(57)【要約】【課題】  共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いた走査分子計数法に於いて、観測対象粒子に結合した発光プローブを、未反応発光プローブの存在下に於いても選択的に検出できるようにすること。【解決手段】  本発明の観測対象粒子の検出技術は、発光プローブが金属粒子の表面に結合した観測対象粒子に結合すると、ＳＥＲＳ現象又はＳＥＲＲＳ現象によって増強されたラマン散乱光を放出する試料溶液を調製し、試料溶液内に於いて顕微鏡の光検出領域の位置を移動させながら検出された光検出領域からの光の時系列光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて光検出領域内を相対的に移動する金属粒子の表面に結合した観測対象粒子に結合した発光プローブからの増強されたラマン散乱光に於いて想定されるプロファイルを有する光強度の時間変化を一つの発光プローブの信号として個別に検出し、観測対象粒子を個別に検出する。【選択図】図３
2015219071.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する観測対象粒子に結合する発光プローブからの光を検出して前記観測対象粒子を検出する方法であって、
前記観測対象粒子と、前記発光プローブと、前記観測対象粒子に結合する表面を有する金属粒子とを含み、前記発光プローブが、前記金属粒子の表面に結合した前記観測対象粒子に結合すると、表面増強ラマン散乱現象又は表面増強共鳴ラマン散乱現象によって増強されたラマン散乱光を放出する試料溶液を調製する過程と、
前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して時系列の光強度データを生成する過程と、
前記時系列の光強度データ上に於いて前記光検出領域内を相対的に移動する前記金属粒子の表面に結合した前記観測対象粒子に結合した前記発光プローブからの前記表面増強ラマン散乱現象又は表面増強共鳴ラマン散乱現象によって増強されたラマン散乱光に於いて想定されるプロファイルを有する光強度の時間変化を前記発光プローブからの光を表す信号として個別に検出することにより、前記観測対象粒子を個別に検出する過程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、前記試料溶液に、前記表面増強ラマン散乱現象又は表面増強共鳴ラマン散乱現象の発生していない状態の前記発光プローブから放出される光を消光する消光剤が添加されている方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子の状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な単一粒子検出方法に係り、より詳細には、発光プローブを用いて溶液中の粒子状の対象物の検出、濃度又は数密度の測定等を行う方法に係る。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う光分析技術が種々提案されている。そのような光分析技術としては、例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１参照）、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity  Distribution  Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献２)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon  Counting  Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献３）などが知られている。
【０００３】
更に、本願出願人は、特許文献４〜６に於いて、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いた光分析技術であって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術とは異なる原理による新規な光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）では、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。励起光が使用される場合には、励起光の集光領域に概ね一致する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子（光を発する粒子。それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよい。）を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を個別に検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子を一つずつ検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−０９８８７６
【特許文献２】特許第４０２３５２３号
【特許文献３】国際公開２００８−０８０４１７
【特許文献４】国際公開第２０１１／１０８３６９
【特許文献５】国際公開第２０１１／１０８３７０
【特許文献６】国際公開第２０１２／０１４７７８
【特許文献７】特表２００２−５１５５９０
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「サーフェス・エンハンスド・ラマン・スペクトロスコピー」  ハインズ他２名  アナリティカル・ケミストリー  ２００５（“Surface-Enhanced  Raman  Spectroscopy” Christy  L.  Haynes,  Adam  D.  McFarland,  Richard  P.  Van Duyne，ANALYTICAL  CHEMISTRY  2005）p.339A-346A
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の走査分子計数法に於いて、観測対象となる粒子（観測対象粒子）自体に発光性がないか非常に弱い場合には、観測対象粒子に対して発光プローブを付加、結合若しくは標識して、観測対象粒子と発光プローブとが一体となって発光粒子となるように試料溶液の調製が行われる（特許文献６等）。しかしながら、観測対象粒子への発光プローブの付加、結合若しくは標識の処理に於いて、又は、試料溶液の調製に於いては、通常、多量の発光プローブが、観測対象粒子に対して付加、結合若しくは標識されずに残留することが多く（以下、「未反応発光プローブ」と称する。）、そのままの試料溶液で、走査分子計数法を実行すると、残留する未反応発光プローブも発光粒子の信号として誤検出されてしまうこととなる。従って、観測対象粒子への発光プローブの付加、結合若しくは標識の処理によって発光粒子を調製する場合には、光計測に先立って、未反応発光プローブを除去する処理が実施される。この点に関し、未反応発光プローブの除去処理では、一般的には、或る程度の観測対象粒子の損失や変性を生ずる可能性が高い。また、走査分子計数法の場合、極めて微量の発光粒子の検出が可能であるので（検出限界は、１００ａＭ程度まで低減可能である。）、走査分子計数法の検出限界未満となるまで、未反応発光プローブを除去することは一般的には困難である。更に、モレキュラービーコン法（核酸の検出）、qbody法（タンパク質の検出）などの発光プローブが観測対象粒子に結合したときにのみ、発光性が増大したり、波長特性が変化するなどして、観測対象粒子に結合した発光プローブと未反応発光プローブとを区別できるようにした方法（ホモジーニアス法）が知られているところ、かかるホモジーニアス法の場合には、利用可能な観測対象粒子の種類が限られており、汎用性があまり高いとは言えない。なお、モレキュラービーコン法を利用して走査分子計数法を実施した場合の検出限界（検出可能な観測対象粒子の最低濃度）は、数百ｆＭ程度であり、qbody法を利用して走査分子計数法を実施した場合の検出限界は、サブｎＭ程度であり、走査分子計数法本来の検出限界が１００ａＭ程度までに達することを考慮すると、上記のホモジーニアス法の例では、走査分子計数法の感度を生かすことができていない。
【０００７】
ところで、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出を可能にする技術として、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）現象又は表面増強共鳴ラマン散乱（ＳＥＲＲＳ）現象を利用した方法が提案され、かかる方法を用いた光分析技術の例が既に報告されている。表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）現象或いは表面増強共鳴ラマン散乱（ＳＥＲＲＳ）現象とは、端的に述べれば、ナノスケールの微細な凹凸構造を有する金属表面に光を照射することにより発生する表面プラズモン共鳴によって金属表面に電磁波が極端に増強された領域が生成され、その増強された電磁波領域内に分子が進入すると、分子のラマン散乱光が増強される現象である。かかるＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象によるラマン散乱光の増強は、金属表面から数ｎｍ程度の範囲でのみ発生し、従って、分子が金属表面に近接したときだけ、増強されたラマン散乱光が発生する。そこで、そのような金属表面に近接した分子の増強されたラマン散乱光を検出することにより、単一分子の挙動や状態の検出を試みる種々の技術が提案されている。例えば、特許文献７に於いては、試料核酸中の標的核酸配列の有無を決定する方法に於いて、標的の塩基配列に相補的な核酸を金属粒子表面に結合する一方、ＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象を起こす分子を検査されるべき核酸に付与し、検査されるべき核酸が金属粒子表面の核酸に結合したときのみ、増強されたラマン散乱光が発生されるような系を構成して、検査されるべき核酸に標的となる塩基配列が存在するか否かを検出する構成が記載されている。また、非特許文献１に於いては、共焦点光学顕微鏡下で、顕微鏡のコンフォーカル・ボリューム（光検出領域）に拡散により進入した金属粒子表面に結合した蛍光一分子の増強されたラマン散乱光を検出した例が報告されている。
【０００８】
上記のＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象に於いては、金属表面の微細な構造とラマン散乱光の増強される分子（ラマン活性分子）が金属粒子の表面の数ｎｍ程度の範囲の領域内に存在するときのみ、ラマン活性分子から増強されたラマン散乱光が発生するので、増強されたラマン散乱光を計測するように光計測を実施した場合には、試料溶液中に金属粒子の表面に近接していないラマン活性分子が存在していても、それらの存在は光計測には実質的に反映されず、金属表面に近接したラマン活性分子のみを選択的に検出できることとなる。かかるＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象に於ける特徴は、走査分子計数法に於いて、未反応発光プローブからの光を検出しないようにする試みに於いて有利に利用できそうである。
【０００９】
かくして、本発明の主な課題は、走査分子計数法に於いて、観測対象粒子に対して発光プローブを付加、結合又は標識して、検出されるべき発光粒子を構成する場合に、ＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象を利用して、未反応発光プローブが存在していても検出されるべき発光粒子を選択的に検出できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一つの態様によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する観測対象粒子に結合する発光プローブからの光を検出して観測対象粒子を検出する方法であって、観測対象粒子と、発光プローブと、観測対象粒子に結合する表面を有する金属粒子とを含み、発光プローブが、金属粒子の表面に結合した観測対象粒子に結合すると、表面増強ラマン散乱現象又は表面増強共鳴ラマン散乱現象によって増強されたラマン散乱光を放出する試料溶液を調製する過程と、試料溶液内に於いて顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光の強度を測定して時系列の光強度データを生成する過程と、時系列の光強度データ上に於いて光検出領域内を相対的に移動する金属粒子の表面に結合した観測対象粒子に結合した発光プローブからの表面増強ラマン散乱現象又は表面増強共鳴ラマン散乱現象によって増強されたラマン散乱光に於いて想定されるプロファイルを有する光強度の時間変化を発光プローブからの光を表す信号として個別に検出することにより、観測対象粒子を個別に検出する過程とを含む方法によって達成される。
【００１１】
かかる構成に於いて、「試料溶液中に分散しランダムに運動する観測対象粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の物であってよい。また、「発光プローブ」は、観測対象となる粒子に結合又は会合する性質を有し、且つ、表面増強ラマン散乱現象或いは表面増強共鳴ラマン散乱現象によってラマン散乱光の増強される「ラマン活性」を有する任意の物質（通常、分子又はそれらの凝集体）であってよい。金属粒子は、表面増強ラマン散乱現象又は表面増強共鳴ラマン散乱現象を発生する粒子であれば、任意の金属粒子であってよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。）。また、典型的には、光検出部は、所定の計測単位時間（ビンタイム）毎に到来する光子数を計数するフォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出し、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。なお、本明細書に於いて、「粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、発光プローブからの増強されたラマン散乱光を表す信号を指すものとする。
【００１２】
上記から理解される如く、本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、試料溶液内にて移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出される。従って、逐次的に検出された光強度データに於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。
【００１３】
かかる構成に於いて、本発明の場合には、試料溶液中に分散された「発光粒子」は、金属粒子の表面に観測対象粒子が結合し、観測対象粒子に発光プローブが結合し、金属表面に光を照射することにより発生する表面プラズモン共鳴によって金属表面に電磁波が極端に増強された領域内に発光プローブが存在する状態にある複合体である。かかる複合体に於いては、発光プローブがラマン活性を有する物質であるので、複合体が試料溶液内にて移動する光検出領域に包含されると、金属粒子の表面に励起光が照射され（光検出領域は励起光の照射領域である。）、これにより、表面増強ラマン散乱現象又は表面増強共鳴ラマン散乱現象が発生して、発光プローブから増強されたラマン散乱光が放出されることとなる。そして、発光プローブは、観測対象粒子と結合し、更に、その観測対象粒子が金属粒子の表面に結合した場合にのみ、増強されたラマン散乱光を放出することとなるので、発光プローブ−観測対象粒子−金属粒子の複合体が存在するときのみ、増強されたラマン散乱光が検出され、従って、増強されたラマン散乱光の検出の有無によって、観測対象粒子と金属粒子との相互作用の有無及び／又は発光プローブと観測対象粒子との相互作用の有無が検出できることとなる。また、発光プローブが単体で存在している場合及び発光プローブが結合した観測対象粒子が金属粒子の表面に結合していない場合には、増強されたラマン散乱光は実質的に発生しないこととなるので、単体の発光プローブを除去しなくても、選択的に観測対象粒子の存在を検出する計測が実行できることとなる。
【００１４】
発光プローブ−観測対象粒子−金属粒子の複合体を構成する発光プローブと観測対象粒子と金属粒子の各々は、適宜、選択可能である。例えば、観測対象粒子が核酸であれば、発光プローブとしてはラマン活性を有する色素分子等が付加された特定の塩基配列に結合するプローブ用核酸が用いられ、金属粒子としては、観測対象粒子に結合し得る塩基配列が表面に付着された金属粒子が用いられる。また、観測対象粒子がタンパク質又はその他の物質である場合には、発光プローブとしては、ラマン活性を有する色素分子等が付加された特定の物質に結合する抗体が用いられ、金属粒子としては、観測対象粒子に結合し得る抗体が付着された金属粒子が用いられる。発光プローブと、観測対象粒子と、金属粒子との組み合わせは、観測対象粒子の物質の種類、検出目的等によって適宜選択可能であることは理解されるべきである。
【００１５】
ところで、上記の構成に於けるラマン活性を有する発光プローブに関して、発光プローブが表面増強ラマン散乱現象又は表面増強共鳴ラマン散乱現象の発生していない状態でも強い蛍光を発する場合、発光プローブ−観測対象粒子−金属粒子の複合体を構成していない発光プローブが光検出領域に包含された際に発せられる蛍光による光強度の時間変化が信号として誤検出されることがある。そこで、上記の本発明の方法に於いては、試料溶液に表面増強ラマン散乱現象又は表面増強共鳴ラマン散乱現象の発生していない状態の発光プローブから放出される光を消光する消光剤が添加されていてよい。かかる構成によれば、表面増強ラマン散乱現象又は表面増強共鳴ラマン散乱現象に依らずに発光プローブから放出される光を、誤って表面増強ラマン散乱現象又は表面増強共鳴ラマン散乱現象が発生したラマン活性分子の信号として検出することを容易に防止できることとなる。また、本発明の方法を実行する装置に於いて、例えば、発光プローブからの増強されたラマン散乱光の光強度が相対的に表面増強ラマン散乱現象又は表面増強共鳴ラマン散乱現象とは別の機構にて発光プローブから放出される光の光強度よりも強くなるように、光強度の計測条件、例えば、励起光波長帯域や検出光波長帯域など、が選択又は調整されることが好ましい。
【００１６】
上記の本発明の単一粒子検出技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。試料溶液に対する光検出領域の位置の移動方法及び態様、時系列光強度データに於ける光強度値から各発光粒子の信号の抽出もしくは検出する方法及び態様、絶対な濃度値を決定するためのパラメータを決定する方法及び態様等は、特許文献４〜６等に記載されている方法及び態様と同様であってよい。
【発明の効果】
【００１７】
上記の本発明の構成によれば、表面増強ラマン散乱現象又は表面増強共鳴ラマン散乱現象による増強されたラマン散乱光を直接の測定対象としているので、既に触れた如く、増強されたラマン散乱光の発生しない発光プローブが試料溶液中に存在していても、発光プローブ−観測対象粒子−金属粒子の複合体の存在を選択的に検出できることとなる。従って、観測対象粒子自体に発光性がないか非常に弱い場合には、観測対象粒子に対して発光プローブを付加、結合又は標識して、観測対象粒子と発光プローブとが一体となって発光粒子となるように試料溶液の調製が行われる場合に、未反応発光プローブの除去処理を行う必要がなくなる。そして、未反応発光プローブの除去処理が不要となることで、かかる除去処理によって観測対象粒子の損失や変性が生ずるといった問題が解消されることとなる。また、発光プローブ−観測対象粒子−金属粒子の複合体の生成に於いては、従前のホモジーニアス法の如く、利用可能な物質が核酸又は特定の種類のタンパク質に限定されず、種々の物質の観測対象粒子の検出に適用でき、より汎用性の高い方法であるということができる。
【００１８】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１（Ａ）は、本発明による走査分子計数法を実行する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。
【図２】図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明が適用される走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）は、表面増強ラマン散乱現象又は表面増強共鳴ラマン散乱現象によりラマン活性粒子（発光プローブ）から増強されたラマン散乱光が発せられる状況を模式的に示した図である。図２（Ｄ）は、発光プローブが単体で存在する場合に発せられる光について説明する模式図である。
【図３】図３（Ａ）、（Ｂ）は、本発明を利用して実行可能な実験例に於ける粒子のモデル図である。（Ａ）は、観測対象粒子がタンパク質等の任意の粒子であり、発光プローブがラマン活性色素の付加された抗体であり、金属表面に観測対象粒子に結合する抗体が付加されている例である。（Ｂ）は、観測対象粒子が核酸であり、発光プローブがラマン活性色素の付加された核酸であり、金属表面に観測対象粒子に結合する塩基配列の核酸が付加されている例である。
【図４】図４は、本発明に従って実行される走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。
【図５】図５（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子（ラマン活性粒子を担持した金属粒子）がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図５（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。
【図６】図６（Ａ）は、実施例１に於いて使用される試料溶液中の金属粒子（ビオチン被覆金コロイド）とラマン活性粒子（Ｃｙ５修飾アビジン）の状態を説明する模式図である。図６（Ｂ）、（Ｃ）は、それぞれ、実施例１に於いて、試料溶液中に金属粒子が存在せず、ラマン活性粒子が単体で存在する場合に得られた時系列光強度データの例と、試料溶液中に金属粒子が存在しラマン活性粒子が金属粒子表面上で表面増強共鳴ラマン散乱現象により増強されたラマン散乱光が発せられる場合に得られた時系列光強度データの例とを示している。図中、棒グラフがフォトンカウントであり、細線が平滑化曲線であり、ｆｔを付した太線がフィッティング曲線である。
【図７】図７（Ａ）、（Ｂ）は、実施例１に於いて、＃１：試料溶液中にラマン活性粒子のみが存在する場合、＃２：試料溶液中にラマン活性粒子とラマン活性粒子の蛍光の消光剤が存在する場合、＃３：試料溶液中にラマン活性粒子、消光剤、金属粒子が存在する場合、＃４：試料溶液中にラマン活性粒子、消光剤、ラマン活性粒子の結合しない金属粒子が存在する場合に於いて得られた時系列光強度データに於いて得られた光強度（光子数）と、粒子数（走査分子計数法による）を、それぞれ、示している。図中、棒グラフとエラーバーは、３回の１００秒間の計測に於ける平均値と標準偏差である。
【図８】図８（Ａ）は、実施例２に於いて使用される試料溶液中の金属粒子（ビオチン被覆金コロイド）と観測対象粒子（ストレプトアビジン）と発光プローブ（ラマン活性色素標識ビオチンの状態を説明する模式図である。図８（Ｂ）は、実施例２に於いて、発光プローブが観測対象粒子に結合し、更に観測対象粒子が金属粒子に結合した状態となる試料溶液の場合に得られた時系列光強度データの例とを示している。図中、棒グラフがフォトンカウントであり、細線が平滑化曲線であり、ｆｔを付した太線がフィッティング曲線である。図８（Ｃ）は、実施例２に於いて、＃１：試料溶液中に金属粒子と発光プローブとが存在する場合と、＃２：試料溶液中に金属粒子と観測対象粒子と発光プローブとが存在する場合とで得られた時系列光強度データに於いて粒子数（棒グラフ）を、それぞれ、示している。
【符号の説明】
【００２０】
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００２２】
光分析装置の構成
本発明による単一粒子検出技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、特許文献４−６に記載の走査分子計数法又はＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象粒子と、ラマン活性を有する発光プローブと、金属粒子とが分散又は溶解される。なお、発光プローブが蛍光性の粒子であり、その蛍光強度が比較的強い場合には、蛍光の消光のために、試料溶液中に消光剤が更に添加されてよい。そして、金属粒子が励起領域に進入し、更に、後に説明されるように、その金属粒子の表面に観測対象粒子と発光プローブとが順に結合し、発光プローブが金属粒子の表面近傍に存在した状態となって、ＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象が生じたときには、それによる増強されたラマン散乱光が放出され、放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が中心光強度の１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの金属粒子上に於ける増強されたラマン散乱光が検出されるところ、その光強度は、微弱なので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な���高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、計測単位時間（ＢＩＮ  ＴＩＭＥ）毎に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。更に、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
【００２３】
そして、上記の光分析装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の走査軌道又は試料溶液の位置の移動経路は、円形、楕円形等の閉じた循環経路であってよく、任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光プローブのＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象を惹起する励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、光をダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ１４ａを用いて波長成分によって分割して別々に検出できるようになっていてよい。
【００２４】
コンピュータ１８は、ＣＰＵおよびメモリを備え、ＣＰＵが各種演算処理を実行することにより、本発明の手順を実行する。なお、各手順は、ハードウェアにより構成するようにしてもよい。本実施形態で説明される処理の全て或いは一部は、それらの処理を実現するプログラムを記憶したコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を用いて、コンピュータ１８により実行されてよい。即ち、コンピュータ１８は、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、本発明の処理手順を実現するようになっていてよい。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよく、或いは、上記のプログラムを通信回線によってコンピュータに配信し、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。
【００２５】
本発明の単一粒子検出技術の原理
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明に於いては、端的に述べれば、走査分子計数法に於いて、観測対象粒子自体に発光性がないか非常に弱いために、観測対象粒子に対して発光プローブを付加、結合又は標識して、観測対象粒子と発光プローブとが一体となった複合体を発光粒子として検出する場合に、更に、観測対象粒子を、表面プラズモン共鳴を生ずる金属粒子の表面上に結合させて、ＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象によって発光プローブが発する増強されたラマン散乱光を検出することによって、観測対象粒子の存在を検出する。これにより、試料溶液の調製に於ける観測対象粒子に結合していない発光プローブを除去するための処理が不要となるという利点が得られる。以下、走査分子計数法による粒子の検出原理と、ＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象を利用して観測対象粒子を検出する本発明の方法の原理について説明する。
【００２６】
１.走査分子計数法の原理
「走査分子計数法」（特許文献４〜６）では、基本的には、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０〜ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。なお、発光粒子の光の検出は、例えば、時系列の光強度データに於いて光検出領域内を相対的に移動する一つの発光粒子からの光に於いて想定されるプロファイルを有する光強度の時間変化を一つの発光粒子の信号として個別に検出することにより為されてよい。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
【００２７】
２．ＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象を利用した走査分子計数法
図２（Ｃ）を参照して、溶液中に金属粒子ＭＰと、ラマン活性粒子ＲＡＰ（ラマン活性を有する粒子）が分散している状態に於いて、金属粒子ＭＰに対して、励起光Ｅｘが照射されると、金属粒子ＭＰの表面に於いて表面プラズモン共鳴によって金属表面に電磁波が極端に増強された領域（ＳＰＲ領域）が生成される。かかる電磁波の増強された領域は、通常、金属表面から数ｎｍ程度の範囲に限定されており、従って、左図のように、金属表面から表面プラズモン共鳴による電磁波の増強されたＳＰＲ領域の外にラマン活性粒子ＲＡＰが存在する場合には、ラマン活性粒子ＲＡＰからのラマン散乱光は、非常に微弱で実質的に検出されない。一方、右図のように、金属粒子ＭＰ表面にラマン活性粒子ＲＡＰが吸着又は結合などによって存在する場合には、ラマン活性粒子ＲＡＰが電磁波の増強されたＳＰＲ領域に進入することとなり、増強されたラマン散乱光が発生し、かかるラマン散乱光が顕微鏡下で検出可能となる。即ち、金属粒子ＭＰとラマン活性粒子ＲＡＰとが溶液中に分散されているとき、ラマン活性粒子ＲＡＰが金属粒子ＭＰ表面に対して何らかの理由で近接している場合にのみ、増強されたラマン散乱光が発生するので、例えば、金属粒子表面を任意の物質にて修飾した場合に、増強されたラマン散乱光が発生するか否かを検出することによって、ラマン活性粒子ＲＡＰと修飾された物質との相互作用の有無が検出できることとなる。
【００２８】
上記のＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象を利用すると、走査分子計数法に於いて、観測対象粒子に対して発光プローブを付加、結合又は標識して、観測対象粒子と発光プローブとが一体となった複合体を発光粒子として検出する場合に、観測対象粒子と結合していない未反応発光プローブの除去が実質的に不要となる。例えば、図３（Ａ）を参照して、或る観測対象粒子ＯＴが試料溶液中に存在するか否かを検出したい場合、発光プローブとして、観測対象粒子ＯＴに結合する分子（例えば、抗体）にラマン活性色素を付加してなるラマン活性粒子ＲＡＰを用い、更に、試料溶液中に、表面に観測対象粒子ＯＴに結合する分子ＳＣが付加された金属粒子ＭＰを前記の如く分散させる。そうすると、観測対象粒子ＯＴが試料溶液中に存在していれば、金属粒子ＭＰ上のＳＣに観測対象粒子ＯＴが結合し、更に、観測対象粒子ＯＴにラマン活性粒子（発光プローブ）ＲＡＰが結合することとなるので、ラマン活性粒子ＲＡＰが金属粒子ＭＰ上のＳＰＲ領域に存在することとなり、これにより、増強されたラマン散乱光ＳＬが放出されることとなる。この場合、試料溶液中に、観測対象粒子ＯＴに結合していないラマン活性粒子ＲＡＰが存在していても、それらのラマン活性粒子ＲＡＰから増強されたラマン散乱光ＳＬが放出されることは殆どない。また、試料溶液中に、観測対象粒子ＯＴとは異なる粒子ＣＴが存在している場合、粒子ＣＴは、発光プローブにも金属粒子ＭＰにも結合しないので、粒子ＣＴの存在によって増強されたラマン散乱光ＳＬが放出されることはない。
【００２９】
上記と同様に、図３（Ｂ）を参照して、或る塩基配列を有する核酸（観測対象粒子）ＯＴが存在するか否かを検出したい場合、発光プローブとして、観測対象粒子ＯＴに相補的な塩基配列を有する核酸プローブにラマン活性色素を付加してなるラマン活性粒子ＲＡＰを用い、試料溶液中に、表面に、観測対象粒子ＯＴの塩基配列のうち、ラマン活性粒子ＲＡＰの結合する塩基配列とは異なる領域と相補的な塩基配列を有する核酸プローブＳＣが付加された金属粒子ＭＰを前記の如く分散させる。そうすると、観測対象粒子ＯＴが試料溶液中に存在していれば、金属粒子ＭＰ上のＳＣに観測対象粒子ＯＴが結合し、更に、観測対象粒子ＯＴにラマン活性粒子（発光プローブ）ＲＡＰが結合することとなるので、ラマン活性粒子ＲＡＰが金属粒子ＭＰ上のＳＰＲ領域に存在することとなり、これにより、増強されたラマン散乱光ＳＬが放出されることとなる。この場合も、試料溶液中に、観測対象粒子ＯＴに結合していないラマン活性粒子ＲＡＰが存在していても、それらのラマン活性粒子ＲＡＰから増強されたラマン散乱光ＳＬが放出されることは殆どない。そして、観測対象粒子ＯＴとは異なる塩基配列を有する核酸ＣＴについては、発光プローブにも金属粒子ＭＰにも結合しないので、粒子ＣＴの存在によって増強されたラマン散乱光ＳＬが放出されることはない。
【００３０】
かくして、ラマン活性粒子（発光プローブ）ＲＡＰ−観測対象粒子ＯＴ−金属粒子ＭＰからなる複合体を、検出すべき発光粒子として、ラマン活性粒子からの増強されたラマン散乱光を計測すべき光とすることによれば、試料溶液中の未反応発光プローブの除去が実質的に不要とすることが可能となる。
【００３１】
ところで、既に述べた如く、増強されたラマン散乱光は、金属粒子ＭＰの表面から離れたラマン活性粒子では発生しないので、ラマン活性粒子（発光プローブ）ＲＡＰ−観測対象粒子ＯＴ−金属粒子ＭＰからなる複合体を構成しない単体のラマン活性粒子ＲＡＰからのラマン散乱光は、図２（Ｄ）中のＳＬの如く、微弱であり、実質的に検出されない。しかしながら、ラマン活性粒子ＲＡＰが、励起光Ｅｘによって強い蛍光ＦＬ１を発する場合、その蛍光が信号として検出され得る。そこで、そのような蛍光の放出を抑制すべく、試料溶液中に、ラマン活性粒子ＲＡＰの蛍光を吸収する消光剤ＱＡが更に添加されてよい。この場合、ラマン活性粒子ＲＡＰから放出される蛍光が消光剤ＱＡに吸収されるので、ラマン活性粒子ＲＡＰの外部に放出される蛍光ＦＬ１の強度を大幅に抑制でき、従って、蛍光を増強されたラマン散乱光として誤検出することを抑制又は防止できることとなる。
【００３２】
処理操作過程
図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明による単一粒子検出の実施形態に於いては、具体的には、（１）金属粒子、発光プローブ（ラマン活性粒子）及び観測対象粒子を含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定及び（３）増強されたラマン散乱光を発する発光粒子の検出・計数処理、濃度の算出等の分析が実行される。
【００３３】
（１）試料溶液の調製
本発明の単一粒子検出技術に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、非生物学的粒子などであってよい。
【００３４】
そして、試料溶液中には、金属粒子と、ラマン活性粒子である発光プローブと、必要に応じて、発光プローブの蛍光を消光するための消光剤とが分散又は溶解される。金属粒子としては、金、銀などの表面プラズモン共鳴現象による表面電磁場の増強効果の高い粒子が適しており、後述のラマン活性粒子の吸収波長に近い表面プラズモン共鳴波長を有する粒径のものが好適に選択される。例えば、波長が６３３ｎｍの励起光を使用する場合であれば、粒径が３０ｎｍ〜１００ｎｍ程度の金粒子又は粒径が１００ｎｍ程度の銀粒子が好適に利用可能である。また、金属粒子としては、球状の他に、ロッド状やワイヤー状の粒子も使用可能である。また、金属粒子は、その表面に観測対象粒子と結合するための処理が施される。例えば、観測対象粒子が上記の如き生体分子である場合には、観測対象粒子に特異的に結合する物質又は抗体などが金属粒子表面上に被覆又は付加される。特に、観測対象粒子が特定の塩基配列を有する核酸であるときには、その特定の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸が金属粒子表面上に付加される。
【００３５】
発光プローブとしては、ＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象によりラマン散乱光が増強される粒子であって、観測対象粒子に特異的に結合する任意の粒子であってよい。そのようなラマン散乱光が増強される粒子としては、典型的には、光を吸収する蛍光色素分子、例えば、FAM、TET、RG、YakimaYellow、HEX、Cy3.5、Cy3、Cy5、Cy5,5、ATTO488、Alexa488、ATTO647N、ATTO647、BODYPY-TR-X、Cy7などが付加された観測対象粒子に特異的に結合する物質又は抗体が利用可能である。特に、観測対象粒子が特定の塩基配列を有する核酸であるときには、その特定の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸に上記の如き蛍光色素分子が付加されたものであってよい。
【００３６】
更に、既に述べた如く、発光プローブが上記の如き蛍光色素分子を含む場合に、励起光の照射による蛍光強度が強く、かかる蛍光が、後に説明される光強度の測定によって得られる時系列光強度のデータ上で有意な信号として検出され、増強されたラマン散乱光の信号との区別ができない状態が生じ得る場合には、蛍光色素分子の蛍光を吸収する消光剤が試料溶液中に添加されてよい。消光剤の種類は、蛍光色素分子の蛍光波長と、ラマン活性粒子、観測対象粒子及び金属粒子への化学的影響とを考慮して、当業者に於いて、適宜、選択可能である。消光剤がされた場合、蛍光色素分子からの蛍光は、消光剤に吸収され、光検出器には殆ど到達せず、時系列光強度のデータ上には実質的に出現しないことが期待される。
【００３７】
（２）試料溶液の光強度の測定
図４は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理過程を示している。なお、下記の記載に於いて、発光粒子は、発光プローブ−観測対象粒子−金属粒子からなる複合体であり、検出される発光粒子からの光は、発光プローブであるラマン活性粒子からの増強されたラマン散乱光である。また、発光粒子の励起光は、ＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象を惹起する光である。
【００３８】
本実施形態の走査分子計数法による光強度の測定処理過程では、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が為される（図４−ステップ１００）。操作処理に於いて、典型的には、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順、励起光を光検出領域に照射する手順及び光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の測定が開始される。測定が開始されると、まず、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、光源２から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器１７によるミラー７（ガルバノミラー）の駆動又はステージ位置変更装置１７ａによるステージの駆動によって、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に受光した光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ  ＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を測定する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
【００３９】
光検出領域の位置の移動速度に関して、走査分子計数法に於いて、一般的には、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出を、定量的に精度よく実行するために、好適には、光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定される。光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図５（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化（発光粒子からの光を表す信号）を特定することが困難となる。そこで、好適には、図５（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略同様となり（粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。図５（Ｃ）上段参照。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
【００４０】
具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径ａの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δτは、平均二乗変位の関係式
（２ａ）２＝６Ｄ・Δτ      …（１）
から、
Δτ＝（２ａ）２／６Ｄ      …（２）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２ａ／Δτ＝３Ｄ／ａ      …（３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
【００４１】
（３）光強度の分析
上記の処理により時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光（金属粒子表面に近接したラマン活性粒子からの増強されたラマン散乱光）に対応する信号の検出、濃度の算出等の分析が実行される。
【００４２】
（ｉ）発光粒子に対応する信号の検出
時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図５（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する（図５（Ｃ）参照）。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、即ち、例えば、時系列の光強度データに於いて光検出領域内を相対的に移動する一つの発光粒子からの光に於いて想定される光強度の時間変化プロファイルを有するとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ２／ａ２）      …（４）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
【００４３】
時系列光強度データからの発光粒子の一括的な検出を行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図５（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図４−ステップ１１０、図５（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法等により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ  ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
【００４４】
次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図５（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
【００４５】
しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が発光粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図５（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。
【００４６】
上記のステップ１３０〜１６０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光信号データの全域に渡って繰り返し実行され、一つの発光粒子が検出される毎に、粒子としてカウントされてよい。そして、時系列光信号データの全域のパルス信号の探索が完了すると（ステップ１６０）、それまで得られた粒子のカウント値が時系列光信号データに於いて検出された発光粒子の数とされる。また、時系列光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
【００４７】
（ii）発光粒子濃度の決定
検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されている場合、更に、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料中の発光粒子の濃度が決定可能となる。光検出領域の通過した領域の総体積は、例えば、特許文献４等に記載されている要領にて決定されてよい。本実施形態では、発光粒子の数は、表面にラマン活性粒子が近接してＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象が発生している金属粒子の数である。従って、発光粒子濃度は、単位体積当たりのＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象の発生数となる。
【００４８】
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
【実施例１】
【００４９】
まず、本発明の適用される走査分子計数法を用いて、金属粒子表面にて近接させたラマン活性粒子に於いてＳＥＲＲＳ現象によって生ずる増強されたラマン散乱光が検出できることを確認した。具体的にはビオチンを標識した金粒子と、蛍光標識されたアビジンとが混合された試料溶液を用いて、走査分子計数法に従って、増強されたラマン散乱光が発生している金属粒子を検出した。かかる試料溶液に於いては、図６（Ａ）に模式的に描かれている如く、ビオチンＢｔを標識した金粒子Ａｕの表面に、蛍光色素Ｃｙ５にて標識されたアビジンＳＡが、アビジン−ビオチン結合反応によって結合するので、金粒子Ａｕの表面にアビジンＳＡに付加された蛍光色素Ｃｙ５のラマン活性により増強されたラマン散乱光ＳＬが発せられることが期待される。即ち、ビオチン標識金粒子が金属粒子であり、Cy5標識ストレプトアビジンがラマン活性粒子である。なお、アビジンＳＡに付加された蛍光色素Ｃｙ５が、金粒子Ａｕの表面に存在しているかどうかによらず放出される蛍光を吸収すべく、蛍光消光剤を添加した場合の計測も実施した。
【００５０】
試料について、金属粒子として用いる６０ｎｍの金コロイド(Cat.No.742015)はSigma-Aldrich社から、金属粒子表面の修飾のためチオール化ビオチン(Biotin-SAM  Formation  Reagent,Cat.No.B564)は同仁化学研究所から、チオール化PEG(Poly(ethylene glycol)methyl  ether  thiol  Mw.  800,  Cat.  No.  729108)はSigma-Aldrich社から、それぞれ、購入した。また消光剤に用いたヨウ化カリウム(Cat.No.32351-30)は、関東化学株式会社から、20xSSC(Cat.No.319-90015)は株式会社ニッポンジーンから、5M  NaCl(Cat.No.31334-51)はナカライ株式会社から購入した。色素標識アビジンとして用いるCy5-Streptavidin(Cat.No.43-4316)はライフテクノロジーズ社から、それぞれ、購入した。
【００５１】
ビオチン標識金属粒子の調製に於いては、まず、金コロイド(60nm)のストック溶液50μLを遠心し(20000g,10min)、上澄みを除去し、100μLの20´SSCと、250μLの5M  NaClと、50μLの水（MilliQ）と、25μLの1μM  Biotin-SAM  Formation  Reagent  (エタノール溶液)と10μM  Poly(ethylene  glycol)  methyl  ether  thiolを含む溶液を加えた。混合した溶液は、振揺器で60rpmで攪拌させて37℃で15時間反応させた。そして、反応後の溶液について、未反応物の除去のために、反応後の溶液を遠心した後に(20000g,10min)上澄みを除去して1mLのバッファー(1mM  Tris-HCl(pH8.0),0.01  %  TritonX100)を加える洗浄操作を２回実施した。また、PEGのみ修飾した金属粒子は、Biotin-SAM  Formation  Reagentを添加しない条件で同様に調製した。
【００５２】
試料溶液は、Cy5標識ストレプトアビジンと上記のビオチン標識金粒子とを、それぞれ、濃度が、200fM、3.2pMとなるようにバッファー(1mM  Tris-HCl(pH8.0),0.01%  TritonX100,１Ｍ  ヨウ化カリウム)に混合し、ボルテックスで1000rpmで10秒間攪拌して調製した（＃３）。なお、対照用溶液として、ビオチン標識金粒子とヨウ化カリウムを除いた溶液（＃１）、ビオチン標識金粒子を除いた溶液（＃２）、ビオチン標識金粒子をPEGのみ修飾した金属粒子に置き換えた溶液（＃４）をそれぞれ調製した。即ち、溶液＃１は、試料溶液中にラマン活性粒子のみが存在する場合であり、溶液＃２は、試料溶液中にラマン活性粒子とラマン活性粒子の蛍光の消光剤が存在する場合であり、溶液＃３は、試料溶液中にラマン活性粒子、消光剤、金属粒子が存在する場合であり、溶液＃４は、試料溶液中にラマン活性粒子、消光剤、ラマン活性粒子の結合しない金属粒子が存在する場合である。
【００５３】
光測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用いた。光強度の計測に於いては、励起光は、６４２ｎｍのレーザー光（出力１ｍＷ）を用い、検出光波長帯域は、バンドパスフィルターを用いて６９０〜７３０ｎｍとした。また、測定中に於いて、半径約２μｍに調整された光検出領域を、試料溶液中にてミラー偏向器によって７７ｍｍ／ｓの速度にて移動した。一回の測定時間が１００秒間である測定を３回実施した。なお、フォトンカウンティングのＢＩＮ  ＴＩＭＥは１０μ秒とした。かくして、得られた時系列のフォトンカウントデータに於ける発光粒子の信号の検出処理に於いては、まず、スムージング処理(Savisky-Golay法に従って５つのデータ点にて移動平均を取る処理を５回繰り返した。)を行い、スムージングされたデータの一次微分値を用いてパルス状信号の存在する領域（パルス存在領域）を特定した。そして、かかる特定されたパルス存在領域に対して最小二乗法によりガウス関数をフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定し、下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜１００μ秒
ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）
相関係数＞０．９
を満たすパルス状信号を、発光粒子の信号の特徴を有する信号として検出し、それらの信号数を計数した。
【００５４】
図６（Ｂ）、（Ｃ）は、それぞれ、ビオチン標識金粒子とヨウ化カリウムを除いた溶液＃１と、Cy5標識ストレプトアビジンとビオチン標識金粒子とを含み、ＳＥＲＲＳ現象による増強されたラマン散乱光が検出される条件の溶液＃３とを用いて、上記の光計測を行った場合の時系列光強度データの例を示している。これらの図から理解される如く、溶液＃１の場合も溶液＃３の場合も、略釣鐘状の光子数の時間変化が観測された。かかる略釣鐘状の光子数の時間変化に関して、溶液＃１（図６（Ｂ））では、Cy5-アビジンの蛍光が計測されるところ、１粒子の信号は最大で2.3光子/10μsであったのに対し、溶液＃３では最大で21.7光子/10μsの強い強度の信号が得られた。溶液＃３についての計測は、消光剤（ヨウ化カリウム）の存在下で実施されているので、検出された信号は、蛍光ではなく、散乱光に由来する信号であると考えられる。
【００５５】
図７（Ａ）、（Ｂ）は、上記の各溶液に於いて得られた時系列光強度データに於ける光子数の総計と、走査分子計数法による検出粒子数を示している。これらの図を参照して理解される如く、図７（Ａ）の光子数の総計を参照する場合には、溶液＃４のCy5標識ストレプトアビジン（ラマン活性粒子）が金粒子（金属粒子）に結合しない場合及び溶液＃１、＃２の金粒子（金属粒子）が存在しない場合に於いても有意な光子数が計測された。溶液＃１の光子数は、Cy5標識ストレプトアビジンによる蛍光とバックグラウンドのよるものであり、溶液＃２の光子数は、バックグラウンドのよるものであり（Cy5標識ストレプトアビジンによる蛍光は、消光剤により吸収されている。）、溶液＃４の光子数は、金粒子自体の散乱光によるものであると考えられるところ、これらの光子数と、ＳＥＲＲＳ現象によって生ずる増強されたラマン散乱光が存在する溶液＃３の光子数との間に於いて、明確な差異を見出すことは困難であった。一方、図７（Ｂ）の走査分子計数法による検出粒子数を参照すると、ＳＥＲＲＳ現象によって生ずる増強されたラマン散乱光が存在する溶液＃３の検出粒子数は、溶液＃１、＃２、＃４の場合と顕著な差異が見られる。かかる粒子数の差異は、ＳＥＲＲＳ現象によって生ずる増強されたラマン散乱光によるものであると考えられる。
【００５６】
かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、本発明によれば、ＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象によって増強されたラマン散乱光を発する金属粒子に結合したラマン活性粒子の存在を検出できることが示された。即ち、本発明によれば、ＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象によって増強されたラマン散乱光の検出を利用した光分析技術に於いて、走査分子計数法の手法を用いることにより、増強されたラマン散乱光の存在の検出が可能となることが示された。
【実施例２】
【００５７】
本発明の単一粒子検出技術を用いて、発光プローブ−観測対象粒子−金属粒子からなる複合体に於ける発光プローブからの増強されたラマン散乱光を検出することにより、発光しないタンパク質などの観測対象粒子の検出が可能であることを確認した。具体的にはビオチンを標識した金粒子と、ストレプトアビジンと、蛍光標識されたビオチンとが混合された試料溶液を用いて、走査分子計数法に従って、増強されたラマン散乱光が発生しているビオチン（発光プローブ）−アビジン（観測対象粒子）−ビオチン（金属粒子）複合体を検出した。この系の試料溶液に於いては、図８（Ａ）に模式的に描かれている如く、非発光性のストレプトアビジンＳＡと、ビオチンＢｔが表面に被覆された金粒子Ａｕと、蛍光色素Ｄが付加されたビオチンＢｔとが混合され、これにより、金粒子Ａｕ表面のビオチンＢｔにストレプトアビジンＳＡが結合し、更に、ストレプトアビジンＳＡに蛍光色素Ｄがさ付加されたビオチンＢｔが結合する。この状態で励起光が照射されると、金粒子Ａｕの表面近傍に存在する蛍光色素Ｄのラマン活性により増強されたラマン散乱光ＳＬが発せられることが期待される。
【００５８】
試料について、金属粒子として用いる１００ｎｍの金コロイド(Cat.No.742031)はSigma-Aldrich社から、金属粒子表面の修飾のためチオール化ビオチン(Biotin-SAM  Formation  Reagent,Cat.No.B564)は同仁化学研究所から、ストレプトアビジン(Cat.No.195-12854)は和光純薬株式会社から、発光プローブとして用いるビオチン修飾ＡＴＴＯ６４７Ｎ(Cat.No.93606)はSigma-Aldrich社から、それぞれ購入した。その他の試料は、実施例１と同様である。
【００５９】
試料の調製について、ビオチン標識金粒子は、実施例１と同様に調製した。試料溶液は、ストレプトアビジン、ATTO647N標識ビオチン及びビオチン標識金粒子（100nm）が、それぞれ、３００ｆＭ、２００ｆＭ、３００ｆＭとなるように、バッファー(1mM  Tris-HCl(pH8.0),0.01%  TritonX100,１Ｍ  ヨウ化カリウム)に混合し、ボルテックスで1000rpmで10秒間攪拌して調製した（＃２）。また、対照用溶液として、上記に於いて、ストレプトアビジンを除いた溶液（＃１）も調製した。
【００６０】
光測定及び発光粒子の信号の検出処理は、実施例１と同様に行った。図８（Ｂ）は、ストレプトアビジン、ATTO647N標識ビオチン及びビオチン標識金粒子を含む試料溶液＃２を用いて上記の光計測を行った場合の時系列光強度データの例を示している。図示の如く、時系列光強度データに於いて、略釣鐘状の光子数の時間変化が観測された。試料溶液＃２に於いては、消光剤（ヨウ化カリウム）の存在下で実施されているので、検出された信号は、蛍光ではなく、散乱光に由来する信号であると考えられる。そして、試料溶液（＃２）と対照用溶液（＃１）をそれぞれ用いて上記の光計測を行って得られた時系列光強度データに於いて検出された走査分子計数法による検出粒子数を参照すると（図８（Ｃ））、検出粒子数は、試料溶液（＃２）の場合が対照用溶液（＃１）の場合に比して有意に多かった。対照用溶液（＃１）の検出粒子数は、金粒子自体の散乱によるものと考えられるところ、これよりも、試料溶液（＃２）の検出粒子数は、更に多いので、かかる増大分は、ATTO647N標識ビオチンがストレプトアビジンを介してビオチン標識金粒子の表面に近接して発生したＳＥＲＳ現象或いはＳＥＲＲＳ現象によって増強されたラマン散乱光によるものであると考えられる。
【００６１】
かくして、上記の結果によれば、走査分子計数法によって、ビオチン（発光プローブ）−アビジン（観測対象粒子）−ビオチン（金属粒子）複合体の存在が検出できることが示された。そして、本発明による方法は、発光性のない観測対象粒子の存在の検出に利用可能であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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