(57)【要約】【課題】これまでレスベラトロールには見られない新しい効果である、優れた白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有し、且つ安全安価に作製することが可能な白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞の分化誘導剤組成物、ならびに該組成物を含有する医薬品及び医薬部外品を提供すること。【解決手段】レスベラトロールをアルカリ性条件下で加熱することを特徴とする白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤、該組成物を含有する医薬品及び医薬部外品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レスベラトロールをアルカリ性条件下で加熱して得られることを特徴とする、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤組成物。
【請求項２】
式（１）：
【化１】
2015027959.tif 000010
、式（２）：
【化２】
2015027959.tif 000011
及び式（３）：
【化３】
2015027959.tif 000012
で示される３種類のレスベラトロール重合化合物を含有する請求項１記載の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤組成物。
【請求項３】
請求項１又は２記載の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤組成物を含有する医薬品又は医薬部外品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非常に簡便な方法によって得られるレスベラトロールの環化反応生成物を含有するエキスを用いることで、初めてヒトに対して応用可能となった白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の脂肪組織を構成する脂肪細胞には白色脂肪細胞と褐色脂肪細胞の二種類が存在する。白色脂肪細胞は主にトリグリセリドの形で摂取したエネルギーを蓄積する役割を持ち、他方、褐色脂肪細胞は筋芽細胞を起源に発生し、細胞内部に多数のミトコンドリアを含むことで褐色に色づき、ミトコンドリア中に発現する脱共役タンパク質（Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １；ＵＣＰ１）の働きにより熱産生を行い、蓄積されたエネルギーを熱へと変換する役割を持っている脂肪細胞である（非特許文献１）。褐色脂肪細胞により構成される褐色脂肪組織は、幼児期に多数見受けられ、成長するに従いその組織量が減少する。従来、褐色脂肪細胞は白色脂肪細胞とは由来する幹細胞が異なることから、白色脂肪細胞より褐色脂肪細胞へとは変化しないと考えられてきた。しかし、近年、白色脂肪組織中に褐色脂肪細胞と同様の応答を示す「褐色様脂肪細胞」の存在が明らかとなってきた（非特許文献２）。褐色様脂肪細胞は白色脂肪細胞由来ながらミトコンドリアの存在量が白色脂肪細胞と比較して格段に多く、蓄積された脂質エネルギーを効率よく熱エネルギーへと変換できる脂肪細胞である。この報告は、ヒト成人にも褐色様脂肪組織を増やすことができる可能性があることを明らかにし、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導が、肥満症や糖尿病の新たな、そして、根本的治療方法として、急速に注目が高まってきている。
【０００３】
しかしながら、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化を誘導することは難しく、確認されている方法は、長期間の寒冷刺激や、アドレナリンによる刺激（非特許文献１）、ペルオキソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲγ）アゴニストの添加（非特許文献３）などのみであり、加えて、すべて、皮下脂肪細胞のみに分化誘導効果が限定される。また、特許文献１にてヒト内臓脂肪細胞に対しＵＣＰ１遺伝子の発現増幅効果のある化合物が報告されているが、白色脂肪細胞の褐色化は見られず、且つ、作用濃度が非常に高く、生体内での有効濃度の達成が難しいなど、白色脂肪細胞の褐色化は、現状、実現には至っていない。
【０００４】
加えて、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦｓ：Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）は、アミノ酸配列の相同性からヒトにおいて現在２２種類存在することが明らかにされている（非特許文献４）。ＦＧＦ‐２１は、脂肪の分解促進と蓄積の抑制、高コレステロール血症、糖尿病（高血糖、インスリン抵抗性）及び肥満の改善に関わる可能性があることが報告されている（非特許文献６）。例えば、特許文献２にはＦＧＦ‐２１の産生を促し、内臓脂肪量の減少効果のある化合物が記載されており、特許文献３にはＦＧＦ‐２１とグルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト、抗糖尿病薬、ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤からなる２型糖尿病治療薬が有用であることが記載されている。あるいは、特許文献４にはＦＧＦ−２１誘導体を用いＦＧＦ−２１の半減期を延長することが代謝疾患の治療に有用であることが記載されている。このような中で、近年、寒冷刺激が血中のＦＧＦ−２１濃度の上昇を促し、白色脂肪の褐色化を促す報告があり、ＦＧＦ−２１は白色脂肪の褐色化誘導因子の一つとして注目されている（非特許文献７）。しかしながら、これまでのところ、ＦＧＦ‐２１をターゲットとした報告は代謝障害の改善を目的とするもののみであり、白色脂肪細胞の褐色化への手段として具体的な提案はなされていない。
【０００５】
また、いわゆる「フレンチパラドックス」と言われる赤ワインの有用な生理効果は、レスベラトロールの抗酸化能を始めとして各種の生理活性機能が一因であるとされている。レスベラトロールはブドウ果皮やピーナッツ赤皮に多く含まれるヒドロキシスチルベン類の一種で、サーチュインを介したカロリー制限効果をはじめ、抗真菌、抗細菌、抗炎症などさまざまな活性を有する植物由来化合物として知られている（非特許文献８）。レスベラトロールには、白色脂肪細胞に特異的に発現する脱共役タンパク質ＵＣＰ２の遺伝子発現亢進効果について報告があるものの（特許文献５）、これまで、レスベラトロールについて、白色脂肪細胞から褐色様脂肪細胞への分化効果について言及されたものは一切無い。
【０００６】
このように、今日に至るまで、食欲の抑制や脂肪吸収抑制ではなく、白色脂肪細胞から褐色様脂肪細胞へと脂肪細胞そのものの性質を変化させ、代謝を変化させることでメタボリックシンドロームを予防・治療する根本的な治療・予防剤の開発が望まれてきたが、これまでのところすべての白色脂肪細胞に対して十分な効果が認められるような物質は見つかっておらず、早期の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−２４１１９５号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／０３７２２３号
【特許文献３】特公表２０１３−５１８０３５号公報
【特許文献４】特公表２０１２−５１５７４７号公報
【特許文献５】特開２０１０−２４２０８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉ． ２０１１ Ｏｃｔ ２８；１：３５
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ．２０１２  Ｊｕｌ  ２０；１５０（２）：３６６−７６９
【非特許文献３】Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０１２ Ｍａｒ ７；５(３)：３９５−４０４
【非特許文献４】Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  ２００１；２（３）：ＲＥＶＩＥＷＳ３００５
【非特許文献６】Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ． ２０１０ Ｊａｎｕａｒｙ； ９１(１)： ２５４Ｓ-２５７Ｓ
【非特許文献７】Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２０１２ Ｆｅｂ  １；２６(３)：２７１−８１
【非特許文献８】レスベラトロールの基礎と応用、シーエムシー出版
【非特許文献９】Ｎａｔｕｒｅ．２００４ Ｊｕｎｅ １７；４２９(６９９３)：７７１
【非特許文献１０】Ｎａｔｕｒｅ．２０１２ Ｓｅｐ  １３；４８９（７４１５）：３１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、前記の状況を鑑みて、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を示す化合物の探索と、その製造方法を確立すべく鋭意検討した結果、レスベラトロールをアルカリ条件下で加熱処理するという簡便且つ安全な方法により、意外にも、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を示す組成物を製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の課題は、これまでレスベラトロールには見られない新しい効果である、優れた白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有し、且つ安全安価に作製することが可能な白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞の分化誘導剤組成物、ならびに該組成物を含有する医薬品及び医薬部外品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
即ち、本発明の要旨は、
［１］レスベラトロールをアルカリ性条件下で加熱して得られることを特徴とする、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤組成物、
［２］式（１）：
【００１１】
【化４】
2015027959.tif 000002
、式（２）：
【００１２】
【化５】
2015027959.tif 000003
【００１３】
及び式（３）：
【００１４】
【化６】
2015027959.tif 000004
【００１５】
で示される３種類のレスベラトロール重合化合物を含有する前記［１］記載の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤組成物、
［３］前記［１］又は［２］記載の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤組成物を含有する医薬品又は医薬部外品
に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤組成物（以下、本発明の組成物ともいう）は、レスベラトロールをアルカリ性条件下で加熱することで安全安価に製造することができ、しかも、前駆物質であるレスベラトロールが持ち合わせない新しい作用である顕著に優れた白色脂肪細胞から褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有しているため、新規なメタボリックシンドローム治療及び予防に有用である。
また、本発明の組成物は、本件出願人が先に提出した特願２０１３−０７１８３６に記載しているような化合物の単離精製工程を行わなくても優れた白色脂肪細胞から褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有しているため、前記先願発明より生産性がよく、より安価に白色脂肪細胞から褐色様脂肪細胞への分化誘導剤を提供することが可能である。
加えて、本発明の組成物を医薬品又は医薬部外品に配合することで、新規なメタボリックシンドローム予防又は改善用の医薬品又は医薬部外品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、実施例１で実施したレスベラトロールの反応溶液のクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、実施例２で実施した分化誘導直後の脂肪細胞中のＦＧＦ‐２１、転写コアクチベーターであるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ補助活性化因子１α（ＰＧＣ−１α）、ミトコンドリアマーカー遺伝子であるシトクロムｃオキシダーゼポリペプチド７Ａ１（Ｃｏｘ７ａ１）、褐色様脂肪細胞にて発現の亢進が観察される転写コアクチベーター、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ補助活性化因子１β（ＰＧＣ−１β）の各遺伝子の相対発現量を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例３で実施した成熟化した脂肪細胞中のＦＧＦ‐２１、ＰＧＣ−１α、ＰＧＣ−１β、褐色様脂肪細胞マーカー遺伝子である細胞死誘導ＤＦＦＡ様エフェクターａ（Ｃｉｄｅａ）、転写コアクチベーターであるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ補助活性化因子１β（ＰＧＣ−１β）の各遺伝子の相対発現量を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例４で実施した正常皮下脂肪分化誘導後の脂肪細胞中のＰＧＣ−１β、ＵＣＰ１、ＣＯＸ７ａ１、褐色様脂肪細胞マーカー遺伝子であるＣＢＰ／ｐ３００‐インターアクティングトランスアクチベーター（ＣＩＴＥＤ１）の各遺伝子の相対発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１９】
本発明の組成物で原料化合物として使用されるレスベラトロールは、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であってもよい。天然由来の原料化合物としては、完全に精製されたものである必要はなく、他の化合物を含む混合物も使用できる。
【００２０】
ただし、加熱による反応効率を高める観点からは、前記レスベラトロールとしては、レスベラトロール換算で、合計５重量％以上含有されたものが原料として望ましい。このような原料としては、例えばブドウ果皮、ワイン、ワイン濃縮パウダー、メリンジョ、リンゴンベリー、ピーナッツ果皮、イタドリ等の原料からの抽出物や該抽出物の凍結乾燥品等を使用してもよい。
【００２１】
本発明では、レスベラトロールを適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであると、レスベラトロールの水への溶解度がいずれも低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させることが好ましい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類については特に制限はなく、レスベラトロールが十分に溶解すればよい。中でも、メタノールやエタノールのみの溶媒や、水とメタノール、水とエタノール等の混合液を使用することが、安全性やコスト面から好ましい。前記の加熱反応後に得られる組成物に最終的な精製を十分に適用せず、その組成物を医薬品、医薬部外品等に使用する場合には、安全性や法規面から溶媒としてエタノールや水、含水エタノールを使用することが望ましい。
【００２２】
前記のようにレスベラトロールを溶媒に溶解して得られる混合溶液（以下、レスべラトロール含有溶液ともいう。）中のレスベラトロールの濃度については、特に制限はないが、レスべラトロールの濃度が高いほど、溶媒使用量が少なくてすむ等のメリットもあるため、レスベラトロールの濃度は各々の溶媒に対しレスベラトロールがそれぞれ飽和する濃度近くに調整することが好ましい。
【００２３】
次に、前記レスベラトロール含有溶液のｐＨをアルカリ性となるように調整する。調整方法として、例えば、レスベラトロール含有溶液を調製した後にアルカリ化剤を添加しｐＨを調整してもよいし、前述のレスベラトロール含有溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいてもよい。レスベラトロール含有溶液の加熱反応開始時のｐＨは８．０以上であれば、効率的に後述のように複数の有用なレスベラトロール重合化合物を生成する反応が進むので好ましく、ｐＨ１３．０を越えると反応と同時に、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために最終的なレスベラトロール重合化合物群の回収量が低下する傾向がある。したがって、反応開始時のｐＨは８．０〜１３．０が望ましい。
【００２４】
前記アルカリ化剤としては、特に制限はないが、安全性、効率及びコスト面からは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムなどが望ましい。反応時のｐＨ変化を極力抑える場合が生じた際には、緩衝溶液を用いてもよいが、必ずしも必要な手法ではない。
【００２５】
次に、アルカリ性に調整されたレスベラトロール含有溶液を加熱する。この加熱により、レスベラトロールどうしを環化反応させることで、有用な化合物が生成する。このような有用な化合物としては、式（１）
【００２６】
【化７】
2015027959.tif 000005
【００２７】
、式（２）：
【００２８】
【化８】
2015027959.tif 000006
【００２９】
及び式（３）：
【００３０】
【化９】
2015027959.tif 000007
【００３１】
で示される３種類のレスベラトロール重合化合物が挙げられる。
【００３２】
前記レスベラトロール重合体化合物において、炭素−炭素２重結合は、トランス又はシスであ  ってよく、シス体とトランス体との混合物を含む。
【００３３】
前記レスベラトロール重合化合物としては、その薬学的に許容可能な塩であってもよい。
【００３４】
前記レスベラトロール重合化合物の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩； マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩； アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩； アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩； α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬理的に許容し得る塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３５】
本発明において前記レスベラトロール重合体化合物を形成するための環化反応とは、レスベラトロールどうしが重合反応することで６員環を形成する反応をいう。
前記環化反応を効率的に進ませるために、レスベラトロール含有溶液の加熱温度は１１０℃以上に調整することが好ましい。また、使用する溶媒の沸点から考え、加圧加熱が望ましい。例えば、開放容器にレスベラトロール含有溶液を入れ、溶媒の沸点を超える高温で前記容器を加熱する、密閉容器にレスベラトロール含有溶液を入れ、前記容器を加熱する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加熱する、超臨界装置やプレッシャークッカー等の装置を用い加圧加熱する等、少なくとも部分的にレスベラトロール含有溶液の温度が１１０℃以上に達するように加熱することが好ましい。前記レスべラトロール重合化合物などの回収効率面から、レスベラトロール含有溶液の温度が均一に１２０℃〜１８０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近で加熱する場合は、１０分〜１２０分の加熱時間が望ましい。また、加熱は、一度でもよいし、複数回に分けて繰り返し加熱してもよい。複数回に分けて加熱する場合、溶媒を新たに追加して行うことが好ましい。
【００３６】
前記加熱による前記式（１）〜（３）で表されるレスベラトロール重合化合物などの生成反応の終了は、例えば、ＨＰＬＣによる成分分析により生成量を確認して判断すればよい。
なお、前記式（１）〜（３）で表されるレスベラトロール重合化合物の生成量については、本発明の組成物中に多いほど白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用が強くなるので好ましいが、具体的には、それぞれの総量が本発明の組成物中に１重量％以上であればよい。
また、式（１）、式（２）、式（３）で表されるレスベラトロール重合化合物のそれぞれの含有比率については特に限定はない。
【００３７】
また、風味の改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記反応物を濃縮して式（１）〜（３）で表されるレスベラトロール重合化合物の濃度を高める、あるいは前記反応物を脱塩精製し、式（１）〜（３）で表されるレスベラトロール重合化合物の濃度を高めたものを得ることができる。前記濃縮や精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等の溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出して式（１）〜（３）で表されるレスベラトロール重合化合物を濃縮できる。また、カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。また、前記濃縮や精製には、再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も使用できる。
中でも、合成吸着剤を用いることで、前記式（１）〜（３）で表されるレスベラトロール重合化合物を吸着させ、その後、溶出することで容易に濃縮、精製ができる。前記合成吸着剤としては、例えば、三菱化学株式会社製のダイヤイオン（登録商標）ＨＰシリーズ、セパビーズ（登録商標）ＳＰシリーズなどの芳香族系合成吸着剤、オルガノ株式会社製のアンバーライト（登録商標）ＸＡＤシリーズなどのスチレン系合成吸着剤などが挙げられる。
【００３８】
また、前記濃縮物や精製物を、必要に応じて、減圧乾燥や凍結乾燥して溶媒を除去することで、粉末状の固形物を得ることができる。
【００３９】
以上のようにして得られる式（１）〜（３）で表されるレスベラトロール重合化合物を含む本発明の組成物は、原料であるレスベラトロールには見られない、強力な白色脂肪細胞からの褐色様脂肪細胞への分化を誘導する作用を有しており、この褐色様脂肪細胞分化誘導作用により、メタボリックシンドロームの予防、治療を図ることができることから、本発明の組成物は、新規のメタボリックシンドローム予防剤及び／又は治療に有用である。
【００４０】
本発明の組成物の投与量としては、患者の性別、年齢、生理的状態、病態（肥満の進み具合等）、製剤形態、投与経路、投与回数、薬剤における有効成分濃度等に応じて広い範囲から適宜選択できるが、例えば、成人１日当たり、本発明の組成物の含有量が固形分として０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ程度、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ程度であればよい。投与は、例えば、１日当たり１回又は数回に分けてもよい。
【００４１】
本発明の組成物は、医薬品として製剤化してもよい。この製剤形態としては特に限定されず、例えば、注射剤、坐剤、点眼剤、軟膏剤、エアゾール剤等の非経口剤、錠剤、被覆錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、トローチ剤、チュアブル錠、シロップ剤等の経口剤等が挙げられる。製剤化の際には、薬学的に許容される担体、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤等が用いられる。
【００４２】
担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００４３】
滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール及びこれらの混合物等が挙げられる。
結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００４４】
崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００４５】
希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類及びこれらの混合物等が挙げられる。
安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００４６】
等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ホウ酸、ブドウ糖、グリセリン及びこれらの混合物等が挙げられる。
ｐＨ調整剤及び緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００４７】
さらに本発明の組成物は、増量剤、可溶化剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、抗酸化剤、細菌抑制剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を含んでいてもよい。
【００４８】
また、本発明の組成物を医薬部外品の形態に製剤化してもよい。医薬部外品としては特に限定されないが、例えば、ドリンク剤等の栄養補助医薬部外品が好ましい。この場合、有効成分であるエキスの医薬部外品における含有量は、固形分として０．００１〜３０重量％程度であればよい。
【００４９】
また、本発明の組成物は、ヒトに対してだけでなく、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。
【００５０】
次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
（実施例１：レスベラトロール重合化合物を含有する組成物の作製及び精製）
レスベラトロール重合化合物を含有する組成物の作製、及び精製を以下の手順で行った。トランス−レスベラトロール（（株）ＴＥＣＮＯ  ＳＣＩＥＮＣＥ社製）１ｇをエタノール１０ｍＬに溶解し、１０％炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業（株）社製）水溶液を１０ｍＬ加えて、レスベラトロール含有溶液（ｐＨ９．９）を得た。このレスベラトロール含有溶液をオートクレーブ（三洋電機製、「ＳＡＮＹＯ  ＬＡＢＯ  ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」、以下同じ）にて１３０℃、９０分間加熱し、レスベラトロール重合化合物含有溶液を作製した。
次いで、レスベラトロール重合化合物含有溶液を蒸留水１Ｌで希釈・溶解させ、４００ｇの合成吸着剤ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０（三菱化学株式会社製）に全量供した。蒸留水１Ｌで洗浄後、１００％エタノール１Ｌで溶出させた。減圧乾燥にて溶媒を除去し、レスベラトロール重合化合物含有組成物（以下、誘導体含有組成物という。）２００ｍｇを得た。得られた重合化合物組成物を２ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶解させ、そのうち１０μＬをＨＰＬＣにより分析した。
【００５２】
ＨＰＬＣ分析は下記の条件にて行った。
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＵＧ８０カラム（４．６ｍｍＩ．Ｄ.×２５０ｍｍ、資生堂株式会社製）
移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、和光純薬株式会社製）／Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル（和光純薬株式会社製）
勾配（容量％）：１００％Ａ／０％Ｂから０％Ａ／１００％Ｂまで３３分、０％Ａ／１００％Ｂを７分（すべて直線）
【００５３】
得られたクロマトグラムを図１に示す。得られた反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、レスべラトロールのピークとは異なる複数のピークが検出できたことから、生成された複数の化合物を含む組成物が取得できた。
【００５４】
次に、得られた反応物のうち、図１の（１）、（２）、（３）に示されるピークに含まれる化合物を分取ＨＰＬＣにより単離し、常法により乾燥したところ、（１）、（２）に示されるピークに含まれる化合物は淡褐色粉末状の物質、式（３）に示されるピークに含まれる化合物は褐色粉末状の物質となった。
【００５５】
次いで、前記３種類の化合物の分子量を、特開２０１１−２５１９１４号公報の実施例２に記載の方法に従って、高分解能Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ＦＡＢ−ＭＳ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）にて測定し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定を行った結果、（１）のピークに含まれる化合物は、前記式（１）で表される化合物（以下、ＵＨＡ４００２という。）、（２）のピークに含まれる化合物は前記式（２）で表される化合物（以下、ＵＨＡ４００３という。）であることがわかった。
【００５６】
一方、（３）のピークに含まれる化合物は、今までに報告されていない新規化合物であった。
すなわち、高分解能Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ＦＡＢ−ＭＳによる測定値は６４７．２１４４であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ42Ｈ31Ｏ7（Ｍ−Ｈ-）：６４７．２１４８
分子式Ｃ42Ｈ32Ｏ7
【００５７】
そして、核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記（３）のピークに含まれる化合物が前記式（３）で表される構造を有する新規化合物（以下、ＵＨＡ４０２２という。）であることを確認した。
【００５８】
なお、前記ＮＭＲ測定値については、ＵＨＡ４０２２を
【００５９】
【化１０】
2015027959.tif 000008
【００６０】
として、その1Ｈ核磁気共鳴スペクトル、13Ｃ核磁気共鳴スペクトルを表１に示す。
値はδ、ｐｐｍで、溶媒はＤＭＳＯ−ｄ6で測定した。
【００６１】
【表１】
2015027959.tif 000009
【００６２】
また、ＵＨＡ４０２２の物理化学的性状は、以下のようになった。
（性状）
褐色粉末
（溶解性）
水：難溶
メタノール：溶解
エタノール：溶解
ＤＭＳＯ：溶解
クロロホルム：難溶
酢酸エチル：難溶
【００６３】
なお、誘導体含有組成物中に含まれるＵＨＡ４００２については、本発明者らはこれまでに抗癌、抗菌作用（特開２０１１−２５１９１４号公報）、サーチュイン発現促進作用（特開２０１２−２４６２４２号公報）、ＡＰＭＫ活性阻害活性（特開２０１３−１１２６５６号公報）、糖吸収抑制作用（特開２０１３−１３６５４７号公報）、ＡｐｏＢ分泌抑制作用（特願２０１２−２５６３６９号公報）、ＬＤＬコレステロール代謝促進作用（特願２０１２−２５６３７８号公報）を、ＵＨＡ４００３について、これまでに抗癌作用（特開２０１１−２５１９１４号公報）、レプチン抵抗性改善作用（特開２０１３−２８５６０）、成熟脂肪細胞肥大化抑制作用（特開２０１３−９５６９３号公報）、抗炎症作用（特願２０１２−０４１７５５）、成熟脂肪細胞のＵＣＰ−２発現促進作用（特願２０１２−２１８６１９）等を有することを確認しているが、白色脂肪細胞より褐色様脂肪細胞への分化誘導に対する効果については、一般的にも未だ知られていない。
【００６４】
（実施例２：誘導体含有組成物の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導作用指標遺伝子発現の検証）
白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導作用を評価するために、３Ｔ３−Ｌ１細胞（マウス由来前駆脂肪細胞）を用いて評価を行った。３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞は通常、分化誘導過程を経て、白色脂肪細胞へと分化、成熟する。しかし、褐色様脂肪細胞へと分化誘導されることで白色脂肪細胞ではほとんど観察されないＣｉｄｅａ遺伝子の発現や、褐色脂肪細胞及び褐色様脂肪細胞にて発現が亢進する転写コアクチベーターＰＧＣ−１β、ミトコンドリアに発現するＣｏｘ７ａ１遺伝子の発現量の増加、及びＵＣＰ１遺伝子の発現亢進が観察されるようになる。加えて、非特許文献６に言及があるように、褐色様脂肪細胞への分化を促す因子の一つとしてＦＧＦ−２１が知られており、ＦＧＦ−２１の発現亢進がもたらすいくつかの効果の一つとして、ＰＧＣ−１αの発現亢進を促し、白色脂肪細胞が褐色用脂肪細胞へと誘導されると考えられている。そこで、ＦＧＦ−２１、ＰＧＣ−１α及びＣｏｘ７ａ１の各遺伝子の発現量を指標に、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導を確認した。
【００６５】
試料にはＰＰＡＲγの合成アゴニストであるロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）及び実施例１にて作成した組成物の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）社製）に０．２ｍＭ、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させて試験に使用した。
【００６６】
培養は、１０％ウシ胎児血清（Ｆｏｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、１％アンチバイオティック−アンチマイコティック（「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ」、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を含む「Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ」（ＤＭＥＭ、商品名、Ｓｉｇｍａ社製）を用いていった。試験に使用する脂肪細胞は定法に従って調製した。
【００６７】
試験は以下のように行った。細胞培養用１２ｗｅｌｌディッシュ（コーニング社製）に３Ｔ３−Ｌ１細胞を５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で１ｍＬ播種して３７℃、５％ＣＯ2条件下で２４時間培養した。２４時間後、ＤＭＥＭ培地を組成物濃度が終濃度２０μｇ／ｍＬ、又はロシグリタゾンが終濃度１μＭとなるように調整したＤＭＥＭ培地に交換し培養を続け、１００％コンフルエントとし、さらに４８時間培養した。次に、培地を「ＡｄｉｐｏＩｎｄｕｃｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ」（商品名、タカラバイオ（株）社製）付属のインスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチンをそれぞれ１％、０．５％、０．１％添加した分化用ＤＭＥＭ１ｍＬに、各試料を終濃度２０μｇ／ｍＬ、１μＭとなるように添加、交換し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で４８時間分化誘導した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを０．５％添加したものをコントロールとした。
【００６８】
培養終了後、細胞よりＲＮＡ抽出キット（商品名：ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて全量ＲＮＡを抽出・精製した。得られたＲＮＡを２ステップリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用逆転写試薬（商品名：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、タカラバイオ（株）製）の取扱説明書に準じて逆転写反応を行った。
【００６９】
つまり５×（Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）２μＬ及び全量ＲＮＡ  ５００ｎｇを混合し、ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  ｄＨ2Ｏで全量を１０μＬにした。ＰＣＲ用サーマルサイクラー（商品名：ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を使用して１サイクルが「３７℃×１５分→８５℃×５秒」であるプログラムにて逆転写反応を行った。逆転写反応液をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用希釈試薬（商品名：ＥＡＳＹ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ、タカラバイオ（株）製）にて５倍希釈した希釈液をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析に使用した。
【００７０】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析は定法に従って行った。解析には、「ＥＣＯ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＲＴ―ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ」（商品名、イルミナ（株）製）を使用した。プライマーには、ＦＧＦ−２１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ−１２６８８６−Ｆ）、ＦＧＦ−２１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ−１２６８８６−Ｒ）、ＰＧＣ−１αフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ−１１４５０９−Ｆ）、ＰＧＣ−１αリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ−１１４５０９−Ｒ）、Ｃｏｘ７ａ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０６８０１−Ｆ）及びＣｏｘ７ａ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０６８０１−Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ−アクチンとし、そのプライマーとして、ＡＣＴＢフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８−Ｆ）及びＡＣＴＢリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８−Ｒ）（前記８種のプライマーはいずれもタカラバイオ（株）製）を使用した。
【００７１】
反応にはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試薬（商品名：ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。反応液は４８ウェルＰＣＲプレート（イルミナ（株）製）中に、２×（ＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）５μＬ、フォワードプライマー（５０μＭ）０．０８μＬ、リバースプライマー（５０μＭ）０．０８μＬ、逆転写反応液２μＬ及びｄＨ2Ｏ  ２．８４μＬ（総量１０μＬ）を混合して『５０℃×２分→９５℃×２分→「９５℃×１５秒→６０℃×１分」×４０サイクル→９５℃×１５秒→５５℃×１５秒→９５℃×１５秒』のプログラムにてＰＣＲ反応を行った。
【００７２】
得られた各細胞中のβ−アクチンとＦＧＦ−２１、ＰＧＣ−１α及びＣｏｘ７ａ１のＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ：一定の増幅量（閾値）に達するサイクル数）からＦＧＦ−２１、ＰＧＣ−１α及びＣｏｘ７ａ１の各遺伝子発現量の相対値を算出した。結果を図２に示した。
【００７３】
その結果、ロシグリタゾン添加時と同様に、褐色様脂肪細胞の誘導因子の一つであるＦＧＦ−２１遺伝子、及びＦＧＦ−２１遺伝子の発現に伴いＰＧＣ−１α遺伝子の発現量が誘導体含有組成物添加時に有意に増大していることが見いだされ、さらに、ミトコンドリアマーカー遺伝子であるＣｏｘ７ａ１の発現量が有意に増大していることが明らかになった。ロシグリタゾンは合成アゴニストであり、その効果は誘導体含有組成物と比較すると強い。しかし、ロシグリタゾンを始めとするチアゾリジン系化合物はヒトに対して浮腫・心不全などの副作用が強く、安全性に問題のある化合物である。これに対し、誘導体含有組成物は遥かに簡便な方法で得られるメリットのある組成物であり、且つ、その前駆化合物であるレスベラトロールは自然界に広く分布し、安全性の極めて高い化合物である上、レスベラトロールを始めとするヒドロキシスチルベン類は重合物を含め自然界に広く分布していることから食経験も豊富な化合物である。故に、本発明品は安全性が高い上に、ロシグリタゾン同様極めて強い白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有する可能性が高い、有用な組成物であることが示された。
【００７４】
（実施例３：誘導体含有組成物の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導作用指標遺伝子発現の検証）
実施例２では誘導体含有組成物が褐色様脂肪細胞へと白色脂肪細胞を分化誘導することを分化誘導直後の細胞を持ち評価したので、実施例３では該誘導細胞が成熟後も褐色様脂肪細胞の形質を維持していることを、成熟脂肪細胞を用い評価した。評価は、ＦＧＦ−２１、ＰＧＣ−１α及び褐色様脂肪細胞マーカー遺伝子である細胞死誘導ＤＦＦＡ様エフェクターａ（Ｃｉｄｅａ）の各遺伝子の発現量、加えて、褐色様脂肪細胞はアドレナリンによる刺激に応答し、ＵＣＰ１遺伝子の発現量を亢進することから成熟化後の脂肪細胞にアドレナリンを添加した場合のＵＣＰ１遺伝子の発現量を指標に、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導を確認した。
【００７５】
実施例２と同様の方法で評価組成物及び化合物を添加し、３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の分化誘導を行った。４８時間の分化誘導後、インスリンを１％添加した維持培養用ＤＭＥＭ２ｍＬに交換し、さらに１週間培養を行い、脂肪細胞の成熟化を行った。アドレナリンによる刺激は、成熟化を行った細胞に対し、Ｌ−アドレナリン（和光純薬工業（株）社製）を１μＭ添加した維持培養用ＤＭＥＭ２ｍＬに交換し、２時間培養を行い、応答を検証した。
【００７６】
１週間の成熟化後、又は、アドレナリン刺激後、実施例２と同様の方法で全量ＲＮＡを抽出、精製し、逆転写反応を行いリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。解析に使用したプライマーは、ＦＧＦ−２１、ＰＧＣ−１α、ＡＣＴＢの各遺伝子については実施例２と同じものを使用し、ＰＧＣ−１β遺伝子については、ＰＧＣ−１βフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１２５５０５−Ｆ）、ＰＧＣ−１βリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１２５５０５−Ｒ）、Ｃｉｄｅａ遺伝子については、Ｃｉｄｅａフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０４６２９−Ｆ）、Ｃｉｄｅａリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０４６２９−Ｒ）ＵＣＰ１遺伝子については、ＵＣＰ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０２７５６１−Ｆ）及びＵＣＰ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０２７５６１−Ｒ）（いずれも、タカラバイオ（株）製）を使用した。
【００７７】
得られた各細胞中のβ−アクチンとＦＧＦ−２１、ＰＧＣ−１α、ＰＧＣ−１β、Ｃｉｄｅａ及びＵＣＰ１のＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ：一定の増幅量（閾値）に達するサイクル数）からＦＧＦ−２１、ＰＧＣ−１β、ＰＧＣ−１α、Ｃｉｄｅａ及びＵＣＰ１の各遺伝子発現量の相対値を算出した。結果を図３に示した。
【００７８】
その結果、ロシグリタゾン添加時と同様に、褐色様脂肪細胞の誘導因子の一つであるＦＧＦ−２１遺伝子、及びＦＧＦ−２１遺伝子の発現に伴いＰＧＣ−１α遺伝子の発現量が有意に増大していることが見いだされ、さらに、褐色様脂肪細胞マーカー遺伝子であるＣｉｄｅａの発現量や、褐色脂肪細胞にて発現が亢進されるＰＧＣ−１βの発現量が有意に増大していることが明らかになった。くわえて、アドレナリン添加によるＵＣＰ１遺伝子の発現亢進効果は、アドレナリン添加有無を比較すると、コントロールがアドレナリンの添加により３．１倍となるのに対し、ロシグリタゾンは６．２倍、本発明品である誘導体含有組成物を添加した場合は６．７倍と大きくその発現量を亢進し、褐色様脂肪細胞のみに見られる特徴が観察された。つまり、本発明の組成物を添加することで、３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞は褐色様脂肪細胞へと分化誘導され、成熟化後も褐色様脂肪細胞の形質を維持していることが明らかとなり、本発明の組成物が、極めて強い白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有する可能性が高いことが示された。
【００７９】
（実施例４：誘導体含有組成物の正常ヒト皮下脂肪に対する褐色様脂肪細胞分化誘導作用指標遺伝子発現の検証）
３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いて見られた、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導作用を評価するために、ヒト皮下脂肪由来正常前駆脂肪細胞（ロンザ・ジャパン社）を用いて評価を行った。正常前駆脂肪細胞は通常白色脂肪細胞へと分化するが、褐色様脂肪細胞へと分化誘導されることで白色脂肪細胞ではほとんど観察されないＵＣＰ−１遺伝子の発現や、ミトコンドリアに発現するＣｏｘ７ａ１遺伝子の発現量の増加、褐色脂肪細胞のマーカー遺伝子であるＰＧＣ−１β及び褐色様脂肪細胞特異的に発現するＣＢＰ／ｐ３００‐ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＣＩＴＥＤ１）遺伝子の発現亢進が観察されるようになる。そこで、ＣＩＴＥＤ１、Ｃｏｘ７ａ１及びＵＣＰ１の各遺伝子の発現量を指標に、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導を確認した。
【００８０】
試料にはＰＰＡＲγアゴニストであるロシグリタゾン及び誘導体含有組成物の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）社製）に適当な濃度で溶解させて試験に使用した。
【００８１】
皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞（ロンザ・ジャパン社製）を １０％のＦＢＳと２ｍＭグ ルタミン、及びＧＡ−１０００を前駆脂肪細胞基本培地（Ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ−２；ＰＭＢ−２培地  ロンザ・ジャパン社製）に添加した前駆脂肪細胞培養培地（ＰＧＭ−２）で４日間前培養後、細胞をＥＤＴＡ−トリプシン液で回収し、ＰＧＭ−２培地に８ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌの 割合で懸濁し、細胞培養用１２−ｗｅｌｌプ レートに０．５ｍｌづ つ植え込んだ。５％の ＣＯ2存 在下、３７℃で２４培養後、ロシグリタゾンを終濃度２μＭ、又はＵＨＡ４００３を終濃度４０μＭとなるようにＰＧＭ−２培地に添加し、０．５ｍｌづつ加えさらに４８時間培養した。培養後、ＰＧＭ−２本分化培地（ＰＧＭ−２培地に、キット付属の各種添加因子（ヒトインスリン、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、インドメタシン）を添加したもの）に、さらにロシグリタゾンを終濃度１μＭ、又は誘導体含有組成物を終濃度２０μｇ／ｍＬとなるように添加した分化用培地を１ｍｌ追添加し、脂肪細胞の分化、成熟化を行った。追添加後１０日間培養を行ったものを試験に使用した。コントロールには溶媒であるＤＭＳＯのみを０．５％添加したものを使用した。
【００８２】
実施例２と同様の方法でＲＮＡを抽出、精製し、逆転写反応、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーには、ＣＩＴＥＤ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ２０４４０４−Ｆ）、ＣＩＴＥＤ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ２０４４０４−Ｒ）、ＰＧＣ‐１βフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１７２１０３−Ｆ）、ＰＧＣ‐１βリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１７２１０３−Ｒ）、ＣＯＸ７Ａ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１３３６４６−Ｆ）及びＣＯＸ７Ａ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１３３６４６−Ｒ）、ＵＣＰ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１５８４５１−Ｆ）及びＵＣＰ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１５８４５１−Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ−アクチンとし、そのプライマーとして、ＡＣＴＢフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ０６７８０３−Ｆ）及びＡＣＴＢリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ０６７８０３−Ｒ）（前記１０種のプライマーはいずれもタカラバイオ（株）製）を使用した。
【００８３】
得られた各細胞中のβ−アクチンとＣＩＴＥＤ１、ＰＧＣ‐１β、ＣＯＸ７Ａ１及びＵＣＰ１のＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ：一定の増幅量（閾値）に達するサイクル数）からＣＩＴＥＤ１及びＰＧＣ‐１β、ＣＯＸ７Ａ１、ＵＣＰ１の各遺伝子発現量の相対値を算出した。結果を図４に示した。
【００８４】
その結果、ロシグリタゾン添加時と同様に、褐色様脂肪細胞のマーカー遺伝子であるＣＩＴＥＤ１遺伝子発現量が誘導体含有組成物添加時に有意に増大していることが見いだされ、さらに、ミトコンドリアマーカー遺伝子であるＣＯＸ７Ａ１の発現量が有意に増大していることが明らかになった。また、ＵＣＰ１遺伝子、ＰＧＣ‐１βの各遺伝子の発現量も有意に増加していることが明らかになった。つまり、本来白色脂肪細胞へと分化するヒト皮下脂肪由来正常前駆脂肪細胞が誘導体含有組成物存在下で褐色様脂肪細胞へと分化したことを示す。即ち、本発明の誘導体含有組成物に極めて強い白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有することが示された。
【００８５】
以上の実施例２、３、４の結果から、誘導体含有組成物を添加することで、細胞内のミトコンドリア量が有意に増加し、白色脂肪細胞からの褐色様脂肪細胞への分化が顕著に誘導されていることから、誘導体含有組成物は、褐色様脂肪細胞への分化誘導効果が優れていることが示された。
また、誘導体含有組成物は、製造コストがかかる合成アゴニストであるロシグリタゾンと比べて、ワンステップで、食品成分から安価に調製することが可能である点でも優れていることがわかる。
【００８６】
（実施例５：本発明の組成物を含有する医薬品）
実施例１と同様にして得られた誘導体含有組成物１ｇをエタノールに溶解し、得られた溶液を微結晶セルロースに吸着させて、減圧乾燥した。本発明品吸着体１０部、コーンスターチ２３部、乳糖１２部、カルボキシメチルセルロース８部、微結晶セルロース３２部、ポリビニルピロリドン４部、ステアリン酸マグネシウム３部、タルク８部を混合し打錠することで、本発明品を含む打錠剤を得た。
【００８７】
（実施例６：本発明の組成物を含有する医薬部外品）
実施例１と同様にして得られた誘導体含有組成物１．２ｇをエタノールに溶解させて得られたエタノール溶液１０ｍＬ、タウリン２０ｇ、ビタミンＢ１硝酸塩０．１２ｇ、安息香酸ナトリウム０．６ｇ、クエン酸４ｇ、砂糖６０ｇ及びポリビニルピロリドン１０ｇを精製水に溶解し、全量を１０００ｍＬにメスアップした。なお、ｐＨは、希塩酸を用いて３．２に調整した。得られた溶液１０００ｍＬのうち５０ｍＬをガラス瓶に充填し、８０℃で３０分間滅菌して、医薬部外品であるドリンク剤を得た。
【図１】
2015027959.tif 000013
【図２】
2015027959.tif 000014
【図３】
2015027959.tif 000015
【図４】
2015027959.tif 000016