(57)【要約】【課題】インジェクション可能で、かつ骨再生能の高い骨再生材料を提供すること。【解決手段】本発明の骨再生用材料は、第８リン酸カルシウムと、前記ヒアルロン酸又はその塩とを含む。【選択図】図１
2015054054.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第８リン酸カルシウムと、ヒアルロン酸又はその塩とを含む骨再生用材料。
【請求項２】
第８リン酸カルシウムが前記ヒアルロン酸又はその塩のゲル又はペースト１ｍｌに対して５ｍｇ〜５０００ｍｇであり、骨再生用材料におけるヒアルロン酸又はその塩の濃度が０．１〜２ｍｇ／ｍｌである請求項１に記載の骨再生用材料。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸又はその塩が平均分子量が約2500kDa以下の架橋処理しないヒアルロン酸ナトリウム、又は架橋処理したヒアルロン酸ナトリウムである請求項１又は２に記載の骨再生用材料。
【請求項４】
骨再生治療のための、第８リン酸カルシウムの結晶とヒアルロン酸又はその塩との組み合わせ。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸又はその塩が平均分子量が約2500kDa以下の架橋処理しないヒアルロン酸ナトリウム、又は架橋処理したヒアルロン酸ナトリウムである請求項４に記載の組み合わせ。
【請求項６】
前記ヒアルロン酸又はその塩の平均分子量が、約900kDa、約1900kDa、又は約6000kDaである請求項４に記載の組み合わせ。
【請求項７】
第８リン酸カルシウムの結晶が前記ヒアルロン酸又はその塩のゲル又はペースト１ｍｌに対して５ｍｇ〜５０００ｍｇで分散され、第８リン酸カルシウムの結晶及び前記ヒアルロン酸又はその塩を含有する組成物における前記ヒアルロン酸又はその塩の濃度が０．１〜２ｍｇ／ｍｌである請求項４に記載の組み合わせ。
【請求項８】
骨再生治療のための、第８リン酸カルシウムを含有するヒアルロン酸製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨再生材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨欠損の治療において、従来の侵襲的な自家骨を用いた骨移植に代わって、人工骨を用いた治療がますます行なわれるようになっている。人工骨材としては、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2、以下ＨＡ）やβ型のリン酸三カルシウム（β−TCP）の焼結タイプのセラミックスや、リン酸カルシウムペーストが既に開発され国内外で実用化されている。ペーストタイプとしては、α型リン酸三カルシウム（α−TCP）や第２リン酸カルシウム２水和物（ＣａＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、以下ＤＣＰＤ）等を出発原料として骨ミネラルのＨＡに近いＨＡを形成させるＨＡセメントが主流である。
【０００３】
本願発明者らは、人工骨材の材料の中でも特に、ＨＡの前駆体である第８リン酸カルシウム（Ｃａ8Ｈ2（ＰＯ4）6・５Ｈ2Ｏ）、以下ＯＣＰ）に着目し、以前の研究により、ＯＣＰは生体内でＨＡに自然に転換するが、100%ＯＣＰから100%ＨＡに一方向に自己組織化して高い骨再生を示すことを初めて証明すると共に（非特許文献１）、ＯＣＰの結晶相を出発材料とするＯＣＰ顆粒、ＯＣＰとコラーゲンの複合体又はＯＣＰとゼラチンの複合体が優れた骨再生能を有することも証明している（非特許文献１，２及び３）。
【０００４】
しかしながら、従来のＯＣＰをベースとする人工骨材は固形物であり、骨欠損の形態に十分にフィットして充填することができなかった。
【０００５】
一方で、ヒアルロン酸（ＨｙＡ）はＤ-グルクロン酸とN-アセチルグルコサミンの交互の繰り返しからなる硫酸基を含まないグルコサミノグリカンの比較的分子量が高い天然の直鎖状重合体であり、関節軟骨など生体の結合組織の大部分に関与する細胞外マトリックスの分子である。医薬品や化粧品等にはヒアルロン酸ナトリウムの形で配合されており、変形性関節炎等の骨関連疾患におけるＨｙＡゲルの有用性の評価が報告されている。
【０００６】
最近の研究で、本願発明者らはＯＣＰ顆粒とＨｙＡ（具体的にはヒアルロン酸ナトリウム）との複合体を製造し、マウスの頭蓋冠にポリテトラフルオロエチレンリングを配置し、該リングの中にＯＣＰ顆粒とＨｙＡの複合体を入れて６週間移植した場合に、ＨｙＡによりＯＣＰ顆粒にインジェクタブルすなわち注射可能な特性を与えると共に、組織学的調査により、ＯＣＰ顆粒が骨マトリックスに包囲されておりＨｙＡがＯＣＰ顆粒の骨伝導能を損なわないことを見出した（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Suzuki O et al., Biomaterials 2006;27:2671-81
【非特許文献２】Kamakura S, J Biomed Mater Res A 2007;83:725-33
【非特許文献３】Handa T et al., Acta Biomaterialia 2012;8:1190-00
【非特許文献４】Bannuru RR., Arthritis Rheum 2009;61:1704-11
【非特許文献５】Suzuki K et al., Key Engineering Materials Vols. 2013;529-530;296-299
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記の組織学的調査では、ＯＣＰによる骨形成に対するＨｙＡの生物学的重要性が未だ不明であった。また、ＯＣＰに対しどのような態様のＨｙＡが効果的に作用するかも不明であった。
【０００９】
本発明は、ＯＣＰとＨｙＡとを複合化してできる、欠損形態にかかわらず適用部位の形状に適合して充填できるインジェクタブルタイプの骨再生材料であって、骨再生を効果的に促進する新規な骨再生材料を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意研究した結果、ＯＣＰとＨｙＡとを複合化したところ、欠損形態にかかわらず、適用部位に隙間なく充填できるインジェクタブルタイプの骨再生材料にでき、しかも、予想外なことに、ＯＣＰとＨｙＡの複合体はＯＣＰ単独又はＨｙＡ単独と比較して高い相乗効果により、骨再生を促進することを見出した。
【００１１】
本発明は、かかる新規の知見に基づくものである。
【００１２】
従って、本発明は、以下の項を提供する：
項１．第８リン酸カルシウムと、ヒアルロン酸又はその塩とを含む骨再生用材料。
【００１３】
項２．第８リン酸カルシウムが前記ヒアルロン酸又はその塩のゲル又はペースト１ｍｌに対して５ｍｇ〜５０００ｍｇであり、骨再生用材料におけるヒアルロン酸又はその塩の濃度が０．１〜２ｍｇ／ｍｌである項１に記載の骨再生用材料。
【００１４】
項３．前記ヒアルロン酸又はその塩が平均分子量が約2500kDa以下の架橋処理しないヒアルロン酸ナトリウム、又は架橋処理したヒアルロン酸ナトリウムである項１又は２に記載の骨再生用材料。
【００１５】
項４．骨再生治療のための、第８リン酸カルシウムの結晶とヒアルロン酸又はその塩との組み合わせ。
【００１６】
項５．前記ヒアルロン酸又はその塩が平均分子量が約2500kDa以下の架橋処理しないヒアルロン酸ナトリウム、又は架橋処理したヒアルロン酸ナトリウムである項４に記載の組み合わせ。
【００１７】
項６．前記ヒアルロン酸又はその塩の平均分子量が、約900kDa、約1900kDa、又は約6000kDaである項４に記載の組み合わせ。
【００１８】
項７．第８リン酸カルシウムの結晶が前記ヒアルロン酸又はその塩のゲル又はペースト１ｍｌに対して５ｍｇ〜５０００ｍｇで分散され、第８リン酸カルシウムの結晶及び前記ヒアルロン酸又はその塩を含有する組成物における前記ヒアルロン酸又はその塩の濃度が０．１〜２ｍｇ／ｍｌである項４に記載の組み合わせ。
【００１９】
項８．骨再生治療のための、第８リン酸カルシウムを含有するヒアルロン酸製剤。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ＯＣＰをＨｙＡと複合化することで、骨欠損の形態によらず使用できる複合体が製造できるので、無機セラミックス材料であるＯＣＰの操作性を向上させることが可能である。かかる液状の複合体は注射器でインジェクションすなわち注射が可能であるため、手術においてインプラント（移植物）の操作時間短縮が可能で、それゆえ侵襲性も低くできる利点もあり、整形外科及び歯科等、骨再生を必要とする分野で、広範な部位の骨再生治療への適用が期待できる。さらに、ＯＣＰとＨｙＡの組み合わせは、骨再生の相乗効果があるため、骨再生の治療にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】（Ａ）篩い分けしたＯＣＰ顆粒 (300-500μm)の写真、(Ｂ)インジェクタブル（注射可能）なＯＣＰ／ＨｙＡ複合材の写真、（Ｃ）実験動物モデルの写真、及び（Ｄ）実験系の略図。
【図２】（Ａ）ＯＣＰ及びＯＣＰ／ＨｙＡ９０複合材のXRDパターン、（Ｂ）ＯＣＰ及びＯＣＰ／ＨｙＡ複合材のFTIRスペクトル、（Ｃ）ＯＣＰの走査型電子顕微鏡写真、及び（Ｄ）ＯＣＰ／ＨｙＡ９０複合材の走査型電子顕微鏡写真。（Ａ）の星印(*)は2θ=4.9°における(100)XRDピークを示し、（Ｂ）の矢印(↓)は特性1,030-1,130cm-1付近のオルトリン酸伸縮吸着のｖ3 P-Oに由来する3つの異なる特徴的バンドを表す。（Ｃ）（Ｄ）中のバーは5μmである。
【図３】ヘマトキシリン-エオシンで染色した切片の写真。（Ａ）−（Ｄ）及び（Ｉ）−（Ｌ）頭蓋冠周囲の写真、（Ｅ）−（Ｈ）及び（Ｍ）−（Ｐ）頭蓋冠周囲の拡大写真。Ａ及びＥは3週目、Ｉ及びＭは6週目のＯＣＰ顆粒、Ｂ及びＦは3週目、Ｊ及びＮは6週目のＯＣＰ／ＨｙＡ９０、Ｃ及びＧは3週目、Ｋ及びＯは6週目のＯＣＰ／ＨｙＡ１９０、Ｄ及びＨは3週目、Ｌ及びＰは6週目のＯＣＰ／ＨｙＡ６００。文字(Ｃ),(Ｂ)及び(*)はそれぞれマウス頭蓋冠、新しく生成した骨、及びＯＣＰ顆粒を表す。バーは 図３Ａ−Ｄ、Ｉ−Ｌで1mm、図３Ｅ−Ｈ、Ｍ−Ｐで200μm。
【図４】図３に続く、ヘマトキシリン-エオシンで染色した切片の、インプラント周囲における拡大写真。Ｑは3週目、Ｕは6週目のＯＣＰ顆粒、Ｒは3週目、Ｖは6週目のＯＣＰ／ＨｙＡ９０、Ｓは3週目、Ｗは6週目のＯＣＰ／ＨｙＡ１９０、Ｔは3週目、Ｘは6週目のＯＣＰ／ＨｙＡ６００。文字(B),(*),(V)及び (HyA)はそれぞれ新しく生成した骨、ＯＣＰ顆粒、血管及びＨｙＡゲルを表す。バーは図4Q-Xで100μm。
【図５】ＯＣＰ／ＨｙＡ６００移植群のアルシアンブルーで染色した切片の写真及び拡大写真。（Ａ）及び（Ｃ）移植後3週目、（Ｂ）及び（Ｄ）移植後6週目。文字(*)及び(HyA)はそれぞれＯＣＰ顆粒及びＨｙＡゲルを表す。バーは(Ａ)と(Ｃ)で1mm、(Ｂ)と(Ｄ)で75μm。
【図６】3週目のＴＲＡＰ及びＡＬＰ染色。（Ａ）リングのみの対照、(Ｂ)ＯＣＰ顆粒無しのＨｙＡ９０、（Ｃ）ＯＣＰ顆粒無しのＨｙＡ１９０、（Ｄ）ＯＣＰ顆粒無しのＨｙＡ６００、(Ｅ)リング及びＯＣＰ顆粒があるがＨｙＡ無しの対照、（Ｆ）ＯＣＰ顆粒有りのＨｙＡ９０、（Ｇ）ＯＣＰ顆粒有りのＨｙＡ１９０、(Ｈ) ＯＣＰ顆粒有りのＨｙＡ６００。星印(*)、矢頭(▲)、矢印(→)及び文字(HyA)はそれぞれＯＣＰ顆粒、ＴＲＡＰ陽性細胞、ＡＬＰ陽性細胞及びＨｙＡゲルを表す。バーは250μm。
【図７】6週目のＴＲＡＰ及びＡＬＰ染色。(Ｉ）リングのみの対照、（Ｊ）ＯＣＰ顆粒無しのＨｙＡ９０ 、（Ｋ）ＯＣＰ顆粒無しのＨｙＡ１９０ 、（Ｌ）ＯＣＰ顆粒無しのＨｙＡ６００、(Ｍ)リング及びＯＣＰ顆粒が有るがＨｙＡ無しの対照。（Ｎ）ＯＣＰ顆粒有りのＨｙＡ９０、(Ｏ) ＯＣＰ顆粒有りのＨｙＡ１９０、(Ｐ) ＯＣＰ顆粒有りのＨｙＡ６００。星印(*)、矢頭(▲)、矢印(→)及び文字(HyA)はそれぞれＯＣＰ顆粒、ＴＲＡＰ陽性細胞、ＡＬＰ陽性細胞及びＨｙＡゲルを表す。バーは250μm。
【図８】6週目の切片のオステオカルシン免疫染色。(Ａ)リングのみの対照、(Ｂ)ＯＣＰ顆粒無しのＨｙＡ９０、（Ｃ）ＯＣＰ顆粒無しのＨｙＡ１９０、（Ｄ）ＯＣＰ顆粒無しのＨｙＡ６００、（Ｅ）リング及びＯＣＰ顆粒が有るがＨｙＡ無しの対照、（Ｆ）ＯＣＰ顆粒有りのＨｙＡ９０、（Ｇ）ＯＣＰ顆粒有りのＨｙＡ１９０、(Ｈ) ＯＣＰ顆粒有りのＨｙＡ６００。星印(*)、矢印(→)、文字（B）及び文字(HyA)はそれぞれＯＣＰ顆粒、オステオカルシン陽性細胞、新たに形成された骨、及びＨｙＡゲルを表す。(Ｉ,Ｊ,Ｋ，Ｌ)は、一次抗体を用いたＯＣＰ+群（Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ）に対応する、一次抗体を用いなかったＯＣＰ群。バーは25μm。
【図９】ＯＣＰ/ＨｙＡ複合材料及び残存インプラントによる骨形成の組織形態学的分析。(Ａ) 複合体、ＯＣＰ及び対照の新たな骨の形成の面積率。(Ｂ) 残存インプラントの面積率。(Ｃ) ＨｙＡ、ＯＣＰ及び対照の新たな骨の形成の面積率。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書において、略語「ＨｙＡ」は、ヒアルロン酸又はその塩を指し、組成物又は製剤で用いられている場合には通常、ヒアルロン酸の塩を指す。ヒアルロン酸の塩は、好ましくは医薬として許容される塩である。ヒアルロン酸の塩にはヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、及びアンモニウムなどが含まれるがこれらに限定されない。本発明の目的では、ヒアルロン酸ナトリウムが特に好ましい。
【００２３】
本発明の骨再生材料は、第８リン酸カルシウム（octacalcium phosphate、（Ｃａ8Ｈ2（ＰＯ4）6・５Ｈ2Ｏ）、以下ＯＣＰ）と、ヒアルロン酸またはその塩（ＨｙＡ）との複合体（以下、ＯＣＰ／ＨｙＡ材料と記載する場合がある）を含む。なお、「ＯＣＰ／ＨｙＡ複合体」、「ＯＣＰ／ＨｙＡ材料」、「ＯＣＰとＨｙＡとの複合体」、「ＯＣＰ及びＨｙＡを含む混合物」、及び「ＯＣＰ及びＨｙＡを含有する組成物」は互換的に使用可能であるものとする。
【００２４】
ＯＣＰ／ＨｙＡ材料は、ゲル状又はペースト状のＨｙＡに、主成分としてのＯＣＰの結晶を分散させた組成物である。ＯＣＰの結晶の凝集体からなる顆粒は予め市販の篩い分け手段により大きさを揃えてもよい。篩い分けられたＯＣＰ顆粒の直径（粒径）は特に限定されないが、通常400nm〜1,000μm、好ましくは300μm〜500μmである(K Miura et al., Applied Surface Science 2013; 282: 138-145及びY Murakami et al., Acta Biomaterialia 6 2010; 1542-1548参照)。
【００２５】
ＯＣＰの結晶の製造方法は限定されないが、例えばＯＣＰの結晶はSuzuki O et al., Tohoku J Exp Med 1991; 164:37-50、Honda Y et al, Journal of Biomedical Materials Research 2007; Part B; Volume 80B:281-289、特開2006-167445 及び特許3115642に記載に基づいて作製可能である。
【００２６】
ＨｙＡは、公知の製造方法により製造してもよいし、市販のヒアルロン酸ナトリウムであってもよい。また、ＨｙＡは直鎖状であっても、少なくとも一部を化学的に架橋したものであってもよい。
【００２７】
例えば、ＨｙＡの供給源として使用可能な市販のヒアルロン酸製剤の例として、Artz（登録商標）、Suvenyl（登録商標）及びSynvisc（登録商標）などが挙げられ、Artz（登録商標）は架橋処理しない直鎖状の平均分子量（重量平均分子量を指す、以下同様）500〜1200kDaのヒアルロン酸ナトリウムを１％含む製剤、Suvenyl（登録商標）は架橋処理しない平均分子量約1900kDaのヒアルロン酸ナトリウムを製剤2.5mL中に25mg含む製剤、Synvisc（登録商標）は製剤2mL中にヒアルロン酸ナトリウム架橋処理ポリマー14.4mg及びヒアルロン酸ナトリウム架橋処理ポリマービニルスルホン架橋体1.6mg（平均分子量6000 kDa）を含有する製剤である。
【００２８】
ＨｙＡの分子量は通常、平均分子量で約400kDa(40万)〜10000kDa(1000万)である。一実施形態では、ＨｙＡは平均分子量が約2500kDa以下の架橋処理しないヒアルロン酸ナトリウムであり、別の実施形態では、ＨｙＡは架橋処理したヒアルロン酸ナトリウムである。さらに別の実施形態では、ＨｙＡは平均分子量が約900kDa、約1900kDa、及び約6000kDaのいずれかのＨｙＡである。
【００２９】
ＯＣＰとＨｙＡとの割合は特に限定されないが、通常、質量比で、ＨｙＡゲル又はペースト１ｍｌに対してＯＣＰが５ｍｇ〜５０００ｍｇ、より好ましくは２０ｍｇ〜１０００ｍｇ、さらにより好ましくは５０〜５００ｍｇ、最も好ましくは約１００ｍｇである。ＨｙＡ  １ｍｌに対してＯＣＰが５ｍｇ未満であると、得られる骨再生材料の骨再生能が劣り、５０００mgを超えると、形状付与性が低下する。
【００３０】
ＯＣＰ／ＨｙＡ材料におけるＨｙＡ濃度は特に限定されないが、通常０．１〜２ｍｇ／ｍｌである。
【００３１】
ＯＣＰ／ＨｙＡ材料の製造方法は特には限定されないが、例えば市販のＨｙＡ製剤などのＨｙＡゲルにＯＣＰ結晶又はＯＣＰ結晶を篩分けした顆粒を加え、混合するだけで製造可能である。
【００３２】
骨再生材料は、本発明の効果が阻害されない範囲内で、一般的に人工骨再生材料に含まれる成分を含んでいてもよい。このような成分としては、例えば、生体吸収性高分子（ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール共重合体など）、生体吸収性リン酸カルシウム（β−ＴＣＰなど）、生体非吸収性材料（ＨＡセラミックスなど）、及び添加剤（アミノ酸、リン酸水素ナトリウム水和物、リン酸二水素ナトリウム、又は塩化ナトリウムなど）が挙げられる。
【００３３】
本発明の骨再生材料は、使用時はゲル状又はペースト状であるため、欠損形態にかかわらず適用部位の種々の形状及び／又はサイズに適合して充填できるので、複雑な欠損部又は損傷部であっても容易に治療でき、無機セラミックス材料であるＯＣＰの操作性を向上させることが可能である。また、かかる液状の複合体は注射器でインジェクションすなわち注射が可能であるため、手術においてインプラント（移植物）の操作時間短縮が可能で、それゆえ侵襲性も低くできる。なお、本発明の骨再生材料は流動性があるため、適用部位以外の箇所への移動を防ぐため、医療用のプラスチック材料やシート等で適用部位の周囲を包囲してもよい。
【００３４】
骨再生材料は、適用部位への適用に先立って、放射線滅菌、高圧蒸気滅菌、乾燥加熱処理などにより滅菌処理されてもよい。
【００３５】
本発明の骨再生材料が適用される対象は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ヒト等であり、好ましくはヒトに適用される。
かかる骨再生材料を移植することにより、対象動物における骨の再生が促進され、種々の骨の損傷又は骨関連疾患の治療に有効である。
【００３６】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例
１．材料及び方法
１．１．ＯＣＰ及びＯＣＰ/ＨｙＡ複合体
ＯＣＰは以前の記載（Suzuki O, et al., Tohoku J Exp Med 1991; 164:37-50）の通りにカルシウム溶液とリン酸塩溶液を混合することにより調製した。ＯＣＰ結晶凝集物からなる顆粒を、ＯＣＰ沈殿物を標準試験用篩いに通過させることにより調製した。300μmから500μmまでの範囲の直径の顆粒を使用した (図１Ａ)。篩い分けたＯＣＰ顆粒を120℃で2時間、加熱滅菌した。３種類の医療グレードの高分子量ヒアルロン酸（ＨｙＡ）であるＨｙＡ９０(Artz（登録商標），MW=500-1200kDa)、ＨｙＡ１９０(Suvenyl（登録商標），MW=1900kDa)及び化学的に架橋したＨｙＡ６００(Synvisc（登録商標），MW=6000kDa))を、生化学工業株式会社、 (日本国東京)、中外製薬株式会社(日本国東京)及びGenzyme Biosurgery社(米国マサチューセッツ州Cambridge)からそれぞれ購入した。ＯＣＰ顆粒(100mg)を1mlの各ＨｙＡゲルに加え、混合した(図１Ｂ)。
１．２．ＯＣＰ/ＨｙＡゲルの特性化（キャラクタリゼーション）
室温で乾燥させた後のＯＣＰ/ＨｙＡゲル及びＯＣＰを、XRDにより特性化した。XRDパターンは、30kV及び15mAの回折計(MiniFlex; 理学電機株式会社、日本国、東京)でCu KαX線を用いて3.0°から60.0°まで0.05°間隔でのステップ走査法により記録した。測定された2θ範囲は、4.7°でＯＣＰの主要なピーク(100)を含んでいた。結晶相を識別するために、ＯＣＰに対しては26-1056A9、ＨｙＡに対しては9-432の粉末回折標準に関する合同委員会（JCPDS)の番号を使用した。臭化カリウムで希釈したサンプルに対し、複合体のFTIRスペクトルを4cm-1の分解能で4,000-400cm-1の範囲にわたりFTIR分光法により得た(FREEXACT-2、株式会社堀場製作所、日本国京都)。ＯＣＰ及びＯＣＰ/ＨｙＡの形態を10kVの加速電圧で作動するJEOL分析走査電子顕微鏡JSM-6390LA(日本国東京)を使用して調べた。金のスパッタリングを観察前に行った。ＨｙＡ溶液の粘度は電磁回転式粘度計（京都電子工業株式会社、日本国京都)を使用して測定した。
１．３  実験動物モデル
重量30-36gの8週齢の雄ICRマウス（日本エスエルシー株式会社、日本国静岡県浜松市）を使用した。実験動物の管理及び使用の原則及び国内法を遵守した。すべての手順は東北大学の動物実験委員会で承認されたものである。実験マウスを、ペントバルビタールナトリウム(50mg/kg)の腹腔内注射で麻酔し、エーテル吸入を補った。マウスが痛みを感じた場合には、手術中にエーテル吸入を施した。頭蓋冠の皮膚及び骨膜を注意深く除去し、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)製のリング(内径6mm、厚さ1mm)を医療用組織接着剤(アロンアルファＡ、第一三共株式会社、日本国東京)を用いて縫合を横切って頭蓋冠の中心に配置した。図１Ｃ及びＤに示すように、頭蓋冠（１）にPTFEリング（２）を配置した後、ＯＣＰ/ＨｙＡ複合体（３）を14Gポリマーカテーテルを取り付けた注射器（４）を使用して注射した。次に、注射したＯＣＰ/ＨｙＡ複合体（５）の流出を防ぐために、リング（２）を医療用組織接着剤を用いて直径8mm 、100μm厚のPTFEシート（６）で被覆した(図１Ｄ)。マウスは、3週目及び6週目(それぞれ6匹のマウス)に過剰量の麻酔薬(ペントバルビタールナトリウム、200mg/kg)を腹腔内に投与して安楽死させた。したがって、ＯＣＰ顆粒、ＯＣＰ/ＨｙＡ複合材料、及びPTFE(未処理)群の各々の12匹のマウスを、組織形態学的検査のために準備した。
１．４．組織標本及び組織形態学的分析
頭蓋冠を切除し、4%パラホルムアルデヒドの0.1Mリン酸緩衝液(PBS)で4℃で一晩維持した。固定した試験片を10%EDTA の0.01M PBS（pH 7.4）で4℃で2週間脱灰した。その後、サンプルを段階的な一連のエタノールで脱水し、パラフィン包埋した。厚さ4μmの連続切片を冠状に切断し、光学顕微鏡観察のためにヘマトキシリン−エオシン(HE)及びアルシアンブルーで染色した。また、画像は顕微鏡写真機(ライカDFC300 FX、ライカマイクロシステムズ株式会社、日本国東京)を使用して取得した。HEで染色された切片の光学顕微鏡写真は組織形態学的測定に使用した。新たに形成された骨の面積率は、新たに形成された骨の面積を合計移植面積で割った値として計算した。同様に、欠損中の残存インプラントの割合は、残存インプラントの面積を合計面積で割った値として計算した。面積率は、Adobe Photoshop Elements 8及びImage J 1.45(NIH Image、米国メリーランド州Bethesda)を使用してコンピュータで定量した。
１．５． 酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(ＴＲＡＰ)及びアルカリフォスファターゼ(ＡＬＰ)による二重染色法
組織切片の酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(ＴＲＡＰ)及びアルカリフォスファターゼ(ＡＬＰ)を、ＴＲＡＰ/ＡＬＰ二重染色キット(和光純薬工業株式会社、コード番号294-67001、日本国大阪)により評価した。切片を30分間ＴＲＡＰバッファに浸漬し、蒸留水で洗浄した後、2-アミノ-2-メチルプロパン-1,3-ジオールで10分間浸漬し、次にＡＬＰバッファで30分間インキュベートした。対比染色はヘマトキシリンを用いて行った。
１．６． オステオカルシン
脱パラフィン化後、内因性ペルオキシダーゼ活性を除去するために連続切片を3%(体積比)のH2O2でインキュベートし、10%正常ヤギ血清(ヒストファインブロッキング試薬、株式会社ニチレイバイオサイエンス、日本国東京)でブロッキングした。調製したスライドをオステオカルシンの一次抗体(タカラバイオ株式会社、コード番号M188 R21C-01A、希釈率1:400)で4℃で一晩インキュベートし、これを、アミノ酸ポリマーとペルオキシダーゼ及びヤギ抗ラットIgG(Simple Stain Mouse MAX PO(RAT)、コード番号414311F、Histofine（登録商標）免疫組織染色試薬、株式会社ニチレイバイオサイエンス、日本国東京)と組み合せせることにより調製されたポリマーと共にインキュベートした。シグナルを3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸塩 (DAB、Sigma-Aldrich社)を使用して検出した。対比染色はヘマトキシリンを用いて行った。オステオカルシンの一次抗体を使用せずに、陰性対照染色についても調べた。
１．７統計分析
組織形態学的分析は、各動物から各時点で得られた3つの切片を使用して行った。それらは信頼できる再現性を示した。試験片間の統計的な差はTukey-Kramer多重比較分析により評価した。P<0.05の値は統計学的に有意であるとみなした。
２．結果
２．１  ＯＣＰ/ＨｙＡゲル
図１Ａ及びＢはそれぞれ篩い分けしたＯＣＰ顆粒及びＯＣＰ／ＨｙＡ９０複合材料の画像を示す。イメージを示す。図２Ａは乾燥後のＯＣＰ及びＯＣＰ/ＨｙＡ複合体のX線回折(XRD)パターンを示す。合成ＯＣＰに関して観察された特徴的な2θ=4.9°の(100)反射及び2θ=33.6°の (700)反射を含むXRDのすべての反射は、ＯＣＰ構造から予測される反射（Mathew M et al., J Crystallogr Spectrosc Res 1988;18:235-250）によく一致していた。特徴的な2θ=10.8°の(100)反射またはＯＣＰ由来の反射以外の反射は検出されず、合成ＯＣＰが単一のＯＣＰ結晶相から成ることが明らかとなった。図２Ｂは、乾燥後のＯＣＰ及びＯＣＰ／ＨｙＡ複合材のフーリエ変換赤外分光法(FTIR)スペクトルを示す。ＯＣＰのFTIRスペクトルは以前に報告した（Fowler BO et al., Arch Oral Biol 1966;11:477-92.）のとよく一致していた。1,030-1,130cm-1付近のオルトリン酸伸縮吸着のｖ3 P-Oに由来する3つの異なる特徴的バンドと、560-600cm-1付近のｖ4 PO4の2つのシャープな吸収バンドが同定された。図２Ｃ及びＤは乾燥後の合成ＯＣＰ顆粒及びＯＣＰ/ＨｙＡの走査電子顕微鏡(SEM)写真を示す。顆粒は、ＯＣＰ結晶凝集体から成る不規則な形態を示した。ＯＣＰ結晶は、長さ数μmの板状の形態を示した。これらのデータは、ＨｙＡの追加がＯＣＰの構造的特性に影響を及ぼさないことを実証した。電磁回転式粘度計を使用した粘度の測定は、ＨｙＡゲルの粘度がそれらの分子量(表１)に依存することを実証した。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
２．２．組織学的検査
図３は、移植後3週目及び6週目のＯＣＰ自体及びＯＣＰ/ＨｙＡゲルインプラントのヘマトキシリン-エオシン染色した頭蓋冠周囲の組織切片の写真であり、図４は同じく、その拡大写真である。以前の研究では、組織切片の調製中に脱灰化の結果として既に存在しないＯＣＰ結晶間の空間内にマトリクスタンパク質の蓄積が存在することにより、主として生じるへマトキシリンに親和性のあるタンパク質が鋳型となってＯＣＰ顆粒が認識可能であることが実証されていた。ほとんどのＯＣＰ顆粒は、すべての群で、新たに形成された骨で覆われる傾向があった。頭蓋冠表面からの新しい骨の形成はＯＣＰ群(図３Ａ)で観察され、ＯＣＰ群に制限された。しかしながら、ＯＣＰとＨｙＡとの組み合わせ、特にＯＣＰとＨｙＡ９０又はＨｙＡ６００との組み合わせは、ＯＣＰのみの群と比較して骨形成を増強した。ＨｙＡが分子量によっては比較的高い骨再生能を有することは予想外のことである。新たに形成された骨の内部で、骨髄組織も形成された。ＯＣＰ／ＨｙＡ６００群では、残りのＨｙＡゲルが明瞭に認識された。ホスト骨領域、界面領域、及び材料領域の拡大像が図３Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｏ及びＰに示される。骨形成は、3週目の頭蓋冠(図３Ｆ)からの反応性骨形成に加えて、頭蓋冠(図３Ｇ及び図３Ｈ)とは無関係にＯＣＰ顆粒の周囲で直接認識された。骨形成は増加し、6週目でホスト頭蓋冠骨と統合されるようになった。(図３Ｍ−図３Ｐ)。
【００４０】
図５はＯＣＰ／ＨｙＡ６００移植群のアルシアンブルーで染色した切片の写真及び拡大写真であり、（Ａ）及び（Ｃ）は移植後3週目、（Ｂ）及び（Ｄ）は移植後6週目である。ＯＣＰ／ＨｙＡ９０及びＯＣＰ／ＨｙＡ１９０では3週目でも残存ＨｙＡゲルは無いが（データ非図示）、ＨｙＡ６００は移植後3及び6週目とも部分的に吸収されずに残っていた。
２．３  ＯＣＰ/ＨｙＡインプラント周囲のＴＲＡＰ陽性破骨用細胞及びＡＬＰ陽性骨芽細胞の検出
図６及び７は、ＯＣＰ及びＯＣＰ/ＨｙＡ複合材の移植後の3週目(図６)及び6週目(図７)の頭蓋冠組織のＴＲＡＰ及びＡＬＰ染色を示す。ＴＲＡＰはＨｙＡの存在にかかわらず(図６Ｅ−Ｈ)ＯＣＰ顆粒に緊密に関連して検出された。ＯＣＰ／ＨｙＡ９０(図６Ｆ)及びＯＣＰ／ＨｙＡ６００(図６Ｈ及び７Ｐ)のＴＲＡＰはＯＣＰ／ＨｙＡ１９０(図６Ｇ及び図７Ｏ)のＴＲＡＰよりも比較的高いように見える。対照 (PTFEリングのみ)のＴＲＡＰは、ＯＣＰ/ＨｙＡ複合体(図６Ａ及び７Ｉ)のＴＲＡＰよりもはるかに低かった。ＡＬＰは、3週目のＯＣＰの無いＨｙＡ９０(図６Ｂ)及びＨｙＡ６００(図６Ｄ)の頭蓋冠表面と、6週目のＨｙＡ１９０(図７Ｋ)及びＨｙＡ６００(図７Ｌ)の頭蓋冠表面とで検出された。ＡＬＰも、3週目のＯＣＰ／ＨｙＡ９０(図６Ｆ)及び6週目のＯＣＰ／ＨｙＡ９０(図７Ｎ)でＯＣＰ顆粒の周囲で検出された。
２．４  骨形成の周囲のオステオカルシンの局在性
図８は、6週目のオステオカルシンの免疫染色を示す。移植されたＯＣＰは、オステオカルシンに関して陽性に染色された。オステオカルシン陽性細胞は新しい骨の周囲で観察された。残りのＨｙＡ(ＨｙＡ６００(図８Ｄ)はオステオカルシンで染色されなかった。ＯＣＰ顆粒も骨組織も、対照群では染色されなかった(図８Ｉ，Ｊ，Ｋ，及びＬ)。
２．５  組織形態学的検査
新しい骨の形成のパーセンテージに関する組織形態学的知見を図９Ａ及び９Ｃに示す。3週目では、PTFEリング、ＯＣＰ顆粒、ＨｙＡ９０、ＯＣＰ／ＨｙＡ９０、ＨｙＡ１９０、ＯＣＰ／ＨｙＡ１９０、ＨｙＡ６００及びＯＣＰ／ＨｙＡ６００における新たな骨の平均面積はそれぞれ3.9±4.2、5.6±4.3、13.6±6.2、17.1±12.5、0.9±0.7、9.9±8.0、15.5±9.2%、及び15.0±10.2%であった。PTFEリング群とＨｙＡ６００及びＯＣＰ／ＨｙＡ６００群との間には有意差が見られた。移植後6週目では、PTFEリング、ＯＣＰ顆粒、ＨｙＡ９０、ＯＣＰ／ＨｙＡ９０、ＨｙＡ１９０、ＯＣＰ／ＨｙＡ１９０、ＨｙＡ６００及びＯＣＰ／ＨｙＡ６００における新たな骨の平均面積はそれぞれ5.6±7.6、20.8±7.1、13.4±5.1、33.0±8.3、3.6±5.9、21.5±8.4、27.4±7.9、及び36.0±5.6%であった。有意差はPTFEリング群と、ＯＣＰ／ＨｙＡ９０、ＯＣＰ／ＨｙＡ１９０、ＨｙＡ６００及びＯＣＰ／ＨｙＡ６００間とで観察された。また、ＯＣＰ／ＨｙＡ９０及びＯＣＰ／ＨｙＡ１９０の新たな骨の面積率はＨｙＡ９０及びＨｙＡ１９０のそれよりもそれぞれ有意に高かった。ＯＣＰ／ＨｙＡ９０及びＯＣＰ／ＨｙＡ６００群の新たに形成された骨のパーセンテージが、ＯＣＰ顆粒群よりも有意に高かったことは注目に値する（図９Ａ、6週目）。つまり、ＯＣＰ/ＨｙＡはＯＣＰ単独あるいはＨｙＡ単独と比較して高い骨再生能を示す。残存インプラントのパーセンテージに関する組織形態学的知見を図９Ｂに示す。移植後3週目では、ＯＣＰ顆粒、ＯＣＰ／ＨｙＡ９０、ＯＣＰ／ＨｙＡ１９０及びＯＣＰ／ＨｙＡ６００群の残存インプラントの平均パーセンテージは、それぞれ21.7±16.3、20.8±10.4、14.9±5.2及び16.8±11.9%であった。ＯＣＰ/ＨｙＡ複合材の群間では、残存インプラントのパーセンテージの有意差は見られなかった。移植後6週目では、ＯＣＰ顆粒、ＯＣＰ／ＨｙＡ９０、ＯＣＰ／ＨｙＡ１９０及びＯＣＰ／ＨｙＡ６００群の残存インプラントの中間のパーセンテージは、それぞれ12.7±5.1、8.3±3.5、13.7±6.2及び14.4±6.8%であり、これはＯＣＰ/ＨｙＡ複合材の群間で有意差はなかった。
ＨｙＡ９０及びＨｙＡ１９０は3週目でもＨｙＡゲルが吸収されているのに対し、ＨｙＡ６００は吸収されていないのに骨伝導能を示すのは、ＨｙＡ９０はＨｙＡの分解中に骨形成での刺激能に関与した可能性があるのに対し、架橋処理したＨｙＡ６００の骨伝導能はマトリックスがＯＣＰ顆粒と新たな骨形成の足場として機能し、それぞれ骨伝導能のメカニズムが異なる可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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