(57)【要約】      （修正有）【課題】レスベラトロールよりも優れた抗癌活性や遅筋形成促進作用を有する新規化合物を提供し、さらに該新規化合物を効率よく安全に製造する方法、前記新規化合物を含有することを特徴とする抗癌剤、遅筋形成促進剤、持久力向上剤、さらには、食品、医薬品及び医薬部外品を提供する。【解決手段】レスベラトロールが３量化された形の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩及び該新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法、前記新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する抗癌剤、遅筋形成促進剤、持久力向上剤、食品、医薬品又は医薬部外品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レスベラトロールの反応生成物であって、式（１）：
【化１】
2015027958.tif 000007
で表される新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
請求項１記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する抗癌剤。
【請求項３】
請求項１記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する遅筋形成促進剤。
【請求項４】
請求項１記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する持久力向上剤。
【請求項５】
請求項１記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する食品、医薬品又は医薬部外品。
【請求項６】
レスベラトロールを塩基性条件下で加熱することにより、目的の化合物を生成することを特徴とする請求項１記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非常に簡便な方法であり、食品でも応用可能な合成方法によって得られる、抗癌活性を有する新規化合物、該新規化合物を含む抗癌剤、遅筋形成促進剤、持久力向上剤、食品、医薬品及び医薬部外品に関する。また、本発明は、前記新規化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブドウ果皮に含有されるスチルベン誘導体であるレスベラトロールについて、画期的な研究成果が明らかにされつつある。レスベラトロールは本来ブドウが病原菌から自己を守るファイトアレキシンとして存在する抗菌作用を有する化合物であり、赤系、白系を問わずブドウ果皮に含まれることが知られているが、最近の研究で、レスベラトロールは哺乳動物に対しても有用な効果を有していることが明らかになりつつある。いわゆる「フレンチパラドックス」と言われる赤ワインの有用な生理効果は、レスベラトロールの抗酸化能を始めとして各種の生理活性機能が一因であるとされている。さらに、レスベラトロールは多くの疾病に効果があることが明らかにされつつあり（非特許文献１）、その一つにレスベラトロールは強い抗癌作用を有することが報告されている（非特許文献２）。
【０００３】
またレスベラトロールには運動機能や筋肉のエネルギー代謝に有用な効果を示すことが報告されている。筋肉組織は体内最大のエネルギー消費器官であるため、そのエネルギー代謝を亢進することは、肥満症、糖尿病、循環器系疾患の予防や治療に効果がある。そのため予防医学において筋肉のエネルギー代謝を向上させるために推奨されるのが有酸素運動であるが、その効果をより高めるためには遅筋とよばれるタイプの筋肉を発達させることが重要である。遅筋は、脂肪を主なエネルギー源とするタイプの筋肉であり、持久力に富む筋肉である。レスベラトロールにはレスベラトロールを有効成分とする持久力向上剤（特許文献１）、レスベラトロールを有効成分とするミトコンドリア生合成増強剤（特許文献２）が先行技術として報告されていることから、筋肉の持久力やエネルギー代謝に対して有用な効果を有するものとして期待されている。
【０００４】
しかしながら、レスベラトロールを含有する食可能な植物としてはブドウや落花生等が知られているがその数は限られている。また、ブドウ中でも特にブドウ果皮に多く含まれているが、それでもその含有量は極めて低く、５０〜１００μｇ／ｇ程度といわれている。
【０００５】
そこで、食品中のレスベラトロール濃度を高める取り組みもされており、紫外線照射によりレスベラトロール濃度を高めた後にレスベラトロール含有抽出物を得て、その抽出物を食品に添加した食品が提案されている（特許文献３）。また、レスベラトロールの腸管吸収効率を高めるための技術として、腸管吸収促進剤の提案もなされている（特許文献４）。このようにレスベラトロールは、抗癌作用、抗菌作用、抗酸化作用、色調保持作用、皮膚老化防止作用、口腔疾患治癒作用等の様々な有用な性質を有する化合物であるが、希少成分であるが故に、高コストな商品となってしまい、サプリメント等で販売はされているものの今現在では十分に社会に浸透しているとは言いがたい。
【０００６】
また、前記レスベラトロールの誘導体として、天然にはレスベラトロールの重合体、例えばε−ビニフェリン（二量体）、α−ビニフェリン（三量体）、バチカノールＣ（四量体）等が報告されているが、いずれもレスベラトロールと同様に天然の希少成分であり、現在のところ十分量を供給することは困難である。
【０００７】
そこで、医薬品分野では、化学合成によりレスベラトロールの作用機序を参考にした新規化合物を作製する試みもある（非特許文献３）が、これらは主に医薬品としての開発対象物であり、安全性の面から未だに多くの課題が残されている。
また、非天然型のレスベラトロール誘導体についての報告もある（特許文献５）。
【０００８】
このように、レスベラトロールは食経験の豊かな天然物質であり、また、生体調節機能に優れた安全な化合物でもあることから、前記のように原料やリード化合物としてのこれらを効率的に製造する技術開示もなされている。
【０００９】
本発明者らもこれまでに、レスベラトロール重合化合物を報告している（特許文献６）。
しかしながら、本発明のレスベラトロールの反応生成物は確認されておらず、他にも報告した例は見られない。
【００１０】
また、厚生労働省の調べによると、平成２０年の日本人の死亡原因の３０％が悪性新生物つまり癌である。現在の抗癌剤の研究では、日常的に摂取できる天然物由来の化合物としては、ケルセチンをはじめとするフラボノイド類等が知られている（非特許文献４）。
【００１１】
従って、有効性の認められている素材をさらに高機能化し、現実的に使用可能な素材を開発することが強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許第４７３９１６１号公報
【特許文献２】特表２０１２−５２４０３３号公報
【特許文献３】特許第４４７１６３１号公報
【特許文献４】特開２００９−１７３５７０号公報
【特許文献５】国際公開第２００８／１３６１７３号
【特許文献６】特開２０１１−２５１９１４号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，５，４９３−５０６（２００６）
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５（１０），２１８−２２０（１９９７）
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ，４５０（２９），７１２−７１６（２００７）
【非特許文献４】Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２３（４），５１９−５３４（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは、レスベラトロールに関する前記の状況を鑑みて、新規な生理活性又は強力な生理活性を有するレスベラトロール誘導体の探索と、その製造方法を確立すべく鋭意検討した結果、意外にもレスベラトロールを塩基性条件下で加熱するという簡便且つ安全な方法により、レスベラトロールと比べて優れた抗癌活性や遅筋形成促進作用を有する新規化合物を製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
したがって、本発明は、レスベラトロールよりも優れた抗癌活性や遅筋形成促進作用を有する新規化合物を提供し、さらに該新規化合物を効率よく、安全に製造する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記新規化合物を含有することを特徴とする抗癌剤、遅筋形成促進剤、持久力向上剤、さらには、食品、医薬品及び医薬部外品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の要旨は、
〔１〕レスベラトロールの反応生成物であって、式（１）：
【００１７】
【化２】
2015027958.tif 000002
【００１８】
で表される新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩、
〔２〕前記〔１〕記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する抗癌剤、
〔３〕前記〔１〕記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する遅筋形成促進剤、
〔４〕前記〔１〕記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する持久力向上剤、
〔５〕前記〔１〕記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する食品、医薬品又は医薬部外品、
〔６〕レスベラトロールを塩基性条件下で加熱することにより、目的の化合物を生成することを特徴とする前記〔１〕記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明である前記式（１）で表される新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩（以下、「新規化合物」という。）は、レスベラトロールと比べて、抗癌活性に優れていることから、新規な抗癌剤として有用である。またレスベラトロールに比べて、遅筋形成促進作用に優れており、新規な持久力向上剤として有用である。
また、本発明の新規化合物は、前記のような生理活性に優れることから、食品、医薬品及び医薬部外品に配合することで、抗癌活性、遅筋形成促進作用に優れた食品、医薬品及び医薬部外品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、実施例１で得られたクロマトグラムを示す。図中、Ａのピークは本発明の新規化合物を含むピークを示す。
【図２】図２は、実施例４で行った培養筋管細胞中のミオシン重鎖の定量結果を示す。レスベラトロールもしくは本発明品であるＵＨＡ４０２２で処理した筋管細胞中の遅筋型ミオシンと速筋型ミオシンをウェスタンブロット解析によって定量し、その比（遅筋型／速筋型）を算出している。ＵＨＡ４０２２によって遅筋型ミオシン比率が向上していることがわかる。
【図３】図３は、実施例５で行った培養筋管細胞中の遺伝子発現を定量ＰＣＲによって定量した結果を示す。定量したのは、遅筋型トロポニン１であるＴｎｎｉ１、ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体δ（ＰＰＡＲδ）を定量した。その結果、両遺伝子の発現量がＵＨＡ４０２２によって増加していることがわかる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２２】
本発明の新規化合物は、レスベラトロールの反応生成物であって、式（１）：
【００２３】
【化３】
2015027958.tif 000003
【００２４】
で示される新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩である。
【００２５】
前記新規化合物の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬学的に許容可能な塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００２６】
本発明の新規化合物は、当該分野で周知の方法に従って化学合成することも可能ではあるが、反応工程が複雑となり、人体に有害な試薬、触媒、溶媒等を必要とする。また、化学合成では不純物を除去する煩雑さもあり、さらに安全性の観点から、前記新規化合物の精製を徹底する必要もあり、製造コストの面で工業的には不向きな方法である。
【００２７】
そこで、本発明者らは、鋭意検討した結果、レスベラトロールを塩基性条件下で加熱することで、前記の化学合成法のように有害な試薬等や煩雑な工程を必要とせずに、本発明の新規化合物を効率的かつ安全に製造することができることを見出した。以下に、本発明の新規化合物の製造方法（以下、「本発明の製造方法」という）について具体的に説明する。
【００２８】
本発明の製造方法では、前駆体としてレスベラトロールを用いる。レスベラトロールにはトランス体とシス体の構造異性体が存在するが、加熱や紫外線によってトランス体とシス体の変換が一部生じる。したがって、レスベラトロールとしては、トランス体でもシス体でも、あるいはトランス体とシス体の混合物であってもよい。レスベラトロールは、ブドウ果皮・茎・葉、ピーナッツの渋皮、メリンジョ、イタドリ、リンゴンベリー等の原料から抽出・精製した天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であってもよい。天然由来のレスベラトロールを用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、レスベラトロール以外の成分を含む混合物も使用できる。また、レスベラトロールには、塩等も含まれる。
ただし、本発明の新規化合物の回収率の観点からは、レスベラトロール換算で５重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。
前記レスベラトロールとしては、ブドウ果皮・茎・葉、ピーナッツの渋皮、メリンジョ、イタドリ、リンゴンベリー等の原料からの抽出物、凍結乾燥品等を使用してもよい
【００２９】
本発明の製造方法では、レスベラトロールを適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであれば、レスベラトロールの水への溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させればよい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類については特に制限はなく、レスベラトロールが十分に溶解すればよい。中でも、メタノールやエタノールのみの溶媒、水とメタノール、水とエタノール等の混合液を使用することが、安全性やコスト面から好ましい。特に、本発明の新規化合物を含む反応後の組成物を、十分な精製をせずに食品等の原料として使用する場合には、安全性や法規面から溶媒としてエタノールや含水エタノールを使用することが望ましい。
【００３０】
得られるレスベラトロールを含有する溶液中のレスベラトロールの濃度については特に制限はないが、レスベラトロールの濃度が高いほど溶媒使用量が少ない等のメリットがあるため、レスベラトロールの濃度は溶媒に対しレスベラトロールが飽和する濃度近くが好ましい。
【００３１】
次に、前記レスベラトロールを含有する溶液（以下、レスベラトロール含有溶液）を塩基性に調整する。具体的には、レスべラトロール含有溶液のｐＨを８以上に調整することが好ましい。調整方法として、例えば、レスベラトロール含有溶液を調製した後にｐＨ調整剤を添加してｐＨを調整してもよいし、前記レスべラトロール含有溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいてもよい。レスベラトロール含有溶液の反応開始時のｐＨは１３．０以上であれば、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために最終的な本発明の新規化合物の回収量が低下する傾向がある。したがって、本発明の新規化合物の回収量の観点から、反応開始時のレスべラトロール含有溶液のｐＨは８以上１３未満が望ましい。
【００３２】
前記ｐＨ調整剤としては、特に制限はないが、安全性、効率及びコスト面からは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウムが望ましい。また、必ずしも必要な手法ではないが、反応時のｐＨ変化を極力抑える場合が生じた際には、緩衝溶液を用いてもよい。
【００３３】
次に、前記のように塩基性条件にしたレスベラトロール含有溶液を加熱処理する。この加熱処理により、本発明の新規化合物の生成反応を行う。生成反応を効率的に進ませるために、レスベラトロール含有溶液の加熱温度は１１０℃以上に調整することが好ましい。例えば、開放容器にレスベラトロール含有溶液を入れ、溶媒の沸点を超える高温で前記容器を加熱する、密閉容器にレスベラトロール含有溶液を入れて前記容器を加熱する、レトルト装置、オートクレーブ、超臨界装置、プレッシャークッカー等を用いて加圧加熱する等、少なくとも部分的に溶液温度が１１０℃以上に達するように加熱することが好ましい。また、使用する溶媒の沸点から考え、加圧加熱が望ましい。回収効率面から、溶液温度が均一に１１０℃〜１５０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近に加熱する場合は、５分〜３６０分の加熱時間が望ましい。特に、生成の効率からすると、なるべく長めの加熱が好ましく、例えば、１１０℃〜１５０℃の加熱を行う場合６０分を超える加熱を行うことがより好ましい。また、加熱は、一度でもよいし、複数回に分けて繰り返し加熱してもよい。複数回に分けて加熱する場合、蒸発した溶媒を補うために溶媒を新たに追加して行うことでより効率よく本発明の新規化合物が生成できるので好ましい。
【００３４】
前記加熱処理による本発明の新規化合物の生成反応の終了は、例えば、ＨＰＬＣによる成分分析により本発明の新規化合物の生成量を確認して判断すればよい。
【００３５】
得られる反応溶液中には、生成した本発明の新規化合物が含有されている。
また、安全な原料のみを用いた工程で本発明の新規化合物を製造した場合には、本発明の新規化合物を含む混合物の状態で食品、医薬品又は医薬部外品に使用することが可能である。例えば、天然由来のレスベラトロールを含水エタノール溶媒に溶解し、炭酸水素ナトリウム等を添加してｐＨを調整し、加熱処理した場合には、得られる反応溶液を食品、医薬品又は医薬部外品の原料の一つとして使用することが可能である。
【００３６】
また、風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記反応溶液を濃縮して本発明の新規化合物の濃度を高める、あるいは前記反応溶液を精製し本発明の新規化合物の純品を得ることができる。濃縮、精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等を用いた溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出して本発明の新規化合物を濃縮できる。また、カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことや、再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。
【００３７】
また、前記反応溶液から本発明の新規化合物を分離して回収する場合には、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等を用いてもよい。
【００３８】
前記濃縮物や精製物を、必要に応じて、減圧乾燥や凍結乾燥して溶媒除去することで、粉末状の本発明の新規化合物を得ることができる。
【００３９】
以上のようにして得られる本発明の新規化合物は、レスベラトロールに比べて、優れた抗癌活性を有する。したがって、本発明の新規化合物を有効成分として含有する抗癌剤を提供することができる。またレスベラトロールに比べて、優れた遅筋形成促進作用を有する。したがって、本発明の新規化合物を有効成分として含有する遅筋形成促進剤及び持久力向上剤を提供することができる。
【００４０】
特に、本発明の新規化合物の生理活性分野を考慮すると、癌予防・治療等の健康増進を目的とした抗癌剤や、遅筋形成促進剤、持久力の向上などを目的とした持久力向上剤として用いることが好ましい。
【００４１】
なお、本発明の新規化合物が持つさらなる効果効能は、得られた生理活性データより類推できる範囲で使用できる。
【００４２】
本発明の新規化合物の原料であるレスベラトロールは、その重合体も含めて食経験豊かな化合物であり、安全性にも優れるといえるため、本発明の新規化合物の安全性も同様に優れたものであると考えられる。
したがって、本発明の新規化合物は、食品、医薬品、医薬部外品等に配合して使用することができる。このような食品、医薬品、医薬部外品は、抗癌作用を有する食品、医薬品、医薬部外品となる。特に、抗癌作用が知られていない材料のみからなる抗癌作用のない食品、医薬品、医薬部外品でも、本発明の新規化合物を配合することで、簡単に抗癌作用を付与することができる。
【００４３】
前記食品としては、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子等、どのような形態でもよく、菓子類の中でも、その容量等から保存や携帯性に優れた、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット等が挙げられるが、特に限定はない。例えば、本発明の新規化合物をワインに添加することで、ワインの健康機能効果をさらに増強した新規なワインとすることもできる。この新規なワインのように、嗜好性と健康機能効果の双方を兼ね備えた飲食品は、社会ニーズの非常に高い分野の飲食品であり、この社会ニーズに十分応えることが可能である。また、本発明の新規化合物は、優れた抗癌活性を有することから、癌に対する予防を目的に、容易に摂取できるキャンディー、グミキャンディ、タブレット等にすることができる。なお、食品には、機能性食品、健康食品、健康志向食品等も含まれる。
【００４４】
また、前記食品には、ヒトが食べる食品だけでなく、例えば、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。
【００４５】
前記医薬品としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤等の固形製剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、ゲル剤等が挙げられる。錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤等の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施してもよいし、胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、前記の製剤に公知の可溶化処理を施すこともできる。常法に基づいて、前記液剤を注射剤又は点滴剤に配合して使用してもよい。
【００４６】
医薬部外品としては、口腔に用いられる医薬部外品、例えば、歯磨き、マウスウォッシュ、マウスリンス、ドリンク剤が挙げられる。
【００４７】
本発明の新規化合物を用いて食品、医薬品又は医薬部外品を調製する場合、本発明の効果が損なわれない範囲内で食品、医薬品又は医薬部外品に通常用いられる成分を適宜任意に配合することができる。
例えば、食品の場合には、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤のような食品に通常配合される原料又は素材と組み合わせることができる。
医薬品や医薬部外品の場合には、主剤、基材、界面活性剤、起泡剤、湿潤剤、増粘剤、透明剤、着香料、着色料、安定剤、防腐剤、殺菌剤等に組み合わせ、常法に基づいて、液状、軟膏状又はスプレー噴射可能な最終形態等にすることができる。
【００４８】
また、本発明の新規化合物を食品に添加する場合には、該食品中に、通常は０．００１〜２０重量％添加することが好ましい。
【００４９】
本発明の新規化合物を医薬用途で使用する場合、例えば、その摂取量は、所望の改善、治療又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常、薬剤の態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。１日当たり約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。
【００５０】
本発明の新規化合物を医薬部外品に添加する場合には、該医薬部外品中に、通常０．００１〜３０重量％添加するのが好ましい。
【００５１】
次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
（実施例１：レスベラトロールの反応生成方法の検討）
トランス−レスベラトロール（東京化成工業（株）製）１ｇをエタノール２０ｍＬに溶解し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液を２０ｍＬ加えて、レスベラトロール含有溶液（ｐＨ９．９）を調製した。このレスベラトロール含有溶液をオートクレーブ（三洋電機（株）製、「ＳＡＮＹＯ  ＬＡＢＯ  ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」）にて１３０℃、９０分間加熱した。得られた反応溶液のうち１ｍＬを取り出して、メタノールにて５０ｍＬにメスアップし、このうちの１０μＬをＨＰＬＣにより分析した。
【００５３】
ＨＰＬＣ分析は以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ2Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）），  Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：８０％Ａ／２０％Ｂから２０％Ａ／８０％Ｂまで３０分間、２０％Ａ／８０％Ｂから１００％Ｂまで５分間、１００％Ｂで１０分間（全て直線）
【００５４】
得られたクロマトグラムを図１に示す。
【００５５】
（実施例２：新規化合物の単離・構造決定）
得られた反応物のうち、図１のＡで示したピーク（溶出時間：約１８分付近）に含まれる化合物を分取ＨＰＬＣにより単離し、常法により乾燥したところ、褐色粉末状の物質を７２．６ｍｇ得た。この物質をＵＨＡ４０２２と命名した。
【００５６】
次いで、前記ＵＨＡ４０２２の分子量を高分解能Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ＦＡＢ−ＭＳ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）にて測定したところ、測定値は６４７．２１４４であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ42Ｈ31Ｏ7（Ｍ−Ｈ-）：６４７．２１４８
分子式Ｃ42Ｈ32Ｏ7
【００５７】
次に、前記ＵＨＡ４０２２を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記ＵＨＡ４０２２が前記式（１）で表される構造を有する新規化合物であることを確認した。したがって、前記式（１）で表される新規化合物は本発明の方法で効率的に生成できることが示された。
【００５８】
なお、前記ＮＭＲ測定値については、ＵＨＡ４０２２を
【００５９】
【化４】
2015027958.tif 000004
【００６０】
として、その1Ｈ核磁気共鳴スペクトル、13Ｃ核磁気共鳴スペクトルを表１に示す。
値はδ、ｐｐｍで、溶媒はＤＭＳＯ−ｄ6で測定した。
【００６１】
【表１】
2015027958.tif 000005
【００６２】
また、ＵＨＡ４０２２の物理化学的性状は、以下のようになった。
（性状）
褐色粉末
（溶解性）
水：難溶
メタノール：溶解
エタノール：溶解
ＤＭＳＯ：溶解
クロロホルム：難溶
酢酸エチル：難溶
【００６３】
（実施例３：ＵＨＡ４０２２のヒト骨髄球性白血病細胞に対する抗癌作用）
次に癌細胞に対する実施例２で得られたＵＨＡ４０２２の効果を見るため、ＨＬ−６０細胞（ヒト骨髄球性白血病細胞）を用いた癌細胞増殖抑制作用について試験した。
【００６４】
ＨＬ−６０細胞の培養には、４ｍＭグルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、シグマアルドリッチジャパン社製）、１％アンチバイオティック−アンチマイコティック（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を含む高栄養培地「ＲＰＭＩ−１６４０」（シグマアルドリッチジャパン社製）を使用した。試験には細胞培養用９６ウェルプレート（コーニングジャパン（株）製）を用い、５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞数を調整したＨＬ−６０細胞を１ウェルあたり１００μＬずつ播種して試験に使用した。
【００６５】
試料は、実施例２で得られたＵＨＡ４０２２、原料のレスベラトロールの２種類を用いた。試料調製は、各々の化合物をジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）製）にて溶解し、ＨＬ−６０細胞培養液中の最終濃度がそれぞれ６．３μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ及び1００μＭとなるように添加して、３７℃、５％ＣＯ2の培養条件下で試験を開始した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを同量添加したものをネガティブコントロールとした。
【００６６】
生存細胞数の定量は「Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８」（（株）同人化学研究所製）を用いたＭＴＴ法にて行った。つまり、試験開始より２４時間後、各ウェルにＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８溶液を１０μＬ添加し、よく攪拌した。３７℃、５％ＣＯ2条件下で１時間の遮光反応を行った。その後にプレートリーダー（「ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ ＦＣ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて測定波長４５０ｎｍの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに細胞生存率を算出した。細胞生存率とは、溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した培養液の生存細胞数を１００％とし、各化合物の濃度下における細胞の生存細胞数を相対値として算出した値である。各化合物濃度と細胞生存率の関係から、細胞増殖を５０％抑制する濃度ＩＣ50（５０％阻害濃度）を算出した。その結果を表２に示す。
表２に示す結果から、ＵＨＡ４０２２に優れた癌細胞増殖抑制能が認められた。この抗癌作用は、レスベラトロールよりも高い抗癌活性を示した。したがってレスベラトロールを前記式（１）で表される新規化合物に変換する高い有意性が示された。
【００６７】
【表２】
2015027958.tif 000006
【００６８】
（実施例４：ＵＨＡ４０２２の遅筋型ミオシンの定量）
次に、ＵＨＡ４０２２の遅筋形成促進作用を評価するために、培養筋管細胞を用いた遅筋型ミオシンの定量を行った。
【００６９】
レスベラトロール及び本発明品であるＵＨＡ４０２２はＤＭＳＯに溶解させたものを使用した。培養筋管細胞は培養筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞，ＤＳファーマ株式会社製）を分化させることによって得た。つまり、Ｃ２Ｃ１２細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、１％アンチバイオティック−アンチマイコティック（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ、シグマ社製）で５ｘ１０4ｃｅｌｌ／Ｄｉｓｈに調整し、１２ｗｅｌｌプレート（コーニング社製）に播種した。３７℃、５％ＣＯ2条件下で４８時間培養した。これにレスベラトロール及び本発明品であるＵＨＡ４０２２を１、０．３μＭ（ＤＭＳＯ  ０．５％）添加した２％馬血清（ＨＳ、ライフテクノロジージャパン社製）、１％Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ含有ＤＭＥＭに交換し、１週間培養した。その際、陰性対象としてＤＭＳＯを用いた。培養終了後、ＲＩＰＡバッファーで細胞を溶解させてタンパク質を抽出した。
【００７０】
抽出したタンパク質はＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック社製）にて定量を行い、定法に従いＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。つまり、タンパク質５μｇに１／５量のＬａｅｍｍｌｉバッファー（１０％ドデシル硫酸ナトリウム、１００ｍＭジチオトレイトール、３０％グリセロール、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８）を添加し、９６℃で５分加熱変性させた。ゲルにはＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  Ｇｅｌ（Ａｎｙ  ｋＤ、バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）を使用した。
変性させたタンパク質サンプルを全量ゲルに供し、２００Ｖ、４０分間電気泳動した。電気泳動後、セミドライ式ブロッティング装置（ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ  Ｓ−Ｄ  ＳＥＭＩ−ＤＲＹ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＣＥＬＬ，バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）でＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写し、イムノブロック（ＤＳファーマ社製）にてブロッキングした。ここから、抗遅筋型ミオシン抗体（アバカム社製）と抗マウスＩｇＧＨＲＰ結合抗体（ＣＳＴジャパン社製）を用いて遅筋型ミオシンを検出した。同時に抗速筋型ミオシン抗体（アバカム社製）と抗マウスＩｇＧＨＲＰ結合抗体を用いて速筋型ミオシンの検出も行った。検出されたバンドを画像解析ソフトＩｍａｇｅＪにてバンド強度を算出し、遅筋型ミオシンと速筋型ミオシンの比を算出した。結果は図２に示した。
【００７１】
図２に示す結果より、ＵＨＡ４０２２においてレスベラトロールよりも遅筋型ミオシン量の比が増加していることが示された。この作用はレスベラトロールよりも高かった。従って、本発明品であるＵＨＡ４０２２はレスベラトロールよりも優れた遅筋形成促進作用を有することが示された。
【００７２】
（実施例５：遅筋関連の遺伝子発現の定量）
次にミオシンタイプにおいて遅筋形成が認められたＵＨＡ４０２２で遅筋に関連する遺伝子の発現量を評価するために、培養筋管細胞を用いてペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体δ（ＰＰＡＲδ）、遅筋型トロポニン１（Ｔｎｎｉ１）遺伝子発現の定量を行った。
【００７３】
試料及び細胞培養は実施例４に準じて行った。培養終了後、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（ライフテクノロジージャパン社製）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡを２ステップリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用逆転写試薬（商品名：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、タカラバイオ（株）製）の取扱説明書に準じて逆転写反応を行った。
【００７４】
つまり５×（Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）４μＬ及び全量ＲＮＡ  １μｇを混合し、ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  ｄＨ2Ｏで全量を１０μＬにした。ＰＣＲ用サーマルサイクラー（商品名：ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を使用して１サイクルが「３７℃×１５分→８５℃×５秒」であるプログラムにて逆転写反応を行った。逆転写反応液を滅菌超純水にて１０倍希釈した希釈液をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析に使用した。
【００７５】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析は定法に従って行った。解析には、ＥＣＯ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＲＴ―ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ」（商品名、イルミナ（株）製）を使用した。ＰＧＣ−１βプライマーには、ＰＰＡＲδフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１２７４９９−Ｆ）及びＰＰＡＲδリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１２７４９９−Ｒ）を使用した。ＴｎｎｉプライマーにはＴｎｎｉ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１１０７７９−Ｆ）及びＴｎｎｉ１リバースプライマー（プライマーＩＤ: ＭＡ１１０７７９−Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ−アクチンとし、そのプライマーとして、ＡＣＴＢフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ０６７８０３−Ｆ）及びＡＣＴＢリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ０６７８０３−Ｒ）（前記６種のプライマーはいずれもタカラバイオ（株）製）を使用した。
【００７６】
反応にはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試薬（商品名：ＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ライフテクノロジージャパン社製）を使用した。反応液は４８ウェルＰＣＲプレート（イルミナ（株）製）中に、２×ＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  ２．５μＬ、フォワードプライマー（５０μＭ）０．０４μＬ、リバースプライマー（５０μＭ）０．０４μＬ、逆転写反応液１μＬ及び（ｄＨ2Ｏ）１．４２μＬ（総量５μＬ）を混合した。各遺伝子の解析には『５０℃×２分→９５℃×３０秒→「９５℃×５秒→６５℃×３０秒」×４０サイクル→９５℃×１５秒→５５℃×１５秒→９５℃×１５秒』のプログラムにてＰＣＲ反応を行った。
【００７７】
得られた各細胞中のβ−アクチンと各遺伝子のＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ：一定の増幅量（閾値）に達するサイクル数）から各遺伝子発現量の相対値を算出した。結果を図３に示した。
【００７８】
図３に示す結果より、本発明の新規化合物により遅筋関連遺伝子がレスベラトロールによるよりも有意に増加していた。従って、本発明の新規化合物がレスベラトロールよりも優れた遅筋形成促進作用を有することが遺伝子発現レベルからも示された。
【００７９】
（実施例６：加熱温度によるＵＨＡ４０２２の生成量の違い）
レスベラトロール１ｇ、エタノール２０ｍＬ、５％炭酸水素ナトリウム水溶液２０ｍＬの混合溶液（ｐＨ＝９．９）を、オートクレーブにて７０℃、９０℃、１１０℃、１３０℃の各温度条件で９０分間加熱した。それぞれの温度条件で得られた反応後組成物１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、実施例１と同様にＨＰＬＣにより分析した。
【００８０】
その結果、１１０℃以上でＵＨＡ４０２２の生成は確認できた。レスベラトロール量からの生成比率（重量％）は、７０℃、９０℃が非生成、１１０℃が極微量、１３０℃が７．１％となり、１３０℃での加熱によりもっとも多くのＵＨＡ４０２２が生成していた。
【００８１】
（実施例７：ＵＨＡ４０２２含有エキスの調製）
レスベラトロール〔（株）Ｔｅｃｈｎｏ  ｓｃｉｅｎｃｅ製〕１ｇ、５％炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業（株）製、食品添加物）水溶液２０ｍＬ、エタノール２０ｍＬを調製した混合溶液（ｐＨ＝９．９）を、オートクレーブにて１３０℃、９０分間加熱した。得られた反応溶液を減圧加熱させて乾固し、ＵＨＡ４０２２含有エキスを１．７ｇ得た。得られたＵＨＡ４０２２含有エキス１．７ｇ中には、実施例２と同様の手法で確認したところＵＨＡ４０２２が０．０７０ｇ含有されていた。必要に応じてこの作業を繰り返した。
【００８２】
（実施例８：ＵＨＡ４０２２を含有する食品）
実施例７で得たＵＨＡ４０２２含有エキス１ｇをあらかじめ１００ｍＬのエタノールに溶解させ、これに砂糖５００ｇ、水飴４００ｇを混合溶解し、生クリーム１００ｇ、バター２０ｇ、練乳７０ｇ、乳化剤１．０ｇを混合した後、真空釜にて−５５０ｍｍＨｇ減圧させ、１１５℃の条件下で濃縮し、水分値３．０重量％のミルクハードキャンディを得た。このミルクハードキャンディは、菓子として食べ易いものであることはもちろん、癌患者における癌の拡散のリスクを低減したり、癌の発症のリスクを低減したり、癌の予防を期待した機能性食品や持久力向上を期待した機能性食品としても利用できる。
【００８３】
（実施例９：ＵＨＡ４０２２を含有する医薬品）
実施例１，２の方法で得たＵＨＡ４０２２をエタノールに溶解し、これを微結晶セルロースに添加して吸着させた後に、減圧乾燥させた。この吸着物を用いて常法に従い、打錠品を得た。処方はＵＨＡ４０２２を１０重量部、コーンスターチ２３重量部、乳糖１２重量部、カルボキシメチルセルロース８重量部、微結晶セルロース３２重量部、ポリビニルピロリドン４重量部、ステアリン酸マグネシウム３重量部、タルク８重量部である。本打錠品は、癌の治癒を目的とする医薬品や脂質代謝能の高い遅筋形成を目的とした医薬品として有効に利用できる。
【００８４】
（実施例１０：ＵＨＡ４０２２を含有する医薬部外品）
実施例１，２の方法で得たＵＨＡ４０２２  １．２ｇを１０ｍＬのエタノールに溶解し、これにタウリン２０ｇ、ビタミンＢ１硝酸塩０．１２ｇ、安息香酸ナトリウム０．６ｇ、クエン酸４ｇ、砂糖６０ｇ、ポリビニルピロリドン１０ｇを溶解させた精製水を混合し、さらに精製水で１０００ｍＬにメスアップした。なお、ｐＨは、希塩酸を用いて３．２に調整した。得られた溶液１０００ｍＬのうち５０ｍＬをガラス瓶に充填し、８０℃で３０分間滅菌して、医薬部外品であるドリンク剤を完成させた。本ドリンク剤は、栄養補給の目的に加えて、癌患者における癌の拡散のリスクを低減したり、癌の発症のリスクを低減したり、癌の予防を目的とする医薬部外品や持久力向上を期待した機能性食品として有効に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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