(57)【要約】      （修正有）【課題】培養液中の乱流発生を抑制し、せん断力を低減する浮遊培養方法の提供。【解決手段】被培養細胞を浸漬させる培養液を有する培養器と、前記培養器を水平面に対して傾斜姿勢で支持させる支持手段と、前記支持手段に支持させた前記培養器を公転させる駆動手段とを備え、前記培養器を、鉛直な公転軸、又は水平面に対し傾斜させた公転軸を公転軌道の中心として公転させることを特徴とする細胞培養装置、並びに当該装置を用いる細胞培養方法。【選択図】図１
2015126720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養器内で被培養細胞を培養液に浸漬させて、細胞培養させる細胞培養方法であって、前記培養器を水平面に対して傾斜させた状態で、公転軸を中心として公転させることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２】
前記培養器の底面と水平面とがなす傾斜角と、培養器の公転半径と、培養器の公転速度との少なくとも一つ以上を、培養器内の培養液を培養器の公転運動に追従させる範囲内で変化させ、前記培養液に層流を形成させることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
培養器の公転軸を水平面に対して傾斜させた状態で培養器を公転させることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
被培養細胞を浸漬させる培養液を有する培養器と、前記培養器を水平面に対して傾斜姿勢で支持させる支持手段と、前記支持手段に支持させた前記培養器を公転させる駆動手段とを備え、前記培養器を、鉛直な公転軸、又は水平面に対し傾斜させた公転軸を公転軌道の中心として公転させることを特徴とする細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養方法およびこれを行う細胞培養装置に関する。特に浮遊培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、血球、粘膜上皮、表皮等特定の機能を有する細胞に分化する能力を、細胞分裂後も保持し続けるため、個体組織の発生メカニズムの研究に重用される。また医療分野では、治療対象の組織や器官の幹細胞を培養して患者に移植することが期待される。
受精卵から発生する胚性幹細胞（Emblyonic Stem cell、ES細胞）は、あらゆる細胞に分化しうる多能性を有する。そのような多能性を有する幹細胞を人工的に作製する技術も向上している。多能性幹細胞から分化させた任意の細胞を利用することにより、難病の原因解明や薬物の安全確認を分子レベルで行える可能性が高まっている。
【０００３】
上記の基礎研究、臨床研究の進展や実用化には、所望の細胞に分化誘導させ得る未分化の幹細胞の量産が前提となる。従来、多能性幹細胞の大量培養方法として、浮遊培養方法がある。浮遊培養方法は、培養液を培養槽内で流動させることにより細胞を浮遊させて三次元培養する細胞培養方法である。浮遊培養方法は、高密度で幹細胞を培養することができる。浮遊培養方法と静地培養方法との培養効率を比較すると、例えば、一般的に直径20μmの動物細胞を培養する場合、浮遊培養方法では培養される細胞の密度は1×106cells/cm2程度である。一方、静地培養方法における上記密度は6×104cells/cm2程度である。
【０００４】
細胞の三次元培養においては、培養液を流動させることにより生じるせん断力が、未分化細胞の培養効率を低減する原因となる。例えば血管内皮や心臓の弁組織の細胞等は、過度のせん断力により細胞分化が促進される。担体を用いて三次元培養を行う場合には、せん断力により細胞が担体から剥離しやすい。
【０００５】
上記に例示する問題を解決する為、培養液のせん断力を抑制させた細胞培養技術が、種々提案されている。そのような技術としては、撹拌翼の形状を改良したり、培養槽内で層流を形成させたりすることが挙げられる。特許文献1には、それぞれマイクロ流路構造を備える第一の基板と第二の基板とを備え、第一の基板と、多孔膜と、第二の基板とが積層されたデバイスが開示される。上記デバイスにおいては、第二の基板のマイクロ流路構造を流通する液体の物性、流速を考慮してそのレイノルズ数が2000未満となるように、第二の基板の幅および高さが設定される。
【０００６】
しかし、上記のデバイスは構造が複雑であるため、簡便に細胞を大量培養することは困難である。また幹細胞培養、特に多能性幹細胞培養では、わずかなせん断力の影響で細胞のロスが多量に生じる。そのため簡便な装置構成で、せん断力をさらに抑制できる細胞培養装置および細胞培養方法が望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2011-147387号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、培養液中の乱流発生を抑制し、せん断力を低減する浮遊培養方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、培養器内で被培養細胞を培養液に浸漬させて、細胞培養させる細胞培養方法であって、前記培養器を水平面に対して傾斜させた状態で、公転軸を中心として公転させる細胞培養方法である。該細胞培養方法は、培養器の底面と水平面とがなす傾斜角と、培養器の公転半径と、培養器の公転速度との少なくとも一つ以上を、培養器内の培養液を培養器の公転運動に追従させる範囲内で変化させ、前記培養液に層流を形成させる。本発明においては、上記培養器の公転軸を水平面に対して傾斜させた状態で、培養器を公転させることが好ましい。本発明は、被培養細胞を浸漬させる培養液を有する培養器と、前記培養器を水平面に対して傾斜姿勢で支持させる支持手段と、前記支持手段に支持させた前記培養器を公転させる駆動手段とを備え、前記培養器を、鉛直な公転軸、又は水平面に対し傾斜させた公転軸を公転軌道の中心として公転させることを特徴とする細胞培養装置を包含する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、培養液の乱流発生を抑制し、細胞培養効率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の細胞培養装置の例を示す概略図である。
【図２】本発明の細胞培養装置の例を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［細胞培養方法］
本発明の細胞培養方法は、培養器を水平面に対して傾斜させた状態で、公転軸を中心として公転させる。これにより、培養器内の培養液が培養器の公転運動に追従し、層流を形成する。その結果、培養液のせん断力を抑制し、培養効率を向上させることができる。
【００１３】
該細胞培養方法を説明するため、本発明に用いられる細胞培養装置の例を示す。図1は鉛直な公転軸を中心として培養器を公転させる細胞培養装置の概略図である。図1において、100は細胞培養装置、200は細胞培養装置100を載置させる水平面である。細胞培養装置100は、その筐体101内に駆動源102を備える。駆動源102の駆動力は、駆動手段103を介して支持軸104に伝達される。
【００１４】
支持軸104は、筐体101の開口部105を挿通して筐体外に露出し、培養器106を載置させるプラットフォーム107を支持する。支持軸104は、これを自転させない構造により駆動手段103および筐体101の開口部105に支持される。そのような構造の例として、支持軸104の端部を駆動手段103に固定し、さらに支持軸104において筐体101の開口部105に対向する挿通部を多軸的に軸支させる構造がある。支持軸104とプラットフォーム107とは、本発明の培養器を支持する支持手段の例である。該支持手段により培養器106は、水平面200に対し傾斜姿勢で支持される。θ1は、培養器106の底面106aと水平面200とがなす傾斜角である。
【００１５】
駆動手段103を介して駆動源102の駆動力が支持軸104に伝達されると、支持軸104は、公転軸300を中心として回動する。支持軸104の回動に伴い、プラットフォーム107上の培養器106は、培養器の底面106aが水平面に対する傾斜角θ1を一定に保った状態で、公転軸300を中心として公転する。本発明において培養器の公転軌道とは、支持軸の軸心の延長線と培養器の底面との接点の軌道を意味する。矢印A1は、支持軸104の軸心の延長線と培養器106の底面106aとの接点の軌道である。r1は公転軌道A1の公転半径である。
【００１６】
本発明は、培養液を培養器の公転運動に追従させることにより、言い換えれば多軸的に流動させることにより、層流を形成させることができる。これにより培養液のせん断力を抑制し、培養液中に懸濁させる被培養細胞のロスを低減することができる。上記の層流形成は、培養器の底面と水平面とがなす傾斜角と、培養器の公転半径と、公転軸の水平面に対する姿勢とにより決まる培養器の公転軌道と、培養器の公転速度との複合的な効果である。上記の要素を所定の範囲内で組合せることにより、本発明の乱流抑制効果や細胞沈降抑制効果が発揮される。
【００１７】
本発明は、培養器において培養液を追従させ得る公転運動をさせるため、培養器の底面と水平面とがなす傾斜角、培養器の公転半径、培養器の公転速度の少なくとも一つ以上を調節する。また水平面に対する公転軸の傾斜角を調節することも好ましい。図1は公転軸300が水平面に対し90°の姿勢、すなわち鉛直な公転軸を中心として培養器106を公転させる例である。公転軸を傾斜させた状態で培養器を公転させる本発明の例は、後に図2を用いて説明する。
【００１８】
図1に例示される、鉛直な公転軸300を中心として培養器106を公転させる細胞培養装置100においては、水平面200と培養器106の底面106aとがなす培養器106の傾斜角θ1は、1°以上30°以下が好ましい。該傾斜角が1°未満の場合、培養液を十分に培養器の公転運動に追従させることができない。傾斜角が30°を超える場合、培養液の乱流が形成されやすくなる。
【００１９】
培養器106の公転軌道A1の公転半径r1は、1cm以上50cm以下が好ましい。公転半径が50cmを超える場合、遠心力が大きくなり、担体のぶつかり等悪影響が生じる。
【００２０】
培養器106の公転速度は、0.1〜60rpmが好ましく、5〜20rpmがより好ましい。培養器の公転速度は支持軸の回動速度に連動させうる。その場合、支持軸104の回動速度を上記の好ましい公転速度の範囲内で設定することにより、培養器を、所定の公転速度で公転させることができる。本発明においては培養液が培養器の公転運動に良好に追従する。したがって公転運動開始当初から培養液に層流が形成される。該層流にのせて細胞や担体を浮遊させることができる。公転速度が0.1rpmより遅い場合、培養液を十分に培養器の公転運動に追従させることができない。公転速度が60rpmより速い場合、培養液の乱流が形成されやすくなる。
【００２１】
本発明は、水平面に対し所定の傾斜角で傾斜させた公転軸を中心として、培養器を公転させることが好ましい。これによりさらに培養液の層流を形成させやすくなる。図2は、水平面に対し傾斜させた公転軸を公転軌道の中心として公転させる細胞培養装置の例を示す概略図である。図2において301は水平面200に対し傾斜する公転軸である。図2に例示される細胞培養装置は、公転軸301を傾斜させた他は図1に例示される細胞培養装置と同様の構成を備える。したがって図1と共通する符号は説明を省略する。矢印A2は培養器106の公転軌道、r2は公転軌道A2の公転半径である。θ2は、公転軸301と水平面200とがなす公転軸の傾斜角である。なお、図2においてθ2は、説明を簡便にするため筐体を形成する水平面と平行な面と公転軸とがなす角度で表されるが、かかる角度は公転軸と水平面とがなす公転軸の傾斜角と同じ大きさである。
【００２２】
水平面200に対する公転軸の傾斜角θ2は、75°以上90°未満が好ましい。公転軸の傾斜角が75°未満の場合、液体を安定に保つことが難しい。水平面に対する公転軸の傾斜角θ2は、予め公転軸が所望の傾斜角に設計された細胞培養装置を選択することにより得ることができる。他法として、細胞培養装置に備えられる公知の角度調節部材を用いて、所望の公転軸の傾斜角に1°〜30°加えた角度になるように調節して、得ることもできる。
【００２３】
水平面に対し傾斜させた公転軸301を中心として培養器106を公転させる場合、公転軌道A2を公転する培養器106の傾斜姿勢は、培養器106が公転軌道A2を進むにしたがって変化する。すなわち、水平面200と培養器106の底面106ａとがなす傾斜角θ1は、培養器106の公転運動に伴って変化する。傾斜させた公転軸を中心として培養器を公転させる場合の培養器106は、傾斜角θ1が0°より大きく45°以下の範囲内で変化することが好ましく、0°以上30°以下の範囲内で変化することがより好ましい。
【００２４】
傾斜させた公転軸を中心として培養器を公転させる場合の公転速度や公転半径の好ましい範囲は、鉛直な公転軸を中心として培養器を公転させる場合と同じである。
【００２５】
培養器の底面と水平面とがなす傾斜角と、培養器の公転半径と、培養器の公転速度と、公転軸と水平面とがなす傾斜角とは、被培養細胞の種類、細胞直径、播種密度、培養器の容積、培養器の内半径を考慮して設定される。培養器は、後に説明する培養液を満たし、担体を供給し、単一細胞に分散させた細胞を播種させた後に、上記の培養器の傾斜角、培養器の公転半径等の各設置条件を少なくとも一つ以上満たして細胞培養装置に設置される。培養器の設置後、上記の好ましい範囲内の公転速度で培養器を公転運動させる。
【００２６】
本発明は、培養器の公転運動に対する培養液の追従性が高いため、公転運動開始と同時に上記の層流が形成され、乱流はほとんど生じない。そのため、培養器の公転運動開始当初から培養液のせん断力が抑制された環境下で細胞を三次元培養することができる。これにより、本発明においては培養液中に播種された細胞は損傷しにくい。担体を用いて細胞培養を行う場合には、細胞が担体から剥離しにくい。すなわち本発明は、細胞のロスが少なく細胞培養効率が良好である。
【００２７】
直径20μmのマウス多能性幹細胞を、播種密度1×105細胞/mlで、鉛直な公転軸を中心として公転する容積15ml、内半径5cmの培養器内で培養する場合、培養器の傾斜角θ1を2°〜10°、培養器の公転半径r1を0cm以上5cm以下とすることが好ましい。その場合、好ましくは培養器を公転速度10〜60rpmで公転させる。
【００２８】
また、上記のマウス多能性幹細胞を、播種密度1×105細胞/mlで、水平面に対し85°傾斜させた公転軸を中心として公転する容積15mlの培養器内で培養する場合、培養器の公転半径r2が0〜3cmとなるように培養器を支持する支持軸を調節することが好ましい。その場合、培養器の傾斜角θ1は、培養器の公転運動に伴い0°以上10°以下の範囲内で変化することが好ましい。これにより培養液の層流を形成させることができる。
【００２９】
また、本発明においては、培養器を上記の公転運動に加え自転運動させることにより、さらに乱流抑制効果を向上させることができる。自転軸は、好ましくは培養器底面の中心領域に設けられることが好ましい。好ましい自転速度は、0.01〜20rpmであり、より好ましくは、0.1〜5rpmである。
【００３０】
形成された層流にのって浮遊した細胞や担体は、培養器の公転速度が遅い場合でも沈降しにくい。細胞や担体は沈降し始めたとしても、より下層で浮遊する細胞や担体に接触するとはね返されて再浮遊する。したがって本発明は、細胞が沈降してコロニーを形成することを回避できる。
【００３１】
該培養液中に播種される被培養細胞は特に限定されないが、本発明は、特にヒト、マウス、ウシ等種々の哺乳動物由来のES細胞、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、多能性生殖幹細胞（mGS細胞）等に好適である。上記の幹細胞の担体に対する播種密度は、5〜100cells/cm2が好ましく、20〜50cells/cm2がより好ましい。
【００３２】
本発明においては培養液のせん断力が小さいため細胞の損傷が少なく、細胞が担体から剥離しにくい。担体に対する接着効率は、50〜100％である。また細胞や担体が培養器の底部まで完全に沈降しがたいため、三次元培養を効率よく行うことができる。本発明は、細胞の大量培養に有用である。
【００３３】
上記の方法により、コンフルエントになるまで担体上で細胞の培養を続ける。培養条件は、従来公知の浮遊培養条件を適用できる。例えば、本発明の培養装置でマウスES細胞を培養する場合、温度条件35〜37℃、2〜5％CO2の環境下で行える。
【００３４】
上記の適切な形状の担体を用いて幹細胞を培養する場合、幹細胞の未分化率は、95〜99％程度であると推察される。幹細胞を分散状態で培養させる場合、幹細胞同士の接触領域が少ない。そのため幹細胞がコロニーを形成しにくい。従って、担体に付着させた全ての幹細胞に十分に分化抑制剤を作用させることができる。その結果、幹細胞の未分化状態を維持させることができる。
【００３５】
培養細胞の未分化状態の確認は、被培養細胞の種類に対応するALP活性や特異的マーカー遺伝子の発現量を測定することにより行うことができる。上記特異的マーカーとしては、Oct-3/4やRex1/Zfp42等の遺伝子産物の発現を利用することができる。
【００３６】
ALP活性の検出の一例は、培養したES細胞をPBSで洗浄後、66％アセトン／3％ホルマリンを含むクエン酸溶液で固定し、PBSで洗浄後、naphthol  AS-BI  phosphate  alkaline染色液で15分間処理し、発色反応させることにより行われる。
【００３７】
また、抗原性分子を未分化マーカーとして利用してもよい。各種抗原性分子の低減、消失によってもES細胞の分化を確認することができるからである。そのような抗原性分子の例として、マウスES細胞の場合は、SSEA-1、ヒトES細胞の場合は、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、GCTM-2等がある。
【００３８】
未分化マーカーの利用例として以下の方法がある。まず、培養されたES細胞からRNAを調整し、常法に従ってcDNAを合成する。該cDNAを鋳型としてPCRにより、所定の未分化マーカーの遺伝子の断片を増幅させる。得られたPCR産物を染色し検出する。未分化マーカーが有意に検出されることにより、培養されたES細胞が未分化であることを確認できる。
【００３９】
培養液がコンフルエントになった場合、本発明は常法により被培養細胞を継代させることができる。継代は少なくとも3〜10継代まで行い得る。
【００４０】
培養した幹細胞を回収する場合、培養液中から幹細胞を分散状態で付着させた担体を回収し、常法により担体から単一細胞を得る。培養器の公転運動を停止させると担体は3〜4時間で自然に培養器の底部に沈降する。細胞の回収は、担体の洗浄後、トリプシン等のタンパク質分解酵素溶液やEDTA溶液を用いて単一細胞を得ることにより行われる。
【００４１】
［細胞培養装置］
本発明の細胞培養装置は、被培養細胞を浸漬させる培養液を有する培養器と、前記培養器を水平面に対して傾斜姿勢で支持させる支持手段と、前記支持手段に支持させた前記培養器を公転させる駆動手段とを備え、前記培養器を、鉛直な公転軸、又は水平面に対し傾斜させた公転軸を公転軌道の中心として公転させる。本発明においては、培養液が培養器の公転運動に良好に追従し、層流を形成する。これにより細胞培養効率を向上させることができる。
【００４２】
本発明の細胞培養装置は、上記の図1または図2に例示される装置構成を備える。本発明に備えられる支持手段は、培養器を水平面に対し上記の所定の傾斜角をなす傾斜姿勢で支持させる構造のものであれば特に限定されない。具体例としては、1本の棒状体からなる支持軸と、角度調節部材を介して該支持軸の端部に連結され、かつ支持軸に固定可能なプラットフォームからなる構成が挙げられる。その場合、支持軸とプラットフォームとを、該プラットフォーム上に載置される培養器の底部が水平面に対し所望の傾斜角をなす状態に角度調節部材により調節した後、プラットフォームを支持軸に固定する。
【００４３】
本発明に備えられる駆動手段は、モーター等の駆動源の駆動力を支持手段に伝達可能な構造のものであれば特に限定されない。具体例としては、モーターのシャフトの先端にプレートを固定し、該プレートに培養器の支持手段を固定する構成が挙げられる。その場合、モーターのトルク出力がシャフトを介してプレートに伝達され、プレートが回転する。該プレートの回転運動が、支持軸等の支持手段に伝達されることにより支持軸を回動させることができる。なお支持軸においては、シャフト固定領域と異なる領域を、2本の支持軸で回動可能に軸支させることにより、支持軸の自転を抑制しながら本発明所定の培養器の公転運動を得ることができる。
【００４４】
本発明にかかる培養器の公転軸は、鉛直または水平面に対し傾斜する。図1は、培養器を、鉛直な公転軸を公転軌道の中心として公転させる本発明の例である。図2は、培養器を水平面に対し傾斜させた公転軸を公転軌道の中心として公転させる本発明の例である。培養器を水平面に対し傾斜させた公転軸を中心として公転運動を行う培養器においては、該公転軸と水平面とがなす傾斜角が、75°以上90°未満が好ましい。
【００４５】
本発明においては、フレキシブルジョイント等を用いて支持軸を駆動手段103に接続させることにより、培養器を自転可能に支持させてもよい。その場合、培養器を公転運動に加え自転運動させることにより、より均質に培養液を撹拌させることができる。
【００４６】
培養器の水平面に対する傾斜姿勢は、鉛直な公転軸を中心として公転する培養器においては、培養器の底面と水平面とがなす傾斜角が、1〜30°となることが好ましい。上記の範囲内で設定された傾斜角は、培養器の公転運動中一定に保たれる。一方、傾斜させた公転軸を中心として公転する培養器においては、該傾斜角が、培養器の公転運動に伴い0°以上45°以下の範囲内で変化するように調整されることが好ましい。
【００４７】
本発明における培養器の公転半径は、0cm以上50cm以下が好ましい。培養器の公転半径の調節は、指示軸の支点と培養器までの距離を調節することにより行うことができる。培養器の公転速度は、培養液を培養器の公転運動に追従させることができる速度であればよく、0.1〜60rpmが好ましく、5〜20rpmがより好ましい。
【００４８】
本発明に用いられる培養器としては、ビニルバック、円筒器、シャーレ等が好ましく用いられる。培養器の内壁には、細胞の付着を抑制する成分を塗布してもよい。本発明は潅流培養に適用することができる。その場合、培養器に培養液の流入口と流出口とが設けられる。その場合、流出口にフィルタ等を取り付け、担体や細胞の流出を防止することが好ましい。
【００４９】
本発明は、培養器内で担体を用いることが好ましい。担体に細胞を付着させて分散培養することにより、未分化状態の細胞を大量培養することができる。担体の形状は、ディスク状、棒状、六角形以上の多角形状のものが好ましい。上記に例示する形状の担体は、担体表面に付着させた細胞が摩擦を受けにくく担体表面から剥離しにくい。また沈降速度が遅い形状を選択することで、担体を浮遊させやすくなる。そのような担体は、沈降し始めても他の担体に接触すると容易に再浮遊するため、浮遊培養に適する。上記の観点から、ディスク状の担体を用いることは特に好ましい。
【００５０】
担体のサイズは、最大外寸が0.1〜6mmのものが好ましく、2〜4mmのものがより好ましい。また、培養器の最小内寸の1/10以下のサイズの担体を選択することが好ましい。直径0.1mmのディスク状担体を用いる場合、ディスクの表裏あわせて直径が20μmの細胞にして50細胞分の面積を有する。そのようなディスク状担体に5細胞を付着させた場合、細胞の種類によっては細胞を10倍に増殖させることができる。
【００５１】
担体の形状やサイズは、培養器の容積、培養する細胞の直径や、播種密度等に対応させて適宜選択される。担体の供給量は、10〜100個/cm3が好ましい。具体例として、培養液量3〜20mlに対する担体の供給量は、3〜100個が好ましく、6〜50個がより好ましい。
【００５２】
担体の材料としては、動物細胞の培養、特に幹細胞、マウスES細胞やヒトES細胞の培養に使用する公知の材料を用いることができる。成形加工性の観点からは、ポリスチレン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリウレタン等が好ましい。
【００５３】
幹細胞培養に際しては、担体に、幹細胞付着性物質をコートさせることも好ましい。幹細胞付着性物質の例としては、フィブロネクチン、コラーゲン等の細胞結合物質が好ましく、特にE-カドヘリン、マトリゲル、ラミニン等がより好ましく用いられる。本発明において、上記の幹細胞付着性物質は一種を用いてもよく、二種以上を混合させて用いてもよい。
【００５４】
該幹細胞付着性物質は、常法にしたがって製造してもよく、市販品を用いてもよい。担体表面に接触した幹細胞は、幹細胞表面に発現する所定の基底膜成分と、担体表面にコートさせた幹細胞付着性物質とが互いの親和性により強固に結合するため、担体表面に十分に接着させることができる。
【００５５】
E-カドヘリンは、未分化のマウスES細胞で発現するタンパク質の一種で、多能性幹細胞の付着性にかかわる物質として知られている。マトリゲルは、マウスEHS肉腫から抽出、生成される基底膜成分である。マトリゲルにはIV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクテン等が含有される。ラミニンは、基底膜を構成する主要タンパク質の一つであり、細胞の接着、遊走、増殖に関与すると考えられている。好ましくは、ラミニン、ヒトラミニン、ヒトラミニンα5β1γ1、ヒトラミニンα3β3γ2が用いられる。
【００５６】
幹細胞付着性物質のコート量は、付着性向上の観点から、担体に対しコートさせ得る最
大量とすることが好ましい。担体基材表面に対する幹細胞付着性物質のコート量は、0.6〜1.1μg/cm2が好ましく、0.8〜1.1μg/cm2がより好ましい。
【００５７】
幹細胞付着性物質を担体表面にコートさせる方法は特に限定されない。一例としては、幹細胞付着性物質を蒸留水またはPhosphate  Buffered  Salin（PBS）で10μg/mlに調製後、ろ過、滅菌した溶液に担体基材を接触させ、室温35〜37℃で30〜60分間静置させる方法を挙げることができる。
【００５８】
担体に上記の幹細胞付着性物質を接触させることにより、担体に対し、幹細胞付着性物質を吸着させたり、共有結合させたりすることにより、幹細胞付着性物質が担体に定着させることができる。幹細胞付着性物質を担体基材に接触させる前に、幹細胞付着性物質に予め抗原性分子を結合させておくと共に、担体基材表面に該抗原性分子と特異的に結合する抗体分子を付加させておくことも好ましい。これにより幹細胞付着性物質中の抗原と担体基材表面の抗体とが特異的に結合し、担体表面に幹細胞付着性物質を良好に定着させることができる。
【００５９】
本発明に用いられる担体は、その表面に高低を形成させてもよい。高部と低部とで構成される平坦でない表面を有する担体を用いることにより、細胞を担体表面にフィットさせやすく、担体表面に形成される高部は、細胞を支持する足場として機能する。そのため、該担体は、細胞の剥離を抑制することができる。また、該担体は表面積を大きくできるため、表面に多量の幹細胞付着性物質を保持させやすい。これにより、良好な幹細胞付着性を有する。
【００６０】
上記の表面粗さを有する担体における低部存在数は、担体表面積1000000μm2あたりおよそ400〜3000000個である。担体表面積1000000μm2あたり1000000〜3000000個が好ましく、1300000〜1700000個がより好ましく、1500000個がさらに好ましい。他の好ましい低部存在数は、担体表面積1000000μm2あたり400〜14000個であり、より好ましくは4000〜7000個である。
【００６１】
上記の表面粗さを備える担体において、となり合う高部の頂点と低部の最低点との距離を高低差とすると、高低差の平均値は0.5μmより大きいことが好ましい。となり合う高部と高部との頂点間距離は、細胞の直径の1〜5％程度が好ましい。これにより細胞の足場が確保され、担体表面で培養細胞を支持しやすくなる。
【００６２】
上記の低部存在数、頂点間距離、高低差は、培養される細胞の直径や柔軟性、移動速度等により適宜決定される。細胞は担体表面上を移動して増殖する。その速度はその担体表面性状により異なる。細胞の移動速度が速い場合、細胞は急速に伸張、収縮する。急速に収縮して球形に近い形状になった細胞は、担体との接触面積が減少する。したがって好ましい付着性を得難くなる。上記に推察される低付着性を補完する観点から、移動速度が速い細胞を培養する場合は、細胞の伸張時に足場となる高部を提供しうる担体を用いることが好ましいと考えられる。すなわち移動速度が速い細胞を培養する場合、本発明所定の範囲内で比較的高部の存在数が多い担体を用いることが好ましい。
【００６３】
マウス多能性幹細胞の培養に用いられる担体の場合、好ましい頂点間距離は、0.1〜2.7μmであり、より好ましくは、0.5〜2.0μmである。担体表面の平均高低差は、0.5〜2.7μmが好ましく、0.5〜2.0μmがより好ましい。
【００６４】
付着性が高い幹細胞の培養において、コロニー形成を防止するためには、幹細胞のサイズに対し適切な表面粗さを備える担体を用いることが好ましい。これにより、底部に多数の幹細胞が入り込むことを回避し、コロニー形成を防止することができる。その結果、未分化の幹細胞を大量培養することができる。
【００６５】
上記の担体表面においては細胞を分散状態で付着させることができる。本発明において分散状態とは、担体表面に幹細胞を単一細胞として個々に付着させた状態を意味し、さらに各幹細胞が明確なコロニーを形成しない程度に互いの接触領域が少ない状態で付着させることを包含する。したがって本発明により培養される幹細胞は細胞塊になりにくく未分化状態を維持しやすい。
【００６６】
担体表面に上記の高低を形成する方法としては、担体にガラス板を圧接させる方法や、射出成型法が挙げられる。上記の圧接による製造方法を行う場合、圧接材は、選択される担体の硬度に対応して適宜選択される。好ましい圧接材としては、ガラス、ステンレス、鉄等の金属、セラミックが挙げられる。
【００６７】
被培養細胞を浸漬させる培養液としては、従来公知の培養液を用いることができる。従来公知の培養液の例としては、Dulbecco's  Modified  Eagle's  Medium（DMEM）、Grasgow  Minimum  Essential  Medium（GMEM）、RPMI640等を挙げることができる。
【００６８】
上記に例示した培養液にL-グルタミン、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウム、2-メルカプトエタノール、L-アラニル-L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラチン酸、グリシン、L-プロリン、L-セリン等公知の成分を添加することができる。培養液には、ウシ胎児血清（FBS）等添加できるが、無血清培養してもよい。
【００６９】
上記の培養液に、分化抑制剤として白血病抑制因子（LIF）を添加してもよい。ヒト多能性幹細胞を培養する場合には、フィーダー細胞を用いない公知の方法を適用することができる。これにより共培養法の影響を回避してヒト多能性幹細胞を適用することができる。
【００７０】
本発明所定の細胞培養装置を用いて被培養細胞を浮遊培養する場合、培養液が培養器の公転に追従させて培養液の層流を形成させることができる。これにより培養液のせん断力が抑制される。そのため細胞培養効率を向上させることができる。
【実施例】
【００７１】
［実施例１］
図1に図示される基本構造を備える本発明の細胞培養装置を、表1に記載の状態になるように調節した。容積15mlの培養器に培養液として15%FBS、非必須アミノ酸、ピルビン酸、グルタミン酸、0.1mMメルカプトエタノール、及びLIFを添加したGMEMを満たしたのち、厚み0.02mm、直径0.4cmのポリスチレン製ディスク型担体を300個供給した。該担体は予めE-カドヘリンをコートさせた。さらに直径20μmのマウス幹細胞を播種密度1×105細胞/mlで播種した。上記培養器を、表1に記載する公転速度で公転させながら、温度条件36〜38℃、5％CO2で培養を開始した。
【００７２】
常法に従って培地交換を行いながら培養を続け、72時間後、培養器の公転運動を停止した。培養液の流動が収まり、担体が自然に沈降した。全ての担体を完全に沈降させた後、該担体を培養器から取り出し細胞を回収した。細胞の回収は、担体にAccutaseを添加して37℃で約10分間インキュベートした後、培養液に懸濁させて単一細胞とすることにより行った。
【００７３】
［実施例２］
図2に図示される基本構造を備える本発明の細胞培養装置を表1に記載の状態になるように調節した。容積15mlの培養器に培養液として15%FBS、非必須アミノ酸、ピルビン酸、グルタミン酸、0.1mMメルカプトエタノール、及びLIFを添加したGMEMを満たしたのち、厚み0.02mm、直径0.4cmのポリスチレン製ディスク型担体を300個供給した。該担体は予めE-カドヘリンをコートさせた。さらに直径20μmのマウス幹細胞を播種密度1×105細胞/mlで播種した。上記培養器を、表1に記載する公転速度で公転させながら、マウス幹細胞の培養を温度条件35〜37℃、2〜5％CO2で培養を開始した。
【００７４】
常法に従って培地交換操作を行いながら培養を続け、72時間後、培養器の公転を停止した。培養液の流動が収まり、担体が自然に沈降した。全ての担体を完全に沈降させた後、該担体を培養器から取り出し細胞を回収した。細胞の回収は、実施例1と同様にして行った。
【００７５】
［比較例］
WAVEバイオリアクターを用いて、マウス幹細胞の培養を温度条件35〜37℃、2〜5％CO2で行った。用いた培養器の容積は、200ml、マウス幹細胞の播種密度は、1×105細胞/mlであった。搖動角は5°、搖動速度は30rpmであった。常法に従って培地交換を行いながら培養を続け、72時間後、培養器の搖動を停止した。培養液の流動が収まり、担体が自然に沈降した。全ての担体を完全に沈降させた後、該担体を培養器から取り出し細胞を回収した。細胞の回収は、実施例1と同様にして行った。
【００７６】
［細胞数の測定方法および細胞密度の算出方法］
実施例1、実施例2および比較例1で培養した後Accutaseで分散させた細胞を回収し、培養器内にいれて沈降させた。培養器底面に沈降させた細胞を異なる視野から3枚写真撮影し、細胞数の平均値を計数した。総細胞数は、総細胞数＝細胞数平均値×培養器底面積/視野面積として算出した。得られた総細胞数を培養器の容積で除して細胞密度を算出した。実施例1、実施例2および比較例で得られた細胞密度を表1に記載する。
【００７７】
【表１】
2015126720.tif 000003
【符号の説明】
【００７８】
100      細胞培養装置
101      筐体
102      駆動源
103      駆動手段
104      支持軸
105      開口部
106      培養器
106ａ    培養器の底面
107      プラットフォーム
108      培養液
200      水平面（細胞培養装置の載置面）
300、301    公転軸
A1、A2      培養器の公転軌道
r1、r2      培養器の公転半径
θ1      培養器の傾斜角
θ2      公転軸の傾斜角
Ｘ       鉛直方向
【図１】
2015126720.tif 000004
【図２】
2015126720.tif 000005