(57)【要約】【課題】通常のデータベース検索では同定が難しい翻訳後修飾を受けたペプチドについても、高い精度でペプチド及び修飾部位の同定を可能とする。【解決手段】目的ペプチド由来のＭＳnスペクトルについて、イオン強度が相対的に大きな複数のピークを起点として低m/z方向にデノボシーケンシングを実行し、アミノ酸配列を推定して複数のタグ候補を抽出する（Ｓ１−Ｓ３）。起点となるピークが異なるタグ候補を比較し、アミノ酸配列が共通するものを信頼度が高いものとして検出し、該アミノ酸配列に基づくシーケンスタグを作成する（Ｓ４）。検出した複数のタグ候補におけるアミノ酸配列の開始m/z同士、終了m/z同士の差から翻訳後修飾分子を推定する（Ｓ５）。シーケンスタグと修飾分子情報とを検索条件としてシーケンスタグサーチを実行することで目的ペプチドを同定する（Ｓ６−Ｓ７）。【選択図】図２
2015230262.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料に対して質量分析を実行することで収集されたデータを用い、該被検試料に含まれる翻訳後修飾を受けたペプチドを同定する質量分析データ解析方法であって、
a)目的ペプチド由来のイオンをプリカーサイオンとしたＭＳn分析（ｎは２以上の整数）を実行することで得られたＭＳnスペクトルに対して、複数の異なるイオンピークを起点として同一質量電荷比軸方向にデノボシーケンシングを実行し、異なる複数のイオン系列についての部分的なアミノ酸配列をそれぞれ求めてタグ候補とするタグ候補抽出ステップと、
b)前記タグ候補抽出ステップにおいて得られたイオン系列毎の１又は複数のタグ候補について、異なるイオン系列に対して同一質量電荷比軸方向に共通のアミノ酸配列を含むタグを見いだして、信頼性の高いタグとしてシーケンスタグを生成するタグ選択ステップと、
c)タンパク質のアミノ酸配列情報が格納されたデータベースを用い、前記タグ選択ステップにおいて生成されたシーケンスタグを検索条件としたシーケンスタグサーチを実行するデータベース検索ステップと、
を有することを特徴とする質量分析データ解析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の質量分析データ解析方法であって、
前記タグ選択ステップにおいて共通のアミノ酸配列を含むことが確認された異なるイオン系列に対する複数のタグを比較することにより、目的ペプチドの翻訳後修飾分子を推定する修飾推定ステップをさらに有し、前記データベース検索ステップにおいて前記修飾推定ステップで推定された翻訳後修飾分子を検索条件の１つとすることを特徴とする質量分析データ解析方法。
【請求項３】
被検試料に対して質量分析を実行することで収集されたデータを用い、該被検試料に含まれる翻訳後修飾を受けたペプチドを同定する質量分析データ解析装置において、
a)目的ペプチド由来のイオンをプリカーサイオンとしたＭＳn分析（ｎは２以上の整数）を実行することで得られたＭＳnスペクトルに対して、複数の異なるイオンピークを起点として同一質量電荷比軸方向にデノボシーケンシングを実行し、異なる複数のイオン系列についての部分的なアミノ酸配列をそれぞれ求めてタグ候補とするタグ候補抽出手段と、
b)前記タグ候補抽出手段により得られたイオン系列毎の１又は複数のタグ候補について、異なるイオン系列に対して同一質量電荷比軸方向に共通のアミノ酸配列を含むタグを見いだして、信頼性の高いタグとしてシーケンスタグを生成するタグ選択手段と、
c)タンパク質のアミノ酸配列情報が格納されたデータベースと、
d)前記データベースを用い前記タグ選択手段により生成されたシーケンスタグを検索条件としたシーケンスタグサーチを実行するデータベース検索手段と、
を備えることを特徴とする質量分析データ解析装置。
【請求項４】
請求項３に記載の質量分析データ解析装置であって、
前記タグ選択手段により共通のアミノ酸配列を含むことが確認された異なるイオン系列に対する複数のタグを比較することによって、目的ペプチドの翻訳後修飾分子を推定する修飾推定手段をさらに備え、前記データベース検索手段は前記修飾推定手段により推定された翻訳後修飾分子を検索条件の１つとすることを特徴とする質量分析データ解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド等の生体由来の高分子化合物に対してＭＳn分析を実行して収集されたデータを解析処理し上記高分子化合物を同定する質量分析データ解析方法及び装置に関し、特に、翻訳後修飾を受けたペプチドやタンパク質を同定するための質量分析データ解析方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質を網羅的に解析するプロテオーム解析の手法は広く用いられており、その技術的な進歩には著しいものがある。プロテオーム解析分野において、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦＭＳ（マトリクス支援レーザ脱離イオン化イオントラップ飛行時間型質量分析装置）を始めとする質量分析装置を用いたペプチドの解析手法として、データベース検索法がよく知られている。データベース検索法では、ＭＳn分析により取得されたＭＳnスペクトルに現れるピークの質量電荷比を列挙したピークリストと、データベースに登録されたタンパク質より算出される質量電荷比とを照合し、その一致度を手がかりとしてペプチドのアミノ酸配列を決定する。また、データベース検索に際して、ペプチドの受けた修飾の種類を検索条件としてユーザが指定することにより、蓋然性の高いペプチドとその修飾部位とを同定する手法も開発されている。
【０００３】
例えば英国マトリクス・サイエンス社が提供するマスコット（Mascot）にはＭＳ／ＭＳイオンサーチと名付けられた検索エンジンが含まれており、検索パラメータとして、タンパク質の分解に使用した消化酵素の種類（エンザイム：Enzyme）、修飾の種類（モディフィケイション：modification）、質量分析の精度の許容値（MS/MS tol.）などをユーザが入力設定できるようになっている（非特許文献１参照）。ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法では、複数のＭＳ／ＭＳ（ＭＳn）スペクトルに対して検索条件に従ったデータベース検索を行い、一致度（スコア）が高いペプチドがリストアップされる。
【０００４】
上述したように従来のデータベース検索法では検索条件の１つとして翻訳後修飾の種類などを指定できるようになってはいるものの、実際には、タンパク質特有の翻訳後修飾を受けたペプチドについて上記ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法などによるデータベース検索の手法を適用しても、妥当なスコアでペプチドや修飾部位を同定することはかなり困難である。その主な理由は、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦＭＳを用いたＭＳn分析により得られるＭＳnスペクトルは、修飾を受けたプロダクトイオンと修飾分子が脱離したプロダクトイオン（ニュートラルロス）とが混在したものとなり、ピークリストがかなり複雑になるためである。
【０００５】
一例として、糖鎖断片であるＨｅｘＮＡｃ１個による修飾を受けたヒトトランスフェリン由来のペプチドイオンをプリカーサイオンとするＭＳ2スペクトルに基づいて作成したピークリストに対し、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法を用いてデータベース検索した結果を図６に示す。図６に示すように、この例では妥当なスコアでペプチド及び修飾部位を同定することはできなかった。図７は図６の検索の元となったＭＳ3スペクトルとその帰属結果を示す図である。図８は図７に示したＭＳ3スペクトルとヒトトランスフェリンペプチドの理論プロダクトイオンとの一致度を示す図である。
【０００６】
図７において、ｙn＋■は、糖鎖が１個付加されているという条件の下での帰属結果である。図７に示すように、ＨｅｘＮＡｃ付加体イオン（図中で■が付いたｙイオン）とＨｅｘＮＡｃのニュートラルロスにより生じたイオン（ｙイオン）とが混在していることが分かる。図７と図８とを比較すると、ＨｅｘＮＡｃのニュートラルロスで生じた強度の比較的大きなイオン、例えばｙ(8)、ｙ(11)などはデータベース検索の際にプロダクトイオンとして帰属されていないことが分かる。こうしたイオンのピークはノイズとして処理されてしまったと考えられ、それによって同定スコアが低くなってしまったと予想される。
【０００７】
一方、ペプチド同定のためのデータベース検索の一手法としてシーケンスタグサーチ（Sequence Tag search）と呼ばれる方法がある。シーケンスタグサーチでは、ペプチド又はタンパク質に存在し得る連続のアミノ酸配列を示すタグ（シーケンスタグ）を利用して、ＭＳ／ＭＳイオンサーチと同様に、データベースに登録されているタンパク質の仮想ＣＩＤスペクトルとの照合によりペプチド同定を試みる。シーケンスタグサーチを実行するツールとしては例えば英国マトリクスサイエンス社が提供する「Mascot Sequence Query」がよく知られている（非特許文献２参照）。この「Mascot Sequence Query」におけるデータベース検索設定画面は「Mascot MS/MS ion search」と同様の検索設定画面であるが、ＭＳ2スペクトルから収集されるピークリストの代わりにシーケンスタグをデータとして入力する点が相違する（非特許文献３参照）。
【０００８】
シーケンスタグサーチは、与えられるシーケンスタグが正確であって該当ペプチドがデータベースに登録されていれば、正解であるペプチドを一意に同定できるという特徴がある。それ故に、シーケンスタグサーチを利用する場合には精度の高いシーケンスタグを取得することが非常に重要である。ＭＳnスペクトルからシーケンスタグを探索するために一般的にはデノボ（de novo）シーケンシングが利用されるが、上述したように翻訳後修飾を受けたペプチドに対するＭＳnスペクトルはかなり複雑になるため、単にデノボシーケンシングを実行しても精度のよいシーケンスタグを見いだすのは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１２−２２０３６５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】「マトリクス・サイエンス マスコット ＭＳ／ＭＳ・イオン・サーチ（Matrix Science  Mascot  MS/MS Ions Search）」、[online]、英国マトリクス・サイエンス社（Matrix Science Ltd.）、[平成２６年５月２３日検索]、インターネット＜URL :  http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=MIS＞
【非特許文献２】「シーケンス・クエリ（Sequence Query）」、[online]、英国マトリクス・サイエンス社（Matrix Science Ltd.）、[平成２６年５月２３日検索]、インターネット＜URL: http://www.matrixscience.com/help/sq_help.html＞
【非特許文献３】「蛋白質同定システム MASCOT Server Version 2.2 チュートリアル」、[online]、英国マトリクス・サイエンス社（Matrix Science Ltd.）、[平成２６年５月２３日検索]、インターネット＜URL: http://www.matrixscience.jp/pdf/jap_2.2_tutorial.pdf＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、ニュートラルロスのために従来のデータベース検索法では十分な信頼度で以て同定できないような翻訳後修飾を受けたペプチドのＭＳnスペクトルを用いて、高い精度で以て、翻訳後修飾の種類や修飾部位及びペプチドのアミノ酸配列を同定することができる質量分析データ解析方法及び装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために成された第１発明は、被検試料に対して質量分析を実行することで収集されたデータを用い、該被検試料に含まれる翻訳後修飾を受けたペプチドを同定する質量分析データ解析方法であって、
a)目的ペプチド由来のイオンをプリカーサイオンとしたＭＳn分析（ｎは２以上の整数）を実行することで得られたＭＳnスペクトルに対して、複数の異なるイオンピークを起点として同一質量電荷比軸方向にデノボシーケンシングを実行し、異なる複数のイオン系列についての部分的なアミノ酸配列をそれぞれ求めてタグ候補とするタグ候補抽出ステップと、
b)前記タグ候補抽出ステップにおいて得られたイオン系列毎の１又は複数のタグ候補について、異なるイオン系列に対して同一質量電荷比軸方向に共通のアミノ酸配列を含むタグを見いだして、信頼性の高いタグとしてシーケンスタグを生成するタグ選択ステップと、
c)タンパク質のアミノ酸配列情報が格納されたデータベースを用い、前記タグ選択ステップにおいて生成されたシーケンスタグを検索条件としたシーケンスタグサーチを実行するデータベース検索ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１３】
また上記課題を解決するために成された第２発明は、上記第１発明に係る質量分析データ解析方法を実施する装置であって、被検試料に対して質量分析を実行することで収集されたデータを用い、該被検試料に含まれる翻訳後修飾を受けたペプチドを同定する質量分析データ解析装置において、
a)目的ペプチド由来のイオンをプリカーサイオンとしたＭＳn分析（ｎは２以上の整数）を実行することで得られたＭＳnスペクトルに対して、複数の異なるイオンピークを起点として同一質量電荷比軸方向にデノボシーケンシングを実行し、異なる複数のイオン系列についての部分的なアミノ酸配列をそれぞれ求めてタグ候補とするタグ候補抽出手段と、
b)前記タグ候補抽出手段により得られたイオン系列毎の１又は複数のタグ候補について、異なるイオン系列に対して同一質量電荷比軸方向に共通のアミノ酸配列を含むタグを見いだして、信頼性の高いタグとしてシーケンスタグを生成するタグ選択手段と、
c)タンパク質のアミノ酸配列情報が格納されたデータベースと、
d)前記データベースを用い前記タグ選択手段により生成されたシーケンスタグを検索条件としたシーケンスタグサーチを実行するデータベース検索手段と、
を備えることを特徴としている。
【００１４】
ここでは、ペプチドのＮ末端由来のｂ系列イオンとＣ末端由来のｙ系列イオンとを別のイオン系列として扱うのみならず、例えばｂ系列イオンでも翻訳後修飾が付加したイオンと該修飾が脱離したイオンとは別のイオン系列として扱う。
【００１５】
例えば修飾分子が脱離したｂ系列（又はｙ系列）フラグメントイオンと修飾分子が付加している（残っている）ｂ系列（又はｙ系列）フラグメントイオンとでは、後者が修飾分子に相当する質量分だけ大きな質量電荷比を有する筈である。即ち、ＭＳnスペクトルにおいて、後者に由来するフラグメントイオンピークは前者に由来するフラグメントイオンピークよりも修飾分子に相当する質量分だけ質量電荷比軸上でシフトした位置に現れる筈である。そのため、修飾分子が脱離したｂ系列（又はｙ系列）フラグメントイオンと修飾分子が付加しているｂ系列（又はｙ系列）フラグメントイオンとをそれぞれ起点として同一質量電荷比軸方向にデノボシーケンシングを実行すると、少なくともその起点から或る位置（後者において修飾分子が含まれる最小のイオンの位置）までのアミノ酸配列は同一になる。換言すれば、デノボシーケンシングを実行する起点のイオン系列が不明であっても、或る２つの異なる起点からそれぞれデノボシーケンシングを実行して得られたアミノ酸配列が一致していれば、そのアミノ酸配列の推定結果は正しいものとみなすことができる。
【００１６】
そこで、第１発明に係る質量分析データ解析方法では、被検試料由来のＭＳnスペクトルが得られると、まずタグ候補抽出ステップにおいてＭＳnスペクトル中の、例えば相対的に強度が大きな複数のピークを起点として同一質量電荷比軸方向にデノボシーケンシングがそれぞれ実行される。それにより、異なる複数のイオン系列についての部分的なアミノ酸配列がそれぞれ１又は複数求まる。タグ選択ステップにおいては、イオン系列毎の１又は複数のタグ候補について、異なるイオン系列に対して同一質量電荷比軸方向に共通のアミノ酸配列を含むタグを検出する。上述したように、検出されたタグは信頼性が高いとみなせるから、これに基づいてシーケンスタグを生成する。そして、データベース検索ステップにおいては、タンパク質のアミノ酸配列情報が格納されたデータベースを用いて、上記シーケンスタグを検索条件としたシーケンスタグサーチを実行することにより、目的とするペプチドを同定する。
【００１７】
シーケンスタグサーチを行う際には、翻訳後修飾分子の種類や修飾部位或いは修飾分子の質量などを検索条件の１つとして与える必要がある。修飾分子の種類などが既知である場合にはそうした既知の情報を検索条件として与えればよい。一方、翻訳後修飾分子の種類などが未知である場合でも、上述したように求めた高い信頼性を有するタグ候補から容易に推定することが可能である。
【００１８】
即ち、第１発明に係る質量分析データ解析方法では、好ましくは、前記タグ選択ステップにおいて共通のアミノ酸配列を含むことが確認された異なるイオン系列に対する複数のタグを比較することにより、目的ペプチドの翻訳後修飾分子を推定する修飾推定ステップをさらに有し、前記データベース検索ステップにおいて前記修飾推定ステップで推定された翻訳後修飾分子を検索条件の１つとするとよい。これにより、目的ペプチドが受けている翻訳後修飾の種類等が不明であっても、目的ペプチドを同定することが可能となる。
【００１９】
なお、シーケンスタグサーチを実行するデータベース検索手段としては、前述した「Mascot Sequence Query」のような既知のソフトウエアを利用することが可能である。
【発明の効果】
【００２０】
第１発明に係る質量分析データ解析方法及び第２発明に係る質量分析データ解析装置によれば、翻訳後修飾を受けたペプチド由来の複雑なＭＳnスペクトルから信頼性の高いシーケンスタグを求めることができるので、従来のデータベース検索を利用しながら、従来は困難であった、翻訳後修飾されたペプチドのアミノ酸配列と修飾部位の同定とを高い信頼性を以て行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明に係る質量分析データ解析装置を含むペプチド解析システムの一実施例の全体構成図。
【図２】本実施例のペプチド解析システムにおいて実施されるデータ解析処理手順の一例を示すフローチャート。
【図３】アクリルアミド標識されたヒトトランスフェリンの二分枝糖鎖結合糖ペプチドから実測により得られた１価のＨｅｘＮＡｃ付加ペプチドイオン（m/z 1694）の擬似ＭＳ3スペクトルを示す図。
【図４】図３の擬似ＭＳ3スペクトル上のイオン強度が高いピークを起点としてデノボシーケシングを実行してアミノ酸配列を推定した結果を示す図。
【図５】シーケンスタグ（ＥＡ[ＩＬ][ＰＶ｜ＶＰ]、開始m/z 741.4、終了m/z 1250.6）を用いてシーケンスタグサーチを実施した結果を示す図。
【図６】ヒトトランスフェリン由来のペプチドイオンをプリカーサイオンとするＭＳ2スペクトルに対しＭＳ／ＭＳイオンサーチ法によるデータベース検索した結果を示す図。
【図７】図６の検索の元となったＭＳ3スペクトルとその帰属結果を示す図。
【図８】図７に示したＭＳ3スペクトルとヒトトランスフェリンペプチドの理論プロダクトイオンとの一致度を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明に係る質量分析データ解析装置を含むペプチド解析システムの一実施例について、添付図面を参照して説明する。図１は本実施例のペプチド解析システムの全体構成図である。
【００２３】
本実施例のペプチド解析システムは、大別して、質量分析部１と、コンピュータを中心に構成される制御・処理部２と、から成る。質量分析部１はマトリクス支援レーザ脱離イオン化四重極イオントラップ飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦＭＳ）であり、被検試料中の分子や原子をイオン化するＭＡＬＤＩ法によるイオン化部１０と、発生したイオンを一時的に捕捉し、質量電荷比m/zに応じたイオンの選別とＣＩＤによるイオンの開裂とを実行可能な３次元四重極型のイオントラップ１１と、イオントラップ１１から出射された各種イオンを質量電荷比に応じて分離して検出する飛行時間型質量分析器１２と、を備える。飛行時間型質量分析器１２は、リフレクトロン電極により発生する電場によりイオンを折返し飛行させる飛行空間１３と、該飛行空間１３を飛行する間に質量電荷比に応じて時間的に分離されたイオンを順次検出するイオン検出器１４と、を含む。
【００２４】
制御・処理部２は、質量分析部１の各部を制御する分析制御部２８、イオン検出器１４から得られる検出信号をデジタル化して内部の記憶部に格納するデータ収集部２１、収集されたデータからＭＳスペクトルやＭＳnスペクトルを作成するスペクトル解析部２２、ＭＳnスペクトルデータに対してデノボシーケンシングを実行してタグ候補である部分的なアミノ酸配列を求めるタグ候補抽出部２３、同一ＭＳnスペクトルを基に得られた複数のタグ候補に基づいて信頼性の高いシーケンスタグを生成するタグ選択部２４、信頼性の高いタグに基づいて翻訳後修飾分子等を求める修飾物判定部２５、シーケンスタグや修飾分子の種類などを検索条件に設定してデータベース検索により被検試料中の目的ペプチドを同定するシーケンスタグサーチ実行部２６、及び、タンパク質（ペプチド）のアミノ酸配列を推定するための同定用情報が予め登録された同定用データベース（ＤＢ）２７、を備える。シーケンスタグサーチ実行部２６の機能は、例えば上述した「Mascot Sequence Query」などの既存の検索エンジンソフトウエアを利用することができる。
【００２５】
制御・処理部２の実体はコンピュータであって、該コンピュータにインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアが動作することにより、前述の各種機能が達成される。制御・処理部２に接続された入力部３は具体的には、コンピュータに接続されるキーボードやマウス等のポインティングデバイスであり、ユーザが検索条件を入力設定したりスペクトル解析のために必要な各種操作を行ったりするためのものである。また、同様に制御・処理部２に接続された表示部４は具体的にはモニタディスプレイであり、検索条件入力設定画面を表示したり同定結果を表示したりするためのものである。
【００２６】
図２に示したペプチド同定の処理手順を示すフローチャートを参照して、本実施例のペプチド解析システムにおける特徴的なデータ解析処理を説明する。
【００２７】
分析者は目的とするタンパク質を適宜の酵素（例えばトリプシン酵素）により消化して、翻訳後修飾を受けたペプチド（被修飾ペプチド）を含む被検試料を調製する。分析制御部２８の制御の下に、質量分析部１により上記被検試料に対するＭＳ1分析が実行されると、スペクトル解析部２２はデータ収集部２１により収集されたデータに基づいてＭＳ1スペクトルを作成する。スペクトル解析部２２は、このＭＳ1スペクトルから目的ペプチドに由来するイオンピークを抽出し、ＭＳ2分析のプリカーサイオンとして選択する（ステップＳ１）。
【００２８】
引き続き、分析制御部２８の制御の下に質量分析部１は、被検試料に対して上記プリカーサイオンについてのＭＳ2分析を実行する。より詳しく述べると、イオン化部１０においてレーザ光の照射により被検試料から生成された各種イオンは一旦イオントラップ１１に捕捉され、イオントラップ１１においてプリカーサイオンの質量電荷比を持つイオンのみが選別された後にＣＩＤによる解離が行われる。この際に、目的とする単一ペプチドのアミノ酸配列の結合が様々な部位で切れ、各種アミノ酸残基がプロダクトイオンとしてイオントラップ１１に捕捉される。このプロダクトイオンはイオントラップ１１から一斉に出射されて飛行時間型質量分析器１２により質量分析され、データ収集部２１はＭＳ2分析により得られたデータを収集し、スペクトル解析部２２は収集されたデータに基づいてＭＳ2スペクトルを作成する（ステップＳ２）。
【００２９】
なお、上記ステップＳ２では、ＭＳ2スペクトル上のイオンピークの中からプリカーサイオンを選択してＭＳ3分析を実行するという操作を１又は複数回繰り返し、ｎが３以上のＭＳnスペクトルを作成してもよい。後述の処理を実行するためには、翻訳後修飾が脱離したプロダクトイオンと翻訳後修飾が脱離していないプロダクトイオンとがＭＳnスペクトルで観測される必要があるから、翻訳後修飾分子が脱離し易いものである場合にはｎ＝２（ただし、後述するように実際に実行しているのはＭＳ2分析であるが、擬似的なＭＳ3分析であるといえる）でもよく、翻訳後修飾分子が脱離しにくいものである場合にはｎを３以上にすることが望ましい。
【００３０】
次に、タグ候補抽出部２３はＭＳ2スペクトル（又はＭＳnスペクトル）においてイオン強度が比較的大きいピークを複数選出し、各ピークを起点とし低質量電荷比側に向かってデノボシーケンシングを実行する。即ち、起点となるピークから低質量電荷比側に向かって、既知のアミノ酸の質量と一致するピークを順に探索することでアミノ酸配列を推定する。そして、得られたアミノ酸配列をシーケンスタグの候補として抽出する（ステップＳ３）。被修飾ペプチド由来のイオンを開裂させると、ＭＳnスペクトルには、翻訳後修飾分子が脱離したイオン系列のプロダクトイオンピークと翻訳後修飾分子が付加されているイオン系列のプロダクトイオンピークとが混在して現れるため、かなり複雑になる。そのため、後述の例で示すように、或る１つのピークを起点としてデノボシーケンシングを試みると、複数の異なるアミノ酸配列が挙げられ、複数のシーケンスタグ候補が抽出される。
【００３１】
続いてタグ選択部２４は、異なるピークを起点とした同一質量電荷比方向のデノボシーケンシングにより得られたシーケンスタグ候補のアミノ酸配列を比較し、共通のアミノ酸配列を有するタグを抽出する。一般的に、デノボシーケンシングの起点とされるイオン強度の大きなピークはそれぞれ異なるイオン系列（ここでは、同じｂ系列イオン、ｙ系列イオンでも翻訳後修飾分子がある場合とない場合とで別の系列とする）に属するイオンピークであると考えられる。また、同一イオン系列に属するイオンピークを正確にデノボシーケンシングした場合、例えば翻訳後修飾分子ありのｂ系列イオンに対して得られるアミノ酸配列と翻訳後修飾分子なしのｂ系列イオンに対して得られるアミノ酸配列とはほぼ一致する筈である。そこで、或る程度長い（アミノ酸残基が４程度以上）アミノ酸配列が共通である部分の信頼性は高いと考えられる。そこで、最も長いアミノ酸配列が共通しているタグ候補を選択し、その共通のアミノ酸配列に基づいて検索に使用するシーケンスタグを作成する（ステップＳ４）。
【００３２】
ステップＳ４で選択されたタグ候補における共通のアミノ酸配列の開始質量電荷比の差及び終了質量電荷比の差は、翻訳後修飾分子の質量である可能性が高い。そこで、修飾物判定部２５は上記差から翻訳後修飾分子の質量を求め、これに対応した翻訳後修飾分子の種類を求める（ステップＳ５）。
【００３３】
次に、シーケンスタグサーチ実行部２６は、ステップＳ４で得られた信頼性の高いシーケンスタグとステップＳ５で求まった翻訳後修飾分子の種類とに基づき検索条件を設定する（ステップＳ６）。そして該シーケンスタグで示されている情報（アミノ酸配列、開始質量電荷比、終了質量電荷比）と同定用データベース２７に登録されているタンパク質のアミノ酸配列や質量などの情報とを照合するシーケンスタグサーチを実行することにより、目的のペプチドを同定する。例えばシーケンスタグサーチ実行部２６として上述した「Mascot Sequence Query」を用いる場合、検索によりヒットしたペプチドにはその検索の信頼度を表すスコアや期待値などの信頼度指標値が付される。そこで、複数のペプチドがヒットした場合でも或る１つのペプチドの信頼度指標値が他のペプチドの信頼度指標値に比べて有意に高い場合には、そのペプチドのみを同定したペプチドとして挙げればよい。一方、唯一のペプチドを同定できない場合には、可能性のある複数のペプチドを上記信頼度指標値とともに候補として選出すればよい。そうして同定したペプチド又はペプチド候補を表示部４に表示して分析者に知らせる（ステップＳ７）。
【００３４】
シーケンスタグサーチでは、同定用データベース２７に目的のタンパク質が登録されており、且つ与えられるシーケンスタグが正確であれば、正解であるペプチドが含まれる検索結果が導出される。即ち、同定用データベース２７に正解があるにも拘わらずそれが含まれない検索結果が得られるということは起こらない。上述した手順によって得られるシーケンスタグの信頼性は高いため、これに基づいて求まるペプチド同定結果も信頼性の高いものとなることが保証される。
【実施例】
【００３５】
上述の特徴的な質量分析データ解析方法によるペプチド同定の具体例を説明する。
【００３６】
図３はアクリルアミド標識されたヒトトランスフェリン（Human Transferrin）の二分岐糖鎖結合糖ペプチドから得られた１価のＨｅｘＮＡｃ付加ペプチドイオン（m/z 1694）の擬似ＭＳ3スペクトルである。Ｎ-結合型糖ペプチドは糖鎖が脱離し易い。このため、糖ペプチドをＭＳ1分析すると、ＭＳ2分析対象となる糖ペプチドイオン（又はシアル酸脱離糖ペプチドイオン）以外に、全ての糖鎖が脱離したペプチドイオン、糖ＨｅｘＮＡｃの環開裂により生じた0,2Ｘ（83Da）付加ペプチドイオン、及びＨｅｘＮＡｃ付加ペプチドイオンに相当する３つのピーク（トリプレットピーク）がＭＳ1スペクトル上に観測されることがある。そこで、ＭＳ1スペクトルに現れるトリプレットピークが、ＭＳ2分析対象イオンをＭＳ2分析して得られたＭＳ2スペクトル上で観測されたトリプレットピークと同じ質量電荷比を持つ場合には、このトリプレットピークのいずれか１個以上を擬似ＭＳ3分析のプリカーサイオンとして選定し、該プリカーサイオンについてのＭＳ2分析を実行する。これにより、実際にはＭＳ2分析を行いながら、擬似ＭＳ3スペクトルを取得することができる。
【００３７】
なお、上述のようにＭＳ1スペクトル上のトリプレットピークとＭＳ2スペクトル上のトリプレットピークとの質量電荷比を比較する際に、トリプレットイオンの価数が異なる場合には、価数が同一になるように質量電荷比を補正した上で質量電荷比を比較する必要がある。特許文献１に記載されているように、Ｎ末端にグルタミン、グルタミン酸、カルバミドメチル化システインなど特定のアミノ酸残基が位置するＮ-結合型糖ペプチドでは、ＣＩＤの過程でＮ末端の特定アミノ酸残基の環化が優先的に生じ、そのためにＮＨ3やＨ2Ｏのニュートラルロスが発生し易い。こうした場合には、ＭＳ2スペクトル上のイオンピークは上記ニュートラルロスによる質量シフトが生じている可能性があるから、そうした質量シフトが検出された場合には、ＭＳ2スペクトル上のイオンピークについて質量シフトを補正した上でトリプレットピーク同士の質量電荷比を比較する。
【００３８】
図３に示した擬似ＭＳ3スペクトルには、ＨｅｘＮＡｃが付加したｂ系列イオン、ＨｅｘＮＡｃが付加したｙ系列イオンともに、ＨｅｘＮＡｃのニュートラルロスにより生じたイオンピークがプロダクトイオンとして現れている。この擬似ＭＳ3スペクトルから得られたピークリストに対し、従来のＭＳ／ＭＳイオンサーチ法を用いてデータベース検索を試みたところ、ＨｅｘＮＡｃ付加ペプチドに対する相同性は得られたものの、ペプチド及び修飾部位を同定できるほどの高いスコアは得られなかった（具体的にはスコア：20、期待値（Expect）：0.86）。
【００３９】
図４は、図３に示した擬似ＭＳ3スペクトルに対して上述したステップＳ３の処理、つまりデノボシーケシングによるアミノ酸配列推定を実行した結果を示す図である。擬似ＭＳ3スペクトル中の最大強度のイオンピーク（m/z 1491.1）を起点とした場合には適切なシーケシングができなかったが、２番目に強い強度のイオンピーク（m/z 1250.6）を起点とすると図４（ａ）に示すような５種類のアミノ酸配列推定結果が得られた。これらが、m/z 1250.6であるイオンピークを起点として得られたタグ候補である。一方、３番目に強い強度のイオンピーク（m/z 1047.4）を起点とすると図４（ｂ）に示すような５種類のアミノ酸配列推定結果が得られた。これらが、m/z 1047.4であるイオンピークを起点として得られたタグ候補である。この図４（ａ）と（ｂ）の両方に共通するアミノ酸配列を探索すると、アミノ酸配列ＥＡ「Ｉ／Ｌ」「ＰＶ｜ＶＰ」が見いだされた（図４中に１点鎖線で囲んだアミノ酸配列）。共通のアミノ酸配列のアミノ酸残基数は４以上であり、その信頼性は高いと考えられる。そこで、そのアミノ酸配列とＨｅｘＮＡｃ付加ペプチドのイオン系列における該アミノ酸配列の両端の質量電荷比から、シーケンスタグ（アミノ酸配列：ＥＡ[ＩＬ][ＰＶ｜ＶＰ]、開始質量電荷比 741.4、終了質量電荷比 1250.6）を作成する。
【００４０】
また、この共通のアミノ酸配列の開始質量電荷比及び終了質量電荷比を比較すると、ＨｅｘＮＡｃ（203Da）に相当する差があることが分かる。これから、解析中である擬似ＭＳ3スペクトルはＨｅｘＮＡｃによる修飾を受けたペプチドのスペクトルである蓋然性が高いことが確認できる。
【００４１】
上記のシーケンスタグと翻訳後修飾分子情報とを検索条件に設定して「Mascot Sequence Query」によるシーケンスタグサーチを実施した結果が図５である。図５に示すように、目的とするペプチドとＨｅｘＮＡｃ修飾部位とが高いスコア（スコア：62）及び低い期待値（Expect：8.3×10-6）で同定されている。これは上述した従来法によるスコアや期待値に比べて格段によい結果であり、本発明に係るデータ解析方法が翻訳後修飾を受けたペプチドの同定に有用であることが確認できる。
【００４２】
なお、上記実施例では目的ペプチド由来の１つのＭＳnスペクトル（上記例ではＭＳ3擬似スペクトル）から得られるデノボシーケンシング結果に基づいて信頼性の高いシーケンスタグを作成したが、１つの目的ペプチドから複数のＭＳnスペクトルが得られる場合には、その複数のＭＳnスペクトル）から得られるデノボシーケンシング結果に基づいて信頼性の高いシーケンスタグを作成してもよい。
【００４３】
また、ピーク強度や質量差の精度などの情報に基づいてシーケンスタグの信頼性を定量化してもよい。それにより、例えば共通のアミノ酸配列が複数種類存在した場合に、定量化されたシーケンスタグの信頼性指標値に基づいてシーケンスタグサーチに用いるタグを決定することができる。
【００４４】
また、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００４５】
１…質量分析部
１０…イオン化部
１１…イオントラップ
１２…飛行時間型質量分析器
１３…飛行空間
１４…イオン検出器
２…制御・処理部
２０…分析制御部
２１…データ収集部
２２…スペクトル解析部
２３…タグ候補抽出部
２４…タグ選択部
２５…修飾物判定部
２６…シーケンスタグサーチ実行部
２７…同定用データベース
２８…分析制御部
３…入力部
４…表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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