(57)【要約】【課題】ＭＥＲＳ−ＣｏＶの生体細胞侵入を防止することができるＭＥＲＳ感染症予防治療剤の提供。【解決手段】ＣＤ２６のアミノ酸番号２４８〜４４９を認識する抗ＣＤ２６モノクローナル抗体、そのキメラ抗体又はそのヒト化抗体を有効成分とするＭＥＲＳコロナウイルス感染症予防又は治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２６のアミノ酸番号２４８〜４４９を認識する抗ＣＤ２６モノクローナル抗体、そのキメラ抗体又はそのヒト化抗体を有効成分とするＭＥＲＳコロナウイルス感染症予防又は治療剤。
【請求項２】
前記抗ＣＤ２６モノクローナル抗体が、２Ｆ９（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６９９）又はｓ６０４０６９．ＹＳＴ−ｐＡＢＭＣ１４９（ＰＴＡ−７６９５）が産生する抗体である請求項１記載のＭＥＲＳコロナウイルス感染症予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中東呼吸器症候群コロナウイルス（Middle East respiratory syndrome coronavirus:ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）感染症の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＥＲＳは、２０１２年に中東地域で発生した新型コロナウイルス感染症であり、ＳＡＲＳに似ているものの、主な感染部位は下気道であり、その致死率が５０％以上と高い感染症である。ＭＥＲＳの原因は、ＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）であり、現在有効な治療法やワクチンは見出されていない。
【０００３】
最近、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのスパイクタンパク質Ｓ１は、ヒトの宿主細胞にウイルスが侵入するのに必要であることが報告された（非特許文献１、２）。さらに、最近では、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＳ１ドメインを介して、ＭＥＲＳ−ＣｏＶの機能的受容体として同定された（非特許文献３）。この受容体は、コウモリやヒトなどの異なる種間においても保持され、ＭＥＲＳ−ＣｏＶの広範囲の宿主域を部分的に説明する。ＤＰＰＩＶ（ＥＣ  ３．４．１４．５）は、ＣＤ２６としても知られており、その細胞外ドメインにジペプチダーゼ活性を有する１１０−ｋＤａの表面糖蛋白である（非特許文献４）。ＣＤ２６／ＤＰＰＩＶは、Ｔリンパ球、気管支粘膜、あるいは、近位細管の刷子縁を含むほとんどの細胞において広く発現される、多機能性細胞表面たんぱく質である。また、血清や、尿、精液、あるいは胸水などの他の体液中に、切断型（ｓＣＤ２６）で存在する。ＣＤ２６やｓＣＤ２６のこのような分散は、ヒトにおけるＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の全身播種の役割を担っている（非特許文献５〜７）。そのため、ＭＥＲＳ−ＣｏＶの有効な治療法は、呼吸器系、腎臓、腸のようなＣＤ２６の発現する臓器（器官）にＭＥＲＳ−ＣｏＶが侵入するのをブロックするだけでなく、血中や他の体液におけるＴ細胞やｓＣＤ２６に関連するＭＥＲＳ−ＣｏＶの循環を阻害するために必要とされる。さらに、最近では、Ｓタンパク質中の受容体結合ドメインが、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓタンパク質の２３１アミノ酸断片にマップされた（残基数３５８−５８８）（非特許文献８）。しかしながら、計算による予測によると、ＣＤ２６受容体中の結合領域は、生物学的実験によっていまだに解読されていないと報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】J. Infect. 66, 464-466(2012)
【非特許文献２】J. Virol. 87, 5502-5511(2013)
【非特許文献３】Nature 495, 251-254(2013)
【非特許文献４】J. Immunol. 149, 481-486(1992)
【非特許文献５】N. Engl. J. Med. 368, 2487-2494(2013)
【非特許文献６】The Lancet Infectious Diseases,13, 745-751(2011)
【非特許文献７】Lancet, 381, 2265-2272(2013)
【非特許文献８】Journal of Vivology,87, 156-158(2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、いまだ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶの生体内侵入を防止できる薬剤は未だ見出されていない。
従って、本発明の課題は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶの生体細胞侵入を防止することができるＭＥＲＳ感染症予防治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、生体に広く分布しているＣＤ２６に対する抗体（抗ＣＤ２６抗体）のうち、抗ＣＤ２６モノクローナル抗体に着目し、種々のモノクローナル抗体を使用してＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染防御能及びそのモノクローナル抗体の特性について検討したところ、ＣＤ２６アミノ酸配列の特定の部位を認識する抗ＣＤ２６モノクローナル抗体、そのキメラ抗体又はそのヒト化抗体が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＣＤ２６発現細胞に対する結合を強力に阻害することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔８〕を提供するものである。
【０００８】
〔１〕ＣＤ２６のアミノ酸番号２４８〜４４９を認識する抗ＣＤ２６モノクローナル抗体、そのキメラ抗体又はそのヒト化抗体を有効成分とするＭＥＲＳコロナウイルス感染症予防又は治療剤。
〔２〕前記抗ＣＤ２６モノクローナル抗体が、２Ｆ９（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６９９）又はｓ６０４０６９．ＹＳＴ−ｐＡＢＭＣ１４９（ＰＴＡ−７６９５）が産生する抗体である〔１〕記載のＭＥＲＳコロナウイルス感染症予防又は治療剤。
〔３〕ＣＤ２６のアミノ酸番号２４８〜４４９を認識する抗ＣＤ２６モノクローナル抗体、そのキメラ抗体又はそのヒト化抗体を投与することを特徴とするＭＥＲＳコロナウイルス感染症の予防又は治療方法。
〔４〕前記抗ＣＤ２６モノクローナル抗体が、２Ｆ９（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０６９９）又はｓ６０４０６９．ＹＳＴ−ｐＡＢＭＣ１４９（ＰＴＡ−７６９５）が産生する抗体である〔３〕記載のＭＥＲＳコロナウイルス感染症の予防又は治療方法。
〔５〕ＭＥＲＳコロナウイルス感染症を予防又は治療するためのＣＤ２６のアミノ酸番号２４８〜４４９を認識する抗ＣＤ２６モノクローナル抗体、そのキメラ抗体又はそのヒト化抗体。
〔６〕前記抗ＣＤ２６モノクローナル抗体が、２Ｆ９（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６９９）又はｓ６０４０６９．ＹＳＴ−ｐＡＢＭＣ１４９（ＰＴＡ−７６９５）が産生する抗体である〔５〕記載の抗体。
〔７〕ＣＤ２６のアミノ酸番号２４８〜４４９を認識する抗ＣＤ２６モノクローナル抗体、そのキメラ抗体又はそのヒト化抗体の、ＭＥＲＳコロナウイルス感染症予防又は治療剤製造のための使用。
〔８〕前記抗ＣＤ２６モノクローナル抗体が、２Ｆ９（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６９９）又はｓ６０４０６９．ＹＳＴ−ｐＡＢＭＣ１４９（ＰＴＡ−７６９５）が産生する抗体である〔７〕記載の使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体を用いれば、生体内に広く分布している細胞に対するＭＥＲＳ−ＣｏＶの侵入を防御でき、ＭＥＲＳ感染症が予防及び／又は治療できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】抗ＣＤ２６モノクローナル抗体の種々のクローン又はコントロールマウスＩｇＧの存在下にＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃで染色する代表的なヒストグラムを示す。
【図２】種々の濃度の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体２Ｆ９（赤色のヒストグラム）又はコントロールマウスＩｇＧ（黒色のヒストグラム）の存在下にＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃで染色する代表的なヒストグラムを示す。
【図３】種々の濃度の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体１Ｆ７（赤色のヒストグラム）又はコントロールマウスＩｇＧ（黒色のヒストグラム）の存在下にＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃで染色する代表的なヒストグラムを示す。
【図４】種々の濃度の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体ＹＳ１１０（赤色のヒストグラム）又はコントロールマウスＩｇＧ（黒色のヒストグラム）の存在下にＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃで染色する代表的なヒストグラムを示す。
【図５】種々の濃度の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体９Ｃ１１（赤色のヒストグラム）又はコントロールマウスＩｇＧ（黒色のヒストグラム）の存在下にＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃで染色する代表的なヒストグラムを示す。
【図６】種々の濃度の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体（赤色のヒストグラム）、２Ｆ９又はコントロールマウスＩｇＧ（黒色のヒストグラム）の存在下にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識化ＡＤＡで染色する代表的なヒストグラムを示す。
【図７】種々の濃度の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体（赤色のヒストグラム）、１Ｆ７又はコントロールマウスＩｇＧ（黒色のヒストグラム）の存在下にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識化ＡＤＡで染色する代表的なヒストグラムを示す。
【図８】種々の濃度の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体（赤色のヒストグラム）、ＹＳ１１０又はコントロールマウスＩｇＧ（黒色のヒストグラム）の存在下にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識化ＡＤＡで染色する代表的なヒストグラムを示す。
【図９】ＡＤＡ結合領域の欠失したヒトＣＤ２６で安定的にトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞（ＪＫＴ−ｈＣＤ２６−ＡＤＡ-）へのＡＤＡ又は抗ＣＤ２６ｍＡｂ  １４Ｄ１０（右側のパネル）の結合を表す代表的なヒストグラム（ａ）、及びＪＫＴ−ｈＣＤ２６−ＡＤＡ-のＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃで染色する代表的なヒストグラム（ｂ）を示す。
【図１０】ＣＤ２６ｃＤＮＡの欠失領域（左側）及びＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓｌ−Ｆｃ、２Ｆ９又はＹＳ１１０を染色する代表的なヒストグラム（右側）を示す。
【図１１】抗ＣＤ２６モノクローナル抗体によるＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染阻害効果を示す。
【図１２】全長ヒトＣＤ２６を遺伝子導入したＪｕｒｋａｔ細胞（ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ）又はベクターコントロール（ＪＫＴ−Ｍｏｃｋ）のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識抗ＣＤ２６ｍＡｂ  ２Ｆ９を用いた染色のヒストグラムを示す（赤ヒストグラム）。
【図１３】ＪＫＴ−Ｍｏｃｋ（上パネル）又はＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ（下パネル）を用いた種々の濃度のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ結合ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ（赤ヒストグラム）又はコントロール組み換え体Ｆｃ（グレーヒストグラム）を用いた染色のヒストグラムを示す。
【図１４】種々の濃度の２Ｆ９（赤ヒストグラム）又はコントロールマウスＩｇＧ（黒ヒストグラム）の存在下における抗ＣＤ２６ｍＡｂ  １４Ｄ１０を用いた染色のヒストグラムを示す。
【図１５】（Ａ）種々の濃度の未標識ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ又はコントロールＦｃの存在下におけるＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃを用いた染色のヒストグラムを示す。（Ｂ）種々の濃度のＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ又はコントロールＦｃの存在下における抗ＣＤ２６ｍＡｂ  １４Ｄ１０を用いた染色のヒストグラムを示す。
【図１６】ＡＤＡ（上パネル）又は抗ＣＤ２６ｍＡｂ  １４Ｄ１０（下パネル）のＪＫＴ−Ｍｏｃｋ（左パネル）又はＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ（右パネル）への結合のヒストグラムを示す。
【図１７】種々の濃度の外因性ＡＤＡ（赤ヒストグラム）又は溶媒コントロール（担体）としてＰＢＳ（黒ヒストグラム）の存在下におけるＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃを用いた染色のヒストグラムを示す。
【図１８】種々の濃度の外因性ＡＤＡ（赤ヒストグラム）又は溶媒コントロール（担体）としてＰＢＳ（黒ヒストグラム）の存在下における２Ｆ９を用いた染色のヒストグラムを示す。
【図１９】種々の濃度の外因性ＡＤＡ（赤ヒストグラム）又は溶媒コントロール（担体）としてＰＢＳ（黒ヒストグラム）の存在下における抗ＣＤ２６ｍＡｂ  １４Ｄ１０を用いた染色のヒストグラムを示す。
【図２０】２Ｆ９を添加するとともに、種々の濃度の外因性ＡＤＡ（赤ヒストグラム）又は溶媒コントロール（担体）としてＰＢＳ（黒ヒストグラム）の存在下におけるＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃを用いた染色のヒストグラムを示す。
【図２１−１】ヒトＣＤ２６の全アミノ酸配列を示す。
【図２１−２】ヒトＣＤ２６の全アミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のＭＥＲＳ感染症予防又は治療薬の有効成分は、ＣＤ２６のアミノ酸番号２４８〜４４９を認識する抗ＣＤ２６モノクローナル抗体、そのキメラ抗体又はそのヒト化抗体である。当該抗ＣＤ２６モノクローナル抗体は、例えば、ＣＤ２６を抗原として用いて得られたモノクローナル抗体から、選択する方法、あるいは前記アミノ酸配列を抗原として用いて得ることができる。
【００１２】
モノクローナル抗体は、ＣＤ２６又は前記アミノ酸配列を有するペプチドを免疫した動物（例えばマウス、ラット、ウサギなど）から脾臓細胞を採取し、ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製することにより得ることができる。ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、またはラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、前記アミノ酸配列を認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、適切な条件下で培養し、分泌された抗体を回収し、当該技術分野においてよく知られる方法、例えばイオン交換カラム、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製することができる。あるいは、ゼノマウス株を用いてヒト型モノクローナル抗体を製造してもよい（Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３，１９９９；Ｗｅｌｌｓ，Ｅｅｋ，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２０００  Ａｕｇ；７（８）：Ｒ１８５−６を参照）。また、免疫を行わないファージディスプレイに基づいたモノクローナル抗体の作製も現在行われており、本発明のモノクローナル抗体はこれらの方法のいずれで製造されてもかまわない。
【００１３】
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号第９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１−８５６．）。
【００１４】
本発明の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体は、ＣＤ２６のアミノ酸番号２４８〜４４９を認識する抗ＣＤ２６モノクローナル抗体であるが、その具体例としては、本発明者らが先に報告した２Ｆ９、ＹＳ１１０、１Ｆ７が好ましく、２Ｆ９、ＹＳ１１０がより好ましい。これらのモノクローナル抗体は、例えば（The Journal of Immunology, 159, 6070-6076(1997)、Molecular Immunology 35, 13-21(1998)、Clinical Cancer Research, Vol.7, 2031-2040(2001)、Clinical Cancer Research, 12(11), 3470-3476(2006)、Clinical Cancer Research, 13(14), 4191-4200(2007)、British Journal of Haematology, 162, 263-277(2013)）に記載の方法に従って製造することができる。ここでＹＳ１１０はヒト化抗体であり、これを産生する大腸菌（ヒトＣＤ２６ｃＤＮＡに対するヒト化モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを有するＤＨ５α大腸菌）ｓ６０４０６９．ＹＳＴ−ｐＡＢＭＣ１４９は、ＰＴＡ−７６９５として米国のＡＴＣＣに寄託されており、２Ｆ９を産生するハイブリドーマ２Ｆ９はＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６９９として独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されている。
また、２Ｆ９はＣＤ２６のアミノ酸番号３５９〜４４９を認識するモノクローナル抗体であり、ＹＳ１１０はＣＤ２６のアミノ酸番号２４８〜３５８を認識するモノクローナル抗体である。
【００１５】
前記の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体は、後記の実施例に示すように、ヒトのＣＤ２６発現細胞に対するＭＥＲＳ−ＣｏＶの結合を顕著に阻害する。一方、ＣＤ２６は、呼吸器、腎臓、腸等の臓器だけでなく、Ｔリンパ球などの体液中の細胞表面にも存在する。従って、本発明のモノクローナル抗体を用いれば、下気道等の臓器におけるＭＥＲＳ−ＣｏＶの侵入を防止し、かつ循環系を介したＭＥＲＳ−ＣｏＶの循環も阻害することができることから、ＭＥＲＳ感染症予防及び／又は治療が可能となる。
【００１６】
本発明のＭＥＲＳ感染症予防治療剤は、抗ＣＤ２６モノクローナル抗体を、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。
【００１７】
経口投与用には、抗ＣＤ２６モノクローナル抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、錠剤、丸薬、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化することができる。
【００１８】
非経口投与用には、抗ＣＤ２６モノクローナル抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、坐剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、抗ＣＤ２６モノクローナル抗体を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性または水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、抗ＣＤ２６モノクローナル抗体を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液または懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、抗ＣＤ２６モノクローナル抗体を粉末化し、ラクトースまたはデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、抗ＣＤ２６モノクローナル抗体をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の予防治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
【００１９】
抗ＣＤ２６モノクローナル抗体の投与量は、患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば成人１日あたり１μｇ〜５００ｍｇであるのが好ましい。
【００２０】
本発明のＭＥＲＳ感染症予防治療剤は、通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与される。
【実施例】
【００２１】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
【００２２】
（材料と方法）
（１）抗体と試薬
４Ｇ８、１Ｆ７、２Ｆ９、９Ｃ１１、１６Ｄ４Ｂ又は１４Ｄ１０といった抗ヒトＣＤ２６マウスモノクローナル抗体の種々のクローン及びヒト化抗ＣＤ２６モノクローナル抗体ＹＳ１１０は、Mol. Immunol. 35, 13-21(1998)に従って製造した。ヤギポリクローナル抗ＣＤ２６抗体は、Ｒ＆Ｄシステムズ（ミネアポリス、ミネソタ）から購入した。キメラ融合タンパク質ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ（もとの名称ｈＣｏＶ−ＥＭＣ  Ｓ１−Ｆｃ）はＢｏｓｃｈ研究室で開発された（Nature 495, 251-254(2013)）。ヒトＦｃ（ヒトイムノグロブリンＧ１のＦｃ領域）組換えタンパク質は、Biochem. Biophys. Res. Commun. 386, 327-332(2009)及びJ. Biol. Chem. 282,10117-10131(2007)に従って製造した。精製アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）は、シグマアルドリッチ（セントルイス、ミズーリ）から購入した。色素（Ａｌｅｘａ  ４８８又はＡｌｅｘａ  ６４７）によるモノクローナル抗体、ＡＤＡ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ又はヒトＦｃの標識は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア）又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ）を用い、使用説明書に従って行った。
【００２３】
（２）細胞
ＣＤ２６陰性親Ｊｕｒｋａｔ細胞株、ＣＯＳ−１細胞及びＨｕｈ−７細胞は、ＡＴＣＣより入手した。全長ヒトＣＤ２６を安定的に導入したＪｕｒｋａｔ細胞（ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ）又はＡＤＡ結合部位を欠失したヒトＣＤ２６を安定的に導入したＪｕｒｋａｔ細胞（ＪＫＴ−ｈＣＤ２６−ＡＤＡ-）は、J. Immunol. 149, 481-486(1992)、Mol. Immunol. 35, 13-21(1998)、J. Immunol. 159, 6070-6076(1997)に従って製造した。ＪＫＴ−ｈＣＤ２６−ＡＤＡ-細胞は、マウスＣＤ２６の３４０番目から３４４番目のアミノ酸を、ヒトＣＤ２６の相当する部分の代わりに有している。Ｊｕｒｋａｔ細胞又はＣＯＳ−１細胞は、１０％熱不活性化胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）（ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、ニューヨーク（ネブラスカ））を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ）で培養した。ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ又はＪＫＴ−ｈＣＤ２６−ＡＤＡ-は、ペニシリン、ストレプトマイシン及びＧ４１８（５０μｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ）を添加した１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。Ｈｕｈ−７細胞は、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（ライフテクノロジーズ）で培養した。
【００２４】
（３）フローサイトメトリー（ＦＣＭ）分析
ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−ＦｃのＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴへの結合阻害アッセイのため、種々の抗ヒトＣＤ２６モノクローナル抗体（染色バッファー（１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１％ＮａＮ3含有ＰＢＳ）中、表記濃度で使用）をＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ（１(１０5／サンプル）と４℃で３０分間インキュベートした。細胞は、氷冷染色バッファーで３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ（染色バッファー中５μｇ／ｍＬ）又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ヒトＦｃを用い、４℃で３０分間染色した。細胞は、氷冷染色バッファーで３回洗浄し、５００μＬのＦＣＭバッファー（１％ホルマリン含有ＰＢＳ）に懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス）を用いて分析した。ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−ＦｃのＣＤ２６中のＡＤＡ結合領域への結合阻害アッセイのため、ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ又はＪＫＴ−ｈＣＤ２６−ＡＤＡ-（１(１０5／サンプル）を精製ＡＤＡ（染色バッファー中、表記濃度で使用）と３７℃で３０分間インキュベートした。細胞は、氷冷染色バッファーで３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ、ヒトＦｃ、抗ヒトＡＤＡモノクローナル抗体及び／又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識抗ＣＤ２６モノクローナル抗体、マウスＩｇＧアイソタイプコントロールを用い、４℃で３０分間染色した。細胞は、氷冷染色バッファーで３回洗浄し、５００μＬのＦＣＭバッファーに懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス）を用いて分析した。
【００２５】
実施例１
（１）抗ＣＤ２６モノクローナル抗体の種々のクローン又はコントロールマウスＩｇＧの存在下にＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃで染色し、抗ＣＤ２６モノクローナル抗体の各クローンが、ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ細胞へのＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃの結合性を阻害するか否かを検討した。
ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ細胞を、４℃の条件下、各々の抗ＣＤ２６（マウスモノクローナル抗体；４Ｇ８、１Ｆ７、１４Ｄ１０、２Ｆ９、１６Ｄ４Ｂ、９Ｃ１１又はヒト化ｍＡｂ；ＹＳ１１０）（赤色のヒストグラム）又はコントロールＩｇＧ（黒色のヒストグラム）（それぞれ１０μｇ／ｍＬ）で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識化ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ（５μｇ／ｍＬ）で染色した。
染色ヒストグラムを図１に示す。図１中、グレー色のヒストグラムは、アイソタイプコントロールでの染色を示している。図のヒストグラムにおいて、グレー色のヒストグラムに対して赤色のヒスドラムがずれている場合にブロックしていることを示す。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識化ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、棒グラフで示した。１Ｆ７又はＹＳ１１０がＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃの結合を部分的にブロックし（＊）、そして２Ｆ９が完全にブロックした（＊＊）。３回の実験の代表的な結果を、平均ＭＦＩ±ｓ．ｅ．ｍ．として示した（両側スチューデントｔ検定、＊、＊＊ｐ＜０．０５対コントロールＩｇＧ）。
【００２６】
（２）種々の濃度の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体２Ｆ９又はコントロールマウスＩｇＧの存在下にＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃで染色し、２Ｆ９による、ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ細胞へのＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃの結合阻害性を検討した。ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ細胞を、４℃の条件下、種々の濃度の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体２Ｆ９又はコントロールＩｇＧで３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識化ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ（５μｇ／ｍＬ）で染色した。
染色ヒストグラムを図２に示す。図２中、グレー色のヒストグラムは、アイソタイプコントロールでの染色を示している。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識化ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−ＦｃのＭＦＩを、棒グラフで示した。３種の異なる実験の代表的な結果を、平均ＭＦＩ±ｓ．ｅ．ｍ．として示した（両側スチューデントｔ検定、＊ｐ＜０．０５ｖｓ．対応のコントロールＩｇＧ）。０μｇ／ｍＬのプレインキュベートされたコントロールＩｇＧ又は２Ｆ９の条件下、黒色のバーと赤色のバーの両方について、同じデータを用いてプロットした。
【００２７】
（３）種々の濃度の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体１Ｆ７、ＹＳ１１０、９ｃ１１又はコントロールマウスＩｇＧの存在下にＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃで染色し、１Ｆ７、ＹＳ１１０又は９Ｃ１１による、ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ細胞へのＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃの結合阻害性を検討した。ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ細胞を、４℃の条件下、種々の濃度の、標識されていない１Ｆ７、ＹＳ１１０、９Ｃ１１又はコントロールＩｇＧで３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識化ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ（５μｇ／ｍＬ）で染色した。
染色ヒストグラムを図３〜図５に示す。図３〜５中のグレー色のヒストグラムは、アイソタイプコントロールでの染色を示している。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識化ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−ＦｃのＭＦＩを、棒グラフで示した。３種の異なる実験の代表的な結果を、平均ＭＦＩ±ｓ．ｅ．ｍ．として示した（両側スチューデントｔ検定、＊ｐ＜０．０５ｖｓ．対応コントロールＩｇＧ）。０μｇ／ｍＬのプレインキュベートされたコントロールＩｇＧ又は抗ＣＤ２６ｍＡＢの条件下、黒色のバーと赤色のバーの両方について、同じデータを用いてプロットした。
【００２８】
（４）上記（１）〜（３）の結果から、抗ＣＤ２６モノクローナル抗体２Ｆ９、１Ｆ７、ＹＳ１１０及び９Ｃ１１はＣＤ２６を発現する細胞へのＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃの結合を阻害することがわかった。このうち、２Ｆ９、１Ｆ７及びＹＳ１１０の結合阻害性が強く、特に２Ｆ９は強力に結合を阻害することがわかった。
【００２９】
実施例２
ＣＤ２６のアデノシン・デアミナーゼ（ＡＤＡ）の結合領域の存在下における、ＣＤ２６発現細胞とＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃとの結合に対する抗ＣＤ２６モノクローナル抗体の作用を検討した。
【００３０】
（１）ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ細胞を、４℃の条件下、種々の濃度の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体又はコントロールＩｇＧで３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識化ＡＤＡ（１０μｇ／ｍＬ）で染色した。
【００３１】
結果を図６〜図８に示す。グレー色のヒストグラムは、アイソタイプコントロールでの染色を示している。データは、３回のそれぞれ独立した実験を代表するものであり、同様の結果が得られた。
【００３２】
ＡＤＡ結合領域の欠失したヒトＣＤ２６で安定的にトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞（ＪＫＴ−ｈＣＤ２６−ＡＤＡ-）へのＡＤＡ又は抗ＣＤ２６モノクローナル抗体１４Ｄ１０の結合を表す代表的なヒストグラムを図９の（ａ）（左側）に示す。ＡＤＡの結合は観察されなかったが、ＣＤ２６の発現を１４Ｄ１０によって検出した。
【００３３】
（２）ＪＫＴ−ｈＣＤ２６−ＡＤＡ-細胞を、表示された濃度条件下、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識化ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ（赤色のヒストグラム）で染色した。
結果を図９の（ｂ）（右側）に示す。グレー色のヒストグラムは、アイソタイプコントロールとして、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識化組み換えＦｃでの染色を示している。データは、３回のそれぞれ独立した実験を代表するものであり、同様の結果が得られた。
【００３４】
（３）（１）及び（２）から、ＡＤＡの存在により、Ｓ１−Ｆｃの結合を部分的にブロックするが、２Ｆ９と合わせるとＳ１−Ｆｃの結合はが完全にブロックされた。２Ｆ９はＡＤＡの存在により、ＣＤ２６との結合は部分的にブロックされた。
【００３５】
実施例３
ヒトＣＤ２６欠失変異体を用いたＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−ＦｃのＣＤ２６における結合領域の評価
（１）ヒトＣＤ２６のＭＥＲＳ−ＣｏＶ結合に関与する領域を決定するため、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−ＦｃのＣＤ２６欠失変異体への結合を、ＦＣＭ、次いで所定の欠失を含むＣＤ２６  ｃＤＮＡコンストラクトと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ベクターのＣＯＳ−１細胞への一過性コトランスフェクションにより分析した。Mol. Immunol. 35, 13-21(1998)で報告したように、ヒトＣＤ２６  ｃＤＮＡコンストラクトのＣ末欠失変異体として、Ｎｃｏ  Ｉ制限酵素サイトを用いてＣ末の７４０−７６６番目のアミノ酸で示されるドメインを欠失させたもの、Ｎｈｅ  Ｉ制限酵素サイトを用いて５７８番目以降のアミノ酸で示されるドメインを欠失させたもの、Ｂｓｐｅ  Ｉ制限酵素サイトを用いて４５０番目以降のアミノ酸で示されるドメインを欠失させたもの、Ｓｔｕ  Ｉ制限酵素サイトを用いて３５９番目以降のアミノ酸で示されるドメインを欠失させたもの、及びＰｓｔ  Ｉ制限酵素サイトを用いて２４８番目以降のアミノ酸で示されるドメインを欠失させたものを作製した。これらのｃＤＮＡは、フレームをあわせてｐｃＤＬ−ＳＲα発現ベクターにライゲーションした（Mol. Cell Biol. 8, 466-472(1988)）。ＧＦＰ発現ベクターｐＥＢ６−ＣＡＧ−ＧＦＰは、三輪佳宏博士（筑波大学、つくば市、日本）より頂いた（Biochem. Biophys. Res. Commun. 264, 938-943(1999)）。ｐｃＤＬ−ＳＲαに組み込んだ各ＣＤ２６欠失コンストラクトは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  ｒｅａｇｅｎｔ（ライフテクノロジーズ）を用いて、ｐＥＢ６−ＣＡＧ−ＧＦＰとともにＣＯＳ−１細胞にコトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、細胞は、５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有氷冷ＰＢＳで剥離して回収し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４９標識ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ、２Ｆ９、ＹＳ１１０又はヒトＦｃ（染色バッファー中５μｇ／ｍＬ）コントロールを用いて４℃で３０分間染色した。細胞は、氷冷染色バッファーで３回洗浄し、５００μＬのＦＣＭバッファー中に懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒによる分析に供した。
【００３６】
（２）図１に記載の欠失を有するＣＤ２６  ｃＤＮＡを、材料と方法で記載のように、ＣＯＳ−１細胞に対して、ＧＦＰ発現プラスミドとコトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識化ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ、２Ｆ９又はＹＳ１１０（それぞれ５μｇ／ｍＬ）で染色した。
【００３７】
結果を図１０に示す。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７のヒストグラムは、得られた全ての細胞の中で、ＧＦＰポジティブな細胞をゲートすることによって得られた。３回の実験による結果は、全長±ｓ．ｅ．ｍ．に対してポジティブ細胞％として示されている（各底部パネルの棒グラフ）。縦線は、マイナスとプラスの強度の間の境界を示している。
その結果、ＭＥＲＳ−ＣｏＶとの結合を阻害する抗ＣＤ２６モノクローナル抗体のＣＤ２６認識領域はアミノ酸番号２４８〜４４９であることが明らかになった。なお、ＣＤ２６の全アミノ酸配列を図２１−１、図２１−２及び配列番号１に示す。
Mol. Immunol. 35, 13-21(1998)で報告したように、２Ｆ９又はＹＳ１１０（１Ｆ７に類似するエピトープを認識する）によって特定されたエピトープは、それぞれ３５９〜４４９番目又は２４８〜３５８番目のアミノ酸に位置していた。一方、図１０に示すように、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃとの結合に関与するＣＤ２６エピトープは、２Ｆ９エピトープと同様に、３５８番目のアミノ酸近傍に位置すると考えられる。計算予測から得られた領域とは異なるが、上記検討の結果は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−ＦｃのＣＤ２６との結合には、ＣＤ２６のＡＤＡ結合領域及び付加的部位が関わっていることを示唆する。
【００３８】
実施例４
抗ＣＤ２６モノクローナル抗体２Ｆ９によるＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の阻害を検討した。
Ｈｕｈ−７細胞を、４０μｇ／ｍＬの濃度条件下、ノーマルマウスＩｇＧ（コントロールＩｇＧ）又は種々の抗ＣＤ２６ｍＡｂ（４Ｇ８、１Ｆ７、２Ｆ９、１６Ｄ４Ｂ、９Ｃ１１）、ヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ（ＹＳ１１０）又は抗ＣＤ２６ヤギポリクローナル抗体（ｐＡｂ）で０．５時間プレインキュベートしてから、ＭＥＲＳ−ＣｏＶウイルスを接種したが（１時間）、全ては室温条件下で行った。Ｍｏｃｋインキュベート細胞（コントロール）を、対照として採用した。３７℃で８時間インキュベーションした後、感染した細胞を、免疫蛍光検査法にて検出し、感染を定量化（対照に対して）した。
【００３９】
結果を図１１に示す。２回の独立した実験を行い、一方の代表的な実験から得られたデータを示す。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示している。ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の部分的な阻害が、１Ｆ７又はＹＳ１１０にて観察され（＊）、一方、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の完全な阻害が、２Ｆ９又はｐＡｂにて観察された（＊＊）。
【００４０】
実施例５
（１）親Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＣＤ２６ＪｕｒｋａｔトランスフェクタントにおけるＣＤ２６発現
全長ヒトＣＤ２６を遺伝子導入したＪｕｒｋａｔ細胞（ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ）又はベクターコントロール（ＪＫＴ−Ｍｏｃｋ）のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識抗ＣＤ２６ｍＡｂ  ２Ｆ９を用いた染色のヒストグラムを図１２に示す（赤ヒストグラム）。ＣＤ２６はＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴで発現するが、ＪＫＴ−Ｍｏｃｋでは発現しない。３回の実験の結果を示す。
（２）ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−ＦｃのＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴへの結合
ＪＫＴ−Ｍｏｃｋ（上パネル）又はＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ（下パネル）を用いた種々の濃度のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ結合ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ（赤ヒストグラム）又はコントロール組み換え体Ｆｃ（グレーヒストグラム）を用いた染色のヒストグラムを図１３に示す。ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃの結合は、ＪＫＴ−Ｍｏｃｋでは検出されなかった。一方で、ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴでは、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃの結合が５μｇ／ｍＬ以上の強度で確認された。３回の実験の結果を示す。
【００４１】
（３）２Ｆ９結合後のＣＤ２６発現レベル
種々の濃度の２Ｆ９（赤ヒストグラム）又はコントロールマウスＩｇＧ（黒ヒストグラム）の存在下における抗ＣＤ２６ｍＡｂ  １４Ｄ１０を用いた染色のヒストグラムを図１４に示す。ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ細胞を各濃度の抗ＣＤ２６ｍＡｂ  ２Ｆ９又はコントロールＩｇＧともに３０分、４℃でインキュベートした。洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識１４Ｄ１０（５μｇ／ｍＬ）で染色した。グレーのヒストグラムは、アイソトープコントロールを用いた染色を示す。２Ｆ９処理後、ＣＤ２６発現に変化はなかった。
（４）ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃを用いたプレインキュベーションによりＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃの結合が部分的に阻害される
（Ａ）種々の濃度の未標識ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ又はコントロールＦｃの存在下におけるＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃを用いた染色のヒストグラムを図１５（Ａ）に示す（左の６つのパネル）。ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ細胞を各濃度の未標識ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ（赤ヒストグラム）又はコントロールＦｃ（黒ヒストグラム）とともに３０分、４℃でインキュベートした。洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ（５μｇ／ｍＬ）で染色した。グレーのヒストグラムは、アイソトープコントロールを用いた染色を示す。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−ＦｃのＭＦＩを棒グラフで示す（右パネル）。ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃは添加量に依存してセルフブロックされたが、完全には阻害されなかった。３回の実験の結果をＭＦＩ平均値±ｓ．ｅ．ｍ．（両側Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定、＊ｐ＜０．０５ｖｓ．対応するコントロールＦｃ）。プレインキュベートのＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ又はコントロールＦｃの０μｇ／ｍＬにおける赤及び黒の棒グラフは同じデータを用いてプロットした。
（Ｂ）種々の濃度のＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ又はコントロールＦｃの存在下における抗ＣＤ２６ｍＡｂ  １４Ｄ１０を用いた染色のヒストグラムを図１５（Ｂ）に示す。（Ａ）と同様に実験を行った。ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ処理後、ＣＤ２６発現レベルに変化はなかった。
（５）アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）のＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴへの結合
ＡＤＡ（上パネル）又は抗ＣＤ２６ｍＡｂ  １４Ｄ１０（下パネル）のＪＫＴ−Ｍｏｃｋ（左パネル）又はＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ（右パネル）への結合のヒストグラムを図１６に示す。ＪＫＴ−Ｍｏｃｋ又はＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ＡＤＡ（１０μｇ／ｍＬ）、１４Ｄ１０（１０μｇ／ｍＬ）又はコントロールＩｇＧとともにインキュベートした。ＡＤＡ及び抗ＣＤ２６ｍＡｂの結合は、ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴで明らかに検出されたが、ＪＫＴ−Ｍｏｃｋでは検出されなかった。データは３回の実験を示し、ほぼ同じ結果が得られた。
（６）外因性ＡＤＡの存在下において２Ｆ９は、ＣＤ２６のＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ結合を完全に阻害する
（Ａ）種々の濃度の外因性ＡＤＡ（赤ヒストグラム）又は溶媒コントロール（担体）としてＰＢＳ（黒ヒストグラム）の存在下におけるＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃを用いた染色のヒストグラムを図１７に示す（左５つのパネル）。ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ細胞を各濃度の外因性ＡＤＡ又は対応する希釈ＰＢＳともに３０分、３７℃でインキュベートした。洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ（５μｇ／ｍＬ）で染色した。グレーのヒストグラムは、アイソトープコントロールを用いた染色を示す。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−ＦｃのＭＦＩを棒グラフで示す（右パネル）。外因性ＡＤＡによりＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ結合は添加量依存的に阻害されたが、完全には阻害されなかった。３回の実験の結果をＭＦＩ平均値±ｓ．ｅ．ｍ．で示す（両側Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定、＊ｐ＜０．０５ｖｓ．対応する担体）。プレインキュベートのＡＤＡ又は担体の０μｇ／ｍＬにおける赤及び黒の棒グラフは同じデータを用いてプロットした。
【００４２】
（Ｂ）種々の濃度の外因性ＡＤＡ（赤ヒストグラム）又は溶媒コントロール（担体）としてＰＢＳ（黒ヒストグラム）の存在下における２Ｆ９を用いた染色のヒストグラムを図１８に示す（左５つのパネル）。（Ａ）と同様に処理した後、ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識２Ｆ９（１０μｇ／ｍＬ）で染色した。グレーのヒストグラムは、アイソトープコントロールを用いた染色を示す。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識２Ｆ９のＭＦＩを棒グラフで示す（右パネル）。外因性ＡＤＡにより２Ｆ９結合は添加量依存的に阻害されたが、完全には阻害されなかった。３回の実験の結果をＭＦＩ平均値±ｓ．ｅ．ｍ．で示す（両側Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定、＊ｐ＜０．０５ｖｓ．対応する担体）。プレインキュベートのＡＤＡ又は担体の０μｇ／ｍＬにおける赤及び黒の棒グラフは同じデータを用いてプロットした。
【００４３】
（Ｃ）種々の濃度の外因性ＡＤＡ（赤ヒストグラム）又は溶媒コントロール（担体）としてＰＢＳ（黒ヒストグラム）の存在下における抗ＣＤ２６ｍＡｂ  １４Ｄ１０を用いた染色のヒストグラムを図１９に示す。（Ａ）と同様に、処理した後、ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識１４Ｄ１０（１０μｇ／ｍＬ）で染色した。グレーのヒストグラムは、アイソトープコントロールを用いた染色を示す。データは３回の実験を示し、ほぼ同じ結果が得られた。
【００４４】
（Ｄ）２Ｆ９を添加するとともに、種々の濃度の外因性ＡＤＡ（赤ヒストグラム）又は溶媒コントロール（担体）としてＰＢＳ（黒ヒストグラム）の存在下におけるＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃを用いた染色のヒストグラムを図２０に示す。ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴ細胞を、各濃度の外因性ＡＤＡ又は対応する希釈ＰＢＳとともに３０分、３７℃でインキュベートし、次いで２Ｆ９（１０μｇ／ｍＬ）とともに３０分４℃で更にインキュベートした。洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ（５μｇ／ｍＬ）で染色した。グレーのヒストグラムは、アイソトープコントロールを用いた染色を示す。２Ｆ９を添加した外因性ＡＤＡによりＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃ結合は完全に阻害された。３回の実験の結果を示す。
【００４５】
（７）（１）〜（６）の結果から、ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴにおいてＣＤ２６の発現が確認されたが、ＪＫＴ−Ｍｏｃｋ（コントロールベクターでトランスフェクト）では確認されなかった。更に、ＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴにおいてＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−ＦｃのＣＤ２６への結合が確認され、またＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴへのＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−Ｆｃの結合濃度は５μｇ／ｍＬ以上であった。２Ｆ９はＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ１−ＦｃのＪＫＴ−ｈＣＤ２６ＷＴへの結合を完全に阻害した。２Ｆ９のブロッキング効果は用量依存的（ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）であった。抗ＣＤ２６ｍＡｂによるＣＤ２６の発現の下方制御（ｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）が、一定の実験条件において観察されていることを踏まえ、細胞表面におけるＣＤ２６の発現を評価した。図１７〜図２０に示すように、ＣＤ２６の発現レベルは２Ｆ９の濃度変化による影響を受けなかった。
【図２１−１】
2015054824.tif 000002
【図２１−２】
2015054824.tif 000003
【図１】
2015054824.tif 000004
【図２】
2015054824.tif 000005
【図３】
2015054824.tif 000006
【図４】
2015054824.tif 000007
【図５】
2015054824.tif 000008
【図６】
2015054824.tif 000009
【図７】
2015054824.tif 000010
【図８】
2015054824.tif 000011
【図９】
2015054824.tif 000012
【図１０】
2015054824.tif 000013
【図１１】
2015054824.tif 000014
【図１２】
2015054824.tif 000015
【図１３】
2015054824.tif 000016
【図１４】
2015054824.tif 000017
【図１５】
2015054824.tif 000018
【図１６】
2015054824.tif 000019
【図１７】
2015054824.tif 000020
【図１８】
2015054824.tif 000021
【図１９】
2015054824.tif 000022
【図２０】
2015054824.tif 000023
【配列表】
2015054824000001.app