７群のＨＰＶのそれぞれのＥ１遺伝子内（すなわち、少なくともＨＰＶ６８、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ１８のそれぞれのＥ１遺伝子内）にある配列を標的としてよい。
【０１４５】
本発明によると、前記少なくとも２のＡ６、Ａ５、Ａ９およびＡ７を標的とするプライマーは、特に、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイム（定量的な）マルチプレックス検出において使用するのに適しているという特別な技術的特徴を有する。
【０１４６】
「１４〜３０ヌクレオチドからなる」とは、「１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドからなる」ということを意味する。  
本願に列挙されているいずれの範囲にも同じことが準用される。  
プライマーのヌクレオチド長は、相互に独立して選択されてよい。
【０１４７】
オリゴヌクレオチドまたはプライマーに関して、少なくとも１のＨＰＶ、または核酸もしくは配列の「増幅において使用するのに適した配列」とは、オリゴヌクレオチドまたはプライマーの配列が、穏和であるが好ましくは高いもしくは非常に高い厳密さの条件下、このＨＰＶまたは核酸もしくは配列とハイブリダイズすることができることを意味する。
【０１４８】
本発明のプライマーは、１４〜３０ｎｔオリゴヌクレオチド（好ましくは１７〜２５ｎｔオリゴヌクレオチド）からなってよく、その配列は、その群の参照鋳型配列に含まれる同じ長さの配列、最も好ましくは前記群の参照鋳型配列のちょうど３’末端またはちょうど５’末端に含まれる同じ長さの配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９２％の同一性を有する。
【０１４９】
本発明の有利な実施形態によると、少なくとも１のアンプリコンが作られたかどうかの決定は、少なくとも１のプローブ、好ましくは少なくとも１のＡ６を標的とするプローブおよび／または少なくとも１のＡ５を標的とするプローブおよび／または少なくとも１のＡ９を標的とするプローブおよび／または少なくとも１のＡ７を標的とするプローブをリアルタイム増幅において使用することにより行われてよい。
【０１５０】
好ましくは、前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーは、１より多いＡ６群の発癌性ＨＰＶ、すなわち少なくともＨＰＶ５６および少なくとも１のＡ６群の他の発癌性ＨＰＶ（例えばＨＰＶ６６、ＨＰＶ５３）の増幅において使用するのに適している。本発明によると、前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーは、Ｅ６および／Ｅ７遺伝子において、それらが標的とするＡ６群のＨＰＶのそれぞれにアニールする。それ故、本発明の有利な実施形態によると、前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーはオリゴヌクレオチドであり、そのそれぞれの配列は以下のＡ６群のＨＰＶのそれぞれのＥ６およびＥ７遺伝子からなる領域に由来する少なくとも１の核酸の増幅において、フォワードおよびリバースプライマーとして使用するのに適している：ＨＰＶ５６およびＨＰＶ６６。ＨＰＶ６６は、現在、１３ＨＲ ＨＰＶの中に挙げられていないが、ＨＰＶ６６がＨＲ ＨＰＶであると考える者もいる。
【０１５１】
好ましくは、前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーは、２以上のＡ５群の発癌性ＨＰＶ、すなわち少なくともＨＰＶ５１および少なくとも１のＡ５群の少なくとも１の他の発癌性ＨＰＶ（例えばＨＰＶ８２）の増幅において使用するのに適している。本発明によると、前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーは、Ｅ７および／またはＥ１遺伝子において、それらが標的とするＡ５群のＨＰＶのそれぞれにアニールする。それ故、本発明の有利な実施形態によると、前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーはオリゴヌクレオチドであり、そのそれぞれの配列は、以下のＡ５群のＨＰＶのそれぞれのＥ７およびＥ１遺伝子からなる領域に由来する少なくとも１の核酸の増幅において、フォワードおよびリバースプライマーとして使用するのに適している：ＨＰＶ５１およびＨＰＶ８２。
【０１５２】
好ましくは、前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーは、上述した７以上のＡ９群の発癌性ＨＰＶ、すなわち少なくともＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ１６、ならびに少なくとも１の他のＡ９群の発癌性ＨＰＶ（例えばＨＰＶ６７）の増幅において使用するのに適している。本発明によると、前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーは、Ｅ１および／またはＥ２遺伝子において、それらが標的とするＡ９群のＨＰＶのそれぞれにアニールする。それ故、本発明の有利な実施形態によると、前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーはオリゴヌクレオチドであり、そのそれぞれの配列は、以下のＡ９群のＨＰＶのそれぞれのＥ１およびＥ２遺伝子からなる領域に由来する少なくとも１の核酸の増幅において、フォワードおよびリバースプライマーとして使用するのに適している：ＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ６７、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３１、およびＨＰＶ１６。
【０１５３】
本発明の群を標的とするプライマーは、さらに、同じ群に属さないＨＰＶを標的としてよく（Ａ６、Ａ５、Ａ７またはＡ９以外のいずれの群も標的としない限り）、すなわち、Ａ９を標的とするプライマー対は、上述したＡ９群のＨＰＶを標的とすることに加え、Ａ６群に属するＨＰＶ（例えばＨＰＶ５３）を標的としてよい。それ故、前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーのそれぞれの配列は、さらに、少なくとも１のＨＰＶ５３の核酸の増幅において、フォワードおよびリバースプライマーとして使用するのに適していてよい。
【０１５４】
好ましくは、前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーは、上述した６以上のＡ７群の発癌性ＨＰＶ、すなわち少なくともＨＰＶ６８、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ４５、およびＨＰＶ１８、ならびに少なくとも１の他のＡ７群の発癌性ＨＰＶ（例えばＨＰＶ８５）の増幅において使用するのに適している。本発明によると、前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーは、Ｅ１遺伝子において、それらが標的とするＡ７群のＨＰＶのそれぞれにアニールする。それ故、本発明の有利な実施形態によると、前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーはオリゴヌクレオチドであり、そのそれぞれの配列は、以下のＡ７群ＨＰＶのそれぞれのＥ１遺伝子に由来する少なくとも１の核酸の増幅において、フォワードおよびリバースプライマーとして使用するのに適している：ＨＰＶ６８、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ８５、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ４５、およびＨＰＶ１８。
【０１５５】
発明者の知る限り、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ１６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ４５、およびＨＰＶ１８以外の粘膜の発癌性ＨＰＶの検出を可能にする先行技術のマルチプレックス方法はない。最近まで、これら１３のＨＰＶは、１３ＨＲ ＨＰＶであると考えられていた（すなわち、１３のハイリスクＨＰＶ、すなわち最も高い腫瘍罹患率を有するＨＰＶ）。しかしながら、現在、他のＨＰＶはＨＲ ＨＰＶ群に属すると考えられており、例えばＨＰＶ６６およびＨＰＶ５３（Ａ６群）である。ＨＰＶAmplicor試験のような先行技術は、グローバルコンセンサスデザインに基づくため、付加的なＨＰＶが包含され得ない。それに対して本発明は、群によるデザインに基づき、１３の基本のＨＲ ＨＰＶより多くを網羅し、患者に対してより安全であり、いずれの発癌性Ａ６、Ａ５、Ａ９およびＡ７のニューカマーも考慮に入れられる可能性があるという意味で、進歩しているという特別な利点を有する。
【０１５６】
それ故、本発明者の知る限り、本発明はいずれの他の先行技術よりも広い粘膜の発癌性ＨＰＶスペクトルを有し、検出されるＨＰＶスペクトルの進化に対する適応性のより大きな力を有する。それ故、本発明はいずれの他の先行技術よりも安全である。
【０１５７】
本発明の増幅プライマー系は、優先的に、Ａ６またはＡ５またはＡ９またはＡ７の群に属するＨＰＶ、すなわち発癌性ＨＰＶを増幅する。
【０１５８】
上述したように、本発明の増幅プライマー系のほとんどは、Ａ５およびＡ６およびＡ７およびＡ９の群により形成されるＨＰＶ組に特異的であり、特に標的とされる群に特異的であり、すなわち、本発明のほとんどのプライマー系は、Ａ６またはＡ５またはＡ９またはＡ７群に特異的である（Ａ１１またはＡ４またはＡ３群のいずれのＨＰＶも増幅しない）。
【０１５９】
それ故、前記少なくとも２のプライマーは、Ａ５およびＡ６およびＡ７およびＡ９群、特にＡ６群またはＡ５群またはＡ９群またはＡ７群、好ましくはＡ６群またはＡ５群またはＡ９群またはＡ７群の発癌性ＨＰＶにより形成されるＨＰＶ組に有利に特異的であってよい。
【０１６０】
それ故、本発明の好ましい実施形態によると、前記少なくとも２のプライマーは、Ａ６、Ａ５、Ａ９またはＡ７群に属さないＨＰＶに由来するいずれかの核酸の増幅において、フォワードおよびリバースプライマーとして使用するのに適さない配列を有し得る。本発明のより好ましい実施形態によると、前記少なくとも２のプライマーのそれぞれの配列は、それ故、発癌性でなく、好ましくは粘膜上皮に対して発癌性でなく、より好ましくは肛門性器のＨＰＶではなく、最も好ましくは子宮頸部ＨＰＶでないＨＰＶに由来する核酸の増幅におけるフォワードおよびリバースプライマーとして使用するのに適していない。
【０１６１】
言い換えると、前記少なくとも２のプライマーは、好ましくは、非発癌性ＨＰＶと比べて発癌性ＨＰＶに特異的である。
【０１６２】
本発明は、シンプレックス、マルチチューブシンプレックス、マルチプレックス、ならびにマルチ-マルチプレックス（メガプレックス）で行われてよい。本発明の有利な実施形態によると、前記増幅は、シングルチューブマルチプレックス増幅またはシングルチューブマルチ-マルチプレックス増幅（「メガプレックス」）であってよい。
【０１６３】
「シングルチューブマルチプレックス増幅」または「マルチプレックス増幅」は、ここでは、同じチューブ内の１より多い標的の増幅、および任意に検出に向けられているいずれかの増幅反応を意味する。例えば、マルチプレックス増幅には、二重の増幅（２つの標的）、三重の増幅（３つの標的）、ならびにそれ以上のマルチプレックス増幅が含まれる。マルチプレックス増幅には、１より多いプライマー対、例えば２のプライマーを用いた増幅反応が含まれる。この場合、４の異なるプライマーが存在してよいが、２つのプライマー対が共通に１つのプライマー、例えばフォワードプライマーを有し、２つの異なるリバースプライマーを有する可能性がある。マルチプレックス増幅および検出には、特有のプライマー対を用いた増幅反応も含まれるが、２以上のプローブは含まれない。
【０１６４】
それ故、本発明のマルチプレックスの実施形態によると、２以上のプライマー対が増幅反応混合物中に存在する。本発明の非常に有益な実施形態として、少なくとも４、好ましくは少なくとも６、より好ましくは少なくとも８のプライマー対が増幅反応混合物中に存在する。実際に、本発明のプライマーは、有意な特異性の損失なく、マルチプレックス増幅を可能にする。それ故、全ての試薬を同じチューブ内に入れて試験されるサンプルにおいて増幅アッセイが行われ、粘膜の発癌性ＨＰＶがサンプル中に存在する場合、シングルステップ法で検出される。
【０１６５】
好ましくは、前記増幅プライマーは、前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーおよび以下から選択される少なくとも２のプライマーを含んでなる：
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマー、
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー。
【０１６６】
好ましくは、前記増幅プライマーは、前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーおよび少なくとも２の以下から選択されるプライマーを含んでなる：
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー。
【０１６７】
好ましくは、前記増幅プライマーは、前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および少なくとも２の以下から選択されるプライマーを含んでなる：
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー。
【０１６８】
好ましくは、前記増幅プライマーは、前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー、および少なくとも２の以下から選択されるプライマーを含んでなる：
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および／または
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマー。
【０１６９】
最も好ましくは、前記増幅プライマーは以下を含んでなる：
−前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマー、および
−前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマー。
【０１７０】
本発明の有利な実施形態によると、少なくとも１のアンプリコンが作られたかどうかの決定は、前記少なくとも１のアンプリコンにアニールすることが意図された少なくとも１のプローブにより行われ、すなわち、プローブの配列は、好ましくは穏和な条件下、高いもしくは非常に高い厳密性で、前記少なくとも１のアンプリコンにプローブがアニールすることができるほど、前記少なくとも１のアンプリコン（またはそれらの相補的な配列）に対して十分相補的である。
【０１７１】
本発明のプローブは、いずれかの適切な形式で実行されてよい。  
好ましくは、本発明のプローブは、個体の支持体上に固定化されない。  
最も好ましくは、本発明のプローブはリアルタイム増幅において使用される。
【０１７２】
それ故、本発明の有利な実施形態によると、前記増幅はリアルタイム増幅であってよい。  
本発明の有利な実施形態によると、前記少なくとも１のプローブはリアルタイム増幅において使用され、すなわち前記少なくとも２のプライマーおよび前記少なくとも２のプローブは、共に増幅反応混合物中に存在してよく、それにより前記少なくとも１のプローブは、前記少なくとも２のプライマーにより産生されるアンプリコンにリアルタイムでアニールする。言い換えると、増幅および検出は単一のステップで行われる、すなわちリアルタイム増幅である。
【０１７３】
リアルタイム増幅とは、通常の増幅方法によるエンドポイント検出とは異なり、各増幅サイクルの間のアンプリコン産生の指標として、反応の間に放射された蛍光のモニタリングを可能にする増幅に基づく方法であると我々は理解する。
【０１７４】
本発明は、少なくとも２のＡ６および／またはＡ５および／またはＡ９および／またはＡ７を標的とするプライマーによる粘膜の発癌性ＨＰＶ核酸の増幅により得られるアンプリコンを標的とすることが意図されるプローブを提供する。  
これらのプローブは、リアルタイムマルチプレックス増幅において使用するのに適するという特別な技術的特徴を有する。
【０１７５】
本発明のいくつかのプローブは、１つの群の全てのＨＰＶを検出することを可能にする（すなわち、それらは、本発明の群を標的とするプライマー対を用いて得られる全てのアンプリコンにアニールする）。本発明の他のプローブは、１つの群の１つまたはいくつかのＨＰＶのみ検出する。それ故、本発明はさらに、異なるレベルの検出を提供する：反応は、Ａ６および／またはＡ５および／またはＡ９および／またはＡ７群の少なくとも１の粘膜の発癌性ＨＰＶの存在もしくは非存在、または少なくとも１の粘膜の発癌性ＨＰＶ型の存在または非存在のようなより正確な反応のように、少なくとも１の粘膜の発癌性ＨＰＶの存在もしくは非存在のグローバル検出またはより正確な反応であってよい。
【０１７６】
好ましくは、少なくとも１のアンプリコンが作られたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、少なくとも１のＡ６および／またはＡ５および／またはＡ９および／またはＡ７を標的とするプローブを用いて行われ、その配列は、前記少なくとも２のＡ６および／またはＡ５および／またはＡ９および／またはＡ７をそれぞれ標的とするプライマーにより作られる少なくとも１のアンプリコンを検出するためのプローブとして使用するのに適している。
【０１７７】
本発明の有利な実施形態によると、前記増幅は、リアルタイムマルチプレックス増幅であってよい。本発明の非常に有利な実施形態によると、前記増幅は、リアルタイムマルチプレックス増幅として行われてよい。それ故、増幅反応混合物は、ＨＰＶの検出における特異性の有意な損失なく、３以上のプライマーおよび少なくとも１のプローブを含んでよい。発明者の知る限り、本技術は、リアルタイムマルチプレックス増幅を可能にする最初のものである。粘膜の発癌性ＨＰＶが全ての反応物（プライマーおよびプローブ）が入れられたシングルチューブアッセイでスクリーニングされるという意味で非常に有益である。特に、本発明は、Ａ６、Ａ５、Ａ９およびＡ７を標的とするプライマーおよびプローブを提供し、有意な特異性の損失なく、同じ反応混合物中に全て存在し得る。
【０１７８】
それ故、本発明は、いずれの先行技術よりもずっと扱いが簡単で、ずっと速い。さらに、サンプル分析における実験エラーまたはコンタミネーションの可能性を制限する。
【０１７９】
発明者の知る限り、本技術は、リアルタイムマルチプレックス増幅を可能にする最初のものであり、少なくとも５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５の群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは、少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ、および上述したように、最も好ましくは少なくとも１８の発癌性ＨＰＶ（すなわち、少なくとも１３ＨＲおよび５の他の発癌性ＨＰＶ、すなわちＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５）を網羅することが可能である。
【０１８０】
本発明の有利な実施形態によると、前記増幅は定量的なリアルタイムマルチプレックス増幅であってよい。  
本発明のより有利な実施形態によると、前記増幅は、定量的なリアルタイムマルチプレックス増幅として行われてよい。実際に、本発明のプライマーおよびプローブは、それらがリアルタイムマルチプレックス増幅において行われた場合であっても、特異性における損失なく且つ定量的な正確さにおいて損失のない配列を有する。
【０１８１】
発明者の知る限り、本技術は定量的なリアルタイムマルチプレックス増幅を可能にする最初のものであり、少なくとも５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合には、Ａ６および／またはＡ５群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３ＨＲ ＨＰＶ、および上述したように、最も好ましくは少なくとも１８の発癌性ＨＰＶ（すなわち、少なくとも１３ＨＲおよび５の他の発癌性ＨＰＶ、すなわちＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５）を網羅することを可能にする。
【０１８２】
本発明は、診断の分野だけでなく、抗ＨＰＶ治療の効果のモニターまたは抗ＨＰＶ薬の効果の評価のような治療評価の分野における適用も見出している。発明者の知る限り、そのような治療に関連する適用は、先行技術のいずれによっても達成されていない。  
本発明は、ＨＰＶモニタリングの分野において、技術的な大きな進歩を提供する。
【０１８３】
それ故、前記増幅は、定量的なリアルタイムマルチプレックス増幅であってよく、粘膜上皮に対して発癌性であり得る１以上のＨＰＶの検出を、シングルチューブ増幅で行うことを可能にする。
【０１８４】
本発明は、
少なくとも５の最も一般的なＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、  好ましくは、少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、
さらに好ましくは、５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合には、Ａ６および／またはＡ５の群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、
さらに好ましくは、ＨＲ ＨＰＶとして既知の少なくとも１３のＨＰＶ（ＨＰＶ５６、５１、５８，３３、５２、３５、３１、１６、６８、３９、５９、４５および１８）、
より好ましくは、少なくとも前記１３のＨＰＶならびにＨＰＶ型６６、８２、６７、８５、および５３の中の少なくとも１、
さらにより好ましくは、少なくとも前記１３のＨＰＶならびにＨＰＶ型６６、８２、６７、８５、および５３の中の少なくとも２、
さらにより好ましくは、少なくとも前記１３のＨＰＶならびにＨＰＶ型６６、８２、６７、８５、および５３の中の少なくとも３、
最も好ましくは、少なくとも前記１３のＨＰＶならびにＨＰＶ型６６、８２、６７、８５、および５３の中の少なくとも４、特に前記１３ＨＲ ＨＰＶおよびＨＰＶ型６６、８２、６７、８５からなる少なくとも１７の粘膜ＨＰＶ、
さらに最も好ましくは、少なくとも１３のＨＰＶならびに少なくとも５のＨＰＶ型６６、８２、６７、８５、および５３のリアルタイムマルチプレックス検出、好ましくはリアルタイムの定量的なマルチプレックス検出をシングルチューブアッセイで可能にする。
【０１８５】
好ましくは、前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーのそれぞれの配列は、少なくとも１の参照鋳型配列の増幅において使用するのに適しており、前記少なくとも１の参照鋳型配列は、配列番号４２０（受付番号NC_001594.1）のＨＰＶ５６配列の４１３〜７９１位からなる断片（配列番号３３７）であるか；または粘膜上皮に対して発癌性であってよいＨＰＶ、好ましくは少なくとも５の最も一般的なＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、さらに好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ、最も好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶおよび少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または５のＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５のリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ６を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持している、その保存的な細断片（sub-fragment）であるか；または前記断片または細断片の全長に渡って前記断片または細断片と完全に相補的である配列である。
【０１８６】
より好ましくは、前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーのそれぞれの配列は、表１８に示すように配列番号２５〜２９および３３４〜３３８の１からなる少なくとも１の参照鋳型配列（Ａ６参照鋳型）または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列の特異的な増幅において使用するのに適している。
【０１８７】
前記参照鋳型配列は、特に、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶ、好ましくは、少なくとも５の最も一般的なＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、さらに好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ、最も好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶおよび少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または５のＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５のリアルタイムマルチプレックス検出ならびに好ましくはそのようなＨＰＶのリアルタイムの定量的なマルチプレックス検出を可能にするＡ６を標的とするプライマーを構成および産生する適切な参照であるという特別な技術的特徴を有する。
【０１８８】
参照鋳型配列は、上述した配列番号からなると定義されているため（上述した配列番号の１つを含んでなるとは定義されていない）、プライマーは、これらの参照鋳型配列に隣接しないが、アンプリコンが列挙された配列番号の１つを構成するように、参照鋳型配列中に存在する。他に断らない限り、それは、ここで配列番号からなるとして定義されているいずれかの参照鋳型配列に適用する。
【０１８９】
前記少なくとも２のＡ６を標的とするプライマーは、例えば、配列番号３０〜３４の少なくとも１（フォワードプライマー）および配列番号３５〜３７の少なくとも１（リバースプライマー）であってよい。
【表１】
2015033383.tif 000002
【０１９０】
表中のＸは、プライマーが相互に対として組み合わされ得ることを示す。
【０１９１】
本発明の有利な実施形態によると、前記少なくとも１のＡ６を標的とするプライマー系により少なくとも１のアンプリコンが作られたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、少なくとも１のプローブ、好ましくは少なくとも１のＡ６を標的とするプローブを用いて行われてよい。
【０１９２】
好都合には、少なくとも１のアンプリコンが作られたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号３８〜４０またはそれらに相補的な配列（すなわち、前記配列の全長に渡って完全に相補的である同じ長さの配列）の１つからなる少なくとも１のＡ６を標的とするプローブ、任意に、少なくとも１の５’および／または３’検出標識および／または少なくとも１のビーコンアーム、またはスコーピオン（登録商標）アーム、好ましくは少なくとも１の５’および／または３’におけるアーム、最も好ましくはそれぞれ５’および３’におけるアームの２つのように、クエンチャーまたはレポーター（例えばフルオロフォア）を運ぶことが意図された少なくとも１のＨＰＶとは無関係なアームを用いて行われる。
【０１９３】
以下の実施例に示すように（例えば表２３を参照されたい）、プライマー対とプローブの好ましい組み合わせを以下に示す：
【表２】
2015033383.tif 000003
【０１９４】
好都合には、前記少なくとも１のＡ６を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は配列番号４１〜４５の１つであるか、それらに相補的な配列（すなわち、前記配列の全長に渡って完全に相補的である同じ長さの配列）の１つである。
【０１９５】
以下の実施例に示すように（例えば、表２３を参照されたい）、プライマー対およびビーコンプローブの最も好ましい組み合わせを以下に示す：
【表３】
2015033383.tif 000004
【０１９６】
好ましくは、前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーのそれぞれの配列は、少なくとも１の参照鋳型配列の増幅において使用するのに適しており、前記少なくとも１の参照鋳型配列は、配列番号４２１（受付番号NC_001533.1）のＨＰＶ５１配列の６７８〜９０２位からなる断片（配列番号３２６）であるか；または粘膜上皮に対して発癌性であってよいＨＰＶ、好ましくは少なくとも５の最も一般的なＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、さらに好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ、最も好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶおよび少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または５のＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５のリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ５を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持している、その保存的な細断片（sub-fragment）であるか；または前記断片または細断片の全長に渡って前記断片または細断片と完全に相補的である配列である。
【０１９７】
より好ましくは、前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーのそれぞれの配列は、少なくとも１の参照鋳型配列の特異的な増幅において使用するのに適しており、前記少なくとも１の参照鋳型配列は、表１２に示すように、配列番号１〜５および配列番号３２０〜３３３の１つからなるか、または前記配列番号の配列の全長に渡ってそれらに完全に相補的な配列である。
【０１９８】
前記参照鋳型配列は、粘膜上皮に対して発癌性であってよいＨＰＶ、好ましくは少なくとも５の最も一般的なＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、さらに好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ、最も好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶおよびＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または５のリアルタイムマルチプレックス検出、好ましくはそのようなＨＰＶのリアルタイムの定量的なマルチプレックス検出を可能にする、Ａ５を標的とするプライマーを構築し、産生する適切な参照であるという特別な技術的特徴を有する。
【０１９９】
前記少なくとも２のＡ５を標的とするプライマーは、例えば、配列番号６〜１０の少なくとも１（フォワードプライマー）および配列番号１１〜１５の少なくとも１（リバースプライマー）であってよい。
【０２００】
以下の実施例で説明するように（例えば、表１７を参照されたい）、フォワードおよびリバースプライマーの好ましい組み合わせは以下の通りである：
【表４】
2015033383.tif 000005
【０２０１】
表中のＸは、対として相互に組み合わせることができるプライマーを意味する。
【０２０２】
好都合には、少なくとも１のアンプリコンが作られるかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号１６〜１９の１つ、またはそれらに相補的な配列（すなわち、前記配列の全長に渡って完全に相補的である同じ長さの配列）の１つからなる少なくとも１のＡ５を標的とするプローブ、および任意に、少なくとも１の検出標識および／または少なくとも１のビーコンアーム、またはスコーピオン（登録商標）アーム、好ましくは５’および／または３’におけるそのようなアームの１つ、最も好ましくは５’および３’のそれぞれにおける２つのそのようなアームのように、クエンチャーまたはレポーター（例えばフルオロフォア）を運ぶことが意図された少なくとも１のＨＰＶとは無関係なアームを用いて行われる。
【０２０３】
以下の実施例で説明するように（例えば、表１７を参照されたい）、プライマー対とプローブとの好ましい組み合わせは以下の通りである：
【表５】
2015033383.tif 000006
【０２０４】
好都合には、前記少なくとも１のＡ５を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号２０〜２４の１つまたはそれらに相補的な配列（すなわち、前記配列の全長に渡って完全に相補的である同じ長さの配列）の１つである。
【０２０５】
以下の実施例で説明するように（例えば、図１７を参照されたい）、プライマー対とプローブとの最も好ましい組み合わせは以下の通りである：
【表６】
2015033383.tif 000007
【０２０６】
好ましくは、前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーのそれぞれの配列は、少なくとも１の参照鋳型配列の増幅において使用するのに適しており、前記少なくとも１の参照鋳型配列は、
−配列番号４２２（受付番号NC_001526.1）のＨＰＶ１６配列の２７０７〜２７９４位からなる断片（配列番号１２２）；または粘膜上皮に対して発癌性であってよいＨＰＶ、好ましくは少なくとも５の最も一般的なＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、さらに好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ、最も好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶおよびＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または５のリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ５を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持している、その保存的な細断片（sub-fragment）；または前記断片または細断片の全長に渡って前記断片または細断片に完全に相補的である配列、あるいは
−配列番号４２２（受付番号NC_001526.1）のＨＰＶ１６配列の３６００〜３８４０位からなる断片（配列番号３７７）；または粘膜上皮に対して発癌性であってよいＨＰＶ、好ましくは少なくとも５の最も一般的なＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、さらに好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ、最も好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶおよびＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または５のリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ５を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持している、その保存的な細断片（sub-fragment）；または前記断片または細断片の全長に渡って前記断片または細断片に完全に相補的である配列である。
【０２０７】
より好ましくは、前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーのそれぞれの配列は、表３０に示すように配列番号１２２〜２１０および３５９〜４１９のいずれか１からなる少なくとも１の参照鋳型配列または前記配列番号の配列の全長に渡ってそれらに完全に相補的な配列の特異的な増幅において使用するのに適している。
【０２０８】
前記参照鋳型配列は、特に、粘膜上皮に対して発癌性であってよいＨＰＶ、好ましくは少なくとも５の最も一般的なＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、さらに好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ、最も好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶおよびＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または５のリアルタイムマルチプレックス検出、好ましくはそのようなＨＰＶのリアルタイムの定量的なマルチプレックス検出を可能にするＡ９を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照であるという特別な技術的特徴を有している。
【０２０９】
前記少なくとも２のＡ９を標的とするプライマーは、例えば、配列番号２１１〜２３９の少なくとも１（フォワードプライマー）および配列番号２４０〜２６５の少なくとも１（リバースプライマー）であってよい。
【０２１０】
以下の実施例において説明するように（例えば、表３５を参照されたい）、フォワードプライマーとリバースプライマーの好ましい組み合わせは以下の通りである：
−Ａ９増幅系Ｃ：配列番号２１１〜２１７の少なくとも１および配列番号２４０〜２４１の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２１１〜２１７の少なくとも３、例えば、２１２、２１４および２１６、および配列番号２４０〜２４１の両方；
−Ａ９増幅系Ｅ１：配列番号２１８〜２２０の少なくとも１および配列番号２４２〜２４７の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２１８〜２２０の少なくとも３および配列番号２４２〜２４７の少なくとも５（例えば、配列番号２４２〜２４３、２４５〜２４７）；
−Ａ９増幅系Ｅ２：配列番号２２１〜２２３の少なくとも１および配列番号２４２〜２４７の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２２１〜２２３の少なくとも３および配列番号２４２〜２４７の少なくとも５（例えば、配列番号２４２〜２４３、２４５〜２４７）；
−Ａ９増幅系Ｅ３：配列番号２２１〜２２３の少なくとも１および配列番号２４８〜２５５の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２２１〜２２３の少なくとも３および配列番号２４８〜２５５の少なくとも５（例えば、配列番号２４８〜２５２）；
−Ａ９増幅系Ｅ４：配列番号２２４〜２２６の少なくとも１および配列番号２４８〜２５５の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２２４〜２２６の少なくとも３および配列番号２４８〜２５５の少なくとも５（例えば、配列番号２４８〜２５２）；
−Ａ９増幅系Ｅ５：配列番号２２４〜２２６の少なくとも１および配列番号２４２〜２４７の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２２４〜２２６の少なくとも３および配列番号２４２〜２４７の少なくとも５（例えば、配列番号２４２〜２４３、２４５〜２４７）；
−Ａ９増幅系Ｅ６：配列番号２１８〜２２０の少なくとも１および配列番号２４８〜２５５の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２１８〜２２０の少なくとも３および配列番号２４８〜２５５の少なくとも５（例えば、配列番号２４８〜２５２）；
−Ａ９増幅系Ｅ１Ｈ Ｚ７：配列番号２１８〜２２０の少なくとも１および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２１８〜２２０の少なくとも３および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも４（例えば、配列番号２５８；２６１；２６４；２６５）；
−Ａ９増幅系Ｅ１Ｈ Ｚ８：配列番号２１８〜２２０の少なくとも１および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２１８〜２２０の少なくとも３および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも４（例えば、配列番号２５８；２６１；２６４；２６５）；
−Ａ９増幅系Ｅ２Ｈ Ｚ７：配列番号２２１〜２２３の少なくとも１および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２２１〜２２３の少なくとも３および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも４（例えば、配列番号２５８；２６１；２６４；２６５）；
−Ａ９増幅系Ｅ２Ｈ Ｚ８：Ａ９増幅系Ｅ２Ｈ Ｚ７と同じ、すなわち、配列番号２２１〜２２３の少なくとも１および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２２１〜２２３の少なくとも３および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも４（例えば、配列番号２５８；２６１；２６４；２６５）；
−Ａ９増幅系Ｅ４Ｈ Ｚ７：配列番号２２４〜２２６の少なくとも１および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２２４〜２２６の少なくとも３および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも４（例えば、配列番号２５８；２６１；２６４；２６５）；
−Ａ９増幅系Ｅ４Ｈ Ｚ８：配列番号２２４〜２２６の少なくとも１および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２２４〜２２６の少なくとも３および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも４（例えば、配列番号２５８；２６１；２６４；２６５）；
−Ａ９増幅系Ｆ：配列番号２２７〜２３０の少なくとも１および配列番号２４８〜２５５の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２２７〜２３０の少なくとも４および配列番号２４８〜２５５の少なくとも５（例えば、配列番号２４８〜２５２）；
−Ａ９増幅系ＦＥ：配列番号２２７〜２３０の少なくとも１および配列番号２４２〜２４７の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２２７〜２３０の少なくとも４および配列番号２４２〜２４７の少なくとも５（例えば、配列番号２４２〜２４３；２４５〜２４７）；
−Ａ９増幅系ＦＨ Ｚ７：配列番号２２７〜２３０の少なくとも１および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２２７〜２３０の少なくとも４および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも４（例えば、配列番号２５８；２６１；２６４；２６５）；
−Ａ９増幅系ＦＨ Ｚ８：Ａ９増幅系ＦＨ Ｚ７と同一、すなわち、配列番号２２７〜２３０の少なくとも１および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２２７〜２３０の少なくとも３および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも４（例えば、配列番号２５８；２６１；２６４；２６５）；
−Ａ９増幅系Ｇ Ｚ７：配列番号２２７〜２３０の少なくとも１および配列番号２５６〜２６１の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２２７〜２３０の少なくとも３および配列番号２５６〜２６１の少なくとも５（例えば、配列番号２５７〜２６１）；
−Ａ９増幅系Ｇ Ｚ８：Ａ９増幅系Ｇ Ｚ７と同じ、すなわち、配列番号２２７〜２３０の少なくとも１および配列番号２５６〜２６１の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２２７〜２３０の少なくとも３および配列番号２５６〜２６１の少なくとも５（例えば、配列番号２５７〜２６１）；
−Ａ９増幅系Ｈ：配列番号２３１〜２３９の少なくとも１および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも１；好ましくは、Ａ９群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、配列番号２３１〜２３９の少なくとも３（例えば、配列番号２３２；２３４；２３５）および配列番号２５６〜２５９；２６１〜２６５の少なくとも４（例えば、配列番号２５８；２６１；２６４；２６５）。
【０２１１】
好都合には、少なくとも１のアンプリコンが作られたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号２６６〜２８２の１つまたはそれらに相補的な配列（すなわち、前記配列の全長に渡って完全に相補的である同じ長さの配列）の１つからなる少なくとも１のＡ９を標的とするプローブ、および任意に、少なくとも１の検出標識および／または少なくとも１のビーコンアーム、またはスコーピオン（登録商標）アーム、好ましくは５’および／または３’における少なくとも１のそのようなアーム、最も好ましくはそれぞれ５’および３’におけるそのようなアームの２つのように、クエンチャーまたはレポーター（例えばフルオロフォア）を運ぶことが意図された少なくとも１のＨＰＶとは無関係なアームを用いて行われる。
【０２１２】
以下の実施例で説明するように（例えば、表３５を参照されたい）、プライマー対およびプローブの好ましい組み合わせは以下の通りである：
【表７】
2015033383.tif 000008
【０２１３】
好都合には、前記少なくとも１のＡ９を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号２８３〜３１９の１つ、またはそれらに相補的な配列（すなわち、前記配列の全長に渡って完全に相補的である同じ長さの配列）の１つである。
【０２１４】
以下の実施例で説明するように（例えば、表３５を参照されたい）、最も好ましいプライマー対とプローブの組み合わせは以下の通りである：
【表８】
2015033383.tif 000009
【０２１５】
上述したプローブの特異的な結果のいくつかは、表６０〜６８に示されている（Ａ９特異性）。
【０２１６】
全ての表において、プローブの名称が他のプローブの名称と最後の１文字だけ異なる場合（例えば、Ａ９Ｅ１Ｓ１０とＡ９Ｅ１Ｓ１０ａ）、これらのプローブは同じハイブリダイズセグメントを有し、それらのビーコンアームにおいてのみ異なる。
【０２１７】
グレーのボックスは、試験されたプローブがアンプリコンを検出することを示す。  
例えば、配列番号２８５のプローブＡ９Ｅ１Ｓ１１は、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ３５を検出し、他のＨＰＶを検出しない。
【０２１８】
例えば、配列番号２８４のプローブＡ９Ｅ１Ｓ１０ａは、Ａ９群のすべての発癌性ＨＰＶ（ＨＰＶ１６、３１、３３、３５、５２、５８、６７）およびＡ６群の１つのＨＰＶ（ＨＰＶ５３）を検出し、配列番号２８８のプローブＡ９Ｅ１Ｓ１２ａは、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ３５を検出し、ＨＰＶ５３を検出しない（「ＮＤ」）。それ故、Ａ９Ｅ１Ｓ１０ａとＡ９Ｅ１Ｓ１２ａとの組み合わせは、ＨＰＶ１６、３１、３３、３５、５２、５８、６７、５３の特異的な検出を可能にする。  
当業者が適切であることを見出せるいずれの組み合わせが、ここでは明確に包含される。
【０２１９】
好ましくは、前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーのそれぞれの配列は、少なくとも１の参照鋳型配列の増幅において使用するのに適しており、前記少なくとも１の参照鋳型配列は、
−配列番号４２３（受付番号NC_001357.1）のＨＰＶ１８配列の１８９５〜２１０３位からなる断片（配列番号４８）；または粘膜上皮に対して発癌性であってよいＨＰＶ、好ましくは少なくとも５の最も一般的なＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、さらに好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ、最も好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶおよびＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または５のリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ７を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持している、その保存的な細断片（sub-fragment）；または前記断片または細断片の全長に渡って前記断片または細断片に完全に相補的である配列、あるいは
−配列番号４２３（受付番号NC_001357.1）のＨＰＶ１８配列の９１６〜１０４４位からなる断片（配列番号６５）；または粘膜上皮に対して発癌性であってよいＨＰＶ、好ましくは少なくとも５の最も一般的なＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、さらに好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ、最も好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶおよび少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または５のＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５のリアルタイムマルチプレックス検出を可能にするＡ５を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照鋳型配列であるという性質を保持している、その保存的な細断片（sub-fragment）；または前記断片または細断片の全長に渡って前記断片または細断片に完全に相補的な配列である。
【０２２０】
より好ましくは、前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーのそれぞれの配列は、表２４に示すように、配列番号４６〜６７；３３９〜３５８からなる少なくとも１の参照鋳型配列、または前記配列番号の配列の全長にわたってそれらに完全に相補的な配列の特異的な増幅において使用するのに適している。
【０２２１】
前記参照鋳型配列は、特に、粘膜上皮に対して発癌性であってよいＨＰＶ、好ましくは少なくとも５の最も一般的なＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、さらに好ましくは少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、さらに好ましくは５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合にはＡ６および／またはＡ５群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、より好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶ、最も好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶおよびＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または５のリアルタイムマルチプレックス検出、好ましくはそのようなＨＰＶのリアルタイムの定量的なマルチプレックス検出を可能にするＡ７を標的とするプライマーを構成し、産生する適切な参照であるという特別な技術的特徴を有している。
【０２２２】
前記少なくとも２のＡ７を標的とするプライマーは、例えば、配列番号６８〜７８の少なくとも１（フォワードプライマー）および配列番号７９〜８７の少なくとも１（リバースプライマー）であってよい。
【０２２３】
以下の実施例で説明するように（例えば、表２９を参照されたい）、フォワードプライマーとリバースプライマーの好ましい組み合わせは以下に示す通りである：
−Ａ７増幅系Ａ：配列番号６８〜７０の少なくとも１および配列番号７９〜８１の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系Ａ１：Ａ７増幅系Ａと同じ、すなわち、配列番号６８〜７０の少なくとも１および配列番号７９〜８１の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系Ａ２：Ａ７増幅系ＡまたはＡ１と同じ、すなわち、配列番号６８〜７０の少なくとも１および配列番号７９〜８１の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系ＡＢ：配列番号６８〜７０の少なくとも１および配列番号８２〜８３の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系ＡＣ１：配列番号６８〜７０の少なくとも１および配列番号８４〜８５の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系ＡＣ２：Ａ７増幅系ＡＣ１と同じ、すなわち、配列番号６８〜７０の少なくとも１および配列番号８４〜８５の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系ＡＣ３：Ａ７増幅系ＡＣ１またはＡｃ２と同じ、すなわち、配列番号６８〜７０の少なくとも１および配列番号８４〜８５の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系Ｂ：配列番号７１〜７３の少なくとも１および配列番号８２〜８３の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系ＢＡ１：配列番号７１〜７３の少なくとも１および配列番号７９〜８１の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系ＢＡ２：Ａ７増幅系ＢＡ１と同じ、すなわち、配列番号７１〜７３の少なくとも１および配列番号７９〜８１の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系ＢＡ３：Ａ７増幅系ＢＡ１またはＢＡ２と同じ、すなわち、配列番号７１〜７３の少なくとも１および配列番号７９〜８１の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系ＢＣ１：配列番号７１〜７３の少なくとも１および配列番号８４〜８５の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系ＢＣ２：Ａ７増幅系ＢＣ１と同じ、すなわち、配列番号７１〜７３の少なくとも１および配列番号８４〜８５の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系ＢＣ３：Ａ７増幅系ＢＣ１またはＢＣ２と同じ、すなわち、配列番号７１〜７３の少なくとも１および配列番号８４〜８５の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系Ｃ：配列番号７４〜７６の少なくとも１および配列番号８４〜８５の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系Ｃ１：Ａ７増幅系Ｃと同じ、すなわち、配列番号７４〜７６の少なくとも１および配列番号８４〜８５の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系ＣＡ１：Ａ７増幅系Ｃ１と同じ、すなわち、配列番号７４〜７６の少なくとも１および配列番号７９〜８１の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系ＣＡ２：Ａ７増幅系Ｃ１またはＣＡ１と同じ、すなわち、配列番号７４〜７６の少なくとも１および配列番号７９〜８１の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て；
−Ａ７増幅系Ｄ：配列番号７７〜７８の少なくとも１および配列番号８６〜８７の少なくとも１；好ましくは、Ａ７群の全ての発癌性ＨＰＶの増幅が望まれる場合、それらの全て。
【０２２４】
好都合には、少なくとも１のアンプリコンが作られたかどうかの決定は、リアルタイム増幅において、配列番号８８〜１０１の１つまたはそれらに相補的な配列（すなわち、前記配列の全長に渡って完全に相補的である同じ長さの配列）の１つからなる少なくとも１のＡ７を標的とするプローブ、および任意に、少なくとも１の検出標識および／または少なくとも１のビーコンアーム、またはスコーピオン（登録商標）アーム、好ましくは５’および／または３’における少なくとも１のそのようなアーム、最も好ましくはそれぞれ５’および３’におけるそのような２つのアームのように、クエンチャーまたはレポーター（例えばフルオロフォア）を運ぶことが意図された少なくとも１のＨＰＶとは無関係なアームを用いて行われる。
【０２２５】
以下の実施例で説明するように（例えば、表２９を参照されたい）、プライマー対とプローブの好ましい組み合わせは以下の通りである：
【表１０】
2015033383.tif 000010
【０２２６】
好都合には、前記少なくとも１のＡ７を標的とするプローブはビーコンプローブであり、その配列は、配列番号１０２〜１２１の１つまたはそれらに相補的な配列（すなわち、前記配列の全長に渡って完全に相補的な同じ長さの配列）の１つである。
【０２２７】
以下の実施例で説明するように（例えば、表２９を参照されたい）、プライマー対とプローブの最も好ましい組み合わせは以下の通りである：
【表１１】
2015033383.tif 000011
【０２２８】
前記増幅は、当業者に適切であることが見出されたいずれの核酸増幅であってもよく、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、または例えばＴＭＡ（transcription mediated amplification）、ＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence based amplification）、３ＳＲ（self sustained sequence replication）または鎖置換増幅のような等温増幅技術である。前記増幅は、好ましくはＰＣＲである。
【０２２９】
好ましい実施形態において、本発明によるプライマーは、最終濃度範囲１００〜２０００ｎＭで使用される。典型的に、前記プライマーは、最終濃度範囲２００〜１５００ｎＭ、好ましくは２５０〜１０００ｎＭ、より好ましくは５００〜１０００ｎＭ、さらに好ましくは６００〜１０００ｎＭで使用されてよい。
【０２３０】
ＰＣＲ反応におけるプローブ濃度は、典型的に、５０ｎＭ〜１０００ｎＭの最終濃度で変化させることにより最適化されてよい。好ましい実施形態において、本発明によるプローブは、最終濃度範囲５０〜１０００ｎＭ、好ましくは１００〜８００ｎＭ、より好ましくは１００〜６００ｎＭ、さらに好ましくは２００〜６００ｎＭで使用される。
【０２３１】
適切な増幅条件は、当業者に既知である。それらには、温度条件、特に熱サイクル条件、例えばサイクルの温度、期間、数、加熱速度が含まれる。好ましい実施形態において、前記温度条件には、ＰＣＲに適した条件が含まれる。もう１つの好ましい実施形態において、前記条件にはＱ−ＰＣＲに適した条件が含まれる。
【０２３２】
少なくとも本発明のＡ６を標的とする１のリアルタイム増幅系および少なくとも１の本発明のＡ５を標的とする１のリアルタイム増幅系および少なくとも１の本発明のＡ９を標的とする１のリアルタイム増幅系および少なくとも１の本発明のＡ７を標的とする１のリアルタイム増幅系を含んでなる、当業者により考えられるメガプレックス、すなわちマルチ-マルチプレックスは、本願に包含される。
【０２３３】
例えば、Ａ５を標的とする系Ｅ、およびＡ６を標的とする系Ａ、およびＡ７を標的とする系Ａ、およびＡ９を標的とする系Ｈは、シングルチューブアッセイにおいて一緒に使用することができ、メガプレックス（「メガプレックスＥＡＡＨ」）を形成する。
【０２３４】
例えば、Ａ５を標的とする系Ｅ、およびＡ６を標的とする系Ｂ、およびＡ７を標的とする系Ａ、およびＡ９を標的とする系Ｃは、シングルチューブアッセイにおいて一緒に使用することができ、メガプレックス（「メガプレックスＥＢＡＣ」）を形成する。
【０２３５】
そのようなメガプレックスの特異性および反応性の結果は、以下の表８３〜８８に示す。  
表８４および８７（「メガプレックスＥＡＡＨ」）から、そのようなメガプレックスは、発癌性ＨＰＶ、すなわち１３のＨＲ ＨＰＶおよび５の他の発癌性ＨＰＶ（ＨＰＶ６６、５３、８２、６７、８５）の効率的な検出を可能にし、このメガプレックスは、結果として少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶおよび４の他の発癌性ＨＰＶ（ＨＰＶ６６、５３、８２、８５）に対して定量的になるように、十分に均質な反応性および特異性（Ｃｔ）を有する。
【０２３６】
表８６および８８（「メガプレックスＥＢＡＣ」）から、そのようなメガプレックスは、少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶの効率的な検出を可能にし、このメガプレックスは、結果として少なくとも５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）に対して定量的になるように、十分に均質な反応性および特異性（Ｃｔ）を有する。
【０２３７】
好ましいメガプレックスは、特に、上述したＥＡＡＨおよびＥＢＡＣメガプレックス、ならびに以下のメガプレックス系を含んでなる：
−Ａ５を標的とする系Ｅ、およびＡ６を標的とする系Ｂ、およびＡ７を標的とする系Ｃ、およびＡ９を標的とする系Ｃの組み合わせは、シングルチューブアッセイにおいて一緒に使用することができ、メガプレックス（「メガプレックスＥＢＣＣ」）を形成する；
−Ａ５を標的とする系Ｅ、およびＡ６を標的とする系Ｂ、およびＡ７を標的とする系Ｂ、およびＡ９を標的とする系Ｃの組み合わせは、シングルチューブアッセイにおいて一緒に使用することができ、メガプレックス（「メガプレックスＥＢＢＣ」）を形成する；
−Ａ５を標的とする系Ｅ、およびＡ６を標的とする系Ｂ、およびＡ７を標的とする系Ｄ、およびＡ９を標的とする系Ｃの組み合わせは、シングルチューブアッセイにおいて一緒に使用することができ、メガプレックス（「メガプレックスＥＢＤＣ」）を形成する；
−Ａ５を標的とする系Ｅ、およびＡ６を標的とする系Ｂ、およびＡ７を標的とする系Ａ、およびＡ９を標的とする系Ｈの組み合わせは、シングルチューブアッセイにおいて一緒に使用することができ、メガプレックス（「メガプレックスＥＢＡＨ」）を形成する。
【０２３８】
本願は、Ａ６、Ａ５、Ａ９またはＡ７群の少なくとも１のＨＰＶを含有するＨＰＶ含有サンプル、例えば、ＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ６６を含有するサンプルにおいて、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法の実行により得られるいずれかのアンプリコンにも関する。
【０２３９】
本発明は、マルチプレックスにおいて使用することができるプライマーの設計において、参照鋳型配列として使用するのに適したポリヌクレオチドにも向けられており、
少なくとも５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶ（ＨＰＶ１６、１８、４５、３１、３３）、
好ましくは、少なくとも７のＨＲ ＨＰＶ、
さらに好ましくは、５の最も一般的なＨＲ ＨＰＶならびに少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ、好都合には、Ａ６および／またはＡ５群に属する少なくとも２の他のＨＲ ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ５６、５１、３３、３１、１６、４５、１８）、
さらに好ましくは少なくとも１３のＨＲ ＨＰＶとして既知のＨＰＶ（ＨＰＶ型５６、５１、５８、３３、５２、３５、３１、１６、６８、３９、５９、４５および１８）、
より好ましくは、少なくとも１３のＨＰＶならびにＨＰＶ６６、８２、６７、８５、および５３の中の少なくとも１、
さらにより好ましくは、少なくとも１３のＨＰＶならびにＨＰＶ６６、８２、６７、８５、および５３の中の少なくとも２、
さらにより好ましくは、少なくとも１３のＨＰＶならびにＨＰＶ６６、８２、６７、８５、および５３の中の少なくとも３、
最も好ましくは、少なくとも１３のＨＰＶならびにＨＰＶ６６、８２、６７、８５、および５３の中の少なくとも４、特に、前記１３ＨＲ ＨＰＶおよびＨＰＶ型６６、８２、６７、８５からなる少なくとも１７の粘膜ＨＰＶ、
さらに最も好ましくは、少なくとも１３のＨＰＶならびに少なくとも５のＨＰＶ型６６、８２、６７、８５、および５３を網羅し、単一の増幅において、リアルタイムの定量的なそれらの増幅を提供する。
【０２４０】
もちろん、本発明によるポリヌクレオチドは、シンプレックスプロトコル、マルチプレックスプロトコル、エンドポイントプロトコル、定性的なプロトコル、定量的なプロトコル、およびそれらの組み合わせ等を含むさらなるプロトコルに対しても適している。
【０２４１】
ヌクレオチドとは、ここでは、ヌクレオチドのポリマーであると解され、該ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、および変性ヌクレオチド等であってよい。前記ヌクレオチドは、好ましくは１本鎖であるが、２本鎖であってもよい。前記ポリヌクレオチドの長さは変化してよく、通常５００ヌクレオチド（ｎｔ）以下であり、好ましくは５０〜４００ｎｔ、より好ましくは１００〜３００ｎｔ、さらにより好ましくは８０〜２６０ｎｔである。
【０２４２】
本願は、Ａ６、Ａ５、Ａ９およびＡ７群のＨＰＶを増幅するためのシングルチューブマルチプレックスにおいて使用することができるプライマーの設計において、および前記増幅されたＨＰＶのリアルタイム検出のためのシングルチューブマルチプレックスにおいて使用することができるプローブの設計において、参照鋳型配列として使用するのに適したポリヌクレオチドにも関し、前記参照鋳型ポリヌクレオチドは以下から選択される：
−Ａ６群：配列番号４２０（受付番号NC_001594.1）のＨＰＶ５６配列の４１３〜７９１位からなる断片、またはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片に対して完全に相補的な配列；
−Ａ５群：配列番号４２１（受付番号NC_001533.1）のＨＰＶ５１配列の６７８〜９０２位からなる断片、またはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片に対して完全に相補的な配列；
−Ａ９群：配列番号４２２（受付番号NC_001526.1）のＨＰＶ１６配列２７０７〜２７９４位からなる断片、またはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片に対して完全に相補的な配列；あるいは配列番号４２２（受付番号NC_001526.1）のＨＰＶ１６配列の３６００〜３８４０位からなる断片、またはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片に対して完全に相補的な配列；
−Ａ７群：配列番号４２３（受付番号NC_001357.1）のＨＰＶ１８配列の１８９５〜２１０３位からなる断片、またはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片に対して完全に相補的な配列；あるいは配列番号４２３（受付番号NC_001357.1）のＨＰＶ１８配列の９１６〜１０４４位からなる断片、またはその保存的な細断片、または前記断片もしくは細断片の全長に渡って前記断片もしくは細断片に対して完全に相補的な配列；
前記保存的な断片は、粘膜上皮に対して発癌性であり得るＨＰＶのリアルタイムマルチプレックス検出を可能にする群を標的とするプライマーを構築および産生するための適切な参照鋳型配列であるという特性を保持している。
【０２４３】
本願は、特に、配列番号２５〜２９および配列番号３３４〜３３８の１つからなるいずれかの参照鋳型ポリヌクレオチド（Ａ６群を標的とする参照鋳型ポリヌクレオチド）、または前記配列番号の配列の全長に渡ってそれらに対して完全に相補的な配列に関する。
【０２４４】
本願は、特に、配列番号１〜５および配列番号３２０〜３３３の１つからなるいずれかの参照鋳型ポリヌクレオチド（Ａ５群を標的とする参照鋳型配列）、または前記配列番号の配列の全長に渡ってそれらに対して完全に相補的な配列に関する。
【０２４５】
本願は、特に、配列番号１２２〜２１０および配列番号３５９〜４１９の１つからなるいずれかの参照鋳型ポリヌクレオチド（Ａ９群を標的とする参照鋳型配列）、または前記配列番号の配列の全長に渡ってそれらに対して完全に相補的な配列に関する。
【０２４６】
本願は、特に、配列番号４６〜６７；３３９〜３５８の１つからなるいずれかの参照鋳型ポリヌクレオチド（Ａ７群を標的とする参照鋳型配列）、または前記配列番号の配列の全長に渡ってそれらに対して完全に相補的な配列に関する。
【０２４７】
本発明の参照鋳型ポリヌクレオチドの保存的な変形も、本願に包含される。与えられた親の参照鋳型配列の保存的な変形には、特に、前記親の参照鋳型ポリヌクレオチドまたはそれらに完全に相補的な配列に由来し、少なくとも１のヌクレオチドの欠失および／または置換および／または付加によるいずれかのポリヌクレオチドであるが、粘膜上皮に対して発癌性であり得る少なくとも１のＨＰＶの増幅を可能にするＡ５および／またはＡ６および／またはＡ７および／またはＡ９を標的とするプライマー対の設計および構築のための参照鋳型ポリヌクレオチドである能力を保持しているポリヌクレオチドが含まれる。実例の保存的な変形は、通常、前記親の参照鋳型ポリヌクレオチドまたはそれらに完全に相補的な配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一の配列を有するポリヌクレオチドを含んでなる（前記同一性の値は、前記親の参照鋳型ポリヌクレオチドの全長または完全に相補的な配列について算出される）。実例の保存的な変形は、親の配列と±５ヌクレオチド異ならないものを含んでなる。
【０２４８】
本願は、本発明のプライマーおよびプローブ、すなわち個々のオリゴヌクレオチド産物にも関する。
【０２４９】
本発明のプライマーの保存的な変形も、本願に包含される。与えられた親プライマーの保存的な変形には、特に、前記親プライマーまたはそれらに完全に相補的な配列に由来し、少なくとも１のヌクレオチドの欠失および／または置換および／または付加によるいずれかのオリゴヌクレオチドであるが、粘膜上皮に対して発癌性であり得る少なくとも１のＨＰＶの増幅のためのＡ５および／またはＡ６および／またはＡ７および／またはＡ９を標的とするプライマーとなる能力を保持しているオリゴヌクレオチドが含まれる。実例の保存的な変形は、通常、前記親プライマーと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８３％、最も好ましくは少なくとも８５％同一の配列を有するオリゴヌクレオチドを含んでなる（前記同一性の値は、前記親プライマーの全長または完全に相補的な配列について算出される）。実例の保存的な変形は、親の配列と±５ヌクレオチド異ならないものを含んでなる。
【０２５０】
本発明のプローブの保存的な変形も、本願に包含される。与えられた親プローブの保存的な変形は、特に、前記親プローブまたはそれらに完全に相補的な配列に由来し、少なくとも１のヌクレオチドの欠失および／または置換および／または付加によるいずれかのオリゴヌクレオチドであるが、粘膜上皮に対して発癌性であり得る少なくとも１のＨＰＶの増幅のためのＡ５および／またはＡ６および／またはＡ７および／またはＡ９を標的とするプローブとなる能力を保持しているオリゴヌクレオチドが含まれる。実例の保存的な変形は、通常、前記親プローブまたはそれらと完全に相補的な配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９３％、最も好ましくは少なくとも９５％同一の配列を有するオリゴヌクレオチドを含んでなる（前記同一性の値は、前記親プローブの全長について算出される）。実例の保存的な変形は、親の配列と±５ヌクレオチド異ならないものを含んでなる。
【０２５１】
本願は、特に、ＨＰＶ増幅に適したプライマーに関し、特に、ＨＰＶ Ａ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される。
【０２５２】
前記プライマーは、例えば、
−配列番号３０〜３４および配列番号３５〜３７のいずれか１からなるＡ６を標的とするプライマー；または
−配列番号６〜１０および配列番号１１〜１５のいずれか１からなるＡ５を標的とするプライマー；または
−配列番号２１１〜２３９および配列番号２４０〜２６５のいずれか１からなるＡ９を標的とするプライマー；または
−配列番号６８〜７８および配列番号７９〜８７のいずれか１からなるＡ７を標的とするプライマーであってよい。
【０２５３】
本願は、特に、ＨＰＶ増幅に適したプライマー系に関し、特に、ＨＰＶ Ａ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される。
【０２５４】
前記プライマー系は、例えば
−配列番号３０〜３４の１からなる少なくとも１のＡ６を標的とするプライマーおよび配列番号３５〜３７の１からなる少なくとも１のＡ６を標的とするプライマー；および／または
−配列番号６〜１０の１からなる少なくとも１のＡ５を標的とするプライマーおよび配列番号１１〜１５の１からなる少なくとも１のＡ５を標的とするプライマー；および／または
−配列番号２１１〜２３９の１からなる少なくとも１のＡ９を標的とするプライマーおよび配列番号２４０〜２６５の１からなる少なくとも１のＡ９を標的とするプライマー；および／または
−配列番号６８〜７８の１からなる少なくとも１のＡ７を標的とするプライマーおよび配列番号７９〜８７の１からなる少なくとも１のＡ７を標的とするプライマーであってよい。
【０２５５】
本願は、特に、ＨＰＶ検出に適したプローブに関し、特に、ＨＰＶ Ａ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される。
【０２５６】
前記プローブは、例えば、
−配列番号３８〜４０のいずれか１からなるＡ６を標的とするプローブ、もしくは前記配列番号の配列の全長に渡って完全にそれらに対して相補的な配列；または
−配列番号１６〜１９のいずれか１からなるＡ５を標的とするプローブ、もしくは前記配列番号の配列の全長に渡って完全にそれらに対して相補的な配列；または
−配列番号２６６〜２８２のいずれか１からなるＡ９を標的とするプローブ、もしくは前記配列番号の配列の全長に渡って完全にそれらに対して相補的な配列；または
−配列番号８８〜１０１のいずれか１からなるＡ７を標的とするプローブ、もしくは前記配列番号の配列の全長に渡って完全にそれらに対して相補的な配列であってよい。
【０２５７】
前記プローブは、例えば、Taqman（登録商標）プローブ（加水分解プローブ）、モレキュラービーコン（Molecular beacon：登録商標）（ビーコンプローブもしくはモレキュラービーコンプローブ）、およびスコーピオン（登録商標）プローブを含む種々の形式で産生されてよい。好ましい形式の１つは、ビーコン形式である。
【０２５８】
それ故、本願は特に、ＨＰＶ検出に適したビーコンプローブに関し、特に、ＨＰＶ Ａ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７群のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される。
【０２５９】
前記ビーコンプローブは、例えば、
−配列番号４１〜４５のいずれか１つもしくは前記配列番号の配列の全長に渡って完全にそれらに対して相補的な配列からなる、Ａ６を標的とするプローブ；または
−配列番号２０〜２４のいずれか１つもしくは前記配列番号の配列の全長に渡って完全にそれらに対して相補的な配列からなる、Ａ５を標的とするプローブ；または
−配列番号２８３〜３１９のいずれか１つもしくは前記配列番号の配列の全長に渡って完全にそれらに対して相補的な配列からなる、Ａ９を標的とするプローブ；または
−配列番号１０２〜１２１のいずれか１つもしくは前記配列番号の配列の全長に渡って完全にそれらに対して相補的な配列からなる、Ａ７を標的とするプローブであってよい。
【０２６０】
ビーコンプローブは、さらに、クエンチャーおよびレポーター（例えばフルオロフォア）を含んでよい。
【０２６１】
好ましくは、各プローブはそれ自身レポーターを有し、それにより各プローブは他のプローブにより示されるものとは異なるレポーターを有し、それにより各プローブは他のプローブと容易に区別され得る。
【０２６２】
本願は、特に、ＨＰＶ増幅に適したプライマーおよびプローブ系に関し、特に、ＨＰＶ Ａ６およびＡ５およびＡ９およびＡ７のリアルタイムマルチプレックス増幅に適用される。  
前記プライマーおよびプローブ系は、少なくとも１の本発明によるプライマー系および少なくとも１の本発明によるプローブを含んでなる。
【０２６３】
本願は、さらに、請求項５３に記載の少なくとも１のプライマー系により、Ａ６、Ａ５、Ａ９またはＡ７群のＨＰＶ、例えば、ＨＰＶ６６および／またはＨＰＶ５３および／またはＨＰＶ８２および／またはＨＰＶ５８および／またはＨＰＶ３３および／またはＨＰＶ６７および／またはＨＰＶ５２および／またはＨＰＶ３５および／またはＨＰＶ３１および／またはＨＰＶ６８および／またはＨＰＶ３９および／またはＨＰＶ８５および／またはＨＰＶ５９および／またはＨＰＶ４５から少なくとも１の核酸を増幅することにより得られるいずれかのアンプリコンに関する。
【０２６４】
そのようなアンプリコンを含んでなる増幅組成物も、本発明に包含される。  
本発明は、少なくとも１の本発明のプライマーまたはプローブを含んでなる増幅組成物、医薬組成物、生物学的組成物にも関する。
【０２６５】
本発明は、子宮頸部の新形成または癌の診断または予防のためのキットであって、以下を含んでなるキットにも関する：
−本発明による少なくとも１のプライマー系、および／または
−本発明による少なくとも１のプローブ、
−任意に、それらおよび／またはヌクレオチドの使用についての説明書。
【０２６６】
好ましくは、前記キットは、少なくとも２の本発明によるプライマー系、より好ましくは少なくとも３の本発明によるプライマー系、最も好ましくは少なくとも４の本発明によるプライマー系を含んでなる。特に前記キットが異なるＨＰＶ型の間で区別することが意図される場合、前記キットは、１より多いプローブ、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５の異なるプローブを含んでなる。
【０２６７】
本発明によるキットにおいて、オリゴヌクレオチド（プライマー、プローブ）は、別々に、または部分的に混合されて、または完全に混合されて保持されてよい。  
前記オリゴヌクレオチドは、乾燥形態で、または当業者が判断した場合に適切な溶媒に可溶化して提供されてよい。適切な溶媒には、ＴＥ、ＰＣＲグレードの水等が含まれる。
【０２６８】
好ましい実施形態において、本発明によるキットは、ＰＣＲステップに適したさらなる試薬を含んでもよい。  
そのような試薬は、当業者に既知であり、ヌクレアーゼを含まない水、ＲＮａｓｅを含まない水、ＤＮＡｓｅを含まない水、ＰＣＲグレードの水のような水；マグネシウム、カリウムのような塩；Ｔｒｉｓのような緩衝剤；Ｔａｑ（登録商標）、Ｖｅｎｔ（登録商標）、Ｐｆｕ（登録商標）、活性化可能なポリメラーゼのようなポリメラーゼが含まれる酵素；デオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、ｄＮＴＰｓ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰのようなヌクレオチド；ＤＴＴおよび／またはＲＮａｓｅ阻害剤；ならびにｐｏｌｙＴ、ｐｏｌｙｄＴのようなポリヌクレオチド、およびプライマーのような他のオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０２６９】
もう１つの好ましい実施形態において、本発明によるキットはＰＣＲコントロールを含んでなる。そのようなコントロールは、当該分野で既知であり、定性的なコントロール、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、内部標準、定量的なコントロール、内部の定量的なコントロール、ならびにキャリブレーション範囲が含まれる。前記ＰＣＲステップに対する内部標準は、ＰＣＲステップにおける標的鋳型に無関係な鋳型であってよい。そのようなコントロールは、コントロールプライマーおよび／またはコントロールプローブを含んでよい。例えばＨＰＶ検出の場合、内部標準として、ヒトの体に由来するサンプルにおいてその存在が排除された遺伝子の中から選択されるポリヌクレオチドを使用することが可能であり（例えば植物遺伝子）、その大きさおよびＧＣ含量は、標的配列に由来するものと均等である。
【０２７０】
好ましい実施形態において、本発明によるキットは、例えば、血液、血清、血漿のような生物学的なサンプルに由来する核酸を抽出および／または精製するための手段を含む。そのような手段は、当業者に周知である。
【０２７１】
好ましい実施形態において、本発明によるキットは、それらの使用についての説明書を含む。前記説明書は、好都合には、リーフレット、またはカード等であってよい。前記説明書は、２つの形態で存在してもよく：詳細には、キットおよびその使用についての網羅的な情報が集められ、可能であれば文献的データも含む場合：およびクイックガイドの形態またはメモ、例えば使用について必要な必須の情報が集められたカードの形態の場合である。
【０２７２】
好ましい実施形態において、前記キットは診断キット、特にインビトロ診断キット、すなわちＨＰＶ診断キットである。
【０２７３】
本発明は、上述したように、診断、予後、および薬物／治療効果のモニタリングの分野にも関する。  
本発明によるオリゴヌクレオチドは、ＨＰＶの群、型、サブタイプまたは株の診断のために使用され得る。特に、本発明によるプライマーおよびプローブは、インビトロタイピング、サブタイピング、およびインビトロサンプル中、例えば患者の子宮頸部のサンプル中、または細胞培養上清中に存在するＨＰＶ核酸の定量化に対して使用され得る。
【０２７４】
「含む」または「含有する」と同義の「含んでなる」という用語は、オープンエンドであり、付加的な、列挙されていない要素、成分または方法ステップを除外しない一方、「からなる」という用語は閉じられた用語であり、明示的に列挙されていない付加的な要素、ステップ、または成分は除外される。「本質的に〜からなる」という用語は、部分的に開いた用語であり、付加的な要素、ステップまたは成分が発明の基礎および新しい特性に実質的に影響を及ぼさない限り、付加的な、列挙されていない要素、ステップ、または成分を除外しない。
【０２７５】
それ故、「含んでなる」という用語は、「〜からなる」ならびに「本質的に〜からなる」という用語を含む。従って、「含んでなる」という用語は、本願において、特に、「〜からなる」および「本質的に〜からなる」という用語を包含すると解される。
【０２７６】
本願において、ｎの要素の組または群に関する「少なくともｘ」という用語は（ｘはゼロではなく、ｎはｘより大きな数である）、ｘとｎの間に含まれる各値を明確に包含する。例えば、６の要素の群または組に関して、「少なくとも１」という用語は、前記要素の１、２、３、４、５および６、ならびに前記要素の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５を明確に包含する。
【０２７７】
ここで挙げられている全ての参考文献の関連する開示は、本明細書中に援用される。以下の実施例は、説明のために提供され、限定するためのものではない。
【０２７８】
定義：
本願において使用される用語および名称は、一般的に、ＨＰＶ検出の分野および特に分子生物学の分野における通常の意味を有する。
【０２７９】
「増幅」とは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、または例えばＴＭＡ（transcription mediated amplification）、ＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence based amplification）、３ＳＲ（self sustained sequence replication）または鎖置換増幅のような等温増幅技術等の核酸増幅のいずれかの技術を意味する。
【０２８０】
増幅方法、特にＰＣＲに基づく方法は、当該分野で既知である（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch, and Sambrook, CSHL Press; Molecular Biology of the Cell, Alberts et al.; PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler, CSHL Press; The Polymerase Chain Reaction, Mullis, Ferre, and Gibbs, Birkhauser Boston Press; Gene quantification, Ferre, Birkhauser Boston Press）。
【０２８１】
ＰＣＲまたはＰＣＲ反応とは、ここでは、いずれかのＰＣＲに基づく方法であると解される。これには、標準的なＰＣＲ、定性的、定量的、および半定量的なＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）、シンプレックスおよびマルチプレックスＰＣＲ等が含まれる。
【０２８２】
リアルタイムＰＣＲとは、通常のＰＣＲ法によるエンドポイント検出とは対照的に、各ＰＣＲサイクルの間のアンプリコン生成の指標として、反応の間に放出される蛍光のようなシグナルをモニタリングすることが可能なＰＣＲに基づく方法とここでは解される。
【０２８３】
定量的なＰＣＲとは、与えられたサンプル中の与えられたＰＣＲ標的の初期の量の見積りを可能にするいずれかのＰＣＲに基づく方法であるとここでは解される。
【０２８４】
マルチプレックスＰＣＲとは、２以上の標的の増幅に向けられているいずれかのＰＣＲ反応であるとここでは解される。例えば、マルチプレックスＰＣＲには、二重のＰＣＲ（２つの標的）、三重のＰＣＲ（３つの標的）、およびそれ以上のマルチプレックスＰＣＲが含まれる。マルチプレックスＰＣＲには、２以上のプライマー対、例えば２のプライマー対を用いたＰＣＲ反応が含まれる。この場合、４の異なるプライマーがあってよいが、２のプライマー対について、共通の１のプライマー、例えばフォワードプライマーを有し、２つの異なるリバースプライマーを有するようにすることも可能である。マルチプレックスＰＣＲには、唯一のプライマー対を用いるが、２以上のプローブを用いるＰＣＲ反応も含まれる。
【０２８５】
「メガプレックス」という用語は、ここでしばしば使用される：それは、基本的には「マルチプレックス」と同じ意味を有するが、少なくとも２の異なる群を標的とする系（例えば、Ａ５およびＡ６およびＡ７およびＡ９を標的とする系）に関するマルチ-マルチプレックスと、１の群を標的とする系（例えば、Ａ７またはＡ９を標的とする系）に関する「マルチプレックス」とを区別するために使用される。
【０２８６】
核酸とは、ここではいずれかの核酸であると解され：合成または非合成、組み換えまたは天然、直鎖状または環状であってよい。これには、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。核酸は、１本鎖または２本鎖または３本鎖であってよい。それは、微生物（細菌、酵母等）、または哺乳動物細胞のようなより高等な生物対のような種々の生物学的な源に由来するものであってよい。前記核酸は、ウイルス起源、例えばＨＰＶ核酸であってもよい。核酸は、全ＤＮＡ、全ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＢＡＣ ＤＮＡ、およびそれらの混合物を含んでよい。さらに、前記核酸は、種々の純度の状態が想定され得る。
【０２８７】
オリゴヌクレオチドとは、ここでは、ヌクレオチドのいずれかの短いポリマーであると解され、前記ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、変性ヌクレオチド等であってよい。前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは１本鎖である。前記オリゴヌクレオチドの長さは変化してよく、通常１５０ヌクレオチド（ｎｔ）以下であり、好ましくは１０〜１００ｎｔ、より好ましくは１３〜６０ｎｔ、さらにより好ましくは１３〜５０ｎｔである。前記オリゴヌクレオチドは、例えば、放射性、蛍光、ビオチニル化、dig標識のような標識付けまたはマーキング等の化学的な修飾を有してよい。本発明によるオリゴヌクレオチドは、フォワード（センス）またはリバース（アンチセンス）であってよい。加えて、本発明によるいくつかのオリゴヌクレオチドに関して好ましい機能が言及されているにも関わらず、与えられたオリゴヌクレオチドがいくつかの機能を有し、本発明による異なる方法において使用できることが明らかであるということを強調すべきである。例えば、オリゴヌクレオチドは、プライマーまたはプローブとして使用することができる。また、オリゴヌクレオチドがアンプリコンターゲッティングプローブとして有用であると述べられる場合、当業者は、このオリゴヌクレオチドに相補的な配列が同じアンプリコンを標的とするプローブとして等しく有用であることを理解する。さらに、マルチプレックスアッセイに適したいずれのプライマーも、本春名の範囲内において、シンプレックスプロトコルにおいて使用できることは明らかである。同じことが、本発明の範囲内において、エンドポイントアッセイのフレームワークにおいて使用されるリアルタイムプロトコルに適したプライマーについても適用される。
【０２８８】
本発明によるオリゴヌクレオチドは、特に、ＰＣＲプライマーおよびプローブを含む。他に示さない限り、核酸配列は、５’から３’方向に与えられる。前記オリゴヌクレオチドは多くの形態であってよく、例えば、乾燥形態、望ましい溶媒および望ましい濃度の溶液／懸濁液である。当業者は、どのような溶媒、濃度、保存条件が本発明のオリゴヌクレオチドに適しているかを知っている。特に、当業者は、保存溶液として前記オリゴヌクレオチドをどのように調製するかを知っている。本発明によるオリゴヌクレオチドは、当業者により、例えばＨＰＬＣクロマトグラフィーで判断された場合に、種々の程度の純度を有してもよい。
【０２８９】
オリゴヌクレオチドの組または系とは、ここでは、少なくとも１のオリゴヌクレオチド、好ましくは少なくとも２、例えば２〜１０のオリゴヌクレオチドを含んでなるいずれかの組み合わせであると解される。前記組は、１のＰＣＲプライマー、またはＰＣＲプライマーの対、またはプローブ、またはプローブおよびプライマーの対を含んでよい。前記オリゴヌクレオチドは、別々に、または部分的に混合されて、または完全に混合されていてよい。
【０２９０】
プライマーまたはＰＣＲプライマーの観念は、当業者に既知である。例えば、適切な厳密な条件下で標的鋳型にアニールすることができるいずれかのオリゴヌクレオチドを含み、ポリメラーゼ鎖伸長を可能にする。前記プライマーの典型的な長さは、１３〜３０ｎｔ、好ましくは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７ｎｔである。
【０２９１】
「プライマー」、「増幅プライマー」または「核酸プライマー」という用語は、ここでは区別なく使用される。「プライマー」は、精製された制限消化において天然発生するか、または人工的に作られた短いポリヌクレオチドを意味し、核酸鎖に対して相補的なプライマー伸長産物の合成が引き起こされる条件下、すなわちヌクレオチドおよびポリメラーゼのような誘発剤の存在および適切な温度およびｐＨに置かれた場合、合成の開始点として作用することができる。プライマーは、望ましい伸長産物の合成を与えるのに十分長いべきである。プライマーの正確な長さは、実験的な因子、特に温度、プライマーの起源および加工の使用に依存する。
【０２９２】
プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなり、前記フォワードプライマーは１のＨＰＶ鎖にハイブリダイズするほど十分相補的であり、前記リバースプライマーは他のＨＰＶ鎖にハイブリダイズするほど十分相補的である。
【０２９３】
厳密性とは、異なる程度の相補性でポリヌクレオチド配列の結合を最適化するために選択されたハイブリダイゼーション条件を意味する。厳密性は、温度、塩条件、ハイブリダイゼーション混合物中における有機溶媒の存在、ハイブリダイズされる配列の長さおよび塩基組成、ならびに塩基ミスマッチの程度により影響され、パラメータの組み合わせは、いずれか１の因子の絶対的な測定よりも重要である。
【０２９４】
非常に高い厳密性：非常に高い厳密性の条件は、5×SSC、2％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、100 μg/ml １本鎖DNAにおいて、55〜65℃で8時間の、フィルター結合DNAに対するハイブリダイゼーションおよび0.1％ SDS中における、60〜65℃で30分間の洗浄を意味する。
【０２９５】
高い厳密性：高い厳密性の条件は、5×SSC、2％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、100 μg/ml １本鎖DNAにおいて、55〜65℃で8時間の、フィルター結合DNAに対するハイブリダイゼーションおよび0.2×SSCおよび0.2％ SDS中における、60〜65℃で30分間の洗浄を意味する。
【０２９６】
中程度の厳密性：中程度の厳密性の条件は、5×SSC、2％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、100 μg/ml １本鎖DNAにおいて、55〜65℃で8時間の、フィルター結合DNAに対するハイブリダイゼーションおよび0.2×SSCおよび0.2％ SDS中における、50〜55℃で30分間の洗浄を意味する。
【０２９７】
プローブの観念も、当業者に既知である。例えば、望ましいハイブリダイゼーション条件下で標的鋳型にアニールすることができるいずれかのオリゴヌクレオチドが含まれる。前記プローブの典型的な長さは１５〜６０ｎｔであり、好ましくは１６〜５０ｎｔ、より好ましくは１７〜４０ｎｔ、より好ましくは１７〜３５ｎｔ、より好ましくは２０〜３０ｎｔである。好ましくは、前記プローブは蛍光標識される。しかしながら、ある一定の条件下でプライマーをプローブとして使用できることおよびその逆も可能であることは、当業者に自明である。さらに、ここでは、本発明による産物、特にオリゴヌクレオチドは、ここで言及される意図された使用に限定されず、意図された目的に関係なく広範に解釈される。例えば、特定の使用に対する産物（オリゴヌクレオチド）に対する請求項は、実際に述べられた使用に適した産物（オリゴヌクレオチド）を意味するとして解釈されるべきである。それ故、マルチプレックスプロトコルにおけるプライマーとしての使用に適したオリゴヌクレオチドは、本発明の目的の範囲内で、シンプレックスプロトコルにも適用可能であることは明らかである。
【０２９８】
プローブは、全体的に、ハイブリダイジングセグメントからなる。プローブの「ハイブリダイジングセグメント」または「アニーリングセグメント」とは、ＨＰＶ標的にアニールすることが意図されるヌクレオチド配列を意味する。
【０２９９】
あるいは、プローブは、少なくとも１の検出部分、例えば少なくとも１の検出標識（例えば放射性要素またはフルオロフォア）を含んでよい。この検出標識は、当業者にビーコンアームまたはスコーピオン（登録商標）アームとして既知の短いＨＰＶとは無関係のオリゴヌクレオチドアームを介してプローブのハイブリダイジングセグメントに結合してよい。少なくとも１の５’および／または３’検出標識、または少なくとも１の５’および／または３’ビーコンアームを含んでなるプローブは、ハイブリダイジングセグメントならびに少なくとも１の５’および／または３’標識もしくはビーコンアームからなる。
【０３００】
Taqman（登録商標）プローブ（加水分解プローブ）、分子ビーコン（登録商標）（ビーコンプローブもしくは分子ビーコンプローブ）、およびスコーピオン（登録商標）プローブを含むプローブの種々の形式（型）は当該分野で既知である。
【０３０１】
好ましい実施形態において、本発明によるプローブは全て合成され、分子ビーコン形式で使用される。
【０３０２】
分子ビーコンの構造は以下の通りである。標的配列に無関係な短いヌクレオチド配列（いわゆるビーコンアーム）は、プローブの両端に共有結合的に結合する。短い無関係なアームは、プローブの５’に結合し、蛍光部分（すなわち、蛍光色素または蛍光マーカー）で標識される。もう１つの無関係なアームは、プローブの３’末端に結合し、蛍光クエンチング部分で標識される。それ故、分子ビーコンは、フルオロフォアおよびクエンチャーを反対の末端に有する。５’の短いアームは、一緒にアニールできるように３’におけるものと全体的に相補的であり、溶液中で標的にハイブリダイズしない場合はヘアピン構造をとり得る。このヘアピン構造において、クエンチャーおよび蛍光色素は、フルオロフォアの効率的なクエンチングを可能にするのに十分相互に近い。しかしながら、プローブが標的分子に出会った場合、アニーリングは、ビーコンアームＴｍおよびプローブＴｍの値が適切に選択された場合のヘアピン構造に関して都合が良い（理論的には、プローブＴｍ＞ビーコンアームＴｍ＞プライマーＴｍ、Ｔｍはそれぞれの融解温度）。フルオロフォアおよびクエンチャーは相互に遠ざかり、適切な光励起により照らされた場合、フルオロフォアは蛍光を発し得る。ＰＣＲの進行につれて、増幅産物が蓄積し、与えられたサイクルにおける蛍光の量はその時点に存在する増幅産物の量に依存する（例えば、Sanjay Tyagi and Fred Russell Kramer, Nature Biotechnology 1996, volume 14, pages 303-308; Nature Biotechnology 1998, volume 16, pages 49-53を参照されたい）。
【０３０３】
（注釈：フルオロフォアは３’末端に結合させることができ、クエンチャーは５’末端に結合させることができる）。
【０３０４】
模式的に、前記プローブは以下の構成をとる（分子ビーコン形式）：
５’フルオロフォア-（アーム１）-プローブ-（アーム２）-クエンチャー３’
５’クエンチャー-（アーム１）-プローブ-（アーム２）-フルオロフォア３’
ここで、アーム１およびアーム２は、例えば、３〜１０ヌクレオチド、好ましくは５、６、７ヌクレオチドのいずれかの短いヌクレオチド配列であってよく、適切な厳密性の条件下でヘアピン構造形成を可能にする、すなわち、アーム１およびアーム２は、望ましい厳密性の条件下で、アニールに対して完全に相補的である（標準的なＰＣＲの厳密性の条件には、例えば、５５〜６５℃のアニーリング温度および４〜８ｍＭのＭｇ濃度が含まれる）。しかしながら、アーム１およびアーム２は、プローブの標的配列とは無関係である、すなわち、アーム１とアーム２の間のアニーリングの結果として生じるヘアピン構造は、本質的に、ハイブリダイズしない場合にのみ可能なプローブに対する二次構造である。当業者は、与えられたプローブについてそのようなアームをどのように選択するかを知っている。
【０３０５】
模式的なビーコンの形式には、以下のものが含まれる：
TGCGC-(プローブ配列)-GCGCA
GCGCA-(プローブ配列)-TGCGC
AGCGC-(プローブ配列)-GCGCT
GCGCT-(プローブ配列)-AGCGC
CGCGA-(プローブ配列)-TCGCG
CGCGC-(プローブ配列)-GCGCG。
【０３０６】
フルオロフォアとは、ここでは、当該分野で既知のいずれかの蛍光マーカー／色素であると解される。そのような適切な蛍光マーカーの例には、ファム（Fam）、ヘックス（Hex）、テト（Tet）、ジョー（Joe）、ロックス（Rox）、タムラ（Tamra）、マックス（Max）、エダンズ（Edans）、Ｃｙ５のようなＣｙ色素、フルオレセイン、クマリン、エオシン、ローダミン、ボディピー（Bodipy）、アレクサ（Alexa）、カスケードブルー、ヤキマイエロー、ルシファーイエローおよびテキサスレッド（これら全ては登録商標である）、ＡＴＴＯ色素のファミリーが含まれる。
【０３０７】
クエンチャーとは、ここでは、当該分野で既知のいずれかのクエンチャーであると解される。そのようなクエンチャーの例には、ダブシル（Dabcyl）、ダーククエンチャー（Dark Quencher）、エクリプスダーククエンチャー（Eclipse Dark Quencher）、エレクエンチャー（Elle Quencher）、タムラ、ＢＨＱおよびＱＳＹ（これらは全て登録商標である）。
【０３０８】
当業者は、プローブを設計する場合に、色素／クエンチャーのどの組み合わせが適切であるかを知っている。
【０３０９】
本発明の好ましい実施形態において、前記プローブのスペクトル特性は、相互に干渉しないように選択される。特に、プローブがマルチプレックスで使用される場合、各シングルプローブは、スペクトル的に相互に有意に異なるフルオロフォアを有する、すなわち、吸収／放出スペクトルが本質的に重複しない。これは、好都合に、全てのシングルプローブについて低いノイズのマルチプレックス検出を可能にし、検出において個々のシグナルが相互に干渉しないことを確実にする。マルチプレックスにおいて一緒に使用することができる色素の例には、FamとTamra、FamとTamraとテキサスレッドが含まれる。一緒に使用する適切な色素の選択は、増幅装置に含まれるフィルターにも依存し得る。
【０３１０】
本発明によると、与えられる全てのオリゴヌクレオチドは、別々、または部分的に混合されて、または完全に混合されてよい。
【０３１１】
前記オリゴヌクレオチドは、乾燥形態、または当業者が判断した場合に適切な溶媒に可溶化されてよい。適切な溶媒には、ＴＥ、ＰＣＲグレードの水等が含まれる。
【０３１２】
「有意に」という用語は、ここでは、統計の分野における通常の意味で使用される（例えば、ｔ検定、ｚ検定、カイ二乗値、またはＦ比等）、すなわち、ある値を他の値と比較し、これらの値が相互に異なるかどうかを決定する。それ故、「有意に」という用語は、度数分布においてデータの広がりの量を測定する標準偏差（もしあれば）を当業者が考慮に入れるという事実を包含する。望ましいｐ値は、通常、５％のαレベルまたは１％のより厳しいαレベルに設定される。
【０３１３】
以下の実施例において、本発明のいくつかのＡ６、Ａ５、Ａ９およびＡ７を標的とする増幅および／検出が述べられている。
【０３１４】
表１２〜３５：これらの表は、本発明の実例の群を標的とする系の参照アンプリコン、フォワードプライマー、リバースプライマー、プローブ、ビーコンプローブの配列番号および位置を示す。
【０３１５】
表１２：Ａ５を標的とする系の参照アンプリコン（ＨＰＶ５１ゲノムに由来する）
表１３：Ａ５を標的とする系のフォワードプライマー
表１４：Ａ５を標的とする系のリバースプライマー
表１５：Ａ５を標的とする系のプローブ
表１６：Ａ５を標的とする系のビーコンプローブ
表１７：Ａ５を標的とする系
表１８：Ａ６を標的とする系の参照アンプリコン（ＨＰＶ５６ゲノムに由来する）
表１９：Ａ６を標的とする系のフォワードプライマー
表２０：Ａ６を標的とする系のリバースプライマー
表２１：Ａ６を標的とする系のプローブ
表２２：Ａ６を標的とする系のビーコンプローブ
表２３：Ａ６を標的とする系
表２４：Ａ７を標的とする系の参照アンプリコン（ＨＰＶ１８ゲノムに由来する）
表２５：Ａ７を標的とする系のフォワードプライマー
表２６：Ａ７を標的とする系のリバースプライマー
表２７：Ａ７を標的とする系のプローブ
表２８：Ａ７を標的とする系のビーコンプローブ
表２９：Ａ７を標的とする系
表３０：Ａ９を標的とする系の参照アンプリコン（ＨＰＶ１６ゲノムに由来する）
表３１：Ａ９を標的とする系のフォワードプライマー
表３２：Ａ９を標的とする系のリバースプライマー
表３３：Ａ９を標的とする系のプローブ
表３４：Ａ９を標的とする系のビーコンプローブ
表３５：Ａ９を標的とする系
表３６〜５０：これらの表は、本発明のプライマーおよびプローブにより示されるヌクレオチドミスマッチの数を示す（５０ＨＰＶ型の配列のアラインメント）；空のボックスは、整合のとれた配列アラインメントがないことを示し；グレーのボックスは、ミスマッチの数が０、１、２または３であることを示す。
【０３１６】
表３６：本発明のＡ５を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数（系Ａ〜Ｃ）
表３７：本発明のＡ５を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数（系Ｄ〜Ｅ）
表３８：本発明のＡ６を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数（系Ａ〜Ｃ）
表３９：本発明のＡ６を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数（系Ｄ〜Ｅ）
表４０：本発明のＡ７を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数（系Ａ〜Ｂ）
表４１：本発明のＡ７を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数（系Ｃ〜Ｄ）
表４２：本発明のＡ９を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数（系Ｃ）
表４３：本発明のＡ９を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数（系Ｅ１）
表４４：本発明のＡ９を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数（系Ｅ２）
表４５：本発明のＡ９を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数（系Ｅ３）
表４６：本発明のＡ９を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数（系Ｅ４）
表４７：本発明のＡ９を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数（系Ｆ）
表４８：本発明のＡ９を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数（系ＧＺ７）
表４９：本発明のＡ９を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数（系ＧＺ８）
表５０：本発明のＡ９を標的とする系のプライマーおよびプローブにより示されるミスマッチ数（系Ｈ）
表５１〜６８：本発明の検出系の特異性
表３６〜５０に記載された増幅系は、本発明のプローブの特異性を試験するために使用された。
【０３１７】
表５１：本発明の検出系のＨＰＶ特異性を試験するために使用することができるＨＰＶプラスミドの実例のリスト
表５２：本発明のＡ５およびＡ６を標的とする検出の特異性を試験するために使用することができる実例のＰＣＲ材料および方法条件
表５３：Ａ５を標的とするプローブの特異性の結果（ボックス「他のＨＰＶ」＝表５１に与えられたリストのＨＰＶ以外の全て）
表５４：Ａ６を標的とするプローブの特異性の結果（ボックス「他のＨＰＶ」＝表５１に与えられたリストのＨＰＶ以外の全て）
表５５：本発明のＡ７を標的とする検出の特異性を試験するために使用することができる実例のＰＣＲ材料および方法条件
表５６〜５９：Ａ７を標的とするプローブの特異性の結果（ボックス「他のＨＰＶ」＝表５１に与えられたリストのＨＰＶ以外の全て）
表５６：Ａ７を標的とする増幅系Ａ、およびＡ７を標的とする増幅系Ａのプローブ（ＰＣＲ当り１のプローブ）
表５７：Ａ７を標的とする増幅系Ｂ、およびＡ７を標的とする増幅系Ｂのプローブ（ＰＣＲ当り１のプローブ）
表５８：Ａ７を標的とする増幅系Ｃ、およびＡ７を標的とする増幅系Ｃのプローブ（ＰＣＲ当り１のプローブ）
表５９：Ａ７を標的とする増幅系Ｄ、およびＡ７を標的とする増幅系Ｄのプローブ（ＰＣＲ当り１のプローブ）
表６０：本発明のＡ９を標的とする検出系の特異性を試験するために使用することができる実例のＰＣＲ物質および方法条件
表６１〜６８：Ａ９を標的とするプローブの特異性の結果（ボックス「他のＨＰＶ」＝表５１に与えられたリストのＨＰＶ以外の全て）
表６１：Ａ９を標的とする増幅系Ｃ、およびＡ９を標的とする増幅系Ｃのプローブ（ＰＣＲ当り１のプローブ）
表６２：Ａ９を標的とする増幅系Ｅ２、およびＡ９を標的とする増幅系Ｅ２のプローブ（ＰＣＲ当り１のプローブ）
表６３：Ａ９を標的とする増幅系Ｅ３、およびＡ９を標的とする増幅系Ｅ３のプローブ（ＰＣＲ当り１のプローブ）
表６４：Ａ９を標的とする増幅系Ｅ４、およびＡ９を標的とする増幅系Ｅ４のプローブ（ＰＣＲ当り１のプローブ）
表６５：Ａ９を標的とする増幅系Ｆ、およびＡ９を標的とする増幅系Ｆのプローブ（ＰＣＲ当り１のプローブ）
表６６：Ａ９を標的とする増幅系ＧＺ７、およびＡ９を標的とする増幅系ＧＺ７のプローブ（ＰＣＲ当り１のプローブ）
表６７：Ａ９を標的とする増幅系ＧＺ８、およびＡ９を標的とする増幅系ＧＺ８のプローブ（ＰＣＲ当り１のプローブ）
表６８：Ａ９を標的とする増幅系Ｈ、およびＡ９を標的とする増幅系Ｈのプローブ（ＰＣＲ当り１のプローブ）
特異性の試験に対して使用された増幅および検出系は、表１７（Ａ５を標的とする系）；表２３（Ａ６を標的とする系）；表２９（Ａ７を標的とする系）；表３５（Ａ９を標的とする系）に示されている。
【０３１８】
Ａ９を標的とする系について、表３５における括弧の中に示されるプライマーは余分なものとして使用されず、実際に、括弧で示されないプライマーは、Ａ９ＨＰＶ群の全てを増幅するのに十分である。それ故、表３５において、括弧の中に示されるＡ９を標的とするプライマーは、Ａ９群の全てのＨＰＶを増幅することを望む場合、任意および／または等価および／または代替のプライマーである。
【０３１９】
表６９〜８２：系の反応性
本発明の系の反応性は、特異性の試験と同じ実験条件下で試験された（表５２、５５、６０を参照されたい）。
【０３２０】
表６９：Ａ５を標的とする系の反応性（系Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）
表７０：Ａ６を標的とする系の反応性（系Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）
表７１〜７４：Ａ７を標的とする系の反応性
表７１：Ａ７を標的とする系Ａの反応性
表７２：Ａ７を標的とする系Ｂの反応性
表７３：Ａ７を標的とする系Ｃの反応性
表７４：Ａ７を標的とする系Ｄの反応性
表７５〜８２：Ａ９を標的とする系の反応性
表７５：Ａ９を標的とする系Ｃの反応性
表７６：Ａ９を標的とする系Ｅ２の反応性
表７７：Ａ９を標的とする系Ｅ３の反応性
表７８：Ａ９を標的とする系Ｅ４の反応性
表７９：Ａ９を標的とする系Ｆの反応性
表８０：Ａ９を標的とする系ＧＺ７の反応性
表８１：Ａ９を標的とする系ＧＺ８の反応性
表８２：Ａ９を標的とする系Ｈの反応性
表８３〜８８：「メガプレックス」特異性および反応性
ＰＣＲは、１のＡ５を標的とする系、１のＡ６を標的とする系、１のＡ７を標的とする系、１のＡ９を標的とする系を用いて、シングルチューブアッセイで行われる。
【０３２１】
Ａ７およびＡ９を標的とする系は既にマルチプレックス系であるため（すなわち、それぞれが２より多いプライマーを有する）、４つの群を標的とする系の混合は、ここでは「メガプレックス」と呼ぶ。
【０３２２】
メガプレックスＰＣＲは、反応性（Ｃｔ；ＲＦＵ）および特異性（Ｃｔ；ＲＦＵ）について、表５１に挙げられたプラスミドを用いて試験された。
【０３２３】
表８３〜８６：メガプレックスＥＡＡＨおよびＥＢＡＣについての得意性の結果
表８３〜８４：メガプレックスＥＡＡＨの特異性
表８３：Ａ５を標的とする系Ｅ、Ａ６を標的とする系Ａ、Ａ７を標的とする系Ａおよび
Ａ９を標的とする系Ｈの混合（すなわち、メガプレックスＥＡＡＨ）について使用することができる、実例のメガプレックス材料および方法条件；これらの実験条件は、表８４に示された結果に対して使用された
表８４：ＥＡＡＨメガプレックスの特異性の結果
表８５〜８６：メガプレックスＥＢＡＣの特異性
表８５：Ａ５を標的とする系Ｅ、Ａ６を標的とする系Ｂ、Ａ７を標的とする系ＡおよびＡ９を標的とする系Ｃの混合（すなわち、メガプレックスＥＢＡＣ）について使用することができる、実例のメガプレックス材料および方法条件；これらの実験条件は、表８６に示された結果に対して使用された
表８６：ＥＢＡＣメガプレックスの特異性の結果
表８７〜８８：メガプレックスＥＡＡＨおよびＥＢＡＣの反応性の結果
表８７：メガプレックスＥＡＡＨの反応性の結果
表８８：メガプレックスＥＢＡＣの反応性の結果
表８９：ＨＰＶゲノム配列のリスト
これらの表の後に、参照鋳型の配列が示される。
【表１２】
2015033383.tif 000012
【表１３】
2015033383.tif 000013
【表１４】
2015033383.tif 000014
【表１５】
2015033383.tif 000015
【表１６】
2015033383.tif 000016
【表１７−１】
2015033383.tif 000017
【表１７−２】
2015033383.tif 000018
【表１７−３】
2015033383.tif 000019
【表１７−４】
2015033383.tif 000020
【表１８】
2015033383.tif 000021
【表１９】
2015033383.tif 000022
【表２０】
2015033383.tif 000023
【表２１】
2015033383.tif 000024
【表２２】
2015033383.tif 000025
【表２３−１】
2015033383.tif 000026
【表２３−２】
2015033383.tif 000027
【表２４−１】
2015033383.tif 000028
【表２４−２】
2015033383.tif 000029
【表２４−３】
2015033383.tif 000030
【表２５】
2015033383.tif 000031
【表２６】
2015033383.tif 000032
【表２７−１】
2015033383.tif 000033
【表２７−２】
2015033383.tif 000034
【表２８−１】
2015033383.tif 000035
【表２８−２】
2015033383.tif 000036
【表２９−１】
2015033383.tif 000037
【表２９−２】
2015033383.tif 000038
【表２９−３】
2015033383.tif 000039
【表２９−４】
2015033383.tif 000040
【表２９−５】
2015033383.tif 000041
【表２９−６】
2015033383.tif 000042
【表２９−７】
2015033383.tif 000043
【表２９−８】
2015033383.tif 000044
【表２９−９】
2015033383.tif 000045
【表２９−１０】
2015033383.tif 000046
【表３０−１】
2015033383.tif 000047
【表３０−２】
2015033383.tif 000048
【表３０−３】
2015033383.tif 000049
【表３０−４】
2015033383.tif 000050
【表３０−５】
2015033383.tif 000051
【表３０−６】
2015033383.tif 000052
【表３０−７】
2015033383.tif 000053
【表３１−１】
2015033383.tif 000054
【表３１−２】
2015033383.tif 000055
【表３２−１】
2015033383.tif 000056
【表３２−２】
2015033383.tif 000057
【表３３−１】
2015033383.tif 000058
【表３３−２】
2015033383.tif 000059
【表３４−１】
2015033383.tif 000060
【表３４−２】
2015033383.tif 000061
【表３４−３】
2015033383.tif 000062
【表３５−１】
2015033383.tif 000063
【表３５−２】
2015033383.tif 000064
【表３５−３】
2015033383.tif 000065
【表３５−４】
2015033383.tif 000066
【表３５−５】
2015033383.tif 000067
【表３５−６】
2015033383.tif 000068
【表３５−７】
2015033383.tif 000069
【表３５−８】
2015033383.tif 000070
【表３５−９】
2015033383.tif 000071
【表３５−１０】
2015033383.tif 000072
【表３５−１１】
2015033383.tif 000073
【表３５−１２】
2015033383.tif 000074
【表３５−１３】
2015033383.tif 000075
【表３５−１４】
2015033383.tif 000076
【表３５−１５】
2015033383.tif 000077
【表３５−１６】
2015033383.tif 000078
【表３６−１】
2015033383.tif 000079
【表３６−２】
2015033383.tif 000080
【表３７−１】
2015033383.tif 000081
【表３７−２】
2015033383.tif 000082
【表３８−１】
2015033383.tif 000083
【表３８−２】
2015033383.tif 000084
【表３９−１】
2015033383.tif 000085
【表３９−２】
2015033383.tif 000086
【表４０−１】
2015033383.tif 000087
【表４０−２】
2015033383.tif 000088
【表４０−３】
2015033383.tif 000089
【表４０−４】
2015033383.tif 000090
【表４１−１】
2015033383.tif 000091
【表４１−２】
2015033383.tif 000092
【表４１−３】
2015033383.tif 000093
【表４２−１】
2015033383.tif 000094
【表４２−２】
2015033383.tif 000095
【表４２−３】
2015033383.tif 000096
【表４３−１】
2015033383.tif 000097
【表４３−２】
2015033383.tif 000098
【表４３−３】
2015033383.tif 000099
【表４４−１】
2015033383.tif 000100
【表４４−２】
2015033383.tif 000101
【表４４−３】
2015033383.tif 000102
【表４５−１−１】
2015033383.tif 000103
【表４５−１−２】
2015033383.tif 000104
【表４５−２−１】
2015033383.tif 000105
【表４５−２−２】
2015033383.tif 000106
【表４６−１−１】
2015033383.tif 000107
【表４６−１−２】
2015033383.tif 000108
【表４６−２−１】
2015033383.tif 000109
【表４６−２−２】
2015033383.tif 000110
【表４７−１】
2015033383.tif 000111
【表４７−２】
2015033383.tif 000112
【表４７−３】
2015033383.tif 000113
【表４８−１−１】
2015033383.tif 000114
【表４８−１−２】
2015033383.tif 000115
【表４８−２−１】
2015033383.tif 000116
【表４８−２−２】
2015033383.tif 000117
【表４９−１−１】
2015033383.tif 000118
【表４９−１−２】
2015033383.tif 000119
【表４９−２−１】
2015033383.tif 000120
【表４９−２−２】
2015033383.tif 000121
【表５０−１−１】
2015033383.tif 000122
【表５０−１−２】
2015033383.tif 000123
【表５０−２−１】
2015033383.tif 000124
【表５０−２−２】
2015033383.tif 000125
【表５１−１】
2015033383.tif 000126
【表５１−２】
2015033383.tif 000127
【表５１−３】
2015033383.tif 000128
【０３２４】
ＤＫＦＺは、Deusches Kresbsorschungszentrum; Tumorvirologie; Im Neuenheimer Feld 242; DE-Heidelberg; Germany;
ＣＮＣＭは、Collection Nationale de Cultures de Microorganisme; Institut Pasteur; 25, rue du Docteur Roux; F-75724 Paris Cedex 15; France;
ＡＴＣＣは、American Type Culture Collection; 10801 University Blvd; Manassas, Virginia 20110-2209; U.S.A.
全てのＨＰＶ株は、ＤＫＦＺから入手可能である。
【表５２】
2015033383.tif 000129
【表５３】
2015033383.tif 000130
【表５４】
2015033383.tif 000131
【表５５】
2015033383.tif 000132
【表５６】
2015033383.tif 000133
【表５７】
2015033383.tif 000134
【表５８】
2015033383.tif 000135
【表５９】
2015033383.tif 000136
【表６０】
2015033383.tif 000137
【表６１】
2015033383.tif 000138
【表６２】
2015033383.tif 000139
【表６３】
2015033383.tif 000140
【表６４】
2015033383.tif 000141
【表６５】
2015033383.tif 000142
【表６６】
2015033383.tif 000143
【表６７】
2015033383.tif 000144
【表６８】
2015033383.tif 000145
【表６９】
2015033383.tif 000146
【表７０】
2015033383.tif 000147
【表７１】
2015033383.tif 000148
【表７２】
2015033383.tif 000149
【表７３】
2015033383.tif 000150
【表７４】
2015033383.tif 000151
【表７５】
2015033383.tif 000152
【表７６−１】
2015033383.tif 000153
【表７６−２】
2015033383.tif 000154
【表７７−１】
2015033383.tif 000155
【表７７−２】
2015033383.tif 000156
【表７８−１】
2015033383.tif 000157
【表７８−２】
2015033383.tif 000158
【表７９−１】
2015033383.tif 000159
【表７９−２】
2015033383.tif 000160
【表８０−１】
2015033383.tif 000161
【表８０−２】
2015033383.tif 000162
【表８１】
2015033383.tif 000163
【表８２−１】
2015033383.tif 000164
【表８２−２】
2015033383.tif 000165
【表８３】
2015033383.tif 000166
【表８４】
2015033383.tif 000167
【表８５】
2015033383.tif 000168
【表８６】
2015033383.tif 000169
【表８７】
2015033383.tif 000170
【表８８】
2015033383.tif 000171
【表８９−１】
2015033383.tif 000172
【表８９−２】
2015033383.tif 000173
【表８９−３】
2015033383.tif 000174
【０３２５】
参照鋳型配列の配列：
<SEQ25;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tggaccgggtcatgttt ggggtgctgg agacaaacat
ctagagaacc tagagaatct acagtataat catgcatggt aaagtaccaa cgctgcaaga
cgt
<SEQ334;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tggaccgggtcatgttt ggggtgctgg agacaaacat
ctagagaacc tagagaatct acagtataat catgcatggt aaagtaccaa cgctgcaaga
cgttgtatta gaactaacac ctcaaacaga aattgaccta cagtgcaatg agcaattgga
cagctcagag gatgaggatg aggatgaagt agaccatttg caggagcggc cacagcaagc
tagacaagct aaacaacata cgtgttacct aatacacgta ccttgttgtg agtgtaagtt
tgtggtgcag t
<SEQ26;DNA;ヒトパピローマウイルス>
ctaatagcacat ggttggaccg ggtcatgttt ggggtgctgg agacaaacat
ctagagaacc tagagaatct acagtataat catgcatggt aaagtaccaa cgctgcaaga
cgt
<SEQ335;DNA;ヒトパピローマウイルス>
ctaatagcacat ggttggaccg ggtcatgttt ggggtgctgg agacaaacat
ctagagaacc tagagaatct acagtataat catgcatggt aaagtaccaa cgctgcaaga
cgttgtatta gaactaacac ctcaaacaga aattgaccta cagtgcaatg agcaattgga
cagctcagag gatgaggatg aggatgaagt agaccatttg caggagcggc cacagcaagc
tagacaagct aaacaacata cgtgttacct aatacacgta ccttgttgtg agtgtaagtt
tgtggtgcag t
<SEQ27;DNA;ヒトパピローマウイルス>
aaggtgctacagatgtca aagtccgtta actccggagg aaaagcaatt gcattgtgac agaaaaagac
gatttcatct aatagcacat ggttggaccg ggtcatgttt ggggtgctgg agacaaacat
ctagagaacc
<SEQ336;DNA;ヒトパピローマウイルス>
aaggtgctacagatgtca aagtccgtta actccggagg aaaagcaatt gcattgtgac agaaaaagac
gatttcatct aatagcacat ggttggaccg ggtcatgttt ggggtgctgg agacaaacat
ctagagaacc tagagaatct acagtataat catgcatggt aaagtaccaa cgctgcaaga
cgt
<SEQ337;DNA;ヒトパピローマウイルス>
aaggtgctacagatgtca aagtccgtta actccggagg aaaagcaatt gcattgtgac agaaaaagac
gatttcatct aatagcacat ggttggaccg ggtcatgttt ggggtgctgg agacaaacat
ctagagaacc tagagaatct acagtataat catgcatggt aaagtaccaa cgctgcaaga
cgttgtatta gaactaacac ctcaaacaga aattgaccta cagtgcaatg agcaattgga
cagctcagag gatgaggatg aggatgaagt agaccatttg caggagcggc cacagcaagc
tagacaagct aaacaacata cgtgttacct aatacacgta ccttgttgtg agtgtaagtt
tgtggtgcag t
<SEQ28;DNA;ヒトパピローマウイルス>
gttggaccgggtcatgttt ggggtgctgg agacaaacat
ctagagaacc tagagaatct acagtataat catgcatggt aaagtaccaa cgctgcaaga
cgt
<SEQ338;DNA;ヒトパピローマウイルス>
gttggaccg  ggtcatgttt ggggtgctgg agacaaacat
ctagagaacc tagagaatct acagtataat catgcatggt aaagtaccaa cgctgcaaga
cgttgtatta gaactaacac ctcaaacaga aattgaccta cagtgcaatg agcaattgga
cagctcagag gatgaggatg aggatgaagt agaccatttg caggagcggc cacagcaagc
tagacaagct aaacaacata cgtgttacct aatacacgta ccttgttgtg agtgtaagtt
tgtggtgcag t
<SEQ29;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tcagaggatgaggatg aggatgaagt agaccatttg caggagcggc cacagcaagc
tagacaagct aaacaacata cgtgttacct aatacacgta ccttgttgtg agtgtaagtt
tgtggtgcag t
<SEQ1;DNA;ヒトパピローマウイルス>
ggcagtggaaagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatgg
<SEQ320;DNA;ヒトパピローマウイルス>
ggcagtggaaagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact 
<SEQ321;DNA;ヒトパピローマウイルス>
ggcagtggaaagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact gtgaaggtac agaggatgag
gg
<SEQ2;DNA;ヒトパピローマウイルス>
agctccgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact
<SEQ322;DNA;ヒトパピローマウイルス>
agctccgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatgg
<SEQ323;DNA;ヒトパピローマウイルス>
agctccgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact gtgaaggtac agaggatgag
gg
<SEQ3;DNA;ヒトパピローマウイルス>
atatgcgtgacca gctaccagaa agacgggctg gacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gaca
<SEQ324;DNA;ヒトパピローマウイルス>
atatgcgtgacca gctaccagaa agacgggctg gacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatgg
<SEQ325;DNA;ヒトパピローマウイルス>
atatgcgtgacca gctaccagaa agacgggctg gacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact
<SEQ326;DNA;ヒトパピローマウイルス>
atatgcgtgacca gctaccagaa agacgggctg gacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact gtgaaggtac agaggatgag
gg
<SEQ327;DNA;ヒトパピローマウイルス>
atatgcgtgacca gctaccagaa agacgggctg gacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcga
<SEQ4;DNA;ヒトパピローマウイルス>
gacaggctacgtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact gtgaaggtac agaggatgag
gg
<SEQ328;DNA;ヒトパピローマウイルス>
gacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatgg
<SEQ329;DNA;ヒトパピローマウイルス>
gacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact
<SEQ330;DNA;ヒトパピローマウイルス>
gacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcga
<SEQ5;DNA;ヒトパピローマウイルス>
cgggctggacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcga
<SEQ331;DNA;ヒトパピローマウイルス>
cgggctggacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatgg
<SEQ332;DNA;ヒトパピローマウイルス>
cgggctggacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact
<SEQ333;DNA;ヒトパピローマウイルス>
cgggctggacaggctac
gtgttacaga attgaagctc cgtgttgcag gtgttcaagt gtagtacaac tggcagtgga
aagcagtgga gacacccttc gcgttgtaca gcagatgtta atgggcgaac taagcctggt
ttgcccgtgt tgtgcgaaca actagcaacg gcgatggact gtgaaggtac agaggatgag
gg
<SEQ122;DNA;ヒトパピローマウイルス>
ggacgtggtccaga ttaagtttgc acgaggacga ggacaaggaa aacgatggag
actctttgcc aacgtttaaa tgtgtgtcag gaca
<SEQ123;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tagtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat 
<SEQ124;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tagtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat ttt
<SEQ125;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tagtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat t
<SEQ126;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tagtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat ttttgtc
<SEQ127;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tagtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat ttttg
<SEQ128;DNA;ヒトパピローマウイルス>
agtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ129;DNA;ヒトパピローマウイルス>
agtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat ttt
<SEQ130;DNA;ヒトパピローマウイルス>
agtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat t
<SEQ131;DNA;ヒトパピローマウイルス>
agtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat ttttgtc
<SEQ132;DNA;ヒトパピローマウイルス>
agtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat ttttg
<SEQ133;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tagtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ134;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tagtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
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<SEQ135;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tagtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
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<SEQ136;DNA;ヒトパピローマウイルス>
agtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ137;DNA;ヒトパピローマウイルス>
agtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat tt
<SEQ138;DNA;ヒトパピローマウイルス>
agtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ139;DNA;ヒトパピローマウイルス>
actacacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgacca
<SEQ140;DNA;ヒトパピローマウイルス>
actacacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ141;DNA;ヒトパピローマウイルス>
actacacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ142;DNA;ヒトパピローマウイルス>
acacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ143;DNA;ヒトパピローマウイルス>
acacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat tt
<SEQ144;DNA;ヒトパピローマウイルス>
acacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat
<SEQ145;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tacacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ146;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tacacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ147;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tacacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ359;DNA;ヒトパピローマウイルス>
actacacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat t
<SEQ360;DNA;ヒトパピローマウイルス>
actacacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ361;DNA;ヒトパピローマウイルス>
actacacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat ttttg
<SEQ362;DNA;ヒトパピローマウイルス>
actacacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat ttttgtc
<SEQ363;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tacacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ364;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tacacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ365;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tacacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ366;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tacacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ367;DNA;ヒトパピローマウイルス>
tacacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ144;DNA;ヒトパピローマウイルス>
acacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ368;DNA;ヒトパピローマウイルス>
acacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ369;DNA;ヒトパピローマウイルス>
acacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
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<SEQ370;DNA;ヒトパピローマウイルス>
acacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat ttttg
<SEQ371;DNA;ヒトパピローマウイルス>
acacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat ttttgtc
<SEQ372;DNA;ヒトパピローマウイルス>
t
agtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat ttttgtctca agttaaaata ccaaaaacta ttacagtgtc
<SEQ373;DNA;ヒトパピローマウイルス>
t
agtaacacta cacccatagt acatttaaaa ggtgatgcta atactttaaa atgtttaaga
tatagattta aaaagcattg tacattgtat actgcagtgt cgtctacatg gcattggaca
ggacataatg taaaacataa aagtgcaatt gttacactta catatgatag tgaatggcaa
cgtgaccaat ttttgtctca agttaaaata ccaaaaacta ttacagtgtc t
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【図面の簡単な説明】
【０３２６】
【図１】本発明の系統樹。
【図２Ａ】ＨＰＶ群Ａ６（ＨＰＶ５６）およびＡ５（ＨＰＶ５１）についての増幅標的の模式図。
【図２Ｂ】および群Ａ９（ＨＰＶ１６）およびＡ７（ＨＰＶ１８）についての増幅標的の模式図。
【図３−１】NCBI_001594.1の写し、ＨＰＶ５６（Ａ６群についての参照ＨＰＶ）の配列;配列番号４２０。
【図３−２】NCBI_001594.1の写し、ＨＰＶ５６（Ａ６群についての参照ＨＰＶ）の配列;配列番号４２０。
【図３−３】NCBI_001594.1の写し、ＨＰＶ５６（Ａ６群についての参照ＨＰＶ）の配列;配列番号４２０。
【図３−４】NCBI_001594.1の写し、ＨＰＶ５６（Ａ６群についての参照ＨＰＶ）の配列;配列番号４２０。
【図３−５】NCBI_001594.1の写し、ＨＰＶ５６（Ａ６群についての参照ＨＰＶ）の配列;配列番号４２０。
【図４−１】NCBI_001533.1の写し、ＨＰＶ５１（Ａ５群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２１。
【図４−２】NCBI_001533.1の写し、ＨＰＶ５１（Ａ５群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２１。
【図４−３】NCBI_001533.1の写し、ＨＰＶ５１（Ａ５群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２１。
【図４−４】NCBI_001533.1の写し、ＨＰＶ５１（Ａ５群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２１。
【図４−５】NCBI_001533.1の写し、ＨＰＶ５１（Ａ５群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２１。
【図５−１】NCBI_001526.1の写し、ＨＰＶ１６（Ａ９群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２２。
【図５−２】NCBI_001526.1の写し、ＨＰＶ１６（Ａ９群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２２。
【図５−３】NCBI_001526.1の写し、ＨＰＶ１６（Ａ９群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２２。
【図５−４】NCBI_001526.1の写し、ＨＰＶ１６（Ａ９群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２２。
【図５−５】NCBI_001526.1の写し、ＨＰＶ１６（Ａ９群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２２。
【図５−６】NCBI_001526.1の写し、ＨＰＶ１６（Ａ９群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２２。
【図６−１】NCBI_001357.1の写し、ＨＰＶ１８（Ａ７群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２３。
【図６−２】NCBI_001357.1の写し、ＨＰＶ１８（Ａ７群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２３。
【図６−３】NCBI_001357.1の写し、ＨＰＶ１８（Ａ７群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２３。
【図６−４】NCBI_001357.1の写し、ＨＰＶ１８（Ａ７群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２３。
【図６−５】NCBI_001357.1の写し、ＨＰＶ１８（Ａ７群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２３。
【図６−６】NCBI_001357.1の写し、ＨＰＶ１８（Ａ７群についての参照ＨＰＶ）の配列；配列番号４２３。
【図７】本明細書中で示される位置の凡例。
【図１】
2015033383.tif 000175
【図２Ａ】
2015033383.tif 000176
【図２Ｂ】
2015033383.tif 000177
【図３−１】
2015033383.tif 000178
【図３−２】
2015033383.tif 000179
【図３−３】
2015033383.tif 000180
【図３−４】
2015033383.tif 000181
【図３−５】
2015033383.tif 000182
【図４−１】
2015033383.tif 000183
【図４−２】
2015033383.tif 000184
【図４−３】
2015033383.tif 000185
【図４−４】
2015033383.tif 000186
【図４−５】
2015033383.tif 000187
【図５−１】
2015033383.tif 000188
【図５−２】
2015033383.tif 000189
【図５−３】
2015033383.tif 000190
【図５−４】
2015033383.tif 000191
【図５−５】
2015033383.tif 000192
【図５−６】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図７】
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【配列表】
2015033383000001.app
【外国語明細書】
2015033383000001.pdf