(57)【要約】【課題】タンパク質生産を改善するための方法及び組成物を提供する。【解決手段】方法は（ａ）所望のタンパク質配列に作動可能に結合するシグナル配列を含む第一核酸配列を宿主細胞へ導入する段階、（ｂ）第一核酸配列を発現する段階、（ｃ）ｂｉｐ１、ｅｒｏ１、ｐｄｉ１、ｔｉｇ１、ｐｒｐ１、ｐｐｉ１、ｐｐｉ２、ｐｒｐ３、ｐｒｐ４、カルネキシン（ｃａｌｎｅｘｉｎ）、及びｌｈｓ１からなる群から選択されるシャペロン又はフォールダーゼをコードする第二核酸配列を共発現する段階、及び（ｄ）宿主細胞から分泌される所望のタンパク質を集める段階、を含む。第一核酸配列は任意にシグナル配列と所望のタンパク質配列の間に酵素配列を含んでよい。【選択図】図１
2015027308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のタンパク質を生産するための方法であって、
（ａ）所望のタンパク質配列に作動可能に結合するシグナル配列を含む第一核酸配列を宿主細胞へ導入する段階、
（ｂ）第一核酸配列を発現する段階、
（ｃ）ｂｉｐ１、ｅｒｏ１、ｐｄｉ１、ｔｉｇ１、ｐｒｐ１、ｐｐｉ１、ｐｐｉ２、ｐｒｐ３、ｐｒｐ４、カルネキシン（ｃａｌｎｅｘｉｎ）、及びｌｈｓ１からなる群から選択されるシャペロン又はフォールダーゼをコードする第二核酸配列を共発現する段階、及び
（ｄ）前記宿主細胞から分泌される前記所望のタンパク質を集める段階、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第一核酸配列がさらに前記シグナル配列と前記所望のタンパク質配列の間に酵素配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素配列がグルコアミラーゼから又はＣＢＨ１酵素から得られることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素配列が完全長の酵素配列を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素配列が触媒コア部位配列を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記第一核酸配列がさらに前記触媒コア部位配列と前記所望のタンパク質配列の間にリンカー配列を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記所望のタンパク質がラッカーゼであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ラッカーゼが糸状菌又は酵母由来であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ラッカーゼがアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、 ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、コリビア（Ｃｏｌｌｙｂｉａ）、セレナ（Ｃｅｒｒｅｎａ）, スタキボトリス（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）、パヌス（Ｐａｎｕｓ）、チエイラバ（Ｔｈｉｅｉｌａｖａ）、フォメス（Ｆｏｍｅｓ）、レンチヌス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ）、プレウロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、プサチレラ（Ｐｓａｔｙｒｅｌｌａ）、ミセリオフィソーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、シタリジウム（Ｓｃｈｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、スポンギスペリス（Ｓｐｏｎｇｉｐｅｌｌｉｓ）、ポリポルス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）、セリポリオプシス サブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、ガノデルマ ツノダエ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｔｓｕｎｏｄａｅ）、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ラッカーゼがセレナ（Ｃｅｒｒｅｎａ）ラッカーゼＡ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｃ、Ｄ１、Ｄ２、又はＥ由来であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ラッカーゼがセレナ（Ｃｅｒｒｅｎａ）ラッカーゼＤの成熟タンパク質由来であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記シグナル配列がセロビオヒドロラーゼＩシグナルペプチド又はＮＳＰ２４シグナルペプチドをコードすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主が糸状菌であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主が子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主がトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一核酸配列がさらにシグナル配列の上流にプロモーターを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロモーターが前記宿主細胞に本来存在し、前記所望のタンパク質配列と自然には結合しないことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記シャペロンがＢＩＰ１であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第二核酸配列がプロモーターに作動可能に結合することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記プロモーターが宿主細胞に本来存在し、前記第二核酸配列と自然には結合しないことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記所望のタンパク質がラッカーゼであり、ラッカーゼが酵素を有する融合蛋白質として生産されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は改善されるタンパク質生産のための方法及び組成物に関する。幾つかの実施態様においては、本明細書にて提供する方法はタンパク質に作動可能に結合するシグナル配列の使用に関する。幾つかの実施態様においては、タンパク質に作動可能に結合するシグナル配列は宿主細胞中少なくとも一つのシャペロンと組み合わせて発現される。幾つかの実施態様においては、タンパク質は糸状菌細胞中に発現される。さらなる実施態様においては、本発明の方法はグルコアミラーゼ又はＣＢＨ１のような酵素触媒部位へのタンパク質融合に関連する。幾つかの実施態様は、シグナル配列、一以上のシャペロン、シャペロニン、及び／又はフォールダーゼ、及び／又は触媒タンパク質又は部位へのタンパク質融合の組合せを提供する。
【背景技術】
【０００２】
酵母、糸状菌、及び細菌のような宿主細胞は外来タンパク質を発現及び分泌のために長く用いられてきた。一般的に、これらの外来タンパク質又は酵母、糸状菌、及び細菌中のタンパク質の生産は宿主細胞又は細胞が増殖する培養培地からタンパク質の発現及び部分的又は完全な精製に関係する。幾つかのタンパク質は宿主細胞の細胞内環境からの精製を必要とするものの、タンパク質が細胞から培養培地へ分泌される場合、精製はかなり簡略化される。
【０００３】
細胞内タンパク質分泌は多様な細胞発現系においてタンパク質生産の複雑かつ重要な局面である。タンパク質分泌に関係するファクターの一つは適切なタンパク質のフォールディングである。コンパクトに折りたたまれるタンパク質構造を特定するのに必要な多くの情報がタンパク質のアミノ酸配列中に存在するので、多くのタンパク質は希釈濃度にてインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で可逆的にアンフォールディング及びリフォールディングできる。しかしながら、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのタンパク質フォールディングは多くのタンパク質が濃縮される環境にて発生し、分子間凝集反応が分子内フォールディングプロセスと競合する。これらの複雑性は原核生物の発現系より真核生物の発現系に顕著である。
【０００４】
真核性分泌経路における第一段階は伸びた状態で小胞体（ＥＲ）を通過する新生ポリペプチドの移送である。正確なフォールディング及びポリペプチドの組み立てが分泌経路を通ってＥＲ中に起こる。しかしながら、多くの場合、タンパク質は非常に過剰発現し、それらのタンパク質は十分に分泌されない。実際に、多くの場合、そのような発現に機能すべき分泌シグナルはその機能を発揮していないようである。さらに、所望のタンパク質の発現は他のタンパク質の相互作用により複雑となる。生物の種、属、又はファミリーから得られるタンパク質の発現が別の種、属、ファミリーにおいて試みられる場合、これらのファクターはさらに重要である。例えば、一般的に、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）タンパク質（例えば、ラッカーゼ）はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）のような子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主中十分に発現しない。実際に、菌類の発現系の分野での多くの研究にもかかわらず、所望のタンパク質の細胞外発現の改善する必要性が残っている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は改善されるタンパク質生産のための方法及び組成物を提供する。方法は所望のタンパク質に作動可能に結合するシグナル配列の使用に関し、宿主細胞中に少なくともひとつのシャペロンと組み合わせて発現することを特徴とする。幾つかの実施態様においては、タンパク質は糸状菌細胞中に発現する。さらなる実施態様においては、本発明の方法はグルコアミラーゼ又はＣＢＨ１のような宿主タンパク質の触媒部位への所望のタンパク質の融合に関する。
【０００６】
幾つかの実施態様においては、本発明はタンパク質と同じ生物から得られるシャペロンタンパク質の発現と組み合わせて分泌シグナルの使用を通して糸状菌宿主（例えば子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ））におけるタンパク質の生産を増加する方法及び組成物を提供する。幾つかの実施態様においては、タンパク質は子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主タンパク質由来分泌シグナルに融合する非子嚢菌類（ｎｏｎ‐Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）タンパク質である。いくつかの追加的実施態様においては、少なくともひとつのシャペロンタンパク質を子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）タンパク質の触媒部位へ融合するタンパク質の発現を増加する際に用いてよい。
【０００７】
幾つかの実施態様は子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主細胞中に少なくとも一つのタンパク質を生産する方法を提供し、宿主と同門、同属、及び／又は同種由来のシグナル配列に作動可能に結合する所望のタンパク質を含むポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入すること、タンパク質と同門、同属、及び／又は同種由来のシャペロンを共発現すること、タンパク質の発現及び生産のための適切な培養条件下宿主細胞を培養すること、及びタンパク質を生産することによる方法を特徴とする。任意に方法は生産されるタンパク質を回収することを含んでよい。幾つかの実施態様は子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）由来酵素の触媒部位にタンパク質を融合することを含む。他の実施態様は子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）由来完全長酵素にタンパク質を融合することを含む。幾つかの実施態様においては、子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主細胞はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）である。幾つかの実施態様においては、シャペロンは次の少なくとも一つであり、ＢＩＰｌ、 ＥＲＯｌ、ＰＤＩｌ、ＴＩＧｌ、ＰＲＰｌ、ＰＰＩｌ、ＰＰＩ２、ＰＲＰ３、ＰＲＰ４、カルネキシン（ＣＡＬＮＥＸＩＮ）、 及びＬＨＳｌである。
【０００８】
タンパク質の選択は任意の属、種、及び／又はファミリー由来の次のタンパク質を含むが、これらに限定されない。それは、ラッカーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐アミラーゼ、粒状デンプン加水分解酵素、セルラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、クチナーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ及びその組み合わせである。幾つかの実施態様はＮＳＰ２４又はＣＢＨ１遺伝子由来シグナル配列を含む。幾つかの実施態様においては、シャペロン遺伝子はｂｉｐ１である。また、方法の態様は子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）プロモーターを含む。幾つかの実施態様においては、宿主細胞及びシグナル配列は同じ子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主由来である。幾つかの実施態様においては、プロモーターはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来ＣＢＨ１プロモーターである。幾つかの実施態様においては、タンパク質は担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）タンパク質である。幾つかの実施態様においては、宿主細胞は子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主細胞である。幾つかの実施態様においては、宿主細胞は担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主細胞であり、タンパク質は子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）タンパク質である。
【０００９】
さらに幾つかの実施態様は子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主細胞において少なくとも一つのタンパク質を生産する方法を提供し、子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）由来酵素の触媒部位に融合する所望のタンパク質を含むポリヌクレオチドを子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主細胞へ導入し、ここで所望のタンパク質が担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）タンパク質であることを特徴とし、子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）シャペロンを共発現し、タンパク質の発現及び生産のために適した培養条件下子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主細胞を培養し、及びタンパク質を生産することによる方法を特徴とする。幾つかの実施態様においては、生産されるタンパク質を回収する。幾つかの実施態様においては、タンパク質は子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）シグナル配列に作動可能に結合する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）発現プラスミドｐＴｒｅｘ４‐ラッカーゼＤ ｏｐｔの図を示す。ポリヌクレオチド配列を配列番号１として示す。
【図２】図２はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）発現プラスミドｐＴｒｅｘ２ｇ‐Ｂｉｐ１の図を示す。ポリヌクレオチド配列を配列番号２として示す。
【図３】図３はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）発現プラスミドｐＴｒｅｘ２ｇ‐Ｐｄｉ１の図を示す。ポリヌクレオチド配列を配列番号３として示す。
【図４】図４はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）発現プラスミドｐＴｒｅｘ２ｇ‐Ｅｒｏ１に用いるＥｒｏ１配列の図を示す。ポリヌクレオチド配列を配列番号４として示す。
【図５】図５はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）発現プラスミドｐＴｒＧＡ‐ラッカーゼＤ ｏｐｔの図を示す。ポリヌクレオチド配列を配列番号５として示す。
【図６】図６はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）発現プラスミドｐＫＢ４０８の図を示す。ポリヌクレオチド配列を配列番号６として示す。
【図７】図７はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）発現プラスミドｐＫＢ４１０の図を示す。ポリヌクレオチド配列を配列番号７として示す。
【図８】図８‐１から図８‐４はトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）ＮＳＰ２４オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列番号８を示す。シグナルペプチドは最初の２０アミノ酸である（配列番号９）。
【図９】図９‐１及び図９‐２はトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１ ＯＲＦ（配列番号１０）を示す。シグナル配列は２１０塩基対にて始まり、２６０塩基対にて終わる（配列番号１１）。触媒コアは２６１塩基対から始まり１６９８塩基対（配列番号１２）に至り、イントロン１（塩基対６７１から７３７）及びイントロン２（塩基対１４３５から１４９７）を含む。リンカー配列は１６９９塩基対にて始まり、１７７０塩基対（配列番号１３）にて終わる。ＣＢＨ１タンパク質配列を配列番号１４として示す。
【図１０】図１０は完全長トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼへセレナ ユニカラー（Ｃ. ｕｎｉｃｏｌｏｒ）ラッカーゼをコードする遺伝子の融合により改善されるラッカーゼ生産を示す。菌株＃８−２はＣＢＨ１ラッカーゼ融合である。菌株１０６６−９、１０６６−１３、及び１０６６−１５はＴｒＧＡラッカーゼ融合である。
【図１１】図１１は振盪フラスコにおけるＣＢＨ１又はＮＳＰ２４シグナル配列へセレナ ユニカラー（Ｃ. ｕｎｉｃｏｌｏｒ）ラッカーゼをコードする遺伝子の融合により改善されるラッカーゼ生産を示す。Ｙ軸はユニット／ｍｌとしてラッカーゼ活性を示す。Ｘ軸は菌株（ＣＢＨ１融合単独、又はシグナル配列を伴う）を示す。
【図１２】図１２は発酵装置におけるＣＢＨ１又はＮＳＰ２４シグナル配列へセレナ ユニカラー（Ｃ. ｕｎｉｃｏｌｏｒ）ラッカーゼをコードする遺伝子の融合により改善されるラッカーゼ生産を示す。Ｙ軸はユニット／ｍｌとしてラッカーゼ活性を示す。Ｘ軸は時間として発酵時間を示す。
【図１３】図１３はＣＢＨ１シグナル配列プラスＢＩＰ１シャペロン発現によりもたらされる改善されるラッカーゼ生産を示す。Ｙ軸はユニット／ｍｌとしてラッカーゼ活性を示す。Ｘ軸は時間として発酵時間を示す。
【図１４】図１４は３、４、及び５日にて振盪フラスコ中セレナ ユニカラー（Ｃ. ｕｎｉｃｏｌｏｒ）を用いてシャペロンの共発現による改善されるラッカーゼ生産を示す。Ｙ軸はユニット／ｍｌとしてラッカーゼ活性を示す。Ｘ軸は菌株（ＫＢ４１０−１３、又はｂｉｐの共発現を伴う）を示す。
【図１５】図１５はＣＢＨ１シグナル配列、触媒部位およびリンカーへセレナ ユニカラー（Ｃ. ｕｎｉｃｏｌｏｒ）ラッカーゼをコードする遺伝子の融合及びＢｉｐ１、ｐｄｉ１又はｅｒｏ１シャペロンと共発現により改善されるラッカーゼ生産を示す。Ｙ軸はユニット／ｍｌとしてラッカーゼ活性を示す。Ｘ軸は菌株を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の実施には、特に定義しない限り、当業者の知識の範囲内である、分子生物学、タンパク質工学、組み換えＤＮＡ技術、微生物学、細胞生物学、細胞培養、トランスジェニックバイオロジー、免疫学、及びタンパク質精製にて通常使用される従来技術が用いられる。そのような技術は当業者に知られ、多くのテキストや参考文献に記載されている。本明細書に記載した全ての特許、特許出願、論文及び出版物は、既述の又はこれ以降に記載するもの両者ともに、引用により本明細書に明確に組み入れられる。
【００１２】
定義
用語「子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）」とは子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）に属する菌類の区分をいう。この門の仲間は子嚢（言い換えると、子嚢胞子を含む細胞のような特別な袋）の存在により特徴付けられる。
【００１３】
用語「担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）」は担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）に属する菌類の区分をいう。この門の仲間は担子胞子（言い換えると、担子器と呼ばれる、こん棒状の末端細胞の外部領域に位置する有性胞子）の生産により特徴付けられる。
【００１４】
「プロテアーゼ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ）」はタンパク質骨格（例えばＥ．Ｃ．３．４）の一以上の多様な位置にてペプチド結合の分解を触媒する能力を有するタンパク質又はタンパク質のポリペプチド部位又はポリペプチドを意味する。プロテアーゼは微生物（例えば、菌類又は細菌類）、植物、及び／又は動物から得られる。
【００１５】
「酸性プロテアーゼ（ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ）」は酸性条件下タンパク質を加水分解する能力を有するプロテアーゼをいう。
【００１６】
本明細書にて用いる用語「シャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）」又は「分子シャペロン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ）」はアンフォールディング領域を周囲のタンパク質から遮断することによりタンパク質フォールディングを機能させ、タンパク質フォールディングの速度を増強させない。これは、小胞体（ＥＲ）における分泌タンパク質のフォールディング及びグリコシレーションを補助するタンパク質及びそれらの相同体を含んでよい。シャペロンはＥＲに存在してよい。一般的なシャペロンはＢｉｐ（ＧＲＰ７８）、ＧＲＰ９４及び酵母Ｌｈｓ１ｐを含み、それらはアンフォールディング状態において露出した疎水性領域に結合することにより分泌タンパク質がフォールディングするのに役立ち、好ましくない相互作用を避けるのに役立つ。また、シャペロンはＥＲ膜を通過するタンパク質の移送に関与するタンパク質を含む。
【００１７】
本明細書にて用いる、「シャペロニン（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎｓ）」はＡＴＰを利用して自然状態（活性状態）にタンパク質フォールディングを補助するタンパク質である。しばしば、タンパク質サブユニットは共に組み立てられ、大きな環構造を形成する。例えば、シャペロニンはそれらの中央の空洞に非天然のタンパク質を結合することにより作用し、その後ＡＴＰと結合し、基質タンパク質をまさに封入される空洞に放出し、生産的にフォールディングする。
【００１８】
「フォールダーゼタンパク質（Ｆｏｌｄａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」はタンパク質フォールディングの速度を増加するタンパク質フォールディング段階を触媒するタンパク質を意味する。例えば、それらはジスルフィド架橋の形成を補助し、プロリン残基に隣接するペプチド鎖の正しい構造の形成を補助する。一般的にフォールダーゼはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ｐｄｉ）とその相同体及びプロリル‐ペプチジルシス‐トランスイソメラーゼとその相同体を含む。
【００１９】
本明細書にて用いる「ＮＳＰ２４ファミリープロテアーゼ（ＮＳＰ２４ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅａｓｅ）はＮＳＰ２４プロテアーゼのファミリーに属するその天然の形態又は野生型の形態においてプロテアーゼ活性を有する酵素を意味する。ＮＳＰプロテアーゼは酸性菌類プロテアーゼのような酸性プロテアーゼである。ＮＳＰ２４プロテアーゼは配列番号８のアミノ酸配列及び生物学的に活性なそのフラグメントに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％の同一性を有する。
【００２０】
本明細書にて用いる用語「所望のタンパク質（ｄｅｓｉｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は関心の有るタンパク質を意味する。所望のタンパク質及び関心有るタンパク質は本出願において互換可能に用いられる。幾つかの実施態様においては、所望のタンパク質は商業的重要な産業用タンパク質である。その用語は自然発生的遺伝子、変異遺伝子及び／又は合成遺伝子によりコードされるタンパク質を含むことを意図する。所望のタンパク質は宿主細胞本来存在するタンパク質、又は宿主細胞に対して本来存在しない（異種の）タンパク質でよい。 
【００２１】
本明細書で用いる「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」はＣ末端及びＮ末端の両方又は片方に一以上のアミノ酸の添加によって、アミノ酸配列中一箇所又は多くの異なる位置に一以上のアミノ酸を置換によって、片方又は両方の蛋白質末端に又はアミノ酸配列中一以上の位置に一以上のアミノ酸の欠損によって、又はアミノ酸配列中一以上の位置に一以上のアミノ酸の挿入によって得られる、プリカーサー又は親タンパク質（例えば、天然の蛋白質）に由来する蛋白質を意味する。
【００２２】
用語「組み換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」は宿主細胞中に自然的に起こらないポリヌクレオチド又はポリペプチドをいう。組み換え体分子は自然的に起こらない態様で一緒に結合する二以上の自然的に起こる配列を含んでよい。
【００２３】
用語「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎs）」、及び「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」は本明細書にて互換可能に用いる。
【００２４】
アミノ酸配列又は核酸配列に関して本明細書で用いる「配列同一性割合（％）（ｐｅｒｃｅｎｔ(％)ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、必要であれば、最大の割合の配列同一性を達成するように、いずれの保存的置換をも配列同一性の一部とみなして、配列を整列し及びギャップを挿入した後、所望の配列（例えば、ＮＳＰ２４シグナルペプチド配列）中のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同定された候補配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドとの割合で定義される。
【００２５】
本明細書にて用いる用語「アルファ‐アミラーゼ（Ａｌｐｈａ‐ａｍｙｌａｓｅｓ）（例えば、Ｅ. Ｃ.クラス３．２．１．１）」はアルファ‐１、４‐グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素をいう。また、これらの酵素は１，４アルファ‐結合Ｄ‐グルコース単位を含むポリサッカライド中１、４‐アルファ‐Ｄ‐グルコシド結合のエキソ又はエンド加水分解に影響するものとして記載される。これらの酵素を記載するために用いる別の用語は「グリコゲナーゼ（ｇｌｙｃｏｇｅｎａｓｅ）」である。一般的に酵素はアルファ‐１、４‐グルカン４‐グルカノヒドラーゼ グルカノヒドロレースである。
【００２６】
本明細書にて用いる用語「グルコアミラーゼ（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）」は酵素（例えば、Ｅ. Ｃ.クラス３．２．１．３、グルコアミラーゼ、１、４‐アルファ‐Ｄ‐グルカン グルコヒドロラーゼ）のアミログルコシダーゼの区分をいう。これらはエキソ‐作用酵素であって、アミロース及びアミロペクチン分子の非還元末端からグルコシル残基を遊離する。また、酵素はアルファ１，４結合より非常に遅い速度だが、アルファ‐１，６及びアルファ‐１，３結合を加水分解する。
【００２７】
用語「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」は遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与する調節配列を意味する。
【００２８】
本明細書で用いる「異種プロモーター（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」は遺伝子又は精製核酸と結合するように配置されるプロモーターで、遺伝子又は精製核酸に自然的には結合しないプロモーターをいう。
【００２９】
本明細書にて用いる「精製調製物（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」及びポリペプチドの「実質的に純粋な調製物（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」はポリペプチドが自然に発生している細胞、他のタンパク質、脂質又は核酸から分離されたポリペプチドを意味する。
【００３０】
本明細書で用いる「相同性（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」は二つ以上のポリペプチド分子の間で又は二つ以上の核酸分子の間での配列相同性をいう。比較された配列の位置が同じ塩基又はアミノ酸のモノマーサブユニットによって占有されているとき、（例えば、もし二つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占有されているならば）それらの分子はその位置において相同性がある。二つの配列間の相同性のパーセントは二つの配列によって一致し又は相同性のある位置の数を比較した位置の数で割り、１００倍して得る関数である。例えば、二つの配列において一致し又は相同性のある場所がもし、１０のうち６であれば、二つの配列は６０％の相同性である。一例としてＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を有している。一般的に最大の相同性を得るように二つの配列を整列させて比較を行う。用語「％ホモロジー（％ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は用語「％同一性（％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と本明細書にて互換可能に用い、配列アライメントプログラムを用いて整列される場合、核酸配列又はアミノ酸配列間での核酸又はアミノ酸配列同一性のレベルをいう。
【００３１】
本明細書にて用いる用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は核酸を１つ以上の細胞タイプに導入するために設計されるポリヌクレオチド配列をいう。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子及びカセット等を含む。
【００３２】
本明細書で用いる「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」は適切な宿主においてＤＮＡの発現に影響を与えることのできる適切な制御配列に作動可能に結合されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築体を意味する。
【００３３】
用語「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが生産さることによるプロセスを意味する。
【００３４】
用語「共発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は少なくとも二つの異なる遺伝子が一つの細胞中に発現されることを意味する。それらは、外因性遺伝子又は内因性遺伝子でよい。それらは同じ又は異なるプラスミドから組み入れられ又は発現されてよく、それらは同じ又は異なるプロモーターから発現されてよい。
【００３５】
本明細書にて用いる「作動可能に結合した（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」はプロモーター、ターミネーター、分泌シグナルまたはエンハンサー領域のような調節領域が構造遺伝子に接着又は結合し、その遺伝子の発現を制御する。宿主細胞の分泌系を通してタンパク質を指示する場合、シグナル配列はタンパク質に作動可能に結合する。
【００３６】
本明細書で用いる「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」は細菌、菌類、ウイルス、原生動物及び他の微生物又は顕微鏡的生物をいう。
【００３７】
用語「糸状菌（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）」は周知のようにユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門のすべての糸状菌の形態をいう。これらの菌はキチン、セルロース及び他の多糖類複合体で構成される細胞壁を有する栄養菌糸を特徴とする。本発明の糸状菌は形態学的、生理学的、遺伝学的に酵母と異にする。糸状菌による栄養成長は菌糸伸長であり、炭素代謝は絶対好気性である。
【００３８】
本明細書にて用いる用語「トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）」及び「トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）」はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）として従来又は現在に分類される任意の真菌属をいう。
【００３９】
本明細書にて用いる用語「培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」は液体、半固体又は固体培地において適切な条件下微生物細胞の集団を増殖することをいう。幾つかの実施態様においては、培養は周知のような容器または反応器中に導入される。幾つかの実施態様においては、粒状デンプンを含む基質のようなデンプン基質の最終産物への発酵性バイオコンバージョンをもたらす。
【００４０】
「発酵（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」は、より簡単な有機化合物を生産するために微生物によって有機物質の酵素的及び嫌気的分解をすることをいう。発酵は嫌気的条件下で行われる一方、この用語は単に嫌気条件下で行われるものに限定されず、酸素存在下での発酵も意図する。
【００４１】
細胞へ核酸配列を挿入するという文脈中「導入される（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）」という用語は、「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」、又は「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」を意味し、真核又は原核細胞へ核酸配列を取り込むことであって、核酸配列が細胞の遺伝子（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアＤＮＡ）へ取り込み、自律的複製への転換、又は一時的な発現（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）を特徴とする。
【００４２】
本明細書にて用いる用語「形質転換した（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」、「安定な形質転換（ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」及び細胞に関して用いる「トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」は細胞がその染色体へ組みこまれた又は複数の世代を通して維持されるエピソーム性プラスミドのような非天然の核酸配列を有することを意味する。
【００４３】
ポリペプチド又は所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関して本明細書にて用いる用語「異種の（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」は宿主細胞中に自然的に発生しないポリペプチド又はポリヌクレオチドを意味する。
【００４４】
ポリペプチド又は所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関して用語「相同の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」又は「内因性の（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）」は宿主細胞中に自然に発生する又は宿主細胞により自然に発現するポリペプチド又はポリヌクレオチドをいう。
【００４５】
用語「過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は野生型宿主細胞によって生産されるレベルよりも高いレベルで宿主細胞中ポリヌクレオチドを発現するプロセスを意味する。さらなる幾つかの実施態様においては、その用語は野生型細胞によって発現される同じ相同性ポリペプチドの発現より高い濃度での相同性ポリペプチドの発現をいう。
【００４６】
本明細書に記載するように、発明のある態様は、タンパク質に作動可能に結合するＮＳＰ２４シグナル又はＣＢＨ１シグナルペプチド及び／又は同等のそのような核酸をコードするヌクレオチド配列を含む「実質的に純粋な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ）」核酸に特徴づけられる。これらの実施態様においては、核酸は他の核酸及び／又は細胞成分から単離される。
【００４７】
「同等なもの（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」という用語は機能的に同等なポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列をいう。同等なヌクレオチド配列は、対立遺伝子多型のような、一以上のヌクレオチド置換、追加又は欠損によって異なる配列を含む。例えば、幾つかの実施態様においては、遺伝子コードの縮重によって、同等なヌクレオチド配列は配列番号８のヌクレオチド配列と異なる配列を含むが、配列番号８によりコードされる機能的に同等なポリペプチド配列であるポリペプチドの生産をもたらす。
【００４８】
本発明は所望のタンパク質を生産する方法を提供する。方法は、
（ａ）所望のタンパク質配列に作動可能に結合するシグナル配列を含む第一核酸配列を宿主細胞へ導入する段階、
（ｂ）前記第一核酸配列を発現する段階、
（ｃ）ｂｉｐｌ、ｅｒｏｌ、ｐｄｉｌ、ｔｉｇｌ、ｐｒｐｌ、ｐｐｉｌ、ｐｐｉ２、ｐｒｐ３、ｐｒｐ４、カルネキシン（ｃａｌｎｅｘｉｎ）、及びｌｈｓｌからなる群から選択されるシャペロン又はフォールダーゼをコードする第二核酸配列を共発現する段階、及び
（ｄ）宿主細胞から分泌される所望のタンパク質を回収する段階、
を含む。
【００４９】
ある実施態様においては、さらに、第一核酸配列はシグナル配列と所望のタンパク質配列の間に酵素配列を含む。例えば、酵素配列がグルコアミラーゼから又はＣＢＨ１酵素から得られる。ある実施態様においては、酵素配列が触媒部位、リンカー、及び結合部位を含む完全長の酵素配列である。別の実施態様においては、酵素配列は触媒部位配列を含み、リンカーにより所望のタンパク質発現に結合する。幾つかの実施態様においては、酵素は天然の宿主中に多く発現及び／又は分泌される宿主タンパク質である。
【００５０】
さらに第一核酸配列はシグナル配列の上流にプロモーターを含む。ある実施態様においては、プロモーターは宿主細胞に本来存在し、所望のタンパク質配列と自然には結合しない。
【００５１】
第二核酸配列がプロモーターに作動可能に結合する。ある実施態様においては、プロモーターが宿主細胞に本来存在し、前記第二核酸配列と自然には結合しない。
【００５２】
タンパク質の改善される発現
本発明は宿主細胞中所望のタンパク質の生産のための方法を提供する。タンパク質の生産はシャペロン、シャペロニン、及び／又はフォールダーゼの共発現と組み合わせて分泌シグナル（例えば、ＮＳＰ２４シグナルペプチド又はＣＢＨ１シグナルペプチド）を含有することにより増加する。幾つかの実施態様においては、分泌シグナルは子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主タンパク質由来である。幾つかの実施態様においては、所望のタンパク質は酵素の触媒部位に融合する。
【００５３】
本発明は特に子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主における他の菌類ファミリーから大量のタンパク質を生産することが困難であるという事実の点において顕著な有利な効果を提供する。実際に、当業者にとって菌類又は細菌の宿主において任意の異種の菌類タンパク質を生産することはしばしば困難である。本発明は適切な菌類又は細菌の宿主において任意の適切なタンパク質の生産に有用な方法及び組成物を提供する。幾つかの実施態様においては、菌類宿主は子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）及びタンパク質は担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）タンパク質であり、一方他の実施態様においては、菌類宿主は担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）及びタンパク質は子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）タンパク質である。
【００５４】
幾つかの実施態様においては、本発明はタンパク質の供給源として同じ生物からシャペロン又はフォールダーゼの一以上の共発現を組み合わせて宿主シグナルペプチドを用いる宿主中のタンパク質の発現及び／又は分泌を増加するための方法を提供する。つまり、幾つかの実施態様においては、異種の子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）タンパク質は担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主シグナルペプチド及び子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）シャペロンを用いて担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主中に発現する。幾つかの別の実施態様においては、異種の担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）タンパク質は子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主シグナルペプチド及び子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）又は担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）シャペロンを用いて子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主中に発現する。幾つかの実施態様においては、子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の仲間である。幾つかの実施態様においては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）はトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）であり、トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）の多様な菌株を含む。幾つかの別の実施態様においては、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）はセレナ（Ｃｅｒｒｅｎａ）属の仲間であり、セレナ ユニカラー（Ｃ. ｕｎｉｃｏｌｏｒ）を含むが、これに限定されない。
【００５５】
本発明の幾つかの実施態様においては、所望のタンパク質の発現及び／又は分泌を所望のタンパク質と同じ生物から一以上のシャペロンの外因性共発現と組み合わせて宿主酵素にタンパク質を融合することにより増加する。共発現は同じプラスミドを介しても、分離したプラスミドを介しても達成される。
【００５６】
さらに追加的な実施態様においては、所望のタンパク質の発現及び／又は分泌を宿主酵素の触媒部位にタンパク質を結合し、宿主シグナル配列にタンパク質を作動可能に結合する組み合わせ、及び好ましくはタンパク質と同じ生物由来のシャペロン、シャペロニン、及び／又はフォールダーゼの一以上の外因性共発現をすることにより増加する。
【００５７】
本明細書にて提供する種々の実施態様に引用される要素は任意の適切な組み合わせにて用いることが考えられる。即ち、種々の実施態様の局面は互いに組み合わせて用いるので、実施態様は本明細書にて提供する特定の記述に限定することを意図していない。
【００５８】
シグナルペプチド
本発明に用いる特定のシグナルペプチドはシグナルペプチドが宿主中に作動的である限り条件はない。「作動的なシグナルペプチド（ｏｐｅｒａｂｌｅ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）」によってシグナルペプチドが宿主細胞中タンパク質に作動可能に結合するタンパク質の分泌増加を提供する。幾つかの実施態様においては、シグナルペプチドは強く分泌されるタンパク質及び／又は強力なシグナルペプチドから得られる。「強力なシグナルペプチド（ｓｔｒｏｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）」は天然のタンパク質がその天然の宿主により多く分泌される場合に得られる。幾つかの実施態様においては、シグナルペプチドは宿主細胞と同門の中での生物から得られる。実際に、幾つかの実施態様においては、これは有利である。幾つかの実施態様においては、シグナルペプチド及び宿主細胞は同属であり、一方、幾つかの追加的な実施態様においては、シグナルペプチド及び宿主細胞は同種である。例えば、幾つかの実施態様においては、宿主細胞は子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主細胞及びシグナルペプチドは子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）から得られる。幾つかの実施態様においては、宿主細胞はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）及びシグナルペプチドはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）から得られる。幾つかの実施態様においては、宿主細胞はトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）及びシグナルペプチドはトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）から得られる。幾つかの実施態様においては、シグナルペプチドは強力なシグナルペプチドである。いくつかの別の実施態様においては、宿主細胞は担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主細胞及びシグナルペプチドは担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）から得られる。本発明にて用いるシグナルペプチドの幾つかの例は、ＣＢＨ１及びＮＳＰ２４シグナルペプチドを含むが、これらに限定されない。シグナルペプチドは子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）のような門の他の仲間において働くことができるが、幾つかの実施態様においては、それが得られた属において用いる場合（言い換えると、多くの分泌を提供するために）シグナルペプチドが最適に使用される。
【００５９】
本明細書にて用いる「強く分泌されるタンパク質（ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は細胞から分泌される総タンパク質の相当の量を形成する任意のタンパク質である。また、細胞から分泌される総タンパク質は「細胞外タンパク質」という。例えば、強く分泌されるタンパク質は細胞外タンパク質の少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％を含む。幾つかの実施態様においては、強く分泌されるタンパク質は培養上清中細胞外タンパク質の少なくとも５％を含む。
【００６０】
ＣＢＨＩシグナルペプチド、リンカー、及び触媒部位
トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）は幾つかのセルラーゼ酵素を生産し、セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）であって、延長したリンカー領域により分離される二つの分離した部位（言い換えると、触媒及び結合部位）にフォールディングする。外来ポリペプチドは触媒部位プラスＣＢＨIのリンカー領域を有する融合としてトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）において分泌されている（例えば、Nyyssonen他、Bio/Technol. 11:591-595 [1993]を参照願いたい）。また、トリコデルマ ロンギブラキアタム（Ｔ. ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｅｍ）は融合において、並びにシグナルペプチド及び／又はリンカーの単離において用いるＣＢＨＩを生産する。リンカーは酵素の触媒部位及び所望のポリペプチドを接続するときに用いてよい。独立的にフォールディングされる領域の間でリンカーが延長され、セミ‐リジッドスペーサーを形成する限り、任意の適切なリンカーを本発明に用いてよい。そのようなリンカー領域は幾つかのタンパク質にみられ、特にヒドロラーゼ類（例えば、細菌及び菌類セルラーゼ類及びヘミセルラーゼ類、例えば、Libby他、Protein Engineering, Design and Selection (1994) vol. 7, 1109-1114を参照願いたい）である。
【００６１】
図９に示すように、ＣＢＨＩ（配列番号１０）について、シグナル配列は塩基対２１０にて開始し、塩基対２６０（配列番号１１）にて終わる。触媒コアは塩基対２６１にて開始し１６９８（配列番号１２）までであり、イントロン１（塩基対６７１から７３７）、及びイントロン２（塩基対１４３５から１４９７）を含む。リンカー配列は塩基対１６９９にて開始し、塩基対１７７０（配列番号１３）にて終わる。セルロース結合部位は塩基対１７７１にて開始し、塩基対１８７８までである。ＣＢＨＩに関する配列及び部位の情報はエクスパシー オーガニゼーション ウェブサイト（ｅｘｐａｓｙ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｅｂｓｉｔｅ）を介して得られ、設計されたｕｎｉｐｒｏｔ/Ｐ６２６９４である。ＣＢＨＩ相同体を他のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種並びに他の糸状菌の仲間の中で同定し、必要に応じて、本発明に用いてよい。 
【００６２】
ＮＳＰ２４シグナルペプチド及びポリヌクレオチド
ＮＳＰ２４遺伝子をトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）から単離し、シークエンスした（例えば、米国特許第7,429,476号を参照願いたい、その全体を参照により本明細書に取り込まれる）。この遺伝子のシークエンシングは図８に示すように、４０７アミノ酸オープンリーディングフレーム（配列番号８）をコードする配列を同定した。シグナルペプチドを配列番号８の最初の２０アミノ酸（MQTFGAFLVSFLAASGLAAA；配列番号９）として同定した。ＮＳＰ２４相同体を他のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種並びに他の糸状菌の仲間の中で同定し、必要に応じて、本発明に用いてよい。幾つかの実施態様においては、ＮＳＰ２４シグナル配列を子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）生物中にて用いる。幾つかの実施態様においては、その配列をトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ.）中で用い、さらにある実施態様においては、トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）中で用いる。
【００６３】
即ち、本発明はタンパク質を分泌するのに用いてよいＮＳＰ２４ファミリープロテアーゼシグナルペプチドを提供する。幾つかの実施態様においては、ＮＳＰ２４シグナルペプチドは設計された「ＮＳＰ２４アスパラギンプロテアーゼシグナルペプチド（ＮＳＰ２４ ａｓｐａｒｔｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）」である。 
【００６４】
本発明のポリヌクレオチド
本発明は多様なポリヌクレオチドを提供し、所望のタンパク質、シグナルペプチド、触媒部位、リンカー、シャペロン、シャペロニン、及びフォールダーゼを含むが、これらに限定されない。幾つかの実施態様においては、ポリヌクレオチドは上記の少なくとも２つを含む。さらに他の実施態様においては、本発明のポリヌクレオチドは上記の少なくとも３つを含む。
【００６５】
幾つかの実施態様においては、ポリヌクレオチドはＬ‐アミノ酸を用いる「同類アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）のような少なくとも一つのアミノ酸置換を含むタンパク質をコードする。ここで、ひとつのアミノ酸は他の生物学的に同類のアミノ酸によって置換される。同類アミノ酸置換は一般的な電荷、疎水性／親水性及び／又は置換されているアミノ酸の立体的かさ高さを保存するアミノ酸置換である。保存的置換の例は次のグループの間でのアミノ酸置換である。Ｇｌｙ／Ａｌａ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｓｅｒ／Ｃｙｓ／Ｔｈｒ、及びＰｈｅ／Ｔｒｐ／Ｔｙｒである。幾つかの実施態様においては、「タンパク質誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」を本発明中に用いてよい。これらの実施態様の幾つかにおいて、タンパク質誘導体は「親（ｐａｒｅｎｔ）」タンパク質配列に比較して、僅か約１から約１０個のアミノ酸残基、例えば約６から約１０個、僅か約5個、僅か約４、約３、約２個又は1個でさえのアミノ酸残基の違いでもよい。表１は従来技術によって認められる典型的なアミノ酸置換を示す。さらなる実施態様においては、置換は一以上の非同類アミノ酸置換、欠損、又は挿入に関与し、シグナルペプチド活性を消失しない。
【表１】
2015027308.tif 000003
【００６６】
幾つかの実施態様においては、本発明のポリヌクレオチドは天然の配列である。幾つかの実施態様においては、天然配列は天然から単離され、一方他の実施態様においては、それらは組み換え手段又は合成手段で作成される。用語「天然の配列（ｎａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は特に自然に発生する欠損又は分泌形状（例えば、生物学的に活性フラグメント）及び天然配列の自然に発生する変異体の形状を含む。
【００６７】
遺伝子コードは縮重するので、２以上のコドンを特定のアミノ酸のコードに用いてよい。従って、幾つかの実施態様においては、異なるＤＮＡ配列をシグナルペプチド、タンパク質、触媒部位、及び／又はシャペロンのような任意のポリペプチドをコードするのに用いてよい。実際に、本発明は同じポリペプチドをコードする異なるポリヌクレオチドを含むことを意図する。
【００６８】
温度及び溶液のイオン強度の適切な条件下核酸の一本鎖の形状が他の核酸へアニールすることができる時核酸は別の核酸配列にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は低い、中程度、高い及びかなり高い条件下ハイブリダイゼーションに関してその分野において周知である。一般的にハイブリダイゼーションはヌクレオチドプローブ及びＤＮＡ相同体配列に関与し、相補ポリヌクレオチドの広い塩基対により安定な二本鎖ハイブリッドを形成する。幾つかの実施態様においては、約６０℃に（中程度のストリンジェンシー）、６５℃（中／高いストリンジェンシー）、７０℃（高いストリンジェンシー）及び約７５℃（とても高いストリンジェンシー）にてプローブ及び配列相同体を有するフィルターを２ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳで洗浄する（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989, 6.3.1 - 6.3.6を参照願いたい、参照により本明細書に取り込まれる）。
【００６９】
本発明は対立遺伝子の変異体、天然の変異体、導入変異体、ラッカーゼをコードする核酸に高い又は低いストリンジェンシー条件下ハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質、ＮＳＰ２４のシグナル配列、ＣＢＨＩのシグナル配列、触媒部位、シャペロン、シャペロニン、及びフォールダーゼを含む。本発明の核酸及びポリペプチドは開示される配列中シークエンシングの誤りにより生じた、本明細書に記載の配列と異なるものも含む。 
【００７０】
「ＤＮＡ配列の相同性（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」は二つのＤＮＡ配列の間の相同性の程度によって決定される。しばしば相同性又は「パーセント同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、コンピュータプログラムを用いてポリペプチド配列及び／又はヌクレオチド配列を決定される。配列整列の実行及び配列同一性の決定の方法は当業者に周知であり、過度の実験をせずに実施してよく、同一性の計算値は明確に得られる。配列整列化及び配列同一性の決定をするためのアルゴリズムの多くは入手か可能であり、当業者に周知である。また、これらのアルゴニズムに使用するコンピュータプログラムは入手可能及び当業者に周知であり、以下のものを含むがこれらに限定はされない。即ち、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｎｇ(ＤＡＮＳＴＡＲ)ソフトウエア又はＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ及びＣＬＵＳＴＡＬである。当業者であれば比較される配列の長さに渡って最大の配列整列を達成するために必要であるアルゴリズムを含め、整列を測定する適切なパラメーターを決定できる。配列同一性はプログラムによって決定されたデフォルトパラメーターを使用することにより決定される。幾つかの実施態様においては、このアルゴリズムが次のサーチパラメーターで、すなわち１２のギャップ開始ペナルティ及び１のギャップ伸長ペナルティで、アファインギャップサーチを使用しているＭＳＰＲＣＨ ｐｒｏｇｒａｍ (Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ) で実行される場合、配列同一性はＳｍｉｔｈ-Ｗａｔｅｒｍａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ (Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ｍｅｔｈ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ７０: １７３-１８７ (１９９７)) によって決定される。対のアミノ酸の比較は１２のギャップウエイトと２のレングスウエイトをもつｂｌｏｓｕｍ６２アミノ酸置換行列を使用しているＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ, Ｉｎｃ.（Ｍａｄｉｓｏｎ, ＷＩ）のＧＣＧ配列分析ソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラムの使用により実行される。二つのアミノ酸配列の最適整列に関して、種々のアミノ酸配列の連続セグメントは参照アミノ酸配列に対して追加アミノ酸残基又は欠損アミノ酸残基をもってもよい。参照アミノ酸配列と比較するために使用した連続セグメントは少なくとも２０アミノ酸残基を含んでもよく、約３０、約４０、約５０又はそれ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。幾つかの実施態様においては、誘導体のアミノ酸配列中ギャップを含む関係で増加した配列同一性の補正はギャップペナルティを割り当てることにより実行できる。
【００７１】
幾つかの実施態様においては、本発明により含まれるタンパク質、シグナルペプチド、酵素触媒部位、シャペロン、シャペロニン、及び／又はフォールダーゼは細菌又は糸状菌のような菌類由来である。糸状菌の例は、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）及びトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）を含む。トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）の有る例はトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）である。しかしながら、幾つかの実施態様においては、本発明により提供されるシグナルペプチド及び／又はシグナルペプチドをコードするＤＮＡは菌類の別の属又は種の由来でよく、次を含むが、これらに限定されない。それは
アブシディア種（Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐｐ．）、
アクレモニウム種（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐｐ）、
アガリクス種（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｓｐｐ）、
アナエロミセス種（Ａｎａｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ）、
アスペルギルス アキュレイタス（Ａ． ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス アワモリ（Ａ． ａｗａｍｏｒｉ）、 アスペルギルス フラバス（Ａ． ｆｌａｖｕｓ）、 アスペルギルス フォエティダス（Ａ． ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、 アスペルギルス フマリクス（Ａ． ｆｕｍａｒｉｃｕｓ）、アスペルギルス フミガツス（Ａ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、 アスペルギルス ニドゥラン（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、 アスペルギルス オリザエ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス テレウス（Ａ． ｔｅｒｒｅｕｓ）及びアスペルギルス ベルシカラー（Ａ． ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）を含むが、これらに限定されないアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、
オーロバシジウム種（Ａｅｕｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、
セレナ種（Ｃｅｒｒｅｎａ ｓｐｐ．）、
セファロスポルム種（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｕｍ ｓｐｐ．）、
セファロスポリウム種（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、
カエトミウム種（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐｐ．）、
コプリナス種（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｓｐｐ．）、
ダクチラム種（Ｄａｃｔｙｌｌｕｍ ｓｐｐ．）、
ダクチリウム種（Ｄａｃｔｙｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、
フザリウム コングロメランス（Ｆ． ｃｏｎｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、フザリウム デセムセルレーレ（Ｆ． ｄｅｃｅｍｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、フザリウム ジャバニクム（Ｆ． ｊａｖａｎｉｃｕｍ）、フザリウム リニ（Ｆ． ｌｉｎｉ）、フザリウム オキシスポラム（Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）及びフザリウム ソラニ（Ｆ． ｓｏｌａｎｉ）を含むフザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ.）、
グリオクラジウム種（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、 
フミコーラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）を含むフミコーラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐｐ.）、
ムコール種（Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ.）、
ニューロスポラ クラッサ（Ｎ． ｃｒａｓｓａ）及びニューロスポラ シトフィラ（Ｎ. ｓｉｔｏｐｈｉｌａ）を含むニューロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ.）、
ネオカリマスチックス種（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ ｓｐｐ．）、
オリピノミセス種（Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、
ファネロケータ種（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｓｐｐ.）、
フェレビア種（Ｐｈｌｅｂｉａ ｓｐｐ．）、
プリオミセス種（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ.）、
リゾプス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．）、
シゾフィラム種（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｐｐ．）、
スタキボトリス種（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｓｐｐ.）、
トラメテス種（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｓｐｐ.）、
トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）（ロンギプラチアタム（ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ））及びトリコデルマ ビリデ（Ｔ． ｖｉｒｉｄｅ）を含むトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ.）、及び
ジゴリンクス種（Ｚｙｇｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）である。
【００７２】
触媒部位融合
所望のタンパク質を酵素へ融合することはしばしば所望のタンパク質の発現及び／又は分泌を増加させる。一般的に、酵素配列は構築体中所望のタンパク質の上流にある。例えば、酵素はグルコアミラーゼから又はＣＢＨＩ酵素から得られる。ある実施態様においては、酵素配列は触媒部位、リンカー、及び結合部位を含む完全長酵素配列である。別の実施態様においては、酵素配列は触媒部位配列を含み、リンカー又は一部のリンカーにより所望のタンパク質配列に結合している。幾つかの実施態様においては、酵素は天然宿主中高く発現及び／又は分泌する宿主タンパク質である。例えば、宿主細胞がトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞である場合、酵素はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）タンパク質由来である。しかしながら、多くの糸状菌タンパク質をタンパク質への融合に用いてよく、首尾よく他の糸状菌の宿主を用いてよいことは理解される。
【００７３】
シャペロン、シャペロニン及びフォールダーゼ
本発明の方法に用いる特定のシャペロン、シャペロニン、及び／又はフォールダーゼ及び本発明に含まれるポリヌクレオチドは限定されない。さらに、本明細書にシャペロン、シャペロニン、及び／又はフォールダーゼの使用を記載する場合、それらを方法中互換可能に用いる。例えば、シャペロンを用いる方法を記載する場合、フォールダーゼ及び／又はシャペロニンを記載されたシャペロンに変えて又は加えて用いてよいことは理解される。本発明に有用なシャペロン、シャペロニン、及び／又はフォールダーゼは宿主細胞中活性であるもの及び所望のタンパク質の発現の増加作用があるものである。
【００７４】
幾つかの実施態様においては、シャペロン、シャペロニン、及び／又はフォールダーゼはタンパク質と同門の生物由来であり、同属由来でよく、また、同属及び同種由来でもよい。いくつかの別の実施態様においては、シャペロン、シャペロニン、及び／又はフォールダーゼは担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）由来であり、タンパク質は担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）タンパク質である。幾つかの実施態様においては、シャペロン、シャペロニン、及び／又はフォールダーゼを組み合わせで用いる。幾つかの実施態様においては、実質的に完全長のシャペロン、シャペロニン、及び／又はフォールダーゼと同様の機能を有するシャペロン、シャペロニン、及び／又はフォールダーゼのフラグメントを用いてよい。一般的なシャペロン、シャペロニン、及び／又はフォールダーゼは米国特許出願６０／９１９，３３２及びＷＯ ２００８／１１５５９６に記載のものを含み、全体を参照により本明細書に組み込む。一般的なシャペロン、シャペロニン、及び／又はフォールダーゼはＢＩＰ１、ＣＬＸ１、ＥＲＯ１、ＬＨＳ１、ＰＲＰ３、ＰＲＰ４、ＰＲＰ１、ＴＩＧ１、ＰＤＩ１、ＰＰＩ１、ＰＰＩ２、ＳＣＪ１、ＥＲＶ２、ＥＤＥＭ、及びＳＩＬ１を含むがこれらに限定されない。表２は本発明に使用できるシャペロン、シャペロニン、及び／又はフォールダーゼに関する番号を表示する。
【表２】
2015027308.tif 000004
【００７５】
分子生物学−プロモーター及び発現ベクター
本発明は当業者に周知である組み換え遺伝子の分野で所定の技術を用いる。幾つかの実施態様においては、本発明は複製及び／又は発現のために宿主細胞（例えば、トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞）に形質転換する前に中間体ベクターへ典型的にクローン化する遺伝子プロモーター配列（例えば、糸状菌由来）を含む異種の遺伝子を提供する。これらの中間体ベクターは一般的に原核生物のベクター（例えば、プラスミド、又はシャトルベクター）である。
【００７６】
一般的に、所望のタンパク質の発現は任意の適切なプロモーター下に達成される。ある実施態様においては、宿主に対して非天然のプロモーターを宿主に対して天然又は非天然いずれかである所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合する。別の実施態様においては、宿主に対して天然のプロモーターを宿主に対して天然又は非天然いずれかである所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合する。幾つかの実施態様においては、所望のタンパク質を異種プロモーター下発現し、プロモーターは所望のタンパク質遺伝子と自然に結合しないことを特徴とする。一方、幾つかの他の実施態様においては、所望のタンパク質は構成的プロモーター又は誘導プロモーター下に発現する。幾つかの実施態様においては、所望のタンパク質はセルラーゼプロモーター（例えば、ｃｂｈ１プロモーター）を有するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）発現系中に発現する。
【００７７】
本明細書にて用いる用語「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」は下流遺伝子の転写を指示する機能を有する核酸配列をいう。プロモーターは、ポリメラーゼＩＩタイプのプロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメントのような転写開始サイトの近くの必要な核酸配列を含んでよい。他の転写及び翻訳調節核酸配列と共に含むプロモーターはまとめて「調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」といい、遺伝子の発現を制御する。一般的に、調節配列はプロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始と停止配列、翻訳開始と停止配列、及びエンハンサー又は活性化配列を含むが、これらに限定されない。調節配列は一般的に宿主に適応し、認識され、下流遺伝子を発現する。幾つかの実施態様においては、用いるプロモーターは宿主細胞と同じ門由来であり、他の実施態様においては、プロモーターは宿主細胞と同じ属であり、及び幾つかの実施態様においては、宿主細胞と同じ属及び種由来である。
【００７８】
「構成的プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」はたいていの環境の条件及び成長の条件下活性であるプロモーターである。「誘導的（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）」又は「抑制的プロモーター（ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」は環境の調節又は成長の調節下活性であるプロモーターである。幾つかの実施態様においては、プロモーターは環境因子の変化により誘導され又は抑制され、それらの環境因子は、炭素、窒素又は他の栄養供給源、温度、ｐＨ、浸透圧、重金属の存在、阻害剤の濃度、ストレス、又は周知である外来物の組み合わせを含み、これらに限定されない。幾つかの実施態様においては、プロモーターは、特定の炭素源のレベル、特定のエネルギー源のレベル、特定のカタボライトのレベル、又は周知の外来物の組み合わせのような代謝因子により誘導され又は抑制される。 
【００７９】
適切なプロモーターの例は、ｃｂｈｌ、ｃｂｈ２、ｅｇｌｌ、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｘｙｎｌ、とｘｙｎ２、ペニシリウム クリソゲナム（Ｐ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の抑制的酸性フォスファターゼ遺伝子 (ｐｈｏＡ)プロモーター（Graessle他、 Appl. Environ. Microbiol., 63:753-756 [1997]を参照願いたい)、グルコース‐抑制的ＰＣＫｌプロモーター (Leuker他、Gene 192 :235-240 [1997]を参照願いたい)、マルトース‐誘導的、グルコース‐抑制的ＭＲＰｌプロモーター(Munro他、Moｌ. Microbiol. ,39 1414- 1426 [2001]を参照願いたい)、 メチオニン‐抑制的ＭＥＴ３プロモーター（Liu他、Eukary. Cell 5:638- 649 [2006]を参照願いたい)、ｐＫｉプロモーター、及びｃｐｃｌプロモーターを含むがこれらに限定されない。
【００８０】
本発明の幾つかの実施態様においては、レポーター遺伝子の構築中のプロモーターは温度感受性プロモーターである。幾つかの実施態様においては、温度‐感受性プロモーターの活性は温度上昇により抑制される。幾つかの実施態様においては、プロモーターはカタボライト‐抑制プロモーターである。幾つかの実施態様においては、プロモーターは浸透圧の変化により抑制される。幾つかの実施態様においては、プロモーターは培養培地中多糖類、二糖類、単糖類の存在レベルにより誘導され又は抑制される。
【００８１】
本発明にて用いてよい誘導的プロモーターの例はトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）のｃｂｈ１プロモーター、登録番号Ｄ８６２３５のＧｅｎＢａｎｋに寄託の核酸配列である。他のプロモーターの例はセルラーゼ酵素をコードする遺伝子の調節に関与するプロモーターを含み、それはｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ５、ｘｙｎｌ及びｘｙｎ２を含むが、これらに限定されない。
【００８２】
本発明の幾つかの実施態様においては、クローン化遺伝子の高い発現レベルを得るために異種の遺伝子を自然に発生する遺伝子と同じようなプロモーターからの距離に有利に配置する。しかしながら、周知なように、この距離での幾つかの変化はプロモーターの機能の消失なしに成し遂げられる。
【００８３】
幾つかの実施態様においては、修飾がプロモーターの機能を変化させない限り、一以上のヌクレオチドの交換、置換、添加、又は放出によって修飾される天然のプロモーターを本発明において用いてよい。実際に、本発明はプロモーターへのそのような変異を含むが、これに限定されないことを意図する。
【００８４】
一般的に発現ベクター／構築体は異種配列の発現に必要なすべての添加要素を含む転写ユニット又は発現カセットを含む。従って、典型的な発現カセットは転写物、リボソーム結合部位、及び翻訳ターミネーションの効率的なポリアデニル化を必要とする異種の核酸配列及びシグナルに作動可能に結合するプロモーターを含む。カセット内の追加的要素はエンハンサーと、もしゲノムＤＮＡを構造遺伝子として用いるならば、機能的なスプライス供与部位及びスプライス受容部位を有するイントロン、分泌リーダーペプチド、リーダー配列、リンカー、及び切断部位を含んでよい。
【００８５】
本発明の実施は遺伝子構築体におけるプロモーターの選択により限定されない。上記に示すように、一般的なプロモーターはトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１、ｅｇ２、ｅｇ３、ｅｇ５、ｘｌｎ１及びｘｌｎ２プロモーターである。本発明に用いるさらなるプロモーターはアスペルギルス アワモリ（Ａ． ａｗａｍｏｒｉ）及びアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）（Nunberg他、 MoI. Cell Biol., 4:2306-2315 [1984]を参照願いたい）由来のもの及びアスペルギルス ニドゥラン（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセタミダーゼ由来のプロモーターを含む。バシルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）にて用いるベクターでの典型的なプロモーターはＡｐｒＥプロモーター、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）にて用いる典型的なプロモーターはＬａｃプロモーター、サッカロミセス セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にて用いる典型的プロモーターはＰＫＧ１、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）にて用いる典型的なプロモーターはｇｌａＡ、及びトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）での典型的なプロモーターはｃｂｈＩである。しかしながら、多様な実施態様において、他の細胞及びプロモーターを用いてよいように、本発明はこれらの具体的な細胞又はこれらの具体的なプロモーターに限定されることを意図していない。
【００８６】
幾つかの実施態様においては、プロモーターの配列に加えて、配列カセットも構造遺伝子の下流に転写ターミネーション領域を含み、効率のよい終結を提供する。幾つかの実施態様においては、ターミネーション領域をプロモーター配列と同じ遺伝子から得る一方、他の実施態様においては、異なる遺伝子から得る。
【００８７】
任意の適切な機能的菌類ターミネーターを本発明にて用いてよいが、幾つかの典型的なターミネーターはアスペルギルス ニドゥラン（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣ遺伝子由来のターミネーター（Yelton他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474 (1984); Mullaney他、(Molecular Genetics and Genomics [MGG] 199:37-45 (1985)を参照願いたい）、アスペルギルス アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）又はアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子（Nunberg他、MoI. Cell. Biol., 4:2306 (1984);Boel他、EMBO J., 3:1581-1585 (1984)を参照願いたい）、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子、ムコール ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）カルボキシプロテアーゼ遺伝子（EP Pat. Publ. No. 0 215 594）及びトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【００８８】
遺伝子情報を宿主細胞へ輸送するために用いる発現ベクターは任意の粒子状ベクターに限定することを意図していない。真核細胞又は原核細胞での発現に用いる従来のベクターを本発明にて用いてよいことは意図される。標準細菌発現ベクターはバクテリオファージλとＭ１３並びに、ｐＢＲ３２２ベースプラスミド、ｐＳＫＦ，ｐＥＴ２３Ｄのようなプラスミド、及びＭＢＰ、ＧＳＴとＬａｃＺのような融合発現系を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施態様においては、エピトープタグを組み換えタンパク質に添加することによる、便利な単離方法（例えば、ｃ‐ｍｙｃ）を提供する。適切な発現／組み込みベクターの例は当業者に周知である（例えば、Bennett and Lasure (eds.) More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press pp. 70-76 and pp. 396-428 (1991); US Pat. No. 5,874,276を参照願いたい）。多くの販売業者（例えば、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等）は有用なベクターを提供し、当業者に周知である。幾つかの特定の有用なベクターはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１００、ｐＤＯＮ（商標）２０１、ｐＥＮＴＲ（商標）、ｐＧＥＮ（商標）３Ｚ及びｐＧＥＮ（商標）４Ｚを含むが、これらに限定されない。しかしながら本発明は同等の機能を果たし周知であるか又は周知になりつつある他の発現ベクターを含むものである。すなわち、広範囲の宿主／発現ベクターの組み合わせは本発明のＤＮＡ配列を発現することに使用される可能性がある。幾つかの実施態様においては、有用な発現ベクターは染色体、非染色体及び／又は合成ＤＮＡ配列（例えば、様々に知られたＳＶ４０誘導体）のセグメント及び周知微生物のプラスミド（例えばｃｏｌＥｌ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭｂ９、ｐＵＣ１９、ｐＳＬ１１８０及びそれらの誘導体を含む大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）由来プラスミド）、より広い宿主範囲のプラスミド（例えばＲＰ４）、ファージＤＮＡ、（例えばファージλの多くの誘導体、例えばＮＭ９８９、他のＤＮＡファージ、例えばＭｌ３及び糸状一本鎖ＤＮＡファージ）、及び酵母プラスミド（例えば、２．ミュー（ｍｕ）プラスミド又はそれらの誘導体）からなってもよい。
【００８９】
幾つかの実施態様においては、発現ベクターは選択マーカーを含む。選択マーカーの例は抗生物質耐性を与えるものを含む。栄養マーカーもまた本発明に用いてよく、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ及びｐｙｒ４のような当業者に周知のマーカーを含む。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の形質転換に有用なマーカーは周知である（例えば、Finkelstein, in Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelstein et ah, (eds.), Butterworth- Heinemann, Boston MA, chapter 6 (1992)を参照願いたい)。幾つかの実施態様においては、また、発現ベクターはレプリコン、組み換えプラスミドを内部にもつ細菌の選択を可能にするため抗生物質耐性をコードしている遺伝子及び／又は異種配列を挿入させるためにプラスミドの重要でない領域に存在する独特の制限部位を含む。任意の有用な抗生物質耐性遺伝子を本発明に用いてよい。トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）が宿主細胞である幾つかの実施態様においては、好ましくは、トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）のＤＮＡの複製又は組み込みを妨げないような原核生物配列が選ばれる。
【００９０】
幾つかの実施態様においては、発現ベクターはレポーター遺伝子のみ、又は任意に関心のあるタンパク質と融合した任意のレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子の例は蛍光レポーター、色検出レポーター（例えば、β‐ガラクトシダーゼ）、及びビオチン化レポーターを含むが、これらに限定されない。幾つかの実施態様においては、レポーター分子が発現する場合、シグナルペプチドが宿主細胞中で活性であるかどうか同定するために用いる。もしシグナルペプチドが活性ならば、レポーター分子は細胞から分泌される。幾つかの実施態様においては、シグナルペプチドは初期にレポーターに作動可能に結合し、特定の宿主細胞からの分泌を同定できる。関心のあるタンパク質及び／又はシグナルペプチドに特異的な抗体を用いるような別の方法も関心のあるタンパク質が分泌されたかどうか決定するために用いてよい。
【００９１】
幾つかの実施態様においては、本発明の形質転換方法によって、糸状菌宿主細胞のような宿主細胞の遺伝子へ全部又は一部の形質転換ベクターの安定した組み込みをもたらす可能性がある。しかしながら、本発明は自己複製、染色体外形質転換ベクターを維持する結果をもたらす形質転換もまた意図している。
【００９２】
多くの標準的なトランスフェクションの方法を本発明に用いてよく、蛋白質を大量発現する糸状菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞株を生産できる。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）のセルラーゼ生産株へのＤＮＡ構築体を導入するための方法は当業者に周知である（例えば、Lorito他、Curr. Genet, 24:349-356 [1993]; Goldman他、Curr. Genet., 17:169-174 [1990]; Penttila 他、Gene 6: 155-164 [1987]; US Pat. No. 6.022,725; US Pat. No. 6,268,328; Nevalainen他、「The Molecular Biology of Tｒchoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes」 in Molecular Industrial Mycology, Leong and Berka (eds.), Marcel Dekker Inc., NY [1992) pp 129-148; Yelton他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474 [1984];, Bajar他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8202-8212 [1991]; Fernandez-Abalos 他、Microbiol., 149:1623 - 1632 [2003); and Brigidi他、FEMS Microbiol. Lett., 55:135-138 [1990]を参照願いたい)。
【００９３】
しかしながら、宿主細胞へ外来ヌクレオチド配列を導入するため任意の周知の方法を本発明に用いてもよい。これらの方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔、遺伝子銃、リポゾーム、マイクロインジェクション、プラスミドベクター、ウイルスベクター及び当業者が周知のようなゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の外来遺伝子材料を宿主細胞へ導入するいずれかの他の周知の方法を含むがこれらに限定されない。また、用いる方法はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介在トランスフェクション法（例えば、米国特許第６，２５５，１１５を参照願いたい）を含む。特定の遺伝子組み換え技術によって遺伝子の発現が可能である宿主細胞へ少なくともひとつの遺伝子がうまく導入できさえすればよい。幾つかの実施態様においては、本発明はタンパク質を生産する方法を提供し、宿主細胞にタンパク質をコードする核酸に結合するＮＳＰ２４シグナルペプチドを含むポリヌクレオチドを導入する段階、タンパク質の発現及び生産のための適切な培養条件下宿主細胞を培養する段階、及び該タンパク質を生産する段階を含む。幾つかの実施態様においては、タンパク質は宿主細胞から分泌される。幾つかの別の実施態様においては、本発明はタンパク質の生産方法を提供し、宿主細胞にタンパク質をコードする核酸に作動可能に結合するＣＢＨ１シグナルペプチドを含むポリヌクレオチドを導入する段階、タンパク質の発現及び生産のための適切な培養条件下宿主細胞を培養する段階、及び該タンパク質を生産する段階を含む。幾つかの実施態様においては、タンパク質は宿主細胞から分泌される。
【００９４】
発現ベクターが宿主細胞に導入された後、トランスフェクションされた又は形質転換された細胞を遺伝子プロモーター配列の制御下遺伝子発現に適した条件下培養する。幾つかの実施態様においては、大型バッチ式で形質転換細胞を培養する。幾つかの実施態様においては、標準手段を用いて生産物（言い換えると、タンパク質）を細胞から採取し及び／又は培養物から回収する。
【００９５】
かくて、本明細書に記載する発明は、所望のポリペプチドの増強された分泌及び発現を提供し、分泌がシグナルペプチド配列、融合ＤＮＡ配列及び種々の異種構築体並びにシャペロン、シャペロニン、及び／又はフォールダーゼの発現によって増強されることを特徴とする。本発明はまた、そのような所望のポリペプチドの高いレベルの分泌及び発現に関するプロセスを提供する。
【００９６】
所望のタンパク質
本明細書にて用いる用語「所望のタンパク質（ｄｅｓｉｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は関心の対象となるタンパク質を意味する。所望のタンパク質は宿主細胞本来存在するタンパク質、又は宿主細胞に対して本来存在しない（異種の）タンパク質でよい。幾つかの実施態様においては、所望のタンパク質は菌類のタンパク質である。幾つかの実施態様においては、宿主は子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主であり、タンパク質は子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）タンパク質以外のタンパク質である。幾つかの実施態様においては、宿主は担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）宿主であり、タンパク質は担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）以外の任意のタンパク質である。幾つかの実施態様においては、タンパク質はトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)タンパク質以外の任意のタンパク質である。幾つかの他の実施態様においては、タンパク質はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）タンパク質以外の任意のタンパク質である。
【００９７】
本発明はタンパク質の特定のタイプに限定することを意図していない。実際に、本発明は任意の関心あるタンパク質を含む。所望のタンパク質の例は、グルコアミラーゼ、アルファ‐アミラーゼ、粒状デンプン加水分解酵素、セルラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、クチナーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、及びそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。
【００９８】
幾つかの実施態様においては、グルコアミラーゼはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)又はリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）の菌株のような糸状菌源から得られる野生型グルコアミラーゼである。しかしながら、他の実施態様においては、グルコアミラーゼはタンパク質組み換えグルコアミラーゼ（例えば、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼの変異体）である。幾つかの他の実施態様においては、本発明の組成物も少なくとも一つのプロテアーゼ及び少なくとも一つアルファ‐アミラーゼを含む。幾つかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼは細菌類の供給源（例えば、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．））から又は菌類の供給源（例えば、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．））から得られる。幾つかの実施態様においては、組成物はまた少なくとも一つのプロテアーゼ、及び／又は少なくとも一つのグルコアミラーゼ、及び／又は少なくとも一つのアルファ‐アミラーゼ酵素を含む。幾つかの実施態様においては、タンパク質は担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）から得られるラッカーゼのようなラッカーゼであり、幾つかの実施態様においては、セレナ ユニカラー（Ｃ. ｕｎｉｃｏｌｏｒ）のようなセレナ（Ｃｅｒｒｅｎａ）属から得られる。これらの酵素の商業的供給源は周知であり、入手可能であり、例えばジェネンコ インターナショナル社（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．）及びノボザイム エイ／エス（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）である。
【００９９】
ラッカーゼ及びラッカーゼ関連酵素
ある好ましい実施態様においては、ラッカーゼ及びラッカーゼ関連酵素が所望のタンパク質である。酵素分類（ＥＣ１．１０．３．２）内の任意のラッカーゼ酵素が含まれる場合、本発明は任意の特定のラッカーゼに限定することを意図しない。幾つかの実施態様においては、ラッカーゼ酵素は微生物又は植物源から得られる。幾つかの実施態様においては、微生物ラッカーゼ酵素は細菌又は菌類（糸状菌及び酵母を含む）から得られる。本発明は特定のラッカーゼに限定することを意図していないが、適切な例は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）（例えば、ニューロスポラ クラッサ（Ｎ. ｃｒａｓｓａ））、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、 ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、コリビア（Ｃｏｌｌｙｂｉａ）、セレナ（Ｃｅｒｒｅｎａ）, スタキボトリス（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）、パヌス（Ｐａｎｕｓ）（例えばパヌス ルディス（Ｐａｎｕｓ ｒｕｄｉｓ））、チエイラバ（Ｔｈｉｅｉｌａｖａ）、フォメス（Ｆｏｍｅｓ）、レンチヌス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ）、プレウロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）（例えば、トラメテス ビロサ（Ｔ. ｖｉｌｌｏｓａ）及びトラメテス ベルシカラー（Ｔ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、（例えば、リゾクトニア ソラニ（Ｒ. ｓｏｌａｎｉ））、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）（例えば、コプリナス プリカチリス（Ｃ. ｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ）及びコプリナス シネレウス（Ｃ. ｃｉｎｅｒｅｕｓ））、プサチレラ（Ｐｓａｔｙｒｅｌｌａ）、ミセリオフィソーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）（例えば、ミセリオフィソーラ テルモンヒラ（Ｍ. ｔｈｅｒｍｏｎｈｉｌａ））、シタリジウム（Ｓｃｈｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）（例えば、フレビア ラジタ（Ｐ. ｒａｄｉｔａ）、例えば、ＷＯ ９２/０１０４６を参照願いたい）、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）（例えば、コリオルス ヒルスタス（Ｃ.ｈｉｒｓｕｔｕｓ）例えば、ＪＰ ２‐２３８８８５を参照願いたい）、スポンギスペリス（Ｓｐｏｎｇｉｐｅｌｌｉｓ）、ポリポルス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）、セリポリオプシス サブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、ガノデルマ ツノダエ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｔｓｕｎｏｄａｅ）、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来のラッカーゼを含む。
【０１００】
幾つかの実施態様においては、ラッカーゼは、ＣＢＳ１１５．０７５菌株由来セレナ（Ｃｅｒｒｅｎａ）ラッカーゼＡ１、Ｂ１及びＤ２、ＣＢＳ１５４．２９菌株由来セレナ（Ｃｅｒｒｅｎａ）ラッカーゼＡ２、Ｂ２、Ｃ、Ｄ１、及びＥ、ＡＴＣＣ２００１３菌株由来セレナ（Ｃｅｒｒｅｎａ）ラッカーゼＢ３酵素（例えば、US Publication No. 2008/0196173を参照願いたい、その全体を参照により取り込まれる）を含む。さらに、これらのラッカーゼの最適化型も本発明に用いてよい。
【０１０１】
別の実施態様においては、ラッカーゼはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）において発現するセレナ（Ｃｅｒｒｅｎａ）ラッカーゼＤの成熟タンパク質を含み、アミノ酸配列を次に示す（配列番号４５）。
2015027308.tif 000005
【０１０２】
宿主細胞 
本発明は本明細書にて記載のようにＤＮＡ構築体及びベクターを用いて形質転換される宿主細胞を提供する。幾つかの実施態様においては、本発明は本明細書にて記載のように所望のタンパク質コードし、ＮＳＰ２４又はＣＨＢＩシグナルペプチドに作動可能に結合するＤＮＡ構築体を用いて形質転換される宿主細胞の提供である。幾つかの実施態様においては、本発明はプロテアーゼ、ラッカーゼ、アルファ‐アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、及びセルラーゼのような少なくとも一つの所望のタンパク質をコードするＤＮＡ構築体であって、宿主細胞に導入する構築体を提供する。幾つかの実施態様においては、本発明は細菌及び／又は菌類宿主細胞における遺伝子プロモーター機能の制御下タンパク質遺伝子の発現及び／又はタンパク質遺伝子の過剰発現を提供する。
【０１０３】
任意の適切な宿主細胞は本発明に有用であることを意図する。本発明は任意の特定の宿主細胞を限定することを意図していない。幾つかの実施態様においては、宿主細胞はシグナルペプチドが所望のタンパク質を分泌する時活性を有する細胞である。例えば、用いることのできるトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）シグナルペプチド関する宿主細胞は菌類及び細菌細胞を含むが、これらに限定されない。宿主細胞は糸状菌細胞を含むが、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）（例えば、トリコデルマ ビリデ（Ｔ． ｖｉｒｉｄｅ）及びトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）、ハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ）の無性世代、以前トリコデルマ ロンギプラチアタム（Ｔ． ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）として区分された）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、フミコーラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐｐ.）（例えば、フミコーラ インソレンス（Ｈ. ｉｎｓｏｌｅｎｓ）及びフミコーラ グリセア（Ｈ. ｇｒｉｓｅａ））、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）（アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス ニドゥラン（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス オリザエ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）、スペルギルス アワモリ（Ａ． ａｗａｍｏｒｉ）、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ.）（例えば、フザリウム グラミナム（Ｆ. ｇｒａｍｉｎｕｍ））、ニューロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ.）、ヒポクレア種（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｐｐ.）、及びムコール種（Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ.）を含むが、これらに限定されない。別の宿主細胞はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、バシルス スブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス レンツス（Ｂ. ｌｅｎｔｕｓ）、バシルス ステアロテルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及びバシルス ブレビス（Ｂ. ｂｒｅｖｉｓ））及びストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ.）（例えば、ストレプトミセス コエリカラー（Ｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）及びストレプトミセス リビダンス（Ｓ. ｌｉｖｉｄａｎｓ））を含むが、これらに限定されない。
【０１０４】
タンパク質が宿主細胞中分泌される又は細胞質に残るか否かを同定するための多くの方法が当分野にて周知である。任意の適切な方法をシグナル配列が活性である宿主細胞を同定するときに用いてよいことは意図される。
【０１０５】
タンパク質発現
本発明の所望のタンパク質は、ＮＳＰ２４又はＣＢＨ１シグナルペプチド配列、フォールダーゼ、シャペロニン、及び／又はシャペロンにより分泌が増強される遺伝子を含む発現ベクターのようなベクターを用いて形質転換した細胞を培養することにより生産される。特に本発明はタンパク質の細胞内及び／又は細胞外生産の増強に有用である。当業者に周知なように、タンパク質の生産のための最適な条件は宿主細胞の選択及び発現されたタンパク質の選択に伴って変化する。そのような条件は通例の実験又は最適化を通して当業者によって容易に確認できる。
【０１０６】
幾つかの実施態様においては、対象となるタンパク質は発現後精製又は単離される。タンパク質の単離又は精製に関する様々な方法は当業者に周知である。任意の適切な方法を本発明に用いてよい。例えば、本発明に用いてよい標準的な精製方法は電気泳動的、分子的、免疫学的及びクロマトグラフィーの方法を含むがこれらに限定されない。これらにはイオン交換、疎水性、親和性及び逆相高速液体（ＨＰＬＣ）クロマトグラフィー及び等電点電気泳動を含む。例えば、幾つかの実施態様においては、当該タンパク質に対する抗体を含む標準的な抗体カラムを用いてタンパク質を精製してもよい。タンパク質濃縮と組み合わせて、限外ろ過法及びダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）法もまた幾つかの実施態様において有用である。当業者に周知なように、タンパク質の使用に応じて精製の程度の必要性は変わってくる。実際に、幾つかの実施態様においては、精製は不必要である。
【０１０７】
幾つかの実施態様においては、本発明により提供されるように、形質転換される宿主細胞により生産されるタンパク質を当業者に周知の従来の方法により培養培地から回収する。これらの方法は、遠心分離又はろ過によって培地から宿主細胞を分離することを含むが、これに限定されない。幾つかの実施態様においては、細胞を壊し、上清を細胞分画及び細胞残屑から分離する。幾つかの実施態様においては、上清又はろ過物のタンパク質性の成分を清澄化後、塩（例えば、硫酸アンモニウム）の手段により沈殿する。沈殿タンパク質をそれから溶解し、幾つかの実施態様において、クロマトグラフィーの手法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、及び他の当該分野で認識される手法）を含む任意の方法により精製する。
【０１０８】
幾つかの実施態様においては、動物（例えば、ウサギ又はマウス）を免疫化して本発明を用いて生産されるペプチド及びタンパク質に対する抗体を発生させ、任意の適切な周知の方法を用いて抗タンパク質及び／又はＮＳＰ２４シグナルペプチド抗体を回収することにより調製する。幾つかの追加的な実施態様においては、モノクローナル抗体を任意の周知な方法を用いて作成する。
【０１０９】
幾つかの実施態様においては、本発明に用いてよい当業者に周知なアッセイはWO 99/34011及び米国特許第6,605,458に記載のものを含むが、これらに限定されず、両者は全体を参照により本明細書に取り込まれる。
【０１１０】
融合
幾つかの実施態様においては、所望のタンパク質を融合タンパク質として生産する。幾つかの実施態様においては、所望のタンパク質を糸状菌により効率的に分泌されるタンパク質に融合し、融合タンパク質の発現に用いる宿主細胞を同じ門、属、及び／又は種由来の酵素触媒部位に融合する。幾つかの実施態様においては、所望のタンパク質はＣＢＨＩポリペプチド、又はその一部に融合する。幾つかの追加的な実施態様においては、所望のタンパク質は触媒活性を最小限にする又は放出する改変をしているＣＢＨＩポリペプチド、又はその一部に融合する。幾つかのさらなる実施態様においては、所望のタンパク質はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼポリペプチド、又はその一部に融合する。幾つかの追加的な実施態様においては、所望のタンパク質はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ、又はその一部に融合し、触媒活性を最小限にする又は放出する改変をしていることを特徴とする。幾つかのさらなる実施態様においては、所望のタンパク質は分泌を増強するポリペプチドに融合し、その後の精製及び／又は安定性の増強に機能する。
【０１１１】
一般的に、本発明の発現宿主中の第一、第二、及び／又は第三ポリヌクレオチドを発現宿主の遺伝子の構築物へ遺伝的に挿入しても、組み換えてもよい（例えば、それを発現宿主の染色体へ組み換える）。しかしながら、幾つかの実施態様においては、それは染色体外である（例えば、それは発現宿主内に複製ベクターとして存在する）。さらなる幾つかの実施態様においては、染色体外ポリヌクレオチドをベクターに存在する選択マーカー用の適切な選択条件下発現する。
【０１１２】
分泌レベルアッセイ
本明細書に記載のように、発現宿主中所望のポリペプチドの分泌レベルを任意の適切な方法を用いて検出する。例えば、幾つかの実施態様においては、分泌レベルは多様な要因（例えば、宿主の増殖条件等）に基づく。しかしながら、幾つかの実施態様においては、宿主中に発現する所望のポリペプチドの分泌レベルは分泌増強タンパク質の存在なしに発現する所望のポリペプチドの分泌レベルより高い。幾つかの実施態様においては、所望のポリペプチド（例えば、トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）のような発現宿主中のセレナ ユニカラー（Ｃｅｒｒｅｎａ ｕｎｉｃｏｌｏｒ）由来ラッカーゼ）の発現レベルは、宿主を振盪フラスコにおいてバッチ発酵様式で増殖する場合、少なくとも約１ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも約５ｍｇ／Ｌであり、又は宿主を制御されたｐＨ、供給量など（例えば、流加発酵）を用いた発酵環境で増殖する場合、少なくとも約５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１０、０００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも約２０，０００ｍｇ／Ｌである。
【０１１３】
例えば、分泌ポリペプチドの発現及び／又は分泌を評価するために、アッセイをタンパク質レベル、ＲＮＡレベルにて、及び／又は分泌ポリペプチド活性及び／又は生産に有用な機能的バイオアッセイの利用により実施する。分泌ポリペプチドの発現及び／又は分泌を分析するために用いる一般的なアッセイはノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡ又はＲＮＡ分析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、又は適切なラベル化プローブ（配列をコードする核酸に基づく）を用いるインシツー（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション、従来のサザンブロッティング及びオートラジオグラフィーを含むが、これらに限定されない。
【０１１４】
幾つかの実施態様においては、分泌ポリペプチドの生産、発現及び／又は分泌をサンプル中直接測定する。幾つかの実施態様においては、測定を酵素活性、発現及び／又は分泌対するアッセイを用いて行う。幾つかの実施態様においては、タンパク質発現を免疫学的方法（例えば、細胞及び／又は組織部位の免疫組織化学的染色又はウェスタンブロッティング又はＥＬＩＳＡ法による組織培養培地の免疫測定法）により評価する。そのような免疫測定法を分泌ポリペプチドの発現を定性的及び／又は定量的に評価するのに用いてよい。これらの方法は当業者に周知である。実際に、そのような方法に用いるための多くの商業的入手可能なキット及び試薬がある。
【０１１５】
幾つかの実施態様においては、本発明は発現宿主を増殖するために用いる培養培地から得られる抽出物（例えば、固体又は上清）も提供する。幾つかの実施態様においては、上清は相当量の発現宿主を含まない一方、幾つかの別の実施態様においては、上清はほとんど発現宿主の量を含まない。
【０１１６】
細胞培養
周知のように、本発明の宿主細胞及び形質転換細胞を従来の栄養培地にて培養してよい。しかしながら、幾つかの実施態様においては、形質転換宿主細胞用の培養培地をプロモーターの活性化及び形質転換体の選別のために必要に応じて改変してよい。温度、ｐＨ等のような特定の培養条件は発現用に選択される宿主細胞のために用いる一般的なものであり、当業者にとって明らかである。宿主細胞用の培養培地及び条件は当業者にとって周知である。培養中トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞のような菌類宿主細胞の安定した形質転換体は迅速な成長速度または個体培養培地上のでこぼこした輪郭よりむしろ滑らかな円形コロニーの形成の点で不安定な形質転換体と一般的に異なる。
【０１１７】
組成物
幾つかの実施態様においては、本発明はＮＳＰ２４又はＣＢＨ１シグナル配列、構築体及びベクターを用いる所望のタンパク質を発現するための組成物及び方法を提供する。幾つかの実施態様においては、本発明は次の酵素を含む組成物を提供し、それはラッカーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐アミラーゼ、粒状デンプン加水分解酵素、セルラーゼ、リパーゼ、フォスフォリパーゼ、キシラナーゼ、クチナーゼ、ヘミセルラーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、ケラチナーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、オキシドリダクターゼ、リダクターゼ、ペルヒドロラーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、タンナナーゼ、プルラナーゼ、ペントサナーゼ、ベータ‐グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロインチナーゼ、マンナンナーゼ、セステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０１１８】
利用
本発明により生産される所望のタンパク質をそのタンパク質の適用に応じて任意の利用に用いてよい。酵素のようなタンパク質に関する利用の例は飼料摂取及び飼料効率（例えば、プロテアーゼ）の改善のための動物用飼料、食物のタンパク質加水分解物（例えば、障害のある消化器系を有する個人のため）、皮革処理、タンパク質繊維（例えば、羊毛及び絹）の処理、クリーニング、タンパク質処理（例えば、苦いペプチドを除去するため、食品の香りを増強するため、及び／又はチーズ又はココアを生産するため）、パーソナルケア製品（例えば、毛髪組成物）、甘味料（例えば、高マルトース又は高フルクトースシロップの生産）、発酵及びバイオエタノール（例えば、バイオエタノールを生産する発酵用穀物を処理するために用いるアルファ‐アミラーゼ及びグルコアミラーゼ）を含むが、これらに限定されない。ラッカーゼに関する利用の例は、パルプ及び紙の漂白、繊維漂白、排水の処理、廃紙のインク除去、芳香族化合物又はタンパク質の重合、ラジカル−仲介重合及び架橋反応（例えば、ペイント、コーティング、バイオマテリアル）、染料の活性化、及び有機化合物の結合を含むが、これらに限定されない。また、ラッカーゼは洗浄組成物に用いてよく、洗濯及び他の洗剤を含むが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１１９】
次の実施例は説明のための目的であり、特許請求の範囲を限定する目的ではない。材料及び方法両者に対する多くの改変が本発明の範囲を逸脱せずに実施されて良いことは当業者にとって明らかである。
【０１２０】
以下に開示された実験において、次の略語が適用される。
モル（Ｍ（Ｍｏｌａｒ））、マイクロモル（μＭ（ｍｉｃｒｏｍｏｉａｒ））、規定（Ｎ（ｎｏｒｍａｌ））、モル（ｍｏｌ （ｍｏｌｅｓ））、ミリモル（ｍｍｏｌ（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅｓ））、マイクロモル（μｍｏｌ（ｍｉｃｒｏｍｏｌｅｓ））、ナノモル（ｎｍｏｌ（ｎａｎｏｍｏｌｅｓ））、グラム（ｇ（ｇｒａｍｓ））、ミリグラム（ｍｇ（ｍｉｌｌｉｇｒａｍｓ））、キログラム（ｋｇ（ｋｉｌｏｇｒａｍｓ））、マイクログラム（μｇとｕｇ（ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ））、リットル（Ｌ（ｌｉｔｅｒｓ））、ミリリットル（ｍｌとｕｌ（ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒｓ））、マイクロリットル（μｌ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒｓ））、センチメートル（ｃｍ（ｃｅｎｔｉｍｅｔｅｒｓ））、ミリメートル（ｍｍ （ｍｉｌｌｉｍｅｔｅｒｓ））マイクロメートル（μｍ（ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒｓ））、ナノメートル（ｎｍ（ｎａｎｏｍｅｔｅｒｓ））、摂氏度（℃（ｄｅｇｒｅｅｓ Ｃｅｎｔｉｇｒａｄｅ））、時間（ｈとｈｒ（ｈｏｕｒｓ））、分（ｍｉｎ（ｍｉｎｕｔｅｓ））、秒（ｓｅｃ（ｓｅｃｏｎｄｓ））、ミリセコンド（ｍｓｅｃ（ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄｓ））、ボルト（Ｖ （ｖｏｌｔａｇｅ））、ｘ重力（ｘｇ （ｔｉｍｅｓ ｇｒａｖｉｔｙ））、華氏（°Ｆ （ｄｅｇｒｅｅｓ Ｆａｈｒｅｎｈｅｉｔ）、アセタミダーゼ（ａｍｄＳ （ａｃｅｔａｍｉｄａｓｅ, アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）から得られる選択マーカー)、ラッカーゼ（ｌｃｃＤ （ｌａｃｃａｓｅ））、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ （ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ））、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ （Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））、カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ｂｒａｎｄ ｏｗｎｅｄ ｂｙ ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ））、シグマ（Ｓｉｇｍａ （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ））、スペクトロニック（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ （Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｌｔｄ．， Ｂｅｄｆｏｒｄｓｈｉｒｅ， ＵＫ)）アドバンスドカイネティクス（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ （Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｏｌｕ
ｔｉｏｎｓ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））。
【０１２１】
本実施例における多くの発現ベクターを識別番号Ｕ１３８６５のＧＥＮＢＡＮＫ（商標）に提供されているｐＳＬ１１８０プラスミド骨格に基づいて生産した。ａｍｄＳマーカーのようなマーカー、シャペロン、またはフォールダーゼ、ラッカーゼ（ｌｃｃＤ）、シグナル配列、ＴｒＧＡ融合及びターミネーターを周知のようなポリリンカー及び／又はＰＣＲ方法を用いて添加した。
【０１２２】
プラスミドの部位を次のように同定する。
ｃｂｈ１―セロビオヒドロラーゼ、
Ｔｃｂｈ１―ｃｂｈ１由来ターミネーター、
ＴｒＧＡ―トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ、
ｌｃｃＤ―ラッカーゼＤ、
ａｍｄＳマーカー―独立栄養用選択マーカー、
ｐＳＬ１１８０―プラスミド骨格、
ラッカーゼＤｏｐｔ―宿主（トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ））での発現用最適化コドン使用頻度を用いて構築されるラッカーゼＤの最適化バージョン、
Ｐｃｐｃ‐１―ニューロスポラ クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）由来クロスパスウェイコントロール（ｃｒｏｓｓ ｐａｔｈｗａｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）‐１由来プロモーター、
ｂｌａ―β‐ラクタマ−ゼ遺伝子（言い換えると、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来選択マーカー）、及び
ＨｐｈＲ―ハイグロマイシン‐耐性遺伝子（大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来選択マーカー）。
【０１２３】
発現プラスミドを構築するために、プライマーをＤＮＡ鋳型含有ヘラクレスＰＣＲ反応（Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））にて設計及び使用した。
【０１２４】
実施例１．発現ベクターｐＴｒｅｘ４‐ラッカーゼＤ ｏｐｔの構築
この実施例は、発現ベクターｐＴｒｅｘ４‐ラッカーゼＤ ｏｐｔの構築に関与する段階を記載する。プラスミドをＣＢＨ1プロモーター及びＣＢＨ１シグナル配列を用いてセレナ ユニカラー（Ｃ. ｕｎｉｃｏｌｏｒ）由来コドン最適化ラッカーゼＤ遺伝子を発現するために生産した。このベクターはＣＢＨ１（セロビオヒドロラーゼ）コア／リンカーに融合し、ＣＢＨ１プロモーターから発現されるラッカーゼＤコドン最適化遺伝子を含んだ。図１はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）発現プラスミドの図を示す。ｐＴｒｅｘ４‐ラッカーゼＤ ｏｐｔプラスミド配列は配列番号１として示す。ＤＮＡの次のセグメントをｐＴｒｅｘ４‐ラッカーゼＤ ｏｐｔの構築体中に組み込んだ（図１を参照願いたい）。ＣＢＨ１プロモーター及びＣＢＨ１シグナル配列及びＣＢＨ１コア／リンカーを表すトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）染色体ＤＮＡのフラグメントをプラスミドｐＳＬ１１８０へ挿入した。セレナ ユニカラー（Ｃ. ｕｎｉｃｏｌｏｒ）ラッカーゼＤ（ラッカーゼＤ ｏｐｔ）遺伝子のコドン最適化コピーを挿入し、リンカー領域にてラッカーゼＤと作動可能に結合した。トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）由来ＣＢＨ１ターミネーターをラッカーゼＤ遺伝子に作動可能に結合した。ａｍｄＳ遺伝子を選択独立栄養マーカーとして加えた。ｂｌａ遺伝子（β‐ラクタマーゼ、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）から得られる選択マーカー）をｐＳＬ１１８０ベクター中に存在する。
【０１２５】
実施例２．発現ベクターｐＴｒｅｘ２ｇ‐Ｂｉｐ１の構築
ｐＴｒｅｘ２ｇ／Ｂｉｐ１プラスミドをトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）由来ｂｉｐ１シャペロンを発現するために作成した。図２はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）発現プラスミドｐＴｒｅｘ２ｇ‐Ｂｉｐ１の図を示す。プラスミドの配列は配列番号２として示す。ＤＮＡの次のセグメントをｐＴｒｅｘ２ｇ‐Ｂｉｐ１の構築体中に組み込んだ。トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）ｂｉｐ１の２２６７ｂｐフラグメントをＰｐｋｉプロモーター（トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）由来ピルビン酸キナーゼ）に作動可能に結合するプラスミドｐＳＬ１１８０へ挿入した。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ｃｂｈ１ターミネーターをｂｉｐ１遺伝子に作動可能に結合した。ＨｐｈＲ大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来選択マーカーを選別のために導入し、Ｐｃｐｃ‐１プロモーター（ニューロスポラ クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）由来クロスパスウェイコントロール（ｃｒｏｓｓ ｐａｔｈｗａｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）‐１）及びｔｒｐＣターミネーター（アスペルギルス ニドゥラン（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来トリプトファン合成遺伝子Ｃ）に作動可能に結合した。
【０１２６】
実施例３．発現ベクターｐＴｒｅｘ２ｇ‐Ｐｄｉ１の構築
トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）ｐｄｉ１シャペロン遺伝子（２４６５ｂｐ）をｂｉｐ１シャペロン遺伝子に変えて挿入した以外はｐＴｒｅｘ２ｇ‐Ｐｄｉ１プラスミドをｐＴｒｅｘ２ｇ‐Ｂｉｐ１（実施例２を参照願いたい）と同様の方法でｐｄｉ１シャペロンを発現するために作成した。図３はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）発現プラスミドｐＴｒｅｘ２ｇ‐Ｐｄｉ１の図を示す。プラスミドの配列は配列番号３として示す。
【０１２７】
実施例４．発現ベクターｐＴｒｅｘ２ｇ‐Ｅｒｏ１の構築
トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）ｅｒｏ１シャペロン遺伝子（２４６５ｂｐ）をｂｉｐ１シャペロン遺伝子に変えて挿入した以外はｐＴｒｅｘ２ｇ‐Ｅｒｏ１プラスミドをｐＴｒｅｘ２ｇ‐Ｂｉｐ１（実施例２を参照願いたい）と同様の方法でｅｒｏ１シャペロンを発現するために作成した。図４はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）発現プラスミドｐＴｒｅｘ２ｇ‐Ｅｒｏ１におけるｅｒｏ１の図を示す。ｅｒｏ１の配列は配列番号４として示す。
【０１２８】
実施例５．発現ベクターｐＴｒＧＡ‐ラッカーゼＤ ｏｐｔの構築
ｐＴｒＧＡ‐ラッカーゼＤ ｏｐｔがトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）由来完全長グルコアミラーゼ及び最適化コドンを有するセレナ ユニカラー（Ｃ. ｕｎｉｃｏｌｏｒ）ラッカーゼＤの融合を発現することを除いて、ｐＴｒＧＡ‐ラッカーゼＤ ｏｐｔプラスミドを実施例１と同様に作成した。図５はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）発現プラスミドｐＴｒＧＡ‐ラッカーゼＤ ｏｐｔの図を示す。ポリヌクレオチド配列は配列番号５として示す。
【０１２９】
実施例６．発現ベクターｐＫＢ４０８の構築
ｐＫＢ４０８プラスミドをトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）ＮＳＰ‐２４シグナルペプチドに作動可能に融合するセレナ ユニカラー（Ｃ. ｕｎｉｃｏｌｏｒ）ラッカーゼＤ ｏｐｔを発現するために作成した。プラスミドをラッカーゼＤ構築体がＮＳＰ‐２４に作動可能に結合され、ＣＢＨ１シグナル配列、触媒部位及びリンカーに結合するラッカーゼＤの代わりに挿入されたこと以外は図１に示すのと同様に構築した。図６はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）発現プラスミドｐＫＢ４０８の図を示す。ポリヌクレオチド配列は配列番号６として示す。
【０１３０】
実施例７．発現ベクターｐＫＢ４１０の構築
トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１シグナル配列をＮＳＰ‐２４シグナルペプチドの代わりに用いる点以外は、ｐＫＢ４１０プラスミドを実施例６に記載のように作成した。図７はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）発現プラスミドｐＫＢ４１０の図を示す。ポリヌクレオチド配列は配列番号７として示す。
【０１３１】
トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）の形質転換及び発現の分析
この実施例において、ＲＬ‐Ｐ３７（Sheir-Neiss and Montenecourt, Appl. Microbiol. Biotechnol., 20:46-53 (1984)を参照願いたい）由来及びBower他 (Bower他、Carbohydrases From Trichoderma reesei and Other Micro-organisms, Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 327-334 (1998)を参照願いたい) によって記載されるｃｂｈｌ、ｃｂｈ２、ｅｇｌｌ、及びｅｇｌ２遺伝子について欠損する安定組み換えトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）菌株を実施例１から１４単独に又は多様な組み合わせにてプラスミドを形質転換するために用いた。遺伝子銃法（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ）及び電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）を下記に記載のようにプラスミドを形質転換するために用いた。
【０１３２】
遺伝子銃形質転換
発現プラスミドをＤＮＡシークエンシングにより確認し、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株へ遺伝子銃を発射することにより形質転換した。遺伝子銃形質転換法によるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株の形質転換を使用説明書（WO 05/001036及びUS Pat. Appl. Publ. No. 2006/0003408を参照願いたい）に従ってＢｉｏｌｉｓｔｉｃ（商標）ＰＤＳ−1000／ｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ (Ｂｉｏ−Ｒａｄ)を用いて実施した。形質転換体を選別し、アセトアミド（ＭＭＡ）を有する最小限の培地プレートへ移し、２８‐３０℃にて４日間培養した。胞子及び菌糸体を含む単一コロニーの小さなプラグを１ｍＭの銅を含有する３０ｍｌのＮＲＥＬ乳糖規定培地（ｐＨ６．２）へ移した。その培地を２８℃にて５日間培養した。培養培地を遠心分離し、上清をラッカーゼ活性に関して下記に記載のようにＡＢＴＳを用いて分析した。
【０１３３】
電気穿孔法
電気穿孔法を米国特許第60/931,072であって、全体を参照により本明細書に取り込まれるが、そこに記載のように実施した。トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）菌株を約１０‐２０日間ジャガイモデキストロース寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ）にて培養し、胞子を形成した。胞子を水でプレートの表面から洗い流しＭｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を通してろ過することにより精製した。胞子を遠心分離（３０００ｘｇ、１２分）により集め、冷水で一回と１．１Ｍソルビトールの冷水で一回洗浄した。胞子の沈殿物を少量の１．１Ｍソルビトール中に再懸濁し、１００μｌの胞子懸濁液当りプラスミドＤＮＡ（ｐＫＢ４０８及びｐＫＢ４１０、図６と７）から単離された約８μｇのゲル精製ＤＮＡフラグメントと混合した。混合物（１００μｌ）を電気穿孔法用キュベット（１ｍｍ ギャップ）に移し、次の電気穿孔法パラメーターを用いて電気パルス処理をした。
電圧 ６０００‐２００００Ｖ／ｃｍ
電気容量＝２５μＦ
抵抗＝５０Ω
電気穿孔法後、胞子を１．１ＭソルビトールとＹＥＰＤ（１％酵母抽出物、２％バクト‐ペプトン（Ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ）、２％グルコース、ｐＨ５．５）の比が５：１の混合液へ約１００倍希釈になるように希釈し、振盪フラスコへ移し、オービタルシェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）（２８℃及び２００ｒｐｍ）にて１６‐１８時間インキュベートした。胞子を再び一回遠心分離により集め、沈殿物の１０倍の体積の１．１Ｍソルビトール中に再懸濁し、ａｍｄＳ改良培地（アセトアミド0.6ｇ/ｌ、塩化セシウム1.68g/ｌ、グルコース20g/ｌ、 リン酸二水素カリウム 15g/ｌ、硫酸マグネシウム 7水和物0.6 g/ｌ、塩化カルシウム ２水和物 0.6 g/ｌ、硫酸鉄（ＩＩ）5mg/ｌ、硫酸亜鉛1.4 mg/ｌ、塩化コバルト（ＩＩ）１mg/ｌ、硫酸マグネシウム（ＩＩ）1.6mg/ｌ、寒天 20g/ｌ及びｐＨ4.25）を含む二つの１５ｃｍペトリ皿上へ移した。形質転換体は２８‐３０℃にて約１週間インキュベーションして現れた。
【０１３４】
ＡＢＴＳアッセイを次のように実施した。
ＡＢＴＳストック液を水に（ＡＢＴＳ；シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログ番号Ａ‐１８８８）４．５ｍＭ ＡＢＴＳを含有するよう調製した。緩衝液を０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．０を含有するよう調製した。そらから１．５ｍｌの緩衝液と０．２ｍｌのＡＢＴＳストック溶液をキュベット（１０ｘ４ｘ４５ｍｍ， Ｎｏ．／ＲＥＦ６７．７４２）に加えよく混合した。余分のキュベットをブランクとして調製した。そらから５０ｕｌの試験すべき（多様な希釈を用いて）各酵素サンプルを混合物へ添加した。
【０１３５】
ＡＢＴＳ活性を次のような（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）ＡＢＴＳ速度論アッセイプログラムセットアップを用いてＧｅｎｅｓｙｓ２装置（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）にて測定した。即ち、
波長４２０ｎｍ、
時間間隔（Ｓｅｃ）２．０、
全実施時間（ｓｅｃ）１４．０、
ファクター１．０００、
下限（ｌｏｗ ｌｉｍｉｔ）−００００００．００、
上限（ｈｉｇｈ ｌｉｍｉｔ）９９９９９９．００、及び
反応オーダー ファースト（ｆｉｒｓｔ）
を用いた。
【０１３６】
方法は１．５ｍＬのＮａＯＡｃ（１２０ｍＭ ＮａＯＡｃ緩衝液ｐＨ５．０）をキュベットに加え、それから０．２ｍＬの４．５ｍＭ ＡＢＴＳをキュベットに添加し、そして、キュベットを隠し、キュベットに０．０５ｍＬの酵素サンプルを添加し、すばやくかつ十分に混合し、最終的に４２０ｎｍ、２秒ごとに１４秒間吸光度の変化を測定する。１ＡＢＴＳユニット（ｕｎｉｔ）を１分当りＡ４２０の変化として規定する（サンプルを希釈していない）。ＡＢＴＳ Ｕ／ｍＬの計算：（Δ４２０／分における変化 * 希釈ファクター）
【０１３７】
実施例９．トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）形質転換体におけるラッカーゼ／グルコアミラーゼ融合遺伝子発現の分析
実施例８に記載のように培養し、得られた形質転換体の培養培地を遠心分離（１６０００ｘｇ、１０分）により菌糸体から分離し、上清からＡＢＴＳ活性を分析した。結果を図１０に示す。表３に図１０に記載の菌株を示す。図１０は完全長トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼにセレナ ユニカラー（Ｃ. ｕｎｉｃｏｌｏｒ）ラッカーゼをコードする遺伝子の融合により改善されるラッカーゼの生産量を示す。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼに融合した場合、ＣＢＨ１に融合した場合より２４−２９％の改善されるラッカーゼの発現を示した。
【表３】
2015027308.tif 000006
【０１３８】
実施例１０．ＮＳＰ２４及び／又はＣＢＨ１シグナル配列を用いるラッカーゼ生産の分析
トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１シグナル配列をラッカーゼ遺伝子に作動可能に結合する場合、図１１（振盪フラスコ）及び図１２（発酵装置）において得られる結果によって示すように振盪フラスコにおいて初めのＣＢＨ１融合菌株＃８‐２に対して発現が４‐５倍改善され、１４リットル発酵装置において５‐６倍改善された。トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）ＮＳＰ‐２４シグナル配列を用いた場合、振盪フラスコにおいて発現は３‐４倍改善され、１４リットル発酵装置において、４‐５倍改善した。振盪フラスコにおいてＣＢＨ１シグナル配列（＃７、＃１０、＃１３）について３つのクローンを分析し、ＮＳＰ２４シグナル配列（＃７及び＃２５）について２つのクローンを分析し、発現を３日（最初のバー）、４日（第二番目のバー）及び５日（三番目のバー）にて分析した。それぞれの単一のクローンを１４リットル発酵装置にて分析し、図１２に結果を示した。この図において、ひし形はラッカーゼＤに作動可能に結合するＮＳＰ２４シグナル配列を示し、四角はラッカーゼＤに作動可能に結合するＣＢＨ１シグナル配列を示し、三角はＣＢＨ１のみの融合を示す。
【０１３９】
実施例１１．発酵装置におけるＣＢＨ１シグナル配列及びｂｉｐ１の共発現を用いるラッカーゼ生産の分析
ＣＢＨ１シグナル配列プラスミド（ラッカーゼに作動可能に結合）をトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｉｐ１プラスミドを用いて同時形質転換し、発現を分析した。結果を図１３に示す。図１３において、ひし形はＣＢＨ１シグナル配列（ラッカーゼに作動可能に結合）プラスＢＩＰ１での得られるデータを示し、一方、四角はＣＢＨ１シグナル配列（ラッカーゼに作動可能に結合）単独での得られるデータを示す。図１３はＣＢＨ１シグナル配列プラスＢＩＰ１シャペロン発現によって与えられるラッカーゼ生産の改善を示し、発酵装置において１５％以上の顕著な発現増加を示す。
【０１４０】
実施例１２．振盪フラスコにおけるＣＢＨ１シグナル配列及びｂｉｐ１の共発現を用いるラッカーゼ生産の分析
ＣＢＨ１シグナル配列プラスミド（作動可能に結合ラッカーゼ）をトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）ｂｉｐ１プラスミドを用いて同時形質転換し、増殖させ、ラッカーゼ発現をＡＢＴＳアッセイを用いて分析した。結果を図１４に示す。５つの異なるクローンを３日（一番目のバー）、４日（二番目のバー）、及び５日（三番目のバー）間分析した。ＫＢ４１０−１３はＣＢＨ１シグナル配列プラスミドを単独に有するコントロールであった。他の４つのクローンは次のｂｉｐ１の一つと同時形質転換を伴うＫＢ４１０−１３であった。それはＥ３２、Ｅ９、Ｅ１６、及びＥ１０である。図１４は振盪フラスコにおいてセレナ ユニカラー（Ｃ. ｕｎｉｃｏｌｏｒ）を伴うシャペロンの共発現によりラッカーゼ生産の改善を示す。
【０１４１】
実施例１３．ＣＢＨ１‐ラッカーゼＤ融合及び多様なシャペロンの共発現を用いるラッカーゼ生産の分析
ＣＢＨ１シグナル配列、触媒部位及びラッカーゼに作動可能に結合するリンカーを有する発現プラスミドを多様なトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）シャペロンプラスミド（ＢＩＰ１、ＰＯＩ１、ＥＲＯ１）と同時形質転換した。得られた形質転換細胞を培地にて増殖させ、ラッカーゼ発現を分析した。図１５はセレナ ユニカラー（Ｃ. ｕｎｉｃｏｌｏｒ）ラッカーゼをコードする遺伝子をＣＢＨ１シグナル配列、触媒部位、及びリンカーに融合させｂｉｐ１、ｐｄｉ１及びｅｒｏ１シャペロンと共発現することによりラッカーゼ生産の改善を示す。
【０１４２】
すべての菌株はＣＢＨ１シグナル配列、触媒部位及びラッカーゼＤに作動可能に結合するリンカーを有した。菌株１Ｂ１、１Ｂ１２、及び１Ｂ１９はｂｉｐ１発現カセットを有した。それらは、３つの独立した形質転換体であって、ｂｉｐ１プラスミドコピー数、組み換えの位置が異なった。菌株３Ｂ２及び３Ｂ８はｐｄｉ１発現カセットを有した。それらは、２つの独立した形質転換体であって、ｐｄｉ１プラスミドコピー数、組み換えの位置が異なった。菌株９Ｂ６及び９Ｂ７はｅｒｏ１発現カセットを有した。それらは、２つの独立した形質転換体であって、ｅｒｏ１プラスミドコピー数が異なり、組み換えの位置が異なってよい。＃８‐２はコントロール菌株であり、シャペロン発現カセットを有していない。
【０１４３】
図１５の結果は発現で最も高い増加はｂｉｐ１シャペロンと共発現を伴うものから得られた。
【０１４４】
実施例１４．ＣＢＨ１シグナル配列及び多様なシャペロンの共発現を用いるラッカーゼ生産の分析
ＣＢＨ１シグナル配列プラスミド（言い換えると、ラッカーゼに作動可能に結合）を多様なトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）シャペロンプラスミド（ｂｉｐｌ、ｌｈｓｌ、ｐｄｉｌ、ｐｐｉ１、ｐｐｉ２、ｔｉｇｌ、ｐｒｐｌ、及びｅｒｏｌ）単独又は組み合わせのいずれかと同時に形質転換した。培養物を周知のように振盪フラスコにおいて増殖させ、ラッカーゼ発現をＡＢＴＳアッセイを用いて分析した。クローンを３通り分析した。表４から得られるデータは二以上のシャペロンの添加はｂｉｐｌ単独の場合以上のラッカーゼの発現増加を示さなかった。表４のデータは同じ菌株由来３つの独立した胞子精製サンプル（又はクローン）を示す。
【表４】
2015027308.tif 000007
【０１４５】
本発明及びそれを作りかつ使用する態様と工程は十分な、明確な、簡潔な、及び正確な用語においてここに記載されるので、当業者は同様のものを作りかつ使用することができる。前述の好ましい本発明の実施態様は特許請求の範囲に記載の範囲を逸脱せず、本明細書に記載されている改変は特許請求の範囲に記載の範囲を逸脱しないことは理解される。発明に関する対象要件を特に指摘し、明確に請求するために、以下に述べる特許請求の範囲により本明細書を終わる。
【図１】
2015027308.tif 000008
【図２】
2015027308.tif 000009
【図３】
2015027308.tif 000010
【図４】
2015027308.tif 000011
【図５】
2015027308.tif 000012
【図６】
2015027308.tif 000013
【図７】
2015027308.tif 000014
【図８−１】
2015027308.tif 000015
【図８−２】
2015027308.tif 000016
【図８−３】
2015027308.tif 000017
【図８−４】
2015027308.tif 000018
【図９−１】
2015027308.tif 000019
【図９−２】
2015027308.tif 000020
【図１０】
2015027308.tif 000021
【図１１】
2015027308.tif 000022
【図１２】
2015027308.tif 000023
【図１３】
2015027308.tif 000024
【図１４】
2015027308.tif 000025
【図１５】
2015027308.tif 000026
【配列表】
2015027308000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年10月28日(2014.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラッカーゼを生産する方法であって、
（ａ）ラッカーゼをコードする核酸配列に作動可能に結合するシグナル配列を含む第一核酸配列を宿主細胞へ導入する段階であり、前記シグナル配列がセロビオヒドロラーゼＩシグナルペプチド又はＮＳＰ２４シグナルペプチドをコードするように設けられる段階、
（ｂ）第一核酸配列を発現する段階、
（ｃ）ｐｄｉ１、ｔｉｇ１、ｐｒｐ１、ｐｐｉ１、ｐｐｉ２、ｐｒｐ３、ｐｒｐ４、カルネキシン（ｃａｌｎｅｘｉｎ）、及びｌｈｓ１からなる群から選択されるシャペロン又はフォールダーゼをコードする第二核酸配列を共発現する段階、及び
（ｄ）前記宿主細胞から分泌される前記ラッカーゼを集める段階、
を含む方法。
【請求項２】
さらに前記第一核酸配列が前記シグナル配列とラッカーゼ配列の間に酵素配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素配列がグルコアミラーゼから又はＣＢＨ１酵素から得られることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素配列が完全長の酵素配列を含むことを特徴とする請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素配列が触媒コア部位配列を含むことを特徴とする請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
さらに前記第一核酸配列が前記触媒コア部位配列と前記ラッカーゼ配列の間にリンカー配列を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ラッカーゼが糸状菌又は酵母由来であることを特徴とする請求項１から６のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項８】
前記ラッカーゼがアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、コリビア（Ｃｏｌｌｙｂｉａ）、セレナ（Ｃｅｒｒｅｎａ）、スタキボトリス（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）、パヌス（Ｐａｎｕｓ）、チエイラバ（Ｔｈｉｅｉｌａｖａ）、フォメス（Ｆｏｍｅｓ）、レンチヌス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ）、プレウロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、プサチレラ（Ｐｓａｔｙｒｅｌｌａ）、ミセリオフィソーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、シタリジウム（Ｓｃｈｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、スポンギスペリス（Ｓｐｏｎｇｉｐｅｌｌｉｓ）、ポリポルス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）、セリポリオプシス  サブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、ガノデルマ  ツノダエ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｔｓｕｎｏｄａｅ）、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ラッカーゼがセレナ（Ｃｅｒｒｅｎａ）ラッカーゼＡ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｃ、Ｄ１、Ｄ２、又はＥ由来であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ラッカーゼが配列番号４５のセレナ（Ｃｅｒｒｅｎａ）ラッカーゼＤの成熟タンパク質由来であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が糸状菌細胞であることを特徴とする請求項１から１０のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞が子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）の細胞であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞がトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
さらに前記第一核酸配列がシグナル配列の上流にプロモーターを含むことを特徴とする請求項１から１３のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項１５】
前記プロモーターが前記宿主細胞に本来存在し、前記ラッカーゼ配列と自然には結合しないことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二核酸配列がプロモーターに作動可能に結合することを特徴とする請求項１から１５のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項１７】
前記プロモーターが宿主細胞に本来存在し、前記第二核酸配列と自然には結合しないことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ラッカーゼが酵素を有する融合蛋白質として生産されることを特徴とする請求項２から１７のいずれかひとつに記載の方法。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれかひとつに記載の方法により生産されるラッカーゼ。
【請求項２０】
請求項１９に記載のラッカーゼを含む組成物。
【請求項２１】
所望のタンパク質を生産するための方法であって、
（ａ）所望のタンパク質配列に作動可能に結合するシグナル配列を含む第一核酸配列を宿主細胞へ導入する段階、
（ｂ）第一核酸配列を発現する段階、
（ｃ）ｐｄｉ１、ｔｉｇ１、ｐｒｐ１、ｐｐｉ１、ｐｐｉ２、ｐｒｐ３、ｐｒｐ４、カルネキシン（ｃａｌｎｅｘｉｎ）、及びｌｈｓ１からなる群から選択されるシャペロン又はフォールダーゼをコードする第二核酸配列を共発現する段階、及び
（ｄ）前記宿主細胞から分泌される前記所望のタンパク質を集める段階、
を含む方法。
【請求項２２】
さらに前記第一核酸配列が前記シグナル配列と前記所望のタンパク質配列の間に酵素配列を含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記酵素配列がグルコアミラーゼから又はＣＢＨ１酵素から得られることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記酵素配列が完全長の酵素配列を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記酵素配列が触媒コア部位配列を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
さらに前記第一核酸配列が前記触媒コア部位配列と前記所望のタンパク質配列の間にリンカー配列を含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記シグナル配列がセロビオヒドロラーゼＩシグナルペプチド又はＮＳＰ２４シグナルペプチドをコードすることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞が糸状菌細胞であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記宿主細胞が子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）の細胞であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記宿主細胞がトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
さらに前記第一核酸配列がシグナル配列の上流にプロモーターを含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記プロモーターが前記宿主細胞に本来存在し、前記所望のタンパク質配列と自然には結合しないことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第二核酸配列がプロモーターに作動可能に結合することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
前記プロモーターが宿主細胞に本来存在し、前記第二核酸配列と自然には結合しないことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記所望のタンパク質が酵素を有する融合蛋白質として生産されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。