(57)【要約】【課題】十分な濃度の界面活性剤を用いて200nm以下の粒子分散液を作製した後、その粒径と分散を維持したままで界面活性剤を精製できる精製方法を提供すること。【解決手段】疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンと界面活性剤とを有する粒子を含む溶液から界面活性剤を減じる精製方法であって、希釈する際の該溶液に含まれる該界面活性剤の濃度は臨界ミセル濃度の30倍以上であることを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンと界面活性剤とを有する粒子を含む溶液から界面活性剤を減じる精製方法において、希釈工程を含み、該希釈工程において該溶液に含まれる該界面活性剤の濃度は臨界ミセル濃度の30倍以上1500倍以下であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記界面活性剤はTween 20又はTween 80であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疎水性フタロシアニンの構造は下記の一般式(1)で示されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【化１】
2015027965.tif 000010
（一般式(1)中、R201、R202、R203、R204、R205、R206、R207、R208、R209、R210、R211、R212、R213、R214、R215、R216は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、炭素数１〜１８のアルキル基、又はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、及び炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のアリール基を表し、
Mは、Zn、Cu、Co及びSiのうちいずれかの元素を示し、
R101、R102は各々が同一でも異なっていてもよく、存在しないか、又は、以下に示す構造を表し、
R101、R102は、各々が同一でも異なっていてもよく、-OH、-OR11、-OCOR12、-OSi(-R13)(-R14)(-R15)、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、炭素数１〜１８のアルキル基、又はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、及び炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のアリール基を表し、
ただし、R11、R12、R13、R14、R15は各々が同一でも異なっていてもよく、また、存在しなくてもよく、存在する場合はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、炭素数１〜１８のアルキル基、又はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、及び炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基かで置換されているか若しくは未置換のアリール基を表す）
【請求項４】
前記疎水性ナフタロシアニンの構造は、下記の一般式（2）で示されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【化２】
2015027965.tif 000011
（式中、R31乃至R54は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、または、炭素数１〜１８のアルキル基若しくは芳香族基であってハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、若しくは炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表し、
R103、R104は各々が同一でも異なっていてもよく、−ＯＨ、−ＯＲ311、−ＯＣＯＲ312、−ＯＳｉ（−Ｒ313）（−Ｒ314）（−Ｒ315）、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基または、炭素数１〜１８のアルキル基若しくは芳香族基であってハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、若しくは炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表し、
Ｒ311乃至Ｒ315は各々が同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、又は炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表す）
【請求項５】
前記疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンは、シリコン２，３−ナフタロシアニンビス（トリヘキシルシリルオキシド）、銅（ＩＩ）２，９，１６，２３−テトラ−ターシャリーブチル−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン、及び亜鉛２，９，１６，２３−テトラ−ターシャリーブチル−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニンからなる群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記界面活性剤は非イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項８】
前記界面活性剤はTween 20又はTween 80であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンと界面活性剤とを有する粒子を含む溶液から界面活性剤を減じる精製方法において、希釈工程を含み、該希釈工程において該溶液に含まれる該界面活性剤の濃度は2.40mM以上215mM以下であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記界面活性剤の濃度は2.40mM以上200mM以下であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンと界面活性剤とを含む粒子であって、平均粒径は20 nm 以下であり、色素あたりの界面活性剤の重量比は60以上140未満であることを特徴とする粒子。
【請求項１２】
前記界面活性剤はTween 20 又はTween 80であることを特徴とする、請求項１１に記載の粒子。
【請求項１３】
前記色素あたりの界面活性剤の重量比は、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法によって60以上140未満に調製された、請求項１１又は１２に記載の粒子。
【請求項１４】
請求項１１乃至１３のいずれか１項に記載の粒子を用いた光音響イメージング用の造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子分散液から界面活性剤を精製する方法及び粒子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
病変部の診断及び治療方針の決定に必要な情報を視覚的に読み取る手段として、各種画像診断技術が用いられている。特に近年では、非侵襲的に診断が出来るイメージング方法として、光音響イメージング法や蛍光イメージング法が注目されている。
【０００３】
光音響イメージング法を用いる測定では、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質（光吸収体）が発する光音響信号の強度と発生時刻を測定することにより、被測定体内部の物質分布を演算して可視化することが出来る。
【０００４】
蛍光イメージング法を用いる測定では、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光吸収体が発する蛍光を測定することにより、被測定体内部の物質分布を可視化することが出来る。
【０００５】
ここで、光吸収体としては、生体内で光を吸収して音響波や蛍光を発するものを好適に用いることができる。例えば人体内の血管や悪性腫瘍などを光吸収体として、光吸収体から発せられた音響波を測定することが可能である。その他にも、近赤外波長領域の光を吸収する色素などを体内に投与し、造影剤として利用することもできる。近赤外波長領域の光は、人体に照射した際の影響が少なくかつ生体への透過性が高いため、この光を吸収する色素は光音響イメージング法における造影剤や、蛍光イメージング法における造影剤として好適に用いることができる。なお、本明細書において色素とは、600nm乃至1300nmの範囲に含まれる波長の光を吸収することのできる化合物と定義する。
【０００６】
このような造影剤において、信号強度（音響波や蛍光の強度）を有効に増幅するために、色素を粒子、ミセル、ポリマーミセル、リポソーム等（総称して粒子等という）に集積することにより、色素密度を上げ、照射エネルギーの吸収効率を上げることが望まれる。その際、粒径が200nm以上の粒子は肝臓から排泄されやすく、腫瘍には集積しにくいことが知られている。そこで、かかる粒子は平均粒径が200nm以下であることが望ましい。
【０００７】
粒子同士の凝集を起こすことなく、均一に分散した粒子を得るためには、十分な濃度の界面活性剤存在下で粒子を作製しなければならない。しかし、分散液中に高濃度の界面活性剤が残存していると、保存中に凝集してしまうなど経時安定性が悪いだけでなく、肝臓や腎臓の機能に悪影響を与える場合があることが、動物実験の結果で明らかになっている。
【０００８】
特許文献１には、1μm以下の微粒子と界面活性剤とを含む液体から、微粒子を分離回収する方法及び装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2005−111428号公報
【特許文献２】特表2009−512663号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１は、分離膜でクロスフロー濾過して界面活性剤濃度を低減した後、微粒子が自己凝集するまで界面活性剤を精製してから該粒子を回収する方法を開示する。しかし、粒子の凝集力は強いため、この方法では画像診断で用いられる200nm以下の粒子を回収後に再分散させることは困難であるという課題がある。
【００１１】
特許文献２は、可溶性賦形剤及び界面活性剤を含む吸入用医薬組成物であって、組成物の平均直径は5μm以下、医薬あたりの界面活性剤の重量比が0.01から10の範囲であるものを開示する。吸入用医薬品は、乾燥粉末であること、また、その作用機序から平均直径は5μm以下であればよい。しかし色素と界面活性剤とからなる粒径200nm以下の粒子は、色素あたりの界面活性剤の重量比が上記範囲では凝集してしまい、液体中で均一分散を維持出来ない。
【００１２】
本発明はこのような課題を鑑みてなされたものであり、十分な濃度の界面活性剤を用いて200nm以下の粒子分散液を作製した後、その粒径と分散を維持したままで界面活性剤を精製できる精製方法の提供を目的とする。また、精製後の経時安定性に優れた粒子の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、少なくとも疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンと界面活性剤とを有する粒子を含む溶液から界面活性剤を減じる工程において、臨界ミセル濃度の30倍以上1500倍以下の濃度で希釈することを特徴とする精製方法であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、200nm以下の粒子の分散安定性を保ったまま、界面活性剤を精製出来る。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（精製）
本実施形態に係る精製方法は、疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンと、界面活性剤とを有する粒子を含む溶液から、界面活性剤を減じて、粒子を精製する方法である。
【００１６】
本実施形態において、粒子を含む溶液（分散液）から界面活性剤を減じる方法としては、例えば、膜濾過法、サイズ排除クロマトグラフィー法、カラムクロマトグラフィー法、遠心法などが挙げられる。
膜濾過法は、クロスフロー濾過方式、全量濾過方式、半透膜濾過方式のいずれでも構わない。また、予め希釈した溶液を濾過しても構わないし、定容加水濾過を行なっても構わない。ここで、定容加水濾過とは、濾過によって減少した液量と同じ容量の液を添加することで、容積を一定に保った状態で濾過を行なう方法を指す。
サイズ排除クロマトグラフィー法は、ゲル浸透クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィーが挙げられる。
カラムクロマトグラフィー法は、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどが挙げられる。
ただし、精製方法は本発明の目的を達成出来る範囲において、上記手法に限定されるものではない。
【００１７】
また、本実施形態に係る精製方法は、希釈工程を有し、希釈工程において、溶液に含まれる界面活性剤の濃度を所定の範囲の濃度に保つことを特徴とする。
本実施形態においては、前記上記粒子を含む溶液に含まれる界面活性剤の濃度が、界面活性剤の臨界ミセル濃度の30倍以上1500倍以下の濃度を保つようにして精製することを特徴とする。界面活性剤の濃度を臨界ミセル濃度の30倍未満に希釈すると、凝集や沈殿が生じる。これは、粒子が安定な状態で分散を保つことが出来なくなることによると考えられる。また、希釈後の界面活性剤濃度が臨界ミセル濃度の1500倍より大きい場合では、精製効率が著しく低下する。精製効率が低下する原因は、公知の「界面活性剤−水系の相図」でも明らかなように、臨界ミセル濃度を大きく超えた濃度では、界面活性剤は単一ミセル構造を維持することが出来ず、棒状ミセルや液晶構造を取るためであると考えられる。これによって、例えば膜濾過法では膜の目詰まりを誘発して精製効率が低下する。遠心法では、本来はある粒径の粒子が沈殿するはずの遠心加速度でも、沈殿しなくなる。これは、粒子を含む分散液の粘度が高くなることで、粒子が移動しにくくなることによると考えられる。
本実施形態に係る精製方法のように、界面活性剤の臨界ミセル濃度の30倍以上1500倍以下の濃度を保つようにして精製することで、上記のような問題は生じにくく、粒子が溶液の中で安定な分散状態を保つことができる。その結果、200nm以下の粒子の分散安定性を保ったまま、界面活性剤を減じることができる。
【００１８】
別の本実施形態に係る発明は、疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンと界面活性剤とを有する粒子を含む溶液から界面活性剤を減じる精製方法であって、前記精製方法は希釈工程を有し、前記希釈工程において該溶液に含まれる該界面活性剤の濃度が2.40mM以上215mM以下であることを特徴とする。
また、前記界面活性剤の濃度が2.40mM以上200mM以下であることが好ましい。
【００１９】
（粒子）
本実施形態に係る粒子は、疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンを含有し、粒子表面に界面活性剤が結合していることを特徴とする。なお、本実施形態における粒子のサイズは、粒径がnm（ナノメートル）オーダー、すなわち1000nm未満である。ただし、後述の造影剤等として実際に使用する際などは、粒径が1000nm以上の粒子が含まれていても、平均粒径が1000nm未満の粒子の集合であれば本実施形態に係る粒子に含まれる。同様に、本実施形態に係る粒子における粒径とは、そうではないことが明らかな場合を除き、平均粒径を意味する。
また、本実施形態において疎水性とは、実施例で後述する薄層液体クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略すことがある）法によって算出したＲｆ値が０以上、０．５０以下であることと定義する。
【００２０】
（粒子内の疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンの充填率）
本実施形態に係る粒子は、界面活性剤を除いた粒子構成要素に対する疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンの比率が重量比で70％以上100％未満であることを特徴とする。好ましくは、界面活性剤を除いた粒子構成要素に対する疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンの比率は重量比で80％以上100％未満であり、さらに好ましくは90％以上100％未満である。粒子内に含まれる色素の比率を高めることで、造影剤として用いたときに、照射エネルギーの吸収効率が上がり、より少ない粒子を用いても大きな強度の信号を得ることが可能になる。また、本実施形態に係る粒子を光音響イメージング法に用いるような場合、色素が粒子内で集積されていることで、蛍光の消光が起こり、照射エネルギーが蛍光発光に用いられることが防がれ、より多くの熱エネルギーに変換することが可能になる。そのため、さらに効率的に音響信号を得ることが可能となる。
本実施形態においては、色素あたりの光吸収量の低下の影響を低く抑えつつ、又は全く光吸収量を低下させずに、色素を粒子内で上記高濃度に集積することが可能である。
【００２１】
（粒子サイズ）
本実施形態に係る粒子の粒径は、10nm以上1000nm未満であることが好ましい。粒径が1000nm未満の場合、EPR（Enhanced Permeability and Retention）効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多くの粒子を集積させることができる。集積した粒子を、光音響トモグラフィー等を用いて検出することによって、腫瘍部位を特異的にイメージングすることができる。また、粒子の粒径は10nm以上500nm以下であることがより好ましく、10nm以上200nm以下であることがさらに好ましい。粒子の粒径が200nm以下であると、粒子が血中のマクロファージに取り込まれにくく、血中滞留性が高くなると考えられるからである。本発明によれば、粒径20nm以下の小粒子でも、その分散安定性を保つことが可能である。
本実施形態において粒子の粒径という場合、動的光散乱解析装置（DLS-8000、大塚電子社製）を用いて、動的光散乱（Dynamic Light Scattering, DLS）法によって流体力学的直径を測定したものである。
【００２２】
（疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニン）
本実施形態に係る疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンとは、ナフタロシアニン骨格又はフタロシアニン骨格を有していればいかなるものでもよい。ナフタロシアニン骨格及びフタロシアニン骨格は疎水性であるため、疎水性相互作用によって複数で集まりやすい。複数集まった疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンはさらに疎水性が高くなる。そのため、本実施形態に係る粒子が血清などの水溶液中におかれた場合、疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンは、粒子外へと漏出しにくくなる。
本実施形態において疎水性フタロシアニンの構造は、下記の一般式(1)で示される。
【化１】
2015027965.tif 000002
（一般式(1)中、R201、R202、R203、R204、R205、R206、R207、R208、R209、R210、R211、R212、R213、R214、R215、R216は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、炭素数１〜１８のアルキル基、又はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、及び炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のアリール基を表す。
Mは、Zn、Cu、Co、Siの元素のいずれかを示す。
R101、R102は各々が同一でも異なっていてもよく、Mの元素により存在しないか、又は、以下に示す構造を表す。
R101、R102は、各々が同一でも異なっていてもよく、-OH、-OR11、-OCOR12、-OSi(-R13)(-R14)(-R15)、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基又は、炭素数１〜１８のアルキル基、若しくはハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、及び炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のアリール基を表す。
ただし、R11、R12、R13、R14、R15は各々が同一でも異なっていてもよく、また、存在しなくてもよく、存在する場合はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、炭素数１〜１８のアルキル基、又はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、及び炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基かで置換されているか若しくは未置換のアリール基を表す。
【００２３】
本実施形態において疎水性ナフタロシアニンの構造は、下記の一般式（2）で示される。
【化２】
2015027965.tif 000003
（式中、R31乃至R54は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、または、炭素数１〜１８のアルキル基若しくは芳香族基であってハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、若しくは炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表す。
また、R103、R104は各々が同一でも異なっていてもよく、−ＯＨ、−ＯＲ311、−ＯＣＯＲ312、−ＯＳｉ（−Ｒ313）（−Ｒ314）（−Ｒ315）、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基または、炭素数１〜１８のアルキル基若しくは芳香族基であってハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、若しくは炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表す。
ここで、Ｒ311乃至Ｒ315は各々が同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、又は炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表す。）
【００２４】
前記疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンは、生体透過性の優れた600nmから900nmの近赤外波長の吸収を持つ。本実施形態に係る粒子は疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンを含有しているため、生体に照射したときに安全で、かつ、生体に対して比較的高い透過性をもつ近赤外波長領域（600nmから900nmの近赤外波長領域）の波長を吸収することができる。
本実施形態において疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンが、シリコン２，３−ナフタロシアニンビス（トリヘキシルシリルオキシド）、銅（ＩＩ）２，９，１６，２３−テトラ−ターシャリーブチル−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン、亜鉛２，９，１６，２３−テトラ−ターシャリーブチル−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニンからなる群から選択される少なくとも１つであること
【００２５】
（界面活性剤）
本実施形態における界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、高分子界面活性剤又はリン脂質等を使用することができる。これらの界面活性剤は、１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を用いてもよい。
【００２６】
上記本実施形態における界面活性剤に使用する非イオン性界面活性剤としては、Tween（登録商標）20、Tween（登録商標）40、Tween（登録商標）60、Tween（登録商標）80及びTween（登録商標）85等のポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、Brij（登録商標）35、Brij（登録商標）58、Brij（登録商標）76、Brij（登録商標）98、Triton（登録商標）X-100、Triton（登録商標）X-114、Triton（登録商標）X-305、Triton（登録商標）N-101、Nonidet（登録商標）P-40、IGEPAL（登録商標）CO530、IGEPAL（登録商標）CO630、IGEPAL（登録商標）CO720並びにIGEPAL（登録商標）CO730等を挙げることができる。これらのうち、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルであるポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Tween 20）及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Tween 80）のいずれか一方が特に好ましい。
【００２７】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用するアニオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホネート、デシルベンゼンスルホネート、ウンデシルベンゼンスルホネート、トリデシルベンゼンスルホネート、ノニルベンゼンスルホネート並びにこれらのナトリウム、カリウム及びアンモニウム塩等、更にラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸のナトリウム、カリウム及びアンモニウム塩等を挙げることができる。
【００２８】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用するカチオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム及び塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム等を挙げることができる。
【００２９】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用する高分子界面活性剤としては、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール及びゼラチン等を挙げることができる。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールの市販品としては、プルロニックF68（BASF社製）、プルロニックF127（BASF社製）などが挙げられる。
【００３０】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用するリン脂質としては、水酸基、メトキシ基、アミノ基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基又はマレイミド基のいずれかの官能基を有するホスファチジル系リン脂質であることが好ましい。また、界面活性剤に使用するリン脂質はPEG（Polyethylene glycol）鎖を含むものであってもよい。
【００３１】
官能基が水酸基、メトキシ基、アミノ基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、マレイミド基でありPEG鎖を含むような界面活性剤に使用するリン脂質としては、例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［カルボキシ（ポリエチレングリコール）］（1, 2- distearoyl- sn- glycero- 3- phosphoethanolamine- N- [carboxy (polyethylene glycol)] ：DSPE-PEG-OH）、ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル），α−［７−ヒドロキシ−７−オキシド−１３−オキソ−１０−［（１−オキソオクタデシル）オキシ］−６，８，１２−トリオキサ−３−アザ−７−ホスファトリアコント−１−イル］−ω−メトキシ−（Poly (oxy- 1, 2- ethanediyl), α- [7- hydroxy- 7- oxido- 13- oxo- 10- [(1- oxooctadecyl) oxy]- 6, 8, 12- trioxa- 3- aza- 7- phosphatriacont- 1- yl]- ω− methoxy- ：（DSPE-PEG-OMe）、Ｎ−（アミノプロピル  ポリエチレングリコール）−カルバミル  ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（N- (aminopropyl polyethyleneglycol)- carbamyl distearoylphosphatidyl- ethanolamine：DSPE-PEG-NH2）、３−（Ｎ−スクシンイミジルオキシグルタリル）アミノプロピル  ポリエチレングリコール−カルバミル  ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（3- (N- succinimidyloxyglutaryl) aminopropyl polyethyleneglycol- carbamyl distearoylphosphatidyl- ethanolamine ：DSPE-PEG-NHS）、Ｎ−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノプロピル  ポリエチレングリコール−カルバミル  ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（N- (3- maleimide- 1- oxopropyl) aminopropyl polyethyleneglycol- carbamyl distearoylphosphatidyl- ethanolamine ：DSPE-PEG-MAL）、SUNBRIGHT（登録商標）DSPE-020-PA、 SUNBRIGHT（登録商標）DSPE-020-CN、SUNBRIGHT（登録商標）DSPE-050-CN、Methoxyl PEG DSPE, Mw10000、Methoxyl PEG DSPE, Mw20000等のリン脂質を挙げることができる。
【００３２】
（粒子の製造方法）
本実施形態における粒子を得る方法としては、限定されるものではないが、例えばナノエマルション（nanoemulsion）法、ナノプリシピテーション（nanoprecipitation）法を挙げることができる。
【００３３】
ナノエマルション法とは、具体的には、以下の（A）から（C）の工程により粒子の水分散液を得ることができる。
（A）疎水性シリコンナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンを有機溶媒に溶解させて得られる第一液体を、少なくとも一種の界面活性剤を溶解させた水溶液である第二液体に加えて混合液を得る工程。
（B）前記混合液を乳化することにより水中油（以下、O/W  と略すことがある）型のエマルジョンを得る工程。
（C）前記エマルジョンの分散質から第一液体に含まれる有機溶媒を留去する工程。
【００３４】
（第一液体）
上記ナノエマルション法に用いる第一液体の溶媒として使用する有機溶媒としては、水への溶解性がないか又は溶解性が小さく、且つ、疎水性シリコンナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンを溶解することができるものであればいかなる有機溶媒をも使用することが可能である。ただし、揮発性の有機溶媒であることが好ましい。
【００３５】
このような有機溶媒としては、限定されるものではないが、ハロゲン化炭化水素（ジクロロメタン、クロロホルム、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）、エーテル類（エチルエーテル、イソブチルエーテル等）、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、及び芳香族炭化水素（ベンゼン、トルエン、キシレン等）等を用いることができる。これらの有機溶媒は単独で用いても良いし、あるいは２種類以上を適宜の割合で混合して用いることもできる。
【００３６】
また、第一液体における疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンの濃度は、0.0005mg/mL以上100mg/mL以下とすることが好ましい。 
【００３７】
（第二液体）
上記ナノエマルション法に用いる第二液体は、界面活性剤を溶解した水溶液である。第二液体に界面活性剤をあらかじめ含ませておくと、第一液体と混合した際にエマルジョンを安定化させることができる。但し、本実施形態においては第一液体と第二液体とを混合した分散液に界面活性剤を含ませることができればよく、界面活性剤は必ずしも第二液体に予め溶解されている必要はない。
【００３８】
また、第二液体に含まれる界面活性剤の好ましい濃度は、用いる界面活性剤の種類及び第一液体との混合比にもよる。例えば、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤又は高分子界面活性剤を用いたときは、第二液体中の濃度を0.1mg/mL以上100mg/mL以下とすることが好ましい。また、例えば、PEG鎖を含むリン脂質を界面活性剤として用いたときは、第二液体中の濃度を0.001mg/mL以上100mg/mL以下とすることが好ましい。
【００３９】
また、二種類の界面活性剤を用いる際に第一の界面活性剤として非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤又は高分子界面活性剤を、第二の界面活性剤としてPEG鎖を含むリン脂質を用いた場合の第一の界面活性剤と第二の界面活性剤との構成比は、モル比で100：1以上1：1以下の範囲が好ましい。第二の界面活性剤の構成比がこの範囲を超えると、粒子の形成が困難になる為、好ましくない。一方、第二の界面活性剤の構成比がこの範囲よりも小さくなると、捕捉分子を固定化する場合、固定化できる捕捉分子の個数が少なくなる。その結果、粒子の標識性能が低下する為、好ましくない。
【００４０】
（エマルジョン）
上記ナノエマルション法におけるエマルジョンは、本発明の目的を達成可能であればいかなる物性のエマルジョンでもよいが、１ピークの粒径分布を有し、且つ、平均粒径が1000nm以下のエマルジョンであることが好ましい。
【００４１】
このようなエマルジョンは、例えば、断続振とう法、プロペラ型攪拌機及びタービン型攪拌機等のミキサーを利用する攪拌法、並びにコロイドミル法、ホモジナイザー法及び超音波照射法等の従来公知の乳化手法によって調製することが可能である。これらの方法は単独で用いてもよいし、あるいは２種以上の方法を組み合わせて用いることも可能である。また、エマルジョンは１段階の乳化によって調製しても良いし、多段階の乳化によって調製しても良い。但し、乳化手法は、本発明の目的を達成できる範囲においてこれらの手法に限定されるものではない。
【００４２】
エマルジョンは、第二液体に第一液体を加えて得られる混合液から調製されるO/W 型のエマルジョンである。ここで、第一液体と第二液体の混合とは、第一液体と第二液体とを空間的に隔離せずに互いに接触して存在させることを意味し、必ずしも互いに混和することを要さない。
【００４３】
混合液における第一液体と第二液体との割合は、O/W 型のエマルジョンを形成することができれば特に限定されることはないが、好ましくは、第一液体と第二液体との重量比が、1：2以上 1：1000以下となる範囲で混合することが好ましい。
【００４４】
（留去）
上記ナノエマルション法における留去とは、エマルジョンの分散質から第一液体に含まれる有機溶媒を除去する操作である。即ち、シリコンナフタロシアニン又はその誘導体、有機溶媒から構成された分散質から有機溶媒を除去することである。
【００４５】
留去は、従来知られる何れの方法でも実施可能であるが、加熱によって除去する方法、あるいはエバポレーター等の減圧装置を利用した方法を挙げることができる。加熱による除去の場合の加熱温度は、O/W 型のエマルジョンを維持できれば特に限定されないが、好ましい温度は0℃から80℃の範囲である。但し、留去は、本発明の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
【００４６】
（ナノプリシピテーション法）
ナノプリシピテーション法とは、具体的には、以下の（A）から（B）の工程により粒子の分散液を得ることができる。
（A）疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンを有機溶媒に溶解させて得られる第一液体を、少なくとも一種の分散化安定剤を溶解させた水溶液である第二液体に加えて混合し、ナノ沈殿を得る工程。
（B）前記ナノ沈殿の分散液から第一液体に含まれる有機溶媒を除去する工程。
【００４７】
（第一液体）
上記ナノプリシピテーション法に用いる第一液体の溶媒として使用する有機溶媒としては、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン等の炭化水素類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、トリクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性極性溶媒類、ピリジン誘導体を挙げることが出来る。これらの溶媒は、単独でも任意に混合して用いても良い。第一液体中におけるシリコンナフタロシアニン又はその誘導体の濃度は、これらが溶解する範囲であれば特に限定されない。
また、第一液体におけるシリコンナフタロシアニン又はその誘導体の好ましい濃度として、0.0005mg/mL以上300mg/mL 以下とすることが出来る。
【００４８】
（第二液体）
上記ナノプリシピテーション法に用いる第二液体は、分散安定化剤を溶解した水溶液である。
【００４９】
（有機溶媒中の各種材料濃度）
上記ナノプリシピテーション法において、使用する第一液体と第二液体の重量比としては、粒子を回収することが出来れば特に限定はない。第一液体と第二液体の重量比が1：1以上1：1000以下となることが好ましい。
【００５０】
（有機溶媒の留去）
上記ナノプリシピテーション法において、第一液体に含まれる有機溶媒を蒸発などによって留去する方法について説明する。
ナノプリシピテーション法での加熱によって有機溶媒を留去する場合の加熱温度は、粒子の凝集を防ぐことが出来れば特に限定されないが、0℃以上80℃以下の範囲であることが好ましい。ただし有機溶媒の留去は、本発明の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
【００５１】
（臨界ミセル濃度）
本実施形態における「臨界ミセル濃度」とは、界面活性剤の溶液がミセルを作り始める場合の界面活性剤濃度のことを言う。
なお、本実施形態における「ミセル」とは、界面活性剤の集合体を指す。
【００５２】
（造影剤）
本実施形態に係る造影剤は、本実施形態に係る粒子及び前記粒子が分散された分散媒を有する。また本実施形態に係る造影剤は、必要に応じて本実施形態に係る粒子の他に薬理上許容できる添加物を有していても良い。
【００５３】
（分散媒）
分散媒は本実施形態に係る粒子を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水などが挙げられる。本実施形態に係る造影剤は、上記本実施形態に係る粒子をこの分散媒に予め分散させておいてもよいし、本実施形態に係る粒子と分散媒とをキットにしておき、生体内に投与する前に粒子を分散媒に分散させて使用してもよい。
なお、本実施形態に係る粒子は、疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンが漏出しにくいため、粒子内に疎水性ナフタロシアニン又は疎水性フタロシアニンが多く含まれる。含まれる色素が多いほど光吸収量が増加するため、本実施形態に係る粒子は、後述するように、光音響イメージング用途、あるいは、蛍光イメージング用途として好適である。なお、濃度消光が生じるほどの多くの量の疎水性色素が含まれる場合は、本実施形態に係る粒子は、光音響イメージング用途としてさらに好適である。
【００５４】
（造影方法）
生体内に投与された本実施形態に係る粒子を、光音響イメージング法を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係る粒子を検出する方法は以下の工程を有する。但し、本実施形態に係る造影方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
（a）本実施形態に係る粒子を生体内に投与する工程。
（b）生体に光を照射し、生体内から発せられる光音響信号を検出する工程。
【００５５】
上記（a）の工程において本実施形態に係る粒子を生体内に投与する方法は特に限定されず、経口投与や注射等の方法によることができる。
【００５６】
上記（b）の工程において生体に照射する光としては、生体に照射したときに安全で、かつ高い生体透過性を示す600nmから900nmの近赤外波長であることが好ましい。また、光を発生させる装置、音響信号を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。
【００５７】
本実施形態に係る粒子を用いた造影方法は、上記（a）、（b）の工程を経ることで腫瘍などの部位を造影することができる。
【００５８】
更に、捕捉分子を有する粒子を生体中で用いた場合、捕捉分子を適宜選択することによって、種々の標的部位を特異的に検出することができる。例えば、捕捉分子として腫瘍に特異的に結合する物質を採用すれば、腫瘍の特異的検出が可能となる。また捕捉分子として、特定の疾病部位の周辺に多く存在するタンパク質や酵素などの生体物質に特異的に結合する物質を用いれば、その疾病を特異的に検出することが可能である。また、本実施形態に係る粒子は、捕捉分子を持たない場合でも、EPR 効果によって腫瘍を検出することができる。
【００５９】
（色素比率定量の方法）
本発明の界面活性剤を除いた粒子構成要素に対する色素の比率は、例えば以下のような工程を経ることで求めることができる。
（1）粒子と粒子以外の部分とを分離する工程。
（2）粒子の成分を分析する工程。
上記（1）の工程において本実施形態に係る粒子を粒子以外の部分を分離する方法は特に限定されず、遠心分離や限外濾過等の方法によることができる。
上記（2）の工程において粒子を分析する方法は特に限定されず、粒子を溶剤に溶解させクロマトグラフィーなどの分離分析手法により成分の定量を行う方法や核磁気共鳴法（NMR）などの固有成分確認手法により既知成分の定量を行う方法などが考えられる。上記溶剤は、特に限定されず、クロロホルムなどのハロゲン系溶剤やN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）等を用いることが可能である。
【００６０】
（界面活性剤重量の測定方法）
本発明の粒子構成要素に対する界面活性剤重量の比率は、例えば以下のような工程を経ることで求めることが出来る。
（1）粒子と粒子以外の部分とを分離する工程。
（2）粒子の重量を測定する工程。
上記（1）の工程において本実施形態に係る粒子を粒子以外の部分を分離する方法は特に限定されず、遠心分離や限外濾過等の方法によることができる。
上記（2）の工程において重量を測定する方法は特に限定されず、凍結乾燥して粒子分散液中の固形分重量を出す方法や、NMR などの固有成分確認手法により既知成分の定量を行う方法などが考えられる。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例で本発明の粒子作製の際に用いる具体的な試薬や反応条件等を挙げているが、これらの試薬や反応条件等は、変更が可能であり、それらの変更は本発明の範囲に包摂されるものとする。したがって以下の実施例は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【００６２】
（光音響信号強度の測定方法）
光音響信号強度の測定は、パルスレーザー光を超純水中に設置したサンプル容器に照射し、容器内のサンプルから発生した光音響信号の強度を圧電素子を用いて検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザー（LT-2211-PC、Lotis社製）を用いた。波長は780nm、エネルギー密度はおよそ10から20mJ/cm2、パルス幅は約20ナノ秒、パルス繰返し周波数は10Hzの条件とした。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径1.27cm、中心帯域1MHzの非収束型超音波トランスデューサー（V303、Panametrics-NDT製）。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長0.1cm、サンプル容量は約200μLであった。水を満たしたガラス容器に前記の測定容器と圧電素子とを浸け、その間隔を2.5cmとした。光音響信号強度を増幅する高速プリアンプは増幅度+30dBの超音波プリアンプ（Model 5682、オリンパス製）を用いた。増幅された信号をデジタルオシロスコープ（DPO4104、テクトロニクス製）に入力した。前記ガラス容器の外からパルスレーザー光を前記ポリスチレン製キュベットに照射した。この際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出し、デジタルオシロスコープにトリガー信号として入力した。デジタルオシロスコープを32回平均表示モードとし、レーザーパルス照射32回平均の光音響信号強度の測定を行った。
【００６３】
（100nm換算粒子当たりの光音響信号強度の算出）
粒子分散液を凍結乾燥することにより、分散液中に含まれる固体成分の重量濃度を算出した。・・・（A）
各構成材料の密度を1（g/cm３）と仮定し、各粒子の粒径から１粒子当たりの重量を算出した。・・・（B）
（A）で求めた重量濃度を（B）で求めた１粒子当たりの重量で除算して、粒子分散液中の粒子濃度を算出した。・・・（C）
光音響信号測定の結果と、（C）の結果より、粒子当たりの光音響信号強度を算出した。その後、同一組成で100nm 粒子が存在した場合に、それぞれの値は、体積比に比例すると仮定して、算出した。
【００６４】
（実施例1）
溶液の調整
シリコン2,3-ナフタロシアニンビス（トリヘキシルシリルオキシド）（以下、化合物1と略すことがある）（4.4mg、シグマアルドリッチジャパン社製）をクロロホルム1.6mLに溶解し、色素クロロホルム溶液を調製した。
Tween 20（180mg、東京化成工業株式会社製）を溶解した水溶液（20mL）を室温で20分以上撹拌した。
溶液の混合
前記色素クロロホルム溶液を滴下混合し、この混合溶液を30分間撹拌した。
O/W型エマルジョンの作製
前記混合溶液を超音波分散機で90秒間処理することによってO/W 型のエマルジョンを調製した。
溶媒の留去
前記エマルジョンを加温状態（40℃）で撹拌し、分散質からクロロホルムを除去して粒子1の水分散液を得た。
大粒子の除去
AMICON 限外濾過撹拌式セル（メルク株式会社製）にオメガ限外濾過メンブレン・ディスクフィルター（孔径300k）（日本ポール株式会社製）をセットして前記粒子1の水分散液を限外濾過し、濾液を回収することで大粒子を除去した。以下、この粒子をNP1’と略す。
【００６５】
粒子中の色素定量
前記NP1’分散液100μLをテトラヒドロフラン（キシダ化学株式会社製）900μLと混合した。吸光度を測定し、773nmの吸収を用いて化合物1の定量を行なった。化合物1の濃度は0.038mg/mLであった。吸光度測定には、パーキンエルマー社製UV-VIS-NIR測定装置（Perkin Elmer 社製、Lambda Bio 40 ）を用いた。
界面活性剤重量の測定
前記NP1’分散液3mLを凍結乾燥して固形分重量を求めた。その重量から、先に記載の粒子中の色素定量手順によって求めた色素の重量を引くことで界面活性剤の濃度を計算したところ、9.2mg/mLであった。
これはTween 20の臨界ミセル濃度の93.8倍に相当する。
過剰な界面活性剤の精製
前記NP1’分散液を超純水で3.1倍希釈して、Tween 20 濃度を3.0mg/mL、臨界ミセル濃度の30倍にした。AMICON 限外濾過撹拌式セルに再生セルロース製限外濾過フィルター（ウルトラセル-YM/PL、孔径30k ）（メルク株式会社製）をセットして、前記希釈溶液の限外濾過を行なった。フィルター上に残った溶液を回収し、NP1 とした。
色素あたりの界面活性剤の重量比の算出
前記方法により求めた粒子中の色素定量結果及び界面活性剤重量の値を用いて、色素あたりの界面活性剤の重量比を算出した。前期NP1’分散液1mL 中に含まれる界面活性剤の重量を、同じく色素量で除することで、色素あたりの界面活性剤の重量比とした。
【００６６】
（実施例2）
実施例1と同様の方法で粒子を作製した。この粒子をNP2’とする。
界面活性剤の濃縮
前記NP2’の分散液を、AMICON 限外濾過撹拌式セル及び再生セルロース製限外濾過フィルター（孔径30k ）を用いて限外濾過を行ない、体積を20分の1に濃縮した。
色素濃度は0.76mg/mL、界面活性剤濃度は133mg/mLであった。
前記濃縮溶液を超純水で10倍に希釈した。このときのTween 20 濃度は、臨界ミセル濃度の140倍に相当する。
この希釈溶液を実施例1 と同様の方法で限外濾過を行なって回収し、NP2 とした。
【００６７】
（実施例3）
実施例1 と同様に粒子を作製した後、実施例2 と同様に濃縮を行なった。この濃縮液を超純水で5倍に希釈した。このときのTween 20 濃度は、臨界ミセル濃度の280 倍に相当する。
この希釈溶液を実施例1 と同様の方法で限外濾過を行なって回収し、NP3 とした。
【００６８】
（実施例4）
界面活性剤にTween 80 （42 mg、日油株式会社製）を用いた以外は実施例1 と同様にして粒子を作製した後、実施例2 と同様に精製を行ない、NP4 とした。
【００６９】
（実施例5）
色素に銅（ＩＩ）２，９，１６，２３−テトラ−ターシャリーブチル−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン（Copper (II) 2, 9, 16, 23-tetra-tert-butyl-29H, 31H-phthalocyanine）を用いた以外は実施例1 と同様にして粒子を作製した後、実施例1 と同様に精製を行ない、NP 5 とした。
【００７０】
（実施例6）
色素に亜鉛  ２，９，１６，２３−テトラ−ターシャリーブチル−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン（Zinc 2, 9, 16, 23-tetra-tert-butyl-29H, 31H-phthalocyanine）を用いた以外は実施例1 と同様にして粒子を作製した後、実施例1 と同様に精製を行ない、NP 6 とした。
【００７１】
（比較例１）
実施例1 と同様にして粒子を作製した後、AMICON 限外濾過撹拌式セル及び再生セルロース製限外濾過フィルター（孔径30k ）を用いて濾液が出なくなるまで限外濾過を行なったところ、体積は140分の1に濃縮された。このときのTween 20 濃度は264 mg/mLで、臨界ミセル濃度の2670 倍に相当する。
【００７２】
（比較例2）
実施例と同様にして粒子を作製した後、AMICON 限外濾過撹拌式セル及び再生セルロース製限外濾過フィルター（孔径30k ）を用いて定容加水によって18時間の限外ろ過を行なった。このときのTween 20 濃度は、臨界ミセル濃度の4倍であった。
【００７３】
（比較例3）
実施例1 において、Tween 20 の量を60 mg に変更した以外は実施例1 と同様に粒子を作製した。このときのTween 20 濃度は、臨界ミセル濃度の29.7倍に相当する。
【００７４】
表１に実施例1〜4、及び比較例１〜3 に記載の粒子の平均粒径を示す。粒径測定は動的光散乱解析装置（大塚電子製、ELSZ-2）で行なった。光源に半導体レーザーを用いて測定を行い、キュムラント径の値を平均粒径として採用した。
【表１】
2015027965.tif 000004
【００７５】
表２に実施例1〜4、及び比較例1 に記載の粒子の粒径経時安定性を示す。
平均粒径20 nm 以下の粒子の割合は、下記要領で算出した。
各粒子溶液の吸光度を測定し、吸収極大波長における吸光度をＡとした。次に、前記粒子溶液を100,000 G、4℃で15分間の遠心分離を行って上清画分を回収し、吸光度を測定した。このときの吸収極大波長における吸光度をＢとした。
吸光度Ｂを吸光度Ａで除することにより、平均粒径20 nm 以下の保持率として算出した。
なお、上記条件で粒子溶液の遠心分離を行なうと、20 nm 以上の粒径を持つ粒子は沈殿することが実験から得られている。
【表２】
2015027965.tif 000005
【００７６】
表３に、実施例1 及び比較例3 に記載の粒子における20nm以下の粒子の割合を示す。
【表３】
2015027965.tif 000006
【００７７】
表１から、実施例1〜4に記載の粒子はいずれも平均粒径が20nm以下であることがわかる。また、比較例2 に記載の粒子の結果より、精製時にTween 20 濃度を臨界ミセル濃度の30倍未満に希釈すると凝集を生じることがわかる。
表２から、実施例1〜4に記載の粒子は、色素あたりの界面活性剤の重量比が60以上140未満であり、作製後6週間たっても20nm以下の粒径を保持していることがわかる。
表３から、粒子作製時の界面活性剤量が不十分だと20 nm 以下の粒子の収率は低いことがわかる。
【００７８】
表４に、実施例1及び実施例5〜6 に記載の粒子における平均粒径を示す。
【表４】
2015027965.tif 000007
疎水性ナフタロシアニン、疎水性フタロシアニンのいずれにおいても、本発明の方法で精製すると平均粒径20 nm 以下の粒子が得られた。
【００７９】
表5 に、実施例1 に記載の粒子、NP1 （精製あり）とNP1’ （精製なし）の、凍結乾燥前後の粒径を示す。
凍結乾燥後の平均粒径とは、凍結乾燥後の粉体に凍結乾燥前と同体積の超純水を加えて再分散させ、測定したものである。
【表５】
2015027965.tif 000008
過剰な界面活性剤を精製したNP1 は、凍結乾燥後に再分散しても100nm以下の小粒径を保っていることがわかる。
【００８０】
表6 に、実施例1 及び実施例4 に記載の粒子の光音響信号強度を示す。粒子当たりの光音響信号強度は、粒径を100nmに換算した値である。
【表６】
2015027965.tif 000009
【００８１】
本発明に記載の方法で精製を行なうと、始めに十分な濃度の界面活性剤存在下で粒子を作製し、そこから過剰な界面活性剤を精製しても、長期間、平均粒径20nm以下の分散を維持出来ることがわかる。また、本発明に記載の方法で得られた粒子は、光音響イメージングに十分な信号強度が得られることがわかる。