(57)【要約】      （修正有）【課題】生物由来の材料中の核酸を単離および／または安定化するための新規な組成物の使用の提供。【解決手段】原核生物、菌類、原生動物もしくは藻類などの微生物中で、または微生物から、核酸を安定化および／または単離するための、下記式で表されるカチオン化合物及び少なくとも１種類のプロトン供与体を必須成分として含有する組成物。式：Ｙ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘ-（ＹはＮ又はＰ；Ｒ1〜Ｒ4は各々独立に、直鎖若しくは分枝Ｃ1−Ｃ20アルキル基及び／又はＣ6−Ｃ20アリール基並びにＣ6−Ｃ26アラルキル基；かつ、Ｘ-は無機若しくは有機の一塩基酸又は多塩基酸のアニオン）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核生物、菌類、原生動物もしくは藻類などの微生物中で、または微生物から、核酸を安定化および／または単離するための、一般式：
Ｙ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘ-
（式中、Ｙは、窒素またはリンを示すことができ、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は互いに独立して、未分枝もしくは分枝Ｃ1−Ｃ20アルキル基および／またはＣ7−Ｃ20アリール基ならびにＣ6−Ｃ26アラルキル基を示すことができ、かつ、
Ｘ-は、無機もしくは有機の一塩基酸または多塩基酸のアニオン示すことができる）のカチオン化合物および少なくとも１種類のプロトン供与体を成分として含有する組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、原核生物、菌類、原生動物もしくは藻類などの微生物からＲＮＡおよび／もしくはＤＮＡを安定化し、並びに／または単離するための、必須成分として、一般式：
Ｙ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘ-
（式中、Ｙは、窒素またはリンを示すことができ、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、未分枝もしくは分枝Ｃ1−Ｃ20アルキル基および／またはＣ6−Ｃ20アリール基並びにＣ7−Ｃ26アラルキル基を示すことができ、かつ
Ｘ-は、無機もしくは有機の一塩基酸または多塩基酸のアニオンを示すことができる）のカチオン化合物と、添加剤として少なくとも１つのプロトン供与体とを含有する組成物の新規な使用に関する。
【０００２】
好ましい組成物は、カチオン化合物がアンモニウム塩からなるものである（式中、Ｒ1は、好ましくは１２個、１４個または１６個の炭素原子を有する高級アルキル基を示し、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれに、メチル基を示す）。
【０００３】
式中、Ｒ1が、アラルキル基、好ましくはベンジル基を示し、Ｒ2が、好ましくは１２個、１４個または１６個の炭素原子を有する高級アルキル基を示し、かつＲ3およびＲ4がメチル基を示す組成物もまた好ましい。
【０００４】
好ましいアニオンは、臭化物、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩またはコハク酸塩である。
【０００５】
Ｃ1−Ｃ6アルキルは一般に、互いに同一であることも、または異なるものであることもできる、１個またはそれ以上のハロゲン原子、好ましくはフッ素によって任意に置換され得る、１〜６個の炭素原子を有する分枝もしくは未分枝炭化水素基を示す。以下の炭化水素基が例として挙げられる：
メチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル（イソ−プロピル）、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ｎ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチル−１−メチルプロピルおよび１−エチル−２メチル−プロピル
【０００６】
高級アルキル基という用語は、互いに同一であることも、または異なるものであることもできる、１個またはそれ以上のハロゲン原子、好ましくはフッ素によって任意に置換され得る分枝または未分枝Ｃ7−Ｃ20アルキル基を表す。以下の炭化水素基：分枝もしくは未分枝ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、ドデカデシルおよびエイコシル、が例として挙げられる。
【０００７】
Ｃ3−Ｃ6アルケニルは一般に、３−６個の炭素原子を有し、１つの二重結合を有し、またはそれ以上の二重結合を有することもある、分枝または未分枝炭化水素基であって、互いに同一であることも、または異なるものであることもできる、１個またはそれ以上のハロゲン原子、好ましくはフッ素によって任意に置換され得る炭化水素基を示す。以下の炭化水素基が、例として挙げられる：
２−プロペニル（アリル）、２−ブテニル、３−ブテニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−メチル−２−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−メチル−３−ブテニル、２−メチル−３−ブテニル、３−メチル−３−ブテニル、１，１−ジメチル−２−プロペニル、１，２−ジメチル−２−プロペニル、１−エチル−２−プロペニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル、１−メチル−２−ペンテニル、２−メチル−２−ペンテニル、３−メチル−２−ペンテニル、４−メチル−２−ペンテニル、１−メチル−３−ペンテニル、２−メチル−３−ペンテニル、３−メチル−３−ペンテニル、４−メチル−３−ペンテニル、１−メチル−４−ペンテニル、３−メチル−４−ペンテニル、４−メチル−４−ペンテニル、１，１−ジメチル−２−ブテニル、１，１−ジメチル−２−ブテニル、１，１−ジメチル−３−ブテニル、１，２−ジメチル−２−ブテニル、１，２−ジメチル−３−ブテニル、１，３−ジメチル−２−ブテニル、１，３−ジメチル−３−ブテニル、２，２−ジメチル−３−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−３−ブテニル、１−エチル−２−ブテニル、１−エチル−３−ブテニル、２−エチル−１−ブテニル、２−エチル−２−ブテニル、２−エチル−３−ブテニル、１，１，２−トリメチル２−プロペニル、１−エチル−１−メチル−２−プロペニルおよび１−エチル−２−メチル−２−プロペニル
【０００８】
Ｃ3−Ｃ6アルキニルは一般に、３−６個の炭素原子を有し、１つの三重結合を有し、またはそれ以上の三重結合を有することもある、分枝または未分枝炭化水素基であって、互いに同一であることも、または異なるものであることもできる１個またはそれ以上のハロゲン原子、好ましくはフッ素によって任意に置換され得る炭化水素を示す。以下の炭化水素基が例として挙げられる：
２−プロピニル（プロパルギル）、２−ブチニル、３−ブチニル、１−メチル−２−プロピニル、２−メチル−２−プロピニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−メチル−２−ブチニル、２−メチル−２−ブチニル、３−メチル−２−ブチニル、１−メチル−３−ブチニル、２−メチル−３−ブチニル、３−メチル−３−ブチニル、１，１−ジメチル−２−プロピニル、１，２−ジメチル２−プロピニル、１−エチル−２−プロピニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、１−メチル−２−ペンチニル、２−メチル−２−ペンチニル、３−メチル−２−ペンチニル、４−メチル−２−ペンチニル、１−メチル−３−ペンチニル、２−メチル−３−ペンチニル、３−メチル−３−ペンチニル、４−メチル−３−ペンチニル、１−メチル−４−ペンチニル、３−メチル−４−ペンチニル、４−メチル−４−ペンチニル、１，１−ジメチル−２−ブチニル、１，１−ジメチル−２−ブチニル、１，１−ジメチル−３−ブチニル、１，２−ジメチル−２−ブチニル、１，２−ジメチル−３−ブチニル、１，３−ジメチル−２−ブチニル、１，３−ジメチル−３−ブチニル、２，２−ジメチル−３−ブチニル、２，３−ジメチル−２−ブチニル、２，３−ジメチル−３−ブチニル、１−エチル−２−ブチニル、１−エチル−３−ブチニル、２−エチル−１−ブチニル、２−エチル−２−ブチニル、２−エチル−３−ブチニル、１，１，２−トリメチル−２−プロピニル、１−エチル−１−メチル−２−プロピニルおよび１−エチル−２−メチル−２−プロピニル
【０００９】
別段の指定がない限り、アリールは、ヘテロ原子１個または２個を任意に含有し得る、炭素原子４−２２個を有する芳香族単環基または多環基を示す。その例には：ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、好ましくはフッ素によって、またはアルキル基によって、互いに独立して任意に一置換または多置換され得る、フェニル、ナフチル、アントラシルまたはピロール、フラン、チオフェン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジンまたはピラジンが含まれる。
【００１０】
上記の定義に従って、アラルキルは、Ｃ1−Ｃ6アルキレン、Ｃ3−Ｃ6アルケニレンまたはＣ3−Ｃ6アルキニレン架橋を介してカチオン部分構造に結合する、単環または多環アリール基を示し、そのＣ1−Ｃ6アルキル、Ｃ3−Ｃ6アルケニルおよびＣ3−Ｃ6アルキニル基は上記で定義したとおりである。本発明の目的には、ベンジル基が好ましい。
【００１１】
適切な対イオンＸ-は、ハロゲン化水素酸のすべてのアニオン、または酢酸塩もしくはシュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩もしくはクエン酸塩などの、一塩基または二塩基有機酸のアニオンであることが好ましい。
【００１２】
本発明の目的のための適切なプロトン供与体は主に、無機酸またはその塩の他に、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニル−カルボン酸、飽和および／または不飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6ジカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸またはケトジカルボン酸ならびにアミノ酸の、単独または組み合わせである。上述のすべての有機酸は、未置換形状で、または置換誘導体として使用され得て、それらの中では、別段の指定がない限り、未置換誘導体またはヒドロキシル基によって一置換もしくは多置換された誘導体であることが好ましい。
【００１３】
本発明の目的のための飽和脂肪族モノカルボン酸という用語には、ギ酸の他に、Ｃ1−Ｃ6アルキル−カルボン酸が含まれ、それらの中では、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、エチル−メチル−酢酸（２−メチル−酪酸）、２，２−ジメチルプロピオン酸（ピバル酸）、ｎ−カプロン酸、ｎ−オクタン酸、ｎ−デカン酸、およびｎ−ドデカン酸（ラウリン酸）が好ましい。さらに、上述の酸から誘導されるケトカルボン酸もまた使用することができる。
【００１４】
本発明の目的のための不飽和アルケニル−カルボン酸の例には、アクリル酸（プロペン酸）、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸およびビニル酢酸が含まれる。
【００１５】
本発明によれば、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸またはアジピン酸などの飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6ジカルボン酸が好ましく、シュウ酸およびコハク酸が特に好ましい。
【００１６】
本発明によって課題を解決するためには、脂肪族ヒドロキシ−ジおよびトリカルボン酸を使用することが特に好ましく、タルトロン酸、Ｄ−（＋）、Ｌ−（−）−またはＤＬ−リンゴ酸、（２Ｒ，３Ｒ）−（＋）−酒石酸、（２Ｓ，３Ｓ）−（−）−酒石酸、メソ−酒石酸およびクエン酸が特に最も好ましい。
【００１７】
このように、マレイン酸もしくはフマル酸などの不飽和ジカルボン酸または、例えばアコニット酸などの不飽和トリカルボン酸もまた、本発明の課題を解決するために適している。
【００１８】
しかしながら、本発明の目的のために、例えばメソシュウ酸およびオキサロ酢酸などの脂肪族ケトジカルボン酸も添加剤として使用することができ、オキサロ酢酸が特に最も好ましい。
【００１９】
本発明の目的には、アミノ酸を使用することも可能であり、それらの中では、例えばアミノ酢酸（グリシン）、α−アミノプロピオン酸（アラニン）、α−アミノ−イソ吉草酸（バリン）、α−アミノ−イソカプロン酸（ロイシン）およびα−アミノ‐β−メチル吉草酸（イソロイシン）などのα−アミノ酸が好ましい。グリシンを使用することが特に好ましい。
【００２０】
上述のプロトン供与体は、個々の物質として、または純粋な立体異性体の形態で、および混合物の状態でも、使用することができる。
【００２１】
本発明の目的のために、無機酸およびその塩を、更なる添加剤として使用することもできる。アルカリ金属またはそのアンモニウム塩と、リン酸または硫酸などの無機酸との塩を使用することが好ましい。リン酸および硫酸アンモニウムを使用することが最も好ましい。
【００２２】
【表１】
2015027310.tif 000002
【００２３】
添加剤は、様々な濃度で組成物中に存在することができる。異なる添加剤の組み合わせを使用することも可能である。添加剤の性質に応じて、他の濃度範囲が有利であると判明することもある。異なる添加剤の組み合わせを使用することも可能である。
【００２４】
組成物の水溶液中のカチオン化合物濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）〜飽和、好ましくは０．１％〜１０％（ｗ／ｖ）〜飽和、さらに好ましくは０．５〜８％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは２〜６％（ｗ／ｖ）の範囲である。
【００２５】
この種類の組成物は、ドイツ出願公開第１００  ３１  ２３６号の説明、ならびに請求項１〜１７に開示されている。本出願はその先の出願に基づいている。
【００２６】
当然、カチオン化合物および添加剤の溶液を添加する場合には、最適な濃度は、生物学的サンプルのそれぞれの容積、および安定化溶液と生物学的サンプルとの容積比によって決定される。
【００２７】
別段の指定がない限り、本発明の目的のための核酸は、より広い意味での核酸、例えば、二本鎖、一本鎖、環状および直鎖ＤＮＡなど、すべての長さまたは形状のデオキシリボ核酸も含むリボ核酸（ＲＮＡ）、並びに、例えば単量体ヌクレオチド、オリゴマー、プラスミド、処理済および未処理状態の細菌ＤＮＡおよびＲＮＡのような、全ての考えられ得る亜種である。
【００２８】
使用する生物学的サンプルは、例えば生物体（単細胞または多細胞生物；昆虫等）、植物および植物の一部、細菌、ウイルス、酵母および他の菌類または原核生物のような、本発明により考えられる遊離もしくは結合核酸または核酸を含有する微生物を含有する、食物サンプルまたは環境サンプルであり得る。
【００２９】
本発明の目的のための、出発原料として使用される微生物を含有する生物学的サンプルは、血漿、血液、血清、細胞、白血球画分、痂皮催炎（ｃｒｕｓｔａ ｐｈｌｏｇｉｓｔｉｃａ）、痰、尿、精液、糞便などの体液、塗抹標本、吸引液、バイオプシー、例えば組織および器官の一部などのすべての種類の組織サンプル、遊離もしくは結合核酸または核酸含有細胞を含む食物サンプルであることもできる。
【００３０】
この他に、上記の生物学的サンプルから得られる核酸および真核生物起源の核酸を、本発明による組成物によって安定化することが可能である。このように、ドイツ特許出願第１００ ３１ ２３６号（出願時の書類のｐ．６、第２段落）に記載の真核性材料を、本発明の教示に従って単離または安定化することが可能である。このように、本発明の教示に従って、血液、痰もしくは骨髄などからの真核生物起源の核酸を、ドイツ特許出願第１００ ３１ ２３６号（これにより、参照として本明細書に組み込まれる）の実施例１〜１５および図１〜１５に開示されているように、首尾よく安定化することができる。
【００３１】
添加剤は、安定化試薬中に様々な濃度で存在することができる；例えば、それは、容積比１：１、好ましくは３：１で、５０ｍＭ〜飽和の濃度、好ましくは１００〜１Ｍ、最も好ましくは２００〜５００ｍＭの濃度で、安定化溶液と血液との混合物中に存在し得る。添加剤の性質に応じて、他の濃度範囲が有利であると判明することもある。異なる添加剤の組み合わせを使用することも可能である。
【００３２】
組成物の水溶液中のカチオン化合物濃度は、０．０１重量％〜飽和、好ましくは０．１重量％〜飽和、さらに好ましくは０．５〜１５重量％、最も好ましくは２〜１０重量％の範囲である。
【００３３】
当然、カチオン化合物および添加剤の溶液を添加する場合には、最適な濃度は、生物学的サンプルの容積、および安定化溶液と生物学的サンプルとの容積比によって決定される。
【００３４】
サンプルと混合する前に、カチオン化合物と添加剤の混合物のｐＨを、通常、広いｐＨ範囲（ｐＨ２〜１２）にわたってサンプルの関数として変化させることができ、ｐＨ２〜ｐＨ１０の範囲であることが好ましく、さらに好ましくはｐＨ３〜ｐＨ８の範囲である。好ましいｐＨ範囲は、使用する生物学的サンプルに依存する。血液、血漿および血清の場合には、範囲ｐＨ２〜ｐＨ６、特にｐＨ３〜ｐＨ４のｐＨ値が好ましい。
【００３５】
カチオン化合物と添加剤の混合物のｐＨは、通常、原核生物、菌類、原生動物もしくは藻類などの微生物中または微生物からの、核酸のサンプル、安定化および／または単離の関数として、広いｐＨ範囲（ｐＨ２〜１２）にわたって変化させることができ、ｐＨ２〜ｐＨ８の範囲であることが好ましく、さらに好ましくはｐＨ２〜ｐＨ５の範囲である。好ましいｐＨ範囲は、使用するサンプルに依存する。
【００３６】
血液、血漿および血清を除く他の細胞体液のような生物学的サンプル、または例えば、上述のものような、細菌、吸引液、細胞、組織、および他の生物学的サンプルの場合、カチオン化合物および添加剤からなる安定化溶液のｐＨ値は、ｐＨ３〜ｐＨ１０の範囲であることが好ましく、さらに好ましくはｐＨ４〜ｐＨ８の範囲である。示したｐＨ値はすべて、生物学的サンプルと混合する前のｐＨとして理解される。
【００３７】
生物学的サンプル中の核酸を安定化するために、サンプルを、カチオン化合物（類）および添加剤を含有する溶液と混合することができる。生物学的サンプルを０．１〜１０，０００容積添加することが可能であり、１〜１０００の範囲の容積を添加することが好ましく、１〜１００の範囲の容積を添加することが最も好ましい。しかしながら、例えば細い針によるバイオプシー（ｆｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅ ｂｉｏｐｓｉｅｓ）または低細胞数の培養物からのサンプルなど、サンプルの性質に応じて、場合によっては、はるかに高い容積もまた使用され得る。
【００３８】
同様に、生物学的サンプル自体が固体を溶解するための液体（例えば、細胞含有体液、培養液中の細胞、尿など）を含有する場合、または液体、例えば水がそれに添加され、固体を溶解する場合、上述のカチオン化合物および添加剤を固体状で添加することもできる。固体を添加する利点は、固体が通常、化学的により安定であり、かつ、それらが、しばしばサンプルに添加するのが容易であることである。
【００３９】
さらに、特に、例えば、組織などの非常に緻密な生物学的サンプルの場合は、核酸または個々の細胞若しくは細胞凝集塊の放出を助けるために、安定化溶液中で、またはそれを安定化溶液と混合する前に、例えばサンプルに対する機械的、化学的、物理的または酵素的作用により、緻密なサンプルを破壊することによって、サンプルを粉砕または均質化することが可能である。機械的作用は、電気ナイフ、ビーズミルによって、または例えばシリンジによって押しつぶすことによって行うことができるのに対し、サンプルに作用するために適切な酵素は、例えば加水分解酵素、プロテアーゼまたはリパーゼであり得る。
【００４０】
さらに、そのサンプルは、純粋な物理的手段、例えば超音波によって前処理することができる。
【００４１】
前処理は、化学的方法のみで、または純粋な物理的方法と組み合わせて実施することもできる。溶解を補助する手段には、例えば、脂肪族アルコール−特にイソプロパノール−またはアルデヒド若しくはジアルデヒド−例えばグリオキサール−またはフェノール若しくはフェノール誘導体−例えば２−ビフェニロール、またはイオン、双性イオンおよび非イオン化合物−例えばメルカプト−または還元剤−例えばジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノール−またはリン酸誘導体−例えばリン酸トリブチル−またはカオトロピック試薬、例えば尿素、チオシアン酸グアニジウム若しくは塩酸グアニジウム、または塩を個々に、または組み合わせて使用することが含まれる。
【００４２】
機械的、化学的、物理的または酵素的にサンプルに作用する、他の考えられ得る方法は、当分野で既知であり、本明細書に含まれることが意図される（ｉｎｔｅｎｄｅｄ ｔｏ ｂｅ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｈｅｒｅ）。
【００４３】
特定の要求に応じて、サンプル材料をかなり長い期間、例えば１日〜１４日以上、室温（ａｍｂｉｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で保存することができるが、例えば４０℃以上の高温、および、例えば４℃または−２０℃以下などの低温でも保存することができる。
【００４４】
上述の化合物の溶液中での生物学的サンプルの保存の後に、核酸を分析する技術を直接用いることもでき、または核酸をサンプルから精製することもできる。
【００４５】
本発明の技術的背景に関して：
例えば定量ＲＴ−ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ｂＤＮＡ技術またはバイオチップおよびノーザンブロットなどの分子生物学的方法による微生物のＲＮＡ発現パターンの調査は、原核生物ならびに原生動物、菌類および藻類の遺伝子発現の分析で基礎研究に使用されており、例えば、医学的診断、微生物病原菌の同定、医薬組成物を開発および評価するための医薬品産業、研究および治療用用途のための組換えタンパク質の製造におけるバイオテクノロジー、生態学および集団生物学において、更に微生物による汚染を検出するための食品分析においても、重要性が増大している。
【００４６】
核酸を単離するためには、調査のための細胞を得るために、自然環境から生物体を取り除かなければならず、次いで核酸を単離する場所にこれらを移送しなければならないという問題がある。同時に、ＲＮＡプロファイル、更にＤＮＡも変化し得るという重要なリスクがある。これは、例えば細胞培養における遺伝子発現、または例えば、核酸分析の基礎を形成する感染した患者の材料（例えば、炎症部位から採取したサンプル）、または細菌、菌類、原生動物もしくは藻類で汚染された食物の調査における医学的／臨床的診断において、診断または分析の誤りを引き起こし得る。食品サンプルまたは患者からの臨床サンプルにおいて、微生物は死んでいる場合さえあり、その後、核酸、特にＲＮＡは完全に破壊される。したがって、核酸、特にＲＮＡを、サンプルを採取した直後に安定化することが最も重要である。
【００４７】
細菌の特性は、周囲条件に対する、それらの遺伝子発現の極めて急速な適応である。細菌での細胞ｍＲＮＡの半減期が非常に短く、かつ、それらは、数秒または数分以内に新しいＲＮＡ転写物を合成する能力を有するので、遺伝子発現パターンの結果、一時的な（ｓｈｏｒｔ−ｌｉｖｅｄ）変化が起こり得る。細胞が採取されており、かつＲＮＡ作製の工程が行われている間でさえ、ＲＮＡ発現パターンの変化が起こり得るために、これらの適応メカニズムは、原核生物のＲＮＡ発現パターンの分析における問題である。このため、その後の分析では、それはもはや、定義された実験培養条件下での発現パターンではなく、むしろ採取、溶解またはそれに続く細胞ライセートの処理中の条件を反映するＲＮＡ発現パターンと見なされた。
【００４８】
このように、本発明の教示は、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡの種類、例えばｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、低分子量（ＬＭＷ）ＲＮＡ種にだけでなく、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）などのＤＮＡにも適用することができる。
【００４９】
原核生物、菌類、原生動物または藻類などの微生物からＲＮＡを単離する従来の方法は、例えばフェノールおよびクロロホルム（トリクロロメタン）などの有機溶媒の使用、カオトロピック塩またはこれらの物質の組み合わせの使用に基づいている。今までに知られている原核生物、菌類、原生動物または藻類から核酸を単離する方法ではすべて、さらなる処理が行われ得る前に、培養培地から遠心分離または濾過によって、細胞を最初に濃縮しなければならない。この最初の段階中、非常に多くの場合で、周囲条件の変化（例えば、温度の変化、遠心分離または濾過によって生じる機械的応力、ガス雰囲気の変化等）のために、細胞における遺伝子発現パターンが変化するので、細胞の遺伝子発現パターンは、定義された培養条件ではなく、核酸の単離プロセスの条件を反映する。このため、その後の分析の妥当性が疑問視される。
【００５０】
それは主に、ＲＮａｓｅによるか、若しくは脱プロトン化などの化学的影響によるＲＮＡの非特異的分解、または発現パターンの変化を引き起こす、特定の配列を分解するＲＮａｓｅによるＲＮＡの配列特異的分解である。さらに、ＲＮＡの新たな合成は、欠点を有し、そのため望ましくない影響も有する。
【００５１】
しばしば、非常に迅速な細胞の採取および迅速な細胞分解によってこの影響を最小限に抑える試みが行われているが、遺伝子発現パターンの変化を、これによって完全に防ぐことはできない。さらに、数多くのサンプルを同時に処理することは不可能である。さらに、酵素的細胞溶解は、有機溶媒または濃縮カオトロピック食塩溶液を添加する前にのみ行うことができ、かつ少なくとも３分の時間を要することから、しばしば敬遠された。このように、酵素的細胞溶解の際に、酵素的ＲＮＡ分解およびＲＮＡの新たな合成を同時に行うことが可能であり、それにより、細胞の遺伝子発現パターンを変化させ得る。この理由から、その後の遺伝子発現の分析に対して、酵素的細胞分解を行うことは常に不利であった。
【００５２】
原核生物、菌類、藻類、更に原生動物からの核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ）の単離に関する別の問題は、このために細胞壁を開かなければならないため、細胞の溶解にある。広く用いられている一つの方法は、酵素リゾチームによって原核細胞壁中のムレインを消化することである；または、リソスタフィンまたはプロテイナーゼなどの他の酵素も使用することができた。消化時には、処理されるサンプルの条件は、対応する酵素の酵素活性が保証されるような条件でなければならない。しかしながら、それと同時に、そのような条件は、通常、更に、細菌ｍＲＮＡをＲＮａｓｅにより切断することを可能するか、または核酸の化学的加水分解も可能とし、その結果、分解された核酸が、対応する調製物から得られることがある。さらに、ＲＮＡ発現パターンをさらに変化させるであろう、細胞のこの酵素的分解の間、核酸が合成されないという保証はない。
【００５３】
本発明の目的に関して：
本発明の一般的な目的は、従来技術から知られている上述の欠点を避けることである。
【００５４】
したがって、本発明の目的は、何らかのその後の分析を確かなものにするために、細胞の遺伝子発現パターンが、細胞収穫の条件または核酸の単離プロセスによって生じる変化ではなく、特定の培養条件、または患者からの試料や食物サンプルのような、元のサンプルにおける条件を反映するように、細菌、菌類（酵母など）、原生動物または藻類のような微生物から核酸を単離する際に、処理により引き起こされる（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ）遺伝子発現の変化を回避することである。
【００５５】
本発明の更なる目的は、ＲＮＡおよびＤＮＡを単離するために、数多くのサンプルを同時に並行して処理することを可能にすることである。本発明はまた、その成分が健康にダメージを与えないため、例えば、フェノールを使用する場合に、サンプルの調製に従事するスタッフに生じるような、何らかの健康のリスクなく、取り除いた場所から実験室へ運ぶ際に、生物学的サンプル材料において、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを安定化するために使用することができる、安定化溶液の形状で組成物を提供することを目指している。
【００５６】
本発明の教示は、古細菌（メタノセルモバクテル・マルビルジェンシス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｂｉｒｇｅｎｓｉｓ）など）の他に、原核生物中でも特に真正細菌に適用することができる。真正細菌には、グラム陽性菌ならびにグラム陰性菌、更に、屈光性菌（ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ）またはクラミジア、マイコプラズマ（例えば、マイコプラズマ・ペネトランス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）など）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、らせん菌（Ｓｐｉｒｉｌｌａ）およびスピロヘータ属（Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅ）（ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ））が含まれ、本発明の教示をそれらに適用することができる。
【００５７】
グラム陽性真正細菌の中でも、バチルス属（例えば、枯草菌など）、ブドウ球菌属（例えば、黄色ブドウ球菌もしくは表皮ブドウ球菌など）、ストレプトミセス属（例えば、ストレプトミセス・ケリコーター（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｔｏｒ）もしくはストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）など）、フラボバクテリウム属（例えば、フラボバクテリウム・ジョンソニエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ）など）、マイコバクテリウム属（例えば、トリ型結核菌など）、または連鎖球菌属が、特に挙げられ得る。
【００５８】
本発明の教示は、以下のグラム陽性真正細菌：
クロストリディウム属（例えば、クロストリディウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、破傷風菌、およびクロストリディウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）など）
リステリア属
ペプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）
ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）
腸球菌
コリネバクテリア（例えば、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）またはコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）など）
プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
乳酸桿菌属
にも適用される。
【００５９】
グラム陰性真正細菌には、特に、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌など）、シュードモナス属（例えば、緑膿菌、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）もしくはシュードモナス・シリンガ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）など）、莢膜桿菌（例えば、肺炎桿菌など）、サルモネラ属（例えば、ネズミチフス菌など）、シノルヒゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（例えば、シノルヒゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ））、またはカンピロバクター属が含まれる。
【００６０】
さらに、本発明の教示は、以下のグラム陰性菌：
ナイセリア属（例えば、淋菌または髄膜炎菌など）
ビブリオ属（例えば、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）など）
赤痢菌属
セラチア属
エンテロバクター属
アシネトバクター属
プロテウス属
エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）
ブルセラ属（例えば、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）など）
ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）など）
バクテロイデス属
カンピロバクター属
ヘリコバクター属（例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）など）
ボルデテラ属
レジオネラ属
パスツレラ属
にも適用される。
【００６１】
真核生物の中で、皮膚糸状菌群の菌類、酵母、糸状菌および二相（ｂｉｐｈａｓｉｃ）菌類を含む菌類は、特に言及に値する。
【００６２】
酵母の中では、サッカロミケス属（例えば、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）、カンジダ属（例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）など）、クリプトコッカス属（例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）など）が、特別に言及されるべきである。糸状菌の中では、アスペルギルス属（例えば、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）など）またはアオカビ属またはケカビ属が、特別に言及されるべきである。
【００６３】
真核生物の他の更なる例は、例えば、トリパノソーマ、トキソプラズマ（ｔｏｘｏｐｌａｓｍｓ）、アメーバ、プラズモディウム（ｐｌａｓｍｏｄｉａ）、鞭毛虫類などの藻類および原生動物であり、それらに本発明の教示を適用することができる。
【００６４】
本発明による課題の解決に関して：
本発明の上記課題は、細菌、菌類、原生動物若しくは藻類の定義された培養物、または、細菌および／若しくは菌類および／若しくは原生動物および／若しくは藻類を含有するサンプルを、一般式１のカチオン化合物と少なくとも１種類のプロトン供与体とを含有する組成物と、またはその水溶液と接触させることによって解決される。
【００６５】
その後の細胞の採取、およびサンプルの更なるワークアップ（ｗｏｒｋｉｎｇ ｕｐ）のために、ＲＮＡ発現パターンの何らかの変化を防ぐように、サンプル中の核酸が酵素的分解または化学的分解を受けることなく、かつ核酸の新たな合成なく、細胞壁、例えば細菌細胞壁のムレイン基本構造が、リゾチームによって酵素的に消化され得る。
【００６６】
または、例えばリソスタフィン、プロテイナーゼＫを用いた酵素的細胞溶解の他の方法、または界面活性剤によって媒介される細胞溶解、またはこれらの方法の、すなわち機械的溶解方法との組み合わせもまた可能である。
【００６７】
ビーズミルの使用または液体窒素中での粉砕などの機械的方法とは異なって、酵素的細胞溶解は、主に、自動化するのが比較的容易であるという利点を有する。さらに、酵素的細胞溶解によって、サンプルのハイ・スループット（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）が可能となり、従来技術からも知られている細胞溶解の機械的方法と比較して、相互汚染のリスクが最少化される。
【００６８】
細菌の酵素的細胞溶解の他に、任意に、ジモラーゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ）若しくはリチカーゼ（ｌｙｔｉｃａｓｅ）を用いて酵母細胞を溶解することや、プロテイナーゼもしくは他の酵素を用いるか、または本発明による組成物によって細胞を安定化した後に界面活性剤を用いる真核細胞の異なる溶解を行うこともできる。
【００６９】
酵素的細胞溶解は、上述の理由で理論上有利であるが、従来の調製方法を行う場合、この段階中に、ＲＮＡ発現パターンの変化を予想しなければならないため、このプロセスは、遺伝子発現パターンの分析に実際に使用することができない。ここに記載したプロセスの使用は、細胞を採取する前でさえ、細胞中のＲＮＡを安定化することによって、この課題を解決する、１つの考えられ得る方法を提供する。その後の段階において、酵素的細胞溶解が可能であるが、一方、ＲＮＡの酵素的分解または化学的分解および新たな合成は阻止される。
【００７０】
酵素的細胞溶解の代わりに、機械的、熱的または化学的な細胞溶解、ならびに上述の溶解方法の１つまたはそれ以上の組み合わせを行うことができる。
【００７１】
安定化および細胞溶解後に、従来技術から知られている改質シリカ材料も基づく核酸単離方法を、さらにサンプルを処理するために用いることができる。
【００７２】
本発明は、例えば有機溶媒、カオトロピック塩を用いるか、または核酸を塩析することによるか、または磁気粒子を使用することによるか、またはハイブリッド捕獲法による、ＲＮＡの単離において、サンプルをさらに処理するために考えられ得る方法を提供する。
【００７３】
ＴＲＩｚｏｌまたはＲＮｅａｓｙなど、従来技術から今まで知られているＲＮＡ抽出方法と比較して、一般式Ｉのカチオン界面活性剤と、添加剤の形の、好ましくは脂肪族カルボン酸の形の、さらに好ましくはジカルボン酸の形の、特に最も好ましくは酒石酸であるプロトン供与体、を含有する、本発明による組成物を使用することによって、例えば通常の従来方法で得られるよりも２〜３倍多い収量が得られる。
【００７４】
この高いＲＮＡ収量は、低発現された（ｌｏｗｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）ＲＮＡ転写物、または分析される細菌群のサブグループのみによって発現されるＲＮＡ転写物の分析に特に有利である。さらに、今まで、細菌からｍＲＮＡを単離するための実行可能な方法はなかったので、細菌ｍＲＮＡを分析する場合、技術者は他のＲＮＡ種（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＰ類）の強いバックグラウンドに対処しなければならない。かかる状況では、分析プロセスの感度の増大は、収量が増大したためであると想定されなければならない。
【００７５】
本発明の利点は、特に、微生物（原核生物、原生動物、菌類、藻類）における遺伝子発現パターンの分析を行わなければならない、すべての適用にある。そのような適用には、例えば、原核生物の遺伝子発現制御の基礎的な理解に寄与する科学的研究、更に、選択された遺伝子の発現と細菌の病原性との間の相関性を分析する研究が含まれる。この後者の問題は、細菌感染の診断および治療に特に関連性がある。
【００７６】
本発明を適用する、別の重要な分野は、医薬品研究および開発での原核生物、原生動物および菌類における遺伝子発現の分析にある。例えば原核生物のＲＮＡ発現パターンの安定化によって、遺伝子発現の時間依存性が実証されるべきである実験の範囲内で、転写物ミラー（ｍｉｒｒｏｒｓ）または完全な発現パターンの分析がかなり単純化されることもある。さらに、複合体群における種、例えば土壌サンプルにおける細菌、または患者からのサンプルにおける病原菌の同定および定量化がはるかに容易となる。さらに、その潜在的な適用は、例えば食品分析などの他の分析領域にまで及ぶ。
【００７７】
本発明により、１つまたはそれ以上のカチオン化合物（類）と１つまたはそれ以上の添加剤（類）との組成物を用いて、核酸を安定化することによって、長い期間貯蔵する場合、または輸送中でさえ、サンプル中の核酸が変化しないことが保証される。このように、後の段階で行われる試験の精度が著しく向上する。特定の場合、例えばサンプル材料を長い距離にわたって輸送しなければならないか、または長い期間貯蔵しなければならない場合に、本発明によるプロセスによって、そのような期間の後に、これらの試験を実行することが初めて可能となった。
【００７８】
本発明の利点は、特に、例えば、除去直後に固定化しなければならない転写物レベルを分析するための研究の分野と、一度採取した患者のサンプルを分析の準備が整うまで貯蔵および輸送する間、安定化しなければならない、分子診断などの臨床分析分野のどちらにもある。
【００７９】
さらに、核酸の単離および安定化は、腫瘍の診断、遺伝性疾患の診断並びにウイルスの診断および観察、並びに他の感染病因の診断および観察、並びに遺伝子発現パターンの分析に用いられる。
【００８０】
図面の説明：
図１は、界面活性剤溶液のｐＨおよび培養液と界面活性剤の容積比に対するＲＮＡ収量の依存性を図示する。
図２は、方法の様々な変形に対するＲＮＡ収量の依存性を図示する。
図３は、本発明による化合物の水溶液の容積の関数として、ＲＮＡ収量を図示する。
図４は、様々な濃度でのカチオン化合物とプロトン供与体との組成物の溶液の異なる容積の溶液を用いて単離された、大腸菌ＲＮＡの変性アガロースゲル電気泳動およびｏｍｐＡノーザンブロット分析の結果を示す。
図５は、本発明による組成物を溶解して、および溶解することなく、リファンピシン（ｒｉｆａｎｐｉｃｉｎ）を添加した後に単離された大腸菌ＲＮＡのｏｍｐＡ（"外膜タンパク質Ａ"）ノーザンブロット分析を示す。
図６は、カチオン化合物と添加剤との組成物、またはその水溶液を使用して、および使用することなく、リファンピシンを添加した後に単離された大腸菌ＲＮＡのｂｌａ（β−ラクタマーゼ）ノーザンブロット分析を示す。
【００８１】
実施例１
大腸菌からのＲＮＡの単離
４％（ｗ／ｖ）テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレートおよび２００ｍＭ酒石酸からなる水溶液を、水酸化ナトリウム溶液で以下のｐＨ値：
２．２（ＮａＯＨの添加なし）；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５および５．０、２５
に調整する。
【００８２】
実験を行うために、各混合物に対して、異なるｐＨ値の界面活性剤溶液２、３または４容積を、ＬＢ培地中の大腸菌培養液の４００μｌアリコートにピペットで滴下し、ＲＮＡの単離を以下の方法により行う：
−調製した界面活性剤溶液に大腸菌培養液４００μｌを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）、
−５０００×ｇにて、４℃で１０分間遠心分離し、
−上清をデカントし、
−ペレットを１ｍｌ Ｈ2Ｏ中に再懸濁し、
−５０００×ｇにて、４℃で１０分間遠心分離し、
−上清をデカントし、
−４００μｇ／ｍｌのリゾチームを含有するＴＥバッファー1)１００μｌ中にペレットを再懸濁し、
−室温で５分間インキュベートし、
−ＲＬＴバッファー2)３００μｌを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、
−Ｈ2Ｏ ２６０μｌを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、
−プロテイナーゼＫ ４０μｌ（１８ｍｇ／ｍｌ）を添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、
−５５℃で１０分間インキュベートし、
−１４０００×ｇにて、３分間遠心分離し、
1)ＴＥバッファーは、１０ｍＭトリス−ＨＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡからなり、ｐＨ８で緩衝作用をする。
2)ＲＬＴバッファーは、イソチオシアン酸グアニジウムなどのグアニジウム塩、および多塩基有機酸のアルカリ金属塩ならびにβ−メルカプトエタノールに基づく、市販の標準バッファー（キアゲン社（Ｍｅｓｓｒｓ． ＱＩＡＧＥＮ）（ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））から入手可能）を意味し、ｐＨ７で緩衝作用をする。
−上清を除去し、１００％エタノール３５０μｌを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、
−ＲＮｅａｓｙミニスピンカラム上に溶液を充填し、
−細菌から全ＲＮＡを単離するために、例えばキアゲン社（Ｍｅｓｓｒｓ． ＱＩＡＧＥＮ）、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）によるＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニの手順と同様に、従来技術から知られているように更に処理する、段階５以降。
【００８３】
図１には、界面活性剤溶液のｐＨおよび培養液と界面活性剤溶液の容積比の関数としてＲＮＡ収量を示す。
【００８４】
得られた結果から、本発明による組成物の水溶液が、３．５〜５．０の範囲のｐＨを有する場合に、最も高いＲＮＡの収量が得られることも示される。
【００８５】
ＲＮＡの完全性（ｉｎｔａｃｔｎｅｓｓ）は、アガロースゲル電気泳動によって分析される。どの場合にも、完全なリボソームＲＮＡバンドが見られる。
【００８６】
実施例２
異なる代替手順による大腸菌からのＲＮＡの単離
この実施例において回収された実験のための出発原料は、再度、ＬＢ培地中で成長した大腸菌培養物である。異なる代替手順すべてを、１．５×１０8個および３×１０8個の細胞を用いて行う。この一連の実験では、以下の組成：
４％（ｗ／ｖ）テトラデシル−トリメチル−アンモニウムオキサレート
２００ｍＭ酒石酸
を有する、ｐＨ４．０の、本発明による組成物の水溶液が使用される。
【００８７】
ＲＮＡ単離方法の以下の部分的段階から始まり、様々な代替手順が試行される：
１）細胞採取
大腸菌培養液に界面活性剤溶液３容積を添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、５０００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離し、上清をデカントする。
２）ペレットの洗浄
ペレットをＨ2Ｏ １ｍｌ中に再懸濁し、５０００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離し、上清をデカントする。
３）リゾチームによる消化
４００μｇ／ｍｌのリゾチームを含有するＴＥバッファー１００μｌ中にペレットを再懸濁し、室温で５分間インキュベートする。
４）結合条件の確立
ＲＬＴバッファー３５０μｌを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、１００％エタノール２５０μｌを添加する。
５）プロテイナーゼＫによる消化
ＲＬＴバッファー３００μｌを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、Ｈ2Ｏ ２６０μｌを添加し、プロテイナーゼＫ ４０μｌ（１８ｍｇ／ｍｌ）を添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、５５℃で１０分間インキュベートし、１４０００×ｇにて３分間遠心分離し、上清を除去し、１００％エタノール３５０μｌを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌する。
６）希釈ＲＬＴバッファー中でのリゾチームによる消化およびプロテイナーゼＫによる消化
ＲＬＴバッファー３００μｌを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、Ｈ2Ｏ １６０μｌを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、４００μｇ／ｍｌのリゾチームを含有するＴＥバッファー１００μｌを添加し、室温で５分間インキュベートし、プロテイナーゼＫ ４０μｌ（１８ｍｇ／ｍｌ）を添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、５５℃で１０分間インキュベートし、１４０００×ｇにて３分間遠心分離し、上清を除去し、１００％エタノール３５０μｌを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌する。
７）例えば、ＲＮｅａｓｙミニスピンカラム（キアゲン社（Ｍｅｓｓｒｓ ＱＩＡＧＥＮ）（ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））から入手可能）など、任意に改質されたシリカカラムを用いたワークアップ
溶液をカラムに充填し、細菌から全ＲＮＡを単離するＲＮｅａｓｙミニ方法に従ってさらに処理する（段階５）。
【００８８】
その初期手順を以下の代替方法：
変形１：段階１）；３）；４）および７）
変形２：段階１）；２）；３）；４）および７）
変形３：段階１）；２）；３）；５）および７）（実施例１と同様の初期手順）
変形４：段階１）；６）および７）
と比較する。
【００８９】
図２には、異なる代替方法のＲＮＡ収量を示す。
【００９０】
これらの実験の結果から、変形１を実行することは、ＲＮＡ収量に関して、初期手順（変形３）に匹敵することがはっきりと示される。この変形には、洗浄段階またはプロテイナーゼＫによる消化がない。このため、全体的として、ワークアッププロセスは大幅に短縮され、その結果、この変形は、以下の実施例において標準方法として使用される。
【００９１】
実施例３
培養液と本発明による組成物の溶液の異なる容積比による、大腸菌からのＲＮＡの単離
以下の組成を有する、本発明による組成物の水溶液を使用する：
溶液 ＱＣＸ ４％ （ｗ／ｖ） テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレート
２００ｍＭ 酒石酸
ｐＨ ４．０
溶液 ＱＣＸ ２ ６％ （ｗ／ｖ） テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレート
３００ｍＭ 酒石酸
ｐＨ ４．０
溶液 ＱＣＸ ３ ８％ （ｗ／ｖ） テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレート
４００ｍＭ 酒石酸
ｐＨ ４．０
溶液 ＱＣＸ ４ １５％ （ｗ／ｖ） テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレート
７５０ｍＭ 酒石酸
ｐＨ ４．０
【００９２】
ＬＢ培地（トリプトン１０ｇ；酵母抽出物５ｇ；ＮａＣｌ １０ｇ；Ｈ2Ｏ ａｄ １０００ｍｌ）中で成長した大腸菌培養液のアリコート４００μｌを、適切な溶液２、３または４容積と混ぜ合わせ、実施例２で定義される標準方法によってワークアップする。
【００９３】
図３には、式１によるカチオン化合物と添加剤との水溶液の容積の関数として、ＲＮＡの収量を示す。
【００９４】
実験的知見から分かるように、ＲＮＡ収量は、様々な界面活性剤溶液を２または３容積用いた場合に十分に匹敵する。上述の溶液を４容積使用した場合、ＲＮＡ収量の一定の低下がある。界面活性剤を２または３容積使用した混合物では、溶液１、２および３に匹敵する収量が得られる。
【００９５】
単離したＲＮＡの完全性を評価するために、ＲＮＡを変性アガロースゲル上で分離し、次いでノーザンブロット分析を行う（図４参照！）。
【００９６】
ｒＲＮＡバンドを視覚的に分析すると、大部分は完全なリボソームＲＮＡバンドがアガロースゲル上に示される。溶液４を用いて得られたバンドのみが、ＲＮＡの部分的な分解を示す。この知見は、大腸菌からのｏｍｐＡ（"外膜タンパク質Ａ"*）ｍＲＮＡに対する（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ）プローブを用いてハイブリダイゼーションが行われる、ノーザンブロット分析によって確認される。
【００９７】
*ｏｍｐＡのｍＲＮＡは、１５分の半減期を有する、比較的寿命の長いＲＮＡ転写物である（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） １９８４，３１２：７５〜７７）。
【００９８】
もう一度、溶液４を用いて単離したＲＮＡのいくらかの分解がある。その他のＲＮＡサンプルを比較すると、最もシャープなｏｍｐＡのｍＲＮＡバンドが、ＲＮＡが溶液１によって単離される痕跡中に見られる。しかしながら、全体的に、溶液１−３で単離されたＲＮＡサンプルは、ＲＮＡ品質のごくわずかな違いしか示さない。
【００９９】
図４には、異なる容積および濃度の溶液によって単離した大腸菌ＲＮＡの変性アガロースゲル電気泳動およびｏｍｐＡノーザンブロット分析の結果を示す。
【０１００】
実施例４
大腸菌ＲＮＡの安定化
安定化効率を評価するために、この実施例では、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤リファンピシンを培養培地中の大腸菌細胞に添加する実験を行う（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９８，４４０：１７２−１７４）。これは、ＲＮＡ転写物の新たな合成を防ぎ、それにより、ＲＮＡ転写物分解の分析がより容易になる。阻害剤を添加した後、所定時間に、ＲＮＡを細胞から単離する。使用する対照は、同様のプロセスに付される混合物であるが、その中で、ＲＮＡは溶液を添加することなく単離される（ＲＮｅａｓｙ標準法）。ｍＲＮＡの完全性を評価するために、ＲＮＡの単離後にノーザンブロット実験を行う。
【０１０１】
図５には、本発明による組成物を溶解して、あるいは溶解することなく、リファンピシンを添加した後に単離した大腸菌ＲＮＡのｏｍｐＡ（"外膜タンパク質Ａ"）ノーザンブロット分析を示す。
【０１０２】
ｏｍｐＡのｍＲＮＡは、使用される培養条件下で１５分の半減期を有する大腸菌転写物である（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） １９８４，３１２：７５−７７）。ノーザンブロット分析（図５）によって、本発明による溶液で処理されるサンプルにおいて、調査の全期間（１５分まで）にわたってｏｍｐＡのｍＲＮＡに対する均一な強度のシグナルが検出され得ることが示される。それと対照的に、界面活性剤を添加していないサンプルにおけるｏｍｐＡのｍＲＮＡについては、転写物の著しい減少が、わずか０〜５分後に認められる。
【０１０３】
図６には、カチオン化合物と添加剤との組成物若しくは水溶液を用いて、または用いることなく、リファンピシンを添加した後に単離した大腸菌ＲＮＡのｂｌａ（β−ラクタマーゼ）ノーザンブロット分析を示す。
【０１０４】
ノーザンブロット分析において、同じ効果が、β−ラクタマーゼのｍＲＮＡ（ｂｌａ）についてさらに明らかに検出され得る。このｍＲＮＡ転写物は、選択された培養条件下で２〜５分の半減期を有する（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） １９８４，３１２：７５−７７）。図６から明らかなように、この転写物は、溶液を添加して単離したＲＮＡサンプルにおいて、調査の全期間にわたって同等のシグナル強度で検出され得る。一方、界面活性剤溶液を含まない対照バッチでは、ＲＮＡを即時に（０分）ワークアップした場合でさえ、ｂｌａ ｍＲＮＡ転写物のほぼ完全な損失がある。ＲＮＡを単離する２種類の方法の間のｂｌａ ｍＲＮＡシグナル強度の差異は、本発明による組成物の対応する水溶液によるｍＲＮＡの即時の安定化を反映している。
【０１０５】
これらの実験から、本発明による組成物は、発現パターンの歪み（ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ）をまねく単離プロセスから人工産物を生じることなく、液体培養状態で細菌のＲＮＡ発現プロファイルを固定化する可能性を開くことが示される。
【０１０６】
実施例５
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＴＴＡＢ）によるＲＮＡの安定化
以下の実験において、以下の組成を有するＴＴＡＢ溶液を使用する：
４％（ｗ／ｖ）ＴＴＡＢ
２００ｍＭ酒石酸
ｐＨ４．０
【０１０７】
異なる種の細菌は、特に、それらの細胞壁の性質が異なる。異なる種を使用する場合、細胞溶解は、ＲＮＡ単離における重要な（ｃｒｉｔｉｃａｌ）段階である。細菌のグラム陰性種に特に良好な結果をもたらす酵素的細胞溶解と比較すると、機械的な細胞溶解は、種のすべての種類を溶解する能力を潜在的に有する。
【０１０８】
以下の表に、一方で、従来技術による方法（リゾチーム媒介細胞溶解によるＲＮｅａｓｙ）を用いて、本発明による組成物およびリゾチーム消化を含むＲＮｅａｓｙを用いて、更に、本発明による組成物およびＲＮｅａｓｙを用いて得られる異なる収率の比較を示す。酵素的細胞溶解は、ビーズミルによって補助される。ビーズミル（キアゲン社（Ｍｅｓｓｒｓ ＱＩＡＧＥＮ）のＭＭ３００）を使用した場合、１バッチ当たり、酸洗浄したガラスビーズ（直径１５０−６００μｍ）５０ｍｇを使用した。ビーズミルにおける細胞溶解を最大振動速度（３０Ｈｚ）で５分間行った。
【０１０９】
【表２】
2015027310.tif 000003
【０１１０】
この比較から明らかなように、機械的な細胞溶解と組み合わせた、本発明による組成物の溶液によるＲＮＡ単離によって、溶液を用いた酵素的細胞溶解と比較して、およそ２５％の増加が引き起こされる（表２）。ＲＮｅａｓｙ標準法によるＲＮＡの単離と比較して、その収量は、平均して、界面活性剤溶液を用いた機械的細胞溶解の３倍であった。
【０１１１】
これらの結果から、界面活性剤溶液を用いた酵素的細胞溶解もまた、グラム陽性枯草菌細胞において効率的に進行することが明らかに示され、このことは、ここで機械的細胞溶解が任意に省略され得ることを意味する。
【０１１２】
しかしながら、以下の実験的知見により明らかに示されるように、酵素的細胞溶解を用いない、ビーズミルなどの機械的な溶解方法の使用も、酵素的または機械的細胞溶解を用いない、ＲＮＡ単離と比較して、収量をおよそ６倍増大する可能性を開く。
【０１１３】
使用する出発原料は、ＬＢ培地中で成長させた枯草菌の培養液である。それぞれの場合において、混合物当たり１．８×１０8個の細胞からのＲＮＡ収量を比較する（表３）。いくつかのサンプルでは、１バッチ当たり酸洗浄したガラスビーズ（直径１５０−６００μｍ）５０ｍｇを用いて、ビーズミル（キアゲン社（Ｍｅｓｓｒｓ ＱＩＡＧＥＮ）製のＭＭ３００）によって細胞溶解を行う。ビーズミルでの細胞溶解を最大振動速度（３０Ｈｚ）で５分間行った。別のサンプル群では、細胞の酵素的な溶解も、機械的な溶解も実施しなかった（参考文献：Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４４（２００１）：２３５−２３８） プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）"ＳＶ全ＲＮＡ単離システム（ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ"。
【０１１４】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】界面活性剤溶液のｐＨおよび培養液と界面活性剤の容積比に対するＲＮＡ収量の依存性を図示する。
【図２】方法の様々な変形に対するＲＮＡ収量の依存性を図示する。
【図３】本発明による化合物の水溶液の容積の関数として、ＲＮＡ収量を図示する。
【図４】様々な濃度でのカチオン化合物とプロトン供与体との組成物の溶液の異なる容積の溶液を用いて単離された、大腸菌ＲＮＡの変性アガロースゲル電気泳動およびｏｍｐＡノーザンブロット分析の結果を示す。
【図５】本発明による組成物を溶解して、および溶解することなく、リファンピシンを添加した後に単離された大腸菌ＲＮＡのｏｍｐＡ（"外膜タンパク質Ａ"）ノーザンブロット分析を示す。
【図６】カチオン化合物と添加剤との組成物、またはその水溶液を使用して、および使用することなく、リファンピシンを添加した後に単離された大腸菌ＲＮＡのｂｌａ（β−ラクタマーゼ）ノーザンブロット分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年10月30日(2014.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物中の、または微生物からの、核酸を安定化し、かつ単離するための方法であって、前記微生物に、一般式：
Ｙ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘ-
（式中、Ｙは、窒素を示し、
Ｒ1は、分枝もしくは非分枝Ｃ1〜Ｃ20アルキル基を示し、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は互いに独立して、分枝もしくは非分枝Ｃ1〜Ｃ6アルキル基を示し、かつ、
Ｘ-は、無機もしくは有機の一塩基酸または多塩基酸のアニオンを示す）のカチオン化合物および少なくとも１種類のプロトン供与体を成分として含有する溶液形状の組成物を加え、存在する沈殿を溶液と分離後、前記沈殿に酵素的細胞溶解を行うことを含む方法であって、
前記プロトン供与体が、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニル−カルボン酸、飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6ジカルボン酸、不飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6ジカルボン酸、飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6トリカルボン酸、不飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6トリカルボン酸、脂肪族ヒドロキシ−ジカルボン酸、脂肪族ヒドロキシ−トリ−カルボン酸、脂肪族ケトジカルボン酸、アミノ酢酸（グリシン）、α−アミノプロピオン酸（アラニン）、α−アミノ−イソ吉草酸（バリン）、α−アミノ−イソカプロン酸（ロイシン）およびα−アミノ‐β−メチル吉草酸（イソロイシン）から選択されるアミノ酸、リン酸およびそのアルカリ金属もしくはそのアンモニウム塩、ならびに硫酸およびそのアルカリ金属もしくはそのアンモニウム塩の中から、単独でまたは組み合わせて選択される方法。
【請求項２】
微生物が、真正細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ1が、１２個、１４個、または１６個の炭素原子を有する高級アルキル基であり、かつ、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4が、それぞれに、メチル基を示すことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アニオンＸ-が、ハロゲン化水素酸のアニオンまたは一塩基もしくは二塩基有機酸のアニオン、リン酸塩のアニオン、または硫酸塩のアニオンの中から選択されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
アニオンＸ-が、臭化物、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩およびクエン酸塩からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、エチル−メチル−酢酸（２−メチル−酪酸）、２，２−ジメチルプロピオン酸（ピバル酸）、ｎ−カプロン酸、ｎ−オクタン酸、ｎ−デカン酸、もしくはｎ−ドデカン酸（ラウリン酸）または前述の酸の混合物から選択される脂肪族モノカルボン酸がプロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
アクリル酸（プロペン酸）、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸およびビニル酢酸または前述の酸の混合物から選択される不飽和アルケニル−カルボン酸がプロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸またはアジピン酸または前述の酸の混合物の中から選択される飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6ジカルボン酸が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
シュウ酸またはコハク酸または前述の酸の混合物から選択される飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6ジカルボン酸がプロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
タルトロン酸、Ｄ−（＋）、Ｌ−（−）−またはＤＬ−リンゴ酸、（２Ｒ，３Ｒ）−（＋）−酒石酸、（２Ｓ，３Ｓ）−（−）−酒石酸、メソ−酒石酸およびクエン酸または前述の酸の混合物から選択される脂肪族ヒドロキシ−ジ−カルボン酸または脂肪族ヒドロキシ−トリ−カルボン酸がプロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
マレイン酸および／若しくはフマル酸または前述の酸の混合物から選択される不飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6ジカルボン酸がプロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
アコニット酸である不飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6トリカルボン酸が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
メソシュウ酸若しくはオキサロ酢酸、または前述の酸の混合物から選択される脂肪族ケトジカルボン酸が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
組成物が水溶液の状態で使用される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
カチオン化合物が、０．０１％（Ｗ／Ｖ）〜飽和の範囲の濃度で組成物中に存在することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
核酸が、グラム陽性菌に由来することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
核酸が、バチルス属(Bacillus)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、フラボバクテリウム属(Flalvobacterium)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、連鎖球菌属(Streptococcus)、クロストリディウム属(Clostridiae)、リステア属(Listeria)、ペプトコッカス属(Peptococcus)、ペプトスレプトコッカス属(Peptostreptococcus)、腸球菌(Enterococcus)、コリネバクテリア(Corynebacterium)、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)、または乳酸桿菌属(Lactobacillus)に由来することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
核酸が、枯草菌に由来することを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
核酸が、グラム陰性菌に由来することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
核酸が、エシェリキア属(Escherichia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、莢膜桿菌(Klebsiella)、サルモネラ属(Salmonella)、シノルヒゾビウム(Sinorhizobium)、カンピロバクター属(Campylobacter)、ナイセリア属(Neisseria)、ビブリオ属(Vibrio)、赤痢菌属(Shigella)、セラチア属(Serratia)、エンテロバクター属(Enterobacter)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、プロテウス属(Proteus)、エルシニア属(Yersinia)、ブルセラ属(Brucella)、ヘモフィルス属(Haemophilus)、バクテロイデス属(Bacteroides)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、ボルデテラ属(Bordetella)、レジオネラ属(Legionella)、またはパスツレラ属(Pasteurella)に由来することを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
核酸が、大腸菌に由来することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
核酸が、クラミジア属(Chlamydia)、屈光性菌、マイコプラズマ属(Mycoplasma)、リケッチア(Rickettsia)、スピロヘータ属(Spirochetes)または、らせん菌に由来することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
微生物の酵素的、機械的、熱的若しくは化学的溶解を行うか、またはそれらの溶解方法の組み合わせを用いることをさらに含む請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法に用いるための組成物であって、前記組成物は、一般式：
Ｙ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘ-
（式中、Ｙは、窒素を示し、
Ｒ1は、分枝もしくは非分枝Ｃ1〜Ｃ20アルキル基を示し、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は互いに独立して、分枝もしくは非分枝Ｃ1〜Ｃ6アルキル基を示し、かつ、
Ｘ-は、無機もしくは有機の一塩基酸または多塩基酸のアニオンを示す）のカチオン化合物および少なくとも１種類のプロトン供与体を成分として含有する、微生物中の、または微生物からの、核酸を安定化しかつ単離するための、溶液形状の組成物であり、
前記プロトン供与体が、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニル−カルボン酸、飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6ジカルボン酸、不飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6ジカルボン酸、飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6トリカルボン酸、不飽和脂肪族Ｃ2−Ｃ6トリカルボン酸、脂肪族ヒドロキシ−ジカルボン酸、脂肪族ヒドロキシ−トリ−カルボン酸、脂肪族ケトジカルボン酸、アミノ酢酸（グリシン）、α−アミノプロピオン酸（アラニン）、α−アミノ−イソ吉草酸（バリン）、α−アミノ−イソカプロン酸（ロイシン）およびα−アミノ‐β−メチル吉草酸（イソロイシン）から選択されるアミノ酸、リン酸およびそのアルカリ金属もしくはそのアンモニウム塩、ならびに硫酸およびそのアルカリ金属もしくはそのアンモニウム塩の中から、単独でまたは組み合わせて選択される組成物。
【請求項２５】
診断用に用いられる請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
請求項２４または２５に記載の組成物を含む、微生物中の、または微生物からの、核酸を安定化しかつ単離するためのキット。
【請求項２７】
微生物を含む生物学的サンプルと、請求項２４または２５に記載の組成物とを含有する、前記微生物中の核酸が安定化されている混合物。