(57)【要約】【課題】被検物質の測定精度を向上させることが可能な被検物質の測定方法及び被検物質測定キットを提供する【解決手段】被検物質測定キット１０は、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された蛍光粒子Ｐ１と、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された非蛍光粒子Ｐ２と、被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定される第一の金属膜１１と、被検物質と結合性を有さず、第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定され、第一の金属膜１１よりも厚みの薄い第二の金属膜１２とが形成された基板１と、を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、標識を有する第一の乾燥粒子と、
前記被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された第二の乾燥粒子と、
前記被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は、前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質が固定される第一の金属膜と、前記被検物質と結合性を有さず、第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定され、前記第一の金属膜よりも厚みの薄い第二の金属膜とが形成された基板と、を備える被検物質測定キット。
【請求項２】
請求項１記載の被検物質測定キットであって、
前記第二の乾燥粒子は、標識を有さず、
前記第四の結合物質は、前記第一の結合物質及び前記第二の結合物質の各々に対して結合性を有する被検物質測定キット。
【請求項３】
請求項１又は２記載の被検物質測定キットであって、
前記第一の金属膜の平均厚みが３５ｎｍ以上４２ｎｍ以下であり、
前記第二の金属膜の平均厚みが２４ｎｍ以上３２ｎｍ以下である被検物質測定キット。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の被検物質測定キットであって、
前記第一の乾燥粒子の平均粒子径が１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、
前記第二の乾燥粒子の平均粒子径が１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下である被検物質測定キット。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の被検物質測定キットであって、
前記第一の金属膜と前記第二の金属膜が金を含む被検物質測定キット。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の被検物質測定キットであって、
前記第三の結合物質と前記第四の結合物質が抗体である被検物質測定キット。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の被検物質測定キットであって、
前記第一の乾燥粒子が蛍光ラテックス粒子であり、
前記第二の乾燥粒子がラテックス粒子である被検物質測定キット。
【請求項８】
被検物質と、前記被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、標識を有する第一の乾燥粒子と、前記被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された第二の乾燥粒子とを含む溶液を、
前記被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質又は前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質が固定された第一の金属膜、及び、前記被検物質と結合性を有さず、前記第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定され、前記第一の金属膜よりも厚みの薄い第二の金属膜、に接触させる工程と、
前記第一の金属膜及び前記第二の金属膜の各々から前記標識に応じた信号を検出する工程と、
前記第二の金属膜から検出した信号を用いて前記第一の金属膜から検出した信号を補正する工程と、を備える被検物質の測定方法。
【請求項９】
請求項８記載の被検物質の測定方法であって、
前記第二の乾燥粒子は、標識を有さず、
前記第四の結合物質は、前記第一の結合物質及び前記第二の結合物質の各々に対して結合性を有する被検物質の測定方法。
【請求項１０】
請求項８又は９記載の被検物質の測定方法であって、
前記第一の金属膜の平均厚みが３５ｎｍ以上４２ｎｍ以下であり、
前記第二の金属膜の平均厚みが２４ｎｍ以上３２ｎｍ以下である被検物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不溶性担体を使用し抗原抗体反応などに基づいて被検物質を測定するための被検物質測定キット及び被検物質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
被検物質に含まれるタンパク質、酵素、及び無機化合物等を定量するための高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する被検物質を含むと考えられる被検試料に上記特定波長の励起光を照射した際に発する蛍光を検出することによって被検物質の存在を確認する方法である。また、被検物質が蛍光体でない場合には、蛍光色素で標識されて被検物質と特異的に結合する物質を被検試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、被検物質の存在を確認することも広くなされている。
【０００３】
このような蛍光検出法において、検出の感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が知られている。この方法では、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属膜を設けたセンサチップを用意する。そして、支持体と金属膜との界面に対して支持体における金属膜形成面の反対面側から全反射角以上の角度で励起光を入射させる。この励起光の照射により金属膜に表面プラズモンが発生し、この表面プラズモンの発生による電場増強作用によって蛍光が増強され、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が向上することとなる。表面プラズモン励起による蛍光検出法（以下、「ＳＰＦ法」とする）は、落射励起による蛍光検出法と比較して約１０倍の信号増強度が得られ、高感度に測定することができる。
【０００４】
このようなＳＰＦ法の例として、特許文献１には、測定領域とリファレンス測定領域が形成された誘電体プレートを用いる例が記載されている。測定領域とリファレンス測定領域は、厚みの異なる金属膜で構成され、測定領域の金属膜上には被検物質と特異的に結合する物質が固定され、リファレンス測定領域の金属膜上には何も物質が固定されていない構成となっている。
【０００５】
従来のＳＰＦ法を利用した免疫診断システムでは、測定時の誤差や、製品に含まれる試薬量等のバラツキを軽減するために、被検物質に反応する測定領域のシグナル値を、被検試料の量に比例する補正領域のシグナル値で補正して測定精度を上げる方法が採用されている。
【０００６】
例えば、特許文献２には、被検物質と結合できる第１の結合物質、及び、第１の結合物質に結合性を有する第２の結合物質と結合できかつ被検物質と結合しない第３の結合物質を結合させた蛍光粒子を被検試料に混ぜた溶液を作成し、この溶液を、第１の結合物質及び第３の結合物質とは結合せず、被検物質とは結合する第４の結合物質を固定した測定領域、及び、第２の結合物質を固定した補正領域が形成された流路に流し込み、測定領域で検出されるシグナルを補正領域で検出されるシグナルを用いて補正することで、補正領域のシグナル値と測定領域のシグナル値の温度依存性の差を小さくする技術が開示されている。
【０００７】
また、特許文献３には、表面プラズモン共鳴を利用したセンサチップにおいて、センサチップの傾きによる検出シグナルの誤差を補正し、正確な濃度分布を可能にする分析装置において、補正領域と測定領域を構成する金属膜の厚みを異ならせる例が開示されている。具体的には、測定領域よりも補正領域の金属膜の厚みを薄くすると共に、測定領域上にのみ被検物質と結合する物質を固定したセンサチップを用いている。
【０００８】
また、被検試料に起因する現象として、被検物質を含まない陰性の被検試料に対しても反応し、陽性となる被検試料が存在し、偽陽性を示す問題が従来から認識されている。
【０００９】
特許文献４には、免疫学的測定方法、特に、凝集を利用した免疫学的測定方法において、０．３〜２．０μｍの感作粒子の非特異的免疫反応を阻止するために０．２μｍ以下の超微粒子を使用して偽陽性を改良する技術が記載されている。
【００１０】
特許文献５には、０．４μｍ以上の感作粒子を用いた免疫凝集反応により被検物質を検出する方法において、ブロッキングに使用する粒子として０．０１μｍ〜０．５μｍの不溶性担体粒子を用いることが記載されている。
【００１１】
特許文献６には、非特異反応の抑制を目的として、特異的に反応する粒子よりも小さい粒子に被検物質と免疫学的に反応しない抗体、または抗原を固定したものを添加する方法が記載されている。
【００１２】
特許文献７には、被検物質に対して免疫学的に反応する抗体あるいは抗原を平均粒子径０．０５〜０．５μｍの担体に担持した免疫測定粒子を使用する免疫測定方法に用いられる非特異反応抑制剤であって、被検物質に対して免疫学的に反応しない抗体または抗原を有機溶媒存在下で担持した不溶性担体からなり、不溶性担体の平均粒子径が担体の平均粒子径よりも小さいことを特徴とする非特異反応抑制剤が記載されている。
【００１３】
特許文献８には、種々の生体分子間における特異的な結合反応と非特異的な結合反応を識別する検出方法において、外径１μｍ以下の粒子により非特異反応の影響を抑止することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００９−０７９９７０号公報
【特許文献２】特開２０１３−０８３６３２号公報
【特許文献３】特開２００３−０５７１７３号公報
【特許文献４】特開昭６０−２５６０５７号公報
【特許文献５】特開２０００−２２１１９６号公報
【特許文献６】特開平１１−３３７５５１号公報
【特許文献７】特開２００７−１２７４３８号公報
【特許文献８】特開２０１０−１９５５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
このように、多量の微粒子を使用することで偽陽性の問題を軽減する技術が知られている。しかし、これらの技術は多量の微粒子を使用するため、特許文献２に記載されているように、測定領域と補正領域のそれぞれにおいて微粒子が固着される可能性のあるシステムにおいては、測定領域と補正領域において、固着される微粒子の数に大きな差が生じることになる。この結果、測定領域と補正領域で屈折率が大きく変化して、励起光の入射角の設計値からのずれに対するプラズモン増強度の変化が、補正領域と測定領域で大きく異なり、補正領域のシグナル値を用いた補正の精度が低下する可能性がある。特許文献２ではこのような課題について認識はない。
【００１６】
また、特許文献１，３に記載された技術は、光検出の対象となる複数の領域に粒子が固着されるものではなく、このような固着粒子数の差に起因する補正精度低下といった課題についての認識はない。
【００１７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、被検物質の測定精度を向上させることが可能な被検物質測定キット及び被検物質の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の被検物質測定キットは、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、標識を有する第一の乾燥粒子と、上記被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された第二の乾燥粒子と、上記被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は、上記第一の結合物質に対して結合性を有する物質が固定される第一の金属膜と、上記被検物質と結合性を有さず、第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定され、上記第一の金属膜よりも厚みの薄い第二の金属膜とが形成された基板と、を備えるものである。
【００１９】
本発明の被検物質の測定方法は、被検物質と、上記被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、標識を有する第一の乾燥粒子と、上記被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された第二の乾燥粒子とを含む溶液を、上記被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質又は上記第一の結合物質に対して結合性を有する物質が固定された第一の金属膜、及び、上記被検物質と結合性を有さず、上記第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定され、上記第一の金属膜よりも厚みの薄い第二の金属膜、に接触させる工程と、上記第一の金属膜及び上記第二の金属膜の各々から上記標識に応じた信号を検出する工程と、上記第二の金属膜から検出した信号を用いて上記第一の金属膜から検出した信号を補正する工程と、を備えるものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、被検物質の測定精度を向上させることが可能な被検物質測定キット及び被検物質の測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施形態である被検物質測定キット１０の概略構成を示す図である。
【図２】図１に示すＩＩ−ＩＩ線断面模式図である。
【図３】被検物質測定キット１０の金属膜付近での作用を説明する図である。
【図４】被検物質測定キット１０を利用して被検物質を測定する被検物質測定装置の概略構成を示す図である。
【図５】励起光入射角のばらつきとプラズモン増強度との関係を説明するための図である。
【図６】厚みの異なる金属膜を形成する方法の一例を示す図である。
【図７】実施例１の測定結果を示す図である。
【図８】実施例２の測定結果を示す図である。
【図９】実施例３の測定結果を示す図である。
【図１０】実施例３の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施形態について図面を参照して説明する。
【００２３】
図１は、本発明の一実施形態である被検物質測定キット１０の概略構成を示す図である。被検物質測定キット１０は、人や動物の血液等の被検試料に含まれる特定の被検物質を検出するために用いられるキットである。図２は、図１に示すＩＩ−ＩＩ線断面模式図である。
【００２４】
被検物質測定キット１０は、基板１と流路形成用部材２とを主体に構成されている。
【００２５】
流路形成用部材２は、図１の例では全体形状がブリッジ状となっている凹部２３が一方の面に形成されている。流路形成用部材２は、この一方の面が基板１の表面と貼り合わせられている。そして、図２に示すように、凹部２３の内壁と基板１とで囲まれる空間により、被検試料を含む溶液を流すための流路が形成される。
【００２６】
流路形成用部材２には、一方の面から他方の面に貫通する流入孔２１及び排出孔２２が形成されている。流入孔２１は、凹部２３の内壁と基板１とで囲まれる空間からなる流路に、被検試料を含む溶液を流し込むためのものである。排出孔２２は、この流路から被検試料を含む溶液を外部に排出するためのものである。
【００２７】
流路形成用部材２の他方の面には、本発明に有用な物質、例えば乾燥粒子の凝集防止に有用な物質（不図示）を保管する容器２４と、被検物質測定キット１０の測定対象としている被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質Ｍ１で修飾され、標識を有する第一の乾燥粒子Ｐ１、及び、被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質Ｍ２で修飾され、標識を有さない第二の乾燥粒子Ｐ２を保管する容器２５とが固定されている。容器２４に保管される物質としては、たとえば、塩化マグネシウムが挙げられる。
【００２８】
第一の乾燥粒子Ｐ１が有する標識の種類は、ＳＰＦ法によって検出することができるものであれば特に限定されないが、好ましくは蛍光物質である。
【００２９】
図２に示すように、基板１には、第一の金属膜１１と第二の金属膜１２が形成されている。具体的には、基板１の表面のうち流路が形成される部分において、この流路に沿って、流入孔２１側から第一の金属膜１１と第二の金属膜１２がこの順に並べて形成されている。本明細書において「基板に形成される」とは、金属膜が基板表面に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して形成されている場合をも含む。第一の金属膜１１及び第二の金属膜１２を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るような物質を用いることができる。プラズモン共鳴を効果的に誘起するためには、第一の金属膜１１及び第二の金属膜１２の材料として金を含むものを用いることが好ましく、全てを金で構成することがより好ましい。
【００３０】
第一の金属膜１１の表面には、被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質Ｍ３が固定されている。第一の金属膜１１により、被検物質量を測定するための測定領域が構成される。
【００３１】
第二の金属膜１２の表面には、被検物質と結合性を有さず、第一の結合物質Ｍ１と第二の結合物質Ｍ２の各々に対して結合性を有する第四の結合物質Ｍ４が固定されている。また、第二の金属膜１２の厚みは、第一の金属膜１１よりも薄くなっている。第二の金属膜１２により、測定領域で測定されたシグナルを補正するため補正領域が構成される。
【００３２】
図３は、被検物質測定キット１０の使用時における第一の金属膜１１及び第二の金属膜１２に捕捉される物質を説明するための図である。図３では、サンドイッチ法による測定方法を採用したときの状態を示している。
【００３３】
被検物質測定キット１０を使用する際は、被検物質を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と、容器２４に保管される物質と、第一の乾燥粒子Ｐ１と、第二の乾燥粒子Ｐ２とを混合した溶液を作製する。被検試料中に被検物質が存在する場合には、この溶液中で、第一の乾燥粒子Ｐ１を修飾する第一の結合物質Ｍ１と被検物質が結合する。そして、この溶液を流入孔２１から流し込み、排出孔２２から流路内の空気吸引を行って流路内で溶液を移動させ、溶液を第一の金属膜１１及び第二の金属膜１２の順に接触させる。
【００３４】
被検試料中に被検物質が存在する場合には、図３に示すように、第一の金属膜１１上の第三の結合物質Ｍ３が、第一の乾燥粒子Ｐ１と結合している被検物質と結合し、被検物質の量に応じた第一の乾燥粒子Ｐ１が第一の金属膜１１上に固定される。
【００３５】
また、第二の金属膜１２上では、第二の金属膜１２上の第四の結合物質Ｍ４が、第一の金属膜１１上に固定されずに通過した第一の乾燥粒子Ｐ１及び第二の乾燥粒子Ｐ２と結合し、第一の乾燥粒子Ｐ１及び第二の乾燥粒子Ｐ２が固定される。
【００３６】
溶液中における被検物質の占める割合は微小であるため、被検物質測定キット１０によれば、第一の金属膜１１上に固定される乾燥粒子の量よりも、第二の金属膜１２上に固定される乾燥粒子の量が遥かに大きくなる。
【００３７】
図４は、被検物質測定装置５０の概略構成を示す図である。
【００３８】
被検物質測定装置５０は、励起光を照射する光源３１を内蔵し、光源３１から照射される励起光を基板１の背面側から基板１と第一の金属膜１１及び第二の金属膜１２との界面に対して所定角度で照射する照明部３０と、励起光の入射によって第一の金属膜１１及び第二の金属膜１２表面から発せられる蛍光を検出するための測定部４０とを備える。測定部４０は、フォトダイオード等の光量検出部４１を含み、光量検出部４１が照明部３０から照射される光を検出しないように、光量検出部４１の前方には光源３１から照射される光をカットする励起光カットフィルタ４２が設けられている。
【００３９】
被検物質測定装置５０は、更に図示しない演算処理部を備える。演算処理部は、光量検出部４１で検出された光量に応じた信号に基づいて、被検物質の量を測定する。具体的には、第一の金属膜１１から発せられた光（図３の第一の乾燥粒子Ｐ１の有する蛍光物質からの蛍光）に応じた情報（シグナル）を、第二の金属膜１２から発せられた光（図３の第一の乾燥粒子Ｐ１の有する蛍光物質からの蛍光）に応じた情報（シグナル）によって補正することで、高い精度で被検物質の量を測定する。
【００４０】
この補正方法の一例としては、測定領域における測定情報値を補正領域における測定情報値で割ることが挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば、補正領域における測定情報値に対応する変換係数を関係式から算出して測定領域における測定情報値を補正することもでき、測定領域における測定情報値から補正領域における測定情報を引くことによって補正を行うこともできる。
【００４１】
この被検物質測定装置５０では、照明部３０から基板１と第一の金属膜１１及び第二の金属膜１２との界面に照射する励起光の入射角を高精度に決めておく必要がある。しかし、実際の装置では、組み立て誤差や製造誤差等により、この入射角が設計値からずれた状態となることがある。
【００４２】
図５は、励起光の入射角が設計値からずれた場合に、どれだけプラズモン増強度が変化するかを検討した結果を示す図である。図５の横軸は、励起光の入射角の設計値からのずれ量を示している。
【００４３】
図５には、３つの波形を示している。実線で示す波形は、励起光を照射する金属膜の厚みを第一の値とし、この金属膜上に捕捉される乾燥粒子の数を第二の値としたときのプラズモン増強度の変化を示している。
【００４４】
一点鎖線で示す波形は、励起光を照射する金属膜の厚みを第一の値よりも小さい値とし、この金属膜上に捕捉される乾燥粒子の数を第二の値よりも少なくしたときのプラズモン増強度の変化を示している。
【００４５】
破線で示す波形は、励起光を照射する金属膜の厚みを第一の値よりも大きい値とし、この金属膜上に捕捉される乾燥粒子の数を第二の値よりも多くしたときのプラズモン増強度の変化を示している。
【００４６】
図５に示すように、プラズモン増強度の特性波形は、金属膜の厚みと固着粒子数によって変化することが分かる。
【００４７】
上述したように、被検物質測定キット１０によれば、第一の金属膜１１上に固着される乾燥粒子の量よりも、第二の金属膜１２上に固着される乾燥粒子の量が遥かに大きくなる。このため、第一の金属膜１１と第二の金属膜１２の厚みが同じと仮定すると、第一の金属膜１１におけるプラズモン増強度の特性が図５の実線波形で示すものであった場合、第二の金属膜１２におけるプラズモン増強度の特性は図５の実線波形よりも左側にシフトすることになり、補正領域の情報を用いた補正を精度良く行うことができない。
【００４８】
そこで、被検物質測定キット１０では、補正領域を構成する第二の金属膜１２の膜厚を、測定領域を構成する第一の金属膜１１の膜厚よりも薄くすることで、固着粒子数の差に起因する補正精度の低下を防ぐようにしている。すなわち、補正領域と測定領域とで、図５に示したプラズモン増強度の変化を示す波形がほぼ一致するように、第一の金属膜１１と第二の金属膜１２の膜厚を決めている。これにより、励起光の入射角が設計値からずれた場合でも、補正領域と測定領域でプラズモン増強度に大きな差が生じることはなく、高い精度で被検物質を検出することができる。
【００４９】
第一の金属膜１１と第二の金属膜１２の膜厚は、表面プラズモン現象を十分に検出できるものであれば特に制限はないが、第一の金属膜１１の平均膜厚を３５ｎｍ以上４２ｎｍ以下とし、第二の金属膜１２の平均膜厚を２４ｎｍ以上３２ｎｍ以下とするのが、励起光の入射角変動や金属膜の膜厚変動を起因とした補正精度低下を防ぐ上で好ましい。
【００５０】
第一の金属膜１１の平均膜厚と第二の金属膜１２の平均膜厚の差は、第二の金属膜１２にどの程度の粒子を固着させるかによるが、第一の金属膜１１の平均膜厚の１０％以上とするのが好ましい。第一の金属膜１１と第二の金属膜１２の平均膜厚は、５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができないため、５００ｎｍ以下としておくのがよい。金属膜の平均膜厚は、分光エリプソメーターにより測定することができる。また、分光エリプソメーターの測定値を基にして、分光光度計を用いた透過率との対応表を作成し、分光光度計の透過率から換算して求めることもできる。また、その他の方法としては、金属膜を作製終了した基板の切片を電子顕微鏡で観察して膜厚を測定する方法を用いることも可能である。
【００５１】
以下、被検物質測定キット１０の各構成要素等について詳細に説明する。
【００５２】
（被検物質）
被検物質測定キット１０の検出対象である被検物質の種類は特に限定されないが、例えば、コルチゾール、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合蛋白３型（ＩＧＦＢＰ−３）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）、成長ホルモン（ＧＨ）、尿中ＧＨ、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、プロラクチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、ＴＳＨ刺激性レセプター抗体（ＴＳＡｂ）、チロキシン（Ｔ４）、抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体（抗ＴＰＯ抗体）、マイクロゾーム抗体、抗サイログロブリン抗体、サイログロブリン、トリヨードチロニン（Ｔ３）、ｆＴ４、ｆＴ３、１，２５−（ＯＨ）２ビタミンＤ、Ｉ型コラーゲン架ＮＮ−テロペプチド（ＮＴｘ）、インタクトＩ型プロコラーゲン−Ｎ−プロペプチド（Ｉｎｔａｃｔ  ＰＩＮＰ）、オステオカルシン、カルシトニン、骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）、デオキシピリジノリン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）、Ｌ−ドーパ、３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニルエチレングリコール（ＭＨＰＧ）、バニリルマンデル酸（ＶＭＡ）、カテコールアミン、セロトニン、メタネフリン、１１−デオキシコルチゾール、１７−ケトジェニックステロイド（１７−ＫＧＳ）、１７−ＯＨプレグネノロン、アルドステロン、アンドロステロン、アンドロステンジオン、１１−ヒドロキシコルチコステロイド（１１−ＯＨＣＳ）、コルチコステロン、コルチゾン、デオキシコルチコステロン（ＤＯＣ）、デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）、プレグネノロン、５αジヒドロテストステロン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）βサブユニット、エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール（Ｅ３）、エストロゲン、エストロン（Ｅ１）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、テストステロン、プレグナンジオール、プレグナントリオール、プロゲステロン、Ｃペプチド（ＣＰＲ）、血管作動性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、インスリン、ガストリン、グルカゴン、抗グルタミン酸脱炭酸酵素抗体（抗ＧＡＤ抗体）、抗インスリノーマ抗原２抗体（抗ＩＡ−２抗体）、抗インスリン抗体、心筋トロポニンＴ、心室筋ミオシン軽鎖Ｉ、ヒト心臓由来脂肪酸結合蛋白（Ｈ−ＦＡＢＰ）、ヒト心房性利尿ペプタイド（ＨＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｎ端フラグメント（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）、ミオグロビンなどを挙げることができる。被検物質の特に好ましい一例としては、ＴＳＨである。
【００５３】
（基板）
基板１としては、ＳＰＦ法で用いることができるものであれば何でもよい。例えば、一般的な光学ガラスの一種であるＢＫ７（ホウ珪酸ガラス）等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００５４】
（金属膜）
第一の金属膜１１及び第二の金属膜１２を構成する金属として、好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられる。これらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。
【００５５】
測定領域および補正領域を構成する金属膜の作製において、基板に対し金属膜をスパッタリングなどで成膜する際、補正領域と測定領域とで膜厚を独立に制御する方法としては、特に制限はないが、図６に示すように、それぞれの領域にのみ成膜可能なマスクＭを用意し、各々のマスクＭを用い所定の膜厚となるよう基板１に対し複数回の成膜を行うことで膜厚を制御する方法を採用することができる。
【００５６】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタリング法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができるが、金属膜を作製する基板との良好な密着を実現するために、スパッタリング法により金属膜を形成することが好ましい。また、金属膜を形成する基板への付着性を考慮して、基板と金属膜との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００５７】
（第三の結合物質Ｍ３）
第三の結合物質Ｍ３としては、被検物質を補足できる限り、特に限定されるものではないが、好ましい例としては、抗原、抗体、又はこれらの複合体があげられ、抗体を用いることが好ましい。第三の結合物質Ｍ３が抗体である場合は、被検物質に対して特異性を有する抗体として、例えば、その被検物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被検物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
【００５８】
抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ハムスターＩｇＭ、ウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナルもしくはモノクローナルの両方に適用可能である。断片化抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。
【００５９】
抗体や抗原などの結合物質を粒子に固定化する方法は、例えば、特開２０００−２０６１１５号公報やモレキュラープローブ社ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）ポリスチレンマイクロスフィアＦ８８１３に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、結合物質として抗体を粒子に固定化する原理として、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を粒子に固定させた後に抗体が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
【００６０】
（第四の結合物質Ｍ４）
第四の結合物質Ｍ４としては、例えば、結合物質（抗体）に対する抗体、結合物質（抗体）に対して結合するタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ）など、第一の結合物質Ｍ１と第二の結合物質Ｍ２に対して親和性を持つ化合物を好ましく用いることができ、中でも抗体を好ましく用いることができる。また、標識を有する第一の乾燥粒子Ｐ１に結合した第一の結合物質Ｍ１の一部が、第四の結合物質Ｍ４とリガンド−非リガンドの関係となる化合物を好ましく用いることができる。抗体などの第四の結合物質Ｍ４を基板に固定化する方法は、例えば、Ｎｕｎｃ社の提供するＴｅｃｈ  Ｎｏｔｅｓ  Ｖｏｌ．  ２−１２などに記載されており、一般的なＥＬＩＳＡ試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、基板上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）などを配することによる表面修飾を施しても良く、第四の結合物質Ｍ４としての抗体を基板に固定化する原理としては、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を基板に固定させた後に抗体が被覆されていない基板表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
【００６１】
（乾燥粒子）
第一の乾燥粒子Ｐ１と第二の乾燥粒子Ｐ２は、乾燥状態で容器２４，２５に保存され、測定時に被検物質を含む溶液と混合することによって、液に分散した状態で使用される。これらの乾燥粒子を、乾燥させずに溶液状態で容器２５内に保存した場合、粒子同士が凝集や融着することにより大サイズ化し、測定精度が変化する場合があるため、第一の乾燥粒子Ｐ１及び第二の乾燥粒子Ｐ２は乾燥状態で保存されている。ここで乾燥状態とは、乾燥重量に占める水分の割合が３０％以下である状態であり、好ましくは２０％以下、より好ましくは、１５％以下の状態である。測定の再現性を良好に保つために、第一の乾燥粒子Ｐ１と第二の乾燥粒子Ｐ２の平均粒子径は、それぞれ１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましい。粒子の平均粒子径が２００ｎｍ以下であれば、被検物質を含む溶液と混合したときに良好な分散性を実現でき、非特異吸着物質が原因と考えられる免疫反応を抑制し、偽陽性の防止能力の再現性を維持することが可能となる。また、粒子の平均粒子径が１００ｎｍ以上であれば、良好なシグナル感度を実現できる。第一の乾燥粒子Ｐ１と第二の乾燥粒子Ｐ２の平均粒子径は、１００ｎｍ以上１９０ｎｍ以下であることがより好ましく、１３０ｎｍ以上１８０ｎｍ以下であることが更に好ましい。
【００６２】
第一の乾燥粒子Ｐ１と第二の乾燥粒子Ｐ２の使用比率については、第一の乾燥粒子Ｐ１に対する第二の乾燥粒子Ｐ２の質量比が１〜６であることが好ましく、２〜６であることが更に好ましい。このようにすることで偽陽性の防止能力を高めることができる。
【００６３】
（平均粒子径の測定方法）
第一の乾燥粒子Ｐ１と第二の乾燥粒子Ｐ２の平均粒子径は、市販の粒度分布計等で計測することができる。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。
【００６４】
粒子径範囲及び測定の容易さから、本発明においては動的光散乱法を好ましく用いることができる。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装（株））、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ−５５０（（株）堀場製作所）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））等が挙げられ、本発明においては、２５℃の測定温度で測定したメジアン径（ｄ＝５０）の値として求めることができる。
【００６５】
（乾燥粒子の材質）
第一の乾燥粒子Ｐ１と第二の乾燥粒子Ｐ２の材質は特に限定されないが、ラテックス粒子を用いることが好ましい。ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸又はメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。
【００６６】
ラテックスの作成方法は特に限定されず、任意の重合方法により作成することができる。但し、抗体標識の際に界面活性化剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、ソープフリー重合が好ましい。
【００６７】
特に好ましい態様は、ラテックス粒子がスチレンおよびアクリル酸またはメタクリル酸を含み、スチレン濃度が１．４Ｍ以下の水系懸濁液に重合開始剤を滴下して重合を行うことによって製造したものである。スチレン濃度が１．４Ｍより高い水系懸濁液を用いることは、重合系中に発生したラテックス粒子同士が結合し、結果として生成するラテックスの平均粒子径が大きくなってしまうので、好ましくない。また、重合開始剤の添加前に水系懸濁液を７５〜１００℃に昇温することが好ましい。このように昇温することにより、添加と同時に開始剤を分解、重合系中のラジカルを一気に発生させ、モノマーの消費を始めることができるため、ラテックスの粒子径を均一にする効果があるので、好ましい。
【００６８】
重合開始剤としては、重合を行えるものであれば特に限定されず、公知の重合開始剤を使用することができる。例えば、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチル）バレロニトリル、２，２’−アゾビス４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル、ベンゾイルパーオキサイド、２，４−ジクロロパーオキサイド、イソプロピルパーオキシカーボネート、クメンハイドロパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイドなどを使用して重合を行なうことができ、特に好ましくは、過硫酸カリウムを用いて重合を行うことができる。重合開始剤の使用量は、単量体組成物の０．１〜５質量％程度であることが好ましい。
【００６９】
また、重合は、架橋剤の存在下で行うこともできる。架橋剤としては、例えば、ジビニルベンゼン、１，４ブタジエンなどを使用することができるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
上述した平均粒子径の範囲内のラテックス粒子の作製は、モノマー濃度や開始剤濃度、重合温度を調製することで可能となる。
【００７１】
（標識を有する第一の乾燥粒子Ｐ１）
第一の乾燥粒子Ｐ１が有する標識の種類は、ＳＰＦ法によって検出することができるものであれば特に限定されないが、好ましくは蛍光物質である。標識を有する第一の乾燥粒子Ｐ１は、好ましくは、蛍光ラテックス粒子である。標識を有する第一の乾燥粒子Ｐ１として蛍光ラテックス粒子を使用する場合、重合により得られたラテックス自体が蛍光性である場合には、そのまま蛍光ラテックス粒子として使用することができる。また、重合により得られたラテックスが非蛍光性の場合には、ラテックスに蛍光物質（蛍光色素など）を添加することによって、蛍光ラテックス粒子を作製することができる。即ち、蛍光ラテックス粒子は、水および水溶性有機溶剤を含むラテックス粒子の溶液に蛍光色素を添加して攪拌することなどにより製造できる。ラテックス粒子の溶液中のラテックス濃度は０．１〜１０質量％が好ましい。溶液には電解質が含まれることが好ましく、電解質としてはＮａＣｌが好ましく、溶液中の電解質濃度は１〜５００ｍＭが好ましい。またラテックス粒子の溶液中に含まれる水溶性有機溶剤としては、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ），  ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），  ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ），  アセトンが好ましく、水と水溶性有機溶剤の比率は１０〜８０質量％程度が好ましい。
【００７２】
上記の通り、本明細書で言う「蛍光ラテックス粒子」とは、重合により得られたラテックス自体が蛍光性である場合の蛍光ラテックス粒子と、重合により得られたラテックスが非蛍光性の場合に、このラテックスに蛍光物質（蛍光色素など）を添加することによって得られる蛍光ラテックス粒子の両方の場合を包含するものである。
【００７３】
（標識を有しない第二の乾燥粒子Ｐ２）
第二の乾燥粒子Ｐ２は、好ましくは、ラテックス粒子である。ラテックス粒子は、水および水溶性有機溶剤を含むラテックス粒子の溶液を攪拌することなどにより製造できる。ラテックス粒子の溶液中のラテックス濃度は０．１〜１０質量％が好ましい。溶液には電解質が含まれることが好ましく、電解質としてはＮａＣｌが好ましく、溶液中の電解質濃度は１〜５００ｍＭが好ましい。またラテックス粒子の溶液中に含まれる水溶性有機溶剤としては、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ），  ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），  ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ），  アセトンが好ましく、水と水溶性有機溶剤の比率は１０〜８０質量％程度が好ましい。
【００７４】
（第一の結合物質Ｍ１）
第一の結合物質Ｍ１の好ましい例は、抗原、抗体、又はこれらの複合体があげられるが、これらに限定されるものではない。例えば、第一の結合物質Ｍ１が抗体である場合は、被検物質に対して特異的な結合性を有する抗体として、例えば、その被検物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被検物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。第一の結合物質Ｍ１が抗体の場合には、認識する被検物質のエピトープは、第三の結合物質Ｍ３が抗体の場合に認識する被検物質のエピトープとは異なるエピトープを認識する抗体を使用することが好ましい。
【００７５】
抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ハムスターＩｇＭ、ウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナルもしくはモノクローナルの両方に適用可能である。断片化抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。
【００７６】
抗体や抗原などの結合物質を粒子に固定化する方法は、例えば、特開２０００−２０６１１５号公報やモレキュラープローブ社ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）ポリスチレンマイクロスフィアＦ８８１３に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、結合物質として抗体を粒子に固定化する原理として、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を粒子に固定させた後に抗体が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
【００７７】
（第二の結合物質Ｍ２）
第二の結合物質Ｍ２としては、例えば、結合物質（抗体）、あるいは結合物質（抗体）に対して結合するタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ）など、被検物質と特異的な結合性を有しない化合物であり、且つ、第三の結合物質Ｍ３および第一の結合物質Ｍ１に対して親和性を有しない化合物であれば特に限定されず、いずれの化合物でも好ましく用いることができる。例えば、第二の結合物質Ｍ２が抗体である場合には、被検物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被検物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。第二の結合物質Ｍ２が抗体の場合には、認識する被検物質のエピトープは、第三の結合物質Ｍ３が抗体の場合に認識する被検物質のエピトープとは異なるエピトープを認識する抗体を使用することが好ましい。
【００７８】
以上のように構成された被検物質測定キット１０を、被検物質測定装置５０にセットし、以下の方法により、被検物質の量を測定する。
【００７９】
被検物質を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と第一の乾燥粒子Ｐ１と第二の乾燥粒子Ｐ２とを混合溶解した溶液を作製する。そして、この溶液を流入孔２１から流し込み、排出孔２２から流路内の空気吸引を行って流路内で溶液を移動させ、溶液を第一の金属膜１１と第二の金属膜１２の順に接触させる。この後、基板１上の第一の金属膜１１と第二の金属膜１２で結合しなかった第一の乾燥粒子Ｐ１と第二の乾燥粒子Ｐ２を除去する目的で、基板１を洗浄してもよい。次いで、第一の金属膜１１に結合した第一の乾燥粒子Ｐ１からの第一のシグナル強度を検出し、第二の金属膜１２に結合した第一の乾燥粒子Ｐ１からの第二のシグナル強度を検出し、第一のシグナル強度を第二のシグナル強度で補正することで、正確な被検物質の濃度を測定する。
【００８０】
ここまでは、被検物質の濃度測定の方法としてサンドイッチ法を用いる例について説明したが、競合法を採用することもできる。競合法を採用する場合は、被検物質測定キット１０の構成が、第一の金属膜１１に固定される物質を、第一の結合物質Ｍ１に対して結合性を有する物質である第五の結合物質に変更したものとなる。
【００８１】
第五の結合物質は、被検物質そのもの、または被検物質と類似な部位を持ち被検物質と同様の第一の結合物質Ｍ１に対するエピトープを持つ化合物を用いる。以下、競合法による測定方法について説明する。
【００８２】
被検物質を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と第一の乾燥粒子Ｐ１と第二の乾燥粒子Ｐ２とを混合溶解した溶液を作製する。そして、この溶液を流入孔２１から流し込み、排出孔２２から流路内の空気吸引を行って流路内で溶液を移動させ、溶液を第一の金属膜１１と第二の金属膜１２の順に接触させる。
【００８３】
被検試料に被検物質が存在しない場合には、この接触により、第一の金属膜１１に固定されている第五の結合物質が、第一の乾燥粒子Ｐ１を修飾する第一の結合物質Ｍ１と結合し、第一の乾燥粒子Ｐ１が第一の金属膜１１に固着される。一方、被検試料に被検物質が存在する場合には、溶液作製した時点で、第一の乾燥粒子Ｐ１を修飾する第一の結合物質Ｍ１が被検物質と結合するため、第一の金属膜１１に固定されている第五の結合物質と被検物質との結合が阻害される。つまり、第一の乾燥粒子Ｐ１は第一の金属膜１１に固着されない。
【００８４】
被検試料に被検物質が存在しない場合と存在する場合のいずれの場合でも、第一の金属膜１１通過後の溶液が第二の金属膜１２に接触すると、第二の金属膜１２ではサンドイッチ法と同様の作用が生じ、第二の金属膜１２には第一の乾燥粒子Ｐ１と第二の乾燥粒子Ｐ２が固着される。このように、競合法であっても、第一の金属膜１１と第二の金属膜１２では、固着粒子数に大きな差が生じるため、第二の金属膜１２を第一の金属膜１１よりも薄くすることが有効となる。
【００８５】
競合法では、予め、被検物質濃度が異なる被検物質量既知の被検試料を複数用意し、この複数の被検試料及び第一の乾燥粒子Ｐ１を測定領域上に接触させつつ、測定領域からの蛍光信号を異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各被検物質濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、被検物質濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する被検物質濃度の検量線を取得する。このように取得した検量線に基づき、目的とする被検試料を用いた蛍光量の時間変化の結果から、被検試料に含まれる被検物質量を定量することができる。
【００８６】
なお、以上の説明では、被検物質測定キット１０の第二の金属膜１２に固定する第四の結合物質は、第一の結合物質Ｍ１と第二の結合物質Ｍ２の各々に対して結合性を有するものとしたが、第一の結合物質Ｍ１にのみ結合性を有するものであってもよい。前述したように、流路に供給する溶液中における被検物質の占める割合は小さいため、第二の結合物質Ｍ２が第二の金属膜に固着されないとしても、第一の金属膜１１に固着する粒子数より第二の金属膜１２に固着する粒子数が多くなる。したがって、第一の金属膜１１と第二の金属膜１２とに厚み差を設けることが有効となる。
【００８７】
また、以上の説明では、第二の乾燥粒子Ｐ２が標識を有しないものとして説明したが、第二の乾燥粒子Ｐ２が標識を有するものであってもよい。この構成でも、第一の金属膜１１に固着する粒子数より第二の金属膜１２に固着する粒子数が多くなるため、第一の金属膜１１と第二の金属膜１２とに厚み差を設けることは有効となる。
【００８８】
本実施形態の被検物質測定キット１０とこれを用いた被検物質の測定方法によれば、金属膜に入射する励起光の角度にばらつきが生じた場合でも精度を落とすことなく被検物質の測定が可能となるため、超高精度の入射角度調整が不要となり、被検物質測定装置の製造歩留まりを向上させたり製造コストを削減したりすることができる。また、被検物質測定キット１０によれば、金属膜の膜厚に製造ばらつきが生じた場合でも、精度を落とすことなく被検物質の測定が可能となるため、キットの個体差に起因する測定精度の変動をなくして正確なデータ測定が可能となる。
【００８９】
以下、本発明の実施例を説明する。
【実施例】
【００９０】
＜実施例１＞
（平均粒子径１５０ｎｍラテックス粒子の作製）
スチレン（和光純薬工業（株）社製）３０ｇ（２８８ｍｍｏｌ）とアクリル酸（和光純薬工業（株）社製）３ｇ（４２ｍｍｏｌ）を超純水４４０ｍＬに懸濁させ、９５℃に昇温し、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）（和光純薬工業（株）社製）１ｇを１０ｍＬに溶解させた水溶液を添加し、９５℃、２５０ｒｐｍで６時間攪拌した。その後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、６時間）を行って上清液を取り除き、超純水に再分散させた。この遠心分離から再分散までの操作を合計で３回繰り返し、固形分濃度を２質量％としたラテックス粒子を作製した。このラテックス粒子の固形分濃度が１質量％となるように、純水を添加して調製し、粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））を用いて、温度２５℃で測定し、メジアン径（ｄ＝５０）を求めたところ、このラテックス粒子は、１５０ｎｍの平均粒子径を有していることが分かった。
【００９１】
（蛍光ラテックス粒子の作製）
上記のように作製した固形分濃度２質量％のラテックス粒子の水分散液１００ｍＬに、メタノール１００ｍＬを加え、１０分間、室温で攪拌した。一方、別途用意した蛍光色素（ＮＫ１３６、株式会社林原生物化学研究所製）溶液（ＤＭＦ  １ｍＬ，  ＣＨＣｌ３  ９ｍＬ，  ＥｔＯＨ  １６ｍＬの混合液に溶解した溶液）を６０分間かけてラテックス溶液に攪拌した状態でゆっくり滴下した。滴下完了後、エパポレーターで有機溶媒を減圧留去し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）を行って上清液を取り除き、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）０．０１ｍｏｌ／Ｌ水溶液を用いて再分散を行った。この遠心分離から再分散の操作を合計で３回繰り返し、蛍光ラテックス粒子の作製を終了した。
【００９２】
（抗ＴＳＨ抗体で標識した蛍光ラテックス粒子の作製）  
抗ＴＳＨ抗体で標識した蛍光粒子を、以下の通り作製した。
２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（平均粒子径１５０ｎｍ）２５０μＬに、５０ｍＭのＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸一水和物）バッファー（ｐＨ６．０）溶液２５０μＬを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗ＴＳＨモノクローナル抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ社製；Ａｎｔｉ−ＴＳＨ  ＭＡｂ  ＭＡＴ０４−４１０）１００μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、和光純薬工業（株）社製）水溶液を５μＬ加え、室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬工業（株）社製）水溶液を２５μＬ添加して３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。その後上清を取り除き、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を５００μＬ加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液５００μＬ加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗ＴＳＨ抗体結合蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。
【００９３】
（蛍光標識をしない粒子の作製）
抗Ｔ４抗体で標識したラテックス粒子を、以下の通り作製した。
２質量％（固形分濃度）ラテックス粒子水溶液（平均粒子径１５０ｎｍ）２５０μＬに、５０ｍＭのＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）溶液２５０μＬを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗Ｔ４モノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ社  Ａｎｔｉ−Ｔｈｙｒｏｘｉｎｅモノクローナル抗体（６９０１））１００μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ水溶液を５μＬ加え、室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬工業（株）社製）水溶液を２５μＬ添加して３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、ラテックス粒子を沈降させた。その後上清を取り除き、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を５００μＬ加え、超音波洗浄機によりラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液５００μＬ加えて、ラテックス粒子を再分散させることで、抗Ｔ４抗体結合蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を作製した。
【００９４】
（蛍光標識粒子と、蛍光標識をしない粒子の乾燥粒子の作製）
超純水２８０μＬ、１２．５質量％スクロース水溶液４２７μＬ、２０質量％ＢＳＡ水溶液１３３μＬ、１質量％抗ＴＳＨ抗体標識蛍光ラテックス粒子（平均粒子径１５０ｎｍ）８０μＬ、１質量％抗Ｔ４抗体標識ラテックス粒子（平均粒子径１５０ｎｍ）３２０μＬを混合した。ポリプロピレン（プライムポリマー社製、プライムポリプロ  ランダムＰＰグレード）を基体としたカップを準備し、１５μＬ点着した。その後、スーパードライ乾燥機（ＴＯＹＯリビング社、ウルトラスーパードライ００シリーズ）を用いて、１２時間かけて含水量を１５％以下となるまで乾燥させることで、乾燥粒子を作製した。
【００９５】
（基板の作製）
ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ、三菱レイヨン（株）社製、アクリペットＶＨ−００１）を基体とした基板の片面に、４ｍｍ×５ｍｍの矩形形状の金膜をスパッタリングにより複数形成し、各金膜の平均膜厚を３３ｎｍ、３５ｎｍ、３６ｎｍ、３７ｎｍ、４０ｎｍ、４４ｎｍと変化させた。各金膜の膜厚値は、分光エリプソメーターの測定値を基にして、分光光度計を用いた透過率との対応表を作成し、この対応表から換算して求めた。各金膜上には、抗ＴＳＨモノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ社製、５４０９）を含む液（濃度：１０μｇ／ｍＬ  ｉｎ１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ）を点着し、物理吸着させて固定化を行った。
【００９６】
（基板の洗浄、ブロッキング）
このように作製した基板をセンサチップの流路に取り付ける前に、予め調製した洗浄用溶液（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、和光純薬工業（株）社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４））を３００μＬ用いて３回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金膜上の抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、１質量％カゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を３００μＬ添加し、１時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ（ＡＢＩ（株）社製）３００μＬを添加し、室温で３０分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除いた。
【００９７】
（センサチップの作製）
特開２０１０−１９０８８０号公報の第２の実施形態の構成となるように、作製した基板を流路に封入し、流路型センサチップを作製した。
【００９８】
（被検試料の準備）
北山ラベスから購入した東洋ビーグル犬の血清を被検試料として使用した。
【００９９】
（蛍光粒子を用いたＴＳＨの免疫測定）
上記のように準備した被検試料（イヌ血清）１００μＬと、塩化マグネシウム４４μｍｏｌを充分に混合した。次に、乾燥させた抗ＴＳＨ抗体標識蛍光粒子及び抗Ｔ４抗体標識ラテックス粒子を入れたカップに、この混合試料を投入し、１０分間攪拌しながら混合した。次に、上記で作製した基板を封入した複数の流路型センサチップに、溶液をそれぞれ点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液を１０μＬ／ｍｉｎの速度で流下させ、ＴＳＨ抗体を固定した金膜上の蛍光強度を１．５分間継続して測定した。金膜に対する励起光の入射角度に対する、金膜から測定された測定領域シグナルの変動率を計測した結果を図７に示す。
【０１００】
図７では、横軸に測定領域を構成する金膜の膜厚、縦軸に励起光の入射角が設計値から１ｄｅｇずれたときの測定領域から検出されたシグナルの変動率を示している。図７の結果から、測定領域を構成する金膜の平均膜厚が３３ｎｍまたは４４ｎｍのときに、２０％以上の変動率となることから、測定領域を構成する金膜の平均膜厚を３５ｎｍ以上４２ｎｍ以下にすることで、入射角１ｄｅｇあたりのシグナル変動率を低減できることが分かった。
【０１０１】
（実施例２）
実施例１と同様の方法で、測定領域を構成する金膜を、実施例１で好ましい範囲とされた範囲内の平均膜厚４０ｎｍで形成し、この測定領域の近傍に、それぞれ、平均膜厚１６ｎｍ、２０ｎｍ、２４ｎｍ、２８ｎｍ、３２ｎｍ、３６ｎｍとなるようにスパッタリングにより金膜を成膜して、補正領域を形成した複数の基板を作製した。この測定領域の金膜上には、第三の結合物質として、抗ＴＳＨモノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ社製、５４０９）を含む液（濃度：１０μｇ／ｍＬ  ｉｎ１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ）を点着し、物理吸着させて固定化を行った。補正領域の各金膜上には、第四の結合物質として、抗マウス抗体（Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２、製品名：ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）  、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を含む溶液（濃度：１０μｇ／ｍＬ  ｉｎ１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ）を点着し、物理吸着させて固定化を行った。このように作製した基板を用い、信号検出対象の領域を補正領域として、実施例１と同様の測定を行った。
【０１０２】
図８には、横軸に補正領域を構成する金膜の平均膜厚、縦軸には励起光の入射角が設計値から１ｄｅｇずれたときの、測定領域から検出したシグナルを補正領域から検出したシグナルで補正して得たシグナルの変動率を示した。
【０１０３】
図８の結果から、補正領域の金膜の平均膜厚を２４ｎｍ以上３２ｎｍ以下にすることで、入射角変動に対する補正精度の低下を防げることが分かった。
【０１０４】
（実施例３）
実施例２と同様の方法で、基板に形成する測定領域の金膜の平均膜厚を３２ｎｍから４２ｎｍの範囲で変化させ、補正領域の金膜の平均膜厚を１６ｎｍから３６ｎｍの範囲で変化させた基板を作製した。この基板を用いて、実施例２と同様にして測定領域と補正領域のシグナルを測定した。
【０１０５】
図９は、各基板における測定領域のシグナル比を示す図である。図９のシグナル比は、測定領域の金膜の平均膜厚が３７ｎｍとなっている基板における測定領域のシグナルを基準にしたときの、各基板における測定領域のシグナルの比である。
【０１０６】
図１０は、各基板における補正領域のシグナル比を示す図である。図１０のシグナル比は、補正領域の金膜の平均膜厚が３６ｎｍとなっている基板における補正領域のシグナルを基準にしたときの、各基板における補正領域のシグナルの比である。
【０１０７】
図９，１０には、各プロットデータから最小二乗法によって求めた曲線を記載している。この結果から、測定領域では平均膜厚３５ｎｍ以上４２ｎｍ以下の範囲、補正領域では平均膜厚２４ｎｍ以上３２ｎｍ以下の範囲においてシグナル変動が小さく抑えられることがわかり、金膜厚の製造ばらつきがあったとしても精度の高い測定が可能なことがわかった。
【０１０８】
以上説明してきたように、本明細書には以下の事項が開示されている。
【０１０９】
開示された被検物質測定キットは、被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、標識を有する第一の乾燥粒子と、上記被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された第二の乾燥粒子と、上記被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質、又は、上記第一の結合物質に対して結合性を有する物質が固定される第一の金属膜と、上記被検物質と結合性を有さず、第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定され、上記第一の金属膜よりも厚みの薄い第二の金属膜とが形成された基板と、を備えるものである。
【０１１０】
開示された被検物質測定キットは、上記第二の乾燥粒子は、標識を有さず、上記第四の結合物質は、上記第一の結合物質及び上記第二の結合物質の各々に対して結合性を有するものである。
【０１１１】
開示された被検物質測定キットは、上記第一の金属膜の平均厚みが３５ｎｍ以上４２ｎｍ以下であり、上記第二の金属膜の平均厚みが２４ｎｍ以上３２ｎｍ以下であるものを含む。
【０１１２】
開示された被検物質測定キットは、上記第一の乾燥粒子の平均粒子径が１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、上記第二の乾燥粒子の平均粒子径が１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるものを含む。
【０１１３】
開示された被検物質測定キットは、上記第一の金属膜と上記第二の金属膜が金を含むものである。
【０１１４】
開示された被検物質測定キットは、上記第三の結合物質と上記第四の結合物質が抗体であるものを含む。
【０１１５】
開示された被検物質測定キットは、上記第一の乾燥粒子が蛍光ラテックス粒子であり、上記第二の乾燥粒子がラテックス粒子であるものを含む。
【０１１６】
開示された被検物質の測定方法は、被検物質と、上記被検物質と特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾され、標識を有する第一の乾燥粒子と、上記被検物質と特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された第二の乾燥粒子とを含む溶液を、上記被検物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質又は上記第一の結合物質に対して結合性を有する物質が固定された第一の金属膜、及び、上記被検物質と結合性を有さず、上記第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定され、上記第一の金属膜よりも厚みの薄い第二の金属膜、に接触させる工程と、上記第一の金属膜及び上記第二の金属膜の各々から上記標識に応じた信号を検出する工程と、上記第二の金属膜から検出した信号を用いて上記第一の金属膜から検出した信号を補正する工程と、を備えるものである。
【０１１７】
開示された被検物質の測定方法は、上記第二の乾燥粒子は、標識を有さず、上記第四の結合物質は、上記第一の結合物質及び上記第二の結合物質の各々に対して結合性を有するものである。
【０１１８】
開示された被検物質の測定方法は、上記第一の金属膜の平均厚みが３５ｎｍ以上４２ｎｍ以下であり、上記第二の金属膜の平均厚みが２４ｎｍ以上３２ｎｍ以下であるものを含む。
【符号の説明】
【０１１９】
１  基板
２  流路形成用部材
１０  被検物質測定キット
１１  第一の金属膜
１２  第二の金属膜
２１  流入孔
２２  排出孔
２３  凹部
２４，２５  乾燥粒子の保存容器
Ｐ１  第一の乾燥粒子（第一の結合物質で修飾）
Ｐ２  第二の乾燥粒子（第二の結合物質で修飾）
Ｍ３  第三の結合物質
Ｍ４  第四の結合物質
５０  被検物質測定装置
３０  照明部
３１  光源
４０  測定部
４１  光量検出部
４２  励起光カットフィルタ
Ｍ  マスク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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