(57)【要約】【課題】  哺乳動物等の培養細胞を用いる環境ストレスの評価法を高感度化するにあたり、副作用などの問題のあるRNA干渉法を使用せず、また、レポーターアッセイ法のようにある特定の化学物質の存在を個別に測定するのではなく、培養細胞を、環境ストレスに対し総合的に高感度化させるための手段を提供すること。【解決手段】  哺乳動物等の培養細胞において、GAS5および／またはこれと同様の機能を有するRNA分子であるIDI2-AS1、SNHG15を高発現させる。これにより、培養細胞は、化学物質、紫外線などの環境ストレスに対し高感度化される。【選択図】図９
2015027290.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養細胞において、GAS5、IDI2-AS1およびSNHG15から選ばれた１またはそれ以上のRNA分子を高発現させることにより、培養細胞を環境ストレスに対し高感度化する方法。
【請求項２】
RNA分子がGAS5であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
RNA分子がIDI2-AS1またはSNHG15であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
RNA分子がGAS5およびIDI2-AS1であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
RNA分子がGAS5およびSNHG15であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
培養細胞が哺乳動物の培養細胞であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
環境ストレスが化学物質による環境ストレスであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
環境ストレスが紫外線による環境ストレスであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法により、環境ストレスに対し高感度化された培養細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の培養細胞を用いることを特徴とする、環境ストレスの評価方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の培養細胞を備えることを特徴とする、環境ストレスの評価装置。
【請求項１２】
哺乳動物細胞に環境ストレスを加え、哺乳動物細胞内において分解速度が速いノンコーディングRNA分子について、その発現量が増加するRNA分子を同定し、当該RNA分子が環境ストレスに対し細胞を高感度化するか否かを検定することを特徴とする、細胞を環境ストレスに対し高感度化するRNA分子のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生命科学分野，環境分析分野の技術に関し、特に、培養細胞を用いた環境ストレスの生物学的影響の評価方法の技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学物質を代表とする環境ストレスの生物学的影響の評価法(バイオアッセイ)として、マウスなどを用いた動物実験を代替するために、哺乳動物等の培養細胞を用い、細胞増殖率や細胞生存率を測定することで環境ストレスを評価する方法が知られている。しかしながら、この方法では、培養細胞が環境ストレスに応答して、最終的に細胞死などの表現型を示すまでには時間がかかるため、本測定を高感度化することが求められていた。
【０００３】
この問題点を解決する方法として、生体内外の異物の代謝に関与するUGT(UDPグルクロン酸転移酵素)に対して、RNA干渉法を用いてその遺伝子発現を抑制することで、細胞における化学物質の細胞毒性評価の高感度化を実現した方法が報告されている(特許文献１)。しかしながら、RNA干渉法は目的の遺伝子以外の発現をも抑制させてしまう副作用が起こることが知られており、また、使用する2本鎖siRNAは大変高価である。
【０００４】
また、特定の化学物質により発現が誘導されることが知られているタンパク質(例えばリポ多糖により発現が誘導されるHSP90βタンパク質等)のプロモーター配列を利用して、当該プロモーターの下流にルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を導入した配列を細胞内に導入することで、培養細胞における当該特定の化学物質の存在を鋭敏に検出し、これによって細胞毒性評価の高感度化を実現した方法(レポーターアッセイ法)が多数報告されている(特許文献２、３)。しかしながら、これらの方法は、特定の化学物質に応答する特定のプロモーターの特性を利用し、当該特定の化学物質の存在を個別に測定するためのものであり、様々な種類の環境ストレスの存在を測定するためには、それらのストレスに応答する仕組みを、それぞれ個別に構築する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2010-265190号
【特許文献２】国際公開2007/004361号
【特許文献３】特開2011-087497号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Mourtada-Maarabouni et al., Oncogene 28,195-208, 2009
【非特許文献２】Kino et al., Sci Signal. 3, ra8, 2010
【非特許文献３】Tani et al., Genome Res. 22, 947-956, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記哺乳動物等の培養細胞を用いる環境ストレスの評価法を高感度化するにあたり、上述の副作用などの問題のあるRNA干渉法を使用せず、また、レポーターアッセイ法のようにある特定の化学物質の存在を個別に測定するのではなく、培養細胞を、環境ストレスに対し総合的に高感度化させるための手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、哺乳動物等の培養細胞において、GAS5および／またはこれと同様の機能を有するRNA分子を高発現させることにより、培養細胞が、化学物質、紫外線などの環境ストレスに対し高感度化されることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
ヒト培養細胞内において、アポトーシス(細胞死)抑制遺伝子の発現制御に関与するGAS5(Growth arrest-specific 5)遺伝子のRNA発現量を増加させることで、細胞がアポトーシスを起こしやすくなることが報告されている(非特許文献１、２)。
本発明者らは、このことを培養細胞による各種環境ストレスの評価に利用することができるのではないかとの発想の下、検討した結果、哺乳動物の培養細胞においてGAS5のRNA発現量を増加させることにより、Mercury(II)Chloride、Cycloheximideなどの環境ストレスとされる化学物質に対し、培養細胞が、より迅速かつ鋭敏に反応し、高感度化することを見出した(図４)。
【００１０】
また、本発明者らは、先に、哺乳動物の細胞内では、タンパク質をコードしないノンコーディングRNAが多種類、発現しており、これらは細胞内で分解速度が速いものとそうでないものに大別できること、そして、このようなノンコーディングRNAの一つであるGAS5は細胞内で分解速度が速いことを見出している(非特許文献３)。
このようなノンコーディングRNAの多くはその機能が未だ知られていないが、本発明者らは、これらの中には、GAS5と同様の機能を有するものが含まれているのではないかとの発想の下、上記細胞内で分解速度が速いRNAについて、細胞の環境ストレスへの感受性に関しGAS5と同様の機能を有するものを探索した。
【００１１】
探索は、以下のように行った。
すなわち、GAS5は飢餓細胞において発現量が増加することが知られている。そこで、哺乳動物細胞であるHEK293細胞にモデル化学物質の暴露を行い、細胞内で分解速度が速いことが報告されている機能未知のノンコーディングRNAについて、GAS5と同様に発現量が顕著に増加するRNAを特定した(図１および２)。
次いで、特定されたノンコーディングRNAの塩基配列を有するRNAの存在量を細胞内で人工的に増加させることで、細胞が環境ストレスにより細胞死を起こしやすくなることを確認した。
具体的には、組換えDNAの手法により上述の特定のノンコーディングRNAの塩基配列を有する核酸を含んだ発現プラスミドベクターを作製し、核酸導入試薬等の使用により哺乳動物細胞内に発現プラスミドベクターを導入し、一定時間を経ることで、哺乳動物細胞内で当該特定の塩基配列を有する核酸の発現量を通常の細胞よりも数倍以上に増加させた(図３〜５)。その後、これらの特定の塩基配列を有する核酸の存在量が通常の細胞よりも数倍以上に増加した細胞が、通常の培養条件下では、細胞増殖率について通常の細胞と有意の差がないことを確認し(図６)、一方、化学物質をはじめとする各種の環境ストレスを与えることで、総じて、通常の細胞よりも迅速かつ高感度に細胞死を測定することができることを確認した(図７〜１０)。
このような手順により、細胞内で分解速度が速い２つのRNA分子、IDI2-AS1およびSNHG15について、細胞の環境ストレスへの感受性に関し、GAS5と同様の機能を有することが確認できた。
また、これらの特定のRNA分子の複数種を組み合わせてその発現量を増加させた細胞について同様の試験を行うことにより、これらを単独で増加させた場合よりもさらに優れた環境ストレスへの感受性を有する細胞が得られることが確認できた(図１１、１２)。
【００１２】
すなわち、この出願は以下の発明を提供するものである。
〈１〉培養細胞において、GAS5、IDI2-AS1およびSNHG15から選ばれた１またはそれ以上のRNA分子を高発現させることにより、培養細胞を環境ストレスに対し高感度化する方法。
〈２〉RNA分子がGAS5であることを特徴とする、〈１〉に記載の方法。
〈３〉RNA分子がIDI2-AS1またはSNHG15であることを特徴とする、〈１〉に記載の方法。
〈４〉RNA分子がGAS5およびIDI2-AS1であることを特徴とする、〈１〉に記載の方法。
〈５〉RNA分子がGAS5およびSNHG15であることを特徴とする、〈１〉に記載の方法。
〈６〉培養細胞が哺乳動物の培養細胞であることを特徴とする、〈１〉〜〈３〉に記載の方法。
〈７〉環境ストレスが化学物質による環境ストレスであることを特徴とする、〈１〉〜〈６〉に記載の方法。
〈８〉環境ストレスが紫外線による環境ストレスであることを特徴とする、〈１〉〜〈６〉に記載の方法。
〈９〉〈１〉〜〈８〉に記載の方法により、環境ストレスに対し高感度化された培養細胞。
〈１０〉〈９〉に記載の培養細胞を用いることを特徴とする、環境ストレスの評価方法。
〈１１〉〈９〉に記載の培養細胞を備えることを特徴とする、環境ストレスの評価装置。
〈１２〉哺乳動物細胞に環境ストレスを加え、哺乳動物細胞内において分解速度が速いノンコーディングRNA分子について、その発現量が増加するRNA分子を同定し、当該RNA分子が環境ストレスに対し細胞を高感度化するか否かを検定することを特徴とする、細胞を環境ストレスに対し高感度化するRNA分子のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、培養細胞内で特定のノンコーディングRNAの塩基配列を有するRNAの存在量を人工的に増加させることで、通常の細胞に比べて、環境ストレスに対して高い感受性を有する機能性細胞を作製することができ、これを用いることにより、各種の環境ストレスによる生物学的影響を迅速かつ高感度で測定し、評価することができる。
本発明によれば、レポーターアッセイ法のようにある特定の化学物質の存在を個別に測定するのではなく、哺乳動物細胞に対する環境ストレスの生物学的影響を総合的に高感度化することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】化学物質の暴露により発現量が顕著に増加するノンコーディングRNAのスクリーニング結果を示す図。
【図２】化学物質の暴露により発現量が顕著に増加するノンコーディングRNAの発現量と化学物質濃度との相関関係を示す図。
【図３】GAS5を組み込んだ発現ベクターによるGAS5の過剰発現を示す図。
【図４】IDI2-AS1を組み込んだ発現ベクターによるIDI2-AS1の過剰発現を示す図。
【図５】SNHG15を組み込んだ発現ベクターによるSNHG15の過剰発現を示す図。
【図６】GAS5、IDI2-AS1、SNHG15の発現量増加による細胞増殖率への影響を示す図。
【図７】GAS5、IDI2-AS1、SNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞におけるシクロヘキシミドの作用を示す図。
【図８】GAS5、IDI2-AS1、SNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における塩化水銀の作用を示す図。
【図９】GAS5、IDI2-AS1、SNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における過酸化水素水の作用を示す図。
【図１０】GAS5、IDI2-AS1、SNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における紫外線の作用を示す図。
【図１１】GAS5、GAS5およびIDI2-AS1、GAS5およびSNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における紫外線の作用を示す図。
【図１２】GAS5、GAS5およびIDI2-AS1、GAS5およびSNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における紫外線の照射後経過時間とその作用の関係を示す図。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００１５】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１６】
（実施例１）化学物質の暴露により発現量が顕著に増加するノンコーディングRNAのスクリーニング(その１)
ヒト細胞株であるHEK293細胞(2×105 cells/12 well plate)に対して、細胞培液に、Cycloheximide(Wako)を0または100μMを添加した系を準備した。それぞれの試薬はDMSOで希釈した。
この状態で、37℃、5％CO2条件下で24時間インキュベートした後、RNAiso plus(TaKaRa)を用いて、細胞回収及びtotal RNA抽出を行った。
得られたtotal RNA 500ngについて、PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)を用いて逆転写反応を行い、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TOYOBO)を用いてリアルタイムPCRを行うことで、先行研究により細胞内で分解速度が速いことが報告されている、機能既知および機能未知を含むノンコーディングRNA ２４種類、並びにGAPDHの発現量を測定し、それぞれのノンコーディングRNAの定量値をGAPDH遺伝子の定量値でノーマライズした(図１)。
その結果、化学物質添加時に、GAS5、IDI2-AS1、SNHG15の３種類のRNAの発現量が、化学物質を添加していないときに比べて8倍以上増加していることがわかった。
なお、リアルタイムPCRで用いたプライマーは以下の通りである。
CDKN2B-AS1 forward primer: 5’- TTGTTAGAAACCAGGCTGCAC -3’
CDKN2B-AS1 reverse primer: 5’- TTCTCTCTTTCTGTGGTTTCTCAAT -3’
HOTAIR forward primer: 5’- CAGTGGGGAACTCTGACTCG -3’
HOTAIR reverse primer: 5’- GTGCCTGGTGCTCTCTTACC -3’
TUG1 forward primer: 5’- CCAGACCCTCAGTGCAAACT -3’
TUG1 reverse primer: 5’- AATCAGGAGGCACAGGACA -3’
GAS5 forward primer: 5’- CTTGCCTGGACCAGCTTAAT -3’
GAS5 reverse primer: 5’- CAAGCCGACTCTCCATACCT -3’
MIR22HG forward primer: 5’- CGGACGCAGTGATTTGCT -3’
MIR22HG reverse primer: 5’- GCTTTAGCTGGGTCAGGACA -3’
FLJ43663 forward primer: 5’- GGGATAATTTGCCATCTGGA -3’
FLJ43663 reverse primer: 5’- CCGTTTCTTCCATTTTCCTCT -3’
LOC100216545 forward primer: 5’- CAGCCAAAATCTGGCCTACT -3’
LOC100216545 reverse primer: 5’- GTCCAGCAATCATTTTCTCGT -3’
LINC00667 forward primer: 5’- AGTTTGCGCCTTTTGGTCT -3’
LINC00667 reverse primer: 5’- GGCCATGTGCAAAGGATTT -3’
HCG18 forward primer: 5’- CTGCCTTCTAGGGGCTCACT -3’
HCG18 reverse primer: 5’- ACATGCTCCACCAACTTTCA -3’
LOC550112 forward primer: 5’- CTGAAATCAGAGCCTGCACA -3’
LOC550112 reverse primer: 5’- TCAAGGACCTGGAAATGACC -3’
LINC00662 forward primer: 5’- GTTTGATTTCTCGCAGACCAG -3’
LINC00662 reverse primer: 5’- GCGAGGTCTAACCCAGGTG -3’
GABPB1-AS1 forward primer: 5’- AGGGAAAGAAAATATGCCATTTCTA -3’
GABPB1-AS1 reverse primer: 5’- ATCATTCCGCCGCTTTCT -3’
FLJ33630 forward primer: 5’- GCAATTATCACGGGAAACCTAT -3’
FLJ33630 reverse primer: 5’- AAATCTTATCTGCTTCCCTATTTGTAA -3’
TTN-AS1 forward primer: 5’- TCCTTAGGCATCACCTAGCC -3’
TTN-AS1 reverse primer: 5’- GATGGAGGAAGTAGAGTCATTGG -3’
LOC728431 forward primer: 5’- CACTCCCTAACCCGTGTCC -3’
LOC728431 reverse primer: 5’- TCCATCAAAGCAGCCAGAC -3’
LINC00473_v1 forward primer: 5’- TATGCGCGTCAGCATACTTT -3’
LINC00473_v1 reverse primer: 5’- TGTCCTGTGCCTCCCTGT -3’
LINC00473_v2 forward primer: 5’- TATGCGCGTCAGCATACTTT -3’
LINC00473_v2 reverse primer: 5’- TCTCCCAAAGCACAACGAG -3’
FAM222A-AS1 forward primer: 5’- CAACATGGAAATGGAGACCA -3’
FAM222A-AS1 reverse primer: 5’- CTTCCGGGATCCCAGTGT -3’
LINC00152 forward primer: 5’- GAGCCACCAGCCTCTCCT -3’
LINC00152 reverse primer: 5’- AAAAACGATCTTGCCGACAC -3’
LINC0541471_v1 forward primer: 5’- CAGATCTTCACAGCACAGTTCC -3’
LINC0541471_v1 reverse primer: 5’- TGCTGATCCACTTTGCTTGT -3’
LINC0541471_v2 forward primer: 5’- CACCAGCCTCTCCCTGAA -3’
LINC0541471_v2 reverse primer: 5’- TTCGATCAAGTGTGTCATAGAGC -3’
IDI2-AS1 forward primer: 5’- GTGTTAAACAAGACAACGCTGAA -3’
IDI2-AS1 reverse primer: 5’- AAGAGCGCTGGAAAAACCTT -3’
SNHG15 forward primer: 5’- GCAACTCCTTTGCAAGATGC -3’
SNHG15 reverse primer: 5’- CTCAAGGAGGGACCTCAGC -3’
ZFP91-CNTF forward primer: 5’- TTGTTCATACTTGGCGGTGA -3’
ZFP91-CNTF reverse primer: 5’- GGCGGGCCTAATCATTTT -3’
GAPDH forward primer: 5’- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3’
GAPDH reverse primer: 5’- TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3’
【００１７】
（実施例２）化学物質の暴露により発現量が顕著に増加するノンコーディングRNAのスクリーニング(その２)
実施例１において化学物質添加時にRNAの発現量が顕著に増加した、GAS5、IDI2-AS1、SNHG15の3種について、それらの発現量と化学物質の添加量との相関性をさらに詳細に調べた。
ヒト細胞であるHEK293細胞(2×105 cells/12 well plate)に対して、細胞培液に、Cycloheximide(Wako)を0、1、10、または100μM添加した系を、それぞれ準備した。それぞれの試薬はDMSOで希釈した。
この状態で、37℃、5％CO2条件下で24時間インキュベートした後、RNAiso plus(TaKaRa)を用いて、細胞回収及びtotal RNA抽出を行った。得られたtotal RNA 500ngを、PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)を用いて逆転写反応を行い、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TOYOBO)を用いてリアルタイムPCRを行うことで、機能既知のノンコーディングRNAであるGAS5、機能未知のノンコーディングRNAであるIDI2-AS1およびSNHG15、並びにGAPDHの発現量を測定し、それぞれのノンコーディングRNAの定量値をGAPDH遺伝子の定量値でノーマライズした(図２)。
その結果、上記のGAS5、IDI2-AS1、SNHG15の３種類のRNAの発現量は、それぞれ化学物質濃度依存的に増加していることがわかった。
さらに、これらのRNAの配列の共通性を探索した結果、RNAの不安定性に寄与するとされているAU-rich element(AUUUAモチーフ)を、GAS5は１つ、IDI2-AS1は１つ、SNHG15は２つ、3’側に有している事を見出した。従って、これらのRNAは配列に共通性を有する。
【００１８】
（実施例３）GAS5を組み込んだ発現ベクターによるGAS5の過剰発現
哺乳動物細胞用発現ベクターであるpcDNA3.1(+)(Invitrogen)を用いて、T7プロモーター直下にヒトのGAS5の塩基配列(NCBI番号：NR_002578の1塩基目から631塩基目まで)を組み込んだベクターを作製した。
GAS5が挿入されたベクターおよびGAS5が挿入されていないベクター(Mockベクター)2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(106 cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO2条件下で48時間インキュベートした後、RNAiso plus(TaKaRa)を用いて、細胞回収及びtotal RNA抽出を行った。
得られたtotal RNA 500ngについて、PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)を用いて逆転写反応を行い、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TOYOBO)を用いてリアルタイムPCRを行うことで、GAS5およびGAPDHの発現量を測定し、GAS5の定量値をGAPDHの定量値でノーマライズした(図３)。
その結果、GAS5が挿入されていないベクターを導入したものに比べ、GAS5が挿入されたベクターを導入したものでは、GAS5が約66倍高く発現していることがわかった。
【００１９】
（実施例４）IDI2-AS1を組み込んだ発現ベクターによるIDI2-AS1の過剰発現
哺乳動物細胞用発現ベクターであるpcDNA3.1(+)(Invitrogen)を用いて、T7プロモーター直下にヒトのIDI2-AS1の塩基配列(NCBI番号：NR_024628の1塩基目から1088塩基目まで)を組み込んだベクターを作製した。
IDI2-AS1が挿入されたベクターおよびIDI2-AS1が挿入されていないベクター(Mockベクター)2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(106 cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO2条件下で48時間インキュベートした後、RNAiso plus(TaKaRa)を用いて、細胞回収及びtotal RNA抽出を行った。
得られたtotal RNA 500ngについて、PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)を用いて逆転写反応を行い、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TOYOBO)を用いてリアルタイムPCRを行うことで、IDI2-AS1およびGAPDHの発現量を測定し、IDI2-AS1の定量値をGAPDHの定量値でノーマライズした(図４)。
その結果、IDI2-AS1が挿入されていないベクターを導入したものに比べ、IDI2-AS1が挿入されたベクターを導入したものでは、IDI2-AS1が約41497倍高く発現していることがわかった。
【００２０】
（実施例５）SNHG15を組み込んだ発現ベクターによるSNHG15の過剰発現
哺乳動物細胞用発現ベクターであるpcDNA3.1(+)(Invitrogen)を用いて、T7プロモーター直下にヒトのSNHG15の塩基配列(NCBI番号：NR_003697の1塩基目から808塩基目まで)を組み込んだベクターを作製した。
SNHG15が挿入されたベクターおよびSNHG15が挿入されていないベクター(Mockベクター)2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(106 cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO2条件下で48時間インキュベートした後、RNAiso plus(TaKaRa)を用いて、細胞回収及びtotal RNA抽出を行った。
得られたtotal RNA 500ngについて、PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)を用いて逆転写反応を行い、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TOYOBO)を用いてリアルタイムPCRを行うことで、SNHG15およびGAPDHの発現量を測定し、SNHG15の定量値をGAPDHの定量値でノーマライズした(図５)。
その結果、SNHG15が挿入されていないベクターを導入したものに比べ、SNHG15が挿入されたベクターを導入したものでは、SNHG15が約56倍高く発現していることがわかった。
【００２１】
（実施例６）GAS5、IDI2-AS1、SNHG15の発現量増加による細胞増殖率への影響
実施例３、４、５で用いたGAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターおよび空ベクター2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(106 cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO2条件下で4時間インキュベートした後、細胞を60mm dishから96 well plateに植え替えた。
また、実施例３で用いたGAS5が挿入されたベクター2.5μg、実施例３で用いたGAS5が挿入されたベクター2.5μgおよび実施例４で用いたIGIDI2-AS1が挿入されたベクター2.5μg、実施例３で用いたGAS5が挿入されたベクター2.5μgおよび実施例４で用いたSNHG15が挿入されたベクター2.5μg、および空ベクター2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(106 cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO2条件下で4時間インキュベートした後、細胞を60mm dishから96 well plateに植え替えた。
続いて、37℃、5％CO2条件下で0、24、48、または72時間インキュベートした後、Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて生細胞カウントを行った(図６Ａおよび図６Ｂ)。n=4で実験を行った。
その結果、GAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターを導入したもの、及びGAS5、GAS5およびIDI2-AS1、GAS5およびSNHG15が挿入されたベクターを導入したものは、空ベクターを導入したものに比べて、いずれも細胞増殖率に統計的に有意な差はみられなかった(t-test：p>0.01)。
【００２２】
（実施例７）GAS5、IDI2-AS1、SNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞におけるシクロヘキシミドの作用
実施例３、４、５で用いたGAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターおよび空ベクター2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(106 cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO2条件下で4時間インキュベートした後、細胞を60mm dishから96 well plateに植え替えた。
続いて、37℃、5％CO2条件下で20時間インキュベートした後、細胞培液にシクロヘキシミド(Wako)を0、1、10または100μM添加した。それぞれの試薬はDMSOで希釈した。その後、37℃、5％CO2条件下で24時間インキュベートした後、Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて生細胞カウントを行った(図７)。n=4で実験を行った。
その結果、GAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターを導入したものについて、それぞれ、空ベクターを導入したものに比べ、生細胞の数の減少が見られ、特にGAS5が挿入されたベクターを導入したものでは、シクロヘキシミドの添加量が1μMにおいてすでに生細胞の数が統計的に有意に減少していることがわかった(t-test：p<0.01)。
【００２３】
（実施例８）GAS5、IDI2-AS1、SNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における塩化水銀の作用
実施例３、４、５で用いたGAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターおよび空ベクター2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(106 cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO2条件下で4時間インキュベートした後、細胞を60mm dishから96 well plateに植え替えた。
続いて、37℃、5％CO2条件下で20時間インキュベートした後、細胞培液に塩化水銀(Mercury (II) Chloride)を0、0.1、1、または10μg/mL添加した。それぞれの試薬はDMSOで希釈した。その後、37℃、5％CO2条件下で24時間インキュベートした後、Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて生細胞カウントを行った(図８)。n=4で実験を行った。
その結果、塩化水銀の添加量1μg/mLにおいて、GAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターを導入したものについて、それぞれ、空ベクターを導入したものに比べ、生細胞の数が統計的に有意に減少していることがわかった(t-test：p<0.01)。
【００２４】
（実施例９）GAS5、IDI2-AS1、SNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における過酸化水素水の作用
実施例３、４、５で用いたGAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターおよび空ベクター2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(106 cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO2条件下で4時間インキュベートした後、細胞を60mm dishから96 well plateに植え替えた。
続いて、37℃、5％CO2条件下で20時間インキュベートした後、細胞培液に過酸化水素水(H2O2)を0、20、40、60または80μM添加した。それぞれの試薬は水で希釈した。その後、37℃、5％CO2条件下で24時間インキュベートした後、Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて生細胞カウントを行った(図９)。n=4で実験を行った。
その結果、GAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターを導入したものについて、それぞれ、過酸化水素水の添加量が20μMにおいて、すでに、空ベクターを導入したものに比べ、生細胞の数が統計的に有意に減少していることがわかった(t-test：p<0.01)。
【００２５】
（実施例１０）GAS5、IDI2-AS1、SNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における紫外線の作用
実施例３、４、５で用いたGAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターおよび空ベクター2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(106 cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO2条件下で4時間インキュベートした後、細胞を60mm dishから96 well plateに植え替えた。
続いて、37℃、5％CO2条件下で20時間インキュベートした後、細胞培液に紫外線を0、20,000、40,000、60,000または80,000 μJ/cm2照射した後、培地交換を行った。その後、37℃、5％CO2条件下で24時間インキュベートした後、Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて生細胞カウントを行った(図１０)。n=4で実験を行った。
その結果、GAS5またはIDI2-AS1が挿入されたベクターを導入したものについて、それぞれ、空ベクターを導入したものに比べ、生細胞の数の減少が見られ、特にIDI2-AS1が挿入されたベクターを導入したものでは、紫外線強度40,000μJ/cm2において、すでに生細胞の数が統計的に有意に減少していることがわかった(t-test：p<0.01)。
【００２６】
（実施例１１）GAS5、GAS5およびIDI2-AS1、GAS5およびSNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における紫外線の作用
実施例３で用いたGAS5が挿入されたベクター2.5μg、実施例３で用いたGAS5が挿入されたベクター2.5μgおよび実施例４で用いたIGIDI2-AS1が挿入されたベクター2.5μg、実施例３で用いたGAS5が挿入されたベクター2.5μgおよび実施例４で用いたSNHG15が挿入されたベクター2.5μg、および空ベクター2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(106 cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO2条件下で4時間インキュベートした後、細胞を60mm dishから96 well plateに植え替えた。
続いて、37℃、5％CO2条件下で20時間インキュベートした後、細胞培液に紫外線を0、20,000、40,000、60,000または80,000μJ/cm2照射した後、培地交換を行った。その後、37℃、5％CO2条件下で24時間インキュベートした後、Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて生細胞カウントを行った(図１１)。n=4で実験を行った。
その結果、GAS5が挿入されたベクター、GAS5が挿入されたベクター及びIDI2-AS1が挿入されたベクター、または、GAS5が挿入されたベクター及びSNHG15が挿入されたベクターを導入したものについて、それぞれ、空ベクターを導入したものに比べ、生細胞の数の減少が見られ、特にGAS5が挿入されたベクター及びIDI2-AS1が挿入されたベクター、または、GAS5が挿入されたベクター及びSNHG15が挿入されたベクターを導入したものでは、20,000μJ/cm2から80,000μJ/cm2において、空ベクターやGAS5が挿入されたベクターを導入したものでは生細胞の数が90％以上に対して、それぞれ、生細胞の数が50％以下であり、統計的に有意に減少していることがわかった(t-test：p<0.01)。このように、紫外線については、GAS5が挿入されたベクターを単独導入したものに比べて、GAS5が挿入されたベクター及びIDI2-AS1が挿入されたベクター、または、GAS5が挿入されたベクター及びSNHG15が挿入されたベクターを導入したもので、生細胞の数が顕著に減少していることがわかった。
【００２７】
（実施例１２）GAS5、GAS5およびIDI2-AS1、GAS5およびSNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における紫外線の照射後経過時間とその作用の関係
実施例１１と同様に、各ベクターをHEK293細胞(106 cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO2条件下で4時間インキュベートした後、細胞を60mm dishから96 well plateに植え替えた。
続いて、37℃、5％CO2条件下で20時間インキュベートした後、細胞培液に紫外線を80,000 μJ/cm2照射した。その後、37℃、5％CO2条件下で0、6、24時間インキュベートした後、Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて生細胞カウントを行った(図１２)。n=4で実験を行った。
その結果、GAS5が挿入されたベクター及びIDI2-AS1が挿入されたベクターを導入したもの、および、GAS5が挿入されたベクター及びSNHG15が挿入されたベクターを導入したものでは、空ベクターを導入したものに比べて、6時間の時点ですでに生細胞の数が統計的に有意に減少していることがわかった(t-test：p<0.01)。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明の方法は、環境ストレスが生体に与える影響について迅速かつ高感度で、総合的な知見を得ることができ、環境ストレスについての診断分野、検査分野、研究分野などにおいて使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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