(57)【要約】【課題】がんの幹細胞性に起因する転移、経年後再発が想定される幅広いがん種の難治性がん患者に有効性が高い、がん幹細胞の検出に有用な分子マーカーを提供することを課題とする。【解決手段】ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現により、がん幹細胞を対象から検出するための分子マーカーであって、好ましくはＰＲＤＭ１４遺伝子産物またはその断片を含む、および／またはＰＲＤＭ１４遺伝子の発現により誘導される液性因子を含む、前記分子マーカーを提供すること。【選択図】図５−Ｇ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現により、がん幹細胞を対象から検出するための分子マーカー。
【請求項２】
ＰＲＤＭ１４遺伝子産物またはその断片を含む、請求項１に記載の分子マーカー。
【請求項３】
ＰＲＤＭ１４遺伝子産物が、ｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドである、請求項２に記載の分子マーカー。
【請求項４】
ＰＲＤＭ１４遺伝子産物が、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現により誘導される液性因子を含む、請求項１に記載の分子マーカー。
【請求項５】
対象が、乳房、肺、食道、胃、大腸、肝臓、膵臓、子宮頸部、子宮体部、卵巣、腎臓、前立腺、膀胱、精巣、甲状腺、副腎、リンパ節、血液およびリンパ液からなる群から選択される１種もしくは２種以上の細胞または組織由来の細胞集団である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分子マーカー。
【請求項６】
対象において、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分子マーカーを指標として、がん幹細胞の有無を判定するか、または、がん幹細胞誘導度を判定する方法。
【請求項７】
分子マーカーが、ＰＲＤＭ１４遺伝子産物またはその断片を含む場合、
該遺伝子産物が、ｍＲＮＡであり、
該遺伝子産物をＲＴ−ＰＣＲ法により検出する工程を含む、請求項６に記載の判定方法。
【請求項８】
分子マーカーが、ＰＲＤＭ１４遺伝子産物またはその断片を含む場合、
ＰＲＤＭ１４遺伝子産物が、ポリペプチドであり、
該遺伝子産物を、該遺伝子産物と特異的に反応する試薬により検出する工程を含む、請求項６に記載の判定方法。
【請求項９】
分子マーカーが、液性因子を含む場合、
該液性因子を、該液性因子と特異的に反応する試薬により検出する工程を含む、請求項６に記載の判定方法。
【請求項１０】
試薬が抗体である、請求項８または９に記載の判定方法。
【請求項１１】
がん幹細胞の有無を判定するためのキットであって、少なくとも請求項１〜５のいずれか一項に記載の分子マーカーを検出するための試薬を含む、前記キット。
【請求項１２】
検出するための試薬が、ＰＲＤＭ１４遺伝子産物であるｍＲＮＡを検出するための、ＰＲＤＭ１４遺伝子に相補的な塩基配列を有するプローブおよび／またはプライマーである、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
検出するための試薬が、ＰＲＤＭ１４遺伝子産物であるポリペプチドを検出するための抗体である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
検出するための試薬が、液性因子であるポリペプチドを検出するための抗体である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれかに記載のキットを使用する、がんまたはがん幹細胞誘導度の判定方法。
【請求項１６】
がん幹細胞において、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を抑制するために用いられる核酸であって、
該核酸が、アンチセンス、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡからなる群から選択される１種または２種以上である、前記核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
医薬組成物が、さらに抗がん剤を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
医薬組成物が、がん治療用またはがん予防用である、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１６に記載の核酸を使用して、がん幹細胞の機能を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん幹細胞を対象から検出するための分子マーカーおよびこれに関連する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん幹細胞は、がんの再発や転移の主要な原因と考えられており、がん治療においてがん幹細胞をターゲッティングすることの重要性が指摘されている。しかしながら、腫瘍組織全体に対するがん幹細胞数の比率はわずかであり（非特許文献４）、がん幹細胞を特異的に認識し、かつ治療することは極めて困難である。多くの論文等で指摘されてきたがん幹細胞の検出方法は、正常幹細胞の検出系を流用したものであるため、正常幹細胞との差異に乏しく、また腫瘍の増殖や浸潤を反映する指標と共通しているため、増殖活性の高いがん細胞の形質マーカーをがん幹細胞の指標としている場合がほとんどである。
【０００３】
現在のところ、がん幹細胞マーカーは、表１に示すように、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４４などの細胞表面マーカーが知られている（非特許文献１〜７）が、正常幹細胞のマーカーの流用であり、体性幹細胞（組織幹細胞）にも発現する分子であることから、がん幹細胞マーカーとしての特異性は必ずしも高くなく、また、治療標的にすると副作用の原因となり得る。そのような理由から、がん幹細胞を標的とする治療は未確立であるといえ、がん治療における「転移・浸潤」、「経年後再発」、「抗癌剤耐性」の課題を克服できないままである。より多くの種類のがんにおいてがん幹細胞を検出するためには、新たな分子マーカーの同定が必要である。
【表１】
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がん幹細胞の検出技術とがん幹細胞を標的にする新たな治療方法との開発は、今後のがん医療にとって極めて重要な課題となっている。
なお、ＰＲＤＭ１４をコードする遺伝子の発現が、正常組織と比較して乳がんおよび卵巣癌において特異的に増加していることは知られている（特許文献１）が、ＰＲＤＭ１４遺伝子産物をがん幹細胞のマーカーとして用いることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００８／０３８８３２号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Shu Zhang et al., Cancer Res. 68:(11) 4311-4320, 2008
【非特許文献２】Shih-Hwa Chiou et al., Clin. Cancer Res. 14(13) 4085-4095, 2008
【非特許文献３】Gang-Ming Zou, J. Cell. Physiol. 217: 598-604, 2008
【非特許文献４】Cheong J. Lee et al., J Clin Oncol 26:2806-2812, 2008
【非特許文献５】Madhuri Kakarala et al., J Clin Oncol 26:2813-2820, 2008
【非特許文献６】Craig D. Peacock et al., J Clin Oncol 26:2883-2889, 2008
【非特許文献７】Xing Fan et al., J Clin Oncol 26:2821-2827, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、がん幹細胞の検出に有用な分子マーカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を続ける中で、固形がんである乳がん、膵臓がんに由来する複数のがん細胞株を使用し、ＰＲＤＭ１４を発現することでがんの幹細胞形質を誘導し得ることをインビトロ、インビボの両面から解明し、ＰＲＤＭ１４のキメラ型ＲＮＡｉによるインビボ治療モデルを構築すること、さらに、それらが腫瘍縮小・転移抑制効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現により、がん幹細胞を対象から検出するための分子マーカーに関する。
本発明は、ＰＲＤＭ１４遺伝子産物、好ましくはｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドであるＰＲＤＭ１４遺伝子産物、あるいはそれらの断片を含む分子マーカーに関する。
【０００９】
本発明は、対象が、乳房、肺、食道、胃、大腸、肝臓、膵臓、子宮頸部、子宮体部、卵巣、腎臓、前立腺、膀胱、精巣、甲状腺、副腎、リンパ節および血液からなる群から選択される１種もしくは２種以上の細胞または組織由来の細胞集団である、分子マーカーに関する。
本発明はまた、対象において、前記分子マーカーを指標として、がん幹細胞の有無を判定するか、または、がん幹細胞誘導度を判定する方法に関する。
【００１０】
本発明は、分子マーカーがＰＲＤＭ１４遺伝子産物またはその断片を含む場合、該遺伝子産物がｍＲＮＡであり、該遺伝子産物をＲＴ−ＰＣＲ法により検出する工程を含む；ＰＲＤＭ１４遺伝子産物またはその断片を含む場合、ＰＲＤＭ１４遺伝子産物がポリペプチドであり、該遺伝子産物を、該遺伝子産物と特異的に反応する試薬により検出する工程を含む；液性因子を含む場合、該液性因子を、該液性因子と特異的に反応する試薬、好ましくは抗体により検出する工程を含む、判定方法に関する。
【００１１】
本発明はさらにまた、がん幹細胞の有無を判定するためのキットであって、前記分子マーカーを検出するための試薬を含むキットにも関する。
本発明は、検出するための試薬が、ＰＲＤＭ１４遺伝子産物であるｍＲＮＡを検出するための、ＰＲＤＭ１４遺伝子に相補的な塩基配列を有するプローブおよび／またはプライマーである；ＰＲＤＭ１４遺伝子産物であるポリペプチドを検出するための抗体である；液性因子であるポリペプチドを検出するための抗体である、キットに関する。
【００１２】
また、本発明は、前記キットを使用する、がんまたはがん幹細胞誘導度の判定方法に関する。
さらに、本発明は、がん幹細胞において、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を抑制するために用いられる核酸であって、該核酸が、アンチセンス、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡからなる群から選択される１種または２種以上である核酸に関する。
【００１３】
さらにまた、本発明は、前記核酸を含み、好ましくはさらに抗癌剤を含む医薬組成物に関する。
本発明は、がん治療用またはがん予防用である医薬組成物にも関する。
また、本発明は、前記核酸を使用して、がん幹細胞の機能を阻害する方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ＰＲＤＭ１４遺伝子が、正常組織では発現が低く、腫瘍組織では発現が上昇し、がん細胞の幹細胞形質に極めて深く関わることが究明されたことに基づき、生検組織による病理診断（免疫組織診断）、さらに、該遺伝子の過剰発現で上昇する液性因子を同定しており、それを用いた血清診断により、患者の腫瘍ががん幹細胞形質を有するか、すなわち、「転移・浸潤」、「経年後再発」を判断する基準マーカーになる。
【００１５】
ＰＲＤＭ１４遺伝子は、正常組織の発現が低く、腫瘍組織での発現が上昇することから、治療標的として、副作用も生じにくく最適である。細胞増殖が盛んな細胞への効果も有するが、むしろ、幹細胞性を有しがん細胞を生産する芽になる細胞群への方に、極めて特異的に効果を有する。既存の抗がん剤との併用で、細胞周期の早い細胞群は既存の抗癌剤で、「転移・浸潤」、「経年後再発」に係るがん細胞群をＰＲＤＭ１４に対する阻害剤（ｓｉＲＮＡ等）で細胞死を誘導することが可能であり、がんの根治に繋がる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−Ａ】図１−Ａは、様々ながん組織でのＰＲＤＭ１４のｍＲＮＡの発現レベルを示したグラフである。
【図１−Ｂ】図１−Ｂは、１７７症例の乳がん組織および５症例の正常乳腺組織でのＰＲＤＭ１４のｍＲＮＡの発現レベルを示したグラフである。グラフ左から５例が正常組織、それ以外が乳がん組織での値を示している。
【図１−Ｃ】図１−Ｃは、乳がん(a)および膵がん(b)夫々のＰＲＤＭ１４タンパク質の発現レベルを免疫組織化学の手法で解析した画像である。
【図１−Ｄ】図１−Ｄは、乳がん、膵臓がん由来のさまざまな腫瘍細胞株におけるＰＲＤＭ１４のｍＲＮＡ発現レベルを示すものである。
【図１−Ｅ】図１−Ｅは、乳がん組織でのＰＲＤＭ１４タンパク質の発現レベルを免疫組織化学の手法で解析した画像（強拡大）である。
【図１−Ｆ】図１−Ｆは、乳がん細胞株と、該乳がん細胞株のＰＲＤＭ１４強制発現株とｓｈＲＮＡによる発現抑制株とにおけるＰＲＤＭ１４の発現レベルを示したものである。なお、発現ベクターに搭載されるＦＬＡＧタグで免疫沈降した後、ＰＲＤＭ１４の抗体でウェスタンブロットを行い、内因性のＰＲＤＭ１４ではなく遺伝子導入により発現したＰＲＤＭ１４のみを検出している。
【００１７】
【図２−Ａ】図２−Ａは、ＰＲＤＭ１４導入株（実線）とコントロールベクター導入株（点線）とを用いてＭＴＴアッセイを行った結果を示すグラフである。
【図２−Ｂ】図２−Ｂは、ＰＲＤＭ１４に対する特異的なｓｉＲＮＡを単独、または種々の抗がん剤と併用処置により乳がん細胞のviabilityを評価する目的でＭＴＴアッセイを行った結果を示すグラフである。
【図２−Ｃ】図２−Ｃは、ＰＲＤＭ１４に対する特異的なｓｉＲＮＡを単独または抗がん剤（ＧＥＭ：ゲムシタビン）と併用処置によりした膵がん細胞のviabilityを評価する目的でＭＴＴアッセイを行った結果を示すグラフである。
【図２−Ｄ】図２−Ｄは、上段が特異的ｓｉＲＮＡを単独で使用した際の、下段がｓｉＲＮＡに抗がん剤として例えばＡＤＲ（アドリアマイシン）を併用した際の前記ＭＴＴアッセイのレジメンを示す。
【図２−Ｅ】図２−Ｅは、乳がん細胞株をＰＲＤＭ１４に対する特異的なｓｉＲＮＡで処置することによりＳＰ画分が消滅したことを示すフローサイトメトリーの解析結果である。
【図２−Ｆ】図２−Ｆは、膵がん細胞株をＰＲＤＭ１４に対する特異的なｓｉＲＮＡで処置することによりＳＰ画分が消滅したことを示すフローサイトメトリーの解析結果である。
【図２−Ｇ】図２−Ｇは、ＰＲＤＭ１４を低濃度のｓｉＲＮＡによりノックダウン（ＫＤ）することにより乳がん細胞株に細胞死が誘導されたことを示すフローサイトメトリーの解析結果である。四分割された右半分の領域が、細胞死が誘導された細胞群である。詳細には右下1/4が早期細胞死、右上1/4が晩期細胞死を示している。
【図２−Ｈ】図２−Ｈは、ＰＲＤＭ１４を低濃度のｓｉＲＮＡによりノックダウン（ＫＤ）することにより膵がん細胞株に細胞死が誘導されたことを示すフローサイトメトリーの解析結果である。同様に、四分割された右半分の領域が、細胞死が誘導された細胞群である。詳細には右下1/4が早期細胞死、右上1/4が晩期細胞死を示している。
【００１８】
【図２−Ｉ】図２−Ｉは、ＰＲＤＭ１４導入株のＴｕｍｏｒ  ｓｐｈｅｒｅアッセイの結果を示す。下段は形成されたＴｕｍｏｒ  ｓｐｈｅｒｅを幹細胞マーカーである分子（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４）の抗体で染色した結果である。
【図２−Ｊ】図２−Ｊは、ＰＲＤＭ１４導入株を用いて一般的な接着性を有する培養皿上で行った増殖アッセイの結果を示す。
【図２−Ｋ】図２−Ｋは、乳がん細胞株をｓｉＲＮＡ処置した後のＰＲＤＭ１４の発現レベル（ｍＲＮＡ）を示したグラフである。
【図２−Ｌ】図２−Ｌは、ＰＲＤＭ１４の安定発現株においてＳＰ画分の増加を示すフローサイトメトリーの解析結果である。なお、レセルピンはＳＰ細胞の解析の際、レセルピンを添加した解析群が陰性コントロールとなる。図中、実線で囲んだ領域がヘキスト33342弱陽性又は陰性画分である。この画分は、レセルピンを添加した陰性コントロールではほぼ消失しているため、この画分がＳＰ細胞画分であることが確定されるものである。
【図２−Ｍ】図２−Ｍは、ｓｈＲＮＡを用いてＰＲＤＭ１４が発現している乳がん細胞に対してＰＲＤＭ１４を恒常的にノックダウン（ＫＤ）した乳がん細胞株においてＳＰ画分が消失したことを示すフローサイトメトリーの解析結果である。
【図２−Ｎ】図２−Ｎは、ＰＲＤＭ１４に対するｓｉＲＮＡとＡＤＲ（アドリアマイシン）を併用処置した乳がん細胞株のフローサイトメトリーの解析結果を示す。
【図２−Ｏ】図２−Ｏは、ＰＲＤＭ１４に対するｓｉＲＮＡをＧＥＭ（ゲムシタビン）と併用処置した膵がん細胞株のフローサイトメトリーの解析結果を示す。
【００１９】
【図３−Ａ】図３−Ａは、ｑ−ＣｈＩＰ−ＰＣＲ（クロマチン免疫沈降−リアルタイムＰＣＲ）の結果を示すものであり、転写因子であるＰＲＤＭ１４が、がん幹細胞の維持に重要である特異的な転写因子（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４）のプロモーター領域に結合することを示す。ＰＲＤＭ１４は、それら転写因子の発現を直接的に制御する可能性を示唆する。
【図３−Ｂ】図３−Ｂは、ＰＲＤＭ１４が、がんの「転移・浸潤」、「経年後再発」に影響を及ぼし得ることを示したチャートである。「ＥＭＴ」は上皮間葉転移を意味する。
【図３−Ｃ】図３−Ｃは、ＰＲＤＭ１４を導入した乳がん細胞株の培養上清を検体として測定したＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３のＥＬＩＳＡの結果を示したグラフである。
【図３−Ｄ】図３−Ｄは、ＰＲＤＭ１４を導入した他の乳がん細胞株の培養上清を検体として測定したＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３のＥＬＩＳＡの結果を示したグラフである。
【００２０】
【図４−Ａ】図４−Ａは、ＰＲＤＭ１４遺伝子を強制発現させた乳がん細胞株の腫瘍サイズの経時変化を表すグラフである。
【図４−Ｂ】図４−Ｂは、ＰＲＤＭ１４遺伝子を強制発現させた乳がん細胞株を同所移植（乳腺）したヌードマウスの画像である。
【図４−Ｃ】図４−Ｃは、ＰＲＤＭ１４遺伝子を強制発現させた乳がん細胞株を同所移植したヌードマウスから得られた肺、リンパ節の病理所見を示す。
【図４−Ｄ】図４−Ｄは、ＰＲＤＭ１４遺伝子に対するｓｈＲＮＡを導入し、ＰＲＤＭ１４遺伝子を恒常的にＫＤした乳がん細胞株の腫瘍サイズの経時変化を表すグラフである。
【図４−Ｅ】図４−Ｅは、ＰＲＤＭ１４遺伝子を強制発現させた乳がん細胞株を尾静脈注射して得られる肺転移形成モデル（ヌードマウス）のエンドポイントでの画像を示す。
【図４−Ｆ】図４−Ｆは、ＰＲＤＭ１４遺伝子を強制発現させた乳がん細胞株を尾静脈注射して得られる肺転移形成モデル（ヌードマウス）の肺の病理所見を示す。
【図４−Ｇ】図４−Ｇは、ＰＲＤＭ１４遺伝子を強制発現させた他の乳がん細胞株を同所移植した際の腫瘍サイズの経時変化を表すグラフである。
【図４−Ｈ】図４−Ｈは、ＰＲＤＭ１４遺伝子を強制発現させた他の乳がん細胞株を同所移植したヌードマウスの画像である。
【図４−Ｉ】図４−Ｉは、ＰＲＤＭ１４遺伝子を強制発現させた乳がん細胞株を同所移植したヌードマウスの移植腫瘍片の病理所見であり、緑色（断片化されたカスパーゼ３に対する抗体による蛍光）がアポトーシスを起こした細胞を示し、赤色（抗ＣＤ３１抗体による蛍光）が血管を示す。
【００２１】
【図５−Ａ】図５−Ａは、乳がん細胞株を同所移植したヌードマウスに対してＰＲＤＭ１４遺伝子特異的なｓｉＲＮＡをＤＤＳ剤（ＰＥＩ）とともに単独投与（腫瘍局所）、またはＡＤＲ併用（腹腔内投与）した治療モデルにおける、腫瘍容積の経時変化のグラフを示す。
【図５−Ｂ】図５−Ｂは、乳がん細胞株を同所移植したヌードマウスに対してＰＲＤＭ１４遺伝子特異的なｓｉＲＮＡをＤＤＳ剤（ＰＥＩ）とともに単独投与（腫瘍局所）、またはＡＤＲ併用（腹腔内投与）した治療モデルの画像である。
【図５−Ｃ】図５−Ｃは、他の乳がん細胞株を同所移植した後、ＰＲＤＭ１４遺伝子特異的なｓｉＲＮＡをＤＤＳ剤（ＰＥＩ）とともに単独投与（腫瘍局所）、またはＡＤＲ併用（腹腔内投与）処置したヌードマウスの腫瘍容積の経時変化のグラフを示す。
【図５−Ｄ】図５−Ｄは、他の乳がん細胞株を同所移植した後、ＰＲＤＭ１４遺伝子特異的なｓｉＲＮＡを単独、もしくは抗がん剤と併用処置したヌードマウスの画像である。
【図５−Ｅ】図５−Ｅは、乳がん細胞株を尾静脈投与し作製した肺転移モデルにおいて、ＰＲＤＭ１４遺伝子特異的なｓｉＲＮＡで治療処置したヌードマウスの画像および摘出した肺の病理所見である。
【図５−Ｆ】図５−Ｆは、乳がん細胞株を尾静脈投与し作製した肺転移モデルにおいて、ＰＲＤＭ１４遺伝子特異的なｓｉＲＮＡで治療処置したヌードマウスの肺重量の経時変化のグラフを示す。
【図５−Ｇ】図５−Ｇは、乳がん細胞株を同所移植したヌードマウスにおいて、ＰＲＤＭ１４遺伝子特異的なｓｉＲＮＡを静脈投与用のＤＤＳ剤（カルシウムリン酸ミセル）とともに単独投与（静脈注射）、またはドセタキセル（ＤＯＣＥ）併用（腹腔内投与）モデルを作製した場合の投与のレジメン、そのモデルで得られた腫瘍容積および腫瘍重量の経時変化を示すグラフ、得られた腫瘍組織片の重量、ならびにそのヌードマウスの画像を示す。これは、転移巣を治療する上でｓｉＲＮＡの静脈投与が不可欠であり、ｓｉＲＮＡをＤＤＳ剤（カルシウムリン酸ミセル）とともに使用している。
【００２２】
【図５−Ｈ】図５−Ｈは、ＰＲＤＭ１４遺伝子特異的なｓｉＲＮＡをＤＤＳ剤（ＰＥＩ）とともに単独投与（腫瘍局注）、またはＡＤＲを併用投与するためのレジメンを示す。
【図５−Ｉ】図５−Ｉは、ｓｉＲＮＡをＤＤＳ剤であるＰＥＩともに単独投与（静脈投与）するためのレジメンを示す。
【図５−Ｊ】図５−Ｊは、ｓｉＲＮＡをＤＤＳ剤であるＰＥＩとともに腫瘍局所に投与する、またはＤＯＣを併用して腹腔内投与するためのレジメンを示す。
【図５−Ｋ】図５−Ｋは、乳がん細胞株を同所移植した後、ｓｉＲＮＡ単独の腫瘍局所投与、またはドセタキセル（ＤＯＣ）を腹腔内投与で併用処置したヌードマウスの腫瘍容積の経時変化を示す。
【図５−Ｌ】図５−Ｌは、乳がん細胞株を同所移植した後、ｓｉＲＮＡ単独の腫瘍局所投与、またはドセタキセル（ＤＯＣ）を腹腔内投与で併用処置したヌードマウスの画像である。
【図５−Ｍ】図５−Ｍは、乳がん細胞株を同所移植した後、ｓｉＲＮＡ単独の腫瘍局所投与、またはドセタキセル（ＤＯＣ）を腹腔内投与で併用処置したヌードマウスの腫瘍重量と体重との経時変化を示す。
【図５−Ｎ】図５−Ｎは、乳がん細胞株を同所移植した後、ｓｉＲＮＡ単独の腫瘍局所投与、またはドセタキセル（ＤＯＣ）を腹腔内投与で併用処置したヌードマウスの腫瘍移植片の画像である。
【図５−Ｏ】図５−Ｏは、乳がん細胞株を同所移植した後、ｓｉＲＮＡ単独の腫瘍局所投与、またはドセタキセル（ＤＯＣ）を腹腔内投与で併用処置したヌードマウスの腫瘍移植片の病理所見を示す。
【図６】図６は、ＰＲＤＭ１４陽性の乳がん症例とＰＲＤＭ１４陰性の乳がん症例との乳がん発症からの経過時間に対する生存率をプロットした図を示す。
【図７−Ａ】図７−Ａは、ＰＲＤＭ１４遺伝子に対するｓｈＲＮＡを導入することによってＰＲＤＭ１４遺伝子を恒常的にノックダウンした膵臓がん細胞株をヌードマウス皮下に移植し、形成された腫瘍のサイズ（腫瘍径）の経時変化を表すグラフである。ｓｈＲＮＡ＃３を導入した場合、腫瘍径が最終的に対照（cntl shRNA）に近接するが、膵臓がん細胞株は粘液を産生する分化能を有することから、腫瘍内部に粘液が蓄積するため、腫瘍径が増大した。ＰＲＤＭ１４の発現を恒常的に抑制すると、膵臓がん細胞株においても、in vivoの系で腫瘍増殖が抑制される。
【図７−Ｂ】図７−Ｂは、膵臓がん細胞株を使用する腫瘍形成能実験（実施例１１）において、in vivoでその経過を追い、エンドポイントで摘出したマウス皮下腫瘍像を示す。
【図７−Ｃ】図７−Ｃは、図７−Ｂに示される摘出された腫瘍の重量を示したグラフである。ｓｈＲＮＡ＃３の腫瘍重量において、腫瘍内部の粘液（細胞成分含まない）を吸引除去した後の腫瘍重量を示す。
【図７−Ｄ】図７−Ｄは、図７−Ｂに示される摘出された腫瘍の病理組織像（ＨＥ染色）を示す。対照ｓｈＲＮＡ（cntl shRNA）が導入された細胞から形成される腫瘍と比較して、ＰＲＤＭ１４をノックダウンした場合の腫瘍の方が、その腫瘍径が有意に小さかった。また、ＰＲＤＭ１４をノックダウンした場合の腫瘍には、化生や腺分泌が見られることから、分化傾向にあることがわかった。
【図８−Ａ】図８−Ａは、ＰＲＤＭ１４を発現している乳がん細胞株に対して、ＰＲＤＭ１４遺伝子特異的なｓｈＲＮＡによりＰＲＤＭ１４をノックダウンし、細胞表面のＣＤ４４およびＣＤ２４の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。
【図８−Ｂ】図８−Ｂは、ＰＲＤＭ１４の発現をｓｈＲＮＡにより低下させた乳がん細胞株および膵臓がん細胞株の夫々をマウス皮下に移植し、形成された腫瘍に対して、夫々の細胞の分化の指標となる分子に特異的な抗体を用いて免疫染色した結果を示す。上段は乳がん細胞株に由来、下段は膵臓がん細胞株に由来する。
【図９】図９は、ＰＲＤＭ１４を発現している明細胞がん（腎臓がん）の細胞株において、ＰＲＤＭ１４遺伝子特異的なｓｉＲＮＡによりＰＲＤＭ１４遺伝子発現を抑制した際のＳＰ分画をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。対照ｓｉＲＮＡで処理した場合（左図）、約３％のＳＰ分画が見られたが、ＰＲＤＭ１４遺伝子特異的なｓｉＲＮＡで処理した場合（右図）、ＳＰ分画が０．８３％と減少しており、幹細胞性が抑えられている可能性がある。
【００２３】
なお、図中の「cntl」は対照を表し、「Negative cntl」は陰性対照を表し、「mock」はモックを表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明について詳細に説明する。
本明細書中に別記のない限り、本発明に関して用いられる科学的および技術的用語は、当業者に通常理解されている意味を有するものとする。一般的に、本明細書中に記載された細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子およびタンパク質および核酸化学に関して用いられる用語、およびその技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものとする。
また、別記のない限り、本発明の方法および技術は、当該技術分野においてよく知られた慣用の方法に従って、本明細書中で引用され、議論されている種々の一般的な、およびより専門的な参考文献に記載されたとおりに行われる。かかる文献としては、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992および2000の補遺); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology-4thEd., Wiley & Sons (1999); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990);およびHarlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)などが挙げられる。
【００２５】
本明細書中に記載された分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学および薬化学に関して用いられる用語、ならびにその実験手順および技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものである。標準的な技術を、化学合成、化学分析、薬剤の製造、製剤および送達、ならびに対象の処置に用いるものとする。
【００２６】
本明細書においては、別記のない限り、タンパク質の名称はアルファベット大文字またはカタカナで表記し、そのタンパク質をコードする遺伝子は、前記のアルファベット大文字またはカタカナで表記したものに「遺伝子」と付記するか、または前記のアルファベット大文字またはカタカナで表記したものに下線を付して表記するものとする。したがって、別記のない限り、例えば、単に「ＰＲＤＭ１４」と表記した場合には、ＰＲＤＭ１４（PR domain-containing protein 14）そのもの自体であるタンパク質を意味し、「ＰＲＤＭ１４遺伝子」と表記した場合には、ＰＲＤＭ１４をコードする遺伝子を意味し、また、「ＰＲＤＭ１４」と表記した場合もＰＲＤＭ１４をコードする遺伝子を意味する。
【００２７】
本発明において用いられるＰＲＤＭ１４は、PR domain-containing protein 14（別名ＰＦＭ１１またはＭＧＣ５９７３０）と呼ばれる、ＰＲドメインおよびジンクフィンガードメインを有するタンパク質であり、例として、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列等を例示することができる。
【００２８】
また、本発明において用いられるＰＲＤＭ１４遺伝子には、例えば、配列番号２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または、配列番号２で表される塩基配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ前記の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同等の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが含まれる。ここで、配列番号２で表される塩基配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする塩基配列を含有するＤＮＡとしては、例えば配列番号２で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等を用いることができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、通常、４２℃、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの条件である。
【００２９】
また、本明細書において、「がん」という用語を「癌腫」に限らない「悪性腫瘍」という意味でも使用する。
なお、異種動物間はもちろんのこと、同種動物間でも、多型、アイソフォーム等によってＰＲＤＭ１４遺伝子の塩基配列に相違が見られる場合があるが、塩基配列が相違する場合であってもＰＲＤＭ１４をコードする限り、ＰＲＤＭ１４遺伝子に含まれる。
【００３０】
本発明は、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現により、がん幹細胞を対象から検出するための分子マーカーに関する。本発明の分子マーカーは、肺がん細胞、乳がん細胞、大腸がん細胞、膵がん細胞など、複数のがん幹細胞に共通して用いることができるので、汎用性のあるがん幹細胞の分子マーカーとして極めて有効である。また、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現により、がん組織の状態が、転移・再発誘発され易い状態であるか否かの悪性度を判定するマーカー、または、抗癌剤治療による予後を予測する予後予測マーカーとしても用いることができる。あるいは、抗癌剤治療において、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現の上昇を指標として、一つの抗癌剤から他の抗癌剤へと切り替えるタイミングを判断するマーカーとして用いてもよい。
【００３１】
本発明において「遺伝子の発現」とは、該遺伝子の転写を起点とし、翻訳まで包含する一連の生体反応をいう。ＰＲＤＭ１４をコードするｍＲＮＡの発現量の定量にあたっては、公知の技術、例えば、ハイブリダイゼーション技術（ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ｃＤＮＡマイクロアレイ等）、遺伝子増幅技術（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等を含む））等を利用することができる。ハイブリダイゼーション技術を用いる場合には、ＰＲＤＭ１４をコードするポリヌクレオチドまたはその一部にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドをプローブとして利用することができ、遺伝子増幅技術を用いる場合には、当該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをプライマーとして利用することができる。「ＰＲＤＭ１４をコードするポリヌクレオチドまたはその一部」としては、ＤＮＡおよびＲＮＡの両者が含まれ、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等が含まれる。したがって、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのいずれであってもよい。本発明におけるＰＲＤＭ１４をコードするｍＲＮＡの発現量の定量にあたっては、用いられるオリゴヌクレオチドの塩基長は、特に限定されないが、通常１５〜１００塩基、好ましくは１７〜３５塩基であり、また、用いられるポリヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常５０〜１０００塩基、好ましくは１５０〜５００塩基である。
【００３２】
また、本発明における「遺伝子の発現」には、ＰＲＤＭ１４の発現に伴い発現が誘導される液性因子をも含めることができる。これら液性因子を介してＰＲＤＭ１４の発現を測定することもできる。ここでＰＲＤＭ１４の発現を間接的に検知・測定できる液性因子としては、ＣＣＬ５、ＧＲＯ（Growth Related Oncogene、またはＣＸＣＬ１、２、３）、可溶化ＣＤ４０Ｌなどが含まれる。これら液性因子は、ＰＲＤＭ１４の発現を検出する、すなわち、がん幹細胞が誘導されている状態を検出する「血清マーカー」としても使用することができる。
【００３３】
ＰＲＤＭ１４の発現量の定量にあたっては、公知の技術、公知のタンパク質解析技術、例えば、抗ＰＲＤＭ１４抗体またはその断片を用いた抗原抗体反応に基づくウェスタンブロッティング法、ドットブロット法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学染色法（ＩＨＣ）等を利用することができる。「遺伝子の発現が有意に高い」とは、ｍＲＮＡの発現レベル（発現量）および／またはタンパク質を包含するポリペプチドの発現レベル（発現量）が、対照と比較して、統計学的に有意に高い（多い）か、あるいは、好ましくは少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、さらに好ましくは少なくとも３倍、もっとも好ましくは少なくとも５倍高い（多い）ことをいう。ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量は、組織や個体間で発現レベルが大きく変動しない遺伝子（例えば、β−アクチン遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子等のハウスキーピング遺伝子）を内部標準遺伝子として、この内部標準遺伝子の発現量に基づいて補正することが好ましい。
【００３４】
「がん幹細胞」とは、がん細胞のうち幹細胞の性質を有する細胞をいう。幹細胞とは細胞分裂を経ても分化能を維持している細胞のことをいう。がん幹細胞は、ヘキスト蛍光色素（Hoechst33342）で染色し、フローサイトメトリーを利用してＵＶレーザー（波長約３５０ｎｍ）を励起光に用いて検出すると、サイドポピュレーション(Side Population)（ＳＰ）画分に濃縮される。ＳＰ画分とは、ヘキスト蛍光色素によって染色されるメインポピュレーション(Main Population)（ＭＰ）画分に対して、ＡＢＣトランスポーターなどを介して色素を細胞外に排出することで染色されない画分のことを指す。また、幹細胞はＯｃｔ３/４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ１およびＳＳＥＡ４などのマーカー分子により特定することもできる。一方、「正常細胞」とは、生体または組織の活動において、正常な機能を有する細胞のことを指す。正常細胞は、体性幹細胞を含んでもよいが、好ましくは成熟細胞である。
【００３５】
本発明の分子マーカーは、好ましくはＰＲＤＭ１４遺伝子産物またはその断片を含み、より好ましくは該ＰＲＤＭ１４遺伝子産物が、ｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドである。「遺伝子産物」とは、例えばｍＲＮＡや内在性ポリペプチド（さらにはタンパク質）など、遺伝子発現に伴う一連の生体反応によって生成される分子をいう。
【００３６】
「対象」は、好ましくは、任意の生物個体、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体からの、乳房、肺、食道、胃、大腸、肝臓、膵臓、子宮頸、子宮内膜、卵巣、腎臓、前立腺、膀胱、精巣、甲状腺、副腎、リンパ節、血液およびリンパ液からなる群から選択される１種もしくは２種以上の細胞または組織由来の細胞集団である。前記「生物個体」は、健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、様々ながんに対する処置が企図される場合には、がんに罹患している生物個体または実験的に罹患させた生物個体、例えばマウス、ラット、スナネズミ、モルモットなどの齧歯類、ネコ、ピューマ、トラなどのネコ科動物、シカ、オオシカなどのシカ科動物等の他、ウサギ、イヌ、ミンク、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、サル、ヒトなどであることが好ましい。
「がん」としては、これらの「対象」に由来するがんの中でも、好ましくは固形がん、より好ましくは乳がん、膵がんおよび腎がんからなる固形がん、または難治性のがん（乳がん、膵がん、胆道がん）が望ましい。
【００３７】
なお、本明細書において「発現している」とは、例えばＲＴ−ＰＣＲ、インシチュハイブリダイゼーション、免疫検定法、クロマトグラフィー法などの、当業者に知られた方法で遺伝子産物が確認できることをいう。また、「検出されない」とは、前記遺伝子産物の確認方法において遺伝子産物が確認できないことをいう。
【００３８】
また、本発明は、前記対象において、前記分子マーカーを指標として、がん幹細胞の有無を判定するか、または、がんにおけるがん幹細胞誘導度を判定する方法にも関する。「判定」は、本発明の分子マーカーが検出された場合にがん幹細胞があると判定され、判定する対象には正常細胞および／またはがん幹細胞でないがん細胞も含まれてよい。また、「がんにおけるがん幹細胞誘導度の判定」は、例えば、図１−Ｃに示されるように、がんのステージ分類（臨床進行期分類）に沿ってＰＲＤＭ１４タンパク質の発現レベルが亢進するため、同一個体の同一組織または器官由来の対象における経時的変化ががん幹細胞誘導度に対応する。ただし、乳がんでは、がんのステージ分類に沿ってＰＲＤＭ１４タンパク質の発現レベルが亢進しない場合もあり、それは、乳がんが、がんの背景にある性質、すなわち、トリプルマーカーであるエストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、ＨＥＲ２分子の組み合わせなどを基本に細分化されており、画一的に論じられないからである（生物学的背景が異なる集団）。また、それら分子と強い相関性がＰＲＤＭ１４にないことから、いままで既存の治療法が確立されていないトリプルネガティブ乳がん、他のカテゴリーとしても併用両方での生存率の改善が望めると推測される。一方、膵がんでは、がんのステージ分類と相関する。
【００３９】
判定は、インビボまたはインビトロでの判定であってもよい。本明細書において「インビトロでの判定」とは、生体から採取した組織または細胞を、例えば培養液など、生体外環境における生育を経た後に判定することをいう。それに対し「インビボでの判定」とは、生体内で直接判定すること、あるいは組織または細胞を生体から採取した後、すぐにもしくは固定化後に判定することをいう。組織または細胞の採取は、これに限定するものではないが例えば切開、細胞吸引、採血、採尿などで行う。判定をインビボで行う場合、当業者において公知のインビボ検出法を用いて行ってよい。インビボでの判定は、例えば血液検査、インサイチュハイブリダイゼーション、インサイチュＰＣＲ、免疫組織染色など、公知の検出法を用いて行ってよい。判定をインビトロで行う場合、これに限定するものではないが例えば免疫組織染色、ＲＴ−ＰＣＲなど、当業者間において公知のインビトロ検出法を用いて行ってよい。ＲＴ−ＰＣＲを行う場合、サイクル数は３０〜３５サイクルが好ましい。組織培養後の腫瘍組織での判定なども、インビトロでの判定に含まれる。
【００４０】
本発明の判定方法は、分子マーカーが、ＰＲＤＭ１４遺伝子産物またはその断片を含む場合、該遺伝子産物が、ｍＲＮＡであり、該遺伝子産物をＲＴ−ＰＣＲ法により検出する工程を含むことが好ましく、その検出の際にはプローブやプライマーなどのｍＲＮＡに特異的に結合する試薬が用いられる。
【００４１】
また、分子マーカーが、ＰＲＤＭ１４遺伝子産物またはその断片を含む場合、ＰＲＤＭ１４遺伝子産物が、ポリペプチドであり、該遺伝子産物を、該遺伝子産物と特異的に反応する試薬により検出する工程を含むことが好ましい。一方、分子マーカーが、液性因子を含む場合、該液性因子を、該液性因子と特異的に反応する試薬により検出する工程を含むことが好ましい。それらの検出の際には、抗体やリガンドなどのペプチドに特異的に結合する試薬が用いられる。例えば、抗体は、ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体が用いられ得る。
【００４２】
本発明は、がん幹細胞の有無を判定するためのキットであって、少なくとも前記分子マーカーを検出するための試薬を含むキットに関する。「検出するための試薬」として、例えば、ＰＲＤＭ１４遺伝子産物であるｍＲＮＡを検出するための、ＰＲＤＭ１４遺伝子に相補的な塩基配列を有するプローブおよび／またはプライマーであっても、ＰＲＤＭ１４遺伝子産物であるポリペプチドを検出するための抗体やリガンドであっても、液性因子であるポリペプチドを検出するための抗体であってもよい。「遺伝子に相補的な塩基配列を有するプローブおよび／またはプライマー」は、遺伝子配列の一部の配列に対して特異的に結合するように相補的な配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡであって、例えば蛍光標識、放射線標識などで随意に標識されていてよい。その他、キットには、反応用緩衝液、反応促進剤など、その使用態様に適した付随的な試薬が含まれ得る。
【００４３】
前記キットを用いてがん幹細胞の検出またはがん幹細胞の誘導を検出することにより、判対象ががんであるか否か、またはがんである場合その予後・経年後再発リスクおよびがんにおけるがん幹細胞誘導度の判定を判定する方法も本発明に包含される。
【００４４】
本発明はまた、がん幹細胞において、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を抑制するために用いられる核酸であって、ＰＲＤＭ１４遺伝子のｍＲＮＡへの転写やｍＲＮＡからタンパク質への翻訳といった過程において阻害作用を発揮する核酸が含まれ、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその一部であるペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を阻害する核酸を挙げることができる。ここで、前記「配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその一部であるペプチドをコードするポリヌクレオチド」はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【００４５】
かかる核酸は、好ましくはアンチセンス、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡからなる群から選択される１種または２種以上である。ｓｉＲＮＡは、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその一部であるペプチドをコードするポリヌクレオチドＲＮＡ（例えば、ＰＲＤＭ１４のｍＲＮＡ）からの連続する１８〜２８ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むものであることが好ましく、さらに、前記ポリヌクレオチドＲＮＡからの連続する１９〜２４ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むものであることが特に好ましい。好適なｓｉＲＮＡ配列の選択には、公知の知識を使用することができる（例えば、Dykxhoorn D.M.et al., Nature Rev. Mol. Cell Biol. 4; 457-67 (2003); Khvorova A et al., Cell, 115: 209-16 (2003)等を参照）。
【００４６】
本発明における好ましいｓｉＲＮＡ配列の例を以下の表２に示す。
【表２】
2015033381.tif 000004
【００４７】
本発明ではさらに、選択されたｓｉＲＮＡ配列は、標的ｍＲＮＡの切断を可能にする限り、その配列に１〜３個、好ましくは１〜２個までのヌクレオチドの欠失、置換もしくは付加を含むように変異していてもよい。変異は、中央から３’側での変異は失活の原因となりやすいので、５’側にあるのが好ましい。なお、選択されたｓｉＲＮＡは、臨床使用の際にいわゆるoff-target効果（使用したｓｉＲＮＡに部分的に相同性を有する標的遺伝子以外の遺伝子の発現を抑制する効果）を示さないものであることが好ましい。したがって、off-target効果を避けるために、候補ｓｉＲＮＡについて、予めジーンチップなどを利用して交差反応がないことを確認しておくことが望ましい。
【００４８】
本発明において用いることができるｓｈＲＮＡは、センス鎖配列およびそれに対するアンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列を含むものであり、細胞内ＲＮａｓｅであるDicerによってプロセシングされてｓｉＲＮＡが形成されるＲＮＡである。ｓｉＲＮＡをコードするヘアピン型ＤＮＡの３’末端には、転写停止シグナル配列として、あるいはオーバーハングのために、１〜６個、好ましくは１〜５個のＴからなるポリＴ配列、たとえば４個もしくは５個のＴからなるＴＴＴＴまたはＴＴＴＴＴが連結される。ベクターＤＮＡから転写されたｓｉＲＮＡ前駆体としてのｓｈＲＮＡは、そのアンチセンス鎖の３’末端に２〜４個のＵからなるオーバーハングを有することが望ましく、オーバーハングの存在によって、センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡはヌクレアーゼによる分解に対して安定性を増すことができる。本発明においては、前記一本鎖ループ配列は、公知のループ配列を適宜使用することが可能である。
【００４９】
本発明における他のｓｉＲＮＡの態様は、タンデム型ＤＮＡから形成されるものであり、これは前記センス鎖をコードするＤＮＡ配列と前記アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とを５’→３’方向に連続して含み、各鎖の５’末端にプロモーターが、また各鎖の３’末端にポリＴ配列が夫々連結された配列からなり、細胞内で転写後、同時に生成したセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとが一緒にハイブリダイズしてｓｉＲＮＡを形成する。ポリＴ配列は、上記と同様に、転写停止シグナル配列としての１〜５個、特に４〜５個のＴからなることが好ましい。また、ヘアピン型と同様に、生成するｓｉＲＮＡは、センスおよび／またはアンチセンス鎖の３’末端に２〜４個のＵからなるオーバーハングを有していてもよい。
【００５０】
また、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスＤＮＡは、例えば、適当なプロモーター配列の下流に組み込んでアンチセンスＲＮＡ発現ベクターとして対象に投与することが可能である。さらにまた、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスＲＮＡ発現ベクター、ｓｉＲＮＡ発現ベクター、ｓｈＲＮＡ発現ベクターを作製し、これらのベクターを対象に投与することができる。すなわち、本発明において、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現ベクター中に組み込まれ、適当なプロモーターの調節下でＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を特異的に阻害するＲＮＡに転写される。本発明で使用される発現ベクターには、プラスミドベクターおよびウイルスベクターが含まれる。
【００５１】
プラスミドベクターは、既知の方法を用いて調製することができ、また、市販のベクター、例えば、ｐｓｉＨＩＶ−Ｕ６（ＰＲＤＭ１４遺伝子に対するレンチウイルスｓｈＲＮＡ発現ベクターのバックボーン；ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社）、ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｌｖ１０２（ＰＲＤＭ１４遺伝子のレンチウイルス発現ベクターＥＸ−Ｗ１０８９−Ｌｖ１０２のバックボーン；ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社）、ｐｉＧＥＮＥ（登録商標）Ｕ６ベクター、ｐｉＧＥＮＥ（登録商標）Ｈ１ベクター、ｐｉＧＥＮＥ（登録商標）ｔＲＮＡベクター（タカラバイオ株式会社）等を利用することもできる（Brummelkamp T.R.et al., Science, 296:550-3, 2002; Lee N.S.et al., Nature Biotechnology, 20: 500-5, 2002; M.Miyagishi et al., Nature Biotechnology, 20: 497-500, 2002; Paul C.P.et al., Nature Biotechnology, 20: 505-8, 2002; 多比良和誠ら編, RNAi実験プロトコール, 羊土社, 2003年等参照）。
【００５２】
プラスミドベクターは一般に、本発明のアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列およびプロモーターの他に、薬剤耐性遺伝子、転写停止配列、制限酵素切断部位、複製開始点などを含むことができる。
【００５３】
また、ウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどを使用することができる。ウイルスベクターは、自己複製能を欠損するように改変されているものであることが好ましい。ウイルスベクターの作製方法は、当業者に既知である。上記ウイルスベクターは、患部にベクターを直接注入し細胞に感染させることによって細胞内に遺伝子導入することができる。
【００５４】
本発明は、前記核酸を含む医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物は、好ましくはさらに抗がん剤やがんワクチンを含み、必要に応じて、例えば抗腫瘍作用を有する薬剤、補助剤、薬学的に許容し得る担体（例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射剤用溶剤等）などを適宜含むことができる。かかる医薬組成物は、好ましくはがん治療用またはがん予防用である。また、本発明の医薬組成物は、特異的に標的組織へ送達させることを可能にする標識やナノカプセル等を含有してもよい。
【００５５】
「抗がん剤」としては、各種がんの治療に有効な公知の抗がん剤、例えば、アドリアマイシン（ＡＤＲ）、ゲムシタビン（ＧＥＭ）、フルオロウラシル、タモキシフェン、アナストロゾール、アクラルビシン、ドキソルビシン（ＤＯＣ）、テガフール、シクロホスファミド、イリノテカン、シタラビン、パクリタキセル、ドセタキセル、エピルビシン、カルボプラチン、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、チオテパ、またはこれらの医薬上許容される塩などが挙げられる。
【００５６】
本発明の医薬組成物の投与経路としては、例えば、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、局所投与等）が挙げられ、投与剤形としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、懸濁剤等が例示される。例えば、局所投与の場合、外科手術にて患部を露出し、癌組織に注射器等の手段で本発明の治療薬を直接投与することができ、また、非局所投与の場合、至適なＤＤＳ剤を使用することで簡便な静脈投与の経路により（腫瘍栄養血管内投与により）行うことができる。好ましい投与経路は、静脈投与および局所投与である。
【００５７】
投与量および投与回数は、目的とする作用効果、投与方法、治療期間、生物個体の年齢、体重、性別等により異なるが、ＰＲＤＭ１４遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはこれらを発現するベクターを利用する場合の投与量は、生物個体がヒトである場合には成人１日当たり通常０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲から適宜選択でき、投与回数は、１日１回から数回の範囲から適宜選択できる。但し、投与量は、種々の条件により変動し得るため、上記範囲に限定されない。
【００５８】
さらに、本発明は、前記核酸を使用して、がん幹細胞の機能を阻害する方法に関する。本発明の分子マーカーとしても機能する核酸は、がん幹細胞に特異的に発現するｍＲＮＡの一部または全部と相補的な配列を有し、その発現を抑制することで、がん幹細胞の有する機能を抑制することができると考えられる。よって、本発明の分子マーカーとして機能するＤＮＡの発現を抑制するための核酸もまた、本発明に含まれる。
【００５９】
発現を抑制する方法としては、これらに限定されるものではないが、例えばＲＮＡｉ、リプレッサーの発現などが挙げられる。核酸は、ＤＮＡの発現を抑制するのに十分な塩基数があれば、いかなる長さであってもよい。
【００６０】
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡの他に、核酸アナログであってもよいが、汎用性などの観点から、好ましくはＤＮＡおよび／またはＲＮＡである。
本発明の分子マーカーとして機能するＤＮＡの発現を抑制することによって、がん幹細胞を特異的におよび／または効率よく攻撃できる可能性を示唆する。すなわち、上記の核酸は遺伝子導入治療に応用できることが示唆される。
【００６１】
ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを用いる場合、公知の方法によって製剤化し、生物個体に投与することができる。例えば、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、標的組織に直接導入することが可能であり、このような場合には、それらを、例えば、リポフェクタミン（登録商標）、リポフェクチン（登録商標）およびセルフェクチン（登録商標）（Invitrogen）等のリポソームやイオンコンプレックス（特開2011-010549号公報、特開2010-233499号公報、WO2009/113645、WO2008/062909）などと複合体を形成させて注入することもできる。
【００６２】
以下の実験例は本発明について、さらに具体的に説明するものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。当業者として通常の知識および技術を有するものは、本発明の精神を逸脱しない範囲で、下記実験例で示された態様に多様な改変を行うことができるが、かかる改変された態様も本発明に含まれる。
【実施例】
【００６３】
＜実施例１＞遺伝子発現解析
（１）がん患者検体におけるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現（図１−Ａ）
ＰＲＤＭ１４の悪性腫瘍における遺伝子発現プロファイルを調べるため、乳がん（正常組織：４、腫瘍組織：２４）、肺がん（正常組織：４、腫瘍組織：１９）、食道がん（正常組織：３、腫瘍組織：１８）、胃がん（正常組織：５、腫瘍組織：１４）、大腸がん（正常組織：７、腫瘍組織：１３）、肝臓がん（正常組織：３、腫瘍組織：１７）、膵臓がん（正常組織：５、腫瘍組織：１７）、子宮頸部がん（正常組織：４、腫瘍組織：９）、子宮体部がん（正常組織：５、腫瘍組織：１７）、卵巣がん（正常組織：３、腫瘍組織：２１）、腎臓がん（正常組織：５、腫瘍組織：１８）、前立腺がん（正常組織：５、腫瘍組織：２１）、膀胱がん（正常組織：２、腫瘍組織：２２）、精巣腫瘍（正常組織：６、腫瘍組織：１９）、甲状腺がん（正常組織：３、腫瘍組織：１８）、副腎がん（正常組織：５、腫瘍組織：１０）、リンパ腫（正常組織：３、腫瘍組織：３４）、から得た全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、サイバーグリーン(cybr green)法を用いた比較ΔＣｔ(delta/delta Ct)法により、ＶｉｉＡ７リアルタイム(real-time)ＰＣＲ解析装置（Lifetechnology）を用いてＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を解析した。内部標準としてはβ−アクチン遺伝子を用いた。
【００６４】
乳がん、肺がん、食道がん、膵臓がん、子宮頸部がん、卵巣がん、腎がん、尿路系腫瘍、精巣腫瘍において、ｍＲＮＡレベルで、ＰＲＤＭ１４発現が上昇していた。特に、乳がん、肺がん、膵がん、卵巣がん、腎がん、膀胱がん、精巣腫瘍での上昇が顕著だった。これらの上昇が顕著だったがん組織において、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現により、がん細胞ががん幹細胞に誘導される度合いも高いものと容易に推測されるものの、がん幹細胞はがん組織にわずかしか含まれていないため、正常部分、腫瘍部分での発現レベルが逆転しているがん組織があっても不思議なことではない。
【００６５】
（２）乳がん患者検体におけるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現（図１−Ｂ）
前記（１）とは別にＰＲＤＭ１４の乳がんにおける遺伝子発現プロファイルを調べるため、浸潤性乳がん１７７症例の乳がん組織、５症例の正常乳腺組織から得た全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成しサイバーグリーン法を用いた比較ΔＣｔ法により、ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲ解析装置（Lifetechnology）を用いてＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を解析した。内部標準としてはβ−アクチン遺伝子を用いた。
正常乳腺に比較して１４８／１７７症例の乳がんで発現の上昇を認めた。
また、図６に示すように、ＰＲＤＭ１４陽性の乳がん症例は、ＰＲＤＭ１４陰性の乳がん症例と比較して予後が不良であることがわかった。
【００６６】
［ｑＲＴ−ＰＣＲ反応に関して］
ＰＲＤＭ１４およびβ−アクチンに対するプライマーは、いずれもOrigene社から購入し、夫々ｈＰＲＤＭ１４がOrigeneのHK205840、β−アクチンがOrigeneのHP204660、ＧＡＰＤＨがOrigeneのHP205798を使用した。
ＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡ５μＬ、2×Power SYBR（登録商標）PCR Master Mix （Life Technologies）１２．５μＬ、プライマー（１０μＭ）１μＬおよび水６．５μＬを含む合計２５μＬの溶液により、９６℃５秒、６０℃１５秒、４０サイクルで行った。実験結果は、β−アクチン遺伝子の発現量に対するＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量の比（すなわち、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量／β−アクチン遺伝子の発現量）について、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を表した。
【００６７】
（３）腫瘍細胞株におけるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現解析（図１−Ｄ(a)(b)）
臨床症例で発現が亢進しており、また、がん幹細胞の関与が濃厚とされる乳がん、膵臓がんに由来する細胞株を用いてＰＲＤＭ１４遺伝子の発現解析を行った。乳がん細胞株であるＢＴ４７４、ＢＴ５４９、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＣＣ１９３７、ＳＫＢｒ−３およびＴ−４７Ｄ、膵臓がん細胞株であるＰＫ−１、Ｐａｎｃ−１およびＢｘＰＣ−３ならびに、乳腺細胞株（非腫瘍性）であるＭＣＦ１０Ａからも同様にして全ＲＮＡを抽出した。これらから得られた全ＲＮＡを用いて前記（１）（２）と同様にリアルタイムＰＣＲ法によりＰＲＤＭ１４の遺伝子発現を解析した。内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量に対するＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量の比（すなわち、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現量／ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量）により、各サンプルにおけるＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を図１−Ｄ(a)(b)に示す（各サンプルにつき３回ずつ実験を行った）。
【００６８】
＜実施例２＞免疫染色法・ウェスタンブロット法によるＰＲＤＭ１４タンパク質の検出
日本人乳がん患者１６１人（ステージ(stage)０：２０例、ステージＩ：４２例、ステージＩＩ：５０例、ステージＩＩＩ：３８例、ステージＩＶ：１１例）から得られた手術検体がん組織をホルマリンにより固定して定法によりパラフィン切片を作製し、また、膵臓がん患者より得られた手術検体（ステージＩＩ：９例、ステージＩＩＩ：１４７例、ステージＩＶ：１３例）により作製されたTissue Microarray（Biomax US、Accumax）１６９検体分に対して、１次抗体として抗ＰＲＤＭ１４抗体（ABGENT社、AP1214A、５０倍）を用いて４℃で一晩インキュベーション後、２次抗体としてストレプトアビジン標識ヤギ抗ウサギ抗体（DAKO社）を用いてインキュベーションを行い、EnVision-Plus（DAKO社）を用いて免疫染色を行った。上記症例の正常部分の組織をコントロールに用いた。また、核染色はヘマトキシリンを用いて行った。
【００６９】
結果を図１−Ｃに示す（倍率は４００倍）。ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現が上昇している症例では、ＰＲＤＭ１４の発現も上昇していることが確認され、遺伝子発現の増加によりタンパク質の発現増加が引き起こされている。
また、ウェスタンブロット法によりがん細胞株のＰＲＤＭ１４遺伝子産物の発現を確認した（図１−Ｄ(c)）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、５％ＢＳＡでブロッキングを行い、１次抗体として抗ＰＲＤＭ１４抗体（ミリポア社、#AB4350、１０００倍）を用いて４℃で一晩インキュベーション後、ＨＲＰ標識２次抗体（抗ウサギ抗体：GE、NA9340-1ML）により定法に従い、ＰＲＤＭ１４遺伝子産物の発現を検出した。
【００７０】
＜実施例３＞細胞増殖におけるＰＲＤＭ１４の関与
ＰＲＤＭ１４のがん化における役割を明らかにする目的で、乳がん細胞株にＰＲＤＭ１４遺伝子を導入した場合の細胞増殖について検討した。
ＰＲＤＭ１４遺伝子のレンチウイルス発現ベクターEX-W1089-Lv102（GeneCopoeia）を使用した。同ベクターを乳がん細胞株である発現が極めて低いＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、中程度の発現のあるＨＣＣ１９３７細胞、発現の高いＭＣＦ７細胞、および、発現がない非がん細胞であるＭＣＦ１０Ａ細胞にレンチウイルス法により遺伝子導入し、コンストラクトが導入された細胞を薬剤マーカーPuromycinにより選別を行い、ｍＲＮＡを前記リアルタイムＰＣＲ法で、タンパク発現をＦＬＡＧタグにて検出して導入を確認した（図１−Ｆ(a)）。
【００７１】
また、同様に中程度の発現のあるＨＣＣ１９３７細胞、発現の高いＭＣＦ７細胞を対象にＰＲＤＭ１４遺伝子に対するレンチウイルスｓｈＲＮＡ発現ベクター（psiHIV-U6）を導入し、コンストラクトが導入された細胞を薬剤マーカーPuromycinにより選別を行い、さらに、ＥＧＦＰによりセルソーターであるFACS Aria（BD）により複数回ソーティングを行った。最終的にｍＲＮＡを前記リアルタイムＰＣＲ法（図１−Ｆ(c)(d)）で、タンパク発現を前記ウェスタンブロット法（抗PRDM14抗体（ミリポア社、#AB4350））にて検出して遺伝子のノックダウン効率を確認した。使用したｃｎｔｌ  ｓｈ、ｓｈＲＮＡ＃１〜４は、いずれもGenecopoeia社製であり、配列等を下表に示す。
【表３】
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【００７２】
遺伝子導入株を用いて、ＭＴＴ法により細胞のバイアビリティ(viability)を測定し、さらに、コロニー形成能を解析した。定常発現株を培養皿へ細胞を播種し３週間後、細胞をメタノールにより固定して、ギムザ液にて染色し、コロニー数を測定した。コントロールとしてバックボーンとなっている発現ベクターのみを導入した細胞を用い、コロニー形成能を比較した。
結果を図２−Ａ、図２−Ｊに示す。
【００７３】
＜実施例４＞ＰＲＤＭ１４を治療標的する上での乳がん細胞の増殖への影響
ＰＲＤＭ１４の治療標的への応用が可能か否か詳細に解析するため、乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＣ１９３７、ＭＣＦ７をＰＲＤＭ１４遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入して、抗腫瘍効果を呈するかどうか、さらに、抗癌剤の併用によるＰＲＤＭ１４遺伝子に対するｓｉＲＮＡの作用を検討した。
【００７４】
ＰＲＤＭ１４遺伝子に対するｓｉＲＮＡをインシリコのプログラムにより７種類選択し、それらの遺伝子発現抑制効果を上記３種の乳がん細胞にｓｉＲＮＡで処理し、７２時間後に定法に従い全ＲＮＡを抽出し、前記ｑＲＴ−ＰＣＲ法で検討したところ、それらの乳がん細胞で共通して効果を発揮した配列がｓｉＲＮＡ＃２、ｓｉＲＮＡ＃３、ｓｉＲＮＡ＃５の３配列であった（図２−Ｋ）。
このうち、３−ＵＴＲの配列に対するｓｉＲＮＡ＃５を除いた。これは、多くの腫瘍で３−ＵＴＲ配列が短縮化される現象が知られており、内因性のｍｉＲＮＡの作用を受けなくなることが報告されているためである。遺伝子のコード領域に対するｓｉＲＮＡ＃２、ｓｉＲＮＡ＃３を使用することとした（それらの配列を表２に示す）。なお、対照ｓｉＲＮＡは、（株）RNAi製、「万能ネガコン」）を使用した。
【００７５】
がん細胞をプレートに播種する際にＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Lifetechnologies）を用いて、リバーストランスフェクション(reverse transfection)法により、上記ｓｉＲＮＡ（５ｎＭ）を細胞に導入した。２４時間後に培地を通常培地に交換し、７２時間後、各種アッセイに供した。抗がん剤との併用においては、４８時間後にシスプラチン（ＣＤＤＰ）（２５μＭ）、アドリアマイシン（１μＭ）、ドセタキセル（０．５μＭ）となるように培地に添加し、７２時間後、ＭＴＴ法により細胞の生存率を測定した。結果を図２−Ｂに示す。
【００７６】
ＰＲＤＭ１４遺伝子発現を低濃度のｓｉＲＮＡにより一過性に発現を低下させた細胞株においては、コントロール細胞に比べ、細胞の生存率が低下した。さらに、一般的に培養細胞系に使用されるより低濃度の抗がん剤を短時間併用したところ、細胞の生存率が相乗的に低下した。したがって、ＰＲＤＭ１４の発現は、抗癌剤感受性の低下に関与することが示唆される（図２−Ｂ）。
【００７７】
＜実施例５＞ＰＲＤＭ１４を治療標的する上での膵臓がん細胞の増殖への影響
実施例４と同じ手法により、実施例１（３）で使用した３種類の膵臓がん細胞株を用いて同様の実験を行った。その際、予めゲムシタビン塩酸塩溶液によりおよそ半数の細胞が生存するゲムシタビン濃度を求めた。ＰＲＤＭ１４に対するｓｉＲＮＡを用い、ＰＲＤＭ１４を過剰発現する３種類の膵臓がん細胞株においてＰＲＤＭ１４遺伝子のノックダウンを行い、ゲムシタビン塩酸塩溶液を併用する場合、夫々、終濃度が１０μＭ、５μＭ、５μＭとなるように添加した。この結果、乳がん細胞株で認められたのと同様に、ＰＲＤＭ１４遺伝子発現を低濃度のｓｉＲＮＡにより一過性に発現を低下させた細胞株においては、コントロール細胞に比べ、細胞の生存率が低下した。さらに、ゲムシタビン塩酸塩溶液を短時間併用したところ、細胞の生存率が相乗的に低下した。したがって、ＰＲＤＭ１４の発現は、膵臓がん細胞においても抗癌剤感受性の低下に関与することが示唆される（図２−Ｃ）。
【００７８】
＜実施例６＞がん細胞のＳＰ画分の解析：
がん幹細胞は、ヘキスト蛍光色素（Hoechst33342）で染色し、フローサイトメトリーを利用してＵＶレーザー（波長約３５０ｎｍ）を励起光に用いて検出すると、Side Population（ＳＰ）画分に濃縮される。ＳＰ画分とは、ヘキスト蛍光色素によって染色されるMain Population（ＭＰ）画分に対して、ＡＢＣトランスポーターなどを介して色素を細胞外に排出することで染色されない画分のことをさす。
【００７９】
（ｉ）試薬の調製
培地は５％の抗ウシ胎児血清（ＦＣＳ）入りＤＭＥＭ培地を調整し、３７℃に温めておいた。ベラパミルは５０ｍＭに調整し、５％ＦＣＳ＋ＤＭＥＭで、５ｍＭに希釈した。ヘキスト33342は５％ＦＣＳ＋ＤＭＥＭで２５０μｇ／ｍＬに調整した。
【００８０】
（ｉｉ）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）用の細胞の調製
細胞を４ｍＬの５％ＦＣＳ＋ＤＭＥＭで懸濁し、細胞数を数えた。さらに５％ＦＣＳ＋ＤＭＥＭを加えて細胞濃度を１×１０６個／ｍｌに調整し、ベラパミル（＋）用に１ｍＬをファルコンチューブに採取した。ベラパミル（＋）用および残りの細胞（ベラパミル（−）用）を３７℃で１０分間、ウォーターバスでインキュベートした。インキュベート後、ベラパミル（＋）用にはベラパミルの最終濃度が５０μＭになるようにベラパミル溶液を加え、その後ベラパミル（＋）用およびベラパミル（−）用に、ヘキスト33342の最終濃度が２．５μＭ〜５．０μＭとなるようにヘキスト33342溶液を加えた。
【００８１】
３７℃で９０分間振とうインキュベートし、すぐに氷上で冷却した。８００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離して上清を取り除いた。１×ＰＢＳ＋５％ＦＣＳ液で懸濁して、氷冷しておいたＦＡＣＳチューブに移した。再び８００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離して上清を取り除き、１×ＰＢＳ＋５％ＦＣＳ液で懸濁した。再度、同様に遠心分離して上清を取り除き、１×ＰＢＳ＋５％ＦＣＳにＥＤＴＡを最終濃度２ｍＭとなるように加えたもの５００μＬで懸濁した。ピペッティングし、ＦＡＣＳ用セルストレイナーに通した。１ｍｇ／ｍＬのプロピジウム・アイオダイド（ＰＩ）を０．５μＬ加え、流動速度を１０００個／秒でＦＡＣＳにかけた。
【００８２】
（ｉｉｉ）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）
フローサイトメーターはBD FACS Aria（BD社製）を用いた。ＦＡＣＳの操作は取扱説明書にしたがって行った。最初にベラパミル（−）の細胞を流してＳＰ画分の細胞が検出できるかを確認し、確認できたらＳＰ画分にゲートをかけてベラパミル（＋）の細胞を流してＳＰ画分の細胞が消えているかを確認した。消えていればその画分の細胞はＳＰ画分細胞であると断定し、その画分の細胞数、割合をFlowJoソフトウェア（トミーデジタルバイオロジー）で解析した。
【００８３】
ＰＲＤＭ１４遺伝子のノックダウンによるＳＰ画分を解析する目的で、前記ｓｉＲＮＡ＃２、ｓｉＲＮＡ＃３を乳がん細胞株ＭＣＦ７、ＨＣＣ１９３７細胞（図２−Ｅ）、実施例１（３）で用いた３種類の膵臓がん細胞株（図２−Ｆ）、さらに、腎臓がん細胞株ＣａＫｉ−１細胞（図９）に導入してから７２時間後に上記の方法でＳＰ画分の解析を行った。それとは別に、前記方法で作製したＰＲＤＭ１４遺伝子の定常発現株、ならびにｓｈＲＮＡベクターで定常的に遺伝子発現を低下させた乳がん細胞でも同様に解析を施行した（図２−Ｍ）。図２−Ｌにおいて、レセルピンはＳＰ画分を消失させるために使用した。
【００８４】
がん細胞をプレートに播種する際にＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Lifetechnologies）を用いて、リバーストランスフェクション法により、上記ｓｉＲＮＡ（５ｎＭ）を細胞に導入した。２４時間後に培地を通常培地に交換し、７２時間後、各種アッセイに供した（図２−Ｅ、Ｆ）。
抗がん剤との併用においては、４８時間後にアドリアマイシン（１μＭ）、もしくは、ゲムシタビン塩酸塩溶液（５μＭ）を添加し、７２時間後に解析を行った。
【００８５】
＜実施例７＞がん細胞のアポトーシスの解析
早期アポトーシスを検出できるアネキシン(Annexin)Ｖと後期のアポトーシスを検出するＰＩ（ヨウ化プロピジウム）により対象のがん細胞を染色した。
冷ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、〜１×１０６個／ｍＬの細胞濃度になるように１×Binding bufferに再浮遊した。５ｍＬのFalconチューブに１００μＬの細胞浮遊液（〜１×１０５個）を加え、各試験管にＦＩＴＣ標識アネキシンＶ試薬（５μＬ）とＰＩ（２μＬ）とを加えた。試験管を緩やかに混和し、室温、暗所で１５分間インキュベーションし、各試験管に１×Binding bufferを４００μＬ加え、１時間以内にフローサイトメーターで測定した。
【００８６】
がん細胞をプレートに播種する際にＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Lifetechnologies）を用いて、リバーストランスフェクション法により、前記ｓｉＲＮＡ（５ｎＭ）を細胞に導入した。２４時間後に培地を通常培地に交換し、７２時間後、各種アッセイに供した（図２−Ｇ、Ｈ）。
抗がん剤との併用においては、４８時間後にアドリアマイシン（１μＭ）、もしくは、ゲムシタビン塩酸塩溶液（５μＭ）を添加し、７２時間後に解析を行った（図２−Ｎ、Ｏ）。
【００８７】
＜実施例８＞がん細胞によるｔｕｍｏｒ  ｓｐｈｅｒｅアッセイ：
スフィアアッセイ（Sphere assay）を、乳がん細胞株を用いて行った。プレート表面を特殊加工して上皮細胞が接着しないUltra-Low Attachment 6 well plate（Corning）を用いて、血清無添加培地（F12 medium）２５ｍＬに対して、上皮細胞成長因子（epidermal growth factor：ＥＧＦ）２０ｎｇ／ｍＬおよび塩基性線維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor：ｂＦＧＦ）２０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、さらに、B27 supplement（Life Technologies）０．５ｍＬを加えて、２週間培養して球状のコロニーが形成されるかどうかを調べた。
【００８８】
その結果、ＰＲＤＭ１４遺伝子を導入された乳がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＣ１９３７）のスフィア形成能が亢進とするとともに、幹細胞性マーカーの上昇を認めた。具体的には、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４に対する蛍光抗体（R&D Systems、Human Embryonic Stem Cell、SC008）をプロトコールに従い、形成されたスフィアを免疫染色し、共焦点顕微鏡で観察した。Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４のタンパクレベルでの発現亢進が認められた（図２−Ｉ）。
【００８９】
＜実施例９＞ＰＲＤＭ１４遺伝子による幹細胞性を担う遺伝子の発現変動
以上から、腫瘍細胞にＰＲＤＭ１４遺伝子を導入することによりＳＰ画分が増加し、アポトーシスに耐性となり、さらにスフィア形成能の亢進が認められた。また、発現を抑制することにより、ＳＰ画分が減少し、アポトーシス感受性となり、最終的に薬剤感受性が亢進することがわかった。
そこで、ＰＲＤＭ１４遺伝子により制御される遺伝子を同定するために、ＰＲＤＭ１４遺伝子を導入した乳がん細胞株（ＭＣＦ７、ＨＣＣ１９３７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ１０Ａ）より抽出したｔＲＮＡを用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法をベースとしたRT2 Profiler PCR Arrays（QIAGEN）を実施した。具体的には、そのうちのアポトーシス関連分子、薬剤耐性関連分子、幹細胞関連転写因子のパネルを実施した。その結果の一部を以下に示す（表４）。
【００９０】
【表４】
2015033381.tif 000006
【００９１】
また、標的遺伝子の一部に関してＰＲＤＭ１４遺伝子産物の直接的な転写制御であるかどうか検証するために、ＣｈＩＰアッセイを実施した。具体的には、乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＣ１９３７細胞にＨａｌｏタグとＰＲＤＭ１４の融合タンパク質を発現させる目的で、レンチウイルスベクターＥＸ−Ｗ１０８９−Ｌｖ１１０（GeneCopoeia）をそれらの細胞に導入し、puromysinで選択後、ウェスタンブロット法でＨａｌｏタグを検出することで陽性細胞を選別した。それらの細胞を用いて、HaloCHIP（商標）System（Promega）のプロトコールに従い、ＰＲＤＭ１４遺伝子産物が結合するゲノムＤＮＡの断片を免疫沈降して得た。それらのＤＮＡ断片をテンプレートとして、定量的ＰＣＲを行った（ｑ−ＣｈＩＰ−ＰＣＲ法）。使用したプライマーは、EpiTect ChIP qPCR Primer Assay For Human NANOG（QIAGEN；NM_024865.2(-)05Kb：GPH1002937(-)05A）、EpiTect ChIP qPCR Primer Assay For Human POU5F1（QIAGEN；NM_002701.4 (-)06Kb：GPH1024787(-)06A）、EpiTect ChIP qPCR Primer Assay For Human POU5F1（QIAGEN；NM_002701.4 (-)03Kb：GPH1024787(-)03A）を使用して解析した。コントロールは、ChIP-qPCR Human IGX1A Negative Control（QIAGEN）を使用した。その結果を図３−Ａに示す。
【００９２】
＜実施例１０＞ＰＲＤＭ１４遺伝子により変動する液性因子の同定
ＰＲＤＭ１４遺伝子産物はＲＴ−ＰＣＲ法、ウェスタンブロット法、免疫組織学的手法で検出が可能であるが、生検組織が必要であることから、コンパニオンマーカーとして血清診断が可能な液性因子の同定が必要とされる。同時にインビトロ培養系ではＰＲＤＭ１４遺伝子の導入に伴う細胞増殖の変化が僅少である一方、インビボ実験系でヌードマウスの乳腺に遺伝子導入腫瘍細胞株を同所移植すると、ＰＲＤＭ１４遺伝子導入腫瘍細胞株の腫瘍の成長が著しく促され、リンパ節転移を生じる現象を確認していた。そこで、ＰＲＤＭ１４遺伝子導入腫瘍細胞株の培養上清中に分泌されるサイトカイン、ケモカインを網羅的に測定することとした。
【００９３】
そのため、Luminex200システム（Luminex社Luminexシステム、ＭＡＰ（Multiple Analyte Profiling）テクノロジーを基盤とする技術）で解析した。ターゲットタンパク質に特異的結合する抗体と結合したLuminex（登録商標）ビーズを液相でターゲット抗原に反応させ、このビーズは蛍光色素で着色されており最大１００種類の抗体を区別することが可能であり、さらに、抗原タンパク質に対する別の抗体と蛍光標識（ビオチン化二次抗体とストレプトアビジン−ＰＥ）した二次抗体を反応させ、ビーズ−抗体−ターゲットタンパク質複合体を形成させる。フローサイトメトリーによってLuminex（登録商標）ビーズを１粒ずつ流しながら、赤色レーザとAPDセンサでビーズの直径と色を測定し、緑色レーザと光電子増倍管でビーズ表面の蛍光量を測定する。このことにより、サンプル中の解析対象である各抗原を同時に定量することが可能である。計測後、標準溶液の蛍光強度とタンパク質濃度から標準曲線を作成し、複数のターゲットタンパク質について濃度を関数式から換算する。今回は、下表に示す４１種類のサイトカイン、ケモカインを網羅的に測定した。
【００９４】
【表５】
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【００９５】
【表６】
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【００９６】
【表７】
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【００９７】
【表８】
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【００９８】
このうち、再現性があったＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５（R&D）、ＣＸＣＲ１（R&D）、ＣＸＣＲ２（USCN）、ＣＸＣＲ３（USCN）、ＣＤ４０Ｌ（R&D）に関してＥＬＩＳＡ法にてＰＲＤＭ１４遺伝子導入腫瘍細胞株の培養上清中に分泌されるサイトカイン、ケモカインを３回反復して定量化実験を行った（図３−Ｂ、Ｃ）。
【００９９】
＜実施例１１＞同所移植モデルを用いた腫瘍形成能実験
前記実施例で作製したＰＲＤＭ１４遺伝子発現腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＣ１９３７）をヌードマウスに接種して腫瘍形成能を確認した。
１×１０６個のＰＲＤＭ１４遺伝子発現腫瘍細胞を氷上で１００μＬの１×ＰＢＳに懸濁し、１００μＬのマトリゲル（BD）に混ぜた。１００μＬの細胞マトリゲル混合液をｎｕ／ｎｕマウス（日本クレア社から入手）の乳腺(fat pad)に同所性接種し、腫瘍を形成し始めたら長径・短径の長さを測り、回転楕円体に近似して体積を算出して比較した。結果を図４−Ａに示す。
さらに、前記実施例で作製したｓｈＲＮＡベクターでＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を抑制した腫瘍細胞（乳がん細胞株ＨＣＣ１９３７由来および膵臓がん細胞株ＰＫ−１由来）を同様の手法で同所性接種し、腫瘍の長径・短径の長さを測り、回転楕円体に近似して体積を算出して比較した。夫々の結果を図４−Ｄおよび図７−Ａに示す。さらに、ＰＫ−１由来については、さらにin vivoで経過を追い、エンドポイントで摘出したマウス皮下腫瘍像を図７−Ｂに示し、その腫瘍重量を図７−Ｃに示し、その病理組織像（ＨＥ染色）を図７−Ｄに示す。
【０１００】
その結果、（ｉ）ｓｈＲＮＡベクターでＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を抑制した場合、ほとんど腫瘍が形成されない、さらに、（ｉｉ）ＰＲＤＭ１４遺伝子の導入によりＳＰ画分細胞が増加し、（ｉｉｉ）逆に同遺伝子を抑制するとＳＰ画分細胞が減少することから、ＰＲＤＭ１４遺伝子産物が、がん幹細胞の腫瘍形成の大きな要因と考えられる。
安楽死後、マウスを剖検し腫瘍重量、リンパ節転移、肺転移を検証し、ＰＲＤＭ１４遺伝子の導入された腫瘍株では腫瘍が重く、リンパ節転移、肺への微小転移が対照に比較して多い結果であった。得られた腫瘍組織に対して、凍結切片を作製し、断片化カスパーゼ−３(Cleaved Caspase-3)抗体（Cell Signaling：SA1E、#9664）、抗ＣＤ３１抗体（BD：#55027）で免疫組織学的検討を行ったところ、ＰＲＤＭ１４遺伝子を導入したがん細胞で形成される腫瘍塊ではアポトーシスに陥る細胞がほとんど皆無であり、腫瘍血管の密度が高いことが判明した（図４−Ｉ）。
【０１０１】
＜実施例１２＞肺転移モデル実験
ｎｕ／ｎｕマウスの尾静脈より肺転移巣を形成することが判明しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いた。具体的には、ＰＲＤＭ１４遺伝子発現腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）と対照の腫瘍細胞（ＰＲＤＭ１４発現ベクターのバックボーンを導入した腫瘍細胞）をヌードマウスの尾静脈より１×１０６個の細胞をマウス１匹あたり静脈注射した。１ケ月後に安楽死させ肺転移巣を確認した。その結果、ＰＲＤＭ１４導入株では大きな転移巣を認めた。一方、コントロールでは数個の微小転移を認めるのみであった（図４−Ｅ、Ｆ）。
【０１０２】
＜実施例１３＞同所性移植片・肺転移巣に対する局所治療モデルの作製
実施例１１と同様にＰＲＤＭ１４遺伝子を発現しており、ヌードマウスに腫瘍を形成することが判明しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、およびＨＣＣ１９３７細胞（ともに野生型であって遺伝子導入株ではない）をヌードマウスに同所移植し、一定の腫瘍径になった段階でｓｉＲＮＡ、および既存の抗がん剤との併用で治療開始するモデルを作製した。ｓｉＲＮＡの投与量は、ｓｉＲＮＡの特異的な治療効果があると判断される極めて低濃度である１ｍｇ／マウス体重（ｋｇ）とし、市販されているインビボ用のドラッグデリバリーシステムであるＰＥＩ（in vivo jet PEI：ポリプラストランスフェクション社）を使用してプロトコールに従い調製し、３回／週で腫瘍内に直接注入した。一方、抗がん剤に関しては、抗がん剤投与群に対してアドリアマイシン（１ｍｇ／マウス体重（ｋｇ））、もしくは、ドセタキセル（５ｍｇ／マウス体重（ｋｇ））を週１回腹腔内に投与した。その結果、ＰＲＤＭ１４遺伝子のｓｉＲＮＡ単独でも腫瘍の極小効果、上記抗がん剤の併用で相乗的に腫瘍の極小効果が得られた（図５−Ａ〜Ｄ）。
【０１０３】
さらに、転移巣への効果を確認する目的で肺転移を形成しやすいＭＤＡ−ＭＢ−２３１を尾静脈より１×１０６個の細胞をマウス１匹あたり静脈注射した。注入１週間後より、前記in vivo jet PEIの静脈投与プロトコールに従い、ＰＲＤＭ１４遺伝子に対するｓｉＲＮＡとＤＤＳ（ＰＥＩ）の合剤を静脈注射で投与した。投与開始後、１ケ月後に安楽死させ肺転移巣を確認した。ｓｉＲＮＡ＃２では効果が乏しいが、ｓｉＲＮＡ＃３では転移巣をほぼ認めない結果であり、肺の重量も有意差を以て小さい結果となった（図５−Ｅ、Ｆ）。
【０１０４】
＜実施例１４＞同所性移植片に対する静脈投与治療モデルの作製
ＰＲＤＭ１４遺伝子を発現しており、ヌードマウスに腫瘍を形成するＨＣＣ１９３７細胞を同所移植し、一定の腫瘍径を超えた後、治療用核酸と東京大学片岡研究室で開発されたＤＤＳ剤（カルシウムリン酸ミセル）を混合し、合剤としてマウスの尾静脈より静注する治療モデルを作成した。具体的には、１×１０６個のＨＣＣ１９３７細胞を氷上で１００μＬの１×ＰＢＳに懸濁し、１００μＬのマトリゲル（ＢＤ）に混ぜた。１００μＬの細胞マトリゲル混合液をｎｕ／ｎｕマウス（日本クレア社から入手）の乳腺(fat pad)に同所性接種し、腫瘍を形成し始めたら長径・短径の長さを測り、回転楕円体に近似して体積を算出して比較した。核酸の投与は、前記実施例と同じく１ｍｇ／マウス体重（ｋｇ）とし、東京大学片岡研究室で開発されたＤＤＳ剤（カルシウムリン酸ミセル）を混合して調製し、３回／週で腫瘍内に直接注入した。また、乳がんの標準治療に用いられるＤＯＣを通常使用される量より減量（５ｍｇ／マウス体重（ｋｇ））して週１回腹腔投与で併用した。その結果、有害事象なく、著名な腫瘍抑制効果が得られた（図５−Ｇ）。
【０１０５】
前記ＤＤＳ剤は、特開2011-231220号公報に基づき、以下のようにして製造した。使用したＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）はSigma社から；β−ベンジル−Ｎ−カルボキシ−Ｌ−アスパラギン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）は日油株式会社から；ジエチレントリアミン（ビス（２−アミノエチル）アミン）は東京化成工業株式会社；酢酸および塩酸は和光純薬工業株式会社から購入し；２−プロピオニック−３−メチルマレイン酸無水物（ＣＤＭ無水物）は、文献（A. Naganawa, Y. Ichikawa, M. Isobe, Tetrahedron 1994, 50, 8969-8982; D. B. Rozema, K. Ekena, D. L. Lewis, A. G. Loomis, J. A. Wolff, Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57）に従って調製した。
【０１０６】
ポリ（エチレングリコール）−ポリ（２−［（２−アミノエチル）アミノ］エチルアスパルトアミド）：ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）（２ａ）の合成：
【化１】
2015033381.tif 000011
【０１０７】
特開平8-310970号公報に開示された方法に従い、α−メトキシ−ω−アミノ−ポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ−ＮＨ２、ＭＷ：１２，０００）を開始剤として、β−ベンジル−Ｎ−カルボキシ−Ｌ−アスパラギン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）を開環重合させ、下記式（１）で表されるポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ｍＰＥＧ−ｂ−ＰＢＬＡ）を得た。ｍＰＥＧ−ｂ−ＰＢＬＡ中の「ＰＢＬＡ」単位の重合度は、１Ｈ−ＮＭＲ測定によると９６であった。
【０１０８】
【化２】
2015033381.tif 000012
【０１０９】
次いで、ChemMedChem 1 (2006) 439-444に記載の方法に従い、ｍＰＥＧ−ｂ−ＰＢＬＡをＮＭＰに氷浴中で溶解し、同容量のＮＭＰで希釈したジエチレントリアミン（ＤＥＴ、ＰＢＬＡセグメントのベンジル基に対して１００当量）を加え、０℃（氷浴）で４時間撹拌しながら反応させた。反応を、冷１０％酢酸を少しずつ加えて停止させた（溶液の容量の２倍）。中和溶液を０．０１Ｍ塩酸溶液（×３）及び蒸留水（×３）に対して４℃で透析した。凍結乾燥後、透析した溶液から白色粉末を得た。得られたｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）は、単峰型分子量分布かつＰＢＬＡからｐＡｓｐ（ＤＥＴ）へほぼ１００％変換したことが、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）及び１Ｈ−ＮＭＲ測定により夫々確認された。
【０１１０】
ポリ（エチレングリコール）−ポリ（Ｎ−｛Ｎ−［Ｎ−（３−プロピオニル−２−メチルマレアミル）−２−アミノエチル］−２−アミノエチル｝アスパルタミド：ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ−ＣＤＭ）の合成：
【化３】
2015033381.tif 000013
【０１１１】
ｍＰＥＧ−ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）（１級アミノの０．５３８ｍｍｏｌ）を０．５Ｍのビシン緩衝液（ｐＨ９）（２ｍｌ）に溶解した。ＣＤＭ無水物（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の１級アミンに対して５倍当量）を溶液にゆっくり加え、０℃で２時間撹拌した。反応混合物をアミコンウルトラ（ＭＷＣＯ＝１０，０００；ミリポア社製）（０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．１）で×３、蒸留水で×３）で精製した。凍結乾燥後、最終生成物を白色粉末として得た。１Ｈ−ＮＭＲから計算した変換収率は、９０％超であった。
【０１１２】
ＤＤＳ剤としてのｓｉＲＮＡ担持リン酸カルシウム（ＣａＰ）ナノ粒子の調製（ＰＥＧ−ＣＣＰ／リン酸カルシウム粒子の調製とｓｉＲＮＡの封入）
２．５Ｍ  ＣａＣｌ２溶液１μＬを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）１１．５μＬで希釈した（第１溶液、１２．５μＬ）。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．７）で希釈した、チャージコンバージョンポリマー（ＣＣＰ）であるｍＰＥＧ−ｐＡｓｐを含む溶液を、１５μＭ  ｓｉＲＮＡ溶液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．２）中）および、１．５ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４および１４０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５）と混合した（第２溶液、１２．５μＬ〜１３μＬ）。第１溶液を一定速度で約２０秒かけてピペットで第２溶液と混合し、ｓｉＲＮＡ担持ＣａＰナノ粒子の溶液を調製した。
【０１１３】
＜実施例１５＞ＰＲＤＭ１４遺伝子と分化形質との関連
ＰＲＤＭ１４を発現している乳がん細胞株ＨＣＣ１９３７に対して、ＰＲＤＭ１４遺伝子特異的なｓｈＲＮＡによりＰＲＤＭ１４をノックダウンし、細胞表面のＣＤ４４およびＣＤ２４の発現をフローサイトメトリーにより解析した。結果を図８−Ａに示す。ＰＲＤＭ１４の発現を低下させると、ＣＤ４４の発現のみが低下した。ＣＤ４４は、表１に示すように、乳がんの幹細胞性の指標となる分子であることから、ＣＤ４４の発現が低下するにつれ分化の形質を示すようになることが示唆される。
また、ＰＲＤＭ１４の発現をｓｈＲＮＡにより低下させた乳がん細胞株（ＨＣＣ１９３７）および膵臓がん細胞株（ＰＫ−１）の夫々をマウス皮下に移植し、形成された腫瘍に対して、分化の指標となる分子（ＣＫ５およびＰＤＸ１）に特異的な抗体を用いて免疫染色した。ＣＫ５は乳腺の未分化性を示し、ＰＤＸ１は膵臓細胞の未分化性を示すマーカーである。得られた結果を図８−Ｂに示す。ＰＲＤＭ１４の発現を低下させると、いずれの細胞においても、未分化マーカーの発現が低下することがわかった。
【０１１４】
［まとめ］
（ｉ）転写因子であるＰＲＤＭ１４は、乳がん、卵巣がん、膵がん、腎がんの臨床多検体による検討により、がん組織特異的にｍＲＮＡ、タンパク発現が上昇していた。さらに、２０例前後の検討であるが、同様に肺がん、食道がん、大腸がん、腎がん、前立腺がん、尿路腫瘍、精巣腫瘍において発現の上昇を認める。一方、正常組織の発現レベルは皆無もしくは極めて低い発現レベルである。
【０１１５】
（ii）ＰＲＤＭ１４遺伝子の過剰発現株、ｓｈＲＮＡによる恒常的なＫＤ株を樹立し、がん細胞に及ぼす影響を検討した：Ａ）Side Population（ＳＰ）画分において、ＰＲＤＭ１４遺伝子により同画分が過剰発現で増加、ＫＤで減少することを複数のがん細胞株で実証した（FACS Aria）。Ｂ）Tumor sphereアッセイにおいて、ＰＲＤＭ１４遺伝子の導入によりsphereの形成能が上昇した。また、その際に形成されるsphereにおいて、幹細胞マーカーの発現を評価したところ、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４のタンパク発現が上昇していた（ＩＣＣ、共焦点）。Ｃ）ヌードマウス（♀、６Ｗ）の乳腺にＰＲＤＭ１４遺伝子の導入株を移植したところ、著名な増腫瘍効果を認めた。逆にＫＤによりほとんど腫瘍が形成されなくなることが判明した。Ｄ）一方で、インビトロにおいては遺伝子導入株で検討したところ、がん細胞の増殖活性は増加しなかった。
【０１１６】
（iii）ＰＲＤＭ１４に対する特異的ｓｉＲＮＡを使用して各種評価を行った：Ａ）ｓｉＲＮＡによるがん細胞処理でがん細胞のバイアビリティが低下し、アポトーシスが誘導され、さらにＳＰ画分が消滅した。Ｂ）乳がん株に関してｓｉＲＮＡに加えＣＤＤＰ、ＡＤＭ、ＤＯＸを併用し、膵がん株に関してはＧＥＭを併用してがん細胞のバイアビリティを評価したところ、ｓｉＲＮＡ単独群に比較してさらにバイアビリティが低下し、アポトーシスが著明に生じた。Ｃ）ヌードマウスを使用しｓｉＲＮＡによる治療モデルを構築、ＤＤＳと併用し腫瘍への局所注射（ＰＥＩ）、尾静脈注（ミセル）により評価した。結果、抗腫瘍効果、肺への転移モデルにおいて肺転移を抑制する作用を確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明に係る分子マーカーは、がんの幹細胞性に起因する転移、再発の予測が、幅広いがん種で可能であるから極めて有望である。また、ＤＤＳ剤との併用で反復・異なる研究室で同様の治療効果を認めており、治療標的として極めて有望である。本発明に係る分子マーカーは、経年後再発が想定される幅広いがん種の難治性がん患者に有効性が高いことが想定され、国民のニーズを十分に満たす。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図１−Ｃ】
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【図１−Ｄ】
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【図１−Ｅ】
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【図１−Ｆ】
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【図２−Ａ】
2015033381.tif 000020
【図２−Ｂ】
2015033381.tif 000021
【図２−Ｃ】
2015033381.tif 000022
【図２−Ｄ】
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【図２−Ｅ】
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【図２−Ｆ】
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【図２−Ｇ】
2015033381.tif 000026
【図２−Ｈ】
2015033381.tif 000027
【図２−Ｉ】
2015033381.tif 000028
【図２−Ｊ】
2015033381.tif 000029
【図２−Ｋ】
2015033381.tif 000030
【図２−Ｌ】
2015033381.tif 000031
【図２−Ｍ】
2015033381.tif 000032
【図２−Ｎ】
2015033381.tif 000033
【図２−Ｏ】
2015033381.tif 000034
【図３−Ａ】
2015033381.tif 000035
【図３−Ｂ】
2015033381.tif 000036
【図３−Ｃ】
2015033381.tif 000037
【図３−Ｄ】
2015033381.tif 000038
【図４−Ａ】
2015033381.tif 000039
【図４−Ｂ】
2015033381.tif 000040
【図４−Ｃ】
2015033381.tif 000041
【図４−Ｄ】
2015033381.tif 000042
【図４−Ｅ】
2015033381.tif 000043
【図４−Ｆ】
2015033381.tif 000044
【図４−Ｇ】
2015033381.tif 000045
【図４−Ｈ】
2015033381.tif 000046
【図４−Ｉ】
2015033381.tif 000047
【図５−Ａ】
2015033381.tif 000048
【図５−Ｂ】
2015033381.tif 000049
【図５−Ｃ】
2015033381.tif 000050
【図５−Ｄ】
2015033381.tif 000051
【図５−Ｅ】
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【図５−Ｆ】
2015033381.tif 000053
【図５−Ｇ】
2015033381.tif 000054
【図５−Ｈ】
2015033381.tif 000055
【図５−Ｉ】
2015033381.tif 000056
【図５−Ｊ】
2015033381.tif 000057
【図５−Ｋ】
2015033381.tif 000058
【図５−Ｌ】
2015033381.tif 000059
【図５−Ｍ】
2015033381.tif 000060
【図５−Ｎ】
2015033381.tif 000061
【図５−Ｏ】
2015033381.tif 000062
【図６】
2015033381.tif 000063
【図７−Ａ】
2015033381.tif 000064
【図７−Ｂ】
2015033381.tif 000065
【図７−Ｃ】
2015033381.tif 000066
【図７−Ｄ】
2015033381.tif 000067
【図８−Ａ】
2015033381.tif 000068
【図８−Ｂ】
2015033381.tif 000069
【図９】
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【配列表】
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