(57)【要約】      （修正有）【課題】繊維状ポリペプチドおよび多糖を含む固体複合物の製造方法とその利用。【解決手段】ポリペプチドは、セルロース結合ドメインのアミノ酸配列に取り付けられたレシリンのアミノ酸配列を含み、レシリンは、セルロース結合ドメインを介してセルロースウィスカーに結合されており、レシリンのアミノ酸配列は、ＮＰ  ９９５８６０に規定される配列に対して少なくとも８５％相同である、固体複合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドと、セルロースウィスカーとを含む固体複合物であって、前記ポリペプチドは、セルロース結合ドメインのアミノ酸配列に取り付けられたレシリンのアミノ酸配列を含み、前記レシリンは、前記セルロース結合ドメインを介して前記セルロースウィスカーに結合されており、前記レシリンのアミノ酸配列は、ＮＰ  ９９５８６０に規定される配列に対して少なくとも８５％相同である、固体複合物。
【請求項２】
前記レシリン中にジチロシン結合が形成されるように架橋されている、請求項１に記載の固体複合物。
【請求項３】
前記セルロース結合ドメインは、前記レシリンに対して異種である、請求項１に記載の固体複合物。
【請求項４】
前記ポリペプチドを、前記セルロースウィスカーと接触させて、請求項１に記載の固体複合物を作製することを含む、請求項１に記載の固体複合物を作製する方法。
【請求項５】
前記接触後に前記複合物を架橋して、前記レシリン中にジチロシン結合を形成させることをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記複合物を、レシリンではない繊維状ポリペプチドにより被覆することをさらに含み、前記被覆することが、前記複合物を架橋した後で達成される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複合物を前記接触前に、レシリンではない繊維状ポリペプチドと結合することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、いくつかの実施形態において、繊維状ポリペプチドおよび多糖を含む組成物ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
材料科学において使用される最も広範に研究されている生物学的ポリマーは、豊富な存在量および極めて多様な機械的性質のために多糖類である。
【０００３】
多糖のセルロースは地球上における最も一般的なバイオポリマーである。セルロースはほとんどが植物バイオマスにおいて見出されるが、動物、真菌および細菌によっても産生される。セルロースは、グルコースから作製されるセロビオースサブ単位の結晶性集合体である。その結晶性構造のために、セルロースは、大きい引張り強さと、合成炭素繊維の弾性に近い弾性とを有しており、例えば、スチールと比較して、非常に好都合な強度／重量比を有している。植物細胞壁において、セルロースが、他の多糖（例えば、ヘミセルロース、ペプチン、リグニンなど）、酵素および構造タンパク質との複合体として見出される。これらの分子はセルロースのミクロフィブリルをつなぎ、細胞が機械的応力にさらされるときの荷重伝達機構を改善し、一方で、病原体の攻撃に対する物理的保護を高めている。
【０００４】
天然のバイオ複合材料の特異な性質により、多くの科学者が、セルロースと合成ポリマーマトリックスとの複合物の製造が促されている。例えば、Ｆａｖｉｅｒ他［Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｃｉｅｎｃｅ、３７（１０）：１７３２〜１７３９］は、ラテックスのゴム状態の３桁以上増大した剪断弾性係数をもたらすセルロース−ラテックス複合物を製造した。そのようなバイオ複合材料は、自動車産業のために、また、生分解性プラスチックの製造のために製造されている。
【０００５】
セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）をセルロース繊維改良のために使用することは、十分に確立された技術である［Ｓｈｏｓｅｙｏｖ他、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ、７０（２）：２８３〜９５］。近年では、ＣＢＤが、新規なセルロース−タンパク質複合材料の製造のために使用された。この場合、組換えによるＣＢＤまたはＣＢＤダイマー、すなわち、ＣＢＤ−ＣＢＤ融合タンパク質（ＣＣＰ）が紙に結合し、これにより、改善された機械的性質および撥水性がもたらされた［Ｌｅｖｙ他、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、９：９１〜９８］。さらに、組換えによるＣＢＤ−デンプン結合ドメイン（ＣＳＣＰ）では、架橋能が、不溶性または可溶性のデンプンおよびセルロースから構成される種々のモデル系において明らかにされた［Ｌｅｖｙ他、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、９：９１〜９８］。
【０００６】
多糖研究に加えて、バイオポリマー研究が、それらの特異な機械的性質のために、近年では繊維状タンパク質に集中している。これらのタンパク質は、機械的強度または柔軟性を与えるそれらの反復アミノ酸配列によって区別される。これらのタンパク質には、哺乳動物のコラーゲンおよびエラスチン、ならびに、節足動物のタンパク質、カイコの絹（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉｉ）、クモのしおり糸、および、レシリンが含まれる。それぞれのタンパク質の特異な反復配列により、その機械的性質が与えられる。例えば、クモの糸は極めて強靱であり、一方で、レシリンおよびエラスチンは、ゴム様の性質とともに、極めて大きい弾性および反発弾性を有する。
【０００７】
レシリンが、多くの昆虫において、特殊化されたクチクラ領域に、特に、大きい反発弾性および低い剛性が要求される領域に見出されるか、または、エネルギー貯蔵系として見出される。レシリンは、昆虫の飛行、ならびに、ノミおよびアワフキムシの顕著な跳躍能におけるその役割について最も良く知られている。このタンパク質がＷｅｉｓ−Ｆｏｇｈによって１９６０年に初めて特定された。Ｗｅｉｓ−Ｆｏｇｈはこのタンパク質をバッタおよびトンボのクチクラから単離し、このタンパク質をゴム様物質として記載した。
【０００８】
レシリンは、可逆的変形と、非常に大きい反発弾性とを併せ持つ特異な機械的性質を示す。レシリンは、知られている最も非常に効率的な弾性物質であることが報告されている。この物質の弾性効率は９７％であると主張される；貯蔵されたエネルギーの３％だけが熱として失われる（米国特許出願公開第２００７００９９２３１号）。レシリンは、類似する機械的性質を脊椎動物の結合組織において産生されるエラスチンと互いに有する。ヒトでは、エラスチンが通常、弾性が要求される部位に、例えば、（多くの場合にはコラーゲンと会合した状態で）皮膚および軟骨などに見出される。エラスチン−コラーゲンの複合物はまた、血管が心臓からの血液の拍動流を途切れない安定した流れに平滑化することを可能にする動脈壁における主要な成分として働く。
【０００９】
それらの機能的類似性にもかかわらず、レシリンと、エラスチンとの間での配列相同性は、グリシンが両方のタンパク質において非常に多いということを除いて、非常に低い。それにもかかわらず、両方のタンパク質の弾性が、ランダムコイル化している架橋されたポリペプチド鎖のそれらの構造様式から生じている。レシリンは昆虫の細胞質で合成され、その後、クチクラに分泌され、クチクラにおいて、ペルオキシダーゼ酵素により、ジチロシン／トリチロシン架橋の形成によるその重合が触媒され、これにより、クチクラのキチンとの天然のタンパク質−炭水化物複合物質が組み立てられる。キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の２つのレシリンｍＲＮＡ変化体が特定されている：それらのキチン結合ドメインの短縮化において異なるＣＧ１５９２０−ＲＡおよびＣＧ１５９２０−ＲＢ（図１Ａを参照のこと）。注釈が加えられた主要な成分が、１７アミノ酸の長さの弾性反復および３５アミノ酸の長さのタイプＲ＆Ｒのキチン結合ドメインである。
【００１０】
近年には、Ｅｌｖｉｎ他（２００５）［Ｎａｔｕｒｅ、４３７：９９９〜１００２］が、合成による短縮化されたレシリン様遺伝子をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現および重合させることに成功した。合成遺伝子は生来的遺伝子の１７回の反復からなる。このタンパク質は、発現されると、タンパク質をゴム様生体材料に注型する光化学的架橋を受ける。米国特許出願公開第２００７００９９２３１号は、レシリンおよび構造ポリペプチドを含むハイブリッド型レシリンを開示する。
【００１１】
絹タンパク質が様々な昆虫およびクモ形類動物によって産生され、後者が地球上での最も強靱な絹ポリマーを形成する。クモが７種類もの多くの異なる絹糸を吐き、それぞれの糸が性質においてその特定の生物学的機能に最適化されている。しおり糸は、クモの巣の安全線および枠糸として使用されるものであり、引張り強さおよび弾性の組合せを有する優れた材料である。その並外れた性質が、あまり組織化されていない「非晶質」マトリックスに埋め込まれる結晶性領域を含む半結晶性ポリマーとしてのその組成に由来する。結晶性領域が、強度を糸に与える、ポリアラニンの広がりの逆平行βプリーツシートからなり、一方で、非晶質マトリックスの優勢な二次構造が、弾性を提供するグリシンリッチならせんである。ほとんどのしおり糸が、数百ｋＤａまでの分子量を有する少なくとも２つの異なるタンパク質からなる。配列類似性に基づいて、しおり糸のタンパク質がスピドロイン１様（ＭａＳｐ１）タンパク質およびスピドロイン２様（ＭａＳｐ２）タンパク質に分類されている。
【００１２】
カイコの絹糸とは対照的に、クモからの絹糸の単離は産業的に実行不可能である。クモは少量で絹糸を産生し、また、クモの縄張り行動は、多数のクモが、隣接する１／４ヤードにおいて捕獲されることを妨げている。したがって、組換えＤＮＡ技術による絹糸タンパク質の製造が好ましい。そのような目的のために、生来的スピドロイン配列のモノマーコンセンサスに基づく合成遺伝子が幅広く使用される。これらの合成遺伝子は、メチロトロフ（ｍｅｔｈｙｌｔｒｏｐｉｃ）酵母宿主のピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ、ならびに、タバコ植物およびジャガイモ植物において首尾良く発現されている［Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ  ＳＲ．およびＢｅｄｚｙｋ  ＬＳ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、４７：３３〜３９（１９９７）；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ  ＳＲ．およびＢｅｄｚｙｋ  ＬＳ、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、４７：２３〜３２（１９９７）；Ｓｃｅｌｌｅｒ  Ｊ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９：５７３〜５７７（２００１）］。そのような手段により、実験室規模の量の絹様タンパク質粉末を容易に得ることができる。人工絹糸を製造する途上における最終的な障害が、これらの粉末を高性能な繊維に変換することができる適切な紡糸技術の開発にある。タンパク質折り畳みプロセスを迂回した場合、これらのタンパク質がインビトロで凝集しやすい傾向は、機能的な絹糸を首尾良く製造することに向けての著しい制限として作用する。液状の結晶性形態から固体の絹糸へのタンパク質の集合は極めて複雑であり、クモの出糸腺の機能的機能を複製することが依然として大きな課題である。
【００１３】
いくつかの試みが、可溶化されたセルロースおよびカイコ絹糸の分子的ブレンドおよび再生によって調製されたセルロース−絹フィブロイン複合物の調製に関して報告されている［Ｆｒｅｄｄｉ  Ｇ他（１９９５）、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ、５６：１５３７〜１５４５；Ｙａｎｇ，Ｇ他（２０００）、Ｊ  Ｍｅｍｂｒ  Ｓｃｉ、２１０：１７７〜１５３］。近年には、Ｎｏｉｓｈｉｋｉ他［Ｎｏｉｓｈｉｋｉ  Ｙ、Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  Ｙ、Ｗａｄａ  Ｍ、Ｋｕｇａ  Ｓ、Ｍａｇｏｓｈｉ  Ｊ．（２００２）、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ、８６：３４２５〜３４２９］がセルロース−絹糸の複合フィルムを固体のセルロースウィスカーおよび再生されたカイコ絹糸から調製した。このフィルムは、顕著に改善された機械的強度をもたらし、破断強さおよび極限ひずみが構成成分材料の単独での破断強さおよび極限ひずみの約５倍であった。
【発明の概要】
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、異種の多糖結合ドメイン（ただし、多糖結合ドメインはセルロース結合ドメインではない）に結合された繊維状ポリペプチドのモノマーをコードするアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、異種の多糖結合ドメインに結合されたレシリンポリペプチドまたはクモ絹糸ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、異種の多糖結合ドメイン（ただし、多糖結合ドメインはセルロース結合ドメインではない）に結合された繊維状ポリペプチドのモノマーをコードするアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、異種の多糖結合ドメインに結合されたレシリンポリペプチドまたはクモ絹糸ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、レシリンをコードする核酸配列と、レシリンの発現を植物において行わすことができるシス作用調節エレメントとを含む核酸構築物が提供される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、クモ絹糸をコードする核酸配列と、クモ絹糸の発現を植物において行わすことができるシス作用調節エレメントとを含む核酸構築物が提供される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本発明の核酸構築物を含む細胞が提供される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本発明の核酸構築物を含む植物細胞が提供される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、レシリンまたはクモ絹糸である繊維状ポリペプチドと、多糖とを含む単離された複合物が提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、異種の多糖結合ドメインを含む繊維状ポリペプチドと、多糖とを含む、固定化されていない単離された複合物が提供される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、少なくとも２つの同一でない繊維状ポリペプチドを含む単離された複合物であって、少なくとも２つの同一でない繊維状ポリペプチドのうちの第１の繊維状ポリペプチドが、異種の多糖結合ドメイン（ただし、多糖結合ドメインはセルロース結合ドメインではない）に結合された繊維状ポリペプチドのモノマーをコードするアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドである複合物が提供される。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、少なくとも２つの同一でない繊維状ポリペプチドを含む単離された複合物であって、少なくとも２つの同一でない繊維状ポリペプチドのうちの第１の繊維状ポリペプチドが、異種の多糖結合ドメインに結合されたレシリンポリペプチドまたはクモ絹糸ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドである複合物が提供される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、繊維状ポリペプチドを、繊維状ポリペプチドと、多糖との間での結合を可能にする条件のもとで多糖と接触させて、本発明の単離された複合物を作製することを含む、本発明の単離された複合物を作製する方法が提供される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、軟骨または骨の疾患または状態を処置するための医薬品の製造のための、本発明の単離された複合物の使用が提供される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、尿失禁を処置するための医薬品の製造のための、本発明の単離された複合物の使用が提供される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本発明の単離された複合物を含む足場が提供される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、治療効果的な量の本発明の単離された複合物をその必要性のある対象に投与し、それにより、軟骨の疾患または状態を処置することを含む、軟骨または骨の疾患または状態を処置する方法が提供される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、治療効果的な量の本発明の単離された複合物をその必要性のある対象に投与し、それにより、尿失禁を処置することを含む、尿失禁を処置する方法が提供される。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本発明の単離された複合物を含む医薬組成物が提供される。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本発明の単離された複合物を含む美容用組成物が提供される。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、繊維状ポリペプチドは、レシリン、エラスチン、クモ絹糸、カイコ絹糸、コラーゲンおよびイガイ足糸（ｍｕｓｓｅｌ  ｂｙｓｓｕｓ）タンパク質からなる群から選択される。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、繊維状ポリペプチドはレシリンを含む。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、繊維状ポリペプチドはクモ絹糸を含む。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、レシリンは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、レシリンは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリペプチドはさらに、配列番号５２または配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、多糖結合ドメインは、キチン結合ドメイン、デンプン結合ドメイン、デキストラン結合ドメイン、グルカン結合ドメイン、キトサン結合ドメイン、アルギン酸結合ドメインおよびヒアルロン酸結合ドメインからなる群から選択される。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、多糖結合ドメインは、キチン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、デンプン結合ドメイン、デキストラン結合ドメイン、グルカン結合ドメイン、キトサン結合ドメイン、アルギン酸結合ドメインおよびヒアルロン酸結合ドメインからなる群から選択される。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたポリペプチドは、配列番号１１〜配列番号１３および配列番号３２〜配列番号３６に示される通りである。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、クモ絹糸は、配列番号１６または配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、配列番号１７〜配列番号２２、配列番号２４、配列番号２８および配列番号２９からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、核酸構築物はさらに、少なくとも１つのシス作用調節エレメントを含む。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、シス作用調節エレメントは植物プロモーターである。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、植物プロモーターはｒｂｃＳ１プロモーターである。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、核酸構築物はさらに、液胞シグナル配列をコードする核酸配列を含む。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、シス作用調節エレメントはターミネーター配列である。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ターミネーター配列はｒｂｃＳ１配列である。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は植物細胞である。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、多糖は、キチン、セルロース、デンプン、デキストラン、グルカン、キトサン、アルギン酸およびヒアルロン酸からなる群から選択される。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、繊維状ポリペプチドは多糖結合ドメインを含む。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、多糖結合ドメインは異種の多糖結合ドメインである。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、多糖結合ドメインは、キチン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、キトサン結合ドメイン、アルギン酸結合ドメイン、デンプン結合ドメイン、デキストラン結合ドメイン、グルカン結合ドメインおよびヒアルロン酸結合ドメインを含む。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、繊維状ポリペプチドは、イガイ足糸タンパク質、レシリン、カイコ絹糸タンパク質、クモ絹糸タンパク質、コラーゲン、エラスチンまたはそれらのフラグメントからなる群から選択される。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離された複合物はさらに、さらなる繊維状ポリペプチドを含み、ただし、さらなる繊維状ポリペプチドは繊維状ポリペプチドとは異なり、イガイ足糸タンパク質、レシリン、カイコ絹糸タンパク質、クモ絹糸タンパク質、コラーゲン、エラスチンおよびそれらのフラグメントからなる群から選択される。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離された複合物は架橋される。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離された複合物は非架橋である。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、方法はさらに、複合物を接触後に架橋することを含む。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、架橋することが、光化学的架橋、酵素的架橋、化学的架橋および物理的架橋からなる群から選択される方法によって達成される。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、方法はさらに、複合物をさらなる繊維状ポリペプチドにより被覆することを含み、ただし、被覆することが、複合物を架橋した後で達成される。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、方法はさらに、繊維状ポリペプチドを接触前にさらなる繊維状ポリペプチドと結合することを含む。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、さらなる繊維状ポリペプチドは、イガイ足糸タンパク質、クモ絹糸タンパク質、コラーゲン、エラスチンおよびフィブロネクチンならびにそれらのフラグメントからなる群から選択される。
【００６６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、多糖は、キチン、セルロース、デンプン、デキストラン、グルカン、キトサン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースおよびヒアルロン酸からなる群から選択される。
【００６７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、使用は、軟骨修復、膝修復、半月板修復、膝潤滑剤および椎間板修復のためである。
【００６８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、投与することが局所的に達成される。
【００６９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、局所的に投与することが関節内投与によって達成される。
【００７０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、関節内投与は、膝関節、肘関節、股関節、胸鎖関節、額関節、手根関節、足根関節、手関節、足関節、椎間円板および黄色靱帯からなる群から選択される接合部の中への投与を含む。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、軟骨の疾患または状態は、変形性関節炎、制限された関節可動性、痛風、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、軟骨溶解、強皮症、変性椎間板障害および全身性エリテマトーデスからなる群から選択される。
【００７２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、投与することが、尿道を取り囲む領域への注入によって達成される。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、組成物は、ゲル、ストリップ、注入物またはフォームとして配合される。
【００７４】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００７６】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、Ｄ．ｍｅｌｏｎｏｇａｓｔｅｒ由来のレシリン遺伝子のサイズおよび構造を例示する概略図（図１Ａ）およびスキャン（図１Ｂ）である。図１Ａは、キイロショウジョウバエのレシリン変化体Ａ（ＣＧ１５９２０−ＲＡ）遺伝子の概略的構造を例示する：Ｓ．Ｐ．；クチクラシグナルペプチド、ＣｈＢＤ  Ｒ＆Ｒ；キチン結合ドメインタイプＲ＆Ｒ。変化体Ｂ（ＣＧ１５９２０−ＲＢ）は、短縮されたキチン結合ドメインを含有する。図１Ｂは、Ｄ．ｍｅｌｏｎｏｇａｓｔｅｒからのレシリン遺伝子の増幅のＲＴ−ＰＣＲ結果を例示する。レシリンｃＤＮＡが赤色の長方形によって強調される。濃いバンドが、２つのレシリン変化体の存在のために形成された。コントロール反応のレーン（−ＲＴ）におけるバンドは、１つのイントロンを含有し、したがって、ＲＴ−ＰＣＲ生成物よりも遅く移動するゲノム遺伝子を示す。
【００７７】
【図２】図２は、ｐＨｉｓ−ｐａｒａｌｌｅｌ３発現ベクター（配列番号５４）の多重クローニング部位の概略である。
【００７８】
【図３】図３Ａ〜Ｂは、ＣＢＤ−レシリン（配列番号１８）構築物のＰＣＲ結果のスキャンである。図３Ａは、ＣＢＤ配列増幅（左）およびレシリン配列増幅（右）の個別反応の１回目のＰＣＲを例示する。ＣＢＤ配列は、レシリンと一致する突出部を３’プライムに含有し、一方、レシリンは、ＣＢＤと一致する突出部を５’プライムに含有する。図３Ｂは、１回目の反応から得られる両方の生成物の１μｌを混合した後での２回目の反応のＰＣＲ結果を例示する。連結された配列の増大した分子量に留意すること。
【００７９】
【図４】図４は、細菌において発現させた６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ（配列番号５５）の小規模回分式精製のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンである。Ｓ：溶解された細胞の可溶性タンパク質画分；ＩＢ：封入体；ＵＢ：遠心分離によって除かれた非結合画分；Ｗ：洗浄；Ｅ１、Ｅ２：０．４Ｍイミダゾールによる溶出タンパク質。ＭＷ：タンパク質分子量マーカー。
【００８０】
【図５】図５は、アフィニティー精製された６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤタンパク質（配列番号５５）を用いたセルロース結合アッセイおよびキチン結合アッセイの結果を例示するクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンである。Ｔ：ＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）親和性生成物によって捕らえられたタンパク質；ＵＢ：遠心分離によって除かれた非結合画分；Ｗ：洗浄画分；Ｂ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料適用緩衝液との煮沸によってセルロース／キチンペレットから溶出された結合画分。ＭＷ：分子量マーカー。
【００８１】
【図６】図６Ａ〜Ｃは、６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ（配列番号５５）を含む粗抽出物のセルロース結合アッセイおよびキチン結合アッセイの結果を例示するクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンである。Ｔ：粗溶解物；Ｗ：洗浄画分；ＵＢ：遠心分離によって除かれた非結合画分；Ｂ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料適用緩衝液との煮沸によってセルロース／キチンペレットから溶出された結合画分。Ｂ１：５：真の初期負荷濃度に対して５倍希釈された結合画分。ＭＷ：タンパク質分子量マーカー。
【００８２】
【図７】図７は、Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ（配列番号５５）の熱安定性アッセイの結果を例示するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。ＵＨ：非加熱のタンパク質。レーン２〜４：８５℃に１５分間、３０分間、６０分間、それぞれ供された試料。ＭＷ：タンパク質分子量マーカー。
【００８３】
【図８】図８Ａ〜Ｂは、６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの小規模アフィニティー精製を例示する。図８Ａ：Ｎｉ−ＮＴＡカラムでのＲｅｓ−ＣｈＢＤの精製を例示するクロマトグラム。観測されたピークが１３．４分において２２０ｍＭのイミダゾールにより溶出された。図８Ｂ：６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ（配列番号５５）の小規模Ｎｉ−ＮＴＡ精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。６〜１７：ゲルに負荷されたＦＰＬＣ分画物の番号；ＦＴ：カラム素通り。分画物９〜１８をさらなる分析のために集めた。
【００８４】
【図９】図９は、６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ（配列番号５５）の光化学重合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンである。ＵＨ：非加熱のアフィニティー精製された６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ；Ｈ：８５℃で１５分間インキュベーションされた精製６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ；Ｐ：日光暴露前にＲｕ（ｂｐｙ）３Ｃｌ２・６Ｈ２Ｏおよび過硫酸アンモニウムにより処理された６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ。処理により、ゲル内に進入することができず、負荷ウエルに留まった高分子量の生成物（矢印によって示される）が生じた。
【００８５】
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ（配列番号５５）の中規模アフィニティー精製を例示する。図１０Ａ：Ｎｉ−ＮＴＡカラムでの６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ精製のクロマトグラム。観測されたタンパク質ピークが２２．７分において１８０ｍＭのイミダゾールにより溶出された。図１０Ｂ：６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの中規模Ｎｉ−ＮＴＡ精製のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。１〜１１：ゲルに負荷されたＦＰＬＣ分画物の番号；ＦＴ：カラム素通り；Ｗ：カラム洗浄。
【００８６】
【図１１】図１１は、Ｎｉ−ＮＴＡ精製された組換えレシリン（配列番号５６）のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンである。レーン１〜８：ＦＰＬＣ分画物；Ｆｔ：素通り。分画物４〜７が精製レシリンに対応する。
【００８７】
【図１２】図１２は、細菌溶解後のＣＢＤ−レシリン（配列番号５７）（矢印によって印が付けられる）のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンである。タンパク質がほとんどもっぱら封入体（ＩＢ）で検出された。
【００８８】
【図１３】図１３は、アフィニティー精製されたＣＢＤ−レシリン（配列番号５７）のセルロース結合能のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンである。Ｔ：Ｎｉ−ＮＴＡ精製されたＣＢＤ−レシリン；ＵＢ：遠心分離によって除かれた非結合画分；Ｗ：洗浄画分；Ｂ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料適用緩衝液との煮沸によってセルロース／キチンペレットから溶出された結合画分。
【００８９】
【図１４】図１４は、セルロースに結合する、Ａｋｔａｐｒｉｍｅ（商標）Ｐｌｕｓ  ＦＰＬＣ自動リフォールディングシステムによりリフォールディングされたＣＢＤ−レシリン（配列番号５７）のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンである。Ｔ：Ｎｉ−ＮＴＡ精製されたＣＢＤ−レシリン；Ｂ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料適用緩衝液との煮沸によってセルロースペレットから溶出された結合画分；ＵＢ：遠心分離によって除かれた非結合画分。
【００９０】
【図１５】図１５は、セルロースと、クモ絹糸との複合物のモデルである。
【００９１】
【図１６】図１６は、Ｎｉ−ＮＴＡ精製された組換えレシリン−ＣＢＤ（配列番号５８）のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンである。試料９〜１７はＦＰＬＣ−ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（商標）プラスの分画物であった。分画物１５〜１６は、Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍにおいて観測されるようなレシリン−ＣＢＤピークに対応する。
【００９２】
【図１７】図１７は、熱処理およびセルロース結合アッセイの後でのレシリン−ＣＢＤ（配列番号５８）のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンである。ＵＨ：非加熱のタンパク質；Ｈ：８５℃で１５分間インキュベーションされたタンパク質；Ｔ：総タンパク質（アフィニティークロマトグラフィー生成物）；Ｂ：セルロースペレットをＸ２ＳＡＢとともに煮沸することによって溶出された結合画分；ＵＢ：遠心分離によって除かれた非結合画分。
【００９３】
【図１８】図１８は、２ＭのＨＣｌにより徐々に行われた滴定の後における異なるｐＨ条件のもとでのレシリン（配列番号５６）タンパク質およびレシリン−ＣＢＤ（配列番号５５）タンパク質の溶解性のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンである。
【００９４】
【図１９】図１９は、Ｒｕ（ｂｐｙ）３Ｃｌ２・６Ｈ２ＯおよびＡＰＳの存在下（＋）または非存在下（−）における異なるｐＨ条件のもとでの光誘導重合に供されたレシリン試料のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンである。Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ（配列番号５５）タンパク質のコントロール試料（ｐＨ７．４）が、類似する架橋条件に供された。矢印は、架橋剤を含有する試料における高分子量の生成物を指し示す。
【００９５】
【図２０】図２０は、リン酸塩緩衝液または水に基づく反応溶液のどちらかにおけるＭＣＯ法によって重合されたレシリンのクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンである。高分子量の生成物がリン酸塩緩衝液およびＨ２Ｏの両方において形成された。Ｈ２Ｏにおいて行われた反応により、Ｈ２Ｏ２のみとの反応における重合作用が明らかにされた。
【００９６】
【図２１】図２１Ａ〜Ｂは、本発明の複合物の作製を例示する写真である。図２１Ａ−Ｔｅｆｌｏｎ鋳型を６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ−セルロース複合物の光化学的架橋の後で開けたとき。図２１Ｂ−左および中央はそれぞれ、６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ−セルロースウィスカーの１５０μｌ試料および７５μ試料の得られた複合物ポリマーであり、一方、右側の試料は、セルロースウィスカーの非存在下で注型された、純粋な６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤポリマーの１５０μｌ試料から得られたものである。
【００９７】
【図２２】図２２Ａ〜Ｂは、本発明の代表的なクモ絹糸の過剰発現の後でのＥ．Ｃｏｌｉタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を例示するスキャンである。図２２Ａ−総Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。タンパク質をクーマシーブルーで染色した。レーン１−タンパク質分子量マーカー、レーン２−非挿入ベクターにより形質転換されたコントロール細菌、レーン３−ＳｐＳ（配列番号３３）発現細菌から集められたタンパク質、レーン４−ＳｐＳ−ＣＢＤ発現細菌のタンパク質（配列番号３４）。図２２Ｂ−可溶性（Ｓ）および不溶性（ＩＢ）のＥ．ｃｏｌｉタンパク質のＩｎｓｔａｎｔブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。タンパク質をクーマシーブルーで染色した。レーン１−タンパク質分子量マーカー、レーン２〜３−ＳｐＳ（配列番号３３）発現細菌のタンパク質（それぞれ、ＳおよびＩＢ）、レーン４〜５−ＳｐＳ−ＣＢＤ（配列番号３４）発現細菌のタンパク質（それぞれ、ＳおよびＩＢ）。
【００９８】
【図２３】図２３Ａ〜Ｂは、Ｅ．Ｃｏｌｉにおいて発現するＦＰＬＣ精製された６Ｈ−ＳｐＳ（配列番号３３）および６Ｈ−ＳｐＳ−ＣＢＤ（配列番号３４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を例示するスキャンである。図２３Ａ−Ｎｉ−ＮＴＡ精製されたＳｐＳタンパク質のＦＰＬＣ分画物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１−タンパク質分子量マーカー、レーン２〜４−非挿入ベクターにより形質転換されたＥ．Ｃｏｌｉコントロール溶解物の可溶性タンパク質、それぞれ、Ｎｉ−ＮＴＡ精製前のＳｐＳ（配列番号３３）試料およびＳｐＳ−ＣＢＤ（配列番号３４）試料。レーン４〜７−コントロールの精製されたタンパク質分画物、それぞれ、Ｎｉ−ＮＴＡ精製後のＳｐＳ（配列番号３３）、ＳｐＳ−ＣＢＤ（配列番号３４）。図２３Ｂ−抗６Ｈｉｓ抗体を用いた、図１７Ａに記載されるような同じ試料のウエスタンブロット分析。
【００９９】
【図２４】図２４Ａ〜Ｃは、６Ｈ−ＳｐＳ（配列番号３３）および６Ｈ−ＳｐＳ−ＣＢＤ（配列番号３４）のＦＰＬＣ精製を例示するグラフである。図２４Ａ−Ｎｉ−ＮＴＡカラムでのコントロールＥ．ｃｏｌｉタンパク質の精製のクロマトグラム。図２４Ｂ−Ｎｉ−ＮＴＡカラムでの６Ｈ−ＳｐＳ（配列番号３３）の精製のクロマトグラム。図２４Ｃ−Ｎｉ−ＮＴＡカラムでの６Ｈ−ＳｐＳ−ＣＢＤ（配列番号３４）の精製のクロマトグラム。
【０１００】
【図２５】図２５は、アフィニティー精製されたＳｐＳ（配列番号３３）およびＳｐＳ−ＣＢＤ（配列番号３４）の定性的なセルロース結合アッセイのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンである。レーン１−タンパク質分子量マーカー、レーン２〜４−クモ絹糸のセルロース結合アッセイ：レーン２−Ｎｉ−ＮＴＡ精製後のＳｐＳ、レーン３−セルロースに結合したタンパク質、レーン４−非結合タンパク質。非結合タンパク質が、レーン２では、タンパク質濃度に対する比較において１：１０希釈される。レーン５〜７−ＳｐＳ−ＣＢＤのセルロース結合アッセイ：レーン５−Ｎｉ−ＮＴＡ精製後のＳｐＳ−ＣＢＤ、レーン６−セルロースに結合したタンパク質、レーン７−非結合タンパク質。非結合タンパク質が、レーン５では、タンパク質濃度に対する比較において１：１０希釈される。
【０１０１】
【図２６】図２６は、吸着／脱着等温線のグラフである。ＣＢＤクロストリジウム・セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）（ＣＢＤｃｌｏｓ）（配列番号１０）、ＳｐＳ（配列番号３３）およびＳｐＳ−ＣＢＤ（配列番号３４）を種々の濃度でセルロースに対して平衡点にまで吸着させた（Ｂ）。平衡に達した後、最高タンパク質濃度を含有する混合物を、脱着させるために希釈した（Ｒ）。
【０１０２】
【図２７】図２７Ａ〜Ｂは、抗ＣＢＤ抗体を免疫検出のために使用する、ＣＢＤ−ＳｐＳ１２（配列番号３５）発現植物およびＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６（配列番号３６）発現植物の溶解物のウエスタンブロット分析のスキャンである。図２７Ａ−ＣＢＤ−ＳｐＳ１２（配列番号３５）をアポプラストにおいて発現および蓄積するタバコ植物。レーン１−タンパク質分子量マーカー、レーン２−野生型タバコ植物の溶解物、レーン３〜８−それぞれ、トランスジェニック植物番号１３．１〜同１３．６の溶解物。Ｓ−可溶性タンパク質、Ｐ−不溶性タンパク質。図２７Ｂ−ＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６（配列番号３６）を細胞質において発現するタバコ植物。レーン１−タンパク質分子量マーカー、レーン２−野生型タバコ植物の溶解物、レーン３〜８−それぞれ、トランスジェニック植物番号６．１〜同６．６の溶解物。Ｓ−可溶性タンパク質、Ｐ−不溶性タンパク質。
【０１０３】
【図２８】図２８Ａ〜Ｂは、抗ＣＢＤ抗体を免疫検出のために使用する、ＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６（配列番号３６）精製手順のウエスタンブロット分析のスキャンである。図２８Ａ−レーン１−タンパク質分子量マーカー、レーン２−野生型タバコ植物抽出物の可溶性タンパク質、レーン３−野生型タバコの不溶性タンパク質、レーン４−トランスジェニック植物＃６．４の可溶性タンパク質、レーン５−トランスジェニック植物＃６．４の不溶性タンパク質、レーン６−＃６．４トランスジェニックタバコ植物の不溶性画分から溶出された可溶性タンパク質ＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６（配列番号３６）、レーン７−＃６．４トランスジェニックタバコ植物の不溶性画分から溶出された不溶性タンパク質ＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６。図２８ＢはＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６（配列番号３６）熱安定性およびｐＨ可溶性を例示する。レーン１−タンパク質分子量マーカー、レーン２−植物抽出物の不溶性画分から溶出される可溶性タンパク質（図２４Ａのレーン６に示される通り）、レーン３〜６−それぞれ、６０℃、７０℃、８０℃および９０℃での熱安定性アッセイ。レーン７〜１２−それぞれ、ｐＨ＝８、７、６、５、４、３のもとでのｐＨ可溶性試験。
【０１０４】
【図２９】図２９は、絹糸の金属触媒重合のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。レーン１−タンパク質分子量マーカー；レーン２〜５−ＤＤＷに対して透析されたＳｐＳ（配列番号３３）の反応分析：レーン２−Ｈ２Ｏ２またはＣｕＣｌ２を含まないタンパク質溶液、レーン３−Ｈ２Ｏ２およびＣｕＣｌ２を含む重合反応、レーン４−Ｈ２Ｏ２のみが添加されるタンパク質溶液、レーン５−ＣｕＣｌ２のみが添加されるタンパク質溶液。レーン６〜９：５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）に対して透析されたＳｐＳの反応分析：レーン６−Ｈ２Ｏ２またはＣｕＣｌ２を含まないタンパク質溶液、レーン７−Ｈ２Ｏ２およびＣｕＣｌ２を含む重合反応、レーン８−Ｈ２Ｏ２のみが添加されるタンパク質溶液、レーン９−ＣｕＣｌ２のみが添加されるタンパク質溶液。
【０１０５】
【図３０】図３０は、ＳｐＳスポンジ調製のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。レーン１−タンパク質分子量マーカー、レーン２−スポンジ調製手順前の可溶性タンパク質、レーン３−５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）に対する透析の後での可溶性タンパク質、レーン４−ＤＤＷに対する透析の後での可溶性タンパク質、レーン５−約５０ｍｇ／ｍｌへの濃縮の後での可溶性タンパク質。試料は、タンパク質の喪失がなかったことを確認するために５０倍希釈された。
【０１０６】
【図３１Ａ】図３１Ａは、ＳｐＳ−セルロースウィスカースポンジのＤＳＣ分析の結果を示す。Ａ−セルロースウィスカースポンジのＤＳＣサーモグラム分析。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、ＳｐＳ−セルロースウィスカースポンジのＤＳＣ分析の結果を示す。Ｂ−ＳｐＳスポンジのＤＳＣサーモグラム分析。
【図３１Ｃ】図３１Ｃは、ＳｐＳ−セルロースウィスカースポンジのＤＳＣ分析の結果を示す。Ｃ−７０％ウィスカー／３０％ＳｐＳスポンジのＤＳＣサーモグラム分析。
【発明を実施するための形態】
【０１０７】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、繊維状ポリペプチドおよび多糖を含む組成物ならびにその使用に関する。繊維状ポリペプチドは、内因性の多糖結合ドメインまたは異種の多糖結合ドメインを含むことができる。
【０１０８】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるか、または実施例において例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行されることが可能である。
【０１０９】
医学的用途、工業的用途および他の用途における使用において優れた機械的性質を有する新規な複合生体材料を特定するための探索において、本発明者らは、多糖における方向性の結合および重合を可能にする新規な繊維状ポリペプチドを作製している。
【０１１０】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、レシリン融合タンパク質およびクモ絹糸融合タンパク質の両方を作製し、精製した。作製された代表的な融合タンパク質には、レシリン−キチン結合ドメイン（Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ）（図４〜図１０、図１８および図１９）、レシリン−セルロース結合ドメイン（Ｒｅｓ−ＣＢＤ）（図１２〜図１４、図１６〜図１７）およびクモ絹糸−セルロース結合ドメイン（図２３〜図２８）が含まれる。
【０１１１】
したがって、本発明の１つの態様によれば、異種の多糖結合ドメインに結合された繊維状ポリペプチドのモノマーをコードするアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが提供される。
【０１１２】
本明細書中で使用されるとき、語句「繊維状ポリペプチド」は、繊維またはシートを形成するようにマトリックスに配置される複数のモノマー鎖からなるポリペプチドを示す。繊維状タンパク質が、Ｄ．Ｖｏｅｔ＆Ｊ．Ｇ．Ｖｏｅｔ、“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”（第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５、１５３頁〜１６２頁）に記載される（これはこの参照として本明細書中に組み込まれる）。
【０１１３】
繊維状ポリペプチドの例には、レシリン、エラスチン、クモ絹糸、カイコ絹糸、コラーゲンおよびイガイ足糸タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
本明細書中で使用されるとき、用語「レシリン」は、そのそれぞれのモノマーが、配列番号４５に示される配列の少なくとも２つの反復単位を含む、繊維を形成することができる弾性ポリペプチドを示す。１つの実施形態によれば、反復単位は、配列番号８に示される配列を含む。レシリンの限定されない例のＧｅｎＢａｎｋアクセション番号が下記の表１に記載される。本発明のレシリンはまた、ホモログを示す（例えば、設定省略時のパラメーターを使用する、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウエアを使用して求められるとき、表１に記載されるレシリン配列に対する相同性が、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％またはそれ以上、例えば、およそ１００％であるポリペプチド）。ホモログはまた、その欠失変化体、挿入変化体または置換変化体（アミノ酸置換を含む）、および、その生物学的に活性なポリペプチドフラグメントを示す場合がある。
【０１１５】
下記の表１はレシリンのＮＣＢＩ配列番号の例を記載する。
【表１】
2015144610.tif 000002
【０１１６】
１つの実施形態によれば、レシリンのポリペプチド配列が配列番号９に示される。
【０１１７】
本明細書中で使用されるとき、用語「エラスチン」は、そのそれぞれのモノマーが、配列番号４６に示される配列の少なくとも２つの反復単位を含む、繊維を形成することができる弾性ポリペプチドを示す。エラスチンの限定されない例のＧｅｎＢａｎｋアクセション番号が下記の表２に記載される。本発明のエラスチンはまた、ホモログを示す（例えば、設定省略時のパラメーターを使用する、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウエアを使用して求められるとき、表２に記載されるエラスチン配列に対する相同性が、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％またはそれ以上、例えば、およそ１００％であるポリペプチド）。ホモログはまた、その欠失変化体、挿入変化体または置換変化体（アミノ酸置換を含む）、および、その生物学的に活性なポリペプチドフラグメントを示す場合がある。
【０１１８】
下記の表２はエラスチンのＮＣＢＩ配列番号の例を記載する。
【表２】
2015144610.tif 000003
【０１１９】
本明細書中で使用されるとき、用語「クモ絹糸」は、そのそれぞれのモノマーが、配列番号２６に示される配列の少なくとも２つの反復単位を含む、クモ絹糸から構成される繊維を形成することができるポリペプチドを示す。１つの実施形態によれば、ポリペプチド鎖はスピドロイン１のアミノ酸配列を含む。別の実施形態によれば、ポリペプチド鎖はスピドロイン２のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態によれば、クモ絹糸はクモ絹糸である。スピドロイン１およびスピドロイン２の限定されない例のＧｅｎＢａｎｋアクセション番号が下記の表３に記載される。本発明のクモ絹糸ポリペプチドはまた、ホモログを示す（例えば、設定省略時のパラメーターを使用する、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウエアを使用して求められるとき、表３に記載されるクモ絹糸配列に対する相同性が、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％またはそれ以上、例えば、およそ１００％であるポリペプチド）。ホモログはまた、その欠失変化体、挿入変化体または置換変化体（アミノ酸置換を含む）、および、その生物学的に活性なポリペプチドフラグメントを示す場合がある。
【０１２０】
下記の表３はクモ絹糸のＮＣＢＩ配列番号の例を記載する。
【表３】
2015144610.tif 000004
【０１２１】
１つの実施形態によれば、クモ絹糸ポリペプチドのポリペプチド配列が配列番号１６または配列番号３８に示される。
【０１２２】
本明細書中で使用されるとき、用語「カイコ絹糸」は、繊維を形成することができるカイコ由来の絹糸ポリペプチドを示す。カイコ絹糸ポリペプチドの限定されない例のＧｅｎＢａｎｋアクセション番号が下記の表４に記載される。本発明のカイコ絹糸ポリペプチドはまた、ホモログを示す（例えば、設定省略時のパラメーターを使用する、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウエアを使用して求められるとき、表４に記載されるカイコ絹糸配列に対する相同性が、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％またはそれ以上、例えば、およそ１００％であるポリペプチド）。ホモログはまた、その欠失変化体、挿入変化体または置換変化体（アミノ酸置換を含む）、および、その生物学的に活性なポリペプチドフラグメントを示す場合がある。
【０１２３】
下記の表４はカイコ絹糸のＮＣＢＩ配列番号の例を記載する。
【表４】
2015144610.tif 000005
【０１２４】
本明細書中で使用されるとき、用語「コラーゲン」は、Ｉ型コラーゲンの場合には、２つのα１鎖および１つのα２鎖を含む集合したコラーゲン三量体を示す。コラーゲン繊維は、末端のプロペプチドＣおよびプロペプチドＮを欠くコラーゲンである。意図されるコラーゲンには、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型、および、それらに由来する生物学的に活性なフラグメントが含まれる。コラーゲンは、プロコラーゲン、アテロコラーゲンまたはテロコラーゲンから構成される場合がある。本発明のコラーゲンはまた、ホモログを示す（例えば、設定省略時のパラメーターを使用する、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウエアを使用して求められるとき、表５に記載されるコラーゲン配列に対する相同性が、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％またはそれ以上、例えば、およそ１００％であるポリペプチド）。ホモログはまた、その欠失変化体、挿入変化体または置換変化体（アミノ酸置換を含む）、および、その生物学的に活性なポリペプチドフラグメントを示す場合がある。
【０１２５】
下記の表５はコラーゲンのＮＣＢＩ配列番号の例を記載する。
【表５】
2015144610.tif 000006
【０１２６】
本明細書中で使用されるとき、語句「イガイ足糸タンパク質」は、コラーゲンドメインおよびエラスチンドメインの両方を含む、イガイの足糸に見出されるポリペプチドを示す（例えば、Ｃｏｌ−ＰまたはＣｏｌ−Ｄ）。本発明のイガイ足糸タンパク質はまた、ホモログを示す（例えば、設定省略時のパラメーターを使用する、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウエアを使用して求められるとき、ＮＣＢＩ配列番号ＡＡＢ３４０４２に記載されるイガイ足糸配列に対する相同性が、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％またはそれ以上、例えば、およそ１００％であるポリペプチド）。
【０１２７】
ホモログはまた、その欠失変化体、挿入変化体または置換変化体（アミノ酸置換を含む）、および、その生物学的に活性なポリペプチドフラグメントを示す場合がある。
【０１２８】
述べられたように、本発明の単離されたポリペプチドは、異種の多糖結合ドメインに結合された繊維状ポリペプチドのモノマーを含む。
【０１２９】
本明細書中で使用されるとき、修飾語「異種の」は、本発明の繊維状ポリペプチドの異種の多糖結合ドメインに関連する場合、その異種の多糖結合ドメインが、そのドメインが融合される繊維状ポリペプチドにおいて自然界で見出されないことを示す。
【０１３０】
語句「多糖結合ドメイン」は、約１０μＭの最小解離定数（Ｋｄ）により多糖と結合するアミノ酸配列を示す［Ｔｏｍｍｅ  Ｐ、Ｂｏｒａｓｔｏｎ  Ａ、ＭｃＬｅａｎ  Ｂ、Ｋｏｒｍｏｓ  Ｊ、Ｃｒｅａｇｈ  ＡＬ、Ｓｔｕｒｃｈ  Ｋ、Ｇｉｌｋｅｓ  ＮＲ、Ｈａｙｎｅｓ  ＣＡ、Ｗａｒｒｅｎ  ＲＡ、Ｋｉｌｂｕｒｎ  ＤＧ（１９９８）、セルロース結合ドメインの特徴づけおよび親和性適用、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ、７１５（１）：２８３〜９６；Ｂｏｒａｓｔｏｎ  ＡＢ、Ｂｏｌａｍ  ＤＮ、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＨＪ、Ｄａｖｉｅｓ  ＧＪ（２００４）、炭水化物結合モジュール：多糖認識を微調整する、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、３８２（Ｐｔ  ３）：７６９〜８１］。典型的には、多糖結合ドメインは、ポリサッカリダーゼまたは多糖結合タンパク質の多糖結合ドメインの機能的部分を少なくとも含む。
【０１３１】
繊維状ポリペプチドは多糖結合ドメインに直接に連結され得るか、または、リンカーを介して連結され得ることが理解される。本発明のために意図される代表的なリンカーのアミノ酸配列が配列番号５２および配列番号５３に示される。
【０１３２】
代表的な多糖結合ドメインには、キチン結合ドメイン（その例が配列番号３９および配列番号４０に示される）、デンプン結合ドメイン（その例が配列番号４１に示される）、デキストラン結合ドメイン（その例が配列番号４２に示される）、グルカン結合ドメイン、キトサン結合ドメイン（例えば、Ｃｈｅｎ，ＨＰ；Ｘｕ，ＬＬ（２０５）、Ｊ．ｏｆ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４７（４）：４５２〜４５６を参照のこと）、アルギン酸結合ドメイン（その例が配列番号４３に示される）およびヒアルロン酸結合ドメイン（その例が配列番号４４に示される）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
本発明のこの態様によれば、繊維状ポリペプチドがレシリンまたはクモ絹糸を含むとき、多糖結合ドメインはまた、セルロース結合ドメインである場合がある。
【０１３４】
下記の表６は、本発明における使用のために意図される多糖結合ドメインの代表的な供給源を記載する。
【表６】
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【０１３５】
下記の表７は、本発明の多糖結合ドメインとして使用するために意図されるキチン結合ドメインを有する酵素の概要を記載する。
【表７】
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【０１３６】
下記の表８は、本発明の多糖結合ドメインとして使用されうる連鎖球菌グルカン結合反復を含むタンパク質（Ｃｐｌスーパーファミリー）の概要を記載する。
【表８】
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【０１３７】
下記の表９は、本発明の多糖結合ドメインとして意図されうる仮想的なβ−１，３グルカン結合ドメインを含むタンパク質を記載する。
【表９】
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【０１３８】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」には、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドのいずれか）、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたポリペプチド）そしてポリペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドが含まれ、これらは、例えば、ポリペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはポリペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。そのような修飾には、Ｎ′末端修飾、Ｃ′末端修飾、ポリペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細が本明細書中下記に示される。
【０１３９】
ポリペプチド内のポリペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、ｏ−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
【０１４０】
これらの修飾は、ポリペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。
【０１４１】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、フェニルグリシン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（ＴＩＣ）、ナフチルエラニン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
【０１４２】
述べられたように、繊維状タンパク質のポリペプチドのアミノ酸配列は、天然に存在する繊維状タンパク質におけるポリペプチドのアミノ酸配列であり得るか、あるいは、同類置換または非同類置換のどちらかを含むアミノ酸配列であり得るかのどちらかである。
【０１４３】
本明細書中で使用されるとき、用語「同類置換」は、ペプチドにおける生来的配列に存在するアミノ酸が、類似する立体的性質を有する天然に存在するアミノ酸もしくは天然に存在しないアミノ酸またはペプチド模倣体により置き換えられることを示す。置換されることになる生来的アミノ酸の側鎖が極性または疎水性のどちらかである場合、同類置換は、（置換されたアミノ酸の側鎖と同じ立体的性質を有することに加えて）同様に極性または疎水性である天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、または、ペプチド模倣体成分とでなければならない。
【０１４４】
天然に存在するアミノ酸は典型的には、それらの性質に従って分類されるので、天然に存在するアミノ酸による同類置換は、本発明に従って、立体的に類似する非荷電アミノ酸による荷電アミノ酸の置換が同類置換であると見なされるという事実を念頭に置いて容易に決定することができる。
【０１４５】
同類置換を、天然に存在しないアミノ酸によって作製するために、当該技術分野において広く知られているアミノ酸アナログ（合成アミノ酸）を使用することもまた可能である。天然に存在するアミノ酸のペプチド模倣体が、当業者に知られている文献には十分に記録されている。
【０１４６】
同類置換を達成するとき、代わりに使用されるアミノ酸は、元のアミノ酸と同じまたは類似する官能基を側鎖に有しなければならない。
【０１４７】
本明細書中で使用されるとき、語句「非同類置換」は、元の配列に存在するアミノ酸が、異なる電気化学的性質および／または立体的性質を有する別の天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸によって置き換えられることを示す。したがって、代わりに使用されるアミノ酸の側鎖は、置換されることになる生来的アミノ酸の側鎖よりも著しく大きく（または小さく）することができ、および／または、置換されることになるアミノ酸と著しく異なる電子的性質を有する官能基を有することができる。このタイプの非同類置換の例には、アラニンに代わるフェニルアラニンまたはシクロヘキシルメチルグリシンの使用、グリシンに代わるイソロイシンの使用、あるいは、アスパラギン酸に代わる−ＮＨ−ＣＨ［（−ＣＨ２）５−ＣＯＯＨ］−ＣＯ−の使用が含まれる。本発明の範囲に含まれるそのような非同類置換として、繊維状タンパク質を形成することができるポリペプチドを依然として構成する非同類置換が挙げられる。
【０１４８】
従って、本明細書において使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、この用語が本明細書中で定義されるように少なくとも１つの付加アミノ酸にペプチド結合またはペプチド結合アナログを介して連結されるＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
【０１４９】
下記の表１０及び表１１は、本発明において使用されることができる、天然に存在するアミノ酸（表１０）、および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（表１１）を記載する。
【０１５０】
【表１０】
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【０１５１】
【表１１】
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【０１５２】
本発明の例示的ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１１〜１３，５５，５７，５８及び配列番号３２〜３６に記載される。
【０１５３】
組換え技術は、本発明のポリペプチドを発生するために使用されることが好ましい。なぜならこれらの技術は相対的に長い（例えば２０アミノ酸より長い）ポリペプチド及びその多量の発生のためにより適しているからである。かかる組換え技術は、Ｂｉｔｔｅｒ他（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６〜５４４；Ｓｔｕｄｉｅｒ他（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８５：６０〜８９；Ｂｒｉｓｓｏｎ他（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ、３１０：５１１〜５１４；Ｔａｋａｍａｔｓｕ他（１９８７）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：３０７〜３１１；Ｃｏｒｕｚｚｉ他（１９８４）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１６７１〜１６８０；およびＢｒｏｇｌｉ他（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：８３８〜８４３；Ｇｕｒｌｅｙ他（１９８６）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６：５５９〜５６５；ならびに、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、１９８８、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、、ＮＹ、第ＶＩＩＩ節、４２１頁〜４６３頁によって記載される。
【０１５４】
本発明のポリペプチドを、組換え技術を使用して作製するために、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは核酸発現ベクターに連結される。この場合、核酸発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列を、宿主細胞における本発明のポリペプチドの構成的転写、組織特異的な転写または誘導可能な転写を行わせるために好適なシス調節配列（例えば、プロモーター配列）の転写制御下に含む。
【０１５５】
レシリンを発現させるために使用することができる単離されたポリヌクレオチドの一例が、配列番号１５に示される通りである。クモ絹糸を発現させるために使用することができる単離されたポリヌクレオチド配列の例が、配列番号２３および配列番号２７に示される通りである。セルロース結合ドメインを発現させるために使用することができる単離されたポリヌクレオチドの一例が、配列番号２５に示される。本発明のポリペプチドを発現させるために使用することができる代表的なポリヌクレオチド配列が、配列番号１７〜配列番号２２、配列番号２４、配列番号２８および配列番号２９に示される。
【０１５６】
本明細書中で使用される表現「単離されたポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列および／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組合せ）の形態で単離および提供される一本鎖または二本鎖の核酸配列を示す。
【０１５７】
本明細書中で使用される表現「相補的ポリヌクレオチド配列」は、逆転写酵素または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してメッセンジャーＲＮＡの逆転写から生じる配列を示す。そのような配列は続いて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してインビボまたはインビトロで増幅することができる。
【０１５８】
本明細書中で使用される表現「ゲノムポリヌクレオチド配列」は、染色体に由来する（染色体から単離される）配列を示し、従って、ゲノムポリヌクレオチド配列は染色体の隣接した一部分を表す。
【０１５９】
本明細書中で使用される表現「複合ポリヌクレオチド配列」は、少なくとも一部分が相補的であり、かつ、少なくとも一部分がゲノムである配列を示す。複合配列は、本発明のポリペプチドをコードするために要求されるいくつかのエキソン配列、ならびに、エキソン配列の間に介在するいくつかのイントロン配列を含むことができる。イントロン配列は、他の遺伝子のものを含めて、任意の供給源のものが可能であり、典型的には、保存されたスプライシングシグナル配列を含む。そのようなイントロン配列はさらに、シス作用の発現調節エレメントを含むことができる。
【０１６０】
本発明のポリヌクレオチドはさらに、繊維状ポリペプチドの分泌のためのシグナルペプチドをコードするシグナル配列を含むことができる。（植物トランスフェクションのための）本発明の構築物において使用され得る代表的なシグナル配列が液胞シグナル配列である。
【０１６１】
発現および分泌の後、シグナルペプチドは典型的には、成熟タンパク質をもたらす前駆体タンパク質から除かれる。
【０１６２】
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書下記の実施例１および実施例７において記載されるようなＰＣＲ技術、あるいは、２つの異なるＤＮＡ配列の連結のために当該技術分野において知られている何らかの他の方法または手法を使用して調製することができる。例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ他編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２）を参照のこと。
【０１６３】
本明細書中上記で述べられたように、本発明のポリヌクレオチド配列は、組換えポリペプチドの発現を可能にするために発現ベクター（すなわち、核酸構築物）に挿入される。本発明の発現ベクターは、このベクターを原核生物または真核生物または好ましくは両方における複製および組込みのために好適にするさらなる配列（例えば、シャトルベクター）を含む。典型的なクローニング用ベクターは、転写開始配列および翻訳開始配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）、ならびに、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含有する。
【０１６４】
真核生物プロモーターは典型的には、２つのタイプの認識配列（ＴＡＴＡボックスおよび上流側のプロモーター要素）を含有する。ＴＡＴＡボックス（これは転写開始部位の２５塩基対〜３０塩基対上流側に位置する）は、ＲＮＡポリメラーゼに、ＲＮＡ合成を開始させることに関与していると考えられる。それ以外の上流側のプロモーター要素は、転写が開始される速度を決定する。
【０１６５】
エンハンサー要素は、転写を、連結された相同的プロモーターまたは異種プロモーターから１０００倍まで刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流側または上流側に置かれたとき、活性がある。ウイルスに由来する多くのエンハンサー要素は広い宿主範囲を有しており、様々な組織において活性がある。例えば、ＳＶ４０の初期遺伝子エンハンサーが多くの細胞タイプについて好適である。本発明のために好適である他のエンハンサー／プロモーター組合せには、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、様々なレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルスまたはラウス肉腫ウイルス、およびＨＩＶなど）からの長末端反復に由来するものが含まれる。Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８３）を参照のこと（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１６６】
発現ベクターの構築において、プロモーターは好ましくは、その天然の環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離で異種の転写開始部位から配置される。しかしながら、当該分野で既知のように、この距離におけるある程度の変動が、プロモーター機能の喪失を伴うことなく受け入れられ得る。
【０１６７】
既に述べられた要素に加えて、本発明の発現ベクターは、典型的には、クローン化された核酸の発現レベルを増大させるために、または、組換えＤＮＡを有する細胞の特定を容易にするために意図された他の特殊化された要素を含有することができる。例えば、数多くの動物ウイルスは、許容細胞タイプにおけるウイルスゲノムの染色体外の複製を促進させるＤＮＡ配列を含有する。このようなウイルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、プラスミドにおいて運ばれる遺伝子によるか、または、宿主細胞のゲノムとともに運ばれる遺伝子によるかのいずれかで提供される限り、エピソームとして複製する。
【０１６８】
ベクターは真核生物のレプリコンを含んでも、含まなくてもよい。真核生物のレプリコンが存在するならば、ベクターは、適切な選択マーカーを使用して真核生物細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物のレプリコンを含まないならば、エピソーム増幅ができない。その代わり、組換えＤＮＡは、操作された細胞のゲノムに組み込まれ、その細胞において、プロモーターが所望の核酸の発現を行わせる。
【０１６９】
本発明の発現ベクターはさらに、例えば、１つのｍＲＮＡからの数個のタンパク質の翻訳を可能にするさらなるポリヌクレオチド配列（例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）など）、および、プロモーターキメラポリペプチドのゲノム組み込みのための配列を含むことができる。
【０１７０】
哺乳動物発現ベクターの例には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能であるｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．ｌ（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能であるｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能であるｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能であるｐＴＲＥＳ、ならびに、それらの誘導体が含まれる。
【０１７１】
真核生物ウイルス（例えば、レトロウイルスなど）に由来する調節要素を含有する発現ベクターもまた使用することができる。ＳＶ４０系ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターには、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタイン・バールウイルスに由来するベクターには、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または、真核生物細胞での発現のために効果的であることが示されている他のプロモーターの指揮下でのタンパク質の発現を可能にする他のベクターが含まれる。
【０１７２】
ウイルスは、多くの場合において宿主の防御機構を回避するように進化してきた非常に特殊化された感染性因子である。典型的には、ウイルスは特定の細胞タイプに感染し、特定の細胞タイプにおいて増殖する。ウイルスベクターの標的化特異性では、その天然の特異性が、所定の細胞タイプを特異的に標的化し、それにより、組換え遺伝子を感染細胞に導入するために利用される。従って、本発明によって使用されるベクターのタイプは、形質転換された細胞タイプに依存する。
【０１７３】
組換えウイルスベクターは、側方感染のような利点を提供するので、本発明のポリペプチドの発現のために有用でありうる。側方感染は、例えば、レトロウイルスの生活環において固有のものであり、出芽し、周りの細胞に感染する多くの子孫ビリオンを１個の感染細胞が産生するプロセスである。その結果は、最初のウイルス粒子によってそのほとんどが最初に感染していなかった広い面積が急速に感染することである。これは、感染性因子が娘核種を介してのみ広がる垂直型の感染とは対照的である。横方向に広がることができないウイルスベクターもまた作製することができる。この特徴は、所望する目的が、指定された遺伝子を局在化した多数の標的化された細胞のみに導入することであるならば、有用であり得る。
【０１７４】
様々な原核生物細胞または真核生物細胞を、本発明のポリペプチドを発現させるための宿主−発現システムとして使用することができる。これらには、微生物、例えば、ポリペプチドコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換される細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（これには、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＰおよびＢＬ２１＊のＥ．ｃｏｌｉ株が挙げられるが、これらに限定されない）、および、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；ポリペプチドコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換される酵母など；ポリペプチドコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）が感染させられるか、または、ポリペプチドコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミドなど）により形質転換される植物細胞システムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７５】
様々な方法を、本発明の発現ベクターをホスト発現系の細胞に導入するために使用することができる。そのような方法が、一般には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９８９）；Ｃｈａｎｇ他、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５）；Ｖｅｇａ他、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５）；Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）；および、Ｇｉｌｂｏａ他［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４〜５１２、１９８６］に記載され、そのような方法には、例えば、組換えウイルスベクターを用いた安定的トランスフェクションまたは一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が含まれる。加えて、陽性−陰性の選択法については米国特許第５４６４７６４号および同第５４８７９９２号を参照のこと。
【０１７６】
ウイルス感染による核酸の導入では、より高いトランスフェクション効率をウイルスの感染性のために得ることができるので、他の方法（例えば、リポフェクションおよびエレクトロポレーションなど）を上回る利点がいくつかもたらされる。
【０１７７】
１つの実施形態によれば、本発明のポリペプチドは植物において発現される。
【０１７８】
本明細書中で使用されるとき、用語「植物」は、完全な植物体、植物および植物の一部分（種子、苗条、茎、根（根茎を含む）および植物細胞を含む）の祖先および子孫、組織および器官を包含する。植物は、懸濁培養物、胚、成長点領域、カルス組織、葉、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を含めて、任意の形態であり得る。本発明の方法において特に有用である植物には、緑色植物亜界に属する全ての植物が含まれ、具体的には、下記の植物を含むリストから選択される家畜用もしくは飼料用のマメ科植物、観賞植物、食物作物、樹木または灌木を含む単子葉植物および双子葉植物が含まれる：アカシア属（Ａｃａｃｉａ）ｓｐｐ．、カエデ属（Ａｃｅｒ）ｓｐｐ．、マタタビ属（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）ｓｐｐ．、トチノキ属（Ａｅｓｃｕｌｕｓ）ｓｐｐ．、カウリマツ（Ａｇａｔｈｉｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、アルビジア・アマラ（Ａｌｂｉｚｉａ  ａｍａｒａ）、アルソフィラ・トリカラー（Ａｌｓｏｐｈｉｌａ  ｔｒｉｃｏｌｏｒ）、ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）ｓｐｐ．、ラッカセイ属（Ａｒａｃｈｉｓ）ｓｐｐ、ビンロウジュ（Ａｒｅｃａ  ｃａｔｅｃｈｕ）、アステリア・フラグランス（Ａｓｔｅｌｉａ  ｆｒａｇｒａｎｓ）、アストラガルス・シセル（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｃｉｃｅｒ）、バイキアエア・プルリジュガ（Ｂａｉｋｉａｅａ  ｐｌｕｒｉｊｕｇａ）、カバノキ属（Ｂｅｔｕｌａ）ｓｐｐ．、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）ｓｐｐ．、オヒルギ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ  ｇｙｍｎｏｒｒｈｉｚａ）、ブルケア・アフリカナ（Ｂｕｒｋｅａ  ａｆｒｉｃａｎａ）、ツルハナモツヤクノキ（Ｂｕｔｅａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）、カダバ・ファリノサ（Ｃａｄａｂａ  ｆａｒｉｎｏｓａ）、ベニゴウカン属（Ｃａｌｌｉａｎｄｒａ）ｓｐｐ、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ダンドク（Ｃａｎｎａ  ｉｎｄｉｃａ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）ｓｐｐ．、カワラケツメイ属（Ｃａｓｓｉａ）ｓｐｐ．、セントロエマ・プベセンス（Ｃｅｎｔｒｏｅｍａ  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、カクーメレス属（Ｃｈａｃｏｏｍｅｌｅｓ）ｓｐｐ．、カシア（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｓｓｉａ）、アラビアコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）、モパネ（Ｃｏｌｏｐｈｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｍｏｐａｎｅ）、コロニリア・バリア（Ｃｏｒｏｎｉｌｌｉａ  ｖａｒｉａ）、コトネアステル・セロチナ（Ｃｏｔｏｎｅａｓｔｅｒ  ｓｅｒｏｔｉｎａ）、サンザシ属（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ）ｓｐｐ．、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）ｓｐｐ．、イトスギ属（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ）ｓｐｐ．、シアテア・デアルバタ（Ｃｙａｔｈｅａ  ｄｅａｌｂａｔａ）、マルメロ（Ｃｙｄｏｎｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、オガルカヤ属（Ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎ）ｓｐｐ．、シンテア・デアルバタ（Ｃｙｎｔｈｅａ  ｄｅａｌｂａｔａ）、マルメロ、ダルベルギア・モネタリア（Ｄａｌｂｅｒｇｉａ  ｍｏｎｅｔａｒｉａ）、ダバリア・ジバリカタ（Ｄａｖａｌｌｉａ  ｄｉｖａｒｉｃａｔａ）、ヌスビトハギ属（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ）ｓｐｐ．、ジクソニア・スクアロサ（Ｄｉｃｋｓｏｎｉａ  ｓｑｕａｒｏｓａ）、ジベテロポゴン・アンプレクテンス（Ｄ��ｂｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ  ａｍｐｌｅｃｔｅｎｓ）、ジオクレア属（Ｄｉｏｃｌｅａ）ｓｐｐ、ドリコス属（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ）ｓｐｐ．、ドリクニウム・レクツム（Ｄｏｒｙｃｎｉｕｍ  ｒｅｃｔｕｍ）、エキノクロア・ピラミダリス（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ  ｐｙｒａｍｉｄａｌｉｓ）、エーラフィア属（Ｅｈｒａｆｆｉａ）ｓｐｐ．、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ）、エラグレスチス属（Ｅｒａｇｒｅｓｔｉｓ）ｓｐｐ．、デイゴ属（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ）ｓｐｐ．、ユーカリプフス属（Ｅｕｃａｌｙｐｆｕｓ）ｓｐｐ．、ユークレア・シンペリ（Ｅｕｃｌｅａ  ｓｃｈｉｍｐｅｒｉ）、ユーラリア・ビロサ（Ｅｕｌａｌｉａ  ｖｉ／ｌｏｓａ）、パゴピルム属（Ｐａｇｏｐｙｒｕｍ）ｓｐｐ．、フェイジョア・セローラナ（Ｆｅｉｊｏａ  ｓｅｌｌｏｗｌａｎａ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）ｓｐｐ．、フレミンギア属（Ｆｌｅｍｉｎｇｉａ）ｓｐｐ、フレイシネチア・バンクスリ（Ｆｒｅｙｃｉｎｅｔｉａ  ｂａｎｋｓｌｉ）、ゲンノウショウコ（Ｇｅｒａｎｉｕｍ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、ギンアゴ・ビロバ（ＧｉｎＡｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）、グリシネ・ジャバニカ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｊａｖａｎｉｃａ）、グリリシジア属（Ｇｌｉｒｉｃｉｄｉａ）ｓｐｐ、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、グレビレア属（Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ）ｓｐｐ．、グイボウルチア・コレオスペルマ（Ｇｕｉｂｏｕｒｔｉａ  ｃｏｌｅｏｓｐｅｒｍａ）、イワオウギ属（Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ）ｓｐｐ．、ヘマフィア・アルチシマ（Ｈｅｍａｆｆｈｉａ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、ヘテロポゴン・コントフス（Ｈｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ  ｃｏｎｔｏｆｆｕｓ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒパレニア・ルファ（Ｈｙｐａｒｒｈｅｎｉａ  ｒｕｆａ）、オトギリソウ（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｅｒｅｃｔｕｍ）、ヒペフェリア・ジソルテ（Ｈｙｐｅｆｆｈｅｌｉａ  ｄｉｓｓｏｌｕｔｅ）、インジゴ・インカマタ（Ｉｎｄｉｇｏ  ｉｎｃａｍａｔａ）、アヤメ属（Ｉｒｉｓ）ｓｐｐ．、レプタレナ・ピロリホリア（Ｌｅｐｔａｒｒｈｅｎａ  ｐｙｒｏｌｉｆｏｌｉａ）、ハギ属（Ｌｅｓｐｅｄｉｚａ）ｓｐｐ．、レツカ属（Ｌｅｔｔｕｃａ）ｓｐｐ．、ギンネム（Ｌｅｕｃａｅｎａ  ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ）、ロウデチア・シンプレクス（Ｌｏｕｄｅｔｉａ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、ロトヌス・バイネスリ（Ｌｏｔｏｎｕｓ  ｂａｉｎｅｓｌｉ）、ミヤコグサ属（Ｌｏｔｕｓ）ｓｐｐ．、マクロチロマ・アクシラレ（Ｍａｃｒｏｔｙｌｏｍａ  ａｘｉｌｌａｒｅ）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）ｓｐｐ．、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｌｉｖａ）、メタセコイア（Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ  ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｓａｐｉｅｎｔｕｍ）、ニコチアヌム属（Ｎｉｃｏｔｉａｎｕｍ）ｓｐｐ．、オノブリキス属（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）ｓｐｐ．、オルニトプス属（Ｏｒｎｉｔｈｏｐｕｓ）ｓｐｐ．、イネ属（Ｏｒｙｚａ）ｓｐｐ．、ペルトホルム・アフリカヌム（Ｐｅｌｔｏｐｈｏｒｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）ｓｐｐ．、ペルセア・グラチシマ（Ｐｅ��ｓｅａ  ｇｒａｔｉｓｓｉｍａ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）ｓｐｐ．、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）ｓｐｐ．、カナリーヤシ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｃａｎａｒｉｅｎｓｉｓ）、ホルミウム・クーキアヌム（Ｐｈｏｒｍｉｕｍ  ｃｏｏｋｉａｎｕｍ）、カナメモチ属（Ｐｈｏｔｉｎｉａ）ｓｐｐ．、カナダトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）ｓｐｐ．、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖａｍ）、ポドカルプス・トタラ（Ｐｏｄｏｃａｒｐｕｓ  ｔｏｔａｒａ）、ポゴナルトリア・フレキイ（Ｐｏｇｏｎａｒｔｈｒｉａ  ｆｌｅｃｋｉｉ）、ポゴナフリア・スクアロサ（Ｐｏｇｏｎａｆｆｈｒｉａ  ｓｑｕａｒｒｏｓａ）、ヤマナラシ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）ｓｐｐ．、プロソピス・シネラリア（Ｐｒｏｓｏｐｉｓ  ｃｉｎｅｒａｒｉａ）、ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）、プテロロビウム・ステラツム（Ｐｔｅｒｏｌｏｂｉｕｍ  ｓｔｅｌｌａｔｕｍ）、セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、コナラ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ）ｓｐｐ．、シャリンバイ（Ｒｈａｐｈｉｏｌｅｐｓｉｓ  ｕｍｂｅｌｌａｔａ）、ロパロスチリス・サピダ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｔｙｌｉｓ  ｓａｐｉｄａ）、ルス・ナタレンシス（Ｒｈｕｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）、セイヨウスグリ（Ｒｉｂｅｓ  ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａ）、スグリ属（Ｒｉｂｅｓ）ｓｐｐ．、ニセアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）、バラ属（Ｒｏｓａ）ｓｐｐ．、キイチゴ属（Ｒｕｂｕｓ）ｓｐｐ．、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）ｓｐｐ．、シザキリウム・サングイネウム（Ｓｃｈｙｚａｃｈｙｒｉｕｍ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｍ）、シアドピチス・ベフィシラタ（Ｓｃｉａｄｏｐｉｔｙｓ  ｖｅｆｆｉｃｉｌｌａｔａ）、セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、セコイアオスギ（Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ  ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）ｓｐｐ．、スポロボルス・フィンブリアツス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ  ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ）、スチブルス・アロペクロイデス（Ｓｔｉｂｕｒｕｓ  ａｌｏｐｅｃｕｒｏｉｄｅｓ）、スチロサントス・フミリス（Ｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｏｓ  ｈｕｍｉｌｉｓ）、タデハギ属（Ｔａｄｅｈａｇｉ）ｓｐｐ、ヌマスギ（Ｔａｘｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ）、テメダ・トリアンドラ（Ｔｈｅｍｅｄａ  ｔｒｉａｎｄｒａ）、シャジクソウ属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）ｓｐｐ．、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）ｓｐｐ．、アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）、スノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）ｓｐｐ．、ソラマメ属（Ｖｉｃｉａ）ｓｐｐ．、ビチス・ビニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ワトソニア・ピラミダタ（Ｗａｔｓｏｎｉａ  ｐｙｒａｍｉｄａｔａ）、オランダカイウ（Ｚａｎｔｅｄｅｓｃｈｉａ  ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、アマランサス、チョウセンアザミ、アスパラガス、ブロッコリー、メキャベツ（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ  ｓｐｒｏｕｔｓ）、キャベツ、カノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、コラード若葉、アマ、ケール、レンズマメ、アブラナ、オクラ、タマネギ、ジャガイモ��イネ、ダイズ、ストロー、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、スクアシュティー（ｓｑｕａｓｈ  ｔｅａ）、樹木。代替では、藻類および他の非緑色植物亜界植物を本発明の方法のために使用することができる。
【０１７９】
本発明のポリペプチドを植物において発現させるためには、本発明のポリペプチドをコードする構築物は典型的には、植物発現可能なプロモーターを含むことが理解される。
【０１８０】
本明細書中で使用されるとき、語句「植物発現可能な」は、植物の細胞、組織または器官における発現を、好ましくは、単子葉植物または双子葉植物の細胞、組織または器官における発現を誘導するか、または与えるか、または活性化するか、または強化することが少なくとも可能であるプロモーター配列（これは、それに結合するか、または、それに含有される何らかのさらなる調節エレメントを含む）を示す。本発明の構築物において有用であり得る１つの代表的なプロモーターが、本明細書中下記の実施例の節において例示されるように、配列番号３１に加えて、または、配列番号３１の存在下でのどちらかであっても、ＲｂｃＳ１プロモーター（配列番号３０）である。留意すべきことに、他の配列もまた、植物発現のために使用することができる（例えば、配列番号４８および配列番号５０に示される配列など）。
【０１８１】
本発明のポリペプチドの核酸配列は植物発現のために最適化することができる。そのような配列改変の例には、目的とする植物種において典型的に見出されるＧ／Ｃ含有量により近づけるための変化させたＧ／Ｃ含有量、および、コドン最適化として一般に示される、植物種において典型的に見出されないコドンの除去が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８２】
語句「コドン最適化」は、目的とする植物におけるコドン使用頻度に近づける、構造遺伝子またはそのフラグメントにおける使用のための適切なＤＮＡヌクレオチドの選択をいう。したがって、最適化された遺伝子または核酸配列は、生来的遺伝子または天然に存在する遺伝子のヌクレオチド配列が、植物における統計学的に好まれるコドンまたは統計学的に好都合であるコドンを利用するために改変されている遺伝子を示す。ヌクレオチド配列は典型的にはＤＮＡレベルで調べられ、植物種における発現のために最適化されたコード領域が、何らかの好適な手法を使用して、例えば、Ｓａｒｄａｎａ他（１９９６、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、１５：６７７〜６８１）に記載されるように決定される。この方法では、コドン使用頻度の標準偏差、すなわち、コドン使用頻度の偏りの尺度を、高発現の植物遺伝子の各コドンに対する生来的遺伝子の各コドンの使用頻度の二乗比例偏差を最初に見出し、その後、平均二乗偏差を計算することによって計算することができる。使用される式が、１ＳＤＣＵ＝ｎ＝１Ｎ［Ｘｎ−Ｙｎ］／Ｙｎ］２／Ｎであり、この式において、Ｘｎは高発現の植物遺伝子におけるコドンｎの使用の頻度を示し、Ｙｎは、目的とする遺伝子におけるコドンｎの使用の頻度を示し、Ｎは、目的とする遺伝子におけるコドンの総数を示す。双子葉植物の高発現遺伝子から得られるコドン使用頻度の表が、Ｍｕｒｒａｙ他（１９８９、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１７：４７７〜４９８）のデータを使用して編集される。
【０１８３】
核酸配列を特定の植物細胞タイプのための好ましいコドン使用頻度に従って最適化することの１つの方法が、コドン最適化表、例えば、日本のＮＩＡＳ（独立行政法人農業生物資源研究所）ＤＮＡバンクからコドン使用頻度データベース（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）においてオンラインで提供されるコドン最適化表などの、何らかの余分な統計学的計算を行うことを伴わない直接的な使用に基づく。このコドン使用頻度データベースは、いくつかの異なる種についてのコドン使用頻度表を含有しており、それぞれのコドン使用頻度表が、Ｇｅｎｂａｎｋに存在するデータに基づいて統計学的に決定されている。
【０１８４】
最も好ましいコドンまたは最も好都合であるコドンを特定の種（例えば、イネ）においてそれぞれのアミノ酸について決定するために上記の表を使用することによって、目的とするタンパク質をコードする天然に存在するヌクレオチド配列をその特定の植物種のためにコドン最適化することができる。これが、低い統計学的出現率を特定の種のゲノムにおいて有し得るコドンを、アミノ酸に関して、統計学的により好都合である対応するコドンにより置き換えることによって達成される。しかしながら、１つ以上のあまり好都合でないコドンを、存在する制限部位を欠失するために、または、新しい制限部位を潜在的に有用な接合部（シグナルペプチドカセットまたは終結カセットを加えるための５’末端および３’末端、正しい全長配列を作製するためにセグメントを切断し、一緒にスプライスするために使用されるかもしれない内部部位）において作るために、または、ｍＲＮＡの安定性もしくは発現に負の影響を及ぼし得るヌクレオチド配列を排除するために選択することができる。
【０１８５】
天然に存在するコードヌクレオチド配列は既に、何らかの改変に先立って、特定の植物種における統計学的に好都合であるコドンに対応するいくつかのコドンを含有する場合がある。したがって、生来的ヌクレオチド配列のコドン最適化では、どのコドンが、生来的ヌクレオチド配列において、特定の植物に関して統計学的に好都合でないかを決定すること、および、これらのコドンをその特定の植物のコドン使用頻度表に従って改変して、コドン最適化された派生物を作製することを含むことができる。改変されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質が、対応する天然に存在する遺伝子または生来的遺伝子によってコードされるタンパク質よりも高いレベルで産生されるならば、改変されたヌクレオチド配列は、植物のコドン使用頻度について完全または部分的に最適化され得る。コドン使用頻度を変更することによる合成遺伝子の構築が、例えば、ＰＣＴ特許出願公開９３／０７２７８号に記載される。
【０１８６】
したがって、本発明は、本明細書中上記の核酸配列、そのフラグメント、それとのハイブリダイゼーションが可能な配列、その相同的配列、そのオルソロガス配列、異なるコドン使用頻度を有する類似したポリペプチドをコードする配列、変異（例えば、天然に存在するか、または、人為的に誘導されたかのどちらであっても、ランダムまたは標的化された様式のどちらであっても、１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置換など）によって特徴づけられる変化した配列を包含する。
【０１８７】
本発明のポリペプチドを植物において発現させるために使用することができる代表的なポリヌクレオチド配列が配列番号２０〜配列番号２２に示される。
【０１８８】
本発明の核酸構築物を用いて、植物細胞を安定的または一過性に形質転換することができる。安定的な形質転換では、本発明の核酸分子は植物のゲノムに組み込まれ、そのため、安定で、かつ、受け継がれる形質を表す。一過性の形質転換では、核酸分子が、形質転換された細胞によって発現されるが、それはゲノムには組み込まれず、そのため、それは一過性の形質を表す。
【０１８９】
単子葉植物および双子葉植物の両方に外来遺伝子を導入する様々な方法が存在している（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）４２：２０５−２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３８：２７４−２７６）。
【０１９０】
外因性ＤＮＡの植物のゲノムＤＮＡへの安定した組み込みを起こす原理的な方法としては、２つの主なアプローチが挙げられる：
（ｉ）アグロバクテリウムによって媒介される遺伝子導入：Ｋｌｅｅら（１９８７）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：４６７−４８６；ＫｌｅｅおよびＲｏｇｅｒｓ（１９８９）．Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，第６巻，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｇｅｎｅｓ，ｐｐ．２−２５，Ｊ．ＳｃｈｅｌｌおよびＬ．Ｋ．Ｖａｓｉｌ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．；およびＧａｔｅｎｂｙ，（１９８９）．ｐｐ．９３−１１２，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓ．Ｋｕｎｇ，およびＣ．Ｊ．Ａｒｎｔｚｅｎ編，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．を参照のこと。
（ｉｉ）直接ＤＮＡ取り込み：Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら，．Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，第６巻，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｇｅｎｅｓ，Ｊ．Ｓｃｈｅｌｌ，およびＬ．Ｋ．Ｖａｓｉｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ，（１９８９）ｐ．５２−６８；およびＴｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．ら，（１９８８）．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ  ６：１０７２−１０７４（プロトプラストにＤＮＡを直接取り込むための方法）を参照のこと。また、Ｚｈａｎｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．（１９８８）７：３７９−３８４；およびＦｒｏｍｍら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３１９：７９１−７９３（植物細胞の短時間の電気的ショックによって誘導されるＤＮＡの取り込み）を参照のこと。また、Ｋｌｅｉｎら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：５５９−５６３；ＭｃＣａｂｅら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：９２３−９２６；およびＳａｎｆｏｒｄ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ（１９９０）７９：２０６−２０９（粒子衝突による植物細胞または組織へのＤＮＡの注入）を参照のこと。また、Ｎｅｕｈａｕｓら，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８７）７５：３０−３６；およびＮｅｕｈａｕｓおよびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ（１９９０）７９：２１３−２１７（マイクロピペットシステムの使用）を参照のこと。米国特許第５４６４７６５号（細胞培養物、胚、またはカルス組織の、ガラス繊維または炭化シリコンウィスカー形質転換）を参照のこと。あるいは、ＤｅＷｅｔら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｇ．Ｐ．，Ｍａｎｔｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．及びＤａｎｉｅｌｓ，Ｗ．編，Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，（１９８５）ｐｐ．１９７−２０９；およびＯｈｔａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：７１５−７１９（発芽花粉とのＤＮＡの直接のインキュベーション）を参照のこと。
【０１９１】
安定的な形質転換が現在好ましいが、葉細胞、分裂組織細胞または植物体全体の一過性の形質転換もまた本発明によって想定される。
【０１９２】
一過性の形質転換を、上記で記載された直接的なＤＮＡ移動方法のいずれかによって、または、改変された植物ウイルスを使用するウイルス感染によって行うことができる。
【０１９３】
植物宿主の形質転換のために有用であることが示されているウイルスには、ＣａＭＶ、ＴＭＶおよびＢＶが含まれる。植物ウイルスを使用する植物の形質転換が、米国特許第４８５５２３７号（ＢＧＶ）；欧州特許ＥＰＡ６７５５３（ＴＭＶ）；特開昭６３−１４６９３（ＴＭＶ）；欧州特許ＥＰＡ１９４８０９（ＢＶ）；欧州特許ＥＰＡ２７８６６７（ＢＶ）；およびＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．他（１９８８）、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１７２頁〜１８９頁に記載される。外来ＤＮＡを、植物を含む多くの宿主において発現させる際に使用するための偽ウイルス粒子が国際特許出願公開ＷＯ８７／０６２６１に記載される。
【０１９４】
宿主細胞系とは無関係であるが、（ポリペプチドをコードする）挿入されたコード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含有すること以外に、本発明の発現構築物はまた、発現ポリペプチドの安定性、産生、精製、収量または活性を最適化するために操作された配列を含むことができることが理解される。
【０１９５】
形質転換された細胞が、多量の組換えポリペプチドの発現を可能にする効果的な条件のもとで培養される。効果的な培養条件には、タンパク質の産生を可能にする効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が挙げられるが、これらに限定されない。効果的な培地は、細胞が、本発明の組換えポリペプチドを産生するために培養される任意の培地を示す。そのような培地には典型的には、同化可能な炭素源、窒素源およびリン酸源、ならびに、適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養分（例えば、ビタミンなど）を有する水溶液が含まれる。本発明の細胞は、従来の発酵用バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿で培養することができる。培養を、組換え細胞に適切な温度、ｐＨおよび酸素含有量において行うことができる。そのような培養条件は当業者の専門的知識の範囲内である。
【０１９６】
産生のために使用されるベクターおよび宿主の系に依存して、得られる本発明のポリペプチドは組換え細胞内に留まり得るか、または、発酵培地に分泌され得るか、または、２つの細胞膜の間の空間（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける細胞膜周辺腔など）に分泌され得るか、または、細胞膜もしくはウイルス膜の外側表面に保持され得るかのいずれかである。
【０１９７】
培養での所定期間の後、組換えポリペプチドの回収が行われる。
【０１９８】
本明細書中で使用されるとき、語句「組換えポリペプチドを回収する」は、ポリペプチドを含有する発酵培地全体を集めることを示し、分離または精製のさらなる工程を意味する必要はない。
【０１９９】
したがって、本発明のポリペプチドは、様々な標準的なタンパク質精製技術を使用して、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび示差的可溶化など（これらに限定されない）を使用して精製することができる。
【０２００】
回収を容易にするために、発現したコード配列は、本発明のポリペプチドと、融合された切断可能な成分（例えば、ヒスチジン）とをコードするように操作することができる。そのような融合タンパク質は、ポリペプチドがアフィニティークロマトグラフィーによって、例えば、切断可能な成分に対して特異的なカラムでの固定化によって容易に単離され得るように設計することができる。実施例３〜実施例５および実施例８は本発明のレシリンポリペプチドおよびクモ絹糸ポリペプチドの精製を記載する。
【０２０１】
切断部位が、ポリペプチドと、切断可能な成分との間で操作される場合、ポリペプチドは、融合タンパク質をこの部位において特異的に切断する適切な酵素または薬剤による処理によってクロマトグラフィーカラムから遊離させることができる［例えば、Ｂｏｏｔｈ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１９：６５〜７０（１９８８）；および、Ｇａｒｄｅｌｌａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１５８５４〜１５８５９（１９９０）を参照のこと］。
【０２０２】
本発明のポリペプチドは好ましくは、「実質的に純粋な」形態で回収される。
【０２０３】
本明細書中で使用されるとき、語句「実質的に純粋な」は、本明細書中に記載される適用におけるタンパク質の効果的な使用を可能にする純度を示す。
【０２０４】
宿主細胞において合成可能であることに加えて、本発明のポリペプチドはまた、インビトロ発現システムを使用して合成することができる。これらの方法が当該技術分野では広く知られており、そのようなシステムの構成成分が市販されている。
【０２０５】
本発明のポリペプチドの発現および最適な精製の後、ポリペプチドは、不溶物を溶液（好ましくは、比較的高い濃度のポリペプチドを有する溶液）から形成するために重合することができる。１つの実施形態によれば、本発明のレシリンポリペプチドの臨界濃度が約５０ｍｇ／ｍｌである。１つの実施形態によれば、ポリペプチドは限外ろ過によって濃縮される。
【０２０６】
一般には、タンパク質の架橋を、標準的な架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド、ジイソシアナートおよびゲニピンなど）を使用して行うことができる。特定の繊維状ポリペプチドモノマーのための代表的な重合条件が本明細書中下記に示される。
【０２０７】
レシリンのための架橋条件
好ましい実施形態によれば、架橋は、ジチロシン結合が形成されるように行われる。これらの方法は当業者には広く知られており、ＭａｌｅｎｃｉｋおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６、３５、４３７５〜４３８６）によって議論される（その内容は参照として本明細書中に組み込まれる）。
【０２０８】
１つの実施形態において、Ｒｕ（ｂｐｙ）３Ｃｌ２・６Ｈ２Ｏの存在下での酵素媒介による架橋を用いることができる。レシリンを架橋するために使用することができる代表的なペルオキシダーゼには、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルトロミセス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ）ペルオキシダーゼ、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）由来のＤｕｏｘペルオキシダーゼ、ウニのオボペルオキシダーゼおよび絨毛膜が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０９】
照射後、Ｒｕ（ＩＩＩ）イオンが形成され、このＲｕ（ＩＩＩ）イオンが、炭素ラジカルをポリペプチド内で、好ましくはチロシン残基において生じさせるための電子引き抜き剤として作用し、したがって、ジチロシン連結の形成を可能にする。この誘導方法は、可溶性のレシリンまたはプロレシリンフラグメントを非常に高分子量の凝集体に定量的に変換することを可能にする。そのうえ、この方法は、組換えレシリンを所望される形状のガラス管に導入し、その中に含有される組換えレシリンに照射することによるバイオエラストマーの好都合な形状化を可能にする。
【０２１０】
別の実施形態において、ＵＶ照射が、本発明のレシリンポリペプチドを架橋するために行われる［Ｌｅｈｒｅｒ  ＳＳ、Ｆａｓｍａｎ  ＧＤ（１９６７）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６（３）：７５７〜６７；Ｍａｌｅｎｃｉｋ  ＤＡ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＳＲ（２００３）、Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ、２５（３−４）：２３３〜４７］。だが、この放射線への暴露によりタンパク質を損傷させないように注意しなければならない。ＵＶＢ放射線による架橋もまた、リボフラビンの存在下または非存在下で着手することができる。リボフラビンの非存在下では、実質的な量の架橋が１時間の暴露のうちに生じる。リボフラビンが存在するならば、架橋時間が実質的に減少する。なおさらに、架橋をクマリンの存在下で紫外光により達成することができ、または、フルオレセインの存在下で白色光によって達成することができる。ジチロシンの分析を、ジチロシン架橋形成の程度を確認するために、従来の方法（例えば、高速液体クロマトグラフィー測定など）を使用して行うことができる。
【０２１１】
金属イオンおよびＨ２Ｏ２もまた、Ｆｅｎｔｏｎ反応によるジチロシン形成を誘導するために使用することができる［Ａｌｉ  ＦＥ、Ｊ  Ｉｎｏｒｇ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、９８（１）：１７３〜８４］。
【０２１２】
エラスチンのための架橋条件：
転移温度（Ｔｍ）を超えて加熱した後で、エラスチンは、下記の酸化剤を使用して架橋することができる：リシルオキシダーゼビス（スルホスクシミジル）スベラート、ピロロキノリンキニン（ＰＱＱ）、カテコール／ペルオキシダーゼ試薬、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下での１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）、１，６−ジイソシアナトヘキサン（ＨＯＢｔ）、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ゲニピン。
【０２１３】
エラスチンはγ照射によってもまた架橋することができ、または、メタクリラートによる官能化の後で、エラスチンはまた光架橋することができる。
【０２１４】
絹糸のための架橋条件：
絹糸ポリペプチド、例えば、クモ絹糸およびカイコ絹糸などは、有機溶媒（例えば、メタノールなど）を使用してβシートに重合することができる。代替では、絹糸ポリペプチドは、βシートを形成させるために、水に可溶化し、続いて、脱水することができる。
【０２１５】
コラーゲンのための架橋条件：
コラーゲンは、グルタルアルデヒドおよび他の化学的架橋剤によって、または、種々の糖を使用する糖化によって、または、金属イオン（例えば、銅など）を使用するＦｅｎｔｏｎ反応によって、または、リシンオキシダーゼによって、または、ＵＶ放射線によって架橋することができる。
【０２１６】
架橋の影響およびモノマー単位あたりの架橋の最適な数を求めるために、架橋ポリマーの反発弾性を、当該技術分野において知られている方法を使用して測定することができる。得られるポリマーが不可欠な弾力性を示すならば、架橋レベルは変化し得る。例えば、架橋がγ照射によるとき、架橋度は照射時間および照射エネルギーの関数である。所望されるレベルの架橋を達成するために要求される時間は、架橋されていないポリマーを放射線源に種々の時間間隔にわたってさらし、得られる架橋物の反発弾性（弾性係数）の程度をそれぞれの時間間隔について求めることによって容易に算定することができる。この実験法によって、特定の適用のために適切なレベルの反発弾性をもたらすために要求される照射時間を決定することが可能である。
【０２１７】
架橋度を反応の期間中にモニターすることができ、または、一定量の反応物を使用することによって事前に決定することができる。例えば、レシリンポリペプチドの場合、ジチロシン架橋は蛍光性であるので、反応物混合物の蛍光スペクトルを、架橋の程度を任意の特定の時間において求めるために反応の経過期間中にモニターすることができる。所望されるレベルの架橋が達成され（所定の蛍光強度に達することによって示される）と、ペルオキシダーゼにより触媒される反応を、例えば、グルタチオンの添加によって停止させることができる。
【０２１８】
本発明のポリペプチドはそのまま使用することができ、または、新規な複合材料を作製するために多糖とブレンド配合することができる。
【０２１９】
したがって、本発明の他の態様によれば、繊維状ポリペプチドと、多糖とを含む単離された複合物が提供される。
【０２２０】
本明細書中で使用されるとき、用語「複合物」は、２つ以上の異なった材料から構成され、１つが繊維状ポリペプチドであり、それ以外が多糖であり、それらのそれぞれがその同一性（例えば、物理的特徴）を保持し、一方で、望ましい性質を複合物に与える実質的に固体の物を示す。
【０２２１】
本明細書中で使用されるとき、用語「単離された」は、複合物がそのインビボ環境において他の物質（例えば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まないこと（例えば、レシリン−キチンの複合物の場合には、昆虫の他の翼成分から除かれていること）を示す。他の実施形態によれば、複合物はまた、固体支持体から単離される（すなわち、除かれる）（すなわち、固定化されていない）。
【０２２２】
本発明の複合物のために意図される代表的な多糖には、キチン、セルロース、デンプン、デキストラン、グルカン、キトサン、アルギン酸塩およびヒアルロン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２３】
セルロースは粉末形態であり得る（例えば、Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ、セルロースウィスカー、セルロース糸または３Ｄ構造物（例えば、紙または足場など）など）。ウィスカーの調製が典型的には、６０％Ｈ２ＳＯ４による６０℃での１時間〜６時間のセルロースの加水分解、その後での超音波処理によって行われる。その後、懸濁物は２回蒸留Ｈ２Ｏ（ＤＤＷ）に希釈され、続いて、酸を除くために、ＤＤＷによる再懸濁および遠心分離のサイクルが繰り返される（少なくとも５回）。最後に、ウィスカーペレットが、７に至るまでｐＨをモニターしながら、ＤＤＷに対して透析される。ウィスカーの品質を透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）によってモニターすることができる。
【０２２４】
本発明のこの態様の１つの実施形態によれば、本発明の繊維状ポリペプチドのモノマーは多糖結合ドメイン（例えば、異種の多糖結合ドメイン）を含む。そのような多糖結合ドメインは、多糖と、繊維状ポリペプチドとの間での一方向の結合を規定された接触点において可能にする。さらには、多糖に対する繊維状ポリペプチドの親和性を多糖結合ドメインに従って調節することができる。
【０２２５】
本発明によって意図される他の複合物には、２つの繊維状ポリペプチドを含む複合物であって、それらの少なくとも１つが異種の多糖結合ドメインを含む複合物が含まれる。
【０２２６】
そのような複合物はまた、多糖を含むことができる。したがって、２つの繊維状ポリペプチドと、多糖との複合物もまた、本発明によって意図される。
【０２２７】
本発明の複合物は、構成成分の繊維状ポリペプチドと比較して、強化された特徴（例えば、増大した強度）を含むことが予想される。これは、多糖（例えば、セルロースウィスカー）の平坦かつ整列した表面が、通常の場合には剪断応力および伸長応力を要求する繊維状ポリペプチドの集合のためのテンプレートとして役立ち得るからである。
【０２２８】
本発明の複合物を作製するために、繊維状ポリペプチドのモノマーの懸濁物および多糖（例えば、セルロースウィスカー）の懸濁物（例えば、およそ２％の固形物含有量）が一緒にブレンド混合される。
【０２２９】
成分懸濁物の代表的な比率には、１００／０、９０／１０、８０／２０、７０／３０、６０／４０、５０／５０、４０／６０、３０／７０、２０／８０、１０／９０および０／１００が含まれる。
【０２３０】
混合された溶液は、好適な鋳型（例えば、Ｔｅｆｌｏｎまたはポリスチレン）に注型することができ、その後、適切な組み立ておよび架橋が必要に応じて行われる。
【０２３１】
上記で述べられたように、架橋のタイプは複合物の繊維状ポリペプチドに依存する。架橋を、本明細書中上記で記載される２つの繊維状ポリペプチド／多糖複合物を作製するために、他の繊維状ポリペプチドの存在下で達成することができる。
【０２３２】
本発明ではまた、新規な複合物を被覆することが意図される。１つの実施形態によれば、被覆は繊維状ポリペプチドから構成される。この方法では、複合物を架橋した後で、他の繊維状ポリペプチドの溶液における浸漬を行うことができる。被覆における繊維状タンパク質は典型的には、複合物の中に吸収される。被覆後、好適な重合法を、被覆の実際の繊維状ポリペプチドに依存して使用することができる。例えば、セルロース−レシリン複合物を、絹糸モノマーを含有する溶液に浸漬することができる。続いて、複合物を、絹糸βシートの形成を促進させる９０％メタノール溶液の中に移すことができ、これにより、セルロース−レシリン−絹糸の複合材料が得られる。
【０２３３】
本発明の複合物は、材料の分解特性および機械的性質を操作するために、ブレンド配合物および付加物において他のポリマーと組み合わせることができる。事実上任意の生体適合性ポリマーを複合物と組み合わせることができる。好ましい実施形態において、加えられたポリマーは生分解性である。代表的な生分解性ポリマーには、多糖、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、コラーゲン−ＧＡＧ、コラーゲン、フィブリンおよび他の細胞外マトリックス成分（例えば、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニンなど）を含めて、様々な天然ポリマーおよびそれらの合成アナログが含まれる。当該技術分野において知られている、加水分解により分解可能なポリマーには、例えば、ある種のポリエステル、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼンおよびポリホスホエステルが含まれる。当該技術分野において知られている生分解性ポリマーには、例えば、ある種のポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメラート、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシアルカノアート、ポリ（アミド−エナミン）、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）、ポリアセタール、ポリエーテル、生分解性ポリシアノアクリラート、生分解性ポリウレタンおよび多糖が含まれる。例えば、本発明において使用することができる具体的な生分解性ポリマーには、ポリリシン、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡおよびＰＧＡのコポリマーおよび混合物（例えば、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）（ＰＬＣ）およびポリ（グリコリド−ｃｏ−カプロラクトン）（ＰＧＣ））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３４】
当業者は、これが、生分解性ポリマーの、網羅的ではないが、代表的な列挙であることを認識する。これらのポリマーおよび他のポリマーの性質、ならびに、それらを調製するための方法がさらに、当該技術分野では記載される。例えば、米国特許第６１２３７２７号、同第５８０４１７８号、同第５７７０４１７号、同第５７３６３７２号、同第５７１６４０４号（Ｖａｃａｎｔｉ）；同第６０９５１４８号、同第５８３７７５２号（Ｓｈａｓｔｒｉ）；同第５９０２５９９号（Ａｎｓｅｔｈ）；同第５６９６１７５号、同第５５１４３７８号、同５５１２６００号（Ｍｉｋｏｓ）；同第５３９９６６５（Ｂａｒｒｅｒａ）；同第５０１９３７９号（Ｄｏｍｂ）；同第５０１０１６７号（Ｒｏｎ）；同第４８０６６２１号、同第４６３８０４５号（Ｋｏｈｎ）；同第４９４６９２９号（ｄ’Ａｍｏｒｅ）を参照のこと。同様にまた、Ｗａｎｇ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２３：９４８０、２００１；Ｌｉｍ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２３：２４６０、２００１；Ｌａｎｇｅｒ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｎ７．Ｒｅｓ．、３３：９４、２０００；Ｌａｎｇｅｒ、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、６２：７、１９９９；および、Ｕｈｒｉｃｈ他、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、９９：３１８１、１９９９を参照のこと。
【０２３５】
本発明の複合物はまた、非生分解性ポリマーと組み合わせることができる。例えば、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェンおよびそれらの誘導体は、播種された細胞または周りの組織に対するさらなる刺激を提供することができる有用な導電性ポリマーである。代表的な非生分解性ポリマーには、ポリスチレン、ポリエステル、非生分解性ポリウレタン、ポリウレア、ポリ（エチレンビニルアセタート）、ポリプロピレン、ポリメタクリラート、ポリエチレン、ポリカルボナートおよびポリ（エチレンオキシド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３６】
生体ポリマーに基づく生体材料の重要性が再建医療の分野では一貫して増大し続けている。近年では、この分野の中心が、埋め込みのための不活性な材料を求める探索から、組織と相互作用し、その正しい再生を促進させる、生体材料に基づく材料の開発に変わっている。さらには、合成インプラントは多くの場合、長期生体適合性の試験に合格せず、そのため、その取り替えが患者の生涯の期間中に必要となり、これが大きな欠点となっている。再建医療に関して、多糖およびタンパク質ポリマーが広範囲に研究されている。
【０２３７】
インビボで、特に、対象（例えば、ヒト患者）の体内で使用されるとき、本発明の複合物が生体適合性であることは重要である。「生体適合性」材料は、変異原性、抗原性、炎症性、発熱性または溶血性を実質的に有しない。さらには、「生体適合性」材料は、実質的な細胞毒性、急性全身毒性または皮内毒性を示してはならないか、あるいは、凝固時間を著しく低下させてはならない。これらの望ましくない生物学的活性についてのインビボ試験およびインビトロ試験が当該技術分野では広く知られている。そのようなアッセイの例が、例えば、米国特許第５５２７６１０号に示される（その内容は参照として組み込まれる）。同様にまた、インビボで使用されるとき、材料は生分解性であり得る。
【０２３８】
毒性または免疫原性が、例えば、関連した複合物において生じる場合、これらの望まれない影響を調節するための方法が当該技術分野では知られている。例えば、複合物を化学物質（例えば、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）またはメタ過ヨウ素酸塩など）で処理することによる複合物の「タンニング」は、毒性および免疫原性の両方を実質的に低下させる。好ましくは、インビボ使用のためのデバイスを作製するために使用される複合物はまた殺菌可能である。
【０２３９】
述べられたように、本発明の複合物は、再建医療の分野において、例えば、足場の作製などのために使用することができる。
【０２４０】
本明細書中で使用されるとき、用語「骨格」は、細胞が培養され得る（すなわち、所定の期間にわたって生存し、好ましくは増殖する）３Ｄマトリックスを示す。
【０２４１】
足場は、全体が本発明の複合物から構成され得るか、または、本発明の複合物が重ねられる固体支持体を含むことができる。
【０２４２】
使用されるような「固体支持体」は、細胞が培養され得る三次元マトリックスまたは平面状表面（例えば、細胞培養プレート）を示す。固体支持体は、天然に存在する物質に由来することができ（すなわち、タンパク質に基づくことができ）、または、合成物質に由来することができる。好適な合成マトリックスが、例えば、米国特許第５０４１１３８号、同第５５１２４７４号および同第６４２５２２２号に記載される。例えば、生分解性の人工ポリマー、例えば、ポリグリコール酸、ポリオルトエステルまたはポリ無水物などを固体支持体のために使用することができる。炭酸カルシウム、アラゴナイトおよび多孔性セラミックス（例えば、高密度ヒドロキシアパタイトセラミックス）もまた、固体支持体における使用のために好適である。ポリプロピレン、ポリエチレングリコールおよびポリスチレンなどのポリマーもまた、固体支持体において使用することができる。
【０２４３】
細胞の活性を調節する治療用化合物または治療剤もまた、足場複合材またはその一部に取り込むことができる（例えば、足場複合材またはその一部に結合、被覆、包埋または含浸することができる）。加えて、細胞接着、細胞拡大、細胞増殖、細胞分化および／または細胞遊走を足場において増大させるように作用する作用因もまた、足場に取り込むことができる。そのような作用因は生物学的作用因が可能である（例えば、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質および／またはプロテオグリカンなど）。
【０２４４】
本発明と一緒に使用することができる好適なタンパク質には、細胞外マトリックスタンパク質［例えば、フィブリノーゲン、コラーゲン、フィブロネクチン、ビメンチン、微小管会合タンパク質１Ｄ、神経突起伸長因子（ＮＯＦ）、細菌セルロース（ＢＣ）、ラミニンおよびゼラチン］、細胞接着タンパク質［例えば、インテグリン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ラミニン、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）１、Ｎ−ＣＡＭ、カドヘリン、テネイシン、ギセリン、ＲＧＤペプチドおよび神経傷害誘導タンパク質２（ニンジュリン２）］、増殖因子［上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−α、線維芽細胞増殖因子−酸性、骨形態形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子−塩基性、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子−Ｉ、インスリン様増殖因子−ＩＩ、インターフェロン−β、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子およびアンギオペプチン］、サイトカイン［例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、β−トロンボグロブリン、ＥＭＡＰ−ＩＩ、Ｇ−ＣＳＦおよびＩＬ−１０］、プロテアーゼ［ペプシン、低特異性キモトリプシン、高特異性キモトリプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、プロリンエンドペプチダーゼ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）、アスパラギン酸プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、ＡＤＡＭＴＳ１７、トリプターゼ−γおよびマトリプターゼ−２］およびプロテアーゼ基質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４５】
加えて、および／または、代替として、本発明の足場は、抗増殖剤（例えば、ラパマイシン、パクリタキセル、トラニラスト、アトルバスタチンおよびトラピジル）、免疫抑制薬物（例えば、シロリムス、タクロリムスおよびシクロスポリン）、および／または、抗血栓性もしくは接着防止性の物質（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、レテプラーゼ、ＴＮＫ−ｔＰＡ、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、クロピドグレル、アスピリン、ヘパリンおよび低分子量ヘパリン（例えば、エノキシパリンおよびダルテパリンなど）を含むことができる。
【０２４６】
本発明の足場は、組織（例えば、結合組織、筋肉組織（例えば、心臓組織など）および膵臓組織など）の再生のために、その必要性のある対象に投与することができる。結合組織の例には、軟骨（弾性のヒアリンおよび線維軟骨を含む）、コラーゲン、脂肪組織、網様結合組織、胚の結合組織（間葉系結合組織および膠様結合組織を含む）、腱、靱帯および骨が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４７】
したがって、本発明の複合物は、軟骨または骨の疾患または状態を処置するために使用することができる。
【０２４８】
代表的な軟骨状態には、変形性関節症、制限された関節可動性、痛風、リウマチ様関節炎、変形性関節症、軟骨溶解、強皮症、変性椎間板障害および全身性エリテマトーデスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４９】
本明細書中で使用されるとき、用語「処置する」は、疾患、障害または状態に苦しむか、あるいは、疾患、障害または状態と診断された個体において、疾患、障害または状態の発達を阻害するか、または停止させること、および／あるいは、疾患、障害または状態の軽減、寛解または退行を生じさせることを示す。当業者は、疾患、障害または状態の発達を評価するために使用することができる様々な方法論およびアッセイを知っており、同様に、疾患、障害または状態の軽減、寛解または退行を評価するために使用することができる様々な方法論およびアッセイを知っている。
【０２５０】
本明細書中で使用されるとき、用語「対象」は哺乳動物を示し、これには、ヒト、イヌおよびウマが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５１】
本発明の複合物は、組織再生、ならびに、軟骨および骨の疾患を処置することのため以外の無数の医学的使用を含むことが理解され、そのような使用には、尿失禁の処置（例えば、尿道膨張）、火傷患者のための治癒補助物としての使用、および、出血を防止するための包帯材としての使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５２】
加えて、他の医学的適用もまた、本発明の複合物の弾性、生分解性および／または生物学的利用能から利益を受けることができる。例えば、腹部手術の後では、腸および他の腹部器官は互いに、また、腹壁に癒着する傾向がある。この癒着は術後の炎症から生じると考えられ、しかしながら、腹部領域に直接に送達される抗炎症性薬物は急速に消失する。本発明の複合物（例えば、レシリンを含む複合物）を、抗炎症性薬物を腹部領域に送達するために使用することができる。
【０２５３】
柔軟かつ可撓性の複合物を、例えば、内部器官を切ることなく、したがって、感染を引き起こすことなく、複合物を腹壁に付けることによって、腹壁と、内部器官との間に埋め込むことができる。抗炎症性薬物を数ヶ月間、複合物から放出することができる。以前の研究者が、これらの問題を解決するために、ヒドロゲル、ヒアルロン酸に基づく膜、および、他の材料を使用することを試みているが、そのような材料は、体内では急速に分解する傾向があり、そのため、より長い入院期間が、癒着を防止するために必要である。
【０２５４】
別の実施形態において、本発明の複合物は、金属性ステントを被覆するために使用することができる。複合物は可撓性にすることができるので、複合物は、破れることなく、ステントとともに広がり、一方で、金属ステントの剛性により、複合物がその以前の形状を弾性的に取ることが防止される。大きい生物学的利用能を有する複合物は、血管を閉塞させ得るか、または、循環問題（脳卒中を含む）を体内の他の所で生じさせ得る血栓を飛ばし得る凝塊または瘢痕組織の形成を防止するためにヘパリンもしくは他の抗凝固剤または抗炎症剤を放出することができる。代替として、または、加えて、血管形成剤を、ステントを取り囲む血管の再構築を促進させるために使用することができる。実際、任意の生体分子、小分子または生物活性剤を本発明の複合物と組み合わせることができる。そのような分子は複合物と共有結合的または非共有結合的に連結され得る。
【０２５５】
本発明の複合物はまた、「長期」医療デバイスを調製するために使用することができる。典型的な永続的医療デバイスとは異なり、本発明の複合物は時間とともに分解する。例えば、材料は、生分解可能な心臓ステントに製造することができる。好ましくは、複合物は、ステントを製造するために可塑的に成形されるより硬いポリマーと組み合わせられる。代表的なポリマーには、上記で列挙されたポリマー（好ましくは、生分解性ポリマー）のいずれかが含まれる。バイオゴムが、ステントが埋め込み後に、所望される形状に広がることを可能にする可塑剤として作用する。ステントは血管の直径を増大させて、より容易な循環を可能にし、しかし、ステントは生分解性であるので、周りの血管は、血栓症を伴うことなく、または、ステントが、血管を再閉鎖させる瘢痕組織で覆われることなく、直径が増大する。ステントが所定位置に留まり、その形状を分解までに保持する時間は患者毎に異なり、部分的には患者の閉塞量および年齢に依存する（例えば、高齢の患者は、治るまでのより多くの時間を必要とする）。当業者は、分解速度を調節するために、ステントにおける複合物の分子量および架橋密度を容易に調節することができる。被覆されたステントに関して、分解可能なステントは、生体分子、小分子、生物活性剤またはこれらの何らかの組合せをインシトゥーで放出することができる。
【０２５６】
本発明の複合物はまた、センサーおよびカテーテルをインビボで支えるために使用することができる。複合物は、光ファイバーに基づくセンサーのためのチャンバーに、または、目的とする領域に挿入されるカテーテルのための被覆に構築することができる。センサーにおいて、チャンバーは、目的とする分子に対する、特定の発色団に結合した受容体を含有する。分析物が受容体に結合するとき、発色団は特定の波長で光を放射または吸収する。吸収または放射を、光ファイバーにつながれた装置によって検出することができる。センサーは、短期間の連続モニタリング（例えば、１０日間〜１５日間）のために使用することができる。同様に、カテーテルを、薬物または他の小分子または生物活性剤を特定の部位または静脈内に周期的に送達するために使用することができる。本発明の生分解性複合物の使用は、２週間を越えて使用されるシャントまたは他のインプラントの周りに通常の場合には形成される瘢痕組織の形成を軽減させる。複合物の分解速度は最適化され、その結果、材料の著しい分解が、複合物が患者の体内に置かれている間に生じることがないようにしなければならない。
【０２５７】
本発明の複合物はまた、閉じることが困難であるか、または、正常な生理学的機構によって適正に治癒しない他の創傷のために使用することができる。例えば、糖尿病では多くの場合、皮膚傷害（「糖尿病性潰瘍」）が特に下肢において生じるが、これは、循環不良のために、治癒するために長い時間を要するか、または、適正に治癒しない。抗生物質または抗炎症剤をこれらの創傷部に送達するための本発明の複合物の使用は治癒を助け、覆いを創傷部に提供する。
【０２５８】
本発明の複合物から製造することができる他の埋め込み可能な医療デバイスには、人工血管、流体の除去または患者への流体の送達のためのカテーテルおよび他のデバイス、人工心臓、人工腎臓、整形外科用のピン、プレートおよびインプラント；カテーテルおよび他のチューブ（泌尿器科用チューブおよび胆管用チューブ、気管内チューブ、末梢挿入可能な中心静脈カテーテル、透析カテーテル、長期トンネル化中心静脈カテーテル、末梢静脈カテーテル、短期中心静脈カーテル、動脈カテーテル、肺カテーテル、Ｓｗａｎ−Ｇａｎｚカテーテル、尿道カテーテル、腹腔カテーテルを含む）、泌尿器用デバイス（長期泌尿器用デバイス、組織結合のための泌尿器用デバイス、人工尿道括約筋、尿道拡張器を含む）、シャント（心室シャントまたは動脈−静脈シャントを含む）；人工補装具（乳房インプラント、陰茎プロステーシス、血管移植プロステーシス、動脈瘤修復デバイス、心臓弁、人工関節、人工咽頭、耳科用インプラントを含む）、吻合デバイス、血管カテーテルポート、クランプ、塞栓デバイス、創傷ドレーンチューブ、水頭症シャント、ペースメーカー、ならびに、埋め込み可能な除細動器などが含まれる。
【０２５９】
留意すべきことに、グルコンアセトバクター・キシリヌス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ）によって産生されるセルロースが、医学的適用のために最も適する。これらの細菌によって産生される細菌セルロース（ＢＣ）は、そのような細菌セルロースを医学的用途の開発のための魅力的な材料にする無視できる異物応答および炎症性応答と組み合わさった大きい機械的強度を有している。ＢＣは、ＢＣを創傷火傷のための長期被覆材の製造のために、また、人工皮膚の製造のためにさえ好適にする優れた保水性を有している。さらに、ＢＣおよびＢＣ複合物は、ほとんど任意の所望される三次元構造物に形状化することができる。
【０２６０】
本発明の複合物は医薬組成物および／または美容用組成物として配合することができる。
【０２６１】
本明細書中で使用されるとき、用語「美容用組成物」は、身体表面を美しくするか、または着色するか、または状態調節するか、または保護するという目的のために、ヒトまたは動物の皮膚、爪または毛髪への外用適用のために配合される組成物を示す。本発明の美容用組成物は、例えば、ゲル、クリーム、ローション、化粧品、着色された美容用配合物、シャンプー、ヘアコンディショナー、洗顔乳液、化粧水、アフターシェーブローション、香水、マニキュア液および爪処理用製造物を含めて、任意の形態が可能である。
【０２６２】
語句「着色された美容用配合物」は、例えば、アイシャドー、口紅およびグロス、リップペンシルおよびアイペンシル、マスカラおよびほお紅を含めて、顔料を含有する美容品を示す。
【０２６３】
述べられたように、本発明の複合物はまた、皮膚および毛髪を処置するために美容用薬剤として使用することができる。
【０２６４】
したがって、本発明では、必要な場合には他の活性な物質（例えば、ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥまたはそれらの混合物）または他の局所活性な物質（これには、アバロール（ａｖａｒｏｌ）、アバロン（ａｖａｒｏｎ）または植物抽出物（例えば、セパエ（Ｃｅｐａｅ）抽出物またはエキナセアエ（Ｅｃｈｉｎａｃｅａｅ）抽出物など）が挙げられるが、これらに限定されない）との組合せで局所適用することができる物質としての本発明の（例えば、コラーゲンを含む）複合物が意図される。本発明の複合物は、クリーム、軟膏、ローションまたはゲル（例えば、ポリアクリラートに基づくヒドロゲル、または、例えば、水およびユーセリン（Ｅｕｃｅｒｉｎ）から作製されるオレオゲル（ｏｌｅｏｇｅｌ）など）の形態での局所剤として配合することができる。
【０２６５】
水相および脂肪相の両方を含むオレオゲルは、特にユーセリヌム・アンヒドリクム（Ｅｕｃｅｒｉｎｕｍ  ａｎｈｙｄｒｉｃｕｍ）（羊毛脂アルコールおよびパラフィンからなる基剤）に基づくものであり、この場合、水および基剤の割合が変化し得る。さらに、稠密度に影響を及ぼすためのさらなる親油性成分を加えることができる（例えば、グリセリン、様々な鎖長のポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００）、植物油（例えば、アーモンド油など）、流動パラフィンおよび天然油など）。本発明のヒドロゲルは、ゲル形成剤および水の使用によって製造することができ、この場合、前者が、特に天然産物から、例えば、セルロース誘導体（例えば、セルロースエステルおよびセルロースエーテルなど、例えば、ヒドロキシエチル−ヒドロキシプロピル誘導体、例えば、チロース（ｔｙｌｏｓｅ）から、または、同様に、合成産物から、例えば、ポリアクリル酸誘導体（例えば、カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）またはカルボマー（Ｃａｒｂｏｍｅｒ）、例えば、Ｐ９３４、Ｐ９４０、Ｐ９４１）などから選択される。本発明のヒドロゲルは、ゲル形成用の基剤を加えることによってアルコール性懸濁物から、知られている規則に基づいて製造または重合することができる。
【０２６６】
美容用組成物は、例えば、湿潤剤、皮膚軟化剤、オイル（これには、例えば、鉱油が含まれる）、および、光沢増強剤（これには、例えば、ジメチコーンおよびシクロメチコーンが含まれる）を含めて、身体表面を整えることができる他の薬剤を含むことができる。本発明の調整剤は本発明の薬理学的組成物および／または美容用組成物のいずれにも含むことができる。
【０２６７】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適な担体および賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０２６８】
本明細書中において、用語「有効成分（活性成分）」は、生物学的効果を説明することができるコラーゲンを示す。
【０２６９】
本明細書中以降、表現「生理学的に許容され得る担体」および表現「医薬的に許容され得る担体」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げない担体または希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。
【０２７０】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２７１】
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【０２７２】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、心内注射（例えば、右心室腔または左心室腔内への注射、共通の冠状動脈内への注射）、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれることができる。
【０２７３】
あるいは、例えば、患者の組織領域に直接的に医薬組成物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に医薬組成物を投与することができる。したがって、尿失禁の処置のために、本発明の組成物は、尿道を取り囲む領域に直接に投与することができる。軟骨疾患の処置のために、本発明の組成物は、関節を介する関節内投与によって投与することができる（例えば、膝関節、肘関節、股関節、胸鎖関節、顎関節、手根関節、足根関節、手関節、足関節、椎間円板または黄色靱帯の中に直接に投与することができる）。椎間板置換のために、本発明の医薬組成物はまた、髄質の中に直接に投与することができる。
【０２７４】
本発明のこの態様の特定の実施形態によれば、本発明の複合物は、人工椎間板置換、人工椎間板髄核置換または椎間板髄核の増強および修復のために椎間板内に直接に投与することができ、あるいは、乳房増強のために乳房内に直接に投与することができる。この実施形態によれば、複合物を、注入可能な架橋されていない配合物に含ませることができる。そのような配合物を注入した後、光重合をインシトゥーで開始することができる。これを、グルタルアルデヒドを含む古典的な架橋技術、または、糖分子を介する架橋を使用して達成することができる。
【０２７５】
１つの実施形態によれば、注入可能な配合物のインシトゥー架橋を、適切な緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を２００μＭのＣｕＣｌ２および１０ｍＭのＨ２Ｏ２と一緒に加え、ジチロシン形成を生じさせるようにすることによって達成することができる。
【０２７６】
別の実施形態によれば、インシトゥー架橋が、本明細書中上記で記載される同じ成分を使用して達成されるが、ｐＨが５．２で維持される。これは、チロシンのＤＯＰＡへの修飾をもたらす。材料を注入した後、０．１ｍＭ〜０．５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムを、繊維状ポリペプチドの架橋を生じさせるＤＯＰＡ−ＤＯＰＡの架橋を形成するために加えることができる。
【０２７７】
別の実施形態によれば、インシトゥー架橋が、Ｈ２Ｏ２と、注入物へのＵＶによる照射とを伴うチロシン架橋技術を使用して達成される。
【０２７８】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
【０２７９】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容されうるキャリアを使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０２８０】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０２８１】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容されうるキャリアと組み合わせることによって容易に配合されることができる。
【０２８２】
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０２８３】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。
【０２８４】
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０２８５】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０２８６】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
【０２８７】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
【０２８８】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量」は、処置されている対象の障害の症状（例えば、軟骨又は骨の疾患）を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（複合物）の量を意味する。
【０２８９】
治療有効量の決定は、特に、本明細書中に与えられる詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２９０】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外アッセイおよび細胞培養アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、望ましい濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて決定されることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０２９１】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照のこと）。
【０２９２】
投薬量および投薬間隔は、生物学的効果を誘導または抑制するのに十分な有効成分の組織レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供するために個々に調節されることができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、生体外でのデータから推定されることができる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、個体の特性および投与経路に依存する。検出アッセイは、血漿濃度を決定するために使用されることができる。
【０２９３】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０２９４】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
【０２９５】
本発明の組成物は、もし望むなら、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態を含有しうるパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供されることができる。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随しうる。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きでありうるか、または、承認された製品添付文書でありうる。医薬的に許容されうるキャリア中に配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上記にさらに詳述されるように、調製され、適切な容器に入れられ、示される状態の処置についてラベル書きされることができる。
【０２９６】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２９７】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２９８】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０２９９】
本明細書で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０３００】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０３０１】
本明細書で使用される場合、用語「方法」は、与えられたタスクを達成するための様式、手段、技術および手順を意味し、限定されないが、化学、薬理学、生物学、生物化学、および医学の分野の当業者に知られているかまたはその当業者が既知の様式、手段、技術および手順から容易に開発する方式、手段、技術および手順を含んでいる。
【０３０２】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０３０３】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０３０４】
上記説明とともに、本発明を非限定的な様式で例示する以下の実施例を参照する。
【０３０５】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ著、ニューヨーク（１９９４），第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅ���，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０３０６】
実施例１
レシリンキメラ遺伝子の構築
レシリンｃＤＮＡの調製：Ｅｌｖｉｎ他［Ｎａｔｕｒｅ、４３７：９９９〜１００２、２００５］によれば、レシリンはほとんどがＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおいてさなぎの段階で発現される。したがって、ＲＮＡをｃＤＮＡ調製のためにこの段階から抽出した。ＲＮＡを、ＴＲＩ（登録商標）試薬（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用してＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのさなぎから抽出した。レシリンｃＤＮＡの逆転写を、製造者の説明書に従って、オリゴ（ｄＴ）１５プライマーとともにＭ−ＭＬＶ  ＲＴ（Ｈ−）（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により行った。
【０３０７】
レシリン融合タンパク質の構築：４つのレシリン遺伝子をＥ．ｃｏｌｉにおける発現のために設計した；
１．生来的な推定されるキチン結合ドメインを含む、レシリンの１７個の弾性反復（ｇｉ｜４５５５０４４０、ヌクレオチド６９８〜１８８８）。これはＲｅｓ−ＣｈＢＤ遺伝子として示される（タンパク質配列：配列番号１１、配列番号５５；ポリヌクレオチド配列：配列番号１７）。
２．Ｅｌｖｉｎ他［Ｎａｔｕｒｅ、４３７：９９９〜１００２、２００５］と類似する遺伝子のＮ末端融合および単独発現のための、レシリンの１７個の弾性反復および生来的リンカー（ヌクレオチド６９８〜１６６６）。これはレシリンとして示される（タンパク質配列：配列番号１４、配列番号５６；ポリヌクレオチド配列：配列番号１５）。
３．レシリンの１７個の弾性反復に融合されたクロストリジウム・セルロボランスＣＢＤ（ＣＢＤｃｌｏｓ）。これはＣＢＤ−レシリンとして示される（タンパク質配列：配列番号１２、配列番号５７；ポリヌクレオチド配列：配列番号１８）。
４．ＣＢＤに融合されたレシリン（遺伝子番号２）。これはレシリン−ＣＢＤとして示される（タンパク質配列：配列番号１３、配列番号５８；ポリヌクレオチド配列：配列番号１９）。
【０３０８】
ＰＣＲプライマーを、本明細書中下記の表１２に詳しく記載されるように、本明細書中上記の遺伝子を構築するために設計した。標準的なＰＣＲ方法を全ての反応のために好適に設計した：９４℃で４分間；９４℃で１分間を３５サイクル、５６℃で１分間、７２℃で１分間および７２℃で４分間。全てのＤＮＡ生成物を１％アガロースゲルで分離した。適切なバンドを外科用メスにより切り出し、ＤＮＡを、ＨｉＹｉｅｌｄ（商標）Ｇｅｌ／ＰＣＲ  ＤＮＡ抽出キット（ＲＢＣ  Ｔａｉｐｅｉ、台湾）により精製した。
【０３０９】
【表１２】
2015144610.tif 000020
【０３１０】
Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの構築：Ｒｅｓ−ＣｈＢＤが、ｃＤＮＡから直接に構築された最初の遺伝子であり、それ以外のレシリン遺伝子の全てをクローン化するためのＰＣＲテンプレートとして役立った。ＰＣＲを本明細書中下記の表１３に従って行った。Ｅｘ  Ｔａｑ（商標）（Ｔａｋａｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）は、ＴＡクローニングのために好適な校正機能酵素である。
【０３１１】
【表１３】
2015144610.tif 000021
【０３１２】
１２００塩基対の生成物（図１Ｂ）を精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にクローン化した。レシリン−ＣｈＢＤの存在を配列決定によって確認した。配列決定を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターに対して相補的であるＴ７プライマーおよびＳｐ６プライマーを使用して行った。配列決定の結果により、ＡｒｄｅｌｌｌおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ［Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３１：９６５〜７０、２００２］による２つのレシリン変化体のクローン化が確認された。変化体Ａをさらなる研究のために選んだ。
【０３１３】
最後に、Ｒｅｓ−ＣｈＢＤをＮｃｏＩ制限酵素およびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、所望される場合にはＮｉ−ＮＴＡカラムでのタンパク質の精製およびＨｉｓタグの除去を可能にするＮ末端ＨｉｓタグおよびｒＴｅｖ切断部位を含有するｐＨｉｓ−ｐａｒａｌｌｅｌ３ベクター（図２）にクローン化した。
【０３１４】
ＣＢＤ−レシリンの構築：この遺伝子をＰＣＲ−融合法によって構築した［Ｈｏｂｅｒｔ  Ｏ．（２００２）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３２：７２８〜３０］。ｐＥＴ−ＣＳＣＰベクター［Ｌｅｖｙ他、２００４、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２５：１８４１〜１８４９］をＰＣＲによるＣＢＤ増幅のためのテンプレートとして使用し、本明細書中上記のＲｅｓ−ＣｈＢＤ生成物をレシリン増幅のためのテンプレートとして使用した。最初の反応では、２つの別個のＰＣＲを行った。ＣＢＤを、プライマーＮｏ．４＆プライマーＮｏ．５を使用して増幅した。レシリンをプライマー６＆プライマー７により増幅した。最初の増幅を、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ  Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）により行った。反応の終了によって、１μｌのそれぞれの生成物（図３Ａ）を、第２工程のＰＣＲのためのテンプレートとして役立たせるために混合した。この工程では、プライマー４およびプライマー７を使用した。ＰＣＲを、ＴＡクローニングを可能にするために、Ｅｘ  Ｔａｑ（商標）（Ｔａｋａｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の使用を除いて同じ条件のもとで行った。１６００塩基対の生成物を精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（Ｆｅｒｍｅｎｔｓ、ＭＤ）にクローン化した（図３Ｂ）。ＣＢＤ−レシリンの存在を、Ｔ７プライマーおよびＴ３プライマーを用いた配列決定によって確認した。完全な遺伝子をＮｃｏＩ酵素およびＮｏｔＩ酵素で消化し、ｐＨｉｓ−ｐａｒａｌｌｅｌ３ベクターにクローン化した。
【０３１５】
レシリン−ＣＢＤおよびレシリン（遺伝子２＆遺伝子４）の構築：レシリン遺伝子を、プライマーＮｏ１．およびプライマーＮｏ．３を使用して増幅した。増幅のために使用された酵素がＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＬＡ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）であった。レシリン−ＣＢＤおよびレシリン（遺伝子２および遺伝子４）をコードするＤＮＡを作製するために使用されたＰＣＲ混合物が本明細書中下記の表１４に記載される。
【０３１６】
【表１４】
2015144610.tif 000022
【０３１７】
本明細書中上記のＰＣＲ反応の後、７μｌの１０×Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液、１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏ−ｌａｂ、イスラエル）、１μｌのｄＮＴＰ混合物、および、１００μｌの体積になるまでの滅菌蒸留水を反応チューブに加えた。その後、ＡヌクレオチドをＰＣＲ生成物に加えるために、チューブを７２℃で３０分間インキュベーションした。最終生成物を精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にクローン化した。レシリン遺伝子の存在を上記のように配列決定によって確認した。
【０３１８】
レシリン−ＣＢＤ遺伝子の構築のために、レシリンフラグメントをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＣＢＤｃｌｏｓ遺伝子の上流側においてｐＥＴ３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、ＣＡ）にクローン化し、その後、レシリン−ＣＢＤをＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、同じ酵素で消化されたｐＨｉｓ−ｐａｒａｌｌｅｌ３ベクターにクローン化した。
【０３１９】
レシリン発現ベクター（遺伝子２）を、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩによるｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−レシリンの消化によって構築した。この方法では、停止コドンが、その直接的な発現を可能にした遺伝子に付加された。遺伝子を続いて、同じ酵素で消化されたｐＨｉｓ−ｐａｒａｌｌｅｌ３にクローン化した。
【０３２０】
実施例２
レシリンキメラ遺伝子の発現
全４つのベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、ＣＡ）に形質転換した。５ｍｌの一晩培養物を、回転式振とう機において３７℃で、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で成長させた。これらの開始培養物を、１／１００の開始培養物／培養体積の比率で、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む２５０ｍｌ〜３５０ｍｌのＬＢへの接種のために使用した。０．８〜０．９のＯ．Ｄ．６００において、発現を１ｍＭのＩＰＴＧにより誘導した。誘導後４時間で、細菌を遠心分離によって集めた。６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤのペレットを最初の分析のために５０ｍｌのアリコートに分け、ペレットを−８０℃で貯蔵した。
【０３２１】
実施例３
レシリン−ＣｈＢＤの精製およびその特徴づけ
６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの小規模回分精製：５０ｍｌの細菌ペレットを２ｍｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、スイス）に再懸濁した。細菌を、氷上での２分間のパルス化バーストを伴う超音波処理によって溶解した。可溶物および細菌沈殿物を４℃で１０分間の１５０００ＲＰＭでの遠心分離によって分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ生成物はほとんどが可溶性画分に見出されることが明らかにされた（図４、レーン１、レーン２）。５００μｌの溶解物を、７５μｌの事前に平衡化されたＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）ニッケル親和性ゲル（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加えた。精製を製造物マニュアルに従って行った。最後の溶出を、０．４Ｍのイミダゾールを含有する１００μｌの溶出緩衝液により２回繰り返した。
【０３２２】
セルロースおよびキチンに対する精製６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの結合アッセイ：２５ｍｇのキチン（Ｓｉｇｍａ）および５０ｍｇのセルロース（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ）を２つの別個の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに加えた。これらの物質をＰＢＳにより洗浄し、その後、５０μｌのアフィニティー精製されたタンパク質溶液を加えた。４５０μｌのＰＢＳをそれぞれのチューブに加え、５００μｌの総反応体積にした。タンパク質を含有した実用規格のキチン（Ｓｉｇｍａ、カタログＮｏ．Ｃ７１７０）が使用されたので、キチンのみを含有する第３のチューブには、５００μｌのＰＢＳが陰性コントロールとして補われた。チューブを、穏やかな回転のもと、ＲＴで３０分間インキュベーションし、その後、遠心分離した。上清を取り出し（非結合画分）、ペレットを５００μｌのＰＢＳにより３回洗浄した。最終ペレットを５０μｌの２×試料適用緩衝液（ＳＡＢ）とともに煮沸した。それぞれのチューブから得られる非結合画分および洗浄画分の試料もまた、ＳＡＢとともに煮沸した。試料を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。
【０３２３】
セルロースおよびキチンに対する６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの粗抽出物の結合アッセイ：細菌溶解物を上記のように５０ｍｌのペレットから作製した。セルロース結合アッセイおよびキチン結合アッセイを、２ｍｌのエッペンドルフチューブにおいて、下記の表１５に記載されるような３つの増大する溶解物体積により行った。
【０３２４】
【表１５】
2015144610.tif 000023
【０３２５】
６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの熱安定性アッセイ：１５μｌのアフィニティー精製されたタンパク質を３つの０．５ｍｌエッペンドルフチューブに加えた。チューブを、１５分間、３０分間、６０分間、８５℃でインキュベーションした。インキュベーションの終了によって、チューブを氷に移し、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。続いて、試料を２×ＳＡＢとともに煮沸し、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。
【０３２６】
６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの小規模ＦＰＬＣ精製：細菌溶解物を上記のように５０ｍｌのペレットから作製した。溶解物を、使用者マニュアルに従って事前に平衡化されたＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰ（ＧＥ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）Ｎｉ−ＮＴＡの１ｍｌのカラムでのＦＰＬＣ（ＧＥ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）精製のために０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過した。
【０３２７】
精製プログラムは下記のように処理された：
結合緩衝液；２０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール
溶出緩衝液；２０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍイミダゾール
１．１ｍｌ／分での５カラム体積（ＣＶ）の結合緩衝液
２．溶解物の、１ｍｌ／分での５ｍｌの注入
３．結合緩衝液による５ＣＶの洗浄
４．溶出緩衝液による０．７ｍｌ／分での１０分間の、５００ｍＭイミダゾールまでの直線勾配
５．１ｍｌ／分での５ＣＶの結合緩衝液による平衡化。
溶出タンパク質をＯ．Ｄ．２８０において検出した。４００μｌの分画物を集め、ＳＡＢとともに煮沸された１０μｌの試料を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。
【０３２８】
可溶性の高分子量６Ｈ−ｒｅｓ−ＣｈＢＤの作製。ＦＰＬＣの分画物９〜分画物１８を集めて、２ｍｌの総体積にし、イミダゾールを２００ｍｌの重合緩衝液（１５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に対する３回の透析によって除いた。５００μｌの透析されたタンパク質を８５℃で１０分間インキュベーションし、その後、４℃で一晩インキュベーションした。重合を、重合緩衝液に溶解された２０μｌの４０ｍＭ過硫酸アンモニウムおよび２０μｌの０．５ｍＭ  Ｒｕ（ｂｐｙ）３Ｃｌ２・６Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ）を、４０μｌの精製タンパク質を含有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに加えることによって行った。試料を日光に５分間さらし、その後、２×ＳＡＢとともに煮沸した。試料を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。
【０３２９】
６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの中規模ＦＰＬＣ精製：２００ｍｌの培養物からの細菌ペレットを上記のように１５ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁した。細菌を、氷浴における５分間のパルス化バーストを伴う超音波処理によって溶解した。可溶物および細菌沈殿物を４℃で１０分間の１５０００ＲＰＭでの遠心分離によって分離した。精製を、上記と同じ方法を使用してＦＰＬＣにより行った。溶出タンパク質をＯ．Ｄ．２８０において検出した。４００μｌの分画物を集め、ＳＡＢとともに煮沸された１０μｌの試料を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。
【０３３０】
固体６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの作製。本明細書中上記の中規模ＦＰＬＣ精製の後、分画物を２つの異なる透析バッグに集めた：濃縮された分画物のＮｏ．４〜Ｎｏ．７（６ｍｌ）および希釈された分画物のＮｏ．３、Ｎｏ．８〜Ｎｏ．１２。透析を上記のように行った。濃縮ピークの濃度が、Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍの測定によって１０ｍｇ／ｍｌであった。試料をＶｉｖａｓｐｉｎ６の１００００ＭＷＣＯ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂａｇｎｅ、フランス）限外ろ過チューブに負荷し、５０００ｇで４０分間遠心分離した。最終生成物は、タンパク質濃度が１６０ｍｇ／ｍｌである５００μｌ前後をもたらした。４０μｌの濃縮タンパク質を、４μｌの１５０ｍＭ過硫酸アンモニウムおよび１μｌの０．５ｍＭ  Ｒｕ（ｂｐｙ）３Ｃｌ２・６Ｈ２Ｏが加えられたエッペンドルフチューブにピペットで加えた。チューブを日光にさらした直後に、固体ポリマーがチューブ内で形成した。それ以上の重合が観測できなくなったとき、反応を、ポリマーを水により洗浄することによって５分後に停止させた。
【０３３１】
結果
６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの小規模回分精製：精製が、図４のレーン３〜レーン７に例示されるように達成された。
【０３３２】
セルロースおよびキチンに対する精製６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの結合アッセイ：タンパク質のクーマシーブルー染色により、６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤがキチンおよびセルロースの両方に結合し、キチンに対する親和性がより大きいことが明らかにされた（図５）。非結合画分におけるタンパク質の存在が、Ｒｅｓ−ＣｈＢＤタンパク質による飽和キチン／セルロースのために説明される。
【０３３３】
セルロースおよびキチンに対する６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの粗抽出物の結合アッセイ：ゲルのクーマシーブルー染色により、セルロースの結合が、６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤを含む粗溶解物において検出されなかったが明らかにされた（図６Ａ、図６Ｂ、レーン２〜レーン５）。これは、アフィニティークロマトグラフィーによるＡＣ精製の後での結合結果と対照をなすものであった。それにもかかわらず、キチンに対するタンパク質の親和性は、粗溶解物の結果によって示されるように、依然として高いままであった。５０μｌおよび１２５μの粗溶解物が２５ｍｇのキチンに負荷された場合、タンパク質のほぼ１００％が沈殿し、タンパク質が非結合画分にはほとんど残らなかった（図６Ｂのレーン７〜レーン１０、図６Ｃのレーン２〜レーン５）。２５０μｌの溶解物が加えられたときには、結合タンパク質の量が増大し続け、しかし、より大きいバンドが、おそらくは結合部位の飽和のために、非結合画分において検出された（図６Ｃのレーン６〜レーン９）。
【０３３４】
６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの熱安定性アッセイ：熱処理は、６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤが８５℃で１時間にわたって安定であることを示した（図７）。材料および方法において示されるように、タンパク質は、熱処理後、氷に直ちに移された。これにより、ゲルにおいて観測されるバンド移動がコアセルベーションプロセスの開始に起因することが説明され得る。
【０３３５】
６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの小規模回分精製：精製プロセスの結果が図８Ａ〜図８Ｂに例示される。
【０３３６】
可溶性の高分子量６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの作製。可溶化プロセスの結果が図９に例示される。
【０３３７】
６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの中規模ＦＰＬＣ精製：精製プロセスの結果が図１０Ａ〜図１０Ｂに例示される。
【０３３８】
実施例４
多糖結合ドメイン（ＰＢＤ）を何ら有しない６Ｈ−レシリン−１７弾性反復（配列番号５６）の発現および精製
配列番号５６のレシリンをＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた後、可溶性タンパク質を、図１１に例示されるようにＮｉ−ＮＴＡカラムで精製した。加えて、このタンパク質は、熱安定性であることが見出され、また、レシリン−ＣｈＢＤと同じ様式で固体レシリンに重合させられた。
【０３３９】
実施例５
ＣＢＤ−レシリン（配列番号５７）の精製およびその特徴づけ
細菌におけるＣＢＤ−レシリンの発現の後、ＣＢＤ−レシリンは、封入体で発現されることが見出された（図１２）。
【０３４０】
細胞を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、スイス）における超音波処理によって溶解した。
不溶性画分を遠心分離によって沈殿させた。
【０３４１】
上清を除き、封入体を下記のように洗浄した：
１．穏やかな振とうとともに３０分間、ＰＢＳ緩衝液／１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／１ｍＭ  ＥＤＴＡによる再懸濁、その後、遠心分離。
２．穏やかな振とうとともに３０分間、ＰＢＳ緩衝液／１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００による再懸濁、その後、遠心分離。
３．穏やかな振とうとともに３０分間、ＰＢＳ緩衝液による再懸濁、その後、遠心分離。
【０３４２】
その段階から、封入体の精製を２つの方法のうちの１つによって行った。
１．変性条件下でのＮｉ−ＮＴＡ精製。ＩＢを、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）／２０ｍＭイミダゾール／０．５Ｍ  ＮａＣｌ／６Ｍ  ＧｕＨＣｌにおいて可溶化した。タンパク質を、事前に平衡化されたＮｉ−ＮＴＡカラムに負荷し、タンパク質を、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）／０．５Ｍイミダゾール／０．５Ｍ  ＮａＣｌ／６Ｍ  ＧｕＨＣｌの直線勾配により溶出した。Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍにおいて検出されたピークを含有する分画物を集め、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝液に対する透析によってリフォールディングさせた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質のリフォールディングをセルロース結合アッセイによってアッセイした（図１３）。
２．洗浄されたＩＢを、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）／２０ｍＭイミダゾール／０．５Ｍ  ＮａＣｌ／６Ｍ  ＧｕＨＣｌにおいて可溶化した。その後、タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラムが装着されたＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（商標）ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）に注入し、装置においてプログラム化される自動リフォールディングプロトコルを使用して精製した。リフォールディングされたタンパク質を含有する分画物を集め（図１４）、その後、セルロース結合アッセイを行った。自動化されたリフォールディングを受けたＣＢＤ−レシリンタンパク質はほとんどが、６ＭのＧｕＨＣｌまたは８Ｍの尿素の存在下で精製された試料の透析を伴う標準的プロトコルによってリフォールディングされたタンパク質と同様な結合画分において見出された。これは、この方法は非常に効率的かつ時間節約であるので、この方法が適用され得ることを示している。
【０３４３】
実施例６
レシリン−ＣＢＤ（配列番号５８）のクローン化および発現
レシリン−１７弾性反復および推定されるレシリンリンカーをコードするＤＮＡフラグメントを、ＣＢＤを含有するベクターに上流側にクローン化して、配列番号１９のポリヌクレオチドを作製した。正しい挿入を配列によって確認し、その後、この遺伝子をタンパク質発現のためにｐＨｉｓ−ｐａｒａｌｌｅｌ３にクローン化した。発現を、他の全タンパク質と同様にＢＬ２１細菌において行った。タンパク質発現の後、細菌を遠心分離し、ＣＢＤ−レシリンについて記載されるように溶解した。可溶性画分および不溶性画分を遠心分離によって分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、組換えタンパク質の約５０％が可溶性画分に見出されたことが明らかにされた。セルロース結合アッセイをレシリン−ＣＢＤの粗溶解物に対して直接に行った。これは、レシリン−ＣＢＤがセルロースに高い親和性で結合することをもたらした（図１７を参照のこと）。
【０３４４】
実施例７
レシリン−ＣＢＤ（配列番号５８）の精製
レシリン−ＣＢＤの発現の後、ＢＬ２１細菌を遠心分離し、他のタンパク質について記載されるように溶解した。可溶性画分および不溶性画分を遠心分離によって分離した。溶解物を０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過した。その後、タンパク質を、事前に平衡化されたＮｉ−ＮＴＡカラムに負荷し、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５、０．５Ｍイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）の直線勾配により溶出した。Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍにおいて検出されたピークを含有する分画物をプールし、リン酸塩緩衝剤生理的食塩水（ＰＢＳ）に対して３回透析して、イミダゾールを除いた。タンパク質をＸ２試料適用緩衝液（ＳＡＢ）とともに煮沸し、クーマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図１６）。
【０３４５】
本明細書中下記の表１６には、本明細書中に記載されるクローン化されたレシリンタンパク質がまとめられている。
【表１６】
2015144610.tif 000024
【０３４６】
実施例８
レシリン−ＣＢＤ（配列番号５８）の耐熱性およびセルロース結合アッセイ
精製されたレシリン−ＣＢＤタンパク質を含有する試料溶液を８５℃で１５分間インキュベーションし、その後、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。５０μｌの加熱されたタンパク質溶液を、実施例３に記載されるようなセルロース結合アッセイのために３０ｍｇのセルロース粉末（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ）に加えた。セルロース結合アッセイはまた、非加熱のレシリン−ＣＢＤ溶液をコントロールとして行われた。図１７に示されるように、レシリン−ＣＢＤタンパク質は、耐熱性と、熱処理によって損なわれなかったセルロースに対する効率的な結合能との両方を示す。
【０３４７】
実施例９
異なるｐＨの溶液におけるレシリンタンパク質の溶解性
材料および方法
酵素的酸化反応または金属触媒酸化（ＭＣＯ）反応から生じる反応性酸素化学種（ＲＯＳ）により誘導される酸化ストレスが大きな影響をタンパク質の側鎖および全体的特性に及ぼし得るという証拠がますます増大している。チロシンは、タンパク質におけるＲＯＳ感受性が非常に大きい残基の１つである。その酸化生成物には、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ドーパミン、ドーパミンキニン、ジチロシン（ＤＴ）およびｉｓｏＤＴが含まれる。加えて、ＤＯＰＡはチロシンのヒドロキシルラジカル処理の主生成物である（Ａｌｉ  Ｆ．Ｅ．他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４、９８、１７３〜１８４）。Ａｌｉ他（２００４）によれば、様々なｐＨの溶液におけるチロシンのＭＣＯは、様々な生成物、例えば、ジチロシンおよび３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）などを生じさせる。
【０３４８】
ＭＣＯシステムを使用して、各種レシリンタンパク質に対するこれらの修飾を達成するために、そのようなｐＨのもとでのそれらの安定性を分析した。
【０３４９】
レシリンおよびレシリン−ＣＢＤのタンパク質溶液（ｐＨ、約７．５）を、ｐＨ５．６またはｐＨ５．４にまで２ＭのＨＣｌにより穏やかに滴定した。滴定期間中に、開始点と、最終ｐＨとの間において異なるｐＨを表す２００μｌの試料を採取した。試料を４℃で７２時間インキュベーションして、タンパク質を沈殿させ、その後、１４０００ｒｐで１５分間遠心分離した。可溶性タンパク質をクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出した。
【０３５０】
結果
両方の場合において、大量のタンパク質沈殿がおよそｐＨ５で観測された。図１８に例示されるように、タンパク質が、５．６および５．４に至るまでのｐＨの溶液にそれぞれ残留した。このことから、これらの組換えタンパク質の溶解性のｐＨ範囲が明らかにされる。これらの基本的な決定により、レシリン側鎖に対するＭＣＯの影響を調べることができる。
【０３５１】
実施例１０
異なるｐＨにおけるレシリンタンパク質生成物の光誘導重合
材料および方法
０．５ｍＭのＲｕ（ｂｐｙ）３Ｃｌ２・６Ｈ２Ｏおよび２．５ｍＭの過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）を含有する、様々なｐＨでのレシリンタンパク質溶液およびレシリン−ＣｈＢＤタンパク質溶液（５０μｌ）を日光に１０分間さらし、その後、タンパク質を分離し、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出した。Ｒｕ（ｂｐｙ）３Ｃｌ２・６Ｈ２ＯおよびＡＰＳを含まないタンパク質試料をコントロールとして使用した。
【０３５２】
結果
Ｒｕ（ｂｐｙ）３Ｃｌ２・６Ｈ２ＯおよびＡＰＳを含有する全試料で、高分子量の生成物が形成された。それにもかかわらず、外見的に架橋された生成物のパターンはｐＨに従って異なった（図１９、矢印を参照のこと）。
【０３５３】
実施例１１
レシリンの金属触媒重合
材料および方法
精製されたレシリンを５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）または脱イオン水のどちらかに対して３回透析した。透析後、タンパク質を８５℃で１５分間インキュベーションし、続いて、１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。一般には、重合を、Ｋａｔｏ他（２００１）（Ｋａｔｏ  Ｙ、Ｋｉｔａｍｏｔｏ  Ｎ、Ｋａｗａｉ  Ｙ、Ｏｓａｗａ  Ｔ（２００１）、他の金属触媒酸化システムではなく、過酸化水素／銅イオンシステムはタンパク質結合型ジチロシンをもたらす、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３１（５）、６２４〜６３２）、および、Ａｌｉ他（Ａｌｉ  ＦＥ、Ｂａｒｎｈａｍ  ＫＪ、Ｂａｒｒｏｗ  ＣＪ、Ｓｅｐａｒｏｖｉｃ  Ｆ（２００４）、銅／過酸化水素の種々の酸化システムによるチロシン残基の金属触媒酸化、Ｊ  Ｉｎｏｒｇ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、９８（１）：１７３〜８４）によって報告されるＭＣＯ法に従って行った。全反応を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにおいて２５０μｌの最終体積で行った。ＭＣＯ重合を、４ｍｍｏｌのＨ２Ｏ２（３０％Ｈ２Ｏ２の１μｌ）および２００μＭのＣｕＣｌ２（Ｈ２Ｏに溶解された２０ｍＭ  ＣｕＣｌ２の２．５μｌ）を加え、その後、３７℃での一晩のインキュベーションを行うことによって行った。タンパク質溶液のみのチューブ、Ｈ２Ｏ２のみまたはＣｕＣｌ２のみを伴うタンパク質溶液のチューブを陰性コントロールとして使用した。反応を、１ｍＭのＥＤＴＡを加えることによって停止させた。最後に、試料をＸ２  ＳＡＢにおいて煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０３５４】
結果
重合が、図２０に示されるように、リン酸塩緩衝液および水の両方において達成された。これらの結果のさらなる分析が進行中である。
【０３５５】
実施例１２
組換えレシリン−セルロースウィスカー複合物の調製
材料および方法
１０ｍｇ／ｍｌの６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ（配列番号５５）を含有するＨｉｓタグ精製されたタンパク質溶液を、１０ｋＤａカットオフのＶｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、英国）に載せ、６０００ｒｐｍで遠心分離して、１００ｍｇ／ｍｌの濃度にした。この段階で、２００μｌの試料をその後の分析のために取り出し、貯蔵し、その一方で、溶液の残りをさらに濃縮して、２００ｍｇ／ｍｌの濃度にした。
【０３５６】
６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ−セルロースウィスカーの複合物を、等体積の２００ｍｇ／ｍｌの６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ−セルロースウィスカー溶液およびセルロースウィスカー溶液（これは、Ｂｏｎｄｅｓｏｎ  Ｄ、Ｍａｔｈｅｗ  Ａ、Ｏｋｓｍａｎ  Ｍ（２００６）、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、１３：１７１〜１８０に記載されるように調製された）を１５０μｌおよび７５μｌのＴｅｆｌｏｎ鋳型に注ぎ、１００ｍｇ／ｍｌの最終的なタンパク質濃度を得ることによって作製した。１００ｍｇ／ｍｌの純粋な６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ溶液の１５０μｌを、コントロールとして、類似する鋳型に注いだ。続いて、２５０μＭのＲｕ（ｂｐｙ）３および２．５ｍＭの過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）をそれぞれの試料溶液に加えた。混合物をピペッティングによって鋳型内で均質化し、その後、重合を、５００Ｗのタングステン灯に５秒間さらすことによる誘導架橋によって行った。
【０３５７】
結果
１５０μｌの６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ試料（図２１Ｂ−右端）、ならびに、７５μｌおよび１５０μｌの６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤ−セルロースウィスカー試料複合物（図２１Ｂ−それぞれ、中央および左）を鋳型から取り出し、さらなる分析のために示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）に送った。
【０３５８】
実施例１３
クモ絹糸−ＣＢＤ融合遺伝子の構築
材料および方法
クモ絹糸（ＳｐＳ）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために最適化された合成遺伝子（配列番号２３）である。その配列は、ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）のスピドロイン１配列の生来的配列（アクセションＰ１９８３７）に由来するモノマーコンセンサスの１５回反復を設計したものである。
【０３５９】
ＳｐＳ合成遺伝子が、所望される場合にはＮｉ−ＮＴＡカラムでのタンパク質の精製と、Ｎ末端のＨｉｓタグの除去とを可能にするＮ末端およびＣ末端のＨｉｓタグと、エンテロキナーゼ切断部位とを含有するｐＥＴ３０ａベクターにおいて提供された。
【０３６０】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためのＳｐＳ−ＣＢＤ融合遺伝子の構築：クロストリジウム・セルロボランスのＣＢＤ（ＣＢＤｃｌｏｓ）（配列番号２５）をクモ絹糸の合成遺伝子の３’に融合した。融合遺伝子はＳｐＳ−ＣＢＤとして示される（配列番号２４）。
【０３６１】
ＰＣＲプライマーを、本明細書中下記の表１７に要約されるように、ＳｐＳ−ＣＢＤ融合遺伝子を構築するために設計した。ＰＣＲプライマーにより、Ｎ末端のＳｐｅＩ制限部位およびＣ末端のＸｈｏＩ制限部位がＣＢＤｃｌｏｓ遺伝子テンプレートに付加される。
【０３６２】
【表１７】
2015144610.tif 000025
【０３６３】
ＣＢＤｃｌｏｓ遺伝子は、融合遺伝子のクローニングのためのＰＣＲテンプレートとして役立った。標準的なＰＣＲを、ＴＡクローニングのために好適な校正機能酵素であるＥｘ  Ｔａｑ（商標）（Ｔａｋａｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して行った。ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲルから精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にクローン化した。ＳｐｅＩ−ＣＢＤｃｌｏｓ−ＸｈｏＩの存在を配列決定によって確認した。
【０３６４】
ＳｐＳ−ＣＢＤのクローニング：ＳｐｅＩ−ＣＢＤｃｌｏｓ−ＸｈｏＩをｐＥＴ３０ａ−ＳｐＳベクターにおいてＳｐｅＩ制限部位およびＸｈｏＩ制限部位にクローン化した。
【０３６５】
タバコ植物における発現のために最適化されたクモ絹糸遺伝子の構築：合成されたしおり糸遺伝子（ＧＥＮＥＡＲＴ  ＧｍｂＨ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ、配列番号２７）は、ニワオニグモ（Ａｒｅｎａｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）のＡＤＦ−３遺伝子の生来的配列（アクセションＵ４７８５５）に由来するコンセンサス（ＧＰＧＧＱＧＰＹＧＰＧＡＳＡＡＡＡＡＡＧＧＹＧＰＧＹＧＱＱＧＰＧＱＱＧＰＧＱＱ）（配列番号２６）に基づいて選択された反復単位から構成される。この反復をコードするマルチマーを、縮合法の使用［Ｌｅｗｉｓ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、７、４００〜４０６（１９９６）］によって開発した。合成遺伝子は、ｐＵＣ１９ベクターにおける別の特有の制限部位（ＡａｔＩＩ）の助けによるマルチマーの開発のために使用されたＳｍａＩ制限部位およびＮａｅＩ制限部位によって制限されるモノマーの配列を含む。
【０３６６】
クモ絹糸モノマー配列の端部には、ＡＤＦ−３しおり糸遺伝子の３’非反復配列が付加されている。この配列は、タンパク質の溶解性に寄与することが示された［Ｌａｚａｒｉｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５：４７２〜４７６（２００２）］。絹糸モノマーの５’には、合成ＣＢＤｃｌｏｓ遺伝子の部分配列が本明細書中下記のように付加された。
【０３６７】
６モノマー（６ｍｅｒ）クモ絹糸遺伝子の構築：６ｍｅｒクモ絹糸遺伝子を構築するために、二重消化を下記のように行った：
１．ＳｍａＩおよびＡａｔＩＩによる合成モノマー（配列番号２６）の消化。
２．ＮａｅＩおよびＡａｔＩＩによる合成モノマー（配列番号２６）の消化。
これらのＤＮＡ生成物を１％アガロースゲルで精製し、精製されたフラグメントの連結により、２ｍｅｒクモ絹糸遺伝子を得た。続いて、２ｍｅｒ体の縮合を行って、４ｍｅｒ遺伝子を作製し、そして、４ｍｅｒ体および２ｍｅｒ体を縮合して、６ｍｅｒ遺伝子を形成した。
【０３６８】
６ｍｅｒ−ＣＢＤｃｌｏｓ融合遺伝子の構築：ＣＢＤｃｌｏｓの配列をタバコ植物における発現のために最適化した。ＣＢＤの合成ＤＮＡを絹糸モノマーの５’に融合した。全長のＣＤＢｃｌｏｓ−６ｍｅｒ融合物を構築するために、部分的なＣＤＢ−６ｍｅｒ遺伝子および全長の非合成ＣＢＤｃｌｏｓにおけるＢｃｌＩ制限部位およびＮｃｏＩ制限部位の消化を行った。
【０３６９】
６ｍｅｒ遺伝子へのＣＢＤの融合を２つの配向で行った：
１．２つの６ｍｅｒ反復をＣＢＤｃｌｏｓの３’末端に融合して、ＣＢＤｃｌｏｓ−ＳｐＳ１２（配列番号２８）を作製した。２つの６ｍｅｒ体の縮合を上記のように行った。
２．ＣＢＤｃｌｏｓを２つの６ｍｅｒ反復の中央において融合した。融合遺伝子はＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６として示される（配列番号２９）。２つの６ｍｅｒ体のクローニングを、１つのＣＤＢ−６ｍｅｒプラスミドのＳｍａＩおよびＮａｅＩによる二重消化、ならびに、もう一方のＳｔｕＩによる消化によって行った。フラグメントを精製し、連結して、ＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６を形成した。
【０３７０】
ＣＢＤ−１２ｍｅｒおよびＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６の両方をｐＢＩＮＰＬＵＳバイナリーベクターにおけるＲｕｂｉｓｃｏの小サブ単位カセット（これは、調節エレメント（例えば、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｓｐ．からクローン化されたプロモーター、ターミネーター、５’および３’の非翻訳領域など）を含む）にクローン化した（配列番号３０および配列番号３１）。使用された別の発現カセットは、融合タンパク質をアポプラストに分泌するための細胞シグナルペプチドを含む。このシグナルを、Ｒｕｂｉｓｃｏの小サブ単位遺伝子の５’ＵＴＲの前において融合遺伝子の５’に融合した。
【０３７１】
表１８には、本明細書中に記載されるクローン化されたクモ絹糸タンパク質がまとめられている。
【表１８】
2015144610.tif 000026
【０３７２】
実施例１４
ＳｐＳ−ＣＢＤ融合遺伝子の発現および精製
材料および方法
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＳｐＳタンパク質およびＳｐＳ−ＣＢＤｃｌｏｓタンパク質の発現：ｐＥＴ３０ａ−ＳｐＳベクターおよびｐＥＴ３０ａ−ＳｐＳ−ＣＢＤｃｌｏｓベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、ＣＡ）に形質転換した。５ｍｌの一晩培養物を、回転式振とう機において３７℃で、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で成長させた。これらの開始培養物を、１／１００の開始培養物／培養体積の比率で、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む２５０ｍｌ〜３５０ｍｌのＬＢへの接種のために使用した。０．６〜０．９のＯ．Ｄ．６００において、発現を１ｍＭのＩＰＴＧにより誘導した。誘導から４時間後、細菌を遠心分離によって集めた。１つのペレットを最初の分析のために５０ｍｌのアリコートに分け、ペレットを−８０℃で貯蔵した。
【０３７３】
６Ｈ−ＳｐＳおよび６Ｈ−ＳｐＳ−ＣＢＤのＦＰＬＣ精製：３００ｍｌの細菌ペレットを５ｍｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、スイス）に再懸濁した。細菌を、氷浴における５分間のパルス化バーストを伴う超音波処理によって溶解した。可溶物および細菌沈殿物を４℃で１０分間の１５０００ｒｐｍでの遠心分離によって分離した。タンパク質の可溶性画分を、使用者マニュアルに従って事前に平衡化されたＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰ（ＧＥ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）Ｎｉ−ＮＴＡの１ｍｌのカラムでのＦＰＬＣ（ＧＥ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）精製のために０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過した。
【０３７４】
精製プログラムは下記のように処理された：
結合緩衝液；２０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール
溶出緩衝液；２０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍイミダゾール
１．１ｍｌ／分での５カラム体積（ＣＶ）の結合緩衝液
２．溶解物の、１ｍｌ／分での５ｍｌの注入
３．結合緩衝液による１０ＣＶの洗浄
４．溶出緩衝液による１ｍｌ／分での１５分間の、５００ｍＭイミダゾールまでの直線勾配
５．１ｍｌ／分での１０ＣＶの結合緩衝液による平衡化。
溶出タンパク質をＯ．Ｄ．２８０において検出した。５００μｌずつの分画物を集め、ＳＡＢとともに煮沸された２０μｌの試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。
【０３７５】
タバコ植物におけるＣＢＤ−ＳｐＳ１２タンパク質およびＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６タンパク質の発現
タバコ植物の形質転換：Ｒｕｂｉｓｃｏ発現カセットおよび融合遺伝子を含むバイナリー型ｐＢＩＮＰＬＵＳベクターを、植物形質転換のためのＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４株に導入した。リーフディスク形質転換を、以前に記載されたように、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ−ＳＲ１植物を用いて行った（ＤｅＢｌｏｃｋ他、１９８４、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、第３巻、第８号、１６８１頁〜１６８９頁、１９８４）。１５個を超える独立したタバコ形質転換体をそれぞれの構築物について作製し、インビトロで増殖させ、温室に移した。導入遺伝子の存在を、Ｒｕｂｉｓｃｏカセットのターミネーター／プロモーターについての特異的なプライマーを使用するゲノムＤＮＡに対するＰＣＲによって確認した。形質転換体の自家受粉によって得られたＴ１種子を集め、カナマイシン（３００ｍｇｌ−１）を含有する発芽培地でさらに選抜した。滅菌処理は、７０％エタノールにおいて３０秒間、その後で、２．５％ＮａＯＣｌにおいて５分間であった。
【０３７６】
Ｔ１ホモ接合植物によるＣＢＤ−ＳｐＳ１２およびＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６の発現：タンパク質の抽出を、ｔｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｒｅｔｃｈ  Ｍｉｘｅｒ  Ｍｉｌｌ  Ｔｙｐｅ  ＭＭ３０１／２２０−２４０Ｖ  ５０／６０ＨＺ、ｃａｔ＃２０．７４１．０００１）において、９０ｍｇのトランスジェニックタバコの葉を冷却された抽出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ＝７．５）、「完全」プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤、Ｒｏｃｈｅ−Ｃａｔ＃１６９７４９８）とともに粉砕することによって行った。可溶性画分および不溶性画分の分離を４℃における１０分間の１５０００ｒｐｍでの遠心分離によって行った。可溶性画分および不溶性画分をＳＡＢとともに煮沸した。
【０３７７】
トランスジェニックタバコ植物からのＣＢＤ−ＳｐＳ１２およびＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６の精製：４０ｍｌの精製緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ＝７．５）、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｇｒのセルロース（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ２０）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）における２０ｍｇのトランスジェニック葉を、均一な混合物が得られるまでブレンダーにおいて粉砕した。可溶性画分および不溶性画分の分離を４℃における１５分間の１４０００ｒｐｍでの遠心分離によって行った。結合したＣＢＤ融合タンパク質を含む不溶性画分を、２回、それぞれ３０ｍｌの抽出緩衝液で徹底的に洗浄した。結合したタンパク質を、振とうローターにおける１時間の溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ＝１２．５）、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ）での懸濁によってセルロースペレットから溶出した。溶出されたＣＢＤ融合タンパク質を含む可溶性画分の分離を４℃における１５分間の１４０００ＲＰＭでの遠心分離によって達成した。
【０３７８】
ＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６のさらなる精製：上記で詳述された手順から得られる溶出された可溶性タンパク質を５リットルの熱安定性試験緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ＝８）、１０ｍＭ  ＤＴＴ）に対して一晩透析した。その後、試料を、４℃で１０分間、１４０００ＲＰＭで遠心分離した。可溶性タンパク質を１０分間の６０℃〜９０℃における熱処理に供し、その後、氷上に２０分間置き、最大速度で１０分間遠心分離した。可溶性タンパク質はまた、８〜２の広範囲のｐＨにおけるその溶解性について試験された。熱安定性試験緩衝液のｐＨを、溶液のｐＨがｐＨ＝２に達するまで２ＭのＨＣＬにより調節した。全ｐＨ変数について、試料を分析のために取り、４℃で一晩インキュベーションした。可溶物を不溶物から分離するために、試料を最大速度で１０分間遠心分離した。可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料適用緩衝液（ＳＡＢ）とともに煮沸した。
【０３７９】
セルロースに対する、精製されたＳｐＳおよびＳｐＳ−ＣＢＤの定性的な結合アッセイ：３０ｍｇのセルロース（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加えた。この物質をＰＢＳにより洗浄し、その後、５０μｌのアフィニティー精製されたタンパク質溶液を加えた。４５０μｌのＰＢＳをそれぞれのチューブに加えて、５００μｌの総反応体積にした。チューブを、穏やかな回転のもと、ＲＴで３０分間インキュベーションし、その後、遠心分離した。上清を取り出し（非結合画分）、ペレットを５００μｌのＰＢＳにより３回洗浄した。最終ペレットを５０μｌのＳＡＢとともに煮沸した。それぞれのチューブからの非結合画分の試料もまた、ＳＡＢとともに煮沸した。試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。
【０３８０】
セルロースに対する、精製されたＣＢＤｃｌｏｓ、ＳｐＳおよびＳｐＳ−ＣＢＤｃｌｏｓの定量的な結合可逆性アッセイ：５００μＬのＰＢＳにおける１００μｇ〜６００μｇのＳｐＳタンパク質およびＳｐＳ−ＣＢＤタンパク質を、２５℃で３０分間、３０ｍｇの事前に洗浄されたセルロース（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ）に吸着させた。セルロースからの脱着を行い、一方で、最大濃縮タンパク質：セルロース混合物（６００μｇ＋３０ｍｇセルロース）を個々の試験チューブにおいて希釈して、６００μｇから１００μｇにまで及ぶ最終タンパク質量にし、その後、さらに３０分間混合した。１０分間の１３０００ｇでの遠心分離の後、結合タンパク質の濃度をＬｏｗｒｙ法によってアッセイした（ＬｏｗｒｙのＡ液におけるＮａＯＨにより、結合タンパク質がセルロースペレットから溶出する）。
【０３８１】
結果
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＳｐＳタンパク質およびＳｐＳ−ＣＢＤｃｌｏｓタンパク質の発現：ＳｐＳタンパク質およびＳｐＳ−ＣＢＤタンパク質がＥ．ｃｏｌｉにおいて首尾良く発現した（図２２Ａ）。可溶性タンパク質および不溶性（ＩＢ含有物）タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、ＳｐＳタンパク質産物が可溶性画分に見出され、これに対して、ＳｐＳ−ＣＢＤタンパク質産物はほとんどが不溶性の封入体（ＩＢ）画分に見出されることが明らかにされた（図２２Ｂ）。
【０３８２】
６Ｈ−ＳｐＳおよび６Ｈ−ＳｐＳ−ＣＢＤのＦＰＬＣ精製：ＳｐＳタンパク質およびＳｐＳ−ＣＢＤタンパク質がＮｉ−ＮＴＡカラムで首尾良く精製された（図２３Ａ）。精製されたＳｐＳおよびＳｐＳ−ＣＢＤが抗６ＨＩＳ抗体によって特定された（図２３Ｂ）。Ｎｉ−ＮＴＡでの精製のクロマトグラム（図２４Ａ〜図２４Ｃ）を見たとき、非特異的なタンパク質ピークがコントロール操作では認められ得る（図２４Ａ）。溶出されたこのタンパク質はＳｌｙＤとして文献によって特定される。ＳｌｙＤは融合タンパク質に先だって溶出するので、これはＳｐＳおよびＳｐＳ−ＣＢＤの精製を妨害しない（図２４Ａ、レーン５〜レーン７）。
【０３８３】
セルロースに対する、精製された１５ｍｅｒおよび１５ｍｅｒ−ＣＢＤの定性的な結合アッセイ：クーマシブルー染色により、ＳｐＳ−ＣＢＤがセルロースに結合したことが示され、明らかなタンパク質が非結合画分においてクーマシブルーによって明らかにされなかった（図２５、レーン５〜レーン７）。ＳｐＳはほとんどが結合手順の後では非結合画分に見出される（図２６、レーン２〜レーン４）。結合画分に見出されるＳｐＳタンパク質はセルロースに非特異的に吸着される。この現象は、下記でさらに明らかにされるように、固体／液体境界でのタンパク質吸着の機構によって説明することができる［Ｈａｙｎｅｓ他、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ，Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、２：５１７〜５６６（１９９４）］。
【０３８４】
セルロースに対する、精製されたＣＢＤｃｌｏｓ、ＳｐＳおよびＳｐＳ−ＣＢＤｃｌｏｓの定量的な結合可逆性アッセイ：吸着／脱着実験は、吸着の可逆性を調べるための非常に重要な試験である。吸着平衡からの逸脱が無限小であるならば、可逆的な吸着プロセスが定義され、その結果、可逆的プロセス（脱着）では、系の状態を特徴づける変数が逆の順序で同じ値に戻る。したがって、可逆的な吸着プロセスでは、等温線の上行き線（溶液における増大する濃度）および下行き線（溶液における低下する濃度）が重ならなければならない。等温線の上行き線および下行き線が重ならないならば、そのプロセスは不可逆として定義され、上行き線と、下行き線との間のずれがヒステリシスとして定義される［Ｈａｙｎｅｓ他、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ，Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、２：５１７〜５６６（１９９４）］。ＣＢＤｃｌｏｓおよびＳｐＳ−ＣＢＤの脱着実験では、新しい平衡が希釈後に確立され、この平衡は同じ等温線の上になかったことが明らかにされた（図２６）。これらの結果は、上行き等温線および下行き等温線が重ならないことを証明する（これが不可逆的な結合のための前提条件である）。これらの結果は、試験された条件のもとでは、ＣＢＤｃｌｏｓおよびＳｐＳ−ＣＢＤｃｌｏｓが類似する吸着挙動を示し、ほとんど不可逆的にセルロースに結合することを明らかにする。これらの結果はまた、ＳｐＳ等温線の上行き線および下行き線がほぼ重なることを明らかにしており、したがって、セルロースに対するＳｐＳの吸着が可逆的ではなく、むしろ、固体／液体境界でのタンパク質吸着に起因することを確かに理解することができる。本明細書中下記の表１９には、定量的な結合可逆性アッセイの結果がまとめられている。
【０３８５】
【表１９】
2015144610.tif 000027
【０３８６】
Ｔ１ホモ接合植物によるＣＢＤ−ＳｐＳ１２およびＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６の発現：上昇したタンパク質発現を有する４つのホモ接合Ｔ１植物を単離した：
１．ＣＢＤ−ＳｐＳ１２を発現し、アポプラストに分泌する、ＣＢＤ−ＳｐＳ１２  Ｎｏ．１３．７およびＮｏ．１３．８の２つの植物が特定された。これらは本明細書中では１３．７および１３．８としてそれぞれ示される。
２．６ｍｅｒ−ＣＤＢ−ＳｐＳ６を細胞質において発現する、ＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６  Ｎｏ．６．４およびＮｏ．６．８の２つの植物が特定された。これらは本明細書中では６．４および６．８としてそれぞれ示される。
【０３８７】
タンパク質抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、ＣＢＤ−ＳｐＳ１２およびＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６の両方がセルロースと結合し、したがって、ほとんどが不溶性画分に見出されたことが明らかにされた（図２７Ａ〜図２７Ｂ）。必要以上のセルロースを抽出手順に加えることにより、可溶性画分のＣＢＤ融合タンパク質の全てがセルロースと結合した。
【０３８８】
トランスジェニックタバコ植物からのＣＢＤ−ＳｐＳ１２およびＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６の精製：ＣＢＤ−ＳｐＳ１２およびＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６の精製は、植物の細胞壁に対する融合ＣＢＤタンパク質の独特な結合に基づく。この特異的な結合は、ＣＢＤが活性であることを裏付けており、精製の第１工程として役立つ（図２８Ａ）。ＣＢＤ含有タンパク質は、細胞壁と結合し、細胞抽出物の不溶性画分と一緒に沈殿することが示された。その後、ペレットを溶出緩衝液で処理した。これにより、この溶出プロセスの可溶性画分へのＣＢＤ含有タンパク質の放出がもたらされた（図２８Ａ、レーン６）。ＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６のさらなる精製は、広範囲のｐＨにおけるクモ絹糸の特有の熱安定性および溶解性に基づく。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、ＳｐＳ６−ＣＢＤ−ＳｐＳ６が広範囲のｐＨにおいて熱安定性かつ可溶性であることが明らかである（図２８Ｂ）。
【０３８９】
実施例１４
クモ絹糸の金属触媒重合
材料および方法
精製されたＳｐＳタンパク質（実施例８）（これは１５個のチロシン残基を含有する）を５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）または脱イオン水のどちらかに対して４回透析した。透析後、タンパク質を１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した（図２９、レーン２、レーン３、レーン４）。重合反応を、Ｋａｔｏ他（２００１）（Ｋａｔｏ  Ｙ、Ｋｉｔａｍｏｔｏ  Ｎ、Ｋａｗａｉ  Ｙ、Ｏｓａｗａ  Ｔ（２００１）、他の金属触媒酸化システムではなく、過酸化水素／銅イオンシステムはタンパク質結合型ジチロシンをもたらす、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３１（５）、６２４〜６３２）、および、Ａｌｉ他（Ａｌｉ  ＦＥ、Ｂａｒｎｈａｍ  ＫＪ、Ｂａｒｒｏｗ  ＣＪ、Ｓｅｐａｒｏｖｉｃ  Ｆ（２００４）、銅／過酸化水素の種々の酸化システムによるチロシン残基の金属触媒酸化、Ｊ  Ｉｎｏｒｇ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、９８（１）：１７３〜８４）によって報告されるＭＣＯ法に従って行った。全反応を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにおいて２５０μｌの最終体積で行った。ＭＣＯ重合を、４ｍｍｏｌのＨ２Ｏ２（３０％Ｈ２Ｏ２の１μｌ）および２００μＭのＣｕＣｌ２（Ｈ２Ｏに溶解された２０ｍＭ  ＣｕＣｌ２の２．５μｌ）を加え、その後、３７℃での一晩のインキュベーションを行うことによって行った。タンパク質溶液のみのチューブ、Ｈ２Ｏ２のみまたはＣｕＣｌ２のみを伴うタンパク質溶液のチューブを陰性コントロールとして使用した。反応を、１ｍＭのＥＤＴＡを加えることによって停止させた。最後に、試料をＸ２  ＳＡＢにおいて煮沸し、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０３９０】
結果
重合が、図２９のレーン３およびレーン７に示されるように、リン酸塩緩衝液および水の両方において達成された。
【０３９１】
実施例１５
ＣＢＤ含有／非含有のクモ絹糸およびセルロースウィスカーのスポンジを調製するための方法
材料および方法
タンパク質水溶液（５ｗｔ％）をＴｅｆｌｏｎ鋳型においてセルロースウィスカーと混合した。均質な溶液を得た後、１００％メタノールを１５％の最終濃度にタンパク質−ウィスカー混合物に加えた（撹拌を手によって行った）。鋳型を−８０℃の冷凍庫に１時間以上置いた。タンパク質−ウィスカーの凍結溶液を凍結乾燥して、スポンジを作製した。この方法は、Ｎａｚａｒｏｖ  Ｒ他、再生絹フィブロインからの多孔性３Ｄ足場、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２００４）、５、７１８〜７２６に基づく。
【０３９２】
実施例１６
組換えクモ絹糸−セルロースウィスカーのスポンジの調製
精製されたＳｐＳタンパク質を、水を４回交換しながら１８時間にわたって水に対して透析した（最初の交換が１２時間後であり、その後の３回の交換が２時間毎であった）。透析後、タンパク質水溶液を５ｗｔ％に濃縮した（図３０、レーン５に対してレーン２およびレーン４）。その後、濃縮されたＳｐＳタンパク質をＴｅｆｌｏｎ鋳型においてセルロースウィスカーと混合して、１００／０％、３０／７０％、０／１００％の所望される比率をそれぞれ得た。
【０３９３】
実施例１７
絹糸−ウィスカー複合物のＴｍの決定
材料および方法
実施例１５および実施例１６に記載される方法に従って作製されたスポンジを示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）によって分析した。それぞれの操作について、約５ｍｇの試料を使用し、サーモグラムを、窒素下、５℃／分の加熱速度で０℃から３００℃まで記録した。
【０３９４】
結果
ＤＳＣ分析（図３１Ａ〜図３１Ｃ）は３つの異なるサーモグラムプロフィルを示す。クモ絹糸−セルロースウィスカーの複合物のサーモグラムにおいて、クモ絹糸およびセルロースウィスカー単独の転移温度ピーク２が消失し、より高いピークが２４３．６９℃に現れた。表２０には、ウィスカー、絹糸および７０％ウィスカー／３０％絹糸スポンジのＤＳＣサーモグラムから得られる転移温度ピークがまとめられている。この分析は、絹糸−ウィスカーの組合せがウィスカーの転移温度ピーク２における著しい増大をもたらすことを明らかにする。表２０には、ウィスカー、絹糸および７０％ウィスカー／３０％絹糸スポンジのＤＳＣサーモグラムから得られる転移温度ピークがまとめられている。
【０３９５】
【表２０】
2015144610.tif 000028
【０３９６】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０３９７】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【配列表フリーテキスト】
【０３９８】
配列番号１〜７，３７及び４７は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号８は、レシリンの弾性反復単位の配列である。
配列番号９は、ショウジョウバエ由来の最小レシリンポリペプチド配列である。
配列番号１０は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ由来のセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）の配列である。
配列番号１１は、天然の仮想的なキチン結合ドメインを含むレシリン１７弾性反復（Ｒｅｓ−ＣＨＢＤ）の配列である。
配列番号１２は、レシリン１７弾性反復に融合されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのＣＢＤ（ＣＢＤｃｌｏｓ）（ＣＢＤ−レシリン）の配列である。
配列番号１３は、リンカーポリペプチドを介してＣＢＤに融合されたレシリンの配列である。
配列番号１４は、Ｃ′リンカーポリペプチド（Ｅｌｖｉｎ）に融合されたレシリンの配列である。
配列番号１５は、リンカーポリペプチド配列に融合されたレシリンの配列である。
配列番号１６は、１５ｓｐｓクモ絹糸ポリペプチドの配列である。
配列番号１７は、天然の仮想的なキチン結合ドメインを含むレシリン１７弾性反復（Ｒｅｓ−ＣＨＢＤ）のポリヌクレオチド配列である。
配列番号１８は、レシリン１７弾性反復に融合されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのＣＢＤ（ＣＢＤｃｌｏｓ）（ＣＢＤ−レシリン）のポリヌクレオチド配列である。
配列番号１９は、リンカーコード配列を介してＣＢＤに融合されたレシリンの配列である。
配列番号２０及び２１は、植物中での発現のためにコドン最適化されたＣＢＤ−レシリン融合構築物の配列である。
配列番号２２は、植物中での発現のためにコドン最適化された、天然の仮想的なキチン結合ドメインを含むレシリンのポリヌクレオチド配列である。
配列番号２３は、１５ｓｐｓクモ絹糸の合成遺伝子の配列である。
配列番号２４は、ＣＢＤポリヌクレオチド配列に融合された１５ｓｐｓクモ絹糸の配列である。
配列番号２５は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのＣＢＤ（ＣＢＤｃｌｏｓ）ポリヌクレオチド配列である。
配列番号２６は、クモ絹糸の反復単位の配列である。
配列番号２７は、合成クモ絹糸の反復単位（ＧＥＮＥＡＲＴ）のポリヌクレオチド配列である。
配列番号２８は、１２ｓｐｓクモ絹糸ポリヌクレオチド配列に融合されたＣＢＤｃｌｏｓの配列である。
配列番号２９は、クモ絹糸６ｓｐｓ−ＣＢＤ−６ｓｐｓ構築物のポリヌクレオチド配列である。
配列番号３０は、プロモーター及び５′ＵＴＲを含むルビスコの小サブユニットカセットの配列である。
配列番号３１は、３′ＵＴＲ及びターミネーターを含むルビスコの小サブユニットカセットの配列である。
配列番号３２は、ＣＢＤに融合された１５ｓｐｓクモ絹糸の配列である。
配列番号３３は、６Ｈｉｓタグ化された１５ｓｐｓクモ絹糸ポリペプチドの配列である。
配列番号３４は、６Ｈｉｓタグ化された１５ｓｐｓクモ絹糸ＣＢＤ融合ポリペプチドの配列である。
配列番号３５は、ＣＢＤｃｌｏｓ  １２ｓｐｓクモ絹糸融合ポリペプチドの配列である。
配列番号３６は、６ｓｐｓ−ＣＢＤ−６ｓｐｓ融合ポリペプチドの配列である。
配列番号３８は、合成クモ絹糸の反復単位（ＧＥＮＥＡＲＴ）のポリペプチド配列である。
配列番号３９は、レシリンキチン結合ドメインの配列である。
配列番号４０は、塩基性エンドキチナーゼＢキチン結合ドメインの配列である。
配列番号４１は、グルコアミラーゼデンプン結合ドメインの配列である。
配列番号４２は、デキストラン結合ドメインの配列である。
配列番号４３は、アルギン酸結合ドメインの配列である。
配列番号４４は、ヒアルロン酸結合ドメインの配列である。
配列番号４５は、レシリンにおける反復アミノ酸配列である。
配列番号４６は、エラスチンにおける反復アミノ酸配列である。
配列番号４８は、液胞区分けシグナルコードポリヌクレオチドの配列である。
配列番号４９は、液胞区分けシグナルポリペプチドの配列である。
配列番号５０は、アポプラスト区分けシグナルコードポリヌクレオチドの配列である。
配列番号５１は、アポプラスト区分けシグナルポリペプチドの配列である。
配列番号５２及び５３は、ＣＢＤとレシリンとの間のリンカーとして使用されるポリペプチドの配列である。
配列番号５４は、Ｌａｃオペレーター、６ＸＨｉｓタグ、スペーサー領域、ｒＴＥＶ切断部位及び多数のクローニング部位を含むｐＨＩＳ−Ｐａｒａｌｌｅｌ３フラグメントの配列である。
配列番号５５は、６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの配列である。
配列番号５６は、６Ｈ−レシリンの配列である。
配列番号５７は、６Ｈ−ＣＢＤ−レシリンの配列である。
配列番号５８は、６Ｈ−レシリン−ＣＢＤの配列である。
配列番号５９は、６Ｈ−Ｒｅｓ−ＣｈＢＤの発現配列である。
配列番号６０は、６Ｈ−レシリンの発現配列である。
配列番号６１は、６Ｈ−ＣＢＤ−レシリンの発現配列である。
配列番号６２は、６Ｈ−レシリン−ＣＢＤの発現配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【配列表】
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