(57)【要約】【課題】非イオン性界面活性剤含有廃水を高効率で処理できる新規の微生物等を提供する。【解決手段】Ｓ４５Ｙ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３６）である微生物が提供される。この微生物はポリオキシエチレンアルキルエーテルの分解能に優れている。当該微生物を用いた廃水の処理方法も提供される。本発明の廃水の処理方法によれば、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを高効率で生物処理することができる。例えば、易分解性の一般有機物が共存する環境であっても、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを効率的に分解することができる。ポリオキシエチレンアルキルエーテルを完全分解することも可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ４５Ｙ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３６）である微生物。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物と、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを含有する廃水とを接触させて、廃水中の前記ポリオキシエチレンアルキルエーテルを分解することを特徴とする廃水の処理方法。
【請求項３】
前記微生物を活性汚泥に組み込んで用いることを特徴とする請求項２に記載の廃水の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物、並びに、廃水の処理方法に関し、さらに詳細には、高い非イオン界面活性剤分解能を有する微生物、並びに、当該微生物を利用した廃水の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性汚泥法等の生物学的処理による廃水処理が広く行われている。しかし、界面活性剤を活性汚泥法によって処理することには、多くの課題がある。すなわち、界面活性剤は難分解性であり、活性汚泥法による処理が難しい。
【０００３】
非イオン界面活性剤の生物処理について、種々の検討がされている。活性汚泥による非イオン界面活性剤の除去調査では１次分解（部分分解）の除去率は１日で９０〜９６％であるものの（非特許文献１)、完全分解では４週間で７４％の除去にとどまるとの報告があり（非特許文献２）、短期間での完全な除去は難しいことが知られている。
対策としては、非イオン界面活性剤分解菌を微生物製剤として添加する等が想定されるが、当該物質を部分的に分解する微生物の分離例はこれまでに報告があるものの、単一の炭素源として完全分解する微生物は報告が少ない（非特許文献３）。
さらに、取得した分解菌が活性汚泥等の生物処理法に応用が可能であった事例（総有機炭素レベルでの完全分解を達成した例）は見当らない。
【０００４】
その他、非イオン界面活性剤を分解する能力を有する微生物が、いくつか見出されている（例えば、特許文献１，２）。しかし、非イオン界面活性剤含有廃水の処理に十分適用されているとは言い難い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−３５４８９１号公報
【特許文献２】特開２０００−２７０８５２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Prats, D., Ruiz, F., Vazquez, B. and Rodriguez-Pastor, M.(1997) Removal of anionic and nonionic surfactans in a water treatment plant with anaerobic digestion. A comparative study. Water Research., 31,1925-1930.
【非特許文献２】独立行政法人  製品評価技術基盤機構，２００７，化学物質の初期リスク評価書，Ver.1.0 No. 89
【非特許文献３】Maki, H., Masuda, N., Fujiwara,Y., Ike, M. and Fujita, M.(1994) Degradation of Alkylphenol Ethoxylates by Pseudomonas sp. Strain TR01. Appl. Environ. Microbiol.60, 2265-2271
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非イオン界面活性剤の生物学的処理における従来技術の問題点をまとめると、以下のとおりである。まず、難分解性である非イオン界面活性剤を処理対象にした場合、活性汚泥法に代表される従来の生物処理手法では処理設備の設計時に求められる十分な除去速度が得られない。また、易分解性の一般有機物が共存する処理環境の場合、活性汚泥はそれを消費し、非イオン界面活性剤のような難分解性物質を分解しない（又は処理効率が低下する）ことがある。さらに、活性炭等の多孔質資材を用いた物理的吸着除去の方法では定期的な資材交換が必要であるため、コストの問題がある。
【０００８】
上記現状に鑑み、本発明は、非イオン界面活性剤分解能に優れた新規微生物を提供するとともに、当該微生物を利用した廃水の生物処理技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、より高い非イオン界面活性剤分解能を有する新規微生物を分離すべく、ウキクサ（Spirodela polyrrhiza）の根圏を分離源として微生物のスクリーニングを行った。その結果、非イオン界面活性剤の一種であるポリオキシエチレンアルキルエーテルに対する分解能に特に優れた新規微生物を分離することに成功した。そして、当該微生物を利用したポリオキシエチレンアルキルエーテル含有廃水の生物処理方法を開発し、本発明を完成した。上記した課題を解決するための本発明は、以下のとおりである。
【００１０】
請求項１に記載の発明は、Ｓ４５Ｙ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３６）である微生物である。
【００１１】
本発明の微生物は、ポリオキシエチレンアルキルエーテルに対する高い分解能を有する。本発明の微生物によれば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル含有廃水を高効率で生物処理することができる。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の微生物と、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを含有する廃水とを接触させて、廃水中の前記ポリオキシエチレンアルキルエーテルを分解することを特徴とする廃水の処理方法である。
【００１３】
本発明は廃水の処理方法に係るものであり、上記した本発明の微生物とポリオキシエチレンアルキルエーテルを含有する廃水とを接触させる工程を包含する。本発明の廃水の処理方法によれば、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを高効率で生物処理することができる。例えば、易分解性の一般有機物が共存する環境であっても、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを効率的に分解することができる。ポリオキシエチレンアルキルエーテルを完全分解することも可能である。
【００１４】
請求項３に記載の発明は、前記微生物を活性汚泥に組み込んで用いることを特徴とする請求項２に記載の廃水の処理方法である。
【００１５】
かかる構成により、活性汚泥法への適用が可能となる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを含む廃水を効率的に生物処理することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】活性汚泥法におけるＴＯＣの経時変化を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の微生物は、Ｓ４５Ｙ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３６）である微生物である。当該微生物は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託されている。寄託の詳細を以下に示す。
【００１９】
表示：Ｓ４５Ｙ株
受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３６
受領日：平成２５年６月１９日
【００２０】
Ｓ４５Ｙ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３６）の菌学的性質は以下のとおりである。「＋」は陽性、「−」は陰性を示す。
【００２１】
〔形態等〕
・細胞形態：桿菌（２．０〜２．５μｍ×０．５〜１．５μｍ）
・グラム染色性：−
・胞子の有無：−
・運動性：−
・コロニー形態（培地：ＬＢ寒天、培養時間：４８時間、培養温度：２８℃）
直径：０．１〜１．５ｍｍ
色調：黄色
形：円形
隆起状態：半球状（convex）
表面の形状など：スムーズ
透明度：不透明
【００２２】
〔好気性、嫌気性〕
・好気性
【００２３】
〔資化性等〕
・カタラーゼ反応：＋
・オキシダーゼ反応：＋
・ウレアーゼ：−
・β−ガラクトシダーゼ：−
・インドール試験：＋
・硝酸塩還元：−
・マンニトール：−
・ソルビトール：＋
・セロビオース：＋
・トレハロース：＋
・キシロース：＋
・フルクトース：＋
・シュクロース：＋
・ラフィノース：＋
・グルコースからの酸産生：＋
・ガラクトースからの酸産生：＋
【００２４】
・１６ｒＤＮＡ塩基配列の相同性
Sphingomonas paucimobilis：１００％
【００２５】
本発明の微生物を培養する方法としては、好気性微生物の培養方法として一般的な方法をそのまま採用することができる。例えば、適当な炭素源等を含有する液体培地を用いて、通気及び撹拌して培養することができる。培養温度としては、例えば５〜４０℃、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２０〜３５℃の範囲を選択することができる。培地に炭素源としてポリオキシエチレンアルキルエーテル（以下、「ＰＯＥアルキルエーテル」と略記することがある。）を添加する場合、濃度としては、例えば７５０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは１００ｍｇ／Ｌ以下の範囲を選択することができる。
【００２６】
本発明の微生物は、高いＰＯＥアルキルエーテルに対する分解能を有する。ＰＯＥアルキルエーテル分解能の評価方法としては、例えば、ＰＯＥアルキルエーテルを含有する培地で本発明の微生物を培養した際の、当該培養液中におけるＰＯＥアルキルエーテルの減少速度をもって評価することができる。ＰＯＥアルキルエーテルの減少速度は、例えば、ＰＯＥアルキルエーテルを唯一、あるいは主たる炭素源とする培地を用い、培地中のＰＯＥアルキルエーテル量の変化を全有機体炭素（ＴＯＣ）の変化をもって検出し、算出することができる。その他、チオシアン酸カリウム法（後述の実施例参照）によってＰＯＥアルキルエーテルを定量することができる。
【００２７】
本発明の廃水の処理方法は、Ｓ４５Ｙ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３６）とＰＯＥアルキルエーテルを含有する廃水とを接触させて、廃水中のＰＯＥアルキルエーテルを分解するものである。
【００２８】
本発明の廃水の処理方法において、処理対象となるＰＯＥアルキルエーテルとしては、例えば、アルキル基の炭素数が１２〜１５のＰＯＥアルキルエーテルが挙げられる。その他、後述の実施例で用いた各ＰＯＥアルキルエーテルが挙げられる。
【００２９】
本発明の廃水の処理方法は、好気性処理のあらゆる方式、例えば、活性汚泥法、生物膜法のいずれにも適用できる。活性汚泥法に適用する場合には、活性汚泥中に本発明の微生物を添加して他微生物と共存（共生）させることにより、ＰＯＥアルキルエーテル含有廃水の処理を高効率で行うことができる。本発明の微生物は、他の微生物と共存する処理環境であっても、ＰＯＥアルキルエーテル対する高い分解能力を発揮できる。
【００３０】
生物膜法に適用する場合には、回転円板法や散水ろ床法等の公知の手法をそのまま適用することができる。本発明の微生物を担体に固定化し、流動床式の処理を行うこともできる。また、本発明の廃水の処理方法は、回分式、連続式のいずれの処理方式にも適用できる。
【００３１】
本発明の廃水の処理方法において、ＰＯＥアルキルエーテル含有廃水に接触させる微生物の量（例えば、添加量や添加サイクル）は、処理すべき廃水の性状、廃水処理施設の構成等に応じて適宜選択すればよい。また、ＰＯＥアルキルエーテル含有廃水と微生物との接触時間についても、廃水に含まれるＰＯＥアルキルエーテルの種類や量、処理すべき廃水の性状等に応じて適宜選択することができる。廃水処理時の温度としては、本発明の微生物の生育可能範囲であればよく、例えば、培養温度として例示した５〜４０℃、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２０〜３５℃の範囲を選択することができる。同様に、ＰＯＥアルキルエーテルの濃度としては、例えば７５０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは１００ｍｇ／Ｌ以下の範囲を選択することができる。
【００３２】
本発明の微生物によれば、ＰＯＥアルキルエーテルを１２時間程度の短時間で分解除去することができる。また、易分解性の一般有機物が共存する処理環境においても、ＰＯＥアルキルエーテルに対する高い分解活性を有する。さらに、雑多な一般微生物を共存する処理環境においてもＰＯＥアルキルエーテルに対する高い分解活性を発揮できる。このことにより、廃水処理方法として最も普及している活性汚泥法等の生物処理方式のストック設備を活用することが可能となる。またさらに、従来法では完全な処理が行われないまま公共用水域に放流されているＰＯＥアルキルエーテルについて、低コストで除去可能な水質浄化方法を提供することができる。
【００３３】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
まず、本実施例で使用した非イオン界面活性剤を以下に示す。
【００３５】
〔ＰＯＥアルキルエーテル〕
・ポリオキシエチレン（７）ラウリルエーテル（ＰＯＥ（７）ＬＥ）（和光純薬工業社製）
・ポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテル（ＰＯＥ（９）ＬＥ）（和光純薬工業社製）
・ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル（ＰＯＥ(２３）ＬＥ）（和光純薬工業社製）
・ポリオキシエチレン（７）オレイルエーテル（ＰＯＥ（７）ＯＥ）（和光純薬工業社製）
・ポリオキシエチレンアルキル（１２〜１４）エーテル（ＢＴ−７）
なお、ＢＴ−７はＰＯＥ（７）ＬＥと類似の構造を有する。
【００３６】
各ＰＯＥアルキルエーテルの化学構造上の特徴を表１に示す。
【００３７】
【表１】
2015033331.tif 000003
【００３８】
〔他の非イオン界面活性剤〕
・ポリエチレンポリプロピレングリコールモノブチルエーテル
・ポリオキシアルキレンエーテル
【００３９】
（１）新規微生物のスクリーニング
根圏にＰＯＥ（７）ＬＥ分解活性を有するウキクサを、新規微生物の分離源とした。ＰＯＥ（７）ＬＥ分解活性を指標とし、平板培養法による直接分離あるいは集積培養による分離によって１次スクリーニングを行った。次に、１次スクリーニングで選抜した菌株について、再度同じ方法でスクリーニングを行い、２次スクリーニングとした。２次スクリーニングで選抜した菌株について、易分解性有機物存在下におけるＰＯＥ（７）ＬＥ分解活性を指標として、３次スクリーニングを行った。３次スクリーニングによって、ＰＯＥ（７）ＬＥ分解活性に特に優れた微生物を１株選抜し、Ｓ４５Ｙ株と命名した。
【００４０】
Ｓ４５Ｙ株に対して、配列番号１及び２に示すプライマーを用いたコロニーＰＣＲを行って１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、塩基配列解析を行った。得られた配列データについて、相同性検索プログラム（BLAST search）を用いてＮＣＢＩデータベースに登録された塩基配列と比較した。その結果、Sphingomonas paucimobilisとの相同性が１００％であった。
【００４１】
Ｓ４５Ｙ株を、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６３６）。
【００４２】
（２）Ｓ４５Ｙ株のＰＯＥ（７）ＬＥ分解活性の評価（２次スクリーニング時）
４８穴マイクロプレートに、５００ＬのＡ＆ＨＰＢ培地（表３）を入れ、ＰＯＥ（７）ＬＥを終濃度５０ｍｇ／Ｌとなるように添加した。各穴にゴマ粒程度の菌株を植菌した後、２５℃、暗条件で回転振とう培養した。培養開始０日目（培養開始前）、２日目、及び５日目に培養液を１００μＬサンプリングした。サンプリングした培養液について、チオシアン酸カリウム法（手順は後述）により、培地中に残存するＰＯＥ（７）ＬＥの濃度を測定した。下記式により、培養５日目のＰＯＥ（７）ＬＥの残存率（％）を算出した。
【００４３】
残存率（％）＝ＰＯＥ（７）ＬＥ濃度(５日目)／ＰＯＥ（７）ＬＥ濃度(０日目)×１００
【００４４】
その結果、Ｓ４５Ｙ株におけるＰＯＥ（７）ＬＥの残存率は１０％以下であった。このように、Ｓ４５Ｙ株はＰＯＥ（７）ＬＥに対する高い分解性能を有していた。
【００４５】
Modified Arnon & Hoagland培地（Ａ＆Ｈ培地）とＡ＆ＨＰＢ培地の組成を、それぞれ表２、表３に示す。
【００４６】
【表２】
2015033331.tif 000004
【００４７】
【表３】
2015033331.tif 000005
【００４８】
チオシアン酸カリウム法による定量は、以下の手順で行った。
検水５０μＬを蒸留水で４倍希釈した。１．５ｍＬサンプリングチューブに希釈検水（検量線作成用試料はＰＯＥ（７）ＬＥ濃度０,４,８,１２,１６,２０ ｍｇ／ｍＬ）を２００μＬ入れ、０．８ｇ／ｍＬのチオシアン酸カリウム溶液５０μＬ、０．４ｇ／ｍＬの硝酸鉄(III)溶液１２．５μＬ、１,２−ジクロロエタン１５０μＬを加えた。振とう機で５分間振とうした後、５分間静置した。有機層を分離し、その吸光度（Ａ５１０ｎｍ)を測定した。検量線から出した近似式より、検水のポリオキシエチレンアルキルエーテル濃度を算出した。
【００４９】
（３）易分解性有機物存在下でのＰＯＥ（７）ＬＥ分解活性（３次スクリーニング時）
２次スクリーニングで選抜した菌株について、終濃度５０ｍｇ／ＬとなるようにＰＯＥ（７）ＬＥを添加したＲ２Ａ培地（表４）にて培養し、易分解性有機物存在下におけるＰＯＥ（７）ＬＥ分解活性について調べた。
具体的には、２５ｍＬネジ口試験管に５ｍＬのＲ２Ａ培地を入れ、ＰＯＥ（７）ＬＥが終濃度５０ｍｇ／Ｌとなるように添加した。ＰＯＥ（７）ＬＥ分解菌を、初期菌体濃度がＯＤ660＝０．０２となるように植菌した。１６０ｒｐｍ、２５℃、暗条件で５日間、往復振とう培養した。培養０時間目（培養開始前）、３時間目、６時間目、１２時間目、２４時間目、４８時間目、及び１２０時間目に、培養液を２００μＬサンプリングした。サンプリングした培養液について、チオシアン酸カリウム法にて培地中に残存するＰＯＥ（７）ＬＥの濃度を測定した。下記式により、培養１２０時間目（５日目）のＰＯＥ（７）ＬＥの残存率（％）を算出した。
【００５０】
残存率（％）＝ＰＯＥ（７）ＬＥ濃度（５日目）／ＰＯＥ（７）ＬＥ濃度（０日目）×１００
【００５１】
その結果、Ｓ４５Ｙ株におけるＰＯＥ（７）ＬＥの残存率は２０％以下であった。このように、Ｓ４５Ｙ株は、易分解性有機物存在下でもＰＯＥ（７）ＬＥを効率よく分解した。
【００５２】
Ｒ２Ａ培地の組成を表４に示す。
【００５３】
【表４】
2015033331.tif 000006
【００５４】
（４）基質特異性
上記（２）と同様にして、ＰＯＥ（７）ＬＥ以外の非イオン界面活性剤について分解性能を調べた。その結果、ＰＯＥ（９）ＬＥでは残存率２０％以下、ＰＯＥ（２３）ＬＥ、ＰＯＥ（７）ＯＥ、及びＢＴ−７では残存率１０％以下であり、ＰＯＥ（７）ＬＥと同様の高い分解性能が認められた。一方、ポリエチレンポリプロピレングリコールモノブチルエーテルとポリオキシアルキレンエーテルは、ほとんど分解されなかった。このように、Ｓ４５Ｙ株は、ＰＯＥアルキルエーテルに対する高い分解性能を有していることが分かった。
【００５５】
（５）活性汚泥への添加実験（微生物製剤としての評価）
３００ｍＬ三角フラスコにＲ２Ａ培地を２００ｍＬ仕込み、Ｓ４５Ｙ株を１白金耳植菌し、対数増殖期後期まで１６０ｒｐｍ、２５℃、暗条件で回転振とう培養した（前培養）。培養菌体をＡ＆Ｈ培地で２回洗浄し、同培地で懸濁した。２５ｍＬのネジ口試験管に、活性汚泥（終濃度１５００ｍｇ／Ｌ）、菌体（終濃度５００ｍｇ／Ｌ)、炭素源（ＰＯＥ（７）ＬＥ（終濃度５０ｍｇ／Ｌ）、及び人工下水（表５）（１１５μＬ）を加えて、全量５ｍＬとした。これを１６０ｒｐｍ、暗条件で１日間往復振とう培養した。０時間目（培養開始前）、３時間目、６時間目、１２時間目、及び２４時間目に培養液を２００μＬサンプリングした。
【００５６】
人工下水の組成を表５に示す。
【００５７】
【表５】
2015033331.tif 000007
【００５８】
サンプリングした培養液について、チオシアン酸カリウム法にてＰＯＥ（７）ＬＥを測定し、ＰＯＥ（７）ＬＥの分解評価を行った。培養１２時間目と２４時間目のＰＯＥ（７）ＬＥの残存率（％）は以下の式により算出した。コントロールとして、Ｓ４５Ｙ株を添加せずに活性汚泥のみを用いて同様の実験を行った。
【００５９】
残存率（％）＝ＰＯＥ（７）ＬＥ濃度（１２時間目又は２４時間目）／ＰＯＥ（７）ＬＥ濃度（０時間目）×１００
【００６０】
その結果、１２時間目、２４時間目のいずれにおいてもＰＯＥ（７）ＬＥの残存率が３０％以下であり、高いＰＯＥ（７）ＬＥ分解性能を示した。一方、活性汚泥のみのコントロールでは、ＰＯＥ（７）ＬＥはほとんど分解されなかった。
【００６１】
また、サンプリングした培養液についてＴＯＣ計にてＴＯＣを測定し、全有機物の分解評価を行った。コントロールとして、Ｓ４５Ｙ株を添加せずに、活性汚泥に人工下水とＰＯＥ（７）ＬＥを添加したもの（コントロール１）、及び、活性汚泥に人工下水を添加したもの（コントロール２）を用いて同様の実験を行った。結果を図１に示す。
【００６２】
図１に示すように、Ｓ４５Ｙ株を用いた場合には、培養開始から１２時間目でほぼ全ての有機物が分解されていた。一方、活性汚泥のみの場合には、人工下水の有機物は分解されたが（コントロール２）、ＰＯＥ（７）ＬＥはほとんど分解されなかった（コントロール１）。
【００６３】
以上のように、Ｓ４５Ｙ株を活性汚泥に組み込むことにより、１２時間という短時間で５０ｐｐｍ程度のＰＯＥ（７）ＬＥを分解除去できることが示された。またＳ４５Ｙ株は、雑多な一般微生物が共存する環境であっても、ＰＯＥ（７）ＬＥに対する高い処理能力を有していることが示された。さらにＳ４５Ｙ株は、易分解性の一般有機物が共存する処理環境においても、ＰＯＥ（７）ＬＥに対する高い分解活性を有していることが示された。
【図１】
2015033331.tif 000008
【配列表】
2015033331000001.app