(57)【要約】【課題】木質系バイオマス由来のセロルース繊維を含むペーパースラッジなどの製紙廃棄物から、発酵によるエタノール製造技術を提供すること。【解決手段】セルラーゼを分泌生産し、さらに、キシロースも発酵できる接合菌門・接合菌綱・ケカビ目に属する野性のカビを見出した。上記のカビは、セルラーゼ剤を組み合わせて、ペーパースラッジの同時糖化発酵に利用できるのみならず、上記カビのみを利用する糖化発酵同時進行よりペーパースラッジの発酵処理が酵素無添加で行うことができエタノール製造時のコスト削減が可能となる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
製紙廃棄物から発酵によりエタノールの製造する方法であって、接合菌門・接合菌綱・ケカビ目に属するカビを用いることを特徴とするエタノールの製造方法。
【請求項２】
製紙廃棄物がペーパースラッジである請求項１に記載のエタノールの製造方法。
【請求項３】
前処理工程を含む請求項１または２に記載のエタノールの製造方法。
【請求項４】
前処理工程が、水洗処理および／または塩酸処理である請求項３に記載のエタノールの製造方法。
【請求項５】
接合菌門・接合菌綱・ケカビ目に属するカビが、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）および／またはリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）である請求項１〜４に記載の製造方法。
【請求項６】
接合菌門・接合菌綱・ケカビ目に属するカビが、セルラーゼ分泌能を有るカビである請求項５に記載のエタノールの製造方法。
【請求項７】
発酵が、セルラーゼ剤を組み合わせた同時糖化発酵である請求項１〜６のいずれか項であるエタノールの製造方法。
【請求項８】
発酵が、接合菌門・接合菌綱・ケカビ目に属するカビのみ使用の糖化発酵同時進行である請求項１〜６のいずれか項であるエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製紙製造工程で発生する製紙廃棄物からエタノールを製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、ブラジルやアメリカなどで行われているエタノールの製造は、トウモロコシやサトウキビから得られた６炭糖を主成分とする糖液を、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いる発酵法により行われる。トウモロコシやサトウキビは生産が容易で加工がしやすく豊富な糖が得られ、酵母は高濃度の糖存在下で優れた成長能力を持ち、エタノール生産収率も高い。しかし食料を燃料に替えるという倫理観の問題に始まり、食料としての供給の減少などの重大な問題を抱えている。このような背景から、未利用なバイオマス資源である農産廃棄物（稲わら、もみ殻など）、林産廃棄物（間伐材、廃木材）や産業廃棄物（ＰＳなど）からエタノールを高収率で得る研究が進められている。
未利用なバイオマス資源である農産廃棄物からのエタノール生産は、成分であるセルロースやヘミセルロースなどを分解・発酵させてエタノールを生産する微生物が利用される。
【０００３】
しかし、これらＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを代表するエタノール発酵微生物を用いて５炭糖の代表であるキシロースからエタノール発酵は不可能であり、キシロース発酵酵母であるＣａｎｄｉｄａ  ｓｈｅａｔａｅやＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓにおいても培養が難しい、副生成物が生成する、エタノール耐性が低い、発酵阻害物質により強く発酵が阻害されるなど多くの問題を抱えている。さらに、組換え微生物（例えば、特許文献１、２）を用いた場合には、高いエタノール生産性を達成できるものの、組換え菌を使用する際の安全性の問題や倫理的問題を解決していく必要がある。
【０００４】
これらのことから、本発明者らエタノール微生物として考えられていなかった糸状菌、特にケカビの検索を行い、全く新しいキシロース発酵糸状菌を発見すると共に、この微生物を用いて我が国の主要な未利用バイオマスとして稲わらからのバイオエタノール製造システムの開発を行ってきた(特許文献３)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１５８１７０
【特許文献２】特開２０１１−０３０５６３
【特許文献３】特開２０１０−０４６０２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
製紙製造事業所から排出されるペーパースラッジやスクリーンテールなど製紙廃棄物は、高水分含量で有り、バイオマス成分である糖質(セルロースとヘミセルロース)を含み、さらに、 リグニンおよび無機分を多量に含んでいる。この成分中の糖質を有効利用し生物変換によりエタノールを製造するためには、セルロースおよびヘミセルロース成分を加水分解する酵素群の分泌と、加水分解液中の５炭糖および６炭糖ともに効率よくエタノールへ変換することが望まれる。しかし、一般の発酵瀬微生物
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、セルロース分解酵素（セルラーゼ）を分泌せず、さらに、５炭糖を資化できるものの発酵性を有しない。また、キシロース発酵酵母であるＣａｎｄｉｄａ  ｓｈｅａｔａｅやＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓは、５炭糖は発酵するもののセルラーゼ等は分泌しない。さらに、セルラーゼを多量に分泌する糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｓｅｉやＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓはエタノール発酵能を有していない。
【０００７】
そこで、近年、セルラーゼおよびキシロース代謝酵素遺伝子を組換えたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＺ．ｐａｌｍａｅ、地球環境産業技術研究機構（ＲＩＴＥ）による組換えコリネ菌などが開発されてきているが、遺伝子組換え菌であることからカルタヘナル法の適用を受けて規制が厳しく、さらに、実際の製造において拡散防止などの設備を必要とする製造施設に多大なコストが負担となり商業化されていない。
【０００８】
一方、同時糖化発酵（ＳＳＦ）システムおよび糖化発酵同時進行（ＣＢＰ）システムは、現在、我が国で進められているエタノール製造において、次世代型のエタノール製造技術であり、２０２０年を目標に実用化が進められている。
一般の発酵微生物と市販の酵素剤を混合し、一つの発酵槽内で糖化と発酵を同時に行う同時糖化発酵システムは、市販の酵素剤を利用するため、酵素製造に関する経費が増大し、エタノール製造コストが向上することが問題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
木質系バイオマス由来のセロルース繊維を含む製紙廃棄物からのエタノール生産を実用化させるためには、セルラーゼを分泌生産し、さらに、キシロースも発酵できる野性の菌株を見出すことも必要である。そこで、発明者らは、当研究室に保存している接合菌ライブラリーからセルラーゼを分泌生産すると共に、キシロースも発酵できる菌株の検索を行い、有用な接合菌株を見出した。さらに、該接合菌のみを用いた糖化発酵同時進行システムを構築した。また、該接合菌と市販のセルラーゼ剤を組み合わせた同時糖化発酵システムを構築した。さらに、前記システムでペーパースラッジからエタノール製造を行う際に問題となる夾雑物の処理法を見出し、本発明を完成させるに至った。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明において使用される接合菌株は、ペーパースラッジからエタノールの生産する能力を有する接合菌門・接合菌綱・ケカビ目に属するカビであり、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）などに属するカビが挙げられる。具体的には、例えば以下のような種を示すことができる。
【００１１】
ムコール・アンビグス（Ｍｕｃｏｒ  ａｍｂｉｇｕｕｓ）
ムコール・シイルシネロイデェス（Ｍｕｃｏｒ    ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）
ムコール・フラギリス（Ｍｕｃｏｒ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）
ムコール・ヘマリス（Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ）
ムコール・イナエクイスポラス（Ｍｕｃｏｒ  ｉｎａｅｑｕｉｓｐｏｒｕｓ）
ムコール・オブロンジエリプティカス（Ｍｕｃｏｒ  ｏｂｌｏｎｇｉｅｌｌｉｐｔｉｃｕｓ）
ムコール・ラセモサス（Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）
ムコール・レクルバス（Ｍｕｃｏｒ  ｒｅｃｕｒｖｕｓ）
ムコール・サトゥルニナス（Ｍｏｃｏｒ  ｓａｔｕｒｎｉｎｕｓ）
ムコール・サブティリススミウス（Ｍｏｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｍｕｓ）
リゾムコール・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ）
【００１２】
上記のケカビ目のカビは、湿気の多い有機物上に出現する、ごく普通のカビである。これら微生物の、土壌、河川、あるいは湖沼などの材料からの単離・同定法は公知である。たとえば単離および同定方法については以下のような文献を参照することができる。
カビ：”The Genera of Hyphomycetes from soil”， G.L.Barron, Baltimore, Maryland, Williams and Wilkins(1968)．
”Compendium of soil Fungi”， K.H.
Domsh, W. Gams, T. Anderson, New York, Academic Press(1980)．
【００１３】
より具体的には、以下の微生物菌株を示すことができる。
ムコール・アンビグス（ＮＢＲＣ６７４２）
ムコール・シイルシネロイデェス（ＮＢＲＣ４５７２，４５５４，４５６９，４５７４，５３８２，５７７４，３０４７０，４５６３，６７４６）
ムコール・フラギリス（ＮＢＲＣ９４０２）
ムコール・ヘマリス（ＮＢＲＣ９４００，９４０７，６７５４）
ムコール・イナエクイスポラス（ＮＢＲＣ８６３５）
ムコール・オブロンジエリプティカス（ＮＢＲＣ９２５８）
ムコール・ラセモサス（ＮＢＲＣ６７４５）
ムコール・レクルバス（ＮＢＲＣ８０９３）
ムコール・サトゥルニナス（ＮＢＲＣ９５６２）
ムコール・サブティリススミウス（ＮＢＲＣ６７５５）
リゾムコール・プシルス（ＮＢＲＣ４５７８）
これらのカビは、野生株または変異株のいずれの株も用いることができる。また、これらのカビは、単独または混合して使用することができる。
【００１４】
上記の菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）
発行の微生物カタログ第１版（２００５年）に記載されており、それぞれのアクセション番号をもとにＮＢＲＣなどのセルバンクから入手することができる。
【００１５】
上記したケカビ目の接合菌株は、エンド−β−グルカナーゼを分泌し、エタノールの発酵生産のみならず、セルラーゼも分泌生産することができる。
【００１６】
上記したセルラーゼの分泌生産能を利用してエタノールの製造を行う場合、ペーパースラッジやペーパースラッジテールなど製紙廃棄物からのエタノール製造を糖化発酵同時進行で行うシステムを構築することができる。
【００１７】
接合菌門・接合菌綱・ケカビ目に属するカビとセルラーゼ剤を用いて、同時糖化発酵により製紙廃棄物からエタノールを製造することができる。
ここで用いられるセルラーゼ剤は特に限定されず、市販のセルラーゼ剤を用いればよい。セルラーゼ剤は複数組み合わせでカクテルとすることができ、例えば、アクセラーゼ・メイセラーゼ・ペクチナーゼのセルラーゼカクテルなどが挙げられる。  
【００１８】
ペーパースラッジからのエタノール製造を同時糖化発酵システムまたは糖化発酵同時進行システムで行う場合、前処理として、ペーパースラッジ中の凝集剤、填料、炭酸カルシウムなどの夾雑物を減らしておくことが好ましい。前処理として水洗処理、塩酸処理およびそれらの組み合わせ処理が挙げられる。塩酸処理には処理後の中和処理も含まれる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のセルラーゼの分泌能を有するエタノール発酵微生物を使用することから、同時糖化発酵においては、使用酵素の添加量の軽減に繋がり、製造コストの削減が可能である。
また、糖化発酵同時進行の場合、本発明のセルラーゼの分泌能を有するエタノール発酵微生物のみを発酵槽へ投入し、ペーパースラッジへの糖化と発酵を行うことから、酵素製造に係わるコストは必要としない。
すなわち、本発明により、ペーパースラッジのような産業廃棄物を含む未利用セルロース系バイオマスからバイオ燃料として利用されているエタノールを安価に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ムコール・シイルシネロイデェスとセルラーゼカクテル剤を組み合わせた同時糖化発酵システムによる生ペーパースラッジからのエタノール生産。
【図２】ムコール・シイルシネロイデェスとセルラーゼカクテル剤を組み合わせた同時糖化発酵システムによる前処理（塩酸浸漬・水洗）したペーパースラッジからのエタノール生産
【図３】ムコール・シイルシネロイデェスのみによる糖化発酵同時進行システムによるペーパースラッジテールからのエタノール生産。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明について、以下の実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
【００２２】
［実施例１］
硫酸アンモニウム（０．７５％）、リン酸水素二カリウム（０．３５％）、塩化カルシウム（０．１％）、硫酸マグネシウム・７水和物（０．０７５％）、酵母エキス（０．５％）、ｐＨ７．５の液体培地に、グルコース（２％）を含む寒天プレートで、ケカビ目の接合菌株を２８℃で３〜５日培養した後、寒天プレートを粉砕し生理食塩液に懸濁させた。
生ペーパースラッジ（５％）を含有する上記の２５ｍＬに、上記懸濁液１ｍＬを加え、２８℃、１２０時間嫌気下で振とう培養した。
【００２３】
培養終了後、定性濾紙(Ａｄｖａｎｔｅｃ製、Ｎｏ．１３１)を用いて濾過を行うことにより菌体を除去し、各培養液の培養上清液を調製した。濾紙上に得られた菌体は、蒸留水で十分洗浄した後、９０℃で２４時間乾燥させた後、重量を測定し、乾燥菌体重量を求めた。一方、ガスクロマトグラフィーにより、培養により得られた培養液中のエタノールを定量した。
ペーパースラッジ発酵能を有するケカビによるエタノール生産を表１に示す。また、ペーパースラッジ発酵能を有するケカビによるペーパースラッジからのエタノール生産とセルラーゼ（エンド−β−グルカナーゼ）生産を表２に示す。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
【表２】
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【００２６】
［実施例２］
＜同時糖化発酵によるペーパースラッジからのエタノール製造＞
硫酸アンモニウム（０．７５％）、リン酸水素二カリウム（０．３５％）、硫酸マグネシウム・７水和物（０．０７５％）、酵母エキス（０．５％）、ｐＨ５．５の液体培地に、セルラーゼカクテル（１Ｌ中のタンパクとして、アクセラーゼ１．３９３ｇ、メイセラーゼ０．９４３、ペクチナーゼ０．６４６４ｇを含有）３ｇ（タンパク／Ｌ）およびペーパースラッジ１００ｇ／Ｌの培地で、ムコール・シイルシネロイデェス（ＮＢＲＣ４５６３）を２８℃で振とう培養した。その結果を図１に示す。
【００２７】
ムコール・シイルシネロイデェス（ＮＢＲＣ４５６３）とペーパースラッジの加水分解に対して最適化したセルラーゼカクテル剤を用いて生ペーパースラッジを原料として同時糖化発酵システムを実施した結果、培養７２時間目に得られたエタノール濃度は８．９ｇ／Ｌ、発酵効率６１％、このときの最大エタノール生産性は０．１２３ｇ／Ｌ／ｈであった。
【００２８】
［実施例３］
＜ペーパースラッジの前処理＞
（１）生ペーパースラッジ中のセルロースに付着している無機・有機成分を水洗した。
具体的には、生ペーパースラッジ １ｋｇを２０Ｌの洗浄容器に入れ、そこへ１０Ｌの蒸留水を加え、常温で４８時間ゆっくり撹拌した。このペーパースラッジ懸濁液を、ガーゼを３枚重ねたザルでこし取り、再度、５Ｌの蒸留水で２４時間以上洗浄した。再度、水で洗浄したペーパースラッジを、ガーゼを重ねたザルでこし取り、得られた固形物を試料とした。
ペーパースラッジ中の各成分の水洗前後の変化を表３に示した。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
生ペーパースラッジを水洗することにより無機・有機成分が約９％減少する一方、発酵糖が約９％増加した。
【００３１】
（２）生ペーパースラッジを１Ｎ塩酸水溶液に浸した後、中和・水洗した。
具体的には、生ペーパースラッジ１ｋｇを２０Ｌの洗浄容器に入れ、そこへ５Ｌの１Ｎ塩酸を加え、常温で４８時間ゆっくり撹拌した。このペーパースラッジ懸濁液を、ガーゼを３枚重ねたザルでこし取り、得られた固形物を再び１０Ｌの容器に入れ、そこへ２Lの蒸留水を加え２４時間ゆっくり撹拌しながら１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加え中和した。中和したペーパースラッジ懸濁液を再びガーゼを重ねたザルでこし取り、再度、５Ｌの蒸留水で２４時間以上洗浄した。再度、ガーゼを重ねたザルでこし取り、得られた固形物を試料とした。
ペーパースラッジ中の各成分の塩酸処理前後の変化を表４に示した。
【００３２】
【表４】
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【００３３】
生ペーパースラッジを塩酸に浸漬後、水洗することにより無機成分が約３０％減少する一方、発酵糖が約２１％増加した。
【００３４】
（３）塩酸処理したペーパースラッジを用いて糖化発酵同時進行を行った結果を図２に示す。
培養２４時間目までエタノール生産量は急激に増加し、培養７２時間目に１８ｇ／Ｌのエタノールを得ることに成功した。このときの最大収率は、約７０％、最大エタノール生産性は０．４８ｇ／Ｌ／ｈに達した。この結果から、生のペーパースラッジ中には製紙製造工程で使用される填料（炭酸カルシウム、カオリン）、界面活性剤、インクなど多くの不純物が含まれ、特に、カルシウム塩が生物変換反応の妨げになっていることが明かとなった。
【００３５】
［実施例４］
＜同時糖化発酵によるペーパースラッジテールからのエタノール製造＞
硫酸アンモニウム（０．７５％）、硫酸アンモニウム・７水和物  ０．０７５％）、リン酸水素二カリウム（０．３５％）、塩化カルシウム・２水和物（０．１％）、硫酸マグネシウム・7水和物（０．０７５％）、酵母エキス（０．５％）、ｐＨ５．５の液体培地に、ペーパースラッジテール８０ｇ／Ｌの培地で、ムコール・シイルシネロイデェス（ＮＢＲＣ４５６３）を２８℃で振とう培養した。その結果を図２に示す。
【００３６】
ムコール・シイルシネロイデェス（ＮＢＲＣ４５６３）のみを用いた糖化発酵同時進行により、８０ｇ／Ｌの抄紙工程から排出されるペーパーテールの直接エタノール生産を実施した結果、最終的に得られたエタノールは２７．５ｇ／Ｌであり、発酵収率は８５％に達した。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明により、製紙業界から排出される製紙廃棄物の問題点である化石燃料の多量消費、それに伴う炭酸ガスの発生を軽減でき、さらに、備蓄性の燃料であるエタノールを安価かつ効率よく製造することが可能となる。この分野において、エタノール製造の実用化は、エタノールの発酵効率の向上とコスト削減に係っている。本発明に使用されるカビは、セルラーゼの分必能を有していることから、バイオマスであるペーパースラッジの発酵処理に必要な酵素添加量の軽減あるいは酵素無添加状態でエタノールを生産でき、大幅なコスト削減が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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