(57)【要約】      （修正有）【課題】ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチドの提供。【解決手段】ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチドを提供。その抗原結合タンパク質の産生のための発現ベクター及び宿主細胞もまた提供される。加えて、ＩＬ−１８受容体によって媒介される疾患を診断および処置するための組成物及び方法も提供。１つの実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、α−およびβ−ＩＬ−１８受容体と結合し、（ａ）スキャフォールド構造；および（ｂ）特定配列のＣＤＲＨ領域又は特定配列のＣＤＲＬ領域から選択される少なくとも１つの相補性決定領域を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００８年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１，０７３，１４２号、２００７年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／９５１，６９２号、および２００７年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／９５１，６９１号（これらの各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
Ｉ．発明の分野
ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチドが、本明細書に提供されている。その抗原結合タンパク質の産生のための発現ベクターおよびそれを含む宿主細胞もまた提供されている。加えて、ＩＬ−１８受容体によって媒介される疾患を診断および処置するための組成物および方法が提供されている。
【背景技術】
【０００３】
ＩＩ．背景
ＩＬ−１８は、リガンドのＩＬ−１ファミリーに属する炎症性サイトカインである。非特許文献１。ＩＬ−１８は、ＩＦＮ−γ誘導因子とも呼ばれ、主に、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞でＩＦＮ−γ産生を誘導するその能力により、ＴＨ１応答に重要な役割を果たすサイトカインである。ＩＬ−１８は、構造および機能の両方でＩＬ−１ファミリーに関連している。構造に関しては、ＩＬ−１８とＩＬ−１βは、重要な一次アミノ酸配列を共有し、両方ともβ−シートポリペプチドとして折り畳まれている。機能に関しては、ＩＬ−１８は、ＩＬ−１、ＴＮＦ、Ｆａｓリガンド、およびいくつかのサイトカインの遺伝子発現および合成を誘導する。
【０００４】
ＩＬ−１８の活性は、それがＩＬ−１８受容体（ＩＬ−１８Ｒ）複合体を形成することによって開始されるシグナル伝達経路を通して伝達される。ＩＬ−１８Ｒは、以前にＩＬ−１Ｒ関連タンパク質（ＩＬ−１Ｒｒｐ）と同定されたＩＬ−１Ｒファミリーのメンバーであるα−ＩＬ−１８受容体（α−ＩＬ−１８Ｒ）と名付けられた結合鎖、および同様にＩＬ−１Ｒファミリーのメンバーであり、かつ以前にＡｃＰＬと同定されたβ−ＩＬ−１８受容体（β−ＩＬ−１８Ｒ）を含む；両方の鎖は、シグナル伝達に必要とされる。非特許文献２。ＩＬ−１８／ＩＬ−１８Ｒ複合体は、ＩＬ−１Ｒ活性化キナーゼおよびＴＮＦ受容体関連因子−６を動員し、それが核内因子κＢ（ＮＦκＢ）誘導キナーゼをリン酸化し、引き続いてＮＦκＢを活性化する。ＩＬ−１８は、自然免疫および獲得免疫の両方に関与する。非特許文献３。
【０００５】
発病におけるＩＬ−１８のレベルの増加および／またはＩＬ−１８媒介性シグナルの関与は、自己免疫疾患（特許文献１；特許文献２；特許文献３；非特許文献４）、肝疾患（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献８）、膵疾患、および心血管系疾患（非特許文献９；特許文献４；特許文献５；特許文献６；非特許文献７）を含む様々なヒトの疾患状態で実証されている。したがって、ＩＬ−１８／ＩＬ−１８受容体相互作用を調節する能力がある新しい作用物質を作製することは望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００４／００２５１９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／０６３２９０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／０３４９８８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０３／０８０１０４号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０２／０６０４７９号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０１／８５２０１号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｏｋａｍｕｒａら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ、３７８巻、８８〜９１頁
【非特許文献２】Ｂｏｒｎら、１９９８年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７３巻、２９４４５〜５０頁
【非特許文献３】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ、１９９９年、Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎ．、１０３巻、１１〜２４頁
【非特許文献４】Ｍａｌｌａｔら、２００２年、Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．、９１巻、４４１〜４４８頁
【非特許文献５】Ｆｉｎｉｔｔｏら、２００４年、Ｌｉｖｅｒ、５３巻、３９２〜４００頁
【非特許文献６】Ｔｓｕｔｓｕｉら、２０００年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１７４巻、１９２〜２０９頁
【非特許文献７】Ｒａｅｂｕｒｎら、２００２年、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２８３巻、Ｈ６５０〜Ｈ６５７頁
【非特許文献８】Ｌｕｄｗｉｃｚｅｋら、２００２年、Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２２巻、３３１〜３３７頁
【非特許文献９】Ｇｅｒｄｅｓら、２００２年、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９５巻、２４５〜２５７頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＩＩＩ．要旨
α−およびβ−ＩＬ−１８受容体（本明細書ではまとめて「ＩＬ−１８受容体」または「ＩＬ−１８Ｒ」とも呼ぶ）抗原結合タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチドが、本明細書に提供されている。ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質は、ＩＬ−１８によって媒介される生物学的応答の少なくとも１つを阻害、妨害、または調節し、したがって、ＩＬ−１８媒介性疾患または障害の影響を改善するために有用であり得る。α−およびβ−ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質の産生のための、株化細胞を含む発現系、および異常なＩＬ−１８活性に関連した疾患を診断および処置するための方法もまた提供されている。
【０００９】
１つの実施形態において、抗原結合タンパク質は、α−およびβ−ＩＬ−１８受容体を結合し、（ａ）スキャフォールド構造；および（ｂ）配列番号８９〜１３９のいずれかのＣＤＲＨ領域または配列番号１４０〜１９０のいずれかのＣＤＲＬ領域から選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。この実施形態において、特に有用なのは、配列番号９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３６、１３９、または配列番号１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０それぞれのＣＤＲＨ３領域またはＣＤＲＬ３領域を有する抗原結合タンパク質である。追加の実施形態では、配列番号８９〜１３９のいずれかのＣＤＲＨ領域から選択される１つのＣＤＲ、および配列番号１４０〜１９０のいずれかのＣＤＲＬ領域を有する抗原結合タンパク質を利用する（例えば、抗原結合タンパク質は、１つは重鎖ＣＤＲ領域であり１つは軽鎖ＣＤＲ領域である２つのＣＤＲ領域を有する；さらに、特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３領域およびＣＤＲＬ３領域の両方を有する）。
【００１０】
抗原結合タンパク質は、配列番号６９または配列番号７１のアミノ酸配列それぞれを有するＩＬ−１８受容体α鎖またはβ鎖に結合することができる。
【００１１】
本明細書では、（ａ）配列番号８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７のいずれかのＣＤＲＨ１；（ｂ）配列番号９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８のいずれかのＣＤＲＨ２；および（ｃ）配列番号９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３６、１３９のいずれかのＣＤＲＨ３からなる群より選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖アミノ酸配列；ならびに／または（ａ）配列番号１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８のいずれかのＣＤＲＬ１；（ｂ）配列番号１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９のいずれかのＣＤＲＬ２；および（ｃ）配列番号１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０のいずれかのＣＤＲＬ３からなる群より選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖アミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質が記載されている。
【００１２】
特定の態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号８９〜１３９のいずれかのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する重鎖アミノ酸配列、ならびに／または配列番号１４０〜１９０のいずれかのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖アミノ酸配列を含む。好ましい抗原結合タンパク質は、配列番号１〜１７からなる群より選択される重鎖アミノ酸配列、および／または配列番号１８〜３４からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列を含む。好ましいＣＤＲＨ３は、配列番号９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３６、１３９のいずれかに示されるものを含む。好ましいＣＤＲＬ３は、配列番号１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０のいずれかに示されるものを含む。
【００１３】
特定の態様において、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、またはＩｇＧ４型のものを含む、１つまたは複数のＩｇＧ重鎖または軽鎖を含む。好ましいＩｇＧ重鎖には、配列番号７３、７７、８１、および８５に示されるものが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。好ましいＩｇＧ軽鎖には、配列番号７５、７９、８３、および８７に示されるものが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００１４】
本明細書に記載されているように、成熟α−ＩＬ−１８受容体（配列番号６９）によって形成される３次元構造のアミノ酸残基２５０〜２５３位および２６７〜２７１位に結合する抗原結合タンパク質は、ＩＬ−１８のＩＬ−１８受容体との相互作用を遮断するのに特に有用である。
【００１５】
抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、またはそれらの断片であり得る。抗体断片には、ミニボディ、ドメイン抗体、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｄ断片、ダイアボディ、または一本鎖抗体分子が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００１６】
他の態様において、１つまたは複数のＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質をコードする単離された核酸が、本明細書に提供される。そのような核酸は、ベクター内に含まれて、調節配列に作動可能に連結され得る。また、そのような単離された核酸で形質転換された宿主細胞も本明細書に提供されている。
【００１７】
加えて、ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が本明細書に提供されている。そのような薬学的組成物は、患者においてＩＬ−１８受容体に関連した状態を予防または処置するための方法に有用であり、その方法は、患者にその有効量を投与することを含む。ＩＬ−１８受容体に関連した疾患および状態には、炎症性疾患および自己免疫疾患（乾癬、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、スチル病、強直性脊椎炎、変形性関節症、潰瘍性関節炎、セリアック病、乾癬性関節炎、慢性閉塞性肺疾患、喘息、特に慢性重度喘息、急性呼吸促迫症候群、敗血症、アルツハイマー病、狼瘡、アレルギー性鼻炎、特発性血小板減少性紫斑病、移植、アトピー性皮膚炎、ＩＩ型糖尿病、クローン病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、ＨＩＶ、アトピー性皮膚炎、重症筋無力症、サルコイドーシスなど）、肝疾患（肝炎など）、膵疾患（慢性膵炎または急性膵炎など）、ならびに心血管系疾患（急性熱中症、じゅく状斑破裂、虚血後心不全、再灌流障害、血管炎症、慢性心不全、アテローム性動脈硬化、関節リウマチの心血管系合併症、およびアテローム発生など）が挙げられる。
【００１８】
さらに、ＩＬ−１８受容体をＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質と接触させることを含む、ＩＬ−１８のＩＬ−１８受容体への結合を阻害する方法が、本明細書に提供されている。ＩＬ−１８受容体を結合することによって、ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質は、その受容体のＩＬ−１８への結合を阻止または遮断する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
以下を含む、ヒトＩＬ−１８受容体を結合する単離された抗原結合タンパク質：
（ａ）配列番号８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７のいずれかのＣＤＲＨ１；（ｂ）配列番号９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８のいずれかのＣＤＲＨ２；および（ｃ）配列番号９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３６、１３９のいずれかのＣＤＲＨ３からなる群より選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖アミノ酸配列；または
（ａ）配列番号１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８のいずれかのＣＤＲＬ１；（ｂ）配列番号１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９のいずれかのＣＤＲＬ２；および（ｃ）配列番号１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０のいずれかのＣＤＲＬ３からなる群より選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖アミノ酸配列。
（項目２）
以下を含む、項目１に記載の抗原結合タンパク質：
（ａ）配列番号８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４、１３７のいずれかのＣＤＲＨ１；（ｂ）配列番号９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５、１３８のいずれかのＣＤＲＨ２；および（ｃ）配列番号９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３６、１３９のいずれかのＣＤＲＨ３からなる群より選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖アミノ酸配列；ならびに  
（ａ）配列番号１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５、１５８、１６１、１６４、１６７、１７０、１７３、１７６、１７９、１８２、１８５、１８８のいずれかのＣＤＲＬ１；（ｂ）配列番号１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７７、１８０、１８３、１８６、１８９のいずれかのＣＤＲＬ２；および（ｃ）配列番号１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０のいずれかのＣＤＲＬ３からなる群より選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖アミノ酸配列。
（項目３）
配列番号８９〜１３９のいずれかのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含む重鎖アミノ酸配列、または配列番号１４０〜１９０のいずれかのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖アミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗原結合タンパク質。
（項目４）
配列番号８９〜１３９のいずれかのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含む重鎖アミノ酸配列、ならびに配列番号１４０〜１９０のいずれかのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖アミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗原結合タンパク質。
（項目５）
配列番号１〜１７からなる群より選択される重鎖アミノ酸配列、または配列番号１８〜３４からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗原結合タンパク質。
（項目６）
配列番号１〜１７からなる群より選択される重鎖アミノ酸配列、および配列番号１８〜３４からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗原結合タンパク質。
（項目７）
配列番号９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３６、１３９のいずれかのＣＤＲＨ３を含む、項目１に記載の抗原結合タンパク質。
（項目８）
配列番号９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３６、１３９のいずれかのＣＤＲＨ３、および配列番号１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０のいずれかのＣＤＲＬ３を含む、項目１に記載の抗原結合タンパク質。
（項目９）
配列番号７３、７７、８１、もしくは８５のＩｇＧ重鎖、または配列番号７５、７９、８３、もしくは８７のＩｇＧ軽鎖を含む、単離された抗原結合タンパク質。
（項目１０）
モノクローナル抗体、ヒト抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、またはそれらの断片である、項目１、２、３、４、５、６、７、８、または９のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
（項目１１）
前記抗体断片が、ミニボディ、ドメイン抗体、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｄ断片、ダイアボディ、または一本鎖抗体分子である、項目１０に記載の抗原結合タンパク質。
（項目１２）
ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、またはＩｇＧ４型である、項目１、２、３、４、５、６、７、８、または９のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
（項目１３）
ＩｇＧ２型である、項目１２に記載の抗原結合タンパク質。
（項目１４）
項目１、２、３、４、５、６、７、８、または９のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質を調製するための方法であって、該抗原結合タンパク質を分泌する宿主細胞から該抗原結合タンパク質を調製する工程を含む、方法。
（項目１５）
項目１、２、３、４、５、６、７、８、または９のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質をコードする単離された核酸分子。
（項目１６）
調節配列に作動可能に連結されている、項目１５に記載の単離された核酸分子。
（項目１７）
項目１５に記載の核酸分子を含むベクター。
（項目１８）
項目１６に記載の核酸分子を含むベクター。
（項目１９）
項目１７に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
（項目２０）
項目１８に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
（項目２１）
項目１、２、３、４、５、６、７、８、または９のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗原結合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
（項目２２）
患者においてＩＬ−１８受容体に関連した状態を予防または処置するための方法であって、それを必要としている患者に項目２１に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
（項目２３）
前記状態が、自己免疫疾患、肝疾患、膵疾患、および心血管系疾患からなる群より選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記自己免疫疾患が、乾癬、関節リウマチ、狼瘡、Ｉ型糖尿病、クローン病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、ＨＩＶ、アトピー性皮膚炎、重症筋無力症、およびサルコイドーシスからなる群より選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記肝疾患が肝炎である、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記膵疾患が慢性膵炎または急性膵炎である、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記心血管系疾患が、急性心臓発作を含む心臓疾患、じゅく状斑破裂、虚血後心不全、再灌流障害、血管炎症、およびアテローム発生からなる群より選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２８）
ＩＬ−１８受容体を項目１、２、３、４、５、６、７、８、または９のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質と接触させることを含む、ＩＬ−１８のＩＬ−１８受容体への結合を阻害する方法であって、該抗原結合タンパク質が該ＩＬ−１８受容体を結合し、該ＩＬ−１８受容体のＩＬ−１８への結合を阻止する、方法。
（項目２９）
成熟ＩＬ−１８受容体（配列番号６９）のアミノ酸残基２５０〜２５３位および２６７〜２７１位によって形成される３次元構造に結合する、単離された抗原結合タンパク質。
（項目３０）
モノクローナル抗体、ヒト抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、またはそれらの断片である、項目２９に記載の抗原結合タンパク質。
（項目３１）
前記抗体断片が、ミニボディ、ドメイン抗体、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｄ断片、ダイアボディ、または一本鎖抗体分子である、項目３０に記載の抗原結合タンパク質。
（項目３２）
ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、またはＩｇＧ４型である、項目２９に記載の抗原結合タンパク質。
（項目３３）
ＩｇＧ２型である、項目３２に記載の抗原結合タンパク質。
（項目３４）
項目２９、３０、３１、３２、または３３のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質を調製するための方法であって、該抗原結合タンパク質を分泌する宿主細胞から該抗原結合タンパク質を調製する工程を含む、方法。
（項目３５）
項目２９、３０、３１、３２、または３３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質をコードする単離された核酸分子。
（項目３６）
調節配列に作動可能に連結されている、項目３５に記載の単離された核酸分子。
（項目３７）
項目３５に記載の核酸分子を含むベクター。
（項目３８）
項目３６に記載の核酸分子を含むベクター。
（項目３９）
項目３７に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
（項目４０）
項目３８に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
（項目４１）
項目２９、３０、３１、３２、または３３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗原結合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
（項目４２）
患者においてＩＬ−１８受容体に関連した状態を予防または処置するための方法であって、それを必要としている患者に項目４１に記載の薬学的組成物を投与することを含む方法。
（項目４３）
前記状態が、自己免疫疾患、肝疾患、膵疾患、および心血管系疾患からなる群より選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記自己免疫疾患が、乾癬、関節リウマチ、狼瘡、Ｉ型糖尿病、クローン病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、ＨＩＶ、アトピー性皮膚炎、重症筋無力症、およびサルコイドーシスからなる群より選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記肝疾患が肝炎である、項目４２に記載の方法。
（項目４６）
前記膵疾患が慢性膵炎または急性膵炎である、項目４２に記載の方法。
（項目４７）
前記心血管系疾患が、急性心臓発作を含む心臓疾患、じゅく状斑破裂、虚血後心不全、再灌流障害、血管炎症、およびアテローム発生からなる群より選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４８）
ＩＬ−１８受容体を項目２９、３０、３１、３２、または３３のいずれかに記載の抗原結合タンパク質と接触させることを含む、ＩＬ−１８のＩＬ−１８受容体への結合を阻害する方法であって、該抗原結合タンパク質が該ＩＬ−１８受容体を結合し、該ＩＬ−１８受容体のＩＬ−１８への結合を阻止する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｂ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｃ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｄ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｅ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｆ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｇ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｈ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｉ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｊ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｋ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｌ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｍ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｎ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｏ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｐ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｑ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＶＨ可変ドメインおよびＶＬ可変ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
【図２Ａ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を示す図である。様々な重鎖領域および軽鎖領域のアミノ酸配列は、配列番号１〜３４に同定されている。個々のＣＤＲの配列は、配列番号８９〜１９０に同定されている。
【図２Ｂ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を示す図である。様々な重鎖領域および軽鎖領域のアミノ酸配列は、配列番号１〜３４に同定されている。個々のＣＤＲの配列は、配列番号８９〜１９０に同定されている。
【図２Ｃ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を示す図である。様々な重鎖領域および軽鎖領域のアミノ酸配列は、配列番号１〜３４に同定されている。個々のＣＤＲの配列は、配列番号８９〜１９０に同定されている。
【図２Ｄ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を示す図である。様々な重鎖領域および軽鎖領域のアミノ酸配列は、配列番号１〜３４に同定されている。個々のＣＤＲの配列は、配列番号８９〜１９０に同定されている。
【図２Ｅ】抗原結合タンパク質の様々な重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を示す図である。様々な重鎖領域および軽鎖領域のアミノ酸配列は、配列番号１〜３４に同定されている。個々のＣＤＲの配列は、配列番号８９〜１９０に同定されている。
【図３Ａ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質の重鎖可変配列および軽鎖可変配列のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域は灰色で強調されている。
【図３Ｂ】α−およびβ−ＩＬ−１８受容体結合タンパク質の重鎖可変配列および軽鎖可変配列のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域は灰色で強調されている。
【図４】重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列の様々な可能な組合せを示す表を示す図である。それぞれ１つの重鎖可変領域と１つの軽鎖可変領域の二量体が示されている。天然の抗体は、典型的には、四量体であり、抗体は、その示された二量体のうちの２つの組合せを含んでもよい。
【図５】特定の抗原結合タンパク質実施形態として、エピトープを形成するα−ＩＬ−１８受容体アミノ酸配列の部分を示す図である。
【図６】完全なＡＭＨ６重鎖ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号７４および７３）を示す図である。矢印は、リーダー配列の切断部位を示す。
【図７】完全なＡＭＬ１２軽鎖ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号７６および７５）を示す図である。矢印は、リーダー配列の切断部位を示す。
【図８】完全なＡＭＨ４重鎖ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号７８および７７）を示す図である。矢印は、リーダー配列の切断部位を示す。
【図９】完全なＡＭＬ１４軽鎖ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号８０および７９）を示す図である。矢印は、リーダー配列の切断部位を示す。
【図１０】完全なＡＭＨ９重鎖ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号８２および８１）を示す図である。矢印は、リーダー配列の切断部位を示す。
【図１１】完全なＡＭＬ９軽鎖ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号８４および８３）を示す図である。矢印は、リーダー配列の切断部位を示す。
【図１２】完全なＡＭＨ１１重鎖ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号８６および８５）を示す図である。矢印は、リーダー配列の切断部位を示す。
【図１３】完全なＡＭＬ７軽鎖ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号８８および８７）を示す図である。矢印は、リーダー配列の切断部位を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
Ｖ．好ましい実施形態の詳細な説明
本明細書で用いられるセクション見出しは、構成を目的とするのみであり、記載された主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００２１】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換、タンパク質精製などについては、標準技術を用いることができる。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野において一般的に達成されているように、または本明細書に記載されているように、行うことができる。以下の手順および技術は一般的には、当技術分野においてよく知られた通常の方法に従って、ならびに本明細書を通して引用および議論されている様々な一般的な参考文献およびより特定の参考文献に記載されているように、行うことができる。例えば、いかなる目的のためにも参照により本明細書に組み入れられている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．を参照されたい。特定の規定が提供されない限り、本明細書に記載された分析化学、有機化学、ならびに医薬品化学および薬化学に関して用いられる用語、ならびにそれらの実験手順および技術は、当技術分野においてよく知られ、かつ一般的に用いられているものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化、および送達、ならびに患者の処置については、標準技術を用いることができる。
【００２２】
Ａ．全般的概観
α−またはβ−ＩＬ−１８受容体を結合する抗原結合タンパク質が本明細書に提供されている；ヒトα−およびβ−ＩＬ−１８受容体のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６９および７１に示されている。本発明の抗原結合タンパク質は、図２Ａ〜２Ｅ、３Ａ、および３Ｂに示されているような、すなわち、配列番号１〜３４のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３部分のような（様々なＣＤＲのアミノ酸配列を示す配列番号８９〜２９２も参照）１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するスキャフォールド構造を含む。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質のスキャフォールド構造は、抗体（モノクローナル抗体、ヒト抗体、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体を含むが、それらに限定されるわけではない）、抗体断片（ミニボディ、ドメイン抗体、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｄ断片など）、合成抗体（本明細書では、「抗体模倣体」と呼ばれることもある）、Ｆｃ融合物を含む抗体融合物（「抗体コンジュゲート」と呼ばれることもある）に基づいている。様々な構造が、以下でさらに記載かつ定義されている。
【００２３】
α−およびβ−ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質は、以下でさらに記載されているが、ＴＨ１駆動型自己免疫疾患（ＷＯ２００４／００２５１９；ＷＯ２００５／０６３２９０；ＷＯ２００４／０３４９８８；Ｍａｌｌａｔら、２００２年、Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．、９１巻、４４１〜４４８頁）、肝疾患（Ｆｉｎｉｔｔｏら、２００４年、Ｌｉｖｅｒ、５３巻、３９２〜４００頁；Ｔｓｕｔｓｕｉら、２０００年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１７４巻、１９２〜２０９頁；Ｌｕｄｗｉｃｚｅｋら、２００２年、Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２２巻、３３１〜３３７頁）、膵疾患（Ｙｏｓｈｉｄａら、１９９８年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１８巻、３３３〜５頁）、および心血管系疾患（Ｇｅｒｄｅｓら、２００２年、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９５巻、２４５〜２５７頁；ＷＯ０３／０８０１０４；ＷＯ０２／０６０４７９；ＷＯ０１／８５２０１；Ｒａｅｂｕｒｎら、２００２年、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２８３巻、Ｈ６５０〜Ｈ６５７頁）を含むＩＬ−１８活性に関連した状態を処置するのに有用である。抗原結合タンパク質についての他の使用には、例えば、ＩＬ−１８関連疾患または状態の診断、およびα−またはβ−ＩＬ−１８受容体の存在または非存在を決定するためのスクリーニングアッセイが挙げられる。α−またはβ−ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質、特に、以下により完全に記載されている、重鎖および／または軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つのＣＤＲならびにそれらの組合せを含む抗原結合タンパク質もまた提供されている。
【００２４】
本発明の抗原結合タンパク質は、ＩＬ−１８とＩＬ−１８受容体との間の相互作用を妨害、遮断、または調節する。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＩＬ−１８経路を中断し、それにより、ＩＬ−１８の少なくとも１つの生物活性を減少させ、その生物活性には、ＩＦＮ−γ産生の誘導、キラー細胞形成の誘導、およびキラー細胞の細胞傷害性の増強が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。本明細書の実施例に示されているように、ＫＧ細胞によるＩＦＮ−γのＩＬ−１８誘導性産生を低下させる抗原結合タンパク質には、ＡＭＨ８およびＡＭＬ１１、ＡＭＨ９およびＡＭＬ９、ＡＭＨ１０およびＡＭＬ８、ＡＭＨ１１およびＡＭＬ７、ＡＭＨ１５およびＡＭＬ３、ＡＭＨ１３およびＡＭＬ４、ＡＭＨ１３およびＡＭＬ５、ＡＭＨ１６およびＡＭＬ２、ＡＭＨ２およびＡＭＬ１６、ＡＭＨ２およびＡＭＬ１７、ＡＭＨ１およびＡＭＬ１６、ＡＭＨ１およびＡＭＬ１７、ＡＭＨ４およびＡＭＬ１４、ＡＭＨ４およびＡＭＬ１５、ＡＭＨ３およびＡＭＬ１４、ＡＭＨ３およびＡＭＬ１５、ＡＭＨ６およびＡＭＬ１２、ＡＭＨ６およびＡＭＬ１３、ＡＭＨ５およびＡＭＬ１２、ならびにＡＭＨ５およびＡＭＬ１３を含むものが挙げられる。
【００２５】
したがって、本発明の抗原結合タンパク質は、ＩＬ−１８またはＩＬ−１８受容体誘導性免疫応答に関連した状態を同定するのに役立ち得る。さらに、抗原結合タンパク質は、ＩＬ−１８またはＩＬ−１８受容体媒介性免疫応答を制御および／または抑制することに利用することができ、したがって、過剰免疫応答により引き起こされる様々な疾患、例えば、炎症性疾患の処置および予防に有効である。したがって、本発明のα−およびβ−ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質は、ＩＬ−１８およびＩＬ−１８受容体媒介性シグナル伝達経路に関連した疾患または状態の診断、予防、または処置に用いることができる。
【００２６】
Ｂ．ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質
１つの態様において、α−またはβ−ＩＬ−１８受容体を結合する抗原結合タンパク質が提供される。本明細書に用いられる場合、「抗原結合タンパク質」とは、特定された抗原を特異的に結合するタンパク質を意味する。特定の実施形態において、抗原は、ヒトα−またはβ−ＩＬ−１８受容体である。
【００２７】
本明細書に用いられる場合、「タンパク質」とは、少なくとも２個の共有結合したアミノ酸を意味し、それは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む。いくつかの実施形態において、２個以上の共有結合したアミノ酸は、ペプチド結合によって結合している。タンパク質は、例えば、そのタンパク質が、下記に概要を示しているように、発現系および宿主細胞を用いて組換えで作製された場合、天然のアミノ酸およびペプチド結合から構成され得る。または、タンパク質は、合成アミノ酸（例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、オルニチン、およびノルロイシン）またはペプチド模倣的構造を含んでもよい、すなわち、プロテアーゼまたは他の生理学的および／もしくは保存状態に抵抗性であり得る、ペプトイド（本明細書に参照により組み入れられているＳｉｍｏｎら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９巻、９３６７頁）などの「ペプチドまたはタンパク質類似体」であってもよい。そのような合成アミノ酸は、特に、抗原結合タンパク質が当技術分野においてよく知られた通常の方法によってインビトロで合成される場合、組み入れることができる。さらに、ペプチド模倣体、合成および天然の残基／構造の任意の組合せを用いることができる。「アミノ酸」はまた、プロリンおよびヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基を含む。アミノ酸「Ｒ基」または「側鎖」は、（Ｌ）−配置または（Ｄ）−配置のいずれであってもよい。特定の実施形態において、アミノ酸は、（Ｌ）−配置または（Ｄ）−配置である。
【００２８】
特定の態様において、本発明は、ＩＬ−１８受容体を、いくつかの実施形態においてはヒトＩＬ−１８受容体を、結合する組換え抗原結合タンパク質を提供する。この状況では、「組換えタンパク質」は、組換え技術を用いて、すなわち、本明細書に記載されているような組換え核酸の発現を通して作製されるタンパク質である。組換えタンパク質の産生のための方法および技術は当技術分野においてよく知られている。
【００２９】
いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、単離されたタンパク質または実質的に純粋なタンパク質である。「単離された」タンパク質は、その天然状態で通常、それが付随している物質の少なくとも一部を伴わず、好ましくは、所与の試料における総タンパク質の少なくとも約５重量％、より好ましくは、少なくとも約５０重量％を構成する。「実質的純粋な」タンパク質は、総タンパク質の少なくとも約７５重量％を構成し、少なくとも約８０％が好ましく、少なくとも約９０％が特に好ましい。その定義は、１つの生物体由来の抗原結合タンパク質の異なる生物体または宿主細胞における産生を含む。または、タンパク質は、タンパク質が増加した濃度レベルで作製されるように誘導性プロモーターまたは高発現プロモーターの使用によって、通常見られる濃度より有意に高い濃度で作製することができる。
【００３０】
抗原結合タンパク質は、ＩＬ−１８受容体、好ましくはヒトＩＬ−１８受容体に特異的に結合することができる。本明細書に用いられる場合、「特異的に結合する」とは、平衡解離定数が少なくとも１０−８Ｍ、好ましくは１０−７〜１０−１０Ｍ、より好ましくは＜１０−８〜＜１０−１０Ｍ、よりいっそう好ましくは＜１０−９〜＜１０−１０Ｍであることを意味する。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号６９または７１のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ−１８受容体に結合する。好ましい抗原結合タンパク質が特異的に結合するα−またはβ−ＩＬ−１８受容体におけるエピトープは、下記に詳述されている。
【００３１】
抗原結合タンパク質が治療への適用として用いられる実施形態において、ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質の重要な特性は、それがＩＬ−１８受容体の１つまたは複数の生物活性を阻害、妨害、または調節することができるかどうかである。この場合、抗原結合タンパク質は、過剰の抗体が、ＩＬ−１８受容体に結合したＩＬ−１８（またはその逆）の量を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％、またはそれ以上、低下させる場合（例えば、インビトロ競合的結合アッセイで結合を測定することにより）、特異的に結合し、および／またはＩＬ−１８のその受容体への結合を実質的に阻害する。ＩＬ−１８受容体は、多くの別々の生物学的効果を生じ、それらは、異なる細胞型において多くの異なるアッセイで測定することができる。ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質のＩＬ−１８の生物活性を阻害、妨害、または調節する能力は、例えば、実施例４に記載されているように、ＫＧ１細胞においてＩＦＮ−γ放出の阻害を測定することにより、または抗原結合タンパク質のＩＦＮ−γ放出を阻害する能力が測定される類似したアッセイを用いて、決定することができる。
【００３２】
抗原に特異的に結合するあらゆる抗原結合タンパク質が、抗原のその通常のリガンドへの結合を遮断し、それに従って、抗原の生物学的効果を阻害または調節することができるとは限らない。当技術分野において知られているように、そのような効果は、抗原結合タンパク質が抗原のどの部分に結合するのか、ならびに抗原および抗原結合タンパク質、この場合、ＩＬ−１８受容体およびＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質の絶対的濃度と相対的濃度の両方に依存し得る。本明細書で意味しているようなＩＬ−１８受容体の生物活性を阻害または調節する能力があるとみなされるためには、抗原結合タンパク質は、例えば、ＩＬ−１８の存在下で観察されるＩＦＮ−γの放出を、実施例４のＫＧ１細胞アッセイまたは類似したアッセイにおいて測定されるように、ＩＬ−１８濃度がその生物活性を阻害する作用物質の効果が容易に明らかであり得る範囲内、例えば、約ＥＣ８０またはＥＣ９０である場合、少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上、阻害できることでもよい。本明細書で意味する場合、ＥＣ８０は、観察され得るＩＬ−１８の最大効果の８０％に必要とされるＩＬ−１８の量である。ＩＬ−１８濃度がＥＣ９０より十分上である場合には、阻害剤の効果は、過剰のＩＬ−１８のためにあまり明らかではない可能性がある。ＩＬ−１８受容体の生物活性を阻害、妨害、または調節するのに必要とされる抗原結合タンパク質の濃度は、大きく変わり得、抗体がＩＬ−１８受容体にどれくらい密接に結合するかに依存する可能性がある。例えば、ＩＬ−１８の１分子あたり抗原結合タンパク質の１分子またはそれ未満が、ＫＧ１細胞アッセイにおいて生物活性を阻害、妨害、または調節するのに十分であることがある。いくつかの実施形態において、約２：１、１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、１：１０、１：２０、１：４０、１：６０、１：１００、１：５００、１：１，０００、またはそれ以上を含む約１，０００：１〜約１：１，０００のＩＬ−１８受容体／抗体の比が、ＩＬ−１８濃度が約ＥＣ５０〜約ＥＣ９０である場合、ＩＬ−１８受容体の生物活性を阻害、妨害、または調節するのに必要とされることがある。これらの値の間のＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質の比率もまた可能である。
【００３３】
一般的構造として、本発明の抗原結合タンパク質は、（ａ）スキャフォールド、および（ｂ）１つまたは複数のＣＤＲ（抗原結合特異性および親和性を決定する領域）を含む。本明細書に用いられる場合、「相補的決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗原結合のための主要な表面接触点を構成する結合タンパク質領域を示す。１つまたは複数のＣＤＲは、抗原結合タンパク質のスキャフォールド構造内に埋め込まれている。抗原結合タンパク質のスキャフォールド構造は、抗体、またはその断片もしくは変異体のフレームワークであってもよいし、事実上、完全に合成であってもよい。抗原結合タンパク質の様々なスキャフォールド構造は以下で、さらに記載されている。
【００３４】
１．ＣＤＲ
抗原結合タンパク質は、（典型的には、天然の抗体の各「アーム」を有するように）６つのＣＤＲ、例えば、１つの重鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）、１つの重鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）、１つの重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）、１つの軽鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）、１つの軽鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＬ２」）、１つの軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）を有してもよい。ポリペプチド、核酸、宿主細胞などの生物学的物質に関連して本明細書を通して用いられる場合、「天然の」という用語は、天然で見出される物質を示す。天然の抗体において、ＣＤＲＨ１は、典型的には、約５個〜約７個のアミノ酸を含み、ＣＤＲＨ２は、典型的には、約１６個〜約１９個のアミノ酸を含み、ＣＤＲＨ３は、典型的には、約３個〜約２５個のアミノ酸を含む。ＣＤＲＬ１は、典型的には、約１０個〜約１７個のアミノ酸を含み、ＣＤＲＬ２は、典型的には、約７個のアミノ酸を含み、ＣＤＲＬ３は、典型的には、約７個〜約１０個のアミノ酸を含む。好ましいＣＤＲは、図２Ａ〜２Ｅ、３Ａ、および３Ｂに示されている。
【００３５】
天然の抗体内のＣＤＲの構造および性質は、以下、このセクションでさらに記載されている。簡単には、伝統的な抗体スキャフォールドにおいて、ＣＤＲは、抗原結合および認識を担う領域を構成する重鎖可変領域および軽鎖可変領域におけるフレームワーク内に埋め込まれている。可変領域は、少なくとも３つの重鎖または軽鎖ＣＤＲ（前記（Ｋａｂａｔら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎ．Ｉ．Ｈ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）参照；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻、９０１〜９１７頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻、８７７〜８８３頁も参照）をフレームワーク領域（Ｋａｂａｔら、１９９１年、前記による名付けられたフレームワーク領域１〜４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７年、前記もまた参照）内に含む。下記参照。しかしながら、本発明により提供されるＣＤＲは、伝統的な抗体構造の抗原結合ドメインを定義するように用いることができるだけでなく、本明細書に記載されているように、様々な他のスキャフォールド構造に埋め込むことができる。
【００３６】
特定の実施形態において、抗原結合タンパク質の１つまたは複数のＣＤＲはそれぞれ、配列番号８９〜１３９のいずれかのＣＤＲＨ領域および配列番号１４０〜１９０のいずれかのＣＤＲＬ領域から、独立して選択される。したがって、１つの実施形態において、本発明は、α−またはβ−ＩＬ−１８受容体を結合する抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質が（ａ）（下記のような）スキャフォールド構造；および（ｂ）配列番号８９〜１３９のいずれかのＣＤＲＨ領域および配列番号１４０〜１９０のいずれかのＣＤＲＬ領域から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む抗原結合タンパク質を提供する。この実施形態において、特に有用なのは、ＣＤＲＨ３またはＣＤＲＬ３領域を有する抗原結合タンパク質である。追加の実施形態では、配列番号８９〜１３９のいずれかのＣＤＲＨ領域から選択される１つのＣＤＲ、および配列番号１４０〜１９０のいずれかのＣＤＲＬ領域を有する抗原結合タンパク質を利用する（例えば、抗原結合タンパク質は、１つのＣＤＲＨと１つのＣＤＲＬである２つのＣＤＲ領域を有し、特定の実施形態は、ＣＤＲＨ３領域およびＣＤＲＬ３領域の両方を有する抗原結合タンパク質である）。
【００３７】
当業者に認識されているように、特に有用な実施形態は、配列番号８９〜１９０の独立して選択されたＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つを含み得る。しかしながら、当業者に認識されているように、特定の実施形態は、一般的に、反復しないＣＤＲの組合せを利用し、例えば、抗原結合タンパク質は、一般的に、２つのＣＤＲＨ２領域などで作製されていない。
【００３８】
いくつかの実施形態において、ＣＤＲＨ３領域およびＣＤＲＬ３領域を含む抗原結合タンパク質が作製され、特に、ＣＤＲＨ３領域は、配列番号９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３、１３６、１３９のいずれかのＣＤＲＨ３領域から選択され、かつＣＤＲＬ３領域は、配列番号１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８１、１８４、１８７、１９０のいずれかのＣＤＲＬ３領域から選択される。特別の組合せは図４に示されている。
【００３９】
追加の実施形態において、配列番号８９〜１３９から、独立して選択されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域を含む抗原結合タンパク質が利用される。より特定的な実施形態において、特に有用なのは、すべての３つのＣＤＲＨ領域が配列番号１〜１７のいずれかの同じ可変領域から選択されている、この型の抗原結合タンパク質であり得る。
【００４０】
さらなる実施形態において、配列番号１４０〜１９０から、独立して選択されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域を含む抗原結合タンパク質が利用される。より特定的な実施形態において、特に有用なのは、すべての３つのＣＤＲＬ領域が配列番号１８〜３４のいずれかの同じ可変領域から選択されている、この型の抗原結合タンパク質である。
【００４１】
追加の実施形態において、抗原結合タンパク質は、この場合もやはり、配列番号８９〜１３９から、独立して選択されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域であって、１つの実施形態では、すべての３つの領域が同じ配列番号から選択されている領域、ならびに、やはり先と同様に、配列番号１４０〜１９０から、独立して選択されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域であって、１つの実施形態では、すべての３つの領域が配列番号１〜３４のいずれかの同じ可変領域から選択されている領域を含む。
【００４２】
本発明のさらに別の態様において、α−またはβ−ＩＬ−１８受容体を結合する抗原結合タンパク質であって、単離された抗原結合タンパク質が、それぞれが配列番号８９〜１３９のいずれかから選択されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、もしくはＣＤＲＨ３を含む重鎖アミノ酸配列もしくはその断片、またはそれぞれが配列番号１４０〜１９０のいずれかから選択されているＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、もしくはＣＤＲＬ３を含む軽鎖アミノ酸配列もしくはその断片を含む抗原結合タンパク質を提供する。本明細書に用いられる場合、重鎖または軽鎖可変領域「断片」は、配列番号１〜３４の少なくとも１つのＣＤＲおよび抗体フレームワークのフレームワーク領域の少なくとも部分を含み、前記部分は、少なくとも１個のアミノ酸を含む。
【００４３】
さらに別の態様において、本発明は、α−またはβ−ＩＬ−１８受容体を結合する抗原結合タンパク質であって、単離された抗原結合タンパク質が、それぞれが配列番号８９〜１３９のいずれかから、独立して選択されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含む重鎖アミノ酸配列、またはそれぞれが配列番号１４０〜１９０のいずれかから、独立して選択されているＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖アミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。特定の実施形態において、ＣＤＲは、配列番号１〜１７の同じ近接した重鎖アミノ酸配列由来、または配列番号１８〜３４の同じ近接した軽鎖アミノ酸配列由来である。
【００４４】
本発明のさらなる態様は、α−またはβ−ＩＬ−１８受容体を結合する、単離された抗原結合タンパク質であって、単離された抗原結合タンパク質が、それぞれが配列番号８９〜１３９のいずれかから、独立して選択されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含む重鎖アミノ酸配列、ならびに、それぞれが配列番号１４０〜１９０のいずれかから、独立して選択されているＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖アミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。特定の実施形態において、重鎖ＣＤＲは、配列番号１〜１７の同じ近接した重鎖アミノ酸配列由来であり、かつ軽鎖ＣＤＲは、配列番号１８〜３４の同じ近接した軽鎖アミノ酸配列由来である。
【００４５】
本発明の追加の態様は、α−またはβ−ＩＬ−１８受容体を結合する単離された抗原結合タンパク質であって、単離された抗原結合タンパク質が、配列番号１〜１７のいずれかの重鎖アミノ酸配列、または配列番号１８〜３４のいずれかの軽鎖アミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、α−またはβ−ＩＬ−１８受容体を結合する単離された抗原結合タンパク質であって、単離された抗原結合タンパク質が、配列番号１〜１７のいずれかの重鎖アミノ酸配列、および配列番号１８〜３４のいずれかの軽鎖アミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。配列番号１〜１７の重鎖配列のいずれも、配列番号１８〜３４の軽鎖配列のいずれとも混合し、かつ適合することができることは留意されたい。その結果として可能な組合せは、図４に示されている。それぞれ１つの重鎖可変領域と１つの軽鎖可変領域との組合せの二量体が示されている。たいていの抗体が四量体であるように、本発明の抗原結合タンパク質は、示された二量体の任意の２つの任意の組合せを含んでもよく、したがって、ヘテロ四量体およびホモ四量体の両方を含み、ホモ四量体（例えば、同一の二量体が２つ）は特異的である。
【００４７】
かさねて、さらなる態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号７３〜８８に示された配列のいずれかを含む。
【００４８】
表１は、配列識別番号に関連づけて、配列の簡単な説明を提供する。本発明の可変領域内のＣＤＲは、図２Ａ〜２Ｅ、３Ａ、および３Ｂに同定されている。
【００４９】
【表１−１】
2015015957.tif 000002
【００５０】
【表１−２】
2015015957.tif 000003
【００５１】
【表１−３】
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【００５２】
【表１−４】
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【００５３】
【表１−５】
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【００５４】
【表１−６】
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【００５５】
【表１−７】
2015015957.tif 000008
２．スキャフォールド
本明細書で述べているように、抗原結合タンパク質は、ＣＤＲが移植されているスキャフォールド構造を含むことができる。スキャフォールド構造は、抗体（モノクローナル抗体、ヒト抗体、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体を含むが、それらに限定されるわけではない）、抗体断片（ミニボディ、ドメイン抗体、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｄ断片など）、合成抗体（本明細書では、「抗体模倣体」と呼ばれることもある）、Ｆｃ融合物を含む抗体融合物（「抗体コンジュゲート」と呼ばれることもある）に基づいてもよい。いくつかの実施形態は、ヒトスキャフォールド構成要素の使用を含む。したがって少なくとも、本発明は、ＩＬ−１８受容体に結合し、および／またはＩＬ−１８受容体の生物活性を阻害することができる、配列番号８９〜１９０に同定された、好ましくは配列番号８９〜１８９の、ＣＤＲの１つまたはいくつかを含む下記のスキャフォールドのいずれかを含む。いくつかの実施形態において、スキャフォールドは、配列番号１〜１７に同定された１つもしくはいくつかの重鎖可変領域、および／または配列番号１８〜３４のいずれかに同定された１つもしくはいくつかの軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、スキャフォールドは、配列番号７７〜８８のいずれかに同定されたＩｇＧ鎖を含む。
【００５６】
１つの実施形態において、１つまたはいくつかのＣＤＲが移植されているスキャフォールドは、抗体である。本明細書に用いられる場合、用語「抗体」は、少なくとも２つ、より典型的には４つのポリペプチド鎖を含む伝統的な抗体構造を有する多量体タンパク質を示す。抗体は、抗原に特異的に結合し、抗原の生物活性を阻害する、または調節することができ得る。特定の実施形態において、抗体は、組換えＤＮＡ技術により作製される。追加の実施形態において、抗体は、天然の抗体の酵素的または化学的切断によって作製される。
【００５７】
伝統的な抗体構造単位は、典型的には、四量体を構成する。各四量体は、典型的には、ポリペプチド鎖ペアの同一のものが２つで構成され、各ペアは１つの「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量をもつ）および１つの「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量をもつ）を有する。各鎖のアミノ末端部は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０個、またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部は、主にエフェクター機能を担う定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義する。ＩｇＧはいくつかのサブクラスを有し、それらにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ＩｇＭはサブクラスを有し、それらにはＩｇＭ１およびＩｇＭ２が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００５８】
軽鎖および重鎖内には、可変領域および定常領域が、約１２個またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖はまた、約１０個またはそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般的には、Ｐａｕｌ，  Ｗ．編、１９８９年、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、７章、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．を参照。各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【００５９】
例えば、ラクダおよびラマに見出される、いくつかの天然の抗体は、２つの重鎖からなる二量体であり、軽鎖を含まない。Ｍｕｌｄｅｒｍａｎｓら、２００１年、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４巻、２７７〜３０２頁；Ｄｅｓｍｙｔｅｒら、２００１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７６巻、２６２８５〜２６２９０頁。ラクダの抗体の結晶学的研究により、ＣＤＲ３領域が、抗原と相互作用する表面を形成し、したがって、より典型的な四量体抗体においてのように、抗原結合に重要であることが明らかにされた。
【００６０】
重鎖および軽鎖の可変領域は、典型的には、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって連結された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的構造を示す。ＣＤＲは、抗原認識および結合を担っている、抗体（または、本明細書で概要を示しているような抗原結合タンパク質）の超可変領域である。各ペアの２つの鎖由来のＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列し、特定のエピトープへの結合を可能にしている。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。アミノ酸の各ドメインへの配置は、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔの定義に従っている。Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻、９０１〜９１７頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻、８７８〜８８３頁。
【００６１】
ＣＤＲは、抗原結合のための主要な表面接触点を構成する。例えば、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻、９０１〜９１７頁参照。さらに、軽鎖のＣＤＲ３、および特に、重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域内で抗原結合における最も重要な決定因子を構成する可能性がある。例えば、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７年、前記；Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏら、２００１年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３１０巻、６０３〜６１５頁；ＸｕおよびＤａｖｉｓ、２０００年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１３巻、３７〜４５頁；Ｄｅｓｍｙｔｅｒら、２００１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７６巻、２６２８５〜２６２９０頁；ならびにＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２００１年、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４巻、２７７〜３０２頁参照。いくつかの抗体において、重鎖ＣＤＲ３は、抗原と抗体の間の接触の主要な領域を構成するように思われる。Ｄｅｓｍｙｔｅｒら、２００１、前記。ＣＤＲ３だけを変化させるインビトロ選択スキームは、抗体の結合性質を変化させるために用いることができる。Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２００１年、前記；Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏら、２００１年、前記。
【００６２】
天然の抗体鎖は、典型的には、抗体鎖をタンパク質分泌のための細胞経路へと方向付け、かつ成熟抗体内には存在しない、シグナル配列を含む。抗体鎖をコードするポリヌクレオチドは、天然のシグナル配列、または下記のような異種性のシグナル配列をコードしてもよい。
【００６３】
１つの実施形態において、抗原結合タンパク質は、本明細書で概要を示しているように、配列番号８９〜１９０のいずれかの示されたＣＤＲの１〜６つを有するモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ抗体を含む任意の型であってもよい。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ型抗体である。よりいっそう特定的な実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ２型抗体である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、例えば、抗原結合タンパク質が完全な重鎖および軽鎖を有する抗体である場合、ＣＤＲはすべて、同じ種、例えば、ヒト由来である。しかしながら、いくつかの実施形態において、スキャフォールド構成要素は、異なる種由来の混合物であり得る。したがって、抗原結合タンパク質が抗体である場合には、そのような抗体は、キメラ抗体および／またはヒト化抗体であり得る。一般的に、両方の「キメラ抗体」は、１つより多い種由来の領域を組み合わせる抗体を示す。例えば、「キメラ抗体」は、伝統的には、マウス（または、場合によっては、ラット）由来の可変領域およびヒト由来の定常領域を含む。
【００６５】
例えば、抗原結合タンパク質が、上記で概要が示された配列由来の６つ未満のＣＤＲを含む実施形態において、追加のＣＤＲは、他の種（例えば、マウスＣＤＲ）由来であってもよいし、その配列に示されたものとは異なるヒトＣＤＲであってもよい。例えば、本明細書で同定された適切な配列由来のヒトＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３領域を用いてもよく、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＬ１、およびＣＤＲＬ２は、任意で、別の種から選択されても、または異なるヒト抗体配列であっても、またはそれらの組合せであってもよい。例えば、本発明のＣＤＲは、商業的関連のあるキメラ抗体またはヒト化抗体のＣＤＲ領域を置換することができる。
【００６６】
本発明の特定の実施形態は、ヒトの構成要素である、抗原結合タンパク質のスキャフォールド構成要素を利用する。
【００６７】
「ヒト化抗体」は、一般的に、可変ドメインフレームワーク領域が、ヒト抗体に見出される配列と交換されている非ヒト抗体を示す。一般的に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされている、またはそのＣＤＲ内を除いて、そのような抗体と同一である。一部または全部が非ヒト生物体に由来する核酸によってコードされているＣＤＲは、ヒト抗体可変領域のβ−シートフレームワークへ移植されて、抗体を生じ、その抗体の特異性は、移植されたＣＤＲによって決定される。そのような抗体の作製は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８、Ｊｏｎｅｓ、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻、５２２〜５２５頁、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻、１５３４〜１５３６頁に記載されている。ヒト化抗体はまた、遺伝子操作された免疫系を有するマウスを用いて作製することができる。Ｒｏｑｕｅら、２００４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．、２０巻、６３９〜６５４頁。本発明において、同定されたＣＤＲはヒトであり、したがって、この関連におけるヒト化抗体およびキメラ抗体の両方は、いくつかの非ヒトＣＤＲを含む；例えば、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３領域を含み、その他のＣＤＲ領域のうちの１つまたは複数が異なる特別な起源である、ヒト化抗体を作製してもよい。
【００６８】
１つの実施形態において、ＩＬ−１８抗原結合タンパク質は、多重特異性抗体、とりわけ、「ダイアボディ」と呼ばれることもある二重特異性抗体である。これらは、２つ（またはそれ以上）の異なる抗原に結合する抗体である。ダイアボディは、当技術分野において知られた様々な方法で製造することができ（ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．、４巻、４４６〜４４９頁）、例えば、化学的に、またはハイブリッドハイブリドーマから調製することができる。
【００６９】
１つの実施形態において、ＩＬ−１８抗原結合タンパク質は、完全なヒト抗体、すなわち、完全にヒト構成要素で構成される抗体である。この実施形態において、上記で概要を示しているように、特定の構造は、図２Ａ〜２Ｅ、３Ａ、および３Ｂに示されたＣＤＲ領域を含む、示された完全な重鎖および軽鎖を含む。追加の実施形態は、本発明のＣＤＲの１つまたは複数を利用し、その他のＣＤＲ、フレームワーク領域、Ｊ領域およびＤ領域、定常領域などは、他のヒト抗体由来である。例えば、本発明のＣＤＲは、いくつのヒト抗体のＣＤＲでも、特に、商業的関連のある抗体のＣＤＲを、置換することができる。
【００７０】
１つの実施形態において、ＩＬ−１８抗原結合タンパク質は抗体断片であり、それは、α−またはβ−ＩＬ−１８受容体への結合特異性を保持する、本明細書で概要が示された抗体のいずれかの断片である。
【００７１】
特定の抗体断片には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメイン、さらに重鎖ヒンジ領域からなるＦａｂ’断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｉｖ）単一の可変ドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４〜５４６頁）、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂ’断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２、（ｖｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、その２つのドメインを結合させるペプチドリンカーによって連結され、抗原結合部位を形成している、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３〜４２６頁、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５巻、５８７９〜５８８３頁）、（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、ならびに（ｉｘ）遺伝子融合により構築された多価または多重特異性断片である、「ダイアボディ」または「トリアボディ」（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、２０００年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２６巻、４６１〜４７９頁；ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０巻、６４４４〜６４４８）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。抗体断片を修飾してもよい。例えば、分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み入れによって安定化され得る（Ｒｅｉｔｅｒら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１４巻、１２３９〜１２４５頁）。本明細書で概要を示しているように、この場合もやはり、これらの断片の非ＣＤＲ構成要素は、好ましくは、ヒト配列である。
【００７２】
１つの実施形態において、ＩＬ−１８抗原結合タンパク質はミニボディである。ミニボディは、ＣＨ３ドメインに連結されたｓｃＦｖを含む、最小化された抗体様タンパク質である。Ｈｕら、１９９６年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６巻、３０５５〜３０６１頁。
【００７３】
１つの実施形態において、ＩＬ−１８抗原結合タンパク質は、ドメイン抗体である；例えば、米国特許第６、２４８，５１６号参照。ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、ヒト抗体の重鎖（ＶＨ）かまたは軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に対応する、抗体の機能性結合ドメインである。ｄＡＢは、約１３ｋＤａの分子量、または完全な抗体の１０分の１未満のサイズをもつ。ｄＡＢは、細菌、酵母、および哺乳類細胞系を含む様々な宿主で十分発現する。加えて、ｄＡｂは高度に安定しており、凍結乾燥または熱変性などの過酷な状態に曝された後でさえも、活性を保持する。例えば、米国特許第６，２９１，１５８号；第６，５８２，９１５号；第６，５９３，０８１号；第６，１７２，１９７号；米国特許出願第２００４／０１１０９４１号；欧州特許第０３６８６８４号；米国特許第６，６９６，２４５号、ＷＯ０４／０５８８２１、ＷＯ０４／００３０１９、およびＷＯ０３／００２６０９参照。
【００７４】
１つの実施形態において、ＩＬ−１８抗原結合タンパク質は、抗体融合タンパク質、またはＦｃ融合物などの抗体断片融合物である（本明細書では、まとめて「抗体コンジュゲート」と呼ばれることもある）。コンジュゲートのパートナーは、タンパク質性または非タンパク質性であり得る；後者は、一般的に、抗原結合タンパク質上（抗原結合タンパク質の共有結合的修飾に関する考察を参照）およびコンジュゲートパートナー上の官能基を用いて作製される。例えば、リンカーは当技術分野において知られている；例えば、ホモまたはヘテロ二官能性リンカーはよく知られている（参照により本明細書に組み入れられている、１９９４年  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙカタログ、架橋剤に関するテクニカルセクション、１５５〜２００頁を参照）。
【００７５】
適切なコンジュゲートには、下記のような標識、薬物、および、限定されるわけではないが、細胞傷害性薬物（例えば、化学療法剤）または毒素もしくはそのような毒素の活性断片を含む細胞傷害性薬剤が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。適切な毒素およびそれらの対応する断片には、ジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンなどが挙げられる。細胞傷害性薬剤はまた、抗原結合タンパク質に放射性同位元素をコンジュゲートする、または抗原結合タンパク質に共有結合しているキレート化剤に放射性核種を結合することによって作製された放射性化学物質が挙げられる。追加の実施形態は、カリチアマイシン、アウリスタチン、ゲルダナマイシン、およびマイタンシンを利用する。
【００７６】
１つの実施形態において、ＩＬ−１８抗原結合タンパク質は、抗体類似体であり、「合成抗体」と呼ばれることもある。例えば、様々な最近の研究は、移植されたＣＤＲを有する、代替タンパク質スキャフォールドかまたは人工的スキャフォールドのいずれかを利用する。そのようなスキャフォールドは、結合タンパク質の３次元構造を安定化させるために導入された突然変異、および、例えば生体適合性ポリマーからなる、完全に合成のスキャフォールドを含むがそれらに限定されるわけではない。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒら、２００３年、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、５３巻、１号、１２１〜１２９頁、Ｒｏｑｕｅら、２００４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．、２０巻、６３９〜６５４頁参照。加えて、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）、およびスキャフォールドとしてフィブロネクチン成分を利用する抗体模倣体に基づいたスキャフォールドを用いることができる。ＩＬ−１８抗原結合タンパク質を作製するために用いることができる代替のスキャフォールドは、Ｈｅｙら、２００５年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３巻、５１４〜２２頁およびＢｉｎｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３巻、１２５７〜６８頁（両方とも全体として参照により本明細書に組み入れられている）に概説されている。
【００７７】
３．ＣＤＲ変異体
配列番号８９〜１９０に示されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列の変異体もまた本発明内に含まれる。したがって、変異体ＣＤＲは、本明細書に用いられたＣＤＲの定義内に含まれる。これらの変異体は、以下の３つのクラス、置換変異体、挿入変異体、または欠失変異体のうちの１つまたは複数に分類され、その最初のクラスは特異的である。
【００７８】
当技術分野において知られているように、タンパク質または核酸が有する、既知の配列に対する配列同一性または類似性の程度を同定するために、いくつかの異なるプログラムを用いることができる。
【００７９】
アミノ酸配列について、配列同一性および／または類似性は、当技術分野において知られた標準技術を用いることによって決定され、それらには、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１年、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．、２巻、４８２頁の局所的配列同一性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３頁の配列同一性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５巻、２４４４頁の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１２巻、３８７〜３９５頁により記載され、好ましくはデフォルト設定を用いる、Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラム、または洞察によるものが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。好ましくは、以下のパラメータに基づいたＦａｓｔＤＢ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１２７〜１４９頁、（１９８８年）、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．によってパーセント同一性が計算される：１のミスマッチペナルティ；１のギャップペナルティ；０．３３のギャップサイズペナルティ；および３０の連結（ｊｏｉｎｉｎｇ）ペナルティ。
【００８０】
有用なアルゴリズムの例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、累進的なペアワイズアラインメントを用いて一群の関連配列から多重配列アラインメントを作成する。それはまた、アラインメントを作成するために用いられるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８７年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．、３５巻、３５１〜３６０頁の累進的アラインメント方法の単純化を用いる；その方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、１９８９年、ＣＡＢＩＯＳ、５巻、１５１〜１５３頁により記載されたものに類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、３．００のデフォルトギャップ重み、０．１０のデフォルトギャップ長重み、および重み付けされた末端ギャップを含む。
【００８１】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３〜４１０頁；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻、３３８９〜３４０２頁；およびＫａｒｉｎら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０巻、５８７３〜５７８７頁に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９６年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６巻、４６０〜４８０頁から入手されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメータを用い、それらの大部分は、デフォルト値に設定されている。調整可能なパラメータは、以下の値に設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ  ＳおよびＨＳＰ  Ｓ２パラメータは動的値であり、特定の配列の構成、および対象となる配列が検索されることになっている特定のデータベースの構成に依存するプログラム自体によって確立される；しかしながら、その値は、感度を高めるように調整することができる。
【００８２】
追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９３年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻、３３８９〜３４０２頁によって報告されているようなギャップドＢＬＡＳＴである。ギャップドＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコアを用いる；閾値Ｔパラメータは９に設定される；非ギャップド伸長をトリガーする２ヒット方法は、ｋのギャップ長に１０＋ｋのコストをチャージする；Ｘｕは１６に設定され、Ｘｇは、データベース検索段階について４０に、およびアルゴリズムの出力段階について６７に設定される。ギャップドアラインメントは、約２２ビットに対応するスコアによってトリガーされる。
【００８３】
一般的に、個々の変異体ＣＤＲ間のアミノ酸相同性、類似性、または同一性は、本明細書に示された配列に対して少なくとも８０％であり、より典型的には、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、およびほとんど１００％の好ましく増加した相同性または同一性を有する。
【００８４】
同じような様式で、本明細書に同定された結合タンパク質の核酸配列に関する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、抗原結合タンパク質のコード配列におけるヌクレオチド残基と同一である、候補配列におけるヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。特定の方法は、デフォルトパラメータに設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用し、オーバーラップスパンおよびオーバーラップフラクションは、それぞれ、１および０．１２５に設定される。
【００８５】
一般的に、個々の変異体ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列と本明細書に示されたヌクレオチド配列との間の核酸配列相同性、類似性、または同一性は、少なくとも６０％であり、より典型的には、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、およびほとんど１００％の好ましく増加した相同性または同一性を有する。
【００８６】
ヌクレオチド配列間の相同性は、お互いにハイブリダイズするそれらの能力によって定義されることが多い。本明細書で言及される、用語「選択的にハイブリダイズする」とは、検出可能かつ特異的に結合することを意味する。本発明によるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびそれらの断片は、非特異的核酸への検出可能な結合のかなりの量を最小にするハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件は、当技術分野において知られた、および本明細書で論じられた選択的ハイブリダイゼーション条件を達成するために用いることができる。
【００８７】
高ストリンジェンシー条件は、当技術分野において知られている；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、前記、およびＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２年を参照、両方とも参照により本明細書に組み入れられている。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、様々な状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ」（１９９３年）に見出される。
【００８８】
一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列についての熱融解点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低いように選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が標的配列に平衡状態でハイブリダイズする（標的配列が過剰に存在する場合、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有されている）温度（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）である。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満ナトリウムイオン、典型的には、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃、および長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）について少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成してもよい。
【００８９】
別の実施形態において、あまりストリンジェントではない条件が用いられる；例えば、当技術分野において知られているように、中程度または低いストリンジェンシー条件を用いてもよい；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、前記；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２年、およびＴｉｊｓｓｅｎ、１９９３年、前記参照。
【００９０】
本発明による変異体については、通常、本明細書に概要を示しているように、カセット式突然変異誘発もしくはＰＣＲ突然変異誘発または当技術分野においてよく知られた他の技術を用いて、抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発により調製して、変異体をコードするＤＮＡを生じさせ、その後、その組換えＤＮＡを細胞培養で発現させる。しかしながら、約１００〜１５０個に及ぶ残基を有する変異体ＣＤＲを含む抗原結合タンパク質断片は、確立された技術を用いるインビトロ合成によって調製することができる。変異体は、典型的には、天然の類似体と同じ質的生物活性、例えば、ＩＬ−１８受容体への結合およびシグナル伝達の阻害を示すが、より完全に下記で概要を示しているように、改変された特性を有する変異体もまた選択することができる。
【００９１】
したがって、「変異体ＣＤＲ」は、本発明の親ＣＤＲに対して特定された相同性、類似性、または同一性を有するものであり、限定されるわけではないが、親ＣＤＲの特異性および／または活性の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む、生物学的機能を共有する。例えば、変異体は、典型的には、下記に概要が示された同じＩＬ−１８受容体エピトープに結合し、ＩＬ−１８受容体シグナル伝達を同じように阻害する。
【００９２】
アミノ酸配列変異を導入する部位または領域はあらかじめ決定されているが、突然変異それ自体は、あらかじめ決定される必要はない。例えば、所定の部位における突然変異の実施を最適化するために、標的コドンまたは領域でランダム突然変異誘発を行い、発現した抗原結合タンパク質ＣＤＲ変異体を、所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングしてもよい。既知の配列を有するＤＮＡにおけるあらかじめ決定された部位に置換突然変異を行うための技術は、よく知られており、例えば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発である。突然変異体のスクリーニングは、ＩＬ−１８受容体結合などの抗原結合タンパク質活性のアッセイを用いて行われる。
【００９３】
アミノ酸置換は、典型的には、単一の残基についてである；挿入は、通常、おおよそ約１個〜約２０個のアミノ酸残基であるが、より相当に大きい挿入を許容することができる。欠失は、約１個〜約２０個のアミノ酸残基の範囲であるが、場合によっては、欠失はずっと大きいこともある。
【００９４】
置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組合せは、最終の誘導体または変異体に達するように用いることができる。一般的に、これらの変化は、分子の変化、特に抗原結合タンパク質の免疫原性および特異性の変化を最小にするように少数のアミノ酸に対して行われる。しかしながら、より大きな変化が特定の状況において許容されることもある。抗原結合タンパク質のＣＤＲの特性における小さな変化が望まれる場合、一般的に、置換が、表２に示された以下のチャートに従って行われる。
【００９５】
【表２】
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機能または免疫学的同一性における実質的変化は、表２に示されたものより保存性が低い置換を選択することによりもたらされる。例えば、より有意に以下に影響する置換を行うことができる：変化の領域におけるポリペプチドバックボーンの構造、例えば、α−ヘリックス構造またはβ−シート構造；標的部位における分子の電荷または疎水性；または側鎖の容積。一般的に、ポリペプチドの性質に最大の変化を生じることが予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルもしくはスレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニルの代わりに（またはそれらによって）置換される；（ｂ）システインもしくはプロリンが任意の他の残基の代わりに（またはそれらによって）置換される；（ｃ）正荷電側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、もしくはヒスチジルが、負荷電残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルの代わりに（またはそれらによって）置換される；または（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有しないもの、例えば、グリシンの代わりに（またはそれらによって）置換されることである。
【００９６】
変異体は、典型的には、天然の類似体と同じ質的生物活性を示し、同じ免疫応答を誘発するが、変異体はまた、必要に応じて、抗原結合タンパク質の特性を改変するように選択される。または、変異体は、抗原結合タンパク質の生物活性が変化しているように設計されてもよい。例えば、本明細書で論じられているように、グリコシル化部位が変化してもよい、または除去されてもよい。
【００９７】
４．ＶＨおよびＶＬ変異体
上記で概要を示しているように、いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、もしくは１７の重鎖可変領域および／または配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、もしくは３４の軽鎖可変領域をそれぞれ、または上記で定義されているようなその断片を含む、またはそれらからなる抗原結合タンパク質を提供する。したがって、それらの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１〜３４に示された少なくとも１つのＣＤＲまたはその変異体を含むだけでなく、示されたフレームワーク配列の少なくとも部分もまた含む。さらに、本発明は、そのような重鎖可変配列または軽鎖可変配列の変異体を含む。
【００９８】
「変異体ＶＨ」または「変異体重鎖可変領域」、および「変異体ＶＬ」または「変異体軽鎖可変領域」は、一般的に、本明細書に示されたものと少なくとも８０％のアミノ酸相同性、類似性、または同一性を共有し、より典型的には、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、およびほとんど１００％の好ましく増加した相同性または同一性を有する。個々の変異体ＶＨおよびＶＬをコードするヌクレオチド配列と本明細書に示された核酸配列との間の核酸配列相同性、類似性、または同一性は、本明細書に示されたものと少なくとも６０％であり、より典型的には、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、およびほとんど１００％の好ましく増加した相同性または同一性を有する。さらに、「変異体ＶＨ」または「変異体重鎖可変領域」、および「変異体ＶＬ」または「変異体軽鎖可変領域」は、典型的には、限定されるわけではないが、親ＣＤＲの特異性および／または活性の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む生物活性を共有する。例えば、変異体は、典型的には、下記で概要が示された、同じＩＬ−１８受容体エピトープに結合し、ＩＬ−１８受容体シグナル伝達を同じように阻害する。
【００９９】
変異体を作製する方法、ならびに配列相同性、類似性、および同一性を決定する方法は、前記で概要が示されており、セクションＶ．Ｂ．１を参照されたい。
【０１００】
いくつかの実施形態において、定常領域変異体もまた含めてもよい。好ましい定常領域変異体には、変異を含む抗体の生物学的機能を変化させるものが挙げられる。例えば、抗体は、補体を活性化する、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導する抗体の能力を変化させる変異を含んでもよい。そのような変異体には、抗体のグリコシル化の変化を結果として生じるものが挙げられ得る。
【０１０１】
Ｃ．ＩＬ−１８受容体およびＩＬ−１８受容体エピトープ
「ＩＬ−１８受容体」または「ＩＬ−１８Ｒ」とは、本明細書では、限定されるわけではないが、ＩＬ−１８を含むリガンドに結合し、結果として、細胞内のシグナル伝達経路を開始する細胞表面受容体を意味する。ＩＬ−１８受容体複合体は、「α−ＩＬ−１８受容体」（α−ＩＬ−１８Ｒ）または「ＩＬ−１８Ｒα鎖」と名付けられたＩＬ−１８結合鎖、およびβ−ＩＬ−１８受容体「β−ＩＬ−１８受容体」（「β−ＩＬ−１８Ｒ」）または「ＩＬ−１８Ｒβ鎖」と名付けられたシグナル伝達鎖で構成される。本明細書に用いられる場合、用語「ＩＬ−１８受容体」は、α−ＩＬ−１８受容体およびβ−ＩＬ−１８受容体の両方をまとめて示している。
【０１０２】
本明細書に開示された抗原結合タンパク質は、ヒトアミノ酸配列が配列番号６９に示されている（その核酸配列は配列番号７０に示されている）ＩＬ−１８Ｒα鎖、またはヒトアミノ酸配列が配列番号７１に示されている（その核酸配列は配列番号７２に示されている）ＩＬ−１８Ｒβ鎖に結合する。特定の実施形態において、ＩＬ−１８受容体はヒトであるが、場合によっては、他の種を用いてもよい。さらに、下記のように、ＩＬ−１８受容体タンパク質にはまた、断片を含めてもよい。
【０１０３】
下記のように、抗原結合タンパク質の特定のエピトープへの結合は特異的である。
【０１０４】
「エピトープ」、「抗原決定基」、および文法的相当語句とは、本明細書では、抗原結合タンパク質によって特異的に結合され得る、抗原、例えば、ＩＬ−１８受容体の領域を意味する。当業者に認識されているように、エピトープは直鎖状または立体構造であり得る。「直鎖状エピトープ」は、直鎖状様式で連結した、少なくとも約５個で、最高で約２０個までのアミノ酸の配列（それらのアミノ酸が、それらだけで、またはより大きな配列の部分として、本発明の抗原結合タンパク質に結合する）を含むエピトープを示す。「立体構造エピトープ」は、３次元、２次および／または３次構造が抗体結合の実質的な面であり得るエピトープを示す。一律ではないが、一般的に、立体構造エピトープを含むアミノ酸は、タンパク質の１次構造の直鎖状配列を含まない。したがって、立体構造エピトープは、非相同性直鎖状アミノ酸配列を有するタンパク質により共有され得る。理論にとらわれるつもりはないが、抗体によって認識される３次構造は２つ以上のアミノ酸配列間で共有され得るため、立体構造エピトープは共有され得る。１つの実施形態において、適切なＩＬ−１８受容体エピトープは、本発明の抗原結合タンパク質によって認識されるいずれかを含む。
【０１０５】
本発明は、ヒトＩＬ−１８Ｒαの第３のＩｇドメインにおける立体構造エピトープ、特に、配列番号６９のアミノ酸残基２５０〜２５３位（すなわち、残基ＭＦＧＥ）およびアミノ酸残基２６７〜２７１位（すなわち、残基ＭＲＩＭＴ）によって構成された、アミノ酸残基２４３〜２７１位によって定義される領域を認識かつ結合する抗原結合タンパク質を提供する。このエピトープのアミノ酸構造は、図５に示されている。このエピトープに結合する抗原結合タンパク質は、特に、ＩＬ−１８のＩＬ−１８Ｒとの相互作用を遮断するのに効果的である。抗原結合タンパク質の結合エピトープを決定する方法は、当技術分野においてよく知られており、１つのそのような方法は、本明細書の実施例４に記載されている。
【０１０６】
実施例４は、特定のヒトＩＬ−１８Ｒ抗原結合タンパク質が、アミノ酸２４３〜２７１位、例えば、２５０〜２５３位または２６７〜２７１位によって定義されるエピトープ内の残基が対応するマウス残基へ変化した場合、ヒトＩＬ−１８Ｒαを結合する能力が有意に低下していることを実証している。したがって、ヒトＩＬ−１８Ｒを結合するが、ヒトＩＬ−１８Ｒα鎖の残基２５０〜２５３位が対応するマウスアミノ酸で置換される場合、そのような結合が低下する、抗原結合タンパク質が本明細書で提供されている。ヒトＩＬ−１８Ｒを結合するが、ヒトＩＬ−１８Ｒα鎖の残基２６７〜２７１位が対応するマウスアミノ酸で置換される場合、そのような結合が低下する、抗原結合タンパク質もまた本明細書で提供されている。
【０１０７】
Ｄ．抗原結合タンパク質の共有結合的修飾
抗原結合タンパク質の共有結合的修飾は、本発明の範囲内に含まれ、常にというわけではないが、一般的に、翻訳後に行われる。例えば、抗原結合タンパク質の共有結合的修飾のいくつかの型は、選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応する能力がある有機誘導体化剤と抗原結合タンパク質の特定のアミノ酸残基を反応させることによって、分子へ導入される。
【０１０８】
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ第二水銀安息香酸塩、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
【０１０９】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でジエチルピロカルボネートとの反応によって誘導体化されるが、なぜならば、この作用物質は、相対的に、ヒスチジル側鎖に特異的であるからである。ｐ−臭化ブロモフェナシルもまた有用である；反応は、好ましくは、ｐＨ６．０で、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。
【０１１０】
リシニル残基およびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの作用物質での誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果を生じる。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル；ピリドキサルホスフェート；ピリドキサル；水素化クロロホウ素；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒性反応が挙げられる。
【０１１１】
アルギニル残基は、１つまたはいくつかの通常の試薬、とりわけ、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのために、反応がアルカリ性条件下で行われることを必要とする。さらに、これらの試薬は、リシンの基、およびアルギニンε−アミノ基と反応することができる。
【０１１２】
チロシル残基の特定の修飾を行ってもよく、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基へスペクトル標識を導入することは特に興味深い。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンが、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ、形成するために用いられる。チロシル残基は、ラジオイムノアッセイに用いる標識タンパク質を調製するために１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨウ素化され、上記のクロラミンＴ方法が適している。
【０１１３】
カルボキシル側基（アスパラチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’、式中、ＲおよびＲ’は、任意で、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどの異なるアルキル基でもよい）との反応によって選択的修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基へ変換される。
【０１１４】
二官能性作用物質での誘導体化は、様々な方法に用いる水不溶性支持体マトリックスまたは表面へ抗原結合タンパク質を架橋するために有用である。一般に用いられる架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成する能力がある光活性化可能中間体を生じる。または、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性水不溶性マトリックス、ならびに米国特許第３，９６９，２８７号；第３，６９１，０１６号；第４，１９５，１２８号；第４，２４７，６４２号；第４，２２９，５３７号；および第４，３３０，４４０号に記載された反応性基質が、タンパク質固定化に用いられる。
【０１１５】
グルタミルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基へ、それぞれ、脱アミドされることが多い。または、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミドされる。これらの残基のいずれの型も本発明の範囲内にある。
【０１１６】
他の修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、７９〜８６頁、［１９８３年］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１１７】
１．グリコシル化
本発明の範囲内に含まれる抗原結合タンパク質の共有結合的修飾の別の型は、タンパク質のグリコシル化パターンを変化させることを含む。当技術分野において知られているように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、下記で論じられた、特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または非存在）、またはタンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物体の両方に依存し得る。特定の発現系は下記で論じられている。
【０１１８】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ−結合型かまたはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖への糖部分の結合を示す。トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在が潜在的グリコシル化部位を生じる。Ｏ−結合型グリコシル化とは、糖、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはスレオニンへの結合を示すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンもまた用いてもよい。
【０１１９】
グリコシル化部位の抗原結合タンパク質への付加は、便利には、アミノ酸配列が上記のトリペプチド配列の１つまたは複数を含むようにそれを変化させることによって達成される（Ｎ−結合型グリコシル化部位について）。変化はまた、出発配列への１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の付加、またはその残基による置換によってもたらされてもよい（Ｏ−結合型グリコシル化部位について）。簡単にするために、抗原結合タンパク質アミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化を通して変化しており、特に、所望のアミノ酸へ翻訳するコドンが生じるように、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡをあらかじめ選択された塩基で突然変異させることによって、変化している。
【０１２０】
抗原結合タンパク質上の糖部分の数を増加させる別の手段は、タンパク質へのグリコシドの化学的または酵素的結合による。これらの手順は、Ｎ−結合型およびＯ−結合型グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としない点で有利である。用いられる結合様式に依存して、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合することができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０、ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、１９８１年、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９〜３０６頁に記載されている。
【０１２１】
出発の抗原結合タンパク質上に存在する糖部分の除去は、化学的または酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシルは、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価化合物へのタンパク質の曝露を必要とする。この処理は、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く、大部分または全部の糖の切断を生じるが、ポリペプチドを無傷のままにしておく。化学的脱グリコシルは、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、１９８７年、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５９巻、５２頁、およびＥｄｇｅら、１９８１年、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８巻、１３１頁に記載されている。ポリペプチド上の糖部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、１９８７年、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８巻、３５０頁により記載されているように、様々なエンド−グリコシダーゼおよびエキソ−グリコシダーゼの使用によって達成することができる。潜在的グリコシル化部位でのグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎら、１９８２年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２５７巻、３１０５頁によって記載されているように、化合物ツニカマイシンの使用によって防止することができる。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を遮断する。
【０１２２】
２．ＰＥＧ化
抗原結合タンパク質の共有結合的修飾の別の型は、限定されるわけではないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンなどの様々なポリオールを含む様々な非タンパク質性ポリマーに抗原結合タンパク質を、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号、または第４，１７９，３３７号に示された方法で、連結することを含む。さらに、当技術分野において知られているように、ＰＥＧなどのポリマーの付加を容易にするために抗原結合タンパク質内の様々な位置にアミノ酸置換を行ってもよい。
【０１２３】
３．標識およびエフェクター群
いくつかの実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質の共有結合的修飾は、１つまたは複数の標識の付加を含む。
【０１２４】
用語「標識群」とは、任意の検出可能な標識を意味する。適切な標識群の例としては、以下が挙げられるが、それらに限定されるわけではない：放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光群（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素群（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光群、ビオチニル群、または二次レポーターによって認識されるあらかじめ決定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体についての結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態において、標識群は、可能性のある立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質に結合している。タンパク質を標識するための様々な方法は当技術分野において知られており、本発明を行うのに用いることができる。
【０１２５】
用語「エフェクター群」とは、細胞傷害性物質として働く、抗原結合タンパク質に結合した任意の群を意味する。適切なエフェクター群の例は、放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）である。他の適切な群には、毒素、治療薬群、または化学療法薬群が挙げられる。適切な群の例には、カリチアマイシン、アウリスタチン、ゲラダナマイシン、およびマイタンシンが挙げられる。いくつかの実施形態において、エフェクター群は、可能性のある立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質に結合している。
【０１２６】
一般的に、標識は、それらが検出されることになっているアッセイに依存して、以下の様々なクラスに分類される：ａ）放射性同位元素または重同位元素であり得る、同位元素標識；ｂ）磁気標識（例えば、磁気粒子）；ｃ）酸化還元活性部分；ｄ）光学色素；酵素群（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；ｅ）ビオチン化群；およびｆ）二次レポーターによって認識されるあらかじめ決定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体についての結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。いくつかの実施形態において、標識群は、可能性のある立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質に結合している。タンパク質を標識するための様々な方法は当技術分野において知られており、本発明を行うのに用いることができる。
【０１２７】
特定の標識としては、光学色素が挙げられ、それらには、限定されるわけではないが、発色団、リン光体、およびフルオロフォアが含まれ、最後のものは、多くの場合、特異的である。フルオロフォアは、「小分子」蛍光体またはタンパク質性蛍光体のいずれでもあり得る。
【０１２８】
「蛍光標識」とは、その固有の蛍光性質によって検出することができる任意の分子を意味する。適切な蛍光標識としては、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、Ｍａｌａｃｉｔｅグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ  ＢｌｕｅＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５、Ｏｒｅｇｏｎグリーン、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  ＹｅｌｌｏｗおよびＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン、およびテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。フルオロフォアを含む適切な光学色素は、参照により本明細書に明確に組み入れられた、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．  ＨａｕｇｌａｎｄによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されている。
【０１２９】
適切なタンパク質性蛍光標識としてもまた、Ｒｅｎｉｌｌａ種、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ種、またはＡｅｑｕｏｒｅａ種のＧＦＰを含む緑色蛍光タンパク質（Ｃｈａｌｆｉｅら、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３巻、８０２〜８０５頁）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、１８０１  ｄｅ  Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ  Ｂｌｖｄ．  Ｗｅｓｔ、８ｔｈ  Ｆｌｏｏｒ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ  Ｈ３Ｈ  １Ｊ９；Ｓｔａｕｂｅｒ、１９９８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２４巻、４６２〜４７１頁；Ｈｅｉｍら、１９９６年、Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．、６巻、１７８〜１８２頁）、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉら、１９９３年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５０巻、５４０８〜５４１７頁）、β−ガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５巻、２６０３〜２６０７頁）、およびウミシイタケ（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許第５２９２６５８号、第５４１８１５５号、第５６８３８８８号、第５７４１６６８号、第５７７０７９号、第５８０４３８７号、第５８７４３０４号、第５８７６９９５号、第５９２５５５８号）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。上記で引用された参考文献の全部は、参照により本明細書に明確に組み入れられている。
【０１３０】
Ｅ．ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
特定の態様において、本発明は、ＩｇＧ、配列番号１〜３４、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９〜１９０の可変領域およびＣＤＲをコードする核酸分子を提供する。１つの実施形態において、核酸は、配列番号３５〜６８、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、および１９１〜２９２のいずれかのヌクレオチド配列を有する。
【０１３１】
本明細書に記載されているように、可変領域核酸またはＣＤＲ核酸は、それぞれ、可変領域タンパク質またはＣＤＲタンパク質をコードする。「核酸」とは、本明細書では、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む、任意の核酸を意味する。本発明の核酸は、典型的には、ポリ核酸、すなわち、３’，５’ホスホジエステル結合によって共有結合性に連結している個々のヌクレオチドのポリマーである。
【０１３２】
核酸は、その使用に依存して、二本鎖であっても、一本鎖であっても、または二本鎖もしくは一本鎖配列の両方の部分を含んでもよい。当業者に認識されているように、１つの一本鎖（「Ｗａｔｓｏｎ」）の記載はまた、他方の鎖（「Ｃｒｉｃｋ」）の配列も定義する；したがって、配列番号３５〜６８に示された核酸配列はまた、これらの配列の相補体も含む。本明細書における用語「組換え核酸」とは、天然では通常見出されない形での、本来には、インビトロで形成された、一般的には、エンドヌクレアーゼによる核酸の操作による、核酸を意味する。したがって、直鎖状型の単離された抗原結合タンパク質核酸、または通常、連結していないＤＮＡ分子をライゲーションすることによってインビトロで形成された発現ベクターは、両方とも、本発明の目的にとって、組換え体であるとみなされる。いったん、組換え核酸が作製され、宿主細胞または生物体へ再導入されたならば、それは、非組換え的に、すなわち、インビトロ操作というよりむしろ、宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて、複製されるだろうことは理解されている；しかしながら、いったん組換えで作製されるが、その後、非組換え的に複製する、そのような核酸は、本発明の目的にとって、なお組換え体とみなされる。
【０１３３】
当業者に認識されているように、遺伝暗号の縮重のために、極めて多数の核酸が作製される可能性があり、それらの全部が、本発明のＣＤＲ（ならびに、抗原結合タンパク質の重鎖および軽鎖または他の構成要素）をコードする。したがって、配列番号１〜３４などの特定のアミノ酸配列が同定されたならば、当業者は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で１つまたは複数のコドンの配列をただ改変するだけで、異なる核酸をいくらでも作製することができる。
【０１３４】
Ｆ．抗原結合タンパク質を作製する方法
本発明はまた、上記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、転写または発現カセットの形をとる、発現系および発現構築物を提供する。さらに、本発明は、そのような発現系または発現構築物を含む宿主細胞を提供する。
【０１３５】
典型的には、宿主細胞のいずれかで用いられる発現ベクターは、プラスミド維持のための配列、および外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。特定の実施形態においての、「フランキング配列」とまとめて呼ばれるそのような配列は、典型的には、以下のヌクレオチド配列の１つまたは複数を含む：プロモーター、１つまたは複数のエンハンサー配列、複製開始点、転写終結配列、供与および受容スプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現することになっているポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれは、下記で論じられている。
【０１３６】
任意で、ベクターは、「タグ」をコードする配列、すなわち、ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質コード配列の５’末端または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含んでもよい；そのオリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）、または市販の抗体が存在するＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）、もしくはｍｙｃなどの別の「タグ」をコードする。このタグは、典型的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質のアフィニティ精製または検出のための手段として働くことができる。アフィニティ精製は、例えば、アフィニティマトリックスとしてタグに対する抗体を用いるカラムクロマトグラフィーによって、達成することができる。任意で、タグは、その後、切断のための特定のペプチダーゼを用いることなどの様々な手段によって精製されたＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質から除去することができる。
【０１３７】
フランキング配列は、同種性（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または系統由来）、異種性（すなわち、宿主細胞の種または系統以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち、１つより多い源由来のフランキング配列の組合せ）、合成、または天然でもよい。したがって、フランキング配列の源は、フランキング配列が宿主細胞機構において機能し、かつ宿主細胞機構によって活性化することができるという条件で、任意の原核生物もしくは真核生物、任意の脊椎動物もしくは無脊椎動物、または任意の植物であってよい。
【０１３８】
本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は、当技術分野においてよく知られたいくつかの方法のいずれかによって得ることができる。典型的には、本明細書で有用なフランキング配列は、マッピングにより、および／または制限エンドヌクレアーゼ消化により、以前に同定されていると考えられ、したがって、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織源から単離することができる。場合によっては、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列が知られていることがある。この場合、フランキング配列は、核酸合成またはクローニングについて本明細書に記載された方法を用いて合成することができる。
【０１３９】
知られているのがフランキング配列の全部であろうと一部だけであろうと、それは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用い、ならびに／または同じもしくは別の種由来のオリゴヌクレオチドおよび／もしくはフランキング配列断片などの適切なプローブでゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、得ることができる。フランキング配列が知られていない場合、フランキング配列を含むＤＮＡの断片は、例えば、コード配列または別の遺伝子（複数可）でも含む可能性があるよりＤＮＡの大きな断片から単離することができる。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化により適切なＤＮＡ断片を生じ、続いて、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｌｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を用いる単離、または当業者に知られた他の方法により達成することができる。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者にとって容易に明らかであろう。
【０１４０】
複製開始点は、典型的には、商業的に購入される原核生物発現ベクターの一部であり、開始点は、宿主細胞におけるベクターの増幅を助ける。最適のベクターが複製開始点部位を含まない場合には、既知の配列に基づいて化学合成し、そのベクターへライゲーションしてもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）由来の複製開始点は、たいていのグラム陰性細菌に適しており、様々なウイルス開始点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）は、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製開始点構成要素は、哺乳類発現ベクターに必要とされない（例えば、ＳＶ４０開始点は、それがまたウイルス初期プロモーターを含むという理由だけで、しばしば用いられる）。
【０１４１】
転写終結配列は、典型的には、ポリペプチドコード領域の末端の３’側に位置し、転写を終結する働きをする。通常、原核細胞における転写終結配列は、ポリＴ配列が後に続くＧ−Ｃリッチ断片である。配列は、ライブラリーから容易にクローン化される、またはベクターの部分として商業的に購入されるとはいえ、それはまた、本明細書に記載された方法などの核酸合成のための方法を用いて容易に合成することができる。
【０１４２】
選択マーカー遺伝子は、選択培地で増殖する宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞について、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、もしくはカナマイシンに対する抵抗性を与えるタンパク質；（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補うタンパク質；または（ｃ）天然培地もしくは合成培地から利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。特定の選択マーカーは、カナマイシン抵抗性遺伝子、アンピシリン抵抗性遺伝子、およびテトラサイクリン抵抗性遺伝子である。有利には、ネオマイシン抵抗性遺伝子はまた、原核生物および真核生物の両方の宿主細胞における選択に用いることができる。
【０１４３】
他の選択遺伝子は、発現することになっている遺伝子を増幅するために用いることができる。増幅は、増殖または細胞生存にとって重要なタンパク質の産生に必要とされる遺伝子が、代々の組換え細胞の染色体内に直列に反復している過程である。哺乳類細胞に適した選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、およびプロモーターをもたないチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳類細胞形質転換体は、その形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子のおかげで生存するように特異的に適応する淘汰圧下に置かれる。培地中の選択用物質の濃度が連続的に増加する条件下で形質転換細胞を培養することにより淘汰圧が課せられ、それにより、選択遺伝子、およびＩＬ−１８受容体ポリペプチドに結合する抗原結合タンパク質抗体などのもう１つの遺伝子をコードするＤＮＡの両方の増幅がもたらされる。結果として、増加した量のＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質などのポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１４４】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン・ダルガノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。そのエレメントは、典型的には、プロモーターの３’側で、かつ発現されることになっているポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。
【０１４５】
真核生物宿主細胞発現系においてグリコシル化が望まれる場合などの場合によっては、グリコシル化または収率を向上させるために様々なプレ配列またはプロ配列を操作してもよい。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変化させてもよいし、またはグリコシル化にも影響する可能性があるプロ配列を付加してもよい。最終タンパク質産物は、発現にありがちな、完全に除去されなかった可能性がある１個または複数の付加的なアミノ酸を−１位（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）に有してもよい。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位に見出される１個または２個のアミノ酸残基を有してもよい。または、いくつかの酵素切断部位の使用によって、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域で切断する場合には、所望のポリペプチドのわずかに切り詰められた型が生じることもある。
【０１４６】
本発明の発現およびクローニングベクターは、典型的には、宿主生物に認識され、かつＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質をコードする分子に作動可能に連結されているプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を調節する構造遺伝子（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ内）の開始コドンの上流（すなわち、５’側）に位置する非転写配列である。プロモーターは、通常、以下の２つのクラスの１つに分類される：誘導性プロモーターおよび構成的プロモーター。誘導性プロモーターは、栄養素の存在もしくは非存在、または温度の変化などの培養条件の何らかの変化に応答して、それらの調節下のＤＮＡからの転写レベルの増加を開始する。他方、構成的プロモーターは、それらが作動可能に連結している遺伝子を一律に転写する、すなわち、遺伝子発現に対してほとんど調節せずに、転写する。様々な宿主細胞候補に認識される多数のプロモーターはよく知られている。適切なプロモーターは、供給源ＤＮＡから制限酵素消化によってプロモーターを取り出し、所望のプロモーター配列をベクターへ挿入することにより、本発明のＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質を含む重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。
【０１４７】
酵母宿主で用いる適切なプロモーターもまた当技術分野においてよく知られている。酵母エンハンサーは、有利には、酵母プロモーターと共に用いられる。哺乳類宿主細胞で用いる適切なプロモーターはよく知られており、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。他の適切な哺乳類プロモーターは、異種性哺乳類プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが挙げられる。
【０１４８】
対象となり得る追加のプロモーターとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されるわけではない：ＳＶ４０初期プロモーター（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、１９８１年、Ｎａｔｕｒｅ、２９０巻、３０４〜３１０頁）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｒｎｓｅｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１巻、６５９〜６６３頁）；ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０年、Ｃｅｌｌ、２２巻、７８７〜７９７頁）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８巻、１４４４〜１４４５頁）；メタロチオニン遺伝子由来のプロモーターおよび制御配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２年、Ｎａｔｕｒｅ、２９６巻、３９〜４２頁）；ならびにβ−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、７５巻、３７２７〜３７３１頁）またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０巻、２１〜２５頁）などの原核生物プロモーター。また、対象となるのは、以下の動物転写調節領域であり、それらは、組織特異性を示し、トランスジェニック動物に利用されている：膵腺房細胞で活性があるエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４年、Ｃｅｌｌ、３８巻、６３９〜６４６頁；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．、５０巻、３９９〜４０９頁；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、７巻、４２５〜５１５頁）；膵β細胞で活性があるインスリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ、３１５頁、１１５〜１２２頁）；リンパ球系細胞で活性がある免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４年、Ｃｅｌｌ、３８巻、６４７〜６５８頁；Ａｄａｍｅｓら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ、３１８巻、５３３〜５３８頁；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、７巻、１４３６〜１４４４頁）；精巣細胞、乳腺細胞、リンパ球系細胞、およびマスト細胞で活性があるマウス乳癌ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６年、Ｃｅｌｌ、４５巻、４８５〜４９５頁）；肝臓で活性があるアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７年、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．、１巻、２６８〜２７６頁）；肝臓で活性があるα−フェトプロテイン遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、５巻、１６３９〜１６４８頁；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３巻、５３〜５８頁）；肝臓で活性があるα１−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７年、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．、１巻、１６１〜１７１頁）；骨髄系細胞で活性があるβ−グロビン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ、３１５巻、３３８〜３４０頁；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６年、Ｃｅｌｌ、４６巻、８９〜９４頁）；脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性があるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７年、Ｃｅｌｌ、４８巻、７０３〜７１２頁）；骨格筋で活性があるミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Ｓａｎｉ、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻、２８３〜２８６頁）；ならびに、視床下部で活性がある生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３４巻、１３７２〜１３７８頁）。
【０１４９】
高等真核生物により本発明のＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質を含む軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡの転写を増加させるために、エンハンサー配列をベクターへ挿入してもよい。エンハンサーは、転写を増加させるようにプロモーターに作用するＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常、長さが約１０〜３００ｂｐである。エンハンサーは、比較的、配向および位置に非依存的であり、転写単位の５’側および３’側の両方の位置で見出されている。哺乳類遺伝子から利用できるいくつかのエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）。しかしながら、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーが用いられる。当技術分野において知られた、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な促進エレメントである。エンハンサーは、コード配列の５’側かまたは３’側のどちらにでもベクター内で位置することができるが、典型的には、それは、プロモーターから５’側の部位に位置する。適当な天然または異種性シグナル配列（リーダー配列またはシグナル配列）をコードする配列を、抗体の細胞外分泌を促進するために、発現ベクターに組み入れることができる。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、抗体が産生されることになっている宿主細胞の型に依存し、異種性シグナル配列が、天然シグナル配列に取って代わることができる。哺乳類宿主細胞で機能するシグナルペプチドの例としては、以下が挙げられる：米国特許第４，９６５，１９５号に記載されたインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら、１９８４年、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻、７６８頁に記載されたインターロイキン−２受容体のシグナル配列；欧州特許第０３６７  ５６６号に記載されたインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されたＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；欧州特許第０  ４６０  ８４６号に記載されたＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド。
【０１５０】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築してもよい。そのようなベクターは、所望のフランキング配列の全部を含んでいてもよいし、全部でなくてもよい。本明細書に記載されたフランキング配列の１つまたは複数がベクター内にまだ存在していない場合、それらを個々に取得し、ベクターへライゲーションしてもよい。各フランキング配列を取得するために用いられる方法は、当業者によく知られている。
【０１５１】
ベクターを構築し、かつＩＬ−１８受容体抗原結合配列を含む軽鎖、重鎖、または軽鎖および重鎖をコードする核酸分子がベクターの適切な部位へ挿入した後、完成したベクターを、増幅および／またはポリペプチド発現に適した宿主細胞へ挿入することができる。ＩＬ−１８抗原結合タンパク質についての発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、または他の知られた技術を含め、よく知られた方法によって達成することができる。選択される方法は、ある程度、用いられることになっている宿主細胞の型に相関する。これらの方法および他の適切な方法は、当業者によく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、前記に示されている。
【０１５２】
適当な条件下で培養される場合、宿主細胞は、ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質を合成し、それは、その後、培地から（宿主細胞がそれを培地へ分泌する場合）、またはそれを産生する宿主細胞から直接（それが分泌されない場合）、収集することができる。適当な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいまたは必要であるポリペプチド修飾（グリコシル化またはリン酸化など）、および生物活性のある分子への折り畳みの容易さなどの様々な因子に依存する。
【０１５３】
発現のために宿主として利用できる哺乳類株化細胞は、当技術分野においてよく知られており、それらには、限定されるわけではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、およびいくつかの他の株化細胞を含む、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）から入手できる不死化株化細胞が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。特定の実施形態において、株化細胞は、どの株化細胞が高い発現レベルを有し、かつＩＬ−１８受容体結合性を有する抗原結合タンパク質を恒常的に産生するのかを決定することによって選択することができる。別の実施形態において、自分自身の抗体を産生しないが、異種性抗体を産生し、分泌する能力をもつＢ細胞系列由来の株化細胞を選択することができる。
【０１５４】
Ｇ．診断および治療のためのＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質の使用
本発明の抗原結合タンパク質は、生体試料においてＩＬ−１８受容体を検出するのに、およびＩＬ−１８受容体タンパク質を産生する細胞または組織の同定のために、有用である。ＩＬ−１８受容体に特異的に結合する本発明の抗原結合タンパク質は、必要としている患者におけるＩＬ−１８受容体媒介性疾患の処置に用いることができる。一例としては、本発明のＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質は、診断アッセイ、例えば、組織または細胞に発現したＩＬ−１８受容体を検出および／または定量化するための結合アッセイに用いることができる。さらに、本発明のＩＬ−１８抗原結合タンパク質は、ＩＬ−１８受容体がそのリガンド、例えば、ＩＬ−１８との複合体を形成するのを阻害し、それにより、細胞または組織におけるＩＬ−１８受容体の生物活性を調節するために用いることができる。このように、ＩＬ−１８受容体に結合する抗原結合タンパク質は、他の結合化合物との相互作用を調節および／または遮断することができ、したがって、ＩＬ−１８受容体媒介性疾患を改善することに治療として用いることができる。特定の実施形態において、ＩＬ−１８抗原結合タンパク質は、ＩＬ−１８のその受容体への結合を遮断することができ、その結果として、ＩＬ−１８受容体誘導性シグナル伝達カスケードの崩壊を生じることができる。
【０１５５】
１．適応症
疾患発生におけるＩＬ−１８のレベルの増加および／またはＩＬ−１８媒介性シグナルの関与は、様々な状態および疾患で実証されている。したがって、本発明の抗原結合タンパク質は、免疫応答を制御または抑制するように働き、過剰免疫応答により引き起こされる様々な疾患の処置および予防に有効である（ＷＯ２００４・００２５１９；ＷＯ２００５／０６３２９０；ＷＯ２００４／０３４９８８；Ｍａｌｌａｔら、２００２年、Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．、９１巻、４４１〜４４８参照）。したがって、本発明のＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質は、ＩＬ−１８に関連した疾患または状態の診断、予防、または処置に用いることができる。
【０１５６】
ＩＬ−１８に関連した疾患または状態とは、患者における発病が、ＩＬ−１８のＩＬ−１８受容体との相互作用によって引き起こされる、または防止される任意の疾患または状態を意味する。疾患または状態の重症度もまた、ＩＬ−１８のＩＬ−１８受容体との相互作用によって増加または減少し得る。例えば、ＩＬ−１８は、自己免疫疾患（ＷＯ２００４／００２５１９；ＷＯ２００５／０６３２９０；ＷＯ２００４／０３４９８８；Ｍａｌｌａｔら、２００２年、Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．、９１巻、４４１〜４４８頁）、肝疾患（Ｆｉｎｉｔｔｏら、２００４年、Ｌｉｖｅｒ、５３巻、３９２〜４００頁；Ｔｓｕｔｓｕｉら、２０００年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１７４巻、１９２〜２０９頁；Ｌｕｄｗｉｃｚｅｋら、２００２年、Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２２巻、３３１〜３３７頁）、膵疾患、および心血管系疾患（Ｇｅｒｄｅｓら、２００２年、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９５巻、２４５〜２５７頁；ＷＯ０３／０８０１０４；ＷＯ０２／０６０４７９；ＷＯ０１／８５２０１；Ｒａｅｂｕｒｎら、２００２年、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２８３巻、Ｈ６５０〜Ｈ６５７頁）に関連している。
【０１５７】
ＩＬ−１８に関連している自己免疫疾患の例としては、乾癬、関節リウマチなどの炎症性関節炎（ＷＯ２００５／０６３２９０；Ｃａｎｎｅｔｔｉら、２００３年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７１巻、１００９〜１０１５頁；Ｃｈａｒｌｅｓら、１９９９年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６３巻、１５２１〜１５２８頁；Ｃｕｎｎａｎｅら、２０００年、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｊ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、２７巻、５８〜６３頁；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ、１９９８年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１巻、３４００〜３４０７頁）、狼瘡（ＷＯ２００５／０６３２９０）、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、クローン病（Ｎｉｅｄｅｒａｕ、１９９７年、Ｏｎｌｉｎｅ  ＮＬＭ）、炎症性腸疾患（ＷＯ２００４／００２５１９）、多発性硬化症、自己免疫性肝炎（Ｔｓｕｔｓｕｉら、２０００年、前記）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アトピー性皮膚炎（Ｋｏｎｉｓｈｉら、２００２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、９９巻、１１３４０〜１１３４５頁）、重症筋無力症、およびサルコイドーシスが挙げられる。
【０１５８】
関節リウマチにおいて、成熟ＩＬ−１８のレベルの上昇が患者血清および滑液で実証されている。いくつかの研究において、ＩＬ−１８レベルは、疾患活動性と相関し、疾患緩和処置に応答することが示された。ＩＬ−１８の極めて高い血清レベルが、全身性若年性特発性関節炎および密接に関係した成人発症スチル病において、一貫して測定されている。ＷＯ２００５／０６３２９０；Ｃａｎｎｅｔｔｉら、２００３年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７１巻、１００９〜１０１５頁；Ｃｈａｒｌｅｓら、１９９９年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６３巻、１５２１〜１５２８頁；Ｃｕｎｎａｎｅら、２０００年、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｊ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、２７巻、５８〜６３頁；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ、１９９８年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１巻、３４００〜３４０７頁。
【０１５９】
ＩＬ−１８に関連している他の型の関節炎には、例えば、強直性脊椎炎、背痛、手根管沈着症候群、エーラースダンロス症候群、痛風、若年性関節炎、エリテマトーデス、筋炎、骨形成不全症、骨粗鬆症、多発性関節炎、多発性筋炎、乾癬性関節炎、ライター症候群、強皮症、腸疾患を伴う関節炎、ベーチェット病、子どもの関節炎、変性関節疾患、線維筋痛症、感染性関節炎、ライム病、マルファン症候群、変形性関節症、骨壊死、骨パジェット病、リウマチ性多発筋痛症、偽痛風、反射性交感神経性ジストロフィー、関節リウマチ、リウマチ、シェーグレン症候群、家族性大腸腺腫症などが挙げられる。Ｄａｉら、２００４年、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．、５０巻、４３２〜４４３頁；Ｋａｗａｓｈｉｍａら、２００４年、Ｏｎｌｉｎｅ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  Ｔｈｅｒ．、６巻、Ｒ３９〜Ｒ４５頁；Ｍｙｅｒｓら、２００４年、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、４３巻、２７２〜２７６頁；Ｗｅｉら、２００１年、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔｓ、５１７〜５２１頁。
【０１６０】
ＩＬ−１８レベルの上昇はまた、潰瘍性大腸炎または非炎症性腸状態を有する患者と比較した場合、クローン病を有する患者に見出されている。腸上皮細胞および固有層単核細胞の両方は、生体内原位置で、増加したＩＬ−１８産生の源として同定されている。クローン病病変は、ＩＬ−１８Ｒ発現細胞が浸潤していることが示されている。Ｎｉｅｄｅｒａｕ、１９９７年、Ｏｎｌｉｎｅ  ＮＬＭ。
【０１６１】
ＩＬ−１８はまた、潰瘍性大腸炎およびセリアック病に関連しているとされている。
【０１６２】
中枢神経系（ＣＮＳ）病変、脳脊髄液、および多発性硬化症を有する患者由来の血清は、ＩＬ−１８メッセージまたはタンパク質のレベルの増加を含むことが示されている。病変内において、ミクログリアおよびマクロファージが、ＩＬ−１８の源であると考えられている。非炎症性ＣＮＳ疾患を有する個体由来の対照組織生検において、ＩＬ−１８は検出され得ない。特に高いレベルのＩＬ−１８は、再発寛解型疾患を有する患者部分集合に見出されている；およびＩＬ−１８レベルは、寛解期と比較して再発中に増加することが見出されている。Ｈｕａｎｇら、２００４年、Ｍｕｌｔ．  Ｓｃｌｅｒ．、１０巻、４８２〜７頁；Ｋａｒｎｉら、２００２年、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、１２５巻、１３４〜４０頁；Ｌｏｓｙら、２００１年、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｓｃａｎｄ．、１０４巻、１７１〜３頁；Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉら、２００１年、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、５７巻、３４２〜４頁；Ｆａｓｓｂｅｎｄｅｒら、１９９９年、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、５３巻、１１０４〜６頁。
【０１６３】
乾癬を有する患者において、ＩＬ−１８の血清レベルは、皮膚病変の程度およびＰＡＳＩスコアと相関して増加していることが報告された。ＩＬ−１８  ｍＲＮＡおよびＩＬ−１８Ｒ  ｍＲＮＡの両方の過剰発現が、非病変対照または正常皮膚対照と比較して、病変皮膚において実証されている。確認された、乾癬皮膚におけるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの過剰発現は、ＩＬ−１８によって発揮される生物活性と一致している。Ａｒｉｃａｎら、２００５年、Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ．、２００５年、２７３〜９頁；Ｐｉｓｋｉｎら、２００４年、Ｅｘｐ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１３巻、７６４〜７２頁；Ｃｏｍｐａｎｊｅｎら、２００４年、Ｅｕｒ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．、１５巻、２１０〜６頁；Ｐｉｅｔｒｚａｋら、２００３年、Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍ．  Ｖｎｅｒｅｏｌ．、８３巻、２６２〜５頁。
【０１６４】
様々な他の自己免疫疾患は、罹患組織または血清のいずれかにおけるＩＬ−１８レベルの増加に関連している。これらには、全身性エリテマトーデス、アトピー性皮膚炎、筋無力症、Ｉ型糖尿病、およびサルコイドーシスが挙げられる。ＩＬ−１８はまた、喘息、アルツハイマー病、アレルギー性鼻炎、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、移植、およびＧｖＨＤに関係している可能性がある。
【０１６５】
ＩＬ−１８はまた、肝臓疾患または肝疾患、および肝臓損傷または傷害に関連した状態に結びつけられている。肝臓損傷または傷害は、多様な原因を有し得る。それは、例えば、ウイルスもしくは細菌感染、アルコール中毒、免疫学的障害、または癌による場合がある。肝臓傷害はまた、胆管の損傷、およびアルコール性肝炎、肝硬変、ウイルス性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、およびアルコール関連肝壊死炎症などの状態における肝臓の損傷を含む。Ｆｉｎｉｔｔｏら、２００４年、Ｌｉｖｅｒ、５３巻、３９２〜４００頁；Ｔｓｕｔｓｕｉら、２０００年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１７４巻、１９２〜２０９頁；Ｌｕｄｗｉｃｚｅｋら、２００２年、Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２２巻、３３１〜３３７頁。
【０１６６】
ＩＬ−１８に関連している肝疾患には、Ｃ型肝炎およびＢ型肝炎が挙げられる。ＩＬ−１８は、自己免疫性肝炎および感染性肝炎の両方の発病に結びつけられている。ＦａｓＬを含むアポトーシス促進性分子の上方制御による肝細胞死に寄与すると考えられている。Ｃ型肝炎におけるインターフェロン−αの有益な効果は、ＩＬ−１８レベルの低下を通して媒介される可能性があることが示唆されている。対照的に、ＩＬ−１８投与は、Ｂ型肝炎のトランスジェニックモデルにおいて有益な効果を生じ、ＮＫおよびＣＴＬ活性の増加を通してウイルス排除を向上させた。Ｆｉｎｉｔｔｏら、２００４年、Ｌｉｖｅｒ、５３巻、３９２〜４００頁；Ｔｓｕｔｓｕｉら、２０００年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１７４巻、１９２〜２０９頁；Ｌｕｄｗｉｃｚｅｋら、２００２年、Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２２巻、３３１〜３３７頁。
【０１６７】
Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルスは別にして、ウイルス関連肝炎を引き起こす少なくとも４つの他のウイルスがこれまでに発見されており、Ａ型、Ｄ型、Ｅ型、およびＧ型肝炎ウイルスと呼ばれている。
【０１６８】
ＩＬ−１８はまた、心血管系疾患に関連しており、それらには、じゅく状斑破裂、虚血後心不全、再灌流障害、アテローム性動脈硬化、慢性心不全、関節リウマチの心血管系合併症、および他の心血管系障害が挙げられる。ＩＬ−１８は、敗血症性または内毒素性ショックの状況において心拍出量を著しく低下させると考えられている。ＩＬ−１８は、炎症過程とアテローム発生との間の重要なリンクであり、ＲＡおよび狼瘡を含む慢性炎症性状態を有する患者における心血管系原因による大過剰の死亡率についての蓄積した証拠を考慮すれば、特に関連性がある。ＩＬ−１８レベルは、心イベントによる死の強力な独立予測因子である（ＣＲＰレベルより強い予測力を有する）ことが示されている。Ｇｅｒｄｅｓら、２００２年、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９５巻、２４５〜２５７頁；ＷＯ０３／０８０１０４；ＷＯ０２／０６０４７９；ＷＯ０１／８５２０１；Ｒａｅｂｕｒｎら、２００２年、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２８３巻、Ｈ６５０〜Ｈ６５７頁。
【０１６９】
ＩＬ−１８はまた、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性重度喘息、および急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）などの肺疾患に関連している。
【０１７０】
２．診断方法
本発明の抗原結合タンパク質は、ＩＬ−１８またはＩＬ−１８受容体に関連した疾患および／または状態を検出、診断、またはモニターする、診断目的に用いることができる。本発明は、当業者に知られた古典的な免疫組織学的方法（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ、１９９３年、Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、１５巻（Ｒ．  Ｈ．  ＢｕｒｄｏｎおよびＰ．  Ｈ．  ｖａｎ  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｚｏｌａ、１９８７年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、１９８５年、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０１巻、９７６〜９８５頁；Ｊａｌｋａｎｅｎら、１９８７年、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０５巻、３０８７〜３０９６頁）を用いる、試料におけるＩＬ−１８受容体の存在の検出を提供する。ＩＬ−１８受容体の検出は、インビボまたはインビトロで行うことができる。
【０１７１】
本明細書に提供される診断適用は、ＩＬ−１８受容体の発現、およびＩＬ−１８受容体へのリガンドの結合を検出するための抗原結合タンパク質の使用を含む。ＩＬ−１８受容体の存在の検出に有用な方法の例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイが挙げられる。
【０１７２】
診断適用について、抗原結合タンパク質は、典型的には、検出可能な標識群で標識される。適切な標識群としては、以下が挙げられるが、それらに限定されるわけではない：放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光群（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素群（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光群、ビオチニル群、または二次レポーターによって認識されるあらかじめ決定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体についての結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態において、標識群は、可能性のある立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質に結合している。タンパク質を標識するための様々な方法は当技術分野において知られており、本発明を行うのに用いることができる。
【０１７３】
本発明の１つの態様は、ＩＬ−１８受容体を発現する細胞（複数可）を同定することを提供する。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は標識群で標識され、標識抗原結合タンパク質のＩＬ−１８受容体への結合が検出される。さらなる特定の実施形態において、抗原結合タンパク質のＩＬ−１８受容体への結合はインビボで検出される。さらなる特定の実施形態において、抗原結合タンパク質−ＩＬ−１８受容体が単離され、当技術分野において知られた技術を用いて測定される。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９９１年版および定期的追補）；Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ編、１９９３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｅｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓを参照。
【０１７４】
本発明の別の態様は、ＩＬ−１８受容体への結合において本発明の抗原結合タンパク質と競合する試験分子の存在を検出することを提供する。１つのそのようなアッセイの例は、試験分子の存在下または非存在下において、ある量のＩＬ−１８受容体を含む溶液中で遊離抗原結合タンパク質の量を検出することを含む。遊離抗原結合タンパク質（すなわち、ＩＬ−１８受容体に結合していない抗原結合タンパク質）の量の増加は、試験分子が、ＩＬ−１８受容体結合において抗原結合タンパク質と競合する能力があることを示す。１つの実施形態において、抗原結合タンパク質は標識群で標識される。または、試験分子が標識され、遊離試験分子の量が、抗原結合タンパク質の存在下および非存在下において、モニターされる。
【０１７５】
３．処置の方法：薬学的製剤、投与経路
いくつかの実施形態において、本発明は、１つまたは複数の本発明の抗原結合タンパク質の治療有効量を、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤、および／またはアジュバントと共に含む薬学的組成物を提供する。さらに、本発明は、そのような薬学的組成物を投与することにより患者を処置する方法を提供する。用語「患者」は、ヒトおよび動物の被験体を含む。
【０１７６】
好ましくは、許容される製剤材料は、用いられる投薬量および濃度においてレシピエントに無毒である。特定の実施形態において、治療有効量のＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質を含む薬学的組成物が提供される。
【０１７７】
特定の実施形態において、許容される製剤材料は、好ましくは、用いられる投薬量および濃度においてレシピエントに無毒である。特定の実施形態において、薬学的組成物は、例えば、ｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解速度または放出速度、組成物の吸着性または浸透性を改変、維持、または保存するための製剤材料を含んでもよい。そのような実施形態において、適切な製剤材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸など）；増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）；キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖；二糖；および他の糖質（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；着色剤、香味剤、および希釈用物質；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩生成対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素など）；溶剤（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０などのポリソルベート、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなど）；安定性増強剤（スクロースまたはソルビトールなど）；張性増強剤（ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、メンニトールソルビトールなど）；送達媒体；希釈剤；賦形剤、ならびに／または薬学的補助剤が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版、（Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｒｍｏ編）、１９９０年、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ参照。
【０１７８】
特定の実施形態において、最適な薬学的組成物は、例えば、意図される投与経路、送達様式、および望ましい投薬量に依存して、当業者によって決定される。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、前記参照。特定の実施形態において、そのような組成物は、本発明の抗原結合タンパク質の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、およびインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼし得る。特定の実施形態において、薬学的組成物における主な媒体または担体は、天然で水性でも非水性でもよい。例えば、適切な媒体または担体は、注射用蒸留水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であり得、場合により、非経口投与のための組成物によく見られる他の材料を追加してもよい。中性の緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した食塩水は、さらに典型的な媒体である。特定の実施形態において、薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、さらに、ソルビトールまたは適切なその代用物を含んでもよい。本発明の特定の実施形態において、ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形をとる任意の製剤補助剤（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、前記）と混合することにより、保存用に調製してもよい。さらに、特定の実施形態において、ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質生成物は、スクロースなどの適当な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤化してもよい。
【０１７９】
本発明の薬学的組成物は、非経口送達用に選択することができる。あるいは、組成物は、吸入用、または経口などの消化管を通しての送達用に選択してもよい。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当技術分野内である。
【０１８０】
製剤成分は、好ましくは、投与部位に受け入れられる濃度で存在する。特定の実施形態において、緩衝剤は、生理的ｐＨ、またはよりわずかに低いｐＨ、典型的には、約５〜約８のｐＨ範囲内に組成物を維持するように用いられる。
【０１８１】
非経口投与が企図される場合、本発明に用いる治療用組成物は、薬学的に許容される媒体に所望のＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質を含む、発熱物質非含有の非経口的に許容される水溶液の形で提供してもよい。非経口的注射に特に適した媒体は、滅菌蒸留水であり、その中に、ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質は、滅菌等張液として製剤化され、適切に保存される。特定の実施形態において、調製物は、デポー注射によって送達することができる生成物の制御放出および持続放出を与えることができる注射可能ミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどの作用物質と共に所望の分子の製剤を含むことができる。特定の実施形態において、ヒアルロン酸もまた用いてもよく、循環中の時間の持続を促進する効果を生じる。特定の実施形態において、埋め込み型薬物送達装置は、所望の抗原結合タンパク質を導入するために用いてもよい。
【０１８２】
本発明の薬学的組成物は、吸入用に製剤化することができる。これらの実施形態において、ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質は、有利には、乾燥した吸入可能粉末として製剤化される。特定の実施形態において、ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質吸入溶液もまた、エアロゾル送達用に噴霧剤と共に製剤化してもよい。特定の実施形態において、溶液を噴霧してもよい。したがって、肺投与および製剤方法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号にさらに記載されており、それは参照により組み込まれ、かつ化学修飾タンパク質の肺送達を記載する。製剤を経口投与し得ることも企図される。この様式で投与されるＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質は、錠剤およびカプセルなどの固体剤形の配合に通常用いられる担体を含有して、または担体を含有せずに、製剤化することができる。特定の実施形態において、カプセルは、胃腸管内時点で製剤の活性部分を放出するように設計することができ、その場合、バイオアベイラビリティは最大で、プレシステミック分解は最小になる。ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質の吸収を促進するために追加の作用物質を含有することができる。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた用いてもよい。
【０１８３】
好ましくは、錠剤の製造に適している無毒性賦形剤との混合物に１つまたは複数のＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質の有効量を含む本発明の薬学的組成物が提供される。滅菌水、または別の適当な媒体中に錠剤を溶解させることにより、単位用量の形で溶液を調製することができる。適切な賦形剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、もしくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；またはデンプン、ゼラチン、もしくはアラビアゴムなどの結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルクなどの潤滑剤が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１８４】
さらなる薬学的組成物は当業者にとって明らかであろうが、ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質を持続性または制御性送達型製剤に含む製剤が挙げられる。リポソーム担体、生体内分解性微粒子または多孔質ビーズ、およびデポー注射剤などの様々な他の持続性または制御性送達手段を製剤化する技術もまた、当業者に知られている。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号参照。それは、参照により組み入れられ、薬学的組成物の送達用の多孔質ポリマー微粒子の制御放出を記載する。持続放出調製物は、成形物、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形をとる半透性ポリマーマトリックスを含有してもよい。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ハイドロゲル、（それぞれが参照により組み入れられている、米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開ＥＰ  ０５８４８１号に開示されているような）ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２巻、５４７〜５５６頁）、ポリ（メタクリル酸−２−ヒドロキシエチル）、（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１年、Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．、１５巻、１６７〜２７７頁およびＬａｎｇｅｒ、１９８２年、Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．、１２巻、９８〜１０５頁）エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１年、前記）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開ＥＰ  １３３，９８８）を挙げることができる。持続放出組成物には、当技術分野において知られたいくつかの方法のいずれかにより調製することができるリポソームも挙げることができる。例えば、参照により組み入れられている、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２巻、３６８８〜３６９２頁；欧州特許出願公開ＥＰ  ０３６，６７６；ＥＰ  ０８８，０４６およびＥＰ  １４３，９４９を参照。
【０１８５】
インビボ投与に用いる薬学的組成物は、典型的には、滅菌調製物として提供される。滅菌は、滅菌濾過膜を通しての濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥されている場合、この方法を用いる滅菌は、凍結乾燥と再構成の前かまたは後のいずれかで行うことができる。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥された形で、または溶液中に保存することができる。非経口組成物については、一般的に、滅菌アクセス口を有する容器、例えば、静脈注射用溶液バッグ、または皮下注射針によって穴を開けることができるストッパーを有するバイアルへ入れる。
【０１８６】
いったん、薬学的組成物が製剤化されたならば、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体、結晶として、または脱水粉末もしくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアルに保存してもよい。そのような製剤は、すぐに使える形かまたは投与前に再構成される形（例えば、凍結乾燥型）のいずれかで、保存することができる。本発明はまた、単一用量投与単位を作製するためのキットを提供する。本発明のキットは、それぞれ、乾燥したタンパク質を有する第１容器、および水性製剤を有する第２容器の両方を含む。本発明の特定の実施形態において、単一チャンバー型および複数チャンバー型のあらかじめ充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが提供される。
【０１８７】
用いられる治療有効量のＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質含有薬学的組成物は、例えば、治療状況および目的に依存する。当業者は、処置のための適当な用量レベルは、ある程度、送達される分子、ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質が用いられることになっている適応症、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表面または器官のサイズ）および／または状態（年齢および一般的健康状態）によって異なる。特定の実施形態において、臨床医は、最適な治療効果を得るために、用量の力価を測定し、投与経路を変更することができる。典型的な用量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇまで、またはそれ以上の範囲であり得る。特定の実施形態において、用量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得、任意で、１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまたは１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【０１８８】
投薬頻度は、用いられる製剤における特定のＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質の薬物動態パラメータに依存する。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する用量に達するまで組成物を投与する。それゆえに、組成物は、単一用量として、または時間をかけての２回以上の用量（同量の所望の分子を含む場合もあるし、含まない場合もある）として、または埋め込み装置もしくはカテーテルを介する持続注入として投与される。適当な用量のさらなる微調整は、当業者によって日常的になされ、彼らが日常的に行う職務の範囲内である。適当な用量は、適当な用量反応データを用いて確認することができる。特定の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、長期間にわたって患者へ投与することができる。本発明の抗原結合タンパク質の長期投与は、完全にはヒトではない抗原結合タンパク質、例えば、非ヒト動物においてヒト抗原に対して産生された抗体、例えば、非ヒト種において産生された不完全ヒト抗体または非ヒト抗体に一般的に関連した有害な免疫応答またはアレルギー性応答を最小化する。
【０１８９】
薬学的組成物の投与経路は、公知の方法による、例えば、経口で、静脈内、腹腔内、脳内、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内経路による注射による；持続放出システムによる、または埋め込み装置による。特定の実施形態において、組成物は、ボーラス注入により、もしくは注入により持続的に、または埋め込み装置により、投与してもよい。
【０１９０】
組成物はまた、膜、スポンジ、または所望の分子が吸収されている、もしくは被包されている別の適当な材料の埋め込みによって局所的に投与してもよい。埋め込み装置が用いられる特定の実施形態において、装置は、任意の適切な組織または器官へ埋め込んでもよく、所望の分子の送達は、拡散、徐放ボーラス投与、または持続投与によることができる。
【０１９１】
本発明によるＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質薬学的組成物をエクスビボで用いることもまた望ましいことがある。そのような場合、患者から取り出された細胞、組織、または器官を、ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質薬学的組成物に曝し、その後、続いて、細胞、組織、および／または器官を患者へ移植し、戻す。
【０１９２】
特に、ＩＬ−１８受容体抗原結合タンパク質は、そのポリペプチドを発現および分泌するように、本明細書に記載された方法などの方法を用いて遺伝子操作されている特定の細胞を移植することによって、送達することができる。特定の実施形態において、そのような細胞は、動物細胞またはヒト細胞でもよく、自家性、異種性、または異種間でもよい。特定の実施形態において、細胞は不死化していてもよい。他の実施形態において、免疫学的応答の機会を減少させるために、細胞は、周囲組織の浸潤を避けるために被包してもよい。さらなる実施形態において、被包材料は、典型的には、タンパク質産物（複数可）の放出を可能にするが、患者の免疫系による、または周囲組織由来の他の有害因子による細胞の破壊を防ぐ生体適合性の半透性ポリマー被包材または膜である。
【０１９３】
本明細書の本文内に引用されたすべての参考文献は、全体として参照により本明細書に明確に組み入れられている。
【０１９４】
行われた実験および得られた結果を含む以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１９５】
ＶＩ．実施例
（Ａ．実施例１）：ｐＶＥ４１４Ｎ一過性発現構築物を用いる抗ＩＬ−１８受容体抗体のＩｇＧ２およびＩｇＧ４型の産生
以下の実施例は、様々な抗ＩＬ−１８受容体結合タンパク質のＩｇＧ２およびＩｇＧ４型を産生するために用いられる一過性発現構築物の作製、ならびにそれらの結合特性および効力を試験するための実験手法を記載する。
【０１９６】
１．構築物の作製
ＡＭＨ９／ＡＭＬ９、ＡＭＨ１１／ＡＭＬ７、ＡＭＨ３／ＡＭＬ１４、およびＡＭＨ６／ＡＭＬ１２のＩｇＧ４型の一過性発現のための発現構築物を、配列番号７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、および８８のポリヌクレオチド配列を一過性発現ベクターへサブクローニングすることによって作製した。同じ可変領域のＩｇＧ２型については、それらのＩｇＧの可変領域をコードするポリヌクレオチド部分を別の一過性発現ベクターへサブクローニングすることによって作製した。
【０１９７】
２．一過性ローラーボトルトランスフェクション
各抗体についてのＣｏｓＰＫＢ株化細胞への８個のローラーボトルトランスフェクションを行った。ＩｇＧ２についての力価は以下のとおりであった：
【０１９８】
【表４】
2015015957.tif 000010
３．様々な抗体の効力および交差反応性についてのアッセイ
ＫＧ−１  ＩＦＮγ放出アッセイ。様々なＩｇＧ構築物を、インビトロのインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）放出アッセイにおいてそれらの阻害活性を決定するために試験した。ＩＦＮγ放出アッセイは、内因性ＩＬ−１８Ｒを発現するヒト骨髄単球性ＫＧ−１細胞がＩＬ−１８に応答してＩＦＮγを放出するという原理に基づいて働く。
【０１９９】
簡単には、アフィニティ精製ｓｃＦｖなどの試薬を、９６ウェル組織培養プレートにおいてＫＧ−１細胞とプレインキュベートする。ＩＬ−１８（＋ＴＮＦα）を細胞に加え、ＩＦＮγ放出を誘導する。ＴＮＦαは、ＩＦＮγ応答を増加させるためにＩＬ−１８と共に加えられ、それゆえに、より低い濃度のＩＬ−１８を用いることを可能にすることによって、アッセイの感度をより高くする。これは、少なくとも一部、ＴＮＦαに誘導された、ＩＬ−１８Ｒ表面発現の上方制御による可能性が高い。
【０２００】
規定のインキュベーション期間後、細胞上清を収集し、ＥＬＩＳＡを用いてＩＦＮγ含有量を分析する。ＩＬ−１８Ｒ媒介性シグナル伝達を阻害する試験化合物は、ＩＦＮγ放出の低下を示すことによって、このアッセイで評価することができる。
【０２０１】
ＫＧ−１細胞については、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ
Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ、８６１１１３０６）から入手した。細胞を、追加されたＩｓｃｏｖｅのＤｕｌｂｅｃｃｏ改変培地（ＩＭＤＭ）中で増殖させ、１〜２×１０６細胞／ｍｌに維持した。組換えヒトＩＬ−１８については、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（２００−１８）から入手し、組換えヒトＴＮＦαは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（２１０−ＴＡ）から購入した。１ｎＭ  ＩＬ−１８（＋１．１ｎＭ  ＴＮＦα）に応答して放出されるＩＦＮγの量を、各実験でモニターし、約２５０〜４０００ｐｇ／ｍｌの範囲であった。
【０２０２】
ＫＧ−１アッセイを、９６平底ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で行った。抗体の試験溶液（２連）を、５０μｌの容量で希釈せずに（またはＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ中に必要とされる濃度まで希釈して）用いた。その後、後で５０μｌ  ＫＧ−１細胞を穏やかに混合しながら加えた、（ＫＧ−１培地を用いた）６〜９ポイントの１／３希釈系列で、抗体を滴定した。ＩＬ−１８のみを含む「抗体無し」対照、および「細胞のみ」対照を常に含めた。抗体／細胞混合物の３７℃、５％ＣＯ２での３０〜６０分間のインキュベーション後、ＫＧ−１培地に希釈されたＩＬ−１８＋ＴＮＦαの１００μｌを穏やかに混合しながら加えた。ＩＭＡＣ精製ｓｃＦｖの最終濃度は、典型的には、２５〜２００μｇ／ｍｌの範囲であった。３つの参照阻害剤を全アッセイで用いた。最初の２つは、ＩＬ−１８Ｒの２つの異なる鎖、ＲＰ１（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ８４０）およびＡｃＰＬ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ１１８１）に対するモノクローナル抗体であった。これらの抗体は、希釈系列の最終の開始濃度が１０〜２０μｇ／ｍｌである点を除いて、ｓｃＦｖについての上記のように用いた。加えて、組換えＩＬ−１８ＢＰ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、１１９−ＢＰ）を、ＩＬ−１８を中和するために用いた。この場合、５０μｌのＫＧ−１培地を細胞培養プレートに加え、続いて、５０μｌの細胞を加えて、抗体についての上記のように細胞をインキュベートした。別の９６ウェル「Ｕ」底細胞培養プレートにおいて、６０μｌ／ウェル中（ＫＧ−１培地を用いた）６〜９ポイント１／２希釈系列で、ＩＬ−１８ＢＰ／Ｆｃを滴定した。等容量のＩＬ−１８＋ＴＮＦαをＩＬ−１８ＢＰ／Ｆｃ希釈系列に加えた。ＩＬ−１８ＢＰ／Ｆｃ／ＩＬ−１８混合物の３７℃、５％ＣＯ２での３０〜６０分間のインキュベーション後、１００μｌ／ウェルを、穏やかに混合しながらＫＧ−１細胞プレートに加えた。希釈系列のＩＬ−１８ＢＰ／Ｆｃの最終の開始濃度は、１ｍｇ／ｍｌであった。ＫＧ−１細胞の最終濃度は１．５×１０６細胞／ｍｌ（すなわち、３×１０５／ウェル）であり、ＩＬ−１８については、１ｎＭの最終濃度（＋１．１ｎＭ  ＴＮＦα）で用いた。
【０２０３】
ＩＦＮγ応答のＥＣ５０を決定するためにＩＬ−１８も滴定した。ＩＬ−１８については、ＴＮＦαを１．１ｎＭで一定に保持して、（ＫＧ−１培地を用いた）６〜１０ポイント１／２希釈系列で滴定した。この場合、５０ｍｌのＫＧ−１培地を細胞培養プレートに加え、続いて、５０ｍｌの細胞を加えた。細胞プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３０〜６０分間、インキュベートし、その後、滴定されるＩＬ−１８の１００ｍｌを穏やかに混合しながら加えた。ＩＬ−１８の最終濃度は、希釈系列として５ｎＭから開始した。典型的には、ＩＬ−１８（＋ＴＮＦα）のＥＣ５０は、０．５〜１ｎＭの範囲であったが、０．３ｎＭまで下がった、または５ｎＭまで上がった、最小および最大ＥＣ５０値も、たまに見られた。
【０２０４】
ＫＧ−１細胞プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩、インキュベートした。きれいな「Ｕ」底９６ウェルプレートへ１８０ｍｌ培地を取り出すことによって、細胞上清を収集し、その後、そのプレートを密封し、１２００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。その後、細胞を含まない上清の１６０ｍｌを別のきれいな「Ｕ」底９６ウェルプレートに移し、清澄化した上清をすぐに試験した、または−２０℃で凍結させた。
【０２０５】
ＫＧ−１細胞上清におけるＩＦＮγの量を、時間分解蛍光定量読み取りを用いる、標準サンドイッチＥＬＩＳＡに基づくアッセイによって決定した。ＦＬＵＯＲＯＮＵＮＣ平底９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ、４３７９５８）を４ｍｇ／ｍｌでのＩＦＮγ特異的モノクローナル捕獲抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ２８５１）の１００ｍｌ／ウェルを用いてコーティングし、＋４℃で一晩、放置した。プレートをＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳですすぎ、その後、ＰＢＳ中３％紛ミルクの２００ｍｌ／ウェルを加え、ＲＴ（ＲＴ）で１〜２時間、インキュベートすることによって、非特異的タンパク質結合をブロッキングした。組換えヒトＩＦＮγ標準（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２８５−ＩＦ−１００）を試薬希釈剤（０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．２〜７．４）中、１６，０００ｐｇ／ｍｌに希釈し、その後、１２ポイント１／２希釈系列で滴定した。ブロッキング緩衝剤を捕獲抗体コーティング化プレートから除去し、１００ｍｌ／ウェルのＩＦＮγ標準または清澄化細胞上清を加えた。「ブランク」対照として試薬希釈剤を加えた。ＲＴで１〜２時間のインキュベーション後、プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回、洗浄した。ビオチン化抗ヒトＩＦＮγポリクローナル検出抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＢＡＦ２８５）を、２％正常ヤギ血清を追加した試薬希釈剤中、１００ｎｇ／ｍｌに希釈し、１００ｍｌ／ウェルを加えた。ＲＴで１時間のインキュベーション後、プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回、洗浄した。ストレプトアビジン−ユーロピウム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、４００１−００１０）をＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝剤（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、４００２−００１０）中、１／１０００希釈し、１００ｍｌ／ウェルを加えた。ＲＴでの３０〜６０分間のインキュベーション後、プレートを、ＤＥＬＦＩＡ洗浄緩衝剤（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、１２４４−１１４）で７回、洗浄した。ＤＥＬＦＩＡ増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、４００１−００１０）を１００ｍｌ／ウェルで加え、プレートをＲＴで少なくとも１０分間、放置した。生じた蛍光シグナルを、Ｖｉｃｔｏｒ２  Ｖプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いる解離増強した時間分解蛍光定量法を用いて測定した。
【０２０６】
ＥＬＩＳＡ「ブランク」対照についての平均値をＩＦＮγ標準についての結果から引き算したが、「細胞単独」対照についての平均値は、細胞上清結果に対して引き算した。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて、（変数傾きを有する）非線形回帰を用いるＩＦＮγ標準曲線を計算した。その後、細胞上清中のＩＦＮγの濃度を、ＩＦＮγ標準曲線について「Ｙからの未知Ｘ」の出力を用いることによって決定した。ＩＬ−１８に応答したＫＧ−１細胞からのＩＦＮγ放出に対するＥＣ５０を、（変数傾きを有する）非線形回帰を用いて計算し、必要に応じて、上端および下端を制限した。試験化合物によるＫＧ−１細胞からのＩＦＮγ放出の阻害を、蛍光カウントデータを用いて、「抗体無し」ＩＬ−１８単独対照の平均値のパーセンテージとして正規化した。その後、試験化合物のＩＣ５０値を、（変数傾きを有する）非線形回帰を用い、かつ下端および上端をそれぞれ、０％および１００％に制限して、計算することができた。
【０２０７】
抗体ＡＭＨ９／ＡＭＬ９、ＡＭＨ１１／ＡＭＬ７、ＡＭＨ３／ＡＭＬ１４、およびＡＭＨ６／ＡＭＬ１２のＩｇＧ２型は、ＫＧ１細胞によるＩＦＮ−γ産生へのそれらの効果を測定するアッセイにおいて最初のＩｇＧ４型と少なくとも等価の効力を有する。さらに、ＩｇＧ２型は、ヒトＮＫ細胞によるＩＮＦ−γ産生を測定するアッセイにおいて最初のＩｇＧ４と少なくとも等価の効力を有する。
【０２０８】
抗体のＩｇＧ２型は、カニクイザルＰＢＭＣ＃０１０１８２細胞によるＩＬ−１８誘導性ＩＮＦ−γ産生へのそれらの効果を測定するアッセイにおいて最初のＩｇＧ４と等価の効力を有する。これは、ＩｇＧ２への変換が、試験された抗体のカニクイザル交差反応性に影響しなかったことを確信させている。
【０２０９】
４．特異性のアッセイ
様々な抗体のＩｇＧを、タンパク質のパネルに対するＥＬＩＳＡによって交差反応性について分析した。
【０２１０】
試験抗原を、タンパク質イモビライザー（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｒ）９６ウェルプレート（Ｅｘｉｑｏｎ、製品番号１０２０３−１１１−６０）上にＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏのｗ／ｏ  ＣａおよびＭｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１４１９０−０８６）中１μｇ／ｍｌで２連、５０μｌ／ウェル、４℃で一晩、コーティングした。
【０２１１】
プレートを、９６ウェルプレート洗浄機（ＢＩＯ−ＴＥＫ、ＥＬＸ４０５ＵＶ）を用いてウェルあたり、３００μｌ  ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）（ＰＢＳ−Ｔ）で３回、および３００μｌ  ＰＢＳで３回、洗浄した。洗浄されたプレートへ、ブロッキング剤としてウェルあたり３００μｌの３％Ｍａｒｖｅｌ  ＰＢＳ（ＭＰＢＳ）を加えた。プレートを室温（ＲＴ）で１時間、ブロッキングした。
【０２１２】
前述のように、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで３回、およびＰＢＳで３回、洗浄した。
【０２１３】
抗体（ｈｕｌｇＧ４）を、３％ＭＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌに希釈した。ウェルあたり５０μｌの希釈されたｈｕｌｇＧ４を加えた。プレートをＲＴで１時間、インキュベートした。プレートを、前述のように洗浄した。
【０２１４】
一次検出抗体（モノクローナル抗ヒトＩｇＧ４クローンＨＰ−６０２５ビオチンコンジュゲート、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｂ−３６４８）を３％ＭＰＢＳ中１：１５，０００希釈し、ウェルあたり５０μｌでプレートへ加えた。一次検出抗体とのインキュベーションはＲＴで１時間であった。プレートを、前述のように洗浄した。
【０２１５】
二次検出抗体（ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎペルオキシダーゼコンジュゲート、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ−２８８６）を３％ＭＰＢＳ中１：１，０００希釈し、ウェルあたり５０μｌでプレートへ加えた。二次検出抗体とのインキュベーションはＲＴで３０分間であった。プレートを、前述のように洗浄した。
【０２１６】
ウェルあたり５０μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＥＬＩＳＡについての液体基質、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ−０４４０）を加え、ＲＴで１０分間、インキュベートした。酵素呈色反応を停止させるために、ウェルあたり５０μｌ  ０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えた。
【０２１７】
９６ウェルプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ２  Ｖプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））上、４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【０２１８】
特定の抗ＩＬ−１８受容体ＩｇＧ４抗体は、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１８受容体タンパク質に対してのみ陽性であった。他の種との交差反応性はなかった。上記抗体のＩｇＧ２型は、同じ交差反応性を有した、すなわち、それはカニクイザルＩＬ−１８受容体とのみ交差反応した。
【０２１９】
（Ｂ．実施例２）：ＩＬ−１８受容体抗体の結合親和性の特徴付け
この実施例は、ＩＬ−１８受容体結合タンパク質の細胞表面発現性ヒトＩＬ−１８Ｒαへの結合親和性を決定する例示的な方法を提供する。ＩＬ−１８受容体抗体を、［１２５Ｉ］−ボルトンハンター試薬を用いてヨウ素化した（二ヨウ素化した；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）。無水ベンゼン中に供給された１ミリキュリーの［１２５Ｉ］−ボルトンハンター試薬を窒素気流下で乾燥状態へと蒸発させた。５マイクロリットルのＩＬ−１８受容体抗体（１６マイクログラム）を等量のホウ酸緩衝食塩水で希釈し、その後、その最初のバイアル中の乾燥した［１２５Ｉ］−ボルトンハンター試薬に加えた。４℃での一晩のインキュベーション後、１０マイクロリットルのＰＢＳ、０．１％ゼラチンを加え、全試料を、平衡２ｍＬ  Ｐ６カラム（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）へ移し、そこで、ヨウ素化ＩＬ−１８受容体抗体を、担体タンパク質としての０．１％ゼラチンでのゲル濾過によって遊離１２５Ｉから分離した。ヨウ素化抗体を含む画分をプールし、結合培地（２．５％ウシアルブミン、フラクションＶ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、および０．２％アジ化ナトリウムを含むＲＰＭＩ  １６４０、ｐＨ７．２）中１００ｎＭの濃度に希釈し、４℃で保存した。３．５×１０１５ｃｐｍ／ｍｍｏｌの特異的活性が、アミノ酸分析による抗体の最初のタンパク質濃度、およびヨウ素化抗体のアリコートに［１２５Ｉ］−ボルトンハンター試薬を排除したヨウ素化プロトコールを実施した対照実験からの７０％の回収率に基づいて、計算された。
【０２２０】
１．直接平衡結合
ＫＧ−１細胞を、２０ｎｇ／ｍＬのヒトＴＮＦαの存在下、２０％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地中、５％ＣＯ２、３７℃で２０時間、刺激した。刺激されたＫＧ−１細胞（５×１０５細胞／１５０マイクロリットル最終）をＰＢＳで２回、洗浄し、その後、一連の濃度のヨウ素化抗体とインキュベートした。ヨウ素化抗体の単一濃度（約３５０ｐＭ、３連）において、１０００倍モル過剰の非標識抗体の存在下で、非特異的結合を測定し、存在するヨウ素化抗体の濃度の一次関数であると仮定した。可能性のある細胞によるヨウ素化抗体の内部移行を抑制するために、全試薬を、アジ化ナトリウム（０．２％）を含む結合培地に希釈した。
【０２２１】
細胞を、ミニオービタルシェーカー上、３７℃、５％ＣＯ２で、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート中でインキュベートした。４時間後、各混合物の２つの６０マイクロリットルのアリコートを、２００マイクロリットルのフタル酸オイル（フタル酸ジブチル１．５：フタル酸ジオクチル１）を含む冷却した４００マイクロリットルのポリエチレン遠心管に移し、４℃卓上用微量遠心分離器（Ｓｏｒｖａｌｌ、Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ、ＮＣ）内、１０，０００ｒｐｍで１．５分間、回転させて、細胞に会合したヨウ素化抗体を遊離ヨウ素化抗体から分離した。そのオイルチューブを切断し、各細胞ペレットおよび上清を、個々の１２×７５ｍｍガラス管に採取し、ｃｐｍ測定のためにＣＯＢＲＡガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）に装填した。各ウェルについての２連のアリコートからのｃｐｍを分析のために平均した。Ｐｒｉｓｍバージョン３．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）における非線形回帰によって、データを単純な１部位結合方程式にフィットさせた。
【０２２２】
３７℃における刺激されたＫＧ−１細胞に結合したヨウ素化抗体は、８１ｐＭのＫＤおよび約４７００部位／細胞を有した。
【０２２３】
２．競合アッセイ
刺激し、かつ洗浄したＫＧ−１細胞（５×１０５細胞／１５０マイクロリットル最終）を、結合培地中、単一濃度のヨウ素化抗体（１５．６ｐＭ）および様々な濃度の非標識抗体とインキュベートした。１０００倍モル過剰の非標識抗体の存在下で、非特異的結合を決定した。ヨウ素化抗体および非標識抗体を、細胞の添加直前に混合した、すなわち、プレインキュベーション工程はなかった。
【０２２４】
細胞を、ミニオービタルシェーカー上、３７℃、５％ＣＯ２で、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート中でインキュベートした。４時間後、各混合物の２つの６０マイクロリットルのアリコートを、２００マイクロリットルのフタル酸オイル（フタル酸ジブチル１．５：フタル酸ジオクチル１）を含む冷却した４００マイクロリットルのポリエチレン遠心管に移し、４℃卓上用微量遠心機（Ｓｏｒｖａｌｌ、Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ、ＮＣ）内、１０，０００ｒｐｍで１．５分間、回転させて、細胞に会合したヨウ素化抗体を遊離ヨウ素化抗体から分離した。オイルチューブを切断し、各細胞ペレットおよび上清を、個々の１２×７５ｍｍガラス管に採取し、ｃｐｍ測定のためにＣＯＢＲＡガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）に装填した。各ウェルについての２連のアリコートからのｃｐｍを分析のために平均した。Ｐｒｉｓｍにおいて、８１ｐＭのＫｄ値を用いる非線形回帰によって、データを単一競合阻害方程式にフィットさせた。
【０２２５】
非標識抗体結合のＫｄは、５３ｐＭであった。
【０２２６】
（Ｃ．実施例３）：抗ＩＬ−１８受容体抗体の活性の特徴付け
ＩＦＮγ放出アッセイを、実施例１、セクション３に記載されているように、下記の様々なＩｇＧ構築物について実施した。
【０２２７】
１．ＡＭＨ２／ＡＭＬ１６、ＡＭＨ２／ＡＭＬ１７、ＡＭＨ１／ＡＭＬ１６、およびＡＭＨ１／ＡＭＬ１７構築物でのＫＧ１細胞によるＩＮＦγ放出の阻害の比較
ＡＭＨ／ＡＭＬ抗原結合タンパク質構築物ＡＭＨ２／ＡＭＬ１６、ＡＭＨ２／ＡＭＬ１７、ＡＭＨ１／ＡＭＬ１６、およびＡＭＨ１／ＡＭＬ１７で処理した場合のＫＧ１細胞によるＩＮＦ−γ放出の阻害を、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＢＰ）での対照処理と比較した。ＡＭＨ／ＡＭＬ抗原結合タンパク質は、ＩＦＮγ放出を阻害することにおいて、有意により効果的であり、すべてが、５２０ｐＭのＩＬ−１８  ＢＰについてのＥＤ５０と比較して６〜１０ｐＭのＥＤ５０を示した。
【０２２８】
２．ＡＭＨ４／ＡＭＬ１４、ＡＭＨ４／ＡＭＬ１５、ＡＭＨ３／ＡＭＬ１４、およびＡＭＨ３／ＡＭＬ１５構築物でのＫＧ１細胞によるＩＮＦγ放出の阻害の比較
ＡＭＨ／ＡＭＬ抗原結合タンパク質構築物ＡＭＨ４／ＡＭＬ１４、ＡＭＨ４／ＡＭＬ１５、ＡＭＨ３／ＡＭＬ１４、およびＡＭＨ３／ＡＭＬ１５で処理した場合のＫＧ１細胞によるＩＦＮ−γ放出の阻害を、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＢＰ）での対照処理と比較した。ＡＭＨ／ＡＭＬ抗原結合タンパク質は、ＩＦＮγ放出を阻害することにおいて、有意により効果的であり、すべてが、５２０ｐＭのＩＬ−１８  ＢＰについてのＥＤ５０と比較して３〜７ｐＭのＥＤ５０を示した。
【０２２９】
３．ＡＭＨ６／ＡＭＬ１２、ＡＭＨ６／ＡＭＬ１３、ＡＭＨ５／ＡＭＬ１２、およびＡＭＨ５／ＡＭＬ１３構築物でのＫＧ１細胞によるＩＮＦγ放出の阻害の比較
ＡＭＨ／ＡＭＬ抗原結合タンパク質構築物ＡＭＨ６／ＡＭＬ１２、ＡＭＨ６／ＡＭＬ１３、ＡＭＨ５／ＡＭＬ１２、およびＡＭＨ５／ＡＭＬ１３で処理した場合のＫＧ１細胞によるＩＮＦ−γ放出の阻害を、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＢＰ）での対照処理と比較した。ＡＭＨ／ＡＭＬ抗原結合タンパク質は、ＩＦＮγ放出を阻害することにおいて、有意により効果的であり、すべてが、５２０ｐＭのＩＬ−１８  ＢＰについてのＥＤ５０と比較して２．９〜１１．３ｐＭのＥＤ５０を示した。
【０２３０】
４．ＡＭＨ８／ＡＭＬ１１、ＡＭＨ９／ＡＭＬ９、ＡＭＨ１０／ＡＭＬ８、およびＡＭＨ１１／ＡＭＬ７ＩｇＧによる、ＫＧ１細胞によるＩＮＦγ放出の阻害
ＡＭＨ８／ＡＭＬ１１、ＡＭＨ９／ＡＭＬ９、ＡＭＨ１０／ＡＭＬ８、およびＡＭＨ１１／ＡＭＬ７ＩｇＧの組合せを含むＡＭＨ／ＡＭＬ  ＩｇＧ抗原結合タンパク質構築物でのＫＧ１細胞によるＩＮＦ−γ放出の阻害を、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＢＰ）での対照処理と比較した。ＡＭＨ／ＡＭＬ抗原結合タンパク質は、ＩＦＮγ放出を阻害することにおいて、有意により効果的であり、すべてが、５２０ｐＭのＩＬ−１８  ＢＰについてのＥＤ５０と比較して３〜４５ｐＭのＥＤ５０を示した。
【０２３１】
５．ＡＭＨ１５／ＡＭＬ３、ＡＭＨ１３／ＡＭＬ４、ＡＭＨ１３／ＡＭＬ５、およびＡＭＨ１６／ＡＭＬ２ＩｇＧによる、ＫＧ１細胞によるＩＮＦγ放出の阻害
ＡＭＨ１５／ＡＭＬ３、ＡＭＨ１３／ＡＭＬ４、ＡＭＨ１３／ＡＭＬ５、およびＡＭＨ１６／ＡＭＬ２ＩｇＧの組合せを含むＡＭＨ／ＡＭＬ  ＩｇＧ抗原結合タンパク質構築物でのＫＧ１細胞によるＩＮＦ−γ放出の阻害を、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＢＰ）での対照処理と比較した。ＡＭＨ／ＡＭＬ抗原結合タンパク質は、ＩＦＮγ放出を阻害することにおいて、有意により効果的であり、すべてが、５２０ｐＭのＩＬ−１８  ＢＰについてのＥＤ５０と比較して１７〜３２０ｐＭのＥＤ５０を示した。
【０２３２】
（Ｄ．実施例４）：記載されたＩＬ−１８受容体抗体の結合エピトープの同定
ＩＬ−１８受容体結合タンパク質の１つまたは複数に結合するのに重要である、ヒトＩＬ−１８受容体（ＩＬ−１８Ｒ）に存在するアミノ酸残基を決定するために実験を行った。ヒトＩＬ−１８Ｒに高親和性で結合する例示的な抗体は、ＩＬ−１８Ｒのマウスオルソログを結合しなかった。実験は、ヒトＩＬ−１８ＲとマウスＩＬ−１８Ｒとの間で異なるアミノ酸を調べる方向へ向けられた。それらのアミノ酸のうちのどれが、受容体の表面上に位置し、それゆえに、その抗体と相互作用する可能性がより高いのかを決定するために、ＩＬ−１８Ｒのコンピュータによる３次元モデルの分析とこれを合わせた。部位特異的突然変異誘発を用いて、特定のアミノ酸をヒト配列からマウス配列へ変化させ、その後、突然変異体ＩＬ−１８Ｒ分子を抗体への結合について試験することにより、候補アミノ酸を、抗体認識へのそれらの寄与について調べた。異なる突然変異を結合する抗体の相対的能力は、抗体用量反応曲線およびその結果のＥＣ５０濃度（最大結合シグナルの５０％に必要とされる抗体の濃度）の決定を用いて評価した。
【０２３３】
抗体結合にとって特に重要であり、したがって、エピトープに寄与する、ヒトＩＬ−１８Ｒの表面上の領域を同定した。この領域は、（図５の太字で示された）アミノ酸２４３〜２７１位を含む。この領域における特定のアミノ酸がマウス配列へと突然変異した場合、抗体結合は減少した（表３に報告された、抗体結合への効果）。アミノ酸２５０〜２５３位（ＭＦＧＥ突然変異体）および２６７〜２７１位（ＭＲＩＭＴ突然変異体）は、抗体結合に最も著明な影響を生じたが、どちらも全面的に抗体結合だけに影響したというわけではない（下線のアミノ酸残基を参照）。受容体が、試験された特定の部位のすべての４つにおいて突然変異した場合、抗体結合は事実上、消失した。対照抗ＩＬ−１８Ｒ受容体抗体の結合は、突然変異によって有意には影響されず、受容体の全体的構造が突然変異によって破壊されなかったことを示している。アミノ酸２４３〜２７１位は、推定のＩＬ−１８接触点のうちの１個をコードし、したがって、このエピトープは、ＩＬ−１８の受容体への結合を遮断する抗体の能力と一致している。
【０２３４】
【表３】
2015015957.tif 000011
ヒトＩＬ１８Ｒを、示された残基においてマウスＩＬ１８Ｒ配列へ突然変異させ、アビジンタグを有する組換え突然変異型受容体をビオチンコーティング化ビーズ上に固定化した。その後、固定化受容体を、可溶性結合アッセイにおいて相対的抗体結合能力を決定するために用いた。結合についてはまた、例示的な抗体とは異なるエピトープを認識する抗ｈｕＩＬ−１８Ｒ抗体を用いて行った。結合実験をすべて、少なくとも２回、行った。平均ＥＣ５０は、最大結合の５０％を達成するのに必要とされる抗体の濃度を示す。
【図１Ａ】
2015015957.tif 000012
【図１Ｂ】
2015015957.tif 000013
【図１Ｃ】
2015015957.tif 000014
【図１Ｄ】
2015015957.tif 000015
【図１Ｅ】
2015015957.tif 000016
【図１Ｆ】
2015015957.tif 000017
【図１Ｇ】
2015015957.tif 000018
【図１Ｈ】
2015015957.tif 000019
【図１Ｉ】
2015015957.tif 000020
【図１Ｊ】
2015015957.tif 000021
【図１Ｋ】
2015015957.tif 000022
【図１Ｌ】
2015015957.tif 000023
【図１Ｍ】
2015015957.tif 000024
【図１Ｎ】
2015015957.tif 000025
【図１Ｏ】
2015015957.tif 000026
【図１Ｐ】
2015015957.tif 000027
【図１Ｑ】
2015015957.tif 000028
【図２Ａ】
2015015957.tif 000029
【図２Ｂ】
2015015957.tif 000030
【図２Ｃ】
2015015957.tif 000031
【図２Ｄ】
2015015957.tif 000032
【図２Ｅ】
2015015957.tif 000033
【図３Ａ】
2015015957.tif 000034
【図３Ｂ】
2015015957.tif 000035
【図４】
2015015957.tif 000036
【図５】
2015015957.tif 000037
【図６】
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【図７】
2015015957.tif 000039
【図８】
2015015957.tif 000040
【図９】
2015015957.tif 000041
【図１０】
2015015957.tif 000042
【図１１】
2015015957.tif 000043
【図１２】
2015015957.tif 000044
【図１３】
2015015957.tif 000045
【配列表】
2015015957000001.app
【外国語明細書】
2015015957000001.pdf