(57)【要約】【課題】β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質の簡便且つ効率的なスクリーニング方法、及び該スクリーニング方法に使用する細胞を提供すること。【解決手段】（ａ）β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに（ｂ）ｃＡＭＰの結合によりレポーター活性が上昇するｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞を使用すること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ポリヌクレオチド（ａ）並びに下記ポリヌクレオチド（ｂ）が導入されたことを特徴とする細胞： 
（ａ）β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに
（ｂ）ｃＡＭＰの結合によりレポーター活性が上昇するｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
ポリヌクレオチド（ａ）及びポリヌクレオチド（ｂ）が導入された哺乳類動物細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記レポータータンパク質がルシフェラーゼである、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
ポリヌクレオチド（ａ）及びポリヌクレオチド（ｂ）が導入されたＨＥＫ‐２９３細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチド（ａ）がカイコガ属に属する生物のβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】
下記工程（ア）、（イ）、及び（ウ）を含む、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質のスクリーニング方法：
（ア）請求項１〜５のいずれかに記載の細胞を被検物質と接触させる工程、
（イ）工程（ア）の後、前記ｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質のレポーター活性を測定し、該活性値を、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値と比較する工程、及び
（ウ）被検物質と接触させた場合のレポーター活性値と、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値とが有意に相違している場合に、被検物質をβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質として選択する工程。
【請求項７】
β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストのスクリーニング方法であって、
前記工程（ウ）が、被検物質と接触させた場合のレポーター活性値が、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値よりも有意に高い場合に、被検物質をβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストとして選択する工程である、
請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アンタゴニストのスクリーニング方法であって、
前記工程（ア）が、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞を、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニスト及び被検物質と接触させる工程であり、
前記工程（イ）が、工程（ア）の後、前記ｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質のレポーター活性を測定し、該活性値を、被検物質と接触させずにβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストと接触させた場合のレポーター活性値と比較する工程であり、
前記工程（ウ）が、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニスト及び被検物質と接触させた場合のレポーター活性値が、被検物質と接触させずにβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストと接触させた場合のレポーター活性値よりも有意に低い場合に、被検物質をβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アンタゴニストとして選択する工程である、
請求項６に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質のスクリーニング方法、及び該スクリーニング方法に使用する細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
オクトパミンは、昆虫などの無脊椎動物の体内に特異的に存在する生体アミンの１種である。オクトパミンがその受容体であるβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体に結合すると、Ｇｓタンパク質を介してアデニル酸シクラーゼが活性化され、細胞内ｃＡＭＰの濃度上昇とプロテインキナーゼＡの活性化が起こる。これにより様々なタンパク質のリン酸化が惹起され、あるいは遺伝子転写が調節され、その結果として神経系の情報伝達が調節される。この調節機構を撹乱することにより害虫の行動や生育が制御されるので、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体は殺虫剤又は害虫制御剤の標的となる。そこで、害虫選択的殺虫剤又は制御剤を創製するために、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質（アゴニスト、アンタゴニスト等）をスクリーニングする方法の開発が求められている。
【０００３】
殺虫剤又は害虫制御剤創製を目的として、神経系の情報伝達を調節する物質をスクリーニングする方法は各種知られている。例えば、神経伝達物質の受容体タンパク質と殺虫剤又は害虫制御剤候補物質との結合実験を行い、その結合性を評価することによりスクリーニングする方法や、神経伝達物質の受容体の安定発現細胞株に、殺虫剤又は害虫制御剤候補物質を作用させ、電流応答に及ぼす影響をパッチクランプ法で解析することによりスクリーニングする方法が知られている（特許文献１〜２、及び非特許文献１）
しかしながら、これら従来のスクリーニング方法は、精製タンパク質の調製、細胞の破砕、放射性物質の使用、又は熟練を要するアッセイ系が必要である等の事情から、操作が複雑であり、多検体を迅速に処理することには向かないものである。
【０００４】
一方、特許文献３には、α-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体に作用物質が結合した際に起こるｃＡＭＰ量の変化を、特定のレポーターシステムを用いて検出し、該変化を指標として受容体作用物質をスクリーニングする方法が開示されている。このようなレポーターシステムを用いる方法であれば、上記従来のスクリーニング方法よりも簡便且つ効率的にスクリーニングが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２８８３０２号公報
【特許文献２】特開２００５−１４３４３４号公報
【特許文献３】特開２０１３−４２７１４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Xi Chen, Hiroto Ohta, Fumiyo Ozoe, Kazuya Miyazawa, Jia Huang, Yoshihisa Ozoe. Functional and pharmacological characterization of a β-adorenergic-like octopamine receptor from the silk worm Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 2010 Jun; 40(6): 476-86
【非特許文献２】A Ohtani, Y Arai, F Ozoe, H Ohta, K Narusuye, J Huang, K Enomoto, H Kataoka, A Hirota, and Y Ozoe. Molecular cloning and heterologous expression of an alpha-adrenergic-like octopamine receptor from the silkworm Bombyx mori. Insect Mol Biol, Dec 2006; 15(6): 763-72.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質をこのようなレポーターシステムを用いてスクリーニングする方法については未だ開発されていない。
【０００８】
そこで、本発明は、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質の簡便且つ効率的なスクリーニング方法、及び該スクリーニング方法に使用する細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体に作用物質が結合した際に産生されるｃＡＭＰ量は、α-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体に作用物質が結合した際に産生されるｃＡＭＰ量よりも遥かに多いことが知られている（非特許文献１〜２）。したがって、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質のスクリーニングは、α-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質のスクリーニング方法（特許文献３）に用いたレポーターシステムはもちろん、その他の各種レポーターシステムを用いることによって可能であると思われた。
【００１０】
しかしながら、全くの予想外なことに、上記特許文献３で用いたレポーターシステムを用いた方法では、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質をスクリーニングすることはできなかった。また、その他の各種レポーターシステム、例えば分泌型ルシフェラーゼや分泌型アルカリフォスファターゼ等の採用を試みたものの、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質をスクリーニングすることはできなかった。
【００１１】
本発明者等は、このような状況下で上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、（ａ）β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに（ｂ）ｃＡＭＰの結合によりレポーター活性が上昇するｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞を使用することにより、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質を簡便且つ効率的にスクリーニングできることを見出した。
【００１２】
このスクリーニング方法の原理は以下の通りである。ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）により形質転換された細胞を被検物質と接触させた場合、該被検物質がβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体に作用する物質であれば、該接触により、ポリヌクレオチド（ａ）から発現されたβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体を介して、細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化が起こる。そして、細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化は、ポリヌクレオチド（ｂ）から発現されたｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質に感知され、レポーター活性を変化させる。こうして、被検物質がβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体に与える作用は、ｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質のレポーター活性の変化として表れる。したがって、細胞を被検物質と接触させた場合のレポーター活性と、細胞を被検物質と接触させない場合のレポーター活性を比較することにより、被検物質がβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質か否かを判定し、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質をスクリーニングすることができる。
【００１３】
上記知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
【００１４】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【００１５】
項１．  下記ポリヌクレオチド（ａ）並びに下記ポリヌクレオチド（ｂ）が導入されたことを特徴とする細胞： 
（ａ）β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに
（ｂ）ｃＡＭＰの結合によりレポーター活性が上昇するｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００１６】
項２．  ポリヌクレオチド（ａ）及びポリヌクレオチド（ｂ）が導入された哺乳類動物細胞である、項１に記載の細胞。
【００１７】
項３．  前記レポータータンパク質がルシフェラーゼである、項１又は２に記載の細胞。
【００１８】
項４．  ポリヌクレオチド（ａ）及びポリヌクレオチド（ｂ）が導入されたＨＥＫ‐２９３細胞である、項１〜３のいずれかに記載の細胞。
【００１９】
項５．  前記ポリヌクレオチド（ａ）がカイコガ属に属する生物のβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドである、項１〜４のいずれかに記載の細胞。
【００２０】
項６．  下記工程（ア）、（イ）、及び（ウ）を含む、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質のスクリーニング方法：
（ア）項１〜５のいずれかに記載の細胞を被検物質と接触させる工程、
（イ）工程（ア）の後、前記ｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質のレポーター活性を測定し、該活性値を、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値と比較する工程、及び
（ウ）被検物質と接触させた場合のレポーター活性値と、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値とが有意に相違している場合に、被検物質をβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質として選択する工程。
【００２１】
項７．  β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストのスクリーニング方法であって、
前記工程（ウ）が、被検物質と接触させた場合のレポーター活性値が、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値よりも有意に高い場合に、被検物質をβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストとして選択する工程である、
項６に記載のスクリーニング方法。
【００２２】
項８．  β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アンタゴニストのスクリーニング方法であって、
前記工程（ア）が、項１〜５のいずれかに記載の細胞を、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニスト及び被検物質と接触させる工程であり、
前記工程（イ）が、工程（ア）の後、前記ｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質のレポーター活性を測定し、該活性値を、被検物質と接触させずにβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストと接触させた場合のレポーター活性値と比較する工程であり、
前記工程（ウ）が、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニスト及び被検物質と接触させた場合のレポーター活性値が、被検物質と接触させずにβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストと接触させた場合のレポーター活性値よりも有意に低い場合に、被検物質をβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アンタゴニストとして選択する工程である、
項６に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニスト又はアンタゴニスト等の作用物質を、多検体の被検物質から簡便且つ迅速にスクリーニングすることができる。さらにβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質を多検体の被検物質からスクリーニングする場合においても、検体間における測定値のばらつきを抑え、高精度にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明のスクリーニング方法で測定された、被検物質のアゴニスト活性を示す。
【図２】本発明のスクリーニング方法で測定された、被検物質のアンタゴニスト活性を示す。
【図３】本発明とは異なるレポーターシステム（分泌型ルシフェラーゼ）を採用して測定された、被検物質のアゴニスト活性を示す。
【図４】本発明とは異なるレポーターシステム（分泌型胎盤由来アルカリフォスファターゼ）を採用して測定された、被検物質のアゴニスト活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
１．本発明の細胞
本発明の細胞は、ポリヌクレオチド（ａ）及びポリヌクレオチド（ｂ）が導入されたことを特徴とする細胞である。
【００２６】
ポリヌクレオチド（ａ）は、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチド（ａ）は、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体タンパク質が発現可能な状態で、細胞に導入される。発現可能な状態とは、ポリヌクレオチド（ａ）が、導入細胞において、適切な転写調節領域、具体的には適切なプロモーターの制御下に配置された状態である。適切なプロモーターとしては、ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）が導入される細胞においてプロモーター活性を有するものであれば特に限定されず、公知のプロモーターを使用することができる。例えば、ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）が導入される細胞が哺乳類動物細胞である場合は、CMVプロモーター若しくはSV40プロモーター等のウィルス性のプロモーター、EF-1αプロモーター、又はUbCプロモーターを使用することができる。
【００２７】
ポリヌクレオチド（ａ）にコードされるβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体タンパク質は、種々の生物由来のものを使用することができ、特に限定されない。例えば、鱗翅目に属する生物が挙げられ、鱗翅目（Lepidoptera）に属する生物の中ではカイコガ科（Bombycidae）カイコガ属（Bombyx）に属する生物が好ましく挙げられ、カイコ（Bombyx mori）がより好ましく挙げられる。また、鱗翅目以外の生物としては、ショウジョウバエ、ミツバチ、ゴキブリ、バッタ、ハマダラカ、又はコクヌストモドキ等を挙げることができる。ポリヌクレオチド（ａ）にコードされるβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体タンパク質としては、カイコβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体タンパク質のアミノ酸配列である配列番号１で示されるアミノ酸配列が挙げられる。
【００２８】
ポリヌクレオチド（ａ）にコードされるβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体タンパク質は、その機能を損なわない限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列における１又は複数個、好ましくは１又は２〜２０個、より好ましくは１又は２〜８個、さらに好ましくは１又は２〜５個、特に好ましくは１又は２〜３個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入されたものであってもよい。アミノ酸が置換、欠失、又は挿入する部位としては、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体タンパク質上の、公知の機能ドメイン以外の部位が好ましい。β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体の公知の機能ドメインは、公知のデータベース、例えばNCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)等のデータベースから公知の検索方法により調べることができる。また、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体の機能を損なわない限り、アミノ酸が置換、欠失、又は挿入する部位は、公知の機能ドメイン上の部位でもよい。
【００２９】
ポリヌクレオチド（ｂ）は、ｃＡＭＰの結合によりレポーター活性が上昇するｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチド（ｂ）は、ｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質が発現可能な状態で、細胞に導入される。発現可能な状態とは、ポリヌクレオチド（ｂ）が、導入細胞において、適切な転写調節領域、具体的には適切なプロモーターの制御下に配置された状態である。プロモーターは、ポリヌクレオチド（ａ）の場合と同様のものを用いることができる。
【００３０】
ｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質は、ｃＡＭＰ結合ドメインとレポータータンパク質との融合タンパク質であって、ｃＡＭＰの結合によりレポーター活性が上昇するタンパク質である限り特に限定されない。ｃＡＭＰの結合によるレポーター活性の上昇の程度は特に限定されないが、ｃＡＭＰが結合していない場合のレポーター活性に比べて、例えば２倍、好ましくは４倍、より好ましくは１０倍、さらに好ましくは１００倍、よりさらに好ましくは１０００倍、特に好ましくは１００００倍以上であることができる。また、ｃＡＭＰが結合していない場合のレポーター活性は特に限定されないが、ｃＡＭＰ結合ドメインが融合していない対応するレポータータンパク質のレポーター活性に比べて、例えば５０％、好ましくは１０％、より好ましくは１％、さらに好ましくは０．１％、よりさらに好ましくは０．０１％、特に好ましくは０．００１％未満であることができる。
【００３１】
レポータータンパク質は特に限定されず、レポーター活性を有する公知のタンパク質を採用できる。その中でも、好ましくはルシフェラーゼ、より好ましくはホタルルシフェラーゼが挙げられる。
【００３２】
上記ｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質は公知の情報に従って設計することができる。例えば、レポータータンパク質がルシフェラーゼである場合は、特表２０１１−５２０４６６の記載に従って設計することができる。具体例としては、Ｎ末端側から、ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の第３５９〜５４４番アミノ酸からなる配列、ｃＡＭＰ結合ドメイン、ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の第４〜３５５番アミノ酸からなる配列の順に連結されたアミノ酸配列のタンパク質、、が挙げられ、より具体的な例としてはプロメガ社のpGloSensor-20F cAMP PlasmidのGloSensor cAMP coding regionにコードされるタンパク質が挙げられる。
【００３３】
ポリヌクレオチド（ａ）及び／又は（ｂ）には、その他の配列が含まれていてもよい。例えば、Hisタグ、Mycタグ、HAタグ、若しくはGFPタグ等のタンパク質タグをコードする配列又は種々の抗生物質に対する耐性遺伝子を発現することができるように設計された領域が含まれていてもよい。この様な耐性遺伝子が発現できるように設計された領域を含むポリヌクレオチド（ａ）及び／又は（ｂ）を用いることにより、ポリヌクレオチド（ａ）及び／又は（ｂ）を細胞に導入した後、耐性遺伝子が耐性を示す抗生物質含有培地中で細胞を培養することにより、ポリヌクレオチド（ａ）及び／又は（ｂ）が導入された細胞群のみを選択することができる。
【００３４】
ポリヌクレオチド（ａ）の調製は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、CMVプロモーター等のプロモーターを含み、且つ該プロモーターの３’側に遺伝子のコーディング配列を挿入するマルチクローニングサイトを有する公知の発現ベクターに、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体タンパク質をコードする配列を適切な制限酵素サイトを介して挿入することにより調製することができる。β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体のタンパク質をコードする配列の配列情報は、種々のデータベース上で公開されており、例えばNCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)等のデータベースから公知の検索方法によって得ることができる。目的の配列からなるポリヌクレオチドは、公知の方法、例えばPCRやDNA人工合成技術を利用して得ることができる。
【００３５】
ポリヌクレオチド（ｂ）の調製もポリヌクレオチド（ａ）と同様に行うことができる。ｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質をコードする配列は、公知の情報（例えば特開２０１１−５２０４６６等）の記載に従って設計したｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質のアミノ酸配列に基づいて決定することができる。また、ポリヌクレオチド（ｂ）としては、市販品を用いても良い。例えば、プロメガ社のpGloSensor-20F cAMP PlasmidやpGloSensor-22F cAMP Plasmidが挙げられる。
【００３６】
ポリヌクレオチド（ａ）及びポリヌクレオチド（ｂ）を導入する細胞は、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体を介したシグナルをｃＡＭＰ濃度の変化に変換する機構を有する細胞である限り限定されない。このような細胞の具体例としては、真核生物細胞を挙げることができ、好ましくは脊椎動物細胞、より好ましくは哺乳類動物細胞、より好ましくはヒト又はげっ歯類の細胞を挙げることができる。また、細胞の由来臓器としては、特に限定されるものではないが、腎臓細胞が好ましく挙げられる。具体的には、HEK-293細胞が特に好ましく挙げられる。
【００３７】
ポリヌクレオチド（ａ）及びポリヌクレオチド（ｂ）の細胞への導入は、公知の方法を利用して行うことができる。具体例としては、これらのポリヌクレオチドをリポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ウィルスを利用する方法等が挙げられる。細胞に導入されたポリヌクレオチド（ａ）及び／又はポリヌクレオチド（ｂ）の状態は特に限定されず、例えばプラスミド状態で一過的に細胞内に存在している状態でも、ゲノムに組み込まれた状態で細胞内に安定的に存在している状態でもよい。
【００３８】
上記本発明の細胞を後述のβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質のスクリーニング方法に使用することにより、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質を効率的に且つ簡便にスクリーニングすることができる。
【００３９】
２．本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、工程（ア）、（イ）、及び（ウ）を含む、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質のスクリーニング方法である。
【００４０】
２‐１．β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質のスクリーニング方法 
β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質とは、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体に作用し、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体の下流のシグナル伝達を調節する作用、具体的にはｃＡＭＰ濃度の増加又は減少をもたらす作用を有する物質である。β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質のスクリーニング方法によれば、被検物質の中から、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質をスクリーニングすることができる。
【００４１】
工程（ア）は、上記「１．本発明の細胞」で説明した、ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）が導入された細胞を、被検物質と接触させる工程である。
【００４２】
被検物質は、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質か否かをスクリーニングする対象物質である。被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。
【００４３】
ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）が導入された細胞を、被検物質と接触させる態様は、細胞膜上に被検物質が接触することができる限り特に限定されない。例えば、細胞を培養している培養液中に被検物質を溶解する態様や、細胞を培養している培養液を、予め被検物質を溶解した培養液に置換する態様が挙げられる。
【００４４】
培養液は、細胞を培養するための培地である。培養液としては、細胞を培養することができる限り特に限定されず、細胞の種類に応じて公知の培地を広く使用することができる。例えば、多種の細胞の培養に適していることが知られているDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）やRPMI培地等を使用することができる。培養する細胞の種類に応じて、培養液には種々の成分（糖、アミノ酸、塩類、金属成分等）を加えることができ、その濃度も細胞の培養に適している限り特に限定されない。
【００４５】
工程（イ）は、工程（ア）の後、ｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質のレポーター活性を測定し、該活性値を、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値と比較する工程である。
【００４６】
工程（ア）の後、レポーター活性を測定するまでの時間は、被検物質の作用が、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体を介してｃＡＭＰ量に変化を起こし得るのに十分な時間であれば特に限定されない。具体例としては、工程（ア）の後、５分〜２時間、好ましくは１０分〜１時間、より好ましくは１５〜３０分間が挙げられる。この間、細胞は、細胞の生存に適切な条件下、例えばCO2濃度5％、37℃、湿潤条件下でインキュベーションされる。
【００４７】
レポーター活性の測定は、レポータータンパク質の種類に応じて公知の方法に従って行うことができる。例えばレポータータンパク質がルシフェラーゼである場合は、工程（ア）の前に予め細胞膜透過性のルシフェリンを細胞と接触させておき、工程（ア）の後一定時間経過後に、細胞から発せられるルシフェラーゼの発光量を測定することによって行うことができる。
【００４８】
被検物質と接触させていない場合とは、工程（ア）において被検物質と接触させていない以外は、工程（ア）を経て工程（イ）に供する細胞と同じ又は同等の処理をした場合である。この場合のレポーター活性も、上記した被検物質と接触させた場合のレポーター活性と同様に測定することができる。
【００４９】
被検物質と接触させた場合のレポーター活性値と、被検物質と接触させていない場合のレポーター活性値との比較は、公知の方法で行うことができ、特に限定されない。例えば、活性値が発光の強さとして表れる場合は、発光の強さを発光値として測定し、該発光値の大小を比較すればよい。
【００５０】
工程（ウ）は、被検物質と接触させた場合のレポーター活性値と、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値とが有意に相違している場合に、被検物質をβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質として選択する工程である。
【００５１】
被検物質と接触させた場合のレポーター活性値と、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値とが有意に相違しているか否かの判断は、工程（イ）における比較の結果、一定の基準、例えば統計学的基準に基づき判断すればよい。具体的には、複数回測定してｐ値を求め、ｐ値が一定値以下、例えば０．０５以下である場合に有意に相違すると判断する方法等が挙げられる。判断の結果、有意に相違している場合は、被検物質をβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質として選択する。
【００５２】
このように選択されたβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質は、さらに殺虫剤又は昆虫制御剤候補物質として２次スクリーニングに供してもよい。
【００５３】
２‐２．β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストのスクリーニング方法
β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストとは、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体に作用し、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体の下流のシグナル伝達を活性化する作用、具体的にはｃＡＭＰ濃度の増加をもたらす作用を有する物質である。β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストのスクリーニング方法によれば、被検物質の中から、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストをスクリーニングすることができる。
【００５４】
β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストのスクリーニング方法は、前記した、工程（ア）、（イ）、及び（ウ）を含むβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質のスクリーニング方法と同様に行うことができる。但し、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストのスクリーニング方法においては、前記工程（ウ）が下記工程（エ）である。
【００５５】
工程（エ）は、被検物質と接触させた場合のレポーター活性値が、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値よりも有意に高い場合に、被検物質をβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストとして選択する工程である。
【００５６】
被検物質と接触させた場合のレポーター活性値が、被検物質と接触させない場合のレポーター活性値よりも有意に高いか否かの判断は、工程（ウ）と同様に行うことができる。判断の結果、有意に高い場合は、被検物質をβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストとして選択する。
【００５７】
このように選択されたβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストは、さらに殺虫剤又は昆虫制御剤候補物質として２次スクリーニングに供してもよい。
【００５８】
２‐３．β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アンタゴニストのスクリーニング方法
β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アンタゴニストとは、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体、オクトパミン及び／又はβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストに作用し、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体の下流のシグナル伝達を抑制する作用、具体的にはｃＡＭＰ濃度の低下をもたらす作用を有する物質である。β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アンタゴニストのスクリーニング方法によれば、被検物質の中から、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アンタゴニストをスクリーニングすることができる。
【００５９】
β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アンタゴニストのスクリーニング方法は、前記した、工程（ア）、（イ）、及び（ウ）を含むβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質のスクリーニング方法と同様に行うことができる。但し、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アンタゴニストのスクリーニング方法においては、前記工程（ア）が下記工程（オ）であり、前記工程（イ）が下記工程（カ）であり、前記工程（ウ）が下記工程（キ）である。
【００６０】
工程（オ）は、上記「１．本発明の細胞」で説明した、ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）が導入された細胞を、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニスト及び被検物質と接触させる工程である。
【００６１】
β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストとしては、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体に作用し、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体の下流のシグナル伝達を活性化する作用、具体的にはｃＡＭＰ濃度の増加をもたらす作用を有する物質を使用することができる。具体例としては、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体の内在リガンドであるオクトパミン、又は公知のβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストであるデメチルクロルジメホルム、ナファゾリン等を使用することができる。また、上記β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストのスクリーニング方法によって選択された被検物質を、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストとして使用することもできる。
【００６２】
培養液中で接触させる場合、培養液中のβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストの濃度としては、特に限定されるものではないが、例えば、10−１M〜10−１０M、好ましくは10−３M〜10−８M、より好ましくは10−５M〜10−７Mが挙げられる。
【００６３】
その他については、工程（ア）と同様である。
【００６４】
工程（カ）は、工程（オ）の後、ｃＡＭＰ結合ドメイン融合型レポータータンパク質のレポーター活性を測定し、該活性値を、被検物質と接触させずにβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストと接触させた場合のレポーター活性値と比較する工程である。
【００６５】
工程（カ）は、工程（イ）と同様に行うことができる。
【００６６】
工程（キ）は、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニスト及び被検物質と接触させた場合のレポーター活性値が、被検物質と接触させずにβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストと接触させた場合のレポーター活性値よりも有意に低い場合に、被検物質をβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アンタゴニストとして選択する工程である。
【００６７】
β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニスト及び被検物質と接触させた場合のレポーター活性値が、被検物質と接触させずにβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストと接触させた場合のレポーター活性値よりも有意に低いか否かの判断は、工程（ウ）と同様に行うことができる。判断の結果、有意に低い場合は、被検物質をβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アンタゴニストとして選択する。
【００６８】
このように選択されたβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アンタゴニストは、さらに殺虫剤又は昆虫制御剤候補物質として２次スクリーニングに供してもよい。
【実施例】
【００６９】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００７０】
実施例１．ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）が導入された細胞の作製
まず、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド（ａ）に相当）が導入された細胞を下記のように作製した。
【００７１】
細胞の培養は、10% FBS、100 unit/mlペニシリン、100 mg/ml硫酸ストレプトマイシンを含有するDMEM（10％FBS/DMEM）中、37℃5％CO2濃度の雰囲気下で行った。第1日目にヒト胎児腎細胞HEK293を、35mmディッシュに2×105/2mlになるように播種した。第2日目に、カイコβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体1タンパク質（配列番号１）をコードするポリヌクレオチドが発現可能な状態で連結されたpcDNA3ベクターを、4μl Lipofectamine(Invitrogen社)(2mg/ml)と1ml OPTI-MEM I減血清培地（Invitrogen社）の混合溶液と混ぜ、該混合物を、第1日目に播種した細胞の培地と置換し、37℃で5時間インキュベーションした。インキュベーション後、FBSを最終濃度20％になるように添加したDMEMを1ml添加し、再度インキュベーションした。第3日目に、培地を、G418を最終濃度1.0mg/mlになるように添加した10％FBS/DMEM（選択培地） 2mlと置換し、セレクションを開始した。その後、5日おきに選択培地を交換し、4週間セレクションを行った。このセレクション後に得られた細胞を、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド（ａ））が導入された細胞（BmOAR2細胞）とした。
【００７２】
次に、cAMP結合ドメイン融合型レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド（ｂ））が導入された細胞を下記のように作製した。
【００７３】
ポリヌクレオチド（ａ）が導入された細胞であるBmOAR2細胞を、10％FBS/DMEM中、37℃/5% CO2濃度下で培養した。その細胞にpGlosensorTM 20F cAMP plasmid（プロメガ製、cAMP結合ドメイン融合型レポータータンパク質の発現ベクター）を一過的にトランスフェクションした。トランスフェクションは、GeneJuice（Novagen社）を用い、そのユーザーマニュアルにしたがって行った。トランスフェクションから1日後の細胞を、ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）が導入された細胞（BmOAR2-pGlosensor細胞）とした。
【００７４】
実施例２．BmOAR2-pGlosensor細胞を用いた、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質のスクリーニング
β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体作用物質のスクリーニング例として、下記実施例２‐１、及び実施例２‐２に、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング例を示す。
【００７５】
実施例２‐１．β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストのスクリーニング
ポリヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）が導入された細胞であるBmOAR2-pGlosensor細胞を、96穴培養プレートに、24000/ウェル、100μl/ウェルとなるように播種し、培養した。一方で、被検物質としてβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体の内在リガンドであるオクトパミン（OA）、又は公知のβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストであるデメチルクロルジメホルム（DMCDM）、若しくはナファゾリン（Nap）を、DMSO溶液に溶解し、該溶解液を、内在リガンド又はアゴニスト濃度10−10、10−9、10−8、10−7、10−6、10−5、10−4、又は10−3M、及びDMSO濃度0.1％となるように無血清培地に添加してアゴニスト培地を作製した。播種から1日経過後、HEPESバッファーで希釈したGloSensorTM cAMP Reagentを各ウェルに2μl添加し、常温で2時間培養した。細胞の培地を捨て、上記アゴニスト培地100μl（/1ウェル）に置換し、さらに20分静置した。その後、各ウェルの発光量SH-9000Lab(コロナ電気製)カウンタを用いて1秒/ウェルで測定することにより、発光値を測定した。
【００７６】
上記発光の測定を3回行った平均値を図１に示す。図１上、横軸は、使用したアゴニスト培地中のオクトパミン（OA）、デメチルクロルジメホルム（DMCDM）、又はナファゾリン（Nap）の濃度を示し、縦軸は相対発光値を示す。相対発光値とは、アゴニスト培地としてオクトパミンを濃度10−6Mとなるように添加した無血清培地を使用した場合に測定された発光量を1とした値である。評価は、濃度10−10の場合の相対発光値を基準値として行った。
【００７７】
図１の結果より、被検物質として内在リガンドであるオクトパミンを使用した場合、オクトパミン濃度10−8〜10−7Mにおいて、基準値に比べて発光量が有意に増加しているのが見られた。このことより、本発明のスクリーニング方法は、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体の内在リガンドによるシグナル伝達を検出できることが示された。さらに、被検物質として、公知のアゴニストを使用した場合も、基準値に比べて発光量が有意に増加しているのが見られた。また、図１より、3種の被検物質のアゴニスト活性の強さの順は、活性の強い方から、デメチルクロルジメホルム、オクトパミン、ナファゾリンであった。この順は、3種の被検物質のアゴニスト活性の強さの順として知られている順と、同じであった。このことより、本発明のスクリーニング方法は、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体を介したアゴニストによるシグナル伝達を、正確に、かつ一定程度定量的に検出できることが示された。
【００７８】
実施例２‐２．β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アンタゴニストのスクリーニング
アゴニスト培地の代わりに、アンタゴニスト培地（被検物質として公知のβ-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アンタゴニストであるクロルプロマジンをDMSOに溶解した溶液をクロルプロマジン濃度10−４ Mになるように無血清培地に添加し、さらに内在リガンドであるオクトパミンDMSOに溶解した溶液を、オクトパミン濃度10−10、10−9、10−8、10−7、10−6、又は10−5 Mになるように無血清培地に添加して得られた培地）、又はントロール培地（クロルプロマジンを加えていない以外は上記アンタゴニスト培地と同様に得られた培地）を用いて、実施例２‐１と同様に行った。
【００７９】
発光の測定を3回行った平均値を図２に示す。図２中、「OA」はコントロール培地を用いた場合の結果を示し、「OA＋Chl」はアンタゴニスト培地を用いた場合の結果を示す。横軸は、使用したアンタゴニスト培地又はコントロール培地中のオクトパミンの濃度を示し、縦軸は相対発光値を示す。相対発光値とは、オクトパミン濃度が10−６ Mであるコントロール培地を使用した場合の発光量から、DMSO濃度を1％に調製した無血清培地を使用した場合の発光量を引いた発光量を1とした値である。
【００８０】
図２の結果より、オクトパミンと共に、クロルプロマジンを共存させると、オクトパミンが10−8 Mのときに、クロルプロマジン非添加時と比較して発光量が有意に減少することが示された。このことより、本発明のスクリーニング方法は、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体に対するアンタゴニストの作用を検出できることが示された。
【００８１】
比較例１及び２．ポリヌクレオチド（ｂ）に替えて他のレポーターをコードするポリヌクレオチドが導入された細胞の作製
実施例１において、pGlosensorTM 20F cAMP plasmid（cAMP結合ドメイン融合型レポータータンパク質の発現ベクター）に替えて、pMetLuc2-Reporter（クロンテック製、分泌型ルシフェラーゼの発現ベクター）のMCSにcAMP応答性プロモーターを挿入したプラスミド（比較例１）、或いはpSEAP2-Basic（クロンテック製、分泌型胎盤由来アルカリフォスファターゼの発現ベクター）のMCSにcAMP応答性プロモーターを挿入したプラスミド（比較例２）を用いる以外は、実施例１と同様に細胞を作製した（比較例１：BmOAR2-pMetLuc2細胞、比較例２：BmOAR2-pSEAP2細胞）。
【００８２】
比較例３．BmOAR2-pMetLuc2細胞を用いた、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストのスクリーニング
実施例２‐１において、BmOAR2-pGlosensor細胞に替えてBmOAR2-pMetLuc2細胞を用いて、Ready-To GlowTM Secreted Luciferase Reporter System（クロンテック製）のプロトコールに従う以外は、実施例２‐１と同様に行った。
【００８３】
測定を3回行った平均値を図３に示す。横軸は、アゴニスト培地中のオクトパミン（OA）の濃度を示し、縦軸は相対発光値を示す。相対発光値とは、オクトパミン濃度10−6Mの場合に測定された発光量を1とした値である。
【００８４】
図３の結果より、各実験間で相対発光値のバラつきが大きかった。したがって、このスクリーニング方法では、擬陽性が多く出ると考えられる。さらに、アゴニストによるシグナル伝達を定量的に検出することも不可能であると考えられる。
【００８５】
比較例４．BmOAR2-pSEAP2細胞を用いた、β-アドレナリン作動性様オクトパミン受容体アゴニストのスクリーニング
実施例２‐１において、BmOAR2-pGlosensor細胞に替えてBmOAR2-pSEAP2細胞を用いて、Great EscAPeTM SEAP Reporter System 3（クロンテック製）のプロトコールに従う以外は、実施例２‐１と同様に行った。
【００８６】
測定を3回行った平均値を図４に示す。横軸は、アゴニスト培地中の各アゴニストの濃度を示し、縦軸は相対発光値を示す。相対発光値とは、オクトパミン濃度10−5Mの場合に測定された発光量を100とした値である。
【００８７】
図４の結果より、アゴニスト濃度と相対発光値との相関が全く見られなかった。したがって、このスクリーニング方法では、擬陽性が多く出ると考えられた。さらに、アゴニストによるシグナル伝達を定量的に検出することも不可能であると考えられた。
【図１】
2015109814.tif 000002
【図２】
2015109814.tif 000003
【図３】
2015109814.tif 000004
【図４】
2015109814.tif 000005
【配列表】
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