(57)【要約】【課題】本発明は、関節リウマチを検出することができる新たな関節リウマチ検出薬、関節リウマチ検出方法及び関節リウマチ検出キットを提供する。【解決手段】抗糖鎖異常スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）抗体の存在を確認するための少なくとも１つの識別薬を含む関節リウマチ検出薬；被検体に由来する生体試料と、前記関節リウマチ検出薬とを接触させること、及び、前記関節リウマチ検出薬と接触した後の生体試料について、前記識別薬と抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体との複合体の存在を確認すること、を含む関節リウマチの検査方法；並びに、前記関節リウマチ検出薬を含む関節リウマチ検出キット。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗糖鎖異常スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）抗体の存在を確認するための識別薬を含む関節リウマチ検出薬。
【請求項２】
前記識別薬が、糖鎖異常ＳＯＤ２を含む請求項１記載の関節リウマチ検出薬。
【請求項３】
被検体に由来する生体試料と、請求項１又は請求項２記載の関節リウマチ検出薬とを接触させること、及び、
前記関節リウマチ検出薬と接触した後の生体試料について、関節リウマチ検出薬中の前記識別薬と抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体との複合体の存在を確認すること、
を含む関節リウマチの検査方法。
【請求項４】
前記生体試料が血液試料である請求項３記載の関節リウマチの検査方法。
【請求項５】
被検体に由来する生体試料と、シトルリン化ペプチド及びガラクトース欠損ＩｇＧからなる群より選択される少なくとも１種の自己抗体検出用抗原とを接触させて、生体試料における抗シトルリン化ペプチド抗体及び抗ガラクトース欠損ＩｇＧ抗体からなる群より選択される少なくとも１種の自己抗体を検出することを更に含む請求項３又は請求項４記載の関節リウマチ検出方法。
【請求項６】
請求項１又は請求項２記載の関節リウマチ検出薬を含む関節リウマチ検出キット。
【請求項７】
更に、シトルリン化ペプチド及びガラクトース欠損ＩｇＧからなる群より選択される少なくとも１種の自己抗体検出用抗原を含む請求項６記載の関節リウマチ検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチ検出薬、関節リウマチ検出方法及び関節リウマチ検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（Rheumatoid arthritis：ＲＡ）は、重度の滑膜炎の組織学的症状を伴う慢性炎症疾患である。免疫学的には、関節リウマチは、抗シトルリン化ペプチド抗体（anti-citrullinated peptide antibodies：ＡＣＰＡｓ）及び抗ガラクトース欠損ＩｇＧ抗体（carbohydrate in rheumatoid arthritis factor：ＣＡＲＦ）の生成により特徴付けられることが知られており、ＡＣＰＡｓ及びＣＡＲＦは、リウマチ因子（ＲＦ）の識別マーカーとしてよく知られている（非特許文献１及び非特許文献２参照）。このため、ＡＣＰＡｓ又はＣＡＲＦを利用した関節リウマチの検査方法が種々提案されている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、ガラクトース欠損ＩｇＧ及びリシナスコミニスアグルチニンＩの一方を固定化した膜と、他方を固定化した有色微粒子とを用いて、試料中に含まれる抗ガラクトース欠損ＩｇＧ抗体を検出する検出試薬が開示されており、この検出試薬を用いることによって慢性関節リウマチ等の診断を正確、簡便かつ迅速に行うことができると記載されている。
【０００４】
また、特許文献２には、他の関節リウマチの診断方法として、特定の糖鎖プロファイルに基づいた関節リウマチの診断方法が開示されている。特に、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を持つ４種類の糖鎖、トリシアリル構造を有する糖鎖、フコースの付加した糖鎖等が、ＲＡ患者において増加する傾向があり、関節リウマチの罹患を推定し、同疾患の診断及び予後の管理又は予測に有用であると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平８−２２００９９号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／０９６４０３号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ann N Y Acad. Sci., (2007) Vol.1108, pp.323-339
【非特許文献２】Nature, (1985) Vol.316, pp.452-457
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、実際によく用いられている関節リウマチの診断マーカーであるＣＡＲＦであっても、関節リウマチ患者の２０％〜３０％程度が陰性であり、ＡＣＰＡｓでも関節リウマチ患者の１０％〜２０％が陰性となり、血液試料等の生体試料を用いた現行の関節リウマチ検査において依然として検出できない関節リウマチ患者が存在する。このため、現状の関節リウマチ検査で陰性となる関節リウマチ患者を検出可能な新たなマーカーを含む関節リウマチ検査薬に対する要請がある。
【０００８】
従って本発明は、ＣＡＲＦ又はＡＣＰＡｓで陰性を示す関節リウマチ患者の場合でも、関節リウマチを検出することができる新たな関節リウマチ検出薬、関節リウマチ検出方法及び関節リウマチ検出キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下のとおりである。
［１］  抗糖鎖異常スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）抗体の存在を確認するための識別薬を含む関節リウマチ検出薬。
［２］  前記識別薬が、糖鎖異常ＳＯＤ２を含む［１］に記載の関節リウマチ検出薬。
［３］  被検体に由来する生体試料と、［１］又は［２］に記載の関節リウマチ検出薬とを接触させること、及び、前記関節リウマチ検出薬と接触した後の生体試料について、関節リウマチ検出薬中の前記識別薬と抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体との複合体の存在を確認すること、を含む関節リウマチの検査方法。
［４］  前記生体試料が血液試料である［３］に記載の関節リウマチの検査方法。
［５］  被検体に由来する生体試料と、シトルリン化ペプチド及びガラクトース欠損ＩｇＧからなる群より選択される少なくとも１種の自己抗体検出用抗原とを接触させて、生体試料における抗シトルリン化ペプチド抗体及び抗ガラクトース欠損ＩｇＧ抗体からなる群より選択される少なくとも１種の自己抗体を検出することを更に含む［３］又は［４］に記載の関節リウマチの検査方法。
［６］  ［１］又は［２］に記載の関節リウマチ検出薬を含む関節リウマチ検出キット。
［７］  更に、シトルリン化ペプチド及びガラクトース欠損ＩｇＧからなる群より選択される少なくとも１種の自己抗体検出用抗原を含む［６］に記載の関節リウマチの検査キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、関節リウマチを検出することができる新たな関節リウマチ検出薬、関節リウマチ検出方法及び関節リウマチ検出キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において得られた糖鎖異常ＳＯＤ２タンパク質のＣｏｎＡパネルでの強度／ＳＹＰＲＯルビーパネルにおける強度比を示すグラフである。
【図２】実施例２に係るウェスタンブロットの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に係る関節リウマチ検出薬は、抗糖鎖異常スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）抗体の存在を確認するための識別薬を含む。
また本発明に係る関節リウマチの検出方法は、被検体に由来する生体試料と、抗糖鎖異常スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）抗体の存在を確認するための識別薬を含む関節リウマチ検出薬とを接触させること（以下、接触工程ということがある）、及び、前記関節リウマチ診断薬と接触した後の生体試料について、前記識別薬と抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体との複合体の存在を確認すること（以下、存在確認工程ということがある）、を含む。
【００１３】
本発明は、関節リウマチを伴う患者（以下、ＲＡ患者という場合がある）からの被検試料において、スーパーオキシドジスムターゼ２（以下、ＳＯＤ２という場合がある）が、健常者からの被検試料におけるＳＯＤ２と糖鎖構造が異なっており、糖鎖異常ＳＯＤ２を認識し得る抗体がＲＡ患者の血清中に存在するとの知見に基づくものである。
即ち、本発明において、ＲＡ患者の生体試料におけるＳＯＤ２の糖鎖部分を、レクチンを用いて糖鎖構造の解析を行ったところ、ＲＡ患者由来のＳＯＤ２の糖鎖では、少なくともマンノース単位において異常が生じており、その結果、ＲＡ患者のＳＯＤ２の糖鎖部分は健常者のＳＯＤ２の糖鎖部分と相違していることが見出された。本発明では、糖鎖異常ＳＯＤ２を抗原とした、抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体の存在を確認するための少なくとも１つの識別薬を含む関節リウマチ検出薬を用いて、抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体の存在を確認することにより、関節リウマチを検出する。
【００１４】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
更に本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本明細書において「健常者」又は「患者」との表現には、特に断らない限り、ヒトに限定されず、明細書中に記載される他の種又は属の生物も包含される。
以下、本発明について説明する。
【００１５】
関節リウマチ検出薬は、抗糖鎖異常スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）抗体の存在を確認するための少なくとも１つの識別薬を含む。
ＳＯＤ（スーパーオキシドジスムターゼ、超酸化物不均化酵素）は、スーパーオキシドアニオンラジカルＯ２・−の［２Ｏ２・−＋２Ｈ＋→Ｏ２＋Ｈ２Ｏ２］の反応を触媒する酵素であり、Ｏ２・−とこれから生じる他の活性酸素の毒性から細胞を保護することが知られている。哺乳類では、活性中心と局在の点から３種類のＳＯＤが存在することが知られている。ＳＯＤ２は、マンガンを活性中心としてミトコンドリアに局在するＳＯＤであり、ホモ４量体で構成された２４．８ｋＤａのタンパク質である。
【００１６】
ＳＯＤ２における糖鎖異常とは、ＳＯＤ２の糖鎖を構成する糖単位の１つ又は２つ以上の欠損、置換又は付加を意味する。ＳＯＤ２の糖鎖構造は明らかにされていないが、ＳＯＤ２の糖鎖を構成する糖単位としては、少なくともマンノース単位（Ｍａｎ）、ガラクトース単位（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルグルコサミン単位（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸単位（Ｎｅｕ５Ａｃ）及びフコース単位（Ｆｕｃ）等が考えられる。ＳＯＤ２の糖鎖異常の例としては、検出精度の観点から、ＳＯＤ２の糖鎖を構成する糖単位の１つ又は２つ以上の欠損であることが好ましく、例えば、Ｍａｎの１つ又は２つ以上の欠損、ＧｌｃＮＡｃの１つ又は２つ以上の欠損、ＭａｎとＧｌｃＮＡｃとの結合の１つ又は２つ以上の欠損等が挙げられる。
【００１７】
抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体の存在を確認するための識別薬としては、糖鎖異常を生じたＳＯＤ２、即ち糖鎖異常ＳＯＤ２が挙げられる。糖鎖異常ＳＯＤ２としては、健常者の末梢血単核球から得たＳＯＤ２にマンノシダーゼを作用させてマンノース除去することにより得られるもの、又は異種（ヒトの抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体の場合にはマウス等）の抗ＳＯＤ２抗体を用いてＲＡ患者の末梢血単核球から免疫沈降を行うことにより得られるものを適用し得る。
【００１８】
本発明における関節リウマチ検出方法における接触工程では、被検体に由来する生体試料と、上述した関節リウマチ検出薬とを接触させる。
本発明における被検体としては特に制限はなく、霊長類等の哺乳類を用いることができる。中でもヒトを被検体として用いることが好ましい。また生体試料は、被検体から採取した血液試料等の体液試料であることが好ましい。体液試料としては、血液（全血）、血清、血漿、関節液等を挙げることができる。本発明の生体試料としては、簡便性及び感度の観点から血清及び血漿からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。
【００１９】
生体試料と関節リウマチ検出薬との接触には特に制限はなく、例えば、２５℃〜３０℃で、６０分間の反応とする。接触工程では、関節リウマチ検出薬の標的となる抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体が生体試料中に存在する場合、関節リウマチ検出薬と抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体との複合体が形成される。
【００２０】
存在確認工程では、関節リウマチ検出薬と接触した後の生体試料において、抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体の存在を確認する。抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体の存在の確認は、関節リウマチ検出薬における識別薬と抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体との複合体を検出することにより行われる。複合体の検出方法については特に制限はなく、通常用いられるタンパク質の検出方法を適用することができ、検出される複合体を定量又は半定量可能な方法であることが好ましい。例えば、ウェスタンブロット染色、イオン交換クロマトグラフィー、質量分析、免疫沈降等を挙げることができる。
【００２１】
検出される複合体の定量又は半定量的検出の簡便性及び感度の観点から、複合体の検出は、標識に基づいて目的複合体の検出を行う酵素免疫測定法、電気化学的発光法、吸光度測定、蛍光抗体法、放射免疫測定法、表面プラズモン共鳴等の既知の検出方法により行うことが好ましい。
【００２２】
使用可能な標識としては、特に制限なく公知の標識を用いることができる。標識としては、例えば、酵素、化学発光物質、電気化学発光物質、放射性物質等を挙げることができる。検出感度と簡便性の観点から、標識として酵素又は電気化学発光物質を用いることが好ましい。酵素としては、物理的、化学的方法で定量可能な酵素であれば特に制限はなく、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等の酵素を挙げることができる。
【００２３】
存在確認工程における抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体の存在の確認は、複合体の検出レベルに基づいて行われる。複合体の検出レベルとしては、生体試料中に含まれる複合体の濃度又はそれに対応する定量値若しくは半定量値であれば、特に制限なく用いることができる。標識物質の種類に応じて例えば、吸光度、発光強度、蛍光強度、放射線計数等を挙げることができる。
【００２４】
複合体の検出レベルと抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体の存在との関連づけは、被検体由来の生体試料における複合体の検出レベルが、対照となる健常者に由来する生体試料中の検出レベルよりも大きい場合に、抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体が存在すると判定する。
ここで対照となる健常者とは、ＲＡが存在しないことが予め判明している個体を意味する。また、検出レベルが大きいとは、例えば、対照となる健常者群に由来する生体試料群における複合体の検出レベルの平均値と標準偏差とを考慮して設定した正常検出レベル（閾値）よりも、被験体に由来する前記特定ペプチドの検出レベルのほうが大きいことである。閾値は、通常、健常体群の検出レベルの平均値に、標準偏差を２倍又は３倍した値を加算した値として定めることができ、感度（検出率）又は特異性（擬陽性率の低さ）をバランスよく満たす値に適宜定めることができる。
【００２５】
また、関節リウマチ検出方法は、抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体の存在を確認する存在確認工程に加えて、ＲＡに特異的に検出される他の物質（他のＲＡ特異的物質）を検出すること（追加検出工程ということがある）を更に設けることができる。
追加検出工程で使用される他の物質としては、公知のＲＡ特異的物質を挙げることができる。公知のＲＡ特異的物質としては、抗シトルリン化ペプチド抗体（ＡＣＰＡｓ）、抗ガラクトース欠損ＩｇＧ抗体（ＣＡＲＦ）、抗Ｓａタンパク（シトルリン化ビメンチン）抗体、抗核周辺因子（perinuclear factor）抗体、抗ケラチン抗体、抗フィラグリン抗体、抗環状シトルリン化（抗ＣＣＰ）抗体等の自己抗体を挙げることができる。これらの他のＲＡ特異的物質は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの他のＲＡ特異的物質の検出は、これらの他のＲＡ特異的物質を用いた既知の方法に従って行うことができる。例えば、他のＲＡ特異的物質が自己抗体の場合には、被検体由来の生体試料と、自己抗体の標的物質（自己抗体検出用抗原）とを接触させること、接触後の生体試料中における他のＲＡ特異的物質と自己抗体の標的物質との複合体を検出することにより、他のＲＡ特異的物質を検出することができる。
【００２６】
中でも、関節リウマチ検出方法は、追加検出工程として、被検体に由来する生体試料と、シトルリン化ペプチド及びガラクトース欠損ＩｇＧからなる群より選択される少なくとも１種の自己抗体検出用抗原とを接触させて、ＡＣＰＡｓ及びＣＡＲＦからなる群より選択される少なくとも１種の自己抗体を検出することを更に含むことが好ましい。これにより、ＲＡ検出の精度がより向上する。ＡＣＰＡｓ及びＣＡＲＦの検出については公知であり、例えば、ＡＣＰＡｓの検出キット及びＣＡＲＦの検出キットは、それぞれ、ＭＥＢＣｈｒｏｍ（商品名）  ＣＣＰテスト（医学生物研究所）及びスマイテスト（商品名）「ＩｇＧ  ＲＦ」  ＥＬＩＳＡ（医学生物研究所）として入手することができる。
【００２７】
本発明における関節リウマチ検出キットは、上述した関節リウマチ検出薬を含み、必要に応じて他の構成要素を含むことができる。本キットは、これまでに検出できなかったＲＡを検出可能とすることができる上述した関節リウマチ検出薬を含むので、上述した関節リウマチ検出薬を使用するＲＡ検出方法を簡便に行うことができる。
【００２８】
本キットの他の構成要素としては、関節リウマチ検出薬を用いた上述のＲＡ検出方法を記載した製品説明書、被検体の生体試料を適度な濃度に希釈するための希釈剤、他のＲＡ特異的物質、シトルリン化ペプチド及びガラクトース欠損ＩｇＧからなる群より選択される少なくとも１種の自己抗体検出用抗原、検出における陽性又は陰性対照サンプル等が挙げられる。これらの構成要素は、収容部に収容された形態であってもよい。本キットにおける「収容部」とは、それぞれの薬剤が混合せずに独立して存在するために有効な形態であれば特に制限はなく、例えば、容器又は個別包装形態などであってもよく、一のシート状で独立して区分けされた領域としての形態であってもよい。
【００２９】
関節リウマチ検出キットには、糖鎖異常ＳＯＤ２を固定可能な支持体を含むことができる。この場合には、支持体上に固定化された識別薬を介して、生体試料中の抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体との間で形成された複合体を支持体に連結させることができるため、ＲＡ検査における取り扱い性が向上する傾向がある。
支持体は、糖鎖異常ＳＯＤ２を固定可能な材料であれば特に制限はなく、通常用いられる支持体から、目的に応じて適宜選択して用いることができる。支持体としては例えば、ガラス基材、フェノール樹脂等の樹脂基材、アルミナ等の金属基材、カーボンなどを挙げることができる。また、支持体は、三次元構造膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜等の合成又は天然高分子膜であってもよい。支持体への固定化方法は、物理的吸着法、化学結合法、その他のいずれの方法であってもよい。
【００３０】
本発明は、上述したＲＡ検出方法の基づくＲＡ診断方法を包含する。即ち、本発明におけるＲＡ診断方法は、被検体に由来する生体試料と、上述した関節リウマチ検出薬とを接触させること、前記関節リウマチ診断薬と接触した後の生体試料において、関節リウマチ検出薬と抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体との複合体の存在を確認すること、及び、抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体の存在の確認に基づいてＲＡと診断すること、を含む。抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体の存在の確認に基づいてＲＡと診断することは、医療行為として医師又は医師の指示を受けた者により行われる。
本ＲＡ診断方法における関節リウマチ検出薬と生体試料との接触、抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体の存在確認、及び他の工程については、ＲＡ検査方法について記述した内容をそのまま適用する。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、生体試料はすべて、ＲＡ患者及び健常者から説明と同意の下に採取したものであり、本研究は聖マリアンナ医科大学の倫理委員会の承認を得たものである。
【００３２】
［実施例１］
＜健常者及びＲＡ患者由来糖タンパク質における糖鎖の解析＞
健常者及びＲＡ患者由来糖タンパク質における糖鎖の解析を、二次元電気泳動法により以下のようにして行った。
ＲＡ患者（ｎ＝４）及び健常者（ｎ＝４、年齢及び性別はＲＡ患者と一致している）のそれぞれの血液試料から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をファイコールパックプラス（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）を用いて単離した。
全細胞タンパク質を、細胞溶解バッファ（４質量％の３−［（コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルフェート／７Ｍ尿素／２Ｍチオ尿素／３０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて抽出した。１００μｇの各サンプルをそれぞれ等電点電気泳動ゲル（Immobiline Drystrip pH 3-11 NL 11 cm; GE Healthcare）上にアプライした。１２．５％（w/w）ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により各タンパク質を分離した。電気泳動後に、ゲルの一部を１０％(v/v）メタノール及び７％（v/v）酢酸を含む溶液で２時間固定した。ゲル状のタンパク質を、SYPRO Ruby（登録商標） (Molecular Probes, Eugene, OR) で染色（ＳＹＰＲＯルビー染色）し、Typhoon 9400 variable mode imager,（GE Healthcare)を用いて画像スキャニングを行い可視化した。
【００３３】
上記のようにして分離したタンパク質を、メンブレン（PROTRAN Nitrocellulose Transfer Membrane、Whatman GmbH, Bremen, Germany)に転写して、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０５％（w/w）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で１時間反応させた。次いで、メンブレンを、ビオチン結合コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、Seigaku Business Co., Tokyo, Japan）で１時間反応させた。ＣｏｎＡは、Ｍａｎ（α−１，３）［Ｍａｎ（α−１，６）］Ｍａｎの構造を認識する。次いで、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンとＣｏｎＡを反応させ、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ Membrane Phosphatase Substrate System (3-C)（登録商標）（KPL, Gaithersburg, MD）を取扱説明書に従って使用して発色させた。
【００３４】
ＳＹＰＲＯルビー染色によって６７１個のタンパク質が検出され、ＣｏｎＡ染色によって５２７個の糖タンパク質が検出された。このうち４６５のスポットが、ＳＹＰＲＯルビー染色（タンパク質検出）とＣｏｎＡ染色（糖タンパク質検出）の双方で陽性になった。ゲル及びメンブレン上の染色又は発色レベルを、ソフトウェア、Progenesis PG240 ver. 2006 (Nonlinear Dynamics, Newcastle, UK)を用いて解析し、ＳＹＰＲＯルビー染色における強度に対するＣｏｎＡパネルでの強度の比（ＣｏｎＡパネルでの強度／ＳＹＰＲＯルビーパネルにおける強度）が１／１．５未満となるものをＲＡ患者由来のＰＢＭＣにおいて糖鎖付加率が減少していると判断し、該当する糖タンパク質を２つ抽出した。
【００３５】
ＲＡ患者由来のＰＢＭＣにおいて糖鎖付加率が減少した２つの糖タンパク質のうちのひとつを、ＣｏｎＡパネルでの強度／ＳＹＰＲＯルビーパネルにおける強度に基づいて更に抽出した（図１参照）。抽出した糖タンパク質について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを用いて以下のように解析した。
【００３６】
二次元電気泳動法後のゲル試料におけるスポット部分を取出し、ゲル中のタンパク質をトリプシンで処理した。トリプシン処理により得られたポリペプチドをゲル試料から抽出し、得られたポリペプチド試料１５μＬを、脱塩及び濃縮にμ-C18 Zip-Tip (Millipore, Billerica, MA) を使用して、AnchorChip（商品名）plate (Bruker Daltonics, Ettlingen, Germany)上にスポットした。Ultraflex ＴＯＦ／ＴＯＦ装置 (Bruker Daltonics）をポジティブイオンモードで用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより、ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ５００−４，４００）を得た。検出されたポリペプチドのスペクトルを更にレーザー誘導解離（ＣＩＤ）によりフラグメント化してＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。得られたＭＳスペクトル及びＭＳ／ＭＳスペクトルを、スイスプロットタンパク質データベースをターゲットとするＭＡＳＣＯＴサーチ（ver.2.4.0, Matrix Science, Tokyo, Japan, http://www.matrixscience.com）に付した。
【００３７】
その結果、ＲＡ患者由来のＰＢＭＣにおいて糖鎖付加率が減少した検出対象の糖タンパク質は、分子量：２３．０、等電点（ｐＩ）：８．５３の糖タンパク質であり、データベースを用いた検索結果より、ＳＯＤ２(分子量２４．７、ｐＩ：８．３５）であることがわかった。
【００３８】
［実施例２］
＜ＲＡ患者における糖鎖異常ＳＯＤ２の検出＞
ＲＡ患者のＰＢＭＣ由来の全タンパク質及び健常者のＰＢＭＣ由来の全タンパク質を対象として、糖鎖異常ＳＯＤ２の解析を以下のように行った。
それぞれ２０μｇのＲＡ患者のＰＢＭＣ由来のタンパク質及び健常者のＰＢＭＣ由来のタンパク質を、１２．５％（w/w）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、メンブレンに転写した。２％（v/v)のウシ胎児血清アルブミン（ＢＳＡ)及び０．１％（w/w)Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ＰＢＳ−ＢＴ）でブロッキング処理を室温（２５℃）で１時間行った後、メンブレンを０．１％（w/w）Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで、２５℃３０分間洗浄し、解析用のメンブレン試料を調製した。
【００３９】
解析用のメンブレン試料を２枚用いて、それぞれ、マウス抗ヒトＳＯＤ２抗体（Santa cruz社）又はＣｏｎＡ（Seigaku Business Co.社）によるウェスタンブロット又はレクチンブロットを以下のようにして行った。
各解析用メンブレン試料を、マウス抗ヒトＳＯＤ２抗体（０．２μｇ／ｍｌ）又はＣｏｎＡ（１μｇ／ｍｌ）で室温１時間にて処理した。０．１％（w/w)Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄後、各解析用のメンブレン試料に対して、可視化処理を行った。マウス抗ヒトＳＯＤ２抗体で処理した解析用のメンブレン試料に対する可視化処理は、西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Zymed laboratories社)を用いて、ジアミノベンジジンを基質として行った。ＣｏｎＡで処理した解析用のメンブレン試料に対する可視化処理は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ Membrane Phosphatase Substrate System (3-C)（登録商標）（KPL, Gaithersburg, MD）を取扱説明書に従って使用して発色させた。結果を図２に示す。なお、ＳＯＤ２の同定は、解析用のメンブレン上のマウス抗ヒトＳＯＤ２抗体によるシグナル位置（バンドの位置）に基づいて行った。
【００４０】
図２に示されるように、健常者のＰＢＭＣ由来タンパク質及びＲＡ患者のＰＢＭＣ由来試料の双方において、ＳＯＤ２タンパク質は存在することがわかった（図２中、「ｍ  α−ＳＯＤ２」）。一方で、ＣｏｎＡは、健常者のＰＢＭＣ由来タンパク質のみに反応し、ＲＡ患者のＰＢＭＣ由来タンパク質には反応しなかった（図２中、「ＣｏｎＡ」）。このことから、ＲＡ患者のＰＢＭＣ由来タンパク質では、ＳＯＤ２に糖鎖異常が生じており、特にＣｏｎＡが認識するマンノースが欠損したマンノース欠損ＳＯＤ２が存在していることがわかった。
【００４１】
［実施例３］
＜ＲＡ患者における抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体の検出＞
実施例２で用いた解析用のメンブレン試料に対して、健常者１０名（ＨＬ１〜ＨＬ３）又はＲＡ患者２０名（ＲＡ５〜ＲＡ９、ＲＡ１２〜１４、ＲＡ１８、ＲＡ２３及びＲＡ２５）の血清試料を用いて、抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体の検出を以下のように行った。
血清試料は、ＲＡ患者２０名（年齢３３歳〜７４歳の男女、平均年齢５６歳）と、健常者１０名（年齢２９〜７２の男女、平均年齢５６歳）から採取した。得られた血清試料は、２％（v/v）のウシ胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．１％（w/w）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ＰＢＳ−ＢＴ）を用いて１００倍希釈して使用した。
１００倍希釈後の各血清試料を、解析用メンブレン試料と接触させ、室温１時間にて処理した。処理後に３回ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、各解析用のメンブレン試料に対して、可視化処理を行った。血清試料で処理した解析用メンブレン試料に対する可視化処理は、西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Zymed laboratories, San Francisco, CA)を用いて６０分間室温で処理した後、ジアミノベンジジンを基質として行った。結果を表１に示す。表１において「＋」は陽性であることを意味し、「＋」の数が増えるに従って反応が強かったことを意味し、「−」は陰性であることを意味する。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
表１に示されるように、２０名のＲＡ患者の血清試料のうち、８の血清試料（ＲＡ５、ＲＡ６、ＲＡ７、ＲＡ１３、ＲＡ１４、ＲＡ１８、ＲＡ２３及びＲＡ２４）は、ＲＡ患者のＰＢＭＣ由来試料に対して反応性を示した（４０％）が、健常者のＰＢＭＣ由来試料に対しては反応性を示さなかった。このことから、ＲＡ患者の血清試料中には、ＲＡ患者のＰＢＭＣ由来試料に対してのみ反応性を示す抗体が含まれていることが示唆された。解析用メンブレン試料上のバンド位置及び実施例２の結果から、ＲＡ患者の血清試料中に含まれる抗体が、抗糖鎖異常ＳＯＤ２抗体、即ち、抗マンノース欠損ＳＯＤ２抗体であることが確認できた。
【００４４】
また、抗マンノース欠損ＳＯＤ２抗体とＡＣＰＡｓ及びＣＡＲＦとの関連性を以下のようにして行った。
上記試験に用いた２０名のＲＡ患者の血清試料におけるＡＣＰＡｓの有無を、ステイシアＭＥＢＬｕｘテスト（医学生物研究所）を添付のマニュアルに従って使用し、確認した。また、上記試験に用いた２０名のＲＡ患者の血清試料におけるＣＡＲＦの有無を、ピコルミＣＡ・ＲＦ（三光純薬株式会社）を添付のマニュアルに従って使用し、確認した。結果を表２に示す。
表２中、「＋」は陽性であってことを示し、「−」は陰性であったことを意味する。ＣＡＲＦの場合、ｐ＝０．１４。ＡＣＰＡｓの場合、ｐ＝０．６５。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
表２に示されるように、２０名のＲＡ患者の内、ＣＡＲＦに対して陰性の患者は２名であり、またＡＣＰＡｓに対して陰性の患者も２名であった。一方、これらのＣＡＲＦ又はＡＣＰＡｓを含まないＲＡ患者のＰＢＭＣ由来試料であっても、抗マンノース欠損ＳＯＤ２抗体が陽性となる場合があることがわかった。
このことから、本実施例において確認された抗マンノース欠損ＳＯＤ２抗体は、ＣＡＲＦ又はＡＣＰＡｓで検出できないＲＡ患者を検出可能な新規のマーカーであることがわかる。
【００４７】
また、本実施例において確認された抗マンノース欠損ＳＯＤ２抗体によるＲＡ検査を、ＣＡＲＦ又はＡＣＰＡｓによるＲＡ検査と組み合わせて行うことにより、いっそう精度よくＲＡを検出することができる。
【００４８】
マンノース欠損ＳＯＤ２を用いて、抗マンノース欠損ＳＯＤ２抗体の有無を検出する場合には、例えば、以下のように行うことができる。
マウス抗ヒトＳＯＤ２抗体（Santa cruz社）を用いた免疫沈降により、健常者のＰＢＭＣ由来試料からヒト正常ＳＯＤ２を単離する。単離されたヒト正常ＳＯＤ２を、マンノシダーゼを用いたマンノース除去処理を行うことにより、マンノース欠損ＳＯＤ２を調製する。
【００４９】
マンノース欠損ＳＯＤ２を、支持体、例えば樹脂基材に、タンパク質を固定化するために用いられる常法に従って固定する。これにより、マンノース欠損ＳＯＤ２固定化支持体を得る。
マンノース欠損ＳＯＤ２固定化支持体に、被検体の生体試料、例えば血清を接触させる。血清と接触後のマンノース欠損ＳＯＤ２固定化支持体上に、抗マンノース欠損ＳＯＤ２抗体と、支持体に固定化されたマンノース欠損ＳＯＤとの複合体の有無を、公知の方法のいずれかを用いて検出する。これにより、抗マンノース欠損ＳＯＤ２抗体の有無を確認する。抗マンノース欠損ＳＯＤ２抗体の存在が確認された生体試料は、ＲＡ患者由来の生体試料であると関連づけされる。これにより、ＲＡを検出することができる。
【００５０】
従って、本発明は、関節リウマチを検出することができる新たな関節リウマチ検出薬、関節リウマチ検出方法及び関節リウマチ検出キットを提供することができる。
【図１】
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【図２】
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