(57)【要約】【課題】  簡便な方法により捕捉した細菌を効率よく検知することができる細菌検知方法、細菌検査用デバイスおよび細菌検査装置を提供する。【解決手段】  細菌検査用デバイスは、所定の流路が形成された容器本体１００を備え、その底面１１１は光を透過させる透過部材であり、流路は、粒状体１０７および液体試料１０８を同時に流下させる断面積を有する通常流路領域１０１と、流路の途中に流路幅を徐々に減少させる流路幅減少領域１０３と、流路幅減少領域の最も小さい流路幅が維持される最小幅流路領域（堰き止め部）１０４とで構成され、通常流路領域の一部と流路幅減少領域とで堆積部１１０が形成される。細菌検知方法は、細菌検査用デバイスによって粒状体を堆積して細菌を捕捉し、その細菌から発せられる光を検出する。細菌検査装置は、細菌検査用デバイスに対して励起光を照射する照射部と、蛍光を検知する光検知デバイスを備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光を発する細菌を検出する方法であって、
堆積された場合に微小空間を形成する形状を具有する複数の微小固体を、前記細菌の検出対象の液体試料に混入する混入工程と、
その混入工程によって前記微小固体が混入された液体試料を、所定流路に流入させるとともに、該流路の途中において前記微小固体の流通を阻害し、流通が阻害された該微小固体を該流路の幅方向および長さ方向への適宜範囲に堆積させる微小固体集合堆積工程と、
前記微小固体集合堆積工程における微小固体の堆積に伴って捕捉された細菌が発する光を検出する検出工程と
を含むことを特徴とする細菌検知方法。
【請求項２】
前記微小固体集合堆積工程は、前記微小固体を流下に伴って集中させつつ堆積させるものであり、液体試料中の細菌が近接する前記微小固体によって移動を規制された状態で保持されるものであることを特徴とする請求項１記載の細菌検知方法。
【請求項３】
前記微小固体は、微小空間の最大容積が、１の前記細菌によって占有される容積近傍の容量で形成されるように構成されていることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の細菌検知方法。
【請求項４】
前記微小固体は、略球状に形成された粒状体であり、粒径がほぼ均等に形成された複数の粒状体を使用することを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の細菌検知方法。
【請求項５】
前記微小固体集合堆積工程にて捕捉される細菌に対してストレス負荷処理を行うストレス負荷処理工程を有しており、
前記検出工程は、前記ストレス負荷処理工程の後に、前記微小固体集合堆積工程における微小固体の堆積に伴って捕捉された細菌が発する光を検出することを特徴とする請求項１ないし４に記載の細菌検知方法。
【請求項６】
前記ストレス負荷処理工程は、比較的短い期間、ストレスを負荷する負荷実施工程と、その負荷実施工程によるストレス負荷の終了後に所定期間放置する放置工程とを含むことを特徴とする請求項５に記載の細菌検知方法。
【請求項７】
前記負荷実施工程は、比較的短い波長の光を照射するものであることを特徴とする請求項５又は６に記載の細菌検知方法。
【請求項８】
前記細菌はレジオネラ属菌である請求項１ないし７のいずれかに記載の細菌検知方法。
【請求項９】
前記細菌はレジオネラ・ニューモフィラである請求項８記載の細菌検知方法。
【請求項１０】
所定の流路が形成された容器本体と、
前記流路の途中に設けられ前記流路中に導入された微小固体の流下を留める堰き止め部と、
前記流路の一部であって、前記堰き止め部の上流側において前記微小固体が所定面積以上を占有するように堆積される堆積部と、
前記容器本体の少なくとも一部であって、前記堆積部の対向面に配設された光を透過させる透過部材とを有し、
前記流路に導入された液体試料に含まれる細菌を、前記微小固体の堆積に伴って、運動が制限された状態で前記堆積部に捕捉し、当該細菌が発する光を、前記透過部材を介して前記容器本体の外部に放射させることを特徴とする細菌検査用デバイス。
【請求項１１】
前記堆積部の下流側端部は、下流側に向かって次第に小径となるテーパ状に形成されており、
前記堰き止め部は、前記堆積部の下流側端部に連通すると共に、細菌の体長よりも大きく且つ前記微小固体にて填塞される流路径で形成された流路であることを特徴とする請求項１０記載の細菌検査用デバイス。
【請求項１２】
前記透過部材は、前記堆積部の表面側と裏面側とのそれぞれに配設されており、
表面側または裏面側のいずれか一方であって励起光入射側とは反対側に配設された前記透過部材に積層される励起光カットフィルタと、
その励起光カットフィルタに積層されるバンドパスフィルタと、
前記励起光カットフィルタおよびバンドパスフィルタを介して入射した蛍光を検出する蛍光検知手段とを備え、
前記励起光カットフィルタ、前記バンドパスフィルタ、前記蛍光検知手段は前記容器本体と一体で形成されていることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の細菌検査用デバイス。
【請求項１３】
前記細菌はレジオネラ属菌である請求項１０ないし１２のいずれかに記載の細菌検査用デバイス。
【請求項１４】
前記細菌はレジオネラ・ニューモフィラである請求項１３記載の細菌検査用デバイス。
【請求項１５】
請求項１０又は１１に記載の細菌検査用デバイスと、
前記細菌検査用デバイスの前記堆積部に対し励起光を照射する第１光源と、
その第１光源からの励起光照射に基づき発生する蛍光を検出する蛍光検知手段とを備えることを特徴とする細菌検査装置。
【請求項１６】
前記堆積部に捕捉された細菌にストレスを負荷するため、前記細菌検査用デバイスの前記堆積部に対し、比較的短い波長の光を照射する第２光源と、
最大照射時間以内の予め設定された時間に基づき、前記第２光源による照射を実行する制限照射実行手段とを備えることを特徴とする請求項１５に記載の細菌検査装置。
【請求項１７】
前記細菌はレジオネラ属菌である請求項１５又は１６に記載の細菌検査装置。
【請求項１８】
前記細菌はレジオネラ・ニューモフィラである請求項１７に記載の細菌検査装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レジオネラ属菌に代表される蛍光物質を産生する細菌を検知するための方法、この方法を使用して細菌を検知する細菌検査用デバイス、およびその細菌検査用デバイスを使用する細菌検査装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
以前より細菌による感染症の事例が多数報告され、重篤な健康被害をもたらす細菌に感染した場合には死に至る事例も報告されるなど、その対策が注目されている。レジオネラ（レジオネラ属菌）は、クーラーの冷却塔水、噴水、雑用水などの人工的な水環境に高率で生存し、エアロゾルが生じた際に人に吸引され、肺炎などのレジオネラ症を発症させることが知られている（非特許文献１参照）。また、多くの温泉旅館やホテルでは、慢性的な温泉の元湯不足を解消するため、循環ろ過式浴槽によって、ろ過を行いながら浴槽水を再利用する循環式浴槽水を使用しているのが実情である。かかる入浴施設ではレジオネラ属菌が繁殖する可能性が高い。
【０００３】
このレジオネラ属菌は、例えば、アメーバに寄生して増殖することが知られている。水を貯留する容器の表面には往々にしてバイオフィルムが形成されるが、アメーバはこのバイオフィルムに特に高率に存在する。宿主となるアメーバ自身は塩素などの消毒剤に強い耐性を持つため、アメーバ内に寄生するレジオネラ属菌はアメーバ内で保護されながら大量に増殖し、最終的にはアメーバを破壊して環境水中に放出されることとなる。
【０００４】
このようなレジオネラ属菌が含まれる水が原因となって、かつて各地の温泉利用客がレジオネラ症に集団感染したことがあり、これが社会的な問題を惹起することとなり、現在では、温泉や公衆浴場では、少なくとも年に１回のレジオネラ属菌の菌数測定検査が行われることとなった。非特許文献２において、全国各地の温泉水に含まれるレジオネラ属菌の検査結果が報告されている。この報告の中で用いられているレジオネラ属菌の測定方法は次のとおりである。
【０００５】
まず、試料２００ｍｌを、６０００ｒｐｍ・３０分間の遠心分離により１ｍｌに濃縮する。次に、濃縮した試料に、等量の０．２ＭのＨＣｌ−ＫＣｌ溶液（ｐＨ２．２）を用いて酸処理（１５分間）を行う。その後、ＷＹＯα寒天培地およびＧＶＰＣα寒天培地に各々０．１ｍｌずつ滴下し、培地全体にコンラージ棒で塗抹し、これらを３７°Ｃで７日間培養する。この培養後、寒天培地の上でレジオネラ属菌を疑う集落を釣菌し、これを、血液寒天培地とＢＣＹＥα寒天培地の２分割平板培地に塗抹し、純培養と同時にシステイン要求性試験を行う。そして、血液寒天培地には発育せず、ＢＣＹＥα寒天培地に発育したグラム陰性の長桿菌の菌株が、レジオネラ属菌と判定される。また、ラテックス凝集反応、免疫血清凝集反応、およびＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより、菌種の同定が行われている。
【０００６】
しかしながら、非特許文献２において報告されるレジオネラ属菌の測定方法は、上述したとおり、複雑かつ特殊な手順によるものであり、非常に煩瑣であるのみならず、特殊な器材を要することから、簡便な検査を行うことができなかった。
【０００７】
また、試料を寒天培地に接種した後、長い培養期間を解消すべく、細菌培養を要することなく迅速に細菌を濃縮し検出するための手段として、電気泳動と走化性の両方を利用する技術が提案されている（特許文献１参照）。この技術は、多孔質膜を電極で挟んで電荷を付与することにより、多孔質膜に電位および硬化性をもたらす化学物質の濃度勾配を形成し、細菌を移動させるものであった。
【０００８】
しかし、特許文献１に記載の技術を使用して細菌を濃縮する場合においては、サンプル槽と濃縮槽に分離した特別な処理槽を用意し、しかも、細菌を泳動させるための電位勾配を付与するための電圧印加装置を必要とし、更には、溶液を撹拌する機械や、微細領域に電界をかけて電気泳動を使用することにより生じる発熱を抑える冷却機構が別途に必要となる。このため、これらの装置の小型化および測定手順の簡易化に資するものではなかった。
【０００９】
そこで、本願発明者の一部において、細菌の特異な性質を検知する方法が提案されている。すなわち、レジオネラ属菌のように励起光の照射によって蛍光を産生する細菌について、その蛍光を検知する方法である（特許文献２参照）。この技術によれば、検出対象の試料を水に浸した後、試料より発せられる蛍光を検出することにより、簡便にレジオネラ属菌等の細菌を測定することができることとなる。しかし、本技術においては、試料中に検出対象の細菌が多量に含まれている場合は、蛍光の検出は容易であるが、試料中の細菌が微量の場合は蛍光を容易に検出し難いという問題点を内在するものであった。
【００１０】
このため、図１１に示すように、容器本体６００に流路を形成し、その流路内に数μｍの径に形成されたシリコンピラー６０５を数μｍの間隔を有して複数立設し、これら複数のシリコンピラー６０５によって櫛状体を構成するものが、本願発明者によって提案されている（非特許文献３参照）。この技術は、液体試料を流路に流入させることにより、その流路中に形成される櫛状体が、液体試料中の検査対象たるレジオネラ属菌を捕獲することとなり、検査対象物の細菌を櫛状体に集めることができるとされている。
【００１１】
また、分析試料中に目的の細菌が高濃度に存在するほど検出を迅速化できるため、細菌の迅速検出を目的に、細菌を濃縮する方法が提案されている。例えば、サンプリングした液体中にビーズを混合し、液中に存在する細菌をビーズ上に固定した後、固液分離によってビーズを回収することでビーズ上に細菌を濃縮し、かかるビーズを分析試料とすることで目的の細菌の検出速度を向上させる方法が開示されている（特許文献３，４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０００−２６２８６５号公報
【特許文献２】特開２０１０−２５２７４７号公報
【特許文献３】特表２０１２−５１３７６８号公報
【特許文献４】特開２０１２−１８９６１５号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】「第３版レジオネラ症防止指針」、財団法人ビル管理教育センター、ｐｐ．３−１７、平成２１年５月
【非特許文献２】古畑勝則他、「温泉水からのレジオネラ属菌の分離状況」、感染症学雑誌、第７８巻、第８号、ｐｐ．７１０−７１６、２００４年
【非特許文献３】Abstract No.ac12000224, The 6th Asia-Pacific Conference on Transducers and Micro/Nano Technologies(APCOT), IEEE, Nanjing, China (2012).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、非特許文献３の技術によれば、櫛状体によりレジオネラ属菌を捕獲しようとした場合、適切な間隔にシリコンピラー６０５の間隔を調整することが非常に困難であるという問題点があった。例えば、レジオネラ属菌の一種であるレジオネラ・ニューモフィラ６０９を捕獲することを想定した場合、レジオネラ・ニューモフィラ６０９の直径は１μｍであるため、シリコンピラー６０５の間隔が１μｍを大きく超える状態では、レジオネラ・ニューモフィラ６０９が素通りし、捕獲できないこととなり得るものであった。一方で、シリコンピラー６０５の間隔が１μｍ以下とすれば、流路の上流側に位置するシリコンピラー６０５によって堰き止められ、櫛状体の上流側にのみレジオネラ・ニューモフィラ６０９が集中して捕獲されることとなり、櫛状体の全体に至る広い範囲に捕獲されないという事態を招来させていた。この場合、流路の上流側に位置するシリコンピラー６０５にはレジオネラ・ニューモフィラ６０９が少なからず捕獲されることとなるため、当該範囲において蛍光を測定することが不可能ではないとしても、櫛状体の極めて限られた僅かな範囲において生ずる蛍光を測定することが要請されることから、検出の精度は、光検出デバイスを設置する位置の精度に依存することとなり、その精度を向上させることは容易でなかった。また、極微量の細菌の検出が求められているところ、更なる検出感度の向上が求められていた。
【００１５】
特許文献３，４に記載の技術は、細菌をビーズ上に付着させることで、その後の細菌検出工程にて用いる試料中の細菌濃度を増加させることを目的としており、細菌検出工程に先立って行う前処理の技術である。このため、できるだけ多くの細菌をビーズ表面に付着させることが重要であるが、細菌の発光によってその存在を検出する非特許文献３の技術においては、単純に菌濃度を増加させただけでは、著しい検出感度の改善を達成することができない。
【００１６】
また、濃縮を目的とするかかる技術は、あらかじめ細菌と結合できる物質をビーズに修飾しておくことが望ましいため、適当な修飾物質を選定する作業や、当該修飾物質のビーズへの修飾作業などが必要となり、用いるビーズに対しての煩雑で複雑な工程が要求されるという問題点があった。
【００１７】
本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであって、その目的は、簡便な方法により捕捉した細菌を効率よく検知することができる細菌検知方法、細菌検査用デバイスおよび細菌検査装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
そこで、本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究した結果、次の発明を完成するに至ったものである。
【００１９】
請求項１記載の細菌検知方法は、光を発する細菌を検出する方法であって、堆積された場合に微小空間を形成する形状を具有する複数の微小固体を、前記細菌の検出対象の液体試料に混入する混入工程と、その混入工程によって前記微小固体が混入された液体試料を、所定流路に流入させるとともに、該流路の途中において前記微小固体の流通を阻害し、流通が阻害された該微小固体を該流路の幅方向および長さ方向への適宜範囲に堆積させる微小固体集合堆積工程と、前記微小固体集合堆積工程における微小固体の堆積に伴って捕捉された細菌が発する光を検出する検出工程とを含むものである。
【００２０】
請求項２記載の細菌検知方法は、請求項１記載の細菌検知方法において、前記微小固体集合堆積工程は、前記微小固体を流下に伴って集中させつつ堆積させるものであり、液体試料中の細菌が近接する前記微小固体によって移動を規制された状態で保持されるものである。
【００２１】
請求項３記載の細菌検知方法は、請求項１又は２のいずれかに記載の細菌検知方法において、前記微小固体は、微小空間の最大容積が、１の前記細菌によって占有される容積近傍の容量で形成されるように構成されている。
【００２２】
請求項４記載の細菌検知方法は、請求項１ないし３のいずれかに記載の細菌検知方法において、前記微小固体は、略球状に形成された粒状体であり、粒径がほぼ均等に形成された複数の粒状体を使用するものである。
【００２３】
請求項５記載の細菌検知方法は、請求項１ないし４に記載の細菌検知方法において、前記微小固体集合堆積工程にて捕捉される細菌に対してストレス負荷処理を行うストレス負荷処理工程を有しており、前記検出工程は、前記ストレス負荷処理工程の後に、前記微小固体集合堆積工程における微小固体の堆積に伴って捕捉された細菌が発する光を検出するものである。
【００２４】
請求項６記載の細菌検知方法は、請求項５に記載の細菌検知方法において、前記ストレス負荷処理工程は、比較的短い期間、ストレスを負荷する負荷実施工程と、その負荷実施工程によるストレス負荷の終了後に所定期間放置する放置工程とを含むものである。
【００２５】
請求項７記載の細菌検知方法は、請求項５又は６に記載の細菌検知方法において、前記負荷実施工程は、比較的短い波長の光を照射するものである。
【００２６】
請求項８記載の細菌検知方法は、請求項１ないし７のいずれかに記載の細菌検知方法において、前記細菌はレジオネラ属菌である。
【００２７】
請求項９記載の細菌検知方法は、請求項８記載の細菌検知方法において、前記細菌はレジオネラ・ニューモフィラである。
【００２８】
請求項１０記載の細菌検査用デバイスは、所定の流路が形成された容器本体と、前記流路の途中に設けられ前記流路中に導入された微小固体の流下を留める堰き止め部と、前記流路の一部であって、前記堰き止め部の上流側において前記微小固体が所定面積以上を占有するように堆積される堆積部と、前記容器本体の少なくとも一部であって、前記堆積部の対向面に配設された光を透過させる透過部材とを有し、前記流路に導入された液体試料に含まれる細菌を、前記微小固体の堆積に伴って、運動が制限された状態で前記堆積部に捕捉し、当該細菌が発する光を、前記透過部材を介して前記容器本体の外部に放射させるものである。
【００２９】
ここで、堰き止め部の上流側とは、液体の流れる方向においてその液体の流れてくる側であり、液体試料および微小固体を流路に導入する際の導入位置に近い側を意味し、導入位置から自然に流下する場合の上流側を意味するのみならず、導入位置から加圧注入する場合、または堰き止め部の反対側から吸引する場合などのように、強制的に流路中を液体試料に移動させる際には、その移動方向に対して移動が開始する側を含む概念である。
【００３０】
請求項１１記載の細菌検査用デバイスは、請求項１０記載の細菌検査用デバイスにおいて、前記堆積部の下流側端部は、下流側に向かって次第に小径となるテーパ状に形成されており、前記堰き止め部は、前記堆積部の下流側端部に連通すると共に、細菌の体長よりも大きく且つ前記微小固体にて填塞される流路径で形成された流路である。
【００３１】
ここで、堰き止め部の下流側とは、液体の流れる方向においてその先となる側であり、液体試料および微小固体を流路に導入する際の導入位置から離れる側を意味し、導入位置から自然に流下する場合の上流側を意味するのみならず、導入位置から加圧注入する場合、または堰き止め部の反対側から吸引する場合などのように、強制的に流路を液体試料に移動させた際には、その移動方向に対して移動が終了する側を含む概念である。
【００３２】
請求項１２記載の細菌検査用デバイスは、請求項１０又は１１に記載の細菌検査用デバイスにおいて、前記透過部材は、前記堆積部の表面側と裏面側とのそれぞれに配設されており、表面側または裏面側のいずれか一方であって励起光入射側とは反対側に配設された前記透過部材に積層される励起光カットフィルタと、その励起光カットフィルタに積層されるバンドパスフィルタと、前記励起光カットフィルタおよびバンドパスフィルタを介して入射した蛍光を検出する蛍光検知手段とを備え、前記励起光カットフィルタ、前記バンドパスフィルタ、前記蛍光検知手段は前記容器本体と一体で形成されている。
【００３３】
請求項１３記載の細菌検査用デバイスは、請求項１０ないし１２のいずれかに記載の細菌検査用デバイスにおいて、前記細菌はレジオネラ属菌である。
【００３４】
請求項１４記載の細菌検査用デバイスは、請求項１３記載の細菌検査用デバイスにおいて、前記細菌はレジオネラ・ニューモフィラである。
【００３５】
請求項１５記載の細菌検査装置は、請求項１０又は１１に記載の細菌検査用デバイスと、前記細菌検査用デバイスの前記堆積部に対し励起光を照射する第１光源と、その第１光源からの励起光照射に基づき発生する蛍光を検出する蛍光検知手段とを備える。
【００３６】
請求項１６記載の細菌検査装置は、請求項１５に記載の細菌検査装置において、前記堆積部に捕捉された細菌にストレスを負荷するため、前記細菌検査用デバイスの前記堆積部に対し、比較的短い波長の光を照射する第２光源と、最大照射時間以内の予め設定された時間に基づき、前記第２光源による照射を実行する制限照射実行手段とを備えるものである。
【００３７】
請求項１７記載の細菌検査装置は、請求項１５又は１６に記載の細菌検査装置において、前記細菌はレジオネラ属菌である。
【００３８】
請求項１８記載の細菌検査装置は、請求項１７に記載の細菌検査装置において、前記細菌はレジオネラ・ニューモフィラである。
【発明の効果】
【００３９】
請求項１記載の細菌検知方法によれば、混入工程により細菌の検出対象の液体試料に混入された複数の微小固体は、液体試料とともに流路に流入し、微小固体集合堆積工程によって、流通が阻害され、流路途中の適宜範囲に堆積されることとなる。微小固体が堆積された態様においては、近接する微小固体間には微小固体形状に応じた微小空間が形成され、当該微小空間によって液体試料中の細菌が捕捉される。そして、捕捉された細菌が発する光が検出工程により検出されることで、細菌の存在が検知される。なお、当該細菌は、微小固体が堆積された適宜範囲に捕捉されるので、例えば、細菌が固有の励起光にて蛍光を発するものであれば、当該適宜範囲に励起光を照射し発生する蛍光を観察（検出）することにより、細菌を検知することができるのである。光の検出は、専ら光検知デバイスを使用することができ、蛍光を発するための励起光が必要な場合には、検出工程において励起光が照射されるものであってよい。ここで、蛍光検出は一般的に高感度で選択性が高い。このため、細菌が固有の蛍光を発する場合には、特定の細菌を高感度に検出することができる。
【００４０】
また、微小固体が堆積する適宜範囲全体に細菌が捕捉されるので、局所的な僅少範囲に細菌が偏在してしまうことを回避できる。ここで、流路の形状や大きさと、導入する微小固体の量とを調整すれば、この適宜範囲を検出に十分な面積で形成できるので、当該適宜範囲に対する光検知デバイスの厳格な位置決めを不要としつつ良好に細菌の存在を検出できるという効果がある。更には、本方法では微小固体への細菌の付着を必要とせず、単に微小固体に囲まれた空間に細菌を捕捉しておくだけなので、微小固体の表面に細菌を付着させるための表面処理を不要とすることができる。言い換えれば、細菌と微小固体とを混合するだけで良く、特殊な表面処理がされた微小固体を、対象の細菌に応じて用意する必要がない。よって、細菌検出操作のための手順を極めて簡便にすることができる。
【００４１】
請求項２記載の細菌検知方法によれば、請求項１記載の細菌検知方法の奏する効果に加え、微小固体集合堆積工程により、微小固体は、流下に伴って集中しつつ堆積し、そして、液体試料中に存在していた細菌は、近接する微小固体によって移動を規制された状態で捕捉される。ここで、細菌が生菌であることが問題となる衛生環境においては、生菌の検出が重要であるが、自力での移動が可能な生菌は、一旦捕捉しても、適宜範囲の外へと移動してしまいかねない。しかし、本検知方法のように微小空間に捕捉された細菌は、近接する微小固体によって移動が規制された状態で保持されるので、微小空間からの脱出が困難となる。従って、適宜範囲に捕捉された細菌は時間が経過しても同じ位置に留まったままとなり易く、時間に対する細菌検知結果の変動を抑制でき、得られる検知結果の信頼性や再現性を向上させることができるという効果がある。
【００４２】
微小固体が堆積すると、微小固体は堆積箇所に留められて下流側への移動は実質的に困難となり、堆積した微小固体の間隙を液体分のみが通過して下流側へ流れることとなる。ここで、例えば、流路が微小（マイクロ流路）である場合、微小固体の堆積によって液体の流下速度が著しく低下するが、導入した液体試料中の液体分が、適宜範囲より下流側へ完全に流下せずとも、微小固体は、適宜範囲に堆積し、その堆積に伴って、液体試料に混入する細菌が微小空間内に嵌まり込んだ状態で捕捉されると共に、この微小固体の堆積状態が比較的長時間保持される。故に、細菌の捕捉状態をより確実に維持することができ、測定の信頼性を更に向上させることができる。
【００４３】
請求項３記載の細菌検知方法によれば、請求項１又は２のいずれかに記載の細菌検知方法の奏する効果に加え、微小固体は、微小空間の最大容積が、１の細菌によって占有される容積近傍の容量で形成されるように構成されているので、検出を目的とする細菌の容積に応じて微小固体の形状を選定することで、当該細菌を適切に捕捉して液体と共に流下してしまうことを抑制でき、捕捉効率を向上させる事ができる。また、微小固体の形状を変更するだけで微小空間の大きさを変更できるので、流路等の構成を細菌ごとに変更する必要がなく、使い勝手がよい。
【００４４】
請求項４記載の細菌検知方法によれば、請求項１ないし３のいずれかに記載の細菌検知方法の奏する効果に加え、微小固体は、略球状に形成された粒状体であり、粒径がほぼ均等に形成された複数の粒状体を使用するものであるので、粒状体が適度な大きさに揃えられることから、近接する複数の粒状体によって、ほぼ同様の間隙を形成させることができることとなり、それぞれ近接する複数の粒状体によって同程度の大きさの細菌を多数捕捉することができる。また、粒状体が略球状であることから、粒状体の間に形成される間隔は一定ではなく、隣接する粒状体が接する点（接点）の周辺では極めて僅少な間隙を形成し、また、当該接点から離れた場所では大きい間隙を形成することとなる。ここで、大きく形成される間隙の容積を１の細菌によって占有される容積近傍となるように当該粒状体の粒径を調整すれば、所望の細菌を容易に捕捉し得、且つ、当該大きな空間の縁端（接点）では僅少な間隙となる事から、当該微小空間に目的の細菌を閉じ込めることができる。
【００４５】
よって、適宜範囲に捕捉された細菌は、より一層移動が制限され、良好な精度で目的の細菌を検出する事ができる。また、細菌の種類によっては、狭小空間に閉じ込められることで発光強度が増強されることがあるため、かかる場合には検出感度を向上することができる。
【００４６】
請求項５記載の細菌検知方法によれば、請求項１ないし４に記載の細菌検知方法の奏する効果に加え、微小空間に捕捉される細菌には、ストレス負荷処理工程によってストレスが負荷される。そして、ストレス負荷処理工程の後に、細菌が発する光が検出工程にて検出される。負荷されるストレスによって細菌が発する光の発光強度が増大されるので、より的確かつ容易に細菌検知を行うことができるという効果がある。
【００４７】
請求項６記載の細菌検知方法によれば、請求項５に記載の細菌検知方法の奏する効果に加え、ストレス負荷処理工程において、負荷実施工程により比較的短い期間、細菌にストレスが負荷され、そのストレス負荷の終了後、所定期間放置された後に、検出工程にて細菌が発する光が検出されることとなる。これによれば、過度のストレス負荷が細菌や産生される発光物質に悪影響を及ぼすことを抑制することができ、更に、細菌が、産生した発光物質を蓄積する場合には、放置される所定期間に蓄積が進むので、放置期間を設けることで同じ細菌濃度でより高い発光強度を得ることができるという効果がある。
【００４８】
請求項７記載の細菌検知方法によれば、請求項５又は６に記載の細菌検知方法の奏する効果に加え、負荷実施工程は、比較的短い波長の光を照射するものであるので、例えば化学物質や熱などの他のストレスを細菌に負荷する場合に比べて、簡便に処理を行うことができるという効果がある。
【００４９】
請求項８記載の細菌検知方法によれば、請求項１ないし７のいずれかに記載の細菌検知方法において、細菌はレジオネラ属菌であるので、特定の励起光を照射することでレジオネラ属菌に蛍光を生じさせることができる。よって、簡易かつ迅速にレジオネラ属菌の検出を行うことができるという効果がある。
【００５０】
請求項９記載の細菌検知方法によれば、請求項８記載の細菌検知方法の奏する効果に加え、細菌はレジオネラ・ニューモフィラであるので、特定の励起光を照射することで生じる蛍光を検出することで、レジオネラ属菌のなかでも病原性が高いとされているレジオネラ・ニューモフィラの存在を特定して検出することができるという効果がある。
【００５１】
請求項１０記載の細菌検査用デバイスによれば、容器本体に形成された流路の途中には堰き止め部が形成されており、流路中に導入された微小固体の流下が堰き止められる。堰き止められた微小固体は、堰き止め部の上流側の堆積部において所定面積以上を占有するように堆積される。堆積部の対向面には、光を透過させる透過部材が、容器本体の少なくとも一部として設けられており、流路に導入された液体試料に含まれる細菌は、微小固体の堆積に伴って、運動が制限された状態で堆積部に捕捉され、その細菌が発する光が透過部材を介して容器本体の外部に放射される。
【００５２】
よって、容器外に放射される光を検出または観察することで、細菌の存在を検知できる。なお、当該細菌は、微小固体が堆積された堆積部に捕捉されるので、例えば、細菌が固有の励起光にて蛍光を発するものであれば、当該箇所に励起光を照射し発生する蛍光を観察（検出）することにより、細菌を検知することができる。ここで、蛍光検出は一般的に高感度で選択性が高い。このため、細菌が固有の蛍光を発する場合には、特定の細菌を高感度に検出することができる。
【００５３】
また、微小固体が堆積する堆積部全体にて細菌が捕捉されるので、局所的な僅少範囲に細菌が偏在してしまうことを回避できる。また、流路の形状や大きさと、導入する微小固体の量とを調整すれば、堆積部を所定面積以上とすることは容易であり、当該堆積部を検出に十分な面積を付与することができる。つまり、光を検出するデバイスを用いて発光を検出する場合、所定面積以上の十分な広がりのある部分から入射光を取得できるように検出デバイスをセットすれば良いので、検出デバイスの厳格な位置決めを不要とし、更にかかる検出デバイスの厳格な位置決めがなくとも、良好に細菌の存在を検出できるという効果がある。
【００５４】
請求項１１記載の細菌検査用デバイスによれば、請求項１２記載の細菌検査用デバイスの奏する効果に加え、堆積部の下流側端部は、下流側に向かって次第に小径となるテーパ状に形成されているので、液体試料と微小固体とは流路を流下することによって次第に集中し、そして堆積部下流側端部の末端に到達すると、堰き止め部を微小固体が填塞し、更に下流側への微小固体の移動が制限される。そして、その後に流下した微小固体は堆積部に順次堆積し、僅かに液体分のみが堰止め部を通過して流下可能となる。また、複数の微小固体は、流下する過程で液体試料中の細菌を囲い込みながら相互に接近することとなり、徐々にその間隔を狭くすることによって、最終的には近接するもの同士が接触することとなって、その間隙（微小空間）に細菌が捕捉される。
【００５５】
よって、本デバイスを用いれば、液体試料と微小固体とをデバイス内に導入し、両者が混合された状態で流路を流下させるという単純な操作を経るだけで、細菌の存否を確認する検査を直ちに行うことができるという効果がある。また、堰き止め部を微小固体が填塞する前に流下した液体試料に細菌が含まれていても、堰き止め部の流路径は細菌の体長よりも大きく形成されているので、細菌によって流路が閉塞してしまうということがない。堰き止め部において微小固体が堆積するよりも前に細菌によって流路が閉塞されると液体分の流下が不能となり易く、これに伴い、堰止め部より上流側において微小固体を堆積部に堆積（集中）させることが困難となりかねないが、本デバイスでは、堰き止め部の流路径を細菌の体長よりも大きくしているので、細菌による目詰まりを回避でき、確実に微小固体を堆積部に堆積させることができるという効果がある。
【００５６】
ここで、例えば、流路が微小（マイクロ流路）である場合には、微小固体の堆積によって液体の流下速度が著しく低下するが、導入した液体試料中の液体分が、堰き止め部よりも下流側へ完全に流下せずとも、微小固体は堆積部に堆積し、その堆積に伴って液体試料に混入する細菌が微小空間内に嵌まり込んだ状態で捕捉され、且つ、この微小固体の堆積状態が比較的長時間保持される。故に、細菌の捕捉状態をより確実に維持することができ、測定の信頼性を向上させることができる。
【００５７】
請求項１２記載の細菌検査用デバイスによれば、請求項１０又は１１に記載の細菌検査用デバイスの奏する効果に加え、透過部材に向かって照射された励起光は、堆積部を透過し、反対側の透過部材に積層される励起光カットフィルタにてカットされる。そして、照射された励起光によって励起された蛍光は、励起光カットフィルタ、バンドパスフィルタを経由して蛍光検知手段に入射され特定波長の蛍光が検知される。これにより、検査対象たる細菌から発せられる特定波長の光のみを検知し、その同定、確認をすることができる。この励起光カットフィルタ、バンドパスフィルタ、蛍光検知手段は前記容器本体と一体で形成されているので、検査現場においては励起光を照射するために光源のみ用意すればよく、大掛かりな検査装置を不要とし、検査用のデバイスとしての使い勝手を向上させることができる。
【００５８】
請求項１３記載の細菌検査用デバイスによれば、請求項１０ないし１２のいずれかに記載の細菌検査用デバイスの奏する効果に加え、細菌はレジオネラ属菌であるので、特定の励起光を照射することでレジオネラ属菌に蛍光を生じさせることができる。よって、簡易かつ迅速にレジオネラ属菌の検出を行うことができるという効果がある。
【００５９】
請求項１４記載の細菌検査用デバイスによれば、請求項１３記載の細菌検査用デバイスの奏する効果に加え、細菌はレジオネラ・ニューモフィラであるので、特定の励起光を照射することで生じる蛍光を検出することで、レジオネラ属菌のなかでも病原性が高いとされているレジオネラ・ニューモフィラの存在を特定して検出することができるという効果がある。
【００６０】
請求項１５記載の細菌検査装置によれば、請求項１０又は１１に記載の細菌検査用デバイスの堆積部に対し、第１光源より励起光を照射し、その第１光源からの励起光照射に基づき発生する蛍光が、蛍光検知手段によって検出されるので、サンプリングした液体試料を細菌検査用デバイスに導入し微小固体と共に流路を流下させることで、液体試料に混入した微小固体を堆積部に堆積させると共に、当該微小固体によって堆積部に捕捉された細菌を直ちに検知することが可能となる。ここで、細菌検査用デバイスとは別体で、励起光のカットフィルタやバンドパスフィルタを設けるとすれば、細菌検査用デバイスを安価にすることができる。かかる場合に、カットフィルタやバンドパスフィルタを装置内に着脱可能で設ければ、複数のカットフィルタやバンドパスフィルタを、検査対象の細菌に対して照射する励起光や生ずる蛍光に応じて適切なものに交換して使用することができる。これにより、液体試料を導入した１の細菌検査用デバイスに対し、多種類の細菌検出検査を行うことができ、複数種類の細菌検出を目的とする場合に検査の効率化を図ることができる。
【００６１】
請求項１６記載の細菌検査装置によれば、請求項１５に記載の細菌検査装置の奏する効果に加え、最大照射時間以内の予め設定された時間に基づいて、制限照射実行手段にて、前記第２光源による照射が実行される。これにより、第２光源から堆積部に捕捉された細菌にストレスを負荷するため、比較的短い波長の光が細菌検査用デバイスの堆積部に対し照射される。比較的短い波長の光は、細菌に対してはストレスとなるので、ストレスに起因して産生される発光物質の産生量を増加させ、目的の光を発する細菌を、より的確に、感度良く検出することができるという効果がある。また、ストレス負荷は、場合によっては生命活動が停止するような多大なダメージを細菌に与えるが、最大照射時間以内の予め設定された時間に基づいて光照射が行われるので、過度のストレス負荷となることを抑制し、細菌の生存への影響や産生される発光物質の変質を抑制することができるという効果がある。更に、光照射で細菌に対してストレス負荷を行うものであるので、例えば化学物質や熱などの他のストレスを細菌に負荷する場合に比べて、簡便に処理を行うことができるという効果がある。
【００６２】
請求項１７記載の細菌検査装置によれば、請求項１５又は１６に記載の細菌検査装置の奏する効果に加え、細菌はレジオネラ属菌であるので、特定の励起光を照射することで生じる蛍光を検出することで、簡易かつ迅速にレジオネラ属菌の検出を行うことができるという効果がある。
【００６３】
請求項１８記載の細菌検査装置によれば、請求項１７に記載の細菌検査装置の奏する効果に加え、細菌はレジオネラ・ニューモフィラであるので、特定の励起光を照射することで生じる蛍光を検出することで、レジオネラ属菌のなかでも病原性が高いとされているレジオネラ・ニューモフィラの存在を特定して検出することができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】細菌検査用デバイスに係る実施形態の説明図である。
【図２】細菌検査用デバイスの使用態様を示す説明図である。
【図３】粒状体により捕捉される細菌の状態を示す説明図である。
【図４】細菌検査装置に係る実施形態の説明図である。
【図５】細菌検知方法に係る実施形態の手順を示す説明図である。
【図６】実施例１における蛍光測定結果を示す図である。
【図７】実施例２における蛍光測定結果を示す説明図である。
【図８】実施例２に関する追加実験における蛍光測定の結果を示す説明図である。
【図９】実施例２に関する追加実験における蛍光測定の結果を示す説明図である。
【図１０】比較例２における蛍光測定結果を示す説明図である。
【図１１】従来の細菌捕獲装置を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。説明の便宜上、細菌検査用デバイスの実施形態について説明し、その後、細菌検査装置および細菌検知方法について説明することとする。
【００６６】
図１（ａ）は、細菌検査用デバイス１の斜視図であり、図１（ｂ）は平面図である。なお、説明を簡単にするために、図１においては、容器本体１００の上面に覆設される蓋部材を省略して図示している。これらの図に示すように、本実施形態の細菌検査用デバイス１は、全体形状が直方体の箱形に構成された容器本体１００の内部に、液体が流動できる流路が形成されている。その流路の上流側には、通常流路領域１０１が形成され、下流側には液体収容のための収容領域１０２が設けられている。また、通常流路領域１０１と収容領域１０２との中間には、流路幅を小さくした複数の流路幅減少領域１０３と、各流路幅減少領域１０３のそれぞれに連通する最小幅流路領域１０４とが設けられている。この流路幅減少領域１０３と最小幅流路領域１０４は、容器本体１００の底面１１１から高さ方向に突出する突起部１０５によって構成され、突起部１０５によって流路の深さ方向に均等な流路幅が形成されている。
【００６７】
流路幅減少領域１０３は、流路幅が徐々に小さくなるように、上流側（通常流路領域１０１の側）を大きく開口し、下流側（収容領域１０４の側）向かって徐々にその幅を狭くしている。換言すれば、突起部１０５が上流側に尖端を有し、側面を傾斜するように設けられているのである。この傾斜面は、最小幅流路領域１０４まで直線的に形成されており、最小幅流路領域１０４は、適宜長さの範囲で同じ幅に構成されている。
【００６８】
なお、最小幅流路領域１０４よりも下流側には流路が拡大する領域１０６が形成されているが、これは、容器を逆に使用した場合であっても同様の効果を得るためのものである。すなわち、収容領域１０４から通常流路領域１０１に向かって液体を流下させる場合には、流路が拡大する領域１０６が流路幅減少領域として機能させることができるものである。
【００６９】
更には、最小幅流路領域１０４は、1μｍ〜30μｍの幅で形成される。好適には3μｍ〜15μｍで形成され、レジオネラ属菌の検出を目的とする場合には、１０μｍの流路幅が特に好適に用いられる。また、用いる粒状体の直径（粒径）に応じて、ストッパーの機能を果たすように、最小幅流路領域１０４の流路幅は設定される。ここで、液体試料に混合する粒状体は、その製造法の限界により平均粒径で規定されるため、平均粒径より小さいものから大きいものまで、およそ正規分布を持ってその粒径が分布している。このため、最小幅流路領域１０４の流路幅は、用いる粒状体の平均粒径の大きくとも２倍以下の間隔とすることが望ましい。それ以上とするとほとんどの粒状体が最小幅流路領域１０４を通過してしまうからである。
【００７０】
因みに、最小幅流路領域１０４の流路幅は、粒状体の粒径（球状の場合は直径）よりも大きく構成した場合であっても、粒状体が隣接する周辺の粒状体と接した状態で集合するため、周辺との摩擦抵抗により容易に通過することはできないものと想定されるが、粒状体を構成する材質等により摩擦抵抗が極めて小さい場合は、流動性を有して、流下することもあり得る。そこで、確実に粒状体１０７の流下をより確実に阻止するために、最小幅流路領域１０４は、粒状体の粒径よりも小さくなるように構成することが好ましい。
【００７１】
一方で、必ずしも最小幅流路領域１０４の流路幅は、粒状体の粒径よりも小さくする必要はなく、例えば、粒状体の粒径の方が最小幅流路領域１０４の流路幅よりも小さい場合であっても、流路幅減少領域１０３から流れに沿って多量の粒状体が一か所（最小幅流路領域１０４）に集中して流れ込むと、込み合って、最小幅流路領域１０４の上流側端部は粒状体にて填塞されるからである。そして、粒状体にて最小幅流路領域１０４が填塞されるまでは、一部の粒状体が最小幅流路領域１０４を通過して下流側へ流下してしまうが、流下する量は一部であって、比較的少ない量（微量）であるので、検出に影響を及ぼすことはない。
【００７２】
また、最小幅流路領域１０４の流路長は、好適には0.1ｍｍ〜5ｍｍであり、更に好適には1ｍｍ〜3ｍｍである。例えば、流路幅が細くなるほど流路抵抗が大きくなるため、上記範囲において、円滑に液体試料が通過できるように適切な長さで形成される。また、最小幅流路領域１０４は、複数設けられることが好ましい。粒状体には、通常ばらつきがあるため、想定よりも大きな粒状体が混在していると、かかる大径の粒状体にて完全に最小幅流路領域１０４が閉塞されることがある。これによって液体の流下が完全に不能となると、液体試料の導入も困難になりかねない。そこで、１の最小幅流路領域１０４が完全に閉塞されても、他の最小幅流路領域１０４によって液体の通過が確保されるように、複数の最小幅流路領域１０４が設けられることが好ましいのである。
【００７３】
このように、最小幅流路領域１０４は、粒状体の大きさとの関係により液体試料を通過させることができるものの、粒状体の通過を阻止することができるものであり、当該最小幅流路領域１０４が本発明の堰き止め部として機能するものである。従って、この最小幅流路領域１０４よりも上流側に堆積部１１０が形成されることとなるのである。そこで、本実施形態では、流路幅減少領域１０３は粒状体を集中させる機能を有するとともに堆積部１１０としての機能を有し、また、通常流路領域１０１は、液体試料を流下させる機能を有するとともに、その一部を堆積部１１０として機能させている。ここで、上記堰き止め部（すなわち最小幅流路領域１０４）によって粒状体１０７が堰き止められ、堆積部１１０に粒状体が堆積する状態を図２に示す。
【００７４】
図２（ａ）は、粒状体が流下を阻止された状態の平面視における図であり、図２（ｂ）は、図２（ａ）のＢ−Ｂ断面図である。ただし、図２（ａ）には容器本体１００を封鎖する蓋部材を省略している。この図に示されているように、粒状体１０７を含む液体試料１０８を通常流路領域１０１から収容領域１０２に向かって流下させることにより、複数の粒状体１０７が、流路幅減少領域１０３によって、最小幅流路領域１０４に向かって案内されるが、その大部分はこの最小幅流路領域１０４を通過できず、結果的に、流路幅減少領域１０３に集中する状態で流下が阻止される。また、液体試料１０８は、粒状体１０７の間隙を通過し、また、最小幅流路領域１０４を通過して収容領域１０２まで流下することとなる。これにより、粒状体１０７は液体試料１０８から分離され、流路幅減少領域１０３を中心に集合されることとなる。
【００７５】
このとき、液体試料１０８に細菌が含まれている場合には、図３に示すように、細菌１０９は、粒状体１０７が集合することによって形成される間隙に嵌まり込んだ状態で捕捉されることとなる。細菌１０９は所定の体長と幅を有しており、粒状体の集合体によって形成される間隙の狭い部分に挟まれる状態となるのである。例えば、レジオネラ・ニューモフィラの場合は、体長が約１０μｍで直径が約１μｍであるため、粒状体１０７を球形として、その直径（粒径）を１０μｍとすると、最も広い間隙でも数μｍ程度となり、体長約１０μｍの菌は容易に通過できない状態となる。
【００７６】
ここで、液体試料１０８の流下方法について説明すると、上述のように粒状体１０７が集合した状態で液体試料１０８を流入した場合は、細菌が上流側にのみ捕捉されることとなるが、液体試料１０８に予め粒状体１０７を混入し、両者を同時に流入させることによって、粒状体１０７が流下するにつれて徐々に集合し、その集合の過程で近接する周辺の粒状体１０７の間隔を狭くすることとなり、最終的に形成される間隙によって細菌を捕捉するのである。従って、細菌は、液体試料１０８に混入した粒状体１０７が集合する過程において、その間隙に嵌まり込んだ状態で捕捉されるものであり、堆積した粒状体１０７の全体にわたって捕捉されることとなるのである。
【００７７】
ところで、本実施形態の細菌検査用デバイス１を使用する場合、液体試料に粒状体を混入したものを流下させるものである。そこで、粒状体が混入された液体試料を通常流路領域１０１から流下させると、粒状体は、流路幅減少領域１０３によって集中されつつ流下が阻止される。ここで、粒状体は、捕捉する細菌の大きさによって適宜選定されるが、一般的には細菌の大きさは、直径１μｍ長さ１０μｍであるので、粒状体１０７には、堆積した場合に形成される間隙が当該細菌に比して著しく大きくならないように、平均的な粒径が７μｍ〜２０μｍのものが好適に用いられる。
【００７８】
ここで、例えば、検出する細菌が体長が約１０μｍで直径が約１μｍのレジオネラ・ニューモフィラである場合は、直角に曲がってビーズ間に少なくとも１細胞（１セル）が充填されるとすると、７μｍ以上の粒径を有する粒状体であることが望ましい。従って、平均的な粒径が７μｍ〜２０μｍの粒状体が好適に用いられ、特に好適には７μｍ〜１０μｍである。
【００７９】
なお、レジオネラ・ニューモフィラと異なる菌種について検知する場合は、その細菌の大きさに応じて粒状体１０７の径を調整すればよく、体長１０μｍで直径１μｍのレジオネラ・ニューモフィラの捕捉に使用する場合には、粒状体１０７の直径を１０μｍとすることが好適であることから、これを一つの目安として、細菌の大小に応じて直径を比例的に変更することにより、粒状体１０７の直径を選定してもよい。
【００８０】
また、微小固体（粒状体）が形成する微小空間とは、少なくとも細菌の１セルが捕捉される空間を最小容積とする適宜の範囲の空間である。従って、捕捉する細菌の種類によって変化するが、例えば、レジオネラ属菌（レジオネラ・ニューモフィラ）であれば、平均的な１セルとほぼ同じ容積である１．０×１０−１１cm3〜３．９×１０−７cm3（検出目的の細菌の容積の１倍〜略４万倍程度）であり、かかる空間に閉じ込められると良好な蛍光発光を生じる。
【００８１】
各流路領域１０１〜１０４の幅が前記例示のように微小である場合（いわゆるマイクロ流路の場合）には、使用される粒状体１０７の径も必然的に微細となり（前記例示参照）、粒状体１０７が集中・堆積した状態では、液体試料の流下は緩慢であり、場合によっては流下できない。このため、粒状体１０７が形成する間隙に浸透、透過する液体および捕捉される細菌を除いた残りの液体試料は、粒状体１０７が堆積した領域よりも上流側に残存することとなる。
【００８２】
また、粒状体１０７が集中・堆積するよりも前に流下した液体試料は、細菌とともに流下することとなるが、流下する液体試料の量は僅少であることから、細菌の検知に支障を来すことはない。さらに、最小幅流路領域１０４の流路幅を細菌の幅（肉厚または径）よりも十分に大きく構成することにより、細菌が最小幅流路領域１０４を通過し得ることとなり、細菌によって最小幅流路領域が堰き止められる事態は生じないこととなる。そして、最小幅流路領域１０４の下流側には、収容領域１０２が形成されているため、最小幅流路領域を通過した液体試料を一時的に容器内に保存させておくことができる。検査対象たる液体試料には、細菌が含まれている可能性があるため、一時的に保存し、検査結果に応じて適宜処理した後廃棄することが可能となる。
【００８３】
さらに、マイクロ流路の場合には、自然流下による液体試料および粒状体１０７の流下は期待できないことから、図２（ｂ）に示すように、上流側の蓋部材１２０に注入口１２１を設け、この注入口１２１からシリンジ等によって強制的に加圧注入することにより、強制的な流下をさせることができる。この場合、強制的に流下された粒状体１０７は、最小幅流路領域１０４で堰き止められ、注入時の圧力によって相互に接触しながら堆積された状態が保持されることとなる。また、注入時の圧力によって複数の粒状体１０７が相互に圧接されることにより、捕捉された細菌に対してストレスを与えることとなり、ストレスが与えられた環境下で自己発光が強くなる種類の細菌については、その検出を容易にすることができる。なお、粒状体１０７が堰き止められる前に最小幅流路領域１０４を通過した液体試料は、収容領域１０２に到達することとなるが、蓋部材１２０に排出口１２２を設けることにより、外部に排出することができる。さらに、この排出口１２２は、加圧注入する際の内部空気の排出用としても機能させることができる。
【００８４】
上記のように、粒状体１０７は堆積状態が保持されることによって、容器内に捕捉された状態のまま光検知により測定することができることから、細菌検知を容易に行うことができる。ここで、堆積状態が保持されるとは、複数の粒状体１０７が堆積された適宜範囲全体に留まることを意味しており、必ずしも個々の粒状体１０７が現位置で固定されていることを意味するものではない。
【００８５】
上記のような微細な流路を構成するためには、半導体プロセスに基づくいわゆるＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical System）の一分野であるマイクロ流路（Micro Fluidic Device）技術を用いることができる。例えば、シリコン基板上に、リソグラフィとエッチングにより、シリコン鋳型を形成する。このシリコン鋳型にポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：poly(dimethyl siloxane)を流し込み、容器の原型を形成する。その後、シリコン鋳型から離型した原型の表面にガラスを張り付けるのである。このような構成により、容器１００を形成することができるため、各構成部分は透過性を有することとなり、特に、容器１００の底面１１１（図１）をもって、本発明の透過部材として機能させることができる。少なくとも、粒状体１０７が堆積する範囲内を、光透過性を有する透過部材にすることにより、細菌の発光を検知することが可能となる。また、粒状体１０７としては、ガラスビーズを使用することができる。ガラスビーズのように透過性を有する材料で粒状体１０７を構成することにより、粒状体１０７によって細菌の発光が遮断されることがなく、捕捉した細菌から発せられる光を余すことなく検出することが可能となる。
【００８６】
このように構成された細菌検査用デバイス１を使用することにより捕捉された細菌の光による検出が可能となる。すなわち、細菌検査用デバイス１内で粒状体１０７が集合している領域は、その全域にわたって細菌が捕捉されることとなるから、当該粒状体１０７が集合している領域に向かって励起光を照射し、これらにより発せられる蛍光を観察すればよいのである。そこで、この種の蛍光の観察には、落射蛍光顕微鏡と分光計を組み合わせて観測することができる。すなわち、落射蛍光顕微鏡は、励起光を照射するための照射部とフィルタブロックを備えており、励起光を排除した蛍光を観察することができる。ここで観察できる蛍光のうち、分光計によって蛍光波長の強度を測定することが可能となる。
【００８７】
そのため、特定の細菌が発する特有の波長の光が観測できるか否かにより、当該特定細菌の存在を判断することができ、また、検出される蛍光の波長のピークを観察することにより、細菌が発する特有の波長の蛍光と照合すれば、その細菌の種類を同定することも可能となる。例えば、レジオネラ・ニューモフィラに対し、励起光として波長が３５０ｎｍの光を照射すると、波長４５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲の近傍にブロードなピークを有する蛍光を観察することができる。そこで、上記範囲の波長の状態を観察することにより、レジオネラ・ニューモフィラの存在を確認することができることとなる。さらに、このような蛍光を指標として、レジオネラ・ニューモフィラの濃度と、蛍光の強度との関係を示す検量線を得ることにより、液体試料中のレジオネラ・ニューモフィラの濃度を検出することも可能となる。
【００８８】
尚、励起光が紫外光であると、照射によって細菌や蛍光物質にダメージが生じることから、上記した励起光の照射時間は比較的短い時間とすることが好ましく、数時間以内であることが好ましい。特に好適には１時間以内、更に好適には１０００秒以内であり、最も好適には６００秒以内である。
【００８９】
また、細菌が、励起光によらず生物発光をする種である場合には、励起光照射は不要である。
【００９０】
ところで、上記容器本体１００の作製については、シリコン鋳型を使用しＰＤＭＳを成型するものを例示したが、鋳型の製造には、シリコンに限定されるものではなく、他の半導体材料を使用してもよく、ＳＵ−８などの材料のほか、ポリイミドまたはポリベンゾオキサゾールに代表される樹脂などを用いることもできる。また、容器本体１００の材料としては、ＰＤＭＳに限定されるものではなく、シリコンをＭＥＭＳ技術によって所定形状に成形したものを使用することができるほか、ガラスや石英を使用することができ、また、上述の樹脂材料を使用することもできる。容器本体１００に収容された状態で蛍光を観測するためには、光透過性を有する材料を選定することが好ましく、このときの光透過性を有するものとは、可視光の透過性を有するものに限らず、特定波長の光のみについて透過性を有するものを意味している。このように、容器１００が透過性を有する材料で形成されることにより、容器１００の構成部材によって透過部材とすることができるほか、図２（ｂ）に示した蓋部材１２０を透過性材料で形成することにより、当該蓋部材１２０を透過部材として機能させてもよい。そして、蓋部材１２０を透過部材とする場合、容器１００の底面１１１とともに、その表面および裏面の双方を透過部材とすることができ、一方を励起光の入射側とし、他方を受光側とすることができる。そして、受光側には、励起光を遮断するためのカットフィルタを積層することにより、細菌が発する光のみを透過させることができ、さらに、バンドパスフィルタを積層することにより、特定波長（特定の細菌が発する光）の受光を可能にすることができる。
【００９１】
さらに、粒状体１０７についても、ガラスビーズを例示したが、これに代えて、例えば、チタン酸バリウムのビーズを用いてもよく、更に、適度な強度と粒径を調整しつつ製造できるものであれば、その材料を問うものではない。また、形状は球状を基本としているが、扁球状としてもよく、要諦は、ビーズ様形状の粒子によって形成される間隙により細菌を捕捉することであり、適宜な間隙を形成できるものであれば、その材料および形状を適宜変更してもよい。この意味において、各種の材料・形状により適宜な大きさに形成されたものを微小固体と総称している。
【００９２】
なお、粒状体１０７を球状又は扁球状とする場合、透明なガラスビーズのように光を透過するもので構成することにより、粒状体１０７がレンズとして機能させることができる。このため、その集光作用によって励起光の単位体積当たりの照射強度を検体中で増大させることとなり、発光状態を一層顕著に観察することができる。前述のように特定波長のみを観察する場合には、少なくとも当該特定波長の光を透過できる材質によって粒状体１０７を構成すれば、当該特定波長に光に対するレンズ機能を得ることができる。
【００９３】
そして、捕捉する細菌としては、レジオネラ・ニューモフィラを例示したが、他のレジオネラ属菌であるレジオネラ・デュモフィ、レジオネラ・ミクダディ、レジオネラ・ボウズマニイ、レジオネラ・アニサなどの蛍光を発する菌種についても同様に検知可能であり、さらには、レジオネラ属菌に限定されず、蛍光を発する細菌であれば適用可能であることは明らかである。
【００９４】
次に、細菌検査装置の実施形態について説明する。図４（ａ）は細菌検査装置を構成する各部材を分離した状態を示し、図４（ｂ）は、これら各部材を一体化した状態を示している。
【００９５】
図４（ａ）に示すように、本実施形態の細菌検査装置２００は、前述した構成の細菌検査用デバイス１と同様の細菌検査用デバイス２０１と、この細菌検査用デバイス２０１に対して励起光を照射するための励起光照射部２０２と、蛍光を受光するための蛍光受光部２０３とを備えている。また、蛍光受光部２０３は、受光する光から励起光を排除するためのカットフィルタ２３１と、特定波長を透過するバンドパスフィルタ２３２と、フォトダイオードなどが実装された光検知デバイス２３３とを備えている。
【００９６】
励起光照射部２０２は、細菌検査用デバイス２０１の上部に設置され、その反対側である細菌検査用デバイス２０１の底面２１１には蛍光受光部２０３が設けられている。図４においては図示を省略しているが細菌検査用デバイス２０１の上面には透明な蓋部材を設けることにより、励起光照射部２０２から照射される励起光は、細菌検査用デバイス２０１の内部に集合する前記粒状体１０７（図２）およびその間隙によって捕捉される細菌に到達するようになっている。なお、ドラフト内で作業を行う場合や、検出する細菌が病原性に問題のない場合などには、蓋部材を非設とし細菌検査用デバイス２０１の上面は開口されていても良い。
【００９７】
また、細菌検査用デバイス２０１は、光透過性を有する材料で設けられ、励起光の照射により発せられる蛍光は、細菌検査用デバイス２０１の底面２１１を透過して蛍光受光部２０３によって受光されるようになっている。
【００９８】
なお、粒状体１０７はガラスビーズなどを使用することにより、粒状体１０７が重なる位置に捕捉される細菌に対しても励起光が到達し、また、蛍光を蛍光受光部２０３まで到達させることができる。
【００９９】
蛍光受光部２０３を構成するカットフィルタ２３１、バンドパスフィルタ２３２および光検知デバイス２３３は、それぞれ積層された状態で一体化され、さらにカットフィルタ２３１の上面も細菌検査用デバイス２０１の底面に積層され、細菌検査用デバイス２０１と蛍光受光部２０３とが一体化されている（図４（ｂ）参照）。
【０１００】
このように、蛍光受光部２０３が細菌検査用デバイス２０１と一体化されることにより、細菌検査用デバイス２０１の向き（または傾斜）に関係なく、細菌検査用デバイス２０１の底面側における蛍光を観測することができ、観測条件を一定にすることができる。また、その観測は、細菌の捕捉した直後に行うことができることから、極めて迅速に測定結果を得ることができる。
【０１０１】
なお、光検知デバイス２３３は、配線基板にフォトダイオードや電荷結合素子など受光素子がフリップチップボンディングにより実装されており、ボンディング材料としては、光透過性のある材料（例えば、旭硝子製ＣＹＴＯＰ（登録商標）など）が使用される。また、受光素子としては、フォトダイオードに限らず、フォトゲート型イメージセンサや相補型金属酸化物半導体イメージセンサなどの種々の受光素子を使用することができる。
【０１０２】
さらに、カットフィルタ２３１は、励起光として使用する光の波長によって選定されるが、例えば、３５０ｎｍの波長を有する励起光を使用する場合には、４００ｎｍ以下の波長の光を遮断するカットフィルタを使用することができる。また、バンドパスフィルタ２３２は、例えば、レジオネラ・ニューモフィラの検知を目的とする場合には、４５０ｎｍ±５ｎｍの波長の光のみを透過するものを使用することができる。
【０１０３】
また、本実施形態の変形例としては、図示を省略するが、励起光照射部２０２を第２の光源（ストレス負荷光源）として機能させるように構成したものがある。ここで、第２の光源（ストレス負荷光源）は、特定波長の光を照射するものであり、捕捉されるべき細菌に対してストレスを与えるものである。
【０１０４】
細菌の中には、よく知られているように、光を好むもの、光を忌避するものがあり、前者の場合は走光性を有する細菌と言われる。また、酸素などに対しては、酸素を好むのも、嫌うものもおり、前者を好気性細菌、後者を嫌気性細菌と称している。このように環境を好まない場合、細菌はその環境を一種のストレスと感じているものと考えられる。光を忌避する場合、これをストレスと感じるため、ストレス負荷によって蛍光物質を産生することがあり、この蛍光物質の蓄積により発光強度を増大させ得ると考えられる。ここで、ストレスとは、当該細菌が特異な性質を示す（発光物質を産生する）程度の外的要因であり、この種の外的要因としては、例えば、上記した（特定波長の）光の照射や雰囲気に加え、温度変化、薬剤等の化学物質の投与、などが考えられる。上記のような意味において、前述の微細な間隙に嵌り込んだ状態（図３参照）も一種のストレスが与えられた状態と評価することができるものである。ここで、何らかの外的要因（ストレス）によって光を発する細菌にあっては、負荷されるストレスによって発光強度（蛍光強度）が変化する傾向にある。例えば、一般的に細菌は圧力に対しての耐性が高いが、酸やアルコール、熱、紫外線等の波長の短い電磁波については耐性が低い。ここで、発光物質（蛍光物質）が生命維持活動（ストレス耐性）の一環として産生される場合には、細菌の生存に過酷なストレスを与えることで、その産生量が増大することとなる。
【０１０５】
そして、そのような影響力の大きい外的要因を選択して負荷することによって、発光強度を増大させ得る。なお、生命維持を阻害する外的要因の付与によって当該細菌が死滅する可能性があり、または産生した蛍光物質を変質（分解）させるといった悪影響を与える可能性があるため、その付与の程度は、当該外的要因の内容によって適宜調整することとなる。
【０１０６】
例えば、波長が４００ｎｍ以下の紫外光を照射する場合、いわゆる殺菌効果により、生命維持を阻害するような環境下に細菌を存在させることができるのである。このような特定波長の紫外光の照射を長時間継続する場合には、細菌が死滅することがあるため、上記の細菌検査用デバイス１の実施形態で説明したと同様の比較的短い時間の照射とするのである。そのために、制限照射実行手段を設けることが好ましい。尚、比較的短い波長とは、可視光よりも短波長であり、好適には、２５０〜４００nmの波長が用いられる。
【０１０７】
制限照射実行手段とは、第２の光源（ストレス負荷光源）による照射時間が最大照射時間以内となるように、予め設定した時間の範囲で照射を行うものであり、例えば、タイマ制御されたスイッチによって構成することができる。なお、最大照射時間とは、前記紫外光を照射した場合において、細菌が死滅に至らない極限の照射時間を意味し、照射する光の波長や強度または照射対象の細菌の種類によって異なるものである。この最大照射時間は実験的に求められるものであるが、例えば、蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社  ＢＸ４３Ｆ型）の試料台上に細菌検査用デバイス１を載置した状態で励起光源（オリンパス株式会社  Ｕ-ＲＦＬ-Ｔ）にて３５０ｎｍの波長の紫外光を照射する場合で、レジオネラ属菌は３時間である。これを一つの目安として、照射光波長および強度、細菌種が異なる場合の最大照射時間を定めてもよい。
【０１０８】
さらに、上記の第２の光源は、励起光照射部２０２とは独立した個別の光源として設けた構成としてもよい。励起光照射部２０２において照射される光の波長が限定的なものであって、当該励起光照射部２０２から照射される蛍光観察のための特定波長の光とは異なる特定波長の光照射がストレス負荷に有効である場合には、当該特定波長を照射するための第２の光源を追加して設けるのである。例えば、励起光照射部２０２によって照射される光の波長が３５０ｎｍの場合であって、ストレス負荷のために３５０ｎｍ以下の波長の光の照射が有効な場合などが挙げられる。この場合においても、第２の光源には制限照射実行手段が設けられ、最大照射時間以内の照射時間となるように調整されるものである。上記とは異なり、同じ波長の光を照射する場合であっても、励起光照射部２０２は蛍光観察時に使用し、第２の光源は、照射時間が制御された一時的な光の照射のために使用するものとして、両者を個別に設けてもよい。
【０１０９】
なお、第２の光源が、上記のような趣旨で設けられることから、細菌に対するストレス負荷を目的として、他のストレス負荷手段を設ける構成もあり得る。すなわち、温度変化によりストレスを与えることができる場合には、第２の光源に代えて温度調整手段を設けることができ、また、薬剤等の化学物質を投与することによりストレスを与えることができる場合には、物質投与手段を設けるように構成することができる。
【０１１０】
次に、細菌検知方法の実施形態について説明する。細菌検知方法に係る実施形態は、前述の細菌検査用デバイスを使用し、この細菌検査用デバイスによって捕捉された細菌を検知するものである。図５は、本実施形態の手順をまとめた図である。
【０１１１】
尚、細菌検知方法の本実施形態においては、以下の説明は、細菌検査用デバイス１を用いたものとして説明を行う。
【０１１２】
本実施形態は、図５に示されているように、粒状体混入工程Ｓ１（混入工程）と、粒状体分離集合工程Ｓ２（微小固体集合堆積工程）と、観察工程Ｓ３（検出工程）との順序に従って行われるものである。粒状体混入工程Ｓ１では、液体試料に粒状体を混入し懸濁液を生成させる工程である。液体試料とは、検査対象となる細菌が含まれる液体（例えば浴槽水など）であり、粒状体の混入とは、液体試料と粒状体とを適量混合し、適度に撹拌することである。粒状体は、前述のようにガラスビーズなどが使用されるため、液体試料中で沈殿するため、液体試料は、沈殿する粒状体が全体的に浸漬できる程度の量を使用する。
【０１１３】
このように粒状体が混入された液体試料を細菌検査用デバイス１に流入することにより粒状体分離集合工程が実行される。すなわち、細菌検査用デバイス１内には、粒状体の流下を阻止し得るように流路幅を変化させるように構成されているため、この細菌検査用デバイス１に液体試料と粒状体との懸濁液を流下させることにより、粒状体は集合しつつ堆積（液体試料から分離する）こととなるのである。
【０１１４】
そして、液体試料から分離された粒状体の堆積部分について観察工程Ｓ３が行われるのである。観察工程Ｓ３は、粒状体の集合物に対して励起光を照射し、この励起光によって細菌が蛍光を発するかどうかを観察するものである。観察は、光検知デバイスなどが使用され、蛍光の状態を測定するものである。
【０１１５】
このような細菌検知方法は、粒状体が集合するときに形成される間隙に捕捉される細菌の存在を検知するものであり、培養等の過程を不要にすることから、検査結果を即時に得ることができる。また、事前処理としては、液体試料に粒状体を混入する工程のみであるため、極めて簡便に行うことができる。
【０１１６】
なお、前記の細菌検知方法に係る実施形態においては、使用する粒状体として、球状または扁球状（両者をまとめて略球状と称する）に成形したものを使用することができ、これらの粒径をほぼ均等とした（近似した粒径の）ものを使用することが好ましい。粒径が大きく異なる場合には、大きい粒径の粒状体の間隙内に小さな粒径の粒状体が侵入することとなり、細菌を捕捉できる程度の間隙を形成できない事態を招来させ得るからである。
【０１１７】
また、液体試料から分離された粒状体は、細菌検査用デバイス１内の所定位置（流路幅減少領域１０４）を境に上流側に集合した状態となることが好ましい。これは、細菌が粒状体によって形成される間隙中に捕捉されることから、捕捉された細菌を粒状体とともに所定の領域内に集合させるためである。このように、粒状体が集合する領域に捕捉された細菌をも集合させることにより、細菌から発せられる蛍光の検知を容易にすることができるのである。また、この蛍光の強度を測定することにより、細菌の濃度を検出することも可能となる。
【０１１８】
本発明の実施形態は以上のとおりであるが、これらの実施形態は本発明の一例を示すものであって、これらに限定される趣旨ではない。従って、他の形態に変形することも可能である。例えば、細菌検査用デバイス（図１）の実施形態においては、細菌検査用デバイス１は、容器１００を直方体状としたが、その形状は適宜変更でき、例えば、円筒形であってもよい。更には、円筒または扁平形の筒（シリンジ）と可動式の押子（プランジャ）とを備え、側方から液体試料を導入し押子によって強制的に流下させる構造としても良い。
【０１１９】
更には、上記実施形態においては、粒状体の流下を阻止する堰き止め部を最小幅流路領域１０４によって形成したが、粒状体の流下を阻止するものであれば、これに限られるものでなく、例えば、フィルターであっても良い。
【０１２０】
また、当該実施形態では、容器本体１００の内部のほぼ中央に突起部１０５が設けられ、流路幅減少領域１０３および最小幅流路領域１０４のほかに、流路が拡大する領域（流路拡大領域）１０６が形成されているが、通常流路領域１０１と、収容領域１０２が明確に区別されている場合には、上記の流路拡大領域１０６を形成する必要はないものである。逆に、通常流路領域１０１と収容領域１０２を区別なく使用可能にする場合には、流路拡大領域１０６に形成される側面は、流路幅減少領域１０３と対称に傾斜させて設けられることとなる。
【０１２１】
また、収容領域１０２は、液体試料に多量の細菌が含まれている場合を考慮して一時的に収容させることを目的としているが、細菌が確保された後の液体試料であることを考慮すれば、一般排水と同様に廃棄し得るものであるから、収容領域１０２に流下した液体試料を廃棄するための排出口を、収容領域１０２に設ける構成としてもよい。
【０１２２】
加えて、上記実施形態における細菌検知方法については、細菌検査用デバイス１に導入された液体試料に対し、１の蛍光波長にて細菌検出を行うことに基づき説明したが、励起光波長を変化させ、複数の蛍光（細菌）を検出するようにしても良い。また、レジオネラ・ニューモフィラは励起光を照射する限り、蛍光を発し続けるが、一方、レジオネラ・デュモフィは励起光照射とともに450 nmの蛍光を発し数秒以内に消光する。両者は類似の蛍光ピーク波長を持つが、かかる特性に基づき、蛍光検知時間をパラメータとして、レジオネラ・ニューモフィラとレジオネラ・デュモフィを区別して検出できる構成としてもよい。これによれば、病原細菌としてレジオネラ属菌の中でもっとも危険とされるレジオネラ・ニューモフィラを多くの細菌の中から選択的に検知することが可能となる。
【０１２３】
言い替えれば、細菌が発光を継続する時間は、当該細菌の種類によって異なるものであるから、その発光挙動を観察することで種類を同定し得るのである。特に、菌が産生する発光物質（化学物質、蛍光物質）の量は、通常、菌濃度が高いほど多くなり、また、化学物質の分解速度は濃度に比例するものであるので、観察対象の菌濃度が比較的高濃度（例えば１０6cell/mL以上）となると、産生される蛍光物質の増加の立ち上がり速度が大幅に増大する一方で、その減少速度も大きくなる。即ち、蛍光強度は、励起光の照射時間に対してピークを描く。かかる場合には、上記したレジオネラ・ニューモフィラとレジオネラ・デュモフィのように顕著な発光特性を有する細菌の同定においては、発光強度が極大値を示すまでの時間やスペクトル変化を測定することが非常に有効となる。
【０１２４】
尚、励起光が紫外光であると、照射によって細菌や蛍光物質にダメージが生じることから、励起光の照射時間は上記したように比較的短い時間とすることが好ましいが、菌種の判別を行うためには、少なくとも数秒以上、励起光を照射することが望ましい。
【０１２５】
さらに、上述した実施形態の細菌検知方法において、ストレス負荷処理工程を追加してもよい。前述のように、何らかの外的要因（ストレス）によって光を発する細菌にあっては、負荷されるストレスによって発光強度（蛍光強度）が変化する傾向にある。細菌検査用デバイス１内の粒状体によって形成される間隙に細菌を保持することも、当該細菌へのストレス負荷の一種と考えられるが、更に、これと異なるストレスを付加することで発光強度を増大させる工程として、本負荷処理工程は設けられる。
【０１２６】
このストレス負荷処理工程は、上述の観察工程Ｓ３（検出工程）の前に行われ、発光強度が増大する状態において観察工程が行われるものである。このように、発光強度が増大した状態で観察することにより、細菌についてより的確な検知を行うことができる。
【０１２７】
このストレス負荷処理工程は、現実に細菌検査用デバイス１内の細菌にストレスを付与するための負荷実施工程と、その後の所定時間中放置する放置工程とに区分して処理してもよい。
【０１２８】
ストレス負荷実施工程では、好適には紫外線（４００ｎｍ以下の波長の光）を照射することが挙げられる。蛍光観察を行う場合には、励起光の光源（第１光源）が必須であり、これが紫外光波長の光源であれば、そのまま細菌検査用デバイス１内に捕捉された細菌にストレスを負荷するための第２光源として併用することができる。更に、光源のオンオフだけでストレスの負荷とその停止とが可能となるので、使い勝手が良い。
【０１２９】
この場合の処理としては、上述した最大照射時間以内の光の照射とすることが好ましい。ストレス負荷は、細菌の生命維持を阻害する要因を与えることから、必要以上の光の照射により細菌が死滅する原因となり、または細菌から産生される発光物質に対する影響を与える（光分解や変質が生じる）ことにより、逆に発光強度が減少することとなるためである。
【０１３０】
放置工程では、ストレスを受けた細菌が発光強度を増大させるための時間を与えるためのものである。負荷実施工程によって、ストレス負荷を短時間とすることにより、過度なストレス負荷による細菌の死滅の可能性を回避し、または細菌によって産生される発光物質に与える影響を小さくすることができる。他方、放置工程によって所定時間放置することにより、細菌が産生する発光物質が蓄積されることが想定され、これによって発光強度の増大を招来させることとなる。なお、上記の負荷実施工程および放置工程に要する時間は、検知すべき細菌によって異なるものであり、特定の細菌の検知を行う場合には、当該細菌の特性に応じて適宜調整することとなる。更には、放置時間を設けることで、負荷実施工程によるストレス負荷によって低下した蛍光強度が回復する場合には、放置期間を基準にしてストレス負荷時間（強度）を調整しても良い。
【実施例】
【０１３１】
次に、実施例により本発明を更に詳細に説明を行うが、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
＜細菌検査用デバイスの作製＞
本実施例にかかる細菌検査用デバイスは、上記実施形態の細菌検査用デバイス１と同様の構成であり、容器本体１００の内部に、液体が流動できる流路が形成されているものである。
【０１３２】
この細菌検査用デバイスの形成は、シリコンを鋳型にした樹脂成型方法を用いた。鋳型は、まず、シリコン基板を、底面１１１と同じ大きさの方形状で底面１１１の厚み分、エッチングによって掘り下げ、次いで、フォトリソ法で図１（ｂ）の平面図を転写したレジストパターンを形成した後、ドライエッチングプロセス法により、突起部１０５と容器１００の側壁部分とに対応する部分をエッチングして、夫々の高さと略同じ深さの溝を形成して作製した。作製された鋳型型枠を設置してＰＤＭＳ（製品名DOW CORNING TORAY SILPOT 184 W/C  東レ・ダウコーニング社製）を溝に流し込むと共に表面まで満たし、60℃、120分の加熱を行い、硬化させた。硬化後、鋳型と硬化したＰＤＭＳを分離させ、ＰＤＭＳを整形して外径が縦10ｍｍ、横60ｍｍ、深さ30μｍの箱型の容器を得た。また、最小幅流路領域１０４は、流路幅10μｍ、流路長6ｍｍで３つ形成された。
【０１３３】
得られた箱型容器の開口に石英ガラス板を載置して接合し、容器内部を密閉した後、超音波ドリルにより石英ガラス板を穿孔して、直径1ｍｍの注入口を通常流路領域１０４の上流側端部近傍に形成し、収容領域１０２の下流側端部近傍に直径1ｍｍの排出口を形成した。これにより実施例１にて用いる細菌検査用デバイスを得た。
＜検体の調整＞
レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila Philadelphia-1 ATCC 33152）を、純水に接種して高濃度菌液を作製し、計数盤（プレパラ−ト）を利用して光学顕微鏡下で菌数をカウントすることで微生物の数を算出した。その後、高濃度菌液の一定量を純水にて希釈し、菌濃度が所望量（１×１０３〜１×１０６cells/mL）となるように調整した。このうち、菌濃度１０6cell/mL（以下、サンプルAと称す。）、菌濃度１０5cell/mL(以下、サンプルBと称す)のものについて、それぞれ１ｍｌに、ガラスビーズ（平均粒径１０μｍ（粒度分布７〜２０μｍ））の５×１０７個を混合して懸濁した後、各懸濁液をそれぞれシリンジによって吸引し、吸引した懸濁液を注入口から細菌検査用デバイス（容器１００）内へ１ｍｌ圧送した。そして、注入口をパテで封止した。これにより、最小幅流路領域１０４より上流の流路幅減少領域１０３に、ガラスビーズが図２（ａ）に示すように堆積した。
【０１３４】
ガラスビーズが堆積した細菌検査用デバイスを落斜蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社製）の顕微鏡台にセットし、上方から細菌検査用デバイスのビーズが堆積する領域に向かって350nmの励起光を照射し、生じる蛍光を細菌検査用デバイスの裏面側から分光光度計（オーシャンオプティクス社製）で測定した。結果を図６に示す。
【０１３５】
また、ブランクとして、細菌検査用デバイスにビーズのみを純水に分散させたビーズ懸濁液を導入したもの及び細菌検査用デバイス単体についても同様に励起光照射とそれにより得られる蛍光の測定とを行った。その結果についても図６に示す。
【０１３６】
図６は、横軸に波長（図６において「Wavelength」と表示）を縦軸に蛍光強度（図６において「Fluorescence intensity」と表示）を示したグラフであり、サンプルA（「Legionella１０6cell/mL」）、サンプルB（「Legionella１０5cell/mL」）、細菌検査用デバイスにビーズ懸濁液を導入したもの（「容器＋ビーズ」）、細菌検査用デバイス単体（「容器」）のそれぞれのスペクトル曲線が示されている。
【０１３７】
図６からも分かるように、サンプルA，Bのスペクトル曲線は、ブランクとした２つのスペクトル曲線とは異なり、レジオネラ・ニューモフィラからの蛍光が４５０nmから５００nm近傍にブロードなピークで観察された。また、サンプルAとサンプルBとでは、菌濃度の高いサンプルAのほうが、蛍光強度が高かったことも示された。即ち、ビーズ間にレジオネラ・ニューモフィラを捕捉すると、レジオネラ・ニューモフィラ特有の蛍光が発せられること、更には、菌濃度の増加に伴ってその蛍光強度が高くなることが示されたものであり、この蛍光を指標として、レジオネラ濃度と蛍光強度との検量線をあらかじめ作成することにより、未知のレジオネラ・ニューモフィラ濃度の検液に対して、その濃度検出が可能となることが示された。
【０１３８】
（実施例２）
実施例１と同様の検体の調整手法でサンプルＡ（菌濃度１０6cell/mL）を調整し、実施例１同様の細菌検査用デバイスに導入して検体を準備した。そしてビーズ間に捕捉されたレジオネラ・ニューモフィラに対し、３５０ｎｍの波長の紫外光を８００秒間継続的に照射し、蛍光強度の積算時間を５秒とし、１０秒ごとに測定した。測定装置は実施例１と同様である。即ち、落斜蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社製）に備えられた蛍光観察用の励起光源をそのままストレス負荷光源として用いた。その結果を図７に示す。図７は、横軸に励起光照射時間、縦軸に蛍光強度を示しており、励起光照射時間に対する蛍光強度の経時変化を示したグラフである。図７から分かるように、レジオネラ・ニューモヒラを含む検体（図７中「ビーズ＋レジオネラ」として示す）においては、紫外光の照射直後から蛍光強度は上昇し、約６分（３６０秒）後に蛍光強度が最大値を示している。
【０１３９】
また、紫外光の照射によってレジオネラ・ニューモフィラが持続的に蛍光物質を産生することが示された。励起光である３５０ｎｍ波長の紫外光は、レジオネラ・ニューモフィラにはストレスとなるものであり、細菌検査用デバイスに導入した状態で更にかかるストレスを負荷することによって蛍光強度が向上することが示された。
【０１４０】
なお、上記最大値を示した後に蛍光強度が減少しているのは、レジオネラ・ニューモフィラの生菌数の減少、または蛍光物質の性質が変質（分解）したものと思われる。つまり、蛍光物質の産生と分解とはトレードオフの関係にあり、観察に最適な時間領域が存在することが示された。
【０１４１】
そこで、追加実験として、検体（細菌検査用デバイス）に短時間（３秒〜５秒）の紫外光照射の後、当該紫外光の照射を中止し、２４時間放置した時点での蛍光強度を９００秒間測定した。本実験でも、ストレス負荷のための紫外光と励起光とは、ともに３５０ｎｍの波長の光を使用した。この結果を図８に示す。尚、放置条件は、室温２０℃、遮光状態とし、以下の追加実験でも同様である。
【０１４２】
図８は、横軸に励起光の照射時間（図８において「照射時間」と表示）、縦軸に蛍光強度を示しており、励起光照射時間に対する蛍光強度の経時変化を示したグラフである。図８から分かるように、紫外光を照射した後２４時間経過したレジオネラ・ニューモフィラの蛍光特性（図８中、「２４時間後」と表示）において、励起光の照射開始直後に非常に高い蛍光強度が示されている。図８には、比較のために、検体調整直後に励起光を照射して蛍光観察を行った結果（図７に示した実施例２の結果、（図８中、「注入直後」と表示））についても示しており、これと比較すれば、２４時間放置後に励起光を照射して蛍光強度を測定した場合の方が、放置を行わなかった比較例よりも顕著に高い蛍光強度をしている。
【０１４３】
そして、更なる追加実験として、長期間の経過を観察するために、紫外光照射後の放置時間を４８時間、７２時間、９６時間とした３種類のサンプルについて、それぞれの蛍光強度を測定した。各サンプルのそれぞれについて、８００秒から９００秒間の蛍光観察（励起光３５０ｎｍ）を行った。そして、得られた最大蛍光強度の結果を放置時間２４時間サンプルの結果と共に図９に示す。図９は、横軸に励起光照射時間、縦軸に蛍光強度を示しており、励起光照射時間に対する蛍光強度の経時変化を示したグラフである。図９から分かるように、紫外光の照射によりストレスを受けたレジオネラ・ニューモフィラを、その後放置した場合、２４時間前後〜４８時間前後の範囲において、最大の蛍光強度を示す結果となった。つまり、短時間のストレスを受けたレジオネラ・ニューモフィラは、その直後から２４時間以上持続して蛍光物質を産生するが、やがて産生を収束させる。このように、短時間のストレス負荷とその後の所定時間の放置とを組み合わせれば、蛍光強度を上昇させてレジオネラ・ニューモフィラの検出を容易化し、検知精度を向上させ得ることが示された。検体となる液体試料を採取して直ちに測定をする場合に比べタイムラグが発生するが、２４時間のタイムラグであれば、培養によって検出する従来法に比べて、検出の迅速化を十分に達成する。
【０１４４】
（比較例１）
実施例１で用いたレジオネラ・ニューモフィラを用いて高濃度の菌液を作製し、遠心分離機を用いた遠心沈降にて菌を回収した。３５０nmの光を照射して観察を行ったところ、４５０nmから５００nmにおいて僅かに蛍光発光が観察された。これは、実施例１の細菌濃度よりも高濃度であるにも関わらず、得られた蛍光強度は実施例１で細菌検査用デバイスを用いて測定した場合に比して、遥かに微弱であった。即ち、相当量の菌が存在（濃縮）したとしても、その存在箇所に、単純に、励起光を照射して生じる蛍光を観察するという手法では、その検出は、非常に高度で困難になることが示された。
【０１４５】
（比較例２）
実施例１と同様に検体を調整した後、紫外線照射を行うことなく、実施例２の追加実験における放置条件と同条件で２４時間の放置を行った後、実施例１と同様の手法にて蛍光観察を行った。結果を図１０に示す。
【０１４６】
図１０は、横軸に励起光の照射時間（図１０において「照射時間」と表示）、縦軸に蛍光強度を示しており、励起光照射時間に対する蛍光強度の経時変化を示したグラフである。図１０から分かるように、励起光の照射直後から蛍光強度は上昇し、５００秒近傍で蛍光強度が最大値を示している。また、その最大蛍光強度は０．００５５ａ．ｕ．程度であり、実施例１のように励起光照射後に直ちに蛍光観察を行った場合と同程度の蛍光特性が得られた。これにより、単に放置しただけでは蛍光強度の大幅な上昇は認められず、蛍光強度の上昇は、紫外線照射によって短時間のストレスを負荷した後に放置することによって生じることが示された。尚、本比較例においては４００秒近傍から６００秒近傍までにかけて蛍光強度が極大を示しており、また、９００秒を超えても照射直後に比べて十分に高い蛍光強度が示されている。また、図１０に示される蛍光の減衰特性から１０００秒を超えても照射直後に比べて十分に高い蛍光強度を確保できる傾向が示された。
【０１４７】
（比較例３）
実施例１と同様の方法で調整したサンプルAの１ｍｌを、ガラスビーズを混合せずに細菌検査用デバイスへ圧送した。これに実施例１と同様の装置にて３５０ｎｍの励起光を照射して蛍光観察を行ったが、蛍光発光を観察することができなかった。また、実施例２と同様に短時間（３秒〜５秒）の紫外光照射の後、当該紫外光の照射を中止し、放置を行っても蛍光強度の上昇は見られなかった。
【符号の説明】
【０１４８】
１，２０１  細菌検査用デバイス
１００  細菌検査用デバイスの容器本体
１０１  通常流路領域
１０２  収容領域
１０３  流路幅減少領域
１０４  最小幅流路領域
１０５  突起部
１０６  流路幅拡大領域
１０７  粒状体
１０８  液体試料
１０９  細菌
１１０  堆積部
１１１  容器本体の底面
１２０  蓋部材
１２１  注入口
１２２  排出口
２００  細菌検査装置
２０２  励起光照射部
２０３  蛍光受光部
２３１  カットフィルタ
２３２  バンドパスフィルタ
２３３  光検知デバイス
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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