(57)【要約】【課題】癌の新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、これにより、当該ポリヌクレオチド又はそれがコードするポリペプチドの検出方法、及びそのためのキット及びプライマーセットを提供することを課題とする。【解決手段】癌患者の一部に存在している、ＰＩＢＦ１遺伝子の一部とＲＥＴ遺伝子の一部との融合遺伝子が癌の原因遺伝子であることを見出し、当該遺伝子であるポリヌクレオチド及びそれがコードするポリペプチドの検出方法を構築した。前記検出方法では、ＰＩＢＦ１遺伝子の一部とＲＥＴ遺伝子の一部との融合遺伝子、あるいは、それがコードする融合タンパク質を検出する。前記プライマーセット又は検出用キットは、ＰＩＢＦ１をコードする部分から設計されるセンスプライマーと、ＲＥＴをコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、プロゲステロンイムノモジュレーターバインディングファクター１（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １）遺伝子とリアレンジドデュアリングトランスフォーメーション（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＲＥＴ）遺伝子との融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合蛋白質の検出方法：
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドである請求項１に記載の検出方法：
（１）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＰＩＢＦ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子の検出用キット：
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドである請求項３に記載の検出用キット：
（１）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項５】
ＰＩＢＦ１遺伝子をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＲＥＴ遺伝子をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＰＩＢＦ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
【請求項６】
配列番号１の塩基番号１から１８３３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１８３４から２９１６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【請求項７】
配列番号３の塩基番号１から２０４９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号２０５０から３１３２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＥＴキナーゼ領域を含む新規の融合遺伝子または各融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法に関する。
【０００２】
レアレンジドデュアリングトランスフォーメーション（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＲＥＴ）遺伝子は染色体１０番長腕のセントロメア付近に存在し、２１個のエキソンからなる。コードする蛋白質は受容体型チロシンキナーゼであり、中央部に細胞膜貫通領域を有し、そのカルボキシル末端側にチロシンキナーゼ領域、アミノ末端側に細胞外領域を有する。カルボキシル末端のスプライシングの違いにより１０７２アミノ酸（ＲＥＴ９）、１１０６アミノ酸（ＲＥＴ４３）、１１１４アミノ酸（ＲＥＴ５１）の３種類の蛋白質が存在することが知られている（非特許文献１）。ＲＥＴはリガンド／ＧＦＲ複合体を介して二量体を形成することで自己のチロシンをリン酸化し活性化する（非特許文献１）。
甲状腺乳頭癌において、ＲＥＴ遺伝子が染色体内逆位もしくは染色体間転座により他の遺伝子（Ｈ４、ＥＬＥ１など）と融合し、癌化能を持った融合型チロシンキナーゼＲＥＴ／ＰＴＣが発現していることが報告されている（非特許文献２）。これらの融合はＲＥＴのチロシンキナーゼ領域のアミノ末端側で生じており、ＲＥＴは細胞外領域及び細胞膜貫通領域を失い、融合パートナーとの融合蛋白質を形成している。融合パートナー分子の多くは複合体形成ドメインを有していることから、融合体自身も複合体を形成していると考えられており、この複合体形成がＲＥＴのチロシンキナーゼ活性の恒常的な自己リン酸化を引き起こし、細胞内シグナルが異常に活性化され癌化及び細胞増殖を惹き起こしていると考えられている（非特許文献２）。実際に、ＲＥＴ／ＰＴＣ融合遺伝子をマウス正常細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入すると癌細胞様に形質転換すること、さらにはＲＥＴキナーゼ抑制化合物がＲＥＴ／ＰＴＣ融合遺伝子を発現した甲状腺癌細胞株の細胞増殖を抑制できることから、ＲＥＴ／ＰＴＣ融合体が甲状腺癌の治療標的分子となる可能性が示唆されている（非特許文献３−５）。これまでに１０種類以上のＲＥＴ／ＰＴＣ融合遺伝子が甲状腺癌において存在する事が報告されている。また、非小細胞肺癌患者において、ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子が融合した遺伝子が発現しているとの報告がある（特許文献１）。
プロゲステロンイムノモジュレーターバインディングファクター１（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １）遺伝子は染色体１３番長腕に存在し１８個のエクソンからなる。ＰＩＢＦ１は妊娠初期トロホブラスト細胞の浸潤に関わることが知られている（非特許文献６）。
これまでにＰＩＢＦ１とＲＥＴが融合しているという報告はなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２０１２/０１４７９５
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】「トレンド・イン・ジェネティクス（TRENDS in Genetics），（（英国），２００６年，２２巻，ｐ．６２７−６３６）」
【非特許文献２】「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー（European journal of  endoclinology），（（英国），２００６年，１５５巻，ｐ．６４５−６５３）
【非特許文献３】「キャンサー・リサーチ（CANCER RESEARCH），（（米国），２００２年，６２巻，ｐ．７２８４−７２９０）」
【非特許文献４】「ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム（The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism），（（米国），２００６年，９１巻，ｐ．４０７０−４０７６）」
【非特許文献５】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY），（（米国），２００７年，２８２巻，ｐ．２９２３０−２９３４０）」
【非特許文献６】「ジャーナル・オブ・リプロダクティブイムノロジ―（Journal of Reproductive Immunology）（（アイルランド）, ２０１１年、９０巻、ｐ．５０−５７）」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
癌の新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、これにより、当該ポリヌクレオチド又はそれがコードするポリペプチドの検出方法、およびそのためのキット又はプライマーセットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、肺癌患者から得た検体からＰＩＢＦ１遺伝子の一部と、キナーゼであるＲＥＴ遺伝子の一部とが融合した新規の融合遺伝子を単離同定し（実施例１）、これらの融合遺伝子が肺癌患者検体に存在すること（実施例２及び３）、またこれらの融合遺伝子を発現させるためレトロウイルスを作成し（実施例４）、感染細胞が腫瘍形成能を有し、癌の原因遺伝子であることを見出した（実施例５及び６）。本発明者は、これらの知見から、これらの融合遺伝子の検出法を構築し（実施例２及び３）、そのためのキットおよびプライマーセットを提供し、これらの融合遺伝子またはそれにコードされる融合タンパク質を検出することにより、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤治療の対象となる癌患者を選別することを可能とした。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［７］に関する。
［１］  被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、プロゲステロンイムノモジュレーターバインディングファクター１（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １）遺伝子とリアレンジドデュアリングトランスフォーメーション（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＲＥＴ）遺伝子との融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合蛋白質の検出方法：
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［２］  前記ポリペプチドが、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドである［１］に記載の検出方法：
（１）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［３］  下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＰＩＢＦ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子の検出用キット：
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［４］  前記ポリペプチドが、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドである［３］に記載の検出用キット：
（１）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）ポリペプチド配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［５］  ＰＩＢＦ１遺伝子をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＲＥＴ遺伝子をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＰＩＢＦ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、「１」又は［２］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
［６］  配列番号１の塩基番号１から１８３３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１８３４から２９１６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
［７］  配列番号３の塩基番号１から２０４９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号２０５０から３１３２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【０００８】
また、本発明は、
下記（１）〜（３）に記載のポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチド」と略すこともある）又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」と略すこともある）：
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。  また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＲＥＴキナーゼ領域を含む融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の存在の検出方法；
被験者から得た試料中の、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＰＩＢＦ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子とを含む融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の診断方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
【０００９】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の存在の検出方法：
（１）被験者から得た試料を鋳型とし、前記［５］〜［７］に記載されたプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及び
（２）ＰＣＲ産物の存在を検出する工程、
に関する。
【００１０】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の診断方法：
（１）被験者から得た試料を鋳型とし、前記［５］〜［７］に記載されたプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及び
（２）ＰＣＲ産物の存在を検出する工程、
に関する。また、更に、上記方法により癌（特には肺癌又は甲状腺癌）を有すると診断された患者に対して、本発明のポリペプチドを抑制する物質（好ましくはＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤）を投与することを含む方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする、染色体の再構成（genomic rearrangement）を検出する方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
【００１２】
さらに、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする、染色体の再構成（genomic rearrangement）を検出する方法：
（１）ｉ）被験者から得た試料、ii）ＰＩＢＦ１遺伝子をコードする５’側ゲノム領域を含む標識プローブ、及びiii）ＲＥＴ遺伝子をコードする３’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブを用い、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、及び
（２）前記標識のシグナルの重なりを検出する工程、
に関する。
【００１３】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の存在の検出方法：
（１）ｉ）被験者から得た試料、ii）ＰＩＢＦ１遺伝子をコードする５’側ゲノム領域を含む標識プローブ、及びiii）ＲＥＴ遺伝子をコードする３’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブを用い、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、及び
（２）前記標識のシグナルの重なりを検出する工程、
に関する。
【００１４】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の診断方法：
（１）ｉ）被験者から得た試料、ii）ＰＩＢＦ１遺伝子をコードする５’側ゲノム領域を含む標識プローブ、及びiii）ＲＥＴ遺伝子をコードする３’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブを用い、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、及び
（２）前記標識のシグナルの重なりを検出する工程、
に関する。また、上記方法の更なる工程として、上記方法により癌（特には肺癌又は甲状腺癌）を有すると診断された患者に対して、本発明のポリペプチドを抑制する物質（好ましくはＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤）を投与する工程を含んでもよい。
また、別の態様として、本発明は、上記の診断方法により癌（特には肺癌又は甲状腺癌）陽性と診断された患者に対してＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤を投与することを含む癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の治療方法、に関する。
【００１５】
また、本発明は、被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、ＰＩＢＦ１とＲＥＴとの融合タンパク質の検出方法：
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
【００１６】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＰＩＢＦ１とＲＥＴとの融合タンパク質陽性の癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の存在の検出方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
【００１７】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＰＩＢＦ１とＲＥＴとの融合タンパク質陽性の癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の診断方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）〜（３）に記載のポリペプチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）、配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。また、上記方法の更なる工程として、ＰＩＢＦ１とＲＥＴとの融合タンパク質陽性の癌（特には肺癌又は甲状腺癌）を有すると診断された患者に対して、上記（１）〜（３）に記載のポリペプチドを抑制する物質（好ましくはＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤）を投与する工程を含んでもよい。
また、別の態様として、本発明は、上記の診断方法によりＰＩＢＦ１とＲＥＴとの融合タンパク質陽性の癌（特には肺癌又は甲状腺癌）を有すると診断された患者に対して、上記（１）〜（３）に記載のポリペプチドを抑制する物質（好ましくはＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤）を投与することを含む癌（特には肺癌又は甲状腺癌）の治療方法、に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の検出方法は、ＰＩＢＦ１遺伝子と、ＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌又は甲状腺癌）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法は、染色体の再構成を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、本発明のポリペプチドを抑制する物質（好ましくはＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤）の適用対象者であるか否かを鑑別することができ、これにより、本発明のポリペプチドを抑制する物質（好ましくはＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤）による治療の有効性が期待されるテーラーメード医療が実践できる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
《本発明の検出方法》
本発明の検出方法には、（Ｉ）融合遺伝子の検出方法と、（ＩＩ）前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法とが含まれる。
【００２０】
（Ｉ）融合遺伝子の検出方法
本発明における融合遺伝子の検出方法は、被験者から得た試料中の、本明細書のポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含む。
【００２１】
被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された体液（好ましくは血液）、肺胞・気管支洗浄液、生検された試料、喀痰試料を用いるが、好適には、被験者の肺患部の生検試料又は喀痰試料を用いる。試料からゲノムＤＮＡを抽出して用いることができ、またその転写産物（ゲノムが転写及び翻訳される結果生じる産物；例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、蛋白質）を用いることができる。特にはｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製して用いることが好ましい。
【００２２】
融合遺伝子の検出方法における「本明細書のポリヌクレオチドの存在を検出する工程」において、その検出対象となる本明細書のポリヌクレオチド（以下、「検出対象ポリヌクレオチド」と称する）は、「ＰＩＢＦ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子」であり、これはＰＩＢＦ１の一部とＲＥＴキナーゼ領域を含むＲＥＴの一部との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのことをいう。検出対象ポリヌクレオチドである「ＰＩＢＦ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子」としては、ＰＩＢＦ１の機能ドメインの一つであるコイルド−コイルドメインとＲＥＴの機能ドメインの一つであるキナーゼドメインを有する融合遺伝子があげられる。
【００２３】
癌を引き起こす融合遺伝子としてＰＴＣ−ＲＥＴ（Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９；７１１９−７１２３）、ＫＩＦ５Ｂ−ＡＬＫ（Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００９；３１４３−３１４９）、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ（Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２；３７５−３７７）、ＥＭＬ４‐ＡＬＫ（Ｎａｔｕｒｅ  ２００７；５６１−５６６）などが知られており、これらの融合遺伝子はＮ末端側にコイルド−コイルドメインを持つ遺伝子とC末端側にリガンド結合部位を欠損したキナーゼが結合した融合遺伝子であり、３Ｔ３細胞に強制的に発現させると形質転換を引き起こすことが知られている。例えば、リガンド結合部位を有さないＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子を発現させた３Ｔ３細胞は、リガンド非依存的にＲＥＴキナーゼ活性化に重要である９０５番目のチロシン自己リン酸化が引き起こされ活性化される。この自己リン酸化は、ＲＥＴ阻害剤であるＶａｎｄｅｔａｎｉｂにより抑制され細胞死を引き起こすことが知られている（Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２；３７５−３７７）。また、同様にリガンド結合部位を有さないＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を内在的に発現している細胞株でもＡＬＫのキナーゼ活性に重要である１６０４番目のリン酸化が引き起こされており、ＡＬＫに阻害活性をもつＴＡＥ６８４によりリン酸化が抑制され増殖が抑制されることが知られている（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８；４２７５−４２８３）。さらに、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を発現している肺癌患者に対し、ＡＬＫキナーゼ阻害剤であるＣｒｉｚｏｔｉｎｉｂが有効な治療薬であることが示唆されている（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  Ｄｅｖｅｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２０１１；  ４７１−４８５）。これらの融合遺伝子の活性化機構として、コイルド−コイルドメインを介したホモ二量体化により、融合しているキナーゼドメインのリガンド非依存的な恒常的活性化が引き起こされることが示唆されている。さらには、このように活性化された融合遺伝子は融合しているキナーゼの阻害剤を使用することにより、融合遺伝子の機能を阻害することができることが示唆される。
【００２４】
したがって、当該融合遺伝子についても、ＲＥＴのキナーゼドメインとＰＩＢＦ１のコイルド−コイルドメインを有する融合遺伝子が癌化を引き起こす重要なドメインと予測される。
【００２５】
そのため前記「検出対象ポリヌクレオチド」としては、例えば、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合遺伝子のうち、ＰＩＢＦ１のコイルド−コイルドメインからＲＥＴのキナーゼドメインに該当する配列である、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが好ましい。
（１）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１若しくは配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）、
（２）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１又は配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）、並びに、
（３）配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１又は配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００２６】
好ましい前記「検出対象ポリヌクレオチド」としては、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる：
（１）配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）、並びに、
（３）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００２７】
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表される塩基配列によりコードされる配列である。配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号３で表される塩基配列によりコードされる配列である。配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１」と称し、配列番号４で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ２」と称する。「ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１」及び「ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ２」を総称して「ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリペプチド」と称する。ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ１をコードする遺伝子を「ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ１」と称し、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリペプチドｖ２をコードする遺伝子を「ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ２」と称する。ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードする遺伝子を「ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」と称する。
【００２８】
さらに好ましい前記検出対象ポリヌクレオチドとしては、配列番号１又は配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２９】
配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＰＩＢＦ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００６３４６．２）の塩基番号３０６（エキソン２のファーストメチオニンに対応）から２１３８（エキソン１４の３’末端に対応）とＲＥＴ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０２０６３０．４）の塩基番号２３２７（エキソン１２の５’末端に対応）から３４０９（エキソン１９のストップコドンに対応）までの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号１に示される塩基配列の内、塩基番号１〜１８３３の配列はＰＩＢＦ１遺伝子に由来し、塩基番号１８３４〜２９１６の配列はＲＥＴ遺伝子に由来する。この融合ポリヌクレオチドを、Ｐ１４Ｒ１２又はＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１とも称する。配列番号１の塩基番号１〜２９１６は、融合タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であり、このＯＲＦにコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００３０】
配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＰＩＢＦ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００６３４６．２）の塩基番号３０６（エキソン２のファーストメチオニンに対応）から２３５４（エキソン１６の３’末端に対応）とＲＥＴ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０２０６３０．４）の塩基番号２３２７（エキソン１２の５’末端に対応）から３４０９（エキソン１９のストップコドンに対応）までの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号３に示される塩基配列の内、塩基番号１〜２０４９の配列はＰＩＢＦ１遺伝子に由来し、塩基番号２０５０〜３１３２の配列はＲＥＴ遺伝子に由来する。この融合ポリヌクレオチドを、Ｐ１６Ｒ１２又は＿ｖ２とも称する。配列番号３の塩基番号１〜３１３２は、融合タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であり、このＯＲＦにコードされるアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００３１】
別の態様における前記検出対象ポリヌクレオチドとしては、配列番号１の塩基番号２３３〜２７３３に対応するＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）の部分配列及び配列番号３の塩基番号２３３〜２９４９に対応するＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｆ１６Ｒ１２）の部分配列などが挙げられる。
【００３２】
「機能的等価改変体」としては、「配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）又は配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜数個、更に好ましくは１〜７個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」が好ましく、「配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）又は配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」が特に好ましい。
【００３３】
「相同ポリペプチド」は、「配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）又は配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」であるが、該同一性が、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好ましい。
【００３４】
なお、本明細書における前記「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ ｐｒｏｇｒａｍ（J Mol Biol 1970; 48: 443-453）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＥＢＬＯＳＵＭ６２
【００３５】
あるポリペプチドが「腫瘍形成能を有する」ことは、一例として、実施例５および６の方法で確認することが挙げられる。具体的には、当該ポリペプチドを発現するプラスミドを導入した宿主（Ｂａ／Ｆ３細胞）がインターロイキン３非要求性の増殖能の有無を確認すること、または、当該ポリペプチドを発現するプラスミドを導入した宿主（３Ｔ３繊維芽細胞）がスフェロイドプレートを用いた足場非依存的増殖能の有無を確認することで判断する。
【００３６】
本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチドとしては、「配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）２又は配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドが好ましく、「配列番号２のアミノ酸番号７８〜９１１（好ましくは配列番号２）又は配列番号４のアミノ酸番号７８〜９８３（好ましくは配列番号４）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドが最も好ましい。
【００３７】
本発明のポリヌクレオチドの検出方法における「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」は、被験者から得た試料のゲノム中の検出対象ポリヌクレオチド（融合点を含むゲノム配列）の存在を検出すること、あるいは、被験者から得た試料から抽出したゲノムＤＮＡの転写産物（例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を調製し、検出対象ポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの存在を検出することにより実施する。
【００３８】
ゲノムＤＮＡの抽出は公知の方法で行うことができ、市販のＤＮＡ抽出キットを用いて簡便に行うことができる。
【００３９】
検出工程は公知の遺伝子解析法（例えば遺伝子検出法として常用されるＰＣＲ，ＬＣＲ（Ligase chain reaction）、ＳＤＡ（Strand displacement amplification）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification）、ＩＣＡＮ（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法、ＴＭＡ法（Gen-Probe’s TMA system）、インサイチュハイブリダイゼーション法、更にマイクロアレイなど周知の方法）に従って実施することができる。例えば、検出対象ポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、又は、検出対象ポリヌクレオチドにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用する。
【００４０】
具体的には、被験者から得た試料由来の核酸、例えばｍＲＮＡ等を用いて測定する。ｍＲＮＡ量の測定は、検出対象ポリヌクレオチド配列を特異的に増幅できるように設計したプライマーを用いて遺伝子増幅反応方法にて測定する。本発明の検出方法に用いられるプライマー、又は、検出用キットに含まれるプライマーは、検出対象ポリヌクレオチド配列を特異的に増幅できるものであれば、特には限定されず、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計する。ＰＣＲ増幅モニター法におけるプライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Primer Express; PE Biosystems）などを利用してできる。また、ＰＣＲ産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。
【００４１】
より具体的には、センスプライマー（５’−プライマー）をＰＩＢＦ１をコードする部分から、アンチセンスプライマー（３’−プライマー）をＲＥＴをコードする部分から設計する。好ましくは、本発明の検出用キットに含まれるプライマーを用い、更に好ましくは、検出用キットに最も好適に含まれるプライマーを用いる。ＰＣＲ増幅モニター法では、各遺伝子に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、１反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスＰＣＲ（Multiplex PCR）を設計することもできる。各増幅技術に適した方法によって目的とした遺伝子（全体又はその特異的部分）が増幅されたか否かを確認することができる。例えば、ＰＣＲ法では、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを確認できる。目的とするサイズの増幅断片が得られた場合は、被験者から得た試料において、検出対象ポリヌクレオチドが存在していたことになる。このように、検出対象ポリヌクレオチドの存在を検出することができる。
【００４２】
本発明の融合遺伝子の検出方法としては、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチドの存在を遺伝子増幅反応により検出する工程に加え、さらに目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを検出する工程を含むことが好ましい。
【００４３】
ハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＮＡプロテクション法などを使用して行う。ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、検出対象ポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする連続した少なくとも３２塩基の核酸分子であって、融合点を中心にその上流及び下流のそれぞれ１６塩基からなる配列又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いることができる。
【００４４】
インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、公知のFISH法（fusion assay）に従って実施することができる。または、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション（CISH）法とシルバーインサイチュハイブリダイゼーション（SISH）法を組み合わせたヒュージョンアッセイで実施することができる。
【００４５】
なお、本明細書における融合点とは、ＰＩＢＦ１の各遺伝子由来の部分とＲＥＴ遺伝子由来の部分とが融合した点を意味する。
【００４６】
また、本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
【００４７】
さらには、ＲＴ−ＰＣＲ等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法（Genome Res., 6(10), 986, 1996）を用いることにより、検出対象ポリヌクレオチドの存在について、より定量的な解析を行うことが可能である。ＰＣＲ増幅モニター法としては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７９００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることが出来る。リアルタイムＰＣＲは公知の方法であり、そのための装置およびキットは市販されており、これらを利用して簡便に行える。
【００４８】
（ＩＩ）前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法
本発明における融合タンパク質の検出方法は、被験者から得た試料における、特定のポリペプチド、すなわち、検出対象ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド（以下、「検出対象ポリペプチド」と称する）の存在を検出する工程を含む。当該検出対象ポリペプチドは、「ＰＩＢＦ１とＲＥＴとの融合タンパク質」である。
【００４９】
このような検出する工程は、被験者から得た試料（例えば、被験者から得た癌組織や細胞）由来の可溶化液を調製し、その中に含まれる検出対象ポリペプチドを、ＰＩＢＦ１に対する抗体と、抗ＲＥＴ抗体とを組み合わせることによる免疫学的測定法又は酵素活性測定法等により実施できる。好適には、検出対象ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた、酵素免疫測定法、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法等の手法を用いることができる。
【００５０】
本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチド又は検出対象ポリペプチドが、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、当該ポリヌクレオチド陽性の癌を有する対象（患者）であり、本発明のポリヌクレオチドを抑制する物質（好ましくはＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤）による治療の適用対象となる。検出又は診断の対象としては、癌であれば特に制限はないが、特には肺癌又は甲状腺癌などであり、より好ましくは肺癌であり、更に好ましくは細気管支肺細胞癌治療剤である。
【００５１】
《本発明の検出用キット、本発明のプライマーセット》
本発明の検出用キットには、少なくとも、本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンス及びアンチセンスプライマーが含まれる。センス及びアンチセンスプライマーセットは、検出対象ポリヌクレオチド増幅用のプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。
【００５２】
「ＰＩＢＦ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子」とは、ＰＩＢＦ１遺伝子の一部とＲＥＴ遺伝子の一部とが融合した遺伝子のことをいう。
【００５３】
本発明のプライマーセットには、
（１）ＰＩＢＦ１をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＲＥＴをコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＰＩＢＦ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなり、センスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」の相補鎖にストリンジェントな条件（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなるプライマーセット
が含まれる。
【００５４】
また、前記プライマーセット（１）のより具体的な態様として、本発明のプライマーセットには、以下の（２）及び（３）のプライマーセットが含まれる。
（２）配列番号１の塩基番号１から１８３３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１８３４から２９１６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
（３）配列番号３の塩基番号１から２０４９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号２０４５から３１３２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【００５５】
これらのプライマーセット（１）〜（３）においては、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。
【００５６】
また、本発明のプライマーは、通常、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、更に好ましくは１８〜２４塩基、特に好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。
【００５７】
本発明のプライマーセットは、本発明の検出方法において、検出対象ポリヌクレオチドを増幅及び検出するために用いることができる。また、本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【００５８】
「本発明のポリペプチドを抑制する物質」としては、本発明のポリペプチドを阻害する物質又は本発明のポリペプチドの発現を抑制する物質（例えば、二重鎖核酸、抗体又は抗体断片を含む蛋白質、ペプチド、又はそれ以外の化合物］）等が挙げられ、好ましくはＰＩＢＦ１とＲＥＴとの融合タンパク質の活性を阻害する物質（ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ阻害剤とも称する）である。これらの物質は、癌治療剤、特には肺癌又は甲状腺癌治療剤として用いることができ、より好ましくは肺癌治療剤、さらに好ましくは細気管支肺細胞癌治療剤である。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
【００６０】
［実施例１］ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド  ｖ１（ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド  ｖ２（ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）の単離
細気管支肺細胞癌患者肺癌組織由来ＲＮＡ（米国アステランド社）Ｌｇ２８０検体ＲＮＡに対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、ライフテクノロジーズ社）およびオリゴ（ｄＴ）プライマー（オリゴ  （ｄＴ）２０プライマー、ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
次に、配列番号５で示されるＰＩＢＦ１＿ＲＥＴ＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿Ｆおよび配列番号６で示されるＰＩＢＦ１＿ＲＥＴ＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿Ｒのプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２；東洋紡績株式会社）を行いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃４分を２５サイクル）を行った。その後、１０倍希釈した前述ＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号７で示されるＰＩＢＦ１＿ＲＥＴ＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＰａｃＩ＿Ｆおよび配列番号８で示されるＰＩＢＦ１＿ＲＥＴ＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＮｏｔＩ＿Ｒのプライマー、同じＤＮＡポリメラーゼ、同じプロトコルでＰＣＲを行い、電気泳動したところ、約２．９ｋｂのＰＣＲ産物と約３．１ｋｂのＰＣＲ産物を得たことがわかった。それぞれのＰＣＲ産物をクローニングベクター（ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ株式会社）にクローニングした。インサートはダイデオキシシーケンス法により配列を決定した（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ）。この結果、約２．９ｋｂのＰＣＲ産物では、ＮＣＢＩに登録されているＰＩＢＦ１（ＮＭ＿００６３４６．２）のコーディングシーケンス（以下ＣＤＳ）のＮ末端からエキソン１４の３’末端までが、ＲＥＴ（ＮＭ＿０２０６３０）のＣＤＳのエキソン１２の５’末端からＣＤＳのＣ末端までと融合している転写産物（ＰＩＢＦ１−ＲＥＴｖ１）（配列番号１）が存在していることが明らかになった。配列番号１によりコードされるポリペプチドを配列番号２に示す。また、約３．１ｋｂのＰＣＲ産物では、ＮＣＢＩに登録されているＰＩＢＦ１（ＮＭ＿００６３４６．２）のコーディングシーケンス（以下ＣＤＳ）のＮ末端からエキソン１６の３’末端までが、ＲＥＴ（ＮＭ＿０２０６３０）のＣＤＳのエキソン１２の５’末端からＣＤＳのＣ末端までと融合している転写産物（ＰＩＢＦ１−ＲＥＴｖ２）（配列番号３）が存在していることが明らかになった。配列番号３によりコードされるポリペプチドを配列番号４に示す。
また、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２のＯＲＦ全長をタンパク質として発現するため、それぞれ制限酵素ＰａｃＩで３７℃、３時間の酵素反応を行い制限酵素処理したＤＮＡ断片を精製し、さらにＮｏｔＩで３７℃、３時間の酵素反応を行い制限酵素処理したＤＮＡ断片を精製した。このＯＲＦを含むＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ；コスモバイオ社）のマルチクローニングサイトに存在するＰａｃＩおよびＮｏｔＩサイトにクローニングし発現プラスミドを構築した。（ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏおよびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ）
【００６１】
［実施例２］ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１４Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドｖ１の検出
肺癌臨床検体由来ｃＤＮＡ（米国アステランド社）２００サンプルを基質とし、配列番号９で示されるＰ１４Ｒ１２＿ｑＰＣＲ＿Ｆおよび配列番号１０で示されるＰ１４Ｒ１２＿ｑＰＣＲ＿Ｒの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、定量的ＰＣＲキット（Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ；ライフテクノロジーズ社）を用い、アプライドバイオシステムズ７９００ＨＴシステムにて、定量ＰＣＲ（９５℃  １０分の後、９５℃１５秒、５９℃６０秒  を４５サイクル）を行い遺伝子発現量を測定した。その結果、上述のサンプルＬｇ２８０から合成したｃＤＮＡのみで増幅が確認された。またＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１６Ｒ１２）＿ｖ２配列を持つプラスミドＤＮＡでは増幅は確認できなかった。以上から、上記方法により、肺癌臨床検体由来の試料中のＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１４Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドｖ１の存在を検出することができ、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１４Ｒ１２）ポリヌクレオチドｖ１陽性患者を選択できることが示された。
【００６２】
［実施例３］ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１６Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドｖ２の検出
肺癌臨床検体由来ｃＤＮＡ（米国アステランド社）２００サンプルを基質とし、配列番号１１で示されるＰ１６Ｒ１２＿ｑＰＣＲ＿Ｆおよび配列番号１２で示されるＰ１６Ｒ１２＿ｑＰＣＲ＿Ｒの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、定量的ＰＣＲキット（Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ；ライフテクノロジーズ社）を用い、アプライドバイオシステムズ７９００ＨＴシステムにて、定量ＰＣＲ（９５℃  １０分の後、９５℃１５秒、５９℃６０秒  を４５サイクル）を行い遺伝子発現量を測定した。その結果、上述のサンプルＬｇ２８０から合成したｃＤＮＡのみで増幅が確認された。またＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１４Ｒ１２）＿ｖ１配列を持つプラスミドＤＮＡでは増幅は確認できなかった。以上から、上記方法により、肺癌臨床検体由来の試料中のＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１４Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドｖ２の存在を検出することができ、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１４Ｒ１２）ポリヌクレオチドｖ２陽性患者を選択できることが示された。
【００６３】
[実施例４] ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１４Ｒ１２）融合ポリヌクレオチド＿ｖ１およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ（Ｐ１６Ｒ１２）融合ポリヌクレオチド＿ｖ２のレトロウイルス液の作成
上記、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏおよびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１６Ｒ１２）／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏを各９μｇ、トランスフェクション試薬（ＦＵＧＥＮＥョＨＤ、ロシュ社）を用いて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅ細胞にトランスフェクションを実施した。トランスフェクション２４時間後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）を含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ培地；インビトロジェン社）を交換し、さらに２４時間の培地上清を採取しレトロウイルス溶液を作成した。
【００６４】
[実施例５]ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドおよびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドによる増殖因子非依存性増殖促進作用の検討
実施例４において、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）／ｐＭＸs−ｐｕｒｏおよびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）／ｐＭＸs−ｐｕｒｏを用いて作成したウイルス溶液にポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Ｓｉｇｍａ社）を４μｇ／ｍＬの濃度で添加したのち、ＢＡ／Ｆ３細胞に添加し感染させた。感染６時間後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）、1ｎｇ／ｍＬのマウスリコンビナントＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ社）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １６４０；インビトロジェン社）培地に交換し培養した。感染１日後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）および１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（シグマ社）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １６４０；インビトロジェン社）培地を用いて、５％ＣＯ2存在下、３７℃で４週間培養を続け、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）／ｐＭＸs−ｐｕｒｏを安定発現するＢＡ／Ｆ３細胞を取得した。（それぞれＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）発現／ＢＡ／Ｆ３細胞およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）発現／ＢＡ／Ｆ３細胞と命名した。）
ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）発現／ＢＡ／Ｆ３細胞およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）発現／ＢＡ／Ｆ３細胞のＩＬ−３非存在下での増殖能を検討した。ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）発現／ＢＡ／Ｆ３細胞、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）発現／ＢＡ／Ｆ３細胞およびＣＤＳ領域を含まない空ベクターであるｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ感染ＢＡ／Ｆ３細胞（Ｍｏｃｋ／ＢＡ／Ｆ３細胞）を増殖因子ＩＬ−3の非存在下で、１ウェル当り１×１０3個となるように１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）を含みマウスリコンビナントＩＬ−３を含まないＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社）で９６ウェルプレートに撒き、５％ＣＯ2存在下、３７℃で培養後、翌日（Ｄａｙ１）および４日後（Ｄａｙ４）の細胞数を細胞数測定試薬（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧｌｏTM Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）をマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ；パーキンエルマー社）を用いた。Ｍｏｃｋ／ＢＡ／Ｆ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで細胞数のカウントは増加しなかったのに対して、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）発現／ＢＡ／Ｆ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで約２３倍の細胞数の増加が観察された。また、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）発現／ＢＡ／Ｆ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで約１３倍の細胞数の増加が観察された。以上により、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドおよびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドは増殖因子非依存性増殖亢進作用を有することがわかった。
【００６５】
[実施例６] ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドおよびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）融合ポリヌクレオチドの足場非依存的増殖亢進作用の検討
実施例４において、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）／ｐＭＸs−ｐｕｒｏおよびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）／ｐＭＸs−ｐｕｒｏを用いて作成したウイルス溶液にポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Ｓｉｇｍａ社）を４μｇ／ｍＬの濃度で添加したのち、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に添加し感染させた。添加６時間後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）を含むＤ−ＭＥＭ培地に交換し、感染１日後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）および１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（シグマ社）を含むＤ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）に交換し、５％ＣＯ2存在下、３７℃で４週間培養を続け、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）を安定発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を取得した。（それぞれＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞と命名した。）
ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞の足場非依存的増殖亢進能を検討するため、９６ウェルスフェロイドプレート（スミロンセルタイトスフェロイド９６Ｕ；住友ベークライト）にＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞および空ベクターであるｐＭＸｓ−ｐｕｒｏを感染させたＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｍｏｃｋ／３Ｔ３細胞）を、それぞれ１ウェル当り１×１０3個となるように１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）を含むＤ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）で播種した。５％ＣＯ2存在下、３７℃で培養後、翌日（Ｄａｙ１）および４日後（Ｄａｙ４）の細胞数を細胞数測定試薬（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧｌｏTM Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）をマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ；パーキンエルマー社）を用いた。Ｍｏｃｋ／３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで細胞数のカウントは増加しなかったのに対してＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ１（Ｐ１４Ｒ１２）発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで約１．７倍の細胞数のカウントの増加が確認された。また、ＰＩＢＦ１−ＲＥＴ＿ｖ２（Ｐ１６Ｒ１２）発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで約２．９倍の細胞数のカウントの増加が確認された。以上のことから、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞は足場非依存的細胞増殖を示すことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の検出方法は、本明細書の融合遺伝子陽性の癌患者の判定に有用である。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、前記検出方法に用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００６７】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号７及び８で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
【配列表】
2015109806000001.app