(57)【要約】【課題】MSn分析を利用した糖ペプチドの構造解析の際に、無駄な分析の実行を回避して試料の使用量を減らし分析時間を短縮する。【解決手段】被検試料に対するMS1スペクトルから選択された複数のプリカーサイオンについて、被検試料に対するMS2分析を実行し複数のMS2スペクトルを取得する（S1-S3）。複数のMS2スペクトルからそれぞれペプチドイオン、HexNAc環開裂付加ペプチドイオン、HexNAc付加ペプチドイオンをプリカーサイオン候補として選定し、さらにトリプレットピークのm/zを比較することでMS2スペクトルの実質的な重複を判断し、同一糖ペプチド由来のプリカーサイオンの重複を排除してプリカーサイオンを整理する（S5-S6）。こうして数を減らしたプリカーサイオンに関し被検試料に対するMS3分析をそれぞれ実行し、その結果得られたMS3スペクトルから収集したピーク情報をデータベース検索に供しペプチドを同定する（S7-S10）。【選択図】図２
2015230261.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともｎが１〜３であるＭＳn分析を実行可能な質量分析装置を利用して、被検試料中の糖ペプチドの構造を解析する糖ペプチド解析方法であって、
a)被検試料をＭＳ1分析して得られたＭＳ1スペクトルに現れる糖ペプチド由来の複数のイオンをプリカーサイオンとして選定するプリカーサ選定ステップと、
b)前記被検試料に対し前記プリカーサ選定ステップにおいて選定された複数のプリカーサイオンに関するＭＳ2分析をそれぞれ実行して複数のＭＳ2スペクトルを取得するＭＳ2分析実行ステップと、
c)前記ＭＳ2分析実行ステップを実行することで取得された複数のＭＳ2スペクトルの間で質量電荷比が一致する特定のトリプレットピークを探索することにより、それらＭＳ2スペクトルを取得するためのＭＳ2分析のプリカーサイオンが同一糖ペプチド由来イオンであるか否かを確認し、同一糖ペプチド由来イオンをプリカーサイオンとした複数のＭＳ2スペクトルのうちのいずれか一つを選択するＭＳ2スペクトル選択ステップと、
d)前記ＭＳ2スペクトル選択ステップにおいて選択されたＭＳ2スペクトルからプリカーサイオンを選定し、被検試料に対する該プリカーサイオンに関するＭＳ3分析を実行してＭＳ3スペクトルを取得するＭＳ3分析実行ステップと、
e)前記ＭＳ3分析実行ステップにより取得されたＭＳ3スペクトルにおいて検出されるイオンピークの情報を収集し、少なくとも該情報を利用して目的とする糖ペプチドのペプチドを同定する同定処理ステップと、
を有することを特徴とする糖ペプチド解析方法。
【請求項２】
少なくともｎが１〜３であるＭＳn分析を実行可能な質量分析装置を利用して、被検試料中の糖ペプチドの構造を解析する糖ペプチド解析方法であって、
a)被検試料をＭＳ1分析して得られたＭＳ1スペクトルに現れる糖ペプチド由来のイオンをプリカーサイオンとして選定するプリカーサ選定ステップと、
b)前記被検試料に対し前記プリカーサ選定ステップにおいて選定されたプリカーサイオンに関するＭＳ2分析を実行してＭＳ2スペクトルを取得するＭＳ2分析実行ステップと、
c)前記ＭＳ2分析実行ステップを実行することで取得された少なくとも一つのＭＳ2スペクトルと前記ＭＳ1スペクトルとの間で質量電荷比が一致するとみなし得る特定のトリプレットピークを探索し、それらＭＳ2スペクトル及びＭＳ1スペクトルが同一糖ペプチド由来イオンであるとの推定の下に、同一糖ペプチド由来のＭＳ2スペクトル及びＭＳ1スペクトルから探索されたトリプレットピークのうちのいずれか一つのトリプレットピークを構成する少なくとも１本以上のイオンピークをＭＳ3又は擬似ＭＳ3プリカーサイオンとして選択するＭＳ3又は擬似ＭＳ3プリカーサイオン選択ステップと、
d)前記被検試料に対し前記ＭＳ3又は擬似ＭＳ3プリカーサイオン選択ステップにおいて選択されたＭＳ3又は擬似ＭＳ3プリカーサイオンに関するＭＳ3分析又は擬似ＭＳ3分析を実行してＭＳ3スペクトル又は擬似ＭＳ3スペクトルを取得するＭＳ3又は擬似ＭＳ3分析実行ステップと、
e)前記ＭＳ3又は擬似ＭＳ3分析実行ステップにより取得されたＭＳ3スペクトル又は擬似ＭＳ3スペクトルにおいて検出されるイオンピークの情報を収集し、少なくとも該情報を利用して目的とする糖ペプチドのペプチドを同定する同定処理ステップと、
を有することを特徴とする糖ペプチド解析方法。
【請求項３】
少なくともｎが１〜３であるＭＳn分析を実行可能な質量分析装置を利用して、被検試料中の糖ペプチドの構造を解析する糖ペプチド解析装置において、
a)被検試料をＭＳ1分析して得られたＭＳ1スペクトルに現れる糖ペプチド由来の複数のイオンをプリカーサイオンとして選定するプリカーサ選定手段と、
b)前記被検試料に対し前記プリカーサ選定手段により選定された複数のプリカーサイオンに関するＭＳ2分析を前記質量分析装置によりそれぞれ実行させて複数のＭＳ2スペクトルを取得するＭＳ2分析実行制御手段と、
c)前記ＭＳ2分析実行制御手段による制御の下に取得された複数のＭＳ2スペクトルの間で質量電荷比が一致する特定のトリプレットピークを探索することにより、それらＭＳ2スペクトルを取得するためのＭＳ2分析のプリカーサイオンが同一糖ペプチド由来イオンであるか否かを確認し、同一糖ペプチド由来イオンをプリカーサイオンとした複数のＭＳ2スペクトルのうちのいずれか一つを選択するＭＳ2スペクトル選択手段と、
d)前記ＭＳ2スペクトル選択手段により選択されたＭＳ2スペクトルからプリカーサイオンを選択し、被検試料に対する該プリカーサイオンに関するＭＳ3分析を前記質量分析装置により実行させてＭＳ3スペクトルを取得するＭＳ3分析実行制御手段と、
e)前記ＭＳ3分析実行制御手段による制御の下に取得されたＭＳ3スペクトルにおいて検出されるイオンピークの情報を収集し、少なくとも該情報を利用して目的とする糖ペプチドのペプチドを同定する同定処理手段と、
を備えることを特徴とする糖ペプチド解析装置。
【請求項４】
少なくともｎが１〜３であるＭＳn分析を実行可能な質量分析装置を利用して、被検試料中の糖ペプチドの構造を解析する糖ペプチド解析装置において、
a)被検試料をＭＳ1分析して得られたＭＳ1スペクトルに現れる糖ペプチド由来のイオンをプリカーサイオンとして選定するプリカーサ選定手段と、
b)前記被検試料に対し前記プリカーサ選定手段により選定されたプリカーサイオンに関するＭＳ2分析を前記質量分析装置により実行させてＭＳ2スペクトルを取得するＭＳ2分析実行制御手段と、
c)前記ＭＳ2分析実行制御手段による制御の下に取得された少なくとも一つのＭＳ2スペクトルと前記ＭＳ1スペクトルとの間で質量電荷比が一致するとみなし得る特定のトリプレットピークを探索し、それらＭＳ2スペクトル及びＭＳ1スペクトルが同一糖ペプチド由来イオンであるとの推定の下に、同一糖ペプチド由来のＭＳ2スペクトル及びＭＳ1スペクトルから探索されたトリプレットピークのうちのいずれか一つのトリプレットピークを構成する少なくとも１本以上のイオンピークをＭＳ3又は擬似ＭＳ3プリカーサイオンとして選択するＭＳ3又は擬似ＭＳ3プリカーサイオン選択手段と、
d)前記被検試料に対し前記ＭＳ3又は擬似ＭＳ3プリカーサイオン選択手段により選択されたＭＳ3又は擬似ＭＳ3プリカーサイオンに関するＭＳ3分析又は擬似ＭＳ3分析を前記質量分析装置により実行させてＭＳ3スペクトル又は擬似ＭＳ3スペクトルを取得するＭＳ3又は擬似ＭＳ3分析実行制御手段と、
e)前記ＭＳ3又は擬似ＭＳ3分析実行制御手段による制御の下に取得されたＭＳ3スペクトル又は擬似ＭＳ3スペクトルにおいて検出されるイオンピークの情報を収集し、少なくとも該情報を利用して目的とする糖ペプチドのペプチドを同定する同定処理手段と、
を備えることを特徴とする糖ペプチド解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖修飾を受けたタンパク質又はペプチドの構造を質量分析を用いて解析する解析方法、及び該方法を利用した解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体を構成するタンパク質の半分以上は糖鎖修飾を受けていると言われており、糖鎖修飾はタンパク質の構造や機能の調節に重要な役割を果たしている。また、近年の研究により、免疫疾患などの各種疾患と糖鎖構造異常や糖化異常との関連性も明らかになってきている。こうしたことから、糖タンパク質や糖ペプチドの構造解析は、生命科学や医療、医薬品開発など様々な分野において非常に重要になっている。近年の質量分析装置の性能向上により、質量分析、特に多段階の解離操作を伴うＭＳn分析はタンパク質解析における主要な手法の一つになっているものの、一般に、糖タンパク質の解析は修飾を受けていないタンパク質の解析に比べてかなり困難であり、その解析手法は未だ研究途上である。
【０００３】
糖タンパク質の解析において取得したい情報は主に、ペプチドのアミノ酸配列、糖鎖構造、及び糖鎖結合部位である。従来一般的な糖タンパク質解析手法は次のとおりである（非特許文献１参照）。
【０００４】
まず目的の糖タンパク質を酵素消化することにより糖ペプチドを含む被検試料を調製し、この被検試料に対するＭＳ分析を実行してＭＳスペクトルを取得する。このＭＳスペクトルに現れているピークに対し所定の基準に従って糖ペプチド由来であると推定されるピークを選定し、そのピークに対応したイオンをプリカーサイオンとして被検試料に対するＭＳ／ＭＳ（＝ＭＳ2）分析を実行してＭＳ2スペクトルを取得する。
【０００５】
Ｎ-結合型糖ペプチドの場合、ＭＳ2スペクトルには所定の質量電荷比間隔で並ぶ３つのピーク（以下、「トリプレットピーク」という）が特徴的に現れる。具体的には、或る１つのイオンピークに対し、質量電荷比が大きい方向に質量電荷比差が120Daであるイオンピークと、質量電荷比が小さい方向に質量電荷比差が83Daであるイオンピークの、３本のピークが典型的なトリプレットピークである。トリプレットピークにおいて、中央のピークはペプチドに結合している糖が環開裂を生じたイオンを示し、それより質量電荷比が大きい方のピークはペプチドに完全な形の単糖が結合した状態のイオンを示し、逆に質量電荷比が小さい方のピークは単糖が付加していないペプチド骨格のみのイオンを示す。そこで一般的には、トリプレットピークの中の最小質量電荷比であるイオンをプリカーサイオンとして、被検試料に対するＭＳ3分析を実行してＭＳ3スペクトルを取得する。このＭＳ3スペクトルはペプチド由来のフラグメントイオンのみのＭＳ3スペクトルであるから、これに基づいて糖鎖の結合部位周辺のアミノ酸配列情報を得ることができる。
【０００６】
アミノ酸配列情報を得る方法としては、例えば英国マトリクス・サイエンス社が提供するマスコット（Mascot）などのデータベース検索を利用した方法や、加国バイオインフォマティック・ソリューションズ（Bioinformatic Solutions）社が提供するピークス（PEAKSTM）などの、デノボ・シーケンシングを利用した方法が広く用いられている。
【０００７】
一方、Ｏ-結合型糖ペプチドの場合には上述したＮ-結合型糖ペプチドとは異なり、ＭＳ2スペクトル上にトリプレットピークなどの指標となるイオンピークが現れない。そこで、プリカーサイオン、つまりペプチド由来の分子イオンピークの質量電荷比から質量電荷比が小さくなる方向に順次、糖鎖由来のフラグメントイオンを探索してゆくことでペプチド由来イオンと単糖が結合した状態のペプチド由来イオンとを見つけ出し、これからペプチドのアミノ酸配列情報と糖鎖組成とを推定する。
【０００８】
しかしながら、上述したような方法で実際に糖ペプチドの解析を行う際には次のような問題がある。
一般に、被検試料に対して得られたＭＳスペクトルに基づいてプリカーサイオンを選定する行程では、ピークの強度などに基づいて複数のプリカーサイオンが選定される。そして、その複数のプリカーサイオンに関してそれぞれＭＳ2分析が実行され、複数のＭＳ2スペクトルが作成される。さらに、その複数のＭＳ2スペクトルについてそれぞれプリカーサイオンが選定され、そのプリカーサイオンに関するＭＳ3分析が実行される。このような分析を行うのは、通常、被検試料には複数種のペプチドが含まれるためである。ところが、分析対象である糖ペプチドの種類によっては、異なるプリカーサイオンに対して取得した複数のＭＳ3スペクトルのピークパターンが殆ど同じになってしまうことがある。これは、同じ情報（ＭＳ3スペクトル上のピーク情報）を得るために、１つの被検試料を何度も分析していることを意味しているわけであるから、被検試料や分析時間の浪費に繋がる。特に生体由来の試料の場合、試料の量が限られていたり試料が高価であったりすることが多く、試料を無駄に使用すると試料が枯渇してしまい、十分な分析結果が得られないこともあり得る。また、分析時間の浪費はスループットの低下を招き、特に、分析作業を担当する企業や公的機関にとっては大きな経済的損失である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１２−２２０３６５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】中家、「複合糖質解析−質量分析計の有用性−」、島津評論、島津評論編集部、第66巻、第3・4号、2010年3月31日、p.173-184
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、糖ペプチドの構造解析に必要な情報をＭＳn分析により取得する際に、実質的に重複する無駄な分析の実行を回避することにより、試料の使用量を抑えるとともに分析時間を短縮することができる糖ペプチド解析方法及び解析装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述したように複数のＭＳ3スペクトルが殆ど同じとなる主な理由は、ＭＳスペクトル上において、ペプチド骨格以外の付加要素のみが異なる同一糖ペプチド由来イオンが、異なる質量電荷比に対して観測されるためである。例えばシアル酸等の比較的脱離し易い成分が結合した糖ペプチドでは、イオン化時などのインソース分解によってその脱離容易な成分が脱離してしまい、該成分が脱離した糖ペプチド由来イオンのピークと脱離していない糖ペプチド由来イオンのピークとがＭＳスペクトルに現れる。具体的にいうと、３個のシアル酸が結合したフェツイン（Fetuin）糖ペプチドでは、シアル酸が脱離していない糖ペプチド由来イオン、一部のシアル酸が脱離した糖ペプチド由来イオン、全てのシアル酸が脱離した糖ペプチド由来イオンがＭＳスペクトル上で検出される。これらイオンのペプチド骨格は同じであるから、ＭＳ2分析におけるプリカーサイオンは相違しても、ペプチド骨格が解離して生じたペプチドフラグメントイオンが殆どを占めるＭＳ2スペクトルは殆ど同じとなる。
【００１３】
そこで本願発明者は、分析対象がＮ-結合型糖ペプチドである場合に、ＭＳ2スペクトルに糖ペプチド由来のトリプレットピークが現れることに着目し、複数のＭＳ2スペクトルにおいてトリプレットピークの位置（質量電荷比）が一致しているか否かを判定し、その結果に基づいてＭＳ2分析のプリカーサイオンが同一糖ペプチド由来であるか否かを判断することに想到した。もし、複数のＭＳ2スペクトルを取得する際のＭＳ2分析のプリカーサイオンが同一糖ペプチド由来であれば、その複数のＭＳ2スペクトルから選定されるプリカーサイオンに関するＭＳ3スペクトルはほぼ同一になる筈であり、重複するＭＳ3分析を実行する必要はなくなる。
【００１４】
即ち、上記課題を解決するために成された第１発明は、少なくともｎが１〜３であるＭＳn分析を実行可能な質量分析装置を利用して、被検試料中の糖ペプチドの構造を解析する糖ペプチド解析方法であって、
a)被検試料をＭＳ1分析して得られたＭＳ1スペクトルに現れる糖ペプチド由来の複数のイオンをプリカーサイオンとして選定するプリカーサ選定ステップと、
b)前記被検試料に対し前記プリカーサ選定ステップにおいて選定された複数のプリカーサイオンに関するＭＳ2分析をそれぞれ実行して複数のＭＳ2スペクトルを取得するＭＳ2分析実行ステップと、
c)前記ＭＳ2分析実行ステップを実行することで取得された複数のＭＳ2スペクトルの間で質量電荷比が一致する特定のトリプレットピークを探索することにより、それらＭＳ2スペクトルを取得するためのＭＳ2分析のプリカーサイオンが同一糖ペプチド由来イオンであるか否かを確認し、同一糖ペプチド由来イオンをプリカーサイオンとした複数のＭＳ2スペクトルのうちのいずれか一つを選択するＭＳ2スペクトル選択ステップと、
d)前記ＭＳ2スペクトル選択ステップにおいて選択されたＭＳ2スペクトルからプリカーサイオンを選択し、被検試料に対する該プリカーサイオンに関するＭＳ3分析を実行してＭＳ3スペクトルを取得するＭＳ3分析実行ステップと、
e)前記ＭＳ3分析実行ステップにより取得されたＭＳ3スペクトルにおいて検出されるイオンピークの情報を収集し、少なくとも該情報を利用して目的とする糖ペプチドのペプチドを同定する同定処理ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１５】
上記特定のトリプレットピークとは、例えばＮ-結合型糖ペプチドのＭＳ2スペクトルに典型的に現れる質量電荷比差が低質量電荷比側から83Da、120Daである３つのピークである。この３つのピークは、ペプチドイオン、HexNAc環開裂イオン付加ペプチドイオン、HexNAc付加ペプチドイオンに相当する。
【００１６】
一般に、プリカーサイオンが同一糖ペチド由来イオンでないにも拘わらず複数のＭＳ2スペクトルにおいて質量電荷比が一致するトリプレットピークが検出される、という確率はかなり低い。したがって、通常、複数のＭＳ2スペクトルにおいて共通するトリプレットピークがあれば、それらＭＳ2スペクトルのプリカーサイオンは同一の糖ペプチド由来イオンであり、例えばシアル酸のような脱離し易い成分の結合の有無のみが相違するイオンであるとみなすことができる。そうしたＭＳ2スペクトルに対しそれぞれプリカーサ選択を実行してＭＳ3分析を実行しても、得られるＭＳ3スペクトルは殆ど同じとなる可能性が高いから、予めその重複を排することによって無駄なＭＳ3分析の実行を回避することができる。
【００１７】
また、上述したように脱離し易い成分が結合した糖ペプチドの場合、衝突誘起解離（ＣＩＤ）等に因らないインソース分解により糖の環内開裂が生じ、ＭＳ1スペクトルであっても上記のような特定のトプリレットピークが現れることがある。そのため、場合によっては、複数のＭＳ2スペクトルの間で質量電荷比が一致する特定のトリプレットピークを探索するだけでなく、ＭＳ2スペクトルとＭＳ1スペクトルとの間で質量電荷比が一致する特定のトリプレットピークを探索することも、無駄な分析の実行を回避する上で有効である（特許文献１参照）。
【００１８】
上記課題を解決するために成された第２発明はこうした手法を採用したものであり、少なくともｎが１〜３であるＭＳn分析を実行可能な質量分析装置を利用して、被検試料中の糖ペプチドの構造を解析する糖ペプチド解析方法であって、
a)被検試料をＭＳ1分析して得られたＭＳ1スペクトルに現れる糖ペプチド由来のイオンをプリカーサイオンとして選定するプリカーサ選定ステップと、
b)前記被検試料に対し前記プリカーサ選定ステップにおいて選定されたプリカーサイオンに関するＭＳ2分析を実行してＭＳ2スペクトルを取得するＭＳ2分析実行ステップと、
c)前記ＭＳ2分析実行ステップを実行することで取得された少なくとも一つのＭＳ2スペクトルと前記ＭＳ1スペクトルとの間で質量電荷比が一致するとみなし得る特定のトリプレットピークを探索し、それらＭＳ2スペクトル及びＭＳ1スペクトルが同一糖ペプチド由来イオンであるとの推定の下に、同一糖ペプチド由来のＭＳ2スペクトル及びＭＳ1スペクトルから探索されたトリプレットピークのうちのいずれか一つのトリプレットピークを構成する少なくとも１本以上のイオンピークをＭＳ3又は擬似ＭＳ3プリカーサイオンとして選択するＭＳ3又は擬似ＭＳ3プリカーサイオン選択ステップと、
d)前記被検試料に対し前記ＭＳ3又は擬似ＭＳ3プリカーサイオン選択ステップにおいて選択されたＭＳ3又は擬似ＭＳ3プリカーサイオンに関するＭＳ3分析又は擬似ＭＳ3分析を実行してＭＳ3スペクトル又は擬似ＭＳ3スペクトルを取得するＭＳ3又は擬似ＭＳ3分析実行ステップと、
e)前記ＭＳ3又は擬似ＭＳ3分析実行ステップにより取得されたＭＳ3スペクトル又は擬似ＭＳ3スペクトルにおいて検出されるイオンピークの情報を収集し、少なくとも該情報を利用して目的とする糖ペプチドのペプチドを同定する同定処理ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１９】
ここで、少なくとも一つのＭＳ2スペクトルとＭＳ1スペクトルとの間で質量電荷比が一致するとみなし得る特定のトリプレットピークとは、単に二つ以上のスペクトル上で質量電荷比が一致しているもののみならず、少なくとも一つのスペクトル上で特定の質量シフトを考慮して、その分を補正した質量電荷比が一致しているものも含む。具体的には例えば、Ｎ末端にグルタミン、グルタミン酸、カルバミドメチル化システインなど特定のアミノ酸残基が位置するＮ-結合型糖ペプチドでは、ＣＩＤの過程でＮ末端の特定アミノ酸残基の環化が優先的に生じ、そのためにＮＨ3やＨ2Ｏのニュートラルロスが発生し易い。こうした場合には、ＭＳ2スペクトル上のイオンピークはニュートラルロスによる質量シフトが生じている可能性があるから、そうしたニュートラルロスに相当する質量シフトが検出された場合には、ＭＳ2スペクトル上のイオンピークについて質量シフトを補正した上でトリプレットピーク同士の質量電荷比を比較すればよい。
【００２０】
また、上記課題を解決するために成された第３発明は、上記第１発明に係る糖ペプチド解析方法を実施するための装置であって、少なくともｎが１〜３であるＭＳn分析を実行可能な質量分析装置を利用して、被検試料中の糖ペプチドの構造を解析する糖ペプチド解析装置において、
a)被検試料をＭＳ1分析して得られたＭＳ1スペクトルに現れる糖ペプチド由来の複数のイオンをプリカーサイオンとして選定するプリカーサ選定手段と、
b)前記被検試料に対し前記プリカーサ選定手段により選定された複数のプリカーサイオンに関するＭＳ2分析を前記質量分析装置によりそれぞれ実行させて複数のＭＳ2スペクトルを取得するＭＳ2分析実行制御手段と、
c)前記ＭＳ2分析実行制御手段による制御の下に取得された複数のＭＳ2スペクトルの間で質量電荷比が一致する特定のトリプレットピークを探索することにより、それらＭＳ2スペクトルを取得するためのＭＳ2分析のプリカーサイオンが同一糖ペプチド由来イオンであるか否かを確認し、同一糖ペプチド由来イオンをプリカーサイオンとした複数のＭＳ2スペクトルのうちのいずれか一つを選択するＭＳ2スペクトル選択手段と、
d)前記ＭＳ2スペクトル選択手段により選択されたＭＳ2スペクトルからプリカーサイオンを選択し、被検試料に対する該プリカーサイオンに関するＭＳ3分析を前記質量分析装置により実行させてＭＳ3スペクトルを取得するＭＳ3分析実行制御手段と、
e)前記ＭＳ3分析実行制御手段による制御の下に取得されたＭＳ3スペクトルにおいて検出されるイオンピークの情報を収集し、少なくとも該情報を利用して目的とする糖ペプチドのペプチドを同定する同定処理手段と、
を備えることを特徴としている。
【００２１】
また、上記課題を解決するために成された第４発明は、上記第２発明に係る糖ペプチド解析方法を実施するための装置であって、少なくともｎが１〜３であるＭＳn分析を実行可能な質量分析装置を利用して、被検試料中の糖ペプチドの構造を解析する糖ペプチド解析装置において、
a)被検試料をＭＳ1分析して得られたＭＳ1スペクトルに現れる糖ペプチド由来のイオンをプリカーサイオンとして選定するプリカーサ選定手段と、
b)前記被検試料に対し前記プリカーサ選定手段により選定されたプリカーサイオンに関するＭＳ2分析を前記質量分析装置により実行させてＭＳ2スペクトルを取得するＭＳ2分析実行制御手段と、
c)前記ＭＳ2分析実行制御手段による制御の下に取得された少なくとも一つのＭＳ2スペクトルと前記ＭＳ1スペクトルとの間で質量電荷比が一致するとみなし得る特定のトリプレットピークを探索し、それらＭＳ2スペクトル及びＭＳ1スペクトルが同一糖ペプチド由来イオンであるとの推定の下に、同一糖ペプチド由来のＭＳ2スペクトル及びＭＳ1スペクトルから探索されたトリプレットピークのうちのいずれか一つのトリプレットピークを構成する少なくとも１本以上のイオンピークをＭＳ3又は擬似ＭＳ3プリカーサイオンとして選択するＭＳ3又は擬似ＭＳ3プリカーサイオン選択手段と、
d)前記被検試料に対し前記ＭＳ3又は擬似ＭＳ3プリカーサイオン選択手段により選択されたＭＳ3又は擬似ＭＳ3プリカーサイオンに関するＭＳ3分析又は擬似ＭＳ3分析を前記質量分析装置により実行させてＭＳ3スペクトル又は擬似ＭＳ3スペクトルを取得するＭＳ3又は擬似ＭＳ3分析実行制御手段と、
e)前記ＭＳ3又は擬似ＭＳ3分析実行制御手段による制御の下に取得されたＭＳ3スペクトル又は擬似ＭＳ3スペクトルにおいて検出されるイオンピークの情報を収集し、少なくとも該情報を利用して目的とする糖ペプチドのペプチドを同定する同定処理手段と、
を備えることを特徴としている。
【００２２】
ここでいう擬似ＭＳ3（Pseudo-MS3）分析とは、ＭＳ2分析において次の分析に有用と推定されたＭＳ3プリカーサイオンと同一質量電荷比を持ったイオン（擬似ＭＳ3プリカーサイオン）がＭＳ1スペクトル上に存在した場合に、ＭＳ3プリカーサイオンに対してＭＳ3分析を行う代わりに、上記擬似ＭＳ3プリカーサイオンに対してＭＳ2分析を行うことである。これは、ＭＳ3プリカーサイオンと擬似ＭＳ3プリカーサイオンとが同一構造を持つと推定されることを前提としている。擬似ＭＳ3分析では、ＭＳ3分析に比べてプリカーサイオン選択操作回数を減らすことができ、目的とするイオンの損失が抑制されるのでＳＮ比を向上させることができる。また、同程度のＳＮ比を得るために必要な試料の量が少なくて済むので微量分析に好適であり、また分析時間の短縮にも有効である。
【００２３】
第１乃至第４発明において、ＭＳ3スペクトル又は擬似ＭＳ3スペクトルにおいて検出されるイオンピークの情報を利用して糖ペプチドのペプチドを同定する手法としては既知の手法を用いることができる。例えば上述した英国マトリクス・サイエンス社が提供するMascotに含まれるＭＳ／ＭＳイオンサーチ法を利用することで、所定の検索条件に則ったデータベース検索を実施し、データベースに登録されているペプチドとの照合を行うようにすればよい。
【００２４】
ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法等のようなデータベース検索の際には、検索条件として翻訳後修飾の種類などを設定することが検索精度を上げるために有効である。そこで、第１乃至第４発明では、複数のＭＳ2スペクトルや糖の環内開裂によるイオンピークが観測されるＭＳ1スペクトルに対してデノボ・シーケンシングのような数理的解析手法を適用して糖鎖組成や糖鎖構造を推定し、推定された糖鎖情報を検索条件の一つとして設定するとよい。
【００２５】
また、第１乃至第４発明では、ＭＳ2分析又はＭＳ1分析のプリカーサイオンが同一糖ペプチド由来イオンであるか否かを確認するために、複数のＭＳ2スペクトルの間で又はＭＳ2スペクトルとＭＳ1スペクトルとの間で質量電荷比が一致する又は一致しているとみなせる特定のトリプレットピークを探索するようにしているが、その際にトリプレットピークの質量電荷比だけでなく各ピークの信号強度や複数のピーク間の信号強度の比も併せて利用することができる。さらにまた同定の信頼性を高めるために、ＭＳ2スペクトル又はＭＳ1スペクトルにおけるトリプレットピーク以外の情報、例えばトリプレットピーク以外のピークの質量電荷比の一致性などを補助的に利用してもよい。
【００２６】
また、同一糖ペプチド由来イオンをプリカーサイオンとしたＭＳ2スペクトル又はＭＳ1スペクトルが複数ある、つまりＭＳ3スペクトルが重複すると判断された場合に、いずれのＭＳ2スペクトル又はＭＳ1スペクトルを選択するかの基準について様々なものを採用し得る。例えば、プリカーサイオンの信号強度が最大であるスペクトルを選択する、トリプレットピークイオンの信号強度が最大であるスペクトルを選択する、ＭＳ2スペクトルよりもＭＳ1スペクトルを優先的に選択する、などの基準が考えられるが、これらは或る一つの方法に固定するのではなく、ユーザが選択できるようにしておいてもよい。
【発明の効果】
【００２７】
第１乃至第４発明に係る糖ペプチド解析方法及び解析装置によれば、糖ペプチドの構造解析に必要な情報をＭＳ1分析〜ＭＳ3分析により取得する際に、ＭＳ3分析を実行する前にＭＳ3スペクトルが重複すると見込まれるＭＳ3分析については重複分が省かれる。そのため、無駄なＭＳ3分析の実行を避けることができ、試料の使用量を抑えることができるとともに、分析時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明に係る糖ペプチド解析方法を実施する糖ペプチド解析システムの一実施例の全体構成図。
【図２】本実施例の糖ペプチド解析システムにおいて実施される糖ペプチド解析処理手順を示すフローチャート。
【図３】図２に示した糖ペプチド解析処理を説明するための概念図。
【図４】図２に示した糖ペプチド解析処理を説明するための概念図。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明に係る糖ペプチド解析方法を実施する糖ペプチド解析システムの一実施例について、添付図面を参照して説明する。図１は本実施例の糖ペプチド解析システムの全体構成図、図２は本システムにおける糖ペプチド解析の処理手順を示すフローチャート、図３及び図４は図２に示した糖ペプチド解析処理を説明するための概念図である。
【００３０】
本実施例の糖ペプチド解析システムは、大別して、質量分析部１と、コンピュータを中心に構成される制御・処理部２と、から成る。質量分析部１はマトリックス支援レーザ脱離イオン化四重極イオントラップ飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦＭＳ）であり、分析対象である試料中の分子や原子をイオン化するＭＡＬＤＩ法によるイオン化部１０と、発生したイオンを一時的に捕捉し、質量電荷比m/zに応じたイオンの選別と衝突誘起解離（ＣＩＤ）によるイオンの開裂とを実行可能な３次元四重極型のイオントラップ１１と、そのイオントラップ１１から出射された各種イオンを質量電荷比に応じて分離して検出する飛行時間型質量分析器（ＴＯＦＭＳ）１２と、を含む。飛行時間型質量分析器１２は、リフレクトロン電極により発生する電場によりイオンを折返し飛行させる飛行空間１３と、該飛行空間１３を飛行する間に質量電荷比に応じて時間的に分離されたイオンを順次検出するイオン検出器１４と、を含む。
【００３１】
ここではイオン化部１０はＭＡＬＤＩイオン源であるが、イオン化法はこれに限るものではなく、例えばＥＳＩなどを用いてもよい。ただし、後述の例のように、インソース分解などにより糖鎖からシアル酸や硫酸基などが脱離することを利用してＭＳスペクトル上で目的とする糖ペプチド由来のイオンを検出する場合には、インソース分解などが起こり易いイオン化法を採用する必要があり、その目的ではＭＡＬＤＩ法やそれ以外のレーザ照射を利用したイオン化法が好適である。
【００３２】
制御・処理部２は、質量分析部１の各部を制御する分析制御部３、イオン検出器１４から得られる検出信号を処理するデータ処理部２０、ユーザが検索条件を入力設定したりスペクトル解析のために必要な各種操作を行ったりするための入力部５や検索条件入力設定画面を表示したり同定結果を表示したりするための表示部６が接続され、システム全体を統括的に制御する制御部４、を含む。データ処理部２０は、検出信号に基づいてＭＳnスペクトルを作成するスペクトル作成部２１、ＭＳnスペクトルを解析して例えば特定のピークを抽出する等のデータ処理を実行するスペクトル解析部２２、ＭＳnスペクトルから収集されたピーク情報に対しデノボ・シーケンシングによる処理を実行するデノボ配列解析処理部２３、ペプチドのアミノ酸配列を推定するための同定用情報が予め登録された同定用データベース（ＤＢ）２５、そのデータベース２５を用いてピークリストに一致する可能性の高いペプチドの検索を行うデータベース検索部２４、などを機能ブロックとして含む。このデータベース検索部２４の機能は、例えば上述したＭＳ／ＭＳイオンサーチのプログラムにより実現することができる。
【００３３】
次に、本実施例の糖ペプチド解析システムにおける特徴的な糖ペプチド解析方法について、図２のフローチャートに沿って説明する。
【００３４】
分析者は目的とするタンパク質を適宜の酵素（例えばトリプシン酵素）により消化し、糖ペプチドを含む被検試料を調製する。分析制御部３の制御の下に、質量分析部１により上記被検試料に対するＭＳ1分析が実行されると、スペクトル作成部２１ではＭＳ1スペクトルが作成される（ステップＳ１）。
【００３５】
スペクトル解析部２２は、作成されたＭＳ1スペクトルからシアル酸等の糖鎖のニュートラルロスによって生成された質量電荷比が相違する複数のプロダクトイオンを見つけ、これら複数のプロダクトイオンをプリカーサイオンとして選定する（ステップＳ２）。
【００３６】
次に、分析制御部３の制御の下に、質量分析部１により被検試料に対してステップＳ２で選択された複数のプリカーサイオンについてのＭＳ2分析がそれぞれ実行され、ＭＳ2スペクトルが取得される（ステップＳ３）。より詳しく述べると、イオン化部１０において被検試料から生成された各種イオンは一旦イオントラップ１１に捕捉され、イオントラップ１１においてプリカーサイオンの質量電荷比を持つイオンのみが選別された後にＣＩＤによる１回の開裂操作がなされる。それによって生成された各種プロダクトイオンはイオントラップ１１から一斉に出射されて飛行時間型質量分析器１２により質量分析され、それにより得られる検出信号に基づいてスペクトル作成部２１においてＭＳ2スペクトルが作成される。ステップＳ２で選定されたプリカーサイオンの数だけ、上記ＭＳ2分析が繰り返され、それぞれＭＳ2スペクトルが作成される。
【００３７】
例えば図３（ａ）に示すＭＳ1スペクトルに対して２本のピークＰ1、Ｐ2が糖ペプチド由来のプロダクトイオンであると推定されてＭＳ2分析のプリカーサイオンとして選定され、それぞれのＭＳ2分析の実行の結果、図３（ｂ）、（ｃ）に示すようなＭＳ2スペクトルが得られたものとする。
【００３８】
続いてスペクトル解析部２２及びデノボ配列解析処理部２３はＭＳ2スペクトルに現れているピークを解析し、そのピーク情報に基づくデノボ・シーケンシング処理を実行することにより糖鎖組成や糖鎖構造を推定する（ステップＳ４）。具体的には、Ｎ型糖鎖結合糖ペプチドの場合、互いに質量電荷比の差が特徴的である３本のピークからなる、特定のトリプレットピークが現れる。ここで特定のトリプレットピークとは、ペプチドイオン、HexNAc環開裂イオン付加ペプチドイオン、HexNAc付加ペプチドイオンに相当する、質量電荷比間隔が83Da、120Daで並ぶピークである。この既知の糖及び糖の開裂断片の質量電荷比に基づき実際のピークの質量電荷比差を判定することにより、トリプレットピークの候補を探索する。トリプレットピークの候補が複数組存在した場合には、イオンピーク強度の高い組から順に候補を表示部６の画面上に表示し、例えば分析者がそのうちの１組のトリプレットピークを入力部５により選択する。トリプレットピークが検出されたならば、そこからプリカーサイオンを終点として糖鎖のニュートラルロスに相当する質量電荷比差を持つイオンピーク列をデノボ・シーケンシングにより推定する。なお、トリプレットピークが検出できなかった場合には、プリカーサイオンから質量電荷比が低くなる方向に向かってデノボ・シーケンシング処理により糖鎖組成推定を実行すればよい。
【００３９】
例えば図３（ｂ）に示すＭＳ2スペクトルにおいては、質量電荷比差ｃ、ｂを持つ３本のピークＴ2が上記トリプレットピーク候補であると判定されたものとする。すると、このトリプレットピークＴ2を始点としプリカーサイオンＰ2の質量電荷比Ｍ2を終点として糖鎖のニュートラルロスに相当する質量電荷比差を持つイオンピーク列をデノボ・シーケンシングに供することにより、糖鎖組成又は糖鎖構造を推定する。
【００４０】
次に、スペクトル解析部２２は複数のＭＳ2スペクトルについて、上記ステップＳ４で抽出されたトリプレットピークにそれぞれ対応するイオンを低質量電荷比側から、全ての糖鎖が脱離したペプチドに帰属されるプロダクトイオンと１個の糖鎖が付加したHexNAc環開裂断片による修飾を受けたペプチドに由来するプロダクトイオン、及び、HexNAcによる修飾を受けたペプチドに由来するプロダクトイオンとみなし、それらイオンをＭＳ3分析のプリカーサイオン（以下、単にＭＳ3プリカーサイオンともいう）の候補として抽出する（ステップＳ５）。ステップＳ４でトリプレットピークが検出されなかった場合には、最も低い質量電荷比においてペプチドに帰属していると推定されたイオンピークをＭＳ3分析のプリカーサイオンの候補とすればよい。さらにまた、ＭＳ2スペクトルから抽出されたＭＳ3プリカーサイオン候補の質量電荷比を中心として質量許容誤差を見込んだ所定質量電荷比範囲に適合するイオンピークがＭＳ1スペクトル中に存在するか否かも調べ、存在すればそのＭＳ1スペクトル中のイオンピークを擬似ＭＳ3分析のプリカーサイオン（以下、単に、擬似ＭＳ3プリカーサイオンともいう）候補として抽出する。
【００４１】
従来であれば、ステップＳ５で抽出された各プリカーサイオンに関するＭＳ3分析又は擬似ＭＳ3分析が実行されるが、本実施例の処理では、ステップＳ５で挙げられたＭＳ3プリカーサイオンの候補及び擬似ＭＳ3プリカーサイオンの候補の重複がチェックされる（ステップＳ６）。具体的には、本実施例では、異なるプリカーサイオンについて得られた複数のＭＳ2スペクトル同士、又は、ＭＳ2スペクトルとＭＳ1スペクトルとの間で、トリプレットピークの３つの質量電荷比をそれぞれ比較して質量電荷比が一致しているとみなせる誤差範囲内であれば、その比較した２つのＭＳ2スペクトル、ＭＳ1スペクトルは同一糖ペプチドイオン由来のスペクトルであると判断する。このスペクトルが実質的に同一であれば、ＭＳ3分析又は擬似ＭＳ3分析のプリカーサイオンは重複している筈であるから、いずれか１つのＭＳ2スペクトル又はＭＳ1スペクトルを選択して該スペクトルから抽出したプリカーサイオン候補のみを真のプリカーサイオンとして残す。
【００４２】
例えば図３（ｂ）、（ｃ）はＭＳ2スペクトル同士でトリプレットピークＴ1、Ｔ2の質量電荷比が一致している例であり、図４（ａ）、（ｂ）はＭＳ2スペクトルとＭＳ1スペクトルとの間でトリプレットピークＴ1とＴ’との質量電荷比が一致している例である。ただし、上述したように、Ｎ末端に特定のアミノ酸残基が位置するＮ-結合型糖ペプチドでは、ＣＩＤの過程でこの特定アミノ酸残基の環化が優先的に生じ、そのためにＮＨ3やＨ2Ｏのニュートラルロスが発生し易い（特許文献１参照）。そこで、これらニュートラルロスに相当する質量シフトがＭＳ2スペクトル上で検出された場合には、そのＭＳ2スペクトル上のイオンピークについて質量シフトを補正した上で、即ち、ＭＳ2スペクトル上の各イオンピークについてニュートラルロスに相当する質量を加算した上で、ＭＳ2スペクトル上のトリプレットピークの質量電荷比とＭＳ1スペクトル上のトリプレットピークの質量電荷比とを比較すればよい。
【００４３】
ステップＳ６においていずれか１つのＭＳ2スペクトル又はＭＳ1スペクトルを選択する際には、予め定められた基準に則って選択するスペクトルを決めるとよい。例えば、ＭＳ2分析時のプリカーサイオンの信号強度が最大であるもの、トリプレットピークの中の最低質量電荷比のピーク信号強度が最大であるもの、などとすることができる。また、ＭＳ1スペクトルにおけるトリプレットピークとＭＳ2スペクトルにおけるトリプレットピークとが重複している場合、一般的にはイオントラップ１１でプリカーサ選択を実施しないＭＳ1スペクトルのほうが信号強度の点で有利であることから、ＭＳ1スペクトルを優先的に選択するようにしてもよい。
【００４４】
上記ステップＳ６において重複したものを除くことで、ＭＳ3プリカーサイオン、擬似ＭＳ3プリカーサイオンの数は少なくなる。これらプリカーサイオンの情報が分析制御部３に送られ、続いて、分析制御部３の制御の下に、これらプリカーサイオンに関するＭＳ3分析や擬似ＭＳ3分析が質量分析部１において実行される（ステップＳ７）。その結果、スペクトル作成部２１ではＭＳ3スペクトル又は擬似ＭＳ3スペクトルが作成される。
【００４５】
次いで、スペクトル解析部２２は、得られたＭＳ3スペクトル又は擬似ＭＳ3スペクトル毎に、スペクトルに現れている有意な、つまりはノイズピーク等を除去したピークの情報を収集してピークリストを作成する（ステップＳ８）。即ち、取得されたＭＳ3スペクトル又は擬似ＭＳ3スペクトルの数だけピークリストが作成される。その後、データベース検索部２４は、ステップＳ８で作成されたピークリストとステップＳ４で推測された糖鎖組成や糖鎖構造等の修飾条件とに基づき、後述する同定のためのデータベース検索の検索条件を設定する（ステップＳ９）。この例では、上述したようにトリプレットピークを構成する３本のピーク間の質量電荷比の差が120Da、83Daであることから、それぞれHexNAcによる修飾、HexNAc環開裂断片による修飾であることが分かるから、これが検索条件として設定すべき修飾条件の１つである。また、別の糖又は糖の開裂断片による修飾であることが判明すれば、それを修飾条件とすればよい。
【００４６】
データベース検索部２４はステップＳ９において設定された検索条件に従って、同定用データベース２５に登録されているペプチドのアミノ酸配列のピークパターンとの照合によるデータベース検索を実行する（ステップＳ１０）。データベース検索として例えば上記ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法を用いるが、データベース検索法はこれに限るものではなく、周知の他の方法を用いてもよい。
【００４７】
例えばＭＳ／ＭＳイオンサーチ法によるデータベース検索では、既知のペプチドとのピークパターンの一致度を示す指標（スコア）が計算されるから、そのスコアが高く、且つ、指定した修飾を受けているものを、候補として例えばスコア順にリストアップする。また、ステップＳ４においてデノボ・シーケンシングにより推定された糖鎖組成の候補もリストアップする（ステップＳ１１）。そして、そのリストアップされたものを同定結果として表示部６の画面上に表示して分析者に提示する（ステップＳ１２）。
【００４８】
以上のようにして、本実施例の糖ペプチド解析システムによれば、目的とする糖ペプチド由来のイオンをプリカーサイオンとして求めたＭＳ3スペクトル又は擬似ＭＳ3スペクトルに基づいて、糖ペプチドを構成するペプチドのアミノ酸配列と糖鎖組成（又は糖鎖構造）とを高い信頼度で推定することが可能となる。特に本実施例の糖ペプチド解析システムによれば、同一結果になることが見込まれるＭＳ3分析の実行回数が少なくなるので、被検試料を無駄に使用することがなく、分析時間の短縮化も期待できる。
【００４９】
なお、上記実施例では、ステップＳ６において複数のＭＳ2スペクトル、ＭＳ1スペクトルが同一の糖ペプチドに由来する実質的に同じものであることを調べるために、特定のトリプレットピークの質量電荷比を利用していたが、質量電荷比のみならず、トリプレットピークを構成する各ピークの信号強度やその信号強度の比などの情報も併せて利用すると精度向上が図れる。さらにまた、トリプレットピーク以外に、ＭＳ2スペクトル又はＭＳ1スペクトル上に現れる糖鎖組成を反映したピークの質量電荷比の一致性も補助的に利用すれば、一層の精度向上が期待できる。また、ＭＳ2スペクトルやＭＳ1スペクトルから収集したピーク情報に基づいたデータベース検索を実行し、同一アミノ酸配列が高いスコアでヒットしたならば、それらスペクトルは重複していると判断するようにしてもよい。
【００５０】
また、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００５１】
１…質量分析部
１０…イオン化部
１１…イオントラップ
１２…飛行時間型質量分析器
１３…飛行空間
１４…イオン検出器
２…制御・処理部
２０…データ処理部
２１…スペクトル作成部
２２…スペクトル解析部
２３…デノボ配列解析処理部
２４…データベース検索部
２５…同定用データベース
３…分析制御部
４…制御部
５…入力部
６…表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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