(57)【要約】【課題】植物細胞からの不定胚形成能のある植物細胞の選抜を経由して植物体を作製することを提供する。【解決手段】以下の工程（ａ）〜（ｃ）、すなわち、（ａ）植物組織を、１種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養して、該植物組織から不定胚形成能を有する植物細胞を誘導し及び選抜する工程、又は、不定胚形成能を有する植物細胞を含む植物細胞塊を、1種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養して、不定胚形成能を有する植物細胞を選抜する工程、（ｂ）工程（ａ）で選抜された不定胚形成能を有する植物細胞から不定胚を誘導する工程、（ｃ）工程（ｂ）で誘導された不定胚から植物体を再生する工程を含む植物体の作製方法、並びに、該不定胚形成能を有する植物細胞の選抜方法及び維持方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）植物組織を、１種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養して、該植物組織から不定胚形成能を有する植物細胞を誘導し及び選抜する工程、又は、不定胚形成能を有する植物細胞を含む植物細胞塊を、1種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養して、不定胚形成能を有する植物細胞を選抜する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選抜された不定胚形成能を有する植物細胞から不定胚を誘導する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で誘導された不定胚から植物体を再生する工程、
を含む、植物体の作製方法。
【請求項２】
工程（ａ）において、選抜された不定胚形成能を有する植物細胞を維持及び/又は増殖することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
植物組織を１種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養して不定胚形成能のある植物細胞を選抜することを特徴とする、不定胚形成能のある植物細胞の選抜方法。
【請求項４】
不定胚形成能のある植物細胞を、１種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で維持することを特徴とする、不定胚形成能のある植物細胞の維持方法。
【請求項５】
植物組織を１種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養することを含むことを特徴とする、不定胚形成能のないもしくは低い細胞塊の生成を抑制する方法。
【請求項６】
植物二次代謝阻害剤が、アセチル-CoAカルボキシラーゼ阻害剤である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
アセチル-CoAカルボキシラーゼ阻害剤が、シクロヘキサンジオン、アリルオキシプロピオン酸エステル及びフェニルピラゾリンからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
シクロヘキサンジオンが、セトキシジムである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アリルオキシプロピオン酸エステルが、フルアジホップである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
植物二次代謝阻害剤が、チオカーバメイト刑除草剤である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
チオカーバメイト系除草剤が、ピリブチカルブである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物組織（外植片）から不定胚形成能のある細胞を誘導し選抜する方法に関する。
本発明はまた、上記の選抜された不定胚形成能のある細胞から不定胚を誘導し植物体を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の栄養体は、挿し木、株分け、塊茎、りん茎などを利用し増殖されるが、植物種によってはインビトロ培養による増殖法が利用されている。現在用いられているインビトロ培養法は、無菌環境下での挿し木、株分け、塊茎誘導、りん茎誘導のほか、植物体再生能を有する細胞から不定芽や不定胚を経由し植物体を再生する方法などである。
【０００３】
植物細胞から不定胚を経由して植物体を再生する方法は、大量の植物体が効率よく得られるので期待される手法である。しかし、すべての細胞から植物体が再生するわけではなく、植物体再生効率を最大化できてはいない。特に、不定胚形成能が高い細胞と不定胚形成能がないもしくは低い細胞が同時に存在する状態で細胞の増殖を行っていることに課題がある。不定胚形成能が高い細胞を形態等から経験的に選別することはある程度可能ではあるが、選別された細胞から再度不定胚形成能がないもしくは低い細胞が生じてしまう。また、一般的に不定胚形成能がある細胞の増殖はその他の細胞より劣るので、選別を伴わない増殖により不定胚形成能がある細胞の割合が時間とともに減ってしまい、最終的に不定胚形成能がないもしくは低い細胞が大半をしめることになってしまう。このように植物体再生が期待されない細胞が存在する状態で細胞を増殖することは、細胞増殖時に無駄が生じるとともに植物体再生時の効率を大きく減じてしまう。
【０００４】
本出願人による特許文献１には、不定胚を経由する植物再生のための、植物組織からの不定胚形成能を有する細胞の誘導および増殖工程、あるいは該不定胚形成能を有する細胞 からの不定胚の誘導工程において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む培地で植物細胞を培養することを含むことを特徴とする、不定胚形成能のないあるいは低い細胞の生成を抑制する方法が開示されている。
【０００５】
ところで、本発明と関係する植物のアセチル-CoAカルボキシラーゼは、色素体や細胞質に存在し、脂肪酸合成、フラボノイド合成などに関わっており、多くの植物では、色素体にみられる４つの各サブユニットの２量体からなるヘテロメリックな酵素と、細胞質にみられる単一のポリペプチドの２量体からなるホモメリックな酵素が存在することが知られている（非特許文献１）。しかし、例外があるもののイネ科植物の色素体アセチル-CoAカルボキシラーゼはホモメリックな酵素である。この相違を利用してホモメリックな酵素の阻害剤がイネ科雑草の選択的除草剤として利用されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−２２０４９３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Sasaki, Y. and Nagano, Y. Plant Acetyl-CoA Carboxylase: Structure, Biosynthesis, Regulation, and Gene Manipulation for Plant Breeding. Biosci. Biotechnol. Biochem. (2004) 68: 1175-1184
【非特許文献２】冨永  達  「アセチル-CoAカルボキシラーゼ阻害剤に対する雑草の抵抗性」雑草研究  (2008) 53: 84-86
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
簡便に不定胚形成能のないもしくは低い細胞の増殖を抑制することにより、植物体再生能が高い細胞の割合を高める方法を提供し、従来法に比してより効率的な不定胚による植物体の作製（すなわち、生産）を可能とする。
【０００９】
特許文献１には、不定胚の誘導工程において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む培地で植物細胞を培養することを含む、不定胚形成能のないもしくは低い細胞の生成を抑制する方法が開示されているが、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤はその効果が不十分な場合があった。また、植物二次代謝阻害剤に、不定胚形成能のないもしくは低い細胞の生成を抑制する作用効果があることは、これまで知られていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
鋭意検討の結果、アセチル-CoAカルボキシラーゼ阻害剤やチオカーバメイト刑除草剤などの植物二次代謝阻害剤を含む培地で植物組織培養することにより、不定胚形成能のないもしくは低い細胞の増殖を特異的に抑制できることを見出し、これにより、植物体再生能が高い細胞の割合を高めることが可能となり、不定胚からの植物体再生の効率を改善することを見出した。これにより本発明を完成した。
【００１１】
本発明は以下の特徴を有する。
（１）下記の工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）植物組織を、１種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養して、該植物組織から不定胚形成能を有する植物細胞を誘導し及び選抜する工程、又は、不定胚形成能を有する植物細胞を含む植物細胞塊を、1種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養して、不定胚形成能を有する植物細胞を選抜する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選抜された不定胚形成能を有する植物細胞から不定胚を誘導する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で誘導された不定胚から植物体を再生する工程、
を含む、植物体の作製方法。
【００１２】
（２）工程（ａ）において、選抜された不定胚形成能を有する植物細胞を維持及び/又は増殖することをさらに含む、上記（１）に記載の方法。
【００１３】
（３）植物組織を１種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養して不定胚形成能のある植物細胞を選抜することを特徴とする、不定胚形成能のある植物細胞の選抜方法。
【００１４】
（４）不定胚形成能のある植物細胞を、１種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で維持することを特徴とする、不定胚形成能のある植物細胞の維持方法。
【００１５】
（５）植物組織を１種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養することを含むことを特徴とする、不定胚形成能のないもしくは低い細胞の生成を抑制する方法。
【００１６】
（６）植物二次代謝阻害剤が、アセチル-CoAカルボキシラーゼ阻害剤である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００１７】
（７）アセチル-CoAカルボキシラーゼ阻害剤が、シクロヘキサンジオン、アリルオキシプロピオン酸エステル及びフェニルピラゾリンからなる群から選択される、上記（６）に記載の方法。
【００１８】
（８）シクロヘキサンジオンが、セトキシジムである、上記（７）に記載の方法。
（９）アリルオキシプロピオン酸エステルが、フルアジホップである、上記（７）に記載の方法。
【００１９】
（１０）植物二次代謝阻害剤が、チオカーバメイト刑除草剤である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（１１）チオカーバメイト刑除草剤が、ピリブチカルブである、上記（１０）に記載の方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、不定胚からの植物体の再生において、植物組織を１種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養して、該植物組織から不定胚形成能を有する植物細胞を誘導し及び選抜すること、あるいは、不定胚形成能を有する植物細胞を含む植物細胞塊を、1種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養して、不定胚形成能を有する植物細胞を選抜することを特徴とする、植物体の効率的な作製を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、セトキシジムがヤツガタケトウヒの不定胚誘導能を有する細胞（「E細胞」と称する）及び不定胚誘導能を有しないもしくは低い細胞（「NE細胞」と称する）の増殖に及ぼす影響を固体培地上で調べた結果を示す。
【図２】図２は、セトキシジムがテーダマツのE細胞及びNE細胞の増殖に及ぼす影響を固体培地上で調べた結果を示す。
【図３】図３は、セトキシジムがニンジンのE細胞及びNE細胞の増殖に及ぼす影響を示す。図中、左：E細胞、右：NE細胞、下段：対照培地、上段：セトキシジム含有培地、である。
【図４】図４は、フルアジホップがテーダマツのE細胞及びNE細胞の増殖に及ぼす影響を固体培地上で調べた結果を示す。
【図５】図５は、ピリブチカルブがテーダマツのE細胞及びNE細胞の増殖に及ぼす影響を固体培地上で調べた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下に、本発明をさらに具体的に説明する。
本発明は、第１の態様により、下記の工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）植物組織を、１種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養して、該植物組織から不定胚形成能を有する植物細胞を誘導し及び選抜する工程、又は、不定胚形成能を有する植物細胞を含む植物細胞塊を、1種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養して、不定胚形成能を有する植物細胞を選抜する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選抜された不定胚形成能を有する植物細胞から不定胚を誘導する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で誘導された不定胚から植物体を再生する工程、
を含む、植物体の作製方法を提供する。
上記方法の工程（ａ）は、選抜された不定胚形成能を有する植物細胞を維持及び/又は増殖することをさらに含むことができる。
【００２３】
本発明における重要な特徴は、工程（ａ）、すなわち、植物組織を、１種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養して、該植物組織から不定胚形成能を有する植物細胞を誘導し及び選抜すること、又は、不定胚形成能を有する植物細胞を含む植物細胞塊を、1種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養して、不定胚形成能を有する植物細胞を選抜すること、である。
【００２４】
＜植物二次代謝阻害剤＞
植物の代謝は、エネルギー獲得のための生命維持の基本物質としての炭水化物、タンパク質、脂肪及び核酸の合成と、二次代謝と呼ばれる、生命維持にとって必ずしも必要でない多数の物質の合成に分けられる。二次代謝で合成される物質には、薬剤上の有用物質が多く含まれており、例えば、アルカロイド、テルペノイド、イソプレノイド、フラボノイドなどが挙げられる。
【００２５】
本発明者らが見出した、植物二次代謝阻害剤が不定胚形成能のないもしくは低い細胞の増殖を特異的に抑制できるという知見は、不定胚形成能のないもしくは低い細胞から、不定胚形成能を有する植物細胞を選抜することを可能にした。このような知見は、これまで知られていなかった。
【００２６】
すなわち、本発明によれば、植物の細胞培養において、植物二次代謝阻害剤、例えばアセチル-CoAカルボキシラーゼ阻害剤及び/又はチオカーバメート刑除草剤の１種又は２種以上の二次代謝阻害剤を含む培地で培養することにより、不定胚形成能のない又は低い細胞の増殖を抑制することが可能である。
【００２７】
本明細書に記載される「不定胚形成能のないもしくは低い細胞」とは、不定胚形成能のある細胞と比べて不定胚形成能が低いもしくは不定胚形成能がない細胞を意味する。
【００２８】
植物のアセチル-CoAカルボキシラーゼは、アセチルCoAのアセチル基にCO2を結合させてマロニルCoAを合成する酵素であり、色素体や細胞質に存在し、脂肪酸合成、フラボノイド合成などに関っている。多くの植物では、色素体にみられる４つの各サブユニットの2量体からなるヘテロメリックな酵素と、細胞質にみられる単一のポリペプチドの2量体からなるホモメリックな酵素が存在することが知られている。しかし、例外があるもののイネ科植物の色素体アセチル-CoAカルボキシラーゼはホモメリックな酵素である。この相違を利用してホモメリックな酵素の阻害剤がイネ科雑草の選択的除草剤として利用されている。
【００２９】
アセチル-CoAカルボキシラーゼ阻害剤として使用しうる化合物は、除草剤活性を有する以下のもの、例えば、（１）シクロヘキサンジオン、（２）アリルオキシプロピオン酸エステル、（３）フェニルピラゾリンなどの化学グループが知られる。
【００３０】
上記（１）の除草剤としてアロキシジム、ブトロキシジム、クレトジム、シクロキシジム、プロホキシジム、セトキシジム、テプラロキシジム、トラルコキシジム、上記（２）の除草剤としてクロジナホップ プロパルギル、シハロホップ ブチル、ジクロホップメチル、フェノキサプロップ P エチル、フルアジホップ 、ハロキシホップ R メチル、プロパキザホップ、キザロホップ P エチル、上記（３）の除草剤としてピノキサデンなど、が知られている。本発明に利用できるアセチル-CoAカルボキシラーゼ阻害剤は、阻害剤としての機能を有する限りこれらの物質に限定されるものではない。
【００３１】
本発明で使用可能なチオカーバメイト刑除草剤は、非限定的に、例えば、ピリブチカルブ（正式名称：Ｏ−３−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル−６−メトキシ−２−ピリジル（メチル）チオカーバメート）、エスプロカルブ（正式名称：S-ベンジル (RS)-1,2-ジメチルプロピル (エチル)チオカーバメート）、モリネート（Ｓ−エチル＝ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピン−１−カルボチオアート）、ブチレート（N,N-ジイソブチルチオカルバミド酸S-エチル）、ベンチオカーブ（S-(4-クロロベンジル) N,N-ジエチルチオカーバメート）、プロスルホカルブ（S−ベンジル−ジプロピルチオカルバマート）、などである。
【００３２】
一般に、不定胚を経由する植物体再生の工程は、（ａ）植物組織から不定胚形成能を有する細胞を誘導・維持・増殖する工程、（ｂ）不定胚形成能を有する細胞から不定胚を誘導する工程、（ｃ）不定胚からの植物体再生工程を含む。これらの中で、（ａ）の工程に、上記アセチル-CoAカルボキシラーゼ阻害剤及びチオカーバメイト刑除草剤のうち１種あるいは複数種を添加した培地で植物組織を培養することにより不定胚形成能のある細胞の選択的増殖が可能となる。それぞれのアセチル-CoAカルボキシラーゼ阻害剤及び/又はチオカーバメイト刑除草剤の添加濃度は、5〜500μMの範囲が好ましいが、植物種により最適濃度が異なるため、不定胚形成能のある細胞の増殖を著しく抑制することなく、不定胚形成能のないもしくは低い細胞の増殖を抑制する最適濃度を事前に測定・確認することが望ましい。以下の濃度に限定されるものではないが、例えばヤツガタケトウヒでは本発明の実施例で用いているセトキシジムの場合、50〜500μM、好ましくは70〜300μM、さらに好ましくは80〜250μMの範囲で用いることができる。例えばテーダマツでは本発明の実施例で用いているセトキシジムの場合、10〜100μM、好ましくは15〜80μM、さらに好ましくは20〜75μMの範囲で用いることができる。例えばニンジンでは本発明の実施例で用いているセトキシジムの場合、10〜100μM、好ましくは30〜70μM、さらに好ましくは40〜60μMの範囲で用いることができる。テーダマツについて、フルアジホップの場合、7〜150μM、好ましくは8〜100μM、さらに好ましくは10〜60μMの範囲で用いることができるし、また、ピイブチカルブの場合、10〜200μM、好ましくは15〜150μM、さらに好ましくは20〜130μMの範囲で用いることができる。
【００３３】
さらに、上述したアセチル-CoAカルボキシラーゼ阻害剤又はチオカーバメイト刑除草剤の施用に用い得る植物、用い得る培養工程を例示する。
【００３４】
＜植物＞
本発明は、不定胚を提供する植物に適用可能である。植物としては、以下のものに限定されないが、好ましくはマンサク科、ヒノキ科、マツ科、マメ科、フトモモ科、ヤナギ科、クワ科、セリ科、サトイモ科、ユリ科及びヒルガオ科に属する、木本植物、双子葉植物、単子葉植物などの植物が挙げられる。
【００３５】
上記植物の例は、以下のとおりである。マンサク科（スイートガム等）、ヒノキ科（ヒノキ等）、マツ科（マツやトウヒ等）、マメ科（アルファルファ、アカシア等）、フトモモ科（ユーカリ等）、ヤナギ科（ポプラ等）、クワ科（ゴムノキ等）、セリ科（ニンジン、セロリ等）、サトイモ科（スパティフィラム等）、ユリ科（アスパラガス等）、ヒルガオ科（サツマイモ等）。
【００３６】
＜植物組織から不定胚形成能を有する細胞を誘導・維持・増殖する工程＞
本発明に用いる各種植物における未熟胚、葉、葉柄、根等の各種植物組織からの細胞の誘導、維持および増殖条件は特に限定はなく、公知の情報を使用することができる。例えば、農林水産研究文献解題No.１７ 植物バイオテクノロジー 平成３年、国際公開WO2007/064028等に記載されている条件を用いることができる。具体的には、例えば、ショ糖１〜６％(w/v%)、２,４-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)１〜８ppm、６-ベンジルアデニン0.05〜２ppmを含み、pHを５〜７ に調整したMurashige-Skoog(MS)培地（寒天0.8〜1.2％による固体培地）で、暗所、20〜30℃で培養するという条件を挙げることができる。ここで言う細胞とは、少なくとも不定胚形成能を有する細胞（エンブリオジェニックカルス、E細胞）を含む細胞を指し、他に不定胚形成能を有しない細胞（ノンエンブリオジェニックカルス、NE細胞）も適宜含み得る。両者の割合は植物種別、培養条件等の要因によって変化し得る。本工程の培地にアセチル-CoAカルボキシラーゼ阻害剤及びチオカーバメイト刑除草剤からなる群から選択された1種又は2種以上の植物二次代謝阻害剤を、対象植物ごとに前もって決定された適切な量を添加し培養することで、不定胚形成能のある細胞を優先的に増殖することが可能となる。
【００３７】
＜不定胚形成能を有する細胞から不定胚を誘導する工程＞
本発明に用いる上記で得られた細胞からの不定胚の誘導条件は特に限定はなく、公知の情報を使用することができる。例えば、農林水産研究文献解題No.１７ 植物バイオテクノロジー 平成３年、国際公開WO2007/064028等に記載されている条件を用いることができる。具体的には、一例として、グルタミン酸及び／又はプロリンを各々１〜10mM、ショ糖 0.5〜４％(w/v%)添加し、pHを５〜７に調整したMS培地に、0.05〜５g／lとなるようカルスを置床し、明所、20〜30℃で培養するという条件を挙げることができる。なお、固体培地と液体培地の何れの条件も適用可能である。また、光条件にも特に限定はない。
【００３８】
＜不定胚の脱水工程＞
不定胚はそのまま発芽工程に供試することができる。ただし、不定胚を脱水や乾燥することによりその後の植物体再生率が向上する場合があることが知られている。また、保存が必要な場合は、不定胚に脱水や乾燥処理を施すことで一定期間の保存が可能となる。脱水を行う容器は特に限定されないが、少量を処理する場合はシャーレ（直径９cm、高さ1.5cm、など）、多量の場合は透明なプラスティック製の箱型容器（例えば22cm×17cm×7cm程度のサイズ）を用いることができる。何れの場合も底部にペーパータオルを敷いて不定胚を適量入れる（９cmシャーレの場合は 1〜20g程度、上記箱型容器の場合は30〜100g程度）。光環境は、12〜16時間日長、光合成光量子束密度1〜80μmole/m2/sec、 の明条件がよいが、暗条件でも可能である。温度は20℃〜30℃、好ましくは23℃〜27℃とすることができる。期間は1日〜20日、好ましくは2日〜10日とすることができる。
脱水を終えた不定胚は、ペーパータオルを敷いた9cmシャーレに入れた状態にて、４℃程度の低温、暗所にて保存することが可能であり、植物種別にもよるが １〜3ヶ月程度であれば保存後の不定胚の発芽に障害を及ぼすことはない。
【００３９】
＜不定胚からの幼植物体再生工程＞
上記のようにして得られた不定胚又は脱水不定胚は固体培地上でも液体培地中でも高効率で発芽する。発芽に用いる培地はMS培地などを基本培地とし、糖源として例えばショ糖を1〜6％、好ましくは2〜4％添加する。発根などが激しい場合は、その他の糖類としてソルビトール又はマンニトールを1〜6％、好ましくは2〜4％を添加し、根の伸長を抑制することも可能である。植物生長調節物質は特に添加する必要はないが、ジベレリン類、オーキシン類、サイトカイニン類からなる群から選択した少なくとも1種の植物ホルモンを添加して発芽を促進させてもよい。培地のpHは通常5〜7 とすることができる。光環境は明条件、12〜16時間日長、光合成光量子束密度1〜80μmole/m2/secとすることができる。温度は 20℃〜35℃、好ましくは25℃〜30℃とすることができる。固体培地の場合は、例えば寒天（0.8〜1.2 w/v％）又はゲルライト（0.1〜0.5 w/v％）を用いて培地を固形化する。容器は植物組織培養に用いられるものであれば特に限定されるものではない。発芽した不定胚は発根も伴い、そのまま幼植物体へと生育する。
【００４０】
＜温室への移植工程＞
不定胚から発芽し再分化した幼植物体は、培養容器から取出し温室にて正常に生育する。移植に用いる培養土は特に限定されるものではなく、育苗用に市販されている培養土でよい。幼植物体を移植した後、1〜3週間程度、適度の加湿と遮光を行うことが好ましい。
【００４１】
本発明はさらに、第２の態様により、植物組織を１種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養して不定胚形成能のある植物細胞を選抜することを特徴とする、不定胚形成能のある植物細胞の選抜方法を提供する。
【００４２】
本発明はさらに、第３の態様により、不定胚形成能のある植物細胞を、１種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で維持することを特徴とする、不定胚形成能のある植物細胞の維持方法を提供する。
【００４３】
本発明はさらに、第４の態様により、植物組織を１種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養することを含むことを特徴とする、不定胚形成能のないもしくは低い細胞塊の生成を抑制する方法を提供する。
【００４４】
これらのいずれの発明も、植物組織を１種又は複数種の植物二次代謝阻害剤を含む培地で培養することを共通の特徴としている。具体的な説明は、上記と同様であり、ここで繰り返されるべきである。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではないことに留意するべきである。
本実施例で使用する培地の組成を以下の表１に示す。
【００４６】
【表１】
2015126717.tif 000003
【００４７】
＜実施例1＞
ヤツガタケトウヒの未熟種子から常法に従って誘導し（丸山ら、” 絶滅危惧種ヤツガタケトウヒの不定胚形成”、 日本森林学会大会学術講演集（2007）118巻）、固体増殖培地（EM）で2〜3週間毎に継代培養されている培養細胞（森林総合研究所保有）について、まず、不定胚誘導能から以下の様に細胞の分類を行った。不定胚誘導培地（MP）を20ml添加した直帰9cmシャーレに約1gの細胞塊をシャーレに置床し、5週間培養後にシャーレあたりの不定胚数を算出した（9回の試験の平均）。その結果により、良好な不定胚誘導能を有する培養細胞（表2の(1)の細胞、E細胞）と、不定胚誘導能を有しないもしくは低い細胞（表2の(2)の細胞、NE細胞）に分類した。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
それらE細胞及びNE細胞を以下の試験に供試した。セトキシジムを100、250、500μMの濃度で添加した固体増殖培地（EM培地、20ml/シャーレ、セトキシジムは99％エタノールに溶解して添加）に、E細胞及びNE細胞の細胞塊（約100mg）をシャーレあたり9個ずつ置床した。25℃、暗所条件にて3週間培養した後、各細胞塊の生重量を計測し、細胞塊あたりに平均増加重量を算出した。
【００５０】
セトキシジムを添加した培地上での細胞の増殖は、E細胞については100μM区では何ら影響を受けず、250μM区では大きく抑制は受けたものの継続した増殖が認められた。一方NE細胞については、全ての濃度区においてほぼ完全に増殖が阻害され、E細胞の結果と顕著な差異となった（図1）。この結果から、セトキシジムは不定胚形成能を失ったヤツガタケトウヒ細胞（NE細胞）の増殖を特異的に抑制することが示された。
【００５１】
＜実施例2＞
テーダマツの未熟種子から常法に従って誘導し（GS. Pullmanら、”Improving loblolly pine somatic embryo maturation : comparison of somatic and zygotic embryo morphology, germination and gene expression” Plant Cell Rep. (2003) 21 : 747-758）、固体増殖培地（LP培地にゲルライトを0.25％濃度で添加した培地）で2〜3週間毎に継代培養されている培養細胞について、まず、不定胚誘導能から以下の様に細胞の分類を行った。不定胚誘導培地（LPSA培地）を20ml添加した直帰9cmシャーレに約1gの細胞塊をシャーレに置床し、5週間培養後にシャーレあたりの不定胚数を算出した（５回の試験の平均）。その結果により、良好な不定胚誘導能を有する培養細胞（表3の(1)の細胞、E細胞）と、不定胚誘導能を有しない或いは低い細胞（表3の(2)の細胞、NE細胞）に分類した。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
それらE細胞及びNE細胞を以下の試験に供試した。セトキシジムを25、50、100μMの濃度で添加した固体増殖培地（LP培地にゲルライトを0.25％濃度で添加した培地、20ml/シャーレ）に、E細胞及びNE細胞の細胞塊（約100mg）をシャーレあたり9個ずつ置床した。25℃、暗所条件にて3週間培養した後、各細胞塊の生重量を計測し、細胞塊あたりの平均増加重量を算出した。
【００５４】
セトキシジムを添加した培地上での細胞の増殖は、E細胞については25μM区では殆ど影響を受けず、50μM区では抑制は受けたものの継続した増殖が認められた。一方NE細胞については、全ての濃度区においてほぼ完全に増殖が阻害され、E細胞の結果と顕著な差異となった（図2）。この結果から、セトキシジムは不定胚形成能を失ったテーダマツ細胞（NE細胞）の増殖を特異的に抑制することが示された。
【００５５】
＜実施例3＞
ニンジンの苗の葉柄部分から常法に従って誘導し（大川博志ら、「不定胚形成能のないあるいは低い細胞の生成抑制方法」、特許公開2010 - 220493）、固体増殖培地（0.1ppm 2.4-D、ショ糖2%、0.2%ゲルライトを含むMS培地）で3〜4週間毎に継代培養されている培養細胞について、不定胚誘導能からE細胞とNE細胞に分類した。
【００５６】
それらE細胞及びNE細胞を以下の試験に供試した。セトキシジムを50μMの濃度で添加した固体増殖培地（0.1ppm 2.4-D、ショ糖2%、0.2%ゲルライトを含むMS培地、20ml/シャーレ）に、E細胞及びNE細胞の細胞塊（約100mg）をシャーレあたり4-5個ずつ置床した。22℃、暗所条件にて3週間培養した後、各細胞塊の増殖状態を観察した。
【００５７】
セトキシジムを添加した培地上での細胞の増殖は、E細胞について若干抑制は受けたものの継続した増殖が認められた。一方NE細胞については、ほぼ完全に増殖が阻害され、E細胞の結果と顕著な差異となった（図3）。この結果から、セトキシジムは不定胚形成能を失ったニンジン細胞（NE細胞）の増殖を特異的に抑制することが示された。
【００５８】
＜実施例4＞
実施例2と同じテーダマツのE細胞及びNE細胞を用いて以下の試験を実施した。フルアジホップを5、12.5、25、50、100μMの濃度で添加した固体増殖培地（LP培地にゲルライトを0.25％濃度で添加した培地、20ml/シャーレ、フルアジホップはDMSOで溶解）に、E細胞及びNE細胞の細胞塊（約100mg）をシャーレあたり9個ずつ置床した。25℃、暗所条件にて3週間培養した後、各細胞塊の生重量を計測し、細胞塊あたりの平均増加重量を算出した。
【００５９】
フルアジホップを添加した培地上での細胞の増殖は、E細胞については12.5μM区までは何ら影響を受けず、25μM以上の区ではかなりの抑制は受け増殖スピードは著しく低下したものの、継続した増殖が認められた。一方NE細胞については、5μM区では増殖抑制は受けなかったが、12.5μM以上の区では完全に増殖が阻害され、E細胞の結果と顕著な差異となった（図4）。この結果から、フルアジホップは不定胚形成能を失ったテーダマツ細胞（NE細胞）の増殖を特異的に抑制することが示された。
【００６０】
＜実施例5＞
実施例2と同じテーダマツのE細胞及びNE細胞を用いて以下の試験を実施した。ピリブチカルブを25、50、100μMの濃度で添加した固体増殖培地（LP培地にゲルライトを0.25％濃度で添加した培地、20ml/シャーレ、ピリブチカルブはDMSOで溶解）に、E細胞及びNE細胞の細胞塊（約100mg）をシャーレあたり9個ずつ置床した。25℃、暗所条件にて3週間培養した後、各細胞塊の生重量を計測し、細胞塊あたりの平均増加重量を算出した。
【００６１】
ピリブチカルブを添加した培地上での細胞の増殖は、E細胞については25μM区から緩やかな抑制は見られたものの継続した増殖が認められた。一方NE細胞については、全ての区は完全に増殖が阻害され、E細胞の結果と顕著な差異となった（図5）。この結果から、ピリブチカルブ不定胚形成能を失ったテーダマツ細胞（NE細胞）の増殖を特異的に抑制することが示された。
【００６２】
＜実施例6＞
実施例3と同様の条件にてニンジンのカルスを誘導する際に、カルス誘導培地にセトキシジムを50μM添加した培地と無添加の培地を用いた。夫々の培地で誘導されたカルスを、特に選別することなく無作為に同じ培地（セトキシジム添加培地、無添加培地）に継代培養した。その後同様の継代培養を3〜4週間毎に約2年間繰り返した後、夫々のカルスを植物体再生培地（ショ糖1％、マンニトール1％、0.8%寒天を含むMS培地、20ml／シャーレ、pH5.8）に置床し、1ヶ月後に植物体再分化の状況を観察した。
【００６３】
何れのカルスについても明確な植物体の再分化はまだ認められなかったものの、顕微鏡観察を行ったところ、セトキシジム添加地で誘導及び維持されたカルスについては植物体再生に繋がり得る形態形成の兆候を認めた。一方、セトキシジム無添加培地で誘導及び維持されたカルスは何ら形態変化を示さず、カルス細胞のままであった。この結果より、セトキシジムをカルス誘導及び維持時に用いることにより、継代培養時の肉眼的な特徴による選抜作業無しに、植物体再生能のある、または高いカルスを誘導しうる可能性が把握できた。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、不定胚形成能のないもしくは低い細胞（NE細胞）の増殖を抑制することによって、従来法に比してより効率的に不定胚形成能のある細胞（E細胞）を選抜及び維持し、効率的に植物体を再生する方法を提供することを可能にしたことにより、農業分野にとり利用価値が大きい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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