(57)【要約】【課題】種子油および膜脂質における脂肪酸不飽和化の示差的調節のための組成物および方法の提供。【解決手段】本発明は、脂肪種子植物を開発するにあたってホスファチジルコリン生合成を調節する新規なホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）を伴うこれまで未知の生合成経路の調整に基づいて、植物の種子油および膜脂質における脂肪酸不飽和化の示差的調節のための方法を提供する。特定の局面は、本発明のＰＤＣＴポリペプチド（例えば、その改変体、欠失体、ムテイン、融合タンパク質、およびオルソログ（ＰＤＣＴタンパク質）が挙げられる）、これらをコードする核酸、このようなＰＤＣＴ配列もしくはタンパク質を含む植物、またはこのようなＰＤＣＴタンパク質もしくは配列を欠くか除去された植物、ＰＤＣＴ発現および／もしくは活性が変化したかもしくはない植物を生成するための方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明の局面は、一般に、脂肪酸生合成、膜脂質および植物種子油、より具体的には、不飽和脂肪酸および関連アシルグリセロールの生合成、ならびに発生中の脂肪種子植物（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、キャノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓもしくはＢ．ｒａｐａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ
ａｎｎｕｕｓ）などの）におけるホスファチジルコリン生合成を調節する新規なホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）を伴うこれまで未知の生合成経路の調整に基づいて、植物の種子油および膜脂質における脂肪酸不飽和化の示差的調節のための組成物および方法に関する。特定の局面は、本発明のＰＤＣＴポリペプチド（例えば、その改変体、欠失体（ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）、ムテイン、融合タンパク質、およびオルソログ（まとめて、ＰＤＣＴタンパク質）が挙げられる）、これらをコードする単離された核酸、このようなＰＤＣＴタンパク質を含む植物、またはこのようなＰＤＣＴタンパク質を欠いている植物、ならびにＰＤＣＴ発現および／もしくは活性が変化したかもしくはない植物を生成するための方法（変異誘発、遺伝子サイレンシング、アンチセンス、組換えＤＮＡ、形質転換（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ）などを含む方法が挙げられるが、これらに限定されない）に関する。
【０００２】
（関連出願の引用）
この出願は、表題「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＬ  ＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＦＡＴＴＹ  ＡＣＩＤ  ＵＮＳＡＴＵＲＡＴＩＯＮ  ＩＮ  ＭＥＭＢＲＡＮＥ  ＬＩＰＩＤＳ  ＡＮＤ  ＳＥＥＤ  ＯＩＬ」の２００９年２月２日に出願された米国仮特許出願第６１／１４９，２８８号および同じ表題の２００８年３月４日に出願された米国仮特許出願第６１／０３３，７４２号（これらの両方は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権の利益を主張する。
【０００３】
（政府支援による研究に関する記述）
本発明は、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＵＳＤＡ）によって付与された助成金２００６−３５３１８−１７７９７および９７−３５３０１−４４２６の下、少なくとも部分的に政府の支援によってなされた。したがって、米国連邦政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
多くの植物種（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａが挙げられる）は、炭素貯蔵としてそれらの種子中にトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を貯蔵する。これらＴＡＧは、エネルギーの主要供給源であり、植物の生命の初期段階の間の実生発生を支持する炭素物質である。ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、キャノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓもしくはＢ．ｒａｐａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）および多くの他の脂肪種子作物に由来する植物性油はまた、ヒトの食事もしくは産業適用（バイオ燃料、バイオ潤滑剤、ナイロン前駆物質、および界面活性剤供給原料が挙げられるが、これらに限定されない）のための重要な油供給源である。植物性油の多価不飽和の脂肪酸の程度および／もしくは量は、食品産業もしくは非食品産業における油使用に関して、特徴的かつ決定的な特性である。より具体的には、上記植物性油の特徴的特性および有用性は、ＴＡＧにおけるそれらの脂肪アシル組成によって主に決定される。
【０００５】
主要な植物性油は、パルミチン酸（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１ｃｉｓ  Δ９）、リノール酸（１８：２ｃｉｓ  Δ９，１２）、およびα−リノレン酸（１８：３ｃｉｓ  Δ９，１２，１５）から主に構成される。上記脂肪酸組成の改変は、ヒトの栄養物摂取および化学物質（例えば、油脂化学）用途（１〜３）に最適な油製品を提供するために、少なくとも１世紀にわたって求められてきた。特に、上記多価不飽和脂肪酸（１８：２および１８：３）は、かなりの注意を引いてきた。なぜなら、それらは、栄養価および油安定性に影響を及ぼす重要な因子であるからである。しかし、これら２つの脂肪酸は、ヒトおよび動物にとっての必須の栄養素を提供する一方で、これらは、油の不安定性を増す。なぜなら、これらは、複数の二重結合を含み、この二重結合は、処理および貯蔵の間に容易に酸化され得るからである。
【０００６】
技術の限界。１８：１を１８：２への不飽和化（ｄｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）は、多価不飽和脂肪酸の合成にとって重要な工程である。貯蔵脂質生合成の間に、この反応は、脂肪酸デサチュラーゼＦＡＤ２（小胞体（ＥＲ）に位置する膜結合型酵素）によって触媒されることが公知である（４）。上記ＦＡＤ２基質である１８：１は、植物細胞の主要な膜リン脂質であるホスファチジルコリン（ＰＣ）のｓｎ−２位でエステル化されなければならない（５，６）。従って、驚くべきことではないが、ＦＡＤ２（およびＦＡＤ３）遺伝子の下方調節は、植物性油を水素化する必要性および望ましくないトランス脂肪酸の付随した生成を回避するための好ましいストラテジーになった。例えば、ダイズは、種子特異的ＦＡＤ２デサチュラーゼおよび構成的ＦＡＤ２デサチュラーゼの両方を有するので、上記種子特異的アイソフォームの遺伝子サイレンシングは、高オレイン酸栽培品種（その油中＞８８％が１８：１）の生成を可能にしてきた。ここで膜不飽和化および植物能力は、大きく影響を受けない。しかし、顕著なことには、このようなＦＡＤ２遺伝子サイレンシングストラテジーは、実質的に制限されている。なぜなら、例えば、キャノーラおよび他の脂肪種子植物は、構成的ＦＡＤ２酵素のみを有するからである。従って、キャノーラおよび他のこのような構成的ＦＡＤ２作物において、ＦＡＤ２のサイレンシングおよび下方調節は、種子中の上記貯蔵トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の脂肪酸組成を変化させるのみならず、細胞膜の脂肪酸組成をも変化させ、このことは、上記植物の生長および収量を重篤に損なう。例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体ｆａｄ２における欠損性ＦＡＤ２は、種子および植物組織の脂肪酸組成を変化させ、植物生長を重篤に損なう（４）。ＦＡＤ２変異およびサイレンシング（これは、その油において最高の１８：１レベルを生じる）はまた、生長組織および種子組織における膜不飽和化を低下させ、発芽しても十分に生長しない植物を生じる。結果として、ＦＡＤ２発現の部分的下方調節のみが可能であり、市販の栽培品種（例えば、Ｎｅｘｅｒａ／Ｎａｔｒｅｏｎ（Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣｌｅａｒ  Ｖａｌｌｅｙ  ７５（Ｃａｒｇｉｌｌ））の油において約７０〜７５％の１８：１を生成する。
【０００７】
従って、植物の種子油および膜脂質における脂肪酸不飽和化の示差的調節のための新規な組成物および方法、ならびに膜脂質成分の不飽和において有害な変化なしに、種子油において低下した脂肪酸不飽和化を有する生存する植物（例えば、キャノーラなど）が当該分野において明らかに必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（例示的実施形態の要旨）
特定の局面は、膜脂質成分の不飽和化における有害な変化なしに、種子油および膜脂質における脂肪酸不飽和化の示差的調節のための新規な組成物および方法を提供する。
【０００９】
さらなる局面は、発生中の脂肪種子植物（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、キャノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓもしくはＢ．ｒａｐａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）などの）におけるホスファチジルコリン生合成を調節する新規なホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）を伴うこれまで未知の生合成経路の調整に基づいて、植物の種子油および膜脂質における脂肪酸不飽和化の示差的調節のための組成物および方法を提供する。
【００１０】
さらなる局面は、本発明のＰＤＣＴポリペプチド（例えば、改変体、欠失体、ムテイン、融合タンパク質、およびそのオルソログ（まとめて、ＰＤＣＴタンパク質）が挙げられる）を提供する。
【００１１】
なおさらなる局面は、このようなＰＤＣＴ配列もしくはタンパク質を含む植物、またはこのようなＰＤＣＴタンパク質もしくは配列を欠いているかもしくは除去された植物、ならびにＰＤＣＴ発現および／もしくは活性が変化したかもしくはない植物を生成するための方法（変異誘発、遺伝子サイレンシング、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、組換えＤＮＡ、形質転換などを含む方法が挙げられるが、これらに限定されない）を提供する。
【００１２】
特定の局面は、種子油における脂肪酸不飽和化を調節するための方法を提供し、上記方法は、脂肪種子をつける植物（ｏｉｌｓｅｅｄ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｐｌａｎｔ）を得る工程；および上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を調整する工程を包含し、ここで上記種子油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して、改変される。特定の実施形態において、上記少なくとも１つのＰＤＣＴの発現もしくは活性を調整する工程は、上記発現もしくは活性を下方調節する工程を包含し、ここで上記改変される種子油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、減少させられる。好ましくは、上記方法は、１種以上の膜脂質における脂肪酸不飽和化と比較して、種子油における脂肪酸不飽和化の示差的調節を包含する。好ましくは、１種以上の膜脂質における脂肪酸不飽和化と比較した、種子油における脂肪酸不飽和化は、種子油において示差的に減少させられる。
【００１３】
さらなる局面は、脂肪種子をつける植物もしくはその一部を生成するための方法を提供し、上記方法は、脂肪種子をつける植物の品種の生殖質に、上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における少なくとも１つのＰＤＣＴの発現もしくは活性を改変する変異もしくは遺伝的改変を付与する工程を包含し、ここで上記種子油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して、改変されている。
【００１４】
さらなる実施形態は、脂肪種子をつける植物もしくはその一部を包含し、上記脂肪種子をつける植物もしくはその一部は、上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を改変する変異もしくは遺伝的改変を含み、ここで上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して改変されている。上記変異もしくは遺伝的改変は、ＰＤＣＴ発現および／もしくは活性を、直接的もしくは間接的に調整するものであり得る一方で、特定の局面において、上記変異は、上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における発現もしくはその活性を改変する少なくとも１つのＰＤＣＴ配列の変異を包含する。ここで上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して改変されている。
【００１５】
さらなる局面は、本明細書で提供される場合、脂肪種子をつける植物もしくはその一部から得られる種子もしくは純粋育種種子（ｔｒｕｅ−ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｓｅｅｄ）を提供する。
【００１６】
さらなる局面は、本明細書で提供される場合、上記脂肪種子をつける植物もしくはその一部から得られる油を提供する。
【００１７】
なおさらなる実施形態は、本明細書で提供される場合、上記脂肪種子をつける植物もしくはその一部から得られる少なくとも１種の油に少なくとも一部基づいて、燃料（例えば、バイオ燃料）を提供する。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
種子油における脂肪酸不飽和化を調節するための方法であって、該方法は、
脂肪種子をつける植物を得る工程；および
該植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子において、少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を調整する工程であって、ここで該種子油における脂肪酸不飽和化のレベル、量もしくは分布は、該ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して改変されている、工程、
を包含する、方法。
（項目２）
上記少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を調整する工程は、該発現もしくは活性を下方調節する工程であり、上記改変されている種子油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、低下させられている、項目１に記載の方法。
（項目３）
１種以上の膜脂質における脂肪酸不飽和化に対する、種子油における脂肪酸不飽和化の示差的調節を含む、項目１および２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４）
上記１種以上の膜脂質における脂肪酸不飽和化に対する、種子油における脂肪酸不飽和化は、種子油において示差的に減少させられている、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）は、配列番号３、配列番号３と少なくとも４６％、少なくとも４８％、少なくとも５８％、少なくとも６４％、少なくとも７１％もしくは少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列、およびそのＰＤＣＴ活性部分からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む、項目１および２のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
上記少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）は、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、およびそのＰＤＣＴ活性部分からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を調整する工程は、変異誘発法および組換えＤＮＡ法のうちの少なくとも一方の使用を含む、項目１および２のいずれか１項の方法。
（項目８）
遺伝子サイレンシング、アンチセンス法、ｓｉＲＮＡ法、形質転換法のうちの少なくとも１つの使用を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
脂肪種子をつける植物もしくはその一部を生成するための方法であって、該方法は、脂肪種子をつける植物の品種の生殖質に、該植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を改変する変異もしくは遺伝的改変を付与する工程を包含し、ここで該種子油における脂肪酸不飽和化のレベル、量もしくは分布は、該ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して改変されている、方法。
（項目１０）
項目９に記載の、脂肪種子をつける遺伝子型もしくは植物もしくはその一部を生成するための方法であって、
適切な方法を使用して、該植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を改変する導入遺伝子を、選択された品種に導入する工程を包含し、ここで該種子油における脂肪酸不飽和化のレベル、量もしくは分布は、該ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して改変されている、
方法。
（項目１１）
項目９に記載の、脂肪種子をつける遺伝子型もしくは植物もしくはその一部を生成するための方法であって、
脂肪種子をつける植物の品種の生殖質を提供する工程；
該生殖質を変異誘発因子で処理して、変異誘発された生殖質を生成する工程；
該変異誘発された生殖質から、該変異誘発因子によって誘発された、該植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を改変する遺伝子型を含む、脂肪種子をつける植物の種子を選択する工程であって、ここで該種子油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、該ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較すると改変されている、工程；ならびに
脂肪種子をつける植物を、該種子から生長させる工程、
を包含する、
方法。
（項目１２）
上記変異誘発された生殖質を生成する工程は、上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における発現もしくはその活性を改変する、少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）配列の変異を生成する工程を包含し、ここで該種子油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、該ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して、改変されている、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
脂肪種子をつける植物もしくはその一部であって、該植物もしくはその一部は、該植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を改変する変異もしくは遺伝的改変を含み、ここで該種子油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、該ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して、改変されている、脂肪種子をつける植物もしくはその一部。
（項目１４）
上記変異は、上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における発現もしくはその活性を改変する少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）配列の変異を含み、ここで上記種子油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、該ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して、改変されている、項目１３に記載の脂肪種子をつける植物もしくはその一部。
（項目１５）
上記植物もしくはその一部は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ以外である、項目１３に記載の脂肪種子をつける植物もしくはその植物。
（項目１６）
上記少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を調整する工程は、該発現および活性のうちの少なくとも一方を下方調節する工程を包含し、ここで上記改変されている種子油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、低下させられている、項目１３に記載の脂肪種子をつける植物もしくはその一部。
（項目１７）
１種以上の膜脂質における脂肪酸不飽和化と比較して、種子油における脂肪酸不飽和化の示差的調節を包含する、項目１６に記載の脂肪種子をつける植物もしくはその一部。
（項目１８）
上記種子油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布を改変する２つ以上の異なる変異もしくは遺伝的改変を含み、ここで該２つ以上の異なる変異もしくは遺伝的改変のうちの少なくとも一方は、上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現および活性のうちの少なくとも一方を改変する変異である、項目１３に記載の脂肪種子をつける植物もしくはその一部。
（項目１９）
上記２つ以上の異なる変異のうちの少なくとも１つは、上記種子もしくは発生中の種子におけるＦＡＤ２の活性もしくは量を低下させるかもしくは除去するＦＡＤ２デサチュラーゼ変異である、項目１８に記載の脂肪種子をつける植物もしくはその一部。
（項目２０）
上記少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）は、配列番号３、配列番号３と少なくとも４６％、少なくとも４８％、少なくとも５８％、少なくとも６４％、少なくとも７１％もしくは少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列、ならびにそのＰＤＣＴ活性部分からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む、項目１３〜１９のいずれか１項に記載の、脂肪種子をつける植物もしくはその一部。
（項目２１）
上記少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）は、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、およびそれらのＰＤＣＴ活性部分からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む、項目２０に記載の脂肪種子をつける植物もしくはその一部。
（項目２２）
項目１３〜２１のいずれか１項に記載の脂肪種子をつける植物もしくはその一部から得られる種子もしくは純粋育種種子。
（項目２３）
項目１３〜２１のいずれか１項に記載の脂肪種子をつける植物もしくはその一部から得られる油。
（項目２４）
上記油は、食品用油である、項目２３に記載の油。
（項目２５）
上記油は、正常の（野生型）ＰＤＣＴ調整を有する植物と比較して、より高度に飽和化もしくは不飽和化されている、項目２４に記載の油。
（項目２６）
項目１３〜２１のいずれか１項に記載の脂肪種子をつける植物もしくはその一部から得られる油に少なくとも一部基づく、可燃性燃料。
（項目２７）
配列番号３、配列番号３と少なくとも４６％、少なくとも４８％、少なくとも５８％、少なくとも６４％、少なくとも７１％もしくは少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列、ならびにそのＰＤＣＴ活性部分からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸であって、ここで該ポリペプチドは、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）を含む、単離された核酸。
（項目２８）
配列番号３、配列番号３と少なくとも４６％、少なくとも４８％、少なくとも５８％、少なくとも６４％、少なくとも７１％もしくは少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列、ならびにそのＰＤＣＴ活性部分からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドは、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）を含む、単離されたポリペプチド。
（項目２９）
配列番号４、配列番号４と少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５５％、少なくとも６２％、少なくとも６４％、少なくとも６６％少なくとも７１％、および少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含む、単離された核酸であって、ここで該配列は、２２８位においてアデノシンヌクレオチドを含む、単離された核酸。
（項目３０）
項目２８に記載の核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチド。
（項目３１）
配列番号５からなる、項目３０に記載の単離されたポリペプチド。
（項目３２）
項目２７および２９のいずれか１項に記載の、トランスフェクトされた核酸を含む、組換え植物細胞。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｄは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの発生中の種子における脂質合成を示す。発生中の種子を、放射活性アセテート（脂肪酸を標識するために）（図１Ｃおよび図１Ｄ）および放射活性グリセロール（脂質骨格を標識するために）で標識した（図１Ａおよび図１Ｂ）。［１４−Ｃ］標識したグリセロール（Ｃ）およびアセテート（Ｄ）を適用した１５分後に、１８０分間にわたって追跡した。ＰＣ、ＤＧおよびＴＧにおける放射活性を、０分、３０分、６０分および１８０分の時点で決定した。
【図１−２】図１Ｅ〜１Ｈは、ｒｏｄ１とＷＴとの間の、開花の９日後の発生中の種子からのＴＧ、ＤＧ、ＰＣおよびＰＥにおける脂肪酸組成の比較を示す。
【図２】図２Ａ−２Ｃは、上記ＲＯＤ１遺伝子が、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいてＡｔ３ｇ１５８２０として同定されたことを示す。図２Ｄは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの第３染色体上のＲＯＤ１遺伝子座のマップベースの同定を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、上記ＲＯＤ１が、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼとして機能することを示す。
【図４】図４は、ＤＨ４における上記ＲＯＤ１変異の短縮型アミノ酸配列（配列番号５）を示す。特定の局面によれば、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）変異体（ｒｏｄ１）コード配列（配列番号４）は、ヌクレオチド位置２２８においてＧ＞Ａ変化を含み、７５アミノ酸短縮型ＲＯＤ１変異配列（配列番号５）を提供するために、上記ＰＤＣＴタンパク質の早期の終結を生じる。
【図５】図５は、特定の例示的局面によれば、ＬＰＴファミリーメンバーの間の一次配列の関係性を示す。特定の局面によれば、ＲＯＤ１は、脂質ホスファターゼ／ホスホトランスフェラーゼファミリーに属する。
【図６】図６は、特定の例示的局面によれば、異なる生物におけるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲＯＤ１に対して相同な公知の配列を示す。特定の局面によれば、ＲＯＤ１は、脂肪種子におけるジアシルグリセロールとホスファチジルコリンとの間の平衡を調節する。
【図７】図７は、特定の例示的局面によれば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓおよび酵母細胞におけるＲＯＤ１およびＡｔ３ｇ１５８３０発現のＲＴ−ＰＣＲを示す。レーン１〜８は、ＲＯＤ１についての結果であり、レーン９〜１６は、Ａｔ３ｇ１５８３０についてである。ＲＴ−ＰＣＲサンプルは、ＷＴ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの発芽中の実生（１，９）、若葉（２，１０）、花（３，１１）、長角果（４，１２）、およびｒｏｄ１変異植物由来の長角果（５，１３）；ｐ４２４ＧＰＤを含む酵母細胞（７，１５）もしくはｐ４２４ＲＯＤ１を含む酵母細胞（８）、ならびにｐ４２４−Ａｔ３ｇ１５８３０を含む酵母細胞（１６）からの総ＲＮＡ；ならびにｒｏｄ１からのゲノムＤＮＡ（６，１４）である。
【図８】図８は、特定の例示的局面によれば、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＲＯＤ１遺伝子のデジタルノーザン分析を示す。上記デジタルノーザンを作り出すために使用されるデータを、Ｇｅｎｅｖｅｓｔｉｇａｔｏｒサイト（ｇｅｎｅｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ．ｅｔｈｚ．ｃｈ／）におけるＡｔＧｅｎＥｘｐｒｅｓｓから得た。シグナル強度は、この図面において含められるステージの全てについて平均した。
【図９−１】図９Ａ〜９Ｇは、特定の例示的局面によれば、ＲＯＤ１が、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の活性を有することを示す。（Ａ）ＣＰＴアッセイのＴＬＣ画像。（Ｂ）ＰＤＣＴアッセイのＴＬＣ画像。ＤＢＹ７４６（ＷＴ）、およびｐ４２４ＧＰＤ（Ｖ）もしくはｐ４２４ＲＯＤ１（Ｒ）で形質転換したＨＪ０９１  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞のミクロソームを使用した。全ての実験における上記ＴＬＣ溶媒系は、以下のとおりである：クロロホルム／メタノール／水＝６５／２５／４（容積単位）。上記基質は、それぞれ、ＣＰＴについてはＣＤＰ−［１４Ｃ］コリンおよびジオレインであり、ＰＤＣＴについては［１４Ｃ−グリセロール］ジ１８：１−ＤＧおよびＰＣ（０ｍＭもしくは１ｍＭ）である。ｂ＝煮沸させたミクロソームタンパク質。（Ｃ）［１４Ｃ−グリセロール］ジ１８：１−ＤＧと、それぞれ、ＰＣ（０ｍＭもしくは１ｍＭ）、ＣＤＰ−コリン、ホスホコリンおよびリゾ−ＰＣとの反応における、ＲＯＤ１形質転換酵母ミクロソームのＰＤＣＴ活性。（Ｄ）ベクターｐ４２４ＧＰＤ（Ｖ）もしくはｐ４２４ＲＯＤ１（Ｒ）で形質転換したＨＪ０９１細胞のミクロソームを、上記ＰＤＣＴアッセイのために、ジ１４：０−ＰＣ［１４Ｃ−コリン］およびジ１８：１−ＤＧとインキュベートした。（Ｅ）ＰＤＣＴ活性に対するｐＨの効果。（Ｆ〜Ｈ）それぞれ、インキュベーション時間、添加されたミクロソームタンパク質、およびＰＣの関数としての上記ＰＤＣＴ活性の線形性。データは、３回の独立した反応の平均および標準偏差を表す。
【図９−２】図９Ａ〜９Ｇは、特定の例示的局面によれば、ＲＯＤ１が、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の活性を有することを示す。（Ａ）ＣＰＴアッセイのＴＬＣ画像。（Ｂ）ＰＤＣＴアッセイのＴＬＣ画像。ＤＢＹ７４６（ＷＴ）、およびｐ４２４ＧＰＤ（Ｖ）もしくはｐ４２４ＲＯＤ１（Ｒ）で形質転換したＨＪ０９１  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞のミクロソームを使用した。全ての実験における上記ＴＬＣ溶媒系は、以下のとおりである：クロロホルム／メタノール／水＝６５／２５／４（容積単位）。上記基質は、それぞれ、ＣＰＴについてはＣＤＰ−［１４Ｃ］コリンおよびジオレインであり、ＰＤＣＴについては［１４Ｃ−グリセロール］ジ１８：１−ＤＧおよびＰＣ（０ｍＭもしくは１ｍＭ）である。ｂ＝煮沸させたミクロソームタンパク質。（Ｃ）［１４Ｃ−グリセロール］ジ１８：１−ＤＧと、それぞれ、ＰＣ（０ｍＭもしくは１ｍＭ）、ＣＤＰ−コリン、ホスホコリンおよびリゾ−ＰＣとの反応における、ＲＯＤ１形質転換酵母ミクロソームのＰＤＣＴ活性。（Ｄ）ベクターｐ４２４ＧＰＤ（Ｖ）もしくはｐ４２４ＲＯＤ１（Ｒ）で形質転換したＨＪ０９１細胞のミクロソームを、上記ＰＤＣＴアッセイのために、ジ１４：０−ＰＣ［１４Ｃ−コリン］およびジ１８：１−ＤＧとインキュベートした。（Ｅ）ＰＤＣＴ活性に対するｐＨの効果。（Ｆ〜Ｈ）それぞれ、インキュベーション時間、添加されたミクロソームタンパク質、およびＰＣの関数としての上記ＰＤＣＴ活性の線形性。データは、３回の独立した反応の平均および標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（例示的実施形態の詳細な説明）
特定の局面は、膜脂質成分の不飽和化において有害な変化なしに、種子油および膜脂質における脂肪酸不飽和化の示差的調節のための新規な組成物および方法を提供する。
【００２０】
さらなる局面は、発生中の脂肪種子植物（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、キャノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓもしくはＢ．ｒａｐａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）などの）におけるホスファチジルコリン生合成を調節する新規なホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）を伴うこれまで未知の生合成経路の調整に基づいて、植物の種子油および膜脂質における脂肪酸不飽和化の示差的調節のための組成物および方法を提供する。
【００２１】
さらなる局面は、本発明のＰＤＣＴ配列およびポリペプチド（例えば、その変異体（例えば、配列番号４および配列番号５）、改変体、欠失体、ムテイン、融合タンパク質、およびオルソログ（まとめて、ＰＤＣＴタンパク質）が挙げられる）を提供する。
【００２２】
なおさらなる局面は、このようなＰＤＣＴタンパク質を含む植物、またはこのようなＰＤＣＴ配列もしくはタンパク質および／もしくは活性を欠いているかもしくは除去されている植物、ならびにＰＤＣＴ発現および／もしくは活性が変化したかもしくはない植物を生成するための方法（変異誘発、遺伝子サイレンシング、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、組換えＤＮＡ、形質転換などを含む当該分野で認識されている方法が挙げられるが、これらに限定されない）を提供する。変異誘発因子および変異誘発している種子もしくは花粉についての情報は、例えば、ＩＡＥＡ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ（ＩＡＥＡ，１９７７）に示されている。特定の実施形態において、変異誘発は、化学的変異誘発（例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）での種子の処理を含む）を含む。種々の植物育種法はまた、本発明の植物を提供するにおいて有用であり、本明細書以下で詳細に議論される。
【００２３】
本明細書以下に記載されるように、本発明の特定の例示的局面は、種子脂肪酸における低下した不飽和化を有するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異植物の遺伝的および生化学的特徴付けを提供する（以下の実施例２の表１を参照のこと）。上記変異植物（もともとは、ＤＨ４として同定されかつ命名された（７））を、標準的な条件下で生長させられたその親の野生型Ｃｏｌ−０植物から区別した。出願人は、本明細書において、上記ＰＤＣＴをコードする遺伝子ＲＯＤ１（Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｏｌｅａｔｅ  Ｄｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  １）を開示し、上記ＤＨ４  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体におけるその変異は、種子油において低下したオレイン酸不飽和レベルを引き起こす。ＤＨ４における上記ｒｏｄ１対立遺伝子は、遺伝的分析によって決定される場合、単一の劣性メンデル変異である。本明細書（作業実施例２）で示される場合、上記ｒｏｄ１変異体における欠損性ＰＤＣＴ活性は、発生中の種子におけるトリアシルグリセロール合成の間に、ホスファチジルコリン（ＰＣ）への１８：１脂肪酸の損なわれた転移を生じた。上記結果は、ＰＤＣＴが、ホスファチジルコリンへの脂質フラックスを調節する主要な因子であることを示し、ここで大部分の脂肪酸改変は、脂肪種子中で起こる。
【００２４】
顕著なことには、上記ｆａｄ２変異体（５，７）と比較して、ＤＨ４における上記脂肪酸組成変化は、種子油に制限される。
【００２５】
本明細書中以下の作業実施例３の下で記載されるように、本発明の特定の例示的局面は、ＤＨ４の上記Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異ｒｏｄ１遺伝子座が、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）からのデノボ合成を介してＰＣへの１８：１の低下した転移に起因して、種子油において低下したオレイン酸不飽和を媒介することが示されたことを示す。
【００２６】
さらなる局面によれば、本明細書以下の実施例４に記載されるように、ＤＨ４の上記Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体ｒｏｄ１の詳細なマッピングを行って、上記ｒｏｄ１変異体（配列番号４）の遺伝子座としてＡｔ３ｇ１５８２０（配列番号２）を本明細書において同定し、初めてホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）であるのみならず、貯蔵物沈着（ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）のピークステージと同時に起こる、種子発生のステージ６において最高レベルを有する発生中の種子において高度に発現されるＰＤＣＴでもあることを示した。
【００２７】
顕著なことには、Ａｔ３ｇ１５８２０（配列番号２）は、推定２型ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ２）様タンパク質として以前に注釈をつけられた。しかし、驚くべきことに、出願人による分析では、Ａｔ３ｇ１５８２０（配列番号２）は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける公知の特徴付けられたＰＡＰ遺伝子（ＡｔＬＰＰ１、ＡｔＬＰＰ２およびＡｔＬＰＰ３）に対する強い相動性を示さなかった（１３，１４）。そして出願人は、ＲＯＤ１が、これら真のＰＡＰ２オルソログに対して配列相動性を本質的に含まないことを決定し、ＲＯＤ１が異なる機能をコードすることを結論づけた。
【００２８】
出願人は、上記Ａｔ３ｇ１５８２０のｃＤＮＡを、全てのＣＤＰ−コリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ活性を欠いている二重変異酵母株ＨＪ０９１（１７）において、誘導性ＧＡＬ１プロモーターの制御下で発現させることによって、ＲＯＤ１をＰＤＣＴ活性について試験した。本明細書で詳述されるように（実施例４）、これら結果は、ＲＯＤ１が、ＰＡホスファターゼ活性を有さないことを示し、そしてＲＯＤ１は、むしろＰＤＣＴ活性を付与し、このことは、上記ｒｏｄ１変異体が、発生中の種子におけるＰＣ合成が欠損しているという事実と一致しているということを実質的に確認する。
【００２９】
さらなる局面によれば、本明細書以下の実施例５に記載されるように、ＲＯＤ１（Ａｔ３ｇ１５８２０）オルソログを同定した。これは、顕著な配列相動性／同一性を有する。実施例５の表２および表３は、それぞれ、Ｂｒａｓｓｉｃａ（配列番号６；配列番号７）、Ｍｏｓｓ（配列番号１６；配列番号１７）、Ｓｐｒｕｃｅ（配列番号１４；配列番号１５）、Ｇｒａｐｅ（配列番号１２；配列番号１３）、Ｒｉｃｅ（配列番号１０；配列番号１１）およびＣａｓｔｏｒ（配列番号８；配列番号９）からの例示的ＲＯＤ１オルソログについてのヌクレオチド類似性（％同一性）およびタンパク質配列類似性（％同一性）を示す（約４６〜８０％の核酸同一性の範囲、および約４２〜８５％のタンパク質配列同一性の範囲を示す）。
【００３０】
さらなる局面によれば、本明細書以下の実施例６に記載されるように、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｂｎａ．６１９４は、真のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲＯＤ１（Ａｔ３ｇ１５８２０）ホモログとして同定されている。出願人は、ＢｎＲＯＤ１としてＢｎａ．６１９４を名付けた。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＢｎＲＯＤ１が、キャノーラの発生中の種子において高度に発現されることを示した。Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓは、複二倍体（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａおよびＢｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａの２つのサブゲノムを含む）である。配列アラインメントはまた、ＢｎＲＯＤ１が、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｂｒａ．２０３８およびＢｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ＥＳ９４８６８７の真のホモログであり得ることを示唆した。
【００３１】
さらなる局面によれば、本明細書以下の実施例７に記載されるように、中程度の不飽和を有する比較的高濃度の長鎖脂肪を含む生物学的物質（例えば、植物種子油）は、本明細書で提供される場合、バイオディーゼルおよび関連製品、ならびに食品用油の生成について改善された供給原料を提供する。
【００３２】
（具体的な好ましい例示的実施形態）
特定の局面は、種子油における脂肪酸不飽和化の調節のための方法を提供し、上記方法は、脂肪種子をつける植物を得る工程；および上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を調整する工程を包含し、ここで上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して改変される。特定の実施形態において、上記少なくとも１つのＰＤＣＴの発現もしくは活性を調整する工程は、上記発現もしくは活性を下方調節する工程を包含し、ここで上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、改変されるか、もしくは低下させられる。好ましくは、上記方法は、１種以上の膜脂質における脂肪酸不飽和化と比較した、種子油における脂肪酸不飽和化の示差的調節を包含する。好ましくは、１種以上の膜脂質における脂肪酸不飽和化と比較した、種子油における脂肪酸不飽和化は、種子油において示差的に低下させられる。特定の実施形態において、上記少なくとも１つのＰＤＣＴは、配列番号３、配列番号３と少なくとも４６％、少なくとも４８％、少なくとも５８％、少なくとも６４％、少なくとも７１％もしくは少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列、ならびにそのＰＤＣＴ活性部分からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む。特定の実施形態において、上記少なくとも１つのＰＤＣＴは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、およびそのＰＤＣＴ活性部分からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む。特定の実施形態において、上記少なくとも１つのＰＤＣＴの発現もしくは活性を調整する工程は、変異誘発および組換えＤＮＡ法のうちの少なくとも１つの使用（遺伝子サイレンシング、アンチセンス法、ｓｉＲＮＡ法、形質転換法のうちの少なくとも１つの使用が挙げられるが、これらに限定されない）を包含する。
【００３３】
さらなる局面は、脂肪種子をつける植物もしくはその一部を生成するための方法を提供し、上記方法は、脂肪種子をつける植物の品種の生殖質に、該植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における少なくとも１つのＰＤＣＴの発現もしくは活性を改変する変異もしくは遺伝的改変を付与する工程を包含し、ここで上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して、改変されている。上記方法の特定の実施形態は、脂肪種子をつける植物の品種の生殖質を提供する工程；上記生殖質を変異誘発因子で処理して、変異誘発した生殖質を生成する工程；上記変異誘発した生殖質から、上記変異誘発因子によって引き起こされる、上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を改変する遺伝子型を含む脂肪種子をつける植物種子を選択する工程てあって、ここで上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して改変されている、工程；ならびに脂肪種子をつける植物を上記種子から生長させる工程を包含する。上記方法の特定の実行において、変異誘発した生殖質を生成する工程は、上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における発現もしくはその活性を改変する少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）配列の変異を生成する工程を包含し、ここで上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して、改変されている。
【００３４】
さらなる実施形態は、脂肪種子をつける植物もしくはその一部を包含し、上記脂肪種子をつける植物もしくはその一部は、上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を改変する変異もしくは遺伝的改変を含み、ここで上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して改変されている。上記変異もしくは遺伝的改変は、ＰＤＣＴ発現および／もしくは活性を、直接的にもしくは間接的に調整するものであり得る一方で、特定の局面において、上記変異は、上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における発現もしくはその活性を改変する少なくとも１つのＰＤＣＴ配列の変異を含み、ここで上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して、改変されている。特定の局面において、上記脂肪種子をつける植物もしくはその一部は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ以外のものである。好ましくは、このような植物において、上記少なくとも１つのＰＤＣＴの発現もしくは活性を調整する工程は、上記発現もしくは活性を下方調節する工程を包含し、ここで改変されている上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、減少させられる。好ましくは、上記発現もしくは活性を調整する工程は、１種以上の膜脂質における脂肪酸不飽和化と比較して、種子油における脂肪酸不飽和化の示差的調節を包含する。特定の植物の実施形態は、上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布を改変する２種以上の異なる変異もしくは遺伝的改変を包含し、ここで上記２種以上の異なる変異もしくは遺伝的改変のうちの少なくとも１つは、上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を改変する変異もしくは遺伝的改変である。このような植物の特定の実施形態において、上記２つ以上の異なる変異のうちの少なくとも１つは、上記種子もしくは発生中の種子におけるＦＡＤ２活性もしくは量を低下させるかもしくは除去するＦＡＤ２デサチュラーゼ変異である。特定の局面において、上記少なくとも１つのＰＤＣＴは、配列番号３、配列番号と少なくとも４６％、少なくとも４８％、少なくとも５８％、少なくとも６４％、少なくとも７１％もしくは少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列、およびそのＰＤＣＴ活性部分からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む。特定の実施形態において、上記少なくとも１つのＰＤＣＴは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、およびそのＰＤＣＴ活性部分からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む。
【００３５】
さらなる局面は、本明細書で提供される場合、上記脂肪種子をつける植物もしくはその一部から得られる種子もしくは純粋育種種子を提供する。
【００３６】
さらなる局面は、本明細書で提供される場合、上記脂肪種子をつける植物もしくはその一部から得られる油を提供する。
【００３７】
なおさらなる実施形態は、本明細書で提供される場合、上記脂肪種子をつける植物もしくはその一部から得られる油に少なくとも一部基づいて、燃料を提供する。
【００３８】
（植物および植物育種）
特定の局面は、脂肪種子をつける植物もしくはその一部を提供し、上記脂肪種子をつける植物もしくはその一部は、上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を改変する変異もしくは遺伝的改変を含み、ここで上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して、改変されている。上記変異もしくは遺伝的改変は、上記ＰＤＣＴ発現および／もしくは活性を改変する任意のものであり得る一方で、好ましい局面において、上記変異は、上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における発現もしくはその活性を改変する少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）配列の変異を含み、ここで上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して改変されている。
【００３９】
種々の植物育種法はまた、このような変異もしくは遺伝的改変に基づいて、有用な植物品種を確立することにおいて有用である。
【００４０】
（植物育種）
さらなる局面は、植物育種において、（本明細書で提供される場合に）上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子において少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を改変する変異を含む脂肪種子をつける植物を使用するための方法を包含し、ここで上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して、改変されている。１つのこのような実施形態は、特定のＰＤＣＴ変異体品種と、上記植物の別の品種と交配して、Ｆ１植物の第１世代集団を形成するための方法である。この方法によって生成される第１世代のＦ１植物の集団はまた、本発明の一実施形態である。Ｆ１植物のこの第１世代集団は、上記特定のＰＤＣＴ変異体品種の対立遺伝子の本質的に完全なセットを含む。当業者は、繁殖植物の本もしくは分子的方法のいずれかを利用して、上記特定のＰＤＣＴ変異体品種を使用して生成される特定のＦ１植物を同定し得、そして任意のこのような個々の植物はまた、本発明によって包含される。これら実施形態はまた、第１世代のＦ１植物を生成するために、特定のＰＤＣＴ変異体品種の形質転換もしくは戻し交配転換（ｂａｃｋｃｒｏｓｓ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）の使用を網羅する。
【００４１】
なおさらなる局面は、特定のＰＤＣＴ変異体−子孫植物を開発するための方法を包含し、上記方法は、特定のＰＤＣＴ変異体品種と、第２の植物とを交配する工程を包含し、育種法を実施する工程はまた、本発明の一実施形態である。
【００４２】
（一般的育種法および選択法）
概説。植物育種は、植物の遺伝的操作である。植物育種の目的は、新たな、独特の、かつ優れた植物品種を開発することである。植物育種プログラムの実際の適用において、および本明細書で以下に詳細に議論されるように、育種家は、最初に２つ以上の親系統を選択してこれを交配し、その後、「自家受粉」および選択を反復し、多くの新たな遺伝的組み合わせを生成する。上記育種家は、交配、「自家受粉」および天然に誘導される変異を介して、数十億もの異なる遺伝的組み合わせのを理論的に生成し得る。上記育種家は、細胞レベルでは、直接的な制御はしないので、２名の育種家が、正確に同じ系統を開発することはない。毎年、上記植物育種家が、上記生殖質を選択して、次世代へと発展させている。この生殖質は、特有のかつ異なる地理的、気候的、および土壌条件下で生長させられ得、さらに、その生長期の間におよび生長期の最後に選択が行われ得る。
【００４３】
適切な試験は、主要な欠点を検出し得、そして現在の品種を超える優秀なものおよび改善のレベルを確立し得る。示される優れた能力に加えて、これが、新たな品種に対する要求を満たすことが望ましい。上記新たな品種は、最適には、産業的標準に適合するか、または新たな市場を作り出すはずである。新たな品種の導入は、特別な広告およびマーケティングのために、種子生産者、栽培者、加工業者および消費者にさらなる費用を負わせ得、種子および商業的製造実施、および新たな製品利用を変え得る。新たな品種の試験的先行販売（ｔｅｓｔｉｎｇ  ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ  ｒｅｌｅａｓｅ）は、最終的な品種の研究開発費および技術的優位性を考慮に入れるべきである。理想的には、容易にかつ経済敵意に種子を生産することもまた、可能であるべきである。
【００４４】
用語「ホモ接合性植物」とは、本明細書によって、その遺伝子座の９５％以上においてホモ接合性遺伝子を有する植物として定義される。
【００４５】
用語「近親交配」とは、本明細書で使用される場合、ホモ接合性植物もしくはホモ接合性植物の集合をいう。
【００４６】
育種法および選択法の選択。育種法および選択法の選択は、植物繁殖の態様、改善されている形質の遺伝性、および産業的に使用される品種のタイプ（例えば、Ｆ１ハイブリッド品種、純系品種など）に依存する。遺伝性の高い形質については、単一の場所で評価される優れた個々の植物の選択は有効であるのに対して、遺伝性の低い形質については、選択は、関連植物のファミリーの反復された評価から得られる平均値に基づくべきである。遺伝の複雑性はまた、育種法の選択に影響を与える。育種は、一般に、２つの遺伝子型の交叉ハイブリッド形成（「交配」）で始まり、２つの遺伝子型の各々は、他方が欠いている１つ以上の望ましい特徴を有し得るか、または他方を補完し得る。上記２つの元の親が、望ましい特徴を全く提供しない場合、他の供給源が、より多くの交配種を作出するために含められ得る。各連続的な親から子への世代（例えば、Ｆ１→Ｆ２；Ｆ２→Ｆ３；Ｆ３→Ｆ４；Ｆ４→Ｆ５など）において、植物は、「自家受粉」されて、上記系統のホモ接合性を増大させる。代表的には、育種プログラムにおいて、５世代以上の選択および「自家受粉」が、ホモ接合性植物を得るために行われる。各植物育種プログラムは、育種手順の効率の周期的な、客観的評価を含むべきである。評価基準は、上記目的および客観性に依存して変動するが、適切な標準に対する比較、勧められる育種系統の全体的な評価、および投入単位あたり（例えば、１年あたり、費やされたドルあたりなど）で生成される好結果の品種の数に基づいて、１年ごとに選択からの利益を含むはずである。
【００４７】
（戻し交配転換）
さらなる実施形態は、脂肪種子をつける植物の戻し交配転換を含むか、戻し交配転換であり、上記脂肪種子をつける植物は、（本明細書で提供される場合に）上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を改変する変異を含み、ここで上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して、改変されている。戻し交配転換は、ＤＮＡ配列が伝統的な（非形質転換）育種技術（例えば、戻し交配）を介して導入される場合に起こる。ＤＮＡ配列は、天然に存在しようと導入遺伝子であろうと、これら伝統的な育種技術を使用して導入され得る。このプロセスを介して移入される望ましい形質としては、栄養向上、産業的向上、疾患抵抗性、昆虫抵抗性、除草剤抵抗性、栽培的向上、穀物品質向上、ワキシーデンプン（ｗａｘｙ  ｓｔａｒｃｈ）、育種向上、種子生産向上、および雄性不稔性が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態は、戻し交配転換植物を開発するための方法を包含するかもしくはその方法であり、上記方法は、このようなＰＤＣＴ変異への反復された戻し交配を伴う。行われ得る戻し交配の回数は、２回、３回、４回、５回、６回もしくはこれ以上であり得、使用される戻し交配の特定の回数は、ドナー親の遺伝および分子マーカーが、戻し交配プログラムにおいて利用されるか否かに依存する。
【００４８】
（本質的に得られる品種）
本発明の別の実施形態は、脂肪種子をつける植物の本質的に得られる品種であり、上記品種は、（本明細書で提供される場合に）上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子において少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を改変する変異を含み、ここで上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して、改変されている。上記ＵＰＯＶ転換によって決定される場合、本質的に得られる品種は、例えば、天然もしくは誘導される変異体、または体細胞クローン品種（ｓｏｍａｃｌｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ）の選択、最初の品種、戻し交配、もしくは遺伝子操作による形質転換の植物からの改変個体の選択によって得られ得る。このようなＰＤＣＴ変異体の本質的に得られる品種は、作出がその反復される使用を必要とするものとしてさらに定義されるか、または特定のＰＤＣＴ変異体の遺伝子型から主に得られる。植物の新品種の保護に関する国際条約（１９９１年５月１９日改正、第Ｖ章、第１４条、第５（ｃ）項）。
【００４９】
（ＤＮＡ構築物）
本発明はまた、植物遺伝子発現制御配列に作動可能に連結された上記開示されるＰＤＣＴ変異体品種からの遺伝的エレメントおよび／もしくはコード配列を含む単離された核酸配列を含むＤＮＡ構築物（例えば、発現ベクター、組換えベクター、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ構築物など）の製造を企図する。「ＤＮＡ構築物」は、本明細書において、ＤＮＡを宿主細胞に導入するために有用な、構築された（天然に存在しない）ＤＮＡ分子であると定義され、上記用語は、キメラ遺伝子、発現カセット、およびベクターを含む。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」とは、そのコードされるタンパク質が発現されるような様式において、ＤＮＡ配列が連結されていること（上記配列の順序、上記配列の配向、および種々の配列の相対的間隔を含む）をいう。発現制御配列をコード配列に作動可能に連結するための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２；およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照のこと。
【００５１】
「発現制御配列」は、転写もしくは翻訳の制御において何らかの様式において関与するＤＮＡ配列である。適切な発現制御配列およびこれを作製および使用するための方法は、当該分野で周知である。
【００５２】
上記発現制御配列は、好ましくは、プロモーターを含む。上記プロモーターは、誘導性であってもよいし、構成的であってもよい。上記プロモーターは、天然に存在してもよいし、種々の天然に存在するプロモーターの一部から構成されていてもよいし、部分的にもしくは全体的に合成のものであってもよい。プロモーターの設計のためのガイダンスは、プロモーター構造の研究によって提供される（例えば、Ｈａｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，２３４３−２３６１，１９８７のもの）。また、転写開始に対する上記プロモーターの位置は、最適化され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：７６０−７６４，１９７９を参照のこと。
【００５３】
植物において使用するための多くの適切なプロモーターは、当該分野で周知である。例えば、植物における使用に適切な構成的プロモーターとしては、植物ウイルスのプロモーター(例えば、落花生白化線条カリモウイルス（ｐｅａｎｕｔ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｓ
ｔｒｅａｋ  ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ）（ＰＣ１ＳＶ）プロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号）；カリフラワーモザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）に由来する３５Ｓおよび１９Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら，Ｉ  ３１３：３８１０−８１２，１９８５）；クロレラウイルスメチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター（米国特許第５，５６３，３２８号）；ゴマノハグサモザイク・ウイルス（ＦＭＶ）（米国特許第５，３７８，６１９号）の全長転写プロモーター；イネアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３−１７１（１９９０））、ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２，１９８９）、および（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９，  １９９２）、ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔら，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８，１９９１）、ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎら，Ｅｍｂｏ  Ｊ．３：２７２３−２７３０，１９８４）、コムギヒストン（Ｌｅｐｅｔｉｔら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３１：２７６−２８５，１９９２、およびＡｔａｎａｓｓｏｖａら，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２：２９１−３００，１９９２）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  ＡＬＳ３（国際公開番号ＷＯ  ９７／４１２２８）のような遺伝子に由来するプロモーター；ならびに種々のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ遺伝子のプロモーター（米国特許第４，７７１，００２号；同第５，１０２，７９６号；同第５，１８２，２００号；および同第５，４２８，１４７号を参照のこと）が挙げられる。
【００５４】
植物における使用に適切な誘導性プロモーターとしては、以下が挙げられる：銅に応答するＡＣＥ１系に由来するプロモーター（Ｍｅｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：４５６７−４５７１，１９９３）：ベンゼンスルホンアミド（ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｏｍｉｄｅ）除草剤毒性緩和剤に応答するコムギＩｎ  ２遺伝子のプロモーター（米国特許第５，３６４，７８０号およびＧａｔｚら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４３：３２−３８，１９９４）、およびＴｎ１０に由来するＴｅｔリプレッサのプロモーター（Ｇａｔｚら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９−２３７，１９９１）。一実施形態によれば、植物における使用のための上記プロモーターは、植物が通常応答しない誘導剤に応答するものである。このタイプの例示的誘導性プロモーターは、ステロイドホルモン遺伝子に由来する誘導性プロモーター（その転写活性は、グルコステロイドホルモン（Ｓｃｈｅｎａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１０４２１，１９９１）もしくはエストラジオールによって活性化されるエストロゲンレセプターベースの誘導性植物発現系において使用するためのキメラ転写アクチベーターＸＶＥの適用（Ｚｏｕら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２４  ２６５−２７３，２０００）によって誘導される）である。植物における使用のための他の誘導性プロモーターは、欧州特許第３３２１０４号、国際公開番号ＷＯ  ９３／２１３３４および国際公開番号ＷＯ  ９７／０６２６９において記載されており、Ｇａｔｚ  ａｎｄ  Ｌｅｎｋ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．，３：３５２−３５８，１９９８、およびＺｏｕ  ａｎｄ  Ｃｈｕａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１：１４６−１５１，２０００において議論されている。最終的には、他のプロモーターの一部、および部分的にもしくは全体的に合成のプロモーターから構成されるプロモーターが、使用され得る。例えば、Ｎｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．７：６６１−６７６，１９９５、および国際公開番号ＷＯ  ９５／１４０９８（これは、植物における使用のためのこのようなプロモーターを記載している）を参照のこと。
【００５５】
上記プロモーターは、１つ以上のエンハンサーエレメントを含み得るか、または含むように改変され得る。好ましくは、上記プロモーターは、複数のエンハンサーエレメントを含む。エンハンサーエレメントを含むプロモーターは、エンハンサーエレメントを含まないプロモーターと比較して、より高いレベルの転写を提供する。植物における使用に適切なエンハンサーエレメントとしては、ＰＣ１ＳＶエンハンサーエレメント（米国特許第５，８５０，０１９号）、ＣａＭＶ  ３５Ｓエンハンサーエレメント（米国特許第５，１０６，７３９号および同第５，１６４，３１６号）、およびＦＭＶエンハンサーエレメント（Ｍａｉｔｉら，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．，６：１４３−１５６，１９９７）が挙げられる。国際公開番号ＷＯ  ９６／２３８９８およびＥｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８３）を参照のこと。
【００５６】
効率的な発現については、上記コード配列はまた、好ましくは、３’非翻訳配列に作動可能に連結される。上記３’非翻訳配列は、好ましくは、転写終結配列およびポリアデニル化配列を含む。上記３’非翻訳領域は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、植物ウイルス、植物および他の真核生物に由来する遺伝子の隣接する領域から得られ得る。植物における使用に適切な３’非翻訳配列としては、カリフラワーモザイク・ウイルス３５Ｓ遺伝子、ファセオリン種子貯蔵タンパク質遺伝子、エンドウ豆リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニットＥ９遺伝子、コムギ７Ｓ貯蔵タンパク質遺伝子、オクトピンシンターゼ遺伝子、およびノパリンシンターゼ遺伝子のものが挙げられる。
【００５７】
５’非翻訳リーダー配列はまた、必要に応じて、使用され得る。上記５’非翻訳リーダー配列は、５’ＣＡＰ部位から翻訳開始コドンへと伸びるｍＲＮＡの部分である。上記ｍＲＮＡのこの領域は、植物における翻訳開始に必要であり、遺伝子発現の調節において一定の役割を果たす。植物における使用に適切な５’非翻訳リーダー配列としては、アルファルファモザイク・ウイルス、キュウリモザイク・ウイルスコートタンパク質遺伝子、およびタバコモザイク・ウイルスのものが挙げられる。
【００５８】
上記ＤＮＡ構築物は、「ベクター」であり得る。上記ベクターは、宿主細胞においてこれを複製することを可能にする１つ以上の複製系を含み得る。自己複製ベクターとしては、プラスミド、コスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。あるいは、上記ベクターは、上記宿主細胞の染色体への、黒根病抵抗性遺伝子生成物をコードするＤＮＡ配列の組み込みを可能にする組み込みベクターであり得る。上記ベクターはまた、望ましくは、ＤＮＡ配列の挿入のための特有の制限部位を有する。ベクターが、特有の制限部位を有さない場合、これは、さらなる操作により適切にするように、制限部位を導入するかもしくは除去するように改変され得る。
【００５９】
植物において発現される場合に、（本明細書で提供される場合に）上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子において少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を調整し、ここで上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布が、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して、改変されている上記核酸を発現することにおいて使用するのに適したベクターとしては、ｐＭＯＮ９７９、ｐＭＯＮ９７７、ｐＭＯＮ８８６、ｐＣａＭＶＣＮ、およびＲｏｇｅｒｓら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：２５３−２７７，１９８７によって記載されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドに由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。上記核酸は、適切な植物活性プロモーターに作動可能に連結されるように、上記ベクターへと挿入される。上記核酸との使用に適切な植物活性プロモーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓ、ＡＣＴＪＮ、ＦＭＶ３５Ｓ、ＮＯＳおよびＰＣＳＬＶプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。上記核酸を含む上記ベクターは、種々の公知の方法を使用して、植物細胞に挿入され得る。例えば、植物細胞のＤＮＡ形質転換としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性植物形質転換、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、花粉への遺伝子移入、生殖器官への注入、未熟胚への注入およびパーティクルボンバードメントが挙げられるが、これらに限定されない。これら方法は、米国特許第５，７５６，２９０号において十分に記載されており、特に効率的なプロトコルにおいて、コムギについては、米国特許第６，１５３，８１２号、およびそこで引用される参考文献に記載されている。部位特異的組換えシステムはまた、上記植物ゲノムへの上記核酸のコピー数およびランダム組み込みを低下させるために使用され得る。例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘシステムは、植物細胞における即座のｌｏｘ部位特異的組換えに使用され得る。この方法は、少なくともＣｈｏｉら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：Ｂ１９，２０００において見いだされ得る。
【００６０】
（導入遺伝子）
分子生物学的技術は、特定の機能（例えば、特定のタンパク質生成物をコードする）を有する遺伝的エレメントの単離および特徴付けを可能にする。植物生物学の分野の科学者は、特定の様式において植物の形質を変化させるために、外来の遺伝的エレメント、またはさらなる、もしくは改変されたバージョンの、ネイティブのもしくは内因性の遺伝的エレメントを含みかつ発現するように、植物のゲノムを操作することに強い興味をわかせてきた。異なる種に由来しようと、同じ種に由来しようと、形質転換を使用してゲノムに挿入される任意のＤＮＡ配列は、本明細書において、まとめて「導入遺伝子」といわれる。トランスジェニック植物を生成するためのいくつかの方法が、開発されてきた。そして本発明はまた、特定の実施形態において、本発明の遺伝子型の形質転換されたバージョンに関し、そして／または１つ以上の導入遺伝子を含む形質転換されたバージョンは、（本明細書で提供される場合に）上記植物の１つ以上の種子もしくは発生中の種子における少なくとも１つのホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の発現もしくは活性を直接的にもしくは間接的に改変し、ここで上記植物油における脂肪酸不飽和化のレベル、量、もしくは分布は、上記ＰＤＣＴの通常の種子の発現を有する植物の種子油と比較して、改変されている。
【００６１】
植物形質転換のための多くの方法が開発されてきた。これら方法としては、生物学的および物理的、植物形質転換プロトコルが挙げられる。例えば、Ｍｉｋｉら，「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ」ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．編（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３）  ｐａｇｅｓ  ６７−８８を参照のこと。さらに、植物細胞もしくは組織の形質転換および植物の再生のための発現ベクターおよびインビトロ培養法は、利用可能である。例えば、Ｇｒｕｂｅｒら，「Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．編（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３）ｐａｇｅｓ  ８９−１１９を参照のこと。
【００６２】
植物形質転換の最も一般に行われているタイプは、発現ベクターの構築を包含する。このようなベクターは、調節エレメント（例えば、プロモーター）の制御下にある遺伝子もしくは上記調節エレメントに作動可能に連結された遺伝子を含むＤＮＡ配列を含む。上記ベクターは、１つ以上の遺伝子および１つ以上の調節エレメントを含み得る。種々の遺伝的エレメントは、形質転換を使用して、上記植物ゲノムに導入され得る。これらエレメントとしては、遺伝子；コード配列（センス配向もしくはアンチセンス配向において）；誘導性プロモーター、構成的プロモーター、および組織特異的プロモーター；増強配列（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）；ならびにシグナル配列および標的化配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
形質転換技術を使用して特定の植物へと操作された遺伝的形質は、植物育種分野において周知の伝統的な育種技術を使用して別の系統に動かされ得る。例えば、戻し交配アプローチは、形質転換された脂肪種子をつける植物からえり抜きの植物品種へ導入遺伝子を動かすために使用され得、得られた子孫は、導入遺伝子を含む。本明細書で使用される場合、「交配」とは、状況に依存して、単純なＸ×Ｙ交配、もしくは戻し交配のプロセスに言及し得る。用語「育種交配」は、自家受粉もしくは近親交配（ｓｉｂｂｉｎｇ）のプロセスを除く。
【００６４】
本発明に従うトランスジェニック植物では、外来タンパク質および／もしくは内因性タンパク質もしくは生成物（例えば、油）の改変された発現は、商業的な量で生成され得る。従って、形質転換された植物の選択および繁殖のための技術（これらは、当該分野で周知である）は、従来の様式において収穫される複数のトランスジェニック植物を生じ、次いで、植物生成物は、目的の組織からもしくは全バイオマスから抽出され得る。植物バイオマスからのタンパク質および油の抽出は、例えば、Ｈｅｎｅｙ  ａｎｄ  Ｏｒｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４：９２−９６，１９８１によって議論されている公知の方法によって達成され得る。
【００６５】
好ましい実施形態によれば、外来タンパク質の商業的生成のために提供されるトランスジェニック植物は、キャノーラ（例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓもしくはＢ．ｒａｐａ）、ダイズ（例えば、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、もしくはヒマワリ（例えば、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）である。別の好ましい実施形態において、目的のバイオマスは種子である。主に、従来のＲＦＬＰ、ＰＣＲ、およびＳＳＲ分析を介して、遺伝的マップが作成され得、これは、組み込まれたＤＮＡ分子のおよその染色体位置を同定する。この点における例示的方法論については、Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６９−２８４（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３）を参照のこと。染色体位置に関するマップ情報は、本発明のトランスジェニック植物の財産保護（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）のために有用である。権限のない繁殖が行われ、他の生殖質との交配が行われる場合、組み込み領域のマップは、疑いのある植物についての類似のマップと比較して、疑いのある植物が、本発明の植物と共通する親系統（ｐａｒｅｎｔａｇｅ）を有するか否かを決定し得る。マップ比較は、ハイブリダイゼーション、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ、ＳＳＲおよび配列決定を包含し得、これらは全て、従来の技術である。
【００６６】
（形質転換による作物学的目的の導入遺伝子の導入）
作物学的遺伝子は、形質転換植物において発現され得る。例えば、植物は、遺伝的に操作されて、種々の作物学的に目的の表現型を発現し得るか、または代わりに、導入遺伝子は、導入遺伝子を有する植物との育種によって、植物に導入され得る。植物の形質転換を介して、遺伝子の発現は、疾患抵抗性、昆虫抵抗性、殺虫剤抵抗性、水ストレス耐性、および作物学的形質、ならびに種子品質の形質を高めるために調整され得る。形質転換はまた、雄性不稔性を制御するかもしくはその制御を補助するＤＮＡ配列を挿入するために使用され得る。特定の植物が本来持っているＤＮＡ配列、および非ネイティブＤＮＡ配列は、ネイティブタンパク質もしくは非ネイティブタンパク質のレベルを調整するために形質転換されかつ使用され得る。アンチセンス技術、ｓｉＲＮＡ技術、種々のプロモーター、標的化配列、増強配列、および他のＤＮＡ配列は、タンパク質の発現を調整する目的で、特定のゲノムに挿入され得る。この点に関して関わっている多くの例示的遺伝子は、当該分野で公知である。
【００６７】
（ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）核酸およびタンパク質の改変体）
本明細書で使用される場合、「生物学的活性」とは、ポリペプチドの機能をいう。上記機能としては、複合体化、ダイマー化、マルチマー化、レセプター関連リガンド結合、および／もしくはエンドサイトーシス、レセプター関連プロテアーゼ活性、リン酸化、脱リン酸化、自己リン酸化、他の分子と複合体を形成する能力、リガンド結合、触媒活性もしくは酵素活性、活性化（自己活性化および他のポリペプチドの活性化を含む）、別の分子の機能の阻害もしくは調整、シグナル伝達および／もしくは細胞応答（例えば、細胞増殖、移動、分化、および生長）の刺激もしくは阻害、分解、膜局在化、ならびに膜結合が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的活性は、本明細書で記載されるアッセイによっておよび当業者に公知の任意の適切なアッセイによって評価され得、これらのアッセイとしては、インビトロアッセイ（細胞ベースのアッセイを含む）、インビボアッセイ（特定の疾患の動物モデルにおけるアッセイを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
好ましくは、上記ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、もしくはその改変体は、配列番号３のアミノ酸配列（もしくは１個から、約３個まで、約５個まで、約１０個まで、もしくは約２０個までの保存的アミノ酸置換を有する配列番号５のアミノ酸配列）、または配列番号３の配列のフラグメント（もしくは１個から、約３個まで、約５個まで、約１０個まで、もしくは約２０個までの保存的アミノ酸置換を有する配列番号５のフラグメント）を含む。好ましくは、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、もしくはその改変体は、配列番号２、もしくは配列番号５、もしくはそれらの保存的アミノ酸置換改変体の配列を含む。
【００６９】
機能的ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、改変体は、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の生物学的活性のうちの１つ以上を示す（もしくは欠いている）タンパク質である。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「野生型ＲＯＤ１もしくはＰＤＣＴ」は、機能的ＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質をコードする、植物内で見いだされる天然に存在するＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子を意味する。対照的に、用語「変異ＲＯＤ１もしくはＰＤＣＴ」とは、本明細書で使用される場合、ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子であって、これらは、機能的ＲＯＤ１タンパク質も、ＰＤＣＴタンパク質もコードしないものに言及する。すなわち、ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子は、本明細書で使用される場合、対応する野生型の機能的ＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質と比較して、生物学的活性を有さないもしくは顕著に低下した生物学的活性を有するＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質に言及する非機能的ＲＯＤ１配列もしくはＰＤＣＴ配列をコードするか、またはＲＯＤ１タンパク質もＰＤＣＴタンパク質も全くコードしない。このような「変異ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子」（「完全ノックアウト」もしくは「ヌル」対立遺伝子ともいわれる）は、野生型ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子であり、これは、その核酸配列において１もしくは数個の変異を含み、それによって、上記変異は、好ましくは、インビボで細胞において機能的ＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質の顕著に低下した（絶対的にもしくは相対的に）量を生じる。上記ＲＯＤ１タンパク質コード核酸配列もしくはＰＤＣＴタンパク質コード核酸配列の変異対立遺伝子は、「ｒｏｄ１もしくはｐｄｃｔ」と本明細書で称される。変異対立遺伝子は、天然において見いだされる変異対立遺伝子である「天然変異」対立遺伝子（例えば、変異誘発因子のヒト適用なしに自然発生的に生成される）もしくはヒト介入によって（例えば、変異誘発によって）誘導される「誘導型変異」対立遺伝子のいずれかであり得る。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「野生型ＲＯＤ１もしくは野生型ＰＤＣＴ」とは、機能的ＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質をコードする植物内で見いだされる天然に存在するＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子を意味する。対照的には、特定の局面において、用語「変異ＲＯＤ１もしくはＰＤＣＴ」とは、本明細書で使用される場合、機能的ＲＯＤ１タンパク質もＰＤＣＴタンパク質もコードしないＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子をいう。すなわち、ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子は、本明細書で使用される場合、対応する野生型の機能的ＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質と比較して、生物学的活性を有さないかもしくは顕著に低下した生物学的活性を有するＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質に言及する非機能的ＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質をコードするか、またはＲＯＤ１タンパク質もＰＤＣＴタンパク質も全くコードしない。このような「変異ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子」（「完全ノックアウト」もしくは「ヌル」対立遺伝子ともいう）は、野生型ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子であり、これは、その核酸配列において１つ以上の変異を含み、それによって、上記変異は、好ましくは、インビボで上記細胞において、顕著に（絶対的にもしくは相対的に）減少した量の機能的ＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質を生じる。記ＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質のコード核酸配列の変異対立遺伝子は、本明細書において「ｒｏｄ１もしくはｐｄｃｔ」と称される。変異対立遺伝子は、天然において見いだされる（例えば、変異誘発因子のヒトによる適用なしに自然発生的に生成される）変異対立遺伝子である「天然変異」対立遺伝子、またはヒト介入によって（例えば、変異誘発によって）誘導される誘導型変異「対立遺伝子」のいずれかであり得る。
【００７２】
ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）の改変体は、本発明の局面のための有用性を有する。改変体は、天然に存在してもよいし、天然に存在しなくてもよい。天然に存在する改変体（例えば、多型）は、種々の種において見いだされ、配列番号３もしくは配列番号５において示されるアミノ酸配列に実質的に同一なアミノ酸配列を含む。上記タンパク質の種ホモログは、以下に記載されるように、他の種（例えば、マウス、サル、酵母、もしくは細菌）に由来するｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし、上記タンパク質のホモログをコードするｃＤＮＡを同定し、当該分野で公知であるように、上記ｃＤＮＡを発現させるに適したプローブもしくはプライマーを作製するために、本発明の部分ゲノムポリヌクレオチドを使用して得られ得る。オルソログが、本明細書で提供される。
【００７３】
天然に存在するタンパク質改変体と実質的に同じ生物学的活性を保持する（もしくは欠いている）天然に存在しない改変体はまた、本明細書で記載される。好ましくは、天然に存在する改変体もしくは天然に存在しない改変体は、配列番号３もしくは配列番号５において示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％より大きく同一であるアミノ酸配列を有する。より好ましくは、上記分子は、少なくとも９８％、９９％もしくは９９％より大きく同一である。％同一性は、当該分野で公知の任意の方法を使用して決定される。非限定的例は、ギャップオープンペナルティー１２およびギャップ伸長ペナルティー１でアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相動性検索アルゴリズムである。上記Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相動性検索アルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９，１９８１において教示されている。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸残基」とは、ペプチド結合におけるポリペプチドの化学的消化（加水分解）の際に形成されるアミノ酸をいう。本明細書で記載されるアミノ酸残基は、一般に、「Ｌ」異性形態にある。所望の機能的特性が上記ポリペプチドによって保持される限りにおいて、「Ｄ」異性形態にある残基は、任意のＬ−アミノ酸残基の代わりに使用され得る。ＮＨ２とは、ポリペプチドのアミノ末端において存在する遊離アミノ基をいう。ＣＯＯＨとは、ポリペプチドのカルボキシル末端において存在する遊離カルボキシ基をいう。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９）に記載されかつ米国特許法施行規則§§１．８２１〜１．８２２において採用された標準的ポリペプチド命名法に従って、アミノ酸残基についての略語を、表２に示す：
【００７５】
【表２−１】
2015109867.tif 000002
本明細書で式によって表される全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の従来の方向において、左から右への方向を有することに注意すべきである。さらに、語句「アミノ酸残基」とは、対応表に列挙されるアミノ酸および改変アミノ酸および通常でないアミノ酸（例えば、米国特許法施行規則§§１．８２１−１．８２２に言及されるもの）を含むと定義され、本明細書に参考として援用される。さらに、アミノ酸残基配列の最初もしくは最後のダッシュ（−）は、１もしくは数個のアミノ酸残基のさらなる配列もしくはアミノ末端基（例えば、ＮＨ２）もしくはカルボキシル末端基（例えば、ＣＯＯＨ）に対するペプチド結合を示すことに注意すべきである。
【００７６】
アミノ酸残基が、生物学的活性もしくは免疫学的活性を破壊することなく、置換され得るか、挿入され得るか、もしくは欠失され得ることを決定することにおけるガイダンスは、当該分野で周知のコンピュータープログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア）を使用して見いだされ得る。好ましくは、本明細書で開示されるタンパク質改変体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化（すなわち、同様に荷電したアミノ酸もしくは非荷電アミノ酸の置換）である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を包含する。天然に存在するアミノ酸は、一般に、４つのファミリーに分けられる：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、ときおり、まとめて芳香族アミノ酸として分類される。好ましくは、ブタホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）ポリペプチド改変体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化（すなわち、同様に荷電したもしくは非荷電のアミノ酸の置換）である。
【００７７】
ロイシンをイソロイシンもしくはバリンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、スレオニンをセリンで散発的に置換すること（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、またはあるアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸で類似置換（ｓｉｍｉｌａｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）することは、得られた改変体の生物学的特性に大きな影響を与えないことが合理的に予測される。ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）ポリペプチドタンパク質もしくはポリペプチド改変体の特性および機能は、配列番号３および配列番号５に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と同じタイプのものであるが、改変体の特性および機能は、程度が異なり得る。
【００７８】
本明細書で開示されるホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）ポリペプチドの改変体としては、グリコシル化形態、他の分子との凝集結合体、および関連しない化学的部分との共有結合体（例えば、ｐｅｇ化分子）が挙げられる。共有結合改変体は、当該分野で公知であるように、上記アミノ酸鎖において、またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基において見いだされる基に官能基を連結することによって、調製され得る。改変体としては、対立遺伝子改変体、種改変体、およびムテインも挙げられる。上記タンパク質の機能的活性に影響を及ぼすもしくは及ぼさない領域の短縮もしくは欠失もまた、改変体である。共有結合改変体は、当該分野で公知であるように、上記アミノ酸鎖において、またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基において見いだされる基に官能基を連結することによって、調製され得る。
【００７９】
変異体（いわゆる、ムテイン）の部分セットは、中性アミノ酸（例えば、セリン）が、ジスルフィド結合に関与しないシステイン残基の代わりに使用されるポリペプチドの群である。これら変異体は、ネイティブの分泌型タンパク質より広い温度範囲に対して安定であり得る（例えば、Ｍａｒｋら，米国特許第４，９５９，３１４号を参照のこと）。
【００８０】
本発明のホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）ポリペプチドのいくらかのアミノ酸配列は、上記タンパク質の構造にも機能にも顕著に影響を与えることなく、変動し得ることは、当該分野で認識されている。配列におけるこのような差異が企図される場合、活性を決定するタンパク質上の重要な領域が存在することを忘れないようにするべきである。一般に、三次元構造を形成する残基を置換することは可能であるが、ただし、類似の機能を発揮する残基が使用される。他の場合には、残基のタイプは、上記タンパク質の重要でない領域において変化が起こる場合には、完全に重要でないかもしれない。アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへのリガンド結合の選択性を変化させ得る（Ｏｓｔａｄｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：２６６−２６８，１９９３）。従って、本発明のホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）ポリペプチドは、天然の変異もしくはヒトによる操作のいずれかによって、１もしくは数個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を含み得る。
【００８１】
機能に必須である、本発明のホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）ポリペプチドにおけるアミノ酸は、当該分野で公知の方法（例えば、部位指向性変異誘発もしくはアラニンスキャニング変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））によって同定され得る。後者の手順は、分子中のあらゆる残基において単一のアラニン変異を導入する。得られた変異分子は、次いで、生物学的活性（例えば、天然もしくは合成の結合パートナーへの結合）について試験される。リガンド−レセプター結合に重要な部位はまた、構造分析（例えば、結晶化、核磁気共鳴法もしくは光親和性標識（Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ  Ｖｏｓら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２（１９９２））によって決定され得る。
【００８２】
示されるように、特定の局面における変化は、好ましくは、重要でない性質（例えば、上記タンパク質の折りたたみにも活性にも顕著には影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換）である。当然のことながら、当業者が行うアミノ酸置換の数は、多くの要因（上記のものが挙げられる）に依存する。他の実施形態は、非保存的置換を含む。概して、任意の所定のホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）ポリペプチドに対する置換の数は、５０個、４０個、３０個、２５個、２０個、１５個、１０個、５個もしくは３個より多くない。
【００８３】
（融合タンパク質）
ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）ポリペプチドのタンパク質もしくはポリペプチドフラグメントを含む融合タンパク質がまた、構築され得る。融合タンパク質は、アミノ酸配列に対する抗体を生成するために、ならびに種々の標的化システムおよびアッセイシステムにおける使用のために、有用である。例えば、融合タンパク質は、本発明のホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）ポリペプチドと相互作用するか、またはその生物学的機能を妨げるタンパク質を同定するために使用され得る。物理的方法（例えば、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、もしくはタンパク質間相互作用についてのライブラリーベースのアッセイ（例えば、酵母ツーハイブリッドもしくはファージディスプレーシステム））はまた、この目的で使用され得る。このような方法は、当該分野で周知であり、薬物スクリーニングとして使用され得る。シグナルタンパク質を含む融合タンパク質が、使用され得る。
【００８４】
融合タンパク質は、ペプチド結合によって一緒に融合される２つのタンパク質セグメントを含む。本発明の融合タンパク質において使用するためのアミノ酸配列は、配列番号３もしくは配列番号５に示されるアミノ酸配列を利用し得るか、または配列番号３もしくは配列番号５の生物学的に活性な改変体（例えば、上記のもの）から調製され得る。第１のタンパク質セグメントは、全長ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）ポリペプチドのものを含み得る。他の第１のタンパク質セグメントは、配列番号３および配列番号５のほぼ機能的タンパク質からなり得る。
【００８５】
第２のタンパク質セグメントは、全長タンパク質もしくはポリペプチドフラグメントであり得る。融合タンパク質構築において一般に使用されるタンパク質としては、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が挙げられる）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が挙げられる。さらに、エピトープタグは、融合タンパク質構築において使用され得る。これらとしては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。他の融合構築物としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ  ａ  ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン融合物、ならびにウイルスタンパク質融合物が挙げられ得る。
【００８６】
これら融合物は、例えば、２つのタンパク質セグメントを共有結合することによって、または分子生物学の分野における標準的な手順によって、作製され得る。組換えＤＮＡ法は、融合タンパク質を、例えば、配列番号３および配列番号５のタンパク質配列についてのコード領域を、当該分野で公知であるように、第２のタンパク質セグメントをコードしかつ宿主細胞においてＤＮＡ構築物を発現するヌクレオチドとともに、適切なリーディングフレームに含むＤＮＡ構築物を作製することによって調製するために使用され得る。融合タンパク質を構築するための多くのキットは、実験用具を研究室に供給する会社（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）、およびＱｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ；１−８８８−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）が挙げられる）から市販されている。
【００８７】
（変異ＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質をコードする核酸配列）
野生型核酸配列に対して１もしくは数個のヌクレオチド欠失、挿入もしくは置換を含む核酸配列は、このような核酸分子のフラグメントである場合、本発明の別の実施形態である。このような変異核酸配列（ＲＯＤ１配列もしくはＰＤＣＴ配列ともいう）は、以下でさらに記載されるように、種々の公知の方法を使用して、生成および／もしくは同定され得る。繰り返すと、このような核酸分子は、内因性形態および単離された形態の両方において提供される。一実施形態において、上記変異は、コードされたＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質のアミノ酸配列において１もしくは数個の変化（欠失、挿入、および／もしくは置換）を生じる（すなわち、「サイレント変異」ではない）。別の実施形態において、上記核酸配列における変異は、野生型タンパク質と比較して、上記コードされたＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質の顕著に低下したもしくは完全に破壊された生物学的活性を生じる。
【００８８】
上記核酸分子は、従って、以下のような１もしくは数個の変異を含み得る：
（ａ）「ミスセンス変異」。これは、あるアミノ酸を別のアミノ酸で置換することを生じる、上記核酸配列における変化である；
（ｂ）「ナンセンス変異」もしくは「終止コドン変異」。これは、早期の（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ）終止コドンの導入、従って、翻訳の終結を生じる（短縮型タンパク質を生じる）上記核酸配列における変化である；植物遺伝子は、翻訳終止コドン「ＴＧＡ」（ＲＮＡにおいてはＵＧＡ）、「ＴＡＡ」（ＲＮＡにおいてはＵＡＡ）および「ＴＡＧ」（ＲＮＡにおいてはＵＡＧ）を含み；従って、翻訳されている（リーディングフレーム中にある）成熟ｍＲＮＡにおいて存在するべきこれらコドンのうちの１つを生じる任意のヌクレオチド置換、挿入、欠失は、翻訳を終結する；
（ｃ）上記核酸のコード配列において付加された１もしくは数個のコドンに起因する、１もしくは数個のアミノ酸の「挿入変異」；
（ｄ）上記核酸のコード配列において欠失された１もしくは数個のコドンに起因する、１もしくは数個のアミノ酸の「欠失変異」；
（ｅ）上記変異の下流にある異なるフレームにおいて翻訳されている上記核酸配列を生じる「フレームシフト変異」。フレームシフト変異は、種々の原因（例えば、１もしくは数個のヌクレオチドの挿入、欠失もしくは重複）を有し得る。
【００８９】
上記核酸配列における変異は、好ましくは、インビボで顕著に低下した生物学的活性を含むかもしくは生物学的活性を含まない変異タンパク質を生じるか、またはタンパク質の生成を生じないことが望ましい。基本的には、野生型タンパク質に対して少なくとも１個のアミノ酸挿入、欠失および／もしくは置換を含むタンパク質を含むタンパク質を生じる任意の変異は、顕著に低下した生物学的活性をもたらし得るか、または生物学的活性をもたらさない。しかし、上記タンパク質の特定の部分における変異は、上記変異ＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質の低下した機能を生じる（例えば、変異は、短縮型タンパク質をもたらし、それによって、上記機能的ドメインのかなりの部分が、欠いている）可能性がより高いことが理解される。
【００９０】
従って、一実施形態において、上記に記載される変異のタイプのいずれかのうちの１つ以上を含む核酸配列が提供される。別の実施形態において、１もしくは数個の終止コドン（ナンセンス）変異、１もしくは数個のミスセンス変異および／または１もしくは数個のフレームシフト変異を含むＲＯＤ１配列もしくはＰＤＣＴ配列が、提供される。上記の変異核酸配列のうちのいずれかは、このような配列を内因的に含む植物および植物部分である場合、それ自体が（単離された形態において）提供される。本明細書中以下の表において、最も好ましいＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子が、記載される。
【００９１】
ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子におけるナンセンス変異は、本明細書で使用される場合、ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子における変異であり、それによって、１もしくは数個の翻訳終止コドンが、上記コードＤＮＡ、およびその対応する野生型ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子の対応するｍＲＮＡ配列に導入される。翻訳終止コドンは、ＴＧＡ（ｍＲＮＡにおいてはＵＧＡ）、ＴＡＡ（ＵＡＡ）およびＴＡＧ（ＵＡＧ）である。従って、上記コード配列中のインフレーム終止コドンの生成をもたらす任意の変異（欠失、挿入もしくは置換）は、上記アミノ酸鎖の翻訳の集結および短縮を生じる。一実施形態において、ナンセンス変異を含む変異ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子は、ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子であって、インフレームの終止コドンが、一ヌクレオチド置換（例えば、ＣＡＧからＴＡＧへ、ＴＧＧからＴＡＧへ、ＴＧＧからＴＧＡへ、もしくはＣＡＡからＴＡＡへの変異）によって上記ＲＯＤ１コドン配列もしくはＰＤＣＴコドン配列に導入される。別の実施形態において、ナンセンス変異を含む変異ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子は、ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子であり、ここでインフレーム終止コドンは、二重ヌクレオチド置換（例えば、ＣＡＧからＴＡＡ、ＴＧＧからＴＡＡ、またはＣＧＧからＴＡＧもしくはＴＧＡへの変異）によって、ＲＯＤ１コドン配列もしくはＰＤＣＴコドン配列において導入される。なお別の実施形態において、ナンセンス変異を含む変異ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子は、ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子であり、ここでインフレームの終止コドンは、三重ヌクレオチド置換（例えば、ＣＧＧからＴＡＡへの変異）によって、上記ＲＯＤ１コドン配列もしくはＰＤＣＴコドン配列に導入される。上記短縮型タンパク質は、上記変異の下流にあるコードＤＮＡによってコードされるアミノ酸（すなわち、上記ＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質のＣ末端部分）を欠いており、上記変異の上流にあるコードＤＮＡによってコードされるアミノ酸（すなわち、上記ＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質のＮ末端部分）を維持する。
【００９２】
本明細書中以下の表は、本明細書で提供されるＲＯＤ１配列もしくはＰＤＣＴ配列における考えられるナンセンス変異の範囲を記載する：
【００９３】
【表１ａ】
2015109867.tif 000003
【００９４】
【表２ｂ】
2015109867.tif 000004
明らかに、変異は、上記表に示されるものに限定されず、類似の終止変異が、配列表において示されるものおよび上記の表中で言及されるもの以外に、ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子に存在し得ることは、理解される。
【００９５】
ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子におけるミスセンス変異は、本明細書で使用される場合、ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子における任意の変異（欠失、挿入もしくは置換）であり、これによって、１もしくは数個のコドンは、上記コードＤＮＡ、およびその対応する野生型のＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子の対応するｍＲＮＡ配列において変更され、野生型のＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質における１もしくは数個のアミノ酸を、上記変異のＲＯＤ１タンパク質もしくはＰＤＣＴタンパク質における１もしくは数個の他のアミノ酸で置換することが生じる。
【００９６】
ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子におけるフレームシフト変異は、本明細書で使用される場合、上記核酸配列が上記変異の下流にある異なるフレームにおいて翻訳される、ＲＯＤ１対立遺伝子もしくはＰＤＣＴ対立遺伝子における変異（欠失、挿入、重複など）である、
（ＲＯＤ１の下流調節）
サイレンシングＲＮＡ分子（すなわち、翻訳される場合に、特定の遺伝子もしくは遺伝子群の発現を低下させるＲＮＡ分子）を生成するためにいくつかの方法が、当該分野で利用可能である（いわゆる、「センス」ＲＮＡ技術もしくは「アンチセンス」ＲＮＡ技術が挙げられる）。
【００９７】
アンチセンス技術。従って、一実施形態において、キメラ遺伝子をコードする阻害性ＲＮＡ分子は、いわゆるアンチセンス技術に基づく。言い換えると、上記キメラ遺伝子のコード領域は、上記ＲＯＤ１のヌクレオチド配列もしくはそのオルソログの相補体の少なくとも１９個もしくは２０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。このようなキメラ遺伝子は、ＲＯＤ１コード遺伝子もしくはそのオルソログから少なくとも１９個もしくは２０個のヌクレオチドを含むＤＮＡフラグメントを作動可能に連結することによって構築され得、本願の他の箇所に記載されるように、植物発現可能なプロモーター、ならびに転写集結およびポリアデニル化に関与する３’末端形成領域に対して逆の配向において、単離および同定され得る。
【００９８】
同時抑制技術（Ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。別の実施形態において、キメラ遺伝子をコードする上記阻害性ＲＮＡ分子は、いわゆる同時抑制技術に基づく。言い換えると、上記キメラ遺伝子のコード領域は、上記ＲＯＤ１コード遺伝子のヌクレオチド配列もしくはそのオルソログ（またはいくつかの実施形態においては、繊維選択的β−１，３エンドグルカナーゼ遺伝子）の少なくとも１９個もしくは２０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。このようなキメラ遺伝子は、上記ＲＯＤ１コード遺伝子もしくはそのオルソログから少なくとも１９個もしくは２０個のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を、植物発現可能なプロモーター、ならびに転写集結およびポリアデニル化に関与する３’末端形成領域に直接の配向において作動可能に連結することによって、構築され得る。
【００９９】
上記ＲＯＤ１コード遺伝子もしくはそのオルソログ（またはいくつかの実施形態においては、上記繊維選択的β−１，３エンドグルカナーゼ遺伝子）の発現を減少することにおける上記のキメラ遺伝子の効率は、異常型の非ポリアデニル化阻害性ＲＮＡ分子の発現を生じるか、または上記細胞の核において上記阻害性ＲＮＡ分子の保持を生じるＤＮＡエレメントの包含によって、さらに増強され得る。その目的に適した１つのこのようなＤＮＡエレメントは、ＷＯ  ００／０１１３３（その全体が、特に、自己スプライシングリボザイムに関する教示について、本明細書に参考として援用される）に記載されるように、自己スプライシングリボザイムをコードするＤＮＡ領域である。その目的に適した別のこのようなＤＮＡエレメントは、ＰＣＴ／ＡＵ０３／００２９２（ＷＯ０３／０７６６１９として公開（参考として援用される））に記載されるように、ＲＮＡ核局在化もしくは保持シグナルをコードするＤＮＡ領域である。
【０１００】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）もしくは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）。目的の遺伝子の発現を下方調節するための都合のよいかつ非常に効率的な方法は、例えば、ＷＯ９９／５３０５０（その全体が、特に、ＲＮＡｉに関する教示について、本明細書に参考として援用される）に記載されるように、いわゆる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）もしくは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を使用する。この技術において、ＲＮＡ分子は、植物細胞に導入され、それによって、上記ＲＮＡ分子は、少なくとも約１９〜約２１個のヌクレオチドにわたる二本鎖ＲＮＡ領域を形成し得、それによって、この二本鎖ＲＮＡ領域の鎖のうちの一方は、その標的遺伝子（「センス領域」）に対してヌクレオチド配列がほぼ同一であるのに対して、他方の鎖は、上記標的遺伝子のもしくは上記センス領域の相補体（「アンチセンス領域」）に対してヌクレオチド配列がほぼ同一である。上記標的遺伝子発現のサイレンシングについては、上記１９個の連続するヌクレオチド配列のヌクレオチド配列は、１つのミスマッチを有していてもよいし、上記センス領域およびアンチセンス領域が、１ヌクレオチド異なっていてもよいことが予期される。このようなＲＮＡ分子もしくは上記コードキメラ遺伝子の構築を達成するために、ＷＯ  ０２／０５９２９４に記載されるように、上記ベクターが利用され得る。
【０１０１】
従って、本発明の一実施形態において、種子油において脂肪酸不飽和化を調節するための方法が提供され、上記方法は、キメラ遺伝子を上記植物の細胞に導入する工程を包含し、ここで上記キメラ遺伝子は、以下の細動可能に連結されたＤＮＡエレメント：
（ａ）植物発現可能なプロモーター；
（ｂ）転写されるＤＮＡ領域であって、上記ＤＮＡ領域は、転写される場合に、ＲＯＤ１もしくはそのオルソログの発現を特異的に低下させ選る二本鎖ＲＮＡ分子を生じ、上記ＲＮＡ分子は、第１のＲＮＡ領域および第２のＲＮＡ領域を含み、ここで
（ｉ）上記第１のＲＮＡ領域は、上記ＲＯＤ１のヌクレオチド配列もしくはそのオルソログに対して少なくとも約９４％の配列同一性を有する少なくとも１９個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み；
（ｉｉ）上記第２のＲＮＡ領域は、上記第１のＲＮＡ領域の少なくとも１９個の連続するヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含み；
（ｉｉｉ）上記第１のおよび第２のＲＮＡ領域は、塩基対合して、上記第１のおよび第２の領域の少なくとも上記１９個の連続するヌクレオチドの間で二本鎖ＲＮＡ分子を形成し得；ならびに
（ｃ）上記植物の細胞において機能する転写終結およびポリアデニル化シグナルを含む３’末端領域
を含む。
【０１０２】
上記第１のもしくは第２のＲＮＡ領域（センス領域もしくはアンチセンス領域）の長さは、約１９ヌクレオチド（ｎｔ）から最大でカロース除去に関与する内因性遺伝子の長さ（ヌクレオチド単位）に等しい長さまで変動し得る。従って、上記センスヌクレオチドもしくはアンチセンスヌクレオチド配列の全長は、少なくとも少なくとも２５ｎｔ、もしくは少なくとも約５０ｎｔ、もしくは少なくとも約１００ｎｔ、もしくは少なくとも約１５０ｎｔ、もしくは少なくとも約２００ｎｔ、もしくは少なくとも約５００ｎｔであり得る。上記センスヌクレオチド配列もしくは上記アンチセンスヌクレオチド配列の全長まで上限は存在しないことが予期される。しかし、実際の理由（例えば、上記キメラ遺伝子の安定性）では、上記センスヌクレオチド配列もしくはアンチセンスヌクレオチド配列の全長は、５０００ｎｔを超えないべきであり、特に、２５００ｎｔを超えるべきではなく、約１０００ｎｔにまで制限され得ることが予期される。
【０１０３】
上記センス領域もしくはアンチセンス領域の全長が長くなるほど、これら領域、およびその対応するＲＯＤ１遺伝子における配列およびそれらのオルソログもしくは相補体の間の配列同一性についての要件があまり厳しくなくなることが認識される。好ましくは、目的の核酸は、その対応する標的配列と少なくとも約７５％の配列同一性を有するべきであり、具体的に、少なくとも約８０％、より具体的に、少なくとも約８５％、極めて具体的に約９０％、特別に、約９５％、より特別に、約１００％、極めて特別に、上記標的配列の対応する部分もしくはその相補体に対して同一であるべきである。しかし、目的の核酸は、常に、上記標的核酸の対応する部分に対して１００％の配列同一性を有する約１９個の連続するヌクレオチド、具体的に、約２５ｎｔ、より具体的には、約５０ｎｔ、特別に、約１００ｎｔ、極めて特別に、約１５０ｎｔの配列を含むことは好ましい。好ましくは、配列同一性を計算し、対応するセンス配列もしくはアンチセンス配列を設計するために、ギャップ数は、最小化されるべきであり、特により短いセンス配列に関しては最小化されるべきである。
【０１０４】
本発明に従うキメラ遺伝子をコードするｄｓＲＮＡは、ＷＯ  ９９／５３０５０（本明細書に参考として援用される）の開示に従って、例えば、上記センスＲＮＡ領域とアンチセンスＲＮＡ領域との間のスペーサー配列中に位置するイントロン（例えば、異種イントロン）を含み得る。
【０１０５】
合成マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）。植物細胞における特定の遺伝子の発現を下方調節するための合成マイクロＲＮＡの使用は、上記標的遺伝子の非常に高い配列特異性を提供し、従って、発現が下方調節されるべき標的遺伝子として密接に関連する対立遺伝子間を便利に区別することを可能にする。
【０１０６】
従って、本発明の別の実施形態において、上記生物学的に活性なＲＮＡもしくはサイレンシングＲＮＡもしくは阻害性ＲＮＡ分子は、植物細胞において上記切断可能なＲＯＤ１コード遺伝子もしくはそのオルソログを標的とし、かつもたらすように設計され、合成され、そして／または調整されるマイクロＲＮＡ分子であり得る。種々の方法が、特定の標的遺伝子に関するｍｉＲＮＡを生成し、使用することについて記載されてきた（Ｓｃｈｗａｂら（２００６，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１８（５）：１１２１−１１３３）、ＷＯ２００６／０４４３２２、ＷＯ２００５／０４７５０５、ＥＰ  ０６００９８３６（全てそれらの全体が、特に、ｍｉＲＮＡに関するそれぞれの教示に関して、本明細書に参考として援用される）が挙げられるが、これらに限定されない）。通常は、既存のｍｉＲＮＡ足場が、生成されるｍｉＲＮＡがそこでＲＩＳＣ複合体を指揮して、上記標的核酸から転写された上記ＲＮＡ分子を切断するように、上記標的遺伝子認識部分において改変される。ｍｉＲＮＡ足場は、上記ｍｉＲＮＡがそこで上記ＲＯＤ１コードヌクレオチド配列もしくはそのオルソログ（例えば、配列表に表される配列）の２１個の連続するヌクレオチドを含むように改変もしくは合成され得、このことは、本明細書中以下で記載される規則に従ってミスマッチを許容する。
【０１０７】
従って、一実施形態において、本発明は、種子油における脂肪酸不飽和化の調節のための方法を提供し、上記方法は、
ａ．脂肪種子をつける植物の細胞にキメラ遺伝子を導入する工程を包含し、
上記キメラ遺伝子は、以下の作動可能に連結されたＤＮＡ領域：
ｉ．植物発現可能なプロモーター；
ｉｉ．植物細胞における導入および転写の際に、ｍｉＲＮＡへとプロセシングされ、それによって、上記ｍｉＲＮＡは、上記植物のＲＯＤ１コード遺伝子もしくはそのオルソログのｍＲＮＡの切断を認識しかつ指揮し得る、ＤＮＡ領域；ならびに
ｉｉｉ．必要に応じて、転写終結およびポリアデニル化に関与する３’ＤＮＡ領域
を含む。
【０１０８】
ｍｉＲＮＡへとプロセシングされる上記のＤＮＡ領域は、ａＲＯＤ１コード遺伝子もしくはそのオルソログの少なくとも２１個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して本質的に相補的なヌクレオチド配列を含み得るが、ただし、以下のミスマッチのうちの１つ以上が、許容される：
ａ．上記ｍｉＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチドと、上記ＲＮＡ分子中の対応するヌクレオチド配列との間のミスマッチ；
ｂ．上記ｍｉＲＮＡの１位〜９位のヌクレオチドのうちのいずれか１つと、上記ＲＮＡ分子中の対応するヌクレオチド配列との間のミスマッチ、および／または
ｃ．上記ｍｉＲＮＡの１２位から２１位のヌクレオチドのうちのいずれか１つと、上記ＲＮＡ分子中の対応するヌクレオチド配列との間の３つのミスマッチ（ただし、２個より多い連続するミスマッチは存在しない）。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ」は、ＲＩＳＣ複合体へと添加され得、別のＲＮＡ分子の切断を指揮し得る約２０〜２２個のヌクレオチド長のＲＮＡ分子であり、ここで他のＲＮＡ分子は、上記ｍｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列に本質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、それによって、以下のミスマッチのうちの１つ以上が、起こり得る：
ｄ．上記ｍｉＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチドと、上記標的ＲＮＡ分子中の対応するヌクレオチド配列との間のミスマッチ；
ｅ．上記ｍｉＲＮＡの１位から９位におけるヌクレオチドのうちのいずれか１つと、上記標的ＲＮＡ分子中の対応するヌクレオチド配列との間のミスマッチ；
ｆ．上記ｍｉＲＮＡの１２位から２１位におけるヌクレオチドのうちのいずれか１つと、上記標的ＲＮＡ分子中の対応するヌクレオチド配列との間の３つのミスマッチ（ただし、２個より多い連続するミスマッチは存在しない）；ならびに／または
ｇ．上記ｍｉＲＮＡの１０位および１１位においては、ミスマッチは許容されない（全てのｍｉＲＮＡ位置は、上記ｍｉＲＮＡ分子の５’末端から始まって示される）。
【０１１０】
ｍｉＲＮＡは、任意の植物細胞に存在し、ＲＩＳＣ複合体（ここでこれは、上記標的ＲＮＡ分子の切断を指揮し得る）上に添加されるタンパク質（例えば、ダイサー様（ＤＣＬ）タンパク質）によって「プレｍｉＲＮＡ」分子からプロセシングされる。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「プレｍｉＲＮＡ」分子は、約１００〜約２００ヌクレオチド、好ましくは、約１００〜約１３０ヌクレオチドのＲＮＡ分子であり、これは、二本鎖ＲＮＡステムおよび一本鎖ＲＮＡループを含みかつ上記二本鎖ＲＮＡステム中に上記ｍｉＲＮＡ（およびその相補配列）のヌクレオチド配列をさらに含む二次構造をとり得る。好ましくは、上記ｍｉＲＮＡおよびその相補体は、上記ｍｉＲＮＡ二本鎖ＲＮＡステムの遊離末端から約１０〜約２０ヌクレオチドに位置する。一本鎖ループ領域の長さおよび配列は重要ではなく、例えば、３０〜５０ｎｔ長の間でかなり変動し得る。好ましくは、非対合ＲＮＡ構造と対合ＲＮＡ構造との間の自由エネルギーの差異は、−２０〜−６０ｋｃａｌ／モルの間であり、特に、約−４０ｋｃａｌ／モルである。上記ｍｉＲＮＡと、上記ｍｉＲＮＡ＊との間の相補性は、完全である必要はなく、非対合ヌクレオチドの約１〜３個の隆起は、許容され得る。ＲＮＡ分子がとる二次構造は、ｍＦＯＬＤのような、当該分野で従来からあるコンピューターアルゴリズムによって推定され得る。ＤＣＬ活性によって放出されかつ上記ＲＩＳＣ複合体に添加される上記プレｍｉＲＮＡに由来する上記二本鎖ＲＮＡステムの特定の鎖は、５’末端における相補性の程度によって決定され、それによって、その５’末端において、上記切断されたｄｓＲＮＡステムの異なる鎖のヌクレオチド間での水素結合に最小に関与する鎖は、上記ＲＩＳＣ複合体に添加され、上記標的ＲＮＡ分子分解の配列特異性を決定する。しかし、経験的に、特定の合成プレｍｉＲＮＡ分子からのｍｉＲＮＡ分子が、機能的でない場合（なぜなら、「間違っている」鎖が上記ＲＩＳＣ複合体に添加されるから）、この問題が、上記プレｍｉＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡステムのそれぞれの鎖上の上記ｍｉＲＮＡ分子およびその相補体の位置を交換することによって解決され得ることがすぐに明らかである。当該分野で公知であるように、２つの水素結合を必要とするＡとＵとの間の結合、もしくは２つの水素結合を必要とするＧとＵとの間の結合は、３つの水素結合を必要とするＧとＣとの間より強くない。
【０１１２】
天然に存在するｍｉＲＮＡ分子は、それらの天然に存在するプレｍｉＲＮＡ分子内で構成され得るが、これらはまた、目的の別のｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列に対するこのような既存のプレｍｉＲＮＡ分子から通常にプロセシングされるｍｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を交換することによって、既存のプレｍｉＲＮＡ分子足場へ導入され得る。上記プレｍｉＲＮＡの足場はまた、完全に合成であり得る。同様に、合成ｍｉＲＮＡ分子は、既存のプレｍｉＲＮＡ分子足場もしくは合成プレｍｉＲＮＡ足場内で構成され得、そしてこれらからプロセシングされ得る。
【０１１３】
上記プレｍｉＲＮＡ分子（および結論として、同様に上記ｍｉＲＮＡ分子）は、植物細胞に、転写される場合に上記プレｍｉＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域に作動可能に連結された植物発現可能なプロモーターを含む遺伝子を提供することによって、上記植物細胞に都合よく導入され得る。上記植物発現可能なプロモーターは、上記プレｍｉＲＮＡ分子と天然に関連したプロモーターであってもよいし、異種プロモーターであってもよい。
【実施例】
【０１１４】
（実施例１）
（材料および方法）
植物材料。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｃｏｌ−０バックグラウンドにおける変異系統ｒｏｄ１を、ガスクロマトグラフィー（１）によって種子サンプルの脂肪酸組成を直接分析することによって、メタンスルホン酸エチルで変異誘発した後に約３，０００の植物のＭ３集団から単離した。植物を、連続蛍光灯照明（１５０μｍｏｌ量子／ｍ２／ｓ）下で２２℃において制御された環境チャンバーにおいて、土壌で生長させた。
【０１１５】
脂肪酸および脂質分析。種子および他の組織の全体的な脂肪酸組成を、記載されるように（２）決定した。パルスチェイス標識を、開花９日後の長角果から採取した発生中の種子において行った。上記種子を、［１−１４Ｃ］グリセロールもしくは［１−１４Ｃ］アセテートで１５分間にわたって適用した。標識後、上記組織に、非標識アセテートもしくは非標識グリセロールを追加した（ｃｈａｓｅｄ）。異なる時間間隔で、全脂質を抽出し、シリカ−ＴＬＣにおいて分析し、ＰＣ、ＤＧおよびＴＧにおける放射活性を、記載されるように（３）、シンチレーションカウンターで計測することによって決定した。
【０１１６】
ＲＯＤ１の遺伝的分析およびマップベースのクローニング。上記ｒｏｄ１変異の遺伝的ベースを決定するために、ｒｏｄ１植物をＣｏｌ−Ｏ野生型（ＷＴ）に交配した。Ｆ１種子は、上記ＷＴ親に類似の脂肪酸プロフィールを示した。Ｆ１植物を生長させ、自家受粉させた。分析した２６３個のＦ２植物のうち、６９個が、元のｒｏｄ１種子に類似の種子脂肪酸プロフィールを有した一方で、残りの１９４個は、ＷＴに類似の脂肪酸組成を有した。この分離パターンは、仮定した３：１比に良好に適合している（χ２＝０．２１，ｐ＞０．０５）。
【０１１７】
上記ｒｏｄ１遺伝子座を、ｒｏｄ１変異体と、Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ  ｅｒｅｃｔａ  ＷＴとの間の交配から得られた８００個のＦ２植物を使用して、マップベースのクローニングによって同定した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムにおいて均一に分布する（４）２０個の単純配列長多型（ＳＳＬＰ）マーカーのセットのバルク分離分析（ｂｕｌｋ  ｓｅｇｒｅｇａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）による初期スクリーニングは、第３染色体におけるマーカーＮＧＡ１６２へのｒｏｄ１の連鎖を生じた（図２Ｄ）。上記ｒｏｄ１遺伝子座を詳細にマップするために、１９６個の個々のＦ２植物を同定したところ、これらは、種子脂肪酸組成において増大した１８：１によって示されるｒｏｄ１遺伝子座においてホモ接合性であった。ＮＧＡ１６２の市販の多型ＳＳＬＰマーカー近接を使用した分離分析は、上記ｒｏｄ１変異を、ＮＧＡ１６２とＮＴ２０４との間の間隔に定めた。次いで、より多くの多型マーカーを、ＰＣＲプライマーを使用して設計し、その後、上記ｒｏｄ１遺伝子座を、ＢＡＣクローンであるＭＪＫ１３、ＭＱＤ１７およびＭＳＪ１１によって網羅される第３染色体の領域中に位置づけた。（図２Ｄ）．
この領域内で、８個の遺伝子を、脂質代謝において公知もしくは考えられる機能を有するタンパク質をコードすると注釈をつけた。刊行された情報（５，６）を熟考した後に、出願人は、ＰＣＲによって、上記遺伝子（Ａｔ３ｇ１５８２０を含む）のうちの６個に対応するｒｏｄ１ゲノムＤＮＡを増幅した。Ｇ→Ａ転位をこの遺伝子において同定し、これのことは、Ｔｒｐ７６から終止コドンへ変化すると推定される。残りの５つの遺伝子は、ＷＴからの変化はないことが示された。
【０１１８】
Ａｔ３ｇ１５８２０を上記ＲＯＤ１遺伝子座として確認するために、Ａｔ３ｇ１５８２０遺伝子を含む３，９６１ｂｐのＰＣＲフラグメントを、Ｃｏｌ−Ｏ  ＷＴ植物から抽出したゲノムＤＮＡを使用して増幅した。このゲノムフラグメントを、ＡｆｌＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位においてバイナリーベクターｐＧａｔｅ−Ｐｈａｓ−ＤｓＲｅｄにクローニングし（２）、次いで、上記ｒｏｄ１変異植物の形質転換のために、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）に移入した。形質転換体を、ＤｓＲｅｄ発現（７）に基づいて選択した。１０個の赤色トランスジェニック種子および３個の褐色非トランスジェニック種子の個々の種子から得られた脂肪アシルメチルエステルを使用して、ガスクロマトグラフィーを使用して、種子脂肪酸組成を決定した。
【０１１９】
ＲＯＤ１酵素活性アッセイ。上記ＲＯＤ１オープンリーディングフレームを、ＰＣＲによって増幅し、グリセルアルデヒド−ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーターの制御下で、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のために、ｐ４２４ＧＰＤ酵母発現ベクター（８）にクローニングした。得られた構築物ｐ４２４ＲＯＤ１および空のｐ４２４ＧＰＤベクターを、Ｃ．ＭｃＭａｓｔｅｒ博士（Ｄａｌｈｏｕｓｉｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＮＳ，Ｃａｎａｄａ）によって供与されたＨＪ０９１（ｃｐｔ１：：ＬＥＵ２，ｅｐｔ１−）の細胞に別個に形質転換した。ＲＯＤ１転写物の発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって確認した（図７）。
【０１２０】
酵母細胞を、一晩培養物に接種し、ウラシルおよびトリプトファンを欠いている２％グルコースを補充した液体合成最小培地（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）中、３０℃において回転振盪させることによって、対数期中期まで増殖させた（ＯＤ６００＝０．５〜１．５）。ミクロソームを調製するために、酵母細胞を、１０分間、１，０００ｇにおいて遠心分離することによって回収した。その細胞ペレットを滅菌水で１回洗浄し、氷冷ＧＴＥ緩衝液（２０％  グリセロール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁して、記載されるように（９）、ガラスビーズを使用して、膜画分を調製した。ＣＤＰ−コリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）アッセイ（図９Ａにおける反応）を、０．１μｍｏｌ  ジオレインおよび１ｎｍｏｌ  ［１４Ｃ］ＣＤＰ−コリンを基質として使用して、記載されるように（９）行った。
【０１２１】
ｐ４２４ＧＰＤ（モック）もしくはｐ４２４ＲＯＤ１で形質転換したＨＪ０９１細胞の膜調製物中の上記ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）活性を、［１４Ｃ−グリセロール］ジオレイン（反応Ａ）もしくは［１４Ｃ−コリン］ジミルスチル−ホスファチジルコリン（反応Ｂ）から生成した［１４Ｃ］ジオレオイル−ＰＣの量として決定した。１．８ｎｍｏｌ（２００，０００ｃｐｍ）  ［１４Ｃ−グリセロール］ジオレイン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および０．１μｍｏｌ  ジオレオイル−ＰＣ（反応Ａ）もしくは０．１μｍｏｌ  ジオレイン、ならびに１ｎｍｏｌ  ［１４Ｃ−コリン］ジ−１４：０−ＰＣおよび０．１μｍｏｌ  ジオレオイル−ＰＣ（反応Ｂ）の基質を、窒素ガス下で乾燥させ、超音波処理バスの助けを借りて（９）、５０μｌ  ４×反応緩衝液（最終濃度：５０ｍＭ  ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中に再懸濁した。反応（２００μｌ）を、上記ＧＴＥ緩衝液中に懸濁した２０〜２５０μｇのミクロソームタンパク質を添加することによって開始した。別段示されなければ、アッセイ系を、１５℃において１５分間にわたってインキュベートし、３ｍｌのクロロホルム／エタノール（２：１，ｖ／ｖ）を添加し、続いて、１．５ｍｌの０．９％  ＫＣｌを添加することによって終了させた。チューブを、ボルテックスすることによって混合し、相分離を、２０００ｇにおいて２分間の遠心分離によって促進した。その水相を吸引し、その有機相を、１．５ｍｌの４０％（ｖ／ｖ）  エタノールで２回洗浄した。サンプルを、クロロホルム／メタノール／水（６５：２５：４，容積単位）の溶媒系中でシリカゲル相上のＴＬＣによって分析し、続いて、燐光撮像機（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）分析もしくはラジオオートグラフィーによって分析した。対応するバンドを掻き取り、放射活性を、シンチレーションカウンターで係数することによって決定した。
【０１２２】
ＲＯＤ１およびＡｔ３ｇ１５８３０の発現。ＲＯＤ１（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘａｒｒａｙｅｌｅｍｅｎｔ２５８２４９＿ｓ＿ａｔ）データベースに関する発現データを、図８に示す。同じアレイエレメントはまた、第２の遺伝子Ａｔ３ｇ１５８３０の転写物を検出するが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＭＰＳＳ）データベース（ｍｐｓｓ．ｕｄｅｌ．ｅｄｕ／ａｔ／）からのデータは、この第２の遺伝子が、花組織において発現されるに過ぎないことを示す（データは示さず）。これらデータを確認するために、出願人は、ＷＴ植物の発芽中の実生、ロゼット葉、花および緑色の長角果、ならびにＲｏｄ１変異植物の緑色の長角果からＲＮＡを調製した。ＲＯＤ１およびＡｔ３ｇ１５８３０に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、製造業者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に従って、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  １工程システムを使用して、上記ＲＮＡサンプルの各々に対して逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。図７に示される結果は、Ａｔ３ｇ１５８３０の発現が花に制限されること、およびこの遺伝子の転写物がＷＴ植物もしくはｒｏｄ１植物のいずれかの発生中の長角果中で検出できなかったことを示す。Ａｔ３ｇ１５８３０がまた、ＰＤＣＴ活性を有したか否かを試験するために、ｃＤＮＡを、上記に記載されるように、ｐ４２４ＧＰＤベクターにクローニングした。次いで、得られた構築物ｐ４２４−Ａｔ３ｇ１５８３０をＨＪ０９１に形質転換し、その発現をＲＴ−ＰＣＲによって確認した（図７，レーン１６）。ＲＯＤ１に対して同じ反応条件を使用するＰＤＣＴアッセイは、放射標識したＰＣを生じなかった。このことは、上記Ａｔ３ｇ１５８３０タンパク質が、ＰＤＣＴ活性を有さないことを示す（データは示さず）。
【０１２３】
系統発生分析。節約ブートストラップツリー（ｐａｒｓｉｍｏｎｙ  ｂｏｏｔｓｔｒａｐ  ｔｒｅｅ）（１０）を生成するための方法は、全体的最適条件（ｇｌｏｂａｌ  ｏｐｔｉｍａ）の検出もしくは節約最適性基準（ｐａｒｓｉｍｏｎｙ  ｏｐｔｉｍａｌｉｔｙ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）の最大化（ｍａｘｍｉｍｉｚａｔｉｏｎ）を最大化するために、樹形二分割再結合法（ｔｒｅｅ  ｂｉｓｅｃｔｉｏｎ  ｒｅｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）、最急降下法（ｓｔｅｅｐｅｓｔ  ｄｅｃｅｎｔ）、および他の設定を使用して各々分析した、１０００ブートストラップ複製データセット（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅ
ｄａｔａ  ｓｅｔ）を含んだ。
【０１２４】
ベイズの合意樹を生成するための方法（１１）は、自己相関したパラメーター推定を回避するために、尤度定常性（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｉｔｙ）において１０，０００世代ごとにサンプリングすると同時に、１，０００，０００世代（２つの別個の実施が、第２のパラメーターサンプルが作製される前に収束するのに十分である）に対して、最も複雑なＷＡＧ＋Ｆ＋Ｉ＋Ｇアミノ酸置換モデルのための事前の設定および２つのマルコフ連鎖を各々実施させることを含めた。
【０１２５】
この実施例１に関して引用されかつ本明細書に参考として援用される参考文献：
【０１２６】
【数１−１】
2015109867.tif 000005
実施例２
（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異ｒｏｄ１は、種子における多価不飽和脂肪酸の顕著な減少を有することを示した）
表１Ａおよび表１Ｂは、ＤＨ４の上記Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異ｒｏｄ１が、種子において多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の顕著な低下を有することを示す。上記ｒｏｄ１変異体の種子脂肪酸組成は、野生型（ＷＴ）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのｆａｄ２変異体のもとのとは異なっている。上記ｆａｄ２変異体（５，７）と比較すると、上記ＤＨ４における脂肪酸組成変化は、種子油に制限される。
【０１２７】
【表１】
2015109867.tif 000006
表１Ａおよび表１Ｂに示されるように、種子の脂質合成に対するｒｏｄ１効果をさらに特徴付けるために、グリセロ脂質の異なるクラスの脂肪酸組成を、成熟種子（表１Ａ）および開花の９日後における発生中の種子（表１Ｂ）（脂肪酸合成に関するピーク段階）において分析した。野生型と比較すると、上記Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのｒｏｄ１変異体の種子油は、多価不飽和脂肪酸において顕著な減少を有するが、葉部組織もしくは根部組織の脂肪酸組成に対する効果は全くない。上記Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのｒｏｄ１変異体は、ＤＡＧおよびＴＡＧの両方において増大したレベルの１８：１を有するが、低下した量の１８：２および１８：３を示した（表１Ａおよび表１Ｂ）。しかし、ホスファチジルエタノールアミンにおける脂肪酸に関しては、ｒｏｄ１と野生型との間でほとんど差異は検出されなかった。興味深いことに、ｒｏｄ１および野生型の発生中の種子に由来する個々の脂質の分析から、上記ｒｏｄ１変異体が、野生型と比較して、ＰＣにおける１８：１および１８：２の両方のわずかに減少したレベル、および野生型と比較して、１８：３における増大を有することが明らかになった。従って、１８：２および１８：３の欠損は、発生中のｒｏｄ１脂質のＤＡＧおよびＴＡＧに限られた。これら知見は、ＰＣへの１８：１の低下した導入（ｔｒａｎｓｆｅｒ）と一致する。そしてこれら知見は、低下したオレイン酸不飽和が不飽和活性によって、しかしジアシルグリセロール（ＤＡＧ）からのデノボ合成（８）またはアシル−ＣｏＡ：リゾ−ＰＣアシルトランスフェラーゼ交換（９）のいずれかを介して、ＰＣへの１８：１の低下した導入に起因して、引き起こされないことを示した。
【０１２８】
これら変化は、上記ｆａｄ２変異体（５，７）において観察されたものに類似であるが、上記ｆａｄ２変異体（５，７）において観察されたものより小さく、このことは、ｒｏｄ１がｆａｄ２の低形質（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ）対立遺伝子を代表した可能性を示す。ｆａｄ２における変異は、葉部および根部、ならびに種子におけるＰＵＦＡ合成を低下させるのに対して、脂肪酸組成における変化は、ｒｏｄ１植物の種子において認められるのみである（表１ＡおよびＢ、ならびに表１Ｃ）．
【０１２９】
【表１Ｃ】
2015109867.tif 000007
ｒｏｄ１とｆａｄ２との間の交配は、いずれの親のものよりもかなり高いＰＵＦＡレベルを有するＦ１種子を生じた。このことは、上記ｒｏｄ１変異が、ｆａｄ２とは異なる遺伝子座に存在することを確認する。これらおよびさらなる試験交配は、ｒｏｄ１が単一の劣性メンデル変異であることを示す。
【０１３０】
表１Ａ（成熟種子）に示されるように、ＤＨ４と上記ｆａｄ２変異体との間の遺伝的相補性試験から、ＤＨ４における上記変異遺伝子座ｒｏｄ１が、ｆａｄ２に対する対立遺伝子ではないことがさらに確認された。上記変異は（本明細書中以下の実施例４においてさらに詳細に議論されるように）、本発明の特定の局面によれば、酵母における異種発現を使用して、酵素活性アッセイによって決定される場合、新規なホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）を通常（野生型）コードする上記遺伝子座Ａｔ３ｇ１５８２０において起こった。出願人は、この変異対立遺伝子をｒｏｄ１（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｏｌｅａｔｅ  ｄｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  １）と称し、ｒｏｄ１は、標準的な遺伝的分析によって決定される場合（データは示さず）、単一劣性メンデル変異である。
【０１３１】
（実施例３）
（ＤＨ４の上記Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異ｒｏｄ１は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）からのデノボ合成を介して、ＰＣへの１８：１の低下した導入に起因して、種子油における低下したオレイン酸不飽和を有することを示した）
ｒｏｄ１植物の生長、発生および種子生産は、ＷＴから区別できなかった。成熟ｒｏｄ１種子の重量は、ＷＴとは区別できなかった（それぞれ、１７．７±０．２μｇ／種子および１７．９±０．１μｇ／種子（平均±標準誤差））。成熟ｒｏｄ１種子の油含有量は、ＷＴの４．６±０．１９μｇ／種子と比較して、４．９±０．３２μｇ／種子（平均±標準誤差）であった。そして脂質蓄積のタイミングは、２つの系統において類似で、受粉後７〜９日間後に最大であった（データは示さず）。種子から抽出されたグリセロ脂質の異なるクラスの脂肪酸組成を、最大トリグリセリド合成のこの段階の間に分析した。ＷＴと比較すると、上記ｒｏｄ１変異体は、ＴＧおよび中間前駆物質ジグリセリド（ＤＧ）の両方において実質的に低下したレベルのＰＵＦＡを有した（図１Ｅ〜１Ｈ）。しかし、驚くべきことに、ＰＣは、増大したＰＵＦＡを、ＷＴにおける１９．９％と比較して、総アシル基の３１．７％を占める、最も高度に不飽和化された脂肪酸である１８：３とともに含む。種子中で第２に量の豊富なリン脂質であるホスファチジルエタノールアミンは、ＴＧ合成において何ら主要な役割を果たしておらず、この脂質の脂肪酸組成は、ＷＴサンプルおよびｒｏｄ１サンプルにおいて類似であった。
【０１３２】
ＰＣは、１８：１を１８：２および１８：３のＰＵＦＡへ変換する上記ＦＡＤ２デサチュラーゼおよびＦＡＤ３デサチュラーゼに対する基質であるので、これらデータは、上記ｒｏｄ１変異は、不飽和のためにＰＣへの１８：１の導入を減少させる可能性を示した。脂肪種子におけるＴＧ合成の先行技術のモデルは、１８：１が、アシル−ＣｏＡ：リゾ−ＰＣアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）の作用、または１８：１−ＤＡＧに対するＣＤＰ−コリン：ＤＡＧコリンホスホトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）の作用のいずれかによって、ＰＣプールに入り得ることを提唱している。
【０１３３】
上記低下したオレイン酸不飽和が、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（８）からのデノボ合成、もしくは上記アシル−ＣｏＡ：リゾ−ＰＣアシルトランスフェラーゼ交換（９）のいずれかを介して、ＰＣへ１８：１の低下した導入に起因するか否かを区別するために、発生中の種子を、放射活性アセテート（脂肪酸を標識するため）（図１Ｃおよび図１Ｄ）、および放射活性グリセロール（脂質骨格を標識するため）（図１Ａおよび図１Ｂ）で標識した。グリセロール追加実験において、ＰＣは、野生型種子において最も多く標識された脂質（３０％）であり、追加している期間の間に比較的安定なままであった。類似の量の標識（２７％）はまた、適用の最後に、ＤＡＧに存在し、これは、追加過程の間に低下し、結論として、失われた標識は、ＴＡＧにおいて見いだされた（図１Ａ）。ｒｏｄ１種子において、標識のうちのわずか８％が、ＰＣにおいて検出されたが、ＤＡＧは、適用の最後には、全放射活性のうちの５１％を含んでいた。ｒｏｄ１種子中のＴＡＧに存在する標識は、野生型におけるものに類似のレベルであった。アセテート追加実験からも類似の結果を得た。これら結果は、アシル−ＣｏＡ：リゾ−ＰＣアシルトランスフェラーゼにおける障害（ｌｅｓｉｏｎ）は、ＰＣへのグリセロールのフラックスを制限するとは予測されないので、ｒｏｄ１種子が、ＤＡＧからのＰＣのデノボ合成を低下させたことを示す。
【０１３４】
図１Ａ〜１Ｄは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの発生中の種子における脂質合成を示す。［１４−Ｃ］標識グリセロールもしくは［１４−Ｃ］標識アセテートでの適用の１５分後に、追加を、１８０分間にわたって行った。ＰＣ、ＤＡＧおよびＴＡＧにおける放射活性を、０分、３０分、６０分および１８０分の時点で決定した。発生中の種子を、放射活性アセテート（脂肪酸を標識するため）（図１Ｃおよび図１Ｄ）および放射活性グリセロール（脂質骨格を標識するため）（図１Ａおよび１Ｂ）で標識した。
【０１３５】
（実施例４）
（ＤＨ４の上記Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異ｒｏｄ１の詳細なマッピングを行い、Ａｔ３ｇ１５８２０を、本明細書において上記ｒｏｄ１変異体の遺伝子座として同定し、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）であるだけでなく、貯蔵蓄積物のピーク段階に一致する種子発生の段階６において最高のレベルを有する発生中の種子において高度発現されているＰＤＣＴでもあることを初めて示した）
上記脂肪種子におけるデノボＰＣ合成は、上記ＣＤＰ−コリン：ＤＡＧコリンホスホトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）によって触媒されることが公知である。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノム（１０）においてＣＰＴについての２つの相同な遺伝子が存在する。従って、出願人は、ｒｏｄ１が、上記２つのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＣＤＰ−コリン：ＤＡＧコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子であるＡｔ１ｇ１３５６０（ＡＡＰＴ１）もしくはＡｔ３ｇ２５５８５（ＡＡＰＴ２）のうちの一方における変異であるようであったことを最初に（誤って）推定した。しかし、驚くべきことに、ｒｏｄ１についての出願人の最初のマッピングデータは、この遺伝子を、第３染色体上のＡＡＰＴ２の約２０ｃＭ北においていた。
【０１３６】
具体的には、上記２つのＣＰＴコード領域を網羅するゲノムＤＮＡを配列決定したが、上記ｒｏｄ１変異体におけるＣＰＴ遺伝子において配列変異は存在しなかった。この結果は、上記ｒｏｄ１におけるＣＰＴが正常に機能すること、および発生中の種子においてＰＣを合成するために別の機構が存在することを示した。従って、マップベースのクローニングアプローチを、ｒｏｄ１とＬａｎｄｓｂｅｒｇ  ｅｒｅｃｔａ野生型との間の交配から得られたＦ２植物を使用して、上記ｒｏｄ１遺伝子座を同定するために使用した（上記実施例１の「材料および方法」の「ＲＯＤ１の遺伝的分析およびマップベースのクローニング」を参照のこと）。このアプローチは、第３染色体上の遺伝子座Ａｔ３ｇ１５８２０における変異の同定を可能にした。Ａｔ３ｇ１５８２０の第１エキソンにおけるＧからＡへの一ヌクレオチド変化は、Ｔｒｐ７６から終止コドンへの変化を生じた（図２Ｃを参照のこと）。野生型核酸配列（配列番号２）と比較すると、この遺伝子コード配列のｒｏｄ１対立遺伝子核酸配列（配列番号４）は、推定オープンリーディングフレームの残基７６において終止コドンを作り出す変異を含む。
【０１３７】
ＲＯＤ１およびＡｔ３ｇ１５８２０の正体は、上記ｒｏｄ１変異体を、野生型の約４ｋｂゲノム配列（配列番号１）（Ａｔ３ｇ１５８２０コード領域およびその内因性プロモーターおよびターミネーター（野生型ＤＮＡの４ｋｂ  ゲノムフラグメント（Ａｔ３ｇ１５８２０のコード領域および５’隣接配列と３’隣接配列の合計２ｋｂを含む）を含む）で補完することによって、後に確認した（図２Ａ）。このＤＮＡフラグメントを、選択マーカーとしてＤｓＲｅｄを使用して（１１）、バイナリー植物形質転換ベクターにクローニングした。トランスジェニック種子を、ＤｓＲｅｄ発現によって同定し、それらの脂肪アシルメチルエステル（ＦＡＭＥ）を、ガスクロマトグラフィーによって分析し、同じ植物に由来する形質転換されていない種子のものと比較した。上記トランスジェニック種子の脂肪酸組成は、野生型のものにほぼ同一であり（図２Ｂ）、このことは、上記ｒｏｄ１変異が、実際に、上記Ａｔ３ｇ１５８２０遺伝子座に存在することを確認する。
【０１３８】
図２Ａ〜２Ｃは、上記ＲＯＤ１遺伝子が、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいてＡｔ３ｇ１５８２０として同定したことを示す。（Ａ）上記変異体における分子障害の位置を有する上記ＲＯＤ１遺伝子の構造。エキソン（太字の矢印）および非翻訳領域（ボックス）を示す約４Ｋｂ領域（配列番号１）を使用して、ｒｏｄ１における変異を補完した。（Ｂ）上記Ａｔ３ｇ１５８２０形質転換体の種子（薄い色の平行線付き）、およびＣｏｌ野生型（白）の脂肪酸組成の比較は、Ａｔ３ｇ１５８２０が上記ｒｏｄ１変異（黒）を完全に元に戻すことを示した。従ってこのことは、ＲＯＤ１の正体を確認する。（Ｃ）ＨＭＭＴＯＰによって推定された推定膜貫通領域（下線を付した）を示すように整えられたＡｔ３ｇ１５８２０の推定アミノ酸配列（配列番号３）。そのアスタリスクは、変異配列である配列番号４におけるＴｒｐ７６のコドンを終止コドンに変化させる位置（単一点変異；第１のエキソン配列においてＧからＡへ）に印をつける。上記推定脂質ホスフェートホスファターゼモチーフは、太字および斜体で示される。
【０１３９】
図４は、ＤＨ４における上記ＲＯＤ１変異短縮化アミノ酸配列（配列番号５）を示す。特定の局面によれば、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）変異（ｒｏｄ１）コード配列（配列番号４）は、ヌクレオチド位置２２８においてＧ＞Ａ変化を含む。このことは、７５アミノ酸の短縮型ＲＯＤ１変異配列（配列番号５）を提供するために上記ＰＤＣＴタンパク質の早期の終結を生じる。
【０１４０】
公に利用可能なマイクロアレイデータ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ．ｅｔｈｚ．ｃｈ／）（１２）を分析すると、貯蔵蓄積物のピーク段階に一致する種子発生の段階６において最高のレベルで、Ａｔ３ｇ１５８２０が発生中の種子において非常に発現されていることが示された。これは、上記ｒｏｄ１変異体における種子特異的な低下したオレイン酸不飽和化と一致している（表１）。さらなる局面によれば、Ａｔ３ｇ１５８２０に対して高い相動性を共有するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ中の唯一の遺伝子は、ちょうど１．２ｋｂ下流に位置するＡｔ３ｇ１５８３０である。しかし、Ａｔ３ｇ１５８３０は、花序において発現されるのみであり、出願人のＲＴ−ＰＣＲ結果から、Ａｔ３ｇ１５８３０が発生中の種子において発現されないこともまた、確認された。
【０１４１】
顕著なことには、Ａｔ３ｇ１５８２０は、推定２型ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ２）様タンパク質として注釈がつけられたが、出願人による分析では、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける公知の特徴付けられたＰＡＰ遺伝子（ＡｔＬＰＰ１、ＡｔＬＰＰ２およびＡｔＬＰＰ３）（１３，１４）に対して強い相動性を示さなかった。具体的には、ＲＯＤ１を、上記ＰＦＡＭデータベースに対して再チェックし、ＰＡＰ２ドメインの同定のためのＥ値（０．０１７）は、推奨されるカットオフを上回った。その配列マッチが不十分であるのみならず、１５個の最も保存された残基のうちの８個のみが、ＲＯＤ１に存在したが、そのアラインメントはまた、ＲＯＤ１が、モチーフ配列の中心において合計６１残基（１７６個のうちの）の欠失を有する（有する必要がある）ことを示した。上記Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムは、ＬＰＰ１（Ａｔ３ｇ０２６００）およびＬＰＰ２（Ａｔ１ｇ１５０８０）を含む、明らかに同定されたＰＡＰ２ドメイン（Ｅ値＜ｅ-４０）を有
する少なくとも４つの遺伝子を含む。上記ＬＰＰ１（Ａｔ３ｇ０２６００）およびＬＰＰ２（Ａｔ１ｇ１５０８０）は、ＰＡホスファターゼ活性を有することが示された。従って、出願人は、ＲＯＤ１がこれら真のＰＡＰ２オルソログに対して配列相動性を本質的に含まないことを決定子、よって、ＲＯＤ１が異なる機能をコードすると結論づけた。さらに、出願人により酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において発現される場合、ＲＯＤ１は、コントロール株より顕著に高いＰＡＰ活性は付与しない。これら結果は、ＲＯＤ１がＰＡホスファターゼ活性を有する可能性がないことを示した。
【０１４２】
位置特異的反復ＢＬＡＳＴ（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを使用し、３回目の反復は、非植物タンパク質であるホスファチジルコリン：セラミドコリンホスホトランスフェラーゼ（哺乳動物のホスファチジルコリン：セラミドコリンホスホトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．７．８．２７））を同定し、上記ホスファチジルコリン：セラミドコリンホスホトランスフェラーゼは、脂質ホスフェートホスファターゼ（ＬＰＰ）の大きなファミリーに属する。この酵素（スフィンゴミエリンシンターゼともいわれる（１５））は、ホスホコリンヘッド基の、ＰＣからセラミドのアルコール基への導入を触媒する。出願人は、スフィンゴ脂質の構造および代謝において、セラミドが、グリセロ脂質に関してＤＡＧに類似の役割を有すると認識した。ＲＯＤ１は、プログラムＨＭＭＴＯＰ（１６）によれば、５個の推定膜貫通ドメインを含む膜結合型タンパク質であり、その配列は、ＬＰＰモチーフを含む（図２Ｃ）。これら結果は、ＲＯＤ１が、植物においてホスホコリンヘッド基を、ＰＣからＤＡＧへ導入する（動物におけるＰＣとセラミドとの反応に類似）ことができることを出願人に示唆した。従って、出願人は、この推定される新たな酵素を、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）と称した。
【０１４３】
系統発生分析は、ＬＰＴファミリー内のＳＭＳ１タンパク質およびＳＭＳ２タンパク質に密接な関係にＲＯＤ１を定め（図５）、トポロジー推定プログラムは、ＲＯＤ１を、他のＬＰＴタンパク質に関する推定に類似して、最大６個までの推定膜貫通ドメインを有する組み込み膜タンパク質として同定する。さらに、ＳＭＳ１、ＳＭＳ２および他のＬＰＴタンパク質のＣ２ドメインおよびＣ３ドメインにおける５個の非常に保存された残基は、上記ＲＯＤ１タンパク質において匹敵する位置において同定される（図２Ｃ、および図５）。植物は、スフィンゴミエリンを含まないが、セラミドの構造は、ＤＧの構造に類似であるので、出願人は、動物においてＳＭＳによって媒介されるものに類似の反応において、ＲＯＤ１が、ＰＣからＤＧへのホスホコリンの導入を触媒する可能性を考えた。生化学的変換の後に、出願人は、この推定酵素を、ＩＵＰＡＣサブクラスＥＣ  ２．７．８におけるホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）と称する。
【０１４４】
ＰＤＣＴ活性についてのＲＯＤ１の試験。ＣＤＰ−コリン：ＤＡＧコリンホスホトランスフェラーゼは、ＰＣの最初の合成を担い、この反応がインビトロで容易に可逆性であるという観察は、発生中の脂肪種子において起こるＰＣツールとＤＡＧツールとの間で迅速な平衡を説明するために引き合いに出された。しかし、実験的に（膜調製物を使用する標識研究もしくはアッセイにおいて）、ＣＤＰ−コリン：ＤＡＧコリンホスホトランスフェラーゼの二重作用（以下の反応スキーム１）とＰＣ：ＤＡＧコリンホスホトランスフェラーゼによって触媒される単一工程反応（以下の反応スキーム２）との間で区別することは困難である。反応スキーム２は、単純かつＰＣとセラミドとの反応に類似であるが、出願人が知る限りでは、おそらく、反応スキーム２を反応スキーム１から区別することの困難性に主に起因して、任意の生物においてこれまで記載されてこなかった。にも関わらず、類似の導入反応が公知である。
【０１４５】
【化１】
2015109867.tif 000008
従って、出願人は、ＰＣ：ＤＡＧコリンホスホトランスフェラーゼ活性についてＲＯＤ１を試験するための最も直接的な方法が、全てのＣＤＰ−コリン：ＤＡＧコリンホスホトランスフェラーゼ活性を欠いている二重変異酵母株（例えば、ＨＪ０９１）において組換えタンパク質を発現させることであると推論した。この株において、ＰＣは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）への脱カルボキシル化、続いて３回のメチル化サイクルを伴う反応シーケンスによって合成されて、ＰＣを生じるに過ぎない。この酵母株からのミクロソーム調製は、［３Ｈ］−標識ＤＡＧもしくは［１４Ｃ］−標識コリン（ＣＤＰ−コリンとして供給）の、ＰＣへの組み込みを助けない。従って、出願人は、ＲＯＤ１の発現が３Ｈ−ＤＡＧの、ＰＣへの変換を生じる場合、ＲＯＤ１がＰＣ：ＤＡＧコリン−ホスホトランスフェラーゼとして作用することを示すと推論した。
【０１４６】
従って、ＰＤＣＴ活性についてＲＯＤ１を試験するために、Ａｔ３ｇ１５８２０のｃＤＮＡを、全てのＣＤＰ−コリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ活性を欠いているΔｃｐｔΔｅｐｔ二重変異酵母株ＨＪ０９１（１７）において誘導性ＧＡＬ１プロモーターの制御下で発現させた。この株において、ＰＣは、ＰＳの、ＰＥへの脱カルボキシル化、続いて、３回のメチル化反応サイクル（１７）を伴う反応シーケンスによって合成されるに過ぎない。この酵母系統からのミクロソーム調製物は、ジアシルグリセロールおよびＣＤＰ−コリンの、ＰＣへの組み込みを助けない。予測されるように、上記ＲＯＤ１形質転換酵母ミクロソームは、ジオレインおよび［１４Ｃ］−標識ＣＤＰ−コリン（示さず）と、もしくは［１４Ｃ−グリセロール］−ジオレインおよびＣＤＰ−コリンとインキュベートした場合に、放射活性ＰＣを合成できない（図３Ａ）。しかし、［１４Ｃ］−標識ＰＣを、［１４Ｃ］−ジオレインおよびＰＣが基質として提供された場合に、明らかに検出した。上記［１４Ｃ］−放射標識は、ジオレインのグリセロール骨格上に存在していなかったので、上記放射活性ＰＣは、ジオレインへのホスホコリンヘッド基導入から明らかに生じた。
【０１４７】
このＰＤＣＴ活性をさらに確認するために、上記ＲＯＤ１形質転換酵母ミクロソームを、［１４Ｃ−コリン］−ＰＣおよびジ−８：０−ＤＡＧとインキュベートした。図３Ｂに示されるように、放射標識したジ−８：０−ＰＣを、このアッセイにおいて検出した。このことは、上記ホスホコリンヘッド基の、上記ジ−８：０−ＤＡＧへの導入を示す。これら結果は、ＲＯＤ１が、ＰＡホスファターゼ活性を有さないことを示し、実質的に、上記ｒｏｄ１変異体が発生中の種子におけるＰＣ合成を欠損するという事実と一致して、ＲＯＤ１がむしろＰＤＣＴ活性を付与することを確認する。
【０１４８】
図３Ａ〜３Ｃは、ＲＯＤ１が、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼとして機能することを示す。ＲＯＤ１で形質転換した酵母株ＨＪ０９１に由来するミクロソームは、［１４Ｃ］グリセロール−標識ジオレオイルグリセロールを、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンに変換する（Ａ）か、もしくは［１４Ｃ］コリン標識ジパルミトイルホスホコリンおよび１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−３−グリセロールとインキュベートした場合に１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを生じる（Ｂ）。空のベクターｐＹＥＳ２で形質転換されたＨＪ０９１を用いる反応（Ａ、Ｂ、Ｃ）において、新たな放射標識ＰＣ生成物は検出されなかった。
【０１４９】
より具体的には、ＲＯＤ１を発現するＪＨ０９１細胞からのミクロソーム調製物、および空のベクターコントロールからのミクロソーム調製物を、ＰＣを、ＤＧおよびＣＤＰ−［１４Ｃ］コリンから合成する能力について最初に試験した（２０）。コントロールミクロソームにおいても、ＲＯＤ１を発現する細胞由来のものにおいても、いずれの活性の検出されなかった（図９Ａ）。しかし、１４Ｃ−標識ＰＣは、ＲＯＤ１ミクロソームをジオレオイル−［１４Ｃ］グリセロールとインキュベートした場合に生成され、この活性は、添加されたＰＣの存在下で増強された（図９Ｂ）。コントロールミクロソームは、このアッセイにおいて活性を有さず、アッセイの前に煮沸したＲＯＤ１ミクロソームはまた、不活性であった。上記［１４Ｃ］放射標識は、上記［１４Ｃ］−ＤＧ基質のグリセロール部分に存在したので、これらアッセイは、ＲＯＤ１が、上記ホスホコリンヘッド基を、ＰＣから［１４Ｃ］−ＤＧへ導入することによって、［１４Ｃ］−ＰＣを合成することを示す。添加されたＰＣなしのアッセイにおいて認められる上記活性は、上記酵母ミクロソームの内因性ＰＣにおそらく依存した。
【０１５０】
他の考えられるホスホコリンドナーでのアッセイは、ＰＣの上記ホスホコリンヘッド基のみが、上記ＲＯＤ１酵素に接近可能であることを示した。１ｍＭ  ＣＤＰ−コリン、ホスホコリンもしくはリゾ−ＰＣの添加は、添加されたＰＣなしで、ＲＯＤ１ミクロソームより高い速度［１４Ｃ］−ＰＣ合成を助けなかった（図９Ｃ）。上記ＰＣヘッド基の導入について具体的に試験するために、ミクロソームと、［１４Ｃ］コリン−標識したジミリストイル−ＰＣおよび標識していないジオレオイル−ＤＧとをインキュベートした。このアッセイにおいて、上記コントロールではなく、ＲＯＤ１ミクロソームは、薄層クロマトグラフィー上での上記ジミリストイル−［１４Ｃ］ＰＣ基質から分離するジオレオイル−［１４Ｃ］−ＰＣを合成した（図９Ｄ）。さらなるアッセイは、上記ＰＤＣＴ活性が、ｐＨ６．５〜７において最高であることを示した（図９Ｅ）。使用したアッセイ条件下で、［１４Ｃ］−ＰＣ合成は、最大３分間までのインキュベーションと、最大５０μｇまでのミクロソームタンパク質濃度で直線的に増大した（図９Ｆ，Ｇ）。最適化したアッセイ条件下で、ＰＤＣＴ活性は、添加されたＰＣの非存在下では０．６ｎｍｏｌ／分／ｍｇ  ミクロソームタンパク質であり、１ｍＭの添加したＰＣありで、４．５ｎｍｏｌ／分／ｍｇへと増大した（図９Ｈ）。
【０１５１】
まとめると、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける上記ｒｏｄ１変異体の出願人の分析、および異種酵母発現を使用する生化学的機能アッセイは、驚くべきことに、ＲＯＤ１（Ａｔ３ｇ１５８２０）が、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼとして機能することを確証する。驚くべきことに、ＲＯＤ１（Ａｔ３ｇ１５８２０）は、種子油植物（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓが挙げられるが、これらに限定されない）の発生中の種子におけるＤＡＧからＰＣへのフラックスを担う。
【０１５２】
ＰＤＣＴを介するフラックスの最小限の予測は、表１におけるデータから行われうる。ＷＴ種子において、脂肪酸のうちの４９．１％は、１８：２＋１８：３（ＰＣに対するＦＡＤ２脱飽和化の２つの生成物）である。上記ｒｏｄ１変異体において、これら脂肪酸は、合計のうちのわずか２９．４％であり、このことは、１８：２＋１８：３に変換された１８：１のうちの４０％が、上記ＰＤＣＴ酵素を介してＰＣに入ることを示す。
【０１５３】
【数１−２】
2015109867.tif 000009
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲＯＤ１に相同な配列は、多くの高等植物（油脂植物（例えば、キャノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕａ）およびヒママメ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）が挙げられる）において同定可能であり、よって、ＰＤＣＴが、多くの植物においてＴＧ合成の重要な酵素であるようである。
【０１５４】
ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＰＤＣＴの本発明者らの発見は、ＴＧ合成を理解するために、およびバイオテクノロジーを使用して、植物油の脂肪酸組成を改変するために、重要な関わり合いを有する。例えば、ＰＤＣＴは、種子におけるＰＵＦＡ合成の制御に寄与するので、ＲＯＤ１発現の調節は、油の水素添加の必要性、および健康でないトランス脂肪の付随する生成（３，４）を減少させ得、さらに増大した酸化安定性を有するバイオ燃料の生成（２２）を提供し得る。ＰＣはまた、ヒドロキシ改変の、エポキシ改変の、アセチレン改変の、および他の改変脂肪酸（２３〜２５）を生成する酵素に対する基質であるので、ＰＤＣＴの本発明者らの発見は、種々の脂肪種子の種においてＴＧ合成をよりよく理解し、ヒトの健康および産業適用の両方のために植物性油の脂肪酸プロフィールを改善する多くの機会を提供する。
【０１５５】
（実施例５：ＲＯＤ１（Ａｔ３ｇ１５８２０）オルソログは、顕著な配列相動性／同一性を有すると同定した）
本発明のさらなる局面によれば、天然での多くの主要な脂肪酸改変は、ＰＣ上でエステル化された脂肪アシル鎖に対して作用することによって達成され、ＲＯＤ１遺伝子のオルソログは、本明細書において、油脂作物（例えば、菜種およびヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）など）を含む多くの他の植物種において同定された。
【０１５６】
特定の局面によれば、酵母株ＨＪ０９１におけるｃＤＮＡの発現は、ＲＯＤ１について本発明者らが行ったように、上記コードされたタンパク質の活性アッセイを提供する。いったん上記キャノーラＲＯＤ１オルソログが同定されたら、これらオルソログは、下方調節のために標的化され得、得られた植物は、上記種子油における増大した１８：１を有する系統を生成する育種プログラムにおいて、それらの価値について評価され得る。
【０１５７】
表２および表３は、Ｂｒａｓｓｉｃａ（配列番号６；配列番号７）、Ｍｏｓｓ（配列番号１６；配列番号１７）、Ｓｐｒｕｃｅ（配列番号１４；配列番号１５）、Ｇｒａｐｅ（配列番号１２；配列番号１３）、Ｒｉｃｅ（配列番号１０；配列番号１１）およびＣａｓｔｏｒ（配列番号８；配列番号９）に由来する例示的ＲＯＤ１オルソログに関して、それぞれ、ヌクレオチド類似性（％同一性）およびタンパク質配列類似性（％同一性）を示す（約４６〜８０％の核酸同一性範囲、および約４２〜８５％のタンパク質配列同一性範囲を示す）。さらなる局面によれば、これらオルソログをコードするクローニングされたｃＤＮＡは、上記Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｒｏｄ１変異体を形質転換的に補完する。
【０１５８】
【表２−２】
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【０１５９】
【表３】
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従って、好ましい実施形態によれば、脂肪種子におけるＰＤＣＴの操作は、植物性油の脂肪酸プロフィールを改変して、特定のエンドユース要件に鑑みて、植物性油を特別に作り替える（ｃｕｓｔｏｍｉｚｅ）および／もしくは最適化するための新規なアプローチ（例えば、遺伝的アプローチ）を提供する。ＲＯＤ１の酵素的正体に関わらず、ＴＡＧ、ＤＡＧおよびＰＣの脂肪酸組成に対する上記ｒｏｄ１変異の効果は、作物植物におけるＲＯＤ１ホモログの下方調節が、膜脂質の不飽和化を維持しながら、上記油中の１８：２および１８：３のレベルを調整もしくは低下させるための実質的有用性を有することを示す。
【０１６０】
（実施例６）
（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ配列、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ（２０３８および３７０）配列、およびＢｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ配列）
本発明のさらなる局面によれば、上記Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｂｎａ．６１９４は、真のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲＯＤ１（Ａｔ３ｇ１５８２０）ホモログとして同定される。出願人は、Ｂｎａ．６１９４をＢｎＲＯＤ１と命名した。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＢｎＲＯＤ１が、キャノーラの発生中の種子において高度に発現されることを示した。Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａおよびＢｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａの２つの部分ゲノムを含め、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓは、複二倍体（ａｍｐｈｉｄｉｐｏｉｄ）である、
その配列アラインメントはまた、ＢｎＲＯＤ１が、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｂｒａ．２０３８およびＢｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ＥＳ９４８６８７の真のホモログであり得ることを示唆した。別のＢｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｂｒａ．３７０はまた、ＢｎＲＯＤ１と高度に同一性を共有するが、それは、発生中の種子のｃＤＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって増幅され得ない。
【０１６１】
【化２】
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【０１６２】
【化３】
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【０１６３】
【化４】
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【０１６４】
【化５】
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【０１６５】
【化６】
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【０１６６】
【表４】
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（実施例７）
（中程度の不飽和を有する、比較的高濃度の長鎖脂肪酸を含む生物学的材料は、本明細書で提供される場合、バイオディーゼルおよび関連製品のための改善された供給原料を提供する）
本発明のさらなる局面によれば、バイオディーゼルの品質は、供給源生物学的材料内の構成油脂の化学的特徴かに由来する。化学的処理および物理的処理は、バイオディーゼル合成および処理の間の油脂プロフィールを変化させるために使用され得る一方で、これらは、最終製品にコスト転嫁される。従って、生長および成熟の間の生物学的材料の油脂組成を変化させる方法は、特に価値がある。
【０１６７】
バイオディーゼルの品質に対する関連性の特定の変数は、曇点と、酸化的安定性と、エネルギー密度との間の相互作用に由来する。例えば；至適曇点は、高融点油に由来し、この高融点油は、代表的には、非常に不飽和のおよび／もしくは短鎖脂肪から構成されるが、この組成の混合物は、しばしば、酸化的に不安定であり、低いエネルギー密度を有する。同様に、最適な酸化的安定性およびエネルギー密度は、不飽和が低い／ほとんど不飽和がない長鎖脂肪を有する油に由来するが、このような混合物は、代表的には、望ましくない低温の曇点を有する。
【０１６８】
よって、本明細書で提供される場合、中程度の不飽和を有する、比較的高濃度の長鎖脂肪酸を含む生物学的材料は、バイオディーゼルおよび関連製品のための改善された供給原料を提供する。
【０１６９】
実施例３〜８に関連して引用された（および教示に言及するために本明細書に参考として援用される）さらなる参考文献：
【０１７０】
【数２】
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【０１７１】
【数３】
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【０１７２】
【数４】
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【図７】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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