(57)【要約】【課題】腱や靭帯などの骨接合部の治癒を促進可能な人工材料を提供すること。【解決手段】第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体を含む骨接合部再生材料が提供される。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体を含む骨接合部再生材料。
【請求項２】
前記骨接合部は骨と接合する結合組織の部分である請求項１に記載の骨接合部再生材料。
【請求項３】
前記骨接合部は腱又は靭帯である請求項１に記載の骨接合部再生材料。
【請求項４】
骨と腱、骨と靭帯、又は骨と骨の間に適用される請求項１に記載の骨接合部再生材料。
【請求項５】
質量比でゼラチン１に対して第８リン酸カルシウムが０．１〜９である請求項１〜４のいずれか一項に記載の骨接合部再生材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨接合部再生材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨再生材料として、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2）の前駆体である第８リン酸カルシウム（Ｃａ8Ｈ2（ＰＯ4）6・５Ｈ2Ｏ）、以下ＯＣＰ）と天然高分子との複合体が有用であることが従来より知られており、本願発明者らはこれまでにＯＣＰとアルギン酸ナトリウムとの複合体（特許文献１）、ＯＣＰと非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ3（ＰＯ4）2・ｎＨ2Ｏ）、第２リン酸カルシウム無水和物（ＣａＨＰＯ4）、第２リン酸カルシウム２水和物（ＣａＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ）、低結晶性のハイドロキシアパタイト又は低結晶性の第８リン酸カルシウムとの複合体（特許文献２）、並びにＯＣＰとゼラチンとの複合体（特許文献３，４）あるいはＯＣＰとコラーゲンとの複合体（非特許文献１）が優れた骨再生能を有することを報告してきた。
【０００３】
肩の腱板断裂は、上腕骨頭に停止する筋肉の腱が、加齢や肩の酷使、外傷により断裂する疾患であり、特に中高年以降における肩の痛み及び機能不全の最も一般的な原因である (非特許文献２)。保存療法が成功しなかった場合には、上腕骨頭に腱板を縫着する外科手術が行なわれるが (非特許文献３〜５)、25％〜90％の割合で術後に再断裂が起こることが報告されている(非特許文献３〜６)。ウサギのモデルでは腱板修復後に新たな腱の骨付着部（enthesis）が形成されるのに24週間かかると報告されているが（非特許文献７）、その理由の一つとして、顕微鏡レベルにおける腱骨接合部の再形成に時間がかかることが挙げられる。腱板修復術後に再断裂した患者では、再断裂のない患者よりも肩の機能が劣ることが広く知られている（非特許文献４，５）。そのため、腱板再建後の治癒を改善し、再断裂率を減少させるには腱の骨付着部の再建プロセスを早める必要がある。
【０００４】
また、膝靭帯損傷（スポーツ膝等）の再建時に、手術場にて自家腱（移植腱）を採取し、その自家腱にリンゲル液に浸漬することによりリン酸カルシウムを析出させて石灰化腱とし、対向する大腿骨の遠位部と脛骨の近位部とに形成した貫通穴に該損傷部を移植する方法が、損傷靭帯治療に有効性があるという報告がある（非特許文献８）。しかしながら、この方法では患者の腱を、手術中に繰り返して溶液で処理する必要があり、操作の煩雑さや手術時間の延長といった問題があり一般に普及するには至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２５４５４７
【特許文献２】特開２０１０−１１０４０４
【特許文献３】特開２０１１−２３４７９９
【特許文献４】特開２０１３−１０６６４４
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2006 79(2): 210-217
【非特許文献２】J Shoulder Elbow Surg. 2010 Jan; 19(1): 116-120
【非特許文献３】J Bone Joint Surg Am. 1997 Jul; 79(7):1064-8
【非特許文献４】Clin Orthop Relat Res. 1994 Jul;(304):43-53.
【非特許文献５】J Bone Joint Surg Am. 1991 Aug;73(7):982-9.
【非特許文献６】Arthroscopy. 1994 Feb;10(1):54-60.
【非特許文献７】J Orthop Res. 2005 Nov;23(6):1433-40.
【非特許文献８】Biomaterials 26 (2005) 1027-1034
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願発明者らの研究から、ＯＣＰとゼラチンとの複合体（ＯＣＰ−Ｇｅｌ）が骨自体の高い再生能を示すことは判明していたが、骨以外の組織の再生にかかる複合体が有用であるかどうかは不明であった。
【０００８】
そこで、本願発明者らは、組織石灰化を早めることが可能な材料は、腱や靭帯などの結合組織における骨付着部の再形成にも有用であると考え、ＯＣＰ−Ｇｅｌが応用できると考えた。
【０００９】
完全な人工材料であるＯＣＰ−Ｇｅｌを、腱や靭帯などの骨接合部の治療にも用いることができれば、材料を安定供給しつつ、骨接合部の疾患の治癒を促進することができ、有益である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意研究した結果、ＯＣＰ−Ｇｅｌを腱の断裂部に適用したところ、腱側からのコラーゲン線維の再生及び骨との連結も促進することで、腱骨接合部の再形成を促進する効果を見出した。本発明は、かかる新規の知見に基づくものである。
【００１１】
従って、本発明は、以下の項を提供する：
項１．第８リン酸カルシウムとゼラチンとの複合体を含む骨接合部再生材料。
【００１２】
項２．前記骨接合部は骨と接合する結合組織の部分である項１に記載の骨接合部再生材料。
【００１３】
項３．前記骨接合部は腱又は靭帯である項１に記載の骨接合部再生材料。
【００１４】
項４．骨と腱、骨と靭帯、又は骨と骨の間に適用される項１に記載の骨接合部再生材料。
【００１５】
項５．質量比でゼラチン１に対して第８リン酸カルシウムが０．１〜９である項１〜４のいずれか一項に記載の骨接合部再生材料。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、治療の際の患者への負担が少ない上、人工骨材料であるＯＣＰ−Ｇｅｌを安定供給できるため有利である。靭帯も含め吸収置換することのない人工材料（高分子繊維）で腱断裂部を結ぶ従来の方法と比較して、本発明の骨接合部再生材料は新しい治療への用途に有効であり、また整形外科領域における応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】棘下筋腱修復の手順。（Ａ）棘下筋腱の修復前。左側の黒色矢印は取外した棘下筋腱の断端を示し、右側の白色矢印は大結節上の骨溝を示す。（Ｂ）棘下筋腱の修復後。青色矢印は棘下筋腱の修復後の骨溝を示す。（Ｃ）棘下筋腱の断端の再取り付けのスキーム。
【図２】移植に使用されたＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体のディスク表面のSEM顕微鏡写真。（Ａ）30倍、（Ｂ）300倍。
【図３】（ａ）−（ｃ）手術後2週後の骨溝内のヘマトキシリン−エオシン(HE)染色。Ｔは棘下筋腱、Ｂは骨を示す。すべての群で骨溝は顆粒組織で満たされ、多数の未分化な間葉系細胞が観察できる。（ｃ）のＯＣＰ＋群では、ＯＣＰ沈殿物がまだ残っており、多くの未分化な間葉系細胞に囲まれている(青色矢印)。
【図４】ヘマトキシリン−エオシン(HE)染色（図４ａ−ｃ：4週間、図４ｇ−ｉ：8週間）。偏光顕微鏡でのHE染色（図４ｄ−ｆ：4週間、図４ｊ−ｌ：8週間。Ｔは棘下筋腱、Ｂは骨を示す。赤色矢印（上向きの矢印）がコラーゲン線維、青色矢印（下向きの矢印）がSharpey線維である。
【図５】トルイジンブルー染色。Ｔは棘下筋腱、Ｂは骨を示す。取り付け後8週目の染色領域。３つの群で、腱と骨の接合部に染色が観察された。これはプロテオグリカンが含まれることを示す（白色矢印）。
【図６】（Ａ）2週目、4週目、及び8週目の未分化間葉系細胞の数、（Ｂ）異染色性面積。（Ｃ）回折した偏光、（Ｄ）Sharpey線維の数。エラーバーは標準誤差を示す。*P<0.05。
【図７】手術後8週目のI型及びIII型コラーゲンの免疫組織化学。Ｔは棘下筋腱、Ｂは骨を示す。青色矢印はSharpey線維を示し、赤色矢印（図７ｆの左側の矢印）はIII型コラーゲンにより染色された腱を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書において、「骨接合部」とは、腱や靭帯を初めとする、骨と接合する組織の部分、特に結合組織の部分を指す。また、骨接合部は、骨と実際に接合している状態のもののみならず、正常な状態では骨と接合しているが、損傷または切断などの理由により骨と部分的または完全に分離したものも含む。
【００１９】
本発明の骨接合部再生材料は、第８リン酸カルシウム（octacalcium phosphate、（Ｃａ8Ｈ2（ＰＯ4）6・５Ｈ2Ｏ）、以下ＯＣＰ）と、ゼラチン（gelatin, Ｇｅｌ）との複合体（以下、ＯＣＰ／Ｇｅｌ材料と記載する場合がある）を含む。なお「ＯＣＰ／Ｇｅｌ材料」、「ＯＣＰとＧｅｌとの複合体」、「ＯＣＰ及びＧｅｌを含む混合物」、及び「ＯＣＰ及びＧｅｌを含有する組成物」は互換的に使用可能であるものとする。
【００２０】
ＯＣＰ／Ｇｅｌ材料は、変性コラーゲンであるゼラチンにＯＣＰの結晶を直接析出させた複合体であり、ＯＣＰの結晶が均一に分散していると考えられる。
【００２１】
ゼラチンとしては、特に限定されない。通常、コラーゲンを熱処理して得られる。市販のゼラチンであってもよい。ゼラチンはＯＣＰのキャリアー材料として作用すると考えられる。
【００２２】
コラーゲンとしては、特に限定されない。例えば、豚、牛の皮膚、骨、腱に由来するコラーゲンが挙げられる。好ましくは、蛋白分解酵素（例えば、ペプシン、プロナーゼ）により可溶化され、テロペプチドが除去された酵素可溶化コラーゲンである。コラーゲンのタイプとしては、例えば、Ｉ型コラーゲン、及びＩ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンの組み合わせが好ましい。コラーゲンは生体由来成分であるので、安全性が高く、特に酵素可溶化コラーゲンがアレルゲン性も低く好ましい。市販のコラーゲンであってもよい。
【００２３】
ＯＣＰとゼラチンとの割合は特に限定されないが、好ましくは、質量比で、ゼラチン１に対してＯＣＰが０．１〜９、より好ましくは０．６７〜４である。ゼラチン１に対してＯＣＰが０．１未満であると、得られる骨再生材料の骨再生能が劣り、９を超えると、形状付与性が低下する。
【００２４】
また、ＯＣＰ／Ｇｅｌ材料中のＯＣＰは、１０〜９０％、より好ましくは２０〜９０％であり、特に４０〜８０％の範囲で骨接合部の修復効果が最良となる。
【００２５】
ＯＣＰ／Ｇｅｌ材料の製造方法は特には限定されず、例えばＯＣＰとゼラチンを共沈及び加熱する方法によって得られた熱脱水架橋体（特開２０１１−２３４７９９号参照）であってもよいし、ＯＣＰの微粉末をゼラチン水溶液に分散させた分散液の凍結乾燥法（特開２０１３−１１６６４４号参照）によって得られた凍結乾燥物であってもよいし、凍結乾燥と熱脱水処理を組み合わせたものでもよく、或いは、Ｇｅｌ上への析出（Handa T et al. Acta Biomater 8 (2012) 1190-1200）、Ｇｅｌとのナノ−マイクロサイズＯＣＰとの混合（Miura K et al. Appl Sur Sci 282 (2013) 138-145），ＯＣＰ顆粒とコラーゲンの混合（Kamakrua S et al., J Biomed Mater Res B Appl Biomater 79: 210-217）等の方法により得られたものであってもよい。
ＯＣＰの微粉末は、市販のものを用いてもよく、ＯＣＰ結晶から作製する場合には、ＯＣＰを硬組織破砕装置、ボールミル、解砕機を用いる手段などを含むがこれらに限定されないＯＣＰを機械的に粉砕する手段により、通常５〜１０００ｎｍ、好ましくは１００〜４００ｎｍの粒径に粉砕し得る。
骨接合部再生材料は、本発明の効果が阻害されない範囲内で、一般的に人工骨再生材料に含まれる成分を含んでいてもよい。このような成分としては、例えば、生体吸収性高分子（ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール共重合体など）、生体吸収性リン酸カルシウム（β−ＴＣＰなど）、生体非吸収性材料（ＨＡセラミックスなど）が挙げられる。
【００２６】
本発明の骨接合部再生材料は、適用部位の形状に応じて、生理食塩水や血液などの流体と混合してゲル水和物にするか、又は固形に適宜成形され、放射線滅菌、高圧蒸気滅菌、乾燥加熱処理などにより滅菌処理後、適用部位に埋入される。
【００２７】
適用部位としては、骨と腱の間や、骨と靭帯の間、及び骨と骨の間が挙げられる。
【００２８】
本発明の骨接合部再生材料が適用される対象は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ヒト等であり、好ましくはヒトに適用される。
かかる骨接合部再生材料を移植することにより、対象動物における材料自身の吸収と骨接合部の再生が促進され、断裂腱及び膝靭帯損傷などの関連疾患の治療に有効である。
【実施例】
【００２９】
実施例
ウサギ腱板断裂モデルのインビボ実験において、腱板の組織学的治癒プロセスを検討した。
１．材料及び方法
（移植用のＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体及びＧｅｌディスクの調製）
ＯＣＰ／Ｇｅｌ共沈物はSuzuki, O. et al., Tohoku J Exp Med 164, 37, 1991及びHanda, T. et. al, Acta Biomater 8, 1190, 2012に記載の方法に従って製造した。ゼラチンはSigma-Aldrich（米国ミズーリ州セントルイス所在）から得た。Ｇｅｌ分子（酸性処理を用いてブタ皮膚から単離した試薬グレードのＧｅｌ）によるＯＣＰの直接核形成を行った。40%のＯＣＰ結晶を含むＯＣＰ／Ｇｅｌ共沈物を調製し、これを型に入れて凍結乾燥した。次に、凍結乾燥させた複合体から直径9mm、厚さ1mmのディスクを得た。ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体は真空乾燥オーブン(DP32、ヤマトサイエンティフィック社、日本国東京所在)で１５０℃にて２４時間、熱脱水処理した。ＯＣＰ結晶のないＧｅｌのみのディスクも対照材料として成形した。
（ウサギ腱板断裂モデル）
体重3.0-3.5kgの29匹の成日本ウサギの雄を用いた。ゼラチンの評価のために、肩の手術は以下の３種類に分けた：１）対照（ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体無し）、２）ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体(ＯＣＰ＋群)、及び３）ＯＣＰなしでＧｅｌのみ（ＯＣＰ−群）。動物の数を減らすために、両側の肩に異なる手術を行った。ウサギ腱板断裂モデルはSano H. et al, J  Shoulder Elbow Surg 11, 166, 2002に基づいて作製した。
【００３０】
筋肉注射によるケタミン(25mg/kg)の臀部への事前投与後、ケタミン(10mg/kg)及びキシラジン（3mg/kg）の耳介静脈への注射によりウサギを麻酔した。麻酔維持の為必要に応じて、ケタミン(10mg/kg)をさらに投与した。
【００３１】
無菌状態で、両側の肩に、縦方向前外側に4cmの皮膚の切開を行い、肩−脊椎の筋肉と三角筋の筋間から棘下筋腱を露出させた。図１（Ｃ）を参照して説明すると、上腕骨大結節（１）から棘下筋（２）の腱（棘下筋腱、符号（３））を完全に切離し、大結節側に残存する線維軟骨を十分に切除し、上腕骨大結節（１）を露出させた。上腕骨大結節（１）にＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体を載せるために、歯科用バーを用いて10mm長、2mm幅、及び2mm深さの溝を作製した。上腕の側面から骨溝へと２つの小さな穿孔を作製し、この上腕骨大結節（１）の溝にＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体(ＯＣＰ＋群)又はＯＣＰなしでＧｅｌのみ（ＯＣＰ−群）のいずれか（４）を載せた（図１Ａ）。対照群の骨溝には何も載せなかった。棘下筋腱の断端を、非吸収性の2-0ナイロンを用いた水平マットレス縫合（５）で骨溝へ修復した。各縫合端は穿孔に通し、皮質の側面で結びつけた。皮膚は4-0ナイロンで閉じた。術後、外固定は行わなかった。手術の前後ともウサギは個別ケージで飼い、標準飼料と水に自由にアクセスさせた。ウサギはすべて術後に食欲不振及び低体重でないことを確認し、ウサギの数は統計学的処理に必要な数に合わせて最小限とした。動物実験プロトコールは本願発明者らの所属施設の動物実験委員会で承認されたものである。
（安楽死及び組織標本の調製）
ケタミン(25mg/kg)の事前投与後、耳介静脈へ過剰量のペントバルビタールナトリウム(120mg/kg)を注射することにより、ウサギを安楽死させた。術後2週目(N=6)、4週目(N=6)、及び8週目(N=7又は8)に肩をすべて採集した。上腕骨頭に付着している棘下筋腱の複合物を注意深く切除し、肉眼で観察し、これを次に棘下筋腱に平行に切り出した。4%パラホルムアルデヒドにより4℃で1日固定した後、4℃の12.5%エチレンジアミン四酢酸溶液(pH7.0)で脱石灰化を行った。
（肉眼による観察）
再断裂の有無を、各標本の切断面の観察により決定した。棘下筋腱が骨溝から完全に離れている場合、その標本には再断裂が有ると判断した。
（組織学的評価）
肉眼で再断裂が有ると判断した標本は以下の組織学的評価から除外した。パラフィン包埋後、切片をヘマトキシリン−エオシン(HE)及びトルイジンブルー（TB）で染色した。96枚のスライド（HEで対照:17、OCP-:15、OCP+:16、TBで対照:17、OCP-:15、OCP+:16）はすべて一人の研究者Ａが調べた。群の名称及び術後の期間を含むすべての情報を隠すために、各スライドはランダムに生成した数で符号を付けた。すべての情報を上記研究者Ａに分からないようにするために組織学的評価は2週間後に行った。
本研究では、本願発明者らは、腱付着の再建を評価するために、Koike Y. et al, J Orthop Res 23, 1433, 2005及びSano H., J Sholder Elbow Surg 11, 166, 2002に報告されている以下の4つの組織学的基準を使用した：
１．未分化間葉系細胞
測定は常に骨溝表面よりも近位側200μmの位置で行った。この位置で、前掲のKoike Y. et alで報告された方法を用いて、標準化した四角形の視野(600×220μm)内のすべての核をHE染色スライド上で数えた。
２．線維軟骨
線維軟骨はTBなどの基本的な青色染料に結合し、かかる染料の色を赤みを帯びた青色に変化させる（前掲のKoike Y. et al）。この現象は異染色性として知られ、プロテオグリカンを含有していることの指標として用いられている（Weischer C.H., Histol Histopathol 1, 303, 1986）。本研究では、強い異染色性のある領域をImageJ 1.42ソフトウェア（米国国立衛生研究書、メリーランド州所在）を用いて測定した。対象の領域を、骨−腱接合の標準化された視野(3×1mm)として設定した。
３．コラーゲン線維
コラーゲンの配向を、偏光顕微鏡を用いてHE染色パラフィン切片で評価した。組織切片中のコラーゲン線維に向けられた偏光は回折し、暗い背景に対して眩しく輝く（前掲のKoike Y. et al）。
本研究では、最大輝度の位置を見出すために、各スライドを顕微鏡のトレイ上で360℃回転させた。次に、異染色性の測定に使用されたのと同じ標準化視野を捕捉した。標準化視野内の明るく回折した光の領域をImageJを用いて測定した。
４．Sharpey線維
腱を束状骨まで貫通するSharpey線維の定量分析を、偏光顕微鏡でHE染色パラフィン切片でこれらの線維を観察した後に行った。偏光した画像を非偏光の画像と結合させ、1mm長さの骨表面当たりを貫通しているSharpey線維の数を骨溝の底部で数えた。
【００３２】
（免疫組織化学）
切片を脱パラフィン化し、0.03%過酸化水素のメタノール溶液で30分間ブロックした。コラーゲン1型及び3型の場合、スライドを室温で0.1%トリプシン 0.1% CaCl2／トリス緩衝液でインキュベートした。内因性の免疫グロブリンは10%正常ヤギ血清(株式会社ニチレイ)のPBS溶液でのインキュベートによりブロックされた。スライドを、コラーゲンI型の抗体（F-56, 第一ファインケミカル株式会社、日本国富山県所在）又はコラーゲンIII型の抗体（F-58, 第一ファインケミカル株式会社、日本国富山県所在）とインキュベートした。最後の検出工程は、3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸塩（3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)、Sigma-Aldrich社）、0.1M イミダゾール及び0.03%過酸化水素を用いて行った。各切片に対し、ヘマトキシリンで後染色を行った。陰性対象として、正常なマウスIgGを一次抗体として用いた。
（統計）
インビボでの組織学的発見の数値を決定するために、One-way ANOVAを用いた。Yateの連続補正したカイ二乗検定を使用して、肉眼観察の再断裂の数の有意差を決定した。結果を平均値及び標準偏差（SD）で示した。P<0.05の値は統計学的に有意であるとみなす。
２．結果
（ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体の調製及び特徴付け）
図２（ａ），（ｂ）はＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体のSEM観察を示す。ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体は非常に多孔性で10μmから500μmの範囲の大きな孔径分布を有していた。ＯＣＰ／Ｇｅｌ中のＯＣＰ結晶は複合体の表面壁及び内部壁上で針状又は板状のように見えた。ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体表面はざらざらしており、ＯＣＰ結晶はゼラチンマトリクスに均質に分散されていた。ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体の多孔率は92%を超えていた。
（肉眼による観察）
対照群、ＯＣＰ−群、及びＯＣＰ＋群の再断裂の総数はそれぞれ、１９個の肩のうち２個（11％）、１９個の肩のうち４個（21％）、及び２０個の肩のうち４個（20％）であり、３つの群間に有意差はなかった（p=0.6375）(表１)。
【００３３】
【表１】
2015054055.tif 000003
【００３４】
（組織学的評価）
１．未分化間葉系細胞
手術後2週目に、HE染色で、3群すべての骨溝に多数の細胞が現れた(図３ａ−ｃ)。特にＯＣＰ＋群ではＯＣＰ沈殿物がまだ残っており（図３ｃ）、2週目には多くの細胞に囲まれていたが、かかる細胞はこれは4週目にはほとんど消失した(図３，図４ｃ)。3群すべてにおいて、細胞の数は4週間から8週間の間に次第に減少した（図４ａ−ｃ、ｈ−ｊ）。いずれの時点でも、3群の細胞数に有意差はなかった（図６Ａ）。
この結果は以前の研究の結果と一致している(Koike Y. et al, J Orthop Res 23, 1433, 2005及びSano H., J Sholder Elbow Surg 11, 166, 2002)。
【００３５】
２．線維軟骨
3群すべてにおいて、TB染色で、骨溝に染色の存在が見え始め（図５）、8週目まで漸進的に増大した。この場合にも、いずれの時点でも3群の細胞数に有意差はなかった（図６Ｂ）。
３．コラーゲン線維
腱側のコラーゲン線維の配向に対応する明るく回折した偏光の領域は、３つすべての群で2週間から8週間まで次第に増大した。ＯＣＰ＋群では他の2群よりも8週目にコラーゲン線維が有意に増大していた（図４ｄ−ｆ，ｊ−ｌ、図６Ｃ）（ＯＣＰ−群に対してp=0.017、対照群に対してp=0.017）。さらに、ＯＣＰ＋群のコラーゲン線維は骨溝の表面に対して垂直に配列していた。こうした線維の配向は他の2群には見られなかった。垂直に整列したコラーゲン線維は、再生される骨や接合部の強度に寄与し得る。
４．Sharpey線維
Sharpey線維は、HE染色切片で偏光下、明瞭に観察された。Sharpey線維の数は3群すべてにおいて2週目から8週目まで次第に増大したが、興味深いことに、4週目と8週目の両方ではＯＣＰ＋群のみしか増大しなかった（図４ａ−ｌ、4週目でＯＣＰ−群に対してp=0.017、対照群に対してp=0.035、8週目でＯＣＰ−群に対してp=0.010、対照群に対してp=0.011）。他の2群では4週目でも8週目でもSharpey線維の数は統計学的に有意なレベルに到達しなかった（図４ａ−ｌ、図６Ｄ）。
【００３６】
上記の結果から、ＯＣＰ沈殿物は経時的に減少しており体内に吸収されていることが確認された。また、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体を用いた場合には、腱-骨間の（tendon to bone）挿入部において、コラーゲン線維が8週目に増大すると共に骨面に対して垂直に整列し、腱と骨の間の接合部に存在するSharpey線維の数も有意なレベルに到達していた。このため、腱側のコラーゲン線維の再生及び骨との連結をも促進することで、骨のみならず骨側の腱の再生を促す効果が確認された。つまり、ＯＣＰ／Ｇｅｌ複合体により腱の骨付着部における再生が促されていることが理解される。
（免疫組織化学）
手術後8週目に、I型コラーゲンは骨溝内で強く検出され、Sharpey線維及び腱ではわずかに検出された（図７ａ−ｃ）。他方、III型コラーゲンはその大部分が、腱及びSharpey線維内に分布していた（図７ｄ−ｆ）。
【図１】
2015054055.tif 000004
【図２】
2015054055.tif 000005
【図３】
2015054055.tif 000006
【図４】
2015054055.tif 000007
【図５】
2015054055.tif 000008
【図６】
2015054055.tif 000009
【図７】
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