(57)【要約】【課題】ドライバー細胞膜タンパク質に結合する第１結合ドメイン、および標的細胞膜タンパク質に結合する第２結合ドメインを含む二重結合分子を含む標的細胞膜タンパク質除去用組成物、前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物を有効成分として含む抗癌組成物、並びに前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物を用いた細胞膜タンパク質の除去方法を提供する。【解決手段】本発明による標的細胞膜タンパク質除去用組成物は、ドライバー細胞膜タンパク質に結合する第１結合ドメイン、および標的細胞膜タンパク質に結合する第２結合ドメインを含む二重結合分子を含み、前記ドライバー細胞膜タンパク質は、前記標的細胞膜タンパク質と同一の細胞の細胞膜に位置し、前記第１ドメインが結合したときに細胞内に移動して分解される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドライバー細胞膜タンパク質に結合する第１結合ドメイン、および標的細胞膜タンパク質に結合する第２結合ドメインを含む二重結合分子を含み、
前記ドライバー細胞膜タンパク質は、前記標的細胞膜タンパク質と同一の細胞の細胞膜に位置し、前記第１ドメインが結合したときに細胞内に移動して分解されるものである、標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項２】
前記ドライバー細胞膜タンパク質および前記標的細胞膜タンパク質は、それぞれ独立して、リガンド、抗体、抗体以外のタンパク質またはペプチドの結合によって細胞内在化が誘発される受容体、チャネルタンパク質、細胞膜酵素、リポタンパク質、インテグリン、および細胞表面マーカーからなる群より選ばれたものである、請求項１に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項３】
前記ドライバー細胞膜タンパク質および前記標的細胞膜タンパク質は、それぞれ独立して、受容体チロシンキナーゼ、Ｇ−タンパク質共役型受容体、トランスフェリン受容体、低密度リポタンパク質受容体、表面分化抗原類および抗体医薬複合体からなる群より選ばれたものである、請求項２に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項４】
前記標的細胞膜タンパク質は、上皮細胞成長因子受容体、血管内皮細胞成長因子受容体、ＨＥＲ２タンパク質、ＨＥＲ３タンパク質、血小板由来成長因子受容体、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ１５１、ＣＤ６３、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＮＥＴ１、ＮＥＴ２、ＮＥＴ４、ＮＥＴ５、ＮＥＴ６、ＴＭ４ＳＦ６、Ｔｓｐａｎ２、Ｔｓｐａｎ３、ＴＭ４Ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ  ７９ｂ、ＣＤ２２、ＧＰＮＭＢ、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、ＣＤ７４、ＴＡＣＳＴＤ２、ＣＥＡ、Ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ＣＤ３７、Ｍｕｃｉｎ１６、ＥＴＢ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ７０、ＳＬＣ４４Ａ４、Ｎｅｃｔｉｎ４、ＡＧＳ−１６、Ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ、Ｍｕｃｉｎ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎからなる群より選ばれたものである、請求項３に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項５】
前記ドライバー細胞膜タンパク質は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質、ｃ−Ｍｅｔタンパク質変異体、上皮細胞成長因子受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、血小板由来成長因子受容体、血管内皮細胞成長因子受容体、インシュリン様成長因子１受容体、エフリン受容体、トランスフェリン受容体、低密度リポタンパク質受容体、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、およびＮＴＲＫ２、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ１５１、ＣＤ６３、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＮＥＴ１、ＮＥＴ２、ＮＥＴ４、ＮＥＴ５、ＮＥＴ６、ＴＭ４ＳＦ６、Ｔｓｐａｎ２、Ｔｓｐａｎ３、ＴＭ４Ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ  ７９ｂ、ＣＤ２２、ＧＰＮＭＢ、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、ＣＤ７４、ＴＡＣＳＴＤ２、ＣＥＡ、Ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ＣＤ３７、Ｍｕｃｉｎ１６、ＥＴＢ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ７０、ＳＬＣ４４Ａ４、Ｎｅｃｔｉｎ４、ＡＧＳ−１６、Ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ、Ｍｕｃｉｎ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎからなる群より選ばれたものである、請求項３に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項６】
前記第１結合ドメインは、前記ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片であり、
前記第２結合ドメインは、前記標的細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片であり、
前記二重結合分子は、前記ドライバー細胞膜タンパク質および前記標的細胞膜タンパク質に対する二重特異性抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項７】
前記ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはその抗原結合断片である、請求項６に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項８】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）内の配列番号７３のアミノ酸配列（ＥＥＰＳＱ）を含む連続する５個以上のアミノ酸からなるエピトープに特異的に結合する抗体である、請求項７に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項９】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号７１のアミノ酸配列内の配列番号７３のアミノ酸配列（ＥＥＰＳＱ）を含む連続する５〜１９個のアミノ酸からなるエピトープに特異的に結合する抗体である、請求項８に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項１０】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、
配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列内の２番目から１０番目までのアミノ酸を含む連続する８〜１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸を含む連続する６〜１３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選ばれた一つ以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域；並びに
配列番号７のアミノ酸配列または配列番号８６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸を含む９〜１７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選ばれた一つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含み、
前記配列番号４〜配列番号９は、それぞれ、下記一般式Ｉ〜一般式ＶＩで表されるアミノ酸配列である抗体である、請求項８に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物：
【化１】
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前記一般式Ｉにおいて、Ｘａａ１は、存在しないかまたはＰｒｏもしくはＳｅｒであり、Ｘａａ２は、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、
前記一般式ＩＩにおいて、Ｘａａ３は、ＡｓｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ４は、ＡｌａまたはＶａｌであり、Ｘａａ５は、ＡｓｎまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＩＩにおいて、Ｘａａ６は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＶにおいて、Ｘａａ７は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ８は、ＳｅｒまたはＴｒｐであり、Ｘａａ９は、ＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１０は、ＬｙｓまたはＡｓｎであり、
前記一般式Ｖにおいて、Ｘａａ１１は、ＡｌａまたはＧｌｙであり、Ｘａａ１２は、ＴｈｒまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１３は、ＳｅｒまたはＰｒｏであり、
前記一般式ＶＩにおいて、Ｘａａ１４は、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１５は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１６は、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＭｅｔである。
【請求項１１】
前記ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものであり、
前記ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２、配列番号２５、および配列番号２６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものであり、
前記ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号３、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号８５からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものであり、
前記ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号１０６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものであり、
前記ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号１１、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものであり、
前記ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３７、配列番号８６、および配列番号８９からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものである、請求項１０に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項１２】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、
配列番号１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号２、配列番号２５、および配列番号２６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号３、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号８５からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ３）を含む重鎖可変領域；並びに
配列番号１０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号１０６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１１、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ２）、および配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３７、配列番号８６、および配列番号８９からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ３）を含む軽鎖可変領域を含む抗体である、請求項１１に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項１３】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号６２、配列番号６４、および配列番号６６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有する重鎖、並びに配列番号６８、配列番号７０、および配列番号１０８からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体である、請求項７に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項１４】
前記ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体および前記標的細胞膜タンパク質に対する抗体は、それぞれ、マウス由来抗体、マウス−ヒトキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項１５】
前記二重特異性抗体は、
前記ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体、および
前記ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体のＣ末端に連結された標的細胞膜タンパク質に対する抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体模倣体（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｉｃｓ）を含むものである、 請求項６〜１３のいずれか１項に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項１６】
前記二重特異性抗体は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、および前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のＣ末端に連結された標的細胞膜タンパク質に対する抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２、または抗体模倣体（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｉｃｓ）を含むものである、請求項１５に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項１７】
前記標的細胞膜タンパク質に対する抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、およびＩＧＦ−１Ｒ抗体からなる群より選ばれたものである、請求項１６に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項１８】
抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、マツズマブ（Ｍａｔｕｚｕｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、ＭＭ−１５１、または配列番号１０９もしくは配列番号１１１のアミノ酸配列からなる重鎖可変部位と、配列番号１１０もしくは配列番号１１２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変部位とを含む抗体であり、
前記抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）またはペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）であり、
前記抗ＨＥＲ３抗体は、ＲＧ−７５９７であり、
前記抗ＶＥＧＦＲ抗体は、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）であり、
前記抗ＰＤＧＦＲ抗体は、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）であり、
前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、シクスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）である、
請求項１７に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物を用いて生体から分離された細胞を処理する段階を含む、標的細胞膜タンパク質の除去方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ドライバー細胞膜タンパク質に結合する第１結合ドメイン、および標的細胞膜タンパク質に結合する第２結合ドメインを含む二重結合分子を含む標的細胞膜タンパク質除去用組成物、前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物を有効性分として含む抗癌組成物、および前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物を用いた細胞膜タンパク質除去方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜タンパク質（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、細胞膜に存在するタンパク質を意味し、それぞれ特異的な機能を有している。これら細胞膜タンパク質の正確な機能に対する研究は、主にｓｉＲＮＡを用いたタンパク質の発現阻害によって行われている。しかし、このようなｓｉＲＮＡを用いたタンパク質の発現阻害による方法によると、細胞膜上におけるタンパク質の正確な機能の究明には限界がある。
【０００３】
細胞膜タンパク質の機能の判別のためのより有利な方法は、これら膜タンパク質が正常に発現して正常に細胞膜に配置された後にこれらを除去するものである。例えば細胞膜タンパク質の中で癌細胞と関連したものとしてよく知られている５８種の受容体チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ；ＲＴＫ）は、ある程度共通する構造を有している。これらＲＴＫタンパク質は、リガンドの結合の有無によりホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）またはヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成し、シグナル伝達に関与する多様な細胞膜または細胞内タンパク質との相互作用を通じて細胞増殖、分化、移動、生存、接着、代謝などの多様な活性に関与している。つまり、細胞膜タンパク質の機能は、細胞膜タンパク質が正常に発現し、また正常に細胞膜に配置されて細胞外部の信号を細胞内部に伝達できてこそ、正常に発揮されることになる。
【０００４】
細胞膜タンパク質は、細胞膜に存在しながら細胞内の位置に応じてそれぞれの特異的な機能を有しているため、これらの正確な機能に対する研究は主にｓｉＲＮＡを用いたタンパク質の発現阻害によって行われているが、上述したように、細胞膜上における正確な機能の究明には限界がある。細胞膜タンパク質の機能の判別のためのより好適な方法として、これらの膜タンパク質が正常に発現して正常に細胞膜に配置された後にこれらを除去できる技術の開発が好ましい。特に細胞膜（ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）上で特定の細胞膜タンパク質の除去が可能になれば、これはｓｉＲＮＡ技術のように汎用化した膜タンパク質の除去（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）方法を提供できると考えられる。
【０００５】
したがって、ＲＴＫタンパク質をはじめとした多様な細胞膜タンパク質の正確な機能分析および効果的な抑制のために、正常に発現および細胞膜に配置された細胞膜タンパク質を除去する技術の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国公開特許第２０１１−００４７６９８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】２０１３  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １２：３３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の一形態は、ドライバー細胞膜タンパク質に結合する第１結合ドメイン、および標的細胞膜タンパク質に結合する第２結合ドメインを含む二重結合分子を含む標的細胞膜タンパク質除去用組成物を提供する。
【０００９】
また、本発明の他の形態は、標的細胞膜タンパク質除去用組成物を有効成分として含む癌の予防および／または治療用組成物を提供する。
【００１０】
さらに、本発明のさらに他の形態は、前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物を用い、生体から分離された細胞を処理する段階を含む標的細胞膜タンパク質の除去方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一形態は、ドライバー（ｄｒｉｖｅｒ）細胞膜タンパク質に結合する第１結合ドメイン、および標的細胞膜タンパク質に結合する第２結合ドメインを含む二重結合分子を含む標的細胞膜タンパク質除去用組成物を提供する。
【００１２】
前記ドライバー細胞膜タンパク質に結合する第１結合ドメインと標的細胞膜タンパク質に結合する第２結合ドメインとを含む二重結合分子は、細胞膜に位置する第１結合ドメインを通じてドライバー細胞膜タンパク質と結合する一方、第２結合ドメインを通じて細胞膜タンパク質にも同時に結合する。この際、ドライバー細胞膜タンパク質は、第１結合ドメインとの結合によって細胞内に移動するようになり、これによって前記二重結合分子とこれに結合した標的細胞膜タンパク質がともに細胞内に移動して、細胞内で分解が行われる（図１および図２参照）。
【００１３】
図１は、本発明に係る細胞膜タンパク質除去技術の原理を模式的に示す。具体的に、図１は、標的の細胞膜タンパク質が細胞膜表面に存在する場合、この標的を認知すると同時に細胞膜上のドライバーと同時に結合して、除去しようとする標的の細胞膜タンパク質をともに細胞内移動（エンドサイト―シス）させて分解することができる二重結合分子（ｔｒｉｇｇｅｒ）を細胞外部から処理して細胞膜タンパク質を除去する様子を示す図である。
【００１４】
図２は、本発明に係る標的特異的な細胞膜タンパク質除去技術の原理を模式的に示す。細胞膜上には様々な種類の細胞膜タンパク質が存在するが、二重結合分子（ｔｒｉｇｇｅｒ）の特異性により他の細胞膜タンパク質には結合せず、標的しようとする特定の細胞膜タンパク質にのみ結合し、このタンパク質の細胞内移動（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）および分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を誘発することができる。
【００１５】
前記ドライバー（ｄｒｉｖｅｒ）細胞膜タンパク質は、上述したとおり、二重結合分子を通じて標的の細胞膜タンパク質を細胞内に移動させる役割を果たすことを表現するために本明細書で命名したものである。
【００１６】
前記ドライバー細胞膜タンパク質は、細胞膜に位置するタンパク質であって、各種リガンド、抗体、または抗体以外のタンパク質（もしくはペプチド）の結合によって細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）が誘発される全てのタンパク質でありうる。前記標的細胞膜タンパク質は、細胞膜に位置するタンパク質であって、二重結合分子を通じて前記ドライバー細胞膜タンパク質と結合されると細胞内在化される全てのタンパク質でありうる。前記ドライバー細胞膜タンパク質と標的細胞膜タンパク質とは、それぞれ独立して、全ての受容体、チャンネルタンパク質、細胞膜酵素（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ）、リポタンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、細胞表面の多様なマーカーなどからなる群より選ばれたものでありうる。具体的に、前記ドライバー細胞膜タンパク質および標的細胞膜タンパク質は、それぞれ独立して、各種リガンド、抗体、または抗体以外のタンパク質（もしくはペプチド）の結合によって細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）が誘発される受容体チロシンキナーゼ類（例えば、ｃ−Ｍｅｔタンパク質、ｃ−Ｍｅｔタンパク質変異体、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ｅｐｈｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＦＧＦＲなど）、インテグリン類、ＮＭＤＡ受容体、Ｇ−タンパク質共役型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＧＰＣＲ）、トランスフェリン受容体、低密度リポタンパク質（Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）受容体、表面分化抗原類（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ；ＣＤ）（例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）等）、ＮＴＲＫ２（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）等）、細胞表面に存在する周辺膜タンパク質（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、テトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓ；例えば、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ１５１、ＣＤ６３、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＮＥＴ１、ＮＥＴ２、ＮＥＴ４、ＮＥＴ５、ＮＥＴ６、ＴＭ４ＳＦ６、Ｔｓｐａｎ２、Ｔｓｐａｎ３、ＴＭ４Ｂなど）、抗体結合によって細胞内在化が可能な抗体薬品複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；ＡＤＣ）に対する細胞膜標的タンパク質（２０１３  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １２：３３０参照）（例えば、ＣＤ２２、ＣＤ  ７９ｂ、ＣＤ２２、ＧＰＮＭＢ、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、ＣＤ７４、ＴＡＣＳＴＤ２、ＣＥＡ、Ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ＣＤ３７、Ｍｕｃｉｎ１６、ＥＴＢ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ７０、ＳＬＣ４４Ａ４、Ｎｅｃｔｉｎ４、ＡＧＳ−１６、Ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ、Ｍｕｃｉｎ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ等）等からなる群より選択されうる。
【００１７】
前記ドライバー細胞膜タンパク質は、細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）にリガンドまたは抗体が結合されると効率的に細胞内に移動する性質を有する全ての細胞膜タンパク質の中から選択されうる。前記ドライバー細胞膜タンパク質のうちの一部は、それ自体は細胞内移動を起こさないが、突然変異を通じてタンパク質にリガンドまたは抗体を処理した際に人為的に細胞内移動が誘発されうる細胞膜タンパク質に変形するものであってもよい。
【００１８】
前記ドライバー細胞膜タンパク質は、前記標的細胞膜タンパク質と同一の細胞の細胞膜に位置するものであってもよいし、前記標的細胞膜タンパク質と同一の細胞の細胞膜に位置するように導入されたものであってもよい。前記ドライバー細胞膜タンパク質は、当該タンパク質に前記第１結合ドメインが結合したときに細胞内に移動し、その後に分解されるものでありうる。一例において、前記ドライバー細胞膜タンパク質は以下の群より選ばれた１種以上でありうる：
１）リガンド、抗体、抗体以外のタンパク質もしくはペプチドの結合によって細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）が誘発される全ての受容体チロシンキナーゼ類（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ；ＲＴＫ）（例えば、ｃ−Ｍｅｔタンパク質、ｃ−Ｍｅｔタンパク質変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）、上皮細胞成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥｒｂＢ３）、血小板由来成長因子受容体（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＤＧＦＲ）、血管内皮細胞成長因子受容体（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ；ＶＥＧＦＲ）、インシュリン様成長因子１受容体（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＧＦ１Ｒ）、エフリン受容体（ｅｐｈｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、繊維芽細胞成長因子受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＦＧＦＲ）等）；
２）リガンド、抗体、抗体以外のタンパク質もしくはペプチドの結合によって細胞内在化が誘発される全ての受容体類（例えば、トランスフェリン受容体（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、低密度リポタンパク質（Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）受容体、表面分化抗原類（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ；ＣＤ）（例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）等）、ＮＴＲＫ２（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）等）；
３）テトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓ；例えば、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ１５１、ＣＤ６３、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＮＥＴ１、ＮＥＴ２、ＮＥＴ４、ＮＥＴ５、ＮＥＴ６、ＴＭ４ＳＦ６、Ｔｓｐａｎ２、Ｔｓｐａｎ３、ＴＭ４Ｂなど）；および
４）抗体結合によって細胞内在化が可能な抗体医薬複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；ＡＤＣ）に対する細胞膜標的タンパク質（Ｒｅｆ：２０１３  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １２：３３０）（例えば、ＣＤ２２、ＣＤ  ７９ｂ、ＣＤ２２、ＧＰＮＭＢ、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、ＣＤ７４、ＴＡＣＳＴＤ２、ＣＥＡ、Ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ＣＤ３７、Ｍｕｃｉｎ１６、ＥＴＢ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ７０、ＳＬＣ４４Ａ４、Ｎｅｃｔｉｎ４、ＡＧＳ−１６、Ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ、Ｍｕｃｉｎ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎなど）。
【００１９】
一実施形態において、前記ドライバー細胞膜タンパク質は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質であってもよく、ここに結合する二重結合分子の第１結合ドメインは、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメインのアミノ酸配列（配列番号７９）の１４３番目から１４７番目のアミノ酸配列（配列番号７３；ＥＥＰＳＱ）に結合するものでありうる。
【００２０】
前記標的細胞膜タンパク質は、タンパク質の種類および性質、または機能に関係なしに細胞膜に存在する全ての種類の細胞膜タンパク質より選ばれたものであってもよく、自体的な性質としては、細胞膜から細胞内に移動しない細胞膜タンパク質まで全て含まれうる。
【００２１】
一例において、前記標的細胞膜タンパク質は、受容体チロシンキナーゼのように腫瘍誘発（ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ）等の非正常的細胞状態と関連した細胞シグナルを媒介する受容体、チャネルなどの細胞膜タンパク質でありうる。このような標的細胞膜タンパク質は、非正常的細胞状態と関連した疾病、例えば癌の治療標的になるものでありうる。
【００２２】
例えば、前記標的細胞膜タンパク質は、細胞膜に存在するＧ−タンパク質共役型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＧＰＣＲ）、受容体チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ）等の全ての種類の内在化タンパク質（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）と細胞表面に存在する周辺膜タンパク質（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を全て含むものであり、マイクロフィラメント（ｍｉｃｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ）と結合した構造タンパク質（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、細胞接着分子（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、細胞膜酵素（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ）、細胞膜受容体（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、キャリアタンパク質（ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、チャンネルタンパク質（ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）と運搬タンパク質（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、また細胞の表面側に位置する脂質アンカー型タンパク質（ｌｉｐｉｄ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）等、全ての種類の細胞膜タンパク質からなる群より選ばれた１種以上のものでありうる。前記内在化タンパク質は、上記でドライバー細胞膜タンパク質と関連して説明したリガンドまたは抗体結合によって細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）が誘発される全ての受容体チロシンキナーゼ類（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ；ＲＴＫ）、Ｇ−タンパク質共役型受容体類（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＧＰＣＲ）、抗体結合によって細胞内在化が誘発される全ての受容体類（トランスフェリン受容体（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、低密度リポタンパク質（Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）受容体、表面分化抗原類（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ；ＣＤ）等）などからなる群より選ばれた１種以上でありうる。一例において、前記標的細胞膜タンパク質は、この中で特に細胞の機能に重要な、上皮細胞成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＧＦＲ）、血管内皮細胞成長因子受容体（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＶＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２タンパク質（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＨＥＲ３タンパク質（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｐｒｏｔｅｉｎ）、血小板由来成長因子受容体（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＤＧＦＲ）などからなる群より選ばれたものでありうる。
【００２３】
前記「ｃ−Ｍｅｔタンパク質」は、肝細胞成長因子と結合する受容体チロシンキナーゼを意味する。前記ｃ−Ｍｅｔタンパク質は、全ての種から由来するものであってもよく、例えば、ヒトｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿０００２３６）、サルｃ−Ｍｅｔ（例えば、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ、ＮＰ＿００１１６２１００）等のような霊長類由来のもの、またはマウスｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿０３２６１７. ２）、ラットｃ−Ｍｅｔ（例えば、ＮＰ＿１１３７０５. １）等のような齧歯類由来のものなどでありうる。前記タンパク質は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｅｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０００２４５に提供されたヌクレオチド配列により暗号化されたポリペプチド、またはＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｅｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＰ＿０００２３６に提供されたアミノ酸配列を含むタンパク質、またはその細胞外ドメインを含む。受容体チロシンキナ−ゼｃ−Ｍｅｔは、例えば、癌発生、癌転移、癌細胞移動、癌細胞浸透、新生血管生成過程などの多様なメカニズムに関与する。
【００２４】
前記上皮細胞成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ｐｒｏｔｅｉｎ）、およびＨＥＲ３（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、それぞれ、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から構成されているＨＥＲファミリーの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）の一員である。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ３の細胞外ドメインに対するリガンドの結合は、他のＥｒｂＢ受容体とのレセプターホモまたはヘテロ二量体化を誘導し、これは特異的なチロシン残基の細胞内自己リン酸化を誘発する。ＥＧＦＲ自己リン酸化は、細胞増殖、血管新生および転移に影響を与えるＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ活性化を含むダウンストリームシグナル伝達ネットワークを率いる。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、および／またはＨＥＲ３の過発現、遺伝子増幅、突然変異、または再配列は、多様な種類のヒト悪性腫瘍で頻繁に観察され、癌治療の不良な予後および悪い臨床的結果と関連している。このような理由で、これらＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、および／またはＨＥＲ３は、抗癌療法において重要な標的になる。
【００２５】
前記ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ３は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。例えば、前記ＥＧＦＲは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＪＱ７３９１６０、ＪＱ７３９１６１、ＪＱ７３９１６２、ＪＱ７３９１６３、ＪＱ７３９１６４、ＪＱ７３９１６５、ＪＱ７３９１６６、ＪＱ７３９１６７、ＮＭ＿００５２２８．３、ＮＭ＿２０１２８４．１、ＮＭ＿２０１２８２．１、またはＮＭ＿２０１２８３．１等に提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドでありうる。例えば、前記ＨＥＲ２は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ０３３６３．１等に提供されるヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドでありうる。例えば、前記ＨＥＲ３は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９８２等に提供されるヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドでありうる。
【００２６】
前記血管内皮細胞成長因子受容体（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＶＥＧＦＲ）は、血管内皮細胞成長因子正常細胞でも存在し、特に癌細胞で分泌される血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）と結合して血管新生を起こし、癌細胞に必要な養分を供給する。ＶＥＧＦＲの過発現は、多様な疾病の原因になり、特に癌の発生のみならず、浸湿、転移などの悪い予後にも関与する。このような理由で、ＶＥＧＦは、抗癌療法において重要な標的になる。前記ＶＥＧＦＲは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。例えば、前記ＶＥＧＦＲは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ０６３６５７．２等に提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドでありうる。
【００２７】
前記血小板由来成長因子受容体（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＤＧＦＲ）は、表面受容体チロシンキナーゼのうちの一つであって、細胞増殖、細胞分化、細胞成長などの調節および癌を起こす多くの疾病と関連している。前記ＰＤＧＦＲは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。例えば、前記ＰＤＧＦＲは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿００６２０６．４（ＰＤＧＦＲ−Ａ）、ＮＭ＿００２６０９．３（ＰＤＧＦＲ−Ｂ）、ＮＭ＿０１６２０５．２（ＰＤＧＦＲ−Ｃ）等に提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドでありうる。
【００２８】
前記インシュリン様成長因子１受容体（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＧＦ１Ｒ）は、受容体チロシンキナーゼのうちの一つであって、インシュリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）により活性化される膜通過受容体である。前記ＩＧＦ１Ｒは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。例えば、前記ＩＧＦ１Ｒは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００８７５．３等に提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドでありうる。
【００２９】
前記エフリン受容体（ｅｐｈｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）は、表面受容体チロシンキナーゼのうちの一つであって、軸索ガイダンス、組織境界の形成、細胞遊走、セグメンテーションなどの胚発生過程を調節する。前記エフリン受容体は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。例えば、前記エフリン受容体は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿００４４４０．３、ＮＭ＿００４４３８．３、ＮＭ＿００４４３１．３、ＮＭ＿００４４４２．６、ＮＭ＿０１７４４９．３、ＮＭ＿００４０９３．３、ＮＭ＿００４４４１．４、ＮＭ＿１８２４７２．２、ＮＭ＿００５２３２．４、ＮＭ＿００５２３３．５、ＮＭ＿１７３６４１．２、ＮＭ＿００１０９９４３９．１、ＮＭ＿００１０８０４４８．２、ＮＭ＿００１０８０４４８．２、ＮＭ＿００４４４３．３、ＮＭ＿１８２６８９．１、ＮＭ＿００４４２８．２、ＮＭ＿００４４３９．５、ＮＭ＿００１９６２．２、ＮＭ＿００４４２９．４、ＮＭ＿１８２６４４．２、ＮＭ＿００４９５２．４、ＮＭ＿１７３６５５．２、ＮＭ＿１８２６９０．２、ＮＭ＿０２０５２６．３、ＮＭ＿００１４０６．３、ＮＭ＿００５２２７．２、ＮＭ＿１８２６８５．１等に提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドでありうる。
【００３０】
前記トランスフェリン受容体（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）は、トランスフェリンのキャリアタンパク質であって、受容体媒介性エンドサイトーシスを通じて鉄の細胞内移動に関与し、細胞内鉄濃度を調節する。前記トランスフェリン受容体は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。例えば、前記トランスフェリン受容体は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿００１１２８１４８．１、ＮＭ＿００３２３４．２、ＮＭ＿００１２０６８５５．１、ＮＭ＿００３２２７．３、ＢＣ００１１８８．１、Ｍ１１５０７．１等に提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドでありうる。
【００３１】
前記低密度リポタンパク質（Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）受容体は、トランスフェリンのキャリアタンパク質であって、受容体媒介性エンドシトシスを通じて鉄の細胞内移動に関与し、細胞内鉄濃度を調節する。前記ＬＤＬ受容体は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。例えば、前記トランスフェリン受容体は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿０００５２７．４、ＮＭ＿００１１９５８０２．１、ＮＭ＿００１１９５７９９．１、ＮＭ＿００１１９５８０３．１、ＮＭ＿００１１９５８００．１、ＮＭ＿００１１９５７９８．１等に提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドでありうる。
【００３２】
前記表面分化抗原類（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ；ＣＤ）は、受容体またはリガンドとして多様に作用するタンパク質であって、ヒトの場合、約３５０種類が知られており、細胞シグナリング（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、細胞接着などの多様な細胞過程に関与する。前記表面分化抗原類は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。例えば、前記表面分化抗原類は、全てのＣＤ系であってもよく、特に癌転移と関連したＣＤ４４、ＣＤ１４７、またはそのｖａｒｉａｎｔであってもよく、より具体的にＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．（ＮＭ＿０００６１０．３、ＮＭ＿００１７２８．３、Ｘ５５１５０．１）等に提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドでありうる。
【００３３】
前記Ｇ−タンパク質共役型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＧＰＣＲ）は、膜通過受容体タンパク質であって、シグナル伝達経路（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）および細胞反応を活性化し、多様な疾病に関与する。ＧＰＣＲは、巨大なタンパク質群であって、配列相同性および機能的類似性に基づいて６個のクラスに分類されうる：クラスＡまたはクラス１（Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）；クラスＢまたはクラス２（Ｓｅｃｒｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ）；クラスＣまたはクラス３（Ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ／ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ）；クラスＤまたはクラス４（Ｆｕｎｇａｌ  ｍａｔｉｎｇ  ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）；クラスＥまたはクラス５（Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）；およびクラスＦまたはクラス６（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）。前記ＧＰＣＲは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。例えば、ＧＰＣＲは、癌転移に関連するケモカイン受容体（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ）、例えば、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＣケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体などであってもよく、より具体的にＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿００１１２３０４１．２、ＮＭ＿００５５０８．４、ＮＭ＿００５２０１．３、ＮＭ＿０１６６０２．２等に提供されたヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされたポリペプチドでありうる。
【００３４】
テトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓ；例えば、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ１５１、ＣＤ６３、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＮＥＴ１、ＮＥＴ２、ＮＥＴ４、ＮＥＴ５、ＮＥＴ６、ＴＭ４ＳＦ６、Ｔｓｐａｎ２、Ｔｓｐａｎ３、ＴＭ４Ｂ、ｅｔｃ．）は、哺乳類で３３種が発見された膜通過タンパク質（ｔｒａｎｓＭｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）であって、ほとんど全ての細胞および組織類型で原形質膜上でまたは多様な細胞内小器官および顆粒内で多様に発見される。他の多くの細胞表面タンパク質とは異なり、テトラスパニンは明確な受容体機能を示してはいない。テトラスパニンは、エンドソームシステムおよびライソゾーム関連小器官で発見される。これらは血小板内の高密度顆粒（ｄｅｎｓｅ  ｇｒａｎｕｌｅ）およびα顆粒（ａｌｐｈａ−ｇｒａｎｕｌｅｓ）、メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）内のメラノソーム（ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅｓ）、Ｔ−細胞内の細胞毒性顆粒（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｇｒａｎｕｌｅｓ）、内皮細胞内のバイベル・パラーデ小体（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ  ｂｏｄｉｅｓ）、および樹枝状細胞内の主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ＩＩ（ＭＨＣＩＩ））等を含む。また、多くの細胞類型で、後期エンドソーム（ｌａｔｅ  ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ）／ＭＶＢｓ（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｂｏｄｉｅｓ）が細胞表面と融合するように誘発され、癌の進行および転移と機能的に関連があるエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を分泌することができる。これはテトラスパニンが膜除去（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）のためのドライバーまたは標的として使用可能であることを提案する。ＣＤ９は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿００１７６９またはＮＭ＿００７６５７のヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。ＣＤ８１は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿００４３５６またはＮＭ＿１３３６５５のヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。ＣＤ１５１は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿００１０３９４９０またはＮＭ＿００１１１１０４９のヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。ＣＤ６３は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿００１０４００３４またはＮＭ＿００１０４２５８０のヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。ＣＤ３７は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿００１０４００３１またはＮＭ＿００７６４５のヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。ＣＤ５３は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿０００５６０またはＮＭ＿００７６５１のヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。ＮＥＴ１は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿００１０４７１６０またはＮＭ＿００１０４７１５９のヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされるアミノ酸配列を含むことがで���る。ＮＥＴ２は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿０１２３３８またはＮＭ＿１７３００７のヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。ＮＥＴ６は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿０１４３９９またはＮＭ＿０２５３５９のヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。ＴＭ４ＳＦ６は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿００１２７８７４３、ＮＭ＿００１２７８７４２、ＮＭ＿００１２７８７４１、ＮＭ＿００１２７８７４０、ＮＭ＿００３２７０、またはＮＭ＿０１９６５６のヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。Ｔｓｐａｎ２は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿００５７２５、ＮＭ＿００１２４３１３２、またはＮＭ＿０２７５３３のヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。Ｔｓｐａｎ３は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿００１１６８４１２、ＮＭ＿１９８９０２、ＮＭ＿００５７２４、またはＮＭ＿０１９７９３のヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。ＴＭ４Ｂ（ＴＳＰＡＮ１６）は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿００１２８２５１０、ＮＭ＿００１２８２５０９またはＮＭ＿０１２４６６のヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ）によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。
【００３５】
本発明に係る標的細胞膜タンパク質除去用組成物は、非正常的細胞状態と関連した細胞信号を媒介したり癌などの疾病に関連した標的細胞膜タンパク質と単純結合して活性を抑制することにとどまらず、これら標的細胞膜タンパク質を細胞内に移動させて分解させる、より根本的な除去作用を示す。
【００３６】
前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物による標的細胞膜タンパク質除去のために、前記ドライバー細胞膜タンパク質と標的細胞膜タンパク質は、同一の細胞（例えば、同一の細胞の細胞膜）に位置するものでありうる。また、前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物により除去される標的細胞膜タンパク質の位置は、細胞膜の柔軟性と標的細胞膜タンパク質の細胞膜発現水準（例えば、非正常的細胞状態での発現水準）を考慮すると、ドライバー細胞膜タンパク質との距離において特に制限はない。
【００３７】
前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物に含まれている前記第１結合ドメインと第２結合ドメインは、ドライバー細胞膜タンパク質または標的細胞膜タンパク質に結合する抗体、抗体断片（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、例えば抗原結合断片）、または抗体模倣体（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｉｃｓまたはａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）等から独立して選択されるものでありうる。前記第１結合ドメインと第２結合ドメインは、例えば、抗体（例えば、ｆｕｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆｏｒｍ）、ｓｃＦｖ抗体、ファージ抗体（ｐｈａｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ドメイン抗体（ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＤＡＲＰｉｎｓ（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ａｎｋｙｒｉｎ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、フィブロネクチンドメイン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ）、クリングルドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ）、ナノボディー（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）、アプチド（ａｐｔｉｄｅ）などからなる群より選ばれたものでありうる。
【００３８】
例えば、前記第１結合ドメインは、ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片であり、前記第２結合ドメインは、標的細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片でありうる。この場合、前記二重結合分子は、前記ドライバー細胞膜タンパク質との結合部位と前記標的細胞膜タンパク質との結合部位を含む、ドライバー細胞膜タンパク質および標的細胞膜タンパク質に対する二重特異性（二重結合）抗体でありうる。
【００３９】
一例において、前記二重特異性抗体は、
ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片、および
前記ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片のＣ末端またはＮ末端に連結された、標的細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片
を含むものでありうる。
【００４０】
この場合、前記二重特異性抗体は、上下非対称形態の二重特異性抗体でありうる。前記上下非対称二重特異性抗体は、二重特異性抗体のＮ−末端とＣ−末端とが構造的に相異するもの（例えば、Ｆｃ部位を基準に、Ｎ−末端部分とＣ−末端部分が互いに異なり、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＤＡＲＰｉｎｓなどの抗体模倣体からなる群より選ばれたもの）、および／または機能的に相異するもの（例えば、Ｃ−末端とＮ−末端とが互いに異なるタンパク質を特異的に認識および／または結合するもの）でありうる。
【００４１】
他の例として、前記二重特異性抗体は、
一本鎖の形態のドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体（ｓｃＦｖＦｃ）またはその抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、および一本鎖の形態の標的細胞膜タンパク質に対する抗体（ｓｃＦｖＦｃ）またはその抗原結合断片（ｓｃＦｖ）を含み、
前記一本鎖の形態のドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体または抗原結合断片と標的細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片とが接合して左右非対称形態を形成するものでありうる。
【００４２】
この場合、前記二重特異性抗体は、左右非対称形態の二重特異性抗体でありうる。左右非対称形態の二重特異性抗体は、互いに異なるタンパク質を特異的に認識および／または結合する２個の一本鎖抗体を含むものでありうる。
【００４３】
前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物または前記二重特異性抗体において、ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体は、ドライバー細胞膜タンパク質の細胞内移動および分解を媒介する役割を発揮することが重要であり、このような役割をより良好に発揮するために、ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体は、完全な抗体形態（例えば、ｆｕｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆｏｒｍ）を有するものでありうる。また、標的細胞膜タンパク質に対する抗体は、標的細胞膜タンパク質に対する特異的認識および結合が重要であるので、ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体は、完全な形態のみならず抗原結合断片形態のものであってもよい。したがって、前記二重特異性抗体は、ドライバー細胞膜タンパク質に対する完全な抗体および前記抗体のＣ末端に連結されたドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体の抗原結合断片を含むものでありうる。
【００４４】
また、ドライバー細胞膜タンパク質と標的細胞膜タンパク質との距離を考慮すると、ドライバー細胞膜タンパク質との結合部位と標的細胞膜タンパク質との結合部位とが柔軟性のある連結部位を通じて連結されている構造が有利でありうる。
【００４５】
前記二重特異性抗体においてドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片と標的細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片は、ペプチドリンカーを通じてまたは通じることなく連結されうる。前記ペプチドリンカーは、１乃至１００個、２乃至５０個、または５乃至２０個のアミノ酸からなるものであってもよく、それに含まれているアミノ酸の種類には制限がない。例えば、前記ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒからなる群より選ばれた１種以上の残基を含むことができ、Ｔｈｒおよび／またはＡｌａのような中性アミノ酸も含むことができる。ペプチドリンカーに適したアミノ酸配列は、当業界に公知となったものでありうる。一方、前記ペプチドリンカーは、前記二重特異性抗体の機能に影響を与えない限度内で、その長さを多様に決定することができる。
【００４６】
具体的な例において、前記標的細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片は、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体からなる群より選ばれた抗体またはその抗原結合断片でありうる。前記抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ；Ｅｒｂｉｔｕｘ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、マツズマブ（Ｍａｔｕｚｕｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、ＭＭ−１５１（ＥＧＦＲの重複しないエピトープに結合するように設計された３個の完全なヒトのモノクローナル抗体の混合物からなるオリゴクローナル治療剤）、配列番号１０９または配列番号１１３の重鎖可変部位および配列番号１１０または配列番号１１４の軽鎖可変部位を有する抗体などからなる群より選ばれたものでありうる。前記抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）などからなる群より選ばれたものでありうる。前記抗ＨＥＲ３抗体は、ＲＧ−７５９７（ヒト化ＩｇＧ１単クローン抗体）等でありうる。前記抗ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）抗体は、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）等より選ばれたものでありうる。前記抗ＰＤＧＦＲ抗体は、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ、ＩＭＣ−３Ｇ３）等でありうる。前記抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、シクスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ；ＩＭＣ−Ａ１２）等でありうる。
【００４７】
前記二重特異性抗体には、前記標的細胞膜タンパク質に対する抗体が完全な抗体の形態で含まれていてもよいし、抗原結合断片として含まれていてもよい。
【００４８】
前記ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、または細胞膜タンパク質を効率的に細胞内に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）させるタンパク質に対する抗体からなる群より選ばれた抗体またはその抗原結合断片でありうる。前記ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体は、完全な抗体の形態で含まれていてもよいし、抗原結合断片として含まれていてもよい。
【００４９】
前記抗原結合断片は、免疫グロブリン構造全体に対するその断片であり、抗原が結合できる部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２でありうるが、これに限定されない。
【００５０】
前記抗原結合断片のうちのＦａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の第一不変領域（ＣＨ１）を有する構造で、１個の抗原結合部位を有する。
【００５１】
Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を形成しつつ生成される。
【００５２】
Ｆｖは、重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体断片であり、Ｆｖ断片を生成するための再構成技術は当業界に広く知られている。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、一本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、一般にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合で連結されたり、またはＣ末端に直結されていて、二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造をなすことができる。前記ペプチドリンカーは、１乃至１００個、２乃至５０個、または５乃至２０個のアミノ酸からなるものであり、それに含まれているアミノ酸の種類には制限がない。例えば、前記ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒからなる群より選ばれた１種以上の残基を含むことができ、Ｔｈｒおよび／またはＡｌａのような中性アミノ酸も含むことができる。ペプチドリンカーに適したアミノ酸配列は、当業界に公知となったものでありうる。一方、前記ペプチドリンカーは、前記抗原結合断片の機能に影響を与えない限度内で、その長さを多様に決定することができる。
【００５３】
前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子再構成技術を通じて作製することができる。
【００５４】
具体的な例において、前記二重特異性抗体は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、および前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のＣ末端に連結された標的細胞膜タンパク質に対する抗体（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、または抗ＰＤＧＦＲ抗体など）のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２、例えばｓｃＦｖを含むものでありうる。例えば、前記抗ＥＧＦＲ抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２は、配列番号１０９または配列番号１１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変部位と配列番号１１０または配列番号１１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部位とを含むものでありうる。したがって、一つの具体的な例において、前記二重特異性抗体は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、および前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のＣ末端に連結された、配列番号１０９または配列番号１１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変部位と配列番号１１０または配列番号１１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部位とを含む抗ＥＧＦＲ抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２を含むものでありうる。
【００５５】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ｃ−Ｍｅｔに作用して細胞内移動（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）および分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を誘導する全ての抗体またはその抗原結合断片であってもよく、ｃ−Ｍｅｔの特定部位、例えばＳＥＭＡドメイン内の特定部位をエピトープで認識するものでありうる。
【００５６】
ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）の受容体であるｃ−Ｍｅｔは、細胞外部位、膜透過部位、細胞内部位の３つの部分に区分され、細胞外部位の場合、ジスルフィド結合によってα−小単位体とβ−小単位体とが連結された形態でＨＧＦ結合ドメインであるＳＥＭＡドメイン、ＰＳＩドメイン（ｐｌｅｘｉｎ−ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ）およびＩＰＴドメイン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｆｏｌｄ  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  ｐｌｅｘｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｄｏｍａｉｎ）からなる。ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメインは、配列番号７９のアミノ酸配列を有するものであってもよく、ｃ−Ｍｅｔの細胞外部位に存在するドメインであって、ＨＧＦが結合する部位に相当する。ＳＥＭＡドメイン中の特定部位、例えば、１０６番目から１２４番目までに相当する配列番号７１のアミノ酸配列を有する領域は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープ中の２番と３番プロペラドメイン間のループ（ｌｏｏｐ）部位に相当し、本発明で提案される抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のエピトープで作用することができる。
【００５７】
「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」という用語は、抗原決定部位（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）であって、抗体により認識される抗原の一部分を意味する。一つの具体的な例によれば、前記エピトープは、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）内の連続する５個以上のアミノ酸を含む部位、例えば、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）内の１０６番目から１２４番目までに該当する配列番号７１内に位置する連続する５個乃至１９個のアミノ酸を含むものでありうる。例えば、前記エピトープは、配列番号７１のアミノ酸配列中の配列番号７３（ＥＥＰＳＱ）を含む連続する５乃至１９個のアミノ酸からなるものでありうる。前記配列番号７３のアミノ酸配列は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン（配列番号７９）の１４３番目位置から１４７番目位置までのアミノ酸配列である。例えば、前記エピトープは、配列番号７１、配列番号７２または配列番号７３のアミノ酸配列を有するポリペプチドでありうる。
【００５８】
前記配列番号７２のアミノ酸配列を有するエピトープは、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内の２番と３番プロペラ構造のドメイン間のループ部位のうち最も外側に位置する部位に相当し、前記配列番号７３のアミノ酸配列を有するエピトープは、一つの具体的な例による抗体または抗原結合断片が最も特異的に結合する部位である。
【００５９】
したがって、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号７１のアミノ酸配列のうち、配列番号７３（ＥＥＰＳＱ）を含む連続する５乃至１９個のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合するものであってもよく、例えば、配列番号７１、配列番号７２、または配列番号７３のアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片でありうる。
【００６０】
一つの具体的な例によれば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、
配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列内の３番目から１０番目までのアミノ酸を含む連続する８乃至１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６のアミノ酸配列、配列番号８５のアミノ酸配列、または配列番号８５のアミノ酸配列内の１番目から６番目までのアミノ酸を含む連続する６乃至１３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３からなる群より選ばれた一つ以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；並びに
配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のアミノ酸配列、配列番号８６のアミノ酸配列、または配列番号８９のアミノ酸配列内の１番目から９番目までのアミノ酸を含む９乃至１７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選ばれた一つ以上の軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、
前記配列番号４乃至配列番号９は、それぞれ、下記一般式Ｉ〜一般式ＶＩで表されるアミノ酸配列の抗体または抗原結合断片でありうる：
【００６１】
【化１】
2015027988.tif 000003
【００６２】
前記一般式Ｉにおいて、Ｘａａ１は、存在しないかまたはＰｒｏもしくはＳｅｒであり、Ｘａａ２は、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、
前記一般式ＩＩにおいて、Ｘａａ３は、ＡｓｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ４は、ＡｌａまたはＶａｌであり、Ｘａａ５は、ＡｓｎまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＩＩにおいて、Ｘａａ６は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、
前記一般式ＩＶにおいて、Ｘａａ７は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、Ｘａａ８は、ＳｅｒまたはＴｒｐであり、Ｘａａ９は、ＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１０は、ＬｙｓまたはＡｓｎであり、
前記一般式Ｖにおいて、Ｘａａ１１は、ＡｌａまたはＧｌｙであり、Ｘａａ１２は、ＴｈｒまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１３は、ＳｅｒまたはＰｒｏであり、
前記一般式ＶＩにおいて、Ｘａａ１４は、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＧｌｎであり、Ｘａａ１５は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＬｙｓであり、Ｘａａ１６は、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＭｅｔである。
【００６３】
一つの具体的な例において、前記ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものでありうる。前記ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２、配列番号２５、および配列番号２６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものでありうる。前記ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号３、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号８５からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００６４】
前記ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号１０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号１０６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものでありうる。前記ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号１１、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものでありうる。前記ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３７、配列番号８６、および配列番号８９からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００６５】
一つの具体的な例において、前記抗体または抗原結合断片は、配列番号１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号２、配列番号２５、および配列番号２６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号３、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号８５からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｈ３）を含む重鎖可変領域；および配列番号１０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号１０６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１１、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ２）、および配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３７、配列番号８６、および配列番号８９からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＣＤＲ−Ｌ３）を含む軽鎖可変領域を含むものでありうる。
【００６６】
所望の抗原を被免疫動物に免疫させて生産する動物由来抗体は、一般に治療の目的でヒトに投与時に免疫拒否反応が起こることがあり、このような免疫拒否反応を抑制するためにキメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）が開発された。キメラ抗体は、遺伝工学的方法を用いて抗アイソタイプ（ａｎｔｉ−ｉｓｏｔｙｐｅ）反応の原因になる動物由来抗体の不変領域をヒト抗体の不変領域で置換したものである。キメラ抗体は、動物由来抗体に比べて抗アイソタイプ反応において相当部分改善されたが、依然として動物由来アミノ酸が可変領域に存在していて、潜在的な抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）反応に対する副作用を有している。このような副作用を改善するために開発されたものがヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。これはキメラ抗体の可変領域中の抗原の結合に重要な役割を果たすＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｉｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ）部位をヒト抗体骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に移植して作製される。
【００６７】
ヒト化抗体を作製するためのＣＤＲ移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）技術において最も重要なことは、動物由来抗体のＣＤＲ部位を最もよく受け入れられる最適化したヒト抗体を選定することであり、このために抗体データベースの活用、結晶構造（ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の分析、分子モデリング技術などが活用される。しかし、最適化したヒト抗体骨格に動物由来抗体のＣＤＲ部位を移植しても動物由来抗体の骨格に位置しながら抗原結合に影響を与えるアミノ酸が存在することがあり、抗原結合力が保存されない場合が相当数存在するため、抗原結合力を復元するための追加的な抗体工学技術の適用は必須といえる。
【００６８】
一つの具体的な例によれば、前記抗体は、マウス由来抗体、マウス−ヒトキメラ抗体またはヒト化抗体でありうる。
【００６９】
完全な抗体は、２個の全長（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖と二硫化結合で連結されている。抗体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域に分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）およびイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
【００７０】
「重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）」という用語は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３とヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖およびその断片を全て含む意味として解釈される。また、「軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）」という用語は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびその断片を全て含む意味として解釈される。
【００７１】
「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）」という用語は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖は、それぞれ３個のＣＤＲを含むことができる（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合する際の主な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、「特異的に結合」または「特異的に認識」という用語は、当業者に通常公知されている意味と同一なものであって、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的に反応することを意味する。
【００７２】
一つの具体的な例によれば、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または抗原結合断片において、前記重鎖可変領域は、配列番号１７、配列番号７４、配列番号８７、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３または配列番号９４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号７５、配列番号８８、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９または配列番号１０７のアミノ酸配列を含むものでありうる。
【００７３】
一つの具体的な例において、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２２０であるハイブリドーマ細胞により生産される、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の細胞外部位（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｇｉｏｎ）に特異的に結合するモノクローナル抗体でありうる（韓国公開特許第２０１１−００４７６９８号参照；前記文献は本明細書に参照として含まれる）。
【００７４】
前記の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、韓国公開特許第２０１１−００４７６９８号に定義された抗体を全て含むことができる。
【００７５】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の上記で定義されたＣＤＲ部位または軽鎖可変部位と重鎖可変部位を除いた軽鎖不変部位と重鎖不変部位は、全てのサブタイプの免疫グロブリンの軽鎖不変部位と重鎖不変部位でありうる。
【００７６】
一つの具体的な例によれば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列（このうち１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号６８のアミノ酸配列（このうち１番目から２０番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体；配列番号６４のアミノ酸配列（このうち１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体；または配列番号６６のアミノ酸配列（このうち１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体でありうる。
【００７７】
他の具体的な例によれば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号７０のアミノ酸配列（このうち１番目から１７番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである）または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体；配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体；または配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号７０または配列番号７０の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列のアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体でありうる。
【００７８】
他の具体的な例によれば、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列または配列番号６２の１８番目から４６２番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１０８のアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体；配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４の１８番目から４６１番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１０８のアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体；または配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１０８のアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体でありうる。
【００７９】
一つの具体的な例において、前記前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号６８の２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体または配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６の１８番目から４６０番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１０８のアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体でありうる。
【００８０】
一方、前記配列番号７０のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖であり、配列番号６８のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、前記配列番号７０のアミノ酸配列を有するポリペプチドで３６番（（カバットナンバリング（ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）に従う、配列番号６８内の６２番目アミノ酸位置）ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）がチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）で置換された形態のポリペプチドである。一実施形態によれば、前記置換によって、抗体の生産量を増加させることができる。また前記配列番号１０８のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、前記配列番号６８のアミノ酸配列中の１番目から２０番目までのシグナルペプチドを除いた２１番目から２４０番目までのアミノ酸配列を有するポリペプチドでカバットナンバリングに従う２７ｅ位置（カバットナンバリングに従う、配列番号１０８内の３２番目位置；ＣＤＲ−Ｌ１内部）のセリン（Ｓｅｒ）がトリプトファン（Ｔｒｐ）で置換されたものであり、一実施形態によれば、前記置換によって、抗体の活性（例えば、ｃＭｅｔに対する結合親和度、ｃ−Ｍｅｔ分解活性およびＡｋｔリン酸化抑制活性など）がより増進されうる。
【００８１】
本発明の他の形態は、前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物またはこれに含まれている二重結合分子（または二重特異性抗体）を用いて細胞を処理する段階を含む標的細胞膜タンパク質の除去方法を提供する。本発明のさらに他の形態は、前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物またはこれに含まれている二重結合分子（または二重特異性抗体）の標的細胞膜タンパク質除去のための用途を提供する。
【００８２】
前記細胞は、哺乳類、例えば、ヒト、サルなどの霊長類、またはラット、マウスなどの齧歯類から由来した全ての細胞であって、生きている細胞でありうる。前記細胞は、例えば癌細胞であってもよく、ドライバー細胞膜タンパク質、例えばｃ−Ｍｅｔタンパク質が発現する細胞でありうる。前記細胞は、生体に存在するもの、または生体から分離したものでありうる。
【００８３】
一方、代表的にＥＧＦＲを含むＲＴＫと癌細胞で共に発現するｃ−Ｍｅｔは、他のＲＴＫとのクロストーク（ｃｒｏｓｓｔａｌｋ）が存在しながら、これらに対する抗癌剤耐性と関連している。したがって、ｃ−Ｍｅｔと共にＥＧＦＲまたはＨＥＲ２のようなＲＴＫを阻害することができれば、既存の抗癌剤の耐性および問題点を克服した新たな機能を有する抗癌剤の開発が可能になる。
【００８４】
そこで、本発明の他の形態は、前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物またはこれに含まれている二重結合分子（または二重特異性抗体）を有効成分として含む癌の予防および／または治療用薬学的組成物を提供する。
【００８５】
さらに他の形態は、前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物またはこれに含まれている二重結合分子（または二重特異性抗体）の薬学的有効量を癌の予防および／または治療を必要とする患者に投与する段階を含む癌の予防および／または治療方法が提供される。さらに他の形態は、前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物またはこれに含まれている二重結合分子（または二重特異性抗体）の癌の予防および／または治療のための用途が提供される。
【００８６】
前記癌は、これに制限されないが、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球内黒色腫、直膓癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、肝細胞癌、胃癌、胃腸癌、すい臓癌、膠芽腫、頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、頭頸部癌などからなる群より選ばれた１種以上でありうる。前記癌は、原発性癌または転移性癌でありうる。特に、前記癌は、既存の抗癌剤、例えば前記標的細胞膜タンパク質に対する拮抗剤に対して耐性が生じた癌でありうる。
【００８７】
前記薬学的組成物は、前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物またはこれに含まれている二重結合分子（または二重特異性抗体）の薬学的有効量と、薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤などとともに提供されうる。
【００８８】
前記組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、抗体の製剤化に通常使用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群より選ばれた１種以上でありうるが、これに限定されない。前記薬学的組成物は、前記成分以外に薬学的組成物の製造に通常使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群より選ばれた１種以上をさらに含むことができる。
【００８９】
前記薬学的組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与することができる。経口投与の時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコーティングしたり前記の分解から保護されるように剤型化しなければならない。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動可能な任意の装置により投与されうる。
【００９０】
前記薬学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因により多様に処方されうる。前記組成物の好適な投与量は、成人基準に０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。「薬学的有効量」という用語は、癌の予防または治療に効果を奏する量を意味する。
【００９１】
前記薬学的組成物は、本技術分野の当業者が容易に実施できる方法により、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されてもよいし、または多容量容器内に内蔵させて製造されてもよい。剤型は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液形態や、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００９２】
また、前記薬学的組成物は、個別治療剤で投与したり他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次的または同時に投与することができる。
【００９３】
一方、前記薬学的組成物は、抗体または抗原結合断片を含むため、免疫リポソームで剤型化することができる。抗体を含むリポソームは、当業界に広く知られた方法により製造されうる。前記免疫リポソームは、フォスファチジルコリン、コレステロールおよびポリエチレングリコール−誘導体化されたフォスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物であって、逆相蒸発法により製造されうる。例えば、抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応を通じてリポソームに接合されうる。ドキソルビシンのような化学治療剤が追加的にリポソーム内に含まれうる。
【００９４】
前記薬学的組成物の投与対象または前記予防および／または治療方法の投与対象患者は、哺乳類、例えばヒト、サルなどの霊長類、またはラット、マウスなどの齧歯類などでありうるが、これに制限されず、既存の抗癌剤、例えば前記標的細胞膜タンパク質に対する拮抗剤に対して耐性が生じた癌患者でありうる。
【００９５】
上述したとおり、本発明による標的細胞膜タンパク質の除去技術において、特定の細胞膜タンパク質の除去が可能になるためには、細胞膜タンパク質のエンドサイトーシスおよび分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を誘発するドライバー（Ｄｒｉｖｅｒ）が細胞膜上にともに存在することが必要であり、二重結合分子（Ｔｒｉｇｇｅｒ）を通じてドライバーと標的とを連結させると同時に標的がドライバーとともに細胞内にエンドサイトーシスされて分解されなければならない。ドライバーは、細胞膜タンパク質で標的細胞膜タンパク質と同一の細胞膜に存在しながら、エンドサイトーシスおよび細胞内分解が可能な分子であり、二重結合分子（Ｔｒｉｇｇｅｒ）は、標的細胞膜タンパク質とドライバーに同時に高い親和度で結合可能な分子で、ドライバーのエンドサイトーシスおよび分解を誘発すると同時に標的を引っ張ってドライバーとともに分解されるようにする。
【００９６】
図３は、本発明の一実施形態において使用されるドライバーとトリガー（Ｔｒｉｇｇｅｒ、二重結合抗体）を模式的に示す図である。抗癌標的としてよく知られた細胞膜タンパク質であるＥＧＦＲは、細胞の表面に存在し、ＥＧＦＲに対する抗体を処理しても活性が抑制されるに過ぎず、生きている細胞膜で除去されない。一実施形態で使用されるドライバーは、特定のエピトープを含むｃ−Ｍｅｔ細胞膜タンパク質であり、二重結合抗体は、特定のエピトープに高い親和度で結合される二重抗体で、ｃ−Ｍｅｔが細胞内に移動されても副作用（ａｇｏｎｉｓｍ）を誘発せず、効果的にｃ−Ｍｅｔを分解させることができる特性を有している。
【発明の効果】
【００９７】
本発明に係る標的細胞膜タンパク質の除去技術は、実際の臨床サンプルに対して次のような効果を期待することができる：
１．細胞生物学分野の細胞膜タンパク質機能研究のための新たなツールの提供で細胞膜タンパク質の機能研究と関連した画期的な方法を提供し、ｓｉＲＮＡ技術のように商品化が可能である
２．二重抗体パイプラインの拡充：ｃ−Ｍｅｔと共に併用投与などで相乗効果が期待される２次ターゲットに対する二重抗体を製造することで、基本的にこれら抗癌ターゲットを除去できる機能を用いて新たな新規抗癌治療剤のパイプラインの拡充が可能である
３．ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２等の抗癌関連主要標的に対する効能向上：ホモダイマーとヘテロダイマーの両方を分解して癌生成機能を阻害することができる
４．ｃ−Ｍｅｔ関連耐性克服およびｃ−Ｍｅｔ治療効能が向上した抗癌剤の製造が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】一実施形態に係る細胞膜における標的特異的な特定の細胞膜タンパク質の除去原理を示す模式図である。
【図２】一実施形態に係る細胞膜における標的特異的な特定の細胞膜タンパク質の除去原理を示す模式図である。
【図３】一実施形態に係る細胞膜タンパク質の除去システム（二重特異性抗体：ＢｓＡｂ）の構成要素を示す模式図である。
【図４】ＭＫＮ４５胃癌細胞株における抗ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体によるｃ−Ｍｅｔ分解率を示すグラフである（Ｙ軸：対照群（ｍｅｄｉａ）に対する相対的ｃ−Ｍｅｔ量；Ｘ軸：Ｌ３−１Ｙ  ＩｇＧ２：抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、ＭＥ−０１、ＭＥ−０３：ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体、ＭＨ２−０１：ｃ−Ｍｅｔ／ＨＥＲ２二重特異性抗体）。
【図５】ＭＫＮ４５胃癌細胞株における抗ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体によるＥＧＦＲ分解を示す蛍光画像である（黄色：抗−ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体；赤色：抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体；緑色：抗−ＥＧＦＲ抗体）。
【図６】ＭＫＮ４５胃癌細胞株における抗ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体によるＥＧＦＲの細胞内移動および分解を抗ＥＧＦＲ抗体（ＩＣＲ６２）単独または融合していない抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と抗ＥＧＦＲ抗体（ＩＣＲ６２）をともに投与した場合と比較して示す蛍光画像である（黄色：抗−ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体；赤色：抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体；緑色：抗−ＥＧＦＲ抗体）。
【図７】ＭＫＮ４５胃癌細胞株における抗ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体によるＥＧＦＲの細胞内移動および分解を抗ｃ−Ｍｅｔ抗体単独または融合していない抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と抗ＥＧＦＲ抗体（ＩＣＲ６２またはＥｒｂｉｔｕｘ）をともに投与した場合と比較して示す蛍光画像である（黄色：抗−ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体；赤色：抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体；緑色：抗−ＥＧＦＲ抗体）。
【図８】ＥＢＣ−１肺癌細胞株における抗ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体によるＥＧＦＲの細胞内移動および分解を抗ｃ−Ｍｅｔ抗体または抗ＥＧＦＲ抗体単独または融合していない抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と抗ＥＧＦＲ抗体（ＩＣＲ６２またはＥｒｂｉｔｕｘ）をともに投与した場合と比較して示す蛍光画像である（黄色：抗−ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体；赤色：抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体；緑色：抗−ＥＧＦＲ抗体）。
【図９】ＭＫＮ４５胃癌細胞株（上段）およびＥＢＣ−１肺癌細胞株（下段）における抗ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体によるＥＧＦＲの総量および活性をウエスタンブロッティングで試験した結果を示す図である。
【図１０】ｃ−Ｍｅｔの発現が低いＡ４３１癌細胞株における抗ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体によるＥＧＦＲの総量および活性をウエスタンブロッティングで試験した結果を示す図である。
【図１１】ＨＣＣ８２７肺癌細胞株およびＨＣＣ８２７  エルロチニブ耐性細胞株（ＨＣＣ８２７  ＥＲ）におけるｃ−Ｍｅｔ発現量増加によるＥＧＦＲ分解をウエスタンブロッティングで確認した結果を示す図である。
【図１２】ＭＫＮ４５胃癌細胞株における抗ｃ−Ｍｅｔ／Ｈｅｒ２二重特異性抗体によるＨＥＲ２の特異的分解をウエスタンブロッティングで確認した結果を示す図である。
【図１３】ｃ−Ｍｅｔ発現が低いＡ５４９癌細胞株でｃ−Ｍｅｔを過発現させた後の抗ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体によるＥＧＦＲ分解誘導の効果を示す蛍光画像である。
【図１４】ｃ−Ｍｅｔ発現が低いＨｅＬａ細胞株でｃ−Ｍｅｔを過発現させた後の抗ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体によるＥＧＦＲ分解誘導の効果を示す蛍光画像である。
【図１５】ｈｕＡｂＦ４６抗体のエピトープマッピングのためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図１６】ＳＥＭＡドメイン上のｈｕＡｂＦ４６抗体のエピトープの位置を確認した模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００９９】
以下、一つ以上の具体的な例を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これら実施例は、一つ以上の具体的な例を説明するためのものであり、発明の範囲がこれら実施例に限定されない。
【０１００】
参考例１：抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の作製
１．１．ｃ−Ｍｅｔに対するマウス抗体（ＡｂＦ４６）の産生
１．１．１．マウスの免疫化
ハイブリドーマ細胞株の開発に必要な免疫化されたマウスを得るために、一匹当たり１００μｇのヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と同量の完全フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）を混合して、５匹の４−６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ，  Ｉｎｃ．）の腹腔内に注射した。２週間後、上記と同様な方法で前記抗原で使用されたヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質を前回に注射した量の半分である５０μｇを同量の不完全フロイントアジュバント（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合してマウスの腹腔内に注射した。その１週間後に最後のブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）を行い、さらに３日後、前記マウスの尻尾から採血して血清を得た後、１／１０００の希釈倍率でＰＢＳを用いて希釈し、ＥＬＩＳＡ法によりｃ−Ｍｅｔを認識する抗体の力価が増加することを確認した。上記の結果から、抗体の量が十分に得られるマウスを選別して下記の細胞融合過程を行った。
【０１０１】
１．１．２．細胞融合およびハイブリドーマの製造
細胞融合実験の３日前、５０μｇのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質とＰＢＳ（１体積)との混合物をＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ，  Ｉｎｃ．）の腹腔内に注射し、免疫化されたマウスを麻酔した後、体の左側に位置する脾臓を摘出した。摘出した脾臓をメッシュで粉砕して細胞を分離し、培養培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合して脾臓細胞懸濁液を調製した。前記懸濁液を遠心分離して細胞層を回収した。上記で得られた脾臓細胞１×１０８個と骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０）１×１０８個とを混合した後、遠心分離して細胞を沈殿させた。遠心分離された沈殿物を徐々に分散させ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の４５％ＤＭＥＭ溶液（１ｍｌ）で処理し、３７℃で１分間維持させた後、培養培地（ＤＭＥＭ）１ｍｌを添加した。以降、培養培地（ＤＭＥＭ）１０ｍｌを１分間添加し、３７℃の水で５分間放置した後、５０ｍｌに合わせて再び遠心分離した。細胞沈殿物を分離培地（ＨＡＴ培地）に１〜２×１０５／ｍｌ程度に再懸濁させ、９６ウェルプレートに０．１ｍｌずつ分注し、３７℃の二酸化炭素培養器内で培養して、ハイブリドーマ細胞群を作製した。
【０１０２】
１．１．３．ｃ−Ｍｅｔタンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別
前記参考例１．１．２で製造されたハイブリドーマ細胞群のうち、ｃ−Ｍｅｔタンパク質にのみ特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選別するために、ヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質とヒトのＦｃタンパク質を抗原として用いたＥＬＩＳＡ分析方法を用いてスクリーニングを行った。
【０１０３】
マイクロタイタープレートにヒトのｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質を１ウェル当たり、それぞれ５０μｌ（２ｕｇ／ｍｌ）ずつ加えてプレート表面に付着させ、反応しない抗原は洗浄して除去した。ｃ−ＭｅｔでないＦｃに結合される抗体を選別して除外するために、ヒトのＦｃタンパク質を上記と同様な方法でプレート表面に付着させた。
【０１０４】
前記参考例１．１．２で得られたハイブリドーマ細胞の培養液を前記準備されたそれぞれのウェルに５０μｌずつを加えて１時間反応させた後、リン酸緩衝溶液−Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）溶液で十分に洗浄して反応しない培養液を除去した。ここにヤギ抗−マウスＩｇＧ−ホースラディッシュペルオキシダーゼを加えて１時間かけて室温で反応させた後、ＴＢＳＴ溶液で十分に洗浄した。次いで、ペルオキシダーゼの基質溶液（ＯＰＤ）を加えて反応させ、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、その反応の程度を確認した。
【０１０５】
上記のような反応の程度の確認によって、ヒトのＦｃには結合せず、ヒトのｃ−Ｍｅｔタンパク質にのみ特異的に高い結合力を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を反復して選別した。反復選別を通じて得たハイブリドーマ細胞株を制限稀釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）してモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株１個のクローンを最終的に得た。最終選別されたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマについては、２００９年１０月６日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国ソウル鍾路区蓮建洞に所在する韓国細胞株研究財団に寄託して受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２２０が与えられた（韓国公開特許第２０１１−００４７６９８参照）。また、本明細書では、当該ハイブリドーマによって産生されるマウス抗体を「ＡｂＦ４６」と称する。
【０１０６】
１．１．４．モノクローナル抗体の産生および精製
前記参考例１．１．３で得たハイブリドーマ細胞を無血清培地で培養し、培養液からモノクローナル抗体を産生し、精製した。
【０１０７】
まず、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが含まれている培養培地（ＤＭＥＭ）培地５０ｍｌで培養した前記ハイブリドーマ細胞を遠心分離し、細胞沈殿物を２０ｍｌのＰＢＳで２回以上洗浄してＦＢＳが除去された状態で、前記細胞沈殿物を培養培地（ＤＭＥＭ）５０ｍｌに再懸濁させ、３７℃の二酸化炭素培養器内で３日間培養した。
【０１０８】
以降、遠心分離して、抗体を産生する細胞を除去し、抗体が分泌された培養液を分離して、４℃にて保管するか、直ちに集めて抗体の分離精製に使用した。アフィニティーカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ａｇａｒｏｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）を装着したＡＫＴＡ精製機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて前記準備された培養液５０ｍｌ〜３００ｍｌから抗体を純粋精製した後、タンパク質凝集用フィルター（Ａｍｉｃｏｎ）を使用してＰＢＳで上層液を置換して精製された抗体を保管し、以降の実施例に使用した。
【０１０９】
１．２．ｃ−Ｍｅｔに対するキメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６の作製
一般にマウス抗体は治療目的でヒトに注入されると、免疫拒絶反応（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を示す可能性が高いことから、これを解決するために、前記実施例１で作製されたマウス抗体ＡｂＦ４６から、抗原結合に関連した変異領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を除いた不変領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）がヒトＩｇＧ１抗体の配列で置換されてなるキメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６を作製した。
【０１１０】
重鎖に該当するヌクレオチド配列は、「ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＴＧＡ−ＸｈｏＩ」（配列番号３８）から構成され、軽鎖に該当するヌクレオチド配列は、「ＥｃｏＲＩ−ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＴＧＡ−ＸｈｏＩ」（配列番号３９）から構成されるようにそれぞれデザインして遺伝子を合成した。以降、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに前記重鎖に相当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片（配列番号３８）を、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に相当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片（配列番号３９）をそれぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｓ）およびＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素を用いてクローニングすることによって、キメラ抗体の発現のための重鎖を含むベクターおよび軽鎖を含むベクターをそれぞれ構築した。
【０１１１】
前記構築されたベクターは、それぞれ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、一過性の発現は、ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。この際に用いた細胞株は２９３Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍを培地として使用して浮遊培養方式で培養を行った。一過性発現の一日前の細胞を５×１０５細胞／ｍｌの濃度に調製した後、２４時間経過後、細胞数が１×１０６細胞／ｍｌになったときに一過性発現を行った。ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を行い、１５ｍｌチューブ（ｔｕｂｅ）に重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の比率でＤＮＡを準備してＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）２ｍｌと混合し（チューブＡ）、さらに別の１５ｍｌチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ２ｍｌとを混合（チューブＢ）した後、（チューブＡ）と（チューブＢ）とを混合して１５分間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。その後、一日前に準備した細胞に混合液を徐々に混合した。形質導入の完了後、３７℃、８０％湿度、８％ＣＯ２、１３０ｒｐｍの培養器内で５日間培養した。
【０１１２】
以降、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２条件下で５時間培養した後、ＦＢＳが添加されていないＤＭＥＭ培地で４８時間にかけて３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
【０１１３】
前記培養した細胞を遠心分離して上澄み液をそれぞれ１００ｍｌ取り、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ＡＫＴＡ  ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０４０５−０３）を設置し、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１００４）で溶出させた。得られた溶出物をＰＢＳバッファーで交換して最終的にＡｂＦ４６のキメラ抗体（以下、ｃｈＡｂＦ４６と命名する）を精製した。
【０１１４】
１．３．キメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６からヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６の作製
１．３．１．重鎖のヒト化（Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）
Ｈ１−ｈｅａｖｙおよびＨ３−ｈｅａｖｙの２種のデザインのために、まずＩｇ  Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｉｇ  Ｂｌａｓｔ／）を通じて前記参考例１．２で精製されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＶＨ遺伝子と最も相同性が高いヒトの生殖腺遺伝子を分析した。その結果、ＶＨ３−７１がアミノ酸レベルで８３％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３をカバットナンバリングで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＨ３−７１のフレームワークに導入されるようにデザインした。この際、３０番目（Ｓ→Ｔ）、４８番目（Ｖ→Ｌ）、７３番目（Ｄ→Ｎ）、７８番目（Ｔ→Ｌ）のアミノ酸はもとのマウスＡｂＦ４６抗体のアミノ酸配列に対して逆突然変異（ｂａｃｋ−ｍｕｔａｔｉｏｎ）させた。以降、Ｈ１は追加的に８３番目（Ｒ→Ｋ）と８４番目（Ａ→Ｔ）アミノ酸に突然変異を与えて最終的にＨ１−ｈｅａｖｙ（配列番号４０）とＨ３−ｈｅａｖｙ（配列番号４１）を構築した。
【０１１５】
Ｈ４−ｈｅａｖｙのデザインのためにヒト抗体のフレームワーク配列を探索した結果、ＡｂＦ４６抗体のマウスフレームワーク配列と配列が非常に類似していると同時に、既存の最も安定であると知られていたＶＨ３  ｓｕｂｔｙｐｅを用いてカバットナンバリングで定義されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３を導入した。これを通じてＨ４−ｈｅａｖｙ（配列番号４２）を構築した。
【０１１６】
１．３．２．軽鎖のヒト化（Ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）
Ｈ１−ｌｉｇｈｔ（配列番号４３）およびＨ２−ｌｉｇｈｔ（配列番号４４２）の２種のデザインのために、Ｉｇ  Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｉｇ  Ｂｌａｓｔ／）を通じて、マウス抗体ＡｂＦ４６のＶＬ遺伝子と最も相同性が高いヒト生殖腺遺伝子を分析した。その結果、ＶＫ４−１がアミノ酸レベルで７５％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３をカバットナンバリングで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＫ４−１のフレームワークに導入されるようにデザインした。この際、Ｈ１−ｌｉｇｈｔは、３６番目（Ｙ→Ｈ）、４６番目（Ｌ→Ｍ）、４９番目（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を逆突然変異させ、Ｈ２−ｌｉｇｈｔは、４９番目（Ｙ→Ｉ）の１個のみのアミノ酸を逆突然変異させて構築した。
【０１１７】
Ｈ３−ｌｉｇｈｔ（配列番号４５）のデザインのために、Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｉｇ  Ｂｌａｓｔ／）を通じてマウス抗体ＡｂＦ４６のＶＬ遺伝子と最も相同性が高いヒト生殖腺遺伝子を分析した結果の中で、前記ＶＫ４−１以外にＶＫ２−４０を選定した。マウス抗体ＡｂＦ４６ＶＬとＶＫ２−４０は、アミノ酸レベルで６１％の相同性を有することを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３をカバットナンバリングで定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分がＶＫ４−１のフレームワークに導入されるようにデザインした。この際、Ｈ３−ｌｉｇｈｔは、３６番目（Ｙ→Ｈ）、４６番目（Ｌ→Ｍ）、４９番目（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸を逆突然変異させて構築した。
【０１１８】
Ｈ４−ｌｉｇｈｔ（配列番号４６）のデザインのために、ヒト抗体のフレームワーク配列を探索した結果、既存の最も安定であると知られていたＶｋ１  ｓｕｂｔｙｐｅを用いてカバットナンバリングで定義されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３を導入した。この際、Ｈ４−ｌｉｇｈｔは、３６番目（Ｙ→Ｈ）、４６番目（Ｌ→Ｍ）、４９番目（Ｙ→Ｉ）の３個のアミノ酸をさらに逆突然変異させて構築した。
【０１１９】
以降、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに前記重鎖に相当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片（Ｈ１−ｈｅａｖｙ；配列番号４７、Ｈ３−ｈｅａｖｙ；配列番号４８、Ｈ４−ｈｅａｖｙ；配列番号４９）をｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに、前記軽鎖に相当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片（Ｈ１−ｌｉｇｈｔ；配列番号５０、Ｈ２−ｌｉｇｈｔ；配列番号５１、Ｈ３−ｌｉｇｈｔ；配列番号５２、Ｈ４−ｌｉｇｈｔ；配列番号５３）をそれぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｓ）およびＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素を使用してクローニングすることによって、ヒト化抗体の発現のためのベクターを構築した。
【０１２０】
前記構築されたベクターは、それぞれ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、一過的な発現は、ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。この際に用いた細胞株は２９３Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養を行った。一過性発現一日前の細胞を５×１０５細胞／ｍｌの濃度に調製した後、２４時間経過後、細胞数が１×１０６細胞／ｍｌになったときに一過性発現を行った。ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を行い、１５ｍｌチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の比率でＤＮＡを準備してＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）２ｍｌと混合し（チューブＡ）、さらに別の１５ｍｌチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ２ｍｌを混合（チューブＢ）した後、（チューブＡ）と（チューブＢ）とを混合して１５分間インキュベーションした。その後、一日前に準備した細胞に混合液を徐々に混合した。形質導入の完了後、３７℃、８０％湿度、８％ＣＯ２、１３０ｒｐｍの培養器内で５日間培養した。
【０１２１】
前記培養した細胞を遠心分離して上澄み液をそれぞれ１００ｍｌ取り、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ＡＫＴＡ  ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０４０５−０３）を設置し、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで交換して最終的にＡｂＦ４６のヒト化抗体（以下、ｈｕＡｂＦ４６と命名する）を精製した。一方、以降の実施例で用いたヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６の重鎖、軽鎖の組み合わせはＨ４−ｈｅａｖｙ（配列番号４２）およびＨ４−ｌｉｇｈｔ（配列番号４６）である。
【０１２２】
１．４．ｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖライブラリーの作製
ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を用いてｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖを作製するための遺伝子をデザインした。それぞれ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を「ＶＨ−リンカー−ＶＬ」の形態になるようにし、前記リンカーは「ＧＬＧＧＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＳＧＶＧＳ」（配列番号５４）のアミノ酸配列を有するようにデザインした。このようにデザインされたｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド（配列番号５５）をＢｉｏｎｅｅｒ社に依頼して合成し、これを発現させるためのベクターのヌクレオチド配列を配列番号５６に示した。
【０１２３】
以降、前記ベクターから発現した結果物を分析して、ｃ−Ｍｅｔに特異的な結合力を示すことを確認した。
【０１２４】
１．５．親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）のためのライブラリー遺伝子の作製
１．５．１．標的ＣＤＲの選定およびプライマーの作製
ｈｕＡｂＦ４６抗体の親和性成熟のために、６個の相補性決定部位（ＣＤＲ）を前記作  されたマウス抗体ＡｂＦ４６から「カバットナンバリング」により定義した。それぞれのＣＤＲは下記表１のとおりである。
【０１２５】
【表１】
2015027988.tif 000004
【０１２６】
抗体ＣＤＲのランダム配列導入のために次のとおりプライマーを作製した。既存のランダム配列導入方式は、突然変異を与えようとする部位に同一比率の塩基（２５％Ａ、２５％Ｇ、２５％Ｃ、２５％Ｔ）が導入されるようにＮコドンを用いたが、本実施例ではｈｕＡｂＦ４６抗体のＣＤＲにランダムに塩基を導入するために、各ＣＤＲのアミノ酸をコードする３個の野生型ヌクレオチド中の１番目と２番目のヌクレオチドの８５％はそのまま保存し、残りの３個の塩基をそれぞれ５％ずつ導入する方法を取った。また、３番目のヌクレオチドは同一に（３３％Ｇ、３３％Ｃ、３３％Ｔ）導入されるようにプライマーをデザインした。
【０１２７】
１．５．２．ｈｕＡｂＦ４６抗体のライブラリー作製およびｃ−Ｍｅｔに対する結合力の確認
ＣＤＲのランダム配列導入を通じた抗体ライブラリー遺伝子の構築を、前記参考例１．５．１のような方法で作製されたプライマーを用いて行った。鋳型としてｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖを含むポリヌクレオチドを用いて、図１に示した方法のように２個のＰＣＲ断片を作製し、これを重複伸長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ）方法を通じて、所望のＣＤＲのみがそれぞれ突然変異したｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖライブラリー遺伝子を得て、作製された６個のＣＤＲをそれぞれ標的とするライブラリーを構築した。
【０１２８】
このように作製されたライブラリーは、野生型と各ライブラリーのｃ−Ｍｅｔに対する結合力を確認しており、それぞれのライブラリーは、野生型に比べてｃ−Ｍｅｔに対する結合力がだいぶ低くなる傾向を示したが、一部ｃ−Ｍｅｔに対する結合力は維持される突然変異を確認した。
【０１２９】
１．６．作製されたライブラリーから親和性が改善された抗体の選別
前記構築されたライブラリーからｃ−Ｍｅｔに対するライブラリーの結合力を向上させた後、それぞれの個別クローンからｓｃＦｖの遺伝子配列を分析した。得られた遺伝子配列はそれぞれ下記表２のとおりであり、これをＩｇＧ形態で変換した。下記クローンのうち、Ｌ３−１、Ｌ３−２、Ｌ３−３、Ｌ３−５から生産された４種の抗体を選別して後続の実験を行った。
【０１３０】
【表２】
2015027988.tif 000005
【０１３１】
１．７．選別された抗体のＩｇＧへの変換
選別された４種の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドは、「ＥｃｏＲＩ−シグナル配列−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＸｈｏＩ」（配列番号３８）から構成され、重鎖の場合、親和性成熟後、抗体のアミノ酸が変更されなかったため、ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖をそのまま使用した。ただし、ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１のヒンジでなく、Ｕ６−ＨＣ７ヒンジ（配列番号５７）で置換した。軽鎖は、「ＥｃｏＲＩ−シグナル配列−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＸｈｏＩ」から構成されるようにそれぞれデザインして遺伝子を合成し、親和性成熟後に選別された前記４種の抗体の軽鎖可変領域を含んでコードするポリヌクレオチド（配列番号５８〜配列番号６１）をＢｉｏｎｅｅｒ社に依頼して合成した。以降、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに前記重鎖に相当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片（配列番号３８）を、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に相当するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片（Ｌ３−１由来ＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ断片：配列番号５８、Ｌ３−２由来ＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ断片：配列番号５９、Ｌ３−３由来ＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ断片：配列番号６０、Ｌ３−５由来ＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ断片：配列番号６１）をそれぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１０１Ｓ）およびＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素を用いてクローニングすることによって、親和性成熟した抗体の発現のためのベクターを構築した。
【０１３２】
前記構築されたベクターは、それぞれ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、一過性の発現は、ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。この際に用いた細胞株は２９３Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ    ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養を行った。一過性発現の一日前の細胞を５×１０５細胞／ｍｌの濃度に調製した後、２４時間経過後、細胞数が１×１０６細胞／ｍｌになったときに一過性発現を行った。ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を行い、１５ｍｌチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の比率でＤＮＡを準備してＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）２ｍｌと混合し（チューブＡ）、さらに別の１５ｍｌチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ２ｍｌとを混合（チューブＢ）した後、（チューブＡ）と（チューブＢ）とを混合して１５分間インキュベーションした後、一日前に準備した細胞に混合液を徐々に混合した。形質導入の完了後、３７℃、８０％湿度、８％ＣＯ２、１３０ｒｐｍの培養器内で５日間培養した。
【０１３３】
前記培養した細胞を遠心分離して上澄み液をそれぞれ１００ｍｌ取り、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ＡＫＴＡ  ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０４０５−０３）を設置し、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで交換して最終的に親和性成熟した４種の抗体（以下、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｌ３−１由来）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２（Ｌ３−２由来）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３（Ｌ３−３由来）、およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５（Ｌ３−５由来）と命名する）を精製した。
【０１３４】
１．８．不変領域および／またはヒンジ領域が置換されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の製造
前記参考例１．７で選別された４種の抗体のうち、ｃ−Ｍｅｔとの結合親和性が最も高く、Ａｋｔリン酸化およびｃ−Ｍｅｔ分化程度が最も低いという測定結果を示したｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１を対象に、ヒンジ領域のみ、または不変領域およびヒンジ領域が置換された抗体を作製した。
【０１３５】
ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１重鎖可変領域、Ｕ６−ＨＣ７ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変領域からなる重鎖およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ（ｋａｐｐａ）不変領域からなる軽鎖からなる抗体をｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）と命名し；ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変領域からなる重鎖およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖からなる抗体をｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２  ｈｉｎｇｅ）と命名し；ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ２不変領域からなる重鎖およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖からなる抗体をｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２  Ｆｃ）と命名した。一方、前記３種の抗体は、生産量増大のためにヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖の３６番目のヒスチジンを全てチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）で置換した。
【０１３６】
前記３種の抗体を作製するために、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、Ｕ６−ＨＣ７ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変領域からなるポリペプチド（配列番号６２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６３）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ１不変領域からなるポリペプチド（配列番号６４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６５）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の重鎖可変領域、ヒトのＩｇＧ２ヒンジおよびヒトのＩｇＧ２不変領域からなるポリペプチド（配列番号６６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６７）、３６番目のヒスチジンがチロシンで置換されたｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ不変領域からなるポリペプチド（配列番号６８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６９）をＢｉｏｎｅｅｒ社に依頼して合成した。以降、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに前記重鎖に相当する塩基配列を有するＤＮＡ断片を挿入し、また、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．８３００−０１）に前記軽鎖に相当する塩基配列を有するＤＮＡ切片を挿入して、前記抗体の発現のためのベクターを構築した。
【０１３７】
前記構築されたベクターは、それぞれ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、一過性の発現は、ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。この際に用いた細胞株は２９３Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養を行った。一過性発現の一日前の細胞を５×１０５細胞／ｍｌの濃度に調製した後、２４時間経過後、細胞数が１×１０６細胞／ｍｌになったときに一過性発現を行った。ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を行い、１５ｍｌチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の比率でＤＮＡを準備してＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）２ｍｌと混合し（チューブＡ）、さらに別の１５ｍｌチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ２ｍｌを混合（チューブＢ）した後、（チューブＡ）と（チューブＢ）とを混合して１５分間インキュベーションした後、一日前に準備した細胞に混合液を徐々に混合した。形質導入の完了後、３７℃、８０％湿度、８％ＣＯ２、１３０ｒｐｍの培養器内で５日間培養した。
【０１３８】
前記培養した細胞を遠心分離して上澄み液をそれぞれ１００ｍｌ取り、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ＡＫＴＡ  ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０４０５−０３）を設置し、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで交換して最終的に３種の抗体（ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２  ｈｉｎｇｅ）、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２  Ｆｃ））を精製した。このうち、本発明による抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を代表してｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２  Ｆｃ）を選択して下記の実施例に使用し、便宜上、前記抗体をそれぞれ抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ（ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７）および抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ  ＩｇＧ２（ｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２  Ｆｃ））と命名した。
【０１３９】
１．９．ｈｕＡｂＦ４６抗体のエピトープマッピング（ｍａｐｐｉｎｇ）のためのペプチド作製
（１）エピトープマッピング
１）ｈｕＡｂＦ４６抗体のエピトープマッピングのためのペプチド作製
ｃ−ＭｅｔのＳＥＭＡドメインを含む５４３個のアミノ酸配列および構造は、ＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ）ＩＤ：１ＵＺＹに示されており、これらアミノ酸配列に基づいてＣＬＩＰＳ（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）技術を用いて構造的エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｔｉｔｏｐｅ）と不連続的エピトープ（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｅｐｉｔｏｐｅ）を作成可能な６０６３個の他の配列がデザインされ合成された（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｉｍｉｃｒｙ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｕｓｉｎｇ  ＣＬＩＰＳＴＭ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２０：２８３−００）。ペプチドアレイ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｒｒａｙ）作製の過程を詳しく説明すると、ＣＬＩＰＳ技術は、既存の典型的な方法である約１５個のアミノ酸長を有する線状ペプチド以外にＣＬＩＰＳ（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）と呼ばれる‘ＰｅｐＳｃａｎ’社固有の構造を有するペプチドを作製する方法であって、ｈｕＡｂＦ４６抗体を対象に線状ペプチドおよびＣＬＩＰＳペプチドの全てに対して結合力を測定した。ＣＬＩＰＳペプチド中のＴ２  ＣＬＩＰＳペプチドは、２個のシステインがループ（ｌｏｏｐ）を形成した構造を人為的にペプチドに付与し、Ｔ３  ＣＬＩＰＳペプチドは、３個のシステインがループを形成した構造をペプチドに付与する。また、Ｔ２Ｔ３またはＴ２Ｔ２のような結合型ペプチドを作製することもできる。
【０１４０】
エピトープマッピングのために総６０６３個のペプチドを作製し（ペプチドアレイの作製はＰｅｐＳｃａｎ社に依頼）、１〜５２９番のペプチドは、典型的な線状ペプチドであって、一部領域がオーバーラッピング（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）されるように１５個のアミノ酸長で作製された。５３０〜１０５８番のペプチドは、Ｔ２  ＣＬＩＰＳペプチドに１〜５２９番のペプチドを導入して作製した。１０５９〜２０１４番のペプチドは、Ｔ３  ＣＬＩＰＳペプチドに１５個のアミノ酸を有するペプチド２個を連結して総９５６個を作製した。２０１５〜６０６３番ペプチドは、８乃至３５個のアミノ酸残基を有するペプチドグループ間の結合を通じて線状および非連続的な構造を有するエピトープを探すためのペプチドで、総４０４８個が作製された。
【０１４１】
例えば、Ｔ２  ＣＬＩＰＳペプチドを含むペプチドアレイは、次のような方法で作製する。０．５ｍＭのＴ２  ＣＬＩＰＳペプチドが含まれている１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼン溶液をアンモニウムビカーボネート（２０ｍＭ、ｐＨ７．９）／アセトンニトリル（１：１（ｖ／ｖ））に溶解させ、前記結果物溶液をペプチドアレイに添加した。前記ＣＬＩＰＳ鋳型は、ペプチドアレイ（３ｕｌのウェルを有する４５５個のウェルプレート）の固相結合されたペプチド内に存在する２個のシステインの側鎖に結合する。前記溶液が完全に覆われるように３０〜６０分間かけて前記溶液内でペプチドアレイを徐々に振る。最後に、前記ペプチドアレイを過量の水で十分に洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）内に１％ＳＤＳ／０．１％β−メルカプトエタノールが含まれている破砕−緩衝液で３０分間かけて７０℃の温度条件で超音波粉砕した後、４５分間水で追加的に超音波粉砕を行った。Ｔ３  ＣＬＩＰＳペプチドは、前記方法と同一であるが、３個のシステインの側鎖に結合するようにする。
【０１４２】
前記ペプチドを用いてＥＬＩＳＡを通じてエピトープマッピングを行った結果、ｈｕＡｂＦ４６の核心エピトープは、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の１６８番目アミノ酸から１７１番目アミノ酸からなるペプチドであるＥＥＰＳＱ（配列番号７３）であることを確認することができた。
【０１４３】
２）ｈｕＡｂＦ４６抗体のエピトープマッピング（ｍａｐｐｉｎｇ）のためのＥＬＩＳＡ分析
エピトープマッピングのために総５２９個の線状ペプチドおよびＣＬＩＰＳペプチドを用いてＰＥＰＳＣＡＮベースのＥＬＩＳＡ分析を行った。前記ペプチドは、５％ブロッキング溶液（４％卵アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、５％ウマ血清および１％のＴｗｅｅｎ８０）を用いて３０分間常温で反応させた。以降、１％のＴｗｅｅｎ８０が添加されたＰＢＳで４℃で一晩中反応させた１〜１００μｇ／ｍｌ範囲のｈｕＡｂＦ４６抗体を前記ペプチドに反応させた後、洗浄した。以降、ウサギ抗ヒツジ抗体（ＳＩＧＭＡ）で処理し、ＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシダーゼが付着されたブタ抗ウサギ抗体（ＳＩＧＭＡ）で処理し、ＰＢＳで洗浄した。以降、３％のＨ２Ｏ２に２μｌ／ｍｌのペルオキシダーゼ２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）（ＳＩＧＭＡ）で処理し、１時間後に発色反応を測定した。
【０１４４】
その結果、図１５に示されるように、線状ペプチドおよびＣＬＩＰＳペプチドの全てにおいて、「ＥＥＰＳＱ」配列（配列番号７３）を含むペプチドのみで特異的なＥＬＩＳＡ陽性反応を示し、そのため、前記ｈｕＡｂＦ４６は、ｃ−Ｍｅｔの線状エピトープおよび構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）を全て認識する抗体であることを確認することができた。
【０１４５】
また、前記「ＥＥＰＳＱ」（配列番号７３）エピトープの中で一部の肺癌患者または卵巣癌患者で発見されることが知られているｃ−Ｍｅｔ  ＳＥＭＡ部位の代表的な突然変異であるＥ１６８Ｄ変異が形成されたポリペプチドを用いて上記と同様な方法でＥＬＩＳＡを行った結果、下記表３のような結果を得た。
【０１４６】
【表３】
2015027988.tif 000006
【０１４７】
前記結果から、ｈｕＡｂＦ４６抗体はＥ１６８Ｄ変異を有するｃ−Ｍｅｔ  ＳＥＭＡには結合できず、したがって、前記抗体は癌発病情報を提供するための診断方法に利用可能であることを意味する。
【０１４８】
３）ｈｕＡｂＦ４６抗体のエピトープマッピングの結果分析
前記実験から、ｈｕＡｂＦ４６抗体は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の１６８番目アミノ酸から１７１番目のアミノ酸からなるペプチドの「ＥＥＰＳＱ」配列を含む線状ペプチドおよびＣＬＩＰＳペプチドの全てにおいて、非特異的な反応なしに特異的な結合反応を示した。これはｈｕＡｂＦ４６抗体がｃ−Ｍｅｔタンパク質中の線状エピトープおよび構造的エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）の全てに結合することを意味し、これを分子構造の側面から確認すると（ＰｙＭＯＬ１．４．１（ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）、Ｃｎ３Ｄ  ４．１（ＮＣＢＩ））、図１６に示したように、ｈｕＡｂＦ４６抗体のエピトープは、ＳＥＭＡドメインに位置し、ＨＧＦの結合部位でも、直接的な結合部位と近い方のループ（ｌｏｏｐ）に相当する位置であることを確認することができた。
【０１４９】
（２）Ｆｕｌｌ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ結果分析
ＥＥＰＳＱ配列の各アミノ酸部位を元来のアミノ酸でない他の２０種のアミノ酸で置換し、これらそれぞれのペプチドがｈｕＡｂＦ４６抗体との結合力に如何なる変化が発生するかを７種のペプチドアレイを通じて詳細に分析した。
【０１５０】
分析の結果、ＥＥＰＳＱのアミノ酸配列中のいずれのアミノ酸が前記抗体の結合に重要であるかを確認し、特に前段のＥＥＰ配列が抗体の結合に非常に重要な要素であることを確認することができた。
【０１５１】
１．１０．ＳＥＭＡドメインの突然変異によるｈｕＡｂＦ４６抗体の結合力分析
ＥＥＰＳＱ配列の各アミノ酸部位または５個のアミノ酸全体を元来のアミノ酸でないアラニンで置換し、これらそれぞれのペプチド（「ＡＡＡＡＡ」、「ＡＥＰＳＱ」、「ＥＡＰＳＱ」、「ＥＥＡＳＱ」、「ＥＥＰＳＱ」、「ＥＥＰＳＡ」、配列番号１３２〜配列番号１３７）とｈｕＡｂＦ４６抗体の結合力をＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて測定した。ＣＭ５チップ上にｈｕＡｂＦ４６抗体を約８０〜１１０ＲＵだけ固定させた後、抗原である前記配列番号１３２〜配列番号１３７のペプチドを１００ｎＭから０．３９ｎＭまでの濃度範囲内で互いに異なる９個の濃度で、且つ３０μｌ／ｍｉｎの速度で注入して、下記表４のようにｋｏｎ値とｋｏｆｆ値を求め、これからＫＤ値を計算した。その結果、アミノ酸が置換されたペプチドにはｈｕＡｂＦ４６抗体が結合できず、このような結果を通じて「ＥＥＰＳＱ」配列がｈｕＡｂＦ４６抗体における必須のエピトープであることを確認することができた。
【０１５２】
【表４】
2015027988.tif 000007
【０１５３】
参考例２：抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖの作製
ＥＧＦＲに結合する抗体の配列は、抗ＥＧＦＲ抗体のｓｃＦｖ配列に基づいて重鎖可変部位と軽鎖可変部位の間に（Ｇ４Ｓ）３リンカーペプチドを入れて作製した。具体的に、自動化遺伝子合成（Ｂｉｏｎｅｅｒ社に依頼）でヒト化抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変部位（配列番号１０９）コードＤＮＡ配列（配列番号１１０）と軽鎖可変部位（配列番号１１１）コードＤＮＡ配列（配列番号１１２）との間に（ＧＧＧＧＳ）３リンカーペプチドコードＤＮＡ配列を添加して抗ＥＧＦＲ抗体のｓｃＦｖをコードするＤＮＡを合成した。
【０１５４】
一方、重鎖可変部位（配列番号１０９）の５１番目のアミノ酸ＦをＩで置換し、６２番目のアミノ酸ＱをＳで置換し、軽鎖可変部位（配列番号１１１）の４６番目のアミノ酸ＲをＬで置換し、８３番目のアミノ酸ＦをＥで置換したことを除いては、上記と同様な方法で１次変形された抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖを作製した。このような変形で抗体の熱安定性を増進させることができる。また、前記１次変形に重鎖の４４番目のアミノ酸および軽鎖の１００番目のアミノ酸をＣで置換することを加えて２次変形された抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖを作製した。具体的に、重鎖可変部位（配列番号１０９）の５１番目のアミノ酸ＦをＩで置換し、４４番目のアミノ酸ＧをＣで置換し、６２番目のアミノ酸ＱをＳで置換し、軽鎖可変部位（配列番号１１１）の４６番目のアミノ酸ＲをＬで置換し、８３番目のアミノ酸ＦをＥで置換し、１００番目のアミノ酸ＧをＣで置換したことを除いては、上記と同様な方法で２次変形された抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ（重鎖可変部位：配列番号１１３；軽鎖可変部位：配列番号１１４）を作製した。このような変形で安定化ジスルフィド結合が導入されて抗体の生体内薬物動態学的特性（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）を改善させることができる。なお、前記抗体内のアミノ酸の位置は、カバットナンバリングに従った。
【０１５５】
このようにして得られた抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ、または１次もしくは２次変形された抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖを下記の二重特異性抗体の作製に使用した。
【０１５６】
参考例３：抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖの作製
Ｈｅｒ２に結合するｓｃＦｖ抗体の配列は、トラスツズマブ（ハーセプチン）の配列に基づいて重鎖可変部位と軽鎖可変部位との間にペプチドリンカー（Ｇ４Ｓ）３を入れて作製した。具体的に、自動化遺伝子合成（Ｂｉｏｎｅｅｒ社）で抗ＨＥＲ２抗体（ハーセプチン）の重鎖可変部位（配列番号１１５）コードＤＮＡ配列（配列番号１１６）と軽鎖可変部位（配列番号１１７）コードＤＮＡ配列（配列番号１１８）との間に（ＧＧＧＧＳ）３リンカーコードＤＮＡ配列を添加して抗ＨＥＲ２抗体のｓｃＦｖコードＤＮＡを合成した。
【０１５７】
【化２】
2015027988.tif 000008
【０１５８】
このようにして得られた抗ＨＥＲ２抗体のｓｃＦｖ（抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ）を下記の二重特異性抗体の作製に使用した。
【０１５９】
実施例１：二重特異性抗体の作製
１．１．抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体の作製
前記参考例１で作製された抗ｃＭｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ  ＩｇＧ２のＦｃのＣ末端に前記参考例２で作製された抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖまたは１次もしくは２次変形された抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖを融合した。その融合過程は次のとおりである。
【０１６０】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．８３００−０１）にＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いて前記参考例１で作製された抗ｃＭｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２の重鎖に該当する塩基配列を有するＤＮＡ断片を挿入し、ｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに前記軽鎖に該当するＤＮＡ断片を挿入した。以降、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３に挿入されたＬ３−１Ｙ−ＩｇＧ２のＦｃのＣ末端に前記参考例２で作製された抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖを（Ｇ４Ｓ）２からなる１０個のアミノ酸長を有するリンカーペプチドを用いて融合することによって二重特異性抗体の発現のためのベクターを構築した。
【０１６１】
前記構築されたベクターは、それぞれ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅され、一過性の発現を、ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。この際に用いた細胞株は２９３Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養を行った。一過性発現の一日前の細胞を５×１０５細胞／ｍｌの濃度に調製した後、２４時間経過後、細胞数が１×１０６細胞／ｍｌになったときに一過性発現を行った。ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を行い、１５ｍｌチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝１：１の比率でＤＮＡを準備してＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）２ｍｌと混合し（チューブＡ）、さらに別の１５ｍｌチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ２ｍｌを混合（チューブＢ）した後、（チューブＡ）と（チューブＢ）とを混合して１５分間インキュベーションした後、一日前に準備した細胞に混合液を徐々に混合した。形質導入の完了後、３７℃、８０％湿度、８％ＣＯ２、１３０ｒｐｍの培養器内で５日間培養した。
前記培養した細胞を遠心分離して上澄み液をそれぞれ１００ｍｌ取り、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ＡＫＴＡ  ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０４０５−０３）を設置し、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで交換して最終的に抗ｃＭｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体を精製した。
【０１６２】
前記作製された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２のＣ末端に抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖが融合された抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体をＭＥ−０１と命名し、Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２のｃ−末端に前記１次変形された抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖが融合された抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体をＭＥ−０３と命名し、Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２のｃ−末端に前記２次変形された抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖが融合された抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体をＭＥ−０３Ｓと命名した。
【０１６３】
前記作製された抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体の２種の抗原（ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ）に対するそれぞれの親和性をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（ＧＥ）を用いて確認した。ヒトＦａｂ結合剤（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＣＭ５チップ（♯ＢＲ−１００５−３０、ＧＥ）の表面に製造会社の説明書に従って固定化させた。約９０〜１２０ＲＵのＭＥ０３Ｓを捕捉し、多様な濃度のｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃ（♯３５８−ＭＴ／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＥＧＦＲ−Ｆｃ（♯３４４−ＥＲ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を前記捕捉された抗体に注入した。ここに１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）溶液を注入して前記表面を再生させた。親和性を測定するために、前記実験で得られたデータをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてフィッティングした。
【０１６４】
前記得られた結果を下記の表５に示した。
【０１６５】
【表５】
2015027988.tif 000009
【０１６６】
表５に示したように、前記製造された抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体は、２種の抗原に全て結合することを確認することができた。
【０１６７】
１．２．抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の作製
前記参考例１で作製された抗ｃＭｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２（ｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２  Ｆｃ））のＦｃのＣ末端に前記参考例３で作製された抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖを融合した。その融合過程は次のとおりである。
【０１６８】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．８３００−０１）にＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いて前記参考例１で作製された抗ｃＭｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２の重鎖に相当する塩基配列（配列番号６６）を有するＤＮＡ断片を挿入し、ｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに前記抗ｃＭｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２の軽鎖に相当する塩基配列（配列番号６８）を有するＤＮＡ断片を挿入した。以降、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３に挿入されたＬ３−１Ｙ−ＩｇＧ２のＦｃのＣ末端に前記参考例３で作製された抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖコードＤＮＡを（ＧＧＧＧＳ）２からなるペプチドリンカーのコードＤＮＡ配列を用いて融合することによって二重特異性抗体の発現のためのベクターを構築した。
【０１６９】
前記構築されたベクターをそれぞれＱｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．１２６６２）を用いて増幅し、一過性の発現を、ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。この際に用いた細胞株は２９３Ｆ細胞であり、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍを培地として用いて浮遊培養方式で培養を行った。一過性発現の一日前の細胞を５×１０５細胞／ｍｌの濃度に調製した後、２４時間経過後、細胞数が１×１０６細胞／ｍｌになったときに一過性発現を行った。ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ法で形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を行い、１５ｍｌチューブに重鎖ＤＮＡ：軽鎖ＤＮＡ＝３：２の比率でＤＮＡを準備してＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）の２ｍｌと混合し（チューブＡ）、さらに別の１５ｍｌチューブにＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔ１００μｌとＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭ２ｍｌを混合（チューブＢ）した後、（チューブＡ）と（チューブＢ）とを混合して１５分間インキュベーションした後、一日前に準備した細胞に混合液を徐々に混合した。形質導入の完了後、３７℃、８０％湿度、８％ＣＯ２、１３０ｒｐｍの培養器内で５日間培養した。
【０１７０】
前記培養した細胞を遠心分離して上澄み液をそれぞれ１００ｍｌ取り、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ＡＫＴＡ  ＰｒｉｍｅにＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０４０５−０３）を設置し、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１００４）で溶出した。これをＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで交換して最終的に抗ｃＭｅｔ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体を精製した。
【０１７１】
前記作製された抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２のＣ末端に抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖが融合された抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体をＭＨ２−０１と命名した。
【０１７２】
前記作製された抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の２種の抗原（ｃＭｅｔ／Ｈｅｒ２）に対するそれぞれの親和性をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（ＧＥ）を用いて確認した。ヒトＦａｂ結合剤（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＣＭ５チップ（♯ＢＲ−１００５−３０、ＧＥ）の表面に製造会社の説明書に従って固定化させた。約９０〜１２０ＲＵのＭＨ２−０１を捕捉し、多様な濃度のｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃ（♯３５８−ＭＴ／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＨｅｒ２−Ｆｃ（１１２９−ＥＲ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を前記捕捉された抗体に注入した。ここに１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）溶液を注入して前記表面を再生させた。親和性を測定するために、前記実験で得られたデータをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてフィッティングした。
【０１７３】
前記得られた結果を表６に示した。
【０１７４】
【表６】
2015027988.tif 000010
【０１７５】
表６に示したように、前記実施例１で作製された二重特異性抗体ＭＨ２−０１は、ｃ−ＭｅｔとＨｅｒ２に全て結合することが確認された
実施例２：二重特異性抗体のｃ−Ｍｅｔ分解
前記実施例１．１および１．２で作製された抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体および抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体の癌細胞の増殖抑制効果を胃癌細胞株であるＭＫＮ４５を用いて確認した。
【０１７６】
全ての細胞株は、ＲＰＭＩ１６４０培地（♯１１８７５−０９３、Ｇｉｂｃｏ）に１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳと１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシンを添加して５％ＣＯ２および３７℃の条件で培養した。
【０１７７】
前記実施例１．１および１．２で作製された抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体のｃ−Ｍｅｔタンパク質の分解の程度を確認するために、相対的な総ｃ−Ｍｅｔ量を測定した。相対的な総ｃ−Ｍｅｔ量を測定するのは、抗体がｃ−Ｍｅｔに結合して内在化を起こしてｃ−Ｍｅｔの分解を引き起こすという事実を利用して、総ｃ−Ｍｅｔ量の増減を把握することにより抗体の効能を検査するためである。
【０１７８】
まず、ＭＫＮ４５胃癌細胞（医薬基盤研究所 ＪＣＲＢ細胞バンク）２×１０５細胞／ｍｌと前記実施例１で作製された抗体５μｇ／ｍｌを９６ウェルプレートに同時にアプライした後、２４時間培養した。以降、抗体で処理された細胞を溶解させ、Ｈｕｍａｎ  ｔｏｔａｌ  ＨＧＦ  Ｒ／ｃ−ＭＥＴ  ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹＣ３５８）を用いて総ｃ−Ｍｅｔ量の変化を測定した後に分析した。
【０１７９】
前記得られた結果を図４に示した。図４に示されているように、ｃ−Ｍｅｔが過発現される細胞であるＭＫＮ４５胃癌細胞株を抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体ＭＥ−０１およびＭＥ−０３で処理することによって、ｃ−Ｍｅｔの８６．８％および８８．４％が分解されることが観察された。また、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗Ｈｅｒ二重特異性抗体ＭＨ２−０１で処理することによって、ｃ−Ｍｅｔの約８０％が分解されることが観察された。これは前記二重特異性抗体中の抗ｃ−Ｍｅｔドメインである抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｌ３−１ＹおよびＬ３−１Ｙ  ＩｇＧ２を単独処理した場合のｃ−Ｍｅｔ分解活性と比較して顕著に増進されたものである。このような結果は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が抗ＥＧＦＲ抗体（ｓｃＦｖ）または抗ＨＥＲ２抗体（ｓｃＦｖ）との融合により上昇したｃ−Ｍｅｔ分解活性を有することを示す。
【０１８０】
実施例３：抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体によるＥＧＦＲの細胞内移動および分解
ＭＫＮ４５細胞株（医薬基盤研究所 ＪＣＲＢ細胞バンク）を２×１０４細胞／ウェルの量で準備し、ここにＬ３−１Ｙ−ＩｇＧ２（参考例１）、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（下記参照）、および抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体ＭＥ−０３（実施例１．１）をそれぞれ単独処理または併用処理の方法で各ウェル当たり５μｇ／ｍｌの濃度になるように添加して４時間かけて３７℃で処理した。併用投与の場合にも各抗体を５μｇ／ｍｌの濃度で添加した。対照群として、抗体処理なしにＰＢＳのみを処理した群を準備した。ここに４％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを１５分間処理して細胞をプレートに固定させ、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、ブロッキングバッファー（０．５％のｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００および５％のロバ血清）を常温で１時間処理した。その後、ｃ−Ｍｅｔ（ＦＡＢ３５８２Ａ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＥＧＦＲ（♯５６１６、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対する１次抗体を１：１００に希釈して１００μｌの量で１５時間かけて４℃で処理した。ＰＢＳで３回洗浄した後、２次抗体（Ａ２１４３３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：２０００で希釈して１００μｌの量で１時間かけて常温で処理し、再びＰＢＳで３回洗浄してＤＡＰＩが含まれているｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｈ−１２００、Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂ）でプレートを準備した。前記準備された細胞を共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ＬＳＭ７１０）で細胞を観察した。
【０１８１】
前記抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  ａｂ）は、ＥＧＦＲを認識するｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体であって、前記参考例２に記載された配列番号１０９の重鎖可変部位と配列番号１１１の軽鎖可変部位とをＩｇＧ２  ＦｃのＮ末端に融合させて作製したものである。
【０１８２】
前記得られた結果を図５に示した。図５に示されているように、細胞膜上にｃ−Ｍｅｔが過発現された状態で抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体を処理すると（右側）、標的細胞膜タンパク質であるＥＧＦＲが細胞内に移動および分解されることが観察された。一方、ｃ−Ｍｅｔに対するモノクローナル抗体を処理した場合には、ＥＧＦＲの細胞内移動は観察されなかった。また、ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  ａｂ）処理によっても何ら変化がなかった。これは抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体によって細胞膜に位置するＥＧＦＲが細胞内に移動して分解されることを裏付ける結果である。
【０１８３】
一方、二重特異性抗体の効能を各抗体を併用投与する場合と比較するために、前記製造された抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  ａｂ）、Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２（参考例１）、および抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体ＭＥ−０３（実施例１．１）をそれぞれ単独処理または併用処理の方法で各ウェル当たり５μｇ／ｍｌの濃度になるように（併用投与の場合、各抗体の濃度がそれぞれ５μｇ／ｍｌになるように添加）処理し、前記図５の結果を得た方法と同様な方法で実験を行った。
【０１８４】
前記得られた結果を図６に示した。図６に示されているように、ｃ−Ｍｅｔ抗体とＥＧＦＲ抗体とを融合二重特異性抗体の形態でなく、単純に複合して処方する場合には、ＥＧＦＲの細胞内移動および分解が誘発されない反面、抗ｃＭｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体（ＭＥ−０３）で処理した場合には、ＥＧＦＲの細胞内移動および分解が誘発されることが確認された。これは、ＥＧＦＲの細胞内移動および分解が誘発される理由は、ドライバーとして作用するｃ−Ｍｅｔと抗ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体（ＭＥ−０３）を用いた細胞膜タンパク質除去システムが作用したためと説明されうる。反面、それぞれのモノクローナル抗体を併用処理する場合にはＥＧＦＲの細胞内位置には何ら変化がなく、ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体（Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２）処理時にはｃ−Ｍｅｔのみが細胞内に移動／分解されるのが観察される。
【０１８５】
ＭＫＮ４５胃癌細胞株での多様な抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、およびこれらの併用処理と、抗ｃ−Ｍｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体の処理時の細胞膜タンパク質（ＥＧＦＲおよびｃ−Ｍｅｔ）の細胞内位置変化を観察した。
【０１８６】
具体的に、前記製造された抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  ａｂ）、Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２（参考例１）、エルビタックス（♯ＥＴ５０９０８１２１３、Ｍｅｒｃｋ）および抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体ＭＥ−０３Ｓ（実施例１．１）をそれぞれ単独処理または併用処理の方法で各ウェル当たり５μｇ／ｍｌの濃度になるように（併用投与の場合、各抗体の濃度がそれぞれ５μｇ／ｍｌになるように添加）処理し、前記図５の結果を得た方法と同様な方法で実験を行った。
【０１８７】
前記得られた結果を図７に示した。図７に示されているように、ＥＧＦＲの細胞内移動は、ＥＧＦＲを認識する抗癌治療剤であるエルビタックスおよびＥＧＦＲを認識するｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体であるａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  ａｂの処理によっては誘発されず、抗ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体（ＭＥ−０３Ｓ）を処理した場合にのみ誘発されることを確認することができる。
【０１８８】
抗ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体のＥＧＦＲの細胞内移動および分解活性を他の癌細胞種であるＥＢＣ−１肺癌細胞株（ＪＣＲＢ）を用いて試験した
具体的に、前記製造された抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  ａｂ）、Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２（参考例１）、ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅ）、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体ＭＥ−０３Ｓ（実施例１．１）、および抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体ＭＨ２−０１（実施例１．２）をそれぞれ単独処理または併用処理の方法で各ウェル当たり５μｇ／ｍｌの濃度になるように（併用投与の場合、各抗体の濃度がそれぞれ５μｇ／ｍｌになるように添加）処理し、前記図５の結果を得た方法と同様な方法で実験を行った。
【０１８９】
前記得られた結果を図８に示した。図８に示されているように、肺癌細胞株でも胃癌細胞株と同様にＥＧＦＲの細胞内移動が抗ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体（ＭＥ−０３Ｓ）を処理した場合にのみ誘発されることを確認することができる。また、ＭＨ２−０１の場合、同じ二重特異性抗体であるが、ＥＧＦＲに対する影響は全くなく、ターゲットであるＨＥＲ２のみを細胞内に移動／分解させることを確認することができ、これは抗ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体（ＭＥ−０３Ｓ）のＥＧＦＲの特異的な除去を立証する結果といえる。
【０１９０】
また、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体が特異的にＥＧＦＲの細胞移動および分解を誘導することを抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体（ＭＥ−０３）処理時のＥＧＦＲ総量およびＥＧＦＲ活性の変化を測定して確認した。つまり、ＭＫＮ４５胃癌細胞株およびＥＢＣ−１肺癌細胞株に抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体（ＭＥ−０３）処理２４時間後のＥＧＦＲ総量およびＥＧＦＲ活性の変化（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＧＦＲで測定）をウエスタンブロッティングで確認した。
【０１９１】
具体的に、ＭＫＮ４５細胞（ＪＣＲＢ）およびＥＢＣ−１細胞（ＪＣＲＢ）を９６ウェルプレートトリプリケートで播種し（５０００〜１０，０００細胞／ウェル）、前記細胞が入っている各ウェルにゲフィチニブ（♯Ｓ１０２５、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）１μＭ、エルビタックス（♯ＥＴ５０９０８１２１３、Ｍｅｒｃｋ）５μｇ／ｍｌ、Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２（参考例１）５μｇ／ｍｌ、および抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体ＭＥ−０３（実施例１．１）５μｇ／ｍｌをそれぞれ処理し、２４時間培養した。ＥＧＦは、細胞溶解液を作る３０分前に１００ｎｇ／ｍｌの濃度に処理した。
【０１９２】
前記得られたウエスタンブロッティングの結果を図９に示した。図９に示されているように、ＭＫＮ４５胃癌細胞株およびＥＢＣ−１肺癌細胞株の全てにおいて、ＥＧＦＲ抑制剤であるゲフィチニブまたは抗ＥＧＦＲ抗体であるエルビタックスを単独処理する場合には、ＥＧＦＲ活性は阻害されるが、ＥＧＦＲ総量には変化がない反面、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体（ＭＥ−０３）を処理する場合には、ＥＧＦＲ活性阻害はもちろん、ＥＧＦＲ総量も顕著に減少して抗体処理２４時間後にＥＧＦＲが全て分解されることを確認することができる。
【０１９３】
実施例４：ｃ−Ｍｅｔ低発現細胞での抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体によるＥＧＦＲ除去試験
ドライバーの役割を果たすｃ−Ｍｅｔの発現が低い細胞でも抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体が細胞膜タンパク質であるＥＧＦＲを除去できるのかを確認するために、ｃ−Ｍｅｔ発現水準が低いＡ４３１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５５）を前記実施例１．１で製造された抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体（ＭＥ−０３）で処理し、これによるＥＧＦＲ除去の有無をウエスタンブロッティングで確認した。Ａ４３１細胞は、ＥＧＦＲ機能研究に多く使用される細胞であって、ドライバーの役割を果たすｃ−Ｍｅｔの発現があるが、ＥＧＦＲの発現量に比べて非常に少なく、ＥＧＦＲの発現量が顕著に多い細胞である。
【０１９４】
具体的に、ＭＫＮ４５細胞およびＥＢＣ−１細胞を９６ウェルにトリプリケートで播種し（２×１０５細胞／ｍｌ）、ここにエルビタックス（♯ＥＴ５０９０８１２１３、Ｍｅｒｃｋ）５μｇ／ｍｌ、Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２（参考例１；図１０にＬ３−１Ｙと示す）５μｇ／ｍｌ、および抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体ＭＥ−０３（実施例１．１）５μｇ／ｍｌを単独または併用処理し（併用処理の場合、各抗体の処理量をそれぞれ５μｇ／ｍｌにする）、２４時間培養した。ＥＧＦは、細胞溶解液を作る３０分前に１００ｎｇ／ｍｌの濃度に処理した。以降、抗体が処理された細胞を溶解させ、Ｈｕｍａｎ  ｔｏｔａｌ  ＨＧＦ  Ｒ／ｃ−ＭＥＴ  ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹＣ３５８）とリン酸化したＥＧＦＲを用いて総ｃ−Ｍｅｔ量の変化およびＥＧＦＲのリン酸化の程度を測定した後に分析した。
【０１９５】
前記得られた結果を図１０に示した。図１０に示されているように、抗ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体（ＭＥ−０３）は、抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖを含んでＥＧＦＲ標的化機能を有するため、ＥＧＦＲのリン酸化阻害機能はあるが、ＥＧＦＲの総量を減少させることはできないことが確認された。この結果は細胞膜上にドライバーの役割を果たすｃ−Ｍｅｔが十分な量で存在しない場合には、前記二重特異性抗体が標的細胞膜タンパク質の分解を誘導できないことを示すもので、標的細胞膜タンパク質の除去に必要な十分な量のドライバーがない状態では、二重特異性抗体のみで細胞膜タンパク質の分解を誘導できないことを意味する。
【０１９６】
実施例５：ｃ−Ｍｅｔ低発現細胞での抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体によるＥＧＦＲ除去試験
抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体の処理時にｃ−Ｍｅｔ発現量の増加によるＥＧＦＲ分解の有無および程度を試験した。
【０１９７】
ＨＣＣ８２７肺癌細胞株で抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体（ＭＥ−０３Ｓ）を処理し、標的細胞膜タンパク質であるＥＧＦＲの分解の有無をウエスタンブロッティング法で確認し、この際、具体的な方法は前記実施例４の方法を参照した。前記細胞株として野生型のＨＣＣ８２７肺癌細胞株（ＨＣＣ８２７  ＷＴ細胞；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２８６８）とエルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７肺癌細胞株（ＨＣＣ８２７  ＥＲ♯１５細胞；ＨＣＣ８２７  ＷＴ肺癌細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２８６８）を培養しながら５ｎＭ濃度から２μＭ濃度まで段階的に濃度を高めながらエルロチニブ（♯Ｓ１０２３、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）で処理し、エルロチニブ耐性を有する細胞株を選別、この中でｃ−Ｍｅｔの発現量が増加したクローンを選別する）を用いた。各抗体の使用量は、図１１に記載されたとおりである（図１１に記載されたＬ３−１Ｙは、Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２（参考例１）を意味する）。
【０１９８】
前記得られた結果を図１１に示した。母細胞であるＨＣＣ８２７  ＷＴ細胞は、ＥＧＦＲ抑制剤であるエルロチニブの機能研究に多く使用される細胞であって、ドライバーの役割を果たすｃ−Ｍｅｔの発現があるが、ＥＧＦＲの発現量に比べて非常に少なく、ＥＧＦＲの発現量が顕著に多い細胞である。図１１に示されているように、ＨＣＣ８２７  ＷＴ細胞で、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体（ＭＥ−０３Ｓ）処理によってＥＧＦＲのリン酸化は阻害されたが、ＥＧＦＲの総量減少は観察されなかった。
【０１９９】
一方、ＨＣＣ８２７  ＥＲ♯１５細胞は、エルロチニブに対する耐性が生じながらｃ−Ｍｅｔの発現量と活性が増加した細胞株である。図１１に示されているように、ＨＣＣ８２７  ＥＲ♯１５細胞でドライバーとして作用するｃ−Ｍｅｔの発現量が増加した結果として、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体（ＭＥ−０３Ｓ）処理によってＥＧＦＲリン酸化が阻害されることはもちろん、ＥＧＦＲの総量が減少した。上記結果は細胞膜上に存在するドライバー（ｃ−Ｍｅｔ）の量に応じて二重特異性抗体による標的細胞膜タンパク質の分解の程度が影響を受けることを示す。
【０２００】
実施例６：ｃ−Ｍｅｔと／Ｈｅｒ２二重特異性抗体によるＨＥＲ２特異的分解
細胞膜タンパク質除去システムの標的特異的な細胞膜タンパク質除去活性を新たな標的細胞膜タンパク質であるＨＥＲ２を対象にＭＫＮ４５胃癌細胞株を用いて試験した。このために細胞膜タンパク質除去システムとして抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体（ＭＥ−０２；実施例１．１）および抗ｃ−Ｍｅｔと／Ｈｅｒ２二重特異性抗体（ＭＨ２−０１Ｓ；実施例１．２）を使用した。
【０２０１】
ＭＫＮ４５胃癌細胞株を、前記作製された抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体ＭＨ２−０１Ｓと抗ｃ−Ｍｅｔと／Ｈｅｒ２二重特異性抗体ＭＥ−０３でそれぞれ処理した後、ＨＥＲ２レベルをウエスタンブロッティングで測定した。
【０２０２】
具体的に、ＭＫＮ４５細胞およびＥＢＣ−１細胞を９６ウェルにトリプリケートで播種し（２×１０５細胞／ｍｌ）、ここにエルビタックス（♯ＥＴ５０９０８１２１３、Ｍｅｒｃｋ）、ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅ）、Ｌ３−１Ｙ−ＩｇＧ２（参考例１）、抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体ＭＥ−０３（実施例１．１）、および抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体ＭＨ２−０１（実施例１．２）をそれぞれ５μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ処理して２４時間培養した。ＥＧＦは細胞溶解液を作る３０分前に１００ｎｇ／ｍｌの濃度に処理した。以降、抗体が処理された細胞を溶解させ、Ｈｕｍａｎ  ｔｏｔａｌ  ＨＧＦ  Ｒ／ｃ−ＭＥＴ  ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹＣ３５８）とリン酸化されたＥＧＦＲを用いて総ｃ−Ｍｅｔ量の変化およびＥＧＦＲのリン酸化の程度を測定した後に分析した。
【０２０３】
前記得られた結果を図１２に示した。図１２に示されているように、細胞膜上にドライバーの役割を果たすｃ−Ｍｅｔが過発現されたＭＫＮ４５胃癌細胞株に抗ｃＭｅｔ／ＨＥＲ２二重特異性抗体（ＭＨ２−０１Ｓ）を処理した場合には、標的細胞膜タンパク質であるＨＥＲ２が細胞内に移動および分解されることが観察された反面、抗ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体ＭＥ−０３を処理した場合には、ＨＥＲ２レベルに変化がないことを確認することができる。図８でＭＨ２−０１ＳがＥＧＦＲに何ら影響を与えないことが確認されたため、ＭＨ２−０１ＳはＨＥＲ２のみを特異的に細胞内に移動および分解させることを確認することができる。これは本発明の細胞膜タンパク質除去システム（二重特異性抗体）の種類によって特定の標的細胞膜タンパク質のみを特異的に除去できることを意味する。
【０２０４】
実施例７：ｃ−Ｍｅｔ過発現後の抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体によるＥＧＦＲ分解誘導の確認
細胞膜タンパク質除去システムの技術的な応用性を証明するために、Ａ５４９肺癌細胞でｃ−Ｍｅｔを人為的に過発現させた後（ｐｌｅｎｉＭｅｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ）に細胞膜タンパク質除去システム（抗ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体ＭＥ−０３Ｓ）を作動させてＥＧＦＲの分解の有無を蛍光顕微鏡で観察した。
【０２０５】
具体的に、Ａ５４９細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１８５）を２×１０４細胞／ウェルの量で準備し、Ｆｕｇｅｎｅ６  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００）とｐｌｅｎｔｉｃ−Ｍｅｔ  ｖｅｃｔｏｒ（ＳＭＣ、Ｓａｍｓｕｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）の混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの製品マニュアルに基づいてＯｐｔｉ−ＭＥＭ溶液で０．１−３．０μｇ／μｌＤＮＡを用いてトランスフェクションを行った）を細胞播種と同時に添加して逆転写法によりトランスフェクションを行った。２４時間培養後、ここにＬ３−１Ｙ−ＩｇＧ２（参考例１）、ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  ａｂ（実施例３）、および抗ｃ−Ｍｅｔ／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体ＭＥ０３Ｓ（実施例１．１）をそれぞれ単独処理または併用処理の方法で各ウェル当たり１μｇ／ｍｌの濃度になるように添加して４時間かけて３７℃で処理した。併用投与の場合、各抗体をそれぞれ１μｇ／ｍｌの濃度に添加した。ここに４％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを１５分間処理して細胞をプレートに固定させ、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、ブロッキングバッファー（０．５％のｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００および５％のロバ血清）を常温で１時間処理した後、ｃ−Ｍｅｔ（３７−０１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＥＧＦＲ（♯５６１６、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対する１次抗体を１：１００で希釈して１００μｌの量で１５時間かけて４℃で処理した。ＰＢＳで３回洗浄した後、２次抗体（Ａ２１４３３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：１０００で希釈して１００μｌの量で１時間かけて常温で処理し、再びＰＢＳで３回洗浄してＤＡＰＩが含まれているｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｈ−１２００、Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂ）でプレートを準備した。前記準備された細胞を共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ＬＳＭ７１０）で観察した。
【０２０６】
前記得られた結果を図１３に示した。図１３の最後の写真は、ＭＥ０３Ｓ処理された細胞の結果で赤色画像が過度に強くて緑色シグナルのパターンがうまく示されないため、緑色画像を通じてＥＧＦＲの細胞内移動をより明確に示すために緑色画像のみを別に分離して示したものである。図１３に示されているように、細胞膜上にドライバー（ｃ−Ｍｅｔ）が人為的に過発現された細胞に抗ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体ＭＥ−０３Ｓを処理する場合、標的細胞膜タンパク質であるＥＧＦＲが細胞内に移動および分解されることが観察された。これは細胞膜タンパク質除去システムがトリガーの種類によって特定の標的細胞膜タンパク質のみを特異的に除去可能であることを意味する。
【０２０７】
また、前記図１３の結果を得た試験過程を参照して、ＨｅＬａ細胞（ＣＣＬ−２、ＡＴＣＣ）でｃ−Ｍｅｔを人為的に過発現させた後（ｐｌｅｎｔｉ：：ｃ−Ｍｅｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ）に細胞膜タンパク質除去システム[抗ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体ＭＥ−０３Ｓ（実施例１．１）または抗ｃＭｅｔ／ＨＥＲ２二重特異性抗体ＭＨ２−０１（実施例１．２）]を作動させてＥＧＦＲの分解の有無を蛍光顕微鏡で観察した。
【０２０８】
前記得られた結果を図１４に示した。図１４におけるＬｏｗ  ｅｘｐｏｓｕｒｅおよびｈｉｇｈ  ｅｘｐｏｓｕｒｅはシグナル強度を異なるようにして示した結果である。具体的に、ｌｏｗ  ｅｘｐｏｓｕｒｅは顕微鏡画像を撮る際にゲイン（ｇａｉｎ）値を低めて撮った結果を示すものであり、ｈｉｇｈ  ｅｘｐｏｓｕｒｅはゲイン値を高めて蛍光が弱い細胞のｃ−Ｍｅｔシグナル（赤色）まで可視化するようにしたものである。図１４に示されているように、細胞膜上にドライバー（ｃ−Ｍｅｔ）が人為的に過発現された細胞に標的細胞膜タンパク質であるＥＧＦＲに対するトリガーである抗ｃＭｅｔ／ＥＧＦＲ二重特異性抗体（ＭＥ０３Ｓ）を処理する場合、ＥＧＦＲが細胞内に移動および分解されることが観察された。反面、標的でない細胞膜タンパク質ＨＥＲ２に対するトリガーであるｃＭｅｔ／ＨＥＲ２二重抗体ＭＨ２−０１を処理する場合には、ＥＧＦＲに何ら影響がないことが観察された。これは本発明の細胞膜タンパク質除去システムがトリガーの種類によって特定の標的細胞膜タンパク質のみを特異的に除去可能であることを意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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