(57)【要約】【課題】生体機能にとって有用性が高いＰＩは両親媒性のために水に対して良好に分散できるものの、水系に分散させた時の分散性や溶解性が不十分であった。したがって、水系への分散性および／または溶解性が更に向上したＰＩ及びその調製方法が求められていた。【解決手段】ＰＩを含有するリン脂質混合物にＰＬＢを作用させ、ＰＣ、ＰＥやホスファチジン酸（以下、ＰＡと略すこともある）等のＰＩ以外のリン脂質を選択的に加水分解した後、残存したＰＩを有機溶媒で抽出する際に、無機塩及びキレート剤の存在下で酵素反応物から有機溶媒でＰＩを抽出することで溶解性に優れたＰＩを調製することができることを見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジルイノシトールの製造方法であって、以下の工程（１）および（２）を含む前記方法。
（１）リン脂質混合物に、ホスホリパーゼＢを作用させる工程
（２）工程（１）で得られたリン脂質混合物とホスホリパーゼＢとの反応物に有機溶媒を添加してホスファチジルイノシトールを抽出する工程であって、無機塩及び／またはキレート剤の存在下で抽出を行う前記工程
【請求項２】
無機塩が、ナトリウム塩である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項３】
ナトリウム塩が、塩化ナトリウムである請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸である請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
ホスホリパーゼＢが、実質的にホスファチジルイノシトールに作用しないものである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法により得られた、ホスファチジルイノシトールを少なくとも５０重量％含有してなる組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファチジルイノシトールの製造方法に関し、特に分散性の良好なホスファチジルイノシトールの製造方法に関する。また、当該方法により製造されたホスファチジルイノシトールを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスファチジルイノシトール（以下、ＰＩと略すこともある）は、ホスファチジルコリン（ＰＣと略すこともある）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥと略すこともある）等の他のリン脂質と異なり、細胞内外の情報伝達機能に深く関わっていることが知られている。近年、ＰＩの摂取により血中のトリグリセリド濃度を減少させ、ＨＤＬコレステロールを増加させることが報告され（非特許文献１及び非特許文献２）、この代謝産物であるリゾホスファチジルイノシトール及びグリセリルホスホリルイノシトールと共にその生理作用が注目されている。また、高脂肪食摂食条件下でＰＩ摂取により抗肥満効果が報告された（非特許文献３）。更に、モデル動物実験において脳内へのアミロイドβ蛋白質投与による海馬の神経細胞障害をＰＩが保護したことが報告された（非特許文献４）。このように、生体にとって極めて高い有用性があると考えられているＰＩの効率的な製造方法としてホスホリパーゼＢ（以下、ＰＬＢと略すこともある）を用いる方法がすでに報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０１０８９２号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Biochemica et Biophysica Acta 15288(2002),p1-7
【非特許文献２】J.Oleo. Sci.（2009）, 58, p111-115
【非特許文献３】J. Agric. Food Chem.（2010）,58, p11218-11225
【非特許文献４】Life Science（2007）80, p1971-1976
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生体機能にとって有用性が高いＰＩは両親媒性のために水に対して良好に分散できるものの、水に分散させた時の分散性や溶解性が不十分であった。したがって、水や水溶性溶媒などの水系への分散性および／または溶解性が更に向上したＰＩ及びその調製方法が求められていた。
なお、ＰＩなどのリン脂質は両親媒性を示し、水系においてミセルを形成して分散する。そして、ＰＩの水系における分散性が向上すると、見かけ上溶解性が向上したように観察される。したがって、本明細書中、特にことわりがない限りＰＩの分散性の向上と溶解性の向上は同義で用いられるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、溶解性に優れたＰＩの調製方法について鋭意検討した結果、ＰＩを含有するリン脂質混合物にＰＬＢを作用させ、ＰＣ、ＰＥやホスファチジン酸（以下、ＰＡと略すこともある）等のＰＩ以外のリン脂質を選択的に加水分解した後、残存したＰＩを有機溶媒で抽出する際に、無機塩及びキレート剤の存在下で酵素反応物から有機溶媒でＰＩを抽出することで溶解性に優れたＰＩを調製することができることを見出した。本発明は係る知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明の様態は以下に関する。
〔１〕ホスファチジルイノシトールの製造方法であって、以下の工程（１）および（２）を含む前記方法。
（１）リン脂質混合物に、ホスホリパーゼＢを作用させる工程（２）工程（１）で得られたリン脂質混合物とホスホリパーゼＢとの反応物に有機溶媒を添加してホスファチジルイノシトールを抽出する工程であって、無機塩及び／またはキレート剤の存在下で抽出を行う前記工程
〔２〕無機塩が、ナトリウム塩である前記〔１〕または〔２〕に記載の製造方法。
〔３〕ナトリウム塩が、塩化ナトリウムである前記〔１〕または〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸である前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造方法。
〔５〕ホスホリパーゼＢが、実質的にホスファチジルイノシトールに作用しないものである前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の製造方法により得られた、ホスファチジルイノシトールを少なくとも５０重量％含有してなる組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ＰＩを含有する溶液にPLBを作用させた後、有機溶媒を用いてＰＩを抽出する際にナトリウム塩及びキレート剤を共存させるだけで水に対する分散性に優れたＰＩを容易に調製することができるため、大豆などの天然物を原料としたＰＩの製造方法として特に有用である。また、本製造方法により得られたＰＩは水分散性に優れるため、飲料、食品、医薬品その他に含有させて使用する場合にも取扱いに優れるなどの利点を有する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明で用いるリン脂質混合物としてはＰＩ を含有するものであれば特に限定されず、鶏卵卵黄由来のリン脂質、イクラ等の魚卵由来リン脂質、トウモロコシ、ナタネ、ダイズ、オリーブ由来の粗製リン脂質を使用することができるが、このうちでもＰＩ含量が安定しているダイズ由来のリン脂質混合物が特に好ましい。
【０００９】
本発明の、リン脂質混合物に作用させるＰＬＢとは、リン脂質のα位及びβ位の脂肪酸エステルを加水分解、脂肪酸エステル合成、又は脂肪酸エステル交換を行う酵素を意味する。また、リゾリン脂質に作用し、残っている脂肪酸エステル結合を加水分解する酵素も本発明のＰＬＢに含まれる。
本発明のＰＬＢは、リン脂質混合物に作用させた場合に、ＰＩを残存させるものであればいずれでもよいが、できるだけ効率よくＰＩを製造するためには、実質的にＰＩに作用せずＰＣ、ＰＥ、ＰＡ等に良好に作用する基質特異性を有する酵素がより好ましい。
このようなＰＬＢであれば特に起源を問わないが、安定供給の点で微生物由来酵素が好ましい。中でも酵母由来酵素が好ましくキャンディダ属由来酵素が特に好ましい。
実質的にＰＩに作用しないとは、基質であるリン脂質混合物中に含まれるホスファチジルイノシトールのホスファチジルコリンに対する活性比（相対活性）が、上限として１０％以下であることを意味し、好ましくは７％以下であることを意味し、さらに好ましくは５％以下であることを意味し、特に好ましくは３％以下であることを意味し、最も好ましくは１％以下であることを意味し、下限として０．０１％以上であることを意味し、より好ましくは０．１％以上を意味する。さらにホスファチジルイノシトールとホスファチジルコリン以外のリン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、又はホスファチジン酸（ＰＡ）等の、ホスファチジルコリンに対する活性比（相対活性）が、下限として１５％以上であることを意味し、好ましくは２０％以上であることを意味し、さらに好ましくは２５％以上であることを意味し、特に好ましくは３０％以上であることを意味し、最も好ましくは４０％以上であることを意味し、上限として２００％以下であることを意味し、好ましくは１５０％以下であることを意味し、さらに好ましくは１００％以下であることを意味する。
【００１０】
本発明のＰＬＢの一例として、特許第４９３３４３２号の明細書段落０００７から段落００１６に記載されたＰＬＢが挙げられる。
すなわち、下記１）〜７）の性質を有するＰＬＢが例示できる。
１）作用：レシチン等のリン脂質から２モル比の遊離脂肪酸と等モル比のグリセリルホスフォリルコリンとに加水分解する作用とトリグリセリドに作用し３モル比の遊離脂肪酸と等モルのグリセリンとに加水分解する作用
２）分子量：５３，０００±３，０００（ＳＤＳ電気泳動法による）
３）等電点電気泳動法による等電点：ｐＨ４．２１±０．２
４）最適反応ｐＨ：ｐＨ５．５から６．５付近
５）ｐＨ安定性：ｐＨ５から９付近（３７℃、９０分間処理）
６）熱安定性：５５℃（ｐＨ５で１０分間処理）
７）基質特異性：ホスファチジルイノシトールに対する活性比がホスファチジルコリンの場合の１０％以下
【００１１】
更に、Penicillium camanbertti由来酵素（リパーゼＧ「アマノ」５０）、Penicillium  roqueforti由来酵素（リパーゼＲ「アマノ」）やRhizupus  orysae由来酵素（リパーゼＤＦ「アマノ」１５）（以上、天野エンザイム株式会社製）等の市販のリパーゼ製剤のＰＬＢも使用できる。
【００１２】
本発明におけるＰＬＢの使用濃度は、リン脂質１ｋｇあたり１０００〜１００００００００単位の範囲で使用することができるが２０００〜５００００００単位程度の範囲が好ましい。使用するＰＬＢの形態は水溶液の形で添加してもよく、セライト又はイオン交換樹脂等の不溶性担体に固定化された形態でもよい。リン脂質混合物は予めホモゲナイザー等を使用して水に分散させてもよく、また、強制的な攪拌によって均一に分散された水溶液を調製することができる。
【００１３】
リン脂質濃度は、水に分散したリン脂質混合物にＰＬＢが作用しうる濃度であれば良いが、１〜２０％の範囲、好ましくは５〜１０％、特に好ましくは６〜８％である。
【００１４】
リン脂質混合物にＰＬＢを作用させるとは、リン脂質混合物とＰＬＢを反応可能な条件下で接触させることをいう。
リン脂質混合物とＰＬＢが反応可能なｐＨは、ｐＨ３〜１０の範囲であり、ＰＬＢの活性が最大になるｐＨ５．５〜６．５付近に調整することが好ましい。特に好ましくはｐＨ６付近である。反応のｐＨを一定に保つために緩衝液を使用することが好ましく、ｐＨ５．５〜６．５の範囲で緩衝能を有する緩衝液であればその種類は特に限定されないが、食品用途の観点からは酢酸緩衝液の使用が特に好ましい。また、緩衝液を使用する代わりに反応中にＮａＯＨ溶液を適宜添加して反応液のｐＨを好ましい範囲にコントロールすることもできる。
【００１５】
酵素反応の温度はＰＬＢが失活しない範囲で使用することができるが、上限としては６０℃以下であることが好ましく、４５℃以下であることがより好ましく、また下限としては１０℃以上であることが好ましく、３０℃以上であることがより好ましい。
【００１６】
本発明において用いられる無機塩としては、ナトリウム塩が好ましく、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硝酸ナトリウム等を使用できるが、好ましくは塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、より好ましくは塩化ナトリウムである。
好ましい無機塩の濃度としては、０．１Ｍ〜３Ｍであり、より好ましくは０．２〜０．５Ｍである。ナトリウム塩の場合も０．１Ｍ〜３Ｍが好ましく、より好ましくは０．２〜０．５Ｍである。塩化ナトリウムの場合も０．１Ｍ〜３Ｍが好ましく、より好ましくは０．２〜０．５Ｍである。
【００１７】
本発明において用いられるキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、クエン酸、酒石酸、フィチン酸等であるが、好ましくはエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸であるが最も好ましくはＥＤＴＡである。本発明において用いられるキレート剤の好ましい濃度は、０．１〜１％であるがより好ましくは０．３％以上である。
【００１８】
リン脂質混合物にホスホリパーゼＢを作用させて得られた反応物からのＰＩの抽出工程は、その工程が無機塩及び／またはキレート剤の存在下で行われればよく、無機塩及び／またはキレート剤（無機塩等）の添加のタイミングとしては、例えば以下が挙げられる。
（１）リン脂質混合物とホスホリパーゼＢとの反応物に無機塩等を添加し、その後有機溶媒を添加し、ＰＩの抽出を行う
（２）リン脂質混合物とホスホリパーゼＢとの反応物に有機溶媒を添加し、さらに無機塩等を添加し、ＰＩの抽出を行う
（３）リン脂質混合物とホスホリパーゼＢとの反応物に、あらかじめ無機塩等を入れておいた有機溶媒を添加し、ＰＩの抽出を行う
【００１９】
本発明において抽出工程に用いられる有機溶媒としては、クロロホルム、メチレンクロライド、トルエン、エチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン、ヘプタン、ヘキサンとエチルアルコール混合液等を使用できるが、好ましくは、クロロホルム、メチレンクロライド、トルエン、より好ましくはヘキサン、ヘキサン‐エチルアルコール混合液である。
【００２０】
更に高純度のＰＩを得る場合には、シリカゲルや吸着樹脂などのすでに公知の精製手段により精製することにより得られる。
【００２１】
本発明の製造方法により、高純度かつ水への分散性に優れたＰＩが提供される。
ＰＩの純度は高純度であれば特に限定されないが、全リン脂質中のＰＩの純度が、下限としては５０モル％以上であることが好ましく、６０モル％以上であることがより好ましく、７０モル％以上であることがさらに好ましく、８０モル％であることが特に好ましく、８５モル％以上であることが最も好ましい。
【００２２】
また、PIの水への分散性や溶解性の評価は、肉眼的な観察でも行うことができるが、より好ましくは500〜750nm付近での吸光度を測定することによっても行うことができる。
【００２３】
本発明により得られたＰＩは、食品、医薬品又は化粧品として利用することができる。
食品及び医薬品中のＰＩ含有量は、何ら限定されるものではないが、1日のＰＩの摂取量が１〜１００００ｍｇとなるような量、好ましくは１０〜５０００ｍｇ、さらに好ましくは３０〜１０００ｍｇとなるような量が良い。
本発明のＰＩを含有する食品としては、これらを含有するものであれば何ら限定されるものでは無く、例えばこれらを含有するサプリメント（散剤、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）、飲料（お茶、炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料等）、菓子（グミ、ゼリー、ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー等）、油、油脂食品（マヨネーズ、ドレッシング、バター、クリーム、マーガリン等）、ケチャップ、ソース、流動食、乳製品（牛乳、ヨーグルト、チーズ等）、パン類、麺類（うどん、そば、ラーメン、パスタ、やきそば、きしめん、そーめん、ひやむぎ、ビーフン等）、スープ類（味噌汁、コーンスープ、コンソメスープ等）、ふりかけ等が挙げられる。
【００２４】
本発明に用いられるＰＩを含有する食品には、必要に応じて各種栄養素、各種ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ等）、各種ミネラル類（マグネシウム、亜鉛、鉄、ナトリウム、カリウム、セレン、酸化チタニウム等）、食物繊維、各種糖類（セルロース、デキストリン、キチン等）、各種多価不飽和脂肪酸（アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸等）、各種共役脂肪酸類（共役リノール酸、共役リノレン酸、共役アラキドン酸、共役ＤＨＡ、共役ＥＰＡ、共役ＤＰＡ等）、各種リン脂質（レシチン、ＰＡ、ＰＳ、ＰＥ、ホスファチジルグリセロール、ＰＣ、ホスファチジルＤＨＡ等）、各種糖脂質類（セレブロシド等）、各種カロチノイド類（β-カロチン、リコピン、アスタキサンチン、β−クリプトキサンチン、カプサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン等）、各種フラボノイド類（ケルセチン、ルテオリン、イソフラボン等）、各種アミノ酸類（グリシン、セリン、アラニン、グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジン、プロリン、メチオニン、システイン等）、その他の各種栄養素（酸化型コエンザイムＱ１０、還元型コエンザイムＱ１０、カルニチン、セサミン、α−リポ酸、イノシトール、Ｄ−カイロイノシトール、ピニトール、タウリン、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、クルクミン、γ−オリザノール、グルタチオン、γ−アミノ酪酸、シネフリン、ピロロキノリンキノン、カテキン、カプサイシン等）、各種分散剤、各種乳化剤等の安定化剤、各種甘味料（ソルビトール、ショ糖等）、各種呈味成分（クエン酸、リンゴ酸等）、フレーバー、ローヤルゼリー、蜂蜜、蜜ロウ、プロポリス、アガリクス、高麗人参、バイオペリン等を配合することができる。また、ペパーミント、ベルガモット、カモンミール、ラベンダーなどのハーブ類を配合してもよい。また、テアニン、デヒドロエピアンドステロン、メラトニンなどの素材を配合してもよい。
【００２５】
本発明のＰＩを含有する医薬品としては、これらを含有するものであれば何ら限定されない。該医薬品の剤型としては、散剤、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、粘付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製されるが、ＰＩは水に難溶性であるため、植物性油、動物性油等の非親水性有機溶媒に溶解するか又は、乳化剤、分散剤もしくは界面活性剤等とともに、ホモジナイザー（高圧ホモジナイザー）を用いて水溶液中に分散、乳化させて用いてもよい。更に、ＰＩの吸収性を高めるために、賦型剤（アラビアガム、デキストリン、カゼイン等）の存在化又は非存在化、平均粒子系を１ミクロン程度まで微粉砕して用いることも可能である。
【００２６】
製剤化のために用いることができる添加剤には、例えば大豆油、サフラー油、オリーブ油、胚芽油、ひまわり油、牛脂、いわし油等の動物性油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等の界面活性剤、精製水、乳糖、デンプン、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、マルトース、レシチン、アラビアガム、デキストリン、ソルビトール液、糖液等の賦形剤、甘味料、着色料、ｐＨ調整剤、香料などをあげることができる。尚、液体製剤は、服用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしても良い。
【００２７】
注射剤の形で投与する場合には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、関節内、滑液嚢内、胞膜内、骨膜内、舌下、口腔内等に投与することが好ましく、特に静脈内投与又は腹腔内投与が好ましい。静脈内投与は、点滴投与、ポーラス投与のいずれであってもよい。
本発明の、ＰＩ含有化粧料としては、クリーム、乳液、ローション、マイクロエマルジョンエッセンス、ハップ剤、入浴剤などが挙げられ、香料等を混合してもよい。
次に実施例で説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
〔試験例１〕ＰＬＢの製造
３０リットル容積のジャーファメンターに３％脱脂綿実粉、０．３％食塩、０．２％リン酸２カリウム、０．２％リン酸１カリウム、０．１％硫酸マグネシウム、消泡剤０．３％から成る滅菌した培地２０リットルに、同一培地で前培養（２８℃、４日間）したキャンディダ・シリンドラッセＡＴＣＣ１４８３０株の培養液１００ｍｌを無菌的に植菌した。１分間２０リットルの無菌空気を通気し１分間３００回転で攪拌しながら２８℃で培養を行った。５０時間後のＰＬＢは最大の活性（０．２Ｕ／ｍｌ）が確認された。
得られた培養液を５０００回転、１０分間遠心分離を行い、１６リットルの上清を得た。この上清を限外濾過法により濃縮を行った。得られた濃縮液３リットルに９リットルの冷アセトンを添加し生じた沈殿物について、５０００回転、１０分間遠心分離を行って沈殿物を回収し、２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（以下、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌと略す）（ｐＨ７．５）２リットルに溶解した。不溶物を遠心分離により除去し、予めカラムに充填したオクチルセファロース（ベッド容積；３００ｍｌ）に通しＰＬＢを吸着させた。次いで、２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄した。カラムに吸着されたＰＬＢは２％アデカトールＳＯ１２０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で溶出された（疎水クロマトによる精製）。次いで、溶出液（1リットル）を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（ベッド容積；２００ｍｌ）に通してＰＬＢを吸着させ、前記の緩衝液でカラムを洗浄後、０〜０．３Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて酵素を溶出した。塩化ナトリウムが約０．１Ｍ付近でＰＬＢ酵素画分Ａ、塩化ナトリウムが約０．２５Ｍ付近でＰＬＢ酵素画分Ｂを得た（イオン交換クロマトによる分離精製）。
【００２９】
［試験例２］
（１）ＰＬＢ活性の測定法
ＰＬＢの酵素活性は、ホスファチジルコリンから生成されるＧＰＣを酵素法により測定することによって確認できる。すなわち、１Ｍ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（以下、ＭＥＳ−ＮａＯＨと略す）（ｐＨ６）０．０５ｍｌ、３％トリトンＸ１００に溶解した１０ｍＭ卵黄ホスファチジルコリン０．０５ｍｌ、１Ｍ塩化カルシウム０．０２５ｍｌ、０．２％ＴＯＤＢ０．０５ｍｌ、０．２％４−アミノアンチピリン０．０５ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌモノグリセリドリパーゼ０．１ｍｌ、３００Ｕ／ｍｌグリセロリン酸オキシダーゼ０．１ｍｌ、６Ｕ／ｍｌＧＰＣホスフォジエステラーゼ０．０２５ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ０．０５ｍｌからなる反応液０．５ｍｌを３７℃で２〜３分間予備加温した後、０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解し同一緩衝液で希釈したＰＬＢ溶液（０．０３〜０．１５Ｕ／ｍｌ）２５μｌを添加して反応を始め、正確に１０分後に０．５％ＳＤＳ１ｍｌを加えて反応を止め、５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、１分間に１マイクロモルのＧＰＣを遊離する活性を１単位とした。
【００３０】
（２）ＰＩの測定方法(酵素法)
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）０．１ｍｌ、１０ｍＭ ＮＡＤ ０．０５ｍｌ、１０ｍＭ塩化マグネシウム０．０５ｍｌ、２％トリトンＸ１００ ０．０５ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌ ＰＩ特異的ホスフォリパーゼＣ ０．０５ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌアルカリホスファターゼ０．０５ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌイノシトールデヒドロゲナーゼ０．０５ｍｌ、５％ニトロテトラゾリウムブルー０．０５ｍｌ、精製水０．１５ｍｌから構成される発色液０．５ｍｌに、ＰＩを含有する被検体（１〜３ｍｇ／ｍｌ）を２％トリトンＸ１００に溶解してできたＰＩ溶液０．０２ｍｌを添加し、３７℃で１０分間反応を行い０．５％ＳＤＳ０．５ｍｌで反応を止め、５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。既知濃度のイノシトール水溶液をキャリブレーターに用いてＰＩ量を定量した。
【００３１】
〔実施例１〕
１．試験方法
１０ｍＭ塩化カルシウムを含有する１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に１０％になるように分散した大豆レシチン溶液１００ｍｌに２００単位のＰＬＢ（試験例１で製造された酵素画分Ａ、試験例２によるＰＬＢ活性は０．８Ｕ／ｍｌ）を添加し、４０℃で１８時間攪拌しながら反応を行った。反応液に塩化ナトリウムおよびＥＤＴＡを表１及び２に記載の各濃度になるように添加し、ヘキサン/エタノール等量混合液１００ｍｌを添加して攪拌した。次に、遠心分離によってヘキサン層を集め、ロータリーエバポレーターで減圧乾固させた後少量のヘキサンに溶解し、エチルアルコールを添加して脱脂肪酸操作を行った。その後、脂肪酸が除去された固形分を減圧乾燥してＰＩの粉末を得た。得られたＰＩの粉末を１ｍｇ／ｍｌになるようにして精製水に溶解し、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、試験例２の測定方法によってＰＩ含量を測定した。
塩化ナトリウムもＥＤＴＡもいずれも含まないものを比較例とした。
２．試験結果
結果を表１に示した。これより、塩化ナトリウムまたはＥＤＴＡの添加によって吸光度が減少した。さらにＥＤＴＡおよび塩化ナトリウムの両者を添加した場合は、ＥＤＴＡの添加量を０．１％から０．４％に増やすことによってさらに吸光度が減少し、また塩化ナトリウムの添加量は２〜４％において吸光度が最も減少し、澄明度が明らかに向上した。したがって、ＥＤＴＡまたは塩化のトリウムの添加によってＰＩの水分散性が向上することがわかった。
また、いずれの場合も粉末中のＰＩ含量は５０重量％以上であり、ＥＤＴＡまたは塩化ナトリウムの添加による影響はみられなかった。
【００３２】
【表１】
2015027260.tif 000002
【００３３】
〔実施例２〕
１．試験方法
反応液に添加するＥＤＴＡ及び各種無機塩を表２に記載のとおりとした以外は実施例１と同様に行った。
２．試験結果
結果を表２に示した。本結果より、いずれの無機塩においてもその添加により吸光度が減少し、澄明度が明らかに向上した。
【００３４】
【表２】
2015027260.tif 000003
【００３５】
〔実施例３〕
１．市販のリパーゼ製品のＰＬＢ活性
前記［試験例２］に記載したＰＬＢ活性測定法を用いてPenicillium camanbertti由来酵素（リパーゼＧ「アマノ」５０）、Penicillium  roqueforti由来酵素（リパーゼＲ「アマノ」）、Rhizupus  orysae由来酵素（リパーゼＤＦ「アマノ」１５）（以上、天野エンザイム株式会社製）の市販のリパーゼ製品のＰＬＢ活性を測定した結果、各々０．９９Ｕ／ｍｇ、０．８２Ｕ／ｍｇ、０．９９Ｕ／ｍｇの活性を示した。
２．試験方法
１０ｍＭ塩化カルシウムを含有する１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に１０％になるように分散した大豆レシチン溶液１００ｍｌに１００単位のＰＬＢ（Penicillium  camanbertti由来酵素（リパーゼＧ「アマノ」５０）、Penicillium  roqueforti由来酵素（リパーゼＲ「アマノ」）、Rhizupus  orysae由来酵素（リパーゼＤＦ「アマノ」１５）を添加し、４０℃で４０時間攪拌しながら反応を行った。ヘキサン/エタノール等量混合液１００ｍｌを添加して攪拌した後、反応液に３％塩化ナトリウムおよび０．４％ＥＤＴＡを添加して室温で1時間撹拌した。次に、遠心分離によってヘキサン層を集め、ロータリーエバポレーターで減圧乾固させた後少量のヘキサンに溶解し、エチルアルコールを添加して脱脂肪酸操作を行った。その後、脂肪酸が除去された固形分を減圧乾燥してＰＩの粉末を得た。得られたＰＩの粉末を１ｍｇ／ｍｌになるようにして精製水に溶解し、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、試験例２の測定方法によってＰＩ含量を測定した。
塩化ナトリウムもＥＤＴＡもいずれも含まないものを比較例とした。
3.試験結果
結果を表３に示した。塩化ナトリウム及びＥＤＴＡの添加によって吸光度が減少した。いずれの酵素を用いた場合でもＰＩ含量は５０重量％以上であり、塩化ナトリウム及びＥＤＴＡ処理によって６６０nmにおける吸光度は減少した。
【００３６】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明によれば、水に対して分散性が良好で、かつ高純度のホスファチジルイノシトールを簡便に製造することができる。したがって、本製造方法により得られたＰＩは、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、等の分野において高い産業上の利用可能性を有する。