(57)【要約】      （修正有）【課題】新たなγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ（γＧＣＴ）を提供する。【解決手段】下記（Ｐ１）〜（Ｐ３）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質を、γＧＣＴとして使用する。（Ｐ１）青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）に由来する特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、（Ｐ２）前記（Ｐ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、（Ｐ３）前記（Ｐ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質【選択図】図１
2015109830.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｐ１）〜（Ｐ３）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ。
（Ｐ１）  配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｐ２）  前記（Ｐ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
（Ｐ３）  前記（Ｐ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
青枯病菌由来である、請求項１記載のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ。
【請求項３】
請求項１または２記載のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼと、その活性化剤とを含むことを特徴とする、前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ試薬。
【請求項４】
前記活性化剤が、真核生物のタンパク質抽出物である、請求項３記載の試薬。
【請求項５】
前記活性化剤が、真核生物のチオレドキシンである、請求項３または４記載の試薬。
【請求項６】
前記真核生物が、動物、植物、菌類および原生生物からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項４または５記載の試薬。
【請求項７】
下記（ｐ１）〜（ｐ３）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ遺伝子。
（ｐ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｐ２）前記（ｐ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｐ３）前記（ｐ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項８】
請求項７記載のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ遺伝子が挿入されていることを特徴とする、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼの発現ベクター。
【請求項９】
γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ遺伝子からγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼを発現させる発現工程を有し、
前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ遺伝子が、請求項７記載のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼの製造方法。
【請求項１０】
前記発現工程が、宿主内で、前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ遺伝子からγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼを発現させる、請求項９記載のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼの製造方法。
【請求項１１】
前記宿主が、酵母または大腸菌である、請求項１０記載のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼの製造方法。
【請求項１２】
前記発現工程において、前記宿主が、前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ遺伝子が導入された形質転換体である、請求項１０または１１記載のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼの製造方法。
【請求項１３】
前記宿主が、前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ遺伝子が挿入された発現ベクターにより、前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ遺伝子が導入された形質転換体である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼの製造方法。
【請求項１４】
さらに、前記発現工程後の前記宿主から、細胞内成分を放出させる放出工程を含む、請求項１０から１３のいずれか一項に記載のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼの製造方法。
【請求項１５】
γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼにより、グルタチオンから５−オキソプロリンを遊離する工程を含み、
前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼが、請求項１または２記載のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼであることを特徴とする、５−オキソプロリンの製造方法。
【請求項１６】
前記遊離工程において、前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼの活性化剤の存在下で、前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼを使用する、請求項１５記載の５−オキソプロリンの製造方法。
【請求項１７】
前記活性化剤が、真核生物のタンパク質抽出物である、請求項１６記載の５−オキソプロリンの製造方法。
【請求項１８】
前記活性化剤が、真核生物のチオレドキシンである、請求項１６または１７記載の５−オキソプロリンの製造方法。
【請求項１９】
前記真核生物が、動物、植物、菌類および原生生物からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１７または１８記載の５−オキソプロリンの製造方法。
【請求項２０】
γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼにより、グルタチオンからシステイン−グリシンジペプチドを遊離する工程を含み、
前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼが、請求項１または２記載のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼであることを特徴とする、システイン−グリシンジペプチドの製造方法。
【請求項２１】
前記遊離工程において、前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼの活性化剤の存在下で、前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼを使用する、請求項２０記載のシステイン−グリシンジペプチドの製造方法。
【請求項２２】
前記活性化剤が、真核生物のタンパク質抽出物である、請求項２１記載のシステイン−グリシンジペプチドの製造方法。
【請求項２３】
前記活性化剤が、真核生物のチオレドキシンである、請求項２１または２２記載のシステイン−グリシンジペプチドの製造方法。
【請求項２４】
前記真核生物が、動物、植物、菌類および原生生物からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項２２または２３記載のシステイン−グリシンジペプチドの製造方法。
【請求項２５】
被検物質から、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼのγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ活性を抑制する活性抑制物質を、防除薬候補物質として選択する選択工程を含み、
前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼが、請求項１または２記載のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼであることを特徴とする、青枯病の防除薬候補物質のスクリーニング方法。
【請求項２６】
前記選択工程において、前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ活性が、前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼの活性化剤の存在下における活性である、請求項２５記載の青枯病の防除薬候補物質のスクリーニング方法。
【請求項２７】
前記活性化剤が、真核生物のタンパク質抽出物である、請求項２６記載の青枯病の防除薬候補物質のスクリーニング方法。
【請求項２８】
前記活性化剤が、真核生物のチオレドキシンである、請求項２６または２７記載の青枯病の防除薬候補物質のスクリーニング方法。
【請求項２９】
前記真核生物が、動物、植物、菌類および原生生物からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項２７または２８記載の青枯病の防除薬候補物質のスクリーニング方法。
【請求項３０】
サンプルと請求項１または２記載のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼとを接触させ、前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼのγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ活性を測定することにより、前記サンプル中に含まれるチオレドキシンを分析することを特徴とする、チオレドキシン分析方法。
【請求項３１】
前記分析が、定性分析または定量分析である、請求項３０記載のチオレドキシン分析方法。
【請求項３２】
前記サンプルと接触させる前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼが、チオレドキシンと未結合の状態のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼである、請求項３０または３１記載のチオレドキシン分析方法。
【請求項３３】
前記サンプルと接触させる前記γ−グルタミルシクロトランフェラーゼが、チオレドキシン非発現の宿主において発現したγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼである、請求項３０から３２のいずれか一項に記載のチオレドキシン分析方法。
【請求項３４】
前記γ−グルタミルシクロトランフェラーゼが、原核生物である宿主において発現したγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼである、請求項３０から３３のいずれか一項に記載のチオレドキシン分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ遺伝子、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼの製造方法およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンは、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基に、システイン−グリシンジペプチドにおける前記システインのアミノ基が結合したトリペプチドである。グルタチオンは、強い抗酸化作用があり、また、グルタチオンから遊離される５−オキソプロリンおよびシステイン−グリシンジペプチドは、それぞれ、皮膚の保湿作用およびＵＶ酸化ストレス抑制作用があることが報告されている。
【０００３】
グルタチオンから、５−オキソプロリンおよびシステイン−グリシンジペプチドを遊離するγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼとして、ＣｈａＣファミリータンパク質が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、前記γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼは、グルタチオンに対する活性が低い。このため、グルタチオンに対する活性が高い新たなγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｕｍａｒ  ｅｔ．ａｌ．、「Mammalian  proapoptotic  factor  ChaC1  and  its  homologues  function  as  γ-glutamyl  cyclotransferases  acting  specifically  on  glutathione」、ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１２、１３、１０９５−１１０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、新たなγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼは、下記（Ｐ１）〜（Ｐ３）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする。
（Ｐ１）  配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｐ２）  前記（Ｐ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
（Ｐ３）  前記（Ｐ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
【０００７】
本発明において、以下、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼを、「γＧＣＴ」ともいい、グルタチオンを、「ＧＳＨ」ともいう。
【０００８】
本発明のγＧＣＴ試薬は、前記本発明のγＧＣＴと、その活性化剤とを含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明のγＧＣＴ遺伝子は、下記（ｐ１）〜（ｐ３）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｐ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｐ２）前記（ｐ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、γＧＣＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｐ３）前記（ｐ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、γＧＣＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００１０】
本発明のγＧＣＴの製造方法は、γＧＣＴ遺伝子からγＧＣＴを発現させる発現工程を有し、前記γＧＣＴ遺伝子が、前記本発明のγＧＣＴ遺伝子であることを特徴とする。
【００１１】
本発明のγＧＣＴの発現ベクターは、前記本発明のγＧＣＴ遺伝子が挿入されていることを特徴とする。
【００１２】
本発明の５−オキソプロリンの製造方法は、γＧＣＴにより、ＧＳＨから５−オキソプロリンを遊離する工程を含み、前記γＧＣＴが、前記本発明のγＧＣＴであることを特徴とする。
【００１３】
本発明のシステイン−グリシンジペプチドの製造方法は、γＧＣＴにより、ＧＳＨからシステイン−グリシンジペプチドを遊離する工程を含み、前記γＧＣＴが、前記本発明のγＧＣＴであることを特徴とする。
【００１４】
本発明の青枯病の防除薬候補物質のスクリーニング方法は、被検物質から、γＧＣＴのγ−ＧＣＴ活性を抑制する活性抑制物質を、前記防除薬候補物質として選択する選択工程を含み、前記γＧＣＴが、前記本発明のγＧＣＴであることを特徴とする。
【００１５】
本発明のチオレドキシン分析方法は、サンプルと前記本発明のγＧＣＴとを接触させ、前記γＧＣＴのγＧＣＴ活性を測定することにより、前記サンプル中に含まれるチオレドキシンを分析することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のγＧＣＴは、公知のγＧＣＴと比較して、グルタチオンに対する活性が高い。このため、本発明のγＧＣＴによれば、例えば、グルタチオンから５−オキソプロリンおよびシステイン−グリシンジペプチドを、より少ないタンパク質量で効率良く製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、実施例１におけるγＧＣＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図２】図２は、実施例１において、γＧＣＴを発現する形質転換酵母の細胞中グルタチオン濃度の相対値を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例１において、γＧＣＴの相対活性を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例２において、γＧＣＴを発現する形質転換酵母と変異γＧＣＴを発現する形質転換酵母のコロニー形成を示す写真である。
【図５】図５は、実施例３におけるγＧＣＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図６】図６は、実施例４におけるγＧＣＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図７】図７は、実施例４において、γＧＣＴ活性を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例５において、酵母タンパク質抽出液存在下での、反応液におけるシステイン濃度を示すグラフである。
【図９】図９は、実施例６において、各種真核生物由来のタンパク質抽出液存在下でのγＧＣＴ活性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施例７において、チオレドキシン存在下でのγＧＣＴ活性を示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施例８において、酵母ツーハイブリッド法によりＲＳｐ１０２２(野生型)とチオレドキシンとの相互作用を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
＜γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼおよび試薬＞
本発明のγＧＣＴは、前述のように、下記（Ｐ１）〜（Ｐ３）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする。
（Ｐ１）  配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｐ２）  前記（Ｐ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、γＧＣＴ活性を有するタンパク質
（Ｐ３）  前記（Ｐ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、γＧＣＴ活性を有するタンパク質
【００１９】
本発明において、前記γＧＣＴは、グルタチオンから５−オキソプロリンおよびシステイン−グリシンジペプチドを遊離する触媒活性を有するタンパク質であればよく、その種類および由来等は、特に制限されない。前記γＧＣＴは、例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属由来があげられる。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属は、例えば、青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）があげられる。
【００２０】
前記Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ由来γＧＣＴとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＰ＿５２２５８３で登録されているアミノ酸配列（配列番号１）からなるタンパク質があげられる。
【００２１】
前記（Ｐ１）における配列番号１のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｐ１）は、例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍから得ることができる。以下の配列において、２カ所の四角で囲んだ残基が触媒機能に関与する領域であり、一方の領域（ＹＬＳＬ）は、本発明のγＧＣＴの基質認識モチーフであり、他方の領域（Ｅ）は、本発明のγＧＣＴの活性中心である。
【００２２】
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【００２３】
前記（Ｐ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｐ２）が、前記γＧＣＴ活性を有する範囲であればよい。前記（Ｐ２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｐ１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜３個」との記載は、「１、２、３個」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００２４】
前記（Ｐ３）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｐ３）が、前記γＧＣＴ活性を有する範囲であればよい。前記（Ｐ３）の「同一性」は、前記（Ｐ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００２５】
前記（Ｐ２）および（Ｐ３）のタンパク質は、前記配列番号１のアミノ酸配列において、前記２カ所の触媒機能に関与する領域の残基（ＹＬＳＬおよびＥ）が保存されていることが好ましい。前記（Ｐ２）および（Ｐ３）のアミノ酸配列において、前記二か所の領域は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を基準として、アライメントを行うことで、判断できる。
【００２６】
本発明のγＧＣＴは、例えば、以下のような化学的特性を有する。
【００２７】
前記γＧＣＴの酵素活性は、特に制限されず、１ｕｎｉｔ（Ｕ）は、例えば、３７℃、ｐＨ８の条件下、１分間に、ＧＳＨから１μｍｏｌの５−オキソプロリンおよびシステイン−グリシンジペプチドを生成する酵素量と定義できる。
【００２８】
前記γＧＣＴは、ＧＳＨを基質とするγＧＣＴ活性を有していればよく、例えば、さらに、その他の触媒活性を有してもよい。
【００２９】
本発明のγＧＣＴは、例えば、前記アミノ酸からなるタンパク質の他に、さらに、活性化因子を含み、両者が複合体を形成してもよい。前記活性化因子は、例えば、チオレドキシン（ＴＲＸ）等があげられる。前記チオレドキシンは、例えば、Ｔｒｘ１、Ｔｒｘ  ｈ２、Ｔｒｘ  ｈ３、Ｔｒｘ  ｈ５等があげられる。前記活性化因子の由来は、特に制限されず、例えば、前記本発明のγＧＣＴにおける前記タンパク質と同じ由来でもよいし、異なってもよい。前記活性化因子の具体例として、酵母由来、植物由来等があげられる。前記酵母としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等があげられる。前記植物としては、Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ等があげられる。前記チオレドキシンの具体例は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＴｒｘ１（配列番号５）、ならびに、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＴｒｘ  ｈ２（配列番号６）、Ｔｒｘ  ｈ３（配列番号７）およびＴｒｘ  ｈ５（配列番号８）等があげられる。
【００３０】
前記チオレドキシンは、例えば、下記データベースのアクセッション番号で登録されている。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来Ｔｒｘ１：  ＮＣＢＩ  アクセッション番号＿００１１８１９３０．１
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来Ｔｒｘ  ｈ２：  ＮＣＢＩ  アクセッション番号＿１２３３５８．３
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来Ｔｒｘ  ｈ３：  ＮＣＢＩ  アクセッション番号＿１２３６６４．３
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来Ｔｒｘ  ｈ５：  ＮＣＢＩ  アクセッション番号１０３５８８．４
【００３１】
前記チオレドキシンとしては、例えば、以下のアミノ酸配列からなるタンパク質（１）または（２）も使用できる。下記（２）において、同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
（１）配列番号５〜８のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号５〜８のいずれかのアミノ酸配列に対する同一性が７０％以上のアミノ酸配列であって、前記（１）と同様の機能を奏するタンパク質
【００３２】
前記本発明のγＧＣＴは、前述のように、グルタチオンから、５−オキソプロリンおよびシステイン−グリシンジペプチド（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）を遊離する触媒活性を示す。このため、本発明のγＧＣＴは、グルタチオンからの５−オキソプロリンおよびＣｙｓ−Ｇｌｙの製造等に使用できる。また、本発明のγＧＣＴは、前記触媒活性を利用したグルタチオンの分析方法等にも使用できる。
【００３３】
本発明のγＧＣＴは、例えば、後述する本発明のγＧＣＴの製造方法により製造することができる。
【００３４】
つぎに、本発明のγＧＣＴ試薬は、前記本発明のγＧＣＴと、その活性化剤とを含むことを特徴とする。
【００３５】
前記活性化剤は、例えば、真核生物のタンパク質抽出物であり、前記真核生物は、特に制限されず、例えば、動物、植物、菌類および原生生物からなる群から選択された少なくとも一つである。前記菌類は、例えば、酵母があげられる。
【００３６】
前記活性化剤は、例えば、前述した活性化因子であるチオレドキシンおよびその誘導体があげられ、好ましくは、真核生物由来のチオレドキシンおよびその誘導体である。前記チオレドキシンは、例えば、前述した通りである。
【００３７】
本発明のγＧＣＴ試薬において、前記γＧＣＴと前記活性化剤とは、例えば、複合体を形成してもよい。
【００３８】
前記本発明のγＧＣＴが、非真核生物の形質転換体で発現したγＧＣＴの場合、前記γＧＣＴは、例えば、前記活性化剤と共存させることが好ましい。
【００３９】
＜γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ遺伝子＞
本発明のγＧＣＴ遺伝子は、前述のように、下記（ｐ１）〜（ｐ７）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｐ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｐ２）前記（ｐ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、γＧＣＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｐ３）前記（ｐ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、γＧＣＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｐ４）前記（ｐ１）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、γＧＣＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｐ５）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｐ６）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、γＧＣＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｐ７）配列番号１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、γＧＣＴ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００４０】
本発明のγＧＣＴ遺伝子は、例えば、前記本発明のγＧＣＴを、遺伝子工学的手法によって合成する際に有用である。
【００４１】
配列番号２の塩基配列は、以下の通りである。配列番号２の塩基配列は、前記配列番号１のアミノ酸配列からなる本発明のγＧＣＴ（Ｐ１）のコード配列である。配列番号２のポリヌクレオチド（ｐ１）は、例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍから得ることができる。前記Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ由来のγＧＣＴのコード配列としては、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＡＬ６４６０５３で登録されている塩基配列における１２８８８５４−１２９０１０４番目の領域（終始コドン含む）があげられる。
【００４２】
（ｐ１）のポリヌクレオチド（配列番号２）
ATGGAAAGAATCTCGACAAATGCCATCTCCAAGACGGTTGCACGGTCGGACCTGAGCAATGGAAGCTCGGCGCCCCCCAGAAAGAAAAACGGCTCGCCGCCGAGACGCGCCCATGCACCGCTTCTCCCGCTGGCCGACCGCAGCCTGACGGCCATTTCGAAGCCCAACGAAACGCTCGGCAGCCGGCTCGCGCCTGTACCGCAACGCGCCGTGCACGCCAGCGCCGTCCCGAGCGCCGCCGGGAACTGGAACCCGCTGTCCCGCCTGAAACCGGAGGAACTGGCGGGCATTCCTGAAACGGTTGTCGAGAAGTTGGGGAAGGATCTGCACGACCTTTACGAAGATGTGCAAAGCAAGGGACTCAACTACGTACCGGTGTTCGGTTATCTGTCGCTGCGCTACAAGAATTTCCATGAACTCGGCAAGCGCAGCCAGGATGAAGTCCGCGAAGGAAAAGACTGGGTCCCGGCCTCGCTGGACAATCACGCCCTGGATTTCGTGATGAGCACCCAGTATCGGGGCCACCATCAACACCCCGGTGTCGTGGCGGGCCTGAGCCAAAGCGAGGGAAGCGCCATGGACGGGGTCATCCTGAAGCTGCCGGTCGGCAACGCTGAAGAGCTGCTCGCCCGTGTCATCCGCCGGGAACTACTGGACGAGAATGACCTGATCCACCCCGTGCCGGCGACCCCACCAGCGGGAACGACCGGGCTCGCCGGTTCGGCAACTGCCGGTCCGGCAACGCCGCTCTCCCCTAAAAAACCGCGCTCCAACCTGATGTACAGCAGCGCCGTCAGACCGGTCACCCTGCCGAATGGCGCCAAGGTCAGAGCGCTGGTGTTCGTGACCAATCCCGACAGCGCCAAATCGCTGGCGAGCGTGTTCAAGGACCGCGAAGGTGTCTCGCCTCAGCGGTTGGCCTATCTGATGACGAGCACGAGCAAGGGCGATCTGGGAGGACCGGCGATCGACTACTGGAAGCGCTTTGTCGAAACCTGCGAAACAGCCAAGACTGCCGTGCCGCCGATCGTGAGCCAGGCGATCCGGCTCGCCAGCGACTGGCCGGACGCATTCACCGGCGAGCCGGCAGCCCCGGACGACATGCCGCGACAGCACCAGGAAGCGGCATGGTTCCGCGCGATGGCCGGCGCCGCGGCCCCGCGCCGCGTCTGGCATGAGCGCAAGCCGGAGCCGAGTCCCGATGGCGCAAGCGCAGGAGGCACATTGGGCACGCAGCCCAAACCCGACTGA
【００４３】
前記（ｐ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｐ２）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記γＧＣＴ活性を有する範囲であればよい。前記（ｐ２）の「１もしくは数個」は、前記（ｐ１）の塩基配列（配列番号２）において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよい。
【００４４】
前記（ｐ３）において、「同一性」は、例えば、前記（ｐ３）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記γＧＣＴ活性を有する範囲であればよい。前記（ｐ３）の同一性は、前記（ｐ１）の塩基配列（配列番号２）に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
【００４５】
前記（ｐ４）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ｐ１）の塩基配列（配列番号２）からなるポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【００４６】
前記（ｐ４）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
【００４７】
前記（ｐ５）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｐ５）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記γＧＣＴ活性を有する塩基配列であればよい。前記（ｐ５）のポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。
【００４８】
前記（ｐ６）において、アミノ酸配列に関する「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｐ６）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記γＧＣＴを有する範囲であればよい。前記（ｐ６）の「１もしくは数個」は、例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【００４９】
前記（ｐ７）において、アミノ酸配列に関する「同一性」は、例えば、前記（ｐ７）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記γＧＣＴ活性を有する範囲であればよい。前記（ｐ７）の同一性は、前記配列番号１のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
【００５０】
本発明において、前記各種ポリヌクレオチドは、例えば、公知の遺伝子工学的手法または合成手法によって製造できる。
【００５１】
＜γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼの発現ベクター＞
本発明の発現ベクターは、前述のように、前記本発明のγＧＣＴ遺伝子が挿入されていることを特徴とする。本発明の発現ベクターによれば、例えば、前記発現ベクターを後述する宿主に導入することで、前記本発明のγＧＣＴを容易に製造できる。
【００５２】
前記発現ベクターは、例えば、前記本発明のγＧＣＴ遺伝子がコードするγＧＣＴを発現可能なように、前記γＧＣＴ遺伝子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。
【００５３】
前記発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、前記γＧＣＴ遺伝子を挿入することで作製できる。前記ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記ベクターは、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターがあげられる。前記導入方法としてヒートショック法により前記宿主の形質転換を行う場合、前記ベクターは、例えば、バイナリーベクターが好ましく、ｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（ノバジェン社）、ｐＱＥ−８０Ｌベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）、ｐＵＣＰ２６Ｋｍベクター、ｐＥＴ２３ｄベクター（ノバジェン社）等があげられる。大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、前記ベクターは、ｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター、ｐＱＥ−８０Ｌベクター、例えば、ｐＥＴ２３ｄベクター等があげられる。酵母等の真核生物に形質転換を行う場合、前記基本ベクターとして、例えば、ｐＹＥ２２ｍ等があげられ、また、ｐＹＥＳ（Invitrogen社）、ｐＥＳＣ（Stratagene社）等の市販の酵母発現用ベクターを用いることもできる。
【００５４】
前記発現ベクターは、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現および前記ポリヌクレオチドがコードする前記本発明のγＧＣＴの発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記プロモーターは、特に制限されず、例えば、ガラクトース誘導性プロモーター等があげられる。前記ガラクトース誘導性プロモーターは、例えば、ＧＡＬ１プロモーター等があげられる。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は特に制限されない。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現およびこれがコードする前記γＧＣＴの発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
【００５５】
前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
【００５６】
前記発現ベクターは、例えば、さらに、タグ配列のコード配列を有してもよい。前記タグ配列は、例えば、ＦＬＡＧタグ、３×ＦＬＡＧタグ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａタグ、Ｈｉｓ６タグ等があげられる。
【００５７】
＜γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼの製造方法＞
本発明のγＧＣＴの製造方法は、前述のように、γＧＣＴ遺伝子からγＧＣＴを発現させる発現工程を有し、前記γＧＣＴ遺伝子が、前記本発明のＧＣＴ遺伝子であることを特徴とする。本発明のγＧＣＴの製造方法は、本発明のγＧＣＴ遺伝子からγＧＣＴを発現させることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。
【００５８】
また、前記発現工程において、前記γＧＣＴ遺伝子は、例えば、前記γＧＣＴ遺伝子そのものを使用してもよいし、前記γＧＣＴ遺伝子が挿入された前記本発明の発現ベクターを使用してもよい。
【００５９】
本発明の製造方法は、前記本発明のγＧＣＴ遺伝子からのγＧＣＴ発現により、前記本発明のγＧＣＴを合成することが特徴であり、その他の方法および条件は、何ら制限されない。本発明の製造方法において、前記本発明のγＧＣＴの発現は、公知の方法が採用でき、例えば、宿主を使用してもよいし、無細胞タンパク質合成系を使用してもよい。
【００６０】
前者の宿主を使用する形態の場合、前記発現工程は、例えば、宿主内で、前記γＧＣＴ遺伝子から前記γＧＣＴを発現させる工程である。前記発現工程において、前記宿主は、例えば、前記γＧＣＴ遺伝子または前記発現ベクターが導入された形質転換体であることが好ましく、前記形質転換体の培養により、前記宿主において前記γＧＣＴを発現させることが好ましい。
【００６１】
前記発現工程は、例えば、前記γＧＣＴ遺伝子を宿主に導入して、前記形質転換体を製造する工程を含んでもよい。本発明のγＧＣＴを合成する前記形質転換体は、例えば、前記γＧＣＴ遺伝子を宿主に導入することで製造できる。
【００６２】
前記宿主は、特に制限されず、例えば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、または、これらの培養細胞等の非ヒト宿主、単離したヒト細胞またはその培養細胞等があげられる。前記微生物は、例えば、原核生物および真核生物等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属があげられる。前記大腸菌としては、例えば、Ｒｏｓｅｔｔａｇａｍｉ  Ｂ  （ＤＥ３）  ｐＬｙｓＳ株等があげられる。前記真核生物は、例えば、酵母等があげられる。前記酵母は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等があげられる。前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ＢＹ４７４３株等があげられる。前記Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅは、例えば、ＡＲＣ０３９株等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等があげられる。
【００６３】
前記γＧＣＴ遺伝子を前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。前記導入方法は、例えば、ヒートショック法、酢酸リチウム法、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。
【００６４】
前記宿主の培養の方法は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜設定できる。培養に使用する培地は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜決定できる。
【００６５】
後者の無細胞タンパク質合成系を使用する形態の場合、前記発現工程は、例えば、無細胞タンパク質合成系において、前記γＧＣＴ遺伝子から前記γＧＣＴを発現させる工程である。前記無細胞タンパク質合成系は、例えば、細胞抽出液と、各種成分を含むバッファーと、目的のポリヌクレオチドが導入された発現ベクターとを用いて、公知の方法により行うことができ、例えば、市販の試薬キットが使用できる。
【００６６】
本発明の製造方法は、例えば、さらに、前記γＧＣＴの精製工程を含んでもよい。例えば、前記γＧＣＴを細胞内成分として発現させた場合、前記精製工程は、前記宿主から、前記γＧＣＴを含む細胞内成分を放出させる放出工程、および、細胞残渣を含む固体画分と前記γＧＣＴを含む液体画分とを分離する固液分離工程を含んでもよい。前記宿主から細胞内成分を放出させる方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができ、例えば、前記宿主をホモジネートする方法等があげられる。また、前記γＧＣＴを細胞外成分として発現させた場合、前記精製工程は、例えば、前記宿主の培養物について、前記宿主の細胞を含む固体画分と前記γＧＣＴを含む液体画分とを分離する固液分離工程を含んでもよい。本発明のγＧＣＴは、例えば、前記本発明のγＧＣＴ遺伝子として、前記（ｐ１）〜（ｐ７）のポリヌクレオチドに、細胞外への分泌に関与するシグナルペプチドのコード配列を連結したものを使用することで、細胞外酵素として発現させることもできる。
【００６７】
前記精製工程において、前記γＧＣＴの精製方法は、特に制限されず、例えば、塩析、各種カラムクロマトグラフィー等があげられる。前記各種精製工程において使用する溶媒は、特に制限されず、例えば、緩衝液が使用できる。
【００６８】
本発明の製造方法により得られたγＧＣＴは、例えば、そのまま粗酵素（非精製酵素）として使用してもよいし、部分的に精製した部分精製酵素として使用してもよいし、単一に精製した精製酵素として使用してもよい。
【００６９】
本発明の製造方法において、発現したγＧＣＴは、例えば、前述した活性化剤（具体例として、前記活性因子）と併存させることが好ましい。この場合、例えば、前記宿主内で、前記γＧＣＴと前記活性因子とを、共発現させることによって、併存させてもよいし、前記宿主内で発現させたγＧＣＴを単離した後、前記活性因子と併存させてもよい。前記宿主として、例えば、大腸菌を使用した場合、前記活性因子は、酵母由来のチオレドキシンが好ましい。
【００７０】
＜有用分解物の製造方法＞
本発明の５−オキソプロリンの製造方法は、前述のように、γＧＣＴにより、グルタチオンから５−オキソプロリンを遊離する工程を含み、前記γＧＣＴが、前記本発明のγＧＣＴであることを特徴とする。前記本発明の製造方法は、前記γＧＣＴとして、前記本発明のγＧＣＴを使用することが特徴であり、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【００７１】
前記５−オキソプロリン遊離工程は、例えば、前記ＧＳＨと前記γＧＣＴとの接触により行うことができる。前記接触方法は、特に制限されず、例えば、酵素を用いる一般的な手段が採用でき、具体例として、前記ＧＳＨと前記γＧＣＴとを含む反応系が使用できる。前記反応系において、前記γＧＣＴは、例えば、遊離した状態で使用してもよいし、担体に固定化した状態で使用してもよい。後者の固定化酵素の場合、前記担体の種類は、特に制限されず、例えば、プレート、容器等の基板、ビーズ、フィルター等、公知の担体が使用できる。前記反応系は、例えば、反応液である。
【００７２】
前記５−オキソプロリン遊離工程において、前記γＧＣＴの使用量は、特に制限されず、例えば、グルタチオン  １ｇに対して、単位Ｕの場合、５５〜５５０Ｕが好ましく、より好ましくは５５〜４００Ｕであり、さらに好ましくは１００〜３００Ｕであり、また、タンパク質量の場合、１５５〜１５００μｇが好ましく、より好ましくは１５５〜１１００μｇであり、さらに好ましくは２８０〜８５０μｇである。
【００７３】
前記５−オキソプロリン遊離工程において、前記γＧＣＴの反応の条件は、特に制限されず、例えば、使用する前記γＧＣＴの化学特性に応じて適宜設定できる。反応温度は、例えば、２５〜４５℃が好ましく、より好ましくは３０〜４０℃であり、さらに好ましくは３５〜３７℃である。反応時間は、例えば、１０〜１２０分が好ましく、より好ましくは３０〜９０分であり、さらに好ましくは４０〜６０分である。前記反応系のｐＨは、例えば、ｐＨ６〜９が好ましく、より好ましくはｐＨ６．５〜８．５であり、さらに好ましくはｐＨ７〜８である。
【００７４】
前記反応系は、グルタチオンおよび前記γＧＣＴの他に、例えば、溶媒、前記γＧＣＴに対する補酵素、イオン性化合物、ジチオスレイトール等の還元剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤等を含んでもよい。前記溶媒は、例えば、水、緩衝液等の水性溶媒があげられ、前記緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等が使用でき、前記緩衝液によって、例えば、前記反応系のｐＨを調整することが好ましい。
【００７５】
前記本発明の５−オキソプロリンの製造方法は、さらに、前記反応系から前記５−オキソプロリンを回収する工程を含んでもよい。５−オキソプロリンの回収方法は、特に制限されず、例えば、ＨＰＬＣ、ＴＬＣ等があげられる。
【００７６】
つぎに、本発明のシステイン−グリシンジペプチド（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）の製造方法は、前述のように、γＧＣＴにより、前記ＧＳＨからＣｙｓ−Ｇｌｙを遊離する工程を含み、前記γＧＣＴが、前記本発明のγＧＣＴであることを特徴とする。本発明のＣｙｓ−Ｇｌｙの製造方法は、前記γＧＣＴとして前記本発明のγＧＣＴを使用することが特徴であり、その他の構成および工程は、何ら制限されない。
【００７７】
前記Ｃｙｓ−Ｇｌｙ遊離工程は、前記本発明の５−オキソプロリンの製造方法における前記５−オキソプロリン遊離工程と同様にして行うことができる。
【００７８】
前記本発明のＣｙｓ−Ｇｌｙの製造方法は、さらに、前記反応系からＣｙｓ−Ｇｌｙを回収する工程を含んでもよい。前記Ｃｙｓ−Ｇｌｙの回収方法は、特に制限されず、例えば、ＨＰＬＣ、ＴＬＣ等があげられる。
【００７９】
本発明の製造方法（例えば、５−オキソプロリンの製造方法、Ｃｙｓ−Ｇｌｙの製造方法）は、前記γＧＣＴを使用する際、前記活性化剤を共存させることが好ましい。具体的には、例えば、前記遊離工程において、前記活性化剤の存在下で、前記γＧＣＴを使用することが好ましい。前記活性化剤は、例えば、前述の通りである。
【００８０】
＜グルタチオンの分析方法＞
本発明のグルタチオンの分析方法は、前述のように、γＧＣＴにより、試料中のグルタチオンからＣｙｓ−Ｇｌｙを遊離する工程、ジペプチダーゼにより、前記遊離したＣｙｓ−Ｇｌｙからシステインを遊離する工程および前記システインを分析する工程を含み、前記γＧＣＴが、本発明のγＧＣＴであることを特徴とする。本発明は、前記γＧＣＴとして本発明のγＧＣＴを使用することが特徴であり、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明における分析は、例えば、定性分析、定量分析および半定量分析のいずれでもよい。
【００８１】
前記試料の種類は、特に制限されず、例えば、前記ＧＳＨを含有する試料、含有すると考えられる試料、含有の有無が不明な試料等が対象となる。前記試料は、例えば、固体でも液体でもよい。前記試料が固体の場合、例えば、溶媒への懸濁、分散または溶解等の前処理を施し、前処理後の試料を、本発明の分析方法に供することが好ましい。
【００８２】
前記Ｃｙｓ−Ｇｌｙ遊離工程において、前記γＧＣＴの使用量は、特に制限されず、例えば、前記試料１ｍＬに対して、単位Ｕの場合、０．２〜４Ｕが好ましく、より好ましくは０．３〜３Ｕであり、さらに好ましくは０．４〜２Ｕであり、また、タンパク質量の場合、０．６〜１１．２μｇが好ましく、より好ましくは０．９〜８．４μｇであり、さらに好ましくは１．２〜５．６μｇである。
【００８３】
前記Ｃｙｓ−Ｇｌｙ遊離工程の条件等は、特に制限されず、前記本発明の５−オキソプロリンの製造方法における５−オキソプロリン遊離工程の説明を援用できる。
【００８４】
前記システイン遊離工程において、前記ジペプチダーゼは、特に制限されず、例えば、前記Ｃｙｓ−Ｇｌｙからシステインを遊離する活性を有すればよい。前記ジペプチダーゼは、Ｃｙｓ−Ｇｌｙジペプチダーゼがあげられ、その種類および由来は、特に制限されない。前記Ｃｙｓ−Ｇｌｙジペプチダーゼは、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来等があげられ、具体例として、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＰ＿１１６７０２で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質が例示できる。
【００８５】
前記システイン遊離工程は、例えば、前記Ｃｙｓ−Ｇｌｙ遊離工程で得られたＣｙｓ−Ｇｌｙと前記ジペプチダーゼとの接触により行うことができる。本発明の分析方法において、前記Ｃｙｓ−Ｇｌｙ遊離工程および前記システイン遊離工程は、例えば、前記Ｃｙｓ−Ｇｌｙ遊離工程の後に、前記システイン遊離工程を行ってもよいし、前記Ｃｙｓ−Ｇｌｙ遊離工程と前記システイン遊離工程とを並行して行ってもよい。
【００８６】
前記反応系において、前記ジペプチダーゼは、例えば、遊離した状態で使用してもよいし、担体に固定化した状態で使用してもよい。後者の固定化酵素の場合、前記担体の種類は、特に制限されず、前述と同様である。
【００８７】
前記システイン遊離工程において、前記ジペプチダーゼの使用量は、特に制限されず、例えば、前記Ｃｙｓ−Ｇｌｙ遊離工程における前記試料１ｍＬに対して、タンパク質量の場合、０．０１〜０．５μｇが好ましく、より好ましくは０．０２５〜０．２μｇであり、さらに好ましくは０．０５〜０．１μｇである。
【００８８】
前記システイン遊離工程において、前記ジペプチダーゼの反応の条件は、特に制限されず、使用する前記ジペプチダーゼの化学特性に応じて適宜設定できる。反応温度は、例えば、２５〜４０℃が好ましく、より好ましくは３０〜３７℃である。反応時間は、例えば、１０〜９０分が好ましく、より好ましくは３０〜６０分である。反応ｐＨは、例えば、６〜９が好ましく、より好ましくは７〜８である。
【００８９】
前記反応系は、前記Ｃｙｓ−Ｇｌｙおよび前記ジペプチダーゼの他に、例えば、溶媒、前記ジペプチダーゼに対する補酵素、イオン性化合物、ジチオスレイトール等の前記還元剤等を含んでもよい。前記溶媒は、例えば、水、緩衝液等の水性溶媒があげられ、前記緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等が使用でき、前記緩衝液によって、例えば、前記反応系のｐＨを調整することが好ましい。前記イオン性化合物は、例えば、二価イオンを遊離する化合物等があげられ、前記二価イオンとしては、例えば、マグネシウム等があげられる。
【００９０】
つぎに、前記システイン分析工程において、システインを分析する方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記分析方法は、例えば、ＨＰＬＣ、酸性ニンヒドリン反応を使用する方法等があげられる。
【００９１】
本発明の分析方法において、前記システイン分析工程は、例えば、前記システイン遊離工程の後に行ってもよいし、前記システイン遊離工程と前記システイン分析工程とを並行して行ってもよいし、前記Ｃｙｓ−Ｇｌｙ遊離工程と前記システイン遊離工程と前記システイン分析工程とを並行して行ってもよい。
【００９２】
本発明の分析方法は、前記γＧＣＴを使用する際、前記活性化剤を共存させることが好ましい。具体的には、例えば、前記Ｃｙｓ−Ｇｌｙ遊離工程において、前記活性化剤の存在下で、前記γＧＣＴを使用することが好ましい。前記活性化剤は、例えば、前述の通りである。
【００９３】
＜グルタチオンの分析試薬＞
本発明の分析試薬は、前述のように、ＧＳＨの分析試薬であって、γＧＣＴおよびジペプチダーゼを含み、前記γＧＣＴが、前記本発明のγＧＣＴであることを特徴とする。
【００９４】
本発明の分析試薬によれば、前記本発明のＧＳＨの分析方法を、より簡便に行うことができる。本発明の分析試薬は、前記γＧＣＴとして前記本発明のγＧＣＴを使用することが特徴であり、その他の構成は、特に制限されない。前記本発明のγＧＣＴおよび前記ペプチダーゼは、前述の通りである。
【００９５】
本発明の分析試薬は、例えば、さらに、前記本発明の分析方法において使用できる成分を備えてもよい。前記成分は、例えば、前述と同様である。
【００９６】
本発明の分析試薬は、例えば、さらに、前記活性化剤を含むことが好ましい。前記活性化剤は、例えば、前述の通りである。本発明の分析試薬は、例えば、γＧＣＴの使用時において、前記活性化剤を共存させることが好ましい。
【００９７】
本発明の分析試薬は、例えば、１つの容器に各成分が収容されてもよいし、複数の容器に各成分が別個に収容されてもよい。後者の場合、本発明の分析試薬は、例えば、分析用キットともいう。本発明の分析用キットは、例えば、さらに、使用説明書を備えてもよい。
【００９８】
＜スクリーニング方法＞
本発明のスクリーニング方法は、前述のように、青枯病の防除薬候補物質のスクリーニング方法であって、被検物質から、γＧＣＴのγＧＣＴ活性を抑制する活性抑制物質を、前記防除薬候補物質として選択する選択工程を含み、前記γＧＣＴが、前記本発明のγＧＣＴであることを特徴とする。前記本発明のスクリーニング方法は、前記防除薬候補物質のターゲットが、前記本発明のγＧＣＴであることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。
【００９９】
前記活性抑制物質は、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、核酸等があげられる。
【０１００】
本発明の前記活性抑制物質のスクリーニング方法は、例えば、前記γＧＣＴ、前記ＧＳＨおよび前記被検物質を含む反応系において、前記γＧＣＴのγＧＣＴ活性を検出する活性検出工程と、前記γＧＣＴのγＧＣＴ活性を低下させた前記被検物質を、前記防除薬候補物質として選択する候補物質選択工程とを含む。
【０１０１】
本発明のスクリーニング方法は、前記選択工程において、前記γＧＣＴ活性が、前記γＧＣＴの活性化剤の存在下における活性であることが好ましい。前記活性化剤は、例えば、前述の通りである。
【０１０２】
＜チオレドキシンの分析方法＞
本発明のチオレドキシンの分析方法は、前述のように、サンプルと前記本発明のγＧＣＴとを接触させ、前記γＧＣＴのγＧＣＴ活性を測定することにより、前記サンプル中に含まれるチオレドキシンを分析することを特徴とする。本発明において、分析は、例えば、定性分析でもよいし、定量分析でもよい。
【０１０３】
前述のように、本発明のγＧＣＴは、例えば、前述のように、前記活性化因子との複合体の形成により、γＧＣＴ活性を示すことがわかった。このため、サンプルと前記本発明のγＧＣＴとを接触させ、前記γＧＣＴの活性を測定した際、前記γＧＣＴ活性の有無によって、前記サンプルにおける前記活性化因子の有無が分析でき（定性分析）、また、前記γＧＣＴ活性の程度によって、前記サンプルにおける前記活性化因子の量が分析できる（定量分析）。
【０１０４】
本発明の分析方法において、前記サンプルと接触させる前記γＧＣＴは、例えば、チオレドキシンと未結合の状態のγＧＣＴである。このような前記γＧＣＴは、例えば、前記チオレドキシン非発現の宿主において、前記本発明のγＧＣＴ遺伝子を発現させることで得られる。前記チオレドキシン非発現の宿主としては、例えば、前述のような原核生物があげられ、具体例としては、例えば、大腸菌である。
【０１０５】
本発明の分析方法においては、例えば、予め準備した相関関係を用いて、前記測定したγＧＣＴ活性から、チオレドキシンを定量することができる。前記相関関係は、例えば、チオレドキシン濃度と、前記濃度のチオレドキシン存在下での前記γＧＣＴ活性との関係であり、具体例として、前記相関関係を示す相関式および検量線等が使用できる。
【実施例】
【０１０６】
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。
【０１０７】
［実施例１］
本例では、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ由来γＧＣＴ（ＲＳｐ１０２２（野生型））遺伝子を導入した形質転換酵母を作製し、γＧＣＴの発現および活性を確認した。
【０１０８】
（１）発現ベクターの構築
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍのゲノムＤＮＡを鋳型として、γＧＣＴ（配列番号１）をコードするＲＳｐ１０２２  ｃＤＮＡ(野生型、配列番号２）を増幅した。得られた前記ＲＳｐ１０２２  ｃＤＮＡ（野生型）を、自家調製したＧａｔｅｗａｙバイナリーベクターｐＭＴ１２９４のクローニングサイトに連結し、ＲＳｐ１０２２（野生型）発現ベクターを構築した。前記ｐＭＴ１２９４は、前記クローニングサイトの５’側にガラクトース誘導性プロモーター（ＧＡＬ１プロモーター）が配置され、３’側に３×ＦＬＡＧタグおよび精製用タグ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａタグ）をコードする塩基配列が機能的に発現するように、連結して配置されている。
【０１０９】
また、部位特異的変異導入法により、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）発現ベクターから、変異ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）発現ベクターを作製した。前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）発現ベクターは、前記γＧＣＴ（配列番号１）の２１６番目のグルタミン酸がグルタミンに置換された変異γＧＣＴ（ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ））をコードするＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）  ｃＤＮＡが挿入されている。なお、後述するように、前記γＧＣＴ（配列番号１）の２１６番目のグルタミン酸は、γＧＣＴの活性中心であり、変異ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）は、グルタミンへの置換により、γＧＣＴ活性が低い不活性型のγＧＣＴである。
【０１１０】
他方、比較例のγＧＣＴとして、酵母由来のＣｈａＣタンパク質を発現する発現ベクターを構築した。具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＣｈａＣタンパク質（ＹＥＲ１６３ｃ）（配列番号３）をコードするＹＥＲ１６３ｃ  ｃＤＮＡ（配列番号４）を増幅した。得られた前記ＹＥＲ１６３ｃ  ｃＤＮＡを、同様にして、前記ベクターのクローニングサイトに連結し、ＹＥＲ１６３ｃ発現ベクターを構築した。
【０１１１】
ＹＥＲ１６３ｃ（配列番号３）
MTNDNSGIWVLGYGSLIYKPPSHYTHRIPAIIHGFARRFWQSSTDHRGTPANPGRVATLIPYEDIIRQTAFLKNVNLYSESAPIQDPDDLVTIGVVYYIPPEHAQEVREYLNVREQNGYTLHEVEVHLETNREHEAELGEALEQLPRHNKSGKRVLLTSVYIGTIDNEAFVGPETVDETAKVIAVSHGPSGSNYEYLAKLEQALAQMPIMKERGRITDHYLTALLETVNKYR
ＹＥＲ１６３ｃ  ｃＤＮＡ（配列番号４）
ATGACTAATGACAACAGTGGTATCTGGGTCCTAGGCTACGGATCTCTGATTTACAAGCCTCCGTCTCATTACACGCATAGAATACCGGCAATAATTCACGGTTTTGCTCGTCGGTTCTGGCAAAGTTCCACTGATCATAGGGGTACACCTGCAAACCCAGGAAGAGTGGCCACACTAATCCCGTATGAGGATATTATAAGGCAAACTGCCTTCTTGAAGAATGTGAATTTGTATAGTGAAAGTGCACCTATCCAGGATCCCGACGACTTAGTCACCATAGGGGTAGTGTATTATATACCACCAGAACATGCTCAAGAGGTTAGAGAGTATTTGAACGTAAGAGAACAAAACGGGTACACTCTACATGAGGTTGAGGTGCATCTAGAAACTAATCGGGAGCACGAGGCAGAATTGGGTGAAGCATTAGAACAGTTGCCTCGGCACAACAAATCGGGTAAACGGGTACTACTTACTTCGGTGTACATTGGTACAATAGATAATGAGGCCTTCGTCGGACCAGAGACCGTGGATGAAACTGCGAAAGTAATTGCCGTGTCGCATGGACCTAGTGGATCTAACTATGAATACCTTGCAAAACTGGAGCAAGCGCTAGCGCAAATGCCCATCATGAAAGAGCGAGGGCGTATTACCGATCATTATCTGACTGCTCTATTGGAGACTGTAAATAAATACAGGTGA
【０１１２】
（２）形質転換酵母の作製
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４３株に、酢酸リチウム法により、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）発現ベクター、前記ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）発現ベクターおよび前記ＹＥＲ１６３ｃ発現ベクターを、それぞれ単独で導入した。得られた各形質転換体を、ウラシル不含合成（ＳＤ）培地を用い、２６℃で７２時間培養し、形質転換酵母を回収した。
【０１１３】
（３）リコンビナントタンパク質の発現の確認
前記形質転換酵母を、２０ｍｇ／ｍＬグルコースを含むＳＤ培地を用い、ＯＤ６００ｎｍ＝０．２となるまで２６℃で１８時間培養した。前記培養後の形質転換酵母を２０００ｒｐｍで５分間遠心し、ペレットを回収した。前記ペレットは、滅菌水で３回遠心洗浄した。つぎに、前記洗浄後の形質転換酵母を、ガラクトースを含む合成（ＳＧａｌ）培地に播種し、２６℃で１８時間培養し、リコンビナントタンパク質を発現させた。そして、培養した前記形質転換酵母を回収し、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴを含む緩衝液（１ｍｏｌ／Ｌソルビトール、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁した。
【０１１４】
前記懸濁液に、前記形質転換酵母ＯＤ６００ｎｍ＝１０あたり１μＬのザイモリアーゼ（商品名：２０Ｔ、ナカライテスク社）を加え、３０℃で１時間反応させ、細胞壁を溶解してスフェロプラスト化した。つぎに、前記スフェロプラストを遠心により回収し、前記緩衝液で洗浄した。さらに、前記スフェロプラストＯＤ６００ｎｍ＝１０あたり、１ｍＬのライシスバッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．１％  ＮＰ−４０、ｐＨ７．５)を加え、ダウンスホモジナイザーを用い、２０ストローク上下させることで前記スフェロプラストを破砕した。そして、前記破砕液を、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心し、リコンビナントタンパク質を含む上清（無細胞抽出液）を回収した。
【０１１５】
前記無細胞抽出液と、ＩｇＧ結合セファロースビーズ（GEヘルスケア社）とを混合し、前記リコンビナントタンパク質におけるプロテインＡと前記ビーズのＩｇＧとを結合させた。そして、遠心によって前記ビーズを回収後、前記ライシスバッファーで３回遠心洗浄し、ビーズに結合させた状態の精製サンプルを調製した。
【０１１６】
つぎに、前記精製サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、前記リコンビナントタンパク質の発現を確認した。すなわち、前記ビーズに結合させた状態の精製サンプルを、ＳＤＳサンプルバッファー中でボイルし、前記リコンビナントタンパク質を前記ビーズから遊離させ、１０％ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。前記ＳＤＳバッファーは、自家調製のLaemmli  sample  buffer（2×stock:  ０．１２５  ｍｏｌ／Ｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２０%グリセロール、２％ＳＤＳ、２．５％  飽和ブロモフェノールブルー含有エタノール）を使用した。前記泳動後、抗Ｇ６ＰＤＨ抗体（Sigma社）およびＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Cell  Signaling  Technology社）を用いて、前記リコンビナントタンパク質を検出した。コントロールは、前記各種ｃＤＮＡを挿入していないベクター（コントロール発現ベクター）を用いた以外は、同様にして、精製サンプルの調製および前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる前記リコンビナントタンパク質の検出を行った。
【０１１７】
これらの結果を図１に示す。図１は、前記精製サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図１において、写真の左側が、分子量を示し、各レーンは、左から、コントロール発現ベクター、前記ＹＥＲ１６３ｃ発現ベクター、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）発現ベクター、前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）発現ベクターを導入した形質転換酵母由来の精製サンプルの結果を示す。
【０１１８】
図１に示すように、コントロール発現ベクターでは、リコンビナントタンパク質の発現は見られなかった。前記ＹＥＲ１６３ｃ発現ベクターでは、約４８ＫＤａ、約４５ＫＤａおよび約４３ＫＤａ付近にバンドが観察された。これらの分子量は、前記ＹＥＲ１６３ｃとプロテインＡとの分子量の合計理論値４８．３ＫＤａと近似していた。また、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）発現ベクターでは、約６５ＫＤａ付近にバンドが観察され、前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）発現ベクターでは、約６５ＫＤａ付近にバンドが観察された。ＲＳｐ１０２２（野生型）とプロテインＡとの分子量の合計理論値は、６６．６ＫＤａ、ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）とプロテインＡとの分子量の合計理論値は、６６．６ＫＤａであり、検出されたそれぞれのバンドは、推定分子量（合計理論値）とほぼ同じ分子量を示した。これらのことから、形質転換酵母により、前記ＹＥＲ１６３ｃ、前記Ｒｓ１０２２および前記Ｒｓ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）が発現され、且つ、それぞれ、単一に精製されていることが確認された。
【０１１９】
（４）形質転換酵母のＧＳＨの発現量の確認
前記（３）で回収した前記無細胞抽出液について、ＧＳＨ濃度をＤＴＮＢ（5-5'-dithiobis［2-nitrobenzoic  acid］）を用いたグルタチオン定量法（Ralman  et  al．，  Nat  Protoc：  3159−3165．  2006  参照）により測定した。そして、コントロールの無細胞抽出液のＧＳＨ濃度を１として、各無細胞抽出液のＧＳＨ濃度の相対値を算出した。
【０１２０】
これらの結果を図２に示す。図２は、前記無細胞抽出液のＧＳＨ濃度の相対値を示すグラフである。図２において、横軸は、前記無細胞抽出物において発現したタンパク質の種類を示し、縦軸は、前記無細胞抽出物におけるＧＳＨ濃度の相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ＧＳＨ  ｌｅｖｅｌ）を示し、図中のパーセントは、ＧＳＨ濃度の相対値を示す。図２に示すように、コントロールに対して、前記ＹＥＲ１６３ｃ、前記ＲＳｐ１０２２(野生型)および前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）を発現した無細胞抽出液は、いずれもＧＳＨ濃度の相対値が低下し、中でも、前記ＲＳｐ１０２２(野生型)を発現した無細胞抽出液は、ＧＳＨ濃度の相対値が著しく低下していた。これらの結果から、前記ＲＳｐ１０２２(野生型)は、前記ＹＥＲ１６３ｃと比較して、極めて高いγＧＣＴ活性を示すことがわかった。また、前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）は、前記ＲＳｐ１０２２(野生型)と比較して、ＧＳＨ濃度の相対値が上昇していることから、配列番号１において２１６番目のグルタミン酸が、ＲＳｐ１０２２(野生型)のγＧＣＴ活性に重要であることがわかった。
【０１２１】
（５）γＧＣＴ活性の確認
前記（３）の前記精製サンプル５０μＬと５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＧＳＨ溶液  ５０μＬとを混合し、３７℃で３０分間反応させ、ＧＳＨから５−オキソプロリンとＣｙｓ−Ｇｌｙを遊離させた。次に、前記混合液に０．５μｇ／ｍＬのＣｙｓ−Ｇｌｙジペプチダーゼ（Sacchromyces cerevisiae由来Ｄｕｇ１、自家調製）  １０μＬを添加し、３７℃で６０分間反応させ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙからシステインを遊離させた。そして、反応後の前記混合液について、酸性ニンヒドリン反応により前記システインの濃度を測定した。そして、前記ＹＥＲ１６３ｃの精製サンプルのシステイン濃度を１００％として、各精製サンプルのγＧＣＴ活性の相対値を算出した。
【０１２２】
これらの結果を図３に示す。図３は、前記精製サンプルのγＧＣＴ活性を示すグラフである。図３において、横軸は、前記精製サンプルのタンパク質の種類を示し、縦軸は、γＧＣＴ活性の相対値を示す。図３に示すように、前記ＲＳｐ１０２２(野生型)は、前記ＹＥＲ１６３ｃの４．５倍のγＧＣＴ活性を示した。そして、本実施例において、前記ＹＥＲ１６３ｃの精製サンプルのタンパク質量は、前記Ｒｓｐ１０２２(野生型)の精製サンプルのタンパク質量の５〜１０倍程度であった。つまり、前記Ｒｓｐ１０２２(野生型)は、前記ＹＥＲ１６３ｃの５〜１０分の１のタンパク質で、４．５倍ものγＧＣＴ活性を示す、極めて優れた比活性の酵素であると言える。また、不活性型の前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）は、γＧＣＴ活性をほとんど示さなかったことから、配列番号１において２１６番目のグルタミン酸が、ＲＳｐ１０２２(野生型)のγＧＣＴ活性に重要であることがわかった。
【０１２３】
［実施例２］
本例では、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ由来γＧＣＴ（ＲＳｐ１０２２（野生型））について、γＧＣＴ活性に必要なアミノ酸を確認した。
【０１２４】
（１）発現ベクターの作製
前記実施例１（１）と同様にして、部位特異的変異導入法により、ＲＳｐ１０２２(野生型)発現ベクターから、変異ＲＳｐ１０２２を発現する以下の発現ベクターを作製した。
変異ＲＳｐ１０２２（Ｙ１２９Ａ）発現ベクター：  配列番号１の１２９番目のチロシンがアラニンに置換された変異γＧＣＴ（ＲＳｐ１０２２（Ｙ１２９Ａ））を発現するベクター
変異ＲＳｐ１０２２（Ｌ１３０Ａ）発現ベクター：  配列番号１の１３０番目のロイシンがアラニンに置換された変異γＧＣＴ（ＲＳｐ１０２２（Ｌ１３０Ａ））を発現するベクター
変異ＲＳｐ１０２２（Ｌ１３０Ｇ）発現ベクター：  配列番号１の１３０番目のロイシンがグリシンに置換された変異γＧＣＴ（ＲＳｐ１０２２（Ｌ１３０Ｇ））を発現するベクター
変異ＲＳｐ１０２２（Ｓ１３１Ａ）発現ベクター：  配列番号１の１３１番目のセリンがアラニンに置換された変異γＧＣＴ（ＲＳｐ１０２２（Ｓ１３１Ａ））を発現するベクター
変異ＲＳｐ１０２２（Ｌ１３２Ａ）発現ベクター：  配列番号１の１３２番目のロイシンがアラニンに置換された変異γＧＣＴ（ＲＳｐ１０２２（Ｌ１３２Ａ））を発現するベクター
【０１２５】
（２）形質転換酵母の作製
前記実施例１（２）と同様にして、前記発現ベクターを、それぞれ単独で導入し、形質転換酵母を作製した。
【０１２６】
（３）γＧＣＴの活性部位の確認
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、細胞内のＧＳＨ濃度が低下すると増殖能力が低下する。そこで、前記形質転換酵母が、コロニー形成できるか否かを確認し、これを指標として、γＧＣＴ活性の有無、ならびに、γＧＣＴ活性に重要なアミノ酸配列を確認した。
【０１２７】
各形質転換酵母を、滅菌水で、所定倍率（１００倍、１０１倍、１０２倍、１０３倍）に希釈した。そして、希釈後の形質転換酵母を、それぞれ単独で、２００ｍｇ／ｍＬ  ガラクトースを含むＳＤ培地に播種し、２６℃で、７２時間培養した。そして、前記培養後の培地におけるコロニー形成の有無を目視により確認した。コントロールは、前記形質転換酵母に代えて、コントロール発現ベクターを導入した形質転換酵母を用いた以外は同様にして、コロニー形成の有無を確認した。また、ガラクトース誘導を解除したコントロールとして、前記ガラクトースに代えて、グルコースを含む培地を用いた以外は同様にして、前記形質転換酵母のコロニー形成の有無を確認した。
【０１２８】
この結果を図４に示す。図４は、各形質転換酵母のコロニー形成の有無を示す写真である。図４において、写真の左側は、形質転換酵母により発現するタンパク質の種類を示し、写真の上側は、培地中のガラクトースの有無（ＯＮはガラクトース添加、ＯＦＦはグルコース添加）を示し、写真の下側は、前記形質転換酵母の希釈倍率を示す。図４に示すように、グルコースを含む培地（ＯＦＦ）では、いずれの形質転換酵母もコロニー形成が確認できた。一方、ガラクトースを含む培地（ＯＮ）では、前記ＲＳｐ１０２２(野生型)を発現する形質転換酵母は、コロニーが形成できないのに対し、前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）、前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｙ１２９Ａ）、前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｌ１３０Ａ）、前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｌ１３０Ｇ）、前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｓ１３１Ａ）および前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｌ１３２Ａ）を発現する形質転換酵母は、いずれもコロニーが形成できた。コロニーが形成できた形質転換酵母は、ＧＳＨ濃度が維持されていることを示すため、これらの結果から、配列番号１において１２９〜１３２番目のアミノ酸配列（ＹＬＳＬ）および２１６番目のアミノ酸残基（Ｅ）が、γＧＣＴ活性に重要であることがわかった。
【０１２９】
［実施例３］
本例では、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ由来γＧＣＴ（ＲＳｐ１０２２（野生型））遺伝子を導入した形質転換大腸菌を作製し、γＧＣＴの発現を確認した。
【０１３０】
前記実施例１（１）のＲＳｐ１０２２  ｃＤＮＡ（野生型、配列番号２）を、ｐＥＴ２３ｄベクター（ノバジェン社、以下同様）のクローニングサイトにより連結し、大腸菌用のＲＳｐ１０２２(野生型)発現ベクターを構築した。つぎに、宿主として、酵母に代えて大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉＢ  （ＤＥ３）  ｐＬｙｓＳ株（ノバジェン社）を用い、ヒートショック法により形質転換を行った以外は、前記実施例１（２）と同様にして、形質転換体を作製した。そして、前記形質転換体を培養し、前記実施例１（３）と同様にして、無細胞抽出液を調製した。前記形質転換体の培養は、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地を用い、３７℃で１８時間培養を行った。さらに、タンパク質の発現を誘導するために７２μｇ／ｍＬ  となるようにＩＰＴＧを添加し、１８℃で６時間培養を行い、タンパク質を発現させた。そして、ニッケルアフィニティーカラムを用いて、前記無細胞抽出物からＲＳｐ１０２２(野生型)を精製し、精製したＲＳｐ１０２２(野生型)をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。また、ＲＳｐ１０２２(野生型)発現ベクターに代えてＹＥＲ１６３ｃ発現ベクターを用いた以外は同様にして、ＹＥＲ１６３ｃを精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【０１３１】
この結果を図５に示す。図５は、前記精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図５において、写真の左側が、分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー（Ｍ）、前記ＹＥＲ１６３ｃ発現ベクター、前記ＲＳｐ１０２２(野生型)発現ベクターを導入した形質転換大腸菌由来の精製サンプルの結果を示す。図５に示すように、前記実施例１と同様に、前記ＹＥＲ１６３ｃ発現ベクターでは、ＹＥＲ１６３ｃとＨｉｓ６タグとの分子量の合計理論値２７．６ＫＤａに、単一のバンドが確認でき、前記ＲＳｐ１０２２(野生型)発現ベクターでは、ＲＳｐ１０２２(野生型)とＨｉｓ６タグとの分子量の合計理論値４６ＫＤａに、単一のバンドが確認できた。
【０１３２】
［実施例４］
本例では、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ由来γＧＣＴ（ＲＳｐ１０２２（野生型））遺伝子を導入した形質転換酵母および形質転換大腸菌を作製し、γＧＣＴの発現および活性を確認した。
【０１３３】
（１）発現ベクター
酵母導入用発現ベクターとして、前記実施例１（１）で構築した前記ＲＳｐ１０２２（野生型）発現ベクター、前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）発現ベクターおよび前記ＹＥＲ１６３ｃ発現ベクターを使用した。また、実施例１の酵母導入用発現ベクターと同様に、大腸菌導入用発現ベクターを構築した。具体的には、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）、前記ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）、または前記ＹＥＲ１６３ｃのＣ末端に、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａタグを融合したｃＤＮＡを、実施例３と同様にして、ｐＥＴ２３ｄベクター（ノバジェン社、以下同様）のクローニングサイトにより連結することで、大腸菌用のＲＳｐ１０２２（野生型）発現ベクター、大腸菌用のＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）発現ベクター、および大腸菌用のＹＥＲ１６３ｃ発現ベクターを構築した。
【０１３４】
（２）形質転換酵母および形質転換大腸菌の作製
前記実施例１（２）と同様にして、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４３株に、前記酵母導入用発現ベクターとして、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）発現ベクター、前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）発現ベクターおよび前記ＹＥＲ１６３ｃ発現ベクターを、それぞれ単独で導入し、形質転換酵母を回収した。また、前記実施例３と同様にして、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉＢ  （ＤＥ３）  ｐＬｙｓＳ株（ノバジェン社）に、前記大腸菌用発現ベクターとして、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）発現ベクター、前記ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）発現ベクター、および前記ＹＥＲ１６３ｃ発現ベクターを、それぞれ単独で導入し、形質転換大腸菌を回収した。
【０１３５】
（３）リコンビナントタンパク質の発現の確認
前記実施例１（３）と同様にして、前記形質転換酵母の培養を行い、また、前記実施例３と同様にして、前記形質転換大腸菌の培養を行った。次に、前記実施例１（３）と同様にして、前記形質転換酵母および前記形質転換大腸菌から、それぞれのリコンビナントタンパク質の精製を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、さらに、ウサギＩｇＧを用いたウエスタンブロッティング法により、前記Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａタグが付加された前記リコンビナントタンパク質の検出を行った。
【０１３６】
これらの結果を図６に示す。図６は、前記精製サンプルのウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図６において、写真の右側が、分子量を示し、各レーンは、左から、コントロール発現ベクター、前記ＹＥＲ１６３ｃ発現ベクター、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）発現ベクター、前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）発現ベクターを導入した前記形質転換酵母由来の精製サンプルおよび前記形質転大腸菌母由来の精製サンプルの結果を示す。
【０１３７】
図６に示すように、前記形質転換酵母および前記形質転換大腸菌のいずれにおいても、以下のことが確認された。すなわち、コントロール発現ベクターでは、リコンビナントタンパク質の発現は見られなかった。前記ＹＥＲ１６３ｃ発現ベクターでは、約４８ＫＤａ付近にバンドが観察され、この分子量は、前記ＹＥＲ１６３ｃとプロテインＡとの分子量の合計理論値４８．３ＫＤａに近似していた。また、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）発現ベクターおよび前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）発現ベクターでは、それぞれ約６５ｋＤａ付近にバンドが観察され、これらの分子量は、ＲＳｐ１０２２（野生型）とプロテインＡとの分子量の合計理論値６６．６ＫＤａ、およびＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）とプロテインＡとの分子量の合計理論値６６．６ＫＤａに近似していた。これらのことから、前記形質転換酵母および前記形質転換大腸菌により、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）および前記ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）が発現され、且つ、それぞれ、単一に精製されていることが確認された。
【０１３８】
（４）γＧＣＴ活性の確認
前記形質転換酵母由来の精製サンプルおよび前記形質転換大腸菌由来の精製サンプルを用いた以外は、前記実施例１（５）と同様にして、システイン濃度を測定し、前記形質転換酵母由来のＹＥＲ１６３ｃの精製サンプルのシステイン濃度を１００％として、前記形質転換酵母由来の各精製サンプルのγＧＣＴ活性の相対値を算出し、また、前記形質転換大腸菌由来のＹＥＲ１６３ｃの精製サンプルのシステイン濃度を１００％として、前記形質転換大腸菌由来の各精製サンプルのγＧＣＴ活性の相対値を算出した。
【０１３９】
これらの結果を図７に示す。図７は、前記精製サンプルのγＧＣＴ活性を示すグラフである。図７において、横軸は、前記精製サンプルのタンパク質の種類を示し、縦軸は、γＧＣＴ活性の相対値を示す。図７に示すように、前記形質転換酵母由来の精製サンプルは、前記実施例１（５）と同様に、前記ＹＥＲ１６３ｃと比較して、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）のみが、極めて高いγＧＣＴ活性を示した。一方、図７に示すように、前記形質転換大腸菌由来の精製サンプルについて、前記ＹＥＲ１６３ｃは、前記形質転換酵母と同程度のγＧＣＴ活性を示したものの、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）は、前記形質転換酵母のようなγＧＣＴ活性は確認できなかった。このように、同じアミノ酸配列であっても、前記形質転換大腸菌由来のＲＳｐ１０２２（野生型）はγＧＣＴ活性を示さず、前記形質転換酵母由来のＲＳｐ１０２２（野生型）はγＧＣＴ活性を示しことから、前記酵母のタンパク質抽出画分が、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）を活性化する活性化画分であることが示唆された。
【０１４０】
[実施例５]
前記酵母のタンパク質抽出画分が、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）を活性化する活性化画分であることを確かめるために、本例では、形質転換大腸菌由来の精製サンプルと、酵母タンパク質抽出液とを反応させ、前記精製サンプルのγＧＣＴ活性を確認した。
【０１４１】
（１）リコンビナントタンパク質の発現の確認
前記実施例４と同様にして、大腸菌用の前記ＲＳｐ１０２２（野生型）発現ベクターおよび前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）発現ベクターを導入した形質転換大腸菌の培養液１５ｍＬを回収し、１ｍＬのライシスバッファーに懸濁し、超音波破砕により大腸菌からタンパク質を抽出した。前記ライシスバッファーの組成は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ＰＨ８．０）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．１％  界面活性剤ＮＰ−４０（SIGMA社製）とした。抽出した粗タンパク質液０．５ｍＬに、２５μＬのＩｇＧ結合ビーズ（ＧＥヘルスケア社）を含む溶液を加え、４℃で３時間回転させながら混合することで、ＩｇＧ結合ビーズに結合させたリコンビナントタンパク質の簡易精製サンプルを調製した。そして、前記実施例１（３）と同様にして、前記精製サンプルについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを行い、前記リコンビナントタンパク質の検出を行った。
【０１４２】
その結果、実施例４の結果と同様に、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）と前記変異ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）において、同様の濃さで単一のバンドが観察された。このことから、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）および前記ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）は、いずれも、同程度の発現量であることが確認された。
【０１４３】
（２）酵母タンパク質抽出液の調製
以下の方法により、酵母タンパク質抽出液を調製した。すなわち、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４３株を、２０ｍｇ／ｍＬグルコースを含むＳＤ培地を用い、ＯＤ６００ｎｍ＝１となるまで２６℃で培養し、前記酵母を集菌した。前記酵母培養液２０ｍＬを集菌し、プロテアーゼ阻害剤Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ  (２μｍｏｌ／Ｌ)およびＰＭＳＦ  (１ｍｍｏｌ／Ｌ)を含む前記（１）のライシスバッファーに懸濁し、グラスビーズ溶液０．５ｍＬを加え、この混合液を、ボルテックスミクスチャーを用いて１分間激しく振盪した。振盪後、前記混合液を速やかに氷上に置いて１分間冷却し、再度、前記ボルテックスミクスチャーで１分間激しく振盪した。この操作を１０回繰り返した後、遠心により、前記混合液から、未破砕酵母および前記グラスビーズを分離除去し、タンパク質抽出液として上清を得た。前記上清のタンパク質濃度を、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のマイクロＢＣＡアッセイキットで定量し、前記上清（酵母タンパク質抽出液）をー８０度で保存した。
【０１４４】
（３）γＧＣＴ活性の確認
前記（１）の前記ＩｇＧ結合ビーズに結合させた精製サンプルに、前記（２）の前記酵母タンパク質抽出液を混合して、混合サンプルを調製した。前記混合サンプルは、前記精製サンプル２０μＬに対し、前記（２）の前記酵母タンパク質抽出液の希釈液４８０μＬ（タンパク質量０、５０、１００、１５０、２００μｇ）を加え、全量を５００μＬとした。そして、前記混合サンプルを、４℃で２時間、回転振盪した。各種タンパク質濃度の前記酵母タンパク質抽出液と反応させた前記精製サンプルを、前記（１）のライシスバッファーで３回洗浄し、前記精製サンプルが結合した前記ビーズを、前記抽出液処理後の精製サンプルとして回収した。前記処理後の精製サンプルを用いて、前記実施例１（５）と同様にして、反応を行い、反応液におけるシステイン濃度を測定した。
【０１４５】
これらの結果を図８に示す。図８は、酵母タンパク質抽出液存在下での、反応液におけるシステイン濃度を示すグラフである。図８において、横軸は、前記混合サンプルにおける、前記酵母タンパク質抽出液のタンパク質濃度を示す。図８において、縦軸は、前記反応液におけるシステイン濃度を示し、これは、前記精製サンプルのγＧＣＴ活性に対応する。図８に示すように、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）は、前記酵母タンパク質抽出液の添加によりシステインが検出され、また、前記酵母タンパク質抽出液の添加濃度依存的にシステイン濃度が増加した。つまり、前記酵母タンパク質抽出液の添加によりγＧＣＴ活性が確認され、その活性は、前記酵母タンパク質抽出液の濃度依存的に上昇した。一方、前記ＲＳｐ１０２２（Ｅ２１６Ｑ）は、前記酵母タンパク質抽出液の添加によっても、システインは検出されず、γＧＣＴ活性が確認できなかった。これらの結果から、前記酵母タンパク質抽出液が、前記形質転換大腸菌由来ＲＳｐ１０２２（野生型）を活性化することがわかった。
【０１４６】
〔実施例６〕
酵母以外の真核生物由来のタンパク質抽出物によっても、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）のγＧＣＴが活性化されるか調べるために、本例では、形質転換大腸菌由来の精製サンプルと、酵母、細菌、動物または植物のタンパク質抽出液とを反応させ、前記精製サンプルのγＧＣＴ活性を確認した。
【０１４７】
（１）各種タンパク質抽出液の調製
酵母タンパク質抽出液は、前記実施例５（２）と同様にして調製した。
【０１４８】
細菌タンパク質抽出液は、以下の方法により、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＧＭＩ１０００から調製した。すなわち、前記菌体を、ＢＧ液体培地（ペプトン１％、酵母エキス０．１％、カザミノ酸０．１％、グルコース０．５％）５ｍＬを用いて、２６℃で一晩培養した。得られた培養液を、ＢＧ液体培地９０ｍＬに移し、２６℃で更に一晩培養した。培養後の培養液から、遠心により集菌し、集菌後の菌体を、滅菌水１０ｍＬで一度洗浄した後、前記実施例５（１）のライシスバッファー５ｍＬに懸濁し、超音波破砕機により細胞を破砕した。得られた破砕菌液を遠心して、上清と未破砕菌体とに分離した。前記上清のタンパク質濃度を、前記マイクロＢＣＡアッセイキットで定量し、前記上清を、細菌タンパク質抽出液として、−８０℃で保存した。
【０１４９】
動物タンパク質抽出液は、以下の方法により、ＨｅLａ細胞から調製した。すなわち、ＨｅＬａ細胞を、直径１０ｃｍ培養ディッシュでコンフルエントになるまで培養した後、セルスクレーパーで掻き取り、１０ｍＬ  ＰＢＳに懸濁した。前記懸濁液を遠心して細胞を回収し、前記細胞に前記ライシスバッファー１ｍＬを加え、さらに、ガラスビーズ溶液４００μＬを加え、この混合液を、ボルテックスミクスチャーを用いて１分間激しく振盪した。振盪後、前記混合液を速やかに氷上において１分間冷却した。この操作を１０回繰り返した後、遠心により、前記混合液から、未破砕酵母および前記グラスビーズを分離除去し、タンパク質抽出液として上清を得た。前記上清のタンパク質濃度を、前記マイクロＢＣＡアッセイキットで定量し、前記上清を動物タンパク質抽出液とし、−８０℃で保存した。
【０１５０】
植物タンパク質抽出液は、以下の方法により、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａから調製した。すなわち、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの葉０．５ｇをスクリューキャップ式２ｍＬ容プラスチックチューブに取り、直径５ｍｍのステンレス球１個を加え、液体窒素で速やかに凍結させた。凍結後のサンプルを、ビードビーター（セントラル科学貿易）により１,２００ｒｐｍで３０秒間破砕し、速やかに液体窒素で冷却した。この操作を３回繰り返し、破砕により粉末になったＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサンプルに、前記ライシスバッファー０．５ｍＬを加え、さらに、遠心により上清と未破砕細胞とに分離した。前記上清のタンパク質濃度を、前記マイクロＢＣＡアッセイキットにより定量し、前記上清を植物タンパク質抽出液とし、−８０℃で保存した。
【０１５１】
（２）γＧＣＴ活性の確認
前記実施例５（１）の前記ＩｇＧ結合ビーズに結合させた精製サンプルに、前記（１）の前記各種タンパク質抽出液を混合して、混合サンプルを調製した。前記混合サンプルは、前記実施例５（１）の前記精製サンプル２０μＬに対し、前記（１）の前記酵母タンパク質抽出液、前記細菌タンパク質抽出液、前記動物タンパク質抽出液、前記植物タンパク質抽出液をそれぞれ４８０μＬ（タンパク質量１００μｇ）を加え、全量を５００μＬとした。そして、前記混合サンプルを、４℃で２時間回転振盪した。各種生物由来のタンパク質抽出液と反応させた前記精製サンプルを、前記ライシスバッファーで３回洗浄し、前記精製サンプルが結合したビーズを、前記各種抽出液処理後の精製サンプルとして回収した。前記処理後の精製サンプルを用いて、前記実施例１（５）と同様にして、反応を行い、反応液におけるシステイン濃度を測定した。
【０１５２】
これらの結果を図９に示す。図９は、前記各種タンパク質抽出液存在下での、反応液における、システイン濃度を示すグラフである。図９において、横軸は、前記各種タンパク質抽出液の種類を示す。図９において、縦軸は、前記反応液におけるシステイン濃度を示し、これは前記精製サンプルのγＧＣＴ活性に対応する。図９に示すように、真核生物である動物および植物のタンパク質抽出液の添加により、前記酵母タンパク質抽出液と同様に、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）のγＧＣＴ活性が確認できた。他方、真核生物に該当しない細菌のタンパク質抽出液の添加によっては、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）のγＧＣＴ活性を確認できなかった。
【０１５３】
〔実施例７〕
発明者らは、真核生物のタンパク質抽出画分における、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）の活性化因子として、チオレドキシンを同定した。本例では、活性化因子がチオレドキシンであることを確認するために、形質転換大腸菌由来の精製サンプルと酵母チオレドキシンとを反応させ、前記精製サンプルのγＧＣＴ活性を確認した。
【０１５４】
（１）γＧＣＴ活性の確認
前記実施例３の前記精製サンプルに、酵母チオレドキシンを混合して、混合サンプルを調製した。前記酵母チオレドキシンは、以下のとおり自家調製した。すなわち、前記酵母チオレドキシン（ＳｃＴｒｘ１、配列番号５）をコードするＴＲＸ１遺伝子をｐＥＴ２３ｄベクターに組み込み、発現ベクターを構築し、前記発現ベクターにより大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ ｇａｍｉ Ｂ  (ＤＥ３)  ｐＬｙｓＳ株を形質転換した。得られた形質転換大腸菌をＬＢ培地で培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）により、前記酵母チオレドキシンタンパク質の発現を誘導した。誘導された前記酵母チオレドキシンタンパク質を、前記形質転換大腸菌から超音波破砕により抽出し、前記酵母チオレドキシンタンパク質のＣ末端に融合したＨｉｓ６タグを用いて、ニッケルアフィニティーレジンによりアフィニティー精製した。
【０１５５】
ＳｃＴｒｘ１（配列番号５）
MVTQFKTASEFDSAIAQDKLVVVDFYATWCGPCKMIAPMIEKFSEQYPQADFYKLDVDELGDVAQKNEVSAMPTLLLFKNGKEVAKVVGANPAAIKQAIAANA
【０１５６】
前記混合サンプルにおいて、前記（１）の前記精製サンプルのタンパク質濃度は０．２μｍｏｌ／Ｌとし、チオレドキシンの濃度は、０．０１、０．０２、０．０４、０．１、０．２μｍｏｌ／Ｌとした。そして、前記混合サンプル５０μＬを使用した以外は、前記実施例１（５）と同様にして、反応液におけるシステイン濃度を測定した。
【０１５７】
これらの結果を図１０に示す。図１０は、チオレドキシン存在下での、反応液におけるシステイン濃度示すグラフである。図１０において、横軸は、前記混合サンプルにおける、チオレドキシンの濃度を示す。図１０において、縦軸は、前記反応液におけるシステイン濃度を示し、これは前記精製サンプルのγＧＣＴ活性に対応する。図１０に示すように、前記ＲＳｐ１０２２（野生型）は、チオレドキシンの添加によりシステインが検出され、また、チオレドキシンの添加濃度依存的にシステイン濃度が増加した。つまり、チオレドキシンの添加によりγＧＣＴ活性が確認され、その活性は、チオレドキシン濃度依存的に上昇した。この結果から、チオレドキシンが、前記形質転換大腸菌由来ＲＳｐ１０２２（野生型）を活性化することがわかった。
【０１５８】
[実施例８]
本例では、酵素ツーハイブリッド法によりＲＳｐ１０２２（野生型）とチオレドキシンとの相互作用を調べた。
【０１５９】
下記表１に示す融合タンパク質をＢａｉｔをとＰｒｅｙとに設定し、以下のようにして、ＲＳｐ１０２２（野生型）とチオレドキシンとの相互作用を確認した。
【０１６０】
Ｂａｉｔ発現用ベクターとしてｐＧＢＫＴ７  ベクター（クロンテック）を用い、このベクターにＲＳｐ１０２２（野生型）遺伝子を組み込んだ場合、増殖阻害が生じる。このため、前記ｐＧＢＫＴ７  ベクターに、γＧＣＴ活性の無い前記ＲＳｐ１０２２（野生型）の活性中心変異型（Ｅ２１６Ｑ）遺伝子を組み込むことで、Ｂａｉｔ発現用ベクターを構築した。他方、Ｐｒｅｙ発現用ベクターとしてｐＧＡＤＴ７ベクター（クロンテック）を用い、このベクターに、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｔｒｘ１遺伝子(ＳｃＴｒｘ１)、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来ｈ型チオレドキシンをコードするＡｔＴｒｘ  ｈ２  ｃＤＮＡ、  ＡｔＴｒｘ  ｈ３  ｃＤＮＡ、またはＡｔＴｒｘ  ｈ５  ｃＤＮＡを組み込むことで、Ｐｒｅｙ発現用ベクターを構築した。そして、下記表に記載する組合せとなるように、前記Ｂａｉｔ発現用ベクターおよび前記Ｐｒｅｙ発現用ベクターを用いて、酵母ＡＨ１０９株（クロンテック）を形質転換した。得られた形質転換酵母を、トリプトファン、ロイシンを含まない酵母合成培地ＳＤ（−Ｔｒｐ、−Ｌｅｕ）に播種することで、形質転換コロニーを得た。得られた形質転換コロニーを滅菌水１００μＬに懸濁し、前記懸濁液１０μＬを、下記（１）、（２）、（３）のプレート培地にスポットし、それぞれのプレートにおける生育を観察して、相互作用を評価した。
（１）トリプトファンおよびロイシンを含まない酵母合成培地ＳＤ(−Ｔｒｐ、−Ｌｅｕ)
（２）トリプトファン、ロイシンおよびヒスチジンを含まない酵母合成培地ＳＤ(−Ｔｒｐ、−Ｌｅｕ、−Ｈｉｓ）
（３）トリプトファン、ロイシンおよびヒスチジンを含まず、ヒスチジンのアナログである３−ＡＴを含む酵母合成培地ＳＤ（−Ｔｒｐ、−Ｌｅｕ、−Ｈｉｓ、＋３−ＡＴ）
【０１６１】
前記（１）の培地は、コントロールであり、全てのＢａｉｔ発現用ベクターおよびＰｒｅｙ発現用ベクターの組合せで形質転換した酵母が、生育可能である培地である。前記（２）および（３）の培地は、ＢａｉｔとＰｒｅｙとが相互作用する時にのみ、前記酵母の生育が可能となる培地である。具体的に、前記（２）の培地は、ＢａｉｔとＰｒｅｙとの相互作用によりレポーターであるヒスチジン合成酵素Ｈｉｓ３が発現し、ヒスチジン栄養要求性が回復した場合にのみ、前記酵母が生育可能である。また、前記（３）の培地は、前記（２）の培地よりも、条件が厳しく、具体的には、ヒスチジンアナログである３ＡＴを加えることで、ＢａｉｔとＰｒｅｙとがより強い相互作用を有する組み合わせにおいてのみ、前記酵母の生育が可能となる培地である。下記表１において、ＧＡＬ４ＤＢＤは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり（ＤＢＤ）、ＡＤは、アクティベータードメイン（ＡＤ）であり、ＳｃＴｒｘ１は、酵母由来チオレドキシン（配列番号５）であり、ＡｔＴｒｘ  ｈ２（配列番号６）、ＡｔＴｒｘ  ｈ３（配列番号７）、ＡｔＴｒｘ  ｈ５（配列番号８）は、それぞれ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来ｈ型チオレドキシンである。
【０１６２】
ＡｔＴｒｘ  ｈ２（配列番号６）
MGGALSTVFGSGEDATAAGTESEPSRVLKFSSSARWQLHFNEIKESNKLLVVDFSASWCGPCRMIEPAIHAMADKFNDVDFVKLDVDELPDVAKEFNVTAMPTFVLVKRGKEIERIIGAKKDELEKKVSKLRA
ＡｔＴｒｘ  ｈ３（配列番号７）
MAAEGEVIACHTVEDWTEKLKAANESKKLIVIDFTATWCPPCRFIAPVFADLAKKHLDVVFFKVDVDELNTVAEEFKVQAMPTFIFMKEGEIKETVVGAAKEEIIANLEKHKTVVAAA
ＡｔＴｒｘ  ｈ５（配列番号８）
MAGEGEVIACHTLEVWNEKVKDANESKKLIVIDFTASWCPPCRFIAPVFAEMAKKFTNVVFFKIDVDELQAVAQEFKVEAMPTFVFMKEGNIIDRVVGAAKDEINEKLMKHGGLVASA
【０１６３】
【表１】
2015109830.tif 000004
【０１６４】
これらの結果を図１１に示す。図１１は、前記Ｂａｉｔと前記Ｐｒｅｙとの各組合せにおけるコロニー形成を示す写真である。図１１において、レーン１「−Ｔｒｐ、−Ｌｅｕ」は、前記（１）の培地の結果であり、レーン２「‐Ｔｒｐ、‐Ｌｅｕ、−Ｈｉｓ」は、前記（２）の培地の結果であり、レーン３「‐Ｔｒｐ、‐Ｌｅｕ、‐Ｈｉｓ、＋３ＡＴ」は、前記（３）の培地の結果である。
【０１６５】
図１１に示すように、ＲＳｐ１０２２（野生型）とチオレドキシン（ＳｃＴｒｘ１、ＡｔＴｒｘ  ｈ２、ＡｔＴｒｘ  ｈ３およびＡｔＴｒｘ  ｈ５）との組合せにおいて、レーン２において、コロニー形成が確認された。特に、チオレドキシンの中でも、ＡｔＴｒｘ  ｈ５の場合に、厳しい条件であるレーン３でのコロニー形成が確認され、強い相互作用が確認された。
【０１６６】
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
【０１６７】
この出願は、２０１３年１０月３０日に出願された日本出願特願２０１３−２２５７９５を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１６８】
以上のように、本発明のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼは、公知のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼと比較して、グルタチオンに対する活性が高い。このため、本発明のγ−グルタミルシクロトランスフェラーゼによれば、例えば、グルタチオンから５−オキソプロリンおよびシステイン−グリシンジペプチドを効率良く製造できる。
【図２】
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【図８】
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【図１０】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【配列表】
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